INTRODUCCIÓN
Los metabolitos secundarios se definen como compuestos que, aún sin ser esenciales para el mantenimiento de las funciones vitales de la planta o su crecimiento, son de gran importancia para la sobrevivencia de las plantas, plantas, ya que facilitan la interacción y adaptación de estas a su entorno, entorno, cumpliendo diversas funciones tales como brindar protección contra patógenos, atraer bacterias fijadoras de nitrógeno y agentes polinizantes, entre otras. Dichos Dichos compuestos compuestos pueden pueden clasificarse clasificarse de acuerdo a sus rutas de biosíntesi biosíntesiss y su naturaleza naturaleza química en grandes grupos! -
estructur turaa base base est# est# con consti stitu tuida ida por un anillo anillo ben benc$n c$nico ico Compuestos Fenólicos ! "u estruc sustituido por uno o m#s grupos hidro%ilo. "e sintetizan a trav$s de la ruta del &cido "hi'imico, la cual tiene tambi$n como productos amino#cidos arom#ticos. Dentro de los compuestos m#s destacados de esta categoría es posible encontrar la lignina, componente
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estructural fundamental de muchos tejidos vegetales. Alcaloide Alcaloides: s: (structuralmente, est#n constituidos por sistemas policíclicos que contienen uno o m#s #tomos de nitrógeno en su estructura, lo cual les confiere a estos compuestos
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propiedades d$bilmente d$bilmente b#sicas. )onsti tituy tuyen en el grup grupoo m#s m#s gran grande de y dive divers rsoo de meta metabo boli lito toss secu secund ndar ario ioss Terpenos! )ons vegetales. (structuralmente, son polímeros de isopreno sintetizados a trav$s de la ruta del &cido *evalónico +*- +*- a nivel citoplasm#tico o la ruta del *etil (ritiol /osfato +*(0 a
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nivel de los cloroplastos. "on los principales constituyentes de los aceites esenciales. Glicósidos! )ompuestos sintetizados a partir de la unión de una azúcar, generalmente glucosa, y otra mol$cula, llamada aglicona por medio de una reacción de condensación y formación de un enlace glicosídico. Dentro de este grupo de metabolitos, es posible dist distin ingu guir ir sub1 sub1gr grup upos os tale taless como como 2lic 2licós ósid idos os card cardia iaco cos, s, sapo saponi nina nas, s, y gluc glucós ósid idos os cianog$nicos.
"e han desarrollado una gran cantidad de m$todos colorim$tricos que permiten detectar la presencia de los diversos grupos de metabolitos secundarios en e%tractos vegetales. Durante la actividad pr#ctica descrita a continuación, se utilizaron 3 de estas t$cnicas! (l m$todo de /olin1)iocalteau officinalis) , (l m$todo para detectar la presencia de fenoles en un e%tracto de 4omero + Rosmarinus officinalis)
de Dragendorff para detectar la presencia de alcaloides en un e%tracto de 5oldo + Peumus Boldus) y la tinción tinción con p1anisaldehído para detectar la presencia de terpenos en un e%tracto de 5ailahu$n + Haplopappus Haplopappus baylahuen). baylahuen).
OBJTI!O":
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Determinar la presencia de compuestos fenólicos en un e%tracto metanólico de 4omero + Rosmarinus officinalis) mediante la utilización del *$todo de /olin1)iocalteau Determinar la presencia de alcaloides en un e%tracto metanólico de 5oldo + Peumus Boldus) mediante la utilización del *$todo de Draggendorf Determinar la presencia de terpenos en un e%tracto de diclorometano de 5ailahu$n + Haplopappus baylahuen) mediante la tinción con p1anisaldehido.
#ATRIA$" % #&TODO" 1
I'
Determinación de la presencia de compuestos (enólicos en un e)tracto de romero
"e comenzó por moler 678 mg de tejido en un mortero, para luego realizar una e%tracción utilizando como solvente 9 mL de metanol. (ste e%tracto fue luego traspasado a un tubo (ppendorf y centrifugado a 98888 rpm durante 3 minutos, tras lo cual se recuperó el sobrenadante, se le cubrió de la luz y se transfirieron 8 :L de este a un tubo de ensayo para luego a;adir 7<8 :L de -gua *illi1= y 988 :L de reactivo de /olin1)iocalteau. 0osteriormente, se esperó 97 minutos mientras la reacción tenía lugar, tras lo cual se agregaron al tubo de ensayo 388 :L de >a 6)?3 @A. 0ara finalizar, se midió la absorbancia de la mezcla de reacción a <<8 nm y se utilizó una curva de calibración de &cido 2#lico para estimar el contenido de fenoles en el e%tracto de romero.
