FROM GENE TO PROTEIN: TRANSKRIPSI DAN TRANSLASI

Preface Biologi molekuler merupakan disiplin ilmu yang perkembangannya sangat cepat. Hampir semua sisi kehidupan manusia kini bersinggungan dengan biologi molekuler dari pangan, energi, sampai dunia pengobatan. Obat-obat yang ada sekarang utamanya memiliki target tertentu yang bertangung jawab pada perkembangan suatu penyakit. Target obat umumnya adalah reseptor, juga enzim, kanal ion, dan transporter. Mempelajari transkripsi dan translasi merupakan bagian dasar dari proses pemahaman ekspresi gen. Bagaimana gen-gen yang ada tubuh kita terekspresi, sistem regulasi yang superketat akan dipelajari di kuliah kali ini. Banyak obat yang bekerja pada reseptor tertentu seperti antibiotik, oncology pipeline, dan masih banyak lagi. Sehingga mahasiswa farmasi setelah mengikuti kuliah ini bisa banyak bicara tentang mekanisme aksi obat sampai level molekuler. Pada bagian terakhir akan disinggung tentang perkembangan bioinformatika yang ledakannya juga luar biasa. Segala informasi biologis setelah selesainya Human Genome Project memicu munculnya databased dan analyzer yang jumlahnya kian banyak. Dengan kemampuan konsep “from gene to protein” diharapkan kita bisa menganalisis ekspresi gen dengan memanfaatkan informasi yang banyak tersedia di internet.

Yogyakarta, 28 Maret 2011 Sarmoko

Biologi Molekuler 2011

FROM GENE TO PROTEIN: TRANSKRIPSI DAN TRANSLASI Oleh: Sarmoko

OVERVIEW Biologi molekuler merupakan suatu ilmu yang mempelajari fenomena biologis pada aras molekuler. Sejak ditemukannya struktur DNA oleh Watson dan Crick (Gambar 1), ilmu ini berkembang dengan sangat pesat. Hal ini terjadi karena hampir semua peristiwa fenomena biologis saat ini, dituntut untuk bisa dijelaskan sampai level molekuler. Ketika mendengar kata level molekuler berati sampai level DNA, RNA, protein dan sebagainya. Sebagai contoh, mekanisme kerja obat sekarang tidak cukup jika hanya dijelaskan sampai level seluler namun sudah bisa dijelaskan sampai level DNA. Pada masa kini, seorang apoteker dituntut untuk bisa menjelaskan mekanisme obat sampai level molekuler. Bahkan, ilmu-ilmu yang ada sekarang makin menyempit ke arah molekuler, misal Farmakologi Molekuler, Toksikologi Molekuler, dan Farmakoepidemiologi Molekuler. Empat ilmu di atas, memerlukan landasan ilmu Biologi Molekuler yang kuat.

Gambar 1. Struktur double helix DNA. Struktur DNA dikemukakan oleh Watson dan Crick pada tahun 1965, mereka menyatakan bahwa model struktur DNA adalah untai ganda, dengan orientasi yang berlawanan (antiparalel), rantai 1 membentuk arah 5’ 3’, berpasangan dengan rantai dengan arah 3’ 5’. Kedua rantai berikatan dengan ikatan hidrogen antara basa A=T (2 ikatan H), dan G=C (3 ikatan H). ©Visionlearning, Inc. 1

FARMASI UNSOED


Dogma Sentral Biologi Molekuler Salah satu hallmark (penanda/karakteristik) dari suatu kehidupan yaitu reproduksi. Informasi genetik dari suatu sel dengan segala keunikannya tentunya harus

dapat

diturunkan

ke

anakannya.

Informasi gentik

(genom)

disimpan

menggunakan asam nukleat, yaitu DNA. Asam nukleat ini mampu menyimpan sejumlah besar informasi secara stabil hanya melalui 4 macam yakni adenin (A), sitosin (C), guanin (G) dan timin (T), yang tersusun menjadi rantai DNA. Informasi yang disimpan DNA tersebut akan diduplikasikan saat terjadi pembelahan sel (REPLIKASI) dan akan disalin menjadi mRNA (TRANSKRIPSI), yang selanjutnya RNA yang terjadi tersebut akan ditranslasikan menjadi urutan asam amino dari protein (TRANSLASI). Proses tersebut dinyatakan sebagi Dogma Sentral dari biologi molekuler (Gambar 2).

Gambar 2. Dogma sentral biologi molekuler. (1) DNA ditranskripsi oleh enzim RNA polymerase menjadi mRNA, (2) mRNA yang terbentuk mengalami proses pasca-transkripsi berupa pembuangan intron sehingga menjadi RNA mature, (3) mRNA ditranslasi menjadi urutan asam amino/protein yang terjadi di sitosol, (4) DNA diperbanyak melalui proses replikasi melibatkan ezim DNA polymerase.

2

FARMASI UNSOED


Gen memberi perintah untuk membuat protein tertentu. Tetapi gen tidak membangun protein secara langsung. Jembatan antara DNA dan sintesis protein adalah RNA. Kita ketahui bahwa RNA secara kimiawi serupa dengan DNA, kecuali RNA mengandung ribosa, bukan deoksiribosa sebagai gulanya. Sedangkan untuk basa nitrogen pada RNA adalah urasil (U), bukan timin (T). Dengan demikian, setiap nukleotida di sepanjang untai DNA memiliki deoksiribosa sebagai gulanya dan A, G, C, T sebagai basanya. Sedangkan pada RNA memiliki gula ribose dan A, G, C, U sebagai basanya. Aliran informasi genetik mirip dengan urutan-urutan huruf tertentu yang menyampaikan informasi dalam bahasa tulisan. Pada DNA atau RNA, monomernya merupakan keempat jenis nukleotida yang berbeda dalam basa nitrogennya. Gen biasanya panjangnya mencapai ratusan atau ribuan nukleotida, masing-masing memiliki urutan basa yang spesifik. Setiap polipeptida dari suatu protein juga memiliki monomer yang tersusun pada struktur primer, tetapi monomernya adalah ke-20 asam amino tersebut. Dengan demikian, asam nukleat dan protein berisi informasi yang ditulis dalam dua bahasa kimia yang berbeda (Gambar 3). Untuk beralih dari DNA, yang ditulis dalam satu bahasa, ke protein, yang ditulis dalam bahasa lain, membutuhkan dua tahapan utama yaitu transkripsi dan translasi.

Gambar 3. Ilustrasi aliran informasi genetik yang ditulis dalam dua bahasa kimia yang berbeda

Transkripsi merupakan sintesis RNA berdasarkan template DNA. Kedua asam nukleat menggunakan bahasa yang sama dan informasinya tinggal ditranskripsi (disalin) dari satu molekul ke molekul yang lain. Persis sebagai mana saat proses replikasi, untai DNA menyediakan suatu cetakan (template) untuk sintesis untai komplemen terbaru, pada transkripsi juga disediakan template untuk menyusun RNA. 3

FARMASI UNSOED


Molekul RNA yang dihasilkan merupakan transkrip penuh dari perintah pembangun protein dari gen tersebut. Jenis molekul RNA ini disebut RNA messenger (mRNA). Translasi merupakan sintesis polipeptida yang sesungguhnya, yang terjadi berdasarkan arahan mRNA. Selama tahapan ini terjadi perubahan bahasa, sel menerjemahkan (mentranslasi) urutan basa molekul mRNA ke dalam urutan asam amino polipeptida. Tempat translasi adalah ribosom yang terletak di sitoplasma. Walaupun mekanisme dasar transkripsi dan translasi serupa untuk prokariot dan eukariot, namun ter terdapat perbedaan penting dalam aliran informasi genetik di dalam sel. Karena bakteri tidak memiliki nukleus, DNA-nya tidak tersegregasi dari ribosom dan perlengkapan pensintesis-protein lainnya. Transkripsi dan translasi dipasangkan dengan ribosom menempel pada ujung depan molekul mRNA sewaktu transkripsi masih terus berlangsung. Sebaliknya, dalam sel eukariotik, selubung nukleus memisahkan transkripsi dan translasi dalam ruang dan waktu. Transkripsi terjadi di nukleus leus dan mRNA dikirim ke sitoplasma di mana terjadi translasi (Gambar 4). Tetapi sebelum mRNA meninggalkan nuk nukleus, leus, transkrip RNA dimodifikasi dengan berbagai cara untuk menghasilkan mRNA yang fungsional. Dengan demikian, pada proses 2 langkah ini, transkrip gen eukariotik menghasilkan pre-mRNA, pre dan pemrosesan RNA menghasilkan mRNA akhir.

