LAPORAN RESMI PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI “Pewarnaan Spora dan Kapsul Bakteri”
Oleh: Nama : Putu Pradnya Candra Asih NPM : 2013210185 Kelas : A Tanggal Praktikum: Senin, 29 September 2014
FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS PANCASILA JAKARTA 2014
I.
Pendahuluan 1.1 Latar Belakang Bakteri merupakan jasad renik yang memiliki morfologi, struktur, dan sifatsifat yang khas. Bakteri yang hidup hampir tidak berwarna dan kontras dengan air di mana sel-sel bakteri tersebut disuspensikan. Melihat dan mengamati bakteri yang disuspensikan dengan mata telanjang sangatlah sulit. Ukurannya yang kecil, bersifat transparan, dan tidak berwarna mengakibatkan sel bakteri semakin susah untuk diamati. Selain itu, bakteri sulit dilihat dengan cahaya karena tidak mengabsorbsi atau membiaskan cahaya, sehingga digunakan zat warna untuk mewarnai mikroorganisme. Salah satu cara untuk mengamati bentuk sel bakteri patogen sehingga mudah untuk diidentifikasi adalah dengan metode pewarnaan. Pewarnaan spora dan kapsul merupakan salah satu teknik untuk melihat struktur bakteri patogen. Teknik pewarnaan ini disebut teknik pewarnaan diferensial yang digunakan untuk mewarnai bagian sel agar dapat dibedakan dari selnya, seperti pewarnaan flagella, pewarnaan kapsul, pewarnaan sopra, dan pewarnaan inti. Teknik ini maksudkan untuk mengidentifikasi setiap spesies guna membantu diagnosis suatu penyakit oleh bakteri patogen. Prinsip dasar dari pewarnaan adalah ikatan ion antara komponen seluler dari bakteri dengan senyawa aktif dari pewarnaanyang disebut kromogen. Terjadi ikatan ion karena adanya muatan listrik baik pada komponen seluler maupun pada zat pewarna. Berdasarkan adanya muatan ini, maka dapat dibedakan pewarna asam dan pewarna basa. Teknik pewarnaan membutuhkan ketelitian dan kecermatan bekerja serta mengikuti aturan dasar yang berlaku. Dalam praktikum kali ini, dilakukan percobaan pewarnaan mikroorganisme sehingga mempermudah dalam melihat bagian-bagian bakteri. 1.2 Rumusan Masalah 1. Bagaimana cara mengidentifikasi bakteri patogen? 2. Bagaimana letak serta bentuk dari spora dan kapsul pada bakteri setelah dilakukan pewarnaan? 3. Warna apa yang dihasilkan setelah dilakukan pewarnaan pada suspensi bakteri? 1.3 Tujuan 1. Melakukan teknik pewarnaan spora dan teknik pewarnaan kapsul pada bakteri untuk identifikasi. 2. Mengamati dan menganalisis hasil reaksi-reaksi pewarnaan di bawah mikroskop. 1.4 Manfaat 1. Dapat melakukan teknik pewarnaan spora dan teknik pewarnaan kapsul. 2. Dapat membedakan bagian-bagian dari bakteri, berupa kapsul dan spora. 3. Dapat menganalisis hasil reaksi-reaksi pewarnaan di bawah mikroskop.
II.
