TUGAS INDUSTRI FERMENTASI
“Production of L-glutamic Acid by Immobilized Cell Reactor of the Bacterium”
Disusun Oleh : Ade Berlian Saputra 0807113362 Kelas A
JURUSAN TEKNIK KIMIA FAKULTAS TEKNIK UNIVERSITAS RIAU PEKANBARU 2010
I. PENDAH NDAHU ULUAN LUAN A. Lata Latarr Be Bela laka kang ng
Asam glutamat termasuk asam amino yang bermuatan (polar) bersama-sama dengan dengan asam asam aspart aspartat at.. Ini terli terliha hatt dari dari titi titik k isoel isoelekt ektri rikny knyaa yang yang rendah rendah,, yang yang menandakan ia sangat mudah menangkap elektron (bersifat asam menurut Lewis). Asam glutamat sebagian dapat dihasilkan dengan cara menggunakan menggunakan mikroba yaitu dengan menggunakan bakteri Corynebacterium Corynebacterium glutamicum glutamicum . Asam glutamat yang dihasilkan oleh bakteri dapat berjumlah sebesar 60 gram/liter, gram/liter, untuk bakterinya bakterinya sebesar 300 miligram/liter. Lama fermentasi 40 jam pada suhu 300C. Jika pembuatan asam glutamat menggunakan bahan kimia akan menghasilkan campuran DL- asam glutamat. Pembuatan asam glutamat dari gula dapat dilakukan dengan cara Embden Meye Meyerho rhorfrf-Pa Parna rnass dan juga juga denga dengan n siklu sikluss asam asam trika trikarbo rboksi ksilat lat,, dengan dengan bantua bantuan n oksigen sebagai terminal akseptor electron. Penambahan penisilin untuk pertumbuhan sel-sel Corynebacterium akan memi memicu cu ekskre ekskresi si tingk tingkat at tingg tinggii asam asam Corynebacterium glutamicum glutamicum akan glutamat. Berbagai teknik yang telah diketahui dalam pembuatan asam L-glutamat [3-5], tapi tapi memi memilik likii berma bermacam cam
varia variasi si efisi efisiens ensii dalam dalam konvers konversii gula gula menj menjadi adi asam
glutamat. Dalam semua system dan di antara parameter lain, ekskresi asam glutamat oleh sel-sel bakteri memiliki tingkat factor peleburan. Dalam penelitian ini, menggunakan sistem fermentasi yang berbeda dengan memanfaatkan sel bakteri C. glutamicum yang diuji untuk membuat asam L glutamat. Dilakukan pengoptimalan parameter fermentasi dengan proses kontinu dan effisiensi konversi gula menjadi asam glutamat.
B. Rumusan Masalah
Dalam penelitian ini akann dilakukan pengujian dalam pembuatan asam glutamate dalam beberapa metoda yaitu dengan fermentasi batch dan kontinu. Disini akan dilihat perbedaan jumlah asam glutamate yang dihasilkan dari menggunakan fermentasi secara batch maupun secara kontinu.
C. Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan untuk : 1. Mengetahui proses yang paling bagus dalam pembuatan asam glutamate. 2. Menguji bagaimana tingkat produksi asam glutamate pada proses batch maupun secara kontinu.
D. Manfaat Penelitian
Penelitian ini diharapkan dapat : 1.
Menambah informasi tentang bagaimana cara pembuatan asam glutamat.
2.
Memberikan inforamasi proses yang optimal dan hasil yang maksimal dalam pembuatan asam glutamate.
II. KONSEP TEORI A. Strain Mikrobia Sebagian besar asam £-Glutamat diproduksi oleh bakteri gram positif yang tidak membentuk spora, non-motile, dan membutuhkan biotin untuk tumbuh. Tabel. Strain Mikrobia yang Menghasilkan Asam £-Glutamat Genus Corynebacterium Brevibacterium
Spesies C. glutamicum, C. lilium, C. callunae, C. herculis B. divaricatum, B. aminogenes, B. flavum,
B. lactofermentum, B. saccharolyticum, B. roseum, B. immariophilum, B. alunicum, Microbacterium Arthrobacter
B. ammoniagenes, B. thiogenitalis M. salicinovolum, M. ammoniaphilum, M. Flavum var. glutamicum A. globiformis, A. aminofaciens
B. Kondisi Kultur
1. Sumber Karbon Bakteri penghasil asam £-Glutamat dapat menggunakan berbagai macam sumber karbon, seperti glukosa, fruktosa, sukrosa, maltosa, ribosa, atau silosa, sebagai substrat untuk pertumbuhan sel dan biosintesis asam glutamat. Konsentrasi biotin pada medium harus benar benar dikontrol dalam level suboptimal agar memaksimalkan pertumbuhan sehingga diperoleh asam glutamat yang tinggi. Oleh karena itu, bahan baku kaya biotin, seperti molase dari gula bit dan gula tebu, tidak dapat digunakan sebelum ditemukannya pengaruh mediasi biotin pada penisilin dan asam lemak jenuh C16 -C18. Asam oleic hanya membutuhkan akumulasi mutan asam £-Glutamat pada medium yang kaya biotin ketika konsentrasi asam oleic terkontrol pada level suboptimal agar pertumbuhan maksimal. 2. Sumber Nitrogen dan Kontrol pH Medium yang baik untuk fermentasi asam £-Glutamat mengandung nitrogen dengan kadar 9, 5 %. Contoh sumber nitrogen yang dapat ditambahkan ke dalam medium adalah amonium klorida atau amonium sulfat. Bakteri yang menghasilkan asam glutamat juga memiliki aktivitas urease yang kuat sehingga urea juga dapat digunakan sebagai sumber