Gambar 4. Lokasi terjadinya transkripsi dan translasi pada eukariot eukariot.. Transkripsi terjadi di nukleus dan mRNA dikirim ke sitoplasma di mana terjadi translasi. Gen memprogram sintesis protein melalui pesan genetik dalam bentuk mRNA. Dengan kata lain, sel diatur oleh rantai perintah molekuler: DNA RNA protein.

4

FARMASI UNSOED


TRANSKRIPSI

Transkripsi adalah proses penyalinan kode-kode genetik yang ada pada urutan DNA menjadi molekul RNA. Mekanisme dasar sintesis RNA Transkripsi (sintesis RNA) dilakukan melalui beberapa tahapan yaitu: 1. Faktor-faktor pengendali transkripsi menempel di bagian promoter, misalnya RNA polimerase (Inisiasi). 2. Pembentukan kompleks promotor terbuka (open promoter complex). Tidak seperti replikasi di mana DNA benar-benar dibuka, pada transkripsi pilinan DNA dibuka namun masih tetap di dalam RNA polimerase. 3. RNA polimerase membaca DNA cetakan (template) dan mulai melakukan pengikatan nukleotida yang komplementer (Elongasi). 4. Setelah pemanjangan untaian RNA, diikuti dengan terminasi yang ditandai dengan lepasnya RNA polimerase dari DNA yang ditranskripsi (Terminasi). Walaupun tahapan-tahapan yang terjadi sama antara eukariot maupun prokariot, namun ada perbedaan fundamental dalam hal struktur gen, faktor-faktor pengendali, mekanisme serta regulasi. Meskipun ada perbedaan, namun secara umum pola mekanisme sintesis RNA serupa. Baik pada eukariot maupun prokariot, PRINSIP yang harus di pegang adalah: 1. Prekursor untuk sintesis RNA ada 4 macam ribonukleotida: 5′-trifosfat ATP, GTP, CTP, dan UTP (tidak ada timin pada RNA). 2. Reaksi polimerisasi atau pemanjangan RNA sama dengan replikasi DNA yaitu dengan arah 5′ 3′ (5’-PO4 ke 3’-OH). 3. Urutan nukleotida RNA hasil sintesis ditentukan oleh urutan DNA template (Gambar 5). 4. Untai DNA yang berperan sebagai cetakan hanya salah satu untai. 5. Hasil transkripsi berupa molekul RNA untai tunggal.

5

FARMASI UNSOED


DNA template

Gambar 5. Urutan nukleotida RNA hasil sintesis ditentukan oleh urutan DNA template. RNA polimerase bekerja dengan membaca template dengan arah 3′ → 5′, namun sintesis mRNA adalah dari 5′ → 3’.

Faktor-faktor pengendali transkripsi, salah satunya adalah Faktor Transkripsi. Terdapat lebih dari 50 protein berbeda dari faktor transkripsi berikatan pada situs promoter, umumnya pada sisi 5’ dari gen yang akan ditranskrip. Kemudian, enzim RNA polimerase berikatan ke kompleks dari Faktor Transkripsi, bekerja sama untuk membuka DNA. RNA polimerase bekerja dengan membaca template dengan arah 3′ → 5′, namun sintesis mRNA adalah dari 5′ → 3’ . RNA polimerase berjalan sepanjang template DNA, membangun ribonukleotida yang disuplai dari bentuk trifosfat dengan prinsip pasangan basa. Ketika bertemu G, maka pada RNA dimasukkan C, G-C, T-A, A-U (U, dari uridine triphosphate, UTP). Tidak ada T pada RNA. Ketika transkripsi selesai, transkrip (mRNA) dilepaskan dari polimerase dan polimerae lepas dari DNA.

Transkripsi pada Prokariot Salah satu ciri dari prokariot adalah adanya struktur operon. Operon adalah organisasi dari beberapa gen yang ekspresinya dikendalikan oleh satu promotor. Misal operon lac, pada metabolisme laktosa pada bakteri E.coli. Masing-masiang gen structural mempunyai kodon inisasi dan kodon terminasi, tetapi ekspresinya dikendalikan oleh satu promoter yang sama (Gambar 6). Pada waktu ditranskripsi, operon lac akan menghasilkan satu mRNA yang membawa kode genetik untuk 3 polipeptida berbeda, disebut dengan mRNA polisistronik. Masing-masing polipeptida akan ditranslasi secara independen dari satu untaian mRNA yang sama.

6

FARMASI UNSOED


Gambar 6. Organisasi operan lac pada E. coli. Operon lac punya 3 gen struktural yaitu lac Z (mengkode β-galaktosidase), lac Y (mengkode permease) dan lac A (mengkode transasetilase). Masing-masing dari gen mempunyai start codon dan stop codon sendiri-sendiri, namun ekspresinya dikendalikan oleh satu promoter (p) yang sama. Operator (o) adalah bagian dari promoter tempet penempelan protein repressor yang dikode oleh gen I. Catabolite activator protein (CAP). AUG adalah start kodon (materi ini akan dijelaskan lebih dalam setelah mid semester.

Struktur Gen Prokariot Gen prokariot secara tersusun atas promoter, gen struktural, dan terminator (Gambar 7).

Gambar 7. Struktur gen prokariot

Promoter adalah urutan DNA spesifik yang berperan dalam mengendalaikan transkripsi gen struktural dan terletak di daerah upstream (hulu) dari bagian struktural gen. Fungsi promoter adalah sebagai tempat awal pelekatan enzim RNA polimerase yang nantinya melakukan transkripsi pada bagian gen struktural. Salah satu bagian penting promoter disebut sebagai Pribnow box pada urutan nukleotida -10 dan -35. Oleh karena urutan consensus pada Pribnow box adalah TATAAT, maka seringkali disebut juga TATA box. Pribnow box berperanan dalam mengarahkan enzim RNA polymerase sehingga arah transkripsinya adalah dari ujung 5’ 3’. Selain itu, daerah ini merupakan tempat pembukaan heliks DNA untuk membentuk kompleks promoter yang yang terbuka.

