Proposal CYP2E1 Sateks Unsri

BIDANG KESEHATAN

Proposal PENELITIAN DOSEN MUDA SATEKs UNSRI

Pengaruh Polimorfisme Gen CYP2E1 Terhadap Kepekaan Individu Untuk Terkena Kanker Nasofaring

KETUA : dr. Puspasari Zuleika, SpTHT-KL,M.Kes ANGGOTA : dr. dr. Yuli Yuli Doris Memy SpTHT-KL

FAKULTAS KEDOKTERAN UNIVERSITAS SRIWIJAYA PALEMBANG 2010

The world’s largest digital library

Try Scribd FREE for 30 days to access over 125 million titles without ads or interruptions! Start Free Trial Cancel Anytime.











2

HALAMAN PENGESAHAN PROPOSAL PENELITIAN DOSEN MUDA SATEKs UNSRI

1. Judul Penelitian 2. Bidang Ilmu Penelitian 3. Ketua Peneliti a. Nama lengkap b. Jenis kelamin c. NIP d. Jabatan fungsional e. Jabatan struktural f. Bidang keahlian g. Fakultas h. Perguruan tinggi i. Alamat

4. Jumlah tim peneliti 5. Lokasi penelitian 6. Mata kuliah yang diampu 7. Waktu penelitian 8. Pembiayaan

: Pengaruh polimorfisme gen CYP2E1 terhadap kepekaan individu untuk terkena kanker nasofaring : Kedokteran : : dr. Puspa Zuleika, SpTHT-KL, M.Kes : Perempuan : 19780107 200812 2 001 : Staf Bagian THT FK UNSRI/RSMH : Tidak ada : Spesialis THT : Kedokteran : Universitas Sriwijaya : Jl. Raya Palembang – Palembang – Prabumulih Prabumulih Km 32 Ogan Ilir 30662 Telp (0711)581077 ; Fax: 0711580053 Email: [email protected] : 2 (dua) orang. : 1. Poliklinik THT RSMH 2. Laboratorium Biologi Molekuler FK UNSRI : Ilmu Penyakit Mata : 7 (tujuh) bulan : Rp 10.000.000

Inderalaya, 8 Mei 2010

An.Dekan Fakultas Kedoktera Pembantu Dekan III

dr. Syarif Husin, MS NIP 19611209 199203 1 003

Ketua Peneliti

dr. Puspa Zuleika, Sp.THT-KL, M.Kes NIP 19780107 200812 2 001

Menyetujui Ketua Lembaga Penelitian Univ. Sriwijaya Sriwij aya











3

BAB I. PENDAHULUAN 1.1 Latar Belakang

Karsinoma nasofaring (KNF) merupakan suatu keganasan yang berasal dari sel epitel nasofaring. Angka kejadian KNF di Indonesia cukup tinggi yaitu 4,7 kasus baru per-tahun per 100.000 penduduk (Susworo, 2004). Catatan dari berbagai rumah sakit menunjukkan bahwa KNF urutan keempat keempat setelah kanker leher leher rahim, kanker payudara dan kanker kanker kulit. (Sisworo 2004). KNF jarang ditemukan di negara-negara Barat, namun di Cina Selatan dan Asia Tenggara ditemukan dengan prevalensi cukup tinggi. Insiden KNF di Cina Selatan dilaporkan dengan rasio 30-50/100.000, sedangkan di Asia Tenggara ditemukan sebesar rasio 3/100.000 pada populasi Thailand murni dan meningkat menjadi 10/100.000 pada populasi Thailand yang berasimilasi dengan etnis Cina. (Mutirangura, 2000). Tingginya insiden KNF di negaranegara Asia tertentu menimbulkan suatu asumsi bahwa faktor genetik turut berperan sebagai faktor predisposisi penyakit ini. Sampai saat saat ini, penyebab penyebab KNF masih masih dianggap bersifat multifaktorial. Faktor yang berperan dalam patogenesis KNF antara lain adalah faktor genetik dan faktor lingkungan. Faktor lingkungan yang sejauh ini telah diketahui berperan antara lain infeksi virus EpsteinBarr (EBV), kekerapan mengkonsumsi makanan yang mengandung nitrosamine yang banyak ditemukan pada makanan yang diawetkan seperti ikan asin (Mutirangura et al, 1997). Selain itu KNF diduga juga berhubungan dengan paparan formaldehid, debu dan asap kayu bakar, beberapa minyak nabati yang mengandung nitrosamine. Nitrosamin diprediksi merupakan senyawa yang dapat mengaktivasi perkembangan KNF. (Chan et al, 2002). Mekanisme terbentuknya nitrosamine melalui penggabungan senyawa nitrat dan nitrit dengan amin. Nitrat dan nitrit ini banyak digunakan sebagai bahan pengawet pada makanan dan untuk memberikan warna dan rasa khusus pada daging. Zat tersebut dapat bergabung dengan amin dan membentuk nitrosamin yang kebanyakan bersifat karsinogen kuat. Selain itu interaksi kimia dapat terjadi melalui berbagai mekanisme, misalnya senyawa nitrit dan amin tertentu dapat bereaksi dalam lingkungan gastrointestinal yang bersifat asam untuk membentuk nitrosamine (Frank, 1991). Terbentuknya Terbentuknya nitrosamine juga dapat terjadi pada saat proses pengolahan makanan seperti











