Tipe Instrumen Spektrofotometer Pada umumnya terdapat dua tipe instrumen spektrofotometer, yaitu singlebeam dan double-beam. gambar Single-beam instrument dan Double-beam instrument -
Single-beam instrument Single-beam instrument dapat digunakan untuk kuantitatif dengan
mengukur absorbansi pada panjang gelombang tunggal. Single-beam instrument mempunyai beberapa keuntungan yaitu sederhana, harganya murah, dan mengurangi biaya yang ada merupakan keuntungan yang nyata. Beberapa instrumen menghasilkan single-beam instrument untuk pengukuran sinar ultra violet dan sinar tampak. Panjang gelombang paling rendah adalah 190 sampai 210 nm dan paling tinggi adalah 800 sampai 1000 nm (Skoog, DA, 1996). -
Double-beam Double-beam instrument Double-beam dibuat untuk digunakan pada panjang gelombang 190
sampai 750 nm. Double-beam instrument dimana mempunyai dua sinar yang dibentuk oleh potongan cermin yang berbentuk V yang disebut pemecah sinar. Sinar pertama melewati larutan l arutan blangko dan sinar kedua secara serentak melewati m elewati sampel, mencocokkan fotodetektor yang keluar menjelaskan perbandingan yang ditetapkan secara elektronik dan ditunjukkan oleh alat pembaca (Skoog, DA, 1996). Hal-hal yang harus diperhatikan dalam analisis analisis spektrofotometri UV-Vis, antara lain: Ada beberapa hal yang harus diperhatikan dalam analisis dengan spektrofotometri UV-Vis terutama untuk senyawa yang semula tidak berwarna yang akan dianalisis dengan spektrofotometri visibel karena senyawa tersebut harus diubah terlebih dahulu menjadi senyawa yang berwarna. Berikut adalah tahapan-tahapan yang harus diperhatikan : Pembentukan molekul yang dapat menyerap sinar UV-Vis
Hal ini perlu dilakukan jika senyawa yang dianalisis tidak menyerap pada daerah tersebut. Cara yang digunakan adalah dengan merubah menjadi senyawa lain atau direaksikan dengan pereaksi tertentu. Pereaksi yang digunakan harus memenuhi beberapa persyaratan yaitu : 1.
Reaksinya selektif dan sensitif.
2.
Reaksinya cepat, kuantitatif, dan reprodusibel.
3.
Hasil reaksi stabil dalam jangka waktu yang lama.
4.
Waktu operasional
Cara ini biasa digunakan untuk pengukuran hasil reaksi atau pembentukan warna. Tujuannya adalah untuk mengetahui waktu pengukuran yang stabil. Waktu operasional ditentukan dengan mengukur hubungan antara waktu pengukuran dengan absorbansi larutan. Pemilihan panjang gelombang Panjang gelombang yang digunakan untuk analisis kuantitatif adalah panjang gelombang yang mempunyai absorbansi maksimal. Ada beberapa alasan mengapa harus menggunakan panjang gelombang maksimal, yaitu : 1.
Pada panjang gelombang maksimal, kepekaannya juga maksimal
karena pada panjang gelombang maksimal tersebut, perubahan absorbansi untuk setiap satuan konsentrasi adalah yang paling besar. 2.
Disekitar panjang gelombang maksimal, bentuk kurva absorbansi
datar dan pada kondisi tersebut hukum 3.
lambert-beer akan terpenuhi.
Jika dilakukan pengukuran ulang maka kesalahan yang disebabkan
oleh pemasangan ulang panjang gelombang akan kecil sekali, ketika digunakan panjang gelombang maksimal (Rohman, Abdul, 2007). Keuntungan Spektrofotometer Keuntungan dari spektrofotometer adalah : 1.
Penggunaannya luas, dapat digunakan untuk senyawa anorganik,
organik dan biokimia yang diabsorpsi di daerah ultra lembayung atau daerah tampak.
Sensitivitasnya tinggi, batas deteksi untuk mengabsorpsi pada jarak
2.
-4
-5
-6
10 sampai 10 M. Jarak ini dapat diperpanjang menjadi 10 sampai 10 7
-
M dengan prosedur modifikasi yang pasti.
3.
Selektivitasnya sedang sampai tinggi, jika panjang gelombang
dapat ditemukan dimana analit mengabsorpsi sendiri, persiapan pemisahan menjadi tidak perlu. 4.