7

FARMASI UNSOED


Operator, merupakan urutan nukelotida yang terletak di antara promoter dan bagian struktural dan merupakan tempat pelekatan protein represor (penekan atau penghambat ekspresi gen). Jika ada represor yang melekat di operator maka RNA polimerase tidak bisa jalan dan ekspresi gen tidak bisa berlangsung. Selain adanya supresor ada juga enhancer. Jika supresor untuk menghambat, kebalikannya enhancer berfungsi meningkatkan transkripsi dengan meningkatkan jumlah RNA polimerase. Namun letaknya tidak pada lokasi yang spesifik, ada yg jauh di upstream atau bahkan downstream dari titik awal transkripsi. Coding Region (gen structural) merupakan bagian yang mengkode urutan nukleotida RNA. Transkripsi dimulai dari sekuens inisiasi transkripsi (ATG) sampai kodon stop (TAA / TGA / TAG). Pada prokariot tidak ada sekuens penyisip (intervening sequences atau intron, yang tidak dapat diekspresikan) sehingga semuanya berupa ekson (urutan nukleotida yang mengkode asam amino). Tidak semua gen mengkode urutan asam amino yang menyusun suatu polipeptida atau protein. Gen dibagi menjadi 3 kelompok yaitu gen yang mengkode protein, gen yang mengkode RNA ribosom (rRNA) dan gen yang mengkode transfer-RNA (tRNA). Gen yang mengkode rRNA dan tRNA hanya akan ditranskripsi dan tidak pernah ditranslasi karena yang diperlukan dalam proses ekspresi genetic adalah molekul RNA-nya. rRNA digunakan untuk menyusun ribosom (tempat sintesis protein) sedangkan tRNA berfungsi membawa molekul asam amino spesifik yang akan dirangkaikan menjadi polipeptida dalam proses sintesis protein. Terminator, adalah bagian gen yang terletak di sebelah hilir dari gen structural. Fungsinya

adalah

memeberikan

signal

pada

enzim

RNA

polymerase

agar

menghentikan proses transkripsi. Signal terminasi dicirikan oleh struktur jepit rambut/hairpin dan lengkungan yang kaya yang akan urutan GC yang terbentuk pada molekul RNA hasil transkripsi. RNA Polimerase, merupakan enzim yang mengkatalisis proses transkripsi. Susunan lengkap adalah α2ββ’σ disebut holoenzim, jika σ tidak ada dan hanya ada α2ββ’ disebut core-enzyme. Fungsi subunit-subunit tersebut adalah: α = diduga berfungsi dalam penyusunan enzim, β = berfungsi dalam pengikatan nukleotida, β’ = berfungsi dalam penempelan DNA, σ = berfungsi untuk mengarahkan agar RNA polimerase menempel pada promoter.

8

FARMASI UNSOED


MEKANISME TRANSKRIPSI PADA PROKARIOT Tahapan transkripsi terdiri dari inisiasi, elongasi, dan terminasi. Inisiasi. Transkripsi dimulai dengan penempelan RNA polimerase holoenzim pada bagian promoter. RNA polimerase menuju ke promoter atas bantuan faktor σ yang mampu menemukan bagian promoter suatu gen. Bisa diibaratkan RNA polymerase adalah pesawat, faktor sigma adalah antenanya, promoter adalah bandaranya. Pada prokariot, RNA polymerase menempel secara langsung pada DNA di daerah promoter tanpa melalui ikatan dengan protein lain (pada eukariot protein pembantu dibutuhkan sangat banyak !!). Kemudian, bagian DNA yang berikatan dengan RNA polimerase membentuk struktur gelembung transkripsi (transcription bubble) yang stabil. Selanjutnya adalah penggabungan beberapa nukleotida awal sekitar 10 nukleotida. Basa-basa RNA yang digabung membentuk ikatan hidrogen dengan basa DNA cetakan. Selanjutnya adalah pelepasan subunit σ setelah terbentuk molekul RNA sepanjang 8-9 nukleotida. Terjadi perubahan konformasi holoenzim jadi core enzyme (tanpa faktor σ). Faktor σ selanjutnya dapat digunakan lagi dalam proses inisiasi transkripsi selanjutnya (dapat digunakan oleh enzim inti RNA polimerase lain) (Gambar 8).

Gambar 8. Proses inisiasi transkripsi pada prokariot. Faktor sigma membantu mengenali promoter suatu gen.

Pada elongasi, nukleotida ditambahkan secara kovalen pada ujung 3′ molekul RNA yang baru terbentuk dengan arah 5′ 3′ pada ikatan fosfodiester (Gambar 9). Nukleotida RNA yg ditambahkan bersifat komplementer dengan nukleotida untai DNA cetakan.

9

FARMASI UNSOED


Gambar 9. Proses pembentukan ikatan fosfodiester. Gugus OH pada posisi 3’ menyerang posphat pada posisi 5’ melepas 2P dan molekul H2O membentuk ikatan fosfodiester yang stabil.

Penghentian transkripsi (terminasi) ada 2 macam yaitu: 1. Rho-independent yaitu terminasi yang dilakukan tanpa harus melibatkan protein khusus, namun ditentukan oleh adanya urutan nukleotida tertentu pada bagian terminator. Ciri urutan adalah adanya struktur jepit rambut/hairpin yang kaya akan basa GC. Akibat struktur itu, RNA polimerase berhenti dan membuka bagian dari sambungan (hibrid) DNA-RNA. Sisa hibrid merupakan urutan oligo U (rU) yang tidak cukup stabil berpasangan dengan A (dA) ikatan hidrogen hanya 2 buah, akibatnya ikatan lemah terlepas dan RNA hasil transkripsi lepas. 2. Rho-dependent yaitu terminasi memerlukan protein rho. Faktor rho terikat pada RNA transkrip kemudian mengikuti RNA polimerase sampai ke daerah terminator. Faktor rho membentuk destabilisasi ikatan RNA-DNA hingga akhirnya RNA terlepas.

10

FARMASI UNSOED


TRANSKRIPSI PADA EUKARIOT Struktur gen Gen-gen pada eukariot bersifat monosistronik, artinya satu transkrip yang dihasilkan hanya mengkode satu macam produk ekspresi. Pada eukariot tidak dikenal namanya operon karena satu gen structural dikendalikan oleh satu promoter. Secara umum hampir sama sama prokariot yaitu adanya promotor, bagian struktural dan terminator. Bagian yang membedakan adalah pada bagian struktural gen. Bagian struktural/coding region pada eukariot ada bagian intron dan ekson (Gambar 10). Intron (intervening sequences) merupakan sekuens yang tidak mengkode asam amino. Bagian ini akan dibuang saat RNA processing. Ekson merupakan sekuen yang dikode menjadi asam amino (Gambar 10).

Gambar 10. Bagian struktural gen eukariot

Mekanisme Transkripsi Pada Eukariot RNA polimerase pada eukariot bermacam-macam yaitu RNA polimerase I (mentranskrip gen kelas I yaitu gen rRNA kecuali 5S rRNA), RNA Polimerase II (mensintesis mRNA dan small nulear RNA/snRNA yang diperlukan pada saat RNA splicing) dan RNA polymerase III (mentranskrip gen kelas III yaitu tRNA, 5S rRNA). Pada bab ini hanya dijelaskan RNA polimerase II karena terlibat pada transkripsi semua gen.

