MANEJO DE
MICROPIP ETAS
MANEJO DE MICROPIPETAS
MAYRA ALEJANDRA BALLESTA RIVERO ANDRES FELIPE JATTIN PINTO MEYKER JHOZ TORDECILLA FLOREZ
PEDRO M. VALENCIA MOVILLA Docente
UNIVERSIDAD DE CÓRDOBA FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD DEPARTAMENTO DE BACTERIOLOGA ASIGNATURA CITOGEN!TICA MONTERA CÓRDOBA "#
%$INTRODUCCIÓN
La micropipeta es un instrumento de laboratorio empleado para absorber y transferir pequeños volúmenes de líquidos y permitir su manejo en las distintas técnicas cientícas. Los volúmenes captables por estos instrumentos varían según el modelo: los más abituales! denominados p"#! p"## y p$###! admiten un má%imo de "#! "## y $### &l! respectivamente. 's de destacar que el uso de micropipetas permite emplear distintos líquidos sin tener que lavar el aparato: para ello! se emplean puntas desecables! de plástico! que abitualmente son estériles. '%isten varios tipos de puntas: por ejemplo! las amarillas para pipetear volúmenes pequeños (por ejemplo! $# &l)! y las a*ules para pipetear volúmenes grandes (por ejemplo! +## &l). '%isten micropipetas manuales! en las que el volumen a aspirar se ja girando un bot,n en su parte superior que está conectado a un sistema anal,gico de conrmaci,n de volumen! y automáticas! en las cuales dico sistema es digital. -ay micropipetas simples! que s,lo acogen una punta cada ve*! y multicanales! que permiten incorporar múltiples puntas (por ejemplo! oco)! absorbiendo el mismo volumen en todas ellas. Las e%igencias impuestas a las pipetas an aumentado continuamente en los ltimos años dada la tendencia a usar volúmenes cada ve* más pequeños. /ontroles gravimétricos peri,dicos y un ajuste de las micropipetas! son requisitos fundamentales de los modernos sistemas de garantía de calidad.
OBJETIVOS GENERAL
0plicar los diferentes requerimientos y normas en el manejo de las pipetas en general que permita seleccionar la pipeta o micropipeta a utili*ar según el volumen a dispensar.
ESPECFICOS
0prender el correcto uso de las micropipetas
/onocer los diferentes tipos de micropipetas que e%isten
1alorar la importancia del empleo de micropipetas! a la ora de dispensar pequeños volúmenes (2l).
MARCO TEÓRICO
MEDICIÓN DE VOL&MENES CON PIPETAS Y MICROPIPETAS
Las mediciones y transferencias de volúmenes e%actos y precisos son requisitos básicos en los laboratorios de análisis. 'stos procedimientos son ecos utili*ando instrumentos como las pipetas manuales! las micropipetas! las buretas! las probetas o los balones de aforar. /ada uno de ellos cumple una funci,n en particular dentro del laboratorio pero en algunos casos estas funciones pueden sobreponerse. 'l grado de precisi,n de los mismos puede variar considerablemente así que la escogencia del instrumento a utili*ar para reali*ar una medici,n en particular es un paso crítico para obtener el resultado esperado. USO CORRECTO DE LAS PIPETAS.
'%isten básicamente dos tipos de pipetas manuales: aquellas para contener y aquellas para verter. 0quellas para contener deben ser enjuagadas con el solvente después de aber dispensado la soluci,n en cuesti,n. 'stas pipetas contienen un volumen e%acto de líquido! el cual debe ser transferido completamente para que la medida sea precisa. 0lgunas pipetas de contener de uso común en el laboratorio tienen nombres particulares como 3icro45olin! 6ali para medici,n de emoglobina! 7ir8 3icro! 9ite4lac8 Lambda entre otros.
5igura $. ;ipos de pipetas de verter: de soplar (0) y no de soplar (). st?ald45olin o pipetas serol,gicas. 'stas pipetas pueden ser distinguidas fácilmente ya que sus graduaciones de escala se e%tienden asta la punta de la pipeta. 0demás! poseen uno o dos anillos esmerilados cerca de la boquilla. 'l otro tipo de pipeta para verter es aquella que no se sopla ya que está calibrada entre dos marcas que no incluyen la punta. @or lo tanto! estas pipetas nunca deben soplarse sino que el volumen a dispensar debe ser regulado manualmente de forma tal que el líquido a dispensar se encuentre entre una marca y otra. 0lgunos nombres comunes que reciben este tipo de pipetas son: pipeta volumétrica! tipo 3or o bacteriol,gica T!CNICA DE PIPETEO.
