Informe de Prácticas: Guía de Enteroparásitos

ESCUELA PROFESIONAL DE BIOLOGÍA

Informe de Prácticas: Enteroparásitos ASIGNATURA

:

Parasitología Clínica DOCENTE

:

Mblga. M. Teresa Silva García ALUMNO

:

Rómulo Aycachi Aycachi Inga

CICLO

:

2008 - I

 Lambayeque, junio del 2008.

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PARASITOLOGÍA CLÍNICA PRACTICA Nº 01 Introducción a la Parasitología Clínica y Técnicas de Diagnóstico de Enteroparasitosis TÉCNICAS COPROSCOPICAS: Examen Directo 1. Intr Introd oduc ucci ción ón::

Normas de Bioseguridad •

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Prohibir el ingreso al laboratorio a personas que no guarden las medidas de bioseguridad. Ingresar al laboratorio obligatoriamente con guardapolvo. Utilizar mascarillas y guantes, cuando sea necesario, según el tipo de trabajo. Desarrollar el hábito de mantener las manos lejos de la boca, nariz, ojos y cara, para evitar la autoinoculación. Descontaminar las superficies de trabajo por lo menos una vez antes de todo todo trab trabaj ajo o y cuan cuando do se prod produz uzca ca cual cualqu quie ierr salp salpic icad adur ura a de mate materi rial al infeccioso. Autoclavar todo material infeccioso antes de ser eliminado. No pipetear con la boca sustancias contaminadas con agentes infecciosos y/o químicos. No comer, beber, fumar, guardar alimentos ni aplicarse cosméticos dentro del laboratorio. Considerar todas las muestras como potencialmente infecciosas para evitar  el posible contagio. Lavarse las manos antes y después de realizar cualquier trabajo, sobre todo después de haber manipulado material infeccioso. Realizar cuidadosamente todos los procedimientos para evitar la formación de aerosoles, sobre todo en el momento de efectuar siembras, aislamientos e identificaciones microbianas. Evitar molestar en el laboratorio con sonidos o conversaciones de alto volumen. Desinfectar el área de trabajo antes y después de cada actividad diaria, con fenol al 5%, cresol al 3% u otro desinectante, dejándolo actuar durante 30 minutos Tomar omar las las mues muestr tras as de sang sangre re se debe deben n util utiliz izan ando do jerin jeringa gass y aguj agujas as descartables. No volver a tapar la aguja con el capuchón de plástico. En caso de hacerlo utilizar los métodos alternativos. Emplear los materiales en buen estado (sin rajaduras). Mientras no sea posible hacer la descontaminación de muestras en el propio laboratorio, colocar el material contaminado en cajas de metal con 2

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tapa. No acumular inadecuadamente material contaminado por más de 12 horas. Verificar que el material infeccioso por descartar sea fácilmente identificable como tal y se esterilice lo antes posible. Colocar horizontalmente el material de vidrio reusable (pipetas, láminas portaobjetos, etc.) en un depósito con mezcla sulfocrómica y esterilizarlo al final de la jornada de trabajo. Trapear Trapear los pisos diariamente, con un paño limpio y solución desinfectante. Almacenar los medios de cultivo, kits de diagnóstico y colorantes en sus envases unitarios originales y con las etiquetas firmemente adheridas al envase. Manipular cuidadosamente las láminas portaobjetos, a fin de evitar cortes o abrasiones en la piel. Limpiar con paños adecuados los lentes (oculares y objetivos), para evitar  contagio con agentes infecciosos. En el transp transport orte, e, utiliz utilizar ar recipi recipient entes es primar primarios ios de vidrio vidrio con con tapa tapa rosca rosca dentro de los cuales se coloca la muestra. Emplear un recipiente secundario que contenga material absorbente entre él y el recipiente primario, de manera que pueda absorber todo el líquido de la muestra en caso de fuga. f uga. Colocar una envoltura exterior para proteger el recipiente secundario de las influencias exteriores durante su transporte. Sellar firmemente todas las bocas de los recipientes con cinta adhesiva, para transportar el material biológico. No colocar los recipientes de transporte dentro de bolsillos de casacas, bolsos o mochilas de uso personal. Realizar el transporte del material biológico en el menor tiempo posible.

2. Obje bjetiv tivos: os: -

Reco Recole lecc cció ión n corre correct cta a de mues muestra tra.. Anál Anális isis is cor corre rect cto o de la mue muest stra ra.. Conoc Conocer er y aplica aplicarr los difer diferent entes es métod métodos os de exame examen n microsc microscópi ópico. co. Difere Diferenci nciar ar un parási parásito to de un pseudo pseudopar parási ásito. to. Conoc Conocer er y difer diferenc enciar iar algu algunas nas estr estruct uctura urass paras parasita itaria rias. s.

3. Mate Materi rial ales es y méto método dos: s: 3.1.

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Materiales: Láminas Laminillas Lugol ugol para arasito sitoló lóg gico ico Microscopio

3.2. Métodos: Métodos:

Requisitos para la toma de muestras de heces: - Mues Muestr tras as de hece hecess fres fresca cas: s: Sirven las heces recién emitidas y evacuadas espontáneamente. espontáneamente. o Deben recogerse en un recipiente limpio y seco. o 3

o o

o

o

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No debe mezclarse con orina. En los los lact lactan ante tess se reco recomi mien enda da toma tomarr la mues muestra tra de hece hecess directamente del pañal o estimular la evacuación mediante una sonda rectal. Debe Debe tran transc scur urri rirr el meno menorr tiem tiempo po posi posibl ble e entr entre e la toma toma de muestra y el examen de la misma. Debido a la eliminación irregular de los elementos parasitarios, el examen parasicológico de una sola muestra de heces puede ser  insuficiente.

Mues Muestr tras as de de hec heces es pre prese serv rvad adas as:: o Para evitar la descomposición de la materia fecal y conservar los elem elemen ento toss para parasi sita tari rios os se util utiliz izan an dive divers rsos os comp compue uest stos os preservadores o fijadores. Las mas frecuentemente usadas son: o  Formalina en solución acuosa al 5 ó 10% en solución acuosa.  Formosal al 5% compuesto por una solución acuosa al 2% de folmoldehído y NaCl al 0.5%.  El MiF (Merthiolate Yodo Formalina) que además colorea las muestras.  El PAF (Fenol-Alcohol-Formalina).  El SAF (Acetato de Na-Ac. Acético-Formalina).  PVA (Alcohol polivinílico).  Fijador de Shaudinn.

Examen de heces en el Laboratorio: -

Exam Examen en Macr Macro oscóp scópic ico: o: Donde se observan las características de las heces como: Olor  o Color  o Consistencia (Líquida, Sólida, Semisólida, Pastosa). o Aspecto (presencia de mucus, sangre). o Presencia de nemátodos adultos (áscaris, oxyurus), anillos de o tenias, larvas u otros.

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Exam Examen en Mic Microsc roscóp ópic ico o: En general se emplean dos métodos: Método directo: o Este méto método do perm permite ite obse observ rvar ar form formas as vege vegeta tativ tivas as de  Este prot protoz ozoa oario rioss (tro (trofo fozo zoito itoss de ameb amebas as)) y ooqu ooquis iste tess de coccideas.  Es útil útil en las las necr necrop opsi sias as,, para para anal analiz izar ar el cont conten enid ido o intestinal. 4



o

Cuando al agregado se le agrega 1 gota de lugol débil, se destruyen los trofozoitos y se observa los quistes.

Método de enriquecimiento o concentración:  Sirve Sirve para para concen concentra trarr las formas formas parasi parasitar tarias ias (huevo (huevos, s, larva rvas) en las las heces, de manera que puedan ser  diagnosticadas, aún cuando existan pequeñas cantidades de huevos.  Pueden ser: Cualitativos (métodos de flotación, métodos de sedimentación) o cuantitativos (Método de cámara de Mc Master, Método de Stoll).

