PRÁCTICA 4. EXTRACCIÓN Y CUANTIFICACIÓN CU ANTIFICACIÓN DE AZÚCARES EN JITOMATE (MÉTODO ANTRONA).
INDICE. INTROUCCIÓN. ............................................................................................................................... 2
MARCO TEÓRICO. ......................................................................................................................... 3 Espectroscopia. .......................................................................................................................... 3 Absorción por los compuestos orgánicos. ......................................................................... 3 Método antrona. .......................................................................................................................... 4 Jitomate. ....................................................................................................................................... 4 OBJETIVO. ....................................................................................................................................... 5 METODOLOGÍA. ............................................................................................................................. 6 Parte 1. Extracción pigmento vegetal. .................................................................................. 6 Parte 2. Obtención del extracto. ............................................................................................. 7 Preparación de muestra de reacción. ................................................................................... 7 RESULTADOS. ................................................................................................................................ 8 DISCUSIONES. ................................................................................................................................ 9 CONCLUSIÓN. ................................................................................................................................. 9 1
PRÁCTICA 4. EXTRACCIÓN Y CUANTIFICACIÓN DE AZÚCARES EN JITOMATE (MÉTODO ANTRONA).
CUESTIONARIO. ............................................................................................................................. 9 BIBLIOGRAFÍA. ............................................................................................................................. 12 ANEXOS. ......................................................................................................................................... 14 Cálculos para la obtención de mg de azúcar concentrados en 1gr de tejido de muestra. . 14
INTROUCCIÓN. Entre los distintos componentes de los alimentos, después del agua, los carbohidratos son sustancias más abundantes y más ampliamente distribuidas en la naturaleza; siendo la celulosa la biomolécula que se encuentra en mayor cantidad en la biosfera, y el almidón, la fuente energética alimentaria más empleada en el mundo. En general, los carbohidratos constituyen la mayor parte de los componentes vegetales. Son carbohidratos los diferentes azúcares, almidones, celulosa, hemicelulosas, pectinas y numerosas gomas. Los azúcares como la glucosa, fructosa y sacarosa se acumulan especialmente en el jugo celular; los almidones son los carbohidratos de reserva y se encuentran en forma de plastidios; la hemicelulosa y pectinas son los polisacáridos que conforman el material estructural y las gomas son productos de desecho. Tradicionalmente las frutas se han valorado por su atractiva apariencia, textura, valor nutritivo y fundamentalmente por su sabor. En todos estos atributos de calidad los carbohidratos desempeñan un papel relevante, por ejemplo, el sabor está dado básicamente por un balance entre 2
PRÁCTICA 4. EXTRACCIÓN Y CUANTIFICACIÓN DE AZÚCARES EN JITOMATE (MÉTODO ANTRONA). azúcares y ácidos orgánicos. El sabor característico de y diferente de las frutas se debe a la gran variación en composición y concentración de los azúcares; el color atractivo se debe principalmente a los glucósidos (antocianinas y antoxantinas) y la firmeza está determinada por los polisacáridos estructurales. Las frutas y hortalizas son los carbohidratos que cumplen funciones estructurales y energéticas, constituyendo algunos la estructura rígida o mecánica de los tejidos vegetales. Además de ser componentes naturales de muchos alimentos, la industria alimentaria emplea los carbohidratos en función de sus propiedades funcionales, usándolos como ingredientes para mejora la aceptabilidad de diversos alimentos. En la naturaleza se encuentran carbohidratos de diferente número de carbonos y distintos grupos funcionales o sustituyentes, debido a esto la diversidad de sus orígenes y la gran variabilidad en su composición química, han surgido una variedad enrome de métodos de análisis de carbohidratos; ya sean métodos: físicos, químicos o bioquímicos (Vega, 2015). La extracción es la técnica empleada para separar un producto orgánico de una mezcla de reacción o para aislarlo de sus fuentes naturales. Puede definirse como la separación de un componente de una mezcla por medio de un disolvente. En la práctica es muy utilizada para separar compuestos orgánicos de las soluciones o suspensiones acuosas en las que se encuentran (Química Orgánica, 2017).
MARCO TEÓRICO. Espectroscopia. La espectroscopía por absorción molecular en las regiones ultravioleta y visible del espectro se usa ampliamente en la determinación cuantitativa de una gran cantidad de especies inorgánicas, orgánicas y biológicas (Douglas, 2008).