II'
Determinación de la presencia de alcaloides en un e)tracto de *oldo
0ara comenzar, se molieron en un mortero 6 g de tejido utilizando nitrógeno líquido hasta obtener un polvo fino, el cual fue posteriormente lavado con 7 mL de he%ano y traspasado a un matraz (rlenmeyer para luego ser macerado con metanol, obteniendo así un e%tracto metanólico, al cual se le a;adieron posteriormente unas gotas de amoniaco. Luego de homogeneizar la solución, se colocaron gotas de esta en una placa de sílica, la cual fue luego rociada con reactivo de Draggendorf, registrando el cambio de color ocurrido y comparando con un est#ndar de 5oldina.
III'
Determinación de la presencia de terpenos en un e)tracto de *aila+u,n'
"e comenzó por introducir 788 mg de tejido en un matraz (rlenmeyer, para luego a;adir B mL de diclorometano y agitar con fuerza. 0osteriormente, se filtró el e%tracto obtenido con una gasa, para luego colocar gotas del filtrado en una placa de sílica y rociar esta con p-anisaldehido, tras lo cual se aplicó calor con un secador de pelo, registrando el cambio de color ocurrido.
2
R"U$TADO" -'. Determinación de la concentración de Fenoles en muestras de Romero / Rosmarinus officinalis0'
Los fenoles totales se determinan mediante el m$todo espectrofotom$trico de /olin )iocalteu usando el #cido g#lico como material de referencia. - partir de la solución patrón de #cido g#lico de 8,9 gCL, se procedió a realizar una serie de diluciones con agua destilada. "e le adicionó el reactivo de /olin1)iocalteau, se agitó y luego se agregó carbonato de sodio al @A. /inalmente, se tomó la lectura en el espectrofotómetro ultravioleta1visible a <<8 nm. (l blanco tuvo los mismos componentes e%cepto el #cido g#lico. @E "e midió la absorbancia de las soluciones de #cido g#lico patrón. )on estos datos se elaboró la curva patrón respectiva. Tabla 1.- Resultados obtenidos para la concentración de fenoles totales
#uestras
A*sor*ancia a 112 nm
*9 *6 *3 *
8,79B 8,<96 8,@9B 8,F3@
Concentración 3cido 43lico 5m4 4 .te6ido seco7 6,@3 3,63 3,@B ,F
La pendiente de la curva de calibración proporciona la absortividad molar GHI la cual sirve para poder despejar la concentración de las muestras problemas con la ecuación de Lambert y beer -J Hbc.
3
8'. 9rue*a de Dra4endor(( para alcaloides de *oldo / Peumus boldus0'
Figura 1: Placas con extractos de boldo previo a la tinción con el reactivo Dragendorff
Figura 2: Placas con extractos de boldo luego de la tinción con el reactivo Dragendorff
4
'. An3lisis de Terpenos de Bailahuén /;aplopappus *aila+uen0
Figura 3: Placas con extractos de bailahun luego de la tinción p-anisaldeh!do
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DI"CU"IÓN
Boldo /9eumus *oldus #olina0 es una planta end,mica de C+ile< =ue se utili>a como un remedio +er*al para el tratamiento de di4esti?o @ o trastornos +epato*iliares' 9rincipios acti?os en el *oldo inclu@en alcaloides< (la?onoides< aceites esenciales @ otros compuestos' ntre ellos< *oldina @ cate=uina< =ue son la principal componentes del alcaloide @ (racciones de (la?onoides en el *oldo +o6as< respecti?amente< son (uertes a4entes antio)idantes' Boldina es el principal alcaloide presente en las +o6as @ la corte>a de *oldo /(eumus *oldus #olina0' sta sustancia se produce en la corte>a de *oldo en concentraciones inusualmente altas superiores a /*asado en peso seco0 =ue< 6unto con la a*undancia de la planta de ori4en< +ace =ue sea un producto natural particularmente *arato' Boldina< como la ma@ora de los alcaloides< es *astante lipo(lica @ *astante insolu*le en a4ua< pero muc+os de sus sales< inclu@endo el +idrocloruro< son solu*les en a4uaE su to)icidad es nota*lemente *a6o' $a mol,cula *oldina presenta dos (enólico 4rupos ad@acentes a dos restos meto)i< caractersticas =umicas =ue se encuentran comnmente en los compuestos =ue muestran altos acti?idades antio)idantes ---'
6
