Madigan Brock Biologie Des Micro Organismes

Brock Biologie des micro-organismes

M. Madigan J. Martinko

Bactéries, micro-algues, champignons, virus… Qu’ils menacent notre santé ou la protègent, qu’ils constituent des acteurs majeurs de la biosphère en assurant le recyclage de la matière organique ou soient devenus des outils précieux dans les domaines des biotechnologies et de l’agroalimentaire, les micro-organismes sont au cœur des défis scientifiques du XXIe siècle.

Thomas Brock est le fondateur de cet ouvrage. C’est aussi à lui que nous devons la découverte de la bactérie thermophile dont est issue la polymérase Taq, pierre angulaire de la réaction de polymérisation en chaine (PCR).

Ouvrage de référence pour tous les microbiologistes, le « Brock » (du nom de son fondateur), aujourd’hui dans sa onzième édition, voit enfin le jour en français, traduit par une équipe de spécialistes du domaine.

Michael T. Madigan est professeur de microbiologie à l’université Carbondale de l’Illinois du Sud (États-Unis). Auteur de plus de 100 articles scientifiques, il a reçu de nombreuses distinctions pour ses travaux de recherche ainsi que pour ses activités d’enseignant.

Ses principaux atouts : • il livre dans ses premiers chapitres toutes les notions scientifiques qu’il est indispensable de posséder pour appréhender le monde des microorganismes : éléments de biochimie, de biologie moléculaire, de biologie cellulaire, de génétique, de métabolisme, etc. ; • tous les aspects de la microbiologie moderne sont abordés de manière équilibrée ; • les micro-organismes sont présentés selon différents ordres logiques, par grandes familles évolutives mais aussi par grandes caractéristiques communes (maladies microbiennes transmises d’homme à homme, par les animaux, par l’eau, etc.) ; • l’écologie microbienne et les applications de la microbiologie sont traitées à part entière ; • le texte est soutenu par de très nombreux tableaux, schémas et clichés, dont la clarté et la qualité en font des outils inestimables. Brock, Biologie des micro-organismes constitue un manuel de cours d’initiation et d’approfondissement parfaitement adapté pour accompagner l’étudiant tout au long de son cursus. Il représente aussi une référence pour les enseignants de la discipline et les chercheurs des domaines apparentés.

John M. Martinko est professeur associé à l’université Carbondale de l’Illinois du Sud (États-Unis) et dirige le Département de microbiologie. Il a été récompensé à plusieurs reprises pour ses travaux de recherche et la qualité de son enseignement.


11e édition

Michael Madigan et John Martinko

11e édition

Public : étudiants en sciences de la vie, environnement, écologie, médecine et pharmacie. Cours : microbiologie, biologie des micro-organismes, virologie, bactériologie, biologie microbienne, écologie microbienne, maladies microbiennes, immunologie, biologie moléculaire des procaryotes, génétique microbienne, diversité microbienne et évolution, microbiologie industrielle, traitement de l’eau, biotechnologie

11e édition

Niveau : licence, master, doctorat, BCPST

ISBN : 978-2-7440-7209-3 Pearson France 47 bis, rue des Vinaigriers 75010 Paris Tél. : 01 72 74 90 00 Fax : 01 42 05 22 17 www.pearson.fr

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7209

1111

89 €

Traduction française coordonnée par Daniel Prieur

19/10/11 16:51

Propriété de 157d6baf97c34b3999aa50686c1a53cc fbd4717df6f1b254a599cc0598fe0c88 customer 388712 at 2015-01-21 20:36:10 +0100 388712

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PHYLOGÉNIE DU MONDE VIVANT – VUE GÉNÉRALE

Bacteria

Archaea

Bactéries vertes non sulfureuses

Euryarchaeota Methanosarcina

Mitochondries Protéobactéries Chloroplastes Flavobactéries

Cyanobactéries

Bactéries Gram positif

MethanoCrenarchaeota bacterium Thermoproteus Methanococcus Pyrodictium

Entamoebae Moisissures glaireuses

Halophiles extrêmes

Animaux Champignons Plantes Ciliés

Thermoplasma

Thermococcus Crenarchaeota marins

Thermotoga

Eukarya

Pyrolobus

Flagellés Methanopyrus

Parabasaliens

Korarchaeota Nanoarchaeota

Thermodesulfobacterium Aquifex

Microsporidies Diplomonadines (Giardia)

Arbre phylogénétique universel. Cet arbre a été obtenu par comparaison de séquences d’ARN ribosomique 16 S ou 18S. Notez les trois domaines majeurs des organismes vivants : les Bacteria, les Archaea et les Eukarya. La distance évolutive entre deux groupes d’organismes est proportionnelle à la distance cumulée entre l’extrémité de la branche et le nœud rejoignant les deux groupes. Voir les sections 11.5 et 11.9 pour plus d’informations sur les phylogénies basées sur les ARN ribosomiques. Les relations phylogénétiques indiquées dans cet arbre ont été confirmées par plusieurs autres relations génotypiques et phénotypiques. Les données concernant cet arbre ont été obtenues du Ribosomal Database project http://rdp.cme.msu.edu.


7209_00_Cartonne Page B Jeudi, 2. août 2007 6:08 06

PHYLOGÉNIE DU MONDE VIVANT – BACTERIA

Deferribacter

Cytophaga Flavobactéries Spirochètes

Deinococci

Planctomyces/ Pirella

Verrucomicrobia

Bactéries vertes sulfureuses

Bactéries vertes non sulfureuses

Chlamydia Cyanobactéries

Ther motoga

Actinobactéries Bactéries Gram positif

Thermodesulfobacterium

Aquifex

Nitrospira ε δ α β

Protéobactéries

γ

Arbre phylogénétique des Bacteria. Cet arbre a été obtenu par comparaison des séquences d’ARN ribosomique 16 S. Au moins 17 groupes principaux de Bacteria sont ainsi définis. Voir les sections 11.5 et 11.9 pour plus d’informations sur les phylogénies basées sur les ARN ribosomiques. Les données concernant cet arbre ont été obtenues du Ribosomal Database project http://rdp.cme.msu.edu.



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Brock Biologie des micro-organismes Onzième édition

MICHAEL T. MADIGAN JOHN M. MARTINKO Université Carbondale de l’Illinois du Sud

Traduction française dirigée par Daniel Prieur, professeur de microbiologie à l’université de Bretagne occidentale


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Le présent ouvrage est la traduction de Brock Biology of Microorganisms, 11th edition, de Michael T. Madigan et John M. Martinko, publié par Pearson Education Inc./Prentice Hall, Copyright © 2006, 2003, 2000, 1997, 1994, 1991, 1988, 1974, 1970 par Pearson Education, Inc. Authorized translation from the English language edition, entitled BROCK BIOLOGY OF MICROORGANISMS, 11th Edition by MADIGAN, MICHAEL; MARTINKO, JOHN, published by Pearson Education, Inc, publishing as Prentice Hall, Copyright © 2006, 2003, 2000, 1997, 1994, 1991, 1988, 1974, 1970 by Pearson Education, Inc. All rights reserved. No part of this book may be reproduced or transmitted in any form or by any means, electronic or mechanical, including photocopying, recording or by any information storage retrieval system, whithout permission from Pearson Education, Inc. French language edition published by PEARSON EDUCATION FRANCE, Copyright © 2007.

Publié par Pearson Education France

Mise en page : Compo-Méca s.a.r.l. 64990 Mouguerre ISBN : 978-2-7440-5840-0 © 2007 Pearson Education France

Tous droits réservés. Aucune représentation ou reproduction, même partielle, autre que celles prévues à l’article L. 122-5 2° et 3° a) du code de la propriété intellectuelle ne peut être faite sans l’autorisation expresse de Pearson Education France ou, le cas échéant, sans le respect des modalités prévues à l’article L. 122-10 dudit code.


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Les auteurs Michael T. Madigan, après ses diplômes de biologie et d’éducation obtenus à l’université du Wisconsin-Stevens Point en 1971, a suivi un master en 1974 puis un PhD en 1976 au département de bactériologie de l’université du Wisconsin-Madison. Son travail de recherche, sous la direction de Thomas D. Brock, concernait l’étude des bactéries phototrophes des sources chaudes. Il a ensuite effectué un post-doctorat de trois ans au département de microbiologie de l’université de l’Indiana, durant lequel il a travaillé sur les bactéries photosynthétiques avec Howard Gest. Il a par la suite rejoint l’université Carbondale de l’Illinois du Sud pour y enseigner la microbiologie. Co-auteur de Biology of Microorganisms à partir de la quatrième édition publiée en 1984, il donne des cours d’introduction à la microbiologie, de diversité bactérienne ainsi que de microbiologie diagnostique et appliquée. Il a été reconnu meilleur enseignant en 1988 et meilleur chercheur du College of Science en 1993. Il a reçu en 2001 une distinction de l’université, le Outstanding Scholar Award, et en 2003 le prix Carski pour son enseignement en premier cycle, remis par la Société américaine de microbiologie. Il a concentré ses travaux de recherche presque exclusivement sur les bactéries phototrophes anoxygéniques, et particulièrement sur celles des milieux extrêmes. Il a publié une centaine d’articles scientifiques, codirigé un ouvrage de référence sur les bactéries phototrophes et a également été rédacteur puis rédacteur en chef de la revue Archives of Microbiology. John M. Martinko a reçu son diplôme de biologie de l’université de Cleveland. Étudiant de premier cycle, il a suivi une formation en alternance qui lui a permis d’acquérir de l’expérience dans plusieurs laboratoires de microbiologie et d’immunologie. Puis, responsable de laboratoire pendant deux ans à l’université Case Western Reserve (Cleveland), il a dirigé des recherches sur la structure, la sérologie et l’épidémiologie de Streptococcus pyogenes. En vue de l’obtention d’un master et d’un PhD en microbiologie à l’université de New York-Buffalo, il a effectué ses recherches sur la spécificité et l’idiotype des anticorps. Pour son post-doctorat, il a étudié au collège de médecine Albert Einstein de New York la structure des protéines du complexe majeur d’histocompatibilité. Depuis 1981, il est professeur agrégé et directeur du département de microbiologie de l’université Carbondale de l’Illinois du Sud. Ses recherches portent sur les effets de l’hormone de croissance sur la réponse immune, sur le développement de tests immunodiagnostiques pour une maladie du soja (pourriture du tronc vivant) et sur l’étude des mutations structurelles qui altèrent les fonctions dans le complexe peptide-protéines du complexe majeur d’histocompatibilité. Il enseigne l’immunologie en premier et deuxième cycles ainsi que l’immunologie, la défense de l’hôte et les maladies infectieuses dans un cours de microbiologie générale. En 2004, il a été désigné meilleur enseignant du College of Science.


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Les traducteurs Georges Barbier est professeur à l’université de Bretagne occidentale (UBO). Il enseigne la microbiologie au département de génie biologique de l’Institut universitaire et technologique de Brest (IUT) ainsi qu’à l’UFR « Sciences et techniques » en M2 recherche microbiologie fondamentale et appliquée. Il dirige le Laboratoire de biodiversité et écologie microbienne (EA3882) à l’École supérieure de microbiologie et sécurité alimentaire de Brest (ESMISAB). Ses activités de recherche portent sur la biodiversité et l’écologie microbienne. Gaëtan Burgaud, diplômé d’un master 2 en microbiologie fondamentale et appliquée à l’UBO, est actuellement doctorant en microbiologie au sein du Laboratoire de biodiversité et écologie microbienne (EA3882). Il étudie la biodiversité fongique marine des écosystèmes hydrothermaux profonds. Également titulaire d’un diplôme d’ingénieur de l’ESMISAB, il enseigne la microbiologie en licence professionnelle et la statistique à l’IUT . Nathalie Byrne est doctorante en microbiologie depuis deux ans au sein du Laboratoire de microbiologie des environnements extrêmes (UMR 6197). Elle étudie la diversité métabolique des micro-organismes des édifices hydrothermaux actifs. Titulaire d’un master de microbiologie fondamentale et appliquée, effectué au sein de l’UBO, elle enseigne la microbiologie en master 1 et à l’IUT. Elle a participé à une campagne océanographique « MoMareto 2006 » au niveau de la dorsale médio-atlantique. Claude Chastel est virologiste, historien de la microbiologie et membre correspondant de l’Académie de médecine (Paris). Ancien professeur agrégé du Service de santé des armées et consultant OMS pour la dengue, il a travaillé en Asie du Sud-Est et en Afrique tropicale. Il a ensuite enseigné, comme professeur des universités-praticien hospitalier, la bactériologie et la virologie à la faculté de médecine de Brest (1973-1998). Spécialiste des arbovirus et des virus émergents, il a écrit Histoire des virus (Boubee, 1992), Ces virus qui détruisent les hommes (Ramsay, 1996), Virus herpès et pensée médicale (Imothep, 1997), Une petite histoire de la médecine (Ellipses Marketing, 2004) et Virus émergents : vers de nouvelles pandémies ? (Vuibert, 2006). Pierre Colin est directeur de recherches à l’Agence française de sécurité sanitaire des aliments et actuellement en poste à l’École supérieure de microbiologie et sécurité alimentaire de Brest (ESMISAB). Spécialiste de microbiologie des aliments, il est également membre de comités d’experts nationaux et européens dans ce domaine. Laurent Esclade est maître de conférences à l’ESMISAB. Il y enseigne le génie industriel alimentaire ainsi que la microbiologie industrielle et organise l’enseignement des procédés de transformation agroalimentaire. Il a été responsable de la deuxième année d’ingénieur pendant cinq ans. Ses recherches ont porté sur l’étude biochimique du stress des Penicillium et sur les altérations de flore dans les produits fromagers. Claire Geslin est maître de conférences à l’UBO. Elle y enseigne la génétique microbienne et la physiologie microbienne en licence ainsi que la biologie des extrêmophiles en master de microbiologie. Ses recherches portent sur l’étude des virus hyperthermophiles issus de sources hydrothermales océaniques. Anne Godfroy est directrice de recherches à l’Institut français de recherche pour l’exploitation de la mer de Brest (Ifremer) au laboratoire de microbiologie des environnements extrêmes. Ses recherches portent sur l’écologie microbienne des sources hydrothermales océaniques profondes, et principalement sur les micro-organismes thermophiles des édifices hydrothermaux actifs. Elle a d’ailleurs contribué à la description de plusieurs nouvelles espèces hyperthermophiles. Elle participe aux enseignements du master 2 de microbiologie fondamentale et appliquée de l’UBO. Elle a embarqué à plusieurs reprises sur des campagnes océanographiques portant sur les sources hydrothermales océaniques et effectué plusieurs plongées à bord du Nautile (sous-marin d’exploration de l’Ifremer). Rémy Guyoneaud est maître de conférences à l’université de Pau et des Pays de l’Adour. Il enseigne la microbiologie générale et l’écologie microbienne en licence sciences de la vie, en master professionnel bioprotection et biotechnologies pour l’environnement et en master recherche environnement et matériaux. Il est membre de l’Institut pluridisciplinaire de recherche sur l’environnement et les matériaux (IPREM, UMR5254) au sein de l’équipe environnement et microbiologie. Ses travaux de recherche portent sur le rôle des micro-organismes, notamment des anaérobies, dans la biotransformation de xénobiotiques, tels que les hydrocarbures, les métaux (mercure, étain) et les métalloïdes (arsenic). Geneviève Héry-Arnaud, pharmacien biologiste, est actuellement assistante hospitalo-universitaire au département de microbiologie du Centre hospitalo-universitaire de Brest (CHU). Elle enseigne la bactériologie à l’UBO en PCEM2 (faculté de médecine de Brest), en génie biologique (IUT de Brest) et en master 1 sciences-technologie-santé mention sciences du vivant, module interactions hôtes micro-organismes. Titulaire d’un DEA d’écologie microbienne (université Claude Bernard, Lyon 1),


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Les traducteurs

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ses recherches, actuellement développées dans le cadre d’une thèse de doctorat, portent sur le rôle des éléments génétiques mobiles dans l’évolution et la virulence du streptocoque du groupe B. Ivan Leguérinel est professeur à l’IUT de Quimper et directeur du Laboratoire universitaire de microbiologie appliquée de Quimper (LUMAQ), rattaché à l’UBO. Il enseigne le génie industriel alimentaire en IUT et la microbiologie prévisionnelle en master 2. Ses recherches dans le domaine de la microbiologie prévisionnelle portent en particulier sur la modélisation et la quantification des croissances et des inactivations des populations microbiennes dans les aliments. Marc Le Romancer est maître de conférences à l’UBO où il enseigne la microbiologie et la bioinformatique. Il est responsable des modules de diversité et physiologie microbienne ainsi que du module de phytopathologie. Spécialiste de virologie, il intervient en licence et en master en virologie moléculaire à l’UFR « Sciences et techniques » ainsi qu’en virologie marine à l’Institut universitaire européen de la mer. Ses recherches portent sur l’étude des virus et plasmides des micro-organismes des milieux extrêmes (sources hydrothermales et milieux polaires) et de leur impact sur la plasticité des génomes et les transferts de gènes chez les procaryotes. Anne-Gabrielle Mathot est maître de conférences à l’UBO. Elle enseigne la microbiologie alimentaire et industrielle aux étudiants de 2e année de l’IUT de Quimper et les « probiotiques » en licence professionnelle aliments-santé et en master alimentation-droitnutrition-santé. Ses recherches au sein du LUMAQ concernent actuellement la toxine émétique de Bacillus cereus (détection et production dans les aliments). Christopher Payan est professeur à la faculté de médecine de l’UBO, où il enseigne la virologie aux niveaux 2 et 3 de médecine et de dentaire. Il organise le master 1/UE42 interaction hôte-micro-organismes destiné aux étudiants de L3 en médecine et sciences. Il est membre du conseil de l’European Society of Clinical Virology (ESCV), du groupe AZAY des microbiologistes universitaires français, de l’Association française pour l’étude du foie (AFEF) et co-coordonne le groupe hépatite C de l’Agence nationale pour la recherche sur le SIDA et les hépatites (ANRS). Il est co-auteur du référentiel de virologie Revir sous l’égide du groupe AZAY. Il est responsable de l’équipe médicale de recherche dans l’Équipe d’accueil EA3882-Laboratoire de biodiversité et d’écologie microbienne et dirige le thème « virus (hépatite C et papillomavirus) et cancer ». Odile Petsaris est assistante hospitalo-universitaire à l’UBO. Elle enseigne la bactériologie générale et systématique à la faculté de médecine de Brest, en L2 et M1. Ses recherches portent sur la génétique de la résistance bactérienne aux antibiotiques et la carcinogenèse induite par le virus de l’hépatite C. Daniel Prieur est professeur de microbiologie à l’UBO, où il est responsable du master sciences du vivant et de la spécialité microbiologie. Spécialiste de la microbiologie des sources hydrothermales océaniques, il est directeur adjoint d’une unité mixte de recherche associée au CNRS et à l’Ifremer, spécialisée dans la microbiologie des environnements extrêmes. Il s’intéresse particulièrement aux micro-organismes adaptés aux fortes pressions hydrostatiques et aux hautes températures qu’il a étudiés lors de nombreuses campagnes océanographiques employant les submersibles de l’Ifremer. Il a reçu la médaille d’argent du CNRS en 1995 et contribué à près de 200 publications et chapitres d’ouvrages. Il participe à de nombreux comités scientifiques, dont le comité des programmes scientifiques du Centre national d’études spatiales (CNES), au titre de l’exobiologie, et plusieurs groupes de travail de l’European Space Agency (ESA). Daniel Prieur a coordonné le travail des 25 traducteurs du Brock, Biologie des micro-organismes. Patrice Rey est depuis 1998 maître de conférences à l’ESMISAB, où il enseigne la microbiologie et la phytopathologie à des étudiants en 2e et 3e cycles. En parallèle, les activités de recherche, orientées vers l’étude des relations plantes-Pythiacées et la gestion d’équilibres microbiens en culture sous serre, lui ont permis d’obtenir une habilitation à diriger des recherches en 2004. Ses travaux actuels portent sur la caractérisation des microflores suppressives ainsi que sur les évolutions et changements de communautés fongiques ou bactériennes suite à l’introduction d’antagonistes microbiens dans les cultures. Erwan Roussel, titulaire d’un DEA en microbiologie fondamentale et appliquée, est doctorant au Laboratoire de microbiologie des environnements extrêmes (LM2E-UMR6197). Il y étudie la diversité et l’activité des procaryotes associés aux sédiments marins profonds. Il est moniteur à l’UBO où il enseigne la diversité, la génétique et la physiologie microbienne en L1, L3 et M1. Marie-Thérèse Thébault est professeur à l’UBO. Elle y enseigne la biochimie en licence et en master ainsi que la microbiologie et l’écophysiologie en master. Ses recherches ont concerné l’étude des mécanismes cellulaires et moléculaires de l’adaptation en environnement variable chez les invertébrés marins. Actuellement, elle utilise l’huître creuse japonaise comme organisme modèle pour caractériser les modalités de la réponse aux variations thermiques du milieu. Daniel Thouvenot est professeur à l’ESMISAB. Il y enseigne aux élèves ingénieurs de 1re année la bactériologie des aliments ainsi qu’une partie de la microbiologie générale. Ses travaux de recherche actuels portent sur la dynamique et la diversité de la microflore bactérienne d’aliments végétaux fermentés. Yves Tirilly est professeur de microbiologie à l’ESMISAB. Il est directeur de cette école d’ingénieur où il enseigne la mycologie et la pathologie végétale. Ses recherches ont porté principalement sur le parasitisme des Pythiacées en culture hors-sol ainsi que


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Les traducteurs

sur la lutte biologique et le développement durable par induction de réactions de défense chez les plantes. Il a dirigé de nombreux travaux sur la maîtrise du risque fongique en industrie agroalimentaire. Jessica Vallance est doctorante en microbiologie et pathologie végétale au sein du Laboratoire de biodiversité et écologie microbienne de l’UBO (EA3882). Ses travaux de recherche portent sur l’écologie microbienne et la lutte biologique en culture sous serre. Titulaire d’un diplôme d’ingénieur en microbiologie et sécurité alimentaire ainsi que d’un master de microbiologie fondamentale et appliquée obtenus au sein de l’UBO, elle enseigne la microbiologie et la qualité en licence professionnelle emballages à Morlaix et à l’ESMISAB. Sophie Vallet est pharmacien biologiste, maître de conférences universitaire et praticien hospitalier dans le secteur de virologie du département de microbiologie du CHU de Brest. Elle enseigne la virologie à l’UBO (UFR de médecine de Brest, étudiants en PCEM2, odontologie et master 1 sciences du vivant, UE interactions hôte-micro-organismes) ainsi qu’à l’IUT (formation génie biologique). Titulaire d’un doctorat de microbiologie, ses recherches portent sur la variabilité et l’implication de la protéase du virus de l’hépatite C dans la carcinogenèse virale C ainsi que sur les coronavirus humains circulant en milieu pédiatrique. Daniel Vaulot est directeur de recherche au CNRS à la station biologique de Roscoff. Ancien élève de l’École polytechnique, il a obtenu un PhD à l’Institut de technologie du Massachusetts (MIT) aux États-Unis. Il travaille depuis vingt ans sur le picoplancton océanique, c’est-à-dire les plus petites cellules rencontrées en milieu marin à la base du fonctionnement de tous les écosystèmes aquatiques. Après avoir développé les applications de la cytométrie en flux dans ce domaine, il a contribué au cours des dernières années à l’expansion des méthodes « biologie moléculaire » pour les études des eucaryotes picoplanctoniques. Il a fondé et développé la collection de cultures de Roscoff qui contient plus de 800 souches de micro-algues. Il a publié plus de 80 articles scientifiques, dont certains dans des revues prestigieuses comme Nature ou Science, et a obtenu plusieurs récompenses, dont la médaille d’argent du CNRS. Pierre Youinou est professeur d’immunologie à l’UFR de médecine (UBO), chef de service du laboratoire d’immunologie du CHU et directeur d’une unité de recherche, vouée à l’étude de l’auto-immunité, en particulier lymphocytes B et auto-anticorps. Outre sa participation au comité de lecture de 19 revues scientifiques internationales, il a signé 460 articles scientifiques et participé à une quarantaine d’ouvrages. Il est éditeur de l’immunologie dans le Larousse Médical et lauréat du Prix de recherche de l’Association nationale de défense contre l’arthrite rhumatoïde en 1992, du Prix Éloi Collery de l’Académie de médecine en 1997 et du Prix Bretagne de la recherche en 2000.


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Sommaire Partie une 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Partie deux 11 12 13 14 15 16

Partie trois 17 18 19

Principes de microbiologie Micro-organismes et microbiologie 1 Vue d’ensemble de la vie microbienne 21 Macromolécules 38 Composition et organisation de la cellule bactérienne 54 Nutrition, culture et métabolisme des micro-organismes 100 Croissance microbienne 134 Bases de biologie moléculaire 166 Régulation du métabolisme 203 L’essentiel de la virologie 228 Génétique bactérienne 254

Évolution et diversité microbiennes Évolution et systématique microbiennes 298 Diversité des procaryotes : les Bacteria 328 Diversité des procaryotes : les Archaea 421 Biologie de la cellule eucaryote et micro-organismes eucaryotes Génomique microbienne 483 Diversité du monde des virus 507

451

Diversité métabolique et écologie microbienne Diversité métabolique 539 Méthodes en écologie microbienne Écologie microbienne 622

602

Partie quatre Immunologie, pouvoir pathogène et réponse immunitaire de l'hôte 20 21 22 23 24

Partie cinq 25 26 27 28 29

Partie six 30 31

Contrôle de la croissance des micro-organismes 679 Interactions homme–micro-organismes 713 Immunologie générale 736 Immunologie moléculaire 767 Diagnostic microbiologique et immunologique 783

Maladies microbiennes Épidémiologie 821 Maladies infectieuses à transmission interhumaine 848 Maladies microbiennes transmises par des animaux, par des arthropodes ou d’origine tellurique 886 Traitement des eaux usées et purification de l’eau, maladies microbiennes d’origine hydrique 907 Conservation des aliments et maladies d’origine alimentaire 924

Les micro-organismes : des outils pour la recherche et l'industrie Microbiologie industrielle 943 Génie génétique et biotechnologie

970


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Présentation de l’ouvrage Chaque nouvelle édition permet de clarifier les concepts par le biais d’illustrations et le programme de Brock, Biologie des microorganismes est, à ce titre, le plus exceptionnel qui soit dans le domaine de la microbiologie. Les étudiants s’appuient chaque année davantage sur les illustrations. C’est pourquoi cet ouvrage s’est toujours attaché à leur fournir des schémas, des photographies et des tableaux qui, outre un visuel attractif, ont pour objectif de les aider à mieux comprendre le sujet. !

Intérieur Composants non spécifiques

Extérieur

Composants spécifiques Membrane cytoplasmique

PEP Enz I

HPr

Enz IIa

Enz IIb

Enz IIc

Pyruvate

P P

Glucose P Glucose 6_P

Sens du transport

ARN polymérase

Transcription 5′

3′′

3′

5′

Facteur sigma 1. 2. 3. 4. 5. 6.

Début de l’ARNm

5′ 3′ CTGTTGACAATTAATCATCGAACTAGTTAACTAGTACGCAAG CTA TTCCTGTGGATAACCATGTGTATTAGAGTTAGAAAACA TGGTTCCAAAATCGCCTTTTGCTGTATATACTCACAGCATA TTTTTGAGTTGTGTATAACCCCTCATTCTGATCCCAGCTT TAGTTGCATGAACTCGCATGTCTCCATAGAATGCGCGCTACT TTCTTGACACCTTTTCGGCATCGCCCTAAAATTCGGCGTC

Séquence -35

Boîte de Pribnow

Consensus T T G A C A

TATAAT

Séquence du promoteur


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X

Présentation de l’ouvrage

Adaptées aux mémoires visuelles, les centaines d’illustrations de la 11e édition ont été entièrement redessinées et améliorées afin d’offrir plus de détails et de réalisme. ! Cytoplasme

Nucléoïde

Ribosomes Plasmide

0,5 µm

Paroi cellulaire (a)

Membrane cytoplasmique

Membrane cytoplasmique Réticulum endoplasmique Ribosomes Noyau

(a)

(b)

(c)

(d)

Nucléole Enveloppe nucléaire Appareil de Golgi Cytoplasme Mitochondrie Chloroplaste

10 µm Nombre de cellules bactériennes par tube

(b)

Aussi souvent que possible, des photographies accompagnent techniques et processus, de façon à associer les représentations abstraites à la réalité biologique. "

Témoin Substance répulsive Temps

Nicholas Blackburn

(e)

Substance attractive

(f)


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Présentation de l’ouvrage XI

Compréhension Le « Glossaire », situé en tête de chaque chapitre, guide l’étudiant dans le langage de la microbiologie. La maîtrise de la terminologie et la compréhension des concepts clés s’en trouvent facilités. "

Contrôlez vos acquis Beijerinck et Winogradsky ont étudié les bactéries dans les sols et l’eau et développé la technique de culture d’enrichissement pour l’isolation des représentants de divers groupes physiologiques. De nombreux concepts majeurs ont émergé durant cette période, incluant les cultures d’enrichissement, la chimiolithotrophie, la chimio-autotrophie et la fixation de l’azote. •

À quoi correspond la technique de culture d’enrichissement ?

•

En examinant la figure 1.16, montrez pourquoi l’oxydation du soufre et la nitrification sont considérées comme des processus chimiolithotrophes, alors que la fixation de l’azote ne l’est pas (indice : observez les réactions utilisant de l’ATP dans chaque cas).

GLOSSAIRE Bactériophage (bacteriophage) Virus qui infecte une bactérie. Cycle lytique (lytic pathway) Série d’étapes après l’infection virale qui conduit à la réplication virale et à la destruction (lyse) de la cellule hôte. Lysogène (lysogen) Bactérie porteuse d’un prophage. Lysogénie (lysogenic pathway) Série d’étapes qui, après l’infection virale, conduit à un état où le génome viral est répliqué comme un prophage avec celui de l’hôte. Nucléocapside (nucleocapsid) Structure de base d’un virion constituée d’acide nucléique et de protéines. Oncogène (oncogene) Gène dont l’activité est associée à la transformation d’une cellule normale en cellule cancéreuse. Plage (plaque) Zone de lyse ou d’inhibition de croissance induite par un virus sur un tapis d’hôte sensible. Prion (prion) Protéine infectieuse dont la forme extracellulaire ne contient pas d’acide nucléique. Protéine précoce (early protein) Protéine synthétisée au début de l’infection virale. Protéine tardive (late protein) Protéine synthétisée vers la fin de l’infection virale. Provirus ou prophage (provirus ou prophage) Génome d’un virus ou d’un phage tempéré, habituellement intégré, qui se réplique avec le chromosome de l’hôte. Rétrovirus (retrovirus) Virus à ARN qui possède une transcriptase inverse et synthétise une copie ADN de son génome.

# L’encadré « Contrôlez vos acquis » incite l’étudiant à faire une pause dans sa lecture pour apprécier sa connaissance des concepts clés.

FOCUS

Les « Focus », étroitement liés au thème central du chapitre, permettent d’approfondir un point particulier. "

Transcription inverse (reverse transcription) Processus impliquant une transcriptase inverse qui synthétise un ADN complémentaire à partir d’une matrice à ARN. Transformation (transformation) Processus chez les eucaryotes par lequel une cellule normale devient une cellule cancéreuse (voir chapitre 10 pour une autre définition). Virion (virion) Particule virale complète ; l’acide nucléique est entouré d’une capside protéique et, dans certains cas, d’autres composants. Viroïde (viroïde) Petit ARN simple brin circulaire qui induit différentes maladies de plantes. Virus (virus) Élément génétique contenant soit de l’ARN soit de l’ADN, qui se réplique dans des cellules hôtes mais qui présente aussi une forme extracellulaire. Virus à ARN simple brin négatif (minus (negative)-strand RNA virus) Virus dont le génome à ARN est complémentaire de la séquence en bases de l’ARNm viral. Virus à brin positif (plus (positive)-strand virus) Virus dont le génome à ARN ou à ADN a la même complémentarité que l’ARNm viral. Virus tempéré (temperate virus) Virus dont le génome se réplique avec celui de son hôte, dont il ne cause pas la mort dans un état dit de lysogénie. Virus virulent (virulent virus) Virus qui lyse ou tue la cellule hôte après l’infection.

Édition des ARN

Dans les chapitres 7 et 14, nous avons vu que certains gènes ont des régions codantes séparées par des régions non codantes, appelées . Classiquement, les introns sont éliminés après la transcription pour produire un ARN mature lors d’un processus appelé (voir section 14.8). Dans les génomes des organites, on trouve un phénomène qui est presque l’opposé de l’épissage : . L’édition des ARN implique à la fois l’insertion ou la délétion de nucléotides pour produire un différent de l’ADN transcrit. L’édition peut aussi impliquer des chimiques des bases de l’ARNm. Dans les deux cas, l’édition des ARN peut altérer les codons, de sorte qu’un acide aminé ou plus, différents de ceux codés par le gène, soient insérés dans le polypeptide. Dans les mitochondries des trypanosomes et des protozoaires apparentés (voir section 14.10), quelques transcrits mitochondriaux sont édités de telle façon qu’un grand nombre (des centaines dans quelques cas) d’uridylates soient ajoutés et, plus rarement, délétés. Un exemple de ce type d’édition des ARN est montré dans la figure 1. L’édition des ARN est précisément contrôlée par des petites séquences de l’ARNm qui « guident » les enzymes assurant les éditions spécifiques. Ce processus doit évidemment être très précisément contrôlé. L’insertion de bases trop ou insuffisamment

nombreuses engendrerait un produit probablement non fonctionnel. L’autre type d’édition des ARN, le remplacement d’une base par une autre, est fréquent dans les mitochondries et les chloroplastes des plantes supérieures. Dans certains sites spécifiques de quelques ARNm un C sera converti en U par désamination oxydative (la modification inverse est plus rare). Il y au moins vingt-cinq sites de conversion de C à U dans le chloroplaste du maïs. Bien que ceci concerne principalement les génomes des organites, un exemple de conversion programmée de C à U est aussi connu pour un gène nucléaire de mammifère. Selon la localisation de l’édi-

tion, un nouveau codon peut être formé, ce qui conduit à la formation d’une séquence protéique qui ne correspond pas à celle du gène dont elle résulte. Cette surprenante édition des ARN aurait pu constituer un obstacle significatif à l’analyse des génomes des . Dans les faits ce n’est pas le cas, car le nombre de protéines concerné est faible et ces protéines sont hautement conservées. La fonction et l’origine de l’édition des ARN sont inconnues. Certains scientifiques ont suggéré que ce puisse être une rémanence du monde à ARN, au même titre que les ribozymes (voir section 14.8) et autres ARN catalytiques (voir section 11.2).

Protéine ...Leu Cys Phe Trp Phe Arg Phe Phe Cys... ARNm

...uuG uGu UUU UGG uuu AGG uuu uuu uGu...

ADN

... ...

G G TTT TCC C C AAA AGG

AGG TCC

G ... C ...

Figure 1 Édition des ARN. La partie supérieure de la figure montre une partie de la séquence d’acides aminés de la sous-unité III de l’enzyme cytochrome oxydase du protozoaire Trypanozoma brucei (voir section 14.10). La mitochondrie code cette protéine. Sous cette séquence d’acides aminés, est visible la séquence d’ARN messager (ARNm) de cette zone. Les bases en lettres majuscules sont transcrites du gène présenté en dessous. Les lettres de l’ARNm en lettres minuscules ont été insérées dans le transcrit par un processus appelé édition de l’ARN. Bien que la séquence d’ADN soit présentée ici avec de nombreux espaces, la molécule n’en comporte pas. Les espaces introduits sur cette figure ont pour fonction de faciliter la compréhension.


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XII

Présentation de l’ouvrage

Navigation Clairs et pratiques, les sommaires présents en début de chapitre annoncent la manière dont s’organisent les notions et facilitent ainsi leur compréhension et leur mémorisation. !

I

Introduction à la microbiologie

1.1 1.2 1.3

La m i cr o b i o l o g i e Les micro-organismes en tant que cellules Les micro-organismes et leur environnement na turel L’impact des micro-organismes sur l’homme e t se s a ct i vi t é s

1.4

II

Découvertes en microbiologie

1.5

Les racines historiques de la microbiologie : Hooke, van Leeuwenhoek et Cohn Pasteur, Koch et les cultures pures La diversité microbienne et la naissance de la microbiologie générale L’ère moderne de la microbiologie

1.6 1.7 1.8

CHAPITRE UN

Micro-organismes et microbiologie

3 3 3 6 7

9 9 11 15 18

Les micro-organismes sont des cellules vivantes microscopiques et indépendantes qui, comme les humains, vivent en communauté.

Les références aux figures permettent au lecteur d’aller et venir aisément entre les illustrations et le texte. ! sentent de nombreux éléments ou fonctions identiques. Elles possèdent toutes une barrière, appelée membrane cytoplasmique (voir figure 2.1), séparant le milieu intracellulaire du milieu extracellulaire. C’est à travers la membrane cytoplasmique que les nutriments et autres composés nécessaires à son

Un renvoi signale au lecteur que la notion abordée intervient ailleurs dans le texte. Le lecteur peut ainsi facilement se reporter aux sections indiquées, relier les différentes informations complémentaires et enrichir sa vision du sujet. ! colonne d’eau ; en produisant de l’O2, ces organismes maintiennent cette zone oxygénée. La décomposition de la matière organique dans la boue conduit à la production d’acides organiques, d’alcools, d’H2, tous des substrats pouvant être couplés à la réduction des sulfates (voir sections 12.18, 13.7, 17.15 et 19.13). Les sulfures résultant de la réduction des sulfates déclenchent le développement des bactéries vertes et pourpres (phototrophes anoxygéniques, sections 12.2 et 12.32), qui utilisent les sulfures comme donneurs d’électrons. Ces organismes


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Table des matières Partie une

Principes de microbiologie 1

Micro-organismes et microbiologie 1

I

INTRODUCTION À LA MICROBIOLOGIE

3

1.1 1.2 1.3

La microbiologie Les micro-organismes en tant que cellules Les micro-organismes et leur environnement naturel L’impact des micro-organismes sur l’homme et ses activités

3 3

1.4

II

DÉCOUVERTES EN MICROBIOLOGIE

1.5


1.6 1.7 1.8

2

Vue d’ensemble de la vie microbienne

6

9 9 11 15 18

21

STRUCTURE CELLULAIRE ET ÉVOLUTION

22

2.1 2.2

22

2.3

Les structures cellulaires et virales L’organisation de l’ADN dans les cellules microbiennes L’arbre universel du vivant

24 26

II

DIVERSITÉ MICROBIENNE

28

2.4 2.5 2.6

La diversité de la physiologie des micro-organismes La diversité des procaryotes Les micro-organismes eucaryotes

28 30 35

3

Macromolécules

I

LIAISONS CHIMIQUES ET EAU DANS LES SYSTÈMES VIVANTS

3.1

Les liaisons chimiques de faible et de forte énergie Les principales macromolécules et l’eau, solvant biologique

II

Composition et organisation de la cellule bactérienne

I

MICROSCOPIE ET MORPHOLOGIE BACTÉRIENNE

4.1 4.2

La microscopie optique L’imagerie tridimensionnelle : microscopie par contraste d’interférence, microscopie à force atomique, microscopie confocale à balayage laser La microscopie électronique Les morphologies cellulaires et la signification de la taille microscopique

4.3 4.4

7

I

3.2

4

54 55 55

59 61 62

II

MEMBRANES ET PAROIS BACTÉRIENNES

65

4.5 4.6 4.7 4.8

La structure de la membrane cytoplasmique Les fonctions de la membrane cytoplasmique Les systèmes de transport membranaire La paroi des procaryotes (bactéries) : le peptidoglycane et les autres molécules La membrane externe des bactéries Gram négatif

65 68 70

4.9

73 78

III

STRUCTURES DE SURFACE ET INCLUSIONS CHEZ LES PROCARYOTES

81

4.10 4.11 4.12 4.13

Les structures bactériennes de surface Les inclusions cellulaires Les vésicules de gaz Les endospores

81 82 84 86

IV

LOCOMOTION MICROBIENNE

90

4.14 Les flagelles et la mobilité 4.15 La mobilité par glissement 4.16 La mobilité cellulaire et la réponse comportementale : chimiotactisme et phototactisme

91 93

95

39

5

Nutrition, culture et métabolisme des micro-organismes 100

40

I

INUTRITION ET CULTURE DES MICRO-ORGANISMES

101

40

5.1 5.2 5.3

La nutrition microbienne Les milieux de culture La culture des micro-organismes

101 104 106

II

ÉNERGÉTIQUE ET ENZYMES

108

5.4 5.5

Éléments de bioénergétique Les enzymes et la catalyse

108 109

OXYDORÉDUCTION ET COMPOSÉS RICHES EN ÉNERGIE

111

43

MACROMOLÉCULES NON INFORMATIONNELLES

44

3.3 3.4

Les polysaccharides Les lipides

44 46

III

MACROMOLÉCULES INFORMATIONNELLES 47

III

3.5 3.6 3.7 3.8

Les acides nucléiques Les acides aminés et la liaison peptidique Les protéines : structures primaire et secondaire Les structures protéiques d’ordre supérieur et la dénaturation

5.6 5.7 5.8

47 48 51 52

L’oxydoréduction Un transporteur d’électrons, le NAD+ Les composés riches en énergie et le stockage de l’énergie

111 114 115


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XIV

IV

Table des matières

PRINCIPALES VOIES CATABOLIQUES, TRANSPORT D’ÉLECTRONS ET FORCE PROTON-MOTRICE

116

5.9 La conservation de l’énergie : les options 5.10 Un exemple de fermentation : la glycolyse 5.11 La respiration et les chaînes de transfert d’électrons associées aux membranes 5.12 La conservation de l’énergie par la force proton-motrice

V

116 117 119 121

FLUX DE CARBONE DANS LA RESPIRATION ET AUTRES VOIES CATABOLIQUES

124

5.13 Le flux de carbone dans la respiration : le cycle de l’acide citrique 5.14 Les autres voies cataboliques

125 125

VI

128

RÉACTIONS DE BIOSYNTHÈSE

5.15 La biosynthèse des sucres et des polysaccharides 5.16 La biosynthèse des acides aminés et des nucléotides 5.17 La biosynthèse des acides gras et des lipides

128 128 130

7

Bases de biologie moléculaire

I

GÈNES ET EXPRESSION GÉNIQUE

167

7.1

Macromolécules et informations génétiques

167

II

STRUCTURE DE L’ADN

168

7.2 7.3 7.4

Structure de l’ADN : la double hélice Structure de l’ADN : super-enroulement Chromosomes et autres éléments génétiques

169 172 174

III

RÉPLICATION DE L’ADN

176

7.5 7.6

Réplication de l’ADN : modèles et enzymes Réplication de l’ADN : la fourche de réplication

176 177

IV

OUTILS DE MANIPULATION DE L’ADN

181

7.7 7.8 7.9

Enzymes de restriction et hybridation Séquençage et synthèse d’ADN Amplification de l’ADN par réaction de polymérisation en chaîne

181 184 186

SYNTHÈSE DE L’ARN : LA TRANSCRIPTION

187

V

6

Croissance microbienne

I

DIVISION CELLULAIRE BACTÉRIENNE

135

6.1 6.2

La croissance cellulaire et la fission binaire Les protéines Fts, le plan de division cellulaire et la morphologie cellulaire La synthèse du peptidoglycane et la division cellulaire

135

7.10 Description de la transcription 7.11 Diversité des facteurs sigma, séquences consensus et ARN polymérases 7.12 Terminateurs de transcription 7.13 Unité de transcription

136

VI

138

CROISSANCE DES POPULATIONS MICROBIENNES

139

6.3

II 6.4 6.5 6.6

III 6.7

6.8 6.9

IV

134

La terminologie et le concept de la croissance exponentielle L’expression mathématique de la croissance exponentielle Les phases de la croissance

141 142

MESURE DE LA CROISSANCE MICROBIENNE

143

Les mesures directes de la croissance microbienne : comptages des cellules totales et viables Les mesures indirectes de la croissance microbienne : turbidité La culture continue en chémostat

IMPACT DE L’ENVIRONNEMENT SUR LA CROISSANCE MICROBIENNE : LA TEMPÉRATURE

6.10 L’impact de la température sur la croissance 6.11 La croissance microbienne à basse température 6.12 La croissance microbienne à haute température

V

IMPACT DE L’ENVIRONNEMENT SUR LA CROISSANCE MICROBIENNE : pH, PRESSION OSMOTIQUE ET OXYGÈNE

6.13 La croissance microbienne à pH acide ou alcalin 6.14 L’influence de la pression osmotique sur la croissance 6.15 L’influence de l’oxygène sur la croissance 6.16 Les formes toxiques de l’oxygène

140

SYNTHÈSE DES PROTÉINES

7.14 Code génétique 7.15 Les ARN de transfert 7.16 Processus de synthèse des protéines : la traduction 7.17 Sécrétion et repliement des protéines

166

188 189 190 191

192 192 194 196 200

8

Régulation du métabolisme

I

VUE D’ENSEMBLE DE LA RÉGULATION

204

8.1

Principaux modes de régulation

204

II

RÉGULATION DE L’ACTIVITÉ ENZYMATIQUE

205

8.2 8.3

Inhibition non covalente d’enzyme Modification covalente des enzymes

205 206

III

PROTÉINES SE LIANT À L’ADN ET RÉGULATION DE LA TRANSCRIPTION PAR CONTRÔLE NÉGATIF ET POSITIF

208

8.4 8.5

Protéines se liant de l’ADN Contrôle négatif de la transcription : répression et induction Contrôle positif de la transcription

210 212

IV

MÉCANISMES DE RÉGULATION GLOBALE

214

8.7 8.8 8.9 8.10

Contrôle global et opéron lac Réponse stringente Autres réseaux de contrôle global Détection de quorum (quorum sensing)

214 216 217 219

156

V

AUTRES MÉCANISMES DE RÉGULATION

220

156

8.11 Atténuation 8.12 Transduction du signal et systèmes de régulation à deux composants 8.13 Régulation du chimiotactisme 8.14 ARN de régulation et riboswitchs

143 146 148

150 150

8.6

151 154

158 160 162

203

208

220 222 224 225


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Table des matières XV

9

L’essentiel de la virologie

I

VIRUS ET VIRION

229

9.1 9.2

Propriétés générales des virus Nature du virion

229 230

II

CROISSANCE ET TITRATION

233

9.3 9.4

Les hôtes des virus Titration de virus

233 234

III

RÉPLICATION VIRALE

236

9.5

Caractéristiques générales de la réplication virale Multiplication virale : attachement et pénétration Multiplication virale : production de l’acide nucléique et des protéines

9.6 9.7

228

236 237 238

Partie deux

Évolution et diversité microbiennes 11 Évolution et systématique microbienne I

298

TERRE PRIMITIVE, ORIGINE DE LA VIE ET DIVERSIFICATION MICROBIENNE

11.1 L’évolution de la Terre et les premières formes de vie 11.2 La vie primitive : le monde à ARN et le codage moléculaire 11.3 La vie primitive : énergie et métabolisme du carbone 11.4 Les eucaryotes et les organelles : l’endosymbiose

299 299 302 303

IV

DIVERSITÉ VIRALE

240

9.8 9.9 9.10 9.11 9.12 9.13

Généralités sur les bactériophages Bactériophages virulents et T4 Bactériophages tempérés Bactériophage lambda Généralités sur les virus animaux Rétrovirus

240 241 243 244 247 249

V

PARTICULES SOUS-VIRALES

251

11.5 Les chronomètres de l’évolution 308 11.6 Le séquençage de l’ARN ribosomique : un outil de l’évolution moléculaire 309 11.7 Les séquences signature, les sondes phylogénétiques et l’analyse des communautés microbiennes 311

251

III

9.14 Viroïdes et prions

10 Génétique bactérienne I

IMUTATION ET RECOMBINAISON

10.1 10.2 10.3 10.4 10.5

Les mutations et les mutants Les bases moléculaires de la mutation Le taux de mutation La mutagenèse La mutagenèse et la carcinogenèse : le test de Ames 10.6 La recombinaison génétique

II

ÉCHANGES GÉNÉTIQUES CHEZ LES PROCARYOTES

10.7 10.8 10.9 10.10

La transformation La transduction Les plasmides : principes généraux Les types de plasmides et leur signification biologique 10.11 La conjugaison : les caractéristiques essentielles 10.12 La formation des souches Hfr et la mobilisation du chromosome 10.13 La complémentation 10.14 Les transposons et les séquences d’insertion

III

GÉNÉTIQUE BACTÉRIENNE ET CLONAGE

254 255 256 258 260 261 265 266

267 268 271 273 275 278 279 282 283

287

10.15 Le clonage moléculaire 10.16 Les vecteurs de clonage : les plasmides 10.17 Les vecteurs de clonage : le bactériophage lambda 10.18 La mutagenèse dirigée

290 292

IV

293

LE CHROMOSOME BACTÉRIEN

10.19 La carte génétique du chromosome d’Escherichia coli

287 288

294

II

MÉTHODES D’ÉTUDE DE L’ÉVOLUTION

ÉVOLUTION MICROBIENNE

306

308

313

11.8 La phylogénie microbienne fondée sur les séquences d’ARN ribosomique 313 11.9 Les caractéristiques des domaines du vivant 315

IV

TAXINOMIE MICROBIENNE ET RELATIONS AVEC LA PHYLOGÉNIE 317

11.10 11.11 11.12 11.13

La taxinomie conventionnelle La chimiotaxinomie Le concept d’espèce en microbiologie La nomenclature – le Bergey’s Manual

317 319 323 325

12 Diversité des procaryotes : les Bacteria

328

I

PHYLOGÉNIE DES BACTERIA

330

12.1 Phylogénie des Bacteria

330

II

331

12.2 12.3 12.4 12.5 12.6 12.7 12.8 12.9 12.10 12.11 12.12 12.13 12.14 12.15

PHYLUM 1 : LES PROTÉOBACTÉRIES

Bactéries pourpres phototrophes Bactéries nitrifiantes Bactéries sulfo-oxydantes et ferro-oxydantes Bactéries hydrogéno-oxydantes Méthanotrophes et méthylotrophes Pseudomonas et pseudomonades Bactéries acétiques Bactéries aérobies, libres, fixatrices d’azote Neisseria, Chromobacterium et genres apparentés Entérobactéries Vibrio et Photobacterium Rickettsiales Spirilles Protéobactéries gainées : Sphaerotilus et Leptothrix 12.16 Bactéries bourgeonnantes, à prosthèques, et pédonculées 12.17 Myxobactéries à mobilité glissante 12.18 Protéobactéries sulfato- et sulfo-réductrices

331 334 336 339 341 345 348 349 351 351 356 358 360 363 365 369 373


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XVI

III

Table des matières

PHYLA 2 ET 3 : LES BACTÉRIES GRAM POSITIF ET LES ACTINOBACTÉRIES

12.19 Bactéries Gram positif, non sporulées, à faible % G+C : bactéries lactiques et apparentées 12.20 Bactéries Gram positif, sporulées, à faible % G+C : Bacillus, Clostridium et bactéries apparentées 12.21 Bactéries sans paroi cellulaire, apparentées aux bactéries Gram positif, à faible (% G+C) : mycoplasmes 12.22 Bactéries (actinobactéries) Gram positif, à fort (% G+C) : bactéries corynéformes et propioniques 12.23 Autres actinobactéries : Mycobacterium sp. 12.24 Actinobactéries filamenteuses : Streptomyces et autres actinomycètes

IV

PHYLUM 4 : LES CYANOBACTÉRIES ET LES PROCHLOROPHYTES

II 375 375

381

386

388 390 392

397

12.25 Cyanobactéries 12.26 « Prochlorophytes » et chloroplastes

397 400

V

402

PHYLUM 5 : CHLAMYDIA

12.27 Chlamydia

VI

402

PHYLUM 6 : PLANCTOMYCES / PIRELLULA

404

12.28 Planctomyces : une bactérie pédonculée phylogénétiquement distincte

404

VII

EURYARCHAEOTA

424

13.3 Archaea halophiles extrêmes 13.4 Archaea productrices de méthane : les méthanogènes 13.5 Termoplasmatales : Thermoplasma, Ferroplasma et Picrophilus 13.6 Euryarchaeota hyperthermophiles : Thermococcales et Methanopyrus 13.7 Euryarchaeota hyperthermophiles : Archaeoglobales

432

III

437

CRENARCHAEOTA

13.8 Habitats et métabolisme énergétique des Crenarchaeota 13.9 Hyperthermophiles des habitats volcaniques terrestres : Sulfolobales et Thermoprotéales 13.10 Hyperthermophiles des habitats volcaniques sous-marins : Desulfurococcales

IV

NANOARCHAEOTA

13.11 Nanoarchaeum

V

L’ÉVOLUTION ET LA VIE À HAUTE TEMPÉRATURE

13.12 Stabilité thermique des molécules biologiques 13.13 Archaea hyperthermophiles, H2 et évolution microbienne

424 429

434 435

437 440 442

444 444

446 446 448

405

14 Biologie de la cellule eucaryote et micro-organismes eucaryotes 451

12.29 Verrucomicrobium et Prosthecobacter

405

I

VIII

406

PHYLUM 7 : VERRUCOMICROBIA PHYLUM 8 : LES FLAVOBACTÉRIES

12.30 Bacteroides et Flavobacterium

IX

PHYLUM 9 : LE GROUPE DES CYTOPHAGA 407

12.31 Cytophaga et apparentés

X

406

PHYLUM 10 : LES BACTÉRIES VERTES SULFUREUSES

407

408

12.32 Chlorobium et autres bactéries vertes sulfureuses

408

XI

410

PHYLUM 11 : SPIROCHÈTES

12.33 Spirochètes

410

XII

414

PHYLUM 12 : DEINOCOCCI

12.34 Deinococcus / Thermus

XIII

PHYLUM 13 : LES BACTÉRIES VERTES NON SULFUREUSES

STRUCTURE ET FONCTION DE LA CELLULE EUCARYOTE 452

14.1 Structure de la cellule eucaryote et noyau 452 14.2 Organelles de la respiration et de la fermentation : mitochondrie et hydrogénosome 453 14.3 Organelle photosynthétique : le chloroplaste 455 14.4 Endosymbiose : relations entre mitochondries et chloroplastes, d’une part, et bactéries, d’autre part 456 14.5 Autres organelles et structures de la cellule eucaryote 457

II

NOTIONS DE GÉNÉTIQUE ET DE BIOLOGIE MOLÉCULAIRE EUCARYOTES 459

414

14.6 Réplication de l’ADN linéaire 14.7 Notions de génétique eucaryote 14.8 Maturation de l’ARN et ribozymes

459 461 462

414

III

DIVERSITÉ MICROBIENNE EUCARYOTE

465

12.35 Chloroflexus et genres apparentés

415

XIV PHYLA 14 ET 16

417

12.36 Thermotoga et Thermodesulfobacterium 12.37 Aquifex, Thermocrinis et genres apparentés

417 418

14.9 14.10 14.11 14.12 14.13

Phylogénie des Eukarya Protozoaires Moisissures glaireuses Champignons Algues

465 468 472 474 478

XV

PHYLA 17 ET 18 : NITROSPIRA ET DEFERRIBACTER

12.38 Nitrospira, Deferribacter et genres apparentés

13 Diversité des procaryotes : les Archaea I

419 419

I

TECHNIQUES DE CLONAGE POUR LA GÉNOMIQUE

483 484

15.1 Vecteurs pour le clonage et le séquençage 15.2 Séquençage du génome 15.3 Annotation du génome

485 487 488

422

II

489

423

15.4 Génomes procaryotes : tailles et cadres ouverts de lecture

421

PHYLOGÉNIE ET MÉTABOLISME GÉNÉRAL 422

13.1 Panorama phylogénétique des Archaea 13.2 Conservation de l’énergie et autotrophie chez les Archaea

15 Génomique microbienne

GÉNOMES MICROBIENS

490


7209.book Page XVII Jeudi, 2. août 2007 5:59 05

Table des matières XVII 15.5 Génomes procaryotes : Analyses bioinformatiques et distributions des gènes 15.6 Génomes des micro-organismes eucaryotes

III

492 495

AUTRES GÉNOMES ET ÉVOLUTION DES GÉNOMES

496

15.7 Les génomes des organites 15.8 Évolution et familles de gènes 15.9 L’exploitation des génomes

496 499 500

IV

501

FONCTION ET RÉGULATION DES GÈNES

15.10 Protéomique 15.11 Puces à ADN et transcriptome

16 Diversité du monde des virus I

501 503

507

LES VIRUS DE PROCARYOTES

508

16.1 Bactériophages à ARN 16.2 Bactériophages à ADN monocaténaire icosaédriques 16.3 Bactériophages à ADN monocaténaire filamenteux 16.4 Bactériophages à ADN bicaténaire : le phage T7 16.5 Mu : un bactériophage à ADN bicaténaire qui se transpose 16.6 Les virus des Archaea

515 517

II

518

LES VIRUS D’EUCARYOTES

16.7 Virus végétaux 16.8 Virus animaux à ARN monocaténaire positif : poliovirus et coronavirus 16.9 Virus animaux à ARN monocaténaire négatif : la rage, la grippe et autres virus apparentés 16.10 Virus à ARN bicaténaire : les Reoviridae 16.11 Cycle réplicatif des virus animaux à ADN bicaténaire 16.12 Virus à ADN bicaténaire : les Herpesviridae 16.13 Virus à ADN bicaténaire : les Poxviridae 16.14 Virus à ADN bicaténaire : les Adenoviridae 16.15 Virus utilisant une transcriptase inverse : les Retroviridae et les Hepadnaviridae

508 510 512 513

519 521 523 527 528 530 531 532

17.8 Donneurs d’électrons inorganiques et énergétique 17.9 Oxydation de l’hydrogène 17.10 Oxydation des composés soufrés réduits 17.11 Oxydation du fer 17.12 Nitrification et Anammox

III

LA VIE EN ANAÉROBIOSE : LES RESPIRATIONS ANAÉROBIES

17.13 17.14 17.15 17.16 17.17 17.18

Respiration anaérobie Réduction des nitrates et dénitrification Réduction des sulfates Acétogénèse Méthanogenèse Fer ferrique, manganèse, chlorate et accepteurs d’électrons organiques

IV

MODES DE VIE ANAÉROBIES : FERMENTATIONS ET SYNTROPHIE

557 557 558 561 563

566 566 567 569 571 573 577

580

17.19 Fermentations : énergétique et équilibre redox 580 17.20 Diversité des fermentations 582 17.21 Syntrophie 584

V

OXYDATION DES HYDROCARBURES ET RÔLE D’O2 DANS LE CATABOLISME DES COMPOSÉS ORGANIQUES

586

17.22 Le rôle de l’oxygène moléculaire (O2) dans les processus biochimiques 17.23 Oxydation des hydrocarbures 17.24 Méthanotrophie et méthylotrophie 17.25 Métabolisme des hexoses, des pentoses et des polysacharides 17.26 Métabolisme des acides organiques 17.27 Utilisation des lipides

590 593 594

VI

595

FIXATION DE L’AZOTE

17.28 Nitrogénase et processus de fixation d’azote 17.29 Génétique et régulation de la fixation d’azote

18 Méthodes en écologie microbienne I

Diversité métabolique et écologie microbienne

I

CHIMIOLITHOTROPHIE : ÉNERGIE OBTENUE DE L’OXYDATION DE DONNEURS D’ÉLECTRONS INORGANIQUES 557

586 587 588

595 599

533

Partie trois

17 Diversité métabolique

II

ANALYSE DES COMMUNAUTÉS MICROBIENNES PAR LES MÉTHODES DE CULTURE

18.1 Enrichissement et isolement 18.2 Isolement en culture pure

539

PHOTOTROPHIE

17.1 Photosynthèse 17.2 Pigments photosynthétiques et leur localisation dans la cellule 17.3 Caroténoïdes et phycobilines 17.4 Photosynthèse anoxygénique 17.5 Photosynthèse oxygénique 17.6 Fixation autotrophe du CO2 : le cycle de Calvin 17.7 Fixation autotrophe du CO2 : cycle inverse de l’acide citrique et cycle de l’hydroxypropionate

II

540 541 542 545 546 551 553

555

ANALYSE DES COMMUNAUTÉS MICROBIENNES PAR LES MÉTHODES MOLÉCULAIRES

18.3 Techniques de coloration pour la viabilité et la quantification 18.4 Colorations génétiques 18.5 Utilisation de la PCR 18.6 Écogénomique (métagénomique)

III

MESURES DE L’ACTIVITÉ MICROBIENNE DANS L’ENVIRONNEMENT

18.7 Radio-isotopes et microélectrodes 18.8 Isotopes stables

602 603 603 607

609 609 612 613 615

616 617 619


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XVIII

Table des matières

19 Écologie microbienne I

ÉCOSYSTÈMES MICROBIENS

19.1 Populations, guildes, communautés 19.2 Environnements et microenvironnements 19.3 Croissance microbienne sur les surfaces et biofilms

II

HABITATS MICROBIENS DU SOL ET DES EAUX DOUCES

622 623 623 624 626

628

19.4 Environnements terrestres 19.5 Environnements d’eaux douces

628 632

III

633

MICROBIOLOGIE MARINE

19.6 Habitats marins et distribution des micro-organismes 19.7 Microbiologie abyssale 19.8 Sources hydrothermales

634 635 638

IV

641

CYCLES DU CARBONE ET DE L’OXYGÈNE

19.9 Cycle du carbone 19.10 Syntrophie et méthanogenèse 19.11 Cycle du carbone chez les ruminants

V

AUTRES CYCLES BIOGÉOCHIMIQUES MAJEURS

641 643 646

650

19.12 Cycle de l’azote 19.13 Cycle du soufre 19.14 Cycle du fer

650 652 653

VI

656

BIOREMÉDIATION MICROBIENNE

19.15 Biolixiviation des minerais 19.16 Le mercure et les transformations des métaux lourds 19.17 Biodégradation du pétrole 19.18 Biodégradation des xénobiotiques

VII 19.19 19.20 19.21 19.22

INTERACTIONS ENTRE PLANTES ET MICRO-ORGANISMES L’environnement des plantes Lichens et mycorhizes Agrobacterium et la maladie du crown gall Association symbiotique des bactéries des nodosités racinaires chez les Légumineuses

656 659 660 662

665 665 666 668 671

Partie quatre

Immunologie, pouvoir pathogène et réponse immunitaire de l'hôte 20 Contrôle de la croissance des micro-organismes I

CONTRÔLE ANTIMICROBIEN, LES MÉTHODES PHYSIQUES

679 681 681 684 686

II

688

CONTRÔLE ANTIMICROBIEN CHIMIQUE

AGENTS ANTIMICROBIENS UTILISÉS IN VIVO

20.6 Molécules antimicrobiennes de synthèse 20.7 Molécules antimicrobiennes naturelles : les antibiotiques 20.8 Antibiotiques à cycle β-lactame : pénicillines et céphalosporines 20.9 Antibiotiques produits par les procaryotes

IV

CONTRÔLE DES VIRUS PATHOGÈNES DES ORGANISMES EUCARYOTES

20.10 Molécules antivirales 20.11 Molécules antifongiques

V

RÉSISTANCES AUX MOLÉCULES ANTIMICROBIENNES ET DÉCOUVERTES DE NOUVELLES MOLÉCULES

20.12 Résistance aux molécules antimicrobiennes 20.13 Recherche de nouvelles molécules antimicrobiennes

21 Interactions homme– micro-organismes I

INTERACTIONS FAVORABLES ENTRE LES MICRO-ORGANISMES ET L’HOMME

21.1 Généralités sur les interactions hôte–microorganisme 21.2 Flore bactérienne normale de la peau 21.3 Flore bactérienne normale de la cavité buccale 21.4 Flore bactérienne normale du tractus gastrointestinal 21.5 Flore bactérienne normale des autres voies cutanéomuqueuses

II

INTERACTIONS NÉFASTES ENTRE LES MICRO-ORGANISMES ET L’HOMME

688 689

692 692 696 697 698

700 700 702

704 704 709

713 714 714 716 716 719 720

722

21.6 Porte d’entrée du pathogène chez l’hôte 21.7 Colonisation et croissance 21.8 Virulence

722 724 724

III

FACTEURS DE VIRULENCE ET TOXINES

727

21.9 21.10 21.11 21.12

Facteurs de virulence Exotoxines Entérotoxines Endotoxines

727 727 729 730

IV

FACTEURS DE L’HÔTE

731

21.13 Facteurs de risque d’infection 21.14 Résistance innée à l’infection

731 733

22 Immunologie générale

20.1 Stérilisation par la chaleur 20.2 Stérilisation par rayonnement 20.3 Filtration stérilisante 20.4 Contrôle chimique de la croissance 20.5 Agents antimicrobiens chimiques à usage externe

III

736

I

PANORAMA DU SYSTÈME IMMUNITAIRE

738

22.1 22.2 22.3 22.4

Cellules et organes du système immunitaire Réponse immunitaire innée Inflammation, fièvre et choc septique Réponse immunitaire adaptative

738 741 744 745

II

ANTIGÈNE, LYMPHOCYTE T ET IMMUNITÉ À MÉDIATION CELLULAIRE 746

22.5 Antigènes et immunogènes 22.6 Présentation de l’antigène aux lymphocytes T 22.7 Lymphocytes T cytotoxiques et cellules natural killer 22.8 Lymphocytes TH : activation de la réponse immunitaire

746 747 750 751


7209.book Page XIX Jeudi, 2. août 2007 5:59 05

Table des matières XIX

III

ANTICORPS DANS LA RÉPONSE IMMUNITAIRE

752

22.9 Anticorps (ou immunoglobulines) 22.10 Production des anticorps 22.11 Complément, anticorps et destruction du pathogène

IV

752 755 757

IMMUNITÉ ET PRÉVENTION DES MALADIES INFECTIEUSES 758

22.12 Immunité naturelle 22.13 Immunité artificielle 22.14 Nouvelles techniques de vaccination

759 759 761

V

762

MALADIES DE LA RÉPONSE IMMUNITAIRE

22.15 Allergie, hypersensibilité et auto-immunité 22.16 Superantigènes

23 Immunologie moléculaire I

762 765

767

RÉCEPTEURS DU SYSTÈME IMMUNITAIRE

768

23.1 Immunité innée et PRM 23.2 Immunité adaptative et superfamille des immunoglobulines

II

768 769

COMPLEXE MAJEUR D’HISTOCOMPATIBILITÉ

770

24.10 Tests immunoenzymatiques (ELISA) et dosages radio-immunologiques (RIA) 24.11 Procédés d’Immunoblot

III

MÉTHODES DE DIAGNOSTIC MOLÉCULAIRE ET DE DIAGNOSTIC VIROLOGIQUE

24.12 Méthodes moléculaires 24.13 Diagnostic virologique

25 Épidémiologie PRINCIPES EN ÉPIDÉMIOLOGIE

822

25.1 25.2 25.3 25.4 25.5

Science de l’épidémiologie Vocabulaire en épidémiologie Réservoirs et épidémie Transmission des infections Communauté de l’hôte

823 823 825 828 829

II

ÉPIDÉMIES ACTUELLES

831

III

773

III

IV

RÉCEPTEURS D’ANTIGÈNE DES CELLULES T

775

23.7 TCR et liaison à l’antigène 23.8 La diversité des gènes du TCR

V

775 776

SIGNAUX MOLÉCULAIRES DE L’AUTO-IMMUNITÉ

777

23.9 Réaction clonale et tolérance 23.10 Seconds signaux 23.11 Cytokines et chimiokines

777 778 779

24 Diagnostic microbiologique et immunologique I

783

MÉTHODES DIAGNOSTIQUES FONDÉES SUR LA CROISSANCE BACTÉRIENNE

24.1 Isolement des agents pathogènes à partir des échantillons cliniques 24.2 Méthodes d’identification basées sur les caractéristiques de croissance 24.3 Étude de la résistance aux antimicrobiens 24.4 Sécurité dans les laboratoires de microbiologie

II

MÉTHODES IMMUNOLOGIQUES ET DE DIAGNOSTIC CLINIQUE

24.5 Immunoanalyses pour le diagnostic des maladies infectieuses 24.6 Anticorps polyclonaux et monoclonaux 24.7 Réactions antigène-anticorps in vitro : sérologie 24.8 Agglutination 24.9 Anticorps fluorescents

784 784 790 792 795

797 797 800 802 804 806

821

I

770 771

773 774

814 818

Maladies microbiennes

23.3 Structure des protéines du CMH 23.4 Le polymorphisme des gènes du CMH

ANTICORPS

814

Partie cinq

25.6 Pandémie du SIDA 25.7 Infections acquises à l’hôpital (nosocomiales) 25.8 Syndrome respiratoire aigu sévère (SRAS)

23.5 Structure des anticorps et de leur liaison aux antigènes 23.6 Diversité des gènes des anticorps

809 813

ÉPIDÉMIOLOGIE ET SANTÉ PUBLIQUE

25.9 Mesures de santé publique pour le contrôle des maladies infectieuses 25.10 Considérations générales en santé publique 25.11 Infections émergentes et réémergentes 25.12 Guerre et armes biologiques 25.13 Le bacille du charbon en tant qu’arme biologique

26 Maladies infectieuses à transmission interhumaine I

MALADIES TRANSMISSIBLES PAR VOIE MÉRIENNE

26.1 26.2 26.3 26.4 26.5 26.6

Pathogènes aériens Maladies streptococciques Corynebacterium spp. et diphtérie Bordetella spp. et coqueluche Mycobacterium, tuberculose et lèpre Neisseria meningitidis, méningite et méningococcémie 26.7 Virus et infections respiratoires 26.8 Rhumes et grippe

II

MALADIES TRANSMISSIBLES PAR CONTACT DIRECT

26.9 Staphylococcus spp. 26.10 Helicobacter pylori et ulcères gastriques 26.11 Virus des hépatites

III

MALADIES SEXUELLEMENT TRANSMISSIBLES

26.12 Gonococcie et syphilis 26.13 Chlamydiose, herpès et trichomonose 26.14 Syndrome d’immunodéficience acquise : SIDA et VIH

831 832 833

834 834 837 837 843 844

848 849 849 851 853 854 855 858 860 862

865 865 867 868

870 871 874 876


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XX

Table des matières

27 Maladies microbiennes transmises par des animaux, par des arthropodes ou d’origine tellurique I

MALADIES TRANSMISES PAR DES ANIMAUX

27.1 Rage 27.2 Syndrome pulmonaire à hantavirus

Partie six 886 887 887 889

Les micro-organismes : des outils pour la recherche et l'industrie 30 Microbiologie industrielle I

MICRO-ORGANISMES INDUSTRIELS ET FORMATION DES PRODUITS

II

MALADIES TRANSMISES PAR DES ARTHROPODES

891

27.3 27.4 27.5 27.6 27.7

Rickettsioses Maladie de Lyme Paludisme Virus West Nile Peste

891 893 896 899 900

30.1 Micro-organismes d’intérêt industriel et leurs produits 30.2 Métabolites primaires et secondaires 30.3 Caractéristiques des fermentations à grande échelle 30.4 Mise à l’échelle des fermenteurs

III

MALADIES D’ORIGINE TELLURIQUE

902

II

27.8 Champignons microscopiques pathogènes 27.9 Tétanos

902 905

28 Traitement des eaux usées et purification de l’eau, maladies microbiennes d’origine hydrique 907 I

MICROBIOLOGIE DES EAUX USÉES ET PURIFICATION DE L’EAU

28.1 Santé publique et qualité de l’eau 28.2 Traitement des eaux usées 28.3 Purification de l’eau potable

II

MALADIES INFECTIEUSES À TRANSMISSION HYDRIQUE

28.4 28.5 28.6 28.7 28.8

Eau et risques sanitaires Choléra Giardiase et cryptosporidiose Légionellose (maladie des légionnaires) Fièvre typhoïde et autres maladies à transmission hydrique

908 908 910 914

915 915 916 918 920 921

29 Conservation des aliments et maladies d’origine alimentaire 924 I

CONSERVATION DES ALIMENTS ET CROISSANCE MICROBIENNE

29.1 Croissance microbienne et altération des aliments 29.2 Conservation des aliments 29.3 Aliments fermentés

II

925 925 926 929

ANALYSE BACTÉRIOLOGIQUE DES ALIMENTS ET TOXI-INFECTIONS ALIMENTAIRES

931

29.4 Maladies infectieuses d’origine alimentaire et analyse bactériologique 29.5 Toxi-infections alimentaires à staphylocoques 29.6 Toxi-infections alimentaires à Clostridium

931 933 934

III

INFECTION ALIMENTAIRE

936

29.7 29.8 29.9 29.10 29.11

Salmonellose Escherichia coli pathogènes Campylobacter Listériose Autres maladies infectieuses d’origine alimentaire

PRODUITS PHARMACEUTIQUES

30.5 Isolement et caractérisation des antibiotiques 30.6 Production industrielle de pénicillines et de tétracyclines 30.7 Vitamines et acides aminés 30.8 Procédés de biotransformation des stéroïdes 30.9 Les enzymes en tant que produits industriels

III

PRINCIPAUX PRODUITS INDUSTRIELS ALIMENTAIRES ET BOISSONS

30.10 30.11 30.12 30.13

Boissons alcoolisées et alcools Production du vinaigre Acide citrique et autres composés organiques La levure en tant que nourriture et supplément diététique 30.14 Champignons comestibles

943 944 944 945 947 948

949 949 950 954 956 957

959 959 964 966 966 968

31 Génie génétique et biotechnologie970 I

TECHNIQUES DU GÉNIE GÉNÉTIQUE

971

31.1 31.2 31.3 31.4 31.5

Principes découlant du génie génétique Hôtes et vecteurs de clonage Identifier le bon clone Vecteurs spécifiques Expression de gènes de mammifères chez des bactéries

971 973 974 976 979

APPLICATIONS PRATIQUES DU GÉNIE GÉNÉTIQUE

981

II

31.6 Production d’insuline : les débuts de la biotechnologie commerciale 31.7 Autres produits et protéines de mammifères 31.8 Vaccins issus du génie génétique 31.9 Génie génétique appliqué à la génétique animale et humaine 31.10 Génie génétique en production végétale : les plantes transgéniques

981 982 983 986 987

Annexe 1

936 937 938 939

Bioénergétique microbienne : les calculs

992

Annexe 2

Bergey’s manual of systematic Bacteriology, deuxième édition

997

940

Index

1009


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Préface des auteurs Nous vivons à l’âge de la microbiologie. Chaque jour ou presque, sont publiés des articles relatant les nouvelles découvertes de cette science extraordinaire : nouvelles maladies émergentes, nouveaux organismes et nouveaux outils de recherche. Ainsi va la microbiologie de nos jours. Pour vous présenter le paysage de cette discipline et ses actualités de dernière minute, voici la 11e édition du Brock, Biologie des micro-organismes. Ce manuel a vu le jour il y a trente-cinq ans. Depuis la publication de la première édition de Brock Biology of Microorganisms par Thomas D. Brock (Prentice Hall, 1970), ce livre a un objectif simple et unique : exposer les principes de la microbiologie dans le cadre de la science moderne. La 11e édition poursuit cette tradition et s’exprime avec la même précision et la même rigueur que les dix éditions précédentes. De nos jours, la microbiologie est très exigeante aussi bien envers les étudiants que les enseignants. La quantité d’informations disponibles est énorme, les prérequis indispensables dans le domaine scientifique sont très importants et les cours d’introduction à la microbiologie sont combles. Les auteurs de la 11e édition du Brock, Biologie des micro-organismes sont parfaitement au fait de ces problèmes et ont beaucoup travaillé pour mettre au point un manuel de microbiologie où les principes, que viennent compléter les détails, sont clairs et évidents et les concepts de base bien intégrés. Nous espérons que vous en conviendrez.

Les nouveautés de la 11e édition Les habitués du Brock, Biologie des micro-organismes trouveront dans la nouvelle édition le même livre de chevet qu’ils appréciaient. Cependant, les enseignants tireront mieux profit de cette édition pour leurs cours et elle représentera pour les étudiants une mine d’informations encore plus inestimable. La 11e édition est orientée vers une pédagogie visuelle. Sa conception est dans la continuation de la 10e, mais apporte des nouveautés en termes de présentation, de couleurs et d’illustrations. Les chapitres sont organisés et numérotés selon le système logique et pratique mis en place dès la 1re édition. Mais désormais, chaque chapitre est organisé en plusieurs ensembles regroupant des informations apparentées et incorporant les concepts dans des paragraphes plus compréhensibles. Comme dans les précédentes éditions, un glossaire, qui définit les termes essentiels pour les étudiants, ouvre chaque chapitre, mettant ainsi en exergue le langage microbiologique. L’encadré « Contrôlez vos acquis » demeure mais est désormais mieux signalé. Il permet à l’étudiant de faire une pause, de réfléchir et de réviser avant de passer au concept suivant. Le lecteur trouvera toujours également des questions et des problèmes en fin de chapitre. L’ensemble de l’ouvrage s’achève par un index détaillé.

Pour chaque chapitre, des « focus », conçus pour une lecture agréable et richement illustrés, complètent l’information donnée dans le chapitre. La présentation des tableaux a été complètement modifiée pour une lecture plus efficace et mieux organisée. Ces tableaux étant indispensables dans une science telle que la microbiologie, ce remodelage plaira aussi bien aux enseignants qu’aux étudiants. D’autres outils pédagogiques faciliteront la lecture, tels les titres plus visibles, les nombreux renvois aux chapitres, les figures ainsi que les questions de révision. Celles-ci aideront l’étudiant à rafraîchir sa mémoire avant de pouvoir se reporter aux réponses. Illustrer cet ouvrage est une tâche particulière, chaque illustration ayant été redessinée par de nouveaux artistes. Le résultat est plus brillant, plus clair, plus coloré, plus attractif, plus précis et plus détaillé que jamais. Le lecteur repèrera immédiatement toutes ces nouveautés, telles que les flèches rouges et ondulées indiquant les réactions énergétiques. Les réactions cellulaires qui produisent ou consomment de l’ATP sont souvent essentielles et cette signalisation colorée est là pour attirer l’attention de l’étudiant. Bien que la 11e édition soit plus courte que les précédentes, elle offre de considérables nouveautés. Chaque chapitre contient de nouvelles informations, dont nous pouvons ici vous donner un avant-goût : les formes toxiques de l’oxygène (chapitre 6) ; la diversité des facteurs sigma, les séquences consensus et les ARN polymérases (chapitre 7) ; la réponse stringente (chapitre 8) ; la régulation de l’ARN et les riboswitches (chapitre 8) ; les particules subvirales (chapitre 9) ; les sources de carbone et le métabolisme énergétique des formes de vie primitives (chapitre 11) ; la biologie de Nanoarchaeum (chapitre 13) ; la maturation de l’ARN et les ribozymes (chapitre 17) ; la réplication de l’ADN linéaire (chapitre 17) ; l’annotation du génome (chapitre 15) ; l’analyse bioinformatique et la distribution des gènes chez les procaryotes (chapitre 15) ; les puces à ADN et le transcriptome (chapitre 15) ; les virus des Archaea (chapitre 16) ; la génomique environnementale (chapitre 18) ; les risques liés à l’hôte dans le cas des infections (chapitre 21) ; inflammation, fièvre et choc septique (chapitre 22) ; l’immunité naturelle (chapitre 22) ; récepteurs et immunité (chapitre 23) ; le virus West Nile (chapitre 27) ; échantillonnage microbien et contamination des aliments (chapitre 29) ; syndrome respiratoire aigu grave (SRAS ; chapitre 25) ; l’anthrax, arme biologique (chapitre 25) et les aliments fermentés (chapitre 29).

Remerciements Le présent ouvrage est le produit de l’effort collectif de nombreuses personnes. Parmi elles, le personnel de Prentice Hall/ Pearson Publishing, et particulièrement Gary Carlson, éditeur en chef, Susan Zeigler et Jennifer Hart, ses assistantes, ainsi


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XXII

Préface des auteurs

que Debra Wechsler, notre remarquable directrice de production. Gary a guidé cette édition tandis que Susan, Jennifer et Debra contrôlaient les étapes du projet et assuraient le lien entre l’édition et la production. Ed Thomas (production) doit aussi être remercié pour son aide dès le début du projet. Les auteurs remercient chaleureusement pour leur rôle essentiel Kenny Beck et Jay McElroy, directeurs du service artistique, ainsi que Patrick Shriner et Crissy Dudonis, nos excellents éditeurs multimédia. La révision de l’ensemble du manuscrit a été assurée avec talent par Jane Loftus (Clackamas, OR). Les auteurs souhaitent particulièrement remercier la contribution consciencieuse et très utile dès le début du projet de Jon Haber (New York), responsable du développement, ainsi que les compétences de Deborah O. Jung (Carbondale) en ce qui concerne les photographies numériques. Nous remercions du fond du cœur le rôle essentiel de Elizabeth McPherson (université du Tennessee) et de David Crowley (université de Californie-Riverside) pour leurs relectures attentives. Les auteurs tiennent aussi à remercier leurs étudiants de troisième cycle, leurs collègues et l’équipe du département de microbiologie pour leur aide et leur patience durant la période laborieuse de préparation qu’un livre de cette envergure demande. La patience apparemment infinie de nos épouses, Nancy et Judy, malgré les heures innombrables passées loin d’elles pendant la réalisation de cet ouvrage, mérite nos remerciements. Leur amour, leur compréhension et leur soutien ont permis aux auteurs d’allouer à ce projet ambitieux le temps nécessaire. Enfin, nous sommes extrêmement reconnaissants de l’aide de tous ceux qui ont relu le manuscrit ou fourni des photographies pour la 11e édition : Laurie Achenbach, université de l’Illinois du Sud Richard Adler, université du Michigan-Dearborn Karen Aguirre, Clarkson University Stephen Aley, université du Texas-El Paso Mary Allen, Hartwick College Ricardo Amils, université autonome de Madrid Robert Andrews, université de l’État de l’Iowa Michael Benedik, université Texas A&M David Boone, université de l’État de Portland Matt Boulton, université du Michigan Cheryl Broadie, université de l’Illinois du Sud Jean Cardinale, Alfred University Jannice Carr, Centers for Disease Control and PreventionAtlanta David Clark, université de l’Illinois du Sud Rhonda Clark, université de Calgary Morris Cooper, université de l’Illinois du Sud, faculté de médecine David Crowley, université de Californie-Riverside Mark Davis, université d’Evansville Michael Davis, université centrale de l’État du Connecticut Dennis Dean, université Virginia Tech Arvind Dhople, Institut de technologie de Floride Biao Ding, université de l’État de l’Ohio Rodney Donlan, Centers for Disease Control and Prevention-Atlanta Paul Dunlap, université du Michigan

Paul Edmonds, Institut de technologie de Géorgie Elizabeth Ehrenfeld, Southern Maine Community College Bruce Farnham, Metropolitan State University-Denver Rebecca Ferrell, Metropolitan State University-Denver Doug Fix, université de l’Illinois du Sud Niels-Ulrik Frigaard, université de l’État de Pennsylvanie George Garrity, université de l’État du Michigan Claire Geslin, université de Bretagne occidentale Eric Grafman, Centers for Disease Control and PreventionAtlanta Bonita Glatz, université de l’État de l’Iowa Ricardo Guerrero, université de Barcelone John Haddock, université de l’Illinois du Sud Martin Hanczyc, université de Harvard Ernest Hanning, université du Texas-Dallas Pamela Hathorn, Midwestern University John Hayes, Institut océanographique Woods Hole Lee Hughs, université du Texas du Nord Michael Ibba, université de l’État de l’Ohio Johannes Imhoff, université de Kiel Mary Johnson, université de l’Indiana Deborah Jung, université de l’Illinois du Sud Judy Kandel, université de Californie-Fullerton Patrick Keeling, université de Colombie britannique Joan Kiely, SUNY-Stonybrook Arthur Koch, université de l’Indiana Allan Konopka, Purdue University Vikki Kourkouliotis, Laboratoire national des énergies renouvelables Susan F. Koval, université de l’Ontario occidental Harry Kurtz, Clemson University Sharon Long, université du Massachusetts Bonnie Lustigman, université de l’État de Montclair Mark Martin, Occidental College William McCleary, Brigham Young University Elizabeth McPherson, université du Tennessee Ohad Medalia, Institut Max Planck de biochimie Jianghang Meng, université du Maryland Eric Miller, université de l’État de Caroline du Nord Abraham Minisky, Institut de sciences Weizmann Ivan Oresnik, université de Manitoba Jörg Overmann, université de Munich Norm Pace, université du Colorado Jack Parker, université de l’Illinois du Sud Laurence Pelletier, Institut Max Planck de génétique et biologie cellulaire et moléculaire Michael Pfaller, université de l’Iowa Reinhard Rachel, université de Regensburg Michael Rappe, université de l’État de l’Oregon Chris Rensing, université de l’Arizona Frank Roberto, Laboratoire national d’ingéniérie et d’environnement de l’Idaho Craig Rouskey, université de l’Illinois du Sud Jill Zeilstra Ryalls, université d’Oakland Herb Schelhorn, McMaster University Bernhard Schink, université de Constance Heide Schulz, université de Californie-Davis Kate Scow, université de Californie-Davis James Shapleigh, université Cornell


7209.book Page XXIII Jeudi, 2. août 2007 5:59 05

Préface des auteurs XXIII

Jolynn Smith, université de l’Illinois du Sud Jerry Sipe, Anderson University Nancy Spear, Murphysboro Julia Thompson, Société américaine de microbiologie Sonia Tiquia, université du Michigan David Tison, Multicare Health Systems Paul Tomasek, université de Californie-Northridge Amy Treonis, Creighton University Michael Wagner, université de Vienne David Ward, université de l’État du Montana Joy Watts, université du Maryland Mary Watwood, université de l’Arizona du Nord Susan Wells, Affymetrix Carl Woese, université de l’Illinois Gordon Wolfe, université de Californie-Chico

Alexander Worden, université de Miami Mark Young, université de l’État du Montana Stephen Zinder, université Cornell Les auteurs sont seuls responsables des erreurs et omissions présentes dans ce livre. Pour les anciennes éditions, les lecteurs ont eu l’amabilité de contacter les auteurs pour signaler les erreurs rencontrées. Même si nous souhaitons que cette 11e édition soit parfaite, nous savons qu’aucun livre ne l’est. Nous encourageons donc les lecteurs à contacter les auteurs à propos des erreurs qui auraient pu subsister. Nous espérons qu’ils apprécieront cette 11e édition du Brock, Biologie des micro-organismes. Michael T. Madigan ([email protected]) John M. Martinko ([email protected])


7209.book Page XXIV Jeudi, 2. août 2007 5:59 05

Préface à l’édition française Il y a une dizaine d’années, je participais à la conférence internationale sur les organismes thermophiles (Thermophiles 96), organisée par mes collègues américains de l’université de Géorgie (Athens, Géorgie, États-Unis). Mon laboratoire souhaitant organiser l’édition suivante (Thermophiles 98, Brest, France), nous étions venus « en force », soit une dizaine de doctorants et chercheurs. Visitant le campus de l’université avant le début du congrès, nous sommes entrés dans le bâtiment abritant le centre commercial de l’université où l’on trouve nourriture, vêtements, T-shirts et autres accessoires aux couleurs de l’équipe de football américain, papeterie et livres recommandés par les enseignants. À la sortie du magasin que nous avions parcouru individuellement, au moins la moitié d’entre nous avait fait, sans concertation aucune, l’acquisition d’un ouvrage de microbiologie : le Brock, à l’époque la 8e édition. Nommé professeur à l’université de Bretagne occidentale en septembre de la même année et venant du CNRS, je dois dire que cet ouvrage a été un compagnon précieux pour la préparation d’une bonne partie de mes cours. C’est dès cette époque que l’idée de disposer d’une édition française a germé dans mon esprit. Dix ans après la découverte de ce livre, une édition française voit le jour grâce au travail intense d’une équipe de traducteurs venant en très grande majorité de l’université de Bretagne occidentale (Brest et Quimper). Nous nous sommes efforcés de respecter l’esprit et le style de la version originale, traduisant tout ce qui pouvait et devait l’être, mais renonçant à inventer des expressions nouvelles pour des expressions, certes anglaises, mais utilisées telles quelles dans tous les laboratoires au monde. Sans outrepasser notre rôle de traducteurs, nous avons parfois supprimé, avec l’accord de l’éditeur, des passages qui n’étaient informatifs que pour des lecteurs

d’Amérique du Nord et ajouté des informations plus utiles à des lecteurs francophones, et en particulier français. Nous espérons que tous nos collègues et étudiants francophones, futurs utilisateurs de ce livre, trouveront dans cette édition française une aide efficace pour l’enseignement et l’apprentissage de cette belle discipline qu’est la microbiologie. Je remercie Pascale Pernet, directrice éditoriale de Pearson Éducation France, d’avoir accepté de publier cette traduction. Merci à Louise Blottière, éditrice scientifique, pour ses précieux conseils et sa collaboration efficace. Pearson Éducation France et moi-même remercions George Szatmari, professeur à l’université de Montréal (Canada), pour sa participation à la relecture de la traduction française. Merci enfin à Thomas Brock, l’initiateur de cet ouvrage et microbiologiste de talent dont je cite souvent les travaux à mes étudiants. Les paléontologues qui amplifient de l’ADN fossile, les médecins qui traquent les pathogènes émergents, les ingénieurs qui contrôlent la qualité de nos aliments, les policiers scientifiques qui réalisent des empreintes génétiques, les chercheurs du monde entier qui utilisent les techniques de biologie moléculaire, tous ceux qui pratiquent la PCR (amplification en chaîne par polymérase) ou utilisent la « Taq polymérase »… Savent-ils tous ce qu’ils doivent à Thomas Brock ? Thomas Brock, qui eut l’idée géniale de rechercher des micro-organismes vivants dans les sources thermales du parc de Yellowstone aux États-Unis dans les années 1960 et découvrit la première bactérie thermophile, Thermus aquaticus, qui allait permettre tous ces travaux grâce à son ADN polymérase thermostable. Daniel PRIEUR


7209.book Page 1 Mercredi, 1. août 2007 8:33 08

I

Introduction à la microbiologie

3

1.1 1.2 1.3

La microbiologie Les micro-organismes en tant que cellules Les micro-organismes et leur environnement naturel L’impact des micro-organismes sur l’homme et ses activités

3 3

II

Découvertes en microbiologie

9

1.5


1.4

1.6 1.7 1.8

CHAPITRE UN


6 7

9 11 15 18

Les micro-organismes sont des cellules vivantes microscopiques et indépendantes qui, comme les humains, vivent en communauté.



2 Chapitre 1


GLOSSAIRE

B

(d)

À quoi correspond la microbiologie ? Cette science étudie le fonctionnement des cellules, plus particulièrement des bactéries, un vaste groupe de cellules (voir figure 1.1). Elle étudie également la diversité, l’évolution, la façon dont les différents micro-organismes survivent et pourquoi, ainsi que leur rôle sur la planète, au sein de la société humaine, du corps humain,

T. D. Brock (c)

(b)

Paul Dunlap

(a)

Norbert Pfennig

ienvenue dans la microbiologie – l’étude des microorganismes. Les micro-organismes constituent un ensemble important et diversifié d’organismes microscopiques, existant en tant que cellule seule ou en groupe. Cet ensemble inclut également les virus microscopiques, mais non cellulaires.

Enzyme (enzyme) Protéine dont la fonction est d’augmenter la vitesse (catalyse) d’une réaction chimique spécifique. Génération spontanée (spontaneous generation) Hypothèse selon laquelle les organismes vivants peuvent avoir pour origine de la matière inorganique. Habitat (habitat) Partie d’un environnement où se développe une population microbienne. Métabolisme (metabolism) Ensemble des réactions biochimiques se déroulant dans une cellule. Micro-organisme (microorganism) Organisme microscopique constitué d’une cellule unique ou d’un groupe de cellules. Les virus (non cellulaires) sont aussi considérés comme des microorganismes. Pathogène (pathogen) Micro-organisme induisant une maladie. Postulats de Koch (Koch’s Postulates) Ensemble de critères démontrant qu’un micro-organisme donné provoque une maladie donnée. Stérile (sterile) Absence de tout organisme vivant (virus compris).

Ricardo Guerrero

ADN (DNA) Acide désoxyribonucléique, matériel héréditaire des cellules et de certains virus. ARN (RNA) Acide ribonucléique impliqué dans la synthèse protéique tels l’ARN messager, l’ARN de transfert et l’ARN ribosomique. Cellule (cell) L’unité fondamentale de la matière vivante. Culture d’enrichissement (enrichment culture) Méthode permettant d’isoler des micro-organismes de leur milieu en utilisant un milieu de culture et des conditions de culture spécifiques. Culture pure (pure culture) Culture constituée d’un type unique de micro-organisme. Cytoplasme (cytoplasm) Contenu d’une cellule vivante, entouré par la membrane plasmique à l’exception du noyau, s’il est présent. Écologie (ecology) Étude des interactions entre les organismes vivants et leur environnement. Écosystème (ecosystem) Ensemble des organismes et des composants abiotiques d’un environnement particulier.

FIGURE 1.1 Micro-organismes. (a, b) Une cellule unique peut avoir une existence indépendante. Les photographies représentent des bactéries pourpres (a) et des cyanobactéries (b). Les bactéries pourpres ont été parmi les premières phototrophes sur la Terre, alors que les cyanobactéries ont été les premières à produire de l’oxygène. Les cyanobactéries oxygénant l’atmosphère ont permis l’évolution des autres formes de vie (c, d). Dans la nature ou au laboratoire, les cellules bactériennes peuvent croître pour former des populations importantes. La photographie c montre une efflorescence de bactéries pourpres (voir figure 1.15) dans un lac en Espagne (lac Ciso), et l’image d, des cellules bioluminescentes de Photobacterium leignathi cultivées en laboratoire. Un millilitre de l’eau du lac (c) ou une colonie issue de la boîte de Petri (d) contient plus d’un milliard (10 9) de cellules.



1.1 La microbiologie 3

chez les animaux et les plantes. D’une façon ou d’une autre, les micro-organismes influent sur toutes les formes de vie sur la Terre (voir figure 1.1b), c’est pourquoi la microbiologie est importante. Les micro-organismes sont distincts des cellules animales et végétales qui constituent les macro-organismes. Celles-ci sont incapables de se développer seules dans la nature et n’existent que comme des parties de structures pluricellulaires, telles que les organes chez les animaux ou les composants structuraux chez les plantes. Au contraire, de nombreux micro-organismes sont capables d’effectuer leur cycle vital, de produire leur énergie et de se reproduire indépendamment des autres cellules. Nous aborderons au cours de ce chapitre les caractéristiques des micro-organismes et leur impact sur la vie. La structure et l’évolution des micro-organismes seront dévoilées dans le chapitre suivant, et la microbiologie y sera également envisagée dans une perspective historique, en tant que processus de découverte scientifique. Grâce à la contribution des premiers microbiologistes et de ceux d’aujourd’hui, la microbiologie étend ses ramifications en médecine, en agriculture et en sciences de l’environnement.

I

INTRODUCTION À LA MICROBIOLOGIE

Les quatre premières parties de ce chapitre concernent la découverte de la microbiologie, les micro-organismes en tant que cellules, leur place dans l’environnement ainsi que leur impact sur les activités humaines.

m n1.1 La microbiologie La microbiologie s’organise autour de deux thèmes principaux : science de la vie et application de la science aux besoins humains. En tant que science biologique fondamentale, la microbiologie fournit les outils pour la compréhension des processus de vie. Les connaissances de base en chimie et en physique de la vie proviennent de l’étude des micro-organismes, car leurs cellules possèdent de nombreuses similitudes avec celles des organismes pluricellulaires. De plus, les cellules microbiennes peuvent se développer à de fortes densités dans des cultures en laboratoire (voir figure 1.1d) et sont donc utilisées pour les études de biochimie et de génétique. Ces propriétés font des micro-organismes d’excellents modèles de compréhension des fonctionnements cellulaires chez les organismes supérieurs. En tant que science appliquée, la microbiologie s’intéresse à de nombreux problèmes en médecine, agriculture et industrie. Les plus importantes maladies humaines, animales et végétales sont causées par des micro-organismes. Cependant ceux-ci jouent également un rôle important dans la fertilité des sols et l’élevage d’animaux domestiques. De plus, ils sont impliqués dans de nombreux processus industriels et biotechnologiques comme la production d’antibiotiques ou de protéines humaines.

L’importance des micro-organismes En l’absence de micro-organismes, les formes complexes de vie n’auraient pu se développer et se maintenir. En effet, l’oxygène que nous respirons provient de l’activité microbienne (voir figure 1.1b). Les hommes, les animaux et les plantes sont étroitement liés aux activités microbiennes dans le recyclage des nutriments et la dégradation de la matière organique. Aucune autre forme de vie ne permet le maintien de la vie sur la planète avec autant d’importance que les micro-organismes. Les micro-organismes existent sur la Terre depuis des milliards d’années, avant même l’apparition des plantes et des animaux. De plus, l’évolution de leur diversité a largement dépassé celle des autres organismes. Cette diversité fait partie de leurs nombreuses propriétés. Par exemple, les micro-organismes peuvent se développer dans des environnements hostiles pour les organismes supérieurs, et la diversité de leurs capacités physiologiques les situe au rang des plus grands chimistes. Ces mêmes micro-organismes ont également établi des relations avec les organismes supérieurs, relations bénéfiques ou néfastes. Chez l’homme, une bonne santé mais aussi de nombreuses maladies sont dues à leur action. Les micro-organismes sont au centre du fonctionnement de la biosphère. La microbiologie est également la science fondatrice en biologie.

micro-organismes m n1.2 Les en tant que cellules La cellule est l’unité fondatrice de la vie. Une cellule unique est une entité isolée des autres cellules par une membrane et contenant une variété de structures internes et de composés chimiques (voir figure 1.2). La membrane cellulaire (ou cytoplasmique) permet la séparation de la cellule de l’environnement extérieur. La compartimentalisation est un prérequis pour la vie et permet aux composés chimiques de se maintenir à des concentrations suffisantes afin de permettre aux réactions chimiques d’avoir lieu. La cellule n’est pas un système fermé, mais, au contraire, une entité dynamique et ouverte. Les cellules communiquent et échangent du matériel avec leur environnement et subissent constamment des changements (pour le détail de la structure et des fonctions cellulaires, voir chapitres 2, 4 et 14).

La chimie cellulaire et les clés structurales Les cellules sont des structures très organisées, constituées principalement de quatre composés chimiques : les protéines, les acides nucléiques, les lipides et les polysaccharides. Ces molécules sont appelées des macromolécules. C’est la chimie et l’organisation de ces macromolécules dans les différentes cellules qui distinguent les différents organismes. Du point de vue chimique, les cellules ont beaucoup en commun, qu’elles appartiennent à une plante, à un animal ou à un micro-organisme. Il y a de nombreuses structures essentielles dans une cellule. La membrane cytoplasmique est une barrière qui sépare l’intérieur de l’extérieur de la cellule. Côté interne de la cellule,




1. Métabolisme Les nutriments prélevés dans l’environnement sont transformés dans la cellule et les déchets sont éliminés dans l’environnement. La cellule est un système ouvert.

L.K. Kimble et M.T. Madigan

4 Chapitre 1

Cellule

Environnement Herbert Voelz

(a) 2. Reproduction (croissance) Les éléments chimiques de l’environnement se transforment en de nouvelles cellules sous la conduite de cellules préexistantes.

(b) FIGURE 1.2 Cellules. (a) Cellules bactériennes en forme de bacilles observées au microscope ; une cellule mesure environ 1 µm de diamètre. (b) Coupe longitudinale d’une cellule bactérienne observée au microscope électronique. Les deux zones claires correspondent au nucléoïde contenant l’ADN.

il existe nombre de structures ou de composés chimiques en suspension ou solubles dans le cytoplasme. Au sein de celui-ci, se trouve la machinerie cellulaire permettant la croissance et le fonctionnement de la cellule. Les structures essentielles comprennent le noyau ou nucléoïde, contenant les informations génétiques – ADN (acide désoxyribonucléique) – et les ribosomes, structures au niveau desquelles les nouvelles protéines sont synthétisées dans la cellule.

3. Différenciation La formation d’une nouvelle structure cellulaire telle qu’une spore fait partie du cycle cellulaire. Spore

4. Communication Les cellules communiquent ou interagissent par des échanges de molécules chimiques.

Les caractéristiques des systèmes vivants Quelles sont les caractéristiques essentielles de la vie ? Qu’est-ce qui différencient les cellules des objets inanimés ? Notre concept du vivant est contraint par ce que nous observons sur la Terre aujourd’hui ou ce que nous déduisons des données fossiles. Ainsi, avec nos connaissances en biologie, de nombreuses caractéristiques appartenant à la plupart des systèmes vivants peuvent être identifiées (voir figure 1.3). Tous les organismes cellulaires possèdent un métabolisme particulier. Les cellules prélèvent les nutriments de leur environnement et les transforment, conservant une part de l’énergie présente dans ces substances sous une forme assimilable ; ensuite elles éliminent les déchets. Toutes les cellules se reproduisent. Une cellule peut diriger une série d’événements biochimiques permettant la croissance et la division afin de former deux cellules. De nombreuses cellules subissent une différenciation, un processus par lequel de nouvelles structures et substances sont formées. La différenciation cellulaire fait partie du cycle au cours duquel les cellules forment des structures spéciales, telles les spores, impliquées dans la reproduction, la dispersion ou la survie. Les cellules répondent à des signaux chimiques dans leur environnement, y compris à ceux produits par d’autres cellules. Elles peuvent ainsi communiquer. Les cellules peuvent même évaluer leur nombre par des petites molécules solubles (diffusibles) transmises entre cellules voisines, processus appelé la détection du

5. Mouvement Les organismes vivants sont souvent capables de mouvement autonome.

6. Évolution Les cellules contiennent des gènes et évoluent, présentant de nouvelles propriétés biologiques. Les arbres phylogénétiques montrent ces relations d’évolution entre les cellules. Cellule ancestrale

Nouvelles espèces

Nouvelles espèces

FIGURE 1.3 Caractéristiques de la vie cellulaire. La différenciation et la mobilité ne sont pas présentes chez toutes les cellules microbiennes.



1.2 Les micro-organismes en tant que cellules 5

quorum (quorum sensing). De nombreux organismes vivants sont aussi capables de mouvement par propulsion autonome ; dans le monde microbien, il existe différents types de mobilité. Enfin, à la différence des structures non vivantes, les cellules peuvent évoluer. À travers le processus d’évolution, elles peuvent changer leurs caractéristiques et les transmettre à leur descendance.

Les cellules en tant que machinerie cellulaire et dispositifs de codage Il y a deux façons de considérer les cellules. D’un côté, on peut les voir comme des machines qui effectuent les transformations cellulaires. Les catalyseurs de ces machines chimiques sont les enzymes, protéines capables d’accélérer considérablement la vitesse des réactions chimiques (voir figure 1.4). D’un autre côté, les cellules peuvent être considérées comme des dispositifs de codage, analogues aux ordinateurs, enregistrant et produisant les informations génétiques (ADN) qui sont par la suite transmises à la descendance lors de la reproduction (voir figure 1.4). La réplication et le processus d’enregistrement de l’information génétique seront abordés au cours du chapitre 7, ainsi que la réplication, la transcription de l’ADN, la production de l’ARN, la traduction et la production de protéine.

Fonctions « codage »

Fonctions « machine » 1. Énergie : ADP + Pi

ADN

Réplication

ATP

2. Métabolisme : génération de précurseurs de macromolécules (sucres, acides Expression des gènes aminés, acides gras, etc.) Transcription 3. Enzymes : catalyseurs métaboliques ARN Traduction

Protéine

Reproduction (croissance) FIGURE 1.4 Les fonctions « machine » et « codage » de la cellule. Pour qu’une cellule se multiplie, elle doit disposer : 1) de suffisamment d’énergie et de précurseurs pour la synthèse de nouvelles macromolécules ; 2) d’informations génétiques permettant au moment de la division cellulaire que chaque cellule reçoive une copie identique des gènes ; 3) d’un processus d’expression des gènes (transcription et traduction) produisant les proportions nécessaires de protéines et autres macromolécules pour fabriquer la nouvelle cellule.

En réalité, les cellules sont à la fois des machineries chimiques et des dispositifs de codage. La croissance fait le lien entre ces deux attributs cellulaires. Dans des conditions appropriées, une cellule grossit et se divise pour en former deux autres (voir figure 1.4). Au cours de ce processus, la quantité de tous les constituants cellulaires est doublée, rendant nécessaire que la machinerie chimique des cellules les approvisionne en énergie et en précurseurs de la biosynthèse des macromolécules. Aussi, quand une cellule se divise, les deux cellules résultantes doivent contenir toutes les informations génétiques indispensables pour la formation de cellules supplémentaires. Lors de la phase de croissance, l’ADN se réplique (voir figure 1.4). La machinerie cellulaire et les fonctions codantes de la cellule doivent être ainsi hautement coordonnées, de façon que la cellule se reproduise. En effet, nous verrons plus tard qu’en plus de la coordination, les différentes machineries cellulaires et fonctions codantes sont soumises à une régulation, qui assure à la cellule son adaptation parfaite à l’environnement.

Les premières cellules D’où viennent les premières cellules ? Toutes les cellules étant construites de la même façon, l’hypothèse d’un ancêtre commun, l’ancêtre universel de la vie est tout à fait plausible (voir chapitre 11). La première cellule provient sans doute d’un organisme non cellulaire, quelque entité apparue avant la cellule, une structure précellulaire. L’évolution de la première cellule sur la Terre, il y a 3,8 milliards d’années, a peut-être duré des centaines de millions d’années. Pourtant, lorsque les premières cellules sont apparues, leur croissance et leur division ont formé des populations. L’évolution a pu alors sélectionner les améliorations et les diversifications de ces premières formes de vie, produisant au cours de milliards d’années une énorme diversité de cellules (pour un avant-goût de cette diversité, voir chapitre 2 ; pour plus de détails, voir chapitres 12 à 16).

Contrôlez vos acquis La cellule possède une barrière, la membrane cytoplasmique, qui sépare le cytoplasme de l’environnement. Les autres dispositifs cellulaires incluent le noyau – ou nucléoïde – et le cytoplasme. Le métabolisme et la reproduction sont associés à la notion de vie, et les cellules peuvent être considérées comme des machines chimiques et des dispositifs de codage. La vie est présente sur la Terre depuis presque quatre milliards d’années. •

Citez les quatre classes de macromolécules.

•

Citez six caractéristiques associées aux organismes vivants. Pourquoi chacune d’elles semble être importante pour la survie de la cellule ?

•

Comparez la machinerie cellulaire et les fonctions codantes d’une cellule microbienne. Pourquoi une fonction seule n’a-t-elle pas de valeur pour une cellule ?



6 Chapitre 1


m n

1.3 Les micro-organismes et leur environnement naturel

Dans la nature, les cellules vivent en association avec d’autres cellules et forment des populations. Celles-ci sont composées de groupes de cellules issues des divisions successives à partir d’une cellule mère. L’habitat correspond au lieu de vie d’une population microbienne dans un environnement donné. Dans les habitats microbiens, une population de cellules vit rarement seule. Au contraire, elle vit et interagit avec d’autres populations au sein de communautés microbiennes (voir figure 1.5). Les composants et le nombre de cellules dans une communauté microbienne sont gouvernés par les ressources et les conditions existant dans l’habitat. On appelle l’étude des micro-organismes dans leur habitat naturel écologie microbienne.

Les interactions entre les micro-organismes et leur habitat

(a)

Jiri Snaidr

D. E. Caldwell

Dans les communautés microbiennes, les populations interagissent de différentes façons, bénéfiques ou néfastes. Dans de nombreux cas, les populations microbiennes coopèrent. Par exemple, les déchets produits par les activités métaboliques de certaines cellules peuvent constituer des nutriments pour d’autres. Les organismes dans un habitat peuvent aussi interagir avec leur environnement chimique et physique. Les habitats diffèrent de par leurs caractéristiques, un habitat favorable pour la croissance d’un organisme pouvant être défavorable

(b)

FIGURE 1.5 Exemples de communautés microbiennes. (a) Observation au microscope d’une communauté microbienne qui se développe dans les profondeurs d’un petit lac (Wintergreen Lake, Michigan, États-Unis), illustrant l’existence de cellules de tailles diverses. (b) Une communauté microbienne dans un échantillon d’eaux d’assainissement. Les différentes colorations de l’échantillon identifient un groupe bactérien spécifique (voir la section 18.4 et la figure 18.11b pour de plus amples détails sur le protocole de coloration). D’après R. Amann, J. Snaidr, M. Wagner, W. Ludwig, et K.-H Schleifer, 1996. Journal of Bacteriology 178 : 34963500, Fig2b. © 1996 American Society for Microbiology.

pour un autre. En général, les organismes vivants et les composés physiques et chimiques de leur environnement forment un écosystème. Les écosystèmes microbiens majeurs incluent les systèmes aquatiques (océans, étangs, lacs, ruisseaux, glace, sources chaudes), terrestres (sol, biosphère souterraine) et les organismes supérieurs, comme les plantes et les animaux. Les écosystèmes sont contrôlés de manière importante par les activités microbiennes. Les organismes réalisant des processus métaboliques transforment les nutriments de l’environnement et les utilisent pour construire de nouvelles cellules. En même temps, les organismes sécrètent des produits de leur métabolisme dans l’environnement. Ainsi, avec le temps, un écosystème microbien se modifie chimiquement et physiquement au cours du cycle des nutriments, sous l’influence des micro-organismes. Les changements environnementaux permettent aux autres micro-organismes de croître. Par exemple, l’oxygène moléculaire (O2) est un nutriment vital pour certains micro-organismes, mais un poison pour d’autres. Cependant, la consommation d’oxygène par un groupe d’organismes (aérobies) peut transformer un habitat oxygéné en habitat anoxique (sans O2), et donc approprié pour la croissance d’organismes anaérobies incapables de se développer au préalable. Dans les chapitres suivants, après avoir vu les dispositifs de base des structures et fonctions microbiennes, nous étudierons l’impact des micro-organismes sur les animaux, les plantes et l’écosystème dans son ensemble.

L’importance de la vie microbienne Les micro-organismes sont petits, mais leur biomasse terrestre est énorme, même lorsqu’elle est comparée à la biomasse des organismes supérieurs. L’examen de matériaux naturels comme les sols ou les eaux révèle toujours des cellules microbiennes. Bien que de toutes petites cellules semblent être sans conséquence, les cellules seules sont pourtant capables de se multiplier rapidement et de produire de vastes populations qui auront un effet majeur sur l’habitat (voir figure 1.1c). Les micro-organismes sont donc extrêmement importants et constituent des composants quantitativement significatifs dans tout écosystème. L’estimation de la totalité des cellules microbiennes sur la Terre, et plus spécifiquement du nombre de procaryotes (bactéries – voir chapitre 2), est de l’ordre de 5 × 1030 cellules. La totalité du carbone présent chez l’ensemble des petites cellules équivaut à celui de toute les plantes sur la Terre (le carbone des plantes étant plus abondant que le carbone des animaux). De plus, les contenus en azote et phosphore totaux des cellules procaryotes sont dix fois supérieurs à ceux des plantes. Ainsi, les cellules procaryotes, aussi petites soient-elles, constituent la majeure portion de la biomasse terrestre et sont les réservoirs clés des nutriments essentiels pour la vie. Une autre révélation surprenante est que la plupart des cellules procaryotes ne résident pas à la surface de la planète, mais au contraire dans les subsurfaces terrestre et océanique. Ces habitats sont encore peu explorés et il reste aux microbiologistes de nombreuses découvertes à faire pour mieux comprendre les formes dominantes de la vie sur la Terre.



1.4 L’impact des micro-organismes sur l’homme et ses activités 7

Contrôlez vos acquis Les micro-organismes existent dans la nature en populations interagissant avec d’autres populations au sein de communautés microbiennes. Les activités de ces communautés microbiennes peuvent affecter de façon conséquente les propriétés physiques et chimiques de leurs habitats. La majorité de la biomasse terrestre est microbienne. •

Qu’est ce qu’un habitat microbien ?

•

Comment les micro-organismes changent-ils les propriétés physiques et chimiques de leurs habitats ?

•

Où est localisée la majorité des cellules procaryotes sur la Terre ?

des micro-organismes m n1.4 L’impact sur l’homme et ses activités Un des objectifs des microbiologistes est de comprendre comment les micro-organismes travaillent et d’inventer des procédés permettant d’augmenter les bénéfices que l’on peut en retirer, tout en réduisant leurs effets nocifs. Les microbiologistes ont réussi dans plusieurs domaines, et la microbiologie a joué un rôle majeur dans l’avancement des connaissances dans les domaines de la santé et du bien-être humain (voir figure 1.6).

Les micro-organismes considérés comme agents infectieux Les statistiques de la figure 1.7 sont une des façons de mesurer le succès des microbiologistes dans le contrôle des microorganismes. Ces données comparent les causes actuelles de mortalité aux États-Unis à celles d’il y a cent ans. Au début du e XX siècle, les causes majeures de mortalité étaient les maladies infectieuses, causées par des pathogènes, atteignant particulièrement les enfants et les personnes âgées. Aujourd’hui, ces maladies sont d’une mortalité moindre dans les pays développés. Leur contrôle est apparu comme le résultat de la compréhension des processus des maladies, l’amélioration des pratiques sanitaires, la découverte et l’utilisation d’agents antimicrobiens. Comme nous le verrons par la suite dans ce chapitre, la microbiologie, en tant que science, prend ses racines dans l’étude des maladies infectieuses. Bien que de nombreuses maladies infectieuses soient désormais sous contrôle, certains micro-organismes peuvent toujours constituer une menace majeure pour la vie. C’est le cas de la mort lente d’un individu par infection microbienne liée au syndrome d’immunodéficience acquise (SIDA) ou celle d’un individu infecté par un pathogène multirésistant aux antibiotiques. De plus, les maladies microbiennes sont toujours la cause majeure de mortalité dans de nombreux pays en voie de développement. Bien que l’éradication de la variole dans le monde ait été un triomphe pour la science médicale, des millions de personnes meurent toujours de maladies microbiennes telles que le paludisme, la tuberculose, le choléra, la maladie du sommeil et de diverses diarrhées.

Agriculture Fixation N2 (N2

Énergie/environnement

2NH3)

Biocarburants (CH4 ) Fermentation (maïs éthanol)

Cycle des nutriments, recyclage NH3 NO3– N2

H2S S0

SO42–

Production animale

Cellulose CO2 + CH4 + Protéine animale

O2 Bioremédiation (pétrole CO2) polluants CO2 organiques Transformation des produits miniers pas les micro-organismes Cu0) (CuS Cu2+

Aliments

Rumen

Maladies

Identification de nouvelles maladies Traitement, soin et prévention

Conservation des aliments (chaleur, froid, radiation, conservateurs chimiques) Aliments fermentés Additifs alimentaires (sodium, glutamate, acide citrique, levure) Biotechnologie

Organismes génétiquement modifiés

(

(

Production pharmaceutique (insuline et autres protéines humaines)

(

(

Thérapie génique pour certaines maladies personne malade

réparation du gène déficient

FIGURE 1.6 Impacts des micro-organismes sur les activités humaines. Bien que de nombreuses personnes associent les micro-organismes aux maladies infectieuses, seuls quelquesuns d’entre eux provoquent des maladies. Les microorganismes affectent de nombreux aspects de notre vie.

Il est certain que les micro-organismes sont toujours des fléaux sérieux pour la santé humaine. Cependant, la microbiologie a montré que la plupart d’entre eux ne sont pas nocifs pour les humains. En fait, la plupart sont même bénéfiques pour les organismes complexes et permettent la mise en œuvre de processus importants pour la société humaine.

Les micro-organismes et l’agriculture Notre système agricole entier dépend, de manières différentes, des activités microbiennes (voir figure 1.6). Les légumes destinés à être récoltés par exemple, se développent en association étroite avec des bactéries formant sur leurs racines des structures appelées nodosités ou nodules. Dans ces nodosités, les bactéries convertissent l’azote atmosphérique en ammonium (NH3), que les plantes utilisent pour leur croissance. Ainsi, les activités bactériennes réduisent les besoins en fertilisants coûteux et polluants.



8 Chapitre 1

Micro-organismes et microbiologie 1900

2000

Grippe et pneumonie

Maladie cardiaque

281

Tuberculose

Cancer

205

Attaque cérébrale

Gastro-entérite

Maladie pulmonaire

Maladie cardiaque

Accidents Grippe et pneumonie Diabètes

Attaque cérébrale Maladie rénale Accidents

SIDA

Cancer

Suicide

Maladies infantiles

Cirrhose du foie

Diphtérie

Homicide 0

100

200

Mortalité pour 100 000 personnes

0

200 100 Mortalité pour 100 000 personnes

FIGURE 1.7 Taux de mortalité des dix principales causes de décès aux États-Unis : 1900 et 2000. Les maladies infectieuses étaient les causes principales de mortalité dans les années 1900, alors qu’aujourd’hui elles sont beaucoup moins significatives. Les maladies microbiennes sont représentées en rouge, les non microbiennes en vert. Données : United States National Center for Health Statistics.

Les micro-organismes ont une importance majeure en agriculture et sont notamment essentiels dans les processus de digestion chez les ruminants comme les vaches et les moutons. Ces animaux d’élevage ont un organe digestif spécial appelé rumen, dans lequel les micro-organismes digèrent la cellulose, le composant majeur des plantes. En l’absence de ces micro-organismes, ces ruminants ne pourraient pas utiliser la cellulose, mais des substances pauvres en nutriments comme l’herbe et le foin. Les micro-organismes jouent également un rôle primordial dans les cycles des nutriments intervenant dans la nutrition des plantes, et particulièrement les cycles du carbone, de l’azote et du soufre. Les activités microbiennes dans le sol et l’eau transforment ces éléments en composés plus accessibles aux plantes. Mais bien qu’ils soient généralement bénéfiques pour l’agriculture, les micro-organismes peuvent avoir des effets néfastes. Les maladies microbiennes des plantes et des animaux ont des impacts majeurs dans l’industrie agricole. Par exemple, les cas de la maladie de la « vache folle » (voir section 29.10), aux États-Unis en 2003, ont fait diminuer l’exportation de viande bovine sur les marchés étrangers, avec de lourdes conséquences pour l’industrie américaine de la viande de bœuf.

Les micro-organismes et les aliments Les micro-organismes jouent un rôle important dans l’industrie agroalimentaire (voir figure 1.6). La seule détérioration des aliments conduit à une perte économique importante chaque année. En effet, les industries de conserverie, de congélation et de déshydratation ont pour finalité de préparer des aliments sains, sans contamination microbienne. Les maladies apportées par les aliments sont également prises en considération. Parce que la nourriture convient à la consommation humaine, elle peut aussi permettre la croissance de nombreux micro-organismes et doit donc être proprement préparée et contrôlée pour éviter toute transmission de maladie. Cependant, tous les micro-organismes présents dans la nourriture n’ont pas d’effets néfastes sur les produits et ceux qui les

absorbent. Par exemple, les produits laitiers comme le fromage, les yaourts et le babeurre, ainsi que tous les produits à importante valeur économique, sont le résultat d’une activité microbienne. De même, la choucroute, les conserves au vinaigre et certaines saucisses doivent leur existence aux fermentations bactériennes. Les produits boulangers et les boissons alcoolisées sont élaborés à partir de la fermentation des levures (voir chapitre 30).

Les micro-organismes, l’énergie et l’environnement Les micro-organismes ont un rôle majeur dans la production d’énergie (voir figure 1.6). Le gaz naturel (méthane) est un produit de l’activité bactérienne provenant du métabolisme de microorganismes méthanogènes. Les micro-organismes phototrophes peuvent utiliser l’énergie lumineuse pour la production de biomasse, en fait de l’énergie stockée dans des organismes vivants. La biomasse microbienne et les déchets comme les déchets domestiques ordures ménagères, les surplus de céréales et les déchets animaux peuvent être convertis en biocarburants, comme le méthane et l’éthanol, par l’activité des micro-organismes. Les micro-organismes peuvent aussi servir au nettoyage des pollutions provoquées par les activités humaines, un processus appelé bioremédiation (voir figure 1.6). Divers micro-organismes peuvent contribuer à la consommation d’hydrocarbures déversés accidentellement, des solvants, des pesticides et d’autres polluants environnementaux toxiques. Dans toute leur diversité, les micro-organismes terrestres possèdent de vastes ressources génétiques permettant de mettre en œuvre des procédés pour nettoyer l’environnement, et de nombreuses recherches dans ce domaine ont lieu aujourd’hui.

Les micro-organismes et les applications futures Les biotechnologies nécessitent l’utilisation de micro-organismes dans les biosynthèses industrielles et, de façon typique, les micro-organismes génétiquement modifiés peuvent synthétiser



1.5 Les racines historiques de la microbiologie : Hooke, van Leeuwenhoek et Cohn 9

des produits à haute valeur commerciale (voir chapitre 31). La biotechnologie est fortement dépendante du génie génétique, qui consiste en la manipulation artificielle des gènes et de leurs produits (voir figure 1.6). Les gènes de sources diverses peuvent être manipulés et modifiés en utilisant les micro-organismes et leurs enzymes comme outils moléculaires. De nos jours, l’insuline humaine, une hormone trouvée à des taux anormalement bas chez certains patients diabétiques, peut être microbiologiquement produite à partir d’un gène d’insuline humaine introduit chez un micro-organisme. En utilisant les techniques de génomique (voir chapitre 15), il est désormais possible de rechercher des centaines de gènes codant des protéines d’intérêt, de cloner ces gènes dans un hôte et de produire en définitive des protéines d’intérêt commercial. L’énorme influence des micro-organismes sur la société humaine est évidente, et il existe en effet de nombreuses raisons de connaître les micro-organismes et leurs activités (voir figure 1.6). Comme l’a exprimé Louis Pasteur, l’un des fondateurs de la microbiologie : « Le rôle de l’infiniment petit dans la nature est infiniment grand. » Les contributions majeures de Pasteur et d’autres pionniers à la microbiologie seront présentées dans les paragraphes qui suivent.

Contrôlez vos acquis Les micro-organismes peuvent être bénéfiques ou nocifs pour les humains. Bien qu’ils soient très souvent considérés comme nuisibles (agents des infections), il existe dans la nature beaucoup plus de micro-organismes bénéfiques que nocifs. •

De quelles façons les micro-organismes sont importants pour les industries alimentaires et agricoles ?

•

Quels carburants les micro-organismes peuvent-ils produire ?

•

Qu’est ce que la biotechnologie et comment peutelle améliorer la vie humaine ?

II

(a)

DÉCOUVERTES EN MICROBIOLOGIE

Comme toute science, la microbiologie moderne doit beaucoup à son passé. Bien que ses racines soient anciennes, la microbiologie ne s’est réellement développée que depuis le e XIX siècle. Depuis cette période, le domaine a explosé et engendré plusieurs nouveaux domaines liés.

racines historiques m n1.5 Les de la microbiologie : Hooke, van Leeuwenhoek et Cohn

Même si l’existence de créatures trop petites pour être vues à l’œil nu a été suspectée, leur découverte ne sera permise que par l’invention du microscope. Robert Hooke montre les structures de reproduction des moisissures en 1665 (voir figure 1.8), et est donc le premier à décrire des micro-organismes. Le premier à

(b) FIGURE 1.8 Les premiers microscopes. (a) Dessin du microscope utilisé par Robert Hooke en 1664. La lentille de l’objectif était fixée à l’extrémité d’un soufflet réglable (G), la lumière était focalisée sur l’objet par une lentille (1). (b) Dessin de Robert Hooke. Ce dessin, publié dans Micrographia en 1655, est la première description d’un micro-organisme. Cet organisme est une moisissure colorée en bleu, se développant sur une surface de cuir. Les structures rondes (sporanges) contiennent les spores de la moisissure.




avoir vu des bactéries est un Hollandais marchand de tissus et constructeur amateur de microscope, Antoine van Leeuwenhoek. En 1864, van Leeuwenhoek, qui est au courant des travaux de Hooke, utilise des microscopes extrêmement simples de sa propre fabrication pour examiner une variété de substances naturelles et y observer leur contenu microbien (voir figure 1.9). Les microscopes de van Leeuwenhoek sont simples par rapport aux standards d’aujourd’hui, mais avec une manipulation délicate et focalisée ils sont capables de voir des organismes aussi petits que des bactéries. Sa découverte des bactéries intervient en 1676, alors qu’il étudie des infusions de poivre. Van Leeuwenhoek reporte ses observations dans une série de lettres à la Société royale de Londres, qui les publie en 1684. Les dessins que van Leeuwenhoek a réalisé de certains petits animalcules, comme il les nommait, sont montrés dans la figure 1.9b. Dans les cent cinquante années qui suivent, les observations de van Leeuwenhoek sont confirmées par d’autres, mais progressent lentement du point de vue de la compréhension de la nature et de l’importance de ces petits organismes. C’est seulement au XIXe siècle que les microscopes se perfectionnent et, à partir de ce moment, la diversité et la nature des formes de la vie microbienne apparaissent. De la moitié jusqu’à la fin du XIXe siècle, des avancées majeures ont lieu en microbiologie, essentiellement en raison de la focalisation des réflexions sur deux questions importantes et simultanées en biologie et médecine : la génération spontanée et la nature des maladies infectieuses. Les réponses à ces questions sont apportées par deux géants dans le domaine nouveau de la microbiologie : le chimiste français Louis Pasteur et le physicien allemand Robert Koch. Mais avant d’explorer leurs travaux, considérons brièvement le travail d’un botaniste allemand, Ferdinand Cohn, contemporain de Pasteur et Koch, et fondateur de la bactériologie.