Elementos que se pueden observar en un análisis coprológico - Pseudoparás rásitos: Residuos vegetales: gránulos de almidón y espículas, granos de o polen, esporas de hongos, células vegetales. Grasas y cristales. o Burbujas de aire. o Huevos y larvas de parásitos de vida libre. o - Parásitos: o Huevos de parásitos. o Ooquistes y quistes de protozoarios. o Larvas de parásitos. 4.

Resultados (Observaciones):

Huevo Trichuris trichura

Huevo Ascaris lumbricoides

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Ooquiste de Isospora

Quiste de Giardia

Huevo de Diphylobotrium sp. 5. Cues Cuestition onar ario io:: -

¿Cuá ¿Cuále less son son las las cara caract cter erís ístitica cass de las hece hecess en cant cantid idad ad,, colo colorr, olor olor y número de evacuaciones? De manera normal, las heces son de color marrón, tiene un olor  o sui sui géne géneri riss (tie (tiene nen n la conf config igur urac ació ión n del del rect recto) o),, tien tienen en una una consistencia blanda (aprox. 75% de agua). o La cantidad y el número de evacuaciones está dada por el estilo de vida de cada individuo, por lo general, es normal evacuar de 2 a 3 veces al día. La cantidad varía según la alimentación: con régimen cárnico, de 50 a 100 g/24 h; con régimen vegetariano, de 250 a 400 g; finalmente, en régimen mixto, de 100 a 200 g. Todo ello por día y en una sola deposición.

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¿A qué qué se se debe debe el col color or y olor olor de de las las hec heces es? ? El color está dado por la estercobilina y la urobilina, derivadas de o la bilirrubina, pigmento amarillo de la bilis. Los alimentos y los medicamentos pueden afectar el color de las heces. El olor de las heces está dado por el escatol (3-metil-indol), que o es un subproducto que se obtiene de la ruptura de la hemoglobina que entra en el intestino a través de la bilis. Aunque el olor de las heces también está dado por la dieta consumida y puede ser  alterada en algunos tipos de infecciones.

6. Refe Refere renc ncia ias: s: -

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Atias, A. 1996. Parasito itolog logía Médica. Publicaciones Técnicas Mediterráneo. Santiago de Chile. Manual Manual de toma de muestras muestras para estudio estudio Bacter Bacteriológi iológico, co, Parasicoló Parasicológico gico y Micológico. 2004. Departamento de Laboratorio Clínico. Hospital de Clín Clínic icas as.. Mont Montev evid ideo eo.. Obte Obteni nido do el 01 de seti setiem embr bre e de 2008 2008 en http://www.bvsops.org.uy/pdf/laboratorio.pdf  Arév Aréval alo o T., W. y otro otros. s. 2005 2005.. Manu Manual al de Prác Práctitica cass de para parasi sito tolo logí gía. a. Labo Labora rato tori rio o de Para Parasi sito tolo logí gía a Veter eterin inar aria ia.. Fac Faculta ultad d de Medi Medici cina na Veterinaria. Veterinaria. UNPRG. Lambayeque. Atla Atlass de paras parasito itolo logí gía. a. 2007. 2007. obten obtenid ido o el 01 de seti setiem embr bre e de 2008 2008 en http://www.pediatriatropical.com/imagenes%20tropicales%20full/fotos%2 0protozoarios/Protozoarios%20intestinales/Giardia%20lamblia/Giardia% 20lamblia%20quiste%20100x.JPG Beltrán F. de E, M; R., Tello y Náquira, C. 2003. Manual de proced procedimi imient entos os de labora laborator torio io para para el diagnó diagnósti stico co de los parási parásitos tos intestinales del hombre. Serie de Normas Técnicas Nº 37. Ministerio de Salud. Lima. Obtenido el 02 de setiembre de 2008 en http://bvs.minsa.gob.pe/archivos/INS/165_NT37.pdf 

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PRACTICA Nº 02 Métodos de Concentración por Sedimentación 1. Intr Introd oduc ucci ción ón:: El diagnóstico de labo labora rato tori rio o de la parasitosis intestinal requiere de prof profes esio iona nale less y pers person onal al espe especi cial aliz izad ado o para para real realiz izar ar la iden identi tific ficac ació ión n correcta de las estructuras parasitarias que se localizan a nivel intestinal aplicando aplican do criterios criter ios morfol morfológi ógicos cos,, así como como las precauc precaucion iones es para la toma toma de muestras y su procesamiento en el laboratorio. Las técnicas de diagnóstico de enteroparasitosis pueden ser parasitológicas, porque porque recupe recuperan ran e identi identific fican an directam directament ente e al parásito ó serológicas, por  detectar la reacción inmune del hospedero frente al parásito. El examen parasitológico de heces conocido como examen coproparasitario, es un conjun njunto to de téc técnicas icas diag diagn nósti ósticcas que cons consti titu tuyyen la ind indicac icació ión n metod metodoló ológic gica a para para la identi identific ficaci ación ón de la mayorí mayoría a de las entero enteropar parasi asitos tosis is causadas por protozoarios o helmintos. La indi indica caci ción ón de un exam examen en copr coprop opar aras asititar ario io,, debe debe tene tenerr en cuen cuenta ta las las características del cuadro clínico que presenta el paciente, y debe atender al parásito que se sospecha, teniendo como premisa que esta metodología es útil para protozoarios y helmintos, cuyas formas evolutivas (trofozoítos, quistes, ooquistes, huevos, larvas, adultos) se emiten con las materias fecales. Para obtener resultados satisfactorios de un examen coproparasitario, debe cumplir con los siguientes requisitos: 1) Solicitud Solicitud de Examen coproparas coproparasitario itario.. 2) Preparació Preparación n del paciente paciente.. 3) Muestra Muestra correctament correctamente e obtenida. obtenida. 4) Muestra seriada (3 muestras mínimas de materia materia fecal). La sedimentación de parásitos intestinales en heces se logra por centrifugación ligera o por gravedad del material fecal, conduciendo a la recuperación de todos los protozoarios, huevos y larvas, especialmente huevos de tremátodos. Se concentra bien estas formas y se elimina bastantes detritus orgánicos. Aunque se inactivan las formas móviles de los protozoarios, se mantiene la inte integr grid idad ad de los los orga organi nism smos os.. Es efec efectiv tivo o aún aún en hece hecess con con cant cantid idad ades es exce excesi siva vass de gras grasas as y pued pueden en obse observa rvars rse e la mayor mayoría ía de los los quis quiste tess de protozoarios, así como huevecillos y larvas de helmintos, incluyendo los huevos con opérculo y tiene una eficacia moderada para los huevos de Esquistosoma. La técnica es útil para examinar heces que contienen substancias grasas que interfieren en los métodos de flotación. 2. Obje Objeti tivo vos: s: - Se pret preten ende de que que el estu estudi dian ante te cono conozc zca a y apli apliqu que e las las diver diversa sass técnicas de sedimentación que perm iten con centrar la s estructuras parasitarias en una muestra. 8

3. Materi Materiale aless y Proc Proced edimie imiento ntos: s: a. Mate Materriale ialess: - Muestras de heces - Gasa - Láminas portaobjeto y láminas - Lugol cubreobjeto - Solución salina - Baguetas fisiológica - Copas para sedimentación - Formol 10% - Pipetas Pasteur  - Éter  - Coladeras b. Proc Proced edim imien iento tos: s: El método de concentración por sedimentación se fundamenta en la precipitación de huevos y quistes de parásitos, cuando estos se encuentran encuen tran en soluciones soluciones de menor menor densidad. densidad. •

Técnica de Baerman Modificada en Copa por Lumbreras: -

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Técnica de Sedimentación Rápida: -

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Homogenizar la muestra de heces. Acondicionar una copa para sedimentación con una coladera, rejilla o embudo sobre la que se coloca una gasa doblada. Colocar 5 -10 g. de heces sobre la coladera con la gasa. Verter por las paredes de la copa, solución salina a 37°C, hasta cubrir las heces. Dejar en reposo a temperatura ambiente por 30 a 45 minutos. Retirar la coladera con las heces, eliminar el sobrenadante y extraer el sedimento utilizando una pipeta Pastear. Observar el sedimento al microscopio con los objetivos de menor  aumento. Esta Esta técn técnic ica a es apro apropi piad ada a para para la obse observ rvac ació ión n de larva larvass de Strongyloides y trofozoitos de Balantidium, entre otros. También puede emplearse utilizando como muestra esputo, en casos sospechosos de Strongyloides. Emulsionar una muestra de heces en 10 a 20 volúmenes de agua de caño. Filtrar el preparado a través de un colador, hacia una copa cónica y completa completarr con agua el volumen de la copa. Dejar en reposo durante 10’. Eliminar el sobrenadante volver a completar el volumen con agua. Repetir el paso anterior por 3 ó 4 veces. Extraer el sedimento con una pipeta y observar al microscopio entre láminas y laminilla.