(n la realización del pr#ctico se utilizó el reactivo de /olin1)iocalteau que se obtiene ya preparado de casas comerciales. (ste reactivo contiene una mezcla de tungstato sódico y molibdato sódico en #cido fosfórico y reacciona con restos fenólicos presentes en las proteínas +tirosinas y en compuestos como #cido g#lico y sus derivados, flavonoides, etc. (l #cido fosfomolibdotúngstico +formado por las dos sales en el medio #cido, de color amarillo, que al ser reducido por los grupos fenólicos da lugar a un complejo de color azul intenso, que es el que medimos en esta pr#ctica para obtener el total de fenoles 3E. (n el reactivo adem#s se utilizó el solvente metanol porque es el m#s adecuado delos compuestos fenólicos debido a su capacidad para inhibir la reacción de polifenol o%idasa que causa la o%idación en dichos compuestos, adem#s de su facilidad de evaporación en comparación con el agua. -sí se obtienen los mejores resultados para e%traer los compuestos fenólicos. E. (n la curva de calibración obtenida para este ensayo se presenta en la fig. 9 resultados de la tabla 3 muestran que, por lo menos, todos los e%tractos contienen compuestos fenólicos en cantidades no muy significativas 2<H2 2<-- m4m$ lo que indica que pudieron haber errores personales en la realización del pr#ctico, ya que según la literatura la composición quimica del romero de los #cidos fenólicos +cafeico, clorog$nico, rosmarínico es de mayor proporción de la resultante, considerando que se tomó 68 microlitros del e%tracto
alcaloides del boldo, puede indicar la presencia de impurezas como la baja concentración de estos en la muestra analizada, tambi$n puede deberse a las interacciones del reactivo utilizado con las muestras, ya que el reactivo de dragendorff identifica principalmente aminas terciarias y aminas secundarias, donde estas últimas generan manchas menos colorida. (l mecanismo de acción se produce a trav$s del acoplamiento del #tomo del metal pesado presente en el reactivo con el nitrógeno del alcaloide para formar pares de iones, por lo que principalmente funciona bien para alcaloides que tienen alguna forma de basicidad, ya que el resultado positivo parece ser la formación del par iónico. Los alcaloides que no son apreciablemente b#sicos es muy probable que no den manchas tan marcadas. (n t$rminos de grupos funcionales nitrogenados pirroles, nitrilos, grupos nitro, y amidas ser#n menos propensas a dar un resultado positivo o un resultado marcado 98E. 0or otro lado, se realizó el an#lisis de terpenos en el bailahu$n utilizando el reactivo p1 anisaldehído +reactivo universal para detectar e identificar una amplia gama de productos naturales y sint$ticos, donde en /igura 3 se puede observar los resultados obtenidos del an#lisis que son manchas fluorescentes bajo una longitud de onda larga +3<7 nm de luz M, donde se observan tonalidades entre moradas y verdosas de las muestras. (l terpeno referencial utilizado +el b1 cariofileno 1 sesquiterpeno presente en varios aceites esenciales1 presenta una mancha o anillo con un mayor radio que la muestra de la planta, que en sí son un poco m#s peque;as pero se muestran con igual intensidad. (sto muestra que el an#lisis dio positivo y que pueden encontrarse una gran cantidad de terpenos o tambi$n pueden ser productos que interfieren en la reacción para reconocer los terpenos, ya que, el p1anisaldehído no solo reacciona con estos, sino que tambi$n puede detectar compuestos ribosa y deso%irribonucleicos, antio%idantes, fenoles, saponinas, glucósidos FE. Debido a que la reacción transcurre a trav$s de intermedios catiónicos sensibles a trav$s del proceso de /riedel1)rafts que lo hace e%tremadamente sensible a la presencia de otros compuestos. 99E
CONC$U"IÓN
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RFRNCIA" 9E Kop'ins, .2., KNner, >.0. +688B Ontroduction to 0lant 0hysiology. a (d. iley P "ons 0ublishers. +?ntario pp! <81@6
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