Introducción a la Microbiología Predictiva - Manual de prácticas de laboratorio

FUNDAMENTOS DE MICROBIOLOGÍA PREDICTIVA: Aplicaciones teóricas y prácticas.

Logaritmo N

ymáx

B

C

A

M λ

Tiempo (t)

ε

𝒚 = 𝑨 + 𝑪𝒆 −𝒆

−𝑩 𝒕−𝑴

Editor Enrique Cabeza Herrera UNIVERSIDAD DE PAMPLONA PAMPLONA – COLOMBIA

Título original: Autor: Editorial:

Fundamentos de Microbiología Predictiva: aplicaciones teóricas y prácticas, 1ª edición. Enrique Alfonso Cabeza Herrera, Ph.D. Universidad de Pamplona.

Copyright © 2011 by Enrique Cabeza Herrera All Righs Reserved Enrique Alfonso Cabeza Herrera Campus Universitario, Km 1 vía a Bucaramanga, Complejo Científico y Tecnológico Simón Bolívar, 2do piso. Pamplona - Colombia

I.S.B.N.: [email protected] http://sites.google.com/site/enalcahe

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FUNDAMENTOS DE MICROBIOLOGÍA PREDICTIVA: Aplicaciones teóricas y prácticas

Queda prohibida su reproducción total o parcial por cualquier medio sin el consentimiento expreso del autor

ENRIQUE ALFONSO CABEZA HERRERA

Ph.D., D.E.A. Ciencia y Tecnología de alimentos Especialista en Protección de Alimentos Microbiólogo

FACULTAD DE CIENCIAS BÁSICAS DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGÍA PAMPLONA – NORTE DE SANTANDER COLOMBIA 2013 ©

CONTENIDO

Pág. Unidad 1. Introducción a la Microbiología Predictiva Unidad 2. Matemáticas del crecimiento bacteriano. Unidad 3. Unidad 4. Unidad 5. Unidad 6. Unidad 7. Unidad 8. Unidad 9. Unidad 10. ACTIVIDADES PRACTICAS

Pág. Actividad 1. Actividad 2. Actividad 3. Actividad 4. Actividad 5. Actividad 6. Actividad 7. Actividad 8. Actividad 9. Actividad 10.

Fundamentos de Microbiología Predictiva: aplicaciones teóricas y prácticas

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Enrique Alfonso Cabeza Herrera, Ph.D.

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UNIDAD 1. INTRODUCCIÓN A LA MICROBIOLOGÍA PREDICTIVA

1.1. INTRODUCCIÓN

El modelamiento Predictivo es un campo promisorio de la microbiología, se trata de un área multidisciplinar emergente de la microbiología de alimentos, que combina disciplinas como las matemáticas, microbiología, ingeniería y la química para desarrollar y aplicar modelos matemáticos para predecir las respuestas de los microorganismos a variables ambientales específicas (McDonald y Sun, 1999). La Microbiología Predictiva (MP) se basa en la premisa de que las respuestas de las poblaciones microbianas a los factores ambientales son reproducibles, y que al considerar los ambientes en términos de dominios identificables es posible, a partir de las observaciones del pasado, predecir las respuestas de los microorganismos. La microbiología predictiva surge como una metodología alternativa a los métodos convencionales microbiológicos para asegurar la calidad y seguridad de los alimentos. La microbiología de alimentos ha utilizado herramientas y métodos de diagnóstico tradicionales que resultan ser muy engorrosos en cuanto a tiempo y gasto económico, ya que solo después de un tiempo relativamente largo se logran obtener resultados que indiquen la presencia, el tipo y cantidad de microorganismos patógenos y alterantes en los alimentos, haciendo que los resultados de laboratorio sean demorados. Posteriormente se ha recurrido a métodos “rápidos” que generan resultados cuantitativos en 15 horas aproximadamente, mediante el empleo de reacciones específicas de enzima-sustrato en medios de cultivo que generan cambios de color (medios cromógenos) o fluorescencia (medios fluorogénicos).

Finalmente se está recurriendo a análisis cualitativos de la calidad de alimentos mediante el empleo de técnicas moleculares, que permiten detectar en tiempo menores a 1 hora la presencia o ausencia de un microorganismo, especialmente los patógenos, como ejemplo de estos métodos tenemos la Reacción en Cadena de la Polimerasa “PCR” que permite detectar la presencia de estos microorganismos mediante la amplificación de un fragmento de su material genético, por otro lado tenemos las pruebas de aglutinación en partículas de látex, alginato u otra forma de encapsular bien sea un anticuerpo o un antígeno que reacciona con una fracción específica del microorganismo blanco, pudiendo detectarse la presencia o ausencia del mismo. Los anteriores métodos han permitido obtener resultados relativamente cortos en el tiempo pero un tanto costosos y con el inconveniente de que no se conoce el número exacto de microorganismos presentes.

La necesidad de tomar decisiones oportunas con respecto a la calidad microbiológica de los alimentos, ha hecho que se esté dando un impulso al desarrollo de herramientas bioinformáticas que resultan ser mucho más ágiles y económicas. En este sentido, ha tomado una importancia cada vez mayor la denominada “Microbiología Predictiva o Ecología Microbiana Cuantitativa. Con el desarrollo de la microbiología predictiva se puede predecir cuál será el comportamiento

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microbiano partiendo como base de que: “las respuestas de los microorganismos a los factores medioambientales son reproducibles”, por otra parte, el papel que juegan los microorganismos en los alimentos es cada día más relevante, no solo desde el punto de vista sanitario, por su impacto en la salud pública, sino también en el deterioro de los productos alimenticios que generan pérdidas económicas. Así mismo, la Microbiología Predictiva a través de interfaces con muchas otras disciplinas se ha convertido en un paradigma de la microbiología moderna de alimentos. Proporciona una base científica para sustentar el concepto de HACCP y la Evaluación Cuantitativa de Riesgos Microbiológicos.

Así

mismo, el uso de modelos predictivos pueden permitir estimar de la vida útil de alimentos, la seguridad microbiológica de los mismos, el aislamiento de puntos críticos y optimización de las cadenas de producción y distribución, también pueden dar una idea de cómo las variables medioambientales o condiciones químicas o físicas tales como la temperatura, pH y actividad de agua afectan la supervivencia de bacterias patógenas y alterantes. 1.2. HISTORIA DE LA MICROBIOLOGÍA PREDICTIVA

El uso de los modelos matemáticos en microbiología de alimentos no es nuevo, ya que Baird-Parker y Kilsby en 1987 informaron que los modelos de destrucción térmica de microorganismos por calor fueron establecidos en la literatura y la industria (Ross y McMeekin, 1994). De hecho, el origen de la microbiología predictiva puede remontarse hacia los años 20’s, cuando Esty y Meyer planearon en 1922 el modelo de la “Cocción botulínica”. Este modelo define el proceso térmico suficiente para destruir 1012 esporas de C. botulinum tipo A. Quizá debido al hecho de que el modelo tuvo aceptación entre los industriales y se convirtió en amplio uso en la industria alimentaria, no se vio la verdadera potencialidad predictiva de este tipo de modelos. El desarrollo histórico de la microbiología predictiva puede dividirse en tres etapas definidas: (1) orígenes, (2) estancamiento, y (3) evolución. Figura 1.1. Etapas del desarrollo de la Microbiología Predictiva



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Fuente: Autor 1.2.1. Orígenes de la Microbiología Predictiva

Como

habíamos comentado, los orígenes de la microbiología predictiva de alimentos pueden remontarse hacia los años 20. Esty y Meyer plantearon en 1922 un modelo que describe el tiempo mínimo de tratamiento térmico a 121°C que debe recibir todo alimento enlatado y con pH igual o mayor a 4.5, para reducir 12 veces la presencia de esporas de Clostridium botulinum tipo A, es decir, desde 1012 hasta 100. Este modelo fue denominado “Cocción botulínica”, y debido a su amplio uso en la industria de alimentos pudo perderse su carácter predictivo (XXXX, 19XX).

Scott en 1937 sentó las bases de los modelos cinéticos al afirmar que “el conocimiento de las velocidades de crecimiento de ciertos microorganismos a diferentes temperaturas es esencial para los estudios sobre el deterioro de la carne refrigerada. Con estos datos, debería ser posible predecir la influencia relativa de la alteración sobre el deterioro ejercida por los diferentes organismos en cada temperatura de almacenamiento”, además, “debería ser posible predecir el potencial alcance de los cambios en las poblaciones que diversos organismos pueden sufrir durante el período inicial de enfriamiento de las superficies de la carne en los mataderos cuando la superficie es con frecuencia mantenida a temperaturas muy favorables para la proliferación microbiana” (Ross y McMeekin, 1994).

Por otra parte, J. Monod (1949) sentó las bases del crecimiento bacteriano aplicado a la industria de la fermentación (McMeekin y Ross, 2002). Monod planteó que “El crecimiento bacteriano, a pesar de la inmensa complejidad de los fenómenos a los que se someten, en general, obedece a unas leyes relativamente sencillas que permiten definir ciertas características cuantitativas del ciclo de crecimiento, fundamentalmente las tres constantes de crecimiento: el crecimiento total (G), la tasa de crecimiento exponencial (R) y la fase de latencia



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(L)”.

1.2.2. Estancamiento Durante los años 60’s y 70’s la literatura sobre el tema permaneció silenciosa y el uso de modelos cinéticos se aplicaron para resolver problemas de alteración de alimentos, mientras que los modelos probabilísticos fueron empleados en los problemas de contaminación de alimentos y ETAS: botulismo. En 1973, Olley y Ratkowsky proponen el modelo de “Curva de Alteración Universal” dependiente de la temperatura en la alteración del pollo.

1.2.3. Evolución



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1.3. MODELAMIENTO MATEMÁTICO

Un

modelo es un análogo de la realidad física, típicamente simple e idealizada. Los modelos pueden ser físicos o matemáticos y son creados con el objetivo de obtener una idea de la realidad de la forma más conveniente. Un modelo físico puede ser una miniatura, tal como una versión preliminar de una pieza a escala de un equipo. Un modelo matemático es un



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análogo matemático de la realidad física, que describe las propiedades y características de un sistema real en términos de variables y operaciones matemáticas.

El

fenomenal crecimiento en el poder de la computación y la facilidad de uso de estas herramientas han permitido que los modelos puedan ser más realistas y han experimentado un rápido crecimiento en el uso de modelos en diseños y experimentación de productos, procesos y equipos. Entre las muchas ventajas de los modelos tenemos (1) reducción en el número de experimentos, así como del tiempo y gastos económicos; (2) proveen grandes ideas de los procesos (en caso de un modelo basado en la física) que regularmente no pueden ser posibles con la experimentación; (3) optimización de procesos; (4) capacidad predictiva, por ejemplo, formas de interpretar escenarios “qué si”; y (5) proveen mejoramiento en la automatización de procesos y capacidades de control (Datta y Sablani, 2006). 1.4. CLASIFICACIÓN DE LOS MODELOS PREDICTIVOS

Los

modelos predictivos microbiológicos pueden ser clasificados desde diversas dimensiones (Gershenfeld, 1999), sin embargo, un esquema de clasificación absoluta aún no ha sido decidido (McDonald y Sun, 1999). El uso uniforme de terminología y clasificación de los modelos en grupos que tienen funciones específicas pueden hacer de la microbiología predictiva una disciplina más exacta y de más fácil uso (Baranyi y Roberts, 1992). Sin embargo, solo el sistema de clasificación propuesto por Whiting y Buchanan (1993) puede agrupar la mayoría de modelos en primarios, secundarios y terciarios (McDonald y Sun, 1999).

Bibliografía Datta, A.K., Sablani, S.S. (2006). Chapter 1: Mathematical Modeling Techniques in Food and Bioprocesses: An Overview. In: Handbook of Food and Bioprocess Modeling Techniques / Editors, Shyam S. Sablani, Mohammad S. Rahman, Ashim K. Datta and Arun S. Mujumdar. Taylor and Francis Group, LLC. CRC Press. Boca Raton, FL, USA. Pages 1 – 11. Gershenfeld, N. (1999). The Nature of Mathematical Modeling. Cambridge: Cambridge University Press. Van Boekel, M.A.J.S., Tijskens, L.M.M. (2001). Kinetic Modelling. In: Food Process Modelling / Editors L.M.M. Tijskens, M.L.A.T.M. Hertog and B.M. Nicolaϊ. Woodhead Publishing Limited. CRC Press. Boca Raton, FL, USA. Pages 35 – 59. Baranyi, J., Pin, C. (2001). Modelling Microbial Safety. In: Food Process Modelling / Editors L.M.M. Tijskens, M.L.A.T.M. Hertog and B.M. Nicolaϊ. Woodhead Publishing Limited. CRC Press. Boca Raton, FL, USA. Pages 383 – 401. Baranyi, J., Roberts, T.A. (1992). A terminology for models in predictive microbiology – A reply to



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K.R. Davey. Food Microbiology, 9: 355. Ross, T., McMeekin, T.A. (1994). Review Paper: Predictive Microbiology. International Journal of Food Microbiology, 23: 241 – 264. McDonald, K., Sun, D-W. (1999). Predictive food microbiology for the meat industry: a review. International Journal of Food Microbiology, 52: 1 – 27.



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UNIDAD 2. MATEMÁTICAS DEL CRECIMIENTO BACTERIANO 2.1.

OBJETIVOS DE LA UNIDAD Al finalizar la unidad el lector estará en capacidad de:  Comprender los fundamentos matemáticos del crecimiento y muerte bacteriana.  Construir gráficos tanto de crecimiento como muerte empleando hojas de cálculo de cualquier programa ofimático (p.ej. Microsoft Office Excel, OpenOffice Cal, Star Office Cal, IBM Cal, etc.).  Manejar las hojas de cálculo como herramienta para estimar el comportamiento de una población bacteriana.  Estimar los diferentes parámetros cinéticos tanto de crecimiento como muerte bacteriana.

2.2.

CRECIMIENTO BACTERIANO

En este capítulo abordaremos el estudio matemático del crecimiento bacteriano desde una perspectiva clásica, es decir, partiendo del principio que el crecimiento bacteriano obedece a un crecimiento constante (crecimiento equilibrado). Los aspectos de fisiología del crecimiento serán vistos en forma general y se profundizará en algunos de ellos en capítulos posteriores. Sin embargo, si el lector desea estudiar a profundidad los aspectos fisiológicos, podemos sugerirle revisar tratados o libros de microbiología como Brock Biology of Microorganisms de Madigan et al. (2008) o Zinsser Microbiology de Joklik et al. (1997).

El crecimiento o desarrollo bacteriano puede definirse como el aumento ordenado de todos los constituyentes químicos de la célula, tratándose de un proceso que implica la replicación de todas las estructuras celulares, organoides y componentes protoplasmáticos a partir de los nutrientes presentes en el medio circundante. Por otra parte, podemos definir el crecimiento bacteriano como el aumento del número de células en el tiempo. Cuando una célula bacteriana se coloca en un medio nutricionalmente completo, aumenta de tamaño y con el tiempo se divide para formar dos células. A este proceso se le denomina fisión binaria (binario para expresar el hecho de que de una célula surgen dos) adoptando una progresión geométrica de 2n, donde n representa el número de generaciones o divisiones que han tenido lugar en el tiempo. De tal forma, que si partimos de una célula, al cabo de la primera generación se formarán 2 células, después de la segunda generación se formaran cuatro, posteriormente ocho y así sucesivamente. El proceso anterior se muestra en la figura 2.1.

En el desarrollo de un cultivo bacteriano se produce un aumento tanto de la masa celular como del número de microorganismos, pero no existe una relación constante entre los dos



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parámetros (Willet, 1997; Madigan et al., 2008), ya que cada especie puede variar su tamaño, velocidad de crecimiento y densidad celular en función de las condiciones intrínsecas, extrínsecas e implícitas del cultivo donde se encuentren. Por tanto, en estudios cuantitativos que se ocupan del desarrollo celular es necesario diferenciar entre la concentración celular, es decir, el número de células por unidad de volumen de cultivo, y la densidad bacteriana, que se define como el protoplasma total por unidad de volumen (Willet, 1997). En apartados posteriores realizaremos una mayor distinción entre estos dos aspectos, la forma de determinarlos y la relación entre ellos. Figura 2.1. Representación del crecimiento bacteriano por fisión binaria.

Fuente: Adaptado de Madigan et al., 2008. Como ya se ha mencionado, el crecimiento se define como un aumento en el número de células microbianas en una población, que también se puede medir como un aumento en la masa microbiana. La tasa o velocidad de crecimiento es el cambio en la cantidad de células o de masa por unidad de tiempo. Durante el ciclo de división celular, todos los componentes estructurales de la célula se duplican. El intervalo para la formación de dos células a partir de una se llama generación y el tiempo requerido para que esto ocurra se llama tiempo de generación. El tiempo de generación es, así, el tiempo requerido para que se duplique el número de células. Debido a esto, también al tiempo de generación se le llama tiempo de duplicación. 2.3.

CRECIMIENTO ASINCRÓNICO

El

estudio del crecimiento bacteriano suele hacerse a nivel de laboratorio en cultivos continuos (sistema abierto) o discontinuos (sistema cerrado). Según señala Willet (1997), por lo general las bacterias se desarrollan en laboratorio en cultivos discontinuos, y por tanto las condiciones se aproximan a las de un sistema cerrado. Cuando un medio adecuado se inocula con bacterias y se toman nuestras pequeñas a intervalos regulares de tiempo, la representación gráfica de los datos dará una curva de crecimiento característica (Figura 2.2).



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Logaritmo del número de células

Figura 2.2. Representación gráfica de la curva de crecimiento bacteriano. Fase estacionaria

Fase de declive

Fase exponencial

Transición 2 Fase de latencia

Transición 3 Transición 1

Fuente: Autor.

Tiempo

En la curva anterior se muestra las cuatro fases del desarrollo bacteriano que se producen cuando se representa el número de células viables en función del tiempo en un cultivo discontinuo y asincrónico. Nótese la presencia de tres interfases con variaciones de pendiente que indican la transición de una a otra fase del desarrollo: transición 1 entre las fases de latencia – exponencial, transición 2 entre las fases exponencial – estacionaria y la transición 3 entre las fases estacionaria – declive. En cultivos sincrónicos las interfases tienden a desaparecer ya que las células crecen de forma simétrica y por tanto la curva de crecimiento adopta una forma lineal entre cada una de las cuatro fases de crecimiento. 2.4.

CRECIMIENTO EQUILIBRADO

En muchos tipos de trabajos de investigación es conveniente emplear microorganismos que estén creciendo en forma equilibrada o sincrónica. En la forma habitual de cultivo de bacterias la división celular ocurre de manera aleatoria, y produce una mezcla de células que representan todas las fases del ciclo de división. Los estudios con estos cultivos sólo dan valores promedio. Sin embargo, se dispone de técnicas para sincronizar la división y para introducir a todas las células en el cultivo para que se dividan de forma simultánea. El estudio de las matemáticas del crecimiento bacteriano se abordará desde este enfoque y las ecuaciones así obtenidas podrán emplearse para el estudio del crecimiento bacteriano en condiciones sincrónicas y asincrónicas. De igual forma, el estudio matemático del crecimiento bacteriano puede abordarse de forma individualizada en cada una de las fases del crecimiento (Curvas Lineales) o desde un enfoque Universidad de Pamplona – Facultad de Ciencias Básicas – Departamento de Microbiología – © 2011


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continuo donde el crecimiento ocurre como una serie de fases sucesivas (Curva Sigmoidal). Ecuaciones de crecimiento equilibrado: Como es sabido el crecimiento bacteriano sigue una relación exponencial de primer orden, esto es, que por cada célula que se divida se originan dos nuevas (Figura 1). De esta forma se puede afirmar que el crecimiento bacteriano se comporta de acuerdo a la siguiente relación:

𝑁 = 2𝑛 (Ecuación 1) donde N es el número de células y n el número de duplicaciones que han tenido lugar. Si asumimos que N = Nf en determinado tiempo Nf(t), entonces Nf(t) es dependiente del número inicial de células (N0) y del número de divisiones que haya tenido lugar en ese intervalo de tiempo n(t), de esta forma si reordenamos la ecuación 1, obtenemos la siguiente expresión matemática que rige el crecimiento bacteriano en función del tiempo:

𝑁𝑓 = 𝑁0 × 2𝑛 (Ecuación 2) Velocidad relativa de crecimiento y velocidad específica de crecimiento: Si x(t) es una variable tiempo-dependiente que describe la variación de cierta sustancia, como biomasa o concentración de la célula. La velocidad instantánea del proceso es la derivada de x(t):dx(t)/dt. La velocidad específica, μ(t), se define como: 𝜇(𝑡) =

𝑑𝑥 𝑑𝑡

Ecc. 3

Si x(t) denota la concentración celular entonces en un cultivo bacteriano la velocidad de crecimiento es medida como el aumento absoluto en la concentración celular por unidad de tiempo de la unidad, mientras que la velocidad de crecimiento específica es el incremento en la concentración celular por unidad de tiempo por célula. Una simple ecuación muestra que si x(t) es positivo entonces: 𝜇(𝑡) =

𝑑(𝑙𝑛 𝑥 𝑡 ) Ecc. 𝑑𝑡

4

Por consiguiente, la velocidad de crecimiento específica puede medirse como la inclinación de la curva de crecimiento cuando el logaritmo natural (ln) de x(t) se traza contra el tiempo. Si el log10 es usado en lugar de ln, entonces la pendiente de log10 será moderada = 2,3 veces menor que la velocidad de crecimiento específico cuando empleamos el ln. La velocidad de crecimiento específica (μ) puede calcularse a través de la ecuación 4.1.



