Manual Completo Micro Alimentos

5/12/2018

ManualCompleto Micro Alimentos-slidepdf.com

LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS

FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICOBIOLOGICAS http://slidepdf.com/reader/full/manual-completo-micro-alimentos

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INTRODUCCION

La microbiología es una ciencia relativamente reciente con respecto a otras ramas de la biología. El estudio de los microorganismos se inicio a partir de que ANTONIE van LEEUWENHOOK en 1670 invento el microscopio, y que a partir de los estudios de Luis Pasteur en 1876, se logro el mayor desarrollo y reconocimiento de los microorganismos como actores de una gran diversidad de procesos. Aunque durante mucho tiempo estos microorganismos causaron graves problemas de enfermedades en plantas, animales y humanos también es cierto que desde la antigüedad algunas especies microbianas han sido utilizadas en procesos de producción de alimentos fermentados como los quesos, vino, pan y cerveza, entre otros y actualmente se ha reconocido su importancia en diversas aéreas de investigación básica, en la industria alimentaria, ambiental y farmacéutica. El objetivo general del curso de Microbiología de Alimentos es que el alumno se inicie en el conocimiento básico de los microorganismos de importancia en el manejo de alimentos, en sus características morfológicas, nutricionales de crecimiento, y que enadquiera las habilidades necesarias para su recuperación control e identificación el laboratorio. Este manual contiene 10 prácticas, diseñadas para que el estudiante se familiarice gradualmente con los procedimientos de cultivo y observación de bacterias y hongos recuperables de los diferentes alimentos y agua. El orden de presentación, corresponde al programa del curso teórico de Microbiología de Alimentos que forma parte del plan de estudios de las carreras de Nutrición y Tecnología de Alimentos así como de la Licenciatura en Biotecnología impartidas en la Universidad Interamericana En cada práctica se presentan los objetivos y una breve introducción para facilitar la compresión de los mismos, después se indican los materiales necesarios y procedimientos a realizarse en forma de instrucciones numerales que se complementan con figuras y esquemas. Esperamos que este manual ayude a los estudiantes en la comprensión del maravilloso mundo de los microorganismos.


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Recomendaciones para el estudiante

Reglas de laboratorio 1. 2. 3.

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7.

Durante las sesiones siempre se deberá usar bata de laboratorio bien abotonada, que deberá quitarse antes de abandonar el laboratorio. No deberá sacar del laboratorio ningún equipo, medios o cultivos microbianos. Evitar la acumulación sobre la mesa de trabajo de objetos no relacionados con la práctica de laboratorio. Colocar todos los objetos personales (libros, mochilas, etc.) en la zona especificada por el profesor Se prohíbe ingerir y/o almacenar cualquier tipo de alimento o bebida dentro del laboratorio. Se prohíbe fumar, aplicarse cosméticos o tocarse la cara con las manos o algún otro objeto. Se deberá lavar las manos meticulosamente con jabón y agua antes de salir del laboratorio. Incluso cuando salgas por breves periodos. Por seguridad no se deberá pipetear oralmente ningún tipo de cultivos microbianos, esta actividad deberá realizarse con pipetas accionadas de forma mecánica o automática, tratando de evitar la formación de aerosoles. No se admiten visitas personales que distraigan la atención y pongan en riesgo la seguridad en el trabajo que se realiza

Procedimientos de laboratorio 1.

2.

3.

Antes y después de cada sesión practica los alumnos deberán limpiar las mesas de trabajo con el desinfectante que se les proporcionara para este fin. Cuando se utilice el mechero, este deberá colocarse alejado del microscopio y otros equipos así como de sus cuadernos o prendas de vestir. Al concluir cada sesión el estudiante deberá asegurarse que los materiales de desecho u objetos contaminantes sean colocados en recipientes específicos para ello, colocados en lugares apropiados, que les indicara el profesor


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5.

Siempre deberá dejar perfectamente limpios todos los equipos utilizados (microscopios, balanzas analíticas, autoclave, potenciómetros, etc.) y reportar al maestro cualquier irregularidad en el funcionamiento. En caso de producirse un incendio o una herida personal, el alumno deberá notificarlo de inmediato al profesor. En el caso de derrame de cultivos o rotura de recipientes con cultivos, deberá conservar la calma y además de informar al profesor, seguir inmediatamente el procedimiento: a) Colocar toallas de papel sobre el material derramado para evitar su dispersión b) Poner abundante solución desinfectante sobre las toallas c) Dejar trascurrir al menos 15 minutos, retirar las toallas y tirarlas al receptáculo destinado a la eliminación de materiales contaminados

Materiales indispensables en cada sesión de laboratorio. 1. 2. 3.

Bata de laboratorio limpia y con botones El protocolo de la practica (practica impresa) Un pedazo de tela limpia y sin pelusa, cerillos, tijeras y marcador indeleble.


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LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS Practica

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Conocimiento del laboratorio de microbiologí a de alimentos y medidas de seguridad Introducción

El estudio de las bacterias, virus, parásitos, hongos y otros agentes infecciosos que pueden ser patógenos para el hombre, los animales u otras formas de vida comporta riesgos que varían según el agente infeccioso y los procedimientos utilizados. Las normas de Seguridad Biológica pretenden reducir a un nivel aceptable el riesgo inherente a la manipulación de material peligroso y son muy rigurosas para los agentes más peligrosos y menos exigentes para los que causan problemas de menor entidad. Deben ser consideradas como compromisos destinados a conseguir que las personas que trabajan con agentes infecciosos en el Laboratorio de Microbiología estén expuestas al mínimo riesgo posible .En el laboratorio de Microbiología de Alimentos es necesario tener en cuenta que aparte de nuestra seguridad es necesario preservar la seguridad y no contaminación de los diferentes alimentos a investigar a fin de evitar los resultados falso positivos debido a la contaminación cruzada. Pongamos pues las siguientes premisas para plantear un esquema de trabajo hacia la prevención y la seguridad en el laboratorio o en cualquier área de trabajo. y y y

y

La seguridad es responsabilidad en línea jerárquica Todos los accidentes pueden ser evitados Las personas son la base fundamental en la gestión de la prevención de riesgos Una gestión eficaz de la prevención de riesgos produce una mejora en el sistema de calidad , así como el aumento de producción ( días / clase )

La prevención efectiva de riesgos evita días perdidos debido a las bajas causadas por accidente o por enfermedades derivadas del trabajo . Principios básicos de Bioseguridad Agentes biológicos (según RD 664/97). Microorganismos, con inclusión

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de los genéticamente modificados, cultivos tipo celulares y endoparásitos humanos susceptibles de originar cualquier de infección, alergia o toxicidad. Microor ganismo (según RD 664/97). Toda entidad microbiológica, celular o no, capaz de reproducirse o de transferir material genético. Cultivo celular (según RD 664/97). El resultado del crecimiento in vitro de células obtenidas de organismos multicelulares. Peligro. Todo aquello que puede producir un daño o un deterioro de la calidad de vida individual o colectiva de las personas.

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Daño.

Es la consecuencia producida por un peligro sobre la calidad de vida individual o colectiva de las personas. Riesgo. Probabilidad de que ante un determinado peligro se produzca un cierto daño, pudiendo por ello cuantificarse. Desinfección (según la OMS). Eliminación de agentes infecciosos que están fuera del organismo por medio de la exposición directa a agentes químicos o físicos. Contaminación (según la OMS). Presencia de un agente infeccioso en la superficie del organismo; también en vestimenta, ropa de cama, juguetes, instrumentos quirúrgicos, apósitos u otros objetos inanimados o substancias, incluyendo el agua y los alimentos. Esterilización (según la OMS). Destrucción de todas las formas de vida por calor, radiación, gas o tratamiento químico. Limpieza (según la OMS). Eliminación, mediante fregado y lavado con agua caliente, jabón o un detergente adecuado, o por el empleo de una aspiradora, de agentes infecciosos y substancias orgánicas de superficies en las cuales éstos pueden encontrar condiciones adecuadas para sobrevivir o multiplicarse.

Clasificación de los agentes biológicos por grupos de riesgo Agente biológico del grupo 1. Aquél que resulta poco probable que cause una enfermedad en el hombre. Agente biológico del grupo 2. Aquél que puede causar una enfermedad en el hombre y puede suponer un peligro para los trabajadores, siendo poco probable que se propague a la colectividad y existiendo generalmente profilaxis o tratamiento eficaz. Agente biológico del grupo 3. Aquél que puede causar una enfermedad grave en el hombre y presenta un serio peligro para los trabajadores, con riesgo de que se propague a la colectividad y existiendo frente a él generalmente profilaxis o tratamiento eficaz. Agente biológico del grupo 4. Aquél que causando una enfermedad grave en el hombre supone un serio peligro para los trabajadores, con muchas probabilidades de que se propague a la colectividad y sin que exista generalmente frente a él profilaxis o tratamiento eficaz.

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Cada laboratorio debe adoptar un manual de seguridad o de trabajo en el que se identifiquen los riesgos conocidosa yeliminar potenciales y se al especifiquen lasriesgos. prácticas los procedimientos encaminados o reducir mínimo esos Lasy técnicas microbiológicas apropiadas son fundamentales para la seguridad en el laboratorio y no pueden sustituirse por equipo de laboratorio especializado, que no pasa de ser un complemento.


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Objetivos: y

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Conocer el laboratorio de microbiología, los materiales, los reactivos, las instalaciones eléctricas, de gas, de agua y el funcionamiento de cada uno de ellos, sus interacciones, utilidades, modos de desecho, etc. Aprender el manejo de todo lo anterior en las prácticas a realizar, en casos extremos de riesgos y contingencias.

Material y y y y y y y y

Reactivos

Mesas de laboratorio Tomas de gas Agua Electricidad Material de vidrio De metal Aparatos Instrumental

Procedimiento

y y y y

Sólidos Ácidos Soluciones Medios de cultivo

experimental:

A través de lase observación conocimiento del equipo de laboratorio, los reactivos y materiales, plantearanyformas de trabajar (vestimenta, organización, lentes, guantes), de prever posibles accidentes (distribución de espacio, rutas de evacuación, anaqueles), zonas de riesgo, puntos críticos, y todos los casos que requieran revisión y modificación para mejorar la seguridad al interior del lugar de trabajo. Acceso al laboratorio

1. El símbolo y signo internacional de peligro biológico (figura 1) deberá colocarse en las puertas de los locales donde se manipulen microorganismos grupo riesgo superior. 2. Sólo podrá entrardelen las de zonas de2 otrabajo del laboratorio el personal autorizado. 3. Las puertas del laboratorio se mantendrán cerradas. 4. No se autorizará ni permitirá la entrada de niños en las zonas de trabajo del laboratorio.


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Figura 1. Símbolo internacional de peligro biológico-infeccioso Protección

personal

1. Se en todo momento batas o uniformes especiales para el trabajo en elusarán laboratorio. 2. Se usarán guantes protectores apropiados para todos los procedimientos que puedan entrañar contacto directo o accidental con sangre, líquidos corporales y otros materiales potencialmente infecciosos o animales infectados. Una vez utilizados, los guantes se retirarán de forma aséptica y a continuación se lavarán las manos. 3. El personal deberá lavarse las manos después de manipular materiales y animales infecciosos, así como antes de abandonar las zonas de trabajo del laboratorio. 4. Se usarán gafas de seguridad, viseras u otros dispositivos de protección cuando necesario proteger los ojosartificial. y el rostro de salpicaduras, impactossea y fuentes de radiación ultravioleta 5. En las zonas de trabajo estará prohibido comer, beber, fumar, aplicar cosméticos y manipular lentes de contacto. 6. Estará prohibido almacenar alimentos o bebidas para consumo humano en las zonas de trabajo del laboratorio. Procedimientos

1. Estará estrictamente prohibido pipetear con la boca. 2. No se colocará ningún material en la boca ni se pasará la lengua por las 3. etiquetas. Todos los procedimientos técnicos se practicarán de manera que se reduzca al mínimo la formación de aerosoles y gotículas. 4. Todos los derrames, accidentes y exposiciones reales o potenciales a materiales infecciosos se comunicarán al supervisor del laboratorio. Se mantendrá un registro escrito de esos accidentes e incidentes. 5. Se elaborará y seguirá un procedimiento escrito para la limpieza de todos los derrames.


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LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS 6. Los líquidos contaminados deberán descontaminarse (por medios químicos o físicos) antes de eliminarlos por el colector de saneamiento. Puede ser necesario un sistema de tratamiento de efluentes, según lo que indique la evaluación de riesgos del agente con el que se esté trabajando. 7. Los documentos escritos que hayan de salir del laboratorio se protegerán de la contaminación mientras se encuentren en éste. Zonas

de trabajo del laboratorio

1. El laboratorio se mantendrá ordenado, limpio y libre de materiales no relacionados con el trabajo. 2. Las superficies de trabajo se descontaminarán después de todo derrame de material potencialmente peligroso y al final de cada jornada de trabajo. 3. Todos los materiales, muestras y cultivos contaminados deberán ser descontaminados antes de eliminarlos o de limpiarlos para volverlos a utilizar. 4. El embalaje y el transporte de material deberán seguir la reglamentación nacional o internacional aplicable. 5. Las ventanas que puedan abrirse estarán equipadas con rejillas que impidan el paso de artrópodos. Cuestionario

1. Elabora un proyecto que implique un plan de seguridad para casos de contingencia en el laboratorio, detectando puntos críticos, manejo de reactivos, posibles soluciones y estrategias para asegurar la estancia y evacuación de las personas presentes durante el fenómeno correspondiente (sismo, incendio, accidente, etc.) 2. ¿Por qué es importante limpiar las mesas con fenol antes y después de realizar las prácticas en el laboratorio de microbiología? 3. ¿Cuál es la importancia de trabajar a no más de 15 cm de la flama del mechero cuando se trabaja con medios y especímenes microbiológicos? 4. Es importante lavarse las manos antes y después de las prácticas ¿Por qué? 5. ¿Qué esperas de las prácticas a realizar en el área de microbiología general, y el porqué de tu respuesta?


