Metabolismo de Zymomonas ymomonas mobilis mobil is para producción del etanol Villada Arellano Victor Manuel Ingeniería en Biotecnología, Universidad Politécnica del Estado de Morelos, Boulevard Cuauhnáhuac #566, Col. Lomas del Texcal, Jiutepec, Morelos
INTRODUCCIÓN Los procesos fermentativos son la etapa más importante de un proceso de producción de un metabolito de alto valor agregado como es el etanol. En esta etapa, tres factores preponderantes han de ser considerados para garantizar la obtención de altos rendimientos de producto y estos son: el sustrato, las condiciones de de operación y el microorganismo fermentador. El sustrato se describe como el resultado de un pretratamiento que se efectúa sobre la materia prima original tal. En esta etapa una alta cantidad de azúcares asimilables son liberados de los componentes principales de la materia prima convirtiéndose en el sustrato que ha de consumir el microorganismo fermentador. (1)
ANTECEDENTES La humanidad emplea la fermentación alcohólica desde tiempos inmemoriales para la elaboración de cerveza (empleando cereales) y del vino(empleando vino(empleando el fruto de la vid: la uva en forma de mosto) fundamentalmente. Los griegos atribuían el descubrimiento de la fermentación al dios Dionisio. En el año 1864 Antoine Lavoisier hizo Lavoisier hizo
experimentos
en 1789 determinando
las
cantidades
de
los
elementos intervinientes en la fermentación (carbono, oxígeno e hidrógeno). Con el advenimiento de los descubrimientos químicos en el año 1815 el investigador francés Joseph Louis Gay-Lussac fue el primero en determinar una reacción de fermentación obteniendo etanol a partir de glucosa, Durante los años 1830s los químicos Jöns Jakob Berzelius y Justus von Liebig desarrollaron una teoría mecanicista que explica la fermentación, teorías que estaban en contraposición con las creencias de Louis Pasteur en Pasteur en el año 1857 que se fundamentaba en la «teoría vitalista» vitalista » como explicación de los mecanismo básicos de la fermentación,
fue el mismo Pasteur que en el año 1875 demostró que la fermentación era un proceso anaeróbico (en ausencia de oxígeno). ( Arthur Harden. 1914)
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OBJETIVOS General:
Analizar el metabolismo de Zymomonas mobilis para la producción de etanol por medio de la via Entner – Doudoroff.
Analizar otras rutas del microorganismo
FERMENTACIÓN Los procesos de fermentación, en sentido metabólico, son aquellos en los que se produce una oxidación de compuestos orgánicos reducidos siendo el aceptor final de electrones un compuesto orgánico interno que se reduce. En estos procesos puede producirse algún rendimiento energético; pero su principal función es la reoxidación del NADH+H+ a NAD necesario para poder iniciar los primeros pasos del catabolismo. Los diferentes procesos pueden identificarse por sus productos finales. Las rutas fermentativas son anaerobias porque no requieren oxígeno como aceptor final de los electrones . Esto no quiere decir que en ausencia de oxígeno sólo se pueda producir fermentación: el aceptor final de los electrones puede ser un compuesto inorgánico oxidado que los reciba al final de la cadena respiratoria produciéndose un proceso de fosforilación oxidativa en ausencia de oxígeno. En estos procesos decimos que los microorganismos son capaces de respirar otras moléculas diferentes al oxigeno como son los nitratos (NO 3) los sulfatos (SO 4), etc. Los procesos de fermentación son universales; esto es: se encuentran en todo tipo de organismos y, por consiguiente, probablemente represente una de las formas más antiguas de conservación de la energía. Cuando una célula carece de cadena respiratoria, el NADH+H+ no puede reoxidarse a NAD+ y, por consiguiente, no se puede regenerar el agente aceptor de hidrógeno necesario para las primeras fases de la glucólisis. Los procesos fermentativos reducen el piruvato regenerando el NAD+ necesario para los procesos metabólicos iníciales del catabolismo de la glucosa. Diferentes tipos de bacterias reducen el piruvato de maneras diversas dando lugar a distintos procesos de fermentación que se conocen por sus productos finales (3).
FERMENTACIÓN ALCOHÓLICA La fermentación alcohólica (denominada también como fermentación del etanol o incluso fermentación etílica) es un proceso biológico de fermentación en plena ausencia de aire (oxígeno - O2), originado por la actividad de algunos microorganismos que procesan los hidratos de carbono (por regla general azúcares: como pueden ser por ejemplo la glucosa, la fructosa, la sacarosa, el almidón, etc.) para obtener como productos finales: un alcohol en forma de etanol (cuya fórmula química es: CH3-CH2-OH), dióxido de carbono (CO2) en forma de gas y unas moléculas de ATP que consumen los propios microorganismos en su metabolismo celular energético anaeróbico. (4) Figura 1 - Fermentación etanólica o alcohólica: Proceso de fermentación llevado a cabo por levaduras y algunas bacterias. El piruvato se reduce para formar etanol y CO2.
