Guía de Laboratorio de Microbiología 2015

MICROBIOLOGIA AMBIENTAL

NORMAS DE TRABAJO EN EL LABORATORIO Es importante que el estudiante desarrolle una actitud positiva y respetuosa hacia los microorganismos y su trabajo con ellos. El mal manejo de una técnica puede causar la contaminación en su prueba e infecciones en usted; en particular cuando se trabaja con patógen patógenos os en potenci potencia. a. En el laboratori aboratorio de microbiol crobiolog ogíía es necesario ecesario observar observar ciertas ciertas normas normas que harán harán de su trabajo prácti prác tico, co, una una labor efectiva efectiva y sin riesgo.

1. En cada clase práctica es obligatorio el uso de mandil blanco y limpio, cabello recogido (señoritas).

2. Antes de la realización de una práctica debe leer cuidadosamente el o los ejercicios a desarrollar. mantener la mesa de trabajo lilibre de materi ater iales no necesarios. 3. Debe mantener

4. Es prohibido fumar, comer o aplicar cosméticos mientras permanece en el labo aboratorio ratorio de microbi crob io logía. lo gía.

5. Al inicio y término de cada trabajo práctico deberá desinfectar cuidadosamente su área de trabajo.

6. Cuando manipule cultivos de microorganismos, trabaje siempre bajo la protección de un un mechero mechero y sin corrientes de aire. aire.

7. Esterilicemos instrumentos de metal (asas de siembra, pinzas, etc.)siempre antes y después desp ués de utiliz utilizar arlos los con microorgan croo rganiis mos.

8. En caso de accidentes, tales como cortes en las manos, quemaduras, salpicaduras de cultivos vivos o absorción de material contaminado repórtelo inmediatamente al jefe de prácticas prácticas de laboratorio. laboratorio.

9. Todo material utilizado en la práctica con posible contaminación deberá ser colocado en recipientes especiales .Los papeles de desecho serán descartados en el tacho disponible.

10. Al término de cada sesión de prácticas y antes de salir del laboratorio lávese las manos con jabón y desinfécte desinféctelas las con alcohol. alcohol.

NORMAS DE TRABAJO EN EL LABORATORIO Es importante que el estudiante desarrolle una actitud positiva y respetuosa hacia los microorganismos y su trabajo con ellos. El mal manejo de una técnica puede causar la contaminación en su prueba e infecciones en usted; en particular cuando se trabaja con patógen patógenos os en potenci potencia. a. En el laboratori aboratorio de microbiol crobiolog ogíía es necesario ecesario observar observar ciertas ciertas normas normas que harán harán de su trabajo prácti prác tico, co, una una labor efectiva efectiva y sin riesgo.

1. En cada clase práctica es obligatorio el uso de mandil blanco y limpio, cabello recogido (señoritas).

2. Antes de la realización de una práctica debe leer cuidadosamente el o los ejercicios a desarrollar. mantener la mesa de trabajo lilibre de materi ater iales no necesarios. 3. Debe mantener

4. Es prohibido fumar, comer o aplicar cosméticos mientras permanece en el labo aboratorio ratorio de microbi crob io logía. lo gía.

5. Al inicio y término de cada trabajo práctico deberá desinfectar cuidadosamente su área de trabajo.

6. Cuando manipule cultivos de microorganismos, trabaje siempre bajo la protección de un un mechero mechero y sin corrientes de aire. aire.

7. Esterilicemos instrumentos de metal (asas de siembra, pinzas, etc.)siempre antes y después desp ués de utiliz utilizar arlos los con microorgan croo rganiis mos.

8. En caso de accidentes, tales como cortes en las manos, quemaduras, salpicaduras de cultivos vivos o absorción de material contaminado repórtelo inmediatamente al jefe de prácticas prácticas de laboratorio. laboratorio.

9. Todo material utilizado en la práctica con posible contaminación deberá ser colocado en recipientes especiales .Los papeles de desecho serán descartados en el tacho disponible.

10. Al término de cada sesión de prácticas y antes de salir del laboratorio lávese las manos con jabón y desinfécte desinféctelas las con alcohol. alcohol.

Equip Equipos os y mate materi riale aless para para e l Laboratorio Laboratorio de Microbiología. Microbiología. 1. Guía de Laboratorio. 2. Guardapolvo blanco juegos de láminas áminas porta y cubre objetos o bjetos (en estuche) 3. Dos juegos siembra (o asa de Kol Ko lle) 4. Un asa de siembra

5. Una pinza simple. 6. Lápiz marcador de vidrio 7. Encendedor o fósforos. 8. Papel toalla 9. Algodón 10. Alcohol. Observación de Bacterias. Las formas bacteriana s pueden ser examinadas al microscopio de dos maneras: observando muestras frescas de células vivas, y observando célula muertas teñidas con ciertos colorantes .Las bacterias vivas carecen de color en preparaciones acuosas ,mientras que en preparaciones teñidas , aumentan su contraste con el medio circundante y se hacen más visibles. El distinguir claramente la estructura bacteriana permite la mejor diferenciación celular interna y la determinación de tipos morfológicos existentes. En microbiología resultan de uso frecuente para la observación de microorganismos las tinciones simples, diferenciales y las tinciones de estructuras.

Tinción de bacterias. Para entender como tiñen un colorante la célula bacteriana, debe entenderse en esencia que es un colorante .La mayoría de ellos constituyen sales en las cuales uno de los iones presenta un color. Una sal es un compuesto formado por un ión cargado positi positivvamen amente te y uno cargado cargado negat negatiivamen vamente te .Un coloran colorante te sim simple ple como como el azu azul de metil etileno, eno, química químicamen mente te constituye la sal cloruro cloruro de azul de metileno metileno que se disocia disoc ia como c omo sigue sigue :

Cloruro Cloruro de azul azul de me me tileno = Azul Azul de me me tileno tile no + Cloruro Cloruro-

El color del azul de metileno reside en el ión cargado positivamente. Las células bacterianas tienen por lo general una superficie cargada negativamente cuando el pH del medio circundante es cercano a la neutralidad, como generalmente ocurre. La célula cargada negativamente se combina con el ión positivo del azul de metileno, cristal violeta, verde malaquita, safranina, etc.). Si el olor reside en el ión negativo, se le denomina colorante ácido (eosina, etc.).

PRÁCTICA N° 1 AMBIENTE Y MATERIALES DE LABORATORIO Objetivo: 

Conocer los diferentes ambientes de laboratorio de microbiología e identificarlos.



Reconocer los distintos materiales de laboratorios de microbiología y comprender sus utilidades, así como de los equipos.

Fundamento. El ambiente de laboratorio El laboratorio de microbiología debe ser un ambiente aislado y protegido de contaminación ya sea física química o biológica. En el laboratorio se deberán de ubicar las siguientes salas o ambientes:

1. Aula, auditorio, o sala de reuniones: Será usado para desarrollar todo lo relacionado a discusiones, exposiciones, y dialogo respecto al trabajo en el laboratorio, así como de actividades académicas.

2. Sala de ejecución de pruebas y análisis microbiológicos : Principalmente debe poseer las mesas de trabajo. Debe estar protegido de contaminación y sólo podrá ingresar a él personal autorizado y de acuerdo a reglas y normas establecidas (las descritas anteriormente)

3. Cubículo de análisis : Se encuentra cerrado y equipado de luz UV la cual estará encendida mientras no se encuentre el personal laborando en él y apagada cuando ingrese el personal (altamente restringido). En este ámbito, que debe mantenerse estéril se ubicarán los materiales y se desarrollarán los análisis por experiencia.

4. Sala de lavados y de preparación de medios de cultivo y reactivos. Aquí se preparan los materiales necesarios para realizar las pruebas. Dentro de esta sala puede ubicarse el almacén. El almacén debe estar dividido en dos ambientes uno para guardar los medios de cultivo y reactivo y otro para almacenar los materiales de análisis.

5. La oficinas:

Generalmente ubicada a la entrada de laboratorio. El suelo en general debe ser de un material de fácil limpieza y que evite los accidentes, como por ejemplo: losetas. A la entrada de la sala de ejecución de pruebas se recomienda tener un depósito con líquido desinfectante para el calzado o botas de goma si se tienen.

Materiales de laboratorio Materiales de vidrio. Deben poseer las siguientes características : 

Poseer bajo coeficiente de dilatación, de modo que resistan los cambios bruscos de temperatura.



Deben ser de vidrio neutro, o con mínima cantidad de álcali libre de modo que no intervengan en las reacciones.



Resistentes a la acción mecánica.



Transparentes

y sin ralladuras de modo que permitan visualizar los eventos que

ocurren en su interior. 

Entre los principales materiales se encuentran los siguientes: 

Tubos de ensayo o de prueba: Son de forma cilíndrica abierto por uno de sus extremos y resistentes al calor, presión y fuego directo. Existen de diversos tamaños: los mas grandes sirven para depositar mayor volumen de muestra o medio de cultivo, los alargados para poseer un mayor espacio o superficie de observación (ver efectos de un medio cultivo), los de tamaño regular, para una mayor comodidad y los mas pequeños para realizar pruebas bioquímicas de determinadas microorganismos, como sembrado. En general sirven para conservar medios de cultivo y hacer diluciones.



Probetas: Son de vidrio de base plana y cuerpo cilíndrico graduado, se le emplea para medir volúmenes de líquidos y sólidos amorfos.



Pipetas:

Es un material de vidrio pirex de diámetro reducido y se llena por succión. Existen de 3 tipos :aforadas o volumétricas , con émbolo o en rase y graduadas ,estas ultimas mas usadas .Sirven para medir volúmenes de líquidos que requieren gran presión agregados a

medios de cultivo y hacer diluciones . Deben estar

tapadas con algodón 

Matraz: Recipiente de vidrio cónico resistente con diámetro mayor en las base que en la parte superior. El mas usado es de tipo erlenmeyer, que sirven para preparar cultivos y medios de cultivo (se tapa con algodón).



Placas Petri: Recipientes de vidrio pirex compuestos por una base y una de diámetro variable. Se utilizan para preparar medios de cultivo y sembrar microorganismos, en ese caso la base debe estar con la tapa.



Espátula de Drigalski: Material de vidrio o de metal que sirve

para homogenizar las siembras por

extensión realizadas en placas petri. 

Asa de kolle: Material de metal con asa de vidrio o material aislante que sirve para transportar con la argolla un liquido a otra superficie o para extraer muestras (sembrar) y colocarlos en otro medio y para hacer repiques.



Tubos Durham: Son de tubos de vidrio muy pequeños (2-3 cm. de largo por 5-6 mm de ancho) que se introducen boca abajo en un medio de cultivo que contiene microorganismos para comprobar la formación de gas por parte del microbio. Al incesar el tubo este no debe contener gas cuando este en el interior.