4

Reaksi antara nitrit dan alkilamin akan membentuk nitrosamine yang bersifat karsinogenik paling kuat di antara karsinogen kimiawi. (Wills et al, 1987). Faktor konsumsi makanan yang diawetkan, difermentasi dan diasapi dapat meningkatkan kandungan xenobiotic nitrosmin yang berkaitan dengan KNF. (Chan, 2002). Aktivasi nitrosamine sebagai suatu penyebab kanker telah dibuktikan pada hewan coba tikus yang diberi makanan berupa ikan asin yang mengandung nitrosamine menunjukkan adanya tumor kavum nasalis (Huang et al, 1996). Yu dkk (1996) melakukan penelitian dengan membandingkan insiden KNF pada orang Cina di Hongkong dan di Los Angeles menyimpulkan bahwa konsumsi ikan asin cenderung menjadi faktor penyebab utama KNF dibandingkan dibandingkan dengan hirupan asap rokok (Yu and Henderson, 1996) Pada manusia, sistem enzim yang berperanan penting pada metabolisme dan biotransformasi senyawa kimia dalam makanan ( xenobiotic xenobiotic) adalah sistem sitokrom P450. Salah satu sub-famili super enzim sitokrom P450 adalah CYP2E1. CYP2E1 merupakan enzim yang bertanggung jawab terhadap metabolisme lebih dari 70-80% dari seluruh proses biotransformasi. Salah satu metabolit yang dikatalisis CYP2E1 adalah karsinogen kimiawi Nnitrosamin (Kongruttanachok et al, 2001). CYP2E1 merupakan enzim yang terlibat dalam aktivasi substrat prokarsinogen nitrosamin sehingga mampu menimbulkan kerusakan pada DNA dan menimbulkan kanker. Polimorfisme (mutasi) pada gen yang menyandi enzim CYP2E1 dihubungkan dengan variasi metabolik individu terhadap suatu xenobiotik sehingga dalam populasi akan dijumpai dua sub group yang berbeda kemampuannya metabolismenya. Sub group dengan kemampuan metabolism kurang disebut sebagai poor metabolizer atau fenotip PM, sedangkan sub group dengan kemampuan metabolism normal disebut sebagai extensive metabolizer atau fenotip EM. Penelitian pada dua di daerah Cina yang mempunyai perbedaan rerata kejadian KNF, diperoleh data bahwa individu yang berdomisili di komunitas resiko tinggi KNF mempunyai kemampuan membentuk nitrosamine endogen yang lebih tinggi dibandingkan dengan individu yang tinggal di komunitas rendah KNF. Hal ini menimbulkan dugaan bahwa perbedaan genotip dan atau fenotip enzim CYP2E1 bertanggung jawab terhadap aktivasi nitrosamine yang memungkinkan adanya perbedaan resiko kejadian KNF (Yu Henderson, 1996).

and











5

karsinoma colorectal (Morita et al, 2009), kanker paru ( Hirvonen 1993). Berdasarkan distribusi endemik, suseptibilitas individu terhadap KNF diduga didapat dari nenek moyang dan diturunkan secara autosomal.

