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UE Biochimie structurale Semestre 4
Les acides nucléiques: méthodes d’analyse Documents cours 1 Les objectifs: -Connaitre la structure d’un acide nucléique -Comprendre les méthodes de purification et d’extraction des acides nucléiques -dosage et électrophorèse : savoir quantifier et vérifier la qualité des ac nucleiques -décrire l’activité d’ enzymes qui permettent d’étudier les acides nucléiques (« couper-coller-copier-marquer »)
-Les acides nucléiques (ADN/ARN )sont des polymères linéaires linéaires de nucléotides reliés par des liaisons phosphodiesters
-NUCLEOTIDE -NUCLEOTIDE =
BASE
Pyrimidine
PENTOSE
GROUPE(s) PHOSPHATE(s) PHOSPHATE(s)
Purine
I - R a p p e l s s u r l e s a c i d e s n u c l é i q u e s ( s t r u c t u r e c h i m i q u e )
Pyrimidine
Purine
I - R a p p e l s s u r l e s a c i d e s n u c l é i q u e s ( s t r u c t u r e c h i m i q u e )
-Les acides nucléiques (ADN/ARN )sont des polymères linéaires de nucléotides reliés par des liaisons phosphodiesters
-NUCLEOTIDE =
BASE
PENTOSE
GROUPE(s) PHOSPHATE(s)
NUCLEOSIDE
Ribose ARN
Liaison N-osidique
2’ désoxyribose
ADN
I - R a p p e l s s u r l e s a c i d e s n u c l é i q u e s ( s t r u c t u r e c h i m i q u e )
-Les acides nucléiques (ADN/ARN )sont des polymères linéaires de nucléotides reliés par des liaisons phosphodiesters
-NUCLEOTIDE =
BASE
PENTOSE
NUCLEOSIDE
Nucléoside monophosphate
Liaison phosphomonoester
Nucléoside triphosphate
GROUPE(s) PHOSPHATE(s)
I - R a p p e l s s u r l e s a c i d e s n u c l é i q u e s
I - R a p p e l s s u r l e s a c i d e s n u c l é i q u e s
I - R a p p e l s s u r l e s a c i d e s n u c l é i q u e s
Hélice droite d’ADN : moléculaire double brin:
-Antiparallèle -Complémentarité des bases [A]=[T] et [C]=[G]
Forme B de la double hélice d’ADN
Principales étapes de purification des acides nucléiques Il existe différents protocoles expérimentaux pour extraire les acides nucléiques qui suivent approximativement le même schéma général:
-Lyse des cellules
-Elimination des protéines et lipides
-Elimination d’un acide nucléique donné (un extrait d’acides nucléiques contient un mélange ARN, ADN
génomique et ADN plasmidique pour les bactéries)
I - e x t r a c t i o n e t p u r i f i c a t i o n d e s a c i d e s n u c l é i q u e s
Principales étapes de purification des acides nucléiques -Lyse des cellules : Pour éliminer l’ARN: digestion par
une RNase( « Dnase free »)
-Dégradation protéines: -hydrolyse enzymatique: -précipitation des protéines avec des agent s chaotropiques -Extraction des acides nucléiques (Elimination protéines et lipides) -extraction phénol /chloroforme (non miscible hydrophobe):
À pH 8 Débris lipidiques
A pH acide pH5
ADN Débris lipidiques
I - e x t r a c t i o n e t p u r i f i c a t i o n d e s a c i d e s n u c l é i q u e s
Principales étapes de purification des acides nucléiques -Extraction des acides nucléiques et concentration des acides nucléiques -extraction par chromatographie d’adsorption sur colonne de silice
Fixation ADN en présence de NaCL
Elution à faible force ionique
lavage
SiO2
-Concentration des acides nucléiques -précipitation éthanol en présence de cations: à haute force ionique NaCl 3M. Na+ neutralisent les groupements PO4 - de l’ac nucléique qui devient moins soluble. - Ajout de 2 volumes d’éthanol , l’acide nucléique est récupéré après centrifugation sous forme solide -un lavage à l’éthanol 70% permet d’éliminer les sels
I - e x t r a c t i o n e t p u r i f i c a t i o n d e s a c i d e s n u c l é i q u e s
Principales étapes de purification des acides nucléiques: minipréparation plasmidique Technique:LYSE ALCALINE 2 sortes d’ADN : L’ADN génomique issu du ou des chromosomes des cellules (taille : + 106 pb ) L’ADN plasmidique ( molécule d’ADN circulaire double brin extra chromosomique à réplication
ADN dénaturé: séparation des deux brins d’ADN ARN digéré
Neutralisation rapide de la solution Réappariement des duplex d’ADN. L’ADN génomique très long ne peut se réapparier correctement. Il devient insoluble. L’ADN plasmidique se renature et reste en solution.