Láminas Porta y cubre objeto y porta objetos escavados: Son placa de vidrio de formas rectangulares, las primeras más grandes que las segundas y más gruesas, que sirven para preparar muestras para ser observadas e el microscopio. Existen lámina porta objetos escavadas, que poseen una escavadas, que poseen una excavación en las que se depositan muestras destinadas a ser

visualizadas a gota pendiente (para ello se usa la lente de inmersión, de mayor alcance) 

Beacker o vaso de precipitación: Son vasos de vidrio graduados que permiten medir volúmenes de líquidos con cierta aproximación. Siendo la más exacta la probeta.



Fiola aforada: Recipiente de vidrio de cuelo largo con un aforo que marca un volumen exacto y de base dilatada. Se emplea en análisis químico cuantitativo para obtener soluciones de determinadas concentraciones.



Matraz de Kitasato o de filtración al vacío. Es igual al matraz Erlenmeyer pero difiere en que la parte del cuello posee un orificio lateral de salida a la cual se coloca una bomba succionadora, sirve para realizar filtraciones al vacío.



Embudo de Buchner: Construido generalmente de porcelana, poseen un vástago corto y agujeros en la parte céntrica sobre el cual se coloca un papel filtro. Se le utiliza para realizar filtraciones al vacío.



Frasco Gotero y Cuenta gotas El primero de vidrio con una tapa que posee un pico que permite dejar caer el líquido que contiene el frasco de gota a gota. El segundo es un tubo de vidrio corto y delgado que en un extremo se adapta una perilla con bombilla de goma y en el otro s encuentra estrangulado, se le utiliza para agregar pequeñas cantidades (gotas de un líquido o reactivo).



Espátula: Instrumento de forma plana, largado de metal, y borde afilado. Sirve para coger, trasladar o transportar muestras sólidas o reactivos químicos puros, así como medios de cultivo para pesarlos o colocarlos en otro medio.

De Material Diverso



Trípode: Instrumento de metal compuesto por un anillo de metal circular apoyado sobre tres patas equidistantes. Sirve como instrumento de soporte sobre el cual se coloca la malla metálica y debajo del mechero Bunsen en operaciones de calentamiento.



Mechero de Bunsen: Instrumento de metal conectado a una fuente de gas y que consta de dos llaves, una que controla el paso del aire y otra el paso de gas con el fin de conseguir una llama no luminosa, la cual, se utiliza para esterilizar otros materiales.



Malla metálica con amianto: Es una malla compuesto por varios alambres entrelazados que posee en la parte central una sustancia llamada asbesto. Se lo utiliza en operaciones de calentamiento, permite difundir la llama a lo largo del asbesto con lo que se logra un calentamiento moderado y se evita el contacto directo del fuego y la sustancia a calentar.

Equipos 

Autoclave: Cámara metálica de cerrado hermético que sirve para esterilizar materiales y eliminar muestras a vapor de presión .Posee un manómetro para controlar la presión del vapor. En el interior se ubica una olla sostenida por un soporte, debajo de ella se coloca el agua que al hervir desprende el vapor (El agua debe ser agua destilada o desionizada).



Estufa u Horno Pasteur: Sirve para incubar microorganismos que requieren una temperatura de 20°- 200°C o 30-300°C, así como para esterilizar materiales



Incubador: Cámara similar aun horno que sirve para incubar microorganismos en medios de cultivo que requieren temperaturas que varían entre los 0-50 °C.



Jarra de anaerobiosis: Es una cámara que se utiliza para incubar microorganismos que necesitan condiciones anaerobias, esta jarra no permite la entrada de oxigeno.



Baño maría:

Equipo que mantiene la temperatura constante en un rango de 0-150 °C. Permite dar un calor indirecto para disolver medios de cultivos sólidos o mantener los líquidos. 

Microscopio: Instrumento que permite amplificar los microorganismos de modo que puedan visualizarse, funcionan en base a la luz natural o artificial.



Contador de colonias: Equipo pequeño que facilita el conteo de microorganismos cultivados en placas petra.



Balanza analítica o metálica: Equipo muy sensible que permite calcular las más pequeñas cantidades de colorantes, medios, entre otros materiales.



Agitador magnético. Sirve para conseguir una mejor homogenización de una sustancia en u recipiente cerrado o abierto. En el caso de un agitador magnético consta de un equipo y una capsulita magnética, la capsulina se introduce en la solución y gira al prenderse el equipo homogenizando así la solución.



Centrífuga: Equipo que al girar un aparato interno permite aislar células microbianas del medio en el que se encuentra al quedar adheridas a la pared.

F i gura 1. Equipo de laboratorio.

PRÁCTICA N°2 PREPARACIÓN DE MATERIALES Y MEDIOS DE CULTIVO PARA ESTERILIZAR Objetivo: 

Aprender a preparar los materiales de vidrio para la esterilización como

su

posterior utilización. 

Comprender la importancia de la esterilización así como la protección de los materiales contra la contaminación microbiana.

Introducción. Existen Varios tipos de medios de acuerdo a las necesidades nutricionales particulares. Al preparar un medio de cultivo para el crecimiento de microorganismos debe tenerse en consideración el proveer de las fuentes de energía, carbono, nitrógeno, fósforo, azufre y de los factores de crecimiento que sean necesarios. En la formulación de los medios de cultivo podemos distinguir entre medios definidos y complejos. El medio definido Provee de los nutrientes requeridos para el crecimiento en la forma de compuestos químicos de concentración conocida .Por ejemplo un medio definido para un heterótrofo como Escherichia coli puede ser compuesto de NH4Cl, MgSO4, KH2PO 4, Na2 HPO4 y glucosa. Otros elementos como fierro, manganeso y cobre están generalmente presentes como contaminantes de los compuestos químicos en cantidades adecuadas para el crecimiento. El medio complejo Contiene todos los nutrientes necesarios para el crecimiento de microorganismos pero ellos están contenidos en ingredientes crudos, es decir, que no todos los componentes del medio ni sus concentraciones exactas son conocidas .Ingredientes de este tipo son los extractos de la levadura, de carne, los hidrolizados de proteínas (peptona, tristona), que constituyen fuentes de polipéptidos aminoácidos, vitaminas, algunos carbohidratos, etc.

De acuerdo al tipo de microorganismo que se quiera cultivar de los medios pueden clasificarse como: 

Comunes:

-Permiten

el

crecimiento

indiscriminado

de

todo

tipo

de

microorganismos. Ejemplo: Agar nutritivo, Caldo nutritivo, Agar gelatina, etc. 

Especiales:

-Son formulados teniendo en cuenta exigencias nutricionales diversas o

características bioquímicas determinadas. Pueden considerarse medios enriquecidos o mejorados, selectivos y diferenciales. 

Medios mejorados o enriquecidos: -Son aquellos a los que se les agrega determinadas sustancias nutritivas (sangre, yema de huevo, suero, etc.) y con ello estimulan las exigencias nutritivas de ciertos microorganismos. Ej. Agar sangre, Caldo selenito, etc.



Medios selectivos: -Se caracterizan porque se incluyen sustancias que favorecen el crecimiento de determinadas especies y sustancias que inhiben el crecimiento de otras no deseadas. Ej .Agar salmonella Shigella, Agar Bismuto sulfito, etc.



Medios de diferenciación: -Ponen de manifiesto algunas propiedades bioquímicas del microorganismo, como formación de gas, cambios en le pH, etc. Los cambios de pH se evalúan incorporando indicadores en el medio y se determinan de acuerdo al rango en

estudio. Ej. .Medios azucarados

como: Caldo glucosado, Caldo

Lactosado, Kligler, etc. Frecuentemente los medios selectivos y diferenciales se deben usar juntos para aislar e identificar especies a la vez. Algunos medios tienen incorporados los ingredientes convenientes para este doble propósito y resultan de gran utilidad y economía .Ej. .Agar Manitol salado, Agar Mac Conkey, etc. Dependiendo de la técnica de cultivo elegido, los medios mencionados anteriormente pueden ser preparados como líquidos o sólidos .Los medios mencionados anteriormente pueden ser preparados como líquidos o sólidos. Los medios líquidos contienen los nutrientes y otros elementos en una solución acuosa que generalmente recibe el nombre de caldo; los medios sólidos contienen además un agente solidificante llamado agar que se utiliza para dar parte del nombre del medio e identificarlo como sólido. El agar es un polisacárido complejo derivado de un alga marina y posee características muy útiles

para microbiología. Muy pocos microorganismos degradan el agar de tal manera que aún después de un periodo de crecimiento, el medio con agar se mantiene sólido .El agar se funde a 90°C o al punto de ebullición del agua y permanece en estado líquido hasta que la temperatura desciende hasta aproximadamente 40°C. Una vez preparado el medio de cultivo líquido o sólido debe ajustarse al pH adecuado, disponerse en un recipiente de vidrio resistente al calor, (Tubo o matraz) y protegerlo con un tapón de algodón o material plástico que permita el intercambio de gases y que impida el ingreso de otros microorganismos. El medio de cultivo así dispuesto debe ser esterilizado en autoclave a 121 °C bajo 15 lb. de presión de vapor por 15 minutos. En caso de contener ingredientes termolábiles, pueden emplearse otros métodos de esterilización como la filtración. 

EJERCICIO 1

Objetivo. 

Preparar y esterilizar medios de cultivo de diferentes características para el cultivo de microorganismos.

Materiales. -

Medos de cultivo o ingredientes deshidratados

-

Agua destilada o desionizada

-

Algodón, gasa

-

Balanza

-

Erlenmeyers de 250 y 500 ml

-

Espátulas

-

Lápiz marcador de vidrio

-

Papel indicador de pH

-

Papel aluminio y papel corriente no absorbente

-

Pipetas graduadas

-

Probetas de 100 ml

-

Tubos de ensayo

Procedimiento a. Caldo nutritivo (extracto de carne, 0.3 % y peptona, 0.5 %) 1. Utilizando un trozo de papel aluminio pese cuidadosamente la cantidad de medio deshidratado suficiente para prepara 100ml de caldo nutritivo.

2. Coloque el polvo en un Erlenmeyer de 250 ml limpio y seco, y agregue cuidadosamente el agua destilada medida en la probeta.

3. Mezcle la preparación con movimientos giratorios hasta la completa disolución. 4. Elabore tapones de algodón para 15 tubos. 5. Distribuya el medio líquido con una pipeta graduada a razón de 5 ml en cada tubo.

