Facultad de Ciencias Departamento de Química Química Biológica Dra. Cecilia Rojas
Efecto de la fuerza iónica en la solubilidad de las proteínas
Autores: Felipe Barría y Fiorella González Ayudantes : Mariana Montanares y Pablo Gutiérrez Jueves 26 de Abril, 2017
1. Introducción Una de las técnicas utilizadas para la separación y determinación de proteínas de fuentes biológicas es la precipitación por salado (salting-out), lo cual evidencia la dependencia de la solubilidad de las proteínas con la fuerza iónica de la solución. En general, a bajas concentraciones de sal las proteínas son más solubles que en agua pura (efecto de salting-in), pero a medida que aumenta la concentración de algunas sales (en general bivalentes), la solubilidad alcanza un máximo y luego comienza decaer. Esto se observa en la figura 1:
Figura 1. Efecto de la fuerza iónica de algunas sales en la solubilidad de las proteínas. [1]
Se utilizará el efecto salting-in y salting-out de 2 sales (cloruro de sodio y sulfato de amonio), para determinar la cantidad de proteínas en el suero sanguíneo. Para la cuantificación de proteínas se utilizará el método de Biuret:
La formación del complejo violeta que tiene la capacidad de absorber en el UV visible, nos permite utilizar la ley de Lambert-Beer, la cual relaciona la absorbancia (A) a cierta longitud de onda con la concentración del complejo (c), el paso óptico (l) y el
coeficiente de extinción ( ) del complejo: 2
= (1) La ley de Lambert-Beer nos permite determinar cantidades entre 0,5 y 10 [mg], de proteína y la absorbancia máxima del complejo es aproximadamente a los 540 [nm]. El suero sanguíneo usualmente contiene dos grandes grupos de proteínas: las albúminas y las globulinas, dado que las proteínas coagulantes fueron retirados. Las albúminas usualmente son muy solubles en agua, mientras que las globulinas son más insolubles, siendo estabilizadas en solución a concentraciones bajas de sal. La relación entre las proteínas albúminas/globulinas es de 1,3-1,7, o bien, una proporción de 60% albuminas y 40% de globulinas, en el caso que son las únicas presentes. [2]
Objetivo específico: Determinación cuantitativa de la cantidad de proteínas en el suero sanguíneo. Estudio del efecto solubilizante y de precipitación de sales como el NaCl y (NH 4 ) 2SO 4 . Objetivo General: Estudio de la fuerza iónica en la solubilidad de las proteínas.
2. Resultados y discusión
2.a Curva de calibración para método de Biuret.
Para la calibración del método de Biuret se utilizaron soluciones de distinta concentración de un suero patrón, la cual contiene seroalbúmina de bovino, cuya concentración es de 10 mg/mL. Para la preparación de las soluciones, se utilizó reactivo de Biuret (1,5 [g] de CuSO4.5H2O, 6 [g] de tartato de de sodio y potasio 4H 2O en 500 mL de agua, con 300 mL de NaOH y enrasado a 1L), calentado a 50°C por 5 min para completar la reacción de formación del complejo, y NaCl 0,15 M para dilución [3]. Se utilizó una solución de NaCl 0,15 [M] y Biuret como blanco, fijando la absorbancia cero. Las absorbancias se midieron por duplicado, y las cantidades utilizadas de cada solución están detalladas en la tabla 1, junto con los valores obtenidos de absorbancia: 3
Tabla 1. Cantidades usadas para la preparación de las soluciones. Vol. [Proteína] NaCl Solución A 1;540nm A 2;540nm A ̅ ;540nm Biuret [mg/6mL] [mL] [mL]
.
1
0,125
0,112
0,119
2
1,8
2
0,214
0,192
0,203
4
1,6
3
0,308
0,272
0,29
6
4
0,379
0,36
0,37
8
5
0,455
0,435
0,445
10
1
0
0
0
0
0
2
1,4
4
1,2
La curva para la calibración, hecha a partir de las absorbancias promedios se observa en la figura 1: 0,5 0,45 0,4 0,35
y = 0,0463x R² = 0,9892
a i 0,3 c n a b 0,25 r o s b 0,2 A
0,15 0,1 0,05 0 0
2
4
6
8
10
Concentración de proteina [mg/6mL]
Figura 2. Absorbancia promedio de ambas mediciones en función de la concentración de la proteína. La ecuación de la recta que define la curva está dada por y=0,0463x, donde x es la concentración de proteína en [mg/6mL] y en tanto la pendiente 0,0463 representa el producto coeficiente de extinción del complejo de cobre y el largo del paso óptico.
