A. Topik : Pewarnaan bakteri secara Gram.
B. Tujuan :
1. Memperoleh keterampilan pewarnaan sel bakteri secara Gram. 2. Untuk menentukan sifat Gram dari bakteri yang diperiksa.
C. Tanggal : Praktikum dilakukan pada tanggal 8 September 2014
D. Dasar Teori
Bakteri merupakan organisme prokariot yang umumnya berukuran sangat kecil. Bentuk tubuh bakteri baru dapat dilihat dengan menggunakan mikroskop dengan pembesaran 1.000 X atau lebih (Waluyo, 2008). Sel sel individu bakteri dapat berbentuk seperti bola/elips, batang (silindris), atau spiral (heliks) (Pelczar & Chan, 2008). Pada umumnya bakteri bersifat tembus cahaya, hal ini disebabkan karena banyak bakteri yang tidak mempunyai zat warna (Waluyo, 2008). Pewarnaan bakteri bertujuan untuk memudahkan melihat bakteri dengan mikroskop, memperjelas ukuran dan bentuk bakteri, untuk melihat struktur luar dan struktur dalam bakteri seperti dinding sel dan vakuola, menghasilkan sifat-sifat fisik dan kimia yang khas daripada bakteri dengan zat warna, serta meningkatkan kontras mikroorganisme dengan sekitarnya (Waluyo, 2008). Teknik pewarnaan sel bakteri ini merupakan salah satu cara yang paling
utama
dalam
penelitian
-
penelitian
mikrobiologi
(Dwijoseputro,2005). Teknik pewarnaan warna pada bakteri dapat dibedakan menjadi tiga macam yaitu pengecatan sederhana, pengecatan diferensial dan pengecatan struktural. Pewarnaan Gram adalah salah satu teknik pewarnaan diferensial yang paling penting dan paling luas digunakan untuk bakteri. Larutan yang digunakan dalam pewarnaan Gram ini antara lain : kristal violet, iodine, alkohol, serta safranin. Bakteri yang diwarnai dengan metode Gram ini dibagi menjadi dua kelompok, salah satu diantaranya bakteri Gram positif dan bakteri Gram negatif (Pelczar & Chan, 2008).
Metode pengecatan Gram pertama kali ditemukan oleh seorang ahli bioteknologi dari Denmark yang bernama Christian Gram pada tahun 1884. Menemukan metode pewarnaan secara tidak sengaja. Dengan metode ini. Bakteri dapat dikelompokkan menjadi dua yatu, bakteri Gram positif dan bakteri Gram negative. Yang didasarkan dari reaksi atau sifat bakteri terhadap cat tersebut. Reaksi atau sifat bakteri tersebut ditentukan oleh komposisi dinding selnya sehingga pengecatan Gram tidak bisa dilakukan pada mikroorganisme yang tidak mempunyai dinding sel (Lay, 1994). Pengecatan Gram dilakukan dalam 4 tahap, yaitu pemberian cat warna utama (cairan Kristal violet) berwarna ungu, pengintensifan cat warna dengan penambahan larutan mordan, pencucian (dekolarisasi) dengan larutan alcohol asam, dan pemberian cat lawan yaitu cat warna safranin. Menurut Hadioetomo (1988), diketahui bahwa komposisi dinding sel bakteri Gram positif berbeda dengan bakteri Gram negatif. Perbedaan struktur dinding sel bakteri Gram positif dan Gram negatif ini menyebabkan perbedaan reaksi dalam permeabilitas zat warna. Sebagian besar dinding sel
bakteri Gram positif terdiri dari peptidoglikan,
sedangkan dinding sel bakteri Gram negatif mempunyai kandungan lipid yang tinggi dibandingkan dinding sel bakteri Gram positif (Lay,1994).