Séparation des espèces d’ADN et des protéines par centrifugation
Concentration des ADN plasmidiques par précipitation éthanol
I - e x t r a c t i o n e t p u r i f i c a t i o n d e s a c i d e s n u c l é i q u e s : p u r i f i c a t i o n d e p l a s m i d e
Dosage des acides nucléiques par spectrophotométrie absorption UV Principe de spectrophotométrie
(Cf TP bases de biochimie )
I0
I
A= log (1/T)=log
I0 I
I I - D o s a g e d e s a c i d e s n u c l é i q u e s : s p e c t r o p h o t o m é t r i e
Dosage des acides nucléiques par absorption UV Les nucléotides ont une absorbance maximale vers 260 nm due aux bases azotées A,C,G,T, U
-Estimation de la concentration en acides nucléiques - Estimation de la pureté de l’échantillon
Abs
Loi de Beer Lambert
Spectre d’absorbance
Absà 260 nm= l
260 nm
C Concentration M
Absorbance ou densité optique
-Échantillon d’ADN pur :
Trajet optique cm
Coeff d’extinction molaire M-1cm-1
Abs 260 /Abs 280 compris entre 1,8 et 2
si le rapport est < 1,7 présence de protéines Si le rapport est > 2 présence d’ARN
I I - D o s a g e d e s a c i d e s n u c l é i q u e s : s p e c t r o h o t o m é t r i e
Dosage de solutions pures d’acides nucléiques par absorption UV
Pour déterminer approximativement des concentrations en acides nucléiques de solutions pures , on peut assumer que:
Dans les conditions standards de mesure (cuve 1 cm, température ambiante) pour une solution pure d’ADN db :
1 Abs 260 = 50 µg/mL
pour une solution pure d’ADN sb :
1 Abs 260 = 37 µg/mL
pour une solution pure d’ ARN :
1 Abs 260 = 40 µg/mL
(hyperchromicité
50 µg/ml d’ADN ont
une absorbance de 1,25 )
Ce dosage est facile d’utilisation et sensible (2-3 µg/ml) mais ne peut pas être
des concentrations inférieures à 0,25 µg/mL (Abs
260=0.005)
utilisé pour
I I - D o s a g e d e s a c i d e s n u c l é i q u e s : s p e c t r o p h o m é t r i e
Electrophorèse sur gel Cas particulier de l’ADN et du BET:
Les acides nucléiques sont des macromolécules polyanioniques chargés négativement à pH 8. Sous un champ électrique, ils vont migrer vers l’anode (pôle +).
Le gel est constitué de polymères formant un maillage d’ agarose ou
polyacrylamide, baignant dans un tampon conducteur.
La vitesse de migration des acides nucléiques dépend: -leur masse moléculaire donc de leur taille (bases ou pb) -du maillage du gel support de l’électrophorèse (concentration en agarose ou acrylamide)
I I I - E l e c t r o p h o r è s e s u r g e l d e s a c i d e s n u c l é i q u e s
Cas particulier de l’ADN et du BET:
Electrophorèse sur gel L’électrophorèse permet aussi de séparer des molécules d’acides nucléiques suivant leur structure: par exple différentes formes d’un plasmide (molécule d’ADN circulaire double brin
extrachromosomique à réplication autonome).
Mobilité élèctrophorétique différente
+
dépôt
III
II
I
-forme relâchée -forme linéaire
Forme I circulaire covalemment fermée Forme II circulaire relachée (un brin coupé) Forme III linéaire (deux brins cassés)
-forme surenroulée
Après une préparation plasmidique on récupère les formes I et III. Après digestion par des enzymes de restriction la forme III
-
I I I - E l e c t r o p h o r è s e s u r g e l d e s a c i d e s n u c l é i q u e s
Des outils enzymatiques pour étudier les acides nucléiques Nucléases -Les ADN et ARN sont les substrats des nucléases qui hydrolysent la liaison phosphodiester. Elles agissent in vivo et in vitro. -Elles sont classées suivant : leur mode d’attaque
I V - O u t i l s e n z y m a t i q u e s p o u r é t u d i e r l e s a c i d e s n u c l é i q u e s
Des outils enzymatiques pour étudier les acides nucléiques Les enzymes de restriction -Endonucléases qui hydrolysent les liaisons phosphodiesters à l’intérieur d’un ADN double brin à des sites spécifiques palindromiques (4 à 8 pb).
Écriture simplifiée GTT/AAC G/AATTC
--ACGTTAACCGAATTCCTCGGTTTAACTGAATTCCGTATCCC---TGCAATTGGCTTAAGGAGCCAAATTGACTTAAGGCATAGGG-Digestion par EcoRI --ACGTTAACCG oH pAATTCCTCGGTTTAACTG OH pAATTCCGTATCCCC---TGCAATTGGCTTAA p HOGGAGCCAAATTGACTTAAp OHGGCATAGGG--
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Des outils enzymatiques pour étudier les acides nucléiques Ligases
Ces enzymes catalysent la formation d’une liaison phosphodiester entre un 5’ phosphate et un 3’OH adjacent. Elles permettent une liaison covalente entre deux molécules d’ADN (ligature -ligation). Elles nécessite nt le nucléotide ATP .
ADN ligase + 2 ATP
2 AMP + PPi
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Des outils enzymatiques pour étudier les acides nucléiques Kinases-polymérases -On peut marquer les acides nucléiques en ajoutant ou substituant des groupes marqueurs: -isotopes radioactifs (32P, 33P, 35S), des fluorophores … -Marquage aux extrémités: -extrémité 3’OH: grâce à la terminal transférase… -extrémité 5’P: grâce à la T4 kinase en remplaçant le groupement 5’P par un isotope radioactif pCGATC----------GCATTTOH OHGCTAG-----------CGTAAAp Déphosphorylation Phosphatase alcaline
CGATC----------GCATTTOH OHGCTAG-----------CGTAAAp p
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Des outils enzymatiques pour étudier les acides nucléiques Kinases-polymérases -On peut marquer les acides nucléiques en ajoutant ou substituant des groupes marqueurs: -isotopes radioactifs (32P, 33P, 35S), des fluorophores … -Marquage aux extrémités: -extrémité 3’OH: grâce à la terminal transférase -extrémité 5’P: grâce à la T4 kinase en remplaçant le groupement 5’P par un isotope radioactif -Marquage interne:
I V - O u t i l s e n z y m a t i q u e s p o u r é t u d i e r l e s a c i d e s n u c l é i q u e s
Des outils enzymatiques pour étudier les acides nucléiques polymérases
