La translocación de GLUT4 estimulado por insulina está mediada por una vía de señalización intracelular divergente * La insulina estimula el transporte de glucosa en gran medida por la mediación de la translocación del transportador de glucosa sensible a la insulina (GLUT4) de un compartimento intracelular a la membrana plasmática. Usando una única sola microinyección adipocitos 3T3-L1, junto con la detección de inmunofluorescencia de las proteínas de GLUT4, hemos determinado que la inhibición de p21ras endógenos o inyección de p21ras oncogénicos no tiene ningún efecto sobre la translocación de GLUT4 estimulado por la insulina. Por otro lado, la microinyección de anticuerpos anti-fosfotirosina o la inhibición de la endógena fosfatidilinositol 3-quinasa mediante microinyección de una proteína de fusión SH2 GST-p85 inhibe notablemente este efecto biológico de la insulina. Estos datos sugieren que la vía de la proteína quinasa p21ras/mitogen-activated no está implicado en este efecto metabólico de la insulina, mientras que la fosforilación de la tirosina y la estimulación de la actividad de fosfatidilinositol 3-quinasa son componentes críticos de esta vía de señalización. La insulina ejerce efectos biológicos pleiotrópicos. Uno de los principales efectos fisiológicos de la insulina es la regulación de los niveles de glucosa en plasma, que se logra mediante la supresión de la producción de glucosa hepática y la estimulación de la captación de glucosa en los tejidos diana. Este último efecto es debido principalmente a la translocación de transportadores de glucosa sensibles a la insulina (GLUT4) de un pool vesicular intracelular a la membrana plasmática, donde se pueden llevar a la absorción de glucosa. Esta respuesta está mediada por una vía de señalización metabólica que es divergente de la vía mitogénica y puede, al menos en parte, utilizar diferentes moléculas de señalización. El esclarecimiento de esta vía de señalización dará información rica con implicaciones para muchos de estados de enfermedad humanos, tales como la diabetes mellitus no dependiente de la insulina, la obesidad y el síndrome de ovario poliquístico. Todas estas condiciones están asociadas con la resistencia a la insulina y ladisminución de transporte de glucosa estimulado por la insulina como una manifestación importante. Por lo tanto, las causas de la resistencia a la insulina en estos estados fisiopatológicos probablemente implican defectos en la vía de señalización metabólica por el cual la insulina provoca un aumento en la captación de glucosa celular. Hemos utilizado microinyección celular de los adipocitos 3T3-L1 y microscopía de inmunofluorescencia de las proteínas GLUT4 para evaluar la vía de señalización transmembrana que conduce a la traslocación de GLUT4 estimulada por insulina. PROCEDIMIENTOS EXPERIMENTALES Materiales Insulina porcina fue proporcionado amablemente por Lilly. Anticuerpo anti-GLUT4 policlonales (F349) fue descrito previamente (6). Anticuerpo anti-GLUT4 monoclonal (1F8) era de Acres Biologicals Este (10). Anticuerpo anti-c-Fos policlonal era de Oncogene Science. Anticuerpo anti-p21ras monoclonal (Y13-259) era de Santa Cruz Biotechnology. Anticuerpo policlonal anti-Shc y el anticuerpo monoclonal anti-fosfotirosina (PY20) eran de Transduction Laboratories. Proteínas recombinantes T24 RAS1 y N17 Ras fueron generosos regalos de JR Feramisco y fueron descritas anteriormente (8). Proteína de fusión GST-p85 SH2 fue proporcionado amablemente por AR Saltiel, y su preparación y uso se han descrito previamente (9). IgG de oveja y el isotiocianato de fluoresceína, isotiocianato de tetrametilrodamina-, y ek AMCA conjugado anti-conejo,-ratón, -rata y anticuerpos IgG de ovejas fueron de Jackson Immunoresearch Laboratories Inc. Todos los demás reactivos fueron adquiridos de Sigma.