4
2.b Determinación de proteínas del suero sanguíneo.
Se utilizará la curva de calibración para determinar la cantidad de globulinas presentes en el suero sanguíneo humano, bajo dos suposiciones: las únicas proteínas presentes en el suero son las globulinas y las albuminas; el cloruro de amonio hace precipitar selectivamente las globulinas del suero, dejando las albuminas en solución. Las cantidades utilizadas en la para la dilución están detalladas en los siguientes esquemas. Solución 1: 0,5 [mL] suero
10 [mL] sol A
2 [mL] sol A
+9,5 [mL] NaCl
6 [mL] sol 1**
+4,0 [mL] sol Biuret
Solución 2: 0,5 [mL] suero
10 [mL] sol B*
+9,5 mL NH4 2SO4
2 [mL] filtrado
Filtración or a el
6 [mL] sol 2**
+4,0 mL sol Biuret
*La solución fue calentada durante 15 min a 37°C.**soluciones calentadas a 50°C durante 5 minutos, para completar la reacción de biuret.
A partir de las soluciones se obtuvieron los valores de absorban cia a 540 nm, de 0,327 para la solución 1 y de 0,109 para la solución 2. Los valores son interpolados por la ecuación de la recta (ver figura 1), utilizando:
0,327 =7,06 =35,3 .1 í = 0,0463 6 1 2 10 0,109 =2,35 [ ]=11,8 .2 í = 0,0463 6 2 2 10 5
Considerando que para ambas soluciones se comenzó con 10 mL y que el cloruro de amonio solo hizo precipitar a la globulina, los resultados se resumen en la tabla 2: Tabla 2. Determinación de abundancia relativa de proteínas en el suero sanguíneo.
Fracción
V [mL]
[Proteína] [mg/mL]
Masa de Proteínas [mg]
%
Solución A
10
3,53
35,3
100
Solución B
10
1,18
11,8
33,4
Precipitado
-
-
23,5
66,6
Si se asume la precipitación selectiva, se puede observar que la composición de proteínas del suero sanguíneo humano analizado es de un 33,4% de Albúminas y un 66,6 % de Globulina. A partir de estos resultados, se puede observar que este suero sanguíneo poseía una alta cantidad de globulina, dado que en general los porcentajes de ambas proteínas son invertidos (albúminas alrededor del 60% y globulinas cerca del 40%
[2]
). También podría
pensarse que el efecto salting-out del cloruro de amonio logro precipitar parte de las albúminas, no logrando una precipitación fraccionada prolija, lo cual se refleja en una menor abundancia determinada. Respecto a esto, queda demostrado el efecto salting-in del cloruro de sodio, dado qu e la solución preparada contenía una alta cantidad de proteínas, mientras que la capacidad del efecto salting-out de sulfato de amonio se observa en la menor cantidad proteína en la solución preparada con esta sal. Molecularmente esto se explica en un efecto de estabilización de los grupos cargados de la proteína en solución y una competencia por la solvatación de las sales. Para todas las sales, cuando aumenta su concentración (y por lo tanto la fuerza iónica), la solubilidad de las proteínas aumenta dado la estabilización de sus grupos polares y sus grupos cargados (residuos de lisina, de ácido aspártico, de histidina, entre otros) con los iones de las sales. Pasada cierta concentración de la sal, efecto deja aumentar la solubilidad, en algunos casos se estabiliza (como el cloruro de sodio, el cual no compite significativamente por las moléculas del solvente), y en otros casos se produce el efecto del salting-out (sales bivalentes, como el sulfato de amonio), dado que iones de alta carga y tamaño son buenos competidores por la solvatación de las moléculas del solvente, quit ándole estabilización a la proteína y precipitándola. Las distintas proteínas requieren distintas 6
concentraciones de sal para precipitar, efecto que se utilizó para precipitarlas fraccionadamente en este práctico. 2.c Estudio del efecto de la concentración de NaCl en la solubilidad de proteínas.