T. D. Brock

10 Chapitre 1

(a)

(b)

Ferdinand Cohn (1828-1898) est botaniste. Son intérêt pour la microscopie l’a amené vers l’étude des plantes unicellulaires – les algues – et, plus tard, vers celle des bactéries photosynthétiques. Cohn croit que toutes les bactéries, même celles sans pigments photosynthétiques, font partie du règne des plantes, et ses études microscopiques abandonnent progressivement les plantes et les algues pour se focaliser sur des bactéries différentes, en incluant les bactéries sulfureuses telles que Beggiatoa (voir figure 1.10). Cohn s’intéresse particulièrement à certaines formes bactériennes qui lui permettent de découvrir le genre Bacillus et le processus de formation des endospores. Nous savons maintenant que les endospores bactériennes sont très résistantes à la chaleur. Cohn décrit le cycle de vie entier de Bacillus (cellule végétative → endospore → cellule végétative – voir section 4.15) et découvre que les cellules végétatives sont détruites par ébullition, mais pas les endospores. En effet, les découvertes de Cohn aident à expliquer pourquoi les pionniers en la matière, comme John Tyndall, ont utilisé l’ébullition comme moyen de stérilisation. Cohn continue à travailler sur les bactéries jusqu’à sa retraite. Pendant cette période, il étend

Brian J. Ford

Ferdinand Cohn et la bactériologie

(c) FIGURE 1.9 Le microscope de van Leeuwenhoek. (a) Photographie d’une réplique du microscope de van Leeuwenhoek. L’objectif est monté dans un plateau en laiton situé à proximité de la pointe de la vis de réglage de la mise au point. (b) Dessins de bactéries par van Leeuwenhoek, publiés en 1684. À partir de ces dessins, il est possible de reconnaître différents types morphologiques de bactéries : des bacilles (A, C, F et G) ; sphérique ou coccobacille (E) ; coques en amas (H) (voir figure 4.11). (c) Observation d’une goutte de sang humain à l’aide du microscope de van Leeuwenhoek. Les hématies sont clairement visibles.



1.6 Pasteur, Koch et les cultures pures 11

FIGURE 1.10 Dessin d’une bactérie filamenteuse sulfooxydante Beggiatoa mirabilis par Ferdinand Cohn en 1866. Les petits granules à l’intérieur des cellules correspondent à du soufre élémentaire, produit de l’oxydation de l’hydrogène sulfuré (H2S). Cohn fut le premier à identifier les granules comme étant du soufre.

son travail de fond pour une élaboration de la classification bactérienne et fonde un journal scientifique majeur. Cohn a été également un farouche défenseur des recherches menées par le premier microbiologiste médical, Robert Koch. Il est aussi reconnu pour sa contribution simple mais efficace à la prévention de la contamination des milieux de culture stérile, comme l’utilisation du coton pour fermer les flacons et tubes. Ces méthodes ont été utilisées par la suite par Koch et lui ont permis de progresser dans l’isolement et la caractérisation de plusieurs bactéries pathogènes (voir section 1.6).

m n1.6 Pasteur, Koch et les cultures pures C’est dans la dernière partie du XIXe siècle que la microbiologie voit véritablement le jour. L’idée de la génération spontanée est abandonnée et celle de la culture pure est mise en avant.

Pasteur et le déclin de la génération spontanée Le concept de génération spontanée existe depuis l’époque biblique. Le principe de base est facile à comprendre. Par exemple, si de la nourriture est laissée à l’air libre pour une durée déterminée, elle se décompose. Lorsque le matériel décomposé est observé au microscope, de grandes quantités de bactéries sont retrouvées, ainsi que des larves diverses et des vers. D’où viennent ces organismes invisibles dans la nourriture fraîche ? Certains disent qu’ils se développent à partir de graines et germes dispersés dans l’air, d’autres qu’ils apparaissent spontanément des matériaux sans vie. Louis Pasteur (1822-1895) est un fervent opposant au concept de génération spontanée. Il montre que les micro-organismes présents dans l’air ont de fortes ressemblances avec ceux retrouvés dans la matière en décomposition. Il avance donc que ces cellules sont constamment déposées sur les objets et croissent lorsque les conditions deviennent favorables. Pour lui, si la

nourriture est traitée de façon à détruire les micro-organismes, de manière à la rendre alors stérile, puis protégée d’une future contamination, il n’y aura pas de décomposition. Il a été préalablement établi que la chaleur tuait les microorganismes. Pasteur utilise donc la chaleur pour éliminer les contaminants. En fait, d’autres travaux ont montré que si une solution nutritive dans une fiole est portée à ébullition, la croissance microbienne est stoppée. Ce processus d’élimination de bactéries ou autres micro-organismes dans ou sur des objets est appelé stérilisation. Les partisans de la génération spontanée critiquent ces travaux, déclarant que l’air est nécessaire pour la génération spontanée. Porter du liquide à ébullition dans une fiole affecte l’air, et donc la génération spontanée. En 1864, Pasteur contrecarre brillamment et simplement cette objection en construisant un flacon à col de cygne, aujourd’hui appelée fiole Pasteur (voir figure 1.11). Dans un tel flacon, les solutions nutritives peuvent être portées à ébullition. Cependant, après refroidissement de la fiole, l’air peut de nouveau entrer, mais est retenu dans le col de cygne, empêchant la matière particulaire (contenant les contaminants) d’entrer dans la fiole et de se développer. Le milieu stérilisé dans une fiole Pasteur ne se décompose pas et les micro-organismes n’apparaissent pas dans la fiole tant que le liquide stérile n’entre pas en contact avec le col de cygne. Si, par contre, la fiole est renversée de façon à permettre au liquide d’entrer en contact avec le col (voir figure 1.11c), le liquide est contaminé par les micro-organismes. Cette expérience règle la controverse autour de la génération spontanée, et la microbiologie fait un grand pas en avant. Par ailleurs, les travaux de Pasteur portent sur le développement de techniques de stérilisation, qui sont améliorées et appliquées dans les recherches de base et fondamentales. La science de la nourriture a une dette envers Pasteur, à qui elle doit beaucoup pour les principes de conservation (pasteurisation). Pasteur a atteint d’autres sommets en médecine et microbiologie. Parmi les plus importants, le développement des vaccins contre l’anthrax, la peste noire et la rage pendant une période scientifiquement productive de sa vie, de 1880 à 1890. Non seulement ces percées médicales et vétérinaires ont une importance majeure, mais elles ont également permis la conception de la théorie des germes, développée par un contemporain de Pasteur, Koch.

Koch et la détermination de la théorie des germes : le développement des postulats de Koch Le fait d’avoir démontré que les micro-organismes peuvent provoquer des maladies a conduit au développement de la microbiologie. Depuis le XVIe siècle on pense qu’une personne porteuse d’une infection peut la transmettre à une personne saine. Après la découverte des micro-organismes, il est accepté qu’ils puissent être responsables, mais les preuves manquent. Les découvertes concernant l’hygiène d’Ignaz Semmelweis et de Joseph Lister fournissent des éléments importants sur l’implication des micro-organismes dans l’induction des maladies humaines, mais il faut attendre les travaux de Koch (1843-1910), un physicien, pour que le concept de sa théorie des germes soit admis et soutenu par l’expérimentation.



12 Chapitre 1

Micro-organismes et microbiologie Sortie de l’air par l’extrémité ouverte

caractéristiques de la maladie. Cependant, Koch va plus loin dans ses expérimentations. Il montre que la bactérie peut être cultivée dans un milieu de culture hors de l’animal, et même malgré de nombreux transferts en culture, la bactérie cause toujours la maladie lorsqu’elle est ré-inoculée à un animal. Avec ces expériences, Koch formule les critères suivants, aujourd’hui appelés postulats de Koch, afin de prouver qu’un micro-organisme spécifique cause une maladie spécifique : 1. L’organisme doit être présent chez l’animal malade et absent chez les animaux sains.

(a) Liquide non stérile versé dans un flacon

Col du flacon courbé à la flamme

Poussière et micro-organismes emprisonnés dans la courbure

Stérilisation du liquide par chauffage

2. L’organisme doit être cultivé en culture pure sans contact avec l’animal.

Extrémité ouverte

3. Une culture pure, inoculée à des animaux choisis, doit faire apparaître les symptômes caractéristiques de la maladie. 4. Les organismes doivent être isolés de nouveau de ces animaux expérimentaux et cultivés en laboratoire ; ils doivent être identiques à l’organisme initial.

Longue période (b) Refroidissement lent du liquide

Le liquide reste stérile

Courte période (c) Le flacon est incliné, le liquide stérile entre en contact avec les microorganismes et la poussière

Croissance des micro-organismes dans le liquide

FIGURE 1.11 Expériences de Pasteur utilisant les flacons à col de cygne. (a) Stérilisation du contenu du flacon à col de cygne. (b) Si le flacon à col de cygne est maintenu droit, il n’y a pas de croissance de micro-organismes. (c) Si des micro-organismes sont emprisonnés dans le col du flacon et atteignent le liquide stérile, il y a croissance microbienne.

Dans ses premiers travaux, Koch étudie l’anthrax, une maladie bovine qui occasionnellement peut toucher les humains. L’anthrax est causé par des spores bactériennes appelées Bacillus anthracis, et le sang d’un animal infecté contient des cellules de cette bactérie (voir section 25.13 et figure 25.13). Par l’observation microscopique, Koch établit que la bactérie est toujours présente dans le sang de l’animal mort. Cependant, la simple association de la bactérie à la maladie n’implique pas nécessairement qu’elle en est la cause. Au contraire, la bactérie peut être le résultat de l’infection. À travers des expériences adaptées, Koch démontre, en utilisant une petite quantité de sang d’une souris infectée injectée dans une souris saine, qu’elle transmet rapidement la maladie de l’anthrax. Il prélève du sang du second animal, l’injecte dans un autre et, de nouveau, obtient les symptômes

Les postulats de Koch sont résumés dans la figure 1.12. Ils constituent une étape monumentale dans l’étude des maladies infectieuses. Ces postulats n’offrent pas seulement le moyen de relier la cause à l’effet dans les cas de maladies infectieuses, mais ils servent aussi à démontrer l’importance des cultures en laboratoire. Avec ces postulats comme guides, Koch et les microbiologistes qui lui ont succédé ont découvert les causes de nombreuses maladies humaines et animales. Ces découvertes ont mené au développement de traitements pour prévenir et guérir ces maladies, et ont de ce fait amélioré les bases de la médecine clinique et de la santé humaine.

Koch et les cultures pures Afin de pouvoir associer un micro-organisme spécifique à un mécanisme spécifique telle une maladie, l’organisme doit être dans un premier temps isolé en culture pure. Ce concept est retenu par Koch lorsqu’il énonce ses postulats (voir figure 1.12), et il développe plusieurs méthodes simples et ingénieuses afin d’obtenir des bactéries en culture pure (voir focus, « Milieu de culture solide, boîte de Petri et cultures pures »). Koch commence de manière simple en utilisant de la nourriture telle qu’une tranche de pomme de terre pour cultiver des bactéries. Mais il développe rapidement des méthodes plus fiables, dont certaines sont encore utilisées aujourd’hui. Koch observe que, lorsqu’une surface solide comme une tranche de pomme de terre est incubée à l’air libre, des colonies bactériennes se développent, chacune ayant une couleur et une forme spécifiques. Il suggère que chaque colonie émergée d’une bactérie unique tombe à la surface, trouve des nutriments appropriés et se reproduit. En d’autres termes, chaque colonie représente une culture pure. Koch réalise que cette découverte permet d’obtenir une culture pure de façon simple. Tous les organismes ne se développent pas sur des pommes de terre, cependant Koch recherche des solutions nutritives plus uniformes et reproductibles, solidifiées avec de la gélatine et plus tard de l’agar (voir focus).



1.6 Pasteur, Koch et les cultures pures 13

Animal malade

POSTULATS DE KOCH : 1. L’organisme suspecté pathogène doit être présent chez tous les animaux malades et absent chez les animaux sains.

Globules rouges

Observation de sang et de tissu au microscope

Agent pathogène suspecté

Ensemencement de boîtes de Petri par un échantillon issu de l’animal sain ou de l’animal malade

2. L’organisme suspecté pathogène doit être cultivé en culture pure. Colonies du pathogène suspecté

Animal sain

Globules rouges

Pas d’organisme présent

Inoculation du pathogène suspecté à un animal sain 3. Les cellules issues d’une culture pure d’un organisme suspect doivent provoquer la maladie chez un animal sain.

Animal malade Observation au microscope d’un échantillon de tissu ou de sang de l’animal malade après infection

4. L’organisme doit pouvoir être isolé à nouveau et s’avérer identique à l’original.

Agent pathogène suspecté

Culture en laboratoire

Culture pure qui doit être identique à celle de départ

FIGURE 1.12 Postulats de Koch établissant un lien entre un agent pathogène et une maladie. Il est important de noter qu’à la suite de l’isolement en culture pure de l’agent pathogène soupçonné, une culture en laboratoire du pathogène doit à la fois provoquer la maladie et être isolée à nouveau de l’organisme malade. La mise au point des conditions adéquates de la croissance du pathogène est essentielle, sinon il ne se développera pas.

Test des postulats de Koch : la tuberculose La plus grande percée de Koch dans le domaine de la bactériologie médicale est sa découverte de l’agent responsable de la tuberculose. Au moment où Koch commence ses travaux (1881), un septième des cas de mortalité humaine répertoriés sont dus à la tuberculose (voir figure 1.7). Il y a fort à croire que la tuberculose est une maladie contagieuse, mais l’organisme suspecté n’a jamais été observé, ni en culture, ni sur les tissus contaminés. Koch est déterminé à identifier l’agent actif de la tuberculose, et pour cela il assemble toutes les méthodes qu’il a développées lors de ses précédentes études : microscopie, coloration des tissus, isolation en culture pure et sur animal. Par expérience, la bactérie Mycobacterium tuberculosis est difficile à colorer du fait de la grande quantité de lipides présente dans ses parois cellulaires, mais Koch met en place une méthode afin de colorer M. tuberculosis dans des tissus en utilisant le bleu de méthylène associé à une seconde

coloration, le brun de Bismarck, marquant seulement les tissus (cette méthode préfigure celle de la coloration utilisée aujourd’hui pour les lipides – voir section 12.23). Par cette méthode, Koch observe des cellules de M. tuberculosis de couleur bleu clair, de forme allongée, le tissu lui-même coloré en marron (voir figure 1.13). Cependant, il a appris de ces précédents travaux sur l’anthrax que la simple identification d’un organisme associé à la tuberculose ne suffit pas. Il sait qu’il doit obtenir l’organisme en culture pour prouver la cause spécifique de la tuberculose. Cultiver M. tuberculosis n’est pas aisé, mais Koch réussit à la faire croître dans des milieux contenant du sérum de sang coagulé. Plus tard il utilise l’agar, qui vient d’être introduit comme un agent solidifiant (voir focus). Dans les meilleures conditions, M. tuberculosis se développe lentement en culture, mais Koch persiste, et il obtient des cultures pures de cet organisme provenant d’échantillons humains et animaux.



14 Chapitre 1

FOCUS


Milieu de culture solide, boîte de Petri et cultures pures

Robert Koch est le premier à cultiver des bactéries sur milieu solide. Ses premiers essais sur des tranches de pomme de terre sont émaillés de problèmes. Malgré l’attention portée à quelques types bactériens se développant sur les tranches, celles-ci sont régulièrement contaminées par des champignons. Koch utilise dans un premier temps de la gélatine comme agent de solidification pour les différentes solutions nutritives utilisées dans la culture de bactéries pathogènes et il développe une méthode de préparation de tranches de milieu solide stériles sous une cloche ou une boîte en verre (voir figure 1.13c). La gélatine nutritive constitue un bon milieu de culture pour l’isolation et l’étude de bactéries diverses, mais cependant avec quelques désavantages, le plus important étant la liquéfaction du milieu à 37 ˚C, température optimale de croissance pour la plupart des pathogènes humains. Donc, un agent de solidification plus commode d’emploi est nécessaire : l’agar. L’agar est un polysaccharide obtenu à partir des algues rouges. Il est utilisé au e XIX siècle comme agent gélifiant. Walter Hesse est le premier à l’employer afin de solidifier des milieux de culture bactériens, l’idée lui étant venue de sa femme, Fannie, qui a recours à l’agar dans la préparation de gelées de fruits. Lorsque Walter Hesse l’utilise comme agent de solidification de milieu, ses qualités supérieures se révèlent de façon évidente. Hesse écrit à Koch à propos de ses découvertes et Koch les applique rapidement à ses propres travaux, y compris pour ses études d’isolation de la bactérie Mycobacterium tuberculosis, la cause de la tuberculose (voir texte et

figure 1.13). L’agar a bien d’autres propriétés qui le rendent intéressant en tant qu’agent gélifiant pour milieu de culture. En particulier, il demeure solide à température corporelle, et, après mélange pendant la phase de stérilisation, redevient liquide autour de 45 ˚C et peut alors être versé dans des flacons stériles. De plus, à l’inverse de la gélatine, qui peut être hydrolysée par de nombreuses bactéries provoquant la liquéfaction du milieu, l’agar n’est pas dégradé par la majorité des bactéries. De ce fait, il trouve sa place parmi les outils incontournables de la microbiologie et est toujours utilisé afin d’obtenir et de maintenir des cultures pures de bactéries. En 1887, Julius Richard Petri publie un court article décrivant la modification de la technique en plaque de Koch. Le développement des boîtes à double face par Petri est particulièrement utile et leur avantage est immédiatement apparent. Elles peuvent être facilement stockées et stérilisées séparément du milieu, et l’addition de milieu à la plus petite des plaques permet d’utiliser la seconde comme couvercle pour éviter toute contamination. Les colonies qui se développent sur la surface de l’agar restent exposées à l’air et peuvent être facilement manipulées. L’idée originelle de Petri n’a pas été améliorée, les boîtes de Petri peuvent être fabriquées à partir de verre recyclé ou de plastique jetable, et stérilisées par l’oxyde d’éthylène (gaz). Enfin, il faut noter que Koch est conscient des implications de ces méthodes de culture pure dans l’étude de la systématique microbienne. Il observe que différentes colonies (couleur, morphologie et

taille variée – voir figure 1) développées dans un milieu solide exposé à un objet contaminé, peuvent être distinguées les unes des autres par leurs caractéristiques. Les cellules des diverses colonies sont différentes observées au microscope, mais aussi en tenant compte de leur température optimale de croissance et de la nature des nutriments. Koch réalise ainsi que ces différences entre micro-organismes correspondent aux conditions de classification taxinomique des organismes supérieurs comme les espèces de plantes et d’animaux. Il énonce : « Toute bactérie qui conserve les caractéristiques qui la différencient des autres lorsqu’elles sont cultivées dans le même milieu et sous les mêmes conditions, doit être désignée comme espèce, variété et forme. » Koch découvre aussi, à partir des cultures pures, qu’il est possible de montrer que des organismes spécifiques ont des effets spécifiques, pas seulement en provoquant des maladies, mais avec également des capacités supplémentaires. Ce concept a été prépondérant dans l’acceptation de la microbiologie comme science biologique indépendante. La découverte par Koch des milieux de culture solide et ses travaux sur les cultures pures en microbiologie sont allés bien audelà du domaine de la bactériologie médicale. Ces découvertes ont fourni des outils pour le développement de la taxinomie, de la génétique et d’autres disciplines bactériennes. En effet, tous les champs de la microbiologie sont redevables à Koch et à ses collaborateurs pour les intuitions dont ils ont fait preuve en saisissant la signification de cultures pures et en développant les méthodes de bases en microbiologie.

Figure 1 Photographie colorée à la main de colonies formées sur de l’agar, prise par Walter Hesse, un collaborateur de Robert Koch. Parmi les colonies, il y a des moisissures et des bactéries obtenues durant les études initiées par Hesse sur le contenu microbiologique de l’air à Berlin en 1882 . D’après Hesse, W. 1884. “Ueber quantitative Bestimmung der in der Luft enthaltenen Mikroorganismen”, in Struck (dir.),. Mittheilungen aus dem Kairserlichen Gesundheitsamte. August Hirschwald.



1.7 La diversité microbienne et la naissance de la microbiologie générale

15

microbienne m n1.7 Laet ladiversité naissance de la microbiologie générale

(a)

(b)

(c)

(d)

FIGURE 1.13 Dessins par Robert Koch de cellules de Mycobacterium tuberculosis issues de tissus et de cultures en laboratoire. Robert Koch a été le premier à isoler M. tuberculosis en démontrant son lien avec la tuberculose. (a) Coupe d’alvéole pulmonaire. Les cellules de M. tuberculosis sont colorées en bleu, les tissus pulmonaires en brun. (b) Cellules de M. tuberculosis dans un crachat de patient atteint de tuberculose. (c, d) Croissance de M. tuberculosis en culture pure. (c) Croissance de M. tuberculosis sur une plaque de verre recouverte de sérum sanguin coagulé et placé dans une boîte en verre (couvercle ouvert). (d) Une colonie de M. tuberculosis issue de la culture (c) et observation au microscope 700X ; les cellules ressemblent à des cordes (comparer avec la figure 12.70b). Dessins originaux tirés de Koch, R. 1884. « Die Aetiologie der Tuberkulose. » Mittheilungen aus dem Kairserlichen Gesundheitsamte 2:1-88.

À partir de là, il est facile d’utiliser ses postulats afin de prouver que M. tuberculosis est bien la cause de la tuberculose. Les cobayes sont infectés par le micro-organisme isolé et parfois succombent. Koch montre que les cobayes décédés ont une forte proportion de M. tuberculosis dans leurs tissus, et ainsi les cultures pures obtenues à partir de ces animaux peuvent contaminer des animaux sains. Pour ses contributions à la compréhension de cette maladie, Koch a reçu le prix Nobel de physiologie ou médecine en 1905.

Contrôlez vos acquis Les travaux de Louis Pasteur sur la génération spontanée ont amené au développement d’une méthode pour le contrôle de la croissance de micro-organismes. Robert Koch a développé des critères pour l’étude des micro-organismes infectieux et la première méthode de culture pure des micro-organismes. •

Comment les expériences de Pasteur ont-elles infirmé le concept de génération spontanée ?

•

Comment les postulats de Koch montrent-ils la cause et l’effet d’une maladie ?

•

Quel avantage offre la culture de micro-organismes en milieu solide ?

Entre les XIXe et XXe siècles, la microbiologie connaît de grandes avancées, notamment dans la compréhension de la diversité microbienne. Durant cette période, de nouvelles sousdisciplines apparaissent, débouchant sur l’ère de la « microbiologie moléculaire ». Parmi les précurseurs dans ces domaines, on trouve le Hollandais Martinus Beijerinck et le Russe Sergei Winogradsky. Ces deux microbiologistes s’intéressent aux bactéries colonisant les sols et l’eau, et tous deux sont reconnus principalement pour leurs avancées dans le domaine de la diversité bactérienne. Cette période, jusqu’à l’ère de la biologie moléculaire, peut être considérée comme le sommet de la microbiologie générale. Cette dernière concerne plutôt les aspects non médicaux de la microbiologie, l’accent étant mis essentiellement sur la diversité et la physiologie des micro-organismes.

Martinus Beijerinck et les techniques de culture d’enrichissement Martinus Beijerinck (1851-1931) est professeur à l’École polytechnique de Delft en Hollande, mais aussi spécialiste en botanique. Sa carrière en microbiologie débute par l’étude de la microbiologie des plantes. Son plus grand apport à la microbiologie est sans doute sa formulation claire des cultures d’enrichissement. Dans les cultures d’enrichissement, les micro-organismes sont isolés des échantillons naturels de manière sélective, en tenant compte de leurs besoins nutritifs et d’incubation (voir section 18.1). Utilisant sa technique d’enrichissement, Beijerinck isole les premières cultures pures de micro-organismes aquatiques et du sol, incluant les bactéries fixatrices d’azote (voir figure 1.14), les bactéries sulfo-réductrices et sulfo-oxydantes, les bactéries fixatrices d’azote sur les nodosités racinaires, Lactobacillus sp, les algues vertes et bien d’autres micro-organismes. Utilisant des techniques de filtration sélective dans ses travaux sur la maladie de la mosaïque du tabac, Beijerinck montre que l’agent infectieux (un virus) n’est pas bactérien, mais s’introduit dans les cellules de l’hôte et nécessite la survie de la plante pour se reproduire. Dans ses travaux, Beijerinck non seulement identifie le premier virus, mais établit les bases de la virologie.

Sergei Winogradsky et le concept de chimiolithotrophie Sergei Winogradsky (1856-1953) partage avec Beijerinck des intérêts scientifiques similaires et est également reconnu pour avoir procédé au premier isolement de diverses bactéries très importantes. Il s’intéresse surtout aux bactéries impliquées dans le cycle de l’azote et du soufre (voir figures 1.15 et 1.16). Il montre dans ses travaux que ces bactéries peuvent être d’importants agents biogéochimiques. De plus, il démontre la signification métabolique des processus biogéochimiques. Par exemple, à partir de ses travaux sur les bactéries sulfo-oxydantes, Winogradsky propose le concept de chimiolithotrophie, soit l’oxydation des composés




Avec l’aimable autorisation de Microbiologie du Sol

Lesley Robertson et le Kluyver Laboratory Museum, université de technologie de Delft

16 Chapitre 1

(b)

Lesley Robertson et le Kluyver Laboratory Museum, université de technologie de Delft

(a)

FIGURE 1.14 Martinus Beijerinck et l’Azotobacter . (a) Extrait d’une page issue du cahier de laboratoire de M. Beijerinck datant du 31 décembre 1900, qui décrit ses observations de la bactérie aérobie Azotobacter chroococcum, fixatrice d’azote (nom entouré en rouge). C’est sur cette page que Beijerinck a utilisé ce nom pour la première fois. Comparez les illustrations par Beijerinck de paires de cellules d’Azotobacter chroococcum avec une photographie au microscope de ces mêmes cellules sur la figure 12.19a. (b) Une peinture d’Henriette Beijerinck, sœur du microbiologiste, montre des cellules d’Azotobacter chroococcum. Beijerinck utilisait de telles peintures pour illustrer ses conférences, car les moyens de projections d’aujourd’hui n’existaient pas.

inorganiques associée à la conservation de l’énergie (voir figure 1.16a). À partir de ses études sur le processus de nitrification (oxydation de l’ammonium en nitrate), il conclut que les organismes responsables – les bactéries nitrifiantes – obtiennent leur carbone à partir du CO2. Winogradsky, propose que ces organismes soient autotrophes – ils sont aujourd’hui appelés des chimio-autotrophes – afin de les distinguer des organismes autotrophes phototrophes. Utilisant une méthode d’enrichissement, Winogradsky isole également les premières bactéries fixatrices d’azote (Clostridium pasteurianum) et en formule le concept. Winogradsky, mort centenaire, a publié de nombreux articles scientifiques, dont « La microbiologie du sol ». Ce dernier contient des dessins originaux de nombreux micro-organismes qu’il a isolés

FIGURE 1.15 Dessins colorés à la main de bactéries phototrophes pourpres sulfureuses. Sergei Winogradsky a signé ces dessins originaux aux environs de 1887. Sa femme Hélène les a ensuite copiés et colorés. Certains d’entre eux représentent des cellules du genre Chromatium, tel que C. okenii (figures 3 et 4). Cette espèce est toujours reconnue aujourd’hui. Comparez avec les photographies au microscope de ces mêmes cellules figure 12.4a.

ou étudiés en culture d’enrichissement ou de matériel naturel durant sa carrière (voir figure 1.15). Le tableau 1.1 résume certaines des découvertes importantes dans le domaine de la microbiologie, depuis van Leeuwenhoek jusqu’à aujourd’hui.

Chimiolithotrophie H2S ADP + Pi

S

0

SO42– ATP

NO2–

ADP + Pi

CO2 (a)

NH3

NO3– ATP

CO2

Chimio-autotrophie Fixation de l’azote N2 + 6H

2NH3

ATP

ADP + Pi

Protéine Acide nucléique

(b) FIGURE 1.16 Concepts majeurs développés par Sergei Winogradsky. (a) Chimiolithotrophie et chimio-autotrophie. L’oxydation des composés soufrés ou azotés produit de l’énergie (ATP), alors que le carbone est apporté aux cellules par le CO 2 . Photographie de gauche, Achromatium ; à droite, Nitrobacter. (b) Fixation de l’azote. Ce processus consomme de l’ATP mais permet à la cellule d’utiliser l’azote gazeux pour tous ses besoins en azote. La photographie représente Azotobacter, un microorganisme aérobie fixateur d’azote (voir aussi la figure 1.14).



1.7 La diversité microbienne et la naissance de la microbiologie générale

TABLEAU 1.1

17

300 ANS DE MICROBIOLOGIE : PUBLICATIONS CLÉS EN MICROBIOLOGIE, 1684 –2000

Années

Investigateur(s)

Découverte

1684

Antoni van Leeuwenhoek

Découverte des bactéries

1798

Edward Jenner

Vaccination contre la variole

1857

Louis Pasteur

Microbiologie de la fermentation de l’acide lactique

1860

Louis Pasteur

Rôle des levures dans la fermentation alcoolique

1864

Louis Pasteur

Controverse de la génération spontanée

1867

Robert Lister

Principes antiseptiques en chirurgie

1876

Ferdinand Cohn

Découverte des endospores

1881

Robert Koch

Méthodes d’études des bactéries en culture pure

1882

Robert Koch

Découverte de la cause de la tuberculose

1882

Élie Metchnikoff

Phagocytose

1884

Robert Koch

Postulats de Koch

1884

Christian Gram

Méthode de la coloration de Gram

1885

Louis Pasteur

Vaccins contre la rage

1889

Sergueï Winogradsky

Concept de chimiolithotrophie

1889

Martinus Beijerinck

Concept de virus

1890

Emil von Behring et Shibasaburo Kitasato

Antitoxine de la diphtérie

1890

Sergueï Winogradsky

Croissance autotrophe des chimiolithotrophes

1901

Martinus Beijerinck

Méthode de culture d’enrichissement

1901

Karl Landsteiner

Groupes sanguins humains

1908

Paul Ehrlich

Agents de chimiothérapie

1911

Francis Rous

Premier virus du cancer

1915/1917

Frederick Twort/Félix d’Hérelle

Découverte des virus bactériens (bactériophages)

1928

Frederick Griffith

Découverte de la transformation des pneumocoques

1929

Alexander Fleming

Découverte de la pénicilline

1931

Cornelius Van Niel

H2S (hydrogène sulfuré) comme donneur d’électron dans la photosynthèse anoxygénique

1935

Gerhard Domagk

Sulfonamides (agents antimicrobiens)

1935

Wendall Stanley

Cristallisation du virus de la mosaïque du tabac

1941

George Beadle et Edward Tatum

Hypothèse d’un gène-une enzyme

1943

Max Delbruck et Salvador Luria

Transmission des caractères génétiques chez les bactéries

1944

Oswald Avery, Colin Macleod, Maclyn McCarty

Explications des travaux de Griffith – l’ADN est du matériel génétique

1944

Selman Waksman et Albert Schatz

Découverte de la streptomycine

1946

Edward Tatum et Joshua Lederberg

Conjugaison bactérienne

1951

Barbara McClintock

Découverte des éléments transposables

1952

Joshua Lederberg et Norton Zinder

Transduction bactérienne

1953

James Watson, Francis Crick, Rosalind Franklin

Structure de l’ADN

1959

Arthur Pardee, François Jacob, Jacques Monod

Régulation des gènes par une protéine répresseur

1959

Rodney Porter

Structure de l’immunoglobine

1959

Frank Macfarlane Burnet

Théorie de la sélection clonale

1960

François Jacob, David Perrin, Carmon Sanchez, Jacques Monod

Concept de l’opéron

1960

Rosalyn Yalow et Solomon Bernson

Développement des radio-immuno essais (RIA)

1961

Sydney Brenner, François Jacob et Matthew Meselson

ARN messager et ribosomes : site de la synthèse protéique

1966

Marshall Nirenberg et Har Gobind Khorana

Découverte du code génétique

1967

Thomas Brock

Découverte des bactéries des sources d’eau chaude

1969

Howard Temin, David Baltimore, Renato Dulbecco

Découverte des rétrovirus/transcriptase inverse



18 Chapitre 1


Années

Investigateur(s)

Découverte

1969

Thomas Brock et Hudson Freeze

Isolement de Thermus aquaticus, source de Taq ADN polymérase

1970

Hamilton Smith

Spécificité d’action des enzymes de restriction

1973

Stanley Cohen, Annie Chang, Robert Helling et Herbert Boyer

ADN recombinant

1975

Georges Kohler, Cesar Milstein

Anticorps monoclonaux

1976

Susumu Tonegawa

Réarrangement des gènes de l’immunoglobuline

1977

Carl Woese et George Fox

Découverte des Archaea

1977

Fred Sanger, Steven Niklen, Alan Coulson

Méthodes de séquençage de l’ADN

1981

Stanley Prusiner

Caracterisation des prions

1982

Karl Stetter

Isolement du premier procaryote avec une température optimale supérieure à 100 ˚C

1983

Luc Montagnier

Découverte du VIH, cause du SIDA

1985

Kary Mullis

Invention de la réaction de polymérisation en chaîne (PCR)

1986

Norman Pace

Écologie moléculaire microbienne

1995

Craig Venter et Hamilton Smith

Séquence complète d’un génome bactérien

1999

The Institute for Genomic Research (TIGR) et autres

Plus de cent génomes microbiens séquencés ou en cours

2000

Edward Delong

Découverte des Archaea marines, protéorhodopsine, et d’autres aspects de la vie marine procaryotique

2004

Craig Venter et autres

Premier grand génome environnemental : mer des Sargasses

Sources majeures des références : Brock, T. D. (1961), Milestones in Microbiology, Prentice Hall, Englewood Cliffs, New Jersey ; Brock, T. D. (1990). Émergence de la génétique bactérienne. Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York. Les années correspondent à la publication de la découverte.

Contrôlez vos acquis Beijerinck et Winogradsky ont étudié les bactéries dans les sols et l’eau et développé la technique de culture d’enrichissement pour l’isolation des représentants de divers groupes physiologiques. De nombreux concepts majeurs ont émergé durant cette période, incluant les cultures d’enrichissement, la chimiolithotrophie, la chimio-autotrophie et la fixation de l’azote. •

À quoi correspond la technique de culture d’enrichissement ?

•

En examinant la figure 1.16, montrez pourquoi l’oxydation du soufre et la nitrification sont considérées comme des processus chimiolithotrophes, alors que la fixation de l’azote ne l’est pas (indice : observez les réactions utilisant de l’ATP dans chaque cas).

m n1.8 L’ère moderne de la microbiologie Au XXe siècle, la microbiologie s’est développée en deux voies distinctes : la microbiologie appliquée et la microbiologie fondamentale.

domaines de la microbiologie médicale et de l’immunologie. Au même moment ont eu lieu la découverte de nouvelles bactéries pathogènes et l’élucidation des mécanismes par lesquels ces bactéries infectent les organismes et sont contrecarrées par les mécanismes immunitaires. D’autres avancées ont été permises par les découvertes de Beijerinck et Winogradsky dans le domaine de la microbiologie agricole, qui ont mené à la compréhension des processus microbiens du sol, comme la fixation de l’azote, bénéfique pour la croissance des plantes. Plus tard, au XXe siècle, l’étude des micro-organismes du sol a conduit à la découverte d’antibiotiques et d’autres molécules chimiques importantes, ouvrant la voie de la microbiologie industrielle et de la culture à grande échelle de micro-organismes pour la production de produits d’intérêt commercial. Les avancées dans le domaine de la microbiologie des sols ont rendu possible ensuite l’étude des micro-organismes colonisant les lacs, les rivières et les océans : domaines de la microbiologie aquatique et marine. Un des aspects de la microbiologie des eaux douces concerne le traitement des effluents et la production de l’eau potable pour la consommation. L’intérêt croissant pour la biodiversité et l’activité des micro-organismes dans leur environnement naturel a favorisé l’émergence de l’écologie microbienne dans les années 1960-1970. L’écologie microbienne connaît actuellement un renouveau spectaculaire, grâce aux apports des outils issus de la biologie moléculaire (voir figure 1.17).

Le développement des sous-disciplines majeures de la microbiologie appliquée

Les sous-disciplines en microbiologie

Les avancées innovantes de Koch ont permis le développement intensif de la microbiologie appliquée. Ainsi sont apparus les

Outre les progrès réalisés dans des domaines appliqués de la microbiologie, le XXe siècle a assisté à de nombreuses percées



1.8 L’ère moderne de la microbiologie 19

Archaea Bacteria

AUG GUC 1687

1864

1944 1941 1946

1895

1985 1953

L’ADN Génétique Structure est du bactérienne de l’ADN matériel génétique

van Pasteur Koch, Leeuwenhoek Winogradsky

1966 Code génétique

1977 1 Séquençage de l’ADN ; 2 Découverte des Archaea

Streptomycine Premières étapes : découverte, microbiologie générale et médicale

Eukarya

AGC T

1986

1995

PCR Écologie moléculaire microbienne

Ère de la biologie moléculaire/microbiologie générale

Premier génôme séquencé

2006 Plus de 500 génômes séquencés

Microbiologie moléculaire, génomique et protéomique

FIGURE 1.17 Quelques dates repères concernant la microbiologie depuis 65 ans. Les icônes ou photos au-dessus des dates symbolisent les découvertes majeures. Chaque découverte présentée ici a été expliquée dans ce chapitre ou le sera dans les chapitres suivants.

dans des domaines de la science fondamentale, en particulier ceux employant les concepts et outils de la biologie moléculaire. Les plus importants des soixante-cinq dernières années sont résumés dans la figure 1.17. Depuis la Seconde Guerre mondiale, de nouveaux microorganismes ont été découverts et classifiés, grâce à l’amélioration de la systématique microbienne et de la construction d’arbres phylogénétiques (voir figure 1.17). L’étude des nutriments nécessaires aux micro-organismes et des produits de leurs métabolismes a conduit à des avancées importantes concernant la physiologie microbienne. La connaissance approfondie de la structure physico-chimique des micro-organismes (cytologie) et la découverte des enzymes microbiennes et de leur réaction (biochimie microbienne) ont également influencé la microbiologie d’aujourd’hui. L’étude de l’hérédité et de la variation, c’est-à-dire la génétique bactérienne a été une clé importante dans la recherche fondamentale et a évolué rapidement au milieu du XXe siècle. Bien que certains aspects de la génétique bactérienne aient été connus au début du XXe siècle, il a fallu attendre la découverte des échanges génétiques chez les bactéries dans les années 1950 pour que la génétique bactérienne devienne un domaine d’étude important. La génétique bactérienne, la biochimie et la physiologie se sont largement développées pendant ces années-là. Au début des années 1960, ces domaines ont fourni une meilleure compréhension de l’ADN, de l’ARN et de la synthèse protéique. À partir de ces études bactériennes, le domaine de la biologie moléculaire a nettement progressé (voir figure 1.17). L’étude des virus a également progressé au XXe siècle. Bien que Beijerinck ait découvert le premier virus cent ans auparavant, ce n’est qu’au milieu du XXe siècle que la vraie nature des virus a été comprise. La plupart des travaux ont impliqué l’étude des virus infectant des bactéries, appelés bactériophages. Les scientifiques ont réalisé que les infections virales étaient analogues aux transferts génétiques, et la relation entre les virus et les autres éléments génétiques est apparue à travers les recherches sur les bactériophages.

L’ère de la microbiologie moléculaire Vers les années 1970, notre connaissance sur la physiologie, la biochimie et la génétique bactériennes a progressé de façon à pouvoir manipuler expérimentalement le matériel génétique d’une cellule. Avec la découverte des enzymes de restriction, il a été possible d’introduire de l’ADN étranger dans des bactéries et de contrôler sa réplication. Ceci a permis le développement des biotechnologies. Au même moment, le séquençage des acides nucléiques s’est développé, avec des conséquences énormes dans tous les domaines de la biologie. En microbiologie, le séquençage de l’ADN a permis de mettre en évidence des relations phylogénétiques entre procaryotes, permettant de nouveaux concepts de classification biologique. Le séquençage a également donné naissance à la génomique, l’analyse comparée des gènes de différents organismes. Les quantités importantes d’informations génomiques disponibles ont engendré des avancées majeures en médecine, en écologie microbienne et dans bien d’autres domaines de la biologie. En effet, l’ère de la génomique a permis la naissance de la protéomique, l’étude de l’expression des protéines dans les cellules (sur la génomique et la protéomique, voir chapitre 15).

Les nouvelles frontières Les 350 ans de la microbiologie ont non seulement permis de mieux connaître la biologie des micro-organismes, mais ils ont aussi suscité de nouveaux défis (bons ou mauvais). D’un côté, de nouvelles maladies comme la SRAS et le SIDA semblent faire leur apparition sans avertissement et remettent en cause notre compréhension des maladies microbiennes. D’un autre côté, de nouvelles découvertes nous amènent petit à petit à la compréhension du fonctionnement cellulaire, et les nouvelles bactéries découvertes repoussent les limites de nos connaissances de la diversité microbienne. La génomique est prête à révéler le plus petit génome, le minimum de gènes nécessaire à la vie. Dans un avenir proche les prérequis nécessaires à la vie pourront être précisément décrits. La création de cellules en laboratoire n’est plus très loin.



20 Chapitre 1


Comme l’a dit Stephen Jay Gould, c’est « l’âge de la bactérie ». Quelle époque excitante pour étudier la science ! Bienvenue dans le monde de la microbiologie !

Contrôlez vos acquis Du milieu à la seconde moitié du XXe siècle, les microbiologies fondamentale et appliquée évoluèrent ensemble pour conduire à l’ère de la microbiologie moléculaire. •

Énumérez les sous-disciplines de la microbiologie se focalisant sur : le métabolisme, l’enzymologie, les acides nucléiques et la synthèse protéique, les microorganismes et leurs environnements naturels.

QUESTIONS 1. Indiquez les six propriétés associées à l’état vivant. Lesquelles sont des propriétés communes à toutes les cellules ? Lesquelles seulement à quelques types de cellules (voir sections 1.1 et 1.2) ? 2. Il est possible de considérer les cellules comme des machineries cellulaires et des dispositifs de codage. Expliquez en quoi ces deux attributs cellulaires diffèrent (voir section 1.2). 3. Quels sont les éléments nécessaires à la traduction dans une cellule ? Quel est le produit de la traduction (voir section 1.2) ? 4. Définissez un écosystème. Les micro-organismes vivent-ils en culture pure dans un écosystème ? Quels effets peuvent avoir les micro-organismes sur leurs écosystèmes (voir section 1.3) ? 5. Comment convaincre un interlocuteur que les micro-organismes ne sont pas que des agents infectieux (voir section 1.4) ? 6. Pour quelles contributions Hooke et van Leeuwenhoek sont-ils connus en microbiologie ? Comment Ferdinand Cohn a-t-il contribué à cette science (voir section 1.5) ? 7. Qu’est-ce qu’une culture pure et comment peut-elle être obtenue ? Pourquoi l’obtention d’une culture pure fut-elle

importante pour le développement de la microbiologie (voir section 1.6) ? 8. Expliquez les principes d’utilisation des flacons à col de cygne de Pasteur dans l’étude de la génération spontanée (voir section 1.6). 9. Expliquez pourquoi la découverte des milieux de culture solide fut importante pour le développement de la microbiologie (voir section 1.6). 10. À quoi correspondent les postulats de Koch et quelle est leur influence sur le développement de la microbiologie ? Pourquoi sont-ils toujours valables aujourd’hui (voir section 1.6) ? 11. Décrivez une contribution majeure de Martinus Beijerinck à la microbiologie (voir section 1.7). 12. Quels concepts majeurs devons-nous à Sergei Winogradsky (voir section 1.7) ? 13. Quelles avancées majeures ont eu lieu depuis la Seconde Guerre mondiale (voir section 1.8) ?

PROBLÈMES 1. Les expériences de Pasteur sur la génération spontanée ont été d’une importance considérable pour l’avancée de la microbiologie, avec un impact sur la méthodologie, sur notre compréhension de l’origine de la vie, sur la conservation de la nourriture. Expliquez brièvement comment ces expériences ont influé sur chacun de ces domaines.

2. Décrivez les différentes preuves utilisées par Robert Koch pour associer la bactérie Mycobacterium tuberculosis à la tuberculose. Comment ces preuves auraient-elles pu être anéanties si les règles utilisées pour l’étude des maladies bactériennes n’avaient pas été validées pour l’étude de la tuberculose ?



I

Structure cellulaire et évolution

22

2.1 2.2

22

2.3

Les structures cellulaires et virales L’organisation de l’ADN dans les cellules microbiennes L’arbre universel du vivant

24 26

II

Diversité microbienne

28

2.4

La diversité de la physiologie des microorganismes La diversité des procaryotes Les micro-organismes eucaryotes

28 30 35

2.5 2.6

CHAPITRE DEUX


La diversité microbienne est extrêmement vaste et les micro-organismes ont exploité toutes les stratégies permettant la vie, dans le cadre des lois de la physique et de la chimie.



22 Chapitre 2


GLOSSAIRE Archaea (Archaea) L’un des trois domaines du vivant. Procaryotes phylogénétiquement distincts des Bacteria. Bacteria (Bacteria) L’un des trois domaines du vivant. Procaryotes phylogénétiquement distincts des Archaea. Chimiolithotrophe (chemolithotroph) Organisme tirant son énergie de l’oxydation de substrats inorganiques. chimio-organotrophe (chemoorganotroph) Organisme tirant son énergie de l’oxydation de substrats organiques. Chromosome (chromosome) Élément génétique comportant les gènes essentiels au fonctionnement cellulaire. Cytoplasme (cytoplasm) Contenu d’une cellule vivante, entouré par la membrane plasmique à l’exception du noyau, s’il est présent. Domaine (domain) Rang le plus élevé dans la classification biologique (il existe trois domaines). Endosymbiose (endosymbiosis) Processus ayant permis l’apparition des mitochondries et des chloroplastes dans les cellules eucaryotes à la suite de la colonisation de celles-ci par des procaryotes du domaine des Bacteria. Eucaryote (Eukaryote) Cellule dont le noyau est séparé du cytoplasme par une membrane et qui possède généralement des organelles. Eukarya (Eukarya) L’un des trois domaines du vivant incluant toutes les cellules eucaryotes. Évolution (evolution) Processus ayant, au cours du temps, conduit à l’apparition de nouvelles espèces ou de variétés à l’intérieur d’espèces. Extrémophile (extremophile) Organisme dont la croissance optimale se réalise à des valeurs extrêmes pour certains para-

I

STRUCTURE CELLULAIRE ET ÉVOLUTION

Ce chapitre concerne la structure, la fonction et la diversité des cellules microbiennes. Les structures internes de ces cellules, distinctes de celles des virus, l’arbre universel du vivant et les principaux groupes de micro-organismes interagissant avec l’homme et la planète seront étudiés successivement. Les techniques de microscopie optique et électronique ont permis d’acquérir les principales connaissances de la structure cellulaire, qu’illustrent les photographies au cours de ce chapitre. La structure cellulaire et ces techniques de microscopie seront approfondies dans le chapitre 4.

m n2.1 Les structures cellulaires et virales Toutes les cellules ont de nombreux points communs et présentent de nombreux éléments ou fonctions identiques. Elles possèdent toutes une barrière, appelée membrane cytoplasmique (voir figure 2.1), séparant le milieu intracellulaire du milieu extracellulaire. C’est à travers la membrane cytoplasmique que les nutriments et autres composés nécessaires à son fonctionnement pénètrent la cellule, et que les déchets et les autres produits cellulaires vont en sortir. À l’intérieur de la cellule se trouve le cytoplasme, un mélange complexe de substances et de structures cellulaires, délimité par la membrane cytoplasmique. Ces différents éléments intracellulaires,

mètres physiques ou chimiques tels que la température ou le pH. Génome (genome) Ensemble des gènes contenus dans une cellule ou un virus. Morphologie (morphology) Forme de la bactérie : bacille, sphérique (coque), spirille et autres. Noyau (nucleus) Structure entourée d’une membrane et contenant les chromosomes chez une cellule eucaryote. Nucléoïde (nucleoid) ADN compacté constituant le chromosome d’une cellule de Bacteria ou d’Archaea. Organelle (organelle) Structure membranaire fermée comme les mitochondries ou les chloroplastes présents dans le cytoplasme des cellules eucaryotes. Phototrophe (phototroph) Organisme utilisant la lumière comme source d’énergie. Phylogénie (phylogeny) Étude des relations d’évolution entre les organismes. Plasmide (plasmid) Élément génétique extrachromosomique qui n’est pas essentiel à la croissance. Procaryote (prokaryote) Cellule dépourvue de structures internes délimitées par une membrane comme le noyau ou d’autres organelles. Protéobactérie (Proteobacteria) Phylum bactérien très étendu incluant les bactéries Gram négatif les plus courantes, dont Escherichia coli. Ribosome (ribosome) Particule cytoplasmique composée d’ARN ribosomique et de protéines, dont la fonction est de synthétiser des protéines.

contenus ou dissous dans l’eau, sont responsables du fonctionnement de la cellule. Les principaux composés dissous dans le cytoplasme comprennent des macromolécules (avec en particulier deux classes très importantes : les protéines et les acides nucléiques), de petites molécules organiques (principalement les précurseurs des macromolécules) et divers ions inorganiques. Les ribosomes – responsables de la synthèse protéique – sont des particules en suspension dans le cytoplasme, composées d’acides ribonucléiques (ARN) et de diverses protéines. Au cours d’un processus clé, la synthèse protéique, les ribosomes interagissent avec des protéines cytoplasmiques, des ARN messagers et des ARN de transfert (voir figure 1.4). La paroi cellulaire, localisée à l’extérieur de la membrane cytoplasmique, est relativement perméable et permet de maintenir la structure de la cellule. Cette paroi est d’ailleurs plus rigide que la membrane cytoplasmique. Les cellules végétales et la majorité des micro-organismes ont des parois cellulaires, contrairement à la plupart des cellules animales. Ces dernières possèdent, à la place, dans leur cytoplasme, une structure appelée cytosquelette.

Les cellules eucaryotes L’étude des structures internes des cellules révèle deux types de structures : procaryote et eucaryote (voir figure 2.1). Les cellules eucaryotes sont généralement de taille plus importante et de structure plus complexe que les procaryotes. Les


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2.1 Les structures cellulaires et virales 23

Cytoplasme

Nucléoïde

micro-organismes eucaryotes comprennent les algues, les champignons et les protozoaires (voir figures 2.23 et 2.24). Tous les végétaux et animaux multicellulaires sont composés de cellules eucaryotes (voir chapitre 14 pour une présentation plus détaillée de ces cellules). Une des principales particularités des cellules eucaryotes (absentes des cellules procaryotes) est la présence de structures membranaires appelées organelles qui comprennent avant tout le noyau, mais aussi les mitochondries et les chloroplastes (ces derniers n’étant présents que dans les cellules photosynthétiques) (voir figures 2.1b et 2.2c). Le noyau possède l’information génétique de la cellule (ADN, « le génome ») et se trouve être le siège de la transcription dans les cellules eucaryotes. Les mitochondries et les chloroplastes interviennent de façon spécifique dans la production d’énergie, les premières par la respiration, les secondes par la photosynthèse.

Ribosomes Plasmide

0,5 µm


Paroi cellulaire (a) Membrane cytoplasmique Réticulum endoplasmique Ribosomes Noyau

Les cellules procaryotes

Nucléole

À la différence des cellules eucaryotes, les cellules procaryotes ont une structure interne plus simple dépourvue d’organelles (voir figures 2.1a et 2.2a, b). Les procaryotes sont composés des Bacteria et des Archaea. Bien que les différentes espèces d’Archaea et de Bacteria partagent la même structure cellulaire, l’histoire de leur évolution diffère considérablement. Dans cet ouvrage, le terme bactérie(s) écrit avec un b minuscule est synonyme du terme procaryote. À l’opposé, le terme Bacteria (écrit avec un B majuscule et en italique) fait référence au groupe phylogénétique des procaryotes, distinct de celui des Archaea (voir section 2.3). En général, les cellules microbiennes sont très petites, notamment les cellules procaryotes. Par exemple, un procaryote en forme de bâtonnet a une longueur caractéristique d’environ 1 à 5 µm et une largeur d’environ 1 µm (1 µm correspond à 10-6 mètres), dimensions qui le rendent invisible à l’œil nu. Pour donner une idée de la taille d’une bactérie, on

Appareil de Golgi Cytoplasme Mitochondrie Chloroplaste

10 µm

(b)

FIGURE 2.1 Structure interne des cellules microbiennes. (a) Schéma d’une cellule procaryote. (b) Schéma d’une cellule eucaryote. Remarquez les différences d’échelle et de structure interne.

John Bozzola et M. T. Madigan

Reinhard Rachel et Karl O. Stetter


(a)

(b)

Noyau

Paroi Membrane interne (c)

Mitochondrie

S. F. Conti et T. D. Brock

Enveloppe nucléaire

FIGURE 2.2 Observation en microscopie électronique de coupes de cellules appartenant à chacun des trois domaines du vivant . (a) Heliobacterium modesticaldum (Bacteria) ; dimensions de la cellule : 1 × 3 µm. (b) Methanopyrus kandleri (Archaea) ; dimensions de la cellule : 0,5 × 4 µm. (Reinhard Rachel et Karl O. Stetter, 1981. Archives of Microbiology, 128:288–293. © Springer-Verlag GmbH & Co. KG). (c) Saccharomyces cerevisiae (Eukarya) ; diamètre de la cellule : 8 µm.



24 Chapitre 2


pourrait placer bout à bout 500 bactéries d’une longueur de 1 µm chacune dans le point final de cette phrase. Les cellules eucaryotes se caractérisent par une taille plus importante que les cellules procaryotes, mais elles peuvent varier considérablement en diamètre, de trois à plusieurs centaines de µm (voir chapitre 4).

Contrôlez vos acquis Toutes les cellules microbiennes ont des structures communes, telles que la membrane cytoplasmique, les ribosomes et (généralement) la paroi cellulaire. Deux types de structures cellulaires sont reconnus : les procaryotes et les eucaryotes. Les virus ne sont pas des cellules, mais dépendent des cellules pour leur réplication.

Les virus Les virus ne sont pas des cellules, mais constituent une classe majeure de micro-organismes (voir figure 2.3). Ils sont dépourvus de nombreuses caractéristiques propres aux cellules, et en particulier ne sont pas des systèmes dynamiques, à l’opposé des cellules qui peuvent absorber des nutriments et rejeter des déchets. Au contraire, les particules virales sont des structures stables et statiques incapables de modifier ou de remplacer leurs constituants. C’est seulement au cours de l’infection d’une cellule que le virus acquiert la propriété clé d’un être vivant – la reproduction. À la différence des cellules, les virus n’ont pas de capacités métaboliques intrinsèques. Bien qu’ils possèdent leur propre génome, ils n’ont pas de ribosomes et, de ce fait, ils dépendent totalement du mécanisme cellulaire de synthèse protéique de leur hôte. Les virus infectent tous les types cellulaires, y compris les cellules microbiennes. De nombreux virus provoquent des maladies chez les organismes qu’ils infectent. L’infection virale peut provoquer d’importantes modifications cellulaires, dont l’altération du matériel génétique, allant même jusqu’à augmenter les capacités cellulaires. Les virus sont beaucoup plus petits que les cellules procaryotes (voir figure 2.3), le plus petit étant d’un diamètre de 10 nm (0,010 µm).

•

En observant l’intérieur d’une cellule, comment pourriez-vous définir s’il s’agit d’une cellule eucaryote ou procaryote ?

•

Quelle fonction importante les ribosomes remplissent-ils dans une cellule ?

•

Quelle est la longueur caractéristique d’une bactérie en forme de bâtonnet ? Comparez votre propre taille à celle d’une seule cellule ?

de l’ADN m n2.2 L’organisation dans les cellules microbiennes Les différents processus permettant à une cellule de vivre sont régis par l’ensemble de ses gènes (le génome). Le gène d’une cellule peut être défini comme un segment d’ADN codant une protéine (via un ARN messager) ou d’autres molécules telles que l’ARN ribosomique ou l’ARN de transfert. Au chapitre 15, nous aborderons les progrès réalisés par les techniques de

Cellule eucaryote

Virus

Erskine Caldwell

Cellule procaryote

(a)

D. Kaiser

Noyau

(b)

1000 nm (1 µm)

(c)

FIGURE 2.3 Structure des virus et taille comparées des virus et des cellules. (a) Particules de rhabdovirus (virus d’eucaryotes). Le diamètre d’une particule virale est d’environ 65 nm (0,065 µm). (b) Virus de bactérie (bactériophage) lambda. Le diamètre de la tête de chaque particule virale est de 65 nm. (c) Taille des virus présentés en (a) et (b) en comparaison d’une cellule bactérienne et d’une cellule eucaryote.



2.2 L’organisation de l’ADN dans les cellules microbiennes 25

séquençage et d’analyse des génomes. Ces avancées ont permis de réaliser des cartes génétiques de centaines d’organismes et d’établir des comparaisons significatives et novatrices. Seule l’organisation des génomes dans les cellules procaryotes et eucaryotes sera abordée dans le présent chapitre.

Le noyau ou nucléoïde

E. Kellenberger

L’organisation des génomes des cellules procaryotes et eucaryotes est différente. Dans une cellule procaryote, l’ADN se trouve sous la forme d’une grande molécule double brin appelée chromosome bactérien. Le chromosome est compacté sous une forme visible appelée nucléoïde (voir figure 2.4). Dans le chapitre 7, nous verrons que l’ADN est circulaire dans la plupart des procaryotes. La majorité d’entre eux n’a qu’un unique chromosome. Et, par conséquent, les procaryotes n’ont qu’une copie unique de chaque gène et sont donc haploïdes. Plusieurs possèdent aussi de petites quantités

(a)

d’ADN circulaire extra-chromosomique, appelées plasmides. Ces plasmides possèdent généralement des gènes conférant à la cellule procaryote des propriétés spécifiques (telles que des propriétés métaboliques). À la différence, les gènes essentiels à la survie (gènes « de ménage ») sont localisés sur le chromosome. L’ADN eucaryote est présent dans le noyau sous forme de molécules linéaires compactées et organisées en chromosomes. Le nombre de chromosomes varie selon les organismes. Par exemple, la levure de boulanger, Saccharomyces cerevisiae, possède 16 chromosomes organisés en 8 paires, alors que les cellules humaines en contiennent 46 (23 paires). Néanmoins, les chromosomes eucaryotes ne sont pas seulement composés d’ADN, ils possèdent aussi des protéines permettant l’enroulement et la compaction de l’ADN, ainsi que d’autres protéines nécessaires à l’expression génétique. Il existe une différence génétique majeure entre les procaryotes et les eucaryotes : ces derniers ont généralement deux copies de chaque gène et sont donc diploïdes. Au cours de la division des cellules eucaryotes, le noyau se divise (après le doublement du nombre de chromosomes) lors d’un processus appelé mitose (voir figure 2.5). Il en résulte deux cellules filles identiques, possédant chacune un noyau avec une copie du génome. Le génome diploïde des cellules eucaryotes, dédoublé au cours du processus de méiose, forme des gamètes haploïdes pour la reproduction sexuée. La fusion de deux gamètes au cours de la formation du zygote rétablit l’état diploïde de la cellule (voir chapitre 14, pour l’approfondissement de ces processus).

Les gènes, les génomes et les protéines

(b) FIGURE 2.4 Le nucléoïde. (a) Observation au microscope optique de cellules d’Escherichia coli traitées de manière à rendre le nucléoïde visible. La longueur d’une cellule est d’environ 3 µm. (b) Observation au microscope électronique d’un nucléoïde isolé d’une cellule d’E. coli. La cellule a été délicatement lysée pour permettre au nucléoïde fortement compacté d’apparaître intact. Les flèches montrent les bords des brins d’ADN.

Le Ma, Harvard Medical School

B. Arnold-Schulz-Gahmen

Combien de gènes et de protéines une cellule contient-elle ? Le génome d’Escherichia coli, bactérie très commune, se présente sous la forme d’un chromosome circulaire de 4,68 millions de

FIGURE 2.5 Image au microscope de la mitose d’une cellule de rat-kangourou marquée par fluorescence. La cellule a été photographiée au cours de la métaphase de la division mitotique. La couleur verte distingue la tubuline, une protéine impliquée dans la séparation des chromosomes (voir section 14.5). Les chromosomes sont colorés en bleu par un intercalant fluorescent de l’ADN. Bien qu’essentielle dans le cycle cellulaire eucaryote, la mitose ne se produit pas chez les cellules procaryotes.



26 Chapitre 2


paires de bases d’ADN. Grâce au séquençage complet du génome d’E. coli, nous savons qu’il contient environ 4 300 gènes. Certains génomes bactériens possèdent jusqu’à trois fois ce nombre de gènes, alors que d’autres peuvent n’en posséder que moins d’un huitième. Les cellules eucaryotes possèdent, en général, un génome de taille plus importante que les cellules procaryotes. Par exemple, une cellule humaine possède 1 000 fois plus d’ADN qu’une cellule d’E. coli et 7 fois plus de gènes (nous verrons par la suite que l’ADN des cellules eucaryotes est majoritairement composé d’ADN non codant). Une seule cellule d’E. coli contient environ 1 900 classes différentes de protéines pour un nombre total d’environ 2,4 millions de protéines (voir tableau 3.2). La quantité de chaque protéine chez E. coli peut considérablement varier, certaines n’étant présentes qu’à quelques copies. E. coli possède ainsi des mécanismes contrôlant l’expression de ses gènes afin qu’ils s’expriment (transcription et traduction, voir figure 1.4) en des proportions et à des temps différents. Ce phénomène est observé couramment chez toutes les cellules eucaryotes et procaryotes et sera détaillé lors de l’étude des principaux mécanismes de l’expression génétique, au chapitre 8.

Contrôlez vos acquis Les gènes régissent les propriétés de la cellule et l’ensemble de ces gènes est appelé génome. L’ADN est organisé dans les cellules sous forme de chromosome. En général, les procaryotes ne possèdent qu’un chromosome circulaire unique, alors que les eucaryotes possèdent plusieurs chromosomes linéaires.

c’est pourquoi les ARN ribosomiques ont été utilisés pour construire l’arbre phylogénétique universel de tous les organismes vivants (voir figure 2.7). Carl Woese, microbiologiste américain, a été le premier à faire usage de l’ARN ribosomique en phylogénie. La figure 2.6 décrit les étapes de la construction d’un arbre phylogénétique à partir d’ARN. En résumé, l’alignement des séquences codantes pour l’ARN ribosomique, obtenues par le séquençage d’un ou plusieurs organismes, est analysé avec un outil informatique. Plus la différence des séquences de l’ARN ribosomique entre deux ou plusieurs organismes est importante, plus leur distance évolutive est grande. Ces distances sont ensuite transcrites sous la forme d’un arbre phylogénétique (voir figure 2.6).

Les trois domaines de la vie La comparaison des ARN ribosomiques a permis de mettre en évidence trois domaines phylogénétiquement distincts qui sont les Bacteria, les Archaea et les Eukarya (eucaryotes) (voir figure 2.7). Les deux premières lignées sont constituées uniquement de cellules procaryotes, tandis que la troisième contient exclusivement des eucaryotes. Les trois domaines pourraient avoir divergé d’un ancêtre commun ou d’une communauté d’organismes au début de l’apparition de la vie sur la Terre (voir section 11.7). Outre le fait de montrer que tous les procaryotes ne sont pas étroitement apparentés, l’arbre universel du vivant établit un autre fait important de l’évolution : les Archaea sont phylogénétiquement plus proches des Eukarya que des Bacteria (voir figure 2.7). Ainsi l’arbre universel du vivant aurait divergé de l’ancêtre commun dans deux directions : une à l’origine des Bacteria et une deuxième, probablement, à l’origine des Archaea et des Eukarya.

•

Quelles sont les différences entre le noyau et le nucléoïde ?

•

En quoi les plasmides diffèrent-ils des chromosomes ?

Eukarya

•

Pourquoi est-il cohérent que les cellules humaines aient plus de gènes que les cellules bactériennes ?

Étant donné que les cellules animales et végétales sont eucaryotes, il en résulte que les micro-organismes eucaryotes sont les ancêtres des organismes pluricellulaires. L’étude de l’arbre universel du vivant le confirme : les micro-organismes eucaryotes divergent de la branche commune des eucaryotes avant les plantes et les animaux de la couronne des pluricellulaires (voir figure 2.7). Néanmoins, des résultats de séquençages ainsi que d’autres indices ont permis d’établir que les cellules eucaryotes possèdent des gènes issus de cellules des deux autres domaines. En plus du génome contenu dans le noyau des cellules eucaryotes, les mitochondries et les chloroplastes des eucaryotes possèdent leur propre génome (ADN circulaire comme chez les Bacteria) et leurs ribosomes. Ainsi, l’analyse de l’ARN ribosomique (voir figure 2.6) de ces organelles a montré qu’elles divergeaient d’ancêtres appartenant au domaine des Bacteria (voir figure 2.7). Les mitochondries et les chloroplastes étaient donc, par le passé, des cellules libres qui, pour des raisons de protection ou d’autres raisons, se sont établies de manière stable dans des cellules d’Eukarya. Ce processus de stabilisation est appelé endosymbiose et sera abordé au cours des prochains chapitres (voir sections 11.3 et 14.4).

m n2.3 L’arbre universel du vivant L’évolution est le processus ayant mené à l’apparition et à la transformation de nouvelles espèces. La structure cellulaire en est-elle un facteur déterminant ? La réponse est mitigée. L’étude de la formation et de l’évolution des organismes vivants se nomme la phylogénie. D’un côté, toutes les cellules procaryotes et eucaryotes connues sont phylogénétiquement distinctes ; de l’autre, toutes les cellules procaryotes n’ont pas entre elles de relations évolutives proches ; Bacteria et Archaea sont phylogénétiquement distinctes. La comparaison de la séquence de certaines macromolécules permet d’établir des liens de parenté phylogénétique. Pour des raisons qui seront abordées au chapitre 11, les macromolécules constituant le ribosome, en particulier les ARN ribosomiques, sont d’excellents marqueurs phylogénétiques. Or, toutes les cellules contiennent des ribosomes,



2.3 L’arbre universel du vivant

27

ADN

Gène codant l’ARN ribosomique

Cellules

Extraction d’ADN (a)

Séquençage de l’ADN A

G

C

T

Analyse des séquences

PCR

(b)

Alignement des séquences du gène codant l’ARNr

(c)

AG T CGC T AG 1 A T T CCG T A G 2 AGCCG T T AG 3

(d)

3

1

Calcul de l’arbre phylogénétique (e)

2

FIGURE 2.6 Séquençage et phylogénie du gène de l’ARN ribosomique (ARNr) . (a) L’ADN est extrait de cellules issues d’une culture pure ou d’échantillons environnementaux. (b) Le gène codant l’ARNr est spécifiquement amplifié par la technique d’amplification en chaîne par polymérisation (PCR) ; voir section 7.9. (c) Le gène est séquencé (voir section 10.13). (d) Les séquences obtenues sont alignées par un logiciel informatique. Un algorithme permettant d’identifier les différences effectue une comparaison par paire des séquences d’ARNr des micro-organismes étudiés, afin de calculer un arbre phylogénétique (e). L’exemple représenté illustre les différences suivantes : trois différences entre l’organisme 1 et 2 ; deux différences entre le 1 et le 3 ; quatre différences entre le 2 et le 3. Les organismes 1 et 3 ont un degré de similitude supérieur à celui existant entre les séquences des organismes 2 et 3, et 1 et 2. Si l’étude porte sur un échantillon environnemental, les séquences d’ARNr amplifiées doivent être préalablement isolées par clonage avant le séquençage. Pour plus de détails sur ces méthodes, voir les sections 11.5 et 18.5.

Les contributions du séquençage à la microbiologie La phylogénie moléculaire a permis de révéler les relations évolutives entre toutes les cellules. Les différents développements technologiques ont contribué à formaliser le cadre d’étude des différentes disciplines de la microbiologie, en particulier la classification et l’écologie microbiennes, de même que le diagnostic clinique. Ainsi, la phylogénie moléculaire a aidé à affiner la notion d’espèce bactérienne, rendant possible l’identification d’organismes sans avoir à les cultiver (voir chapitres 11, 18 et 24).

Contrôlez vos acquis Le séquençage et l’analyse comparative des ARN ribosomiques ont permis de définir les trois domaines de la vie : Bacteria, Archaea et Eukarya. Le séquençage moléculaire a aussi montré que les principales organelles des Eukarya proviennent des Bacteria et a fourni de nouveaux outils à l’écologie microbienne et à la microbiologie clinique. •

Comment différencier les Bacteria des Archaea ? En quoi sont-elles similaires ?

•

Quels sont les indices moléculaires soutenant la théorie de l’endosymbiose ?

FIGURE 2.7 L’arbre phylogénétique universel YOTES PROCAR du vivant défini à partir des comparaisons de séquences du ARCHAEA gène d’ARNr. L’arbre se Méthanogènes « Couronne » compose de trois domaines des pluricellulaires d’organismes : les Halophiles extrêmes Hyperthermophiles Bacteria et les Archaea, BACTERIA qui sont des cellules EUKARYA Bactéries procaryotes, et les Gram positif Protéobactéries Eukarya (eucaryotes). Moisissures Animaux Mitochondries Seuls quelques glaireuses groupes Champignons d’organismes de Plantes chaque domaine sont Cyanobactéries représentés. Des Flagellés Chloroplastes arbres phylogénétiques Giardia plus détaillés de chaque ES domaine sont représentés Racine YOT EUCAR Hyperthermophiles dans les figures 2.9, 2.18 et de l’arbre 2.22, ainsi qu’aux chapitres 11 à 14. Les hyperthermophiles sont des prokaryotes dont la température optimale de croissance est de 80 °C ou plus. Les groupes colorés en rouge sont des macro-organismes. Tous les autres organismes de l’arbre phylogénétique du vivant sont des micro-organismes.



28 Chapitre 2

II


DIVERSITÉ MICROBIENNE

L’évolution a façonné toute la vie sur la Terre. La diversité microbienne actuelle est la résultante de l’évolution sur presque quatre milliards d’années. Cette diversité peut être étudiée sous des angles multiples : variations de la taille des cellules, de la morphologie (forme de la cellule), des stratégies métaboliques (physiologie), de la mobilité, des mécanismes de division cellulaire, de pathogénicité, de la biologie du développement, de l’adaptation aux environnements extrêmes et de bien d’autres aspects de la biologie cellulaire. De fait, la diversité microbienne est immense. Chaque année, de nouvelles découvertes démontrent les stratégies ingénieuses des micro-organismes. Nous donnons dans les sections suivantes un aperçu de la diversité microbienne (pour plus de détails, voir chapitres 12 à 15), précédé par une introduction à la diversité métabolique (voir aussi chapitres 5, 6 et 19), les deux domaines étant étroitement liés. Les micro-organismes ont exploité toutes les possibilités concevables pour « faire de la matière vivante » en accord avec les lois de la physique et de la chimie. Cette importante capacité métabolique a rendu possible la colonisation de nombreux habitats par les micro-organismes, stimulant ainsi leur évolution et leur diversification.

de la physiologie m n2.4 Ladesdiversité micro-organismes Toutes les cellules ont besoin de produire de l’énergie et de la conserver. Toutes requièrent aussi des mécanismes génétiques autorisant la réplication et permettant l’adaptation à leurs différents environnements. Les sources d’énergie sont d’une importance primordiale pour les cellules, car les processus vitaux consomment beaucoup d’énergie. Trois stratégies s’offrent pour puiser l’énergie de la nature : à partir des composés organiques, des composés inorganiques ou de la lumière (voir figure 2.8).

Les chimio-organotrophes Des milliers de composés organiques existant sur la Terre peuvent être utilisés par un micro-organisme ou un autre. Tous les composés organiques naturels et la plupart des composés organiques synthétiques peuvent être métabolisés par un ou plusieurs micro-organismes. L’énergie est obtenue par oxydation d’un de ces composés (perte de ses électrons) et accumulée dans la cellule sous la forme d’un composé riche en énergie, l’adénosine triphosphate (ATP) (voir figure 2.8). Certains micro-organismes peuvent extraire l’énergie d’un composé seulement en présence d’oxygène ; ces organismes sont qualifiés d’aérobies. Au contraire, d’autres micro-organismes ne peuvent extraire leur énergie qu’en absence d’oxygène (anaérobie). Néanmoins, certains d’entre eux sont indifférents à la présence ou l’absence d’oxygène. Les organismes puisant leur énergie à partir de composés organiques sont appelés chimio-organotrophes (voir figure 2.8) et représentent la majeure partie des micro-organismes cultivés.

Substances chimiques

Chimiotrophie Composés organiques

Composés inorganiques

(glucose, acétate, etc.)

Chimio-organotrophes (glucose + O2

Phototrophie

(H2, H2S, Fe2+, NH4+, etc.)

Chimiolithotrophes Phototrophes

CO2 + H2O) (H2 + O2

ATP

H2O) (lumière

ATP)

ATP

FIGURE 2.8 Différentes options métaboliques pour l’obtention d’énergie. Les substances chimiques indiquées dans la figure ne constituent qu’une petite partie des composés utilisés par les organismes chimiotrophes. Ces derniers produisent de l’ATP par oxydation des composés organiques ou inorganiques, tandis que les phototrophes convertissent l’énergie solaire en énergie chimique, également sous forme d’ATP.

Les chimiolithotrophes De nombreux procaryotes peuvent utiliser l’énergie disponible dans les composés inorganiques. Il s’agit là d’une forme de métabolisme appelée chimiolithotrophie (découverte par Winogradsky – voir section 1.7), qui est employée par des chimiolithotrophes (voir figure 2.8). Cette forme de métabolisme producteur d’énergie n’est présente que chez les procaryotes et est prévalente chez les Archaea et les Bacteria. L’éventail des composés inorganiques utilisés est très large, mais, en règle générale, un procaryote spécifique se spécialise dans l’utilisation d’un groupe de composés inorganiques ou de sa famille. La raison pour laquelle la capacité d’extraire de l’énergie de composés inorganiques s’impose comme une évidence est qu’elle évite la concurrence avec les chimio-organotrophes. De plus, de nombreux composés inorganiques oxydés, tels que le H2 et le H2S, sont des déchets de ces chimio-organotrophes. Ainsi, les chimiolithotrophes ont élaboré des stratégies évoluées pour exploiter des ressources que d’autres organismes sont incapables d’utiliser.

Les phototrophes Les micro-organismes phototrophes possèdent un pigment qui leur permet d’utiliser la lumière comme source d’énergie, ce qui explique par ailleurs leur coloration cellulaire (voir figure 2.10a). À la différence des organismes chimiotrophes, les phototrophes ne requièrent pas de composés chimiques comme source d’énergie, l’ATP étant produit à partir de l’énergie solaire. Cela constitue un avantage important, car il



2.4 La diversité de la physiologie des micro-organismes 29

exclut toutes compétitions pour l’énergie avec les chimiotrophes, la lumière étant disponible dans un grand nombre d’habitats microbiens. Il existe deux types de phototrophies chez les procaryotes. L’une est appelée photosynthèse oxygénique et produit de l’O2. La photosynthèse oxygénique est caractéristique des cyanobactéries et des micro-organismes phylogénétiquement affiliés. L’autre forme, appelée photosynthèse anoxygénique, intervient chez les bactéries vertes et pourpres et ne conduit pas à la production d’O2. Néanmoins, ces deux groupes de phototrophes utilisent la lumière pour produire de l’ATP, et leurs mécanismes de synthèse sont remarquablement similaires. En effet, les principes de base de la photosynthèse oxygénique ont évolué à partir des procédés anoxygéniques, moins complexes (voir chapitre 17).

Les hétérotrophes et les autotrophes Toutes les cellules nécessitent du carbone comme nutriment principal. Les cellules microbiennes sont soit hétérotrophes, nécessitant un ou plusieurs composés organiques comme source de carbone, soit autotrophes, leur source de carbone étant le CO2. Les chimio-organotrophes sont aussi des hétérotrophes. À l’opposé, de nombreux chimiolithotrophes et pratiquement tous les phototrophes sont autotrophes. Les autotrophes sont parfois appelés producteurs primaires, parce qu’ils synthétisent de la matière organique à partir du CO2, à la fois pour leur propre bénéfice et celui des chimioorganotrophes. Ces derniers se nourrissent directement des producteurs primaires ou à partir des produits qu’ils

TABLEAU 2.1 Condition extrême

excrètent. Toute la matière organique de la Terre a été synthétisée par des producteurs primaires, principalement des organismes phototrophes.

Les habitats et les environnements extrêmes Les micro-organismes sont présents partout où règne la vie. Cela inclut des habitats tels que le sol, l’eau, les animaux et les plantes, mais aussi toutes les structures fabriquées par l’homme. En effet, la stérilité (absence de forme de vie) au sein d’un échantillon environnemental est extrêmement rare. Certains de ces environnements microbiens peuvent s’avérer trop extrêmes pour l’espèce humaine. Bien qu’ils soient des défis à la survie des micro-organismes, dans bien des cas les environnements extrêmes regorgent de vie microbienne. Les procaryotes habitant de tels environnements sont appelés extrémophiles, un groupe remarquable constitué essentiellement de procaryotes qui définissent collectivement les limites physico-chimiques de la vie. Les extrémophiles abondent dans des environnements aussi rigoureux que les sources chaudes, la glace des lacs gelés, les glaciers, les océans polaires, les milieux hypersalins, alcalins ou acides (pH inférieur à 0 et aussi élevé que 12). Ces procaryotes ne sont pas seulement tolérants à ces conditions extrêmes, mais celles-ci sont requises pour leur croissance, ce qui explique l’appellation extrémophiles (le suffixe « –phile » signifiant « aimer »). Le tableau 2.1 résume les valeurs extrêmes de certains paramètres pour des procaryotes extrémophiles et liste leurs habitats. Nous reverrons plusieurs de ces espèces aux chapitres 6, 12 et 13.

CLASSE ET EXEMPLES D'EXTRÊMOPHILESa

Terme descriptif

Genres/espèces

Domaine

Élevée

Hyperthermophile

Pyrolobus fumarii

Archaea

Basse

Psychrophile

Polaromonas vacuolata

Faible

Acidophile

Élevé

Habitat

Minimum

Optimum

Maximum

Source chaude hydrothermale marine

90 ˚C

106 ˚C

113 ˚Cb

Bacteria

Mer de glace

0 ˚C

4˚C

12 ˚C

Picrophilus oshimaec

Archaea

Sources chaudes acides

– 0,06

0,7c

4

Alcalophile

Natronobacterium gregoryid

Archaea

Lacs salés

8,5

10d

12

Pression

Barophile

Moritella yayanosiie

Bacteria

Sédiments marins profonds

500 atm

700 atm

>1000atm

Salinité (NaCl)

Halophile

Halobacterium salinarum

Archaea

Milieux salés

15 %

25 %

32 % (saturation)

Température

pH

a

Chaque organisme présenté est le « détenteur du record » pour ces conditions extrêmes de croissance. Archaea récemment isolée serait capable de croissance jusqu’à 121 °C. c P. oshimae est aussi thermopile, capable de croître à 60 °C. d N. gregoryi est aussi un halophile extrême, ayant un optimal de croissance avec 20 % NaCl. e Moritella yayanosii est aussi psychrophile, ayant un optimal de croissance à 4 °C. b



30 Chapitre 2


Contrôlez vos acquis Toutes les cellules requièrent des sources de carbone et d’énergie. Les termes chimio-organotrophe, chimiolithotrophe et phototrophe désignent respectivement les cellules utilisant des composés organiques, des composés inorganiques ou de la lumière comme source d’énergie. Les organismes autotrophes utilisent du CO2 comme source de carbone, alors que les hétérotrophes utilisent du carbone organique. Les extrémophiles sont abondants dans des environnements où certains organismes plus évolués ne pourraient pas survivre. •

•

Comment différencier, par observation microscopique, un micro-organisme phototrophe d’un microorganisme chimiotrophe ? Qu’est ce qu’un extrémophile ?

m n2.5 La diversité des procaryotes Le groupe des procaryotes se scinde en deux domaines distincts, les Archaea et les Bacteria (voir figure 2.7). La plupart des procaryotes que connaît l’étudiant débutant en microbiologie appartiennent au domaine des Bacteria. Nous commencerons donc par celles-ci.

Les Bacteria Le domaine des Bacteria est extrêmement diversifié, comportant tous les procaryotes pathogènes connus à ce jour, ainsi que des centaines d’autres espèces non pathogènes. De plus, ce domaine présente une grande variété de morphologies et de physiologies. Les protéobactéries sont le groupe (phylum) le plus important des bactéries (voir figure 2.9). Chez les protéobactéries se retrouvent un grand nombre de chimio-organotrophes, tel qu’Escherichia coli, organisme modèle en physiologie, biochimie et biologie moléculaire. Plusieurs phototrophes (voir figure 2.10a) et chimiolithotrophes (voir figure 2.10b) sont aussi des protéobactéries. De nombreux chimiolithotrophes utilisent le sulfure d’hydrogène (H2S, odeur d’œuf pourri) dans leur métabolisme, conduisant à la production de soufre élémentaire stocké à l’intérieur ou en périphérie de la cellule (voir figure 2.10b). Le soufre est un produit d’oxydation du H2S et peut à son tour être oxydé en sulfate (SO42-). Le sulfure (S2-) et le soufre sont oxydés pour permettre la réalisation d’importantes réactions métaboliques, telles que la fixation de CO2 (autotrophie) ou la production d’énergie (voir figure 2.8). De nombreux autres procaryotes communs du sol, de l’eau, des plantes, des animaux, ainsi que des espèces pathogènes (Salmonella, Rickettsia, Neisseria et bien d’autres encore), sont des protéobactéries. Celles-ci incluent les espèces de Pseudomonas qui, pour beaucoup d’entre elles, sont capables de dégrader des complexes organiques naturels ou synthétiques, et d’Azobacter, capables de fixer l’azote. Certaines bactéries peuvent être distinguées par l’utilisation de la coloration de Gram, technique qui permet de distinguer

Spirochètes Deinococcus Bactéries vertes non sulfureuses


Planctomyces Cyanobactéries

Thermotoga Env-OP2

Bactéries gram positif

Aquifex Protéobactéries

FIGURE 2.9 Arbre phylogénétique détaillé des Bacteria. Cet arbre phylogénétique ne représente pas tous les groupes connus de Bacteria. La dimension de chaque rectangle de couleur est proportionnelle au nombre relatif de genres et d’espèces connus par groupes. Les protéobactéries constituent à ce jour le groupe le plus représenté chez les Bacteria. Le groupe dit « Env » (environnemental) n’est pas représentatif d’une espèce cultivée mais de séquences de gènes de l’ARNr obtenues d’un organisme issu d’un échantillon environnemental (voir le texte). Dans cet exemple, l’affiliation la plus proche du groupe Env-OP2 est Aquifex. Bien qu’absents sur cet arbre phylogénétique, de nombreux autres groupes de séquences environnementales existent.

les cellules Gram positif des cellules Gram négatif (voir chapitre 4). Les Gram positif se distinguent par une parenté phylogénétique et des propriétés de paroi communes. On retrouve ainsi Bacillus, une bactérie formant des endospores (découverte par Ferdinand Cohn – voir section 1.5 et figure 2.11a), Chlostridium, et d’autres bactéries sporulantes telles que Streptomyces, capable de produire des antibiotiques. On trouve également des bactéries lactiques telles que Lactobacillus et Streptococcus (voir figure 2.11b), qui sont fréquemment identifiées dans les produits laitiers, les plantes et la matière en décomposition. Les mycoplasmes sont aussi apparentés aux Gram positif : ces procaryotes n’ont pas de paroi cellulaire et contiennent de très petits génomes. Les Mycoplasma sont souvent des pathogènes et constituent un genre important au sein de ce groupe, présentant un intérêt médical de premier ordre (voir section 12.21 et figure 12.62). Les cyanobactéries (voir figure 2.12), phototrophes oxygéniques, sont phylogénétiquement apparentées aux bactéries Gram positif (voir figure 2.9). Elles ont joué un rôle crucial dans l’évolution de la vie sur la Terre, pour avoir été les premiers phototrophes oxygéniques (voir figure 1.1b). La production d’O2 à la surface terrestre, qui était alors anoxique, a ouvert la voie à l’évolution des procaryotes qui, eux, étaient capables de respirer de l’oxygène. Le développement « d’organismes supérieurs », tels que les végétaux et les animaux, suivit des milliards d’années plus tard, dans un environnement enrichi en oxygène. De nombreuses espèces de bactéries ont des morphologies uniques. Ces espèces incluent le groupe aquatique des Planctomyces, qui se caractérisent par des cellules comportant un pédoncule leur permettant de se fixer à un substrat solide (voir figure 2.13).



D. E. Caldwell

Hans-Dietrich Babenzien

2.5 La diversité des procaryotes 31

(a)

(b)

FIGURE 2.10 Protéobactéries phototrophes et chimiolithotrophes. (a) Observation au microscope d’une communauté microbienne où des bactéries phototrophes sulfureuses pourpres, Chromatium, sont identifiables grâce à leur grande taille, leur couleur rouge et leur forme de bacille. Une cellule a un diamètre d’environ 10 µm. (b) Achromatium est une bactérie chimiolithotrophe soufre-oxydante de grande taille. Le diamètre d’une cellule mesure environ 20 µm. Des globules de soufre élémentaire sont visibles à l’intérieur des cellules (indiqués par des flèches). Ces deux micro-organismes sont capables d’oxyder le sulfure d’hydrogène (H 2S) produit par des bactéries sulfato-réductrices. Les bactéries sulfato-réductrices sont des chimio-organotrophes capables de coupler l’oxydation de composés organiques ou de H2 à la réduction du sulfate (SO42–) en H2S, complétant ainsi le cycle du soufre (voir section 19.13).

R. W. Castenholz

Elles incluent aussi les spirochètes, bactéries de forme hélicoïdale responsables de nombreuses maladies, notamment la syphilis et la maladie de Lyme (voir sections 26.12 et 27.4). Deux autres groupes de Bacteria sont phototrophes : les bactéries vertes sulfureuses (groupe des Chlorobium) et les bactéries vertes non sulfureuses (groupe des Chloroflexus) (voir figure 2.15). Ces espèces contiennent toutes deux des pigments photosynthétiques similaires et sont capables d’autotrophie. Chloroflexus est un procaryote filamenteux retrouvé au niveau des sources chaudes, ainsi que des baies marines peu profondes, et représente souvent l’organisme majoritaire des

R. W. Castenholz

(a)

T. D. Brock

Tiffany Full et M. T. Madigan

(a)

(b)

FIGURE 2.11 Bactéries Gram positif. (a) Bacillus, une bactérie sporulante en forme de bâtonnet, se présentant ici sous l’aspect de cellules en chaînettes. Remarquez la présence d’endospores (structures réfringentes) à l’intérieur des cellules. Les endospores sont extrêmement résistantes aux agents chimiques, à la chaleur et aux radiations. (b) Streptococcus est une bactérie de forme sphérique (coque), formant des chaînettes. Les streptocoques se retrouvent dans les produits laitiers et certaines souches sont potentiellement pathogènes.

(b) FIGURE 2.12 Cyanobactéries filamenteuses. (a) Oscillatoria, (b) Spirulina. Les cyanobactéries sont responsables de l’apparition de l’oxygène sur Terre. Elles sont aussi connues sous forme unicellulaire, coloniale et hétérocystée. Cette dernière forme est capable de fixer l’azote grâce à des structures nommées hétérocystes (voir sections 12.25 et 17.28).




James T. Staley

32 Chapitre 2

FIGURE 2.14 Spirochètes. Une cellule de Spirochaeta zuelzerae. Ces procaryotes à la morphologie particulière sont phylogénétiquement distincts (voir figure 2.9). Les spirochètes sont très ubiquistes et certains sont responsables d’affections telles que la syphilis et la maladie de Lyme.

d’irradiation importants, Deinococcus radiodurans (voir figure 2.16) étant la principale espèce de ce groupe. Cet organisme est capable de survivre à des doses de radiation largement supérieures à celles suffisantes pour tuer un animal, grâce à des mécanismes de réparation de son génome. Ce micro-organisme surprenant sera étudié plus en détail à la section 12.34. Enfin, quelques groupes des Bacteria divergent à la base de l’arbre universel du vivant (voir figure 2.9). Malgré le fait qu’ils soient phylogénétiquement distincts, ces groupes ont la capacité de croître à des températures élevées (hyperthermophilie). Ainsi, des organismes tels que Aquifex (voir figure 2.17) et Thermotoga sont capables de se développer dans de l’eau

(a)

M. T. Madigan

Norbert Pfennig

tapis bactériens. Chloroflexus est aussi remarquable car il est soupçonné d’être un chaînon important dans l’évolution de la photosynthèse (sections 12.35 et 17.7). Le genre Chlamydia (voir figure 2.9), dont la plupart des espèces, hébergées chez l’homme, sont des pathogènes transmissibles par voies sexuelles et respiratoires (voir sections 12.27 et 26.13). Les Chlamydia sont des parasites intracellulaires obligatoires, ce qui signifie qu’elles vivent à l’intérieur de cellules d’organismes évolués, et dans ce cas de cellules humaines. Il existe plusieurs autres pathogènes procaryotes intracellulaires, tels que Rickettsia (membre des protéobactéries qui provoque des maladies telles que le typhus et la fièvre pourprée des Montagnes Rocheuses) et Mycobacterium tuberculosis (bactérie Gram positif responsable de la tuberculose). La localisation intracellulaire de ces pathogènes leur permet entre autres de se protéger du système immunitaire de leur hôte. Un autre groupe majeur de bactéries, Deinococcus (voir figure 2.9), est composé de bactéries présentant des parois cellulaires inhabituelles et qui sont capables de résister à des taux

John Breznak

FIGURE 2.13 Morphologie atypique de la bactérie pédonculée Planctomyces. De nombreuses bactéries groupées en forme de rosette sont reliées par leur pédoncule.

(b)

FIGURE 2.15 Bactéries vertes phototrophes. (a) Chlorobium (bactéries vertes sulfureuses) ; la largeur d’une cellule est d’environ 0,8 µm. (b) Chloroflexus (bactéries vertes non sulfureuses) ; la largeur d’un filament est d’environ 1,3 µm. Phylogénétiquement assez éloignés (voir figure 2.9), ces micro-organismes se caractérisent par des pigments et des structures membranaires similaires (voir section 17.2).



2.5 La diversité des procaryotes 33

Env-marine

Crenarchaeota Env-marine

Halobacterium Natronobacterium

Méthanogènes halophiles

Michael J. Daly

Methanosarcina Thermoplasma

proche de son point d’ébullition (sources hydrothermales). Le caractère précoce de la bifurcation de ces groupes (voir figures 2.7 et 2.9) conforte l’idée qu’à l’origine la température à la surface de la Terre était bien plus élevée qu’aujourd’hui (voir section 11.1). Les organismes primitifs étaient donc probablement des hyperthermophiles. C’est ce que montrent les arbres phylogénétiques des Bacteria et des Archaea (voir figures 2.9 et 2.18). Des micro-organismes tels qu’Aquifex, Methanopyrus et Pyrolobus pourraient donc être considérés comme les descendants de très anciennes lignées cellulaires.

Les Archaea


Le domaine des Archaea (voir figure 2.18) se divise en deux : les Euryarchaeota et les Crenarchaeota. Chacune de ces divisions représente une branche majeure de l’arbre des Archaea (voir figure 2.18). De nombreux Archaea sont des extrémophiles, dont certaines espèces sont capables de croître à des températures et des pH extrêmes (voir tableau 2.1). Par exemple, Pyrolobus (voir figures 2.18 et 2.19) est le procaryote le plus thermophile connu (voir tableau 2.1). Toutes les Archaea sont chimiotrophes, bien qu’Halobacterium puisse utiliser la lumière pour synthétiser de l’ATP, mais d’une manière différente des autres organismes phototrophes.

FIGURE 2.17 Aquifex. Ces espèces hyperthermophiles ont une température optimale de croissance supérieure à 80 ˚C et sont positionnées, sur l’arbre universel du vivant, à la base de la branche des Bacteria (voir figure 2.9).

Sulfolobus

Methanobacterium Methanocaldococcus

Pyrococcus Thermoproteus Pyrolobus Methanopyrus

Desulfurococcus

FIGURE 2.18 Arbre phylogénétique détaillé du domaine des Archaea. Tous les groupes d’Archaea décrits ne sont pas représentés sur cet arbre. Il existe des sous-groupes d’Archaea, les Euryarchaeota et les Crenarchaeota. Les hyperthermophiles, des organismes capables de croître à très haute température, sont délimités par une ligne en pointillé rouge. Les méthanogènes, les halophiles extrêmes et les acidophiles extrêmes sont représentés en rose. Chaque groupe comporte des lignées environnementales spécifiques (Env-marine), qui sont pour la plupart des espèces marines (voir figure 2.9). Il y a un nombre équivalent d’espèces dans les deux sous-groupes d’Archaea, mais le nombre total d’Archaea cultivées est bien inférieur à celui des Bacteria.

Certaines Archaea utilisent des composés organiques dans leur métabolisme énergétique. Néanmoins, la plupart sont chimiolithotrophes, leur principale source d’énergie étant l’hydrogène (H2) (voir figure 2.8). Les Euryarchaeota (voir figure 2.8) se subdivisent en trois groupes d’organismes ayant des physiologies distinctes. Certaines espèces ont besoin d’oxygène (O2), alors qu’il est létal


FIGURE 2.16 Deinococcus radiodurans : une bactérie fortement radiorésistante. Cette bactérie résiste à des niveaux de radiation bien supérieurs à ceux susceptibles de tuer un homme. Voir section 12.34 pour l’étude de ses étonnantes propriétés de radiorésistance.

Euryarchaeota

FIGURE 2.19 Pyrolobus. Une Archaea hyperthermophile dont la température optimale de croissance est supérieure à celle du point d’ébullition de l’eau (100 ˚C) !




William D. Grant

pour d’autres ; d’autres espèces sont capables de croître à des niveaux extrêmes de pH (voir tableau 2.1). Les méthanogènes tels que Methanobacterium sont des anaérobies strictes. Leur métabolisme est unique en ce sens qu’ils puisent leur énergie en produisant un composé riche en énergie, le méthane (gaz naturel). Le rôle joué par les méthanogènes est essentiel pour la dégradation de la matière organique de la nature (voir sections 13.4, 17.7 et 19.10). Ainsi, pratiquement tout le gaz naturel sur la Terre est issu de leur métabolisme. Les halophiles extrêmes sont phylogénétiquement proches des méthanogènes (voir figure 2.18), mais physiologiquement distincts. À la différence des méthanogènes qui sont tués en présence d’oxygène, les halophiles extrêmes requièrent de l’oxygène et sont caractérisés par leurs besoins élevés en sels (NaCl) nécessaires à leur métabolisme et leur reproduction. C’est pourquoi ces micro-organismes sont appelés halophiles (« qui aiment le sel »). D’ailleurs, des micro-organismes tels qu’Halobacterium sont si halophiles qu’ils sont capables de croître sur et à l’intérieur des cristaux de sel (voir figure 2.20). Comme nous l’avons mentionné précédemment, de nombreux procaryotes sont phototrophes et peuvent produire de l’ATP grâce à la lumière. Bien que les espèces d’Halobacterium ne produisent pas de chlorophylle comme de vrais phototrophes, ils sont tout de même pourvus d’une classe de pigments capables d’absorber la lumière et de synthétiser de l’ATP (section 13.3). Les halophiles extrêmes se retrouvent dans les lacs salés, les marais salants et bien d’autres environnements très salés. Certains d’entre eux, tels que Natronobacterium, sont présents dans des lacs de soude, milieu caractérisé par une importante concentration en sel et un pH élevé. Ces micro-organismes alcalophiles, sont capables de croître à des pH supérieurs à ceux de tous les autres organismes (voir tableau 2.1). Un dernier groupe d’Archaea est constitué par les thermoacidophiles, tels que Thermoplasma (voir figure 2.21). Ces procaryotes ont une membrane cytoplasmique, mais sont dépourvus de paroi cellulaire (semblables à cet égard au Mycoplasma) ; ils ont une faculté de croissance optimale à des températures élevées et à des pH extrêmement faibles. Ce groupe comprend Picrophilus, le plus acidophile de tous les procaryotes connus (voir tableau 2.1).

FIGURE 2.20 Archaea halophile extrême. Flacon de saumure ayant atteint le point de précipitation du NaCl et contenant l’espèce halophile extrême, Halobacterium. Les pigments contenus dans ce microorganisme absorbent la lumière et permettent ainsi la production d’ATP. Des cellules de Halobacterium peuvent aussi survivre dans des cristaux de sel (voir Focus, chapitre 4, Combien de temps une endospore peutelle survivre ?).

T. D. Brock

34 Chapitre 2

FIGURE 2.21 Procaryotes acidophiles extrêmes. Thermoplasma, phylogénétiquement proche de Picrophilus, est une Archaea dépourvue de paroi et capable de croître à des températures relativement élevées et des pH extrêmement faibles (voir tableau 2.1). Malgré son appartenance au domaine des Bacteria, le genre Mycoplasma compte des espèces sans paroi. Les procaryotes n’ayant pas de paroi sont présentés dans les sections 12.21 et 13.5.

Analyses phylogénétiques de communautés microbiennes Tous les Archaea ne sont pas des extrémophiles. La plupart de ces Archaea ont déjoué jusqu’à présent toute tentative de culture en laboratoire, ce qui limite nos connaissances sur leurs fonctions dans leur environnement. Il en est de même pour les espèces non cultivées de Bacteria. Comme ils ne sont pas cultivés, comment pouvons-nous connaître l’existence de ces micro-organismes ? Nous le savons parce qu’il est possible d’extraire l’ARN ribosomique de cellules contenues dans des échantillons environnementaux tels que le sol. La présence d’ARN ribosomique dans un échantillon révèle ainsi la présence des micro-organismes qui l’ont synthétisé. Après l’extraction et le séquençage des ARN ribosomiques d’un échantillon, il est possible d’établir un arbre phylogénétique comme lors d’une étude de la diversité microbienne à partir de cultures (voir figures 2.9 et 2.18). L’utilisation de ces outils moléculaires pour l’étude en écologie microbienne, initialement mis au point par le microbiologiste américain Norman Pace, a permis de constater que la diversité des procaryotes était beaucoup plus grande que celle envisagée auparavant. L’étude, par cette approche, de pratiquement n’importe quel habitat révèle que la majorité des micro-organismes n’a jamais été cultivée. Le défi est maintenant de recueillir suffisamment d’indices sur ces micro-organismes non cultivés pour mettre au point de nouvelles techniques afin de pouvoir les cultiver. L’analyse génomique d’Archaea et de Bacteria non cultivés (génomique environnementale, voir section 18.6) permet d’identifier les gènes de ces organismes et de révéler leurs capacités métaboliques. Ainsi, la connaissance du modèle métabolique contribuera à la conception de nouveaux outils d’isolation de ces micro-organismes.



2.6 Les micro-organismes eucaryotes 35

Contrôlez vos acquis Plusieurs groupes phylogénétiques sont présents dans les domaines des Archaea et des Bacteria, ainsi qu’une grande diversité de morphologies cellulaires et de physiologies. Les analyses d’ARN ribosomiques extraits d’échantillons environnementaux ont révélé de nombreux groupes phylogénétiques distincts, mais à ce jour non cultivés. •

Quelles espèces appartenant aux protéobactéries résident majoritairement dans notre intestin ?

•

Pourquoi peut-on dire que les cyanobactéries ont initié des conditions favorables au développement de formes de vie supérieures à la surface de la Terre ?

•

En quoi le genre Halobacterium est-il particulier ?

•

Comment peut-on identifier la présence d’un type de procaryote dans un échantillon environnemental sans utiliser l’approche culturale ?

m n2.6 Les micro-organismes eucaryotes Les principales caractéristiques unissant les micro-organismes eucaryotes sont une organisation cellulaire distincte (voir figure 2.1) et leur relation phylogénétique (voir figure 2.7). L’étude du domaine des Eukarya (voir figure 2.22) montre que le groupe d’organismes ayant le plus divergé (les animaux et les végétaux) se situe à l’extrémité de la branche principale de l’arbre. Il est intéressant de constater que les groupes phylogénétiques positionnés à la base de la branche du domaine des Eukarya sont des eucaryotes de structure simple, dépourvus de mitochondries et d’autres organelles majeurs. Ainsi, les Giardia, de l’ordre des diplomonadines (figure 2.22) sont probablement les descendants de cellules primitives qui n’ont pas subi d’endosymbiose ou qui ont perdu leur symbiote (voir sections 2.3, 11.3 et 14.4). La plupart de ces eucaryotes positionnés à la base de l’arbre du vivant sont des parasites de l’homme et d’animaux, ils sont incapables de survivre indépendamment.

La diversité microbienne des eucaryotes Tout comme les procaryotes, il existe une très grande diversité d’eucaryotes. Ces micro-organismes sont communément appelés protistes. Certains d’entre eux, tels que les algues (voir figure 2.23a), sont phototrophes. En effet, ces algues contiennent des organites riches en chlorophylle appelés chloroplastes et peuvent vivre dans des environnements pauvres composés de seulement quelques minéraux (par exemple K, P, Mg, N, S), d’eau, de CO2 et de lumière. Les algues sont présentes dans des habitats terrestres et aquatiques, et sont les principaux producteurs primaires. Les mycètes (voir figure 2.23b) sont soit unicellulaires (levure), soit filamenteux (moisissures), et ne possèdent pas de pigments photosynthétiques. Ces champignons sont d’ailleurs les principaux agents

Flagellés Parabasaliens Diplomonadines

Moisissures glaireuses Ciliés

Animaux

Algues vertes Plantes Algues rouges Champignons Diatomées Algues brunes Embranchements précoces, absence de mitochondries FIGURE 2.22 Arbre phylogénétique détaillé du domaine des Eukarya. Tous les groupes d’Eukarya décrits ne sont pas représentés sur cet arbre. Certains embranchements précoces d’espèces d’Eukarya ne possèdent pas d’organelle autre que le noyau. Remarquez combien les organismes les plus évolués (les végétaux et les animaux) sont proches du sommet de l’arbre.

de biodégradation de la nature et recyclent la majorité de la matière organique des sols et d’autres écosystèmes. Les cellules des algues et des champignons possèdent des parois cellulaires alors que les protozoaires (voir figure 2.23c) n’en ont pas. La plupart des protozoaires sont mobiles et certaines espèces sont ubiquistes (habitat aquatique, pathogène humain et animal). Différents protozoaires sont répartis sur l’arbre des Eukarya. Certaines espèces telles que les flagellés se retrouvent à la base de l’arbre, alors que d’autres espèces cilliées, telles que Paramecium (voir figure 2.23), se retrouvent dans les branches supérieures (voir figure 2.22). Les myxomycètes ressemblent à des protozoaires du fait qu’ils sont mobiles et n’ont pas de paroi cellulaire, mais ils en diffèrent phylogénétiquement et par leur cycle biologique. Durant ce cycle, les cellules mobiles s’agrègent pour former des fructifications à partir desquelles sont produites les spores qui donneront naissance à de nouvelles cellules (voir section 14.11). Les myxomycètes sont les premiers protistes à former des coopérations cellulaires pour créer des structures microscopiques. Les lichens sont des structures foliacées colonisant majoritairement les rochers, les arbres et autres surfaces (voir figure 2.24). Ils sont un exemple de mutualisme microbien, association à bénéfice réciproque entre les différents partenaires. Les lichens sont composés d’un champignon qui sert de support et de protection, et d’un partenaire phototrophique (producteur primaire) qui est soit une algue (eucaryote) soit une cyanobactérie (procaryote). Le lichen est ainsi un « organisme » dynamique qui a développé une stratégie d’interactions mutualistes entre deux micro-organismes très différents.

Remarques finales Les différents thèmes abordés au cours de ce chapitre ne sont qu’une vue d’ensemble de la diversité microbienne. Il s’agit d’un sujet très vaste qui sera donc poursuivi aux chapitres 12 à 15. C’est volontairement qu’il n’a pas été fait mention ici



(a)

(c) FIGURE 2.23 Micro-organismes du domaine des Eukarya. (a) Algue ; l’algue verte de structure coloniale Volvox (voir section 14.13). Chaque cellule sphérique contient de nombreux chloroplastes, l’organelle spécifique des eucaryotes phototrophes. (b) Champignons ; structures sporulantes typiques d’une moisissure. Chaque spore peut générer de nouveaux filaments mycéliens (voir section 14.12). (c) Protozoaires ; le protozoaire cilié Paramecium (voir section 14.10). Les cils agissent comme les rames d’un bateau, permettant la motilité de la cellule.

des virus. Les virus ne sont pas des cellules, mais cependant ils requièrent celles-ci pour leur réplication (voir section 2.1). Les cellules de tous les domaines du vivant possèdent des parasites viraux ; nous traiterons de la diversité virale aux chapitres 9 et 16. Avant d’aborder plus en détail la diversité microbienne, il sera nécessaire d’étudier les particularités moléculaires des cellules, et en particulier celles des procaryotes, tout en découvrant l’extraordinaire diversité des composés chimiques constituant les organismes vivants, conséquence directe de plus de quatre milliards d’années d’évolution.

M. T. Madigan

(b)

Sydney Tamm

(a)

M. T. Madigan

Barry Katz, Mycosearch


Dennis Kunkel

36 Chapitre 2

(b) FIGURE 2.24 Lichens. (a) Un lichen de couleur orange sur un rocher. (b) Un lichen de couleur jaune sur une souche d’arbre mort, parc national de Yellowstone, États-Unis. La couleur du lichen provient d’une algue pigmentée présente dans la structure du lichen. Outre de la chlorophylle, ces algues peuvent contenir des pigments caroténoïdes (voir section 17.3), de couleur jaune, orange, brune, rouge, verte ou violette.

Contrôlez vos acquis La diversité des micro-organismes eucaryotes est composée des algues, des protozoaires, des mycètes et des myxomycètes. Les associations mutualistes d’algues et de mycètes sont appelées lichens. •

Citez au moins deux caractères permettant de différencier les algues des cyanobactéries.

•

Citez au moins deux caractères permettant de différencier les algues des protozoaires.

•

Exposez les bénéfices mutuels de chaque partenaire du lichen.



Questions 37

QUESTIONS 1. Pourquoi la cellule a-t-elle besoin d’une membrane cytoplasmique (voir section 2.1) ? 2. Quels sont les domaines de la vie possédant une structure cellulaire de type procaryote ? Une telle cellule peut-elle permettre d’étudier les relations évolutives (voir section 2.1) ? 3. En quoi les virus ressemblent-ils aux cellules ? Et en quoi en diffèrent-ils (voir section 2.1) ? 4. Quelle est la signification du terme génome ? En quoi l’organisation du génome des procaryotes est-elle différente de celle des eucaryotes (voir section 2.2) ? 5. Pourquoi les processus de mitose et de méiose ont-ils lieu dans les cellules eucaryotes (voir section 2.2) ? 6. Combien de gènes un organisme tel qu’Escherichia coli comptet-il ? Comparez ce nombre à celui d’une cellule humaine (voir section 2.2). 7. Énoncez la théorie de l’endosymbiose (voir section 2.3).

8. De nombreuses macromolécules présentes chez les Archaea montrent une analogie avec leurs homologues présentes chez les eucaryotes plus importante qu’avec leurs homologues des Bacteria. Expliquez pourquoi (voir section 2.3). 9. Quelles sont les différences, du point de vue de leur métabolisme énergétique, entre les chimio-organotrophes et les chimiolitotrophes ? Quelles sont leurs différentes sources de carbone ? Sont-elles alors hétérotrophes ou autotrophes (voir section 2.4) ? 10. Quelle est la particularité du micro-organisme Pyrolobus (voir section 2.5) ? 11. Quels sont les points communs et les différences entre ces trois microorganismes : Pyrolobus, Halobacterium et Thermoplasma (voir section 2.5) ? 12. Examinez la figure 2.18 et donnez la signification de « Envmarine » (voir section 2.5). 13. Quelles sont les différences structurelles et phylogéniques entre Giardia et une cellule humaine (voir section 2.6) ?

PROBLÈMES 1. Les cellules procaryotes possédant des plasmides peuvent souvent être débarrassées de ceux-ci (de façon définitive) sans effets dommageables, alors que la suppression du chromosome cellulaire serait létale. Expliquez cela. 2. Il a été dit que les connaissances sur l’évolution des macro-organismes ont précédé celles des micro-organismes. Pensez-vous qu’il serait plus facile de reconstruire l’évolution des équidés plutôt que celle des procaryotes ? 3. Examinez l’arbre phylogénétique de la figure 2.6. En utilisant les données présentées, expliquez pourquoi l’arbre serait incorrect si ses branches conservaient des longueurs

identiques mais que la position des organismes 2 et 3 était inversée ? 4. Les microbiologistes ont cultivé une importante diversité de micro-organismes, mais sont conscients qu’il en existe une diversité encore plus abondante, même s’ils n’ont jamais pu les observer ou les cultiver en laboratoire. Expliquez. 5. Quelles données de ce chapitre pourriez-vous utiliser pour convaincre un ami que les extrémophiles ne sont pas uniquement des organismes dont la présence dans leurs habitats respectifs est fortuite ? 6. Argumentez ce point de vue : si les cyanobactéries n’avaient jamais évolué, la vie sur la Terre serait restée seulement de type microbien.





CHAPITRE TROIS

Macromolécules

I

Liaisons chimiques et eau dans les systèmes vivants

3.1

Les liaisons chimiques de faible et de forte énergie Les principales macromolécules et l’eau, solvant biologique

3.2

40 40 43

II

Macromolécules non informationnelles 44

3.3 3.4

Les polysaccharides Les lipides

44 46

III

Macromolécules informationnelles

47

3.5 3.6 3.7 3.8

Les acides nucléiques Les acides aminés et la liaison peptidique Les protéines : structures primaire et secondaire Les structures protéiques d’ordre supérieur et la dénaturation

47 48 51 52

La structure des protéines, groupe clé de macromolécules, détermine leur fonction.



40 Chapitre 3

Macromolécules

GLOSSAIRE Acide nucléique (nucleic acid) ADN ou ARN. Apolaire (nonpolar) Possédant des propriétés hydrophobes (repoussant l’eau) et peu soluble dans l’eau. Dénaturation (denaturation) Destruction de la structure tridimensionnelle d’une protéine conduisant à la perte de son activité biologique. Énantiomères (enantiomer) Molécules de même formule chimique, image l’une de l’autre dans un miroir. Isomères (isomers) Deux molécules ayant la même formule chimique mais différant par leur structure. Liaison covalente (covalent bond) Liaison chimique dans laquelle les électrons se répartissent entre deux atomes. Liaison glycosidique (glycosidic bond) Liaison covalente reliant les sucres d’un polysaccharide. Liaison hydrogène (hydrogen bond) Liaison chimique de faible énergie entre un atome d’hydrogène et un atome plus électronégatif, généralement un oxygène ou un azote. Liaison peptidique (peptide bond) Liaison covalente reliant les acides aminés d’un polypeptide. Liaison phosphodiester (phosphodiester bond) Liaison covalente reliant les nucléotides d’un polynucléotide. Lipide (lipid) Glycérol lié par une liaison ester ou éther à des acides gras ou à d’autres molécules hydrophobes. Contient souvent d’autres groupements (par exemple un groupement phosphate). Macromolécule (macromolecule) Polymère constitué d’unités monomériques reliées par des liaisons covalentes. Molécule (molecule) Au moins deux atomes liés chimiquement.

I

LIAISONS CHIMIQUES ET EAU DANS LES SYSTÈMES VIVANTS

On ne peut comprendre le fonctionnement cellulaire sans acquérir au préalable la connaissance des biomolécules et des processus chimiques qui se produisent dans la cellule. Les molécules, et en particulier les macromolécules (polysaccharides, lipides, acides nucléiques et protéines), sont les « briques » de la cellule.

liaisons chimiques de faible m n3.1 Les et de forte énergie L’hydrogène, l’oxygène, le carbone, l’azote, le phosphore et le soufre sont les principaux éléments chimiques du monde vivant. Ces éléments se combinent de différentes manières dans les biomolécules. Une molécule résulte de l’union d’au moins deux atomes par des liaisons chimiques. Ainsi, deux atomes d’oxygène (O) peuvent s’assembler pour former une molécule d’oxygène (O2) ; le glucose C6H12O6 est un sucre formé par la combinaison de carbone (C), d’hydrogène (H) et d’oxygène (O). Les atomes peuvent s’unir au moyen de liaisons de forte énergie, dans lesquelles des électrons sont mis en commun. Ce sont les liaisons covalentes. Considérons par exemple la

Nucléoside (nucleoside) Nucléotide dépourvu de groupement phosphate. Nucléotide (nucleotide) Monomère d’acide nucléique contenant une base azotée (adénine, guanine, cytosine, thymine ou uracile), un groupement phosphate et un sucre, le ribose (dans l’ARN) ou le désoxyribose (dans l’ADN). Polaire (polar) Possédant des propriétés hydrophiles et généralement soluble dans l’eau. Polymère (polymer) Composé chimique formé par polymérisation d’unités répétitives appelées monomères. Polynucléotide (polynucleotide) Polymère de nucléotides reliés par des liaisons phosphodiester. Polypeptide (polypeptide) Polymère d’acides aminés reliés par des liaisons peptidiques. Polysaccharide (polysaccharide) Polymère d’unités glucidiques reliées par des liaisons glycosidiques. Protéine (protein) Polypeptide ou groupe de polypeptides formant une molécule possédant une fonction biologique spécifique. Structure primaire (primary structure) Description de la séquence de monomères dans une macromolécule informative, comme un polypeptide. Structure quaternaire (quaternary structure) Assemblage de plusieurs chaînes polypeptidiques identiques ou ne formant pas une protéine. Structure secondaire (secondary structure) Repliement dans l’espace d’un polypeptide ou d’un polynucléotide généralement imposé par la formation de liaisons hydrogène. Structure tertiaire (tertiary structure) Structure tridimensionnelle d’un polypeptide préalablement replié en structure secondaire.

formation d’une molécule d’eau à partir de ses éléments de base, O et H : O + 2H

HOH

L’oxygène compte six électrons dans sa couche externe et l’hydrogène, un seul. Quand ces deux atomes se combinent pour former H2O, les liaisons covalentes maintiennent fortement les trois atomes. Selon les molécules, des liaisons covalentes doubles et même triples peuvent se former (voir figure 3.1). Les possibilités d’association de ces éléments chimiques du vivant sont nombreuses, formant des unités simples appelées monomères. Les macromolécules sont des polymères formés par l’assemblage de monomères. Parmi les milliers de monomères connus dans les quatre catégories de macromolécules, seul un petit nombre d’entre eux revêt une importance biologique. Ce sont les propriétés chimiques des monomères qui déterminent, dans une large mesure, la structure et les fonctions spécifiques des macromolécules.

Les liaisons hydrogène D’autres types de liaisons chimiques, de faible énergie, jouent également un rôle important dans les macromolécules. Parmi celles-ci figure la liaison hydrogène. La liaison hydrogène (voir figure 3.2) résulte du partage d’un atome



3.1 Les liaisons chimiques de faible et de forte énergie

C

C

H

Acétylène

Éthylène Éthylène, composé organique possédant une double liaison

Acétylène, composé organique possédant une triple liaison

C

O (CO2)

N

N (N2)

–

O P

O- (PO43-)

O-

Dioxyde de carbone

Azote

O H H H

O

H

O H

H

O O

H

O

O

H

NH2

C C

H

H

N

N C N

H O

C C C O

N H

Cytosine

O

H

H NH2

Cytosine (base azotée de l’ADN et de L’ARN)

O C R4 C H

C O

H N

N H

O C

Guanine N

H N

N

H

N H N

O

H

H

Liaison peptidique des protéines

N

N

OH

H N

(b) Acides aminés dans une chaîne protéique

(a) Eau

Phosphate

R3 C H

C O N H H C R2

O

H

H

Quelques composés inorganiques possédant une double ou une triple liaison H O

H C R1

H

H

H

H

C H

H

H

H C

H

H

H

O

C

O

C

H

H

H

H C C H H H

41

H

Phénylalanine (acide aminé dans les protéines)

Composés organiques possédant une double liaison FIGURE 3.1 Exemples de molécules contenant des liaisons covalentes doubles ou triples. Les configurations électroniques de l’acétylène et de l’éthylène sont représentées à côté de la formule chimique.

d’hydrogène entre deux autres atomes, comme l’oxygène et l’azote. Une liaison hydrogène est une liaison de faible énergie. Les molécules d’eau forment spontanément des liaisons hydrogène (voir figure 3.2a) qui contribuent à la polarité de l’eau. Contrairement à l’atome d’hydrogène, l’atome d’oxygène est plutôt électronégatif (attirant les électrons). Dans une liaison covalente entre un atome d’oxygène et un atome d’hydrogène, les électrons se partagent inégalement ; la densité des électrons est plus élevée autour de l’atome d’oxygène. La charge négative des électrons entraîne un déséquilibre dans la répartition des charges, l’oxygène portant une charge négative partielle et l’hydrogène portant une charge positive partielle (voir figure 3.2a). Du fait de leur polarité, les molécules d’eau ont tendance à s’associer et à repousser les molécules apolaires (hydrophobes). Les molécules d’eau s’orientent spontanément en solution ; en raison de la différence des charges, un atome d’hydrogène d’une molécule d’eau est attiré par les deux atomes d’oxygène d’une autre molécule d’eau, et une liaison hydrogène se forme. On trouve également des liaisons hydrogène dans les macromolécules (voir figure 3.2b et c). Les multiples liaisons hydrogène dans une macromolécule ou entre des molécules différentes augmentent considérablement la stabilité de la macromolécule ou du complexe moléculaire, jouant un rôle déterminant dans le maintien de leur structure tridimensionnelle.

CH3

Thymine

H N

O N H

N H

N

N

O

Adénine N

N

H

Liaisons hydrogène

(c) Bases azotées dans l’ADN FIGURE 3.2 Liaison hydrogène. Dans les acides nucléiques, la liaison hydrogène est souvent figurée par des traits plutôt que par des points : deux traits entre les paires adénine/thymine et trois traits entre les paires guanine/cytosine (voir figure 3.11). Dans (b), R représente la chaîne latérale de chaque acide aminé (voir figure 3.12).

Les autres liaisons faibles D’autres types de liaisons ou d’interactions faibles peuvent se former dans les biomolécules ; les forces de van der Waals sont des forces d’attraction qui s’opèrent entre deux atomes distants de 3-4 angströms (Å). Ces liaisons sont impliquées dans la fixation des substrats aux enzymes (voir section 5.5) et dans les interactions entre protéines et acides nucléiques. Les liaisons ioniques, qui, par exemple, se forment entre Na+ et Cl– dans NaCl, sont des interactions électrostatiques de faible énergie, responsables de l’ionisation des solutions aqueuses. Beaucoup des biomolécules importantes, comme les acides carboxyliques et les phosphates (voir tableau 3.1), sont ionisées aux pH physiologiques (généralement pH 6-8) et peuvent donc se trouver sous forme dissoute en grande quantité dans le cytoplasme. Les interactions hydrophobes se produisent parce que les molécules apolaires ou les régions apolaires des biomolécules ont tendance à se rassembler dans un environnement polaire. Elles jouent un rôle déterminant dans le repliement des protéines, ainsi que dans la formation des complexes enzyme-substrat (voir section 5.5). Enfin, le



42 Chapitre 3

TABLEAU 3.1

Macromolécules

QUELQUES GROUPEMENTS FONCTIONNELS IMPORTANTS RENCONTRÉS PARMI LES BIOMOLÉCULES Structurea

Nom

Catégories de molécules, métabolisme

Acide carboxylique

O || — C — OH

Acides organiques, acides aminés et acides gras ; lipides ; protéines

Aldéhyde

O || —C— H

Groupe fonctionnel de sucres réducteurs comme le glucose ; polysaccharides

H | — C — OH | H

Alcool

O || —C—

Céto

Ester

Phosphoester

Thioester

Éther

Anhydride d’acide

Phosphoanhydride

a

H O | || — C —O — C — | H O– | | –O — P — O — C — || | O O || —C ~S — H H | | — C —O — C — | | H H O O– || | — C ~O — P — —O | O– O– O– || | –O — P ~ O — P — O– || || O O

Lipides ; hydrates de carbone

Pyruvate, intermédiaires du cycle de l’acide citrique

Lipides des Bacteria et des Eukarya ; liaison des acides aminés aux ARNt

Acides nucléiques ADN et ARN

Métabolisme énergétique ; biosynthèse des acides gras

Lipides des Archaea ; sphingolipides

Métabolisme énergétique, par exemple l’acétyl phosphate

Métabolisme énergétique, par exemple l’ATP

Un ~ signifie liaison « riche en énergie » (voir section 5.8).

contrôle de l’association de sous-unités protéiques en un multimère biologiquement actif et la stabilité de l’ARN dépendent souvent d’interactions hydrophobes.

Les groupements fonctionnels des biomolécules La majorité des macromolécules des systèmes vivants contiennent des atomes de carbone, qui se lient entre eux et à de nombreux autres éléments pour former de grandes structures extrêmement diverses et complexes. Dans les différents composés organiques (contenant du carbone), il existe un grand nombre de liaisons possibles. Chaque groupe fonctionnel possède des propriétés chimiques caractéristiques qui déterminent leur rôle biologique. Le tableau 3.1 présente quelques types courants de groupes fonctionnels et les catégories de molécules et de macromolécules concernées.

Contrôlez vos acquis Les liaisons covalentes sont des liaisons de forte énergie qui relient les différents éléments des macromolécules. Les liaisons de faible énergie, comme la liaison hydrogène, les forces de van der Waals et les interactions hydrophobes jouent également un rôle déterminant dans la structure macromoléculaire ; cependant, les interactions mises en œuvre entre les atomes sont plus ténues. Un certain nombre de groupes fonctionnels carbonés sont communs aux biomolécules. •

Pourquoi les liaisons covalentes sont-elles plus fortes que les liaisons hydrogène ?

•

Quel est le rôle d’une liaison hydrogène dans la structure d’une macromolécule ?



3.2 Les principales macromolécules et l’eau, solvant biologique 43

m n

3.2 Les principales macromolécules et l’eau, solvant biologique

L’analyse chimique de la cellule d’un procaryote, Escherichia coli, bactérie fréquente dans le tube digestif de l’homme, indique que l’eau est le composant prépondérant des cellules, mais que celles-ci sont également riches en macromolécules. Les cellules contiennent en outre des quantités beaucoup plus faibles de monomères et de divers ions inorganiques (voir tableau 3.2). Les macromolécules constituent environ 95 % du poids sec de la cellule, les protéines étant de loin, en poids, la catégorie la plus représentée (voir tableau 3.2). Les protéines sont des polymères d’acides aminés. Certaines sont des éléments structuraux, tandis que d’autres exercent une fonction catalytique (enzymatique) (voir figure 3.3). En moyenne, une cellule contient plusieurs milliers de protéines différentes (voir tableau 3.2). Les acides nucléiques sont des polymères formés de nucléotides. On les trouve dans les cellules sous deux formes, l’ARN

TABLEAU 3.2

Nombre total de macromolécules

Pourcentage en poids secb

Nombre de molécules par cellule (différents types)

96

24 610 000

Protéines

55

2 350 000

Polysaccharides

5

4 300 (2)c

Lipides

9,1

22 000 000 (4)d

Lipopolysaccharides

3,4

1 430 000 (1)

ADN

3,1

2,1 (1)

ARN

20,5

255 500

Nombre total de monomères

3,0

—e (~350)

Acides aminés et précurseurs

0,5

— (~100)

Sucres et précurseurs

Ions inorganiques Total a

Flagelle


Paroi cellulaire Cytoplasme

COMPOSITION CHIMIQUE a D’UNE CELLULE PROCARYOTE

Molécule

Nucléotides et précurseurs

et l’ADN. Les acides ribonucléiques (ARN) sont les macromolécules les plus abondantes, après les protéines, dans les cellules en phase de croissance (voir tableau 3.2 et figure 3.3b). Dans de telles cellules, des milliers de ribosomes, composés d’ARN et de protéines, synthétisent continuellement de nouvelles protéines. D’autres types d’ARN, les ARN messagers et les ARN de transfert, présents en très petite quantité, jouent également un rôle essentiel dans la synthèse protéique. Contrairement à l’ARN, l’ADN représente une fraction négligeable (en poids) de la cellule bactérienne (voir tableau 3.2). En revanche, il joue un rôle primordial dans les systèmes biologiques, car il porte l’information génétique. Les lipides sont des molécules à la fois hydrophobes et hydrophiles. Ce sont des constituants importants des membranes ; ils

2 0,5 1 100 %

(a) Protéines

Nucléoïde

Ribosomes

(b) Acides nucléiques : ADN ARN

(c) Polysaccharides

Granules de réserve

—(~50) — (~200) —(~18) —

Données de Neidhardt, F.C., et al. (éd.), 1996. Escherichia coli and Salmonella typhimurium—Cellular and Molecular Biology, deuxième édition. American Society for Microbiology, Washington, DC. b Poids sec d’une cellule de E. coli en phase de croissance = 2,8 x 10–13 g ; poids total (70 % d’eau) = 9,5 x 10–13 g. c À condition que le peptidoglycane et le glycogène soient les principaux polysaccharides présents. d Il y a plusieurs classes de phospholipides, chacune d’elles existant sous différentes formes en raison de la variabilité interspécifique de la composition en acides gras et des différentes conditions de croissance. e Les estimations exactes de la composition en monomères et en ions inorganiques manquent.

(d) Lipides FIGURE 3.3 Localisation des macromolécules dans la cellule. (a) Les protéines (en brun), éléments de structure et enzymes, sont réparties dans toute la cellule. Le flagelle est une structure impliquée dans la motilité. (b) Les acides nucléiques. L’ADN (en vert) se trouve dans le nucléoïde des cellules de procaryotes et dans le noyau des cellules d’eucaryotes. L’ARN (en orange) se situe dans le cytoplasme (ARNm, ARNt) et dans les ribosomes (ARNr). (c) Les polysaccharides (en jaune) sont localisés dans la paroi cellulaire et occasionnellement dans des granules internes de réserve. (d) Les lipides (en bleu) entrent dans la constitution de la membrane cytoplasmique, de la paroi cellulaire et des granules de réserve.



