Manual de Electroforesis de Proteinas

CYAN MAGENTA AMARILLO NEGRO

MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE ELECTROFORESIS PARA PROTEÍNAS Y ADN


Serie de Normas Técnicas N° 38 Serie de Normas Técnicas N° 39

Lima - 2003

CYAN MAGENTA AMARILLO NEGRO


Serie de Normas Técnicas N° 38 Lima - 2003

MINISTERIO DE SALUD

Subcomité Editor

Ministro Dr. Álvaro Vidal Rivadeneyra

Presidente Dra. Aída Palacios Ramírez

Viceministro Econ. Carlos Rodríguez Cervantes Secretario técnico Dr. César Cabezas Sánchez INSTITUTO NACIONAL DE SALUD Jefe Dr. Luis Fernando Llanos Zavalaga

Miembros Q.F. Zulema Arévalo Chong Dr. Jorge Barnaby Rodríguez Dr. Zuño Burstein Alva Lic. Iván Gómez-Sánchez Prieto Dr. Alfredo Guillén Oneeglio Dr. César Náquira Velarde Q.F Rosa Mendoza Yanavilca Dra. Frine Samalvides Cuba Dr. Víctor Suárez Moreno

Subjefe Dra. Aída Cecilia Palacios Ramírez Centro Nacional de Salud Pública Dra. Susana Zurita Macalupú Directora General Centro Nacional de Alimentación y Nutrición Dr. Napoleón Chávez Villanueva Director General Centro Nacional de Control de Calidad Dra. Rosa Guevara Ormeño Directora General

Editor Dr. Leonid Lecca García

Centro Nacional de Productos Biológicos Q.F. Ricardo Valera Sánchez Director General

Asistente Editorial Lic. Daniel Cárdenas Rojas

Secretaria Srta. Rocío Solís Agurto

Centro Nacional de Salud Intercultural Dr. Carlos del Águila Campos Director General

Centro Nacional de Salud Ocupacional y Protección del Ambiente Para la Salud Dr. Enrique P. Swayne Díaz Director General

Revista Peruana de Medicina Experimental y Salud Pública Volumen 19 Número 4 octubre – diciembre 2002 La Revista Peruana de Medicina Experimental y Salud Pública es una publicación trimestral del Instituto Nacional de Salud que estimula la divulgación de trabajos teóricos o aportes prácticos desarrollados por técnicos y científicos, promueve el avance y la aplicación de la investigación y experiencia científica en salud Los artículos firmados no expresan necesariamente la opinión de la revista, siendo los autores responsables de los criterios por ellos emitidos. Todos lo derechos quedan reservados por el Instituto Nacional de Salud. Cualquier publicación, difusión y/o distribución de la información presentada queda autorizada siempre que se cite la fuente de origen. Copyright octubre – diciembre 2002 INS-PERÚ Carátula: Frontis del local central del Instituto Nacional de Salud

ARTES & DISEÑOS LASER S.R.LTDA. Calle Las Turquesas 263-265-269 - Balconcillo - Lima 13 Teléfono: 265-8320 Telefax: 266-0075 e-mail: [email protected]

MPR-CNSP-016

1726-4634 Versión impresa

Depósito Legal 2000-2856

Dirección: Instituto Nacional de Salud Cápac Yupanqui 1400. Lima 11, Perú. Telf.: (051-1)471-9920 Anexo 162 E-mail: [email protected] Página web: www.ins.gob.pe Editor: Dr. Leonid Lecca García E-mail: [email protected]

Instituto Nacional de Salud

Manual de procedimientos de electroforesis para proteínas y ADN


ELABORACIÓN: Blgo. Carlos Augusto Yábar Varas División de Biología Molecular Centro Nacional de Salud Pública Instituto Nacional de Salud Lima-Perú

MPR-CNSP-016

I



AGRADECIMIENTO: Blgo. Roger Calderón Espinoza Blgo. Carlos Padilla Rojas Blgo. Christian Baldeviano Vidalón Blgo. Omar Cáceres Rey Blga. Gisely Hijar Guerra Blga. Elizabeth Sánchez Romaní División de Biología Molecular Centro Nacional de Salud Pública Instituto Nacional de Salud

Catalogación hecha por el Centro de Documentación e Información del INS Yábar Varas, Carlos. Manual de procedimientos de electroforesis para proteínas y ADN / Elaborado por Carlos Yábar Varas. — Lima : Ministerio de Salud, Instituto Nacional de Salud, 2003. 59 p. : 30 cm. — (Serie de Normas Técnicas; 38)

1. PROTEINAS /aislamiento y purificación 2. ADN /aislamiento y purificación 3. ELECTROFORESIS I. Yábar Varas, Carlos II. Instituto Nacional de Salud (Perú) III. Perú. Ministerio de Salud

ISBN 9972 – 857 – 26 – 3 (O.C.) ISBN 9972 – 857 – 38 – 7 (N°38) ISSN 1607 – 4904 Hecho el Depósito Legal Nº 1501152003-4205 ©Ministerio de Salud, 2003 Av. Salaverry cuadra 8 s/n, Jesús María, Lima, Perú Telf.: 431-0410 ©Instituto Nacional de Salud, 2003 Cápac Yupanqui 1400, Jesús María, Lima, Perú Telf.: 471-9920 Fax 471-0179 e-mail: [email protected] Página Web: www.ins.gob.pe Publicación aprobada con R.J. Nº 460-2003-J-OPD/INS Se autoriza su reproducción total o parcial siempre y cuando se cite la fuente.

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II



CONTENIDO INTRODUCCIÓN SECCIÓN 1: 1.1 1.2 1.3

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GENERALIDADES Objetivo Campo de aplicación Abreviaturas y definiciones ○

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SECCIÓN 7: VERIFICACIÓN DE LA CALIDAD ÓPTIMA DE LOS EQUIPOS Y REACTIVOS EMPLEADOS 7.1 Generalidades 7.2 Buffer para electroforesis de proteínas y ADN 7.3 Persulfato de amonio ○

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VARIANTES DE ELECTROFORESIS Electroforesis bidimensional Electroforesis de capilaridad Electroforesis en campo pulsado (PFEG)

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SECCIÓN 6: 6.1 6.2 6.3

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5.7 5.8

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PROCEDIMIENTOS PARA LA ELECTROFORESIS DE ADN Objetivo general Electroforesis vertical Electroforesis de ADN en geles de poliacrilamida Preparación de geles de agarosa para ADN Electroforesis de ADN Coloración y visualización de ADN en geles de poliacrilamida y agarosa usando bromuro de etidio Coloración y visualización de ADN en geles de poliacrilamida con nitrato de plata Factores que afectan la migración del ADN

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V

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SECCIÓN 5: 5.1 5.2 5.3 5.4 5.5 5.6

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PROCEDIMIENTOS PARA LA ELECTROFORESIS DE PROTEÍNAS Objetivo Materiales Ensamblaje de la cámara de electroforesis Preparación de geles de poliacrilamida Preparación del gel de resolución Preparación del gel de empacamiento Preparación de la muestra biológica Electroforesis Coloración y visualización de las proteínas usando azul brillante de coomasie Interpretación de resultados Factores que afectan la migración de las proteínas ○

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SECCIÓN 4: 4.1 4.2 4.3 4.4 4.5 4.6 4.7 4.8 4.9 4.10 4.11

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SECCIÓN 3: MANEJO DE MUESTRAS Y REACTIVOS EN BIOLOGÍA MOLECULAR

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SECCIÓN 2: MEDIDAS DE BIOSEGURIDAD

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21 21 21 22 25 27 28 30 32 35 35 35 36

37 37 37 37



7.4 7.5 7.6 7.7 7.8

Bromuro de etidio Agarosa Poliacrilamida al 30% Agua destilada Equipos de laboratorio ○

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ANEXOS

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ANEXO A:

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SECCIÓN 8: REGISTROS Y ARCHIVOS BIBLIOGRAFÍA

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UNIDADES Y FÓRMULAS

ANEXO C:

MEDIDAS A TOMARSE EN CASO DE CONTACTO ACCIDENTAL CON REACTIVOS TÓXICOS ○

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EJERCICIOS RESUELTOS PARA LA PREPARACIÓN DE SOLUCIONES

ANEXO F:

PÁGINAS WEB RECOMENDADAS

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ANEXO E:

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PROBLEMAS MÁS COMUNES DURANTE LOS PROCEDIMIENTOS DE ELECTROFORESIS

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ANEXO B:

MPR-CNSP-016

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PREPARACIÓN DE SOLUCIONES PARA ELECTROFORESIS DE PROTEÍNAS Y ELECTROFORESIS DE ADN ○

ANEXO D:

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INTRODUCCIÓN La electroforesis constituye parte importante del procedimiento rutinario del análisis de los ácidos nucleicos y proteínas. Y así como el microscopio permite visualizar microorganismos y estructuras similares, la electroforesis nos ayuda a observar los ácidos nucleicos y proteínas al final del procedimiento. El principio básico de la electroforesis consiste en la migración de las moléculas a través de un gel u otro tipo de matriz de naturaleza porosa, en el cual, por acción de un campo eléctrico, serán separadas de acuerdo a su tamaño o peso molecular. Para controlar el avance de la separación de las moléculas en la matriz y establecer un patrón de fragmentos, las moléculas deberán ser teñidas con diferentes colorantes. Estos pasos facilitan la visualización de las moléculas a manera de simples bandas las cuales serán posteriormente analizadas e interpretadas. En biología molecular, la mayoría de los estudios básicos y aplicados requieren el uso de la electroforesis; sin embargo, este procedimiento presenta variaciones de acuerdo al tipo de estudio que se piensa ejecutar. En la electroforesis de tipo vertical, se analizan tanto moléculas de ADN como proteínas, mientras que en la electroforesis horizontal generalmente se trabaja con ADN o ARN. De otro lado, existen otros métodos electroforéticos que presentan ciertas modificaciones, así tenemos la electroforesis en campo pulsado, mayormente usada para separar fragmentos muy grandes de ADN (ADN genómico), la electroforesis bidimensional para un análisis más sofisticado de las proteínas etc. Es importante señalar que la electroforesis en asociación con otras técnicas tales como PCR, e hibridación, brinda una gran ayuda en el campo de la salud. Gracias a esta técnica es posible visualizar las bandas de ARN o ADN de patógenos, detectar cambios o mutaciones a nivel genético, visualizar una nueva proteína, entre otros. El presente manual de procedimientos es la recopilación de protocolos actualizados por los investigadores de la División de Biología Molecular del Instituto Nacional de Salud. En este material se incluye, además de los procedimientos técnicos de la electroforesis, un anexo indicando el modo de preparación de soluciones de electroforesis, unidades y fórmulas básicas a ser aplicadas y algunas importantes medidas de bioseguridad que deben considerarse durante la manipulación de los reactivos.

MPR-CNSP-016

V



SECCIÓN 1 GENERALIDADES 1.1

OBJETIVO Establecer los procedimientos de la técnica de electroforesis de ADN y proteínas para ser difundidas en la red de laboratorios.

1.2

CAMPO DE APLICACIÓN Laboratorios de nivel de bioseguridad II que realicen análisis y determinación de ADN y proteínas en general.

1.3

ABREVIATURAS Y DEFINICIONES

1.3.1

ADN: ácido desoxirribonucleico.

1.3.2

ARN: ácido ribonucleico.

1.3.3

kDa: kilodaltons.

1.3.4

nM: nanomolar.

1.3.5

OD: densidad óptica.

1.3.6

pb: pares de bases.

1.3.7

PCR: reacción en cadena de polimerasa (Polimerase chain reaction).

1.3.8

pg: picogramo.

1.3.9

rpm: revoluciones por minuto.

1.3.10

µL: microlitro.

1.3.11

µM: micromolar.

1.3.12

ácido desoxirribonucleico: molécula compuesta de un anillo de desoxiribosa, una base nitrogenada y un grupo fosfato que en su conjunto forman una estructura de doble hebra tipo helicoidal. Constituye el material genético de todo tipo de células y virus de ADN, y tiene como función transmitir la información genética de una generación a otra.

1.3.13

ácido ribonucleico: molécula compuesta de un anillo de ribosa, una base nitrogenada y un grupo fosfato. Presenta un rol informativo, estructural y enzimático a nivel de ADN y durante la síntesis de proteínas.

1.3.14

aminoácido: pequeñas moléculas conformadas por un grupo amino y otro carboxilo y que en su conjunto forman la estructura de las proteínas.

1.3.15

anfoterismo: propiedad de las proteínas para adaptarse al pH del medio y cambiar de carga, dependiendo del pH y su punto isoléctrico (pI).

MPR-CNSP-016

1



1.3.16

densidad óptica: unidad de medida de absorción de la luz, definido como el logaritmo de la intensidad de luz de entrada entre la intensidad de luz de salida.

1.3.17

desnaturalización de proteínas: pérdida de las estructuras nativas (secundaria, terciaria y cuarternaria) de una proteína, adoptando la estructura primaria únicamente.

1.3.18

electroforesis: técnica utilizada para separar partículas coloidales tales como proteínas o ácidos nucléicos a través una matriz sólida (gel de agarosa o poliacrilamida) de acuerdo a su tamaño y carga eléctrica mediante la aplicación de un campo eléctrico (IUPAC, NHLBI, DOE).

1.3.19

enfoque isoeléctrico: técnica en gradiente de pH montada entre un ánodo y un cátodo, de donde éste último tiene un pH más alto que el primero.

1.3.20

estructura cuaternaria: se refiere a la estructura tridimensional compleja adoptada por la proteína compuesta de varios monómeros o polipéptidos.

1.3.21

estructura primaria de proteínas: se refiere a la estructura lineal formada por la unión secuencial de aminoácidos.