Técnica de Sedimentación por Centrifugación: 9

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Técnica de Baerman Modificada: -

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Emulsionar la muestra de heces en agua corriente. Homogenizar y filtrar la muestra a través de un colador hacia una cop copa cónic ónica. a. Agre Agrega garr agua agua corr corrie ient nte e hast hasta a comp comple leta tarr su capacidad. capacidad. Dejar en reposo por 24 horas. Eliminar el sobrenadarme. Con Con una una pipe pipeta ta Past Pasteu eurr, toma tomarr una una part parte e del del sedi sedime ment nto o y observar observar al microscopio microscopi o

Técnica de Sedimentación Espontánea en Tubo (Ref. Dr. Raúl Tello): -

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Emulsionar la muestra de heces en agua ó S.S.F. Filtrar a través de un colador. Colocar el filtrado en un tubo de centrífuga y centrifugar a 2,000 rpm durante 2 minutos. minutos. Elimi limin nar el sobre obren nada adante, nte, agre gregar agua gua y vo lve lver a cent centri rifu fuga garr. Esto Esto pued puede e repetirse hasta que el líquido sobr sobren enad adan ante te sea sea trans transpa pare rent nte. e. Obse Observa rvarr el sedi sedime ment nto o al microscopio.

Homogenizar 2.5 g de heces con 10 - 20ml de solución salina fisiológica. Verter la mezcla en un tubo cónico de centrifuga de 50 ml de capacidad filtrándola a través de gasa. Completar el volumen del tubo con más solución salina y tapar el mismo herméticamente. Agitar y dejar reposar por 45 minutos, como mínimo. Tomar omar con con una una pipe pipeta ta dos dos alíc alícuo uota tas: s: una una de la mita mitad d del del sedimento y otra del fondo del tubo, colocarlos en portaobjetos diferentes diferent es y a la alícuota alícuot a del fondo agre agrega garlrle e gota gotass de lug lugol ol,, lueg luego o cubrirla con laminilla. Observar al microscopio.

Técnica de Enriquecimiento por Sedimentación: Soluciones empleadas: Solución Solución fisiológ fisiológica ica formolada formo lada (Solución (Sol ución A) → (s.s.f ( s.s.f.. 90 mL) o

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o

Formo ormoll comerc mercia iall

(10 (10 mL) mL)

o

Solución cítrica formolada (Solución B) → (Ácido cítrico 12 g)

o

Formol comercial (2 mL)

o

Agua destilada 2 (mL)

o

Éter 

Diluir una porción de heces en la solución A. Filtrar a través de un embudo con gasa (o colador) y recoger el filtrado en tubos tubos de centrífuga. centrí fuga. Centrifugar por 5 minutos a 2,000 rpm. 10

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Eliminar el sobrenadante y agregar al sedimento la solución B; hasta los 2/3 partes de tubo y luego 1 ó 2 ml de éter. Agitar el tubo y centrifugar un minuto. Agitar el tubo con una bagueta y volver a centrifugar por un minuto. Eliminar el sobrenadante y observar el sedimento al microscopio. •

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Técnica de Ritchie o Centrifugación con Formol – Éter: Mezclar una pequeña porción de materia fecal en unos 10 mL de formol  – salina al 10% en un tubo o frasco. Filtrar la suspensión a través tra vés de un colador con gasa. Vaciar unos 6 mL del filtrado en un tubo de centrífuga. Agregar unos 3 ml de éter (el éter nunca debe usarse cerca de un mechero). mecher o). Mezclar Mezclar bien por inversión inversión del tubo y centrifugar centrifugar a 3,000 rpm durante un minuto. Al centrifugar el contenido del tubo se divide en cuatro capas, en la siguiente siguiente forma: forma : Una capa superior de éter  o Una copa intermedia de partículas de materia fecal o Una capa inferior de formol o El sedimen se dimento to donde do nde se en-Mitrarán en-Mitrarán los los parásitos parásitos o Con una bagueta o palillo separar la capa media de las paredes del tubo y vaciarla junto con el éter y el formol. Resuspender el sedimento golpeando el fondo del tubo con el dedo y transferir con una pipeta Pasteur a una lámina y cubrir con laminilla. Observar al microscopio usando lugol.

4. Result Resultado adoss (obser (observac vacion iones) es):: - Técnica de Baerman Modificada por Lumbreras

Dejar en reposo 30 a 45 min

Homogenizar  la muestra

En la coladera agregar la muestra y verter SSF a 37º hasta cubrirla

Observar 

Huevo de  Ascaris

Eliminar sobrenadante

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Técnica de Ritchie o Centrifugación con Formol – Éter:

De la soluc. filtrada anteriormente vaciamos a un tubo una pequeña cantidad

Luego agregamos 2/3 partes de formol y 1/3 de éter (en este caso xilol)

Mezclar por  inversión

Centrifugar a 3000 rpm x 1 min.

Eter Tubo, después de la centrifugación Restos Líp. disueltos

Se elimina el sobrenadante y se observa el sedimento al micr micros osco co io

Se observó huevos de  Hymenolepis

Formol

Sedimento Parásitos

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Técnica de sedimentación rápida:

Dejar reposar   por 10 min.

Emulsionar la muestra en 10 a 20 vol. de agua de caño

Observar 

Filtrar el preparado y completar el vol. con agua

Repetir los  pasos anteriores (x 2 veces más) Eliminar  sobrenadante

Huevo de  Ascaris

5. -

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Referencias: Apuntes varios. 2008. Diagnostico de Laboratorio de las Ente Entero rop paras arasit ito osis sis. Obte Obten nido ido el 01 de seti setiem emb bre de 2008 2008 en www.unav www .unav.es/bioquimica/analisisbiologico .es/bioquimica/analisisbiologicos/archivos/bactypara/para05 s/archivos/bactypara/para0506t 06t ema3web.ppt Atia Atiass, A. 1996. 996. Para Parassito itologí logía a Méd Médica ica. Publ Public icac acio ione ness Técn écnicas icas Mediterráneo. Santiago de Chile. Coproparasitoscopia: Concentración por sedimentación. 2006. Obtenido el 01 de setiembre de 2008 en http://www.uacj.mx/icb/manuales/mparasi/P8%20Copro%20Sediment.pdf  Beltrán rán F. de E, M; R., Tello y Náquira, C. 2003. Manual de proced procedimi imient entos os de labora laborator torio io para para el diagnó diagnósti stico co de los parási parásitos tos intestinales del hombre. Serie de Normas Técnicas Nº 37. Ministerio de Salud. Lima. Obtenido el 02 de setiembre de 2008 en http://bvs.minsa.gob.pe/archivos/INS/165_NT37.pdf 

