Fenol-cloroformo Fenol-cloroformo (abreviado PC o PCIA, ver reactivos abajo) es una extracción líquido-líquido en líquido-líquido en la
tcnica bioquímica bioquímica ! ! "s am#liamente utili$ado en biolo%ía molecular #ara #ara el aislamiento de A&' de A&' , , A' A' #roteínas ! *ol+menes i%uales de un fenol cloroformo se me$cla una muestra acuosa se me$clan, formando una me$cla bifsica ! "ste mtodo #uede tardar ms de unsistema unsistema basado en columnas , columnas , como la #urificación a base de sílice, #ero tiene una maor #ure$a . cita requerida / la ventaja de una alta recu#eración de A' una columna de A' es normalmente adecuado #ara la #urificación de corta duración (0122 nucleótidos A') es#ecies, como si'A si'A , , mi'A mi'A , , %'A t'A t'A ! ! 3todos de columna tambin ci$allamiento fra%mentos %randes de A&', que #uede o no #uede ser un #roblema en función de las a#licaciones #osteriores! Fue ideado ori%inalmente #or Piotr C4omc$ns5i 6acc4i 'icoletta #ublicada en 789: (referido como tiocianato de guanidinio-fenol-cloroformo). .7/ .1/ "l reactivo utili$ado es#ecíficamente #ara la extracción de 'A se vende #or 6i%ma-Aldric4 6i%ma-Aldric4 #or #or el ;I nombre eactivo, #or Invitro%en #or Invitro%en bajo bajo el nombre ;I$ol , #or
Cómofunciona "ste mtodo se basa en la se#aración de fases #or centrifu%ación de una me$cla de la muestra acuosa una solución que contiene a%ua saturada con fenol fenol , , cloroformo cloroformo una solución caotró#ico desnaturali$ante ( tiocianato de %uanidinio ), %uanidinio ), resultando en una fase su#erior acuosa una fase inferior or%nica (#rinci#almente fenol)! >cido nucleico (A', A&') de las #articiones en la fase acuosa, mientras que las #articiones de #roteínas en fase or%nica! "n una +ltima eta#a, el A' se recu#eró de la fase acuosa mediante #reci#itación con 1-#ro#anol o etanol etanol ! ! A&' se encuentra en la fase acuosa en ausencia de tiocianato de %uanidinio #or lo tanto la tcnica se #uede utili$ar #ara la #urificación de A&' solo! ;iocianato de %uanidinio desnaturali$a %uanidinio desnaturali$a las #roteínas, incluendo las 'asas, se#ara r'A de #roteínas ribosomales, mientras fenol , iso#ro#anol iso#ro#anol a%ua son disolventes con una mala solubilidad! "n #resencia de cloroformo o
Reactivos •
Fenol: "l fenol usado #ara bioquímica es en una solución saturada de a%ua con tam#ón de
;ris , tal como un tam#ón ;ris-solución B2 de fenol, cloroformo al B2, o como un tam#onada con ;ris B2 fenol, cloroformo al D9, 1 de alco4ol isoamílico solución (a veces llamado E1B1D7E)! "l fenol es, naturalmente, al%o soluble en a%ua, da una interfa$ difusa, la cual se a%udi$a #or la #resencia de cloroformo, el alco4ol isoamílico reduce la formación de es#uma! @a maoría de las soluciones tambin tienen un antioxidante, como fenol oxidado daos a los cidos nucleicos! Para la #urificación del A', el # se mantiene a alrededor de # D, que retiene el A' en la fase acuosa #referentemente! Para la #urificación del A&', el # es %eneralmente cerca de :, momento en el que todos los cidos nucleicos se encuentran en la fase acuosa! •
Cloroformo: Cloroformo se estabili$a con #equeas cantidades de amileno o etanol , a que
la ex#osición de cloroformo #uro a la lu$ ultravioleta oxí%eno #roduce fos%eno%as! Al%unas soluciones de cloroformo venir como #re-cloroformo 4i$o un 8=, D de me$cla de alco4ol isoamílico que se #uede me$clar con un volumen i%ual de fenol #ara obtener la solución 1B1D7! •
Alcohol isoamílico: alco4ol isoamílico #uede reducir la formación de es#uma ase%urar la
desactivación de 'asas!
