Universidad Nacional de Cajamarca “Norte de la universidad peruana” peruana”
Facultad de Ciencias Agrarias Escuela Académico Profesional de Ingeniería en Industrias Alimentarías ASIGNA!"A
: Bioquímica
E#A
: Factores físico-químicos que modifican la Velocidad de las reacciones enzimáticas.
.
$%CENE
: MURRUGARRA ABAN!" #alom$n.
A&!#N%
:%aura &uaman 'o(selin Melissa antalean #il)a *)el+n Maria Valera Ramos 'o(ana Ramos Vasquez ,alter
CIC&%
: .
G"!P%
: A/
0a1amarca" Ma+o 2345
[FACTORES FISICO- QUIMICOS]
FACTORES FISICO-QUIMICOS QUE MODIFICAN LA VELOCIDAD DE LAS REACCIONES ENZIMATICAS RESUMEN: En general, todas las enzimas, independientemente del tipo de reacción que catalizan, presentan características comunes en cuanto a los factores que intervienen favoreciendo, retardando o impidiendo su actividad. Estos factores se investigan teniendo en cuenta la velocidad de la reacción enzimática sobre un sustrato adecuado y en determinadas condiciones. Tomando una determinada enzima como patrón es posible tener una idea más o menos clara de la influencia de los factores (Tiempo, temperatura, concentración de enzima, concentración de sustrato, pH, iones, etc, sobre la serie infinita de enzimas que se conoce. Este patrón general, como se comprenderá, varia en forma característica para cada enzima en particular. !ara estudiar cada uno de estos factores es necesario que los otros permanezcan constantes, de tal manera que la investigación del factor variable no se vea afectada por la variación que pudieran sufrir los otros. "a finalidad de este e#perimento es observar el efecto de iones activadores, pH, concentración de enzima, concentración de sustrato, tiempo y temperatura sobre la velocidad de una reacción enzimática, tomando como e$emplo la %idrólisis enzimática del almidón y evaluando las variaciones del sustrato transformado y de los productos de la reacción enzimática.
1
| BIOQUIMICA- UNIERSI!A! NACIONA" !E CA#AMARCA
[FACTORES FISICO- QUIMICOS]
INTRODUCCION "a temperatura, la concentración de sustrato, enzimas y la concentración de iones %idrogeniones, son algunos de los factores que act&an directamente sobre la actividad enzimática, produciendo consecuencias particulares seg&n el efecto que tienen sobre la enzima, ya sea favoreciendo, retardando o impidiendo su actividad. El efecto que produce estos factores sobre las enzimas es diferente en cada una de ellas, pues dependen en gran parte de las condiciones en las que se realiza dic%a reacción. !ara estudiar cada uno de estos factores es necesario que los otros permanezcan constantes, de tal manera que la investigación del factor variable no sea afectada por las variaciones que pudieran sufrir los otros. "a finalidad de estos e#perimentos es observar el efecto de los iones activadores, !H, concentración de enzima, concentración de sustrato, tiempo y temperatura sobre la velocidad de una reacción enzimática, tomando como e$emplo la %idrolisis enzimática del almidón y evaluando las variaciones del sustrato transformado y de los productos de la reacción enzimática.
FUNDAMENTACION "a velocidad a la que las reacciones enzimáticas proceden depende de varios factores, dentro de los que destacan el pH del medio de reacción, la temperatura, la concentración de sustrato y de enzima, y el agua disponible en el medio, entre los más importantes.
Concentración del ion idro!eno "#$: "a actividad de las enzimas depende fuertemente de la concentración de iones %idronio del medio, ya que esto afecta el grado de ionización de los aminoácidos de la proteína, incluyendo a los del sitio activo, del sustrato (en caso de ser ionizable, o del comple$o enzima'sustrato de %ec%o el pH influye en la estructura tridimensional de la proteína y a su vez, sobre la afinidad que tenga la enzima por el sustrato. "a mayoría de las enzimas presentan un rango de pH relativamente estrec%o en el que presentan una actividad óptima, desactivándose en pHs e#tremos aunque e#isten e#cepciones, como la catalasa bovina o la )'amilasa que presentan un rango de actividad óptima muy amplio. En el cuadro *.* se muestran los valores de pH óptimo para algunas enzimas. !ara su aplicación en alimentos, %ay que considerar que el pH de la mayoría de los alimentos varía entre +. y -., sólo las frutas y sus derivados tienen un pH más ácido que llega a ser de .. !or obvias razones, se seleccionan enzimas que funcionen bien al pH del alimento, pues /ste es difícilmente modificable.