Ketelitiannya baik, kesalahan relatif pada konsentrasi yang ditemui
dengan tipe spektrofotometer UV-Vis ada pada jarak dari 1% sampai 5%. Kesalahan tersebut dapat diperkecil hingga beberapa puluh persen dengan perlakuan yang khusus. 5.
Mudah, spektrofotometer mengukur dengan mudah dan kinerjanya
cepat dengan instrumen modern, daerah pembacaannya otomatis (Skoog, DA, 1996). Incoming search terms:
spektrofotometer uv_vis (209)
prinsip kerja spektrofotometri uv-vis (128)
analisis spektrofotometri (89)
spektrofotometri uv vis (83)
spektrofotometri uv_vis (54)
analisa spektrofotometri (50)
cara kerja spektrofotometri UV-Vis (36)
Spektrofotometri UV-Vis Spektrofotometri serapan (meliputi spektro UV-VIS, IR, dan serapan atom) merupakan pengukuran suatu interaksi antara radiasi elektromagnetik dengan molekul atau atom dari suatu zat kimia. Molekul selalu mengabsorbsi radiasi elektromagnetik jika frekuensi radiasi ini sama dengan frekuensi getaran molekul tersebut. Elektron yang terikat maupun tidak terikat akan tereksitasi pada suatu daerah frekuensi, yang sesuai dengan radiasi UV/VIS. UV/ VIS.
Bagian molekul yang mengabsorbsi dalam daerah UV-VIS dinyatakan sebagai kromofor. Suatu molekul dapat mempunyai beberapa kromofor. Untuk berbagai bahan farmasi, pengukuran spektrum dalam daerah UV dan visible dapat dilakukan dengan ketelitian dan kepekaan yang lebih baik daripada dalam daerah IR-dekat dan IR. Panjang gelombang daerah spektrum UV adalah 190-380 nm, sedangkan spektrum visible adalah 380-780 nm. Spektrofotometer yang sesuai untuk pengukuran di daerah spektrum UV-VIS terdiri dari suatu sistem optik dengan kemampuan menghasilkan cahaya monokromatik dalam jangkauan 200800 nm dan suatu alat yang sesuai untuk menetapkan serapan. serapan. Spektrum UV-VIS dari suatu zat umumnya tidak mempunyai derajat spesifikasi yang tinggi. Walaupun demikian, spektrum tersebut sesuai untuk pemeriksaan kuantitatif dan untuk berbagai zat spektrum tersebut bermanfaat sebagai tambahan pada identifikasi. Penggunaan kualitatif sangat terbatas karena rentang daerah radiasi yang relatif sempit (500 nm) hanya dapat mengakomodasi sedikit sekali puncak absorpsi maksimum dan minimum, karena itu identifikasi senyawa yang tidak diketahui tidak memungkinkan. memungkinkan. Alasan Pemilihan Metode Suatu senyawa dapat dianalisis dengan spektrofotometer UV-Vis jika mempunyai kromofor pada strukturnya, seperti: 1.
Ikatan rangkap terkonjugasi: Dua ikatan rangkap terkonjugasi
memberikan suatu kromofor, seperti dalam butadien akan mengabsorbsi pada 217nm. Panjang gelombang serapan maksimum (lmax) dan koefisien ekstingsi molar (e) akan bertambah dengan bertambahnya jumlah ikatan rangkap terkonjugasi. 2.
Senyawa aromatik: cincin aromatik mengabsorbsi dalam daerah
radiasi UV. Misal : benzen menunjukkan serapan pada panjang gelombang sekitar 255nm, begitu juga asam asetil salisilat. 3.
Gugus karbonil: pada gugus karbonil aldehida dan keton dapat
dieksitasi baik dengan peralihan n®p* atau p®p*.
4.
Auksokrom: gugus auksokrom mempunyai pasangan elektron
bebas, yang disebabkan oleh terjadinya mesomeri kromofor. Yang termasuk dalam gugus auksokrom ini adalah substituen seperti – OH, OH, NH2, -NHR, dan – NR2. NR2. Gugus ini akan memperlebar sistem kromofor dan menggeser absorbsi maksimum (lmax) ke arah l yang lebih panjang 5.