Absorción por los compuestos orgánicos. La absorción de la radiación por parte de las moléculas orgánicas en la región de las longitudes de onda de entre 180 y 780 nm es el resultado de las interacciones entre los fotones y electrones que participan directamente en la formación de 3
PRÁCTICA 4. EXTRACCIÓN Y CUANTIFICACIÓN DE AZÚCARES EN JITOMATE (MÉTODO ANTRONA). enlaces (y, por lo tanto, están asociadas con más de un átomo) o que están localizados alrededor de átomos como el oxígeno, azufre, nitrógeno y halógenos. La longitud de onda de absorción de una molécula orgánica depende de qué tan fuerte estén enlazados sus electrones. Los electrones compartidos en los enlaces sencillos carbono-carbono o carbono-hidrógeno están unidos de manera tan fuerte que su excitación requiere energías correspondientes a longitudes de onda en el vacío en la región de luz ultravioleta menores que 180 nm. Los espectros ultravioleta para análisis cuantitativos son medidos normalmente utilizando disoluciones diluidas del analito. Sin embargo, en el caso de compuestos volátiles, los espectros obtenidos de muestras en fase gaseosa son más útiles que los espectros obtenidos de una disolución o fase líquida. Un disolvente para la espectroscopia ultravioleta/visible debe ser transparente en la región del espectro donde el soluto absorbe radiación. El analito debe ser lo suficientemente soluble en el disolvente para dar un analito bien definido. Además, debemos tomar en cuenta las interacciones posibles del disolvente con las especies químicas absorbentes (James, 2015)
Método antrona. Uno de los métodos más comúnmente usados para cuantificar azúcares totales es el de la Antrona. Este procedimiento nos permite determinar cuantitativamente hexosas, aldopentosas, ácidos urónicos ya sea en forma libre o formando parte de polisacáridos. Para que la medición sea digna de confianza, deben controlarse cuidadosamente las concentraciones de antrona y de ácido en el reactivo así como el tiempo y temperatura de reacción. Es aconsejable que la muestra se encuentre libre de proteínas ricas en triptófano para evitar interfer encias en la reacción colorida (Dimler y col.1952).
Jitomate. El jitomate (Lycopersicon esculentum Mill) es una especie de gran importancia económica a nivel mundial. En la actualidad, se ha convertido en una de las hortalizas más populares y cultivadas en todo el mundo, siendo la base de una importante industria agraria. Sus frutos, además de consumirse frescos, se 4
PRÁCTICA 4. EXTRACCIÓN Y CUANTIFICACIÓN DE AZÚCARES EN JITOMATE (MÉTODO ANTRONA). procesan para la obtención de salsas, sopas, purés, zumos, concentrados, conservas, etc. (Diez, et al., 1996). El jitomate es una planta originaria de la planicie costera occidental de América del Sur, aunque se considera a México como su centro de domesticación. Es la hortaliza que ocupa mayor superficie sembrada en todo el mundo, con alrededor de 3,593,490 ha, con una producción de 53,857,000 ton (FAO, 2001). En México se siembran alrededor de 80,000 ha con un rendimiento promedio de 28.7 ton/ha., por lo cual es la segunda hortaliza más importante por la superficie sembrada que ocupa; la más importante por su volumen en el mercado nacional, y la primera por su valor de producción (Nieto y Velasco, 2006).
OBJETIVO. Extraer y determinar el contenido de azúcares en frutos de jitomate mediante la técnica antrona.
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PRÁCTICA 4. EXTRACCIÓN Y CUANTIFICACIÓN DE AZÚCARES EN JITOMATE (MÉTODO ANTRONA).
METODOLOGÍA. Parte 1. Extracción pigmento vegetal.
1. 20mg de tejido de jitomate.
2. Se colocó en tubo de ensaye con 3mL de metanol al 80%
3. El tubo fue cubirto con alumnio.
4. En baño maría 80°C/10min. hasta que el tejido quedó blanco.
5. Lo obtenido se agregó en un frasco previamente limpio.
6. Se realizarón tres repeticiones con el mismo tejido.
7. Las muestras fuerón colodas en el mismo frasco.
8. Se congeló en tubo eppendorf.
6
PRÁCTICA 4. EXTRACCIÓN Y CUANTIFICACIÓN DE AZÚCARES EN JITOMATE (MÉTODO ANTRONA).
Parte 2. Obtención del extracto.
1. Se agreó 1mL agua a cada tubo (12)
2. De acuerdo a tabla, se agregó Stock Glucosa a 6 tubos.
3. Se uso una dilución de 1:800 con: 15µl muestra mas 1mL agua.
4. Fueron agregados 3mL de antrona a todos los tubos.
5. Después de la mezcla, se colocó cada tubo en el rotor.
6. Los tubos se colocarón en hielo 5min.
7. Después de agitar, se colocarón en baño maria 10min.
8. Se colocarón en espectroscopia para leer a 625nm.
Preparación de muestra de reacción. Tabla 1. Preparación de soluciones estándar.
E s tándar
S tock G lucos a
A g ua des tilada
Concentración(mg/mL)
(µL)
(µL)
1
0
1000
0.0000
2
10
990
0.0250
3
20
980
0.0500
4
30
970
0.0750
5
50
960
0.1000
6
60
950
0-1250
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PRÁCTICA 4. EXTRACCIÓN Y CUANTIFICACIÓN DE AZÚCARES EN JITOMATE (MÉTODO ANTRONA).