Tiocianato de guanidinio (GI;C) es un com#uesto químico utili$ado como un desnaturali$ante
de #roteínas en %eneral, ser una%ente caotró#ico , aunque se usa ms com+nmente en la extracción de A&' A'! .7/ 'ota "ste com#uesto tambin #uede ser reconocida como tiocianato de guanidina. "sto es #orque %uanidinio es el cido conju%ado de %uanidina se llama el catión de %uanidinio , .C = ' H/ ! ;iocianato de %uanidina se #uede usar #ara desactivar un virus , como el virus de la %ri#e que causó el 7879 E %ri#e es#aola E, de modo que #ueden ser estudiadas de manera se%ura! "sta a#licación es de su#oner que la base de su actividad desnaturali$ación! ;iocianato de %uanidinio se utili$a tambin #ara lisar las clulas las #artículas de virus en el A' las extracciones de A&', donde la función, adems de su acción de lisis, es evitar que la actividad de las en$imas 'asa &'asa mediante la desnaturali$ación de las en$imas ellos! "stas en$imas de otro modo daar el extracto! Jn mtodo com+nmente usado es tiocianato de %uanidinio-fenol-cloroformo extracción ! 'o es estrictamente necesario el uso de fenol o cloroformo si la extracción de A' de transferencia
'ort4ern o un A&' #ara el anlisis de 6out4ern blot #orque la electroforesis en %el se%uido de la transferencia a una membrana se se#ara el A' K A&' de las #roteínas! Adicionalmente, #uesto que estos mtodos utili$an sondas que se unen a sus conju%ados, los ##tidos que conse%uir a travs del #roceso %eneralmente no im#orta a menos que un ##tido es una 'asa o &'asa, sólo si la en$ima se las arre%la #ara renaturali$ar, que no debería ocurrir si los #rotocolos adecuados se si%uen! Jna #osible exce#ción #odría ser cuando se trabaja con tem#eraturas extremófilos #orque al%unas en$imas de estos or%anismos #uede #ermanecer estable bajo circunstancias extraordinarias
Agente caotrópico De Wikipedia, la enciclopedia libre Saltar a navegación , búsqueda Un agente caotrópico es una sustancia que altera la estructura de, y desnaturaliza , macromoléculas tales como proteínas y cidos nucleicos !por e"emplo #D$ y #%$ &' Solutos caotrópicos aumentar laentropía del sistema al inter(erir con las interacciones mediadas por intramoleculares no covalentes tales como (uerzas de enlaces de )idrógeno , (uerzas de van der Waals , y los e(ectos )idró(obos ' *structura macromolecular y la (unción es dependiente del e(ecto neto de estas (uerzas !véase el plegamiento de la proteína &, por lo tanto, se deduce que un aumento de solutos caotrópicos en un sistema biológico desnaturalizarn macromoléculas, reducir la actividad enzimtica e inducir estrés en una célula !es decir, una célula tendr que sintetizar protectores de estrés&' +legamiento de proteínas terciaria es dependiente de las (uerzas )idró(obas de aminocidos en toda la secuencia de la proteína' Solutos caotrópicos disminuir la red e(ecto )idró(obo de regiones )idró(obas a causa de un desorden de las moléculas de agua adyacentes a la proteína' *sta solubiliza la región )idró(oba en la solución, lo que la desnaturalización de la proteína' *sto es también directamente aplicable a la región )idró(oba en bicapas lipídicas , si una concentración crítica de un soluto c)aotropgn(gnc se alcanza !en la región )idro(óbica de la bicapa&, entonces la integridad de membrana se ver comprometida, y la célula se lisan ' -./ 0aotrópicos sales que se disocian en solución e"ercer e(ectos caotrópicos a través de di(erentes mecanismos' 0onsiderando que los compuestos caotrópicos tales como etanol inter(erir con no1 covalentes(uerzas intramoleculares como se indicó anteriormente, las sales pueden tener propiedades caotrópicas por blinda"e cargos y prevenir la estabilización de puentes de sal' *l enlace de )idrógeno es ms (uerte en medios no polares, por lo que las sales, que aumentan la polaridad química del disolvente , también pueden desestabilizar el enlace de )idrógeno' 2ecanísticamente
esto es porque )ay moléculas de agua insucientes para e(ectivamente solvato los iones' *sto puede resultar en ión1dipolo interacciones entre las sales y especies de enlaces de )idrógeno que son ms (avorables que las normales de enlaces de )idrógeno ' -3/