6. Coloque los tubos los tapones de algodón evitando que queden flojos o muy compactos.

7. Disponga los tubos en un contenedor resistente al calor, envuélvalos con papel, identifíquelos con el nombre del medio, la fecha de preparación y el nombre de la persona responsable en la elaboración.

8. Esterilice los tubos con medio en un autoclave a 121 °C (15 lb. de presión) durante 15 minutos.

b. Agar nutritivo (Extracto de carne de 0.3; peptona, 0.5 %; agar, 1.5%) 1. Prepare 200 ml de caldo nutritivo. (repita los pasos 1,2 y 3 del procedimiento anterior con la corrección en el peso para la nueva cantidad solicitada y en le erlenmeyer a usar, debe tener unas tres veces el volumen que tendrá el medio).

2. Agregue 3 g de agar (1.5 %), y lleve a licuar en baño de agua a ebullición hasta que el medio luzca transparente a la luz.

3. Elabore tapones de algodón para unos 16 tubos. 4. Una vez licuado el medio, déjelo enfriar ligeramente y distribúyalos en los tubos con una pipeta graduada .Prepare 6 tubos con 12 ml y 10 tubos con 7 ml.

5. Repita los pasos 6, 7, 8 del procedimiento anterior. 6. El medio restante debe ser acondicionado para su esterilización junto a lo anterior.

c. Agar mac conkey (peptona, 1.7 %; proteosa – peptona, 0.3 %; lactosa,1%, sales biliares,0.15%; NaCl, 0.5%; agar, 1.5%, rojo neutro, 0.003%, cristal violeta, 0.0001 %)

d. Agar manitol salado (Extracto de carne 0.1 %; proteosa – peptona, 1.0 %; NaCl, 7.5%; manitol, 1.0%; agar, 1.5%, rojo fenol, 0.0025%)

1. Pese la cantidad d medio deshidratado necesario para preparar 100 ml de cada uno. Observando la formulación de cada medio comprobará que los pesos a realizar son distintos.

2. Coloque el polvo de cada medio en Erlenmeyers de 25. ml y llévelos a licuar en baño de agua caliente hasta la completa disolución del agar.

3. Elabore tapones de algodón para cada erlenmeyer.Luego de colocarlos cubra los recipientes con papel e identifique el material con el nombre del medio, fecha de elaboración y el nombre de la persona responsable de su preparación.

4. Esterilice en autoclave a 121 °C por 15 min. e. Agar almidón (Peptona, 1%; K 2HPO4 ,0.5 %; almidón, 0.3%;agar, 1.5%). 1. Pese cuidadosamente el almidón necesario para preparar 100 ml de medio. 2. Coloque el polvo en un Erlenmeyer de 250 ml con un volumen pequeño de agua destilada que ha medido en la probeta.

3. Caliente el recipiente con el almidón agitando constantemente hasta su disolución.

4. Pese el resto de los ingredientes y agréguelos con la cantidad de agua destilada restante.

5. Licue el medio al baño de agua cliente hasta la completa disolución del agar. Deje enfriar ligera mente y ajuste el pH.

6. Coloque en el Erlenmeyer un tapón de algodón a la medida, cubra con papel, etiquete el material y esterilice a 121 °C por 15 min.

f. Agar gelatina (Peptona ,0.1%; extracto de levadura ,0.3%; gelatina, 0.4%; agar, 1.5%).

1. Pese cuidadosamente la cantidad necesaria de cada ingrediente para preparar 100 ml de medio.

2. Coloque los ingredientes en un esrlenmeyer de 250 ml y agregue agua destilada medida en probeta.

3. Lleve el recipiente a licuar en baño de agua en ebullición hasta la completa disolución del agar. Deje enfriar ligeramente y ajuste el pH a 7.0.

4. Acondicione su medio para esterilización como en los procedimientos anteriores. Esterilice en autoclave a 121 °C por 15 minutos.

Cuestionario. 1. ¿Cuales son las ventajas de los medios complejos para el cultivo de microorganismos?

2. ¿Por qué no es necesario ajustar el pp. en el caldo nutritivo y sí lo es en el agar almidón?

3. Determine la naturaleza química y la función nutritiva de cada uno de los ingredientes que contienen los medios que ha utilizado.

4. Describa la autoclave y su forma de uso. 5. ¿Qué otros métodos de esterilización se emplean para los medios de cultivo? ¿Qué ventajas otorgan?

PRACTICA N° 3 TÉCNICAS DE CULTIVO DE MICROORGANISMOS Objetivo 

Conocer las diferentes técnicas de aislamiento en medios de cultivos sólidos para la obtención de cultivos puros de bacterias.



Identificar las diferentes formas de medios de cultivos de uso general, diferenciales y selectivos para los cultivos de diferentes especies bacterianas.

Fundamento Para iniciar un cultivo de microorganismos es necesario que un número de células (inóculo) sea transferido (inoculado) a un medio fresco estéril .Si se quiere cultivar una especie en particular a partir de una mezcla de microorganismos, deben emplearse técnicas de aislamiento que permitan obtenerla en forma pura. Esto involucra un proceso seriado de varias transferencias y la utilización de medios tanto comunes como especiales, mayormente sólidos, seleccionados de acuerdo a la naturaleza del microorganismo. La técnica d cultivo por aislamiento pueden ser realizada por:

a) Por estrías, que consiste en diseminar los microorganismos en la superficie se un medio sólido dispuesto en placa Petri; si el inóculo inicial se encuentra sólido o en polvo, es recomendable llevarlo a suspensión.

b) Por diluciones sucesivas, que consiste en hacer diluciones seriada de la muestra o del inóculo inicial y disponer alícuotas de ellas en placas petri con medio. Las colonias de varios microorganismos difieren en forma, tamaño, color, consistencia, por

lo tanto su apariencia en

cultivo es importante para propósitos de identificación. Por otro lado, si se tiene ya aislado un microorganismo, que a asume puro, desde un medio agotado en nutrientes hacia un medio fresco. Las técnicas de transplante se realizan por lo general en tubos de ensayo con medios líquidos o sólidos, siendo la práctica más común de

conservación

de

cepas

(de

forma

aeróbicas

y

anaeróbicas

facultativas), el realizar estrías en tubos de agar inclinado. En todo procedimiento de inoculación la aguja o asa de Kölle debe ser calentada “al rojo” por flameo antes y después de la transferencia. El flameo destruye la formas vivas

en la superficie del filamento previniendo la contaminación .Durante la transferencia se debe sostener el tubo de trabajo en la mano izquierda en posición casi horizontal y retirar el tapón sosteniéndolo con los dedos anular y meñique de la mano derecha (asumir la posición inversa en individuos no diestros). La boca del tubo de trabajo (tanto del que se va tomar el microorganismo como del que se va a recibirlo) debe ser flameada antes y después de la transferencia. Aparte de destruir los microorganismos en los bordes del tubo, el flameo crea corrientes convectivas que disminuyen las probabilidades de contaminación. Las técnicas de cultivo de aislamiento y transplante nos permitirán obtener los microorganismos en forma pura y en estado activo así como el estudio de sus características de crecimiento, el primer registro de datos en la identificación de todo microorganismo.

F igura 1. a) siembra masiva; b) estría simple; c) estría con fin capilar.



EJERCICIO 1. “Técnicas de Cultivo de Microorganismos: Características de crecimiento en medio de cultivo.”

Objetivo 

Observar las características de crecimiento de los microorganismos al transplante en medios de cultivo líquido y sólido.

Materiales -

Cultivo de Microorganismos de 18

-

horas.

Tubos

con

agar

nutritivo

inclinado.

-

Asa de kolle.

-

Tubos con agar nutritivo vertical.

-

Mechero.

-

Tubos con caldo nutritivo.

Procedimiento 1. Esterilice el asa de kolle por flameo a la llama. 2. Tome el tubo con el cultivo de 18 horas, retire el tap6n, flamee la boca del tubo al mechero y obtenga una pequeña porción del cultivo con ayuda del asa de kolle. Flamee la boca del tubo antes de volver a taparlo.

3. Tome el tubo con caldo nutritivo, y con los mismos cuidados anteriores introduzca el asa en el líquido para dejar el inóculo. Homogenice la mezcla girando el tubo entre las palmas de la mano.

4. Repita el procedimiento 1 para obtener m6s in6culo, pero usando esta vez aguja de kolle.

5. Tome el tubo con agar inclinado y realice la siembra depositando el inóculo a lo largo de una sola línea descrita desde la base de la inclinaci6n hasta el extremo.

6. Repita el procedimiento 1 para obtener inóculo, usando nuevamente aguja de kolle. 7. Tome el tubo con agar vertical y realice la siembra por picadura profunda del medio.

8. Rotule los tubos sembrados y póngalos a incubar a 37° C por 24 horas. 9. Cumplido el tiempo de incubación, evalué el crecimiento y anote sus resultados en la hoja adjunta, según lo siguiente:

a) Crecimiento en estrías sobre agar inclinado Cantidad:

Escasa, moderada o abundante

Distribuc ión en la superficie:

Uniforme o irregular

Forma de crecimiento difuso, etc.

Arborescente,

equinulado,

filiforme. Consistencia del crecimiento:

Butiroso, viscoso, fibroso

Pigmentación

Coloración del cultivo

rizoide,

Guía de Prácticas de Laboratorio

Microbiología General

b) Crecimiento en agar vertical por picadura profunda Crecimiento:

-

Limitado a la línea de inoculación o picadura.

-

Con propagación fuera de la línea de inoculación.

-

Superficial o en profundidad o ambas a la vez.

c) Crecimiento en caldo nutritivo Cantidad:

-

Escasa, moderada o abundante

Caldo

-

Turbidez, aparición de opacidad en el medio.

Apariencia o tipo:

-

Sedimento, depósito de células en el fondo del tubo;

-

si el tubo se agita el sedimento se re-suspende el y no disgregan aun si el tubo se agita.

-

Formación de película, masa de células en la superficie del caldo.

-

Mucosidad, depósito de células que permanecen adheridas.

Cuestionario 10. ¿Por qué algunos microorganismos desarrollan en caldo un característico crecimiento tipo película? ¿Qué factores ambientales podrían alterar la formación de una película superficial?

11. ¿Cuándo utiliza tubos de agra inclinado para el estudio de las características de crecimiento? ¿Es preferible inocular con aguja de kolle y no con asa? ¿Por qué?

12. ¿Qué factores influyen en la abundancia del crecimiento en caldo, agar? inclinado y agar vertical

1

Guía de Prácticas de Laboratorio 


EJERCICIO 2. “Técnicas de cultivo de microorganismos: Aislamiento y Re cuento en placas”

Objetivo. 

Separar colonias individuales a partir de una mezcla de microorganismos utilizando técnicas de aislamiento.

