1. TEMA Técnica de coloração de GRAM
2. Introdução Corantes são substâncias que possuem a propriedade de transmitir sua cor a outros corpos. Preparações coradas são comumente usadas no exame microscópico de bactérias em Microbiologia, nas quais esfregaços de material são submetidos á ação de um ou mais corantes, após fixação (Moraes et al., 2000). Em 1884, o médico dinamarquês Christian Gram descobriu, empiricamente, ao corar cortes histológicos com violeta genciana, através do método de Ehrlich (1882), que as bactérias que eles continham não eram descoradas pelo álcool, se previamente tratadas com solução de iodo. Ele adicionou a este procedimento um contra-corante (safranina, fucsina básica, etc.) e estabeleceu, a partir daí, um novo método de coloração diferencial. Ao longo destes anos, o mecanismo de coloração de Gram foi muito estudado, e, nesta medida, muitas modificações foram propostas, sem, contudo afetar substancialmente a idéia original (Moraes et al., 2000; Marczwski & Vélez, 1999). Externamente à membrana plasmática as bactérias apresentam uma parede celular, esta é uma estrutura rígida, responsável pela forma da célula bacteriana, que age como uma membrana seletiva e permeável, além de proteger contra choques osmóticos. São as características da parede celular que determinam a reação de Gram. Análises químicas demonstraram diferenças entre as paredes das bactérias Gram positivas e Gram negativas (Fig. 1), já que a parede das Gram negativas é geralmente mais rica em lipídios que as Gram positivas. Nas Gram negativas o teor de peptídeoglicano (5 a 10%) é mais baixo que nas Gram positivas (40 a 90%) (Salle, 1961; Romeiro, 1995).
Figura 1: Diferenças entre as paredes das bactérias Gram positivas e Gram negativas. Fonte: www.terravista.pt/bilene/biologia/célula/bact24.htm.
Os diferentes tipos de bactérias reagem de modo diferente à coloração de Gram, porque diferenças estruturais em suas paredes celulares afetam a retenção ou liberação de uma combinação de violeta de genciana e iodo, denominada complexo violeta-iodo (CV-I). Entre outras diferenças, as bactérias gram-positivas têm uma parede celular mias espessa de peptideoglicana(dissacarídeos e aminoácidos) que as bactérias gram-negativas. Além disso, as bactérias gram negativas contêm uma camada de lipopolissacarídeos (lipídeos e polissacarídeos) como parte de sua parede celular. Quando aplicada a células gram-positivas e gram-negativas, a violeta de genciana e o iodo penetram facilmente nas células. Dentro as mesmas, a violeta de genciana e o iodo se combinam para formar o CV-I. Esse complexo é maior que a molécula CV que entrou na célula e, devido ao seu tamanho, não pode ser removido da camada intacta de peptideoglicano das células grampositivas pelo álcool.
Nas células gram-negativas o álcool rompe a camada lipopolissacarídica e o complexo é removido através da camada fina de peptideoglicano, que não consegue reter o complexo. Como resultado, as células gram-positivas retêm o corante e permanecem de cor púrpura. As células gram-negativas não retêm o corante e ficam incolores até serem contracoradas com um corante vermelho, após o que adquirem cor rosa. O método de Gram é uma das mais importantes técnicas de coloração em microbiologia médica. Porém, os resultados da coloração de Gram não são universalmente aplicáveis, pois algumas células bacterianas coram-se fracamente ou não adquirem cor. A reação de Gram é mais consistente quando usada em bactérias jovens, em crescimento. O método de coloração de Gram consiste no tratamento de uma amostra de uma cultura bacteriana crescida em meio sólido ou líquido, com um corante primário, o cristal violeta, seguido de tratamento com um fixador, o lugol. Tanto bactérias gram-positivas quanto gram-negativas absorvem de maneira idêntica o corante primário e o fixador, adquirindo uma coloração violeta devido à formação de um complexo cristal violeta-iodo, insolúvel, em seus citoplasmas. Segue-se um tratamento com um solvente orgânico, o etanol -acetona. O solvente dissolve a camada lipídica das membranas externas das bactérias gram-negativas, deixando também pequenos buracos na fina camada de peptideoglicana pelos quais o complexo CV-I se espalha , decorando as células. Por outro lado, o solvente desidrata as espessas paredes celulares das bactérias gram-positivas e provoca a contração dos poros do peptideoglicano, tornando-as impermeáveis ao complexo; o corante primário é retido e as células permanecem coradas. A etapa da descoloração é crítica, pois a exposição prolongada ao solvente irá provocar a remoção do cristal violeta dos dois tipos de bactérias, podendo produzir resultados falsos. A retenção ou não do corante primário é, portanto, dependente das propriedades físicas e químicas das paredes celulares
bacterianas tais como espessura, densidade, porosidade e integridade. Em seguida, a amostra é tratada com um corante secundário, a fucsina básica. Como as bactérias gram-negativas ficam incolores após a lavagem com álcool, a adição do contracorante colore as células. Ao microscópio, as células gram-positivas aparecerão coradas em violeta e as gram-negativas em rosa. Em células de bactérias gram-positivas velhas, mortas ou com envelopes danificados por agentes físicos ou químicos, tendem a perder o cristal violeta e uma mesma amostra bacteriana pode exibir parte ou todas as células coradas como gram-negativas. Portanto, o uso de amostra nova é importante. Por outro lado, resultados do tipo "falso gram-positivo" só são obtidos se o tratamento com etanolacetona for omitido. O corante cristal violeta pode ser substituído, com os mesmos resultados, pelo azul de metileno e a fucsina básica pode ser substituído pelo corante vermelho safranina. A fucsina cora muitas bactérias gram-negativas mais intensamente que a safranina, que por sua vez não cora prontamente algumas espécies de bactérias. O solvente etanol-acetona pode ser substituído por álcool 95%.