nitrogen. Ion amonium berpengaruh pada pertumbuhan sel dan pembentukan produk sehingga konsentrasinya dalam medium harus dikontrol pada konsentrasi rendah. Tingkat keasaman (pH) medium sangat mudah menjadi asam karena ion amonium terasimilasi dan dihasilkan asam glutamat. Amonia dalam bentuk gas lebih baik daripada basa cair dalam menjaga pH pada level 7-8, sebagai pH optimum untuk produksi asam £Glutamate. Amonia dalam bentuk gas berperan sebagai agen pengontrol pH dan sebagai sumber nitrogen serta dapat mengatasi bermacam-macam masalah teknis. Penambahan otomatis gas amonia dapat mengontrol pH dengan tepat. Selain itu, juga mencegah efek merugikan dari amonia dan pengenceran yang tidak diinginkan pada cairan fermentasi. 3. Faktor Tumbuh Bakteri penghasil asam £-Glutamat membutuhkan biotin untuk pertumbuhan dan konsentrasinya harus dikontrol agar memperoleh produk yang maksimal. Dampak biotin pada fermentasi asam £-Glutamat sangat erat kaitannya dengan permeabilitas asam £-Glutamat terhadap membran sel. 4. Ketersediaan Oksigen
Biosintesis dari asam glutamat merupakan proses aerob yang membutuhkan oksigen selama proses fermentasinya. Untuk mengoptimalkan produksi, kadar oksigen terlarut harus dijaga pada kondisi optimal. Sel yang melakukan respirasi akan mengkonsumsi oksigen dalam media hanya dalam beberapa detik sehingga oksigen harus disuplai secara terusmenerus untuk menjaga konsentrasi oksigen terlarut. C. Akumulasi Produk Lain yang Dipengaruhi oleh Perubahan Kondisi Kultur
1. Asam Laktat dan Asam Suksinat Brevibacterium flavum yang memproduksi asam glutamat mengakumulasi asam laktat
dan asam suksinat ketika dikulturasi dengan jumlah oksigen yang kurang. Saat jumlah suplai oksigen kurang dari kondisi kejenuhan komplet ke berbagai derajat kecukupan kebutuhan oksigen, produk utama berubah dari asam glutamat menjadi asam suksinat kemudian menjadi asam laktat. Lebih dari 30 g l-1 asam suksinat atau 45 g l-1 asam laktat dapat mengakumulasi pada 72 h kondisi optimum. 2. Asam α-Ketoglutarat
Suplai oksigen yang cukup dengan ketidakadaan ion amonium pada fermentasi asam £-Glutamat akan menghasilkan akumulasi asam α-Ketoglutarat. Ketika pengontrol pH diubah dari NH4OH menjadi NaOH pada pada akhir fase pertumbuhan, 18 g l-1 asam α-Ketoglutarat terakumulasi pada hasil substrat 0,20 g g l-1 pada pembudidayaan 72 h.
3. Asam £-Glutamin
Asam £-Glutamat diubah menjadi £-glutamin ketika terdapat kelebihan amonium klorida pada kultur pada pH rendah dengan adanya ion seng. Pada medium yang mengandung 40 g l-1 amonium klorida dan 10 mg l-1 sulfat seng, sel terakumulasi lebih dari 40 l-1 £Glutamin pada 0,30 g l-1 sumber karbon. Konsentrasi tinggi ion amonium pada kondisi pH rendah menghasilkan produksi N -asetil-£-glutamin. Ion seng efektif dalam pengurangan ekskresi N -asetil-£-glutamin dalam akumulasi £-glutamin. D. Fisiologi Mikrobia dari Fermentasi Asam £-Glutamat 1.
Permeabilitas Membran Sel dan Asam Glutamat dalam Hubungannya dengan Konsentasi Biotin Biotin merupakan komponen kunci dalam fermentasi asam £-Glutamat. Akumulasi
produk asam £-Glutamat. dapat mencapai maksimal ketika konsentrasi biotin dalam keadaan suboptimal. Kelebihan biotin dapat menunjang pertumbuhan sel, namun menurunkan akumulasi asam glutamat. Kandungan biotin untuk mengakumulasi asam glutamat adalah 0,5 pg pergram sel kering. Akan tetapi, adanya kelebihan biotin pada penambahan penisillin diketahui dapat menghentikan formasi cross-links peptidoglikan bakteri pada fase pertumbuhan sehingga memungkinkan sel untuk mengakumulasi asam £-Glutamat dalam jumlah yang besar. Antibiotik lain seperti cephalosporin C , yang menghentikan sintesis dinding sel, juga dapat menggantikan fungsi penisilin. Penambahan asam lemak jenuh C16-C18 maupun
esternya
dengan
polialkohol
hidrofilik
selama
fase
pertumbuhan
juga
memungkinkan sel untuk mengakumulasi asam £-Glutamat dalam medium yang kaya biotin. Penggunaan antibiotik dan asam lemak jenuh C16-C18 ini akan mempermudah suatu industri dengan bahan dasar kaya biotin, seperti gula tebu dan gula bit. Akumulasi asam £-Glutamat tidak tergantung pada proses biosintesis tapi pada proses ekskresi. Ekskresi asam £-Glutamat sangat berkaitan dengan permeabilitas dinding sel yang terdiri atas kumpulan dari komponen kimia dan fisika dari membran sel. Produksi sel asam £Glutamat dengan jumlah biotin terbatas atau berlebih dan diolah dengan penisilin ataupun Tween-60 terekskresi intraseluler asam £-Glutamat ketika dicuci dengan larutan buffer fosfat.