Materiales. -

Tubos de caldo conteniendo una mezcla de microorganismos (Serratia marceasen, Bacillus sp., Escherichia coli, Mlcrococcus sp., Proteos sp.)

-

Asa de kolle, aguja de kolle -

Mechero

-

Tubos con 12 ml de agar nutritivo licuado y mantenido a 50° C.

-

Placas petri estériles -

Placas con agar nutritivo

-

Placas con Agar Mac Conkey

Procedimiento a) Aislamiento por estrías 1. Tome el tubo de caldo que contiene la mezcla de microorganismos y con ayuda del asa o aguja de kolle previamente esterilizada a la llama, retire inoculo. Considere todas las recomendaciones antes dadas para el trabajo en asepsia.

2. Tome la placa con agar nutritivo con la mano izquierda y con ayuda de los dedos pulgar e índice levante hacia un lado la tapa, procurando que la parte expuesta se encuentre bajo la influencia de la llama del mechero. No descubra por completo la placa, así evitara mayor contaminación. Con el asa cargada de inoculo, haga estrias sobre toda la superficie del medio, procurando trazar una ultima estría en un espacio libre. Cierre la placa.

3. Esterilice el asa a la llama nuevamente. 4. Repita los pasos 2 y 3 para la placa con agar Mac Conkey. 2



5. Coloque las places en incubaci6n a 37° C por 24 horas. 6. Observe el desarrollo de colonias individuales y describa sus características de forma, elevación, consistencia, bordes, etc. Diferencie las características de las colonias desarrolladas en el medio selectivo-diferencial.

F igura 2. Aislamiento por estrías.

b) Aislamiento por diluciones 1. Tome el tubo de caldo conteniendo la mezcla de microorganismos y con ayuda del asa de kolle retire inoculo.

2. Tome un primer tubo de agar licuado y mantenido a 50° C y transfiera as6pticamente el inoculo. Esterilice el asa a la llama del mechero. Con el tubo cerrado mezcle el inoculo con el medio, haci6ndolo girar entre las palmas de las manos.

3. Transfiera una asada del agar mezclado con el inoculo hacia un segundo tubo de agar licuado. Repita la operación anterior para obtener una mezcla homogénea.

4. Vierta el contenido de cada tubo por separado en dos placas petri est6riles y rótelas lentamente para distribuir el medio de manera uniforme. Identifique cada dilución.

5. Incube las placas a 37° C por 24 horas. 6. Examine el crecimiento de las colonias en las placas. Haga un recuento de colonias, si el estimado no es inferior a 30 ni superior a 300. Describa las características diferenciales de las colonias observadas.

3



F igura 3. Aislamiento por diluciones.

Cuestionario 1. ¿Qué procedimiento seguiría a continuación del desarrollado en estos ejercicios para obtener el cultivo puro de cada cepa contenida en la mezcla? ¿Como podríamos comprobar que estas cepas obtenidas finalmente corresponden a las colonias aisladas?

2. ¿Qué factores limitan el tamaño de las colonias en una placa de cultivo? 3. Suponga que recibe una muestra de leche en polvo y se le pide determinar el número total de colonias por gramo. Plantee una metodología cuantitativa basada en diluciones sucesivas para resolver el problema.

4. ¿En qué consiste la técnica del número más probable y que usos tiene? 5. ¿De qué manera se pueden preservar cepas puras por largos periodos? 6. ¿Qué técnicas de cultivo se emplean para aislar microorganismos anaeróbicos?

4



PRÁCTICA N°4 PREPARACIÓN DE UNA MUESTRA FIJA PARA TINCIÓN Objetivos: 

Aprender las técnicas de preparación de frotis, de fijación y coloración más utilizadas en el estudio microscópico de cultivos bacterianos.

Fundamentos: Previo al desarrollo de una técnica de tinción, el material a ser observado debe ser fijado, es decir adherido a una lámina de vidrio sobre la cual ha de realizarse la tinción. Si la preparación no es fijada, la muestra tiende a perderse durante los procedimientos de tinción. El procedimiento de fijación mata al microorganismo, coagula el protoplasma celular y provoca su adhesión a la lámina de vidrio .Un agente de fijación ideal preserva la estructura de la célula en la forma y posición normal sin causar la aparición de artefactos (estructuras no presentes en las célula viviente). Aunque el calentamiento es el agente de fijación más común, el alcohol y otros agentes químicos también pueden ser usados satisfactoriamente. El procedimiento a seguir en este ejercicio es preliminar a la mayoría de métodos de tinción usados para las bacterias.

Materiales -

Muestra conteniendo bacterias

-

Mechero de alcohol

-

Asa de Kolle

-

Piseta con agua

-

Lamina porta objeto

Procedimiento 1. Coloque una gota de agua sobre una lámina porta objeto completamente limpia. Con ayuda del asa de Kolle coloque sobre la gota una pequeña porción de la

5



muestra a fijar. Si la muestra que contiene al microorganismo es líquida, puede aplicarse directamente sin la gota de agua.

2. Distribuya la gota cargada con la muestra en la lámina hasta formar una película delgada.

3. Seque la lámina al aire o a una razonable distancia sobre la llama del mechero. 4. Cuando la película este seca, pase la lámina a través de la llama del mechero unas tres veces, cuidando que la película este hacia arriba y que la lámina no se recaliente. La sobre exposición al calor puede alterar la forma y estructura del microorganismo.

F i gura 1. Preparación y fijación de cultivos bacterianos.

6



TINCIÓN SIMPLE CON COLORANTES BÁSICOS Objetivo. 

Observar las diferentes formas, tamaños y agrupaciones que presentan los microorganismos aplicando un método simple de tinción.

Fundamentos. La tinción simple construye una técnica sencilla y directa que a través del uso de un colorante, nos permite contrastar y diferenciar los microorganismos de su entorno. Los colorantes básicos, los cales se utilizan comúnmente para teñir microorganismos, difiere n en el grado de reactividad con las células. El azul de metileno reacciona con las células cargadas negativamente a la tasa más baja, tomando de 20 a 30 segundos para teñir apropiadamente una preparación microbiana. El cristal violeta es más reactivo y generalmente requiere sólo 10 segundos. El carbol fucsina es un colorante aún más reactivo y generalmente requiere solo 15 segundos. Su reactividad es tan grande que ciertamente puede dificultar una tinción apropiada, sobre todo cuando la muestra contiene abundante materia orgánica.

Materiales -

Láminas fijadas de microorganismos

-

Aceite de inmersión

-

Colorantes básicos:

Azul de metileno Cristal violeta Carbolfucsina -

Papel secante

-

Piseta de agua

-

Soporte para tinción

7



Procedimiento 1. Coloque las láminas fijadas de microorganismos sobre el soporte para tinción. 2. Agregue 5 o 6 gotas de cada colorante dejando que actúen por un tiempo de 30 segundos para el azul de metileno; 10 segundos para el cristal violeta; y 5 segundos para la carbolfucsina.

3. Una vez cumplido el tiempo para los colorantes, lave cada lámina con la piseta de agua.

4. Seque las láminas al aire o dentro del papel secante 5. Examine las preparaciones teñida bajo el objeto de inmersión (100 – 150 x) de un microscopio compuesto.

6. Elabore esquemas de sus observaciones destacando las diferencias en tamaño, forma y agrupaciones que se presenten.

Cuestionario. 1. ¿Cuales son las asociaciones más frecuentes en las bacterias? 2. ¿En que rango de tamaño se definen las bacterias? 3. ¿Cuáles son las formas bacterianas más frecuentes? 4. ¿Qué diferencia a una tinción directa de una tinción negativa? 5. ¿Qué importancia le atribuye a las diferencias en reactividad de los colorantes empleados?

8



PRACTICA N°5 TINCIÓN DIFERENCIAL GRAM Y TINCIÓN DIFERENCIAL ÁCIDO RESISTENTE. Objetivo. 

Demostrar a través de la técnica de tinción diferencial de Gram la existencia de dos grupos principales de bacterias.



Distinguir a través de dos técnicas de tinción diferencial la presencia de endosporas bacterianas y diferenciarlas de las estructuras vegetativas normales.

Fundamento. Tinción diferencial Gram Los microorganismos no sólo difieren químicamente de su entorno, sino también muestran diferencias físicas y químicas entre ellos. Esto da lugar a que puedan reaccionar diferencialmente ante un procedimiento de tinción. La tinción diferencial por lo tanto, nos permite distinguir entre grupos de microorganismos .En particular, la tinción de Gram, es la más utilizada de las técnicas de tinción diferencial para distinguir entre dos grupos de bacterias: Gram positivas y Gram negativas. La diferencia entre estos dos tipos de células radica en la variación de capas que conforman sus paredes. La pared de la gram-positivas es principalmente una gruesa capa de peptidoglucano, mientras que las gram-negativas la pared es una multicapa formada por una capa de peptidoglucano rodeada por una capa externa de proteína y lipopolisacárido. La diferente permeabilidad de estas estructuras de superficie ante los reactivos utilizados en la tinción Gram, permite la diferenciació n en la coloración final. La tinción de Gram requiere de cuatro soluciones: Un colorante básico, Un mordiente, un agente decolorante y un contraste (otro colorante básico). Las propiedades de los colorantes básicos ya fueron discutidas previamente. Un

mordiente es una sustancia que incrementa la afinidad entre la célula y el colorante, es 9



decir ayuda a la fijación del colorante en la estructura de interés. Ejemplos de mordientes son ácidos, bases, sales metálicas, y yodo. Bajo la acción de un mordiente una célula se tiñe más intensamente y es más difícil decolorarla. Un agente

decolorante es una sustancia que retira el colorante de una estructura teñida. Algunas células teñidas se decoloran más rápidamente que otras, y está variación en la tasa de decoloración es la que diferencia tipos de bacterias cuando la tinción Gram y otras tinciones diferenciales se usan. El contraste es un colorante básico de un color diferente al usado inicialmente. El propósito de su aplicación es da a las células decoloradas un color contraste con el inicial. Aquellas células que no se decoloran rápidamente retienen el color del colorante básico inicial, mientras que las células que se decoloran fácilmente toman el color del contraste. La tinción Gram se resume en lo siguiente: El primer paso es teñir la preparación intensamente con un colorante básico, preferentemente el cristal violeta. Esto es seguido de por un tratamiento de las células teñidas con un mordiente, por ejemplo, un compuesto iodado como el lugol. La preparación luego es tratada con un agente decolorante como el alcohol o alcohol-cetona. Las células que retienen el colorante básico después de la decoloración son llamadas gram – positivas, y aquellas que son decoloradas son gram-negativas, y pueden ser reteñidas con un contraste como la safranina.