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LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS Practica 2 Toma y Manejo de muestras 0bjetiv

o

Proveer ejo

os os e rg o e estreo s re tr es e es r s r e to a l alumn nca ad d l mu la di c ic n c a ia pa a una ad cuada ote man y transporte de muestras que garanticen resultados representativos del producto o lma, de donde provienen.

Campo de aplicación

- Área analítica (toma de muestras) - Área de recepción de muestras (muestras f oráneas) - Área de transporte de muestras (recolección de muestras).

Definiciones e te or e te er se o et e roorg s os v vos e e o AFesécha pticam n , f ma d man n la au ncia c mpl a d mic ani m i n un m e e te e e se o s er e ro to e o e d caducidad, f cha lími n qu c n id a qu un p duc almac nad ndila.s condiciones sugeridas por el fabricante, conserva las caracteristicas sanitarias que debe reunir para su consumo. Después de esta f echa no debe comercializarse ni consumirse. Muestra representativa, es un número de unidades tomadas de un lote, que se han sido seleccionadas en f orma aleatoria y cuyas caracteristicas son lo más similar posible al as del lote del que procede. Muestra testigo, muestra que queda en poder del interesado y a disposición de la autoridad competente. Pro ductos perecederos, grupo de alimentos que por su naturaleza biológica y fisico-química, su vida útil es de haste 30 días, dando lugar al establecimiento de una f echa de caducidad, la cual debe ostentarse en su etiqueta o envase. Toma de muestra, es el procedimiento que se requiere para elegir el material a analizar a partir de la totalidad del lote o partida. Vida útil o vida de anaquel,es el tiempo durante el cual un alimento es seguro y conserva un nivel de calidad sanitaria aceptable para su consumo, ba jo condiciones específicas de procesamiento, envasado y almacenamiento.

Responsable de ejecución - MUESTREADOR: será responsable de tomar y transportar las muestras adecuadamente siguiendo este procedimiento de manera cabal para garantizar la representatividad. - RECEPCIONISTA: será responsable de recibir y aplicar los criterios de aceptación o rechazo de las muestras con el fin de garantizar que estas llegan en condiciones aceptables para el análisis microbiológico.


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LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS - MENSAJERO: será responsable de servir como primer filtro de aceptación, aplicando los criterios de aceptación o rechazo al momento de recibir las muestras, así como de su transporte y custodia hasta la entrega en el laboratorio. - ANALISTA: será responsable de recibir las muestras únicamente por conducto de la recepcionista haciéndose responsable éste de la custodia y análisis.

Fundamento El análisis microbiológico de alimentos, la adecuada selección de la muestra, la toma correcta, l os medios de conservación y su transporte al laboratorio, son de primordial importancia para obtener resultados significativos y confiables. Es necesario precisar el ob jetivo del estudio, la naturaleza de las muestras y la cantidad, el tamaño o volumen, del producto y del l ote de donde provienen. La recolección de la muestra se debe ef ectuar evitando toda contaminación ambiental como humana, para asegurar la integridad de la misma.

na, tanto

exter

Método Proyecto de Norma Oficial Mexicana NOM-109-SSAI-1994 Procedimientos para la toma, manejo y transporte de muestras de alimentos para su analisis microbiologIco. NOM-014-SSAI-1993.Procedimientos sanitarios para el muestreo de agua para uso y consumo humano.

Reactivos No aplica Aparatos - Frascos de boca ancha con tapa de rosca o tapón esmerilado de material esterilizable, no tóxico y de tamaño acorde con la cantidad de muestra deseada. - Bolsas de polietileno estériles de varias medidas - Hieleras de poliestireno o de otro material aislante - Papel aluminio - Papel estraza - Etiquetas autoadheribles - Cinta testigo - Marcadores indelebles - Algodón - Cerillos o encendedor - Instrumentos para toma de muestra: muestreadotes, cucharones, cucharas, espátulas, cuchillos, pinzas, etc. (de acero inoxidable o de cualquier otro material que no provoque cambios que puedan af ectar el resultado). - Lámparas de alcohol FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICOBIOLOGICAS http://slidepdf.com/reader/full/manual-completo-micro-alimentos

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LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS - Frasco con etanol o isopropanol al 70% - Frascos con tiosulfato de sodio, para toma de muestra. - Hielo o bolsas ref rigerantes - Bata, cubre boca, cofia y guantes estériles. - Autoclave -Termómetros metálicos para toma de temperaturas de alimentos con rangos de -40 a 100 ºC. . Sistema analí tico Según el Proyecto de Norma Oficial Mexicana NOM-109-SSAI-1994. Procedimientos para la toma, manejo y transporte de muestras de alimentos para su analisis microbiologico. Y NOM-014-SSAIProcedimiento sanitario para el muestreo de agua para uso y consumo humano. Preparació

n del material

e tos e estreo ejo -tran Tosdpoorte el ma qutoe se la etonto ma,, dman e vn r en contac ebe estayr de ter muialestre ains,strquum an a destamu direucttoiliceconnpaelraalim limpio, estéril y libre de substancias que pudieran af ectar la viabilidad de los microorganismos. El material para toma de muestra que requiera esterilización se envolverá con papel estraza en f orma individual antes de esterilizarlo. La tapa de los f rascos se protegerá con papel estraza o aluminio fi jándolos adecuadamente. Colocar cinta testigo en el material a esterilizar, El material que se utilice para la toma de muestra debe ser esterilizado en autoclave a 121ºC durante 15 min. De ser necesario, si se requiere mayor número de utensilios, limpiar los que hayan sido usados y flamearlos con etanol o isopropanol al 70%, y emplearlos de inmediato.

t para la t ma e m e tra, epe erá el tip e pr ct e la fi ali a Edlel pr exame ocedimie n. n o o d u s d nd d o d odu o y d n d d

Obtención de muestras: Es importante que la persona que tome las muestras se lave las manos y u tilice cubre bocas, cofia y guantes. 1. Toma de nuestras de productos envasados para su venta al menudeo se llevará a cabo tomando el producto tal y como se vende al consumidor, pueden ser alimentos enlatados o en f rascos de vidrio, o empacados en bolsas o cualquier otro tipo de envase, en cantidad suficiente para su análisis, no se requieren condici ones especiales para su muestreo. En caso de que el producto se encuentre en recipientes grandes, es necesario abrirlos y extraer la muestra de tal f orma para evitar cualqui er tipo de contaminación externa, empleando utensilios limpios y si es posible estériles. 2. Para alimentos expuestos al aire libre y otras contaminaciones, no se requieren condiciones tan estrictas en la toma de muestra ya que se deben tomar las muestras en las condiciones en se consumen. 3. En el caso de alimentos en donde se requieran condiciones más estrictas para su muestreo, se deben tomar en sitios en donde las condiciones de posibles FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICOBIOLOGICAS http://slidepdf.com/reader/full/manual-completo-micro-alimentos

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LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS contaminaciones externas sean mínimas, el personal que ef ectúe este procedimiento se debe lavar las manos antes del muestreo así como utilizar bata, cofia, cubre bocas y guantes estériles. La toma de muestra debe hacerse con rapidez, pero cuidadosamente. Los recipientes para la toma de muestra deben abrirse únicamente al momento de introducir ésta y cerrarlos de inmediato. 4. Para alimentos preparados sin envasar de consumo inmediato, se recomienda que la erso e e or os e tos se e tro estr os re e tes o o s s estér es o os te s os ee e or e te os e tos e se estre e e te se e e o serv r tr s r te er t r e ero estre os esto s o s s tr s o es e or or e o o tr r o se e e e r r te er t r e te tr s ort rse e o o es e re r ger e so e e tos os o se os se e erá g t r o e r st o seg r o oge e r es és e e t r to e estr e ere tes rtes e o te e or e tos s os o se e es r o ort r e ro to e e estre rse o e te s os e os s es os e estér es o o r s os te e ores et P s r s os re e tes e os o ro or o os o to e estr se re e e o to e s o o ert tes e o te er estr se e e ej r s r s r er s r o es e ro to r r s o e jo e so e s er es v v s e ertes se e e e t r s er e re rese t t v e tot estre r e e e e so o e so r ese se rot o ogé e e te e s er e estre r oster or e te se s erge e so se err se e v or tor o o tes os e r s á ss e so e g o est rov e e e gr o e e re overse os esor os exter os tes e to r estr rse e or o exter o o tor rox e te e e ej rse orrer e g

p b l na qu ina n duzca a l n cipiqun a qu illab c anl l alim u nnili , qua la mpl malmlanmu. L aalim mu an n cali n d b n c n a y a lada a la mp a u a qu fu n mu ad , ól i u a lad m n a una h a, d l c n a i d b n nf ia a mp a u a ambi n y an p a n c ndici n d f i ación. 5. En l ca d alim n líquid milíquid d b a i a m zcla ha a c n ui h m n iza y d pu f c ua la ma d la mu a n dif n pa d l c n n d . 6. En alim n ólid cuand a n c a i c a l p duc , d b mu a c n ayuda d u n ili bi n limpi y i p ibl il , c m cucha a , cuchill , n d c. a a la a l cipi n ad cuad p p ci nad . 7. Cuand la ma d mu a alic n un c nduc d alida una c mpu a an d b n la mu a d b n d a pa a la p im a f acci n d l p duc pa a limpia dicha alida c n l flu . 8. En l ca d up fici i a in d b d limi a una up fici p n a i a d l al a mu a . S hum d c un hi p n una lución pa a fin y f a h m n am n n la up fici a mu a , p i m n um n dicha lución ci a y n ía al lab a i l an p ibl pa a u an li i . 9. En l ca d a ua cuand a p i n d un if d b n m l acc i n an d ma la mu a. 10. Limpia l ifici n c n una unda 11. D b d a c l a ua ap imadam n 3 min o r 12. Tmu ma la muestra sin llenar el f rasco y tapar inmediatamente después de obtenida la estra 13. En captación de agua superficial o tanque de almacenamiento deben lavarse manos y antebrazos con agua y jabón y sumergir el recipiente hasta una profundidad de 15 a 30 cm. debe ser de la parte media. 14. En p ozo profundo si tiene grif o se procederá como en el paso 9 :De lo contrario se hará del tubo de desf oge dejando correr el agua 3 min.. 15. Las cantidades requeridas son: -Para análisis de agua: Pref erentemente: 250 ml Mínimo: 100 ml. - Para análisis de alimentos: Pref erentemente: 250 g ó ml. Mínimo: 100 g ó ml. La toma de la muestra debe hacerse con rapidez pero cuidadosamente. Los recipientes para la toma de muestra deben abrirse únicamente al momento de introducir esta y serrarlo de inmediato no tocar el interior de los envases y evitar que la tapa se contamine. FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICOBIOLOGICAS http://slidepdf.com/reader/full/manual-completo-micro-alimentos

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LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS Cuando sea necesario tomar la temperatura la muestra que se utilice para tal fin deberá ser dif erente de la que se envié para su análisis. Las muestras para su análisis deberán estar bien identificadas con el nombre del producto, y cualquier otro dato pertinente, con etiqueta o marcador de tinta indeleble para evitar su deterioro. os tos or e estreo da coiqu nsietgna la etcoiqu a so en:ntre f echa, lugayre, lhcu a dpoldmu turd er el f rasco,,lanúm lLote y tempquerea se a.ebYelan et a dr eebnerá locaetrse la tapa ca jaeroendeel nudo o sierre de la bolsa de tal f orma que se evite que la muestra sea violada o alterada.

Conservación y transporte El manejo y transporte de las muestras deberá ef ectuarse de tal manera que se impida su ruptura, alteración o contaminación, evitando su exposición a la luz solar directa. Las muestras deben entregarse al laboratorio lo más rápidamente posible. Los alimentos perecederos se transportan ba jo condiciones de temperatura de 2 a 8 ºC y se debe r s s e tro e s tes so e e tos inicia uosanlaálitesimp dernaturadnoladeb24e ser hormay as sor iguiaen0ºC aPasrua larecreof lericción. En esca re geración congelad codmealim ndablne el empleo de líquido ref rigerante o hielo potable contenido en bolsas de plástico impermeables para evitar que el agua de deshielo alcance los envases de los alimentos y que de alguna manera se puedan contaminar. No sobrellenar los recipientes que contengan los alimentos con el fin de evitar que el c ontenido se derrame en el transporte y se pueda originar derrame del c ontenido y se puedan contaminar las muestras originales. En caso de muestras individuales blandas evitar que la presión que puedan ejercer otros recipi entes la def orme u originen derrames provocando que el contenido se ponga en contacto con el exterior de la envoltura. so e estr s e g En d mu a d a ua deben trasportarse al laboratorio a una temperatura de 4-10C tos con presentación comercial deben ser transportados en sus envases originales a L0scaproduc temperatura ambiente, siempre y cuando esta no exceda de 45ºC. Para la conservación durante el transporte de la muestras no esta permitido el empleo de sustancias química.

Criterios de aceptación

Cumplir con las norma correspondiente proyecto de norma NOM-109-SSAI-1994.


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LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS Materiales

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Frascos esteriles de boca ancha Pinzas esteriles Espatulas esteriles Cuchillos esteriles Algodon Torundas con alcohol Hielera Ref rif erantes Etiquetas Plumon indeleble

c dimiento. 1. Elegir las muestras a tomar

Pro e

rre r s o e to r estr o te os ester es o o r s e se 2. Ab i n lestos f a c alim al meonmtosen, totodma r ma n untancili deilcir, dce ndif laesrecucha una lamumuestra areypcrese ntes saitiqu sirve tiva, es os d el contenedor , de la superficie y el f ondo, en caso de ser necesario tomar la temperatura. 3. Etiquetar el f rasco, con la f echa, nombre del alimento,sitio de muestreo, temperatura y cantidad aproximada 4. Trasladar la muestra al lugar de analisis en las condiciones adecuadas. 5. En caso de agua obtenida de grif os, limpiar la boca de la llave , dejar correr el agua por 2 minutos y colectar la muestra..