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𝜇=

(𝑙𝑛 𝑁 𝑓 − 𝑙𝑛 𝑁0 ) (𝑡 𝑓 − 𝑡 0 )

Ecc. 4.1

La velocidad de crecimiento relativo (k) puede calcularse a través de la ecuación 4.2. 𝑘 = 2,303

(𝐿𝑜𝑔𝑁 𝑓 − 𝐿𝑜𝑔𝑁0 ) (𝑡 𝑓 − 𝑡 0 )

Ecc. 4.2

Tiempo de duplicación (Td) y tiempo de generación (Tg): En un momento fijo (tfix), el valor de μ(t) será μ(tfix) = μfix. La relación para el tiempo de duplicación, Td = ln2/ μfix = 0.69/μfix, de tal forma que si μ(t) permaneciera constante, al tiempo t fix + Td, la concentración celular sería el doble que cuando estaba a tfix. Es importante anotar que, en cultivos asincrónicos, Td no es equivalente al tiempo medio de generación. De hecho, el tiempo medio de generación puede estimarse por 1/ μfix en lugar de la relación 0.69/ μfix, si la división celular puede aproximarse por un proceso aleatorio, como el proceso de Poisson. El tiempo de generación puede calcularse a través de la siguiente ecuación: 𝑇𝑔 =

𝑡 𝑛

Ecc. 5

donde t es el diferencial de tiempo y n el número de generaciones. El número de generaciones puede estimarse a través de la ecuación 6: 𝑛 = 3,3 (𝐿𝑜𝑔𝑁𝑓 − 𝐿𝑜𝑔𝑁0 ) Ecc.6 Si reemplazamos la Ecc. 6 en Ecc. 5, el tiempo de generación se puede calcular mediante la ecuación 7: 𝑇𝑔 =

𝑡 3,3 𝐿𝑜𝑔𝑁 𝑓 −𝐿𝑜𝑔𝑁0

Ecc. 7

Curvas de crecimiento y muerte bacteriana: Como hemos comentado anteriormente, la cinética de crecimiento bacteriana sigue una tendencia de primer orden, lo mismo puede asumirse para la muerte bacteriana, esto es que al graficar el Log de la población en función del tiempo se obtiene una línea que representa cómo evoluciona esta población. Esta línea de crecimiento o muerte puede entonces ajustarse a nuevas líneas de tendencia que comparan el crecimiento real frente a una función matemática definida: función lineal o función exponencial por método gráfico o estimación lineal o estimación logarítmica por medio de fórmulas Excel, de las cuales pueden obtenerse la ecuación que representa cada una de estas funciones, su coeficiente de correlación R 2 o los valores de las diferentes constantes. En este caso puede asumirse que el crecimiento o muerte bacteriana sigue una



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tendencia lineal o exponencial dependiendo del valor de R 2, cuando R2 se aproxima a 1 el comportamiento bacteriano sigue esa tendencia. A manera de ejemplo, si en un estudio de crecimiento se ajusta la gráfica de los datos a una función lineal con un R2 = 0,955 y a una función exponencial con un R2 = 0,985, la tendencia de crecimiento de esa población se comporta más como una función exponencial que una lineal. En el caso de un comportamiento se dice que es lineal cuando la gráfica de la población final a un tfix es una línea recta; y por consecuencia tiene la forma: y = f(x)= mx + b Donde m representa la pendiente de la recta y b la ordenada al origen (es el punto de intersección de la recta al eje de las “y”. También es importante mencionar que este tipo de funciones crecen a tasas constantes; y en ellas puede calcularse tanto el tiempo (t) como una densidad de población (y) específica. Si el crecimiento se ajusta a un comportamiento exponencial, puede obtenerse la población final a un tfix o calcularse el tiempo a una densidad de población y a través de una ecuación exponencial que adopta la forma: y = f(x) = ax y = f(x) = cebx Donde la base a es una constante positiva, c y b son constantes y e es la base del logaritmo neperiano. Por otro lado, si los datos de crecimiento se asemejan a una función logarítmica, la población final a un tfix o el tiempo a una densidad de población y puede calcularse por medio de una ecuación que adopta la forma: y = f(x) = logax y = f(x) = blnmx Donde la base a es una constante positiva, b es una constante equivalente a c y lnm es la constante equivalente a eb. Es importante aclarar que las funciones logarítmicas son las inversas a las exponenciales.

2.5.

MODELAMIENTO DEL CRECIMIENTO



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El desarrollo de los diversos modelos de predicción empleados en microbiología descansa sobre bases matemáticas preestablecidas con anterioridad, sin importar tanto si se trata de modelos probabilísticos, cinéticos, mecanísticos, etc,. Como comentaba en la introducción de este manual, los orígenes del modelamiento microbiano se sitúa sobre los años de 1922 cuando Esty y Meyer desarrollan un modelo para estimar el tiempo necesario para reducir las esporas de Clostridium botulinum tipo A de 1012 a 100 (Conocido como cocción botulínica). En 1949, J.L. Monod desarrolló un modelo matemático para representar el crecimiento equilibrado de una población bacteriana, posteriormente este modelo fue aplicado a la industria de la fermentación. En años posteriores diversos investigadores empezaron a explicar en forma de expresiones matemáticas la relación existente entre el número de bacterias finales en función del tiempo y como varían estas con respecto a la aplicación de algún factor externo que influye sobre su crecimiento/supervivencia.

Uno de los factores que más ha influido en el desarrollo de la microbiología predictiva ha sido el empleo de las nuevas tecnologías informáticas, y en especial la aparición y desarrollo de herramientas de cálculo como Excel de Microsoft Office®, Calc de OpenOffice.org (Software Gratuito), Calc de StarOffice, etc. Estas nuevas opciones han facilitado por un lado comprometer conceptualmente a todas aquellas personas poco familiarizadas con el Álgebra en la ayuda de visualización de las ecuaciones y sus soluciones de nuevas maneras y no de la forma tradicional, es decir haciendo énfasis en la repetición y las reglas del algoritmo. Con el empleo de estas herramientas en concepto de Margaret Niess se logra que el foco del pensamiento del estudiante se traslade del campo algorítmico al de la verdadera comprensión del concepto.

El modelamiento microbiano tampoco ha escapado a esta nuevas herramientas, antaño el desarrollo de ecuaciones simples de predicción (modelos primarios) requería del conocimiento profundo de las matemáticas y en especial del álgebra para poder llegar al fin absoluto del trabajo: la obtención de un modelo matemático expresado como una ecuación que permita predecir en futuras ocasiones el comportamiento de los microorganismos, sin embargo, con el desarrollo de estas herramientas tecnológicas, esta labor se ha vuelto un tanto más simple. Esto no quiere decir que se abandone del todo el método más clásico, ya que todos los modelos no son iguales ni funcionan de la misma forma, esto depende del fin con el cual fue hecho, por ejemplo: si es aplicable para todos o solo algún grupo microbiano de interés, las condiciones particulares de prueba y validación con que fue hecho entre otros.

Los datos obteniendo gráficos, ecuaciones y tendencias del comportamiento microbiano. Así mismo, se han desarrollado bases de datos y programas estadísticos gráficos y software específicos de modelamiento, que con solo digitar algunos datos permiten observar y predecir el comportamiento microbiano. Dentro de las bases de datos más conocidas está el ComBase Predictor, y ejemplos de programas estadísticos gráficos son el Prisma, Staph Graphic Plus, Universidad de Pamplona – Facultad de Ciencias Básicas – Departamento de Microbiología – © 2011


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Statistica, SPSS, Microfit, DMFit, mientras ejemplos de software específicos son: Pathogen Modeling Program (PMP), Seafood Spoilage and Safety Predictor (SSSP).

ACTIVIDAD PRÁCTICA 1: CONSTRUCCIÓN DE CURVAS DE CRECIMIENTO-MUERTE BACTERIANA Y ESTIMACIÓN DE PARÁMETROS CINÉTICOS EMPLEANDO LA HOJA DE CÁLCULO MICROSOFT OFFICE Y OPEN OFFICE.

En la presente actividad se explica cómo desarrollar las gráficas de crecimiento bacteriano, así como la estimación de diversos parámetros cinéticos por los métodos gráficos y matemáticos, empleando como herramienta las hojas de cálculo de los programas Office 2007 © y Open Office 3.1 ©. Las gráficas de muerte serán vistas en una unidad posterior. 2.6.

MATERIALES, EQUIPOS E INSUMOS Computador con paquete Microsoft Office 2003 o posterior o OpenOffice 3.1. Para esta práctica emplearemos el software Office 2007 de Microsoft.

2.7.

REACTIVOS No se requieren.

2.8.

PROCEDIMIENTO Antes de abordar el procedimiento, debemos aclarar que en esta práctica se empleará un ejemplo sencillo de crecimiento equilibrado con independencia de fases de la curva de crecimiento, es decir, que los datos se manejaran teniendo en cuenta solo la fase de crecimiento exponencial y no los datos de crecimiento de una curva completa, la cual se abordará en una práctica posterior. También se presentarán dos procedimientos (método gráfico y método de las funciones) en forma de ventanas.

Método gráfico A través de ventanas que representa la hoja de cálculo Excel desarrollaremos un ejercicio de construcción de curvas de crecimiento y estimación del mismo, con los supuestos datos de crecimiento de S. aureus (100 UFC/g) mostrados en la Tabla 1, donde el microorganismos mantenido durante 25 horas a 37ºC. Tabla 1: Resultados supuestos del crecimiento de S. aureus en caldo BHI incubado a 37ºC durante 25 horas.



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Tiempo (horas)

Población (UFC/g)

Tiempo (horas)

Población (UFC/g)

0,0

100

13,0

61659500

1,1

105

14,1

141253754

2,2

230

15,1

251188643

3,3

1230

16,2

354813389

4,3

4266

17,3

426579519

5,4

15136

18,4

457088190

6,5

52481

19,5

478630092

7,6

186209

20,5

489778819

8,7

645654

21,6

489778819

9,7

2187762

23,4

489778819

10,8

7244360

25,2

489778819

11,9

22387211

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PASO 1: Los datos de crecimiento se representan en una hoja de Excel, a la densidad de población (UFC/g) le calcularemos el log10 y Ln insertando en la casilla C2 la siguiente orden =LOG10(B2) y en la casilla D2 =LN(B2), de esta forma calculamos los logaritmos para la población al tiempo 0, continuamos con el mismo procedimiento para las demás casillas o simplemente arrastraremos la fórmula. De igual forma procedemos a calcular la tasa de crecimiento específica (µ) para el primer intervalo de tiempo en E2 =(D3-D2)/(A3-A2) empleando la ecuación 3 y velocidad de crecimiento relativo k =(C3-C2)/(0,301*(A3-A2)) en F2 o =(D3-D2)/(0,693*(A3-A2)) en G2 (Fig 2). Figura 2. Cuadro de datos de crecimiento de S. aureus.



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PASO 2: Para proceder a graficar los datos de crecimiento, seleccionamos en la columna B las filas correspondientes desde B2 hasta B24 (B2:B24) que corresponde a los datos de crecimiento de S. aureus expresado en UFC/g (Fig. 3). Si seleccionamos (C2:C24) obtendremos la gráfica del crecimiento de S. aureus expresado como log10UFC/g o (D2:C24) para representar el crecimiento en lnUFC/g (Fig 4). Figura 3. Representación del crecimiento de S. aureus en notación científica.



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Crecimiento de S. aureus (UFC/g) 600000000 500000000 400000000 300000000 200000000 100000000 0 0,0

5,0

10,0

15,0

20,0

25,0

30,0

Figura 4. Representación del crecimiento de S. aureus en notación logarítmica.

Crecimiento de S. aureus (Ln o Log10) UFC/g 25,000 20,000 15,000 Ln UFC/g 10,000

Log10 UFC/g

5,000 0,000 0,0

5,0

10,0

15,0

20,0

25,0

30,0

En los siguientes pasos calcularemos los diversos parámetros del crecimiento tales como: velocidad media específica de crecimiento, duración de la fase de latencia y duración de la fase exponencial. Así mismo, con los datos anteriores, calcularemos el tiempo medio de generación. PASO 3: De acuerdo con la figura anterior procedemos a graficar nuevamente los datos de crecimiento exponencial, para tal fin seleccionaremos aquella porción del crecimiento en el cual la población aumenta de forma lineal. Seleccionamos la pestaña “Insertar” y allí escogemos la opción “Dispersión” y elegimos el gráfico con “líneas suavizadas y marcadores”.



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Figura 5. Selección del tipo de gráfico de crecimiento de S. aureus.

Posteriormente, en la pestaña de Diseño escogemos la opción “Seleccionar datos”, según muestra la Figura 6. Figura 6. Selección del tipo de gráfico de crecimiento de S. aureus.

PASO 4: Inmediatamente hemos escogido la opción Seleccionar datos se despliega una ventana como el que se muestra en la Figura 7a. En esta ventana deberemos seleccionar “Agregar” y se despliega una nueva ventana donde escogeremos los valores tanto del eje X (2) como del eje Y (3) a graficar, así como el nombre de la serie (1) (Figura 7b). Para tal fin damos un click sobre las tablas que aparecen seleccionadas en la figura 7b. Figura 7. a) Ventana principal Seleccionar origen de datos; b) Ventana secundaria seleccionar datos. Universidad de Pamplona – Facultad de Ciencias Básicas – Departamento de Microbiología – © 2011


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1 2 3

1) Nombre de la serie: escogemos el nombre que queremos para la curva, por ejemplo si graficamos el logaritmo 10 de los datos de crecimiento, seleccionamos la casilla C1. 2) Valores de X: Para nuestro caso seleccionaremos los correspondientes al tiempo desde A5 hasta A13. 3) Valores de Y: En nuestro ejemplo escogemos los correspondientes al crecimiento en logaritmo 10, desde C5 hasta C13. Una vez finalizada la opción de cargar datos para la curva damos click en “Aceptar” según se muestra en la figura 8; posteriormente repetimos el procedimiento del PASO 4 para cargar los datos de crecimiento en logaritmo natural (ln UFC/g). Figura 8. Ventana Secundaria de datos diligenciada.

PASO 5: Al finalizar de cargar los datos de logaritmo natural obtendremos la gráfica con los crecimientos lineales de la fase exponencial. Posteriormente nos ubicamos con el cursor sobre la línea que representa el crecimiento y damos clic con el botón derecho del ratón, y seleccionamos la opción “Agregar línea de tendencia…” según se muestra en la figura 9. Figura 9. Ventana principal de “Agregar línea de tendencia….”.



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PASO 6: En la siguiente ventana (figura 10) escogemos la opción de “tendencia lineal” en la ventana “tipo” y en la ventana “opciones” marcamos presentar ecuación en el gráfico y presentar R cuadrado; posteriormente damos click en aceptar. Repetimos esta operación para la otra línea de crecimiento, y así obtendremos la gráfica de la figura 11. Figura 10. Ventana principal de “Formato de línea de tendencia”.

Figura 11. Curva de crecimiento exponencial de S. aureus con sus respectivas ecuaciones y coeficientes de determinación.



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Logx UFC/g

Crecimiento exponencial de S. aureus 18,000 16,000 14,000 12,000 10,000 8,000 6,000 4,000 2,000 0,000

Ln UFC/g y = 1,1437x + 3,4217 R² = 0,9997

Log10 UFC/g

0,0

5,0

10,0

y = 0,4967x + 1,486 R² = 0,9997 15,0

Tiempo (horas)

Al analizar la figura 11 podemos observar que los coeficientes de determinación o regresión (R2) son próximos a 1 (0,999). Por lo tanto, las ecuaciones obtenidas serán las que emplearemos para el cálculo de los parámetros cinéticos.

Método de las fórmulas en Excel En algunos casos puede ser que no contemos con una hoja de cálculo Excel que permita construir las gráficas y agregar las líneas de tendencia, tal como ocurre con algunos paquetes ofimáticos como el IBM Lotus Symphony (el cual está basado en la tecnología de OpenOffice.org), o el mismo Open Office en versiones inferiores a la 3.0. En estos softwares se pueden agregar gráficos pero las ecuaciones de regresión no se pueden obtener tan fáciles como en Excel o en OpenOffice Cal V 3.0 o mayor. En estos casos podemos usar una función que traen las hojas de cálculo denominada Estimación Lineal. Esta función calcula las estadísticas de una línea utilizando el método de "mínimos cuadrados" para calcular la línea recta que mejor se ajuste a los datos y, a continuación, devuelve una matriz que describe la línea. Debido a que esta función devuelve una matriz de valores, debe ser especificada como una fórmula de matrices. La ecuación de la curva es la ecuación de la recta: 𝑦 = 𝑚𝑥 + 𝑏 𝑜 𝑦 = 𝑚1𝑥1 + 𝑚2𝑥2 + ⋯ + 𝑏 (si hay varios rangos de valores X), donde el valor Y dependiente es función de los valores X independientes. Los valores m son coeficientes que corresponden a cada valor X, y b es un valor constante. Observe que Y, X y m pueden ser vectores. La matriz que devuelve ESTIMACION.LINEAL es {mn,mn-1,...,m1,b}. ESTIMACION.LINEAL también puede devolver estadísticas de regresión adicionales. Para mayor conocimiento de esta función puede consultar la ayuda de Excel.


 


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Conocido y: es el conjunto de valores de y que se conocen en la relación y = mx+b. Conocido x: es un conjunto opcional de valores x que se conocen en la relación y = mx+b. Constante: es un valor lógico que especifica si se ha de hacer que la constante b sea igual a 0, si el argumento constante es VERDADERO o se omite, b se calcula normalmente; pero si constante es FALSO, b se establece como igual a 0 y los valores m se ajustan para encajar en y = mx. Estadística: es un valor lógico que especifica si se deben devolver estadísticas de regresión adicionales. Si estadística es VERDADERO, ESTIMACION.LINEAL devuelve las estadísticas de regresión adicionales (Tabla 2), si estadística es FALSO o se omite, ESTIMACION.LINEAL sólo devuelve los coeficientes m y la constante b.





Tabla 2. Estadísticas de regresión adicionales si estadística es VERDADERO. Estadística se1,se2,...,sen

Descripción Los valores de error estándar para los coeficientes m1,m2,...,mn.

seb

El valor de error estándar para la constante b (seb = #N/A cuando constante es FALSO).

r2

El coeficiente de determinación. Compara los valores y calculados y reales, y los rangos con valor de 0 a 1. Si es 1, hay una correlación perfecta en la muestra, es decir, no hay diferencia entre el valor y calculado y el valor y real. En el otro extremo, si el coeficiente de determinación es 0, la ecuación de regresión no es útil para predecir un valor y.

sey

El error estándar para el cálculo y.

F

La estadística F o valor F observado. Utilice la estadística F para determinar si la relación observada entre las variables dependientes e independientes se produce por azar.

df

Grados de libertad. Utilice los grados de libertad para encontrar valores F críticos en una tabla estadística. Compare los valores que encuentre en la tabla con la estadística F devuelta por ESTIMACION.LINEAL para determinar un nivel de confianza para el modelo.

ssreg

La suma de regresión de los cuadrados.

ssresid

La suma residual de los cuadrados.

Para el método de las fórmulas emplearemos el mismo ejemplo del caso anterior. PASO 1: En la ventana principal de la hoja de cálculo seleccionamos 5 casillas en blanco en dos columnas seguidas, posteriormente en la pestaña “Fórmulas” seleccionaremos “Insertar Función” como se muestra en la figura 12.



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Figura 12. Ventana principal de la hoja de cálculo Excel

PASO 2: En la ventana “Insertar Función” (Figura 13) seleccionamos en categoría “todas” y buscamos la opción ESTIMACION.LINEAL, damos clic en aceptar. También podemos seleccionar la función “ESTIMACIÓN.LOGARÍTMICA”, para aquellos casos donde el crecimiento se ajusta a una función exponencial. Figura 13. Ventana de selección de funciones.

PASO 3: Posteriormente complementamos la información que se despliega en la ventana de Argumentos de función mostrada en la figura 14. Figura 14. Ventana de argumentos de la función Estimación.Lineal.



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Los argumentos a escribir en esta ventana para completar la información son los siguientes (figura 15).  En el cuadro Conocido_y escribimos D5:D13 que representa el logaritmo natural del crecimiento de la población (mismos valores seleccionados en el paso 4 del método gráfico).  En el cuadro Conocido_x escribimos A5:A13 que representa el tiempo durante el cual crece la población (mismos valores del tiempo seleccionados en el paso 4 del método gráfico).  En la casilla correspondiente a Constante y Estadística escribimos la palabra VERDADERO. Figura 15. Ventana de argumentos de la función Estimación.Lineal completa.

PASO 4: Una vez diligenciada esta información presionamos al tiempo las teclas: Ctrl + Shif + Alt + Aceptar de la ventana anterior. La tecla Shif corresponde a aquella que tiene la flecha: . Al final obtendremos los datos mostrados en la siguiente figura:



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Figura 16. Resultados finales de la estimación lineal.

Estimación lineal 1,14372017 3,42169901 0,00746925 0,06030027 0,99970154 0,06239195 23446,9196 7 91,2731138 0,02724929 En la ilustración anterior los datos de estimación lineal corresponden en su orden a las siguientes estadísticas de regresión correspondientes a la función lineal:

    

H2: Pendiente “m” (1,14372017) H3: Error estándar para el coeficiente m (0,00746925) H4: Coeficiente de determinación o regresión (0,99970154). H5: Valor F observado (23446,9196). H6: Suma de regresión de los cuadrados (91,2731138).


    


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I2: Constante b (3,42169901). I3: Error estándar para la constante b (0,06030027). I4: Error estándar para el cálculo Y (0,06239195). I5: Grados de libertad (7). I6: Suma residual de los cuadrados 0,02724929).

Con los datos obtenidos puede entonces construirse la ecuación lineal. Si 𝑦 = 𝑚𝑥 + 𝑏, entonces al reemplazar los datos la ecuación queda conformada así:

𝑦 = 1,1437𝑥 + 3,4217 R2 = 0,9997 Como podemos ver, estos datos son los mismos obtenidos en la figura 11 (método gráfico).