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PRACTICA Nº 03 Métodos de Concentración por Flotación 1. Intr Introd oduc ucci ción ón:: Las Las para parasi sito tosi siss inte intest stin inal ales es pued pueden en sosp sospec echa hars rse e por por la pres presen enci cia a de sintomatología y datos epidemiológicos, pero la única forma de confirmar el diagnó diagnósti stico co es la demost demostrac ración ión del parási parásito to en cualqu cualquier iera a de sus formas formas evolutivas: diagnóstico parasitológico. Este se fundamenta en el conocimiento de la biología del parásito: hábitat, ciclo evolutivo, lo que permite tomar la mues muestr tra a biol biológ ógic ica a y la técn técnic ica a de labo labora rato tori rio o adec adecua uada da.. El exa examen men para parasi sito toló lógi gico co de las las hece heces: s: copr coprop opar aras asititol olog ogía ía,, tien tiene e como como obje objetitivo vo diagnosticar los parásitos intestinales. Se han descrito muchas técnicas de examen de heces, algunas de ellas son de utilidad general, mientras que otras sólo sirven en casos muy concretos, de modo que se elige la más adecuada para un determinado tipo de muestra o para la detección de un determinado parásito. La consistencia de una muestra de heces es de gran importancia, indicando el tipo de organismo que puede contener. A de examinarse toda la superficie de la muestra en busca de parásitos macroscópicos. Con frecuencia pueden verse los oxiuros en la superficie de la muestra de heces, del mismo modo que las proglótides. El examen inmediato de las heces completamente form formes es no es tan tan impo import rtan ante te,, pero pero han han de mant manten ener erse se refr refrig iger erad adas as.. La efectividad de la técnica depende de varios factores: sensibilidad, especificidad, calidad de los equipos y reactivos utilizados, adecuada ejecución y experiencia del operador. 2. Obje Objeti tivo vos: s: - Se espera que el estudiante conozca conozca y aplique las diversas técnicas de flotación para concentrar parásitos. 3. Materi Materiale aless y Proc Proced edimie imiento ntos: s: a. Mate Materi ria ales les: - Muestra de heces - Laminas portaobjeto y lamina cubreobjeto Baquetas - Pipetas Pastear Copas - Tubos - Solu Soluci ción ón,, satu satura rada da de sal sal Solu Soluci ción ón satu satura rada da de azúc azúcar  ar  Solución salina fisiológica Lugol - Sulfato de Zinc b. Proc Proced edim imie ient ntos os:: El método de concentración por flotación se fundamenta en la separación separación de las estructuras parasitarias mediante el empleo de soluc solucion iones es de densida densidad d intermedia, intermedia, que permite permite la flotación flotación de 14

huevo huevoss y/o quiste quistess y la sedi sedime ment ntac ació ión n de restos restos fecales fecales.. Este método método no es conveni conveniente ente para para la obte obtenc nció ión n de trofozo trofozoitos itos y larvas de nemátodes cuyas estructuras se alteran por la solución que emplean. •

Técnica de Willis – Molloy (Sol. Satur. Sal al 38%):

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Esta Esta técn técnic ica a requ requie iere re solu soluci ción ón satu satura rada da de sal, sal, la cual cual se obtie obtiene ne mezclando 38g de sal de cocina en 100 ml de agua caliente o calentar la mezcla a fin de homogenizarla. Desmenuzar con la ayuda de una baqueta 1 ó 2 g de heces en un tubo de ensayo o en un frasco vacío (vial) que contenga aproximadamente 4 mL de solución saturada de sal. Adicionar la misma solución hasta formar un menisco sobre el borde del tubo o frasco. Cubr Cubrir ir el meni menisc sco o del del tubo tubo o frasc frasco o con con una una lamin laminililla la evit evitan ando do la formación de burbujas. Dejar en reposo durante 15 a 20 minutos para que los huevos y quistes de parásitos floten y se adhieran por viscosidad a la laminilla. Depositar una gota de lugol en una lámina portaobjetos y sobre ella colocar la laminilla. Observar al microscopio.

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Técnica de Flotación con Solución Azucarada (Sheather's):

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Emulsionar 2 – 5 g de heces en 10 mL de agua. Homogenizar y filtrar a través de un cernidor. Transferir el filtrado a un tubo de centrifuga hasta alcanzar 113 de tubo llenando las 2/3 partes restantes con agua. Centrifugar a 1,500 rpm durante 2 a 5 minutos. Eliminar el sobrenadarte (estos lavados pueden repetirse). Agregar al sedimento (1/3 del tubo), 2/3 parte de solución saturada de azúcar. azúcar. Centrifugar durante 5 minutos a 1,500 rpm. Con una bagueta o un asa bacteriológica tornar 2 o 3 gotas de la superficie y colocarla en una lámina portaobjeto agregarle lugol, cubrirla con una Iaminilla y observar al microscopio. Para preparar la solución saturada de azúcar hay que mezclar 38g de azúcar en 100 ni de agua.

Técnica de Faust: Esta técnica utiliza sulfato de Zinc al 33% (33 g de sulfato de zinc e n 1 0 0 m L d e agu a t i bi a) de ns id ad 1 :1 80 ( ve r i f i ca r co n 15

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densímetro) si es preciso se añadirá agua o sulfato según el caso hasta obtener este valor. Emulsionar un volumen de heces en 10 volúmenes de agua. Filtrar a través de un colador con gasa y recibir el filtrado en un tubo de centrífuga. Completar con agua y centrifugar a 1,500 rpm durante dos minutos. Eliminar el sobrenadante y agregar unas cuantas gotas de agua para romper el sedimento y homogenizar. Repetir la centrifugación agregando agua hasta que el sobrenadarte este transparente. Agrega Agregarr al sedime sedimento nto sulfa sulfato to de zinc zinc hasta hasta la superf superfici icie e super superior ior y centrifugar por dos minutos a 1,500 rpm. Torrar con una baqueta o asa bacteriológica la muestra de la superficie del tubo en el cual se ha formado una película clocarla en una lámina portaobjetos, agregarle lugol, una laminilla y observar al microscopio.

4. Result Resultado adoss (obser (observac vacion iones) es):: -

Técnica de Willis – Molloy:

Dejar en reposo x 15 a 20 min.

Del filtrado se adiciona una pequeña porción + la sol. sat. de sal

Adicionar hasta forma un menisco, luego cubrirlo con una laminilla

Observar al microscopio

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Técnica de Sheather’s (flotación por solución saturada):

Agua Eliminar  sobrenadante Filtrado Centrifugar 2 a 5 min.

Observar al microscopio

Centrifugar x 2 a 5 min. y luego eliminar  sobrenadante

Repetir   procedimiento una vez más

Después de eliminar  sobrenadante, agregar la soluc. azucarada

Huevo de Taenia

5. Refe Refere renc ncia ias: s: - Apuntes varios. 2008. Diagnostico de Laboratorio de las Ente Entero rop paras arasit ito osis sis. Obte Obten nido ido el 01 de seti setiem emb bre de 2008 2008 en www.unav www .unav.es/bioquimica/analisisbiologico .es/bioquimica/analisisbiologicos/archivos/bactypara/para05 s/archivos/bactypara/para0506t 06t ema3web.ppt - Atia Atias, s, A. 1996 1996.. Para Parasi sito tolo logí gía a Médi Médica ca.. Publ Public icac acio ione ness Técn Técnic icas as Mediterráneo. Santiago de Chile. Técnicas coproparas coproparasitoló itológicas gicas:: Directo, Directo, Willis, Willis, Kato, Kato Cuantitati Cuantitativo, vo, - Técnicas Faust, Coloración Rápida. Morfologia de Cestodes. 2007. Universidad de los Andes. Obtenido el 01 de setiembre de 2008 en http://usuarios.lycos.es/paraelsa/manual04/practica-6.htm - Arévalo T., W. y otros. 2005. Manual de Prácticas de parasitología. Labo Labora rato tori rio o de Para Parasi sito tolo logí gía a Veter eterin inar aria ia.. Fac Faculta ultad d de Medi Medici cina na Veterinaria. Veterinaria. UNPRG. Lambayeque. rán F. de E, M; R., Tello y Náquira, C. 2003. Manual de - Beltrán proced procedimi imient entos os de labora laborator torio io para para el diagnó diagnósti stico co de los parási parásitos tos intestinales del hombre. Serie de Normas Técnicas Nº 37. Ministerio de Salud. Lima. Obtenido el 02 de setiembre de 2008 en http://bvs.minsa.gob.pe/archivos/INS/165_NT37.pdf  17

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Técnica de Faust:

Agua Eliminar  sobrenadante Filtrado Centrifugar 2 a 5 min.

