Extracción y análisis análisis de ADN Objetivo general: métodos de extracción extracción y análisis de ADN. Objetivos específicos: 2.1. Extraer ADN genómico de la bacteria Escherichia coli.(dia 1) 2.2. Extraer ADN plasmídico de la bacteria E. coli.(dia 1) 2.3. Estimar por espectrofotometría la concentración y pureza de las l as preparacione preparacioness de ADN (día2). 2.4. Analizar la calidad del ADN extraído mediante electroforesis en gel de agarosa (día 2) 2.5. Realizar una digestión del ADN con enzimas de restricción (día1) y analizar el patrón de restricción mediante electroforesis (día 2) EXTRACCIÓN EXTRACCIÓN DE ADN
La extracc ex tracción ión de ADN se realiza re aliza en tres etapas: 1) ruptura de las células y homogeneización de la muestra; 2) aislamiento del ADN de las proteínas y lípidos; 3) concentración concentración del de l ADN. Homogeneización Homogeneización de la muestra mu estra La forma de homogeneización depende de pende de las características características de la muestra. En En general, se aplica una combinación de agentes físicos y químicos que rompen tejidos. Para tejidos blandos blandos se emplean emplean generalmente homogeneizadores homogeneizadores que rompen rompen el tejido e n forma mecánica. mecánica. Para hacer más eficiente eficie nte la lisis celular, se pueden puede n incluir ciclos de agitación violenta (utilizando (utilizando vortex ) y/o y /o combinar con ciclos de congelado-descongelado de l a muestra. Para lisar células célul as vegetales, hongos, bacterias, bacterias, o cápside cápsidess virales, se suele congelar congelar la muestra en nitrógeno líquido y pulverizarla mientras permanece congelada con un mortero, evitando así la degradación de los AN por nucleasas celulares Dependiendo de la naturaleza de la muestra, en el “buffer” de lisis se pueden incluir enzimas que faciliten la degradac degradación ión de la pared pared celular (p.ej.li sozima, que hidroliza el peptidoglicano presente presente en la pared celular de las bacterias) La adición de detergentes permite la desestabilización de la membrana celular alterando las interacciones lípido-lípido, lípido-proteína y proteína-proteína Eliminación de proteínas Pueden ser degradadas degradadas mediante mediante el e l tratamiento con proteasas, como la proteinasa K. (es activa activa en condiciones condiciones relativamente relativamente ex igentes como lo son l a presencia de SDS, urea, agentes quelantes (EDTA), (EDTA), Etc). Por otro lado, un incremento de temperatura desde 37 a 50 - 65 ºC aumenta su actividad, en condiciones en que las nucleasas que pueden afe ctar ctar la integridad del ADN son inactivas. inactivas. De este modo, la proteinasa K degrada las nucleasas y demás proteínas, y permite la obtención de ADN genómico de alto peso molecular.
Otra forma de eliminar las proteínas y lípidos es con solventes orgánicos que permite inactivar y remover compuestos solubles en la fase orgánica, y mediante una centrifugación posterior, eliminar proteínas desnaturalizadas que precipitan en la interfase (solv org.mezcla de fenol:cloroformo:alcohol isoamílico y cloroformo:isoamílico cloroformo:isoamílico La mezcla de solventes solve ntes en la primera extracción hace que el procedimiento sea más eficiente, efi ciente, y la segunda se gunda extracción extracción remueve restos restos de fenol. Su principal desventaja desve ntaja radica en la tox icidad de los reactivos y en el descarte descarte de los desechos orgánicos) orgánicos) También se utili zan con al ta pureza: la extracción del ADN con frecuencia “kits ” comerciales que permiten obtener AN de alta se basa en una cromatografía de intercambio iónico, en la que el ADN se une a una resina y después de realizar varios varios lavados, el ADN e s eluído en un pequeño volumen de agua o de buffer. Concentración del ADN por preci p recipitación pitación
La precipitación de los AN permite eliminar e liminar contaminantes contaminantes, cambiar el “buffer” en el cual se e ncuentra ncuentra disuelto y concentrar el ADN. A DN. Requiere l a presencia de dos elementos: el ementos: (i) cationes, cationes, provenientes de sales, sales, que neutralizan neutralizan la carga carga negativa reduceniendo reduceniendo l a repulsión de las hebras de ADN y (i i) alcohol, que reduce reduce la constante constante dieléctr dielé ctrica ica y deshidrata deshidrata las moléculas de ADN, haciendo que pie rdan rdan solubili dad y precipiten.