Suku bangsa di Indonesia selama berabad-abad telah menjalin perdagangan dengan bangsa Cina sehingga sedikit banyak terdapat pengaruh budaya Cina dalam kultur suku bangsa di Nusantara. Adanya perkawinan campur antara suku asli Indonesia dengan Cina telah menyebabkan perubahan genetik ( genetik drift ) yang dapat diturunkan pada keturunan berikutnya. Gen CYP2E1 secara genetik diturunkan secara autosomal kepada turunannya (offspring). Bukti-bukti arkeologis juga memberikan dugaan bahwa suku bangsa Indonesia berasal dari daratan Cina Selatan yang mempunyai angka kejadian KNF yang tinggi. Hal tersebut di atas ditambah dengan kebiasaan suku bangsa Indonesia mengkonsumsi makanan yang diawetkan dengan cara pengasinan dan pengasapan merupakan faktor resiko untuk terjadinya KNF. Hal ini menunjang dugaan bahwa cukup tingginya insiden KNF berkorelasi dengan adanya polimorfisme pada gen CYP2E1. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui sejauh mana peran polimorfisme gen CYP2E1 dalam patogenesis KNF di Indonesia. Pendekatan yang digunakan pada penelitian dengan melakukan amplifikasi DNA dengan PCR dilanjutkan RFLP dengan enzim restriksi yang spesifik. Penelitian ini diharapkan dapat berfungsi sebagai skrining untuk menilai kepekaan seseorang untuk menderita penyakit keganasan khususnya KNF.

1.2 Rumusan Masalah Setelah mempertimbangkan latar belakang penelitian di atas, maka dirumuskan masalah yang akan diteliti sebagai berikut: 1. Bagaimana distribusi genotipe dan alotipe gen CYP2E1 pada penderita KNF di Indonesia 2. Apakah genotipe dan alotipe CYP2E1 berasosiasi dengan kepekaan individu terhadap KNF

1.3 Tujuan Penelitian Tujuan Umum:

Mempelajari pengaruh pengaruh polimorfisme gen CYP2E1 terhadapa terjadinya terjadinya KNF pada populasi Indonesia.











6

2. Mengetahui hubungan polimorfisme CYP2E1 yang direstriksi dengan DraI dengan suseptibilitas individu terhadap KNF.

1.4 Manfaat Penelitian

1. Hasil penelitian ini dapat menjadi data awal tentang pola distribusi alel gen CYP2E1 pada populasi di Indonesia. Diharapkan data ini dapat digunakan untuk penelitian keganasan lain yang dihubungkan dengan aktivitas enzim CYP2E1. 2. Hasil penelitian ini dapat pula digunakan pada konseling bagi keluarga penderita KNF agar dapat mengambil tindakan preventif untuk meminimalkan resiko terkena KNF.

BAB II. STUDI PUSTAKA 2.1 Karsinoma Nasofaring (KNF) 2.1.1 Insiden

Karsinoma nasofaring (KNF) merupakan tumor ganas yang terjadi pada sel epitel di daerah nasofaring, yaitu pada daerah cekungan Rossenmuelleri dan tempat bermuaranya tuba eustachii. Di Indonesia, KNF merupakan tumor ganas terbanyak di bidang THT dan menempati urutan ke-empat terbanyak setelah kanker leher rahim, kanker payudara, dan kanker kulit. Angka kejadian KNF diperkirakan 4,7 kasus dalam 100.000 orang penduduk pertahun atau diperkirakan 7000-8000 kasus pertahun di seluruh Indonesia, dengan angka kejadian pada pria lebih tinggi yaitu 2-3 kali lebih banyak dibandingkan wanita (Sisworo, 2004). Usia penderita bervariasi dan dapat mengenai semua golongan umur, namun terutama dijumpai pada usia masih produktif (30-60 tahun), dengan kelompok usia terbanyak berumur 40-50 tahun (Sisworo, 2004)

2.1.2 Etiologi

KNF merupakan penyakit endemis yang bersifat multifaktorial. Banyak factor yang diduga berkaitan dengan patofisiologi terjadinya KNF, di antaranya adalah kerentanan genetik (ras mongoloid), factor lingkungan (kebiasaan hidup) dan infeksi virus eptein-barr













7

bahan atau bumbu tertentu dan kebiasaan mengkonsumsi makanan terlalu panas. Kebiasaan ini sering dilakukan oleh penduduk Guangdong yang hampir setiap hari mengkonsumsi ikan yang diasinkan atau diasapi (Yin and Chien, 2003). Pada ikan yang telah diawetkan dijumpai zat yang bersifat karsinogenik yaitu nitrosamine yang berperan sebagai factor predisposisi terjadinya KNF.