2
| BIOQUIMICA- UNIERSI!A! NACIONA" !E CA#AMARCA
[FACTORES FISICO- QUIMICOS]
En ocasiones, es posible in%ibir la actividad enzimática endógena, si el alimento lo permite, mediante la reducción del pH adicionando ácidos disponibles como aditivos (por e$emplo, adición de ácido cítrico al aguacate. El pH óptimo se debe determinar e#perimentalmente, y se deben considerar otras variables operacionales como la temperatura, el sustrato y la capacidad amortiguadora de la solución tampón utilizada. 0i la enzima se encuentra en un pH muy ale$ado del óptimo, se alterará su estructura secundaria y terciaria como consecuencia de la protonación o desprotonación de los residuos de aspártico, glutámico, lisina, arginina e %istidina, principalmente. "a consecuencia será el desplegamiento o desnaturalización permanente o irreversible de la proteína. 0i el ambiente en el que se encuentra la enzima no está a un pH e#tremo, /sta puede replegarse y regresar a su conformación y actividad original, es decir, se puede renaturalizar.
E%ecto de la teerat'ra: 1omo sucede con cualquier otra reacción química, la velocidad de las reacciones enzimáticas se incrementa con la temperatura, al aumentar la energía cin/tica de las mol/culas, pero sólo en el intervalo en que la enzima es estable y retiene su capacidad catalítica en casos e#tremos, cuando el incremento es muy grande, se favorece la desnaturalización y consecuentemente la proteína pierde su capacidad catalítica. E#isten varios factores que, además de la estabilidad conformacional, tambi/n afectan la actividad enzimática al aumentar la temperatura, y son2 la solubilidad de gases (o#ígeno, el pH de la solución amortiguadora, la afinidad de la enzima por el sustrato, por activadores o in%ibidores así como la presencia de reacciones de competencia. !or esta razón, cada enzima tiene un intervalo óptimo de temperatura en el cual se logra la mayor actividad, para la mayoría está entre + y 3*41, y se inactiva a más de 541, a
3
| BIOQUIMICA- UNIERSI!A! NACIONA" !E CA#AMARCA
[FACTORES FISICO- QUIMICOS]
esta temperatura la energía introducida en el sistema sobrepasa la energía de las fuerzas que mantienen la estructura activa de la enzima (figura *.*.
Concentración de ('(trato: 6na enzima funciona de manera más eficiente cuando la concentración de sustrato está en e#ceso en relación con la concentración de enzima. Esto se debe a que las colisiones 7e#itosas7 con el reactivo son más frecuentes, asegurando así que la mayor cantidad de enzima se encuentre activa. En estas condiciones, el producto se obtiene a la má#ima velocidad posible para la cantidad de enzima presente. En caso de que la concentración de sustrato sea menor, la velocidad de reacción disminuye. Este aspecto es muy importante en la caracterización cin/tica de una enzima, como se verá más adelante. !or otra parte, la acción de una enzima a nivel industrial debe ser óptima tanto en t/rminos de costo como de eficiencia catalítica, por lo que la reacción se debe llevar a cabo en la medida de lo posible a la má#ima velocidad.
Cin)tica de Mic*aeli(-Menten 1omo las reacciones catalizadas por enzimas son saturables, la velocidad de catálisis no muestra un comportamiento lineal en una gráfica al aumentar la concentración de sustrato. 0i la velocidad inicial de la reacción se mide a una determinada concentración de sustrato (representado como 809, la velocidad de la reacción (representado como : aumenta linealmente con el aumento de la 809, como se puede ver en la figura. 0in embargo, cuando aumentamos la 809, la enzima se satura de sustrato y alcanza su velocidad má#ima (:ma#, que no sobrepasará en ning&n caso, independientemente de la 809.
