Escuela de Bioquímica UACh BIOQ251 Luis Guzmán, Sergio Hernández
Informe 4: Cromatografía en gel Objetivos -
Separar mediante cromatografía en gel, proteínas que presentan distintas pesos moleculares.
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Comprender la importancia de esta técnica para la purificación de proteínas.
Resultados Numero de Fracción 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
Color Transparente Transparente Azul Azul Azul Transparente Amarillo Amarillo Amarillo Amarillo Amarillo Amarillo Amarillo Amarillo Amarillo Amarillo Transparente Transparente
Intensidad 1-10 10 9 8 8 9 10 7 6 5 4 3 2 1 -
Tabla 1. Fracciones eluídas de muestra a 200 μL
Numero de Fracción 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
Color
Transparente Transparente Transparente Azul Azul Azul Transparente Amarillo Amarillo Amarillo Amarillo Amarillo Amarillo Amarillo Amarillo Amarillo Amarillo Transparente
Intensidad 1-10 10 9 8 8 9 10 7 6 5 4 3 2 1 -
Tabla 2. Fracciones eluídas de muestra a 50 μL
Figura 1. 1. Representación de las intensidades obtenidas por número de fracciones de muestras a 200 μL de azul de dextrano con dicromato de potasio y a 50 μL.
Discusión
Apéndice 1-
¿Qué puede concluir acerca de los resultados obtenidos en las dos cromatografías realizadas?
En primer lugar, la separación de azul de dextrano y dicromato de potasio se logro de manera eficiente, debido a la obtención de dos colores en las fracciones, eluyendo en primera instancia el azul de dextrano y luego el dicromato de potasio, de color amarillo. La diferencia en sus pesos moleculares y debido a que el azul de dextrano no se encontraba en el rango de separación por la columna de sephadex, ya que posee un peso molecular muy, permitió la purificación de ambas proteínas.
2-
¿Qué puede concluir de las distintas fracciones que ha colectado?
Podemos concluir que estas poseían, a medida que iba aumentando la tonalidad en mismas, distintas cantidades de moléculas, por ende distintos pesos moleculares hasta alcanzar la tonalidad más oscura en ambos casos, lo que nos permite poder cuantificar mas tarde con un espectrofotómetro y calcular los respectivos pesos moleculares de estas sustancias. Sin embargo, en el presente practico inferíamos la pronta elución del azul de dextrano debido a su alto peso molecular, ya que el rango de separación de la columna de Shephadex G-50, que iba desde 1000 a 30000 produciría la pronta elución del azul de 6
dextrano (que pesa alrededor de 2 x10 D) del dicromato de potasio (que pesa alrededor de 194.2 D), el que finalmente eluye mas tarde de color amarillo.
3-
De acuerdo al resultado que Ud. obtuvo, ¿Qué podría decir del peso molecular de ambos compuestos en forma comparativa?
Podemos concluir que el peso del dicromato de potasio se encontraba en el rango de separación provisto por la columna de Sephadex G-50, y que el dextrano azul se encontraba afuera de este, debido a la pronta elución por parte de este de la columna, y la posterior elución del dicromato de potasio, que eluyó de color amarillo. 4-
Diseñe un método experimental que le permita cuantificar las muestras eluídas.
Luego de realizar la cromatografía de exclusión molecular, y haber separado cualitativamente las muestras eluídas se procede a medir las absorbancias de las distintas soluciones en un espectrofotómetro utilizándose como blanco el solvente que las contiene, para de esta manera calcular la concentración de estas, utilizando la ley de Lambert Beer, juntos con sus respectivos coeficientes de extinción molar obtenidos en la literatura.
5-
¿Qué pasaría si en esta misma columna aplica una mezcla de ovoalbúmina y albúmina (PM = 43.000 y 66.000, respectivamente)? ¿Se separarán ambas proteínas? Explique.
Si la columna se encontrara en las condiciones utilizadas en el trabajo practico, ambas proteínas eluirian rápidamente, ya que estas no se encuentran en el rango de separación de la columna de Sephadex-50G, siendo sus respectivos pesos moleculares de 43000 para la ovoalbúmina y de 66000
para la albumina, por lo que estas no serian
separadas de forma efectiva.
6-
Con respecto al práctico realizado, ¿qué pasaría si el largo de la columna es de 100 cm? Construya un gráfico comparativo del resultado esperado.
El largo de la columna utilizada experimentalmente fue de 5 cm, la que permitió una buena separación de tanto las muestra a 200 μL como en la de 50 μL. El aumento del largo de la columna a 100 cm permitirá una mayor resolución del proceso, debido a que el recorrido de las moléculas es mucho mayor, por ende, las distancias entre las distintas moléculas es mas amplia, provocando que el grado de fraccionamiento aumente, lo que podría producir un riesgo debido ala difusión de las partículas, obteniéndose resultados alterados.