2.1.3 Diagnosis dan Terapi

Diagnosis karsinoma nasofaring seringkali terlambat ditegakkan karena penyakit ini tidak memiliki gejala yang spesifik serta karena letak nasofaring yang sulit dijangkau oleh mereka yang bukan ahlinya. Gejala awal KNF berupa gangguan pilek biasa yang disertai rasa tidak nyaman. Umumnya penderita mengeluh pilek disertai dengan rasa tidak nyaman pada telinga, pendengaran menurun, dan keluar lendir dari hidung disertai perdarahan yang berulang (Sisworo, 2004). Pembesaran Pembesaran di daerah leher merupakan pertanda penyebaran KNF ke daerah ini atau sakit kepala yamng disebabkan desakan tulang dasar tengkorak oleh tumor. Pemeriksaan serologis sebaiknya dilakukan dilakukan jika telah mengalami gejala tersebut sebagai deteksi dini terhadap KNF. Diagnosis juga dapat ditegakkan dengan melakukan biopsy nasofaring yang dilakukan melalui hidung atau mulut. Bila hasilnya kurang memuaskan dapat dilakukan kuretase daerah lateral nasofaring dalam narkose. Selain itu, diagnosis juga dapat dilakukan dengan melacak DNA EBV dengan menggunakan metode PCR. Pada sel epitel nasofaring penderita KNF dapat terdeteksi DNA EBV pada hampir semua sampel yang diperiksa. Hasil pemeriksaan Shotelersuk et al (2006) menunjukkan bahwa pada plasma darah yang mengandung DNA EBV dapat menjadi penentu diagnosis KNF. Sejauh ini pengobatan yang efektif untuk penderita KNF adalah dengan radioterapi. Berdasarkan penelitian Tan dkk (2006) yang membandingkan kadar EBV dalam plasma











8

menunjukkan bahwa resiko KNF juga ditemukan pada konsumsi sayuran yang diasinkan yang diketahui sumber nirit dan nitrosamine. Pada hewan percobaan, telah dibuktikan bahwa tikus yang diberi ikan asin ala Cina akan terinduksi untuk berkembang menjadi karsinoma kavum nasalis, sehingga disimpulkan terdapat asosiasi antara konsumsi ikan asin dan bahan makanan yang banyak mengandung nitrosamine dengan kepekaan kepekaan terjadinya KNF (Huang et al, 1978) Ikan asin ala Kanton diperkirakan mengandung beberapa zat karsinogenik yang mampu menginduksi perkembangan KNF. Nitrosamin yang mudah menguap ( volatile ) juga terdeteksi pada ikan asin di Tunisia, Cina dan Greenland, Selain itu, N-nitrosodimetilamin dan N-nitrosodietilamin yang mudah menguap terdeteksi dalam sampel ikan asin, dan konsentrasinya tergantung cara pengolahannya (Poirier, 1987). Derivat senyawa N-nitroso yaitu dimetilnitrosamina dan N-nitroso-N-metilurea yang terdapat dalam makanan awetan dengan cara pengasapan merupakan senyawa yang juga ditemukan dalam asap tembakau.Senyawa ini terbentuk dari amina sekunder atau amida dan nitrit. Amina sekunder terbentuk pada saat pemanasan protein (Mustschler, 1991). Interaksi kimia nitrit dan amin dapat terjadi melalui berbagai mekanisme. Misalnya senyawa nitrit dan amin tertentu dapat berinteraksi dalam lingkungan gastrointestinal yang bersifat asam untuk membentuk nitrosamine. Peningkatan nitrat di lingkungan tanah dan air dapat terjadi akibat pemakaian pupuk secara intensif dank arena pembuangan ekskreta manusia dan hewan ternak. Nitrat akan diubah menjadi nitrit di tanah, air dan saluran gastrointestinal melalui kerja mikroba, kemudian nitrit dapat bereaksi dengan amin untuk membentuk nitrosamine (Frank, 1991). Selain senyawa amin yang berasal dari asam amino, terdapat juga senyawa amin hasil metabolit dalam ikan asin yaitu alkilamin. Alkilamin yang berada dalam ikan asin akan bereaksi dengan nitrit dari sayuran atau bereaksi dengan natrium yang terdapat pada daging