10



F igura 1.Tipos de Tinción Gram.

Materiales. - Cultivos jóvenes de microorganismos (18-24horas): Bacillus sp; streptococcus sp; Escherichia coli. - Colorantes básicos: Cristal violeta; Safranina - Decolorante: Alcohol-cetona - Láminas porta objeto - Mordiente : Lugol - Papel secante - Piseta de agua - Soporte para tinción - Asa de Kolle - Aceite de inmersión.

Procedimiento. 1. Prepare una lámina fija de cada uno de los cultivos microbianos proporcionados y una lámina fija con la mezcla Streptoccus y Escherichia coli

2. Agregue cristal violeta y deje que actúe por 30 segundos. 3. Enjuague con agua 4. Cubra la película teñida con lugol y deje que actúe por 30 a 60 segundos. 11



5. Enjuague con agua. 6. Decolore con alcohol acetona. Para una película delgada, la exposición al decolorante por 10-20 segundos es suficiente.

7. Enjuague con agua 8. Aplique el colorante de contraste safranina por 30 segundos. 9. Enjugue con agua y seque la lámina al aire o dentro del papel secante. 10. Examine cada muestra bajo el objeto de inmersión 11. Elabore los esquemas correspondientes.

F i gura 2. Procedimiento para hacer tinción G ram.

Tinción Diferencial Ácido-Resistente La tinción ácido-resistente es una tinción diferencial que mide en células teñidas la resistencia a la decoloración mediante ácido. La propiedad de ácido resistencia en ciertas micobacterias y actinomicetos está correlacionada con su salto contenido 12



lipídico. Teñir estas bacterias requiere de un tratamiento de alta temperatura y la utilización de colorantes fuertemente a fines. El procedimiento consiste en teñir con carbolfucsina caliente, decolorar con una solución de alcohol-ácido y reteñir con un contraste. Las bacteria ácido en comparación a otros microorganismos y retienen el color del colorante inicial. Este tipo de coloración es utilizada en el estudio y diagnóstico de enfermedades causadas por especies ácido-resistentes como los de la tuberculosis, la lepra, y también para la diferenciación de estructuras resistentes como las endosporas bacterianas.

Tinción De Endosporas Las especies del genero Bacillus y Clostridium producen una estructura denominada endospora. A diferencia de la célula la endospora es una estructura resistente capaz de sobrevivir por largos periodos en ambientes desfavorables, en condiciones extremas de alta temperatura o bajo la acción de agentes desfavorables, en condiciones extremas de alta temperatura o bajo la acción de agentes químicos. Existen variadas técnicas que se utilizan para la tinción de endosporas. Destacan entre ellas la técnica Dörner y la de Schaeffer & Fulton. En la primera se emplea carbol fucsina para teñir la espora y nigrosina como agente decolorante y de tinción negativa; la espora se tiñe de rojo, la parte vegetativa incolora y toda la estructura aparece sobre un fondo oscuro .La técnica se Schaeffer y Fulton emplea carbolfucsina para teñir la espora, alcohol ácido como decolorante y verde malaquita como colorante de contraste; la espora se tiñe de rojo y la parte vegetativa de verde. Ambas técnicas emplean fenol y alta temperatura como agentes coadyugantes para lograr la penetración de la Fucsina en la estructura de la espora.

Técnica de Dörner Materiales - Cultivo de 48 horas: Bacillus_sp; Clostridium sp. 13



- Aceite de inmersión - Asa de Kölle - Baño de agua a 100°C - Lámina porta objeto - Soluciones colorantes: Carbolfucsina, Nigrosina. - Tubos con agua destilada estéril.

14



Procedimiento. 1. Haga una suspensión concentrada del organismo en 2 ó 3 gotas de agua destilada contenida en un tubo pequeño de prueba. 2. Añada igual cantidad de carbolfucsina y coloque el tubo en un recipiente con agua hirviendo por 10 min. 3. Transfiera una gota de la suspensión de células hervidas en un recipiente con agua hirviendo por 10 minutos. 4. Agregue una gota de nigrosina y extienda la mezcla con ayuda de otra lámina hasta obtener una delgada película. 5. Seque la lámina al aire o dentro del papel secante. 6. Examine al microscopio compuesto bajo un objeto en inmersión. 7. Elabore los esquemas correspondientes.

Técnica de Schaeffer y Fulton Materiales. - Cultivo de 48 horas: Bacillus sp; Clostridium sp. - Aceite de inmersión - Asa de Kölle - Lámina porta objeto - Mechero de alcohol - Pinzas - Soluciones colorantes: Carbolfucsina; verde malaquita. - Solución decolorante: Alcohol ácido.

Procedimiento 1. Prepare una muestra fija del microorganismo proporcionado. 2. Agregue a la preparación carbolfucsina hasta cubrirla totalmente. 3. Con ayuda de una pinza, caliente la lámina con el colorante haciéndola pasar ligeramente por la llama del mechero hasta que observe el desprendimiento de vapores. 15



4. Mantenga esta condición durante tres minutos , evitando que el colorante se seque o entre en ebullición

5. La ve con alcohol ácido hasta que este resulte incoloro. 6. Enjuague con agua. 7. cubra la preparación con unas gotas de verde malaquita dejando que actúe por dos minutos.

8. Enjuague con agua. 9. Seque la lámina al aire o dentro del papel secante. 10. Examine al microscopio compuesto bajo un objeto de inmersión. 11. Elabore los esquemas correspondientes. Cuestionario 1. ¿Bajo que circunstancia la tinción diferencial de Gram podría resultar errada? 2. Que efecto traería reemplazar el lugol con otro agente oxidante. 3. ¿Podría usted variar el colorante primario y el contraste obteniendo los mismos resultados?

4. ¿Cuál es la influencia del pH? en la reacción Gram? 5. Liste cinco ejemplos de bacterias gram positivas y cinco de Gram negativas, señalando su importancia.

6. ¿Cual de los métodos utilizado s le permitió observar mejor las endosporas bacteriana? ¿A qué atribuye la diferencia?

7. ¿Qué efecto producirá el reemplazar el alcohol ácido por otro decolorante como el alcohol cetona?

8. ¿Qué otros géneros de bacterias pueden formar endosporas? 9. Revise otras técnicas de tinción de esporas y compárelas con las técnicas usadas en este ejercicio. Destaque ventajas y desventajas.

16



PRACTICA N°6 MICROORGANISMOS DEL AIRE Objetivo. 

Observar el desarrollo de hongos misceleares y levaduriformes en sustrato de diferente origen e identificar los géneros más frecuentes.



Observar las muestras diversas para obtener crecimiento bacteriano en colonias aisladas (cultivo y aislamiento), además del estudio de reacciones hemolíticas en una amplia variedad de microorganismos.

Materiales. - Agar Sangre - Agar sabouraud - Asa de Kolle o estilete - Láminas porta objetos - Cristal violeta - Safranina - Lugol - Alcohol Cetona - Azul de metileno

Procedimiento. a) Observación macroscópica Hongos y levaduras en Agar Sabouraud 1. Observe cuidadosamente cada sustrato infectado y determine el tipo de colonia que desarrolla. 2. Describa el aspecto externo de las colonias de hongos

Reacciones Hemolíticas en Agar Sangre Humana 1. Observe las características de las colonias deacuerdo a las reacciones hemolíticas. Hemólisis alfa: lisis parcial de los glóbulos rojos. Se observa un halo de color verdoso alrededor de la colonia en estudio. Es debido a la oxidación de la hemoglobina a metahemoglobina (compuesto de color 17



verdoso) por el peróxido de hidrógeno generado por los microorganismos. Hemólisis beta: lisis total de los glóbulos rojos. Se observa un halo claro, brillante alrededor de la colonia en estudio. Hemólisis gamma: ausencia de lisis de los glóbulos rojos. El medio de cultivo no presenta modificaciones de color y aspecto alrededor de la colonia en estudio.

b) Observación microscópica Crecimiento de Hongos y levaduras 1. Coloque una gota de azul de metileno en un porta objeto limpio y desgrasado. 2. Con ayuda del asa de Kolle en forma de gacho, extraiga una pequeña cantidad de u micelio de una muestra y coloque en la gota de colorante.

3. Coloque sobre la preparación la lámina cubre objetos. 4. Observe bajo el objetivo de 10 y 40 aumentos. 5. Reconozca las estructuras más características del cuerpo vegetativo del hongo. 6. Elabore los esquemas que correspondan para cada observación. 7. Con ayuda de láminas referenciales trate de identificar el o los géneros que observe. Crecimiento de microorganismos por reacciones hemolíticas en agar sangre humana 1. Realice el procedimiento de tinción Gram.  EJERCICIO 1. “Aislamiento de hongos ,

levaduras y microorganismos

exigentes del medio ambiente”. Objetivo. 

Aislar en medios de cultivo los diferentes géneros de microorganismos que frecuentan el medio ambiente y determinar sus características.

Materiales. -

Placas petri, con medios de cultivo Agar sabouraud, Agar Sangre. 18



Procedimiento. 1. Elija u punto determinado en el ambiente que quiera evaluar. 2. Destape la placa petri exponiendo al medio de cultivo al aire (Se asume que las esporas de hongos se encuentran suspendidas). El tiempo de exposición puede ser de 5 a 10 minutos. Vuelva a tapar la placa identifiquela con su nombre, grupo y lugar muestreado.

3. Trabaje de manera similar para cada placa y lugar. 4. En el laboratorio incube las placas en una estufa de 30 °C por cuatro o cinco días. 5. Transcurrido el tiempo, examine las placas y realice una descripción detallada de las mismas.

Cuestionario. 1. ¿Qué géneros de Hongos abundan frecuentemente en el medio ambiente? 2. ¿Qué variaciones medio ambientales modificaría sustancialmente la presencia de hongos? Formule su respuesta tomando en cuenta modificaciones en cantidades y en diversidades de especies.

3. ¿Podrían las especies de hongos patógenos estar presentes en el aislamiento de hongos que usted realizo?

4. ¿Cuál es la diferencia entre microorganismos exigentes y no exigentes? 5. ¿Cuáles son los tipos de reacciones hemolíticas?

19



PRACTICA N°7 AISLAMIENTO DE COLIFORMES Objetivos 

Familiarizarse con la técnica de preparación de muestras sólidas.



Determinar la prueba positiva sobre la presencia de coliformes en la muestra.