11

FARMASI UNSOED


Berbeda dengan prokariot, RNA polymerase eukariot tidak menempel secara langsung pada DNA di daerah promoter namun melalui perantaraan protein-protein lain disebut faktor transkripsi/transcription factor (TF). TF ada 2 macam yaitu ada yang umum dan ada yang khusus. TF umum berfungsi mengarahkan RNA polymerase ke promoter. TF umum meiputi TFIIA, B, D, E, F, H, J (transcription factors regulating RNA pol II). Penempelan RNA polymerase [ada promoter oleh daktor transkripsi umum hanya menghasilkan transkripsi pada aras dasar (basal level). Pengaturan yang lebih spesifik dilakukan oleh FT yang khusus untuk suatu gen. Promoter eukariot sangat beragam dan sulit untuk dikarakterisasi. Basal promoter

elements

dikenal

dengan

TATA-box

dan

CCAAT-box,

dinamakan

berdasarkan sekuen motifnya (Gambar 11). TATA-box berada pada 20 sampai 30 basa upstream dari transcriptional start site dan ini sama dengan sekuen pada prokariot atau Pribnow-box (sekuen konsensusnya adalah TATAAA, TATAT/AAT/A, dimana T/A menandakan basa yang mungkin ditemukan pada posisi tersebut). TFIID adalah faktor transkripsi pertama yang secara langsung berikatan dengan TATA box dan penempelan ini mengarahkan faktor transkripsi lainnya dan RNA polymerase II untuk mengenali promoter. TFIID sebenarnya merupakan kompleks protein yang terdiri dari protein pengikat kotak TATA (TATA-box binding protein, TBP) dan TAF (TBPassociated factors). CCAAT-box terdapat pada posisi -100. CCAAT-box diketahui mengikat protein FT CCAAT-binding transcription factor (CTF) dan CCAAT-enhancerbinding protein (C/EBP).

Gambar 11. Struktur umum dari gen eukariot

Ada banyak regulator lain pada urutan gen, yaitu tempat berikatannya berbagai faktor transkripsi (Gambar 12). Urutan regulator ini sebagian besar adalah terletak hulu (5') dari situs inisiasi transkripsi, meskipun beberapa elemen terjadi hilir (3') atau bahkan di dalam gen itu sendiri. Jumlah dan jenis elemen regulator ditemukan bervariasi tiap masing-masing gen. Kombinasi yang berbeda dari faktor transkripsi ini 12

FARMASI UNSOED


memberikan efek yang berbeda. Berbagai jenis sel mengekspresikan kombinasi karakteristik dari faktor transkripsi, dan ini menghasilkan mekanisme utama untuk kekhususan tipe sel dalam regulasi ekspresi gen.

Gambar 11. Struktur bagian upstream gen eukariot. Dihipotesiskan terdiri dari 2 ekson dan 1 intron. Diagaram menunjukkan adanya TATA-box dan CCAAT box basal element masingmasing pada posisi -25 dan -100. FTIID terlihat berikatan dengan TATA-box binding protein, TBP. [CREB = cAMP response element binding protein] [C/EBP = CCAAT-box/enhancer binding protein]. Lingkaran besar hijau menggambarkan RNA polymerase II. Source: http://themedicalbiochemistrypage.org/gene-regulation.html

Tabel 1. Eukaryotic promoter elements

Kebanyakan walau tidak semua, CAAT dan GC-box berlokasi antara -200 dan -70. N = any (A, T, C, atau G), Py (pirimidin = C atau T). Penghilangan atau mutasi pada GC box dapat menghilangkan aktivitas promoter. Selain sekuen di atas, GC box juga mempunyai sekuen CCGCCC. Table 2. Daftar Beberapa Faktor Transkripsi Faktor transkripsi MYC and MAX

Sequence Motif

Komentar

CACGTG

FOS and JUN

TGA /GT /AA

CREB

TGACG /T /A /A

MYC pertama kali diidentifikasi sebagai onkogen retrovirus; MAX secara khusus bergabung dengan MYC di sel Keduanya pertama kali ditemukan sebagai onkogen retrovirus; bergabung di sel, dikenal juga sebagai faktor transkripsi AP1 Terikat pada cAMP response element (CRE); family minimal ada 10 factor transkripsi hasil dari gen yang berbeda

C

C

C

C

G

13

FARMASI UNSOED


ERBA; also TR (thyroid hormone receptor) ETS

GTGTCAAAGGTCA

GATA

T

/AGATA

MYB

T

/CAAC /TG

MYOD NFκB and REL

CAACTGAC A T (1) GGGA /CTN /CCC

RAR (retinoic acid receptor)

ACGTCATGACCT

SRF (serum response factor)

GGATGTCCATATTAGGACATCT

G

A

A

T

/C /CGGA /TG /C

G

atau alternative splicing; dapat membentuk dimer dengan JUN Pertama diidentifikasi sebagai onkogen retrovirus; member of the steroid/thyroid hormone receptor superfamily; binds thyroid hormone Pertama diidentifikasi sebagai onkogen retrovirus; mendominasi pada sel B dan T Family dari erythroid cell-specific factors, GATA-1 sampai -6 Pertama diidentifikasi sebagai onkogen retrovirus; hematopoietic cell-specific factor master kontrol diferensiasi sel otot kedua faktor diidentifikasi secara independen; REL pertama kali diidentifikasi sebagai onkogen retrovirus; mendominasi dalam sel B-dan -T mengikat pada elements disebut RAREs (retinoic acid response elements) juga mengikat situs JUN/FOS Terdapat banyak dalam gen yang diinduksi oleh faktor-faktor pertumbuhan yang ada pada serum

Daftar ini hanya mewakili ribuan dari faktor transkripsi yang telah diidentifikasi. N menandakan segala macam basa dapat menduduki posisi ini.

Proses pemanjangan transkrip berlangsung sama seperti pada prokariot. Proses ini akan berlangsung sampai RNA polymerase II mencapai daerah terminator. Terminasi transkripsi dapat terjadi karena adanya aktivitas fosfatase yang spesifik untuk CTD sehingga mengembalikan RNA polymerase II menjadi bentuk yang tidak terfosforilasi. Pada keadaan ini, RNA polymerase dapat digunakan secara berulangulang.

Proses pasca-transkripsi Pre-mRNA yg dihasilkan dari proses transkipsi tidak bisa langsung dikeluarkan ke sitoplasma untuk ditranslasi namun harus dimodifikasi dahulu. 1. Pemberian topi (capping) dan ekor (poliadenilasi) Setiap ujung molekul pre-mRNA dimodifikasi dengan cara tertentu. Ujung 5’ yaitu ujung depan, pertama kali dibuat saat transkripsi segera ditutup dengan mukleotida guanin (G) yang termodifikasi. Pemerian topi ini mempunyai setidaknya 2 fungsi. a. Ujung ini melindungi mRNA dari degradasi enzim hidrolisis. b. Setelah mRNA sampai di sitoplasma, ujung 5’ berfungsi sebagai bagian dari tanda “lekatkan di sini” untuk ribosom. 14

FARMASI UNSOED


Pada ujung 3’ suatu enzim menambahkan ekor polia(A) yang terdiri dari 30-200 nukleotida adenin. Ekor poli(A) berfungsi mempermudah ekspor mRNA dari nukleus.

Gambar 12. Capping dan pemberian ekor pada mRNA

Poliadenilasi merupakan proses penambahan poliA (rantai AMP) pada ujung 3′ nukleotida mRNA. Fungsinya untuk meningkatkan stabilitas mRNA dan meningkatkan efisiensi translasi. 2. Splicing Saat proses transkripsi, RNA polimerase mentranskripsi intron maupun ekson dari DNA. Splicing merupakan proses pembuangan intron dan penyambungan ekson. Intron adalah bagian penyela, merupakan segmen asam nukleat bukan pengkode dan terletak diantara daerah pengkode. Sedangkan ekson adalah daerah yang yang diekspresikan atau ditranslasi menjadi asam amino. Dalam penyambungan RNA, intron dikeluarkan dan ekson bergabung. Penyambungan RNA dikatalis oleh ribonukleoprotein nucleus kecil (snRNP), yang beroperasi de dalam susunan yang lebih besar disebut spliosom. Setelah dilakukan berbagai modifikasi di atas, jadilah mRNA matang (mature mRNA) (Gambar 13).