Se preparó una solución de 100[mL] que contaba de 10[mL] de suero sanguíneo, los cuales se llevaron a 100[mL] con agua destilada en un matraz de aforo, luego la solución fue traspasada a un vaso de precipitado de 200[mL] de capacidad y por medio de soluciones de hidróxido de sodio (NaOH) 0,1[N] y ácido acético 0,1[N] se llevó empíricamente hasta su punto isoeléctrico. Debido a que la solución de suero está a pH fisiológico el cual varía entre los valores de 7,35 y 7,45, de forma aproximada, dependiendo de donde se obtuvo la sangre para el suero se puede especular que su pH es de aproximadamente de 7,4 si la sangre era de origen arterial o de 7,35 si era de origen venosa(4). Para llevarla a su PI primero se agregó á cido acético gota a gota hasta que empíricamente se viera que se pasó el punto de mayor turbidez, una vez pasado ese punto se volvió al punto de mayor turbidez por medio de la adición del NaOH, una vez alcanzado este punto se agregó la sal de NaCl 2[M], de modo que visualmente se observó como la proteína se solubilizaba hasta el máximo posible, el proceso de agregado de la sal puede ser observado en la figura 3. (1)
(2)
Figura 1. Fotografías demostrativas del efecto de solubilidad de la sal en las proteínas donde (1) es la solución en su PI empírico antes de agregar NaCl y (2) es la solución lo más solubilizada posible con NaCl. 7
Para solubilizar las proteínas se utilizaron 30 gotas de solución NaCl , estimando cada gota con un volumen de 0,05[mL], de forma aproximada se puede decir que se utilizó 1,50[mL]. De lo observado se destaca que la presencia de sal afecta la solubilidad de una proteína a modo de que la aumenta, pero también, al menos en el caso del NaCl esta alcanza un máximo de solubilidad para lo proteína, de modo que al punto de llegar por sobre las 60 gotas adicionadas a la solución de suero en agua, las proteínas no mostraron signo de aumentar aún más su solubilidad de lo ya observado a las 30 gotas, sin embargo tampoco fue observable que la solubilidad de las proteínas disminuyera, como se muestra con otras sales en la figura 1, esto también corrobora empíricamente la información sobre el NaCl mostrada en la figura 1.
3. Conclusiones A partir de los resultados obtenidos, se comprueba ele efecto salting in de las sales a bajas concentraciones, y el efecto salting-out de sales bivalentes a concentraciones altas como el sulfato de amonio. En el caso del experimento 2.b, se observa que los iones de gran tamaño y carga (como los NH4+ y el SO4-2), se pasa por un máximo de solubilidad y luego esta disminuye. En tanto en el experimento 2.c se comprueba que para iones pequeños (Na+ y Cl) la solubilidad alcanza un máximo en el cual se estabiliza. Se determinó que en el suero utilizado, el porcentaje de albúminas era de un 33,4% y de globulinas de un 66,6%, una proporción inusual para el suero sanguíneo. Se observa que las globulinas son proteínas mucho más sensibles a los cambios en la fuerza iónica que las albúminas.
4. Bibliografía [1] B.Q. Experimental. (2010). [En línea]. Purificación de la enzima lactato deshidrogenasa de músculo esquelético de pollo. Disponible en: Consultado el 23 de Abril del 2017. 8
[2] M. Sabata. M. Serrano. R. Devis. (2014). Practico 2. “Salado” (Salting ao t) de proteinas, su aplicación en la separación de albúmina y globulinas en suero o plasma sanguineo. Departamento de ciencias fisiologicas. Pag. 8. [3] M. C. Rojas. (2016) Química Biológica, Guías de trabajos prácticos.Santiago de Chile. Departamento de Química. Unidad I: Efectos de la fuerza iónica. Precipitación por salazón y cuantificación de las proteinas del suero sanguíneo. Efecto solubilizante del NaCl sobre las proteinas del suero sanguíneo. [4] Morcillo, Jesús (1989). Temas básicos de química (2.ª edición). Alhambra Universidad. Pag. 270-272.
Anexo 0,5 0,45 y = 0,0479x R² = 0,9832
0,4
y = 0,0448x R² = 0,9934
0,35 a 0,3 i c n a v 0,25 r o s b A 0,2
0,15 0,1 0,05 0 0
2
4
6
8
10
Concentración de proteina [mg/6mL]
Figura 1 Anexo. Absorbancias medidas por duplicado para las preparaciones 1 (naranja) y 2 (azul) en función de la concentración de la proteína.
= 0,0479 y para la solcuión
Donde para la solución 1 la ecuación obtenida es d e 2 es de , cada uno con sus respectivos valores de R.
= 0,0448
9