44 Chapitre 3

Macromolécules

assurent également des fonctions de réserve de carbone et d’énergie (voir figure 3.3d). Les polysaccharides sont des polymères de sucres. Ce sont les principaux constituants de la paroi des cellules procaryotes. Certains, comme le glycogène, servent de réservoir de carbone et d’énergie (voir figure 3.3.c).

Un solvant biologique, l’eau Toutes les molécules et les macromolécules intracellulaires se trouvent en solution dans l’eau, qui constitue un excellent solvant biologique. Elle est nécessaire à la vie telle que nous la connaissons. L’eau développe deux propriétés particulièrement importantes, étant une molécule polaire et fortement cohésive. De nombreuses biomolécules sont également polaires (voir tableau 3.2) et donc solubles dans l’eau. Des substances dissoutes, nutriments nécessaires à la construction de nouveaux constituants ou déchets du métabolisme (voir chapitre 4), traversent continuellement la membrane cytoplasmique des cellules dans les deux sens (voir sections 4.6 et 4.7). La polarité de l’eau permet aussi l’agrégation de grosses molécules, par création de liaisons hydrogène. Les molécules d’eau forment, entre elles et dans les macromolécules, un réseau tridimensionnel (voir tableau 3.2a). Elles contribuent à la formation de réseaux d’interactions entre atomes. La polarité de l’eau pousse également les composés apolaires à se regrouper. Les membranes, par exemple, sont constituées majoritairement de lipides, molécules en grande partie apolaires. Ces lipides forment des agrégats imperméables aux substances polaires. L’eau est fortement cohésive. Ses molécules ont une forte affinité entre elles. L’eau liquide a une structure partiellement ordonnée, dans laquelle les liaisons hydrogène se forment et se rompent constamment (voir figure 3.2). L’omniprésence des liaisons hydrogène explique en partie sa tension superficielle et sa chaleur spécifique (quantité de chaleur requise pour augmenter la température de 1 ˚C) élevées. Ainsi, l’eau se dilate pendant la formation de glace. Dans un lac, par exemple, la glace, moins dense que l’eau, forme une couche isolante en surface qui protège les organismes aquatiques d’un refroidissement fatal. La vie est apparue en milieu aqueux il y a près de quatre milliards d’années ; sur la Terre, là où il y a de l’eau sous forme liquide, on peut trouver des microorganismes.

II

MACROMOLÉCULES NON INFORMATIONNELLES

Les polysaccharides et les lipides ne portent pas d’information génétique ; ces macromolécules jouent un rôle important dans la cellule, notamment comme éléments de structure et de réserve.

m n3.3 Les polysaccharides Les hydrates de carbone (sucres) sont des composés organiques contenant du carbone, de l’hydrogène et de l’oxygène dans les proportions 1 ; 2 ; 1. La formule chimique du sucre le plus commun, le glucose, est C6H12O6 (voir figure 3.4). Les principaux hydrates de carbone contiennent 4, 5, 6 ou 7 atomes de carbone (ce sont les sucres en C4, C5, C6 et C7). Les sucres à cinq carbones (pentoses) sont particulièrement importants, car ils forment le squelette des acides nucléiques. De la même façon, les sucres en C6 (hexoses) sont les constituants de base des polymères des parois cellulaires et des polymères de réserve. La figure 3.4 présente la structure de quelques sucres communs. Chaîne ouverte

Sucre

1

Pentoses H C H

Ribose

H H

Pourquoi les protéines et l’ARN constituent-ils la majeure partie d’une cellule en croissance ?

•

Pourquoi la forte polarité de l’eau en fait-elle un excellent solvant biologique ?

3

C

4

C

O OH

5

4C

OH

H

OH

Désoxyribose H

1

H

2

H

H

3

OH

H

4

OH

C C C C

O

H

5

O

H

2

OH

3

H

Glucose

C C

HO C H

4

C

5

C

OH

O H

H

OH C2 H H

OH

Source d’énergie ; parois cellulaires

6

HOCH2 5

O

C

H

OH

HO

OH

3C

CH2OH

H

6

OH

H

4C

C

3

HO C H H

4

C

5

C

6

O H OH OH

CH2OH

H

C2 OH

Source d’énergie ; sucre des fruits

CH2OH

2

C1

H

1

Fructose

Squelette de l’ADN

C1

H

3C

CH2OH

1

OH

HOCH2 C

Squelette de l’ARN

C1

C2 H

OH

4

Fonction

OH H

3C

5

Hexoses H

O

HOCH2

CH2OH

Contrôlez vos acquis

•

C

5

H

Les protéines sont les macromolécules les plus abondantes dans les cellules. Les autres macromolécules sont les acides nucléiques (ADN et ARN), les lipides, les polysaccharides et les lipopolysaccharides. L’eau est un excellent solvant pour les organismes vivants en raison de sa polarité et de sa force de cohésion.

2

Formule cyclique

6

HOCH2 C 5

H H C 4 OH

O

OH OH C 2 3C

1CH2OH

H

FIGURE 3.4 Structure de quelques sucres communs. On peut représenter la structure d’un sucre de deux façons, en chaîne ouverte ou sous forme cyclique. La chaîne ouverte est plus simple, mais la formule cyclique est plus communément utilisée. Remarquez le système de numérotation des cycles.



3.3 Les polysaccharides 45

Des dérivés de ces hydrates de carbone sont obtenus par remplacement d’un ou de plusieurs groupements hydroxyles par d’autres groupements. Par exemple, le peptidoglycane, polymère majeur de la paroi cellulaire (voir section 4.8), contient un dérivé du glucose, la N-acétylglucosamine (voir figure 3.5). Les dérivés de sucres qui ont la même formule au niveau chimique peuvent former des stéréoisomères (voir section 3.6). Ainsi, les cellules contiennent une grande variété de sucres disponibles pour la construction de polysaccharides.

La liaison glycosidique

O C H O 1

Groupement acétyle

2

H

4

H

5 6

C OH C OH CH2OH

6

N remplace O dans le sucre

4

HO

H 4

HO

OH 3

H

O H

2OH

5

H OH 3

H

CH2OH

O H

H

H

1

2

O

H OH

H

H

OH

OH

O

OH

H

Liaison glycosidique α-1,4

CH2 H 1

H

H O

2

H OH

H 2

HO

OH

CH2OH

O

H 1

O

H

OH

H

Liaison glycosidique α-1,6

H OH

H

Liaison glycosidique β-1,4

(a)

Amidon Liaisons α-1,4

Liaisons α-1,6

Glycogène

Cellulose

Liaisons α-1,4

Liaisons β-1,4

(b) FIGURE 3.6 Polysaccharides. (a) Structure de différentes liaisons glycosidiques. Remarquez que la position, sur le cycle, des atomes de carbone impliqués dans la liaison et la géométrie (α ou β) de la liaison peuvent varier dans les différentes liaisons glycosidiques. (b) Structure de quelques polysaccharides communs. Les codes de couleur correspondent à ceux de la figure (a).


CH2OH

5

H C N C CH3 H 3C H

H

O

Les polysaccharides sont des sucres constitués par la répétition de nombreuses unités monosaccharidiques (quelquefois des centaines et même des milliers), liées entre elles par des liaisons covalentes appelées liaisons glycosidiques (voir figure 3.6). Une telle liaison entre deux monosaccharides forme un disaccharide. Les trisaccharides sont constitués de trois monosaccharides. L’addition de quelques monosaccharides supplémentaires forme un oligosaccharide. Les polysaccharides sont de longues chaînes de monosaccharides. La liaison glycosidique existe dans deux orientations géométriques, dites alpha (α) et bêta (β) (voir figure 3.6a). Les polysaccharides, formés par la répétition d’unités glucose liées par leurs carbones 1 et 4 dans l’orientation alpha (par exemple le glycogène et l’amidon, voir figure 3.6), constituent les réserves d’énergie et de carbone chez les bactéries, les plantes et les animaux. La cellulose, composant des parois des plantes et des algues, est un polymère constitué d’unités répétitives de glucose réunies par des liaisons β-1,4 (voir figure 3.6b). L’amidon et la cellulose sont constitués uniquement de glucose, mais leurs fonctions biologiques sont différentes en raison des configurations α ou β de leurs liaisons glycosidiques. Les polysaccharides peuvent également s’associer à d’autres classes de macromolécules, comme les protéines et les lipides, pour former des polysaccharides complexes, les glycoprotéines et les glycolipides. Ces composés assurent des fonctions cellulaires importantes, notamment celle de récepteur de surface des membranes cytoplasmiques. Les composés habituellement situés à la surface externe des membranes sont en contact avec l’environnement. Les glycolipides entrent également, pour une grande part, dans la composition de la paroi cellulaire des bactéries Gram négatif ; ils sont situés à la surface externe et confèrent à ces parois des propriétés spécifiques (voir section 4.9).

H

6 CH

OH 1

H

2

NH C O CH3

FIGURE 3.5 Structure de la N-acétylglucosamine, un dérivé du glucose. La N-acétylglucosamine est un des principaux composants du peptidoglycane, un polysaccharide de la paroi cellulaire chez les Bacteria (voir la section 4.8).

Les sucres (monosaccharides) s’assemblent en longs polymères appelés polysaccharides. Les propriétés spécifiques de ces polymères dépendent de l’orientation (α ou β) de la liaison glycosidique reliant entre eux deux sucres. Les polysaccharides peuvent aussi s’associer à d’autres molécules comme des protéines et des lipides, formant des polysaccharides complexes. •

Pourquoi le glycogène et la cellulose sont-ils si différents, alors qu’ils sont tous les deux constitués uniquement de glucose ?



46 Chapitre 3

Macromolécules

m n3.4 Les lipides Les lipides sont des constituants essentiels de tous les êtres vivants. Les trois domaines du vivant comptent des lipides aux structures différentes, et dans chaque domaine on rencontre également une grande variété de lipides. Les acides gras sont les principaux constituants des lipides des Bacteria et des Eukarya. En revanche, les lipides des Archaea sont construits à partir d’une molécule hydrophobe, le phytane (voir section 4.5). Les acides gras sont des composés amphipathiques, c’est-àdire possédant à la fois des propriétés hydrophiles et des propriétés hydrophobes. Le palmitate (forme ionisée de l’acide palmitique) [voir figure 3.7], par exemple, est un acide gras à 16 atomes de carbone composé d’une chaîne saturée comprenant 15 atomes de carbone (complètement hydrogénée et hautement hydrophobe) et d’un groupement carboxylique (constituant la partie hydrophile). On trouve fréquemment d’autres acides gras saturés et insaturés, de C12 à C20, dans les lipides des Bacteria (voir figure 3.7).

•

Quelles sont les différences entre un phospholipide et un triglycéride ?

•

Dessinez la structure chimique du butyrate, acide gras saturé à 6 atomes de carbone.

Acides gras communs :

O

16 15 14 13 12 11 10 9

8

H3C

7

5

6

4

3

2

1

C OH

Saturé, à 16 atomes de carbone (acide palmitique) O CH3

C OH

Monoinsaturé, à 16 atomes de carbone (acide palmitoléique) Lipides simples (triglycérides) : les acides gras sont liés au glycérol par une liaison ester

Glycérol O

Les triglycérides et les lipides complexes Les lipides simples (graisses) sont des acides gras (ou, chez les Archaea, des unités phytanyles) liés au C3 d’un alcool, le glycérol (voir figure 3.7). Les triglycérides comportent trois résidus d’acides gras fixés à une molécule de glycérol. Les lipides complexes sont des lipides simples qui contiennent des éléments additionnels tels que le phosphore, l’azote, le soufre, ou des petits composés organiques hydrophiles comme les sucres, l’éthanolamine (voir figure 3.7), la sérine ou la choline. Les lipides contenant un groupement phosphate sont appelés phospholipides. Ils jouent un rôle important dans la structure de la membrane cytoplasmique (voir section 4.5). Grâce à leurs propriétés amphipathiques, les lipides sont parfaitement adaptés aux structures membranaires. Ils s’alignent pour former les membranes. La partie hydrophile des phospholipides (glycérol) est en contact avec le cytoplasme et l’environnement externe, alors que la partie hydrophobe reste à l’intérieur de la membrane (voir section 4.5 et figure 4.16). Les régions hydrophobes des membranes sont imperméables aux substances polaires. Cette propriété prévient la fuite des constituants cytoplasmiques. Des mécanismes spécifiques permettent cependant la pénétration dans les cellules des substances polaires nécessaires à leur fonction (transport, voir section 4.5).

H3C

C O C H O

H3C

C O C H O

•

Quelle partie de la molécule d’acide gras est hydrophobe ? hydrophile ?

C O C H

H3C

H Liaison ester

Acides gras Lipide complexe : Phosphatidyléthanolamine (un phospholipide)

O

H

H3C

C O C H O

H3C

C O C H O –O P O C H O H

Acides gras Phosphate

CH2 CH2

Éthanolamine

+NH

3

Lipide complexe : diglycéride monogalactosyle (un glycolipide) 6

OH 4

Galactose

CH2OH 5

OH 3

O 1 2

OH

Contrôlez vos acquis Les lipides possèdent des régions hydrophiles et des régions hydrophobes ; leurs propriétés chimiques en font des composants de choix dans la structure des membranes cytoplasmiques.

H

Acides gras H3C H3C

H O C H

O C O C H O C O C H H

FIGURE 3.7 Acides gras, lipides simples (graisses) et lipides complexes. Les lipides simples sont composés d’acides gras liés par des liaisons esters à une molécule de glycérol, après perte d’un H2O. La composition en acides gras d’une cellule varie avec la température de croissance.



3.5 Les acides nucléiques 47

III

Bases pyrimidiques

MACROMOLÉCULES INFORMATIONNELLES

Contrairement aux polysaccharides et aux lipides, les acides nucléiques et les protéines portent l’information génétique.

m n3.5 Les acides nucléiques

Les nucléotides Les bases azotées des acides nucléiques se divisent en deux catégories. Les purines – adénine et guanine – contiennent deux hétérocycles (composés d’atomes différents). Les pyrimidines – thymine, cytosine et uracile – contiennent un seul hétérocycle à six sommets (voir figure 3.9). La guanine, l’adénine et la cytosine sont présentes dans l’ADN et l’ARN. On trouve la thymine (à quelques exceptions près) seulement dans l’ADN, tandis que l’uracile est présent uniquement dans l’ARN. La base azotée est reliée au pentose par une liaison glycosidique entre l’atome de carbone en position 1 du sucre et l’atome d’azote en 1 (bases pyrimidiques) ou en 9 (bases puriques) de la base. Cet ensemble est appelé nucléoside. Les nucléotides sont donc des nucléosides possédant un ou plusieurs groupements phosphates (voir figure 3.10). Les nucléotides ont également d’autres fonctions dans la cellule. Ainsi, certains nucléotides ne servent pas seulement d’éléments de construction pour les acides nucléiques, mais,

6

1

2

O

N H

O

Thymine (T)

ADN ARN

C 4′ H 3′ H C OH

O

Base H 2′ C

1′ C

OH

Ribose Dans l’ADN, H remplace OH

FIGURE 3.8 Nucléotides. Les atomes de carbone du cycle de la base azotée sont numérotés 1, 2, 3, etc. (voir figure 3.9), et ceux du sucre 1’, 2’, 3’, etc.

O

5 6 1N 2 4 3

7 9

N H

Uracile (U)

N

N

N

N H

N

Adénine (A)

Guanine (G)

ADN ARN

ADN ARN

NH2

FIGURE 3.9 Structure des bases de l’ADN et de l’ARN. Remarquez le système de numérotation des cycles. Le carbone 1’ du sucre phosphate est lié à l’azote 1 de la base azotée dans les pyrimidines, et à l’azote 9 dans les purines.

comme l’ATP (voir figure 3.10), sont aussi des sources d’énergie chimique pour la cellule. L’hydrolyse de la liaison phosphate libère cette énergie (voir section 5.8). D’autres nucléotides, ou leurs dérivés, interviennent dans les réactions d’oxydoréduction cellulaires (voir section 5.7), transportent des sucres dans les réactions de biosynthèse des polysaccharides (voir section 5.15), ou encore contrôlent l’activité de certaines enzymes ou chaînes métaboliques.

Les acides nucléiques Un acide nucléique est un polymère formé par l’alternance de sucres et de phosphates (voir figure 3.11). Un polynucléotide est une succession de nucléotides dans laquelle le phosphate est relié par une liaison covalente, d’une part au carbone 3 [appelé 3' (3 prime)] d’un sucre, et d’autre part au carbone 5 (5') du sucre adjacent (voir figure 3.11a). Cette liaison, qui relie le phosphate au sucre par une liaison ester, porte le nom de liaison phosphodiester (voir figure 3.11a). La séquence nucléotidique d’une molécule d’ARN ou d’ADN se nomme structure primaire. C’est la séquence singulière des bases qui dicte la séquence des acides aminés des protéines ou celle des ARN de transfert, ou ribosomiques. La réplication de l’ADN et la synthèse d’ARN sont les événements clés de la vie (voir section 1.2, figure 1.4 et chapitre 7).

O

Ribose

Phosphoester

O– O

Phosphates

H

N H

8

ADN ARN seulement seulement

NH2 N

O–

–O P ~ O P ~O P

5′

CH2

O

NH2 N

N O

N H

O–

O

O N

Phosphoanhydride

O– –O P

H3C

5 4 3N

Cytosine (C)

Les acides désoxyribonucléique (ADN) et ribonucléique (ARN) sont des macromolécules composées de monomères appelés nucléotides. Ce sont donc des polynucléotides. L’ADN est la matrice de l’information génétique de la cellule, alors que l’ARN est le maillon qui convertit cette information en une séquence d’acides aminés dans les protéines (voir figure 1.4). Un nucléotide résulte de l’assemblage de trois composants ; un sucre à cinq atomes de carbone ou pentose, le ribose (dans l’ARN) ou le désoxyribose (dans l’ADN), une base azotée et une molécule de phosphate PO43–. La structure générale des nucléotides de l’ADN et de l’ARN est très proche (voir figure 3.8).

Phosphate

O

NH2

Bases puriques

O

O CH2 H

8

O

7

9

N

H

H

OH

OH

H

5 6 1N 2 4 3

N

Adénine

FIGURE 3.10 Les composants d’un nucléotide important, l’adénosine triphosphate. L’énergie d’hydrolyse d’une liaison phosphoanhydride (représentée en ondulé) est supérieure à celle d’une liaison ester et a une signification en bioénergétique (voir section 5.8). L’adénosine (un nucléoside) est composée d’un sucre lié à une base azotée sans groupement phosphate.



48 Chapitre 3

Macromolécules

5′

Position 5’

H2C

4′

Position 3’

O

5’’

1′

H

H

O

H2C H

H

T C G A A T C G 3′ 5′

A C

H

H

O –O P

Liaisons hydrogène

3′ U C G

5′ 3′ (ii) C C G A C A C G U C G G

Base H

G C

5′ (i) C A G U G A C C A

O

O

T T A

(b)

Désoxyribose

H

O

Base azotée rattachée en position 1’

H

2′

3′

–O P

Liaison phosphodiester

Base

3′

A G C

Fragment apparié

O

O

(a)

(c)

C

G

A

U

G

C

C

G

5′C

Structure primaire Structure secondaire

G 3′

FIGURE 3.11 ADN et ARN. (a) Structure d’un fragment de chaîne d’ADN. Les bases azotées sont l’adénine, la guanine, la cytosine et la thymine. Dans l’ARN, un groupement OH est présent sur le carbone 2’ du pentose (voir figure 3.8) et l’uracile remplace la thymine. (b) Représentation simplifiée de la structure de l’ADN dans laquelle figurent uniquement les bases azotées. Notez la complémentarité des bases dans la séquence (A = T ; G ≡ C) et la nature des liaisons hydrogène qui relient les paires entre elles. (c) ARN : (i) Séquence montrant uniquement la structure primaire ; (ii) Fragment de séquence permettant l’établissement d’une structure secondaire. La figure montre que, dans l’ARN, la formation de structures secondaires dépend de la possibilité d’appariements intra-brin. Dans certains ARN de très grande taille, comme les ARN ribosomiques (voir sections 7.15 et 11.5), des régions mono-brin alternent avec des régions possédant à la fois des fragments mono- et double-brins (voir figure 11.11c). La fonction biologique de ces molécules fortement repliées et entortillées dépend de leur structure tridimensionnelle finale.

L’ADN Dans les cellules, l’ADN se trouve sous la forme d’une double hélice. Chaque chromosome contient deux brins d’ADN, constitués chacun de centaines de milliers à plusieurs millions de nucléotides liés par des liaisons phosphodiester. Les deux brins sont retenus par des liaisons hydrogène entre un nucléotide d’un brin et son complémentaire sur le brin opposé. Les bases puriques et pyrimidiques adjacentes forment entre elles des liaisons hydrogène (voir figure 3.2c). Ce sont les appariements guanine-cytosine (G-C), d’une part, et adénine-thymine (A-T), d’autre part, qui forment les liaisons hydrogène les plus stables (voir figure 3.2c). La complémentarité de séquence des bases des deux brins d’ADN résulte de l’appariement spécifique entre A et T et G et C. Quand G se trouve sur un brin, C lui fait face sur l’autre brin ; de même T, présent sur un brin, fait face à A sur l’autre brin (voir figure 3.11b).

L’ARN À quelques exceptions près, les ARN sont des molécules simple brin. Cependant, de courtes régions d’une molécule d’ARN peuvent s’apparier par complémentarité des bases. Ces structures portent le nom de structures secondaires (voir figure 3.11c). L’ARN remplit trois fonctions cruciales dans les cellules. Les ARN messagers (ARNm) portent l’information génétique de l’ADN sous la forme d’une molécule simple brin, complémentaire de la séquence des bases de l’ADN qui lui sert de matrice. Les ARN de transfert (ARNt) convertissent le langage nucléotidique en langage d’acides aminés pour la synthèse de protéines.

Les ARN ribosomiques (ARNr) sont de plusieurs types ; ce sont des composants structuraux et catalytiques du ribosome, la machinerie de synthèse protéique de la cellule (voir chapitres 7 et 11).

Contrôlez vos acquis L’information d’un acide nucléique réside dans la séquence des bases azotées de la chaîne polynucléotidique. L’ARN et l’ADN sont des molécules de l’information génétique. L’ARN peut se replier sur lui-même en de multiples configurations et former des structures secondaires. •

Quels sont les constituants d’un nucléotide ?

•

Quelle est la différence entre un nucléotide et un nucléoside ?

•

Faites la distinction entre les structures primaire et secondaire d’un ARN.

acides aminés et la liaison m n3.6 Les peptidique Les acides aminés sont les monomères des protéines. Alors que la majorité des vingt et un acides aminés les plus communs dans les cellules est constituée uniquement de carbone, d’hydrogène, d’oxygène et d’azote, deux d’entre eux contiennent du soufre et



3.6 Les acides aminés et la liaison peptidique 49

Carbone-α

R Groupement aminé

H

O

C

C OH Groupement acide carboxylique

NH2

(a) Structure générale d’un acide aminé

CH3 CH3 CH3

CH3

Gly Glycine (G)

OH CH2

CH3

Ala Alanine (A)

Thr Thréonine (T)

CH

Val Valine (V)

CH3 CH O OH NH2 C CH2 O

Asn Asparagine (N)

+NH

CH2 CH2 CH2 CH2

NH2 C CH2 CH2

Gln Glutamine (Q)

+NH

C

CH CH2 Leu Leucine (L) CH3

CH3 CH2

CH

CH3 S CH2 CH2

CH2

Trp Tryptophane (W)

H2C

CH COO–

HSe CH2

Met Méthionine (M) Phe Phénylalanine (F)

H2C

HS CH2

Ile Isoleucine (I)

CH2

N H CH2 N H

O -O C CH 2 O

H

HO

CH2

Ser Sérine (S)

-O C CH CH 2 2 3

2

Glu Glutamate (E) Lys Lysine (K)

H N CH2 CH2 CH2 Arg Arginine (R)

NH2

Cys Cystéine (C)

Asp Aspartate (D)

+HN

CH2

His Histidine (H)

N H

Sec Sélénocystéine (U)

Légende des couleurs Ionisable : acide

Tyr Tyrosine (Y)

Ionisable : basique Non ionisable polaire Non polaire (hydrophobe)

Pro Proline (P)

(Note : la proline est représentée en entier parce qu’elle ne possède pas de groupement aminé libre. C’est un acide iminé et non un acide aminé.)

(b) Structure des groupements « R » des acides aminés FIGURE 3.12 Structure des 21 acides aminés les plus communs. (a) Structure générale. (b) Structure du groupement R. À gauche du nom de l’acide aminé, la nomenclature à trois lettres de l’acide aminé et, à droite, entre parenthèses, son code à une lettre. Voir le Focus du chapitre 7 pour la description d’un éventuel 22 e acide aminé.

un, du sélénium. Tous les acides aminés possèdent un groupe acide carboxylique (-COOH) et un groupe aminé (-NH2) [voir tableau 3.1 et figure 3.12a]. Des liaisons covalentes se forment entre le groupement carboxyle d’un acide aminé et le groupement amine d’un second acide aminé (par élimination d’une molécule d’eau), pour former la liaison peptidique (voir figure 3.13). Tous les acides aminés possèdent la même formule générale (voir figure 3.12a). Ils se distinguent par leur chaîne latérale (appelée R dans la figure 3.12a) rattachée au carbone α. Le carbone α est l’atome de carbone immédiatement adjacent au groupement carboxylique. La structure des différentes chaînes latérales varie considérablement, d’un simple atome d’hydrogène dans la glycine à des structures aromatiques comme dans la phénylalanine (voir figure 3.12b). Les propriétés chimiques d’un acide aminé dépendent essentiellement de la nature de sa chaîne latérale. Les acides aminés ayant des propriétés similaires sont regroupés en « familles » (voir figure 3.12b). Ainsi, la chaîne latérale peut contenir un groupement carboxylique, comme dans l’acide aspartique et l’acide glutamique, acides aminés acides. D’autres acides aminés contiennent des groupements additionnels, leur conférant des propriétés basiques. Les acides aminés qui contiennent des chaînes latérales hydrophobes sont regroupés en

acides aminés non polaires. La cystéine contient un groupement sulfhydryle (-SH) qui peut se lier à une autre cystéine pour former un pont disulfure (R-S-S-R). La diversité des acides aminés (voir figure 3.12b) explique l’énorme variété des protéines cellulaires et leurs propriétés H H2N C

O

H H C OH + H N C

O C OH

R2

R1

H2O

H2N

H

O H H

O

C

C

C OH

R1

N C R2

Liaison peptidique

FIGURE 3.13 Formation de la liaison peptidique. La partie variable des acides aminés (chaîne latérale) est représentée par R 1 et R2 (voir figure 3.12). Regardez comment, après la formation de la liaison peptidique, un groupement OH reste disponible pour former une nouvelle liaison peptidique (voir figure 7.38).



50 Chapitre 3

Macromolécules

biochimiques. Par exemple, une cellule d’Escherichia coli contient environ 2 000 protéines différentes (voir tableau 3.2), solubles et membranaires, qui assurent des fonctions sensorielles, de maintien, de transport et beaucoup d’autres encore. La fonction d’une protéine est en grande partie dictée par sa structure. Inversement, des protéines remplissant des fonctions similaires ont souvent des structures proches.

a

d

C

Les isomères

b

b

C

c

Deux molécules ayant la même formule chimique peuvent exister sous des formes structurales différentes, ou isomères. Louis Pasteur, microbiologiste qui a battu en brèche la théorie de la génération spontanée (voir section 1.5), débuta sa carrière scientifique dans le domaine de la chimie par l’étude d’une classe d’isomères, les isomères optiques. Il décrivit l’asymétrie des cristaux d’acide tartrique (voir figure 3.14), démontrant ensuite que les organismes vivants pouvaient produire des molécules optiquement actives telles que, par exemple, les sucres et les acides aminés (une molécule est optiquement active si sa solution pure ou son cristal diffractent la lumière dans une seule direction). Les isomères qui possèdent les mêmes formules structurales et moléculaires, mais dont l’un est le « reflet » de l’autre dans un miroir, comme la main gauche est l’image de la main droite, sont des énantiomères et sont nommés D et L (voir figure 3.15). Les sucres de la série D prédominent dans les systèmes biologiques. Les acides aminés peuvent aussi exister sous forme d’énantiomères. Cependant, seules les formes L entrent dans la composition des protéines (voir figure 3.15c). Néanmoins, on rencontre occasionnellement des acides aminés D dans les cellules, en particulier dans le peptidoglycane, polymère de la

n

n T

T h

h

P

b'

M

d

c

(a)

D-Glucose

H

O C H

HO C

H

H C OH

H C

OH

HO C

H

H C

OH

HO C

H

CH2OH

L-Alanine

O

H C

H C OH HO C

L-Glucose

CH2OH

(b)

D-Alanine

COOH

COOH H2N C H

H C

NH2

CH3 CH3 Représentation sur un plan COOH H2N

(c)

C H CH3

COOH H

C NH2 CH3

Représentation en trois dimensions

FIGURE 3.15 Les isomères. (a) Modélisation de deux isomères optiques. (b) Énantiomères du glucose. (c) Énantiomères de l’acide aminé alanine. Remarquez que, quelle que soit l’orientation choisie pour ces représentations tridimensionnelles, les formes L et D ne se surperposent jamais. Dans la projection tridimensionnelle, la flèche signifie que le groupement est dirigé vers l’avant, et la ligne pointillée, que le groupement est dirigé vers l’arrière.

paroi cellulaire (voir section 4.8), et dans certains antibiotiques (voir section 20.9). Les racémases sont des enzymes qui catalysent de façon spécifique l’interconversion des énantiomères. Ainsi, certains procaryotes sont capables de se multiplier en présence de sucres-L ou d’acides aminés-D, parce qu’ils peuvent les convertir en leurs énantiomères.


b'

M

(a)

a

P

(b)

FIGURE 3.14 Représentation de cristaux d’acide tartrique (C4H6O6) utilisée par Louis Pasteur pour illustrer sa célèbre publication sur l’activité optique. (a) Cristal « gauche » (forme L). (b) Cristal « droit » (forme D). Les deux cristaux sont le reflet l’un de l’autre dans un miroir (ce sont des énantiomères). Pasteur a utilisé des lettres pour identifier les faces des cristaux, qui sont les images l’une de l’autre dans un miroir. Ici, pour mieux les distinguer, on a ajouté des couleurs. Pasteur a conforté son hypothèse de l’existence d’un lien entre l’asymétrie chimique et la vie en démontrant que la moisissure du genre Aspergillus ne pouvait métaboliser que le D-tartrate.

Vingt et un acides aminés, présents dans les cellules, peuvent former des liaisons peptidiques. Les sucres et les acides aminés peuvent exister sous forme d’énantiomères (images l’un de l’autre dans un miroir), mais on trouve seulement un de ces deux isomères optiques dans la plupart des polysaccharides et des protéines cellulaires. •

Pourquoi tous les acides aminés ont-ils une structure similaire mais diffèrent les uns des autres ?

•

Dessinez la structure complète d’un dipeptide qui contient les acides aminés alanine et tyrosine. Entourez la liaison peptidique.

•

Quels sont les énantiomères de sucres et d’acides aminés les plus communs dans les organismes vivants ? Pourquoi l’acide aminé glycine n’a-t-il pas d’énantiomère ?



3.7 Les protéines : structures primaire et secondaire 51

m n

3.7 Les protéines : structures primaire et secondaire

C O

Les protéines jouent des rôles clés dans les cellules. Chaque type cellulaire est caractérisé par son contenu en protéines. Pour cette raison, on ne peut comprendre les différents types cellulaires sans connaître la structure des protéines. Il existe deux catégories principales de protéines, les protéines catalytiques (enzymes) et les protéines de structure. Les enzymes catalysent les réactions chimiques des cellules (voir chapitres 5 et 17). Les protéines de structure, quant à elles, font partie intégrante des structures des membranes, des parois et des différents composants du cytoplasme. Toutes les protéines ont en commun certaines propriétés structurales.

O

CH C H N CH N HR C O

R H CH N H R R CH H N CH O C C N C C CH O O CH N O R H R O O O O C N C C H C H N CH CH N C R CH N R H R R H H O

La structure primaire Les protéines sont des polymères d’acides aminés unis par des liaisons covalentes (voir figure 3.13). Deux acides aminés unis par une liaison peptidique forment un dipeptide, trois un tripeptide et ainsi de suite. De nombreux acides aminés unis de manière covalente par des liaisons peptidiques forment un polypeptide. Les protéines possèdent une ou plusieurs chaînes polypeptidiques. Le nombre d’acides aminés varie d’une protéine à l’autre, de 15 pour les plus petites à 10 000 pour les plus grosses. La composition en acides aminés des protéines, leur séquence et leur masse sont très variables, ce qui explique leur grande diversité structurale et fonctionnelle. La séquence linéaire des acides aminés d’un polypeptide est appelée structure primaire. Le mode de repliement d’un polypeptide dépend en premier lieu de sa structure primaire. Mais seul le polypeptide, dans sa conformation définitive, est biologiquement actif.

R

(a)

C C CH N CH N R H R H O O C C H C CH N N R R H H O O C N C CH N CH H H R R

R

C

N H O C R C R C O H N

H N C R O C R

C

N H O C R R C

H N C R O C R

C

C O H N

N H C C O

N H C C O

C O H N C R C R N H O C

N H O C

(b)

N C

C O H N C R C R N H O C

N H O C R R C

H N C R O C

Liaisons hydrogène entre des acides aminés proches

C O C O H N C R C R N H O C

C O H N

La structure secondaire Les interactions entre les chaînes latérales des acides aminés d’un polypeptide contraignent la molécule à se replier, formant des structures secondaires (voir figure 3.16). Ce sont les liaisons hydrogène, liaisons faibles et autres liaisons non covalentes (voir section 3.1), qui stabilisent ces structures secondaires. Une des structures secondaires les plus courantes est l’hélice-α, qui se présente comme un cylindre formé par la torsion d’un ruban (voir figure 3.16a). Cette torsion permet aux atomes d’oxygène et d’azote des différents acides aminés proches de former des liaisons hydrogène. Ces liaisons confèrent à l’hélice-α sa stabilité (voir figure 3.16a). La structure primaire d’autres polypeptides favorise la formation d’un type de structure différent, le feuillet-β. Dans cette structure, la chaîne polypeptidique se replie plusieurs fois sur elle-même. Comme dans l’hélice-α, le repliement est stabilisé par des liaisons hydrogène (voir figure 3.16b). Les feuillets-β sont des structures plus rigides que les hélices-α. Ainsi, une enzyme, dont l’activité dépend de sa flexibilité, peut contenir une grande proportion d’hélices-α. En revanche, une protéine de structure du cytosquelette peut être majoritairement constituée de feuillets-β. De nombreux polypeptides possèdent, dans la même chaîne polypeptidique, des régions en hélices-α et en feuillets-β. Les différentes opportunités de formation de liaisons hydrogène et

O

N H

Liaisons hydrogène entre des acides aminés éloignés

FIGURE 3.16 Structure secondaire des polypeptides. (a) Structure secondaire en hélice-α. Remarquez que les liaisons hydrogène ne concernent pas les groupements R, mais se forment entre des atomes des liaisons peptidiques. (b) Structure secondaire en feuillet-β.

d’interactions hydrophobes gouvernent le mode de repliement et la position de ces régions dans les polypeptides (voir figure 3.17). Ces régions, portant le nom de domaines, sont généralement des segments du polypeptide qui possèdent des fonctions singulières.



52 Chapitre 3

Macromolécules

Chaînes α

Chaîne A Hélice-α

Chaîne B Feuillet-β (a) Insuline

(b) Ribonucléase

FIGURE 3.17 Structure tertiaire de polypeptides montrant l’emplacement des structures secondaires en hélice-! et en feuillet-". (a) L’insuline, protéine contenant deux chaînes polypeptidiques (voir section 31.6) ; remarquez que la chaîne B possède à la fois des structures secondaires en hélice-α et en feuillet-β, et que les ponts disulfures (en bleu) participent à la stabilisation de la structure tertiaire. (b) La ribonucléase, grosse protéine possédant plusieurs régions de structure secondaire (hélices-α et feuillets-β).

structures protéiques d’ordre m n3.8 Les supérieur et la dénaturation Les polypeptides organisés en structures secondaires continuent de se replier en une conformation unique encore plus stable. Cette structure tridimensionnelle spécifique est la structure tertiaire. Comme la structure secondaire, la structure tertiaire dépend de la structure primaire. Cependant, elle est également dictée, jusqu’à un certain point, par la structure secondaire de la molécule, qui oriente la chaîne latérale des différents acides aminés dans une direction précise (voir figure 3.16). Le repliement d’un polypeptide est stabilisé par les nouvelles liaisons hydrogène et covalentes, ainsi que les nouvelles interactions hydrophobes ou autres interactions entre atomes qui peuvent alors se former (voir figure 3.17). La structure tertiaire de la protéine montre des régions exposées ou des crevasses (voir figures 3.17 et 3.18) ; ces dernières peuvent fixer d’autres molécules (par exemple un substrat – s’il s’agit d’une enzyme – ou un ADN – s’il s’agit d’une protéine régulatrice) [voir sections 5.5 et 8.4]. Souvent, quand un polypeptide se replie, les groupes sulfhydryles de cystéines se rapprochent. Ces groupes -SH peuvent former une liaison covalente entre ces deux acides aminés, le pont disulfure. Si les deux cystéines sont situées sur deux polypeptides différents, le pont disulfure relie ces deux molécules (voir figure 3.17a). Un seul polypeptide peut aussi se replier spontanément et former un pont disulfure intramoléculaire. La structure quaternaire définit une protéine formée de deux chaînes polypeptidiques au moins (voir figure 3.18). Chaque polypeptide, appelé sous-unité, est organisé en structures primaire, secondaire et tertiaire. Certaines protéines contiennent plusieurs exemplaires de la même sousunité. Une protéine contenant deux sous-unités identiques,

(a)

Chaînes β

(b)

FIGURE 3.18 Structure quaternaire de l’hémoglobine humaine. (a) L’hémoglobine est constituée de deux polypeptides différents, les chaînes α (en bleu et en rouge) et les chaînes β (en orange et en jaune), qui s’assemblent pour former la protéine (α et β se rapportent aux noms des chaînes et non à des structures polypeptidiques secondaires). Des couleurs différentes représentent les quatre chaînes. (b) Structure moléculaire de l’hémoglobine déterminée par cristallographie aux rayons-X. Sur cette dernière image, les deux chaînes α sont colorées en rouge et les deux chaînes β en bleu.

par exemple, sera qualifiée d’homodimère. D’autres protéines sont formées de sous-unités différentes, présentes en un seul ou en plusieurs exemplaires (un hétérodimère contiendra, par exemple, deux polypeptides différents). Les sousunités des protéines multimères sont liées par des interactions non covalentes (liaisons hydrogène, forces de van der Waals et interactions hydrophobes) ou covalentes, généralement un pont disulfure.

La dénaturation Quand les protéines sont exposées à des températures élevées, à des changements de pH ou à certains composés chimiques ou métaux qui affectent leur repliement, elles se dénaturent (voir figure 3.19). On appelle dénaturation la perte des structures secondaire, tertiaire et quaternaire de la molécule. Si la dénaturation n’est pas trop importante, la protéine peut retrouver sa forme active (voir figure 3.19) après élimination de l’agent dénaturant. La dénaturation entraîne la perte de l’activité biologique de la protéine. Les liaisons peptidiques (voir figure 3.13) ne sont pas détruites, et c’est pourquoi une protéine dénaturée conserve sa structure primaire. En se repliant, un polypeptide adopte une conformation singulière avec une fonction biologique spécifique. La dénaturation des protéines revêt un intérêt particulier car c’est un des moyens les plus employés pour détruire les microorganismes. Par exemple, les alcools et phénols sont des désinfectants efficaces parce qu’ils pénètrent facilement dans les cellules et dénaturent de façon irréversible les protéines intracellulaires. Ces agents chimiques sont utilisés pour la désinfection d’objets, de surfaces, et ont de nombreuses applications domestiques, ainsi que dans les hôpitaux et l’industrie (voir chapitre 20).



Questions 53

Contrôlez vos acquis La structure primaire d’une protéine est déterminée par sa séquence en acides aminés, mais seul le repliement du polypeptide (pour former des structures d’ordre supérieur) détermine ses propriétés fonctionnelles. Dénaturation douce ; urée

Élimination de l’urée ; renaturation

Protéine active

Protéine active

Protéine active

Dénaturation sévère ; 100 °C

Protéine active Refroidissement

•

Définissez les structures primaire, secondaire et tertiaire d’une protéine.

•

De quelle manière un polypeptide diffère-t-il d’une protéine ?

•

Pourquoi les feuillets-β sont-ils plus rigides que les hélices-α ?

•

Donnez le nombre et les types de polypeptides présents dans une protéine homotétramérique.

•

Décrivez les effets structuraux et biologiques de la dénaturation d’une protéine. Quelle application pratique de la connaissance du processus de dénaturation d’une protéine permet-elle ?

Protéine active

FIGURE 3.19 Dénaturation de la ribonucléase. La structure de la ribonucléase est présentée dans la figure 3.17b. Remarquez qu’une dénaturation sévère détruit irréversiblement la protéine (ou plutôt sa fonction biologique), parce qu’elle ne peut plus retrouver sa conformation initiale.

QUESTIONS 1. Quels sont les principaux éléments qui entrent dans la composition des êtres vivants ? Pourquoi l’oxygène et l’hydrogène sontils particulièrement abondants dans les organismes vivants (voir section 3.1) ? 2. Qu’est ce qu’une molécule ? Combien d’atomes y a-t-il dans une molécule de gaz hydrogène ? dans une molécule de glucose (voir sections 3.1 et 3.3) ? 3. Regardez le schéma de la base azotée cytosine (voir figure 3.1). Dessinez sa structure en indiquant les positions de toutes les liaisons simples et les doubles liaisons de la molécule (voir section 3.1). 4. Comparez et donnez les différences entre un monomère et un polymère. Donnez trois exemples de polymères ayant une importance biologique et énumérez les monomères qui les composent.

Quelles sont les classes de macromolécules les plus abondantes (en poids) dans une cellule (voir sections 3.1 et 3.2) ? 5. Énumérez les différents composants d’un lipide simple. Quelles sont les différences entre un triglycéride et un lipide complexe (voir section 3.4) ? 6. Examinez les structures du triglycéride et de la phosphatidyl éthanolamine de la figure 3.7. Comment la substitution du phosphate et de l’éthanolamine par un acide gras modifie-t-elle les propriétés chimiques du lipide (voir section 3.4) ? 7. L’ADN et l’ARN sont des macromolécules proches qui présentent cependant des différences. Énumérez trois propriétés chimiques et physiques permettant de distinguer l’ARN de l’ADN. Quelle est la fonction cellulaire de l’ADN ? de l’ARN (voir section 3.5) ?



54 Chapitre 3

Macromolécules

8. Que signifie le mot acide aminé ? Écrivez la structure générale d’un acide aminé. Quelle est l’importance de la chaîne latérale R dans la structure tridimensionnelle d’une protéine ? Pourquoi l’acide aminé cystéine joue-t-il un rôle particulier dans la structure d’une protéine (voir section 3.6) ? 9. Chimiquement parlant, quelle réaction entre deux acides aminés entraîne la formation d’une liaison peptidique (voir section 3.6) ?

10. Donnez la définition des termes suivants ; primaire, secondaire, tertiaire et quaternaire, appliqués à une protéine. Lequel (ou lesquels) est (sont) concerné(s) par le processus de dénaturation (voir sections 3.7 et 3.8) ? 11. Complétez les espaces. Une liaison glycosidique est à un _____ ce qu’une liaison _____ est à un polypeptide, et une liaison _____ à un acide nucléique. Ces différents types de liaisons sont des exemples de liaisons _____, qui sont chimiquement plus fortes que les liaisons faibles, comme _____ et _____ (voir chapitre 3).

PROBLÈMES 1. Observez la séquence nucléotidique de l’ARN ci-après ; (a) GUCAAAGAC, (b) ACGAUAACC. L’une de ces deux molécules a-t-elle une structure secondaire ? Si oui, dessinez cette(ces) structure(s) potentielle(s). 2. Quelques protéines solubles (cytoplasmiques) possèdent une grande proportion d’acides aminés hydrophobes. Quel type de structure tertiaire vont adopter ces protéines et pourquoi ? 3. Les cellules du genre Halobacterium, une Archaea qui vit dans des environnements hypersalins, contiennent des concentrations élevées de potassium [au-delà de cinq molaires (M)]. En conséquence, la plupart des protéines cytoplasmiques d’Halobacterium contiennent une proportion plus élevée de deux acides aminés particuliers que les protéines homologues chez Escherichia coli (dont le cytoplasme contient très peu d’ions K+). Quels sont ces acides aminés et pourquoi sont-ils si abondants ? (C’est-à-dire ;

quels acides aminés peuvent le mieux neutraliser les charges positives du K+ ?) 4. Quand on place une culture de la bactérie Escherichia coli, bactérie du tube digestif de l’homme, dans un récipient d’eau bouillante, des changements importants se produisent immédiatement dans les cellules. Cependant, quand on soumet une culture de Pyrodictium, bactérie hyperthermophile des sources chaudes, aux mêmes conditions, aucun changement ne se produit. Expliquez. 5. Examinez la figure 3.6b et décrivez les différences qui font la spécificité de chacun de ces polymères. Si toutes les liaisons glycosidiques de ces polymères étaient hydrolysées, quelle molécule resterait-il ? 6. Examinez la figure 3.12b. De tous les acides aminés figurant en bleu, quelle est la particularité chimique qui les regroupe en une « famille » ?



I

Microscopie et morphologie bactérienne 56

4.1 4.2

La microscopie optique L’imagerie tridimensionnelle : microscopie par contraste d’interférence, microscopie à force atomique, microscopie confocale à balayage laser La microscopie électronique Les morphologies cellulaires et la signification de la taille microscopique

4.3 4.4

56

60 62 63

II

Membranes et parois bactériennes

66

4.5 4.6 4.7 4.8

La structure de la membrane cytoplasmique Les fonctions de la membrane cytoplasmique Les systèmes de transport membranaire La paroi des procaryotes (bactéries) : le peptidoglycane et les autres molécules La membrane externe des bactéries Gram négatif

66 69 71

79

III

Structures de surface et inclusions chez les procaryotes

82

4.10 4.11 4.12 4.13

Les structures bactériennes de surface Les inclusions cellulaires Les vésicules de gaz Les endospores

82 83 85 87

IV

Locomotion microbienne

91

4.14 4.15 4.16

Les flagelles et la mobilité La mobilité par glissement La mobilité cellulaire et la réponse comportementale : chimiotactisme et phototactisme

92 94

4.9

CHAPITRE QUATRE


74

Les procaryotes sont typiquement de petite taille, mais sont parfois relativement grands. Cette image de microscopie montre le procaryote Epulopiscium aux côtés de quatre cellules de l’eucaryote Paramecium.

96



56 Chapitre 4


GLOSSAIRE Capsule (capsule) Enveloppe externe facultative de nature polysaccharidique ou protéique entourant certaines bactéries. Chimiotaxie (chemotaxis) Réaction d’attraction (chimiotaxie positive) ou de répulsion (chimiotaxie négative), en réponse à un gradient chimique. Couche S (S-layer) Couche externe présente à la surface cellulaire de certaines Bacteria et Archaea, et composée de protéines ou de glycoprotéines. Endospore (endospore) Structure différenciée élaborée par certaines Bacteria Gram positif et caractérisée par une paroi épaisse conférant une grande thermorésistance à la bactérie. Flagelle (flagellum) Organe cellulaire locomoteur long et fin, capable de mouvement rotatif, présent chez les procaryotes. Gram (Gram) Technique de coloration des bactéries fondée sur les propriétés de la paroi bactérienne mise au point par Christian Gram (1884). Cette coloration est utilisée en taxinomie bactérienne. Gram négatif (Gram-negative) Les bactéries Gram négatif sont caractérisées par une paroi pauvre en peptidoglycane et par la présence d’une membrane externe qui contient des lipopolysaccharides, des lipoprotéines et d’autres macromolécules. Gram positif (Gram-positive) Les bactéries Gram positif sont caractérisées par une paroi composée principalement de peptidoglycane et par l’absence de membrane externe (présente chez les bactéries Gram négatif). Lipopolysaccharide (LPS) (lipopolysaccharide) Composant essentiel de la membrane externe des bactéries Gram négatif constitué de lipides associés à des polysaccharides et des protéines. Magnétosomes (magnetosomes) Particules de magnétite (Fe3O4) organisées en structures libres dans le cytoplasme des bactéries magnétotactiques. Membrane cytoplasmique (cytoplasmic membrane) Membrane perméable séparant le cytoplasme de l’environnement extérieur de la cellule. Membrane externe (outer membrane) Membrane composée de phospholipides et de polysaccharides qui sépare le peptidoglycane du milieu extracellulaire chez les bactéries Gram négatif.

I

MICROSCOPIE ET MORPHOLOGIE BACTÉRIENNE

Nous avons vu au chapitre 2 les notions d’organismes procaryote et eucaryote. Penchons-nous à présent de manière plus précise sur la structure d’une cellule bactérienne. Bien que leurs constituants cellulaires présentent une grande diversité chimique, les Eubacteria, les Archaea et les Eukarya partagent une architecture cellulaire commune. Des macromolécules sont assemblées à partir de monomères, puis ellesmêmes sont intégrées dans des structures complexes aux fonctions bien définies, comme les ribosomes, les membranes ou les parois cellulaires. Nous développons ci-après les points essentiels de la microscopie, les structures des membranes, des parois, des composants externes et des organites intracellulaires, et enfin la locomotion bactérienne. C’est le microscope qui a révélé pour la première fois les secrets de la structure des bactéries et il reste encore à ce jour un outil très puissant utilisé en microbiologie.

Morphologie (morphology) Forme de la bactérie : bacille, sphérique (coque), spirille et autres. Peptidoglycane (peptidoglycan) Polymère constitué de chaînes polysaccharidiques (dont l’unité est constituée par l’assemblage de deux sucres aminés, la N-acétyl-glucosamine et l’acide N-acétylmuramique) arrangées en feuillets et reliées par des ponts peptidiques. Périplasme (periplasm) Espace situé entre la face externe de la membrane cytoplasmique et la face interne de la membrane externe lipopolysaccharidique des bactéries Gram négatif. Péritriche (peritrichous) Mode de disposition des flagelles où ceux-ci sont localisés sur toute la surface de la bactérie. Phototaxie (phototaxis) Mouvement d’un organisme en direction de la lumière. Polaire (polar) Adjectif faisant référence à la localisation de flagelle(s) au(x) pôle(s) d’une bactérie. Poly-β-hydroxybutyrate (PHB) (poly-β-hydroxybutyrate) Forme commune de stockage dans les cellules procaryotes constituée d’un polymère de β-hydroxybutyrate ou d’un autre acide β-alcanoïque, ou d’un mélange de différents acides β-alcanoïques. Protoplaste (protoplast) Cellule délimitée par une membrane cytoplasmique, mais débarrassée de sa paroi. Résolution (resolution) Capacité à distinguer de manière séparée deux objets adjacents. Stérols (sterols) Molécules carbonées cycliques de nature hydrophobe renforçant la membrane cytoplasmique des cellules eucaryotes et de quelques procaryotes Translocation de groupe (group translocation) Système de transport actif au cours duquel la substance transportée est modifiée chimiquement. Transporteur ABC (ATP-Binding Cassette) (ABC transporter) Système de transport membranaire constitué de trois protéines, dont une assure le transport actif de substrats spécifiques par hydrolyse d’ATP. Vésicules de gaz (gas vesicles) Structures intracytoplasmiques remplies de gaz et délimitées par des protéines, conférant une flottabilité aux cellules bactériennes.

m n4.1 La microscopie optique

L’observation des micro-organismes requiert soit la microscopie optique soit la microscopie électronique. En général, les microscopes optiques sont utilisés pour observer les bactéries à un faible grossissement, alors que les microscopes électroniques le sont pour observer leur structure interne ou les détails à leur surface. Tous les microscopes sont équipés de lentilles pour grossir l’image de la bactérie, dont les détails, au départ invisibles à l’œil nu, deviennent apparents. Contrairement au grossissement qui, en théorie, peut être augmenté sans limite, le pouvoir de résolution d’un microscope est limité, car dicté par les propriétés physiques de la lumière. C’est donc la résolution et non le grossissement qui conditionne finalement les capacités d’un microscope. En microscopie optique, la limite de résolution est de l’ordre de 0,2 µm (ou micromètre) ou 200 nm (ou nanomètres) ; en microscopie électronique, la résolution est mille fois supérieure, ce qui permet l’examen de molécules individualisées.



4.1 La microscopie optique 57

Les composants d’un microscope optique

lumière). En général, il y a une correspondance entre le grossissement d’une lentille et son ouverture numérique : les lentilles possédant les plus forts grossissements sont typiquement celles qui ont les ouvertures numériques les plus élevées (le chiffre est indiqué sur la lentille à côté du grossissement). Le diamètre du plus petit objet résolu par une lentille est égal à 0,5 λ (ouverture numérique), où λ désigne la longueur d’onde utilisée. À partir de cette formule, il apparaît que la résolution est optimale avec une lumière bleue et un objectif possédant une très grande ouverture numérique. Comme nous l’avons dit auparavant, la résolution la plus élevée atteint 0,2 µm en microscopie optique. Ceci signifie que deux objets distants de moins de 0,2 µm ne peuvent être distingués. La plupart des microscopes utilisés en microbiologie possèdent des oculaires grossissant de 10× à 15× et des objectifs grossissant de 10× à 100× (voir figure 4.1b). Ainsi, au grossissement 1 000×, les objets de 0,2 µm de diamètre peuvent être résolus. Les objectifs 100× et certains autres objectifs à haute ouverture numérique nécessitent l’ajout d’une goutte d’huile déposée entre le spécimen et l’objectif ; ils sont appelés objectifs à immersion. L’huile à immersion augmente la capacité de la lentille à capter la lumière, permettant alors la visualisation des angles du spécimen dont le rayonnement ne serait autrement pas capté par la lentille de l’objectif.

En microscopie optique, c’est le rayonnement du visible qui permet d’éclairer le spécimen observé. Différents types de microscopes optiques sont couramment employés en microbiologie : à fond clair, en contraste de phase, à fond noir et à fluorescence. En microscopie optique à fond clair, les spécimens sont visualisés grâce à la différence de contraste (densité) qui existe entre leur surface et le milieu environnant. Les différences de contraste proviennent des variations d’absorption et de réflexion de la lumière par les échantillons. Le microscope à fond clair est le microscope le plus utilisé dans les laboratoires de biologie et de microbiologie. Il comporte deux séries de lentilles (lentille de l’oculaire et lentille de l’objectif), dont la fonction est d’aboutir à la construction de l’image (voir figure 4.1). De nombreuses bactéries sont difficiles à voir distinctement avec les microscopes à fond clair du fait de leur manque de contraste avec leur milieu environnant. Les organismes pigmentés sont une exception, car leur couleur renforce le contraste, améliorant ainsi leur observation (voir figure 4.2).

Le grossissement et la résolution Le grossissement final d’un microscope est le produit du grossissement de la lentille de l’objectif et de celui de la lentille de l’oculaire (voir figure 4.1b). Le grossissement 1 500× est la limite supérieure pour les microscopes optiques. Au-dessus de cette limite, la résolution n’augmente plus. La résolution est fonction de la longueur d’onde de la lumière utilisée et est déterminée par une caractéristique de l’objectif dénommée ouverture numérique (mesure de la capacité à capter la

La coloration : un moyen d’augmenter le contraste en microscopie à fond clair Une des limites du microscope à fond clair est le manque de contraste. La coloration des bactéries est un moyen d’augmenter leur contraste de manière à mieux les observer en Grossissement Trajet lumineux 100×, 400×, Image visualisée 1 000× Œil

Oculaire

10×

Lentille oculaire Image intermédiaire (inversée par rapport au spécimen)

Objectif Platine Condenseur

10×, 40×, ou 100× (huile)

Lentille de l’objectif Spécimen

Carl Zeiss, Inc.

Molette de mise au point Source lumineuse

(a)

Aucun

Lentille du condenseur Diaphragme de champ [« Source lumineuse » en (a)]

(b)

FIGURE 4.1 Microscopie. (a) Microscope optique, avec indication de ses principaux éléments. (b) Trajet lumineux à travers un microscope optique. En plus du grossissement 10 ×, la lentille oculaire existe en grossissement 15 à 30 ×.



58 Chapitre 4


T. D. Brock

Étalement de la culture en couche fine sur la lame

Séchage à l’air libre

I. Préparation du frottis

(a)

Norbert Pfennig

Passage de la lame à travers la flamme pour fixer la préparation II. Fixation à la chaleur et coloration

Recouvrement de la lame avec le colorant ; rinçage et séchage

100×

(b)

Lame

FIGURE 4.2 Micro-organismes pigmentés en microscopie à fond clair. (a) Algue verte microscopique (eucaryote). (b) Bactérie pourpre phototrophe (procaryote). Le diamètre des algues est d’environ 15 µm et celui des bactéries, d’environ 5 µm.

microscopie à fond clair. Les colorants sont des composés organiques et chaque classe de colorants possède une affinité particulière pour certains compartiments ou constituants cellulaires. Les colorants utilisés en microbiologie, comme le bleu de méthylène, le cristal violet ou la safranine, sont pour la plupart chargés positivement (colorants basiques) ; ils vont s’associer avec des constituants cellulaires chargés négativement, tels que les acides nucléiques, les acides polysaccharidiques, ou même les surfaces cellulaires. Ce type de colorant convient donc parfaitement pour une observation de la morphologie bactérienne. Pour une coloration simple, la préparation observée provient en général d’une suspension bactérienne. Après fixation du frottis cellulaire (soit par la chaleur, soit par l’alcool à 90˚), la lame est recouverte pendant une à deux minutes par une solution diluée de colorant, puis rincée plusieurs fois à l’eau et enfin séchée. L’examen microscopique d’une préparation bactérienne colorée se fait à fort grossissement, à l’aide d’un objectif à immersion (voir figure 4.3).

La coloration de Gram, une coloration différentielle Une coloration est dite différentielle quand elle permet de distinguer différents types cellulaires selon leur aptitude à fixer ou non un ou des colorants. La coloration de Gram est une coloration différentielle très largement utilisée en microbiologie (voir figure 4.4a). Elle est à la base des deux grands groupes dichotomiques suivants : bactéries Gram positif et bactéries Gram négatif. Après coloration de Gram, les bactéries Gram positif sont colorées en mauve, tandis que les bactéries Gram négatif sont colorées en rose (voir figure 4.4b).

III. Observation au microscope

Huile

Dépôt d’une goutte d’huile sur la lame ; observation à l’objectif 100x

FIGURE 4.3 Coloration des bactéries destinée à leur observation au microscope. La coloration permet d’améliorer le contraste entre les bactéries et le milieu environnant.

La différence de coloration provient de la différence de structure entre la paroi des bactéries Gram positif et celle des bactéries Gram négatif. Au final, l’éthanol décolore les bactéries Gram négatif et non celles Gram positif (voir figure 4.4). La coloration de Gram est à la base du diagnostic bactériologique, car toute nouvelle identification commence en effet par la détermination du Gram (positif ou négatif) de la bactérie isolée. En cas d’utilisation d’un microscope à fluorescence, la coloration de Gram peut être réduite à une seule étape, à l’issue de laquelle les bactéries Gram positif ou négatif émettront des fluorescences différentes (voir figure 4.4c).

La microscopie en contraste de phase, à fond noir et à fluorescence La microscopie en contraste de phase renforce la différence de contraste entre les bactéries et leur milieu environnant, permettant ainsi leur visualisation tout en évitant leur coloration (voir figure 4.5). Cette technique de mise au point se prête bien à l’observation de spécimens à l’état frais. Elle présente également l’avantage d’éviter la mort, et donc la déformation, des bactéries provoquée par la coloration. La microscopie en contraste de phase, découverte par le physicien mathématicien hollandais Frits Zernike en 1936, découle du principe suivant : les bactéries ralentissent la vitesse de la lumière qui les traverse et diffèrent ainsi de leur milieu environnant par leur indice de réfraction. Ceci se traduit par une différence de phase entre la bactérie et son



4.1 La microscopie optique 59

La coloration de Gram Étape 1

Recouvrement du frottis fixé à la chaleur par le violet de gentiane pendant 1 min Leon J. Lebeau

Résultat : toutes les bactéries sont colorées en violet

Élimination du violet de gentiane par ajout de lugol et maintien en contact pendant 1 min

Résultat : toutes les bactéries restent colorées en violet Étape 3

Décoloration à l’éthanol (environ 20 sec)

Résultat : les bactéries Gram positif restent violettes ; les bactéries Gram négatif sont décolorées

Étape 4

(b) Molecular Probes, Inc., Eugene, Oregon

Étape 2

(c) G–

Contre-coloration avec la fuschine

Résultat : les bactéries Gram positif (G+) sont colorées G+ en violet, les bactéries Gram négatif (G–) sont colorées en rose-rouge (a) FIGURE 4.4 Coloration de Gram. (a) Étapes de la coloration de Gram. (b) Bactéries Gram positif (bleu-violet) et Gram négatif (rose-rouge). Les espèces représentées sont Staphylococcus aureus et Escherischia coli. (c) Pseudomonas aeruginosa (Gram négatif, couleur verte) et de Bacillus cereus (Gram positif, couleur orange), mises en évidence par une coloration fluorescente. Cette méthode permet de différencier les bactéries Gram positif des bactéries Gram négatif en une seule étape de coloration.

environnement. Un anneau spécial, appelé « plateau de phase » et monté dans l’objectif du microscope, amplifie cette différence subtile. Le résultat est la construction d’une image foncée qui apparaît sur un fond lumineux (voir figure 4.5b). La découverte de Zernike a permis d’autres innovations en microscopie, toutes établies sur le principe du contraste de phase, comme la microscopie à fluorescence ou la microscopie confocale. Pour cette découverte, Zernike a reçu le prix Nobel de physique en 1953. Le microscope à fond noir est un microscope optique dans lequel le système d’éclairage a été modifié de manière à éclairer le spécimen uniquement par les côtés (en lumière rasante). Les seuls rayons qui atteignent la lentille ont donc été diffusés par le spécimen, lequel apparaît alors lumineux sur un fond noir (voir figure 4.5c). La résolution obtenue en microscopie à fond noir est sensiblement meilleure qu’en microscopie à fond clair ou même en contraste de phase, et permet souvent l’observation de détails non résolus par ces dernières techniques. La microscopie à fond noir est également un excellent moyen pour observer la mobilité des micro-organismes,

notamment par l’observation des ciliatures flagellaires (voir figure 4.5a). Le microscope à fluorescence est généralement utilisé pour l’observation des spécimens produisant une fluorescence naturelle, c’est-à-dire capables d’émettre un rayonnement lumineux (fluorescent) après excitation lumineuse (dans une autre couleur) [voir figure 4.6]. Le phénomène de fluorescence se produit soit en raison de la présence au sein des cellules de substance(s) naturellement fluorescente(s), comme la chlorophylle ou d’autres composés fluorescents (autofluorescence) [voir figure 4.6a, b], soit parce que les cellules ont préalablement été traitées par un colorant fluorescent appelé fluorochrome (voir figures 4.4c et 4.6c). Le DAPI (diamidino2-phénylindole) est un fluorochrome très utilisé qui émet une fluorescence bleue (voir figure 18.6). Grâce au DAPI, les bactéries sont repérables dans des milieux complexes tels que les échantillons de sol, d’eau, ou dans des prélèvements alimentaires ou cliniques (voir section 18.3). La bactériologie médicale et l’écologie microbienne emploient largement la microscopie à fluorescence (voir chapitres 18 à 20 et 24).



(a)

M.T. Madigan

M.T. Madigan

M.T. Madigan

4.2 L’imagerie tridimensionnelle 60

(c)

(b)

FIGURE 4.5 L’observation de la Saccharomyces cerevisiae (levure du boulanger) par différents types de microscopie optique. (a) À fond clair. (b) En contraste de phase. (c) À fond noir. Les cellules mesurent de 8 à 10 µm de diamètre.

Contrôlez vos acquis La microscopie est essentielle à la microbiologie. Différents types de microscopes optiques existent, comme les microscopes à fond clair, à fond noir, en contraste de phase et à fluorescence. En microscopie à fond clair, les colorations sont nécessaires pour augmenter le contraste.

tridimensionnelle : m n4.2 L’imagerie microscopie par contraste

d’interférence, microscopie à force atomique, microscopie confocale à balayage laser

Dans les différents types de microscopie optique décrits cidessus, les images obtenues sont essentiellement bidimensionnelles. D’autres techniques de microscopie optique ainsi que les techniques de microscopie électronique permettent l’observation tridimensionnelle de spécimens.

•

Quelle est la limite supérieure de grossissement en microscopie optique ?

•

Quelles techniques utilisées en microscopie optique permettent parfois d’augmenter la résolution ?

La microscopie par contraste d’interférence différentielle

•

Quelle couleur prend une bactérie Gram négatif après coloration de Gram ?

La microscopie par contraste d’interférence différentielle (en anglais DIC, pour differential interference contrast) est une technique de microscopie optique utilisant un polariseur qui produit de la lumière polarisée. Cette lumière polarisée passe à travers un

(a)

(b)

T. D. Brock

R. W. Castenholz

Définissez le terme résolution.

R. W. Castenholz

•

(c)

FIGURE 4.6 Observation de micro-organismes divers en microscopie à fluorescence. (a, b) Cyanobactéries. (a) Observation des bactéries en microscopie à fond clair. (b) Observation des mêmes en microscopie à fluorescence (longueur d’onde d’exposition égale à 546 nm). La couleur rouge vient de l’autofluorescence de la chorophylle a et d’autres pigments. (c) Bactéries filamenteuses Leucothrix mucor émettant une fluorescence verte après teinture avec un colorant fluorescent, l’acridine orange. Ces bactéries font 3 µm de diamètre et peuvent atteindre plus de 100 µm de longueur.



4.2 L’imagerie tridimensionnelle : microscopie par contraste d’interférence, microscopie à force atomique,

Le microscope à force atomique

adapté à l’observation tridimensionnelle des structures biologiques. En microscopie à force atomique, une fine pointe (sonde) est positionnée extrêmement près de l’échantillon, si bien que de faibles forces répulsives atomiques s’établissent entre la surface de l’échantillon et la sonde. L’échantillon subit un balayage vertical et horizontal, et la sonde enregistre en continu les variations mesurées à la surface du spécimen. Un ordinateur, par traitement de tous ces paramètres, reconstitue l’image de la surface du spécimen (voir figure 4.7b). Bien que les images obtenues par le microscope à force atomique soient identiques à celles de la microscopie électronique à balayage (comparez l’image de la figure 4.7b avec celle de la figure 4.10b), l’AFM présente l’avantage de n’employer ni fixateur ni enduit. Il permet ainsi l’observation de spécimens à l’état frais et hydratés, chose impossible en microscopie électronique.

Le microscope à force atomique (en anglais AFM, pour atomic force microscope) est un autre type de microscope

La microscopie confocale à balayage laser

Linda Barnett et James Barnett

prisme qui génère deux faisceaux. Ces faisceaux traversent le spécimen en des endroits différant légèrement par leur indice de réfraction et sont collectés ensuite par la lentille de l’objectif, où ils sont recombinés en un seul faisceau. Suivant les milieux traversés par chacun des rayons, ceux-ci subissent un déphasage différent qui crée ainsi un effet d’interférence. Cet effet permet d’intensifier les différences subtiles existant entre les structures intracellulaires. Ainsi, par microscopie DIC, les structures telles que le noyau des cellules eucaryotes (voir figure 4.7a), les endospores, les vacuoles et les granules des procaryotes prennent un aspect tridimensionnel. La microscopie DIC est particulièrement adaptée à l’observation des cellules non colorées, car elle permet de révéler les structures intracellulaires les moins visibles (ou même invisibles) par les techniques de microscopie à fond clair (comparez la figure 4.5a à la figure 4.7a).

Suzanne Kelly

(a)

(b) FIGURE 4.7 Imagerie tridimensionnelle des micro-organismes. (a) Microscopie par contraste d’interférence et (b) microscopie à force atomique. Les levures en (a) mesurent environ 8 µm de diamètre. Notez comme le noyau est bien visible (comparez la figure 4.7a à la figure 4.5a). Les bactéries en (b) mesurent environ 2,2 µm de longueur ; l’image provient d’un biofilm naturel développé à la surface d’une lame de verre plongée pendant 24 h dans le bol d’eau d’un chien. La lame a été séchée à l’air libre avant d’être observée en microscopie à force atomique.

La microscopie confocale à balayage laser (MCBL, en anglais CSLM, pour confocal scanning laser microscopy) est une technique de microscopie numérique où une source laser est couplée à un microscope optique. Cette technique de microscopie génère des images digitales tridimensionnelles de micro-organismes ou d’autres spécimens biologiques, après reconstruction par un ordinateur (voir figure 4.8). En MCBL, un rayon laser rebondit sur un miroir qui redirige le rayon à travers un dispositif de balayage. Le rayon laser passe ensuite à travers un « trou d’épingle » (pinhole), qui permet d’ajuster précisément le plan focal du rayon laser à un niveau de profondeur donné du spécimen. Grâce à l’éclairage d’un plan unique dudit spécimen, l’intensité de l’éclairage parasite (situé au-dessous et au-dessus du plan focal) diminue rapidement. Ainsi, la lumière émanant des plans autres que le plan focal (plans défocalisés) est minimisée. Au total, l’observation en MCBL d’échantillons épais tels que les biofilms microbiens (voir figure 4.8a) permet l’observation non seulement des bactéries situées en surface – telle que le permettrait la microscopie optique conventionnelle –, mais également celle des bactéries composant les différentes couches, cela grâce à l’ajustement du plan focal du rayon laser aux différentes profondeurs du biofilm. En MCBL, les bactéries sont fréquemment colorées avec des fluorochromes, ce qui permet de les distinguer (voir figure 4.8a). De manière alternative, des images artificiellement colorées peuvent être produites en ajustant le microscope de telle manière que les couches distinctes apparaissent colorées différemment. Un logiciel informatique réalise l’assemblage des images digitales issues des divers plans focaux, ce qui autorise ainsi la reconstruction en trois dimensions du spécimen entier (voir figure 4.8a). La MCBL trouve une large application en écologie microbienne, spécialement pour l’identification de populations bactériennes phylogénétiquement distinctes et présentes dans un habitat microbien donné (voir figure 18.11b pour un exemple) ou pour explorer la composition des couches successives d’un biofilm (voir figures 4.8a et 19.4b). Finalement, la MCBL permet l’étude des échantillons épais sur la totalité de leur épaisseur.



62 Chapitre 4


Subramanian Karthikeyan

m n4.3 La microscopie électronique

Gernot Arp et Christian Boeker, Carl Zeiss, Iéna

(a)

(b) FIGURE 4.8 Microscopie confocale à balayage laser. (a) Image confocale d’un biofilm microbien développé en laboratoire. Les bactéries vertes en forme de bacilles sont des Pseudomonas aeruginosa, introduites expérimentalement lors de la formation du biofilm. Les bactéries apparaissant d’une couleur distincte sont situées à différentes épaisseurs du biofilm. (b) Image confocale de cyanobactéries filamenteuses provenant d’un lac de soude.

La microscopie électronique utilise les électrons au lieu des photons pour la construction de l’image des cellules ou des structures intracellulaires. En microscopie électronique à transmission (MET), les électroaimants fonctionnent comme les lentilles et le système fonctionne entièrement sous vide (voir figure 4.9). Les microscopes électroniques sont équipés d’un appareil photo. Le microscope électronique à transmission est utilisé classiquement pour examiner les structures intracellulaires. Le pouvoir de résolution est bien meilleur qu’en microscopie optique et permet l’observation jusqu’au niveau moléculaire (voir figure 2.4b). Par exemple, alors que le pouvoir de résolution d’un bon microscope optique est de l’ordre de 0,2 micromètre, celui d’un bon microscope électronique est de l’ordre de 0,2 nanomètre. C’est pourquoi des molécules comme les protéines ou les acides nucléiques sont observables de manière individualisée en microscopie électronique. Contrairement à la lumière du visible, les sources d’électrons ne pénètrent pas bien ; même une unique cellule reste trop épaisse pour être observée directement. En conséquence, des techniques spécifiques de coupes fines sont nécessaires pour préparer les spécimens avant l’observation en microscopie électronique. Une seule bactérie subit ainsi de nombreuses coupes très fines (de 20 à 60 nm), qui sont ensuite observées une par une (voir figure 4.10a). Pour obtenir suffisamment de contraste, les préparations sont traitées avec des colorants tels que l’acide osmique, les sels de plomb, de permanganate, d’uranium ou de lanthanum. En effet, ces substances, composées d’atomes de haut poids atomique, dispersent les électrons, ce qui permet d’augmenter le contraste (voir figure 4.10a).


•

Quelle structure présente chez les eucaryotes est visualisée plus aisément en DIC qu’en microscopie à fond clair ? (Indice : comparez les figures 4.5a et 4.7a).

JEOL, USA Inc.

La microscopie confocale à balayage laser (MCBL) et la microscopie à contraste d’interférence différentielle (DIC) sont des techniques de microscopie optique permettant une observation tridimensionnelle bien meilleure que les autres techniques de microscopie optique. La MCBL permet en plus l’observation de spécimens épais. Le microscope à force atomique (AFM) permet l’observation détaillée tridimensionnelle de préparations à l’état frais.

•

Comment la MCBL permet-elle l’observation des différentes couches d’une préparation épaisse ?

FIGURE 4.9 Microscope électronique. Cet appareil compte à la fois des fonctions de microscope à balayage et de microscope à transmission.



4.4 Les morphologies cellulaires et la signification de la taille microscopique 63 Membrane

ADN

Stanley C. Holt

Paroi

FIGURE 4.10 Bactéries observées en microscopie électronique. (a) Microscopie électronique à transmission et (b) microscopie électronique à balayage. (a) Coupe fine de bactérie Gram positif typique, Bacillus subtilis. La bactérie vient de se diviser en deux entités qui sont délimitées par une membrane, mais encore rattachées par leur paroi. Notez la région claire correspondant à l’ADN ou nucléoïde. La bactérie mesure environ 0,8 µm de diamètre. (b) Bactéries phototrophes Rhodo-vibrio sodomensis. Cette bactérie mesure environ 0,75 µm de largeur. Notez combien la microscopie électronique à balayage offre une grande profondeur de champ et ainsi une excellente image tridimensionnelle.

F. R. Turner

(a)

(b)

La microscopie électronique à balayage Si seules les caractéristiques externes d’un organisme requièrent l’observation, les coupes fines ne sont pas nécessaires. Les cellules intactes ou les constituants cellulaires peuvent être directement examinés en MET grâce à une technique appelée coloration négative (voir figure 4.54). Une alternative est la microscopie électronique à balayage (MEB) [voir figures 4.9 et 4.10b]. En microscopie électronique à balayage, le spécimen est recouvert d’une fine couche d’un métal lourd tel que l’or. Un rayon d’électrons est dirigé vers le spécimen et le parcourt sur toute sa longueur. Les électrons dispersés par le métal sont collectés et activent un écran où l’image est produite (voir figure 4.10b). En MEB, l’observation est possible pour même d’assez grands spécimens et la profondeur de champ est excellente. De nombreux grossissements peuvent être obtenus, de 15× à plus de 100 000×, sachant que seule la surface d’un spécimen est observable.

Contrôlez vos acquis Les microscopes électroniques ont un pouvoir de résolution élevé par rapport aux microscopes optiques, puisque la limite de résolution est de l’ordre de 0,2 nm. Deux principaux types de microscopes électroniques existent : le microscope électronique à transmission, qui sert à observer les structures intracellulaires jusqu’au niveau moléculaire, et la microscopie électronique à balayage, utile pour les observations en trois dimensions et l’examen des surfaces.

•

Comment une image est-elle obtenue en microscopie électronique ?

•

Sachant que l’utilisation de fixateurs chimiques est nécessaire en microscopie électronique et que la technique doit s’effectuer sous vide, quel est l’inconvénient majeur des microscopes électroniques par rapport aux microscopes optiques ?

•

Quel type de microscope électronique serait adapté à l’observation du nucléoïde bactérien ?

morphologies cellulaires m n4.4 Les et la signification de la taille microscopique

En biologie, le terme morphologie fait référence à la forme cellulaire. Plusieurs morphologies sont connues chez les procaryotes et la plupart sont désignées par des termes spécifiques. Dans cette section, les différentes morphologies cellulaires seront détaillées de même que les avantages procurés par les petites tailles.

Les principales morphologies cellulaires La figure 4.11 montre les morphologies bactériennes typiques, schématisées et illustrées par des exemples de micro-organismes observés en microscopie en contraste de phase. Une bactérie de forme sphérique ou ovoïde s’appelle une coque (du latin coccus, au



Norbert Pfennig Norbert Pfennig

La taille des procaryotes varie de 0,2 µm à plus de 50 µm de diamètre. Seulement quelques très grands procaryotes, tels que le symbiote du poisson-chirurgien Epulopiscium fishelsoni (voir figure 4.12a), dépassent 80 µm de diamètre et peuvent excéder 0,6 mm de long (voir tableau 4.1). Le plus grand procaryote connu en terme de volume cellulaire total, la bactérie chimiolithotrophe sulfo-oxyadantée Thiomargarita (voir figure 4.12b), peut mesurer jusqu’à 0,75 mm (750 µm) de diamètre, ce qui le rend presque visible à l’œil nu. Les dimensions des procaryotes varient énormément, à la fois en taille et en volume (voir tableau 4.1). La plupart des grands procaryotes sont soit des bactéries sulfureuses, soit des cyanobactéries (voir chapitre 2 et tableau 4.1). La raison de cette grande taille n’est pas bien comprise, bien que l’on suppose que pour les bactéries sulfo-oxydantes cette grande taille soit la résultante d’un mécanisme de stockage intensif des substrats. L’hypothèse est que ce sont les limites des processus de diffusion et de métabolisme qui dictent de manière ultime l’expansion de la taille des procaryotes. Le taux de métabolisme d’une cellule varie de manière inversement proportionnelle avec le carré de sa taille. Ainsi, pour les grandes cellules, le mécanisme de diffusion pourrait limiter le métabolisme de sorte que la cellule ne serait plus assez compétitive. Cependant, les grandes tailles ne sont pas la norme dans le monde des procaryotes. À la différence des genres Thiomargarita ou Epulopiscium (voir figure 4.12), les dimensions moyennes d’un bacille, comme l’espèce Escherichia coli, sont de l’ordre de 1 à 3 µm, ce qui représente les dimensions typiques de la grande majorité des procaryotes. Par comparaison, les eucaryotes font de 2 µm à plus de 200 µm de diamètre. De manière générale, les procaryotes sont donc de petite taille par rapport aux eucaryotes. La raison de cette petite taille observée pour la plupart des procaryotes est qu’elle représente un avantage significatif. Par exemple, les échanges cellulaires avec le milieu extérieur (entrée des nutriments et sortie des déchets produits) sont plus faciles que dans une grande cellule, accélérant ainsi le métabolisme et la croissance cellulaires. Ceci est lié au fait que les petites cellules contiennent une aire de surface rapportée au volume

Bacille

Spirille

E. Canale-Parola

La taille des procaryotes

Coque

Spirochète

Pédoncule

Hyphe

Bactéries bourgeonnantes et appendiculées

Norbert Pfennig

pluriel, cocci). Une bactérie avec une forme cylindrique est appelée un bacille. Certains bacilles incurvés formant des spirales sont appelés des spirilles. Chez de nombreux procaryotes, les cellules restent en groupes ou en amas après leur division ; le mode d’arrangement de celles-ci est souvent caractéristique du type d’organisme. Par exemple, les cocci ou les bacilles peuvent se présenter sous forme de longues chaînes. Certains cocci forment des chaînes, d’autres des amas tridimensionnels, réguliers ou irréguliers. Certains groupes de bactéries se reconnaissent immédiatement du fait de leur forme très caractéristique : les spirochètes, bactéries fines spiralées, les bactéries appendiculées, qui possèdent des extensions de leur cellule sous forme de longs tubes ou de pédoncules, et les bactéries filamenteuses, qui forment de longues et fines cellules ou de longues chaînes de cellules (voir figure 4.11). Les formes cellulaires de la figure 4.11 doivent être abordées avec l’idée qu’elles représentent les principales morphologies. De nombreuses déclinaisons de ces morphologies basiques typiques, à la fois distinctes et subtiles, sont retrouvées dans le monde microbien.

Norbert Pfennig


T. D. Brock

64 Chapitre 4

Bactéries filamenteuses FIGURE 4.11 Représentation des différentes formes (morphologies) cellulaires chez les procaryotes. En regard de chaque dessin se trouve une microphotographie illustrant chaque morphologie. Les micro-organismes représentés sont des coques, Thiocapsa roseopersicina (diamètre d’une cellule = 1,5 µm) ; des bacilles, Desulfuromonas acetoxidans (diamètre = 1 µm) ; des bactéries spiralées comme Rhodospirillum rubrum (diamètre = 1 µm) ou le spirochète Spirochaeta stenostrepta (diamètre = 0,25 µm) ; des bactéries bourgeonnantes et appendiculées, Rhodomicrobium vannielii (diamètre = 1,2 µm) ; et des bactéries filamenteuses, Choroflexus aurantiacus (diamètre = 0,8 µm).



4.4 Les morphologies cellulaires et la signification de la taille microscopique 65

r = 1 µm

r = 1 µm Surface (4πr2) = 12,6 µm2 Volume (43 πr3) = 4,2 µm3

Esther R. Angert, université d’Harvard

Surface =3 Volume

(a)

r = 2 µm

r = 2 µm Surface = 50,3 µm2 Volume = 33,5 µm3

Surface = 1,5 Volume

Heidi Schulz

FIGURE 4.13 Relation entre la surface et le volume d’une cellule. Plus la taille de la cellule augmente, plus le rapport surface sur volume diminue.

(b) FIGURE 4.12 Quelques très grands procaryotes. (a) Photographie en microscopie à fond noir d’un procaryote géant, Epulopiscium fishelsoni, symbiote d’un poisson-chirurgien. E. fishelonsi est un bacille mesurant environ 600 µm (0,6 mm) de long et 75 µm de large, présenté sur cette image avec quatre Paramecium, protozoaires unicellulaires (eucaryotes) mesurant environ 150 µm de long chacun. E. fishelsoni appartient au domaine des Bacteria et est phylogénétiquement proche du genre Clostridium. (b) Thiomargarita namibiensis, bactérie chimiolithotrophe utilisant le soufre pour son métabolisme (phylum des Protéobactéries), est le plus grand des procaryotes actuellement connus. Une seule cellule (forme de coque) a un diamètre d’environ 400 µm (voir d’autres exemples de grands et petits procaryotes, tableau 4.1).

cellulaire plus importante que les grandes cellules. Considérons le cas simple de la sphère, dans laquelle le volume est fonction du rayon au cube (V = 4/3πr3), alors que l’aire de surface est fonction du carré du rayon (S = 4πr2). Ainsi, le rapport surface sur volume (S/V) d’une sphère est égal à 3/r (voir figure 4.13). Au total, une cellule de petit rayon a un rapport S/V supérieur à celui d’une cellule de grand rayon. En plus de l’échange de nutriments, le rapport S/V affecte d’autres aspects de la biologie cellulaire. Par exemple, le taux de croissance dépendant dans une certaine mesure du taux

d’échanges nutritionnels, le taux supérieur S/V des petites cellules permet un taux de croissance plus important que celui des grandes cellules. Donc, par unité de ressources disponibles, les petites cellules développeront typiquement de plus grandes populations que ne le feront les grandes cellules. Or, étant donné que les taux de mutations sont les mêmes pour tous les organismes, les grandes populations sont synonymes de plus de divisions cellulaires et donc de plus de mutations accumulées lors des erreurs spontanées survenant pendant la réplication de l’ADN. Les mutations sont à la source de l’évolution des procaryotes. Outre cet aspect, il faut rappeler que les procaryotes sont haploïdes (voir section 2.2) ; par conséquent, les mutations bénéfiques vont être immédiatement exprimées. La petite taille des procaryotes montre donc un autre avantage : celui de s’adapter rapidement aux changements des conditions environnementales et d’exploiter facilement les ressources des nouvelles niches écologiques.

Les limites inférieures de la taille des procaryotes En conséquence, il apparaît que plus les bactéries deviennent petites, plus elles cumulent les avantages sélectifs dans leur environnement. Cependant, il existe des limites à la petite taille des procaryotes. Certains microbiologistes ont avancé l’existence dans la nature de très petites bactéries, qu’ils appellent des nanobactéries. La taille de ces nanobactéries hypothétiques serait de l’ordre de 0,1 µm de diamètre pour les cocci, ou peut-être même inférieure ; ce qui est extrêmement petit, même pour des standards procaryotiques (voir tableau 4.1). La question qui se pose alors est de savoir si ces nanobactéries sont à considérer comme de vraies bactéries. Les nanobactéries ont été associées à la formation de précipités et des biofilms (voir section 19.3) dans des environnements aussi diversifiés que les surfaces minérales et les tissus humains. Même si certains microbiologistes croient fermement au concept de nanobactérie, d’autres pensent que les nanobactéries sont en fait de simples artefacts de réactions chimiques ou géochimiques de composés inertes, étant donné que même les bactéries les plus



66 Chapitre 4


TABLEAU 4.1

TAILLE ET VOLUME CELLULAIRES DE QUELQUES CELLULES PROCAYOTES (PAR ORDRE DÉCROISSANT)

Organisme

Caractéristiques

Taillea (µm)

Volume cellulaire (µm3)

750

200 000 000

Thiomargarita namibiensis

Bactérie sphérique chimiolithotrophe sulfo-oxydante

Epulopiscium fishelsoni

Bactérie chimio-organotrophe

80 × 600

3 000 000

Beggiatoa sp.

Bactérie filamenteuse chimiolithotrophe sulfo-oxydante

50 × 160

1 000 000

Achromatium oxaliferum

Bactérie ellipsoïde sulfo-oxydante

35 × 95

80 000

Lyngbya majuscula

Cyanobactérie sulfureuse

8 × 80

40 000

Prochloron sp.

Prochlorophyte

30

14 000

Thiovulum majus

Bactérie sphérique chimiolithotrophe sulfo-oxydante

18

3 000

Staphylothermus marinus

Hyperthermophile

15

1 800

Titanospirillum velox

Bactérie bacillaire chimiolithotrophe sulfo-oxydante

5 × 30

600

Magnetobacterium bavaricum

Bactérie magnétotactique

2 × 10

30

Escherichia coli

Bactérie chimio-organotrophe

1×2

2

Mycoplasma pneumoniae

Bactérie pathogène

0,2

0,005

a Quand un seul chiffre est donné, il s’agit du diamètre des bactéries sphériques. La valeur donnée est celle observée pour la plus grande cellule de l’espèce considérée. Par exemple, T. namibiensis mesure en moyenne 200 µm de diamètre. Mais, parfois, des cellules géantes de 750 µm ont été observées. Le diamètre moyen de S. marinus est de 1 µm. Source: D’après Schulz, H.N., et B. B. Jørgensen. 2001. Ann. Rev. Microbiol. 55: 105–137.

petites seraient significativement plus grandes que les nanobactéries (voir tableau 4.1). De plus, si l’on considère toutes les molécules intracellulaires essentielles à la physiologie bactérienne, il semble impensable que celles-ci puissent tenir dans un volume correspondant à un diamètre égal à 0,1 µm ou moins. Si toutefois de telles structures cellulaires existaient, elles seraient alors la forme de vie la plus petite jamais connue. Mis à part les nanobactéries, les habitats microbiens contiennent malgré tout des cellules de très petites tailles. Les océans, par exemple, contiennent 104 à 105 procaryotes par millilitre, ce qui signifie un diamètre de l’ordre de 0,2 à 0,4 µm. Des bactéries pathogènes peuvent également atteindre d’aussi petites tailles. Au total, il semble que de très petites bactéries existent bien dans la nature, mais que des structures de taille inférieure à 0,2 µm ne sont potentiellement pas viables (c’est-à-dire capables de se reproduire).

Contrôlez vos acquis Les procaryotes sont typiquement plus petits et plus polymorphes que les eucaryotes. Leur petite taille a une répercussion sur leur physiologie, leur taux de croissance et leur écologie. La question de l’existence des structures cellulaires de taille inférieure à 0,2 µm n’est pas tranchée. •

Citez trois types morphologiques décrits chez les procaryotes.

•

Quelle propriété physique des bactéries augmente avec la diminution de leur taille ?

II

MEMBRANES ET PAROIS BACTÉRIENNES

La membrane cytoplasmique et la paroi bactérienne sont deux structures très importantes chez les procaryotes. Ces deux structures sont déterminantes pour des fonctions précises et essentielles de la cellule, comme le transport des nutriments (membrane) ou la prévention de la lyse osmotique (paroi).

structure de la membrane m n4.5 Lacytoplasmique La membrane cytoplasmique est une structure fine qui entoure la cellule. Avec ses 8 nm d’épaisseur, cette structure vitale constitue une barrière séparant l’intérieur de la cellule (le cytoplasme) de son environnement. Si la membrane est cassée, l’intégrité cellulaire est atteinte, le cytoplasme se vide dans l’environnement et la cellule meurt. La membrane cytoplasmique est aussi une barrière de haute perméabilité sélective, permettant à la cellule de concentrer certains métabolites spécifiques et d’excréter ces déchets métaboliques.

La composition chimique des membranes La structure générale des membranes biologiques est une bicouche phospholipidique (voir figure 4.14). Les phospholipides contiennent à la fois des composants hydrophobes (acides gras) et hydrophiles (phosphates de glycérol), et peuvent exister sous de nombreuses formes chimiques par suite de la variation des substituants chimiques reliés à la chaîne



4.5 La structure de la membrane cytoplasmique 67

section 3.1). De plus, des cations comme Mg2+ et Ca2+ aident à stabiliser la membrane en se combinant aux charges négatives des phospholipides.

Région hydrophile

Acides gras

Région hydrophobe Région hydrophile Glycérol Phosphate

FIGURE 4.14 Structure d’une double couche phospholipidique. La membrane cytoplasmique a une largeur d’environ 8 nm (80 Å). Voir la figure 3.7 pour la structure d’un phospholipide.

principale de glycérol (voir section 3.4). Lorsque les phospholipides s’agrègent en solution aqueuse, ils forment spontanément une structure en double couche. Les acides gras se mettent vers l’intérieur, les uns en face des autres, alors que les portions hydrophiles restent exposées à l’environnement extérieur aqueux (voir figure 4.14). La bicouche ainsi formée représente l’arrangement le plus stable pour des molécules lipidiques dans un environnement aqueux. Une coupe fine de membrane cytoplasmique observée en microscopie électronique montre que la membrane cytoplasmique apparaît sous forme de deux lignes claires séparées par des zones sombres (voir figure 4.15a). Cette unité membranaire (chaque feuillet phospholipidique forme la moitié d’une unité) est constituée d’une bicouche phospholipidique (voir figure 3.7), dans laquelle sont enchâssées des protéines (voir figure 4.16). La majorité des protéines des membranes cytoplasmiques ont typiquement leurs surfaces externes hydrophobes au niveau des régions qui traversent la membrane et leurs surfaces hydrophiles qui sont en contact avec l’environnement extérieur et le cytoplasme (voir figure 4.16). La structure globale de la membrane cytoplasmique est stabilisée par des liaisons hydrogène et des interactions hydrophobes (voir

Les protéines membranaires La surface externe de la membrane cytoplasmique est au contact de l’environnement et chez certaines bactéries établit le contact avec une variété de protéines qui lient des substrats ou qui prennent en charge de grosses molécules pour les transporter dans la cellule (sur les protéines périplasmiques, voir la discussion aux sections 4.7 et 4.9). La face interne de la membrane cytoplasmique interagit avec des protéines impliquées dans des réactions produisant de l’énergie et d’autres fonctions cellulaires importantes. De nombreuses protéines membranaires sont enchâssées dans la membrane et sont appelées des protéines intramembranaires. D’autres, fermement attachées à l’une des surfaces membranaires, fonctionnent également comme des protéines de membranes. On y trouve les protéines du périplasme (région comprise entre la membrane cytoplasmique et la membrane externe des bactéries Gram négatif – voir section 4.9) et quelques protéines cytoplasmiques. Quelquesunes de ces protéines périphériques (extramembranaires), sont des lipoprotéines qui contiennent une queue lipidique liée à la fonction aminée de la protéine et permettant l’ancrage de la protéine à la membrane. Ces protéines interagissent directement avec les protéines transmembranaires et participent à des processus cellulaires essentiels tels que le métabolisme énergétique. Sur les schémas, la membrane cytoplasmique peut apparaître quelque peu rigide. En réalité (voir figures 4.15 et 4.16), elle est assez fluide, les phospholipides et les protéines ayant une certaine liberté de mouvement en son sein. Les membranes ont une viscosité proche de celle de l’huile. Ainsi, les protéines de membrane (ou protéines transmembranaires) enjambent une bicouche phospholipidique extrêmement mobile, mais cependant ordonnée. Dans la prochaine section, seront développées les implications de cette structure en mosaïque fluide dans les fonctions cellulaires.

En microscopie, les lignes noires entre les lignes claires = région des acides gras (hydrophobe)

G. Wanner

Lignes claires en microscopie = glycérol des phospholipides (hydrophile)

(a)

(b)

FIGURE 4.15 La membrane cytoplasmique. (a) Image en microscopie électronique d’empilements de membranes photosynthétiques dérivées de la membrane cytoplasmique chez la bactérie phototrophe Halorhodospira halochloris. Noter les multiples doubles couches phospholipidiques. Chaque double couche mesure environ 8 nm d’épaisseur. (b) Représentation schématique d’une unité membranaire visible en (a).



68 Chapitre 4

Composition et organisation de la cellule bactérienne Extérieur

Phospholipides

Groupements hydrophiles Groupements hydrophobes

Intérieur

Molécule de phospholipide

Protéines intramembranaires

FIGURE 4.16 Structure de la membrane cytoplasmique. La face interne de la membrane cytoplasmique est au contact du cytoplasme et la face externe, au contact du milieu extérieur. La membrane cytoplasmique est composée de phospholipides, dont les résidus hydrophobes sont dirigés vers l’intérieur et les groupes hydrophiles vers l’extérieur, où ils sont associés à l’eau. Des protéines sont enchâssées dans cette matrice et, du fait de leur grande hydrophilie, traversent la bicouche d’acides gras. Des protéines hydrophiles et d’autres composés chargés, comme les ions métalliques, peuvent s’accrocher aux surfaces hydrophiles. Malgré quelques différences dans la composition chimique, la structure globale de la membrane cytoplasmique est semblable chez les procaryotes et les eucaryotes (voir une exception dans la structure de la bicouche, figure 4.19d).

Les agents de renforcement de la membrane : stérols et hopanoïdes Une différence majeure dans la composition chimique des membranes entre les cellules eucaryotes et les cellules procaryotes est que les eucaryotes contiennent des stérols dans leurs membranes (voir figure 4.17a, b). Les stérols sont absents des membranes de virtuellement tous les procaryotes (à l’exception des bactéries méthanotrophes et des mycoplasmes – voir sections 12.6 et 12.21). En fonction du type cellulaire, les stérols représentent de 5 à 25 % des lipides totaux des membranes chez les eucaryotes. Les stérols et les molécules dérivées sont rigides et plans, alors que les acides gras sont flexibles. Ainsi, la présence de stérols stabilise une membrane et la rend moins flexible. Les molécules présentes chez les Bacteria et homologues des stérols s’appellent des hopanoïdes et jouent un rôle similaire à celui des stérols chez les eucaryotes. Un hopanoïde très répandu est un C30 appelé diploptène (voir figure 4.17b). Pour ce que l’on sait, les hopanoïdes sont absents chez les Archaea.

appelé l’isoprène (voir figure 4.18c). Néanmoins, l’architecture globale de la membrane cytoplasmique des Archaea, qui forme des surfaces hydrophiles externe et interne avec un intérieur hydrophobe, est la même que chez les Bacteria et les Eukarya.

CH3

H3C C H2C H2C H2C CH H

CH3 3

CH3 1

(a)

2

HO

3 CH3

CH3 1

Les membranes des Archaea Les lipides des Archaea diffèrent de ceux des autres organismes. À la différence des lipides des Bacteria et des Eukarya, chez qui les liaisons ester lient les acides gras au glycérol (voir figure 4.18a et la section 3.4), les lipides des Archaea ont des liaisons éther entre le glycérol et leurs chaînes latérales hydrophobes. De plus, les lipides des Archaea ne possèdent pas d’acides gras. À la place, les chaînes latérales sont composées d’unités répétées d’un hydrate de carbone à cinq carbones

CH3

(b)

CH3

2

CH3 CH3

CH3

FIGURE 4.17 Stérols et hopanoïdes. (a) Structure du cholestérol, un stérol typique. (b) Structure du diploptène, hopanoïde. Les stérols sont présents dans les membranes des eucaryotes et les hopanoïdes dans celles de certains procaryotes. L’indication des noyaux cycliques (1, 2 et 3) a pour but de montrer les similitudes entre la structure des stérols et des hopanoïdes.



4.6 Les fonctions de la membrane cytoplasmique 69 O H 2C

O

C

Ester R

O HC

O

C O

R

H2C

O

P

O–

H2C

O

C

R

HC

O

C O

R

H2C

O

P

O–

O–

O–

(a)

membranaires est une des caractéristiques majeures de ce groupe phylogénétique.

Éther

(b)

Contrôle CH3 H2C

C

C H

CH2

(c)

FIGURE 4.18 Liaisons chimiques des lipides. (a) La liaison ester est retrouvée dans les lipides des Bacteria et des Eukarya. (b) La liaison éther est celle des lipides des Archaea. (c) L’isoprène est la structure de base des chaînes hydrophobes latérales des lipides chez les Archaea. À la différence, chez les Bacteria et les Eukarya, les chaînes latérales des lipides sont composées d’acides gras.

Les diéthers et les tétraéthers de glycérol (voir figure 4.19a, b) sont les lipides majoritairement présents chez les Archaea. Dans la molécule de tétraéther, les chaînes latérales de phytanyle (composé de quatre molécules d’isoprène) de chaque molécule de glycérol sont liées entre elles par des liaisons covalentes (voir figure 4.19b). Cette structure donne alors une monocouche de lipides au lieu de la bicouche phospholipidique de la membrane cytoplasmique des Bacteria et des Eukarya (voir figure 4.19d). Les monocouches lipidiques sont résistantes à la dissociation. Ce type de structure membranaire est donc très répandu chez les Archaea hyperthermophiles, procaryotes adaptés à une croissance à de très hautes températures (voir sections 6.10 et 13.5 à 13.10). D’autres éléments distinguent également les Archaea des Bacteria, mais la composition chimique de leurs lipides

Liaison éther

Phytanyl CH3

H2C O C

CH3

HC O C H2COPO32–

Groupement CH3

La membrane cytoplasmique est une barrière perméable hautement sélective, construite à partir de lipides et de protéines qui forment une bicouche hydrophile à ses surfaces interne et externe, et hydrophobe en son milieu. D’autres molécules, telles que les stérols et les hopanoïdes, viennent renforcer la membrane et des protéines intégrales impliquées dans le transport, et d’autres fonctions la traversent. À la différence des Bacteria et des Eukarya, les Archaea contiennent des lipides avec des liaisons éther, et certaines espèces ont des membranes de type monocouche et non bicouche. •

Dessinez la structure basique d’une bicouche lipidique.

•

Pourquoi les composés tels que les hopanoïdes ou les stérols stabilisent-ils les membranes cytoplasmiques ?

•

Différenciez les liaisons entre le glycérol et les portions hydrophobes chez les Bacteria et les Archaea.

fonctions de la membrane m n4.6 Les cytoplasmique La membrane cytoplasmique est plus qu’une simple barrière séparant le milieu intracellulaire du milieu extracellulaire. La membrane joue un rôle important dans de nombreuses fonctions

FIGURE 4.19 Principaux lipides des Archaea et structures membranaires. (a) Diéthers de glycérol. (b) Tétraéthers de diglycérol. Notez que, dans les deux cas, l’hydrate de carbone est lié au glycérol par une liaison éther. L’hydrate de carbone en (a) est un biphytanyl glycérol diéther (C20) et en (b) un dibiphytanyl diglycérol tétraéther (C40). (c, d) Structure membranaire des Archaea. (c) Bicouche lipidique. (d) Monocouche lipidique.

(a) Diéther de glycérol Biphytanyl HOCH2

H2C O C HC O C H2COPO32–

C

O CH

C

O CH2

(b) Tétraéther de glycérol

Phosphate Glycérol Phytanyl

Biphytanyl

Protéine membranaire (c) Bicouche lipidique

(d) Monocouche lipidique



70 Chapitre 4


cellulaires. Avant tout, la membrane fonctionne comme une barrière perméable qui prévient la fuite passive des constituants cytoplasmiques (voir figure 4.20). De plus, elle est le site d’attache de nombreuses protéines, parmi lesquelles se retrouvent les enzymes impliquées dans le transport intra ou extracellulaire de substances. La membrane cytoplasmique est le site principal pour la conservation de l’énergie cellulaire (voir chapitre 5). La membrane peut exister sous une forme « chargée » en énergie, provenant de la séparation des protons (H+) des ions hydroxyles (OH–) à sa surface (voir figure 4.20). Cette séparation de charge représente une forme d’énergie analogue à l’énergie potentielle présente dans une batterie chargée. Cette forme énergétique liée à la membrane s’appelle la force protonmotrice (FPM) et est responsable de la bonne conduction de nombreuses fonctions cellulaires demandant de l’énergie, comme certaines formes de transport, la mobilité et la biosynthèse d’une forme d’énergie cellulaire, l’ATP.

La membrane cytoplasmique, barrière perméable L’intérieur d’une cellule est composé d’une solution aqueuse de sels, de sucres, d’acides aminés, de nucléotides, de vitamines, de coenzymes et d’une variété d’autres matériaux solubles. La nature hydrophobe de la portion intérieure de la membrane cytoplasmique (voir figure 4.16) en fait une barrière de diffusion assez imperméable. Bien que de petites molécules

hydrophobes puissent passer à travers la membrane par diffusion simple, les molécules hydrophiles ou chargées doivent faire l’objet de transports spécifiques. Parce qu’elle est chargée, une molécule aussi petite que l’ion hydrogène (H+) ne peut pas diffuser à travers la membrane cytoplasmique. L’eau est une molécule qui pénètre librement à travers la membrane, car elle est suffisamment petite pour passer entre les molécules de phospholipides de la bicouche membranaire (voir tableau 4.2). Le transport de l’eau à travers la membrane peut être grandement accéléré grâce à des protéines de transport appelées aquaporines. Ces protéines forment des canaux qui traversent la membrane, permettant le transport spécifique de l’eau à l’intérieur ou à l’extérieur du cytoplasme. L’aquaporine AqpZ d’Escherichia coli, par exemple, est un canal à eau bien étudié. La synthèse de la protéine AqpZ est très augmentée en cas de pression osmotique faible. Sous de telles conditions, AqpZ fonctionne en tant qu’exportateur d’eau, de manière à prévenir un choc hypo-osmotique. Au contraire, en cas de pression hyperosmotique, de moindres quantités d’AqpZ sont présentes et, cette fois-ci, les protéines transportent les molécules d’eau dans la cellule pour contrecarrer la tendance de l’eau à aller vers la solution à plus forte concentration de solutés, c’est-à-dire vers le milieu extracellulaire. Le tableau 4.2 indique la perméabilité relative de quelques substances biologiques d’importance. La plupart des substances ne peuvent pas entrer de manière passive dans la cellule et nécessitent alors un mode de transport. Les données du tableau 4.2 doivent être analysées avec l’idée que le flux hydrique dans les cellules procaryotes se fait par le biais des aquaporines et ne vient pas entièrement de la diffusion à travers la membrane.

La nécessité de protéines de transport 1. Barrière perméable. Prévient les fuites et fonctionne comme un lieu de passage pour le transport des nutriments dans ou à l’extérieur de la cellule.

Le transport par des protéines implique plus que la simple prise en charge de composés à travers la membrane, car il y a une accumulation de solutés contre des gradients de concentration. La nécessité de transport médié par des transporteurs chez les micro-organismes est facile à comprendre. Si la diffusion était le seul moyen pour les solutés de pénétrer dans les cellules, celles-ci n’atteindraient jamais les concentrations

TABLEAU 4.2

H+

+++ –

++++++++ –––––––

OH-

++++ ––

+++++++++++++ ++ –––––––––––– ––

+++++ ––––

3. Conservation de l’énergie. Site de synthèse et d’utilisation de la force proton-motrice. FIGURE 4.20 Principales fonctions de la membrane cytoplasmique. Bien que de structure fragile, la membrane cytoplasmique a beaucoup de fonctions cellulaires importantes.

COMPARAISON DE LA PERMÉABILITÉ MEMBRANAIRE VIS-À-VIS

2. Ancrage des protéines. Emplacement de nombreuses protéines impliquées dans le transport, les voies énergétiques et la chimiotaxie.

DE DIFFÉRENTES MOLÉCULES

Substance Eau

Taux de perméabilitéa 100

Glycérol

0,1

Tryptophane

0,001

Glucose

0,001

Ion chlorure

0,000001

Ion potassium

0,0000001

Ion sodium

0,00000001

a

Échelle relative – perméabilité calculée par rapport à celle de l’eau fixée à 100. La perméabilité de la membrane vis-à-vis de l’eau peut être modifiée par les aquaporines (voir texte).



Taux d’entrée du soluté

4.7 Les systèmes de transport membranaire 71

Contrôlez vos acquis Transporteur saturé par le substrat

Transport par l’intermédiaire d’un transporteur Diffusion simple

Concentration extracellulaire du soluté FIGURE 4.21 Relation entre le taux d’entrée et la concentration extracellulaire lors de la diffusion et du transport. Notez que, dans les processus faisant intervenir des transporteurs, le taux d’entrée montre une saturation à de faibles concentrations extracellulaires.

intracellulaires nécessaires à la réalisation des réactions biochimiques. En effet, à la fois le taux d’entrée et le taux intracellulaire des solutés diffusables sont proportionnels à leur concentration externe (voir figure 4.21). La concentration des nutriments dans la nature est toutefois souvent très faible, beaucoup plus faible que dans les milieux de culture (solutions utilisées pour faire croître les micro-organismes au laboratoire). Ainsi, les bactéries doivent être équipées de systèmes pour capter les nutriments à des taux supérieurs à ceux trouvés dans la nature ; c’est la fonction des systèmes de transport. Contrairement à la diffusion simple, les systèmes de transport utilisant des transporteurs montrent un phénomène de saturation. Si la concentration des substrats est suffisamment forte pour saturer le transporteur, ce qui arrive typiquement à de faibles concentrations de substrats, le taux d’entrée de substrats est maximal et l’addition de substrats supplémentaires n’augmente pas le taux (voir figure 4.21). Cette caractéristique aide énormément les cellules à concentrer les nutriments dans le cytoplasme, même à partir d’un environnement où les nutriments sont souvent très dilués. Une autre caractéristique des processus de transport assurés par des transporteurs est la nature hautement spécifique du type de transport. De nombreuses protéines de transport réagissent uniquement avec une seule molécule, alors que d’autres montrent une affinité pour une classe de molécules. Par exemple, il existe des transporteurs pour une grande variété de sucres ou d’acides aminés. Cette polyvalence dans l’entrée de substrats réduit le nombre de protéines de transport nécessaires à l’entrée de chaque acide aminé ou de chaque sucre. La synthèse des protéines de transport est également régulée par la bactérie, de telle manière que les composants spécifiques des transporteurs présents dans la membrane sont dépendants à la fois du type de nutriments présents dans l’environnement et de leur concentration. Cette dernière est un facteur important, car le mode de transport de nutriments particuliers varie fréquemment en fonction de leur concentration : quand le nutriment est présent à de fortes concentrations, un premier type de transporteur intervient ; quand il l’est à de faibles concentrations, un autre type de transporteur intervient, d’une plus grande affinité.

La fonction principale de la membrane cytoplasmique est, telle une barrière de perméabilité, de prévenir la fuite des métabolites cytoplasmiques dans l’environnement. La perméabilité sélective prévient aussi la diffusion de la plupart des solutés. Pour accumuler les nutriments contre leur gradient de concentration, des mécanismes de transport spécifiques sont employés. •

En plus de la perméabilité, quelles autres fonctions assurent la membrane cytoplasmique ?

•

Citez deux raisons pour qu’une cellule ne puisse dépendre de la diffusion comme seul moyen d’accumuler des nutriments dans son cytoplasme.

•

Pourquoi la destruction physique de la membrane cytoplasmique est-elle plus grave que celle d’autres composants cellulaires ?

systèmes de transport m n4.7 Les membranaire Comme nous l’avons vu plus haut, le transport des nutriments et l’expulsion des déchets cellulaires sont des événements cellulaires fondamentaux. Différents mécanismes de transport ont évolué chez les procaryotes, chacun ayant ses caractéristiques propres.

Structure et fonction des protéines de transport membranaires Il existe trois systèmes de transport des substances chez les procaryotes : le transport simple, la translocation de groupe et le système ABC. Le transport simple requiert une protéine intramembranaire uniquement. La translocation de groupe implique une série de protéines lors du transport. Le système ABC implique une protéine liant le substrat, un transporteur membranaire et une protéine hydrolysant l’ATP (voir figure 4.22). Tous ces systèmes de transport nécessitent de l’énergie, sous forme de force protonmotrice, d’ATP ou d’autres composés riches en énergie. Les protéines intramembranaires de tous les systèmes de transport bactériens connus montrent des homologies significatives, à la fois dans leurs structures primaire et secondaire, témoins des racines communes de leur évolution. Structurellement, ces transporteurs ont une architecture comportant douze hélices alpha (voir section 3.7) transmembranaires, formant un canal au travers duquel les substances sont transportées dans la cellule (voir figure 4.23). Le transport implique un changement conformationnel de la protéine après sa liaison à son substrat, ce qui déclenche alors la circulation du substrat à travers la membrane. Au total, trois classes de transporteurs sont connues (voir figure 4.24). Les uniports transportent une molécule de manière unidirectionnelle à travers la membrane. Les transporteurs symports transportent une substance dans le même sens qu’une autre substance, souvent un proton (H+). Les antiports, comme leur nom l’indique, transportent une substance à travers la membrane dans une direction, tout en transportant simultanément une seconde substance dans la direction opposée (voir figure 4.23).



72 Chapitre 4


Extérieur

Transport simple : grâce à l’énergie de la force motrice protonique

Intérieur Lactose H+

H+

Na+

H+ +

– OH–

H+ +

– OH–

H+ +

P HPO42–

R~P

– OH– – OH–

Lactose perméase Lac (symport)

H+

Substance transportée Translocation de groupe : modification chimique de la substance transportée grâce à un phosphoénolpyruvate

H+ + H+ +

H+ +

Antiport sodium-proton – OH–

H+

Symport phosphate

H+

1

H+ +

2

– OH–

Uniport potassium K+

Le système ABC : des protéines de liaison périplasmiques sont impliquées et l’énergie provient de l’ATP

3 ATP

ADP + Pi

H+ +

– OH–

H+ +

– OH–

H+ +

– OH–

H+

– OH–

Symport sulfate

H+

FIGURE 4.22 Les trois systèmes de transport membranaire. Notez que les transporteurs simples et les systèmes de type ABC transportent les molécules sans les modifier chimiquement, alors que la translocation de groupe aboutit à une modification chimique (phosphorylation) de la substance transportée. Les trois protéines du système ABC sont désignées par les chiffres 1, 2 et 3.

Entrée du lactose chez Escherichia coli : la perméase Lac La bactérie Escherichia coli métabolise le lactose (dissacharide). Le lactose est transporté par les cellules d’E. coli grâce à un symport appelé perméase Lac. La perméase Lac est un transporteur simple. Sur la figure 4.24, l’activité de cette perméase Lac est comparée à d’autres transporteurs simples, dont des uniports et des antiports.

Extérieur

HSO4–

Extérieur

+

Intérieur

FIGURE 4.24 Perméase Lac (transport de type symport) et autres transporteurs simples caractérisés chez Escherichia coli. Pour des raisons de simplification, des formes globulaires représentent les protéines transmembranaires (voir leurs structures à la figure 4.23). Notez que les symports et antiports fonctionnent grâce à l’énergie de la force proton-motrice. Cette dernière est régénérée grâce à des réactions cellulaires génératrices d’énergie (réactions cataboliques).

La perméase Lac a besoin d’énergie pour fonctionner. À chaque molécule de lactose transportée, l’énergie de la force proton-motrice est lentement diminuée à cause du cotransport des protons dans la cellule. Cependant, la force protonmotrice est rétablie dans la cellule grâce à l’énergie produite par des réactions qui seront décrites plus loin (voir chapitres 5 et 17). Le résultat net de l’activité de la perméase Lac est l’accumulation de lactose jusqu’à une concentration élevée suffisante pour que sa métabolisation fournisse de l’énergie nécessaire à la cellule.

La translocation de groupe : le système phosphotransférase Intérieur

Uniport

Antiport

Symport

FIGURE 4.23 Structure de trois types de transporteurs transmembranaires et événements associés. Chez les procaryotes, les transporteurs transmembranaires contiennent typiquement douze hélices alpha agencées en cercle et formant un canal à travers la membrane. Pour l’antiport et le symport, les molécules cotransportées sont indiquées en jaune.

La translocation de groupe est un mécanisme de transport au cours duquel la substance transportée est chimiquement transformée pendant le passage à travers la membrane. Le système de translocation de groupe le mieux étudié est celui du transport des sucres tels que le glucose, le mannose et le fructose chez E. coli. Ces composés sont phosphorylés pendant le transport par le système phosphotransférase. Le système phosphotransférase est constitué d’une famille de protéines, dont cinq sont nécessaires pour transporter un sucre donné. Avant que le sucre ne soit transporté, les protéines du



4.7 Les systèmes de transport membranaire 73

système sont elles-mêmes alternativement phosphorylées et déphosphorylées en cascade, jusqu’à ce que la protéine transmembranaire, l’enzyme IIc, accepte le groupement phosphate et phosphoryle le sucre (voir figure 4.25). La petite protéine appelée HPr, l’enzyme qui la phosphoryle (enzyme I) et l’enzyme IIa, sont des protéines cytoplasmiques. À la différence, l’enzyme IIb est liée à la surface interne de la membrane et l’enzyme IIc est une protéine membranaire intégrale (voir figure 4.25). L’enzyme I et HPr sont des constituantes non spécifiques du système phosphotransférase et participent à l’entrée de différents sucres, alors que les enzymes II spécifiques existent pour chaque sucre transporté de manière individualisée (voir figure 4.25). L’énergie pour le système phosphotransférase vient d’un composé riche en énergie, le phosphoénolpyruvate. Cependant, il faut noter que, bien que de l’énergie, sous la forme d’un phosphate lié riche en énergie, soit consommée pendant le transport de la molécule de glucose (voir figure 4.25), dans tous les cas, la phosphorylation du glucose en glucose-6-P est la première étape de sa métabolisation intracellulaire (glycolyse – voir section 5.10). Ainsi, le système phosphotransférase prépare le glucose pour son entrée immédiate dans la voie métabolique principale.

Les protéines périplasmiques et le système ABC Nous apprendrons un peu plus loin dans ce chapitre (voir section 4.9) que les bactéries Gram négatif contiennent un espace appelé le périplasme, situé entre la membrane cytoplasmique, et une membrane externe riche en lipides (voir figure 4.35). Le périplasme contient des protéines variées, dont de nombreuses sont impliquées dans des fonctions de transport. Celles-ci sont appelées protéines liées au périplasme. Les systèmes de transport de ce type utilisent trois composants : 1) les protéines liées au périplasme ; 2) les protéines transmembranaires et 3) les protéines hydrolysant l’ATP (kinases). Ces dernières fournissent l’énergie nécessaire. Les transporteurs de ce type s’appellent des transporteurs ABC, ABC signifiant ATP-binding cassette c’est-à-dire cassette

de liaison à l’ATP (voir figure 4.26). Plus de 200 transporteurs ABC ont été identifiés chez les procaryotes et les études de structure ont montré qu’ils sont clairement liés à la même famille de protéines. Les transporteurs ABC existent pour le transport de nutriments tels que les sucres et les acides aminés, pour une variété de nutriments inorganiques tels que les sulfates, les phosphates et les métaux. Une des propriétés intéressantes des transporteurs ABC est la très grande affinité des protéines périplasmiques pour leurs substrats. Ces protéines peuvent bouger au sein du périplasme et se lier à leurs substrats même en cas de très faible concentration. Par exemple, les concentrations de substrat de 1 micromolaire (10–6 M) ou moins peuvent aisément être liées et transportées par les protéines périplasmiques. Une fois lié, le complexe interagit avec la protéine transmembranaire et le transport est conduit grâce à l’énergie fournie par l’ATP (voir figure 4.26). De manière intéressante, même si les bactéries Gram positif n’ont pas de périplasme, ce type de système de transport a été retrouvé. Mais, chez les bactéries Gram positif, les protéines de liaison au substrat ne sont pas mobiles et, au contraire, sont ancrées dans la membrane cytoplasmique. Néanmoins, comme chez les Gram négatif, une fois que ces protéines ont lié leur substrat, elles interagissent avec un composant transmembranaire qui, grâce à l’hydrolyse de l’ATP, permet leur transport à travers la membrane.

L’export de protéines Jusqu’à présent, notre discussion a porté sur les petites molécules. Qu’en est-il des grosses molécules telles que les protéines ? Pour fonctionner correctement, de nombreuses protéines ont besoin d’être transportées hors du cytoplasme ou d’être insérées dans la membrane. La translocation de protéines se fait chez les procaryotes grâce à l’activité de protéines appelées les translocases ; le système Sec (pour sécrétion) en est un exemple majeur. SecYEG est ainsi une translocase de membrane qui exporte certaines protéines tout en insérant d’autres dans la membrane avec

Intérieur Composants non spécifiques

Extérieur

Composants spécifiques Membrane cytoplasmique

PEP Enz I

HPr

Enz IIa

Enz IIb

Pyruvate

Enz IIc P

P

Glucose P Glucose 6_P

Sens du transport FIGURE 4.25 Mécanismes du système phosphotransférase chez Escherichia coli . Pour l’entrée de glucose, le système comprend cinq protéines : l’enzyme (Enz) I ; les enzymes IIa, IIb et IIc, et HPr. Le phosphate est transféré successivement du phosphoénolpyruvate (PEP), via des protéines, jusqu’à l’enzyme IIc. Sur le schéma, cette dernière transporte (et phosphoryle) le sucre. Les protéines HPr et l’enzyme I sont non spécifiques et impliquées dans le transport de tous les sucres. Les composants de l’enzyme II sont spécifiques d’un sucre particulier.



74 Chapitre 4


Périplasme

Peptidoglycane Protéine périplasmique

Expliquez la différence d’énergie requise par les transporteurs simples, le système phosphotransférase et le système de transport ABC.

•

Expliquez les différences entre les trois systèmes de transport quant aux transformations chimiques de la molécule transportée.

•

Quel type de transport est le plus adapté aux nutriments présents dans l’environnement à de très faibles concentrations et pourquoi ?

•

Comment les protéines sont-elles exportées de la cellule ?

Substance transportée

Extérieur

Transporteur membranaire

paroi des procaryotes m n4.8 La(bactéries) : le peptidoglycane

Intérieur Protéine hydrolysant l’ATP

•

et les autres molécules

ATP

ADP+Pi

FIGURE 4.26 Mécanisme des transporteurs de type ATPBinding Cassette (ABC). La protéine de liaison périplasmique a une grande affinité pour le substrat, la protéine transmembranaire forme le canal de transport et la protéine cytoplasmique hydrolysant l’ATP apporte l’énergie pour le transport. Chez Escherichia coli, le système de transport du maltose (disaccharide) est un exemple de transporteur de type ABC. La structure de la paroi des bactéries Gram négatif, incluant le périplasme, est développée à la section 4.9.

une orientation spécifique compatible avec leur fonction. Alors que certaines translocases sont spécifiques du type de protéines exportées, SecYEG est largement distribuée chez les procaryotes et peut transporter une large variété de protéines. Nous discuterons dans un prochain chapitre le mode de reconnaissance des protéines destinées au transport (voir section 7.17). L’export de protéines est important pour la bactérie, car de nombreuses enzymes fonctionnent en dehors de la cellule (exoenzymes). Par exemple, les exoenzymes hydrolytiques telles que l’amylase ou la cellulase, sont exportées directement dans l’environnement extérieur, où elles clivent l’amidon ou la cellulose (voir figure 3.6b), respectivement, en glucose. Ce sucre est ensuite utilisé par la cellule comme source de carbone et d’énergie. De plus, de nombreuses bactéries pathogènes excrètent des toxines ou d’autres protéines délétères pour l’hôte durant le processus d’infection. Toutes ces grandes molécules ont besoin de passer la membrane cytoplasmique et les translocases telles que SecYEG les assistent dans ce transport.

Contrôlez vos acquis En tout, trois types de transporteurs sont connus : les transporteurs simples, les transporteurs de type phosphotransférase et les systèmes ABC, ces derniers contenant trois types de composants interagissant. Le transport requiert de l’énergie tirée de la force protonmotrice, de l’ATP ou d’autres substrats riches en énergie.

Les bactéries contiennent une grande concentration de solutés dissous. Ceci cause une pression considérable – près de deux atmosphères chez Escherichia coli, ce qui correspond à la pression des pneus d’une automobile. Pour contenir cette pression, la bactérie possède une paroi, également responsable dans une certaine mesure de la forme et de la rigidité cellulaire. Les espèces de Bacteria se partagent en deux groupes majeurs, les bactéries Gram négatif et celles Gram positif. Cette distinction est fondée sur la coloration de Gram (voir section 4.1). Mais, ce sont en fait les différences dans la structure de la paroi qui sont au cœur de la réaction à la coloration de Gram. En microscopie électronique, l’aspect de la paroi des deux types de bactéries diffère totalement, comme le montre la figure 4.27. La paroi des bactéries Gram négatif est une structure assez complexe formée de plusieurs feuillets, alors que la paroi des bactéries Gram positif est constituée d’un seul type de molécule et est souvent plus épaisse. Dans cette section, sera développé le composant polysaccharidique de la paroi des procaryotes, à la fois des Bacteria et Archaea. Ceci inclut en particulier le peptidoglycane, mais aussi toute une variété de polysaccharides proches ou non, retrouvés chez les Archaea. Les constituants de la paroi des bactéries Gram négatif seront décrits dans la section 4.9.

Le peptidoglycane La paroi des Bacteria possède une couche rigide responsable de la résistance de la paroi. Chez les bactéries Gram négatif, des feuillets supplémentaires sont présents du côté extérieur de la couche rigide. Cette couche rigide est très similaire dans sa composition chimique entre les bactéries Gram négatif et les bactéries Gram positif. Appelé peptidoglycane, ce polysaccharide est composé de deux dérivés, la N-acétylglucosamine et l’acide N-acétylmuramique, et d’un petit nombre d’acides aminés spécifiques incluant la L-alanine, la D-alanine, l’acide D-glutamique, et soit la lysine, soit l’acide diaminopimélique (DAP) [voir figure 4.28]. Ces constituants sont connectés pour former une structure répétée, le tétrapeptideglycane (voir figure 4.29).



4.8 La paroi des procaryotes (bactéries) : le peptidoglycane et les autres molécules

75

Gram négatif

Gram positif

Peptidoglycane

Peptidoglycane

Membrane (a)

(b)

Membrane Périplasme Membrane externe (lipopolysaccharide et protéine)

Outer membrane Membrane externe

Membrane Cytoplasmic membrane cytoplasmique

Peptidoglycane

Peptidoglycan Peptidoglycane

J. L. Pate

T. D. Brock et S. F. Conti


(c)

(e)

A. Umeda et K. Amako

A. Umeda et K. Amako

(d)

(f)

FIGURE 4.27 Les parois des bactéries. (a, b) Représentation schématique de la paroi des bactéries Gram positif et Gram négatif. (c) Microscopie électronique à transmission montrant la paroi d’une bactérie Gram positif, Arthrobacter crystallopoietes, et (d) d’une bactérie Gram négatif, Leucothrix mucor. (e, f) Images en microscopie électronique à balayage d’une bactérie Gram positif (Bacillus subtilis) et d’une bactérie Gram négatif (Escherichia coli). Notez la texture de la surface des bactéries en (e) et en (f). Une cellule bactérienne de B. subtilis ou d’E. coli mesure 1 µm de diamètre.