Película superficial

Centrifugar x 2 a 5 min. y luego eliminar  sobrenadante

Repetir   procedimiento una vez más

Después de eliminar  sobrenadante, agregar el sulfato de Zinc Sulfato de cinz

Observar al microscopio

Sedimento

Huevo de  Hymenolepis

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PRACTICA Nº 04 Diagnóstico de Enterobiosis u Oxyuriosis 1. Intr Introd oduc ucci ción ón::

Enterobius vermicularis es conocido como oxiuro y causa una enfermedad intestinal conocida como oxiuriasis o más específicamente enterobiasis. enterobiasis. Los oxiuros son parásitos que se encuentran distribuidos por todo el mundo y es el helminto más común de América, infectando principalmente a niños menores de 12 años y en muchas ocasiones a hombres que tienen sexo con otros hombres o lo adquieren en la ingestión de verduras contaminadas. El ciclo vital de Enterobius vermicularis está restringido restringido exclusiva exclusivamente mente al humano. Este parásito vive en promedio un par de días. El macho mide 2-3 mm, la hembra es más grande, llegando a alcanzar los 15 mm . El organismo no soporta las las condicion iones secas de la intem temperie y muere casi inmediatamente, al ser sacado de su hábitat normal. Tanto la hembra como el macho habitan en el colon o intestino grueso donde ocurre el apareamiento. En la noche la hembra emigra hacia los pliegues anales y región perianal donde deposita miles de huevecillos fertilizados. En las siguientes 6 horas los huevecillos progresan a larvas y se vuelven infestantes. La contaminación por los huevecillos ocurre cuando éstos son acarreados a alimentos u utensilios de cocina, o bien directamente a la boca (fenómeno conocido como reinfestación) después de haberse rascado la piel o cuando se practica anilingus. anilingus. Los Los huev huevec ecilillo loss inge ingeri rido doss se incu incuba ban n en el intestino intestino delgado delgado donde donde son liberados y se desarrollan a gusanos adultos desplazándose hacia el colon. colon. Aunque Aunque puede puede haber haber altera alteracio ciones nes gastr gastroin ointes testin tinale aless por la presen presencia cia del gusano en la cavidad intestinal, el prurito anal es el síntoma más destacado. Además el rascarse frecuentemente puede provocar  escoriación en el área y dar origen a una infección bacteriana secundaria. También provoca insomnio, falta de atención y bruxismo (rechinamiento de dientes). El diagnóstico en el laboratorio de la presencia de oxiuros se efectúa por la recuperación de los huevecillos de la piel anal y perianal mediante el uso de la técn técnic ica a de la cint cinta a adhe adhesi siva va a travé travéss de la cual cual se pued pueden en obse observa rvarr al microscopio. Al Al contrario de otros nemátodos intestinales, los huevecillos de los oxiuros no se encuentran en la heces mientras que los gusanos adultos pueden aparecer en las heces o bien aparecer en la cinta adhesiva al momento del examen si el momento coincide con la deposición de huevecillos de la hembra en la zona anal y perianal. 2. Obje Objeti tivo vos: s: - Se pretende que el estudiante conozca la técnica especifica de diagnóstico de Enterobius vermicularis.

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3. Materi Materiale aless y Proc Proced edimie imiento ntos: s: a. Mate Materi ria ales les: -

Laminas portaobjetos Cinta engomada Microscopio

b. Proc Proced edim imie ient ntos os:: El diagnóstico de oxyuriasis oxyuriasis se fundamenta en el hallazgo de huevos huevos de Enterobius Enterobius en la región región perianal perianal o de nemátodes nemátodes adultos en las heces, ropa interior, ropa de cama etc. El momento más adecuado para tomar la muestra durante la noche es después de 2-3 horas que el niño se haya acostado para dormir o en el caso de que la muestra se tome en el laboratorio a primeras horas de la mañana.

Técnica de Graham o Prueba del Parche: La recolección de la muestra se efectúa mediante una lámina portaobjeto a la cual se le aplica longitudinalmente un pedazo de cinta engomada a todo lo largo de la lámina, dejando un sobrante para fijar un papel en blanco, donde se anotará el nombre de la persona, edad, sexo. La técnica se realizará de la sgte. manera: 1. Despegar la cinta del porta y darle vuelta al extremo del porta, de form forma a que que la cara cara adhe adhesiv siva a qued quede e expu expues esta ta por por amba ambass cara carass (Figuras 1 y 2). 2. Cuidadosamente separar los glúteos con una mano y con la otra presione la zona perianal con la cinta varias veces, tanto en la zona izquierda como en la derecha de los pliegues (Figuras 2 y 3). 3. Vuelver a colocar la cinta adhesiva a lo largo del portaobjetos con la cara adhesiva contra la superficie del mismo. 4. Introducir los portas en un sobre y llevarlos al laboratorio para su observación. Obse Observ rvar ar al micr micros osco copi pio o a meno menorr aume aument nto, o, para para apre apreci ciar ar los los huev huevos os cara caract cter erís ístic ticos os larva larvado doss o con con segm segmen enta taci ción ón avan avanza zada da.. Desp Despué uéss de practicada la lectura de la muestra deben depositarse las láminas usadas en solución desinfectante para su posterior empleo. 

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4. Result Resultado adoss (obser (observac vacion iones) es)::

Huevos de Enterobius en cinta adhesiva 5. Refe Refere renc ncia ias: s: -

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Clinic Clinica a Rotger Rotger.. 2007. 2007. Test de Graha Graham: m: detec deteccio cion n de huevos huevos de Enterobius vermicularis. Obtenido el 01 de setiembre de 2008 en http://www.clinicarotger.e http://www .clinicarotger.es/doc/atelab/doc07.htm s/doc/atelab/doc07.htm Arévalo T., W. y otros. 2005. Manual de Prácticas de parasitología. Labor Laborato atorio rio de Paras Parasito itolog logía ía Veterin eterinari aria. a. Facult Facultad ad de Medici Medicina na Veterinaria. UNPRG. Lambayeque. Atia Atias, s, A. 1996 1996.. Para Parasi sito tolo logí gía a Médi Médica ca.. Publ Public icac acio ione ness Técn Técnic icas as Mediterráneo. Santiago de Chile. Belt Beltrá rán n F. de E, M; R., R., Tello ello y Náqu Náquir ira, a, C. 2003 2003.. Manu Manual al de procedimientos de laboratorio para el diagnóstico de los parásitos intestinales del hombre. Serie de Normas Técnicas Nº 37. Ministerio de Salud. Lima. Obtenido el 02 de setiembre de 2008 en http://bvs.minsa.gob.pe/archivos/INS/165_NT37.pdf 