Cálculo de los parámetros cinéticos De acuerdo con Zwietering et al. (1992), a partir de los datos de crecimiento pueden estimarse diversos parámetros cinéticos, entre ellos la duración de las fases de latencia (λ) y exponencial (α), fin de la fase de crecimiento (ε), la velocidad específica de crecimiento (µ) y la máxima velocidad específica de crecimiento (µmáx). La forma más común de calcular la duración de la fase de latencia (λ) es la extrapolación de la tangente en el punto de inflexión de la curva de crecimiento, hasta que corta con la recta equivalente al nivel inicial de inoculación (Ymin). Después de esta fase de latencia se establece la fase exponencial. El final de esta fase exponencial (ε) se puede definir como el momento en el que la extrapolación de la tangente en el punto de inflexión corta con la recta de la máxima densidad poblacional (Ymáx). La duración de la fase exponencial (α) surge entonces de restar el tiempo final de la fase exponencial menos el tiempo de duración de la fase de latencia. La velocidad específica de crecimiento (µ) corresponde con el valor de la pendiente en la gráfica del Ln UFC/g vs tiempo, mientras que la máxima velocidad específica de crecimiento (µ máx) corresponde a la máxima velocidad vista en todos los intervalos de tiempo. De acuerdo con los datos del ejemplo que nos ocupa, identificamos los siguientes valores:  Ymin = 4,605 ln UFC/g  Ymáx = 20,009 ln UFC/g  Ecuación de la recta: y = 1,1437x + 3,4217 Duración de la fase de latencia:  λ = (y – 3,4217) / 1,1437 λ = (4,605 – 3,4217) / 1,1437 λ = 1,0346 horas. Universidad de Pamplona – Facultad de Ciencias Básicas – Departamento de Microbiología – © 2011


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Final de la fase exponencial:  ε = (y – 3,4217) / 1,1437 ε = (20,009 – 3,4217) / 1,1437 ε = 14,5932 horas. Duración de la fase exponencial:  α = 14,5932 – 1,0346 α = 13, 5586 oras. Velocidad específica de crecimiento:  µ=m µ = 1,1473 ln UFC/g*hora Máxima Velocidad de crecimiento específico: este parámetro para nuestro ejemplo se obtiene de la columna E (µ). En ella debemos escoger la casilla en la cual se observa la mayor velocidad y que en nuestro caso corresponde a E4 (intervalo entre las 2,2 horas y 3,3 horas).  2.9.

µmáx = 1,5243 ln UFC/g*hora que corresponde al intervalo =(D5-D4)/(A5-A4). NIVEL DE RIESGO

Para el desarrollo de la anterior práctica se ha definido un nivel de Riesgo Bajo o nivel 1; es decir que se requiere del uso de Bata de Laboratorio Manga Larga, Zapato Cerrado Bajo, Pantalón Largo. 2.10. BIBLIOGRAFÍA  Labuza, T. (2004). Predictive Microbiology Principles. Department of Food Science and Nutrition. University of Minnesota. USA. Pp. 12.  Nies, M.L. (2006). Using Computer Spreadsheets to Solve Equations. Learning & Leading with Technology, 3(23).  Monod, J. (1949). The growth of bacterial cultures. Annual Review of Microbiology 3: 371– 394.  Microsoft Office Excel 2007 de Microsoft Corporation Inc. Marca registrada.  Zwietering, M.H., Rombouts, F.M., van’t Riet, K. (1992). Comparison of definitions of the lag phase and the exponential phase in bacterial growth. J. Appl. Bacteriol., 72: 139–145.  Madigan, M.T., Martinko, J.M., Dunlap, P.V., Clark, D.P., Brock, T. (2008). Chapter 6: Microbial Growth - Unit 1: Principles of Microbiology. In: Brock Biology of Microorganisms: International Edition. 20th ed. Prentice Hall Edit.  Willett, H.P. (1997). Capítulo 5 Fisiología del crecimiento bacteriano. En: Zinsser Microbiología. 20ª edición. Joklik, W.K., Willett, H.P., Amos, B., Wilfert, C.M., Editores. Editorial Médica Panamericana S.A. Buenos Aires, Argentina. Págs. 78 – 109.



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ACTIVIDAD 2 ESTANDARIZACIÓN DE UNA CURVA PATRON DE CRECIMIENTO BACTERIANO POR MÉTODO TURBIDIMÉTRICO (PATRÓN McFARLAND) Y RECUENTO EN PLACA. 2.11.

OBJETIVOS

Los objetivos que se buscan con esta práctica son:  Diferenciar entre los distintos tipos de métodos de recuento bacteriano y discernir cual de ellos emplear bajo diversas situaciones.  Comprender los fundamentos que rigen los diversos métodos instrumentales de recuento microbiano.  Construir una curva patrón para la medida indirecta del crecimiento diversas bacterias (E. coli, S. aureus, etc.) para futuras prácticas.  Ahorrar material de laboratorio, tiempo de trabajo, etc., en el desarrollo de las futuras actividades relacionadas a la asignatura de Microbiología predictiva.  Obtener ecuaciones de primer orden para la predicción del crecimiento de estas bacterias dependiente de la población inicial a temperatura constante. 2.12.

MARCO TEÓRICO

El crecimiento de una población bacteriana puede ser entendido desde perspectivas diferentes y de acuerdo a éstas se puede llegar a determinar la medida del crecimiento mediante diversas metodologías. Para algunos, el crecimiento es la capacidad que tienen las células individuales para multiplicarse, esto es iniciar y completar una división celular. De esta forma, se considera a los microorganismos como partículas discretas y el crecimiento es entendido como un aumento en el número total de partículas bacterianas. Existen varias formas de determinar el número total de microorganismos en una muestra: Determinación del número de microorganismos, Determinación de la masa celular, y Determinación de la actividad celular. Independientemente de los métodos empleados para el conteo bacteriano estos se pueden agrupar en dos modalidades claramente definidas, así pues tendríamos los métodos de recuento directo o cuantitativos (como su nombre lo indica nos permite contar directamente el número de células) y aquellos indirectos o cualitativos, que a través de la determinación de diversos factores nos permite correlacionar la medida de los mismos con un número de bacterias. En la práctica habitual del laboratorio, los ensayos se realizan siempre con poblaciones bacterianas, a menudo tomando muestras en diversos momentos de su crecimiento en un medio de cultivo. En el resto del manual nos vamos a referir al crecimiento microbiano a escala de poblaciones. Comenzaremos con describir algunos métodos habituales de medir ese crecimiento poblacional, algunos de los cuales serán reforzados por el alumno en las siguientes prácticas de laboratorio. Universidad de Pamplona – Facultad de Ciencias Básicas – Departamento de Microbiología – © 2011


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El crecimiento de una población o cultivo bacteriano se puede expresar en función de:  Aumento del número de células (microorganismos).  Aumento de masa del cultivo (masa celular).  Aumento de la actividad celular. Estos tipos de expresiones son equivalentes entre sí en cultivos que estén en crecimiento balanceado o equilibrado (en el que todos los componentes aumentan una misma proporción por unidad de tiempo). En cultivos cerrados (discontinuos o no equilibrados) estas expresiones de crecimiento son coincidentes durante algún periodo pero transcurrido el tiempo, dejan de ser equivalentes, por ejemplo la masa celular y la actividad celular. La medida del crecimiento bacteriano puede medirse también mediante dos tipos de métodos: directos (los cuales requieren preparaciones limpias, sin partículas extrañas) e indirectos. Ahora bien, hagamos una descripción de cada uno de ellos: 2.2.1 DETERMINACIÓN DEL NÚMERO DE MICROORGANISMOS: Estos métodos pueden ser indirectos como el Recuento en placa ya sea en superficie o incorporado, Método de las diluciones múltiples o del Número Más Probable, Filtración por membrana e incubación de ésta sobre medio de cultivo sólido, o métodos directos como Recuento microscópico directo de los microorganismos, ya sea en frotis o en cámaras, Conteo al microscopio de membranas, Conteo electrónico de partículas (tipo Coulter), Recuento proporcional de Wright. 2.2.2 DETERMINACIÓN DE LA MASA CELULAR: El crecimiento de una población bacteriana pueden determinarse por medio de métodos directos de conteo de la población: medida del peso seco, medida del peso húmedo, medida del volumen, determinación del contenido de N, etc., o bien por métodos indirectos como turbidimetría (escala de McFarland y espectrofotometría) y Nefelometría. 2.2.3 DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD CELULAR: Este tipo de conteo nos permite entre otros la determinación de una actividad enzimática, determinación de un metabolito, medida del consumo de oxigeno, medida de ATP, calorimetría, medida de impedancia, radiometría (de C02). A los efectos de llevar a cabo cualquier técnica de recuento, hay que tener en cuenta el tipo de muestra sobre la que se va a trabajar, por cuanto es posible que algunos de los métodos no sean aplicables. Cuando es necesario llevar a cabo diluciones, la toma y preparación de la muestra se realiza de la manera común. En las descripciones que siguen se denominará homogeneizado a la muestra preparada para su análisis microbiológico. Universidad de Pamplona – Facultad de Ciencias Básicas – Departamento de Microbiología – © 2011


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Los primeros incluyen normalmente el recuento en placa (mucho trabajo, costos, tiempo) o conteo directo al microscopio (cámara de Neubauer), mientras los segundos cuantifican indirectamente la población a través de diferentes métodos:  Métodos eléctricos: impedancia, conductancia.  Métodos turbidimétricos ópticos: Escala de McFarland.  Métodos turbidimétricos instrumentales: Absorbancia, Tramitancia.  Citometría de flujo  Otros. 2.2.4 MÉTODOS TURBIDIMÉTRICOS INSTRUMENTALES: La medición del crecimiento por métodos turbidimétricos resulta ser más rápido y útil, para obtener una estimación del número de células o biomasa. Una suspensión celular aparece turbia porque las células dispersan la luz que atraviesa la suspensión. Cuantas más células haya más luz se dispersa y más turbia aparece la suspensión. La turbidez puede medirse con un fotómetro o un espectrofotómetro, aparatos que hacen pasar la luz a través de una suspensión celular y detectan la cantidad de luz no dispersada. La mayor diferencia entre estos dos instrumentos es que el fotómetro emplea un filtro simple (normalmente rojo, verde o azul) para generar luz incidente de una amplitud de onda relativamente ancha, mientras que el espectrofotómetro emplea un prisma o red de difracción para generar luz incidente de banda estrecha. Sin embargo, ambos aparatos miden solamente luz no dispersada expresando los resultados en unidades fotométricas (por ejemplo, Unidades Klett) o unidades de densidad óptica (DO) para espectrofotómetro. Para organismos unicelulares, las unidades fotométricas DO son proporcionales (dentro de ciertos límites) a la masa celular y también al número de células. Por tanto las medidas de turbidez pueden utilizarse como un sustituto para otros métodos de contaje. Sin embargo y antes de utilizar la turbidez como método de contaje, hay que realizar una curva estándar que relacione medidas directas (microscópicas o por recuento en placa) con las unidades indirectas de turbidez (DO) (Francois et al., 2007). Tales curvas contienen datos para número de células y masa celular, permitiendo la estimación de ambos parámetros a partir de una sola medida de la turbidez. A elevadas concentraciones de células, la luz dispersada de la unidad detectora puede ser rescatada por otra (apareciendo a la fotocélula como si nunca se hubiese dispersado). Cuando esto ocurre, la correspondencia uno a uno entre número de células y turbidez pierde linealidad. Sin embargo, dentro de ciertos límites, las medidas de turbidez pueden ser razonablemente precisas y además tienen la virtud de ser rápidas y fáciles de tomar. Adicionalmente, las medidas de turbidez pueden tomarse sin distorsionar mucho las muestras. Por estas razones, las medidas de turbidez se emplean ampliamente para seguir el crecimiento de los cultivos microbianos; se puede medir repetidamente la misma muestra y construir gráficos semilogarítmicos para calcular tiempos de generación. La población



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bacteriana puede determinarse midiendo la turbidez del cultivo a diferentes intervalos de tiempo y confrontando estos resultados con medidas directas de la población a los mismos intervalos de tiempo por ejemplo mediante recuento directo en placa. El cambio de luz se registra en el espectrofotómetro como porcentaje de transmisión (cantidad de luz transmitida) y absorbancia o densidad óptica (D.O.), valor derivado del porcentaje de transmisión, correspondiente al log del cociente entre la intensidad de luz incidente sobre la suspensión (Io) y la de la luz transmitida por la suspensión (I). A = log Io/I. Cuando se inocula una pequeña población bacteriana en un medio de cultivo líquido adecuado, generalmente el crecimiento no comienza inmediatamente, sino que hay un período de latencia. Una vez que empieza el crecimiento, se observa un incremento exponencial en la densidad celular, que corresponde a la fase exponencial de crecimiento. Esta fase es la más significativa en el ciclo de crecimiento de los microorganismos y se caracteriza porque los parámetros cinéticos del crecimiento (µ, k) se mantienen constantes. A medida que el crecimiento avanza, la concentración de los nutrientes esenciales disminuye, y se acumulan los productos finales del metabolismo, hasta que el crecimiento llega a detenerse, de modo que el cultivo entra en fase estacionaria. Después las células lentamente se mueren, lisándose en algunos casos, en una última fase de muerte celular (Figura 2.1). Figura 2.1. Representación gráfica de las fases de crecimiento bacteriano

(Tomado de Labuza, 1994).

Tomado de Schlessinger et al., 1994.


2.13.


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MATERIALES, EQUIPOS E INSUMOS

2 frascos Erlenmeyer con 99 mL de caldo BHI. 48 tubos de ensayo con 9 mL de agua peptona. 64 Pipetas estériles de 1 mL. 16 Pipetas estériles de 10 mL. 96 cajas de petri estériles con agar BHI. 12 tubos de ensayo estériles. Incubadora de 35ºC +/- 2ºC Espectrofotómetro calibrado a 600 nm. Celdas plásticas para espectrofotometría. 2.14.

REACTIVOS

Patrón de McFarland 5 (0,5 ml de BaCl2 al 1,175% + 9,5 ml de H2SO4 al 1%) (Ver anexo 2.1 y 2.2, preparación y control de calidad del estándar de McFarland). 2.15.

PROCEDIMIENTO

2.5.1 Cultivos Se usaran cultivo puros en fase exponencial de diversas bacterias (por ejemplo E. coli ATCC25922 o S. aureus ATCC29213). Estos cultivos serán mantenidos a 37ºC durante 24 horas en caldo Infusión-Cerebro-Corazón (Brain Heart Infusión - BHI) (Oxoid Ltd., Basingstoke, UK) para ser usadas en la estandarización de las curvas de crecimiento de estas bacterias, las cuales se usarán como referencia para el desarrollo de las demás actividades prácticas de la asignatura. 2.5.2 Preparación del inoculo, mantenimiento del cultivo y medida directa del crecimiento: 1. A partir de un cultivo bacteriano (en fase exponencial) preparar una suspensión inicial (Patrón 1 – P1) de la cepa seleccionada y ajustarla a una turbidez correspondiente al patrón McFarland 0,5, el cual equivale aproximadamente a 1,5x108 bacterias/ml (ICONTEC, 2000). De este cultivo preparar una dilución 1:10 (Patrón 2 – P2) inoculando 1 ml de P1 en un tubo conteniendo 9 ml de caldo BHI (población final equivalente a 1,5x107 bacterias/ml). 2. A partir de P2 preparar cinco diluciones 1:10 para obtener los patrones P3, P4, P5, P6 y P7 con unas poblaciones aproximadas a 1,5x106 bacterias/ml; 1,5x105 bacterias/ml; 1,5x104 bacterias/ml; 1,5x103 bacterias/ml y 1,5x102 bacterias/ml, respectivamente. 3. A partir de cada patrón preparar diluciones decimales (1:10) consecutivas en agua peptona estéril de tal forma que la población teórica final sea de 1,5x102 bacterias/ml, según el esquema anexo al final de la guía (ver anexo 2.3). De la última dilución sembrar



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en profundidad y por duplicado 0,1 ml para cada patrón. De la dilución anterior sembrar en profundidad y por duplicado 1 ml de cada patrón. Adicionar 15 mL de agar BHI y homogenizar las cajas, llevando a incubar la totalidad de las cajas a una temperatura de 35ºC ± 2ºC por 24 – 48 horas. Al finalizar el tiempo de incubación, realizar los cálculos de la población así:

4.

𝑁=

𝑐 𝑛

De esta forma se calcula la población en ufc/mL equivalentes al patrón 1, la cual será correlacionada con el valor inicial de la curva obtenida por espectrofotometría. A partir de cada patrón (P1, P2, P3, P4, P5, P6 y P7) determine el valor de la absorbancia a 600 nm, de esta forma obtendremos el equivalente en Ab para cada patrón, la cual será correlacionada con el recuento en placa profunda para cada patrón. Con ayuda de Excel obtener una gráfica de dispersión donde ubicaremos en el eje X el valor de la absorbancia y en el eje Y el Log10 de la población. Posteriormente usando regresión lineal, agregar la línea de tendencia que mejor ajuste tenga según el coeficiente de regresión (R2) y obtener el valor de la ecuación. Esta ecuación es la que usaremos para futuros cálculos de población. Solo basta con preparar el inoculo inicial del microorganismo (en nuestro caso Escherichia coli ATCC25922 y Staphylococcus aureus ATCC29213) medir la absorbancia y reemplazar este valor en la X de ecuación. De esta forma obtendremos el valor aproximado de la población en ufc/ml.

5.

6.

7.

2.16.

RESULTADOS

Construir la curva experimental de absorbancia vs LnN empleando los datos recogidos en la siguiente tabla 2.1: Tabla 2.1. Tabla de resultados de la actividad práctica 2. Patrón (dilución del patrón)

Población teórica (cel/ml)

1 (100)

1,5x108

2 (10-1)

1,5x107

3 (10-2)

1,5x106

4 (10-3)

1,5x105

5 (10-4)

1,5x104

Absorbancia media (600 nm)

Media Población (ufc/ml)

Población real (Ln ufc/ml)



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6 (10-5)

1,5x103

7 (10-6)

1,5x102

Ajustar la curva a la función más adecuada (lineal, exponencial o logarítmica). Calcular la ecuación de predicción y corregir hasta obtener un R 2 > 0,98. Trabajar con un mínimo de 4 valores de referencia. La ecuación así obtenida será la que se empleará para los cálculos de la población final a diferentes intervalos de tiempo en las prácticas siguientes. 2.17.

NIVEL DE RIESGO

Para el desarrollo de la presente práctica se ha definido un Nivel de Riesgo Medio o Nivel 2, ya que se manejaran microorganismos considerados oportunistas y que en algún momento por malas prácticas de laboratorio pueden conllevar algún peligro para los manipuladores. Por tanto, todo estudiante, auxiliar y docente que oriente e intervenga en el desarrollo de la misma deberá usar los siguientes equipamientos:  Bata de Laboratorio manga larga, Guantes, Cofia, Tapabocas, Zapato Cerrado Bajo, Pantalón Largo. 2.18.

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Willett, H.P. (1997). Fisiología del Crecimiento Bacteriano, Capítulo 5. En: Zinsser, Microbiología. 20ª edición. Editores: Joklik, W.K., Willett, H.P., Amos, D.B., Wilfert, C.M. Editorial Médica Panamericana, S.A. Buenos Aires. Argentina. Págs. 78 – 109. ANEXOS ANEXO 2.1. Escala de McFarland Fundamento: El patrón o la escala de McFarland consiste en una serie de tubos herméticamente cerrados, previamente calibrados y con una densidad óptica diferente originada por la aparición de un precipitado de sulfato de bario (SO4Ba) resultante de la reacción entre el cloruro de bario (Cl2Ba) al 1,175% (0,048 M) y el ácido sulfúrico (H 2SO4) al 1% (0,36N). Esta turbidez puede interpretarse ópticamente o por métodos espectrofotométricos y cada una de ellas se corresponde a una concentración conocida de bacterias/ml. Para cada cepa bacteriana hay que establecer la equivalencia entre la turbidez de cada tubo y la masa o la concentración de bacterias (cel/ml) que genera una turbidez similar. Inconveniente: Es un método poco preciso, que solo se emplea cuando no hace falta exactitud, ha sido desplazado por los métodos espectrofotométricos. Conservación: El estándar de McFarland puede ser almacenado hasta por 6 meses en la oscuridad y a temperatura ambiente entre 22º a 25ºC. Sin embargo, se recomienda almacenarse a ser posibles en refrigeración. Cuidados: Descartar después de 6 meses o antes si su volumen es menor. Antes de cada uso, debe agitarse muy bien usando un shaker, hasta que el precipitado blanco de sulfato de bario se haya disuelto en todo el medio. Para asegurar la densidad del estándar de McFarland así preparado puede ser chequeado usando un espectrofotómetro con una celda de cuarzo de 1-cm; para el estándar 0,5 de McFarland, la absorbancia a una longitud de onda de 625 nm puede estar entre 0,08 a 0,1. Alternativamente, el aseguramiento del estándar de McFarland puede ser verificado por ajuste de una suspensión de una cepa control (por ejemplo, E. coli ATCC 25922) a la misma turbidez, preparando diluciones seriadas 1:10, y realizando el respectivo recuento en placa. La suspensión así ajustada puede tener un conteo de 1,5x10 8 ufc/ml. Para levaduras el estándar 0,5 de McFarland es equivalente a una suspensión de 106 ufc/ml (Andreu et al., 1998). Preparación: Se adicionan cantidades crecientes (o decrecientes según corresponda) de BaCl2*2H2O al 1,175% (p/v) en H2SO4 al 1% (v/v) de acuerdo a la siguiente tabla (Tabla 2.2.) para obtener la equivalencia deseada:



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Tabla 2.2. Preparación del estándar de McFarland. Escala de BaCl2*2H2O (0.048M) H2SO4 (0.36N) McFarland

ml final

[ ] celular

1

0,1

9,9

10,0

3 x 108

2

0,2

9,8

10,0

6 x 108

3

0,3

9,7

10,0

9 x 108

4

0,4

9,6

10,0

12 x 108

5

0,5

9,5

10,0

15 x 108

6

0,6

9,4

10,0

18 x 108

7

0,7

9,3

10,0

21 x 108

8

0,8

9,2

10,0

24 x 108

9

0,9

9,1

10,0

27 x 108

10

1,0

9,0

10,0

30 x 108

Fuente: ICONTEC, 2000. Los estándares de turbidez se preparan en tubos similares a los que se emplearan para preparar la suspensión del inoculo. Después, el tubo debe ser bien tapado usando una tapa rosca con teflón, Parafilm, o algún otro medio que evite la evaporación del mismo. Esta escala de 3x10 8 a 3x109 bacterias por ml es de gran utilidad en cuanto que, en la mayoría de los experimentos, los conteos quedarán dentro de estos límites, excepto en los casos de muy bajo crecimiento.



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ANEXO 2.2. Procedimiento para la preparación y control de calidad del estándar 0,5 de McFarland (Equivalente a 1,5x108 bact/ml)

Fuente: Fernández et al., 1998.