RESULTADOS. MUESTRA DE JITOMATE. Muestra. Abs. 625nm. Resultados mg/mL mg azúcar/1g tejido (1:800) 1 0.148 0.031 48.32 2 0.182 0.04 61.68 3 0.029 0.003 1.57 4 0.035 0.004 3.92 5 0.65 0.152 245.57 Tabla 2. Tabla de resultados de la cantidad de azúcar encontrado en el tejido de jitomate.
Curva de valoración. 0.6 y = 4.072x + 0.025 R² = 0.9775
0.5 . a i c n a b r o s b A
0.4 0.3 0.2 0.1 0 0
0.02
0.04
0.06
0.08
0.1
0.12
0.14
Concentración mg/mL
Figura 1. Curva de valoración para la determinación de cantidad de azúcar en muestra de jitomate.
CURVA DE VALORACIÓN. Valores estándar. Muestra. Concentración mg/mL Abs 625nm. 1 0 0 2 0.025 0.124 3 0.05 0.272 4 0.075 0.321 5 0.1 0.457 6 0.125 0.503 Tabla 3. Tabla con las valoraciones obtenidas para la obtención de la propia curva de valoración de la muestra analizada.
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PRÁCTICA 4. EXTRACCIÓN Y CUANTIFICACIÓN DE AZÚCARES EN JITOMATE (MÉTODO ANTRONA).
DISCUSIONES. Para determinar la cantidad de azúcar presente en una muestra de jitomate, se realizó el método de antrona en seis muestras con diferente cantidad de Stock para medir la concentración en mg/mL y así lograr determinar la absorbancia a 625nm. Obteniendo una curva de valoración en la concentración de azúcares contenidos en un gramo del tejido; así bien se puede decir que la concentración de azúcar está implicada con la madurez del jitomate y la forma de su cultivo. De los factores ambientales, la luz en el cultivo tiene el efecto más drástico en la concentración de azúcar en la fruta. El sabor característico del jitomate es influenciado por diversas sustancias volátiles, muchas de las cuales se desarrollan durante la maduración (Mikkelsen, 2005). Con la obtención de la curva de valoración se puede interpretar que la ascendencia de concentración de azúcar es proporcional a la muestra, pudiendo observar en su línea de tendencia una valoración de aumento proporcional y casi en los mismos rangos-
CONCLUSIÓN. La elaboración de análisis para la determinación y cuantificación de azúcares encontrados en jitomate a través del método Antrona, que es específico para generar un resultado de mayor exactitud en la concentración de azúcar de cada una de las muestras, observando las diferencias en la absorbancia de acuerdo a la cantidad de Stock agregados y poder determinar así las concentraciones, así bien se pudo dar una análisis de la concentración de azúcar en concentración en cada una de las muestras de tejido de jitomate.
CUESTIONARIO. 1. ¿Qué importancia tiene el determinar los grados brix y la determinación de azucares mediante el método de antrona? Los grados brix son el porcentaje de sólidos solubles presentes en alguna sustancia. Este valor indica la cantidad de azúcar presente en el fruto. Así que, permite determinar con exactitud el extracto total que se ofrece en grados brix. El método antrona muestra la cantidad o concentración
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PRÁCTICA 4. EXTRACCIÓN Y CUANTIFICACIÓN DE AZÚCARES EN JITOMATE (MÉTODO ANTRONA). presentes de manera que permite determinar cantidades de cualquier tipo de azúcar.
2. Explica cuál de las técnicas anteriores te da resultados más fiables. La importancia de los hidratos de carbono con la antrona, ofrece en este sentido un gran interés, ya que se trata de una reacción extremadamente sensible y especifica que puede ser aplicada a todos los hisrato s de carbono, sean o no reductores y permite la valoración sin necesidad de recurrir a la hidrolisis de los mismos (F. Grande, 1953).
3. Explica que es un carbohidrato y qué importancia tiene en el metabolismo humano y en el vegetal Los carbohidratos son macromoléculas o moléculas biológicas. Así bien son compuestos orgánicos que constan de carbono, hidrogeno y oxígeno en proporción (1:2:1). Teniendo como de suma importancia su presencia para ser utilizados como primera fuente de energía en los humanos, mientras que en los vegetales es causante del sabor dulce presente en ellos, pero también en ambas partes los carbohidratos son responsables de dar estructuras biológicas.