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PRACTICA Nº 05 Diagnóstico de Cryptosporidium y Cyclospora 1. Intr Introd oduc ucci ción ón:: Cryptosporidium es un parásito parásito protozoari protozoario o pertenecient perteneciente e a la familia de los coccidios. Es un nuevo agente patógeno humano, asociado con enteritis severa y quizácon colitis en pacientes inmunocomprometidos y diarrea autolimitada en el hospedero inmunocompetente. Aunque la prevalencia de la enfermedad en el humano no es conocida, los recientes estudios sugieren que es una causa común de diarrea en el mundo, particularmente en la gente joven. La forma diagnóstica en material fecal de Cryptosporidium corresponde a la forma de ooquiste, que aparece como una estructura esférica o ligeramente ovoidal que mide de 4 a 6 micras de diámetro. Cuando se observa con microscopía de contraste de fases se ve que poseen una deble pared y una estr estruc uctu tura ra inte intern rna a form formad ada a por por 4 espo esporo rozo zoititos os verm vermififor orme mess y cuerp uerpos os residuales que no son claramente visibles. Pueden observarse varios tipos de ooquistes: oosquistes no esporulados y ooquistes esporulados, en los cuales en much muchos os caso casoss es posi posibl ble e obse observ rvar ar los los espo esporo rozo zoititos os como como líne líneas as transversales claras y el cuerpo residual como una mancha oscura excéntrica cuando están teñidos con Zielh-Neelsen modificado. coccidio io intest intestina inall de recien reciente te descri descripci pción, ón, Cyclospora Cyclospora cayetanes cayetanesis is es un coccid productor de diarreas y de procesos extraintestinales en el hombre. La primera descripción de este organismo fue realizada por Ashford quién observó, en las hece hecess de tres tres paci pacien ente tess de Papú Papúaa-Nu Nuev eva a Guin Guinea ea,, la exis existe tenc ncia ia de unos unos elementos esféricos, algunos de ellos esporulados y con cuatro esporozoítos, lo que le sugirió que podría tratarse de una nueva especie del género Isospora. La asociación entre la presencia en las heces de unos organismos esféricos de unos 8-10 μm de diámetro y la aparición de unos cuadros diarreicos explosivos fue posterior, y se pensó que dichos elementos podrían ser los ooquistes de un nuevo coccidio patógeno para el hombre. La aparente forma quística de este nuevo organismo y su característica ácidoalcohol resistencia sugirieron que podría tratarse de un protozoo flagelado intestinal o de una nueva especie del género Cryptosporidium, respectivamente. Sin embargo, la observación de estructuras internas similares a los los cuer cuerpo poss tila tilaco coid ides es,, típi típico coss de las las cian cianob obac acte teri rias as,, dete determ rmin inó ó su denominación como “CLB” ( cyanobacterium-like-body ). ). El tamaño de los CLB, las las cara caract cter erís ístic ticas as de su espo esporu rula laci ción ón cuan cuando do se incu incuba ban n en dicr dicrom omat ato o potá potási sico co,, y la libe libera raci ción ón de célu célula lass ultra ultraes estru truct ctur ural alme ment nte e simil similar ares es a los los espo esporo rozo zoít ítos os de los los cocc coccid idio ioss inte intest stin inal ales es,, perm permititie iero ron n incl inclui uirr a esto estoss organismos en el género Cyclospora y la creación de una nueva especie, Cyclospora cayetanensis, en honor a la Universidad Cayetano Heredia (Lima, Perú), lugar donde se habían realizado los estudios iniciales. 2. Obje Objeti tivo vos: s: 1. Se pretende que el estudiante conozca la técnica de coloración para el diagnóstico de Cryptosporidium, Cyclospora e identifique al parásito.

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3. Materi Materiale aless y Proc Proced edimie imiento ntos: s: a. Mate Materi ria ales les: de heces - Muestras colectadas por los estudiantes. preparadas - Láminas positivas a Cryptosporidium y cyclospora. Láminas portaobjeto, baquetas.

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Metanol NaOH 1N Carbol Fucsina Alcohol de ácido Azul de metileno Microscopio

b. Proc Proced edim imie ient ntos os:: Para Para el diag diagnó nóst stic ico o de Crypt Cryptos ospo porid ridiu iumn mn y/o y/o cycl cyclos ospo pora ra se utiliza utiliz a la técnica de KINYOUN KINYOUN o de Ziehl Neelseen Neelseen modificada. modificada.

Coloración de Kinyoun: - Hacer un extendido de la muestra de heces en láminas previamente desengrasadas y secar a temperatura ambiente. - Fijar con Metanol durante 5 minutos. - Agregar NaOH 1 N durante 1,5 minutos. - Colorear con carbol fucsina durante 5 - 10 minutos - Decolorar con alcohol ácido. - Colorear con azul de metileno - Real Realiz izar ar las las obse observ rvac acio ione ness al micros microsco copio pio,, utiliz utilizan ando do el objetivo de inmersión inmersió n y el aceite de cedro. cedro. - Los ooquistes de Cryptosporidium y Cyclospora se observan de color rojo, por ser ácido alcohol resistentes 4. Result Resultado adoss (obser (observac vacion iones) es)::

Ooquiste de Cyclospora 23

Ooquiste de Cryptosporidium 5. Refe Refere renc ncia ias: s: -

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Cryp Crypto tosp spor orid idiu ium. m. 2007 2007.. Aspe Aspect ctos os gene genera rale les. s. Obte Obteni nido do el 01 de setiembre de 2008 en http://catarina.udlap.mx/u_dl_a/tales/documentos/lqf/hinojosa_s_le/capit ulo6.pdf  García, A. y otros. 2007. Cyclospora y ciclosporosis. Departamento de Microb Microbiol iologí ogía. a. Facult Facultad ad de Medici Medicina na y Hospit Hospital al Clínic Clínico o Univer Universit sitari ario. o. Valencia. Obtenido el 01 de setiembre de 2008 en http://www.seimc.org/control/revi_para/Cyclospora.htm Atia Atias, s, A. 1996 1996.. Para Parasi sito tolo logí gía a Médi Médica ca.. Publ Public icac acio ione ness Técn Técnic icas as Mediterráneo. Santiago de Chile. Beltrán rán F. de E, M; R., Tello y Náquira, C. 2003. Manual de proced procedimi imient entos os de labora laborator torio io para para el diagnó diagnósti stico co de los parási parásitos tos intestinales del hombre. Serie de Normas Técnicas Nº 37. Ministerio de Salud. Lima. Obtenido el 02 de setiembre de 2008 en http://bvs.minsa.gob.pe/archivos/INS/165_NT37.pdf 