1.3.22

estructura secundaria de proteínas: se refiere a la estructura bidimensional formada por el plegamiento de la estructura primaria estabilizada por interacciones débiles.

1.3.23

estructura terciaria de proteínas: se refiere a la estructura tridimensional adoptada por la proteína estabilizada por enlaces covalentes y no covalentes.

1.3.24

grado biología molecular: alto grado de pureza (ausencia de contaminantes externos como nucleasas, proteasas o pirógenos) que presentan algunos reactivos que son utilizados en pruebas moleculares.

1.3.25

kilodalton: unidad de medida referente al peso molecular de las proteínas en general.

1.3.26

marcador estándar de peso molecular: fragmentos de ADN de peso molecular conocido utilizados para determinar el tamaño de una molécula de ADN de interés por comparación después de una electroforesis.

1.3.27

pares de bases: cada par de nucleótidos complementarios que en conjunto forman una doble hebra de ADN.

1.3.28

PCR: polimerase chain reaction o reacción en cadena de la polimerasa; reacción enzimática in vitro por el cual mediante múltiples ciclos de denaturación, alineamiento y extensión se sintetizan grandes cantidades de una región genética específica.

1.3.29

plásmido: moléculas de ADN circular que se encuentran en la mayoría de bacterias y otros organismos procariontes y que pueden llevar información genética para el organismo que lo alberga.

1.3.30

polimerización: acción química por el cual las moléculas de acrilamida y bisacrilamida forman un entramado a manera de malla por la acción de catalizadores (TEMED y APS) generando una sustancia gelatinosa.

1.3.31

producto de amplificación: Moléculas de ADN sintetizadas en múltiples copias in vitro a partir de ADN molde mediante el uso de PCR.

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SECCIÓN 2 MEDIDAS DE BIOSEGURIDAD 2.1

Algunos reactivos utilizados en los procedimientos descritos en este manual tienen la característica de ser tóxicos, irritantes, corrosivos, cancerígenos, mutagénicos y neurotóxicos, por lo tanto el investigador siempre deberá usar guantes, mascarillas, lentes protectores y mandil para evitar un contacto directo o accidental con ellos (Ver más adelante lista de estos reactivos).

2.2

La luz ultravioleta (UV) empleada para la visualización de ADN a 385 nm de longitud de onda con 8W de potencia ocasiona graves daños oculares y epiteliales, por lo tanto, el investigador deberá contar con una lámina de policarbonato transparente ubicada entre la lámpara y el punto de observación. Además, deberá usar lentes de protección contra rayos UV del mismo material.

2.3

El voltaje utilizado para la electroforesis puede generar quemaduras por descarga eléctrica. Aunque la mayoría de cámaras de electroforesis han sido diseñadas para evitar el contacto directo con la electricidad, el operador deberá asegurarse de mantener la fuente poder apogada o desconectada al momento de manipular el equipo.

2.4

El proceso de ebullición de las proteínas en baño maría a 100ºC deberá realizarse con extremo cuidado para evitar quemaduras. En este sentido, se recomienda utilizar envases de vidrio resistentes a altas temperaturas (por ejemplo: Pyrex) y gradillas flotantes de polipropileno para colocar los viales.

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SECCIÓN 3 MANEJO DE MUESTRAS Y REACTIVOS EN BIOLOGÍA MOLECULAR 3.1

El investigador deberá usar guantes de látex mientras se encuentre trabajando con ADN y proteínas. Este paso ayudará a evitar la degradación de las biomoléculas por acción de las nucleasas o proteasas presentes en la superficie de las manos. Asimismo, el uso de guantes evitará que el laboratorista se exponga ante algún posible riesgo de intoxicación por material infeccioso.

3.2

El material biológico debe ser conservado a bajas temperaturas. El ADN genómico y los productos de amplificación pueden ser almacenados a 4°C, mientras que el ADN plasmídico a - 20°C. Las proteínas deben ser conservadas a -80°C o en su defecto a -20°C. Todas las muestras biológicas deben ser repartidas en alícuotas y en volúmenes pequeños para evitar etapas de descongelamiento o congelamiento drásticos que ocasionarían un eventual deterioro de las moléculas.

3.3

Debido a la importancia que tiene la medición de volúmenes en los procedimientos de electroforesis, se sugiere que los insumos destinados para tal fin, las micropipetas y puntas de 10, 20, 200 y 1000 µl, viales de 0,5 y 1,5, tubos de 15, 50 y 250 mL y los equipos de laboratorio, cuenten con un certificado que acredite la calidad del producto (Ejm: certificado ISO 9000, ISO 8655, DIN 12650).

3.4

Se recomienda que las puntas que se insertan en las micropipetas y que tienen contacto directo con las moléculas de ADN sean nuevas y estériles, a fin de evitar una posible contaminación de la muestra con nucleasas. Es importante señalar que es posible trabajar con puntas previamente usadas, siempre y cuando estén libres de restos orgánicos y hayan sido previamente esterilizadas en autoclave (121°C a 1,5 psi). Con respecto a la manipulación de las proteínas, no se exige el uso de puntas nuevas pero sí se recomienda esterilizarlas previamente.

3.5

Se recomienda que los equipos empleados para los procedimientos descritos en este manual cuenten con un certificado de calidad que garantice su precisión y calibración (Ejm. ISO9000, ISO 8655, DIN 12650).

3.6

Los reactivos a usarse durante los procesos de extracción y purificación de ácidos nucleicos y proteínas deben tener grado "biología molecular" para asegurar el éxito del procedimiento. El uso combinado de reactivos de diferente grado de pureza puede llevar a un fracaso del experimento.

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SECCIÓN 4 PROCEDIMIENTOS PARA LA ELECTROFORESIS DE PROTEÍNAS 4.1

OBJETIVO Realizar el proceso de electroforesis vertical discontinua denaturante de proteínas.

4.2

MATERIALES

4.2.1

Cámara de electroforesis vertical y accesorios.

4.2.2

Micropipetas de 20, 200 y 1000 µL.

4.2.3

Vaso de precipitación de 500 mL de capacidad.

4.2.4

Flotadores para microtubos de 1,5 mL.

4.2.5

Lámina extensible de parafina.

4.2.6

Gradillas de plástico.

4.2.7

Puntas descartables de polipropileno con capacidad para 20, 200 y 1000 µL.

4.2.8

Solución de poliacrilamida al 30% (Anexo A).

4.2.9

Buffer Tris-HCL 1,5 M pH= 8,8 (Anexo A).

4.2.10

Buffer Tris-HCL 0,5M pH= 6,8 (Anexo A).

4.2.11

Dodecilsulfato de sodio (SDS) al 10% (Anexo A).

4.2.12

Persulfato de amonio (APS) al 10% recién preparado (Anexo A).

4.2.13

N,N,N',N'-Tetrametiletilendiamina (TEMED solución stock).

4.2.14

Agua bidestilada.

4.2.15

Buffer de resolución Tris-Glicina (Anexo A).

4.2.16

Butanol-agua (Anexo A).

4.3

ENSAMBLAJE DE LA CÁMARA DE ELECTROFORÉSIS

4.3.1

El procedimiento para el ensamblaje de la cámara de electroforesis varía de acuerdo al modelo del equipo, en consecuencia el investigador deberá seguir las instrucciones que recomienda el fabricante.

4.3.2

Debido a que la mayoría de las cámaras de electroforesis parten del mismo principio técnico, hemos representado gráficamente un modelo que permite orientar al investigador en el ensamblaje de este equipo (Figuras N° 1-4).

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4.3.3

En general, una cámara de electroforesis vertical puede tener los siguientes componentes:

4.3.3.1

Dos placas de vidrio del mismo grosor y anchura, de acuerdo al fabricante. En algunos modelos, la altitud de los vidrios es diferente (uno con mayor altitud que el otro). En general, el tamaño de los vidrios es variable, dependiendo de la dimensión de la cámara.

4.3.3.2

Dos espaciadores, que son dos placas largas de iguales dimensiones hechas de un material flexible pero resistente (generalmente poliestireno o teflón). La función de los espaciadores es determinar el grosor del gel.

4.3.3.3

Un peine, cuyos dientes pueden variar en número, tamaño y grosor. Tiene el mismo grosor de los espaciadores y está confeccionado del mismo material. Sirve para moldear los pocillos donde se colocarán las muestras

4.3.3.4

Un soporte o base: dispositivo que sirve para permitir el ensamblaje de los vidrios con los espaciadores, a través de unas serie de prensas que ejercen presión y mantiene fijo todo el sistema

4.3.3.5

El tanque de electroforesis: recipiente que contiene el buffer de corrida superior e inferior. En algunos sistemas, este tanque contiene electrodos permanentes a lo largo de sus bases listos para ser conectados. En otras cámaras existe una tapa que contiene los electrodos, de tal manera que el investigador ya no tiene contacto directo con el buffer durante el proceso de electroforesis.

4.3.3.6

Fuente de poder: aparato que tiene por función proveer de energía eléctrica a la cámara de electroforesis. El voltaje, el amperaje y el tiempo, pueden ser regulados de acuerdo a las necesidades del investigador. Es importante señalar que la cámara de electroforesis ya ensamblada deberá estar ubicada sobre una superficie totalmente plana y nivelada. Este paso es importante en el momento en el que se vierte la solución del gel dentro de la cámara, ya que se evita el derrame de la solución y la generación de matriz desnivelada. Esta última podría generar la distorsión del perfil de las bandas de las proteínas al final de la electroforesis.

4.4

PREPARACIÓN DE LOS GELES DE POLIACRILAMIDA

4.4.1

La electroforesis de proteínas descrito en este manual corresponde al sistema discontinuo denaturante. Es discontinuo porque está conformado por dos geles de poliacrilamida de resolución y empacamiento que presentan diferente concentración, composición y pH. Ambos geles se encuentran unidos pero limitados por una fase de separación visible al trasluz. Debido a que en estado líquido ambos geles pueden mezclarse fácilmente, deben ser preparados por separado esperando la total polimeración del primero para continuar con la polimerización del otro. El gel de empacamiento generalmente se localiza en la parte superior del sistema formando los pocillos donde se depositarán las muestras. El gel de resolución por su parte forma el cuerpo del gel por donde migrarán y se separarán las proteínas.

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Cátodo

Vidrio grande

Anodo

Peine Vidrio chico Tanque de electroforesis vertical

Espaciadores

Fuente de Poder

Soporte

Voltímetros

Ganchos o prensas

Reguladores de voltaje

Base de jebe Electrodos

Interruptor

Figura N° 1. Componentes de una cámara de electroforesis vertical

Peine

Peine

Espaciadores Vidrio grande

1 - 5 cm

Área para el gel de empacamiento

Área para el gel de resolución

Vidrio chico

Figura N° 2. Modo de ensamblar los vidrios y los espaciadores de una cámara de electroforesis vertical

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1. Ensamblar vidrios y espaciadores y colocar sobre un soporte

4. Remover el butanol con agua y añadir gel de empacamiento

Peine

Ganchos o prensas Soporte

Presión

Base de jebe 5. Colocar peine y dejar polimerizar

2. Añadir gel de resolución

Peine

3. Añadir butanol Dejar gelificando

6. Retirar el peine. Colocar sobre mesa nivelada

Figura N° 3. Procedimiento para el ensamblaje de un modelo de cámara de electroforesis vertical.

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Ánodo

Cátodo

Buffer de electroforesis

Fuente de poder Tanque de electroforesis vertical

Figura N° 4. Sistema de electroforesis vertical ensamblado

4.5

PREPARACIÓN DEL GEL DE RESOLUCIÓN

4.5.1

Fundamento teórico El gel de resolución es la matriz de poliacrilamida donde las moléculas de ADN o proteínas, van a migrar generando un perfil de bandas o patrón electroforético. Dicho patrón varía de acuerdo al peso molecular de cada una de las moléculas y a la concentración del gel mismo.

4.5.2

Procedimiento

4.5.2.1

Asegurarse de usar guantes durante la manipulación de las soluciones.

4.5.2.2

Marcar el límite hasta donde la matriz de acrilamida será vertida, trazando una línea horizontal en el vidrio con un marcador indeleble. Para saber la ubicación exacta de la línea, colocar el peine entre ambos vidrios y medir entre uno y cinco centímetros (dependiendo del tamaño de la cámara) por debajo de los dientes del peine (Figura N° 2)

4.5.2.3

Realizar la preparación del gel de resolución a una concentración de acuerdo a las necesidades, mezclando los componentes en el orden que se indica en el Anexo A.

4.5.2.4

Aproximadamente 5 mL de solución deberán ser preparados en caso de trabajar con geles pequeños de aproximadamente 8 - 10 cm de ancho por 5 - 7 cm de largo y un espesor de 0,7 - 0,8 mm. La concentración de poliacrilamida a usar dependerá de las necesidades del operador.

4.5.2.5

Una vez finalizada la preparación de la solución, añadir los catalizadores APS y TEMED uno por uno, tratando de mezclar cada reactivo de manera uniforme en todo el volumen.

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4.5.2.6

Agregar un volumen de la solución de poliacrilamida entre las placas de vidrio hasta la línea trazada. Posteriormente, añadir una capa de butanol-agua (aproximadamente 100 µL) sobre la solución de poliacrilamida para evitar el ingreso de moléculas de oxígeno que retarden la polimerización.

4.5.2.7

Dejar polimerizar a temperatura ambiente por 15 a 30 minutos, usando como control polimerización la solución de poliacrilamida remanente.

4.5.2.8

Una vez formado el gel, descartar la capa de butanol y lavar la parte superior del gel varias veces con agua destilada hasta eliminar completamente los restos de acrilamida no polimerizada y butanol.