15

FARMASI UNSOED


Gambar 13. Proses splicing

16

FARMASI UNSOED


Alternatif splicing

Gambar 14. Alternative splicing memberikan hasil protein yang berbeda

NOTE:

Proses pembentukan RNA dari DNA dinamakan transkripsi, dilakukan oleh RNA polymerase. Pada kebanyakan virus, materi genetik berupa RNA sehingga ketikan menginfeksi host, materi genetik di retro-transkripsi dari RNA menjadi cDNA (complement DNA) oleh ennzim Reverse trancriptase.

17

FARMASI UNSOED


TRANSLASI

Translasi adalah proses penerjemahan urutan nukleotida yang ada pada molekul mRNA menjadi rangkaian asam amino yang menyusun suatu polipeptida atau protein. RNA yang ditranslasi adalah mRNA, sedangkan tRNA dan rRNA tidak ditranslasi. Molekul rRNA adalah salah atau molekul penyusun ribosom yaitu organel tempat berlangsungnya sintesisi protein, sedangkan tRNA adalah pembawa asamasam amino yang akan disambungkan menjadi rantai polipeptida. Beberapa tipe RNA yang disintesis di nukleus pada sel eukariot, yang menarik sebagai berikut: 1. messenger RNA (mRNA). mRNA kemudian bisa ditranslasi menjadi polipeptida. 2. ribosomal RNA (rRNA). rRNA digunakan untuk membangun ribosom, yaitu mesin untuk mensintesis protein pada saat translasi mRNA. 3. transfer RNA (tRNA), yaitu molekul RNA yang membawa asam amino selama pembentukan polipeptida. 4. small nuclear RNA (snRNA). Transkripsi DNA dari gen menjadi mRNA, rRNA, dan tRNA menghasilkan molekul prekursor dengan struktur yang besar disebut "primary transcripts". Molekul ini harus diproses dalam nukleus untuk menghasilkan molekul fungsional untuk diekspor ke sitosol. Beberapa tahapan proses ini banyak melibatkan snRNA. 5. microRNA (miRNA). Molekul RNA yang sangat kecil (~22 nukleotida) yang terlihat pada regulasi ekspresi mRNA. Molekul mRNA merupakan transkrip urutan DNA yang menysusun suatu gen dalam bentuk ORF (open reading frame, kerangka baca terbuka). Ciri-ciri ORF: 1. Kodon inisasi translasi, yaitu ATG (pada DNA) atau AUG (pada mRNA) 2. Serangkaian urutan nukleotida yang mneyusn banyak kodon 3. Kodon terminasi translasi yaitu TAA, TAG, TGA (pada DNA) atau UAA, UAG, UGA (pada RNA). Kodon (kode genetik) adalah urutan nukloetida yang terdiri dari 3 nukloetida berurutan sehingga sering disebut sebagai triplet codon yang menyandi suatu asam amino tertentu. Kodon inisiasi translasi merupakan kodon untuk asam amino metionin 18

FARMASI UNSOED


yang mengawali struktur suatu polipeptida (protein). Pada prokariot, asam amino awal tidak berupa metionin tetapi formil metionin (fMet). Dalam proses translasi, rangkaian nukleotida pada mRNA akan dibaca tiap tiga nukleotida sebagai satu kodon untuk satu asam amino, dan pembacaan dimulai dari urutan kodon metionin (Gambar 15).

Gambar 15. Ilustrasi translasi kodon

Translasi berlangsung di dalam ribosom, ribosom disusun oleh molekul-molekul rRNA dan beberapa macam protein. Ribosom tersusun atas dua subunit yaitu subunit kecil dan subunit besar. Pada eukariot, subunit kecil mempunyai koefisien sedimentasi sebasar 30S (unit Svedberg) dan subunit besar 50S, pada eukariot yaitu 50S dan 70S. Pada prokariot, riosom tersebar di seluruh bagian sel, sedangkan pada eukariot ribosom terletak di sitoplsma kususnya pada bagian permukaan membran retikulum endoplasma.

19

FARMASI UNSOED


Gambar 16. Penentuan unit sedimentasi pada komponen ribosom

Pada eukariot, translasi sudah dimulai sebelum proses transkripsi (sintesis mRNA) selesai dilakukan. Dengan demikian proses transkripsi dan translasi berlangsung hampir serempak. Sebaliknya, pada eukariot proses translasi baru dapat berlangsung jika proses transkripsi (sintesis mRNA yang matang) sudah selesai dilakukan. Proses transkripsi pada eukariot berlangsung di dalam inti sel, sedangkan translasi berlangsung dalam ribosom yang ada di dalam sitoplasma. Setelah sintesis mRNA selesai, selanjuttnya mRNA keluar dari inti sel menuju sitoplasma untuk bergabung dengan ribosom. Proses Translasi Proses translasi berlangsung melalaui 3 tahapan utama: 1. Inisiasi (initiation) 2. Pemanjangan (elongation) poli-asam amino 3. Pengakhiran (termination). Perangkat translasi yaitu molekul tRNA (aminoasil tRNA) yang berfungsi membawa asam amino spesifik. Terdapat sekitar 20 macam tRNA yang masingmasing membawa asam amino spesifik karena di alam ada sekitar 20 asam amino yang menyusun protein alami. Enzim yang mengikatkan antar-asam amino adalah aminoasil tRNA sintetase.

20

FARMASI UNSOED


Gambar 17. Struktur tRNA aminoasil

Inisiasi Ada beberapa perbedaan dalam hal proses inisiasi translasi antara prokariot dengan eukariot. Pada eukariot kodon inisiasi adalah metionin, sedangkan pada prokariot adalah formil-metionin/fMet. Molekul tRNA inisiator disebut tRNAiMet. Ribosom bersama-sama dengan tRNAiMet dapat menemukan kodon awal dengan cara berikatan dengan ujung 5’ (tudung) kemudian melakukan scanning transkrip ke arah 3’ (arah 5’Æ 3’) sampai menemukan start kodon (AUG). selama scanning, ribosom memulai translasi pada waktu menjumpai sekuen konsensus CCRCCCAUGG (R adalah purin: A/G).

Gambar 18. Perbedaan translasi pada prokariot dan eukariot

21

FARMASI UNSOED


Elongasi Proses elongasi terjadi dalam 3 tahapan: 1. Pengikatan aminoasil-tRNA pada sisi A (aminoasil) yang ada di ribosom 2. Pemindahan rantai polipeptida yang tumbuh dari tRNA yang ada pada sisi P (peptidil) ke arah sisi A dengan membentuk ikatan peptida 3. Translokasi ribosom sepanjang mRNA ke posisi kodon selanjutnya yang ada di sisi A.

Gambar 19. Proses elongasi translasi

Proses pemanjangan polipeptida berlangsung sangat cepat. Pada E. coli sintesis polipeptida yang terdiri dari atas 300 asam amino hanya memelrukan waktu selama 15 detik. Ribosom membaca kodon-kodon pada mRNA dari ujung 5’ Æ 3’. Hasil proses translasi adlah molekul poliptida yang mempunyai ujung amino dan ujung karboksil. Ujung amino adalaah ujung uang pertama kali disntesis dan merupakan hasil penerjemahan kodon yang terletak pada ujung 5’ pada mRNA, sedangkan ujung yang terakhir disitesis adlah gugus karboksil, hasil terjemahan kodn yang terletak pada ujung 3’ pada mRNA. Terminasi Translasi akan berakhir pada waktu salah satu dari ketiga kodon terminasi (UAA, UGA, UAG) yang ada pada mRNA mencapai posisi A pada ribosom. Dalam keadaan normal, tidak ada aminoasil-tRNA yang membawa asam amino sesuai

22

FARMASI UNSOED


dengan ketiga kodon tersebut. Oleh karena itu, jika ribosom mencapai salah satu dari ketiga kodon terminasi tersebut, maka proses translasi berakhir.