El Acetato de sodio es la sal más frecuentemente empleada para precipitar ADN y ARN, mi entras que el isopropanol y el etanol son los alcoholes más utilizados. El ADN (o ARN) se recupera en el precipitado luego de centrifugar. Se remueve el sobrenadante y el precipitado se lava con EtOH (elimina de sales que pueda inhibir pasos posteriores, por ej reacciones enzimáticas). Finalmente, el precipitado de AN es solubilizado en un cierto volumen de “buffer” o agua. La solución de ADN se mantiene en hielo mientras se trabaja con ella y se la conserva en al ícuotas congeladas a - 20 °C. ANÁLISIS DE ADN
Cuantificación de AN: Espectrofotometría Las bases nitrogenadas absorben UV. Método útil, siempre y cuando el ADN esté puro y no haya degradación de la muestra, que no contenga proteínas ni solventes orgánicos que absorben a λ cercanas a la de los AN. Algunas reglas empíricas permiten estimar la concentración a partir del valor de absorbancia a 260 nm. 1 UA a 260nm = 50 g/mL ADN doble cadena 1 UA a 260nm = 33 g/mL ADN cadena si mple 1 UA a 260nm = 40 g/mL de ARN
“Nanodrop”, equipo que permite determinar la concentración en un volumen de muestra de 1 μL, en un rango aproximado de 5 ng/ L a 3.000 ng/ L, y no requiere el uso de celdas (capacidad de 0.5 – 1 mL)
Evaluación de la pureza del ADN por espectrofotometría A pesar de ser estimativo, es posible considerar que una preparación es de buena calidad en relación al grado de pureza si cumple con las siguientes relaciones: A - contaminación con proteínas: ADN A260 /A280 ≥ 1,8 ARN A260 /A280 ≥ 2,0
B - contaminación con compuestos orgánicos como el fenol: ADN A260 /A230 ≥ 1,5 ARN A260 /A230 ≥ 2,0
Electroforesis y visualización de ADN Forma sencilla de resolver y visuali zar los AN. Se basa en la diferente velocidad de migración a través de un soporte poroso que tienen moléculas cargadas sometidas a un campo eléctrico. Dicha velocidad de migración de las moléculas es proporcional a la intensidad del campo eléctrico. La visualización de l os AN resuelto se basa en el teñido fluorescente del ADN utilizando un agente intercalante (Bromuro de Etidio: bajo luz UV produce una señal fluorescente, como es cancerígeno pueden usarse SyberSafe, GoodView (estos compuestos no atraviesan las membranas celulares) Las moléculas de ADN están cargadas negativamente, presentando una densidad de carga constante, por lo que la diferencia de velocidad de migración se basa en la diferencia de: tamaño (largo en pares de bases, pb), de conformación (li neal, circular cerrado o superenrollado) , en la formación de estructuras secundarias o por la unión de proteínas o ligandos específicos. Separación de fragmentos de ADN de diferente tamaño: la velocidad de migración a través del gel disminuye con el mayor tamaño del ADN. En el rango de pH en que se trabaja normalmente, la carga neta del ADN es negativa debido a la carga de los grupos fosfato. Dado que por cada par de bases hay dos grupos fosfato, la -
densidad de carga (relación carga/masa) es constante para moléculas de ADN de diferente tamaño, en su forma lineal . Las moléculas de mayor tamaño tendrán menor movil idad que las pequeñas por diferencia de fricción a través del gel. Para el ADN de doble hebra, la migración es inversamente proporcional al log 10 del número de pb en un intervalo determinado. La conformación del ADN afecta la migración: Fragmentos de ADN de igual tamaño en pares de bases, de idéntica secuencia nucleotídica, migran con diferente velocidad, en función de la conformación. Una molécula de ADN de determinada longitud (número de pb) puede presentarse en diferentes conformaciones: 1. superenrollada (ADN doble hebra circular cerrado superenrollado), (migra más) 2. forma lineal. 3. circular relajada (sin superenrollamiento) = migra menos -
Matrices más utilizadas son la agarosa y la poliacrilamida (fragmentos ADN cortos (de 5 a 500 pb), son más trabajosos de preparar, sin polimerizar es tóxica)
