ISO_11133-2 ES

Vencimiento consulta pública: 2008.07.11

PROYECTO DE NORMA EN CONSULTA PUBLICA

NCh3162/2.c2008 NCh3162/2.c2008 ISO/TS 11133-2:2003

Microbiología de los alimentos para consumo humano y animal - Guía para la preparación y producción de medios de cultivo - Parte 2: Guía práctica para los ensayos de rendimiento de medios de cultivo

Preámbulo El Instituto Nacional de Normalización, INN, es el organismo que tiene a su cargo el estudio y preparación de las normas técnicas a nivel nacional. Es miembro de la INTERNATIONAL ORGANIZATION FOR STANDARDIZATION (ISO) y de la COMISION PANAMERICANA DE NORMAS TECNICAS (COPANT), representando a Chile ante esos organismos. Este proyecto de norma se estudió a través del Comité Técnico Microbiología de los alimentos, alimentos, para establecer los criterios y métodos para los ensayos de rendimiento de los medios de cultivo. Este proyecto de norma es idéntico a la versión en inglés de la Especificación Técnica Internacional ISO/TS 11133-2:2003 Microbiology of food and animal feeding stuffs Guidelines on preparation and production of culture media - Part 2: Practical guidelines on performance performance testing testing of culture culture media. media. Para los propósitos de este proyecto de norma, se han realizado los cambios editoriales que se indican y justifican en Anexo D. La Nota Explicativa incluida en un recuadro en cláusula 2 Referencias normativas y en Anexo Bibliografía, es un cambio editorial que se incluye con el propósito de informar la correspondencia con norma chilena de las normas internacionales citadas en este proyecto de norma.

I

NCh3162/2 El proyecto de norma NCh3162/2 ha sido preparado por la División de Normas del Instituto Nacional de Normalización. El Anexo B forma parte del proyecto de norma. Los Anexos A, C y D no forman parte del proyecto de norma, se insertan sólo a título informativo.

II

Vencimiento consulta pública: 2008.07.11

PROYECTO DE NORMA EN CONSULTA PUBLICA

NCh3162/2.c2008 NCh3162/2.c2008 ISO/TS 11133-2:2003

Microbiología de los alimentos para consumo humano y animal - Guía para la preparación y producción de medios de cultivo - Parte 2: Guía práctica para los ensayos de rendimiento de medios de cultivo

0 Introducción Para realizar análisis microbiológicos de alimentos de manera fiable, es imprescindible utilizar medios de cultivo de calidad probada. Para todos los medios descritos en métodos normalizados, es imprescindible definir los criterios de aceptación mínimos requeridos para garantizar la fiabilidad de los mismos. Se recomienda que en la determinación de las características de rendimiento de un medio de cultivo se realicen ensayos que se ajusten a la presente norma. Esto se aplica a: a) medios deshidratados o listos para su empleo preparados comercialmente; b) medios de cultivo preparados a partir de sus componentes individuales en el laboratorio donde son utilizados. El establecimiento de criterios de rendimiento mínimos ampliamente aceptados debería conducir a productos comerciales de calidad más consistente y de este modo reducir el número de ensayos necesarios en el laboratorio donde son utilizados. Además los criterios mínimos de aceptación evaluados mediante los métodos definidos en esta norma se pueden utilizar por todos los laboratorios de microbiología para evaluar las propiedades productivas, selectivas y/o electivas de un medio de cultivo. Los requisitos de esta norma son prioritarios en la evaluación de la calidad de los medios para el análisis microbiológico de alimentos para consumo humano y animal.

1

NCh3162/2

1 Alcance y campo de aplicación Esta norma establece criterios y métodos para los ensayos de rendimiento de los medios de cultivo. Esta norma se aplica a: -

entidades comerciales que produzcan y/o distribuyan medios de cultivo listos para su uso, reconstituidos semielaborados o deshidratados, a los laboratorios de microbiología;

-

entidades no comerciales que suministran medios a terceros;

-

laboratorios de microbiología que preparan medios de cultivo para su propio uso y evaluan su rendimiento.

2 Referencias normativas Los documentos referenciados siguientes son indispensables para la aplicación de esta norma. Para referencias con fecha, sólo se aplica la edición citada. Para referencias sin fecha se aplica la última edición del documento referenciado (incluyendo cualquier enmienda). ENV ISO 11133-1 1)

Microbiology of food and animal feeding stuffs - Guidelines on preparation and production of culture media - Part 1: General guidelines on quality assurance for the preparation of culture media in the laboratory (ISO/TR 11133-1:2000).

NOTA EXPLICATIVA NACIONAL La equivalencia de las norma internacional señalada anteriormente con norma chilena, y su grado de correspondencia es el siguiente: Norma internacional ENV ISO 11133-1

Norma nacional En estudio NCh3162/1

Grado de correspondencia -

3 Términos y definiciones Para los propósitos de esta norma, se aplican los términos y definiciones indicados en ENV ISO 11133-1:2000 (NCh3162/1).

1)

2

ENV = European Prestandard.

NCh3162/2

4 Criterios para el control de calidad de rutina 4.1 Criterios de calidad generales 4.1.1 Calidad de los medios de cultivo La calidad de los medios de cultivo depende de la calidad de sus ingredientes individuales, su formulación correcta, la calidad de los procedimientos de preparación, la eliminación de los agentes microbianos contaminantes y las condiciones adecuadas de envasado y almacenamiento (ver ENV ISO 11133-1) (NCh3162/1). El fabricante o el que lo produce en el laboratorio debe cumplir con las características fisico-químicas de los medios de cultivo que se especifican en la norma correspondiente. Además, la evaluación de la calidad debe asegurar que el medio de cultivo es conforme con las condiciones establecidas, incluyendo: -

cantidad distribuida y/o el espesor;

-

aspecto, color y homogeneidad;

-

consistencia del gel;

-

contenido en humedad;

-

valor del pH;

-

capacidad tampón;

-

contaminación microbiana.

Los componentes individuales y cualquier suplemento nutritivo o selectivo deben también ser sometidos a procedimientos apropiados de evaluación de la calidad.

4.1.2 Calidad de los componentes individuales de los medios Los medios de cultivo descritos en normas internacionales se consideraron satisfactorios, sin embargo, debido a la variabilidad de su calidad, se puede admitir que los fabricantes de medios modifiquen la concentración de algunos ingredientes biológicos individuales, como se indica más abajo: -

peptonas y extractos de carne o de levadura según sus propiedades nutritivas;

-

agar según sus propiedades de gelificación;

-

sustancias tampón;

-

sales biliares, extracto de bilis y desoxicolato, colorantes antibacterianos, dependiendo de sus propiedades selectivas;

-

antibióticos dependiendo de su actividad. 3

NCh3162/2

4.2 Criterios de calidad microbiológica 4.2.1 Generalidades Los ensayos de rendimiento microbiológico se deben realizar sobre una muestra que sea representativa de un lote del producto final.

4.2.2 Contaminación microbiana Se debe analizar una cantidad representativa, dependiendo del tamaño del lote del medio de cultivo, para evaluar la contaminación microbiana mediante incubación en condiciones adecuadas. Se debería establecer, o bien ser especificado por el fabricante, el porcentaje máximo de placas o recipientes de medios líquidos que puedan presentar contaminación para cada medio. Los fabricantes deberían establecer especificaciones basadas en los componentes de los medios, límites ligados a los procesos y tipo de envase. NOTAS 1)

Las muestras a analizar deberían ser como mínimo una placa o tubo, o el 1% de las placas o tubos, desde el principio y una placa o tubo, o el 1% de las placas o tubos, desde el final del proceso de llenado o dispensación. Las placas o tubos se deberían incubar como mínimo durante 18 h a 37ºC o en las condiciones de incubación utilizadas habitualmente para este medio, según norma específica.