Proses Pasca-Translasi Selama proses translasi dan sesudahnya, rantai polipeptida yang terbentuk mulai menggulung dan melipat secara spontan membentuk protein fungsional dengan konformasi yang spesifik. Konformasi ini berupa suatu molekul tiga dimensi dengan struktur skunder dan tersier. Pelipatan protein dibantu oleh suatu protein chaperon. Langkah tambahan yang dilakukan sebelum dikirim ke target adalah memberikan modifikasi secara kimiawi. Pada asam amino tertentu dilakukan penambahan gula, lipid, gugus fosfat atau penambahan-penambahan lain. Pada beebrapa kasus, rantai polipetida tunggal dapat membelah secara enzimatik menjadi dua atau lebih potongan, missal insulin. Protein insulin pertama kali disintesis sebagai rantai

polipeptida

tunggal

tetapi

menjadi

aktif

hanya

setelah

suatu

enzim

menghilangkan bagian tengah dari rantai tersebut, membentuk protein yang terdiri dari 2 rantai peptida yang terhubung dengan jembatan sulfida. Polipeptida sinyal mengarahkan beberapa polipeptida eukariotik ke tujuan spesifik di dalam sel. Protein yang akan tetap berada dalam sitosol dibuat pada ribosom bebas. Protein yang ditujukan untuk membrane atau untuk diekspor dari sel , disintesis pada ribosom yang terikat RE. Partikel pengenlan-sinyal mengikatkan diri pada urutan sinyal pada ujung leading dari polipeptida yang sedang tumbuh, yang membuat ribosom dapat mengingkatkan diri pada RE.

Obat Yang Bertarget Pada Translasi Banyak obat yang bertarget pada proses translasi terutama obat golongan antibiotik. 1. Puromisin.

Proses pemanjangan polipeptida dihambat oleh puromisin,

mempunyai struktur yang mirip dengan suatu aminoasil-tRNA sehingga dapat melekat pada sisi A ribosom. Jika puromisin melekat pada sisi A, maka selanjutnya dapat membantuk ikatan peptida dengan peptida yang ada pada sisi P dan menhasilkan peptidil puromisin. Peptidil puromisin tidak dapat melekat kuat pada ribosom sehingga akhirnya terlepas. Hal ini menyebabkan terjadinya terminasi translasi secara prematur. Mekanisme inilah yang 23

FARMASI UNSOED


menyebabkan puromisin dapat membunuh bakteri dan sel lainnya. Antibiotik lain yang dapat menghambat translasi dengan cara berikatan pada ribosom adlaah strptomisin, kloramfenikol, tetrasiklin, eritromisin, dan sikloheksimid. 2. Streptomisin.

Kode Genetik

OPEN READING FRAME Tidak semua bagian DNA merupakan kode genetik, pada manusia sejumlah 98% adalah junk DNA, hanya 2% yang berupa gen yang mengkodekan protein. Namun, dari persentase yang sedikit tersebut bagaimana membentuk protein yang jumlahnya ribuan? ATGTATTCTTACGGAATCCCTGAT Sel membaca kalimat di atas sebagai kata-kata 3 huruf: ATG TAT TCT TAC GGA ATC CCT GAT (DNA) M Y S Y G I P D (Asam amino) Reading Frame 24

FARMASI UNSOED


Bisa juga kita melakukan alternatif pembacaan berikut: A TGT ATT CTT ACG GAA TCC CTG AT Atau seperti ini: AT GTA TTC TTA CGG AAT CCC TGA T Dan kalau diterjemahkan hasilnya pun akan berbeda: A TGT ATT CTT ACG GAA TCC CTG AT C I L T E S L AT GTA TTC TTA CGG AAT CCC TGA T V F L R N P * Jadi ada 3 alternatif pembacaan dari satu untai DNA, dan karena DNA itu adalah pasangan 2 untai yang saling berkomplemen, berarti kalimat inipun bisa dibaca pada untai pasangannya, artinya total ada 6 cara pembacaan DNA, atau disebut Reading Frame. Dari 6 reading frame, biasanya hanya salah satu frame saja yang merupakan kalimat bermakna alias disebut gen. Contoh pembahasan ORF di bagian bioinformatika berikut.

25

FARMASI UNSOED


PEMANFAATAN BIOINFORMATIKA UNTUK ANALISIS EKSPRESI GEN Sarmoko

Perkembangan bioinformatika berkembang sangat pesat. Penggunaan internet dan komputer untuk melakukan analisis semakin sering digunakan, dan kita pun dituntut untuk dapat menguasainya. Seiring dengan itu, telah banyak diciptakan

software maupun database yang menunjang dan mempermudah kita untuk dapat melakukan analisis tentang berbagai disiplin ilmu. Demikian halnya dengan biologi molekular yang mempelajari makhluk hidup dalam tingkat molekuler, seperti gen, DNA, ataupun RNA yang berperan dalam proses sintesis berbagai jenis asam amino dan protein. Saat ini telah ada banyak situs

database tentang gen (gen bank) yang dapat diakses secara mudah melalui internet yang memungkinkan kita untuk melakukan analisis seputar gen. Gen bank ini disediakan antara lain oleh situs NCBI

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/.

Melalui situs tersebut kita bisa melakukan analisis serta mencari informasi biologi dan referensi selengkap-lengkapnya terhadap gen tertentu yang kita inginkan, misalnya dari makhluk hidup jenis gen tersebut berasal, letak domain, gen sehomologi, asam amino yang dihasilkan, open reading frame, struktur 3 dimensi dari protein yang mungkin dihasilkan, transuksi signal, dan lain-lain. TOUR BEGIN Masuklah ke situs: HGNC (http://www.genenames.org). Misal kita ingin menganalisis tumor supressor gene p53. Dari halaman TP53 diperoleh link yang lengkap, dan bisa membawa kita ke NCBI. Berikut hasil analisis yang dilakukan: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/35213? Tentang p53 p53 plays a major role in preventing tumour development. It responds to a range of potentially oncogenic stresses by activating protective mechanisms, most notably cell cycle arrest and apoptosis. Its importance as a tumour suppressor is reflected by its high rate of mutation in human cancer, with >50% of adult human tumours bearing inactivating mutations or deletions in the TP53 gene. In many cancers where p53 is wild-type, the p53 pathway may be altered by other oncogenic events. This means that the p53 response is probably defective in most cancers.

26

FARMASI UNSOED


This gene encodes tumor protein p53, which responds to diverse cellular stresses to regulate target genes that induce cell cycle arrest, apoptosis, senescence, DNA repair, or changes in metabolism. p53 protein is expressed at low level in normal cells and at a high level in a variety of transformed cell lines, where it's believed to contribute to transformation and malignancy. p53 is a DNA-binding protein containing transcription activation, DNA-binding, and oligomerization domains. It is postulated to bind to a p53-binding site and activate expression of downstream genes that inhibit growth and/or invasion, and thus function as a tumor suppressor. Mutants of p53 that frequently occur in a number of different human cancers fail to bind the consensus DNA binding site, and hence cause the loss of tumor suppressor activity. Alterations of this gene occur not only as somatic mutations in human malignancies, but also as germline mutations in some cancer-prone families with Li-Fraumeni syndrome. Multiple p53 variants due to alternative promoters and multiple alternative splicing have been found. These variants encode distinct isoforms, which can regulate p53 transcriptional activity. [provided by RefSeq]

DNA Sequence Gen p53 berlokasi pada kromosom 17 (17p13).