4. Explica cómo se aplica la ley de Beer en la elaboración de curvas de calibración. La ley de Lambert-beer expresa la reacion entre absorbancia de luz monocromática (de longitud de onda fija) Y concentración de un comoforo de solución. La absorbancia de una solución es directamente proporcional a su concentración a mayo número de moléculas mayor interacción de la luz con ellas; también depende de la distancia que recorre la luz por la muestra más moléculas se encontrara. Uno de los métodos más utilizados para determinar la concentración de una muestra problema, es el método de la curva de calibración. Esta curva de calibración es una gráfica que relaciona la concentración de al menos cinco 10
PRÁCTICA 4. EXTRACCIÓN Y CUANTIFICACIÓN DE AZÚCARES EN JITOMATE (MÉTODO ANTRONA). soluciones de estándar de concentraciones conocidas, con la absorbancia de cada uno de ellos a la longitud de onda máxima, Una vez obtenida la gráfica se determina la función matemática que presenta dicha recta a través del tratamiento estadístico de regresión de los mínimos cuadrados, la cual relaciona la absorbancia y la concentración de un analito.
5. Investiga el fundamento de reacción para la formación de un complejo colorido con la técnica de Antrona-ácido sulfúrico. En presencia del ácido sulfúrico de reactivo de antrona, los carbohidratos experimentan deshidratación convirtiéndose en furfural o hidroximenoles, antrona, etc; produciendo compuestos coloreados. La formación del furfural o sus derivados acomplejados con estas sustancias puede utilizarse como método cualitativo o cuantitativo para estimar azúcares, ya que la intensidad de color desarrollado durante la condensación va a estar en función de la concentración de carbohidrato presente en la muestra. Los polisacáridos por acción del ácido son primeramente hidrolizados a monosacáridos los cuales se de deshidratan formando furfural o hidroximetilfurfural; esto se condensan con la antrona generando complejos coloreados (Rodríguez, 1987).
6. Explica porque la espectroscopía UV-Visible es muy utilizada para diversos análisis en las ciencias biológicas. La espectrometría UV/Vis se utiliza habitualmente en la determinación cuantitativa de soluciones de iones metálicos de transición y compuestos orgánicos
Soluciones
muy
de
iones
conjugados.
metálicos
de
transición.
Las soluciones de iones metálicos de transición pueden ser coloreadas (es decir, absorben la luz visible) debido a que los electrones en los átomos de metal se pueden excitar desde un estado electrónico a otro. El color de las soluciones de iones metálicos se ve muy afectado por la presencia de otras especies, como algunos aniones o ligando. Por ejemplo, el color de una solución diluida de sulfato de cobre es muy azul; agregando amoníaco se 11
PRÁCTICA 4. EXTRACCIÓN Y CUANTIFICACIÓN DE AZÚCARES EN JITOMATE (MÉTODO ANTRONA). intensifica el color y cambia la longitud de onda de absorción máxima.
Compuestos
orgánicos.
Los compuestos orgánicos, especialmente aquellos con un alto grado de conjugación,
también
electromagnético visible
absorben o
luz
ultravioleta.
en
las
Los
regiones
disolventes
del espectro para
estas
determinaciones son a menudo el agua para los compuestos solubles en agua, o el etanol para compuestos orgánicos solubles. Los disolventes orgánicos pueden tener una significativa absorción de UV, por lo que no todos los disolventes son adecuados para su uso en espectrometría UV. El etanol absorbe muy débilmente en la mayoría de longitudes de onda. La polaridad y el pH del disolvente pueden afectar la absorción del espectro de un compuesto orgánico. La tirosina, por ejemplo, aumenta su máximo de absorción y su coeficiente de extinción molar cuando aumenta el pH de 6 a 13,
o
cuando
disminuye
la
polaridad
de
los
disolventes.
El espectrofotómetro UV/Vis puede utilizarse como detector para la Cromatografía Líquida de Alta Resolución (CLAR). La presencia de un analito da una respuesta que puede ser proporcional a la concentración. Para resultados precisos, la respuesta del instrumento al analito debe compararse con la respuesta a un estándar, lo que es muy similar al uso de curvas de calibración. La respuesta (por ejemplo, el pico de altura) para una concentración particular se conoce como factor de respuesta.
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Espectrometría, 2015. Es.slideshare.net
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ANEXOS. Cálculos para la obtención de mg de azúcar concentrados en 1gr de tejido de muestra.
= 0.9775
= 4.072 + 0.025
=
=
=
=
=
.−. .
.−. .
.−. .
.−. .
.−. .
=
=
=
=
=
.
.
4.072
∗ 800 = 30.84/*1g/(0.5mg/mL)=61.68mg
.
.
0.025
∗ 800 = 24.16/*1g/(0.5mg/mL)=48.32mg
.
=
∗ 800 = 0.7858/*1g/(0.5mg/mL)=1.57mg
∗ 800 = 1.96/*1g/(0.5mg/mL)=3.92mg
∗ 800 = 122.78/*1g/(0.5mg/mL)=245.57mg
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