PROCESO BIOQUÍMICO DE LA FERMENTACIÓN ALCOHÓLICA La fermentación alcohólica tiene como finalidad biológica proporcionar energía anaeróbica a los microorganismos unicelulares (levaduras) en ausencia de oxígeno para ello disocian las moléculas de glucosa y obtienen la energía necesaria para sobrevivir, produciendo el alcohol y CO2 como desechos como consecuencia de la fermentación. Las levaduras y bacterias causantes de este fenómeno son microorganismos muy habituales en las frutas y cereales y contribuyen en gran medida al sabor de los productos fermentados. Una de las principales características de estos microorganismos es que viven en ambientes completamente carentes de oxígeno (O2), máxime durante la reacción química, por esta razón se dice que la fermentación alcohólica es un proceso anaeróbico. (3)
FERMENTACIÓN MICROBIANA La síntesis de etanol por vía microbiana generalmente es llevada a cabo por levaduras, siendo la más representativa Saccharomyces cerevisiae. Sin embargo, ha sido reportado en la literatura la producción de bioetanol por Zymomonas mobilis bajo diferentes condiciones, resultando en procesos altamente ventajosos comparado con S. Cerevisiae. Zymomonas mobilis es una bacteria Gram negativa, anaerobia facultativa con morfología de bacilo (como se muestra en la Figura 2). Se encuentra predominante como parte de la flora natural en fermentación de las savias, por ejemplo el agave, la palma y la caña de azúcar, donde están presentes altas concentraciones de glucosa; así como en las cervezas, peras y las sidras, donde actúa como flora de los desechos (M. Coton. et al. 2005) (5)
.Figura 2 y 3 - Zymomona mobilis. Imagenes tomada de la red
Como ya se menciono anteriormente, se ha reportado que puede producir etanol con rendimientos hasta cinco veces mayores bajo condiciones anaerobias (Tao. et al. 2005) (6). Produciendo 1 mol de ATP por mol de glucosa, a diferencia de la vía de S. Cerevisiae, que produce 2 mol de ATP por mol de glucosa, este decremento permite que más energía sea usada para la formación de etanol (Wilkins, 2009; Rogers, Davis, Pearce y Peiris, 2006). (7)(8). En la Tabla 1 se muestran los microorganismos con sus respectivos rendimientos y sustratos. El rendimiento se define como la relación entre los g de etanol producido por cada g de sustrato consumido y para la producción de este alcohol el rendimiento teórico, que sirve de referencia para cuantificar la eficiencia de un microorganismo, es de 0.511 g de etanol producido/g de sustrato consumido . (9)
Tabla 1 – comparación de S. cerevisiae y Z. mobilis, ambos productores de etanol
Z. mobilis presenta altos rendimientos y productividades de etanol debido a que este microorganismo metaboliza la glucosa anaeróbicamente mediante la vía de Entner Doudoroff (ED) en lugar de la de Embde Meyerhof Parnas (EMP) . La vía ED genera sólo la mitad del ATP generado por la vía EMP por mol de glucosa, como consecuencia, Z. mobilis genera menos biomasa y por lo tanto una mayor cantidad de carbono es dirigida hacia los productos de fermentación. Además, todas las enzimas relacionadas con la fermentación se expresan de manera constitutiva y comprenden aproximadamente el 50% de la biomasa.
Vía de Entner Doudoroff (ED) La ruta de Entner-Doudorof es una ruta metabólica alternativa que cataboliza glucosa a piruvato usando una serie de enzimas distintos a la glucólisis y a la ruta de la pentosa fosfato. Es exclusiva de un número reducido de microorganismos carentes de la ruta Embden Meyerhof. El 6-fosfogluconato puede deshidratarse a 2-ceto-3-desoxi-6-fosfogluconato. Este compuesto puede desdoblarse luego en piruvato y gliceraldehido-3-fosfato mediante una aldolasa. Mediante esta ruta se produce menos NADPH que en situación en la que el 6-fosfogluconato es descarboxilado a ribulosa-5-fosfato. Adicionalmente, el gliceraldehido-3-P se oxida a piruvato por la vía de Embden-Meyerhof, descarboxilándose en ambos casos el piruvato y originando acetato. Figura 4 – Reacción en general de la ruta de Entner-Doudorof
En Gluconobacter oxydans y Melanogenes, el 6fosfogluconato puede deshidratarse a 2-ceto-3-desoxi6-fosfogluco neto. Este compuesto puede desdoblarse luego en piruvato y gliceraldehido-3-P mediante una aldolasa. Mediante esta ruta se produce menos NADPH que en la situación en la que el 6fosfogluconato es descarboxilado a ribulosa-5-P Adicionalmente, el gliceraldehído-3-P se oxida a piruvato por la vía de EmbdenMeyerhof, descarboxilándose en ambos casos el piruvato y originando acetato tal como ha sido descrito anteriormente. Esta vía se conoce como vía de Entner-Doudoroff, y es la mismautilizada por Zymonomas mobilis para llevar a cabo una fermentación alcohólica con una estequiometria similar a la de las levaduras (Figura Nº 2.5 y Figura Nº 2.6).