3. OBJETIVO Desenvolver habilidades para executar as técnicas de preparação de esfregaços e para o método de coloração de Gram, sabendo diferenciar e classificar as bactérias de acordo com a coloração obtida. Desenvolver a habilidade, também, para utilizar o microscópio óptico, observando as bactérias após a coloração de Gram.
4. MATERIAIS E REAGENTES 4.1.
Aparelhagem
Lâmina de dimensões 76 x 26 mm;
Porta-lâmina de aço inoxidável ou vidro;
Pinça de aço inoxidável;
Bico de Bunsen;
Alça de platina ou níquel-cromo com aro de 3 mm de diâmetro interno e 70 mm de comprimento;
Cronômetro;
Microscópio óptico, com condensador de campo claro seco , permitindo aumentos de até 1500X (objetiva de imersão).
4.2.
Solução, Reagente e Óleo
Água destilada;
Gram I (Solução de cristal violeta);
Gram II (Solução de lugol);
Gram III (Etanol absoluto a 95 % (v/v)) ;
Gram IV (Solução de fucsina de Zielh ou safranina);
Óleo de imersão.
5. PROCEDIMENTO 5.1.
Coloração e esfregaço
Utilizando-se da área estéril em volta do bico de Bunsen retirar, com o auxílio da alça de platina, uma pequena porção da bactéria desejada (já inoculada em placa petri). Colocar uma gota de água destilada em uma lâmina, esfregar a ponta da alça de platina com a bactéria na gota, fazendo um círculo. Secar a água com o auxílio do bico de bunsen. Corar com Cristal violeta por 60 segundos. Lavar com esguicho de água. Corar com Lugol por 60 segundos. Lavar com esguicho de água. Passar álcool acetona até que não haja mais desprendimento de corante. Lavar com esguicho de água. Corar com fucsina por 30 segundos. Lavar com esguicho de água e esperar secar.
5.2.
Microscópio
Ligar o microscópio na tensão adequada. Acoplar a lâmina à mesa (platina) do microscópio. Focalizar utilizando o parafuso macrométrico, ajustar o foco com o parafuso micrométrico. No caso da lente de maior aumento, colocar óleo de imersão, imergir a lente no óleo, focar utilizando o parafuso macrométrico e ajustar com ajuda do micrométrico. Após o término da visualização, retirar a lâmina e limpar imergindo-a no óleo.
6. Resultados e Discussão de Resultados. A tabela 1 abaixo é referente aos resultados obtidos durante a prática da observação da coloração de GRAM.
Tabela 1: Resultado da Coloração de GRAM PLACAS Resultado da Coloração 1 vermelha 2 3 4 5 6 7
vermelha violeta vermelha Tons de vermelha e violeta violeta vermelha
Resultado do tipo da coloração GRAM NEGATIVA GRAM NEGATIVA GRAM POSITIVA GRAM NEGATIVA GRAM POSITVA E NEGATIVA GRAM POSITIVA GRAM NEGATIVA
TIPO DE BACTÉRIA Bastonestes Bastonestes e Bacilos Levedura Cocos Bastonetes Cocos Cocos
O cristal violeta e o lugol penetram tanto nas bactérias Gram-positivas quanto nas Gram negativas, formando um complexo de cor roxa. O tratamento com álcool é a etapa diferencial; nas Gram-positivas, o álcool não retira o complexo
cristal violeta + lugol, pois a sua ação desidratante faz com que a espessa camada de peptídeoglicano se torne menos permeável, retendo o corante. Nas Gram-negativas, devido à pequena espessura da camada de peptídeoglicano e sua maior permeabilidade, o complexo corado é extraído pelo álcool, deixando as células descoradas. Como as bactérias Gram positivas possuem a parede celular mais impermeável, o álcool não consegue descolorilas, portanto, permanecem com a coloração azul-violeta do corante. O tratamento com álcool não altera a cor roxa das Gram-positivas, ao passo que as Gram-negativas, descoradas pelo álcool, tornam-se avermelhadas, cor característica do corante de fundo (Moraes et al., 2000; Ferreira & Salgado, 1995; Romeiro, 1995). O esquema representativo da etapa de coloração de GRAM é representado conforme a figura 2 abaixo.
Figura 2: Esquema representativo dos processos envolvidos durante a coloração de Gram. Fonte: WESP, 2003.
Para a identificação das bactérias foi realizado a visualização e para entender melhor foram postadas as figura 3 a 9 ilustrando o que cada componente do grupo visualizou.
Figura 3: Placa 1 representa os Bastonetes GRAM POSITIVO não esporulados.
Figura 4: Placa 2 representa os Bastonetes ( cocobacilos) Gram Positivo.
Figura 5: Placa 3 representa a Levedura Gram Negativa.
Figura 6: Placa 4 representa o Cocos Positivo agrupados 2 a 2 ( diplococos).
Figura 7: Placa 5 representa os bastonetes em forma de Gram negativo e gram positivo.
Figura 8: Placa 6 representa os Cocos Gram negativo agrupados 2 a 2 (diplococos) intra e extra- celulares.
Figura 9: Placa 7 representa os Cocos Gram positivo agrupados em cachos de uva.