4.6

PREPARACIÓN DEL GEL DE EMPACAMIENTO

4.6.1

Fundamento teórico El gel de empacamiento es la matriz de poliacrilamida que tiene como característica retener a las proteínas manteniéndolas uniformes antes que ellas migren hacia el gel de resolución. Este proceso permite mejorar la resolución de las proteínas en la electroforesis.

4.6.2

Procedimiento

4.6.2.1


4.6.2.2

Mezclar los componentes del gel (Anexo A).

4.6.2.3

Una vez finalizada la preparación de la solución, agitar moderadamente sin hacer burbujas a fin de asegurar que el TEMED y el APS se distribuyan uniformemente en todo el volumen de la solución.

4.6.2.4

Agregar la poliacrilamida entre los vidrios de la cámara y sobre el gel de resolución ya polimerizado. Inmediatamente después, colocar el peine entre ambos vidrios secando con papel toalla los restos de poliacrilamida que lleguen a derramarse.

4.6.2.5

Dejar polimerizar la poliacrilamida a temperatura ambiente por 15 a 30 minutos usando como control de la polimerización la solución de poliacrilamida que quedó remanente en el tubo.

4.6.2.6

Una vez formado el gel, retirar el peine cuidadosamente y lavar todos los pocillos ya formados con chorro suave de agua destilada.

4.7

PREPARACIÓN DE LA MUESTRA BIOLÓGICA

4.7.1

Objetivo Someter las muestras de proteínas a procesos químicos y físicos que permitan su óptimo fraccionamiento en la electroforesis vertical.

4.7.2

Materiales

4.7.2.1

Micropipetas para volúmenes de 20 µL, 200 µL y 1000 µL.

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4.7.2.2

Tubos de polipropileno de 1,5 mL y 15 mL de capacidad.

4.7.2.3

Guantes.

4.7.2.4

Cocinilla de asbesto.

4.7.2.5

Vaso de precipitación de 500 mL.

4.7.2.6

Gradilla para tubos de 1,5 mL.

4.7.2.7

Buffer de la muestra (Anexo A).

4.7.2.8

Puntas de 20 µL, 200 µL y 1000 µL.

4.7.3

Principio del procedimiento La preparación de la proteína consiste en un proceso fisico-químico, en el cual se rompen enlaces peptídicos y puentes disulfuro gracias a la acción de detergentes iónicos, reactivos reductores y altas temperaturas, los que en conjunto consiguen desnaturalizar la proteína hasta su estructura primaria.

4.7.4

Procedimiento

4.7.4.1

Mezclar la proteína con el buffer de la muestra concentrada por cuatro veces (4x) en proporción 3:1 (tres partes de la muestra y una de buffer).

4.7.4.2

Asegurar la tapa de los tubos con lámina extensible de parafina y someter la muestra a una temperatura de 100° C durante 5 minutos. Para tal efecto colocar los viales en una gradilla para microtubos dentro de un recipiente o vaso de precipitación con agua hirviendo.

4.7.4.3

Controlar la temperatura con un termómetro adecuado.

4.7.4.4

Finalizado el procedimiento, retirar los tubos del vaso de precipitación y centrifugarlos por diez segundos a 12 000 rpm. Mantenerlos en una gradilla para microtubos dentro de un recipiente con hielo hasta el proceso de electroforesis.

4.8

ELECTROFORESIS

4.8.1

Objetivo Fraccionar las proteínas de acuerdo a su peso molecular en una matriz de poliacrilamida usando un campo eléctrico.

4.8.2

Materiales

4.8.2.1

Micropipetas para volúmenes de 20 µL.

4.8.2.2


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4.8.2.3

Fuente de poder.

4.8.2.4

Buffer de electroforesis para proteínas (Anexo A).

4.8.2.5

Guantes.

4.8.2.6


4.8.2.7

Puntas para micropipeta de 20 µL.

4.8.2.8

Envase con lejía al 10% para descarte de puntas.

4.8.3

Principio del procedimiento En el proceso de la electroforesis se realizará la separación de las proteínas a analizar, de acuerdo a su peso molecular. Dicha distribución dependerá de la concentración del gel de resolución con el que se esté trabajando.

4.8.4

Procedimiento

4.8.4.1

Todo el procedimiento requiere el uso de guantes a fin de evitar la degradación de las moléculas por la acción de las proteasas presentes en la mano.

4.8.4.2

Sumergir el sistema contiendo los geles polimerizados en un tanque conteniendo buffer de electroforesis o de resolución para proteínas 1X. Dicho tanque lleva dos electrodos: uno positivo y otro negativo (frecuentemente representados por colores rojo y negro, respectivamente) que serán conectados a una fuente poder (Figuras N° 1 y 5). Al momento de sumergir los geles en el tanque, asegurarse que los pocillos del gel estén totalmente cubiertos por el buffer.

4.8.4.3

Mediante el uso de puntas de hasta 20 µL y 30 µL de capacidad proceder a depositar cuidadosamente la muestra en los pocillos evitando la contaminación del pocillo contiguo.

4.8.4.4

Considerar el uso de un marcador estándar de proteínas para la medición del peso molecular de la muestra. Dicho marcador debe ser sometido a los mismos tratamientos de la proteína, excepto cuando se trate de un marcador previamente teñido en que el que se obviará el uso del buffer de la muestra.

4.8.4.5

Una vez finalizada la colocación de las proteínas en cada pocito del gel, cubrir el tanque con la tapa y conectar los cables correspondientes de los electrodos en la fuente de poder.

4.8.4.6

Encender la fuente de poder y proceder a seleccionar el voltaje y amperaje correspondientes.

4.8.4.7

Para el cálculo del voltaje es importante conocer la distancia en centímetros del gel desde la parte superior hasta la parte inferior de la matriz. La distancia multiplicada por voltios (8V - 15 V) permitirá determinar el voltaje total. El voltaje óptimo dependerá de la naturaleza de la molécula de ADN que se piensa separar, en consecuencia, se recomienda estandarizar este procedimiento.

4.8.4.8

El valor del amperaje o corriente eléctrica (medida en amperios o miliamperios) dependerá de la fuerza iónica del buffer. En el caso de trabajar con buffer Tris-Glicina 1X (Ver solución stock, Anexo A), el valor recomendado es de 25 a 30 miliamperios.

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4.8.4.9

Realizar la electroforesis hasta que el frente de corrida (visualizado como una línea azul por el colorante del buffer) haya llegado a los límites de la parte inferior del gel.

4.8.4.10

Finalizada la electroforesis proceder al desmontaje del equipo empezando con desconectar los electrodos de la fuente de poder ya apagada y removiendo el sistema que contiene el gel de poliacrilamida.

4.8.4.11

Levantar lentamente uno de los espaciadores de tal manera que se vaya realizando la separación de los vidrios que contienen el gel.

4.8.4.12

Separar el gel de empacamiento del gel de resolución realizando un corte transversal.

4.8.4.13

Hacer una pequeña muesca en una de las esquinas del gel, a fin de que sirva de orientación para ubicar el orden en que fueron cargadas las muestras.

4.8.4.14

Remover el gel. Para realizar este proceso se requiere de mucho cuidado pues el gel es muy frágil y puede romperse con facilidad especialmente cuando se seca o es de baja concentración. Para desprender el gel del vidrio remojarlo nuevamente con buffer de electroforesis o agua destilada y usar uno de los espaciadores a manera de espátula para levantarlo por una de las puntas. Coger el gel cuidadosamente (usar guantes) y luego sumergirlo en un envase conteniendo el colorante azul brillante de coomasie.

4.8.4.15

El buffer de electroforesis puede ser devuelto a su frasco original para su posterior uso, pudiendo ser reciclado hasta cinco veces, después de los cuales se deberá preparar una nueva solución dado que puede afectar el tiempo de corrida de la prueba.

4.8.4.16

Los vidrios, los espaciadores y el tanque deberán ser lavados con abundante agua y detergentes especiales que puedan ser fácilmente removidos. Posteriormente, enjuagarlos con agua destilada y secarlos a temperatura ambiente o en una estufa a 37°C. CÁTODO

ÁNODO

e-

e-

e-

e-

a Buffer de resolución c b

Gel de empacamiento

d e

e-

e-

Gel de resolución

Buffer de resolución e- e- e- e- e- e- e- e- ee-

Figura N° 5. Interior de una cámara de electroforesis vertical en operación: a) Durante la colocación de la muestra en el pocillo del gel, b) Después de aplicar un voltaje determinado el cual genera el empacamiento uniforme de las proteínas, c, d y e) las proteínas migran hacia el ánodo y se distribuyen en el gel a manera de bandas. (e-)= electrones

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4.9

COLORACIÓN Y VISUALIZACIÓN DE LAS PROTEÍNAS USANDO AZUL BRILLANTE DE COOMASIE

4.9.1

Objetivo Visualizar las proteínas en el gel de poliacrilamida.

4.9.2

Materiales

4.9.2.1

Frasco oscuro de 1 L para el colorante azul brillante de coomasie.

4.9.2.2

Recipiente para colorear el gel.

4.9.2.3

Solución de trabajo de azul brillante de coomasie R-250 (Anexo A).

4.9.2.4

Solución de decoloración rápida (Anexo A).

4.9.2.5

Solución de decoloración lenta (Anexo A).

4.9.2.6

Solución glicerol-metanol (Anexo A).

4.9.2.7

Agua destilada.

4.9.2.8

Guantes.

4.9.3

Principio del procedimiento El proceso de coloración se basa en la atracción electrostática del enlace peptídico de las proteínas sobre grupos de ácido sulfónico que son los que tiñen la proteína de color azul. Asimismo, las fuerzas de Van der Waals y las interacciones hidrofóbicas participan en este proceso de unión mecánica. Este paso permite la visualización de proteínas en un rango de sensibilidad entre 0,5 µg y 2 µg.

4.9.4

Procedimiento

4.9.4.1

Todo el procedimiento requiere el uso de guantes a fin de evitar algún tipo de contacto con los reactivos.

4.9.4.2

Sumergir el gel de poliacrilamida en un envase de vidrio o teflón, conteniendo solución de trabajo de azul brillante de coomasie en un volumen que permita cubrir completamente el gel. Dejar incubando con un suave movimiento rotatorio por 15 a 20 minutos. Es importante precisar que el tiempo de incubación dependerá del grado de sensibilidad requerida en la prueba, de la concentración del gel y de la sensibilidad del azul brillante de coomasie propiamente dicho. En ese sentido, una máxima sensibilidad de coloración puede ser obtenida incubando por ejemplo un gel al 5% en 1 hora y un gel al 10% por 2 horas.

4.9.4.3

Evitar la coloración del gel por más de dos horas, debido a que el colorante puede quedar retenido fuertemente en el gel generando un fondo oscuro por sobretinción que impediría la visualización de las proteínas.

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4.9.4.4

Culminado el tiempo de incubación, depositar el colorante en su frasco original.

4.9.4.5

Cubrir el gel teñido con solución de decoloración rápida e incubar por 30 minutos. Eliminar la solución decolorante rápida y añadir un segundo volumen de la misma solución hasta apreciar las primeras bandas. Acto seguido, eliminar la solución de decoloración rápida y añadir la solución decolorante lenta. Dejar destiñendo a movimiento constante por lo menos una hora, cambiando la solución por una nueva cuantas veces sea necesario. Seguir destiñendo hasta que las bandas de las proteínas puedan ser apreciadas claramente.

4.9.4.6

Finalizada la remoción del azul de coomasie, descartar el decolorante usado y lavar el gel. Para poder analizar los resultados es recomendable secar el gel usando un equipo secador a vacío o manualmente.

4.9.5

Secado manual de geles de poliacrilamida

4.9.5.1

Remojar el gel teñido en el reactivo glicerol-metanol por 2 horas con un movimiento de rotación suave.

4.9.5.2

Posteriormente, remojar una lámina de celofán de aproximadamente 15 x 15 cm en agua y colocarlo encima de un bastidor cuyo tamaño dependerá del tamaño del gel. Seguidamente, colocar el gel sobre el celofán y observar que no se formen burbujas.

4.9.5.3

Cubrir el gel con un segundo celofán previamente remojado en agua y presionar el sistema tipo "sandwich" con grapas en todos los lados. Dejar secar por 2 días.

4.9.5.4

Remover las grapas y desprender de la placa de vidrio el celofán que contiene el gel.

4.9.5.5

Cortar y guardar el exceso de celofán. Nota importante: el celofán debe ser hidrofílico y no plastificado

4.10

Interpretación de resultados

4.10.1

Las proteínas fijadas en geles de poliacrilamida y teñidas con azul brillante de coomasie se observan como bandas azules de diferentes pesos moleculares.

4.10.2

El peso molecular de una proteína se mide en kilodaltons (Equivalente a 1 000 Daltons) y puede ser determinado comparando la banda con un patrón de proteínas estándar de peso conocido denominado marcador de peso molecular.

4.10.3

La distribución de las proteínas depende de la concentración del gel, por lo tanto, el operador deberá seleccionar el marcador de peso molecular más adecuado.

4.10.4

Algunas proteínas suelen migrar anómalamente y muchas veces aparecen con un mayor peso del esperado; ello se debe a que algunas de ellas presentan modificaciones postraduccionales en su estructura como residuos de glicosilación, fosforilación y acetlización, las cuales podrían retardar la migración de las muestras.

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4.10.5

Las proteínas degradadas (desnaturalización de las proteínas por causa de un agente químico catalizador, ejm: proteasas) suelen dejar manchas difusas en todo el frente de corrida y a veces suelen confundirse con proteínas de menor peso molecular (Figuras N° 6 y 7) 1

2

3

4

5

6

7

Figura N° 6. Electroforesis de proteínas totales del virus de la fiebre amarilla en geles de poliacrilamida al 10%. Carril 1 al 5: concentraciones de 1, 2, 3, 4 y 5 µg de proteína. Carriles 6 y 7: proteínas degradadas.

