INMUNOFIJACION •
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Combina los principios de la electroforesis y la inmunoprecipitación. La técnica fue descrita en 1964 por Wilson. Posteriormente modificada por Alper y Johnson en 1969.
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Utilizada para la identificación monoclonal de inmunoglobulinas, en el estudio del polimorfismo proteico y para estudios genéticos tales como alfa-1-antitripsina.
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En la inmunofijación de proteínas, la muestra es colocada sobre un gel de agarosa en diferentes posiciones, y sometida a un corrimiento electroforético. Posteriormente, cada corrimiento por separado es cubierto con un suero monoespecífico para IgG, IgA, IgM, kappa y lambda.
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Después de un período de incubación en donde se forman los complejos inmunes antígeno anticuerpo, si es que existe una cantidad equilibrada de anticuerpo ó un exceso, se harán evidentes los complejos inmunes formados, ya que son muy grandes e insolubles para ser eliminados por lavado, mientras que la fracción de anticuerpo no unida y las demás proteínas son removidas, dejando sólo los inmunoprecipitados.
muestras •
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Suero fresco o refrigerado LCR ORINA NO UTILIZAR PLASMAS PORQUE EL FIBRINOGENO PRESENTA EN LA MUESTRA OCASIONA INTERFERENCIA
VENTAJAS 1. El proceso es más rápido que una Inmunoelectroforésis. Aproximadamente 2 1/2 hrs. 2. Es fácil distinguir las diferentes bandas cuando tenemos una gamapatía biclonal con movilidad similar y de la misma clase de inmunoglobulina. 3. El personal no requiere gran experiencia para interpretar las bandas como en el caso de la Inmunoelectroforésis. 4. La inmunofijación es más exacta en la detección de la proteína de Bence Jones. 5. La inmunofijación tiene una mejor resolución de bandas pequeñas ó bandas muy cercanas entre sí.
INMUNOCROMATOGRAFIA: PRUEBAS RAPIDAS
Técnicas Inmunológicas •
Las técnicas de serología diagnóstica caen en tres categorías generales: –
Pruebas de unión primaria (miden directamente el
enlace Ag-Ac) –
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Pruebas de unión secundaria (miden los resultados
de la interacción Ag-Ac in-vitro) Pruebas de unión terciaria (miden el efecto protector real de los Ac en un animal)
Pruebas Inmunodiagnósticas Unión Primaria: - Enzimáticas: ELISA, IHQ, Dot Blot,
Western Blot. - Fluorescentes: IFD, IFI. - Radiactivas: RIA.
- Metales: Inmunocromatografía Union Secundaria: - Aglutinaciones.
- Precipitaciones. - Fijación del Complemento. Union Terciaria: Sistemas Vivos
Pruebas de unión primaria •
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Este tipo de pruebas se realizan combinando antígenos y anticuerpos y después midiendo directamente las cantidades de inmunocomplejos que se hayan formado. Son técnicas de inmunomarcado. Se utilizan marcadores como radioisótopos, colorantes fluorescentes, o enzimas para identificar uno de los reactivos.
CONCEPTO •
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La inmunocromatografía es una de las técnicas de inmunodiagnóstico más modernas cuyas principales ventajas son la sencillez y rapidez del test. No es necesario reactivos ni instrumentación adicional, como en el campo clínico. El ejemplo más conocido son los test de embarazo de las farmacias.
Membrana de nitrocelulosa o nylon hay absorbidos en la línea de reacción anticuerpos contra el antígeno que buscamos La línea control anticuerpos anticonjugado, de forma que cuando la muestra contiene antígeno, este fluye por la membrana quedando retenido en la línea de reacción. El conjugado, que también es un anticuerpo específico frente al antígeno que buscamos, está marcado con una molécula de oro coloidal, que también fluye por la membrana, .
Es retenido por el antígeno en la línea de reacción y por el anticuerpo en la línea control. En el caso de muestras negativas que no contienen antígeno, el conjugado es retenido únicamente en la línea control. Estás técnicas son rápidas, obteniéndose resultados en 15-30 minutos
Inmunocromatografía •
Son técnicas cualitativas sencillas que utilizan anticuerpos marcados con metales pesados como el oro (color rosa) o el selenio (color azul). El ejemplo más clásico es la prueba de embarazo en humanos.
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La técnica consiste en hacer que una solución de Ag (por ej. sangre entera) fluya a través de una tira porosa. El Ac puede estar marcado con oro (banda color rosa) o con selenio (banda color azul).
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Sobre una membrana de nitrocelulosa, se encuentran absorbidos en la línea de reacción anticuerpos contra el antígeno que buscamos y sobre la línea control anticuerpos anti-conjugado, de forma que cuando la muestra contiene antígeno, este fluye por la membrana quedando retenido en la línea de reacción. El conjugado, que también es un anticuerpo específico frente al antígeno que buscamos, está marcado con una molécula no contienen antígeno, el conjugado es retenido únicamente en la línea control. Estás técnicas de oro coloidal, que también fluye por la membrana, es retenido por el antígeno en la línea de reacción y por el anticuerpo en la línea control. En el caso de muestras negativas, el conjugado será retenido únicamente en la línea de control. Los resultados se dan visualizan entre 15 y 30 minutos.
TÉCNICA DE INMUNOCROMATOGRAFÍA C
T
S
FUNDAMENTO DE INMUNOCROMATOGRAFÍA PARA DETECCIÓN DE ANTÍGENOS Anticuerpos de detección marcados con Oro Coloidal Antígeno en muestra
TIRA NITROCELULOSA Anticuerpo de Captura contra anticuerpo
Anticuerpo de Captura contra antígeno
PROCEDIMIENTO
RESULTADOS POSITIVO
NEGATIVO
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El método basado en el oro coloidal como marcador ha tenido un gran desarrollo en los últimos años y ésto por diversas razones: En primer lugar las partículas de oro se pueden fabricar en diferentes tamaños, de entre 2-3 nm a 100-150 nm, con todas las posibles medidas intermedias. Estas partículas pueden fabricarse en el laboratorio aunque actualmente existe una amplia disponibilidad comercial. Las partículas de oro absorven todo tipo de proteínas formando complejos muy estables. Muchas de las proteínas acomplejadas con oro mantienen sus propiedades y actividad biológica. Los tamaños de 2 a 3 nm son los menores disponibles para un marcador y por ello el oro es el marcador que permite la máxima resolución
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La utilización del oro como marcador unido a proteína A, anticuerpos u otras proteínas, se ha limitado tradicionalmente a la microscopía electrónica, pero recientemente el desarrollo de métodos de amplificación de la señal mediante precipitación de plata metálica ha permitido su aplicación en microscopía óptica. Los métodos de amplificación de señal se basan en la propiedad del oro de catalizar la reducción de iones plata a plata metálica en presencia de un agente reductor. Durante este proceso las partículas de oro son rodeadas por plata metálica haciendose visibles al microscopio óptico con una coloración marrón oscuro. Se utiliza el lactato de plata como donador de iones y la hidroquinona como reductor a un pH de aproximadamente 3.5. Actualmente el oro coloidal unido a anticuerpos o a proteína A es el marcador más empleado en microscopía electrónica.