2)

Para los planes de muestreo estadístico consultar ISO 2859-1:1999 (NCh44).

4.2.3 Crecimiento 4.2.3.1 Generalidades Para evaluar cada lote de medio de cultivo completo, los componentes nutritivos o los suplementos, el crecimiento debe ser evaluado apropiadamente mediante: a) métodos cuantitativos; o b) métodos semicuantitativos; o c) métodos cualitativos. Las evaluaciones cuantitativas, semicuantitativas o cualitativas se deben realizar por los métodos descritos en esta norma o por otra técnica ampliamente aceptada. Para la interpretación de los resultados de los ensayos, es necesario comparar la cantidad de crecimiento del medio probado con la del medio de referencia. Por lo tanto, el uso de un medio de referencia específico es obligatorio para los métodos cuantitativos (ver norma específica o Anexo B).

4

NCh3162/2 Para los métodos semicuantitativos o cualitativos, el uso de un medio específico de referencia (ver norma específica correspondiente o Anexo B) o un medio de cultivo que de una reacción positiva, ayuda a interpretar los resultados. El medio de referencia debe ser seleccionado de un lote producido recientemente de reconocida buena calidad o, si se compara la estabilidad a largo plazo, un lote de otro suministrador o, un medio listo para su empleo, etc. Además, el crecimiento de las cepas objetivo o diana debe presentar un aspecto, tamaño y morfología típicos de las colonias y, el crecimiento de las cepas no objetivo o diana debe ser inhibido parcial o completamente.

4.2.3.2 Productividad Empleando un instrumento adecuado, se siembran los medios de cultivo sólidos, semisólidos o líquidos con un inóculo apropiado (ver 5.2.1.1) de la cepa de trabajo de cada uno de los microorganismos de control definidos. La productividad debe alcanzar un límite mínimo definido (ver norma específica correspondiente o Anexo B). Para los métodos cuantitativos la Relación de Productividad P R (1) se determina como sigue:

P R =

N S

(1)

N 0

en que: N S

=

recuento total de colonias obtenido en el medio de cultivo sometido al ensayo (obtenido de una o más placas);

N 0

=

recuento total de colonias obtenido en el medio de cultivo de referencia definido, obtenido de una o más placas y, deber ser ≥100 ufc.

NOTA - La relación de productividad de un medio no selectivo es al menos 0,7 para los microorganismos que puedan crecer fácilmente en ese medio. El P R del microorganismo objetivo o diana en un medio selectivo debería ser al menos 0,1. Estos valores son generalmente alcanzables, sin embargo se pueden aceptar criterios menos rigurosos para determinadas combinaciones de medios y microorganismos de control (ver norma específica correspondiente o Anexo B).

Para métodos semicuantitativos, las puntuaciones de sectores consecutivos de una placa inoculada mediante la técnica ecométrica se suman para obtener el índice de crecimiento G I , el cual varía según el medio de cultivo. Por ello es importante compararlos con índices previos y/o G I de un medio de referencia y asegurar que las variaciones no son excesivas. Una vez que se haya adquirido experiencia suficiente con el método, se puede también establecer el intervalo de variación esperado de cada medio de cultivo. Las evaluaciones cualitativas deben ser realizadas visualmente, asignando puntuaciones de crecimiento. 5

NCh3162/2 4.2.3.3 Selectividad Para la evaluación cuantitativa de la selectividad se siembran medios de cultivo selectivos y un medio de referencia con el inóculo adecuado (ver 5.2.1.2) del microorganismo de control definido, usando un instrumento adecuado. La selectividad debe alcanzar valores definidos (ver norma específica correspondiente o Anexo B). El factor de selectividad S F (2), se calcula como sigue: S F = D0 − D S

(2)

en que: D0

=

dilución más alta que muestra un crecimiento de al menos 10 colonias en el medio de referencia;

DS

=

dilución más alta que muestra un crecimiento comparable en el medio que se está evaluando.

S F , D0 y D S se expresan en logaritmos decimales.

NOTA - El

S F

de los microorganismos no objetivo o diana en un medio selectivo debería ser al menos 2. Este valor

es generalmente alcanzable. Sin embargo, se pueden aceptar criterios menos rigurosos para determinadas combinaciones de medios y microorganismos de control (ver norma específica correspondiente o Anexo B).

Para los métodos semicuantitativos y cualitativos, el crecimiento de la(s) cepa(s) no objetivo o diana debe ser inhibido total o parcialmente.

4.2.4 Características bioquímicas y fisiológicas (selectividad y especificidad) Con el objeto de obtener una descripción completa del rendimiento de un medio, se debería establecer la morfología de las colonias y las características diagnósticas, junto con el grado de selectividad. Las características esenciales de especificidad se deben definir y cumplir. En el caso de los medios diferenciales, se debería determinar, con un conjunto adecuado de cepas de control, la calidad de las características bioquímicas/fisiológicas del o de los microorganismos objetivos o dianas así como el grado de inhibición de los microorganismos no objetivos dianas.

4.2.5 Características para los ensayos de antimicrobianos La acción antimicrobiana de los antibióticos depende de sus característica de difusión en el agar y de cualquier efecto antagonista de los componentes presentes. Los medios utilizados para comprobar la presencia o la ausencia de sustancias antimicrobianas en muestras de alimentos deberían ser conformes con los métodos de referencia.

6

NCh3162/2

4.3 Evaluación del rendimiento e interpretación de los resultados Un lote de medio de cultivo funciona de manera satisfactoria si todos los microorganismos de control utilizados se comportan según las especificaciones dadas. Se debe aceptar si se cumplen tanto los criterios generales como los de calidad microbiológica.

5 Métodos para los ensayos de rendimiento de los medios de cultivo 5.1 Generalidades En esta claúsula se describen ejemplos de métodos de evaluación cuantitativos, semicuantitativos y cualitativos para medios sólidos y líquidos. En la mayoría de los casos, las técnicas semicuantitativas y cualitativas cumplen los requisitos relativos a los ensayos de rendimiento de un lote de medio de cultivo, en el laboratorio en el que es utilizado. En casos particulares, por ejemplo la evaluación de un nuevo medio o de un nuevo fabricante, etc., se deben realizar métodos de prueba cuantitativos por parte del laboratorio usuario. Se asume que se conocen las técnicas microbiológicas generales y por ello no se describen los métodos de manera exhaustiva. En Anexo B (ver también ENV ISO 11133-1) (NCh3162/1) se enumeran los microorganismos apropiados. NOTA - En el futuro, el propósito es que cada una de las normas, tanto nuevas como revisadas, para la detección o recuento de microorganismos específicos o de grupos de microorganismos, describan los microorganismos de control pertinentes que han de utilizar, junto con los criterios de aceptación para cada medio de cultivo descrito en esa norma.

