Judul
:1. Pemisahan Serum/Plasma ari Sel Darah Merah 2. Pencuc Pencucian ian Sel Sel Dara Darah h Merah Merah Pekat Pekat 3. Pembua Pembuatan tan Susp Suspens ensee Sel Sel Darah Darah Mera Merah h
Hari, tanggal: Senin, 18 Maret 2013
I. Tujuan
1. Untuk Untuk memisah memisahkan kan serum/p serum/plasm lasmaa dari dari sel darah darah merah merah dan mendap mendapatk atkan an plasma/serum yang bebas dari sel darah merah. 2. Untuk mendapatka mendapatkan n sel darah darah merah merah yang bebas dari protein/ protein/glob globulin. ulin. 3. Untuk dapat membuat membuat suspense suspense sel sel darah darah merah merah (5%, 10%, 40%)
II. Metode ode
Metode yang digunakan dalam praktikum ini adalah metode tube test.
III.Prinsip
A. Pemisahan Pemisahan serum/plasma serum/plasma dari sel darah darah merah merah Darah beku atau darah sitrat disentrifugasi, maka akan terjadi pemisahan antara serum/plasma dengan sel darah merah. B. Pencuc Pencucian ian sel sel darah darah merah merah pekat pekat Dengan Dengan penamb penambaha ahan n larutan larutan saline saline dan disentr disentrifu ifugasi gasi maka maka antibo antibody dy disekitar sel darah merah akan hilang. C. Pembua Pembuatan tan suspen suspense se sel darah darah merah merah
1
Membuat kepekatan sel darah merah menjadi enceran tertentu guna mengoptimalkan reaksi antigen sel darah merah terhadap antibody.
IV. Dasar Teori
Darah adalah satu bagian tubuh manusia yang paling penting yang harus ada dalam jumlah yang sesuai. Darah merupakan cairan yang terdiri dari banyak sel bebas yang membawa zat penting yang diperlukan oleh tubuh melalui sebuah jalur yang disebut pembuluh darah. Kinerja darah diatur oleh “master kontrol” yaitu jantung. Zat yang dibawa bisa apa saja, seperti oksigen, mineral, protein, vitamin dan hormon yang berasal dari sistem endokrin. Hasil sisa olahan tubuh seperti karbondioksida dibawa oleh darah ke paru-paru untuk ditukar dengan oksigen. Begitu pula banyak racun dan bahan kimia yang tidak dikehendaki tubuh dibawa ke hati dan ginjal untuk kemudian dideportasi keluar dari tubuh manusia melalui feces atau urine (Ridwan, 2012). Menurut Flagan (2007) preparasi sampel adalah suatu proses penyiapan sampel yang bertujuan untuk memisahkan atau menyingkirkan pengotor atau zatzat yang tidak diinginkan (selain analit) sehingga diperoleh hasil yang valid. Beberapa hal yang perlu diperhitungkan dalam tahapan penyiapan sampel adalah: jenis dan sifat biologis spesimen, fisikokimia dari spesimen, serta tujuan analisis. Dengan demikian akan dapat merancang atau memilih metode penanganan sampel, jumlah sampel yang akan digunakan, serta memilih metode analisis yang tepat. Penanganan sampel perlu mendapat perhatian khusus, karena sebagian besar sampel adalah materi biologis, sehingga sedapat mungkin mencegah terjadinya penguraian dari analit (Gelgel, 2008). Dalam tahapan penyiapan sampel darah, pemisahan sel darah dan serum sangat diperlukan. Tidak jarang sampel darah, yang diterima sudah mengalami hemolisis atau menggupal, dalam hal ini darah dilarutkan dengan metanol, dan kemudian disentrifuga, sepernatannya dapat langsung dilakukan uji penapisan menggunakan teknik immunoassay. Selain itu untuk membuat sel uji ataupun
2