Gugus aromatik: adalah yang mempunyai transisi elektron
n®pseperti nitrat (313 nm), karbonat (217 nm), nitrit (360 dan 280 nm), azida (230 nm) dan tritiokarbonat triti okarbonat (500 nm). Prinsip Kerja Radiasi polikromatis dipancarkan dari sumber radiasi melewati monokromator sehingga diperoleh radiasi monokromatis. Radiasi monokromatis diteruskan ke kuvet yang berisi larutan/pelarut yang akan dianalisis. Radiasi tersebut akan dipantulkan, diabsorbsi dan ditransmisikan. Jika Io adalah intensitas radiasi yang dipancarkan; dan I adalah intensitas radiasi setelah melewati larutan; maka Io-I adalah intensitas radiasi yang diabsorbsi oleh larutan. Nilai Absorban (A) adalah sebagai berikut: A = log Io/I, menurut hukum Lambert-Beer Lambert-Beer : A = a b C Dimana: A = absorban;
a = absorptivitas; b = lebar medium medium (cm); C = konsentrasi
senyawa yang menyerap radiasi. -1
-1
Jika C = Molar, maka maka A = e = absorptivitas molar (L mol cm ) -1
-1
Jika C = g/L, maka A = a = absorptivitas (L g cm ) Jika C = % (b/v, g/100mL), maka A = A
1%
1cm
= absorptivitas jenis
Kegunaan Identifikasi (Kualitatif), yaitu dengan membandingkan hasil pengukuran pada sampel dengan pustaka pustaka atau pembanding. Yang Yang dibandingkan adalah: adalah: 1.
Panjang gelombang serapan maksimum (lmax);
2.
Nilai a (absorptivitas);
3.
Nilai e (absortivitas molar)
4.
1%
A
1cm
(absorptivitas jenis): khas untuk senyawa yang dilarutkan
dalam suatu pelarut pada pH tertentu; 5.
Nilai A pada C tertentu
6.
Rasio A pada berbagai panjang p anjang gelombang
Uji kemurnian, dengan membandingkan hasil pengukuran pada sampel dengan persyaratan yang ada pada kompendia. Yang dibandingkan adalah: nilai A maksimum dan lmax, rasio A pada dua l max yang berbeda. Penetapan Kadar (Kuantitatif), dapat digunakan untuk senyawa tunggal maupun campuran. Dalam melakukan pengukuran serapan suatu larutan pada l tertentu sebaiknya digunakan pelarut yang sesuai, yaitu yangdapat melarutkan zat yang akan dianalisis, dapat diperoleh dalam bentuk murni, dan hanya sedikit atau tidak memberikan serapan pada daerah pengukuran. Pelarut yang biasa digunakan dengan panjang gelombang transparan terendahnya adalah air (190 nm), etanol (210 nm), n – n – heksan heksan (195 nm), sikloheksan (210 nm), benzen (280 nm), dietileter (210 nm), aseton (330 nm), dan 1,4-dioksan (220 nm).(Satiadarma, 89). Letak Amax tergantung pada pelarut dan akan bergeser ke arah l yang lebih panjang dengan bertambahnya polaritas pelarut. Konsentrasi kerja larutan analit umumnya 10- 20 ug/ml, tetapi untuk senyawa yang nilai absorptovitas nya besar dapat diukur pada konsentrasi yang lebih rendah. Metode Penetapan Kadar 1.
Metode kurva kalibrasi: yaitu dengan cara mengukur Absorban (A)
sampel pada beberapa konsentrasi (C), kemudian dibuat kurva kalibrasi konsentrasi (C) terhadap absorban (A). Jika absorptivitas (a) suatu senyawa pada l max telah diketahui dari perhitungan atau literatur, maka kadar larutan senyawa yang sama dapat dihitung. Larutan senyawa dengan kadar tidak diketahui dibuat dalam pelarut yang sama dengan larutan senyawa yang diketahui kadarnya. Kadar larutan pembanding harus dibuat sesuai dengan kadar dimana hukum Lambert-Beer masih dipenuhi. Maka kadar larutan uji dapat dihitung: Cu = Au/(b.a)
2.
Metode ”One Point”: digunakan untuk penentuan kadar secara
rutin pada lmax, suhu pelarut, dan instrumen yang sama. Larutan uji dibandingkan terhadap larutan baku yang telah diketahui kadar dan kemurniannya : Cu = (Au/Ab).Cb