En los medios líquidos, las interacciones que conducen al crecimiento con éxito de los microorganismos son más complejas, de ahí que la definición de los métodos para los ensayos de rendimiento es menos sencilla que en el caso de los medios sólidos. En los métodos de análisis que incluyen múltiples etapas, por ejemplo la detección de Salmonella, el aislamiento satisfactorio del microorganismo objetivo o diana se produce a través de complejas interacciones que tienen lugar en cada una de las etapas de crecimiento. En este caso se debería demostrar la productividad o selectividad, respectivamente, del método en su conjunto, utilizando para ello un ensayo de control con las muestras, cultivos y materiales de referencia apropiados. Esto es adicional para demostrar que cada uno de los componentes del medio es adecuado para su fin.

5.2 Microorganismos de control En Anexo B se indican las cepas de referencia apropiadas de los microorganismos objetivo o diana (productividad) y no objetivo o diana (selectividad) para cada medio de cultivo. Los microorganismos de control deberían cumplir los requisitos que se dan en ENV ISO 11133-1:2000, 5.2.2 (NCh3162/1), por ejemplo, cepas robustas, que crecen débilmente, bioquímicamente no reactivas o lesionadas, según corresponda. 7

NCh3162/2 Las recomendaciones respecto a la conservación y mantenimiento de las cepas de referencia se dan en ENV ISO 11133-1:2000, Anexo B (NCh3162/1).

5.2.1 Preparación de los cultivos de trabajo Los cultivos de trabajo se deben preparar como un cultivo puro en fase estacionaria en un caldo no selectivo, procedente de las cepas de referencia de reserva. Se pueden emplear diferentes técnicas pero se debe garantizar la pureza del inóculo y su normalización, lo que permite que se pueda utilizar posteriormente. NOTA - Se pueden emplear inóculos congelados si se puede demostrar que los microorganismos pueden sobrevivir durante el periodo escogido.

5.2.1.1 Cultivos de trabajo para ensayos de productividad Para ensayos cuantitativos de medios en placa para los microorganismos deseados, se usa un nivel de inóculo de aproximadamente 10 2 ufc. Para ensayos semicuantitativos o cualitativos de medios en placa, es necesario un nivel de inóculo entre 10 3 ufc y 104 ufc. Para ensayos de productividad de medios líquidos, se usa un nivel de inóculo entre 10 ufc y 100 ufc.

5.2.1.2 Cultivos de trabajo para ensayos de selectividad Para ensayos de selectividad de medios de cultivo se inocula en el medio en placa o en tubo, una suspensión del microorganismo no objetivo o diana que contenga entre 10 4 ufc y 106 ufc.

5.2.1.3 Condiciones de incubación Se incuban los medios de cultivo inoculados de acuerdo con las condiciones descritas en la norma correspondiente y las dadas en las tablas apropiadas del Anexo B.

5.3 Métodos para medios de cultivo sólidos 5.3.1 Métodos cuantitativos de siembra en placa 5.3.1.1 Generalidades El método es general y apropiado para la mayoría de los medios de cultivo sólidos. Puede no ser apropiado para ensayar algunos tipos de mohos.

5.3.1.2 Procedimiento -

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Se emplean cultivos de trabajo como los descritos en 5.2.1.

NCh3162/2 -

Se selecciona un número apropiado de placas representatrivas de cada lote que va a ser evaluado y se comprueba que la superficie de cada placa esté correctamente seca. Las placas del medio de referencia se deberían preparar de manera similar (ver ENV ISO 11133-1:2000, 4.4.4) (NCh3162/1).

-

Se extiende un inóculo del cultivo de trabajo diluido en la superficie de las placas de ensayo y en las de referencia, para obtener recuentos que entren dentro de los límites recomendados en 5.2.1.

NOTAS 1)

Se puede también utilizar el método de la gota en superficie de Miles-Misra modificado y otros sistemas basados en gotas o en siembra en espiral.

2)

Se puede utilizar también el método de siembra en profundidad para medios de cultivo empleados habitualmente para recuento por este método.

-

Se incuban las placas en las condiciones apropiadas definidas en las normas individuales.

-

Se cuentan las colonias presentes en cada placa o en cada gota, según corresponda. Se evalúa el tamaño y el aspecto de las colonias.

5.3.1.3 Cálculos Se puede calcular el recuento promedio del medio de cultivo, en función del volumen extendido en las placas y del factor de dilución. En el caso de los métodos de siembra por gotas, se debe tener en cuenta el número de gotas y su volumen.

5.3.1.4 Interpretación de los resultados Para interpretar los resultados, se debe calcular la relación de productividad

P R

(ver 4.2.3.2), y cuando sea apropiado, el Factor de Selectividad S F (ver 4.2.3.3).

5.3.2 Método semicuantitativo de siembra en estría basado en la ecometría 5.3.2.1 Generalidades El método de siembra en estría es adecuado para ensayos de rendimiento de medios de cultivo sólidos y líquidos, pero el método es solo semicuantitativo. Por ello los índices de crecimiento se dan a título indicativo y se pueden considerar solo como un ensayo suplementario para los medios de cultivo sólidos. Cuando se emplea este método, el medio de cultivo que se ensaya debería ser secado de forma homogénea y el procedimiento completo debe estar normalizado de tal forma que se puedan comparar los resultados de diferentes lotes.

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NCh3162/2 5.3.2.2 Procedimiento -

Las placas de agar se preparan de la manera habitual con unos 15 ml de agar. Los medios que se utilizan habitualmente para la técnica de siembra en profundidad, por ejemplo el Agar para Recuento en Placa (PCA), se pueden ensayar también mediante siembra en superficie en el medio solidificado.

-

Se utilizan cultivos de trabajo como se describe en 5.2.1.

-

Las placas se siembran en estrías con un asa de 1 µL como se indica en Figura 1. Con el asa se realizan cuatro líneas paralelas a intervalos de aproximadamente 0,5 cm en el sector A. La siembra en estría se repite en los sectores B y C y se acaba en el sector D con una sola línea. Se puede utilizar una plantilla bajo la placa para facilitar la siembra en estría.

-

Se utilizan los tiempos y temperaturas de incubación establecidos en los métodos normalizados.

NOTA - Sólo se debe introducir el asa en el cultivo, no el alambre. Es conveniente que el asa se cargue completamente con el cultivo. El exceso de líquido se debería eliminar presionando tres veces la parte más ancha del asa contra el borde del recipiente. Cuando se siembren las placas mediante estrías, es conveniente que el ángulo entre el asa y la superficie del agar esté entre 20º y 30º. La presión del asa en la superficie del agar y la rapidez de siembra en estría debe ser constante del principio a fin. Se debería evitar la introducción del asa en el caldo de cultivo mientras haya espuma y/o burbujas en su superficie.

Habitualmente se emplea el mismo asa para sembrar en estría todos los sectores, desde el A hasta el D sin flamear el asa entre las estrías. En algunos casos, cuando se espera un índice de crecimiento G I inferior para demostrar distintas diferencias, puede ser apropiado cambiar o esterilizar el asa entre la siembra de los Sectores A y B.

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NCh3162/2

5.3.2.3 Cálculo Después de la incubación, se evalúa el aspecto, el tamaño de las colonias y la intensidad de crecimiento y se calcula el índice G I . Cada estría que presente crecimiento se marca con 1. La máxima puntuación por placa es 16. Si sólo hay crecimiento en la mitad de su longitud, la estría se marca como 0,5. Una estría sin crecimiento o con crecimiento escaso (menos de la mitad de su logitud), se marca como 0. Las puntuaciones se suman para obtener el G I . Por ejemplo, si se obtuvo crecimiento en los Sectores A y B y en la mitad del Sector C, el G I sería de 10.