Sel tidak dapat tumbuh tanpa adanya pengolahan dengan penisilin ataupun Tween-60 meskipun ada biotin berlebih. Asam amino lain dikeluarkan dari sel bahkan ketika pertumbuhan berlangsung dengan biotin terbatas. Walaupun dengan jumlah biotin terbatas
selama ekskresi sel asam £-Glutamat, pemenuhan kebutuhan asam oleik atau penambahan asam lemak jenuh C16-C18 mengandung sedikit fosfolipid dalam membran sel. Di lain sisi, sel dengan kemampuan rendah dalam mengakumulasi asam £- Glutamat pada medium dengan kandungan biotin tinggi akan mengandung lebih banyak konsentrasi membran fosfolipid. Biotin merupakan kofaktor dari asetil KoA karboksilase, enzim pertama pada biosintesis asam oleik, dan asam lemak jenuh C16-C18 menghambat biosintesis pada asam oleik dengan menahan asam karboksilase asetil KoA. Jumlah biotin ataupun asam lemak jenuh C16-C18 yang terbatas dapat menyebabkan biosistesis asam oleik berjalan tidak sempurna dan menghasilkan penurunan konsentrasi fosfolipid. Akibatnya, fosfolipid seperti kardiolipin dan phosphatidynositol dimannoside dibutuhkan dalam pengaturan permeabilitas sel asam £-Glutamat. Pengaruh penisilin pada permeabilitas asam £-Glutamat tidak dapat dijelaskan dengan kandungan fosfolipid pada membran sel. Permeabilitas pada sel dengan penisilin dipengaruhi oleh tekanan osmosis. Selama terjadi penurunan tekanan osmosis, penisilin meningkatkan ekskresi asam £-Glutamat dalam medium kaya biotin dan studi mikroskopik menunjukkan bahwa penisilin meningkatkan masa elongasi dan pembesaran sel. Sementara itu, asam lemak jenuh C16-C18 meningkatkan ekskresi asam £-Glutamat dalam medium kaya biotin tanpa tergantung pada tekanan osmosis. Berdasar hal tersebut, penisilin mempunyai pengaruh sekunder terhadap fungsi membran. Utamanya, penisilin menghambat sintesis dinding sel sehingga membran sel lebih mudah rusak. 2. Mekanisme Biosintesis Asam £-Glutamat
Produksi asam £-Glutamat membutuhkan dua enzim penting, yaitu Phosphoenol Carboxylase
dan
α-Ketoglutarate
Dehydrogenase . Phosphoenol
Carboxylase
akan
mengkatalis karboksilasi dari fosfofenolpiruvat ke dalam bentuk oxaloasetat. Sedangkan α Ketoglutarate Dehydrogenase , mengubah α- Ketoglutarat menjadi suksinil KoA. Efisiensi
dari fiksasi karbondioksida oksaloasetat bergantung pada hasil dari aktivitas Phosphoenol Carboxylase . Asam aspartat menunjukan adanya hambatan dan tantangan enzim.
Penghambatan ini telah ditingkatkan oleh asam α-Ketoglutarat. Oleh karena itu, endogenus asam aspartat dan asam α-Ketoglutarat harus diminimalkan apabila produk asam £-Glutamat ingin dimaksimalkan. α-Ketoglutarate Dehydrogenase ini penting untuk oksidasi glukosa menjadi CO2. Enzim ini dicegah oleh cisakonitat, suksinil KoA, NADH, NADPH, piruvat dan oksalat yang kemudian akan diubah menjadi asetil KoA. Kandungan α- Ketoglutarate Dehydrogenase dari bakteri penghasil asam glutamat sangat menguntungkan untuk sintesis
asam glutamat dari asam α ketoglutarat, mencegah oksidasi asam α-Ketoglutarat menjadi CO2 dan H2O melalui suksinil KoA. Nilai K m α-Ketoglutarate Dehydrogenase untuk asam αKetoglutarata adalah sekitar 1 X 17 glutamat dehydrogenase. Enzim ini kemudian mengkatalis
formasi
asam glutamat menjadi
lebih
luas daripada α-Ketoglutarate
Dehydrogenase. Akibatnya, konsentrasi endogenus α-Ketoglutarat yang mengatur daur
metabolit α-Ketoglutarat mengikuti biosinteseis asam glutamat ataupun oksidasi. Hal ini ditunjukan dengan cukup tingginya produksi asam glutamat. 3. Perubahan Genetik Mikrobia Penghasil Asam £-Glutamat
Kelebihan produksi dari asam glutamat ditunjukan dengan adanya strain asing dalam dinding permeabilitas yang telah dimodifikasi. Akan tetapi, produktivitasnya ditingkatkan oleh adanya perkembangan mikrobia. Sebagai salah satu contoh, dinding permeabilitas sel asam £-Glutamat dimodifikasi dengan mutasi berupa mutan temperatur sensitif yang menunjukan pertumbuhan normal pada 30 0C tetapi tidak tumbuh pada 37°C, asam £Glutamat diproduksi dalam jumlah besar bahkan medium mengandung biotin secara berlebihan pada kultur bertemperatur 30°C sampai 40°C selama pembudidayaan. Sintesis membran dari mutan ini dibentuk agar tidak mampu betahan pada suhu 37°C- 40°C. Oleh karena itu, terjadi pengurangan asam £-Glutamat. Tidak ada kontrol kimia dari penicillin ataupun asam lemak jenuh C16-C18 yang dibutuhkan untuk produksi asam £-Glutamat dalam medium yang kaya akan biotin. Usaha yang lain untuk meningkatkan produksi, yaitu meningkatkan fiksasi karbondioksida. Asam £-Glutamat disintesis melalui siklus glioksilat sebagai sistem pembaharuan oksaloasetat tanpa fiksasi karbondoksida. Peningkatan fiksasi ini memungkinkan terjadinya peningkatan produksi. Sebagian dari monofluoroasetat yang resistan terhadap mutan diturunkan dari Brevibacterium lactofermentum yang menunjukan peningkatan produktivitas dari asam
glutamat dengan peningkatan aktivitas Phosphoenol Carboxylase. Penurunan aktivitasi Isositrat lyase juga turut meningkatkan jumlah asam £- Glutamat. Fiksasi karbondioksida
telah ditingkatkan oleh perubahan mutan tersebut. Piruvat hydrogen mutan yang tidak resisten diturunkan dari Brevibacterium lactofermentum yang menggunakan asam asetis dan glukosa secara kontinu. Asam asetis telah diasimilasi sebagai subtrat asetil KoA dan glukosa sebagai oksaloasetat. Aplikasi dalam teknik DNA rekombinan untuk meningkatkan bakteri penghasil asam glutamat merupakan penawaran cara baru. Berbagai jenis plasmid Brevibacterium lactofermentum dan plasmid Corynebacterium yang menghubungkan spectinomycin resisten
yang ditemukan dicocokan sebagai sistem vektor yang memungkinkan. Kontraksi dari plasmid ini mengandung kumpulan gen dengan asam glutamat yang ditunjukan Brevibacterium lactofermentum.