Panjang origin: 1..20303 Namun gen terletak pada: 843..19876 mRNA adalah dari : join(843..949,11689..11790,11906..11927,12021..12299, 13055..13238,13320..13432,14000..14109,14452..14588, 14681..14754,17572..17678,18599..19876)

Kita hitung joinan di atas, ternyata terdapat 11 exons. There is a very large intron between exons 1 and 2 (jarak nukleotida sangat panjang bukan? Dari 950-11688). Exon 1 is non-coding

27

FARMASI UNSOED


in the human p53 and it has been demonstrated that this region could form a stable stem-loop structure which binds tightly to wild type p53 but not to mutant p53.

Note: The exon are numbered in the diagram above. The pink region denotes the UTR, the blue region denotes the coding region and the grey region denotes the internal exons within the introns.

Kita bisa melihat persebaran 11 exon dan panjangnya dari informasi berikut: prim_transcript 843..19876 /gene="p53" exon 843..949 /gene="p53" /number=1 intron 950..11688 /gene="p53" /number=1 repeat_region 2581..2587 /gene="p53" /note="5'-ALU flanking" Repeat region banyak sekali di sini repeat_region

exon

11374..11378 /gene="p53" /note="3' ALU-flanking" 11689..11790 /gene="p53"

CDS join(11717..11790,11906..11927,12021..12299,13055..13238, 13320..13432,14000..14109,14452..14588,14681..14754, 17572..17678,18599..18680) 28

FARMASI UNSOED


/gene="p53" /codon_start=1 /product="protein p53" /protein_id="CAA38095.1" /db_xref="GI:35214" /db_xref="GDB:120445" /db_xref="GOA:P04637" /db_xref="HGNC:11998" /db_xref="InterPro:IPR002117" /db_xref="InterPro:IPR008967" /db_xref="InterPro:IPR010991" /db_xref="InterPro:IPR011615" /db_xref="InterPro:IPR012346" /db_xref="InterPro:IPR013872" /db_xref="InterPro:IPR015551" /db_xref="PDB:1A1U" /db_xref="PDB:1AIE" /db_xref="PDB:1C26" Kode pDB juga banyak di sini. Artinya adalah sudah banyak struktur Kristal protein yang sudah diidentifikasi. Klik tiap PDB ID akan membawa kita ke protein data bank dan didapat informasi tentang kompleks protein. /db_xref="PDB:3LW1" /db_xref="PDB:3SAK" /db_xref="UniProtKB/Swiss-Prot:P04637"

Hasil translasi adalah: /translation="MEEPQSDPSVEPPLSQETFSDLWKLLPENNVLSPLPSQAMDDLM LSPDDIEQWFTEDPGPDEAPRMPEAAPRVAPAPAAPTPAAPAPAPSWPLSSSVPSQKT YQGSYGFRLGFLHSGTAKSVTCTYSPALNKMFCQLAKTCPVQLWVDSTPPPGTRVRAM AIYKQSQHMTEVVRRCPHHERCSDSDGLAPPQHLIRVEGNLRVEYLDDRNTFRHSVVV PYEPPEVGSDCTTIHYNYMCNSSCMGGMNRRPILTIITLEDSSGNLLGRNSFEVRVCA CPGRDRRTEEENLRKKGEPHHELPPGSTKRALPNNTSSSPQPKKKPLDGEYFTLQIRG RERFEMFRELNEALELKDAQAGKEPGGSRAHSSHLKSKKGQSTSRHKKLMFKTEGPDS D" intron 11791..11905 /gene="p53" /number=2 Analisis promoter Pada keterangan di atas, dikatakan bahwa CDS (coding sequence) dimulai pada urutan 843..19876. Exon 1 adalah 843-949 Start codon adalah ATG. Coba cek, ada banyak ATG sebelum nomor 843 bukan?? Hal ini sesuai dengan teori bahwa bukah ATG pertama lah yang bakal jadi stop codon, bisa kedua ketiga dst, sampai ATG yang paling dekat dengan CDS (coding sequence = warna merah): yaitu 801-803 (warna biru) 1 ttcccatcaa gccctagggc tcctcgtggc tgctgggagt tgtagtctga acgcttctat 29

FARMASI UNSOED


61 cttggcgaga aaagcacctg 121 caccgccccc tgcatctcat 181 tctccaggct gctcttactt 241 gctacccagc gtagaaaaat 301 tctatatcct ataaatctta 361 tcagagtgat agtatctggg 421 agaaaacgtt tttaactgat 481 gagaagaaag cccttcatat 541 ttgacacaat acagctctgg 601 cttgcagaat cgagaatcct 661 gactctgcac cggattactt 721 gcccttactt gggttgatgg 781 gattggggtt agcttctcaa 841 aagtctagag actttgcgtt 901 cgggctggga taagctcctg

agcgcctacg ctccccctac cgagtcccgc ggtaattctt ccgccgcctg cagagggcgc agcaggtctt gcacctcttc tcagacctgt ctccctcatt caaaaaatat ttattatcga actgatatag gcactcagga atacaacaat gaataagata cataaggctt acgtttccat gtactgaaag caatgaacaa aagggttgtg aaggagatta aataagatgg tgtgatataa agggtgtgga tattacggaa agccttccta aaaaatgaca gatccagctg agagcaaacg caaaagcttt cttccttcca gcaggattcc tccaaaatga tttccaccaa ttctgccctc tttccacccc aaaatgttag tatctacggc accaggtcgg cctcctcccc aactccattt cctttgcttc ctccggcagg gtcatggcga ctgtccagct ttgtgccagg agcctcgcag ttcccctccc atgtgctcaa gactggcgct aaaagttttg ccaccgtcca gggagcaggt agctgctggg ctccggggac gcgtgctttc cacgacggtg acacgcttcc ctggattggg

Dst ……

Sekuen berikutnya adalah intron yang ternyata berupa repeat sekuen yang

sangat

panjang

sampai

ketemu

exon

kedua

yaitu

pada

sekuen:

11689..11790 Dst sampai exon 12. Stop kodon berhenti pada urutan setelah exon terakhir. exon

18599..19876 /gene="p53" /number=11 repeat_region 19424..19431 /gene="p53" /note="3' ALU-flanking"

Berarti pada 19887-19889 yaitu: 19861 taaaactttg ctgccacctg tgtgtctgag gggtgaacgc cagtgcaggc tactggggtc

30

FARMASI UNSOED


OPEN READING FRAME Dari hasil 6 pembacaan diperoleh hasil:

Masih banyak lagi yang bisa ditelusur dari gen, bisa diklik di sebelah kanan sbb:

31

FARMASI UNSOED


Hasil translasi adalah: /translation="MEEPQSDPSVEPPLSQETFSDLWKLLPENNVLSPLPSQAMDDLM LSPDDIEQWFTEDPGPDEAPRMPEAAPRVAPAPAAPTPAAPAPAPSWPLSSSVPSQKT YQGSYGFRLGFLHSGTAKSVTCTYSPALNKMFCQLAKTCPVQLWVDSTPPPGTRVRAM AIYKQSQHMTEVVRRCPHHERCSDSDGLAPPQHLIRVEGNLRVEYLDDRNTFRHSVVV PYEPPEVGSDCTTIHYNYMCNSSCMGGMNRRPILTIITLEDSSGNLLGRNSFEVRVCA CPGRDRRTEEENLRKKGEPHHELPPGSTKRALPNNTSSSPQPKKKPLDGEYFTLQIRG

RERFEMFRELNEALELKDAQAGKEPGGSRAHSSHLKSKKGQSTSRHKKLMFKTEGPDS M adalah metionin (hasil translasi dari AUG)

Protein sequence: The human p53 protein comprises of several domains: 1. The amino-terminus part (1-44) contains the transactivation domain, which is responsible for activating downstream target genes. 2. A proline-rich domain (58-101) mediates p53 response to DNA damage through apoptosis. 3. The DNA-binding domain (102-292) is a core domain which consists of a variety of structural motifs. It is the target of 90% of p53 mutations found in human cancers as a single mutation within this domain can cause a major conformational change. 4. The oligomerization domain (325-356) consists of a β-strand, which interacts with another p53 monomer to form a dimer, followed by an α-helix which mediates the dimerization of two p53 dimers to form a tetramer. 5. Three putative nuclear localization signals (NLS) have been identified in the Cterminus, through sequence similarity and mutagenesis. The most N-terminal NLS (NLSI), which consists of 3 consecutive Lysine residues to a basic core, is the most active and conserved domain. 6. Two putative nuclear export signals (NES) have been identified. The leucine-rich Cterminal NES, found within the oligomerization domain, is highly conserved and it has been suggested that oligomerization can result in masking of the NES, resulting in p53 nuclear retention.