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ANEXO 2.3. Esquema de trabajo curva de calibración de población por método turbidimétrico y recuento en placa. LECTURA TURBIDIMÉTRICA P1 PT = 108

RECUENTO EN PLACA

Cultivo madre de E. coli / o S. aureus

fluorescens 1 ml PT =102

P2 PT = 107

1 ml

1 ml

1 ml

1 ml

1 ml

1 ml 0,1 ml

PT =101

1 ml

Medir Absorbancia a 600 nm

PT =102 P3 PT = 106

1 ml

1 ml

1 ml

1 ml

1 ml 0,1 ml

PT =101

1 ml PT =102 P4 PT = 105

1 ml

1 ml

1 ml

1 ml

0,1 ml

PT =101

1 ml PT =102 P5 PT = 104

1 ml

1 ml

0,1 ml

PT =101

1 ml P6 PT = 103

1 ml

1 ml

PT =102 1 ml 0,1 ml

1 ml P7 PT = 102

1 ml 0,1 ml

PT =101 PT =102 PT =101



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ACTIVIDAD 3 INFLUENCIA DE LA TEMPERATURA SOBRE EL CRECIMIENTO BACTERIANO 3.1 OBJETIVO Al finalizar la práctica el estudiante estará en capacidad de:  Comprender el efecto que la temperatura ejerce sobre la cinética de crecimiento bacteriano.  Evidenciar la relación existente entre la temperatura de incubación y la velocidad de crecimiento bacteriano.  Conocer el mecanismo básico de acción de la temperatura en el crecimiento y metabolismo a nivel de bacterias. 3.2 MARCO TEÓRICO Así como los humanos estamos adaptados a vivir y trabajar en diversas condiciones de temperatura, los microorganismos no escapan a esta regla. Por ejemplo cuando una persona está acostumbrada a vivir y trabajar en un clima frío, el hecho de desplazarse y realizar sus labores en clima cálido causa una afectación sobre su estado anímico y nivel de actividad, reduciendo el rendimiento que cabría esperarse de la misma que cuando se encuentra en su entorno natural. De esta forma podríamos decir que la temperatura afecta nuestras actividades, lo mismo ocurre con los microorganismos. Probablemente dentro de los factores físicos que influyen en el crecimiento, la temperatura es el principal factor que afecta la viabilidad y el desarrollo microbiano, es decir, determina la velocidad de crecimiento bacteriano (Adair et al., 1989; McDonald y Sun, 1999; Olson y Nottingham, 2000). Para entender mejor el efecto de este y otros factores medioambientales (extrínsecos e intrínsecos) diversos modelos matemáticos han sido desarrollados, con el objeto de predecir el comportamiento de las poblaciones bacterianas cuando crecen en condiciones controladas de laboratorio y muchos de ellos han logrado ser validados en condiciones de producción, transporte y almacenamiento de alimentos, esto es posible incluso tomando en cuenta variaciones en factores de crecimiento extrínsecos como la temperatura y en otros intrínsecos como la concentración de sal, actividad de agua, entre otros (Wijtzes et al., 1995; Zwitering et al., 1990). Las bacterias suelen presentar diferentes exigencias en relación a la temperatura de crecimiento. Entre la máxima temperatura, por encima de la cual esta no puede crecer y una temperatura mínima, por debajo de la cual un cultivo no se desarrolla, se ubican los límites en los que pueda haber crecimiento. Al rango de temperaturas sobre la cual pueden crecer los microorganismos se le conoce como temperatura cardinal, así esta temperatura esta constituida por una temperatura mínima, una máxima y una óptima, situándose esta última



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por lo general en valores muy cercanos o próximos a la máxima que a la mínima temperatura de crecimiento. Las mejores condiciones de crecimiento de un organismo tienen lugar dentro de unos límites bastante reducidos que es lo que se conoce como temperatura óptima de crecimiento. La temperatura óptima para el crecimiento de una especie microbiana determinada, está relacionada con la temperatura del hábitat normal del organismo. La influencia de la temperatura sobre el crecimiento, es realmente, una medida de la influencia de la temperatura sobre la actividad enzimática de la célula. 3.2.1 Comportamiento de los microorganismos respecto a la temperatura. El efecto de la

temperatura sobre el crecimiento es complejo. Por un lado cada reacción química individual, de todas las que conforman el metabolismo, es afectada por la temperatura, por lo que un incremento de ésta resulta en una mayor velocidad de reacción. Esto se traduce en un aumento de µmáx con la temperatura (ver Fig. 2). Por otra parte, aumentos posteriores de temperatura inactivan las enzimas que catalizan las reacciones, con lo que el valor de µ máx decrece rápidamente.

2. Fuente: Wijtzes y col., 1995 Como se ha mencionado, cada microorganismo tiene una temperatura de crecimiento adecuada. Si consideramos la variación de la velocidad de crecimiento (y, por lo tanto al tiempo de generación, g) en función de la temperatura de cultivo (y suponiendo que el resto de condiciones ambientales se mantienen constantes), podemos distinguir tres puntos característicos llamados temperaturas cardinales: una temperatura mínima por debajo de la cual no hay crecimiento; a temperaturas mayores se produce un incremento lineal de la velocidad de crecimiento con la temperatura de cultivo hasta que se alcanza la temperatura óptima a la que la velocidad es máxima (o sea, g mínimo). Por encima de esta temperatura



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óptima, se encuentra la máxima de crecimiento donde la velocidad de crecimiento decae bruscamente y finalmente se produce la muerte celular. El margen entre la temperatura mínima y la máxima se suele llamar margen de crecimiento o temperatura cardinal, y en muchas bacterias suele comprender unos 40 grados. Hay varios tipos de microorganismos en función de sus temperaturas de crecimiento mínima, máxima y óptima (ver tabla 1). Tabla 1. Temperaturas cardinales para los microorganismos procarióticos. Temperatura (ºC) Grupo mínima

óptima

máxima

Mesófilo

5 a 15

30 a 45

35 a 47

Psicrófilo

–5a5

12 a 15

15 a 20

Psicrótrofoa

–5a5

25 a 30

30 a 35

Termófilob

40 a 45

55 a 75

60 a 90

Termótrofoc

15 a 20

45 a 55

65 a 75

Fuente: ICMSF, 2000. aLos

microorganismos psicrótrofos son mesófilos que pueden crecer a temperaturas bajas. Por tanto, se les puede considerar como psicrófilos facultativos. Esto es importante desde el punto de vista aplicado porque cuando se encuentran contaminando alimentos, son capaces de crecer en condiciones de refrigeración (4 – 8ºC) y de producir infecciones en los consumidores del alimento (30 – 35ºC). bDe acuerdo con Enrique Iañez las bacterias denominadas termófilas pueden presentan mínimos a 25oC, óptimos a 50 – 75oC y máximos entre 80 y 105oC. Dentro de esta categoría se suele distinguir las termófilas extremas (=hipertermófilas), que pueden llegar a presentar óptimos cercanos a los 100oC, y que taxonómicamente pertenecen al dominio de las Archaea. Las termófilas estrictas (o estenotermófilas), con óptimos por encima de los 80ºC son de hecho incapaces de crecer a menos de 37oC, como las citadas arqueas (ej., Thermoproteus, Pyrococcus, Pyrodictium). La arquea Pyrolobus fumarii, habitante de los humeros termales submarinos tiene su óptimo nada menos que a 105ºC y puede llegar a aguantar 113ºC, y parece detiene su metabolismo (por "frío") a la "agradable" temperatura de 90ºC. Las termófilas facultativas (o euritermófilas) pueden crecer a menos de 37 oC, como p. ej. Thermus aquaticus. cDe acuerdo con Mescle y Zucca (1994), los termótrofos son mesófilos capaces de crecer a temperaturas relativamente elevadas, como ocurre con algunas bacterias lácticas (Streptococcus thermophilus, Lactobacillus bulgaricus) o enterococos de origen fecal (E. faecalis).



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Por encima de la temperatura mínima la tasa de crecimiento va aumentando proporcionalmente hasta alcanzar la temperatura óptima, esto se debe al incremento generalizado de la velocidad de las reacciones metabólicas catalizadas por enzimas se van aproximando a su óptimo. En dicha temperatura óptima las enzimas y reacciones se dan a su máxima tasa posible. Se denomina coeficiente de temperatura a la relación entre el incremento de la velocidad de reacción y el de temperatura. En términos generales, la velocidad de las reacciones bioquímicas suele aumentar entre 1,5 y 2,5 veces al aumentar 10ºC la temperatura a la que tienen lugar. A partir de la temperatura óptima, si seguimos subiendo la temperatura se produce un descenso acusado de la tasa de crecimiento hasta alcanzar la temperatura máxima. Dicha temperatura refleja:  Desnaturalización e inactivación de proteínas enzimáticas esenciales,  Colapsamiento de la membrana citoplasmática,  Lisis térmica de la bacteria. Lo anterior conduce inevitablemente a la muerte celular. Es importante tener en cuenta que a temperaturas bajas, el metabolismo celular es lento y las células paran de crecer; aunque suelen morir en algunos casos, no siempre es así. Sin embargo, cuando la temperatura es superior a la óptima, se produce la muerte celular rápidamente y las células no pueden recuperar su capacidad de división si baja posteriormente la temperatura. Esto permite esterilizar por calor y no por frío. Para concluir, veamos las principales adaptaciones bioquímicas a bajas y altas temperaturas seguidas por las bacterias en general. 1.1.1. Principales adaptaciones bioquímicas a medios fríos (exhibidas por los psicrótrofos): - Enzimas más resistentes al frío, - Sistemas de transporte adaptados a bajas temperaturas, - Los fosfolípidos de la membrana celular aumentan la proporción de ácidos insaturados (y en algunas bacterias, poliinsaturados), ello supone que la membrana sigue en su estado semifluido evitándose su congelación. 1.1.2. Principales adaptaciones bioquímicas a altas temperaturas (en células vegetativas bacterianas) - Enzimas termorresistentes. Algunas de ellas tienen un interior molecular muy hidrófobo, - Ribosomas termorresistentes, - Membranas ricas en ácidos grasos saturados, que permiten enlaces hidrofóbicos más fuertes, - En Arqueas hipertermófilas los lípidos son muy especiales: en vez de basarse en ésteres de ácidos grasos con el glicerol, se trata de éteres de hidrocarburos unidos al glicerol (el enlace éter es más resistente). Algunas, además, en vez de la típica bicapa lípídica, exhiben una monocapa bioquímica de C40-bifitanil-tetraéteres (resultado de unirse "cola con cola" dos C20-fitanil-diéteres), que condicionan una extrema resistencia a Universidad de Pamplona – Facultad de Ciencias Básicas – Departamento de Microbiología – © 2011


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agentes ambientales. 1.1.3. Modelamiento del efecto de la temperatura sobre el crecimiento. Las aproximaciones modernas de la Microbiología Predictiva de Alimentos han tratado de entender y establecer un vínculo entre el crecimiento de microorganismos y los factores que regulan el crecimiento tales como la temperatura, pH, actividad de agua, potencial redox, etc. La gran mayoría de los modelos secundarios son modelos de tipo cinético (Labuza y Fu, 1993; McDonald y Sun, 1999), tales como el modelo de Arrhenius, modelo modificado de Arrhenius, modelo de Schoolfield, modelo de la raíz cuadrada de Ratkowsky y algunos modelos polinómicos, de los cuales el más comúnmente usado ha sido el modelo de Arrhenius. Los modelos cinéticos para la determinación de la vida útil en alimentos son generalmente basados en la ocurrencia de fenómenos y estos no han sido desarrollados para un alimento en particular. Sin embargo, los parámetros experimentales y ambientales de un modelo pueden aplicarse para un producto en especial. De estos, la temperatura es normalmente considerada como el factor más importante en las reacciones de deterioro de los alimentos, especialmente, para la alteración microbiana donde la velocidad de crecimiento específico y la fase de latencia son altamente dependientes de la temperatura (Giannuzzi y col., 1998). Diversos modelos predictivos han sido usados a través del tiempo para evaluar la relación entre la temperatura y la velocidad de crecimiento bacteriano (Adair et al., 1989). La ecuación original del modelo lineal de Arrhenius se ha aplicado tanto al crecimiento microbiano como a las reacciones químicas, es decir, este modelo está basado en consideraciones termodinámicas empíricas (McDonald y Sun, 1999), pero se reconoce ampliamente que la relación entre el logaritmo de los parámetros de la curva de crecimiento y el inverso de la temperatura absoluta es no-lineal o por lo menos lineal sólo por encima de una fracción del rango de temperatura (Adair et al, 1989). . 1.1.3.1. Modelo de la Raíz Cuadrada

El modelo de la raíz cuadrada es probablemente la ecuación más estudiada y el modelo más ampliamente usado para analizar el efecto de la temperatura sobre la velocidad específica de crecimiento (Giannuzzi et al., 1998). Ratkowsky et al., (1983) propusieron la siguiente relación:

𝜇 = 𝑏 × 𝑇 − 𝑇0 Donde µ es la velocidad específica de crecimiento, b es un coeficiente de regresión [(log (ufc/cm2) días-1)1/2⁰C-1], T es la temperatura de incubación absoluta (K)y T0 es una temperatura conceptual sin significancia metabólica para psicrófilos, psicrótrofos y mesófilos, es decir, la menor temperatura en la cual la velocidad de crecimiento es cero o la Universidad de Pamplona – Facultad de Ciencias Básicas – Departamento de Microbiología – © 2011


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fase de latencia es infinita (Ratkowsky et al., 1983; Adair et al., 1989; Giannuzzi et al., 1998). La ecuación anterior fue modificada como sigue (Giannuzzi et al., 1998):

𝜇 = 𝑏×+ 𝑞×𝑇 Donde T es la temperatura de incubación (⁰C), q es la pendiente de la línea de regresión [(log (ufc/cm2) días-1)1/2⁰C-1] y p [(log (ufc/cm2) días-1)1/2] es el intercepto a 0ºC.

1.1.3.2. Modelo de Arrhenius

La ecuación de Arrhenius fue derivada empíricamente basada en consideraciones termodinámicas (Labuza y Riboh, 1982), y describe la velocidad con que una reacción cambia cuando se emplean diferentes temperaturas conocidas (Ross y McMeekin, 1994). La forma más simple de esta ecuación es: −𝐸𝑎

k = A 𝑒 𝑅𝑇 o

ln 𝑘 = ln 𝐴 −

𝐸𝑎 𝑅𝑇

Donde, k es la velocidad de reacción; A (ufc/ml*tiempo) es un factor pre-exponencial – que corresponde al intercepto de “y” en una gráfica de Lnk vs 1/T–, R es la constante universal de los gases (8,314 KJ/KgºK o 1,987 cal/ºKmol), T es la temperatura absoluta (ºK), y Ea (KJ/Kg) es denominada como la energía de activación de la reacción límite de velocidadcrecimiento (Ross y McMeekin, 1994). Si en la ecuación anterior los valores de k son calculados a diferentes temperaturas y si el lnk es graficado contra 1/T, puede obtenerse una línea recta en la cual la pendiente (m) es igual –Ea/R (Labuza y Riboh, 1982; Labuza y col., 1992; McDonald y Sun, 1999). Así el modelo de Arrhenius puede catalogarse en la clasificación de Whiting y Buchanan (1993) como un modelo de tipo secundario. Cuando el modelo de Arrhenius es empleado para evaluar el efecto de la temperatura sobre el crecimiento microbiano, entonces k se transforma en la velocidad de crecimiento específico (Ross y McMeekin, 1994; Giannuzzi y col., 1998), y la ecuación de Arrhenius puede escribirse como: −𝐸𝜇

μ = A 𝑒 𝑅𝑇

Sin embargo, el crecimiento bacteriano es complejo y las extrapolaciones de las gráficas pueden no mostrar linealidad, por lo tanto, la ecuación anterior no puede encajar muy bien



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por debajo de los datos óptimos o por encima de las temperaturas mínimas para el crecimiento. Entonces, las gráficas obtenidas solo sirven para predecir el crecimiento microbiano en un limitado rango de temperatura (Labuza y Fu, 1993; McDonald y Sun, 1999). Así la ecuación que ha sido utilizada mayoritariamente para describir el efecto de la temperatura sobre el crecimiento microbiano es el modelo de la raíz cuadrara propuesto por Ratkowsky y col., en 1982 (Adair y col., 1989; Willocx y col., 1993; Neumeyer y col., 1997; Giannuzzi y col., 1998). MATERIALES, EQUIPOS E INSUMOS 

     

Cultivo madre de E. coli o S. aureus en fase exponencial (mantenido en caldo BHI) y ajustado a un McFarland 0,5. Pipetas de 10 ml y 1 ml estériles. Espectrofotómetro. Celdas para espectrofotometría. Incubadoras a distintas temperaturas (25ºC, 30ºC, 35ºC, 40ºC y 45ºC. Frascos erlenmeyer con 99 ml de caldo BHI. 20 mL de caldo BHI estéril (Solución Blanco).

REACTIVOS No aplica PROCEDIMIENTO  A partir del cultivo madre inocular 1 ml en un frasco erlenmeyer conteniendo 99 ml de caldo BHI.  De esta suspensión determine la absorbancia a 600 nm y confronte con la curva patrón de Ab vs. LnN obtenida en la práctica 1, y prediga la población inicial. Esta población será la equivalente a la población inicial a tiempo 0.  Colocar a incubar la suspensión a diferentes temperaturas durante una hora. Pasado este tiempo en condiciones asépticas tome un inóculo y determine la absorbancia. Posteriormente cada media hora haga lecturas espectrofotométricas hasta obtener por lo menos 8 datos de incrementos en este valor. Confrontar estos resultados con la curva patrón y calcular la población a los diferentes intervalos de tiempo.  Realizar la gráfica de crecimiento a cada temperatura, para tal fin, tome los datos de lectura obtenidos por los otros grupos. Una vez construida la gráfica y con los valores obtenidos determine en cada una de ellas la duración de la fase de latencia, la velocidad de crecimiento específico y el tiempo de duplicación. Discuta además el comportamiento del crecimiento a cada una de las diferentes temperaturas.



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Tiempo (min)

0

60

90

120

150

180

210

240

270

300

Ab (600 nm) LnN células/ml NIVEL DE RIESGO Para el desarrollo de la presente práctica se ha definido un Nivel de Riesgo Medio o Nivel 2, ya que se manejaran microorganismos considerados oportunistas y que en algún momento por malas prácticas de laboratorio pueden conllevar algún peligro para los manipuladores. Por tanto, todo estudiante, auxiliar y docente que oriente e intervenga en el desarrollo de la misma deberá usar los siguientes equipamientos:  Bata de Laboratorio manga larga, Guantes, Cofia, Tapabocas, Zapato Cerrado Bajo, Pantalón Largo. BIBLIOGRAFÍA  Adair, C., Kilsby, D.C., Whittall, P.T. (1989). Comparison of the Schoolfield (non-linear Arrhenius) model and the Square Root model for predicting bacterial growth in foods. Food Microbiol., 6: 7 – 18.  Giannuzzi, L., Pinotti, A., Zaritzky, N. (1998). Mathematical modeling of microbial growth in packaged refrigerated beef stored at different temperatures. Int. J. Food Microbiol., 39: 101 – 110.  http://www.biologia.edu.ar/microind/crecimiento%20bacteriano.htm. Fecha de acceso: 13 de abril de 2007.  Iañez, E. (2007). Curso de Microbiología On Line. Capítulo: Factores físicos que afectan el crecimiento bacteriano (I). Fecha de acceso: 13 de abril de 2007. Tomado de: http://fai.unne.edu.ar/biologia/microgeneral/micro-ianez/17_micro.htm#temp.  ICMSF. (2000). Temperatura, Capítulo 1. En: Ecología microbiana de los alimentos 1. Factores que afectan a la supervivencia de los microorganismos en los alimentos. Editorial Acribia, S.A. Zaragoza, España. Pps. 1 – 38.  McDonald, K., Sun, D.W. (1999). Predictive food microbiology for the meat industry: a review. Int. J. Food Microbiol., 52: 1 – 27.  Mescle, J.F., Zucca, J. (1994). El comportamiento de los microorganismos en los alimentos, la temperatura. En: Microbiología alimentaria, volumen 1. Aspectos microbiológicos de la seguridad y calidad alimentaria. Editorial Acribia, S.A. Zaragoza, España. Pps. 7 – 50.  Ratkowsky, D.A., Lowry, R.K., McMeekin, T.A., Stokes, A.N., Chandler, R.E. (1983). Model for bacterial culture growth rate throughout the entire biokinetic temperature range. J. Bacteriol., 154: 1222 – 1226.  Roberts, T.A. (1997). Microbial growth and survival: developments in predictive modeling.


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 

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Food Technol., 51(4): 88 – 90. Valbuena, E., Barreiro, J., Sánchez, E., Castro, G., Bríñez, W., Tovar, A. (2005). Modelos Cinéticos Aplicados al Crecimiento de Lactococcus lactis subsp. lactis en leche. Revista Científica, FCV-LUZ / Vol. XV, Nº 5, 464 – 475. Whiting, R.C.; Buchanan, R.L. (1994). Microbial modeling. Food Technol., 48 (6): 113 – 120. Wijtzes, T.; Wit, J.C.; Huis, J.H.; Vant Riet, K.; Zwietering, M.H. (1995). Modelling bacterial growth of Lactobacillus curvatus as a function of acidity and temperature. Appl. Environ. Microbiol., 61(7): 2533 – 2539. Zwitering, M.H.; Cuppers, H.G.; de Wit, J.C.; Van´t Riet, K. (1994). Evaluation of data transformation and validation of a model for the effect of temperature on bacterial growth. Appl. Environ. Microbiol. 60(1): 195 – 203. Zwitering, M.H.; de Koos, J.T.; Hasenack, B.E.; de Wit, J.C.; Van´t Riet, K. (1991). Modeling of bacterial growth as a function of temperature. Appl. Environ. Microbiol. 57: 1094 – 1101. Zwitering, M.H.; Jongenburger, I.; Rombouts, F.M.; Van´t Riet, K. (1990). Modeling of the bacterial growth curve. Appl. Environ. Microbiol. 56(6): 1875 – 1881.