Fundamento. Streptococcus. Son cocos gram (+) de forma esférica u ovoide que crecen en pares o longitudes variada. No forman esporas, son catalasa negativa, inmóvil, algunos capsulados, y son anaerobios facultativos. Existen 25 especies identificadas. A pesar de ser gram (+) pueden convertirse en gram (-) a medida que el cultivo envejece. En consecuencia su pared consta de:

1. Peptidoglucano, que le confiere rapidez. 2. Proteínas. 3. Ácido teicoico. Una característica importante es que los Streptococcus son homofermentativos, es decir forman ácido láctico como producto principal de la fermentación de la glucosa. Para la clasificación de streptococcus existen dos criterios que son muy útiles: Según la hemólisis y según el criterio de Lancefield. Genero Escherichia. Son enterobacterias, es decir bacterias en forma de bacilos, gram (-), de 2-4



m de

largo, con bordes redondeados, no esporulados. Su metabolismo es respiratorio y fermentativo. Este género contiene más de veinte géneros y más de cien especies.

20



Por ser la entero bacterias gram (-), su envoltura celular está formada por: Membrana celular, pared celular (contenida en el periplasma) y membrana externa, siendo sus componentes individuales:

1. Fosfolípidos.

5. Cápsula.

2. Peptidoglucano.

6. Fimbrias.

3. Lipopolisacárido.

7. El

4. Proteínas de membrana externa.

antígeno

enterobacterial

común.

Fisiología y estructura antigénica Esta bacterias crecen de manera abundante en medios de cultivo ordinario, a diferencia de los streptococcus que requieren medios de cultivo complejos (Son bacterias exigentes). El crecimiento se realiza entre temperaturas de 10°C – 46°C, siendo el grado optimo 37°C; la mayor parte de la cepas son destruidas con calentamientos a 60°C x 30 min. El género Escherichia se caracteriza porque fermenta rápidamente diversos tipos de azucares, como la lactosa, produciendo ácido y gas. El principal ácido formado por ácido láctico, y en cantidades menores ácido acético y fórmico junto con etanol. Este género tiene una estructura antigénica compleja, habiéndose detectado más de 150 antígenos somático o termoestables (lipopolisacáridos), más de 100 antígenos k termolábiles (capsulares) y más de 50 antígenos H (flagelares). Este género produce así mismo enterotoxinas y hemolisinas. Las enterotoxinas median el transporte de iones y de agua desde los tejidos hacia el lumen intestinal para originar una secreción neta que se manifiesta en forma de diarreas; existen dos tipos de enterotoxinas: Toxina termolábil (TL) que provoca pérdida de agua y electrolitos, y la toxina termoestable (TS), que produce secreción de agua y electrolitos, y es muy resistente al calor (Soporta 100°C x 10 min) También produce hemolisinas, cuya producción se relaciona con la virulencia, es citóxica para leucocitos. 21



Importancia del género Escherichia. Dado que las especies de género Escherichia se hallan presentes como comensales en el intestino humano y animal ,particularmente E. Coli, estos microorganismos son utilizados como indicadores de contaminación fecal, aunque no necesariamente indica que un alimento esté contaminado con heces, sino que indica una mala higiene en el procesamiento de los alimentos. Aunque existe la probabilidad de reemplazar las bacterias coniformes por los virus conocidos como colifagos (que infectan los coliformes), que se hallan presentes constantemente en la heces humanas, desagües, aparte que su detección es fácil y rápida, de modo que la relación coliformes – colifagos es muy estrecha, además los colifagos también serían indicadores de enterovirus en muestras “contaminadas”. Por

ello se piensa que los colifagos podrían ser una alternativa frente a los coliformes

Materiales, reactivos y equipos. -

Frasco para licuar.

-

Balanza mecánica.

-

Cucharilla.

-

Mechero Bunsen.

-

Tubos de ensayo.

-

Matraz Erlenmeyer.

-

Pipeta 1 ml.

-

Placas petri.

-

Papel craft.

-

Tapones de algodón.

-

Agar VRBA.

-

Solución salina peptonada (ssp).

-

Alcohol.

-

Muestras

-

Licuadora.

-

Estufa.

a

analizar

(Chifón,

sémola).

Procedimiento experimental. 3. Preparación De Muestra Sólida. 

Cerca de un mechero Bunsen tomamos 10 g de la muestra y la depositamos en un frasco para licuar estéril.



Al frasco se le añade 90 ml SSp estéril provenientes de un matraz el cual no será desechado. 22





Llevamos el frasco una vez tapado con los 10 g de muestra y los 90 ml de ssp a licuar, el tiempo necesario hasta que todo se desmenuce y la mezcla quede uniforme.



Retiramos el frasco y su contenido lo vaciamos al matraz del cual extrajimos los 90 al ssp.



Colocamos tapón de algodón. A esta mezcla la llamamos solución madre (sm).

4. Preparación del cultivo 

De la SM o de la muestra original (en caso sea líquida de por sí) extraemos con una pipeta de 1 ml cerca del mechero 1 ml y lo depositamos en el tubo de ensayo con 9 ml SSP, lavamos la pipeta. Esta será la dilución 10-1 .



Realizamos lo mismo con el tubo que contiene la dilución 10 -1 o “- 1”: Extraemos 1ml del tubo “- 1” y lo depositaos en otro tubo con 9 ml SSP. Lavamos la pipeta, y

tapamos el tubo con tapones de algodón. Siempre cerca del mechero. 

Realizamos la tercera dilución, no olvide lavar la pipeta.



A cada placa agregamos una delgada lámina o capa de agar VRVA, esterilizando el autoclave, uniformizamos el contenido de la placa moviéndola en círculos y esperando que el agar solidifique : siembra por incorporación.



Luego agregamos una segunda capa y protectora de agar VRBA a las mismas placas(esta ya deberían estar rotuladas al agregar el 1 ml de la dilución)



Se espera que solidifique, colocamos papel crac a las placas y rotulamos.



Incubamos las placas en la estufa a 37 °C por 24 – 48 horas.

Contamos las colonias que es tán en el fondo de las placas y no en las superficies. PRÁCTICA N°8 DETERMINACIÓN DE BACTERIAS DEL AGUA 23



Objetivos 

Determinar el número de unidad formadora de colonia en un mililitro de agua.



Identificar diferencias entre la flora microbiana del agua.



Identificar las bacterias presentes en el agua y comparar sus requerimientos nutricionales con el contenido del medio cultivo en el que fueron incubados.

Fundamento. Bacteria de aguas continentales. Entre la flora bacteriana del suelo y las aguas continentales hay ciertas relaciones y esto es particularmente si se trata de aguas que están constantemente expuestas a la contaminación del suelo. No obstante en las aguas y arroyos sólo se pueden desarrollar de las bacterias del suelo menos exigentes. En el caso de microorganismos patógenos más frecuentemente transmitidos por el agua producen infecciones del aparato digestivo, como tifoidea y cólera, cuyos agentes, eteológicos de esta se encuentran en materias fecales y la orina de los infectados. Agentes patógenos de las aguas. Las aguas residuales domésticas son portadores de bacterias y hongos patógenos conservando su virulencia durante el tiempo, frecuentemente transportan bacteria intestinal, como S. typi y S. Paratipi, más caro es la presencia de Shigella y en países tropicales abunda

el

vibrión

cholerae,

aunque

también

suele

encontrarse

con

frecuencia

microbacterium tuberculosis y esporas Clostridium patógeno. Se pueden encontrar bacterias patógenas en mariscos procedentes de aguas contaminadas. Entre los hongos patógenos se hallan la especie levaduriforme, Cándida albicans (productores de la candidiasis).Así mismo las aguas residuales transportan virus de la especie humana como es la

que produce la poliomilitis, virosis intestinal y gripe de

verano.

24



Tanto los virus como las bacterias de agua son más resistentes en agua dulce que en agua de mar. Determinación de la cantidad sanitaria. Las investigaciones sanitarias de los sistemas productores de agua incluyen la infección de las fuentes de agua sin tratar y sus condiciones que influyen en su calidad, las operaciones de la planta purificadora y el mecanismo de distribución del agua a los consumidores. Entre las pautas microbiológicas está la determinación de microorganismos patógenos en las aguas particularmente. Escherichia coli, otras coliformes fecales (como Clostridium faecalis,) y clostridium prfringes, su presencia indica contaminación fecal. Entre las características de la E. Colli están. Producción de indol, producción de ácido, producción de acetil metil carbinol en medios con pectona glucosado y utilización de citratos de sodio.

Materiales. - Placas petri

- Pipetas de 1 ml.

- Tubos de ensayo.

- Gradillas para tubos de ensayos.

- Matraz Erlenmeyer.

- Espátulas

Reactivos. - Muestra suelo.

- Agar VRA

- Agar nutritivo

- Violeta de Genciana

- SSP

- Zafranina

- Solución alcohol-cetona.

- Agua destilada.

- Aceite de inmersión.

Equipos. -

Microscopio Óptico.

-

Mechero.

-

Balanza mecánica.

-

Estufa.

Procedimiento. a) Preparación de la solución madre 25



- En el platillo del abalanza colocaos un trozo de papel craft. - Con ayuda de una espátula depositamos 10 g de muestra (suelo fértil) sobre el papel. - Agregaos la muestra sobre el Erlenmeyer con 90 ml de SSP. - Agitamos y mezclamos la muestra con los 90 ml de SSP, hemos obtenido la solución madre o a 10-1 (SM)

b) Preparación de Soluciones e incubación. 1. Tomar un ml de la SM y la colocamos en un tubo de ensayo de ml SSP. Esta dilución será a la – 1 con respecto a la SM o – 2 , respecto, a los g/mm. Repetimos este procedimiento extrayendo del tubo “- 1” un ml y lo colocamos en un tubo de

ensayo con 9 ml de SSP, esta dilución será a la – 3, así continuamos hasta obtener la solución – 4.

2. De cada tubo con la dilución extraemos u ml con ayuda de la pipeta y lo depositamos en una placa petri estéril, comenzando desde el tubo más diluido al menos diluido. Por cada tubo se preparan 2 placas con 1 ml.

3. Cuando todas las placas tienen 1 ml, en una colocamos una capa de agar nutritivo y en la otra placa perteneciente a la misma dilución agregamos una capa de agar VRBA, homogenizamos y dejamos secar: siembra por incorporación.

4. Luego agregamos una segunda capa del mismo agar a cada placa con el fin de proteger el cultivo.

5. Rotulamos y envolvemos cada placa en papel craft. 6. Incubamos a 37 ° C x 24 – 48 horas. c) Coloración gran y conteo 1. Luego de la incubación extraemos las placas de la estufa y procedemos a contar el número de colonias presentes en la placa del fondo de la placa, no aquellas que se encuentran en las superficies.

2. Una vez realizado el conteo, con una asa de Kolle extraemos (hacemos un corte) en el dio de cultivo una parte de la primera capa con el fin de extraer una muestra de colonia, si es necesario también se perforará la segunda capa.