76 Chapitre 4


La structure basique du peptidoglycane est celle d’une couche d’épaisseur variable entourant la bactérie, formée de feuillets individualisés de peptidoglycane reposant les uns sur les autres. Les chaînes de glycanes sont reliées entre elles par des ponts tétrapeptidiques, c’est-à-dire constitués de quatre acides aminés. Les ponts glycosidiques reliant les sucres au sein de la chaîne glycane sont très solides, mais seuls ils seraient incapables de procurer une rigidité multidirectionnelle. La rigidité globale de la structure du peptidoglycane est achevée seulement lorsque ces chaînes sont reliées par les acides aminés. Ce maillage intervient à différents degrés chez les Bacteria, une plus grande rigidité étant obtenue avec son augmentation. Chez les bactéries Gram négatif, les liaisons se font par un pont interpeptidique réalisé entre le groupement aminé du DAP et le groupement carboxyle de la D-alanine terminale (voir figure 4.30). Chez les bactéries Gram positif, les liaisons se font par l’intermédiaire d’un pont interpeptidique, le nombre et le type d’acides aminés variant entre les espèces. Par exemple, chez Staphylococcus aureus, cocci Gram positif très étudié, le pont interpeptidique est constitué de cinq molécules de glycine (voir figure 4.30b). La structure globale d’une molécule de peptidoglycane est représentée à la figure 4.30c. Chez les bactéries Gram positif, jusqu’à 90 % de la paroi cellulaire sont constitués de peptidoglycane, bien qu’une autre molécule, l’acide teichoïque (abordé plus loin dans cette section), soit généralement présente en petites quantités. Et, bien que certaines bactéries aient un seul feuillet de peptidoglycane, nombreuses sont celles, notamment Gram positif, à avoir plusieurs (plus de 25) de ces feuillets empilés les uns sur les autres. Chez les bactéries Gram négatif, seulement 10 % de la paroi sont constitués de peptidoglycane, la grande part de la

paroi étant constituée par la membrane externe (voir section 4.9). Que ce soit pour les bactéries Gram positif ou Gram négatif, la morphologie est déterminée par la longueur des chaînes de peptidoglycane et, dans une certaine mesure, par l’importance des liaisons établies entre les chaînes.

La diversité dans la structure du peptidoglycane Le peptidoglycane est uniquement présent chez les espèces de Bacteria ; l’acide N-acétylmuramique et l’acide diaminopimélique n’ayant jamais été trouvés dans la paroi des Archaea et des Eukarya. Quoi qu’il en soit, la totalité des espèces de Bacteria ne possède pas de DAP dans le peptidoglycane. Cet acide aminé est présent dans le peptidoglycane de toutes les bactéries Gram négatif et chez quelques espèces Gram positif, mais la plupart des cocci Gram positif possèdent une lysine à la place du DAP (voir figure 4.30b) ; quelques autres bactéries Gram positif possèdent d’autres acides aminés. Une autre caractéristique dans la structure du peptidoglycane est la présence de deux acides aminés ayant la configuration D, la D-alanine et l’acide D-glutamique. Or, comme nous l’avons vu chapitre 3, les acides aminés cellulaires sont toujours sous la forme énantiomérique L (voir section 3.6).

Squelette de glycane G

M

G

G

Peptides

L-Ala

H O β(1,4

)

H OH

H

H

NH

Groupement N-acétyle

C

H H

O β(1,4

H

) H

D-Ala

L-Lys

Gly

D-Ala

DAP

D-Ala

Gly

HC

CH3

C

C CH3 O

NH

Ponts interpeptidiques

H3C

O

CH C

C CH2 CH2 CH NH2

NH

HOOC C CH2 CH2 CH2 CH H

O C NH

H3C CH COOH

Gly

L-Ala

M

D-Ala

G

L-Lys

(a) Escherichia coli (gram négatif)

O β(1,4

D-Glu-NH2 L-Ala

) G

O

M

G

(b) Staphylococcus aureus (gram positif)

CH3

Liaison sensible à l’action du lysozyme

M

G G

NH

O

Gly

D-Glu

NH

O

O

Gly

D-Glu-NH2

G

H

Pont interpeptidique

DAP

CH2OH O H

G

L-Ala

D-Glu

N-Acétylglucosamine (G) Acide N-acétylmuramique (M) CH2OH O

M

L-Alanine

M M M

G M

COOH

Acide D-Glutamique Acide mésodiaminopimélique D-Alanine

FIGURE 4.29 Structure des unités répétées du peptidoglycane de la paroi bactérienne, le glycane-tétrapeptide. La structure est celle présente chez Escherichia coli et chez la majorité des bactéries Gram négatif.

M

G

M G

M G M G M

M

G

M

G G

G M G M G

G G

M M

G

G G

M M

G M

M M M M

G G

G G M

M

G M G M G

G

M M M

M

G G

G G G

G

M M M

M M M

G G G

(c) FIGURE 4.30 Connexion entre les unités peptidiques et glycanes formant le peptidoglycane chez Escherichia coli et Staphylococcus aureus. (a) Aucun pont interpeptidique n’est présent chez E. coli et chez les autres bactéries Gram négatif. (b) Le pont glycine interpeptidique chez S. aureus (Gram positif). (c) Structure globale du peptidoglycane. G, N-acétylglucosamine ; M, acide N-acétylmuramique.



4.8 La paroi des procaryotes (bactéries) : le peptidoglycane et les autres molécules

COOH

COOH

H2N CH

H2N CH

CH2

CH2

CH2

CH2

CH2

CH2

H2N CH

H2N CH

COOH

H

(a)

(b)

FIGURE 4.28 Acides aminés de liaison du peptidoglycane. (a) Acide diaminopimélique. (b) Lysine. La couleur surligne la seule différence entre les deux molécules. En plus de ces deux acides aminés, d’autres sont retrouvés au sein du peptidoglycane.

Plus de cent types différents de peptidoglycanes sont connus, les variations étant situées au niveau des ponts interpeptidiques. La chaîne glycane est toujours uniforme quel que soit le type de peptidoglycane, avec l’alternance des seuls oses Nacétylglucosamine et acide N-acétylmuramique. Ces sucres sont toujours liés par les liaisons β-1,4 osidiques (voir figure 4.29). Le tétrapeptide montre des variations au niveau d’un seul acide aminé, avec une alternance entre la lysine et le DAP. Cependant, l’acide D-glutamique est hydroxylé en position 2 chez certaines espèces, alors que chez d’autres espèces les substitutions sont en positions 1 et 3 des acides aminés. Tous les acides aminés présents dans le tétrapeptide peuvent intervenir dans la formation du pont interpeptidique, mais de plus un certain nombre d’acides aminés tels que la glycine, la thréonine, la sérine et l’acide aspartique peuvent participer à l’élaboration de ces ponts interpeptidiques. Cependant, les acides aminés branchés ou contenant un noyau aromatique ou

Protéine associée à la paroi O

O O

C

D-Glucose

O

C

D-Alanine

O

C

D-Alanine

O

C

un atome de soufre, l’histidine, l’arginine et la proline (voir figure 3.12), ne se retrouvent jamais dans la composition des ponts interpeptidiques. Ainsi, bien que la composition du peptidoglycane puisse varier, le squelette carboné (avec l’alternance des unités de glucosamine et d’acide muramique) est le même chez toutes les espèces de Bacteria.

Les acides teichoïques et la paroi des bactéries Gram positif De nombreuses bactéries Gram positif possèdent des acides teichoïques enchâssés dans leur paroi. Ce terme inclut tous les polymères pariétaux, membranaires ou capsulaires qui contiennent du glycérophosphate ou des résidus phosphate du ribitol. Ces polyalcools sont reliés par les esters de phosphate et sont attachés généralement à d’autres sucres et à la D-alanine (voir figure 4.31a). Les acides teichoïques étant chargés négativement, ils sont en partie responsables de la charge négative de la surface cellulaire. Les acides teichoïques fonctionnent aussi en liant des cations bivalents comme Ca2+ ou Mg2+, dont certains sont transportés dans la bactérie. Certains acides teichoïques sont reliés par des liaisons covalentes aux lipides membranaires et sont donc appelés les acides lipoteichoïques. La figure 4.31b résume la structure de la paroi des bactéries Gram positif et montre comment les acides teichoïques et lipoteichoïques interviennent dans la structure globale de la paroi.

Les bactéries dépourvues de paroi Le peptidoglycane, qui est la signature moléculaire des espèces de Bacteria, peut être détruit par certains agents. Le lysozyme, par exemple, est une enzyme qui clive les liaisons β-1,4-glycosidiques entre la N-acétylglucosamine et l’acide N-acétylmuramique du peptidoglycane (voir figure 4.29), provoquant ainsi un affaiblissement de la Acide teichoïque Acide lipoteichoïque

P –O

77

Peptidoglycane

O– H2C

O

P


O

O Ribitol

(a)

(b)

FIGURE 4.31 Acides teichoïques et structure globale de la paroi des bactéries Gram positif. (a) Structure de l’acide teichoïque de Bacillus subtilis. L’acide teichoïque est un polymère d’unités répétées de ribitol. (b) Schéma de la paroi des bactéries Gram positif.



78 Chapitre 4


paroi. L’eau pénètre alors dans la bactérie, qui gonfle et éventuellement éclate, ce processus s’appelant la lyse (voir figure 4.32a). Le lysozyme se trouve dans les sécrétions animales comme les larmes, la salive ou d’autres fluides biologiques, et agit en tant qu’élément important dans la première ligne de défense contre les infections bactériennes. Si un soluté comme le saccharose, qui ne pénètre pas dans la cellule, est ajouté à la suspension bactérienne, la concentration du soluté à l’extérieur contrebalance celle de l’intérieur (conditions isotoniques). Sous de telles conditions, le lysozyme peut encore casser les liaisons du peptidoglycane, mais l’eau ne pénètre pas dans la bactérie et la lyse ne s’accomplit pas. À la place, se forme un protoplaste (bactérie ayant perdu sa paroi) (voir figure 4.32b). Si de tels protoplastes, au départ stabilisés par le saccharose, sont placés dans l’eau, la lyse survient immédiatement. Le terme sphéroplaste est fréquemment utilisé comme synonyme de protoplaste, bien que ces deux termes aient une signification légèrement différente. Les protoplastes sont des bactéries débarrassées de tout matériel pariétal résiduel, alors que les sphéroplastes en ont conservé des fragments. Bien que la plupart des procaryotes ne puissent survivre dans la nature sans leur paroi, certains peuvent s’en dispenser. Il s’agit des mycoplasmes, un groupe responsable de bactéries pathogènes (voir section 12.21) et le groupe des Thermoplasma, Archaea qui naturellement sont dépourvus de paroi (voir section 13.5). Ces procaryotes sont des protoplastes libres et viables sans paroi, soit parce qu’ils ont des membranes particulièrement résistantes soit parce qu’ils vivent dans des habitats osmotiquement protégés, tels que les corps des hôtes. Certains mycoplasmes ont des stérols (voir section 4.5) dans leur paroi, qui procurent une force et une rigidité à sa structure.

Paroi Membrane

H20 pénètre (a)

H20 pénètre

Le lysozyme digère la paroi

Lyse

H20 Solution hypotonique pénètre

Le lysozyme digère la paroi Protoplaste Solution isotonique (b) FIGURE 4.32 Formation des protoplastes. (a) En solution hypotonique, la paroi éclate et le protoplaste est libéré, mais celui-ci est immédiatement lysé du fait de la fragilité structurelle de la membrane cytoplasmique. (b) En solution isotonique de sucrose, l’eau ne pénètre pas dans le protoplaste et celui-ci reste stable. Le lysozyme casse les liaisons glycosidiques β-1,4 du peptidoglycane (voir figure 4.29).

Le pseudopeptidoglycane, les couches S et les parois des Archaea Certaines espèces d’Archaea contiennent une paroi construite à partir d’un polysaccharide très similaire au peptidoglycane. Celui-ci s’appelle le pseudopeptidoglycane (voir figure 4.33a). L’épine dorsale du pseudopeptidoglycane est composée d’unités répétées de N-acétylglucosamine et d’acide N-acétylosaminuronique (ce dernier remplaçant l’acide N-acétylmuramique du peptidoglycane) [comparez les figures 4.29 et 4.33a]. L’épine dorsale du pseudopeptidoglycane diffère aussi par les liaisons glucosidiques qui sont de type de β-1,3 à la place des liaisons β-1,4 retrouvées dans le peptidoglycane (comparez les figures 4.29 et 4.33a). Les autres Archaea ont une paroi qui ne contient ni de peptidoglycane ni de pseudopeptidoglycane, mais est constituée de polysaccharides, de glycoprotéines ou de protéines. Par exemple, les espèces de Methanosarcina contiennent des parois polysaccharidiques épaisses composées de glucose, d’acide glucuronique, de galactosamine et d’acétate. Les Archaea halophiles extrêmes telles que Halococcus contiennent des parois similaires à celles des Methanosarcina, sauf qu’elles incluent en plus des résidus sulfate (SO42–). Le type de paroi le plus répandu chez les Archaea est la couche de surface paracristalline (couche S) [voir section 4.10]. La couche S, constituée de protéines ou de glycoprotéines, présente généralement une symétrie hexagonale. Les couches S ont été décrites chez toutes les groupes d’Archaea, les halophiles extrêmes, les méthanogènes et les hyperthermophiles (voir section 2.5). Certaines espèces de Bacteria ont également des couches S à leur surface (voir figure 4.33b). Parmi les espèces d’Archaea, une variété dans la composition chimique des parois est observée, allant des molécules proches du peptidoglycane aux parois totalement dépourvues de polysaccharides. Mais, à quelques rares exceptions près, toutes les Archaea sont naturellement résistantes à l’action du lysozyme (voir supra) et aux pénicillines, des agents qui respectivement dégradent le peptidoglycane ou inhibent sa synthèse correcte (voir section 6.2).

Contrôlez vos acquis Les parois des Bacteria contiennent un polysaccharide, le peptidoglycane. Celui-ci est constitué de chaînes composées de répétitions alternées de N-acétylglucosamine et d’acide N-acétylmuramique, ce dernier étant relié à d’autres chaînes identiques par de courts ponts peptidiques. De nombreux feuillets de peptidoglycane peuvent être présents et l’épaisseur varie en fonction des espèces. Les Archaea ne possèdent pas de peptidoglycane, mais leur paroi est constituée d’autres polysaccharides ou protéines. Le lysozyme est une enzyme qui dégrade ce peptidoglycane, aboutissant à la lyse cellulaire. •

Établissez la liste des constituants du peptidoglycane.

•

Pourquoi le peptidoglycane est-il une molécule aussi résistante ?



4.9 La membrane externe des bactéries Gram négatif 79

Résistant au lysozyme

O

H

HO

H

HO O

H H

NAG

H

H

O

Groupement N-acétyle

NH H C

O

H O O

H

H

NH C

C

β(1,3) O

CH2OH

CH3

O

CH3

Glu

NAT

Ala Lys

Glu Lys

Peptides liés

Ala

NAT

Susan F. Koval

Glu

NAG

(a)

(b)

FIGURE 4.33 Pseudopeptidoglycane et couches S. (a) Structure du pseudopeptidoglycane, le polymère de la paroi de Methanobacterium. Notez la ressemblance avec la structure du peptidoglycane montrée à la figure 4.29, spécifiquement au niveau de la présence de ponts peptidiques entre les résidus acides N-acétyltalosaminuronique (au lieu des résidus d’acides muramiques). NAG, N-acétylglucosamine. (b) Image de microscopie électronique à transmission d’une portion de la couche S montrant la nature paracristalline de cette couche pariétale cellulaire chez la bactérie Aquaspirillum serpens ; cette couche S montre une symétrie hexagonale, comme on l’observe souvent pour la couche S des Archaea.

•

Comment les bactéries dépourvues de paroi fontelles pour survivre ?

•

Quelles sont les similitudes entre le pseudopeptidoglycane et le peptidoglycane ? En quoi ces molécules diffèrent-elles ?

externe m n4.9 Ladesmembrane bactéries Gram négatif En plus du peptidoglycane, les bactéries Gram négatif contiennent une épaisseur supplémentaire, la membrane externe. Cette couche est une seconde bicouche phospholipidique, mais qui n’est pas constituée uniquement de phospholipides et de protéines comme la membrane cytoplasmique (voir figure 4.16). La membrane extérieure contient aussi des polysaccharides. Les lipides et les polysaccharides sont reliés à la membrane externe et forment le complexe polysaccharidique. À cause de cela, la membrane externe porte souvent le nom de couche lipopolysaccharidique, ou plus simplement de LPS.

La composition chimique du LPS Bien que complexe, la composition du LPS de plusieurs bactéries est à présent décryptée. Comme le montre la figure 4.34, la portion polysaccharidique du LPS se constitue de deux composants, le noyau polysaccharidique et le polysaccharide O.

Chez Salmonella, genre bactérien pour lequel le LPS a été le mieux étudié, le noyau polysaccharide se compose de cétodésoxyoctonate (KDO), de sucres à sept carbones (heptoses), de glucose, de galactose et de N-acétylglucosamine. Relié au noyau, le polysaccharide O, qui contient du galactose, du glucose, du rhamnose et du mannose (tous des hexoses), ainsi que un ou plusieurs sucres didésoxy tels que l’abéquose, le colitose, le paratose ou le tyvélose. Ces sucres sont liés par séquences de quatre ou cinq, lesquelles sont souvent reliées entre elles. Une fois les séquences répétées, un long polysaccharide O est formé. La portion lipidique du lipopolysaccharide, dénommé lipide A (voir figure 4.34), n’est pas un lipide associé au glycérol, mais à la place les acides gras sont reliés par une liaison amine ester à un disaccharide composé de phosphate de N-acétylglucosamine (voir figure 4.34). Le disaccharide est attaché au noyau polysaccharidique grâce au KDO (voir figure 4.34). Les acides gras retrouvés communément dans le lipide A comprennent les acides caproïque, laurique, myristique, palmitique et stéarique. Dans la membrane externe, le LPS s’associe à différentes protéines pour former le feuillet externe de la membrane. Un complexe lipoprotéique est retrouvé au niveau du feuillet interne du LPS de nombreuses bactéries Gram négatif (voir figure 4.35a). Les lipoprotéines fonctionnent comme des points d’ancrage entre la membrane et le peptidoglycane. Finalement, dans le feuillet externe de la membrane externe, le LPS remplace les phospholipides. Ceux-ci résident uniquement dans le feuillet



80 Chapitre 4


Chaîne latérale O

Polysaccharidique central P

GluNac Glu n

Gal

KDO

P

GlcN

Gal

Hep

P

KDO

Glu Glu

Hep

Hep

KDO

P

Lipide A Amine ester

GlcN P

FIGURE 4.34 Structure du lipopolysaccharide chez les Bacteria Gram négatif. La composition chimique précise du lipide A et du polysaccharide varie entre Bacteria Gram négatif, mais la séquence des composés majeurs (lipide A – KDO – polysaccharide – chaîne latérale O) est généralement uniforme. Le polysaccharide O, spécifique, varie entre les espèces. KDO, cétodésoxyoctonate ; Hep, heptose ; Glu, glucose ; Gal, galactose ; GluNac, N-acétylglucosamine ; GlcN, glucosamine ; P, phosphate. Les acides gras, glucosamine et lipide A sont liés par une liaison amine ester. La portion lipide A du LPS peut être toxique chez les animaux et comporte le complexe endotoxine (voir section 21.12). Comparez cette figure avec les figures 4.35 et 4.36 (code couleur identique pour les différentes parties du LPS présenté aux figures 4.34 et 4.35).

interne (voir figure 4.35a). Ainsi, bien que la membrane externe puisse être considérée comme une bicouche lipidique, sa structure est relativement distincte de celle de la membrane cytoplasmique (comparez les figures 4.16 et 4.35a).

Les endotoxines Bien que la fonction majeure de la membrane externe soit structurale, un de ses aspects biologiques majeurs est sa toxicité pour les animaux. Les bactéries Gram négatif pathogènes pour les hommes et les animaux incluent les espèces des genres Salmonella, Shigella et Escherichia, parmi d’autres, et certains des symptômes occasionnés par ces pathogènes chez leur hôte sont dus à la toxicité de leur membrane externe. Les propriétés toxiques sont dues en partie à la couche de LPS, en particulier au lipide A. Le terme endotoxine fait référence à ce constituant toxique du LPS (voir section 21.12). Certaines endotoxines provoquent des symptômes violents chez les hommes, comme une défaillance gastro-intestinale sérieuse (gaz, diarrhées, vomissements). Les endotoxines sont responsables de nombreuses maladies bactériennes, en particulier les intoxications alimentaires à Salmonella (voir section 29.7). Il faut noter que le LPS des bactéries non pathogènes montre quand même une activité de type endotoxine. Ainsi, la bactérie ellemême n’a pas besoin d’être pathogène pour contenir des constituants toxiques de la membrane externe.

Les porines et le périplasme Contrairement à la membrane cytoplasmique, la membrane externe des bactéries Gram négatif est relativement perméable aux petites molécules, même s’il s’agit d’une membrane de type bicouche lipidique. Ceci provient des protéines dénommées porines, présentes dans la membrane externe, qui fonctionnent comme des canaux pour l’entrée et la sortie de substances hydrophiles de bas poids moléculaires (voir figure 4.35). Différentes classes de porines sont connues, spécifiques ou non. Les porines non spécifiques forment des canaux remplis d’eau à travers lesquels n’importe quelle petite molécule peut passer. À la différence, certaines classes de porines sont hautement spécifiques, car elles contiennent des sites de fixation caractéristiques pour une substance ou une

classe de substances. Les études de structure ont montré que la plupart des porines sont des protéines qui contiennent trois sous-unités identiques. Les porines sont des protéines transmembranaires (voir figure 4.35a) et s’associent pour former de petits trous d’environ un nanomètre de diamètre dans la membrane externe (voir figure 4.35b). Bien que perméable aux petites molécules, la membrane externe reste imperméable aux enzymes et aux autres grosses molécules. En fait, une des fonctions majeures de la membrane externe est de prévenir la diffusion extracellulaire des protéines présentes à l’extérieur du cytoplasme. Ces enzymes sont présentes dans une région dénommée périplasme (voir figures 4.35 et 4.36). Cet espace, situé entre la membrane cytoplasmique et la face interne de la membrane externe mesure environ 12 à 15 nm de large. Le contenu périplasmique présente la consistance d’un gel du fait de l’abondance des protéines retrouvées à ce niveau (voir figure 4.36). En fonction des espèces, le périplasme peut contenir différents types de protéines : les enzymes hydrolytiques, qui fonctionnent dans la dégradation initiale des molécules provenant des aliments, les protéines de liaison, qui initient le transport des substrats (voir section 4.7) et les chimiorécepteurs, qui sont des protéines impliquées dans la réponse chimique (voir sections 4.16 et 8.12). La plupart des ces protéines gagnent le périplasme, transportées par le système SecYEG (voir section 4.7).

Les relations entre la structure de la paroi et la coloration de Gram Les différences structurelles observées entre les parois des bactéries Gram négatif et positif sont responsables des différences observées à l’issue de la coloration de Gram. Dans la coloration de Gram (voir section 4.1), un complexe insoluble de violet de gentiane et d’iodure apparaît à l’intérieur de la cellule. Ce complexe est extrait par l’alcool chez les bactéries Gram négatif, mais pas chez les bactéries Gram positif (voir figure 4.4). Les bactéries Gram positif ont une paroi très épaisse constituée de plusieurs couches de peptidoglycane. Celles-ci sont déshydratées par l’alcool, causant alors la fermeture des pores dans la paroi et empêchant alors la sortie des complexes de violet de gentiane et d’iodure de la bactérie.



4.9 La membrane externe des bactéries Gram négatif 81 Polysaccharide O

Noyau polysaccharidique Lipide A

Protéine

Porine

Extérieur

Lipopolysaccharide (LPS)

Membrane externe 8 nm

Paroi

Phospholipide

Peptidoglycane Peptidoglycan

Périplasme

Lipoprotéine Membrane cytoplasmique Intérieur

FIGURE 4.35 Paroi des bactéries Gram négatif. Même si la membrane externe est souvent appelée la « seconde bicouche lipidique », la composition chimique et l’architecture de cette membrane diffèrent par de nombreux points de celles de la membrane cytoplasmique. (a) Arrangement du lipopolysaccharide, du lipide A, des phospholipides, des porines et des lipoprotéines dans la membrane externe. (Voir la figure 4.34 pour les détails de la structure du LPS.) Le lipide A peut être toxique pour l’homme et s’appelle, dans ce cas, une endotoxine (voir section 21.12). (b) Modèle moléculaire des protéines de type porine. Notez les quatre pores présents : celui formé par le regroupement des protéines formant les porines et les trois situés au centre des porines. La vue est perpendiculaire à la surface de la membrane. Le modèle a été élaboré à partir des études par diffraction des rayons X de la structure de la porine de Rhodobacter blasticus.

En plus du peptidoglycane, les bactéries Gram négatif contiennent une membrane externe constituée de lipopolysaccharides, de protéines et de lipoprotéines. Les protéines, appelées des porines, assurent la perméabilité de la membrane externe. L’espace situé entre les membranes est le périplasme contient différentes protéines impliquées dans des fonctions cellulaires importantes. •

Quels sont les constituants de la couche de LPS présente chez les bactéries Gram négatif ?

•

Quelles sont les fonctions des porines et à quel endroit de la paroi des bactéries Gram négatif sont-elles situées ?

(b)

Membrane externe Périplasme Membrane cytoplasmique

Terry Beveridge


Georg E. Schulz

(a)

FIGURE 4.36 Paroi d’Escherichia coli. Coupe fine au fort grossissement de la paroi d’E. coli montrant le périplasme délimité par la membrane externe et la membrane cytoplasmique. Les grandes particules noires intracytoplasmiques sont des ribosomes.




•

Quel constituant de la bactérie possède des propriétés d’endotoxine ?

•

Pourquoi l’alcool décolore-t-il les bactéries Gram négatif et non les bactéries Gram positif ?

III

STRUCTURES DE SURFACE ET INCLUSIONS CHEZ LES PROCARYOTES

Outre la paroi et les membranes de surface développées cidessus, quelques cellules procaryotes possèdent des membranes externes ou des structures en contact avec l’environnement. La plupart des cellules peuvent également former un ou plusieurs types d’inclusions cellulaires, qui sont ensuite métabolisées et utilisées comme source de nutriments. Ces inclusions, internes et de surface, sont examinées ici.

4.10 Les structures bactériennes m n de surface Les procaryotes peuvent produire une grande variété de structures qui sont attachées ou font saillie par rapport à la surface de la cellule, par exemple les fimbriae, les pili, les couches-S, les capsules et les couches mucoïdes. Ces structures sont examinées ici.

Les fimbriae et pili Les fimbriae et les pili sont des structures filamenteuses courtes composées de protéines qui s’étendent depuis la surface d’une cellule. Les fimbriae (voir figure 4.37) donnent aux micro-organismes une capacité d’adhésion, en particulier aux tissus animaux dans le cas de bactéries pathogènes, ou de former des pellicules ou des biofilms sur les surfaces (voir section 19.3). Les plus connus d’entre ces pathogènes sont Salmonella typhimurium (salmonellose), Neisseria gonorrhoeae (gonococcie), Bordetella pertussis (coqueluche).

Fimbriae

J. P. Duguid et J. F. Wilkinson

Flagelle

FIGURE 4.37 Fimbriae. Observation en microscopie électronique de Salmonella typhi en cours de division, montrant les flagelles et les fimbriae. Chaque bactérie mesure environ 0,9 µm.

Les pili sont structurellement similaires aux fimbriae, mais sont en général plus longs. Un seul ou quelques pili sont présents à la surface de la bactérie. Parce qu’ils servent de récepteurs à certains types de virus, les pili peuvent être observés en microscopie électronique, lorsqu’ils sont recouverts de particules virales (voir figure 4.38). Malgré leur possible implication dans l’attachement, comme les fimbriae, les pili sont clairement impliqués dans le processus de conjugaison (une forme d’échange génétique) chez les procaryotes (voir section 10.9). De nombreuses classes de fimbriae/pili sont connues, différentes par leur structure et leur fonction. L’une de ces classes, appelée fimbriae/pili de type IV, est impliquée dans une forme inhabituelle de mobilité chez certaines bactéries, la mobilité rapide. La mobilité rapide est un certain type de mouvement sur les surfaces solides, vraisemblablement une extension suivie d’une rétraction rapide et réversible des fimbriae, permettant à la cellule de ramper le long de la surface. Contrairement aux autres fimbriae, les fimbriae de type IV sont retrouvés seulement aux pôles de la cellule. Mise à part la mobilité, ce sont également des facteurs de pathogénicité majeurs chez des pathogènes variés, dont Vibrio cholerae (choléra) et Neisseria meningitidis (méningite cérébrospinale). Les fimbriae de type IV seraient aussi le support de transferts génétiques à travers le phénomène de transformation (voir section 10.7) chez une grande variété de bactéries.

Les structures cristallines de surface De nombreux procaryotes possèdent une structure de surface composée d’un ensemble bidimensionnel de protéines. Ces structures sont appelées couches-S. Les couches-S ont été détectées chez quasiment tous les représentants des groupes phylogénétiques de Bacteria et sont très répandus parmi les Archaea. Chez quelques espèces d’Archaea, la couche-S est aussi la paroi (voir section 4.8). Les couches-S ont une apparence cristalline, montrant des symétries variées, hexagonale, tétragonale ou trimérique, dépendant du nombre et de la structure des sous-unités protéiques ou glycoprotéiques dont elles sont composées (la figure 4.33b montre une couche-S observée en microscopie électronique). La fonction principale des couches-S est inconnue. En tant qu’interface entre la cellule et son environnement, il est vraisemblable que la couche-S fonctionne comme une membrane

Pilus recouvert de virus Charles C. Brinton, Jr.

82 Chapitre 4

FIGURE 4.38 Pili. Les pili à la surface d’Escherichia coli sont visualisés grâce à l’adhérence spécifique de virus. Chaque bactérie mesure environ 0,8 µm.



4.11 Les inclusions cellulaires 83

sélective, autorisant le passage des molécules de bas poids moléculaire et excluant les grosses molécules et les structures tels des virus. La couche-S retiendrait de plus les protéines à proximité de la cellule, comme le fait la membrane externe des bactéries Gram négatif. Des expériences montrent que, chez les bactéries pathogènes possédant une couche-S, cette structure pourrait protéger la bactérie contre certains mécanismes de défense de l’hôte.

cellules appelée biofilm. Les polysaccharides jouent un rôle clé dans le développement des biofilms (voir section 19.3). Les couches mucoïdes possèdent de nombreuses fonctions. Par exemple, les bactéries pathogènes capsulées sont, en général, plus difficilement reconnues par les cellules phagocytaires du système immunitaire (voir section 22.2) et donc plus difficilement détruites. Il est également probable que ces couches externes jouent un rôle dans la résistance à la dessiccation, car elles retiennent une quantité significative d’eau.

Les capsules et les couches mucoïdes Les cellules procaryotes possèdent souvent des structures de surface variées, par exemple les fimbriae, les pili, les couches-S, les capsules et les couches mucoïdes. Ces structures ont plusieurs fonctions, l’une des principales étant l’attachement des cellules à une surface solide. •

Comment les fimbriae diffèrent-ils structurellement et fonctionnellement des pili ?

•

Bien qu’elles soient pauvres en lipides, comment les couches-S jouent-elles un rôle similaire à celui de la membrane externe ?

4.11 Les inclusions cellulaires m n Des granules et d’autres inclusions sont souvent observés dans les cellules procaryotes. Leur nature est variable selon les organismes. Ce sont fréquemment des réserves d’énergie ou des réserves de constituants de structure. La microscopie électronique permet souvent d’observer les inclusions directement (voir figure 4.41). La plupart des inclusions cellulaires sont délimitées par une membrane monocouche mince, constituée de lipides séparant l’inclusion du cytoplasme de la cellule.

Frank Dazzo et Richard Heinzen

FIGURE 4.39 Capsules bactériennes. (a) Capsule chez Acinetobacter, observée en microscopie à contraste de phase, après coloration négative à l’encre de Chine. Celle-ci ne pénètre pas dans la capsule dont le contour est révélé et apparaît en clair sur fond noir. (b) Observation en microscopie électronique d’une coupe fine de Rhizobium trifolii, colorée au rouge de ruthenium pour visualiser la capsule. Le diamètre de la cellule (capsule non incluse) est d’environ 0,7 µm. Ces capsules bactériennes sont le plus souvent constituées de polysaccharides. Elles sont rarement protéiques. Bacillus anthracis, bactérie responsable de la maladie du charbon et utilisable comme arme biologique (voir sections 25.12 et 25.13), possède une capsule constituée d’acide poly-D-glutamique, lui permettant d’échapper à la destruction par les cellules immunitaires de l’hôte.


Elliot Juni

De nombreux procaryotes sécrètent du matériel visqueux ou de consistance collante à leur surface (voir figure 4.39). Certaines sont constituées de polysaccharides, d’autres de protéines. Les termes capsule et couche mucoïde sont fréquemment utilisés pour désigner ces couches polysaccharidiques. La composition de ces structures varie selon les organismes. Elles peuvent être épaisses ou minces, flexibles ou rigides, selon leur nature chimique. Les structures rigides se présentent comme une matrice serrée excluant les petites particules, dont l’encre de Chine. Cette structure est appelée capsule (voir figure 4.39a). Si la structure se déforme plus facilement, elle n’exclut pas les petites particules et est donc plus difficilement observable. Ce type de structure est appelé slime. Les structures monocouches polysaccharidiques ont plusieurs fonctions dans la bactérie. Les polysaccharides de surface contribuent à l’attachement des micro-organismes aux surfaces solides. Ainsi qu’il est rappelé dans la section 21.6, la pénétration d’un micro-organisme pathogène dans un organisme animal par une porte d’entrée particulière requiert tout d’abord l’attachement spécifique aux composants de surface des cellules de l’hôte. Cette liaison est souvent médiée par les polysaccharides présents à la surface de la bactérie. De nombreuses bactéries non pathogènes se fixent également aux surfaces solides dans l’environnement, formant parfois une couche épaisse de

(a)

(b)



84 Chapitre 4


Les polymères de stockage du carbone

Autres matériels de stockage et inclusions

Chez les procaryotes, l’un des types d’inclusions les plus courantes est constitué par de l’acide poly-β -hydroxybutyrique (PHB), un lipide formé à partir d’unités d’acide β -hydroxybutyrique (voir figure 4.40a). Les monomères de cet acide sont liés par des liaisons ester, formant un long polymère de PHB. Ces polymères s’agrègent sous forme de granules (voir figure 4.40b). La longueur du monomère de base variant considérablement, de C4 à C18 chez certains organismes, le terme général poly-βhydroxyalkanoate (PHA) est utilisé pour désigner le groupe entier des polymères de stockage de carbone et d’énergie. Les PHA sont synthétisés quand le carbone est en excès. Lorsque les conditions le justifient, ils sont catabolisés et utilisés comme source de carbone pour des biosynthèses ou des synthèses d’ATP. Une grande variété de procaryotes, dont des espèces appartenant aux Bacteria et aux Archaea, produisent des PHA. Le glycogène, polymère de glucose, est une autre forme de produit de stockage synthétisé par les procaryotes (voir section 3.3 et figure 3.6). Le glycogène est, comme les PHA, une forme de stockage de carbone et d’énergie. Le glycogène est produit lorsque le carbone est en excès et consommé lorsque la quantité de carbone disponible devient limitée. Le glycogène est voisin de l’amidon, forme de réserve majeure des plantes, mais il diffère par le type de liaison entre les monomères de glucose (voir figure 3.6b).

De nombreux micro-organismes accumulent le phosphate inorganique sous forme de granules de polyphosphate. Ces granules peuvent être dégradés et utilisés comme source de phosphate pour la synthèse d’acides nucléiques et de phospholipides. De plus, de nombreux procaryotes sont capables d’oxyder des composés soufrés réduits comme le sulfure d’hydrogène (H2S). Ces oxydations sont liées aux réactions de production d’énergie (voir sections 17.8 et 17.10) et aux réactions de biosynthèse (voir section 17.6). Dans chaque cas, le soufre élémentaire s’accumule dans la cellule sous forme de globules facilement visibles (voir figure 4.41). Ces globules de soufre élémentaire continuent à se former tant que la source de soufre réduit est présente. Lorsque cette dernière est épuisée, le soufre des granules s’oxyde en sulfate (SO42–) et les granules disparaissent progressivement. En général, les globules de soufre s’accumulent dans le périplasme plutôt que dans le cytoplasme (les procaryotes sulfooxydants phototrophes ou chimiolithotrophes sont des microorganismes Gram négatif). Lorsque H2S est oxydé (H2S → S0), le périplasme s’élargit pour stocker les globules. Il se contracte lorsque le soufre est oxydé (S0 → SO42–). Il est probable que certaines inclusions « intracytoplasmiques », par exemple les poly-β -hydroxyalkanoates (voir figure 4.40), sont périplasmiques chez les bactéries Gram négatif. Les magnétosomes sont des particules intracellulaires de magnétite minérale de fer – Fe3O4 (voir figure 4.42). La présence des magnétosomes transforme la cellule en dipôle magnétique, lui permettant de répondre à l’action d’un champ magnétique. Les bactéries qui synthétisent des magnétosomes (voir figure 4.42a) sont capables de magnétotactisme, un processus d’orientation et de migration le long des lignes du champ magnétique terrestre (voir section 12.14). Bien que le suffixe -tactisme soit utilisé dans le mot magnétotactisme, il n’a pas été démontré que la bactérie magnétotactique utilise le même système sensoriel que les bactéries

C

O

CH3 O

CH

CH2

C

O

CH3 O

CH

CH2

C

CH3 O

CH

CH2

β-carbone

Poly-β-hydroxybutyrate

F. R. Turner et M. T. Madigan

(a)

Norbert Pfennig

O

(b)

FIGURE 4.40 Poly-β -hydroxybutyrate (PHB). (a) Monomère (en couleur) de PHB, un poly-bêta-hydroxyalkanoate courant. La polymérisation est obtenue en substituant le groupe –CH 3 sur le carbone β par une longue chaîne carbonée. (b) Micrographie électronique de Rhodovibrio sodomensis (voir 0b), bactérie phototrophe contenant des granules de PHB.

FIGURE 4.41 Globules de soufre. Photomicrographie en contraste de phase de la bactérie pourpre sulfureuse Isochromatium buderi, contenant des globules de soufre formés par oxydation du sulfure d’hydrogène (H 2S). Les bactéries mesurent environ 4 x 7 µm.



4.12 Les vésicules de gaz 85

Stefan Spring

R. Blackemore et W. O’Brien

chélatants) sous forme Fe3O4 dans le magnétosome en formation. La morphologie des magnétosomes semble être spécifique de l’espèce, variant en forme (carrés, rectangles, aiguilles chez certaines bactéries) et formant des chaînes à l’intérieur de la cellule (voir figure 4.42).

(b)

Dennis Bazylinski

(a)

(c) FIGURE 4.42 Bactéries magnétotactiques et magnétosomes. (a) Observation en microscopie à contraste de phase interférentiel de bactéries coccoïdes magnétotactiques (diamètre 2,2 µm) contenant des magnétosomes. (b) Magnétosomes (longueur 50 nm) isolés de la bactérie magnétotactique Magnetospirillum magnetotacticum (voir figure 12.32). (c) Micrographie électronique en transmission de magnétosomes. Chaque magnétosome (largeur 90 nm) est limité par une membrane simple lipido-protéique (indiquée par la flèche). Bien que contenant lipides et protéines, la membrane d’un magnétosome, comme la membrane entourant les PHB (voir figure 4.40), est monocouche.

chimiotactiques ou phototactiques (voir sections 4.16 et 8.12). L’alignement des magnétosomes dans la cellule lui confère des propriétés magnétiques qui orientent la cellule dans une direction particulière de son environnement. La fonction principale des magnétosomes est inconnue. Cependant, les magnétosomes se retrouvent chez des bactéries aquatiques très variées (voir figure 4.42a) qui se multiplient préférentiellement à faible concentration d’oxygène. Une hypothèse avance que l’une des fonctions des magnétosomes est de guider ces cellules aquatiques vers les sédiments, où le champ magnétique principal se dirige vers le bas et où les niveaux d’oxygène sont faibles. Les magnétosomes sont entourés par une membrane contenant des phospholipides, des protéines et des glycoprotéines (voir figure 4.42b et c). Cette membrane n’est pas une membrane unitaire comme la membrane cytoplasmique (voir figure 4.16). C’est une membrane monocouche, similaire à celle entourant les granules de poly-β -hydroxybutyrate (PHB, voir figure 4.40). Les protéines membranaires du magnétosome jouent probablement un rôle dans la précipitation du Fe3+ (apporté dans la cellule sous forme soluble par des agents

Contrôlez vos acquis Les cellules procaryotes contiennent souvent des granules internes composés de substances de stockage ou jouant un rôle dans le magnétotactisme, par exemple les granules de soufre, les PHA et les magnétosomes. •

Quelles sont les conditions de croissance permettant la synthèse de PHA ou de glycogène ?

•

Pourquoi est-il impossible pour les bactéries Gram négatif de stocker du soufre comme le peuvent les chimiolithotrophes sulfo-oxydants ?

•

Quelle est la forme de fer présente dans les magnétosomes ?

4.12 Les vésicules de gaz m n Certains procaryotes sont planctoniques, flottant durant leur existence au sein de la colonne d’eau dans les lacs et les océans. De nombreux procaryotes planctoniques produisent des vésicules de gaz qui leur confèrent une certaine flottabilité par diminution de leur densité. Les vésicules de gaz sont en fait un moyen de mobilité verticale, permettant aux cellules de monter et de descendre dans la colonne d’eau, en réponse aux facteurs environnementaux. Les exemples les plus visibles de flottaison dus aux vésicules de gaz sont observés chez les cyanobactéries qui forment des efflorescences massives à la surface des lacs (voir figure 4.43). Les cellules possédant des vésicules gazeuses se rassemblent à la surface des lacs en masses denses poussées par les vents. Les vésicules gazeuses sont également présentes chez certaines bactéries phototrophes rouges et vertes (voir sections 12.2 et 12.32) et chez quelques bactéries non phototrophes vivant dans les lacs et les étangs. Quelques espèces d’Archaea contiennent également des vésicules de gaz.

La structure des vésicules de gaz Ces vésicules sont des structures protéiques fusiformes remplies de gaz. Elles sont creuses mais rigides, de longueur et de diamètre variables (voir figure 4.44). Selon les organismes, elles présentent une longueur de 300 à 1 000 nm et une épaisseur de 45 à 120 nm. Ces vésicules sont cependant de taille plus ou moins constante pour un organisme donné. Chaque cellule peut posséder de une à plusieurs centaines de vésicules, dont la membrane protéique, d’une épaisseur voisine de 2 nm, est imperméable à l’eau et aux solutés, mais perméable aux gaz. La présence de vésicules gazeuses dans les cellules peut être observée en microscopie optique (les groupes de vésicules, appelés vacuoles gazeuses, se présentent sous forme d’inclusions irrégulières et brillantes) ou en microscopie électronique (voir figure 4.45).




A. E. Walsby

86 Chapitre 4

T. D. Brock

(a)

S. Pellegrini et M. Grilli Caiola

FIGURE 4.43 Vésicules de gaz en milieu naturel. Efflorescence de cyanobactéries produisant des vésicules de gaz à la surface d’un lac riche en nutriments (lac Mendota, Madison, Wisconsin, États-Unis).

La structure moléculaire des vésicules de gaz Les vésicules gazeuses sont composées de deux protéines différentes (voir figure 4.46). La protéine majeure, appelée GvpA, est petite, hautement hydrophobe et très rigide. La rigidité de la membrane vésiculaire est essentielle, car la vésicule doit pouvoir résister à la pression exercée par le milieu extérieur. Représentant 97 % des protéines totales vésiculaires, GvpA constitue la structure de la vésicule. GvpC, protéine mineure, renforce cette structure (voir figure 4.46). Les vésicules sont constituées de protéines GvpA, disposées en travées parallèles. Cette structure en « grillage » forme une coque étanche. Le grillage de protéines GvpA est renforcé par les protéines GvpC, qui croisent et sont liées aux GvpA en angle, comme des attaches (voir figure 4.46). La forme définitive de la vésicule gazeuse varie selon les organismes considérés. Longue et mince ou courte et épaisse, cette forme dépend du mode d’arrangement des protéines GvpA et GvpC lors de la formation de la vésicule. La membrane de la vésicule gazeuse étant parfaitement perméable aux gaz, la composition et la pression du gaz à

(b) FIGURE 4.45 Vésicules de gaz des cyanobactéries Anabaena et Microcystis. (a) Au centre, un hétérocyste (cellule transparente à paroi épaisse) sans vésicule de gaz. Dans les autres cellules, les vésicules sont regroupées en vacuoles brillantes en contraste de phase (indiquées par les flèches). (b) Micrographie électronique en transmission de la cyanobactérie Microcystis. Les vésicules de gaz forment des amas visibles en coupes longitudinale et transversale.

l’intérieur de la vésicule est la même que celle du gaz du milieu extérieur. La densité d’une vésicule gazeuse approchant les 5 à 20 % de la densité de la cellule, ces vésicules diminuent la densité de la cellule, augmentant de ce fait sa flottabilité. Les organismes aquatiques phototrophes tirent un bénéfice particulier de

FIGURE 4.44 Vésicules de gaz. Vésicules de gaz (diamètre 100 nm) isolées de la bactérie Ancyclobacter aquaticus, observées en microscopie électronique en transmission après coloration négative. (Reproduit avec l’autorisation de Archives of Microbiology 112:133-140, 1977.)

4,6 nm

A. E. Konopka et J. T. Staley

GvpA

GvpC

FIGURE 4.46 Protéines des vésicules de gaz. GvpA et GvpC, protéines constitutives des vésicules de gaz, forment une structure étanche à l’eau, mais perméable au gaz. GvpA, protéine majeure de structure en feuillet β, constitue la trame de la vésicule. GvpC, protéine en hélice α renforce cette structure (voir section 3.7 et figure 3.16).



4.13 Les endospores 87

Contrôlez vos acquis Les vésicules gazeuses sont de petites structures protéiques remplies de gaz qui permettent la flottabilité des cellules. Les vésicules gazeuses contiennent deux protéines différentes dont la disposition forme une structure perméable aux gaz, mais imperméable à l’eau. •

Quel bénéfice les vésicules gazeuses apportentelles aux organismes phototrophes ? (Comment les phototrophes se multiplient-ils ?)

•

Comment les deux protéines constituant la vésicule gazeuse sont-elles disposées pour former une structure imperméable à l’eau ?

4.13 Les endospores m n

(a)

La structure des endospores Les endospores se présentent comme des structures très réfringentes en microscopie optique (voir figure 4.47). Imperméables à la plupart des colorants, les endospores apparaissent comme des zones incolores sur des préparations colorées par des méthodes classiques (bleu de méthylène). Pour colorer les endospores, des méthodes spécifiques sont nécessaires. La structure d’une endospore observée en microscopie électronique diffère nettement de celle d’une cellule végétative (voir figure 4.48). L’endospore est structurellement plus complexe, car elle possède plusieurs enveloppes n’existant pas dans la cellule végétative. L’enveloppe la plus externe est l’exosporium, constituée d’une fine couche de protéines. Sous l’exosporium se trouvent les tuniques sporales, membranes composées de protéines spécifiques à la spore (voir figure 4.48b), puis le cortex, de structure voisine du peptidoglycane. Dans le cortex se trouve la partie centrale (partie centrale ou protoplaste), qui contient la paroi de la spore, la membrane cytoplasmique, le cytoplasme, les acides nucléiques, les ribosomes et les autres organites cellulaires indispensables (voir section 2.1 et figure 2.1a). L’endospore diffère donc structurellement de la cellule végétative par les enveloppes retrouvées à l’extérieur de la paroi. Les endospores contiennent une substance chimique particulière, absente des cellules végétatives : l’acide dipicolinique (voir figure 4.49). L’acide dipicolinique, présent dans la partie centrale sous forme de complexe calcique, est présent chez toutes les endospores des bactéries sporulées. Le complexe calcium-acide dipicolinique représente environ 10 % du poids sec de la spore. La présence de ce complexe réduit la biodisponibilité de l’eau, favorisant ainsi la déshydratation de la spore. De plus, ce complexe s’intercale (s’insère entre les bases) dans l’ADN, empêchant sa dénaturation par la chaleur.

Hans Hippe

Hans Hippe

Certaines bactéries produisent des structures appelées endospores (voir figure 4.47) lors du phénomène de sporulation (voir figure 4.50). Les endospores (le préfixe endo- signifie « à l’intérieur ») sont des cellules différenciées très résistantes à la chaleur et difficiles à détruire, même par traitement chimique radical ou par irradiation. La fonction biologique des endospores est de permettre à l’organisme de survivre à des conditions extérieures difficiles, par exemple des températures extrêmes, la dessiccation ou la déplétion en nutriments. Les endospores sont également des structures idéales pour être dispersées par le vent, l’eau ou le tractus intestinal des animaux. Les bactéries capables de sporulation se retrouvent le plus fréquemment dans le sol. Parmi les bactéries sporulées, les genres Bacillus et Clostridium sont les plus étudiés. La découverte des endospores bactériennes a été d’une importance considérable en microbiologie, car savoir qu’il existe des formes très résistantes à la chaleur était essentiel pour le développement de méthodes de stérilisation adéquates, pour les milieux de culture, mais aussi pour les aliments et les produits périssables. Bien que de nombreux micro-organismes forment des spores, l’endospore bactérienne est remarquable

par son degré de résistance à la chaleur, jusqu’à un chauffage à 150 °C, bien qu’un autoclave fonctionnant à 121 °C tue les endospores de la plupart des espèces. Les endospores sont également résistantes à d’autres agents physico-chimiques (dessiccation, rayonnement ultraviolet, acides ou bases forts, désinfectants) et peuvent rester en dormance pendant des périodes extrêmement longues (voir focus, « Combien de temps une endospore peut-elle survivre ? »).

(b)

Hans Hippe

ce système, qui leur permet de se positionner verticalement dans la colonne d’eau, à des niveaux où l’intensité lumineuse nécessaire à la photosynthèse est optimale.

(c)

FIGURE 4.47 Endospores bactériennes. Image en microscopie par contraste de phase montrant différents types de spores ainsi que leur localisation intracellulaire. (a) Terminale. (b) Subterminale. (c) Centrale.




Tunique sporale Cortex Exosporium Paroi sporale

(b)

La formation de l’endospore

FIGURE 4.48 Coupe d’une endospore bactérienne. (a) Observation en microscopie électronique à transmission d’une endospore mature de Bacillus megaterium. (b) Observation en microscopie à fluorescence de Bacillus subtilis en cours de sporulation. Les protéines de la tunique sporale ont été spécifiquement colorées en vert.

Les propriétés de la partie centrale des endospores La partie centrale d’une endospore mature est très différente de la cellule végétative dont elle est issue. Les concentrations importantes de dipicolinate de calcium (voir figure 4.49), réduisant la teneur en eau de cette partie centrale, lui permettent de se déshydrater progressivement lors de la sporulation. Cette partie centrale d’une endospore mature ne contenant que 10 à 25 % de l’eau initialement présente dans la cellule végétative, la consistance de son cytoplasme est celle d’un gel. La déshydratation de la partie centrale augmente considérablement sa résistance à la chaleur. Il a également été montré que cette déshydratation confère à l’endospore une résistance aux agents chimiques, par exemple au peroxyde d’hydrogène (H2O2), et permet d’inactiver les enzymes résiduelles de la partie centrale. Outre la faible teneur en eau de l’endospore, le pH de la partie centrale est inférieur d’environ une unité à celui du cytoplasme

–OOC

N

COO–

N

COO– +Ca+ –OOC

(b)

Cellule végétative

Cellule en cours de sporulation

(a)

+Ca+ –OOC

Pendant la formation de l’endospore, une cellule végétative est transformée en une structure résistante à la chaleur, ne se multipliant pas (voir figure 4.50). Les différences entre une endospore et une cellule végétative sont importantes (voir section précédente et tableau 4.3). La sporulation fait appel à une série d’événements complexes de différenciation cellulaire. La sporulation bactérienne n’intervient pas lorsque les cellules sont en phase exponentielle de croissance, mais seulement lorsque la multiplication cesse, suite au manque d’un nutriment essentiel. Lorsqu’un nutriment de ce type, comme le carbone ou l’azote, devient limité, la multiplication végétative de Bacillus, genre bactérien sporulé typique, s’arrête alors que commence la sporulation. De nombreuses modifications génétiques cellulaires régulent la conversion de l’état végétatif à la sporulation. La figure 4.51 montre les modifications structurales intervenant chez les cellules de Bacillus en cours de sporulation. Le processus de sporulation peut-être divisé en plusieurs stades.

Hans Hippe

(a)

Kirsten Price

H. S. Pankratz, T. C. Beaman et Philipp Gerhardt

ADN

de la cellule végétative. La partie centrale contient, de plus, de fortes concentrations de protéines appelées petites protéines acido-solubles (small acid-soluble proteins ou SASP). Ces dernières sont synthétisées pendant la sporulation et possèdent au moins deux fonctions. Les SASP se lient étroitement à l’ADN de la partie centrale et le protègent des dommages potentiels liés au rayonnement ultraviolet, à la dessiccation, à la chaleur sèche. La résistance aux ultraviolets est obtenue par modification de la structure moléculaire de l’ADN, la fixation des SASP permettant le passage d’une forme « B » normale à une forme « A » plus compacte. L’ADN sous forme A est plus résistant à la formation de dimères de pyrimidine, sous l’action des rayons ultraviolets générant des mutations (voir section 10.4), et à l’effet dénaturant de la chaleur sèche. De plus, les SASP sont des sources de carbone et d’énergie utilisables lorsque l’endospore redonne une nouvelle cellule végétative, processus appelé germination (voir plus loin dans cette section).

N

COO– +Ca+

Groupements carboxyles

FIGURE 4.49 Acide dipicolinique (DPA). (a) Structure du DPA. (b) Molécules de DPA complexées par un ion calcium.

Spore mature

Hans Hippe

88 Chapitre 4

FIGURE 4.50 Sporulation. Observation en microscopie à contraste de phase de Clostridium pascui.




TABLEAU 4.3

COMPARAISON ENTRE ENDOSPORES ET CELLULES VÉGÉTATIVES

Caractéristique


Endospore

Structure

Surtout bactéries Gram positif ; Quelques bactéries Gram négatif

Cortex sporal épais Tunique sporale Exosporium

Aspect microscopique

Non réfringent

Réfringent

Teneur en calcium

Faible

Élevée

Acide dipicolinique

Absent

Présent

Activité enzymatique

Élevée

Faible

Métabolisme (consommation O2)

Élevé

Faible ou absent

Synthèse des macromolécules

Oui

Non

ARNm

Présent

Faible ou absent

Résistance à la chaleur

Faible

Élevée

Résistance aux radiations

Faible

Élevée

Résistance aux agents chimiques (H2O2, acides)

Faible

Élevée

Colorabilité

Colorable

Colorable (méthodes spécifiques)

Action du lysozyme

Sensible

Résistant

Teneur en eau

Élevée, 80 à 90 %

Basse, 10 à 25 % dans le protoplaste

Petites protéines acidosolubles (gènes ssp)

Absentes

Présentes

pH cytoplasmique

pH d’environ 7

pH d’environ 5,5 à 6,0 (dans le protoplaste)

Chez Bacillus subtilis, étudié de façon approfondie, le processus entier de sporulation dure environ huit heures. Des études génétiques de mutants de Bacillus, bloqués à chacun des stades de sporulation indiqués sur la figure 4.51, montrent que plus de deux cents gènes sont impliqués dans le processus de sporulation. Celle-ci demande l’arrêt de la synthèse de nombreuses protéines impliquées dans les fonctions cellulaires végétatives et la synthèse des protéines spécifiques de l’endospore (voir figure 4.48b), après activation de nombreux gènes spécifiques de l’endospore (spo, ssp codant les SASP), en réponse à des modifications de l’environnement. Les protéines codées par ces gènes catalysent la série de modifications conduisant d’une cellule végétative, hydratée et métaboliquement active à une endospore déshydratée, métaboliquement inerte, mais extrêmement résistante (tableau 4.3, figure 4.51).

La germination Une endospore peut rester dormante pendant de nombreuses années (voir focus, « Quelle est la durée de vie d’une endospore ? »), mais elle peut très rapidement revenir à l’état de cellule végétative. Ce changement se fait en trois étapes : activation, germination et émergence d’une nouvelle cellule végétative (voir figure 4.52). L’activation est facilement obtenue par chauffage d’endospores nouvellement formées, pendant quelques minutes, à une température élevée, sublétale. Les endospores ainsi activées sont conditionnées pour germer en présence de nutriments spécifiques, comme certains acides aminés (l’alanine en particulier). La germination est habituellement un processus rapide (de l’ordre de quelques minutes) entraînant chez l’endospore la perte de la réfringence observée au microscope, une plus grande

perméabilité aux colorants ainsi que la perte de la résistance à la chaleur ou aux agents chimiques. La disparition du dipicolinate de calcium et des composants du cortex ainsi que la dégradation des SASPs interviennent à ce stade. Le stade final (émergence) implique un gonflement visible de la cellule dû à une absorption d’eau et la synthèse de nouveaux ARN, protéines et ADN. La cellule émerge de la tunique sporale rompue et commence éventuellement à se diviser (voir figure 4.52). La cellule demeure ensuite à l’état végétatif jusqu’à ce que des signaux environnementaux déclenchent à nouveau la sporulation.

La diversité et les aspects phylogéniques de la sporulation Il a été montré qu’environ vingt genres de Bacteria sont capables de sporulation, bien que ce processus n’ait été étudié en détail que chez quelques espèces de Bacillus et de Clostridium. Néanmoins, de nombreux mécanismes de survie de l’endospore, comme la formation des complexes de dipicolinate de calcium et la possession de gènes spécifiques, semblent les mêmes. À quelques détails près, les principes généraux de formation des endospores sont les mêmes chez toutes les bactéries capables de sporulation. En considérant la phylogénie, la capacité de produire des endospores est liée à une sous-lignée particulière de bactéries Gram positif (voir sections 2.5 et 12.20). Cependant, les physiologies des bactéries sporulées sont très variées, comprenant des anaérobies, des aérobies, des phototrophes et des chimiolithotrophes. Compte tenu de cette diversité physiologique, les signaux déclenchant la sporulation peuvent varier selon les espèces et être différents de la simple déplétion en nutriments, signal principal de sporulation chez Bacillus et Clostridium.



Quelle est la durée de vie d’une endospore ?

Dans ce chapitre, nous avons discuté des propriétés de latence et de résistance des endospores bactériennes. Les endospores peuvent survivre pendant longtemps lorsqu’elles sont maintenues en état de latence. Mais que signifie longtemps ? La longévité évidente de l’endospore suggère que ces structures peuvent rester viables (c’est-à-dire, capables de germer sous forme de cellules végétatives) pendant plusieurs décennies, vraisemblablement plus longtemps encore. Une suspension d’endospores de la bactérie Clostridium aceticum (voir figure 1a), préparée en 1947, a été ensemencée dans un milieu de croissance stérile en 1981. Trente-quatre ans plus tard, et en moins de douze heures, la croissance bactérienne a repris, sous forme d’une culture abondante. Clostridium aceticum a été tout d’abord isolée par le Néerlandais K. T. Wieringa, en 1940. La souche fut supposée avoir été perdue, jusqu’à ce qu’un flacon contenant des endospores de C. aceticum soit retrouvé dans une réserve de l’université de Berkeley, en Californie, permettant de relancer la culture*. C. aceticum est une bactérie homoacétogène, capable de synthétiser de l’acétate à partir de CO2 + H2 ou à partir du glucose (voir section 17.16). D’autres exemples de longévité des endospores encore plus extraordinaires ont été publiés. Les bactéries du genre Thermoactinomyces forment des endospores thermophiles, retrouvées dans la nature, dans le sol, les déchets végétaux et le compost. L’étude microbiologique, au Royaume-Uni, d’un site archéologique romain datant de plus de deux mille ans, a mis en évidence un nombre significatif d’endospores viables déposées sur diverses pièces archéologiques. Par ailleurs, des endospores de Thermoactinomyces ont été trouvées dans des échantillons de carottes sédimentaires provenant d’un lac du Minnesota, datant de plus de sept mille ans. Bien que, dans une telle étude, la contamination soit toujours possible, les échantillons étaient traités de façon à éliminer avec une quasi-certitude, une contamination par des endospores « récentes »**. Quels sont les facteurs limitant l’âge d’une endospore ? Les radiations solaires ont été considérées comme un facteur

(a)

William D. Grant

FOCUS


Gerhardt Gottschalk

90 Chapitre 4

(b)

Figure 1 Longévité des endospores (a) Tube contenant des endospores de Clostridium aceticum, préparées le 7 mai 1947. En dormance depuis plus de trente ans, ces endospores, remises en suspension en milieu de culture liquide, ont poussé en douze heures*. (b) Bactéries halophiles du genre Halobium piégées dans des cristaux de sel (d’environ 1 cm de diamètre), synthétisés au laboratoire en présence de ces bactéries (orange) qui y restent viables. Des cristaux similaires, datant du Permien (250 millions d’années), ont été décrits comme contenant des bactéries halophiles sporulées.

majeur, car elles provoquent des mutations dans l’ADN. On suppose qu’au-delà de mille ans, les effets cumulés des rayonnements produisent tant de mutations dans le génome d’un organisme, que même des structures hautement résistantes aux rayons telles que les endospores meurent à la suite de l’altération de leur matériel génétique. Toutefois, des extrapolations à partir d’essais expérimentaux concernant l’effet des radiations naturelles sur les endospores suggèrent que si des suspensions d’endospores sont partiellement protégées du rayonnement, en étant par exem-

ple incluses dans une couche de matière organique, elles peuvent redevenir viables après des périodes de plusieurs centaines de milliers d’années et peut-être plus encore. Surprenant, mais est-ce là la limite possible ? En 1995, un groupe de scientifiques décrit une culture d’endospores bactériennes âgées de 25 à 40 millions d’années***. Les endospores étaient conservées dans l’intestin d’une abeille fossilisée dans de l’ambre d’âge géologique connu. La présence de bactéries sporulées chez ces abeilles avait été préalablement suspectée par l’observation en microscopie électronique de l’intestin de l’insecte, montrant des structures comparables à des endospores. De l’ADN de Bacillus avait également été retrouvé chez cet insecte. De façon surprenante, les échantillons de tissu d’abeille incubés dans un milieu stérile produisirent rapidement une culture de bactéries sporulées. Des précautions rigoureuses furent observées pour démontrer que les bactéries sporulées produites à partir de l’abeille fossilisée dans l’ambre n’étaient pas un contaminant d’âge récent. La découverte de bactéries sporulées halophiles, isolées des inclusions liquides piégées dans des cristaux de sel datant du Permien, il y a 250 millions d’années, fut encore plus spectaculaire****. Ces cellules avaient été vraisemblablement incluses dans le cristal lors de sa formation (voir figure 1b) et étaient restées viables pendant ce laps de temps considérable ! Ces données concernant l’incroyable longévité des endospores sont confirmées par la reproduction de ces résultats dans différents laboratoires (une telle confirmation est extrêmement importante pour vérifier des conclusions aussi hautement controversées). Des endospores conservées dans de bonnes conditions peuvent donc se maintenir indéfiniment en vie. L’endospore est une structure remarquablement adaptée, dont la viabilité est relativement courte, mais dont le maintien en latence est possible pendant des centaines de milliers, voire pendant des millions d’années.

* Braun, M., F. Mayer, et G. Gottschalk. 1981. Clostridium aceticum (Wieringa), a microorganism producing acetic acid from molecular hydrogen and carbon dioxide. Arch. Microbiol. 128: 288–293. ** Gest, H., et J. Mandelstam. 1987. Longevity of microorganisms in natural environments. Microbiol. Sci. 4: 69–71. *** Cano, R. J., et M. K. Borucki. 1995. Revival and identification of bacterial spores in 25- to 40-million-year-old Dominican amber. Science 268: 1060–1064. ***** Vreeland, R.H., W.D. Rosenzweig, et D.W. Powers. 2000. Isolation of a 250 million-year-old halotolerant bacterium from a primary salt crystal. Nature 407:897–900.




Stade 0

Stade VII Exosporium

Paroi bactérienne Membrane cytoplasmique


Lyse de la cellule et libération de l’endospore

ADN L’ADN devient plus dense Stade I

Maturation (développement de la résistance à la chaleur et aux agents chimiques) Endospore en formation

Stade II

Formation du septum autour du protoplaste (enkystement)

Stade III

Formation de la préspore

Noyau

Stade VI

Tuniques sporales

Incorporation de Ca2+ ; déshydratation avancée ; synthèse de SASP et d’acide dipicolinique ; formation des tuniques Membrane sporale externe

Spore libre

Noyau

Stade V

Stade IV Déshydratation

Apparition de l’exosporium. Le cortex primitif se forme dans l’espace intermembranaire

Membrane sporale interne

Exosporium Cortex primitif

FIGURE 4.51 Stades de sporulation. Des études génétiques et microscopiques définissent ces stades (de 0 à VII).

Judith Hoeniger et C. L. Headley


La sporulation ne s’observe chez aucune espèce d’Archaea, suggérant que la capacité à produire des endospores est apparue après que la lignée principale des procaryotes a divergé, il y a des milliards d’années (voir section 2.3 et figure 2.7).


(b)


(a)

(c)

(d)

FIGURE 4.52 Germination chez Bacillus. Retour d’une endospore mature (a) à l’état végétatif ; (d) Observation en microscopie optique de la germination d’une spore mature hautement réfringente. En (b), perte de la réfringence (activation) ; en (c) et en (d), émergence d’une nouvelle cellule végétative (excroissance).

Contrôlez vos acquis L’endospore est une cellule bactérienne différenciée très résistante, que produisent certaines Bacteria, Gram positif. La formation de l’endospore conduit à une structure très déshydratée, qui contient les macromolécules essentielles, et des substances variées, dipicolinate de calcium et petites protéines acido-solubles, absentes de la cellule végétative. Les endospores peuvent rester dormantes indéfiniment, mais germent rapidement lorsque le signal de sporulation adéquat est rencontré. •

Qu’est-ce que l’acide dipicolinique et où se trouvet-il ?

•

Que sont les SASP et quelles sont leurs fonctions ?

•

Décrivez la germination d’une endospore.

IV

LOCOMOTION MICROBIENNE

L’étude des structures microbiennes et de leurs fonctions est complétée par celle de leurs moyens de locomotion. De nombreuses cellules peuvent se mouvoir par elles-mêmes. Cette mobilité leur permet d’atteindre différentes régions de leur environnement. Dans une optique de survie, le mouvement vers un nouvel environnement peut offrir à la cellule de nouvelles ressources et des possibilités de croissance. Les bactéries mobiles



92 Chapitre 4


sont également capables de mouvement en direction de substances attractives ou, à l’inverse, de s’éloigner d’une substance répulsive (ce type de mouvement est appelé tactisme).

De nombreux procaryotes sont mobiles. Cette propriété est due à une structure particulière appelée flagelle (voir figure 4.53). Certaines bactéries peuvent se mouvoir sur des surfaces solides par glissement (voir section 4.14). Des micro-organismes planctoniques sont en mesure de stabiliser leur position dans une colonne d’eau grâce à des vésicules remplies de gaz (voir sections 4.12 et 12.25). Cependant, la majorité des procaryotes mobiles se meuvent par rotation de leurs flagelles.

Carl E. Bauer

4.14 Les flagelles et la mobilité m n

(a)

Les flagelles des bactéries sont des appendices longs et fins, libres à l’une de leurs extrémités, fixés à la cellule bactérienne par l’autre extrémité. Les flagelles sont si fins (environ 20 nm) qu’on ne peut les observer en microscopie optique qu’après une coloration spéciale destinée à augmenter leur épaisseur (voir figure 4.53). Il est, par contre, facile d’observer les flagelles en microscopie électronique (voir figure 4.54). La disposition des flagelles varie selon les bactéries. Les flagelles polaires sont insérés à l’une ou aux deux extrémités de la bactérie (voir figures 4.53b et 4.54a). Parfois, plusieurs flagelles groupés peuvent être fixés à une même extrémité de la cellule, disposition appelée lophotriche (en grec, lophos signifie « touffe », trichos signifie « cheveu ») (voir figure 4.53c). De telles touffes de flagelles peuvent être observées sur des cellules vivantes grâce au microscope à fond noir (voir section 4.1 et figure 4.55a). Bactéries et flagelles apparaissent alors en clair sur fond noir. Chez les procaryotes de très grande taille, des touffes de flagelles peuvent être également observées au microscope à contraste de phase (voir figure 4.55b). Dans le cas d’une ciliature péritriche (voir figures 4.53a et 4.54b), les flagelles sont insérés tout autour de la bactérie (peri signifie « autour »). Le type de ciliature, polaire ou péritriche, est utilisé en taxinomie bactérienne.

La structure des flagelles

(a)

(b)

(c)

E. Leifson

Les flagelles ne sont pas rectilignes, mais possèdent une structure hélicoïdale, caractérisée, lorsque les flagelles flottent

FIGURE 4.53 Flagelles bactériens. Observation en microscopie optique de procaryotes possédant différents types de ciliatures colorés par la méthode de Leifson. (a) Péritriche. (b) Polaire (monotriche). (c) Lophotriche.

Carl E. Bauer

Les flagelles bactériens

(b) FIGURE 4.54 Structure fine des flagelles bactériens. Ciliatures de la bactérie phototrophe Rhodospirillum centenum, observées par coloration négative en microscopie électronique à transmission. (a) Flagelle unique polaire. (b) Flagelles péritriches. La ciliature péritriche n’est observée chez R. centenum que sous certaines conditions de croissance (bactéries en cours d’essaimage). Voir également la figure 4.63b.

librement dans leur milieu, par une distance constante entre deux courbures adjacentes. Cette distance est appelée longueur d’onde, caractéristique d’une espèce bactérienne donnée (voir figures 4.53 à 4.55). Le filament d’un flagelle bactérien est composé de sous-unités d’une protéine appelée flagelline. La forme et la longueur d’onde du flagelle sont en partie déterminées par la structure de la flagelline ainsi que par la direction de l’axe de rotation du filament. La structure élémentaire des flagelles varie sensiblement selon les espèces bactériennes. Chez les Archaea, plusieurs types de flagellines sont connus. La structure de leurs flagelles semble assez différente de celle des bactéries, bien que de fonction similaire. Chez les Bacteria, la flagelline est hautement conservée, suggérant que la mobilité flagellaire est un caractère ancien. Un flagelle est formé de plusieurs parties et fonctionne par rotation, de manière comparable à l’hélice d’un bateau. La base du flagelle et le filament ont une structure différente (voir figure 4.56a). La structure plus large, située à la base du flagelle, liant le filament au corps basal, est appelée crochet. Le crochet est constitué d’un seul type de protéine et sert de jonction entre le filament et le moteur flagellaire. Le moteur est ancré dans la membrane cytoplasmique et dans la paroi. Il se présente sous la forme d’un petit axe central traversant une série d’anneaux. Chez les bactéries Gram négatif, un anneau externe, l’anneau L, est inséré dans le lipopolysaccharide. Un deuxième anneau, l’anneau P, est ancré dans le peptidoglycane de



4.14 Les flagelles et la mobilité 93

R. Jarosch

Norbert Pfennig

Touffe flagellaire

(a)

(b)

FIGURE 4.55 Flagelles de bactéries vivantes. (a) Observation en microscopie optique en fond noir de gros bacilles, de 2 µm de largeur, possédant une touffe de flagelles à chaque pôle. La microscopie en fond noir utilise une lumière rasante diffusée à la surface de l’échantillon (voir section 4.1 et figure 4.5c). (b) Observation en microscopie optique en contraste de phase de la grosse bactérie pourpre phototrophe Rhodospirillum photometricum (3 x 30 µm), possédant à l’un de ses pôles une ciliature lophotriche.

la paroi. Enfin, les anneaux MS et C, sont respectivement fixés à la membrane cytoplasmique et au cytoplasme (voir figure 4.56a). En l’absence de membrane externe, les bactéries Gram positif ne possèdent que la paire d’anneaux internes du corps basal. Une série de protéines, les protéines Mot (voir figure 4.56a) entourent l’anneau interne et sont ancrées dans la membrane cytoplasmique. Ce dispositif est complété par les protéines Fli (voir figure 4.56a), formant le complexe d’inversion du moteur, déterminant le sens de sa rotation en réponse à des signaux intracellulaires.

Les mouvements des flagelles Le flagelle est un minuscule moteur rotatoire, composé d’un rotor et d’un stator. Les anneaux C, MS et P constituent le rotor et forment le corps basal. Le stator est constitué par les protéines Mot qui, entourant les anneaux MS et C, génèrent le mouvement rotatoire. Ce mouvement rotatoire du flagelle s’exprime à partir du corps basal. L’énergie nécessaire à la rotation du flagelle provient de la force proton-motrice (voir sections 4.6 et 5.12), que produit un flux de protons traversant la membrane cytoplasmique et les protéines Mot environnantes (voir figure 4.56a). Il semblerait que le passage d’environ mille protons soit nécessaire pour engendrer une seule rotation du flagelle. Ce mécanisme n’est pas encore réellement bien connu. Un modèle de « turbine à protons » a cependant été proposé pour expliquer les résultats expérimentaux disponibles (voir figure 4.56b). Dans ce modèle, le flux de protons traversant les canaux du stator exerce des forces électrostatiques sur les charges disposées en hélice des protéines du rotor. Les attractions entre charges négatives et positives entraîneraient la rotation du corps basal lorsque le flux de protons traverse le stator (voir figure 4.56b).

La synthèse des flagelles La synthèse et donc la mobilité des flagelles requièrent plusieurs gènes. Chez Escherichia coli et Salmonella typhimurium,

bactéries les plus étudiées, plus de quarante gènes sont nécessaires à leur mobilité. Ces gènes possèdent plusieurs fonctions. Certains codent des protéines de structure du flagelle, d’autres, pour le transport des composés flagellaires vers l’extérieur de la cellule à travers la membrane cytoplasmique ; enfin, certains assurent la régulation biochimique de la synthèse de nouveaux flagelles. Un nouveau flagelle ne se développe pas à partir de sa base, contrairement aux poils des espèces animales, mais à partir de son sommet. L’anneau MS est synthétisé en premier, puis inséré dans la membrane cytoplasmique. D’autres protéines sont synthétisées avec le crochet avant que ne débute la formation du filament (voir figure 4.57). Les molécules de flagelline, synthétisées dans le cytoplasme, diffusent à travers un canal de trois nanomètres existant dans le filament et sont ajoutées à son extrémité pour former le flagelle mature. L’extrémité du flagelle en cours d’élongation est recouverte d’une protéine « coiffe » qui guide l’assemblage des molécules de flagelline (voir figure 4.57). La croissance du flagelle est quasi continue jusqu’à ce que le flagelle ait atteint sa longueur définitive. Un flagelle cassé est encore capable de rotation et peut être reconstitué à l’aide de nouvelles unités de flagelline diffusant par le canal du filament.

La vitesse de déplacement La vitesse de rotation des flagelles n’est pas constante, mais augmente ou diminue en relation avec l’intensité de la force proton-motrice les traversant. Cette rotation peut propulser les bactéries à travers un milieu liquide à des vitesses supérieures à 60 fois leur propre longueur par seconde, soit environ 0,00017 km/h. Exprimée sous forme de longueurs corporelles parcourues par seconde, cette vitesse est relativement élevée. En effet, des animaux rapides, comme le guépard, atteignent des vitesses de 110 km/h, soit seulement 25 longueurs corporelles/s. En tenant compte de la taille de



94 Chapitre 4


l’organisme, des procaryotes nageant de 50 à 60 longueurs corporelles/s. se déplacent plus vite que des organismes supérieurs ! La mobilité des organismes à ciliature polaire et lophotriche est microscopiquement différente de celle des organismes péritriches. Les micro-organismes à ciliature polaire se déplacent en ligne droite, de façon rapide, parfois en zigzags. Les micro-organismes péritriches tournoient de façon lente et majestueuse. Les types de mobilité des organismes polaires et péritriches, ainsi que les changements de direction par inversion du sens de rotation des flagelles sont représentés dans la figure 4.58.

14 nm Filament Flagelline

Crochet Membrane externe (LPS)

Contrôlez vos acquis Anneau L Cylindre axial Anneau P Périplasme

Peptidoglycane

++++

++++

Anneau MS

Corps basal Anneau C

––––


––––

Protéines Fli (complexe d’inversion)

Protéine Mot

Protéine Mot

45 nm

(a)

H+

Cylindre axial Anneau MS +

+

+

–

–

– +

+

+

–

–

– +

+

–

+

– + – – ++ – –

+

– + – – ++ – –

Protéine Mot

Anneau C +

(b)

+

+

–

–

– +

+

+

–

–

– +

+

H+

–

H+

La plupart des micro-organismes sont mobiles grâce à des flagelles. Chez les procaryotes, le flagelle est une structure complexe, constituée de plusieurs protéines, dont la plupart sont ancrées dans la paroi et la membrane cytoplasmique. Le filament flagellaire, formé d’une seule protéine, tourne sous l’action de la force proton-motrice entraînant le moteur flagellaire. •

Qu’est-ce que la flagelline et où la trouve-t-on ?

•

Comment le flagelle peut-il propulser une bactérie vers l’avant ?

•

En quoi une ciliature polaire diffère-t-elle d’une ciliature péritriche ?

4.15 La mobilité par glissement m n Quelques procaryotes sont mobiles alors qu’ils ne possèdent pas de flagelle. Ces bactéries ne nagent pas, mais se déplacent le long de surfaces solides par glissement. Lorsque la mobilité des bactéries est flagellaire, le déplacement se fait au hasard, par une série de courses suivies de culbutes et de changements de direction. Le glissement est une forme de mouvement plus régulier, s’orientant en général dans l’axe de la cellule. Il est très répandu chez les bactéries, mais a été bien étudié seulement chez quelques groupes. Bien que beaucoup plus lent (10 µm/s pour les plus rapides) que la propulsion par des flagelles, le glissement permet à la cellule de se mouvoir autour de son habitat. Les procaryotes capables de glissement sont des cellules filamenteuses ou bacillaires (voir figure 4.59). Le glissement demande le contact avec une surface solide. La morphologie des bactéries glissantes est caractéristique, car les cellules glissent du centre de la colonie vers l’extérieur (voir

FIGURE 4.56 Structure et fonction du flagelle procaryote chez les Bacteria Gram négatif. (a) Structure. L’anneau L est inséré dans la membrane externe (lipopolysaccharide), l’anneau P dans le peptidoglycane. L’anneau MS s’insère dans la membrane cytoplasmique, l’anneau C dans le cytoplasme. Pour atteindre le site de synthèse du flagelle, les molécules de flagelline diffusent à travers un fin canal persistant dans le cylindre axial et le filament. Les protéines Mot sont impliquées dans la rotation (moteur flagellaire), les protéines Fli forment le complexe d’inversion. La rotation des flagelles permet de propulser la bactérie dans le milieu. (b) Fonction. La rotation du flagelle est expliquée par un modèle type « turbine à protons ». Les protons, traversant les protéines Mot, exercent une force électrochimique sur les charges des anneaux C et MS, entraînant la mise en mouvement du rotor.



4.15 La mobilité par glissement 95 Synthèse du filament Crochet mature Membrane externe Anneaux MS/C

Peptidoglycane

Crochet primitif Protéines Mot (moteur)

Anneau P

Protéines Cap

Jonction filamentcrochet

Filament

Anneau L


FIGURE 4.57 Étapes de synthèse du flagelle. La synthèse commence par l’assemblage des anneaux MS/C dans la membrane cytoplasmique, suivie de la formation des autres anneaux, du crochet et de la protéine Cap. La flagelline diffuse à travers le crochet jusqu’à la protéine Cap pour former le filament. L’assemblage des molécules de flagelline (environ 20 000 molécules sont nécessaires à la synthèse d’un filament) est guidé par la protéine Cap, qui assure la croissance régulière du filament.

figure 4.59c) [une colonie est une masse de bactéries dérivant par divisions successives d’une même cellule mère – voir section 5.3]. Les bactéries glissantes les plus connues sont les cyanobactéries filamenteuses (voir figure 4.59a et b, et section 12.25), certaines bactéries Gram négatif, comme les Myxococcus et autres myxobactéries (voir section 12.17), et des espèces de Cytophaga et Flavobacterium (voir figure 4.59c et d, et section 12.31).

Les mécanismes de la mobilité par glissement Il est probable que cette mobilité est due à un ensemble de mécanismes, bien que ceux-ci ne soient pas totalement élucidés. Chez les cyanobactéries (voir figure 4.59a et b), une couche mucoïde polysaccharidique est sécrétée et recouvre la surface externe de la bactérie lors de son glissement. Cette couche mucoïde est une interface entre la bactérie et la surface solide servant de support. L’adhésion du mucus à cette surface entraînerait par réaction le glissement de la bactérie.

Cette hypothèse est étayée par l’observation de pores excrétant des produits muqueux à la surface de cyanobactéries filamenteuses. Chez les bactéries glissantes non phototrophes, le mécanisme de glissement n’est pas lié à la production de couches mucoïdes. Flavobacterium johnsoniae (voir figure 4.59c), par exemple, n’en produit pas. Le mécanisme de glissement le plus probable s’appuie sur des mouvements de protéines à la surface de la cellule. Chez F. johnsoniae, des protéines spécifiques de mobilité, ancrées dans la membrane cytoplasmique et la membrane externe, s’appuieraient sur une surface solide pour faire glisser la bactérie en un mouvement continu. L’énergie nécessaire au mouvement des protéines cytoplasmiques est fournie par la force proton-motrice (voir sections 4.6 et 5.12). Ce mouvement est transmis aux protéines de la membrane externe dispersées à la surface de la cellule, qui, s’appuyant sur la surface solide, propulseraient alors celle-ci en avant (voir figure 4.60). Flagelle réversible

Faisceau de flagelles (rotation anti-horaire)

Étalement du faisceau sur place (rotation horaire)

Rotation horaire

Flagelle unidirectionnel

Faisceau de flagelles (rotation anti-horaire) (a) Péritriche

Rotation anti-horaire

Rotation horaire (b) Polaire

Arrêt et réorientation de la bactérie Rotation horaire

FIGURE 4.58 Type de mouvement chez les procaryotes à ciliature polaire et péritriche. (a) Péritriche : la rotation du faisceau de flagelles dans le sens inverse des aiguilles d’une montre ou anti-horaire (CCW, counterclockwise) propulse la bactérie en avant (nage). La rotation horaire des flagelles (CW, clockwise) provoque la culbute de la bactérie et le pivotement dans une nouvelle direction. (b) Polaire : changement de direction par inversion du sens de rotation du flagelle (propulsion ou traction de la bactérie). Lorsque le mouvement est unidirectionnel (rotation horaire des flagelles), la bactérie s’arrête fréquemment pour se réorienter avant de continuer dans une nouvelle direction. Les flèches jaunes indiquent le sens du mouvement.



96 Chapitre 4


des communautés leur permettant de s’adapter à des conditions environnementales difficiles (voir section 12.17).

Richard W. Castenholz

Contrôlez vos acquis Les procaryotes se déplaçant par glissement ne possèdent pas de flagelles. Ils se meuvent le long d’une surface solide par plusieurs mécanismes. •

En quoi la mobilité par glissement diffère-t-elle de la mobilité flagellaire (mécanismes, structures cellulaires impliquées) ?

•

Quelles sont les différences de mobilité par glissement entre les cyanobactéries filamenteuses et les Flavobacterium ?

Richard W. Castenholz

(a)

(c)

Mark J. McBride

Mark J. McBride

(b)

(d)

FIGURE 4.59 Bactéries mobiles par glissement. (a, b) Oscillatoria princeps, cyanobactérie filamenteuse. (a) Observée en microscopie optique (largeur 35 µm. (b) Vue en microscopie optique de filaments glissant sur une surface d’agarose. Les bactéries sont mobiles par glissement sur une surface solide ou peuvent glisser par un filament utilisant lui-même un second filament comme surface solide. (c, d) Flavobacterium johnsoniae, bactérie Gram négatif, en cours de glissement. (c) Masses de bactéries glissant à partir du centre de la colonie (colonie d’environ 2,7 mm de large). (d) Souches mutantes non glissantes montrant une morphologie typique de ce type de colonies (diamètre 0,7 à 1 mm). [Voir figure 4.60 pour les mécanismes de glissement chez F. johnsoniae.]

Tout comme les autres formes de mobilité, le glissement favorise l’adaptation de la bactérie à son écosystème. Le glissement permet au micro-organisme d’exploiter de nouvelles ressources ou de profiter d’interactions avec d’autres cellules. Les myxobactéries se déplacent par glissement, interagissent et forment

4.16 La mobilité cellulaire m n et la réponse comportementale :

chimiotactisme et phototactisme

Les procaryotes, évoluant au sein de gradients naturels d’agents physiques ou de substances chimiques, ont développé des systèmes de réponse à ces gradients. Ils sont capables de se déplacer vers des substances attractives et de s’éloigner d’autres substances qui leur sont nuisibles. Ce déplacement vers ou à l’opposé de signaux environnementaux est appelé tactisme. Le chimiotactisme, réponse aux substances chimiques et le phototactisme, réponse à la lumière, sont deux tactismes bien connus. Le chimiotactisme et sa régulation sont détaillés dans la section 8.13 ; la régulation des autres tactismes connus chez les procaryotes se calque sur ce modèle. Le chimiotactisme et sa régulation ont été bien étudiés chez les bactéries se déplaçant grâce à des flagelles. Certaines bactéries

Intérieur

H+

Membrane cytoplasmique Peptidoglycane Membrane externe

Out Extérieur Mouvement de la cellule

Mouvement Surface des protéines de la membrane externe

FIGURE 4.60 Mécanismes de glissement chez Flavobacterium johnsoniae et chez d’autres bactéries glissantes. La présence de tubules protéiques dans le peptidoglycane, reliant les protéines cytoplasmiques (en marron) et les protéines de la membrane externe (en orange) permettrait de les faire glisser le long d’une surface solide. Le mouvement de ces dernières est de sens opposé au mouvement de la bactérie. L’énergie nécessaire au mouvement est liée à la force proton-motrice.



4.16 La mobilité cellulaire et la réponse comportementale : chimiotactisme et phototactisme 97

glissantes sont également capables de chimiotactisme, tandis que l’on a observé des déplacements phototactiques chez les cyanobactéries filamenteuses. Les mécanismes expliquant ces tactismes, c’est-à-dire la transmission à l’appareil locomoteur d’informations concernant l’environnement, sont par contre inconnus en ce qui concerne les bactéries glissantes.

Le chimiotactisme Le chimiotactisme est mis en évidence par l’observation du comportement d’une bactérie face à un gradient chimique de substance attractive (voir figure 4.61). Contrairement aux organismes de dimensions plus élevées, les procaryotes sont trop petits pour qu’il soit possible de déceler un gradient chimique entre leurs extrémités, celles-ci étant très rapprochées. Lorsqu’ils se déplacent, les procaryotes comparent le statut physique ou chimique de leur environnement avec celui qu’ils ont expérimenté quelques secondes auparavant. Lorsqu’elles nagent, les bactéries répondent à un gradient plutôt temporel que spatial de molécules signal. Le comportement chimiotactique d’Escherichia coli, bactérie à ciliature péritriche, a été bien étudié. En l’absence de gradient de substance, E. coli se déplace au hasard. La bactérie se déplace en ligne droite (elle fait une course), puis elle s’arrête, tournoie et culbute (voir figure 4.61a). La culbute est suivie d’une course dans une autre direction, prise au hasard (voir figure 4.61a). En présence d’un gradient de substance attractive, le mouvement s’oriente. Lorsque le micro-organisme se déplace vers des concentrations de substance attractive élevées (la bactérie analyse périodiquement son environnement chimique), la course s’allonge et les culbutes deviennent moins fréquentes. L’organisme se dirige donc progressivement vers les concentrations croissantes de substance attractive. En présence d’une substance répulsive, les courses sont allongées et les culbutes supprimées lorsque la bactérie s’éloigne de la substance toxique. Elle se dirige donc vers un gradient décroissant de répulsif.

Le déplacement en ligne droite est dû à la rotation des flagelles dans le sens inverse des aiguilles d’une montre (rotation anti-horaire). Lorsque les flagelles tournent dans le sens des aiguilles d’une montre (rotation horaire), le faisceau s’étale, la course cesse et la bactérie culbute (voir figures 4.58 et 4.61). Le comportement des bactéries à ciliature polaire est légèrement différent. Ces bactéries (par exemple, Pseudomonas spp.) changent de direction en inversant le sens de rotation de leurs flagelles (voir figure 4.58b). Quelques bactéries à ciliature polaire, dont la bactérie phototrophe Rhodobacter sphaeroides, possèdent un flagelle unidirectionnel qui ne tourne que dans le sens horaire. L’orientation du déplacement de type chimiotactique se fait par arrêt périodique de la rotation du flagelle. Pendant cet arrêt, la cellule se réoriente au hasard, portée par les mouvements browniens. À la reprise de la rotation du flagelle, la cellule se déplace dans une nouvelle direction. R. sphaeroides est très attirée par des éléments nutritifs de type carboné et montre également un chimiotactisme à l’oxygène et à la lumière (voir sections ci-dessous). Bien qu’il ne puisse pas inverser le sens de rotation de son moteur flagellaire, le déplacement orienté de R. sphaeroides est identique à celui d’E. coli. Si R. sphaeroides se dirige vers des concentrations plus élevées de substance attractive, la rotation de son flagelle se maintient. À l’opposé, lorsque la bactérie s’éloigne d’une substance attractive (gradient négatif) ou se rapproche d’une substance répulsive (gradient positif), la rotation des flagelles s’arrête plus fréquemment pour laisser la cellule se réorienter.

La mesure du chimiotactisme Le mécanisme moléculaire du chimiotactisme met en jeu des protéines sensorielles insérées dans la membrane cytoplasmique (voir section 8.13). Ces protéines, appelées chimiorécepteurs, détectent en permanence les composants chimiques de l’environnement et transmettent des signaux à des protéines

Culbute


Culbute Nage

Nage

(a) Absence de substance attractive

(b) Présence de substance attractive

FIGURE 4.61 Chimiotactisme chez une bactérie péritriche (Escherichia coli). (a) En l’absence de substances attractives, la bactérie se déplace au hasard, changeant de direction pendant les culbutes. (b) En présence d’une substance attractive, le déplacement est orienté et progresse vers le gradient de concentration élevé.




cytoplasmiques régulant la rotation flagellaire. Le chimiotactisme est donc un système de réponse sensorielle à l’environnement chimique qui influe sur la fonction des flagelles. Le chimiotactisme est démontrable par l’immersion d’un fin tube capillaire en verre rempli d’une solution attractive dans une suspension de bactéries mobiles. Tandis que la substance attractive diffuse à partir du capillaire, formant un gradient chimique décroissant (voir figure 4.62a), les bactéries se rassemblent et nagent vers le tube (voir figure 4.62b). Quelquesunes migrent de façon fortuite dans le tube capillaire, même si celui-ci contient une solution de même composition que le milieu extérieur (voir figure 4.62c). Toutefois, en présence d’une substance attractive, la concentration de bactéries dans le tube capillaire peut être beaucoup plus élevée que la concentration extérieure. Si le tube capillaire contient une substance répulsive, le nombre de bactéries à l’intérieur du tube capillaire est nettement inférieur à celui des bactéries présentes à l’extérieur du tube (voir figure 4.62d). Les chimiorécepteurs spécifiques, détectant l’augmentation de gradient de la substance répulsive, modifient la rotation des flagelles pour entraîner la bactérie loin du répulsif (voir figure 4.62d). En utilisant la méthode du tube capillaire, il est possible de classer les molécules chimiques selon leurs propriétés attractive ou répulsive pour une bactérie donnée. Le comportement chimiotactique des bactéries peut être étudié au microscope, avec l’apport d’une caméra vidéo. L’enregistrement des positions instantanées de chaque cellule permet de tracer leur trajectoire (voir figure 4.62f). Cette méthode a été adaptée à l’étude des bactéries chimiotactiques en environnement naturel, où les substances attractives principales sont les nutriments excrétés par d’autres organismes (bactéries de plus grande taille, macro-organismes vivants ou morts). Les algues produisent, par exemple, des composés organiques et de l’oxygène (O2, provenant de la photosynthèse) attirant certaines bactéries chimiotactiques (voir figure 4.62f).

(a)

(b)

(c)

(d)

Nombre de cellules bactériennes par tube

98 Chapitre 4

(e)


Témoin Substance répulsive Temps

De nombreux micro-organismes phototrophes sont attirés par la lumière. Ce phénomène est appelé phototactisme. Le phototactisme permet aux organismes phototrophes de s’orienter plus efficacement, de façon à recevoir l’intensité lumineuse maximale nécessaire à la photosynthèse. Le phototactisme est démontrable par l’observation de bactéries phototrophes mobiles déposées sur une lame de verre et exposées à un spectre de lumière visible. Ces bactéries se déplacent et s’accumulent aux longueurs d’onde correspondant à l’absorption de leurs pigments photosynthétiques (voir figure 4.63a et sections 17.2 et 17.3). Les procaryotes phototrophes révèlent deux types de tactisme différents. L’un d’eux, appelé scotophobotactisme, est observable seulement au microscope, lorsqu’une bactérie, traversant le champ lumineux de l’appareil, se trouve plongée dans l’obscurité. L’obscurité, défavorable à l’énergie cellulaire, déclenche un signal de culbute, suivie d’une course dans une nouvelle direction, ramenant la bactérie à la lumière. Chez Rhodospirillum centenum, organisme phototrophe très mobile, des colonies entières sont phototactiques et se déplacent collectivement vers la lumière (voir figure 4.63b).

Nicholas Blackburn

Le phototactisme

(f) FIGURE 4.62 Chimiotactisme. (a-e) Techniques de mesure du chimiotactisme chez les bactéries. (a) Un capillaire est placé dans une suspension bactérienne, entraînant la formation d’un gradient de concentration. (b) Accumulation de bactéries dans le capillaire contenant une substance attractive. (c) Capillaire témoin contenant une solution salée, ni attractive, ni répulsive. La densité de bactéries est identique à l’intérieur comme à l’extérieur du capillaire. (d) Les bactéries s’éloignent d’une substance répulsive. (e) Courbes montrant les densités de bactéries dans les capillaires contenant différentes substances. (f) Trajectoires en eau de mer de bactéries mobiles autour d’une algue unicellulaire (tache blanche au centre), filmées à l’aide d’une caméra video couplée à un microscope. Les bactéries montrent un chimiotactisme positif à l’oxygène en se déplaçant vers l’algue qui en produit. La vitesse moyenne des bactéries est d’environ 25 µm/s. Diamètre de l’algue ; environ 60 µm.



500

600

700

Longueur d’onde (nm)

850

Carl E. Bauer

400

99

Norbert Pfennig

Questions

(b) (a) FIGURE 4.63 Phototactisme (a) Accumulation scotophobique de la bactérie phototrophe Thiospirillum jenense aux longueurs d’onde d’absorption de ses pigments. Une suspension dense de bactéries déposée sur une lame de verre a été exposée à un spectre de lumière visible. Après un certain temps, l’accumulation sélective des bactéries a été photographiée en microscopie optique. Les longueurs d’onde d’accumulation des bactéries correspondent au spectre d’absorption de la bactériochlorophylle a (comparer avec la figure 17.3b). (b) Phototactisme positif d’une colonie de bactéries pourpres phototrophes Rhodospirillum cetenum, après 2 h d’exposition à la lumière (temps 0 en haut). La colonie de bactéries phototrophes se déplace vers la source de lumière, vers la droite. Voir figure 4.54, l’observation en microscopie électronique de R. centenum.

Le système de régulation du chimiotactisme est également impliqué dans le phototactisme, en particulier les protéines cytoplasmiques (protéines Che) contrôlant la direction de rotation du flagelle (voir section 8.13). En effet, l’étude de bactéries phototrophes mutantes a montré que si leur phototactisme était déficient, leur système chimiotactique l’était également. Des photorécepteurs, analogues aux chimiorécepteurs, mais sensibles au gradient de lumière, modulent la réponse phototactique. Les photorécepteurs interagissent avec les protéines cytoplasmiques contrôlant la rotation du flagelle pour maintenir la course de la bactérie si celle-ci se dirige vers des intensités lumineuses plus élevées. Les mêmes protéines cytoplasmiques régulent donc le chimiotactisme et le phototactisme, bien que les stimuli à l’origine du mouvement soient différents.

Les autres tactismes Les bactéries peuvent être également attirées ou repoussées par l’oxygène (aérotactisme – voir figure 4.62f) ou par des milieux hypertoniques (osmotactisme). Ces mécanismes commencent à être compris au niveau moléculaire. Pour adapter ses réponses comportementales simples, la bactérie teste régulièrement son environnement à l’aide d’un système de capteurs sensoriels qui interagissent avec des protéines contrôlant

la direction de rotation des flagelles. En compétition avec d’autres espèces d’une communauté microbienne, les procaryotes mobiles sont capables de se rapprocher avantageusement d’éléments nutritifs ou de s’éloigner de substances toxiques.

Contrôlez vos acquis Les bactéries mobiles sont capables de répondre à un gradient physique ou chimique environnemental. Le chimiotactisme ou le phototactisme est l’orientation du déplacement d’un procaryote vers un stimulus, ou en direction opposée, par modification de la répartition des courses et des culbutes. La direction de rotation du flagelle est contrôlée par un système de capteurs sensoriels et de protéines de réponse. •

Définissez le chimiotactisme.

•

Quels événements provoquent une course ? Une culbute ?

•

Différenciez le scotophobotactisme du phototactisme.

QUESTIONS 1. Quelle fonction a la coloration en microscopie ? À quoi servent les colorants cationiques (voir section 4.1) ? 2. Quel est l’avantage de la microscopie par contraste d’interférence différentielle sur la microscopie à fond clair ? De la microscopie à contraste de phase par rapport à la microscopie à fond clair (voir section 4.2) ? 3. Quel est l’avantage principal de la microscopie électronique sur la microscopie optique ? Quel type de microscope électronique 5. Décrivez en une seule phrase la structure membranaire (voir

doit-il être utilisé pour observer les caractéristiques tridimensionnelles d’une cellule (voir section 4.3) ? 4. Quelles sont les principales morphologies des procaryotes ? Dessinez les bactéries pour chaque forme. Quelle est la taille maximale d’un procaryote ? Minimale ? Comment expliquezvous que l’on connaisse mieux la limite inférieure que la limite supérieure ? Quelles sont les dimensions d’un bacille comme Escherichia coli (voir section 4.4) ? section 4.5).



100 Chapitre 4


6. Expliquez en une seule phrase pourquoi les molécules ionisées ne peuvent passer librement à travers la membrane cytoplasmique. Comment s’effectue leur transport transmembranaire (voir sections 4.5 et 4.6) ? 7. Décrivez la différence majeure dans la composition des membranes entre Bacteria et des Archaea (voir section 4.5). 8. La bactérie Escherichia coli importe le lactose par l’intermédiaire du système de la perméase Lac, le glucose grâce à un système phosphotransférase et le maltose au moyen d’un transporteur ABC. Pour chacun de ces sucres, décrivez : 1) les constituants de leur système de transport ; 2) la source d’énergie fournie pour ce transport (voir section 4.7). 9. Pourquoi le feuillet rigide de la paroi bactérienne s’appelle-t-il le peptidoglycane ? Quelles sont les raisons chimiques expliquant la rigidité conférée par le peptidoglycane à la structure cellulaire (voir section 4.8) ? 10. Pourquoi le saccharose est-il capable de stabiliser la structure cellulaire après une lyse par le lysozyme (voir section 4.8) ? 11. Listez différentes fonctions de la membrane externe des bactéries Gram négatif. Quelle est la composition chimique de la membrane externe (voir section 4.9) ? 12. Quelles sont les fonctions des structures polysaccharidiques de surface chez les procaryotes (voir section 4.10) ? 13. Quels sont les types d’inclusions cytoplasmiques retrouvés chez les procaryotes ? En quoi une inclusion de d’acide poly-β -

hydroxybutyrique (PHB) diffère-t-elle d’un magnétosome (composition, rôle métabolique) [voir section 4.11] ? 14. Quelle est la fonction des vésicules de gaz ? Pourquoi leur structure permet-elle de retenir leur contenu gazeux (voir section 4.12) ? 15. Précisez en quelques phrases les différences entre l’endospore bactérienne et la cellule végétative (structure, composition chimique, aptitude à résister à des conditions extérieures difficiles) [voir section 4.13]. 16. Définissez les termes suivants : endospore mature, cellule végétative, germination (voir section 4.13). 17. Pendant combien de temps les endospores peuvent-elles rester viables et en dormance ? Comment le montre-t-on (voir section 4.13) ? 18. Décrivez la structure et la fonction d’un flagelle bactérien. Quelle est la source d’énergie utilisée par le flagelle (voir section 4.14) ? 19. En quoi le mécanisme de mobilité par glissement chez Flavobacterium diffère-t-il de la mobilité chez Escherichia coli (voir section 4.15) ? 20. Expliquez en quelques phrases comment une bactérie mobile est capable de percevoir la présence d’une substance attractive et de s’en rapprocher (voir section 4.16).

PROBLÈMES 1. Calculez la taille la plus petite d’un spécimen observable avec une longueur d’onde de 600 nm et l’objectif à immersion à un grossissement de 100× avec une ouverture numérique de 1,32. Comment la résolution peut-elle être améliorée avec cette lentille ? 2. Calculez le rapport surface sur volume d’une cellule sphérique de 15 µm de diamètre et d’une cellule de 2 µm. Quelles sont les conséquences de ces différences de rapport surface sur volume dans les fonctions cellulaires ?

3. Imaginez que l’on vous donne deux cultures, l’une d’une bactérie Gram négatif et l’autre d’une espèce d’Archaea. Trouvez quatre méthodes, autres que le séquençage du gène codant l’ARN ribosomique (voir section 2.3), pour attribuer les deux cultures aux domaines des Bacteria et des Archaea. 4. Calculez le temps nécessaire à la bactérie Escherichia coli (1 × 3 µm), nageant à vitesse maximale, pour traverser un tube capillaire de 3 cm de long, contenant une substance chimique attractive.



I

Nutrition et culture des microorganismes

5.1 5.2 5.3

La nutrition microbienne Les milieux de culture La culture des micro-organismes

102 105 107

II

Énergétique et enzymes

109

5.4 5.5

Éléments de bioénergétique Les enzymes et la catalyse

109 110

III

Oxydoréduction et composés riches en énergie

112

5.6 5.7 5.8

L’oxydoréduction Un transporteur d’électrons, le NAD+ Les composés riches en énergie et le stockage de l’énergie

IV

102

112 115 116

Principales voies cataboliques, transport d’électrons et force proton-motrice 117

5.9 5.10 5.11

La conservation de l’énergie : les options Un exemple de fermentation : la glycolyse La respiration et les chaînes de transfert d’électrons associées aux membranes 5.12 La conservation de l’énergie par la force proton-motrice

117 118 120 122

V

Flux de carbone dans la respiration et autres voies cataboliques

125

5.13 5.14

Le flux de carbone dans la respiration : le cycle de l’acide citrique Les autres voies cataboliques

126 126

VI

Réactions de biosynthèse

129

5.15 5.16

La biosynthèse des sucres et des polysaccharides 129 La biosynthèse des acides aminés et des nucléotides 129 La biosynthèse des acides gras et des lipides 131

5.17

CHAPITRE CINQ

Nutrition, culture et métabolisme des micro-organismes

Des connaissances en nutrition et en bioénergétique sont indispensables pour cultiver les micro-organismes et comprendre comment les cellules microbiennes « vivent » dans leur habitat naturel.



102 Chapitre 5


GLOSSAIRE Accepteur d’électron (electron acceptor) Substance oxydée qui peut accepter des électrons d’un donneur d’électron et est réduite au cours de la réaction. Anabolisme (anabolism) Ensemble de toutes les réactions de biosynthèse des cellules. ATP Synthase (ATPase) [ATP synthase (ATPase)] Complexe enzymatique multiprotéique inclus dans la membrane cytoplasmique, catalysant la synthèse de l’ATP par couplage à une force proton-motrice. Autotrophe (autotroph) Organisme capable de biosynthétiser tous les constituants cellulaires à partir de CO2, source unique de carbone. Catabolisme (catabolism) Ensemble de toutes les réactions conduisant à la production de l’énergie utilisable par les cellules (généralement sous forme d’ATP). Catalyseur (catalyst) Substance accélérant la vitesse d’une réaction chimique sans être consommée. Chimio-osmose (chemiosmosis) Processus utilisant la force proton-motrice pour produire de l’ATP. Coenzyme (coenzyme) Petite molécule non protéique associée à une enzyme et participant à une réaction catalytique. Culture pure (pure culture) Culture constituée d’un type unique de micro-organisme. Cycle de l’acide citrique (citric acid cycle) Série cyclique de réactions conduisant à la conversion de l’acétate en CO2. Donneur d’électron (electron donor) Substance réduite qui peut donner des électrons à un accepteur d’électron et est oxydée au cours de la réaction. Endergonique (endergonic) Processus nécessitant de l’énergie. Énergie d’activation (activation energy) Énergie requise pour activer le(les) substrat(s) d’une réaction enzymatique. Énergie libre (free energy [G]) Énergie disponible pour effectuer un travail ; G0' est l’énergie libre dans des conditions standard. Enzyme (enzyme) Protéine dont la fonction est d’augmenter la vitesse (catalyse) d’une réaction chimique spécifique. Exergonique (exergonic) Processus libérant de l’énergie. Fermentation (fermentation) Catabolisme anaérobie au cours duquel un composé organique sert à la fois de donneur et d’accepteur

I

NUTRITION ET CULTURE DES MICRO-ORGANISMES

Avant qu’elle puisse se diviser, une cellule doit coordonner un grand nombre de réactions chimiques différentes et assembler les molécules en structures spécifiques. Le terme métabolisme désigne l’ensemble de toutes ces réactions. Les réactions métaboliques comprennent d’une part des réactions libérant de l’énergie, ou réactions cataboliques (catabolisme), et d’autre part des réactions consommant de l’énergie, ou réactions anaboliques (anabolisme). La plupart des connaissances concernant le métabolisme des micro-organismes ont émergé de l’étude de cultures au laboratoire.

m n5.1 La nutrition microbienne Les cellules sont constituées principalement de macromolécules, polymères composés d’unités plus petites appelées monomères

d’électrons, et qui produit de l’ATP par phosphorylation au niveau du substrat. Force proton-motrice (proton motive force) État activé d’une membrane résultant d’un potentiel membranaire et du transport des éléments constitutifs de l’eau (H+ contre OH–) à travers la membrane. Glycolyse (glycolysis) Voie biochimique conduisant à la formation d’ATP et de divers produits de fermentation, et dans laquelle le glucose est fermenté ; appelée également voie d’Embden-Meyerhof. Milieu complexe (complex medium) Milieu de culture contenant des substances de composition chimique inconnue telles que les extraits de levure et les hydrolysats de viande. Milieu de culture (culture medium) Solution de divers nutriments permettant la croissance des micro-organismes. Milieu défini (defined medium) Milieu de culture dont la composition chimique est connue avec précision. Phosphorylation au niveau du substrat (substrate-level phosphorylation) Synthèse d’ATP à partir d’ADP par transfert d’un groupement phosphate riche en énergie appartenant à un composé organique phosphorylé. Phosphorylation oxydative (oxidative phosphorylation) Synthèse d’ATP à partir de la force proton-motrice développée pendant le transport d’électrons. Photophosphorylation (photophosphorylation) Synthèse d’ATP à partir de la force proton-motrice développée pendant le transport d’électrons grâce à l’utilisation de l’énergie lumineuse. Potentiel de réduction (E0') (reduction potential) Mesure, en volts, de la tendance d’un composé à donner ses électrons ; E0' est le potentiel de réduction dans des conditions standard. Respiration (respiration) Processus au cours duquel un composé est oxydé par l’accepteur terminal d’électrons O2 (ou un autre composé remplaçant O2) et qui conduit généralement à la synthèse d’ATP par phosphorylation oxydative. Sidérophore (siderophore) Chélateur qui peut fixer du fer présent en très faibles concentrations. Technique d’asepsie (aseptic technique) Ensemble de procédures destinées à empêcher la contamination d’objets stériles ou de cultures microbiennes pendant leur manipulation.

et d’eau (voir section 3.2). La nutrition microbienne est le domaine qui étudie les processus par lesquels les cellules incorporent les monomères (ou les précurseurs de monomères) indispensables à leur croissance. Ces substances sont appelées nutriments. Les besoins nutritifs diffèrent en nature et en quantité selon les organismes. Quelques nutriments, appelés macronutriments (voir tableau 5.1), sont utilisés en quantité importante ; d’autres, les micronutriments, sont utilisés en quantité moindre, parfois même à l’état de traces.

Le carbone et l’azote Le carbone, est un élément indispensable à toutes les cellules et la plupart des procaryotes utilisent un composé organique comme source de carbone. Environ 50 % du poids sec d’une cellule microbienne est composé de carbone, celui-ci étant l’élément de base de toutes les classes de macromolécules. Des composés organiques carbonés comme des acides aminés, des acides gras, des acides organiques, des sucres, des



5.1 La nutrition microbienne 103

TABLEAU 5.1

MACRONUTRIMENTS RENCONTRÉS EN MILIEU NATUREL ET PRÉSENTS DANS LES MILIEUX DE CULTURE Types courants de nutriments dans l’environnement

Élément

Forme chimique apportée aux milieux de culture

Carbone (C)

CO2, composés organiques

Glucose, malate, acétate, pyruvate, acides aminés, des centaines d’autres composés ou des mélanges complexes (extrait de levure, peptone, etc.)

Hydrogène (H)

H2O, composés organiques

H2O, composés organiques

Oxygène (O)

H2O, O2, composés organiques

H2O, O2, composés organiques

Azote (N)

NH3, NO3–, N2, composés organiques azotés

Inorganiques : NH4Cl, (NH4)2SO4, KNO3, N2 Organiques : Acides aminés, bases azotées de nucléotides, beaucoup d’autres composés contenant N

Phosphore (P)

PO43–

KH2PO4, Na2HPO4

SO42–,

Soufre (S)

H2S, composés organiques soufrés S, sulfures métalliques (FeS, CuS, ZnS, NiS, etc.)

Na2SO4, Na2S2O3, Na2S, cystéine ou autres composés organiques soufrés

Potassium (K)

K+ en solution ou sous diverses formes de sels de K

KCl, KH2PO4

Magnésium (Mg)

Mg2+ en solution ou sous diverses formes de sels de Mg

MgCl2, MgSO4

2+

Sodium (Na)

Na en solution ou sous forme de NaCl ou d’autres sels de Na

NaCl

Calcium (Ca)

Ca2+ en solution ou sous forme de CaSO4 ou d’autres sels de Ca

CaCl2

Fer (Fe)

Fe2+ ou Fe3+ en solution ou sous forme de FeS, Fe(OH)3 ou de nombreux autres sels de Fe

FeCl3, FESO4, diverses solutions chélatant le fer (Fe3+ EDTA, Fe 3+ citrate, etc.)

bases azotées, des composés aromatiques et bien d’autres composés organiques sont assimilés par l’une ou l’autre des différentes espèces de bactéries pour synthétiser leurs composants cellulaires. Quelques procaryotes, en revanche, capables de construire toutes leurs structures cellulaires à partir de dioxyde de carbone (CO2), sont autotrophes. L’énergie nécessaire à ce processus provient de la lumière ou de composés inorganiques. L’élément le plus abondant dans les cellules après le carbone est l’azote. Environ 12 % du poids sec d’une cellule microbienne est constitué d’azote, élément présent dans les protéines, les acides nucléiques et plusieurs autres constituants cellulaires. Dans le milieu naturel, l’azote se trouve sous forme organique et inorganique (voir tableau 5.1). L’azote assimilable se manifeste cependant sous forme inorganique : ammoniac (NH3), nitrate (NO3–), ou N2. La plupart des bactéries sont capables d’utiliser l’ammoniac comme source unique d’azote, et beaucoup d’entre elles peuvent aussi utiliser le nitrate. Cependant, certaines bactéries, les bactéries fixatrices d’azote, utilisent l’azote atmosphérique (N2) comme unique source d’azote.

formes diverses et subit, dans l’environnement, un certain nombre de transformations chimiques, la plupart effectuées exclusivement par des micro-organismes (voir section 19.13). Le soufre cellulaire provient essentiellement de sources inorganiques, sous forme de sulfate (SO42–), ou d’ion hydrosulfure (HS–) [voir tableau 5.1]. Le potassium est indispensable à tous les organismes. Il est nécessaire à l’activité de nombreuses enzymes, y compris celles qui sont impliquées dans la synthèse protéique. Le magnésium stabilise les ribosomes, les membranes cellulaires et les acides nucléiques, et sert également de cofacteur à de nombreuses enzymes. Le calcium n’est pas un élément essentiel pour la croissance de nombreux micro-organismes ; il stabilise les parois cellulaires et joue un rôle essentiel dans la thermorésistance des endospores (voir section 4.13). Le sodium est indispensable à certains micro-organismes qui vivent dans des environnements particuliers. L’eau de mer, par exemple, en contient beaucoup, et les micro-organismes marins en ont généralement besoin pour leur croissance. La plupart des espèces d’eau douce, au contraire, peuvent se développer en absence de sodium.

Les autres macronutriments : P, S, K, Mg, Ca, Na

Le fer

Le phosphore se trouve dans l’environnement sous forme de phosphate organique et inorganique, et la cellule en a essentiellement besoin pour la synthèse des acides nucléiques et des phospholipides. Le soufre est nécessaire parce qu’il entre dans la composition de deux acides aminés, la cystéine et la méthionine (voir section 3.6), d’un certain nombre de vitamines, telles que la thiamine, la biotine et l’acide lipoïque, et du coenzyme A. Le soufre est utilisé par les organismes sous des

Le fer joue un rôle important dans la respiration cellulaire car c’est un élément clé des cytochromes et des protéines fer-soufre impliqués dans le transfert d’électrons (voir section 5.11 et tableau 5.2). En condition anoxique, le fer se trouve généralement sous sa forme réduite Fe2+ (fer ferreux) et soluble. En présence de O2, le fer se présente généralement sous sa forme oxydée Fe3+ (ferrique) et sous diverses formes minérales insolubles. Pour se procurer du fer à partir de ces minéraux, les



104 Chapitre 5


cellules synthétisent des composés appelés sidérophores, qui complexent le fer et le transportent dans les cellules. L’un des types principaux de sidérophores est un dérivé de l’acide hydroxamique, qui chélate très fortement le fer ferrique (voir figure 5.1a). Une fois que le complexe fer-hydroxamate a pénétré dans la cellule, le fer est libéré et l’hydroxamate peut être excrété et réutilisé pour le transport du fer. Les bactéries telles qu’Escherichia coli et Salmonella typhimurium synthétisent des sidérophores phénoliques à structure complexe appelés entérobactines (voir figure 5.1b). Ces sidérophores dérivent d’un composé aromatique, le catéchol, et ont une affinité très élevée pour le fer. Sans ces agents fixant

R

N

C

OH

Fe3

R +

+

R

O

Élément Bore (B)

Chrome (Cr)

+

+

Hydroxamate Hydroxamate ferrique

Respiration, cytochrome c oxydase ; photosynthèse, plastocyanine, quelques superoxyde dismutases

Fer (Fe)b

Cytochromes ; catalases ; peroxydases ; protéines fer-soufre ; oxygénases ; toutes les nitrogénases

Manganèse (Mn)

Molybdène (Mo)

Nickel (Ni)

Sélénium (Se)

La plupart des hydrogénases ; coenzyme F430 des méthanogènes ; monoxyde de carbone déshydrogénase ; uréase Formiate déshydrogénase ; quelques hydrogénases ; l’acide aminé sélénocystéine

Tungstène (W)

Quelques formiate déshydrogénases ; oxotransférases d’hyperthermophiles

Vanadium (V)

Vanadium nitrogénase ; bromoperoxydase

Zinc (Zn)

Anhydrase carbonique ; alcool déshydrogénase ; ARN et ADN polymérases ; de nombreuses protéines liant l’ADN

a

+

Fe2

Hème

Enzymes contenant du fer (a) O C

NH

O

L’ensemble des micronutriments indiqués n’est pas requis par toutes les cellules ; quelques-uns des métaux indiqués sont seulement présents dans des enzymes de certains micro-organismes. b Nécessaires en quantités plus importantes que les autres oligoéléments.

O

O

Fe3+

O

O

Activateur de nombreuses enzymes ; présent dans certaines superoxide dismutases et dans l’enzyme qui dissocie l’eau chez les phototrophes oxygéniques (Photosystème II) Certaines enzymes flaviniques ; quelques nitrogénases, nitrate réductases, sulfite oxydases, DMSOTMAO réductases ; quelques formiate déshydrogénases

Réduction

Hydroxamate

Requis par les mammifères pour le métabolisme du glucose ; non requis par les micro-organismes

Cuivre (Cu)


Hydroxamate ferrique

Fonction cellulaire

Vitamine B12 transcarboxylase (bactéries propioniques)

R

Fe3

a REQUIS PAR LES ORGANISMES VIVANTS

Cobalt (Co)

O

Fe3

MICRONUTRIMENTS (OLIGOÉLÉMENTS)

Présent dans un auto-inducteur (quorum sensing) chez les bactéries ; trouvé également dans quelques antibiotiques polycétides

C

O

Groupement hydroxamate

e–

TABLEAU 5.2

N

HN

C

N H

O

O

C O

(b)

Tête peptidique fixant le fer ferrique 3+

3+

Queue hydrophobe

Fe

HO O N H

(c)

Fe OH 3+ O Fe O H N N H O 3+ OH Fe

O

HO OH 3+ Fe O H N N H O H2N O

Fe

N

3+

O

HO H N O Fe

O N H 3+ OH

N

O OH

FIGURE 5.1 Agents chélateurs de fer produits par les microorganismes. (a) Hydroxamate. Le fer est lié sous sa forme Fe 3+ et libéré dans la cellule sous sa forme Fe 2+. L’hydroxamate quitte alors la cellule et le cycle recommence. (b) L’entérobactine ferrique d’Escherichia coli. Les atomes d’oxygène des molécules de catéchol sont représentés en jaune. (c) L’aquachéline, sidérophore peptidique de forme allongée, fixe des ions Fe3+. La queue hydrophobe aide l’aquachéline à traverser la membrane cellulaire.



5.2 Les milieux de culture 105

fortement le fer, beaucoup de micro-organismes pathogènes ne pourraient pas provoquer d’infection. Les micro-organismes ont souvent des difficultés à obtenir du fer à partir de tissus animaux parce qu’il est piégé dans des complexes (voir sections 21.7 et 21.8). Le fer est difficile à détecter dans l’eau de mer. Ainsi, les eaux de surface des océans contiennent généralement quelques picogrammes (un picogramme est égal à 10– 12 g) de fer par millilitre. C’est pour cette raison que beaucoup de bactéries marines synthétisent des sidérophores à structure complexe pouvant séquestrer le fer à partir de très faibles quantités. Ces sidérophores comportent une tête peptidique qui complexe Fe3+ et une queue lipidique qui peut s’associer à la membrane cytoplasmique. Quand de tels composés, comme l’aquachéline (voir figure 5.1c) ont fixé du fer, ils s’agrègent sous forme de micelles lipidiques et transportent le fer dans la cellule. Quelques procaryotes peuvent se développer en l’absence de fer : par exemple, les bactéries Lactobacillus plantarum et Borrelia burgdorferii (cette dernière est l’agent de la maladie de Lyme – voir section 27.4) ne contiennent pas de fer. Dans ces bactéries, le Mn2+ remplace le fer dans les métallo-enzymes qui normalement incorporent du Fe2+.

la biotine, la pyridoxine (vitamine B6) et la cobalamine (vitamine B12).

Les micronutriments (oligo-éléments)

m n5.2 Les milieux de culture

Bien que nécessaires en très faible quantité, les micronutriments sont néanmoins indispensables au bon fonctionnement cellulaire. Comme le fer, les micronutriments, souvent appelés oligo-éléments, sont des métaux. Ils jouent généralement un rôle dans la catalyse en tant que composants de diverses enzymes (voir tableau 5.2). Les besoins des micro-organismes en oligo-éléments sont infimes et il est souvent inutile d’en ajouter au milieu de culture. Cependant, si un milieu de culture contient des produits chimiques ultra-purs dissous dans de l’eau distillée, elle-même très pure, les concentrations en oligo-éléments peuvent être insuffisantes. Dans ce cas, les métaux nécessaires sont fournis par une solution diluée d’oligo-éléments (voir tableau 5.2) ajoutée au milieu.

Les facteurs de croissance Les facteurs de croissance sont des composés organiques qui, comme les micronutriments, sont nécessaires en très petite quantité à certains micro-organismes. Les vitamines, les acides aminés, les purines et les pyrimidines sont des facteurs de croissance synthétisés par la plupart des micro-organismes ; quelques micro-organismes doivent cependant obtenir ces constituants essentiels à partir de leur environnement. Pour ces derniers, ces composés doivent donc être rajoutés au milieu de culture. Les vitamines sont les facteurs de croissance les plus courants. La plupart des vitamines (récapitulées dans le tableau 5.3) entrent dans la composition des coenzymes (voir, par exemple, les figures 5.10, 5.12 et 5.15). Les besoins en vitamines varient énormément selon les micro-organismes (d’aucune à plusieurs vitamines). Les bactéries lactiques qui incluent, entre autres, les genres Streptococcus, Lactobacillus et Leuconostoc (voir section 12.19), sont connues pour exiger de multiples vitamines, bien plus que l’homme (voir tableau 5.4). Les vitamines les plus communément indispensables aux micro-organismes sont la thiamine (vitamine B1),

Contrôlez vos acquis Les centaines de composés chimiques d’une cellule vivante sont formées à partir de substances de base appelées nutriments. Les éléments nécessaires en grande quantité sont les macronutriments, alors que les métaux et composés organiques, indispensables mais en quantités très faibles, sont, d’une part, les micronutriments, et d’autre part, les facteurs de croissance. •

Quelles sont, dans les cellules, les deux catégories de macromolécules qui contiennent de l’azote ?

•

Pourquoi le Co2+ est-il un micronutriment tandis que le C est un macronutriment ?

•

Quel rôle joue le fer dans le métabolisme cellulaire ? Comment les cellules séquestrent-elles le fer ?

Un milieu de culture est une solution d’éléments nutritifs utilisée au laboratoire pour la croissance des micro-organismes. La culture est une étape indispensable à l’étude d’un microorganisme ; la réussite d’une culture dépend du choix du milieu et de l’attention particulière apportée à sa préparation.

Les types de milieux Deux types de milieux de culture sont couramment utilisés en microbiologie : les milieux définis chimiquement et les milieux non définis (dits complexes). Les milieux définis chimiquement (milieux définis, en abrégé) sont préparés en ajoutant à de l’eau distillée des quantités connues d’éléments chimiques inorganiques ou organiques hautement purifiés. La composition chimique exacte d’un milieu défini est donc connue. La source de carbone d’un milieu de culture est très importante parce que toutes les cellules ont besoin de grandes quantités de carbone pour synthétiser les nouveaux composants cellulaires. Dans un milieu défini simple (voir tableau 5.4), une seule source de carbone est présente. La nature de la source de carbone et sa concentration dépendent de l’organisme cultivé. Il n’est pas essentiel de connaître la composition exacte d’un milieu pour cultiver la plupart des organismes. Des milieux complexes peuvent alors suffire et même être plus appropriés. Les milieux complexes contiennent des hydrolysats préparés par digestion protéolytique partielle de produits animaux ou végétaux : caséine (protéine du lait), viande de bœuf, soja, cellules de levure, ou un certain nombre d’autres substances (non définies du point de vue chimique) hautement nutritives. Ces hydrolysats sont disponibles dans le commerce sous forme de poudre et peuvent être rapidement pesés et dissous dans de l’eau distillée. Cependant, la composition précise des éléments nutritifs d’un milieu complexe ne peut être contrôlée avec précision.



106 Chapitre 5


TABLEAU 5.3

FACTEURS DE CROISSANCE : LES VITAMINES ET LEURS FONCTIONS

Vitamine

Fonctions

Acide p-Aminobenzoïque

Précurseur de l’acide folique

Acide folique

Métabolisme des composés à un atome de carbone ; transfert de groupements méthyles

Biotine

Biosynthèse des acides gras ; quelques réactions de fixation de CO2

Cobalamine (B12)

Réduction et transfert de fragments à un seul carbone ; synthèse de désoxyribose

Acide lipoïque

Transfert de groupements acyles au cours de la décarboxylation du pyruvate et de l’α-cétoglutarate

Acide nicotinique (niacine)

Précurseur du NAD+ (voir figure 5.10) ; transfert d’électrons dans les réactions d’oxydoréduction

Acide pantothénique

Précurseur du coenzyme A ; activation de l’acétyle et des autres dérivés acyles

Riboflavine

Précurseur du FMN (voir figure 5.15), du FAD des flavoprotéines impliquées dans le transport d’électrons

Thiamine (B1)

α-décarboxylations, transcétolase

Vitamines B6 (groupement pyridoxal-pyridoxamine)

Transformations des acides aminés et des céto-acides

Groupe des vitamines K ; quinones

Transport d’électrons ; synthèse des sphingolipides

Hydroxamates

Composés fixant le fer ; solubilisation et transport du fer à l’intérieur des cellules

TABLEAU 5.4

EXEMPLES DE MILIEUX DE CULTURE POUR DES MICRO-ORGANISMES PEU OU TRÈS EXIGEANTS a EN NUTRIMENTS

Milieu de culture défini pour Escherichia coli

Milieu de culture défini pour Leuconostoc mesenteroides

Milieu de culture complexe pour E. coli ou L. mesenteroides

K2HPO4 7 g

K2HPO4 0,6 g

Glucose 15 g

KH2PO4 2 g

KH2PO4 0,6 g

Extrait de levure 5 g

(NH4)2SO4 1 g

NH4Cl 3 g

Peptone 5 g

MgSO4 0,1 g

MgSO4 0,1 g

KH2PO4 2 g

CaCl2 0,02 g

Glucose 25 g

Eau distillée 1 000 mL

Glucose 4–10 g Oligoéléments (Fe, Co, Mn, Zn, Cu, Ni, Mo) 2–10 µg de chaque Eau distillée 1 000 mL pH 7

Acétate de sodium 20 g Acides aminés (alanine, arginine, asparagine, aspartate, cystéine, glutamate, glutamine, glycine, histidine, isoleucine, leucine, lysine, méthionine, phénylalanine, proline, sérine, thréonine, tryptophane, tyrosine, valine) 100-200 µg de chaque Purines et pyrimidines (adénine, guanine, uracile, xanthine) 10 mg de chaque Vitamines (biotine, folate, acid nicotinique, pyridoxal, pyridoxamine, pyridoxine, riboflavine, thiamine, pantothénate, acide p-aminobenzoïque) 0,01– 1 mg de chaque Oligoéléments (voir la première colonne) 2– 10 µg de chaque Eau distillée 1 000 mL pH 7

pH 7

(a)

(b)

a

Les photos montrent des tubes contenant a) le milieu défini décrit ci-dessus et b) le milieu complexe décrit ci-dessus. Notez la couleur du milieu complexe, due aux divers extraits organiques et hydrolysats qu'il contient. Photos de Cheryl L. Broadie et John Vercillo, université Southern Illinois à Carbondale.