Gambar 1. Jalur pembentukan asam glutamat melalui siklus glioksilat sebagai sistem pembentuk oksaloasetat tanpa pembentukan karbondioksida
Gambar 2. Jalur pembentukan asam glutamat melalui fosfoenolpiruvat dengan pengikatan karbondioksida
4. Fermentasi Asam Glutamat Skala Besar Sterilisasi kontinu lebih berhasil daripada sterilisasi batchwise untuk mengeliminasi mikrobia asing yang tidak diinginkan pada media volum besar. Beberapa manfaatnya adalah (1) hemat energi; (2) kendali mutu yang lebih baik; (3) meningkatnya produktivitas. Filter udara yang dilengkapi dengan wol kaca biasanya bagus untuk sterilisasi udara. Pada fermentasi asam £-Glutamat, dibutuhkan input daya yang lebih sedikit untuk agitasi daripada fermentasi antibiotik, sebagaimana cairan kultur bakteri memiliki viskositas (kekentalan) lebih rendah daripada cairan kultur mycelial . Meskipun demikian, perlu diperhatikan bahwa kebutuhan oksigen dan perubahan panas secara perlahan perunit waktu dan volum pada kultur adalah lebih tinggi, karena asimilasi gula dan respirasi sel yang juga pada laju yang lebih tinggi. Untuk keberhasilan operasi fermentasi, tekanan pelarutan oksigen, suhu, dan pH harus dioptimalkan selama fermentasi. Kelarutan oksigen dipelihara di atas 0,01 atm dengan mengubah laju aliran udara, suhu dikontrol lewat alat pendingin, dan kultur pH dipelihara pada level konstan dengan gas amonia. Pengendalian tersebut dapat dilakukan dengan sistem computer-aided . Selain itu, serangkaian kontrol pada beberapa operasi, contohnya
mensterilisasikan sistem, penggunaan medium pada fermenter, pemberian larutan gula terkonsentrasi ke fermenter, dan kemudian pencucian fermenter dengan air, dapat dengan mudah diprogram sehingga dapat berlangsung secara serempak.( http://www.scribd.com) E. Proses Fermentasi
Fermentasi merupakan kegiatan mikrobia pada bahan pangan sehingga dihasilkan produk yang dikehendaki. Mikrobia yang umumnya terlibat dalam fermentasi adalah bakteri, khamir dan kapang. Contoh bakteri yang digunakan dalam fermentasi adalah Acetobacter xylinum pada pembuatan nata decoco, Acetobacter aceti pada pembuatan asam asetat. Contoh
khamir dalam fermentasi adalah Saccharomyces cerevisiae dalam pembuatan alkohol sedang contoh kapang adalah Rhizopus sp pada pembuatan tempe, Monascus purpureus pada pembuatan angkak dan sebagainya.Fermentasi dapat dilakukan menggunakan kultur murni ataupun alami serta dengan kultur tunggal ataupun kultur campuran. Fermentasi menggunakan kultur alami umumnya dilakukan pada proses fermentasi tradisional yang memanfaatkan mikroorganisme yang ada di lingkungan. Salah satu contoh produk pangan yang dihasilkan dengan fermentasi alami adalah gatot dan growol yang dibuat dari singkong.
Tape merupakan produk fermentasi tradisional yang diinokulasi dengan kultur campuran dengan jumlah dan jenis yang tidak diketahui sehingga hasilnya sering tidak stabil. Ragi tape yang bagus harus dikembangkan dari kultur murni.Kultur murni adalah mikroorganisme yang akan digunakan dalam fermentasi dengan sifat-dan karaktersitik yang diketahui dengan pasti sehingga produk yang dihasilkan memiliki stabilitas kualitas yang jelas. Dalam proses fermentasi kultur murni dapat digunakan secara tunggal ataupun secara campuran. Contoh penggunaan kultur murni tunggal adalah Lactobacillus casei pada fermentasi susu sedang contoh campuran kultur murni adalah pada fermentasi kecap, yang menggunakan Aspergillus oryzae pada saat fermentasi kapang dan saat fermentasi garam digunakan bakteri Pediococcus sp dan khamir Saccharomyces rouxii.
Industri fermentasi dalam pelaksanaan proses dipengaruhi oleh beberapa faktor: 1. Mikrobia 2. Bahan dasar 3. Sifat-sifat proses 4. Pilot-plant 1. Mikrobia
Mikrobia dalam industri fermentasi merupakan faktor utama, sehingga harus memenuhi syarat-syarat tertentu yaitu: 1. Murni 2. Unggul 3. Stabil 4. Bukan patogen - Murni Dalam proses-proses tertentu harus menggunakan biakan murni (dari satu strain tertentu) yang telah diketahui sifat-sifatnya. Untuk menjaga agar biakan tetap murni dalam proses maka kondisi lingkungan harus dijaga tetap steril. Penggunaan kultur tunggal mempunyai resiko yang tinggi karena kondisi harus optimum. Untuk mengurangi kegagalan dapat digunakan biakan campuran. Keuntungan penggunaan biakan campuran adalah mengurangi resiko apabila mikrobia yang lain tidak aktif melakukan fermentasi. Dalam bidang pangan penggunaan biakan campuran dapat menghasilkan aroma yang spesifik.
