Universidad Andrés bello Departamento de Ciencias Químicas Laboratorio de Química e Instrumental
LABORATORIO N°6 CROMATOGRAFÍA LIQUIDA DE ALTA RESOLUCION (HPLC) DETERMINACIÓN DE TEOFILINA EN UNA MUESTRA PROBLEMA
INTEGRANTES
:
RODRIGO AGUILAR CHRISTOPHER ESPINOZA
GRUPO
:
N°4
PROFESOR
:
LUIS RAUL DE LA NUEZ
FECHA
:
16/11/2015
ENTREGA
RESULTADOS
Determinación de la concentración muestra problema (MP)
de Teofilina en una
Se trabajó con una fase móvil isocrática (30:70 = Metanol, Agua), a un flujo de 1mL/min y utilizando una longitud de onda detección de 260nm. Por el método de estándar interno (10ppm de Teobromina) se determinara la concentración de MP, ya que se hace una curva de calibración previamente medida usando patrones de Teofilina de 5, 10, 15, 20 y 25 ppm. Luego del análisis en el cromatógrafo liquido de alta resolución de todos los patrones de Teofilina y la MP, se tabularon los siguientes datos.
TABLA N°1: MEDICIÓN CROMATOGRAFICA Flujo 1mL/min
5ppm
10ppm
15ppm
20ppm
25ppm
Teob
Teof
Teob
Teof
Teob
Teof
Teob
Teof
Teob
Teof
A
25837
28760
24420
40086
24442
90427
24398
118137
24325
Tr
5,092
6,842
5,275
7,392
5,083
6,958
5,133
7,042
w
1,12
1,37
1,23
0,99
1,16
1,63
1,18
1,56
Tm
1,617
1,592
1,583
1,583
Teob
Teof
137076
24594
106304
5,233
7,217
5,158
7,083
1,14
1,43
1,18
1,52
1,583
A: área de pico; Tr : Tiempo de retención; w : Ancho de banda; Tm: Tiempo muerto
TABLA N°2: VALORES PROMEDIO DE MEDICION CROMATOGRAFICA Valores promedio (Flujo 1mL/min)
Teob
Teof
A
24684,4
82897,2
Tr
5,1632
7,0902
w
1,166
1,369
Tm
1,5916
MP
1,592
Influencia del flujo de la fase móvil Se trabajo con un patrón de 10 ppm de Teofilina y una fase móvil isocrática (30:70= Metanol, Agua). Se midió a 260 nm con flujos de 0,8 mL/min y 1,2 mL/min. Se tabularon los siguientes datos:
TABLA N°3: FLUJO DE FASE MOVIL (10ppm) POR TIEMPO (mL/min)
Flujo A Tr W Tm
0,8 mL/min
1,0 mL/min
1,2 mL/min
Teob
Teof
Teob
Teof
Teob
Teof
21659
44550
24420
40086
22028
49296
6,292
8,608
5,275
7,392
4,3
5,792
1,31
1,14
1,23
0,99
1,13
1,35
1,942
1,592
1,358
A partir de la medición se obtuvieron los siguientes datos:
TABLA N°4: CONCENTRACION DE TEOFILINA (ppm), AREA DEL PICO DE TEOFILINA Y TEOBROMINA
Concentración Teofilina (ppm)
rea del pico Teofilina
rea del pico Teobromina
5
28760
25837
10
40086
24420
15
90427
24442
20
118137
24398
25
137076
24325
Muestra
106304
24594
Para determinar la concentración de la MP, se hizo una curva de calibración en donde se grafica área del pico de teofilina/área del pico del patrón interno en función de la Concentración de Teofilina.
TABLA N°5: CONCENTRACION TEOFILINA V/S ATEOF /ATEOB
Concentración de Teofilina (ppm)
ATeof /ATeob
5 10 15 20 25 Muestra
1,113 1,641 3,699 4,842 5,635 4,322
Según esta tabla se obtiene el siguiente gráfico:
GRAFICO N°1 CURVA DE CALIBRACION: [ ] TEOFILINA V/S COCIENTE ENTRE AREA TEOF Y TEOB
[ ] Teofilina (ppm) V/S ATeof /ATeob 7 6
y = 0,2449x - 0,2871 R² = 0,9681
5 b o e T 4
A / f
o 3 e T A 2 1 0 0
5
10
15
[TEOFILINA]ppm
20
25
30
Para calcular la concentración de Teofilina en la muestra problema se reemplaza Y = 4,322 (ATeof /ATeob con los datos obtenidos de la Tabla N°5 para la muestra) en la ecuación de la recta obtenida, entonces:
= = 0,2449 0,2871 4,322 = 0,2449 0,2871 = 4,3220,2871 0,2449 = 18,82 Por lo tanto la concentración de Teofilina la muestra problema es 18,82 ppm Teofilina .