9

meningkat

sekitar 2-8 kali lebih besar pada pada etnis Cina di Hongkong, Guangxi dan

Guangzhou di Cina Selatan. Sedangkan pada komunitas orang perahu di Vietnam, tingginya kasus KNF diduga berkaitan dengan kebiasaan menggunakan kayu sebagai bahan bakar untuk memasak (Yin and Chien,2003). Konsumsi pengawet makanan seperti yang terdapat dalam telur asin, jamur hijau asin, pasta kedelai hitam dan pasta kedelai selama masa sapih berasosiasi dengan peningkatan resiko KNF sekitar 3-5 kali lebih besar dalam penelitan di Guangxi Cina (Yu et al, 1988), Sedangkan makanan lain seperti saos ikan yang difermentasi, pengawet pada pasta udang asin dan tahu diketahui secara signifikan berkaitan dengan kejadi KNF pada penelitian Guangzhou Cina (Yu et al, 1989). Karsinogenesis Karsinogenesis akibat bahan kimia berjalan secara bertahap. Senyawa kimia karsinogenik bekerja memicu perubahan genetic dalam sel sehingga menyebabkan pembentukan neoplasma atau perubahan neoplasma jinak menjadi ganas (kanker). Zat karsinogen berinteraksi dengan makromolekul DNA dan membentuk carcinogen adduct serta menginduksi perubahan kimiawi lainnya pada DNA. Karsinogen akan mengaktifkan onkogen sehingga mengubah sel normal menjadi sel kanker. Sel tumor yang telah mengalami inisiasi mungkin akan tetap “tenang” untuk jangka waktu yang lama sebelum berubah menjadi sel tumor akibat proses proliferasi (Frank, 1981).

2.1.5 Pengaruh Polimorfisme CYP2E1 Terhadap Terjadinya KNF

Polimorfisme adalah suatu istilah yang digunakan untuk menunjukkkan adanya bentuk yang berbeda dari struktur dasar yang sama. Suatu lokus gen dikatakan polimorfik jika alel yang sering ditemukan frekwensinya tidak kurang dari 99% pada lokus yang bersangkutan. Menurut hukum Hardy-Weinberg dikatakan polimorfisme bila frekwensi alel polimorfik lebih dari 2%. Contohnya adalah golongan darah A merupakan suatu fenotip yang











10

protein yang berbeda sehingga mungkin akan menghasilkan perubahan fenotip yang nyata (Nussbaum et al, 2001). Polimorfisme ini diturunkan menurut hokum Mendel sehingga dapat digunakan untuk menganalisis keturunan. Mutasi pada suatu gen yang menyandi menyandi enzim yang berperan dalam dalam metabolisme suatu substansi substansi menyebabkan menyebabkan adanya adanya variasi aktivitas enzim enzim yang dapat lebih tinggi atau lebih rendah atau pula tidak memberikan efek apapun. Dengan demikian individu dengan potensi peningkatan aktivasi dan rendahnya kemampuan detoksifikasi menjadi lebih rentan terhadap kanker. Polimorfisme genetic telah membuat populasi manusia terbagi menjadi dua sub group yang mempunyai kemampuan memetabolisme yang berbeda. Sub group yang mempunyai kemampuan metabolisme berkurang atau menurun disebut sebagai poor metabolizer atau fenotip PM dan sub group dengan metabolisme normal yang disebut extensive metabolizer atau fenotip EM. Polimorfisme pada CYP2E1yang terlibat dalam kemampuan menginaktivasi nitrosamin (fenotip PM) akan menyebabkan nitrosamine yang karsinogenik tidak mampu diubah menjadi produk non toksik sehingga dapat menyebabkan kerusakan DNA yang berasosiasi dengan timbulnya kanker khususnya KNF. Salah satu teknik yang secara luas digunakan untuk mendeteksi variasi pada tingkat DNA adalah restriction fragment length polymorphism (RFLP). Deteksi RFLP dilakukan berdasarkan perbedaan profil pita-pita DNA suatu produk PCR yang dipotong dengan enzim restriksi endonuklease misalnya DraI yang dapat memotong DNA dengan sekuen DNA tertentu. Perbedaan panjang DNA ini dapat dilihat dengan elektroforesis pada gel dan divisualisasi dengan sinar UV (Sambrook, 2003). Keunikan alel CYP2E1 juga berkaitan dengan tingginya resiko KNF di beberapa kelompok etnis Asia (Hildesheim et al, 1995). Gen yang menyandi enzim CYP2E1 terletak di kromosom 10q24.3-q. Gen ini terdiri atas 9 ekson dan 8 intron yang regulasinya melibatkan mekanisme transkripsi dan post transkripsi yang kompleks (Hildesheim et al, 1995). Gen CYP2E1 pada populasi dijumpai dalam bentuk











11

tinggi untuk terkena KNF (Hildesheim et al, 1995). Penelitian ini hanya membatasi untuk mengidentifikasi polimorfisme pada situs restriksi DraI saja karena alas an biaya.

BAB III. METODOLOGI PENELITIAN 3.1

Rancangan Penelitian

Desain penelitian ini bersifat analitik observasional kasus-kontrol.

3.2

Tempat dan Waktu Penelitian

Penelitian ini dilakukan di Departemen THT RSMH/FK UNSRI dan Laboratorium Biologi Molekuler FK UNSRI Palembang yang berlangsung selama 7 bulan mulai JuniDesember 2010.