Tinjauan Pustaka 2.1 Pewarnaan Spora Anggota dari genus Clostridium dan Desulfotomaculum dan genus aerobic Bacillus adalah contoh dari organisme yang mempunyai kemampuan untuk hidup baik secara metabolik sel vegetatif atau sebagai resisten yang tinggi, inaktif metabolik sel disebut spora. Ketika kondisi lingkungan menjadi tidak menguntungkan untuk aktivitas sel, walaupun dengan keadaan sumber nutrisi yang sangat kurang, sel ini memiliki kemampuan untuk mengalami sporogenesis
dan berkembangnya intraseluler yang baru yang dinamakan dengan endospora, yang mana dikelilingi oleh lapisan tahan air yang disebut selubung spora. Dalam kondisi yang terus memburuk, endospora dilepaskan dari sel vegetatif menjadi sel yang berdiri sendiri yang disebut spora. Karena komposisi kimia yang dimiliki lapisan spora, spora dapat tahan terhadap efek merusak dari reagen yang berlebihan serta terhadap pewarnaan bakteri. Dengan kembalinya kondisi lingkungan yang menguntungkan, spora yang bebas dapat kembali menjadi sel vegetatif secara metabolik. Harus ditekankan bahwa sporogenesis bukanlah alat reproduksi, melainkan hanya mekanisme yang menjamin kelangsungan hidup sel di bawah semua kondisi lingkungan. Dalam praktiknya, pewarnaan spora menggunakan dua reagen yang berbeda. Spesies-spesies tertentu bakteri menghasilkan spora, di luar sel vegetatif (eksospora) atau di dalam sel vegetatif (endospora). Ini adalah tubuh yang secara metabolik dorman, dihasilkan pada fase yang lanjut pada pertumbuhan sel dan pada kondisi-kondisi yang sesuai akan berkecambah dan menghasilkan sel-sel yang sama seperti asalnya atau vegetatif. Spora bersifat tahan terhadap bahan fisik dan kimiawi. Endospora hanya terdapat pada bakteri. Merupakan tubuh berdinding tebal, sangat refraktif, dan sangat resisten. Dihasilkan oelh semua spesies bakteri Bacillus , Clostridium, dan Sporosarcina . Bakteri yang mampu membentuk endospora dapat tumbuh dan bereproduksi selama banyak generasi sebagai sel vegetatif. Namun, pada beberapa tahapan di dalam pertumbuhannya, terjadi sintesis protoplasma baru di dalam sitoplasma vegetatifnya yang dimaksudkan untuk menjadi spora. Salah satu ciri unik endospora bakteri ialah susunan kimiawinya. Semua endospora bakteri mengandung sejumlah besar asam dipikoglinat, yaitu substansi yang tidak terdeteksi pada sel-sel vegetatif. Sesungguhnya, asam tersebut merupakan 5 sampai 10 persen berat kering endospora. Sejumlah besar kalsium juga terdapat dalam endospora dan diduga bahwa lapisan korteks terbuat dari kompleks Ca 2+ asam dipikoglinat-peptidoglikan. Diameter spora dapat lebih besar atau lebih kecil dari diameter sel vegetatifnya, karena itu adanya letak serta ukuran endospora sangat bermanfaat di dalam pencirian dan identifikasi bakteri. Spora bakteri adalah bentuk bakteri yang sedang dalam usaha mengamankan diri terhadap pengaruh buruk dari luar. Spora bakteri mempunyai fungsi untuk melindungi diri terhadap faktor luar yang tidak menguntungkan. Dibandingkan dengan sel vegetatifnya, spora sangat resisten terhadap kondisikondisi fisik yang kurang menguntungkan seperti suhu tinggi dan kekeringan serta terhadap bahan-bahan kimia seperti desinfektan. Endospora hanya terdapat pada bakteri, merupakan tubuh dinding yang tebal yang sangat refraktif, dan sangat resisten. Dihasilkan oleh semua spesies basillus, clostidum, dan sporosarcina. Bakteri yang mampu membentuk endospora dapat tumbuh dan bereproduksi selama banyak generasi sehingga sel vegetatif. Namun pada beberapa tahapan di dalam pertumbuhanya, terjadi sintesis protoplasma baru dalam sitoplasma vegetatifnya yang di maksudkan untuk menjadi spora. Bentuk spora ada yang bulat, ada pula yang bulat panjang. Hal ini tergantung oleh spesisesnya endospora ada yang lebih