untuk pemeriksaan antigen golongan darah sel darah dapat dicuci. Tujuan pencucian sel darah merah ini: a. Menghilangkan protein plasma. b. Menghilangkan antibodi pd sel darah merah (Anti A/Anti B). c. Menghilangkan/mengurangi sel darah putih (lekosit). Pisahkan sel darah dari plasmanya. Cuci endapan selnya dengan cara menambahkan saline yang jumlahnya dibandingkan dengan endapan sel adalah 10 bagian atau lebih berbanding 1 bagian. Campurkan merata dengan pipet pasteur, kemudian putar sebagai mana memisahkan serum dari sel. Buang supernatan saline dan ulangi pencucian seperti ini sampai 2 kali. Setelah pencucian terakhir, supernatan saline pencuci dibuang sebanyak-banyaknya dan didapatkan sel darah (Gelgel, 2008). Dari hasil pencucian sel darah dapat dibuat suspensi sel darah. Sel di dalam medium akan mempengaruhi interaksi agen – antibodi. Oleh karena itu kepekatan sel dapat diatur, dibuat sesuai dengan kebutuhan, yang kita sebut % suspensi. Persen (%) suspensi sel dibuat berdasarkan perbandingan sel pekat (Packed Cells) dengan mediumnya. Mediumnya dapat berupa saline, serum/plasma atau Albumin (Anonim, 2011). Koleksi sampel darah dapat berasal dari kapiler maupun vena. Untuk koleksi darah arteri sangat jarang digunakan kecuali pada kasus khusus seperti pada analisis gas yang terkandung dalam darah. Darah terdiri daripada beberapa jenis korpuskula (sel-sel darah) yang membentuk 45% bagian dari darah. Bagian 55% yang lain berupa cairan kekuningan yang membentuk medium cairan darah yang disebut plasma darah (Wisnu,2011). A. Plasma Darah
Unsur ini merupakan komponen terbesar dalam darah, karena lebih dari separuh darah mengandung plasma darah. Hampir 90% bagian dari plasma darah adalah air. Sebagian besar plasma darah mengandung garam-garam terlarut dan protein. Protein utama dalam plasma adalah albumin. Protein lainnya adalah antibodi (imunoglobulin) dan protein pembekuan. Plasma darah berfungsi untuk mengangkut sari makanan ke sel-sel serta membawa sisa pembakaran dari sel ke tempat pembuangan. 3
Selain menyalurkan sel-sel darah, plasma juga: •
merupakan cadangan air untuk tubuh
•
mencegah mengkerutnya dan tersumbatnya pembuluh darah
•
membantu mempertahankan tekanan darah dan sirkulasi ke seluruh tubuh.
•
dan yang lebih penting, plasma menghasilkan zat kekebalan tubuh terhadap penyakit atau zat antibodi.
Antibodi dalam plasma melindungi tubuh melawan bahan-bahan asing (misalnya virus, bakteri, jamur dan sel-sel kanker) ketika protein pembekuan mengendalikan perdarahan. Selain menyalurkan hormon dan mengatur efeknya, plasma juga mendinginkan dan menghangatkan tubuh sesuai dengan kebutuhan (Kukuh, 2009). B. Sel Darah Merah
Sel darah merah, eritrosit ( bahasa Inggris: red blood cell RBC), eritrosit adalah jenis sel darah yang paling banyak dan berfungsi membawa oksigen ke jaringan-jaringan tubuh lewat darah dalam hewan bertulang belakang. Bagian dalam eritrosit terdiri dari hemoglobin, sebuah biomolekul yang dapat mengikat
oksigen. Hemoglobin akan
paru dan insang,
dan
oksigen
mengambil akan
oksigen
dilepaskan
saat
dari parueritrosit
melewati pembuluh kapiler . Warna merah sel darah merah sendiri berasal dari warna hemoglobin yang unsur pembuatnya adalah zat besi. Pada manusia, sel darah merah dibuat di sumsum tulang belakang (Anonim, 2013). Menurut strukturnya eritrosit terdiri atas membran sel yang merupakan dinding sel. Substansi seperti spons yang disebut stroma dan hemoglobin yang menempati ruang-ruang kosong dari stroma. Analisa kimia membuktikan bahwa dinding eritrosit terdiri terutama dari 2 macam substansi yaitu protein dan lipida. Kombinasi protein dan lipida ini disebut lipo-protein. (Jasin, 1989)