1

2

3

4

5

97,4 66 -

45

-

31

-

21,5 -

Figura N° 7. Electroforesis de proteínas purificadas (Carriles 2 y 4) y proteínas totales de Leishmania brazilensis.

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4.11

FACTORES QUE AFECTAN LA MIGRACIÓN DE LAS PROTEÍNAS Los principales factores que afectan la migración de las proteínas durante la electroforesis son las siguientes:

4.11.1

Fuerza del campo eléctrico (E) Es la fuerza que determina el movimiento o migración de la proteína a través del campo eléctrico. Su unidad de medición es voltios/cm y es por esa razón que la tasa de migración de una proteína puede ser alterada cambiando tanto la distancia comprendida entre los electrodos (cm) como el potencial eléctrico del sistema (Voltaje). Del mismo modo, los valores de E dependen de la fuerza direccional (Fa) y de la carga neta de la molécula (Q). Puede ser calculada a través de la siguiente fórmula: E = Fa/Q E= v/d Donde: Fa = Fuerza direccional. v = voltios. d = distancia de los electrodos (en centímetros) Q = carga en (coulomb)

4.11.2

Temperatura Depende básicamente del voltaje de la electroforesis, la concentración de sales (poder de conductancia) del buffer y del pH. Un aumento en la temperatura del buffer genera el efecto "sonrisa" o smiling (Figura Nº 8).

Figura Nº 8. Gel de electroforesis en SDS-PAGE para proteínas mostrando el efecto "sonrisa" o smiling. Figura extraída de Internet. (http://www.cas.vanderbilt.edu/bsci11a/protein-electro/protein-electro.htm).

4.11.3

Carga neta de la molécula La presencia de aminoácidos de diferentes grupos bioquímicos otorga a una determinada proteína una carga neta totalmente diferente a otra, compuesta por diferentes grupos de aminoácidos. Debido

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a que en la electroforesis, las muestras son sometidas a un determinado campo eléctrico, la migración de las proteínas en el gel dependerá básicamente de su carga y no de su peso molecular. Para evitar este efecto, es importante igualar la carga neta de todas las proteínas aprovechando sus propiedades anfotéricas. En ese sentido, el SDS evita el efecto de diferencias de carga entre las proteínas, a fin de favorecer la separación de ésta únicamente por su peso molecular. 4.11.4

Tamaño y forma de la molécula

4.11.4.1

Las proteínas tienen características moleculares que actúan como factores intrínsecos durante la electroforesis alterando su migración y generando bandas de diferentes tamaños, que no necesariamente van acorde al peso molecular real del polipéptido. Ciertas modificaciones postraduccionales, multimerización y formación de complejos con otro tipo de moléculas generan modificaciones en el tamaño de la proteína dando pesos moleculares aparentes en el momento del análisis.

4.11.4.2

Debido a la dificultad de reconocer la naturaleza bioquímica de una proteína no caracterizada, perviamente deberá estandarizarse diversas condiciones experimentales a fin de optimizar el análisis de la proteína por electroforesis.

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20



SECCIÓN 5 PROCEDIMIENTOS PARA LA ELECTROFORESIS DE ADN 5.1

OBJETIVO GENERAL Conocer los procedimientos básicos del proceso de electroforesis horizontal y vertical para ADN.

5.2

ELECTROFORESIS VERTICAL

5.2.1

Objetivo Conocer el procedimiento técnico de la electroforesis vertical para ADN en geles de poliacrilamida.

5.2.2

Materiales

5.2.2.1


5.2.2.2

Micropipetas de 20 µ, 200 µL y 1 000 µL.

5.2.2.3


5.2.2.4

Puntas de polipropileno con capacidad para 20 µ, 200 µ y 1 000 µl.

5.2.2.5

Buffer de resolución stock TBE 5X (Anexo A).

5.2.2.6

Buffer de resolución TBE 1X (Anexo A).

5.2.2.7

Poliacrilamida al 30%.

5.2.2.8

APS al 10%.

5.2.2.9

TEMED.

5.2.3

Ensamblaje de la cámara de electroforesis vertical El modo de ensamblar una cámara de electroforesis vertical fue detallado en la sección 4.3. Sin embargo, toda cámara de electroforesis vertical viene acompañada de una serie de especificaciones técnicas de los fabricantes, en tal sentido recomendamos leer el manual del equipo.

5.2.4

Preparación del gel de resolución

5.2.4.1

El sistema de electroforesis vertical para ADN corresponde al sistema continuo no denaturante. Este sistema, a diferencia de la electroforesis para proteínas, no utiliza un gel de empacamiento y los componentes del gel de resolución son totalmente diferentes.

5.2.4.2

Procedimiento

a.


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b.

No será necesario marcar el límite hasta donde será vertida la poliacrilamida, debido a que el gel usado es continuo.

c.

Realizar la preparación del gel siguiendo el orden que se indica en el Anexo A.

d.

Aproximadamente 5 mL de la solución deberán ser preparado en caso de trabajar con geles pequeños (aproximadamente 8 - 10 cm de ancho x 5 - 7 cm de largo y un espesor de 0,7 - 0,8 mm). La concentración de poliacrilamida para ADN dependerá de los objetivos de trabajo del operador.

e.

Una vez finalizada la preparación de la solución, agitar moderadamente sin hacer burbujas a fin de asegurar que el TEMED y el APS se distribuyan uniformemente en todo el volumen.

f.

Agregar un volumen de la solución de poliacrilamida entre las placas de vidrio hasta el tope. Inmediatamente después, colocar el peine de teflón entre ambos vidrios secando con papel toalla los restos de poliacrilamida que se lleguen a derramar.

g.

Dejar polimerizar la poliacrilamida a temperatura ambiente por 15 - 30 minutos, usando como control la solución de poliacrilamida que quedó remanente en el tubo.

h.

Una vez formado el gel, retirar el peine cuidadosamente y lavar todos los pocillos ya formados con chorro suave de agua destilada.

5.3

ELECTROFORESIS DE ADN EN GELES DE POLIACRILAMIDA

5.3.1

Objetivo Separar las moléculas de ADN de acuerdo a su peso molecular a través de geles de poliacrilamida.

5.3.2

Materiales

5.3.2.1

Micropipetas para volúmenes de 20 µl.

5.3.2.2

Cámara de electroforesis.

5.3.2.3

Fuente de poder.

5.3.2.4

Poliacrilamida al 30%.

5.3.2.5

TEMED.

5.3.2.6

APS 10%.

5.3.2.7

Buffer de electroforesis para ADN TBE (Anexo A).

5.3.2.8

Buffer de la muestra para ADN (Anexo A).

5.3.2.9

Guantes.

5.3.2.10


5.3.2.11

Puntas para micropipeta de 20 µl.

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5.3.2.12

Envase para descarte de puntas.

5.3.3

Principio del procedimiento En el proceso de la electroforesis se realizará la separación de las moléculas de ADN a analizar de acuerdo a su peso molecular. Dicha distribución será afectada por la concentración del gel de resolución que se esté trabajando.

5.3.4

Procedimiento

5.3.4.1

Asegurarse de usar guantes durante la manipulación de las muestras, los reactivos y el equipo.

5.3.4.2

Sumergir el sistema conteniendo los geles polimerizados en su tanque correspondiente. Existen dos tanques de electroforesis y cada uno de ellos lleva dos electrodos: uno de polo positivo y otro de polo negativo que serán conectados a una fuente de poder. Asimismo, contiene el buffer de electroforesis para ADN, en este caso el buffer TBE 1X (Figura N° 9). Al momento de sumergir los geles en el tanque, asegurarse que los pocillos del gel estén totalmente saturados de buffer.

5.3.4.3

Para colocar el ADN en los pocillos es importante mezclar cinco volúmenes de solución que contiene el ácido nucleico con un volumen del buffer de la muestra de ADN concentrada 6 veces o buffer de muestra 6X. Añadir un volumen de buffer de la muestra repartidos en alícuotas, de acuerdo al número de muestras que se colocarán en los pocillos, sobre un pedazo de lámina extensible de parafina (Figura N° 10). Acto seguido, añadir cinco volúmenes de cada una de las muestras de ADN sobre las alícuotas de buffer de la muestra y mezclar totalmente.

5.3.4.4

Mediante el uso de puntas de 20 µl proceder a cargar cuidadosamente la muestra en los pocillos evitando la contaminación del pocillo contiguo (Figura N° 9). CÁTODO

ÁNODO

e-

e-

e-

eA

B

C

D

Punta de la micropipeta depositando la muestra en el pocillo

E

Buffer de resolución Banda de ADN ee-

Gel de resolución

e- e- e- e- e- e- e- e- ee-

Figura N° 9. Interior de una cámara de electroforesis vertical para ADN en operación. A: Durante el depósito de la muestra de ADN mezclado con el buffer de muestra. B-D: Aplicación del voltaje y migración del ADN a través del gel poliacrilamida. E: Las moléculas de ADN se agrupan en la matriz formando una banda que puede ser visualizada por fluorescencia tiñiendo el ADN con bromuro de etidio y aplicando luz ultravioleta.

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Micropipeta

Lámina extensible de parafina

Alícuotas de buffer de la muestra

Figura N° 10. El ADN es mezclado con el buffer de la muestra usando una lámina extensible de parafina antes de colocar las muestras en el gel de electroforesis.

5.3.4.5

Considerar el uso de un marcador de peso molecular estándar de ADN para la determinación del peso molecular de la muestra. Preparar el marcador de acuerdo a las intrucciones del fabricante.

5.3.4.6

Una vez finalizada la colocación del ADN en los pocillos, cubrir el tanque con la tapa y conectar los cables correspondientes de los electrodos en la fuente de poder.

5.3.4.7

Encender la fuente de poder y proceder a seleccionar el voltaje adecuado. El voltaje dependerá principalmente de las necesidades del operador y del tipo de ADN que es utilizado. Para el caso de productos de PCR, el voltaje puede estar comprendido entre 75 a 100 voltios. Es importante señalar que en la electroforesis de ADN el valor del voltaje debe ser constante, a diferencia del valor del amperaje que dependerá principalmente del valor del voltaje.

5.3.4.8

Luego de seleccionar las condiciones de voltaje, iniciar el proceso de la electroforesis. Durante el proceso se evidenciarán dos frentes de corrida de diferente color y distancia de migración. Ambos colores, azul oscuro y azul claro corresponden a los colorantes azul de bromofenol y xilene cianol, respectivamente, que conforman el buffer de la muestra. El xilene cianol en geles de poliacrilamida al 8% migra de manera similar a un fragmento de ADN de 160 pb, mientras que el azul de bromofenol a esta misma concentración de poliacrilamida es equivalente a un fragmento de 45 pb (Anexo B1.3).

5.3.4.9

Detener la electroforesis hasta que ambos frentes de corrida se localicen en la posición deseada por el operador (este proceso debe ser estandarizado).

5.3.4.10

Finalizada la electroforesis proceder al desmontaje del equipo empezando con la desconección de los electrodos de la fuente de poder, removiendo el sistema que contiene el gel de poliacrilamida.

5.3.4.11

Levantar lentamente uno o ambos espaciadores a la vez, de tal manera que se vaya realizando la separación de los vidrios que contienen el gel.

5.3.4.12

Remover el gel de uno de los vidrios. Para realizar este proceso se requiere de mucho cuidado, pues el gel es muy frágil y puede romperse con facilidad. Para desprender el gel del vidrio, remojarlo nuevamente con buffer de electroforesis y usar uno de los espaciadores a manera de espátula para levantarlo por una de las puntas. Desplazar el gel hacia un envase limpio para su respectiva tinción en bromuro de etidio o en nitrato de plata ( Anexo C).

5.3.4.13

Los vidrios, los espaciadores y el tanque deberán ser lavados con abundante agua y detergente que no deje residuos. Posteriormente enjuagarlos con agua destilada y secarlos a temperatura ambiente o en una estufa a 37° C.

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5.3.4.14

El proceso de visualización de ADN se describe en la sección 5.8

5.4

PREPARACIÓN DE GEL DE AGAROSA PARA ADN

5.4.1

Objetivo Realizar la electroforesis de moléculas de ADN mayores de 100 pb.

5.4.2

Materiales

5.4.2.1

Cámara de electroforesis horizontal y accesorios.

5.4.2.2

Agarosa de porcentaje requerido por el operador (Anexo A).

5.4.2.3

Buffer TAE 50X (Anexo A). Nota: Para la preparación del gel es importante tener completamente ensamblada la cámara de electroforesis ubicándola sobre una superficie totalmente plana asegurando que no presente algún tipo de declive.

5.4.3

Preparación del gel de resolución

5.4.3.1


5.4.3.2

Preparar la agarosa de acuerdo al protocolo contemplado en el Anexo A.

5.4.3.3

Licuar la agarosa y posteriormente enfriarla en baño maría hasta que alcance una temperatura entre 50ºC y 60°C.

5.4.3.4

Añadir agarosa en un volumen dependiente del tamaño de la cámara (20mL-25 mL son suficientes para dimensiones de L x A x H del gel: 8 x 6 x 0,5 cm) asegurando tener los peines debidamente insertados (Figura N° 11). Luego dejar enfriar por espacio de 20 minutos.

5.4.3.5

Después que la agarosa haya quedado completamente solidificada, añadir el buffer de electroforesis TAE 1X entre 0,5 y 1 cm por encima del gel (Figura N° 12). Posteriormente empezar a colocar las muestras (Figuras N° 10,13 y 14).