kecil ada pula yang lebih besar dari pada diameter sel induk. Letak sel di dalam sel serta ukurannya dalam pembentukanya tidaklah sama bagai semua spesies. Bentuk, lokasi, dan ukuran relatif spora yang dibentuk terhadap sel induk adalah oval, terminal; rektangular, terminal; rektangular, subterminal; rektangular, sentral; sirkular, terminal; sirkular, sentral; dan bentuk klub, terminal. Pada umumnya sporulasi itu mudah terjadi jika keadaan medium memburuk dan zat-zat yang timbul sebagai zat-zat pertukaran zat bertimbun-timbun. Faktor-faktor luar lainnya merugikan tetapi pada beberapa spesies mampu membentuk spora meskipun tidak terganggu oleh faktor luar. Sporulasi dapat di cegah, jika selalu diadakan pemindahan ke medium yang baru, beberapa spesies bakteri dapat kehilangan kemampuannya untuk membentuk spora-spora
dapat tumbuh lagi menjadi bakteri apabila keadaan di luar menguntungkan. Mula-mula air meresap ke dalam spora, kemudian spora mengembang dan kulit spora menjadi retak karenanya keretakan ini dapat terjadi pada salah satu ujung. Tetapi juga dapat terjadi di tengah-tengah spora. Hal ini merupakan ciri khas bagi beberapa spesies bacillus, jika kulit spora pecah di tengah-tengah, maka masing-masing pecahan merupakan suatu tutup pada kedua ujung bakteri. 2.2 Pewarnaan Kapsul Kapsul adalah lapisan luar yang bersifat seperti gelatin, disekresikan oleh sel. Berfungsi mengelilingi dan melekat pada dinding sel. Kapsul tidak umum untuk semua organisme bakteri. Sel-sel yang memiliki kapsul berat umumnya virulen dan mampu menghasilkan penyakit, karena strukturnya berfungsi melindungi bakteri terhadap aktivitas fagositosis normal sel inang. Ukuran kapsul sangat dipengaruhi oleh medium tempat ditumbuhkannya bakteri itu. Pada beberapa kejadian, tebalnya kapsul jauh lebih besar dari pada selnya. Karena kekentalannya, kapsul tidak akan mudah berdifusi lepas dari sel dan karenanya menyelubungi dinding sel. Bahan lendir yang lebih mudah larut yang diekskresikan oleh sel melebur di dalam medium tempat tumbuhnya organisme tersebut. Produksi tipe-tipe tertentu bahan kapsul dapat sangat menambah kekentalan medium tempat organisme itu dibiakkan. Kapsul bakteri penting artinya baik bagi bakterinya maupun bagi organisme lain. Bagi bakteri, kapsul merupakan penutup lindung dan juga berfungsi sebagai gudang cadangan makanan. Kapsul bakteri-bakteri penyebab penyakit tertentu menambah kemampuan bakteri tersebut untuk menginfeksi. Bila bakteri itu kehilangan kapsulnya sama sekali, maka bakteri tersebut dapat kehilangan virulensinya dan dengan demikian kehilangan kemampuannya sebagai penyebab infeksi. Bahan kimia kapsul yang utama terdiri dari polisakarida kompleks seperti levans, dekstran, dan selulosa. Pewarnaan kapsul lebih sulit daripada jenis lain dari prosedur pewarnaan diferensial karena bahan kapsul yang larut dalam air dan dapat lepas dan dihapus dengan pencucian kuat. Pewarnaan tidak boleh dipanaskan karena penyusutan sel yang dihasilkan dapat menciptakan zona bening di sekitar organisme yang merupakan artefak dan dapat salah untuk proses pewarnaan kapsul. Pewarnaan kapsul menggunakan dua reagen. Pewarnaan kapsul bertujuan untuk membedakan kapsul dari sel bakteri. Pewarnaan kapsul disebut juga pewarnaan negatif, karena materi yang akan dilihat (kapsul) tidak diwarnai, yang diwarnai adalah daerah latar belakang dan badan sel bakterinya. Kapsul tidak dapat diwarnai dengan pewarna asam maupun basa karena kapsul adalah materi yang tidak memiliki muatan. Sebelum dilakukan pewarnaan dan diamati, sel bakteri harus difiksasi dulu pada object glass. Fiksasi bertujuan untuk menginaktivasi enzim yang mungkin dapat merusak morfologi atruktur sel sehingga sel tidak berubah saat diwarnai dan diamati. III.
