Secara umum mekanisme dasar transkripsi pada eukaryote serupa dengan terjadi pada prokaryot, yaitu memerlukan DNA cetakan, DNA polymerase, NTP (ribonukleotida), serta molekul protein regulator. Transkripsi pada eukaryot juga berlangsung dengan diawali proses inisiasi transkripsi, kemudian dilanjutkan dengan pemanjangan transkrip, dan berhenti pada saat DNA polymerase mencapai daerah terminator. Meskipun demikian, ada banyak perbedaan fundamental antara sistem transkripsi prokaryot dengan transkripsi pada eukaryot.
Organisasi Gen pada Eukaryot Berbeda halnya dari organisasi gen pada prokaryot yang ada pada umumnya bersifat polisistronik, gen-gen pada jasad eukaryote bersifat monosistronik, artinya satu transkrip yang dihasilkan hanya mengkode satu macam produk ekspresi. Pada jasad eukaryote tidak dikenal adanya sistem operon karena satu gen struktural dikendalikan oleh satu promoter. Gen-gen eukaryote tersebar pada beberapa kromosom. Hal ini berbeda dari organisasi gen prokaryot yang umumnya hanya terdapat dalam satu unit bahan genetik utama. Banyak gen eukaryot yang bagian strukturalnya berselang-seling antara sekuens yang mengkode suatu urutan spesifik (ekson) dan sekuens yang tidak mengkode urutan spesifik (intron). Secara genetis, jasad eukaryot yang paling sederhana mempunyai organisasi gen yang lebih kompleks dibandingkan dengan prokaryot. Pada manusia, misalnya, gen yang bertanggung jawab terhadap pemunculan penyakit genetik Duchenne muscular dystrophy berukuran sekitar 2.000 kb (2 juta pasangan basa). Ukuran gen semacam ini seribu kali lebih besar dibandingkan dengan ukuran gen lacZ, pada bakteri Echerichia coli, dan ukuran tersebut ekuivalen dengan setengah genom E. coli. Tidak seperti pada prokaryot, pada jasad eukaryot terdapat tiga macam RNA polimerase yang bertanggung jawab di dalam proses transkripsi tiga kelas gen. Pada eukaryot dapat dibedakan tiga kelas gen, yaitu: (1) gen kelas I (ditranskripsi oleh RNA polimerase I), meliputi gen-gen yang mengkode 18S rRNA dan 28S rRNA, dan 5,8S rRNA, (2) gen kelas ll ditranskripsi oleh RNA polimerase II), meliputi semua gen yang mengkode protein dan beberapa RNA berukuran kecil yang terdapat di dalam nukleus, dan (3) gen kelas III (ditranskripsi oleh RNA polimerase III), meliputi gen-gen yang mengkode tRNA, 55 rRNA, dan beberapa RNA kecil yang
ada di dalam nukleus. Perbedaan kelas gen tersebut mempunyai implikasi dalam hal struktur gen.
Struktur Gen Kelas I Gen kelas I mengkode rRNA yang digunakan untuk menyusun ribosom, yaitu 18S rRNA, 28S rRNA, don 5,8S rRNA. Gen ini hanya ditranskripsikan tetapi tidak ditranslasi karena produk ekspresi yang digunakan adalah molekul rRNA-nya. Transkripsi gen kelas I dilakukan oleh RNA polimerase I. Gen yang mengkode rRNA terdapat dalam jumlah kopi yang besar sehingga molekul rRNA adalah molekul RNA yang paling banyak terdapat di dalam sel. Meskipun demikian, masing-masing kopi gen mempunyai struktur yang sama. Gen yang mengkode rRNA bersifat spesifik untuk suatu spesies tertentu (species-specifc), artinya sekuens promoter gen rRNA sangat bervariasi di antara spesies. Gen yang mengkode rRNA diekspresikan dalam laju yang sangat tinggi karena produk ekspresinya digunakan untuk menyusun ribosom yang merupakan komponen sangat penting dalam proses sintesis protein. Sintesis rRNA dalam jumlah tinggi dapat dicapai karena terdapat ratusan kopi gen berukuran 6-5 kb yang mengkode satu prekursor tunggal yang mengandung rRNA berukuran 18S; 5,8S; dan 28S. Setiap gen rRNA yang aktif dapat membawa 100 molekul RNA polimerase I. Struktur gen yang mengkode rRNA tersusun dalam bentuk unit-unit transkripsi yang bersambungan (tandem) dan terdapat di dalam nukleolus. Unit transkripsi yang satu dengan unit transkripsi yang lain dipisahkan oleh sekuens DNA pemisah yang secara keliru dikatakan sebagai tidak ditranskripsikan (non-transcribed spacer, NTS). Pada
Xenopus,
NTS
sebenarnya
juga
ditranskripsikan
meskipun
produk
transkripsinya berupa molekul RNA yang tidak stabil karena segera didegradasi. Pada gen kelas I terdapat dua macam promoter, yaitu (1) promoter antara (spacer promoter), yaitu suatu promoter yang terletak di daerah NTS, dan (2) promoter utama. Promoter utama berukuran sekitar 45 pasangan basa dan terletak pada posisi -35 dan +9. Hasil penelitian menunjukkan bahwa transkripsi berawal dari promoter antara dan berakhir pada suatu daerah terminator yang terletak tepat di sebelah
hulu
promoter
utama.