E. Alat dan Bahan 1. Alat
-
Mikroskop
-
Kaca benda
-
Mangkuk pewarna
-
Kawat penyangga
-
Pipet
-
Pinset
-
Lampu spiritus
-
Botol penyemprot
-
Jarum inokulasi lurus (needle)
-
Jarum inokulasi kolong (ose)
2. Bahan
-
Aquades steril
-
Biakan murni bakteri umur 1x24 jam
-
Larutan Ammonium Oksalat Kristal Violet
-
Kertas penghisap atau tisua
-
Korek api
-
Alkohol 95%
-
Larutan Safranin
-
Larutan iodium
-
Air kran
F. Prosedur Kerja
Disediakan kaca benda yang bersih, lalu dilewatkan di atas nyala api spiritus.
Diteteskan setetes aquades steril di atas kaca benda tersebut.
Secara aseptik diambil inokulum bakteri yang akan diperiksa, lalu diletakkan di atas tetesan aquades itu. Kemudian diratakan perlahan-lahan dan ditunggu sampai mengering.
Dilakukan fiksasi dengan cara sediaan dilewatkan diatas nyala api lampu spiritus dengan cepat.
Diletakkan sediaan di atas kawat penyangga yang berada di atas mangkuk pewarna, lalu larutan ammonium oksalat krisztal violet diteteskan di atas sediaan tersebut. Ditunggu selama 1 menit.
Kelebihan zat warna dibuang ke dalam mangkuk dan sediaan dibilas dengan air kran.
Larutan iodium diteteskan di atas sediaan, lalu ditunggu selama 2 menit.
Kelebihan larutan iodium dibuang ke dalam mangkuk dan sediaan dibilas dengan air kran.
Larutan alkohol 95% diteteskan di atas sediaan, lalu dibiarkan selama 1 menit.
Sisa alkohol dibuang ke dalam mangkuk dan sediaan dibilas dengan air kran.
Larutan safranin diteteskan di atas sediaan, lalu dibiarkan selama 30 detik.
Kelebihan larutan safranin dibuang ke dalam mangkuk, lalu dibilas dengan air kran.
Sediaan dikeringkan dengan hati-hati dengan kertas penghisap atau tisu, lalu diperiksa dibawah mikroskop.
G. Data Hasil Pengamatan
Pewarnaan Bakteri Secara Gram No.
Bentuk Sel
Warna Sel
Sifat Gram
1.
Basil
Merah
Negatif
2.
Basil
Ungu
Positif
H. Analisa Data
Berdasarkan praktikum yang telah dilakukan, maka diperoleh data hasil pengamatan pewarnaan bakteri secara Gram. Pada pengamatan bakteri secara Gram ini menggunakan dua jenis bakteri berbeda yang diperoleh dari dua tempat berbeda. Bakteri A didapat dari foodcourt
Matos, sedangkan bakteri B diperoleh dari blower Matos. Setelah dilakukan praktikum, diperoleh hasil bahwa bakteri A setelah diwarnai secara Gram berwarna merah dan setelah diamati dibawah mikroskop bakteri A berbentuk basil. Dari hasil pewarnaan Gram tersebut, menandakan bahwa bakteri A bersifat Gram negatif. Berbeda dengan bakteri B, setelah diwarnai secara Gram berwarna ungu dan setelah diamati dibawah mikroskop bakteri B berbentuk basil. Dari hasil pewarnaan Gram tersebut, menandakan bahwa bakteri B bersifat Gram positif.