Metodologi Sebelum melakukan teknik pewarnaan sporan dan bakteri, disiapkan alat-alat berupa object glass bersih, tabung reaksi bersih, sengkelit/jarum Ose, pembakar spiritus, pipet tetes bersih, penjepit kayu, mikroskop, kertas saring, dan kertas lensa. Disiapkan juga bahan-bahan yang meliputi kultur/biakan Bacillus subtilis , Klebsiella pneumoniae berumur 3 hari dalam media Nutirent Agar miring, minyak inersi, dan xylol. Bahan berupa pereaksi dan zat warna yang terdiri dari gentian violet, karbol Fuchsin, NaCl 0,9% (NaCl fisiologis), methylen blue, tinta Cina, H 2SO4 1%. 3.1 Pewarnaan Spora Sebelum masuk ke Laboratorium Mikrobiologi praktikan memakai jas laboratorium yang bersih lengkap dengan masker, penutup kepala, dan sarung
tangan, kemudian mensterilkan diri sendiri sebelum memulai pekerjaan dengan cara mencuci tangan dengan sabun di wastafel, lalu tangan dibersihkan lagi dengan alkohol 70%. Bersihkan pula meja laboratorium dengan alkohol 70% dan diletakkan 2 lampu spiritus yang telah diberi jarak sekitar 20 cm. Pengerjaan dilakukan di antara 2 lampu spiritus agar dicapai media yang steril. Teknik pengerjaan ini disebut teknik aseptis. Disiapkan alat-alat berupa tabung reaksi bersih, object glass, mikroskop, lampu spiritus, dan kertas saring serta bahan-bahan yang berupa kultur bakteri dari Nutrient Agar miring, NaCl 0,9%, karbol Fuchsin, H2SO4 1%, dan methylen blue. Dibuat suspensi bakteri pekat dalam 0,5 mL NaCl 0,9% dalam tabung reaksi bersih kemudian ditambahkan karbol Fuchsin (pewarna primer) sama banyaknya dengan NaCl tadi (0,5 mL). Dipanaskan suspensi tersebut di atas api kecil selama 6 menit atau di dalam water bath 80° selama10 menit. Setelah dilakukan pemanasan terhadap suspensi, dibuat preparat dari suspensi tersebut di atas object glass, dikeringkan dan difiksasi (direkatkan). Direndam suspensi yang telah difiksasi dengan H 2SO4 1% untuk membuang kelebihan zat warna yang berlebihan selama 1-3 detik. Dibilas air kran sebagai decolorizing agent dengan melewatkan air kran tersebut di ibu jari atau telunjuk agar bakteri yang telah direkatkan tidak hilang saat pencucian. Preparat bakteri yang telah dibilas dituangi dengan methylen blue dan didiamkan selama 2-4 menit. Dibuang zat warna dengan dibilas air kran. Dikeringkan dengan kertas saring atau didiamkan di udara. Diamati hasil pewarnaan di bawah mikroskop. 3.2 Pewarnaan Kapsul Disiapkan alat-alat berupa object glass, mikroskop, lampu spiritus, dan kertas saring serta bahan-bahan yang berupa kultur bakteri dari Nutrient Agar miring, NaCl 0,9%, tinta Cina, dan karbol Fuchsin. Langkah awal diteteskan NaCl 0,9% di atas alas object glass, kemudian ditanamkan 1 mata sengkelit atau secukupnya biakan bakteri. Diletakkan di sebelah campuran tadi satu tetes tinta Cina, dicampurkan tinta Cina dengan bakteri dengan cara menghapuskannya dengan alat object glass lain seperti membuat preparat rekatan darah. Dikeringkan preparat yang telah dihapuskan dengan cara difiksasi. Dituangi karbol Fuchsin dan didiamkan selama 5-10 menit. Zat warna yang berlebih dibuang dan dibilas dengan air kran. Dikeringkan preparat di antara kertas saring atau di udara dan diamati hasil pewarnaan. IV.