3.3

Subjek dan Sampel Penelitian :

Subjek dalam penelitian ini terdiri atas kelompok kasus yaitu penderita KNF yang sudah didiagnosis pasti menderita KNF oleh dokter spesialis THT di Departemen Telinga Hidung dan Tenggorokan Rumah Sakit Mohammad Hoesin/Fakultas Kedokteran Universitas Sriwijaya Palembang yang didasarkan anamnesis dan pemeriksaan fisik. Sedangkan kelompok kontrol dipilih dari sukarelawan sehat yang tidak menderita KNF. Seluruh subjek penelitian terlebih dahulu dijelaskan maksud penelitian dan bila bersedia diminta menandatangani informed consent . Sampel dikumpulkan dari subjek penelitian yang memenuhi kriteria inklusi secara consecutive sampai jumlah sampel terpenuhi. Spesimen penelitian ini adalah darah yang diambil dari penderita KNF dan sukarelawan sehat (tidak menderita K NF).













12

3.5

Kriteria Inklusi dan Eksklusi Kelompok Kasus

1. Bersedia mengikuti penelitian yang dinyatakan dengan menandatangani surat persetujuan atas dasar kesadaran ( informed consent ). ). 2. Laki-laki atau wanita 3. Suku Indonesia asli bertempat tinggal di Sumatera Selatan 4. Penderita yang telah didiagnosis KNF oleh seorang Spesialis THT berdasarkan pemeriksaan klinis

Kelompok Pembanding

1. Bersedia mengikuti penelitian yang dinyatakan dengan menandatangani surat persetujuan atas dasar kesadaran ( informed consent ). ). 2. Laki-laki atau wanita 3. Suku Indonesia asli bertempat tinggal di Sumatera Selatan, 4. Penderita yang telah diperiksa oleh seorang Spesialis THT berdasarkan pemeriksaan klinis dan dinyatakan tidak menderita KNF

3.4.3 Kriteria Penolakan Sampel Sampel (Eksklusi)

1. Penderita KNF yang dengan perdarahan











13

Genomic DNA Purification Kit dari Promega), Etanol absolut, Etanol 70 % dan DNA ®

Hydration Solution atau TE (Promega, Wizard Genomic DNA Purification Kit ). ).

Cara kerja: Langkah pertama isolasi DNA adalah sel darah untuk 300 µ l volume sampel adalah pada tabung eppendorf steril 1,5 ml dimasukkan 900 µl Cell Lysis Solution lalu ditambahkan 300 µl darah dari tabung vacutainer dan inkubasi campuran selama 10 menit pada suhu ruangan sambil sesekali tabung di invert . Langkah tersebut bertujuan untuk melisiskan sel sel darah merah dan lekosit dan melarutkan komponen selulernya. Setelah itu dilakukan sentrifugasi pada suhu ruangan dengan kecepatan 13.000 X g selama 20 detik. Kemudian supernatan dibuang tanpa mengganggu pellet putih yang terbentuk di bagian dasar. Tabung selanjutnya divortex selama selama 10-15 detik untuk untuk meresuspensikan meresuspensikan kembali sel darah putih. Tambahkan 300 µl Nuclei Lysis Solution dan dilakukan pipetting sebanyak 5-6 kali untuk melisiskan melisiskan sel darah putih. Jika tumpukan sel darah putih masih masih tampak, maka maka o

inkubasi kembali pada suhu 37 C selama 1 jam. Jika setelah diinkubasi selama 1 jam tumpukan tersebut masih terlihat maka tambahkan Nuclei Lysis Solution dan lakukan inkubasi kembali. Tambahkan Protein Precipitation Solution sebanyak 100 µl pada lisat nukleus dan vortex selama 10-20 detik. Tumpukan kecil protein akan terlihat setelah divortex. Sentrifugasi Sentrifugasi tabung tersebut pada suhu ruangan ruangan dengan kecepatan 13.000 x g











14

3.6.2 Desain Primer yang Spesifik

Gel CYP2E1 yang akan diamplifikasi pada bank gen ( GeneBank National Center for Biotechnology Biotechnology /NCBI) dapat diakses dengan kode aksesNC_00010.9 aksesNC_00010.9 (dapat diakses pada

http://www.ncbi.nlm.nih.gov) Pemilihan primer dengan memperhitungkan syarat suatu primer dengan memperhatikan letak polimorfisme

T7668A pada pada intron 6 yang dapat dikenali dikenali oleh enzim restriksi restriksi

endonuklease DraI (TTT^AAA). Pasangan primer terpilih mempunyai sekuen

5`

TCGTCAGTTCCTGAAAGCAGG 3` sebagai primer upsteam, sedangkan primer downstream

adalah 5’ memiliki sekuen 5’GAGCTCTGATGGAAGTATCGCA3’. Spesufusitas kedua primer

dikonfirmasi

dengan

melakukan

’BLAST’

melalui

wesite

http://www.ncbi.nlm.nih.gov .Hasil konfirmasi menunjukkan kedua primer spesifik untuk amplifikasi gen CYP2E1.