La agarosa es un polímero lineal formado por residuos alternados de D- y L-galactosa. Se prep ara fundiendo agarosa con un tampón, y dejando enfriar para que gelifique. El tamaño de los poros de la matriz depende de la concentración de la agarosa. La resolución de fragmentos de ADN en la electroforesis depende de esta concentración. La velocidad relativa de migración se ve afectada de diferente forma principalmente por la concentración y el tipo de soporte de electroforesis (por ejemplo agarosa), pero también por la intensidad del campo eléctrico y la fuerza iónica del “buffer” o l a presencia de agentes intercalantes. Si se qui ere determinar el tamaño de un fragmento de ADN por ele ctroforesis, por comparación de la migración respecto a un marcador de PM, únicamente puede compararse fragmentos que estén en conformación lineal. Para un determinado ADN y una determinada concentración de gel en una electroforesis hay una relación aproximadamente li neal entre el logaritmo del PM y su Rf (movili dad electroforética relativa). -
Otros factores que afectan la movilidad ele ctroforética
El intercalado del EtBr en las moléculas de AN afecta el superenrollamiendo, la carga neta, y la rigidez dependiendo de la concentración. La presencia de EtBr en la electroforesis modifica la migración de una molécula de ADN hasta un 15%. Otros factores que pueden afectar la separación de los AN son el campo eléctrico, la composición y secuencia de bases de los fragmentos de ADN, la temperatura y la composición del “buffer” de electroforesis.
PLÁSMIDOS Los plásmidos son moléculas de ADN extracromosómico que se encuentran naturalmente en las bacterias. Su tamaño varía entre 1 y 250 kb Tienen una estructura circular, covalentemente cerrada y contienen un origen de replicación. proveen de alguna característica que confiere una ventaja selectiva a la bacteria que lo posee Por ejemplo, resistencia a algún antibiótico. Tecnologia ADN – recombinante: es necesario insertar la secuencia de ADN que codi fica para la proteína de interés en un plásmido adecuado, el cual será incorporado en el si stema de expresión elegido para su producción. El proceso de aislar un fragmento de ADN ( inserto), de introducirlo en un plásmido, de amplificar y aislar la molécula recombinante, se denomina clonado o clonación. Una estrategia muy utilizada es la que se basa en el uso de enzimas de restricción. Enzimas de restricción Las endonucleasas de restricción son enzimas que forman parte del sistema de restricción-modificación de bacterias. El sistema de restricción-modificación tiene un rol de defensa en la bacteria para diferenciar el ADN propio del exógeno, y degradar el ADN exógeno preservando la integridad del propio. Las enzimas de restricción reconocen secuencias específicas en el ADN de doble cadena, palindrómicas, de 4 o 8 pares de bases y cortan las dos hebras en un sitio específico. Según la enzima, se pueden generar dos tipos de extremos en e l ADN, cohesivos o romos. Estos extremos pueden aparearse con cualquier otro extremo complementario. Fragmentos de cualquier ADN que hayan sido digeridos con la misma enzima de restricción podrán unirse por los extremos, por apareamiento de bases complementarias. De esta manera, si se digiere el inserto y el plásmido con la misma enzima se obtienen extremos cohesivos, complementarios, lo que facilita el clonado del i nserto en el plásmido. Finalmente, para unir dos fragmentos de ADN y formar el enlace fosfodiéster se utili za una enzima llamada ADN ligasa. Mapas de restricción Representación del ADN donde se muestran los sitios de corte de distintas enzimas de restricción sobre una secuencia de ADN particular. Estos sitios constituyen puntos de ref erencia sobre la secuencia Para construir un mapa de restricción el ADN se digiere con varias enzimas de restricción, cada una por separado y en todas sus combinaciones. Los fragmentos resultantes de la digestión se analizan mediante electroforesis. Se determina el tamaño de los fragmentos obtenidos por comparación con un estándar de peso molecular. Con el conjunto de los datos se construye el mapa cual un rompecabezas determinándose el orden y la ubicación precisa de los sitios de corte de las enzimas en la representación del ADN total. Los mapas de restricción son característicos de la secuencia nucleotídica del ADN y permiten elegir las enzimas adecuadas para clonar un inserto en el mismo.
