guía de prácticas bioquimica III

UNIVERSIDAD NACIONAL DE SAN CRISTÓBAL DE HUAMANGA FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS DEPARTAMENTO ACADÉMICO DE CIENCIAS BIOLÓGICAS ÁREA ACADÉMICA DE CIENCIAS BÁSICAS

GUÍA DE PRÁCTICAS DE BIOQUÍMICA I ( BI – 245 )

✔ Blgo. CISNEROS DE LA CRUZ, Juan Clímaco

Alumno: …............................................................................................................ Grupo de práctica: ….............................. de …..............................

Ayacucho – Perú 2009

PRESENTACIÓN

Las prácticas de laboratorio en la enseñanza de la Bioquímica, tienen un rol importante en el proceso de aprendizaje, a través del cual se busca motivar al estudiante en la investigación con el desarrollo de experimentos, a su vez promover el desarrollo del análisis y razonamiento concatenado con la teoría. Para lograr este objetivo es recomendable que el estudiante haga una revisión y ampliación de la parte introductoria que acompaña cada experimento. Desde esta perspectiva, consideramos la necesidad de esta herramienta de trabajo, con el compromiso de que se explote, investigue y profundice los tópicos considerados en la guía y no hacer uso de ella sólo para seguir la marcha procedimental y desarrollar los cuestionarios planteados. Lo que se pretende en definitiva es que el propio estudiante sea capaz de aprender a aprender y construya sus propios conocimientos y demostrar que la enseñanza estratégica es integrada y aplicada a cada situación. Con aprecio, este esfuerzo para los estudiantes de Bioquímica de la EFP de Biología, con la recomendación de que el estudio es permanente y arduo, que luego vendrán las recompensas con creces.

ÍNDICE Tema

pág.

Presentación …....................................................................................................................................2 Normas para el uso y trabajo en el laboratorio de Bioquímica............................................................4 1. Preparación de soluciones de importancia bioquímica...................................................................5 2. Comportamiento de ácidos y bases débiles frente a bases y ácidos débiles..................................10 3. Determinación de pH y preparación de soluciones buffer de interés biológico …........................18 4. Determinación de calcio en leche y suero sanguíneo …...............................................................24 5. Separación de aminoácidos básicos y neutros por cromatografía en papel circular.....................28 6. Titulación de aminoácidos, obtención de la curva de valoración y cálculo de los pK y pI de los aminoácidos........................................................................................................................................32 7. Espectrofotometría uv-vis (fundamentos y aplicaciones bioquímicas).........................................36 8. Reacciones generales de las proteínas...........................................................................................45 9. Cuantificación de proteínas totales por espectrofotometría..........................................................53 10. Factores que afectan la actividad enzimática (pH, temperatura, [sustrato], tiempo)...................57 11. Inhibidores de proteasas ….........................................................................................................63 12. Reacciones generales de carbohidratos........................................................................................68 13. Determinación semicuantitativa de oligofrutanos en tuberosas..................................................75 14. Propiedades físicas y químicas de los lípidos..............................................................................79 15. Vitaminas hidrosolubles y liposolubles (ácido ascórbico y β-carotenos)....................................88

NORMAS PARA EL USO Y TRABAJO EN EL LABORATORIO DE BIOQUÍMICA 1. El alumno debe estar presente a la hora indicada en la práctica. 2. Al momento de ingresar al laboratorio siempre tiene que tener puesto el mandil. 3. Lea cuidadosamente la guía de prácticas y tenga en cuenta las indicaciones de los profesores con el fin de conocer la toxicidad de los reactivos, así como los posibles riesgos en el manejo de equipos y materiales de laboratorio. 4. Los reactivos orgánicos NUNCA inflamables.

deben ser calentados a la llama ya que son muy

5. El empleo defectuoso de algunos aparatos conlleva a riesgos para el operador y para el resto de personas presentes en el laboratorio. Es necesario conocer correctamente el funcionamiento de un aparato antes de su utilización. 6. Todos los accidentes personales por triviales que sean deben comunicarse al profesor encargado de la práctica. 7. Dirija la boca del tubo o matraz de reacción, lejos de sí mismo y del vecino, el contenido puede proyectarse. 8. Tener precaución con todos los reactivos ya que por más diluidos que estén siempre son tóxicos, y dañinos para la salud, ya sea por ingestión, aspiración o contacto. 9. Nunca se debe de comer o beber en el laboratorio. 10. Todo reactivo preparado debe de tener su etiqueta. 11. Nunca tomar dos reactivos diferentes con la misma pipeta, use otra o lávala antes de tomar la otra. 12. Para eliminar un reactivo o producto de ello, primeramente agregue a ella agua de caño y luego deseche. 13. Todos los materiales de vidrio utilizados en la práctica deben ser lavados y llevados a la estufa. 14. El estudiante nunca debe abandonar la práctica sin previa autorización del docente.

“Recuerda mas vale prevenir que lamentar”

PRÁCTICA Nº 01: PREPARACIÓN DE SOLUCIONES DE IMPORTANCIA BIOQUÍMICA. En toda la naturaleza existe una determinada cantidad de sustancia, ya sea diluida o pura, pero generalmente en el medio existe como, la solución o disolución a una determinada cantidad (soluto) interaccionando en el solvente. Solución: Es la mezcla de dos o más sustancias. Se las clasifica de acuerdo a: Su tamaño: soluciones coloidales, soluciones verdaderas, dispersiones macroscópicas, dispersiones finas, suspensiones, emulsiones. Su tonicidad: soluciones isotónicas, soluciones hipotónicas, soluciones hipertónicas. Su concentración: en criterios cualitativos: soluciones diluidas, soluciones concentradas, soluciones saturadas, soluciones sobresaturadas. y en criterios cuantitativos: soluciones porcentuales, soluciones peso/volumen, soluciones volumen/volumen, soluciones peso/peso. Disolución: Es la dispersión molecular o iónica de un sólido en un determinado líquido. En los cuales tenemos. V → V: Cantidad en mL en 100 ml de solución final. P → V: Cantidad en g en 100 g de solución final P → P: Cantidad en g en 100 ml de solución final. Expresiones de concentración: molaridad, molalidad, normalidad, parte por millón, partes por billón. I. OBJETIVOS: •

Identificar y comparar las propiedades de las soluciones para su posterior aplicación.

•

Adquirir destreza en los cálculos y preparación de los diversos tipos de soluciones.

•

Preparar soluciones de importancia bioquímica.

•

Diferenciar los diferentes tipos de soluciones de interés bioquímico.

II. MATERIALES Y REACTIVOS. MATERIALES

REACTIVOS

•

Balanza analítica

- Sal común

•

Pipetas graduadas

- Sulfato de cobre pentahidratado

•

Beakers

- Glucosa anhidra

•

Fiolas

- Alcohol medicinal

•

Calculadora (personal)

- azúcar de mesa

•

Tabla periódica

III. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL Ensayo nº 01. preparación de soluciones porcentuales. •

Solución azucarada al 2% (identifique tipo de solución).

•

200 mL de solución isotónica para la sangre (tipo de solución)

•

Solución hidroalcohólica 4:6 (determinar el porcentaje)

Ensayo nº 02. preparación de soluciones molares. ✔ Preparar 2 dL de una solución de CuSO4.5H2O 0.2 M. ✔ Preparar 200 μL. De una solución 1/1000 de glucosa. ✔ Se tiene 250 cm3 de solución de 0,5 N de ácido sulfúrico. Se desea saber: cuantos moles tiene y cuantos equivalentes gramo. ✔ Calcular el soluto presente en una solución de 5 p.p.b. De glucosa en 1m3 de solución. ✔ Preparar 20 dL de glucosa a 10 p.p.m. Ejercicios resueltos: •

Cuántos g de H3PO4 estarán contenidos en 200 cc. De un frasco de reactivo comercial cuyos datos son % pureza = 85 % (p/p), δ = 1.71 g/ml. Resolución :

como δ = m/v para el problema m = δ x V = 1,71 x 200 = 342 g. Entonces: 100 g de reactivo 342 g de reactivo

→ →

contiene 85 g de H2PO4 X

X = 290.7 g •

Hallar la molaridad y osmolaridad de una solución de NaCl al 0,9 %. Resolución:

M = nº de moles/ nº de litros; pero nº de moles = peso/peso molecular = 0,9/58,5 = 0,015 M = 0,015/0,1 = 0,154 molares. Calculamos Osmolaridad: Calculamos el nº de iones: Osm del NaCl

Cl- + Na+ = 2 iones

Osm = M x 2 = 0,154 x 2 = 0,308 Por lo cual como el plasma sanguíneo es 0,308 Osm, la disolución 0,154M de NaCl es isotónica con respecto a los glóbulos rojos. •

Preparar 250 ml de ácido clorhídrico 0,01 N a partir de una solución de 2 N. Resolución: De la ecuación V1C1 = V2C2 ; 2 x X = 250 x 0,01 = 1,25 ml.

•

Una solución de ácido clorhídrico tiene una densidad de 1,2 g/ml y contiene 35% en peso de ácido clorhídrico que hay en 250 ml de una solución. Hallar el peso del ácido en la solución.

Resolución: De la ecuación de densidad tenemos que m = δ x V. Reemplazamos a la ecuación de soluciones; % peso = peso soluto / peso solución (δxV)x 100. ordenando la ecuación.

De la cual tenemos: m = 1,2 g/ml x 250 ml x 0,35 = 105 g. Ejercicios propuestos: •

Una solución de ácido sulfúrico tiene una densidad de 1,84 g/ml y contiene 98 % en peso de ácido. ¿qué volumen de la solución ocuparán 360 g de ácido químicamente puro?

•

¿cuál es la normalidad de una solución que contiene 168 g de KOH, disueltos en cantidad de agua sufuciente, hasta realizar 500 ml de solución ?

•

¿Cuántos cm3 de solución de sulfato de sodio N/4 se podrán preparar con 7,1 g de sulfato de sodio al 50 % de pureza? ¿Qué volumen de solución de nitrato de amonio al 4,5 % P/P d: 1,20 g/ml se podrán preparar con 160 g de nitrato de amonio con 10 % de impurezas Calcular M, N, g/l, % P/V (g %) Osm, mM, mN y mOsm de una solución de Ca(H2PO4)2 que tiene 30 g de esta sal por cada 5 L de solución .PM :234. Se quiere preparar 280 ml de una solución de ácido perclórico al 5% P/P d: 1,2 g/ml y se dispone de una solución del ácido al 70 % P/P d: 1,70 g/ml. ¿Cuántos ml de esta última se necesitarán?. El ácido sulfúrico 96 % P/P tiene una densidad de 1,84 g/cm3 cuántos ml de este ácido es necesario para preparar 700 cm3 de una solución que contenga un meq del ácido por mililitro? Una solución de 7 g de ácido clorhídrico en 500 gramos de agua tiene una densidad de 1,06 g/cm3.Expresar la concentración en gramos de ácido clorhídrico por litro de solución. Se tiene 150 ml de solución de ácido nítrico al 10 % P/P d: 1,20 g/ml y se los diluye a 6 litros con agua calcular N,M y %P/V de la solución que se obtiene.

• • •

•

• •

IV. RESULTADOS

V. DISCUSION DE RESULTADOS:

VI.

VII.

CONCLUSIONES

CUESTIONARIO

Describa y explique mediante gráficos los fenómenos: Difusión, Diálisis, Equilibrio Donnan, Ósmosis, presión osmótica.

VIII.

BIBLIOGRAFÍA

PRÁCTICA Nº 02 COMPORTAMIENTO DE ÁCIDOS Y BASES DÉBILES FRENTE A BASES Y ÁCIDOS DÉBILES. Entender la química ácido-base es fundamental para comprender las propiedades de las moléculas biológicas. Una gran cantidad de los metabolitos de bajo peso molecular y de los componentes macromoleculares de las células vivientes, son ácidos y bases, por lo que son capaces de ionizarse. Un electrolito es una especie que en disolución acuosa conduce la corriente eléctrica. La disociación es el proceso por el cual un compuesto iónico se separa en sus iones en disolución, por ejemplo NaCl. La ionización es el proceso por el cual un compuesto molecular se separa formando iones en disolución, por ejemplo HCl. Los ácidos y bases De acuerdo con la teoría clásica de la ionización electrolítica desarrollada por Arrenhius, los electrolitos disueltos en agua, se disocian directamente en partículas cargadas (positivas y negativas) llamadas iones. Para Química Analítica, son de gran interés aquellos electrolitos cuyos iones provocan que la disolución sea ácida ó básica. De acuerdo con la misma teoría, los iones que dan origen al comportamiento ácido son los protones y los iones hidróxido provocan el comportamiento alcalino. Por lo tanto, ácidos son los electrolitos que en disolución acuosa liberan iones hidrógeno, y bases son los que liberan iones hidróxido. El equilibrio ácido - base se puede representar por medio de las ecuaciones siguientes: Ácido → anión + H+ Base → catión + OHCuando un ácido se disuelve en agua y se ioniza completamente se lo denomina ácido fuerte: HCl + H2O → H3O+ + ClPor el contrario, cuando un ácido se disuelve en agua y se ioniza parcialmente se lo denomina ácido débil: CH3COOH + H2O ↔ H3O+ + CH3COOH Análogamente, cuando una base se disuelve en agua y se disocia completamente se la denomina base fuerte: NaOH → Na + + OH mientras que si se ioniza parcialmente se la denomina base débil: NH3 + H2O ↔ NH4 + OH Es importante resaltar la diferencia entre los conceptos concentrado–diluido y los conceptos fuerte– débil, los primeros se refieren a la cantidad de soluto disuelto en la disolución, en general, expresado en número de moles de ácido o base presentes en un litro de disolución; los segundos se refieren al poder dador o aceptor de protones del ácido o la base con respecto al disolvente. Un ácido fuerte como el HCl, puede estar concentrado (por ejemplo, 0,1 M) o diluido (1 x 10 -3 M); en cualquier caso el ácido estará completamente ionizado en disolución acuosa. Un ácido débil puede estar concentrado, por ejemplo: CH3COOH 0,1 M y se encuentra que sólo cerca del 1,3% de las moléculas de CH3COOH están ionizadas, o puede estar diluido: 1 x 10-3 M en que el 12,4 % de las moléculas están ionizadas, o sea, en ambos casos, concentrado o diluido, el ácido débil esta parcialmente ionizado. Como toda reacción de equilibrio químico, la ionización de los ácidos y bases débiles está gobernada por una constante termodinámica, que en rigor debe expresarse como relación de actividades de las especies, pero para disoluciones diluidas se puede usar concentraciones como aproximación:

La constante de ionización de un ácido ó una base se emplea como una medida cuantitativa de la fuerza del ácido ó la base en la solución acuosa. Dado que la mayoría de las concentraciones de especies en soluciones acuosas son potencias negativas de 10, se define el operador matemático “p = - log”. Para una especie de concentración C, pC = - log C. En el caso de la especie H+, pH = - log [H+] El operador “p” también puede aplicarse a constantes de equilibrio. Para un ácido de Ka = 1 x 10-5, pKa = 5. Ecuaciones para determinar el pH de ácidos y bases fuertes. Ecuaciones para determinar el pH de ácidos y bases débiles. En las soluciones de bases débiles, se calcula el pOH usando la Molaridad y la constante de disociación de la base o pKb, y después se convierte en pH. Para un par ácido–base conjugado pKa y pKb se relacionan a través del producto iónico del agua:

I. OBJETIVOS: •

Interpretar los conceptos de ácido base y pH para que explique el comportamiento de los principales sistemas amortiguadores en el organismo.

