Barovo telo, kariotip i kariogram 5.1. Polni hromatin i efekat doze Barr i Bertrame (1949) su u jedrima nervnih ćelija ženki mačke našli, uz samu nukleusnu membranu, jednu bazofilnu masu u vidu trougla, veličine oko 1 mikrona, koje nije bilo u ćelijama mužjaka. Nazvana „seks hromatin“ ili „Barovo telo“, ova je grupacija kasnije nalažena i u telesnim ćelijama žena (Moor i Barr, 1955). Polni hromatin se obično primećuje u interfazi somatskih ćelija sisara (nema ga u germinativnim ćelijama, oogonijama i oocitama), ali može nekada da se vidi i za vreme rane profaze u mitozi. U kasnijoj profazi i u ostalim fazama mitoze primećeno je da se jedan od X hromozoma intenzivnije boji hromatinskim bojama, pa se pretpostavilo da je ovaj hromozom heterohromatičan (Ohno i Makino, 1961). Metodom autoradiografskog obeležavanja nešto kasnije se utvrdilo da se ovaj hromozom deli asihrono u odnosu na svog parnjaka, za razliku od drugih parova homologih hromozoma koji se repliciraju skoro istovremeno. Morichima i sar. (1962) izvode zaključak da u formiranju polnog hromatina (Barovog tela)učestvuje heterohromatičan X hromozom, koji se, e.g. kod žena, uvek kasnije replicira od svog parnjaka. Ovaj hromozom je genetički neaktivan i prisutan je u svim somatičkim ćelijama žena, počev od 12-18 dana embrionalnog razvoja (Park, 1957), dok je odsutan kod muškaraca. U nizu eksperimenata Russella i Bangham (1959-1961) su proučavaliefekat translokacije autozomnih gena miša na jedan od X hromozoma i došli su do zaključka da u nekim slučajevima ovi geni mogu da postanu neaktivni. Autori su pretpostavili da je jedan od X hromozoma neaktivan i da je kod ženki sisara samo jedan X hromozom genetički aktivan. Zaključke Russella i Banghama potvrdila je i engleska naučnica Marry Lyon (1961), koja je pružila dalje dokaze da je kod sisara u oba pola genetički aktivan samo po jedan X hromozom, i da se kod žena inaktivacija jednog od X hromozoma vrši u ranim stupnjevima razvića. Tako je telo ženki sisara sastavljeno iz dve populacije ćelija u kojima je jedan ili drugi hromozom aktivan, dakle predstavlja vrstu mozaika. Do ovog zaključka Lyon je došla na osnovu eksperimenata sa miševima jedne linije, koja je bila heterozigotna za glukozo- 6- Fosfat- dehidrogenazu (roditelji su stvarali različitu G6PD). Od iste jedinke je uspela da izoluje 14 pojedinačnih ćelija, da ove razloži putem kulture ćelija u 14 klonova ćelija, i da elektroforetskim ispitivanjem utvrdi da je kod sedam klonova bio prisutan jedan tip G6DP, a kod drugih sedam- drugi tip. To je sugeriralo da je različiti X hromozom bio funkcionalan u jednim i drugim ćelijama Isti rezultati su dobijeni i za enzim hipoksantin guanin fosforibozil transferazu (HGPRT). . Zaključci Lyon hipoteze svodili bi se na sledeće stavove: 1. U somatskim ćelijama sisara genetički je aktivan samo jedan X hromozom, bez obzira na broj prisutnih X hromozoma. 2. Do inaktivacije jednog X hromozoma kod ženki sisara dolazi rano tokom embrionalnog razvića
3. X hromozom se inaktivira po principu slučajnosti 4. Isti X hromozom je inaktivan u svim ćelijama potomcima, ireverzibilan proces 5. Geni na inaktiviranom X hromozomu su inaktivni, (danas znamo da nisu svi) Činjenica da je samo jedan od X hromozoma genetički aktivan, ukazivala bi na to da mužjak i ženka sisara imaju jednake količine genskih produkata za karakteristike koje determinišu geni na X hromozomu. Ovo izjednačavanje genskog dejstva, koje odlikuje pripadnike različitog pola kod sisara, označavamo kao efekat doze delovanja gena. Za razliku od autozomnih