Extraccion de Aceites Esenciales Por Fluido Supercritico
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EXTRACCIÓN DE DNA MICRO ESCALADO POR “SALTING OUT” Autor
Lic. Raúl P. Ferreira Capote
Departamento
Biología Molecular y Genética
OBJETIVO •
Método para la extracción y purificación de DNA a partir de sangre periférica con una calidad suficiente para análisis por PCR
Indicaciones •
Se utilizará cuando las cantidades de DNA requeridos para el estudio sean menores de 1 microgramo. Esta situación se presenta en análisis en que sólo se necesita realizar uno o dos procesos de amplificación a partir del DNA del paciente.
Breve descripción •
Método propuesto por Bunce M. (ver protocolo con código salting out macro) microescalado en nuestro Laboratorio. Se basa en la lisis inicial de los glóbulos rojos mediante solución hipotónica y la lisis total de las células y sus estructuras subcelulares mediante el empleo de detergentes con la posterior eliminación de la proteínas mediante precipitación salina (saltingout) y extracción con solventes orgánicos.
Personal requerido •
Un técnico medio
Equipos requeridos •
Centrífuga refrigerada para microtubos
•
Freezer -200C
•
Vortex para tubos
•
Juego de micropipetas de volumen variable
Reactivos •
Relacionados en el protocolo reactivos comunes requeridos para el trabajo en Genética Molecular
Preparación de soluciones •
Buffer de lisis de glóbulos rojos (RCLB) ¾ NH4CL
7.70 gramos
¾ Na HCO3
0.84 gramos
¾ H2O destilada c.s.p.
1 000 mL
¾ Disolver mediante agitación y esterilizar en autoclave. ¾ Conservar a 40C •
Buffer de lisis nuclear (NLB)
•
¾ NaCL ¾ 1M tris HCL pH8.2 ¾ 0.5M EDTA pH 8.0 ¾ H2O destilada c.s.p. Salting out micro
23.37 gramos 10 mL 4 mL 900 mL
¾ Disolver mediante agitación y esterilizar en autoclave ¾ Añadir 50 mL de solución 10 % SDS y 50 mL agua destilada estéril ¾ Conservar a temperatura ambiente. •
Solución de cloruro de sodio 6M ¾ Na Cl
35,1 gramos
¾ H2O destilada
100 mL
¾ Esterilizar en autoclave ¾ Conservar a temperatura ambiente •
CIA ¾ Cloroformo
96 mL
¾ Alcohol isoamílico
4 mL
0
¾ Conservar a 4 C Toma de muestra •
Colectar 0,5 mL de sangre periférica en un tubo de 1,5 mL estéril conteniendo 20 μl de EDTA 5.6 %.Agitar bien por inversión fuerte para garantizar homogenización.
•
Conservar en refrigeración hasta su procesamiento, el cual deberá realizarse en un plazo no mayor de 48 horas después de haberse realizado la toma de muestra. No congelar en este estado, pues se produce la lisis de las
células nucleadas.
Extracción y purificación del DNA • • •
Centrifugar 2 minutos a 10 000 rpm a 4o C Eliminar cuidadosamente parte del plasma, cuidando de no remover el buffy
coat.
Añadir el buffer de lisis de los glóbulos rojos (RCLB) bien fría hasta completar 1 mL, homogeneizar por inversión repetida del tubo y colocar por 5 minutos en el congelador. Verificar antes de usar que esta solución
no presente mohos.
•
Agitar por inversión suave y centrifugar 2 minutos a 10 000 rpm a 40C. Eliminar el sobrenadante por inversión del tubo teniendo cuidado de no remover el pellet.
•
Repetir los pasos 3 y 4 (hasta que el pellet de leucocitos quede blanco)
•
Añadir 100 μL de buffer de lisis nuclear (NLB) a temperatura ambiente y agitar con vortex suave hasta resuspender bien el pellet. Añadir otros 200 μL de NLB y homogeneizar con toque de vortex.
•
Añadir 100 μL de solución de cloruro de sodio 6M y agitar fuertemente invirtiendo el tubo. Si la solución de cloruro de sodio 6M presenta
precipitado, antes de utilizar calentar a 37-560C hasta que se disuelva el precipitado. •
Añadir 200 μL de la mezcla de cloroformo-alcohol isoamílico (CIA) y agitar por vortex. La suspensión debe presentar un aspecto lechoso.
•
Centrifugar 5 minutos a 10 000 rpm a temperatura ambiente.
•
Pasar cuidadosamente el sobrenadante a un tubo de 1,5 mL con pipeta de con punta amarilla cortada, cuidando de no remover la interfase. Si se
remueve la interfase es necesario reintegrar al tubo la solución extraída y repetir los pasos 9 y 10. Precipitación y resuspensión del DNA •
Añadir 2 volúmenes de etanol absoluto frío (aproximadamente 800 μL) y agitar por inversión fuerte. Si no observa la medusa de DNA, dejar
toda la noche a -200C. Salting out micro •
Centrifugar 10 minutos a 10 000 rpm a 40C.
•
Eliminar el sobrenadante por inversión del tubo, vigilando que el pellet de DNA no se desprenda de la pared del tubo.
•
Añadir 500 μL de etanol 70 % frío y dar vortex hasta la resuspensión del pellet de DNA.
•
Centrifugar 10 minutos a 10 000 g a 40C. Eliminar el sobrenandante por inversión, vigilando que no se desprenda el pellet de DNA.
•
Repetir los pasos 14 y 15 (segundo lavado con etanol 70 %)
•
Dar toque de centrífuga y extraer todo el exceso de etanol con una pipeta con punta amarilla, cuidando de no arrastrar el pellet de DNA
•
Secar el DNA a vacío por el tiempo mínimo requerido (unos 15 minutos). El
•
secado excesivo del DNA dificulta su posterior resuspensión.
Añadir un volumen de 50 μL de agua destilada estéril. Dar vortex ligero para resuspender el pellet e incubar a 560C por al menos 30 minutos con vortex ocasional. Conservar en refrigeración.