'l primer paso de una buena técnica de pipeteo es seleccionar la pipeta más apta para el volumen que se desea medir. 's precisamente este volumen el que determina la pipeta a utili*ar: el volumen a pipetear debe ser lo más cercano posible a la capacidad má%ima de la pipeta. 0demás! debe considerarse que el volumen mínimo que una pipeta puede dispensar con precisi,n es apro%imadamente el $# A de su capacidad. Bna ve* seleccionada la pipeta! es necesario cerciorarse qué tipo de pipeta es! si es de soplar o no. 's imperativo que familiari*arse con estos tipos de pipetas y sus escalas. 'l siguiente paso es ajustar en la boquilla de la pipeta el dispositivo que se utili*ará para crear vacío y succi,n. 'n este caso utili*aremos la pera de ule! cuyo funcionamiento se describe en la leyenda.
5igura ". =ispositivo tipo pera para crear vacío y succi,n en la pipeta. 'sta pera de ule cuenta con tres puntos rotulados con Cecas o 0! y / o $! " y D. 0l ejercer presi,n manual en uno de esos puntos! un balín interno permitirá la entrada o salida de aire para que la pipeta pueda succionar (0) o dispensar () el líquido que contiene. 'l punto / o D es útil para dispensar la última gota en aquellas pipetas que son de soplar (/). 'l uso correcto de este dispositivo requiere de práctica para ajustar la fuer*a manual que debe usarse para ejercer presi,n. 6i en algún momento su pera se umedece con el líquido a dispensar! dejará de funcionar pues no se podrá ejercer vacío. @ara proceder! es necesario secar antes bien la pera. La pipeta se debe llenar asta un poco más arriba del inicio de la graduaci,n de la escala y luego poco a poco se ajusta! frente a los ojos y en posici,n vertical! al punto e%acto de graduaci,n de la escala (generalmente #). Eecuerde que para líquidos transparentes! el fondo del menisco del líquido se ajusta a la graduaci,n! mientras que para líquidos no transparentes! los e%tremos del menisco se ajustan a la graduaci,n de la escala. Bna ve* ajustado el volumen! la pipeta conteniendo el líquido a dispensar es transferida al recipiente donde se depositará el líquido. 'n este momento se presiona la pera suavemente en el punto que permitirá la salida del líquido! manteniendo la pipeta en posici,n vertical y con la punta de la misma descansando en el recipiente. Bna ve* dispensado el volumen! se retira la pera y la pipeta se descarta cuidadosamente! con la punta acia abajo en el recipiente para descartar pipetas. 6i por algún motivo debe volver a utili*ar una pipeta en la misma soluci,n en la que fue utili*ada! es recomendable dejar la pipeta en posici,n ori*ontal sobre la mesa de trabajo! con la punta de la misma unos centímetros fuera del borde de la mesa. USO CORRECTO DE LAS MICROPIPETAS.
Las micropipetas son dispositivos que permiten medir volúmenes pequeños que van desde $ &l asta $ ml o más. 0l igual que las pipetas éstas pueden ser para contener o para verter volúmenes. =urante el curso utili*aremos micropipetas para verter! ya sea un volumen jo o un volumen variable. 'n las de volumen variable! se puede seleccionar un volumen dentro de un rango de valores determinado. La micropipeta más comúnmente usada en los laboratorios de análisis fue introducida por la compañía 'ppendorf y este nombre se adopt, de forma genérica para estos dispositivos! aunque oy en día e%isten una gran cantidad de compañías y modelos similares que funcionan bajo un mismo principio de pistones para operar. @or lo tanto! es aconsejable consultar las instrucciones del fabricante sobre el empleo correcto de cada modelo. 6in embargo! todas ellas utili*an puntas o FtipsG descartables plásticos que se ajustan al e%tremo de la micropipeta. 'n estas puntas de plástico es donde se deposita el líquido a medir.