I. Pembahasan
Pada praktikum pewarnaan bakteri secara Gram ini digunakan dua jenis bakteri berbeda, yaitu bakteri A yang diambil dari foodcourt Matos dan bakteri B yang diambil dari blower Matos. Hal ini dikarenakan agar didapatkan data pembanding antar bakteri, sehingga diharapkan hasil yang diperoleh juga akan berbeda sehingga mahasiswa dapat membedakan jenis bakteri dari dua tempat yang berbeda tersebut. Penggunaan pewarnaan secara Gram ini dikarenakan proses pewarnaan ini termasuk proses pewarnaan bakteri secara sederhana yang dapat dilakukan dengan cukup mudah oleh mahasiswa. Pada proses pewarnaan bakteri secara Gram ini digunakan inokulum bakteri berumur 1x24 jam. Hal ini dikarenakan biakan bakteri berumur 1x24 masih merupakan biakan yang segar dan akan didapatkan hasil pewarnaan yang baik. Hal ini sesuai dengan sumber yang menyatakan bahwa pewarnaan Gram memberikan hasil yang baik bila digunakan biakan segar yang berumur 24-48 jam. Bila digunakan biakan tua, terdapat kemungkinan penyimpanan hasil pewarnaan Gram karena banyak sel mengalami kerusakan pada dinding-dinding selnya. Kerusakan pada dinding sel ini menyebabkan zat warna dapat keluar sewaktu dicuci dengan lartan pemucat. Ini berarti bahwa bakteri Gram positif dengan dinding sel yang rusak tidak lagi dapat memertahankan crystal violet sehingga terlihat sebagai bakteri Gram negatif (Lay,1994).
Hasil praktikum menunjukkan bahwa bakteri A dan B setelah diamati di bawah mikroskop dengan perbesaran 1000x menunjukkan bahwa bentuk keduanya adalah basil atau batang. Namun secara pewarnaan, jenis dari kedua bakteri tersebut berbeda. Bakteri A setelah pewarnaan secara Gram menunjukkan berjenis Gram negatif karena warna bakteri adalah merah pada akhir pewarnaan dan bakteri B berjenis Gram positif karena pada akhir pewarnaan secara Gram menujukkan warna ungu. Maka dapat dikatakan bahwa dinding sel bakteri A diketahui mengandung banyak lemak, sedangkan dinding sel bakteri B mengandung banyak lipoprotein. Hal ini sesuai dengan pernyataan Lay (1994) yang menyatakan bahwa sebagian besar dinding sel bakteri Gram positif terdiri dari
peptidoglikan, sedangkan
dinding sel
bakteri
Gram
negatif
mempunyai kandungan lipid yang tinggi dibandingkan dinding sel bakteri Gram positif. Proses pewarnaan Gram ini memerlukan 4 jenis reagen, yaitu amonium oksalat kristal violet, iodine, alkohol, serta safranin. Bakteri terbagi atas dua kelompok berdasarkan pewarnaan ini, yaitu bakteri Gram positif dan bakteri Gram negatif. Perbedaan ini berdasarkan warna yang dapat dipertahankan bakteri. Reagen pertama amonium kristal oksalat atau disebut warna dasar (berupa pewarna basa), jadi pewarna ini akan mewarnai dengan jelas bakteri A dan B menjadi berwarna ungu. Selanjutnya yaitu pemberian iodine yang merupakan pewarna Mordan, yaitu pewarna yang berfungsi memfiksasi pewarna primer yang diserap mikroorganisme target atau mengintensifkan warna utama. Pemberian iodine pada pengecatan Gram dimaksudkan untuk memperkuat pengikatan warna oleh bakteri. Reagen ketiga disebut bahan pencuci warna (decolorizing agent ) yaitu alkohol 95%. Tercuci tidaknya warna dasar tergantung pada komposisi dinding sel, bila komponen dinding sel kuat mengikat warna, maka warna tidak akan tercuci sedangkan bila komponen dinding sel tidak kuat mengikat warna dasar, maka warna akan tercuci. Pada bakteri A, karena dinding selnya mengandung banyak lipid, maka lipid akan larut
