KỸ THUẬT TẠO DÒNG PHÂN TỬ Tạo dòng phân tử dùng kỹ thuật di truyền phân lập và làm thuần một gene và gồm các bước cơ bản sau Bước 1: Tách và phân đoạn DNA nguồn bằng enzyme cắt hạn chế. Bước 2: Gắn các đoạn DNA bị cắt ở trên vào các vector hoặc plasmid để tạo dòng. Bước 3: Biến nạp vector tái tổ hợp vào vi khuẩn hoặc tế bào vật chủ và giữ vector tái tổ hợp trong tế bào vật chủ, Bước 4: Tạo dòng, phát hiện và làm thuần dòng mục tiêu. Bước 5: Chọn lọc dòng có gene cần khuếch đại và nuôi cấy dòng mục tiêu để ly trích và nghiên cứu DNA tái tổ hợp. I.
Kỹ thuật tạo dòng phân tử là gì?
AND tái tổ hợp được dùng để chỉ các phân tử DNA được tại từ hai hay nhiều phân đoạn DNA xuất xứ từ các nguồn gốc khác nhau Kỹ thuật tái tổ hợp DNA còn được gọi là tạo dòng phân tử ( molecular cloning) Các bước tạo dòng phân tử 1. Bước 1 Sau khi tách được một lượng tế bào nhất định thì ta tiến hành cắt hay phân đoạn gene cần tạo dòng bằng enzyme cắt hạn chế. Tùy vào trình tự của gene đích mà ta lựa chọn enzyme cắt hạn chế phù hợp. Mỗi enzyme hạn chế nhận biết và cắt một trình tự DNA đặc trưng chứa 4 hoặc 4 căp nucleotide. Ví dụ: enzyme EcoRI chiết từ E.coli cắt trình tự GAATTC, enzyme TaqI của Thermus aquaticus cắt trình tự TCGA. Vì một enzyme hạn chế nhận biết một trình tự duy nhất, cho nên số vị trí cắt trên một phân tử DNA đặc biệt thường rất nhỏ.Các đoạn DNA cắt bởi enzyme hạn chế sẻ có đàu bằng hoặc đầu sole và có thể phân tách theo kích thước bằng điện di agarose gel để nghiên cứu Sau khi cắt bằng enzyme hạn chế thích hợp thì ta có một số lượng lớn các đoạn gene có trình tự khác nhau. II.
2. Bước 2 Bước này ta tiến hành gắn các đoạn DNA thu được ở trên sẻ được gắn đồng hóa trị in vitro vào vector tạo dòng bằng cách dùng enzyme gắn ligase.Trước khi gắn, vector được cắt ra ở một vị trí đơn, thông thường là cùng với enzyme được dùng để cắt DNA nguồn, nhằm tạo điều kiện kết dính bổ trợ cho các đầu của đoạn DNA chèn vào. Hai loại vector được sử dụng phổ biến nhất là một loại có nguồn gốc từ các plasmid của vi khuẩn và một loại khác có nguồn gốc virus xâm nhiễm vào tế bào vi khuẩn (phage). Các plasmid là những phân tử DNA mạch vòng, sợi đôi, kích thước từ 1200kb, kich thước tương đối nhỏ, mang nhiều gên chỉ thị chọn lọc cho phép xác định các nhân tố biến nạp và duy trì plasmid trong quần thể vi khuẩn. Các plasmid đuợc dùng phổ biến nhất hiện nay là các plasmid đa năng và thuộc thế hệ thứ 3. Tùy vào chiều dài của đoạn gene mà mình cần gắn mà ta chọn plasmid để gắn hay chọn phage, vì phage vector (phage λ) mang được đoạn DNA lớn hơn (15-23 kb) so với plasmid, dễ bảo quản và dễ tách ra để phân tích. 3. Bước 3 Biến nạp vector tái tổ hợp vào vi khuẩn hoặc tế bào vật chủ. Sau khi tạo được vector tái tổ hợp mang gene ngoại lai, việc tiếp theo là biến nạp nó vào tế bào vật chủ.Tế bào vật chủ thường được sử dụng là vi khuẩn E.coli để khuếch đại một lượng lớn DNA của plasmid tái tổ hợp cho các phân tích về sau. Hai phương pháp được dùng để biến nạp vector tái tổ hợp vào E.coli là điện biến nạp và hóa biến nạp.