5.3.2.4 Interpretación de resultados El índice de crecimiento G I obtenido por una cepa objetivo o diana debería ser de 6 como mínimo para que se pueda concluir que el medio es aceptable. En el caso de medios no selectivos, el G I es generalmente más elevado. Además, el crecimiento de cepas objetivo o diana debe ser típico y, el crecimiento de las cepas no objetivo o diana debe estar parcial o completamente inhibido.

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NCh3162/2 5.3.3 Método cualitativo de siembra en estría 5.3.3.1 Generalidades El método es apropiado para ensayos suplementarios de rendimiento de medios de cultivo sólidos. El método es sólo cualitativo y por ello las puntuaciones son sólo indicativas.


Las placas de agar se preparan de la manera habitual con unos 15 ml de agar. Los medios que se utilizan habitualmente para la técnica de siembra en profundidad, por ejemplo el Agar para Recuento en Placa (PCA), se pueden ensayar también mediante siembra en superficie de medios solidificados.

-

Se utilizan cultivos de trabajo como se describe en 5.2.1.

-

Los microorganismos de control se siembran en estría en líneas paralelas con un asa de 1 µL, en la superficie del medio de ensayo. Se pueden sembrar varios microorganismos de control en estrías en la misma placa, sin que las estrías se crucen.

NOTA - Se pueden emplear otras técnicas normalizadas de siembra en estría.

-


5.3.3.3 Interpretación de resultados Se evalúa el crecimiento de las placas después de la incubación como: -

0 corresponde a crecimiento nulo;

-

1 corresponde a un crecimiento débil; y

-

2 corresponde a un crecimiento bueno.

Los microorganismos objetivo o diana deben tener una puntuación de 2 y un aspecto, tamaño y morfología de las colonias típicas. El crecimiento de los microorganismos no objetivo o diana debe estar parcial o completamente inhibido (0 ó 1).

5.4 Métodos para medios de cultivo líquidos 5.4.1 Generalidades Para determinar la productividad de un medio líquido, se debe utilizar un inóculo adecuado. Los métodos cuantitativo, semicuantitativo y cualitativo que se describen más adelante evalúan la productividad y selectividad. Los métodos propuestos determinan la cantidad de crecimiento, después de la incubación apropiada, mediante la siembra de los 12

NCh3162/2 medios líquidos en placa o en estría en medios de agar, realizándose un recuento de unidades formadoras de colonias (ufc) o calculando una puntuación a partir del medio líquido. Para los métodos cualitativos en medios líquidos se evalúan visualmente las reacciones características.

5.4.2 Método cuantitativo de dilución para microorganismos objetivo o diana y no objetivo o diana El método es también apropiado para la evaluación de medios de cultivo, caldos o diluyentes nuevos.


Se selecciona un número apropiado de tubos o porciones de 10 ml de cada lote de medio líquido que se va a evaluar.

-

Siembra de microorganismos objetivo o diana: Se siembra el caldo a evaluar y el caldo de referencia para cada organismo de control con un número bajo (por ejemplo de 10 ufc a 100 ufc en cada tubo; para la preparación del inóculo, ver 5.2.1) y se mezcla.

-

Siembra de microorganismos no objetivo o diana: Se siembra el caldo a evaluar y el caldo de referencia para cada organismo de control con un número más alto (>1 000 ufc en cada tubo; para la preparación del inóculo, ver 5.2.1) y se mezcla.

-

Siembra de microorganismos objetivo o diana y no objetivo o diana como cultivo mixto: Para evaluar cultivos mixtos en medios selectivos se siembra el caldo a evaluar y el caldo de referencia con un bajo número de microorganismos objetivo o diana (por ejemplo de 10 ufc a 100 ufc por cada tubo; para la preparación del inóculo ver 5.2.1) y en el mismo tubo con un número más alto de microorganismos no objetivo o diana (>1 000 ufc en cada tubo; para la preparación del inóculo ver 5.2.1) y se mezcla.

-

Siembra de microorganismos objetivo o diana y no objetivo o diana en líquidos de dilución y medios de transporte: Se inoculan los líquidos de dilución con los microorganismos de control (por ejemplo, de 100 ufc a 1 000 ufc por cada tubo; para la preparación del inóculo ver 5.2.1) y se mezcla.

-


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NCh3162/2 Los líquidos diluyentes se deberían incubar durante 45 min a temperatura ambiente y después sembrar en placa. Los medios de transporte se deberían incubar durante un tiempo y una temperatura apropiados según su uso habitual y después sembrar en placa. -

Se toma una alícuota o si es necesario una dilución de cada caldo después de la etapa de incubación y se vuelve a aislar sobre una placa de agar no selectivo como se describe en 5.3.1.

NOTAS 1)

Para obtener colonias contables en las placas se puede utilizar el método de la gota en superficie de MilesMisra modificado, otros sistemas basados en gotas o siembra en espiral.

2)

Para evaluar cultivos mixtos, se deberían volver a aislar cuando sea posible en placas de agar no selectivo que permita la diferenciación de los microorganismos en el cultivo mixto (por ejemplo, agar para recuento en placa con MUG para contar Escherichia coli y Salmonella spp.). Cuando no sea posible distinguir cultivos mixtos en agar no selectivo, se deberían utilizar medios de agar selectivos siempre que su rendimiento se haya evaluado previamente.

5.4.2.2 Lectura, cálculo e interpretación de resultados Después de la incubación, se cuentan las colonias de los microorganismos objetivo o diana y no objetivo o diana, distinguiendo los diferentes tipos en el caso de cultivo mixtos. Los cálculos e interpretaciones deben corresponder al objeto del examen: a) interpretación comparativa entre el caldo de referencia y el caldo a evaluar usando las cifras de P R y S F como se describió en 4.2.3.2 y 4.2.3.3: - para los microorganismos objetivo o diana el P R no debe ser <0,1 (la diferencia en el crecimiento no excede un orden de magnitud); - para los microorganismos no objetivo o diana S F debe ser al menos igual a 2; - en los cultivos mixtos el crecimiento de los microorganismos objetivo o diana no debe ser inhibido por los microorganismos no objetivo o diana, es decir los microorganismos objetivo o diana deben ser siempre la población dominante. b) en otros casos es más apropiado alcanzar recuentos mínimos determinados para los microorganismos objetivo o diana y recuentos máximos para microorganismos no objetivo o diana: - los microorganismos objetivo o diana deben alcanzar 10 6 ufc/ml a 10 8 ufc/ml; - los microorganismos no objetivo o diana no deben superar las 10 4 ufc/ml en el caldo selectivo.

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NCh3162/2 c) para los líquidos de dilución y medios de transporte no se requieren ni un número reducido ni superior de organismos objetivo o diana y/o no objetivo o diana. El número de microorganismos después de la incubación en estos medios deben estar entre ± 50% del recuento inicial. NOTA - La calidad de un medio líquido con respecto a las propiedades de crecimiento óptimo se indica de manera más adecuada durante la fase de crecimiento inicial. La observación de la duración de la fase de latencia y el crecimiento durante la fase de latencia inicial, proporcionan la información más sensible de la productividad y selectividad de los microorganismos objetivo o diana y no objetivo o diana respectivamente, en los caldos de prueba y de referencia. Por lo tanto, si sólo se buscan diferencias menores en la calidad de los medios se deberían volver a aislar los medios líquidos en las placas después de un período corto de incubación de por ejemplo 6 h o 12 h.