V. Alat dan Bahan A. Alat
1. Tabung reaksi 4
2. Centrifuge 3. Pipet pasture 4. Rak tabung reaksi 5. Gelas plastic 6. Botol semprot 7. Label B. Bahan
1. Sampel darah tanpa antikoagulan/ whole blood 2. Sel darah merah 3. Larutan saline 0,9% 4. Sel darah merah pekat(100%) 5. Aquades VI. Cara Kerja A. Pemisahan serum/plasma dari sel darah merah
1. Alat dan bahan disiapkan. 2. Sampel darah dimasukkan ke dalam tabung dan diberi label. 3. Sampel disentrifugasi dengan kecepatan 1500 rpm selama 3 menit. 4. Sampel dalam tabung akan terpisah antara plasma/serum (bagian bening) dengan sel darah merah. 5. Bagian plasma/serum dipindahkan dengan bantuan pipet ke tabung lain(jangan sampai bagian sel darah ikut terambil)
B. Pencucian sel darah merah pekat 5
1. Alat dan bahan disiapkan. 2. Sel darah merah dimasukkan ke dalam tabung. 3. Larutan saline 0,9% ditambahkan ke dalam tabung sebanyak 3-5 mL atau kurang lebih sampai ¾ bagian tabung. 4. Sel darah merah dan larutan saline dihomogenkan dengan bantuan pipet tetes. 5. Tabung disentrifugasi dengan kecepatan 1500 rpm selama 3 menit. 6. Bagian supernatant dibuang dengan bantuan pipet. 7. Proses pencucian tersebut diulangi sebanyak 2 kali atau sesuai kebutuhan.
C. Pembuatan suspense sel darah merah
a. Pembuatan suspense sel darah merah 5% 1. Alat dan bahan disiapkan. 2. Larutan saline 0,9% diteteskan ke dalam tabung sebanyak 19 tetes. 3. Sel darah merah pekat diteteskan ke dalam tabung sebanyak 1 tetes. 4. Suspensi tersebit lalu dihomogenkan. b. Pembuatan suspense sel darah merah 10% 1.
Alat dan bahan disiapkan.
2.
Larutan saline 0,9% diteteskan ke dalam tabung sebanyak 9 tetes.
3.
Sel darah merah pekat diteteskan ke dalam tabung sebanyak 1 tetes.
4.
Suspensi tersebit lalu dihomogenkan. 6
c. Pembuatan suspense sel darah merah 40% 1.
Alat dan bahan disiapkan.
2.
Larutan saline 0,9% diteteskan ke dalam tabung sebanyak 9 tetes.
3.
Sel darah merah pekat diteteskan ke dalam tabung sebanyak 1 tetes.
4.
Suspensi tersebit lalu dihomogenkan.
VII. Hasil Pengamatan
a. Pemisahan serum/ plasma dari sel darah merah
Gambar 1 •
Gambar 2
Setelah darah disentrifugasi maka serum / plasma akan terpisah dari sel darah merah ( Gambar 1). Bagian serum/ plasma akan berada pada bagian atas sedangkan sel darah merah pada bagian dasar tabung.
•
Serum / plasma yang terbentuk kemudian dipindahkan ke dalam tabung lain yang sudah diberi tanda ( Gambar 2).
7
b. Pencucian sel darah merah pekat Setelah sel darah merah pekat ditambahkan dengan saline ( NaCl 0,9%) serta disentrifugasi maka akan terbentuk 2 lapisan yaitu, supernatan (bagian atas) dan sel darah merah pekat (100%) (bagian dasar tabung). Pencucian dilakukan 2x( sesuai kebutuhan) dan supernatannya dibuang. c. Pembuatan suspense sel darah merah (5%,10% dan 40%)
o
Suspensi sel darah yang dibuat pada praktikum ini yaitu suspensi sel darah merah 5%, suspensi SDM 10%, dan suspensi SDM 40%.
o
Pembuatannya yaitu dengan cara melakukan pengenceran terhadap sel darah merah pekat (100%) dengan larutan saline 0,9% dgn perbandingan jumlahnya sesuai dengan konsentrasi yang akan dibuat.