hromozoma, normalna funkcija gena na X hromozomu ostvaruje se aktivnošću pojedinačnih alela. Slučaj da je aktivan X hromozom koji nosi mutirani gen za neku osobinu kod žena naziva se lajonizacija (e.g. slučaj da žena oboli od hemofilije iako je heterozigot). Ipak, znatno češći slučaj je da se inaktivira onaj X hromozom koji nosi mutirane gene. Efekat doze prisutan je isključivo kod somatskih ćelija. Polne ćelije nemaju Barova tela i u toku oogeneze aktivna su oba X hromozoma. Postavljeno je pitanje koji mehanizam dovodi do nastanka i održavanja inaktivacije, da li je to metilacija, fosforilacija ili imprinting? Eksperimentalno je dokazano da na X hromozomu postoje inaktivacioni centri (Lyon, 1964; Russell, 1964) u vidu jednog ili više gena koji determinišu sintezu proteina koji je odgovoran za nastanak inaktivacije X hromozoma. Ipak, šta je inaktivacioni impuls, još uvek nije rasvetljeno. Interesantan eksperiment je urađen za enzim ornitin-karbamil transferazu (OCT). Gen koji determiniše ovaj enzim nalazi se na q kraku X hromozoma. Gen se u jedinkama nalazio u heterozigotnom stanju tako da je jedan X hromozom nosio dominantni alel a drugi recesivni alel. Neke ćelije su bile OCT pozitivne a neke OCT negativne zavisno od toga koji X hromozom je bio inaktiviran. Na jednom soju miševa došlo je do translokacije dela X hromozoma sa OCT pozitivnim genom na hromozom 4, a deo hromozoma 4 je translociran na X hromozom (recipročna translokacija). Kod ovog soja sve ćelije su bile OCT pozitivne jer je deo koji se translocirao na hromozom 4 bio udaljen od inaktivacionog centra, koji je ostao na dugom kraku X hromozoma. To širenje inaktivacionog impulsa duž X hromozoma nazivamo spreding efektom. Interesantno je da se može dogoditi da deo X hromozoma bude translociran zajedno sa inaktivacionim centrom na bilo koji autozom i da će se inaktivacioni impuls širiti duž autozomnog hromozoma ali samo do tačke prekida. Drugim rečima, inaktivacija se kontroliše iz više inaktivacionih centara odakle ona počinje da se prostire duž hromozoma ali nikada ne zahvata ceo autozom koji je translociran. Mehanizam inaktivacije je očigledno specifičan za X hromozom. Jedan od mogućih mehanizama inaktivacije jeste i inprinting. U svakom hromozomskom setu, svaki par hromozoma pa i X hromozomi, prolaze kroz gametogenezu roditelja ( oogenezu majke i spermatogenezu oca) u smislu određenog rasporeda euhromatinskih i heterohromatinskih regiona, tako da se tačno zna koji hromozom potiče od kog roditelja. S obzirom da su hromozomi različito obeleženi, izvestan broj naučnika je
mišljenja da je to možda ključ za rešenje problema inaktivacije. Utvrđeno je da se X hromozomi ponašaju različito tokom embriogeneze i da je metilacija X hromozoma poreklom od majke slabija od metilacije X hromozoma poreklom od oca (zbog čega je on u početku inaktiviran). Uporednim pregledom utvrđeno je da se kod marsupijalnih sisara uvek dešava paternalna inaktivacija (inaktivacija X hromozoma poreklom od oca). Takođe, kod placentalnih sisara utvrđena je paternalna inaktivacija na stadijumu morule (trofoektoderm), ali se na kasnijim stupnjevima embriogeneze dešava random inaktivacija (inaktivacija po principu slučajnosti). Jasno je, dakle, da je evolucija sisarskog genoma išla u pravcu randomizacije inaktivacije X hromozoma što je nosiocima mutacija dalo evolutivnu prednost. Jednika čiji je maternalni X opterećen nekom naslednom bolešću obično ima aktivan zdrav paternalni hromozom dok bi to u slučaju marsupijalnih sisara bilo nemoguće (štetni recesivni geni bi se svakako