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ACTIVIDAD 4 INFLUENCIA DEL PH Y ACIDEZ SOBRE EL CRECIMIENTO BACTERIANO OBJETIVO Al finalizar la práctica el estudiante estará en capacidad de:  Comprender el efecto que el pH tiene sobre la viabilidad y crecimiento bacteriano.  Conocer el mecanismo básico de acción del pH sobre el medio, sobre la membrana celular y sobre las reacciones metabólicas de las bacterias. MARCO TEÓRICO En estado natural, la mayoría de los alimentos (carnes, pescados y productos vegetales) son ligeramente ácidos. La mayor parte de las frutas son bastantes ácidas y solo algunos alimentos, como la clara de huevo por ejemplo, son alcalinos. Para preservar los alimentos, durante miles de años se ha venido aumentando su acidez, bien sea de manera natural, por fermentación, o artificial, por adición de ácidos débiles, con lo que se consigue inhibir la proliferación microbiana. De este modo, la acidez puede ser un factor básico en la preservación, como en el caso de algunos alimentos fermentados tales como el yogur, la col fermentada o los pepinillos en vinagre, o tener un papel auxiliar, cuyo efecto se combina con el de otros factores tales como conservantes químicos, calor o actividad de agua (aw). El pH es el logaritmo de la inversa de la concentración de iones hidrógeno de una disolución. Proporciona una indicación de la actividad de estos iones sobre los componentes del medio. Influye sobre las reacciones químicas y bioquímicas y, en consecuencia, sobre los microorganismos. Comportamiento de los microorganismos respecto del pH: Como sabemos, las bacterias pueden desarrollarse a pHs entre 4,5 y 9 con un óptimo de crecimiento entre 6,5 y 7,5. Esto quiere decir que a valores de pHs comprendidos entre estos rangos la velocidad de crecimiento es mayor y, por tanto la duración de la fase de latencia es menor que cuando las bacterias crecen a valores de pHs inferiores o superiores a los óptimos. Naturalmente existen excepciones, es decir, como las bacterias acéticas y las bacterias lácticas, que soportan pHs inferiores a 3,5. Para las primeras el pH óptimo se sitúa en torno a 5,4 – 6,3, mientras que para las segundas oscila entre 5,5 (incluso menor) y 6 (ICMSF, 2000). En nuestro caso particular y según describe Mescle y Zucca (1994), los límites de pH para el crecimiento de E. coli y S. aureus son:



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Microorganismo

pH mínimo

pH óptimo

pH máximo

E. coli

4.3

6.0 – 8.0

9.0

S. aureus

4.2

6.8 – 7.5

9.3 – 9.8*

* ICMSF, 2000. Como hemos mencionado, muchos microorganismos pueden crecer dentro de un apmplio rango de pH, cabría suponer pues, que estas células tienen la capacidad o disponen de métodos eficaces para estabilizar su pH interno. Sin embargo, se ha comprobado que el pH interior puede sufrir o verse considerablemente afectado por el pH del medio exterior. Esta cuestión se ha estudiado a través del seguimiento paso a paso, a través de la membrana celular, de un ácido débil, la 5,5-dimetil-2,4-oxaxolidindiona (DMO). En el rango de pH entre 5 y 7, el pH interno de E. coli resultó ser más alcalino que el del medio exterior y por encima de pH 7, más ácido (ICMSF, 2000). Mecanismo de acción del pH sobre el crecimiento de los microorganismos: La acción del pH sobre el crecimiento de los microorganismos se puede situar a tres niveles: el medio, la permeabilidad de la membrana y la actividad metabólica. La disponibilidad de ciertos nutrientes en el medio de cultivo sufre modificaciones en función del equilibrio iónico. Como ocurre con los iones metálicos, a pHs ácidos los iones magnesio forman complejos insolubles, a pHs básicos lo hacen los iones de zinc, calcio y los férricos. Bajo estas formas, estos iones, que son indispensables como cofactores de enzimas, son difícilmente utilizables. La permeabilidad de la membrana se ve igualmente afectada por las variaciones en la concentración de iones H+ y OH-. En medio ácido las permeasas catiónicas se saturan de iones hidrógeno, lo que limita o anula el transporte de cationes indispensables. En medio alcalino, son los iones hidroxilo los que saturan la membrana, impidiendo la transferencia de aniones. Las reacciones enzimáticas poseen un óptimo de actividad por encima o por debajo del cual la cinética sufre cambios. Toda variación del pH citoplásmico entraña una disminución de la actividad enzimática y, por tanto, del crecimiento del microorganismo. No todos los enzimas tienen el mismo comportamiento en función del pH, las hidrolasas extracelulares son menos sensibles en general que los enzimas citoplásmicos. En la práctica se pueden emplear dos tipos de conservadores ácidos en alimentos que actúan sobre los tres niveles antes mencionados: -

Ácidos fuertes (fosfórico o el clorhídrico). Su efecto consiste en bajar considerablemente el pH, proporcionando una concentración externa de protones muy elevada, que determina la acidificación del medio interno celular. Tales condiciones son normalmente inaceptables en alimentos pero permisibles en bebidas carbónicas.

-

Ácidos débiles lipofílicos (láctico, cítrico, acético, fórmico). Provocan la entrada de



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protones a través de la membrana celular, acidificando el interior de la célula e inhibiendo el transporte de nutrientes. Algunos ácidos se disocian dando lugar a aniones (lactato o citrato) que la célula es capaz de transportar y cuya presencia por tanto no inhibe el metabolismo energético. En su defecto, el ácido acético o el fórmico, son eficaces conservadores debido a que no solo son buenos conductores de protones, sino que además pueden dar lugar a concentraciones intracelulares de sus aniones que ejercen acción inhibitoria. También existen algunos iones que potencian la acción de los ácidos, tal es el caso del sulfito o el nitrito (las sales minerales de ácidos débiles), que resultan altamente inhibitorios a pH bajos. MATERIALES, EQUIPOS E INSUMOS      

Cultivo madre de E. coli y S. aureus en fase logarítmica (mantenido en caldo BHI). Pipetas de 10 ml y 1 ml estériles. Espectrofotómetro. Celdas para espectrofotometría. Incubadora a 35ºC +/- 2ºC Frascos erlenmeyer con 99 ml de caldo BHI ajustado a pHs 5,0; 6,0 y 7,0.

REACTIVOS No aplica PROCEDIMIENTO  A partir del cultivo madre inocular 1 ml en un frasco erlenmeyer conteniendo 99 ml de caldo BHI ajustado a diferentes concentraciones de pH.  De esta suspensión determine la absorbancia a 600 nm y confronte con la curva patrón de Ab vs. LnN obtenida en la práctica anterior (Fig 1 y Fig 2), y prediga la población inicial. Esta población será la equivalente a la población inicial a tiempo 0.  Colocar a incubar la suspensión a 35ºC +/- 2ºC y cada hora determine la absorbancia durante dos horas. A partir de las 2 horas reduzca el tiempo de medida a 30 minutos hasta obtener por lo menos 8 datos de incrementos en la absorbancia. Confrontar estos resultados con la curva patrón y calcular la población a los diferentes intervalos de tiempo.  Realizar la gráfica de crecimiento a cada valor de pH y calcular en cada una de ellas la duración de la fase de latencia, la velocidad de crecimiento específico y el tiempo de duplicación.



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Tiempo (min)

0

60

120

150

180

210

240

270

Ab (600 nm) NIVEL DE RIESGO Para el desarrollo de la presente práctica se ha definido un Nivel de Riesgo Medio o Nivel 2, ya que se manejaran microorganismos considerados oportunistas y que en algún momento por malas prácticas de laboratorio pueden conllevar algún peligro para los manipuladores. Por tanto, todo estudiante, auxiliar y docente que oriente e intervenga en el desarrollo de la misma deberá usar los siguientes equipamientos:  Bata de Laboratorio manga larga, Guantes, Cofia, Tapabocas, Zapato Cerrado Bajo, Pantalón Largo. BIBLIOGRAFÍA  Mescle, J.F., Zucca, J. (1994). El comportamiento de los microorganismos en los alimentos, incidencia del pH. En: Microbiología alimentaria, volumen 1. Aspectos microbiológicos de la seguridad y calidad alimentaria. Editorial Acribia, S.A. Zaragoza, España. Pps. 7-50.  ICMSF. (2000). pH y Acidez, Capítulo 5. En: Ecología microbiana de los alimentos 1. Factores que afectan a la supervivencia de los microorganismos en los alimentos. Editorial Acribia, S.A. Zaragoza, España. Pps. 97-117.



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ACTIVIDAD 5 EFECTO DE DIVERSOS DEPRESORES DE LA ACTIVIDAD DE AGUA (AW) [CONCENTRACIÓN DE NaCl, GLUCOSA Y SACAROSA] SOBRE EL CRECIMIENTO BACTERIANO OBJETIVO Al finalizar la práctica el estudiante estará en capacidad de:  Comprender el efecto que la actividad de agua (aw) y la concentración de solutos depresores de aw tienen sobre la viabilidad y crecimiento bacteriano.  Evidenciar la relación existente entre la concentración de sal, glucosa y sacarosa vs la actividad de agua de un medio.  Conocer el mecanismo básico de acción de la actividad de agua y solutos depresores de la misma sobre el metabolismo bacteriano. MARCO TEÓRICO Los microorganismos requieren la presencia de agua, en una forma disponible, para que puedan crecer y llevar a cabo sus actividades metabólicas. La mejor forma de medir la disponibilidad de agua es mediante la actividad de agua (aw). La deshidratación es un método de conservación de los alimentos basado en la reducción de la aw, lo que se consigue eliminando el agua de los productos. Durante el curado y/o salazonado, así como en el almíbar y otros alimentos azucarados, son los solutos los que, al ser añadidos, descienden la aw. un pequeño descenso de la aw es a menudo suficiente para evitar la alteración de los alimentos siempre que esta reducción sea potenciada por otros agentes tal como ocurre con los nitritos en muchas carnes curadas y con los componentes del humo en los alimentos ahumados, salazonados y desecados. De esta forma la aw puede tener un papel principal en la conservación de alimentos o en su defecto tener un papel auxiliar, cuyo efecto se combina con el de otros factores tales como conservantes químicos, calor, acidez, etc. La actividad de agua (aw) es definida como la relación de la presión parcial del vapor de agua en el producto (p) y la del agua pura (po) a la misma temperatura (Christian, 1980; Mathlouthi, 2001).

𝑎𝑤 =

𝑃 𝑃0

A medida que una solución se concentra, la presión de vapor disminuye y la aw va descendiendo a partir de un valor máximo de 1 para el agua pura (en ausencia de capilares



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o fuerzas de adsorción). La aw está relacionada con el punto de congelación y con el de ebullición así como con la humedad relativa en equilibrio (HRE) y la presión osmótica. Relación entre la Actividad de Agua, la Humedad Relativa en equilibrio y la Presión Osmótica: Según Christian (1980) los primeros estudios sobre el efecto de la humedad en el crecimiento microbiano se describieron en términos de HRE o presión osmótica. La relación entre la aw y la humedad relativa viene dada por la fórmula:

𝐻𝑅𝐸 % = 𝑎𝑤 × 100 En este caso la HRE al igual que la aw, es la relación entre la presión de vapor de la solución y la del agua pura pero expresada en porcentaje. Esta ecuación podría ser válida para sistemas en los cuales teóricamente se alcance el equilibrio, sin embargo, en la praxis resulta complejo que la aw y la HRE alcancen el equilibrio, aún incluso en aquellos alimentos que podríamos considerar cerrados como los enlatados, la aw no alcanza el equilibrio con la humedad relativa). La HRE se refiere estrictamente a la atmósfera en equilibrio con una solución o alimento y constituye una expresión menos apropiada que la aw como forma de medir el agua disponible. La presión osmótica está relacionada con la aw a través de la siguiente ecuación:

𝑃. 𝑂𝑠 =

−𝑅𝑇 𝑙𝑛𝑎𝑤 𝑉

Donde R es la constante de los gases, T la temperatura absoluta (ºK), lnaw el logaritmo natural de la aw y V el volumen molar parcial del agua. El uso de la presión osmótica presupone la presencia de una membrana con unas características de permeabilidad adecuadas. Relación entre la Actividad de Agua y la concentración de depresores de la misma: La aw de un alimento puede reducirse aumentando la concentración de solutos en la fase acuosa de los alimentos bien mediante la extracción del agua (secado, deshidratación, etc.) o mediante la adición de solutos (NaCl, azúcar, glicerina, etc.). Algunas moléculas del agua se orientan en torno a las moléculas del soluto y otras quedan absorbidas por los componentes insolubles de los alimentos. En ambos casos, el agua queda en forma ligada que es una forma menos reactiva (no disponible). La relación entre la aw y la concentración de solutos viene dada por la ley de Raoult y puede expresarse de la siguiente forma:

𝑃 𝑛2 = 𝑃0 𝑛1 + 𝑛2



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Es decir, la relación entre la presión de vapor de la solución y la del solvente puro es igual a la fracción molar del solvente, donde p y po son las presiones de vapor de la solución y del solvente, respectivamente y n1 y n2 el número de moles del soluto y del solvente, respectivamente. En la figura 1 se presenta la relación de tres solutos depresores de la actividad de agua (Sacarosa, Glucosa y NaCl) frente a la aw. Figura 1. Relación entre la concentración de sacarosa, glucosa y cloruro sódico (g/L) vs actividad de agua en medio acuoso a 25ºC. 1,02 0,98

aw

0,94 0,90

Sacarosa Glucosa Sal

0,86 0,82 0,78 0,74 0

500

1000

1500 2000 Concentración (g/Lt)

Fuente: adaptada de los valores de Christian, 1980. A partir de la figura anterior podemos inferir que la relación entre la concentración tanto de sacarosa, glucosa y NaCl y la actividad de agua es inversamente proporcional, tomando una relación de tipo lineal. En este sentido, el cloruro de sodio actúa como un fuerte represor de la actividad de agua y en menor medida la glucosa y sacarosa. Con los datos anteriores se puede predecir la aw de una solución acuosa sencilla de composición conocida, sin embargo, la relación entre la composición de un alimento y su aw es mucho más compleja. Para conocer estas relaciones, lo habitual es determinar los valores de la a w de un alimento con diferentes concentraciones de solutos, los que se representan gráficamente con el fin de obtener la curva de correlación entre el % soluto vs aw. A partir de los datos mostrados en la figura 1, se obtienen las siguientes ecuaciones que pueden ser usadas para preparar medios sencillos con diferentes valores de aw para el estudio de las relaciones de agua desde un punto de vista microbiológico, la bondad de las gráficas (coeficiente de determinación –R2) es de 0,996 para la sacarosa y NaCl y 0,993 para la glucosa: -

Sacarosa:

𝑔

𝑎𝑤 = −0,00007 × 𝑠𝑎𝑐𝑎𝑟𝑜𝑠𝑎 𝐿𝑡

+ 1,00412



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𝑔

- Glucosa:

𝑎𝑤 = −0,00010 × 𝑔𝑙𝑢𝑐𝑜𝑠𝑎 𝐿𝑡

- NaCl:

𝑎𝑤 = −0,00067 × 𝑁𝑎𝐶𝑙 𝐿𝑡

𝑔

+ 0,99808

+ 1,00551

Relación entre la Actividad de Agua y la Temperatura: La relación entre la concentración de los solutos y la actividad de agua es dependiente de la temperatura, dado que esta influye sobre la presión de vapor de agua de las soluciones pero el efecto es pequeño con la mayoría de los solutos salvo que las soluciones sean saturadas. En tales casos, las cantidades de algunas sustancias de la solución, y por tanto la aw, pueden variar marcadamente con la temperatura. Concentración de NaClentre para diversos valores Figura 2. Relación la actividad dedeagua Aw a 25ºC

25ºC y b 30ºC.

de NaCl para diversos valores de y el Concentración porcentaje de NaCl en solución acuosa: a Aw a 30ºC

y = -0,0064x + 1,0043 R2 = 0,9975

1,010

1,020

1,000

a

1,000

0,980 0,970

0,940

Aw

Aw

0,960

0,920

0,840 0,00

0,960 0,950

0,900

0,860

b

0,990

0,980

0,880

y = -0,0067x + 1,0015 R2 = 0,996

0,940 0,930

y = – 0,0064x + 1,0043 R2 = 0,9975 5,00

10,00

0,920 15,00

NaCl (% p/p)

20,00

25,00

0,910 0,00

Y = - 0,0067x + 1,0015 R2 = 0,996 2,00

4,00

6,00

8,00

10,00

12,00

14,00

NaCl (% p/p)

En la figura 2 (a y b) puede verse la relación entre la actividad de agua y el % de NaCl a dos temperaturas (25 y 30ºC). A manera de ejemplo y para ilustrar la relación entre la temperatura y actividad de agua podemos calcular la aw para una concentración del 10% de NaCl a 25ºC y 30ºC, en este caso los valores obtenidos a partir de las ecuaciones equivalen a una aw = 0,930 a 25ºC, mientras a 30ºC esta misma concentración equivale a una aw = 0,935. En términos generales aunque la variación es poca (0,005 unidades) podría resultar letal en algún momento si existe una combinación de diversos factores que afecten el crecimiento (temperatura, pH, aw, atmósfera gaseosa, presencia e antimicrobianos, etc.). A temperaturas inferiores a las del punto de congelación de una solución o alimento, la presión de vapor del agua líquida disminuye al descender la temperatura y por tanto, disminuye también la aw. La aw de una solución o alimento congelados es función de la temperatura presentando un valor de 0,953 a -5ºC; de 0,907 a -10ºC; de 0,864 a -15ºC y de 0,823 a -20ºC (Christian, 1980). Si representamos los datos anteriores en forma gráfica (Figura 3), podemos apreciar el concepto descrito anteriormente, es decir, con el descenso



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de la temperatura por debajo el punto de congelación de un alimento (generalmente situado en torno a los -1,5ºC a -2,5ºC) disminuye la actividad de agua en forma proporcional así:

𝑎𝑤 = 0,0087 × 𝑇℃ + 0,995 (𝑅 2 = 0,999) Figura 3. Relación entre la temperatura de congelación de un alimento y la actividad de agua del mismo. 0,96

aw

0,92 0,88

0,84 0,80 -20

-15

-10

-5

0

Temperatura de congelación (°C)

Comportamiento de los microorganismos respecto a la aw Como sabemos, la mayoría de los microorganismos, incluyendo las bacterias patógenas, crecen más rápidamente a niveles de aw de 0,995 – 0,980 (la aw de la mayoría de los medios de cultivo empleados en laboratorio es de 0,999 – 0,990) (ICMSF, 2000). A valores de a w inferiores a estos, la velocidad de crecimiento y la población estacionaria o la masa celular final disminuye y la fase de latencia aumenta (Figuras 5, 6 y 7 -Anexos). A una aw suficientemente baja, la cual es difícil de definir con precisión, la fase de latencia se hace infinita, es decir, el crecimiento cesa. Por ejemplo, la tasa de crecimiento de S. aureus desciende en un 10% de su máximo cuando la aw baja a 0,90 (Mescle y Zucca, 1994). A una aw suficientemente baja, la cual es difícil de definir con precisión, la fase de latencia se hace infinita, es decir, el crecimiento cesa (ICMSF, 2000). El crecimiento de la mayoría de las bacterias y hongos ocurre a aw superiores a 0,90. Sin embargo, entre los microorganismos que tienen una importancia en la conservación de los alimentos existen muchos que pueden multiplicarse a valores de aw muchos más bajos. Dichos microorganismos se denominan de forma variada: halófilos, xerófilos y osmófilos. Al igual que el crecimiento, la aw del medio también afecta a la supervivencia de los microorganismos. La letalidad se reduce, a temperatura ambiente y bajo refrigeración (ICMSF, 2000), al descender la aw o al aumentar la concentración de solutos. Esta protección que proporciona una aw baja puede disminuirse bajo condiciones de acidez



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(ICMSF, 2000). Específicamente hablando de microbiología de alimentos, la supervivencia de microorganismos es más importante en el contexto del tratamiento térmico. La supervivencia a altas temperaturas es generalmente menor a altos valores de a w. Entre las bacterias gram-negativas de mayor importancia están las Pseudomonas spp y las Enterobacteriaceae, las que habitualmente proliferan sólo a aw superiores a 0,96 y 0,93, respectivamente. Por otro lado las bacterias gram-positivas no formadoras de esporas son mucho más tolerantes a las aw reducidas que las gram-negativas. Dentro de este grupo el patógeno más tolerante es S. aureus el cual puede desarrollarse a aw de 0,86 y 0,83 dependiendo del sustrato. Sin embargo, a aw inferiores de 0,93 no se ha observado la producción de toxina (ICMSF, 2000). Dentro de los gram-positivos formadores de esporas el límite normal de aw es de 0,90 – 0,91. A aw de 0,97 – 0,93 no germinan ni crecen las cepas de B. cereus productoras de ETAs. Por otro lado C. botulinum deja de producir toxina a unos valores de aw cercanos a los de crecimiento. Estos valores dependen del tipo así: 0,95 para el tipo A, 0,94 para el B y 0,97 para el E. C. perfringens presenta una aw de crecimiento próximo a 0,95 (ICMSF, 2000). Mecanismo de acción de la actividad de agua (aw) sobre el crecimiento/supervivencia de los microorganismos Cuando una bacteria es expuesta a un incremento en la presión osmótica del ambiente (adición de un soluto como la NaCl, el cual disminuye la actividad del agua) trae consigo un fenómeno de plasmólisis de la célula (Sperber, 1983). Esto disminuye o paraliza el crecimiento de los microorganismos, a causa de la inhibición de las actividades enzimáticas. Algunas bacterias responden a este hecho mediante la acumulación de biomoléculas en el interior celular para prevenir la deshidratación o mantener la presión intracelular (Pocard et al., 1994; Mazomba y Mabinya, 2010). Estas biomoléculas usualmente no interfieren con las funciones macromoleculares, y son denominadas como “solutos compatibles”, debido a que funcionan, a grandes concentraciones intracelulares, como protectores de la actividad enzimática en vez de actuar como inhibidores. En síntesis general, los microorganismos responden frente a aw reducidas acumulando potasio, aminoácidos y polialcoholes. Algunas moléculas como la glicina betaina, prolina, prolina betaina, trehalosa, colina, dimetilglicina, dimetilsulfoniopropionato, ectoina, glucosilglicerol y carnitina, han sido reportadas por Kempf y Bremer (1998) y Prescott et al., (1999) como osmoprotectores en Escherichia coli, y juegan un papel importante en la ecología bacteriana, especialmente en ambientes adversos. Estos componentes pueden ser acumulados bien sea directamente desde el medio exterior o ser sintetizados a partir de compuestos presentes en este medio (Mazomba y Mabinya, 2010).