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PRACTICA Nº 06 Reacción Inflamatoria y Diferenciación Celular  1) Intr Introd oduc ucci ción ón:: Los procesos inflamatorios se caracterizan caracterizan por el reclutamiento y activación de “células inflamatorias”, constituidas por leucocitos, macrófagos y linfocitos que se desplazan atraídas por citoquinas pro-inflamatorias y se concentran en sitios donde existe injuria tisular. Diversos agentes de naturaleza física, química o biol biológ ógic ica a pued pueden en prov provoc ocar ar alte altera raci cion ones es en algu alguna nass de las las estru estruct ctur uras as hepáticas desencadenando desencadenando señales de peligro que son captadas por el sistema inmuno inmunológ lógico ico y hemat hematoló ológic gico. o. Las citoqu citoquina inass pro-in pro-inflam flamato atoria riass son sintetizadas y secretadas secretadas por casi todos los los tipos de células. células. La cascada de citoquinas citoquinas a nivel del hígado determina determina de primera intención la expr expres esió ión n de molé molécu cula lass de adhe adhesi sión ón en las las célu célula lass endo endote telia liale less de los los sinusoides. Las moléculas de adhesión permiten que leucocitos, linfocitos y macróf macrófago agos, s, se adosen adosen al endot endoteli elio o y se active active la diapédes diapédesis, is, lo que les perm permite ite la migr migrac ació ión n trans transva vasc scul ular ar y su desp despla laza zami mien ento to haci hacia a el foco foco inflam inflamato atorio. rio. Las Las célula célulass inflam inflamato atoria riass const constituy ituyen en un verdad verdadero ero ejérci ejército to organizado, dotado de poderoso armamento, con capacidad para identificar al agente causal, capturar y destruir virus, bacterias, parásitos y células hepáticas infectadas infectadas o lesionada lesionadas. s. La comunicac comunicación ión entre estas estas células se realiza realiza medi median ante te cito citoqu quin inas as prov proven enie ient ntes es sobr sobre e todo todo de los los linf linfoc ocititos os T CD4 CD4 ayudadores que comandan el proceso. Una vez desencadenado, el proceso inflamatorio provoca daño tisular, que por lo general afecta no solo a las células blanco, si no que puede también lesionar a células adyacentes inocentes. Los procesos procesos inflamator inflamatorios ios hepáticos hepáticos traen como consecue consecuencia ncia dos fenómenos fenómenos fundamenta fundamentales les en la patogenia patogenia hepátic hepática: a: la muerte de los hepatoci hepatocitos tos y la fibrogénesis. En la práctica, las enfermedades parasitarias son muy útiles por permitir la observa observaci ción, ón, de manera manera muy gráfic gráfica, a, de todas todas las varian variantes tes del proces proceso o inflamatorio y aun de sus secuelas. Hay algunos hechos curiosos en patología parasicológica. Usualmente en la inflamación se busca la presencia de exudado, con determinado tipo de células predominantes; sin embargo, en la hepatitis o encefalitis palúdica, se sabe que no hay reacción reacción leucoc leucocita itaria ria en el tejido tejido:: solo solo se obser observa va al compo componen nente te alternativo y algunos trastornos circulatorios, como el edema. Es muy fácil demostrar en muchos casos, como en la amebiasis hepática o en la toxoplasmosis encefálica, que es el parásito, como ente extraño, el que desencadena el proceso inflamatorio; pero hay situaciones, como sucede a veces en la miocarditis chagásica y en la toxoplásmica, especialmente en las formas crónicas, en que cerca de una colonia de parásitos no se aprecia reacción inflamatorio; en cambio, ésta puede ser importante lejos del sitio en que el parásito está, lo que hace suponer que está, lo que hace suponer que hay sustancias antigénicas, producidas por el parásito, que provocan reacción a distancia. Los tipos de exudado también suelen variar: puede ser purulento, como en las colang colangiti itiss por ascari ascaris, s, por esquis esquistos tosoma oma o pro fascio fasciola la y en la mening meningiti itiss pro produci ducid da por larv larva a de Dermatobia hominis. Pue Puede haber ber exuda xudad do 25

hemo emorrág rrágic ico o, como en la colit olitis is balan alanti tid diana iana,, en la para parago goni nimo mossis pleuropulmonar y en la estrongiloidosis. 2) Obje Objeti tivo vos: s: - El propósito de la práctica es que el estudiante establezca la diferencia en el labo labora rato tori rio o entr entre e la infe infecc cció ión n inte intest stin inal al que que ocas ocasio iona na diar diarre rea a infamatoria y la no inflamatoria. Esta difere diferenci ncia a puede puede establ establece ecerse rse deter determin minand ando o la presen presencia cia de - Esta Leucocitos en materia fecal. Los Leucocitos se encuentran asociados a moco y su presencia indica una diarrea tipo inflamatoria lo cual sugiere infecc infección ión por  Shiguella, Salmonella, E. histolytica (generalmente destruidos). - Las diarre diarreas as no inflam inflamato atoria riass (sin (sin leucoc leucocito itos) s) son caract caracterí erísti sticas cas de Vibrio cholerae, rotavirus, Giardia, entre otros. - En cuanto a la diferenciación celular los polimorfonucleares predominan en shiguellosis, colitis invasiva y ulcerativa. - Los mononu mononucle cleare aress se encuent encuentran ran en mayor mayor proporci proporción ón en fiebre fiebre tifoidea. 3) Materi Materiale aless y Proced Procedimie imiento ntos: s: a) Mate Materi rial ale es: - Muestra fecal - Laminas portaobjetos y cubreobjetos - Colorante azul de metileno - Colorante Wright - Aceite de Cedro - Microscopio

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b) Proc Proced edim imie ient ntos os:: Colo Coloca carr una una pequ pequeñ eña a porc porció ión n de mate materi ria a feca fecall sobr sobre e una una lámi lámina na portaobjeto, agregarle una gata de azul de metileno, cubrirla con una laminilla y observar al microscopio en busca de leucocitos. Hacer una extensión de materia fecal sobre una lámina portaobjeto dejar  secar y colorear con wrigth. Obse Observ rvar ar al micr micro oscop scopio io y difer iferen enci cia ar entr entre e mono ononucl nucle eares ares y polimorfonucleares. Para un estudio cuantitativo contar 200 células con objetivo de 40x. La interpretación es la siguiente: Positivo + : menos de 10 leucocitos /campo. o o

Positivo ++ : de 10 a 30 leucocitos/campo. leucocitos/campo.

o

Positiva +++: + ++: más m ás de 30 leucocitos leucocitos/camp /campo o

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-

-

La diarrea inflamatoria podría estar causada por especies como Shigella, Salmonella, Entamoeba hystolitica; y las las diar diarre reas as no infl inflam amat ator oria iass podrían estar causadas por especies como Vibrio, Giardia, Rotavirus. En la diferenciación celular hay que observar si hay prevalencia de Polimo Polimorfo rfonuc nuclar lares es (shige (shigelos losis, is, coliti colitiss invasi invasiva) va) o de Monon Mononucl uclear eares es (salmonelosis).

1. Result Resultado adoss (obser (observac vacion iones) es)::

2. Refe Refere renc ncia ias: s: -

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Atia Atias, s, A. 1996 1996.. Para Parasi sito tolo logí gía a Médi Médica ca.. Publ Public icac acio ione ness Técn Técnic icas as Mediterráneo. Santiago de Chile. Garassinni, M. 2008. Inflamación. Obtenido el 1 de setiembre de 2008 en http://blog.360.yahoo.com/blogm8EReUk8cqFoz9UqYomxTFNFosf9QPC3mg--?cq=1 K. Abbas, A. y otros. 2002. Inmunología Celular y Molecular. Mc Graw Hill. Madrid. Beltrán rán F. de E, M; R., Tello y Náquira, C. 2003. Manual de proced procedimi imient entos os de labora laborator torio io para para el diagnó diagnósti stico co de los parási parásitos tos intestinales del hombre. Serie de Normas Técnicas Nº 37. Ministerio de Salud. Lima. Obtenido el 02 de setiembre de 2008 en http://bvs.minsa.gob.pe/archivos/INS/165_NT37.pdf  27

PRACTICA Nº 07 Métodos Cuantitativos para el Diagnóstico de Enteroparasitosis 1. Intr Introd oduc ucci ción ón:: El diagnóstico de la mayoría de las infecciones por parásitos intestinales se fundamenta sobre todo en el examen microcópico de la materia fecal y ha expe experi rime ment ntad ado o poco pocoss camb cambio ioss en los los últi último moss 50 años años.. Sin Sin emba embarg rgo o se pudieran citar algunas excepciones como son la técnica de Harada – Mori para cocprocultivos de larvas y el frotis grueso en celofán de Kato. La técn técnic ica a de Kato Kato,, fue fue intr introd oduc ucid ida a en 1954 1954 por por KAT KATO & MIUR MIURA A y fue fue ampliamente empleada en programas de control, que se realizaron el la década del 50 en Japón. Japón. Sin embargo embargo no se difundió difundió su conocimiento conocimiento en el mundo, mundo, hasta el año 1966, donde aparece una publicación en inglés de KOMIYA & KOBAYASHI con una evaluación de las ventajas y limitaciones del método. En 1968, aparece una publicación publicación de MARTIN MARTIN & BEAVER, BEAVER, donde se realiza una evaluación de la técnica y se le introducen 3 importantes modificaciones, que consistían en remover las fibras de la muestra fecal mediante un fino tamiz, la diseminac diseminación ión uniforme uniforme del frotis, y la prevención prevención del sobreacla sobreaclaramien ramiento to de la preparación al determinar el tiempo óptimo para la lectura. En 1972, KATZ introduce una nueva modificación, convirtiendo la técnica de gravimétrica a volumétrica y haciendo posible su empleo para trabajos de campo. Es esta forma se difunde el método por la OMS para el diagnóstico cuali-cuantitativo de las infecciones intestinales humanas por geohelmintos. Los métodos cuantitativos han sido adaptados, principalmente para determinar  la intensidad de la infección por helmintos y se basan en la cuantificación del número de huevos por gramo o mg de materia fecal, estas técnicas son útiles en estudios clínicos y epidemiológicos para determinar el grado de infección y evaluar la eficacia de los tratamientos. 2. Obje Objeti tivo vos: s: o Se preten pretende de que el estudi estudiant ante e conozc conozca a y apliqu aplique e las técnicas técnicas de rec recuento de estructur turas parasitarias ias en el diagnóstico de enteroparasitosis. 3. Materi Materiale aless y Proced Procedimie imiento nto:: o