5.4.3 Método semicuantitativo del tubo único para microorganismos objetivo o diana, no objetivo o diana y mixtos 5.4.3.1 Procedimiento -

Se selecciona un número apropiado de tubos o de porciones de 10 ml de cada lote que se va a probar (ver 4.2.2).

-

Siembra de organismos objetivo o diana y no objetivo o diana como cultivo mixto: Se siembra un tubo de caldo de prueba con unas 10 ufc a 100 ufc de microorganismos objetivo o diana y en el mismo tubo se siembra un número mas alto de microorganismos no objetivo o diana (>1 000 ufc por cada tubo) y se mezcla.

-

Siembra de microorganismos no objetivo o diana: Se siembra un tubo de caldo de prueba por microorganismo con un número más alto (>1 000 ufc) y se mezcla.

-


-

Se toman 10 µL del cultivo mixto y se vuelven a aislar en una placa del medio selectivo específico para el microorganismo objetivo o diana.

-

Se toma un asa (10 µL) del cultivo del microorganismo no objetivo o diana y se vuelve a aislar en una placa de un medio no selectivo (por ejemplo TSA).

-

Se incuban ambas placas en condiciones apropiadas durante un tiempo adecuado, como se indica en las normas individuales.

5.4.3.2 Cálculo e interpretación de los resultados La productividad del medio líquido evaluado es satisfactoria si en la placa de agar selectivo han crecido como mínimo 10 colonias del microorganismo objetivo o diana. La selectividad del medio líquido evaluado es satisfactoria si en la placa agar no selectivo no hay crecimiento (o menos de 10 ufc) del microorganismo no objetivo o diana. 15

NCh3162/2 5.4.4 Método cualitativo del tubo único 5.4.4.1 Generalidades El método es adecuado para ensayos de rendimiento de medios de cultivo líquidos. El método es solo cualitativo y por ello las puntuaciones son solo indicativas. Los medios turbios, por ejemplo caldo de tetrationato, no se pueden evaluar por este método.


para probar el rendimiento de medios de cultivo líquidos se siembran directamente los cultivos de trabajo en el medio que se está probando empleando un asa de 1 µL;

-

se utilizan los tiempos y temperaturas de incubación establecidos en los métodos normalizados individuales.

5.4.4.3 Interpretación de los resultados La evaluación cualitativa se debe realizar visualmente asignando puntuaciones de crecimiento, por ejemplo de 0 a 2. Para tubos y frascos -

0 corresponde a una turbidez nula;

-

1 corresponde a una turbidez muy ligera;

-

2 corresponde a una turbidez elevada.

La puntuación de un microorganismo objetivo o diana debe ser 2. NOTAS 1)

A veces, el crecimiento de los microorganismos se puede observar sólo como una agregación o depósito de células en el fondo del tubo o del frasco. En este caso una agitación cuidadosa puede mejorar la evaluación y la interpretación.

2)

También se pueden evaluar por este método otras características como la formación de gas, cambio de color, etc.

6 Documentación de los resultados de los ensayos 6.1 Información suministrada por el fabricante El fabricante o proveedor del medio de cultivo debe suministrar, bajo petición, las características específicas de crecimiento microbiológico e información general relativa al lote específico del medio de cultivo, ver ENV ISO 11133-1:2000, 4.1.1 (NCh3162/1).

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NCh3162/2

6.2 Trazabilidad Todos los datos de los ensayos de rendimiento de rutina deberían ser documentados de una manera apropiada y conservados durante un período de tiempo suficiente de acuerdo con el sistema de calidad seguido. Se recomienda el empleo de hojas de control para documentar y evaluar los resulatados de los ensayos (ver Anexo A).

17

NCh3162/2

Anexo A (Informativo)

Ejemplo de ficha para registrar los resultados de los ensayos de los medios de cultivo preparados por el laboratorio usuario Tabla A.1 - Ejemplo de una ficha Ficha de control para ensayos internos de la calidad de los medios de cultivo Medio de cultivo: Medio deshidratado referencia):

Volumen preparado:

Fecha de vertido:

Número de lote interno:

(y Suministrador:

Lote

Cantidad:

Fecha/firma:

Suministrador:

Lote

Cantidad:

Fecha/firma:

Ph medido:

Calidad confirmada:

Defectos:

Fecha/firma:

Defectos:

Fecha/firma:

Defectos:

Fecha/firma:

Defectos:

Fecha/firma:

Defectos:

Fecha/firma:

Calidad confirmada:

Número de placas o

Fecha/firma:

Sí

Tubos contaminados:

Suplemento:

Comentarios sobre el proceso: Control de calidad físico Valor de pH esperado:

Sí Cantidad que se espera llenar

Observado

Calidad confirmada: Sí

y/o espesor de la capa: Color esperado:

Observado

No No


No

Limpidez esperada / presencia Observado de

Calidad confirmada:

defectos ópticos

Sí

Estabilidad esperada del agar /

Observado


consistencia / humedad

No No

Contaminación microbiana Número de probados: Incubación:

placas

o

tubos Resultado:

No

Crecimiento microbiano - Productividad

Método de control:

Cuantitativo

Cualitativo

Cepas:

Resultado:

Calidad confirmada:

Fecha/firma:

Criterios:

Sí

Incubación: Medio de referencia:

No

Crecimiento microbiano - Selectividad

Método de control:

Cuantitativo

Cualitativo

Cepas:

Resultado:

Calidad confirmada:

Fecha/firma

Criterios:

Sí

Incubación: Medio de referencia:

No

Crecimiento microbiano - Especificidad

Método de control:

Cuantitativo

Cualitativo

Cepas:

Resultado:

Calidad confirmada:

Fecha/firma:

Criterios:

Incubación: Medios de referencia:

Sí

No

Sí

No

Visto bueno del lote Detalles de almacenamiento

18

Visto bueno del lote

Fecha/firma:

NCh3162/2

Anexo B (Normativo)

Microorganismos de control recomendados para medios de cultivo utilizados habitualmente (se da información del medio de cultivo, condiciones de cultivo, microorganismos de control, número de la colección del cultivo de los organismos de control y las reacciones esperadas) Las Tablas B.1 a B.6 han sido establecidas teniendo en cuenta las cepas de control empleadas en la Farmacopea Europea y las recomendaciones de la Farmacopea para medios de cultivo en microbiología de alimentos (grupo de trabajo del ICFMH). Estos criterios serán incluidos en las normas específicas cuando se preparen o revisen en el futuro (normas nuevas o revisiones). Un lote de medio validado es un lote de medio que ha mostrado un rendimiento satisfactorio. Se permite el empleo de cepas equivalentes de otras colecciones de referencia (por ejemplo NCTC, CIP…). Todos los medios citados están descritos en normas EN e ISO. Tabla B.1 - Medios selectivos para recuento de microorganismos

Medio

Tipo

Baird Parker

Sa)

RPFA

S

Microorganismos Estafilococos coagulasa positivos

Estafilococos coagulasa positivos

Medio de referencia

Método de control

Criterios

S. aureus ATCC 6538 S. aureus ATCC 25923b)

TSA

Cuantitativo

PR≥0,5

48 h/ 37ºC

E. coli ATCC 25922 ó 8739b)

-

Cualitativo

Especificidad

24 h -48 h/ 37ºC

S. epidermidis ATCC 12228b)

-

Cualitativo

Productividad

24 h -48 h/ 37ºC

S.aureus ATCC 6538 ó 6538 P S. aureus ATCC 25923b)