dengan alkohol sehingga zat warna ungu akan larut. Sesuai dengan sumber yang menyatakan bahwa pada bakteri Gram negatif lipid terekstraksi dari dinding sel, pori-pori mengembang, kompleks ungu kristal iodium keluar dari sel, sel menjadi tidak berwarna (Pelczar, 2008). Berbeda dengan bakteri B, karena dinding sel bakteri B banyak mengandung lipoprotein, maka zat warna ungu tetap bertahan pada sel, hal ini dikarenakan menurut Pelczar (2008), pada bakteri Gram positif dinding sel mengalami dehidrasi, pori-pori menciut, daya rembes dinding sel dan membran menurun, ungu kristal iodium tak dapat keluar dari sel, sehingga sel tetap ungu. Reagen terakhir adalah safranin. Safranin akan mewarnai kembali sel yang telah kehilangan pewarna setelah perlakuan dengan alkohol. Pada bakteri A yang merupakan Gram negatif, setelah perlakuan dengan alkohol, sel menjadi tidak berwarna sehingga ketika diberikan safranin, maka sel akan terwarnai menjadi merah. Sedangkan pada bakteri B, karena bersifat Gram positif ditunjukkan dengan warna safranin tidak dapat masuk ke dalam sel sehingga akan tetap berwarna ungu. Praktikum ini juga dilakukan fiksasi sebelum pemberian amonium oksalat kristal violet. Fiksasi dilakukan dengan cara sediaan dilewatkan diatas nyala api lampu spiritus dengan cepat. Teknik fiksasi ini bertujuan agar bakteri yang akan diteliti mati sesuai dengan sumber yang menyatakan bahwa fiksasi bertujuan untuk mematikan bakteri dan melekatkan sel bakteri pada objek glass tanpa merusak struktur selnya (Lay,1994).
J. Diskusi
Mengapa terjadi perbedaan reaksi dan hasil pewarnaan antara bakteri Gram positif dan Gram negatif? Jelaskan proses kimiawi yang terjadi dalam proses pewarnaan Gram! Jawaban: Bakteri gram positif memiliki selapis dinding sel berupa
peptidoglikan yang tebal. Setelah pewarnaan dengan kristal violet, pori pori dinding sel menyempit akibat dekolorisasi oleh alkohol sehingga
dinding sel tetap menahan warna biru. Sel bakteri gram positif akan tampak merah jika waktu dekolorisasi terlalu lama. Sedangkan bakteri gram negatif akan tampak ungu bila waktu dekolorisasi terlalu pendek. Bakteri gram positif akan mempertahankan zat warna metil ungu gelap setelah dicuci dengan alkohol, sementara bakteri gram negatif tidak. Pemberian kristal violet pada bakteri gram positif akan meninggalkan warna ungu muda. Perbedaan respon terhadap mekanisme pewarnaan gram pada bakteri adalah didasarkan pada struktur dan komposisi dinding sel bakteri. Bakteri gram positif mengandung protein dan gram negatif mengandung lemak dalam persentasi lebih tinggi dan dinding selnya tipis. Pemberian
alkohol
(etanol)
pada
praktikum
pewarnaan
bakteri,
menyebabkan terekstraksi lipid sehingga memperbesar permeabilitas dinding sel. Pewarnaan safranin masuk ke dalam sel dan menyebabkan sel menjadi berwarna merah pada bakteri gram negatif sedangkan pada bakteri gram positif dinding selnya terdehidrasi dengan perlakuan alkohol, pori – pori mengkerut, daya rembes dinding sel dan membran menurun sehingga pewarna safranin tidak dapat masuk sehingga sel berwarna ungu.
K. Kesimpulan
Dari hasil pengamatan, maka diperoleh kesimpulan sebagai berikut: 1. Bakteri A bersifat Gram negatif dan berbentuk basil . 2. Bakteri B bersifat Gram positif dan berbentuk basil.
L. Daftar Rujukan
Dwidjoseputro, D. 2005. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Jakarta: Djambatan. Hadioetomo. 1988. Mikrobiologi Dasar Dalam Praktek . Jakarta: PT Gramedia Lay dan Hartono.1994. Mikrobiologi. Jakarta: Rajawali Pers. Pelczar, Michael J. & Chan, E. C. S. 2008. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Jakarta: UI Press. Waluyo. 2008. Mikrobiologi Umum. Malang: UMM Press.