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Sperber (1983) y Mezcle y Zucca (1994) describen el mecanismo general de adaptación al descenso de la aw seguido por aquellas bacterias que son capaces de crecer cuando la aw es reducida, este mecanismo supone dos fases: A. Con una aw igual o mayor a 0,995 el desarrollo microbiano tiene lugar en óptimas condiciones. La aw intracelular de las células es significativamente menor que el del medio exterior, de tal forma que las células son capaces de mantener la turgencia. Cuando la aw del medio externo es reducido (shock osmótico: por ejemplo el aw pasa de 0,995 a 0,950), se observa en primer lugar un fenómeno de plasmólisis con una pérdida rápida de agua. Durante este lapso la célula es incapaz de crecer. Paso seguido, se evidencia una acumulación citoplasmática de iones potasio (K+) e iones Glutamato. La acumulación de solutos en el citoplasma permite la recuperación de la turgencia. B. Cuando se presenta una reducción de la aw menor a 0,950, nuevamente hay pérdida de agua y el crecimiento se detiene. El descenso de la concentración de agua intracelular incrementa efectivamente la concentración interna de iones potasio desde la concentración inicial. El incremento en estos iones, activan la enzima Glutamato deshidrogenasa, la cual reduce la α-cetoglutarato a Glutamato, que se acumula en el citoplasma, provocando un nuevo ingreso de agua al interior, tras lo cual se reactiva el crecimiento aunque a velocidades menores. En general, la mayoría de las bacterias más comunes han mostrado una acumulación de aminoácidos intracelulares cuando se enfrentan a stress osmótico (Sperber, 1983). Aquellos que generalmente acumulan Glutamato por lo general son incapaces de crecer a aw menor a 0.95. El Glutamato, puede afectar negativamente al pH celular (acidificándolo), por lo que se requiere de la presencia de cationes (usualmente ión potasio) para contrapesarla. Cuando la concentración de iones Glutamato es suficiente para reducir la aw intracelular a 0,950, la concentración de iones potasio se eleva tanto que resulta ser tóxico para algunas de las funciones celulares y el crecimiento cesa. Algunas especies de bacterias que son capaces de producir Glutamato son: Pseudomonas aeruginosa, Vibrio parahaemolyticus, Escherichia coli, Salmonella oranienburg, Clostridium sporogenes, Lactobacillus plantarum, Serratia marcescens y Klebsiella aerogenes. Algunos microorganismos pueden adaptarse a un descenso más pronunciado de la aw bien sea descarboxilando el Glutamato hasta ácido α-aminobutírico (GABA) o bien reduciendo el Glutamato hasta Prolina, compuestos que se acumulan en el citoplasma bacterianoLos anteriores aminoácidos son compuestos sin carga, por lo que no se requiere de la presencia de cationes de contrapeso; por consiguiente, las células que son capaces de aumentar estos aminoácidos pueden crecer a valores más bajos de aw que aquéllos que aumentan sólo en Glutamato (Sperber, 1983). Según señala Mescle y Zucca (1994), estos microorganismos pueden crecer incluso a aw de 0,930 – 0,900 o aún a valores de aw de 0,860.



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Figura 4. Adaptación intracelular a la reducción de actividad de agua (o = iones potasio; o = iones Glutamato, □ = ácido α-aminobutírico –GABA– o Prolina) aw mayor a 0.995

Reducción de aw (0.950)

aw menor a 0.950

Ácido α-aminobutírico Incremento de (K+)

α-cetoGlutarato

Glutamato Prolina

Microorganismos como Micrococcus lysodeikticus, Sarcina lutea, Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Bacillus cereus Streptococcus faecalis, Klebsiella aerogenes, Serratia marcescens, Bacillus megaterium, Lactobacillus plantarum, Clostridium sporogenes, Salmonella oranienburg y Eschericia coli pueden producir un incremento en Prolina, mientras que Escherichia coli, Clostridium sporogenes y Streptococcus faecalis pueden producir GABA. Hajmeer et al. (2006), evaluaron el efecto del cloruro de sodio sobre E. coli O157:H7 y S. aureus, encontrando que E. coli O157:H7 fue menos tolerante a la NaCl que S. aureus en concentraciones de 5% y 10%. Estos resultados están de acuerdo con los datos teóricos reportados por Jay (1992) o Stein (2000), dónde los niveles de tolerancia a la sal para E. coli O157:H7 se sitúa en un 8% cuando está creciendo en los medios de cultivo, mientras que algunas cepas de S. aureus son capaces de tolerar hasta un 20%. La osmotolerancia de S. aureus al NaCl se debe a su habilidad de mantener la integralidad estructural de la membrana exterior. Así mismo, S. aureus puede crecer en ambientes osmóticos altos debido a la acumulación de productos osmoprotectores tales como la prolina y glicinbetaina en las células bajo estres osmótico (Neidhardt et al., 1990). Jablonski y Bohach (1999) observaron que diferentes compuestos aumentan en S. aureus tales como L-prolina, el betaine del proline, el choline, taurino, y sobre todo betaine de glicina que refuerza el crecimiento del staphylococcal bajo la tensión osmótica



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Tabla 1. Valores mínimos de actividad de agua para el crecimiento y/o germinación de ciertos patógenos alimentarios. Mínimo Organismo NaCl Glucosa Glicerol Campylobacter spp. 0.980 ----Clostridium botulinum tipo E (Crecimiento)

*0.970

---

*0.940

Clostridium botulinum tipo E (Germinación)

*0.930

---

*0.890

Shigella spp.

0.970

---

---

Yersinia enterocolitica

0.970

---

---

Vibrio vulnificus

0.960

---

---

Escherichia coli Enterohemorrágica

0.950

---

---

Salmonella spp.

0.940

---

---

Vibrio parahaemolyticus

*0.948

*0.984

*0.937

Bacillus cereus (Crecimiento)

*0.950

---

*0.930

Bacillus cereus (Germinación)

*0.950

---

*<0.85

Clostridium botulinum tipos A y B (Crecimiento)

*0.960

---

*0.930

Clostridium botulinum tipos A y B (Germinación)

*0.930

---

*0.890

Clostridium perfringens (Crecimiento)

*0.970

*0.960

*0.950

Listeria monocytogenes

0.920 0.830 *0.860 0.880

---

---

---

---

---

---

*0.957

---

0.94*

Staphylococcus aureus (Crecimiento) Staphylococcus aureus (Producción de toxina) Pseudomonas fluorescens Fuente: ICMSF, 1996. *Sperber, 1983.

Modelamiento del efecto de la aw sobre el crecimiento Diversos autores han estudiado el efecto de la aw sobre el crecimiento de varios microorganismos y estabilidad de los alimentos (Sperber, 1983; Neumeyer et al., 1997a y 1997b; Carrillo et al., 2007; Grau et al., 2007; Mathlouthi, 2010; Mazomba y Mabinya, 2010). Muchos de los trabajos solo se tratan de simples curvas de crecimiento a diversos valores de a w, de la cual se determina la velocidad de crecimiento. Sin embargo, otros autores como McMeekin et al. (1987) y el mismo Neumeyer et al. (1997) describen un modelo de regresión no lineal tipo Bĕlehrádek que permite estimar los valores de la velocidad de crecimiento (µ) como una función dependiente de la actividad de agua. Este modelo es:

𝑟=𝑏×

𝑎𝑤 − 𝑎𝑤𝑚𝑖𝑛

Donde  b = la pendiente de la línea de regresión  aw = actividad de agua Universidad de Pamplona – Facultad de Ciencias Básicas – Departamento de Microbiología – © 2011




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awmin = aw mínima teórica para crecimiento al cual la velocidad de crecimiento es predicha como cero.

MATERIALES, EQUIPOS E INSUMOS  Cultivo madre de E. coli, S. aureus u otra bacteria en fase logarítmica (mantenido en caldo BHI y ajustado a un patrón McFarland 0,5).  Micropipetas de 5-10 ml y 100-1000 µl.  Espectrofotómetro.  Celdas para espectrofotometría.  Incubadora a 35ºC +/- 2ºC  Frascos erlenmeyer con 50 ml de caldo BHI ajustado a concentraciones de NaCl, Glucosa y Sacarosa: 0,5%; 2%; 4%; 6% y 8%. REACTIVOS No aplica PROCEDIMIENTO  Debido a la concentración de solutos variable y el nivel de color para cada depresor, medir la absorbancia inicial a 600 nm para cada medio de cultivo (Absorbancia blanco Abb).  A partir del cultivo madre inocular 2ml en un frasco erlenmeyer conteniendo 50 ml de caldo BHI ajustado a las diferentes concentraciones de los depresores de a w.  De esta suspensión determine la absorbancia a 600 nm (Abt0) y reste la Abb para corregir el valor de la absorbancia.  El resultado de esta Abt0 corregida se confronta con la curva patrón de Ab vs. Ln ufc/ml obtenida en la práctica 1, para predecir la población inicial. Esta población será la equivalente al tiempo 0.  Colocar a incubar la suspensión a 35ºC +/- 2ºC y cada hora determine la absorbancia (Abt1 – Abtn) hasta obtener por lo menos 8 datos de incrementos en este valor. Corregir los valores de absorbancia y confrontar estos resultados con la curva patrón para calcular la población a los diferentes intervalos de tiempo.  Realizar la gráfica de crecimiento para cada concentración del depresor y calcular en cada una de ellas la duración de la fase de latencia, la velocidad de crecimiento específico y el tiempo de duplicación. Discuta además el comportamiento del crecimiento a cada una de las diferentes concentraciones de NaCl, Glucosa y Sacarosa. Tabla 2. Resultados para cada concentración de soluto depresor. Tiempo (min)

0

60

120

150

180

210

240

270

Ab (600 nm)



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Ln N (ufc/ml)

NIVEL DE RIESGO Para el desarrollo de la presente práctica se ha definido un Nivel de Riesgo Medio o Nivel 2, ya que se manejaran microorganismos considerados oportunistas y que en algún momento por malas prácticas de laboratorio pueden conllevar algún peligro para los manipuladores. Por tanto, todo estudiante, auxiliar y docente que oriente e intervenga en el desarrollo de la misma deberá usar los siguientes equipamientos:  Bata de Laboratorio manga larga, Guantes, Cofia, Tapabocas, Zapato Cerrado Bajo, Pantalón Largo. BIBLIOGRAFÍA  Carrillo, M.L., Zavala, D., Alvarado, B. (2007). Modelado del efecto de la temperatura, actividad de agua y pH sobre el crecimiento de Rhizopus oryzae. Información Tecnológica, 18(4): 57 – 62.  Christian, J.H.B. (1980). Capítulo 4: Actividad de Agua Reducida. En: Ecología Microbiana de los Alimentos 1. Factores que afectan la supervivencia de los microorganismos en los alimentos. Editorial Acribia S.A., Zaragoza, España, Págs. 74 – 96.  Esteban, M.A., Alcala, M., Marcos, A., Fernandez-Salguero, J., García de Fernando, G.D., Ordoñez, J.A., Sanz, B. (1990). Water activity of cultura media used in food microbiology. Int. J. Food Sci. and Technology, 25: 464–468.  Graü, C., Sánchez, D., Zerpa, A., García, N. (2007). Influencia de la actividad del agua, pH y temperatura en el crecimiento de Aspergillus penicillioides y A. terreus aislados de la carne seca y salada de atún listado (Katsuwonus pelamis). Revista Científica, FCV-LUZ, Vol XVII, Nº2: 193 – 199.  ICMSF. International Commission on Microbiological Specification for Foods. (2000). Ecología microbiana de los alimentos 1. Editorial Acribia, S.A. Zaragoza, España.  ICMSF. International Commission on Microbiological Specification for Foods. (1996). Microorganisms in foods. Roberts TA, Baird-Parker AC, Tompkin RB, editors. Volume 5, Characteristics of microbial pathogens. London: Blackie Academic & Professional. p 513.  Kempf, B., Bremer, E. (1998). Uptake and synthesis of compatible solutes as microbial stress responses to high-osmolality environ. Arch. Microbiol., 170: 319 – 330.  Mathlouthi, M. (2001). Water content, water activity, water structure and the stability of foodstuffs. Food Control, 12: 409–417.  Mazomba, N.T., Mabinya, L.V. (2010). Water relations of Pseudomonas solanacearum. Afr. J. Biotechnol., 9(35): 5767 – 5774.  McMeekin, T.A., Chandler, R.E., Doe, P.E., Garland, C.D., Olley, J., Putro, S., Ratkowsky, D.A. (1987). Model for combined effect of temperature and salt concentration/water activity on the growth rate of Staphylococcus xylosus. J. Appl. Bacteriol., 62: 543 – 550. Universidad de Pamplona – Facultad de Ciencias Básicas – Departamento de Microbiología – © 2011









 


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Mescle, J.F., Zucca, J. (1994). El comportamiento de los microorganismos en los alimentos, actividad del agua. En: Microbiología alimentaria, volumen 1. Aspectos microbiológicos de la seguridad y calidad alimentaria. Editorial Acribia, S.A. Zaragoza, España. Págs. 7-50. Meumeyer, K., Ross, T., McMeekin, T.A. (1997a). Development of a predictive model to describe the effects of temperature and water activity on the growth of spoilage pseudomonads. Int. J. Food Microbiol., 38: 45 – 54. Meumeyer, K., Ross, T., Thomson, G., McMeekin, T.A. (1997b). Validation of a model describing the effects of temperature and water activity on the growth of psychrotrophic pseudomonads. Int. J. Food Microbiol., 38: 55 – 63. Pocard, J.A., Smith, L.T., Smith, G.M., Le Rudulier, D. (1994). A prominent role of glucosylglycerol in the adaptation of Pseudomonas mendocina SKB70 to osmotic stress. J. Bacteriol., 176: 6877 – 6884. Prescott, L.M., Harley, J.P., Klein, D.A. (1999). Microbiology, 4 th Edition. The McGraw-Hill Co., Inc., New York, USA. Sperber, W.H. (1983). Influence of Water Activity on Foodborne Bacteria – A Review. J. Food Protection, 46(2): 142–150.



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ACTIVIDAD 6 EFECTO DE LA TEMPERATURA SOBRE LA MUERTE BACTERIANA 6.1 OBJETIVO Al finalizar la práctica el estudiante estará en capacidad de:  Comprender el efecto integrado temperatura-tiempo sobre la supervivencia microbiana.  Aplicar modelos primarios y secundarios de destrucción térmica para predecir el número de supervivientes.  Evaluar el efecto de la temperatura sobre la velocidad de muerte. 6.2 MARCO TEÓRICO La mayor parte de las bacterias patógenas tienen una tolerancia limitada a las variaciones extremas en su medio ambiente físico y escasa capacidad para sobrevivir fuera del organismo vivo. Otras, en cambio, producen esporas que son muy resistentes a las condiciones físicas deletéreas del medio ambiente y que dotan al microorganismo de un valor incrementado de supervivencia. En el vocabulario común se emplea la palabra esterilización como un absoluto que implica la inactivación total de todas las formas de vida microbiana en términos de la capacidad del microorganismo para reproducirse. El sufijo cida se agrega cuando se hace alusión a una acción letal, en tanto que stasis se añade cuando simplemente se trata de inhibir el desarrollo o la multiplicación del microorganismo. Teóricamente se ha descrito que la destrucción de una población bacteriana sigue un orden matemático progresivo, que obedece a un descenso exponencial. Rahn (1929, 1930) atribuyó a Madsen y Nyman (1907) y Chick (1908) como los primeros en observar la naturaleza aparentemente exponencial de las curvas de supervivencia, aunque los primeros autores aportaron pocos datos para poyar su conclusión con respecto a la muerte térmica. Couvert et al. (2005) también atribuye el modelo cinético de muerte de primer orden a Madsen y Nyman, el cual fue corroborado por diversos estudios realizados por Chick (1908 y 1910); Esty y Meyer (1922) y Esty y Williams (1924) con células vegetativas. Estos estudios se basaron en el efecto de la temperatura sobre las células, pero con el tiempo se fue extendiendo para evaluar el efecto de diversos factores medioambientales sobre la supervivencia microbiana, por ejemplo, el efecto del tipo y concentración de antimicrobianos, efecto del pH (tipo y concentración de acidulantes), efecto de la depresión de la actividad de agua, etc. 6.2.1. Índice de letalidad de los microorganismos: la información referida a la cinética de la destrucción de una población bacteriana es esencial para comprender las bases de la



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esterilización por agentes letales. Para los microorganismos el único criterio válido de muerte es la pérdida irreversible de la capacidad de reproducirse. Esto en general está determinado por técnicas de siembra en placas que cuantifican, por medio de recuento de colonias, el número de sobrevivientes. Cuando se expone una población bacteriana a un agente letal, con el tiempo tiene lugar una reducción progresiva en el número de microorganismos sobrevivientes. La cinética de la destrucción de una población microbiana suele ser de primer orden y en la mayoría de los casos de tipo exponencial: el número de sobrevivientes disminuye en función del tiempo y puede representarse por medio de la ecuación 6.1 que se describe a continuación:

𝑁𝑓 = 𝑁0 × 𝑒 −𝑘𝑡

Ecuación 6.1

Si el logaritmo natural del número de supervivientes se representa como una función del tiempo de exposición se obtiene una línea recta (figura 6.1) cuya pendiente negativa define la velocidad de destrucción. Sin embargo, el índice germicida solo nos dice que fracción de la población inicial sobrevive a un periodo determinado de exposición al agente antimicrobiano. Para determinar el número real de sobrevivientes es necesario conocer el tamaño inicial de la población. Esta relación se expresa de forma matemática por la ecuación 6.2: 1

𝑁

𝑘 = 𝑡 ∗ 𝑙𝑛 𝑁0 𝑓

Ecuación 6.2

Donde k es la velocidad de muerte, N0 el número inicial de microorganismos y Nf el número final que queda luego de un tiempo t de exposición. Figura 6.1. Gráfica de la velocidad de muerte bacteriana (Curva de supervivientes).



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No. Supervivientes 14,5

Log células

13,5 12,5 11,5 10,5 9,5 8,5

0

20

40

Tiempo (min)

60 80 y = -0,08296x + 13,82022 R² = 0,99999

Como puede apreciarse en la figura 6.1, la pendiente negativa de la curva obtenida refleja la tasa de destrucción de la población a ese factor específico; pero dicha tasa es independiente del número inicial de bacterias y se ve influenciada por un sinnúmero de factores. Esto es común para todas las bacterias, pero cada una de ellas difiere en su velocidad de destrucción, la cual se halla reflejada en la pendiente de la gráfica. Esta velocidad será la que determine el grado de resistencia del microorganismo, por lo tanto ésta será diferente para cada especie bacteriana; constituyéndose en una importante herramienta para la medida de la resistencia bacteriana. En el ejemplo mostrado en la figura 6.1, la velocidad de muerte de la población es: 0.08296 log células/min. 6.2.2 Modelo del valor D El tiempo necesario para la esterilización es inversamente proporcional a la temperatura de exposición. Esta relación se puede expresar por el término de tiempo de muerte térmica o valor D de inactivación térmica (McDonald y Sun, 1999; Joklik et al., 1997; Brennan et al., 1990), que se refiere al tiempo mínimo necesario para destruir el 90% de una suspensión de microorganismos a una temperatura predeterminada en un medio ambiente especificado (Rahman et al., 2004), lo cual equivale a reducir la población en una unidad logarítmica. Por tanto, el modelo del valor D puede catalogarse como un modelo primario (McDonald y Sun, 1999). Este valor D, como veremos más adelante es equivalente al valor del inverso de la pendiente de la curva TDT). La definición de lo que conocemos como tiempo de reducción decimal – DRT (Modelo del valor D) fue presentado por Katzin et al., en 1943, pero fueron Ball y Olson en 1957 quienes simbolizaron este tiempo como “Valor D”. Debido a los elevados coeficientes de temperatura implicados en la esterilización por calor, un cambio mínimo en la temperatura altera



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de manera significativa el tiempo de muerte térmica. De acuerdo con la ley de acción de masas, el tiempo de esterilización se relaciona de forma directa con el número de microorganismos en la suspensión. El modelo del valor D puede representarse por la siguiente expresión matemática (Ecuación 6.3):

𝐷=

∆𝑡 𝐿𝑜𝑔 10 𝑁0 − 𝐿𝑜𝑔 10 𝑁𝑓

Ecuación 6.3

Donde Δt corresponde al lapso de tiempo que ha transcurrido para que la población inicial (Log10N0) se reduzca hasta una población final (Log10Nf). Si representamos los datos de supervivientes en coordenadas logarítmicas (Log10 población) en el eje de las ordenadas y el tiempo en las abscisas, obtendremos una línea recta, tal como se muestra en la figura 6.2. Figura 6.2. Representación logarítmica de una población microbiana frente al tiempo.

Log10 Supervivientes 6,50

Log10 células

6,00 5,50 5,00

4,50 4,00 3,50 0

20

40

Tiempo (min)

60 80 y = -0,03603x + 6,00205 R² = 0,99999

La pendiente de la línea recta está directamente relacionada con el “tiempo de reducción decimal” (Singh y Heldman, 1997) o valor D; por tanto, este valor D es equivalente al valor inverso de la pendiente de la curva TDT (ecuación 6.4).

𝐷=

−1 𝑚

Ecuación 6.4

En el ejemplo mostrado en la figura 6.2, el valor D puede calcularse reemplazando la pendiente en la ecuación 6.4, obteniendo un valor de 27.75 minutos (D = -1/-0.03603).



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Debido a que cada ensayo para evaluar o determinar un valor D, se hace a una temperatura constante; ésta temperatura debe indicarse como un subíndice en la letra, así por ejemplo, el valor D215ºF, indica el tiempo de reducción decimal de una población a una temperatura correspondiente a 215ºF. Existe una relación inversa entre la velocidad de muerte y el tiempo de reducción decimal (D), la cual es mostrada en la ecuación 6.5.