Cuestionario. 1. ¿ Cuál es la importancia de una buena toma de muestra? 2. ¿ Como realizaría la toma de muestra en un recipiente que contenga un guisado en una ba rra de alimentos calientes ,en un c omedor industrial.? 3. Para recolectar una muestra de agua de cisterna.¿cual seria el procedimiento a seguir? 4. ¿Qué datos debe contener la etiqueta de identificación de la muestra? 5. ¿Cómo se debe transportar una muestra al laboratorio y cuanto tiempo debe transcurrir antes de su proceso? Referencias

Literatura Microbiología e Inocuidad de los alimentos. Eduardo Fernández Escartín. Universidad de Querétaro, 2000. Manual del Ing. en alimentos.Ed.Grupo Latino Ltda.edición2006 Proyecto de Norma Oficial Mexicana NOM-109-SSAI-1994 y NOM-014-SSAL-1993. FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICOBIOLOGICAS http://slidepdf.com/reader/full/manual-completo-micro-alimentos

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n y dilución de muestras de alimentos

Preparació

Objetivo

Reducir el número de microorganismos por unidad de volumen, para permitir la cuenta de colonias en medios sólidos o líquidos.

Definiciones

Dilución primaria, es la solución, suspensión o emulsión obtenida despues de pesar o medir una cantidad del producto ba jo examen y mezclarla con una cantidad de nueve veces en proporción de diluyente. Diluciones decimales adicionales, las suspenciones o soluciones obtenidas al mezclar un determinado volumen de la dilución primaria con un volumen nueve veces un diluyente y que por repetición de esta operación con cada dilución así preparada , se obtiene la serie de diluci ones decimales adecuadas para la inoculación de medios de cultivo.

Introduccion El método se basa en la preparación de diluciones primarias, para obtener una distribución, lo más unif orme posible de los microorganismos presentes en la porción de la muestra. El número de diluciones que se vayan a preparar depende del número de microorganismos esperado en la muestra. Según la norma NOM-110 SSA1-1994 microbiológico

Pre

paración y dilución de muestras para su análisis

Reactivos Solución de hidróxido de sodio 1,0 N : Solución reguladora de f osfatos (solución concentrada) FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICOBIOLOGICAS http://slidepdf.com/reader/full/manual-completo-micro-alimentos

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LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS . Solución de traba jo: Tomar 1,25 ml de la solución concentrada y llevar a un litro con agua. Esterilizar a 121ºC durante 15 minutos.  

AGUA PEPTONADA Si este diluyente no es usado inmediatamente, almacenar en lugar oscuro a una temperatura entre 0 a 5ºC por u tiempo no mayor de un mes, en condiciones tales que no alteren su volumen o composición.

Muestreo y muestra Se aceptan muestras colectadas en recipientes esterilizados y que hayan sido transportadas adecuadamente. La muestra deberá ser suficiente para su estudio (50 a 100 g ó ml) según las técnicas para el muestreo y análisis microbiologico de alimentos y bebidas . Sistema analí tico Según la Norma Oficial Mexicana NOM-110-SSAI-194 para la preparación y dilución de muestras de alimentos. Uso del sistema analí tico Preparación de la dilución primaria A partir de muestras líquidas: a a muestras líquidas no viscosas (agua, leche, ref rescos, etc.,) en las cuales la distribución de microorganismos es homogénea o f ácilmente homogeneizable por medios mecánicos (agitación, etc.). P r

a a muestras congeladas de un alimento originalmente líquido o licuable, fundir por completo en baño de agua de 40 a 45ºC un tiempo máximo de 15 minutos y homogeneizar agitando vigorosamente. P r

a a la parte líquida de una muestra heterogénea la cual sea considerada suficientemente representativa de la muestra total (por ejemplo la fase acuosa de grasas animales y vegetales). P r


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LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS Agitar la muestra manualmente con 25 movimientos de arriba aba jo en un arco de 30 cm. ef ectuados en un tiempo de 7 segundos. Tomar 1ml de la muestra y dilui r con 9ml del diluyente el cual debe encontrarse a una temperatura similar a ésta, evitando el c ontacto entre la pipeta y el diluyente. e e to r ladiluid cantidad muoestr a lodpeerlamimita,sma ma alícu porter eje os codn 90 ribió, an dSieemp 10 ure11quml, 99 ml, f orma quote ases may descores iormpl meon tevo. lúmenes

A partir de muestras sólidas o semisólidas. Las muestras sólidas y semisólidas congeladas, deben d escongelarse en ref rigeración de 4 a 8ºC durante 18 horas y no más de 24 horas antes de proceder a su análisis. a una cantidad de 10 u 11 g de la muestra por analizar en un recipiente o bolsa plástica estériles de tamaño adecuado. Pes r

Adicionar un volumen de 90 a 99 ml de diluyente llevado a una temperatura similar a la de la muestra. Operar la licuadora o el homogeneizador peristáltico de 1 a 2 minutos hasta obtener una suspensión completa y homogénea según se indique en la técnica correspondiente para cada alimento .Aun en los equipos más lentos, este tiempo no debe exceder de 2,5 minutos. Permitir que las partículas grandes se sedimenten, y transf erir la cantidad deseada tomando de las capas superiores de la suspensión. o Cuand la dilución primaria es muy viscosa o pega josa, adicionar más diluyente, lo cual debe tomarse en cuenta para las operaciones subsecuentes o expresión de resultados.

El h omogeneizador peristáltico (Stomacher) puede no ser adecuado para al gunos productos (por ejemplo, aquellos con partículas agudas o constituyentes que no se dispersen f ácilmente). Debe ser utilizado sólo cuando exista evidencia (publicada o por ensayos) de que los resultados obtenidos no difieren significativamente con aquellos obtenidos con licuadora. Algunos componentes de los alimentos como la grasa dificultan la dispersión homogénea de los microorganismos, por lo que en estos casos se recomienda que para realizar la p rimera dilución, el diluyente se calienta ligeramente (40ºC) en un baño María para lograr la distribución homogénea de la grasa y con ello una dispersión homogénea de microorganismos. Para obtener datos reproducibles en los análisis, al realizar las diluci ones es necesario estandarizar la agitación que se realice. Además, es importante recalcar que la viabilidad de bacterias, hongos y levaduras puede resultar af ectada al entrar en contacto con el diluyente, por lo que se recomienda que el tiempo que transcurre desde que el alimento entra en contacto con el diluyente hasta que se incorpora el inoculo al medio de cultivo, no exceda los 20 minutos. FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICOBIOLOGICAS http://slidepdf.com/reader/full/manual-completo-micro-alimentos

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LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS REPARACIÓN DE LAS DILUCIONES DECIMALES ADICIONALES Transf erir 1ml o un múltiplo, por ejemplo, 10 u 11 ml de la dilución primaria 1 + 9 (10¹), en otro recipi ente contenido nueve veces el volumen del diluyente estéril a la temperatura apropiada, evitando el contacto entre la pipeta y el diluyente. Mezclar cuidadosamente cada botella de diluyente siempre de la misma manera que se describe P

or e te anter m n de. diluciones que se vayan a preparar y de aquellas que se van a inocular, dependen seliección La del número esperado de microorganismos en la muestra, con base a los resultados de análisis previos y de la inf ormación que se obtenga del personal de inspección que la haya colectado. En ausencia total de inf ormación, traba jar con las diluciones de la primera a la sexta. Utilizar pipetas dif erentes para cada dilución inoculado simultáneamente las ca jas que se hayan seleccionado. El volumen que se transfiera nunca debe ser menor al 10% de la capacidad total de la pipeta. Si la pipeta es terminal y se transfiere un volumen de líquido equivalente a su capacidad total, escurrir aplicando la punta de la pipeta una sola vez en un área de la ca ja Petri sin líquido. e tr s se or e o e et e ést e e o rse e e ter or e Mi af tea ner l líquid d ición la pipvert a,ical, la pa punratalodcual este a d úlbtimapo dyaebe inclina n l rse in loi nedcesl acurioe.llo del f nrasaco y man la en pos En estudios donde la presencia o ausencia de una determinada especie de microorganismos en 0,1 g, no es necesario preparar diluci ones mayores. El criterio para seleccionar las diluci ones a preparar de acuerdo con el número de microorganismos esperados es: Para la técnica del número más probable utilizar tres tubos: donde sea posible demostrar el microorganismo en 10 ml de la solución más alta. Para la técnica de cuenta en placa, considerar aquellas en las que se puedan contar de 25 a 250 colonias en un mínimo de una de tres diluciones en el método de cuenta de Bacterias aerobias en placa. En el caso de otros grupos microbianos, considerar el número es e o

cificado de colonias en la norma Oficial Mexicana correspondiente N paplica Cuestionario. 1. ¿ cual es la finalidad de realizar diluciones en una muestra? 2. ¿ que relación se guarda al hacer las diluciuones de las muestras? 3. ¿Qué medio se emplea como solvente para hacer las diluciones? 4. ¿ como debe encontrarse el medio empleado para las diluciones .?explique 5. ¿ Cuantas diluciones deben prepararse de una muestra? Explique.

Bibli

ografia

Microbiología e Inocuidad de los alimentos. Eduardo Fernández Escartín. Universidad de Querétaro, 2000. Manual del Ing. en alimentos.Ed.Grupo Latino Ltda.edición200) NOM-110-SSA1-1994 FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICOBIOLOGICAS http://slidepdf.com/reader/full/manual-completo-micro-alimentos

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LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS Practica 4 Método para la cuenta de bacterias aerobias en placa 0bjetiv

o

Establece el método para estimar la cantidad de microorganismos viables presentes en un alimento, a gua potable y a gua purificada, por la cuenta de colonias en un medio sólido incubado aeróbicamente.

Definiciones

Unidades Formadoras de Colonias (UFC), término que debe utilizarse para reportar la cuenta de colonias en placa, las cuales pueden surgir de una célula o de un cúmulo de células.

Introducción Cuando se requiere investigar el contenido de microorganismos viables en un alimento, la técnica comúnmente utilizada es la cuenta en placa. En realidad esta técnica no pretende poner en evidencia todos los microorganismos presentes. La variedad de especies y tipos dif erenciables por sus necesidades nutricionales, temperatura requerida para su crecimiento, oxígeno disponible, etc., hacen que el número de colonias contadas const ituyan una estimación de la cif ra realmente presente y la misma refleja si el manejo sanitario del producto ha sido el adecuado Se considera que cada colonia que desarrolla en el m edio de cultivo de elección después de un erto t e o e te er t r e rov e e e roorg s o o e ciagreg adi omp d incubación a la mp a u a ad cuada, p i n d un mic m d un os son capaces de ellos de la muestra ba jo estudio; ese microorganismo o microorganismani de f ormar la colonia, es decir una UFC.

Método Según la norma NOM-092- SSA1-1994 Método para la cuenta de bacterias aerobias en placa.

Reactivos Los reactivos que a continuación se mencionan deben ser de grado analítico y cuando se indique agua debe entenderse como agua destilada. Medios

de cultivo

Agar Triptona-Extracto de Levadura (agar para cuenta estándar).


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SOLUCIONES

Solución

reguladora de fosfatos (solución concentrada).

. Solución

de trabajo:

o

Tomar 1,25 ml de la solución concentrada y llevar a un litro con agua

o

, distribuir en porciones de 99, 90 y 9 mL según se requiera.

Agua peptonada

Si este diluyente no es usado inmediatamente, almacenar en lugar oscuro a una temperatura entre 0 a 5°C por un tiempo no mayor de un mes, en condiciones tales que no alteren su volumen o composición.

Muestreo y muestra Se aceptan muestras colectadas en recipientes esterilizados y que hayan sido transportadas adecuadamente. La muestra deberá ser suficiente para su estudio (50 a 100 g ó ml) según las técnicas para el muestreo y análisis microbiologico de alimentos y bebidas) Sistema analí tico Según la Norma Oficial Mexicana NOM-092-SSAI-1994. Para la cuenta de bacterias aerobias en placa. Uso del sistema analí tico o d

n o

Pr ce imie t

Distribuir las ca jas estériles en la mesa de traba jo de manera que la inoculación; la adición de e o e t vo s st s o os

o oge se r o re e te mu diapad cculn li da y htos mpertinnización, entes previam pueedan su inocóm da y cliborrer m pnor duplicad . Marcarola. s ca jas en nterea aliza culación

Después de inocular las diluciones de las muestras preparadas según Preparación y dilución de muestras de alimentos para su análisis microbiológico, en las ca jas Petri, agregar de 12 a 15 ml del medio preparado, m ezclarlo mediante 6 movimientos de derecha a izquierda, 6 en el sentido de las manecillas del reloj, 6 en sentido contrario y 6 en sentido contrario y 6 de atrás a adelante, FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICOBIOLOGICAS http://slidepdf.com/reader/full/manual-completo-micro-alimentos

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LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS b una superficie lisa y horizontal hasta lograr una completa incorporación del inóculo en el medio; cuidar que el medio no moje la cubierta de las ca jas. Dejar solidificar . so re

Incluir una ca ja sin inóculo por cada lote de medio y diluyente preparado como testigo de esterilidad. El tiempo transcurrido desde el momento en qu e la muestra se incorpora al diluyente hasta que finalmente se adiciona el medio de cultivo a las ca jas, no debe exceder de 20 minutos. Incubar las ca jas en posición invertida (la tapa hacia aba jo) por el tiempo y la temperatura que se requieran, según el tipo de alimento y microorganismo de que se trate, véase la Tabla 1. Tabla 1. Tiempo y temperatura de incubación para bacterias aerobias (1). Grupo bacteriano

Temperatura (°C)

Tiempo de incubación

ero os TMereso mofílic fílicososaaero bibios Psicrotróficos Psicrofílicos

55 35 ± 2°C 20 ± 2°C 5 ± 2°C

48 ± 2 h 3  5 días 7  10 días

En la lectura seleccionar aquellas placas donde aparezcan entre 25 a 250 UFC, para disminuir el error en la cuenta. t r to s s o o s es rro s e s s se e o Clevonadu a r as)da la ecndlonia a s llada placa l cci nadas (excepto las de mohos y er uso del microscopio para resolver los casos , incluy las codlonia puntif ornmesla, hac en los que no se pueden distinguir las colonias de las pequeñas partículas de alimento o de levaduras.

o s n o de datos VALORES DE RESULTADOS. Pr ce amie t

Después de la incubación, contar las placas que se encuentren en el intervalo de 25 a 250 colonias, usando el contador de colonias y el registro de la cuenta d e colonias. Las placas de al m enos una o es e e est r e e o e os o dineterv tresalodiluci n od, bvénase eal cuad n ro l in2,tervejealmpl d o 25 250. Cuand ól una dilución está en el apropiad 1. aCalcula r la cuenta promedio por gramo o mililitro de dicha dilución y reportar.