26



3. La muestra de colonia la colocamos y disolvemos en una lámina porta objeto (previamente la lámina tiene gotas de agua destilada) con agua y procedemos a realizar la tinción de Gram.

4. Colocamos la lámina tincionada al microscopio y observamos el resultado.

27

Guía de Prácticas de Laboratorio Laborat orio

Microbiología Microbiología General

PRÁCTICA N°9 DETERMINACIÓ DETERMIN ACIÓN N DE BACTERIAS BACTERIAS DEL SUELO SUELO Objetivos 

Determi Dete rmina narr el número número de unida unidadd formadora formador a de col co lonia en e n el suelo.



Identificar diferencias entre la flora microbiana del suelo.



Identificar las bacterias presentes en el suelo y comparar sus requerimientos nutric nutric ionales iona les con co n el conteni contenido do del de l medio cultivo cultivo en el que fuero fueronn incubados. incubad os.

Fundamento. En la naturaleza los microorganismos se encuentran formando comunidades de diversos géneros y especies, por lo que es casi imposible encontrar un hábitat con un solo género de microo microorgani rganismos. smos.

Por lo que para los estudios en que que se requi req uiera era el

conocimiento de un solo organismo de esa comunidad (estudio autoecológico), es necesario neces ario el aislami aislamiento ento del de l mismo. mismo.

Obvi Ob viamente amente se debe de be tener en mente que

muchas muchas reacciones rea cciones fisiol fisiológicas, ógicas, bioquími bioquímicas ca s y hasta hast a algunas algunas morfológicas, morfológicas, requi req uiere erenn de la presenci pres enciaa del resto res to

de los integrantes ntegrantes de la la comun comuniidad para que se expresen

(estudios sinecológicos). Se han empleado una serie de métodos para la propagación de los micro microorganism organismos os a partir partir de cél cé lulas ulas indivi individuales. duales.

El cultivo cultivo en caja de Petri Petri es un

sistema sencillo y rápido para el aislamiento de los microorganismos de una mezcla, permi permitiendo tiendo que a partir partir de una célu célula o un cong congllomerado omerado de célu células del mismo smo géner géneroo y especie, esp ecie, se forme una coloni co loniaa (clona), (c lona), que q ue sea visi visible ble a simple simple vista. vista.

Los métodos método s

más usados son: a) método de la estría cruzada y b) el método del vaciado en placa. El método de la estría cruzada, es un método cualitativo que permite trabajar un gran número número de muestras uestra s en e n corto co rto tiempo tiempo y consiste consiste en tomar una una muestr muestraa con co n un

asa previ pre viamente amente esteril este riliizada y col co locarla ocarla sobre una superfi supe rficie cie del de l medio de culti cultivo vo

sólido sólido que q ue se encuentra encuentra en una una caja de Petri Pe tri,, Posteriorm Pos teriormente ente se trazan un unaa serie de estrías estrías pegadas pegadas al borde de la caja, esteri esterilizando el asa al final nal de cada serie. serie.

El método 28

Guía de Prácticas de Laboratorio Laborat orio de


vaciado vaciado en placa, placa, es e s un método cuant c uantiitativo, tativo, ya que además de aisl aislar ar a los los

micro microorganism organismos os,, en un cultivo cultivo puro (formado po porr un solo so lo género géne ro y esp e specie), ecie), nos permi permite con contar tar el núm número de organ organiismos smos presentes presentes en esa muestra. uestra.

Esto Esto es posibl posiblee

ya que a partir partir de una muestr muestraa perfecta perfectamente mente medida se reali rea lizan zan una seri ser ie de diluciones, diluciones, lo que nos da la oportunidad de conocer la cantidad exacta de muestra en cada tubo de diluci dilución, ón, si después desp ués de sembrar la muestra en nu nuestro estro medio conocem conoce mos el nú núm mero de col co lonias que q ue crec c recieron, ieron, pode po demos mos multi multipli plicar car este po porr la inversa de la dilu dilución ción y po porr la inversa nversa de la alícuota alícuota que sembramos, dándonos como resultado resultado el núm número ero de uni unidad dades es formado formadoras ras de colonias colonias (UFC) por un uniidad de volu volum men o masa masa de la muestra original. Para el trabajo con ambos procedimientos se requiere procesar las muestras bajo condiciones de esterilidad con objeto de no incorporar microorganismos de otra fuente fuente extraña a la la que q ue estamos analiza analiza ndo.

Materiales. -

Muestra de Suelo.

-

Horno o incubadora

-

5 pipetas pipetas de 1 mL mL estériles estériles

-

Asa bacteriológica

-

Frasco de dilución de 9 0mL

-

Varilla acodada

con agua destilada estéril

-

Alcohol

5 tubos con 9 mL de agua

-

Metanol

destilada estéril.

-

Succionador para pipetas

-

Agua destilada

-

Cajas Petri con medio de

-

Capsulas de porcelana

cultivo

-

Pinzas

levaduras (Saboraud)

-

Mechero

-

para

hongos

y

Procedimiento. a) Método de la disolución. 1. Pesar 10g de suelo y colocarlos en condiciones de esterilidad en una botella de dilución dilución conteniendo conteniendo 90mL de agua agua destil d estilada ada estéril. estéril. 29

Guía de Prácticas de Laboratorio Laborat orio


una pipeta de vidr vidriio, tomar 1mL del sobrenadante sob renadante de la botella botella 2. Por medio de una de dil dilución, ución, teniendo teniendo cui cuidad dadoo de no arrastrar arras trar sedim sedimento y vaciar vaciar en condiciones condiciones de esterili esterilidad a un tubo de ensaye con 9mL de d e agua destilada destilada estéril. estéril. Agitar Agitar perfectam perfectamente ente para hom homogeni ogenizzar la muestr muestraa (fi (figura 1).

3. A partir del tubo anterior, tomar 1 mL y vaciarlo a otro tubo de ensaye con 9 mL de agua destilada estéril, agitar perfectamente.

4. Repita el punto tres, tomando siempre 1mL del último tubo inoculado y vacíelo a un tubo nuevo nuevo con 9mL 9mL de agua destilada destilada estéril (figura (figura 1).

5. Al terminar la serie de tubos, tomar de los tres últimos tubos 0.1mL y colocarlo en el centro de tres cajas de Petri perfectamente marcadas arca das para p ara su identifica dentificacc ió n.

6. Tomar una varilla acodada esterilizarla flameando con alcohol, y una vez fría, distribuir la muestra sobre toda la superficie de la caja, girando ésta y moviendo moviendo la varilla varilla en un un sentido. Collocar las cajas en una una canasti ca nastillllaa e incubarlas a 35 – 37 37 °C durante durante 24 h. 7. Co

F i gura 1. Procedimiento para la preparación preparación de dilución dilución seriada. seriada.

b) Método de estría cruzada. 1. A partir del frasco de dilución en que se realizó la primera dilución del experimento anterior, tomar una asada y colocarla en una porción de la caja,

30



trazando una serie de estrías que cubran aproximadamente 1 cm a partir de la orilla de la caja.

2. Flamear el asa, dejar enfriar y trazar una nueva serie de estrías a partir de un extremo de las anteriores.

3. Repetir el paso anterior durante dos series de estrías. 4. Trazar la última serie de estrías abriendo esta hacia el centro de la caja. 5. Incubar a 35 – 37°C durante 24 - 48 h. 6. Repetir los pasos anteriores para las diluciones 10-5 , 10-6 y 10-7 .

F igura 2. Procedimiento para la preparación de estrías cruzadas.

Transcurrido el tiempo de incubación para las cajas utilizadas en ambos métodos, haga sus observaciones de morfología colonial.

c) Determine las UFC/g de suelo seco de la muestra original. 1. Pesar una capsula de porcelana, registre el peso. 2. Pesar aproximadamente 10 g de suelo en la capsula de porcelana, registre el peso. 3. Colóquelos en el horno a 105 °C por 48 hrs. Una vez concluido el tiempo de secado enfríelo, péselo y registre el peso. 31



Calcular el número de unidades formadoras de colonias (UFC) por gramo de suelo seco:

Determinación del peso del suelo seco:

Determinación del % de humedad del suelo:

Cuestionario 1. Desde el punto de vista práctico, ¿qué ventajas y desventajas encontró al utilizar los dos métodos de aislamiento?

2. ¿Qué

características

generales

tienen

las

colonias

bacterianas

que

las

distinguen de los hongos?

3. ¿Por qué reportamos los resultados como UFC/mL ó g en la determinación cuantitativa de microorganismos en lugar de usar el término células/mL ó g?

32



PRÁCTICA N°10 ACTIVIDAD ENZIMÁTICA Y METABOLISMO DE CARBOHIDRATOS AMINOÁCIDOS Y UREA Fundamento Para el caso de los microorganismos, la mayoría de los carbohidratos de que disponen se encuentra en la forma de polisacáridos. Un ejemplo común de estos compuestos es el almidón. Un organismo puede hidrolizar almidón solo si produce la enzima amilasa. Como no todos los microorganismos producen amilasa, la hidrólisis del almidón puede ser usado para ayudar a identificar microorganismos desconocidos. La hidrólisis de la proteína, algunas veces Llamada peptonización, es también útil en la identificación de especies microbianas; por ejemplo, la gelatina es un buen sustrato para el ensayo de microorganismos con enzimas proteo líticas. La caseína, es la principal proteína de la leche y muchas bacterias producen enzimas que hidrolizan esta proteína en derivados más solubles como proteosas, peptonas, péptidos y aminoácidos; por citarlos en orden decreciente de tamaño. Muchos microorganismos pueden degradar grasas y aceites (Lipolisis) y obtener así acetato para el metabolismo de carbohidratos y la síntesis de aminoácidos. La presencia de lipasa constituye otra característica de los microorganismos que puede ser útil para su clasificación.

Materiales -

Medios de cultivos: Placas de agar almidón, agar gelatina, agar caseína, agar grasa.

-

Asa de kolle

-

Mechero

-

Cultivo de microorganismos de 18 horas

33



Procedimiento 1. Con un plumón marcador dividir la base de la placa en cuatro secciones, enumerarlos como I, II, III y IV.

2. Utilizando la aguja de Kolle, colocar una estría de cada cultivo en un cuadrante. Dejar el primer cuadrante como control.