Determinación promedio de platos teóricos Se procede en calcular los platos teóricos en base a la tabla N°3. Entonces:
= 16 ∗ ℎ
- Para la Teobromina con un flujo 0,8 mL/min
, = 16 ∗ , = , - Para la Teofilina con un flujo de 0,8 mL/min
8,608 = 16 ∗ ( 1,14 ) = , - Para la Teobromina con un flujo de 1,0 mL/min
5,275 = 16 ∗ ( 1,23 ) = , - Para la Teofilina con un flujo de 1,0 mL/min
= 16 ∗ , , = ,02 - Para la teobromina con un flujo de 1,2 mL/min
4,300 = 16 ∗ ( 1,13 ) = ,
- Para la Teofilina con un flujo de 1,2 mL/min
5,792 = 16 ∗ ( 1,35 ) = , Con los cálculos señalados se genera esta tabla:
TABLA N°6: PLATOS TEORICOS TEOBROMINA Y TEOFILINA EN LOS 3 FLUJOS MEDIDOS FLUJO FASE MOVIL (mL/min)
Teobromina
Teofilina
0,8
369,11
912,25
1,0
294,28
892,02
1,2
231,69
294,52
Ahora se puede calcular los promedios de los platos teóricos para cada flujo
TABLA N°7: RESUMEN CALCULOS DE PROMEDIOS PLATOS TEORICOS
FLUJO (mL/min) PROMEDIO PLATOS TEORICOS 0,8 1,0 1,2
, + , = 640,68 ,+ , = 593,15 N= ,+, N= = 263,11 N=
DETERMINACIÓN DE ALTURA DE PLATOS TEÓRICOS
Luego calcular los platos teóricos (N) se puede obtener la altura de platos teóricos aplicando la siguiente ecuación:
=
En donde L= altura de la columna y H= altura de platos teóricos.
Para este práctico la altura de columna es de 25cm. Entonces por simple despeje nos queda:
= Entonces para cada flujo seria así:
TABLA N°8: RESUMEN DE CALCULO DE ALTURA DE PLATOS TEORICOS POR CADA FLUJO FASE MOVIL
FLUJO FASE MOVIL (mL/min) 0,8
ALTURA PLATOS TEORICOS
H=
= 0,0390 cm 640,68
1,0
H=
= 0,0421 cm ,
1,2
H=
= 0,0950 cm ,
DETERMINACIÓN DE LA RESOLUCIÓN (Rs) Para obtener la resolución se ocuparon los datos de la Tabla N°3 y la siguiente ecuación:
– = – Tr: Tiempo de retención; W= ancho de pico
Entonces para flujo 0,8 mL/min
608 6,292 = 1,891 = 2 8, 1,311,14 Para flujo 1,0 mL/min
2 7,392 5,275 = 1,23 0,99 = 1,907 Y, para el flujo 1,2 mL/min
−, = 1,203 = , ,+, TABLA N°9: RESOLUCIONES CALCULADAS A 0,8; 1,0 Y 1,2 mL/min
FLUJO FASE MOVIL (mL/min)
RESOLUCI N (Rs)
0,8
1,891
1,0
1,907
1,2
1,203
DETERMINACIÓN DE LA SELECTIVIDAD (α)
Para calcular la selectividad de cada flujo se necesita aplicar la siguiente ecuación:
= Tr: Tiempo de retención; Tm: Tiempo muerto
Entonces, para el flujo de 0,8 mL/min
= 8,6081,942 6,2921,942 = 1,532 Para el flujo de 1,0 mL/min
392 1,592 = 1,575 = 7, 5,2751,592 Y, para el flujo 1,2 mL/min
792 1,358 = 1,507 = 5, 4,3001,358 TABLA N°10: RESUMEN DE CALCULO DE SELECTIVIDAD (α)
FLUJO FASE MOVIL (mL/min)
SELECTIVIDAD
0,8
1,532
1,0
1,575
1,2
1,507
(α)
DISCUSION
En el presente practico utilizamos la técnica de cromatografía liquida de alta resolución (HPLC), con el cual determinamos la concentración de una muestra problema que contenía teofilina utilizando como patrón interno teobromina (10 ppm). Para determinar la concentración de la muestra problema utilizamos una curva de calibración con el cual preparamos soluciones con diferentes concentraciones de teofilina y el patrón interno (teobromina) obteniendo a través de la gráfica Aanalito/Apatron interno vs concentración del analito. La ecuación de la recta en la cual obtuvimos el siguiente valor Y =0,2449x- 0,2871, donde “y” corresponde al valor del área del analito de la muestra problema obtenido. Y “x” corresponde al valor de la concentración del analito. Al despejar la x de la ecuación de la recta se obtuvo la concentración del analito correspondiente a 18,82 ppm. El coeficiente de regresión dio un valor lejano al ideal (R 2= 0,9681), puesto que el punto N°2 correspondiente a 1,641 - 10 ppm (y,x), se desvía hacía la parte inferior del gráfico, por lo tanto el cálculo de la concentración del analito en la muestra problema estará afectada por algún tipo