Agarosa

Peine para moldear los pocillos Figura N° 11. Preparación de la cámara de electroforesis para ADN en geles de agarosa.

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Cámara de electroforesis horizontal Buffer de electroforesis

Pocillo 0.5 - 1 cm.

Tanque 1

Tanque 2

Gel de agarosa

Base o contenedor del gel Electrodos Figura N° 12. Corte sagital de un sistema de electroforesis de ADN en geles de agarosa. En la figura se indica el nivel del buffer con respecto al gel de agarosa.

Cámara de electroforesis Fuente de poder

Figura N° 13. Sembrando ADN en la cámara de electroforesis.

ÁNODO

Buffer de corrida

CÁTODO

Figura N° 14. Detalle de la muestra de ADN ingresando en el pocillo de la cámara de electroforesis.

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5.5

ELECTROFORESIS DE ADN

5.5.1

Objetivo Separar las moléculas de ADN de acuerdo a su peso molecular a través de geles de agarosa.

5.5.2

Materiales

5.5.2.1

Cámara de electroforesis incluyendo gel preparado.

5.5.2.2

Fuente de poder.

5.5.2.3

Buffer de solución stock ADN TAE 50X (Anexo A).

5.5.2.4

Buffer de la muestra para ADN (Anexo A).

5.5.2.5

Guantes.

5.5.2.6

Gradilla para tubos de 1,5 mL

5.5.2.7

Micropipetas para volúmenes de 20 µL.

5.5.2.8

Puntas para micropipeta de 20 µL.

5.5.2.9

Envase para descarte de puntas.

5.5.2.10


5.5.3

Principio del procedimiento En el proceso de la electroforesis se realizará la separación de las moléculas de ADN a analizar de acuerdo a su peso molecular. Dicha distribución dependerá de la concentración del gel de resolución que se esté trabajando.

5.5.4

Procedimiento

5.5.4.1

Asegurarse de usar guantes durante la manipulación de las soluciones, las muestras y el equipo.

5.5.4.2

Mezclar cinco volúmenes de solución conteniendo ADN con un volumen del buffer de muestra 6X. Para realizar la mezcla, añadir 1 volúmen de buffer de muestra, repartidos en alícuotas de acuerdo al número de muestras a cargar, sobre un pedazo de lámina extensible de parafina (Figura N° 10). Añadir cinco volúmenes de cada una de las muestras de ADN sobre las alícuotas de buffer de la muestra y mezclar totalmente.

5.5.4.3

Mediante el uso de puntas de 20 µL proceder a cargar cuidadosamente la muestra en los pocillos, evitando la contaminación del pocillo contiguo (Figuras N° 13 y 14).

5.5.4.4

Considerar el uso de un marcador estándar de ADN para la medición del peso molecular de la muestra. Dicho marcador también debe ser mezclado con buffer de la muestra excepto cuando ya se encuentra previamente mezclado con el buffer.

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5.5.4.5

Una vez finalizada la colocación del ADN en los pocillos, cubrir el tanque con la tapa y conectar los cables correspondientes de los electrodos en la fuente de poder.

5.5.4.6

Encender la fuente de poder y proceder a seleccionar el voltaje adecuado.

5.5.4.7

Aplicar un voltaje de acuerdo al peso molecular de las moléculas de ADN que se va a separar. Para el caso de productos de PCR (entre 100 pb a 1,5 kb), se recomienda usar voltajes comprendidos entre 75 a 100 voltios. Para muestras de ADN genómico y plasmídico (>2kb) se recomienda aplicar valores entre 25 y 75 voltios. Los criterios para aplicar un determinado voltaje son explicados en la sección 5.8.

5.5.4.8

Calibrar el tiempo de electroforesis de acuerdo a la posición adoptada por los indicadores azul de bromofenol y xilencianol en la matriz de agarosa. Esta posición permitie que el investigador tenga una idea de la ubicación aproximada de su muestra de ADN en el gel. Sin embargo, es importante que el nvestigador estandarice el tiempo de electroforesis a fin de conseguir la mejor resolución de ADN.

5.5.4.9

Luego de seleccionar las condiciones de voltaje iniciar la electroforesis. Durante el proceso se definen dos frentes de corrida de diferente color y distancia de migración. Ambos colores, azul y verde corresponden a los colorantes azul de bromofenol y xilene cianol respectivamente que conforman el buffer de la muestra. En geles de agarosa dentro del rango de 0,5 a 1,4% el xilene cianol migra de manera similar a un fragmento de ADN de 4 Kilopares de bases (Kb), mientras que el azul de bromofenol se comporta como un fragmento de 300 pb.

5.5.4.10

Detener la electroforesis hasta que ambos frentes de corrida se localicen en la posición deseada por el investigador.

5.5.4.11

Finalizada la electroforesis proceder al desmontaje del equipo empezando con desconectar los electrodos de la fuente de poder ya apagada y removiendo el sistema que contiene el gel de agarosa.

5.5.4.12

El buffer de electroforesis puede ser devuelto a su frasco original para su posterior uso en un siguiente procedimiento. Limpiar la cámara de electroforesis con chorro suave de agua destilada. Secar a temperatura ambiente.

5.6

COLORACIÓN Y VISUALIZACIÓN DEL ADN EN GELES DE POLIACRILAMIDA Y AGAROSA USANDO BROMURO DE ETIDIO

5.6.1

Objetivo Visualizar moléculas de ADN por coloración con bromuro de etidio.

5.6.2

Materiales

5.6.2.1

Bromuro de etidio (Anexo A).

5.6.2.2

Transiluminador.

5.6.2.3

Guantes.

5.6.2.4

Agua destilada.

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5.6.3

Principio del procedimiento El proceso de coloración de ADN se basa en la propiedad del bromuro de etidio para intercalarse entre las bases del ADN y posteriormente fluorecer frente a la exposición con rayos ultravioleta. Su sensibilidad es de aproximadamente 30 pg de ADN por banda, dependiendo del grosor de la matriz en el que se esté visualizando. ADVERTENCIA: Debido a las propiedades mutagénicas, teratogénicas y carcinogénicas del bromuro de etidio, se recomienda realizar el procedimiento con guantes.

5.6.4

Procedimiento

5.6.4.1

Asegurarse de usar guantes durante la manipulación de los reactivos.

5.6.4.2

Sumergir el gel de poliacrilamida o agarosa en un envase de teflón conteniendo bromuro de etidio a una concentración de 1µg/mL y dejar incubando por 5 minutos en reposo.

5.6.4.3

Devolver la solución de bromuro de etidio en su frasco original y lavar el gel cuidadosamente con abundante agua.

5.6.4.4

Trasladar el gel hacia un cuarto oscuro donde se encuentre un transiluminador de luz UV.

5.6.4.5

Depositar el gel cuidadosamente sobre la pantalla del transiluminador.

5.6.4.6

Visualizar el ADN usando lentes protectores contra la luz UV.

5.6.5

Interpretación de resultados

5.6.5.1

Las moléculas de ADN son visualizadas indirectamente cuando son coloreadas con bromuro de etidio, fluoreciendo como bandas de un color naranja frente a la luz UV. Las moléculas de ADN que son más grandes, generalmente migran más retardadamente que las moléculas de menor peso (Figura N° 15). 1

2

3

40001000500

Figura N° 15. Resultado de una electroforesis horizontal de ADN en gel de agarosa. Carril 1:marcador de peso molecular. Carril 2 y 3: moléculas de ADN del gen ial de Bartonella baciliformis.

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5.6.5.2

Para determinar el peso molecular del ADN es necesario usar un marcador estándar de peso molecular conocido, el cual al ser comparado con la muestra problema permite determinar de manera aproximada el número de pares de bases de la molécula a analizar. Estos marcadores comerciales además pueden ser útiles como controles positivos del sistema de visualización del ADN, principalmente cuando se piensa evaluar la calidad del bromuro de etidio de la matriz (agarosa o poliacrilamida), o para determinar la intensidad del ADN que estamos evaluando (cálculos cualitativos de concentración de ADN), etc.

5.6.6

Descontaminación del bromuro de etidio usando carbón activado

5.6.6.1

Cubrir el fondo de un embudo con capacidad para 100 mL de solución con papel filtro Whatman N° 1.

5.6.6.2

Añadir 300 mg de carbón activado sobre el papel filtro y filtrar la solución de bromuro usado sobre el carbón.

5.6.6.3

Descartar el filtrado al desagüe o alcantarillado.

5.6.6.4

Repetir el proceso cuantas veces sea necesario durante un año.

5.6.6.5

Eliminar el carbón de un año de antigüedad así como los geles de agarosa teñidos con bromuro de etidio en bolsas de plástico de bioseguridad.

5.6.6.6

Incinerar.

5.7

COLORACIÓN Y VISUALIZACIÓN DEL ADN EN GELES DE POLIACRILAMIDA CON NITRATO DE PLATA

5.7.1

Ventajas y desventajas

5.7.1.1

De manera alternativa, es posible visualizar ADN en geles de poliacrilamida a través del método de tinción con plata. La ventaja de este método es que es de dos a cinco veces más sensible que el bromuro de etidio (detecta desde 0,1 a 0,001 ng de ADN por banda) y es menos tóxico. Del mismo modo, puede teñir ADN precoloreado con bromuro de etidio sin interferir en el resultado final.

5.7.1.2

Entre las desventajas que tiene este método es que también utiliza reactivos peligrosos, como el formaldehído, y requiere el uso de solución de nitrato de plata en cantidades moderadamente altas que con el tiempo resultaría muy costoso.

5.7.1.3

Es importante señalar que el método de tinción con plata también puede ser aplicado para la visualización de proteínas usando un protocolo similar que no será descrito en este manual. Para el caso de las proteínas, la sensibilidad del método es de 10 a 50 veces más alto que usando azul brillante de coomasie (Puede detectar de 0,1 a 1,0 ng de polipéptido).

5.7.1.4

En general, el proceso de tinción con plata surge como una buena alternativa para la visualización de ADN y proteínas; sin embargo, el procedimiento demanda mucho tiempo y esfuerzo, y en muchos casos es necesario estandarizar las condiciones.

5.7.2

Materiales

5.7.2.1

Guantes.

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5.7.2.2

Pizeta con agua destilada.

5.7.2.3

Micropipetas para volúmenes de 20 y 200 µL.

5.7.2.4

Agua bidestilada.

5.7.2.5

Solución de fijación (Anexo A).

5.7.2.6

Solución de tinción (Anexo A).

5.7.2.7

Solución de revelado (Anexo A).

5.7.2.8

Solución de detención (Anexo A).

5.7.2.9

Formaldehído al 37% (Anexo A).

5.7.2.10

Tiosulfato de sodio (frasco stock).

5.7.3.

Procedimiento

5.7.3.1


5.7.3.2

Colocar el gel de poliacrilamida en una bandeja conteniendo solución de fijación e incubar en agitación constante durante 30 minutos. Alternativamente, el gel puede dejarse en solución de fijación, en reposo durante toda la noche.

5.7.3.3

Retirar el gel de la solución de fijación y colocarlo en un recipiente con agua destilada.

5.7.3.4

Lavar el gel con agua destilada agitando constantemente durante dos minutos, repetir esta operación tres veces.

5.7.3.5

Retirar el gel del recipiente (dejar secar sobre una lámina de plástico o placa petri por 10 a 20 segundos).

5.7.3.6

Colocar el gel en la solución de tinción y dejar en agitación constante durante 30 minutos.

5.7.3.7

Retirar el gel de la solución de tinción y lavar en agua destilada durante 5 segundos.

5.7.3.8

Añadir en el momento 150 µL de formaldehído (37% concentración comercial) y 1 mg de tiosulfato de sodio pentahidratado para preparar la solución de revelado y enrazar hasta 100 mL.

5.7.3.9

Inmediatamente colocar el gel en la solución de revelado (Anexo A) y dejar en agitación constante hasta que empiecen a aparecer las bandas.

5.7.3.10

Cuando las bandas hayan alcanzado la intensidad deseada, agregar una solución fría (4°C -8°C) de reactivo de parada o detención y dejar en agitación hasta que no aparezcan más burbujas.

5.7.3.11

Secar el gel para registrar el resultado final (Figura N° 16)

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1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

Figura N° 16. Gel de poliacrilamida teñido con plata para la visualización de moléculas de ADN. Carril1: Marcador de peso molecular. Carril del 2 al 12: ADN ribosomal de mosquito Aedes aegypti.

5.8

FACTORES QUE AFECTAN LA MIGRACIÓN DEL ADN Existen diferentes factores que tienen una marcada influencia sobre la distribución de las moléculas de ADN. Generalmente, estos factores suelen confundir los resultados finales, por lo que se recomienda al investigador estandarizar algunos parámetros importantes que en la práctica suelen pasar desapercibidos. Estos factores pueden ser:

5.8.1

Tamaño del ADN Generalmente la tasa de migración del ADN es inversamente proporcional al log10 del número de pares de bases que conforman la molécula. Esto significa que las moléculas de ADN más grandes generalmente migran más lentamente que las más pequeñas.

5.8.2

Concentración de la agarosa Una molécula de ADN migrará y se distribuirá de modo diferente a medida que varíe la concentración de la matriz de agarosa o poliacrilamida. Este fenómeno se puede explicar matemáticamente mediante la siguiente fórmula: log µ = log µo - Krt Donde logm es el logaritmo de la movilidad electroforética del ADN, t es la concentración de la agarosa, mo es la libre movilidad electroforética del ADN y Kr es el coeficiente de retraso relacionado a las propiedades del gel y del tamaño y forma de las moléculas que se desplazan (Anexo B).