𝑘=

2.303 𝐷

Ecuación 6.5

A partir de los resultados obtenidos de la figura 6.2 podemos calcular la velocidad de muerte, reemplazando el valor D en la ecuación 6.5. Así obtenemos una velocidad de 0.08297/min, la cual es idéntica al valor de la pendiente obtenida en la figura 6.1. 6.2.3 Modelo del valor Z La constante de resistencia térmica o valor Z, es un factor que describe la resistencia térmica de una población. Se define como el aumento de temperatura necesario para causar una disminución del 90% en el tiempo de reducción decimal D (Rahman et al., 2004). Si representamos los valores D obtenidos a diferentes temperaturas en coordenadas logarítmicas, el valor Z representa el aumento de temperatura necesario para cambiar un orden logarítmico el valor de D, tal como se muestra en la figura 6.3. Figura 6.3. Representación logarítmica del tiempo de reducción decimal frente a la temperatura. 1,600 1,400 Log10 D (min)

1,200 1,000 0,800 0,600 0,400 0,200 0,000

100

105 Temperatura (⁰C)

110

115

120

y = -0,09177x + 10,97885 R² = 0,99969

En base a la definición anterior, z puede expresarse mediante la siguiente ecuación (6.6):



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𝑍=

𝑇2 −𝑇1 𝐿𝑜𝑔 𝐷𝑇 1 − 𝐿𝑜𝑔 𝐷𝑇 2

Ecuación 6.6

Donde T2 y T1 corresponde a la Temperatura más alta y más baja, respectivamente, mientras que el LogDT2 y LogDT1 corresponde a los valores D para T1 y T2, respectivamente. Al igual que el modelo del Valor D, el valor Z puede obtenerse a partir de la gráfica logarítmica del tiempo de reducción decimal frente a la temperatura (figura 6.3). Como puede verse en esta gráfica, se obtiene una línea recta y por medio del inverso de la pendiente puede hallarse el valor Z (ecuación 6.7). −1 𝑍 = 𝑚 Ecuación 6.7 Como hemos visto, el modelo del valor Z evalúa el efecto de la temperatura sobre la resistencia térmica microbiana, por tanto, desde la clasificación propuesta por Whiting y Buchanan (1993), el modelo del valor Z puede catalogarse como un modelo secundario (McDonald y Sun, 1999). 6.2.4 Modelo de Arrhenius La ecuación de Arrhenius es una expresión matemática que se utiliza para demostrar la dependencia de la constante de velocidad (k) de una reacción con la temperatura a la que se lleva a cabo esa reacción, de acuerdo con la expresión 6.8, esta expresión fue inicialmente propuesta por Svante Arrhenius en 1889. Salvo contadas excepciones, la velocidad de una reacción aumenta, a menudo con el aumento de la temperatura (Man, 2004).

𝑘 =𝐴×𝑒

𝐸

−𝑅𝑇𝑎

Ecuación 6.8

Donde k es la velocidad de reacción o constante cinética, A es un factor pre-exponencial o factor de frecuencia, Ea es la energía de activación de la reacción (KJ/mol), R la constante universal de los gases (8,3143 J·K-1·mol-1 o 0,001987 Kcal·K-1·mol-1) y T la temperatura absoluta (K). Esta ecuación es considerada como una primera aproximación adecuada para el estudio del efecto de la temperatura sobre la cinética de reacción. En la ecuación 6.8 puede verse que a temperatura constante cuanto mayor es la Ea, más pequeña será la constante de velocidad y por lo tanto más lenta será la velocidad de reacción. Por el contrario, velocidades de reacción rápida tendrán una Ea pequeña. Esta ecuación también ha sido utilizada para evaluar el efecto o dependencia de la velocidad específica de crecimiento o muerte (µ) de una población a una temperatura específica. Por tanto, es posible sustituir en la expresión 6.8 la constante de velocidad (k) por la velocidad específica µ (ecuación 6.9).



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𝜇 =𝐴×𝑒

𝐸

−𝑅𝑇𝑎

Ecuación 6.9

De la anterior expresión puede concluirse que, cuanto menor sea la temperatura de crecimiento (T), mayor energía (Ea) requiere el microorganismo para su desarrollo y por tanto, su velocidad de crecimiento será menor (µ). Un caso similar lo veremos cuando la temperatura sobrepasa la máxima de crecimiento, a medida que aumenta la temperatura de exposición, menor energía se requiere para causar un daño letal en la célula y por tanto la velocidad de muerte aumenta. Para que la expresión 6.9 pueda ser usada como un modelo de regresión lineal entre las variables µ y T-1, esta ecuación puede ser reescrita como se muestra en la expresión 6.10a y 6.10b: 𝐸

ln 𝜇 = 𝑙𝑛 𝐴 − 𝑅𝑇𝑎

Ecuación 6.10a 𝐸

𝑎 log10 𝜇 = 𝑙𝑜𝑔10 𝐴 − 2.303×𝑅𝑇

Ecuación 6.10b

En teoría, si representamos lnµ con el recíproco de la temperatura absoluta se debería obtener una línea recta, siendo su inclinación la energía de activación dividida por la constante universal de los gases (Ea/R). Las gráficas de k con 1/T se llaman gráficas de Arrhenius. Muchas reacciones cumplen con el modelo de Arrhenius, es decir sus gráficas son una línea recta. Por tanto, estudiando la reacción y midiendo k a dos o tres temperaturas diferentes, se puede extrapolar lo que pasará a una temperatura inferior y predecir la velocidad a esa temperatura (Man, 2004). De igual forma que el modelo del valor Z, el modelo de Arrhenius puede clasificarse como un modelo secundario en la clasificación propuesta por Whiting y Buchanan (1993) (McDonald y Sun, 1999), ya que evalúa la dependencia de la velocidad de reacción en función de la temperatura. 6.2.5 Relación entre el modelo de Arrhenius y el modelo del Valor Z Sin embargo, la representación que se utiliza con mayor frecuencia entre los industriales es una representación del valor D basado en el modelo de Arrhenius, el cual se trata de un modelo usado inicialmente en cinética química para describir la influencia de la temperatura en la constante de velocidad de reacción enzimática (Singh y Heldman, 1997); sin embargo, este modelo se ha empleado en aquellos casos donde se quiera evaluar la influencia de la temperatura sobre la velocidad de reacción, en este caso se relaciona el logaritmo neperiano de D en función de la inversa de la temperatura absoluta (en grados Kelvin –K–). En esta gráfica la exactitud es tan buena o mejor que la de la ecuación del valor z descrita anteriormente, con la Universidad de Pamplona – Facultad de Ciencias Básicas – Departamento de Microbiología – © 2011


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ventaja de que en la recta de Arrhenius uno puede hacer ligeras extrapolaciones y en la de la ecuación del valor z el hacerlo resultaría en una imprudencia (Cerf et al., 1988). La pendiente en la recta de Arrhenius es igual a Ea/R; Ea es la energía de activación (expresada en J/mol) y R la constante de los gases ideales (8,314 J/molºK). Existe una relación sencilla entre Ea y z:

𝑇𝐴2 𝑧 = 19,15 × 𝐸𝑎

(5.9)

La ecuación anterior puede utilizarse usando un valor de T que corresponda a la temperatura absoluta media experimental.

6.2.6 Mecanismo de la lesión térmica: la inactivación de las bacterias por calor no puede ser definida en términos bioquímicos simples. Aunque el efecto letal del calor húmedo por encima de una temperatura determinada en general se atribuye a la desnaturalización y coagulación de las proteínas, el patrón del daño térmico es bastante complejo y la coagulación sin duda enmascara otros cambios más sutiles inducidos en la célula antes de que se evidencie la coagulación. La producción de rupturas en una hebra de DNA puede ser el primer episodio letal. La pérdida de viabilidad de las células expuestas a una temperatura suave se puede correlacionar con la introducción de estas rupturas. El daño al DNA parece ser de naturaleza enzimática y es una consecuencia de la inactivación de las nucleasas. La capacidad de la célula para reparar este daño y para recuperar la viabilidad depende del estado fisiológico del microorganismo y de su conformación genética. El calor también ocasiona una pérdida de la integridad funcional de la membrana y la filtración de pequeñas moléculas y de material absorbente a 260 nm. Este material es de origen ribosómico y aparentemente proviene de la degradación de los ribosomas por ribonucleasas activadas por el tratamiento térmico. Parece existir una correlación entre la degradación del RNA ribosómico y la pérdida de viabilidad de las células expuestas a temperaturas elevadas. El mecanismo por el cual los microorganismos resultan destruidos por el calor seco es diferente al del calor húmedo. Los efectos letales del calor seco, o la desecación en general, habitualmente se atribuyen a la desnaturalización proteica, al daño por oxidación y a los efectos tóxicos de elevadas concentraciones de electrolitos. En ausencia de agua el número de grupos polares sobre las cadenas peptídicas disminuye y se requiere más energía para abrir las moléculas; de ahí el aumento aparente de la estabilidad del microorganismo. 6.3 MATERIALES, EQUIPOS E INSUMOS    

30 tubos con 9 ml de agua peptonada estéril 0.1%. 2 fiolas con 99 mL de caldo BHI 1120 mL de agar BHI fundido y mantenido a una temperatura de 55ºC. Cepas de bacterias mantenidas a 35ºC en caldo BHI (en fase exponencial).


    


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56 cajas de petri estériles. 40 pipetas estériles de 1 mL. 2 pipetas de 5 mL estéril. 2 Baños serológicos ajustados a diferentes temperaturas. Patrón de McFarland No 0,5.

6.4 REACTIVOS  No requiere. 6.5 PROCEDIMIENTO (Se seguirá la metodología propuesta por Byrne et al., 2006).  A partir de la cepa mantenida en caldo BHI se prepara una solución patrón 0,5 de McFarland.  A partir del patrón se toma una alicuota de 11 ml que se suspende y homogeniza en 99 ml de solución diluyente para disminuir 10 veces la concentración y preparar una suspensión de una población teórica aproximada de 1,5x107 bact/mL.  Se pasa 1 mL exacto de la suspensión, previamente homogenizada, a cada uno de los 6 tubos con 9 ml de agua peptona estéril. De ésta manera reducimos 10 veces la anterior población, es decir que supuestamente cada tubo tendrá una concentración de 1,5x106 bact/mL. Cada tubo se rotula con 9, 18, 27, 36, 45 y 54 minutos.  Se toma el tubo rotulado para 9 minutos, y se le realiza un recuento inicial para verificar la concentración de las suspensiones. El recuento se hace de la dilución 103, por duplicado en agar BHI.  En un baño serológico, mantenido a una temperatura constante, indicada por el profesor para cada microorganismo, se introducen los 6 tubos, manteniendo la temperatura constante. Transcurridos los primeros 9 minutos, se toma el respectivo tubo, con la debida asepsia, y se le realiza el correspondiente recuento de la siguiente manera: se lleva hasta la dilución 10-1, tomándose 1 y 0,1 mL para inocular en las placas de Petri estériles, cubriendo con agar BHI fundido.  El procedimiento anterior se repite para cada tubo cuando se cumpla el tiempo respectivo de exposición a la temperatura indicada.  Se incuban las placas durante 24 – 48 horas a 37ºC, según el microorganismo a ensayar. Se hace la lectura correspondiente y se construye la gráfica para especificar el valor D del mismo. 6.6 NIVEL DE RIESGO Para el desarrollo de la presente práctica se ha definido un Nivel de Riesgo Medio o Nivel 2, ya que se manejaran microorganismos considerados oportunistas y que en algún momento por malas prácticas de laboratorio pueden conllevar algún peligro para los manipuladores. Por tanto, todo estudiante, auxiliar y docente que oriente e intervenga en el desarrollo de la misma deberá usar los siguientes equipamientos:





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Bata de Laboratorio manga larga, Guantes, Cofia, Tapabocas, Zapato Cerrado Bajo, Pantalón Largo.

6.7 BIBLIOGRAFÍA  

  

 



 





  

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6.8. ANEXOS Tabla 6.1. Relación de temperatura y tiempo para determinación del valor D y z en cultivos asporógenos. Temperatura

Tiempo (minutos)

(ºC) 50

0

10

20

30

40

55

0

8½

17

25 ½

34

60

0

7

14

21

28

65

0

6

12

18

24

70

0

5

10

15

20

75

0

4

8

12

16

80

0

3

6

9

12

85

0

2½

5

7½

10

Tabla 6.2. Tiempos mínimos requeridos para la esterilización por calor húmedo y calor seco a diferentes temperaturas. Calor húmedo Calor seco Temperatura (ºC)

Tiempo (min)

Presión (lb)

Tiempo (min)

121

15

15

-

126

10

20

-

134

3

30

-

140

-

-

180

150

-

-

150

160

-

-

120

170

-

-

60

Fuente: Joklik et al., 1997.



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Figura 6.4. Diagrama de flujo del proceso 6 ml

Cepa S. aureus

54 ml Cultivo de trabajo

10 ml

TRATAMIENTO TÉRMICO

10 ml

T0

10 ml

T1

10 ml

T2

1 ml

10 ml

T3

1 ml

5 ml

T4

1 ml

CºT Control Temperatura

10-1

1 ml

1 ml

1 ml

1 ml

1 ml

10-2

1 ml

1 ml

DILUCIONES Y SIEMBRA

1 ml 10-3

1 ml

1 ml

1 ml

10-4

1 ml

1 ml



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Ejemplo de la determinación del valor z empleando el modelo tradicional y el modelo basado en la cinética de Arrhenius. Tabla 6.3. Valores D de S. senftenberg 774W y S. typhimurium en chocolate lacteado. Valores D (min)* S. senftenberg S. typhimurium 774W 360 720 480 678 480 1050 144 222 96 222 108 222 36 78 30 72 42 ---

Temperatura (ºC) 70

80

90

Valor D medio (min) S. senftenberg S. typhimurium 774W 440 ± 69,3

816 ± 203,7

116 ± 24,9

222 ± 0,0

36 ± 6,0

75 ± 4,24

* Datos de Olson y Nottingham (1980). Figura 6.4. Representación del Log10D vs. T para S. senftenberg 774W y S. typhimurium obtenidos en chocolate lacteado. 3,50

Log10 D

3,00

S. senftenberg 774W S. typhimurium

2,50 2,00

y = -0,0544x + 6,4367 R² = 0,9986

1,50 y = -0,0518x + 6,5242 R² = 0,9973

1,00 60

70

80

90

100

Temperatura (°C)



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Figura 6.5. Representación del LnD vs. 1/TA para S. senftenberg 774W y S. typhimurium obtenidos en chocolate lacteado. 7,00000 6,00000

S. senftenberg 774W

Ln D

S. typhimurium

5,00000 4,00000

y = 15589x - 39,378 R² = 0,9995

3,00000

y = 14868x - 36,668 R² = 0,9987

0,002700

0,002800

0,002900

0,003000

1/Temperatura (°K)

Como puede verse en las figuras anteriores, cuando se grafica el Log10D vs T, se obtienen líneas rectas con una bondad de ajuste de 0,9986 y 0,9973 para S. senftenberg 774W y S. typhimurium, respectivamente; mientras que si usamos el modelo modificado de Arrhenius, los coeficientes de correlación son mejores con valores de 0,9995 y 0,9987, respectivamente. Los valores de z obtenidos por los dos modelos son similares tal y como puede verse en la tabla siguiente, sin embargo, ya hemos visto que la bondad de ajuste de la gráfica es mayor para el modelo modificado de Arrhenius. Tabla 6.4. Valores z para S. senftenberg 774W y S. typhimurium en chocolate lacteado Modelo de z Modelo tradicional Modelo de Arrhenius

Valores z (°C) S. senftenberg 774W S. typhimurium 18,382 19,305 18,266 19,152



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ACTIVIDAD 7 EFECTO CONJUGADO DE LA TEMPERATURA, ACTIVIDAD DE AGUA (% NaCl), pH Y COMPOSICIÓN DEL MEDIO SOBRE LA CINÉTICA DE CRECIMIENTO FÚNGICA OBJETIVOS Al finalizar la práctica el estudiante estará en capacidad de:  Diseñar diversas metodologías para cuantificar el crecimiento miceliar fúngico  Desarrollar protocolos para cuantificar la cinética conidial  Evaluar el/los efecto(s) individual o conjugado de diversos factores sobre el crecimiento de hongos. MARCO TEORICO Todos los organismos tienen un potencial de incrementar su masa por división celular, alargamiento celular, o ambos. De esta forma, el incremento de la masa se constituye en una medida de su crecimiento. Muchos micólogos y científicos tienen un número diverso de razones prácticas para estudiar lo concerniente al crecimiento fúngico. Primero, los hongos son extremadamente importantes en los hábitats naturales donde ellos crecen como saprófitos o simbióticos. Las actividades saprofíticas y el crecimiento fúngico están envueltas en los ciclos nutritivos dentro del suelo, mientras que en la vida simbiótica hacen parte de otros organismos. El conocimiento de cómo los hongos crecen y de los factores que afectan su crecimiento es importante para entender la ecología fúngica. Segundo, el crecimiento de los hongos también puede ser controlado. Muchos hongos causan alteraciones o pérdidas grandes de alimentos y materiales de importancia para los humanos. El crecimiento parasítico a expensas de su hospedador puede resultar en una enfermedad o muerte de su hospedador. Naturalmente, los fitopatólogos, veterinarios, y demás profesionales relacionados son conscientes de controlar el crecimiento de estos hongos, mientras que por otras razones individuales existe una necesidad directa de permitir su crecimiento. Si bien se han desarrollado una multitud de trabajos evaluando el papel de los hongos (mohos y levaduras) como agentes deteriorantes, estos se han enfocado principalmente al efecto de diversas tecnologías de conservación (química, física, biológica) sobre la supervivencia de los mismos en alimentos, materiales de construcción, etc., o a describir simplemente una curva normal de supervivencia cuando son expuestos a diversos factores medioambientales de forma individual; pero son relativamente pocas las publicaciones sobre investigaciones hechas a partir del modelamiento predictivo del efecto conjunto de la temperatura, aw y pH en el crecimiento/supervivencia de mohos. Lo anterior puede explicarse debido al hecho de que la medida del crecimiento fúngico no es fácil de cuantificar, ya que a diferencia de las bacterias y levaduras, los hongos no crecen Universidad de Pamplona – Facultad de Ciencias Básicas – Departamento de Microbiología – © 2011


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como células individuales, sino como filamentos hifales que no pueden ser cuantificados por las habituales técnicas de enumeración. Además, las hifas fúngicas pueden penetrar en los sustratos sólidos haciendo difícil su extracción. Así mismo, la capacidad de los hongos para producir esporas, resulta en un gran aumento en el número de células viables (ufc/ gr o ml) que a menudo tienen poca relación con la biomasa (Pitt, 1984; Taniwaki et al., 2006). Tradicionalmente el crecimiento y caracterización ecofisiológica de los hongos contaminantes de alimentos ha sido determinado usando un alto nivel de inóculo en forma de suspensión de esporas o discos circulares cortados de los márgenes de un cultivo fúngico (Samapundo et al., 2007). Crecimiento de los hongos Es importante tener en cuenta que en el crecimiento en los mohos se da de forma micelial, sólo el borde de la colonia (las puntas de las hifas) crece. La parte central de una colonia micelial está formada por células viejas mientras que el borde de la colonia está formado por células jóvenes. Las células jóvenes se encuentran en trofofase (fase de alimentación y crecimiento), mientras que las células viejas se encuentran en idiofase (fase de diferenciación). Cuando observamos una colonia micelial (por ejemplo una colonia de moho sobre una naranja), el crecimiento de la colonia se produce sólo por el borde de la parte mohosa y en la parte central de la colonia se produce la diferenciación que dará lugar a la formación de las esporas y a la aparición del color verdoso característico. Las células jóvenes desarrollan la mayoría de la actividad metabólica del hongo, liberando enzimas al medio y absorbiendo los nutrientes. La zona central, por otra parte, tiene células en las que se acumulan las substancias de reserva que pueden ser necesarias para que el micelio colonice nuevas zonas pobres en nutrientes (por ejemplo, cuando el moho de una fruta comienza a extenderse por la fuente de plástico en la que se encuentra) o cuando el hongo se diferencia (por ejemplo, cuando produce esporas o cuerpos fructíferos) (Aristegui, B., 2002). Por otra parte, para la medición del crecimiento fúngico se han desarrollado varios métodos, a pesar que solo hasta hace algunos años se ha comenzado a comprender bien sus principios y aplicaciones. El método más frecuentemente usado ha sido el del recuento de células viables o unidades formadoras de colonias (ufc/ g o ml), una técnica derivada del recuento de bacterias en alimentos. Sin embargo, este método sufre graves inconvenientes, ya que el conteo de esporas suele reflejar solo números en lugar de la biomasa (Pitt, 1984); cuando el crecimiento de los hongos consiste fundamentalmente en el crecimiento de hifas, es decir, en jóvenes individuos en el interior de las colonias, por tanto, el recuento de este tipo dará unos resultados bajos al inicio, pero cuando se produce la esporulación, el conteo a menudo aumenta rápidamente sin que se observe un aumento de la biomasa. En consecuencia, se considera que el recuento de células viables es un pobre indicador del grado de crecimiento de los hongos y parece que se correlacionan mal con otras medidas tales como ergosterol (Taniwaki et al., 2006).



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Un segundo método comúnmente utilizado es la medición del diámetro de la colonia. Cuando se mide el tiempo durante varios intervalos, el diámetro de la colonia puede traducirse en tasas de crecimiento, que son con frecuencia muy lineal a lo largo de grandes períodos de tiempo (Taniwaki et al., 2006) y han sido ampliamente utilizados en estudios de actividad de agua. Sin embargo, el diámetro de la colonia como una medida de la biomasa de los hongos no tiene en cuenta la densidad de la colonia. Factores que afectan el crecimiento de los hongos El desarrollo de los hongos, se afecta profundamente por el medio ambiente. Las variaciones en el ambiente externo no solo influye en el grado de crecimiento sino que en la mayoría de los casos pueden dar lugar a diferencias en el tipo del mismo, por esta razón se describe a continuación algunos de estos factores: 

Necesidades nutricionales: Los hongos son considerados generalmente como quimioheterótrofos estrictos. Son incapaces de fotosintetizar y por consiguiente necesitan substratos ricos en energía para alcanzar sus requerimientos de energía y biomasa. Los hongos producen una amplia variedad de enzimas extracelulares, principalmente oxidasas e hidrolasas y pueden utilizar la mayor parte de los sustratos orgánicos que existen naturalmente, incluyendo la celulosa, la quitina, el almidón, azucares, hemicelulosas y lignina. Normalmente los carbohidratos son las principales fuentes de carbono accesibles a los hongos; son metabolizados para proporcionar energía y también actúan como precursores para síntesis del material celular. Otras fuentes de carbono utilizadas incluyen alcoholes, hidrocarburos, glicerol y almidón. Los hongos utilizan nitrógeno, fundamentalmente en la forma de amonio, aunque casi todos pueden utilizar nitrato.los hongos generalmente crecen en el laboratorio sobre medio definido que contiene azucares, como glucosa y sacarosa, o sobre polímeros como celulosa. Actualmente los investigadores utilizan también medios complejos no definidos sobre los que crecen los hongos, incluyendo el medio Agar Papa dextrosa y medios basados en vegetales. Otros nutrientes minerales requeridos y de gran importancia para un máximo rendimiento de los hongos incluyen fosforo, azufre, potasio y magnesio (Wainwright, M. 1995).