ispoljili). Danas takođe znamo da inaktivacija nije ireverzibilna, kao što je tvrdila Marry Lyon šezdesetih godina prošlog veka. Znamo da se kod placentalnih sisara u fetusu, nakom paternalne inaktivacije (non random), dešava reaktivacija X hromozoma i inaktivacija ali po random modelu. Ukoliko je X hromozom oštećen u bilo kom smislu inaktivacija je takođe non random. Na taj način, održava se aktivnim onaj X hromozom koji ima sve gene i tako omogućava nosiocu aberacije preživljavanje i normalno razviće. Još jedno bitno otkriće dovelo je do revizije još jednog stava koji je postavila Marry Lyon. Znamo da je u toku evolucije sisara došlo do diferencijacije polnih hromozoma i da se oni jasno morfološki razlikuju. U evoluciji se nešto ne bi moglo inaktivirati a da prethodno nije duplirano. Tako se smatra, a tome u prilog govore i dokazi, da su X i Y hromozomi bili jednake veličine i da je došlo do translokacije q krakova Y hromozoma na X hromozom. Danas znamo da na periferiji kratkih krakova X hromozoma nalaze geni koji ne podležu inaktivaciji iako se nalaze na inaktiviranom X hromozomu. Taj deo hromozoma X se sparuje sa Y hromozomom u pahitenu spermatogeneze. Dolazimo do zaključka da je na taj način izvršena kompletna dozna kompenzacija između produkata gena koji se nalaze na polnim hromozomima (ženski i muški pol imaju aktivan jedan X hromozom i ženski pol deo drugog X hromozoma koji odgovara Y hromozomu muškog pola).
5.2.
Standardizacija humanog kariotipa
Polovinom dvadesetok veka, usled brojnih otkrića u citogenetici (e.g. Tio i Levan, 1956; dokazano 46 hromozoma u komplementu čoveka), a posebno u oblasti humane citogenetike, javlja se potreba za uvođenjem „citogenetičkog jezika“ koji bi omogućio komunikaciju između različitih centara u svetu koji se bave ovom vrstom istraživanja. Naravno, prioritet je bio standardizovati normalan humani kariotip uvođenjem parametara, na osnovu koga bi se mogle utvrđivati i eventualne promene na hromozomima.
Prva konferencija na kojoj su citogenetičari celog sveta doneli svoje kariotipove a zatim pokušali da ga slože, održana je u Denveru, 1960.godine. Ujedno su utvrđeni i parametri u odnosu na koje bi se mogli rasporediti hromozomi. Odlučeno je da parametri budu: dužina hromozoma, indeks krakova (kraći krak u odnosu na duži) i centromerni indeks (kraći krak u odnosu na ceo hromozom). U odnosu na ove parametre hromozomi su poređani po veličini od najvećeg do najmanjeg i obeleženi brojevima (od 1 do 22, zaključno sa 23. parom polnih hromozoma). U to vreme, hromozomi još uvek nisu bili raspoređeni po grupama ali se znalo da su 13, 14, 15 akrocentrični, kao i 21 i 22 ali naravno manji po veličini. U Londonu, 1963. godine, hromozomi su podeljeni po grupama (A-G) a utvrđeno je i da 13, 14, i 21 imaju satelite (14 i 21 doduše male) a da 15 i 22 nemaju satelitne regione. Ipak, konačna standardizacija humanog kariotipa izvršena je 1966. godine u Čikagu analizom 1000 kariotipova. Tada usvojena standardizacija primenjuje se i danas u konvencionalnoj analizi humanog kariotipa sa manjim modifikacijama (1995). Naravno, verovatno najrevolucionarnije otkriće bila je tehnika G bendova koju je postavila Marina Seabright i na osnovu koje je 1971. godine, u Parizu, standardizacija izvršena na osnovu ove tehnike, koja je omogućila jasno razlikovanje svakog hromozomskog para (G trake su specifične za svaku vrstu i za svaki hromozomski par). Kariotip predstavlja skup svih hromozoma jedne ćelije. Kada hromozome složimo po grupama na osnovu morfoloških osobina dobijamo kariogram.