Cuando dos diluciones están en el intervalo apropiado, d eterminar la cuenta promedio dada por cada dilución antes de promediar la cuanta d e las dos diluciones para obtener la cuenta en placa por gramo o mililitro, véase el cuadro 2, ejemplo 2. FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICOBIOLOGICAS http://slidepdf.com/reader/full/manual-completo-micro-alimentos

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LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS Con el fin de unif ormar los criterios para el reporte de las cuentas en ensayos donde las placas presenten situaciones no contempladas en los ejemplos anteriores, se presentan las siguientes guías: lacas con menos de 25 colonias.- cuando las placas corridas para la menor dilución muestran

P

s e e os e o t r e ero e o o s rese tes e nteadia dr eml núm n ero d d25e ccoolloonia niass,y cmul n atiplica l núm c l dnia p n par a nobdicha r por el dfactor e dilución tener dilución, el valor pcuroem estimado de cuenta en placa, aclarar en su inf orme esta situación agregando la leyenda valor estimado, véase el cuadro 2, ejemplo 3.

lacas con m ás de 250 colonias.- cuando el número de colonias por placa exceda d e 250, contar las colonias en aquellas porciones de la placa que sean representativas de la distribución de colonias, contar por ejemplo, una cuarta parte o una mitad del área de la ca ja y multiplicar el valor obtenido por 4 ó 2, respectivamente. Si solamente pueden c ontarse algunos cuadros, considerar que el f ondo de una ca ja p etri de 100 mm de diámetro contiene 65 cuadros de la cuadricula del P

contador. Aclarar en el inf orme esta situación agregando la leyenda valor estimado. Colonias extendidas.- las colonias extendidas pueden presentarse en las siguientes f ormas: Cadenas de colonias no separadas claramente entre si, que parecen desintegración de un cúmulo de bacterias.

ser

causadas por la

Colonias que se desarrollan en película entre el agar y el f ondo de la ca ja. Colonias que se desarrollan en película en la orilla de la ca ja sobre la superficie del agar. Colonias de crecimiento extendido y en algunas ocasiones acompañadas de inhibición del crecimiento, que en con junto exceden el 50% de la ca ja o represión del crecimiento que por si mismo excede el 25% de la superficie de la ca ja. lacas sin colonias.- cuando las placas de todas las diluciones no muestran colonias, reportar la cuenta en placa como menor que una vez el valor de la dilución más ba ja usada. P

lacas corridas por duplicado, una con crecimiento dentro del in tervalo adecuado y otra con m ás de 250 colonias.- cuando una placa tiene entre 25 y 250 colonias y su duplicado más de 250 P

ceonloplaca. nias, contar ambas placas incluyendo la que está fuera del intervalo para determinar la cuenta lacas corridas por duplicado, una placa de cada dilución dentro del intervalo de 25 a 250 colonias.- cuando una placa dentro de dif erentes diluciones contiene el número de colonias especificadas en el intervalo, contar el número de colonias de las cuatro placas para calcular la cuenta en placa. P


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LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS lacas corridas por duplicado, ambas placas con una dilución dentro del intervalo de 25 a 250 y sólo una de otra dilución dentro del mi smo, contar las cuatro ca jas incluyendo aquella con menos de 25 o más de 250 colonias, para calcular cuenta en placa P

Después de contabilizar las colonias en las placas seleccionadas, multiplicar por la inversa de la e tro o gr o e estr re o e r r dilución milili d osamdígitos d lasigmu d inici nd oa dlae cif eradquUFC e sop rezcan tia, vos al esta b nidapaenralaobcuteennerta edl enúm manero loorapa nifica cif ra, para redondear, elevar el segundo digito al número inmediato superior cuando el tercer digito de la derecha sea cinco o mayor(por ejemplo: 128 redondear a 130).Si el tercer digito es cuatro o menos, reemplazar el tercer digito con cero y el segundo digito mantenerlo igual(por ejemplo:2417 a 2400). o te

Los ejemplos para el cálculo de UFC para casos específicos INFORMAR Unidades f ormadoras de colonias------UFC/g o ml, de bacterias aerobias en placa en agar triptona extracto de levadura o agar para cuenta estándar, incubadas -------horas a -----oC

Cuestionario 1. ¿ que importancia tiene la determinación de bacterias aerobias en alimentos? 2. ¿ que medio de cultivo de utiliza para esta determinación .? 3. ¿ cuantas colonias se cuentan? 4. ¿ Como se reporta el resultado .? 5. ¿ en que NOM se basa esta determinación.?

Anexos

La norma NOM-092- SSA1-1994


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Método para la cuenta de mohos y levaduras en alimentos Objetivo Establecer la cuenta de mohos y levaduras viables en alimentos por medio de la cuenta en placa a 25±1ºC.

Definiciones Colonias, agrupamiento de células en f orma de masas visibles, sobre el agar de cultivo. Levaduras, son microorganismos cuya f orma dominante de crecimiento es unicelular. Poseen un núcleo y se multiplican por reproducción sexual o asexual, por gemación o por fisión transversal. La reproducción sexual cuando ocurre, es por medio de ascosporas contenidas en un saco o asca. Mohos, grupo de hongos microscópicos; organismos pertenecientes al reino Fungi, que se caracterizan por tener un cuerpo f ormado por estructuras filamentosas con ramificaciones, qu e se conocen con el nombre de hifas, el con junto de hifas constituye el micelio, carecen de clorofila, se alimentan por absorción pudiendo propagarse por esporas flageladas o no, las paredes celulares pueden ser de queratina, celulosa o manana. Crecen f ormando colonias en un medio selectivo a 25 °C. Unidades Formadoras de Colonias (UFC), término que debe utilizarse para reportar la cuenta d e colonias en placa, las cuales pueden surgir de una célula o de un cúmulo de célula

Introducción

Los hongos son organismos que poseen núcleo verdadero, carecen de clorofila, se reproducen sexual o asexualmente por esporas y pueden tener f orma multicelular filamentosa (moho) o ser células individuales en gemación (levaduras). Los mohos y las levaduras están ampliamente distribuidos en la naturaleza y se pueden encontrar f ormando parte de la flora normal de un alimento, o como agentes contaminantes y en los equipos sanitizados inadecuadamente, o e eter oro s o o e estos e o et o s o e os provo rbohid cand ratos ,l dácidosi orgáfi nic ic osquímic d s y lípid , dosbid la utoilización abo elil smabord yl el ca , prote ína origainand mal oloren, alsutermand color en la superficie de los productos contaminados. Además los mohos y levaduras pueden sintetizar metabolitos tóxicos termo resistentes, capaces de soportar algunas sustancias químicas, así como la irradiación, permitiendo el crecimiento de bacterias patógenas. El método se basa en inocular una cantidad conocida de muestra de prueba en un medio selectivo especifico acidificad o a un pH 3.5 e incubado a una temperatura de 25±1ºC.


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LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS Método Según la Norma Oficial Mexicana NOM-111-SSA1-1994. Método para la cuenta de mohos y levaduras en alimentos.

Reactivos Los reactivos que a continuación se mencionan deben ser de grado analítico y cuando se indique agua debe entenderse como agua destilada. Medios de cultivo Agar papa- dextrosa, comercialmente disponible en f orma deshidratada. A fin de preservar las propiedades gelificantes del medio, no calentar después de agregar el ácido tartárico. SOLUCIONES .Solución reguladora de f osfatos (solución concentrada) Solución de traba jo. .Tomar 1.25 ml de la solucón concentrada y llevar a un litro con agua r r te .ESoster ilizaester a 121º minutos. lución il de± á1.0º cidoC tadurtáranico al1510%

Muestreo y muestra Se aceptan muestras colectadas en recipientes esterilizados y que hayan sido transportadas adecuadamente. La muestra deberá ser suficiente para su estudio (50 a 100 g ó ml) según las técnicas para el muestreo y análisis microbiologico de alimentos y bebidas Sistema analí tico Norma Oficial Mexicana NOM-111-SSA1-1994, Bienes y Servicios. Método para la cuenta de mohos y levaduras.


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LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS Uso del sistema analí tico REPARACIÓN DE LA MUESTRA Debe ser de acuerdo a lo establecido en la práctica de preparación y dilución de muestras P

placa o en ca jas petri 1 ml de la muestra líquida directa o de la dilución primaria, olocar do CSembra porenduplicad utilizando para tal proposito una pipeta estéril.

Repetir el procedimiento tantas veces como diluciones decimales se requiera sembrar, utilizando una pipeta estéril para cada dilución . Verter de 15 a 20 ml del agar dextrosa papa acidificado, fundido y mantenido a 45 ± 0.1º C en un baño de agua. El tiempo trascurrido entre la preparación de la dilución primaria y el momento en que es vertido el medio de cultivo, no debe exceder de 20 minutos. Mezclar cuidadosamente el medio con seis movimientos de derecha a izquierda, seis en el sentido de las manecillas del reloj, seis en el sentido contrario y seis de atrás para adelante, sobre una superficie lisa. Permitir que la mezcla se solidifiqu e dejando las ca jas petri reposar sobre una superficie horizontal f ría. Pre

parar una ca ja control con 15 ml de medio, para verificar la esterilidad.

Invertir las ca jas y colocarlas en la incubadora a 25 ± 1ºC Contar las colonias de cada placa después de 3,4 y 5 días de incubación . Procesamiento de datos u n d o onias

c e ta e c l

Considerar las cuentas de placas con 10 a 150 colonias como las adecuadas para el inf orme. multiplicar por el inverso de la dilución, tomando en consideración los criterios de la NOM-092SSA1-1994 . Método para la cuenta de bacterias aerobias en placa, para la resultados.

ex res

p ión de

Contar las colonias de cada placa después de 3, 4 y 5 días de incubación. después de 5 días, seleccionar aquellas placas que contengan entre 10 y 150 colonias. si alguna parte de la ca ja muestra crecimiento extendido de mohos o si es difícil contar colonias bien aisladas, considerar los FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICOBIOLOGICAS http://slidepdf.com/reader/full/manual-completo-micro-alimentos

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LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS conteos de 4 días de incubación y aún de 3 días. en este caso, inf ormar el p eriodo de incubación de 3 o 4 días en los resultados del análisis. INFORMAR: Unidades f ormadoras de colonias por gramo o mililitro (UFC/g o mL) de mohos o levaduras en agar papa-dextrosa acidificado, incubadas a 25 ± 1°C durante 5 días.

Cuestionario. 1. ¿Cuál es la importancia de la busquedad de hongos y levaduras en alimentos:? 2. ¿ que medio de cultivo se emplea .? 3. ¿ Por qué se siembra por duplicado? 4. ¿ en que NOM se basa esta técnica? 5. ¿ como reporta sus resultados? ex An Segúnosla norma NOM-111- SSA1-1994


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Practica 6 Método para la cuenta de microorganismos coliformes totales en placa 0bjetiv

o

Establece el método microbiológico para determinar el número de microorganismos colif ormes totales en alimentos por medio de la técnica de cuenta en placa.

ici e DefiConlif on s ormes, bacilos Gram negativos, n o esporulados, aerobios o anaerobios facultativos que a

35 ºC f ermentan la lactosa con f ormación de ácido, ocasionando en las colonias desarrolladas el vire del indicador rojo neutro presente en el medio y la precipi tación de las sales biliares.

Introduccion

El método permite determinar el número de microorganismos colif ormes presentes en una muestra, utilizando agar rojo violeta bilis en el que se desarrollan bacterias a 35ºC en aproximadamente 24 horas dando como resultado la producción de ácidos orgánicos que viran el indicador de pH y precipitan las sales biliares El grupo de los microorganismos colif ormes es el más ampliamente utilizado en la microbiología de los alimentos como indicador de prácticas higiénicas inadecuadas. Según la norma NOM-113- SSA1-1994, Bienes y Servicios. Método para la cuenta de microorganismos colif ormes totales en placa.

Reactivos Los reactivos que a continuación se mencionan deben ser de grado analítico y cuando se indique agua debe entenderse como agua destilada.


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Medios

de cultivo

Agar-rojo- violeta-bilis -lactosa (RVBA ) S

olución reguladora de fosfatos (solución concentrada).

.

Se aceptan muestras colectadas en recipientes esterilizados y que hayan sido transportadas adecuadamente. La muestra deberá ser suficiente para su estudio (50 a 100 g ó ml) según las té

s

r e

estreo

á ss

ro o og o e

e tos

e

s

cnica pa a l mu y an li i mic bi l ic d alim n y b bida . Sistema analí tico Según la Norma Oficial Mexicana NOM-113-SSAI-1994 para la cuenta de microorganismos colif ormes totales en placa. Uso del sistema analí tico Preparació

n de la muestra

Según lo establecido en la practica 3 Sembrado de placas Colocar en ca jas Petri por duplicado 1 ml de la muestra líquida directa o de la dilución primaria, utilizando para tal propósito una pipeta estéril. Repetir el procedimiento tantas veces como diluciones decimales se requiera sembrar, u tilizando una pipeta estéril dif erente para cada dilución. Verter de 15 a 20 ml del medio RVBA fundido y mantenido a 45 ± 1,0°C en baño de agua. En el caso de utilizar ca jas de Petri de plástico se vierte de 10 a 15 ml del medio. El tiempo transcurrido entre la preparación de la dilución primaria y el momento en que se vierte el medio de cultivo, no debe exceder de 20 minutos. FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICOBIOLOGICAS http://slidepdf.com/reader/full/manual-completo-micro-alimentos

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LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS Mezclar cuidadosamente el inóculo con el medio con seis movimientos de derecha a izquierda, seis movimientos en el sentido de las manecillas del reloj, seis movimientos en el sentido contrario al de las manecillas del reloj y seis de atrás para adelante, sobre una superficie lisa y nivelada. Permitir que la mezcla solidifique dejando las ca jas Petri reposar sobre una superficie horizontal f ría. Pre

parar una ca ja control con 15 ml de medio para verificar la esterilidad.