Cultivo de células y Microinyección Fibroblastos Rat1 que habían sido transfectadas de manera estable y que sobreexpresan receptor de insulina humano de tipo salvaje (células HIRcB ) se cultivaron como se ha descrito previamente. Células 3T3-L1 se cultivaron y mantuvieron en medio alto en glucosa que contiene 50 unidades / ml de penicilina, 50 mg / ml de estreptomicina, y 10 % de suero fetal de ternera (FCS) en un ambiente de 10 % de CO2. Las células se dejaron crecer hasta 2 días y luego se diferenciaron mediante la adición del mismo medio que contiene isobutilmetilxantina (500 mM ), dexametasona (25 mM) e insulina ( 4 mg / ml) durante 3 días, y el medio que contiene insulina por 3 días más. El medio se cambió cada 3 días hasta que las células fueron completamente diferenciadas, típicamente por 10 días . Antes de la experimentación, los adipocitos se tripsinizaron y se volvieron a sembrar en cubreobjetos de vidrio lavados con ácido. Las células se cultivaron en el mismo medio sin suero durante 2 h, y la microinyección de diversos reactivos se llevó a cabo usando un sistema de microinyección de Eppendorf semiautomatizado. Todos los reactivos se disolvieron en un buffer que contiene 5mM de fosfato sódico (pH 7,2), 100 mM de KCl . N17 Ras, T24 Ras y proteínas GST-p85 SH2 - p85 fueron cada una co- inyectadas con 10 mg / ml de IgG de oveja para propósitos de detección. Antes de la teñir las células se les permitió recuperarse durante un periodo de 1 h. Immunostaining and Fluorescence Microscopy Tinción de la proteína GLUT4 — Las células se estimularon con insulina durante 20 min y después se fijaron en formaldehído al 3,7% en PBS durante 5 min en hielo y durante 5 min a temperatura ambiente. Después del lavado, las células fueron permeabilizadas y bloqueadas con 0,1 % de Triton X - 100 y 1 % de FCS en PBS durante 10 min a temperatura ambiente. Las células fueron luego incubadas con anticuerpo policlonal de conejo anti- GLUT4 ( F349 ) ( 1 mg / ml ) que había sido generado contra un péptido sintético correspondiente a los 16 residuos C-terminales de GLUT4 o un anticuerpo anti - GLUT4 monoclonal ( 1F8 ) ( 7 ) ( 2 mg / ml ) en PBS con 1 % de FCS durante la noche a 4 ° C. Después del lavado y la tinción de GLUT4, la identidad de las células microinyectadas se determinó por incubación con fluoresceína conjugada de burro anti-IgG de conejo para F349 o anti- IgG de ratón para 1F8 - y AMCA – conjugadoa de burro IgG anti-oveja. Después los resultados fueron analizados y fotografiados por microscopía de inmunofluorescencia. Cada célula AMCA - positiva microinyectada fue evaluada por la presencia de GLUT4 asociada a la membrana de plasma teñida. Como en todos los estudios de microinyección, las células de control se microinyectaron con IgG de oveja preinmune y luego se procesaron de la misma manera que las células inyectadas experimentales. Tinción de la proteína c-Fos — Después de la tinción de GLUT4 y la inyección de IgG, las células se tiñeron con anticuerpo de conejo anti-c-Fos ( 1/100 ) durante 90 min a 37 ° C ,seguido por incubación con rodamina conjugada anticuerpo anti-conejo IgG. RESULTADOS Y DISCUSIÓN Adipocitos 3T3-L1 individuales, vivos y diferenciados se microinyectaron con diversos reactivos , seguido por la estimulación con insulina. A continuación, la translocación de GLUT4 a la superficie celular se visualizó por microscopía de inmunofluorescencia usando anticuerpo anti - GLUT4 seguido por un segundo anticuerpo conjugado con fluoresceína. La figura.1 , A y B , muestra un campo que contiene adipocitos 3T3-L1 antes (A ) y después (B ) de la estimulación con insulina . En la basal, o sea en estado no estimulado, la tinción de GLUT4 es relegado casi exclusivamente al compartimiento intracelular, con típico puntiforme difusa y tinción perinuclear discreta. Después de la estimulación de insulina, se produce una marcada diferencia en el patrón de tinción, con prominente tinción intensa distribuida de manera uniforme en la superficie celular, acompañado por una disminución de la tinción intracelular de GLUT4 , indicativa de la translocación de proteínas GLUT4 del pool vesicular intracelular a la membrana plasmática. En el estado basal, menos de 10 % de células presentan tinción de GLUT4 en la superficie, mientras que después de un tratamiento con insulina entre el 60 y el 80 % la localización de GLUT4 en