VIII.Pembahasan
A. Pemisahan Serum/Plasma Dari Sel Darah Merah
8
Darah terdiri dari bagian padat dan bagian cair. Bagian padat berupa selsel darah seperti eritrosit, leukosit, dan trombosit. Sedangkan bagian cair berupa plasma darah . plasma darah adalah bagian cairan darah yang membentuk sekitar 5% dari berat badan, merupakan media sirkulasi elemenelemen darah yang membentuk sel darah merah, sel darah putih, dan sel pembeku darah juga sebagai media transportasi bahan organik dan anorganik dari suatu jaringan atau organ. Hampir 90% dari plasma darah terdiri dari air, di samping itu terdapat pula zat-zat lain yang terlarut di dalamnya seperti protein, senyawa organic dan anoerganik. Sedangkan serum merupakan bagian dari cairan tubuh yang bercampur dengan darah. Serum sendiri dapat diartiakan sebagai cairan tanpa sel darah dan faktor koagulasi atau fibrinogen. Serum merupakan juga sebuah plasma darah tanpa adanya fibrinogen. Dalam persiapan untuk membuat suspense darah dan persiapan untuk penentuan golongan darah, serum/plasma akan dipisahkan dari sel darah merah, sehingga diperoleh serum/plasma yang bebas dari sel darah merah. Serum dan plasma, sama-sama merupakan komponen cair dari darah, perbedaanya serum dibuat tanpa menambahkan antikoagulan sedangkan untuk memperoleh plasma dengan cara penambahan antikoagulan. Sehingga di dalam serum tidak akan ditemukan factor koagulasi (fibrinogen) seperti yang derdapat di dalam plasma, selain itu dalam pembuatan plasma, sel-sel darah yang terpisah dengan plasma memiliki morfologi yang masih utuh, sehingga nantinya dapat dianalis, Namun dalam pembuatan serum, sel-sel darah akan mengalami koagulasi atau menggumpal sebagai akibat aktifnya fibrinogen menjadi fibrin. Dalam persiapan penentuan golongan darah, baik plasma ataupun serum sama-sama dapat digunakan karena di dalam plasma/serum terdapat ab (aglutinine). Anglutinine ini yang akan digunakan untuk menentukan golongan darah seseorang. Proses pemisahan plasma/serum diawali dengan menampung darah pada tabung reaksi yang sesuai, apabila ingin mendapatkan serum darah yang digunakan adalah darah tanpa antikoagulan sedangkan jika yang dicari adalah plasma, maka darah yang digunakan adalah darah dengan anti koagulan.
9
Darah ini kemudian dicentrifugasi pada kecepatan 3000-3400 rpm selama 1-2 menit, atau pada kecepatan 1500 rpm selama 3 menit. Kecepatan dan lama centrifugasi disesuaikan dengan alat yang digunakan. Centrifugasi ini dilakukan untuk mempercepat proses pemisahan antara plasma/serum dengan sel darah. Setelah centrifugasi ini akan terbentuk dua lapisan yaitu lapisan padat atau sel-sel darah yang mengendap di dasar tabung dan lapisan cair yang berwarna bening kekuningan atau plasma/serum yang berada dibagian atas. Plasma/serum kemudian dipindahkan ke tabung lain dengan menggunakan pipet Pasteur. Pemipetan harus dilakukan secara hati-hati dan jangan sampai sel-sel darah yang sudah mengendap ikut terpipet.