;ecanismo de unión de &nico sustrato para una reacción enzimática. constantes cin/ticas para cada una de las etapas de la reacción.
k 1, k -1 y k 2 son
las
El modelo de cin/tica mic%aeliana para una reacción de &nico sustrato se puede ver en la figura de la izquierda. !rimeramente, tiene lugar una reacción química bimolecular entre la enzima E y el sustrato 0, formándose el comple$o enzima'sustrato E0. = tambi/n llamado =cat o n&mero de recambio, %ace referencia al má#imo n&mero de reacciones enzimáticas catalizadas por segundo. 4
| BIOQUIMICA- UNIERSI!A! NACIONA" !E CA#AMARCA
[FACTORES FISICO- QUIMICOS]
< ba$as concentraciones de sustrato, la enzima permanece en un equilibrio constante entre la forma libre E y el comple$o enzima'sustrato E0.
Cepresentación gráfica de la curva de saturación de una enzima donde se puede observar cómo evoluciona la relación entre la concentración de sustrato y la velocidad de la reacción.
5
| BIOQUIMICA- UNIERSI!A! NACIONA" !E CA#AMARCA
[FACTORES FISICO- QUIMICOS]
O+,ETIVOS O.eti/o !eneral:
O.eti/o( e(#ec0%ico(: Demostrar la importancia de la coenzima en el sistema enzimático para la velocidad de reacción.
:erificar que la reacción enzimática es lenta en un medio acido o en un medio básico.
1omprobar que a una temperatura muy alta la enzima se desnaturaliza o muy ba$a, la enzima se in%ibe.
6
| BIOQUIMICA- UNIERSI!A! NACIONA" !E CA#AMARCA
[FACTORES FISICO- QUIMICOS]
MATERIALES 1 METODOS Materiale(
> Tubos de ensayo. Fradilla. !ipetas. 1ocina el/ctrica.
Reacti/o(: Reacti/o Sol'ción de al&idón +'%%er %o(%ato +'%%er acetato +'%%er %o(%ato Sol'ción clor'ro de (odio A&ila(a (ali/al diali2ada 3cido clor*0drico Sol'ción 4odada "4od'ro de #ota(io$5 Sol'ción c6#rico alcalina Sol'ción %o(%o&ol0dica A!'a de(tilada
Concentración >G .>; .>; .>; G .*G .*
# 5.5 3.5 >.
7arte e8#eri&ental: 1olocar los componentes mencionados en la siguiente tabla, utilizando tubos de ensayo (armar el sistema2
Eta#a A: COM7ONENTES "en &l5$ 0olución de almidón al > G @uffer acetato .>; pH 3.5 @uffer fosfato .>; pH 5.5 @uffer acetato .>; pH > 0olución de 1la al G
I >. ' *. ' >.3 .5
II >. ' *. ' ' +.
TU+OS DE ENSA1O III IV V VI . >. >. >. ' *. ' ' *. ' *. ' ' ' ' *. >.3 >.3 >.3 >.3 >.5 >.5 >.5 >.5
VII >. ' *. ' >.3 .5
;ezclar y colocar los tubos2 del I al :II al ba?o maría a +-41, por + minutos, para el equilibrio de la temperatura.
El tubo :III mantenerlo en agua %elada entre 41 y 341 durante + minutos. !asado * minutos agregar el preparado enzimático (amilasa salival dializada al .*G y el preparado enzimático %ervido (amilasa salival dializada al .*G, a los tubos2 seg&n se indica en el siguiente cuadro y tomar el tiempo2
7
| BIOQUIMICA- UNIERSI!A! NACIONA" !E CA#AMARCA
VIII >. ' *. ' >.3 >.5
[FACTORES FISICO- QUIMICOS]
COM7ONENTES "en &l5$ !reparado enzimático !reparado enzimático %ervido
I ' '
II >. '
TU+OS DE ENSA1O III IV V VI >. >. >. >. ' ' ' '
VII ' >.
VIII >. '
;ezclar y continuar la incubación.
"os controles de la actividad enzimática. !or el sustrato residual, se realizará en toda la serie de tubos del I al :III pasado los + minutos de incubación.
CONTROL DE ACTIVIDAD ENZIM3TICA 7OR EL SUSTRATO RESIDUAL
El control del sustrato no transformado se realizara por la acción del yodo, de la siguiente manera.