•

Determinar la concentración del ácido clorhídrico y del ácido acético

•

Construir las curvas de titulación potenciométrica del ácido clorhídrico y del ácido acético.

•

Determinar el pH y pK del ácido acético y ácido clorhídrico.

•

Observar y diferenciar el comportamiento de un ácido fuerte y un ácido débil frente a una base fuerte.

•

Determinar el pH de NaOH y HCl en soluciones diluidas y de las diferentes muestra biológicas presentes.

II. MATERIALES Y REACTIVOS Materiales

Reactivos

•

Base y varilla soporte

- Agua destilada

•

Nuez doble y pinzas de bureta

- Hidróxido de sodio

•

Matraz erlenmeyer de 100 ml

- Ácido clorhídrico problema

•

Matraz aforado de 250 ml

- Fenolftaleína alcohólica al 0,1 %.

•

Tapón de plástico

- Hidróxido de sodio 0,1 N

•

Probeta de 100 ml

- Ácido clorhídrico 0,1 N

•

Balanza

- Indicadores

•

Cucharilla o espátula

•

Vaso de precipitados de 50 y 100 ml.

•

Gradilla y tubos de ensayo

•

Pipetas de 5 y 10 ml

•

Cinta de pH

•

Potenciómetro

•

Fiolas de 50 y 100 ml

Muestras Biológicas: Orina, zumo de frutas, lejía, café, leche, clara de huevo, saliva, sangre, etc. III.PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL En la primera parte de la práctica se determinará la acidez total de dos disoluciones. La primera es una disolución de ácido fuerte (HCl) en agua y la segunda es un ácido débil (ácido acético) la concentración del ácido se determinará por medio de una valoración potenciométrica con una base fuerte (NaOH) de normalidad conocida basándose para ello en los fundamentos explicados anteriormente. 1. Valoración de una disolución de ácido fuere (HCl) Preparar una disolución HCl 0,1 M partir de HCl 2M .Para ello usar una fiola aforada, limpia y seca,. Una vez preparada la disolución HCl, aproximadamente 0,1M, medir exactamente 10 ml de

esta disolución en un matraz usando para ello pipeta de 10 ml, agregar dos gotas de indicador fenolftaleína. Por otro lado enrasar una bureta de 10 ml. Con NaOH 0,1M colocar el matraz bajo la bureta (coloca un papel blanco debajo del matraz, para ver mejor el viraje del color ) y dejar caer NaOH , agitando el con una mano y manejando la llave con la otra, con la ayuda de un pHmetro tomar las lecturas de pH en cada punto seguir con el procedimiento hasta notar el primer cambio de color en la disolución problema, añadir más lentamente la disolución de hidróxido sódico. Tras añadir la primera gota que produzca un cambio de color permanente, cerrar la bureta y anotar la lectura final de la misma, medir el pH con el pHmetro y calcular la concentración exacta del HCl obtener el pH teórico (pH=7), con la concentración exacta obtener el pH teórico, medir la disolución de HCl en el pHmetro y comparar con el teórico, explicar sus resultados. Construir la curva de titulación del ácido clorhídrico vs Hidróxido de sodio, determinar el pH práctico y el pK. 2. Titulación: ácido débil y base fuerte. Preparar una solución de ácido acético 0,1M, añadir 2 gotas de fenolftaleína y proceder a titular con NaOH 0,1 N, como se indicó en el caso anterior hasta el viraje de color, anotar el gasto de NaOH y medir el pH en el pHmetro, calcular la concentración exacta de ácido acético y determinar el pH teórico en la solución preparada, medir el pH de la solución y comparar con el pH teórico. Construir la curva de titulación del ácido acético vs Hidróxido de sodio, determinar el pH práctico y e pK. 3. Determinación de pH, método cintas de pH, colorimétrico y pH-metro. •

Colocar una alícuota de cada muestra presente en los tubos de ensayo y una alícuota de HCl 0,1N y de NaOH 0,1N que servirán de patrón, determinar el pH con cintas de pH.

•

Colocar una alícuota de cada muestra en los tubos de ensayo y una alícuota de HCl 0,1 N y de NaOH 0,1 N que servirán de patrón, inmediatamente después agregar a cada tubo 2 gotas de los indicadores azul de metilo, verde de bromocresol y fenolftaleína, preparando una batería de tubos para cada indicador, Anotar los diversos cambios de color y comparar con la tabla de indicadores para su interpretación y discusión.

•

Colocar una alícuota de cada muestra en los tubos de ensayo y una alícuota de HCl 0,1 N y de NaOH 0,1N y medir el pH con el pHmetro.

•

Los resultados obtenidos incorporar a la escala de pH presente al del fundamento teórico de la práctica.

IV. RESULTADOS Completar la tabla con sus resultados: 1 .Titulaión del HCl vs NaOH 0,1N NaOH ml

pH

NaOH ml

pH

Titulación del ácido acético vs NaOH NaOH ml

pH

NaOH ml

pH

V. DISCUSION DE RESULTADOS

VI. CONCLUSIONES

VII.

CUESTIONARIO

•

La constante de disociación del ácido hipocloroso es 3.2x10-8. Calcule el pH de una disolución buffer preparada a partir de 10mL de HClO ( 0,1 mol/L) y 20 mL de NaClO (0,1 mol/L) KHClO = 4,0x 10-8.

•

El indicador rojo de metilo toma color rojo a pH menor de 4,2, amarillo a pH mayor de 6,3 y naranja entre 4,2 y 6,3 .Que color tomara el indicador de una disolución de bromuro de amonio 0,10 mol/L? KNH3= 1,8x10-5

•

Si la Kb = 1,81x10-5 para la reacción NH3(g) + H2O (l) = NH4+(ac) + OH-(ac)

que fracción del NH3 esta presente como NH4+ en una disolución de 6,0 mol/L en NH3 ¿Cuál es el pH? •

El ácido metanoico es también llamado ácido fórmico por ser segregado por las hormigas. Para una disolucion al 5% en masa y densidad 1,012g/mL. K HCO2H = 1,8 x10-4.

a) Calcule el pH de la disolución. b) Diga que color tomara la disolución al añadir indicador anaranjado de metilo c) Explique como se altera el equilibrio si a esa disolución se le añade hidróxido de sodio. • Calcule la concentración de una disolución acuosa de amoniaco si se desea que tenga un pH = 12 y evalúe su grado de ionización a esta concentración. Kb = 1,8x10-5. • Se ha preparado una disolución formada por 100 ml de ácido nítrico 0,5 M y 300 ml. de hidróxido de sodio 0,5 M. Calcular el pH de la disolución. • Una disolución acuosa de ácido yodhídrico 0,1 M posee una concentración de protones de 0,0335 mol/L calcular: a. La constantes de ionización del ácido (Ka) b. La concentración de ácido yodhídirco necesaria para que el pH de la disolución sea 2. • Se mezclan 45 ml de HCl 0,03 M con 30 ml de NaOH 0,05 M. Calcular: a. ¿Cuál será el pH de la mezcla? b. ¿Qué volumen adicional de una de las dos disoluciones iniciales tendríamos que añadir a la mezcla para que el pH fuera 7? • Se dispone de 1 L de una disolución de ácido monoprótico débil 0,20 M. El grado de disociación es del 22%. Calcular: a. Ka. b. El pH de la disolución. c. El grado de disociación del ácido tras añadirle 0,8 gramos de ácido nítrico puro. • Mencione qué enfermedades se producen por desequilibros de pH en el organismo.

VIII.

BIBLIOGRAFÍA

PRÁCTICA Nº 03 PREPARACIÓN DE SOLUCIONES BUFFER DE INTERÉS BIOLÓGICO Casi todos los procesos biológicos son de pendientes del pH; un pequeño cambio en el pH produce un gran cambio en la velocidad del proceso. las enzimas que catalizan las reacciones celulares y muchas de las moléculas sobre las que actúan contienen grupos ionizables con valores de pKa característicos. Los grupos amino protonados y carboxilo de los aminoácidos y el grupo fosfato de los nucleótidos, funcionan como ácidos débiles; su estado iónico depende del pH del medio que los rodea. Las soluciones o sistemas reguladores, amortiguadores, tampón o tope están formados por aquellos compuestos o mezclas de compuestos, cuya presencia en una disolución determina el que ésta se resista a variaciones de pH, al añadir alícuotas de un ácido o de una base fuerte . A esta resistencia a los cambios de pH se le denomina capacidad, efectividad o acción reguladora, amortiguadora o de tamponación, β. El pH de una solución buffer o reguladora y la variación del pH por la adición de un ácido o de una base fuerte puede calcularse mediante la ecuación reguladora. Esta expresión se deduce considerando el efecto de una sal sobre la ionización de un ácido débil cuando la sal y el ácido poseen un ión común. Cuando se añade la sal al ácido, la constante de disociación del ácido débil se altera momentáneamente, pues el ión suministrado por la sal, aumenta la concentración de iones de el numerador. Para mantener la constante Ka , la concentración de iones hidrógeno [H3O+] del numerador disminuye instantáneamente, con el correspondiente incremento de la sal. Por tanto, la constante Ka permanece inalterada y el equilibrio se desplazará en la dirección de las sustancias reaccionantes. Y el pH de la disolución final se obtiene a partir de la ecuación de equilibrio. Ka = ([H3O+][Ácido débil])/[Sal] [H3O+] = Ka [Ácido débil]/[Sal] La ecuación en forma logarítmica y cambiando los signos, será : – log [H3O+] = - log Ka – log [ácido débil] + log [Sal] y a partir de ella se deduce una expresión, conocida como la ecuación reguladora o ecuación de Henderson-Hasselbalch, para un ácido débil y su sal Y la ecuación reguladora para una solución buffer de una base débil y su sal , será:

El rango de tamponamiento de una solución buffer oscila entre pH = pKa ±1. entre ella podemos calcular la efectividad de la capacidad amortiguadora mediante la ecuación: β = ΔB/ΔpH Donde: ΔB = nº de equiv-g/L de ácido o base fuerte añadidos. ΔpH = (pHfinal – pHinicial), después de cada adición Siempre se tomará con signo positivo. Ecuación para determinar el pH de una buffer ácido luego de adicionar una alícuota de una base fuerte.

Ecuación para determinar el pH de un buffer ácido luego de adicionar una alícuota de un ácido fuerte. Ecuación para determinar el pH de un buffer básico luego de adicionar una alícuota de un ácido fuerte.

Ecuación para determinar el pH de un buffer básico luego de adicionar una alícuota de una base fuerte.

I. OBJETIVOS: •

Preparar soluciones buffer de diferentes pH.

•

Comprobar el efecto regulador de las soluciones buffer.

•

Hallar la efectividad o capacidad amortiguadora.

II. MATERIALES Y REACTIVOS Materiales:

Reactivos:

•

Matraces

- Hidróxido de Sodio 0,1 N

•

Fiolas

- Ácido clorhídrico 0,1 N

•

Pipetas de 1, 2, 5 y 10 ml.

- Ácido acético 1M (COO3-COOH)

•

Pisetas

- Acetato de sodio 1M (COO3COONa)

•

pHmetro.

- Fosfato monosódico 1M (NaH2PO4)

•

Beakers

- Fosfato Disódico 1M (Na2HPO4)

III. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL A partir de las soluciones stock preparar las siguientes soluciones buffer: •

Preparar 250 ml de buffer fosfato 0,1 M a pH 6.5, 7.4 y 7,8 (cada mesa trabajará sólo con un pH), hallar la proporción entre el ácido y la sal empleando la ecuación de HendersonHasselbalch, ajustar el pH con NaOH 0,1N o HCl 0,1N según fuera el caso y en algunos casos completar con agua libre de carbonatos hasta el volumen indicado.

•

Preparar 250 ml de buffer acetato 0,2M a pH 4, 4.6 y 5.1. proceder de la misma manera que se indica en el paso anterior.

Comprobación del carácter regulador. Disponerse de tres matraces y agregar a la primera una solución amortiguadora preparada por su mesa de trabajo; al segundo ácido clorhídrico y al tercero agregar agua destilada (la misma cantidad a todos ) y proceder a titular con NaOH 0,1N medir el pH después de agregar cada 0,5 ml. Repetir

el mismo procedimiento tres veces y con el promedio de cada uno construir la curva de valoración práctico y teórico (emplear la ecuación para determinar el pH) IV. RESULTADOS.