Hal
ini
nampaknya
dimaksudkan
untuk
mengumpulkan molekul RNA polimerase I dalam jumlah banyak pada daerah promoter utama sebelum dilakukan inisiasi sesungguhnya dalam proses sintesis rRNA. Pada Xenopus diketahui bahwa transkripsi berlanjut sampai daerah NTS. Akan tetapi molekul RNA yang dihasilkan pada daerah ini bersifat tidak stabll karena akan segera didegradasi. Transkripsi daerah NTS ini akan berakhir pula pada daerah terminator yang terletak tepat di sebelah hulu promoter utama. Terminator ini sebenarnya terletak tumpang-tindih dengan promoter utama dan meliputi suatu sekuens berulang sepanjang 18 pb (pasangan basa) yang bersambungan (tandem repeat). Pada mencit, ada perbedaan dengan Xenopus dalam hal terminatornya karena pada mencit ada terminator sesungguhnya yang terletak sekitar 500 pb di sebelah hilir (pada sisi 3') dari gen struktural sehingga nampaknya RNA polimerase I tidak berjalan melewati daerah NTS.
Struktur Gen Kelas II Gen kelas II meliputi semua gen yong mengkode segala macam protein. Gen kelas II ditranskripsi dengan menggunakan RNA polimerase II. Pada eukaryot, satu gen struktural kelas II diatur ekspresinya oleh satu promoter sehingga transkrip yang dihasilkan bersifat monosistronik karena hanya membawa informasi untuk satu macam polipeptida atau protein. Promoter gen kelas II dapat terdiri atas empat elemen, yaitu sekuens pemulai (initiator) yang terletak pada daerah inisiasi transkripsi, elemen hilir (downstream) yang terletak di sebelah hilir dari titik awal transkripsi, kotak TATA, dan suatu elemen hulu (upstream). Meskipun demikian, banyak gen yang tidak mempunyai salah satu elemen tersebut.
Struktur Promoter Gen Kelas II Promoter gen kelas II mempunyai strukur yang mirip dengan promoter prokaryot karena ada daerah konsensus (kotak TATA). Kotak TATA pada promoter gen kelas II mempunyai sekuens konsensus yaitu: T82 A99 T93 A83 A63 A83 A50
Angka-angka di belakang huruf tersebut menyatakan frekuensi nukleotida tersebut pada gen-gen yang telah dianalisis. Kotak TATA pada gen kelas II terletak pada posisi -25, tetapi pada khamir Saccharomyces cerevisiae posisinya lebih bervariasi yaitu antara -30 sampai -120 dari titik awal transkripsi. Sekuens pada kotak TATA menentukan titik inisiasi transkripsi secara tepat. Penghilangan kotak TATA pada gen -globin menyebabkan penurunan transkripsi secara in vitro sampai 20 kali lebih rendah. Pengubahan sekuens TATA menjadi TAGA atau TAAA pada gen konalbumin menghilangkan transkripsi. Meskipun kotak TATA mempunyai peranan sangat menentukan dalam inisiasi transkripsi beberapa gen, namun ada cukup banyak gen yang tidak mempunyai kotak TATA. Pada beberapa gen, misalnya gen hipoxantin fosforibosil transferase, fungsi kotak TATA digantikan oleh urutan GC, yaitu GGGGCGGAGC, yang terletak pada posisi -33. Gen-gen yang tidak mempunyai kotak TATA dapat dikelompokkan meniadi dua subkelas yaitu: (1) gen house-keeping, yaitu gen-gen yang diekpresikan secara konstitutif di dalam semua sel karena diperlukan dalam metabolisme utama, dan (2) gen-gen yang diatur ekspresinya berdasarkan atas perkembangan jasad hidup, misalnya gen-gen homeotik yang mengatur perkembangan lalat buah atau gen-gen yang terlibat di dalam perkembangan sistem kekebalan pada mamalia. Beberapa gen house-keeping yang tidak mempunyai kotak TATA misalnya gen yang mengkode adenine deaminase, timidilat sintetase, dan dihidrofolat reduktase, yang semuanya terlibat dalam biosintesis nukleotida. Seringkali transkripsi gen-gen semacam ini menghasilkan transkrip yang mempunyai ujung 5' yang beragam. Gengen semacam ini diekspresikan pada semua sel. Dalam proses transkripsi, kotak TATA menentukan ketepatan awal proses transkripsi. Pada