TSA

Cuantitativo

Norma

Función

Incubación

Cepas de control

EN ISO 6888-1

Productividad

24 h -48 h/ 37ºC

Selectividad

EN ISO 6888-2

Reacciones características

Colonias negro/gris con halo claro (reacción de aclaramiento de la yema de huevo) Inhibición total Colonias negro/gris sin reacción de aclaramiento de la yema de huevo PR≥ 0,5 Colonias negro/gris con halo de opacidad (continúa)

19

NCh3162/2 Tabla B.1 - Medios selectivos para recuento de microorganismos (continuación)

Medio

Cloranfenicol u OGA (OGY)

Tipo

S

Microorganismos

Levaduras/ Mohos

Norma

ISO 7954

Función

Incubación

Cepas de control

Medio de referencia

Método de control

Selectividad

48 h/ 37ºC

E. coli ATCC 25922 ó 8739b)

-

Cualitativo

Especificidad

24 h -48 h/ 37ºC 3-5 días/ 25ºC

S.epidermidis ATCC 12228b)

-

Cualitativo

Inhibición total -

C. albicans ATCC 10231 A. niger ATCC 16404b) P. cyclopium ATCC 16025 S. cerevisiae ATCC 9763b)

Cuantitativo

PR≥ 0,5

Cuantitativo

72 h/ 30ºC

Lote de medio MRS ya validado -

Inhibición total PR≥ 0,5

Selectividad Productividad

TSA

Cuantitativo

Selectividad

24 h - 48 h/ 30ºC 48 h/ 37ºC

E. coli ATCC 25922 ó 8739b) B. subtilis ATCC 6633 L. sake ATCC 15521b) Ped. damnosus ATCC 29358 Lc. lactis ATCC 19435b) E.coli ATCC 25922 u 8739b) B. cereus ATCC 11778 B. cereus ATCC 11778b)

Cualitativo

Productividad

3-5 días/ 25ºC 72 h/ 30ºC

Lote de medio SDA (Sabouraud Dextrosa Agar) u OGA o Agar cloranfenicol -

E. coli ATCC 25922 u 8739b)

-

Cualitativo

Especificidad

48 h/ 37ºC

B. subtilis ATCC 6633b)

-

Productividad

48 h/ 37ºC

TSA

Cuantitativo

Selectividad

48 h/ 37ºC

L. mono 1/2a ATCC 19111 L. mono 4b ATCC 13932b) E. coli ATCC 25922 u 8739b) E. faecalis ATCC 29212 u 19433 C. albicans ATCC 10231

-

Cualitativo

Productividad

Selectividad MRS

MYP

Oxford

S

S

S

Bacteria ácido láctica

Bacillus cereus

Listeria monocytogenes

ISO 15214

EN ISO 7932 (NCh3116)

EN ISO 11290 (NCh2657/2)

Cualitativo

Criterios

Inhibición total PR≥ 0,7 Inhibición total -

Reacciones características Colonias negro/gris sin halo de opacidad Colonias características según cada especie

Colonias características según cada especie Colonias rosas con halo de precipitación -

Colonias amarillas sin halo de precipitación PR≥ 0,5 Colonias de gris a negro con halo negro Inhibición total (continúa)

20

NCh3162/2 Tabla B.1 - Medios selectivos para recuento de microorganismos (continuación)

Medio

Tipo

PALCAM

S

TS(C)

VRBG

VRBL

CTSMAC

S

S

S

S

Microorganismos

Norma

Función

Incubación

Cepas de control


EN ISO 11290 (NCh2657/2)

Productividad

48 h/ 37ºC

Selectividad

72 h/ 30ºC

EN ISO 7937 (NCh3061)

Productividad

L. mono 1/2a ATCC 19111 L. mono 4b ATCC 13932b) E. coli ATCC 25922 u 8739b) E. faecalis ATCC 29212 ó 19433 Cl. perfringens ATCC 13124 Cl. perfringens ATCC 12916

Clostridium perfringens

Enterobacterias

Coliformes

Escherichia coli O157

ISO 7402 ISO 8523

ISO 4832

ISO 16654

20 h/ 37ºC atmósfera anaerobia Selectividad TSC 20 h/ 37ºC atmósfera anaerobia Especificidad TS

E. coli ATCC 25922 u 8739

Medio de referencia

Método de control

Criterios

TSA

Cuantitativo

PR≥ 0,5

-

Cualitativo

Lote de medio TS(C) ya validado -

Cuantitativo


Cualitativo

-

Cualitativo

Inhibición total -

Productividad

24 h/ 37ºC

E. coli ATCC 25922 u 8739b) S. typhimurium ATCC 14028

TSA

Cuantitativo

PR≥ 0,5

Selectividad

24 h/ 37ºC

E.faecalis ATCC 29212 ó 19433b)

-

Cualitativo

Productividad

24 h/ 30ºC


TSA

Cuantitativo


Selectividad

24 h/ 30ºC

E. faecalis ATCC 29212 ó 19433b)

-

Cualitativo

Especificidad

24 h/ 30ºC

Ps. aeruginosa ATCC 27853

-

Cualitativo

Inhibición total -

Productividad

24 h/ 37ºC

E. coli O 157:H7 ATCC 43894 ó 43895b) (no tóxicas)

TSA

Cuantitativo

PR≥ 0,5

Selectividad

24 h/ 37ºC

S.aureus ATCC 6538 ó 25923b)

-

Cualitativo

Especificidad

24 h/ 37ºC

E. coli ATCC 11775 ó 25922b)

-

Cualitativo

Inhibición total -

Reacciones características Colonias gris-verdosas a negro con halo negro Colonias negras

Colonias blancas Colonias de rosado a rojo con o sin halo de precipitación Colonias púrpura con o sin halo de precipitación Colonias de incoloras a beige Colonias transparentes con un aspecto amarillento pálido marrón y un diámetro de aproximadamente 1 mm Colonias rosadas (continúa)

21

NCh3162/2 Tabla B.1 - Medios selectivos para recuento de microorganismos (conclusión)

Medio

Tipo

Microorganismos

Norma

Función

Incubación

Cepas de control

Medio de referencia

Método de control

BGBLB

Lc)

Coliformes

ISO 4831

Productividad

24 h - 48 h/ 30ºC


-

Semicuantitativo

-

Cualitativo

-

Semicuantitativo

C. freundii ATCC 43864 Selectividad LST

L

Coliformes

ISO 4831

Productividad

24 h - 48 h/ 30ºC 24 h - 48 h/ 30ºC

E. faecalis ATCC 29212 ó 19433b) E. coli ATCC 25922 u 8739b) C. freundii ATCC 43864

EC

L

Escherichia coli

ISO 7251

Selectividad

-

Productividad

24 h - 48 h/ 44ºC

Selectividad

24 h - 48 h/ 44ºC

a)

S = medio sólido.

b)

Cepas a emplear por el laboratorio usuario (mínimo).

c)

L = medio líquido.

E. faecalis ATCC 29212 ó 19433b) E. coli ATCC 25922 u 8739b)

-

Cualitativo

-

Semicuantitativo

Ps. aeruginosa ATCC 27853b)

-

Cualitativo

NOTA - Para los medios de cultivo sólidos es posible también utilizar un método en placa semicuantitativo.