Hasil Praktikum dan Pembahasan Jenis Pewarnaan
Spora
Kapsul
Gambar
Keterangan Nama bakteri: Bacillus subtilis Bentuk: Basil/batang Warna sel bakteri: Ungu Warna dan bentuk spora: merah oval Letak spora: Terminal Nama bakteri: Klebsiella pneumoniae Bentuk dam warna sel: Basil dan merah Warna latar belakang: Hitam Bentuk dan warna selubung: Basil dan tidak berwarna Zat warna: Karbol Fuchsin, tinta Cina
1. Pada bakteri Bacillus subtilis spora yang terbentuk dengan hasil pewarnaan akan berwarna merah dan bakterinya sendiri akan berwarna biru/ungu. 2. Bentuk spora pada bakteri Bacillus subtilis adalah oval dengan letak terminal terhadap sel induk. 3. Pada bakteri Bacillus subtilis spora tersebut merupakan alat untuk mempertahankan hidup, di mana spora akan muncul jika bakteri merasa kurang mendapat nutrisi, suhu yang tidak mendukung pertumbuhannya, dan karena adanya senyawa kimia yang mengancam kehidupannya. 4. Jenis spora yang diamati pada praktikum kali ini adalah endospora. 5. Pada bakteri Klebsiella pneumoniae kapsul yang terbentuk terlihat menyelubungi badan sel bakteri. Berupa suatu bagian yang tidak berwarna dengan latar belakang hitam. 6. Bentuk kapsul yang terlihat pada Klebsiella pneumoniae adalah oval dan tidak berwarna. 7. Pewarnaan kapsul disebut juga sebagai pewarnaan negatif, karena materi yang akan dilihat (kapsul) itu sendiri tidak diwarnai, yang diwarnai adalah daerah latar belakang dan badan sel bakterinya. 8. Kapsul tidak dapat diberi zat warna dengan pewarna asam maupun pewarna basa karena kapsul adalah materi yang tidak memiliki muatan (muatan positif atau muatan negatif). 9. Kapsul dan spora umumnya ditemukan pada bakteri yang memiliki patogenitas tinggi, di mana kapsul dan spora akan melindungi sel bakteri dari mekanisme fagositosis sel inang dan digunakan juga sebagai gudang makanan cadangan. 10. Bila bakteri kehilangan kapsul, maka ia dapat kehilangan virulensinya dan dengan demikian kehilangan kemampuannya menyebabkan infeksi. 11. Kapsul berupa lapisan lendir yang menyelubungi dinding sel dan bila ditemukan di dalam makanan, maka makanan tersebut akan menjadi berlendir. V.
Kesimpulan 1. Cara menidentifikasi bakteri patogen salah satunya dengan pewarnaan bakteri diferensial, yaitu pewarnaan spora dan pewarnaan bakteri. 2. Letak spora saat dilakukan pewarnaan adalah terminal terhadap sel bakteri, sedangkan bentuk kapsul saat dilakukan pewarnaan adalah lonjong dan tak berwarna. 3. Warna yang dihasilkan spora setelah dilakukan teknik pewarnaan adalah berwarna merah, dan kapsul tidak berwarna.
VI.
Daftar Pustaka 1. Cappuccino, James dan Natalie Sherman. -. Microbiology a Laboratory Manual Eight Edition. Pearson Benjamin Cummings. New York. hal. 2. Pelczar, Michael J. 1988. Dasar-dasar Mikrobiologi. Universitas Indonesia Press. Jakarta. hal. 112-113 dan hal. 123-128
VII.
Lampiran
Pewarnaan Kapsul ( Klebsiella pneumoniae)
Pewarnaan Spora ( Bacillus subtilis )