5.3 La culture des micro-organismes 107

Dans certains cas, particulièrement en microbiologie clinique, les milieux de culture sont souvent conçus pour être sélectifs ou différentiels (ou les deux à la fois). Un milieu sélectif contient des composés qui inhibent de façon sélective la croissance de quelques micro-organismes sans en affecter d’autres. En revanche, un milieu différentiel est un milieu dans lequel un indicateur, généralement un colorant, est ajouté afin de mettre en évidence des réactions chimiques particulières spécifiques de la croissance. Les milieux différentiels sont tout à fait utiles pour distinguer différentes espèces de bactéries, sur la base de la présence ou de l’absence d’une réaction particulière (voir chapitre 24).

Les besoins nutritifs et la capacité biosynthétique Le tableau 5.4 montre la composition de trois milieux de culture, deux milieux définis et un milieu complexe. Le milieu complexe est le plus facile à préparer et permet une bonne croissance des organismes présentés dans le tableau, la bactérie entérique Escherichia coli et la bactérie lactique Leuconostoc mesenteroides (exigeante du point de vue nutritif), extrêmement fastidieuse à cultiver. Le milieu défini simple présenté dans le tableau 5.4 est particulièrement indiqué pour la culture d’E. coli, mais pas pour celle de L. mesenteroides. Pour cultiver ce dernier micro-organisme dans le milieu défini, il faut y ajouter plusieurs éléments nutritifs organiques et des facteurs de croissance, qui ne sont pas nécessaires à la croissance d’E. coli (voir tableau 5.4). Lequel de ces deux micro-organismes possède la capacité biosynthétique la plus grande ? C’est évidemment E. coli, car, puisqu’elle peut se développer sur un milieu de culture défini simple, pouvant synthétiser tous ses constituants organiques à partir d’un composé carboné simple, ici le glucose (voir tableau 5.4). Contrairement à E. coli, L. mesenteroides a besoin de nombreux facteurs de croissance et d’éléments nutritifs organiques essentiels (par exemple des acides aminés), ce qui montre bien sa faible capacité biosynthétique. Les besoins alimentaires complexes de L. mesenteroides peuvent être satisfaits par la préparation d’un milieu défini comme celui indiqué dans le tableau 5.4 (la préparation d’un tel milieu peut prendre plusieurs heures) ou d’un milieu complexe (voir tableau 5.4), qui peut généralement être préparé rapidement. Quelques micro-organismes pathogènes sont encore plus exigeants que L. mesenteroides. Pour cultiver ces organismes, un milieu enrichi peut être nécessaire. Un milieu enrichi est un milieu complexe dans lequel on a ajouté des aliments supplémentaires, tels que du sérum ou du sang. Ces aliments, qui sont plus proches de ceux fournis par leur hôte, sont indispensables pour cultiver des micro-organismes tels que Streptococcus pyogenes (streptocoque responsable d’angines) et Neisseria gonorrhoeae (gonorrhée). Le tableau 5.4 montre que les besoins nutritionnels varient largement avec les micro-organismes. Pour cultiver un microorganisme donné, il est donc nécessaire de connaître ses besoins alimentaires afin d’apporter au milieu de culture les éléments nutritifs sous la forme la mieux appropriée et dans les proportions adéquates. Si les milieux de culture sont préparés avec soin, il est assez facile de cultiver de nombreux types de micro-organismes.

Contrôlez vos acquis Les milieux de culture, chimiquement définis ou non définis (complexes), subviennent aux besoins alimentaires des micro-organismes. Les milieux, utilisés pour isoler une espèce particulière ou pour effectuer des études comparatives sur divers micro-organismes, peuvent être qualifiés de sélectifs, différents et enrichis. •

Pourquoi la culture de Leuconostoc mesenteroides est-elle plus facile dans un milieu complexe que dans un milieu chimiquement défini ?

•

Dans quel milieu, défini ou complexe (voir tableau 5.4), pensez-vous qu’Escherichia coli aura la croissance la plus rapide ? Pourquoi ?

m n5.3 La culture des micro-organismes Une fois qu’un milieu de culture a été préparé et stérilisé afin d’éliminer tous les micro-organismes, il peut être inoculé (c’est-à-dire que des organismes y sont ajoutés) et être incubé dans des conditions qui favoriseront la croissance microbienne. Au laboratoire, l’inoculation sera généralement réalisée à partir d’une culture pure, culture contenant seulement une seule espèce de micro-organisme. Il est essentiel d’empêcher d’autres organismes de croître dans une culture pure. Ces organismes indésirables, appelés contaminants, sont omniprésents (découverte de Pasteur il y a plus de 125 ans – voir section 1.6), et les microbiologistes doivent utiliser des techniques pour les éliminer.

Les milieux de culture solides et liquides Les milieux de culture sont parfois préparés sous forme semi-solide en ajoutant un agent gélifiant au milieu liquide. De tels milieux immobilisent les cellules, leur permettant de se développer en formant des amas isolés appelés colonies (voir figure 5.2). Les colonies bactériennes peuvent prendre des formes et des tailles diverses selon le type d’organisme, les conditions de culture, l’apport nutritif (y compris la quantité d’oxygène) et plusieurs autres paramètres physiologiques. Quelques bactéries produisent des pigments qui colorent la colonie (voir figure 5.2). Les colonies permettent au microbiologiste d’évaluer la pureté de la culture. Les boîtes qui contiennent plus d’un type de colonie sont contaminées. L’utilisation de milieux solides préparés dans des boîtes de Petri est une méthode courante pour obtenir des cultures pures et pour évaluer la pureté d’une culture. Les milieux solides sont préparés de la même manière que les milieux liquides ; cependant, avant stérilisation, on ajoute un agent gélifiant, la gélose (voir focus « Milieu de culture solide, boîte de Petri et cultures pures », au chapitre 1), généralement à la concentration de 1,5 %. La gélose fond pendant la stérilisation et le milieu est alors versé dans les boîtes stériles en verre ou en plastique, puis on le laisse solidifier avant emploi (voir figure 5.2).



James A. Shapiro, université de Chicago


(c)



108 Chapitre 5

(a)


(d)

(b)

Les techniques d’asepsie Parce que les micro-organismes sont omniprésents, les milieux de culture doivent être stérilisés avant emploi. Pour la plupart des milieux de culture, la stérilisation est effectuée par chauffage, généralement par une chaleur humide, dans une grande chaudière sous pression appelée autoclave (voir section 20.1). Une fois le milieu de culture stérile préparé, il est prêt à recevoir un inoculum précédemment développé en culture pure. Cette manipulation nécessite l’utilisation d’une technique d’asepsie, série d’étapes empêchant la contamination pendant la manipulation des cultures et des milieux de culture stériles (voir figures 5.3 et 5.4). La maîtrise de techniques d’asepsie est nécessaire pour réussir une culture et c’est une des premières méthodes apprises dans le laboratoire de microbiologie par le microbiologiste débutant. Les contaminants apportés par l’air constituent le problème le plus courant parce que l’air du laboratoire contient de petites particules de poussière, qui abritent une communauté de micro-organismes. Quand des récipients sont ouverts, ils doivent être manipulés de sorte que l’air chargé de contaminants ne puisse pas entrer (voir figures 5.3 et 5.4). Le transfert aseptique d’une culture d’un tube de milieu à un autre est habituellement réalisé avec une anse ou une aiguille à inoculation, préalablement stérilisées à la flamme (voir figure 5.3).

FIGURE 5.2 Exemples de colonies bactériennes. Les colonies forment des amas de cellules résultant de la division d’une ou de quelques cellules. La taille, la forme, la texture et la couleur d’une colonie bactérienne dépendent des micro-organismes. Selon la taille et la disposition des cellules, une colonie peut présenter un nombre très variable de cellules ; les colonies contenant plus d’un milliard de cellules ne sont pas rares. (a) Serratia marcescens, cultivée sur de la gélose MacConkey. (b) Gros plan de colonies de Serratia marcescens. (c) Pseudomonas aeruginosa, cultivée sur de la gélose trypticase de soja. (d) Shigella flexneri, cultivée sur de la gélose MacConkey.

Des cellules de cultures en milieu liquide peuvent également être transférées sur des boîtes contenant de la gélose (voir figure 5.4), où les colonies se développent à partir de la croissance et de la division d’une cellule unique. Le repiquage et l’ensemencement en stries d’une colonie isolée sont le moyen le plus courant pour l’obtention de cultures pures à partir de communautés microbiennes contenant de nombreux organismes différents.

Contrôlez vos acquis La croissance de micro-organismes peut être réalisée au laboratoire dans des milieux de culture contenant les substances nutritives indispensables. La réussite et l’entretien d’une culture pure de micro-organismes ne peuvent se faire qu’en pratiquant des techniques d’asepsie. •

Que signifie le mot stérile ? Que se produirait-il si des milieux de culture nouvellement préparés n’avaient pas été stérilisés et avaient été laissés à la température ambiante ?

•

Pourquoi une technique d’asepsie est-elle nécessaire pour réussir des cultures pures au laboratoire ?



5.4 Éléments de bioénergétique

(a)

(b)

(c)

(d)

(e)

109

(f)

FIGURE 5.3 Transfert aseptique. (a) L’anse de platine est chauffée au rouge dans la flamme, puis est refroidie rapidement dans l’air. (b) Le tube est débouché. (c) L’ouverture du tube est flambée. (d) L’échantillon est prélevé avec l’anse stérile. (e) Le tube contenant le milieu stérile est de nouveau flambé, puis l’échantillon est transféré dans le milieu stérile. (f) Le tube est rebouché. L’anse est de nouveau chauffée au rouge avant d’être mise de côté.

II

ÉNERGÉTIQUE ET ENZYMES

Quel que soit son mode de vie, un organisme doit être capable de stocker l’énergie sous forme d’ATP.

m n5.4 Éléments de bioénergétique L’énergie se définit comme la capacité d’accomplir un travail. En microbiologie, elle est exprimée en kilojoules (kJ), mesure de l’énergie libérée sous forme mécanique. Les réactions chimiques sont accompagnées de variations d’énergie. Dans

toute réaction chimique, une partie de l’énergie est perdue sous forme de chaleur ; la forme d’énergie qui intéresse les microbiologistes est l’énergie libre (G), énergie disponible pour effectuer un travail. La variation d’énergie libre au cours d’une réaction est appelée ∆G0', où ∆ signifie « variation » ; « 0 » et « ' » signifient que l’énergie libre est mesurée dans des conditions standards : pH 7, 25 ˚C, pression de 1 atmosphère, réactifs et produits à la concentration de 1 M. Dans la réaction : A+B→C+D Si le ∆G0' de la réaction est négatif, la réaction libère de l’énergie libre que la cellule peut stocker sous forme d’ATP.

Croissance confluente à partir de la première strie


Colonies isolées à partir de la dernière strie

(a)

(b)

(c)

FIGURE 5.4 Méthode des stries pour obtenir une culture pure. (a) L’inoculum est prélevé dans le tube avec une anse préalablement stérilisée. (b) L’inoculum est étalé sur la gélose d’une boîte de Petri, stérile sous la forme d’une strie. D’autres stries sont ensuite réalisées à différents angles de la première, l’anse étant stérilisée entre chaque opération. (c) Aspect des stries sur la boîte après incubation. Colonies de la bactérie Micrococcus luteus sur de la gélose au sang. Les cultures pures peuvent être obtenues à partir des colonies bien isolées sur la boîte.



110 Chapitre 5


De telles réactions sont dites exergoniques. Si le ∆G0' est positif, la réaction ne peut s’effectuer qu’avec un apport extérieur d’énergie. De telles réactions sont dites endergoniques. Dans une cellule microbienne, les réactions exergoniques produisent de l’énergie, alors que les réactions endergoniques consomment de l’énergie.

L’énergie libre de formation et le calcul de ∆G0' Pour calculer l’énergie libre d’une réaction, il faut connaître l’énergie libre des réactifs et des produits de cette réaction. C’est l’énergie libre de formation (Gf0), énergie libérée (ou au contraire consommée) lors de la formation d’une molécule donnée à partir de ses éléments. Le tableau 5.5 donne quelques exemples de valeurs de Gf0. Par convention, l’énergie libre de formation des composés sous leur forme la plus simple (par exemple C, H2, N2) est égale à zéro. Cependant, la valeur de Gf0 des différents composés n’est pas nulle. Si la formation d’un composé à partir de ses éléments est exergonique, la valeur de Gf0 est négative (de l’énergie est libérée). Si la réaction est endergonique (de l’énergie est nécessaire), la valeur de Gf0 est positive. La plupart des composés ont une Gf0 négative. Ils se forment spontanément à partir de leurs éléments. Ainsi, le Gf0 pour l’oxyde nitreux est positif (+ 104,2 kJ/mol – voir tableau 5.5), ce qui indique que cette molécule ne se forme pas spontanément, mais se décompose d’elle-même en azote et oxygène. Les énergies libres de formation des composés les plus importants en microbiologie sont données dans l’annexe 1. Il est possible de calculer la variation d’énergie libre standard (∆G0') d’une réaction donnée à partir des énergies libres de formation. Pour la réaction A + B C + D, ∆G0' est calculé en soustrayant la somme des énergies libres de formation des réactifs (A et B) de celle de leurs produits (C et D). Ainsi : ∆G0' = Gf0 [C + D] – Gf0 [A + B] C’est un moyen simple de calculer la variation d’énergie libre d’une réaction chimique. Il faut cependant que la réaction soit

TABLEAU 5.5

ÉNERGIE LIBRE DE FORMATION DE QUELQUES COMPOSÉS D’INTÉRÊT BIOLOGIQUE

Composé

Énergie libre de formationa

Eau (H2O)

– 237,2

Dioxyde de carbone (CO2)

– 394,4

Gaz hydrogène (H2) Gaz oxygène (O2) Ammonium (NH4+)

0 0 – 79,4

Oxyde nitreux (N2O)

+ 104,2

Acétate (C2H3O2–)

– 369,4

Glucose (C6H12O6)

– 917,3

Méthane (CH4)

– 50,8

Méthanol (CH3OH)

– 175,4

Les valeurs d'énergie libre de formation (Gf0) sont exprimées en kJ/mol. Le tableau A1.1 présente une liste plus complète d'énergies libres de formation.

a

en équilibre chimique avant d’effectuer ces calculs (voir annexe 1).

∆G0' ou ∆G Le calcul de l’énergie libre dans les conditions standard donne seulement une approximation de la variation d’énergie libre d’une réaction dans les conditions naturelles. Il donne généralement une bonne estimation des variations d’énergie libre, mais ne peut être généralisé. En effet, dans le milieu naturel, les concentrations en produits et réactifs sont rarement de 1 M, ce qui peut modifier l’énergétique des réactions de façon parfois significative (voir sections 17.21, 19.10 et annexe 1). Dans ce cas, le ∆G, variation d’énergie libre dans les conditions naturelles de croissance de l’organisme, est plus approprié que le ∆G0' pour le calcul des énergies libres. L’équation suivante tient compte des concentrations réelles des réactifs et des produits de la réaction : ∆G = ∆G0' + RT ln K où R et T sont des constantes physiques et K la constante d’équilibre de la réaction (voir annexe 1).

Contrôlez vos acquis Les réactions chimiques des cellules sont accompagnées de variations d’énergie, exprimées en kilojoules. Une réaction chimique peut libérer de l’énergie (exergonique) ou en consommer (endergonique). •

Qu’appelle-t-on énergie libre ?

•

D’une manière générale, les réactions du catabolisme sont-elles exergoniques ou endergoniques ?

•

À partir des données du tableau 5.5, calculez les valeurs de ∆G0' pour la réaction CH4 + 1- O2 → 2 CH3OH. Quelle est la différence entre ∆G0' et ∆G ?

m n5.5 Les enzymes et la catalyse Le calcul de l’énergie libre indique seulement si l’énergie est libérée ou, au contraire, consommée pendant le déroulement d’une réaction. La valeur obtenue ne renseigne en rien sur la vitesse de cette réaction. Considérons la formation de l’eau à partir d’oxygène et d’hydrogène gazeux. La réaction est favorable du point de vue énergétique : H2 + 1--- O2 → H2O, ∆G0' = – 237 kJ. Cependant, 2 si nous mélangeons O2 et H2 dans une bouteille, il ne se forme pas d’eau, même au bout de plusieurs années. En effet, les liaisons chimiques entre les atomes de O2 et de H2 doivent être rompues pour permettre leur réarrangement lors de la formation d’eau. La rupture de ces liaisons demande de l’énergie, appelée énergie d’activation. L’énergie d’activation d’une réaction chimique est l’énergie nécessaire pour activer toutes les molécules de réactifs (voir figure 5.5). La barrière d’énergie d’activation, qui ne peut théoriquement être surmontée en l’absence de catalyseur, est beaucoup plus facilement dépassée en présence d’un catalyseur approprié (voir figure 5.5).



Énergie libre

5.5 Les enzymes et la catalyse

Énergie d’activation – sans enzyme

De nombreuses réactions qui se produisent chez les organismes vivants seraient bien trop lentes sans catalyse. Les catalyseurs biologiques sont appelés enzymes. Ce sont des protéines (dans quelques cas, des ARN) hautement spécifiques des réactions qu’elles catalysent. Chaque enzyme catalyse en effet un seul type de réaction ou, parfois, une famille de réactions. Cette spécificité fonctionnelle résulte de la structure tridimensionnelle de la molécule d’enzyme. Dans une réaction catalysée par une enzyme, l’enzyme se lie avec le réactif, appelé substrat (S), pour former un complexe enzyme-substrat. Puis le produit (P) est libéré et l’enzyme (E) retrouve son état initial :

Énergie d’activation avec enzyme

Substrats (A + B)

111

∆G0′= Gf0(C + D) – Gf0(A + B)

E + S ↔ E–S ↔ E + P Produits (C + D) Évolution de la réaction FIGURE 5.5 Déroulement d’une réaction exergonique hypothétique : A + B → C + D et concept d’énergie d’activation. Les réactions chimiques ne peuvent se produire spontanément, même si elles libèrent de l’énergie, parce que les réactifs doivent être préalablement activés. Après activation, la réaction se déroule spontanément. Des catalyseurs tels que les enzymes abaissent l’énergie d’activation.

Les enzymes Du point de vue biochimique, un catalyseur est une substance qui diminue l’énergie d’activation d’une réaction, accélérant de cette façon la vitesse de cette réaction. Les catalyseurs facilitent les réactions, sans pour autant être consommés ni transformés pendant le processus. De plus, ils ne modifient ni l’énergie, ni l’équilibre des réactions, mais seulement leur vitesse.

P O H2C

La taille d’une enzyme est généralement bien plus grande que celle de son (ou ses) substrat(s), et l’association entre l’enzyme et son (ses) substrat(s) dépend de liaisons faibles, comme les liaisons hydrogène, les forces de van der Waals et les interactions hydrophobes (voir section 3.1). La partie de l’enzyme sur laquelle se fixent le(s) substrat(s) est appelée site actif de l’enzyme.

La catalyse enzymatique Le pouvoir catalytique des enzymes est impressionnant. Les enzymes accélèrent la vitesse des réactions de 108 à 1020 fois. Pour catalyser une réaction donnée, une enzyme doit : 1) fixer le substrat approprié, et 2) orienter correctement le substrat par rapport aux acides aminés du site actif, qui participent au processus catalytique. Après la fixation de substrat sur l’enzyme, cette dernière (voir figure 5.6) exerce des contraintes sur des liaisons spécifiques du(des) substrat(s). La formation du complexe enzyme-substrat abaisse l’énergie d’activation nécessaire à la transformation de(s) substrat(s) en

Glycéraldéhyde 3-P O

OH

CHO

OH

H 2C

OH P

CH2OH C=O

HCOH

CH2 O P

Fructose 1,6-diphosphate (substrat)

Dihydroxyacétone-P

O H2 C

OH

O OH CH2

OH

O

P P

O H2 C

OH

O OH

O

O

O

P

Produits

OH

CH2

H2C

P

P

P

O H2 C O

OH

OH

OH OH

CH2 O

P

Site actif Complexe enzyme-substrat

Aldolase libre

Aldolase libre

FIGURE 5.6 Le cycle catalytique d’une enzyme : exemple de la fructose diphosphate aldolase. Cette enzyme de la glycolyse catalyse la réaction : fructose 1,6-diphosphate → glycéraldéhyde 3-phosphate + dihydroxyacétone phosphate (voir figure 5.14). La fixation du fructose 1,6-diphosphate entraîne la formation d’un complexe enzyme-substrat qui modifie la conformation de l’enzyme ; ce changement génère des tensions au niveau de certaines liaisons du substrat, qui se rompent, donnant ainsi naissance aux deux produits.



112 Chapitre 5


produit(s) [voir figure 5.5]. L’exemple de la fructose diphosphate aldolase (voir figure 5.6), enzyme clé de la glycolyse (voir section 5.10), résume bien ces étapes. La réaction décrite dans la figure 5.5 est exergonique parce que l’énergie libre de formation des substrats est supérieure à celle des produits. La synthèse des produits libère donc de l’énergie libre. Les enzymes catalysent également des réactions consommant de l’énergie, transformant des substrats peu énergétiques en produits riches en énergie. Dans ce cas, non seulement la barrière d’énergie d’activation doit être franchie, mais suffisamment d’énergie libre doit être apportée pour amener l’énergie des substrats au niveau de celle des produits. Ce processus repose sur le couplage de la réaction consommant de l’énergie avec une réaction qui produit de l’énergie, comme celle de l’hydrolyse de l’ATP (voir figure 5.12). Théoriquement, les réactions catalysées par les enzymes sont réversibles. En pratique, les enzymes qui catalysent des réactions très exergoniques ou très endergoniques ne fonctionnent que dans une direction. Dans les cellules, la réaction inverse est généralement effectuée par une autre enzyme.

des coenzymes dérivent de vitamines ; le NAD+/NADH, par exemple, dérive d’une vitamine appelée niacine. Les noms des enzymes se rapportent, soit à leur substrat, soit à la réaction qu’elles catalysent, et se terminent par le suffixe -ase. Ainsi, la cellulase est une enzyme qui catalyse la dégradation de la cellulose, la glucose oxydase est une enzyme qui catalyse l’oxydation du glucose et la ribonucléase est une enzyme qui dégrade les acides ribonucléiques. Les biochimistes emploient une nomenclature plus précise, fondée sur une numérotation spécifique dépendant du type de réaction chimique et de la nature des substrats.

Contrôlez vos acquis Dans une réaction chimique, les réactifs doivent préalablement être activés par un catalyseur avant que la réaction ne démarre. Les enzymes sont des protéines catalytiques qui accélèrent la vitesse des réactions biochimiques. La haute spécificité des enzymes résulte de la structure spatiale du (ou des) polypeptides constitutifs.

La structure et la nomenclature des enzymes

•

Quelle est la fonction d’un catalyseur ?

Presque toutes les enzymes sont des protéines (voir sections 3.6 à 3.8), polymères d’acides aminés. La structure tridimensionnelle des enzymes détermine leur fonction enzymatique. Une protéine donnée a donc des propriétés physiques et catalytiques spécifiques. La modélisation de la structure spatiale d’une enzyme peut être réalisée à l’aide d’outils informatiques (voir figure 5.7). Dans l’exemple du lysozyme, enzyme qui coupe le peptidoglycane (voir section 4.8), la crevasse correspond au site de fixation du substrat (le site actif). Beaucoup d’enzymes ont besoin de petites molécules non protéiques, qui participent à la catalyse mais qui ne sont pas à proprement parler des substrats. Ces petites molécules sont divisées en deux classes, selon leur mode d’association avec l’enzyme : les groupements prosthétiques et les coenzymes. Les groupements prosthétiques sont liés très fortement aux enzymes et de façon permanente par des liaisons covalentes. L’hème des cytochromes (voir section 5.11) est un exemple de groupement prosthétique. Les coenzymes, au contraire, sont liés aux enzymes par des liaisons faibles et un coenzyme peut passer d’une molécule d’enzyme à une autre. La plupart

•

À quelle(s) classe(s) de macromolécules appartiennent les enzymes ?

•

Sur quelle partie de l’enzyme le substrat se fixet-il ?

•

Qu’est-ce que l’énergie d’activation ?

III

OXYDORÉDUCTION ET COMPOSÉS RICHES EN ÉNERGIE

La conservation de l’énergie dans les cellules met en jeu des réactions d’oxydoréduction (redox). L’énergie libérée au cours de ces réactions est emmagasinée sous forme de composés riches en énergie, comme l’ATP.

m n5.6 L’oxydoréduction Pour les chimistes, une oxydation est une perte d’électron(s) par un composé. Une réduction est un gain d’électron(s) par un composé. En biochimie, les réactions d’oxydation et de réduction impliquent fréquemment le transfert d’un électron (e–) et d’un proton (H+).

Richard Feldmann

Les donneurs et les accepteurs d’électrons

FIGURE 5.7 Modèle compact d’une enzyme, le lysozyme. Le site de fixation (site actif) du substrat (peptidoglycane) est situé dans la grande fissure (comme l’indique la flèche), du côté gauche du modèle (voir section 4.8).

On parle d’oxydoréduction quand, dans une réaction, les électrons libérés par un donneur d’électrons sont captés par un accepteur d’électrons. Si, par exemple, le donneur d’électrons est l’hydrogène gazeux (H2), il peut céder ses électrons et ses protons en s’oxydant : H2 → 2e– + 2H+ Cependant, les électrons ne peuvent pas exister à l’état libre dans une solution ; ils doivent appartenir à un atome ou à une molécule. L’équation ci-dessus donne une information chimique, mais ne



5.6 L’oxydoréduction 113

représente pas, à elle seule, la réaction. Cette demi-réaction doit être couplée à une deuxième demi-réaction, car oxydation et réduction ont toujours lieu ensemble. Ainsi, l’oxydation de H2 peut être couplée à la réduction de nombreux composés, dont O2 : 1 – + --- O2 + 2e + 2H → H2O 2

Cette demi-réaction, qui est une réduction, peut être couplée à l’oxydation de H2, ce qui donne : H2 + 1--- O2 → H2O 2

Dans ce type de réaction, le composé oxydé, dans le cas présent H2, est le donneur d’électrons, et le composé réduit, dans le cas présent O2, est l’accepteur d’électrons (voir figure 5.8). Pour comprendre une réaction d’oxydoréduction, il faut prendre en compte les demi-réactions qui la composent. Dans une réaction redox, il doit toujours y avoir une réaction impliquant un donneur d’électrons et une autre impliquant un accepteur d’électrons.

Les potentiels de réduction Les composés diffèrent par leur capacité à être oxydés ou réduits. Cette tendance est exprimée par le potentiel de réduction (E0’ dans les conditions standard) de la demi-réaction. Ce potentiel est mesuré en volts (V) par rapport à un composé standard, H2. Par convention, on calcule les potentiels de réduction de la demi-réaction de réduction. Si des protons sont impliqués dans la réaction, et c’est souvent le cas, le potentiel de réduction dépend, jusqu’à un certain point, de la concentration en ions hydrogène (pH). Par convention, en biologie, les potentiels de réduction sont donnés à pH 7 parce que le pH cytoplasmique est neutre ou voisin de la neutralité. Dans ce cas, à pH 7, le E0’ de 1 + – --- O2 + 2H + 2 e → H2O 2

est égal à + 0,816 volts (V), et le E0’ de 2H+ + 2e– → H2

est de – 0,421 V. Ces valeurs indiquent que O2 est un excellent accepteur d’électrons et H2, un excellent donneur d’électrons (voir figure 5.8).

Les couples d’oxydoréduction et les réactions redox De nombreuses molécules peuvent se comporter comme des donneurs d’électrons ou des accepteurs d’électrons, selon les

1. H2

2. –12 O2 + 2 e–

2 e– + 2 H+

Demi-réaction d’oxydation (donne un ou plusieurs électrons)

2–

O

Demi-réaction de réduction (accepte un ou plusieurs électrons) Donneur d’électrons

3. 2 H+ +

O

2–

Formation d’eau

H2O

4.

H2 + –12 O2

Accepteur d’électrons H2O

Réaction globale

FIGURE 5.8 Exemple d’une réaction d’oxydoréduction. Formation de H2O à partir du donneur d’électrons H 2 et de l’accepteur d’électrons O2.

substances avec lesquelles elles réagissent. Les molécules impliquées dans les demi-réactions et situées de chaque côté de la flèche forment un couple redox, par exemple 2H+/H2 et 1 --- O2/H2O. Par convention, un couple redox s’écrit toujours 2 avec la forme oxydée à gauche. Quand on construit une réaction d’oxydoréduction à partir de ses demi-réactions, le composé réduit d’un couple redox dont le E0' est plus négatif donne ses électrons au composé oxydé d’un couple redox dont le E0’ est plus positif. Ainsi, dans le couple 2H+/H2 (E0’ – 0,42 V), H2 a une plus grande tendance à céder ses électrons que les protons à accepter des électrons. Dans le couple 1--- O2/H2O (E0’ + 0,82 V), H2O a peu 2 tendance à céder ses électrons, tandis que O2 en accepte très facilement. En conséquence, dans une réaction impliquant H2 et O2, H2 sera le donneur d’électrons et sera oxydé, et O2 sera l’accepteur d’électrons et sera réduit (voir figure 5.8). Par convention, toutes les demi-réactions sont écrites sous la forme de réductions. Cependant, dans une réaction redox, une des demi-réactions est une oxydation et doit donc être écrite dans la direction opposée. Par exemple, dans la réaction de la figure 5.8, l’oxydation de H2 en 2H+ + 2e– est l’inverse de la réaction partielle de réduction.

La tour des électrons Un bon moyen pour visualiser les réactions de transfert d’électrons dans les systèmes biologiques et leur niveau d’énergie est d’imaginer une tour (voir figure 5.9). La tour représente les valeurs que peuvent prendre les potentiels de réduction (E0’) des couples redox rencontrés en milieu naturel, en partant des plus négatifs au sommet vers les plus positifs à la base. Le composé réduit d’un couple redox situé au sommet de la tour est celui qui a la plus forte tendance à donner ses électrons, tandis que le composé oxydé d’un couple situé en bas de la tour est celui qui en accepte le plus facilement. Lorsque les électrons d’un donneur d’électrons situé dans la partie haute de la tour « tombent », ils peuvent être « captés » par les différents accepteurs situés au-dessous. La différence de potentiel de réduction entre deux composés de la tour est exprimée par ∆E0’. Plus le chemin parcouru par les électrons entre le donneur et l’accepteur est long, plus la quantité d’énergie libérée est élevée. ∆E0’ est donc proportionnel à ∆G0’ (voir figure 5.9). L’oxygène (O2), situé à la base de la tour, est l’accepteur d’électrons le plus favorable rencontré en abondance dans le milieu naturel. Au milieu de la tour, les couples redox peuvent se comporter soit comme des accepteurs, soit comme des donneurs d’électrons, en fonction des couples redox avec lesquels ils réagissent. Le couple 2H+/H2, par exemple (– 0,42 V), peut réagir avec le couple fumarate/ succinate (+ 0,02 V) comme suit : H2 + fumarate2– → succinate2En revanche, l’oxydation du succinate en fumarate peut être couplée à la réduction de NO3– ou de 1--- O2 : 2

Succinate2– + NO3– → fumarate2– + NO2– + H2O Succinate2– + 1--- O2 → fumarate2– + H2O 2

Ainsi, en présence de H2 et en conditions anoxiques, le fumarate se comporte comme un accepteur d’électrons (produisant



114 Chapitre 5


Exemples de réactions avec H2 comme donneur e–

Couple redox

E0′ (V)

CO2/glucose (–0,43) 24 e– 2H+/H (–0,42) 2 e–

– 0,50

2

succinate2–

(1) H2 + fumarate2– ∆G0

′

=

(1)

– 86 kJ

– 0,40

CO2/méthanol (–0,38) 6 e– NAD+/NADH (–0,32) 2 e–

– 0,30

CO2/acétate (–0,28) 8 e–

– 0,20

S0/H2S (–0,28) 2 e– SO 2–/H S (–0,22) 8 e– 4

– 0,10

2

Pyruvate/lactate (–0,19) 2

e–

0,0

S4O62–/S2O32– (+0,024) 2 e–

(2) H2 +

NO3– 0′

NO2–

Fumarate/succinate (+0,03) 2 e–

+ H2O

(2)

Cytochrome box/red (+0,035) 1

e–

Fe3+/Fe2+ (+0,2) 1 e–, (pH 7)

∆G = – 163 kJ

Ubiquinoneox/red (+0,11) 2 e– Cytochrome cox/red (+0,25) 1 e

+ 0,10 + 0,20 + 0,30

–

Cytochrome aox/red (+0,39) 1 e– NO3–/NO2– (+0,42) 2 e–

+ 0,40 + 0,50 + 0,60

1 (3) H2 + 2 O2

H2O

1 NO3–/ 2 N2 (+0,74) 5 e–

(3)

0′

∆G = – 237 kJ

Fe3+/Fe2+ (+0,76) 1 e–, (pH 2) 1 2

+ 0,70 + 0,80

–

O2/H2O (+0,82) 2 e

+ 0,90

FIGURE 5.9 La « tour des électrons ». Les couples redox des agents réducteurs les plus puissants (potentiels de réduction négatifs) ocupent le sommet et les couples redox des agents oxydants les plus puissants (potentiels de réduction positifs) sont à la base. Les électrons cédés par les donneurs situés plus haut dans la tour peuvent être captés par tous les accepteurs situés plus bas. Plus la distance parcourue par les électrons est grande, plus la différence de potentiel entre le donneur et l’accepteur est élevée et plus l’énergie libérée est importante. Dans l’exemple ci-dessus, on voit sur la gauche les quantités d’énergie libérées quand un donneur d’électrons, H2, réagit avec trois accepteurs d’électrons : le fumarate, le nitrate ou l’oxygène.

du succinate). Dans d’autres conditions (par exemple en anoxie et en présence de NO3– ou en présence d’oxygène), le succinate se comporte comme un donneur d’électrons (produisant du fumarate). De nombreux micro-organismes (dont Escherichia coli) effectuent toutes ces réactions qui impliquent le fumarate et le succinate en fonction de certaines conditions nutritionnelles et environnementales.

Donneur d’électrons ↔ Source d’énergie Les donneurs d’électrons sont souvent appelés sources d’énergie parce que leur oxydation libère de l’énergie. Il existe de nombreux donneurs d’électrons potentiels dans le milieu naturel, composés organiques et inorganiques (voir chapitres 17 et 19). En réalité, ce n’est pas le donneur d’électron lui-même qui contient de l’énergie, c’est la réaction chimique pendant laquelle le donneur d’électrons s’oxyde qui libère de l’énergie. En effet, la quantité d’énergie libérée au cours d’une réaction redox dépend à la fois du donneur et de l’accepteur d’électrons. Plus la différence entre les potentiels de réduction des deux réactions partielles est importante, plus

l’énergie libérée dans une réaction redox est élevée (voir figure 5.9 et annexe 1).

Contrôlez vos acquis Les réactions d’oxydoréduction sont accompagnées d’un transfert d’électrons entre un donneur et un accepteur d’électrons. La tendance d’un composé à accepter ou à donner des électrons est exprimée par son potentiel de réduction E0’. •

Dans la réaction H2 + 1- O2 → H2O, quel est le 2 donneur d’électrons et quel est l’accepteur d’électrons ?

•

Quel est le E0’ du couple 2H+/H2 ? Les protons sontils de bons accepteurs d’électrons ? Pourquoi ?

•

Pourquoi le nitrate (NO3–) est-il un meilleur accepteur d’électrons que le fumarate ?



5.7 Un transporteur d’électrons, le NAD+ 115

m n

5.7 Un transporteur d’électrons, le NAD+

Dans les réactions redox, le transfert d’électrons requiert un ou plusieurs intermédiaires, appelés transporteurs. Quand de tels transporteurs sont utilisés, le donneur initial est appelé donneur primaire d’électrons, et l’accepteur final, accepteur terminal d’électrons. La variation d’énergie de l’ensemble des réactions est déterminée par la différence de potentiel de réduction entre le donneur primaire et l’accepteur terminal. Les transporteurs d’électrons peuvent être séparés en deux catégories : ceux qui diffusent librement (les coenzymes) et ceux qui sont liés par covalence aux enzymes de la membrane

NADH + H+

O

HH

C

H H

N

cytoplasmique (les groupements prosthétiques). Ces derniers participent aux réactions de transport d’électrons associées à la membrane (voir section 5.11). Parmi les transporteurs d’électrons qui diffusent librement, les coenzymes nicotinamide-adénine dinucléotide (NAD+) et le NAD-phosphate (NADP+) sont les plus représentatifs (voir figure 5.10). Le NAD+ et le NADP+ sont des transporteurs d’électrons et de protons, transportant en même temps 2e– et 2H+. Le potentiel de réduction du couple NAD+/NADH (ou NADP+/NADPH) est de – 0,32 V, ce qui le place assez haut dans la tour d’oxydoréduction. Le NADH (ou NADPH) est donc un donneur d’électrons performant. Cependant, bien que les potentiels de réduction des couples NAD+ et NADP+ soient identiques, le rôle biologique de ces coenzymes est

Réaction 1. L’enzyme I réagit avec le substrat (donneur d’électrons) et avec la forme oxydée du coenzyme, NAD+.

NH2 + H+

Réaction 2. L’enzyme II réagit avec le substrat (accepteur d’électrons) et avec la forme réduite du coenzyme, NADH.

H

Site de fixation Site actif du NAD+

Site de fixation du NADH

Site actif

R 2 H (2 H+ + 2 e–)

Oxydé

NAD+

H Nicotinamide

P

+ N

O

Enzyme II

O C

H H

O HO

Enzyme I

Réduit

NH2

NAD+

H

Substrat (donneur d’électrons)

NADH

Substrat (accepteur d’électrons)

O

CH2

Ribose OH

O HO

P O

OH

NH2 N

O

O

CH2

N

N

Adénine

Ribose OH

N

Complexe enzyme-substrat

Complexe enzyme-substrat

OH

HO P

O

OH

Groupement phosphate présent seulement dans le NADP+ FIGURE 5.10 Structure de la nicotinamide adénine dinucléotide (NAD+), coenzyme d’oxydoréduction . Le NADP+ possède un groupement phosphate, indiqué en bleu. Le NAD + et le NADP+ sont tous les deux des coenzymes d’oxydoréduction qui diffusent librement et transportent 2e– + 2H+. « R », dans la partie supérieure de la figure, correspond à l’adénine-nucléotide présent dans le NAD+, la partie inférieure de la figure montrant la formule complète du NAD+.

+ NADH

Substrat oxydé

Enzyme et produits

+ NAD+

Substrat réduit

Enzyme et produits

FIGURE 5.11 Schéma d’une réaction d’oxydoréduction. Cette réaction implique les formes oxydées et réduites du coenzyme nicotinamide-adénine dinucléotide, NAD + et NADH.



116 Chapitre 5


sensiblement différent. Le couple NAD+/NADH est impliqué dans les réactions produisant de l’énergie (catabolisme), tandis que le couple NADP+/NADPH intervient principalement dans les réactions de biosynthèse (anabolisme).

Le cycle du NAD+/NADH La diversité des réactions redox est augmentée grâce aux coenzymes. En effet, dans un système redox, une première molécule peut servir de donneur primaire et une deuxième d’accepteur terminal, par l’intermédiaire d’un coenzyme. Dans le cas du NAD+/NADH par exemple, les électrons donnés par une première molécule peuvent réduire le NAD+ en NADH ; celui-ci peut ensuite être converti en NAD+ par une deuxième molécule jouant le rôle de donneur d’électrons. Le schéma de la figure 5.11 décrit le fonctionnement du couple NAD+/NADH dans un tel système. NAD+ et NADH sont seulement des intermédiaires dans le processus ; ils facilitent la réaction mais ne sont pas consommés. Ainsi, à l’inverse du donneur primaire et de l’accepteur terminal, qui doivent être présents en concentrations relativement élevées, de petites quantités de NAD+ et NADH suffisent à assurer le fonctionnement des enzymes qui utilisent ces coenzymes pour effectuer leur catalyse.

Contrôlez vos acquis Dans une cellule, le transfert d’électrons d’un donneur vers un accepteur met en jeu un ou plusieurs électrons. Certains transporteurs d’électrons sont fixés aux membranes, d’autres en revanche, comme le NAD+/NADH, diffusent librement, transférant des électrons d’un endroit de la cellule à un autre. •

Le NADH est-il un meilleur donneur d’électrons que H2 ? Argumentez en vous basant sur les données de la figure 5.9.

composés riches en énergie m n5.8 Les et le stockage de l’énergie L’énergie libérée par les réactions redox doit être stockée par les cellules afin d’être utilisée par les différents processus consommant de l’énergie. Chez les organismes vivants, l’énergie chimique fournie par les réactions redox est d’abord stockée sous la forme de composés phosphorylés, et en particulier sous forme d’ATP. De tels composés sont dits riches en énergie parce que le potentiel d’énergie libéré par l’hydrolyse des liaisons phosphates est plus élevé que celui de la plupart des réactions chimiques cellulaires. Dans les composés phosphorylés, des liaisons ester ou anhydride lient les groupements phosphates à des atomes d’oxygène (voir figure 5.12). Cependant, toutes les liaisons phosphates ne sont pas riches en énergie. L’énergie d’une liaison phosphate est représentée par l’énergie libre libérée au cours de l’hydrolyse du phosphate. Comme le montre la figure 5.12, le ∆G0’ correspondant à l’hydrolyse de la liaison phosphoester du glucose 6-phosphate est seulement de – 13,8 kJ/mol. En revanche, le ∆G0’

correspondant à l’hydrolyse de la liaison phosphoanhydride du phosphoénolpyruvate est de – 51,6 kJ/mol, soit presque quatre fois plus. Ainsi, contrairement au glucose 6-phosphate, qui est un ester phosphate, le phosphoénolpyruvate est un anhydride phosphate (voir tableau 3.1), riche en énergie. Bien que, théoriquement, n’importe quel composé puisse être hydrolysé pour fournir de l’énergie, les cellules utilisent généralement comme « monnaie » énergétique des composés dont le ∆G0’ est supérieur à –30 kJ/mol (voir figure 5.12 et tableau 17.6).

L’adénosine triphosphate (ATP) Dans les cellules, le principal composé phosphorylé riche en énergie est l’adénosine triphosphate (ATP). L’ATP est un ribonucléoside adénylique lié à une chaîne de trois groupements phosphates (voir figure 5.12). C’est la principale forme d’énergie des cellules, produite par les réactions exergoniques et consommée dans certaines réactions endergoniques. Dans l’ATP (voir figure 5.12), deux des liaisons phosphates sont des liaisons phosphoanhydrides dont les énergies libres d’hydrolyse sont supérieures à 30 kJ. Les réactions ATP → ADP + Pi, et ADP → AMP + Pi libèrent chacune environ 32 kJ/mol (voir figure 5.12). Quel est, dans une cellule, le coût énergétique de la synthèse de l’ATP ? Dans une cellule en phase de croissance, le rapport ATP/ADP reste élevé, aux environs de 1 000. En conséquence, l’énergie nécessaire (donnée par ∆G – voir section 5.4) à la synthèse d’une mole d’ATP est de l’ordre de – 55 à – 60 kJ. Néanmoins, dans ce chapitre, nous resterons dans les « conditions standard » (∆G0’) et retiendrons la valeur de 32 kJ/mole pour la synthèse ou l’hydrolyse de l’ATP.

Le coenzyme A En dehors des composés phosphorylés riches en énergie, la cellule synthétise d’autres composés capables de stocker l’énergie produite par les réactions exergoniques. Parmi ceux-ci, figurent les dérivés du coenzyme A (par exemple, l’acétyl-CoA ; voir sa structure figure 5.12). Les dérivés du coenzyme A possèdent une liaison thioester (voir figure 5.12 et tableau 3.1), dont l’hydrolyse fournit suffisamment d’énergie pour permettre la synthèse d’une liaison phosphate riche en énergie. Par exemple, dans la réaction : acétyl-S-CoA + H2O + ADP + Pi → acétate– + HS-CoA + ATP + H+ l’énergie libérée par l’hydrolyse du coenzyme A est utilisée pour synthétiser l’ATP. Les dérivés du coenzyme A (l’acétylCoA est l’un d’eux) jouent un rôle important chez les organismes anaérobies, surtout chez ceux dont le métabolisme énergétique implique des réactions de fermentation (voir sections 5.10, 17.19 et 17.20).

Le stockage à long terme de l’énergie L’ATP est continuellement hydrolysé pour faire fonctionner les réactions de biosynthèse, et resynthétisé au cours des réactions cataboliques. La teneur en ATP dans les cellules en croissance est cependant relativement faible, d’environ deux millimolaires (mM). Pour le stockage d’énergie à plus long terme, les micro-organismes synthétisent des polymères insolubles qui, par hydrolyse, peuvent produire de l’ATP.



5.9 La conservation de l’énergie : les options 117 NH2

O– CH2

COO–

C

–O

O –O

P O

O– O P

O P

O

N

N

O–

CHO N

Liaisons anhydrides Liaison ester N

HCOH

H3C

O–

Phosphoénolpyruvate

OH

O–

C

O

–

Glucose-6-phosphate

Adénosine triphosphate (ATP)

Liaison thioester

~

O

CH3 C S Acétyl

H (CH2)2 N C

β-Mercaptoéthylamine

O–

Acétyl phosphate

Composé

O

P O

O

O OH

O

Liaison anhydride O

CH2 O P

O

O–

P

Liaison ester

OHCH HCOH

OH

O CH2

HCOH

O H (CH2)2 N C (CH2)3 O R Acide pantothénique

Acétyl-CoA

∆G0′ kJ/mol

∆G0′ > 30kJ Phosphoénolpyruvate 1,3-diphosphoglycérate Acétyl phosphate ATP ADP Acétyl CoA

– 51,6 – 52,0 – 44,8 – 31,8 – 31,8 – 31

∆G0′ < 30kJ AMP Glucose 6-phosphate

– 14,2 – 13,8

FIGURE 5.12 Quelques composés importants pour la transformation de l’énergie dans les cellules. Le tableau représentant les énergie libres d’hydrolyse de quelques esters et anhydrides clés du phosphate montre que certaines de ces liaisons phosphoester sont très énergétiques. La position de ces liaisons est indiquée pour quatre de ces composés. L’ATP possède trois groupements phosphates, dont deux ont des énergies libres d’hydrolyse > 30kJ. L’énergie libre de la liaison thioester entre le carbone et le soufre de l’acétyl-CoA (un coenzyme) est également > 30kJ. Le groupement « R » de l’acétyl-CoA est un groupement 3’ phospho ADP.

Parmi les composés destinés au stockage à long terme de l’énergie, citons un polymère de glucose, le glycogène (voir figure 3.6), des polymères lipidiques, le poly-β-hydroxybutyrate et autres polyhydroxyalcanoates (voir figure 4.52), ainsi que le soufre élémentaire, emmagasiné par de nombreuses bactéries chimiolithotrophes (voir figure 2.10b). Ces polymères s’accumulent dans la cellule sous la forme de gros granules visibles au microscope optique ou électronique (voir section 4.11). Chez les eucaryotes unicellulaires, les principaux composés de réserve sont un polymère du glucose, l’amidon (voir figure 3.6) ou des lipides sous forme de graisses simples (voir figure 3.7). Lorsqu’elles ne disposent pas d’une source d’énergie externe, les cellules oxydent ces polymères pour fabriquer leur nouvelle matière cellulaire, ou, si elles sont en phase stationnaire de croissance, l’énergie nécessaire au maintien de l’intégrité cellulaire, ou énergie de maintenance.

Contrôlez vos acquis L’énergie libérée par les réactions redox est stockée sous la forme de quelques composés possédant des liaisons phosphates ou soufres riches en énergie. Le premier de ces composés est l’ATP ; c’est la principale forme d’énergie des cellules. Le stockage à long terme est lié à la formation de polymères, qui peuvent être consommés pour produire de l’ATP. •

Combien d’énergie est libérée par la conversion d’ATP en ADP + Pi ? Par la conversion d’une mole d’AMP en adénosine et Pi ?

•

Après des périodes d’abondance en nutriments, comment les cellules se préparent-elles à des périodes de jeûne ?

IV

PRINCIPALES VOIES CATABOLIQUES, TRANSPORT D’ÉLECTRONS ET FORCE PROTON-MOTRICE

La force proton-motrice, processus clé de la respiration aérobie et anaérobie et autres processus cataboliques, (photosynthèse et chimolithotrophie) produit de l’ATP, mais alimente également un certain nombre d’autres fonctions cellulaires, incluant les transports et la motilité cellulaire (voir sections 4.7 et 4.14 à 4.16).

de l’énergie : m n5.9 Lalesconservation options Les chimio-organotrophes utilisent deux mécanismes de conservation de l’énergie : la fermentation et la respiration. Dans chacun de ces mécanismes, l’ATP est synthétisé à partir de l’énergie libérée par les réactions d’oxydoréduction. Cependant les réactions redox de la fermentation sont différentes de celles de la respiration. Dans la fermentation, la réaction d’oxydation est obligatoirement couplée à la réduction d’un composé dérivé du donneur d’électrons. Dans la respiration, au contraire, c’est un accepteur d’électrons exogène, soit l’oxygène moléculaire ou un autre accepteur d’électrons, qui



118 Chapitre 5


est réduit. Fermentation et respiration fournissent des quantités très différentes d’énergie : dans la fermentation, la quantité d’énergie disponible reste limitée.

La phosphorylation au niveau du substrat et la phosphorylation oxydative Il n’y a pas que les accepteurs d’électrons qui diffèrent dans la respiration et la fermentation, mais aussi les mécanismes de synthèse de l’ATP. Dans la fermentation, l’ATP est produit par phosphorylation au niveau du substrat. Dans ce processus, l’ATP est synthétisé au cours de différentes étapes conduisant à la dégradation d’un composé organique (voir figure 5.13). Dans la phosphorylation oxydative, au contraire, l’ATP est produit aux dépens de la force protonmotrice (voir figure 5.13b). Chez les organismes phototrophes, l’ATP peut également être synthétisé par photophosphorylation. Dans ce processus, la lumière, et non un composé chimique, est utilisée par les réactions redox pour générer la force proton-motrice.

A

Composés intermédiaires de la voie biochimique

B

Pi

B~P C~P

ADP

D + ATP (a) Phosphorylation au niveau du substrat

– –

–– –––––––––– – ––––––––––––

++

––

+ ++

+++++++++++

++

+++++++++++

+

ATP +

–

–

+

+

+

–

–

––

+

–

–

–

+

–

Membrane moins polarisée

+

+

•

Dans quel processus de synthèse d’ATP la membrane cytoplasmique est-elle mise à contribution ? Pourquoi ?

•

En quoi la phosphorylation au niveau du substrat diffère-t-elle de la phosphorylation oxydative ?

5.10 Un exemple de fermentation : m n la glycolyse La glycolyse, ou voie de Embden-Meyerhof, du nom des spécialistes qui l’ont mise en évidence, est la plus commune de toutes les voies biochimiques de fermentation du glucose (les autres voies sont décrites au chapitre 17). C’est un processus anoxique qui peut être divisé en trois phases, comprenant chacune une série de réactions catalysées par des enzymes spécifiques (voir figure 5.14). La phase I correspond à une série de réactions préparatoires qui n’impliquent pas d’oxydoréduction et ne libèrent pas d’énergie, mais qui aboutissent à la formation, à partir du glucose, d’un intermédiaire clé, le glycéraldéhyde 3-phosphate. Les réactions d’oxydoréduction de la phase II libèrent de l’énergie, emmagasinée sous forme d’ATP, et deux molécules de pyruvate. Dans la phase III, d’autres réactions d’oxydoréduction forment les produits de fermentation (voir figure 5.14).

Les phases I et II : réactions préparatoires et réactions redox

ADP + Pi

+

Les chimio-organotrophes produisent leur énergie par fermentation ou respiration, à partir de l’oxydation de composés organiques. Au cours de ces réactions cataboliques, la synthèse d’ATP se fait à partir de la phosphorylation au niveau du substrat (fermentation) ou de la phosphorylation oxydative (respiration).

+

++

––

Membrane polarisée

+


+ (b) Phosphorylation oxydative

FIGURE 5.13 Conservation de l’énergie au cours de la fermentation et de la respiration. (a) Durant la fermentation, la synthèse d’ATP résulte de la phosphorylation au niveau du substrat ; on ajoute un groupement phosphate à des composés intermédiaires dans la voie biochimique et on le transfère finalement à l’ADP pour former l’ATP. (b) Durant la respiration, la membrane cytoplasmique, activée par la force protonmotrice, utilise une partie de cette énergie pour former de l’ATP à partir d’ADP et de phosphate inorganique (Pi) ; on nomme ce processus phosphorylation oxydative. Le couplage entre la force proton-motrice et la synthèse d’ATP se réalise par un complexe enzymatique membranaire appelé ATP synthase (ATPase) [voir section 5.12 et figure 5.21].

La phase I débute avec la phosphorylation du glucose à partir de l’ATP. Le glucose 6-phosphate formé est converti en l’un de ses isomères, le fructose 6-phosphate. Une deuxième phosphorylation conduit à la formation de fructose 1,6-diphosphate, intermédiaire clé de la glycolyse. Une enzyme, l’aldolase, coupe le fructose 1,6-diphosphate en deux trioses, le glycéraldéhyde 3-phosphate et son isomère, la dihydroxyacétone phosphate ; cette dernière est convertie en glycéraldéhyde 3-phosphate. Ces réactions, dont l’une consomme de l’ATP, ne sont pas des oxydoréductions. La conversion du glycéraldéhyde 3-phosphate en acide 1,3-diphosphoglycérique est la première réaction redox de la glycolyse de la phase II. Dans cette réaction (qui se produit deux fois, avec une réaction par molécule de glycéraldéhyde 3-phosphate), une enzyme à NAD+, la glycéraldéhyde 3phosphate déshydrogénase, accepte 2e– + 2H+ pour former du NADH. Chaque molécule de glycéraldéhyde 3-phosphate est en même temps phosphorylée par incorporation de phosphate inorganique. Cette réaction, au cours de laquelle un phosphate inorganique se change en une forme organique, est



5.10 Un exemple de fermentation : la glycolyse 119

PHASE I : RÉACTIONS PRÉPARATOIRES AT P

Glucose

ADP

AT P

Hexokinase

Glucose-6-

Isomérase

P

Fructose-6-

ADP

Phosphofructokinase

P

P

Fructose-1,6-

P

Aldolase

Tableaux synthétiques

2

1. Glucose Glucose-6-P 2. Fructose-6-P Fructose-1,6, diphosphate 3. 2 (1,3-diphosphoglycérate) 2(3-Phosphoglycérate) 4. 2 (Phosphoénolpyruvate) 2 Pyruvate

ATP Rendement (produit/consommé) en ATP –1 –1 –1 –2 +2 0 +2 +2

2

2 éthanol + 2 CO2 2 lactate– + 2 H+

Levure Bactéries lactiques

P 1,3-diphosphoglycérate–

2 NADH

2 3-Phosphoglycérate–

P

2 2-Phosphoglycérate–

P

2 AT P

Énolase

2. Lactate : – 196 kJ, avec un rendement de 32 %.

2 Phosphoénolpyruvate–

PHASE III : SYNTHÈSE DES PRODUITS DE FERMENTATION

P

2 ADP

Pyruvate kinase

NADH NAD+

2

Pyruvate–

Lactate deshydrogénase

Lactate–

FIGURE 5.14 Voie de Embden-Meyerhof (glycolyse). Étapes de la conversion du glucose en pyruvate, puis en produits de fermentation (les enzymes figurent en petits caractères). Les produits de la réaction catalysée par l’aldolase sont en réalité le glycéraldéhyde 3-P et la dihydroxyacétone, mais cette dernière est convertie en glycéraldéhyde 3-P. Notez que le pyruvate est le « pivot » central de la glycolyse, tous les produits de fermentation dérivant du pyruvate. Seuls quelques exemples parmi les plus courants sont représentés.

l’étape qui permet la conservation d’énergie par phosphorylation au niveau du substrat. La formation d’ATP est possible parce que chaque phosphate de la molécule d’acide 1,3-diphosphoglycérique a une énergie libre d’hydrolyse > 30 kJ (voir figure 5.12). De l’ATP est synthétisé quand : 1) chaque molécule d’acide 1,3-diphosphoglycérique est convertie en acide 3-phosphoglycérique et 2) quand chaque molécule de phosphoénolpyruvate est transformée en pyruvate (voir figure 5.4). Dans la glycolyse, deux molécules d’ATP sont consommées au cours de la phase I pour phosphoryler deux molécules de glucose, et quatre molécules d’ATP sont formées au cours de la phase II (deux ATP par molécule d’acide 1,3-diphosphoglycérique convertie en pyruvate) [voir figure 5.14]. Le rendement net de la glycolyse est donc de deux molécules d’ATP par molécule de glucose fermentée.

P

2 NAD+

Phosphoglycérokinase

1. Éthanol/CO2 : – 238,8 kJ/mol de glucose fermenté. Approximativement 64 kJ sont stockés sous forme d’ATP, avec un rendement de 27 %.

Vers la phase II

Électrons

2 ADP

II. Bilan énergétique de la glycolyse chez la levure et les bactéries lactiques Rendements en énergie libre : Exemples de bilans globaux : Organismes : (1) Glucose (2) Glucose

P

Glycéraldéhyde-3-P déshydrogénase

2 Pi

I. Consommation et formation d’ATP dans la glycolyse Réaction

Glycéraldéhyde-3-

Vers la phase III

PHASE II : SYNTHÈSE D’ATP ET DE PYRUVATE

2 AT P Pyruvate : Formiate lyase

Acétate–+ Formiate–

Pyruvate décarboxylase

Formiate Hydrogène lyase

Acétaldéhyde + CO2 Alcool déshydrogénase

NADH NAD+

H2 + CO2 Vers la phase II

Éthanol

La phase III : formation des produits de fermentation

Deux molécules de NAD+ sont réduites en NADH pendant la formation de deux molécules d’acide 1,3-diphosphoglycérique (voir figure 5.14). Cependant, l’oxydation du glycéraldéhyde 3-phosphate n’est possible que si la concentration en NAD+ disponible est suffisante pour accepter les électrons libérés lors de la réaction. Des enzymes réalisent l’oxydation de NADH en NAD+ par réduction du pyruvate en divers produits de fermentation (voir figure 5.14). Chez la levure, le pyruvate est réduit en éthanol avec libération de CO2. Chez les bactéries lactiques, il est réduit en lactate. De nombreuses voies de réduction du pyruvate ont été décrites chez les procaryotes fermentatifs (voir chapitres 12 et 17), mais toutes réoxydent le NADH. Le NADH est un coenzyme



120 Chapitre 5


diffusible qui peut facilement se détacher de la glycéraldéhyde 3-phosphate déshydrogénase et se lier à l’enzyme qui réduit le pyruvate en lactate (la lactate déshydrogénase), puis diffuser une fois encore, après son oxydation en NAD+, pour recommencer le même cycle (voir figures 5.14 et 5.11). Dans tous les processus produisant de l’énergie, les oxydations doivent contrebalancer les réductions, et chaque électron libéré doit être capté par un accepteur d’électrons. Dans la glycolyse, la réduction du NAD+ par une réaction donnée est équilibrée avec l’oxydation du NADH par une autre réaction. Le(s) produit(s) terminal(aux) doit(doivent) également être en équilibre redox et atomique avec le substrat de départ, le glucose. Par exemple, les produits de fermentation, éthanol et CO2, ou lactate et protons, sont en équilibre redox et atomique avec le glucose : glucose (C6H12O6) = 2 éthanol (C2H5OH) + 2CO2 ; glucose (C6H12O6) = 2 lactate– (C3H10O3) + 2H+.

La fermentation du glucose : bilan net et applications pratiques Au cours de la glycolyse, du glucose est consommé, deux ATP sont synthétisés, et des produits de fermentation sont formés. L’ATP est un composé essentiel pour les organismes ; il peut être utilisé par les nombreuses réactions qui consomment de l’énergie, alors que les produits de fermentation ne sont que des déchets. Cependant, ces produits ne sont pas considérés comme des déchets par les distilleries, les brasseries, les fabricants de fromage ou les boulangers (voir focus, « Les produits de la fermentation de la levure »). La fermentation n’est donc pas seulement un processus énergétique. C’est également un moyen de fabriquer des produits naturels utiles à l’homme (voir chapitre 30).

Contrôlez vos acquis La glycolyse est un processus de fermentation d’une importance majeure et une voie universelle du métabolisme anaérobie. La glycolyse libère une petite quantité d’énergie emmagasinée sous forme d’ATP, et des produits de fermentation. Au cours de la glycolyse, deux ATP sont produits par molécule de glucose consommée. •

Quelle(s) réaction(s) de la glycolyse sont des réactions d’oxydoréduction ?

•

Quel est le rôle du couple NAD+/NADH dans la glycolyse ?

•

Pourquoi des produits de fermentation sont-ils synthétisés pendant la glycolyse ?

m n 5.11

La respiration et les chaînes de transfert d’électrons associées aux membranes

Dans la fermentation, une petite quantité d’énergie est libérée (seules quelques molécules d’ATP sont synthétisées) à partir de l’oxydation d’un substrat sans accepteur d’électrons exogène parce que : 1) les atomes de carbone du composé de départ sont seulement partiellement oxydés (voir figure 5.14)

et 2) la différence de potentiel de réduction entre le donneur d’électrons primaire et l’accepteur d’électrons terminal est petite. En présence de O2 ou d’un autre accepteur terminal, au contraire, le glucose peut être complètement oxydé en CO2 ; dans ce cas, le rendement en ATP est supérieur. L’oxydation en présence de O2 comme accepteur terminal d’électrons est appelée respiration aérobie. Deux points retiendront notre attention : 1) le mode de transfert des électrons d’un composé organique à l’accepteur terminal d’électrons et 2) les voies biochimiques impliquées dans la transformation du carbone organique en CO2. Durant l’étape 1, la synthèse d’ATP se fait aux dépens de la force protonmotrice (voir figure 5.13b).

Les transporteurs d’électrons Les systèmes de transport d’électrons sont associés aux membranes. Ces systèmes ont deux fonctions élémentaires. Premièrement, ils transfèrent des électrons d’un donneur primaire vers un accepteur terminal. Deuxièmement, ils emmagasinent de l’énergie libérée pendant le transfert des électrons pour former de l’ATP. Plusieurs types d’enzymes d’oxydoréduction sont impliqués dans le transfert des électrons, dont les NADH déshydrogénases, les flavoprotéines, les protéines fer-soufre et les cytochromes. On trouve également une classe supplémentaire de transporteurs non protéiques, les quinones. Les NADH déshydrogénases sont des protéines situées à la surface interne de la membrane cytoplasmique. Elles ont un site actif qui fixe le NAD+ et accepte 2e– + 2H+ au cours de la conversion du NAD+ en NADH (voir figure 5.10). Les 2e– + 2H+ sont ensuite transférés à des flavoprotéines. Les flavoprotéines sont des protéines contenant un dérivé de la riboflavine (voir figure 5.15). La partie flavinique, liée à la protéine, est un groupement prosthétique, qui est réduit quand il accepte des atomes d’hydrogène et oxydé par perte d’électrons. Les flavoprotéines acceptent 2e– + 2H+ mais ne donnent que des électrons. Deux flavines sont fréquemment observées dans les cellules, la flavine mononucléotide (FMN) et la flavine-adénine dinucléotide (FAD). Cette dernière est liée au ribose et à l’adénine par un deuxième groupement phosphate. La riboflavine, également appelée vitamine B2, est le précurseur de la flavine des flavoprotéines et se révèle indispensable à la croissance de certains organismes (voir section 5.2 et tableau 5.3). Les cytochromes sont des protéines qui contiennent des groupements prosthétiques constitués d’un noyau porphyrine contenant du fer (hème) [voir figure 5.16]. Les cytochromes s’oxydent et se réduisent en perdant ou en gagnant un seul électron provenant d’un atome de fer situé dans l’hème : Cytochrome-Fe2+ ↔ Cytochrome-Fe3+ + e– Les différentes classes de cytochromes divergent largement par leur potentiel de réduction (voir figure 5.9) et sont désignées par des lettres en fonction du type d’hème présent, comme, par exemple, le cytochrome a, le cytochrome b, le cytochrome c. Les cytochromes des différents organismes varient légèrement les uns des autres et sont appelés, pour une même classe, cytochromes a1, a2, a3, etc. Les cytochromes peuvent occasionnellement former des complexes avec



5.11 La respiration et les chaînes de transfert d’électrons associées aux membranes 121 Noyau isoalloxazine O

HO

N

H

H

H

H

P

O C

C

C

C

OH

H

N

O

Pyrrole

N

HC

N

CH CH

N H

CH2

OH OH OH

Oxydée

(a)

(b)

Porphyrine (un tétrapyrrole, C20H14N14)

Ribitol COO–

2 H (2 e– + 2 H+)

H

HO

H3C

N

H3C

N

O

H

H

H

H

P

O C

C

C

C

OH

H OH OH OH

Métal

N

H3C O

HC

NH

N

N

H3C

Hème (une porphyrine) CH2

CH2

CH2

CH2

O

O

CH3 N

H

N

H2C

N-Histidine N

C

CH3 CH3

Réduite Cystéine-S

FIGURE 5.15 Structure de la flavine mononucléotide (FMN) (riboflavine phosphate, un transporteur d’atome d’hydrogène). Le site d’oxydation-réduction est le même dans la FMN et dans la flavine-adénine dinucléotide (FAD).

N Fe

Histidine-N

CH2

C H2C S-Cystéine

Acide aminé

(c)

Acide aminé

Cytochrome

Noyau porphyrine Richard Feldmann

d’autres cytochromes ou avec des protéines fer-soufre. Par exemple, le cytochrome bc1 est un complexe formé de deux cytochromes b différents et d’un seul type de cytochrome c. Ce complexe joue un rôle important dans le métabolisme énergétique (voir section 5.12 et figure 5.20). En dehors de ces cytochromes, dans lesquels le fer est fixé à un hème (voir figure 5.16), on trouve, dans les chaînes de transfert d’électrons, une ou même plusieurs protéines non héminiques contenant du fer. Ces protéines contiennent des complexes constitués d’atomes de fer et de soufre, dont les plus courants sont les complexes Fe2S2 et Fe4S4 (voir figure 5.17). Les atomes de fer sont liés aux atomes de soufre libre et à des atomes de soufre provenant de résidus cystéine de la protéine (voir figure 5.17). La ferrédoxine est une protéine fer-soufre, avec une configuration Fe2S2, qui est fréquemment rencontrée dans les systèmes biologiques. Les potentiels de réduction des protéines fer-soufre varient largement en fonction du nombre d’atomes de fer et de soufre présents et selon la manière dont ils sont encastrés dans la protéine. Ainsi, différentes protéines fer-soufre peuvent fonctionner à différents endroits de la chaîne de transfert d’électrons. Comme les cytochromes, elles transportent uniquement des électrons. Les quinones (voir figure 5.18) sont des molécules non protéiques très hydrophobes impliquées dans le transport d’électrons. Certaines quinones bactériennes sont proches de la vitamine K, facteur de croissance chez les animaux supérieurs. Comme les flavoprotéines, les quinones acceptent 2e– + 2H+, mais transfèrent uniquement les électrons au transporteur suivant.

Protéine

H3C

NH N

COO–

(d) FIGURE 5.16 Structure du cytochrome . (a) Structure du noyau pyrrole. (b) Le noyau porphyrine est formé par condensation de quatre noyaux pyrroles. Différents métaux peuvent être incorporés dans le noyau porphyrine. Par exemple, les pigments chlorophylliens contiennent du Mg2+ (voir section 17.2 et figure 17.3), la vitamine B12, du Cu2+ (voir section 30.7 et figure 30.12), et certains coenzymes porphyriques particuliers, du Ni 2+ (voir section 17.17 et figure 17.42). (c) Dans quelques cytochromes, comme le cytochrome c, le noyau porphyrine est lié par des ponts disulfures à des résidus cystéine appartenant à la protéine. Notez la présence de fer au centre du noyau. (d) Modèle compact du cytochrome c. La protéine entoure complètement le noyau porphyrine central (en bleu clair). Les cytochromes transportent seulement des électrons ; le site redox est l’atome de fer, qui passe alternativement du stade Fe2+ (réduit) au stade Fe3+ (oxydé). Le potentiel de réduction des différents cytochromes varie considérablement (voir figure 5.9) selon le type de cytochrome et le mode de fixation du cytochrome à la protéine.



122 Chapitre 5


R-Cystéine

Cystéine-R

S Fe

O CH3OC

Fe

R-Cystéine

S

CH3OC

Cystéine-R

C C

C

CH3

CH3

C

(CH2 CH

C

Oxydée

O

(a)

CH2)nH

2 H (2 e- + 2 H+)

R Cystéine S

Fe S

Fe

S Fe

Cystéine

Fe

OH

R

Cystéine

R

S

Cystéine R (b) FIGURE 5.17 Disposition des centres fer-soufre dans les protéines fer-soufre non héminiques. (a) Centre Fe2Se2. (b) Centre Fe4S4. Les cystéines impliquées dans les liaisons appartiennent à la partie protéique de la molécule. Les protéines fer-soufre ne transportent généralement que des électrons.

Contrôlez vos acquis Les chaînes de transfert d’électrons sont constituées d’une série de transporteurs d’électrons membranaires, fonctionnant d’une manière coordonnée pour transférer les électrons d’un donneur primaire à l’oxygène, qui est l’accepteur terminal du système. •

Quelles sont les principales différences entre les quinones et les autres transporteurs d’électrons membranaires ?

•

Quels transporteurs d’électrons décrits dans cette section acceptent 2e– + 2H+ ? Lesquels acceptent seulement e– ?

5.12 La conservation de l’énergie m n par la force proton-motrice La figure 5.19 montre les principaux composants des chaînes de transfert d’électrons et leurs E0’ respectifs. Chaque composant possède un potentiel de réduction caractéristique. L’ATP est produit par phosphorylation oxydative au cours du transport d’électrons. La production d’ATP est liée à l’établissement d’une force proton-motrice (fpm) (voir section 4.6) à travers la membrane, tandis que les réactions de transfert d’électrons déterminent le niveau d’énergie.

CH3OC CH3OC

C C

C

CH3

CH3

C

(CH2 CH

C

OH

CH2)nH

Réduite

FIGURE 5.18 Structure des formes oxydées et réduites d’une quinone, le coenzyme Q. La structure de la chaîne latérale (isoprénoïde) est une répétition d’unités de base à cinq carbones. Généralement, chez les procaryotes, n = 6 ; chez les eucaryotes, n = 10. Notez que 2 e– et 2 H+ sont nécessaires à la réduction complète de la forme oxydée de la quinone. Une forme intermédiaire, appelée semiquinone (quinone partiellement réduite), se constitue au cours de la réaction de réduction.

La force proton-motrice : chimio-osmose Pour comprendre le lien qui existe entre le transport d’électrons et la synthèse d’ATP, il est nécessaire de connaître l’orientation de ce système dans la membrane cytoplasmique. Les protéines membranaires sont enchâssées dans la double couche lipidique, de sorte que la plupart d’entre elles ont accès à la fois à l’intérieur et à l’extérieur de la cellule (voir section 4.5 et figure 4.16). Les protéines membranaires intégrales sont appelées protéines transmembranaires. Les transporteurs d’électrons sont orientés de sorte que les protons et les électrons se séparent dans la membrane au cours du processus de transport. Deux électrons plus deux protons, donnés par des composés comme le NADH, sont transférés le long de la chaîne par des transporteurs spécifiques. Durant ce processus, des protons sont libérés dans l’environnement (chez les procaryotes Gram négatif, les protons sont libérés dans le périplasme). La sortie des protons entraîne une légère acidification de la surface externe de la membrane. Les électrons sont captés par l’accepteur terminal situé à l’extrémité de la chaîne. Dans le cas de la respiration aérobie, l’accepteur terminal, O2, est réduit en eau. Les protons du cytoplasme sont indispensables pour réduire O2 en H2O. Ces protons proviennent de la dissociation de l’eau en H+ et OH–. H+ est utilisé dans la réduction de O2 en eau, et la sortie de H+ dans l’environnement entraîne l’accumulation de OH– du côté interne de la membrane. Malgré leur petite taille, H+ et OH– ne peuvent pas diffuser à travers la membrane parce qu’ils sont chargés. L’équilibre ne peut donc être spontanément rétabli. Le résultat global du transport d’électrons est donc la formation d’un gradient de pH et d’un potentiel électrochimique à travers la membrane. La surface interne de la membrane se charge négativement et devient alcaline, alors que sa surface



5.12 La conservation de l’énergie par la force proton-motrice 123

E0′

– 0,40

– 0,30

– 0,20

Substrats NAD+ /NADH

Flavoprotéine Protéines fer-soufre

– 0,10

Potentiel de réduction (V)

0,0

Quinone Cytochrome bc1

La génération de la force proton-motrice : complexes I et II

+ 0,10

+ 0,20

Cytochrome c + 0,30

+ 0,40

externe se charge positivement et devient acide. Le gradient de pH et le potentiel électrochimique (appelé force protonmotrice) chargent la membrane en énergie comme une batterie. Une partie de cette énergie électrique peut être emmagasinée par la cellule sous forme d’ATP. L’énergie de la membrane résultant du transfert d’électrons peut être utilisée directement pour effectuer un travail, comme le transport d’ions (voir section 4.7) et la rotation des flagelles, ou pour synthétiser l’ATP. Ce processus a été décrit pour la première fois en 1961 sous le nom de théorie chimio-osmotique par le scientifique britannique Peter Mitchell. Plus tard, Mitchell a reçu le prix Nobel pour ce concept dont les implications sont considérables pour toutes les formes du métabolisme énergétique, à part la fermentation. La chimio-osmose est un processus commun à toutes les cellules chez les Bacteria, les Archaea, ou les Eukarya.

Cytochrome aa3

+ 0,50

+ 0,60

+ 0,70

+ 0,80

O2 FIGURE 5.19 Les chaînes de transport des électrons en fonction des potentiels de réduction (E0’). Exemple d’un système transportant des électrons d’un donneur primaire (appelé substrats dans la figure) vers O 2 (l’accepteur terminal d’électrons). Cette séquence particulière est caractéristique de la chaîne de transport d’électrons au sein des mitochondries des cellules eucaryotes et de quelques Bacteria (par exemple, Paracoccus denitrificans). Escherichia coli étant déficiente en cytochromes c et aa3, les électrons passent directement du cytochrome b aux cytochrome o ou au cytochrome d (ce dernier a un E0’ comparable à celui du cytochrome aa3), qui est l’oxydase terminale du système (voir figure 17.37a). La conservation de l’énergie en ATP via la formation d’une force proton-motrice est possible grâce au fractionnement du processus d’oxydation en une série de réactions libérant chacune une quantité d’énergie faible mais utilisable. Comparez les couleurs employées ici à celles de la figure 5.9.

La force proton-motrice se développe à partir de l’activité des enzymes flaviniques, des quinones, du complexe cytochrome bc1 et de l’oxydase terminale. Le NADH cède 2 e– + 2H+ au FAD pour former le FADH2. Les deux protons sont ensuite expulsés du côté externe de la membrane quand le FADH2 cède 2e– à une protéine non héminique contenant du fer, qui fait partie du complexe I membranaire (voir figure 5.20). Ces transporteurs sont appelés « complexes » car ils sont constitués chacun de plusieurs protéines. Le complexe I d’Escherichia coli, par exemple, contient quatorze protéines différentes. Le complexe I est communément appelé NADH : quinone oxydoréductase parce qu’il catalyse une réaction au cours de laquelle le NADH est oxydé et la quinone réduite. Puis le coenzyme Q est réduit par la protéine non héminique du complexe I contenant du fer, grâce à deux protons provenant de la dissociation de l’eau dans le cytoplasme (voir figure 5.20). Le complexe II court-circuite les étapes du complexe I et envoie directement ses électrons et ses protons (en passant par le couple FAD/FADH2) dans la réserve de quinones. Le complexe II est également appelé complexe succinate déshydrogénase, en raison du substrat spécifique de ce complexe, le succinate (un produit du cycle de l’acide citrique, voir figure 5.22), qu’il oxyde. Cependant, comme le complexe II court-circuite le complexe I, moins de protons sont pompés quand deux électrons entrent dans la chaîne de transfert d’électrons que quand les électrons proviennent du NADH (voir figure 5.20).

Les complexes III et IV : cytochromes bc1 et de type-a Le coenzyme Q réduit donne un par un ses électrons au complexe cytochrome bc1, protéine membranaire appartenant au complexe III (voir figure 5.20). Le complexe cytochrome bc1 est associé à plusieurs protéines contenant un hème ou des centres métalliques, dont deux hèmes de type b (bL et bH), un hème de type c (c1), ainsi qu’une protéine fer-soufre (appelée protéine de Rieske). Le complexe bc1 est présent dans la chaîne de transfert d’électrons de la plupart des micro-organismes qui



124 Chapitre 5


+

+

+

2 H+

Com

ple

2e

–

xe I

2 e–

FMN 2 e–

Fe/S

–

NAD+

+ +

2 H+

NADH + H+ 2

Q

QH2

H+ +

2 OH–

H2O

Complexe II

+

Fumarate

FADH2

+

FAD

QH2/Q

Succinate

–

4 H+

4 H+

+ +

bL

cyt e–

bH

–

Fe/S

I

– –

+

Comp

–

lexe II

c1

V

eI plex

Com

+

a

cyt

a3

1 2

O2

H 2O

–

cyt c

4 H+ +

Cytoplasme

–

2 H+

+ Environnement

+ +

FIGURE 5.20 Formation de la force proton-motrice pendant la respiration aérobie. La figure montre la disposition des transporteurs d’électrons au sein de la membrane de Paracoccus denitrificans, organisme procaryote modèle dans les recherches sur la respiration. Les charges + et – de chaque côté de la membrane représentent respectivement les ions H+ et OH–. Les abréviations utilisées sont les suivantes : FMN pour flavoprotéine ; FAD pour flavine adénine dinucléotide ; Q pour quinone ; Fe/S pour protéine fer soufre ; cyt a, b, c pour cytochromes (bL et bH, cytochromes de type b à bas et haut potentiel). Un recyclage des électrons se produit au niveau de la quinone, durant le « cycle Q ». Les électrons venant de QH2 peuvent se répartir entre la protéine Fe/S et les cytochromes de type b du complexe bc1 (complexe III). Les électrons qui ont traversé les cytochromes de type b réduisent Q en QH2 (en deux étapes d’un électron chacune), augmentant de ce fait le nombre de protons pompés au site Q-bc1. Les électrons qui ont traversé la protéine Fe/S réduisent le cytochrome c1, puis le cytochrome c, les cytochromes de type a du complexe IV et finalement O2 en H2O (les deux électrons nécessaires pour réduire 1- O2 en H2O proviennent 2 des électrons qui ont traversé le cytochrome c et les deux protons proviennent du cytoplasme). Le complexe II, ou complexe succinate déshydrogénase, court-circuite le complexe I et prend ses électrons directement à la quinone. Les scientifiques qui travaillent dans le domaine de la bioénergétique des membranes utilisent classiquement les nombres caractérisant les différents complexes. Comparez la chaîne de transport d’électrons décrite ici avec celle d’Escherichia coli décrite dans la figure 17.37. Des différences dans les conditions de culture peuvent affecter de manière significative les composants des chaînes de transport d’électrons.

respirent. Il joue également un rôle dans le flux d’électrons lors de la photosynthèse (voir sections 17.4 et 17.5). La fonction principale du complexe cytochrome bc1 est de transférer des électrons des quinones vers le cytochrome c (voir figure 5.20). Les électrons voyagent du complexe bc1 vers une molécule de cytochrome c située dans le périplasme et, de là, vers les cytochromes à haut potentiel a et a3 (complexe IV – voir figure 5.20). Le dernier élément de la chaîne est l’oxydase terminale qui réduit O2 en H2O. Le complexe IV pompe aussi deux protons pour 2e– consommés dans la réaction (voir figure 5.20). Le complexe cytochrome bc1 peut également interagir avec la réserve de quinones pour pomper deux protons supplémentaires au niveau du site Q-bc1 (voir figure 5.20), au cours d’une série d’échanges d’électrons appelée le cycle Q. Comme les quinones et le bc1 ont approximativement le même E0’, (proche de 0 V, voir figure 5.19), différentes quinones peuvent, soit se réduire, soit s’oxyder, en utilisant les électrons qui proviennent du complexe bc1. Ce mécanisme permet de pomper au total 4H+ vers le côté externe de la membrane, au niveau du complexe Q-bc1 chaque fois que 2e– entrent dans la chaîne au niveau du complexe I (voir figure 5.20). La figure 5.20 montre une des nombreuses modalités de transfert d’électrons que l’on rencontre chez différents organismes. Cependant, plusieurs propriétés sont communes à toutes les chaînes de transport d’électrons : 1) la présence d’une série de transporteurs d’électrons associés à une membrane et disposés de manière à obtenir une augmentation de E0’ vers des valeurs plus positives ; 2) l’alternance, dans la chaîne, de transporteurs d’électrons et de transporteurs d’électrons et de protons ; et 3) la génération d’une force proton-motrice, en raison de la séparation des charges à travers la membrane, milieu acide à l’extérieur et milieu alcalin à l’intérieur.

Les ATPases, la force proton-motrice et la formation d’ATP Quel est le lien entre la force proton-motrice générée par le transfert d’électrons (voir figure 5.20) et la synthèse d’ATP ? Curieusement, il existe une forte analogie entre le mécanisme de synthèse de l’ATP et le mécanisme de rotation du flagelle bactérien (voir section 4.14 et figure 4.56). L’enzyme qui catalyse la conversion de la force proton-motrice en ATP est un complexe membranaire de grande taille appelé ATP synthase, ou plus communément ATPase. Les ATPases sont également connues sous le nom de complexe V. Les ATPases sont composées de deux parties : le complexe F1, situé du côté cytoplasmique de la membrane, et le complexe F0, qui traverse la membrane et laisse passer les protons (voir figure 5.21). Le complexe F1/F0 catalyse la transformation réversible de l’ATP en ADP + Pi (voir figure 5.21). La structure protéique des ATPases est hautement conservée dans les trois domaines du vivant, suggérant l’ancienneté de ce mécanisme de conservation de l’énergie au cours de l’évolution (voir section 11.2). L’ATPase F1/F0 est le plus petit moteur biologique actuellement connu. Le mouvement des protons à travers la sous-unité a de F0 commande la rotation des protéines c, générant une torsion transmise à F1 par les sous-unités γε (voir figure 5.21).



5.12 La conservation de l’énergie par la force proton-motrice 125

δ

α ADP + Pi α

β

β

α

F1

ATP

Cytoplasme

b2

γ H+

Les inhibiteurs et les agents découplants

ε Membrane a Fo

C12 H+

H+

H+

la phosphorylation oxydative, possèdent encore ces complexes enzymatiques. Beaucoup de réactions importantes dans les cellules, comme le mouvement et le transport, tirent leur énergie de la force proton-motrice plutôt que de l’ATP (voir section 4.6). Ainsi, l’ATPase des organismes qui ne respirent pas, comme les bactéries lactiques, fonctionne dans une seule direction pour générer la force proton-motrice indispensable au fonctionnement de la cellule.

Environnement

FIGURE 5.21 Structure et fonctionnement de l’ATP synthase (ATPase, complexe V). F1 est un complexe de cinq polypeptides différents α3β3γεδ. C’est le complexe catalytique responsable de l’interconversion de ATP + Pi en ATP. F0 est un complexe membranaire de trois polypeptides ab 2c12. La sous-unité a transporte les protons à travers la membrane ; la sous-unité b fait saillie à l’extérieur de la membrane et forme, avec les sousunités b2 et δ, le stator. La force proton-motrice induit un passage de protons vers l’intérieur de la cellule, qui conduit à la synthèse d’ATP. Si l’action de l’ATPase est réversible, à l’inverse l’hydrolyse de l’ATP peut générer la force proton-motrice.

L’énergie potentielle produite est transférée à F1 par la rotation couplée des sous-unités γε, entraînant une déformation des sous-unités β. Ce changement de conformation permet la fixation de ADP + Pi à chaque sous-unité β. La synthèse d’ATP a lieu quand les sous-unités β retournent à leur conformation de départ. Par analogie avec le moteur flagellaire (voir figure 4.56), la première fonction des sous-unités b2δ de F1 est de servir de stator, empêchant la rotation des sous-unités α et β avec γε, si bien que les changements conformationnels se produisent au niveau de β. Mais, à la différence du moteur flagellaire, la rotation de l’ATPase n’est pas utilisée pour la propulsion des cellules, mais pour la synthèse d’ATP (voir figure 5.21). La synthèse d’ATP catalysée par l’ATPase est désignée sous le nom de phosphorylation oxydative des systèmes respiratoires ou de photophosphorylation chez les organismes phototrophes. L’ATPase consomme trois ou quatre protons par mole d’ATP produite.

La réversibilité de l’ATPase Le moteur moléculaire miniature F1/F0 est réversible. L’hydrolyse de l’ATP fournit l’énergie requise par γ pour tourner dans la direction opposée, permettant le passage par la sous-unité a des protons de l’intérieur vers l’extérieur de la cellule. Ce processus génère la force proton-motrice au lieu de la consommer. Cette réversibilité explique pourquoi les micro-organismes strictement fermentatifs, qui n’ont pas de chaîne de transport d’électrons et sont incapables de produire

Certaines substances chimiques qui affectent le flux d’électrons ou la phosphorylation oxydative sont utilisées pour étudier les réactions de transport d’électrons. Ces composés sont regroupés en deux catégories : les inhibiteurs et les agents découplants. Les inhibiteurs bloquent le flux d’électrons et, en conséquence, la force proton-motrice. Parmi ceux-ci, citons le monoxyde de carbone (CO) et le cyanure (CN–) ; ces deux inhibiteurs se fixent fortement aux cytochromes de type a (voir figure 5.20) et empêchent leur fonctionnement. Les agents découplants, au contraire, bloquent la synthèse d’ATP sans affecter le transport d’électrons. Ce sont des substances liposolubles, comme le dinitrophénol et le dicumarol, qui relâchent les membranes et détruisent ainsi la force protonmotrice, rendant la synthèse d’ATP impossible (voir figure 5.21).

Contrôlez vos acquis La force proton-motrice est générée quand des électrons sont transportés à travers une chaîne de transfert d’électrons et que des protons sont expulsés à l’extérieur de la membrane. Les principaux transporteurs d’électrons varient en fonction des organismes ; ce sont des flavines, des quinones, le complexe cytochrome bc1 et d’autres cytochromes. Les cellules utilisent la force proton-motrice pour la synthèse d’ATP par l’ATPase. •

Comment les réactions de transfert d’électrons génèrent-elles la force proton-motrice ?

•

Quelle est, chez P. denitrificans, la quantité de protons expulsée pour deux électrons qui traversent la chaîne de transport d’électrons ? À quel endroit de la chaîne la force proton-motrice est-elle générée ?

•

Quelle structure cellulaire convertit la force proton-motrice en ATP ? Comment cela fonctionne-til ?

V

FLUX DE CARBONE DANS LA RESPIRATION ET AUTRES VOIES CATABOLIQUES

Pour comprendre comment l’ATP est synthétisé au cours de la respiration, il faut passer en revue les différents aspects du métabolisme carboné qui lui sont associés. Les autres voies de production d’énergie telles que la respiration anaérobie, la photosynthèse et la chimiolithotrophie seront également abordées.



126 Chapitre 5

m n 5.13


Le flux de carbone dans la respiration : le cycle de l’acide citrique

Les premières étapes de la respiration à partir du glucose sont les mêmes que celles de la glycolyse (voir figure 5.14). L’intermédiaire clé de ce processus est le pyruvate. Cependant, contrairement à la fermentation, où le pyruvate est réduit et transformé en produits de fermentations (voir figure 5.14), il est complètement oxydé en CO2 au cours de la respiration. Le cycle de l’acide citrique (CAC) [voir figure 5.22] est la voie d’oxydation totale du pyruvate en CO2 la plus largement rencontrée. Le pyruvate est d’abord décarboxylé, ce qui produit une molécule de NADH et une molécule acétylée couplée au coenzyme A (acétyl-CoA – voir figure 5.12). Puis le groupement acétyle de l’acétyl-CoA se combine à l’oxaloacétate, composé à quatre atomes de carbone, pour former de l’acide citrique (voir figure 5.12) en utilisant l’énergie de la liaison thioester de l’acétyl-CoA. Ensuite, des réactions d’hydratation, de décarboxylation et d’oxydation conduisent à la libération de deux molécules supplémentaires de CO2 (voir figure 5.22a). Enfin, le cycle est bouclé par la régénération de l’oxaloacétate, qui peut encore accepter un acétyle.

La libération de CO2 et le transport d’électrons Pour chaque molécule de pyruvate oxydée au cours du cycle, trois molécules de CO2 sont libérées, la première durant la formation d’acétyl-CoA, la deuxième par la décarboxylation de l’isocitrate, et la troisième par la décarboxylation de l’α-cétoglutarate (voir figure 5.22). Comme dans la fermentation, les électrons libérés au cours de l’oxydation des intermédiaires du cycle sont transférés à des enzymes contenant du NAD+ ou du FAD. Cependant, la respiration et la fermentation diffèrent par leur mode d’oxydation du NADH et du FADH2. Dans la respiration, les électrons du NADH sont transférés à l’oxygène ou à un autre accepteur d’électrons terminal par la chaîne de transfert d’électrons (voir section 5.12) ; dans la fermentation, ils sont utilisés pour réduire le pyruvate (voir figure 5.14). Ainsi, contrairement à la fermentation, dans la respiration, la présence d’un accepteur d’électrons permet l’oxydation complète du glucose en CO2, avec un meilleur rendement énergétique (voir figure 5.22b). En fait, alors que les fermentations lactique ou alcoolique produisent seulement deux ATP par molécule de glucose (voir figure 5.14), la respiration conduit à la synthèse de trente-huit ATP par molécule de glucose (voir figure 5.22).

La biosynthèse et le cycle de l’acide citrique En dehors de son rôle clé dans le catabolisme, le cycle de l’acide citrique est également important pour les biosynthèses. Le cycle comporte un certain nombre d’intermédiaires clés qui peuvent être utilisés dans des réactions de biosynthèse, en fonction des besoins de la cellule. Les composés les plus importants à cet égard sont l’α-cétoglutarate et l’oxaloacétate, car ce sont les précurseurs de nombreux acides aminés (voir section 5.16), et le succinyl-CoA, qui entre dans la formation du noyau porphyrine des

cytochromes, des chlorophylles et autres composés tétrapyrroliques (voir figure 5.16). L’oxaloacétate peut également être converti en phosphoénolpyruvate, précurseur du glucose (voir figure 5.25). L’acétyl-CoA, quant à lui, est un précurseur de la biosynthèse des acides gras (voir section 5.17). Ainsi, le cycle de l’acide citrique remplit deux fonctions essentielles dans la cellule : une fonction bioénergétique et une fonction biosynthétique. De même, certains intermédiaires de la voie de la glycolyse peuvent être utilisés pour les biosynthèses (voir figure 5.26).

Contrôlez vos acquis La respiration, pendant laquelle un composé organique est complètement oxydé, libère beaucoup plus d’énergie que la fermentation. Le cycle de l’acide citrique joue un rôle essentiel dans la respiration des composés organiques. •

Dans le cycle de l’acide citrique, combien de molécules de CO2 et de paires d’électrons sont-elles libérées par molécule d’acétate consommée ?

•

Quelles sont les deux principales fonctions que le cycle de l’acide citrique et la glycolyse ont en commun ?

5.14 Les autres voies cataboliques m n Le monde microbien est caractérisé par sa grande diversité métabolique et, en particulier, par les diverses stratégies utilisées par les différents micro-organismes pour synthétiser l’ATP. La figure 5.23 résume les mécanismes cellulaires de la production d’énergie par des voies différentes de la respiration aérobie et de la fermentation : la respiration anaérobie, la chimiolithotrophie et la phototrophie.

La respiration anaérobie Des accepteurs d’électrons autres que l’oxygène peuvent être utilisés pour produire de l’énergie par la respiration. Contrairement à la respiration aérobie, ces processus sont appelés respiration anaérobie. Parmi les accepteurs d’électrons utilisés dans la respiration anaérobie, on trouve le nitrate (NO3–), l’ion ferrique (Fe3+), le sulfate (SO42–), le carbonate (CO32–), et même certains composés organiques. Quand ces accepteurs d’électrons sont utilisés à la place de l’oxygène, moins d’énergie est libérée, du fait de leur position dans la tour des électrons (aucun de ces accepteurs n’a de E0’ aussi positif que le couple O2/H2O) (voir figure 5.9). Ces accepteurs d’électrons permettent aux micro-organismes de respirer dans des environnements dépourvus d’oxygène. Les respirations anaérobies sont extrêmement importantes du point de vue écologique parce que O2 est relativement peu soluble dans l’eau et se montre un accepteur d’électrons très exigeant (voir section 17.13).

La chimiolithotrophie Un deuxième mode de production d’énergie implique l’utilisation de composés inorganiques à la place de composés organiques. Les organismes capables d’utiliser des composés inorganiques comme donneurs d’électrons sont appelés



5.14 Les autres voies cataboliques 127

Pyruvate– (trois carbones) NAD+ + CoA

CO2

NADH

Légende des couleurs C2

Acétyl-CoA

C4 C5

CoA Oxaloacétate2–

NADH

C6

Citrate3– Aconitate3–

NAD+ Malate2–

Isocitrate3– NAD(P)+

Fumarate2–

CO2

FADH FAD Succinate2–

α-Cétoglutarate2– Succinyl-CoA

CoA

GTP

GDP + Pi

NAD(P)H

CoA + NAD+ NADH

CO2

(a)

Balance énergétique de la respiration aérobie (1) Glycolyse : Glucose + 2 NAD+ + 2 ATP 2 Pyruvate– + 4 ATP + 2 NADH + 4 ADP vers le CAC (a) Phosphorylation au niveau du substrat 2 ADP + Pi 2 ATP ( 2) (b) Phosphorylation oxydative 2 NADH 6 ATP (2) CAC: Pyruvate– + 4 NAD+ + GDP + FAD

(a) Phosphorylation au niveau du substrat 1 GDP + Pi 1 GTP 1 GTP + 1 ADP 1 ATP + 1 GDP (b) Phosphorylation oxydative 4 NADH 12 ATP 1 FADH 2 ATP (3) Rendement en ATP : glycolyse plus CAC

Vers le complexe I

8 ATP

3 CO2 + 4 NADH + FADH + GTP Vers le Vers le complexe I complexe II 15 ATP ( 2)

38 ATP par glucose

FIGURE 5.22 Le cycle de l’acide citrique (CAC). (a) Le CAC commence par la condensation de l’acétyl-CoA, composé à deux carbones (formé à partir du pyruvate), avec l’oxaloacétate, composé à quatre carbones, formant le citrate, composé à six carbones. L’oxaloacétate est de nouveau formé par une succession d’oxydations et de transformations, et un nouveau cycle peut commencer, par réaction avec une nouvelle molécule d’acétyl-CoA. (b) Bilan global des substrats énergétiques (NADH/FADH) pour la chaîne de transport d’électrons et pour la production de CO 2 par le CAC. Les substrats énergétiques (NADH/FADH) entrent dans la chaîne de transport des électrons (voir figure 5.20).



128 Chapitre 5


Composé organique

CO2

Flux de carbone Transport d’électrons/ Force proton-motrice Biosynthèse

ATP S0

– NO3– SO42– Accepteurs d’e organiques

O2

Respiration aérobie

Respiration anaérobie (a) Métabolisme des chimioorganotrophes

Composé inorganique ATP

Transport d’électrons/ Force proton-motrice S0

O2

NO3– SO42–

CO2

Flux de carbone Biosynthèse

(b) Métabolisme des chimiolitotrophes

Photohétérotrophie

Composé organique Flux de carbone Biosynthèse

Lumière Transport d’électrons Force protonmotrice

Photoautotrophie

CO2

Flux de carbone Biosynthèse

ATP (c) Métabolisme des phototrophes

FIGURE 5.23 Les flux d’énergie et de carbone. (a) Le métabolisme respiratoire des chimioorganotrophes (b) le métabolisme des chimiolitotrophes et (c) le métabolisme des phototophes. Notez que, chez les phototrophes, le carbone utilisé pour les biosynthèses peut provenir du CO2 (photoautotrophie) ou de composés organiques (photohétérotrophie). Notez également l’importance du transport d’électrons, générant dans chaque cas une force proton-motrice.

chimiolithotrophes. L’hydrogène sulfureux (H2S), le gaz hydrogène (H2) et l’ammoniac (NH3) sont des exemples de donneurs d’électrons inorganiques. Le métabolisme des chimiolithotrophes est généralement aérobie, mais débute par l’oxydation d’un donneur d’électrons inorganique (voir figure 5.23). Les chimiolithotrophes ont des systèmes de transport d’électrons similaires à ceux des chimio-organotrophes et génèrent une force proton-motrice à partir d’un flux d’électrons, exactement de la même manière. Cette force proton-motrice fournit l’énergie nécessaire à la synthèse d’ATP. Cependant, les chimiolithotrophes et les chimio-organotrophes se distinguent par les sources de carbone qu’ils utilisent pour leurs biosynthèses. Les chimio-organotrophes utilisent des composés organiques (glucose, acétate et autres) comme sources de carbone. Les chimiolithotrophes, au

contraire, utilisent le dioxyde de carbone (CO2) comme source de carbone, et sont donc autotrophes (voir chapitre 17).

La phototrophie De nombreux organismes tirent leur énergie à partir de la lumière, par photosynthèse : ils sont phototrophes. Les mécanismes qui utilisent la lumière comme source d’énergie sont uniques et complexes, mais génèrent une force proton-motrice qui est employée pour synthétiser l’ATP, processus appelé photophosphorylation. La plupart des phototrophes ont recours à l’énergie de l’ATP pour assimiler du CO2 comme source de carbone pour leurs biosynthèses ; ce sont les photoautotrophes. Certains phototrophes utilisent des composés organiques comme sources de carbone et la lumière comme source d’énergie ; ce sont des photohétérotrophes (voir figure 5.23). Il existe, chez les micro-organismes, deux processus photosynthétiques différents mais apparentés : la photosynthèse oxygénique et la photosynthèse anoxygénique (voir chapitre 2).

L’importance de la force proton-motrice dans les stratégies bioénergétiques des différentes voies cataboliques Les micro-organismes présentent une diversité étonnante de stratégies bioénergétiques. Des milliers de composés organiques, de nombreux composés inorganiques et la lumière peuvent leur servir de source d’énergie. Cependant, à l’exception des fermentations qui utilisent la stratégie de phosphorylation au niveau du substrat, dans la respiration et la photosynthèse, la diversité métabolique tourne autour d’une stratégie commune, la génération d’une force proton-motrice. Dans les processus bioénergétiques contrôlés au niveau membranaire, les électrons, qu’ils proviennent de l’oxydation de composés chimiques organiques ou inorganiques, ou de processus phototrophiques, traversent tous une chaîne de transfert d’électrons associée à la membrane. Ce faisant, ils génèrent une force proton-motrice (voir figure 5.20). Dans tous les cas, la conservation d’énergie résulte de l’activité de l’ATPase (voir figure 5.21), soit par phosphorylation oxydative (chez les chimio-organotrophes et les chimiolithotrophes), soit par photophosphorylation (chez les phototrophes) [voir figure 5.23].

Contrôlez vos acquis Des accepteurs d’électrons autres que O2 peuvent servir d’accepteurs terminaux pour la production d’énergie. Comme, dans ces conditions, O2 est absent, le processus est appelé respiration anaérobie. Les chimiolithotrophes utilisent des composés inorganiques comme donneurs d’électrons, alors que les phototrophes utilisent la lumière pour générer une force proton-motrice. Celle-ci est impliquée dans tous les types de respiration et de photosynthèse. •

En tant que donneurs d’électrons, comment les chimio-organotrophes diffèrent-ils des chimiolithotrophes ?



5.15 La biosynthèse des sucres et des polysaccharides 129

•

Quelle source de carbone utilisent les organismes autotrophes ?

•

En quoi les photoautotrophes diffèrent-ils des photohétérotrophes ?

VI

RÉACTIONS DE BIOSYNTHÈSE

Les monomères, éléments de base des polymères, qui ne sont pas fournis par le milieu de culture ou le milieu naturel, doivent être synthétisés à partir de composés plus simples ; ce processus est appelé anabolisme. L’énergie stockée sous forme d’ATP ou de force protonmotrice par les réactions du catabolisme est consommée durant la formation des monomères et au cours de leur polymérisation pour former les macromolécules. La plus grande part de la dépense énergétique revient à la synthèse protéique et à la synthèse des acides nucléiques. Il faut comparativement peu d’énergie pour synthétiser des lipides et des polysaccharides. La plupart des biosynthèses de polymères consomment de l’ATP ou d’autres composés phosphorylés riches en énergie ; cependant, si la cellule dispose de ressources suffisantes, elle peut rapidement régénérer l’ATP grâce aux réactions de fermentation ou aux réactions de respiration générant une force proton-motrice. L’ATP et la force proton-motrice sont les formes interchangeables de l’énergie cellulaire (voir figure 5.24).

Substrats

Produits Catabolisme Production d’énergie

5.15 La biosynthèse des sucres m n et des polysaccharides Chez les procaryotes, les polysaccharides sont synthétisés à partir de deux formes activées du glucose, l’uridine diphosphoglucose (UDPG – voir figure 5.25a) ou l’adénosine diphosphoglucose (ADPG). L’ADPG est le précurseur du glycogène. L’UDPG est le précurseur de nombreux dérivés du glucose servant à la synthèse d’autres polysaccharides tels que la N-acétylglucosamine et l’acide N-acétylmuramique du peptidoglycane ou le lipopolysaccharide de la membrane externe des bactéries Gram négatif (voir sections 4.8 et 4.9). Quand une cellule croît sur un hexose tel que le glucose, elle peut facilement utiliser ce dernier pour synthétiser des polysaccharides. Quand elle croît sur d’autres sources carbonées, le glucose doit être synthétisé. Ce processus, appelé gluconéogenèse, utilise comme composé de départ le phosphoénolpyruvate, un des intermédiaires clés de la glycolyse (voir figure 5.14). Le phosphoénolpyruvate peut être synthétisé à partir d’oxaloacétate, un intermédiaire du cycle de l’acide citrique. La figure 5.25c présente la voie de la gluconéogenèse.

La biosynthèse des pentoses Les pentoses sont formés à partir des hexoses, par libération d’un atome de carbone sous forme de CO2 (voir figure 5.25b). Le ribose et le désoxyribose, pentoses utilisés dans la synthèse des acides nucléiques, sont synthétisés selon le schéma présenté dans la figure 5.25d. Une enzyme importante, la ribonucléotide réductase, convertit le ribose en désoxyribose par réduction du carbone en 2' du cycle. Curieusement, la réaction se produit après, et non avant la synthèse des nucléotides. Ainsi, les ribonucléotides sont synthétisés de novo, certains d’entre eux étant réduits ensuite en désoxyribonucléotides et utilisés pour la synthèse de l’ADN.

Contrôlez vos acquis ATP

Force proton-motrice

Les polysaccharides, composés de structures importantes dans les cellules, sont synthétisés à partir de monomères préalablement activés. La gluconéogenèse est la voie qui produit du glucose à partir de précurseurs non glucidiques. •

Sous quelle forme le glucose est-il utilisé pour former du glycogène ?

Anabolisme Consommation d’énergie Monomères

Biosynthèse

Macromolécules et autres composants cellulaires

FIGURE 5.24 Schéma de l’anabolisme et du catabolisme montrant les rôles essentiels de l’ATP et de la force proton-motrice. Les monomères peuvent provenir de substances nutritives de l’environnement ou de voies cataboliques comme la glycolyse et le cycle de l’acide citrique. Dans de nombreux cas, on doit synthétiser les monomères à partir d’intermédiaires du catabolisme ou de nutriments fournis par le milieu extérieur ; ces réactions de biosynthèse peuvent également être des réactions anaboliques.

5.16 La biosynthèse des acides aminés m n et des nucléotides La biosynthèse des monomères constitutifs des protéines et des acides nucléiques met en jeu des voies souvent longues et à étapes multiples nécessitant de nombreuses enzymes.

Les acides aminés, monomères des protéines Les organismes qui ne sont pas en mesure d’assimiler certains acides aminés à partir de leur environnement doivent les synthétiser à partir d’autres sources. Des familles structurales ayant en



130 Chapitre 5


(a) HOCH2 O

H HO

α-Cétoglutarate

H

H

OH

OH O P O

H

–O

HN O C

O –O

P

Cycle de l’acide citrique

O

O

C N

Oxaloacétate

CH CH

O

O CH2 H

H

HO

H

Uridine diphosphoglucose (UDPG)

(b)

(c)

Famille de l’alanine Valine Leucine

3-Phosphoglycérate

Famille de la sérine Glycine Cystéine

Phosphoénolpyruvate Chorismate

ADPG + Glycogène

ADP + Glycogène-Glucose

Érythrose-4-P Ribose 5-P

Composés C2, C3, C4, C5

Famille de l’aspartate Asparagine Lysine Méthionine Thréonine Isoleucine

Pyruvate Glycolyse

OH

Famille du glutamate Proline Glutamine Arginine

Histidinol

Famille des acides aminés aromatiques Phénylalanine Tyrosine Tryptophane Histidine

FIGURE 5.26 Les familles d’acides aminés. Notez que les squelettes carbonés de la plupart des acides aminés proviennent du cycle de l’acide citrique ou de la glycolyse. La synthèse des différents acides aminés d’une famille nécessite fréquemment de nombreuses étapes catalysées par des enzymes différentes, à partir de l’acide aminé précurseur (représenté en gras).

Cycle de l’acide citrique Oxaloacétate Phosphoénolpyruvate + CO2 Étapes inverses de la glycolyse

Glucose-6-P (d)

Glucose-6-P Ribulose-5-P + CO2 Ribose-5-P

Ribonucléotides

Ribonucléotides NADPH

ARN

Ribonucléotide réductase

Désoxyribonucléotides

ADN

FIGURE 5.25 Le métabolisme des sucres. (a) Les polysaccharides sont synthétisés à partir de formes activées d’hexoses comme l’UDPG. La couleur bleu ici représente le glucose. L’UDPG est principalement impliqué dans la biosynthèse des dérivés du glucose, tels que la N-acétylglucosamine. (b) La synthèse du glycogène s’obtient à partir de l’adénosine-phosphoglucose (ADPG), par addition séquentielle de glucose. (c) La gluconéogenèse. Le glucose peut être synthétisé à partir d’autres composés carbonés, généralement par l’inversion des étapes de la glycolyse. (d) Les pentoses nécessaires à la synthèse des acides nucléiques sont formés par la décarboxylation des hexoses, comme le glucose-6-phosphate. Notez que les précurseurs de l’ADN sont produits par la ribonucléotide réductase, à partir des précurseurs de l’ARN.

commun des étapes biosynthétiques peuvent regrouper les acides aminés. Le squelette carboné des acides aminés provient presque exclusivement des intermédiaires de la glycolyse ou du cycle de l’acide citrique (voir figure 5.26). Le groupe aminé des acides aminés provient généralement de sources d’azote inorganique de l’environnement, telles que l’ammoniac (NH3). Les acides aminés glutamate ou glutamine sont le plus souvent formés à partir d’ammoniac grâce à deux enzymes, la glutamate déshydrogénase et la glutamine synthétase (voir figure 5.27). L’ammoniac incorporé de cette façon peut ensuite être utilisé pour former d’autres composés azotés. Par exemple, le glutamate peut transférer son groupe aminé à l’oxaloacétate dans une réaction de transamination, produisant l’α-cétoglutarate et l’aspartate (voir figure 5.27c). De même, la glutamine peut réagir avec l’α-cétoglutarate pour former deux molécules de glutamate dans une réaction catalysée par une aminotransférase (voir figure 5.27d). Ces réactions servent à incorporer l’ammoniac dans divers squelettes carbonés à partir desquels d’autres réactions de biosynthèse peuvent former les vingt et un acides aminés (voir figure 3.12) entrant dans la composition des protéines.

Les nucléotides, monomères des acides nucléiques La biosynthèse des purines et des pyrimidines met en jeu des réactions complexes. Les purines sont littéralement construites atome par atome à partir de plusieurs sources distinctes de carbone et d’azote, dont le CO2 (voir figure 5.28a). La purine « clé de départ » – l’acide inosinique (voir figure 5.28a) – est



5.17 La biosynthèse des acides gras et des lipides 131 NADH (a) α-Cétoglutarate + NH3 NH2 (b) Glutamate + NH3

Glutamate déshydrogénase

ATP ADP + Pi Glutamine synthétase

NH2 Glutamate

Groupement aminé (provenant de l’aspartate)

NH2 NH2 Glutamine

N1

NH2

NH2 α-Cétoglutarate + Aspartate

Transaminase

NH2

(d) Glutamine + α-Cétoglutarate

C

6 5C

2

NH2 (c) Glutamate + Oxalacétate

CO2

NADH Glutamate synthase

NH2

Glycine

N 7

Groupement formyle (HCOO–) (provenant de l’acide folique)

8C

C 3 4C 9 N N Groupement formyle (provenant de l’acide folique) Azote du groupement amide de la glutamine

O

(a)

FIGURE 5.27 Incorporation d’ammoniac dans les bactéries. La couleur bleu représente l’ammoniac libre et les groupes aminés des acides. Les bactéries utilisent deux voies principales d’assimilation de NH3, catalysées par (a) la glutamate déshydrogénase et (b) la glutamine synthétase. (c) Les réactions de transamination transfèrent un groupement aminé d’un acide aminé à un acide organique. (d) Dans la réaction catalysée par la glutamate synthase, deux glutamates sont formés à partir d’une glutamine et d’un α-cétoglutarate.

C O –O

Contrôlez vos acquis Les acides aminés sont formés de squelettes carbonés produits pendant le catabolisme, alors que les nucléotides utilisent pour leur biosynthèse plusieurs sources de carbone. •

Quelle forme d’azote est généralement utilisée pour former le groupe aminé des acides aminés ?

•

Quelles bases sont des purines et quelles bases sont des pyrimidines ?

5.17 La biosynthèse des acides gras m n et des lipides Bien que les lipides des Archaea contiennent des composés hydrophobes différents des acides gras, les lipides des espèces de Bacteria et d’Eukarya contiennent des acides gras (voir section 4.5). Les lipides occupent des fonctions diverses dans les cellules (voir section 4.9). Une cellule peut contenir de nombreux types de lipides, dont certains sont produits seulement dans certaines conditions ou jouent un rôle particulier dans certaines structures cellulaires. La biosynthèse des acides gras est donc cruciale pour la plupart des cellules.

H

Ribose-5-P

C

N

N

O

POCH2 –O

H

H

OH

OH

H

(b) NH3

C O CO2

Acide aspartique

O HN

le précurseur des nucléotides puriniques adénine et guanine (voir figure 3.9) qui, une fois synthétisés (sous leur forme triphosphate) et attachés à leur pentose, sont prêts à être incorporés dans l’ADN et l’ARN (voir sections 7.5 à 7.11). Comme le noyau purine, le noyau pyrimidine est également construit à partir de sources différentes (voir figure 5.28c). La pyrimidine clé de départ est l’uridylate, à partir de laquelle dérivent les pyrimidines thymine, cytosine et uracile (voir figure 3.9) et leurs dérivés (voir figure 5.28d).

N

HN

2 Glutamate

C N H

O

CH

HN

C

C

CO2–

O

O –O

(c)

H

N

CH CH

O

POCH2 –O

C

H

H

OH

OH

H

(d) FIGURE 5.28 Biosynthèse des purines et des pyrimidines. (a) Les précurseurs du squelette des purines. (b) L’acide inosinique, précurseur de tous les nucléotides puriques. (c) L’acide orotique, précurseur du squelette des pyrimidines. (d) L’uridylate, précurseur de tous les nucléotides pyrimidiques. Il se forme à partir de l’orotate, par décarboxylation et addition de ribose-5-phosphate.

La biosynthèse des acides gras Les acides gras sont synthétisés par addition de deux atomes de carbone à la fois avec l’aide d’une petite protéine appelée protéine transporteuse de groupement acyle (ACP). L’ACP se lie à l’acide gras en formation et le libère une fois qu’il a atteint sa longueur finale (voir figures 5.29 et 3.7). Curieusement, bien que la chaîne d’acide gras soit construite par addition de deux carbones à la fois, les deux carbones proviennent d’un composé à trois carbones appelé malonate, lié à l’ACP pour former le malonyl-ACP. Chaque fois qu’un résidu malonyle est apporté, une molécule de CO2 est libérée (voir figure 5.29). La composition en acides gras des cellules varie d’une espèce à l’autre et peut aussi changer légèrement dans une même cellule en fonction de la température (la croissance à basse température favorise la synthèse d’acides gras à chaîne plus courte, tandis que la croissance à des températures élevées favorise la synthèse d’acides gras à chaîne plus longue).



132 Chapitre 5


O Acétyl-ACP H3C

C

Malonyl-ACP

ACP

HOOC CH2

Les lipides

O C

ACP

CO2

ACP O

O

H3C C CH2

Acétoacétyl-CoA

C ACP 2 NADPH 2 NADP+

H2O

O H3C CH2 CH2 Palmitate (16 C)

ACP

4C 3C CO2

6C 3C

CO2

3C 14 C

CO2

3C

CO2

3C

C

CO2

12 C

CO2

8C

3C 10 C

FIGURE 5.29 Biosynthèse des acides gras. Le schéma représente la biosynthèse d’un acide gras à 16 C, le palmitate (voir figure 3.7). La condensation de l’acétyl-ACP et du malonylACP forme l’acétoacétyl-CoA. Ensuite, les unités acétyles sont successivement rajoutées à partir du malonyl-ACP.

Douze à vingt atomes de carbone forment les acides gras les plus communs des lipides des Bacteria. Des acides gras ayant un même nombre d’atomes de carbone peuvent être saturés ou insaturés, ramifiés ou posséder un nombre impair d’atomes de carbones. Les acides gras insaturés contiennent une ou plusieurs doubles liaisons dans la longue portion hydrophobe de la molécule. Le nombre et la position de ces doubles liaisons sont souvent spécifiques d’une espèce ou d’un groupe, et les doubles liaisons sont généralement ajoutées par désaturation d’un acide gras saturé. Les chaînes branchées et les acides gras à nombre impair d’atomes de carbone sont synthétisés à partir d’un précurseur qui contient soit une chaîne d’acide gras branchée, soit un groupe propionyle (C3).

L’assemblage final des lipides des Bacteria et des Eukarya met en jeu l’addition d’acides gras à une molécule de glycérol. Pour les triglycérides simples, les trois carbones du glycérol sont estérifiés par des acides gras. Dans les lipides complexes, un des carbones contient une molécule de phosphate, de l’éthanolamine, un sucre, ou d’autres substances polaires (voir figure 3.7). Chez les Archaea, les lipides contiennent des chaînes latérales phytanyl au lieu de chaînes latérales d’acides gras (voir section 4.5). Cependant, comme chez les Bacteria et les Eukarya, le troisième carbone du squelette glycérol des lipides d’Archaea contient généralement un groupe polaire quelconque. Les lipides sont utilisés comme biomarqueurs dans des études d’écologie microbienne. Par exemple, les lipides contenant des liaisons éther sont typiques d’espèces d’Archaea, mais pas de Bacteria ou d’Eukarya. D’autres lipides sont hautement spécifiques de groupes particuliers d’organismes, et cette grande diversité des lipides est utilisée pour détecter ces groupes dans des échantillons provenant du milieu naturel (voir section 11.10). Les lipides des organismes morts sont souvent plus réfractaires à la dégradation que les autres macromolécules des cellules. Cette propriété, de même que leur spécificité, font de l’analyse des lipides une méthode idéale pour évaluer la composition bactérienne des matériaux anciens. Par exemple, les analyses de lipides faites sur des échantillons provenant de lacs ou de sédiments marins peuvent permettre de déterminer les différentes espèces de microorganismes et leur quantité dans les diverses couches d’un échantillon de sédiment. Comme chaque couche a un âge différent, qui peut être aisément déterminé, le profil lipidique constitue un enregistrement des types d’organismes présents dans l’habitat au cours du temps.

Contrôlez vos acquis Les acides gras sont synthétisés par addition de deux carbones à la fois et sont ensuite rattachés à un glycérol pour former des lipides. •

Expliquez pourquoi, dans la synthèse des acides gras, les atomes de carbone sont rajoutés par deux, alors que la molécule qui fournit ces carbones contient trois carbones.



5.17 La biosynthèse des acides gras et des lipides 133

Les produits de la fermentation de la levure

Chaque producteur de vin ou chaque brasseur est un microbiologiste amateur, même si quelquefois il l’ignore. En effet, les processus anaérobies de production d’énergie sont au cœur de certaines des plus saisissantes découvertes de l’homme : les nourritures et les boissons fermentées (voir figure 1). Dans la production du pain et de la plupart des boissons alcoolisées, c’est la levure Saccharomyces cerevisiae qui est exploitée pour produire de l’éthanol et du CO 2. Les levures, rencontrées dans divers milieux riches en sucre, comme les jus et les nectars de fruits, peuvent effectuer les deux modes opposés du métabolisme des chimio-organotrophes discutés dans ce chapitre, la fermentation et la respiration. En présence d’oxygène, les levures se développent efficacement sur différents sucres et se multiplient en libérant du CO 2 (qui provient du cycle de l’acide citrique – voir section 5.13). Cependant, en conditions anoxiques, les levures dirigent leur métabolisme vers la fermentation. Dans ce cas, le rendement en cellules est réduit, mais des quantités significatives d’alcool et de CO2 sont produites. Quand des raisins sont pressés pour en extraire le jus, un petit nombre de cellules de levure présentes sur les raisins dans la vigne sont transférées au moût. Pendant les premiers jours du procédé de vinification, les cellules de levure se multiplient en respirant et consomment de l’O2, rendant le jus anoxique. Dès que l’oxygène est épuisé, la fermentation démarre, et la production d’alcool et de CO2 commence. Ce passage du métabolisme aérobie au métabolisme anaérobie est crucial, et il faut veiller attentivement à ce que l’air ne pénètre pas dans la cuve de fermentation. Le vin est un des nombreux produits fabriqués avec la levure. La bière (voir focus

Barton Spear

FOCUS

Figure 1 Les principaux produits pour lesquels l’étape critique de fabrication est la fermentation sous l’action de la levure Saccharomyces cerevisiae.

« Comment faire de la bière chez soi », chapitre 30) et les spiritueux distillés tels que l’eau-de-vie, le whisky, la vodka et le genièvre (voir figure 1) sont également des produits de fermentation de la levure. Dans des spiritueux distillés, l’éthanol, produit en quantité relativement faible par la levure (10 à 15 % par unité de volume), est concentré par distillation pour atteindre 40 à 60 % d’alcool dans la boisson. Même l’alcool utilisé comme carburant de moteur est fait avec la levure, dans les parties du monde où le sucre est abondant, mais le pétrole est difficile à obtenir (comme au Brésil). Aux États-Unis, la production principale d’alcool éthylique, à partir de l’amidon de maïs comme substrat

fermentescible, est utilisée comme dissolvant industriel. La levure sert également à faire lever le pain ; dans ce cas, ce n’est pas l’alcool qui est important, car il se volatilise, mais le CO2, l’autre produit de la fermentation alcoolique (voir figure 5.14 et chapitre 30). Nous pouvons ainsi apprécier comment une cellule de levure, forcée d’adopter la fermentation parce que l’oxygène dont elle a besoin pour respirer est absent, a influencé la vie des hommes. Bien qu’étant des « déchets » de la voie glycolytique chez la levure, l’éthanol et le CO2 sont les ingrédients clés de l’industrie des boissons alcoolisées et des produits de boulangerie.



134 Chapitre 5


QUESTIONS 1. Pourquoi le carbone et l’azote sont-ils des macronutriments et le cobalt un micronutriment (voir section 5.1) ? 2. Que sont les sidérophores et pourquoi sont-ils nécessaires (voir section 5.1) ? 3. Pourquoi le milieu suivant ne peut-il pas être considéré comme un milieu défini chimiquement : glucose, 5 g ; NH4Cl, 1 g ; KH2PO4, 1 g ; MgSO4, 0,3 g ; extrait de levure, 5 g ; eau distillée, 1 l (voir section 5.2) ? 4. Qu’est une technique d’asepsie et pourquoi est-elle nécessaire (voir section 5.3) ? 5. Décrivez comment vous calculeriez ∆G0' pour la réaction : glucose + 6O2 → 6CO2 + 6H2O. Si on vous disait qu’elle est hautement exergonique, quel signe (négatif ou positif) utiliseriez-vous pour cette réaction (voir section 5.4) ? 6. Faites la distinction entre ∆G0', ∆G et Gf0 (voir section 5.4). 7. Pourquoi les enzymes sont-elles nécessaires aux cellules (voir section 5.5) ? 8. Quelle est la différence entre un coenzyme et un groupement prosthétique (voir section 5.5) ? 9. Voici une série de donneurs d’électrons appariés à des accepteurs d’électrons (écrits donneur/accepteur). En utilisant simplement les données de la figure 5.9, ordonnez cette série en commençant par la paire produisant le plus d’énergie et en finissant par la paire produisant le moins d’énergie. H2/Fe3+, H2S/O2, méthanol/NO3– (produisant du NO2–), H2/O2, Fe2+/O2, NO2–/Fe3+, H2S/NO3 (voir section 5.6). 10. Quel est le potentiel de réduction du couple NAD+/NADH (voir section 5.7) ? 11. Pourquoi l’acétyl phosphate est-il considéré comme un composé riche en énergie et non le glucose 6-phosphate (voir section 5.8) ?

12. Comment l’ATP est-il synthétisé au cours de la fermentation et de la respiration (voir section 5.9) ? 13. Dans la glycolyse, où le NADH est-il produit ? Où le NADH est-il consommé (voir section 5.10) ? 14. Que signifie l’expression force proton-motrice et pourquoi ce concept est-il si important en biologie (voir sections 5.11 et 5.12) ? 15. Comment l’énergie de rotation est-elle utilisée par l’ATPase pour produire l’ATP (voir section 5.12) ? 16. Le dinitrophénol et le cyanure sont deux produits chimiques considérés comme des poisons cellulaires, mais ils agissent de manière tout à fait différente. Comparez et énoncez les modes d’action de ces deux produits chimiques (voir section 5.12). 17. Parcourez les tableaux montrant les bilans énergétiques de la fermentation et de la respiration, et repérez tous les sites de synthèse d’ATP. Les organismes peuvent produire presque vingt fois plus d’ATP quand ils se développent à partir du glucose en conditions aérobies plutôt qu’en le fermentant. Exprimez cette différence en une phrase (voir section 5.13). 18. Pourquoi peut-on dire que le cycle de l’acide citrique joue deux rôles principaux dans la cellule (voir section 5.13) ? 19. En quoi diffèrent le donneur d’électrons et la source de carbone lorsqu’on compare Escherichia coli et Acidithiobacillus thioparus (un chimiolithotrophe oxydant le soufre) [voir section 5.14] ? 20. Quelles sont les deux voies cataboliques qui fournissent les squelettes carbonés pour la biosynthèse de sucres et d’acides aminés (voir sections 5.15 et 5.16) ? 21. Décrivez le processus par lequel un acide gras comme le palmitate (acide gras linéaire saturé à seize atomes de carbone) est synthétisé dans une cellule (voir section 5.17).

PROBLÈMES 1. Concevez un milieu de culture défini pour un organisme qui peut se développer en conditions aérobies en utilisant l’acétate comme source de carbone et d’énergie. Assurez-vous que tous les besoins nutritifs de l’organisme sont satisfaits et fournis dans les proportions correctes. 2. Desulfovibrio peut se développer en conditions anaérobies avec H2 comme donneur d’électron et SO42– comme accepteur d’électron (lequel est réduit en H2S). À partir de cette information et des données du tableau A1.2 (voir annexe 1), indiquez lequel des composants suivants – cytochrome c, ubiquinone, cytochrome c3, cytochrome aa3, ferrédoxine –, ne pourrait exister dans la chaîne de transport d’électrons de cet organisme, et pourquoi.

3. Utilisez encore les données du tableau A1.2 pour prévoir l’ordre des transporteurs d’électrons dans la membrane d’un organisme qui croît en conditions aérobies et possède les transporteurs d’électrons suivants : ubiquinone, cytochrome aa3, cytochrome b, NADH, cytochrome c, FAD. 4. Interprétez l’observation suivante : les cellules d’Escherichia coli, qui fermentent du glucose, croissent plus rapidement quand NO3– est fourni à la culture (NO2– est produit) et, dès lors, croissent encore plus rapidement (et arrêtent la production de NO2–) quand la culture est fortement aérée.