5.8.3

Conformación del ADN Existen moléculas de ADN que a pesar de presentar el mismo peso molecular adoptan conformaciones estructurales diferentes. Un ejemplo de ello son los plásmidos que en la mayoría de los casos generan estructuras superenrrolladas, formas lineales o formas circulares menos enrolladas o relajadas. En la electroforesis, estos plásmidos migran de manera no uniforme y se distribuyen en la matriz de agarosa de tal manera que dan la impresión de tratarse de moléculas de diferente peso molecular.

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Sin embargo, estas diferencias pueden ser alteradas variando algunos parámetros físicos como la fuerza iónica del buffer, el voltaje aplicado o la concentración misma de agarosa (Figura N° 17). 5.8.4

Voltaje aplicado Este parámetro es muy importante en la electroforesis ya que permite la movilización de las moléculas de ADN de un polo a otro. Es de resaltar que a medida que aumenta la fuerza del campo eléctrico (aumento de voltaje), se incrementa la movilidad de las moléculas de ADN de alto peso molecular pero de manera indistinta. Ello genera que las moléculas no se separen completamente unas de otras pese a aumentar la velocidad de la electroforésis. En consecuencia, se recomienda no aplicar más de 5V/cm para moléculas de ADN mayores de 2 Kb.

23130941665574361-

ADN circular relajado ADN circular enrollado

23222027-

ADN superenrollado

Figura N° 17. Electroforesis de ADN plasmídico de E. coli fraccionado en agarosa a diferentes concentraciones. Carril 1: Marcador de peso molecular Lambda Hind III en agarosa al 1,5% Carril 2: Plásmido en agarosa al 1,5%, Carril 3: Plásmido en agarosa al 1%. Carril 4: Plásmido en agarosa al 0,8% . Las flechas indican las distintas conformaciones estructurales del ADN plasmídico. En el carril 3 se puede apreciar una menor concentración de ADN.

5.8.5

Dirección del campo eléctrico Durante una electroforesis normal, las moléculas de ADN migrarán a través de una determinada dirección influenciada por un campo eléctrico. Esta dirección tiene singular repercusión sobre la tasa de migración de una molécula de ADN. Mientras este factor permanezca constante, la dirección de la migración del ADN se mantendrá inalterable. Sin embargo, existe la posibilidad de alterar la dirección del campo eléctrico y con ello es posible cambiar el curso de la migración del ADN. En ese sentido, si consideramos fraccionar dos grandes moléculas de ADN que miden entre 50 y 100 kb (por ejm. ADN genómico) bajo un campo eléctrico de una sola dirección el resultado final será la presencia de una

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sola banda difusa en el que se encuentren ambos fragmentos. Pero, si realizamos un cambio en la dirección del campo eléctrico, las moléculas más grandes de 100 kb se autoalinearán, alterarán su migración y se podrán separar en dos fragmentos completamente distinguibles. Este tipo de electroforesis es conocido como electroforesis de campo pulsado (PFGE o Pulse Field Gel Electrophoresis), y es bastante usado para la separación de moléculas de ADN de grandes tamaños (por encima de 100 kb). 5.8.6

Composición de las bases y temperatura En geles de agarosa, la composición de las bases del ADN y la temperatura no son factores que influyen sobre la migración del ADN. En ese sentido no existen diferencias de migración de las moléculas de ADN desde 4° C a 30° C. Sin embargo, en concentraciones de ADN por debajo del 0,8%, un eventual aumento de temperatura por encima de 50°C (cambio que puede ocurrir al aumentar el voltaje de electroforesis o por la alta fuerza iónica del buffer) puede generar la licuación del gel y en consecuencia la pérdida de la muestra del ADN.

5.8.7

Presencia de agentes intercalantes Algunos investigadores prefieren mezclar el ADN con el bromuro de etidio antes de realizar la electroforesis. Ello genera que el bromuro de etidio se intercale entre las bases del ácido nucleico produciendo una alteración del peso molecular del ADN y reduciendo su movilidad durante la electroforesis, en aproximadamente un 15%. Para evitar este problema se recomienda realizar primero la electroforesis y posteriormente la tinción del gel de agarosa con bromuro de etidio a fin de evitar distorsiones en la migración del ADN.

5.8.8

Composición del buffer de electroforesis La migración del ADN es afectada por la composición y la fuerza iónica del buffer de electroforesis. En un caso hipotético en que por error se llevase a cabo la electroforesis usando agua en lugar de buffer, la conductividad eléctrica disminuiría drásticamente por la falta de iones y, en consecuencia, la migración del ADN sería casi nula. Si la concentración de iones fuera excesivamente alta, la conductividad eléctrica sería muy eficiente y se generaría un sobrecalentamiento del buffer. El calor excesivo podría causar la licuación de la agarosa o la denaturación del ADN. Actualmente se dispone de distintos buffers para electroforesis de ADN de doble hebra. Los más usados son el buffer TAE (Tris, ácido acético y EDTA) y el TBE (Tris Borato EDTA). La ventaja de usar TAE es que es menos costoso y a diferencia del TBE permite que las moléculas de ADN migren 10% más rápido. El TBE por su parte es un buffer muy eficiente y no se sobrecalienta fácilmente a grandes voltajes. Por esta razón, este buffer es usado para la resolución de grandes fragmentos de ADN en matrices poco concentradas.

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SECCIÓN 6 VARIANTES DE ELECTROFORESIS Nuevos protocolos y técnicas basadas en la electroforesis de ADN y proteínas, han venido apareciendo en los últimos años. Mencionaremos brevemente los más importantes: 6.1

ELECTROFORESIS BIDIMENSIONAL

6.1.1

Es un proceso de separación e identificación de proteínas en dos dimensiones, orientando los frentes de corrida en ángulo recto uno de otro. En tal sentido, las moléculas primero son separadas por su carga o punto isoeléctrico (pI) por la técnica de enfoque isoeléctrico o IEF (Isoelectric Focusing). Posteriormente, las proteínas son separadas de acuerdo a su tamaño o peso molecular por electroforesis en SDS PAGE (Figura N° 18).

6.1.2

A diferencia de la electroforesis en una dimensión en el que se puede resolver cerca de 50 bandas, la electroferesis de dos dimensiones permite resolver 2500 manchas de polipéptidos.

Figura N° 18. Electroforesis en dos dimensiones de proteínas totales de Caenorhabditis elegans (Tomado de: http://www.aber.ac.uk/ parasitology/Proteome/Tut_2D.ht).

6.2

ELECTROFORESIS DE CAPILARIDAD

6.2.1

Como su nombre lo indica este tipo de electroforesis se lleva a cabo en finos capilares de sílica fundida cubierta con poliamida. Los tubos de sílica tienen una longitud de 30 a 100 cm con un diámetro de 25 a 100 µm y presentan radicales oxidrilo que al disociarse confieren una carga neta negativa.

6.2.2

El proceso se realiza en condiciones de alto voltaje y de campo eléctrico, donde el calor generado es eficientemente disipado gracias a la acción de los pequeños capilares. Para este propósito, el buffer utilizado en el sistema Tris 0,02 M pH = 8,6 pasa por los capilares removiendo los H+ de los radicales oxidrilos. Con ayuda de corriente eléctrica se generará un flujo de protones hacia el cátodo, proceso conocido como flujo endo-osmótico.

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6.2.3

Este tipo de electroforesis permite separar una gran variedad de moléculas entre las cuales tenemos: proteínas, péptidos, aminoácidos, ácidos nucleicos, iones inorgánicos, bases orgánicas, ácidos orgánicos y células en general.

6.2.4

En este sistema el tiempo de separación es relativamente corto (5 a 10 minutos), mientras que la eficiencia de separación es muy alta (Figura N° 19). Detector Fuente de luz 280 nm

Ánodo (+)

Cátodo (-)

Buffer

Buffer Foto-receptor

Computadora con registrador

E = V/d

Figura N° 19. Esquema representativo de un modelo de electroforesis capilar (E= campo eléctrico, V = voltaje, d= distancia). La figura es una versión modificada de http://ntri.tamuk.edu/ce/ce.html

6.3

ELECTROFORESIS EN CAMPO PULSADO (PFEG) Es una técnica diseñada especialmente para la separación de ADN de alto peso molecular (>100 kilopares de bases). PFEG (Pulsed-Field Electrophoresis Gel) opera alternando dos diferentes campos eléctricos sobre una matriz de agarosa; de esta manera es posible alterar la migración del ADN hacia diferentes direcciones facilitando la separación de dos grandes moléculas de ADN.

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SECCIÓN 7 VERIFICACIÓN DE LA CALIDAD ÓPTIMA DE LOS EQUIPOS Y REACTIVOS EMPLEADOS 7.1

GENERALIDADES

7.1.1

Se recomienda que los equipos utilizados en biología molecular cuenten con un certificado de calidad avalado por sus propios fabricantes, a fin de asegurar el óptimo funcionamiento de las pruebas moleculares.

7.1.2

Asimismo, los reactivos que se empleen deberán ser de grado biología molecular a fin de asegurar resultados satisfactorios después de cada experimento. Para el caso de algunos reactivos que exigen mantenerse en refrigeración, deberán ser evaluados por el propio investigador que los adquirió antes de realizar cualquier experimento. Para el caso del TEMED, el cual es adquirido en condiciones de refrigeración, el control de calidad se realiza preparando geles de poliacrilamida. Generalmente, la polimerización no debe demorar más de media hora.

7.1.3

La acrilamida/bisacrilamida es otro reactivo importante que en polvo puede guardarse a temperatura ambiente; sin embargo, en estado de solución puede mantenerse en refrigeración hasta por 6 meses.

7.1.4

Es importante verificar la calidad de los reactivos y soluciones de trabajo preparados en laboratorio.

7.2

BUFFER PARA ELECTROFORESIS DE PROTEÍNAS Y ADN

7.2.1

Tanto el buffer de electroforesis para proteínas como de ADN, deberán ser preparados adecuadamente y renovados en forma periódica. En tal sentido, se recomienda preparar solución stock de buffer de electroforesis concentrado 10 veces para proteínas (Anexo A) ó 50 veces para ADN (Anexo A). Este paso permite conservar la reproducibilidad del experimento.

7.3

PERSULFATO DE AMONIO

7.3.1

En el caso del APS es un reactivo que se caracteriza por ser altamente higroscópico, es decir, suele hidratarse con facilidad. Por lo tanto, deberá realizarse un control periódico del frasco que lo contiene a fin de evitar la humedad en su interior y consecuentemente la pérdida de sus propiedades químicas durante el proceso de polimerización.

7.3.2

Para controlar la calidad de este reactivo verificar que el contenido no se encuentre endurecido ni que se hallen gotas de agua en su interior. De otro lado, preparar geles de poliacrilamida usando APS al 10% y verificar que la polimerización no demore por más de media hora.

7.3.3

Para evitar la hidratación del APS se recomienda guardarlo en ambientes secos asegurando la tapa con lámina extensible de parafina.

7.4

BROMURO DE ETIDIO

7.4.1

La solución de trabajo (1 µg/mL) debe tener un color casi transparente. Una vez preparada la solución, forrar el frasco con papel aluminio y rotular.

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7.4.2

La calidad del bromuro de etidio puede ser verificado visualizando concentraciones de ADN desde 50 pg (Sección 6.3) en un gel de agarosa incubado durante 5 minutos. La visualización de la mínima concentración de ADN permitirá determinar la calidad óptima del bromuro de etidio.

7.4.3

El contacto de este reactivo con la luz puede ocasionar la pérdida de sus propiedades fluorescentes por lo que se recomienda incubar los geles en oscuridad.

7.5

AGAROSA

7.5.1

La continua licuación de la agarosa incrementa su concentración por deshidratación alterando el perfil de las bandas al final del resultado. Por lo tanto, se recomienda preparar soluciones de agarosa en volúmenes no mayores de 200 mL y verificar constantemente la turbidez de la agarosa antes de la preparación del gel.

7.5.2

De otro lado también se recomienda, verificar la presencia de residuos extraños en la solución ya que pueden interferir con el análisis del resultado final y con la electroforesis misma. Por lo tanto, será necesario preparar una nueva solución a fin de superar este inconveniente.

7.6

POLIACRILAMIDA AL 30% Esta solución de trabajo debe ser renovada cada mes debido a que la constante exposición a la luz y el cambio de temperatura fácilmente deterioran su calidad.

7.7

AGUA DESTILADA

7.7.1

En biología molecular la calidad del agua (grado de pureza) es imprescindible para obtener óptimos resultados en cada experimento. En ese sentido, se recomienda preparar tanto los buffers para proteína y ADN, así como también para los geles de poliacrilamida y agarosa con agua bidestilada. Si el investigador cuenta con un equipo de destilación asegúrese que el agua presente una resistividad eléctrica dentro de un rango de 10 a 18 Meghoms (rango por el cual existe una mínima concentración de iones y cationes de agua, lo cual indica un alto grado de pureza).

7.8

EQUIPOS DE LABORATORIO

7.8.1

Los equipos que se usan en biología molecular deben pasar por un proceso de mantenimiento preventivo continuo por lo menos una vez al año. Este proceso deberá ser realizado por personal técnico altamente capacitado o de preferencia por representantes de la misma compañía fabricante.

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SECCIÓN 8 REGISTROS Y ARCHIVOS Para llevar a cabo el registro y archivo de resultados finales es importante seguir los siguientes pasos: 8.1

Para conservar los resultados en el cuaderno de trabajo a partir de un gel de agarosa visualizado con la luz UV, tomar una fotografía con una cámara fotográfica resistente a este tipo de luz.

8.2

En caso de no ser posible tomar una fotografía, tratar de dibujar con un lápiz el resultado lo más parecido posible a lo que se observa. De manera alternativa, usar un forro de plástico para cuaderno, colocarlo sobre la lámina de protección de luz UV y dibujar el gel con un marcador para vidrio.