Pengembangan inokulum yang terdiri campuran biakan murni belum berkembang di Indonesia. Sebagai contoh, inokulum tempe yang dibuat LIPI masih merupakan inokulum kultur tunggal sehingga produsen tempe sering mencampur inokulum murni dengan inokulum tradisional dengan maksud memperoleh hasil yang baik. Inokulum tape (ragi tape) juga belum berkembang. Di Malaysia, telah dikembangkan campuran kultur murni untuk membuat tape rendah alkohol. Ini merupakan upaya untuk memenuhi tuntutan masyarakat yang sebagian besar muslim. Isolatnya sendiri diperoleh dari ragi yang telah ada di pasaran. Penggunaan
inokulum
campuran
harus
memperhatikan
kebutuhan
nutrisi
mikroorganismenya. Kultur campuran yang baik adalah model suksesi sehingga antar organisme tidak bersaing namun saling mendukung untuk pembentukan produk. - Unggul Pada kondisi fermentasi yang diberikan, mikrobia harus mampu menghasilkan perubahan-perubahan yang dikehendaki secara cepat dan hasil yang besar. Sifat unggul yang ada harus dapat dipertahankan. Hal ini berkaitan dengan kondisi proses yang diharapkan. Proses rekayasa genetik dapat dilakukan untuk memperbaiki sifat jasad dengan maksud mempertinggi produk yang diharapkan dan mengurangi produk-produk ikutan. - Stabil Pada kondisi yang diberikan, mikrobia harus mempunyai sifat-sifat yang tetap, tidak mengalami perubahan karena mutasi atau lingkungan. - Bukan Patogen Mikrobia yang digunakan adalah bukan patogen bagi manusia maupun hewan, kecuali untuk produksi bahan kimia tertentu. Jika digunakan mikrobia patogen harus dijaga, agar tidak menimbulkan akibat samping pada lingkungan. 2. Bahan Baku
Bahan dasar untuk kepentingan fermentasi dapat berasal dari hasil-hasil pertanian, perkebunan maupun limbah industri. Bahan dasar yang umum digunakan di negara berkembang adalah: 1. Molase, karena banyak tebu 2. Jerami 3. Dedak 4. Kulit kopi, kulit coklat, sabut kelapa
5. Ampas tebu, ampas biji-bijian yang telah diambil minyaknya 6. Kotoran binatang 7. Air limbah 8. Sampah sebagai komponen pupuk 9. Sisa pabrik kertas, pabrik susu dan sebagainya. Bahan dasar harus mempunyai syarat-syarat: 1. Mudah didapat 2. Jumlah besar 3. Murah harganya 4. Bila diperlukan ada penggantinya. 3. Sifat-sifat Proses
Sifat-sifat proses harus disesuaikan dengan kondisi yang dibutuhkan oleh mikrobia dalam melakukan metabolisme. Kondisi yang dibutuhkan dapat aerob ataupun anaerob, sedang bentuk medium dapat cair ataupun padat. Dalam proses produksi dapat digunakan proses tertutup ataupun kontinyu. Perbedaan kondisi yang dibutuhkan oleh mikrobia dalam proses industri juga akan menentukan : 1. Tipe fermentor 2. Optimasi lingkungan: pH, aerasi, suhu. kadar nutrien 3. Macam alat bantu: sumber air, listrik, kompresor dan sebagainya 4. Cara pengunduhan hasil, sterilisasi. 4. Pilot-plant
Pilot plant adalah semacam laboratorium tetapi di atas skala laboratorium dan di bawah skala perusahaan. Jika dalam pilot plant sudah menunjukkan hasil baik, dapat dibawa ke skala industri, karena dalam skala industri sudah terkait modal sehingga diperhitungkan kegagalan. Dengan pilot plant kegagalan dikurangi 75% daripada langsung dari laboratorium. ( http://ptp2007.wordpress.com) F. Fermentor
Fermentor yang digunakan dalam produksi etanol tergantung pada bahan baku yang digunakan. untuk penggunaan dengan bahan baku gula dapat langsung dengan fermentor anaerob. sedang jika akan digunakan dengan bahan baku dari pati atau karbohidrat lain aharus ada proses sakarifikasi sehingga minimal ada dua fermentor. Fermentor adalah tempat
berlangsungnya fermentasi dapat berupa alat dengan kerja anaerob ataupun anaerob. Prinsip kerja dari fermentor akan kami muat dalam fermentor. silahkan dicari di tag fermentor. Fermentor adalah unit alat yang digunakan untuk tempat berlangsungnya suatu proses biokimia dari bahan mentah menjadi zat atau bahan tertentu yang dikehendaki, dikatalisis oleh suatu enzim atau oleh jasa mikroorganisme secara langsung. Prinsip umum pemilihan fermentor
Beberapa faktor penting yang harus diperhatikan dalam memilih konstruksi fermentor: - Bejana fermentor harus dapat dioperasikan secara aseptic dalam jangka waktu operasi yang panjang. - Tingkat aerasi dan pengadukan harus dilakukan memadai sesuai kebutuhan - Metabolisme tanpa merusak pertumbuhan mikroorganisme. - Konsumsi tenaga atau daya listrik sedapatnya sekecil mungkin. - Fermentor harus dilengkapi system pengontrol suhu, pH dan pengambilan sample. - Evaporator yang mengakibatkan hilangnya sebagian cairan diusahakan tidak berlebihan - Bejana fermentor harus dirancang sedemikian rupa sehingga operasi fermentasi, pemanenan, pembersihan dan pemeliharaan alat memerlukan tenaga kerja sekecil mungkin. - Bejana fermentor harus dirancang sedemikian rupa sehingga permukaan bagian dalam licin. - Agar penerapan penggandaan skala lebih mudah, bejana fermentor skala lab, pilot plant dan skala industri mempunyai kesaamaan bentuk geometris. - Bahan yang digunakan untuk membuat fermentor hendaknya yang murah, tatapi memeerkan hasil yang memuaskan. - Harus diusahakan agar tersedia jasa pelayanan peralatan dan suku cadang untuk kebutuhan industri. Kontrol Fermentasi dan Hubungannya Dengan Pertumbuhan Mikrobial
Sensor pada fermentor dapat dikategorikan dalam 2 kelompok : a. Sensor-sensor lingkungan fisik – Suhu. – Tekanan Kecepatan impeller