22

Criterios Turbidez 2+ Gas en 1/3 de la campana Durham Ausencia de crecimiento Turbidez 2+ Gas en 1/3 de la campana Durham Ausencia de crecimiento Turbidez 2+ Gas en 1/3 de la campana Durham Ausencia de crecimiento

Reacciones características Producción turbidez

de

gas

y

de

gas

y

de

gas

y

Producción turbidez

Producción turbidez

-

NCh3162/2

Tabla B.2 - Medios no selectivos para recuento de microorganismos

Medio PCA

Tipo a)

S

Microorganismos Flora total

Norma ISO 4833

Función Productividad

a)

S = medio sólido.

b)


Incubación 72 h/ 30ºC

Cepas de control

Medio de referencia

Método de control

Criterios


TSA

Cuantitativo

PR≥ 0,7

-

b)

E. coli ATCC 25922 ó 8739 S. aureus ATCC 6538 ó 6538P B. subtilis ATCC 6633b)

Tabla B.3 - Medios de enriquecimiento selectivos

Medio

Tipo

EE

La)

HalfFraser

L

Microorganismos

Norma

Función

Incubación

Cepas de control

Enterobacterias

ISO 7402 ISO 8523

Productividad

24 h/ 37ºC

Selectividad

24 h/ 37ºC

Productividad

24 h/ 30ºC

Selectividad

24 h/ 30ºC

E. coli ATCC 25922 u 8739b) o S. typhimurium ATCC 14028 + E. faecalis ATCC 29212 ó 19433b) L. mono 1/2a ATCC 19111 o L. mono 4b ATCC 13932b) + E.coli ATCC 25922 u 8739b) + E. faecalis ATCC 29212 ó 19433b) E. coli ATCC 25922 ó 8739b)


EN ISO 11290-1

E. faecalis ATCC 29212 ó 19433

Medio de referencia

Método de control

-

Semicuantitativo

>10 col. en VRBG

-

Semicuantitativo Semicuantitativo

Inhibición total

Colonias de rosado a rojo con o sin halo de precipitación -

>10 col. en Oxford o PALCAM

Colonias de gris a negro con halo negro

Inhibición total en TSA <100 colonias en TSA

-

-

-

Semicuantitativo

Criterios


(continúa)

23

NCh3162/2

Tabla B.3 - Medios de enriquecimiento selectivos (continuación)

Medio

Tipo

Fraser

L

ITC

Park & Sanders

Preston

L

L

L

Microorganismos Listeria monocytogenes

Yersinia enterocolitica

Campylobacter

Campylobacter

Norma

Función

Incubación

Cepas de control

EN ISO 11290-1

Productividad

48 h/ 37ºC

Selectividad

24 h - 48 h/ 37ºC

L. mono 1/2a ATCC 19111 o L. mono 4b ATCC 13932b) + E. coli ATCC 25922 ó 8739b) +E.faecalis ATCC 29212 ó 19433b) E. coli ATCC 25922 u 8739b)

ISO 10273

ISO 10272

ISO 10272

Productividad

48 h/ 25ºC

Selectividad

48 h/ 25ºC

Productividad

Ver norma

Selectividad

Ver norma

Productividad

18 h/ 42ºC

Selectividad

18 h/ 42ºC

E. faecalis ATCC 29212 ó 19433 Y. enterocolitica ATCC 23715 ó 9610b) + E. coli ATCC 25922 ó 8739b) +Ps. aeruginosa ATCC 27853b) Ps. aeruginosa ATCC 27853b) P. mirabilis ATCC 29906 C. coli ATCC 43478* o C.jejuni ATCC 33291 ó 29428* +E. coli ATCC 25922 u 8739b) +P. mirabilis ATCC 29906b) E. coli ATCC 25922 u 8739b) P. mirabilis ATCC 29906 C. coli ATCC 43478b) o C. jejuni ATCC 33291 ó 29428b) + E. coli ATCC 25922 u 8739b) +P. mirabilis ATCC 29906b) E. coli ATCC 25922 u 8739b) P.mirabilis ATCC 29906

Medio de referencia

Método de control

Criterios


-

Semicuantitativo

>10 col. en Oxford o PALCAM

Colonias de gris a negro con halo negro

-

Semicuantitativo

-

-

Semicuantitativo

Inhibición total en TSA <100 colonias en TSA >10 col. en CIN o SSDC

-

SemiInhibición total en cuantitativo TSA Semi>10 col. en medio Colonias características cuantitativo Karmali u otro medio según cada medio elegido (ver norma)

-

-

-

Colonias características según cada medio (ver norma)

SemiInhibición total en cuantitativo TSA Semi>10 col. en medio Colonias características cuantitativo Karmali u otro medio según cada medio elegido (ver norma)

Semicuantitativo

Inhibición total en TSA

(continúa)

24

NCh3162/2

Tabla B.3 - Medios de enriquecimiento selectivos (continuación)

Medio

Tipo

PSB

L

MKTTn

Rappaport Vassiliadis

RVS

L

L

L

Microorganismos

Norma

Función

Incubación

Cepas de control


ISO 10273

Productividad

3-5 días/ 25ºC

Selectividad Productividad

3-5 días/ 25ºC 24 h/ 37ºC

Selectividad

24 h/ 37ºC

Y. enterocolitica ATCC 23715 ó 9610b) + E. coli ATCC 25922 ó 8739b) +Ps. aeruginosa ATCC 27853b) Ps. aeruginosa ATCC 27853b) P.mirabilis ATCC 29906 S. typhimurium ATCC 14028b) o S. enteritidis ATCC 13076b) +E.coli ATCC 25922 u 8739b) +Ps. aeruginosa ATCC 27853b) E. coli ATCC 25922 u 8739b)

Salmonella

Salmonella

Salmonella

ISO 6579

EN 12824

ISO 6579

Productividad

24 h/ 41,5ºC

Selectividad

24 h/ 41,5ºC

Productividad

24 h/ 41,5ºC

E.faecalis ATCC 29212 ó 19433 S. typhimurium ATCC 14028b) o S. enteritidis ATCC 13076b) +E. coli ATCC 25922 u 8739 +Ps.aeruginosa ATCC 27853 E. coli ATCC 25922 u 8739b) E. faecalis ATCC 29212 ó 19433 S. typhimurium ATCC 14028 o S. enteritidis ATCC 13076b) +E.coli ATCC 25922 ó 8739b) +Ps.aeruginosa ATCC 27853*

Medio de referencia

Método de control

Criterios

-

Semicuantitativo

>10 col. en CIN o SSDC


-

Semicuantitativo Semicuantitativo

Inhibición total en TSA >10 col. en XLD u otro medio de elección

-

-

Semicuantitativo

Inhibición total en TSA <10 col. en TSA

-

-

Semicuantitativo

>10 col. en BGA u otro medio de elección


-

Semicuantitativo


-

-

Semicuantitativo

>10 col. en XLD u otro medio de elección


-



(continúa)

25

NCh3162/2

Tabla B.3 - Medios de enriquecimiento selectivos (conclusión)

Medio

Selenitocistina

Tipo

L

Microorganismos

Salmonella

Norma

EN 12824

Función

Incubación

Cepas de control

Medio de referencia

Método de control

Selectividad

24 h/ 41,5ºC

E.coli ATCC 25922 u 8739b)