de error, lo más probable que por parte del cromatógrafo no hay mucho error porque es manejado, entonces el error s e debe con mayor certeza de una falla humana de manipulación, ya que el cromatógrafo de alta resolución es un instrumento extremadamente sensible se necesita una prolijidad ya sea para maniobrar la bomba presión, la cual se encarga de introducir el soluto a presión para una óptima separación, y por la intensidad de corriente que debe haber durante el proceso de análisis ya que no debe hacer baja de voltaje porque el cromatógrafo es muy costoso y también para que su análisis sea confiable. En cuanto a la Influencia del flujo de la fase móvil podemos decir que a medida que se aumente el flujo de la fase móvil el tiempo de retención y el área de la teofilina y de la teobromina disminuyen, estando en una relación inversamente proporcional entre el flujo y el área y/o el tiempo de retención (1). En cuanto a la resolución medida a un flujo de 1mL/min que dio 1,907 comparado con la resolución a un flujo de 1,2mL/min que dio 1,203 se evidencia claramente que el aumento de flujo afecta la resolución pero no baja del valor aceptable que 1,0.(2). Cada plato teórico representa un equilibrio teórico de distribución del soluto entre las fases. El número total de platos teóricos de una columna representa el poder de separación de la columna. Una buena columna tiene un número alto de platos teóricos (3). En este practico se midieron los platos a 3 flujos los cuales dieron, para
un flujo de 0,8mL/min =640,68; para un flujo de 1,0mL/min = 593,15 y para un flujo de 1,2mL/min = 263,11. Entonces en un flujo de 0,8mL/min los platos fueron mayores contra los medidos para los otros flujos, cabe destacar que en la medición de 1,0mL/min se produjo un error anteriormente señalado, el cual pudo haber incidido en los cálculos de platos. Por último se calcularon las selectividades a 0,8mL/min; 1,0mL/min y 1,2mL/min, siendo 1,532; 1,575 y 1,507 respectivamente. Como La selectividad se refiere a la capacidad del método para distinguir las propiedades de los componentes a nivel molecular y que permite diferenciarlos, por eso que su selectividad son muy parecidas porque solo medimos una mezcla de Teobromina y Teofilina las cuales tienen igual formula molecular y solo difieren en su conformación.
CONCLUSION
Se obtuvieron resultados muy fiables, por lo que podemos decir que la concentración de la muestra problema es de 18,82ppm de Teofilina y se obtuvo al interpolar la señal que dio el cromatógrafo en la ecuación de la recta que dio la curva de calibración. Con los datos obtenidos por el análisis se pudo calcular: promedio platos teóricos para cada flujo, altura de platos para cada flujo, resolución para cada flujo y selectividad. En conclusión aprendió todo el manejo para poder operar un cromatógrafo de alta resolución ya que es una herramienta fundamental En la actualidad, ya que ha alcanzado tal nivel de fineza y especialización que cada uno de sus tipos constituyen herramientas imprescindibles en las áreas de la ciencia y la tecnología, en la industria química, farmacéutica, cosmética, en estudios ambientales, en la clínica, en alimentos, etc (4). Buen laboratorio
BIBLIOGRAFIA (1)Willard, HH., Instrumental Methods of Analysis, Wadsworth, Inc., U.S.A., 1988. (2) Karger B.L., Snyder L.R. and Horvath C., An introduction to separation science. John Wiley and Sons, Canada, 1973.
(3) Howard G.A. and Martin A.J.P., The separation of the C12C18 fatty acids by reversedphase partition chromatography, Biochem J, 1950, 46:532538.
(4) Gooding K. and Regnier F., HPLC of Biological Macromolecules, Vol 51, Chromatographic Science Series, Marcel Dekker Inc., USA, 1990