CHAPITRE SIX


I

Division cellulaire bactérienne

136

6.1 6.2

La croissance cellulaire et la fission binaire Les protéines Fts, le plan de division cellulaire et la morphologie cellulaire La synthèse du peptidoglycane et la division cellulaire

136

6.3

139

II

Croissance des populations microbiennes

6.4

6.6

La terminologie et le concept de la croissance exponentielle 141 L’expression mathématique de la croissance exponentielle 142 Les phases de la croissance 143

III

Mesure de la croissance microbienne 144

6.7

Les mesures directes de la croissance microbienne : comptages des cellules totales et viables 144 Les mesures indirectes de la croissance microbienne : turbidité 147 La culture continue en chémostat 149

6.5

La division cellulaire est l’ensemble des événements qui produisent deux cellules à partir d’une cellule.

137

6.8 6.9

IV

Impact de l’environnement sur la croissance microbienne : la température

140

151

6.10 L’impact de la température sur la croissance 151 6.11 La croissance microbienne à basse température 152 6.12 La croissance microbienne à haute température 155

V

Impact de l’environnement sur la croissance microbienne : pH, pression osmotique et oxygène

6.13 6.14

La croissance microbienne à pH acide ou alcalin L’influence de la pression osmotique sur la croissance L’influence de l’oxygène sur la croissance Les formes toxiques de l’oxygène

6.15 6.16

157 157 159 161 163



136 Chapitre 6


GLOSSAIRE Acidophile (acidophile) Organisme se développant préférentiellement à pH acide. Aérobie (aerobe) Organisme pouvant utiliser l’oxygène (O2) lors d’une respiration ; certains en ont besoin pour leur croissance. Alcaliphile (Alkaliphile) Organisme se développant préférentiellement à pH alcalin. Anaérobie (anaerobe) Organisme ne pouvant utiliser l’oxygène (O2) lors d’une respiration et dont la croissance peut être inhibée par l’oxygène. Anaérobie aérotolérant (aerotolerant anaerobe) Micro-organisme incapable de respirer l’oxygène (O2), mais dont la croissance est néanmoins possible en présence de celui-ci. Autolyse (autolysis) Lyse cellulaire spontanée due à l’activité de protéines lytiques appelées autolysines. Chémostat (chemostat) Système permettant la culture continue des micro-organismes ; le taux de croissance et le nombre de cellules peuvent être contrôlés indépendamment. Composés osmorégulateurs ou solutés compatibles (compatible solute) Molécules accumulées dans le cytoplasme, qui n’inhibent pas les processus biochimiques et permettent d’ajuster le niveau de l’activité de l’eau. Croissance (growth) Augmentation du nombre de cellules. Croissance exponentielle (exponential growth) Croissance d’un micro-organisme dont le nombre de cellules double au cours d’une période de temps constante. Culture en milieu clos (batch culture) Système de culture microbienne dont le volume est fixe et non renouvelé. Divisome (divisome) Complexe protéique impliqué dans la division cellulaire chez les procaryotes. Extrémophile (extremophile) Organisme dont la croissance optimale se réalise à des valeurs extrêmes pour certains paramètres physiques ou chimiques tels que la température ou le pH. Facultatif (facultative) Dans le cas de l’oxygène : un organisme pouvant se développer en présence ou absence d’oxygène. Fission binaire (binary fission) Division cellulaire après que la cellule a atteint deux fois sa taille minimale. FtsZ (FtsZ) Protéine clé de la division cellulaire qui forme un anneau dans le plan de division pour débuter l’élongation cellulaire. Halophile (halophile) Micro-organisme nécessitant NaCl pour sa croissance. Halophile extrême (extreme halophile) Micro-organisme nécessitant la présence

I

DIVISION CELLULAIRE BACTÉRIENNE

Avant d’aborder l’étude de la biosynthèse des macromolécules et la génétique des micro-organismes (voir chapitre 7), ce chapitre s’intéresse à différents aspects de la croissance microbienne, processus de la vie d’une cellule aboutissant à la formation de deux cellules.

croissance cellulaire et la fission m n6.1 Labinaire En microbiologie, la croissance est définie par un accroissement du nombre de cellules. La croissance constitue une étape essentielle de la vie. Les cellules ont une période de vie limitée

d’une grande quantité de sel (NaCl) pour sa croissance, généralement plus de 10 %, voire à un taux proche de la saturation. Halotolérant (halotolerant) Organisme ne nécessitant pas NaCl pour sa croissance, mais capable de se développer en présence de sel jusqu’à des concentrations importantes. Hyperthermophile (hyperthermophile) Micro-organisme dont la température optimale de croissance est supérieure à 80 °C. Mésophile (mesophile) Organisme dont la température optimale de croissance se situe entre 20 °C et 45 °C. Microaérophile (microaerophile) Organisme aérobie qui ne peut se développer qu’à des pressions partielles en oxygène inférieures à celle de l’air. pH (pH) Logarithme négatif de la concentration en ions H+ d’une solution. Phase de latence (lag phase) Période précédant la phase exponentielle de croissance, où les cellules peuvent être actives métaboliquement mais ne présentent pas de croissance. Phase stationnaire (stationary phase) Période suivant la phase exponentielle de croissance où le taux de croissance chute pour atteindre zéro. Psychrophile (psychrophile) Micro-organisme dont la température optimale de croissance est inférieure à 15 °C et la température maximale est de 20 °C. Psychrotolérant (psychrotolerant) Organisme pouvant se développer à des températures faibles mais dont l’optimum de croissance est supérieur à 20 °C. Températures cardinales (cardinal temperatures) Températures minimales, maximales et optimales de croissance pour un organisme donné. Temps de génération (generation time) Temps nécessaire pour le doublement du nombre de cellules d’une population microbienne. Thermophile (thermophile) Micro-organisme dont la température optimale de croissance se situe entre 45 et 80 °C (lorsque la température optimale est comprise entre 45 et 60 °C, on parle parfois de thermophile modéré). Transpeptidation (transpeptidation) Formation de liaisons peptidiques covalentes entre les résidus d’acide muramique lors de la synthèse du peptidoglycane. Viable (viable) Capable de se reproduire. Xérophile (xerophile) Organisme capable de vivre, parfois préférentiellement, dans des environnements très secs.

et le maintient d’une espèce est lié à une croissance continue de sa population. L’étude de la croissance microbienne a des implications pratiques dans de nombreux domaines. Les connaissances de base sur le développement des populations microbiennes sont notamment utiles pour mettre en place des méthodes de contrôle de ces populations (voir chapitre 20). La cellule bactérienne constitue une machine vivante capable de se dupliquer. Le processus de la croissance bactérienne fait intervenir plus de deux mille réactions chimiques très variées. Certaines de ces réactions sont d’ordre énergétique, d’autres impliquent la biosynthèse de petites molécules (monomères de macromolécules) ou sont responsables de l’approvisionnement en cofacteurs et coenzymes nécessaires pour les réactions enzymatiques. Néanmoins, les principales réactions de la synthèse cellulaire sont des réactions de polymérisation, processus par



6.2 Les protéines Fts, le plan de division cellulaire et la morphologie cellulaire 137

lequel des macromolécules vont être formées à partir de monomères. Les macromolécules accumulées dans le cytoplasme d’une cellule seront assemblées en structures telles que la paroi cellulaire, la membrane cytoplasmique, les flagelles, les ribosomes, des inclusions cytoplasmiques, des complexes enzymatiques, ce qui aboutira finalement à la division cellulaire.

La fission binaire Chez la plupart des procaryotes, la croissance d’une cellule se poursuit jusqu’à sa division en deux nouvelles cellules. Ce processus est appelé fission binaire, en référence au fait que deux cellules apparaissent à partir d’une cellule. Chez une bactérie en forme de bâtonnet telle qu’Escherichia coli, les cellules s’allongent jusqu’à atteindre deux fois leur longueur d’origine, puis se divisent pour finalement se séparer et former deux cellules filles (voir figure 6.1). Le point de division, appelé septum, est le résultat de la croissance vers l’intérieur de la membrane cytoplasmique et de la paroi cellulaire, dans des sens opposés, jusqu’au pincement entre les deux cellules filles (voir figure 6.1). Par définition, lorsqu’une cellule se divise pour en former deux, une génération est survenue. Pendant le cycle de croissance, tous les constituants cellulaires augmentent de façon proportionnelle. Chaque cellule fille reçoit un chromosome et suffisamment de ribosomes et autres complexes macromoléculaires, monomères et ions

Réplication de l’ADN

Élongation cellulaire

Une génération

Contrôlez vos acquis La croissance microbienne implique une augmentation du nombre de cellules. La croissance de la plupart des micro-organismes est due à un processus de fission binaire. •

Définissez le terme de génération.

protéines Fts, le plan m n6.2 Les de division cellulaire

et la morphologie cellulaire

ADN

Septum

inorganiques pour vivre de façon indépendante. La répartition de l’ADN répliqué entre les deux cellules filles est due au fait que cet ADN reste attaché aux membranes pendant la division. La formation du septum aboutit à la séparation des chromosomes, chacun dans une des deux cellules filles (voir figure 6.1). Le temps nécessaire pour une génération est très variable et dépend de nombreux facteurs, tant nutritionnels que génétiques. Dans des conditions nutritionnelles optimales, la bactérie E. coli peut accomplir un cycle en une vingtaine de minutes. Quelques bactéries peuvent croître encore plus vite, mais la plupart sont plus lentes. Les phénomènes de division cellulaire sont intimement liés aux processus de réplication du chromosome.

Formation du septum

Finalisation de la division (septum) et formation de cellules distinctes Séparation des cellules

FIGURE 6.1 Processus général de fission binaire chez une cellule procaryote en forme de bâtonnet. Par souci de simplification, le nucléoïde est représenté par un cercle vert.

Plusieurs protéines, appelées protéines Fts, sont essentielles dans la division cellulaire. L’acronyme Fts signifie « filaments sensibles à la température » (« filamentous temperature sensitive » en anglais), formulation qui décrit les caractéristiques des cellules présentant des mutations dans le gène codant les protéines Fts. De telles cellules ont du mal à se diviser. FtsZ, l’une des protéines clés parmi les protéines Fts, a été étudiée en détail chez Escherichia coli, ainsi que quelques autres bactéries. Les protéines Fts sont présentes chez tous les procaryotes, y compris les Archaea, et les protéines FtsZ sont également présentes dans les mitochondries et les chloroplastes, ce qui met en évidence les liens en termes d’évolution entre ces organites et les bactéries (voir sections 2.3, 14.4 et 14.5). De plus, les protéines FtsZ présentent des similitudes avec les tubulines, protéines intervenant dans la division cellulaire des eucaryotes (voir section 14.4).

Les protéines Fts et la division cellulaire Les protéines Fts interviennent dans le processus de division au niveau du divisome. Dans une cellule en forme de bâtonnet, la formation du divisome commence par l’attachement de molécules de la protéine FtsZ en un anneau, tout autour du cylindre, au centre de la cellule (voir figure 6.2). Ce point d’ancrage deviendra au final le plan de division cellulaire. Dans une cellule d’Escherichia coli, l’anneau est formé par la polymérisation de près de dix mille molécules de la protéine FtsZ. Cet anneau attire d’autres protéines impliquées dans la division cellulaire telles que FtsA et ZipA (voir figure 6.2).



138 Chapitre 6


FtsA est une ATP-hydroxylase qui va fournir l’énergie nécessaire pour l’assemblage des nombreuses protéines dans le divisome ; ZipA permet l’ancrage de l’anneau formé par les protéines FtsZ à la membrane cytoplasmique. Le divisome contient également des protéines Fts impliquées dans la synthèse du peptidoglycane, telle que FtsI (voir

ZipA

Membrane externe Peptidoglycane

FtsI FtsA ATP

GTP Anneau FtsZ

GDP + Pi

FtsK ADP + Pi


Anneau Protéines FtsZ du divisome

Membrane cytoplasmique Plan de division

T. den Blaauwen et Nanne Nanninga, université d’Amsterdam

(a)

(b) FIGURE 6.2 L’anneau FtsZ et la division cellulaire. (a) Plan de coupe d’une cellule en bâtonnet montrant l’anneau de protéines FtsZ tout autour du plan de division. L’agrandissement montre la disposition des protéines du divisome. ZipA constitue l’attache de FtsZ, FtsI est une protéine de la biosynthèse du peptidoglycane, FtsK intervient dans la séparation du chromosome, et FtsA est une ATPase. (b) Apparition et dégradation de l’anneau de protéines FtsZ au cours du cycle cellulaire d’Escherichia coli. Microscopie : première ligne, contraste de phase ; deuxième ligne, coloration du nucléoïde ; troisième ligne, coloration spécifique des protéines FtsZ ; quatrième ligne, coloration des protéines FtsZ et du nucléoïde. Événements de la division cellulaire : première colonne, l’anneau de protéines FtsZ n’est pas encore formé ; deuxième colonne, l’anneau FtsZ apparaît alors que le nucléoïde commence à se séparer ; troisième colonne, maximum de l’anneau FtsZ lors de l’élongation cellulaire ; quatrième colonne, dégradation de l’anneau FtsZ et division cellulaire. La barre sur la photo, en haut à gauche, représente 1 µm.

figure 6.2). FtsI est une protéine dont l’activité est inhibée par un antibiotique, la pénicilline (voir section 6.3). Le divisome est sans doute responsable de la synthèse de la membrane cytoplasmique et de la paroi cellulaire, de part et d’autre de son point d’ancrage, jusqu’à ce que la cellule ait atteint deux fois sa longueur initiale. Finalement, la constriction des cellules forme le septum, ce qui aboutit à la formation de deux cellules filles (voir figure 6.1).

La réplication de l’ADN et la division cellulaire La réplication de l’ADN se fait avant la formation de l’anneau FtsZ. De fait, c’est l’arrêt de la synthèse d’ADN qui constitue le signal pour la formation de cet anneau qui se forme entre les deux nucléoïdes. La localisation du centre de la cellule par les protéines FtsZ se réalise grâce à des protéines Min, notamment les protéines MinC et MinE. MinC inhibe la division cellulaire et empêche la formation de l’anneau FtsZ tant que la localisation précise du centre n’a pas été définie. MinE inhibe l’activité de MinC et se fixe au centre de la cellule. Son activité déclenche l’attachement des protéines FtsZ et le début du divisome. Au fur et à mesure de l’élongation cellulaire, les deux copies du chromosome sont séparées, chacun vers sa propre cellule fille (voir figure 6.1). Plusieurs protéines Fts, dont la protéine FtsK, interviennent dans ce processus (voir figure 6.2). Lors de la constriction, l’anneau de protéines FtsZ se dépolymérise, déclenchant la croissance vers l’intérieur du matériel cellulaire pour finalement isoler les deux cellules filles. La protéine FtsZ possède une activité d’hydrolyse de la guanosine triphosphate (GTP) pour produire l’énergie nécessaire à la polymérisation et la dépolymérisation de FtsZ, et donc à la formation et la dissociation de l’anneau FtsZ (voir figure 6.2). Le bon fonctionnement des protéines FtsZ est indispensable au processus de la division cellulaire bactérienne. De nombreuses données sur la division cellulaire sont apparues récemment et des données de génomique ont confirmé que les protéines FtsZ sont très bien conservées parmi des lignées phylogénétiques différentes. Au-delà de la recherche fondamentale, il y a un grand intérêt à comprendre la division cellulaire bactérienne d’un point de vue moléculaire, car cela pourrait permettre le développement de nouvelles molécules ciblant spécifiquement des processus clés de la division. Comme pour la pénicilline (qui cible la synthèse de la paroi cellulaire – voir section 6.3), des molécules qui interféreraient avec le fonctionnement des protéines FtsZ, ou d’autres protéines de la division cellulaire bactérienne, pourraient être d’un grand intérêt en médecine.

La forme de la cellule et les protéines de type Actine chez les procaryotes Bien que les protéines FtsZ jouent un rôle majeur dans le processus de division cellulaire, quels sont les facteurs qui interviennent dans la morphologie des cellules procaryotes ? Pendant longtemps, on a cru que le mode de synthèse du peptidoglycane définissait la morphologie cellulaire. Il apparaît aujourd’hui que certaines protéines spécifiques définissent la morphologie des cellules chez les procaryotes et que le peptidoglycane n’assume qu’un rôle mineur. Ces « protéines de



6.3 La synthèse du peptidoglycane et la division cellulaire 139

Contrôlez vos acquis La division cellulaire et la réplication du chromosome sont coordonnées, et les protéines Fts constituent les clés de ces processus. Les protéines FtsZ définissent le plan de division chez les procaryotes, tandis que les protéines Mre définissent la forme des cellules. •

Quand la réplication du chromosome a-t-elle lieu au cours du processus de division binaire ?

•

Comment les protéines FtsZ trouvent-elles le centre de la cellule ?

•

Quelles sont les protéines eucaryotes homologues des protéines FtsZ et MreB ?

du peptidoglycane m n6.3 Laet lasynthèse division cellulaire Avant que la division cellulaire puisse survenir, la synthèse de paroi nouvelle doit intervenir. De plus, cette synthèse de paroi nouvelle, doit être additionnée à de la paroi préexistante sans perte de l’intégrité cellulaire. La figure 6.3 décrit ce processus essentiel. À la base de l’anneau FtsZ (voir figure 6.2a et figure 6.3), de petites ouvertures sont créées dans la paroi cellulaire grâce à des enzymes, appelées autolysines, dont la fonction est analogue à du lysozyme (voir section 4.8). Les autolysines sont présentes au

Anneau FtsZ

Bourrelets pariétaux

Zones de croissance

(a)

A. Ulmeda et K. Amako

forme » présentent des homologies avec les actines, protéines clés du cytosquelette des eucaryotes (voir section 14.4). La principale « protéine de forme » chez les procaryotes est appelée MreB. Cette protéine constitue un cytosquelette de type actine chez les Bacteria, et probablement aussi chez les Archaea. Les protéines MreB forment des anneaux filamenteux en spirales tout autour de l’intérieur de la cellule, sous la membrane cytoplasmique. Ce cytosquelette MreB définit probablement la forme de la cellule en générant une contrainte pour la membrane cytoplasmique. Les bactéries en forme de coques ne possèdent pas de protéines MreB, ni les gènes codant ces protéines. Ceci indique clairement que la forme par défaut d’une bactérie est une sphère. Des modifications dans la conformation des filaments MreB chez les bactéries non sphériques sont probablement responsables des nombreuses morphologies rencontrées chez les procaryotes (voir section 4.11). Entre les protéines FtsZ et MreB, les cellules procaryotes produisent de nombreuses protéines identiques, du point de vue de leur structure, aux tubulines et actines des eucaryotes, impliquées respectivement dans la division cellulaire et l’échafaudage de la partie interne de la cellule. Étant donné l’importance de la division cellulaire dans la biologie de la cellule, il n’est pas surprenant que les solutions biologiques aux problèmes de la division cellulaire et de la forme des cellules chez les eucaryotes trouvent leur fondement, en termes d’évolution, chez les cellules procaryotes. Comme d’autres fonctions fondamentales des cellules (réplication de l’ADN, transcription et traduction), les mécanismes de la division cellulaire ont été des inventions précoces de l’évolution microbienne.

(b) FIGURE 6.3 Synthèse de la paroi chez une bactérie Gram positif. (a) Localisation de la nouvelle paroi synthétisée lors de la division cellulaire. Chez les coques, la synthèse de la paroi (en vert) est localisée en un seul point. L’anneau FtsZ (voir figure 6.2) définit le plan de division. (b) Observation au microscope électronique à balayage de cellules de Streptococcus hemolyticus montrant les bourrelets pariétaux (indiqués par les flèches blanches). Une cellule mesure 1 µm de diamètre.

sein du complexe protéique du divisome. La nouvelle paroi est alors constituée à travers ces ouvertures (voir figure 6.3a). La jonction entre nouveau et ancien peptidoglycane forme un bourrelet à la surface des bactéries Gram positif (voir figure 6.3b), constituant comme une cicatrice. Il est essentiel, pour la synthèse du peptidoglycane, que les précurseurs de la paroi cellulaire (acide muramique, glucosamine, tétrapeptide – voir figure 6.5) soient réunis au peptidoglycane déjà existant de manière coordonnée afin d’éviter une rupture au point de réunion. Si ceci n’est pas réalisé, un processus de lyse cellulaire spontané, appelé autolyse, peut survenir.

La biosynthèse du peptidoglycane On peut considérer la couche de peptidoglycane (voir section 4.8) comme une structure de résistance au stress, telle une fine couche de caoutchouc. La synthèse du nouveau peptidoglycane, lors de la croissance, nécessite la coupure contrôlée de l’ancien peptidoglycane par les autolysines et l’insertion simultanée des précurseurs du nouveau peptidoglycane. Une molécule transporteuse de lipides, le bactoprénol (voir figure 6.4) joue un rôle majeur dans ce processus. Le bactoprénol est une molécule d’alcool en C55 qui se lie aux précurseurs du peptidoglycane N-acéthyl glucosamine/acide N-acéthyl muramique/pentapeptide (voir figure 6.5a). Le bactoprénol permet le transport des précurseurs du peptidoglycane au travers de la membrane cytoplasmique jusqu’au périplasme grâce à son caractère très hydrophobe. Une fois dans le périplasme, le bactoprénol réagit avec des enzymes qui



140 Chapitre 6


H3C

CHCH2(CH2C

C

CH3

CH3

CH3

CHCH2)9CH2C

CHCH2 O O–

O P O

O–

O P Acide N-acétyl-muramique

O

FIGURE 6.4 Bactoprénol (undécaprénol diphosphate). Cette molécule très hydrophobe transporte les précurseurs du peptidoglycane au travers de la membrane cytoplasmique.

additionnent les précurseurs de la paroi au point de croissance et catalysent les réactions de formation des ponts glycosidiques (voir figure 6.5b).

La transpeptidation : cible de la pénicilline La dernière étape de la synthèse de la paroi est appelée transpeptidation. Elle consiste en la formation de liaisons peptidiques Peptidoglycane G

M G

G M

Zone de croissance de la paroi

M G

G M

M G

G M


M G

G

M

M

G

P

P

M

G G

M M

G G

entre résidus d’acide muramique contenus dans des chaînes de glycane adjacentes (voir section 4.8, et figures 4.29 et 4.30). Cette réaction de transpeptidation est intéressante du point de vue médical, car elle est inhibée par un antibiotique, la pénicilline. De nombreuses protéines se fixant à la pénicilline ont été identifiées dans le périplasme des bactéries Gram négatif, dont la protéine FtsI (voir figure 6.2). Lorsque la pénicilline se fixe à ces protéines, elles ne présentent plus d’activité catalytique. En l’absence de synthèse de la nouvelle paroi, l’activité des autolysines va affaiblir la paroi pour finalement aboutir à une lyse cellulaire. La pénicilline a été très utilisée en médecine pour deux raisons principales : en premier lieu, les humains, eucaryotes, ne possèdent pas de peptidoglycane, ce qui permet l’utilisation de cet antibiotique à forte dose ; en second lieu, pratiquement toutes les bactéries pathogènes contiennent du peptidoglycane et présentent donc potentiellement des cibles pour la pénicilline. La transpeptidation est la formation d’un pont peptidique comprenant un ou plusieurs acides aminés selon la structure de la paroi de l’organisme considéré. Chez les bactéries Gram négatif telles qu’Escherichia coli, ce pont peptidique se réalise entre l’acide diamino-pimélique et la D-alanine de deux peptides adjacents (voir figure 6.5b). L’une des deux molécules de D-alanine présentes initialement est éliminée lors de la transpeptidation (voir figure 6.5b). Ceci apporte l’énergie nécessaire pour la poursuite de la réaction de transpeptidation, qui se réalise dans l’espace périplasmique où l’ATP n’est pas disponible. Chez E. coli, les protéines FtsI (voir figure 6.2) sont considérées comme étant les protéines clés de la transpeptidation. Chez les bactéries Gram positif, où un pont glycine est présent (voir section 4.8 et figure 4.30) la réaction se réalise entre ces ponts entre la L-lysine et la D-alanine de deux peptides adjacents.

Extérieur


Intérieur Pentapeptide

M

G

P

P

Bactoprénol

(a)

D-Ala

G M

L-Ala

D-Glu

DAP

D-Ala

DAP

D-Glu

L-Ala

M G

D-Ala

Transpeptidation

La nouvelle paroi cellulaire est synthétisée au cours de la croissance bactérienne par l’insertion de nouvelles unités de glycane au sein de la paroi existante. Un alcool hydrophobe, le bactoprénol, facilite le transport de ces nouvelles unités glycane au travers de la membrane cytoplasmique pour être insérées à la paroi en croissance. La transpeptidation lie les précurseurs à la structure de peptidoglycane existante. •

Que sont les autolysines et pourquoi sont-elles nécessaires ?

•

Quelle est la fonction du bactoprénol ?

•

Qu’est-ce que la transpeptidation et pourquoi estelle importante ?

G M

(b)

L-Ala

D-Glu

DAP

D-Ala

DAP D-Ala

D-Glu

L-Ala

M G

FIGURE 6.5 Synthèse du peptidoglycane . (a) Transport des précurseurs au travers de la membrane cytoplasmique vers la zone de croissance de la paroi cellulaire. (b) Réaction de transpeptidation aboutissant à la jonction de deux chaînes de peptidoglycane. La pénicilline inhibe cette réaction.

II

CROISSANCE DES POPULATIONS MICROBIENNES

La croissance microbienne est définie comme l’augmentation du nombre de cellules d’une population. Nous allons maintenant considérer la croissance non plus comme la croissance et la division d’une cellule individuelle, mais du point de vue de la dynamique de croissance des populations bactériennes.



6.4 La terminologie et le concept de la croissance exponentielle 141

La croissance exponentielle La figure 6.6 présente une expérience au cours de laquelle une seule cellule d’un micro-organisme, présentant un temps de doublement de trente minutes, est mise en culture. Ce type de modèle d’accroissement de population qui voit le nombre de cellules doubler à intervalle de temps régulier, est appelé croissance exponentielle. La représentation arithmétique (échelle linéaire) du nombre de cellules en fonction du temps donne une courbe dont la pente augmente de façon continue (voir figure 6.6b). À l’inverse, lorsqu’une représentation semi-logarithmique est utilisée (nombre de cellules sur une échelle logarithmique de base 10, temps sur une échelle arithmétique), comme le montre la figure 6.6b, une droite est obtenue. Cette fonction linéaire indique que la population croît de façon exponentielle, c’est-à-dire que le nombre de cellules double à intervalle de temps régulier. La représentation semi-logarithmique est pratique et simple pour l’estimation du temps de génération à partir de données expérimentales de la croissance. En effet, le temps de génération peut être lu directement sur le graphique (voir figures 6.7 et 6.12b). Au cours de la croissance exponentielle, l’accroissement du nombre de cellules est faible au départ, mais augmente

Temps (h) 4 4,5 5 5,5 6 . . 10

1 2 4 8 16 32 64 128

0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5

Nombre total de cellules 256 (28) 512 (29) 1 024 (210) 2 048 (211) 4 096 (212) . . 1 048 576 (219)

(a) 1 000

1 000

Logarithmique Arithmétique

100 500 10

Nombre de cellules (échelle logarithmique)

Au cours du cycle de division cellulaire (voir figure 6.1), tous les composants structurels de la cellule se dupliquent. Si l’intervalle pour la formation de deux cellules à partir d’une est appelé génération, le temps nécessaire à cet événement est appelé temps de génération (voir figure 6.1). C’est donc le temps indispensable pour que la population cellulaire double (la masse cellulaire double également pendant cette période). C’est pour cette raison que le temps de génération est également appelé temps de doublement. Le temps de génération varie énormément entre microorganismes. Dans la plupart des cas, les bactéries ont un temps de génération minimal plus court que les eucaryotes. Le temps de génération d’un organisme donné dépend du milieu de culture et des conditions d’incubation appliquées. De nombreuses bactéries ont des temps de génération minimaux, en conditions optimales de croissance, compris entre une et trois heures. Néanmoins, quelques micro-organismes à croissance rapide ont des temps de génération inférieurs à dix minutes alors que d’autres, à croissance lente, connaissent des temps de génération de plusieurs jours. Dans le milieu naturel, les temps de doublement des populations microbiennes sont sans doute beaucoup plus longs que ceux obtenus dans des cultures de laboratoire. En effet, dans le milieu naturel, les conditions de culture idéales pour un organisme donné n’existent que par intermittence. Ainsi, selon la disponibilité des ressources, les conditions physico-chimiques (température, pH et autres), le taux d’humidité et les variations saisonnières, les populations bactériennes en milieu naturel peuvent ne se dupliquer que toutes les semaines ou plus.

Nombre total de cellules

Temps (h)

Nombre de cellules (échelle arithmétique)

m n

6.4 La terminologie et le concept de la croissance exponentielle

100 0 (b)

1

2

3

4

5

1

Temps (h)

FIGURE 6.6 Croissance d’une culture microbienne . (a) Données pour une population doublant toutes les trente minutes. (b) Représentation arithmétique et logarithmique des données (voir axes des ordonnées).

continuellement. Vers la fin de la croissance, cela aboutit à une augmentation spectaculaire du nombre de cellules. Ainsi, dans l’expérience décrite par la figure 6.6, une seule cellule est produite au cours des trente premières minutes, alors qu’entre 4 et 4,5 heures, 256 cellules sont produites en trente minutes. Une des implications de cette croissance exponentielle concerne les produits consommables, riches en nutriments et non stériles, tels que du lait, laissés en conditions idéales pour la croissance des micro-organismes. Les quelques heures correspondant au début de la croissance exponentielle ne nuisent pas au produit, alors que la même durée en fin de croissance peut être catastrophique.

Contrôlez vos acquis Les populations microbiennes ont un type de croissance caractéristique appelée croissance exponentielle, qui se visualise facilement en reportant le nombre de cellules en fonction du temps, selon un graphique semi-logarithmique. •

Pourquoi la croissance exponentielle aboutit-elle à un nombre de cellules si important en un temps si court ?

•

Qu’est-ce qu’une représentation semi-logarithmique ?



142 Chapitre 6


n le nombre de générations au cours de la croissance exponentielle. Le temps de génération g de la population en croissance exponentielle est t/n, où t représente la durée de la croissance exponentielle, exprimée en jours, heures ou minutes selon le type d’organisme et les conditions de culture. Lorsque les nombres de cellules initiales et finales sont connus pour une population de cellules en croissance exponentielle, il est possible de calculer n, puis, en connaissant la durée de cette croissance (t), le temps de génération g.

4 x 107

Cellules·mL–1

Pente = 0,05

2x

t=6h n=1 g = nt = 6 h

107

La population double en 6 heures 0

(a)

1

2

3

4

5

6

La relation entre N et N0 avec n L’équation N = N0 2n peut permettre de déterminer n comme suit :

1 x 108 t=2 n=1 g = nt = 2 h

8 x 107 6 x 107

La population double en 2 heures

N = N0 2n log N = log N0 + nlog2 log N - log N0 = nlog2

Cellules·mL–1

Pente = 0,15 4 x 107

n=

3 x 107

2 x 107

1 x 107 (b)

log N – log N0 log N – log N0 = = 3,3 (log N – log N0) log2 0,301

Cette nouvelle équation permet de déterminer le temps de génération à partir des quantités mesurables que constituent N et N0. Par exemple, d’après les données de la figure 6.7 (en bas) ou N = 108 cellules.mL–1, N0 = 5 × 107 cellules.mL–1 et t=2h:

2h

n = 3,3 [log (108) – log (5 × 107)] = 3,3 (8 – 7,69) = 3,3 (0,301) = 1 0

1

2

3

4

5

Temps (h)

FIGURE 6.7 Les paramètres de la croissance. Méthode d’estimation du temps de génération (g) sur la base de représentations semi-logarithmiques pour des populations en phase exponentielle de croissance, dont les temps de génération sont de 6 heures (a) et 2 heures (b). La pente de chacune des droites est égale à 0,301/g et n est le nombre de générations durant le temps t. Tous les nombres sont exprimés en notation scientifique (10 000 000 = 1 × 107 ; 60 000 000 = 6 × 107).

mathématique m n6.5 L’expression de la croissance exponentielle L’augmentation du nombre de cellules dans une culture bactérienne en croissance exponentielle constitue une progression géométrique d’ordre 2 (voir figure 6.6a). Une cellule se divise pour en donner deux, puis ces deux cellules se divisent pour en donner quatre, et ainsi de suite. Ceci peut s’exprimer de la façon suivante : 20 → 21 → 22. La relation mathématique entre le nombre de cellules initiales et le nombre de cellules après une période de croissance exponentielle est la suivante : N = N0 2n avec N le nombre de cellules finales N0 le nombre de cellules initiales

Dans cet exemple, le temps de génération t/n = 2/1 = 2 h. Si la croissance exponentielle continuait pendant deux heures de plus, la concentration en cellules au final serait de 2 × 108 cellules.mL–1.

Les paramètres de la croissance Le temps de génération d’une culture en croissance exponentielle peut également être calculé d’après la pente de la droite obtenue par une représentation semi-logarithmique des données de croissance exponentielle. La pente de cette droite est égale à 0,301 n/t ou (log2 n/t). D’après l’exemple ci-dessus, la pente est égale à 0,301 (1)/2, soit 0,15. Le temps de génération g étant égal à 0,301/pente, le calcul aboutit à g = 2 h. La valeur 0,301 n/t, est appelée taux de croissance spécifique et notée k. Un autre paramètre de la croissance est le taux de division, ou ν, qui est l’inverse du temps de génération. Le taux de division, égal à 1/g, s’exprime en unités inverses du temps (h–1). Alors que le terme g représente le temps nécessaire pour le doublement d’une population, le terme ν représente le nombre de générations par unité de temps dans une culture en croissance exponentielle. La pente de la droite obtenue pour une représentation du Log du nombre de cellules en fonction du temps (voir figure 6.7) est égale à ν/3,3. D’après les données de n et t, il est possible de calculer g, k et ν pour différents organismes et conditions de culture. Ceci peut être utilisé pour optimiser les conditions de culture d’un organisme ou pour tester l’effet positif ou négatif de traitements particuliers sur des cultures bactériennes.



6.6 Les phases de la croissance 143

Contrôlez vos acquis En connaissant le nombre de cellules initiales et finales, ainsi que le temps de croissance exponentielle, il est possible de déterminer directement le temps de génération et le taux de division d’une population. Les paramètres clés de la croissance sont n, g, ν, k et t. •

Différenciez les termes de taux de croissance spécifique et de temps de génération ?

•

Calculez n, g, ν, k pour une population en croissance exponentielle dont la concentration en cellules passe de 5 × 106 cellules.mL–1 à 5 × 108 cellules.mL–1 en 8 heures.

m n6.6 Les phases de la croissance Les données présentées dans la figure 6.6 ne reflètent qu’une partie de la croissance d’une population microbienne, celle que l’on nomme phase exponentielle de croissance. Lors de la réalisation d’une culture dans un tube ou un flacon, condition appelée batch ou culture en milieu clos, la croissance exponentielle ne peut se poursuivre indéfiniment. La concentration en cellules en fonction du temps suit une courbe de croissance typique (voir figure 6.8), qui comprend une phase de latence, une phase exponentielle, une phase stationnaire et une phase de mort cellulaire.

La phase de latence Lorsqu’une population microbienne est ensemencée dans un milieu de culture neuf, la croissance commence le plus souvent après une période appelée phase de latence. La durée de cette période peut être plus ou moins longue selon la culture

d’origine et les conditions de culture. Si une culture en phase exponentielle de croissance est transférée dans le même milieu de culture et dans les mêmes conditions, il n’y a pas de latence et la croissance exponentielle commence immédiatement. Par contre, dans le cas où un inoculum provenant d’une culture plus ancienne (phase stationnaire) est transféré dans le même milieu de culture, une phase de latence est observée même si les cellules de l’inoculum sont viables, c’est-à-dire capables de se diviser. Ceci est dû au fait que les cellules manquent de certains constituants essentiels et que leur synthèse nécessite du temps. Ce phénomène s’observe également lorsque l’inoculum est constitué de cellules lésées mais non mortes, à la suite d’un traitement par la chaleur, des radiations ou des composés toxiques, étant donné le temps nécessaire pour réparer les dommages causés par ce traitement. Une phase de latence est également observée lorsqu’une population est transférée depuis un milieu de culture riche dans un milieu plus pauvre en nutriments. La croissance de cellules dans un milieu de culture particulier implique la présence dans ces cellules d’un panel d’enzymes impliquées dans la synthèse des métabolites essentiels non fournis dans le milieu de culture. Ainsi, lors du transfert de cellules dans un milieu où de nouvelles biosynthèses seront indispensables, il faut du temps pour la mise en place des enzymes qui interviendront dans ces synthèses.

La phase exponentielle Au cours de la phase exponentielle, chaque cellule se divise pour former deux cellules qui vont à leur tour se diviser pour produire plus de cellules, et ainsi de suite, et ce pendant une période plus ou moins longue selon les ressources du milieu et d’autres facteurs. Les cellules en phase exponentielle de croissance sont dans l’ensemble dans le meilleur état physiologique possible. C’est pourquoi il est souhaitable d’utiliser des cellules en milieu de phase exponentielle pour l’étude de leurs enzymes ou tout autre composant cellulaire.

Phases de la croissance Stationnaire (plateau)

9,0

8,0

Mort cellulaire Cellules viables

Turbidité (Densité optique)

1,0 0,75 0,50

7,0

Densité optique (DO)

Log10 (Nombre cellules viables).mL-1

Latence Exponentielle

0,25 6,0

5,0 Temps

0,1

FIGURE 6.8 Courbe de croissance caractéristique d’une population bactérienne. Le dénombrement estime la quantité de cellules viables, c’est-à-dire capables de se reproduire (voir sections 6.5 et 6.6). La turbidité, ou densité optique, est une mesure de la diffraction et de l’absorption de la lumière par une culture bactérienne en milieu liquide (voir figure 6.12).



144 Chapitre 6


La plupart des micro-organismes unicellulaires ont une croissance exponentielle dont les paramètres peuvent varier énormément. Le taux de croissance exponentiel est sous l’influence des conditions de l’environnement (température, composition du milieu de culture) ainsi que des caractéristiques génétiques de l’organisme. Les procaryotes croissent en général plus vite que les micro-organismes eucaryotes, et les petits eucaryotes plus vite que les organismes de taille plus grande. Ceci est en relation avec le rapport de la surface sur le volume de l’organisme (voir chapitre 4, section 4.4). Les cellules les plus petites ont des capacités d’échange de nutriments et de déchets avec le milieu extérieur plus importantes, comparées aux cellules plus grosses, cet avantage métabolique influençant leur taux de croissance.

La phase stationnaire Dans le cas d’une culture batch, ou culture en milieu clos, dans un tube ou un flacon, la croissance exponentielle est limitée. Effectivement, une seule cellule bactérienne qui aurait un temps de génération de vingt minutes pourrait produire, selon une croissance exponentielle durant quarante-huit heures, une population de cellules dont le poids équivaudrait à quatre mille fois celui de la Terre. Et pourtant, le poids d’une seule cellule bactérienne est de l’ordre de 10–12 g, soit un billionième de gramme (voir tableau 3.2). Il est évident que ce scénario est impossible. Quelque chose fait que la croissance est limitée bien avant. En règle générale, une ou les deux des possibilités suivantes limitent cette croissance : 1) l’un des nutriments essentiels à la croissance s’épuise dans le milieu ou 2) un ou plusieurs déchets issus du métabolisme s’accumulent dans le milieu de culture et inhibent la croissance. Quoi qu’il en soit, la croissance cesse et la population atteint la phase stationnaire. Pendant cette phase, il n’y a ni augmentation ni diminution de la concentration en cellules. Bien qu’il n’y ait pas de croissance, de nombreuses fonctions cellulaires, dont le métabolisme énergétique et les biosynthèses, se poursuivent. Chez certains organismes, une faible croissance peut en fait survenir au cours de cette phase stationnaire, mais il n’y a pas d’augmentation de la concentration nette de cellules. La production de cellules est compensée par la mort d’autres cellules. Ce phénomène est appelé croissance cryptique.

La mort cellulaire Si l’incubation se poursuit après la phase stationnaire, il se peut que les cellules se maintiennent en vie et continuent leur métabolisme, mais elles peuvent également mourir. Dans ce dernier cas, les cellules entrent dans la phase de mort cellulaire, avec selon les cas lyse cellulaire. La phase de mort cellulaire peut être également exponentielle (voir figure 6.8), mais le plus souvent le taux de mortalité est bien plus faible que le taux de croissance exponentiel. Les différentes phases de la croissance (voir figure 6.8) reflètent les événements dans une population de cellules et non pas dans une cellule en particulier. Les termes phase de latence, phase exponentielle, phase stationnaire et phase de mort cellulaire n’ont aucune signification dans le cadre d’une cellule individuelle, mais uniquement dans le cadre d’une population de cellules.

Contrôlez vos acquis Les micro-organismes présentent une courbe de croissance caractéristique lorsqu’ils sont ensemencés dans un milieu de culture neuf. Cette courbe est constituée le plus souvent d’une phase de latence, puis la croissance débute de façon exponentielle. Lorsque les nutriments sont épuisés ou des produits toxiques accumulés, la croissance s’arrête et la population atteint la phase stationnaire. Si l’incubation se poursuit, il y a mort cellulaire. •

Lors de quelle phase de la courbe de croissance les cellules se divisent-elles selon un processus régulier ?

•

Quand n’y a-t-il pas de phase de latence ?

•

Pourquoi les cellules entrent-elles en phase stationnaire ?

III

MESURE DE LA CROISSANCE MICROBIENNE

La croissance d’une population est mesurée par les variations du nombre de cellules ou de la quantité de ces constituants cellulaires tels que les protéines, les acides nucléiques ou le poids sec de ces mêmes cellules. Différentes méthodes, détaillées par la suite, de dénombrement des cellules ou d’estimation de la biomasse cellulaire sont envisageables selon le type d’organisme et les possibilités techniques.

mesures directes m n6.7 Les de la croissance microbienne :

comptages des cellules totales et viables

Les méthodes de comptage (dénombrement) des cellules totales et viables constituent deux des techniques les plus couramment utilisées pour dénombrer les micro-organismes unicellulaires. Chacune de ces techniques a ses avantages et inconvénients et peut aboutir à des résultats assez différents pour la même culture bactérienne.

Le comptage des cellules totales Le nombre de cellules dans une population peut être mesuré par comptage au microscope, méthode appelée comptage microscopique direct. Ces comptages peuvent se faire soit à partir d’échantillons séchés sur lame, soit d’échantillons liquides. Dans le cas d’échantillons liquides, des lames spéciales, appelées cellules de comptage, sont utilisées. Une grille est gravée à la surface de ces lames de façon à définir des carrés de taille connue (voir figure 6.9). Le volume au-dessus de chacun de ces carrés est très faible mais mesuré et connu de façon précise. Le nombre de cellules par unité de surface de la grille peut être déterminé au microscope, ce qui donne une mesure du nombre de cellules par unité de volume contenu dans le liquide présent au-dessus des carrés. La valeur obtenue est convertie en nombre



6.7 Les mesures directes de la croissance microbienne : comptages des cellules totales et viables 145

Pour calculer le nombre de cellules par mL d’échantillon : 12 cellules × 25 grands carrés × 50 × 103 = 1,5 × 107

Support de lamelle Lamelle

Nombre par mm2 Échantillon (prendre soin de ne pas additionner trop de liquide). L’espace entre la cellule et la lamelle est de 0,02 mm (1/50 mm). L’ensemble de la cellule comprend 25 carrés de grande taille représentant une aire de 1 mm2, soit un volume de 0,02 mm3

Observation microscopique : le nombre de cellules est compté dans un carré de grande taille (ici 12 cellules). Dans la pratique, plusieurs carrés sont pris en compte et une moyenne est calculée.

Nombre par mm3 Nombre par cm3 (mL)

FIGURE 6.9 Comptage direct de cellules au microscope sur cellules de Petroff-Hausser. Un microscope à contraste de phase est le plus souvent utilisé afin d’éviter la coloration des cellules.

de cellules par millilitre de suspension cellulaire en prenant en compte un facteur de conversion dépendant du volume de la cellule de comptage (voir figure 6.9). Le comptage direct au microscope est une méthode rapide d’estimation du nombre de cellules d’un échantillon. Néanmoins cette méthode présente des limites : 1) les cellules mortes ne sont pas différenciées des cellules vivantes ; 2) les cellules les plus petites sont difficiles à voir au microscope, ce qui amène parfois à ne pas prendre en compte certaines d’entre elles ; 3) une bonne précision est difficile à obtenir ; 4) l’utilisation d’un microscope à contraste de phase est nécessaire si l’échantillon n’est pas coloré ; 5) cette méthode n’est pas applicable pour des échantillons de faible densité cellulaire (dans le cas de bactéries, pour une suspension cellulaire de 106 cellules.mL-1, peu ou pas de cellules seront observables dans le champ du microscope et il sera donc nécessaire de concentrer les suspensions peu denses) ; 6) les cellules mobiles doivent être immobilisées avant le comptage. En écologie microbienne, le comptage des cellules totales est souvent utilisé sur des échantillons naturels en utilisant des colorations plus ou moins spécifiques pour visualiser les cellules. Ainsi, un colorant spécifique de l’ADN, le DAPI, colorera toutes les cellules d’un échantillon (voir figure 18.6). En revanche, l’utilisation de colorants fluorescents fixés sur des sondes oligonucléotidiques spécifiques peut permettre le comptage de certains micro-organismes d’intérêt ou de groupes bactériens particuliers (voir figure 18.11). Si la densité cellulaire est faible, comme c’est le cas de certains échantillons d’eau, les cellules sont concentrées par filtration et le comptage se réalise sur le filtre une fois les cellules colorées.

Le comptage des cellules viables Lors du comptage microscopique direct, les cellules vivantes et mortes sont comptées. Pourtant, très souvent, le comptage le plus intéressant concerne les cellules viables. Une cellule viable est une cellule capable de se diviser et de produire une descendance. Le comptage des cellules viables le plus couramment utilisé est celui qui consiste à déterminer le nombre de cellules d’un échantillon capables de former des colonies sur un milieu de culture solide approprié. Ce type de comptage est appelé aussi comptage sur boîte ou comptage en milieu

solide. Le postulat de départ de ce type de comptage est que chaque cellule viable d’un échantillon va pouvoir se multiplier et former une colonie. Il existe des techniques de coloration des cellules viables (voir figure 18.7), néanmoins la méthode sur boîte reste la plus couramment utilisée pour dénombrer les cellules viables d’un échantillon. Il existe deux techniques principales pour effectuer un dénombrement en milieu solide : l’ensemencement par étalement et l’ensemencement en masse (voir figure 6.10). Dans la technique de l’ensemencement par étalement un volume connu, généralement 0,1 mL, d’un échantillon (naturel ou culture) correctement dilué est étalé sur la surface d’une boîte de Petri à l’aide d’un étaleur stérile (râteau en verre ou spatule de Drigalski). La boîte est ensuite incubée jusqu’à ce que des colonies apparaissent, puis le nombre de colonies sur la boîte est compté. Il est important que la surface de la boîte soit assez sèche afin que l’inoculum soit absorbé par la gélose. Des volumes supérieurs à 0,1 mL sont peu souvent utilisés car la totalité du volume peut ne pas être absorbé. Dans ce cas, lors de la croissance, les colonies sont à même de fusionner rendant le comptage difficile. Dans la technique de l’ensemencement en masse (figure 6.10) un volume connu, généralement compris entre 0,1 et 1 mL, d’un échantillon correctement dilué est versé dans une boîte de Petri stérile. Le milieu de culture gélosé maintenu en surfusion est alors additionné et homogénéisé avec l’échantillon en faisant tourner doucement la boîte de Petri sur la surface de la paillasse. Des volumes plus grands peuvent être utilisés du fait que l’échantillon est mélangé au milieu gélosé avant solidification. Par contre, les micro-organismes à dénombrer doivent résister à la température de l’agar en surfusion (45-50 °C). Avec cette méthode, les colonies peuvent se développer dans l’ensemble de la boîte et non pas uniquement en surface.

La dilution des échantillons avant ensemencement Quelle que soit la méthode utilisée pour le comptage sur boîte il faut que le nombre de colonies qui se développent sur les boîtes ne soit pas trop élevé. Sur des boîtes trop chargées, certaines cellules peuvent ne pas former de colonies et certaines colonies peuvent fusionner, ce qui amène à des comptages erronés. Il faut également que le nombre de colonies ne soit pas trop faible



146 Chapitre 6


Étalement sur boîte

Colonies en surface

Incubation

L’échantillon, ou sa dilution, est placé à la surface du milieu gélosé (0,1 mL ou moins)

L’inoculum est étalé sur l’ensemble de la surface de la boîte de Petri à l’aide d’un râteau de verre

Résultat type pour les géloses ensemencées par étalement

Ensemencement en masse Incubation

L’échantillon, ou sa dilution, est placé dans la boîte de Petri

Le milieu stérile est additionné et mélangé avec l’inoculum

Colonies dans la gélose

Colonies en surface

Résultat type pour les géloses ensemencées en masse

FIGURE 6.10 Dénombrement des cellules viables. Deux méthodes sont possibles pour les dénombrements en boîte de Petri. Une dilution de l’échantillon est souvent nécessaire. Dans les boîtes de gélose en masse, les colonies se développent à la fois en surface et dans le milieu solide.

afin que le comptage soit significativement représentatif. Dans la pratique, le meilleur résultat est statistiquement obtenu pour des boîtes comprenant entre 30 et 300 colonies. De plus, il convient de déterminer les conditions d’incubation (température, milieu de culture, temps) pour lesquelles le nombre maximal de colonies sera obtenu pour un organisme donné afin d’utiliser systématiquement ces conditions. Afin d’obtenir un nombre de colonies significatif (entre 30 et 300), l’échantillon doit presque systématiquement être dilué. Étant donné que la concentration en cellules viables n’est pas connue par avance, il est nécessaire de réaliser et d’ensemencer plusieurs dilutions, généralement effectuées au dixième (voir figure 6.11). La réalisation de la dilution au dixième (dilution 10-1) peut se faire en mélangeant 0,5 mL de l’échantillon avec 4,5 mL de diluant ou bien 1 mL d’échantillon avec 9 mL de diluant. La réalisation d’une dilution au centième (dilution 10-2) peut se faire en mélangeant 0,05 mL de l’échantillon avec 4,95 mL de diluant ou bien 0,1 mL d’échantillon avec 9,9 mL de diluant. Cette dilution 10-2 peut également être obtenue par deux dilutions successives au dixième. Dans la plupart des cas, des séries de dilutions sont nécessaires pour obtenir la dilution pour laquelle le nombre de colonies sera significatif. Ainsi, si une dilution 10-6 est nécessaire, elle peut être obtenue soit en réalisant trois dilutions successives au centième (10-2), soit par six dilutions successives au dixième (voir figure 6.11).

Les sources d’erreurs lors des comptages sur boîte Le nombre de colonies obtenues lors d’un dénombrement sur boîte dépend non seulement de la taille de l’inoculum et de la viabilité des cellules qui le composent, mais également de

l’adéquation du milieu de culture utilisé et des conditions d’incubation. Le temps d’incubation fait également varier le nombre de colonies. Par exemple, si une culture mixte est utilisée, les cellules déposées dans la boîte de Petri ne vont pas se développer toutes à la même vitesse. Si le temps d’incubation est trop court, le nombre maximal de colonies ne sera pas atteint. De plus, la taille des colonies varie souvent. Les colonies très petites peuvent ne pas être prises en compte lors du comptage. Dans le cas de cultures pures, le développement des colonies est plus synchrone. Les comptages des cellules viables sont exposés à de nombreuses sources d’erreurs du fait des pipetages successifs, du manque d’homogénéité des échantillons ou de la mauvaise homogénéisation notamment. Si des comptages précis veulent être obtenus, il faut accorder une grande attention et entretenir un souci de qualité lors de la préparation des échantillons et du pipetage, et des réplicats des dilutions clés doivent être réalisés. Lors des dénombrements sur boîte, des cellules en agrégats ne formeront au final qu’une seule colonie. Si l’échantillon contient de nombreux agrégats, les comptages seront artificiellement sous-estimés. C’est pour cette raison que les résultats de dénombrements sur boîte sont exprimés en unité formant colonies (UFC) plutôt qu’en nombre de cellules viables (une colonie peut être due à plusieurs cellules présentes au départ). Malgré les limites et difficultés liées à la méthode de comptage des cellules viables, cette technique donne la meilleure information possible sur leur nombre dans un échantillon et est donc largement utilisée dans de nombreux domaines de la microbiologie. C’est notamment le cas en microbiologie alimentaire, médicale ou en écologie microbienne des milieux aquatiques. Cette méthode a l’avantage d’être extrêmement



6.8 Les mesures indirectes de la croissance microbienne : turbidité 147

Échantillon à dénombrer

1 mL

Dilution 1 mL

1 mL

1 mL

1 mL

1 mL

Diluant 9 mL 1/100 1/10 (10–1) (10–2) 1 mL d’inoculum

Trop de colonies

1/103 (10–3)

1/104 (10–4)

1/105 (10–5)

1/106 (10–6)

159 17 2 0 colonies colonies colonies colonies

= 159 x 103 Nombre Facteur de colonies de dilution

1,59 x 105 UFC (unités formant colonies) par mL d’échantillon

FIGURE 6.11 Dénombrement des cellules viables (ensemencement en masse) par la méthode des séries de dilutions de l’échantillon. Le liquide stérile utilisé pour les dilutions peut être de l’eau, néanmoins une solution saline ou issue du milieu de culture peut permettre le dénombrement d’une quantité plus importante de cellules. Le facteur de dilution est l’inverse de la dilution. Dans le cas d’un ensemencement par étalement (voir figure 6.10), la série de dilution doit être adaptée (le volume ensemencé est le plus souvent de 0,1 mL).

sensible étant donné qu’un échantillon ne contenant qu’une seule cellule peut être théoriquement dénombré. Cette caractéristique permet la détection avec un haut niveau de sensibilité de la contamination microbienne dans les produits alimentaires ou autres. Dans ce cadre, l’utilisation de milieux de culture et de conditions d’incubation très sélectifs (voir sections 5.2 et 24.2) permet le dénombrement d’espèces particulières au sein de populations mixtes. Ainsi, l’utilisation de la méthode de dénombrement sur boîte permet, en utilisant des milieux sélectifs, la mise en évidence (aspect qualitatif) et la quantification des contenus microbiens dans un produit alimentaire.

Les biais de la méthode de comptage sur boîte Les comptages sur boîte, bien que très sensibles, sont très discutables lorsqu’il s’agit de dénombrer l’ensemble des cellules contenues dans un échantillon naturel d’eau ou de sol. En effet, les dénombrements directs des cellules totales par microscopie dans des échantillons naturels donnent des résultats largement supérieurs à ceux obtenus par comptage sur

boîte, et ce quel que soit le milieu de culture utilisé (voir sections 18.3 et 18.4). Certains microbiologistes ont parlé de « great plate count anomaly ». La première explication vient du fait que les méthodes directes au microscope prennent également en compte les cellules mortes. De plus, des organismes différents, même dans un échantillon de très petite taille, peuvent avoir des besoins complètement différents quant aux ressources utilisables et aux conditions de culture (voir chapitres 5, 6, 17 à 19). Ainsi, un seul milieu de culture et un seul ensemble de conditions d’incubation ne permettront la croissance que d’une part de la population totale. Si cette part représente par exemple 106 cellules.g–1 sur une population viable totale de 109 cellules.g–1, la technique de comptage sur boîte ne révélera que 0,1 % de la population totale, soit une énorme sous-estimation des cellules viables. L’utilisation de la technique de comptage sur boîte pour le dénombrement de groupes microbiens ciblés et faisant appel à des milieux et des conditions de culture sélectifs donne des résultats fiables (voir sections 28.1, 29.1 et 29.4). Par contre, les comptages totaux sur boîte, utilisant un seul milieu de culture et un seul ensemble de conditions d’incubation, aboutissent le plus souvent à une sous-estimation qui va de un à plusieurs ordres de grandeur.

Contrôlez vos acquis La croissance se mesure par la variation de la concentration en cellules en fonction du temps. Les dénombrements effectués au microscope donnent le nombre total de cellules, alors que les dénombrements des cellules viables par comptage sur boîte ne mesurent que la fraction viable/vivante dans un échantillon. •

Pourquoi le comptage des cellules viables est-il plus sensible que le comptage direct au microscope ?

•

Quel est le postulat de départ pour pouvoir relier les résultats de comptages sur boîte avec un nombre de cellules ?

•

Décrivez comment diluer une culture bactérienne pour obtenir la dilution 10–7.

•

Quel est le principal biais de la méthode de comptage sur boîte ?

mesures indirectes m n6.8 Les de la croissance microbienne : turbidité

Une méthode rapide et utile pour estimer la concentration cellulaire est la mesure de la turbidité. Une suspension cellulaire apparaît trouble à l’œil car les cellules dispersent la lumière qui passe au travers. Plus il y a de cellules, plus la lumière est dispersée, et plus la suspension est trouble. La turbidité peur être mesurée avec un colorimètre ou un spectrophotomètre, appareils qui mesurent la quantité de lumière résiduelle après passage au travers d’une suspension cellulaire



148 Chapitre 6


(voir figure 6.12). La différence essentielle entre les deux appareils vient du fait qu’un colorimètre utilise un seul filtre à bande passante large pour générer la lumière incidente (qui va à l’échantillon), alors qu’un spectrophotomètre utilise un prisme, plus précis, ou une grille de diffraction pour générer cette lumière incidente (voir figure 6.12a). Les longueurs d’onde le plus souvent utilisées pour la mesure de la turbidité bactérienne sont de 540 nm (vert), 600 nm (orange) et 660 nm (rouge). Les deux types d’appareils mesurent la lumière non dispersée. La décroissance de cette lumière, qui résulte de l’augmentation de la concentration en cellules, se mesure en unités Klett (pour le colorimètre de Klett-Summerson) ou en densité optique (DO) pour un spectrophotomètre (voir figure 6.12b).

être utilisées à la place des méthodes de comptage direct. Néanmoins, il est nécessaire de réaliser une courbe d’étalonnage entre des valeurs de comptage direct du nombre de cellules (microscopie, comptage sur boîte) ou de la masse (poids sec) avec les mesures indirectes de turbidité (voir figure 6.12c). Les mesures de turbidité permettront ensuite d’estimer la concentration en cellules ou la masse de ces cellules. Pour des concentrations cellulaires élevées, la lumière déviée une première fois par une cellule (et qui devrait ne pas être prise en compte par la cellule de mesure) peut être à nouveau déviée par une autre cellule (et donc être prise en compte par la cellule de mesure). Ainsi, pour des concentrations en cellules élevées, il n’y a plus de relation linéaire entre concentration cellulaire et turbidité (voir figure 6.12c). Néanmoins, dans le domaine linéaire de la courbe d’étalonnage, les mesures de turbidité fournissent des résultats précis et ont l’avantage d’être rapides et faciles à obtenir.

La réalisation d’une courbe d’étalonnage Pour les micro-organismes unicellulaires, les unités Klett ou la DO sont proportionnelles, jusqu’à un certain point, à la concentration en cellules. Les mesures de turbidité peuvent donc

Lumière incidente (I0)

Filtre ou prisme (540 nm)

Lumière non déviée (I)

Échantillon contenant des cellules ( )

Unités

Spectrophotomètre – Densité optique (DO) I0 = Log I

(a) Organisme A

400

0,8

300

400

0,6 0,4

150

0,3

100

0,2 DO

80 60

Unités Klett

Organisme B

200

Unités Klett

Enregistreur

Cellule photoélectrique (mesure de I)

0,1

40

20

0

5

10

15

20

25

30

0,8

350

0,7

300

0,6

250

Expérimental

0,5

200

0,4

150

0,3

100

0,2

50

0,1

0

35

Théorique

Colorimètre Klett – Unités Klett = DO 0,002

DO

Nombre de cellules ou poids sec

Temps (h) (b)

(c)

FIGURE 6.12 Estimation de la croissance bactérienne par mesure de la turbidité. (a) La mesure de turbidité se réalise à l’aide d’un spectrophotomètre ou colorimètre. La cellule photoélectrique mesure la lumière incidente non déviée, ni absorbée ; le résultat est exprimé en unité DO ou Klett. (b) Courbes de croissance obtenues en unités DO ou Klett pour deux organismes distincts. Dans la pratique, le temps de génération (g) est déterminé par la formule suivante : n = 3,3 (Log N – Log N0). N et N0 sont les valeurs (unités Klett ou DO) obtenues au cours de l’intervalle de temps t. Quel organisme A ou B croît le plus vite ? (c) Relation entre nombre de cellules ou poids sec et mesure de la turbidité. Cette relation n’est linéaire que pour les faibles valeurs de turbidité.



6.9 La culture continue en chémostat 149

Les mesures de turbidité peuvent se faire sans détruire ou perturber l’échantillon. Pour ces raisons, ces mesures sont largement utilisées pour suivre la croissance d’une culture microbienne. Le même échantillon peut être mesuré plusieurs fois et les résultats sont utilisés selon une représentation semilogarithmique en fonction du temps (voir figure 6.12b). Il est alors facile de calculer le temps de génération et les autres paramètres de la croissance.

Milieu neuf (réservoir)

Régulation du débit

Air ou autre gaz stérile

Phase gazeuse Réacteur de culture

Contrôlez vos acquis Les mesures de turbidité constituent une approche indirecte, rapide et facile pour le suivi de la croissance microbienne. Néanmoins, une courbe d’étalonnage entre mesure de turbidité et comptage direct doit être effectuée au préalable. •

Donnez deux avantages à l’utilisation de la turbidité pour la mesure de la croissance microbienne.

•

Décrivez comment vous utiliseriez une mesure de turbidité pour estimer le nombre de colonies attendues avec la méthode de comptage sur boîte ?

m n6.9 La culture continue en chémostat Une culture en milieu clos (batch) est constituée par un volume fixe de milieu de culture qui subit des modifications du fait de l’activité métabolique des organismes en croissance. Lors des premiers stades de la croissance exponentielle en milieu fermé, les conditions du milieu restent relativement favorables, mais en fin de croissance, lorsque le nombre de cellules devient important, de profondes modifications interviennent dans la composition chimique du milieu de culture. De nombreuses études nécessitent de maintenir les cultures dans des conditions constantes, et ce pendant des périodes assez longues. C’est notamment le cas de l’étude de processus physiologiques tels que la synthèse d’enzymes, pour lesquels la possibilité d’obtenir en permanence des cellules en phase exponentielle de croissance est très utile. Ceci n’est possible que dans le cadre d’une culture continue. Une culture continue est un système ouvert, de volume constant, qui reçoit en permanence du milieu neuf, provenant d’un réservoir, alors que le milieu épuisé (qui contient les cellules en croissance) est éliminé à la même vitesse. Si les vitesses de flux de milieu entrant et sortant sont stables, il arrive un moment où le volume du chémostat, la concentration en cellules et la concentration en nutriments restent constants ; le système est dit en état d’équilibre.

Le chémostat Il existe plusieurs types de systèmes de culture continue, dont le plus courant est le chémostat (voir figure 6.13). Il permet de contrôler à la fois le taux de croissance et la densité des populations dans la culture. Deux paramètres sont importants pour permettre ce contrôle : le taux de dilution et la concentration en facteur limitant (source de carbone ou d’azote par exemple).

Culture

Surverse

Effluent contenant des cellules microbiennes FIGURE 6.13 Représentation schématique d’un chémostat. La densité de la population est contrôlée par la concentration en substrat limitant dans le réservoir de milieu neuf, alors que le taux de croissance est contrôlé par le débit de milieu neuf (voir figure 6.15). Ces deux paramètres sont choisis par l’expérimentateur.

Dans une culture en milieu fermé, la concentration en nutriment a une influence sur le taux de croissance et sur la production de biomasse (voir figure 6.14). Pour des concentrations faibles en nutriments, le taux de croissance est réduit, probablement du fait d’une vitesse de transport vers l’intérieur de la cellule trop faible. Pour des concentrations plus fortes en nutriments, le taux de croissance ne varie plus (il est au maximum) alors que la production de biomasse augmente avec la concentration en nutriments (voir figure 6.14). Dans un chémostat, le taux de croissance et la production de biomasse peuvent être contrôlés indépendamment l’un de l’autre, le premier en ajustant le taux de dilution (voir figure 6.15) et le second en ajustant la concentration de nutriments constituant le facteur limitant. Il est possible en chémostat de faire varier le taux de croissance, en changeant le taux de dilution, dans une gamme assez large et sans pour autant que la concentration cellulaire soit modifiée (voir figure 6.15). Si le taux de dilution est trop important, l’organisme ne peut se développer suffisamment vite et la culture est lavée (les cellules sont éliminées par le flux de milieu sortant plus rapidement qu’elles ne sont produites par croissance). Au contraire, pour des taux de dilution très faibles, une part importante des cellules contenues dans le chémostat meurt par manque de nutriment limitant apporté par le flux de milieu entrant en provenance du réservoir. La densité cellulaire dans un chémostat est contrôlée par la concentration en nutriment limitant, de la même façon que la production est contrôlée par la concentration en nutriment en milieu fermé (voir figure 6.14). Si la concentration de ce nutriment limitant dans le milieu neuf entrant est augmentée (par accroissement de la concentration dans le réservoir de milieu



150 Chapitre 6


Le taux et la production varient

Production (

Taux de croissance (

)

)

Seule la production varie

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

–1

Concentration en substrat (mg·mL ) FIGURE 6.14 Impact de la concentration en substrat sur la croissance. Relation entre la concentration en substrat, le taux de croissance (courbe verte) et la production (courbe rouge) dans une culture en milieu clos (batch culture). Pour des concentrations en substrat faible, le taux de croissance et la production varient.

de culture) et que le taux de dilution est maintenu constant, la densité cellulaire augmentera. Ainsi, en ajustant le taux de dilution et la concentration en nutriment limitant, l’expérimentateur pourra obtenir des populations microbiennes de faible (105 cellules.mL–1), moyenne (107 cellules.mL–1) ou forte (109 cellules.mL-1) densité et qui se développent à des taux de croissance faibles, intermédiaires ou élevés.

L’utilisation du chémostat

Zone de travail Concentration bactérienne

5

6

4 3

4 Te m

2 1 0

0

0,25

ps

de

dou b

0,5

2

leme nt

0,75

Taux de dilution (h–1)

1,0

Temps de doublement (h)

Concentration bactérienne à l’équilibre (g·L–1)

Le chémostat permet donc de contrôler le taux de croissance ainsi que la densité cellulaire, indépendamment l’un de

0

Lavage de la culture

FIGURE 6.15 Culture en chémostat et état d’équilibre. Le débit du milieu et le volume de culture déterminent le taux de dilution. Pour une culture de 1 000 mL et un débit de 500 mL/h –1, le taux de dilution sera de 0,5 h–1. Pour des taux de dilution élevés, la croissance ne peut contrebalancer la dilution et les populations sont éluées (lavage de la culture). La zone de travail permet, pour des concentrations bactériennes stables, de faire varier le taux de croissance (ou le temps de doublement) selon une large gamme de valeurs.

l’autre, ce que ne permettent pas les cultures en milieu fermé, où les conditions varient en fonction de la croissance. L’un des avantages du chémostat est la possibilité de maintenir des cellules en phase exponentielle de croissance, et ce pendant un temps assez long. La possibilité d’obtenir à tout moment des cellules en phase exponentielle de croissance est intéressante pour les études sur la physiologie d’une population. Cela permet notamment de planifier les expérimentations qui ne dépendent pas de la croissance plus ou moins rapide d’une culture en milieu fermé. C’est aussi la possibilité de répéter les expériences en disposant de matériel biologique (la population cellulaire) dans un état physiologique toujours identique. Enfin, l’étude de certains processus enzymatiques doit se réaliser sur des cultures en phase exponentielle, car l’activité étudiée peut varier selon la phase de croissance. Le chémostat peut également être utilisé en écologie microbienne, permettant notamment de réaliser des cultures à des concentrations en substrat limitant très faibles, ce qui est le cas en milieu naturel. Il est possible de réaliser des cultures mixtes afin d’étudier les phénomènes de compétition entre populations, et ce pour différentes concentrations en substrat. Grâce à l’utilisation des méthodes de cultures et des méthodes de pointe de l’écologie microbienne telles que les colorations spécifiques d’un groupe microbien ou la mise en évidence de gènes particuliers (voir chapitre 18), il est possible de suivre les modifications de structure au sein d’une communauté microbienne sélectionnée dans un chémostat. De telles expériences révèlent souvent des interactions entre populations microbiennes qui ne sont pas mises en évidence par les techniques de culture en milieu fermé. Les systèmes de culture en chémostat ont également été utilisés pour l’enrichissement et l’isolement de bactéries (voir sections 1.7, 18.1 et 18.2). À partir d’un inoculum complexe il est possible de sélectionner une communauté stable en fonction de la concentration en nutriment et du taux de dilution. L’augmentation progressive du taux de dilution permettra alors de sélectionner un seul type d’organisme, le plus compétitif dans ces conditions. C’est ainsi qu’un organisme ayant un temps de génération de six minutes (le plus court jamais obtenu) a pu être isolé.

Contrôlez vos acquis Les systèmes de culture continue constituent un moyen pour maintenir des populations cellulaires en phase exponentielle de croissance pendant de longues périodes. Dans un chémostat, le taux de dilution de la culture détermine le taux de croissance, alors que la densité de la population est déterminée par la concentration en nutriment limitant qui est amené dans la culture. •

Dans quelle mesure les micro-organismes dans un chémostat diffèrent-ils de ceux dans une culture en milieu fermé ?

•

Que se passe-t-il dans un chémostat si le taux de dilution est supérieur au taux de croissance maximal de la population ?

•

Des cultures pures peuvent-elles être cultivées dans un chémostat ?



6.10 L’impact de la température sur la croissance 151

IMPACT DE L’ENVIRONNEMENT SUR LA CROISSANCE MICROBIENNE : LA TEMPÉRATURE

L’activité des micro-organismes et donc leur croissance varient selon les conditions physiques et chimiques de l’environnement. La connaissance de l’impact de cet environnement permet à la fois de mieux comprendre leur distribution dans la nature et de concevoir des méthodes pour contrôler ou favoriser les activités microbiennes. De nombreux facteurs de l’environnement peuvent être pris en compte. Néanmoins, quatre facteurs clés remplissent une fonction majeure dans le contrôle de la croissance de l’ensemble des micro-organismes : la température, le pH, l’eau et l’oxygène. D’autres facteurs, tels que la pression ou les radiations, peuvent également influer sur la croissance des micro-organismes. Leur influence sera discutée plus loin dans ce livre, lors de la description d’habitats où ils jouent un rôle important.

6.10 L’impact de la température m n sur la croissance La température est l’un des paramètres de l’environnement les plus importants, si ce n’est le plus important, vis-à-vis de l’impact sur la croissance et la survie des micro-organismes. Si elle est trop basse ou trop élevée, les micro-organismes ne se développeront pas. Néanmoins, selon les micro-organismes et leur habitat d’origine, ces températures minimales et maximales varient énormément.

Les températures cardinales La température influe sur les organismes vivants de deux manières. Lors d’une augmentation de la température les réactions chimiques et enzymatiques dans la cellule sont plus rapides et le taux de croissance augmente. Néanmoins, au-delà d’une température donnée, certaines protéines peuvent être dénaturées. Ainsi, lorsque la température s’accroît selon une certaine gamme de valeur, la croissance et les fonctions métaboliques augmentent, et ce jusqu’à un certain point où la dénaturation intervient et les fonctions cellulaires chutent brutalement. Pour chaque organisme, il existe une température minimale au-dessous de laquelle il n’y a pas de croissance, une température optimale où la croissance est la plus rapide, et une température maximale au-dessus de laquelle la croissance n’est plus possible (voir figure 6.16). L’optimum de température est toujours plus proche du maximum que du minimum. Ces trois températures, appelées températures cardinales, sont caractéristiques de chaque organisme et peuvent être légèrement modifiées en fonction d’autres paramètres de l’environnement, notamment la composition du milieu de culture. Les températures cardinales des micro-organismes varient largement ; l’optimum de température pouvant aller de 4 °C à plus de 100 °C. La gamme de température pour laquelle la croissance est possible est encore plus large, depuis des températures inférieures au point de congélation jusqu’à des

Réactions enzymatiques à leur vitesse maximale Taux de croissance

IV

La vitesse des réactions enzymatiques augmente

Minimal

Optimal

Maximal Température

Processus de transport intermembranaires trop lents pour la croissance, la membrane se gélifie

Dénaturation des protéines, affaissement de la membrane cytoplasmique, lyse thermique

FIGURE 6.16 Effet de la température sur le taux de croissance et conséquences au niveau moléculaire pour la cellule. Les trois températures cardinales varient selon l’organisme.

températures au-delà du point d’ébullition. Néanmoins, un seul organisme ne peut vivre sur l’ensemble de cette gamme de température, la gamme pour un seul organisme variant de 30 à 40 °C. La température maximale de croissance pour un organisme est la conséquence de la dénaturation d’une ou plusieurs protéines essentielles. Les facteurs contrôlant la température minimale de croissance sont moins bien définis. La membrane cytoplasmique doit être fluide pour fonctionner correctement (voir section 4.5). La température minimale de croissance d’un organisme peut être le résultat du raidissement de la membrane cytoplasmique, qui ne fonctionnera plus correctement pour assurer notamment le transport des nutriments ou la mise en place d’une force proton-motrice. Cette explication est corroborée par des expériences où la température minimale de croissance d’un organisme peut être légèrement modifiée selon la composition en lipides membranaires (voir section 6.11). Les températures maximales et minimales de croissance d’un organisme peuvent ainsi être augmentées ou diminuées selon le cas, lorsqu’elles sont testées dans un milieu de culture complexe.

Le classement des organismes selon la température Parmi l’ensemble des organismes, l’optimum de croissance balaie une gamme de température allant des plus basses aux plus élevées. Néanmoins, il est possible de distinguer quatre grands groupes de micro-organismes par rapport à leur relation à la température optimale de croissance : les psychrophiles (température optimale basse), les mésophiles (température optimale moyenne), les thermophiles (température optimale élevée) et les hyperthermophiles (température optimale très élevée) [voir figure 6.17]. Les mésophiles se retrouvent chez les animaux à sang chaud ainsi que dans les environnements terrestres ou aquatiques des



152 Chapitre 6


Thermophile

Taux de croissance

Mésophile

Exemple : Bacillus stearothermophilus 60˚

Exemple : Escherichia coli

Hyperthermophile Hyperthermophile Exemple : Thermococcus celer

Exemple : Pyrolobus fumarii 106˚

88˚

39˚

Psychrophile

Exemple : Polaromonas vacuolata 4˚

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

110

120

Température (°C) FIGURE 6.17 Relation vis-à-vis de la température d’organismes psychrophiles, mésophiles, thermophiles et de différents hyperthermophiles. Les températures optimales des différents organismes cités en exemple sont indiquées sur les courbes. Les hyperthermophiles ont des températures optimales supérieures à 80 °C.

latitudes tempérées à tropicales. Les psychrophiles et les thermophiles colonisent des environnements exceptionnellement froids ou chauds selon le cas. Les hyperthermophiles se retrouvent dans des environnements extrêmement chauds tels que les sources géothermales, les geysers ou au niveau des sources hydrothermales océaniques profondes (voir sections 6.12, 13.8 et 19.8). En ce qui concerne Escherichia coli, organisme mésophile, des études de croissance en fonction de la température ont permis de déterminer avec précision ses températures cardinales. L’optimum de température d’E. coli en milieu complexe est de 39 °C (voir section 5.2), la température maximale est de 48 °C et la minimale de 8 °C. Ainsi la gamme de température pour le développement d’E. coli est de 40 °C, proche du maximum pour un procaryote.

Contrôlez vos acquis La température est un des paramètres de l’environnement majeur pour le contrôle de la croissance microbienne. Les températures cardinales correspondent aux minimum, optimum et maximum de température pour la croissance d’un organisme. Les micro-organismes peuvent être classés en fonction de la gamme de température permettant leur croissance. •

Quelles sont les températures cardinales pour Escherichia coli ? À quelle classe d’organismes appartient-elle en regard de la température ?

•

Quelles sont les différences entre psychrophile et hyperthermophile ?

•

Escherichia coli peut se développer à une température plus élevée dans un milieu complexe par rapport à un milieu minimum. Pourquoi ?

6.11 La croissance microbienne m n à basse température Les habitats humains à la surface de la planète sont répartis dans des zones où les températures sont tempérées. C’est pourquoi les environnements très chauds ou très froids sont considérés comme extrêmes, la vie humaine n’étant pas possible dans de l’eau bouillante ou de la glace. Néanmoins, ces environnements constituent l’habitat de nombreux micro-organismes, considérés comme extrémophiles (voir section 2.4 et tableau 2.1), qui se sont adaptés pour se développer de façon optimale dans ces conditions.

Les environnements froids Une large part de la surface de la planète se caractérise par des températures basses. Ainsi les mers et les océans, qui constituent 70 % de la surface de la planète, ont une température moyenne de 5 °C, et les zones profondes de ces masses d’eau présentent des températures constantes de l’ordre de 1 °C à 3 °C. De vastes zones arctiques et antarctiques sont soit gelées en permanence, soit dégelées durant quelques semaines tout au plus en été (voir figure 6.18). Ces environnements froids ne sont pas pour autant stériles, et certains micro-organismes se développent à des températures froides pourvu que de l’eau sous forme liquide soit encore présente. Même dans le cas d’environnements gelés, les micro-organismes peuvent être actifs au niveau de poches d’eau liquide. Ainsi, au sein des glaciers, il existe des réseaux de petits chenaux d’eau liquide dans lesquels les micro-organismes se développent. Parmi les environnements froids, il convient de distinguer ceux qui sont froids en permanence de ceux qui le sont uniquement en période hivernale. Dans ce dernier cas, caractéristique de zones au climat continental tempéré, les températures peuvent atteindre + 40 °C en été et – 20 °C ou moins en hiver. Certains lacs en zone tempérée, par exemple, sont recouverts



John Gosink et James T. Staley

Deborah Jung et Michael T. Madigan

6.11 La croissance microbienne à basse température 153

(c)

John Gosink et James T. Staley

(a)

(b)

FIGURE 6.18 Habitats microbiens en Antarctique. (a) Carotte d’eau de mer en permanence congelée dans le détroit de McMurdo, Antarctique. La carotte mesure 8 cm de large. La coloration dense est due à la présence de micro-organismes pigmentés. (b) Observation au microscope à contraste de phase des organismes photosynthétiques contenus dans la carotte. Ces organismes sont pour la plupart des diatomées et des algues vertes (micro-organismes eucaryotes, voir section 14.13). (c) Photo de la surface du lac Bonney, dans la vallée aride de McMurdo, Antarctique. Comme souvent en Antarctique, le lac Bonney, d’une profondeur de 40 m, reste gelé toute l’année sur une épaisseur de 5 m environ. La colonne d’eau, caractérisée par des zones oxiques et anoxiques (voir section 19.5 et figure 19.9), est à une température voisine de 0 ˚C. Des micro-organismes aérobies et anaérobies colonisent cet environnement. Aucun organisme eucaryote n’est présent dans les lacs de ces vallées arides, ce qui en fait des écosystèmes uniques.

de glace en hiver, la période pendant laquelle la température est proche de 0 °C étant néanmoins assez courte. Ces environnements, où l’amplitude de variation des températures est grande, sont moins favorables au développement d’organismes psychrophiles que ceux qui sont froids en permanence, tels que les zones polaires, les zones d’altitude ou le fond des océans. Ainsi, les lacs d’eau douce des vallées antarctiques arides sont en permanence recouverts d’une couche de glace de plusieurs mètres d’épaisseur (voir figure 6.18c). La température au sein de la colonne d’eau dans ces lacs se maintient aux alentours de 0 °C pendant toute l’année, ce qui en fait un habitat idéal pour les organismes adaptés au froid.

Les micro-organismes psychrophiles et psychrotolérants Un organisme psychrophile présente une température optimale de 15 °C ou moins, une température maximale inférieure à 20 °C et une température minimale de 0 °C ou moins. Un organisme pouvant se développer à une température de 0 °C mais dont l’optimale se situe entre 20 °C et 40 °C est appelé psychrotolérant. Les psychrophiles sont localisés dans les environnements en permanence froids, tels que les régions polaires, et peuvent être tués à des températures modérées. C’est pourquoi leur étude en laboratoire nécessite des précautions pour éviter une augmentation de température au cours des prélèvements, du

transport jusqu’au laboratoire et de leur manipulation (isolement, caractérisation). Les organismes psychrophiles les mieux connus sont les algues se développant en masse sur et dans la glace dans les régions polaires ou au niveau d’autres glaciers permanents (voir figure 6.18). Ces algues psychrophiles sont souvent présentes à la surface de champs de neige et de glaciers où leur développement massif se visualise par une coloration rouge ou verte (voir figure 6.19a). L’algue de neige la plus commune est Chlamydomonas nivalis, dont les spores sont responsables d’une coloration rouge (voir figure 6.19b). Cette algue verte se développe dans la glace sous la forme de cellules végétatives vertes et produit des spores. Au fur et à mesure que la glace et la neige disparaissent par fusion, vaporisation ou érosion, les spores se concentrent à la surface. C’est pourquoi les algues de neige sont couramment observées au niveau de champs de neige lors de la fonte durant l’été, et notamment dans des zones ensoleillées et sèches. De nombreux autres micro-organismes chimio-organotrophes psychrophiles sont connus, notamment en Antarctique (voir figure 6.18). Certains, isolés notamment de glaces marines temporaires, ont les températures maximales de croissance les plus faibles connues à ce jour. Les organismes psychrotolérants sont beaucoup plus largement répandus que les psychrophiles et peuvent être isolés de sols ou d’eaux en milieu tempéré, mais également de produits



154 Chapitre 6


tels que la viande, le lait et certains de ses dérivés, du cidre, des légumes et des fruits stockés en chambre froide (4 °C). Ces organismes psychrotolérants ont un optimum de croissance compris entre 20 et 40 °C. Les milieux tempérés dont la température augmente en période estivale ne permettent pas la croissance des psychrophiles, sensibles à la chaleur. Néanmoins la croissance de la plupart des organismes psychrotolérants à des températures proches de 0 °C est le plus souvent extrêmement lente et il faut attendre plusieurs semaines avant de pouvoir la détecter dans un milieu de culture. De nombreux genres de bactéries, champignons, algues et protozoaires sont des psychrotolérants.

Katherine M. Brock

Les adaptations moléculaires à la psychrophilie

T. D. Brock

(a)

(b) FIGURE 6.19 Les algues de neige. (a) Congère de neige dans la Sierra Nevada, Californie (États-Unis), dont la coloration rouge est due à la présence d’algues eucaryotes (voir section 14.13). De tels développements d’algues, en été, sur des congères de neige à haute altitude, sont très répandus dans le monde. (b) Observation au microscope des spores rouges de l’algue de neige Chlamydomonas nivalis. Les spores germent pour donner des cellules d’algues vertes mobiles. Les différentes espèces d’algues de neige contiennent divers types de pigments caroténoïdes (voir section 17.3). Les champs de neige colonisés par ces algues peuvent ainsi apparaître de couleur verte, orange, brune ou pourpre.

Les psychrophiles produisent des enzymes dont le fonctionnement est optimal à basse température et qui sont souvent dénaturées ou inactives à des températures plus élevées, mêmes modérées. Les bases moléculaires n’en sont pas totalement expliquées mais, au niveau de leur structure secondaire, ces enzymes contiennent une proportion plus importante d’hélices et moins de feuillets (voir section 3.7 et figure 3.16) par rapport à des enzymes inactives à basse température. Les feuillets tendant à former une structure plus rigide, la proportion plus élevée d’hélices dans les enzymes adaptées à un fonctionnement en milieu froid permet plus de flexibilité dans ces conditions. Ces mêmes enzymes contiennent également plus d’acides aminés polaires et moins d’acides aminés hydrophobes que leurs correspondantes mésophiles ou thermophiles. Ceci participe également à la flexibilité de ces enzymes (et donc à leur activité) aux basses températures. Enfin, les protéines des organismes adaptés au froid présentent moins de liaisons faibles (voir section 3.1) et moins d’interactions entre leurs différents domaines par rapport aux protéines des organismes se développant à des températures plus élevées. Ces modifications favorisent probablement leur flexibilité. Une autre des caractéristiques chez les psychrophiles concerne les processus de transport (voir section 4.7) qui fonctionnent mieux à basse température. Ceci indique que la structure des membranes cytoplasmiques des psychrophiles est adaptée à un fonctionnement à basse température. Ces membranes contiennent plus d’acides gras insaturés (voir section 5.17), ce qui favorise leur fluidité en milieu froid (les membranes contenant plus d’acides gras saturés deviennent cireuses et non fonctionnelles à basse température). Les lipides de certains psychrophiles contiennent également des acides gras polyinsaturés et de longues chaînes hydrocarbonées contenant de nombreuses doubles liaisons. Ainsi, un hydrocarbure contenant neuf doubles liaisons (C31:9) a pu être identifié parmi les lipides de bactéries de l’Antarctique et la bactérie du genre Psychroflexus contient des acides gras avec quatre à cinq doubles liaisons. Ces acides gras sont plus fluides à des températures basses que les acides gras saturés ou mono-insaturés.

La congélation Bien que certains organismes puissent se développer à des températures très basses, il existe une limite au-dessous de



6.12 La croissance microbienne à haute température 155

laquelle la vie n’est plus possible. L’eau pure gèle à 0 °C et l’eau de mer à – 2,5 °C, néanmoins de microscopiques poches d’eau liquide sont encore présentes à ces températures, voire à des températures bien plus basses. Tant que de l’eau sous la forme liquide est présente, la vie est possible. Le gel empêche la croissance microbienne mais ne provoque pas forcément la mort. Le milieu dans lequel se trouvent les cellules influe énormément sur leur sensibilité au gel. Certains liquides miscibles à l’eau, tels que le glycérol ou le diméthylsulfoxyde (DMSO), à une concentration de 10 % au final, ont la particularité de pénétrer dans les cellules et de les protéger du gel en réduisant le phénomène de déshydratation ainsi que la formation de cristaux de glace. De fait, l’utilisation de ces produits appelés cryoprotecteurs, constitue l’un des modes de préservation des cultures microbiennes à très basse température (entre – 70 °C et – 196 °C). Des cellules de micro-organismes correctement congelées restent viables durant de très longues périodes (plusieurs dizaines d’années).

Contrôlez vos acquis Les organismes dont l’optimum de croissance se situe à des températures froides sont appelés psychrophiles. Leurs représentants les plus extrêmes colonisent les habitats en permanence froids. Les psychrophiles ont développé des biomolécules qui fonctionnent à basse température mais sont très sensibles à des températures plus élevées. •

Dans quelle mesure les organismes psychrotolérants sont-ils différents des organismes psychrophiles ?

•

Quelles sont les adaptations moléculaires au niveau des membranes cytoplasmiques des psychrophiles et pourquoi sont-elles nécessaires ?

6.12 La croissance microbienne m n à haute température La vie microbienne est très abondante dans des environnements ou la température est élevée, y compris dans l’eau bouillante. Au-delà de 65 °C environ, où seule la vie procaryote existe, il existe une grande diversité de Bacteria et d’Archaea.

Les environnements chauds Les organismes dont la température optimale de croissance se situe au-delà de 45 °C sont des thermophiles alors que ceux dont la température optimale de croissance est au-delà de 80 °C sont des hyperthermophiles (voir figure 6.17). De telles températures ne se trouvent que dans quelques environnements. Ainsi, un sol exposé au soleil peut atteindre en surface une température de 50 °C à midi et dans certains cas de 70 °C, alors qu’à quelques centimètres de profondeur la température est bien moindre. Les produits sujets à fermentation tels qu’un tas de compost ou des produits d’ensilage peuvent atteindre des températures de 70 °C. Néanmoins, les habitats à haute température les plus abondants naturellement sont ceux liés à une activité volcanique, dont font partie les sources chaudes.

De nombreuses sources chaudes ont des températures proches du point d’ébullition et des jets de vapeurs (fumerolles) peuvent atteindre des températures de 150 à 500 °C. Les cheminées hydrothermales présentes dans le fond des océans ont ainsi des températures pouvant aller jusqu’à 350 °C (voir section 19.8). Les sources chaudes sont distribuées sur l’ensemble de la planète, mais sont notamment concentrées dans l’ouest des États-Unis, la Nouvelle-Zélande, l’Islande, le Japon, l’Italie, l’Indonésie, l’Amérique centrale et l’Afrique centrale. La zone du globe connaissant la plus grande concentration de sources chaudes est constituée par le parc national de Yellowstone aux États-Unis (Wyoming). Certaines sources chaudes présentent des variations de températures, alors que d’autres sont très stables, avec des écarts de 1 ou 2 °C au maximum, sur plusieurs années. De plus, des sources différentes peuvent avoir des compositions chimiques et des pH très variés. Quelle que soit leur composition, ces sources contiennent généralement suffisamment d’éléments nutritifs pour permettre le développement de populations, souvent abondantes, de chimio-organotrophes et chimiolithotrophes hyperthermophiles.

Les hyperthermophiles des sources chaudes Beaucoup de sources chaudes jaillissent au point d’ébullition de l’eau, qui varie selon l’altitude du site (92 ou 93 °C à Yellowstone, 99 ou 100 °C au niveau de la mer). En ce qui concerne ces sources chaudes bouillantes (voir figure 6.20), la croissance des hyperthermophiles peut être étudiée en immergeant des lames de microscope dans les sources et en les récupérant après quelques jours. L’observation microscopique de ces lames révèle systématiquement la présence de colonies de procaryotes (voir figure 6.20b), dues à des cellules qui ont adhéré à ces lames et se sont développées dessus. De nombreuses études écologiques sur les organismes vivant dans des sources bouillantes ont démontré que les taux de croissance étaient assez élevés, avec la mise en évidence de temps de division de l’ordre de une heure et même moins. Des cultures de plusieurs de ces procaryotes ont pu être obtenues et ont montré une grande diversité de formes et de physiologies (voir chapitre 13). Des études phylogénétiques fondées sur le séquençage du gène des ARN ribosomiques (voir sections 2.3, 11.5 et 11.6) ont montré de grandes différences entre ces hyperthermophiles. Des espèces parmi les Bacteria et les Archaea sont présentes. Certaines, parmi les Archaea hyperthermophiles, ont un optimum de température au-delà de 100 °C et doivent être cultivées sous pression afin d’atteindre des températures dépassant le point d’ébullition.

Les thermophiles De nombreux thermophiles (optimum de 45 à 80 °C) sont présents dans les sources thermales comme dans d’autres environnements chauds. Au niveau des sources thermales, l’eau bouillante jaillit de la source, coule depuis celle-ci et se refroidit graduellement, établissant un gradient thermique. De nombreux micro-organismes se développent en fonction de ce gradient (voir figure 6.21), selon leur température optimale. L’étude de la distribution de ces espèces le long de ce gradient thermique dans des sources chaudes et d’autres habitats chauds dont la température était différente a permis d’établir les températures supérieures limites pour les différents types




T. D. Brock

156 Chapitre 6

T. D. Brock

Nancy L. Spear

(a)

(b) FIGURE 6.20 Hyperthermophiles dans une eau bouillante. (a) La source chaude de Boulder Spring se situe dans le parc national de Yellowstone (États-Unis). La température est de 1 à 2 °C supérieure à la température d’ébullition. Les dépôts minéraux autour de la source sont majoritairement constitués de soufre et de silice. (b) Observation au microscope d’une microcolonie d’organismes procaryotes qui se sont développés sur une lame de verre immergée dans une source bouillante, comme celle présentée en (a).

de micro-organismes (voir tableau 6.1). On peut en conclure que : 1) les organismes procaryotes sont capables de croissance à des températures plus élevées que les eucaryotes ; 2) les plus thermophiles parmi les procaryotes sont des Archaea ; 3) les organismes non phototrophes sont capables de croissance à des températures plus élevées que les phototrophes. Les procaryotes thermophiles sont également présents dans des habitats artificiels. Les chauffages domestiques ou industriels ont une température comprise entre 55 et 80 °C et constituent un habitat favorable pour les procaryotes thermophiles. Des organismes proches de Thermus aquaticus (voir section 12.34) ont été isolés de chauffage d’eau. Les centrales électriques, les eaux industrielles chaudes ou des sources d’eau chaude artificielles sont autant d’habitats où les thermophiles peuvent se développer. La plupart de ces micro-organismes peuvent être isolés à condition d’utiliser les milieux de culture appropriés.

Les adaptations moléculaires à la thermophilie Les enzymes et autres protéines des thermophiles et hyperthermophiles sont plus stables à la chaleur que celles des

FIGURE 6.21 Cyanobactéries thermophiles d’une source chaude dans le parc national de Yellowstone. Motif en V formé par des cyanobactéries vivant à la limite supérieure de température pour la vie phototrophe, 70-74 °C, dans le gradient thermique formé par une source chaude bouillante. Ce motif se développe car la température chute plus vite sur les côtés qu’au centre du chenal. La source coule depuis l’arrièreplan de la photo vers le premier plan. La coloration vert clair est due à une cyanobactérie thermophile du genre Synechococcus. Lorsque l’eau thermale s’écoule, il se forme un gradient de température ; moins de cellules thermophiles sont présentes, la densité de cellules augmente, ce qui donne une coloration verte plus intense.

mésophiles et leur fonctionnement est optimal à des températures élevées. L’étude de plusieurs enzymes thermostables a montré peu de différences en termes de composition en acides aminés par rapport aux enzymes sensibles à la chaleur retrouvées chez les mésophiles. Des changements très ciblés en acides aminés permettent aux enzymes thermostables de se replier de manière à présenter une plus grande stabilité à la chaleur. La stabilité à la chaleur est également le fait d’une augmentation du nombre de liaisons ioniques entre acides aminés chargés positivement et négativement, ainsi que le fait des propriétés hydrophobes fortes à l’intérieur de ces protéines, qui évitent le dépliement dans le milieu aqueux cytoplasmique. Enfin, certaines molécules telles que le di-inositol phosphate, le di-glycérol phosphate et le mannosyl-glycérate, produites en grande quantité dans le cytoplasme de certains hyperthermophiles, pourraient participer à la stabilité à la chaleur des protéines. Les membranes cytoplasmiques doivent également résister à la chaleur chez les hyperthermophiles. Chez les psychrophiles la proportion d’acides gras insaturés est forte (voir section 6.11), ce qui augmente la fluidité de ces membranes. Au contraire, les lipides des thermophiles sont plus riches en acides gras saturés, ce qui permet aux membranes de rester stables et fonctionnelles à température élevée. Ces acides gras



6.13 La croissance microbienne à pH acide ou alcalin 157

TABLEAU 6.1

TEMPÉRATURES MAXIMALES CONNUES POUR LA CROISSANCE DES ORGANISMES VIVANTS

Groupe

Limite supérieure de température (˚C)

Animaux Poissons et autres vertébrés aquatiques

38

Insectes

45–50

Ostracodes (crustacés)

49–50

Plantes Plantes vasculaires

45

Mousses

50

Micro-organismes eucaryotes Protozoaires

56

Algues

55–60

Champignons

60–62

Procaryotes Bacteria Cyanobactéries

70–74

Phototrophes anoxygéniques

70–73

Chimio-organotrophes, chimiolithotrophes

95

plus efficaces à température élevée. Les enzymes de ces organismes sont justement capables de catalyser certaines réactions à haute température (voir section 30.9 et figure 30.15b) et sont plus stables que les enzymes des mésophiles, ce qui autorise des durées de vie plus longues des préparations enzymatiques. Le meilleur exemple est fourni par l’ADN polymérase de Thermus aquaticus. La Taq polymerase a été utilisée pour automatiser les différentes étapes de la technique de la PCR (réaction de polymérisation en chaîne, en anglais polymerase chain reaction), technique importante pour amplifier des fragments d’ADN (voir section 7.9). D’autres applications industrielles utilisent ou développent l’utilisation d’enzymes ou d’autres produits cellulaires thermostables.

Contrôlez vos acquis Les organismes dont l’optimum de croissance se situe à des températures comprises entre 45 et 80 °C sont des thermophiles, alors que ceux dont cet optimum se situe au-delà de 80 °C sont des hyperthermophiles. Ces organismes colonisent des habitats chauds, y compris des eaux de sources thermales bouillantes ou des sources hydrothermales profondes dans les océans, dont les températures peuvent dépasser 100 °C. Thermophiles et hyperthermophiles produisent des macromolécules thermostables. •

Quelle est la température maximale de croissance pour un procaryote ? Cet organisme fait-il partie des Archaea ou des Bacteria ?

•

Quelle est la structure des membranes des Archaea hyperthermophiles et dans quelle mesure cette structure permet-elle la croissance à température élevée ?

•

Qu’est-ce que la Taq Polymerase et pourquoi a-telle été utilisée ?

Archaea Chimio-organotrophes, Chimiolithotrophes

113a

a

Température limite supérieure pour la croissance de Pyrolobus fumarii. D’autres espèces, dans le genre Pyrodictium, peuvent croître à des températures allant jusqu’à 121 ˚C.

saturés forment un milieu plus hydrophobe que les acides gras insaturés, ce qui favorise la stabilité des membranes à haute température. Les hyperthermophiles, parmi lesquels se trouvent beaucoup d’Archaea, ne contiennent pas tous des acides gras au niveau de leurs membranes, mais plutôt des hydrocarbures en C40, composés d’unités répétées d’isoprène en C5 (voir figure 4.19c), reliées entre elles par des liaisons éther avec du glycérol phosphate. De plus, la structure de ces membranes forme une monocouche lipidique (voir figure 4.19d), structure qui est beaucoup plus stable à la chaleur que la bicouche lipidique des Bacteria et des Eukarya. La structure des membranes des Archaea hyperthermophiles (voir section 4.5) et d’autres aspects de la stabilité à la chaleur, notamment de l’ADN, sont présentés ailleurs (voir section 13.12).

V

IMPACT DE L’ENVIRONNEMENT SUR LA CROISSANCE MICROBIENNE : pH, PRESSION OSMOTIQUE ET OXYGÈNE

Si la température a une influence majeure sur la croissance microbienne, d’autres facteurs tels que le pH, la pression osmotique ou l’oxygène jouent un rôle important. Comme dans le cas de la température, les organismes ont des optima de croissance différents en fonction de ces facteurs de l’environnement.

La thermophilie et les biotechnologies

6.13 La croissance microbienne à pH m n acide ou alcalin

Les organismes thermophiles et hyperthermophiles sont intéressants bien au-delà de l’aspect biologique. Ces organismes présentent des avantages pour les procédés industriels et biotechnologiques qui, bien souvent, se réalisent plus vite et sont

L’acidité ou l’alcalinité d’une solution est exprimée par son pH, neutre s’il est égal à 7 (voir figure 6.22). Des valeurs de pH inférieures à 7 caractérisent des milieux acides et des valeurs supérieures, des milieux alcalins (ou basiques).



158 Chapitre 6


pH

Exemple

0

Acidophile

10–1

10–13

10–2

10–12

10–3

10–11

10–4

10–10

10–5

10–9

10–6

10–8

8

Eau de mer

10–8

10–6

9

Sol naturel très alcalin

10–9

10–5

3 4 5 6

Alcalinophile

10–14

7

2

Neutralité

1 Sol volcanique, eau Fluide gastrique Jus de citron Drainage acide de mine Vinaigre Rhubarbe Pêche Sol acide Tomate Fromage américain Chou Petit pois Maïs, saumon, crevette Eau pure

1

Acidité croissante

Moles par litre de H+ OH–

10– 7 10–7

13

10–10 Lac alcalin Solution de savon –11 Ammoniaque domestique 10 Lac hyperalcalin sodique 10–12 Chaux (solution saturée) 10–13

14

10–14

10 Alcalinité croissante 11 12

10–4 10–3 10–2 10–1 1

FIGURE 6.22 Échelle de pH. Bien que certains microorganismes vivent à des pH très faibles ou très élevés, le pH interne des cellules est proche de la neutralité.

L’échelle de pH est logarithmique ; une variation d’une unité pH représente un changement d’un facteur 10 de la concentration en ions H+. Ainsi, le vinaigre (pH proche de 2) est un milliard de fois plus concentré en ions H+ que l’ammoniac domestique (pH proche de 11).

Le pH et la croissance Chaque organisme présente une gamme de pH où la croissance est possible et un optimum bien défini. La gamme de pH s’étend le plus souvent sur deux ou trois unités pH. La plupart des habitats naturels ont des pH compris entre 5 et 9 et de très nombreux organismes ont des optima compris dans cette gamme. Au contraire, les organismes qui peuvent se développer à des pH inférieurs à 2 ou supérieurs à 9 sont plus rares. Les organismes dont la croissance est meilleure pour des pH bas sont appelés acidophiles. Les champignons sont souvent plus tolérants à l’acide que les bactéries. De nombreux champignons ont un optimum de pH vers 5 ou moins, et certains se développent très bien à pH 2. De nombreuses bactéries sont également acidophiles, voire acidophiles obligatoires, incapables de se développer à des pH neutres. Parmi ces bactéries, se trouvent des représentants du genre Acidithiobacillus (voir section 12.4) ainsi que des Archaea des genres Sulfolobus, Thermoplasma et Ferroplasma (voir sections 13.5 et 13.9). L’un des facteurs clés de l’acidophilie concerne la stabilité des membranes cytoplasmiques. Lorsque le pH augmente et atteint la neutralité, les membranes cytoplasmiques des acidophiles se détruisent et il y a lyse cellulaire. Ceci indique qu’une concentration importante en ions H+ est nécessaire pour le maintien de la stabilité des membranes. Le plus acidophile des procaryotes

connus, Picrophilus oshimae, qui colonise des sols chauds acides liés à l’activité volcanique (voir section 13.5), a un pH optimal de 0,7 et ses cellules se lysent à des pH supérieurs à 4. Quelques extrémophiles ont un optimum de pH très élevé, proche de pH 10, et sont appelés alcaliphiles. Ces organismes colonisent des lacs hyperalcalins sodiques ou des sols riches en carbonate. Les plus étudiés et les plus connus parmi ces organismes sont des espèces de Bacillus telles que B. firmus. Cet organisme est un alcaliphile, mais il se développe sur une large gamme de pH allant de pH 7,5 à 11. Certains alcaliphiles extrêmes sont également des halophiles (qui aiment le sel) et la plupart sont des Archaea (voir section 13.3). L’étude de certains alcaliphiles a débouché sur des activités industrielles car ces organismes sont capables de produire des enzymes (protéases, lipases) qui fonctionnent à des pH élevés et sont donc utilisables dans les détergents domestiques (voir section 30.9). Les alcaliphiles sont également intéressants pour des problèmes de bioénergétique que pose la vie dans un milieu ou le pH est élevé. Comment se met en place une force proton-motrice (voir section 5.12) lorsque la surface externe de la membrane cytoplasmique est à ce point basique ? Des études chez B. firmus ont montré qu’un gradient de Na+ permettait d’obtenir l’énergie nécessaire aux phénomènes de transport et de mobilité et qu’une force proton-motrice permettait la synthèse d’ATP à partir de la respiration. Le fonctionnement précis de ces phénomènes reste un problème très intéressant dans les recherches menées sur les alcaliphiles.

Le pH interne de la cellule L’optimum de pH pour la croissance représente le pH externe à la cellule. Le pH interne doit rester relativement proche de la neutralité pour éviter la destruction des macromolécules acidoou alcali-sensibles. Pour la majorité des micro-organismes dont le pH optimal est compris entre 6 et 8 (les neutrophiles), le pH cytoplasmique reste proche de la neutralité (voir figure 6.22). En ce qui concerne les acidophiles et alcaliphiles, ce pH interne peut varier. Ainsi, chez P. oshimae, le pH interne a été mesuré à 4,6 et, chez certains alcaliphiles extrêmes, il peut atteindre 9,5. Si ces valeurs ne constituent peut-être pas les limites inférieures et supérieures du pH cytoplasmique, elles sont probablement proches de ces limites au-delà desquelles la stabilité des macromolécules serait compromise.

Les tampons Au cours de cultures en milieu fermé, le pH change du fait de l’activité métabolique qui consomme ou produit des molécules acides ou basiques. C’est pourquoi des solutions tampons sont utilisées de façon à maintenir le pH à des valeurs constantes. Étant donné qu’un seul tampon ne fonctionne que pour une gamme donnée et étroite, plusieurs types de tampons sont utilisés. Pour des gammes de pH proches de la neutralité (pH compris entre 6 et 7,5) le phosphate de potassium est un excellent tampon. D’autres tampons existent et peuvent être utilisés pour les milieux de culture ou les extraits cellulaires (test enzymatique). Le meilleur tampon possible peut varier énormément selon l’application donnée ; c’est pourquoi le choix de celui-ci se réalise empiriquement. Néanmoins, un tampon utilisé pour un



6.14 L’influence de la pression osmotique sur la croissance 159

test enzymatique chez un organisme fonctionne généralement pour le même test enzymatique chez un autre organisme.

Contrôlez vos acquis L’acidité ou l’alcalinité d’un environnement peut avoir une influence sur la croissance microbienne. Certains organismes se sont adaptés pour pouvoir croître à des pH bas ou élevés, mais la plupart des organismes ont un optimum de pH compris entre 6 et 8. Le pH interne d’une cellule est souvent proche de la neutralité, même lorsque le pH externe est acide ou basique. • •

Quelle est l’augmentation de la concentration en protons lorsque le pH passe de 7 à 4 ? Que sont les tampons et pourquoi leur utilisation est-elle importante ?

6.14 L’influence de la pression m n osmotique sur la croissance L’eau est le solvant de la vie. Tous les organismes ont besoin d’eau, et la disponibilité de cette eau est l’un des paramètres importants qui influe sur la croissance des micro-organismes dans l’environnement. La disponibilité de l’eau ne dépend pas uniquement de sa présence dans l’environnement (pourcentage d’eau dans un habitat donné), mais également de la concentration en solutés, tels que sels, sucres ou tout autre composé dissous dans cette eau. Les substances dissoutes ont une affinité pour l’eau, ce qui rend l’eau associée à ces composés non accessible pour les organismes.

L’activité de l’eau et l’osmose La disponibilité de l’eau s’exprime selon une variable physique qui est l’activité de l’eau, notée aw, et qui correspond au rapport entre la tension de vapeur de l’air en équilibre avec une substance ou une solution et la tension de vapeur de l’eau pure. Les valeurs d’aw varient entre 0 et 1 (voir tableau 6.2). L’activité de l’eau d’un sol agricole varie généralement entre 0,9 et 1. L’eau diffuse depuis les zones à forte concentration en eau (faible concentration en éléments dissous) vers les zones à faible concentration en eau (forte concentration en éléments dissous) ; c’est le processus appelé osmose (voir section 4.8 et figure 4.32). Dans la plupart des cas, le cytoplasme est plus concentré en éléments dissous que le milieu environnant. L’eau a donc tendance à diffuser vers l’intérieur de la cellule qui présente une balance positive pour l’eau. Néanmoins, lorsqu’une cellule se trouve dans un milieu où l’activité de l’eau est faible, l’eau diffuse de la cellule vers le milieu. Ceci pose problème si aucun système n’est mis en place pour empêcher ce phénomène.

Les organismes halophiles Dans l’environnement, l’impact de l’osmose est important, notamment dans les habitats où la concentration en sels est forte. L’eau de mer contient à peu près 3 % de NaCl ainsi que

TABLEAU 6.2 Activité de l’eau

MESURES DE L’ACTIVITÉ DE L’EAU (aW) DE CERTAINS PRODUITS Produits

Exemples d’organismesa

1,000

Eau pure

Caulobacter, Spirillum

0,995

Sang humain

Streptococcus, Escherichia

0,980

Eau de mer

Pseudomonas, Vibrio

0,950

Pain

La pluspart des bacilles Gram positif

0,900

Sirop d’érable, jambon

Coques Gram positif tels que Staphylococcus

0,850

Salami

Saccharomyces rouxii (levure)

0,800

Gâteau aux fruits, confiture

Saccharomyces bailii, Penicillium (champignon)

0,750

Lacs salés, poisson salé

Halobacterium, Halococcus

0,700

Céréales, sucre, fruits secs

Xeromyces bisporus et autres champignons xérophiles

a Exemples d’organismes procaryotes ou de champignons capables de croissance dans un milieu de culture dont l’activité de l’eau est ajustée à la valeur indiquée.

des quantités plus faibles de nombreux autres minéraux ou autres éléments dissous. Les micro-organismes colonisant les milieux marins nécessitent le plus souvent de l’ion sodium pour leur développement et ont une croissance optimale pour des valeurs d’activité de l’eau proches de celles de l’eau de mer (voir figure 6.23). Ces organismes sont appelés halophiles. Ils ont besoin de faibles quantités de NaCl pour leur croissance, mais leur optimum peut varier. Les termes d’halophiles très modérés ou modérés caractérisent les organismes dont les besoins en NaCl sont respectivement faibles (1 à 6 %) ou modérés (6 à 15 %) [voir figure 6.23]. La plupart des micro-organismes sont incapables de faire face à des environnements ou l’activité de l’eau est très faible et, dans ces conditions, soit meurent, soit se déshydratent et sont réduits à un état de dormance. Les organismes halotolérants peuvent résister à une réduction de l’activité de l’eau dans leur environnement, mais leur croissance est meilleure dans le cas où la concentration en soluté est plus faible (voir figure 6.23). Il existe par contre des organismes qui se développent à des valeurs d’aw très faibles. Ces organismes sont intéressants non seulement pour l’étude des processus d’adaptation à ces conditions de vie, mais aussi d’un point de vue pratique étant donné que l’addition de solutés tels que le saccharose ou le sel est un procédé couramment utilisé pour la préservation de la nourriture du développement microbien. Les organismes capables de se développer dans des milieux très salés sont des halophiles extrêmes (voir figure 6.23). Ces organismes nécessitent la présence de 15 à 30 % de NaCl, selon l’espèce, pour leur croissance (voir section 13.3). Les organismes susceptibles de vivre dans des environnements riches en sucre sont appelés osmophiles, alors que ceux en



160 Chapitre 6


Halotolérant Halophile Taux de croissance

Exemple : Staphylococcus aureus

Exemple : Vibrio fischeri

Halophile extrême

Exemple : Halobacterium salinarum

Non halophile Exemple : Escherichia coli

0

NaCl

FIGURE 6.23 Impact de la concentration en NaCl sur la croissance de micro-organismes possédant différents besoins et tolérances vis-à-vis du sel. La croissance optimale vis-à-vis du NaCl pour des organismes marins tels que V. fischeri est proche de 3 % ; pour les halophiles extrêmes, elle se situe entre 15 et 30 % selon l’organisme.

mesure de se développer dans des habitats très secs (à cause du manque d’eau) sont appelés xérophiles (voir tableau 6.2).

Les composés osmocompatibles (ou solutés compatibles) Un organisme vivant dans un milieu où l’activité de l’eau est faible doit augmenter la concentration interne en composés dissous pour pouvoir obtenir de l’eau. Cette augmentation de la concentration interne en solutés peut se réaliser soit en pompant des ions inorganiques de l’environnement vers la cellule, soit en synthétisant ou en concentrant des solutés organiques (voir tableau 6.3). Les solutés utilisés pour ajuster l’activité de l’eau dans le cytoplasme ne doivent pas être des inhibiteurs des processus

TABLEAU 6.3

biochimiques. Ces solutés sont appelés composés osmocompatibles (solutés compatibles ou encore osmorégulateurs). Il en existe plusieurs chez les micro-organismes (voir tableau 6.3 et figure 6.24). Ces composés sont des sucres, des alcools ou des acides aminés, ainsi que leurs dérivés, et sont tous très solubles dans l’eau (voir figure 6.24). Dans le cas d’Archaea halophiles extrêmes et de certaines bactéries, le soluté est le K+ (sous la forme de KCl). Les composés osmocompatibles sont soit synthétisés par l’organisme, soit accumulés depuis l’environnement (c’est le cas de KCl et de la glycine-bétaïne). La concentration de ces composés dans la cellule varie selon les conditions de l’environnement mais, pour chaque organisme, il existe une concentration maximale de composés produits ou accumulés dont le déterminisme est génétique. C’est pourquoi les organismes n’ont pas le même niveau de résistance à l’encontre de l’activité de l’eau (voir tableaux 6.2 et 6.3). La détermination d’organismes non-halotolérants, halotolérants, halophiles ou halophiles extrêmes dépend surtout de leur capacité « génétique » à produire ou accumuler des composés osmocompatibles. Les coques Gram positif appartenant au genre Staphylococcus sont connus pour être des halotolérants (une des méthodes d’isolement consiste à utiliser un milieu de culture contenant 7,5 % de NaCl) et utilisent la proline (acide aminé) comme composé osmocompatible. La glycine-bétaïne est un dérivé de la glycine, où les atomes d’hydrogène du groupement amine sont remplacés par des groupements méthyle. L’atome d’azote est ainsi chargé positivement, ce qui le rend plus soluble (voir figure 6.24). La glycine-bétaïne est un composé osmocompatible usuel, notamment chez les Bacteria halophiles et les cyanobactéries (voir tableau 6.3). Certaines bactéries halophiles extrêmes produisent de l’ectoïne (voir figure 6.24), dérivé cyclique de l’acide aspartique. De nombreux glycosides, ainsi que le diméthyl-sulfoniopropionate (voir figure 6.24) sont produits par les algues marines. Ils s’accumulent le plus souvent à de faibles concentrations étant donné que ces cellules sont faiblement halophiles. Les levures xérophiles et les

COMPOSÉS OSMORÉGULATEURS CHEZ LES MICRO-ORGANISMES Organisme

Composé majoritaire

aw minimum pour la croissance

Bacteria, non phototrophe

Glycine bétaïne, proline (Gram positif), glutamate (Gram négatif)

0,97–0,90

Cyanobactérie d’eau douce

saccharose, tréhalose

0,98

Cyanobactéries marines

α-glucosylglycérol

0,92

Algues marines

Mannitol, glycosides, proline, diméthylsulfoniopropionate

0,92

Cyanobactéries de milieux hypersalés

Glycine bétaïne

0,90–0,75

Bactéries phototrophes anoxygéniques halophiles (Ectothiorhodospira/Halorhodospira, Rhodovibrio)

Glycine bétaïne, ectoïne, tréhalose

0,90–0,75

Archae halophiles extrêmes (par exemple, Halobacterium) ainsi que quelques Bacteria (par exemple, Haloanaerobium)

KCl

0,75

Dunaliella (algue verte halophile)

Glycérol

0,75

Levures xérophiles

Glycérol

0,83–0,62

Champignons filamenteux xérophiles

Glycérol

0,72–0,61



6.15 L’influence de l’oxygène sur la croissance 161

1. Acides aminés et apparentés Glycine bétaïne H3C

CH3 N+ CH2

croissance est meilleure lorsque l’activité de l’eau est plus faible, et certains nécessitent la présence de fortes concentrations en sels pour croître.

Ectoïne N

COO–

CH3

C

H3C

CH2

CH2 C

N

COO–

Diméthylsulfoniopropionate O

CH3 H3C S +

O–

CH2CH2C

2. Hydrates de carbone

OH

O

HOH2C

OH

OH

O

CH2OH

OH

OH

Tréhalose CH2OH O

OH

OH

O OH

O HOH2C OH OH OH

3. Alcools Glycérol CH2OH

Que représente la valeur aw de l’eau pure ?

•

Qu’est ce qu’un composé osmocompatible et quel est son rôle ?

•

Quel est le composé osmocompatible chez le genre Halobacterium ?

6.15 L’influence de l’oxygène m n sur la croissance

Saccharose CH2OH O

•

Mannitol CH2OH

CHOH

HO C H

CH2OH

HO C H H C OH H C OH CH2OH

FIGURE 6.24 Structure des composés osmorégulateurs les plus courants chez les micro-organismes. Les structures du glutamate et de la proline, autres composés osmorégulateurs, sont présentées dans la figure 3.12. Le nom formel de l’ectoïne est le 1,4,5,6-tétrahydro-2-méthyl-4-pyrimidine carboxylate. La glycine bétaïne et le diméthylsulfoniopropionate sont des osmorégulateurs courants chez les algues.

algues vertes halophiles produisent le plus souvent du glycérol. D’autres exemples d’organismes et de composés osmocompatibles sont donnés dans le tableau 6.4 et la figure 6.24.

Contrôlez vos acquis L’activité de l’eau devient limitante pour un organisme lorsque la concentration en solutés augmente dans l’environnement. Les organismes produisent ou accumulent à l’intérieur des cellules des composés osmocompatibles qui permettent de maintenir pour la cellule une balance positive vis-à-vis de l’eau. Certains micro-organismes se sont adaptés de sorte que leur

Étant donné que la vie humaine nécessite la présence d’oxygène moléculaire (O2), il serait facile de supposer que toutes les formes de vie nécessitent cet oxygène. Néanmoins, de nombreux micro-organismes peuvent vivre sans, ou doivent vivre en absence d’oxygène. L’oxygène est peu soluble dans l’eau et les activités de respiration des micro-organismes dans les habitats aquatiques ou humides (notamment dans le cas où la matière organique est présente en abondance) épuisent cet oxygène. Ainsi, les habitats microbiens anoxiques sont très répandus dans l’environnement. Ils comprennent notamment les vases et autres sédiments, les tourbières et marécages, les sols humides, le tractus intestinal des animaux, les eaux usées, les milieux souterrains profonds et d’autres environnements. Dans ces habitats anoxiques, se développent de nombreux micro-organismes, notamment des procaryotes.

La classification des micro-organismes vis-à-vis de l’oxygène Les besoins ou la tolérance vis-à-vis de l’oxygène varient selon les micro-organismes. Ils peuvent ainsi être classés dans plusieurs grands groupes selon leur relation à l’oxygène (voir tableau 6.4). Les aérobies sont capables de croissance à la pression partielle maximale en oxygène (l’air contient 21 % d’O2) et ils respirent l’oxygène au cours de leur métabolisme. De nombreux aérobies tolèrent même des concentrations en oxygène plus élevées que celles dues à la pression normale en oxygène (conditions hyperoxiques). Les microaérophiles, au contraire, sont des aérobies qui utilisent l’oxygène lorsqu’il est présent à des pressions partielles réduites (conditions micro-oxiques). Ceci est dû au fait que leurs capacités de respiration sont limitées ou bien qu’ils contiennent des molécules sensibles à l’oxygène telles que certaines enzymes. De nombreux aérobies sont facultatifs c’est-à-dire que, selon les conditions du milieu (nutriments notamment), ils pourront se développer en conditions oxiques ou anoxiques. Certains micro-organismes, les anaérobies, ne peuvent pas respirer l’oxygène. Il est possible de distinguer entre les anaérobies aérotolérants, qui tolèrent la présence d’oxygène et se développent en sa présence même s’ils ne peuvent pas l’utiliser, et les anaérobies stricts, qui sont inhibés ou tués en présence d’oxygène (voir tableau 6.4). Les raisons pour lesquelles les anaérobies stricts sont ainsi détruits pourraient



162 Chapitre 6

TABLEAU 6.4 Groupe


RELATION DES MICRO-ORGANISMES AVEC L’OXYGÈNE Relation à l’O2

Type de métabolisme

Exemplea

Habitatb

Aérobies Stricts

Nécessaire


Micrococcus luteus (B)

Peau, poussière

Facultatifs

Non nécessaire mais croissance améliorée

Respiration aérobie ou anaérobie, fermentation

Escherichia coli (B)

Gros intestin des mammifères

Microaérophiles

Nécessaire à concentration inférieure à l’O2 atmosphérique


Spirillum volutans (B)

Lac (eau)

Aérotolerants

Non nécessaire et croissance non améliorée

Fermentation

Streptococcus pyogenes (B)

Tractus respiratoire supérieur

Stricts

Toxique, létale

Fermentation ou respiration anaérobie

Methanobacterium (A) formicicum

Station d’épuration des eaux usées, sédiments anoxiques

Anaérobies

a

Les lettres entre parenthèses indiquent le type d’organisme (B, Bacteria ; A, Archaea). Des représentants de chacun des domaines des prokaryotes sont connus dans chaque catégorie. La plupart des Eukarya sont des aérobies stricts, mais certains anaérobies facultatifs (levures par exemple) ou stricts (certains protozaires et champignons) sont connus. b Les habitats typiques des organismes cités sont listés.

être qu’ils ne peuvent éliminer certains produits toxiques issus du métabolisme de l’oxygène (voir section 6.16). L’anaérobiose stricte ne se rencontre que dans trois groupes de micro-organismes : de nombreux procaryotes, quelques champignons et quelques protozoaires. Le groupe de bactéries anaérobies stricts le plus connu est celui constitué par le genre Clostridium, des bacilles anaérobies Gram positif formant des endospores, largement répandus dans les sols, les sédiments dulçaquicoles et les tractus intestinaux, et responsables de la détérioration de produits alimentaires en conserve (voir section 12.20). Parmi les autres micro-organismes anaérobies stricts, se trouvent les méthanogènes et de nombreuses autres Archaea (voir chapitre 13), les bactéries sulfatoréductrices et les homoacétogènes (voir chapitres 12 et 13), ainsi que de nombreuses autres bactéries colonisant le tube digestif des animaux (voir section 21.4). Néanmoins, parmi les anaérobies stricts la sensibilité à l’oxygène varie énormément. Certaines espèces tolèrent des traces d’oxygène, voire une pression partielle maximale en oxygène, selon les conditions, alors que d’autres non.

Les techniques de culture pour les aérobies et anaérobies La croissance de nombreux aérobies nécessite une aération efficace. En effet, l’oxygène consommé par les organismes durant leur croissance n’est pas remplacé assez rapidement par les processus de diffusion. Une aération forcée des cultures est donc souvent nécessaire et peut être obtenue soit par agitation vigoureuse des flacons, soit en insufflant de l’air stérile dans le milieu au travers d’un tube en verre fin ou en verre fritté. Dans ces conditions la croissance est nettement améliorée. Dans le cas des anaérobies, le problème consiste à exclure l’oxygène des milieux de culture. Étant donné que l’oxygène est présent dans l’air, des méthodes spéciales sont utilisées pour la culture des anaérobies. Les anaérobies stricts étant

plus ou moins sensibles à l’oxygène, il existe plusieurs procédures pour réduire la concentration en oxygène dans les cultures. Certaines de ces techniques les plus simples sont utilisables pour les organismes peu sensibles, alors que d’autres, plus complexes à mettre en œuvre, sont nécessaires pour les anaérobies stricts. Des tubes ou des flacons complètement remplis de milieu de culture et fermés avec des bouchons bien ajustés sont suffisants pour la culture d’organismes peu sensibles à la présence de petites quantités d’oxygène. Il est également possible d’ajouter au milieu de culture un produit chimique appelé réducteur, qui réagira avec l’oxygène et le réduira en H2O. C’est le cas du thioglycolate additionné à un milieu appelé bouillon au thioglycolate et utilisé pour tester les besoins en oxygène d’un organisme (voir figure 6.25). Afin d’éliminer toute trace d’oxygène pour la culture des anaérobies, il est possible d’incuber les tubes ou les boîtes dans une jarre à paroi épaisse (jarre anaérobie), fermée hermétiquement par un couvercle étanche aux gaz et contenant un système qui va consommer l’oxygène (voir figure 6.26a). L’air dans la jarre est remplacé par un mélange de H2 et CO2, et en présence d’un catalyseur les traces d’oxygène seront consommées par l’hydrogène (H2 + O2 → H2O), ce qui aboutira à l’anoxie. Pour les organismes anaérobies stricts tels que les méthanogènes (voir section 13.4 et 17.17), il est nécessaire non seulement d’éliminer toute trace d’oxygène dans les milieux de culture, mais également de réaliser toutes les manipulations à l’abri de l’oxygène. En effet les anaérobies stricts peuvent être tués par une exposition, même brève, à l’oxygène. Dans ces cas, le milieu de culture est tout d’abord porté à ébullition afin d’éliminer toute trace d’oxygène, ensuite un réducteur tel que le H2S est additionné, puis le milieu est conditionné sous une atmosphère exempte d’oxygène. Les manipulations se réalisent sous un flux de gaz ne contenant pas d’oxygène (N2 ou



6.16 Les formes toxiques de l’oxygène 163

6.16 Les formes toxiques de l’oxygène m n L’oxygène est un oxydant puissant et le meilleur accepteur d’électrons lors d’une respiration (voir section 5.11). Néanmoins il peut constituer un poison pour certains micro-organismes, non en soi, mais par certains dérivés qui sont toxiques pour les micro-organismes en question.

La chimie de l’oxygène Zone oxique

Zone anoxique

(a)

(b)

(c)

(d)

(e)

FIGURE 6.25 Croissance en fonction de la concentration en oxygène. Localisation des colonies (points noirs) révélant la croissance d’organismes aérobies stricts, anaérobies, anaérobies facultatifs, microaérophiles et anaérobies aérotolérants dans un milieu au thioglycolate, additionné d’agar et de rézazurine. La rézazurine, indicateur de potentiel redox est rose en milieu oxydé et incolore en milieu réduit. (a) Du fait de la faible pénétration de l’oxygène dans le tube, les aérobies stricts ne se développent qu’en surface. (b) Les anaérobies, sensibles à l’oxygène, ne se développent qu’en profondeur. (c) Les anaérobies facultatifs, pouvant se développer en présence ou en absence d’oxygène, se répartissent dans l’ensemble du tube ; néanmoins la croissance est meilleure en surface, où ces organismes effectuent une respiration aérobie. (d) Les microaérophiles se développent mieux dans des zones où la concentration en oxygène est faible mais non nulle. (e) Les anaérobies aérotolérants se développent dans l’ensemble du tube ; néanmoins leur croissance n’est pas meilleure en surface, car ils sont seulement capables de fermentation.

H2) afin d’éviter une contamination par l’oxygène de l’air lors des manipulations. Des boîtes à gants spéciales (chambres anaérobies) existent pour la réalisation de manipulations sur les anaérobies dans une atmosphère exempte de traces d’oxygène (figure 6.26b).