V. DISCUSIÓN DE RESULTADOS

VI. CONCLUSIONES

VII.

CUESTIONARIO

•

Como prepararía 3 L de solución buffer acetato a concentración 0.05 mol/L a partir de ácido acético (95%, D = 1.13 g/cc) y sal de acetato de sodio (pKa 4,76).

•

Se preparó un buffer fosfato de la siguiente manera: se pesaron 36 g de Na2HPO4.2H2O de 95% de pureza con 52 g NaH2PO4.5H2O 98% puro y se añadió agua c.s.p. 850 mL; calcular el pH del buffer si el pKa es 7,2.

•

Cual es el pH de los siguientes sistemas buffer y cual es su concentración, sabiendo que se tiene un stock del ácido acético 0.1 mol/L y de la sal acetato de sodio 0.2 mol/L. pKa 4,76. a) Se mezclan 20 mL de ácido con 10 mL de la sal. b) Se mezclan 20 mL de ácido con 10 mL de la sal y se añade 70 mL de agua-d. c) Se mezclan 10 mL de la sal con 10 mL de ácido. d) Se mezclan 10 mL de ácido con 10 mL de sal y se agrega 80 mL de agua-d.

•

Si al buffer del primer problema , se le añade 5 mL de la sal conjugada 10 g% ¿cuál sería el nuevo pH?

•

A cierto buffer de pH 5.8; 0.12 mol/L se le diluyó 1/10; ¿cuál es el nuevo pH y cuál su nueva concentración? pKa 6,0.

Calcule la variación de pH que se producirá por el agregado de 0,010 mol de NaOH a un litro de solución reguladora 0,100 M de ácido acético y 0,100 M de acetato de sodio. Ka = 1,82 x 10 – 5. • ¿Cuántos moles de NH4Cl hay que agregar a un litro de solución 0,150 M de NH3 para obtener una buffer de pH 9,20? ¿Cuál es la variación de pH si se agregan 0,010 moles de HCl? Datos: pKb = 4,74 pKw = 14,00. • Mencione los buffers de importancia biológica y grafique su desprotonación. •

VIII.

BIBLIOGRAFÍA

PRÁCTICA Nº O4 DETERMINACIÓN DE CALCIO EN LECHE Y SUERO SANGUÍNEO Por su naturaleza los minerales siempre tienen carga eléctrica y se unen a otros elementos, a veces esta unión es tan firme que hace imposible la absorción intestinal o la absorción radicular. A pesar de que se encuentran en pequeñas cantidades (mg, μg, ) son esenciales para muchos fenómenos vitales (como en las enzimas), Nuestro organismo requiere principalmente: Ca, K, Na, P, S, Cl, Mg; y otros en mínimas cantidades (ρg, ppm. ppb) las cuales son denominadas oligoelementos, tales como: Cu, Co, Zn, Fe, Mn. Mo, I. el calcio es uno de los minerales que se encuentra en mayor cantidad en el organismo, una persona adulta tiene en el organismo aproximadamente 1.2 Kg de calcio, localizado en los huesos, dientes, y una pequeña fracción en los fluidos del cuerpo y los músculos, participando de diversas maneras. El calcio se absorbe en el intestino, principalmente en el yeyuno, es hidrosoluble. Entre las principales fuentes podemos mencionar a los derivados lácteos, frutos secos, cítricos, vegetales verdes, etc. según fuentes de estudio reportan que el contenido de leche humana es de 30 a 45 mg% y en la leche de vaca de 120 a 180 mg%. I. OBJETIVOS: •

Determinar los niveles de calcio en diversas muestras por permanganometría

•

Correlacionar los valores obtenidos con los de referencia.

II. MATERIALES Y REACTIVOS Materiales

Reactivos

•

Centrífuga

- Hidróxido de amonio al 2 %

•

Baño María

- Ácido sulfúrico 1 N

•

Microbureta

- Permanganato de potasio 0,01N Y 0,1N (v)

•

Bureta

- Ácido acético glacial

•

Vasos

- Oxalato de amonio al 4 %

•

Embudo

- ácido oxálico 0,1 N (v)

•

Papel filtro

•

Aguja hipodérmica nº 21 x 11/2”

III.PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL Método Clark-Collip Modificado Principio: El calcio presente en el suero se precipita en forma de oxalato, que en presencia del ácido sulfúrico librera el ácido oxálico, el que se cuantifica con una solución valorada de permanganato de potasio. 1. De la muestra de sangre separar el suero (muestra A) por centrifugación a 3000 r.p.m. Por 5 min.

2. Medir 10 ml de leche más 0,5 ml de ácido acético. Filtrar. El filtrado constituye la muestra B. 3. Colocar 2 ml de muestra en un tubo de centrífuga, agregar 2 ml de agua destilada y 2 ml de oxalato de amonio al 4 % gota a gota. Mezclar y dejar en reposo por 30 minutos. 4. Agitar y centrifugar por 5` a 3000 r.p.m. Eliminar el sobrenadante. Añadir 3 ml de hidróxido de amonio al 2 %. centrifugar y eliminar el sobrenadante. 5. Disolver el precipitado con 2 ml de ácido sulfúrico 1N. Calentar en baño de agua hirviendo por 1 minuto. 6. Titular con KMnO4 0,1 N y 0,01 N hasta un color rosado estable. 7. Titular un blanco: 2 ml de agua destilada más 2 ml de ácido sulfúrico. Mg% de Ca = 0,2 x Gasto de KMnO4 (ml) x 50 Donde: gasto de KMnO4 Gasto de muestra – Gasto blanco IV. RESULTADOS

V. DISCUSIÓN DE RESULTADOS

VI. CONCLUSIONES

VII.

CUESTIONARIO

•

Explicar el fundamento de los reactivos Oxalato de amonio, ácido sulfúrico, ácido acético glacial, hidróxido de amonio.

•

Mencione el mecanismo de acción del calcio en la coagulación de la sangre.

•

Mencione y explique del por qué es necesario la vitamina D en la absorción de calcio.

•

Qué otros métodos existen para la cuantificación directa de calcio

VIII.

BIBLIOGRAFÍA

PRÁCTICA Nº 05 SEPARACIÓN DE AMINOÁCIDOS BÁSICOS Y NEUTROS POR CROMATOGRAFÍA EN PAPEL CIRCULAR La cromatografía en papel, es una variante de la cromatografía de partición en columna de celulosa en el que el soporte de celulosa adopta la forma de una hoja de papel. La celulosa contiene una gran cantidad de agua enlazada, incluso cuando ha sufrido procesos de deshidratación. El reparto tiene lugar entre el agua y el solvente del revelado. El movimiento diferencial de los solutos es consecuencia de la distribución selectiva entre la fase estacionaria, constituida por la celulosa o las sustancias adheridas a ella, y el solvente (fase móvil), que puede ser totalmente orgánico o una solución orgánica saturada de agua. Esta práctica se basa en la capacidad de adsorción y migración diferencial que tienen los aminoácidos al aplicárselas determinados solventes. Los valores de Rf Rm hRf, tanto en cromatografía unidimencional como la radial, el comportamiento migratorio de una sustancia se describe en función de la relación de frente (R f). Es decir, el cociente de la distancia recorrida por la mancha de la sustancia y la distancia recorrida, al mismo tiempo, por el disolvente. Si se considera la distancia recorrida, por una sustancia patrón x, los valores se denominan Rm. La distancia de migración del soluto se puede medir desde el punto de origen hasta el centro geométrico de la mancha o el punto de máximo. Ascenso de la mancha o a los límites de la mancha principal o a los de su cola. Lo que importa es la constancia en la forma de medir las distancias. Los resultados de una cromatografía bidimensional se expresan haciendo una lista de los valores de Rf de la mancha de cada disolvente y dirección, acompañados de un dibujo o fotografía del cromatograma final. Para el estudio de la relación entre la estructura molecular de una sustancia y su movimiento en una cromatografía se ha adoptado el concepto de Rm, que se define por la siguiente ecuación: Rm = log(1/Rf – 1) Como la relación de los frentes cromatográficos (Rf) es un valor fraccionario, se acostumbra a multiplicarlo por 100, lo que da el hRf. I.

OBJETIVOS: ➢ Conocer los fundamentos básicos de la cromatografía de aminoácidos. ➢ Conocer las propiedades de afinidad a los solventes de los aminoácidos. ➢ Separar un mix de aminoácidos básicos y neutros por cromatografía circular en papel. ➢ Determinar los valores de Rf Rm hRf de la práctica. II. MATERIALES Y REACTIVOS: Materiales •

Placas petri

•

Hipodérmicas tuberculinas

•

Papel de filtro Whatman #3 cortados en círculos de 10 cm de diámetro. Reactivos

•

Ácido acético 1 N

•

NH4OH concentrado.

•

Solventes: n-butanol, ácido acético glacial y agua destilada (4:1:5)

•

Muestras: Soluciones 0,05 M de los siguientes aminoácidos: Glicina; ácido glutámico; LLisina.

•

Revelador: Solución de Ninhidrina al 0,2 % en butanol.

III. PROCEDIMIENTOS: •

Determinar el centro del papel y trazar un círculo de 1 cm de diámetro a partir del centro; con ayuda de un lápiz y regla dividir el papel en cuadrantes. Hacer dos cortes radiales a una distancia de 1 cm. Para la formación de la mecha de absorción. Doblar la mecha hacia abajo y cortar a una altura de tal forma que la mecha no toque el fondo de la cámara (placa petri).

•

En la periferia del disco escribir en cada cuadrante en nombre de los estándares y la mezcla.

•

Utilizando la aguja tuberculina, uno para cada aminoácido, colocar aproximadamente 0,02 ml. (20 mg) de cada solución, sobre la línea de origen de modo que a cada lado delas líneas que separan los cuadrantes queden unos 3 cm. Sin muestra alguna. Dejar secar el papel con las soluciones de muestra en el horno a 55 ºC o secar en la campana.

•

Preparar el solvente y verterlo en la parte inferior de una placa petri hasta 0,4 cm. De distancia del borde superior de la placa.

•

Pasar el papel filtro seco conteniendo las muestras sobre una botella que contenga amoniaco para neutralizar los aminoácidos y luego colocar el papel sobre el borde superior de la base de modo que su centro coincida con el centro de la placa petri o desecador y que la mecha del papel no toque el fondo de la misma; seguidamente cubrir el papel con otra base de placa petri de modo que el disco se mantenga lo suficientemente sujeto.

•

El desarrollo termina cuando el solvente ha alcanzado el borde de la placa petri, luego secar en las mismas condiciones antes descritas. Revelar las manchas con la solución de ninhidrina, secar nuevamente y calcular los Rf a partir del centro de cada zona.

Rf = Distancia recorrida por el soluto/Distancia recorrida por el disolvente. IV. RESULTADOS

V. DISCUSIÓN DE RESULTADOS

VI. CONCLUSIONES

VII.

CUESTIONARIO

•

Describir la reacción entre los aminoácidos y la ninhidrina.

•

Que otros métodos existen para detectar aminoácidos.

•

Qué es el índice hidropático, determine de los aminoácidos utilizados en la práctica.

•

Mencione la importancia del ácido glutámico en la alimentación.

VIII.

BIBLIOGRAFÍA

PRÁCTICA Nº 06 TITULACIÓN DE AMINOÁCIDOS, OBTENCIÓN DE LA CURVA DE VALORACIÓN Y CÁLCULO DE LOS pK y pI DE LOS AMINOÁCIDOS. Las proteínas son las macromoléculas biológicas más abundantes, estando presentes en todas las células y en todas partes de las mismas, las mismas estás constituidas por 20 aminoácidos que las conforman. Los 20 aminoácidos estándar encontrados en las proteínas son α-aminoácidos Tienen un grupo carboxilo y un grupo amino unidos al mismo átomo de carbono y alguno de ellos en el grupo R adicionales. Cuando un aminoácido se disuelve en agua, se encuentra en solución en forma del ión dipolar, o Zwitterion, en donde en una sola molécula podemos encontrar los dos iones equilibrados.

Las sustancias con esta naturaleza dual son anfóteras y a menudo se denominan anfolitos (de electrolitos anfóteros). Un aminoácido monoamino monocarboxilo, tal como la alanina, es un ácido diprótico cuando está totalmente protonado esto es, tiene dos grupos, el grupo -COOH y el grupo NH3+ ; Que pueden dar protones.

La Valoración ácido-base implica la adición o eliminación gradual de protones, una gráfica de de la valoración de la forma diprótica tiene dos etapas distintas que corresponden a la desprotonación de dos grupos diferentes cada etapa se asemeja en su forma a la curva de valoración de un ácido monoprótico. La curva de valoración predice la carga eléctrica de los aminoácidos, otra información importante de la curva de valoración de un aminoácido es la relación entre su carga eléctrica neta y el pH de la solución. A pH 5,97, punto de inflexión entre las dos etapas de su curva de valoración. El el punto donde el pH es igual al pK1 de un aminoácido éste está cargado negativamente, en el punto donde el pH es igual al pK 2 está cargado positivamente; pero si hacemos un promedio de los pK(1 y 2) obtendremos un punto de pH donde la carga neta será se cero el cual se denomina punto isoeléctrico o pH isoeléctrico, designado pI. Tras lo cual un aminoácido tiene una carga neta negativa a cualquier pH por debajo de su pI y se desplazará al electrodo positivo (ánodo) cuando se coloque en un campo eléctrico. A cualquier pH por encima del pI está cargado positivamente y se

desplazará hacia el electrodo negativo (el cátodo). Cuando más alejado esté el pH de una solución de aminoácido de su pI, mayor será la carga eléctrica neta de la población de moléculas.

I. OBJETIVOS: •

Conocer la propiedad ácido-base de los aminoácidos.

•

Construir la curva de titulación de un aminoácido.

•

Determinar el pK y pI práctico de un aminoácido.