-

Semicuantitativo


-

-

Semicuantitativo

>10 col. en BGA u otro medio de elección


-

Semicuantitativo

<100 colonias en TSA

-

Productividad

Selectividad

a)

L = medio líquido.

b)


26

E.faecalis ATCC 29212 ó 19433 24 h/ 37ºC S. typhimurium ATCC 14028b) o S. enteritidis ATCC 13076b) +E.coli ATCC 25922 u 8739b) +Ps.aeruginosa ATCC 27853b) 24 h/ 37ºC E.coli ATCC 25922 u 8739b) E.faecalis ATCC 29212 ó 19433

Criterios


NCh3162/2 Tabla B.4 - Medios de enriquecimiento no selectivos

Medio

Tipo

Microorganismos

Norma

Función

Incubación

Cepas de control

Medio de referencia

Método de control

Criterios


BHI

La)

Staphylococcus

ISO 6888

Productividad

24 h/ 37ºC

S. aureus ATCC 25923b)

-

Cualitativo

Turbidez de 1 a 2

-

Brucella

L

Campylobacter

ISO 10272

Productividad

Cualitativo

Turbidez de 1 a 2

-

L

Líquidos de dilución

ISO 6887

Diluyente

C. coli ATCC 43478 C. jejuni ATCC 33291 ó 29428b) E. coli ATCC 25922 ó 8739b) S. aureus ATCC 25923

-

Peptona salina

2-5 días/ 25ºC 45 min/ 20ºC-25ºC

TSA

Cuantitativo

-

Thioglicolato

L

Productividad

24 h/ 37ºC

Cl. perfringens ATCC 13124b)

-

Cualitativo

± 50% col./T0 (±50% del recuento original Turbidez de 1 a 2

TSYEB

L

Productividad

24 h/ 25ºC

L. mono ½ a ATCC 19111 L. mono 4b ATCC 13932 b)

-

Cualitativo

Turbidez de 1 a 2

-

ISO 7937 Clostridium (NCh3061) perfringens Listeria ISO 11290 monocytogenes

a)

= L medio líquido.

b)


-

Tabla B.5 - Medios de aislamiento selectivos

Medio

Tipo

Microorganismos

Norma

Función

Incubación

Cepas de control

Medio de referencia

Método de control

Butzler modificado

Sa)

Campylobacter

ISO 10272

Productividad

24 h - 72 h/ 42ºC

C. coli ATCC 43478

-

Cualitativo

Buen crecimiento (2)


-

Cualitativo

Inhibición total o parcial (0-1) Inhibición total (0)

Colonias no características -

CCDA Karmali Preston

C. jejuni ATCC 33291 ó 29428b) Selectividad

Skirrow

Criterios

24 h - 72 h/ 42ºC

E. coli ATCC 25922 u 8739b) S. aureus ATCC 25923


(continúa)

27

NCh3162/2

Tabla B.5 - Medios de aislamiento selectivos (conclusión) Medio de referencia

Método de control

Y. enterocolitica ATCC 23715 ó 9610b)

-

Cualitativo



-

Cualitativo

-

Cualitativo

Inhibición total o parcial (0-1) Inhibición total (0) Buen crecimiento (2)

-

Cualitativo

Medio

Tipo

Micro-organismos

Norma

Función

Incubación

Cepas de control

CIN

S


ISO 10273

Productividad

24 h/ 30ºC

Selectividad

24 h/ 30ºC

SSDC

S. aureus ATCC 25923 Agar verde brillante (BGA)

S

Salmonella

EN 12824/ ISO 6579

Productividad

24 h - 48 h/ 37ºC

S. typhimurium ATCC 14028b)

Criterios

S. enteritidis ATCC 13076 Selectividad XLD

24 h - 48 h/ 37ºC

E. coli ATCC 25922 u 8739b) E. faecalis ATCC 29212 ó 19433

a)

S = medio sólido.

b)


28

Inhibición total o parcial (0-1) Inhibición total (0)

Reacciones características Colonias caracteristicas según cada medio (ver norma) Colonias no características Colonias características según cada medio (ver norma) Colonias no características -

NCh3162/2

Tabla B.6 - Medios de aislamiento no selectivos

Medio

Tipo

Microorganismos

Norma

Función

Incubación

Cepas de control

Medio de referencia

Método de control

Criterios


Agar nutritivo

Sa)

Enterobacteriaceae

ISO 7402 ISO 8523 EN 12824 ISO 6579 ISO 10273

Productividad

24 h/ 37ºC

E. coli ATCC 25922 u 8739c)

-

Cualitativo


-

24 h/ 37ºC

S. typhimurium ATCC 14028c)

24 h/ 30ºC

Y. enterocolitica ATCC 23715 ó 9610c)

EN ISO 11290

Productividad

24 h/ 37ºC

L. mono ½a ATCC 1911 ó L. mono 4b ATCC 13932b)

-

Cualitativo


-

Salmonella

Agar TSYEA

S

Yersinia enterocolitica Listeria monocytogenes

a)

S = Medio sólido.

b)

Cepas a emplear por el laboratorio (mínimo).

c)

Cepas de libre elección según el método utilizado.

29

NCh3162/2

Anexo C (Informativo)

Bibliografía Microbiology of food and animal feeding stuffs - Preparation of test samples, initial suspension and decimal dilutions for microbiological examination - Part 1: General rules for the preparation of the initial suspension and decimal dilutions.

[1]

EN ISO 6887-1

[2]

EN ISO 8261

[3]

prEN ISO 6887-2

Microbiology of food and animal feeding stuffs - Preparation of test samples, initial suspension and decimal dilutions for microbiological examination - Part 2: Specific rules for the preparation of meat and meat products.

[4]

prEN ISO 6887-3

Microbiology of food and animal feeding stuffs - Preparation of test samples, initial suspension and decimal dilutions for microbiological examination - Part 3: Specific rules for the preparation of fish and fishery products.

[5]

prEN ISO 6887-4

Microbiology of food and animal feeding stuffs - Preparation of test samples, initial suspension and decimal dilutions for microbiological examination - Part 4: Specific rules for the preparation of products other than milk and milk products, meat and meat products, and fish and fishery products.

[6]

ISO 7218:1996

[7]

ISO 2859-1:1999

[8]

Corry JEL, Curtis GDW, Baird RM, 1995 Culture Media for Food Microbiology. London: Elsevier Science, Volumen 34.

Milk and milk products - General guidance for the preparation of test samples, initial suspensions and decimal dilutions for microbiological examination.

Microbiology of food and animal feeding stuffs - General requirements and guidance for microbiological examinations Sampling procedures for inspection by attributes -- Part 1: Sampling schemes indexed by acceptance quality limit (AQL) for lot-by-lot inspection.

[9] Anon. 1998 Int. J. Food Microbiol. 45, 65.

30

NCh3162/2

NOTA EXPLICATIVA NACIONAL La equivalencia de las normas internacionales señaladas anteriormente con norma chilena, y su grado de correspondencia es el siguiente: Norma internacional

Norma nacional

Grado de correspondencia

EN ISO 6887-1

No hay

-

EN ISO 8261

No hay

-

prEN ISO 6887-2

No hay

-

prEN ISO 6887-3

NCh3033/3.Of2006

prEN ISO 6887-4

No hay

ISO 7218:1996

NCh2047.Of1999

ISO 2859-1:1999

NCh44.Of2007

Idéntica No equivalente Modificada

31

ISO_11133-2 ES

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