32

FARMASI UNSOED


Mutations Inactivation of the p53 gene is essentially due to small mutations (missense and nonsense mutations or insertions/deletions of several nucleotides), which lead to either expression of a mutant protein (90% of cases) or absence of a protein (10% of cases. Mutations of p53 have been found in nearly all tumor types and are estimated to contribute to around 50% of all cancers. Polymorphisme The role of natural p53 variants (polymorphisms) or variants in the p53 signalling pathway is an area that is less well explored. Several polymorphisms have been identified in the p53 gene. A well known SNP occurs on Codon 72 (Arg/Pro). Transcription Factors p53 transcription under different conditions is related to vast number of biological events in response to various cellular stresses. Human p53 consists of two promoters: •

P1 responsible for the transcription of the major p53 mRNA species and located upstream of first exon,

•

P2 involved in transcription of other rarer species and located within the first intron region.

Recent studies have suggested that there is another "P2" located within intron 4 and responsible generating the p53 isoforms. Regulatory elements are found in both p53 upstream and downstream of start sites including exons and introns. So far, there are more than 15 transcription factors binding sites are experimentally and computationally identified within the P1 and first exon regions. A binding site for members of the PAX family of transcription factors was identified in the first non-coding exon of the human p53 gene. c-Myc/Max heterodimers have been shown to bind to and transactivate the human promoter through a CATGTG motif. NF-kB Jun/Fos and homeobox factor Hoxa5 are shown to regulate p53 expression transcriptionally. These transcription factors function under different biological conditions such as apoptosis, cell-cycle arrest and etc, in terms of time, space and quantity. 33

FARMASI UNSOED


Protein Interactions

Post-translational modifications and activation of p53 by genotoxic stresses Appella, E. and Anderson, C.W. Eur. J. Biochem. 268, 27644-72 (2001) Monoclonal Antibodies The p53 protein is a potent antigen that has the ability to raise antibodies when injected into a foreign host. Currently, the p53 knowledgebase contains more than 50 distinct antibodies recognizing the different domains of p53. Most of the antibodies recognize epitopes localized in the N-terminal of p53. Some of the antibodies are able to bind to p53 in its native conformation, while other antibodies, like pAb240, DO12 and HO3.5, can only bind to mutant p53 whose structural conformation has been altered. Regulatory pathway, klik berikut: http://p53.bii.a-star.edu.sg/aboutp53/pathway/index.php

34

FARMASI UNSOED

Biologi Molekuler 2011 Daftar Istilah

Istilah

Definisi

Hipotesis one gene-one polypeptide

Beadle and Tatum's idea that genes do not always form an enzyme or protein, they instead form one polypeptide

transkripsi

synthesis of RNA under the direction of DNA

messenger RNA, mRNA

the RNA molecule that carries the genetic message from the nucleus to the ribosomes

translasi

synthesis of a polypeptide

ribosom

particles that facilitate the linking of amino acids in the polypeptide chain

RNA processing

pre-mRNA undergoes this in order to acheive the finished RNA

primary transcript

the initial RNA transcript that is not translated into protein

triplet code

genetic instructions for a polypeptide chain are written in the DNA as a series of three-nucleotide words

template strand

the strand of DNA that is transcribed (the other strand will be duplicated, in a sense, on the mRNA)

kodon

triplet dari basa mRNA

reading frame

Cara pembacaan spesifik dari gugusan kata (uua ccg gca uaa bisa juga di baca uac cgg cau aa...)

RNA polimerase

pries the two strands of DNA apart and hooks together RNA nucleotides as they base-pair

promoter

Urutan DNA dimana RNA polimerase menempel dan menginisiasi transkripsi

terminator

sequence that signals the end of transcription

transcription unit

stretch of DNA that is transcribed into an RNA molecule

Faktor transkripsi

mediate the binding of RNA polymerase and the initiation of transcription

transcription initiation complex

the completed assembly of transcription factor and RNA polymerase II bound to the promoter

TATA box

promoter DNA sequence in eukaryotes

5' cap (tudung 5)

a modified form of guanine that facilitates the export of mRNA from the nucleus and protects it from degradation

poly-A tail (ekor poli-A)

on the 3' end, many adenines are added for protection from degradation and to help it exit the nucleus

RNA splicing

Proses pemotongan pembuangan intron

intron

non coding sequences of nucleic acid

exon

Sekuen pengkode pada RNA

spliceosome

a type of snRNP that assists in RNA splicing

snRNP small nuclear ribonucleoproteins

located in the cell nucleus and is the signal molecule for splicing

ribozymes

RNA molecules that function as enzymes; can splice itself

alternative RNA splicing

genes that can give rise to two or more different polypeptides depending on which segments are treated as exons 35

FARMASI UNSOED


domains

discrete functional and structural regions of proteins that make up the modular architecture

transfer RNA

brings amino acids to the ribosome for making the polypeptide chain; clover shaped with anticodon end and recieving end

anticodon

a nucleotide triplet that will base pair with the complimentary codon on the mRNA

aminoacyl-tRNA synthetase

enzyme that joins the correct amino acid to tRNA

wobble

relaxation of base-pairing rules; allows for the third base to be different and still yield the same amino acid

ribosomal RNA

composes the two ribosomal subunits

P site "peptidyl-tRNA site"

holds the tRNA carrying the growing polypeptide chain

A site "aminoacyl-tRNA site"

holds the tRNA carrying the next amino acid to be added to the chain

E site "exit site"

discharged tRNAs leave the ribosome from here

polyribosomes or polysomes

multiple ribosomes can synthesize polypeptides from the same mRNA strand at the same time

signal peptide

marks the polypeptides that are destined for the endomembrane system or secretion

this particl is that adapter that brings the ribosome to a receptor signal-recognition particle protein in the ER so polypeptide synthesis can continue and be on (SRP) its way to the endomembrane system/ secretion

Daftar Pustaka Alberts, B., Johnson, A., Lewis, J., Raff., M., Roberts, K., Walter, P., 2008, Molecular Biology of The Cell, 5th Edition, Garland Science, Taylor&Francis Group Campbell, N.A., Reece, J.B., dan Mitchell, L.G., 2002, Biologi, Edisi 5, Jilid 1, Erlangga, Jakarta Lodish, H., 2003, Molecular Cell Biology, 5th Ed., Freeman Yuwono, T., 2005, Biologi Molekular, Erlangga, Jakarta

36

FARMASI UNSOED

FROM GENE TO PROTEIN: TRANSKRIPSI DAN TRANSLASI

Recommend Documents