las células son positivas para la superficie. Usando esta técnica, la translocación se produce con un curso de tiempo ( C ) y la curva de dosis-respuesta ( D ) típico para la estimulación de insulina del transporte de glucosa , lo que indica que este ensayo visual de la translocación de GLUT4 es representativo del proceso estimulada por la insulina fisiológica . A continuación, se utiliza este sistema junto con estudios de microinyección en un intento de elucidar la cascada de señalización que media el efecto de la insulina sobre la translocación de GLUT4 . Después de que la insulina se une a su receptor, se inicia una serie de eventos, incluyendo la autofosforilación del receptor y la fosforilación de tirosina de sustratos endógenos tales como el IRS- 1 y Shc. A través de sus múltiples sitios de fosforilación de tirosina, el IRS- 1 puede servir como una proteína de acoplamiento formando complejos con proteínas que contienen el dominio SH2 tales como la IP3 quinasa. Phospho- Shc forma complejos con Grb2zSOS y conducen a la activación de p21ras, que posteriormente estimula la vía de la MAP quinasa. Mientras que una gran cantidad se conoce acerca de las acciones mitogénicas de la insulina, se sabe relativamente poco acerca de los procesos de señalización que median la translocación de GLUT4. Por ejemplo, numerosos estudios han demostrado que la formación de p21ras - GTP y la estimulación de la vía de la MAP quinasa son pasos esenciales en la vía de señalización mitogénica de la insulina. Sin embargo, si estas moléculas están involucradas en acciones metabólicas de la insulina sigue siendo poco claro. Por ejemplo, se ha demostrado que el metabolismo y las vías de señalización mitogénicas divergen, y es posible que el punto de divergencia es proximal a la formación de p21ras - GTP . Varios estudios, utilizando diferentes enfoques experimentales , se han encontrado resultados con un papel para p21ras en la estimulación del transporte de glucosa, mientras que otros estudios han encontrado evidencia a favor . Nuestra técnica actual permite la oportunidad de probar directamente la importancia de las moléculas intracelulares en una vía de señalización dado. Por lo tanto, adipocitos 3T3-L1 microinyectados con una serie de reactivos relacionados con Ras. Como se ve en la figura.2, la microinyección de inhibidor dominante de Ras N17 no tuvo efecto sobre la localización basal de GLUT4 o estimulado por la insulina en concentraciones máximas de insulina (10ng/ml). Microinyecciones idénticas de proteína Ras N17 se llevaron a cabo en células que fueron posteriormente estimuladas con varias concentraciones submáximas de insulina. Cuando la translocación de GLUT4 se cuantificó en estas células inyectadas, se observó una curva de dosis-respuesta idéntica a la obtenida con las células no inyectadas (Fig. 1D), lo que indica que la proteína RasN17 no cambia esta respuesta a la dosis . Por lo tanto, dentro de los límites de detección del ensayo de inmunofluorescencia, no parece que la inhibición de la actividad de Ras endógeno afecta a la medida en que se transloca GLUT4 o translocación en respuesta a la insulina. Se observó una similar falta de efecto sobre la microinyección de anticuerpo anti-p21ras. En contraste, tanto de estos reactivos inhibidores Ras impide la síntesis de ADN estimulada por la insulina cuando se inyectaron simultáneamente en Rata 1 fibroblastos (células HIRC ) que sobreexpresan los receptores de insulina humanos. Los porcentajes de células positivas para la tinción de BrdU fueron 76, 22 , 21 , y 28 % después de las inyecciones de control de IgG, N17 Ras , anticuerpo anti - p21ras , y el anticuerpo anti - Shc , respectivamente . Oncogénicas de Ras T24 es una proteína constitutivamente activa que estimulará efectos aguas abajo de p21ras -GTP . Proteína Ras T24 se microinyectó en adipocitos 3T3-L1 , y sus efectos sobre c-Fos expresión de la proteína y la translocación de GLUT4 se evaluaron simultáneamente . Como se demuestra en la figura . 3 , la proteína Ras T24 era biológicamente activo dentro de las células y causó una marcada inducción de la proteína c-Fos como se visualiza mediante tinción con rodamina nuclear con anticuerpo anti - c-Fos . En contraste , T24 de Ras no pudieron influir en la localización de GLUT4 en la presencia o ausencia de insulina ( Figs. 2 y 3 , D y H ) . Además , las inyecciones simultáneas de esta preparación de T24 de Ras estimularon la síntesis de ADN en las células quiescentes HIRC en la misma medida como la insulina . Los porcentajes de células BrdU - positivas siguientes IgG de control y las inyecciones de T24 de Ras , sin estimulación por la insulina , eran 19 y 72 % , respectivamente . Por lo tanto , la vía de señalización que conduce a la expresión de c - Fos fue activado por las Ras T24 microinyectados , mientras que la estimulación de esta vía no influyó en la translocación de GLUT4 . Además , hemos encontrado que la microinyección de anticuerpo anti - Shc ( fig. 2 ) , así como una