8.3

Para la conservar los resultados a partir de geles de poliacrilamida para ADN, el proceso puede realizarse usando una cámara fotográfica. Sin embargo, es posible recurrir a la tinción con plata y secar el gel para su posterior análisis y registro. Para el caso de proteínas teñidas con azul brillante de ccomasie también se recomienda secar el gel.

8.4

Registrar los resultados obtenidos siguiendo el Esquema N° 1.

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ESQUEMA N° 1 RESULTADOS EXPERIMENTO N°_________ FECHA: _______________ OBJETIVO DEL EXPERIMENTO: _____________________________________________________________________________ CONCENTRACIÓN DEL GEL: CARRIL 1: _________________________________ CARRIL 2: _________________________________ CARRIL 3: _________________________________ CARRIL 4: _________________________________ CARRIL 5: _________________________________ CARRIL 6: _________________________________ CARRIL 7: _________________________________ CARRIL 8: _________________________________ CARRIL 9: _________________________________ CARRIL 10: _________________________________ CARRIL 11: _________________________________ CARRIL 12: _________________________________ CARRIL 13: _________________________________ CARRIL 14:_________________________________ OBSERVACIONES: __________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________________________ ___________________________________________

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ANEXOS ANEXO A A.1

PREPARACIÓN DE SOLUCIONES PARA ELECTROFORESIS DE PROTEÍNAS

A.1.1

BUFFER DE LA MUESTRA 4X PARA PROTEÍNAS Reactivos Tris 0,5 M, pH 6,8 SDS al 10 % 2-Mercaptoetanol Glicerol Azul de bromofenol

2,5 mL 2,5 mL 2,5 mL 2,5 mL 1 mg

Concentración final 0,125 M 2.5 % 25 % 25 % 0,1 mg/mL

Mezclar los componentes arriba mencionados. A.1.2

BUFFER DE ELECTROFORESIS TRIS-GLICINA 10X PARA PROTEÍNAS Reactivos STris base Glicina SDS

3,038 gr 15,01 gr 1 gr

Concentración final 0,25 M 2M 1%

Completar con 100 mL de agua bidestilada. A.1.3

SOLUCIÓN DE TRABAJO ACRILAMIDA/BISACRILAMIDA AL 30% Reactivos Acrilamida Bisacrilamida Mezcla total

29,2 gr 0,8 gr 30 gr

Concentración final 29,2% 0,8% 30%

Disolver con 100 mL de agua bidestilada. Filtrar para remover las impurezas en papel Whatman N° 1 y forrar el recipiente con papel aluminio o kraft. A.1.4

BUFFER TRIS 1,5 M pH= 8,8 Pesar 181,65 g de tris base y enrasar con agua bidestilada hasta un volumen de 1 L. Ajustar a pH= 8,8 con HCl.

A.1.5

BUFFER TRIS 0,5 M pH=6,8 Pesar 60,55 g de tris base y enrasar con agua bidestilada hasta un volumen de 1 L. Ajustar a pH = 6,8 con HCl.

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A.1.6

PERSULFATO DE AMONIO (APS 10%) Pesar 100 mg y diluir en un volumen final de 1 mL con agua tridestilada. Este reactivo en polvo es altamente hidrofílico, por lo tanto, es importante mantener el envase herméticamente cerrado. Esta preparación debe ser de 1 semana de antigüedad como máximo.

A.1.7

BUTANOL-AGUA Mezclar un volumen de butanol más un volumen de agua destilada y mezclar. Tomar la fase superior de la mezcla.

A.1.8

PREPARACIÓN DE GELES POLIACRILAMIDA DE RESOLUCIÓN DE ACUERDO A SU CONCENTRACIÓN Y VOLUMEN COMPONENTES DE LA SOLUCIÓN

VOLUMEN FINAL DE LA SOLUCIÓN

GEL AL 6 Agua bidestilada Acrilamida/bisacrilamida 30% Tris 1,5 m pH 8,8 SDS 10% Persulfato de amonio 10% TEMED COMPONENTES DE LA SOLUCIÓN GEL AL 8% Agua bidestilada Acrilamida/bisacrilamida 30% Tris 1,5 m pH 8,8 SDS 10% Persulfato de amonio 10% TEMED GEL AL 10% Agua bidestilada Acrilamida/bisacrilamida 30% Tris 1,5 m pH 8,8 SDS 10% Persulfato de amonio 10% TEMED

10 mL 5,3 2,0 2,5 0,1 0,05 0,05 10 mL

15 mL 7,9 3,0 3,8 0,15 0,075 0,0075 15 mL

20 mL 10,6 4,0 5,0 0,2 0,1 0,01 20mL

2,3 1,3 1,3 0,05 0,025 0,0025

4,6 2,7 2,5 0,1 0,05 0,05

6,9 4,0 3,8 0,15 0,075 0,0075

9,3 5,3 5,0 0,2 0,1 0,01

1,9 4,0 5,9 7,9 1,7 3,3 5,0 6,7 1,3 2,5 3,8 5,0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,025 0,05 0,075 0,1 0,0025 0,05 0,0075 0,01 VOLUMEN FINAL DE LA SOLUCIÓN

GEL AL 12% Agua bidestilada Acrilamida/bisacrilamida 30% Tris 1,5 m pH 8,8 SDS 10% Persulfato de amonio 10% TEMED

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5 mL 2,6 1,0 1,3 0,05 0,025 0,0025 5 mL

1,6 2,0 1,3 0,05 0,025 0,0025

44

3,3 4,0 2,5 0,1 0,05 0,05

4,9 6,0 3,8 0,15 0,075 0,0075

6,6 8,0 5,0 0,2 0,1 0,01



GEL AL 15% Agua bidestilada Acrilamida/bisacrilamida 30% Tris 1,5 m pH 8,8 SDS 10% Persulfato de amonio 10% TEMED A.1.9

1,1 2,5 1,3 0,05 0,025 0,0025

3,4 7,5 3,8 0,15 0,075 0,0075

4,6 10,0 5,0 0,2 0,1 0,01

PREPARACIÓN DE GELES DE EMPACAMIENTO AL 5% DE ACUERDO A SU VOLUMEN COMPONENTES DE LA SOLUCIÓN Agua bidestilada Acrilamida/bisacrilamida 30% Tris 1,5 m pH 8,8 SDS 10% Persulfato de amonio 10% TEMED

A.1.10

2,3 5,0 2,5 0,1 0,05 0,05

3 mL 1,1 2,5 1,3 0,05 0,025 0.0025

4 Ml 2,3 5,0 2,5 0,1 0,05 0.05

6 mL 3,4 7,5 3,8 0,15 0,075 0.0075

8 mL 4,6 10,0 5,0 0,2 0,1 0.01

SOLUCIÓN DE TRABAJO DE AZUL BRILLANTE DE COMASIE R250 Disolver 0,25 g de azul brillante de coomasie R250 en 90 mL de metanol:H2O (v/v 1:1) y 10 mL de ácido acético glacial. Filtrar la solución a través de un papel Whatman N° 1 para eliminar los residuos extraños. Antes de usar dejar en reposo por una semana en un frasco oscuro.

A.1.11

SOLUCIÓN DE DECOLORACIÓN RÁPIDA Mezclar 10 mL de ácido acético glacial con 50 mL de metanol. Llevar la solución a 100 mL con 40 mL de agua destilada.

A.1.12

SOLUCIÓN DE DECOLORACIÓN LENTA Mezclar 10 mL de ácido acético glacial con 5 mL de metanol. Llevar la solución a 100 mL con 85 mL de agua destilada.

A.1.13

SOLUCIÓN GLICEROL METANOL Mezclar 4 mL de glicerol con 45mL de metanol. Llevarlo a un volumen de 100 mL de agua destilada.

A.1.14

SDS 10% Disolver 10 g de SDS en 80 mL de agua bidestilada, una vez disuelto se lleva a pH 7,2 con 10 N de NaOH, finalmente se completa hasta 100 mL con agua bidestilada. Calentar a 68° C para disolver completamente el SDS.

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A.2

PREPARACIÓN DE SOLUCIONES PARA ELECTROFORESIS DE ADN

A.2.1

BUFFER DE RESOLUCIÓN STOCK TRIS-BORATO (TBE) 5X Reactivo Tris base Ácido bórico EDTA 0,5M Ph 8,0

Cantidad 54 g 27,5 g 20 Ml

Concentración final 0,45 M 0,45 M 0,01 M

Llevar a un volumen de un litro con agua bidestilada A.2.2

BUFFER DE RESOLUCIÓN STOCK TRIS-ACETATO (TAE) 50X Preparar: Reactivo Tris base Ácido acético glacial EDTA 0,5M Ph8,0

Cantidad 242 g 571 Ml 100 Ml

Concentración final 1,9 M 57,1% 0,05 M

Cantidad 25 mg 25 mg 4g

Concentración final 0,25% w/v 0,25% w/v 40% w/v

Completar con 1 Litro de agua bidestilada A.2.3

BUFFER DE MUESTRA PARA ADN (6X) Preparar: Reactivo Azul de bromofenol Xilene cianol FF Sucrosa Disolver en 10 mL de TAE 1X

A.2.4

PREPARACIÓN DE GELES DE POLIACRILAMIDA PARA ADN Mililitros de reactivo para la preparación de geles a varias concentraciones (Volumen final 100 mL) Reactivos

3,5%

5,0%

8,0%

10%

12,0%

20%

11,6

16,6

26,6

33,3

40,0

66,6

Agua bidestilada

67,7

62,7

52,7

46,0

39,3

12,7

TBE 5X

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

APS

0,7

0,7

0,7

0,70

0,7

0,7

Acrilamida/bisacrilamida al 30%

Añadir 35 µL de TEMED por cada 100 mL de solución. MPR-CNSP-016

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A.2.5

AGAROSA 0,8%, 1,5% Y 2% Disolver 0,8 g, 1,5 g ó 2 g de agarosa en 98 mL de agua bidestilada. Adicionar a la solución 2 mL de TAE 50X, homogeneizar y disolver la agarosa en horno microondas o en baño María.

A.2.6

SOLUCIÓN STOCK DE BROMURO DE ETIDIO (10mg/mL) Nota: El bromuro de etidio es un agente cancerígeno y moderadamente tóxico. Usar guantes para manipular este reactivo Pesar 100 mg de bromuro de etidio en 10 mL de agua bidestilada. Forrar el recipiente con papel aluminio u otro que impida el paso de la luz.

A.2.7

SOLUCIÓN DE TRABAJO DE BROMURO DE ETIDIO (1 µg/mL) Diluir 100 µL de bromuro de etidio a partir de la solución stock en 100 mL de agua bidestilada. Forrar el recipiente con papel aluminio u otro que impida el paso de la luz.

A.2.8

SOLUCIÓN DE FIJACIÓN/ DETENCIÓN AL 10% PARA TINCIÓN CON PLATA Mezclar 10 mL. de ácido acético glacial y 90 mL de agua bidestilada.

A.2.9

SOLUCIÓN DE TINCIÓN CON PLATA Disolver 0,1 gr de nitrato de plata en 80 mL de agua, agregar 150 µL de formaldehído al 37%, completar la solución hasta 100 mL.

A.2.10

SOLUCIÓN DE REVELADO PARA TINCIÓN CON PLATA Disolver 3 gr de carbonato de sodio (Na2CO3) en 100 mL de agua bidestilada. Dejar enfriar Agregar 150 µL de formaldehído al 37% y 1 mg de tiosulfato de sodio pentahidratado segundos antes de ser usado.

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ANEXO B B.1

UNIDADES Y FÓRMULAS

B.1.1

EQUIVALENCIAS DE VALORES EN PESO 1 mg = 10-3 g 1 µg = 10-6 g 1 ng = 10-9 g 1 pg = 10-12 g 1Kb de ADN equivale a 333 aminoácidos de capacidad codificante = 37,000 Daltons

B.1.2

VALORES PARA CUANTIFICAR ADN Y ARN Una unidad de densidad óptica (OD) a 260 nm de ADN de cadena doble= 50 µg Una unidad de densidad óptica (OD) a 260 nm de ADN de cadena simple= 37 µg Una unidad de densidad óptica (OD) a 260 nm de ARN de cadena simple= 40 µg

B.1.3

Rango de movilidad del ADN, xilene cianol y azul de bromofenol por diferentes concentraciones de geles de poliacrilamida Rango de separación efectiva en pb

Acrilamida (% peso/volumen) 3,5 5,0 8,0 12,0 15,0 20,0

1000 - 2000 80 - 500 40 - 200 60 - 400 25 - 150 6 - 100

Xilene Cianol FF (*)

Azul de bromofenol (*)

460 260 160 70 60 45

100 65 45 20 15 12

(*) Los números dados son los tamaños aproximados en pares de bases de fragmentos de ADN de cadena doble con lo cual los colorantes migran en conjunto (Fuente: Sambrook et. al., 1989) B.1.4

RANGO DE SEPARACIÓN DEL ADN EN GELES QUE CONTIENEN DIFERENTES CONCENTRACIONES DE AGAROSA (FUENTE: SAMBROOK et. al., 1989) Concentración de agarosa en gel (% [w/v]) 0,3 0,6 0,7 0,9 1,2 1,5 2,0

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Eficiente rango de separación de ADN lineal en Kilopares de bases (Kb) 5 - 60 1 - 20 0,8 - 10 0,5 - 7 0,4 - 6 0,2 - 3 0,1 - 2

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B.1.5

RANGO DE SEPARACIÓN DE PROTEÍNAS EN GELES QUE CONTIENEN DIFERENTES CONCENTRACIONES DE POLIACRILAMIDA (RADIO 29:1 DE ACRILAMIDA/ BISACRILAMIDA) Concentración de poliacrilamida (%)

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Rango lineal de separación en Kilodaltons (kDa)

15

12 - 43

10

16 - 68

7,5

36 - 94

5,0

57 - 212

50



ANEXO C C.1

MEDIDAS A SEGUIRSE EN CASO DE CONTACTO ACCIDENTAL CON REACTIVOS TÓXICOS En casi todos los casos en los que se tiene contacto con los reactivos que se mencionan en la lista adjunta, es importante seguir los siguientes pasos como medida de emergencia:

•

Si el reactivo hizo contacto con los ojos, lavar con abundante agua por espacio de 15 a 20 minutos hasta que no haya evidencia de restos del reactivo. Si el contacto fue en la piel, lavar con jabón y abundante agua.