– Busa – Laju alir gas dapat diukur dengan menggunakan berbagai peralatan, misal flowmeter, rotameter, dll – Laju umpan cairan, dapat diukur dengan menggunakan flowmeter elektromagnetik. – Viskositas, dapat digunakan sebagai indicator pertumbuhan sel atau morfologi sel. b. Sensor-sensor lingkungan kimia – pH, pengukuran menggunakan elektroda pH. Pada fermentor dilakukan penambahan – Redoks, pengontrolan dilakukan dengan sparging gas dengan N2, 02 atau dengan sistin, asam askorbat atu Na-Tioglikolat – Oksigen terlarut, pengukuran dilakukan dengan amporometrik.( http://apwardhanu .wordpress.com) E. Aspek Komersial pada Fermentasi Asam £-Glutamat
Produksi asam £-Glutamat tahunan di dunia mencapai 370.000 ton. Asam £-Glutamat diproduksi di Jepang, Korea, Taiwan, Thailand, Malaysia, Indonesia, Filipina, Prancis, Italia, Spanyol, Brazil, Peru, dan Amerika Serikat. Di antara negara-negara tersebut, Jepang merupakan produsen terbesar dengan Ajinomoto Co., Asahi-Kasei Co., Kyowa Hakko Co., dan Takeda-Yakuhi Co. yang menghasilkan 107.000 ton dari total produksi dunia. Molase tebu atau starch tapioka merupakan bahan baku asam £- Glutamat. Biayanya adalah sekitar $95 perton untuk molase tebu (mengandung 60% gula) dan sekitar $360 perton untuk starch tapioka. Harga internasinal asam £-Glutamat adalah sekitar $2 perkilogram.( http://www.scribd.com)
III. METODA PENELITIAN 3.1 Mikroorganisme dan Kultur Media
Bakteri C. glutamicum ATCC 14022 diperoleh dari American Type Culture Collection, Rockville Meryland USa dan digunakan dalam penelitian ini. Bakteri ini dipertahankan dalam media (A) yang memiliki komposisi : glukosa 40 g; K 2HPO4 1 g; MgSO4.7H2O 0,5 g; ekstrak ragi 1 g; urea 8g dan air 1 L. Media produksi (media B) mengandung bahan yang terklarifiksi gula tebu molase 100 atau 175 g; K 2HPO4 1,2 g; MgSO4.7H2O 6 , 2 g ; K2 SO4 1,2 g; FeSO4.7H2O 6 ppm; MnSO4.H2O 6 ppm; air 1 L. Gula tebu digantikan dengan 40 g/L glukosa jika media yang sama digunakan untuk penyebaran secara aktif pertumbuhan sel untuk keperluan imobilisasi sel. Gula tebu molase jelas sesuai dengan metode yang diterangkan Amin. pH kaldu fermentasi dipertahankan 7,8 dengan penambahan otomatis ammonia selama fermentasi berlangsung. Suhu fermentasi dijaga 300C dengan sirkulasi air hangat disesuaikan melalui dinding ganda reaktor. Asam oleat digunakan sebagai agen antifoam. Aerasi untuk kaldu fermentasi dikendalikan 102 mMO2/l.h. 3.2 Prodesur Fermentasi
Baik batch maupun fed batch proses jalannya fermentasi ditentukan dalam double walled glass column dengan total volume media fermentasi yang ditambahkan pada awal sama dengan volume media fermentasi yang ditambahkan pada waktu yang telah ditentukan pada jalannya fermentasi fed batch. Jumlah total gula sebagai umpan sama tanpa memperhatikan teknik fermentasi yang digunakan. Dalam fermentasi kontinu dilakukan dengan tingkat pengenceran yang berbeda yang diuji dalam ada dan tidak adanya penisilin. Asam oleat digunakn sebagai agen antifoam yang kapan saja diperlukan. pH kaldu fermentasi dikontrol dengan penambahan otomatis larutan ammonia (16%). Sewaktu-waktu sampel dari kaldu fermentasi dan campuran agar diambil dan dianalisis asam glutamat, gula sisa, biomassa dan produk. 3.3 Penentuan Analitis
Asam glutamat, gula sisa ditentukan dengan cara yang telah dijelaskan sebelumnya. Untuk mengukur konsentrasi ketoglutarate, aspartate, succinic acid, asam laktat dan asam glukonat, digunakan metode yang digunakan sebelumnya. Konsentrasi sel dalam campuran agar sebagai berat sel kering digunakan metode yang digunakan Amin dan Verachter.
IV. HASIL DAN PEMBAHASAN 4. 1 Tahap Permulaan Bakteri dalam Immobilized Cell Reaktor C. glutamicum
Dalam urutannya untuk menghasilkan biomassa sel yang cukup bakteri terjebak masuk ke dalam campuran agar lalu dimasukkan ke dalam reactor, media produksi berjumlah 40 g/L glukosa, dengan memanfaatkan gula tebu molase, yang dilengkapi dengan 0,4 g/L urea dan diumpankan terus-menerus ke dalam reactor. Secara relatif laju umpan rendah (D= 0,02 h-1) . Sampel diambil pada jarak jarak waktu yang teratur dan dianalisis untuk pertumbuhan sel, asam glutamat, dan produk lainnya. Hasil dapat dilihat pada gambar 1.
Gambar 1 : Kurva pertumbuha sel bakteri dengan campuran agar selama perioda awal immobilized cell reactor oleh bakteri C. glutamicum * jumlah sel yang hidup dalam aliran reactor Hal ini jelas bahwa sel bergerak tumbuh pesat dan secara aktif berlipat ganda dalam campuran agar selama 48 jam pertama. Konsentrasi sel bergerak meningkat menjadi 2,45 g/L setelah 20 jam dari pada saat awala. Walaupun asam glutamat dan jumlah sel yang hidup
tidak terdeteksi dalam aliran reactor setelah 20 jam pertama kultivasi, pengujian sisa gula dan bergeraknya biomassa dinyatakn dengan jumlah gula yang cukup besar untuk dikonversi menjadi biomassa sel dalam campuran agar. Setelah 20 jam pertama kultivasi, sel yang hidup nampak dalam aliran reactor dan berangsur meningkat untuk mencapai pertumbuhan maksimum setelah 30 jam kultivasi. Peningkatan dalam konsentrasi sel secara terus-menerus bergerak dan mencapai stabil hampir 8,5 g/L selama periode yang sama. Hasil yang sama ditunjukkan selama permulaan immobilized cell reactor untuk menghasilkan etanol dengan pertumbuhan sel bakteri Zymomonas mobilis dan untuk menghasilkan asam glutamat dalam pertumbuhan sel dalam busa polyurethane. 4.2 Waktu yang dibutuhkan untuk pertumbuhan sel dan menghasilkan asam glutamat dalam proses batch immobilized cell reactor dengan bakteri C. Glutamicum.
Percobaan ini dirancang dan dilaksanakan dalam proses batch untuk menindaklanjuti kedua pertumbuhan sel dan produksi asam glutamat. Media B berisi gula tebu molase dengan total gula 100 g/L yang diumpankan ke reactor pada D 0,05 h-1 dan proses fermentasi seperti yang dijelaskan di bagian bahan dan metoda.