1umplidos los + minutos de incubación sacar los tubos del ba?o maría y agua %elada y armar una serie paralela de tubos marcados del I al :III, agregando a cada tubo marcado, > ml. del incubado de su correspondiente tubo.
Eta#a +:
Coonente( "en &l5$
I
II
Incubado correspondiente
>. 1.0
Jcido clor%ídrico .* 0olución yodada
*. .*
*. .*
TU+OS DE ENSA1O III IV V VI
VII
VIII
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
*. .*
*. .*
*. .*
*. .*
*. .*
*. .*
Kbservar y anotar los resultados de las reacciones de cada uno de los tubos, valorando los cambios de coloración.
0e obtuvo los siguiente2
8
| BIOQUIMICA- UNIERSI!A! NACIONA" !E CA#AMARCA
[FACTORES FISICO- QUIMICOS]
CONTROL DE ACTIVIDAD ENZIM3TICA 7OR LOS 7RODUCTOS FORMADOS
El control de los productos formados se %ará en base a la capacidad reductora de estos (glucosa, maltosa de la siguiente manera2
"uego procedemos a armar el siguiente sistema utilizando tubos de ensayo nuevos.
Eta#a C: COM7ONENTES
TU+OS
Incubado correspondientemente a los tubos III y : del sistema >
III >. ml.
V >. ml.
0olución c&prico alcalina
>. ml.
>. ml.
;ezclar y colocar en ba?o maría %irviendo por * minutos los tubos III y :.
1umplidos los * minutos sacamos los tubos y enfriamos con agua corriente.
"uego agregamos a cada uno de los tubos los siguientes componentes2
COM7ONENTES
TU+OS
III V 0olución fosfomolíbdica >. ml. >. ml.
9
| BIOQUIMICA- UNIERSI!A! NACIONA" !E CA#AMARCA
[FACTORES FISICO- QUIMICOS]
RESULTADOS 1 CONCLUCIONES: < continuación detallaremos que componentes contenía cada tubo, como estos reaccionaron, y el porqu/ de los colores que se muestran en las anteriores imágenes2
TU+O I: Conten0a:
0olución de almidón al >G (>ml L ('(trato5 @uffer fosfato .>; pH 5.5 (*ml L # ó#ti&o5 0olución de 1la al G (>.3ml L Cl e( el ión acti/ador de la en2i&a5
E8#licación: Debido a que no %ubo enzima (amilasa salival el sustrato (almidón no se degradó. !or ende al interactuar el almidón con el indicador (I la reacción se torna azul oscuro como observamos en la imagen.
TU+O II: Conten0a:
0olución de almidón al >G (>ml L ('(trato5 @uffer fosfato .>; pH 5.5 (*ml L # ó#ti&o5
E8#licación: Debido a que no %ubo 1l (ión activador la reacción fue lenta por eso se obtuvo escasos productos. 1omo en la mezcla resultante %abía aun presencia de almidones no degradados y escasos azucares reductores, el indicador (I ti?o la mezcla de un color naran$a como se pudo observar.
TU+O III: Contenido:
0olución de almidón al >G (ml L ('(trato5 @uffer fosfato .>; pH 5.5 (*ml L # ó#ti&o5 0olución de 1la al G (>.3ml L Cl e( el ión acti/ador de la en2i&a5 .5ml L rinda el &edio l09'ido a la reacción5
10
| BIOQUIMICA- UNIERSI!A! NACIONA" !E CA#AMARCA
[FACTORES FISICO- QUIMICOS]
E8#licación: Debido a que la cantidad de sustrato estaba aumentada (era el doble comparando con los demás tubos, la velocidad de la reacción fue aumentando %asta que alcanzó un valor má#imo y luego se mantuvo constante. < pesar de esto si se formaron productos por ello el indicador al interactuar sobre aquellos ti?o la reacción de color azul oscuro.
TU+O IV: Contenido:
0olución de almidón al >G (>ml L ('(trato5 @uffer acetato .>; pH 3.5 (*ml L # ;cido5 0olución de 1la al G (>.3ml L Cl e( el ión acti/ador de la en2i&a5 .5ml L rinda el &edio l09'ido a la reacción5
E8#licación: Debido a que el pH de la reacción fue ácido provoco la desnaturalización de la enzima, impidiendo su acción sobre el sustrato de esta manera no se formó productos (azucares reductores. !or ello el indicador al interactuar sobre el sustrato ti?o la reacción de color azul oscuro.