Respiración: Todos los hongos necesitan de oxigeno para su crecimiento, pero pueden crecer en ambientes bajos en tenciones de oxígeno, por ejemplo cuando crecen sumergidos en medio liquido pueden llegar a producir estructuras atípicas, a veces semejantes a levaduras, otras veces viscosas pero de igual manera el crecimiento es lento y depende del oxigeno disuelto en el liquido. Las esporas de muchos hongos filamentosos germinan cuando se sumergen en un medio líquido, pero crecen con excesiva lentitud hasta que algunas hifas alcanzan la superficie, desarrollándose después rápidamente y de forma típica hasta cubrir la superficie. Uno de los efectos más comunes cuando se limita la aireación es la supresión del color normal, tanto del micelio como de los conidios. Si bien los hongos no Universidad de Pamplona – Facultad de Ciencias Básicas – Departamento de Microbiología – © 2011


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pueden aprovechar el CO2 para la fotosíntesis y normalmente libera el gas, se ha demostrado que por lo menos algunos reabsorben parte del CO2 producido en la respiración y lo utilizan para formar compuestos de 4 o más átomos de carbono. Actualmente se sabe muy poco sobre el mecanismo de la respiración en los hongos filamentosos (Smith, G., 1963) 

Influencia de la luz: No es posible generalizar en cuanto a la influencia de la luz sobre el desarrollo de los hongos, pues existen muchas especies comunes que parecen desarrollarse lo mismo en la luz que en la oscuridad, otras se afectan de diversas maneras por la acción de aquella. Como por ejemplo muchas Mucoráceas parecen ser completamente indiferentes a la acción de la iluminación moderada; en cambio, algunas cepas de Rhizopus nigricans crecen especialmente mejor en la luz difusa que en la oscuridad. Algunos hongos son fototrópicos, es decir crecen en presencia de la luz, dirigiendo sus órganos reproductores hacia esta. En muchos mohos el efecto de la luz consiste en estimular la producción de esporas u órganos reproductores, por lo que las breves exposiciones a la luz solar constituyen un método útil para inducir la esporulación en cultivos que habían llegado estériles. Otro efecto de la luz moderada es la producción de pigmentos miceliales (Smith, G., 1963)



Influencia de la temperatura: Los hongos muestran grandes diferencias en su reacción a los cambios de temperatura y en su resistencia al calor y frio. Se ha visto que cada especie se desarrolla mejor a una cierta temperatura, denominada temperatura optima. En general las especies de Penicillium son más comunes en países templados y su temperatura óptima se encuentra entre 20°C y 25°C, por otro lado, las especies del género Aspergillus se desarrollan mejor alrededor de los 30°C siendo comunes en regiones cálidas. Se trata de una generalización muy amplia y con muchas excepciones, pero con frecuencia valiosa en trabajos industriales, donde el 90% de los hongos aislados crecen a temperaturas alrededor de 25 – 30°C.



Influencia de la aw: El agua es el solvente en donde ocurren las reacciones químicas y enzimáticas de la célula y es indispensable para el desarrollo de los microorganismos. Variaciones en la actividad de agua puede afectar la tasa de crecimiento, la composición celular y la actividad metabólica del hongo debido a que si no disponen de suficiente cantidad de agua libre en el medio necesitaran realizar más trabajo para obtenerla y disminuirá el rendimiento del crecimiento. Cuando un microorganismo se encuentra en un substrato con una actividad de agua menor que la que necesita, su crecimiento se detiene. Esta detención del crecimiento no suele llevar asociada la muerte del microorganismo, sino que éste se mantiene en condiciones de resistencia durante un tiempo más o menos largo. En el caso de las esporas, la fase de resistencia puede ser considerada prácticamente ilimitada. La gran mayoría de los microorganismos requiere unos valores de actividad de agua muy altos para poder crecer. De hecho, los valores mínimos de actividad para Universidad de Pamplona – Facultad de Ciencias Básicas – Departamento de Microbiología – © 2011


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diferentes tipos de microorganismos son, a título orientativo, los siguientes: bacterias aw >0.90, levaduras aw >0.85, hongos filamentosos aw >0.80. Como puede verse, los hongos filamentosos son capaces de crecer en substratos con una actividad de agua mucho menor (más secos) de la que permite el crecimiento de bacterias o de levaduras. Por esta razón se puede producir deterioro de alimentos de baja actividad de agua (por ejemplo, el queso o almíbares) por mohos (hongos filamentosos) y no por bacterias. 

Influencia del pH: Un cambio drástico en el pH produce una drástica reducción de la supervivencia de los microorganismos. La mayoría de los microorganismos crecen a pH entre 5 y 8, en general los mohos y las levaduras son capaces de crecer a pH más bajos que las bacterias. Puesto que la acidificación del interior celular conduce a la pérdida del transporte de nutrientes, los microorganismos no pueden generar más energía de mantenimiento y, a una velocidad variable según las especies, se produce la muerte celular. (Pereira, G., et al 2007)

MATERIALES, EQUIPOS E INSUMOS  Cepas de hongos filamentosos obtenidas de la colección de cultivos microbianos del Cepario de la Universidad de Pamplona. Las cepas son mantenidas en Agar Patata Dextrosa (PDA) e incubadas a 27 ± 0,5ºC por un máximo de 5-7 días hasta obtener un crecimiento miceliar y formación abundante de conidias.  Calibrador Vernier o Nonio ± 0,1 mm.  Incubadoras a 25ºC, 30ºC y 35ºC.  2 tubos con 10 ml de agua destilada estéril + Tween 80.  Perforadora de agar de mm de diámetro.  Micropipeta de 100 – 1000 µl.  Micropipeta de 1- 20 µl.  Cajas de Petri de 4 divisiones de 100 x 20 mm o en su defecto cajas de petri corrientes de 100 x 20 mm. REACTIVOS Y MEDIOS     

27 cajas de petri con 20 ml de Agar PDA 27 cajas de petri con 20 ml Agar Sabouraud 27 cajas de petri con 20 ml de Agar Malta 27 cajas de petri con 20 ml de Agar OGY 27 cajas de petri con 20 ml de Agar Rosa de Bengala



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PROCEDIMIENTO  Para el desarrollo de esta práctica se empleara un diseño factorial 4X3X3X3X2 para evaluar el efecto del medio de cultivo (4), temperatura (3), actividad de agua (3), pH (3) y por duplicado (2) sobre el crecimiento radial.  La actividad de agua de los cuatro medios de cultivo se modificarán empleando como soluto depresor el cloruro de sodio (NaCl) en concentraciones de 0,5%, 5% y 10% en cada medio de cultivo, para obtener una actividad de agua teórica* de 0,995; 0,971 y 0,938, respectivamente. Las cajas inoculadas serán incubadas a 25ºC, 30ºC y 35ºC.  Para la siembra de los diversos mohos se empleará la técnica de punción central descrita por Samson et al., 1999 y Graϋ et al., 2007:  Tomar una caja de petri estéril y trazar por la parte inferior de la base dos líneas perpendiculares que pasen por el centro de tal forma que dividan la caja en 4 cuadrantes.  Inocular la cepa en el centro de la caja con ayuda de un asa de punción.

1 4 2 3  Incubar de forma invertida las cajas a cada una de las temperaturas, y hacer lectura del crecimiento radial en cada cuadrante con ayuda de un calibrador Vernier cada día, durante 15 días o hasta que el crecimiento alcance el borde de la caja.  Obtener el valor medio de crecimiento fúngico (expresado en mm) para cada tiempo (expresado en horas): 4 1𝑟

𝑟=

Donde

𝑛𝑟

𝑟 es el radio medio,

𝑛𝑟

4 1 𝑟 es la sumatoria del valor de los radios medidos y

es el número de radios contados.



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Tabla 7.1. Crecimiento radial fúngico expresado en mm, para una temperatura de 25ºC y 0% NaCl en agar PDA. Tiempo (horas)

radio 1

radio 2

radio 3

radio 4

radio medio

Desviación estándar

0 48 96 144 192 240 288 336 360

Repetir el cuadro anterior para cada temperatura, medio, porcentaje de NaCl y pH.  Graficar los datos para calcular la velocidad radial de crecimiento fúngico (mm/horas), según la figura mostrada de ejemplo.  Graficar las velocidades radiales de crecimiento fúngico como una función de cada combinación empleando gráficos de respuesta superficial (Excel, SPSS, Statistica, etc.)

Tomada de Graü et al., 2007. NIVEL DE RIESGO Para el desarrollo de la presente práctica se ha definido un Nivel de Riesgo Medio o Nivel 2, ya que se manejaran microorganismos considerados oportunistas y que en algún momento por malas prácticas de laboratorio pueden conllevar algún peligro para los manipuladores. Por tanto,



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todo estudiante, auxiliar y docente que oriente e intervenga en el desarrollo de la misma deberá usar los siguientes equipamientos:  Bata de Laboratorio manga larga, Guantes, Cofia, Tapabocas, Zapato Cerrado Bajo, Pantalón Largo. BIBLIOGRAFÍA Aristegui, B. (2002). Reino de los hongos. En: Hongos y Actinomicetos Alergénicos. Pontón, J., Moragues, M.D., Gené, J., Guarro, J., Quindós, G., Editores. Bilbao, España. Editorial: Revista Iberoamericana de Micología. Págs. 1-4. ISBN 84-607-5370-0. Disponible en: http://hongos-alergenicos.reviberoammicol.com/ Carrillo, L. (2003). Los hongos de los Alimentos y Forrajes. Argentina. Universidad Nacional de Salta. ISBN 987-9381-19x. Dantigny, P., Guilmart, A., Bensoussan, M. (2005). Basis of predictive mycology. Int. J Food Microbiol., 100: 187–196. Flores, T. (1997). I. Taxonomía de hongos ambientales y su influencia en el biodeterioro y la salud humana. Corporación para las investigaciones Biológicas. 1997. P. 14 -76. García, D., Ramos, A.J., Sanchis, V., Marín, S. (2010). Modelling mould growth under suboptimal environmental conditions and inoculum size. Food Microbiol., 27: 909–917. Grau, C., Sánchez, D., Zerpa, A., García, N. (2007). Influencia de la actividad del agua, pH y temperatura en el crecimiento de Aspergillus penicillioides y Aspergillus terreus aislados de la carne seca y salada de atún listado (Katsuwonus pelamis). Revista Científica, FCV-LUZ, XVII(2): 193–199. Grimm, L.H., Kelly, S., Krull, R., Hempel, D.C. (2005). Morphology and productivity of filamentous fungi. Appl Microbiol Biotechnol., 69: 375–384. Kapetanakou, A.E., Ampavi, A., Yanniotis, S., Drosinos, E.H., Skandamis, N. (2010). Develpment of a model describing the effect of temperatura, wáter activity and (gel) structure on growth and ochratoxin A production by Aspergillus carbonarius in vitro and evaluation in food matrices of different viscosity. Food Microbiol., xxx (2010) 1–9. Article in press. Moore-Landecker, E. (1996). Chapter 10: Growth. In: Fundamentals of the Fungi. 4th Edition, Prentice Hall, Inc., New Jersey, USA, pp. 279–310. Pereira, G., Herrera, J., Machuca, A. (2007). Efecto del pH sobre el crecimiento in vitro de hongos ectomicórricos recolectados de palazones de Pinus radiata. Bosque. 28: 215-219. ISSN 0717-9200. Pitt, J.I. (1984). The significance of potentially toxigenic fungi in foods. Food Technol. Aust., 36: 218–219. Samapudo, S., Devlieghere, F., De Meulenaer, B., Debevere, J. (2007). Growth kinetics of cultures from single spore of Aspergillus flavus and Fusarium verticillioides on yellow dent corn meal. Food Microbiol., 24: 336–354.



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ACTIVIDAD 8 y 9 CONOCIMIENTO Y MANEJO DE LA BASE DE DATOS COMBASE, PATHOGEN MODELING PROGRAM (PMP), SEAFOOD SPOILAGE AND SAFETY PREDICTOR (SSSP), MICROFIT OBJETIVO Al finalizar la práctica el estudiante estará en capacidad de:  Conocer los diversos software de modelamiento microbiano como instrumento fundamental de la simulación bacteriana.  Aplicar las distintas bases de datos como una herramienta práctica para el estudio del comportamiento de una población bacteriana.  Utilizar los software específicos para cada caso particular.  Utilizar el software DMFit y MicroFit para la estimación de diversos parámetros cinéticos (crecimiento/muerte) en el estudio de poblaciones bacterianas. MARCO TEÓRICO El desarrollo de los diversos modelos de predicción empleados en microbiología descansa sobre unas bases matemáticas preestablecidas con anterioridad. Los diferentes softwares de modelamiento han empezado a popularizarse a partir de los años 90. En el presente documento se describe en forma general el aplicativo ComBase y sus componentes principales: ComBase Predictor, Perfringens Predictor y el DMFit web edition. MATERIALES, EQUIPOS E INSUMOS (por estudiante) 

Ordenador con conexión a internet (fundamental para el normal desarrollo de la práctica)

REACTIVOS 

No aplica

PROCEDIMIENTO Esta práctica se desarrollará en tres sesiones. A través de una serie de ventanas y ejemplos prácticos se explicará paso a paso la metodología a seguir para el manejo de cada software. NIVEL DE RIESGO Para el desarrollo de la presente práctica se ha definido un Nivel de Riesgo bajo, ya que no se manejaran. Por tanto, todo estudiante, auxiliar y docente que oriente e intervenga en el desarrollo de la misma deberá usar los siguientes equipamientos:  Bata de Laboratorio manga larga, Zapato Cerrado Bajo, Pantalón Largo.



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ANEXOS



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I.

NORMAS DE SEGURIDAD

La bioseguridad comprende el conjunto de medidas preventivas destinadas a proteger la salud del personal frente a riesgos por agentes, biológicos, químicos y/o físicos en las áreas de trabajo del laboratorio, así corro medidas de seguridad aplicables a los edificios e instalaciones donde se realicen las actividades. Su objetivo es crear un ambiente de trabajo SEGURO Y ORDENADO que permita alcanzar la productividad óptima. Reglas básicas de seguridad:  

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Usar ropa adecuada (bata manga larga abotonada y limpia, zapatos cerrados y limpios, uso de cofia y tapabocas). No permitir el acceso a las áreas de trabajo sin la debida precaución. Respetar las áreas de acceso restringido; no ingresar inmediatamente a cuartos de siembra previamente esterilizados con radiación ultravioleta. Al iniciar y finalizar las prácticas, lavarse las manos con agua y jabón Flamee el asa antes y después de usarla. El lugar de trabajo debe estar siempre limpio y ordenado. Antes de comenzar cada práctica es conveniente desinfectar la superficie de trabajo. Los desinfectantes más habituales para este propósito son la lejía y el alcohol (etanol 96º), o una solución de hipoclorito a 15 - 20 ppm. Los microorganismos deben manejarse siempre alrededor de la llama. Se deben evitar los desplazamientos innecesarios con el asa bacteriológica cargada con algún microorganismo por el laboratorio, ya que pueden crear corrientes que originen contaminaciones, aerosoles o producir accidentes. Durante las prácticas está prohibido comer, beber, fumar o mascar chicle. Cuando se manipulan microorganismos hay que evitar llevarse las manos a la boca, nariz, ojos, y otras partes del cuerpo (por ejemplo heridas) que podrían constituirse en puertas de entrada de microorganismos oportunistas, ya que los dedos y las uñas se contaminan fácilmente, llevando microorganismos y otras sustancias nocivas; por tanto es recomendable el uso de guantes de látex, en especial cuando se manipulen microorganismos patógenos o aquellos considerados oportunistas. No portar maquillaje o aplicarse cosméticos en el laboratorio. En caso de no contar con micropipetas, debe emplearse pipeteadores para la transferencia de volúmenes y colocar algodón, está prohibido pipetear soluciones con la boca (reactivos, sueros y soluciones en general). Libros, carpetas, abrigos y cualquier otro material que no se utilice en la realización de la práctica deben estar apartados del lugar de trabajo. Para deshacernos del material contaminado utilizaremos los recipientes adecuados (generalmente de color rojo o bolsas de este mismo color), los cuales deben estar


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debidamente marcados con el logo de residuos biológicos. Estos recipientes serán esterilizados posteriormente. Nunca se debe tirar nada por el fregadero o a la basura común. Bajo ningún concepto debe sacarse ninguna muestra contaminada del laboratorio. El suministro de gas para los mecheros Bunsen requiere las precauciones propias de estas instalaciones. Los escapes de gas son muy peligrosos, por lo que hay que cerrar todas las llaves de paso de gas al finalizar la práctica, evitar la presencia de sustancias inflamables y revisar periódicamente las conducciones. En las prácticas en que se trabaje con luz ultravioleta debe tenerse en cuenta que la exposición a este tipo de radiación es peligrosa, ya que tiene poder mutagénico. Por tanto, nunca se debe mirar directamente el foco emisor. Hay que protegerse los ojos y cualquier zona de la piel expuesta a la radiación (gafas, guantes, máscaras, etc.). En caso de accidente (ruptura de material, derramamiento de microorganismos, etc.) se comunicará inmediatamente al instructor. Trabaje solamente en su puesto. Marque cuidadosamente todos los cultivos y las preparaciones que de ellas se hacen. Incube en el lugar asignado por el instructor. Al terminar cada sesión de trabajo, limpie la superficie de la mesa. Descarte el material que no necesita ya sea usando los recipientes respectivos o entregándolos al instructor, al monitor o auxiliar de laboratorio. Nunca retire los cultivos de microorganismos del lugar de trabajo sin previa autorización del instructor. Los cultivos microbianos empleados para las prácticas solo se deben abrir durante el momento de ser usados. Trabaje con el cabello recogido, evite usar joyas (anillos, pulseras y cadenas largas por fuera de la blusa). Esterilizar todo el material de desecho. Deben establecerse reglas para la eliminación de desechos sólidos, incluyendo agujas hipodérmicas, que deben colocarse en envases sellados etiquetados como "material peligroso". Los medios de cultivo o muestras de suero que se sospecha que contienen un agente Infeccioso, o virus de la hepatitis, deben autoclavarse antes de su eliminación final. Si se trabaja con material que no es desechable, tener las debidas precauciones. Etiquetar todos los frascos con fecha, nombre de la preparación, concentración y personal que elaboró. Cada tubo de cultivo, placa de medio y reactivo debe tener una etiqueta que indique claramente el contenido y las fechas de preparación y vencimiento. Los tubos, medios y reactivos "codificados por ser peligrosos" deben estar etiquetados de forma tal que incluso personal ajeno al laboratorio pueda interpretar el signo. Almacenar las sustancias volátiles en envases adecuados, ventilados y fríos. Disponer de neutralizantes para usar en caso de accidente y extinguidores Deben utilizarse guantes adecuados cuando se manipulan instrumentos calientes, así


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como protectores faciales u oculares cuando se manipulan o mezclan sustancias cáusticas. Todas las sustancias corrosivas o cáusticas deben designarse con una etiqueta de color brillante y guardarse en gabinetes cerrados cerca del piso. Las soluciones corrosivas que se vierten en las piletas deben enjuagarse con abundante agua, antes de la eliminación real y después de ella. Todo el equipo eléctrico debe estar apropiadamente conectado a tierra y debe tomarse la preocupación de no sobrecargar los circuitos. No manipular con las manos húmedas o sin conocer adecuadamente su funcionamiento. En el laboratorio esta estrictamente prohibido el uso extensiones eléctricas y artefactos domésticos, como cafeteras o calentadores eléctricos. El personal de laboratorio debe informar al supervisor sobre cualquier choque eléctrico con el uso del aparato. Nunca debe intentarse la reparación mientras el dispositivo está conectado con el circuito eléctrico. Los tanques de gases comprimidos deben asegurarse bien a la pared y el nombre de su contenido debe estar claramente indicado en la etiqueta.

Recomendaciones antes y durante la práctica:  Llegue siempre al laboratorio con un conocimiento completo de la práctica que va a realizar.  Llegue a tiempo para la práctica, evite interrupciones.  Atienda las explicaciones del profesor y pregunte lo que no entienda.  Marque todos sus cultivos y especímenes del estudio siguiendo las indicaciones del instructor. Dicha marcación debe contener por lo menos:  Grupo de trabajo, Fecha, Nombre del microorganismo, Datos relativos a la práctica como temperatura y tiempo de incubación, medio de cultivo, número de lista y otros que considere pertinente, Semestre y nombre de la asignatura.  Para estos rótulos usar marcador de vidrio, rótulos adhesivos o escriba en cinta de enmascarar, que usted debe llevar al laboratorio.  No olvide llevar siempre el kit de trabajo elemental: porta y cubreobjetos, lanilla o toalla, jabón, marcador, cinta de enmascarar, cortapapel, asas de siembra reta, redonda, de Driglasky y todo lo demás que considere necesario.



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II.

NIVEL DE RIESGO

Para el desarrollo en general de este curso se han definido en cada una de las prácticas el nivel de riesgo, sin embargo de forma genérica para las actividades descritas en este manual se ha definido un Nivel de Riesgo Medio o Nivel 2, ya que se manejaran microorganismos considerados oportunistas y que en algún momento por malas prácticas de laboratorio pueden conllevar algún peligro para los manipuladores. Por tanto, todo estudiante, auxiliar y docente que oriente e intervenga en el desarrollo de este curso deberá usar los siguientes elementos protectores:  Bata de Laboratorio manga larga, Guantes, Cofia, Tapabocas, Zapato Cerrado Bajo, Pantalón Largo Nota 1: el docente será el responsable de velar por el cumplimiento de los elementos descritos anteriormente. Nota 2: cada estudiante deberá portar un kit de trabajo conteniendo mínimo los siguientes elementos:  Pipeteador, tijeras, cinta de enmascarar, marcador para vidrio, jabón líquido, en polvo o en barra antibacterial, toalla absorbente, porta y cubre objetos, guantes desechables de látex, gasa, algodón, asas de platino redonda, recta y de Driglasky (hockey), encendedor o fósforos, alcohol antiséptico.


Introducción a la Microbiología Predictiva - Manual de prácticas de laboratorio

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