Gambar 2 : Waktu yang dibutuhkan dalam memproduksi asam glutamat dengan pembentukan produk dengan IMC bakteri C. glutamicum dalam proses batch. Waktu dalam fermentasi ini ditunjukkan dalam gambar 2. Tingkat asam glutamat relative rendah setelah 2 hari pertama dan malah berkembang pesat pertumbuhannya dan biomassa yang dihasilkan dalam periode ini >27 g/L. ini menunjukkan akumulasi asam glutamat yang hanya dimulai pada hari kedua dan meningkat dengan pesat. Keduanya pertumbuhan gula dan konsumsi gula terus meningkat pada proses kultivasi dengan pembentukan asam laktat dan asam succinic sebagai produk utama. Konsentrasinya dalam reactor berkisar 7,42 dan 4,22 g/L. Konsentrasi sel mencapai maksimum pada hari ke 3 (28,3 g/L). Pada proses fermentasi, penggunaan gula dan produksi asam glutamat meningkat dan konsentasi asam succinic dan asam laktat menurun pada hari ke 5 berkisar 2,65 dan 1,05 g/L. Konsentrasi asam glutamat mencapai nilai maksimum pada hari ke 5 (57,8 g/L) dan telah diatur keadaan stationer pada hari ke 6. Aspartate dan ketoglutarate merupakan produk utama yang terbentuk selama periode ini. Konsentrasinya meningkat dari 2,75 dan 8,45 g/L pada hari ke menjadi 7,32 dan 17,30 g/L pada hari ke 6. Pembentukan dua produk ini barangkali persaingan antara beberapa enzim. Seperti ditentukan persaingan ini dengan contoh pengatuh pengontrolan. Dengan cara yang sama, Aida et al menemukan bagaimana meningkatkan bagian dalam sel asam glutamat yang menyebabkan hambatan umpan balik dalam dehidrogenasi glutamat dan sintesis sitrat dan menghasilkan akumulasi ketoglutarate dan aspartate. Ini bisa menjelaskan aktifnya pembentukan yang simultan dari aspartate dan ketogluratat dan aspartate selama periode awal akumulasi asam glutamat. Selama periode ini, konsentrasi intrasel asam glutamat dapat mencapai tingkat kritis dalam pengontrolan umpan balik untuk menjadikan tempat dan akibatnya berhentinya produksi asam glutamat pada hari ke 6 (gambar 2). Crueger dan crueger menyatakan konsentrasi intrasel asam glutamat antara 25-35 µg/mg berat sel kering yang mampu menghentikan pembentukan asam glutamat dengan lengkap. 4.3 Fermentasi Batch dalam memproduksi asam glutamat dari gula tebu molase dengan ICR C. glutamicum.
Dalam pengujian kemampuan dari ICR C. glutamicum dalam memproduksi sebagai produk akhir konsentrasi asam glutamat dengan tepat, diumpankan ke dalam reactor media produksi yang mengandung konsentrasi gula tebu yang tinggi (175 g/L) dalam reactor batch.
Gambar 3 : Fermentasi Batch asam dalam memproduksi asam glutamat dengan ICR dari bakteri C. glutamicum. *SGB. Pemakaian gula dalam pertumbuhan sel dan pembentukan produk. *SPRG, laju pembentukan spesifik asam glutamat. Seperti yang ditunjukkan gambar 3, biomassa yang dihasilkan membantu dalam produksi asam glutamat dan dihasilkan asam glutamat >93 g/L dalam 16 jam dengan tidak adanya peningkatan konsentrasi asam glutamat setelah 4 jam terakhir. Seperti bertambahnya hasil yang mungkin terjadi karena konsentrasi awal biomassa dalam reaktor. Selanjutnya peningkatan biomassa dengan seketika setelah hari pertama tapi pelan-pelan dan mencapai 38,3 g/L pada saat akhir waktu kultivasi/pengembangbiakan. Ini merupakan hal yang menarik
untuk diperhatikan bagaimana laju produksi spesifik (SPRG, gglutamat /gcell.h) maksimum setelah 4 jam pertama, lalu penurunan tajam dalam proses fermentasi. Kemudian, pengaruh hambatan muncul dari kontak langsung sel bakteri ke konsentrasi asam glutamat yang tinggi bisa digunakan untuk menjelaskan nilainya yang lebih turun dalam SPRG. Walaupun konsentrasi relatif asam glutamat akhir tinggi (93 g/L), ICR C. glutamicum memperlihatkan yield rendah (54,8%) dan daya produksi volumetric rendah (3,83 g/L .h) dibandingkan dengan ICR dari strain bakteri yang sama dimasukkan ke dalam busa polyurethane 6,2, tapi dengan jumlah yang lebih tinggi dari yang muncul selama fermentasi dengan menggantungkan pada reaktor sel bakteri Bacillus megaterium. Ini dapat diketahui konsentrasi konsentrasi asam glutamat akhir yang direcovery dari kaldu fermentasi dan menghasilkan penurunan nilai harga produksi. Dengan cara yang sama sangat bagus dengan yield dan daya produksi volumetric. Oleh karena itu, didapatkan pengontrolan utama dalam kondisi local yang bervariasi. 4.4 Pengulangan fermentasi batch dalam memproduksi asam glutamat dengan ICR C. glutamicum dari gula tebu molase.
Dapat dilihat konsentrasi akhir asam glutamat tinggi (93 g/L) dan tidak memuaskan prduktivitas dan efisiensi volumetric dalam konversi gula menjadi asam glutamat yang dicapai percobaan di atas, itu mencoba untuk menyelidiki lebih lanjut teknik fermentaswi berharap untuk lebih banyak perbaikan di ICR dari C. glutamicum. Pertama, fermentasi batch diulangi dan diselidiki. Biomassa yang dihasilkan dari C. glutamicum dicuci secara merata dengan sirkulasi larutan garam steril ke dalam reaktor dan media produksi dipompakan untuk memulai fermentasi batch. Dilakukan 5 fermentasi batch secara berurutan.
Gambar 4 : Fermentasi batch berulang untuk memproduksi asam glutamat dengan immobilized cell reactor bakteri Corynebacterium glutamicum. *SGB adalah konsumsi gula dalam pertumbuhan sel dan pembentukan produk. **SPRG adalah pembentukan asam glutamat Telah dinyakan dalam waktu yang cukup lama bergeraknya system sel mikroba mempertahankan lebih agresif kondisi lingkungan dibandingkan dengan system sel yang bebas dan mendukung tingkat produksi yang stabil dalam operasi jangka panjang. Hasil yang diperoleh (gambar 4) tidak sama dengan pendapat ini; sel C. glutamicum yang bergerak mendukung konsentrasi tinggi asam glutamat hanya selama dua fermentasi berjalan. Setelah itu, asam glutamat mengalami penurunan produksi mencapai nilai terendah 54,35 g/L di run 5. Walaupun peningkatan konsentrasi sel dalam reaktor setelah lima jalannya fermentasi berturut-turut, dimana teradi penurunan tajam pada laju produksi tertentu asam glutamat (SPRG) dari 0,5 dalam run1 menjadi 0,22 g/g.h di run 5, yang dapat menjelaskan penurunan dramatis produksi asam glutamat (gambar 4). Intrasel asam glutamat mungkin telah meningkat dengan fermentasi berturut-turut dan mencapai titik kritis yang dinyatakan oleh Crueger dan Crueger dan menghasilkan pengaruh hambatan dan pengurangan berat SPRG spesifik.