5igura D. 'squema general de las micropipetas marca ioEad. 0$: bot,n pulsador! 0": tornillo del bot,n pulsador! : rueda dentada de graduaci,n del volumen! /: cono de la pipeta! =: e%pulsor de punta y ': punta o FtipG descartable. ;omado del manual de manejo de micropipetas iorad! EH#IH#J. @ara absorber el líquido! el pist,n es presionado asta una primera posici,n! el tip es puesto en contacto con el líquido y luego! lentamente! se permite que el pist,n vuelva a su posici,n original. 'ste paso permite el llenado del tip con el volumen correspondiente. 'l tip de plástico
generalmente no se seca por fuera ya que se considera que su supercie no absorbe líquido. 0 continuaci,n se describen las instrucciones especícas para los modelos de micropipetas. $. 6elecci,n de la micropipeta a utili*ar según el volumen a dispensar. @ara este paso! se aplican las mismas reglas que se utili*an para el manejo de las pipetas. 'l /uadro J muestra los rangos de volúmenes que se pueden pipetear con cada modelo de micropipeta de la marca iorad! además de Los usos más comunes. La mayoría de la micropipetas indican en el bot,n pulsador el rango o volumen má%imo que pueden pipetear. @ara prevenir un daño en el mecanismo interno de la micropipeta recuerde nunca sobrepasar los volúmenes má%imos permitidos para cada micropipeta.
CUADRO '. MODELO( RANGO DE VOL&MENES Y APLICACIONES M)S COMUNES DE LAS MICROPIPETAS MARCA BIORAD. MODELO
RANGO DE VOLUMEN *+L,
USO M)S COM&N
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3edida y transferencia de microvolúmenes. iología molecular y ensayos en*imáticos 3edida y transferencia de soluciones acuosas en general! ácidos y bases Kgual a E"#
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Kgual a E"#
". =ebido a que la micropipeta tiene un rango de volumen ajustable! es necesario seleccionar el volumen a medir. @ara ello se debe locali*ar el indicador de volumen! compuesto de tres dígitos que se deben leer de
arriba acia abajo. 'n la parte más baja del indicador ay una escala que permite el ajuste del volumen al último dígito o decimal permitido según el caso. 'n las micropipetas de " asta "## &l! los dígitos negros indican microlitros y los dígitos rojos representan décimas de microlitro. 'n el /uadro I se muestran ejemplos de c,mo debe lucir el indicador de volumen para medir diferentes volúmenes. D. 0justar el volumen de la pipeta con el tornillo del bot,n pulsador (5igura D! 0") o la rueda de graduaci,n del volumen (5igura D! )! asta llegar a $HD por encima del valor deseado. Luego! lentamente! girando el tornillo o la rueda! disminuir el ajuste asta el valor deseado prestando atenci,n para no e%cederlo. 6i se e%cede! es aconsejable repetir el procedimiento de ajuste. 6iempre se debe ajustar el volumen deseado desde un volumen más alto disminuyendo las indicaciones del indicador.
CUADRO -. DISPOSICIÓN DE LOS DGITOS EN EL INDICADOR SEG&N LA MICROPIPETA A USAR. MICROPIPETA CON VOLUMEN M)IMO A DISPENSAR
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M ;odos los dígitos deben aparecer en negro! e%cepto cuando se indique lo contrario en paréntesis. N. 6eleccionar la punta o tip plástico apropiado para la micropipeta: la punta debe ajustarse al cono de la micropipeta (5igura D). 0l insertar la punta en el cuerpo de la pipeta ay que aplicar una fuerte presi,n con movimiento giratorio para asegurar la ermeticidad.
pipeta con líquidos sin la punta colocada. 's posible que la punta plástica se encuentre en una caja también plástica que facilita su uso. 6i la punta no queda bien ajustada o no está en caja! deberá ajustarse con la mano sin tocar la supercie que estará en contacto con la soluci,n a e%traer. J. 0spiraci,n: apretar el bot,n pulsador asta el primer tope (5igura N0) I. /on la pipeta en posici,n vertical! sumergir la punta entre $ mm y D mm en la muestra. . Lentamente se aspira el líquido al relajar la presi,n del dedo sobre el bot,n pulsador (5igura N). 6i este paso no se reali*a con atenci,n! puede entrar aire en la punta y la cantidad de muestra aspirada no es la adecuada. +. 'sperar un segundo y retirar la punta del líquido. O. =osicaci,n: colocar la parte inferior de la punta contra la pared interior del recipiente donde se depositará el líquido! con un ángulo entre $#o y N# o. $#. 0pretar el bot,n pulsador suavemente asta el primer tope (5igura N/) y esperar un segundo. $$. 0pretar el bot,n pulsador asta el segundo tope para vaciar el resto del líquido (5igura N=). $". 3anteniendo apretado el bot,n pulsador en el segundo tope! retirar la pipeta desli*ando la punta por la pared del recipiente. 6oltar luego el bot,n pulsador (5igura N'). $D. '%pulsar la punta apretando el bot,n del e%pulsor (5igura N5 y 5igura D! =).