Tùy vào ưu điểm và nhược điểm của mỗi phương pháp mà ta chọn phương pháp thích hợp để chuyển vector tái tô hợp vào tế bào vật chủ. Mục đích là tăng hiệu quả của việc biến nạp. 4. Bước 4 Sau khi biến nạp vector tái tổ hợp vào vi khuẩn hoặc tế bào vật chủ thì ta phải tạo điều kiện cho thể tái tổ hợp này phát triển. Nói cách khác thì phải để cho gene đưa vào được phiên mã, dịch mã và biểu hiện ra bên ngoài. DNA được tạo dòng trong plasmid sản xuất ra các khuẩn lạc khi các nuôi cấy biến nạp được dàn mỏng trên đĩa agar chứa môi trường sinh trưởng và nuôi cấy dưới những điều kiện thích hợp. Chúng ta có thể dựa và các khuẩn lạc tạo vết tan hay có kháng kháng sinh hay không để phân lập và chọn ra khuẩn lạc mang gene mình cần tạo dòng. Dựa vào các phương pháp khác nhau để ta nhận biết được khuẩn lạc nào mang vector tái tổ hợp mà mình quan tâm, từ đó chúng ta lấy ra đem đi phân lập, điện di để cắt lấy đoạn gene mà mình muốn tạo dòng. Nhằm làm thuần khiết dòng mục tiêu. 5. Bước 5 Sau khi tách chiết được đoạn gene mình quan tâm thì ta có thể tiến hành PCr để tăng số lượng đoạn gene này lên. Hoặc nuôi cấy các tế bào chứa các gene mình cần quan tâm để tăng số lượng và nghiên cứu cấu trúc và sản phẩm do gene này tạo ra. III.
Ứng dụng
Công nghệ sinh học sử dụng các tế bào sống để tạo ra các nguyên liệu hữu dụng cho con người: + Nấm men được dùng xản xuất bia, rượu vang.. + Các vi khuẩn được dùng sản xuất các chất kháng sinh, rượu và một số cản phẩm khác. Sự tạo dòng gene được dùng để sản xuất một lượng lớn protein. Phần lớn các gene có thể được chèn vào vi khuẩn hoặc nấm men. Các tế bào này có thể được dùng tạo ra một lượng lớn sản phẩm. Việc tạo dòng gene giúp tạo ra các giống cây trồng cho năng suất cao (lúa chuyển gene) và tăng khả năng chống chịu với điều kiện môi trường so với giống ban đầu. Việc tạo dòng gene có thể giúp tạo ra các giống cây trồng chuyển gene có mang vaccine tái tổ hơp, mà thay vì ta tiêm hay uống vaccine thì bây giờ ta có
thể ăn sản phẩm của cây chuyển gene. Giúp giảm chi phi sản xuất cho ngành y dược và giá thành sản phẩm giảm. Có một số sản phẩm như hormone, thuốc kháng sinh nếu sản xuất theo phương pháp truyền thống thì rất mất thoài gian và giá thành sản phẩm thì cao. Thông qua việc tạo dòng gene chuyển gene cần quan tâm hay mã hóa các protein quan tâm vào trong một loài sinh vật có tốc độ tổng hợp sản phẩm nhanh hơn thì giá thành sản phẩm sẻ rẻ hơn ( insulin, interleukin ) . Ngoài ra tạo dòng gene còn được ứng dụng trong việc xử lý môi trường, giúp giảm bớt ô nhiễm. Chúng ta phải tạo dòng gene khi gene mình cần quan tâm không biết có cấu trúc, dài ngắn nhu thế nào. Đồng thời số lượng gene quan tâm rất ít nên ta phải tiến hành clone nó lên để có đủ số lượng thichs hợp để phục vụ cho mục đích nghiên cứu và các mục đích khác nữa.