proteína de fusión GST - SH2 Shc ( datos no mostrados ) no inhibió la insulina estimula la translocación de GLUT4 en adipocitos 3T3-L1 , mientras que anti- Shc anticuerpo inhibe la síntesis de ADN estimulada por la insulina en más de un 80 % en las células HIRC , y la proteína SH2 - GST Shc inhibió el crecimiento de la síntesis de ADN estimulada por factor de epidérmica . Tomados en conjunto , estos resultados sostienen que la activación de p21ras es ni necesaria ni suficiente para la translocación de GLUT4 e indican que la vía metabólica de la mediación de este efecto biológico diverge de la vía de señalización mitogénica proximalto p21ras activados . Hay pruebas que sugieren que la PI3 - quinasa puede ser una molécula intermediaria facilitar la translocación de GLUT4 estimulada por la insulina ( 29-32 ) . Cuando las células son tratadas con el inhibidor de la PI3 - quinasa wortmanina , la estimulación de insulina del transporte de glucosa se inhibe ( 31 , 32 ) . Aunque este es sugerente de un papel para la PI3 - quinasa en este efecto de la insulina , la especificidad de wortmanina como un inhibidor ha sido cuestionada recientemente ( 33 ) . Para evaluar directamente la relevancia de la PI3 - quinasa en los efectos metabólicos de la insulina , se utilizó una proteína de fusión GST que comprende el dominio SH2 Nterminal de la subunidad p85 de la PI3 - quinasa . En estudios anteriores , hemos demostrado que la microinyección de esta proteína de fusión SH2 - GST en células HIRC insulina inhibió completamente , similar a la insulina factor de crecimiento I , y de crecimiento epidérmico síntesis de ADN inducida por el factor ( 9 ) . Como se ve en la figura . 4 , la microinyección de la proteína SH2 - GST p85 inhibe la insulina estimula la translocación de GLUT4 por 75 % . La especificidad de este efecto es verificada por el hecho de que una proteína de fusión GST que contiene el dominio SH2 Shc fue sin efecto sobre la translocación de GLUT4 ( datos no mostrados ) . En apoyo de esto, también encontramos que la preincubación de las células con Wortmannin ( 1 mM) translocación GLUT4 inhibió completamente (datos no presentados). La insulina conduce a la autofosforilación del receptor de insulina con la fosforilación de tirosina del IRS 1 , que luego se une a los dominios SH2 de la PI3 - quinasa conducen a la activación de esta enzima ( 17 ) . Para evaluar el papel de la fosforilación de tirosina en esta vía , también microinjected anticuerpos anti - fosfotirosina en células 3T3-L1 . El anticuerpo monoclonal anti-fosfotirosina marcadamente inhibida la translocación de GLUT4 que indica la necesidad de fosforilación de la tirosina así como la actividad de PI3 - quinasa en la translocación de GLUT4 ( fig. 4 ) . Estudios previos que examinaron si las moléculas en la vía p21ras / MAP quinasa están implicadas en la estimulación de insulina del transporte de glucosa han arrojado resultados contradictorios ( 19-25 ) . Algunos de estos estudios no han medido específicamente la translocación de GLUT4 o han utilizado líneas celulares que no expresan GLUT4 . Otros han utilizado transfección para generar líneas celulares que sobreexpresan moléculas relacionadas con Ras . Con este último enfoque , siempre existe la posibilidad de que las líneas celulares seleccionadas se han adaptado a la transgén expresado de una manera tal como para que los resultados no representativa del contexto celular fisiológica . Microinyección de células individuales evita muchos de estos problemas , ya que nuestros estudios se pueden realizar en las células diana de insulina pertinentes (adipocitos) , con la evaluación directa de la evento biológico en cuestión ( translocación de GLUT4 ) . Además , la introducción aguda de moléculas de ensayo en el interior de la célula seguido de un ensayo rápido de acción de la insulina no permite las células tiempo suficiente para someterse a cambios de adaptación a la perturbación . Individual microinyección célula viva ha sido una poderosa técnica que ha demostrado ser útil en la identificación de los componentes de la vía de señalización para la mitogénesis de crecimiento mediada por el factor ( 8 , 9 , 11 , 34-37 ) . El sistema actual proporciona los medios para identificar los componentes moleculares intracelulares que transducen importante efecto metabólico de la insulina , es decir, la estimulación de la translocación de GLUT4 . En el informe actual de los datos han demostrado que la vía Ras , que es un componente crítico de la señalización mitogénica , es necesario para la estimulación de la insulina de la translocación de GLUT4 . Como tal , esto proporciona una clara evidencia de la divergencia de los eventos de señalización metabólicas y mitógenos . También encontramos que la PI3 - quinasa es una molécula necesario acoplar la señal de fosforilación de la tirosina generada por el receptor de la insulina a la glucosa estimulación del transporte . Aunque nuestros estudios no dilucidar el mecanismo por el cual la PI3 - quinasa facilita la translocación de GLUT4 , nuestros resultados son consistentes con estudios recientes ( 38 ) muestra que
después de la estimulación de insulina , la PI3 - quinasa puede estar localizada en las vesículas que contienen GLUT4 - intracelulares , consistentes con un papel para esta enzima en el tráfico de GLUT4 a la superficie celular . Utilizando los métodos que figuran en el presente informe , anticipamos que más moléculas de esta vía de señalización clave serán identificados en el momento oportuno . Como los detalles de esta vía de señalización se desarrollan, nuevos conocimientos sobre los mecanismos de insulinresistant estimulación del transporte de glucosa en estados de enfermedad humanos es probable que surjan