II. MATERIALES Y REACTIVOS Materiales

Reactivos

•

Matraz de 200 ml

- NaOH 0,5 mol/L

•

pipetas

- HCl 0,5 mol/L

•

picetas

-

•

pHmetro

•

fiolas de 50 y 100 ml.

L-Histidina 0,05 mol/L

III.PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL  Tomar 20 ml de la solución de L-Histidina 0,05M en un matraz de 200 ml. Medir el pH inicial.  Añadir 0,2 ml de NaOH 0,5 mol/L. Agitar el vaso y volver a medir el pH, anotar los resultados.  Repetir los pasos hasta llegar a un pH de 13.9 o 14.  Tomar 20 ml de la solución de L-Histidina en un matraz de 200 ml medir el pH inicial, añadir 0,2 ml de HCl 0,5 mol/L. Agitar el vaso y volver a medir el pH; anotando los

resultados, repetir el paso hasta llegar a un pH por debajo de 0,5.  Hacer la gráfica de pH vs meq/ de NaOH y meq/ de HCl. Localizar en la gráfica los tres pKs e identifica el pI.  Para optimizar los resultados se debe de trabajar con repeticiones y graficar el promedio. IV. RESULTADOS

V. DISCUSIÓN DE RESULTADOS

VI. CONCLUSIONES

VII.

CUESTIONARIO

•

Graficar la estructura de la histidina y el ácido glutámico, desprotonizar y hallar el pI teórico.

•

Explique el método de Isoelectroenfoque.

•

Qué otros métodos existen para determinar el pI de los aminoácidos.

•

¿para qué debo conocer el pI, en qué me sirve?

VIII.

BIBLIOGRAFÍA

PRÁCTICA Nº 07 ESPECTROFOTOMETRÍA UV-VIS (FUNDAMENTOS Y APLICACIONES BIOQUÍMICAS) El esprectrofotómetro es un instrumento que permite comparar la radiación absorbida o transmitida por una solución que contiene una cantidad desconocida de soluto, basado principalmente en la intensidad del color comparando una cantidad conocida y desconocida de la misma sustancia. La longitud de onda (λ) comprende entre 190 y 800 nm. Y la empleada en espectrofotometría es de 400 hasta 700 nm.

La espectroscopia UV-visible se utiliza para identificar algunos grupos funcionales de moléculas, y además, para determinar el contenido y fuerza de una sustancia, en la determinación cuantitativa de los componentes de soluciones de iones de metales de transición y compuestos orgánicos altamente conjugados. Partes de un espectrofotómetro:

la fuente de luz proporciona energía radiante de luz visible y no visible, el cual atravieza una regilla donde se reduce la luz difusa al máximo y evita que la luz dispersa ingrese al sistema de selección de onda, los lentes optimizan la luz uniformizada por la regilla, la luz que ingresa al primsma es fragmentada a todos sus componentes (los colores), una rendija de salida seleciona a una longitud de onda adecuada para su muestra a analizar (esta parte del aparato es manipulada por el operador de acuerdo a su necesidad), de acuerdo al color de la muestra, la longitud de onda seleccionada atravieza la cubeta de Muestra (en la cual la intensidad de onda disminuye en relación directa de acuerdo a la consentración de la muetra). Las intensidad de luz atravezada es detectada por un detector, que puede ser una fotocélula o un fototubo multiplicador quien registra la cantidad de luz y pasa al medidor, en las fotocélulas la lectura es directa ientras que en los fototubos la señal es amplificada. LEYES DE ABSORCIÓN: Cuando un haz de radiación UV-Visible atraviesa una disolución conteniendo un analito absorbente, la intensidad incidente del haz (Io) es atenuada hasta I. Esta fracción de radiación que no ha logrado traspasar la muestra es denominada transmitancia (T) (T = I/Io). Por aspectos prácticos, se utizará la absorbancia (A) en lugar de la transmitancia (A = -logT), por estar relacionada linealmente con la concentración de la especie absorbente.

Cuando un haz de luz pasa a través de un medio, se registra una cierta pérdida de intensidad, debido a la absorción por parte de la sustancia. Se llama “TRANSMITANCIA (T)” a la relación entre la luz incidente y la luz transmitida, expresada en porcentaje.

La Transmitancia se usa poco, se emplea más la Absorbancia (A) porque la relación entre A y la concentración de una solución es directamente proporcional. La relación entre la absorbancia y la transmitancia es la siguiente: Si el %T = 100 entonces: A = 2-log T = 2-log 100 = 0 Si el %T = 0 A = 2-log 0 = T En conclusión: A = 2 - log%T En los aparatos que se usan actualmente se presentan absorbancias, pero el aparato lo que mide realmente es %T que luego transforma a absorbancia. LEY DE BEER-LAMBERT Enóptica la ley de Beer-Lambert, también conocida como ley de Beer o ley de Beer-LambertBouguer es una relación empírica que relaciona la absorción de luz con las propiedades del material atravesado.

Donde: A = Es la absorbancia (o absorbencia) I0 = Es la intensidad de la luz incidente I1 = Es la intensidad de la luz una vez ha atravesado el medio l = Es la distancia que la luz atraviesa por el cuerpo (cm.) c = Es la concentración de sustancia absorbente en el medio (mol/L) α = Es el coeficiente de absorción o la absorbancia molar de la sustancia (mol -1. cm-1) λ = Es la longitud de onda del haz de luz k = Es el coeficiente de de extinción. Espectrofotómetro Modelo “Spectronic 20D+ ” 1. Pantalla digital 2. Selección de modo 3. Inicador de modo 4. Botón incrementar 5. Botón decrecer 6. Control de longitud de onda 7. Compartimiento de la muestra 8. Control para las cubetas (se emplea cuando se trabaja con más de una muestra)

I.

OBJETIVOS: •

Proporcionar al estudiante los conceptos teóricos relacionados a la espectrofotometría y cómo estos son aplicados en el laboratorio de Bioquímica para la cuantificación de sustancias.

•

Determinar el espectro de Absorción de una solución coloreada

•

Diferenciar una curva espectral de una curva de calibración

•

Determinar la longitud de onda óptima para la solución coloreada en estudio

•

Construir la curva de calibración

•

Determinar la consentración d una solución problema.

II.

MATERIALES Y REACTIVOS

Materiales

Reactivos

•

Calculadora

- K2Cr2O7 al 0,120 g%

•

Espectrofotómetro y accesorios

- Agua destilada

•

Pipetas de 1, 2, 5 y 10 ml

•

Tubos de ensayo

•

Papel milimetrado

•

Regla lápiz, borrador.

III.

PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

Ensayo nº 01: Determinación de la longitud de onda óptima (espectro de absorción) Un espectro consiste en una representación de la absorbancia de la radiación en función de la longitud de onda; es decir se selecciona la longitud de onda, donde existe un máximo de absorción. •

Colocar en dos tubos de ensayo 0,5 ml y 1 ml de la solución de K 2Cr2O7 y diluir hasta 10 ml con agua destilada, Mezclar

•

Leer en el espectrofotómetro desde 400 a 590 nm.

•

Graficar el espectro de absorción para cada tubo (absorbancia vs Longitud de onda) encontrar el punto de máxima absorción.

Ensayo nº 02: Determinación de la concentración de una solución problema (curva de calibración) •

Tomar 0,5, 1, 1,5, 2, 2,5 ml de la solución de K 2Cr2O7 y diluir hasta 10 ml en cada caso. Mezclar

•

Leer en el espectrofotómetro en la longitud de onda óptima determinada en el ensayo nº 01 (leer absorbancia y % de transmitancia)

•

Hallar la concentración en mg% de cada uno de los tubos y graficar: absorbancia (Y) vs Concentracion (Y)

•

Graficar porcentaje de Transmitancia vs concentración y Log (porcentaje de transmitancia) vs concentración.

Muestra problema: Tomar 1 ml de la muestra desconocida de K2Cr2O7 diluir con agua destilada

de tal manera que el color quede dentro de los tubos estándares, leer en el espectrofotómetro a longitud de onda óptima. Hallar la concentración de las muestra por los dos métodos. IV.

RESULTADOS

V.

DISCUSIÓN DE RESULTADOS

VI.

CONCLUSIONES

VII.

CUESTIONARIO

•

La absortividad molar de cierto soluto es de 2.1x104. Calcular la transmitancia para una solución 2.00x10-6 M. utilizando una cubeta de 5.00 cm.

•

Se sabe que una sustancia tiene una absortividad molar de 14 000 a su longitud de onda de máxima absorción. Calcular que molaridad de esta sustancia podrá medirse en un espectrofotómetro, si se desea que la lectura de absorbancia sea de 0.850, en una cubeta de 1.00 cm.

•

El porcentaje de transmitancia de una solución acuosa de fumarato de sodio a 250 nm y 25 ºC, es de 19.2% para una solución 5x10-4 M. en una celda de 1.00 cm. Calcular la absorbancia y la absortividad molar correspondiente.

•

Una solución de concentración C de una sustancia coloreada tiene un %T de 82.0 si la concentración se cuadriplica en %T es de 45.2. demostrar que la solución obedece la ley de Lambert-beer y calcular el %T para una concentración 2C.

•

Cuando se analiza una muestra que contiene hierro (II) por el método del α-α’ bipiridilo se obtiene una transmitancia de 57.5% contra un blanco de reactivos, en una cubeta de 1.00 cm. Si la absortividad molar del α-α’ bipiridilo ferroso es de 8.650. ¿cuál será la concentración del hierro en la muestra, en moles/litro?

•

Utilizando una cubeta de absorción de 1.00 cm, se determinó la transmitancia de la luz de 436 nm (436 A) para una solución de bromo en tetracloruro de carbono, encontrándose los siguientes resultados:

C, moles/l

5.46x 10-3

3.5x10-3

2.1x10-3

1.25x 10-3

0.64x10-3

% transmit. Absorbancia

1.0 2

3.0 1.52

16.0 0.796

34.3 0.465

57.0 0.244

Calcular la absortividad molar, Є. •

Se sabe que las sales de VO+2 tienen una absortividad molar de 12.000 a su longitud de onda de máxima absorción. Si se utiliza celda de 10.00 cm, calcular cuántos mg/ml de VO +2 deberán estar presentes para producir una absorbancia de 0.573. (Pm VO+2= 91.942).

•

La absortividad molar (Є) del ácido benzoico en metanol es aproximadamente 1950 a 275 nm. ¿cuál será la máxima concentración de ácido benzoico, en g/ml que puede usarse en una celda de 1.00 cm para que la absorbancia no exceda de 0.013?

•

Una solución de permanganato de potasio de concentración C tiene una transmitancia de

60.0 % en una celda de 1.00 cm., a una determinada longitud de onda. Si se dobla la concentración, calcular. a. El % de T b. La absorbancia La concentración de KMnO4 para dar 60.0 % de T en una celda de 10.00 cm de paso de luz. •

Una muestra de 1.000 g que contiene manganeso se determinó por espectrofotometría, se preparó un extracto de 250 ml de la solución de concentración desconocida, se tomó una alícuota de 5 ml y se diluyó en un balón aforado de 50 ml. Luego, para poder interpolar la curva estándar de manganeso a 535 nm de la última solución, se tomó una alícuota y se diluyó en una solución 1:2. La transmitancia de la solución medida en un espesor de 1 cm es de 40 %. Si la absortividad molar es 2300 L.mol-1 .cm-1, determine:

a) % de Mn en la muestra b) mg / Kg de Mn en la muestra.

VIII. BIBLIOGRAFÍA

PRÁCTICA Nº 08 REACCIONES GENERALES DE LAS PROTEÍNAS Son las moléculas más importantes y de primordial importancia, dado que las proteínas son muy complejas se hace difícil interpretar su comportamiento químico, en general podemos decir que las proteínas reflejan las propiedades químicas de los aminoácidos constituyentes. Todos los aminoácidos se unen por enlaces peptídicos para formar péptidos, oligopéptidos, polipéptidos. Los átomos de situados en el entorno del enlace peptídico no puede girar libremente, ya que son coplanares . el enlace C-N es un enlace rígido. Los C α están situados en posición trans, con excepción de la prolina que es cis. Existen diferentes maneras de clasificar las proteínas: 1.

Por su composición: ◦ Simples: después de realizar la hidrólisis de la proteína únicamente podemos encontrar aminoácidos. ◦ Conjugadas: al realizar la hidrólisis encontramos junto a los aminoácidos diversas sustancias que son conocidos como los grupos prostéticos. ◦ Dependiendo de la sustancia que encontremos hablaremos de 1.

Lipoproteínas; si están unidos a lípidos

2. Nucleoproteínas; si está unidos a histonas 3. Glucoproteínas; si están unidas a carbohidratos 4. Fosfoproteínas; si están unidas a un grupo fosfato 5. Cromoproteínas; si están unidas a un grupo que les confiere un color característico, como el grupo hemo de la hemoglobina o la clorofila de las plantas. 2.

Por su estructura:

✔ Proteína globulares ✔

Proteínas fibrosas 3.

✔ ✔

Por el número de subunidades

Monoméricas; cuando la proteína consta de una sola cadena polipeptídica. Oligoméricas; la conforman 2 o más cadenas polipeptídicas, generalmente de un número par. 4. Por su función biológica.

Proteínas con actividad catalítica (enzimas), de transporte, de reserva, contráctiles, estructurales, de defensa, reguladoras de diversos proceso biológicos. Propiedades de las proteínas: Las propiedades de las proteínas nos sirven para clasificarlas. •

Propiedades ácido-base: tan solo se pueden ionizar los extremos terminales de las proteínas,

al igual que las cadenas laterales, pero hay ciertas configuraciones donde todos los grupos polares están en la superficie de la proteína y ocultan los extremos apolares. •

Solubilidad: en esta propiedad intervienen una serie de factores como el: 1. pH:

•

En su pI la proteína muestra un mínimo rango de solubilidad.

•

Existen la posibilidad de precipitar selectivamente las proteínas.

•

Se mantiene la configuración nativa.