Penjelasan lain terletak pada kenyataan bahwa sel C. glutamicum saat berhubungan dengan media yang kaya biotin, sepert gula tebu (Imrie(1969), sintesis rantai karbon pendek dan asam lemak tak jenuh, seperti asam oleat menigkat dan hasil dalam membrane sel dengan rendah cairan dan rendah ekskresi asam glutamat. Dengan demikian, dapat disadari bahwa harus ada konsentrasi asam glutamat tertentu dalam kaldu fermentasi yang seharusnya bisa menghindari control fenomena umpan balik dan akibatnya penurunan produksi asam glutamat.
4.5 Produksi Kontinu asam glutamat dengan immobilized cell reaktor dari bakteri C. glutamicum
Di lain percobaan, ini mencoba unuk menguji dan mengidentifikasi kondisi yang sesuai yang bisa mempertahankan operasi panjang masa yang stabil dengan konsentrasi asam glutamat akhir yang
memuaskan, hasil
dan produktivitas volumetric lebih tinggi dari
fermentasi batch dan batch berulang yang telah dilakukan.
Immobilized cell reactor yang segar dengan bakteri C. glutamicum disiapkan dan diumpankan dengan media produksi yang mengandung total gula 100 g/Ldan fermentasi dimulai di bawah parameter lingkungan yang disebutkan di atas. Baik penicillin supplementasi dan laju pengenceran berubah (gambar 5). Setelah mencapai kondisi steady state, satu dari dua parameter diubah. Sampel diambil dari masing-masing kondisi steady state dan analisis.
Hasil yang disajikan Gambar 5 menunjukkan bahwa produksi asam glutamat dipertahankan selama hamper dua minggu (fase A dan B, table 1) dan pada dua periode steady state berturut-turut mencapai tingkat pengenceran dari 0,05 dan 0,1 h-1 dengan konsentrasi akhir asam glutamat masing-masing 58,4 dan 63,2 g/L. Namun, setelah 50 jam kultivasi ICR C. glutamicum mulai melakukan pertunjukan yang buruk. Konsentrasi asam glutamat dalam limbah berangsur berkurang menjadi 50,2 g/L, dengan tingkat tertinggi gula sisa dan SGB; 22,6 dan 26 g/L. Ini dapat dijelaskan oleh kemungkinan akumulasi biotin, adanya gula tebu molase, di sekitar lingkungan mikro biomassa bergerak k tingkat penghambatan menhilangkan sekresi asam glutamat. Dengan menigkatkan konsentrasi penisilin dalam media umpan dari 10 menjadi 20 U/ml, aktivitas reaktor selama 72 jam sangat memungkinkan peningkatan fluiditas membrane sel bakteri. Tingkat pengenceran semakin menigkat dan menghasilkan dalam keadaan steady state baru 72,8 g/L dengan efisiensi konversi tertinggi dan produktivitas volumetric reaktor 75,75 dan 29,1 g/L .h (table 1).
Hasil yang diperoleh menyatakan bahwa untk produksi asam glutamat kontinu yang stabil dengan konsentrasi akhit yang lumayan., pertumbuhan kontnu dari biomassa bergerak dengan reaktor yang harus bisa dipertahankan pada laju relative lambat. Seperti pertumbuhan yang dibutuhkan untuk memasok metabolit yang diperlukan dalam memproduksi asam glutamat dan pada waktu yang sama meminimalkan jumlah gula yang dikonsumsi dikonversi menjadi biomassa sel. Ini tercapai dengan sempurna melalui fine tuning simultan dari kedua konsentrasi penisilin dalam media umpan dan laju pengenceran. Sebuah penghentian lengkap untuk sel diusulkan untuk produksi asam glutamat dengan memanfaatkan strain bakteri yang sama, yang bertentangan dengan hasil yang diperoleh. System kontinu digunakan immobilized cell reactor dengan bakteri C. glutamicum dioptimalkan dalam studi ini, sangat menguntungkan dibandingkan dengan yang berada dalam literature (table 2). Walaupun, Yoshioka et al melaporkan konsentrasi akhir asam glutamat dalam kaldu fermentasi, keduanya yield dan produktivitas volumetric system ini rendah masing-masing 55% dan 8,3 g/L. Dalam penelitian ini, sampai dengan 75,7% dan 29,1 g/L tercapai untuk yield dan produktivitas volumetric. Tentu saja, nilai-nilai yang signifikan nampak positif dalam menerapkan system skala industry yang diambil.
V. KESIMPULAN Dari penelitian yang dilakukukan dapat disimpulkan bahwa 1.
Hasil akhir konsentrasi asam glutamat tinggi dengan fermentasi batch yaitu >93 g/L tetapi hanya memilki produktivitas yang rendah sebesar 3,8 g/L
2.
Pada fermentasi yang diulang didapatkan sel begerak untuk menghasilkan asam glutamat tidak memuaskan.
3.
Dan hasil yang terbaik diperoleh pada immobilized cell reactor yang dioperasikan dalam modus kontinus dan kedua laju pengenceran dan suplementasi penisilin yang dimanipulasi. Pada D 0,4 h-1 dan dengan 20 U/ml penisilin yang diumpankan dalam media , dan mencapai 73 g/L asam glutamat yang ditemukan dalam reakot dengan yield 75,7% dan produktivitas ve=olumetiric reaktor 29,1 g/L .h.
DAFTAR PUSTAKA
http://ptp2007.wordpress.com/2007/10/08/fermentasi/ http://www.freepatentsonline.com/6852516.html http://www.scribd.com/doc/24725217/L-Glutamic-Acid-Fermentation
LAMPIRAN
Gambar Alat Immobilized Cell Reactor