Después de que está el medio completamente solidificado en la ca ja, verter aproximadamente 4 ml del medio RVBA a 45 ± 1,0°C en la superficie del medio inoculado. Dejar que solidifique. Invertir las placas y colocarlas en la incubadora a 35°C, durante 24 ± 2 horas. Después del periodo especificado para la incubación, contar las colonias con el contador de colonias y registrar las cuentas en el f ormato MB-F00001. Seleccionar las placas que contengan entre 15 y 150 colonias. Las colonias típicas son de color rojo oscuro, generalmente se encuentran rodeadas de un halo de precipitación debido a las sales biliares, el cual es de color rojo claro o rosa, la morf ología colonial es semejante a lentes biconvexos con un diámetro de 0,5 a 2,0 mm. En caso de que el recuento sea en día inhabil, la revisión y conteo la realizara personal capacitado o s

n o de datos

Pr ce amie t

Recuento de colonias s que contienen entre 15 y 150 colonias características. S eparar las placas que contienen el número antes mencionado de colonias características en dos diluciones consecutivas. Contar las colonias presentes. Calcular el número de colif ormes por mililitro o por gramo de producto, multiplicando el número de colonias por el inverso de la dilución correspondiente, tomando los criterios del Método para la Cuenta de Bacterias Aerobias en Placa. Placa

s qu e contienen menos de 15 colonias características. Si cada una de las placas tiene menos

Placa

e s r ter st s dcorres 15pondi coleonnia te. ca ac í ica ,

re ort r e

p a l número obtenido

seg

uido de la dilución

s on colonias no características. Si en la s placas no hay colonias características, reportar el resultado como: menos de un colif orme por 1/d por gramo, en donde d es el factor de dilución. Placa c

INFORMAR: UFC/g o ml en placa de agar rojo violeta bilis, incubados a 35°C durante 24 ± 2 h. FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICOBIOLOGICAS http://slidepdf.com/reader/full/manual-completo-micro-alimentos

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LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS En caso de emplear diluciones y no observar crecimiento, inf ormar utilizando como ref erencia la dilución más ba ja utilizada, por ejemplo dilución 10-1. En caso de no observar crecimiento en la muestra sin diluir se inf orma: "no desarrollo de colif ormes por ml". ari Cue1.sti on¿Qu o. son los colif ormes? e 2. ¿ porque es necesario cuantificarlos en las muestras de aguas y alimentos? 3. ¿ que medio de cultivo emplea ? 4. ¿ a que temperatura y por cuanto tiempo incuba las placas antes de hacer el conteo.? 5. En caso de tener una cuenta d e 56 colonias en una dilución a la -3 . ¿C omo reportaria su resultado:?

Anexos

Según la norma NOM-113- SSA1-1994


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Practica

7

Determinación de bacterias colif ormes por la técnica del numero mas probable ( NMP) 0bjetiv

o

Determinación de bacterias colif ormes en alimentos por el método de Número más probable (NMP).

Definiciones

Colif ormes, bacilos Gram n egativos, no esporulados, a erobios o anaerobios facultativos, que a 35 °C f ermentan la lactosa con la producción de gas ba jo las condiciones especificadas en esta norma. tr cció In oduero El núm denmicroorganismos colif ormes puede estimarse mediante el uso de cuenta en placas o

por medio de la técnica del número más probable. Esta última, también llamada técnica de dilución en tubo, proporciona una estimación estadística de la d ensidad microbiana presente con base a que la probabilidad de obtener tubos con crecimiento positivo disminuye conf orme es menor el volumen de muestra inoculada. El primero, es que Escherichia coli es aceptada como bacteria colif orme, la especie contiene variantes que no producen gas de la lactosa o lo hacen d espués de 48 h oras, p or lo que no se les identifica por medio de esta técnica. El método se basa en que las bacterias colif ormes, f ermentan la lactosa incubadas a 35 ± 1°C durante 24 a 48 horas, resultando una producción de ácidos y gas el cual se manifiesta en las campanas de f ermentación. Método Según la norma NOM-112- SSA1-1994, Determinación de bacterias colif ormes técnica del número más probable. Reactivos Los reactivos que a continuación se mencionan deben ser de grado analítico y cuando se indique agua debe entenderse como agua destilada. Medios

de cultivo

Caldo lactosado (medio de enriquecimiento para agua potable y hielo). Caldo lauril sulfato triptosa (medio de enriquecimiento selectivo). Caldo lactosa bilis verde brillante (medio de confirmación). En el caso del análisis de agua potable y hielo puede utilizarse caldo lactosado o caldo lauril sulfato triptosa con púrpura de bromocresol (concentración 0,01 g/l de medio), como alternativa al uso de campanas de fermentación. Los tubos positivos se manifiestan por el vire del indicador a color amarillo


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LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS . . .

Muestreo y muestra e t Streanac p an muestras colectadas en recipientes esterilizados y muestras que hayan sido sportadas adecuadamente. La muestra deberá ser suficiente para su estudio (50 a 100 g ó ml) según las técnicas para el muestreo y análisis microbiologico de alimentos y bebidas

Sistema analí tico Según la Norma Oficial Mexicana NOM-112-SSAI-1994 para deteminaciòn de bacterias colif ormes técnica del número más probable. Uso del sistema analí tico gua potable y hielo

Para a

u ba presuntiva

Pr e

Inoculación. Agitar la muestra. T ransf erir volúmenes de 10 ml de muestra a cada uno de 5 tubos con 20 ml de caldo lactosado de mayor concentración y 1,0 ml y 0,1 ml de muestra a cada uno de los tubos de las series de 5 respectivamente con 10 ml de caldo lactosado de concentración sencilla o caldo lauril sulfato triptosa con púrpura de bromocresol. Incubación. Incubar los tubos a 35 °C. Examinar a las 24 ± 2 h y observar si hay f ormación de gas o la f ormación de gas no se observa en este tiempo, incubar por 48 ± 2 h. u ba confirmativa

Pr e

De cada tubo que muestre f ormación de gas, tomar una azada y sembrar en un número igual de tubos con medio de confirmación, caldo lactosa lauril bilis verde brillante. Incubar a 35 ± 0,5 °C por 24 ± 2 horas o si la f ormación de gas no se observa en este tiempo, incubar por 48 ± 2 horas. En este procedimiento, para el análisis de agua potable, agua purificada así como hielo, se emplea la serie de 5 tubos inoculados, 5 tubos con 10 ml, 5 tubos con 1 ml y 5 tubos con 0,1 ml, veáse el cuadro 4.

n os.

Para alime t

parar suficiente número de diluciones para asegurar que todos los tubos correspondientes a la última dilución rindan un resultado negativo. FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICOBIOLOGICAS Pre


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LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS u

suntiva

Pr eba pre

Inoculación. Tomar tres tubos de medio de enriquecimiento de mayor concentración. Usar una pipeta estéril para transf erir a cada tubo 10 ml de la muestra si es líquida o 10 ml de la dilución primaria inicial, en el caso de otros productos. Tomar tres tubos de concentración sencilla del medio selectivo de enriquecimiento. Usar una pipeta estéril para transf erir a cada uno de estos tubos 1 ml de la muestra si es líquida o 1 ml de la dilución primaria en el caso de otros productos. a a las diluciones subsecuentes, continuar como se indica en el párraf o anterior, usando una pipeta dif erente para cada dilución. Mezclar suavemente el inóculo con el medio. P r

Incubación. Incubar los tubos a 35 ± 0,5 °C por 24 ± 2 horas y observar si hay f ormación de gas, en caso contrario prolongar la incubación hasta 48 ± 2 horas. u

onfirmativa

Pr eba c

De cada tubo que muestre f ormación de gas, tomar una azada y sembrar en un número igual de tubos con m edio de confirmación. Incubar a 35 ± 0,5 °C p or 24 ± 2 horas o si la f ormación de gas no se observa en este tiempo, prolongar la incubación por 48 ± 2 horas. este ro e En p c dimiento se considera una combinación de tres tubos por cada dilución de la serie. Para algunos productos y siempre que se requiera una mayor precisión en los resultados, será necesario inocular una serie de cinco o diez tubos.

o s

n o de datos

Pr ce amie t

Tomar la serie de tubos de la prueba confirmativa que dé f ormación de gas después del periodo de incubación requerido y buscar el NMP en los cuadros correspondientes.


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Indice del NMP y lí mites de confianza 95% para varias combinaciones de resultados positivos -1 -2 -3 cuando son usados varios números de tubos. (Diluciones 10 , 10 y 10 )

COMBINACION DE POSITIVOS 0-0-0 0-0-1 0-1-0

3 TUBOS POR DILUCION 5 TUBOS POR DILUCION INDICE DEL 95% LIMITES DE INDICE 95% LIMITES DE NMP CONFIANZA DEL NMP CONFIANZA ALTO ALTO POR G BAJO POR G BAJO <3 <0,5 <9 <2 <0,5 <7 3 <0,5 9 2 <0,5 7 3 <0,5 13 2 <0,5 7

0-2-0 1-0-0 1-0-1 1-1-0 1-1-1 1-2-0 2-0-0

----- 4 7 7 11 11 9

----- <0,5 1 1 3 3 1

----- 20 21 23 36 36 36

4 2 4 4 6 6 5

<0,5 <0,5 <0,5 <0,5 <0,5 <0,5 <0,5

11 7 11 11 15 15 13

2-0-1 2-1-0 2-1-1 2-2-0 2-2-1 2-3-0 3-0-0 3-0-1 3-0-2 3-1-0 3-1-1 3-1-2 3-2-0

14 15 20 21 28 ----- 23 39 64 43 75 120 93

3 3 7 4 10 ----- 4 7 15 7 14 30 15

27 44 89 47 150 ----- 120 13 380 210 230 380 380

7 7 9 9 ----- 12 8 11

1,0 1,0 2,0 2,0 ----- 3,0 1,0 2,0

17 17 21 21 ----- 28 19 25

11 14 ----- 14

2,0 4,0 ----- 4,0

25 34 ----- 34


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LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS 3-2-1 3-2-2 3-3-0 3-3-1

150 210 240 460

30 35 36 71

440 440 130 240

17 ----- ----- -----

5,0 ----- ----- -----

46 ----- ----- -----

3-3-2 3-3-3 4-0-0 4-0-1 4-1-0 4-1-1 4-1-2 4-2-0 4-2-1 4-3-0 4-3-1 4-4-0 5-0-0 5-0-1 5-0-2

1100 >1100 ----- ----- ----- ----- ----- ----- ----- ----- ----- ----- ----- ----- -----

150 >150 ----- ----- ----- ----- ----- ----- ----- ----- ----- ----- ----- ----- -----

480 >480 ----- ----- ----- ----- ----- ----- ----- ----- ----- ----- ----- ----- -----

----- ----- 13 17 17 21 26 22 26 27 33 34 23 31 43

----- ----- 3,0 5,0 5,0 7,0 9,0 7,0 9,0 9,0 11 12 7 11 15

----- ----- 31 46 46 63 78 67 78 80 93 93 70 89 114

5-1-0 5-1-1 5-1-2 5-2-0 5-2-1 5-2-2 5-3-0

----- ----- ----- ----- ----- ----- -----

----- ----- ----- ----- ----- ----- -----

----- ----- ----- ----- ----- ----- -----

33 46 63 49 70 94 79

11 16 21 17 23 28 25

93 120 150 130 170 220 190

5-3-1 5-3-2 5-3-3 5-4-0 5-4-1 5-4-2

----- ----- ----- ----- ----- -----

----- ----- ----- ----- ----- -----

----- ----- ----- ----- ----- -----

110 140 180 130 170 220

31 37 44 35 43 57

250 340 500 300 490 700


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LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS 5-4-3 5-4-4 5-5-0 5-5-1

----- ----- ----- -----

----- ----- ----- -----

----- ----- ----- -----

280 350 240 350

90 120 68 120

850 1000 750 1000

5-5-2 5-5-3 5-5-4 5-5-5

----- ----- ----- -----

----- ----- ----- -----

----- ----- ----- -----

540 920 1600 >1600

180 300 640 >640

1400 1200 5800 >5800

INFORMAR: "Número más probable (NMP) de colif ormes por gramo o mililitro de muestra". En caso de muestras de agua inf ormar NMP/100 ml. Cuestionario. 1. ¿ En que se basa este método .? 2. ¿ Por cuanto tiempo se incuban los tubos? 3. ¿ Cuantas series de tubos inocula en caso de agua , y cuantas en caso de alimentos.? 4. ¿ Que características debe tener un tubo para darlo como positivo? 5. Si obtuvo un resultado 3-3-2 ¿ como reportaría su resultado , en caso de un alimento liquido?

Anexos Según la norma NOM-112 SSA1-1994


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Metodo para la determinación de Staphylococcus aureus en alimentos 0bjetiv

o

Identificación y cuenta de St aphylococcus aureus en alimentos

Definiciones

Staphylococcus aureus, microorganismo que se desarrolla en medios de cultivo selectivo y dif erencial, que es capaz de dar positiva la prueba de coagulasa y termonucleasa.

Introducción

Este método permite hacer una estimación del contenido de St aphylococcus aureus en alimentos, se ef ectua directamente en placas de medio de cultivo selectivo y dif erencial, con la confirmación mediante las pruebas de coagulasa y deneasa. Método Según la norma NOM-115- SSA1-1994, Bienes y St aphylococcus aureus en alimentos.

serv

icios. Método para la determinación de

Reactivos Los reactivos que a continuación se mencionan deben ser de grado analítico y cuando se indique agua debe entenderse como agua destilada. Medios

de cultivo

.

Medio

de Baird-Parker

Caldo

de infusión cerebro-corazón (BHI)

ADN helicoidal de timo de ternera

Solución

de telurito

.