•

Si hubo inhalación, trasladarse inmediatamente hacia un área donde haya aire fresco.

•

Recibir asistencia médica inmediatamente.

C.2

LISTA DE REACTIVOS USADOS EN ELECTROFORESIS CON SUS CARACTERÍSTICAS TÓXICAS Y QUÍMICAS

REACTIVO

CARACTERISTICA

Acido acético glacial Acido bórico

Irritante por inhalación, corrosivo. Dañino por inhalación o por contacto con la piel. Irrita los ojos, sistema respiratorio y piel. Posible riesgo de efecto irreversible. Posible teratógeno. Puede causar daño al sistema nervioso central. Neurotóxico, cancerígeno, genera daño genético heredable. No se reporta algún grado de toxicidad. Puede ocasionar asfixia por inhalación. Neurotóxico, nocivo e inflamable. Genera daño genético heredable, irrita los ojos el sistema respiratorio y la piel. Nocivo. Tóxico, nocivo, puede causar severa irritación a las vías respiratorias, piel y ojos. Nocivo. Irrita ojos y piel. No se reporta algún grado de toxicidad. Tóxico por inhalación o contacto con la piel, genera severa irritación. Tóxico e inflamable. Corrosivo, inflamable, nocivo por inhalación, produce quemaduras en la piel. No se reporta algún grado de toxicidad. Corrosivo, inflamable, nocivo por inhalación, produce quemaduras en la piel. Posible cancerígeno, produce irritación al sistema respiratorio y piel. Irrita ojos, piel y sistema respiratorio.

Acrilamida Agarosa Azul de bromofenol Bisacrilamida Bromuro de etidio Butanol Dodecil sulfato de sodio (SDS) EDTA Glicerol Glicina Mercaptoetanol Metanol Persulfato de amonio Sucrosa TEMED Tris Xilene cianol

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Posible(s) causa (s) Solución (es)

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Medir el pH del buffer. Volver a preparar el buffer con los reactivos adecuados y si es posible volver a preparar la solución stock 10X. Evaluar la precisión de los instrumentos de medición (probetas, pipetas, etc.). Disminuir voltaje. Preparar nueva solución de trabajo.

Buffer de electroforesis se calienta excesivamente Alta concentración de sales (mayor de 1X de concentración)pH del buffer menor de 8.Preparación (por encima de los 60° C). del buffer de electroforesis con Tris-HCl en lugar de Tris-Base.Buffer viejo usado varias veces

Preparar geles más delgados de tal manera que se pueda visualizar el color del recipiente que lo contiene a través de ellos. Manipular las proteínas en frío. Todo procedimiento que involucre manipulación del ADN como de proteínas debe realizarse con guantes.

Las bandas de ADN no se ven nítidamente en el Gel de agarosa muy grueso. gel. Bromuro de etidio muy diluido.

Manchas indefinidas o difusas de proteína/ADN a Degradación de la proteína/ADN. lo largo de todo el gel. Efecto "smearing".

Solución (es)

Para evitar cualquier tipo de fuga del buffer localizar el lugar de escape y untar con una capa mediana de vaselina.

Se pierde volumen del buffer de la cámara de Fuga de buffer. electroforesis durante la corrida.

Posible(s) causa (s)

Preparar nueva solución de trabajo de APSMezclar los componentes de tal manera que no se generen burbujas. Preparar nueva solución de acrilamida/ bisacrilamida.

Deficiente polimerización de los geles de Solución de trabajo de persulfato de amonio (APS) al 10% con más de una semana de antigüedad. poliacrilamida. Poliacrilamida con más de un mes de antigüedad. Presencia de burbujas en la solución.

Problema

Calentar las muestras a 100°C antes de colocarlas en los pozos. No diluir mucho el buffer de la muestra con la muestra propiamente dicha. Volver a preparar buffer de la muestra.

Muestra no cae eficientemente y se difunde en el Muestras de proteínas no fueron calentadas a 100° buffer de electroforesis en el momento que es C antes de ser depositadas en el gel de agarosa.Buffer de la muestra tiene baja depositada en el pocillo. concentración de glicerol o sucrosa en el medio.

Pocillos de los geles de poliacrilamida mal Mala homogeneización del APS y el TEMED en la Realizar la mezcla del APS y el TEMED con polimerizados. solución de poliacrilamida.APS al 10% con más de movimiento de rotación lento y suave sin hacer una semana de antigüedad. burbujas. Preparar nueva solución de trabajo de APS al 10%

Problema


ANEXO D

PROBLEMAS MÁS COMUNES PRESENTES DURANTE LOS PROCEDIMIENTOS DE ELECTROFORESIS



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ANEXO E E.1

EJERCICIOS RESUELTOS PARA LA PREPARACIÓN DE SOLUCIONES

E.1.1

Preparar 500 ml de Buffer TAE 1X a partir de una solución stock de TAE 50X Solución Si se toma un volumen inicial de la solución stock concentrada 50X de buffer TAE para diluirla con agua hasta obtener 500 mL de buffer TAE concentrado a 1X. ¿Cómo calcular dicho volumen? Se tiene los siguientes datos: Volumen inicial 1 (V1)= ? Concentración inicial 1 (C1) = 10X Volumen final 2 (V2)= 500 mL Concentración final 2 (C2) = 1X Aplicando el siguiente factor de dilución: V1 x C1 = C2 x V2 y reemplazando valores se tiene: V1(50X) = (1X)(500 mL) Despejando V1 y cancelando el factor X nos queda: V1= 10 mL Rp.- Debemos tomar 10 mL de TAE 50 X y llevarlo hasta 500 mL con 490 mL de agua bidestilada

E.1.2

Preparar 250 mL de agarosa al 1,5% en TAE 1X Solución Calcular cuanto de agarosa debemos pesar y qué volumen de TAE 50X emplear para un volumen final de 250 mL de agarosa al 1,5%. Calculando el peso de la agarosa. Cuando nos referimos a agarosa al 1,5% decimos que 1,5 g de agarosa deben estar contenidos en 100 mL de volumen total de TAE 1X. En consecuencia si 1,5 g es para 100 mL x g será para 250 mL Por regla de tres simple x = 1,5g x 250 mL = 3,75 g 100 mL Calculando volumen de TAE 50X: Recordando el factor de dilución: V1 x C1 = C2 x V2 El volumen inicial:

V1 = (1X)(250 mL) 50X

V1 = 5 mL Rp.- Pesar 3,75 g de agarosa, luego añadir 5 mL de TAE 50X y llevar toda la mezcla a un volumen de 250 mL con agua bidestilada. MPR-CNSP-016

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E.1.3

Preparar 450 mL de buffer TBE 1X a partir de un stock de 10X Solución Empleando la fórmula conocida: V1 x C1 = C2 x V2 V1 = (1X) (450 mL) 10X V1 = 45 mL Rp.- Usaremos 45 mL de TBE 10 X para preparar 450 mL de TBE 1X

E.1.4

Preparar 100 mL de bromuro de etidio a una concentración de 1µg/µl a partir de una solución stock de 10 mg/mL. Solución En este caso también usar la fórmula: V1 x C1 = C2 x V2 ..................................(1) Donde: V1 = ?, C1 = 10 mg/mL, V2 = 100 mL, C2 = 1 µg/µL Convirtiendo 10 mg/mL a µg/µL: En 10 mg hay 10 000 µg. En 1 mL hay 1000 µL. Dividiendo: 10 000 µg = 10 µg/µL = C1 1000 µL Reemplazando en (1) V1 (10 µg/µL) = (1 µg/µL)(100 mL) V1 = 10 mL Rp.- Se necesita un volumen de 10 mL de stock de bromuro de etidio (10 mg/mL) para diluirlo con 990 mL de agua bidestilada.

E.1.5

Preparar 50 mL de una solución de EDTA al 0,5M. El peso molecular del EDTA es de 336,2 g/Mol Solución El EDTA es un agente quelante cuya presentación comercial es en forma de polvo. En consecuencia, debemos calcular cuanto de EDTA debemos pesar para preparar una solución de 0,5 M. Aplicando la siguiente fórmula: W = M x PM x V.........................(a) Donde: W = es el peso que queremos calcular expresado en gramos, PM= corresponde al peso molecular del compuesto compuesto en g/Mol y V = Volumen expresado en litros. Datos: PM del EDTA = 336,2 g/Mol. Molaridad = M = 0,5M = 0,5 Moles/Litro. Volumen EDTA que se quiere preparar = 50 mL. Convirtiendo 50 mL a litros (Lt): 1 Lt contiene 1000 mL x Lt habrá en 50 mL

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Aplicando regla de tres simple: x = (50 mL) (1Lt) = 0,05 Lt 1000 mL Reemplazando y despejando unidades(a): W = (0,5Moles) (336,2g) (0,05 Lt) Lt Moles W = 8,405 g Rp.- Diluir 8,405 g de EDTA en 50 mL de agua para preparar una solución 0,5 M de EDTA. E.1.6

Preparar 10 mL de una solución de butanol-agua en proporción 1:1 Solución Cuando se refiere a una proporción 1:1 significa que se debe realizar una mezcla de volúmenes proporcionalmente iguales entre ambas soluciones. Así tenemos: Butanol = 5 mL Agua = 5 mL Volumen final 10 mL Rp.- Mezclar 5 mL de butanol más 5 mL de agua.

E.1.7

¿Qué volumen de una solución stock de Tris 5M pH = 8,8 se necesita para preparar un volumen de 250 mL Tris-HCl de Buffer Tris 1,5M pH= 8,8? Solución Aplicando la fórmula y reemplazando valores: V1 x C1 = C2 x V2 (V1 ) (5M) = (1,5M) (250 mL) V1 = 75 mL Rp.- Se necesita un volumen de 75 mL de Tris 5M pH= 8,8.

E.1.8

¿Cuánto de acrilamida y bisacrilamida se necesita para preparar 100 mL de una solución al 30% si se desea mantener una proporción de 29:1 de acrilamida:bisacrilamida respectivamente? Solución La proporción 29:1de acrilamida/bisacrilamida indica que son 29 partes de acrilamida sobre 1 de bisacrilamida. Asimismo, nos indica que la concentración final de la solución será de 30%, es decir 30 partes de la mezcla en un total de 100 partes de la solución. Así tenemos: 29:1 = 29 g de acrilamida + 1g de bisacrilamida. Volumen final = 100 mL Rp.- Se necesitan 29 g de acrilamida y 1 g de bisacrilamida.

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ANEXO F F.1

PAGINAS WEB RECOMENDADAS

F.1.1

ELECTROFORESIS EN GENERAL:

•

DNA Electrophoresis. http://www.protocol-online.net/molbio/DNA/dna_electrophoresis.htm. Polyacrilamide gel electrophoresis (Page): http://archive.uwcm.ac.uk/uwcm/mm/page.html#sds_bact Electroforesis vertical: http://matematicas.udea.edu.co/~carlopez/cnq533/ELECTROFORESIS_VERTICAL.pdf Electrophoresis lecture notes. http://www.tulane.edu/~wiser/methods/handouts/elect.PDF. Electrophoresis. Agarose gel electrophoresis of PCR products. En: Rob Cruickshank's Protocol Book. http://taxonomy.zoology.gla.ac.uk/~rcruicks/pb.html Gustafsson J, Blomberg A, Rudemo M (2001). Warping two-dimensional electrophoresis gel images to correct for geometric distortions of the spot pattern. http://www.math.chalmers.se/Math/Research/Preprints/2001/73.pdf

• • • • •

F.1.2

BIOSEGURIDAD:

• •

ORS chemical safety. Decontamination of Ethidium Bromide. http://www.northwestern.edu/research-safety/chem/ethid2.htm Sinclair Bob. An Eye for a Dye. Safe and sensitive new stains replace ethidium bromide for routine nucleic acid detection. (2000) The Scientist 14[8]:31. Pag Web: http://www.the-scientist.com/yr2000/apr/profile_000417.html(Previa subscripción gratutita)

F.1.3

UNIDADES Y FÓRMULAS:

•

Roe, B. Units and formulas. Department of Chemistry and Biochemistry, The University of Oklahoma, Norman, Oklahoma 73019 [email protected]. http://www.genome.ou.edu/protocol_book/protocol_adxG.html

F.1.4

PROTEÓMICA:

•

Introduction to Proteomics. Pág. Web: http://www.bb.iastate.edu/~chitnis/joe/papers/wilder.html

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ARTES Y DISEÑOS LASER S.R.Ltda. Calle Las Turquesas 263-265-269 Balconcillo Lima 13 - Perú Telf.: 265-8320 Telefax: 266-0075 Setiembre 2003 Tiraje: 3,000 ejemplares

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INSTITUTO NACIONAL DE SALUD SEDE CENTRAL Cápac Yupanqui N° 1400, Jesús María Lima 11, Apartado N° 451 Telf.: (51-1) 471 9920 - Fax: (51-1) 471 0179 E-mail: [email protected] Página Web: www.ins.gob.pe

Manual de Electroforesis de Proteinas

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