Contrôlez vos acquis Les aérobies nécessitent de l’oxygène pour vivre, contrairement aux anaérobies qui peuvent même être tués par lui. Les anaérobies facultatifs peuvent vivre avec ou sans oxygène. Des techniques spécifiques sont utilisées pour la culture des micro-organismes aérobies et anaérobies. •

Qu’est ce qu’un anaérobie facultatif ?

•

Comment fonctionne un agent réducteur ?

L’état fondamental de l’oxygène correspond à l’oxygènetriplet (3O2), mais d’autres configurations électroniques sont possibles. L’une des formes les plus toxiques de l’oxygène est l’oxygène-singulet (1O2) une forme de plus forte énergie où les couches électroniques extérieures sont très réactives et responsables de nombreuses réactions d’oxydation spontanées au sein d’une cellule. L’oxygène-singulet est produit par réaction photochimique et biochimique ; notamment du fait de l’activité de peroxydases. Les organismes susceptibles d’être en présence d’oxygène-singulet, tels que les micro-organismes de l’air et les organismes photosynthétiques, contiennent souvent des pigments caroténoïdes qui interviennent pour transformer l’oxygène-singulet en formes non toxiques (voir section 17.3). D’autres formes très toxiques de l’oxygène sont l’anion superoxyde (O2–), le peroxyde d’hydrogène (H2O2) et le radical hydroxyle (OH•). Toutes ces formes sont des sous-produits de la réduction de l’O2 en H2O au cours de la respiration (voir figure 6.27). Les flavoprotéines, les quinones, les thiols et les protéines fer-soufre (voir section 5.11) qui se trouvent dans pratiquement toutes les cellules peuvent également réduire l’O2 en O2–. Ainsi, qu’elles soient capables ou non d’utiliser l’oxygène (voir tableau 6.3), presque toutes les cellules peuvent être exposées à certaines de ses formes toxiques. L’anion superoxyde est un oxydant puissant qui peut pratiquement oxyder n’importe quelle molécule organique dans une cellule, y compris les macromolécules. Les peroxydes tels que le H2O2 peuvent également causer des dégâts mais sont moins toxiques que les superoxydes ou le radical hydroxyle. Ce dernier est le plus réactif et peut oxyder rapidement n’importe quelle molécule organique. Néanmoins, le radical hydroxyle ne constitue qu’une forme éphémère dans la cellule, car sa source majeure provient des radiations ionisantes auxquelles les cellules sont rarement exposées. De petites quantités de radical hydroxyle peuvent être produites à partir de H2O2 (voir figure 6.27), mais le peroxyde pouvant être éliminé par l’activité de la catalase (voir plus loin), cette source de radical hydroxyle est pratiquement éliminée. Des formes toxiques de l’oxygène peuvent être produites par des cellules du système immunitaire pour lutter contre une infection microbienne (voir section 22.2).

Les enzymes destructrices des formes toxiques de l’oxygène Étant donné la gamme de dérivés toxiques de l’oxygène, les organismes ont développé des enzymes capables de détruire ces composés (voir figure 6.28). La plus répandue de ces enzymes est la catalase, qui dégrade le peroxyde d’hydrogène. L’activité de cette enzyme est illustrée dans les




(a)

Coy Laboratory Products

Deborah O. Jung et Michael T. Madigan

164 Chapitre 6

(b)

FIGURE 6.26 Incubation en conditions anoxiques. (a) Jarre anaérobie. Une réaction chimique, dans le sachet inclus dans la jarre, génère H2 +CO2 ; le H2 produit réagit avec le O2 en présence de palladium comme catalyseur et génère du H 2O. L’atmosphère finale contient du H2, du N2 et du CO2. (b) Enceinte anaérobie (boîte à gants) pour la manipulation et l’incubation en conditions anoxiques. Le sas sur la droite peut être purgé avec du gaz sans oxygène et sert à l’introduction et au retrait de matériel de l’enceinte.

figures 6.28a et 6.29. La peroxydase dégrade également le peroxyde d’hydrogène, mais son activité est différente (voir figure 6.28b) puisqu’elle nécessite la présence d’un réducteur, souvent le NADH, pour produire de l’H2O. La superoxyde dismutase dégrade l’anion superoxyde (voir figure 6.28c) en combinant deux molécules de superoxyde pour former une molécule de peroxyde d’hydrogène et une molécule d’oxygène. Les deux enzymes superoxyde dismutase et catalase fonctionnent ensemble pour former de l’oxygène à partir de l’anion superoxyde (voir figure 6.28d). Les aérobies et les anaérobies facultatifs possèdent d’habitude à la fois la superoxyde dismutase et la catalase, bien que certains aérobies stricts ne possèdent pas cette dernière. La superoxyde dismutase est indispensable pour les cellules aérobies. Son absence chez les anaérobies stricts a longtemps été considérée comme la raison de la toxicité de l’oxygène pour ces organismes. Certains anaérobies aérotolérants tels que les bactéries lactiques ne possèdent pas la superoxyde dismutase et utilisent des complexes protéines-manganèse (Mn2+) pour effectuer la transformation de l’anion superoxyde en H2O2 et O2. Ce type de réaction correspond sans doute à une forme ancienne d’activité superoxyde dismutase. De fait, toutes les superoxydes dismutases connues contiennent un cofacteur

e–

O2 + O2– + e– + 2 H+ H2O2 + e– + H+ OH + e– + H+

O2–

Superoxide H2O2 Peroxyde d’hydrogène H2O + OH Radical hydroxyle H2O Eau

Bilan : O2 + 4 e– + 4 H+

2 H2O

FIGURE 6.27 Réactions successives de réduction de l’oxygène en H2O par addition d’électrons . Tous les intermédiaires formés, à part l’eau, sont très réactifs et toxiques pour les cellules.

métallique au niveau de leur site actif, souvent du Mn2+, mais également du Fe2+, ou la combinaison Cu2+ et Zn2+. Une autre voie d’élimination de l’anion superoxyde est présente chez certains procaryotes anaérobies stricts. Chez l’Archaea Pyrococcus furiosus, la superoxyde dismutase est absente mais une autre enzyme unique responsable de l’élimination de superoxyde est présente, la superoxyde réductase. Cette enzyme réduit le superoxyde en H2O2 sans production de O2 (voir figure 6.28d), ce qui évite l’exposition à l’oxygène chez cet organisme. P. furiosus ne possède pas de catalase, une enzyme qui génère également de l’O2 (voir figure 6.28a).

(a) Catalase : H2O2 + H2O2

2 H2O + O2

(b) Peroxydase : H2O2 + NADH + H+

2 H2O + NAD+

(c) Superoxyde dismutase : O2– + O2– + 2 H+ H2O2 + O2 (d) Superoxyde dismutase/catalase en combinaison : 4 O2– + 4 H+ 2 H2O + 3 O2 (e) Superoxyde reductase : H2O2 + cyt coxydé O2– + 2 H+ + cyt créduit FIGURE 6.28 Les enzymes responsables de la dégradation des composés toxiques de l’oxygène. (a) Les catalases et (b) les peroxydases sont des protéines contenant des noyaux porphyrines, mais certaines flavoprotéines (voir section 5.11) peuvent aussi consommer les composés toxiques de l’oxygène. (c) Les superoxydes dismutases sont des protéines contenant des métaux tels que le cuivre, le zinc, le manganèse ou le fer. (d) Action combinée de la superoxyde dismutase et de la catalase. (e) La superoxyde réductase catalyse la réduction du O2 en H2O2, avec le cytochrome c comme donneur d’électron.



T. D. Brock

Questions 165

FIGURE 6.29 Test de la présence de la catalase dans une culture microbienne. De la biomasse bactérienne issue d’une culture sur agar (colonie) est mise en présence d’une goutte d’eau oxygénée (30 % en volume) sur une lame de microscope (à droite). L’apparition de bulles indique la présence de la catalase. Les bulles sont de l’oxygène issu de la réaction : H2O2 + H2O2 → 2H2O + O2.

Chez P. furiosus, le H2O2 produit par la superoxyde réductase est éliminé par l’activité d’enzymes de type peroxydase, dont le produit final est H2O (voir figure 6.28b). La superoxyde réductase semble être largement distribuée chez les anaérobies stricts, du moins les études portant sur les génomes complets ont-elles révélé la présence de gènes codant ce type d’enzyme chez de nombreux anaérobies stricts. Ces organismes, dont on pensait qu’ils étaient sensibles à l’oxygène car ils ne possèdent pas de superoxyde dismutase, semblent disposer

d’un système d’élimination de la forme toxique de l’oxygène que constitue l’anion superoxyde. La sensibilité de ces organismes vis-à-vis de l’oxygène dans les milieux de culture pourrait être due à des raisons encore inconnues. De nombreux organismes hyperthermophiles anaérobies stricts tolèrent l’oxygène à des températures basses. Même s’il n’y a pas de croissance dans ces conditions, la superoxyde réductase semble les protéger de la mort. Cette tolérance à l’oxygène pourrait jouer un rôle important dans le transfert de ces organismes depuis une source hydrothermale profonde à une autre (voir section 19.8).

Contrôlez vos acquis De nombreuses variétés toxiques de l’oxygène peuvent être formées dans la cellule, mais des enzymes assurent leur neutralisation. L’anion superoxyde est l’une des formes toxique de l’oxygène la plus commune. •

Comment la superoxyde dismutase protège-t-elle la cellule des formes toxiques de l’oxygène ?

•

Dans quelle mesure l’activité de la superoxyde dismutase diffère-t-elle de celle de la superoxyde réductase ?

QUESTIONS 1. Décrivez les processus moléculaires clés lors de la croissance et la division cellulaire. Quelles protéines facilitent le processus de division cellulaire (voir section 6.1) ? 2. Décrivez le rôle des protéines Fts dans le processus de division cellulaire (voir section 6.2). 3. Dans quelle mesure des cellules issues de la bactérie en forme de bâtonnet Escherichia coli et présentant une mutation inactivant la production de la protéine MreB apparaissent différentes en microscopie par rapport aux cellules non mutées ? Quelle en est la raison (voir section 6.2) ? 4. Comment la pénicilline agit-elle pour tuer les cellules bactériennes (voir section 6.3) ? 5. Quelle est la différence entre le taux de croissance spécifique (k) d’un organisme et son temps de génération (g) (voir sections 6.4 et 6.5) ? 6. Décrivez les phases de croissance d’une population de cellules bactériennes à partir du moment où cette population est inoculée dans un milieu de culture neuf (voir section 6.6). 7. Décrivez une méthode directe et une méthode indirecte permettant de mesurer la croissance microbienne (voir sections 6.7 et 6.8). 8. Décrivez brièvement le processus par lequel une seule cellule forme une colonie visible sur une boîte de Petri. Sur cette base expliquez le principe de la méthode de comptage des cellules viables (voir section 6.7). 9. Comment le chémostat permet-il de contrôler le taux de croissance et la densité cellulaire, et ce, indépendamment l’un de l’autre (voir section 6.9) ?

10. En observant la figure décrivant la relation entre le taux de croissance et la température (voir figure 6.17), expliquez d’un point de vue biochimique pourquoi l’optimum de croissance est le plus souvent plus proche du maximum que du minimum (voir section 6.10). 11. Décrivez un environnement dans lequel vous pourriez trouver un organisme psychrophile. Même chose pour un hyperthermophile (voir sections 6.11 et 6.12). 12. En prenant en compte le pH de l’environnement et le pH interne de la cellule, dans quelle mesure un acidophile et un alcaliphile sont-ils différents ? Dans quelle mesure sont-ils identiques (voir section 6.13) ? 13. Expliquez, en termes moléculaires, comment une cellule halophile est capable de créer un courant d’eau de l’extérieur vers l’intérieur de la cellule (voir section 6.14). 14. Listez trois classes de composés osmocompatibles produits par différents micro-organismes. Donnez au moins deux propriétés communes à ces composés (voir section 6.14). 15. Différenciez aérotolérant et anaérobie strict en termes de sensibilité à l’oxygène et de capacité de croissance en présence d’oxygène (O2). Dans quelle mesure un anaérobie aérotolérant diffère t-il d’un microaérophile (voir section 6.15) ? 16. Comparez les enzymes catalase, superoxyde dismutase et superoxyde réductase en fonction des points suivants : substrats, produits oxygénés, organismes qui les contiennent, rôle dans la tolérance à l’oxygène des cellules (voir section 6.16).



166 Chapitre 6


PROBLÈMES 1. En débutant une culture en milieu riche avec quatre cellules par millilitre et en prenant en compte une phase de latence de 1 heure et un temps de génération de 20 minutes, combien de cellules obtiendra-t-on par litre après 1 heure ? Après 2 heures ? Après 2 heures si l’une des quatre cellules initiales est morte ? 2. Calculez g et k lors d’une croissance où un milieu de culture est inoculé avec 5 × 106 cellules mL–1 d’Escherichia coli, avec une phase de latence de 1 heure suivie d’une phase de croissance exponentielle de 5 heures, aboutissant à une population de 5,4 × 109 cellules.mL–1.

3. Localisez dans le chapitre 3 une figure décrivant le mieux ce qui arriverait aux enzymes d’une cellule d’un organisme mésophile tel qu’Escherichia coli lorsqu’elle est placée dans un milieu de culture à 80 °C. Comparez à une figure du chapitre 6 décrivant le mieux ce qui arriverait si des cellules de Pyrolobus fumari étaient placées dans les mêmes conditions. Expliquez pourquoi aucun des organismes ne se développerait. 4. Serait-il possible de trouver un micro-organisme psychrophile vivant dans une source thermale ? Pourquoi ? Il est fréquent d’isoler des micro-organismes hyperthermophiles dans des environnements froids. Donnez une explication à cela.



CHAPITRE SEPT


Bien que de nombreuses formes d’acides nucléiques soient connues dans la nature, toutes les cellules possèdent un génome constitué d’ADN double brin. Le génome dirige tous les événements moléculaires ayant lieu dans la cellule.

I

Gènes et expression génique

7.1

Macromolécules et informations génétiques 168

II

Structure de l’ADN

7.2 7.3 7.4

Structure de l’ADN : la double hélice 170 Structure de l’ADN : super-enroulement 173 Chromosomes et autres éléments génétiques 175

III

Réplication de l’ADN

7.5 7.6

Réplication de l’ADN : modèles et enzymes 177 Réplication de l’ADN : la fourche de réplication 178

IV

Outils de manipulation de l’ADN

182

7.7 7.8 7.9

Enzymes de restriction et hybridation Séquençage et synthèse d’ADN Amplification de l’ADN par réaction de polymérisation en chaîne

182 185

V

Synthèse de l’ARN : la transcription

188

7.10 7.11

189

7.12 7.13

Description de la transcription Diversité des facteurs sigma, séquences consensus et ARN polymérases Terminateurs de transcription Unité de transcription

190 191 192

VI

Synthèse des protéines

193

7.14 Code génétique 7.15 Les ARN de transfert 7.16 Processus de synthèse des protéines : la traduction 7.17 Sécrétion et repliement des protéines

168 169

177

187

193 195 197 201



168 Chapitre 7


GLOSSAIRE ADN gyrase (DNA gyrase) Enzyme présente chez la plupart des procaryotes, introduisant des super-enroulements négatifs dans l’ADN. ADN polymérase (DNA polymerase) Enzyme synthétisant un nouveau brin d’ADN dans le sens 5' → 3', en utilisant un brin d’ADN antiparallèle comme modèle. Aminoacyl-ARNt synthétase (aminoacyl-tRNA synthetase) Enzyme catalysant la fixation d’un acide aminé à son site spécifique sur l’ARNt. Amorce (primer) Oligonucléotide auquel l’ADN polymérase peut attacher le premier déoxyribonucléotide durant la réplication de l’ADN. Anticodon (anticodon) Séquence de trois bases de l’ARNt, complémentaire d’un codon pendant la synthèse protéique. Antiparallèle (antiparallel) En référence à l’ADN double brin, l’un dans le sens de lecture 5' → 3' et le complémentaire dans le sens 3' → 5'. ARN de transfert (ARNt) (transfer RNA, tRNA) Adaptateur moléculaire utilisé dans la traduction, spécifique à la fois d’un acide aminé particulier et d’un ou plusieurs codons. ARN messager (ARNm) (messenger RNA, mRNA) Molécule d’ARN contenant l’information génétique codant un ou plusieurs polypeptides. ARN polymérase (RNA polymerase) Enzyme synthétisant les ARN dans le sens 5' → 3' en utilisant un brin d’ADN complémentaire et antiparallèle comme modèle. ARN ribosomique (ARNr) (ribosomal RNA, rRNA) Types d’ARN localisés dans le ribosome, certains participent activement au processus de synthèse protéique. Chaperon moléculaire (molecular chaperone) Protéine facilitant le repliement des protéines et permettant leur désagrégation. Chromosome (chromosome) Élément génétique, généralement circulaire chez les procaryotes et linéaire chez les eucaryotes, comptant les gènes essentiels au fonctionnement cellulaire. Codon (codon) Séquence de trois bases de l’ARNm codant un acide aminé. Complémentaire (complementary) Séquences d’acides aminés pouvant s’apparier.

L

es cellules sont définies comme des « machines chimiques », qui accumulent et transforment des macromolécules pour former de nouvelles cellules, et des « appareils de codage », qui emmagasinent, transforment et utilisent les gènes, information génétique de la cellule (chapitre 1). La biologie moléculaire étudie les gènes et leurs transformations. Ce chapitre portera donc sur l’étude des gènes, la structure et la fonction de l’ADN / ARN et la réplication de l’ADN. Il abordera également la biosynthèse des protéines, macromolécules jouant un rôle important dans la structure ainsi que dans le fonctionnement de la machinerie cellulaire.

I

GÈNES ET EXPRESSION GÉNIQUE

et informations m n7.1 Macromolécules génétiques Le gène est l’unité fonctionnelle de l’information génétique. Tous les micro-organismes contiennent des gènes, il est donc fondamental de comprendre leur fonctionnement, pour mieux

Enzyme de restriction (restriction enzyme) Enzyme reconnaissant et coupant l’ADN à des séquences spécifiques. Exon (exon) Séquences codantes d’une portion de gène (par opposition à intron). Gène (gene) Fragment d’ADN codant une protéine (via les ARNm), un ARNt ou un ARNr. Génome (genome) Ensemble des gènes contenus dans une cellule ou un virus. Hybridation (hybridization) Formation d’un duplex d’acides nucléiques à partir de deux brins d’ADN d’origines différentes par complémentarité de bases. Intron (intron) Séquences non codantes d’une portion de gène (par opposition à exon). Opéron (operon) Groupe de gènes dont l’expression est contrôlée par un seul opérateur. Promoteur (promoter) Site sur l’ADN auquel l’ARN polymérase se fixe pour commencer la transcription. Réaction de polymérisation en chaîne (PCR) (polymerase chain reaction, PCR) Méthode d’amplification in vitro de séquences spécifiques d’ADN par des cycles répétés de synthèse en utilisant des amorces spécifiques et de l’ADN polymérase. Réplication semi-conservative (semiconservative replication) Synthèse d’ADN produisant de nouvelles doubles hélices, chacune comportant un brin parental et un brin nouvellement formé. Réplication (replication) Synthèse d’ADN utilisant l’ADN comme modèle. Ribosome (ribosome) Particule cytoplasmique composée d’ARN ribosomique et de protéines, dont la fonction est de synthétiser des protéines. Traduction (translation) Synthèse de protéines en utilisant l’information génétique des ARNt comme modèle. Transcription (transcription) Synthèse d’ARN en utilisant l’ADN comme modèle. Transcrit primaire (primary transcript) Molécule d’ARN brute qui est le produit direct de la transcription.

appréhender la structure, la fonction et le comportement des cellules et des virus. De plus, avec l’entrée de la biologie dans l’ère de la génomique, il est important de comprendre le processus de transfert des informations pour comprendre la biologie des micro-organismes.

Les gènes et les étapes dans le flux de l’information Dans toutes les cellules, les gènes sont composés d’acide désoxyribonucléique (ADN), lui-même composé d’une séquence de bases puriques (adénine et guanine) et pyrimidiques (thymine et cytosine). Les informations stockées dans l’ADN sont transférées aux acides ribonucléiques (ARN). Les ARN peuvent être des messagers ou, dans certains cas, des acteurs dans la machinerie cellulaire. Du fait des informations génétiques contenues dans leur séquence, ADN, ARN et protéines sont définies comme des macromolécules informationnelles (voir section 3.2). Les processus moléculaires à la base du flux des informations génétiques peuvent être divisés en trois phases (voir figure 7.1).



7.1 Macromolécules et informations génétiques 169

1. Réplication. La molécule d’ADN possède une structure en forme de double hélice (voir section 3.2). Durant la réplication, l’ADN est dupliqué, produisant deux doubles hélices (voir figure 7.1). 2. Transcription. L’ADN participe à la synthèse des protéines par l’intermédiaire des ARN. Le transfert des données aux ARN s’appelle la transcription et les molécules d’ARN qui codent un ou plusieurs polypeptides sont des ARN messagers (ARNm). Certains gènes codent d’autres types d’ARN comme les ARN de transfert (ARNt) et les ARN ribosomiques (ARNr). Ceux-ci jouent un rôle dans la synthèse protéique mais n’encodent pas eux-mêmes des informations génétiques pour la formation des protéines. 3. Traduction. Il existe une relation linéaire entre la séquence des bases de l’ARNm (et donc du gène) et la séquence des acides aminés d’un polypeptide (voir figure 7.1). Un codon est constitué de trois bases de la molécule d’ARN et encode un seul acide aminé. Ce code génétique est traduit en protéine par l’intermédiaire du système de synthèse protéique composé de ribosomes (euxmêmes composés de protéines et d’ARNr), d’ARNt et de nombreuses enzymes. La figure 7.1 décrit les trois étapes cellulaires du transfert ADN → ARN → protéine. Certains virus n’obéissent pas à ce dogme de la biologie moléculaire (voir chapitre 9). Ceci inclut les cas où l’ARN est le matériel génétique tenant lieu d’ARNm, ou encore dans le cas des rétrovirus comme le HIV – agent responsable du SIDA – où le génome ARN encode la production d’ADN (transcription réverse). Dans les deux cas, le transfert d’informations se fait d’acides nucléiques à acides nucléiques mais pas de manière classique. Les virus à ARN sont une des surprises moléculaires du monde viral !

ADN

5′

T T T GT T A A T CA G CA T CT T

3′

3′

A A A CA A T T A GT C GT A GA A

5′

5′′


3′

3′


5′

La génétique des procaryotes et des eucaryotes Il existe quelques différences dans les mécanismes de la réplication, de la transcription et de la traduction entre les procaryotes et les eucaryotes. Ceci est dû, d’une part à une organisation de l’ADN différente et d’autre part, à la présence d’un noyau chez les eucaryotes. Le génome de la majorité des procaryotes est constitué d’une molécule d’ADN circulaire dans le cytoplasme de la cellule (voir chapitre 2) tandis que celui des eucaryotes est constitué de fragments linéaires d’ADN, individualisés en chromosomes dans le noyau. Chez les eucaryotes, il existe donc une séparation spatiale de la transcription et de la traduction. Chez les procaryotes, Bacteria et Archaea sont deux groupes phylogénétiquement différents (voir chapitre 2). Dans de nombreux cas, les processus moléculaires des Archaea sont plus proches de ceux des Eukarya que de ceux des Bacteria. Dans toutes les cellules, la structure d’un gène est la même : c’est un segment d’ADN définissant une protéine (via les ARNm), un ARNt ou un ARNr. Chez les eucaryotes, les gènes codant des protéines sont divisés en plusieurs régions codantes et non codantes. Les séquences codantes sont des exons et les séquences non codantes, des introns. Les introns et les exons sont transcrits dans le transcrit primaire qui, par excision des régions non codantes, va former l’ARNm. Celui-ci est ensuite transporté jusqu’au cytoplasme pour la traduction (voir section 14.8). Peu de gènes contiennent des introns chez les procaryotes. La figure 7.2 résume les principales différences concernant les événements moléculaires ayant lieu chez les procaryotes et les eucaryotes.

Contrôlez vos acquis Les trois processus clés de la synthèse de macromolécules sont : (1) la réplication de l’ADN ; (2) la transcription (synthèse d’ARN à partir de l’ADN) ; et (3) la traduction (synthèse de protéines à partir des ARN messagers). Bien que les mécanismes de base soient les mêmes chez les procaryotes et les eucaryotes, l’organisation du contenu génétique est plus complexe chez ces derniers. Chez les eucaryotes, la plupart des gènes possèdent des régions codantes (exons) et non codantes (introns). •

Quelles sont les trois macromolécules informationnelles qui interviennent dans le transfert des informations génétiques ?

•

Dans les cellules, trois processus interviennent dans la circulation des informations génétiques. Quels sont-ils ?

Réplication 5′


3′

3′


5′

Transcription du brin inférieur (vert clair) ARN

5′ U U U G U U A A U C A G C A U C U U 3′

Traduction Protéine H2N- Phe

Val

Asn

Gln

His

Leu -COOH

FIGURE 7.1 Synthèse des trois types de macromolécules informationnelles. Seul l’un des deux brins de la double hélice d’ADN est transcrit.

II

STRUCTURE DE L’ADN

Le chapitre 3 traite de la structure des acides nucléiques de façon générale. Dans ce chapitre, il est question de la structure de l’ADN et notamment des différents éléments génétiques contenant de l’ADN, que l’on peut trouver dans une cellule. Partant de ces informations, la façon dont l’ADN est répliqué, transcrit en ARN et traduit en protéines, sera expliquée.



170 Chapitre 7


Gène A ADN

du premier sucre au carbone de l’extrémité 5’ du second (voir figure 7.4). À une extrémité de l’ADN, le sucre est relié à un phosphate en position 5’-hydroxyle, tandis qu’à l’autre extrémité, le sucre possède un groupement hydroxyle libre en position 3’.

Gène B Transcription

Région codante A ARNm

Région codante B

La double hélice de l’ADN

Traduction

A

B

Protéine

(a) Procaryote

Gène X Exon 1 Intron 1 Exon 2 Intron 2 Exon 3 ADN Transcription Exon 1 Intron 1 Exon 2 Intron 2 Exon 3 Transcrit primaire Transformation (épissage) de l’ARN

ARNm maturé

Dans le noyau

Excision des introns

Transport dans le cytoplasme

Il existe des virus dont les chromosomes sont simple brin (chapitre 9), cependant, dans toutes les cellules, l’ADN existe sous la forme de deux brins polynucléotidiques dont les séquences sont complémentaires. Cette complémentarité de l’ADN provient de l’appariement spécifique des bases puriques et pyrimidiques : l’adénine s’apparie toujours avec la thymine, et la guanine toujours avec la cytosine (voir figure 7.3). Les deux brins de la molécule double brin résultante sont assemblés de manière antiparallèle (figures 7.3 et 7.4, les deux brins sont de deux nuances de vert) : sur la figure 7.4, le brin de gauche est dans le sens 5’→ 3’, du haut vers le bas, et l’autre brin dans le sens 5’ → 3’ mais du bas vers le haut. Les deux brins s’enroulent l’un autour de l’autre pour former une double hélice (voir figure 7.5) contenant un grand et un petit sillon. La plupart des nombreuses protéines interagissant avec l’ADN (chapitre 8) se fixent au niveau du grand sillon, du fait du large espace disponible. À cause de la régularité de la double hélice, certains atomes des bases sont toujours exposés dans le grand sillon (et certains autres, dans le petit sillon). Les régions clés des nucléotides dans les interactions avec les protéines sont montrées sur la figure 7.3.

La taille de la molécule d’ADN

ARNm Traduction

Dans le cytoplasme

La taille de la molécule d’ADN peut être exprimée en termes de milliers de bases nucléotidiques ou de paires de bases par

Protéine X H N H (b) Eucaryote FIGURE 7.2 Différence dans le transfert de l’information chez les procaryotes et les eucaryotes. (a) Procaryote. Souvent un ARNm contient plus d’une région codante. (b) Eucaryote. Les régions non codantes (introns) sont excisées de l’ARN du transcrit primaire avant traduction, laissant les exons se rejoindre dans l’ARNm maturé. Pour les détails de la transformation de l’ARN chez les eucaryotes, voir la section 14.8.

O

N

Cytosine N

H N

O

H N

N Squelette phosphoglucidique

N N

Squelette phosphoglucidique

Liaison H hydrogène H

CH3

H N

O

N

Thymine N

m n

7.2 Structure de l’ADN : la double hélice

On trouve quatre bases dans l’ADN : l’adénine (A), la guanine (G), la cytosine (C) et la thymine (T). Comme le montre la figure 3.11, le squelette de la chaîne d’ADN est composé d’une alternance répétée de phosphate et d’un sucre, le désoxyribose, sur lequel est fixée l’une des quatre bases. Notez particulièrement le système de numérotation sur les positions du sucre et des bases. Deux sucres adjacents sont connectés par un phosphate reliant le carbone de l’extrémité 3’

Guanine


O

H

N

N

Liaison hydrogène

Adénine


FIGURE 7.3 Appariements spécifiques entre adénine (A) et thymine (T) et entre guanine (G) et cytosine (C), via des liaisons hydrogène. Cette figure montre les appariements de bases dans l’ADN double brin. Les atomes se trouvant dans le grand sillon de la double hélice et interagissant avec les protéines sont surlignés en rose. Le squelette phosphoglucidique de l’ADN est également indiqué. Dans cet ouvrage, les deux brins d’ADN sont représentés par deux nuances différentes de vert.



7.2 Structure de l’ADN : la double hélice 171

P O H H

5′

–O

P O –O

O

G 5′-Phosphate

O

H 3′-Hydroxyl

H2C

H H

H

O

H

H

H

3′

H

C

FIGURE 7.4 Structure de l’ADN. Complémentarité et antiparallélisme de l’ADN. Un brin se termine par un groupement phosphate à l’extrémité 5’ tandis que l’autre brin se termine par un groupement hydroxyle en 3’. Les bases pyrimidiques, cytosine (C) et thymine (T), sont représentées en rouge et les bases puriques, adénine (A) et guanine (G), en jaune.

molécule : une molécule d’ADN de 1 000 bases contient donc 1 kilobase (kb) d’ADN. Lorsqu’il s’agit d’ADN double brin, on parle de kilopaires de bases (kpb) : la taille d’une double hélice de 5 000 paires de bases serait donc 5 kpb. Le chromosome de la bactérie Escherichia coli possède environ 4 640 kpb d’ADN. Étant donné l’importance des séquences génomiques désormais disponibles, il est souvent plus utile de parler de millions de paires de bases ou de mégapaires de bases (Mpb). En termes de longueur réelle, chaque paire de bases mesure 0,34 nanomètre (nm) sur la double hélice, et chaque tour d’hélice contient environ dix paires de bases. Par conséquent, 1 kilobase d’ADN contient 100 tours d’hélice et mesure 0,34 µm de long. Ce type de calcul peut être intéressant (voir section 7.3).

Les séquences inversées répétées, la structure secondaire et les structures tige-boucle Les longues molécules d’ADN sont relativement flexibles alors que les fragments de moins de 100 paires de bases sont plus rigides. De courts fragments d’ADN peuvent être recourbés par des protéines interagissant avec eux tandis que

Stephen Edmondson et Elizabeth Parker

P O

O

H 2C

O

P O O

H

H

–O

A

O

H

O

O

H2C

H H

H

–O

H

H

H

T

H

O

Grand sillon

O

O H2C

–O

C

O

P O

Squelette phosphoglucidique

O

H

3,4 nm

H 2C

H H

H

O

H

H

H

G

H H –O

H

H2C

O

O

O

P O

P

Liaisons hydrogène

Petit sillon

–O

H

H

O

5′

O

3′

O –O

1′

O

H

H

3′

T

A

Un tour d’hélice (10 paires de bases)

3′-Hydroxyl

H2C

H

1′

O

5′

H

H2C

H

O

H H

5′-Phosphate

P O

H

–O

O H

O–

FIGURE 7.5 Modélisation par ordinateur de l’organisation de la double hélice sur un court fragment d’ADN. Les squelettes phosphoglucidiques sont représentés en bleu pour un brin et en vert pour l’autre. Les bases pyrimidiques sont en rouge et les bases puriques en jaune. Notez la position du petit et du grand sillon. On compte 10 paires de bases par tour d’hélice.

certaines séquences provoquent elles-mêmes des repliements dans l’ADN : ces séquences impliquent souvent plusieurs suites de cinq ou six adénines (sur le même brin), chacune séparée par quatre ou cinq des autres bases. Certaines séquences contribuent également à rendre l’ADN capable de se replier lorsqu’il interagit avec certaines protéines. Le repliement de l’ADN est un mécanisme intervenant dans la régulation de l’expression des gènes (activation et répression des gènes) abordée dans le chapitre 8. Les molécules d’ADN contiennent souvent des régions composées de courtes séquences répétées inversées avec lesquelles un grand nombre de protéines interagissent (chapitre 8). Ces séquences inversées répétées confèrent à l’ADN une double symétrie pouvant aboutir à la formation de structures tige-boucle : courtes régions en double hélice avec des appariements de bases normaux et des brins antiparallèles (voir figure 7.6). La formation de structures tige-boucle dans l’ADN n’est pas un processus répandu dans les cellules alors qu’il est commun d’en voir apparaître dans l’ARN lors de la transcription. Une telle structure secondaire (voir section 3.5), formée par appariement de bases sur un simple brin, est critique pour le fonctionnement des ARN de transfert (voir section 7.15) et des ARN ribosomiques (voir section 11.5). Les séquences inversées répétées, même si elles ne conduisent



Séquences répétées inversées (a) G

C T T

5′

A T C T A G

A A

(b)

C C G

G A C G A C T G

C T G C T G A C

C A G T C G T C

G T C A G C A G

Boucle

Tige

AGC T CG

Structure tige-boucle

5′

C G G C G

FIGURE 7.6 Séquences répétées inversées et formation d’une structure tige-boucle. (a) Séquences répétées inversées de l’ADN. Les flèches indiquent la symétrie autour d’un axe imaginaire (ligne en pointillé). (b) Formation de structures tige-boucle par appariement de bases complémentaires sur un même brin. Si l’ARN était synthétisé à partir de ces brins, il formerait également une tige-boucle.

pas à la formation de tige-boucle, sont souvent des sites de fixation spécifiques pour les protéines régulant la transcription (voir chapitre 8).

L’effet de la température sur la structure de l’ADN Bien que les liaisons hydrogène entre les paires de bases soient individuellement des liaisons faibles (voir section 3.1), le grand nombre de ces liaisons le long de l’ADN (des millions voire des centaines de millions en fonction du nombre de paires de bases) maintient les deux brins ensemble. Chaque appariement adénine-thymine contient deux liaisons hydrogène tandis que l’appariement guanine-cytosine en contient trois, rendant celui-ci plus fortement lié (voir figure 7.3). Isolé des cellules et maintenu à température ambiante dans des concentrations physiologiques en sel, l’ADN reste sous sa forme double brin. Si la température augmente, les deux brins vont se séparer par destruction des liaisons hydrogène et non pas par destruction des liaisons covalentes internes à chaque chaîne. Cette dénaturation (fusion) de l’ADN peut être mesurée expérimentalement : l’ADN simple ou double brin ne possède pas la même absorbance des UV à 260 nm (voir figure 7.7). L’ADN à haut pourcentage de GC se dénature à des températures plus importantes qu’une molécule de taille similaire

Simples brins

1,2

Fusion

G T A T G C A

C

A T A

C G T

1,0

Tm = 85,0° C G A T T A A T C G G C T A

5′

C A T A C G T

ATCGTCAGCAGTTCGCCGCTGCTGACAGC TAGCAGTCGTCAAGCGGCGACGACTGTCG

G T A T G C A

5′


Absorbance relative à 260 nm

172 Chapitre 7

Double brin

0,8 72

76

80

84

88

92

96

°C FIGURE 7.7 Dénaturation thermique de l’ADN. Lorsque la double hélice est dénaturée, l’ADN absorbe davantage les radiations UV à 260 nm. La transition est très brutale et la température au point d’équilibre, Tm, est proportionnelle au contenu en GC de l’ADN. Bien que l’ADN dénaturé se réapparie lors d’un refroidissement lent, le processus suit une cinétique différente. Le réappariement devient complet à des températures bien inférieures à celle du Tm et seulement après un long temps d’incubation.

contenant plus d’AT. Lorsqu’un ADN dénaturé se refroidit lentement, le double brin originel va se reformer par hybridation (ou annelage). Ce processus peut être également utilisé pour former des molécules hybrides dont les brins proviennent de deux origines différentes. L’hybridation artificielle de deux simples brins par complémentarité de bases est un outil puissant et utile en biologie moléculaire (voir section 7.7).

Contrôlez vos acquis L’ADN est une molécule double brin formant une double hélice mesurée en nombre de paires de bases. Les deux brins de la double hélice sont antiparallèles mais les séquences inversées répétées rendent possible la formation de structures secondaires. Les brins de la double hélice peuvent être dénaturés par la chaleur et se réhybrider par refroidissement. •

Expliquez la signification du mot antiparallèle en fonction de la structure double brin de l’ADN.

•

Définissez le terme complémentaire lorsqu’il est utilisé en référence aux brins d’ADN.

•

Définissez les termes dénaturation, réhybridation (ou annelage) et hybridation lorsqu’il s’agit d’acides nucléiques.



7.3 Structure de l’ADN : super-enroulement 173

de l’ADN : superm n7.3 Structure enroulement Une molécule d’ADN relâchée est une molécule contenant le nombre de tours d’hélice que l’on peut prédire à partir du nombre de paires de bases (voir figure 7.8). Si le chromosome d’Escherichia coli était rendu linéaire, il mesurerait plus d’1 mm de longueur, soit 400 fois plus que la taille d’Escherichia coli elle-même ! Comment est-il possible qu’autant d’ADN soit contenu dans un espace aussi petit ? Cela est rendu possible par une structure de l’ADN d’un « ordre supérieur », dans lequel l’ADN double brin est replié de manière dite super-enroulée. La figure 7.8 schématise la façon dont le super-enroulement se produit dans un ADN circulaire. Le superenroulement soumet la molécule d’ADN à une torsion, il peut se produire dans le sens positif ou dans le sens négatif. Un super-enroulement négatif a lieu lorsque l’ADN est enroulé autour d’un axe dans la direction opposée à celle de la double hélice droite. Il s’agit de la forme prédominante trouvée dans la nature, à quelques exceptions près chez les Archaea (voir ci-dessous). Comparés aux chromosomes des eucaryotes, ceux des procaryotes, malgré les protéines associées, sont considérés comme étant constitués d’ADN « nu ». Chez les eucaryotes, de nombreuses protéines sont fixées sur l’ADN de manière régulière : chaque chromosome eucaryote contient une molécule d’ADN linéaire (voir section 7.1) enroulée autour d’histones pour former des nucléosomes (voir figure 7.9). La formation des nucléosomes implique des super-enroulements négatifs de l’ADN. Les histones sont des protéines chargées positivement qui neutralisent les charges négatives de l’ADN (résultant des groupements phosphate). Les nucléosomes sont espacés de façon très régulière le long de l’ADN mais peuvent s’agréger pour former de la chromatine, qui elle-même, en se compactant, forme des structures très denses, les chromosomes. Ce sont ces chromosomes qui sont facilement visibles lors de la division cellulaire eucaryote (voir section 14.7).

(a) ADN circulaire relâché, clos par des liaisons covalentes Cassure d’un brin

Soudure Coupure simple brin

(b) ADN circulaire à coupure simple brin relâché Cassure d’un brin

Rotation de l’extrémité du brin coupé autour de l’hélice et soudure

(c) ADN circulaire super-enroulé

Protéines

Domaine super-enroulé

Les topoisomérases : ADN gyrase Il existe chez les Bacteria et la plupart des Archaea une enzyme appelée ADN gyrase qui introduit des superenroulements négatifs dans l’ADN. Ce processus peut se décomposer en plusieurs étapes : la molécule d’ADN circulaire se tord, une coupure se produit à l’endroit où les deux chaînes se rencontrent et finalement la double hélice coupée est ressoudée du côté opposé au brin intact (voir figure 7.10). L’ADN gyrase appartient aux topoisomérases II. Il faut noter que la plupart des antibiotiques affectant les Bacteria, tels que les quinolones (acide nalidixique), les fluoroquinolones (ciproflaxine) et la novobiocine, inhibent l’activité de l’ADN gyrase. Il semble que cette dernière inhibe également plusieurs espèces d’Archaea de la même manière. Une autre enzyme est capable de supprimer le super-enroulement de l’ADN. Cette enzyme, la topoisomérase I, provoque

(d) ADN chromosomique avec domaines super-enroulés FIGURE 7.8 ADN super-enroulé. (a), (b) et (c) Interconversions de l’ADN circulaire super-enroulé et relâché, et de l’ADN circulaire ayant subi une coupure simple brin. Une coupure simple brin correspond à la cassure d’un pont phosphodiester sur l’un des deux brins. (d) Dans la réalité, l’ADN double brin du chromosome bactérien est composé non pas d’un, mais de plusieurs domaines super-enroulés. Escherichia coli compterait pas moins de 50 domaines super-enroulés, chacun étant stabilisé par fixation à des protéines spécifiques.



174 Chapitre 7


La molécule d’ADN peut évoluer de l’état super-enroulé à l’état relâché par l’activité des topoisomérases. Ces processus complémentaires jouent un rôle important dans la biologie de la cellule. Le super-enroulement est en effet nécessaire pour contenir tout l’ADN dans la cellule et le relâchement, pour la réplication de l’ADN. Chez la plupart des procaryotes, le degré de super-enroulement négatif est le résultat de l’équilibre entre l’activité de l’ADN gyrase et de la topoisomérase I. Le super-enroulement affecte également l’expression des gènes : certains sont transcrits plus activement lorsque l’ADN est super-enroulé tandis que d’autres sont inhibés par un excès de super-enroulements.

ADN double brin

Nucléosome Histone H1

Archaea et réverse gyrase

Histones du cœur du nucléosome FIGURE 7.9 Formation d’un nucléosome par encapsidation de l’ADN autour d’un noyau protéique d’histones. Les nucléosomes sont assemblés le long de l’ADN comme les perles dans un collier. Cet assemblage est typique de l’ADN des cellules eucaryotes : les histones H2A, H2B, H3 et H4 forment un octamère protéique associé à une histone H1 autour desquels l’ADN s’enroule. Un nucléosome contient environ 200 paires de bases.

une coupure simple brin dans l’ADN et la rotation d’un brin autour de l’autre. Comme le montre la figure 7.8, une rupture dans un des brins permet à l’ADN de retourner à l’état relâché. Pour éviter que cela se produise à chaque coupure, le chromosome bactérien possède des domaines super-enroulés (voir figure 7.8d) : une cassure dans un de ces domaines ne relâche pas l’ADN dans les autres. Ce qui maintient l’ADN dans cette conformation n’est pas clairement identifié mais implique certainement des protéines spécifiques.

Quelques procaryotes contiennent une enzyme appelée réverse gyrase, une topoisomérase introduisant des superenroulements positifs dans l’ADN. Les organismes possédant cette enzyme appartiennent aux Archaea et à quelques Bacteria qui se développent à des températures extrêmes (hyperthermophiles, voir section 6.12 et chapitre 13). Methanothermus fervidus est un exemple intéressant d’Archaea hyperthermophile : cette bactérie possède des protéines ressemblant aux histones et forme des structures proches des nucléosomes dans lesquels l’ADN est superenroulé positivement (voir section 13.12). Le super-enroulement positif est probablement responsable de la non-dénaturation de l’ADN des hyperthermophiles à hautes températures. À quelques exceptions près, seuls les organismes se développant à des températures extrêmes possèdent une réverse gyrase, ce qui confirmerait l’hypothèse précédente. Cependant, comme dans toutes les cellules, l’information génétique, pour être utilisée, doit être accessible à la réplication et à la machinerie transcriptionnelle. En conséquence, que le super-enroulement soit contrôlé ou non par l’activité de l’ADN gyrase ou de la réverse gyrase, la structure de l’ADN dans la cellule reste dynamique.

Cassure du double brin par l’ADN gyrase

1. ADN circulaire relâché.

2. Une partie de l’ADN circulaire passe au-dessus de l’autre.

3. Un contact a lieu à deux endroits de l’hélice. Aucune torsion ne s’est encore effectuée.

Soudure du double brin cassé

4. Après action de l’ADN gyrase, une torsion (super-enroulement négatif) a été introduite.

5. ADN super-enroulé.

FIGURE 7.10 ADN gyrase. Introduction d’un super-enroulement négatif dans l’ADN circulaire par l’activité de l’ADN gyrase (topoisomérase II) qui provoque une cassure du double brin.



7.4 Chromosomes et autres éléments génétiques 175

TABLEAU 7.1

Contrôlez vos acquis Une molécule d’ADN de très longue taille peut être contenue dans une cellule grâce au super-enroulement. Chez les procaryotes, ce super-enroulement est le résultat de l’activité d’enzymes appelées des topoisomérases. Dans les chromosomes eucaryotes, l’ADN est enroulé autour de protéines appelées histones, formant des structures appelées nucléosomes. Chez les procaryotes, l’ADN gyrase est une enzyme clef introduisant des super-enroulements négatifs dans l’ADN. La réverse gyrase introduit des super-enroulements positifs. •

Pourquoi le super-enroulement est-il important ?

•

Quelles fonctions assurent les topoisomérases dans les cellules ?

•

De quelle manière les activités de l’ADN gyrase et de la réverse gyrase diffèrent-elles ?

m n

7.4 Chromosomes et autres éléments génétiques

Les éléments génétiques sont des structures contenant du matériel génétique (de l’ADN chez la plupart des organismes mais de l’ARN chez les virus). Le génome correspond à l’ensemble des gènes contenus dans une cellule ou un virus. Chez les procaryotes, bien que le principal élément génétique soit le chromosome, d’autres éléments existent et jouent des rôles importants dans le fonctionnement des gènes chez les procaryotes et les eucaryotes (voir tableau 7.1).

Le chromosome Un procaryote typique possède un unique chromosome circulaire contenant l’ensemble (ou la plupart) des gènes de la cellule (voir section 2.2). Il existe des exceptions : quelques procaryotes appartenant aux Bacteria et aux Archaea possèdent deux chromosomes (voir tableau 7.2). Le génome des eucaryotes, quant à lui, est composé de plusieurs chromosomes linéaires. Le tableau 7.2 indique le nombre, la taille et la configuration des chromosomes de quelques espèces procaryotes et eucaryotes. Notez que le chromosome de la bactérie Borrelia burgdorferi, agent responsable de la maladie de Lyme (voir section 27.4), est linéaire. Bien que peu communs, les chromosomes linéaires existent chez plusieurs autres Bacteria et notamment chez le genre Streptomyces, producteur d’antibiotiques (voir sections 12.24 et 30.5). Des informations plus détaillées sur les tailles et les caractéristiques des génomes microbiens sont disponibles au chapitre 15. Les exemples procaryotes listés dans le tableau 7.2 n’ont pas été choisis au hasard : ils incluent des espèces d’Archaea et de Bacteria ainsi que quelques-uns des plus petits et des plus grands chromosomes. Seuls quelques exemples de micro-organismes

DIFFÉRENTS TYPES D’ÉLÉMENTS GÉNÉTIQUES

Organisme Procaryote

Élément

Description

Chromosome

ADN double brin, extrêmement long et normalement circulaire

Plasmide

ADN double brin, relativement court, normalement circulaire, et extrachromosomique

Chromosome

ADN double brin, extrêmement long et linéaire

Plasmidea

ADN double brin circulaire ou linéaire, relativement court et extrachromosomique

Tous les organismes

Éléments transposables

Molécule d’ADN double brin (toujours à l’intérieur d’une autre molécule d’ADN)

Mitochondrie ou chloroplaste

Chromosome

Molécules d’ADN de taille intermédiaire, normalement circulaires

Virus

Génome

Molécule d’ADN ou d’ARN simple ou double brin

Eucaryote

a

Peu commun chez les eucaryotes.

eucaryotes ont également été cités. L’ADN linéaire des chromosomes eucaryotes possède à chaque extrémité une séquence appelée télomère et, entre elles, un centromère. Les centromères sont importants pour la scission des chromosomes durant la division cellulaire. Les télomères jouent un rôle important dans la réplication des molécules d’ADN linéaires (voir chapitre 14, sections 14.6 et 14.12). Les eucaryotes contiennent plus d’ADN que nécessaire pour encoder les protéines essentielles au fonctionnement cellulaire : seuls 3 % du génome humain sont codants alors que chez les Bacteria, cette proportion dépasse souvent les 90 %. Cet ADN supplémentaire est présent sous forme d’introns (voir figure 7.2) ou de séquences répétées, certaines des centaines de milliers de fois. Les micro-organismes eucaryotes possèdent moins d’introns que les eucaryotes « supérieurs » : chez la levure Saccharomyces cerevisiae, environ 70 % de l’ADN encodent des protéines. Les eucaryotes possèdent également de multiples copies de certains gènes, comme ceux encodant les ARN de transfert et les ARN ribosomiques. Ces derniers sont aussi répétés chez les procaryotes mais seulement en petit nombre.

Éléments génétiques non chromosomiques En plus du chromosome, la cellule contient nombre d’autres éléments génétiques, rassemblés sous le terme d’éléments génétiques non chromosomiques tels que les virus, les plasmides, les génomes des organelles et les éléments transposables.



176 Chapitre 7


TABLEAU 7.2

TAILLE, FORME ET NOMBRE DE CHROMOSOMES DE QUELQUES MICRO-ORGANISMES SÉLECTIONNÉS DANS CHAQUE DOMAINE DU VIVANT

Chromosome Organisme

Commentaires

Taille (Mpb)a

Nombre

0,58

1

Géométrie

Bacteria Mycoplasma genitalium

Plus petit génome connu appartenant aux Bacteria

b

Borrelia burgdorferi

Responsable de la maladie de Lyme (voir chapitre 27)

0,91

1

Haemophilus influenzae

Gram négatif, responsable de maladies (voir chapitre 26)

1,83c

1

d

4,00

2

Rhodobacter sphaeroides

Gram négatif, phototrophe

Bacillus subtilis

Gram positif, modèle génétique

4,21

1

Escherichia coli K-12

Gram négatif, modèle génétique

4,64e

1

Streptomyces coelicolor

Actinomycète, producteur d’antibiotiques (voir chapitre 12)

8,66

1

Nanoarchaeum equitans

Parasite d’Ignicoccus (voir chapitres 13 et 15)

0,49

1

Methanococcus jannaschii

Méthanogène, croît à haute température (voir chapitres 6 et 13)

1,66

1

Pyrococcus abyssi

Croît à haute température (voir chapitres 6 et 13)

1,77

1

Halobacterium sp. NRC1

Croît dans des concentrations élevées en sel (voir chapitres 6 et 13)

2,57f

3

Sulfolobus solfatarius

Croît à haute température et à pH acide (voir chapitres 6 et 13)

2,99

1

Giardia lamblia

Protozoaire flagellé responsable de gastro-entérites aiguës (voir chapitre 14)

12,00

4

Saccharomyces cerevisiae

Levure très utilisée en sciences et en industries (voir chapitres 14 et 30)

12,06h

16

Dictyostelium discoideum

Moisissure glaireuse, modèle développemental (voir chapitre 14)

34,0

6

Tetrahymena thermophila

Protozoaire cilié (voir chapitre 14)

210,0

5

Archaea

Eukaryag

a

Mpb = mégapaires de bases. Dans le cas des Eukarya, la taille du génome et le nombre de chromosomes correspondent à la forme haploïde. (Tous les génomes procaryotes listés ont été complètement séquencés.) b Correspond au chromosome linéaire. Le génome de cet organisme contient également au moins dix-sept plasmides linéaires et circulaires qui, combinés, ont une taille de plus de 0,5 Mpb. c La souche Rd d’Haemophilus influenzae a été le premier organisme dont le génome a été entièrement séquencé. d Le chromosome I fait 3,1 Mpb et le chromosome II, 0,90 Mpb. La souche séquencée contient également cinq plasmides. e La séquence rapportée ici ne contient pas le plasmide F (voir section 10.9) ni celui du bactériophage lambda (voir section 9.11), lesquels seraient normalement présents chez une souche K-12 typique. f Il existe un grand chromosome de 2,01 Mpb et deux minichromosomes de 0,19 et 0,37 Mpb. g Tous les organismes listés sont unicellulaires. h Saccharomyces cerevisiae a été le premier eucaryote dont le génome a été séquencé. Le nombre donné ici n’inclut ni le génome mitochondrial ni l’ensemble des copies de certaines séquences répétées.

Les virus contiennent des génomes ADN ou ARN qui contrôlent leur réplication et leur transfert de cellule en cellule. Le génome viral, contenant les gènes essentiels au virus et non pas à la cellule hôte, est également appelé chromosome bien qu’il soit fonctionnellement différent des chromosomes cellulaires. Il existe des chromosomes viraux circulaires et linéaires. Les virus présentent un intérêt particulier puisqu’ils sont souvent responsables de maladies (voir chapitres 9 et 16 sur les virus, et chapitres 26 et 27 pour les maladies virales).

Les plasmides sont des éléments génétiques qui existent et se répliquent indépendamment du chromosome. La grande majorité des plasmides sont des ADN double brin circulaires bien qu’il en existe des linéaires. Les plasmides diffèrent des virus : 1) parce qu’ils ne causent aucun dommage cellulaire (ils sont généralement bénéfiques) et 2) parce qu’ils ne possèdent pas de formes extracellulaires. Les plasmides sont présents chez quelques eucaryotes et chez la plupart des procaryotes où ils peuvent être d’une grande importance pour la biologie de l’organisme (voir chapitre 10).



7.5 Réplication de l’ADN : modèles et enzymes 177

Beaucoup de procaryotes contiennent un ou plusieurs plasmides en plus de leur chromosome. Certains plasmides contiennent des gènes codant des protéines conférant à la cellule hôte des propriétés particulières telles que la résistance aux antibiotiques. Quelle est donc la différence entre un grand plasmide et un chromosome ? Le chromosome contient les gènes indispensables au fonctionnement cellulaire : les gènes de ménage. Ces gènes encodent des protéines essentielles telles que les ADN et ARN polymérases et les ARN ribosomiques et de transfert. En comparaison, les plasmides sont souvent extensibles et ne contiennent pas de gènes nécessaires à la croissance. Il existe de nombreux gènes chromosomiques non indispensables, mais pour qu’un élément génétique soit appelé chromosome, il faut qu’il contienne des gènes essentiels. La majorité des organelles cellulaires eucaryotes sont des mitochondries et des chloroplastes, qui contiennent chacun un petit chromosome. Ces organelles ne possèdent pas seulement de l’ADN mais aussi une machinerie complète pour la synthèse protéique incluant des ribosomes, des ARN de transfert et tous les autres composants nécessaires pour la traduction et la formation de protéines fonctionnelles. Ces organelles partagent plusieurs caractéristiques avec les procaryotes auxquels elles sont reliées phylogénétiquement (voir sections 2.3 et 14.4). Les éléments transposables sont des molécules d’ADN mobiles présentes chez les procaryotes et les eucaryotes et jouant un rôle important dans la variation génétique. Chez les procaryotes, ces éléments sont de trois types : séquences d’insertion, transposons et certains virus particuliers. Les séquences d’insertion sont les éléments transposables les plus simples et ne portent pas d’information génétique autre que celle nécessaire à leurs déplacements alors que les transposons sont plus grands et contiennent d’autres gènes (voir chapitre 10). Mu est un virus bactérien qui est lui-même un élément transposable et sera évoqué au chapitre 16. Le point commun à tous ces éléments transposables est qu’ils se répliquent en s’associant à une autre molécule d’ADN.

Contrôlez vos acquis Il existe un certain nombre d’autres éléments génétiques en plus du chromosome. Les plasmides sont des molécules d’ADN existant séparément du chromosome dans la cellule. Les mitochondries et les chloroplastes contiennent leurs propres chromosomes. Les virus contiennent un génome ADN ou ARN qui contrôle leur réplication. Les éléments transposables existent en tant qu’autres éléments génétiques. •

Qu’est-ce qu’un génome ?

•

Quel matériel génétique trouve-t-on dans un chromosome cellulaire ?

•

Qu’est-ce qui définit un chromosome procaryote ?

III

RÉPLICATION DE L’ADN

Le flux d’informations biologiques commence avec la réplication de l’ADN qui est nécessaire à la division cellulaire, à la reproduction des organismes unicellulaires ou à la multiplication cellulaire chez les organismes pluricellulaires. Le processus de réplication doit être hautement fidèle de manière à ce que la cellule fille soit génétiquement identique à la cellule mère. Ceci implique un hôte où se déroulent les processus et contenant des enzymes cellulaires particulières.

de l’ADN : m n7.5 Réplication modèles et enzymes L’ADN cellulaire existe sous la forme d’une double hélice avec complémentarité de bases (voir figures 7.3 et 7.4). La réplication est semi-conservative : les doubles hélices résultantes sont constituées d’un brin nouvellement formé, complémentaire du brin matriciel, et d’un brin parental (ou brin matriciel) [voir figure 7.11]. La chimie de l’ADN, la nature de ses précurseurs ainsi que les activités enzymatiques impliquées dans la réplication imposent des limitations quant à la manière dont est synthétisé un nouveau brin. Le précurseur de chaque nucléotide est un nucléoside 5’-triphosphate dont deux phosphates sont éliminés et le troisième fixé de façon covalente à la chaîne en croissance (voir figure 7.12). L’addition d’un nouveau nucléotide requiert la présence d’un groupement hydroxyle libre, seulement disponible à l’extrémité 3’ de la molécule d’ADN. Cette restriction est à la base d’un principe important de la réplication : la réplication de l’ADN se déroule toujours dans le sens 5’ → 3’, le phosphate en 5’ du nucléotide arrivant se fixant à l’extrémité 3’-OH du nucléotide précédemment ajouté.

5′ 3′

Réplication semi-conservative

5′ 3′

5′ 3′

Brin parental +

Nouveau brin

FIGURE 7.11 Vue d’ensemble de la réplication de l’ADN. La réplication de l’ADN est un processus semi-conservatif chez les procaryotes et les eucaryotes. Chaque nouvelle double hélice contient un brin nouvellement formé et un brin parental.



178 Chapitre 7

Bases de biologie moléculaire Amorce ARN

–O P

H

H

O –O P O O H 2C H

H

H

Contrôlez vos acquis Base H

3′

OH

FIGURE 7.13 L’amorce ARN. Structure du complexe ARN/ADN pour initier la synthèse d’ADN.

H

O

5′

Endroit de l’élongation

Base H

3′

5′

ADN

O

5′

H2C

3′-OH

PPP-5′ 3′

O

O

ADN

H

ADN polymérase

H –H2O OH O P

Désoxyribonucléotide triphosphate

Les deux brins de la double hélice d’ADN servent de modèle pour la synthèse de nouveaux brins (réplication semi-conservative). Les deux brins « fils » contiennent chacun un brin parental et un brin nouvellement synthétisé. L’élongation des nouveaux brins se fait par addition à l’extrémité 3’. L’ADN polymérase nécessite une amorce, celle-ci est composée d’ARN.

O O P

O

OH

H2C

O

5′

H

H

O O P

OH

OH

À quelle extrémité (5’ ou 3’) d’un brin d’ADN nouvellement synthétisé la polymérase ajoute-t-elle une base ?

•

Pourquoi la réplication de l’ADN nécessite-t-elle une amorce ?

Base H

H

3′

OH

•

H

FIGURE 7.12 Structure du brin d’ADN et élongation par addition d’un désoxyribonucléoside triphosphate à l’extrémité 3’. L’élongation de l’ADN se réalise de l’extrémité 5’ vers celle en 3’ et l’ADN polymérase catalyse cette réaction. Les quatre désoxyribonucléotides servant de précurseurs sont la désoxythymidine triphosphate (dTTP), la désoxyadénosine triphosphate (dATP), la désoxyguanosine triphosphate (dGTP) et la désoxycytidine triphosphate (dCTP). Lors de l’insertion d’un nucléotide, deux des trois phosphates sont éliminés pour former un pyrophophate (PPi). Deux ponts phosphates riches en énergie sont alors consommés.

de l’ADN : la fourche m n7.6 Réplication de réplication

L’ADN polymérase et la primase

L’initiation de la synthèse d’ADN et les brins avancé/retardé

Les enzymes catalysant l’addition des nucléotides sont des ADN polymérases de plusieurs sortes avec des fonctions bien spécifiques. Toutes les polymérases connues synthétisent de l’ADN dans le sens 5’ → 3’ mais sont incapables de le synthétiser de novo : elles ne peuvent ajouter un nucléotide qu’à un groupement 3’-OH préexistant. Débuter la synthèse d’une nouvelle chaîne d’ADN nécessite donc la présence d’une amorce nucléotidique à laquelle la polymérase pourra fixer le premier nucléotide. Dans la plupart des cas, cette amorce est un court fragment d’ARN. Lors de l’ouverture de la double hélice au début de la réplication, une enzyme, la primase, catalyse la synthèse de l’amorce ARN. Cette amorce est un court fragment (< 15 nucléotides) d’ARN complémentaire de l’ADN matriciel, terminé par un groupement 3’-OH libre auquel la polymérase pourra attacher le premier désoxyribonucléotide. L’élongation de la molécule se fait donc sous forme d’ADN et non d’ARN (voir la structure montrée figure 7.13). L’amorce sera ensuite enlevée et remplacée par de l’ADN (voir plus loin).

L’étude d’Escherichia coli a permis d’obtenir nombre d’informations sur la réplication de l’ADN des Bacteria. Chez les Archaea, bien que l’ADN soit circulaire, les mécanismes de la réplication ressemblent plus à ceux des cellules eucaryotes qu’à ceux des Bacteria. Ceci soulève encore la question de l’affiliation phylogénétique entre les Archaea et les Eukarya (voir section 2.3).

Chez les procaryotes, la synthèse d’ADN débute à un endroit précis du chromosome : l’origine de réplication. L’origine de réplication est une séquence spécifique d’environ 300 paires de bases reconnue par des protéines d’initiation dont une qui ouvre la double hélice pour rendre les brins accessibles à la machinerie réplicationnelle. La réplication de l’ADN commence alors sur les deux simples brins. Au fur et à mesure que la réplication se poursuit, le site de réplication, appelé fourche de réplication, se déplace le long de l’ADN (voir figure 7.14). Escherichia coli possède cinq ADN polymérases différentes : les ADN polymérase I, II, III, IV et V. L’ADN polymérase III (Pol III) est la première à agir au niveau de la fourche de réplication où sont également présentes plusieurs autres enzymes (voir tableau 7.3). Les hélicases déroulent la double hélice d’ADN, mettant ainsi à jour une petite région d’ADN simple brin. Ces enzymes sont ATP-dépendantes, elles avancent le long de l’hélice et séparent les brins à l’avant de la fourche de réplication (voir figures 7.14 et 7.15). La région simple brin générée est complexée avec une protéine de liaison simple brin,



7.6 Réplication de l’ADN : la fourche de réplication 179 5′ Amorce ARN

Fourche de réplication

Brin retardé

Hélicase

Primase Protéine de liaison à l’ADN simple brin

3′ 5′

ADN polymérase III

Hélicase

Extrémité 3’-OH libre

Brin avancé Amorce ARN

3′

5′

FIGURE 7.14 Schéma fonctionnel d’une fourche de réplication de l’ADN. Les deux brins d’ADN sont antiparallèles et de polarité inverse. Les ribonucléotides triphosphates sont les substrats de la primase et les désoxyribonucléotides triphosphates, ceux de l’ADN polymérase. La protéine de liaison à l’ADN simple brin maintient l’hélice déroulée après le passage de l’ADN hélicase. Comparez avec la figure 7.19 qui montre le complexe protéique du réplisome.

qui stabilise l’ADN afin d’éviter la formation de liaisons hydrogène intra-brin et le retour à la structure en double hélice. La réplication de l’ADN se déroule toujours dans le sens 5’-phosphate vers 3’-hydroxyle (addition d’un nouveau

TABLEAU 7.3

ENZYMES MAJEURES IMPLIQUÉES DANS LA RÉPLICATION DE L’ADN

Enzyme

Gènes

Fonction

ADN polymérase III

polC ; dnaE, Q, N, X ; holA-E ; mutD

Principales enzymes de polymérisation

ADN polymérase I

polA

Excise l’amorce ARN et remplit les trous

Hélicase

dnaB

Déroule la double hélice à la fourche de réplication

Primase

dnaG

Amorce les nouveaux brins d’ADN

Protéine se liant à l’origine de réplication

dnaA

Se fixe à l’origine de la réplication ; facilite la fusion pour ouvrir le complexe

Protéine se liant à l’ADN simple brin

ssb

Empêche le réappariement des brins de l’hélice ouverte

ADN ligase

ligA, ligB

Soude les coupures dans l’ADN

FIGURE 7.15 ADN hélicase déroulant une double hélice. Sur cette figure, les protéines et l’ADN sont dessinés à l’échelle. Les diagrammes généralement utilisés donnent une idée des événements moléculaires ayant lieu dans la cellule, mais donnent souvent l’impression trompeuse que la plupart des protéines sont relativement petites comparées à l’ADN.

nucléotide à l’extrémité 3’-OH de la chaîne en croissance) ce qui génère une différence importante dans la réplication des deux brins comme le montre la figure 7.14. Sur le brin en croissance dans le sens 5’ → 3’, appelé brin avancé, la synthèse d’ADN est continue : il y a toujours un groupement 3’-OH libre au niveau de la fourche de réplication auquel un nouveau nucléotide pourra être ajouté. Sur le brin opposé, le brin retardé, la synthèse d’ADN est discontinue (il n’y a pas de 3’-OH libre). Où se trouve l’extrémité 3’-OH sur ce brin ? Elle se trouve à l’extérieur de la fourche de réplication. Sur le brin retardé, la primase doit donc synthétiser plusieurs amorces ARN au contraire du brin avancé où une seule amorce est nécessaire. Après la synthèse de l’amorce, la primase est remplacée par la polymérase III. Cette enzyme est constituée d’un complexe de dix protéines comprenant le complexe du noyau polymérase lui-même. Les autres protéines fonctionnent comme un système d’attache maintenant la polymérase sur chacun des brins matriciels et participent à l’assemblage du réplisome (voir plus loin). La polymérase III ajoute des désoxyribonucléotides triphosphates jusqu’à atteindre un ADN précédemment synthétisé (voir figure 7.16). L’ADN polymérase I (Pol I) prend alors le relais. En plus de synthétiser de l’ADN, Pol I possède une activité exonucléasique 5’ → 3’ qui supprime l’amorce ARN (voir figure 7.16). Lorsque l’amorce a été enlevée et remplacée par de l’ADN, Pol I est relâchée. L’ADN ligase met alors en place une liaison phosphodiester finale. Cette enzyme est capable de ressouder des ruptures dans les ADN qui possèdent une extrémité 5’-phosphate et une extrémité 3’-OH et elle participe également, comme Pol I, à la réparation de l’ADN.



180 Chapitre 7

Bases de biologie moléculaire ADN polymérase III

Origine de réplication

3′ 5′

5′ 3′ 3′-OH

Amorce d’ARN

5′-P

(a)

(b)

ADN polymérase I

ADN nouvellement synthétisé

Fourche de réplication Structure θ

(c) 3′-OH 5′-P

ADN ligase

(d)

5′ 3′

3′ 5′ (e)

FIGURE 7.16 Assemblage de deux fragments sur le brin retardé. (a) Sur le brin retardé, l’ADN polymérase III synthétise l’ADN dans le sens 5’ → 3’ vers l’amorce d’ARN du fragment précédemment synthétisé. (b) Lorsque le précédent fragment est atteint, l’ADN polymérase I remplace l’ADN polymérase III. (c) L’ADN polymérase I continue la synthèse de l’ADN pendant qu’elle enlève l’amorce d’ARN du précédent fragment. (d) L’ADN ligase remplace l’ADN polymérase I après que l’amorce a été enlevée. (e) L’ADN ligase soude les deux fragments ensemble.

La réplication bidirectionnelle et le réplisome Chez Escherichia coli, comme probablement chez tous les procaryotes contenant un chromosome circulaire, la réplication est bidirectionnelle (voir figures 7.17 et 7.18) : deux fourches de réplication progressent dans deux directions opposées formant des structures caractéristiques, les structures thêta

FIGURE 7.17 Réplication de l’ADN circulaire : structure thêta. Dans l’ADN circulaire, la réplication bidirectionnelle conduit à la formation d’intermédiaires de réplication ressemblant à la lettre grecque thêta (θ).

(voir figure 7.17). La plupart des grandes molécules d’ADN procaryotes ou eucaryotes possèdent une réplication bidirectionnelle à partir d’origines fixes (un chromosome eucaryote possède plusieurs origines de réplication). Lors de la réplication, la synthèse d’ADN a lieu de manière avancée et retardée sur chacun des brins matriciels (voir figure 7.18). La synthèse d’ADN bidirectionnelle permet à la réplication de se dérouler le plus rapidement possible. Même en tenant compte de cette remarque et en considérant que Pol III peut ajouter 1 000 nucléotides par seconde, la réplication du chromosome d’Escherichia coli prend tout de même 40 minutes.

Origine de réplication (site de fixation de la DnaA) Fourche de réplication 3′

5′

5′

3′

Brin retardé Brin avancé

3′

5′

5′

3′

Brin avancé Brin retardé

3′ 5′

5′ 3′ Sens de réplication

Sens de réplication Origine de réplication

Fourche de réplication

FIGURE 7.18 Double fourche de réplication dans le chromosome circulaire. Au site d’initiation d’une réplication bidirectionnelle, deux fourches réplicatives peuvent être initiées. Il est donc nécessaire que deux amorces se fixent sur les brins précoces, une dans chaque sens. Chez Escherichia coli, la fixation d’une protéine spécifique, la DnaA (voir tableau 7.3) permet d’identifier l’origine de réplication.



7.6 Réplication de l’ADN : la fourche de réplication 181

Dans les meilleures conditions, le temps de génération (doublement de population) d’E. coli est de 20 minutes alors que la réplication du chromosome prend toujours 40 minutes. La solution à cette énigme est que les cellules d’E. coli en croissance possèdent plusieurs fourches de réplication : une nouvelle réplication de l’ADN démarre avant que la précédente ne soit terminée. C’est la seule façon de maintenir un temps de génération plus court que le temps nécessaire à la réplication du chromosome.

Le réplisome Le déroulement de l’ADN par l’activité des topoisomérases (voir section 7.3) est une des étapes essentielles de la réplication. Lorsque l’ADN est super-enroulé, il se déroule plus facilement du fait de la tension. En régulant le degré de super-enroulement, les topoisomérases régulent donc le processus de réplication (et aussi de transcription comme nous le verrons plus loin). La figure 7.14 montre la différence de réplication des brins avancé et retardé ainsi que les enzymes impliquées. D’après ce schéma simplifié, il apparaîtrait que chaque fourche de réplication contiendrait une multitude de protéines agissant indépendamment. Dans la réalité, ce n’est pas le cas : les protéines impliquées dans ce processus fonctionnent de façon dynamique et s’associent pour former un large complexe appelé le réplisome (voir figure 7.19). Le brin d’ADN retardé se réenroule plus loin pour permettre au réplisome d’avancer doucement sur chacun des brins en faisant passer l’ADN à travers lui (voir figure 7.19). Ce n’est donc pas l’ADN polymérase qui se déplace pendant la réplication mais bien l’ADN. Il faut également noter que l’hélicase et la primase forment un complexe (le primosome) leur permettant de travailler en étroite association dans le processus de réplication (voir figure 7.19). En résumé, le réplisome contient, en plus de la polymérase, plusieurs protéines clés de réplication : 1) l’ADN gyrase, qui

supprime les super-enroulements ; 2) les ADN hélicase / primase (le primosome), qui déroulent et amorcent l’ADN ; et 3) les protéines de liaison simple brin, qui empêchent les brins séparés de reformer la double hélice (voir figure 7.19). Le tableau 7.3 résume les propriétés des protéines essentielles impliquées dans la réplication.

La fidélité de la réplication de l’ADN : correction des erreurs d’élongation (proofreading) Des erreurs dans la réplication introduisent des mutations, c’està-dire des changements dans la séquence ADN. Les taux de mutation cellulaires sont remarquablement bas, entre 10–8 et 10–11 erreurs par paire de bases insérée. Cette exactitude est rendue possible en partie parce que la polymérase a deux possibilités pour incorporer la bonne base à un site donné. La première est consécutive aux règles de l’appariement de bases, A avec T et G avec C, sur le modèle du brin matriciel et la deuxième, à l’activité correctrice des enzymes Pol I et III (voir figure 7.20). Comment fonctionne cette correction des erreurs d’élongation ? Pol I et III possèdent en plus de leur rôle d’insertion des nucléotides, une activité exonucléasique 3’ → 5’ (exo signifie « au dehors ») qui leur permet d’enlever un nucléotide mal apparié et de le remplacer par le bon nucléotide. Cette correction des erreurs se produit lorsqu’une base incorrecte a été insérée, créant ainsi une discordance dans l’appariement des bases. La polymérase est « avertie » du problème parce qu’un nucléotide mal inséré est incapable de former une liaison hydrogène stable avec son complémentaire. Cette activité correctrice donne à la polymérase une seconde chance pour insérer la bonne base. L’activité exonucléasique correctrice diffère de l’activité exonucléasique 5’ → 3’ de Pol I qui l’utilise pour enlever l’amorce ARN des brins avancé et retardé (voir figure 7.16). Seule Pol I possède cette activité. La correction des erreurs d’élongation se déroule dans les systèmes de réplication procaryotes, eucaryotes

Brin nouvellement synthétisé

ADN polymérase III sur le brin avancé

5′ 3′ Amorce ARN

ADN hélicase ADN primase

Brin avancé servant de matrice

ADN polymérase III sur le brin retardé

Primosome

ADN gyrase 5′

Protéines de liaison à l’ADN simple brin

3′′

ADN parental 3′

5′

5′

5′

Brin nouvellement synthétisé

Amorce ARN Brin retardé servant de matrice

FIGURE 7.19 Le réplisome. Le réplisome est constitué de deux copies d’ADN polymérase III, d’une hélicase et d’une primase (formant ensemble le primosome), et de plusieurs copies de protéines de liaison à l’ADN simple brin. En amont du réplisome, l’ADN gyrase déroule la super-hélice de l’ADN pour qu’il puisse être répliqué. Notez la manière dont le brin retardé servant de matrice se réenroule plus loin afin d’écarter les constituants du réplisome les uns des autres et de pouvoir continuer à avancer.




Liaison hydrogène normale

3′

T

A

T

A

T

C

G

G

C

G

C

A

3′

5′ G

C

A

T

A

A

T

A

T

C

G

C

G

G

C

G

C

C

A C

Mauvais appariement de bases

(a)

3′

T

G

A

3′

(b)

A

C

G

A

T

T

A

C

ADN polymérase III

A

C

T

3′

G

C

A

C T

5′ G

C

T

A

C

G

Liaison hydrogène anormale

5′ G

G

182 Chapitre 7

T

(c)

FIGURE 7.20 Autocorrection par l’activité exonucléasique 3’→ 5’ de l’ADN polymérase III. (a) Un mauvais appariement de bases provoque l’arrêt momentané de la polymérase et le déclenchement de l’autocorrection (b) par excision du nucléotide mal apparié et son remplacement par la base adéquate (c) grâce à l’activité de la polymérase.

et viraux. De nombreux organismes possèdent d’autres mécanismes de réduction des erreurs de réplication (voir chapitre 10).

La terminaison et la réplication Les détails du processus de terminaison de la réplication ne sont pas complètement connus. Il est cependant clair que certaines séquences ADN et plusieurs protéines sont impliquées dans ce processus. Lorsque la réplication d’un chromosome circulaire est terminée (voir figure 7.17), les deux molécules obtenues sont reliées ensemble, comme les maillons d’une chaîne. Elles pourront être séparées par une topoisomérase. Le chapitre 6 a souligné comment la synthèse de la paroi cellulaire et la réplication de l’ADN étaient couplées à la division cellulaire (voir section 6.2). Il est évidemment essentiel qu’après la réplication, l’ADN soit partitionné pour que chaque cellule fille reçoive une copie du chromosome. Ce processus est assisté par une protéine FtsZ qui dirige plusieurs événements du processus de division cellulaire (voir section 6.2).

Contrôlez vos acquis La synthèse d’ADN débute en un endroit précis, l’origine de réplication. La double hélice est déroulée par l’hélicase et stabilisée par des protéines de liaison simple brin. L’élongation de l’ADN se déroule de façon continue sur le brin avancé et discontinue sur le brin retardé. La plupart des erreurs d’appariement sont corrigées par la fonction de correction des erreurs d’élongation associée aux autres activités des ADN polymérases. •

Pourquoi y a-t-il des brins avancés et retardés ?

•

Qu’est-ce que le réplisome et que sont ses composants ?

•

Pourquoi la correction des erreurs d’élongation est-elle aussi importante dans les cellules ?

IV

OUTILS DE MANIPULATION DE L’ADN

de restriction m n7.7 Enzymes et hybridation Les cellules procaryotes contiennent typiquement une ou plusieurs enzymes capables de modifier chimiquement l’ADN. Les plus importantes de ces enzymes sont les endonucléases de restriction encore appelées enzymes de restriction. Alors que de tels systèmes sont répandus parmi les procaryotes (Bacteria et Archaea), ils sont très rares chez les eucaryotes. Les enzymes de restriction reconnaissent certaines séquences d’ADN et les coupent. Ces enzymes sont essentielles pour manipuler l’ADN in vitro, leur découverte a donné naissance au domaine du génie génétique (voir chapitre 31).

Le mécanisme des enzymes de restriction La majorité des endonucléases de restriction sont des enzymes de restriction de type II. La plupart des séquences ADN reconnues par ces enzymes possèdent une double symétrie autour d’un point donné. La figure 7.21 montre la séquence reconnue et coupée par l’endonucléase de restriction d’Escherichia coli EcoRI (cet acronyme provient d’Escherichia coli, enzyme de restriction I). Les sites de coupure sont indiqués par une flèche et l’axe de symétrie par une ligne en pointillé. Notez que les deux brins ont la même séquence si l’un est lu depuis la gauche et l’autre depuis la droite (ou en termes de brins polynucléotidiques, si les deux sont lus dans le sens 5’ → 3’ ou dans le sens 3’ → 5’). Un tel modèle de séquence est appelé un palindrome (le terme palindrome est dérivé du grec « en retour et course »). La plupart des enzymes de restriction sont des protéines homodimériques composées de deux sous-unités polypeptidiques identiques qui reconnaissent et coupent l’ADN sur l’un des brins. Les séquences reconnues sont typiquement courtes



7.7 Enzymes de restriction et hybridation 183

TABLEAU 7.4

CH3

5′ 3′

G–A–A–T–T–C

3′

5′

C–T–T–A–A–G

5′

3′

G–A–A–T–T–C

PAR QUELQUES ENDONUCLÉASES

C–T–T–A–A–G

5′

DE RESTRICTION

CH3 A–A

5′

–G

3′

–C –T–

(a)

SÉQUENCES RECONNUES

3′

Organisme

(b) –T–

T–A

T–

–A

C–

3′

G–

5′

Extrémités cohésives des simples brins

FIGURE 7.21 Restriction et modification de l’ADN. (a) (Haut de la figure) Séquence d’ADN reconnue par l’endonucléase de restriction Eco RI. La flèche rouge indique les liaisons coupées par l’enzyme et la ligne en pointillé, l’axe de symétrie de la séquence. (Bas de la figure) Après coupure par l’enzyme de restriction EcoR1, l’ADN présente des extrémités cohésives sur les simples brins (voir section 10.15). (b) Séquence identique après modification par l’EcoR1 méthylase. Les groupements méthyles ajoutés par l’enzyme protègent l’ADN de la coupure par EcoR1.

et palindromiques de sorte que les coupures soient double brin, libérant ainsi de courtes régions d’ADN simple brin au lieu de couper l’ADN et de produire des extrémités franches (voir figure 7.21). Les séquences et sites de coupure de quelques enzymes de restriction sont présentés dans le tableau 7.4. Plus de 2 000 enzymes de restriction avec plus de 200 spécificités différentes sont actuellement connues mais les recherches continuent pour en identifier d’autres. L’enzyme EcoRI peut couper n’importe quel ADN double brin contenant sa séquence de reconnaissance mais elle ne coupera que cette séquence. Une séquence spécifique de six paires de bases, telle que celle coupée par EcoRI (voir figure 7.21), apparaîtrait environ tous les 4 096 nucléotides dans le génome (six bases avec quatre possibilités, 46) étant donné que la séquence de l’ADN est aléatoire. Comme nous l’aborderons dans les chapitres 10 et 31, de tels fragments avec des extrémités ainsi définies ont de nombreux usages, particulièrement dans les technologies de clonage de gènes. Les enzymes de restriction sont largement commercialisées du fait de leur importance pour la recherche en génétique moléculaire.

Les modifications : une protection contre la restriction La fonction majeure des enzymes de restriction chez les procaryotes est probablement de protéger la cellule contre les invasions d’ADN étrangers (comme les ADN viraux) en les détruisant. La cellule doit cependant protéger son propre ADN de la destruction par ses propres enzymes. Cette protection est assurée par un système enzymatique qui modifie chimiquement la séquence de reconnaissance en méthylant certaines bases, de manière à ce que l’enzyme de restriction ne puisse plus s’y fixer. Par exemple, la séquence reconnue par EcoRI (voir figure 7.21a) peut être modifiée par méthylation de ses deux adénines les plus internes (voir figure 7.21b). L’enzyme

Enzyme dénominationa

Séquence reconnueb

Bacillus globigii

BglII

A↓GATCT

Bacillus subtilis

BsuRI

GG↓CC

Brevibacterium albidum

BalI

TGG↓CCA

*

*

*

Escherichia coli

EcoRI

G↓AATTC c

Haemophilus haemolyticus

HhaI

GCG↓C


HindII

GTPy↓PuAC


HindIII

A↓AGCTT

Klebsiella pneumoniae

KpnI

GGTAC↓C

Nocardia otitidiscaviarum

NotI

GC↓GGCCGC

Proteus vulgaris

PvuI

CGAT↓CG

Serratia marcescens

SmaI

CCC↓GGG

Thermus aquaticus

TaqI

T↓CGA

*

*

*

*

a

Nomenclature : la première lettre de l’abréviation désigne le genre dont l’enzyme est originaire ; les deux suivantes, l’espèce. Le chiffre romain indique l’ordre dans lequel les enzymes de cet organisme ont été découvertes, et les lettres additionnelles désignent les souches. b Les flèches désignent les sites des attaques enzymatiques. Les astérisques désignent les sites de méthylation (modification). G, guanine ; C, cytosine ; A, adénine ; T, thymine ; Pu, purine ; Py, pyrimidine. Seule la séquence 5' → 3' est montrée. c Voir figure 7.21a.

catalysant cette réaction est la EcoRI méthylase. Si un seul brin est modifié, la séquence n’est plus un substrat pour l’enzyme de restriction EcoRI.

L’électrophorèse et l’analyse de restriction de l’ADN Les séquences reconnues par les enzymes de restriction ont une taille de 4 à 8 nucléotides (voir tableau 7.4), il n’y en aura donc qu’un nombre limité dans une molécule d’ADN (voir figure 7.23). Après coupure de l’ADN, les fragments générés peuvent être séparés par électrophorèse sur gel et analysés. L’électrophorèse est un procédé par lequel des molécules chargées migrent dans un champ électrique en fonction de leur charge, de leur taille et de leur forme. Dans un gel d’électrophorèse (voir figure 7.22a) les molécules sont séparées dans de l’agarose. Lorsqu’un courant électrique est appliqué, les acides nucléiques (qui sont chargés négativement) vont migrer à travers le gel, les petites molécules migrant plus vite que les grandes. Après avoir migré, le gel peut être « coloré » à l’aide d’un composé capable de se fixer à l’ADN, comme le bromure d’éthidium (voir section 10.3), et qui va le rendre fluorescent sous UV (voir figure 7.22b). La figure 7.22b montre un gel d’agarose typique : le puits A contient un ADN standard et les autres puits, de l’ADN purifié (dans ce cas, un plasmide) digéré par une ou plusieurs enzymes de restriction. Le profil de digestion d’un ADN est reproductible



(a)

– A

B

C

D

Taille (paires de bases) 5 000 — 4 000 —

Alex Lim, Eileen Dimalanta, et David C. Schwartz


Elizabeth Parker

184 Chapitre 7

FIGURE 7.23 Cartographie des fragments de restriction par microscopie à fluorescence. Observation en microscopie à fluorescence d’une portion du chromosome d’Escherichia coli digéré par l’enzyme de restriction Xho1 (isolée de Xanthomonas holica). Les flèches indiquent les sites de coupure de l’enzyme. La fluorescence du brin d’ADN est visible alors qu’il est trop petit pour être observé par microscopie optique. Sur cette figure, la taille du fragment d’ADN est d’environ 260 kpb. La cartographie par microscopie à fluorescence a été utilisée pour établir des cartes de restriction des chromosomes entiers d’E. coli et d’autres bactéries telles que Deinococcus radiodurans.

3 000 — 2 000 —

classification des micro-organismes. Les profils générés suite à l’utilisation d’enzymes de restriction seules ou en combinaison, permettent d’interpréter facilement les liens existant entre différentes molécules d’ADN (voir section 11.11).

1 800 —

500 —

+

Jack Parker

1 000 —

(b) FIGURE 7.22 Électrophorèse de l’ADN sur gel d’agarose. (a) Les échantillons d’ADN sont déposés dans les puits d’un gel d’agarose immergé dans une solution de migration. (b) Photographie d’un gel d’agarose après révélation. L’ADN a été déposé dans les puits situés en haut du gel (pôle négatif), le pôle positif du champ électrique se situant en bas du gel. Dans le puits A, la taille des fragments d’ADN de l’échantillon est connue ; ils servent de références pour déterminer la taille des fragments dans les autres puits. Le marquage des bandes situées en bas du gel est plus faible car les fragments d’ADN sont de petite taille et incorporent moins de marqueur.

du fait que les enzymes coupent toujours aux mêmes endroits. La taille des fragments générés pourra être déterminée par comparaison avec le standard, dont la taille des bandes est connue. Cette technique peut être utilisée pour générer des cartes de restriction de l’ADN. Combiner la digestion enzymatique d’une molécule d’ADN et la microscopie à fluorescence permet d’établir directement une carte de restriction à partir de la manière dont l’ADN est coupé (voir figure 7.23). C’est ce que l’on appelle la cartographie optique. Les analyses de restriction sont utilisées pour des études comparatives de deux ou plusieurs ADN, notamment pour la

L’hybridation des acides nucléiques et la technique de Southern Blot Des fragments d’ADN peuvent être purifiés à partir de gels pour différentes utilisations telles que l’hybridation. Lorsque l’ADN est dénaturé, il peut former des molécules hybrides avec d’autres ADN (ou ARN) simple brin dont la séquence est complémentaire (ou presque complémentaire) [voir section 7.2]. Ces ADN sont appelés des sondes nucléiques. L’hybridation est un outil permettant de trouver des séquences identiques à différents éléments génétiques ou pour identifier la localisation d’un gène spécifique. Il existe plusieurs techniques basées sur l’hybridation de sondes, la plus couramment utilisée est la technique du Southern Blot, du nom de son inventeur E. M. Southern. Dans la technique du Southern Blot, des fragments d’ADN contenus dans un gel sont transférés sur une membrane avant d’être dénaturés pour générer des fragments simple brin (les fragments sont fixés à la membrane pour éviter qu’ils ne se réhybrident ensemble). La membrane est ensuite mise en contact avec une sonde marquée qui permettra ainsi la détection de l’hybridation. Les sondes peuvent être marquées par radioactivité, par des agents colorés ou par fluorescence. Lorsque les sondes ADN ou ARN sont mises à hybrider avec de l’ADN, il s’agit de Southern Blot, par opposition au Northern Blot où les sondes sont mises à hybrider avec de l’ARN. La figure 7.24 montre comment la technique de Southern Blot peut être utilisée pour identifier des fragments d’ADN contenant la séquence recherchée.



Laurie Achenbach

7.8 Séquençage et synthèse d’ADN 185

FIGURE 7.24 Technique de Southern blot. (Partie gauche de la figure) Gel d’électrophorèse de molécules d’ADN. Des molécules d’ADN purifiées provenant de différents plasmides ont été traitées avec des enzymes de restriction avant migration électrophorétique. (Partie droite de la figure) Résultat du transfert de l’ADN du gel de gauche sur une nouvelle membrane. Après transfert de l’ADN et hybridation avec une sonde radioactive marquée, les fragments d’ADN hybridés spécifiquement à la sonde sont révélés par autoradiographie (entourés en jaune). Un marqueur de taille a été déposé dans le puits 6 ; aucune de ses bandes ne s’est hybridée avec la sonde marquée.

Contrôlez vos acquis Les enzymes de restriction s’hybrident avec des séquences spécifiques et provoquent des coupures dans l’ADN. Les produits de la digestion enzymatique peuvent être séparés par électrophorèse et les séquences complémentaires détectées par hybridation. •

Pourquoi les enzymes de restriction sont-elles utiles aux généticiens ?

•

Qu’est-ce que le Southern Blot et que vous dit-il ?

fragments d’ADN terminés par l’une des quatre bases marquées au préalable. Ces fragments sont ensuite mis à migrer par électrophorèse de manière à séparer les molécules dont la taille diffère d’un nucléotide. Cette technique requiert quatre réactions séparées, une pour chacune des quatre bases : adénine, guanine, cytosine et thymine. La position des fragments est révélée par autoradiographie (ou par des sondes fluorescentes, voir plus loin) pour permettre la lecture des séquences. La méthode de Sanger permet de déterminer une séquence inconnue par l’intermédiaire d’une copie du simple brin d’ADN réalisée grâce à l’ADN polymérase. Comme nous l’avons précédemment vu, cette enzyme ajoute des désoxyribonucléosides triphosphate à une amorce (voir section 7.6). Chaque mélange réactionnel (dans quatre tubes séparés) contient l’un des différents analogues didésoxy des désoxyribonucléosides triphosphates (voir figure 7.25). Les analogues didésoxy ne possèdent pas d’extrémité 3’-OH sur leur sucre, empêchant ainsi l’élongation de la chaîne lors de leur insertion. Ils agissent donc comme des agents spécifiques de terminaison. Après électrophorèse, des oligonucléotides de différentes tailles sont obtenus. En fonction des conditions d’incubation, utilisant des nucléotides radioactifs ou fluorescents, la position des différentes bandes est obtenue par exposition à un film sensible aux rayons X ou par détection de la fluorescence. Les bandes de migration des quatre didésoxynucléotides ainsi que les positions verticales relatives des différents fragments permettent de lire la séquence de la copie du brin d’ADN directement à partir du gel (voir figure 7.26). O–

5′ O P O C

Le séquençage de l’ADN Actuellement, la technique de séquençage repose majoritairement sur la méthode de Sanger. Cette méthode génère des

2′ H

3′ OH

(a)

5′ O P O C

Base

O–

H

Désoxynucléotide normal

O–

H

3′ H

H

Sens d’élongation de la chaîne

H

3′ O

H

O

O P O C

Base

–

H H

(b)

2′ H

Base

O–

O

Base

Groupement –OH manquant Didésoxynucléotide analogue

O

O P O C 5′

O

O–

Chaîne d’ADN

m n7.8 Séquençage et synthèse d’ADN Le séquençage est une autre technique d’analyse de l’ADN, il permet de déterminer l’ordre précis des nucléotides. Il existe des procédés de synthèse de molécules d’ADN de séquence précise pour les utiliser en tant qu’amorce ou sonde dans le séquençage ou l’hybridation. Ces courts fragments d’ADN, de 10 à 20 nucléotides, sont appelés des oligonucléotides. Tout comme les enzymes de restriction, le séquençage est un outil clé de la biologie moléculaire dont les principes vont être décrits ci-dessous.

O–

O

H

Absence de groupement 3′–OH libre ; la réplication de l’ADN va s’arrêter à cet endroit

FIGURE 7.25 Didésoxynucléotides et séquençage par la méthode de Sanger. (a) Un désoxynucléotide normal possède un groupement hydroxyle sur le carbone de l’extrémité 3’, ce qui n’est pas le cas d’un didésoxynucléotide. (b) L’élongation de la chaîne s’arrêtera après l’incorporation d’un didésoxynucléotide. Comparez cette figure avec la figure 7.12.



186 Chapitre 7


L’ARN et le séquençage automatique La méthode de Sanger permet de séquencer l’ARN de la même manière que l’ADN. La première étape consiste à obtenir une copie d’ADN simple brin de l’ARN matriciel grâce à une enzyme virale, la transcriptase inverse (voir section 9.13). La synthèse d’ADN simple brin en présence de didésoxynucléotides va générer des fragments de différentes tailles adaptés à un séquençage de type Sanger. La séquence d’ARN est déduite de la séquence d’ADN en fonction des règles d’appariement. Des projets de séquençage à grande échelle (voir chapitres 15 et 31) ont conduit au développement de systèmes de séquençage automatisés. Ces systèmes sont toujours basés sur la méthode didésoxy mais emploient des amorces fluorescentes (ou des nucléotides) au lieu de la radioactivité. Les produits sont séparés par une électrophorèse automatique et les bandes, détectées par spectroscopie à fluorescence. Chacune des quatre réactions utilise un fluorochrome différent scanné par un laser. De cette manière, les quatre réactions peuvent avoir lieu simultanément. Les résultats sont analysés par ordinateur et une séquence est générée avec chacune des quatre bases d’une couleur différente (voir figure 7.26c).

L’ADN de synthèse Il existe des techniques automatisées pour fabriquer de l’ADN de synthèse : des oligonucléotides de 30 à 35 bases peuvent être synthétisés en quelques heures. Dans le cas de polynucléotides, des fragments oligonucléotidiques peuvent être soudés enzymatiquement en utilisant l’ADN ligase (voir section 7.6). Dans la synthèse d’ADN in vitro sur phase solide, le premier nucléotide est fixé sur un support solide inerte (gel de silice dont la taille des particules est d’environ 50 µm, par exemple). L’ensemble du procédé est décrit sur la figure 7.27. Plusieurs étapes sont nécessaires pour ajouter un nucléotide. Après chaque addition, les réactifs sont élués et les étapes répétées pour la fixation d’un nouveau nucléotide. Une fois la taille désirée atteinte, l’oligonucléotide est séparé du support puis purifié pour éliminer toute trace de réactifs et les contaminants. Les ADN de synthèse sont utilisés dans un grand nombre de réactions : en tant qu’amorces pour le séquençage et la PCR (voir section 7.9), en tant que sondes de détection dans le Southern (voir figure 7.24) ou le Northern Blot. L’ADN de synthèse est également utilisé dans le procédé de mutagenèse dirigée pour la création de mutations particulières à des endroits précis d’un gène (voir section 10.18).

Brin d’ADN à séquencer 3′ C G A C T C G A T T C 5′ 5′ G C T G 3′

Addition d’ADN polymérase et des quatre désoxyribonucléotides triphosphates ; séparation en quatre tubes de réaction

Amorce d’ADN radioactive

Addition dans chaque tube d’un didésoxynucléotide triphosphate (ddGTP, ddATP, ddTTP ou ddCTP) Produits de réaction ddGTP

ddATP

AG AGCTAAG

A AGCTA AGCTAA

ddTTP AGCT

ddCTP AGC

Les produits de réaction sont séparés par électrophorèse sur gel de polyacrylamide et révélés par autoradiographie G

A

T

C

(a)

7 6 5 4 3 2 1

La séquence se lit à partir du bas du gel : AGCTAAG. La séquence inconnue est donc 3’ TCGATTC 5’ (b)

Contrôlez vos acquis L’ADN peut être séquencé par la méthode de Sanger, ce qui implique de faire une copie de l’ADN à séquencer avec des didésoxynucléotides terminateurs de chaîne. Les produits finaux sont séparés par électrophorèse et la séquence lue. Les amorces nécessaires peuvent être synthétisées chimiquement. •

Pourquoi utilise-t-on quatre réactions différentes pour le séquençage de l’ADN ?

•

Quel est le terme employé pour désigner une molécule contenant plusieurs nucléotides ?

(c)

A

G

C

T

A

A

G

FIGURE 7.26 Séquençage de l’ADN par la méthode de Sanger. (a) Brin d’ADN matriciel dont on cherche la séquence. Pour cela, quatre réactions différentes sont effectuées, une avec chaque didésoxynucléotide. Ces réactions étant réalisées in vitro, l’amorce nécessaire à la synthèse d’ADN n’a pas besoin d’être de l’ARN ; on utilise donc plus simplement de l’ADN. (b) Partie du gel contenant les produits de la réaction (a). (c) Résultat du séquençage du même fragment d’ADN qu’en (a) et (b) par séquençage automatique avec des marqueurs fluorescents.



7.9 Amplification de l’ADN par réaction de polymérisation en chaîne 187 Nombre de copies du(des) gène(s) cible(s) Cycle PCR

Support de nucléotide solide Gène(s) cible(s)

A A A C A C T

5′ C

3′ T

5′ G

A C T G A C T G T A C T G T G

3′ 5′

ADN polymérase

3′ 5′

3′

(a)

Augmentation de la température

Extension

G

1

2

Répétition du cycle

2

4

Répétition du cycle

3

8

+

A

A C T G T G A

1

Amorces

5′ T

0

(b)

Séparation du support

A C T G T G A

Heptamère d’oligonucléotides ; purification et utilisation

de l’ADN m n7.9 Amplification par réaction de polymérisation en chaîne

La synthèse et le séquençage d’ADN ont permis l’émergence d’une méthode rapide d’amplification de l’ADN, la réaction de polymérisation en chaîne (PCR). À partir d’un gène spécifique, de grandes quantités d’ADN sont obtenues in vitro, l’ADN polymérase copiant jusqu’à un milliard de fois cette région cible (voir section 7.6). En résumé, les étapes d’amplification de l’ADN sont les suivantes : 1. Deux amorces oligonucléotidiques d’ADN synthétisées in vitro et entourant l’ADN cible (voir figure 7.28a) sont ajoutées en excès à l’ADN dénaturé par chauffage. 2. Lors du refroidissement du mélange, les amorces étant en excès, la plupart des brins d’ADN cible se fixent à cellesci et non entre eux (voir figure 7.28a). 3. L’ADN polymérase prolonge les amorces en utilisant les brins cibles comme matrice (voir figure 7.28b). 4. Après une période appropriée d’incubation, le mélange est chauffé de nouveau pour séparer les brins. Il est alors refroidi pour que les amorces s’hybrident aux régions complémentaires de l’ADN nouvellement synthétisé. Le processus complet est alors répété (voir figure 7.28c). Le secret de la PCR est que le produit d’un cycle d’extension sert de matrice pour le suivant (voir figure 7.28). Ainsi, la technique PCR est remarquable par le fait que l’ADN cible

(c)

Nombre de copies du gène cible

FIGURE 7.27 Synthèse en phase solide d’un fragment d’ADN de séquence connue. La synthèse chimique est réalisée par addition d’un nucléotide à la fois à la chaîne en croissance.

108 107 106 105 104 103 102 10 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20

(d)

Nombre de cycles de PCR

FIGURE 7.28 Réaction de polymérisation en chaîne (PCR) pour amplifier une séquence spécifique d’ADN. (a) L’ADN cible est chauffé pour séparer les deux brins. Les amorces complémentaires des deux brins sont apportées en excès avec l’ADN polymérase. (b) Après hybridation des amorces, l’extension de celles-ci conduit à la formation d’une copie de l’ADN double brin initial. (c) Deux cycles supplémentaires conduisent à la formation de 4 puis 8 copies de l’ADN initial. (d) Résultat de 20 cycles de PCR à partir d’un ADN contenant à l’origine 10 copies du gène cible. Le graphique obtenu est semi-logarithmique (voir figure 6.6).

voit sa quantité doubler lors de chaque cycle. En pratique, 20 à 30 cycles sont habituellement réalisés, ils génèrent 106 à 109 fois la séquence cible (voir figure 7.28).

PCR et haute température À l’origine, la technique PCR utilisait l’enzyme Pol III d’Escherichia coli ; cependant, les hautes températures nécessaires à la dénaturation des copies d’ADN double brin nouvellement générées dénaturaient aussi l’enzyme, elle devait alors être ajoutée lors de chaque cycle. Ce problème a été résolu en



188 Chapitre 7


utilisant une ADN polymérase thermiquement stable d’une bactérie thermophile, Thermus aquaticus, isolée d’une source chaude. Cette enzyme nommée ADN Taq polymérase est stable à 95 ˚C et n’est pas affectée par l’étape de dénaturation. Avec l’ADN Taq polymérase, l’ADN étant copié à 72 ˚C et non plus 37 ˚C, son utilisation augmente la spécificité de la PCR. Aux hautes températures, l’hybridation non spécifique d’amorces à l’ADN non cible est rare, les produits de la Taq PCR sont donc plus homogènes que ceux obtenus avec l’enzyme d’E. coli. L’ADN polymérase de l’hyperthermophile Pyrococcus furiosus (croissance optimale à 100 ˚C) [voir sections 6.12 et 13.6], appelée Pfu polymérase (ou « vent polymérase » parce que P. furiosus a été isolé d’une source hydrothermale, section 19.8), est aussi très utilisée, elle est même plus stable que la Taq polymérase. De plus, à l’inverse de cette dernière, la Pfu polymérase a une activité autocorrectrice (voir section 7.6), elle est donc particulièrement intéressante lorsqu’une haute précision est requise. La technique PCR requérant un grand nombre d’étapes répétitives, des appareils PCR, les thermocycleurs, ont été développés pour effectuer automatiquement les cycles de chauffage et de refroidissement. Chaque cycle étant d’environ 5 minutes, la durée de la procédure automatique pour une amplification importante sera de seulement quelques heures. Pour fournir les marchés de la PCR et du séquençage en ADN polymérase thermostable, les gènes de ces enzymes ont été clonés dans E. coli et produits commercialement en grandes quantités. Le coût de la PCR est alors devenu négligeable comparé à ce qu’il fut au début de son utilisation.

Les applications et la sensibilité de la PCR La PCR est un outil puissant, facile d’utilisation, hautement efficace, extrêmement sensible et spécifique. Lors de chaque cycle, la quantité d’ADN étant multipliée par deux, il y a augmentation exponentielle de celle-ci (voir figure 7.28). Une grande quantité d’ADN est produite en quelques heures à partir de quelques molécules d’ADN cible présentes en début de réaction. La spécificité est si importante qu’avec des amorces d’environ 15 nucléotides et des hautes températures d’hybridation, il y a très peu de « faux positifs », ce qui rend le produit PCR virtuellement homogène. La connaissance des séquences de bordures entourant un gène d’intérêt est importante, les produits d’amplification obtenus par PCR peuvent alors être utilisés pour le clonage et le séquençage de ces gènes ou pour des études comparatives ou phylogénétiques. Dans ces deux derniers cas, les amorces sont spécifiques des régions conservées d’un gène commun d’une grande variété d’organismes. Par exemple, l’ARNr 16S (voir section 2.3) a des régions hautement conservées et d’autres fortement variables. Selon leurs spécificités, les amorces du gène ARNr 16S de Bacteria et Archaea permettent de détecter la présence d’espèces de chaque groupe ou sous-groupe dans un habitat donné. Cette technique est très utilisée en écologie microbienne et a révélé l’énorme diversité du monde microbien, beaucoup plus que ne le font les méthodes culturales (voir chapitres 2, 11 à 14, 18). La PCR étant une technique très sensible, elle est utilisée pour amplifier de très petites quantités d’ADN. Par exemple, elle a permis d’amplifier et cloner l’ADN provenant de sources

aussi variées que les momies humaines ou les plantes et animaux fossilisés. Elle est un outil très répandu pour le diagnostic microbiologique après amplification d’ADN provenant d’échantillons cellulaires complexes. Par exemple, la présence d’un gène spécifique d’un pathogène dans un échantillon clinique indique la présence vraisemblable du micro-organisme dans l’échantillon. Grâce à cette information, le traitement du patient pourra commencer (voir section 24.12). Ainsi, la PCR évite de devoir cultiver l’organisme, une procédure souvent longue et peu fructueuse. La PCR a aussi été utilisée pour établir des empreintes d’ADN, c’est un outil juridique puissant qui permet d’identifier les individus à partir de très petites quantités d’ADN (voir le focus Empreinte ADN, chapitre 31). La PCR peut aussi être couplée avec une étape de transcriptionréserve appelée la RT-PCR, afin d’obtenir de grandes quantités d’ADN à partir d’une matrice ARN.

Contrôlez vos acquis La réaction de polymérisation en chaîne est un procédé d’amplification de l’ADN in vitro où une ADN polymérase stable thermiquement isolée de procaryotes thermophiles est utilisée. La chaleur dénature l’ADN en deux molécules simple brin, chacun étant copié par la polymérase. Après chaque cycle, les doubles brins nouvellement synthétisés sont de nouveau séparés par la chaleur et un nouveau processus de copie est initié. À chaque cycle, la quantité d’ADN cible double. •

Pour quelle(s) raison(s) les amorces sont-elles nécessaires pour la PCR ?

•

Pour quelle(s) raison(s) une amorce est-elle nécessaire à la « fin » de chaque fragment d’ADN devant être amplifié ?

V

SYNTHÈSE DE L’ARN : LA TRANSCRIPTION

Les acides ribonucléiques (ARN) ont plusieurs rôles importants dans la cellule. La chimie de l’ARN se différencie de celle de l’ADN par trois points majeurs : 1) le sucre est le ribose et non le désoxyribose ; 2) une base, l’uracile, remplace la thymine et 3) à l’exception de certains virus, l’ARN n’est pas double brin. Le remplacement du ribose par le désoxyribose modifie plusieurs propriétés chimiques d’un acide nucléique, et les enzymes agissant sur l’ADN n’ont généralement pas d’effet sur l’ARN, l’inverse est aussi vérifié. Cependant, le changement de la thymine par l’uracile n’affecte pas l’appariement des bases, les deux nucléotides s’appariant de façon égale avec l’adénine. Les trois principaux types d’ARN connus sont : l’ARN messager (ARNm), l’ARN de transfert (ARNt) et l’ARN ribosomique (ARNr). Tous sont le produit de la transcription de l’ADN. Il faut souligner que l’ARN a un rôle génétique lorsqu’il porte l’information de l’ADN via l’ARNm (chez les virus à ARN, c’est l’ARN qui porte l’information génétique) ou fonctionnel quand il intervient dans le transfert d’acides aminés lors de la synthèse de protéines (ARNt). Par contre,



7.10 Description de la transcription 189

l’ARNr a un double rôle fonctionnel et structural chez les ribosomes, quelques ARN ont même une activité catalytique (enzymatique) [ribozymes, voir section 14.8].

Description de la transcription

La transcription de l’information génétique de l’ADN à l’ARN est réalisée par l’enzyme ARN polymérase. Comme l’ADN polymérase, elle catalyse la formation de liaisons phosphodiester, mais ici entre ribonucléotides et non pas entre désoxyribonucléotides. L’ARN requiert l’ADN comme matrice et ses précurseurs sont les ribonucléosides triphosphates : ATP, GTP, UTP et CTP. La chimie de la synthèse de l’ARN est très proche de celle de l’ADN (voir figure 7.12). Ainsi, durant l’élongation d’une chaîne ARN, les ribonucléotides triphosphates sont additionnés à la partie 3’-OH du ribose du nucléotide précédent, cette polymérisation libère l’énergie de deux liaisons phosphates. Comme lors de la synthèse de l’ADN, pour l’ARN, la direction de la chaîne en croissance est 5’ → 3’, le brin matrice est antiparallèle à celui nouvellement synthétisé. Cependant, à l’inverse de l’ADN polymérase, l’ARN polymérase peut initier une synthèse de novo sans la présence d’amorces.

L’ARN polymérase L’ADN matrice pour l’ARN polymérase est une molécule double brin, même si pour chaque gène, uniquement un des deux brins est transcrit. Lors du processus de transcription chacune de ces régions est transcrite à des temps différents. Ces principes sont vrais pour toutes les ARN polymérases, même si ces enzymes diffèrent chez les Bacteria, les Archaea et les Eukarya. Les Bacteria et Archaea ont une seule ARN polymérase tandis que le noyau des eucaryotes en contient trois (ARN polymérases I, II et III), chacune impliquée dans la transcription de différents types de gènes. Quelle que soit leur origine, toutes les ARN polymérases ont des sous-unités conservées (voir figure 11.16). Du fait de leur ancêtre commun, les ARN polymérases archéennes et eucaryotes sont similaires et structurellement plus complexes que celles des Bacteria. Dans la suite du chapitre, seule l’ARN polymérase de Bacteria sera abordée, elle est la plus simple mais aussi la plus connue. Toutes les ARN polymérases des espèces de Bacteria sont des protéines relativement proches. L’enzyme d’Escherichia coli a quatre sous-unités : β, β’, α (en double) et σ (sigma) qui interagissent pour former l’enzyme active, l’ARN polymérase holoenzyme, le facteur sigma est le moins fortement lié et est facilement dissociable, on parle alors d’ARN polymérase core enzyme (α2ββ’). L’enzyme core seule peut catalyser la formation d’ARN ; sigma ayant un rôle dans la reconnaissance du site approprié sur l’ADN lors de l’initiation de la synthèse d’ARN. Sur la figure 7.29, la transcription d’ARN impliquant l’ARN polymérase et sigma est illustrée.

Les promoteurs L’ARN polymérase est une protéine de taille importante qui établit un contact avec plusieurs bases de l’ADN simultanément.

Facteur sigma

5′

3′

3′

5′

Région du promoteur

Gène(s) à transcrire (brin vert clair)

Le facteur sigma reconnaît le promoteur et le site d’initiation

Facteur sigma

5′

3′

3′

5′ 5′

La transcription commence ; le facteur sigma est libéré. L’élongation de la chaîne d’ARN se poursuit jusqu’au site de terminaison 5′

3′

3′

5′

Le site de terminaison atteint, l’élongation s’arrête

5′

5′

3′

3′

La polymérase et l’ARN sont libérés

3′

5′

5′

(a) Petits transcrits

Longs transcrits

Sarah French

m n 7.10

ARN polymérase

(b) FIGURE 7.29 Transcription. (a) Étapes de la synthèse d’ARN. Les sites d’initiation et de terminaison sont des séquences nucléotidiques spécifiques de l’ADN. Le facteur sigma permet à l’ARN polymérase de reconnaître le site d’initiation (le promoteur) ; il se détache pendant l’élongation. L’ARN polymérase se déplace le long de la chaîne d’ADN, provoquant l’ouverture temporaire de la double hélice et la transcription d’un des deux brins. Lorsque le site de terminaison est atteint, l’élongation s’arrête et l’ARNm et la polymérase sont libérés. (b) Transcription d’un gène du chromosome d’Escherichia coli observé par microscopie électronique. La région active de transcription représente environ 2 kpb. La transcription se déroule de la gauche vers la droite : les transcrits de petite taille sur la gauche deviennent plus longs au fur et à mesure que la transcription avance.



190 Chapitre 7


Ce type de protéine peut interagir spécifiquement avec l’ADN grâce à l’accessibilité des bases dans le sillon principal (voir figure 7.5). Cependant, pour initier correctement une chaîne d’ARN, l’ARN polymérase doit premièrement reconnaître des régions spécifiques de l’ADN, les promoteurs. Dès que l’ARN polymérase s’est fixée au promoteur, elle ouvre le double brin d’ADN et la transcription peut commencer (voir figure 7.29). Lorsque l’enzyme se déplace, de courtes portions d’ADN se déroulent de façon transitoire ; le brin d’ADN est alors accessible et est copié en ARN complémentaire. Le promoteur oriente donc l’ARN polymérase dans une direction précise. Si une région d’ADN a deux promoteurs proches orientés différemment, la transcription d’un promoteur se fera sur un brin dans une direction donnée alors que sur l’autre brin, elle se fera dans l’autre sens. L’élongation est réalisée par le core enzyme (voir figure 7.29), car dès qu’un court fragment d’ARN est formé, le facteur sigma se dissocie, il est en effet uniquement impliqué dans la formation du complexe ARN polymérase / ADN au niveau du promoteur. Lorsque l’ARN nouvellement synthétisé se dissocie de l’ADN, la partie d’ADN ouverte reprend sa structure initiale en double hélice. La transcription s’arrête à des régions spécifiques appelées terminateurs de transcription (voir section 7.12). À l’inverse de la réplication de l’ADN où le génome entier est copié, la transcription concerne souvent un seul gène. Selon les besoins en protéines de la cellule, la transcription des gènes se fera à des fréquences différentes. La régulation de la transcription chez les procaryotes est un processus très élaboré impliquant des mécanismes très divers ; il est très efficace pour contrôler l’expression génétique et permet la conservation des ressources potentielles de la cellule (voir chapitre 8).

Contrôlez vos acquis Les trois types principaux d’ARN sont l’ARN messager (ARNm), l’ARN de transfert (ARNt) et l’ARN ribosomique (ARNr). La transcription de l’ARN en ADN nécessite l’enzyme ARN polymérase qui ajoute des bases vers l’extrémité 3’ de la chaîne en croissance. À l’inverse de l’ADN polymérase, l’ARN polymérase n’a pas besoin d’amorces et reconnaît un site spécifique d’initiation, le promoteur, sur l’ADN. •

Dans quel sens (5’ → 3’) ou (3’ → 5’) la transcription sur le brin directeur se fait-elle ?

•

Qu’est-ce qu’un promoteur ?

7.11 Diversité des facteurs sigma, m n séquences consensus et ARN polymérases

Lors de la transcription, les promoteurs qui sont des séquences d’ADN spécifiques auxquelles se fixent les ARN polymérases, ont un rôle très important. Les séquences de plusieurs d’entre eux ont été décrites chez une grande variété d’organismes, la figure 7.30 montre quelques promoteurs d’Escherichia coli. Au sein de l’ARN polymérase, c’est le facteur sigma qui, premièrement, reconnaît ces promoteurs.

La diversité des facteurs sigma Un organisme peut synthétiser différents facteurs sigma ce qui permet à l’ARN polymérase de reconnaître plusieurs séquences de promoteurs ; par exemple, le génome d’Escherichia ARN polymérase

Transcription 5′

3′′

3′

5′

Facteur sigma 1. 2. 3. 4. 5. 6.

Début de l’ARNm

5′ 3′ CTGTTGACAATTAATCATCGAACTAGTTAACTAGTACGCAAG CTA TTCCTGTGGATAACCATGTGTATTAGAGTTAGAAAACA TGGTTCCAAAATCGCCTTTTGCTGTATATACTCACAGCATA TTTTTGAGTTGTGTATAACCCCTCATTCTGATCCCAGCTT TAGTTGCATGAACTCGCATGTCTCCATAGAATGCGCGCTACT TTCTTGACACCTTTTCGGCATCGCCCTAAAATTCGGCGTC

Séquence -35

Boîte de Pribnow

Consensus T T G A C A

TATAAT

Séquence du promoteur

FIGURE 7.30 Interaction entre l’ARN polymérase et le promoteur. En dessous du schéma se trouvent six séquences de promoteur différentes identifiées chez l’espèce bactérienne Escherichia coli. Les zones de contact de l’ARN polymérase avec la séquence – 35 et la boîte de Pribnow (séquence –10) sont indiquées. La transcription débute au niveau d’une base située en aval de la boîte de Pribnow. Sous les séquences des régions – 35 et de la boîte de Pribnow, se trouve une séquence consensus résultant de la comparaison des différents promoteurs. Dans cet exemple, les séquences du promoteur sont celles du brin d’ADN 5’→ 3’ (en vert foncé), mais c’est le brin 3’→ 5’ en vert clair qui sera réellement transcrit (l’ARN



7.12 Terminateurs de transcription 191

coli code sept d’entre eux et celui de Bacillus subtilis, quatorze. Chez un organisme, un même facteur sigma peut être impliqué dans la reconnaissance d’un ensemble de gènes, mais certains d’entre eux, aux fonctions spécifiques ou rarement exprimées, ont différents σ. Cela permet de contrôler leur expression ; ainsi en l’absence du facteur sigma, le gène correspondant sera « éteint ». Sur la figure 7.30, toutes les séquences des ADN promoteurs sont reconnues par un seul facteur sigma, le principal chez E. coli est σ70. Une lecture attentive des séquences montre qu’elles ne sont pas identiques à l’exception de deux régions hautement conservées. L’une est localisée 10 bases (région – 10 ou boîte de Pribnow), l’autre 35 bases (région – 35), en amont du site d’initiation de la transcription. La comparaison de ces deux régions des promoteurs reconnus par le facteur sigma a permis de déterminer les bases les plus fréquemment rencontrées à une position donnée, les séquences consensus TATAAT (région –10) et TTGACA (région – 35) ont alors été obtenues. Ces deux régions ne sont pas exactement les mêmes chez tous les promoteurs mais elles sont relativement proches des séquences consensus. Sur la figure 7.30, seule la séquence du promoteur sur un seul brin d’ADN est décrite. Par convention, c’est le brin commençant à l’extrémité 5’ qui est présenté (ce n’est pas le brin utilisé comme matrice par l’ARN polymérase, figure 7.30). En réalité, les promoteurs sont des entités double brin reconnues par l’ARN polymérase et auxquelles elle se lie (notez que la transcription n’utilise que l’un des deux brins d’ADN comme matrice). Chez d’autres organismes, les facteurs sigma sont parfois beaucoup plus spécifiques que σ70 (voir figure 7.30). Dans ces cas, très peu de variations sont permises au niveau des bases spécifiques devant être reconnues. Chez E. coli, les promoteurs les plus proches des séquences consensus sont habituellement très efficaces dans la fixation de l’ARN polymérase. Ces derniers, nommés promoteurs forts, sont très utiles en génie génétique (chapitre 31).

Les ARN polymérases chez Eukarya et Archaea Le noyau des eucaryotes contient trois polymérases différentes reconnaissant un promoteur associé à une classe particulière de gènes. L’ARN polymérase I synthétise la plupart des ARNr, l’ARN polymérase II tous les ARNm et l’ARN polymérase III, les ARNt et un type d’ARNr. À l’inverse, chez les Bacteria, le promoteur d’un gène codant une protéine et un ARNt peut être identique. Les ARN polymérases eucaryotes nécessitent des protéines additionnelles permettant la reconnaissance de promoteurs spécifiques ; mais à l’inverse des Bacteria, ces facteurs d’initiation eucaryotes (d’Archaea aussi) ne font pas partie d’une holoenzyme polymérase mais reconnaissent indépendamment les éléments du promoteur (voir figure 7.31). Une représentation de la liaison d’une ARN polymérase II avec un promoteur est montrée sur la figure 7.31. Ce promoteur a une séquence conservée, la boîte TATA, qui ressemble à la boîte de Pribnow des Bacteria (voir figure 7.30), ainsi qu’un élément d’initiation très proche du site de début de la transcription. Ces deux régions sont les éléments clés des promoteurs eucaryotes, même si d’autres séquences peuvent être impliquées.

5′′ 3′

3′ 5′

FIGURE 7.31 Interaction entre l’ARN polymérase II eucaryote et un promoteur. La polymérase (en brun) est positionnée au niveau de l’élément initiateur (INR) du promoteur. Une protéine de fixation (en jaune) est accrochée à la boîte TATA. La polymérase possède une « queue », faite d’une séquence répétée d’acides aminés qui peuvent être phosphorylés et affecter son fonctionnement. Les autres protéines (en bleu) représentent une partie des nombreux facteurs nécessaires à l’initiation de la transcription chez les eucaryotes.

Les espèces d’Archaea ont une seule polymérase qui ressemble à l’ARN polymérase II eucaryotique et la structure des promoteurs est aussi semblable à celle des eucaryotes. Les promoteurs archéens qui ont été caractérisés possèdent une boîte TATA de 6 à 8 paires de bases située 18 à 27 nucléotides en amont du site d’initiation de la transcription. Chez les Archaea, la transcription requiert des facteurs additionnels identiques à ceux des eucaryotes (voir figure 7.31). Ainsi les similitudes phylogénétiques entre Archaea et Eukarya (voir section 2.3) se retrouvent chez un processus moléculaire complexe comme la transcription. Plusieurs autres relations entre Archaea et Eukarya sont décrites dans cet ouvrage.

Contrôlez vos acquis Chez les Bacteria, les promoteurs reconnus par la sousunité sigma de l’ARN polymérase ont des séquences très similaires. Chez les Eukarya, les principales classes d’ARN sont transcrites par des ARN polymérases différentes, l’ARN polymérase II produit la plupart des ARNm. La seule ARN polymérase existant chez les Archaea ressemble par sa structure et sa fonction à l’ARN polymérase II. •

Qu’est-ce qu’une séquence consensus ?

•

Chez un eucaryote, quel type d’ARN polymérase transcrit les gènes codant les protéines ?

7.12 Terminateurs de transcription m n L’initiation et la terminaison de la transcription sont des étapes très importantes pour la fidélité de synthèse d’une protéine. Chez les Bacteria, la terminaison se fait fréquemment au niveau d’un fragment inversé au centre duquel une zone non répétée est insérée (voir section 7.2 et figure 7.6). Quand cette séquence d’ADN est transcrite, l’ARN forme une structure en tige-boucle par appariement de bases du même brin



192 Chapitre 7


(voir figure 7.32). Ces structures suivies d’une série d’uridines sont des terminateurs efficaces de la transcription. Des séquences riches en GC suivies par une autre riche en AT sont aussi des sites spécifiques de terminaison. Ces régions qui ne nécessitent pas de facteurs additionnels sont nommées, terminateurs intrinsèques.

La terminaison Rho-dépendante D’autres types de terminateurs nécessitent des facteurs protéiques spécifiques. Chez Escherichia coli, la protéine Rho se fixe fortement à l’ARN (mais pas à l’ARN polymérase ni à l’ADN), elle parcourt alors la chaîne jusqu’au complexe ARN polymérase / ADN. Dès que l’ARN polymérase s’arrête à un site de terminaison Rho-dépendant, Rho favorise la libération de l’ARN et de la polymérase positionnée sur l’ADN, terminant ainsi la transcription. D’autres protéines impliquées dans la terminaison de transcription sont, comme Rho, liées à l’ARN. Dans tous les cas, les séquences impliquées dans la terminaison sont localisées au niveau de l’ARN ; cependant, l’ARN étant transcrit depuis l’ADN, la terminaison de transcription est au final toujours déterminée par des séquences nucléotidiques spécifiques sur l’ADN. On connaît moins ce qui se passe au niveau des signaux de terminaison de transcription chez les Archaea. Pour quelques gènes, il est certain que des séquences inversées répétées suivies par une région riche en AT sont impliquées, elles sont relativement identiques à celles des terminateurs de transcription bactériens. Cependant, ce n’est pas le cas chez d’autres gènes archéens où des séquences non répétées mais ayant une succession de T sont vraisemblablement des terminateurs de transcription. Il est à noter que des protéines analogues à Rho n’ont pas été retrouvées chez les Archaea. ADN avec des séquences répétées inversées Séquence répétée inversée

5′

5′

TGCG TCGACTG CCGAT CAGTCGAT T T T ACGC AGCTGA C GGCTA GTCAGCTA A A A

3′

Transcription du brin vert clair

Séquence répétée inversée

3′

5′ 3′ U G C G U C G A C U G C C G A U C A G U C G A U U U U ARN

Formation d’une structure secondaire par repliement 5′ U G C G

U U U U 3′ A Une structure G C tige-boucle dans l’ARN U en aval d’une chaîne G d’uraciles conduit à A l’arrêt de la C

U C G A C U G

C C

G

U A

transcription

FIGURE 7.32 Séquences répétées inversées et arrêt de la transcription. Les séquences répétées inversées dans l’ADN transcrit conduisent à la formation de structures tige-boucle dans l’ARN qui peuvent mettre fin à la transcription.

Contrôlez vos acquis L’ARN polymérase arrête la transcription à des sites spécifiques appelés terminateurs. Bien qu’ils soient codés par l’ADN, ces signaux fonctionnent au niveau de l’ARN. Quelques-uns sont des terminateurs intrinsèques qui ne nécessitent pas d’autres protéines, mise à part la polymérase. Chez Bacteria, ces séquences sont souvent en tige-boucle suivies par une série de U. D’autres terminateurs nécessitent des protéines, par exemple Rho. •

Qu’est-ce qu’un terminateur intrinsèque ?

•

Qu’est-ce qu’une structure tige-boucle ?

7.13 Unité de transcription m n Les chromosomes sont organisés en unités de transcription où la transcription de l’ADN en ARN est initiée et terminée. Certaines ont un seul gène, d’autres ont deux ou plusieurs gènes co-transcrits et génèrent une seule molécule d’ARN.

ARN ribosomiques et ARN de transfert : la longévité de l’ARN Il a été rapporté dans la section 7.1 que la plupart des gènes codent des protéines alors que d’autres, non traduits, codent des ARN : ARN ribosomiques (ARNr) et de transfert (ARNt). Il y a différents types d’ARNr chez un organisme (voir section 7.16), les procaryotes en ont trois : l’ARNr 5S, 16S et 23S (l’importance de l’ARNr 16S dans les études sur l’évolution des procaryotes est discutée dans le chapitre 2). Les structures appelées groupements (voir figure 7.33) contiennent un gène de chacun des ARNr et sont alors co-transcrites. Une situation similaire a été décrite chez les eucaryotes. Ainsi, chez tous les organismes, l’unité de transcription pour la plupart des ARNr est plus longue que celle correspondant à un seul gène. Chez les procaryotes, les gènes ARNt sont souvent co-transcrits ensemble ou avec ceux d’ARNr (voir figure 7.33). Cependant, tous ces transcrits doivent être clivés en unités individuelles pour générer des ARNr ou ARNt matures et fonctionnels. Chez les procaryotes, la plupart des ARN messagers ont une demi-vie très courte (quelques minutes), puis ils sont dégradés par les ribonucléases cellulaires. Ce phénomène contraste avec la stabilité des ARNr et ARNt, leurs structures repliées les protégeant en effet des attaques enzymatiques. Le taux de renouvellement rapide des ARNm procaryotes est probablement un mécanisme par lequel la cellule s’adapte rapidement à de nouvelles conditions environnementales ; elle arrête alors de traduire les ARNm dont les produits ne sont plus nécessaires.