Materiales: 

Matraz con marca a 56 ml y 60 ml



Perlas de vidrio



Pipeta de 1 ml graduada en centésimas (can bulbo ce caucho) Solución de NaOH 0.1 N (4g de NaOH en 1,000 ml de agua)



Lámina portaobjeto. 28

o

•

Papel celofán transparente.



Solución de kato: •

Solución acuosa de verde de malaquita al 3% (1 ml)

•

Glicerina (100 ml)

•

Agua destilada (100ml)



Balanza



Microscopio

Procedimientos:

Técnica de Stoll Hausheer: -

-

-

•



Este método se basa en el estudio de una cantidad conocida de heces, que se diluye en un volumen determinado. Colocar en el frasco de stoll (frasco de vidrio al que se le marca a 56 ml y 60 ml) 10 perlas de vidrio. Verter una solución de hidróxido de sodio (0.1 N) hasta la marca que indica 56 mL. Luego llenar las heces hasta la marca de 60 mL. Tapar el frasco y agitar vigorosamente durante 1 minuto. Es pref prefer erib ible le deja dejarr en repo reposo so por por 12 a 24 hora horass y mezc mezcla lar  r  ocasionalmente. En el mome moment nto o de hace hacerr el recu recuen ento to,, se mezc mezcla la muy muy bien bien y rápidamente se quita el tapón y con la pipeta se toma 0.15 mL del centro del líquido. Colocar esta cantidad sobre una lámina en dos gotas separadas, colocarles a cada una un cubreobjeto. Contar el número de huevos existentes en las dos preparaciones. El número de huevos huevos encontrados multiplicados por 100 100 da el total por gramo de heces, esto se debe a que la materia fecal esta diluida al 1:15 y el volumen estudiado es 0.15 ml. El resu resultltad ado o debe debe mult multip iplilica cars rse e por por un fact factor or de acue acuerd rdo o a la consistencia de las heces: 1: Para muestras sólidas 2: Para muestras semisólidas 3: Para muestras liquidas

Técnica de Kato – Miura: -

Tamizar la muestra de heces. Pesar 50 mg de heces sobre una lámina portaobjetos. 29

-

-

-

•

Técnica de Mac. Master Modificado: -

•

Cubrir la muestra con un cuadrado de celofán transparente (22 x 22 mm) el cual previamente fue sumergido, por lo menos 24 horas en solución de Kato. Presio Presionar nar para para que las heces heces se extien extiendan dan (en una una extens extensión ión circular de 10 - 20 mm de diámetro). Se da la vuelta al preparado y se presiona sobre una superficie plana en la que se ha colocado papel de filtro. Dejar reposar a temperatura ambiente durante 30-45 minutos en estu estufa fa a 40°C 40°C dura durant nte e 20-3 20-30 0 minu minuto tos, s, para para que que se acla aclare re la muestra. El recuento se debe hacer inmediatamente pues la hiperaclaración dificulta la lectura. El número de huevos huevos por gramos gramos se calcula calcula multiplicando el Nº de huevos contados por 20 y además multiplicarlo por un factor de acuerdo a consistencia de las heces.

Homogenizar 3g de heces en 42 ml de agua. Tamizar y colocar 15 ml del filtrado en un tubo de prueba. Deja Dejarr sedi sedime ment ntar ar por por 30 minu minuto toss o cent centrif rifug ugar ar a 1,00 1,000 0 r.p.m .p.m.. durante 1 minuto. Eliminar el sobrenadante y reemplazarlo con la solución saturada de cloruro de sodio. Homogenizar y con el gotero tomar una muestra y llenar la cámara de Mac. Master. Esperar 2 minutos. Observar y contar los huevos ubicados dentro del recuadro de lectura

Recuento En Cámara De Malassez: -

Esta cámara de recuento se utiliza entre otras para recuento de células en líquido lumbar o para recuento de nemátodes.

30

4.

Resultados (observaciones): -

Técnica de Stoll – Hausheer:

Sol. NaOH (0.1 N)

Pipeta de Stoll Para el conteo, llenar con la  pipeta de Stoll hasta la marca 0.15

Perlas de vidrio

Agregar la sol. de NaOH hasta la marca 56 y luego completar con la muestra de heces hasta la marca 60.

Colocar en una lámina dos gotas separadas, cada una con su laminilla.

Tapar el frasco y agitar x 1 min. Luego dejar en reposo por  12 a 24 h.

Contar el número de huevos existentes en las dos  preparaciones.

Realizar los cálculos

Huevos de  Hymenolepis:  Hymenolepis: 9

Huevos de Ascaris: 148

 Nº huevos/gr = Nº huevos x 100 x factor   Hymenolepis = 9 x 100 x 1 → 900 huevos/gr   Ascaris = 148 x 100 x 1 → 14 800 huevos/gr 

31

-

Técnica de Kato – Miura: Celofán 22 x 22 mm

Solución de Kato

Dejar remojar en la sol. de Kato cuadraditos de celofán x 24 h.

Pesar 50 mg de heces, luego  ponerlas sobre la lámina porta objeto y apretar con los celofanes impregnados con la sol. de Kato

Observar al microscopio, realizar conteo y realizar los cálculos Dejar reposar x 30 a 45 min

 Nº huevos/gr = Nº huevos x 20 x factor   Ascaris = 19 x 20 x 1 → 380 huevos/gr 

Huevos de Ascaris: 19

5. Refe Refere renc ncia ias: s: -

-

Atia Atias, s, A. 1996 1996.. Para Parasi sito tolo logí gía a Médi Médica ca.. Publ Public icac acio ione ness Técn Técnic icas as Mediterráneo. Santiago de Chile. Parasitología. Métodos de diágnostico.2006. Obtenido el 1 de setiembre del 2008 en http://pdf.rincondelvago.com/parasitologia_9.html Beltrán rán F. de E, M; R., Tello y Náquira, C. 2003. Manual de proced procedimi imient entos os de labora laborator torio io para para el diagnó diagnósti stico co de los parási parásitos tos intestinales del hombre. Serie de Normas Técnicas Nº 37. Ministerio de Salud. Lima. Obtenido el 02 de setiembre de 2008 en http://bvs.minsa.gob.pe/archivos/INS/165_NT37.pdf  NUNEZ-FERNANDEZ, Fidel Ángel, SANJURJO GONZALEZ, Esperanza and VILLALVILLA, Carlos M. Finlay. Comparación de varias técnicas coproparasitológicas para el diagnóstico de geohelmintiasis intestinales. Rev. Inst. Med. trop. S. Paulo [online]. 1991, vol. 33, no. 5 [cited 200809-04], pp. 403-406. Available from: . >. ISSN ISSN 0036-4 36-466 665 5. doi: doi: 10.1590/S0036-46651991000500011 32