•

La fuerza iónica

•

Al colocar una proteína en un medio con altas concentraciones de iones H+ o OH- ésta tiende a inactivarse y hasta perder su estructura tridimensional, pues se rompen todos los puentes de hidrógeno, interacciones iónicas, fuerzas de van der waals, tras el cual la proteína se desnaturaliza.

•

En ocasiones una concentración de sales baja puede favorecer la solubilidad de la proteína.

•

En su pH óptimo se mantiene la configuración nativa. 2. Temperatura:

•

En el intervalo de 0 a 40 ºC la solubilidad aumenta, pero al pasar de los 40 ºC la proteína pierde la configuración nativa. 3. Disolventes orgánicos:

•

Etanol o acetona (0 ºC)

•

Reducen la solubilidad provocando la precipitación, se mantiene la configuración nativa. 4. Detergentes:

Se solubilizan las proteínas, algunos detergentes son: TritiónX-100, Tween-20. Se conserva la configuración nativa. 5. Agentes químicos desnaturalizantes. TCA (ácido tricloroacético), PCA (ácido perclórico), se pierde la configuración nativa.

II. OBJETIVOS. •

Conocer les propiedades principales de las proteínas.

•

Identificar y caracterizar algunos tipos de aminoácidos, que forman las proteínas.

•

Demostrar el efecto de la acción del calor, ácidos fuertes y solventes orgánicos sobre las proteínas.

•

Demostrar la capacidad amortiguadora de las proteínas frente a un ácido y una base.

III. MATERIALES Y REACTIVOS Materiales:

Reactivos:

•

Tubos de ensayo

- Ácido nítrico concentrado

•

Baño maría

- Etanol

•

Gradilla

-

•

Pipetas de 1, 5 y 10 ml.

- Ácido tricloroacético 5%

•

Embudo

- Bicloruro de mercurio 5%

•

Papel de filtro

- Solución de pepsina 1%

Ácido picrico5%

- Ninhidrina 0.2% - NaOH 10% - Sulfato de amonio saturado - CuSO4 1% -

Ácido acético conc.

- Acetato de plomo 5% - Suero fisiológico

IV. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL A. REACCIONES DE IDENTIFICACIÓN. De acuerdo a la característica química de los respectivos aminoácidos, es decir la presencia de diversos grupos funcionales y/o elementos, es posible establecer una diferenciación e identificación de los aminoácidos, frente a determinados reactivos, dando lugar a la formación de complejos coloreados. -

REACCIÓN DE BIURET:

Es una prueba general para proteínas y la reacción es positiva cuando los péptidos contienen dos o más enlaces peptídicos. Procedimiento: v Colocar 1 ml de muestra en un tubo de ensayo, agregue 1ml de NaOH al 1% y 0,5 ml de solución de CuSO4 1%. v

Observar el complejo formado

-

REACCIÓN DE NINHIDRINA:

La ninhidrina es un agente oxidante poderoso, reacciona con todos los aminoácidos para dar un compuesto de color púrpura. Esta reacción también se efectúa con polipéptidos, peptonas y aminas primarias. Procedimiento.

§ Colocar 1 ml de muestra en un tubo de ensayo y añadir 0,5 ml de reactivo de ninhidrina y dejar hervir 2`, observar el color desarrollado. - REACCIÓN XANTOPROTEICA: Se basa en que los aminoácidos aromáticos, cuando se calientan con ácido nítrico concentrado dan lugar a la formación de nitroderivados fenólicos de color amarillo. Procedimiento. A 1 ml de muestra añadir 0.5 ml de HNO3 concentrado. Se forma un precipitado blanco. Hervir 1` observar el color formado. Agregar ± 1 ml de NaOH 40% y observar el cambio. B. REACCIONES DE PRECIPITACIÓN En soluciones neutras, los aminoácidos existen como iones doblemente cargadas, conocidos como zwitteriones, es decir se ionizan a la vez como ácidos y como bases, denominados anfóteros. La forma zwitterión de un aminoácido será isoeléctrica (PH en el que no hay migración en un campo eléctrico). Las sustancias anfotéricas reaccionan tanto con las bases con los ácidos, dando sales y precipitados diversos.

H H3C C COO - + NaOH NH + 3

H H3C C COONa NH +

+

OH2

3

– PRECIPITACIÓN POR METALES PESADOS: Al comportarse las proteínas como iones híbridos, se ionizan negativamente en soluciones neutras o alcalinas, precipitando las proteínas al combinarse con las sales de los metales pesados. Procedimiento: Trabajar con dos tubos (si el acetato de plomo estuviera presente) a 1 ml de muestra agregar unas gotas de HgCl2 al 5%. y gotas de acetato de plomo al otro (si hubiera). Observar la precipitación. – PRECIPITACIÓN POR ÁCIDOS DÉBILES: Las proteínas precipitan de sus soluciones frente a la acción de los ácidos débiles formando precipitaciones. Procedimientos: Trabajar en dos tubos por muestra: A 1 ml de muestra añadir gotas de ácido tricloroacético al 5%, y gotas de ácido prícrico al otro tubo. – PRECIPITACION POR ALTAS CONSENTRACIONES SALINAS: la mayoría de las proteínas son insolubles en soluciones saturadas de sales, como el sulfato amónico que precipita a las proteínas. Procedimientos: A 1 ml de muestra agregar gotas de sulfato de amonio saturado. Observar los cambios que ocurren. C. REACCIONES DE DESNATURALIZACIÓN:

Las fuerzas comparativamente débiles responsables de mantener las estructuras secundaria, terciaria y cuaternaria de las proteínas, son fácilmente destruidas con la correspondiente pérdida de la actividad biológica. Esta destrucción de su estructura nativa se llama desnaturalización. Procedimientos: Toar una proporción de clara pura y someter a la acción del calor, ácidos fuertes, solventes orgánicos y acción mecánica. D. AMORTIGUAMIENTO DE UNA PROTEÍNA FRENTE A UN ÁCIDO: Los químicos que conforman el enlace peptídico no presentan poder amortiguador en un medio ácido o alcalino, las proteínas se comportan igual que los aminoácidos debido a que el enlace peptídico se realiza dentro de los grupos NH3+ y COO- los únicos grupos que tienen la capacidad de ceder o captar hidrogeniones son los que se encuentran en los extremos de la cadena polipetídica y cadenas laterales. Procedimiento: Tomar 5 ml de agua destilada en un tubo de ensayo, en un segundo tubo colocar 2 ml de suero diluido con 3 ml de agua destilada. En un tercer tubo agregue 2 ml de gelatina diluida con 3 ml de agua destilada, añadir 2 gotas de indicador rojo de metilo en cada tubo y titular con HCl 0,01N cada tubo hasta que vire del indicador, anotar los gastos encontrados.

V. RESULTADOS

VI. DISCUSION DE RESULTADOS

VII.

CONCLUSIONES

VIII.

CUESTIONARIO

1. Explique la estructura molecular de la gelatina, colágeno, fibroína de seda. 2. Explique a el proceso del plegamiento asistido de proteínas. 3. Explique el proceso de renaturalización de proteínas 4. Mencione cuál es la proteína de mayor peso molecular y el de menor peso molecular. 5. Explique bioquimicamente la anemia falciforme. 6.

¿por qué el suero sanguíneo se comporta como un amortiguador?

7. Mencione la importancia de los aminoácidos sulfurados en el plegamiento de las proteínas.

IX. BIBLIOGRAFÍA

PRÁCTICA Nº 09

CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS TOTALES POR ESPECTROFOTOMETRÍA Las proteínas están presentes en todas las células y en los distintos líquidos corporales: suero plasma (66 – 83 g/L), orina (100-200 mg/L), líquido cefalorraquídeo (15-45 mg/dL). Pues prácticamente todo organismo vivo está constituido de proteínas incluso los viruces a pesar de que no son considerados seres vivos. En la presente práctica se determinará la concentración de proteínas en diferentes muestras. Dado que la mayoría de las proteínas no absorben luz dentro del rango de longitud de onda visible, es necesario acoplar una reacción química que regenere color y así poder cuantificarlas. El método Biuret modificado se fundamenta en que Las proteínas y péptidos reaccionan con iones de cobre en solución alcalina, formando un quelato color violeta de configuración desconocida cuantificable a 540 nm. La intensidad de color es directamente proporcional a la concentración de proteínas presente en la muestra. I. OBJETIVOS: •

Cuantificar el contenido de proteínas totales en diferentes muestras biológicas

•

Interpretar los resultados obtenidos en relación a los valores normales

•

Afianzar los conocimientos de espectrofotometría

II. MATERIALES Y MÉTODOS Materiales

Reactivos

•

Muestras biológicas

- Reactivo de Biuret modificado

•

Tubos de centrifuga

- Solución de NaCl al 0,9 %

•

Aguja hipodérmica Nº0211/2

- Bencina, Cloroformo, etanol

•

Estándar de proteínas

- Sulfato de amonio al 4 %

•

Pipetas de 1, 2, 5, 10 ml

•

Centrífuga

III.PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL Extracción de proteínas Consiste en la degradación de la muestra del tejido a extraer en crudo, en el extracto se encuentran todos los componentes celulares, como proteínas, lípidos, carbohidratos, sales, metabolitos secundarios, etc. El proceso consiste en extraer todos los componentes solubles en solventes orgánicos y acuosos, para lo cual preparamos un mix de solventes Bencina:Cloroformo:agua alcohol, (5:5:4:1) con la cual agitaremos a bajas temperaturas por espacio de 30 min. Y separar la fase acuosa en la pera de decantación; al terminar esta etapa se centrifuga a 3000 r.p.m. Por 5 min. y se recupera el sobrenadante con la finalidad de desechar el precipitado que contiene algunas impurezas, y descartar los restos de tejidos. Precipitación con Sulfato de Amonio

Al obtener un extracto crudo se debe tener en cuenta que nuestras proteínas de interés se encuentran en solución acuosa a una baja salinidad. Al incrementar la concentración de sales en la solución incorporando lentamente sulfato de amonio, la proteína comienza a ceder intercambios iónicos con los iones amonio y sulfato, y sustituye los sitios de intercambio que compartía con el agua y pasado un tiempo de esta manera, la proteína disminuye su solubilidad y precipita. Redisolución y Diálisis. El siguiente paso en la purificación de proteínas consiste en tomar una alícuota del precipitado y dializar mediante el flujo selectivo de materia de una zona de mayor concentración a otra de menor concentración con ayuda de la presión osmótica. Es necesario realizar este paso a baja temperatura y en agitación constante. Preparar la siguiente batería de tubos : Patrón de proteínas en mg% Tubos

Blanco

10

20

40

80

160

320

Muestra problema

Patrón de proteínas

-

1

1

1

1

1

1

-

Muestra problema

-

-

-

-

-

-

-

1

Sol. De NaCl 0,9%

5

4

4

4

4

4

4

4

Reactivo de Biuret.

5

5

5

5

5

5

5

5

Dejar en reposo por 30 minutos a temperatura ambiente y leer en el espectrofotómetro a una longitud de onda de 540 nm. IV. RESULTADOS Calcular la concentración de proteínas en las muestras problemas por el método analítico y gráfico.

V. DISCUSIÓN DE RESULTADOS

VI. CONCLUSIONES

VII.

CUESTIONARIO

•

Qué técnicas directas existen en la actualidad para cuantificar proteínas

•

Qué técnicas indirectas existen en la actualidad para cuantificar proteínas.

•

Mencione algunos métodos para la separación y purificación de proteínas

VIII. BIBLIOGRAFÍA

PRÁCTICA Nº 10 FACTORES QUE AFECTAN LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA (pH, TEMPERATURA, [SUSTRATO], TIEMPO) Las enzimas son los biocatalizadores de la gran mayoría de las reacciones bioquímicas, de naturaleza orgánica y estado coloidal, elaboradas por las células vivas, pero actúan independientemente de éstas. Las enzimas son de gran importancia biológica ya que la totalidad de las células de todos los microorganismos son posibles gracias a la acción catalítica de las enzimas. Las enzimas son altamente específicas y poseen gran poder catalítico. Normalmente aumentan la velocidad de reacción al menos 107 veces. Las reacciones enzimáticas no alteran el equilibrio de reacción, más bien actúan reduciendo la energía de activación de las reacciones bioquímicas.

E

+S

K1 K2

K3 ES

K4

E+P

La velocidad de la reacción enzimática se define como la variación en el tiempo de la concentración del sustrato, siendo proporcional a dicha concentración. De manera que si aumentara la concentración del sustrato llega un momento en que por mucho que se aumente la concentración del sustrato, no aumenta la velocidad de reacción, se dice que ésta a alcanzado la velocidad máxima y está saturada por la concentración del sustrato.

Donde Km es la constante de Michaelis Esta constante indica la afinidad por el sustrato y cuanto más pequeña es, mayor es la afinidad y nos dice cuál es la cantidad del sustrato máximo, cuanto más grande es la concentración enzimasustrato, es más rápida la obtención del producto. Todas las enzimas alcanzan su actividad máxima en condiciones ambientales óptimas, cualquier cambio en ésta provoca la disminución de la actividad de la enzima e incluso su desnaturalización. Los factores que pueden influir en la actividad enzimática son la temperatura, el pH, la concentración del sustrato y los activadores e inhibidores. EFECTOS DE LA TEMPERATURA: un aumento en la temperatura provoca un aumento de la velocidad de reacción hasta una temperatura, en la cual llamamos temperatura óptima, ya que después de ésta a mayor temperatura se desnaturaliza EFECTOS DE LA CONCENTRACIÓN DEL SUSTRATO Cuando en el medio existe una pequeña cantidad de sustrato la conversión a producto es de alta velocidad, a medida que aumentamos el sustrato la velocidad tiende a disminuir la relación es inversa, hasta llegar a un punto donde la enzima es completamente saturada, cuando la concentración de sustrato se mantiene constante se dice que la enzima a alcanzado su velocidad máxima. La concentración de sustrato [S], a la semivelocidad máxima de la reacción (½ V) se puede determinar en la gráfica la cual representa la constante de Michaelis o K m la cual es una característica para cada enzima. La inversa de Km o 1/Km mide la afinidad de la enzima por sus sustrato. Si varias enzimas compiten en el metabolismo por el mismo substrato, éste será transformado preferentemente por la enzima con mayor afinidad.