.


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LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS . SOLUCIONES Solución

reguladora de fosfatos (solución concentrada).

Solución o o

de trabajo:

Tomar 1,25 ml de la solución concentrada y llevar a un litro con agua Esterilizar a 121° ± 1,0°C durante 15 minutos.

o

Agua peptonada. Solución

salina isotónica

Solución

de cloruro de calcio anhidro 0,01M

. Solución

de azul de toluidina 0,1 M

Solución

amortiguadora 0,05 M tris-(hidroximetilaminometano)

.

Reactivo biológico plasma de conejo

.

Muestreo y muestra Se aceptan muestras colectadas en recipientes esterilizados y que hayan sido transportadas adecuadamente. La muestra deberá ser suficiente para su estudio (50 a 100 g ó ml) según las técnicas para el muestreo y análisis microbiologico de alimentos y bebidas Según la Norma Oficial Mexicana NOM-115-SSAI-1994. Metodo para la determinación de St aphylococcus aureus en alimentos. Uso del sistema analí tico n de la muestra La preparación de la muestra se debe realizar de acuerdo a lo establecido en practica 3 Preparació

Sembrado en placa Utilizando dif erentes pipetas de 1 ml para cada dilución, depositar 0,1 ml sobre la superficie de las placas de agar Baird-Parker. Distribuir el inóculo sobre la superficie del agar con varillas estériles de vidrio en ángulo recto, utilizando una para cada dilución. Mantener las placas en su posición hasta que el inóculo sea absorbido por el agar. FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICOBIOLOGICAS http://slidepdf.com/reader/full/manual-completo-micro-alimentos

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LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS Invertir las placas e incubar de 45 a 48 h a 35ºC. Seleccionar las placas que tengan entre 15 y 150 colonias típicas de St aphylococcus aureus; si no es posible, seleccionar las placas de las diluci ones más altas no obstante tengan más de 150 colonias. o s s te g se e e greg r ot

Cuand de imad 15 coolo".nias típicas también pueden ser utilizadas y al inf orme or est d b ala placa a la n n aandem"vealnos Las colonias típicas son negras, circulares, brillantes, c onvexas, lisas, de diámetro de 1 a 2 mm y muestran una zona opaca y un halo claro alrededor de la colonia. Seleccionar las colonias de acuerdo con el siguiente cuadro para realizar las pruebas de coagulasa y termonucleasa: Cuadro 1 Cuadro 1 Número de colonias sospechosas Número de colonias por probar en placa Menos de 50

3

51 101aa100 150

57

Seleccionar el número de colonias y sembrar cada una en tubos con 0,5 ml de caldo de infusión cerebro-corazón. Incubar a 35ºC durante 24 h. Inocular en la misma f orma cepas conocidas de St aphylococcus aureus y St aphylococcus epidermidis como testigos positivo y negativo. Después del periodo de incubación pasar con una pipeta de 1 ml, 0,3 ml de cada cultivo a otro tubo de 10 mm x 75 mm y conservarlo para la prueba de termonucleasa. el resto del cultivo se usa r e o g s pa la pdreuceobaagdula csaa ula a. Pruaeba Agregar a los 0,2 ml del cultivo anterior, 0,2 ml de plasma de conejo diluido volumen a volumen con solución salina estéril. Incubar en baño de agua de 35 a 37ºC y observar durante 6 h a intervalos de 1 h; si no hay f ormación de coágulo, observar a las 24 h. considerar positiva la prueba si hay f ormación de coágulo. Para comprobar la coagulabilidad del plasma de conejo se añade una gota d e cloruro de calcio al 5% a 0,5 ml de plasma reconstituido empleado, f ormándose un coágulo en 10-15 seg. Prueba de termonucleasa e t r r te e t vo e o e s ere ro or e o e g Cal a odu hirvinend . an 15 min, 0,3 ml d cul i n cald d infu ión c b -c azón n bañ d a ua Pasar una gota de cada cultivo por medio de una pipeta pasteur a un orifici o del medio, incluye testigo. Incubar a 35ºC en cámara húmeda de 4 a 24 h. La aparición de un halo color rosa extendido de por lo menos 1 mm alrededor de la perf oración se califica como positiva.


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o s n o de datos Hacer el cálculo del contenido de microorganismos en el producto tomando en cuenta el número de colonias totales, el número de colonias confirmadas, la dilución y el volumen inoculado (0,1 Pr ce amie t

) . o 1: Si la ca ja tiene 80 colonias en la dilución 1:1000 jempl Eml

Se toman 5 colonias para la prueba, de éstas dan 4 positivas, el cálculo es: 80 4 64 1000 10 640000 x

5

!

x

x

!

E jemplo 2: Si la ca ja tiene 14 colonias en la dilución 1:10 Se toman 3 colonias para la prueba, de éstas dan 2 positivas, el cálculo es: 14 2 9,3 10 10 930 x

!

INFORMAR: Según ejemplo 1:

x

x

!

3

Inf ormar como St aphylococcus aureus: 640 000 UFC/g según ejemplo 2: Inf ormar como St aphylococcus aureus: 930 UFC/g valor estimado Si las pruebas confirmativas resultan negativas en todas las colonias probadas, inf ormar como: 0 UFC/g en muestras directas CUESTIONARIO. ¿ QUE TIPO DE MEDIO DE CULTIVO SE EMPLEA EN ESTA TECNICA:? 1. 2. ¿ EN QUE ALIMENTOS SE BUSCA ESTE MICROORGANISMO.? 3. ¿ CUANTAS COLONIAS DEBE PROBAR SI SU CONTEO ESTA ENTRE 50 Y 100 ? 4. SI CONTO 26 COLONIAS Y PROBO 3 Y 2 DIERON POSITIVAS,¿COMO REPORTARIA SU RESULTADO.? 5. ¿ EN QUE NOM ESTA BASADA ESTA DETERMINACIO? 6. ¿ PORQUE ES IMPORTANTE LA DETERMINACION DE ESTE MICROORGANISMO?

Anexos

La norma NOM-115 SSA1-1994


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Practica

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Metodo para la determinación de Salmonella spp en alimentos Objetivo La detección y el control de salmonella spp en alimentos.

Definiciones Detección de Salmonella: determinación de la presencia o ausencia de estos microorganismos en una masa determinada de producto, cuando las pruebas se llevan a cabo de acuerdo con esta norma. Salmonella: microorganismo patógeno perteneciente al grupo de Enterobacterias. Bacilo gram negativo, aerobio, no esporulado que f orman colonias típicas en m edios selectivos sólidos y que presentan además las características bioquímicas y serológicas descritas cuando los procedimientos se ef ectúan de acuerdo con esta norma.

Introducción Las especies del género Salmonella (Salmonella spp) han sido muy estudiadas como patógenas cuando se encuentran presentes en los alimentos. La detección de este microorganismo depende en cierta medida del método analítico en muestras clínicas y los métodos empleados para estos casos se adaptaron posteriormente para su detección en alimentos. Las modificaciones a los métodos consideraron dos aspectos importantes, el primero es el debilitamiento o daño de las celular bacterianas presentes en un alimento, debido al proceso a que esta su jeto (por ejemplo: tratamiento térmico, secado, etc.) y el segundo, la variabilidad inherente a la naturaleza del producto ba jo estudio. Método Según la norma NOM-114 SSA1-1994 para la determinación de Salmonella en alimentos.



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LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS Medios

de cultivo

Medios

de pre-enriquecimiento Medios de aislamiento

Agar verde brillante (VB) Agar XLD

Agar salmonella-shigella (SS). Agar entérico Hektoen

Medios para

pruebas bioquímicas

Agar de tres azúcares y hierro (TSI) Agar de hierro y lisina (LIA) AGAR

NUTRITIVO.

Medio

de SIM (para Sulfuro, Indol y Movilidad)

Agar citrato de Simmons

Caldo MR-VP Caldo

(Rojo de metilo-Voges Proskauer)

manitol

Caldo

malonato Caldo

urea

Caldo

infusión cerebro corazón (BHI)

SOLUCIONES Solución

verde brillante al 0,1% (1:1000) de yodo-yoduro Solución salina al 0,85% Solución salina formalizada Reactivo de Kovac Solución de alfa-naftol al 5% Solución de rojo de metilo Solución de gelatinasa al 5% Solución


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LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS Antisueros o o o

Antisuero polivalente somático (O) Antisuero polivalente flagelar (H) Antisuero polivalente capsular

Muestreo y muestra Se aceptan muestras colectadas en recipientes esterilizados y que hayan sido transportadas adecuadamente. La muestra deberá ser suficiente para su estudio (50 a 100 g ó ml) según las técnicas para el muestreo y análisis microbiologico de alimentos y bebidas Sistema analí tico Según la Norma Oficial Mexicana NOM-114-SSAI-1994 para la determinación se salmonella spp en alimentos. Uso del sistema analí tico preparación de la muestra Los siguientes métodos se basan en el análisis de 25 g de la muestra analítica en una proporción de 1 parte de muestra por 9 de caldo (para una dilución final de 1:10). Esta cantidad puede variarse siempre que se mantenga la misma proporción. Se recomienda una muestra de 25 g o más (25 g de muestra en 225 mL de caldo). o d n o general para la preparación de muestras Pesar asépticamente 25 g de la muestra en un vaso estéril de licuadora o en bolsa estéril para tr j r e aba a n homogeneizador peristáltico (stomacher). Adicionar 225 ml del medio de preenriquecimiento estéril (generalmente caldo lactosado, a m enos que se indique otro) y licuar si es necesario durante un min. Transf erir asépticamente la mezcla homogeneizada a un recipiente estéril de boca ancha con tapón de rosca y dejar reposar por 60 min a temperatura ambiente con la tapa bien enroscada. Mezclar bien y determinar el pH aproximado con papel pH. A justar, si es necesario, a un pH 6,8 ± 0,2 con hidróxido de sodio 1N o ácido clorhídrico 1N estériles. Mezclar y cubrir el recipiente enroscando suavemente la tapa. Incubar 24 ± 2 h a 35ºC. Continuar como se indica en5.9.1. Pr ce imie t

o d

no s

í o

n de muestra según el producto.

Pr ce imie t e pec fic para la preparació

Huevo en polvo, claras de huevo en polvo, yema de huevo en polvo, huevos líquidos pasteurizados y congelados, fórmulas infantiles y mezclas preparadas en polvo (harinas para hot cakes, galletas, donas, bisquets y pan). De pref erencia no descongelar la muestra. Si se requiere, preparar los alimentos congelados justo antes de tomar la muestra analítica descongelándolos a FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICOBIOLOGICAS http://slidepdf.com/reader/full/manual-completo-micro-alimentos

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LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS 45ºC por 15 min aproximadamente con agitación constante en un baño de agua o por 18 h a una temperatura entre 2-5ºC. Los productos que no son en polvo se traba jan como indica el procedimiento general (9.4.1). Para los productos en polvo, pesar 25 g de muestra analítica en el medio de pre-enriquecimiento, dejando que el polvo se humecte lentamente. Si es necesario homogeneizando poco a poco con una varilla de vidrio estéril u otra herramienta también estéril. Continuar igual que el procedimiento general. Productos no pasteurizados congelados de huevo. Descongelar la muestra como se indica en 9.4.2.1. Pesar asépticamente y por duplicado 25 g de muestra. Colocar en un matraz con 225 ml de caldo selenito cistina una de las muestras y la otra en un matraz con 225 ml de caldo tetrationato, sin verde brillante. Proceder como en 9.4.1 hasta a justar el pH. Adicionar 2,25 ml de verde brillante al 0,1% y 4,5 ml de solución yodo-yoduro a la muestra contenida en el caldo tetrationato y mezclar bien. Incubar como se indica en 9.5.2. oductos que contienen huevo en su f ormulación (pastas

Pr

para

sopa, rollos chinos, etc.);

, pav ); fr ta fre ca , c a eca ; nsus d oss ( d ss ( ng n os hu, ev os, sp, olallngos o, attiún o taus) ys pesscado. s Pre ongf eela dte smoenste on nos , langos ren jaiba nso descongelar la muestra antes de su análisis, si esto es necesario, proceder igual que en 9.4.2.1. utilizando caldo lactosado como medio de pre-enriquecimiento, licuar dos min. Continuar después de la incubación como en 9.5.1. e ala a prepara a jamó , cr táce camar e , ca rej

Leche en polvo, entera, semidescremada o descremada. Seguir el p rocedimiento general para el pesado de la muestra y adicionarla lentamente a un matraz Erlenmeyer con 225 ml de solución verde brillante al 0,1%, procurando que el polvo quede en la superficie del líquido y se hidrate suavemente. Dejar la mezcla en reposo por 60 min, e incubar como se indica en 9.4.1 u so. Proceder igual que en 9.4.1. utilizando agua de peptona tamponada como medio de preenriquecimiento. Q e

Caseína. Seguir el procedimiento señalado en 9.4.1, licuar por dos min y a justar cuidadosamente el pH. Coco. Proceder como se indica en 9.4.1 hasta a justar, si es necesario, el pH a los valores indicados. Adicionar hasta un máximo de 2,25 ml de Tergitol aniónico 7 estéril (121ºC ± 1ºC/15 min) y mezclar bien. Puede utilizarse Tritón X-100 estéril. Usar la cantidad necesaria de estos detergentes t o e vo o r e or uX-100 ilizand lum egot n mínim paracoqumeo seseinici mación de espuma. Puede ser, para el Tritón de d osl a tres as. Incuba indicalaenf 9.4.1.