gen yang mengkode protein histon pada sea urchin diketahui bahwa delesi kotak TATA menghilangkan spesifisitas inisiasi transkripsi, meskipun tidak mengurangi efisiensi transkripsi secara nyata, sehingga transkripsi dimulai dari beberapa titik secara acak. Transkrip yang dihasilkan dari inisiasi transkripsi secara acak tersebut setidak-tidaknya ada tiga macam. Hal ini memberikan gambaran bahwa RNA polimerase tidak dapat menemukan tempat yang tepat untuk memulai transkripsi. Penelitian yang dilakukan oleh Max Birnstiel dan kawan-kawan pada sekitar tahun 1990 tersebut kemudian dikonfirmasi oleh hasil penelitian Christophe Benoist dan Pierre Chambon yang meneliti transkripsi pada virus SV40, khususnya
pada promoter gen awal. Kedua penelitian tersebut membuktikan bahwa kotak TATA diperlukan untuk menentukan posisi awal transkripsi, meskipun tidak menentukan efsiensi transkripsi. Meskipun demikian, penghilangan kotak TATA pada beberapa macam promoter menghilangkan sama sekali proses transkripsi, misalnya pada gen -globin pada kelinci (yang sebenarnya mempunyai kotak CATA). Dengan demikian dapat disimpulkan bahwa pada beberapa gen, keberadaan kotak TATA diperlukan untuk aktivitas promoter, sedangkan pada beberapa gen yang lain, kotak TATA hanya diperlukan untuk menentukan posisi awal yang tepat untuk memulai transkripsi. Beberapa Promoter gen pada khamir diketahui mempunyai beberapa kotak TATA, misalnya gen CYC 1, ADH 1, dan SUC2. Keberadaan kotak TATA yang berjumlah lebih dari satu tersebut ada hubungannya dengan titik awal sintesis mRNA yang juga dapat dimulai dari beberapa posisi. Selain kotak TATA, ada sekuens lain yang terletak di sebelah hulu dari TATA yang juga diperlukan dalam proses transkripsi, yaitu kotak GC yang terletak pada posisi sekitar -47 sampai -61 dan antara -80 sampai-105. Penghilangan atau mutasi kotak GC tersebut daPat menghilangkan aktivitas Promoter. Sekuens pada kotak GC dapat terdiri atas urutan GGGCGG atau CCGCCC. Kotak GC pada suatu promoter dapat terdiri atas lebih dari satu, misalnya pada promoter awal virus SV40 yang mempunyai enam kotak GC. Fungsi kotak GC tidak tergantung pada orientasinya sehingga meskipun urutannya dibalik masih dapat berfungsi untuk menstimulasi transkripsi, tetapi letaknya tidak dapat diubah. Jika letak kotak GC tersebut dipindahkan dari posisinya semula, maka fungsinya untuk memengaruhi transkripsi menjadi hilang. Selain kotak GC, pada posisi sekitar -100 ada kotak lain yang disebut kotak CCAAT yang juga sangat penting dalam mengawali transkripsi. Kotak CCAAT tersebut biasanya tidak ditemukan pada Promoter gen house-keeping yang tidak mempunyai kotak TATA. Mutasi pada kotak CCAAT dapat menyebabkan hilangnya aktivitas promoter. Kotak CCAAT diketahui mengikat protein faktor transkripsi yaitu CCAATbinding transciption factor (CTF) dan CCAAT-enhancer-binding protein (CIEBP). Penelitian menunjukkan bahwa beberaPa Promoter pada khamir mempunyai sekuens yang terletak beberapa ratus nukleotida dari titik awal transkripsi yang diperlukan untuk transkripsi. Sekuens tersebut dikenal sebagai UAS (upstream
activating sequences), misalnya UAS1 dan UAS2 yang terletak pada posisi -256 dan -279 pada gen sitokrom oksidase (CYC1). Sekuens UAS tersebut diketahui mengikat suatu protein spesifik yang dapat memengaruhi transkripsi. Pada khamir, UAS tidak berfungsi jika terletak pada posisi sebelah hilir dari daerah gen struktural. Elemen UAS biasanya berukuran pendek, sekitar 10-30 pasangan basa. Gen-gen yang diatur oleh sistem pengaturan yang sama biasanya mempunyai elemen UAS yang serupa, sedangkan gen-gen yang sistem pengaturannya tidak terkoordinasi mempunyai elemen UAS yang berbeda. UAS merupakan elemen