EFECTOS DEL pH: La concentración de los hidrogeniones en el medio es de suma importancia para que se lleve a cabo una reacción de catálisis, recordemos que las enzimas en casi su totalidad son proteínas, y se desnaturalizan a altas concentraciones de H3O+ o OH-. Toda enzima trabaja a un pH óptimo en su velocidad máxima, por debajo o más de ello se inactiva momentáneamente. Pero concentraciones altas llegan a perder sus estructura nativa. ACTIVADORES Son la presencia de iones necesarios para la unión de enzima sustrato y hacer más rápida la reacción. Como el caso de la glucosa 6P para que se transforme a fructosa 6-P es necesario la enzima fosfoglucoisomerasa que es dependiente de iones magnesio e iones manganeso. INHIBIDORES Se habla de inhibición cuando disminuye la actividad o eficacia del la enzima y las sustancias que producen este efecto reciben el nombre de inhibidores. Entre otros factores que afectan podemos hablar de la concentración de la enzima, el tiempo de incubación, etc. I. OBJETIVOS: •

Demostrar la influencia del pH en una reacción enzimática.

•

Demostrar la influencia de la concentración de sustrato en una reacción enzimática.

•

Demostrar la influencia de la temperatura en una reacción enzimática

•

Demostrar la influencia del tiempo de incubación en una reacción enzimática.

•

Determinar la Km y Vmáx para la pepsina.

II. MATERIALES Y REACTIVOS Materiales

Reactivos

•

Fiolas de 50 ml

- Solución de pepsina 1 %

•

Tubos de prueba

- Solución de albúmina 100 mg%

•

Pipetas de 1 y 5 ml

- Buffer acetato 0,1M a pH 4, 5

•

Baño maría

- Buffer fosfato 0,1 M a pH 6, 7, 8, 12.

•

Espectrofotómetro

- HCl 0,1 N

•

Mortero y pilón

- NaOH 0,1 N

•

Rallador

•

papel filtro

•

Embudos

III. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

Ensayo nº 01: Efecto del pH prepare la siguiente batería de tubos. Tubos nº

Blanco

1

2

3

4

Sustrato albúmina 100 mg%

4 ml

4 ml

4 ml

4 ml

4 ml

Solución de pepsina

2 ml

2 ml

2 ml

2 ml

2 ml

c.s.p.* Buffers 4ml

pH-7

pH-4

pH-6

pH-8

pH-12

Incubar a 37 ºC por espacio de 1 hora. •

el buffer se empleará de acuerdo al pH puede ser de acetato o fosfato u otro emplear el pHmetro.

Ensayo nº 02: Efecto de la temperatura. Prepara la siguiente batería de tubos: Tubos nº

1

B-1

2

B-2

3

B-3

Sol. De albúmina

5

5

5

5

5

5

Sol. de pepsina

0,5

-

0,5

-

0,5

-

Temperatura ºC

0

37

90

Sacar del baño maría y colocar en un baño de hielo, añadir a cada tubo 3 ml del reactivo de biuret. Reposar 10 min y leer a una longitud de 540 nm. Obtener la actividad neta y hacer una diferencia de medias de las tres temperaturas. Ensayo nº 03: Efecto de la concentración de sustrato. Preparar la siguiente batería de tubos: Tubo nº

Blanco

1

2

3

4

5

6

7

Sol. De albúmina

10,5

0,5

1

2

3

5

8

10

0,5

0,5

0,5

0,5

0,5

0,5

0,5

Sol. De pepsina

Colocar en baño de agua a 37 ºC por 15 minutos Sacar del baño maría y colocar en un baño de hielo, añadir a cada tubo 3 ml del reactivo de biuret. Reposar 10 min y leer a una longitud de 540 nm. Realizar la gráfica de Lineweaver-Burk. Y determinar la Vmáx. Km. Ensayo nº 01: Efecto del tiempo. Prepare la siguiente batería de tubos. Tubo nº

Blanco

1

2

3

4

5

Sol. De albúmina

5

5

5

5

5

5

Sol. De pepsina

-

0,5

0,5

0,5

0,5

0,5

Tiempo min

5

10

15

20

25

30

Sacar del baño maría y colocar en un baño de hielo, añadir a cada tubo 3 ml del reactivo de biuret. Reposar 10 min y leer a una longitud de 540 nm. Realizar la gráfica de actividad enzimática vs tiempo. IV. RESULTADOS

V. DISCUSIÓN DE RESULTADOS

VI. CONCLUSIONES

VII.

CUESTIONARIO

•

Explique el mecanismo de acción de la pepsina en condiciones de estado estacionario.

•

Qué mecanismos presentan las enzimas de las bacterias psicrófilas.

•

Haga un listado de 20 enzimas con los valores de Km de las principales enzimas de importancia industrial.

•

Mencione los mecanismos de Inhibición con ejemplos de algunas enzimas.

•

¿En qué unidades de cuantifican la actividad enzimática?

•

Mencione 10 activadores enzimáticos y sus respectivas enzimas.

VIII.

BIBLIOGRAFÍA

PRÁCTICA Nº 11 INHIBIDORES DE PROTEASAS Los inhibidores enzimáticos son agentes moleculares que interfieren en la catálisis, haciendo más lentas o deteniendo las reacciones. Los enzimas catalizan, prácticamente, todos los procesos celulares por lo que no es sorprendente que los inhibidores enzimáticos se encuentren entre los agentes farmacéuticos más importantes. El estudio de los inhibidores enzimáticos también ha proporcionado información valiosa sobre los mecanismos enzimáticos y ha ayudado a definir algunas rutas metabólicas. Hay dos amplias clases de inhibidores enzimáticos; reversibles e irreversibles. En los reversibles podemos encontrar tres tipos de inhibición; la competitiva cuando el inhibidor se une con el enzima y el sustrato queda libre. la acompetitiva, cuando el inhibidor no interviene en la unión del sustrato con el enzima sino que actúa formando un complejo enzima-sustrato-inhibidor y detiene la reacción. La no competitiva, cuando el inhibidor puede combinarse con el enzima libre o con el complejo enzima sustrato interfiriendo con la acción de ambos. Los inhibidores de proteasas actualmente han adquirido gran importancia por su aplicación en procesos biológicos y biotecnológicos. Uno de las importancias radica en la eficiencia con que los organismos digieren y utilizan los componentes nutritivos depende de la presencia de ciertas enzimas digestivas y de esta manera, se podría utilizar un alimento en forma óptima basándose en el conocimiento de la capacidad fisiológica del organismo. I. OBJETIVOS: •

Demostrar la presencia de inhibidores de proteasas en diferentes muestras de la región.

•

Resolver y elaborar las diferentes ecuaciones de los tipos de inhibición

•

Determinar el tipo de inhibición de los diferentes inhibidores.

•

Realizar las pruebas cinéticas para determinar los mecanismos de inhibición.

II. MATERIALES Y REACTIVOS Materiales

Reactivos

•

Tubos de ensayo

- Sulfato de amonio 20 %

•

Pipetas de 1, 2, 5 ml

- Tris-HCl- CaCl2 con pH 8

•

Centrífuga

- Solución de pepsina al 1 %

•

Papel filtro

- Solución de albúmina 100 mg%

•

Vaso de precipitados

- Buffer fosfato 0,1 M pH 6

•

Embudos de vidrio

- Bencina

•

Mortero y pilón

- Cloroformo

•

Espectrofotómetro.

- Buffer acetato 0,1 M pH 4

Muestras: Semillas secas de Opuntia megacantha (tuna).

III.PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL Extracción de proteínas inhibidores de proteasas Consiste en la degradación de la muestra del tejido a extraer en crudo, en el extracto se encuentran todos los componentes celulares, como proteínas, lípidos, carbohidratos, sales, metabolitos secundarios, etc. El proceso consiste en extraer todos los componentes solubles en solventes orgánicos y acuosos, para lo cual preparamos un mix de solventes Bencina:Cloroformo:agua alcohol, (5:5:4:1) con la cual agitaremos a bajas temperaturas por espacio de 30 min. Y separar la fase acuosa en la pera de decantación; al terminar esta etapa se centrifuga a 3000 r.p.m. Por 5 min. y se recupera el sobrenadante con la finalidad de desechar el precipitado que contiene algunas impurezas, y descartar los restos de tejidos. Precipitación con Sulfato de Amonio Al obtener un extracto crudo se debe tener en cuenta que nuestras proteínas de interés se encuentran en solución acuosa a una baja salinidad. Al incrementar la concentración de sales en la solución incorporando lentamente sulfato de amonio, la proteína comienza a ceder intercambios iónicos con los iones amonio y sulfato, y sustituye los sitios de intercambio que compartía con el agua y pasado un tiempo de esta manera, la proteína disminuye su solubilidad y precipita. Redisolución y Diálisis. El siguiente paso en la purificación de proteínas consiste en tomar una alícuota del precipitado y dializar mediante el flujo selectivo de materia de una zona de mayor concentración a otra de menor concentración con ayuda de la presión osmótica. Es necesario realizar este paso a baja temperatura y en agitación constante. Calentamiento Este tipo de inhibidores de proteasas , posee la propiedad de ser altamente resistentes a la temperatura. Por lo tanto, al aplicar una temperatura alta, la mayoría de las proteínas se desnaturalizan y disminuyen, permitiendo purificar el inhibidor de proteasa de interés. Seguido de ello se procede a centrifugar a 2500 r.p.m por 10 min. Trabajar con el sobrenadante. Determinación de la actividad inhibitoria de proteasas. Preparar la siguiente batería de tubos en bloques (blanco) Tubos nº

1

2

3

4

5

6

Sol. De albúmina

0,5

1

2

3

4

5

Sol. de pepsina

0,5

0,5

0,5

0,5

0,5

0,5

Buffer acetato pH 4

2 ml

2 ml

2 ml

2 ml

2 ml

2 ml

4,5

3,5

2,5

1,5

0,5

Agua destilada 5 Batería de tubos (Experimento) Tubos nº

1

2

3

4

5

6

Sol. De albúmina

0,5

1

2

3

4

5

Sol. de pepsina

0,5

0,5

0,5

0,5

0,5

0,5

Buffer acetato pH 4

2 ml

2 ml

2 ml

2 ml

2 ml

2 ml

Agua destilada

5

4

3

2

1

-

Inhibidor

0,5

0,5

0,5

0,5

0,5

0,5

Leer al espectrofotómetro la Absorbancia inicial a 540 nm e incubar a 37 ºC por espacio de 30 min. Pasado el tiempo proceder a leer nuevamente la diferencia será la actividad enzimática.

Graficar las pruebas cinéticas y determinar el tipo de inhibición.

IV. DISCUSIÓN DE RESULTADOS

V. CONCLUSIONES

VI. CUESTIONARIO •

Definir las ecuaciones de los tipos de inhibición.

•

Mencione otras muestras de donde se extraen inhibidores de proteasas

•

Mencione la importancia de los inhibidores en la crianza de animales en las granjas

•

Qué otras aplicaciones tienen los inhibidores de proteasas.

•

Mencione una enzima con su inhibidor y explique el mecanismo de inhibición.

VII.

BIBLIOGRAFÍA

PRÁCTICA Nº 12 REACCIONES GENERALES DE LOS CARBOHIDRATOS Los carbohidratos también llamados azúcares, osas o sacáridos, son polihidróxialdehidos o polihidroxicetonas o compuestos poliméricos que por hidrólisis producen polihidroxialdehidos y polihidroxicetonas. Según el número de unidades de azúcares sencillos que posean se clasifican en: • MONOSACÁRIDOS o azúcares sencillos, que a su vez pueden ser ALDOSAS cuando contienen el grupo aldehído o CETOSAS cuando contienen el grupo cetona. Los monosacáridos naturales pertenecen a la serie D de los azúcares y pueden tener entre tres y hasta siete átomos de carbono. • DISACÁRIDOS que están formados por dos monosacáridos unidos entre sí por enlaces glucosídicos. • OLIGOSACÁRIDOS que tienen entre tres y diez monosacáridos unidos también por enlaces glucosídicos. • POLISACÁRIDOS que son polímeros naturales con varios miles de unidades de azúcar sencillo ligadas entre sí. De acuerdo con lo anterior, además de reconocer si un compuesto pertenece a la familia de los carbohidratos, es necesario diferenciar si se trata de un monosacárido tipo aldosa o cetosa, si es fácilmente oxidable o no, es decir si es un AZÚCAR REDUCTOR o no lo es, si es de cinco átomos de carbono (pentosa) o de seis átomos de carbono (hexosa), si es disacárido o polisacárido. I.

OBJETIVOS: • •

II.