Levadura seca. Seguir el procedimiento de 9.4.1, utilizando como medio de enriquecimiento caldo soya tripticasa estéril. Mezclar para f ormar una suspensión homogénea. A justar el pH y terminar el procedimiento como en 9.4.1. Para levadura seca inactiva, continuar como en 9.5.1. Para levadura seca activa, mezclar la muestra incubada y transf erir 1 ml a cada tubo de 10 ml de caldo FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICOBIOLOGICAS http://slidepdf.com/reader/full/manual-completo-micro-alimentos

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LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS a i nato y 10 ml de caldo lauril triptosa. Incubar los medios selectivos por 24 ± 2 h. C ontinuar como se indica en 9.5.2. tetr t o

Carnes, sustitutos de carnes, derivados cárnicos, sustancias de origen animal, productos glandulares y harinas (pescado, carne y hueso). oductos procesados térmicamente y productos secos. Se sigue el procedimiento señalado en 9.4.1 hasta la homogeneización. Si la muestra es en polvo o molida, el licuado puede omitirse. Después de reposar, mezclar bien y a justar el pH como se indica en el procedimiento general. Para emulsionar las grasas, agregar los detergentes en las mismas proporciones y con las mismas recomendaci ones que para el coco. La cantidad de los mismos dependerá en gran m edida de la composición del alimento. Los detergentes no serán necesarios en los productos glandulares en polvo. Incubar las muestras como se indica en 9.4.1. Pr

oductos crudos o altamente contaminados. Pesar porciones de 25 g de producto en dos vasos

Pr

r or o e o e o t rse e ro to e e pa licuad Si elantemu eestr a es enespEorlvo o m lida, puedml. mi i onay r l225 p duc trac eyer pesa rse direca.tam n ma lenm estérl licuad iles de 500 Adici ml depucalddo selenito-cistina o 225 ml de caldo tetrationato (sin verde brillante) a cada muestra analítica. Licuar por dos min y pasar asépticamente a matraces Erlenmeyer de 500 ml. Dejar reposar y a justar el pH como se indica en 9.4.1. Adicionar 2,25 ml de solución de verde brillante 0,1% y 4,5 ml de solución yodo-yoduro a la muestra que se enriquecerá con caldo tetrationato. Homogeneizar e incubar. Continuar como se indica en 9.5.1.

Dulces y dulces cubiertos ( incluyendo chocolate). Pesar asépticamente 25 g de la muestra en un vaso para licuadora agregando 225 ml de leche descremada reconstituida. Licuar por dos min. ej r g ee Man nezcla 2.4.1 hasta después de a justar el pH. Adicionar 0,45 ml de la solución verde r bien. Incubar como se indica en 9.4.1. brillanate ali ual 0,1%quy m

Especias n ng n n s d o o no, perejil seco, romero, tomillo, chile en polvo, paprika o pimentón, ajon jolí , ho juelas de vegetales (vegetales secos). Pesar asépticamente 25 g de la muestra y verter en un recipiente de tapón de rosca de 500 ml con 225 ml de caldo soya tripticasa estéril y mezclar bien. Continuar con el procedimiento 9.4.1. Pimie ta e ra, pimie ta bla ca, emilla e api , c mi

j e p lv Averter o n enouno reu cipi ho jeunela s; cebolla en polvo u ho juelas. Pesar asépticamente 25 g de la muestra y te de tapón de rosca de 500 ml con 225 ml de caldo soya tripticasa estéril adicionado con sulfito de potasio y mezclar bien. Continuar con el procedimiento 9.4.1.

n de Jamaica (Pimienta inglesa), clavo de especia, canela y orégano. No se conoce un método para neutralizar la toxicidad de estas cuatro especias. Diluir por lo tanto, más allá de su poder de toxicidad. Examinar la pimienta, canela y orégano en una proporción 1:100 muestra/caldo, y el clavo a 1:1000 muestra/caldo. Seguir el procedimiento igual que en 9.4.2.11.1 FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICOBIOLOGICAS Pimie ta


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LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS Gelatina. Pesar asépticamente 25 g de muestra en un recipiente de boca ancha y tapón de rosca de 500 ml. Adicionar 225 ml de caldo lactosado estéril con 5 ml de solución acuosa de gelatinasa al 5% y mezclar bien. Dejar reposar 60 min y continuar igual que el procedimiento 9.4.1. Aislamiento Cerrar firmemente el tapón de rosca de los matraces con los cultivos de pre-enriquecimiento y agitar suavemente, transf erir respectivamente 1 ml de la mezcla a un tubo que contenga 10 ml de caldo tetrationato y a otro con 10 ml de caldo selenito cistina. Como alternativa, en sustitución del caldo tetrationato puede emplearse el medio Vassiliadis-Rappaport. Incubar de 18 a 24 h a 35ºC o, para alimentos fuertemente contaminados a 42ºC por el mismo periodo. Estriar los productos que fueron directamente enriquecidos en medios selectivos. e r e t o o o se e to st estr r e r x os s esox o to ) g r M zcla l ub c )n ycald ia er an daegalos ilmedi a os li ina la o(XLD verd e br illan te (VB seledctivosicadici una terlcernia caci ja ina conycualqui nales, (aagar entérico Hektoen, agar Sulfito de Bismuto o Agar SS). Ef ectuar el mismo procedimiento para el caldo tetrationato. Incubar las placas 24 ± 2 h a 35ºC.

Examinar las placas para investigar la p resencia de colonias típicas de Salmonella, de acuerdo con las siguientes características: Agar XLD: colonias rosas o rojas que pueden ser transparentes con o sin centro negro. En algunos casos las colonias pueden aparecer completamente negras. Agar VB: colonias rojas o rosas que pueden ser transparentes rodeadas por medio enrojecido; las bacterias f ermentadoras de la lactosa dan colonias amarillas. Agar entérico Hektoen: colonias verdes o azulverdes con o sin c entro negro. En algunos casos las colonias pueden aparecer completamente negras. Agar Sulfito de Bismuto: la s colonias típicas de Salmonella spp pueden ser caf és, grises o negras; con o sin brillo metálico. Generalmente el medio circundante (halo) es caf é, tornándose posteriormente negro. Algunas cepas producen colonias verdes sin la f ormación del halo oscuro. Si las placas no muestran colonias típicas o no se observa crecimiento, incubar 24 h adicionales. Agar SS: colonias translúcidas, ocasionalmente opacas. Algunas colonias dan centro negro. Las colonias f ermentadoras de la lactosa son rojas. Identificación bioquí mica FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICOBIOLOGICAS http://slidepdf.com/reader/full/manual-completo-micro-alimentos

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LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS Seleccionar al menos dos colonias típicas de cada medio selectivo, que se encuentren bien aisladas. Tocar levemente el centro de cada colonia e inocular dos tubos, uno con agar triple azúcar hierro (TSI) y otro con agar hierro lisina (LIA), por estría en la superficie inclinada y por punción en el f ondo. Incubar por 24 ± 2 h a 35ºC. Almacenar en ref rigeración de 5 a 8ºC las placas con medios selectivos por si es necesario retomar más colonias. Observar el crecimiento en l os tubos y considerar presuntivamente positivas para Salmonella las colonias que den las siguientes reacciones: Agar TSI, en el f ondo del tubo se observa vire del indicador debido a la f ermentación de la glucosa; en la superficie del m edio se observa un color rojo más intenso que el m edio original debido a la no f ermentación de la lactosa ni de la sacarosa. En la mayoría d e los casos se observa coloración negra a lo largo de la punción debido a la producción de ácido sulfihídrico. Agar LIA, se observa intensificación del color púrpura en todo el tubo por la descarboxilación de la o s er r eg t vos e os t vos e ro te o or r oe e o o lidseina. i qu spp p pduzcan claárcid amoe snulfihíd c l ricoama ill mn edil f o nd epasllde Scul almonella roducen l agaCr. nLaidmayaornía daeilas caqu en este con ennegrecimiento a lo largo de la punción.

Retener todos los cultivos que muestren las reacciones características de Salmonella spp en los medios TSI y LIA para las pruebas adicionales, indicadas en 3.2.3. Los cultivos con TSI que no parecen de Salmonella spp pero que presentan reacciones en LIA típicos, d eben traba jarse como cultivos presuntivos positivos, ya que en estos casos, el m edio LIA permitirá detectar S. arizonae y cepas atípicas de Salmonella spp que utilicen lactosa o sacarosa. Descartar solamente los cultivos que muestren reacciones atípicas en ambos medios. Continuar el análisis a partir de los tubos de TSI con reacciones típicas. Si el cultivo presenta reacciones atípicas en este medio, tomar colonias adicionales de las placas de donde se obtuvo el cultivo atípico anterior y sembrar las pruebas bioquímicas nuevamente. Continuar la identificación bioquímica y serológica a partir de los cultivos recuperados de TSI. Se recomienda traba jar seis cultivos por cada 25 g de unidad analítica seleccionando colonias procedentes de ambos medios de enriquecimiento. Pr e

u ba de ureasa Prueba de ureasa (convencional). Con un asa estéril, tomar crecimiento del cultivo presumiblemente positivo de cada tubo de medio TSI e inocular tubos de caldo urea. U tilizar un control de medio para comparar el vire púrpura de las reacciones positivas con el color del medio original. Incubar 24 ± 2 h a 35ºC. FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICOBIOLOGICAS http://slidepdf.com/reader/full/manual-completo-micro-alimentos

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LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS u ba de ureasa (rápida). Tomar dos asadas de crecimiento del cultivo presumiblemente positivo de cada tubo de medio TSI e inocular tubos de caldo urea (rápida). Incubar 2 h a 37 ± 0,5ºC en baño de agua. Descartar todos los cultivos que den ureasa positiva. Retener los cultivos que den la prueba negativa (sin cambio de color del medio). Pr e

Identificación serológica Ensayo de los antígenos somáticos de Salmonella spp (Antisuero polivalente O) Colocar con un asa dos gotas separadas de solución salina estéril sobre un portaob jetos o en d os secciones de una placa para aglutinación. Suspender en cada una de las gotas, una porción del cultivo desarrollado en TSI. Agregar a una de ellas una gota del an tisuero polivalente somático (O) y m ezclar con el canto del asa o empleando aplicadores de madera. Agitar inclinando la lámina hacia atrás y hacia adelante durante aproximadamente un min. Observar ba jo buena iluminación sobre un f ondo oscuro. Considerar cualquier grado de aglutinación como positiva. La prueba positiva resulta cuando se presenta aglutinación en la gota con el cultivo y el antisuero y no aglutinación en la gota que contiene el cultivo y la solución salina. Si se observa aglutinación en ambas gotas, la prueba no es definitiva y se debe continuar con las pruebas bioquímicas complementarias. Cuando la aglutinación es positiva con el suero polivalente O, puede determinarse el subgrupo e re

e o t s eros r os ere tes s gr os os gr os s e e ser os ás f mpl cueand ntes). an i u pa a l dif n ub up (l up B, C, D y E, u l n l m

Si la aglutinación con el antisuero O es negativa, u tilizar antisuero Vi y ef ectuar la prueba. Si hay aglutinación con Vi calentar el cultivo a ebullición y repetir la aglutinación con el antisuero polivalente O. Si no se cuenta con los sueros grupo específicos, solicitar la tipificación de la cepa al Laboratorio de Enterobacterias del Centro Nacional de Diagnóstico y Ref erencia de la Secretaría de Salud o al Laboratorio Nacional de Salud Pública. Si se requiere, practicar el ensayo de los antígenos flagelares de Salmonella (Antisuero polivalente H). Inocular el crecimiento del tubo de TSI en agar infusión de cerebro corazón e incubar de 4 a 6 h a 35ºC hasta que se observe crecimiento (para ensayo en el mismo día), o bien, en caldo soya tripticaseina e incubar por 24 ± 2 h a 35ºC (para ensayo al día siguiente). Adicionar 2,5 ml de solución salina f ormalizada a 5 ml del cultivo en caldo o al cultivo en agar cerebro corazón (BHI). FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICOBIOLOGICAS http://slidepdf.com/reader/full/manual-completo-micro-alimentos

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LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS Colocar 0,5 ml del antisuero polivalente flagelar (H) preparado en un tubo para serología (13 x 100 mm aproximadamente). Adicionar 0,5 ml del cultivo f ormalizado. Preparar un control d e solución salina mezclando 0,5 ml de solución salina f ormalizada con 0,5 ml del antígeno f ormalizado. Incubar las mezclas en baño de agua a 48-50ºC. Observar a intervalos de 15 min por espacio de es e una Unal. Dperubeebainpterospitret ivaarse cuand a agplurtuinación n laqume enin zclaguna de pdreuelabas pmero nos va una eba en la ezcla n ehl orcoa.ntro comoo nseeg oabtiserv muestre aglutinación. Cuando ambas mezclas se aglutinan, se considera la prueba inespecífica. e

u s oquí micas complementarias Cuando las pruebas serológicas o bioquímicas iniciales, dan resultados atípicos o no concluyentes, realizar las pruebas que se describen a continuación: Pr eba bi

Inocular los cultivos positivos provenientes de TSI y LIA en: m edio SIM, agar citrato de Simmons, caldo manitol y caldo RM-VP. Usar caldo malonato para confirmar la presencia de la especie S. arizonae. Interpretar los cambios en los medios inoculados conf orme lo siguiente: Agar citrato Simmons Inocular por estría el tubo. Incubar 96 ± 2 h a 35 ± 2ºC. u ba positiva: crecimiento acompañado de un cambio de color de verde a azul.

Pr e

u ba negativa: ausencia de crecimiento y sin cambio de color.

Pr e

Medio SIM Inocular por punción. Incubar 24 h a 35 ± 2ºC. Movilidad. : crecimiento a lo largo de la punción y en el seno del medio de cultivo.

P rueba

posi ti va

P rueba

negat iva

Pro

: crecimiento a lo largo de la punción exclusivamente.

ducción de ácido sulfhídrico.

P rueba

posi ti va

: desarrollo de un color negro a lo largo de la punción que puede extenderse a todo

e

l medio.

P rueba

negat iva

: ausencia de color negro.

ducción de indol. Adicionar al tubo con medio SIM que presente crecimiento, de 0,2 a 0,3 ml de reactivo de Kovac. Pro

P rueba

d a ll d un anillo de color rojo. FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICOBIOLOGICAS

posi ti va: es rro o e


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LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS P rueba

in cambio de color.

negat iva: s

Caldo RM-VP. Inocular un tubo con el medio. Incubar 48 ± 2 h a 35 ± 2ºC para la prueba de VP y 96 h para la prueba RM. u ba de Voges-Proskauer (VP):

Pr e

d a ll d c l

P rueba

posi ti va: es rro o e o or rojo

P rueba

negat iva: s

ladrillo.

in cambio de color.