B. Pencucian Sel Darah Merah Pekat Selain plasma/serum, komponen darah yang lain juga digunakan dalam penentuan golongan darah. Komponen darah tersebut adalah sel darah merah (eritrosit). Sel darah merah (eritrosit) merupakan sel darah yang berbentuk cakram kecil bikonkaf yang cekung pada kedua sisinya. Pada permukaan eritrosit ini terdapat suatu factor yang dapat digunakan untuk menentukan golongan darah. Factor ini disebut dengan antigen (agglutinogen). Sel darah merah yang digunakan adalah sel darah merah yang berasal dari pemisahan sel darah merah dengan plasma. Hal ini dikeranakan dalam pembuatan plasma sel-sel darah yang tepisah masih dalam keadaan yang utuh. Namun sebelum digunakan dalam pembuatan suspense darah merah dalam penentuan golongan darah, sel-sel darah merah ini, harus dicuci terlebih dahulu, pencucian ini bertujuan untuk mendapatkan sel darah merah pekat yang bebas dari sisa-sisa plasma dan untuk menghilangkan agglutinine atau antibody yang kemungkinan masih ada disekitar sel darah merah. Adanya agglutinine ini tentu dapat mengganggu proses penentuan golongan darah. Pencucian dilakukan dengan menggunakan larutan saline 0,9% atau NaCl 0,9 %. Konsentrasi larutan saline (NaCl 0,9%) ini digunakan karena memiliki osmolaritas yang sama dengan sel-darah merah. Dengan kata lain larutan ini 10
isotonis dengan sel darah merah. Sehingga sel darah merah yang dicuci masih memiliki morfologi yang sama dan tidak mengalami lisis atau krenasi karena pencucian. Proses pencucian dilakukan dengan menambahkan larutan saline (NaCl) kedalam sel darah merah pekat sebanyak 4 - 4,5 mL atau sampai ¾ volume
tabung.
Sel darah
merah dengan larutan
saline
kemudian
dihomogenkan dengan cara mengocok dengan menggunakan pipet Pasteur sehingga tercampur rata. Untuk memisahkan sel-sel darah yang telah tercuci dengan larutan pencucinya makan dilakukan centrifugasi pada kecepatan 3000rpm selama 1 sampai 3 menit atau 1500rpm selama 1,5 menit. Tergantung alat centrifuge yang digunakan. Dari centrifugasi sel-sel darah merah yang telah tercuci akan mengendap pada dasar tabung dan cairan supernatannya yang merupakan larutan pencuci atau saline berada pada bagian atas. Seperti pemisahan sel darah dengan plasma, cairan supernatannya dipipet dengan pipet Pasteur secara hati-hati agar sel-sel darah
tidak bercampur
dengan larutan saline. Pengulangan pencucian dapat dilakukan sesuai dengan kebutuhan. Namun dalam praktikum ini pencucian dilakukan sebanyak 2 kali. Pada pencucian yang terakhir cairan supernatanya tetap dibuang dan dipipet juga 10% bagian dari sel darah merah untuk memastikan bahwa sel darah merah yang diperoleh adalah sel darah merah pekat(100%) bebas dari angglutinine dan larutan pencuci atau saline. C. Pembuatan Supensi Sel Darah Merah (Suspensi Sel Darah Merah 5%, 10%, 40%) Sel darah merah yang telah dipisahkan dari bagian plasma dan dicuci dengan mengguakan saline(NaCl 0.9%) merupakan suspense sel darah merah pekat 100%. Untuk analisis penentuan golongan darah suspense sel darah merah yang digunakan tidak langsung dari suspense sel darah merah 100% melainkan dibuat beberapa variasi suspense sel darah merah lain dari suspense sel darah merah 100% yang telah tersedia. Tujuan pembuatan suspense ini adalah untuk membuat kepekatan sel darah merah menjadi enceran tertentu yang berguna untuk mengoptimalkan reaksi antigen pada sel darah merah terhadap antibody pada serum atau plasma.
11
Variasi konsentrasi suspense sel darah merah yang umum digunakan antara lain suspense sel darah merah 2%, 5%, 10%, 40% dan 50%. Namun dalam praktikum ini variasi konsentrasi suspense yang dibuat hanya suspense 5%, 10% dan 40%. Sama seperti pencucian sel darah merah, larutan yang digunakan dalam pembuatan suspense ini adalah larutan yang isotonis terhadap sel darah merah sehingga sel darah tidak akan mengalami kerusakan baik lisis atau krenasi. Larutan yang digunakan adalah saline 0.9%. Sel darah merah pekat (100%) disiapkan terlebih dahulu. Untuk membuat suspense sel darah merah 5 % , sel darah merah pekat 100% diambil 5 tetes dan kedalam 5 bagian tersebut ditambahkan 95 tetes larutan saline(NaCl 0,9%) kemudian dihomogenkan dengan pipet Pasteur. Dengan kata lain dalam suspense sel darah merah 5% ini terdapat 5 bagian sel darah merah dalam larutan saline (NaCl 0.9%) atau dengan perbadingan 1 : 19. Satu bagian untuk sel darah merah dan 19 bagian untuk larutan saline yang ditambahkan.