TU+O V: Contenido:
0olución de almidón al >G (>ml L ('(trato5 @uffer fosfato .>; pH 5.5 (*ml L # o#ti&o5 0olución de 1la al G (>.3ml L Cl e( el ión acti/ador de la en2i&a5 .5ml L rinda el &edio l09'ido a la reacción5
E8#licación: En esta reacción no %ubo ning&n factor que altere la acción de la enzima sobre el sustrato por ello la formación de productos (azucares reductores se dio sin ning&n
11
| BIOQUIMICA- UNIERSI!A! NACIONA" !E CA#AMARCA
[FACTORES FISICO- QUIMICOS]
inconveniente. Este tipo de reacción es ideal.
TU+O VI: Contenido:
0olución de almidón al >G (>ml L ('(trato5 @uffer fosfato .>; pH >. (*ml L # ;(ico5 0olución de 1la al G (>.3ml L Cl e( el ión acti/ador de la en2i&a5 .5ml L rinda el &edio l09'ido a la reacción5
E8#licación: Debido a que el pH de la reacción fue básico provocó la desnaturalización de la enzima, impidiendo su acción sobre el sustrato de esta manera no se formó productos (azucares reductores. !or ello el indicador al interactuar sobre el sustrato ti?ó la reacción de color azul oscuro.
TU+O VII: Contenido:
0olución de almidón al >G (>ml L ('(trato5 @uffer fosfato .>; pH 5.5 (*ml L # o#ti&o5 0olución de 1la al G (>.3ml L Cl e( el ión acti/ador de la en2i&a5
E8#licación: Debido a que la cantidad de enzima fue ba$a (a comparación de los demás tubos esta se saturo muy rápido. !or ello la cantidad de almidón no se degrado en su totalidad. 1omo en la mezcla resultante %abía aun presencia de almidón no degradado y azucares reductores, el indicador (I ti?o la mezcla de un color azul oscuro.
TU+O VIII: Contenido:
12
0olución de almidón al >G (>ml L ('(trato5 | BIOQUIMICA- UNIERSI!A! NACIONA" !E CA#AMARCA
[FACTORES FISICO- QUIMICOS]
@uffer fosfato .>; pH 5.5 (*ml L # o#ti&o5 0olución de 1la al G (>.3ml L Cl e( el ión acti/ador de la en2i&a5 .5ml L rinda el &edio l09'ido a la reacción5
E8#licación: Debido a que la temperatura fue ba$a la enzima se desnaturalizo, en este caso el color de la reacción fue azul oscuro
CUADRO 7ARA LA VALORACI
V ;KDEC
TU+O III: Debido a que muc%a cantidad de sustrato la enzima se saturo, y no alcanzo a degradar a toda la cantidad de sustrato (almidón, por ende %ubo no %ubo totalidad de productos (azucares reductores. !or eso el indicador (solución fosfomolibdica lo ti?o de un color azul no muy oscuro.
TU+O V: En esta reacción no %ubo ning&n factor que altere la acción de la enzima sobre el sustrato por ello la formación de productos (azucares reductores se dio sin ning&n inconveniente. Este tipo de reacción es ideal.
13
| BIOQUIMICA- UNIERSI!A! NACIONA" !E CA#AMARCA
[FACTORES FISICO- QUIMICOS]
DISCUSIONES =7or 9') la( reaccione( no %'eron la( e(#erada(> "as reacciones no fueron las esperadas en la práctica debido a muc%os factores o errores %umanos, los cuales pueden ser la mala medición o el mal uso de los equipos de medición de los reactivos (!ipeta.
=7or 9') (e de(nat'rali2o la en2i&a> "a enzima se puede %aber desnaturalizado por muc%os factores como pueden ser la temperatura, pH, concentración del sustrato entre otros, principalmente en la práctica podemos influir o decir que fue el factor temperatura.