3. Invertir las placas e incubar a 37" C por 18 - 24 horas. Después de la incubación determinar los resultados de la prueba como sigue: a) Hidrólisis del almidón - Cubrir la superficie de la placa con solución de Lugol - Las zonas claras o transparentes alrededor de las colonias bacterianas indican la hidrólisis del almidón. Anotar sus resultados en el cuadro de conclusiones.

b) Hidrólisis de la gelatina - Cubrir la superficie de la placa de agar gelatina con HgCl2 por 5' - La actividad de la gelatinaza se indica por medio de zonas transparentes alrededor de las colonias. La zona opaca del medio se debe a la gelatina precipitada - Anotar las conclusiones en la secci6n de resultados y observaciones.

c) Hidrólisis de la caseína - Observar zonas claras de hidr6lisis alrededor de las colonias que indican la degradación de la caseína. Para incrementar el contraste, se puede utilizar también HgCl2.

d) Hidrólisis de los Lípidos - Cubrir la superficie del medio con SO4Cu2. - Un color verde azulado alrededor de las colonias indica la producci6n de la enzima lipasa.

EJERCICIO 1. Metabolismo de carbohidratos, aminoácidos y urea Materiales -

Medios de cultivos: Agar Kligler, agar citrato de Simmon's, caldo lisina, caldo triptófano y caldo urea 34



-

Asa de kolle

-

Mechero

-

Cultivo de microorganismos de 18 - 24 horas

I. Degradación de carbohidratos b) Fermentación de glucosa y lactosa Procedimiento Se realiza en un solo medio: Agar Kligler, en el cual la siembra se realiza por picadura profunda y una estria en la superficie. Incubar a 37° C por 18 - 24 horas.

Interpretación Parte inferior amarillo

Fermentación de glucosa

Parte superior amarillo

Fermentación de lactosa

Indicador del medio

Rojo de fenol

Además:

Producción de gas (glucosa)

Ruptura del medio

H2S positivo

Ennegrecimiento del medio

b) Asimilación del citrato La habilidad para utilizar el citrato como única fuente de carbono y energía distingue a ciertos bacilos gram negativos. El agar citrato de Simonías contiene citrato como única fuente de carbono y energía. El crecimiento en este medio indica una reacción positiva para la utilización de citrato. Ciertos organismos que clan una reacción positiva incrementa el pH del agar, virando el indicador azul de bromo timol en el medio de verde a azul.

Procedimiento 1. Inocular con la aguja de Kolle sobre la superficie inclinada del agar citrato de Simmon's

2. Incubar a 37° C por 24 horas 35



3. La prueba es positiva cuando el medio vira del color verde al azul o cuando se observa crecimiento del microorganismo.

c) Degradación de aminoácidos 

Descarboxilacion de la lisina La Descarboxilación de un aminoácido consiste en la perdida de su grupo carboxilo

para producir una amina y CO2. La descarboxilación bacteriana puede ser demostrada por la desaparición del aminoácido, usualmente un procedimiento complejo, o la formación de amina y CO 2. Como la reacción resulta en la acumulación de una amina (la cual es básica), la descarboxilación también puede ser demostrada midiendo la elevación del pH. La descarboxilación de los aminoácidos aminados da como producto la formación de diaminas como putrecsina y cadaverina (con liberación de CO2), alcalinizando el medio de un modo acentuado.

Procedimiento Inocular con el asa de Kolle en el caldo lisina un microorganismo determinado Incubar a 37° C por 18 - 24 horas.

Interpretación Durante las primeras horas el medio se torna amarillo por fermentación de la glucosa contenida en el medio y produciendo ácido. Posteriormente, al ocurrir la descarboxilación del aminoácido, el medio se torna alcalino y el indicador vira al rojo púrpura. 

Degradación del triptófano El indol es un compuesto que contiene nitrógeno que puede ser formado de la

degradación del aminoácido triptófano por ciertas bacterias. La prueba de indol es importante porque solo ciertas bacterias forman indol, y pueden ser fácilmente detectadas. De este modo, la degradación del triptófano es otra reacción de diferenciación.

36



Las bacterias que poseen triptófanasa son capaces de hidrolizar y desaminar el triptófano con producción de indol, ácido pirúvico y amoniaco.

Procedimiento Inocular con el asa de Kölle en el caldo indol un microorganismo determinado incubar a 37° C por 24 horas. Luego de la incubación agregar reactivo de Kovacs al tubo de ensayo.

Interpretación La formación de un anillo color rojo fucsia en la interfase del reactivo y el caldo, indica la presencia de indol. 

Degradación de la urea

Procedimiento Inocular en tubos con caldo urea los microorganismos a ensayar. Incubar junto con un tubo control a 37° C por 24 horas.

Interpretación La presencia de un color púrpura indica la degradaci6n de la urea por la ureasa. Anotar los resultados en la hoja de reporte.

Cuestionario 1. Nombre algunos ácidos producidos por bacterias. Mencione el género principal que producen cada uno de estos ácidos.

2. Algunos microorganismos usan carbohidratos sin formar niveles de ácido detectables. ¿En tales casos, cómo podría determinar si el carbohidrato ha sido utilizado?

3. ¿Por qué las amilasas, gelatinazas, caseinazas y lipasas son clasificadas como enzima hidrolíticas?

37



4. Las enzimas que hidrolizan la caseína y gelatina rompen el mismo enlace químico. ¿Cuál es?

5. ¿Cuál es el nombre de la amina formada por la descarboxilación de la lisina?

38



PRÁCTICA N°11 CONTROL DE CRECIMIENTO POR AGENTES QUÍMICOS Objetivo 

Determinar el efecto bactericida o bacteriostatico de algunos agentes químicos

Fundamento. Existen infinidad de compuestos químicos que afectan la viabilidad de los microorganismos. Hay sustancias químicas que pueden interferir o eliminar el desarrollo bacteriano tales como desinfectantes, colorantes, metales pesados y sus compuestos, antibióticos, etc. Aquí nos ocuparemos de los que inhiben el crecimiento o matan a la célula y de modo especial de algunos productos químicos que se emplean para prevenir la actividad infecciosa o destructora de los microorganismos. Varios de los colorantes empleados para teñir microorganismos tienen poder antiséptico. Estos colorantes son de gran utilidad para ajustar las condiciones de los medios bacteriológicos de tal manera que supriman el crecimiento de ciertas especies. El colorante mayormente usado es el cristal violeta, a concentraciones relativamente altas, este colorante inhibe tanto las bacterias Gram (+) como a las Gram (-). Sin embargo, al reducir la concentración, la acción del colorante se vuelve selectiva, inhibiendo a las Gram (+) mas no a las Gram (-). Si la concentración se reduce aun mas, se alcanza un nivel tolerable para ambos tipos de bacterias. Otros colorantes como el verde brillante y el verde malaquita inhiben también a los gram positivos. Los desinfectantes y antisépticos son agentes antimicrobianos que se usan en situaciones muy diferentes. Los desinfectantes son sustancias que matan a los microorganismos y se usas sobre objetos inanimados. Los antisépticos son agentes químicos, que matan o inhiben el desarrollo de microorganismos, que no son t6xicos para su aplicación sobre tejidos vivos. Los agentes químicos antibacterianos que se suelen denominar germicidas tienen un amplio use en situaciones donde no es practico usar calor en la esterilización.

39



Los metales pesados produce la desnaturalización de enzimas y otras proteínas. Actúan como desinfectantes o antisépticos. Son de uso común nitrato de plata, mercurio, cromo, sulfato de cobre, bicloruro de mercurio, etc.

Materiales -

Agar nutritivo en tubos.

-

Cultivos en caldo nutritivo: Bacillus sp, E. co/i, Salmonella sp, Staphylococcus sp.

-

Discos de papel de filtro

-

Placas estériles

-

Pinzas

-

Asa de Kolle

Reactivos -

-

Soluciones colorantes: Cristal violeta:

1/1000, 1/5000, 1110000

Verde malaquita:

1/1000, 1/5000, 1/10000

Azul de metileno:

1/1000, 1/5000, 1/10000

Soluciones desinfectantes: Feno

l0.5%, 1 % y 3%

Soluciones de metales pesados: Sulfato de cobre

0.5%, 1 % y 3%

Cloruro de mercurio:

0.5%, 1 % y 3%

Procedimiento 1. Colocar dos asadas de uno de los cultivos bacterianos a los tubos con los medios licuados, mezclar bien y verter el contenido de los tubos en las placas petri. Dejar enfriar.

2. Después de la solidificación del medio dividir la superficie de la placa en seis partes iguales con un plumón marcador.

3. En condiciones asépticas, coger un disco de papel de filtro con las pinzas y sumerja ligeramente uno de sus bordes en una de las soluciones antimicrobianas.

40



Una vez que el colorante ha impregnado el disco colóquelo sobre el agar en uno de los sectores marcados.

4. Repetir el procedimiento con cada uno de los agentes antimicrobianos y los cultivos.

5. Incubar las placas a 37° C por 24 horas. Observar los resultados.

41



EXPERIMENTO EXPERIMENTO 1. DEL CURSO DE MICROBIOLOGIA AMBIENTAL COLUMNA DE WINOGRADSKY Objetivo: Observar el desarrollo de un ecosistema utilizando como modelos diferentes columnas de Winodrasky Una columna de Winodrasky se podría representar con el siguiente esquema. Los alumnos construirán una columna

y contaran con una realizada por personal de la

cátedra.En ella podrá comprender la importancia de los distintos tipos de metabolismo que caracterizan a los microorganismos del suelo (autotrófico, litotrófico, organotrófico y heterotrófico) y que permiten, entre otras actividades microbianas , la transformación de la materia orgánica. La columna de Winodrasky es un medio muy simple que se le permitirá observar el desarrollo de distintos tipos de microbios del suelo. Esta columna permite el desarrollo de bacterias del tipo fotosintético. La columna provee un gradiente de oxigeno desde la superficie al fondo de la misma que junto a una fuente de luz crea un ambiente adecuado para organismos aerobios y bacterias fotosintéticas (anaeróbicas). El tipo de suelo y los nutrientes determinan las variedades de organismos que aparecen en la columna luego de un cierto tiempo. La capa acuosa de la parte superior soporta el desarrollo de una mezcla de protozoos, hongos y algas. Todos estos microorganismos son aerobios, teniendo estilos de vida y requerimientos nutritivos diferentes. En el fango anaeróbico se encuentran las bacterias fotosintéticas (Brock y Madigan, 1991).

PREPARACION DE LA COLUMNA Metodología de trabajo Mezclar 1gr de CaSO4 con 2g de CaCO3 y 0.5 g de papel pulverizado por 2mm.Se puede utilizar suelo de distinto origen (jardín, campo, fondo de estanque, etc). Colocar la mezcla preparada en un cilindro de vidrio (Pj, Una probeta) y mezclar suavemente con el objeto de remover los poros de aire de mayor tamaño .Agregar agua para humedecer la mezcla 42

Guía de Laboratorio de Microbiología 2015

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