Identificar los azúcares en las diferentes muestras problemas. Caracterizar y reconocer algunas propiedades de los carbohidratos MATERIALES Y REACTIVOS

Materiales Reactivos • Tubos de prueba - Reactivo de MOLISH • Gradilla - Reactivo de Benedict • Pipetas de 5, 3, 2, 1 ml. - Reactivo de Fheling • Beacker - Reactivo de Seliwanof • Cocinilla - Nitrato de plata • Vaso de precipitados - Reactivo de Tollens • Muestra azúcares problema al 1%- Lugol • Baño maría - Reactivo de Bial - Reactivo de Barfoed - Reactivo de BrauN ESQUEMA DE IDENTIFICACIÓN:

III.PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL a. REACCIÓN DE MOLISCH Esta reacción sirve para el reconocimiento de todo tipo de azúcares. Los azúcares, en medio ácido fuerte se deshidratan formando furfurales. Estos furfurales al reaccionar con el α-naftol originan complejos de intenso color. Procedimiento: 1.Pipetear en un tubo de ensayo 2 ml de disolución de azúcar problema 2.Añadir 2 gotas de α-naftol al 1% y mezclar bien. 3.Con una pipeta se deja deslizar por la pared del tubo de ensayo 2 ml de ácido sulfúrico 1 N con mucho cuidado procurando que no se mezcle para que forme una capa bajo la disolución de azúcar. En la superficie de separación de ambas capas se producirá la deshidratación del azúcar y su reacción con el α-naftol formándose un anillo de color oscuro en dicha interfase. Ayudar la reacción con calor en baño maría. Molisch positivo: anillo violeta oscuro. b. REACCIÓN DE BIAL En un tubo de ensayo se depositan 2 ml de la muestra a ensayar, agregue 1 ml del reactivo de Bial + 2.5 ml de ácido clorhídrico concentrado y proceda a colocar el tubo de ensayo en un baño de María a 80° C durante 5-10 minutos. c. REACCIÓN DE FEHLING Esta prueba se utiliza para el reconocimiento de azúcares reductores. El poder reductor que pueden presentar los azúcares proviene de su grupo carbonilo, que puede ser oxidado a grupo carboxilo con agentes oxidantes suaves. Si el grupo carbonilo se encuentra combinado no puede presentar este poder reductor. Los azúcares reductores, en medio alcalino, son capaces de reducir el ión Cu2+ de color azul a Cu+ de color rojo. Para ello el grupo carbonilo del azúcar se oxida a grupo carboxilo. En medio fuertemente básico como en nuestro caso el NaOH el ión Cu2+ formaría Cu(OH)2 insoluble por eso añadimos tartrato sódico potásico que actúa como estabilizador al formar un complejo con el Cu2+. Procedimiento: 1. Mezclar en un tubo de ensayo: Fehling A (CuSO4) 2 ml Fehling B (Tartrato/NaOH) 2 ml 2. Agitar y calentar a ebullición (aproximadamente 1 min). 3. Añadir 1 ml de la disolución de azúcar y hervir durante un minuto. Si se reduce el cobre se forma un precipitado de Cu2O de color rojizo. Fehling positivo: color rojizo. d. REACCIÓN DE LUGOL: Agregar a 2 ml de la muestra 4 gotas de lugol. Observe la reacción. e. REACCIÓN DE BENEDICT Esta prueba sirve para el reconocimiento de azúcares reductores. Se basa en la reducción de Cu2+ a Cu+ en medio básico débil. Aunque es similar a la reacción de Fehling, el medio básico débil (HNaCO3) y el estabilizante (citrato sódico) usados hacen que este test sea más sensible y estable. Procedimiento:

1. Pipetear en un tubo de ensayo 5 ml de reactivo de Benedict 2. Calentar a ebullición. 3. Añadir 1 ml de la solución de azúcar, mezclar bien y volver a calentar a ebullición. Si la reacción es positiva aparece un precipitado rojizo, aunque si la cantidad de azúcar es pequeña puede dar color anaranjado o verdoso. f. REACCIÓN DE BRAUN Esta reacción sirve para el reconocimiento de azúcares reductores. Los azúcares reductores en medios alcalinos pueden reducir el picrato, de color amarillo, a picramato, de color rojo en medio alcalino (Na2CO3). Procedimiento: 1. Añadir en un tubo de ensayo: - Disolución de azúcar 2 ml - Ácido pícrico saturado 1 ml (MUY VENENOSO) - Na2CO3 1M 1 ml 2. Calentar a ebullición. Si el test es positivo, el color amarillo pasa a rojo. g. PRUEBA DE BARFOED Esta prueba sirve para el reconocimiento de monosacáridos. En medio ácido, tan sólo los monosacáridos son capaces de reducir el Cu2+ a Cu+. El Cu+ así producido reduce al ácido fosfomolíbdico a un complejo de intenso color azul oscuro. Procedimiento: 1. Pipetear en un tubo de ensayo: Disolución de azúcar 1 ml Disolución ácida de cobre 1 ml 2. Calentar a ebullición durante 3 minutos. Aparece un precipitado de Cu2O. 3. Enfriar en agua durante 2 min 4. Añadir 1 ml del reactivo de fosfomolibdato. Si la prueba es positiva aparece un color azul oscuro muy intenso. h. PRUEBA DEL ESPEJO DE PLATA Esta prueba sirve para el reconocimiento de monosacáridos. Los monosacáridos son capaces de reducir, en medio amoniacal, el ión Ag+ a Ago (plata metálica), que se deposita en las paredes del tubo. Procedimiento: 1. Añadir en un tubo de ensayo: - AgNO3 1% 1 ml - NH3 30% 1 ml - Disolución de azúcar 1 ml 2. Mezclar bien y calentar durante 2 minutos. 3. Sacar y dejar reposar. Si el ensayo es positivo la plata metálica, que precipita, se va depositando en la pared del tubo formando un espejo (“espejo de plata”). i. PRUEBA DE SELIWANOFF Esta prueba es específica para las cetosas. Las cetosas se deshidratan más rápidamente que las

aldosas, dando furfurales. Estos se condensan con el resorcinol produciendo un complejo coloreado. Si el tiempo de ebullición se prolonga, puede dar también positivo para otros azúcares. Procedimiento: 1. En un tubo de ensayo pyrex se añadir: - Reac. Seliwanoff (resorcinol/HCl) 1 ml - Disolución de azúcar 1 ml 2. Hervir durante 1 minuto en el baño a ebullición. La aparición de un color rojo o un precipitado rojo es indicativo de la presencia de cetosas. j. PRUEBA DE TOLLENS Esta prueba es análoga a la de Seliwanoff, pero para el reconocimiento de galactosa y sus derivados. La galactosa, algunas pentosas y el ácido glucurónico dan un color rojo con el HCl y floroglucina. La glucosa da también un color rojo con la floroglucina, pero muy opaco, en contraste con el color rojo transparente de la galactosa. Procedimiento: 1. Añadir en un tubo: - Disolución de azúcar 2 ml - HCl (concentrado) 2 ml - Floroglucina (Tollens) 0,1 ml 2. Calentar a ebullición. El color puede aparecer hasta 5 minutos después de calentar. k. HIDRÓLISIS ÁCIDA DE UN DISACÁRIDO En el caso de que la disolución problema de azúcar fuese sacarosa o lactosa se hace una comprobación. En primer lugar se hidroliza el disacárido en sus componentes (sus dos monosacáridos) mediante una hidrólisis ácida Procedimiento: 1. En un tubo de ensayo limpio añadir: - Disolución problema 1 ml - HCl 0,1N 1 ml 2. Hervir durante 1 minuto. 3. Realizar la prueba de Seliwanoff si se trata de sacarosa o la reacción de Barfoed si se trata de lactosa. IV. RESULTADOS: Expresar el resultado (+/-) que daría cada prueba con cada uno de los azúcares. ALMIDÓN MOLISH FEHLING BENEDICT BRAUN BIAL BARFOED ESP. PLATA SELIVANOF LUGOL

RIBOSA

GLUCOSA

SACAROSA

FRUCTOSA

LACTOSA

GALACTOSA

V. DISCUSION DE RESULTADOS :

VI. CONCLUSIONES

VII. CUESTIONARIO: A. B.

Dibujar la molécula 3D de la glucosa, lactosa, galactosa, fructosa y sacarosa señalando las características químicas que permitan su identificación. Desarrolle las reacciones químicas de las diversas pruebas con los azucares problemas.

C.

Explicar brevemente qué función tienen los siguientes compuestos. Cu2+; H2SO4; Ácido pícrico; Ag+.

D.

Explicar una de las reacciones en condiciones de estado estacionario.

E.

¿por qué la sacarosa no reacciona con el reactivo de BENEDICT?

F.

¿A qué se refiere la isomería de los azúcares y cuáles son los tipos de isomería?

A.

VIII. BIBLIOGRAFÍA:

PRÁCTICA Nº 13 DETERMINACIÓN SEMICUANTITATIVA DE OLIGOFRUTANOS EN TUBEROSAS Los fructo-oligosaridos (fructanos) del tipo inulina, son polímeros de fructosa que presentan un residuo de glucosa generalmente en la extremidad de la molécula. Son compuestos asociados, estructural y metabólicamente la sacarosa, constituidos por series homólogas de oligosacáridos no reductores, donde cada miembro presenta un residuo más de fructosa que en el miembro anterior de la serie. Es bien conocida las bondades medicinales del yacón , ya que contiene un azúcar que no es asimilado por el organismo humano , lo que significa que transcurre sin metabolizarse , pero en el intestino grueso es utilizado por las bacterias para su metabolismo entonces el azúcar del yacón ayuda a incrementar la mico flora que se encuentra en la última parte del intestino grueso y al tener altas poblaciones de esas bacterias conocidas con el nombre de bifodibacterias permiten regularizar otras poblaciones de bacterias que se encargan de la perforación de los residuos que se encuentran en el intestino grueso. Estudios realizados en animales de experimentación con diabetes inducida, a los que se les suministró zumo de yacón, no mostraron alteraciones en la glucemia de estos animales. Esto se explica, porque la fructosa desaloja la glucosa del torrente sanguíneo hacia los tejidos; evitando así riesgos de hiperglucemia. Principio: la reacción se produce por condensación de un derivado furfúrico obtenido por la acción del ácido clorhídrico sobre la cetosa, con el resorcinol que contiene el reactivo.

I.

OBJETIVOS: •

Encontrar el pico de la máxima absorción y construir la curva de calibración para la cuantificación de los fructanos

•

Determinar cuantitativamente el contenido de fructanos en extracto de yacón.

•

Determinar las unidades estructurales de los frutanos

II. MATERIALES Y REACTIVOS: •

Muestra, zumo de yacón.

•

Mortero ó rallador.

•

Baño maría

•

Centrifuga o equipo de filtración.

•

Tubos de ensayo con su respectiva gradilla.

•

Pipeta graduada de 1, 2 y 5 mL.

•

Soluciones de fructosa de 0.6, 1, 1.2, 1.5 y 2 mg%.

•

Agua destilada.

•

Reactivo de seliwanoff

III.

PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL:

Cuantificación directa: •

Obtener el extracto de yacón, ya sea utilizando la centrífuga o el sistema de filtración.

•

Del zumo de yacón obtenida, separar 0.2 ml.

•

Preparar las soluciones de las diferentes concentraciones de fructosa para determinar la curva de calibración de la fructosa, guiándose del siguiente cuadro. gr de fructosa/ 100 mL

Tubos

blanco

0.6 g

1g

1.2 g 1.5 g

2g

Problema

Reactivo de Seliwanoff

2.0

2.0

2.0

2.0

2.0

2.0

2.0

Fructosa

--

0.2

0.2

0.2

0.2

0.2

--

Muestra de yacón

--

--

--

--

--

--

0.2

Agua destilada

3.0

2.8

2.8

2.8

2.8

2.8

2.8

Mezclar bien, llevar a baño maría hirviente por 5 minutos. Leer a 480 nm en el espectrofotómetro. Presentación de resultados:

Proceso de hidrólisis: Los enlaces glucosídicos de oligosacáridos o polisacáridos pueden ser digeridos por altas concentraciones de iones hidrógeno. A 2 ml de muestra añadir 1 ml de HCl 1N y hervir por 5 minutos. Hacer la prueba de reconocimiento de pentosas (Seliwanoff) y hexosas (con tartrato alcalino de cobre y ácido fosfomolíbdico). Para cuantificar fructosa se usa el cuadro anterior y para la cuantificar glucosa se usa el cuadro siguiente: preparar la siguiente batería de tubos

gr de glucosa / 100 mL Tubos

blanco

0,5 g

1g

1.2 g

1.5 g

2g

Problema

Tartrato alcalino de cobre

2.0

2.0

2.0

2.0

2.0

2.0

2.0

Glucosa

--

0.2

0.2

0.2

0.2

0.2

--

Muestra de hidrolizada

--

--

--

--

--

--

0.2

Agua destilada

3.0

2.8

2.8

2.8

2.8

2.8

2.8

Colocar en baño maría hirviendo por 8 min. Y luego enfriar a chorro de agua Agregar a todos los tubos 1 ml de reactivo ácido fosfomolíbdico Mezclar bien y dejar en reposo por 10 min y leer a 420 nm al espectrofotómetro

IV. RESULTADOS Hallar la cantidad de oligofructanos, fructosa y glucosa mediante el método analítico y gráfico y determinar la proporción entre glucosa y fructosa en los oligofructanos.

V. DISCUSIÓN DE RESULTADOS

VI. CONCLUSIONES

VII. CUESTIONARIO • Estimar la posible estructura molecular de los oligofructanos • cómo y a qué se llama azúcar invertido • qué otros métodos existen para cuantificar fructosa y glucosa. • El tiempo de ebullición y grado de temperatura influirá sobre los niveles de fructosa. Explique

VIII.

BIBLIOGRAFÍA

PRÁCTICA Nº 14 PROPIEDADES FÍSICAS Y QUÍMICAS DE LOS LÍPIDOS Los lípidos son sustancias constituidas fundamentalmente por C, H, O. El 95% de las grasas contenidas en los alimentos y en el cuerpo humano son triglicéridos, también veremos los fosfolípidos y el colesterol, que aunque están en pequeñas cantidades son muy importantes. Los lípidos son un grupo heterogéneo de compuestos que tienen la propiedad común de ser insolubles en agua pero solubles en solventes orgánicos tales como la propiedad común de ser insolubles en agua pero solubles en solventes orgánicos tales como la acetona, alcohol, cloroformo o benceno. Desde el punto de vista químico los lípidos pueden dividirse en lípidos simples (que por hidrólisis dan ácidos grasos y alcoholes) y los lípidos complejos (que pueden contener fosfato, diversos carbohidratos y a sustancias nitrogenadas, como esfingosina, etanolamina, y hexosaminas) Los ácidos grasos son elementos constituyentes esenciales de las grasas, sean estas de origen animal o vegetal, pudiendo ser saturadas o insaturados, los que con mayor frecuencia se encuentran en el organismo animal son: A)

Saturados: palmítico y esteárico.