Begitu juga
untuk membuat variasi suspense sel darah merah yang lain, cara yang digunakan sama seperti pembuatan sel darah 5%, namun volume sel darah merah dan saline yang digunakan tergantung dari konsentrasi suspense sel darah merah yang ingin dibuat. Untuk membuat suspense sel darah merah 10 % perbadingan jumlah sel darah merah dengan larutan saline (NaCl 0.9%) yang digunakan adalah 1 : 9 dan untuk suspesnsi 40 % perbandingannya adalah 2 :3. Seperti yang telah dijelaskan di atas, pembuatan suspense ini secara umum bertujuan untuk membuat sel darah merah dengan enceran tertentu guna mengoptimalkan reaksi antigen dan antibody. Namun secara spesifik, fungsi masing-masing suspense yang dibuat adalah sebagai berikut :
12
Suspensi sel darah merah 5% umunya digunakan untuk pemerikasaan % SUSPENSI
ENDAPAN
MEDIUM
KEGUNAAN
5%
SDM 5 bagian
(SALIN) 95 bagian
PEMERIKSAAN 1. Gol. Darah (tube
test) 10%
10 bagian
90 bagian
2. USS (CM) Gol. Darah (slide test)
40%
40 bagian
60 bagian
Gol. Darah Rh
golongan darah dengan metode tabung (Tube test) dan untuk pemeriksaan USS. Sedangkan untuk suspense sel darah merah 10% digunakan untuk penentuan golongan darah dengan metode slide test, dan untuk suspense sel darah merah 40% digunakan untuk penentuan golongan darah Rh(Rhesus). IX. Simpulan
1. Pemisahan plasma/serum dilakukan dengan penambahan anti koagulan (plasma) dan tanpa anti koagulan (serum) ke dalam darah, dan dipercepat dengan centrifugasi pada kecepatan 1500 rpm selama 3 menit. 2. Pencucian sel darah merah dilakukan dengan menggunakan larutan saline 0,9% yang isotonis dengan sel darah merah sehingga sisa antibody disekitar sel darah merah dapat dihilangkan dan diperoleh sel darah merah yang bebas dari protei/globulin. 3. Suspense sel darah merah yang dibuat adalah suspense sel darah merah 5%, 10% dan 40%. Pembuatan suspense ini dilakukan dengan menambahkan larutan isotonis (saline 0,9%) kedalam beberapa bagian sel darah merah pekat 100% sesuai konsentrasi yang diinginkan. X.
Daftar Pustaka
Anonim,
2013.
Sel
Darah
Merah.
Diakses
pada:
http://cara-
analis.blogspot.com/2013/01/sel-darah-merah-eritrosit.html (Diakses tanggal 23 Maret 2013)
13
Anonim. 2011. Mencuci dan membuat Suspensi Sel. Diakses pada: http://www.sodiycxacun.web.id/2011/10/mencuci-dan-membuatsupensi-sel.html . (Diakses tanggal 23 Maret 2013). Jasin, Maskoeri. 1989. Biologi Umum, untuk perguruan tinggi. Surabaya : Bina Pustaka Tama. Kukuh.
2009.
Bagian
Darah.
Diakses
http://1001karya.blogspot.com/2009/07/bagian-darah.html
pada: (Diakses
tanggal 23 Maret 2013). Ridwan. 2012. Pengertian Darah dan Bagiannya. Tersedia pada : http://ridwananalis.wordpress.com/2012/08/13/pengertian-darahdan-bagiannya/ (Diakses tanggal 12 Maret 2013). Wirasuta, Made Agus Gelgel. 2008. Analisis Toksikologi Forensik Dan Interpretasi Temuan Analisis. Wisnu.
2011.
Sel
Darah
Merah.
Diakses
pada:
http://id.scribd.com/doc/75932286/Sel-darah-merah (Diakses tanggal 23 Maret 2013).
14
