DEPARTAMENTO DE CIENCIAS DE LA VIDA CARRERA DE INGENIERIA EN BIOTECNOLOGIA
GENETICA
Calvopiña Flores Jonathan Alexander Resumen artículo científco: Herencia Extracromosómica
Enero 08 del 2015
SEMESTRE: oct!re 2015 " #e!rero 201$
Tr%nerenc'% !%cter'%n% de %()l'o DNA *en+('co #nc'on%l en c,ll%& -(%n%& La transerencia efciente de vectores !asados en el cromosoma en c"lulas de mamíero es diícil# de!ido principalmente a su $ran tamaño% &sando un vector invasivo de Escherichia coli $en"ticamente diseñado# el A'( sat"lite ala clonado en el cromosoma artifcial !asado en )* ue entre$ado de manera esta!le en la línea celular H+*,-, . $eneró efcientemente cromosomas artifciales humanos de novo% 'el mismo modo# un $ran re$ulador de conductividad de transmem!rana de la f!rosis /uística $enómico 0CF+R1# construcción de *2, 3!# /ue contiene una porción del $en CF+R se propa$an de orma esta!le en el vector !acteriano . se transferen a c"lulas H+*,-, donde se transcri!ió . empalmó correctamente# lo /ue indica la transerencia de un locus intacto . uncional de al menos -, 3!% Estos resultados demuestran /ue las !acterias permiten la clonación# la propa$ación . la transerencia de $randes ra$mentos intactos . uncionales de '(A $enómico . su posterior entre$a directa en las c"lulas para el an4lisis uncional% Este eno/ue a!re nuevas perspectivas para la terapia $"nica% El primer re/uisito para /ue se produ5ca la transerencia de $enes de las !acterias a las c"lulas de mamíeros es la internali5ación celular efciente de las !acterias# /ue varía dependiendo de la línea celular% El porcenta6e de c"lulas H+*,-, inectadas inicialmente se determinó mediante an4lisis de citometría de 7u6o de c"lulas 7uorescentes despu"s de la invasión con !acterias /ue expresan 8F) !a6o el control de un promotor procariota% La E% coli /ue al!er$a un pl4smido /ue diri$e la síntesis de 8F) en las !acterias# se usó en multiplicidades de inección en la proporcion 09;1 0!acterias < c"lulas de mamíeros1 de = o >= para inectar H+*,-,% 'espu"s de unas > horas de coincu!ación# las c"lulas se lavaron . se incu!aron en el m"dium completo /ue contenía >, m$ < ml de $entamicina para destruir las !acterias extracelulares%
'espu"s de ?= min de incu!ación# las c"lulas se trataron con tripsina . se anali5aron por citometría de 7u6o% En una 9; de =# el @?%= de las c"lulas eran 7uorescente# . a una 9; de >=# el B@%2 de las c"lulas eran uertemente 7uorescentes% acterias intracelulares via!les se enumeran despu"s de la lisis celular suaveD el nmero de !acterias via!les por c"lula se calculó a partir del nmero de !acterias recuperadas por pocillo% El nmero de !acterias intracelulares via!les recuperadas ue ,%>= por c"lula en una 9; de = . *%># . en una 9; de >=% La discrepancia entre el nmero de !acterias via!les recuperadas de las c"lulas . el porcenta6e de c"lulas positivas para 8F) se puede explicar por el hecho de /ue las !acterias muertas o mori!undas pueden se$uir siendo 8F) positivo% En con6unto# los resultados indican /ue# a una 9; de >=# casi todas las c"lulas ha!ían internali5ado al menos una !acteria productora de 8F)% La via!ilidad celular en ?- horas despu"s de la inección# varió desde B, hasta =, para una 9; de = . >=# respectivamente% arios la!oratorios han demostrado recientemente /ue las !acterias pueden transerir $enes uncionales a una $ama mu. amplia de c"lulas de mamíero% Las cepas atenuadas de Ghi$ella# E% coli invasivos# Galmonella . Listeria son capaces de transerir '(A de pl4smido a c"lulas de mamíero% Las !acterias utili5adas para la transerencia a las c"lulas a$ocíticas . no a$ocíticas son pató$enos intracelulares acultativos /ue han sido diseñados para lisar despu"s de la invasión celular% Hasta ahora# esta propiedad se ha explotado principalmente para desarrollar vacunas de '(A !asado en la capacidad de Ghi$ella . Galmonella para diri$ir c"lulas dendríticas% 94s recientemente# las !acterias invasivas tam!i"n han sido utili5adas como vectores de '(A para la terapia $"nica% La administración a ratones $en"ticamente inmunodefcientes de Galmonella avirulenta /ue llevan el $en de ;F($ por pl4smido murino dio lu$ar a la expresión del trans$"n dentro de los macróa$os . las c"lulas dendríticas . la corrección del deecto $en"tico% En conclusión se ha mencionado /ue tomando venta6a de la proximidad de la mucosa intestinal a las !acterias luminales# se ha entre$ado con "xito un $en terap"utico a la mucosa del colon de los ratones% La E% coli 09>@*,
invhl.1 ue capa5 de entre$ar el $en +8F!*pl4smido reali5ado en la línea celular epitelial del colon C9+BI# . de la administración oral a ratones de las !acterias redu6o si$nifcativamente la $ravedad de la colitis experimental inducida por +(G% Adem4s los vectores !asados en el cromosoma se consideran /ue son potencialmente tiles para introducir $enes exó$enos en c"lulas de mamíeros# .a /ue al replicarse de orma autónoma . al tener capacidad de clonación ilimitada# permite la inserción de $enes enteros con su endó$eno adecuado . elementos re$uladores específcos de te6ido% )or lo tanto# las t"cnicas simples . efcientes para transerir estas mol"culas mu. $randes en c"lulas de mamíero necesitan ser desarrolladas% a /ue concretamente ha. una $ran variedad de enermedades $en"ticas de las cuales este tipo de vectores uncionales via!les con pl4smidos /ue permiten la inserción de nuevos $enes al $enoma humano . replicarse con
existo# podrían intervenir en esos errores del '(A para solucionar pro!lemas de índole expresivo# es decir corri$iendo correctamente un $en mal ormado o por una deleción# se o!tendría las proteínas apropiadas para el correcto uncionamiento de los mamíeros# en su meta!olismo o morolo$ía%