3.6.3 Polymerase Chain Reaction Reaction (PCR)

DNA genom yang diperoleh dari hasil isolasi, dengan menggunakan tehnik PCR, fragmen-fragmen DNA genom yang ingin dianalisa dapat ditingkatkan kuantitasnya dengan cara amplifikasi secara in vitro dalam waktu singkat dengan menggunakan pasangan primer oligonukleotida sintetik yang membatasi daerah yang akan diperbanyak. Pada penelitian ini digunakan sepasang primer oligonukleotida untuk deteksi polimorfisme titik. Komposisi











15

yang berulang sebanyak 30 siklus pada suhu berbeda, yaitu : reaksi denaturasi pada suhu di 0

atas 95 C untuk memisahkan rantai ganda menjadi dua rantai tunggal, reaksi annealing yaitu 0

menyatunya kembali kedua rantai DNA tersebut pada suhu 60 C, dan ekstensi yaitu sintesis DNA melalui perpanjangan suatu primer mengikuti urutan nukleotida DNA rantai tunggal 0

pasangannya yang umumnya berlangsung pada suhu 72 C. Kondisi PCR selengkapnya dapat dilihat pada gambar dan table di bawah ini: Kondisi PCR untuk amplifikasi gen CYP2E1

Tahap Denaturasi Awal

0

95 C (5 menit)

Siklus PCR :

30 siklus 0

-Tahap Denaturasi

95 C (30 detik)

-Tahap Annealing

60 C (30 detik)

-Tahap Ekstensi

72 C (30 detik)

Tahap ekstensi tambahan

72 C (7 menit)

0 0 0











16

TBE buffer. Gel dielektroforesis pada tegangan listrik 110 volt. Selanjutnya dideteksi dengan menggunakan Gel Doc 1000 ( BioRad, USA) untuk divisualisasi dengan sinar ultra violet pada panjang gelombang 300 nm dan direkam.

3.6.5

Deteksi Polimorfisme gen CYP2E1 dengan teknik RFLP

Polimorfisme T7668A ditentukan ditentukan dengan dengan analisis PCR RFLP. RFLP. Hasil alel alel T7668A diperoleh dengan enzim DraI. Sebanyak 1 µL enzim DraI 10 Unit (10 U/µL) ditambahkan ke dalam tabung eppendorf yang berisi 20 µL µ L produk PCR. Selanjutnya divorteks beberapa beberapa detik dan diinkubasi diinkubasi dalam waterbath waterbath pada suhu suhu 39oC selama 3 jam. Setelah digesti digesti oleh DraI, produk PCR dielektroforesis pada 2% agarose gel dan dilihat dengan pewarnaan ethidium bromide.

3.7

Analisis Data

Semua data ditampilkan dalam bentuk tabel frekuensi dan persentase untuk mendeteksi perbedaan satu unit/satuan data yang diperoleh, dilakukan uji dengan uji standar 2

uji X (Chi Kuadrat), kemudian dilakukan analisis hubungan antara alel gen CYP2E1 baik yang polimorfik maupun yang normal ( wild type) baik pada kelompok kasus maupun kontrol 3.8.

Alur Kerja Penelitian Kelompok kasus dengan

Kelompok kontrol tanpa













17

3.10

No

Perincian Waktu Penelitian

Kegiatan Juni

1 2 3 4 5 6

Pemesanan material Pengumpulan sampel Optimasi PCR-RFLP Pengumpulan Data Pengolahan Data Presentasi Hasil

Juli

Agustus

Tahun 2010 Bulan September Oktober

November Desember











18

DAFTAR PUSTAKA 1. Brennan B. Carcinoma nasopharyngeal. Orphanet Journal of Rare Disease [serial 2. 3.

4.

5.