Reincubar el resto del medio RM-VP 48 h más a 35 ± 2ºC. u ba de rojo de metilo (RM)

Pr e

Adicionar al medio de cultivo de 96 h de incubación de dos a tres gotas de solución de rojo de metilo. Interpretar los resultados inmediatamente. d a ll d c l

.

P rueba

posi ti va: es rro o e o or rojo

P rueba

negat iva

: desarrollo de color amarillo.

Caldo malonato. Inocular un tubo conteniendo el medio. Incubar 40 ± 2 h a 35 ± 2ºC. Prueba positiva: desarrollo de color azul. u ba negativa: sin cambio de color.

Pr e

Caldo manitol. Inocular un tubo conteniendo el medio. Incubar 24 ± 2 h a 35 ± 2ºC. u ba positiva: desarrollo de color amarillo.

Pr e Pr e

u ba negativa: sin cambio de color. Consultar los resultados obtenidos en el cuadro 2 para la identificación de los géneros de las bacterias investigadas. Nota: los sistemas bioquímicos comerciales validados pueden ser usados como alternativa para las pruebas bioquímicas convencionales. FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICOBIOLOGICAS http://slidepdf.com/reader/full/manual-completo-micro-alimentos

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LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS Interpretació n de reacciones bioquí micas y serológicas. CUADRO 1 Reacciones Serológicas

Reacciones bioquí micas Típica Típica Típica Reacciones atípicas

Antígeno O, Vi o H positivo Todas las reacciones negativas No probadas Antígeno O, Vi o H positivo

Reacciones atípicas

Todas las reacciones negativas

Interpretació n Cepas consideradas como

Salmonella spp

ud

P e e ser Salmonella spp

No debe ser considerada

Salmonella spp

Reacciones bioquí micas y serológicas de Salmonella u

P

Negativo

TSI (glucosa) LIA (Lisina descarboxilasa) H2S (LIA y TSI) Ureasa Caldo de lisina descarboxilasa

Amarillo Púrpura Negro Rojo púrpura

Rojo Amarillo No negro Sin cambio de color

Caldo dulcitol rojo de f enol

Amarillo o gas

Caldo KCN

Crecimiento

Caldo malonato Prueba de indol Antígeno flagelar (H) Antígeno somático (O)

Azul Superficie color violeta Aglutinación Aglutinación

Caldo lactosa rojo de f enol

Amarillo o gas

Pr eba

o sustrato

ositivo

ú pura

Amarillo

P r

Sin cambio de color ni gas Sin crecimiento

Reacción tí pica + + + - + +b -

Sin cambio de color -c Superficie color amarillo - Sin aglutinación + Sin aglutinación + Sin cambio de color ni -c gas FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICOBIOLOGICAS


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LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS Sin cambio de color ni gas Sin cambio de color Amarillo difuso

Caldo sacarosa rojo de f enol Amarillo o gas u ba Voges-Proskauer Prueba rojo de metilo

De rosa a rojo Rojo difuso

Citrato de simmons

Crecimiento color azul

Pr e

Sin crecimiento, sin cambio

- - + v

a +, 90% o más positivos en 1 o 2 días; -, 90% o más negativas en 1 o 2 días;. b La mayoría de los cultivos S. arizonae son negativos. c La mayoría de los cultivos S. arizonae son positivos. v, variable

o s n o de datos INFORMAR: presencia o ausencia de Salmonella en __________ g o ____________ ml de muestra. Pr ce amie t

Cuestionario. 1. ¿ porque es importante buscar Salmonella en alimentos? 2. Mencione por lo menos tres medios de enriquecimiento 3. ¿Cómo se realiza la dilución del alimento para buscar Salmonella? e e os e t vo e 4. i n placa emplea para buscar este microorganismo? oquímicas¿Cuáles son las iniciales que se emplean? 5. ¿Dequlasmprudiebasdbicul Anexos Según la norma NOM-114- SSAI-1994


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Metodo para la determinación de Listeria monocytogenes en alimentos o

0bjetiv

El aislamiento e identificación de Listeria monocyitogenes en alimentos. Definiciones ß-hemolísis , zona transparente alrededor de la colonia debida a la lisis total del eritrocito. List eria monocy to genes, bacilo corto, gram positivo , no esporulado, móvil, aerobio, capaz de crecer en condiciones de mictroaerofilia, catalasa positivo y oxidasa negativo. En agar sangre da origen a c olonias puntif ormes, circulares, li sas y translucidas de color azul grisáceo con una zona de ß-hemolísis. Introduccion genes se éto o r ete t r e List eria monoci to s e e s e to El d pa a de es c apelaciesp rese n ydlae dif merenciación dencia List deria spp., principalmente pbaor a lan f el raimelami ntación carbohidratos y la actividad hemolítica de los miembros de este genero.

Método Según la NOM-143-SSA1-1995. Método de prueba microbiológico para alimentos. Determinación de List eria monocy to genes.


y

y

y

y

y

y

y

y

y

Acido acético 5 N Acido clorhídrico 1 M Acido sulfanílico (cristales) Alfa-naf tilamina Alfa-naf tol 5% en etanol absoluto Etanol absoluto Granalla de zinc Hidróxido de sodio 1 M Lactamato de glicil-glicina (anhídrido de glicina) FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICOBIOLOGICAS


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y

y

y

y

y

y

y

Regulador de f osfatos glicerinado con pH 9,0 ± 0,2 Sangre de carnero desfibrinada Solución al 3% de peróxido de hidrógeno Solución salina fisiológica 0,85% estéril Sueros comerciales para tipificación de Listeria spp Sulfato de cadmio al 20% Zinc pulverizado

Reactivos para Tinción de Gram Alcohol-acetona

Cristal

violeta

Solución

de Yodo-yoduro

Solución

de Safranina

Reactivos para la determinación de nitritos Solución

Medios

de sulfato de cadmio al 20%

.

de cultivo

Caldo

soya tripticaseína con 0,6 % de extracto de levadura (CSTEL)

Caldo

de enriquecimiento (EB) pH 7,3

Medio

de cloruro de litio feniletanol -moxolactam (LMP)

y

.

Medio Oxford

.

.


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LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS .

Agar soya tripticaseína con 0,6% de extracto de levadura (ASTEL)

Agar sangre de carnero

Caldo nitratos

Medios Medio

para la prueba de movilidad

de SIM

Medio MTM Caldo

púrpura para fermentación de carbohidratos

.

Muestreo y muestra Se aceptan muestras colectadas en recipientes esterilizados y que hayan sido transportadas adecuadamente. La muestra deberá ser suficiente para su estudio (50 a 100 g ó ml) según las técnicas para el muestreo y análisis microbiologico de alimentos y bebidas Sistema analí tico Según la Norma Oficial Mexicana NOM-143-SSA1-1995. Método de prueba microbiologico para alimentos determinación de List eria monocy to genes. Uso del sistema analí tico Este método debe realizarlo un microbiólogo experimentado, en un ambiente controlado, aislado de áreas de producción de alimentos. Se debe tener especial cuidado en la disposición de aquellos materiales y equipo que hayan estado en contacto con alimentos sospechosos, antes de desecharlos o volver a utilizarlos. c dimiento de enriquecimiento Tomar una muestra representativa del alimento, tanto de la superficie externa como del interior colocar 25 ml o 25 g de la muestra en un recipiente conteniendo 225 ml de medio de enriquecimi ento (EB), homogeneizar e incubar por 48 h a 30°C. En el caso de muestras en donde se sospecha que tienen células de List eria spp. dañadas, se recomienda la incubación en un caldo de enriquecimiento que contenga piruvato de sodio al 0.1% (p/v) incubado a 30°C por 6 horas sin suplementos. Después de las 6 h de incubación los suplementos deben agregarse y continuar la incubación a 30°C hasta un total de 48 h. Pro e


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LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS Aislamiento Después de 24 y 48 h de incubación en el medio EB, resembrar en los medios LMP y OXA. Incubar las placas del medio LMP a 30°C por 24 a 48 h y las de medio OXA a 35°C por el mismo periodo. Observar el c recimiento en las placas del m edio LMP con luz blanca en un ángulo de 45° (iluminación de Henry), a simple vista o con la ayuda de una lupa. En este medio ge er e te re e o o s e List eria so

s o o s e o or o o e e o d o cnegro l blanc s azul iridis spu ceendtes En re lcm OXAtolanos on hal en. apa er cdi on un c ln niaalmd n apa c nnnlaegr ac s,l cnia . Alguna colonia caf é oscuro que se define mejor a los siete días de incubación. Seleccionar cinco o más colonias típicas del medio OXA o LMP y pasar a placas de medio ASTEL. Este paso es importante debido a que las colonias aparentemente aisladas en los medios OXA y LMP pueden estar contaminadas con flora competitiva parcialmente inhibida, invisible a simple vista. Debido a que puede estar presente más de una especie de List eria en una muestra, deben id entificarse como mínimo cinco colonias.

Identificación se e

e e t r e r oo st s se r r u ilizar Incuba cepas rdea re f erepncia pah.ra Ecada ba. Spueleedccienona mbrse a or 24 stos pculutivos erse aípica n md ebdion ASTEL. 35°C manctelnnia 4°C yyutiliza como inóculo para realizar las pruebas de identificación. Prueba de catalasa Emulsificar un cultivo puro, con una gota de solución de peróxido al 3%. La f ormación inmediata de burbu jas indica que la prueba es positiva. Las especies de List eria son catalasa positivo. Tinción de Gram Hacer una tinción de Gram d e cultivos de 16 a 24 h. Todas las especies de List eria son bacilos cortos Gram positivos. Pr e e ss u jba de hcuad móliricula i de 20 a 25 espacios en el f ondo de la placa de agar sangre de carnero al Dibu ar una 5% . Inocular por picadura un cuadro por cada cultivo. Incubar por 48h a 35°C. al inocular, observar la reacción hemolítica en las placas. L. monocy t ogenes y L. seeligeri producen una zona ligeramente clara alrededor del punto de picadu ra. Confirmar las reacciones dudosas con la prueba de CAMP. Prueba de reducción de nitratos Inocular los tubos conteniendo caldo nitratos, incubar a 35°C por 5 días. Para la lectura se debe agregar 0.2 ml del reactivo A y 0.2 ml del reactivo B, un color rojo indica una prueba p ositiva (presencia de nitritos). Si esta coloración no se observa, adicionar zinc en polvo. El desarrollo de rojo es és e or o r r e eg t v rese e tr tos) cProluore ba puilidad d euna dedmov n aghar a c nfi ma una p u ba n a i a (p ncia d ni a . Inocular el m edio SIM o MTM, incubar por 7 días a temperatura ambiente (20-25°C), observar diariamente. Las especies de List eria son móviles, dando un crecimiento típico en f orma de paraguas. Prueba de utilización de carbohidratos. Inocular tubos de caldo púrpura para f ermentación de carbohidratos al 0.5%: dextrosa, esculina, maltosa, ramnosa, manitol y xilosa. Incubar 7 días a 35°C. Una coloración amarilla FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICOBIOLOGICAS http://slidepdf.com/reader/full/manual-completo-micro-alimentos

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LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS indica una prueba positiva. Todas especies dan positivas las pruebas para dextrosa, esculina y maltosa. Consultar el cuadro 1 para reacciones con ramnosa, xilosa y manitol.

ro ere e s es e es nciación dPro laducción p ci de HemoCuad lisis 1 Dif Reducción ácidos de (beta) nitratos M R X L. monoci to genes + + L. ivanovii + - + L. innocua - bV L. welshimeri - bV + L. seeligeri + - - + L. grayic bV + bV -

Especies

CAMP S.a R.e + - + +1 -

u ba de Cristie-Atkins-Munch-Peterson (CAMP) Para la prueba de CAMP se emplean las siguientes cepas de colección de Pr e

St aphylococcus aureus

ATCC 49444

NCTC 7428

Rhodococcus equi ATCC 6339 NCTC 1621

ATCC 25923 CIP 5710

Las cepas empleadas en la prueba de CAMP pueden obtenerse de diversas colecciones nacionales e internacionales. En una placa de agar sangre de carnero sembrar una estría de la cepa de S. aureus y paralelamente una de R. equi, separadas lo suficiente para que entre éstas se puedan estriar perpendicularmente las cepas sospechosas de List eria, sin que lleguen a tocarse (aproximadamente 5 mm de separación). Después de 34 y 48 h de incubación a 35°C observar el organismos entre las hemolisis de S. aureus, R. equi y List eria que se manifiesta como una zona hemolítica más intensa.

o s

n o de datos

Pr ce amie t

Comparar los resultados obtenidos con el cuadro 1 y determinar el género y especie de las cepas aisladas. La correspondencia de resultados con el cuadro anterior indica la presencia del género List eria, El único miembro del género List eria de importancia es List eria monocy to genes.


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LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS Inf orme de la prueba Cuando los resultados sean positivos para L. monocy t ogenes inf ormar la presencia en 25g o 25 ml de muestra. Y si los resultados son negativos inf ormar ausencia en 25g o 25 ml de muestra Cuestionario. 2. 1. 3. 4. 5.

e te encrqu sca estelister D¿ es ibae alim breveenmtos n se ebul ge nero microorg ia anismo .? mencione algunas pruebas para la identificación del mismo. ¿ Como se reporta el resultado? De las especies de Listeria ¿ cual es la que se reporta?

Anexos La norma NOM-143- SSA1-1995.


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LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS 11 Proyecto final Análisis de un alimento Practica

Haciendo uso de este manual el alumno realizara un análisis del alimento que se le proporcione re ort o roorg s os e o s o e o gos ev r s t

ero os o or es tot es e p nandlla,..mic m a h, Smaphyl fílicooscoaccu sbi alm h n y laniadu etc., c lif m al n placa y en tubo, Para este propósito, prepara los medios necesarios y ef ectuara las diluciones correspondientes


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Manual Completo Micro Alimentos

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