B)

Insaturados: palmitoleico, oleico y el araquidónico.

I. OBJETIVOS: •

Reconocer las principales características fisicoquímicas de los lípidos.

•

Reconocer el comportamiento de los lípidos frente a diferentes solventes.

•

Demostrar la emulsificación de las grasa.

•

Reconocer la hidrólisis y formación de jabones en los lípidos.

II. MATERIALES Y REACTIVOS Materiales

III.

Reactivos

•

Tubos de ensayo

- Bencina

•

Gradilla

- Aceite de oliva

•

Pipetas de 1 y 2 mL.

- Solución de NaOH al 1%.

•

Hornilla eléctrica

- Solución de sales biliares.

•

Balón con reflujo

PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

A) Comportamiento de las grasas simples frente a diferentes solventes. FUNDAMENTO: La solubilidad de los lípidos en general depende de la relación numérica entre el número de los

grupos hidrófilos e hidrófobos de los ácidos grasos que lo constituyen, los grupos hidrófilos están representados por el grupo carboxílico de la cadena del ácido graso, mientras que los grupos hidrófobos, están representados por el resto de la cadena carbónica, lo que significa que cuanto más larga sea la cadena constitucional del ácido, la relación entre los grupos mencionados será tanto menor y menos soluble, en agua será el ácido graso. La solubilidad en los solventes orgánicos por el contrario depende de la afinidad del solvente por la cadena carbónica no funcional. Tomar 4 tubos de ensayo y trabajar como se indica en el siguiente cuadro: Componentes

1

2

3

4

2 mL

-

-

-

Alcohol frío (mL)

-

2 mL

-

-

Alcohol caliente (mL)

-

-

2 mL

-

Bencina (mL)

-

-

-

2 mL

0.5

0.5

0.5

0.5

Agua destilada (mL)

Aceite de oliva(mL)

Agitar enérgicamente cada uno de los tubos y dejar en reposo. RESULTADOS:

B) Emulsificación de las grasas FUNDAMENTO: Cuando se agrega aceite a una cantidad de agua y se agita enérgicamente, se forma pequeñas gotitas de grasa que rápidamente tienden a confluir para formar un agregado mayor, si se agrega una cantidad de álcali, NaOH, al agitarse, se forma una cantidad de jabón sódico, que actúa como sustancia tensioactiva y favorece la formación de pequeñas gotitas de grasa, y el agua que los circunda, en forma tal que el ión sodio y el grupo hidrófilo COO-, del jabón disociado están en contacto con el agua, mientras que el grupo no activo del jabón, no soluble en agua está en contacto con la grasa, formando una verdadera película que estabiliza la emulsión formada. Tomar tres tubos de ensayo y proceder como se indica a continuación: componentes

1

2

3

Agua destilada

5 mL

5 mL

5 ml

Sol. NaOH 1%, ml

-

0.3 ml

-

Sol. De sales biliares

-

-

2 mL

Aceite de oliva

0.5

0.5

0.5

Agitar enérgicamente, dejar en reposo y observar lo que sucede. RESULTADOS:

C) Formación de jabones: FUNDAMENTO: Las grasas simples son ésteres de los ácidos grasos con el glicerol, debido a esto es posible realizar la hidrólisis, que consiste en la separación de ambos componentes por acción de temperaturas altas y de catalizadores, cuando dicha hidrólisis se realiza utilizando álcalis tipo NaOH, se tiene la denominada saponificación, la saponificación de diferencia de la simple hidrólisis, porque en ella se forma la sal sódica del correspondiente ácido graso. A estas sales se les denominan jabones, que se caracterizan por ser solubles en agua y por actuar sobre la tensión superficial, disminuyéndola, el experimento tiene varias fases, correspondientes a: 1.

Formación de jabones

2.

Separación de los ácidos grasos

3.

Separación de glicerol

Formación de jabones:

•

En un balón pequeño para adaptación de condensador de reflujo, colocar:

Manteca de cerdo, 2. g Solución alcohólica de KOH 15 mL (lo suficiente aprox. 15 ml) •

Adaptar el condensador de reflujo, una vez hechas las conexiones correspondientes, colocar en un baño de agua hirviente por una hora, durante este tiempo correspondientes, colocar en un baño de agua hirviente por una hora, durante este tiempo se agita continuamente la mezcla.

•

Una vez cumplido el tiempo de ebullición, agregar 15 mL de agua destilada y mezclar.

Precipitación salina: Se añaden 20 mL de agua a unos 5 mL de la solución jabonosa obtenida por saponificación añadirle cloruro de sodio hasta saturación (alrededor de 5 g) Anote las propiedades físicas del jabón que se separa. Jabones insolubles: Con la mezcla de saponificación obtenida realizar las siguientes pruebas: Componentes

1

2

3

Mezcla saponificada

5 mL

5 mL

5 mL

Sol. De CaCl2 10%

-

1 mL

-

Sol. De MgCl2 10%

-

-

1 mL

Mezclar y dejar en reposo, observar lo que sucede en cada uno de los tubos de ensayo. RESULTADOS

D) Hidrílisis de Triglicéridos

•

Separación de los ácidos grasos.

Se realiza a partir de los jabones obtenidos en la fase anterior por simples reacciones de desplazamiento. 1. Someter a evaporación la mezcla jabonosa, hasta obtener un volumen igual a la mitad, para ello utilizar un baño de agua hirviendo, pues siendo el objeto eliminar alcohol, sería peligroso hacerlo a la llama. 2. Agregar 100 mL de agua destilada, mezclar, agregar dos gotas de rojo fenol y neutralizar o acidificar ligeramente con una solución de ácido clorhídrico. 3. Calentar ligeramente, hasta la formación de una capa superior nítida de ácidos grasos. 4. Filtrar, utilizando un embudo y papel de filtro fino, el filtrado se guarda, servirá para preparar glicerol, se lavan estos ácidos haciendo pasar a través del filtro que contiene una cantidad adecuada de agua destilada, este líquido de lavado se colecta junto con el filtrado anterior, pues contiene algo de glicerol. Explicar las reacciones que se llevan a cabo durante la obtención de ácidos grasos. •

Separación del glicerol:

Se hace a partir de los jabones obtenidos es la fase anterior. 1. Controlar la acidez del líquido anterior, y si es necesario acidificar ligeramente, con solución de ácido clorhídrico. 2. Evaporar a sequedad, agregar 20mL de alcohol etílico absoluto, extraerá el glicerol, separar por decantación, quedarse con la parte líquida. 3. Evaporar el líquido decantado en un baño de agua hirviendo, de esta manera queda un residuo pequeño de glicerol. 4. Para comprobar que efectivamente se ha aislado glicerol proceder de la siguiente manera: En un tubo de prueba colocar: bisulfito de potasio 0.5 g más una pequeña cantidad de producto aislado. Someter a la acción del calor, directamente a la cantidad de producto aislado. Someter a al acción del calor, directamente a la llama de un mechero, hasta el desprendimiento de humos de olor irritante y característico de la acroleína, repetir la misma prueba con una solución de glicerol y con unas gotas de aceite de oliva. RESULTADOS

IV. DISCUSIÓN DE RESULTADOS

V. CONCLUSIONES

VI. CUESTIONARIO •

Con relación al experimento nº 01

1. ¿cuál o cuales son las diferencias que resaltan al usar los cuatro solventes diferentes. Explique a nivel molecular? 2. ¿existe alguna diferencia entre los resultados obtenidos en el tubo 2 y 3. Explique a nivel molecular? 3. ¿cuál sería la razón que explique tal diferencia, si la hubiera? •

Con relación al experimento nº 02:

1. ¿cuáles son las diferencias encontradas? 2.

Explicar el mecanismo por el cual actúan las sales biliares.

3. Representar esquemáticamente la explicación teórica de la acción del NaOH. 4. ¿qué importancia biológica tendrá el conocimiento del fenómeno de emulsificación? 5. ¿Qué sucede en el organismo? 6. ¿existen sustancias tensioactivas en el organismo y cuáles son?, ¿Dónde ejercen su mayor actividad? •

Con relación al experimento nº 03:

1. ¿qué diferencias pueden notarse entre los tubos 1 y 2 a que se debe si hubiera diferencias? 2. Mediante ecuación química explicar la transformación del glicerol en acroleína.

VII.

BIBIOGRAFÍA

PRÁCTICA Nº 15 VITAMINAS HIDROSOLUBLES Y LIPOSOLUBLES (ÁCIDO ASCÓRBICO Y BCAROTENOS) Las vitaminas son compuestos orgánicos presentes en concentraciones pequeñas en los alimentos. En general el cuerpo no las sintetiza, por lo que su ausencia u absorción inadecuada produce enfermedades carenciales o avitaminosis específicas. El ácido ascórbico y su forma oxidada el ácido dehidroascórbico se encuentran ampliamente en las plantas y tejidos animales. El ácido ascórbico es la forma de presentación más común en la naturaleza, especialmente en las frutas cítricas. Es una sustancia cristalina, soluble en agua, alcohol, e insoluble en éter y benceno; se destruye por efectos de la oxidación, el calor y el cocimiento de los alimentos. Desempeña funciones en el sistema inmunitario y el requerimiento diario oscila entre 50 a 70 mg/d. Los carotenoides son pigmentos hidrocarbonados de naturaleza tetraterpenoide, actúan como provitaminas que se convierten en vitamina propiamente dicha (vitamina A) en el interior de la pared intestinal. Los carotenoides por lo general presentan color desde el amarillo hasta el rojo pero también hay terpenoides incoloros como el fitoeno, fitoflueno. Principalmente se encuentran ubicados en la clorofila donde amplían las longitudes de onda a absorber. II. OBJETIVOS: •

Cuantificar el contenido de B- carotenos en hortalizas a través de métodos colorimétricos.

•

Determinar cuantitativamente el contenido de ácido ascórbico de diferentes muestras

•

determinar la relación de ácido ascórbico de las muestras presentes

III. MATERIALES

IV.

REACTIVOS

•

Vasos de 50 y 100 mL (2)

- Alcohol de 95º

•

Matraz de 50 mL (3)

-

Eter de petróleo o bencina

•

Probeta de 250 ó 500 mL

-

Patrón artificial de B- caroteno

•

Embudo

-

Solución valorada de yodo a Pipetas 0,1N

•

Bureta de 10 mL

-

Indicador: engrudo de almidón al 1%

•

Tubos de centrífuga

•

Centrífuga

•

Bagueta

-

Zumo de frutas cítricas.

•

Balanza

-

zanahoria, zapallo, tomate.

•

Rallador

•

Baño maría a 80 ºC

•

Espectrofotómetro

MUESTRAS

VI. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL.

a. Determinación de B-carotenos. •

Pesar 1 g. de muestra rallada o triturada, colocar en un vaso. Agregar 5 ml de etanol y 10 ml de bencina.

•

Agitar por 5` con la ayuda de la bagueta. Trasvasar todo a un tubo de centrífuga(en lo posible tapar el tubo) y centrifugar a 3000 r.p.m. Por 5`.

•

trasvasar la capa etérea a un tubo graduado y reducir el volumen por calentamiento suave (baño maría), hasta concentrar a 5 ml. Enfriar.

•

Leer en el espectrofotómetro a 420 nm contra un blanco constituido por éter de petróleo.

•

La lectura de la solución de bicromato se hace empleando el mismo filtro contra una blanco de agua destilada.

b. Determinación de ácido ascórbico. (método Iodométrico) La vitamina C es un reductor energético, los oxidantes suaves lo transforman en ácido dehidroascórbico, reacciona cuantitativamente con yodo, en exceso del reactivo. Titulante, el punto final puede detectarse con el indicador engrudo de almidón que origina un color azul con un exceso de yodo. •

Obtener el zumo de toda la fruta, pasar por un filtro y medir la cantidad total del fruto con la ayuda de la probeta.

•

Tomar 10 ml y agregar 1ml de solución de yodo al 1%.

•

Titular con una solución de yodo normalizado hasta una coloración azul transparente. Anotar el gasto.

VII. RESULTADOS: A. CÁLCULOS DE B- CAROTENO El bicromato de potasio 20 mg%. El color equivale a 112 Ug de B-caroteno por 100 ml de extracto etéreo. Conservarse al abrigo de la luz. Con la cual utilizamos la ecuación.

Estimar el contenido total de B-caroteno de la muestra empleando regla de tres simple.

B. CÁLCULOS DE ÁCIDO ASCÓRBICO.

Donde: N = normalidad del yodo Peq = Peso equivalente del ácido ascórbico. G = gasto total del yodo Estimar el contenido total de ácido ascórbico de la muestra mediante regla de tres simple.

IX. DISCUSIÓN DE RESULTADOS

IX. CONCLUSIONES:

X. CUESTIONARIO : 1. Describa brevemente la conversión del B-caroteno a vitamina A. 2. Cuales son los signos de las carenciales por deficiencias de vitamina A. 3. Describa brevemente el ciclo bioquímico del proceso de la visión. 4.

Grafique la estructura molecular del ácido ascórbico y mencione el nombre mediante la I.U.P.A.C. Indique los extremos aniónicos.

5. Describa el proceso bioquímico de la síntesis de ácido ascórbico en las plantas. 6. Describa la transformación de ácido ascórbico a vitamina C.

XI. BIBLIOGRAFÍA:

BIBLIOGRAFÍA •

Guía de prácticas de Bioquímica I semestre 2008 I, Biología

•

Guía de prácticas de Bioquímica II semestre 2007 II, Biología

•

Guía de prácticas de Bioquímica II semestre 2008 II, Biología

•

Guía de prácticas de Físico-química. Ing. Química.

•

Sanchez L; 1995, “Instrumentación en Bioquímica” Concytec, Lima Perú.

•

“Principios de bioquímica”; David N. Nelson; Michael M. Cox. Tercera edición. editorial Omega. Barcelona 2003.

“NUNCA LO OLVIDES: SOMOS EL REFLEJO DE NUESTROS PENSAMIENTOS” J.Cl.