6.

online][cited 2010 March 23] Available from: http://www.OJRD.cm/content/1/1/23 Chan ATC, Teo PML, Johnson PJ. Nasopharyngeal carcinoma. Ann Oncol 2002;13:1007-15. Frank CLU. Basic toxicology: target organs and risk assessment. Hemisphere Publishing Corp 1991: 29, 38, 54, 107-109, 208 Hildesheim A, Chen CJ, Neil EC, Cheng YJ, Robert NH, Hsu M, Paul H, Chen HI, Yang CS, Ann KD, Jeffry ID. Cytochrome P4502E1 genetic polymorphisms and risk of nasopharyngeal carcinoma: Result from a case control study conducted in Taiwan. J Natl Cancer Inst 1995; 4:607-610. Hirvonen A, Pursiainen KH, Anttila S. The human CYP2E1 gene and lung cancer: DraI and RsaI restriction fragment length polymorphisms in a Finish study population. Carcinogenesis 1993; 14:85-88 Huang DP, Ho JHC, Saw D and Teoh TB. Carcinoma of the nasal and paranasal regions in rat fed Cantonese salted marine fish. IARC Sci Pub, 1978. Lyon, France, p











19

17. Sharif R, Ghazali AR, Rajab NF,Haron H, Osman F. Toxicological evaluation of some Malaysian locally processed raw food product. Food and Chem. Toxicol 2008: 46:368-74. 18. Shoterlersuk K, Khorprasert C, Sakdikul S, Pornthanakasem W, Voravud N, Mutirangura. Eppstein Barr Virus DNA in serum/plasma as tumor marker for nasopharyngeal nasopharyngeal cancer. Clin Cancer Res 200; 6:1046-1051 19. Tan EL, Lool LM, Sam CK. Evaluation of plasma EBV DNA as a prognostic marker for nasopharyngeal carcinoma. Singapore Med. J2006; 49:803-7 20. Wills RBH, Silalahi J, and Wooton M. Simultaneous determination of foo-related

amines by high performance liquid chromatography. J Liq Chromatog 1987;10:318391 21. Yin-Chu Chien and Chien-Jen Chen. Epidemiology and etiology of nasopharyngeal carcinoma: gene-environment interaction. Cancer rev 2003; 1:1-19 22. Yu MC, Henderson BE. Nasopharyngeal cancer. In: Schottenfeld D, Fraumeni JF, nd editors. Cancer epidemiology and prevention, 2 ed. New York: Oxford University Press; p. 603-18 23. Yu MC, Huang TB, Henderson BE. Diet and nasopharyngeal carcinoma: A case











20

PUSPA ZULEIKA, dr. SpTHT-KL. M Kes.

Personal Information:

Name

: Puspa Zuleika

Address

: Sawit VIII Block AQ-02, Bukit Sejahtera Residence, Palembang











21

-

Magelang State Junior High School (1)

July 1990 – June 1992

-

Magelang State Elementary School (VII)

July 1984 – June 1990

Relevant Training: -

Participant of Advanced Cardiac Life Support

February 2003

-

Committee of Demo Operasi & Symposium Timpanomastoidektomi Timpanomastoidektomi

March 2004

Committee of Symposium Pengembangan Potensi AnakAnak Tuna Rungu

March 2004

Participant of Symposium Penatalaksanaan Otitis Media Suppurativa Kronik Operatif dan Non Operatif

July 2004

-

-













22

-

-

Course

March 2009

Participant of 5th Jakarta International Functional Endoscopic Sinus Surgery Course and Workshop

March 2009

Paricipant of Training for Tutor Angkatan XI dalam rangka Pelaksanaan Kurikulum Berbasis Kompetensi (KBK) Fakultas Kedokteran Universitas Sriwijaya

March 2009











23

Hospital Yogyakarta, 2003-2004. -

Large otogenic brain abscess with skull erosion: case report.

-

Validitas Pemeriksaan Sitologi Basofil Mukosa Hidung Untuk Membantu Penegakan Diagnosis Rinitis Alergi

Daftar Riwayat Hidup











24

-

2001

Divisi Pemberantasan Narkoba, Forum Studi Islam FKUI, Jakarta

-

2001-2002

Koordinator personalia, Tim Medis segitiga Salemba, Jakarta

Sertifikat-sertifikat Sertifikat-sertifikat : -

2003

Peserta Pertolongan Pertama pada Kegawatan dan kedaruratan, Jakarta

-

2004

Peserta Training For Trainer for P2K2’s Instructor, Jakarta

-

2004

Peserta pendidikan metodologi penelitian FKUI, Jakarta

-

2005

Peserta recent management of ENT Problems, Jakarta

Proposal CYP2E1 Sateks Unsri

Recommend Documents