5igura N. @osiciones de la micropipeta a la ora de medir un volumen especíco 0:
ot,n pulsador en el primer tope! : la punta de la micropipeta es sumergida entre $ mm y D mm en la muestra para luego liberar el bot,n pulsador suavemente asta su posici,n original! /: 5orma correcta de dispensar el líquido medido en el recipiente correspondiente! =: @osici,n de la micropipeta al apretar el bot,n pulsador asta el segundo tope! ': 1uelta a la posici,n inicial! 5: '%pulsi,n de la punta! la cual debe ser descartada en un recipiente apropiado. ;omado del manual de manejo de micropipetas iorad! EH#IH#J
PARA NO DA/AR EL SISTEMA INTERNO DE PISTONES 0UE POSEE LA MICROPIPETA1
el líquido nunca debe entrar en contacto con el cono de la micropipeta nunca vuelque la micropipeta con la parte de arriba acia abajo nunca coloque la micropipeta en forma ori*ontal si la punta tiene líquido nunca ajuste el volumen fuera del rango de la micropipeta! con respecto a la micropipeta multicanal! éstas tienen la ventaja de que se puede pipetear el mismo volumen al mismo tiempo en varios recipientes a la ve*. 'stas micropipetas fueron diseñadas principalmente para los ensayos en formato micro! donde se utili*a también un plato de plástico de OI po*os para trabajar esa cantidad de ensayos de forma simultánea. Las micropipetas
3ulticanal son dispositivos más complejos que las micropipetas unicanal ya que básicamente pueden repetir varias veces la funci,n que reali*a esta última en un solo momento.
@ara ello! poseen un solo mango! bot,n pulsador! etc pero un cono que permite la inserci,n de N asta $" puntas al mismo tiempo. 'n el curso se utili*arán micropipetas multicanales ($" canales) con un rango de volumen de J# &l a D## &l similares a las de la 5igura J. @ara su uso! se deben tener los mismos cuidados que con las micropipetas unicanal! además de cerciorarse que todas las puntas estén bien colocadas! e%trayendo la misma cantidad de soluci,n y que no se observen burbujas de aire en ninguna.
5igura J. 3icropipeta multicanal (+ canales)! modelo ioit de rango de volumen de
J# &l a D## &l. 'ste tipo de micropipeta es muy útil para microensayos semiautomati*ados o automati*ados en platos descartables de OI po*os.
E0UIPOS Y MATERIALES1
@ipetas: (") de "J ml! $#ml! Jml! $ ml. =ispositivos de cauco o succionadores para pipetas. (").
3icropipetas de: #.J! $#! J#! $##! J##! $###! microlitros! una por cada volumen. ;ubos eppendorf: I. ;ubos de ensayos medianos: J. eac8er: J de J## ml D de $### ml @untas blancas! amarillas! a*ules N de cada una. alan*a digital eléctrica: $.
PROCEDIMIENTO1 T2cn3c4 5e 636eteo.
@ara este paso! se aplican las mismas reglas que se utili*an para el manejo de las pipetas.
$. MEDICIÓN DE VOLUMENES1
3edir los siguientes volúmenes: Btili*ar el aplicador o succionador de plástico.
$# ul de la sustancia = en los tubos de ensayo $! " y D.
OJ ul de la sustancia 0 en el tubo $.
D## ul de la sustancia en el tubo ".
NJ# ul de la sustancia / en el tubo D.
$## ul del tubo $ en el tubo ".
"J# ul del tubo D al tubo ".
$. Kdenticamos la masa del tubo vaci, en la balan*a digital luego medimos la masa del tubo
9. ;B> 10/K>
9. ;B> LL'<> 9. =' L0
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$. #!O$JI g ". #!O$JI g D. #!O$JI g
#!O"J"g $!NNIDg $!#OJg
6B6;0
;B> J ul NI# ul "$# ul
CONCLUSIÓN
/on la reali*aci,n de este trabajo se logr, aprender el correcto uso de las micropipetas y conocer los diferentes tipos de micropipetas que e%isten. 0sí como también! valorar la importancia del empleo de micropipetas! a la ora de dispensar pequeños volúmenes de muestras en 2l.
BIBLIOGRAFA
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