Figura 5 – Esquema de la vía de EntnerDoudoroff como estrategias microbianas de fermentación alcohólica.
Comienza con las mismas reacciones de las pentosas fosfato. Se forma 2-ceto-3desoxi-6-fosfogluconato o KDPG. Desde GAL-3P hasta Piruvato es catalizado porenzimas comunes a la vía Glicolítica. Se produce 1NADPH y 1 NADH por molécula de glucosa metabolizada
La mayoría de las bacterias tienen las vías glucolítica y de las pentosas fosfato, pero algunas sustituyen la glucólisis por la Vía Entner-Doudoroff. (9)
Figura 7 – Esquema resumido de la vía de EntnerDoudoroff, el destino de la mayoría de los distintos átomos de carbono. (10)
Figura 7 - Las dos vías del 6-P-gluconato. (a) sistema de la 6-Pgluconato deshidrogenasa (b) reacción clave de la vía de EntnerDoudoroff (c) origen de los átomos de C de las moléculas de CO2 formadas en la fermentación alcohólica de la glucosa por las levaduras (vía de EmbdenMeyerhorf) y Zymononas mobilis (vía de EntnerDoudoroff).
OTRAS VÍAS METABÓLICAS DEL ZYMOMONAS MOBILIS No hay literatura disponible de las otras rutas metabólicas que realice este microorganismo en específico, sin embargo, se han hecho pruebas del comportamiento del género al estimularlo con diversos nutrientes pero no se han logrado a entender a fondo como para poder representarlo en un esquema como se presentaron antes, por ejemplo:
Formación de acetaldehído – el acetaldehído puede ser atrapado durante la fermentación de la glucosa, este compuesto, junto con cantidades variables de sulfuro de hidrógeno, contribuye al sabor y olor desagradables del sidra. Esto debe ser considerado como uno de carácter general y se aplica a un tipo de fermentación que se distingue por la descomposición de los azúcares para producir no solo etanol, si no aldehídos en suficiente cantidad para llamarlo fermentación de aldehídos Se sabe que también el género Zymomonas lleva a cabo la formación de acetilmetilcarbonilo metabolismo de los aminoácidos, de alcoholes superiores, de H2S y el metabolismo del azufre
CONCLUSIÓN Zymomona mobilis es una bacteria muy inusual ya que fermentan la glucosa anaerobicamente por la ruta de Entner – Doudoroff. El etanol es un combustible limpio, renovable, que puede reducir la dependencia del petróleo; sin embargo, aunque el proceso fermentativo para la producción de bioetanol es ya bien conocido, los costos de producción son todavía el impedimento clave para su amplio empleo como combustible.
Para que esto resulte factible, es necesario seguir llevando a cabo proyectos de investigación enfocados al uso de cepas altamente eficientes en la producción de etanol, como lo es Zymomonas mobilis , con capacidad de co-fermentar C5/C6, sustratos de fermentación económicos, inmovilización de células, y optimización de condiciones para que ocurra la fermentación .
REFERENCIAS 1. Triana Caranton, C.F. (2010). Producción de etanol a partir de residuos provenientes del cultivo de café. Universidad Nacional de Colombia sedes Manizales, Tesis de posgrado. 2. Arthur Harden, 1914, Alcoholic Fermentation .Ed. Longmans, Green and co 3. http://biolcchn.wikispaces.com/Fermentaciones
4. http://www.unac.edu.pe/documentos/organizacion/vri/cdcitra/Informes_Final es_Investigacion/Octubre_2011/IF_DECHECO%20EGUSQUIZA_FIPA/CAP ITULO%20N%BA%2002.pdf 5. Coton, M., Laplace, J. M., Auffray, Y., y Coton, E. (2005). Duplex PCR method for rapid detection of Zymomonas mobilis in cider. Journal of the Institute of Brewing, 111(3), 299-303 6. Tao, F, Miao, J. Y., Shi, G. Y., y Zhang, K. C. (2005). Ethanol fermentation by an acid-tolerant Zymomonas mobilis under non-sterilized condition. Process Biochemistry, 40, 183-187. 7. Wilkins, M. R. (2009). Effect of orange peel oil on ethanol production by Zymomonas mobilis. Biomass and Bioenergy, 33, 538-541. 8. Rogers, P., Davis, L., Pearce, J., y Peiris, P. (2006). Evaluation of Zymomonas-based ethanol production from a hydrolysed waste starch stream. Biomass and Bioenergy, 30, 809-814. 9. http://www.unac.edu.pe/documentos/organizacion/vri/cdcitra/Informes_Final es_Investigacion/Octubre_2011/IF_DECHECO%20EGUSQUIZA_FIPA/CAP ITULO%20N%BA%2002.pdf 10. J Swings and J De Ley. 1977. The biology of zymomonas. Bacteriol Rev. 41 (1). 1-46.