=7or 9') no *'o reacción en ca(i todo( lo( t'o(>
o %ubo reacción en los tubos I, II, I:, :I, :II y :III. Debido a factores diversos ocurridos en la práctica. En los tubos III y :, %ubo una reacción mínima ya que la presencia del sustrato residual fue mayor. Esto se puede %aber debido a que la enzimas se %aya desnaturaliza o in%ibida. !ara empezar, se %a de aclarar que las diluciones óptimas para salivas de diferentes personas son distintas porque las características y concentraciones de los compuestos varían de una persona a otra. Es tomismo ocurre con el pH salival y el tiempo de referencia.
14
| BIOQUIMICA- UNIERSI!A! NACIONA" !E CA#AMARCA
[FACTORES FISICO- QUIMICOS]
CUESTIONARIO ?5 =Identi%i9'e en cada 'no de lo( t'o( el %actor %0(ico-9'0&ico 9'e inter/iene &odi%icando la /elocidad en2i&;tica> En casi todos los tubos, e#cepto en /l tuvo II se adiciono la Sol$ci%n de ClNa al &'( la cual es el ion activaron de la enzima. Además en todos los tubos tambin se adiciono la soluci!n de )Cl *+*,N( "ara detener la reacci!n enzimática.
5 =E8#li9'e '(ted 9'e %inalidad tiene la 'tili2ación de la (ol'ción 4odada> "a solución yodada tiene la &nica finalidad de mostrar la actividad enzimática. En el sustrato la cual nos va indicar si %ubo o no actividad mediante el color, la cual va desde azul oscuro %asta un amarillo claro.
@5 =E8#li9'e '(ted 9'e %inalidad tiene la 'tili2ación de la (ol'ción c6#rica alcalina> "a solución c&prico alcalina tiene la finalidad controlar los productos formados en base a la capacidad reductora de la glucosa y maltosa.
5 =E8#li9'e lo( re('ltado( otenido(> "os resultados obtenidos no fueron los previstos por que solo %ubo una reacción en los tubos III y :, y en los otros tubos bien es el caso de que la enzima se desnaturalizo o se in%ibió por que no ocurrió ninguna reacción.
B5 =Di!a '(ted c'ale( (on lo( coonente( e(tr'ct'rale( del al&idón> El almidón está constituido por dos compuestos de diferente estructura2 •
•
15
L 3 en una cadena sin ramificar, o muy escasamente ramificada mediante enlaces )'(> L 5 . Esta cadena adopta una disposición %elicoidal y tiene seis monómeros por cada vuelta de %/lice. 0uele constituir del * al + G del almidón. L 3, como se indicó en el caso anterior, y muc%os enlaces )'(> L 5 que originan lugares de ramificación cada doce monómeros. 0u peso molecular es muy elevado, ya que cada mol/cula suele reunir de . a . unidades de glucosa.
| BIOQUIMICA- UNIERSI!A! NACIONA" !E CA#AMARCA
[FACTORES FISICO- QUIMICOS]
5 =di!a '(ted a 9'e (e lla&a a&ila(a (ali/al diali2ada 4 c';l e( (' acción (ore el al&idón> 0e llama amilasa salival dializada a amilasa que a perdido o e#traído toda la sal y por lo tanto pierde el 1HK+. "a enzima amilasa degrada el almidón para así formar azucares más simples como la glucosa, es decir, de mol/culas comple$as pasa a mol/culas simples. "as mol/culas de glucosa atraviesan la pared intestinal y posteriormente llegan a la sangre.
16
| BIOQUIMICA- UNIERSI!A! NACIONA" !E CA#AMARCA
[FACTORES FISICO- QUIMICOS]
+I+LIORAFIA
BIOQUIMICA LEHNINGER Albert L. Las Bases Moleculares de la Estructura y la Funcin Celular de la acti!idad en"i#atica $da E%ICION.
@IKO6I;I1< DE H*va. Edición !ag. -' >33.
%ttp2QQRRR.monografias.comQtraba$os'pdfSQactividad'enzimatica' amilasaQactividad'enzimatica'amilasa.pdf
%ttp2QQes.Ri=ipedia.orgQRi=iQ0ustrato(bioquG1+G
%ttp2QQRRR.e%u.esQbiomoleculasQenzimasQenz>.%tm
%ttp2QQes.Ri=ipedia.orgQRi=iQ
17
| BIOQUIMICA- UNIERSI!A! NACIONA" !E CA#AMARCA