L’ARNm polycistronique et l’opéron Chez les procaryotes, les gènes codant des enzymes apparentées sont souvent regroupés (voir figure 10.42) et co-transcrits par des ARN polymérases qui génèrent une longue molécule, l’ARNm polycistronique (voir section 10.13). Lors de la traduction, plusieurs polypeptides sont alors synthétisés en même temps.



nt nt da s oda S r o c t c 6 eu ot ène r 1 ène RN m N A G G R o Pr un l’A

nt da S o c 3 ne r 2 Gè RN l’A

G l’A ène RN co r 5 dan S t Ter de mina tra teu nsc r rip tio n

7.14 Code génétique 193

ADN

3′ ARN

5′

Transformation

ARNt ARNr 16S

ARNr 23S

ARNr 5S

ARN maturés

FIGURE 7.33 Unité bactérienne de transcription ribosomique de l’ARNr (opéron ARNr) et sa transformation. Chez les Bacteria, ces opérons contiennent les gènes codant les ARNr dans l’ordre suivant : ARNr 16S, ARNr 23S et ARNr 5S (schéma approximativement à l’échelle). Dans cet opéron particulier, « l’espace » entre les gènes ARNr 16S et 23S est un gène d’ARNt. Pour d’autres opérons, cet « espace » peut contenir plusieurs ARNt et souvent un ou plusieurs gènes codant des ARNt se trouvent après le gène ARNr 5S, lesquels sont cotranscrits. Escherichia coli a sept opérons de ce type.

La régulation de la synthèse d’ARNm sera discutée au chapitre 8, mais le concept d’opéron sera introduit dans ce chapitre. Un opéron est une unité d’expression de gènes codant souvent plusieurs polypeptides (ou des gènes codant des ARNr, figure 7.33) à partir d’un ARNm polycistronique. Dans quelques cas, la transcription de l’ARNm d’un opéron est sous le contrôle d’une région spécifique de l’ADN, l’opérateur, qui est adjacente à celle codant le premier gène de l’opéron. L’opérateur fonctionne en se liant à des protéines spécifiques qui régulent le processus transcriptionnel (voir chapitre 8). Généralement, les ARNm polycystroniques n’existent pas chez les eucaryotes car la partition des gènes (voir section 7.1 et figure 7.2) rend nécessaire leur épissage. Ces sujets sont abordés au chapitre 14 dédié à la cellule eucaryote.

Contrôlez vos acquis L’unité de transcription contient souvent plus d’un gène. La transcription de plusieurs gènes en une seule molécule d’ARN est observée chez les procaryotes, ainsi l’ARNm contient l’information de plus d’un polypeptide. Un opéron est constitué lorsque plusieurs gènes sont transcrits ensemble à partir d’un même promoteur. Chez tous les organismes, les gènes codant l’ARNr sont cotranscrits puis séparés pour former les différents ARNr. •

Qu’est-ce qu’un ARN messager (ARNm) ?

•

Qu’est-ce qu’un ARNm polycystronique ?

VI

SYNTHÈSE DES PROTÉINES

Les deux premières étapes dans le transfert de l’information, la réplication et la transcription, nécessitent la synthèse d’acides nucléiques à partir d’une matrice d’autres acides nucléiques. La dernière étape, la traduction, implique une matrice du même type mais le produit final sera dans ce cas une protéine.

7.14 Code génétique m n Avant d’aborder le mécanisme de la traduction, il est important d’évoquer le code génétique qui établit une correspondance entre la matrice d’acides nucléiques et le produit final, le polypeptide, constitué d’acides aminés. Comme mentionné à la section 7.1, un triplet de bases appelé codon, code un acide aminé spécifique. Le code génétique est écrit avec l’ARNm plutôt qu’avec l’ADN car c’est avec le premier que le processus de traduction se fait. Les 64 codons possibles (4 bases combinées 3 fois, soit 43) sont indiqués dans le tableau 7.5. Il faut noter qu’à côté des codons spécifiques des acides aminés, d’autres sont dédiés à l’initiation et à l’arrêt de la traduction. L’aspect le plus intéressant du code génétique est certainement le fait que certains acides aminés sont codés par plusieurs codons apparentés mais différents. Dans plusieurs cas, il n’y a pas de correspondance entre un acide aminé et un codon unique. Ainsi pour un acide aminé, le codon correspondant n’est pas automatiquement connu ; l’expression code dégénéré est employée pour décrire ce phénomène. À l’inverse, à partir d’une séquence d’ADN et d’un cadre de lecture connu, l’acide aminé correspondant peut être déterminé. La possibilité d’établir la séquence en acides aminés à partir de celle de l’ADN est au centre de la révolution génomique (chapitre 15). Un codon est reconnu lors de l’appariement avec une séquence de trois bases, l’anticodon, portée par un ARNt (voir section 7.16). Si l’appariement était toujours standard comme avec les bases A/U et G/C, à chaque codon correspondrait au moins un ARNt spécifique. Ceci est vérifié dans quelques cas ; par exemple chez Escherichia coli, 6 ARNt différents transportent l’acide aminé leucine, chacun sur des codons non identiques (voir tableau 7.5). À l’inverse, un ARNt peut reconnaître plusieurs codons. Toujours chez E. coli, il existe deux codons lysine mais un seul ARNt lysyl dont l’anticodon s’apparie avec AAA ou AAG (voir tableau 7.5). Ceci est possible parce que les molécules d’ARNt forment des appariements standard avec les deux premières bases du codon mais tolèrent un appariement irrégulier en 3e position. Ce phénomène appelé flottement (wobble) est illustré sur la figure 7.34 (avec appariement entre G et U à la place de G et C).

Les codons d’initiation et stop Quelques codons ne correspondent pas à un acide aminé (voir tableau 7.5), les triplets : UAA, UAG et UGA nommés « codon stop » ou « codons non-sens », indiquent la fin de traduction d’un ARNm codant une protéine. Le message commence par la lecture d’un « codon d’initiation » AUG codant l’acide aminé N-formylméthionine (ou la



194 Chapitre 7

TABLEAU 7.5


LE CODE GÉNÉTIQUE : CORRESPONDANCE ENTRE LES TRIPLETS DE BASES DE L’ARNMa ET LES ACIDES AMINÉS

Codon

Acide aminé

Codon

Acide aminé

Codon

Acide aminé

Codon

Acide aminé

UUU

Phénylalanine

UCU

Sérine

UAU

Tyrosine

UGU

Cystéine

UUC

Phénylalanine

UCC

Sérine

UAC

Tyrosine

UGC

Cystéine

UUA

Leucine

UCA

Sérine

UAA

Stop (non sens)

UGA

Stop (non sens)

UUG

Leucine

UCG

Sérine

UAG

Stop (non sens)

UGG

Tryptophane

CUU

Leucine

CCU

Proline

CAU

Histidine

CGU

Arginine

CUC

Leucine

CCC

Proline

CAC

Histidine

CGC

Arginine

CUA

Leucine

CCA

Proline

CAA

Glutamine

CGA

Arginine

CUG

Leucine

CCG

Proline

CAG

Glutamine

CGG

Arginine

AUU

Isoleucine

ACU

Thréonine

AAU

Asparagine

AGU

Sérine

AUC

Isoleucine

ACC

Thréonine

AAC

Asparagine

AGC

Sérine

AUA

Isoleucine

ACA

Thréonine

AAA

Lysine

AGA

Arginine

AUG (début)b

Méthionine

ACG

Thréonine

AAG

Lysine

AGG

Arginine

GUU

Valine

GCU

Alanine

GAU

Acide aspartique

GGU

Glycine

GUC

Valine

GCC

Alanine

GAC

Acide aspartique

GGC

Glycine

GUA

Valine

GCA

Alanine

GAA

Acide glutamique

GGA

Glycine

GUG

Valine

GCG

Alanine

GAG

Acide glutamique

GGG

Glycine

a

Les cases des codons sont colorées selon la légende suivante : m ionisable = acide, m ionisable = basique, m non ionisable polaire et m non polaire (voir figure 3.12). Le nucléotide de gauche est à l’extrémité 5' du triplet. Noter que certains codons stop (non sens) ne fonctionnent pas toujours de cette manière selon les organismes (voir le texte et le focus « Acides aminés non conventionnels »). b AUG code la N-formylméthionine au début des ARNm des Bacteria.

méthionine chez Eukarya et Archaea). Le code étant en triplet de bases, la traduction doit commencer à un point de départ précis. Si ce n’est pas le cas, le cadre de lecture sera décalé et une protéine entièrement différente (ou aucune protéine si ce décalage introduit un codon arrêt) sera formée. Par convention, le cadre de lecture adéquat correspondant à la protéine normale codée par le gène est nommé cadre 0. Les deux autres cadres de lecture possibles, –1 et +1, ne donnent pas les mêmes acides aminés (voir figure 7.35). Par conséquent, il est essentiel que les ribosomes trouvent le codon d’initiation adéquat pour

commencer la traduction, puis qu’il se déplace précisément toutes les trois paires de bases sur l’ARNm. Dans la section 7.16, les ribosomes de Bacteria qui reconnaissent spécifiquement le codon d’initiation AUG sur l’ARNm avec l’aide d’une séquence amont dite de Shine-Dalgarno seront abordés. Chez les Bacteria, cette nécessité d’une

ARNm

(a) 3′

5′′

Correct 0

A A C A U A C C G A U C A C

A A C A U A C C G A U C A C Thr

5′ (b)

ARNt Alanine

Incorrect –1

Bases clés du codon : appariement d’anticodons 5′

Anticodon Position du flottement ; appariement de bases plus flexible à cet endroit 3′

GCU

ARNm Codon FIGURE 7.34 Le concept du flottement. L’appariement de bases est plus flexible pour la troisième base du codon que pour les deux autres. Seule une partie de l’ARNt est montrée (voir figure 7.36).

(c)

Incorrect +1

Tyr

Arg

Ser

A A C A U A C C G A U C A C Asn

CGG

3′

Ile

Pro

Ile

Thr

A A C A U A C C G A U C A C His

Thr

Asp

His

FIGURE 7.35 Cadres de lecture possibles dans un ARNm. Séquence interne partielle d’un ARNm. (a) Acides aminés codés lorsque le ribosome est dans le cadre correct de lecture (appelé le cadre « 0 »). (b) Acides aminés codés par cette région de l’ARNm lorsque le ribosome est dans le cadre −1 de lecture. (c) Acides aminés codés lorsque le ribosome est dans le cadre +1 de lecture.



7.15 Les ARN de transfert 195

séquence additionnelle lors de l’initiation de traduction lui permet d’utiliser d’autres codons, comme GUG. Cependant, même dans ces cas, le premier acide aminé formé est la N-formylméthionine.

Les cadres de lecture ouverts Actuellement le génome de beaucoup d’organismes a été séquencé (chapitre 15). Cette accumulation de résultats serait sans valeur si les scientifiques ne pouvaient déterminer les gènes codant les protéines. Une méthode courante d’identification de ces gènes consiste à rechercher les cadres ouverts de lecture (Open reading frames, ORF) sur chaque brin d’ADN et d’en déduire celle de l’ARN. Sur le même ARNm il doit donc y avoir une succession de codons ; celui d’initiation (principalement AUG), ceux codant les acides aminés et celui stop. Un ordinateur peut être programmé pour rechercher les cadres ouverts de lecture dans les séquences nucléotidiques à partir d’une banque d’ADN. La recherche peut aussi inclure les différents codons, les promoteurs et les séquences ShineDalgarno des ribosomes. La présence des ORF est très importante en génomique (chapitre 15) et génie génétique (chapitre 31). Par exemple, chez un ADN séquencé mais de nature inconnue, la détection de cadres de lecture ouverts indique qu’ils codent des protéines.

Les autres codes génétiques En l’état actuel des connaissances, le terme code universel est employé car quasiment toutes les cellules le possèdent. Cette assertion doit cependant être tempérée par le fait que quelques organelles et cellules utilisent un code génétique légèrement différent (voir Focus, Acides aminés non conventionnels). Les premières découvertes de ces codes génétiques alternatifs ont été faites chez le génome mitochondrial d’animaux. Dans ces cas, certains codons « non-sens » sont devenus « sens ». Chez les mitochondries d’animaux (mais pas de plantes), le codon UGA donne le tryptophane à la place de l’information « stop » (voir tableau 7.5). D’autres cellules des genres Mycoplasma (Bacteria) et Paramecium (Eukarya) ont aussi certains codons « non-sens » codant des acides aminés. Dans quelques cas, les codons non-sens peuvent coder des acides aminés inhabituels à la place des vingt les plus communs (voir Focus).

Les biais chez les codons À l’origine, les chercheurs pensaient que l’utilisation des codons était un processus aléatoire dans une cellule. Après l’établissement du code génétique et avant le séquençage de quelques gènes, il était estimé que les codons dégénérés étaient utilisés avec des fréquences égales. Cette assertion était fausse. La génomique a en effet montré que leur utilisation était hautement biaisée et qu’elle variait selon les organismes. Par exemple, chez les protéines d’Escherichia coli, seule 1 isoleucine sur 20 est codée par le codon AUA, les 19 autres le sont par AUU et AUC. L’origine de ces biais chez les codons est mal connue mais ces particularités génomiques sont maintenant prises en compte lors d’analyses des séquences de gènes. Par exemple en biotechnologie, pour un même gène, l’utilisation des codons diffère grandement d’un organisme à un autre ; il sera

donc plus ou moins bien traduit selon la cellule dans laquelle il est cloné. Les outils du génie génétique permettent de corriger ou d’atténuer ce problème pour que la traduction d’ARNm se fasse efficacement dans un organisme donné. Le sujet sur les biais des codons sera à nouveau évoqué au chapitre 31 dédié aux biotechnologies.

Contrôlez vos acquis Le code génétique est exprimé en ARN et un simple acide aminé peut être codé par plusieurs codons tout à la fois apparentés et différents. En plus des codons non-sens, il y a aussi des codons spécifiques d’initiation qui indiquent que le processus de traduction peut commencer. •

Pourquoi est-il important pour un ribosome de lire « un cadre » ?

•

Décrivez un cadre ouvert de lecture. Si une séquence nucléotidique vous est donnée, comment identifier le cadre ouvert de lecture ?

7.15 Les ARN de transfert m n Dans le chapitre précédent, il a été montré que l’anticodon de l’ARNt s’apparie avec les bases du codon. Cependant, l’ARNt est bien plus que cela (voir figure 7.36), il a une spécificité au niveau de l’anticodon mais aussi d’un acide aminé. Des enzymes spécifiques, les aminoacyl-ARNt synthétases, ont l’importante fonction de reconnaître l’acide aminé approprié et l’ARNt spécifique à cette molécule.

La structure des ARNt Il y a environ 60 ARNt différents dans les cellules bactériennes et 100 à 110 dans celles des mammifères. Les molécules d’ARN de transfert sont formées de 73 à 93 nucléotides, elles sont courtes, simples brins avec d’importantes structures secondaires ; certaines bases et structures secondaires sont constantes alors que d’autres parties sont variables. Les ARN de transfert contiennent des purines et pyrimidines modifiées chimiquement, ce qui les différencie légèrement des bases constituant normalement les ARN. Ces modifications se font après la transcription, les plus inhabituelles de ces bases sont la pseudouridine, l’inosine, la dihydrouridine, la ribothymidine, le méthyle guanosine, la diméthyle guanosine, et le méthyle inosine. L’ARNt final et mature contient aussi d’importantes régions doubles brins résultant de l’appariement de bases lors du repliement de celui-ci. Sur la figure 7.36a, la structure de l’ARNt ressemble à une « feuille de trèfle ». Plusieurs régions secondaires ont reçu des noms correspondant soit aux bases les plus fréquentes à cet endroit (boucles TψC et boucles D par exemple) soit à des fonctions spécifiques (boucle de l’anticodon et extrémité acceptrice). La structure tridimensionnelle de l’ARNt est montrée sur la figure 7.36b. Il faut noter que les bases qui apparaissent éloignées dans le modèle « feuille de trèfle » sont proches dans la vue à trois dimensions. Il est ainsi montré que les bases de plusieurs boucles ont la possibilité de s’apparier.



196 Chapitre 7

FOCUS


Acides aminés non conventionnels

Le code génétique possède des codons correspondant à vingt acides aminés (voir le tableau 7.5). Cependant, au moins cent « autres » acides aminés non conventionnels ont été retrouvés dans de nombreuses protéines. À l’origine, il était admis que ces molécules résultaient de la modification d’un acide aminé standard et étaient incorporées dans la protéine par modification post-traductionnelle. Ce phénomène existe, mais au moins deux « autres » acides aminés, la séléno-cystéine et la pyrrolysine, sont insérés par la machinerie traductionnelle dans une protéine. La sélénocystéine a la même structure que la cystéine à l’exception d’un atome de sélénium remplaçant un soufre (voir figure 1). Il est connu que diverses protéines (dont certaines de l’Homme) possèdent cet acide aminé inhabituel. Par exemple, Escherichia coli a deux formate déshydrogénases différentes contenant cette molécule. Le séquençage d’une de ces enzymes a montré que le codon correspondant à la sélénocystéine était UGA. Normalement, c’est un codon non-sens chez E. coli (voir tableau 7.5) mais certains ARNm de cette bactérie, mais aussi d’autres procaryotes, eucaryotes dont l’Homme, le traduisent en sélénocystéine. Cette molécule est donc le 21e acide aminé dont on a découvert le code. La pyrrolysine est une lysine qui a en plus un noyau aromatique (voir figure 1). Cet acide aminé a d’abord été découvert chez des espèces d’Archaea dites méthanogènes car leur métabolisme génère un gaz naturel, le méthane (voir section 3.14). Il a par la suite était retrouvé chez d’autres

Archaea et chez des Bacteria. L’enzyme méthylamine méthyltransférase de plusieurs méthanogènes contient une pyrrolysine. L’analyse du gène de cette enzyme a montré qu’un processus semblable à celui décrit pour la sélénocystéine existait dans le cas présent. Un codon non-sens, ici UAG, codait la pyrrolysine. Comment un codon peut-il parfois être non-sens et d’autres fois sens ? Ce phénomène est bien connu chez la pyrrolysine et est à relier au contexte, c’est-à-dire aux séquences de bases, entourant UGA. Ceci diffère du « code alternatif » des mitochondries où UGA code le tryptophane indépendamment des séquences l’environnant. Dans certains contextes, la machinerie traductionnelle décode UGA en sélénocystéine alors que dans d’autres cas, ce codon arrête la traduction. La sélénocystéine a son propre ARNt (comme les acides aminés standard) avec l’anticodon UCA et un facteur protéique spécifique qui conduit cet ARNt au ribosome lors de la traduction. La pyrrolysine a aussi un ARNt qui lui est dédié, mais elle diffère de NH3+ –

OOC

C

NH3+

CH2

SH

–

OOC

H

CH2

(CH2)2 CH2

NH3+

(CH2)2 CH2

N

Lysine

NH3+ C

C H

Cystéine

–OOC

la sélénocystéine par un point important : cette dernière est formée lorsque la sérine aminoacyl-ARNt synthétase modifie la sérine attachée à l’ARNt-sélénocystéine. Dans le cas de la pyrrolysine, une aminoacyl-ARNt synthétase charge directement l’ARNt-pyrrolysine avec l’acide aminé. L’évolution a vraisemblablement permis certaines « libertés » avec le code génétique. L’incorporation de la pyrrolysine et de la sélénocystéine en sont d’excellents exemples ; on peut donc s’interroger sur l’existence d’autres acides aminés inhabituels codés par des codons sens ou nonsens « réaffectés » à cette tâche. L’ère de la génomique a simplifié leur recherche ; en effet, l’analyse des séquences d’acides nucléiques par ordinateur identifie rapidement les codons non-sens qui ne sont pas à leur place dans un cadre ouvert de lecture. La détection des codons-sens « réaffectés » est plus complexe, mais la recherche par ordinateur d’une corrélation entre acides aminés inhabituels, leurs codons et le contexte de la séquence pourra générer d’intéressantes surprises.

NH3+

CH2

SeH

–OOC

C

CH2

H

H

Sélénocystéine

Pyrrolysine

O

H

C

C N

C

CH3

CH2 CH

Figure 1 Comparaison des structures cystéine / sélénocystéine et lysine / pyrrolysine.

Une région variable capitale de l’ARNt est l’anticodon, site qui reconnaît le codon sur l’ARNm. L’anticodon est situé dans la boucle du même nom (voir figure 7.36), il est constitué de trois nucléotides qui sont spécifiquement impliqués dans le processus de reconnaissance et d’appariement avec les bases du codon (voir section 7.14 et figure 7.34). D’autres régions de l’ARNt interagissent avec le ribosome (ARNr et protéines), les protéines de traduction non ribosomiques et l’ARNt-aminoacyl synthétase. À l’extrémité 3’ ou acceptrice terminale de tous les ARNt, il y a toujours trois nucléotides non appariés qui sont : cytosine-cytosine-adénine (CCA). C’est au ribose de l’adénine terminale que l’acide aminé est lié de façon covalente par un lien ester. À partir de cette position sur l’ARNt, l’acide aminé sera incorporé dans la chaîne peptidique en formation au niveau du ribosome. Ce mécanisme est décrit dans la section suivante.

La reconnaissance, l’activation et le chargement des ARNt La reconnaissance de l’ARNt adéquat par l’ARNt-aminoacyl synthétase requiert des contacts spécifiques entre les régions d’acides nucléiques et les acides aminés des deux molécules (voir figure 7.37). L’anticodon du fait de son caractère unique est une région essentielle dans la reconnaissance par l’enzyme ; cependant, d’autres sites ont aussi leur importance. Des études ont montré, à l’aide de mutations sur des bases spécifiques de l’ARNt, qu’un petit nombre de nucléotides localisés à côté de l’anticodon sont aussi impliqués dans cette reconnaissance. Ils font souvent partie de la tige acceptrice ou de la boucle D (voir figure 7.36). Il faut souligner que la fidélité dans le processus de reconnaissance est primordiale, car si



7.16 Processus de synthèse des protéines : la traduction 197 Tige acceptrice

5′

3′

phe 3′ A C Boucle TψC C Extrémité A G 5′ C acceptrice Tige C G acceptrice G C U G U A Boucle D U A U U A Boucle D CC G ACAG mA U A mG C U C A D G D G U G U mC C G C G A G T C Ψ A G U GA mG G mG Boucle TψC G C G C Tige de l’anticodon U A mC G A Y A mC Y U A A mG Anticodon 3′ 5′ Boucle de l’anticodon ARNm U U C

Codon

(a)

Extrémité acceptrice

Tige de l’anticodon

A A mG

Anticodon

(b)

FIGURE 7.36 Structure d’un ARN de transfert. (a) Structure dite en feuille de trèfle de l’ARNt de la phénylalanine chez les levures. L’acide aminé est fixé au ribose du A terminal de l’extrémité acceptrice. A, adénine ; C, cytosine ; U, uracile ; G, guanine ; ψ, pseudouracile ; D, dihydrouracile ; m, groupement méthyle ; Y, purine modifiée. (b) Dans la réalité, la molécule d’ARNt est repliée de telle manière que les boucles D et TψC sont proches l’une de l’autre et associées par des interactions hydrophobes. Certaines bases non courantes sont présentes dans l’ARNt ainsi que la thymine, absente dans les ARNm.

un acide aminé non approprié s’attache à l’ARNt, il sera inséré au polypeptide donnant vraisemblablement une protéine inadéquate. La réaction spécifique entre l’acide aminé et l’ARNt est catalysée par l’aminoacyl-ARNt synthétase, il y a premièrement activation de l’acide aminé par l’ATP : acide aminé + ATP ↔ aminoacyl-AMP + P-P L’aminoacyl-AMP intermédiaire formé reste normalement lié à l’enzyme jusqu’à ce qu’il y ait une rencontre avec la molécule d’ARNt appropriée. L’acide aminé est alors activé (voir figure 7.37a), transféré à l’ARNt et forme un ARNt chargé : aminoacyl-AMP + ARNt ↔ aminoacyl-ARNt + AMP Le pyrophosphate (PPi) formé dans la première réaction est coupé par une pyrophosphatase, formant deux molécules de phosphate inorganique. Ainsi, puisqu’un ATP est utilisé et un AMP est formé, l’activation d’un acide aminé et de l’ARNt correspondant nécessite l’énergie de deux liaisons riches en phosphate. Dès que l’activation et le chargement sont effectués, l’aminoacyl-ARNt quitte la synthétase et se dirige vers le ribosome où la synthèse polypeptidique va se faire. Ce mécanisme sera décrit dans la section suivante.

Contrôlez vos acquis Un ou plusieurs ARN de transfert existent pour chaque acide aminé des protéines. Les enzymes, ARNt-aminoacyl synthétases, attachent un acide aminé à un ARNt.

Un acide aminé adéquat doit être attaché à son ARNt, mais la spécificité réside d’abord dans l’interaction codon-anticodon. •

Quelle est la fonction de l’anticodon de l’ARNt ?

•

Quelle est la fonction de l’extrémité acceptrice de l’ARNt ?

7.16 Processus de synthèse m n des protéines : la traduction Nous avons appris au chapitre 3 que c’est la séquence en acides aminés qui détermine la structure, et au final, la fonction de la protéine. Ainsi, il est crucial que la traduction soit fidèle pour que l’acide aminé approprié soit inséré à la place adéquate dans la chaîne polypeptidique. C’est le rôle de la machinerie de synthèse protéique cellulaire qui inclut, en particulier, le ribosome.

Les ribosomes Les ribosomes sont les sites de synthèse des protéines. Une cellule peut avoir plusieurs milliers de ribosomes, ce nombre est corrélé positivement avec le taux de croissance. Chaque ribosome est formé de deux sous-unités nommées 30S et 50S chez les procaryotes, l’ensemble donnant des ribosomes 70S. Les nombres 30S, 50S et 70S font référence à l’unité Svedberg, qui est l’unité du coefficient de sédimentation quand les sous-unités ou l’ensemble du ribosome sont soumis à une force centrifuge.



198 Chapitre 7


H OH

O

P

ARNt spécifique de la valine non lié (ARNtVal)

C

C

CH

O

Acide aminé (valine)

NH 2

CH 3

CH 3

Tige acceptrice

Région de l’anticodon

AMP + PPi

C A C

Aminoacyl-ARNt synthétase pour la valine

Liaison de la valine à l’ARNtVal

AMP Valine H O

C O

ARNt lié à une valine prêt pour la synthèse protéique

C

NH 2 CH CH 3

CH 3

Dino Moras

Boucle de l’anticodon C A C

(b)

(a)

FIGURE 7.37 Aminoacyl-ARNt synthétases. (a) Mode d’action d’une aminoacyl-ARNt synthétase. La reconnaissance spécifique entre un ARNt et une synthétase implique des interactions entre les acides nucléiques spécifiques de la boucle D et de l’extrémité acceptrice de l’ARNt et les acides aminés spécifiques de la synthétase. Sur cette figure, la valyl-ARNt synthétase catalyse l’étape finale de la réaction, où la valine sous forme valyl-AMP est transférée à l’ARNt. (b) Modélisation par ordinateur montrant l’interaction de la glutaminyl-ARNt synthétase (en bleu) avec son ARNt (en rouge). Imprimé avec la permission de M. Ruff et al., Science 252 : 1682-1689, 1991. © 1991, AAAS.

Chaque sous-unité ribosomique est un complexe ribonucléoprotéique constitué d’ARN et de protéines ribosomiques. La sous-unité 30S est formée d’ARN16S et d’environ 21 protéines, tandis que la 50S contient les ARNr 5S et 23S et environ 34 protéines (voir tableau 7.6 et figure 7.38a). Chez Escherichia coli, il y a au moins 53 protéines ribosomiques distinctes, la plupart présentes à raison d’une copie par ribosome. Le génome d’E. coli ayant été complètement séquencé et les ribosomes très étudiés, le nombre total de protéines ribosomiques devrait être connu. La tâche est cependant ardue car plusieurs protéines sont fortement attachées au ribosome alors que d’autres le sont beaucoup moins, certaines sont associées avec une sous-unité alors que d’autres le sont avec les 2. Il existe aussi des protéines essentielles pour le fonctionnement du ribosome, qui interagissent avec celui-ci à des stades spécifiques de la traduction, mais qui ne sont pas des « protéines ribosomiques » sensu stricto. Il faut aussi prendre en compte que le ribosome est une structure très dynamique où les parties s’associent et se dissocient alternativement et qui interagit avec plusieurs autres protéines cellulaires. Déterminer le nombre de « protéines ribosomiques » n’est donc pas une tâche aisée.

TABLEAU 7.6

COMPARAISON DES RIBOSOMES a PROCARYOTES ET EUCARYOTES

Propriété

Procaryote

Eucaryote

Taille globale

70S

80S

Petite sous-unité

30S

40S

Nombre de protéines

~21

~30

Taille de l’ARN (nombre de bases)

16S (1 500)

18S (2 300)

50S

60S

Nombre de protéines

~34

~50

Taille de l’ARN (nombre de bases)

23S (2 900)

28S (4 200)

5S (120)

5,8S (160)

Grande sous-unité

5S (120) a

Les ribosomes des mitochondries et des chloroplastes eucaryotes sont semblables aux ribosomes procaryotes (voir section 14.4).



7.16 Processus de synthèse des protéines : la traduction 199

Les étapes de la synthèse des protéines La synthèse d’une protéine est un processus complexe dans lequel différentes composantes du ribosome ont un rôle spécifique. C’est aussi un processus continu mais il est possible d’y distinguer plusieurs étapes : l’initiation, l’élongation et la terminaison. Au-delà de l’ARNm, de l’ARNt et des ribosomes, cette synthèse nécessite plusieurs protéines appelées facteurs d’initiation, d’élongation et de terminaison, tandis que l’énergie est fournie par la guanosine triphosphate. Les étapes clés de la synthèse d’une protéine sont décrites sur la figure 7.38.

Site E Site P Site A Sous-unité 50S Sous-unité 30S

As p

Site E Site P Site A f-Met C U A

(a)

ARNt

L’initiation

Initiation (requiert plusieurs protéines d’initiation, IF-1, 2 et 3)

U A C 5′

ARNm 3′

G A U A G G G C G

(i)

Site E vide

f-Met

Asp

Fixation au site A de l’ARNt chargé Élongation (requiert les protéines EF-Tu et EF-Ts)

U A C C U A A U G A G G G C G

(ii)

g

Ar

Formation d’une liaison peptide f-Met

Prochain ARNt chargé

Asp U C

Site E vide

C

U A C C U A A U G

A G G G C G

(iii)

Ar

f-Met

g

Asp

C

Translocation

C

ARNt fMet non chargé

Site A vide

U

Site E occupé

TRANSLOCATION (requiert

(requires proteinEF-G) EF-G) la protéine

U A C C U A A U G G A U

G C G

(iv)

Ala

C

f-Met Asp U

A

C

Libération de l’ARNt fMet non chargé 5′

(v)

(b)

Arg

G

Prochain ARNt chargé C

Continuation du processus jusqu’à un codon stop (les protéines RF participent à la terminaison)

C U A U C C A U G G A U A G G G C G

3′

Chez les procaryotes, l’initiation de la synthèse protéique commence toujours avec une sous-unité libre 30S. Puis un complexe d’initiation constitué de la sous-unité 30S, d’ARNt formylméthionine, et de plusieurs protéines d’initiation, IF1, IF2 et IF3 se forme. La guanosine triphosphate est aussi requise pour cette étape. À ce complexe, s’ajoute la sous-unité 50S, pour donner au final un ribosome 70S actif. À la fin de la traduction, le ribosome se sépare de nouveau en sous-unités 30S et 50S. Sur l’ARNm, le codon d’initiation est précédé par une séquence de 3 à 9 nucléotides, dite de Shine-Dalgarno, impliquée dans la liaison au ribosome. Ce site de liaison au ribosome situé à l’extrémité 5’ de l’ARNm est complémentaire de la partie 3’ terminale de l’ARN 16S. L’appariement des bases entre ces deux molécules permet la formation du complexe ARNm / ribosome à l’endroit approprié au niveau du cadre ouvert de lecture. Les ribosomes des procaryotes traduisent alors les ARNm polycistroniques, et reconnaissent chaque site d’initiation après leur liaison avec la région de Shine-Dalgarno (voir section 7.13). La traduction commence toujours avec un ARNt-aminoacyl spécial se liant au codon d’initiation, AUG. Chez les Bacteria, c’est l’ARNt formylméthionine. Par la suite, le groupe formyl à l’extrémité N-terminale du polypeptide est ôté ; l’acide aminé terminal de la protéine complète est alors la méthionine. Les sites Shine-Dalgarno (ainsi que d’autres interactions possibles entre ARNr et ARNm) dirigeant le ribosome vers le site d’initiation approprié, les messagers procaryotiques peuvent utiliser un autre codon que AUG ; l’alternative la plus courante est GUG. Quand il est utilisé dans ce contexte, GUG donnera une formylméthionine liée à l’ARNt-initiateur (et non pas une valine, tableau 7.5). Chez les Eukarya et Archaea, l’initiation commence avec la méthionine à la place de la formylméthionine. Même si toutes les protéines des cellules sont initiées par l’une de ces deux molécules, cet acide aminé n’est pas toujours

FIGURE 7.38 Ribosome et synthèse protéique. (a) Structure du ribosome indiquant la position des sites : accepteur (A), peptide (P) et sortie (E). (b) Traduction. Initiation et élongation. (i, ii) L’interaction entre le codon et l’anti-codon permet de mettre en position l’ARNt chargé adéquat (dans le cas présent, l’ARNt initial et le second ARNt chargé). (iii) Lors de l’élongation, la formation du peptide se fait par liaison des acides aminés à partir d’ARNt adjacents. (iv) La translocation du ribosome d’un codon à un autre conduit à la libération de l’ARNt au site E. (v) L’ARNt chargé suivant se lie au site A.



200 Chapitre 7


le premier retrouvé dans les protéines cellulaires. La méthionine (ou formylméthionine chez les Bacteria) est éliminée des protéines matures par une protéase spécifique.

L’élongation, la translocation et la terminaison L’ARNm se fixe premièrement à la sous-unité 30S. Les site-A et site-P sont localisés au niveau de la sous-unité 50S (voir figure 7.38b) et l’ARNt nouvellement chargé s’attache premièrement au site accepteur (site-A). Toute une série de facteurs protéiques (EF), appelés EF-Ta, facilitent le déplacement et l’attachement d’un ARNt à ce site. Sur le site peptide (site-P), l’ARNt est lié au peptide en formation mais il se déplacera vers l’ARNt du site-A durant la formation d’un nouveau lien peptidique. Plusieurs protéines non ribosomiques, en particulier EF-Tu et EF-Ts (famille EF), sont nécessaires pour l’élongation, ainsi que des molécules additionnelles de GTP (la figure 7.38b a été simplifiée en omettant les facteurs d’élongation et en ne montrant qu’une partie du ribosome). Dans la suite de l’élongation, l’ARNt lié au peptide est transloqué des sites A vers P, permettant ainsi la réception d’un nouvel ARNt chargé sur le site accepteur (voir figure 7.38b). Lors de chaque événement de translocation, une protéine EF spécifique (EF-G) et une molécule de GTP sont nécessaires. Le ribosome avance de trois nucléotides, exposant un nouveau codon au niveau du site-A du ribosome et poussant l’ARNt maintenant vide vers un troisième site dit de sortie (site-E) où l’ARNt est libéré du ribosome (voir figure 7.38b). La précision de la translocation est cruciale pour l’exactitude de la synthèse protéique car lors de chaque étape, le ribosome doit se déplacer d’exactement un codon. Durant ce processus, l’ARNm semble se déplacer dans le complexe ribosomique, mais en réalité, c’est le ribosome qui migre le long de l’ARNm. Ainsi les trois sites du ribosome identifiés sur la figure 7.38 ne sont pas dans des positions statiques mais sont au contraire dans les parties mobiles d’une machinerie biomoléculaire complexe. Plusieurs ribosomes peuvent simultanément traduire une seule molécule d’ARNm formant un complexe nommé polysome (voir figure 7.39). L’activité des ribosomes étant indépendante de celle de son voisin, dans un polysome chacun d’entre eux synthétise un polypeptide complet, ce qui augmente la vitesse et l’efficacité de la traduction. Notez sur la

Polypeptide en croissance

figure 7.39 que les ribosomes proches de l’extrémité 5’ (le début) de l’ARNm ont de courts polypeptides qui leur sont attachés car ils n’ont lu que quelques codons tandis que ceux proches de la partie 3’ du messager ont des polypeptides presque terminés. La terminaison de la synthèse de protéine se fait quand un codon non-sens est atteint, les ARNt ne pouvant plus s’y fixer. À la place, des protéines spécifiques, les facteurs RF de libération, reconnaissent ce signal et coupent le polypeptide attaché à l’ARNt terminal, libérant le produit fini. Par la suite, les sous-unités 30S et 50S se dissocient, elles peuvent alors former de nouveaux complexes d’initiation et recommencer le processus.

Le rôle des ARN ribosomiques dans la synthèse protéique De l’initiation à la terminaison, le rôle de l’ARN ribosomique est crucial dans toutes les étapes de la synthèse protéique. Par contre, pour plusieurs protéines du ribosome ce rôle est moins connu, elles agiraient en stabilisant ou positionnant les séquences clés des différents ARN ribosomiques. Comme évoqué précédemment, chez les procaryotes, lors de l’initiation, l’ARNr 16S s’apparie avec l’ARNm au niveau de la séquence de liaison au ribosome (dite de Shine-Dalgarno). L’ARN ribosomique a aussi un rôle dans l’association des sousunités ainsi que dans le positionnement de l’ARNt sur les sites A et P du ribosome (voir figure 7.38b). Les ARNt chargés s’apparient au niveau des bases codon : anticodon mais ils sont aussi physiquement attachés au ribosome lors de l’interaction tige-boucle de l’anticodon avec les séquences spécifiques de l’ARNr 16S. L’extrémité acceptrice des ARNt (voir figure 7.36) s’apparie aussi avec des séquences de l’ARNr 23S. La formation des liens peptidiques est aussi catalysée par l’ARNr. Ce processus, nommé la réaction de peptidyl transférase, se fait sur la sous-unité 50S, il n’est pas catalysé par les nombreuses protéines du ribosome ou celles qui lui sont associées mais par l’ARNr 23S lui-même. Lors du processus de traduction impliquant l’ARNr 23S, les protéines EF interagissent spécifiquement avec cet ARNr. Enfin, l’ARNr 16S catalyse les réactions de terminaison, certainement lors d’interactions avec l’ARNm ou les protéines dites de libération. Ainsi, l’ARN ribosomique a un double rôle dans le ribosome : structural mais aussi catalytique lors de la traduction.

Polypeptide presque achevé

ARNm 5′

3′

FIGURE 7.39 Polysomes. Le polysome est formé lors de la traduction d’un ARN messager par plusieurs ribosomes. Les ribosomes proches de l’extrémité 5’ sont au stade initial de la traduction ; seule une partie du peptide final a donc été formée.



7.17 Sécrétion et repliement des protéines 201

L’effet des antibiotiques sur la synthèse des protéines Plusieurs antibiotiques sont utilisés en clinique ou en recherche car ils inhibent la synthèse des protéines en interagissant avec le ribosome. Les interactions sont spécifiques et impliquent souvent les ARNr. Ces antibiotiques agissent lors d’étapes particulières de la synthèse des protéines ; par exemple, la streptomycine inhibe l’initiation alors que la puromycine, le chloramphénicol, le cycloheximide et la tétracycline ont un effet sur l’élongation. En plus de leur utilité clinique, plusieurs antibiotiques inhibent spécifiquement les ribosomes d’organismes phylogénétiquement différents. Dans la liste ci-dessus, le chloramphénicol et la streptomycine sont spécifiques des ribosomes de Bacteria et le cycloheximide de ceux d’Eukarya. Leur mode d’action ainsi que ceux d’autres antibiotiques sont décrits au chapitre 20.

Contrôlez vos acquis Dans le processus de traduction, le ribosome a un rôle primordial en mettant en liaison l’ARNm et les ARNt aminoacyls. Il y a trois sites sur le ribosome : l’accepteur où se fixent premièrement les ARNt chargés ; le site peptide où la chaîne polypeptidique en croissance se place et un site de sortie. Lors de l’ajout de chaque acide aminé, le ribosome avance de trois nucléotides (un codon) sur l’ARNm et l’ARNt se déplace du site accepteur au peptide. La terminaison de la synthèse protéique se fait lorsqu’un codon non-sens, ne codant pas un acide aminé, est atteint. •

Quels sont les composants d’un ribosome ?

•

Quels rôles fonctionnels ont les ARNr dans la synthèse protéique ?

7.17 Sécrétion et repliement m n des protéines Il a précédemment été décrit comment l’information génétique contenue dans la séquence des bases de l’ADN est répliquée en une copie identique, transcrite en ARN et traduite en acides aminés pour former une protéine. Cependant pour fonctionner, une protéine doit prendre une conformation spéciale (voir sections 3.6 à 3.8) et se placer à un endroit précis dans la cellule. Ces deux derniers processus sont maintenant abordés.

Il y a plusieurs types de chaperons et quelques-uns sont associés aux ribosomes. Certains sont très abondants dans la cellule, particulièrement lorsque les conditions de croissance induisent un risque dans la stabilité des protéines (par exemple lors de températures élevées). Les chaperons moléculaires semblent extrêmement répandus et ont des séquences hautement conservées. Escherichia coli possède quatre chaperons : DnaK, DnaJ, GroeEL et GroeES. Les deux premiers sont des enzymes-ATP dépendantes qui, en se liant aux peptides nouvellement formés, empêchent leur repliement trop rapide (voir figure 7.40), ce ralentissement favorisant les chances de succès du processus. Le complexe DnaKJ ne participe pas au repliement d’une protéine mais peut transférer une protéine partiellement repliée aux multi sousunités GroEL et GroES. La protéine va alors entrer dans GroEL (une protéine basiforme) et prendre une conformation correcte grâce à l’énergie libérée par l’hydrolyse de l’ATP. GroES aide à la réalisation de ce processus (voir figure 7.40). En plus du repliement des protéines nouvellement synthétisées, les chaperons peuvent reconformer celles qui ont été partiellement dénaturées dans une cellule ; par exemple, suite à une augmentation très importante des températures dans l’environnement. Les chaperons sont donc un type de protéine de choc thermique et leur synthèse est grandement accélérée quand une cellule est stressée par une chaleur excessive (voir section 8.9). La réponse de choc thermique est donc une tentative de la cellule pour reconformer des protéines partiellement dénaturées avant

ATP

Protéine avec une conformation incorrecte

ou

ADP

DnaK DnaJ

Protéine avec une conformation correcte (active)

ATP GroEL ADP

GroES

Le repliement protéique Plusieurs protéines prennent spontanément une conformation active lors de leur synthèse (voir figure 7.39). En revanche, d’autres nécessitent l’assistance de protéines, les chaperons moléculaires, pour acquérir leur conformation ou pour s’assembler en complexes. Les chaperons ne font pas partie des assemblages protéiques mais aident seulement au processus de repliement. Prévenir l’assemblage inadéquat de protéines est une de leur plus importante fonction.

Protéine avec une conformation correcte (active) FIGURE 7.40 Activité des chaperons moléculaires. Une protéine à la conformation incorrecte peut être reconformée par les complexes DnaKJ ou GroEL/ES. Dans les 2 cas, l’énergie nécessaire à ce processus provient de l’ATP.



202 Chapitre 7


que les protéases ne les reconnaissent comme étant non conformes et ne les détruisent. La reconformation n’est pas toujours réussie, et les cellules contiennent une variété de protéases qui détruisent spécifiquement les protéines dénaturées et génèrent ainsi des acides aminés utilisables pour la synthèse de nouvelles protéines.

La sécrétion de protéines et les particules de reconnaissance du signal Plusieurs protéines exercent une fonction dans la membrane cytoplasmique, le périplasme des cellules Gram négatif (voir section 4.9) ou même en dehors de la cellule. À partir de leur lieu de synthèse, le ribosome, elles doivent donc circuler jusqu’à la membrane cytoplasmique ou la traverser. Les cellules peuvent transférer sélectivement certaines protéines au travers d’une membrane et laisser les autres dans le cytoplasme. La plupart des protéines qui sont transférées dans ou au travers d’une membrane sont synthétisées avec une séquence peptidique supplémentaire d’environ 15 à 20 acides aminés, la séquence signal, située au début de la molécule. Il en existe plusieurs, elles sont très variables mais ont en commun quelques résidus chargés positivement au début des séquences, une région centrale comptant des résidus hydrophobes et une région plus polaire. Ce type de séquence informe le système sécréteur de la cellule que cette protéine particulière doit être exportée et l’empêche de se replier complètement, un processus susceptible de gêner la sécrétion. La séquence signal étant la partie de la protéine initialement formée, les premières étapes de l’exportation peuvent commencer avant que la protéine ne soit complètement synthétisée (voir figure 7.41). Dans toutes les cellules, les particules de reconnaissance du signal (SRP) ont un rôle crucial dans l’identification des protéines devant être sécrétées (voir figure 7.41). Chez les Bacteria, elles sont constituées d’une protéine et d’un petit ARN nommé ARN 4,5S (voir section 8.14), qui n’est pas un ARNt, un ARNr ou un ARNm. Une SRP reconnaît la séquence signal d’une protéine et la présente à un complexe membranaire protéique spécifique (par exemple le complexe SecYEG, section 4.7) où elle traversera un pore et sera sécrétée dans le périplasme ou l’environnement (voir figure 7.41). Habituellement, durant ce transport, une modification post-traductionnelle se fait par enlèvement de la séquence signal par une protéase. La translocation de protéines au travers d’une membrane est beaucoup moins connue chez les espèces d’Archaea. Les analyses génomiques ont montré qu’elles produisent une SRP et ont en commun plusieurs étapes du processus de translocation rencontré chez les Bacteria mais aussi chez les Eukarya. Dans ce dernier cas, cela confirme leur parenté phylogénétique (voir section 2.3). À noter que le SRP archéen est un ARN 7S de petite taille, identique à celui des cellules eucaryotes.

La sécrétion des protéines repliées : le système TAT Avec le système de transport de protéine Sec, où intervient une particule de reconnaissance du signal, les

Particule de reconnaissance du signal

Membrane Périplasme

Protéine non sécrétée Protéine ne contenant pas la séquence signal Ribosome

Protéine contenant la séquence signal

Protéine

Système de sécrétion membranaire

ARNm

Complexe de traduction FIGURE 7.41 Protéines de sécrétion et la particule de reconnaissance du signal (SRP). La séquence signal est reconnue par le SRP et la protéine transportée jusqu’au système de sécrétion membranaire. Chez les bactéries Gram négatif, la protéine est sécrétée dans le périplasme (voir section 4.9). Les espèces bactériennes ont un SRP de 4.5S tandis qu’il est plus important, environ 7S, chez les Archaea et les Eukarya.

protéines à l’état non replié sont véhiculées au travers de la membrane plasmique et prennent uniquement une conformation normale dans le périplasme (chez les cellules Gram négatif) [voir figure 7.41]. Cependant, de petits cofacteurs peuvent s’insérer dans d’autres protéines nécessitant un transport extracellulaire et leur permettre d’acquérir leur conformation finale. Ce phénomène est localisé dans le cytoplasme et les protéines repliées sont véhiculées par le système d’exportation de protéine Tat qui est distinct du Sec. L’acronyme Tat provient de twin arginine translocase car les protéines transportées ont une courte séquence signal avec une paire d’arginines. Les séquences signaux des protéines repliées sont reconnues par les protéines TatBC qui les présentent au transporteur membranaire protéique TatA. L’énergie nécessaire à ce transport est fournie par la force proton-motrice. Le système Tat transporte des protéines très diverses, il a une certaine spécificité pour les protéines fersoufre et celles de type « redox » intervenant dans le métabolisme énergétique et localisées dans le périplasme. Plusieurs protéines impliquées dans la biosynthèse des membranes externes (voir section 4.9) ainsi que celles ne contenant pas de cofacteurs mais se repliant dans le cytoplasme sont transportées par Tat. Dans ce chapitre, l’essentiel des processus moléculaires clés se déroulant dans une cellule ont été abordés. La grande diversité et les régulations hautement élaborées à l’intérieur d’une cellule ainsi que la régulation de l’expression d’un gène ou d’un ensemble de gènes seront abordées dans le chapitre suivant.



Questions 203

Contrôlez vos acquis Les protéines doivent prendre une conformation particulière pour fonctionner. Ce repliement peut se faire spontanément mais peut aussi impliquer des protéines dites chaperons moléculaires. Plusieurs protéines doivent être transportées dans ou au travers des membranes cellulaires. Elles sont synthétisées avec une séquence signal qui est reconnue par l’appareil cellulaire

d’exportation mais qui est aussi enlevée durant ou après le transport. •

Qu’est-ce qu’un chaperon moléculaire ?

•

Pourquoi plusieurs protéines ont une séquence signal ?

•

Qu’est-ce qu’une particule de reconnaissance du signal ?

QUESTIONS 1. Décrivez le dogme central de la biologie moléculaire (voir section 7.1). 2. Les gènes ont été découverts avant que leur nature chimique ne soit connue. Définissez un gène sans mentionner sa nature chimique. Quelle est la composition d’un gène (voir section 7.1) ? 3. Les séquences répétées inversées peuvent donner des structures tige-boucle. Donnez un exemple d’une séquence ADN double brin contenant une région répétée inversée et indiquez comment le transcrit peut former une structure tige-boucle (voir section 7.2). 4. La séquence 5’-GCACGGCACG-3’ est-elle répétée inversée ? Argumentez votre réponse (voir section 7.2). 5. Les molécules d’ADN riches en AT se séparent plus facilement à haute température que celles riches en GC. En vous appuyant sur les propriétés d’appariement des bases AT et GC, donnez une explication à cette observation (voir section 7.2). 6. Décrivez comment l’ADN, qui lorsqu’il est linéaire fait plusieurs fois la taille de la cellule, peut être contenu dans celle-ci (voir section 7.3). 7. Donnez la liste des éléments génétiques d’un micro-organisme (voir section 7.4). 8. Durant la réplication, une structure fréquemment observée avec l’ADN circulaire est la structure thêta. Faites un diagramme du processus de réplication et montrez comment une structure thêta peut se former (voir sections 7.5 et 7.6). 9. Pourquoi les erreurs de réplication de l’ADN sont-elles si rares ? Quelle autre activité enzymatique, en plus de la polymérisation, est associée à l’ADN polymérase III et comment fait-elle pour qu’il y ait un minimum d’erreurs (voir section 7.6) ? 10. Que sont les enzymes de restriction ? Dans les cellules, qui les produit, quelle est leur fonction probable ? Pourquoi n’endommagent-elles pas l’ADN dans les cellules (voir section 7.7) ?

11. Comment les didéoxynucléotides interviennent comme terminateurs de chaînes ? Figure 7.26b, pourquoi sur le gel les bandes ont-elles migré à des positions différentes (voir section 7.8) ? 12. Décrivez les principes de base d’amplification d’un gène par la réaction de polymérisation en chaîne (PCR). Comment les procaryotes thermophiles et hyperthermophiles ont-ils facilité l’utilisation de la PCR (voir section 7.9) ? 13. Y a-t-il des promoteurs ou des codons d’initiation chez les gènes codant les ARNt ? Argumentez (voir sections 7.10 et 7.11). 14. Les sites d’initiation et d’arrêt de la synthèse d’ARNm (sur l’ADN) sont différents de ceux de la synthèse des protéines (sur l’ARNm). Argumentez (voir sections 7.10 à 7.13). 15. Qu’est-ce que le « flottement » et pourquoi est-il nécessaire pour la synthèse des protéines (voir section 7.14) ? 16. Que sont les ARNt-aminoacyl synthétases et quel type de réactions catalysent-elles ? Combien cette enzyme a-t-elle de types différents (approximativement) dans une cellule ? Comment une synthétase reconnaît-elle le substrat approprié (voir section 7.15) ? 17. La formation de liens peptidiques sur le ribosome est appelée activité peptidyl transférase. Qu’est-ce qui catalyse cette réaction (voir section 7.16) ? 18. Parfois les protéines ayant une conformation inadéquate peuvent reprendre une forme fonctionnelle ; lorsque ce processus ne se fait pas avec succès, elles sont alors détruites. Quels types de protéines sont impliqués dans la reconformation des protéines mal repliées ? Quels types d’enzymes détruisent ces protéines mal conformées (voir section 7.17) ? 19. Comment une cellule reconnaît les protéines ayant une fonction extracellulaire (voir section 7.17) ?

PROBLÈMES 1. Le génome de la bactérie Neisseria gonorrhoeae est une molécule d’ADN double brin de 2 220 kilos paires de bases. Calculez sa longueur en centimètres. Si 85 % de cet ADN sont formés de cadres de lecture ouverts pour les gènes codant des protéines et sachant qu’en moyenne une protéine a 300 acides aminés, combien Neisseria a-t-elle de gènes de ce type ? Quel type d’information est fourni par les 15 % d’ADN restant ? 2. Comparez et indiquez les différences entre les ADN et ARN polymérases. Quels sont les fonctions et substrats de chacune ?

Laquelle est nécessaire pour la PCR ? Que faut-il d’autre pour la PCR ? 3. Lors de la synthèse des protéines, qu’adviendra-t-il si l’ARN polymérase initie la transcription ou si la traduction commence une base en amont du site d’initiation normal ? Argumentez dans les deux cas. 4. Au chapitre 10, les mutations seront abordées avec des changements dans la séquence des nucléotides du génome se retrouvant dans les différentes générations de cellules. D’après le tableau 7.5, expliquez comment le code génétique minimise l’impact de ces mutations.





Les cellules régulent l’expression de leurs gènes de sorte que les protéines et les autres molécules soient produites en quantités correctes et au bon moment pour le cycle cellulaire. La régulation de l’expression génétique est fortement influencée par l’environnement de la cellule.

I

Vue d’ensemble de la régulation

206

8.1

Principaux modes de régulation

206

II

Régulation de l’activité enzymatique 207

8.2 8.3

Inhibition non covalente d’enzyme Modification covalente des enzymes

III

Protéines se liant à l’ADN et régulation de la transcription par contrôle négatif et positif 210

8.4 8.5 8.6

Protéines se liant de l’ADN Contrôle négatif de la transcription : répression et induction Contrôle positif de la transcription

212 214

IV

Mécanismes de régulation globale

216

8.7 8.8 8.9 8.10

Contrôle global et opéron lac Réponse stringente Autres réseaux de contrôle global Détection de quorum (quorum sensing)

216 218 219 221

V

Autres mécanismes de régulation

222

8.11 8.12

Atténuation 222 Transduction du signal et systèmes de régulation à deux composants 224 Régulation du chimiotactisme 226 ARN de régulation et riboswitchs 227

8.13 8.14

CHAPITRE HUIT


207 208

210



206 Chapitre 8


GLOSSAIRE Atténuation (attenuation) Mécanisme de contrôle de l’expression génétique qui entraîne une terminaison prématurée de la transcription. Contrôle négatif (negative control) Mécanisme de régulation de l’expression génétique par lequel une protéine répresseur empêche la transcription d’un ou de plusieurs gènes. Contrôle positif (positive control) Mécanisme de régulation de l’expression génétique par lequel une protéine activatrice accroît la transcription d’un ou de plusieurs gènes. Détection de quorum (quorum sensing) Système de régulation dont l’existence chez un organisme requiert la présence d’une certaine densité de cellules de la même espèce. Enzyme allostérique (allosteric enzyme) Enzyme qui compte deux sites de fixation, le site actif (auquel se lie le substrat) et le site allostérique (où une molécule effectrice se lie). Expression génétique (gene expression) Transcription et/ou traduction de gènes. Induction (induction) Production d’une enzyme seulement lorsque son substrat est présent. Kinase (kinase) Enzyme qui ajoute un groupement phosphate à une molécule organique. Opéron (operon) Un ou plusieurs gènes transcrits en un seul ARN sous le contrôle d’un seul site de régulation. Protéine activatrice (activator protein) Protéine régulatrice qui se lie à des sites spécifiques de l’ADN et stimule la transcription, impliquée dans le contrôle positif. Protéines de choc thermique (heat shock proteins) Ensemble de protéines induites par une augmentation soudaine de température ou

D

ans le chapitre précédent, nous avons vu comment l’information génétique, un gène constitué d’une séquence de nucléotides, peut être transcrite en ARN. Cette information est ensuite traduite pour produire un polypeptide spécifique. L’ensemble de ces processus constitue l’expression génétique. La plupart des protéines sont des enzymes (voir section 5.5), qui réalisent les centaines de réactions enzymatiques nécessaires à la croissance cellulaire. Les micro-organismes doivent répondre rapidement aux modifications de leur environnement. Pour utiliser au mieux les ressources disponibles, les cellules doivent réguler les types et les quantités de macromolécules qu’elles synthétisent. Ce chapitre traite de cette régulation du métabolisme.

I

VUE D’ENSEMBLE DE LA RÉGULATION

Certaines enzymes cellulaires dites constitutives sont nécessaires en quantités égales quelles que soient les conditions de croissance. Plus fréquemment, les besoins dépendent des conditions. Par exemple, les enzymes nécessaires au catabolisme du lactose sont requises si du lactose est présent dans l’environnement. Les génomes microbiens codent des protéines beaucoup plus nombreuses que celles présentes à un instant donné. La régulation est donc un processus majeur pour toutes les cellules, économiseur d’énergie et de ressources.

par d’autres facteurs de stress dont la fonction est de reconformer les protéines partiellement dénaturées Protéine kinase de détection (sensor kinase protein) Membre d’un système à deux composants. Protéine membranaire qui s’auto-phosphoryle en réponse à un signal externe et qui transfère ensuite le groupement phosphate à une protéine régulatrice de réponse (voir protéine régulatrice de réponse). Protéine régulatrice de réponse (response regulator protein) Membre d’un système à deux composants. Protéine régulatrice phosphorylée par une protéine récepteur kinase (voir protéine kinase de détection). Protéine répresseur (repressor protein) Protéine régulatrice qui se lie à des sites spécifiques de l’ADN et bloque la transcription, impliquée dans le contrôle négatif. Réponse stringente (stringent response) Contrôle de régulation global activé par un manque d’acide aminé. Répression (repression) Activité de synthèse d’une enzyme empêchée lorsque le produit de la réaction est présent en excès. Rétro-inhibition (feedback inhibition) Réduction d’activité de la première enzyme d’une voie biochimique provoquée par le produit de cette voie. Riboswitch (riboswitch) ARN messager qui fixe une petite molécule spécifique près de son extrémité 5’, ce qui modifie sa structure secondaire et empêche la traduction. Système de régulation à deux composants (two-component regulatory system) Système de régulation comptant deux protéines : une kinase de détection et un régulateur de réponse (voir protéine kinase de détection et protéine régulatrice de réponse).

m n8.1 Principaux modes de régulation Il y a deux modes majeurs de régulation dans la cellule. L’un contrôle l’activité des enzymes présentes et l’autre la production d’enzymes (voir figure 8.1). La régulation de l’activité d’une enzyme est post-traductionnelle. La régulation de la quantité d’enzymes synthétisées peut se situer au niveau de la transcription (contrôle de la quantité d’ARNm produite) ou de la traduction (traduction ou non de l’ARNm). Chez les procaryotes, la régulation de l’activité enzymatique est très rapide (au plus quelques secondes) alors que la régulation de la synthèse d’enzymes est longue (quelques minutes). Malgré des temps de réponse différents, le contrôle d’activité et le contrôle de synthèse assurent une régulation efficace du métabolisme cellulaire.

Contrôlez vos acquis La plupart des gènes codent des protéines et la plupart des protéines sont des enzymes. L’expression d’un gène peut être régulée en contrôlant l’activité de l’enzyme ou en contrôlant la quantité d’enzymes produites. •

Quelles étapes de la synthèse des protéines peuvent faire l’objet de régulation ?

•

Quelle régulation est la plus rapide, celle de l’activité ou celle de la synthèse ? Pourquoi ?



8.2 Inhibition non covalente d’enzyme 207 Absence de contrôle

Substrat

Produit

Enzyme A

Contrôle Contrôle de l’activité enzymatique – absence de produit

Enzyme B

Contrôle traductionnel – pas de synthèse de l’enzyme Contrôle transcriptionnel – pas de synthèse d’ARNm

Traduction ARNm

Transcription Gène A

Gène B

Gène C

Gène D

FIGURE 8.1 Vue d’ensemble des mécanismes de régulation. Le produit d’un gène A est l’enzyme A dont la synthèse est constitutive. L’enzyme A effectue sa réaction. La synthèse de l’enzyme B est aussi constitutive mais son activité est inhibée. La synthèse du produit du gène C est empêchée par un contrôle au niveau de la traduction. La synthèse du produit du gène D est empêchée par un contrôle au niveau de la transcription.

II

RÉGULATION DE L’ACTIVITÉ ENZYMATIQUE

De nombreuses voies régulent l’activité d’une enzyme synthétisée (régulation post-traductionnelle). Dans les deux sections suivantes, nous présentons des formes de régulation réversibles mais aussi des modifications plus radicales des molécules enzymatiques.

non covalente m n8.2 Inhibition d’enzyme Certaines protéines subissent une réduction d’activité ou même une inhibition complète par des composés cellulaires spécifiques. Ces composés sont habituellement des constituants de la voie métabolique au sein de laquelle l’enzyme est active. L’inhibition peut être le résultat d’une modification covalente ou non covalente de l’enzyme. Commençons par des exemples d’interactions non covalentes.

La rétro-inhibition La rétro-inhibition est un mécanisme majeur du contrôle de l’activité enzymatique. Elle assure essentiellement la régulation de voies de biosynthèse complètes, comme la voie de biosynthèse d’un acide aminé ou d’un nucléotide. De telles voies comptent de nombreuses transformations enzymatiques et le produit final, acide aminé ou nucléotide, résulte du substrat de départ après de nombreuses étapes (voir section 5.16). La régulation par rétro-inhibition a lieu lorsque l’acide aminé ou un autre produit final de la voie de biosynthèse inhibe l’activité de la première enzyme de cette voie. L’inhibition de la première étape bloque la voie entière dans la mesure où aucun produit intermédiaire n’est plus disponible (voir figure 8.2). Par conséquent, lorsque le produit terminal d’une voie métabolique s’accumule dans la cellule, la poursuite de sa synthèse est inhibée. La

rétro-inhibition est réversible : lorsque l’inhibiteur vient à manquer, sa synthèse reprend (voir figure 8.2). Comment le produit final d’une voie peut-il inhiber l’activité d’une enzyme dont le substrat diffère totalement ? C’est possible du fait d’une propriété de l’enzyme connue sous le nom d’allostérie. Une enzyme allostérique a deux sites de liaison, le site actif où le substrat se fixe (voir section 5.5) et le site allostérique où l’inhibiteur (appelé effecteur) se fixe de manière réversible. Quand l’effecteur se fixe – généralement de façon non covalente – sur le site allostérique, la conformation de l’enzyme change de sorte que le substrat ne puisse plus se lier au site actif (voir figure 8.3). Lorsque la concentration de l’effecteur chute dans la cellule, l’équilibre favorise sa dissociation du site allostérique. Le site actif reprend alors sa forme catalytique et l’enzyme redevient active.

Enzyme allostérique

Substance de départ Enzyme A Intermédiaire I Enzyme B Intermédiaire II Enzyme C Intermédiaire III Enzyme D Produit final

FIGURE 8.2 Rétro-inhibition d’une activité enzymatique. L’activité de la première enzyme d’une voie métabolique est inhibée par le produit final dont la production est ainsi contrôlée.



208 Chapitre 8


Enzyme Site actif

Site allostérique

Effecteur allostérique

Substrat

des souches mutantes d’organismes producteurs d’acides aminés qui ont perdu la capacité de rétro-inhiber la production d’acides aminés particuliers (voir chapitre 30). De tels mutants « surproduisent » des acides aminés et sont utilisés pour la production à grande échelle d’acides aminés employés comme compléments alimentaires (voir section 30.7 et figure 30.13).

Les isoenzymes

Inhibition : le substrat ne peut pas se fixer ; la réaction enzymatique est inhibée

Activité : la réaction enzymatique est réalisée

FIGURE 8.3 Allostérie. Le mécanisme d’inhibition enzymatique par un effecteur allostérique. Lorsque l’effecteur s’insère au niveau du site allostérique, la conformation spatiale de l’enzyme est modifiée et le substrat ne peut plus se fixer au site actif.

Les enzymes allostériques sont communes dans les voies anaboliques et cataboliques et sont particulièrement importantes dans les voies ramifiées. Par exemple, les acides aminés proline et arginine sont tous les deux synthétisés à partir de l’acide glutamique. Chacun de ces acides aminés peut contrôler la première enzyme spécifique de sa propre synthèse sans affecter la synthèse de l’autre. Ainsi, un surplus de proline n’induit pas une privation d’arginine (voir figure 8.4). Le mécanisme de rétro-inhibition n’est pas que d’intérêt cognitif. La compréhension de la biochimie d’une rétroinhibition a permis à la microbiologie industrielle d’isoler

Acide glutamique AGS

Certaines voies de biosynthèse utilisent des isoenzymes (iso signifie « même ») pour la rétro-inhibition. Les isoenzymes sont des protéines différentes qui catalysent la même réaction mais qui sont soumises à des contrôles différents. La synthèse des acides aminés aromatiques chez Escherichia coli en est un exemple (voir figures 8.5 et 5.26). L’enzyme DAHP synthétase joue un rôle important dans la biosynthèse des acides aminés aromatiques. Chez E. coli, trois isoenzymes différentes de la DAHP synthétase catalysent la première réaction de cette voie et chacune est régulée indépendamment par l’un des trois acides aminés produits. Cependant, à la différence des exemples précédents de rétroinhibition où l’activité enzymatique était totalement bloquée, elle est ici diminuée par étapes ; l’activité ne cesse totalement que lorsque les trois produits sont en excès. Quelques organismes utilisent une seule enzyme pour faire la même chose. Chez ces organismes, une rétro-inhibition concertée existe. Chaque produit rétro-inhibe partiellement l’enzyme, l’inhibition totale existe lorsque les trois produits sont présents en excès.

Contrôlez vos acquis De nombreuses réactions métaboliques peuvent être régulées via le contrôle des enzymes qui les catalysent. La rétro-inhibition est un type important de régulation de l’activité enzymatique dans lequel le produit final d’une voie biosynthétique inhibe la première enzyme spécifique de cette voie. •

Qu’est-ce que la rétro-inhibition ?

•

Qu’est-ce qu’une enzyme allostérique ?

covalente m n8.3 Modification des enzymes

GK Rétro-inhibition

Rétro-inhibition

Proline

Arginine FIGURE 8.4 Rétro-inhibition à l’embranchement d’une voie de biosynthèse. Un intermédiaire clé pour chaque voie est représenté en rose. Les enzymes inhibées (flèches roses discontinues) sont la N-acétyl glutamate synthétase (AGS) et la γ-glutamyl kinase (GK).

Plusieurs exemples de régulation par modification covalente d’enzymes sont connus chez les bactéries. Le plus souvent une petite molécule est ajoutée ou enlevée à la protéine enzymatique. Comme dans le cas des protéines allostériques, la fixation d’un groupement change la conformation de la protéine, ce qui affecte son activité catalytique. L’élimination de ce groupement rend l’enzyme de nouveau active. Les mécanismes usuels de modification covalente comprennent l’ajout des nucléotides adénosine monophosphate (AMP) ou adénosine diphosphate (ADP), de phosphate inorganique (PO43–) ou de groupement méthyle (CH3). Examinons le cas bien connu de la glutamine synthétase dont l’activité est modulée par l’AMP.



8.3 Modification covalente des enzymes 209

1

+ Erythrose

4-phosphate

(TYR)

2

(PHE)

Substrats

3

(TRP)

DHAP synthétases (Isoenzymes 1, 2, 3)

DAHP

Chorismate

Tyrosine

Tryptophane Phénylalanine

Produits

FIGURE 8.5 Isoenzymes et rétro-inhibition. La voie usuelle de synthèse des acides aminés aromatiques compte trois isoenzymes de la DAHP synthétase (DAHP : 3-désoxy-D-arabino-heptulosonate 7-phosphate). Chacune de ces enzymes est spécifiquement rétroinhibée par un des acides aminés aromatiques. Notez que la présence des trois acides aminés en excès est nécessaire pour que cesse la synthèse de DAHP.

figure 5.27b), sa régulation a une incidence sur le statut énergétique de la cellule.

La maturation des protéines et les intéines La modification covalente d’enzymes pour leur régulation, telle que l’adénylation de la GS (voir figure 8.6), est réversible. Cependant, toutes les modifications post-traductionnelles des protéines ne le sont pas. Dans certains cas, les polypeptides nouvellement traduits doivent être transformés pour devenir actifs. Toutes les protéines sont synthétisées en commençant par une méthionine (une formyle-méthionine dans les cellules des Bacteria) [voir chapitre 7]. Par conséquent, on s’attend à trouver une méthionine ou une formyle-méthionine à l’extrémité N-terminale de toutes les protéines. Or, ce n’est pas le cas pour la plupart des protéines car cette méthionine est éliminée par une enzyme spécifique (chez les Bacteria, le groupement formyle de la méthionine est éliminé en premier et ce, pour toutes les protéines). Les protéines secrétées sont synthétisées avec une séquence signal qui est éliminée lors de l’exportation de la cellule (voir section 7.17). Ce sont deux exemples de modifications post-traductionnelles.

ATP

La glutamine synthétase et l’adénylation

Concentration de glutamine

GS

ADP

GS–AMP (1–12)

AMP

Pi

(a) 100 Activité enzymatique Activité relative GS

L’enzyme glutamine synthétase (GS) subit une modification covalente par adénylation, une addition d’AMP. La GS joue un rôle clé dans l’assimilation de l’ammoniaque par la cellule (voir section 5.16). L’activité de la GS est contrôlée à deux niveaux. Tout d’abord, elle est contrôlée par rétro-inhibition par neuf composés différents comprenant des acides aminés et des composés du métabolisme des nucléotides. Cette inhibition est concertée dans la mesure où chaque effecteur supplémentaire réduit l’activité GS proportionnellement. La présence simultanée des neuf inhibiteurs inhibe totalement l’activité GS. L’activité GS peut être régulée indépendamment de la rétroinhibition par modification covalente. Cette régulation est contrôlée par les concentrations de glutamine et d’un précurseur, l’α-cétoglutarate, un intermédiaire du cycle de l’acide citrique qui ne compte pas de groupe aminé (voir figure 5.22). Chaque molécule de GS contient douze sous-unités identiques et chacune peut être adénylée en un site précis. Lorsque cette enzyme est totalement adénylée (donc qu’elle compte douze groupements AMP), elle est catalytiquement inactive. Lorsqu’elle est partiellement adénylée, son activité est réduite. L’enzyme nommée PII qui ajoute et enlève l’AMP à la GS est elle-même régulée par modification covalente. Quand le niveau de glutamine diminue dans la cellule, la modification covalente de PII promeut la désadénylation de la GS et l’augmentation de son activité. Lorsque la quantité de glutamine augmente dans la cellule, l’adénylation de la GS s’accroît et son activité diminue (voir figure 8.6). Ainsi le niveau d’activité de la GS est un indicateur du niveau de l’azote dans la cellule. Quand le niveau de l’azote est faible, la GS montre une forte activité ; quand le niveau de l’azote est élevé, l’activité de la GS diminue. Puisque la réaction catalytique de la GS consomme de l’ATP (voir

PPi

Glutamine

50

0

Glutamine

Phosphoénol pyruvate

0

3

6

9

12

Groupes AMP ajoutés (b) FIGURE 8.6 Régulation de la glutamine synthétase par modification covalente. (a) Quand les cellules sont cultivées dans un milieu riche en azote fixé, la glutamine synthétase (GS) subit une modification covalente par adénylation progressive. Jusqu’à 12 groupes adényl (AMP) peuvent être ajoutés. Quand le milieu s’appauvrit en azote, les groupements adényl sont libérés sous forme d’ADP. (b) Les sous-unités adénylées de la GS sont catalytiquement inactives et par conséquent l’activité décroît selon le nombre de sous-unités adénylées.



210 Chapitre 8


Dans certains cas, une protéine peut être le résultat d’une transformation importante du produit initial de la traduction. Par exemple, certains gènes viraux sont transcrits et ensuite traduits sous la forme d’une « polyprotéine », un long polypeptide qui est ultérieurement clivé pour produire plusieurs molécules actives différentes. Nous en verrons des exemples dans le cas des polyovirus (voir section 16.8) et des rétrovirus (voir section 9.13). Un cas assez inhabituel de transformation post-traductionnelle correspond à la suppression de portions de protéines et à la reconnexion des domaines de la protéine active. Souvenez-vous de la présentation des introns, séquences de séparation des gènes eucaryotes morcelés. Ces acides nucléiques non codants sont éliminés lors de la maturation des ARNm (voir sections 7.1 et 14.8). Quelques exemples d’introns sont aussi connus chez les procaryotes. Et de nombreux exemples sont connus où les séquences surnuméraires sont éliminées au niveau protéique et non de l’ARN. Ce processus est appelé l’épissage protéique et le peptide éliminé est nommé intéine. L’épissage protéique est connu pour diverses protéines d’Archaea, de Bacteria et d’Eukarya. La figure 8.7 le décrit dans le cas de la production de l’ADN gyrase (topoisomérase II, voir section 7.3) de la bactérie Gram positif Mycobacterium leprae, l’agent de la lèpre (voir section 26.5). Le gène qui code la sous-unité A de l’ADN gyrase de M. leprae est nommé GyrA ; il code la protéine GyrA (voir figure 8.7). Les régions flanquantes dans le polypeptide GyrA, nommées extéines, sont ligaturées pour former la protéine active finale et les intéines sont éliminées (voir figure 8.7). Les intéines qui assurent l’auto-épissage ont donc l’activité enzymatique d’une protéase hautement spécifique. La raison pour laquelle GyrA requiert cette transformation inhabituelle pour produire la protéine active est inconnue. Des preuves existent (au moins chez les eucaryotes) que les introns jouent un rôle important de régulation de l’expression génétique. Il n’est pas exclu qu’un système de régulation s’applique aussi aux intéines qui assurent l’autoépissage.

N-extéine 130 Intéine 551

ADN gyrase sous-unité A

Contrôlez vos acquis La modification covalente est un système de régulation pour modifier l’activité d’une enzyme. Les enzymes régulées de la sorte subissent des modifications réversibles. Un type de modification est l’adénylation (l’addition d’AMP). L’épissage protéique est une forme de modification post-traductionnelle. •

Quel est l’effet d’une modification covalente sur l’activité d’une enzyme ?

•

Comment une modification covalente peut-elle affecter « temporairement » une enzyme ?

•

Quelle différence y a-t-il entre une intéine et un intron ?

III

PROTÉINES SE LIANT À L’ADN ET RÉGULATION DE LA TRANSCRIPTION PAR CONTRÔLE NÉGATIF ET POSITIF

Dans la suite de ce chapitre, nous verrons les mécanismes par lesquels les cellules contrôlent quantitativement la synthèse d’une protéine. Nous examinerons le contrôle au niveau de la transcription pour lequel plusieurs mécanismes particulièrement élégants sont connus chez les procaryotes. Notez que la demi-vie d’un ARNm est courte chez les procaryotes, au mieux quelques minutes. Les procaryotes répondent ainsi rapidement aux changements des paramètres de l’environnement par la néosynthèse d’ARNm et la dégradation de ceux qui avaient été synthétisés antérieurement. Dans une cellule en croissance, transcription et dégradation d’ARNm coexistent. Pour que la transcription se fasse, l’ARN polymérase doit reconnaître un promoteur spécifique sur l’ADN et commencer son activité. La régulation négative ou positive de la transcription repose sur des protéines se liant à l’ADN qu’il convient d’examiner.

m n8.4 Protéines se liant de l’ADN

C-extéine 1273

Intéine libre

FIGURE 8.7 Épissage protéique. La protéine synthétisée selon l’ARNm gyrA dans Mycobacterium leprae compte 1 273 résidus acides aminés. La N-extéine est l’extéine N-terminale et la C-extéine est l’extéine C-terminale. Les résidus 131 à 550 correspondent à une séquence qui s’extrait par une réaction d’auto-épissage pour produire une intéine libre et la sousunité A de l’ADN gyrase.

Des petites molécules participent souvent à la régulation des activités enzymatiques. Par exemple, la figure 8.4 montre la fixation de la proline et de l’arginine à des enzymes que ces acides aminés inhibent. La situation est assez différente pour la régulation de la synthèse des enzymes. Bien que des petites molécules assurent souvent la régulation de la transcription, leur action est rarement directe. Classiquement, elles influencent la fixation de protéines dites de régulation à des sites spécifiques de l’ADN. Ce sont donc ces protéines qui assurent la régulation de la transcription.

Les interactions des protéines avec les acides nucléiques Les interactions protéines / acides nucléiques ont un rôle central dans la réplication, la transcription et la traduction, ainsi que pour la régulation de ces processus. Elles peuvent être



8.4 Protéines se liant de l’ADN 211

spécifiques ou non selon que la protéine se fixe n’importe où sur l’acide nucléique ou que l’interaction est spécifique d’une séquence. Les histones (voir section 7.3) sont de bons exemples du premier cas. Du fait de leur charge positive, les histones s’associent fortement et assez peu spécifiquement à l’ADN chargé négativement. Si l’ADN est recouvert par des histones, l’ARN polymérase ne pourra pas se lier et le transcrire. Le retrait des histones n’aboutit pas nécessairement à la transcription mais laisse les gènes dans un état où ils peuvent être activés par d’autres facteurs. Après la fixation et le début de la transcription, les ARN polymérases eucaryotes ont encore besoin de plusieurs facteurs protéiques pour effectuer l’élongation avec un ADN chargé d’histones (voir section 7.11). Les histones sont universellement présentes chez les Eukarya et sont aussi présentes chez plusieurs Archaea. La plupart des protéines se liant à l’ADN présentent une spécificité de séquence. Elle résulte de la complémentarité des chaînes latérales d’acides aminés des protéines avec les bases et l’ossature des groupements sucre/phosphate de la molécule d’ADN. Du fait de sa taille, le grand sillon dans la molécule d’ADN est un site important de fixation des protéines. La figure 7.3 a présenté plusieurs des atomes des paires de bases qui interagissent avec les protéines. La spécificité de la fixation d’une protéine résulte fréquemment de l’interaction avec plusieurs nucléotides, donc avec une séquence de bases spécifique. Nous avons déjà décrit une structure de l’ADN appelée répétition inversée (voir figure 7.6). Ces répétitions inversées sont fréquemment des endroits où les protéines se combinent spécifiquement à l’ADN (voir figure 8.8). Notez que cette interaction n’implique pas la formation dans l’ADN des structures en épingle à cheveux vues à la figure 7.6. Les protéines se liant à l’ADN sont classiquement des homodimères, ce qui signifie qu’elles sont constituées de deux polypeptides identiques. Chaque chaîne polypeptidique compte un domaine qui interagit spécifiquement avec une région de l’ADN localisée dans le grand sillon. Quand des dimères protéiques interagissent avec des séquences inversées répétées, chacun des polypeptides du dimère s’associe avec chacun des brins de l’ADN (voir figure 8.8). La protéine ne reconnaît pas les séquences nucléotidiques mais des complémentarités moléculaires associées à des séquences nucléotidiques spécifiques.

La structure des protéines se liant à de l’ADN L’étude de la structure de plusieurs protéines procaryotes et eucaryotes se liant à l’ADN a révélé plusieurs catégories de domaines protéiques déterminantes pour leur fixation correcte à l’ADN. L’une d’elle est le motif hélice-tour-hélice (voir figure 8.9). Le motif hélice-tour-hélice se compose d’un polypeptide qui forme une structure secondaire en hélice α ; c’est l’hélice de reconnaissance qui interagit spécifiquement avec l’ADN. L’hélice de reconnaissance est liée à trois acides aminés – le premier est usuellement une glycine qui sert à « couder » la protéine (voir figure 8.9a). L’autre extrémité du « tour » est liée à une seconde hélice, l’hélice de stabilisation, qui stabilise la première hélice par interaction hydrophobe avec elle. La reconnaissance de séquence résulte d’interactions non covalentes dont des liaisons hydrogène et des forces de Van der Vaals (voir section 3.1) entre la protéine et des points de contact précis de la séquence nucléotidique d’ADN.

Domaine de contact des protéines : il assure l’assemblage des dimères protéiques. Domaine de liaison à l’ADN : il s’insère dans les grands sillons et dans l’alignement du squelette de groupements sucre-phosphate de l’ADN.

Répétitions inversées 5′ 3′

T G T G T G G A AT T G T G A G C G G ATA A C A AT T T C A C A C A ACACACCTTAACACTCGCCTATTGTTAAAGTGTGT

3′ 5′

Répétitions inversées FIGURE 8.8 Protéines se liant à l’ADN. De nombreuses protéines de ce type sont des dimères qui se combinent spécifiquement à deux sites de l’ADN. Les séquences spécifiques d’ADN qui interagissent avec la protéine sont des répétitions inversées. La séquence nucléotidique du gène opérateur de l’opéron lactose est représentée et les séquences inversées répétées qui sont les sites où le répresseur lac se lie à l’ADN sont indiquées.

De nombreuses protéines bactériennes se liant à l’ADN, dont des protéines répresseurs tels les répresseurs lac et trp d’Escherichia coli (voir section 8.5) et quelques protéines de bactériophages telles que le répresseur du phage lambda (voir figure 8.9b), comptent des structures hélice-tour-hélice. Plus de 250 protéines présentant cette structure affine de l’ADN régulent la transcription chez E. coli. Deux autres types de domaines protéiques sont fréquemment observés pour les protéines se liant à l’ADN. L’un d’eux, le doigt de zinc, est fréquemment trouvé dans les protéines de régulation eucaryotes. Comme son nom le suggère, le doigt de zinc est une protéine qui se lie à un ion zinc (voir figure 8.10a). Une partie du « doigt » constituée par les acides aminés forme une hélice α, et cette hélice de reconnaissance interagit avec l’ADN au niveau d’un grand sillon. Les protéines concernées comptent usuellement deux de ces doigts. L’autre domaine protéique classiquement observé pour les protéines se liant à l’ADN est la fermeture à leucine. Ces protéines comptent des régions à résidus leucine placés tous les sept acides aminés, ce qui produit une structure type fermeture Éclair. À la différence de la structure hélice-tour-hélice et du doigt de zinc, cette structure n’interagit pas directement avec l’ADN mais assure le maintien de deux hélices de reconnaissance dans une bonne position pour la liaison à l’ADN (voir figure 8.10b). Après qu’une protéine s’est liée en un site spécifique de l’ADN, diverses conséquences sont possibles. Dans certains cas, la protéine liée est une enzyme qui catalyse une réaction sur l’ADN comme la transcription par l’ARN polymérase. Dans d’autres cas, la fixation peut bloquer la transcription (régulation négative, voir section 8.5) ou l’activer (régulation positive, voir section 8.6).



212 Chapitre 8


Hélice-tour-hélice Hélice de stabilisation

Tour Hélice de reconnaissance (a)

négatif de la transcription : m n8.5 Contrôle répression et induction La transcription est la première étape dans le flux de l’information génétique (voir figure 8.1) ; en conséquence, il est relativement aisé d’influer sur l’expression génétique à ce niveau. Si un gène est transcrit plus fréquemment qu’un autre, les ARNm de ce gène et les protéines traduites seront plus abondants dans la cellule. Plusieurs mécanismes contrôlent la synthèse des enzymes chez les bactéries et tous sont fortement influencés par l’environnement dans lequel le micro-organisme se développe,

Doigt de zinc Hélice de reconnaissance H

C

Stephen Edmondson

Zn C

H

(a) Glissière à leucine

(b) FIGURE 8.9 Structure hélice-tour-hélice de quelques protéines se liant à l’ADN. (a) Un modèle simple des constituants d’une structure hélice-tour-hélice. (b) Un modèle bio-informatique du répresseur du bactériophage lambda – une protéine représentative de la structure hélice-tour-hélice – lié à son gène opérateur. L’ADN est en rouge et bleu, la protéine est en brun (une sous-unité du dimère répresseur) et jaune (la seconde sous-unité). Chaque sous-unité présente une structure hélicetour-hélice. Les coordonnées utilisées pour obtenir cette image ont été téléchargées de la banque de données sur les protéines (Protein Data Bank, Brookhaven, NY).

Hélices de reconnaissance

Contrôlez vos acquis Certaines protéines peuvent se lier à l’ADN du fait d’interactions entre des domaines particuliers de la protéine et des régions spécifiques de l’ADN. Dans la plupart des cas, ces interactions présentent des spécificités de séquences. Les protéines affines de l’ADN peuvent être des enzymes dont l’ADN est le substrat ou des protéines de régulation qui affectent l’expression génétique. •

Qu’est-ce qu’un domaine protéique ?

•

Pourquoi des interactions sont-elles spécifiques de certaines séquences d’ADN ?

(b) FIGURE 8.10 Modèles simples de structures des protéines eucaryotes se liant à l’ADN. Les hélices α sont représentées par des cylindres. Les hélices de reconnaissance sont les domaines impliqués dans la liaison à l’ADN. (a) La structure en doigt de zinc. Les acides aminés liés à l’ion Zn 2+ comprennent toujours au moins deux résidus cystéine (C) ; les autres sont des résidus histidine (H). (b) La structure en glissière à leucine (leucine zipper). Les résidus leucine (représentés en jaune) sont placés exactement tous les sept acides aminés. L’interaction latérale de ces chaînes de leucines aide à maintenir les deux hélices ensemble.



8.5 Contrôle négatif de la transcription : répression et induction 213

en particulier par la présence ou l’absence de petites molécules particulières. Ces petites molécules signalent l’état physiologique de l’environnement des cellules et peuvent interagir avec certaines protéines telles que les protéines affines de l’ADN. Le résultat est le contrôle de la transcription et plus rarement de la traduction. Nous commencerons par décrire la répression et l’induction, formes simples de régulation qui déterminent l’expression génétique au niveau de la transcription. Dans cette section, nous n’examinerons que le contrôle négatif de la transcription, un mécanisme de régulation qui empêche la transcription (d’où le terme « négatif »).

La répression et l’induction enzymatiques Souvent les enzymes qui catalysent la synthèse d’un produit donné ne sont pas synthétisées si le produit est présent en quantité suffisante dans le milieu de culture. Par exemple, les enzymes impliquées dans la production de l’arginine ne sont synthétisées que lorsque l’arginine est absente du milieu de culture. Un excès d’arginine réprime la synthèse de ces enzymes. C’est la répression enzymatique. Si de l’arginine est ajoutée à une culture en phase exponentielle de croissance dans un milieu dépourvu d’arginine, la croissance se poursuit au même rythme mais la production des enzymes impliquées dans la synthèse de l’arginine cesse (voir figure 8.11). Notez que cet effet est spécifique car la synthèse des autres enzymes reste inchangée. Les enzymes affectées par un mécanisme de répression ne représentent qu’une minuscule fraction des protéines synthétisées par la cellule à un instant donné. La répression enzymatique est largement répandue chez les bactéries comme moyen de contrôler la synthèse de diverses enzymes impliquées dans la biosynthèse des acides aminés et des purines et pyrimidines. Dans presque tous les cas, le produit final de la voie de biosynthèse réprime les enzymes de cette voie. La répression est alors assez spécifique et ce

processus n’a généralement aucun effet sur la synthèse des autres enzymes (voir figure 8.11). L’organisme bénéficie de la répression. En effet, elle évite d’utiliser de l’énergie et des nutriments pour la synthèse d’enzymes inutiles. L’induction enzymatique est le concept opposé de la répression. Dans ce cas, une enzyme n’est produite qu’en cas de présence du substrat. La répression enzymatique concerne classiquement les enzymes biosynthétiques (anaboliques). À l’opposé, l’induction enzymatique concerne usuellement les enzymes cataboliques. Prenons l’exemple de l’utilisation du lactose comme source de carbone et d’énergie par Escherichia coli. Le cas de la β-galactosidase, l’enzyme qui hydrolyse le lactose en glucose et galactose, est présenté en figure 8.12. Cette enzyme est nécessaire à la croissance d’E. coli sur lactose. Si le lactose est absent du milieu, l’enzyme n’est pas synthétisée, mais la synthèse débutera presque immédiatement après ajout du lactose. On voit bien l’intérêt d’un tel mécanisme pour l’organisme : il permet de ne synthétiser des enzymes particulières qu’au moment où elles sont nécessaires. La substance qui initie l’induction enzymatique est appelée un inducteur et celle qui réprime la synthèse d’enzymes est appelée un corépresseur. Ces substances qui sont toujours des petites molécules forment ensemble les effecteurs. Les inducteurs et les corépresseurs ne sont pas tous des substrats ou des produits ultimes des enzymes concernées. Par exemple, des analogues structuraux peuvent induire ou réprimer même s’ils ne sont pas des substrats de l’enzyme. L’isopropylthiogalactoside (IPTG), par exemple, est un inducteur de la β-galactosidase bien qu’il ne puisse pas être hydrolysé par cette enzyme. Dans la nature cependant, les inducteurs et les corépresseurs sont probablement des métabolites cellulaires normaux. L’inducteur réel de la β-galactosidase, qui est l’une des trois protéines codées par les gènes de l’opéron lac, n’est pas le lactose mais l’allolactose, un composé de structure semblable, produit par la cellule à partir du lactose.

Répression

Induction

Nombre de cellules Protéines totales

Addition d’arginine

Augmentation relative

Augmentation relative

Protéines totales

Nombre de cellules β-galactosidase Addition de lactose

Enzymes de biosynthèse de l’arginine Temps FIGURE 8.11 Répression enzymatique. Répression d’enzymes impliquées dans la synthèse de l’arginine par addition d’arginine dans le milieu de culture. Notez que le taux de synthèse des protéines totales reste inchangé.

Temps FIGURE 8.12 Induction enzymatique. Induction de l’enzyme β-galactosidase par addition de lactose dans le milieu de culture. Notez que le taux de synthèse des protéines totales reste inchangé.



214 Chapitre 8


Les mécanismes de répression et d’induction Comment les inducteurs et les corépresseurs peuvent-ils affecter la transcription avec une telle spécificité ? Ils le font indirectement par combinaison avec des protéines spécifiques se liant à l’ADN qui, à leur tour, affectent la transcription. Dans le cas d’une enzyme répressible (voir figure 8.11), le corépresseur (en l’occurrence l’arginine) se combine avec une protéine répresseur spécifique, le répresseur arginine, présent dans la cellule (voir figure 8.13). La protéine répresseur est une protéine allostérique (voir sections 8.2 et 8.4) ; sa conformation est modifiée lorsqu’elle est associée au corépresseur. En se liant à son effecteur, la protéine répresseur devient active et peut alors s’associer à une région précise de l’ADN, près du promoteur du gène, la région opératrice. Cette région donne son nom à l’opéron, une série de gènes successifs dont l’expression est sous le contrôle d’un seul opérateur (voir section 7.13). Tous les gènes d’un opéron sont transcrits simultanément et produisent un unique ARNm. L’opérateur est situé en aval du promoteur, lieu d’initiation de la synthèse de l’ARNm (voir figure 8.13). Si le répresseur se lie à l’opérateur, la transcription est impossible car l’ARN polymérase ne peut ni se fixer, ni catalyser. Par conséquent, les polypeptides codés par les gènes de l’opéron ne peuvent pas être synthétisés. Si l’ARNm est polycistronique (voir section 7.13), tous les polypeptides codés par cet ARNm seront donc réprimés. L’induction enzymatique peut aussi être contrôlée par un répresseur. La protéine répresseur est alors active en absence de l’inducteur et bloque la transcription. Quand l’inducteur est ajouté, il se combine avec la protéine répresseur et l’inactive. L’inhibition est alors levée, ce qui permet la transcription (voir figure 8.14). Tous les systèmes de régulation utilisant des répresseurs suivent le même mécanisme : inhibition de la synthèse de l’ARNm par l’activité de protéines répresseurs spécifiques qui sont ellesmêmes sous le contrôle de petites molécules qui agissent

comme inducteurs ou corépresseurs spécifiques. Comme le répresseur a un rôle inhibiteur, il s’agit d’un contrôle négatif.

Contrôlez vos acquis La quantité d’une enzyme dans la cellule peut être contrôlée en augmentant (induction) ou en diminuant (répression) la quantité d’ARNm qui code cette enzyme. Cette régulation transcriptionnelle met en jeu des protéines allostériques de régulation qui se fixent à l’ADN. Dans le cas du contrôle négatif de la transcription, la protéine de régulation est appelée répresseur et elle agit en inhibant la synthèse d’ARNm. •

Pourquoi parle-t-on de « contrôle négatif » ?

•

Comment un répresseur peut-il inhiber la synthèse d’un ARNm précis ?

m n8.6 Contrôle positif de la transcription Dans le contrôle négatif, l’agent du contrôle, la protéine répresseur, entraîne la répression de la synthèse d’ARNm. Par contre, dans le contrôle positif de la transcription, une protéine régulateur active la fixation de l’ARN polymérase, d’où le terme positif. Un excellent exemple de régulation positive est fourni par le catabolisme du maltose chez Escherichia coli.

Le catabolisme du maltose chez Escherichia coli Les enzymes du catabolisme du maltose chez Escherichia coli ne sont synthétisées qu’après addition de maltose dans le milieu. L’expression de ces enzymes suit donc le modèle montré pour la β-galactosidase (voir figure 8.12) sauf que le Promoteur lac

Promoteur arg Opérateur arg

argC

ARN polymérase

argB

ARN polymérase

La transcription se déroule

Promoteur lac Promoteur arg Opérateur arg ARN polymérase (b)

argC Corépresseur Répresseur

lacZ

lacY

lacA

Répresseur

La transcription est bloquée

(a)

Répresseur

(a)

Opérateur lac

argH

argB

Opérateur lac

lacZ

lacY

lacA

argH ARN polymérase

La transcription est bloquée

FIGURE 8.13 Le processus de répression enzymatique avec l’exemple de l’opéron arginine. (a) La transcription de l’opéron a lieu lorsque le répresseur ne peut pas se lier à l’opérateur. (b) Après la fixation d’un corépresseur (une petite molécule) au répresseur, le répresseur se fixe au gène opérateur et bloque la transcription. Les ARNm et les protéines codées ne sont plus produites. Dans le cas de l’opéron argCBH, le corépresseur est l’arginine.

(b)

La transcription se déroule Répresseur Inducteur

FIGURE 8.14 Le processus d’induction enzymatique avec l’exemple de l’opéron lactose. (a) Une protéine répresseur se fixe au gène opérateur et bloque l’action de l’ARN polymérase. (b) Une molécule inductrice se lie au répresseur et l’inactive de sorte qu’il ne puisse plus se lier au gène opérateur. L’ARN polymérase peut effectuer la transcription ; l’ARNm de cet opéron est produit. Dans le cas de l’opéron lac, l’inducteur est l’allolactose.



maltose plus que le lactose est requis pour induire l’expression génétique. Mais le contrôle de la synthèse des enzymes hydrolysant le maltose n’est pas soumis à un contrôle négatif à l’instar de l’opéron lac mais à un contrôle positif ; la transcription nécessite l’activité d’une protéine activatrice. La protéine activatrice du maltose ne peut pas se lier à l’ADN sans liaison préalable au maltose, l’effecteur. Dès lors que la protéine activatrice du maltose se lie à l’ADN, l’ARN polymérase peut démarrer la transcription (voir figure 8.15). Comme les répresseurs, les activateurs ne se lient qu’à des séquences d’ADN spécifiques. La région de l’ADN où se trouve le site de l’activateur n’est pas appelée opérateur (voir figures 8.13 et 8.18), mais site de fixation de l’activateur (voir figure 8.15). Les gènes contrôlés par ce site sont tout de même appelés opérons.

La fixation des protéines activatrices Pour le contrôle négatif, le répresseur se fixe à l’opérateur et bloque la transcription. Mais comment fonctionne une protéine activatrice ? Les promoteurs des opérons contrôlés positivement ont des séquences nucléotidiques qui ne sont pas identiques à la séquence consensus (voir figure 7.27). Par conséquent, même avec le bon facteur sigma, l’ARN polymérase reconnaît difficilement ces promoteurs. Lorsqu’elle est liée à l’ADN, la protéine activatrice aide l’ARN polymérase à reconnaître le promoteur et à commencer la transcription. Par exemple, la protéine activatrice peut provoquer un changement de structure de l’ADN en le recourbant (voir figure 8.16), offrant ainsi à l’ARN polymérase les contacts adaptés avec le promoteur pour engager la transcription. Ceci peut arriver aussi bien lorsque le site de fixation de l’opérateur est à proximité du promoteur (voir figure 8.17a) que lorsqu’il

Site de fixation Promoteur de l’activateur mal

malE

ADN

Protéine

FIGURE 8.16 Modèle bio-informatique de l’interaction d’une protéine de régulation positive avec l’ADN. Cette figure montre la protéine de fixation de l’AMP cyclique (protéine CAP ; voir section 8.7), une protéine de régulation impliquée dans le contrôle de plusieurs opérons. Le squelette des carbones α de cette protéine est représenté en bleu et violet. La protéine est liée à une double hélice d’ADN, représentée en vert et bleu clair. Notez que la fixation de la protéine induit une courbure de l’ADN.

est éloigné de plusieurs centaines de paires de bases du promoteur, situation dans laquelle une boucle de l’ADN est nécessaire pour permettre les contacts nécessaires (voir figure 8.17b). De nombreux gènes d’Escherichia coli ont des promoteurs sous contrôle positif et nombreux sont aussi ceux sous contrôle négatif. De plus, de nombreux opérons ont des promoteurs avec de multiples types de contrôles, et certains même ont plus d’un

malG Site de fixation de l’activateur Promoteur

Pas de transcription

ARN polymérase (a)

malF

ARN polymérase

Protéine activatrice de l’opéron maltose

Site de fixation Promoteur de l’activateur mal ARN polymérase

Protéine activatrice

(a) malE

malF

malG


Promoteur



Protéine activatrice de l’opéron maltose (b)

Thomas A. Steitz et Steve Schultz

8.6 Contrôle positif de la transcription 215

ARN polymérase


Inducteur

FIGURE 8.15 Contrôle positif de l’induction enzymatique avec l’exemple de l’opéron maltose. (a) En absence d’inducteur, ni la protéine activatrice, ni l’ARN polymérase ne peuvent se lier à l’ADN. (b) Une molécule inductrice se lie à la protéine activatrice qui, à son tour, se lie au site de fixation de l’activateur. Ceci permet à l’ARN polymérase de se fixer sur le promoteur et de commencer la transcription. Dans le cas de l’opéron malEFG, le maltose est l’inducteur de la protéine activatrice.

(b)

Site de fixation de l’activateur

FIGURE 8.17 Interactions entre protéine activatrice et ARN polymérase. (a) Le site de fixation de l’activateur est proche du promoteur. (b) Le site de fixation de l’activateur est éloigné de plusieurs centaines de paires de bases du promoteur. Dans ce cas, l’ADN doit former une boucle pour permettre le contact de l’activateur et de l’ARN polymérase.




Les opérons et les régulons Chez Escherichia coli, les gènes requis pour l’utilisation du maltose sont répartis dans plusieurs opérons sur le chromosome, chacun ayant un site de liaison de l’activateur sur lequel une protéine activatrice du maltose peut se fixer. Dans ce cas, la protéine activatrice du maltose contrôle plus d’un opéron. Lorsqu’une seule protéine régulatrice contrôle plus d’un opéron, ces opérons forment alors un régulon. Les enzymes requises pour l’utilisation du maltose sont ainsi codées par le régulon maltose. Les régulons existent aussi pour les opérons sous contrôle négatif. Par exemple, les enzymes de la biosynthèse de l’arginine (voir section 8.5) sont codées par le régulon arginine dont les opérons sont tous sous le contrôle de la protéine répresseur de l’arginine (la figure 8.13 ne montre qu’un des opérons arginine). Lors du contrôle d’un régulon, qu’il s’agisse d’activation ou de répression, la protéine se liant à l’ADN se lie seulement aux opérons qu’elle contrôle, les autres opérons ne sont pas concernés.

Contrôlez vos acquis Les régulateurs positifs de la transcription sont appelés protéines activatrices. Ils se lient au site de fixation de l’activateur sur l’ADN et stimulent la transcription. Comme pour les répresseurs, l’activité des protéines activatrices est modifiée par des effecteurs. Pour le contrôle positif de l’induction d’enzymes, l’effecteur permet la fixation de la protéine activatrice ce qui stimule la transcription. •

Comparez et montrez les différences entre les activités d’un activateur protéique et celles d’un répresseur protéique.

•

Faites la distinction entre un opéron et un régulon.

IV

MÉCANISMES DE RÉGULATION GLOBALE

Un organisme a fréquemment besoin de réguler simultanément des gènes indépendants en réponse à une modification de l’environnement. Les mécanismes de régulation qui répondent aux signaux de l’environnement en régulant l’expression de nombreux gènes différents sont appelés des systèmes de contrôle global. L’opéron lactose et le régulon maltose répondent au contrôle global. Nous allons commencer l’examen de ce système de régulation en revenant à l’opéron lactose.

sources de carbone différentes et utilisables. Par exemple, Escherichia coli peut utiliser une large gamme de sources de carbone. Lorsque plusieurs sucres sont disponibles (dont le glucose), les cellules d’E. coli les utilisent-elles tous simultanément ou au contraire un par un ? La réponse est que le glucose est toujours utilisé en premier. En effet, ce serait du gaspillage de synthétiser des enzymes pour métaboliser les autres sucres lorsque la meilleure source de carbone, le glucose, est disponible. Un mécanisme de contrôle global, la répression catabolique, permet qu’il en soit ainsi.

La répression catabolique Lors de la répression catabolique, la synthèse de nombreuses enzymes, essentiellement cataboliques, est réprimée lorsque les cellules sont cultivées sur un milieu contenant du glucose. La répression catabolique est aussi appelée l’effet glucose parce que le glucose fut la première substance pour laquelle elle fut démontrée. Cependant, chez quelques organismes, la répression catabolique est provoquée par d’autres sources de carbone que le glucose. Le point important est que la source de carbone qui provoque la répression catabolique doit être la meilleure source d’énergie. Ainsi la répression catabolique assure que l’organisme utilise en premier la meilleure source de carbone et d’énergie disponible. Une conséquence de la répression catabolique est qu’elle détermine deux phases de croissance exponentielle, une situation nommée croissance diauxique. Si deux sources d’énergie utilisables sont disponibles pour la cellule, en croissance diauxique l’organisme utilise d’abord la meilleure source d’énergie. Puis après une phase de latence, la croissance reprend avec l’autre source d’énergie. La figure 8.18 représente la croissance diauxique d’Escherichia coli sur un mélange de glucose et de lactose. Comme nous l’avons vu, la β-galactosidase est une enzyme requise pour l’utilisation du lactose, elle est inductible (voir figures 8.12 et 8.14). Mais sa synthèse est aussi sujette à la répression catabolique. Ainsi, tant que le

Glucose épuisé

Croissance sur glucose

0

m n

8.7 Contrôle global et opéron lac

Notre examen des contrôles positifs et négatifs n’a pas porté sur la situation usuelle où l’environnement dans lequel les cellules bactériennes se développent contiendrait plusieurs

Croissance sur lactose

1

2

3

Niveau relatif de β-glucosidase ( )

promoteur, chacun avec son propre système de contrôle ! Ainsi les représentations assez simples des figures 8.13 à 8.17 ne correspondent pas à tous les opérons. Les situations de contrôles multiples sont communes chez quasiment tous les procaryotes et par conséquent leur régulation peut être fort complexe.

Densité cellulaire relative ( )

216 Chapitre 8

4

Temps (h) FIGURE 8.18 Croissance diauxique sur un mélange de glucose et de lactose. Le glucose réprime la synthèse de la β-galactosidase. Après l’épuisement du glucose, un temps d’arrêt correspond à la synthèse de la β-galactosidase, puis la croissance reprend sur le lactose mais à un taux réduit.



8.7 Contrôle global et opéron lac 217

glucose est présent, la β-galactosidase n’est pas synthétisée et le lactose n’est pas utilisé. Lorsque le glucose est consommé, la répression catabolique est levée et après une brève période de latence, la β-galactosidase est synthétisée et la croissance sur lactose démarre. Notez que la figure 8.18 montre que les cellules croissent plus rapidement sur glucose que sur lactose. Bien que le glucose et le lactose soient deux excellentes sources d’énergie pour E. coli, le glucose est la meilleure source de carbone pour cet organisme et en conséquence la croissance est la plus rapide sur ce substrat.

L’AMP cyclique et la protéine CAP Comment fonctionne la répression catabolique ? La répression catabolique nécessite le contrôle de la transcription par une protéine activatrice et est donc une forme de contrôle positif (voir section 8.6). La fixation de l’ARN polymérase à l’ADN qui code les enzymes soumises à la répression catabolique n’a lieu que si une autre protéine, la protéine activatrice du catabolisme (CAP, catabolite activator protein), a été fixée préalablement. CAP, une protéine allostérique, ne se fixe à l’ADN que si elle s’est préalablement liée à une petite molécule, l’adénosine monophosphate cyclique ou AMP cyclique (voir figure 8.16). L’AMP cyclique (voir figure 8.19) est une molécule clé de nombreux systèmes de contrôle du métabolisme, non seulement chez les procaryotes mais aussi chez les eucaryotes. L’AMP cyclique est synthétisé à partir de l’ATP par une enzyme appelée adénylate cyclase. Le glucose inhibe la synthèse de l’AMP cyclique et stimule le transport de l’AMP cyclique à l’extérieur de la cellule. Quand du glucose entre dans la cellule, le niveau d’AMP cyclique est abaissé et la fixation de l’ARN polymérase aux promoteurs des opérons spécifiques de CAP n’a pas lieu. La répression catabolique est donc le résultat de la présence de la meilleure source de carbone (le glucose). Le déficit cellulaire en AMP cyclique est la cause directe de la répression catabolique.

Les aspects globaux de la répression catabolique Pourquoi la répression catabolique est-elle considérée comme un mécanisme de contrôle global ? Dans le cas d’Escherichia coli et d’autres organismes pour lesquels le glucose est la source d’énergie de premier ordre, tant que le glucose est présent, la répression catabolique empêche l’expression de tous les autres opérons cataboliques affectés par ce mécanisme de contrôle. Ceci peut concerner des dizaines d’opérons cataboliques et affecte non 5′ CH2

O AMP cyclique HO P

O

H

O

H

Adénine H

H

3′ O

OH

FIGURE 8.19 AMP cyclique. L’adénosine monophosphate cyclique (AMP cyclique, AMPc) est produite à partir de l’ATP par l’enzyme adénylate cyclase.

seulement le catabolisme du lactose mais aussi celui du maltose, de nombreux autres sucres et de la plupart des sources de carbone et d’énergie communément utilisées par E. coli. Examinons l’opéron lac dans le cadre de la régulation globale. La figure 8.20 montre l’ensemble de la zone de régulation de l’opéron lac. Pour que la transcription des gènes lac ait lieu, deux exigences doivent être respectées : 1) le niveau d’AMP cyclique doit être suffisamment élevé de sorte que la protéine CAP se lie à son site de fixation (contrôle positif), et 2) le lactose doit être présent pour que le répresseur du lactose ne bloque pas la transcription en se fixant à l’opérateur (contrôle négatif). Si ces deux conditions sont réunies, la cellule est informée que le glucose est absent et le lactose présent ; alors la transcription de l’opéron lac commence.

Contrôlez vos acquis Les systèmes de contrôle global régulent l’expression de nombreux gènes simultanément. La répression catabolique est un système de contrôle global qui aide les cellules à réaliser l’utilisation la plus efficace des sources de carbone. L’opéron lac est sous le contrôle de la répression catabolique tout autant que de son propre système de régulation négative. •

Expliquez comment la répression catabolique peut impliquer une protéine activatrice.

•

Expliquez comment l’opéron lac est contrôlé à la fois positivement et négativement.

Site de fixation de la protéine CAP

lacZ Promoteur –35 –10

Opérateur

ADN AUG

5′

ARNm

Shine-Dalgarno Codon d’initiation de la traduction FIGURE 8.20 Régulation globale de l’opéron lactose. Le premier gène structural de cet opéron, lacZ, code l’enzyme β-galactosidase, qui décompose le lactose (voir figure 8.14). L’opéron contient deux autres gènes qui sont aussi impliqués dans le métabolisme du lactose. Les deux moitiés de l’opérateur (où le répresseur se fixe) sont des répétitions inversées presque parfaites. Le site de fixation de la protéine CAP compte aussi des répétitions inversées, bien que moins parfaites. Le site de début de transcription localisé sur l’ADN correspond exactement à l’extrémité 5’ de l’ARNm. La localisation de la séquence – 35 et de la boîte de Pribnow, qui font partie du promoteur (figure 7.30), sont aussi présentées. La localisation des paires de bases codant la séquence de Shine-Dalgarno et le codon d’initiation de la traduction sont aussi indiqués. Ce sont des séquences cruciales de l’ARNm (section 7.16).



218 Chapitre 8


m n8.8 Réponse stringente Les cellules bactériennes sont souvent confrontées dans la nature à des changements transitoires mais significatifs des quantités de nutriments. De telles situations peuvent bien sûr être aisément simulées en laboratoire et de nombreux travaux ont été réalisés avec Escherichia coli et d’autres procaryotes sur la régulation de l’expression génétique consécutive à une « diminution » ou à un « accroissement » des conditions nutritionnelles. Ces travaux incluent en particulier les régulations déclenchées par le manque d’acides aminés. Le passage de l’excès au manque d’acides aminés – dû au transfert d’une culture d’un milieu de culture riche et complexe à un milieu de culture défini ne contenant qu’une source de carbone – provoque l’arrêt presque immédiat des synthèses d’ARNr et d’ARNt. En conséquence, aucun nouveau ribosome ne sera produit. Les synthèses de protéines et d’ADN seront limitées parallèlement à l’activation de la synthèse de nouveaux acides aminés (voir figure 8.21a). Après un tel changement, de nombreuses nouvelles protéines doivent être produites pour assurer la synthèse des acides aminés qui ne sont plus disponibles dans le milieu. Elles sont synthétisées par les ribosomes disponibles. Au bout d’un certain temps, la synthèse d’ARNr (et donc de nouveaux ribosomes) reprend mais à un nouveau rythme, proportionné au taux de croissance cellulaire réduit (voir figure 8.21a). Cette série d’événements est appelée la réponse stringente (ou contrôle stringent) qui constitue un autre exemple de contrôle global.

ppGpp et le mécanisme de la réponse stringente Les acteurs de la réponse stringente sont deux nucléotides modifiés, le guanosine tétraphosphate (ppGpp) et le guanosine pentaphosphate (pppGpp) [voir figure 8.21b]. Chez Escherichia coli, ces nucléotides, appelés alarmones, s’accumulent rapidement lors du passage de l’excès au manque d’acides aminés. Les alarmones sont synthétisées par une protéine appelée RelA en utilisant l’ATP comme donneur de phosphate (voir figure 8.21b, c). La protéine RelA est associée à la sous-unité 50S du ribosome (voir tableau 7.6) et est activée par un signal du ribosome lors de la réduction des nutriments. Ce signal résulte de l’arrêt de l’activité du ribosome dû au manque d’acides aminés. Dans de telles conditions, le nombre d’ARNt non chargés augmente dans la cellule. Lorsqu’un de ces ARNt non chargés se lie au ribosome, celui-ci décroche, ce qui déclenche la synthèse de ppGpp et de pppGpp par RelA (voir figure 8.21c). Les alarmones ppGpp et pppGpp ont un effet de contrôle global. Elles inhibent fortement la synthèse d’ARNr et d’ARNt en interférant avec l’ARN polymérase au niveau de l’initiation de transcription des gènes codant ces ARN. D’autre part, les alarmones activent les opérons de biosynthèse de certains acides aminés et de divers opérons cataboliques. À l’opposé, les opérons qui codent les protéines de biosynthèse des acides aminés disponibles en quantités suffisantes restent inactifs. De nombreux effets secondaires sont aussi observés lors de la réponse stringente, incluant l’inhibition de la synthèse d’ADN, de la synthèse de lipides membranaires et de la division cellulaire.

ARN et protéines

Carence

Croissance

Croissance en milieu riche

Réponse stringente ppGpp et pppGpp 0

30

60

90

120

Temps (min) (a) O– –O

P

O– O

O

P

O

5′ CH2

O

O H

H

H

3′ O –O

P

Guanine

H

OH O

O –O

P

O

O–

(b) Polypeptide

ARNt chargé

Ribosome AA

5′ ARNm

Traduction normale

RelA

ARNt non chargé

5′ ARNm

RelA

GTP

ATP

Réponse stringente 1. La synthèse d’ARNr et d’ARNt diminue 2. Les opérons de biosynthèse ppGpp des acides aminés sont activés

(c) FIGURE 8.21 La réponse stringente. (a) En situation de carence nutritionnelle, la synthèse d’ARNr, d’ARNt et de protéines cesse temporairement. La croissance peut ensuite reprendre mais à un taux de croissance réduit comparativement à la situation initiale. (b) Structure du guanosine tétraphosphate (ppGpp), le déclencheur de la réponse stringente. (c) Synthèse du guanosine tétraphosphate. La traduction normale (graphique a) requiert des ARNt chargés. Quand le manque d’acides aminés apparaît, un ARNt non chargé peut se fixer au ribosome (schéma c), ce qui provoque l’arrêt de l’activité du ribosome. Cet événement enclenche la synthèse de ppGpp par la protéine RelA.



8.9 Autres réseaux de contrôle global lac 219

La réponse stringente apparaît comme un mécanisme d’ajustement de la machinerie cellulaire de biosynthèse à des conditions limitantes en acides aminés. La cellule atteint ainsi un nouvel état d’équilibre entre anabolisme et catabolisme. La plupart des procaryotes sont confrontés à l’irrégularité des ressources trophiques dans la nature. Un mécanisme global tel que la réponse stringente qui équilibre l’état métabolique cellulaire avec la disponibilité des acides aminés améliore probablement leur compétitivité dans la nature.

Contrôlez vos acquis La réponse stringente est un mécanisme global de contrôle déclenché par le manque d’acides aminés. Les alarmones ppGpp et pppGpp sont produites par RelA, une protéine qui contrôle l’activité des ribosomes. La réponse stringente assure l’équilibre intracellulaire entre la production et les besoins de protéines. •

Quels sont les gènes activés lors de la réponse stringente et pourquoi ?

•

Comment les alarmones sont-elles synthétisées ?

m n8.9 Autres réseaux de contrôle global Nous avons vu la répression catabolique chez Escherichia coli en section 8.7 et la réponse stringente en section 8.8. Ce sont deux exemples de contrôle global. Il y a plusieurs autres systèmes de contrôle global chez E. coli (et probablement chez tous les procaryotes), quelques-uns sont présentés par le tableau 8.1. Les systèmes de contrôle global peuvent réguler plus d’un seul régulon (voir section 8.7). Le terme modulon est utilisé pour mentionner un groupe de gènes régulé par la même protéine de régulation même si ces gènes appartiennent à différents régulons (et par conséquent ont au moins un autre type

TABLEAU 8.1 Système

de contrôle). Le terme stimulon est utilisé pour mentionner un groupe de gènes qui répondent tous au même signal environnemental, même si ces gènes codent des protéines dont les fonctions sont indépendantes. Des exemples de ces larges systèmes de contrôle global sont présentés par le tableau 8.1.

Les facteurs sigma alternatifs Les gènes qui répondent aux systèmes de contrôle global ne sont pas tous régulés par une combinaison simple de répresseurs et d’activateurs. Plusieurs sont contrôlés par des facteurs sigma alternatifs (voir tableau 8.2). La régulation résulte alors de modifications de la quantité ou de l’activité de ces facteurs sigma, sachant que chaque facteur sigma alternatif ne reconnaît qu’un sous-ensemble de gènes (par exemple, certains modulons ou stimulons) dans le génome. Rappelons-nous que sigma est la sous-unité de l’ARN polymérase responsable de la reconnaissance du promoteur (voir section 7.10). La plupart des gènes d’Escherichia coli requièrent le facteur sigma σ70 (l’exposant 70 indique la taille de cette protéine, 70 kilodaltons) pour leur transcription et ont des promoteurs identiques à ceux de la figure 7.30. Au total, E. coli a sept facteurs sigma différents et chacun reconnaît différentes séquences consensus promotrices (voir tableau 8.2). Elles ont pour la plupart des homologues chez les autres Bacteria. La bactérie sporulante Bacillus subtilis a quatorze facteurs sigma différents dont quatre strictement voués à la transcription des gènes de sporulation (voir section 4.13). La clé du contrôle de la transcription avec des facteurs sigma alternatifs est le contrôle de la synthèse et de l’activité de chaque facteur sigma. La concentration de chaque facteur sigma dans la cellule peut être modulée par le contrôle transcriptionnel que nous avons vu préalablement ou par le taux de dégradation dans la cellule par des protéases spécifiques. L’activité des facteurs sigma alternatifs présents dans la cellule peut être contrôlée par d’autres protéines appelées anti-facteurs sigma, qui peuvent inactiver temporairement un facteur sigma ou un autre en réponse aux changements des signaux de l’environnement (voir tableau 8.1).

EXEMPLES DES SYSTÈMES DE CONTRÔLE GLOBAL CONNUS CHEZ ESCHERICHIA COLIa Signal

Activité primaire de la protéine de régulation

Nombre de gènes régulés


Présence d’O2

Répresseur (ArcA)

≥ 50

Respiration anaérobie

Manque d’O2

Activateur (FNR)

≥ 70

Répression catabolique

Concentration en AMP cyclique

Activateur (CAP)

Choc thermique

Température

≥ 300 32

Facteur sigma alternatif (σ )

36 54

Utilisation de l’azote

Limitation en NH3

Activateur (NR1) / facteur sigma alternatif (σ )

≥ 12

Stress oxydatif

Agent oxydant

Activateur (OxyR)

≥ 30

Réponse SOS

ADN endommagé

Répresseur (LexA)

≥ 20

a

Pour de nombreux systèmes de contrôle global, la régulation est complexe. Une protéine de régulation peut jouer plusieurs rôles. Par exemple, la protéine de régulation de la respiration aérobie est un répresseur pour de nombreux promoteurs mais un activateur pour d’autres, alors que la protéine de régulation de la respiration anaérobie est un activateur pour de nombreux promoteurs mais un répresseur pour d’autres. La régulation peut aussi être indirecte ou nécessiter plus qu’une seule protéine de régulation. Certaines des protéines de régulation sont membres d’un système à deux composants (voir section 8.12). De nombreux gènes sont régulés par plus d’un seul système global. (Informations complémentaires sur la réponse SOS en section 10.4.)



220 Chapitre 8

TABLEAU 8.2


FACTEURS SIGMA D’ESCHERICHIA COLI

Noma

Séquence consensus de reconnaissance située en amont (– 35)b

σ70

TTGACA

Facteur sigma pour la plupart des gènes au cours de la croissance normale

σ

54

Fonction

TTGGCACA

Assimilation de l’azote

σ38

CCGGCG

Principal facteur sigma pendant la phase stationnaire et aussi lors de la réponse aux chocs oxydatifs et osmotiques

σ32

TNTCNCCTTGAAc

Réponse au choc thermique

σ

28

TAAA

Gènes impliqués dans la synthèse du flagelle

σ

24

GAACTT

Réponse aux défauts de repliement des protéines du périplasme

AAGGAAAAT

Certains gènes de transport du fer

σ19

Les exposants de la colonne Nom indiquent la taille des protéines en kilodaltons. La plupart des facteurs ont aussi d’autres noms ; par exemple σ70 est aussi appelé σD. b Pour informations complémentaires sur les séquences consensus, voir sections 7.10 et 7.11 et figure 7.30. c N, nucléotide quelconque. a

La réponse au choc thermique Les protéines sont pour la plupart relativement stables. Une fois produites, elles assurent leurs fonctions et sont transmises lors de la division cellulaire. Cependant, certaines protéines sont reconnues par les protéases cellulaires parce qu’incorrectement repliées et pour ce type de raison, elles sont rapidement dégradées. Par exemple, chez Escherichia coli, le facteur σ32 est normalement dégradé une ou deux minutes après sa synthèse. Mais quand les cellules sont soumises à une augmentation soudaine et significative de la température (un choc thermique), la dégradation de σ32 est inhibée. En conséquence, il y aura plus de σ32 dans la cellule et les opérons qui contiennent le promoteur spécifique de σ32 seront davantage transcrits (voir tableau 8.2). La majorité des gènes contrôlés par σ32 chez E. coli correspondent à des gènes de choc thermique qui codent des protéines de choc thermique exprimées lors de la réponse au choc thermique. Les protéines de choc thermique assistent la cellule pour récupérer après un stress. Elles sont non seulement induites par la chaleur mais aussi par d’autres facteurs de stress que la cellule peut rencontrer. Ceci inclut l’exposition à des concentrations élevées de produits chimiques – comme l’éthanol – ou l’exposition à de fortes doses de rayonnement ultraviolet. Chez E. coli et la plupart des procaryotes étudiés, on observe trois classes principales de protéines de choc thermique, Hsp70, Hsp60 et Hsp10. Nous avons déjà rencontré ces protéines sous des noms différents. La protéine Hsp70 d’E. coli est DnaK, une protéine qui prévient l’agrégation des protéines nouvellement synthétisées et qui stabilise les protéines non conformées (voir section 7.17). DnaK joue aussi un rôle dans la dégradation de σ32, servant ainsi de boucle de rétroaction pour maintenir la quantité de ce facteur sigma sous contrôle dans les cellules non stressées. En situation de stress, DnaK a essentiellement un rôle de sauvetage / réparation des protéines, donc σ32 est plus abondant et la transcription des gènes de choc thermique est effectuée à un rythme plus important. Les représentants principaux des familles Hsp60 et Hsp10 chez E. coli sont respectivement les protéines GroEL et GroES. Ce sont des chaperons moléculaires qui catalysent le repliement correct

des protéines mal conformées (voir section 7.17 et figure 7.40). Une autre classe de protéines de choc thermique comprend diverses protéases qui, dans la cellule, éliminent les protéines dénaturées ou irréversiblement agrégées. Les protéines de choc thermique semblent assez anciennes et sont présentes dans toutes les cellules. Le séquençage des protéines de choc thermique, spécialement Hsp70, a été utilisé pour aider à démêler la phylogénie des eucaryotes (voir section 14.9). Quand la période de stress est achevée, par exemple après une diminution de température, σ32 est rapidement inactivé par DnaK, et la synthèse des protéines de choc thermique est fortement réduite. Puisque les protéines de choc thermique réalisent des fonctions vitales dans la cellule, ces protéines sont toujours présentes en faible quantité, même lorsque les cellules croissent en conditions optimales. Cependant, une synthèse rapide des protéines de choc thermique dans les cellules stressées accroît leur importance afin de survivre à la chaleur excessive, à des agents chimiques ou physiques. La chaleur ou d’autres stress peuvent produire de grandes quantités de protéines inactives qui doivent être re-conformées (et en même temps, réactivées) ou sinon dégradées pour libérer des acides aminés disponibles pour la biosynthèse de nouvelles protéines.

Le choc froid Les stress cellulaires produits à basses températures induisent aussi de nombreux gènes (la réponse au choc froid), mais il ne s’agit pas de protéines Hsp. La réponse au choc froid est déclenchée par l’effet du froid qui retarde le fonctionnement du ribosome. Les protéines de choc froid incluent des hélicases, des nucléases et des protéines associées au ribosome qui interagissent directement ou indirectement avec l’ADN, l’ARN et les ribosomes pour réduire les synthèses de macromolécules. Des protéines qui augmentent la production de solutés compatibles (voir section 6.14) dans la cellule sont aussi induites par le choc froid pour éviter la formation de cristaux de glace dans le cytoplasme. Des protéines de nucléation de la glace sont synthétisées si l’on approche les conditions de gel. Elles catalysent la formation d’un réseau de glace moins destructeur que la glace amorphe pour les constituants cellulaires (tels que les membranes).



8.10 Détection de quorum (quorum sensing) 221

Contrôlez vos acquis Les cellules peuvent contrôler plusieurs régulons en utilisant des facteurs sigma alternatifs. Ceux-ci ne reconnaissent que certains promoteurs, ce qui permet ainsi la transcription d’une catégorie particulière de gènes. D’autres signaux globaux incluent les protéines de choc thermique et froid dont la fonction est d’aider la cellule à surmonter les stress de température. •

Pourquoi les cellules ont-elles plus d’un type de facteur sigma ?

•

Pourquoi les protéines induites pendant un choc thermique ne sont-elles pas nécessaires lors d’un choc froid ?

8.10 Détection de quorum m n (quorum sensing) Comme précédemment indiqué, les systèmes de contrôle global permettent à un organisme de réguler simultanément de nombreux gènes différents en réponse aux signaux de son environnement. Un signal potentiel auquel les procaryotes peuvent répondre est la présence de cellules de la même espèce dans leur voisinage. Quelques procaryotes ont des voies de régulation contrôlées par la densité des cellules du même type. Ce genre de contrôle est appelé la détection de quorum (le mot quorum signifie ici « nombre suffisant »).

Les opérons lux qui codent les protéines impliquées dans la bioluminescence sont sous le contrôle d’une protéine activatrice appelée LuxR et sont induits quand la concentration de l’AHL spécifique de V. fischeri, la N-3-oxohexanoyl homosérine lactone, est suffisamment présente. Cette AHL est synthétisée par la protéine codée par le gène luxI.

Exemples de détection de quorum De nombreux gènes sont contrôlés par un système de détection de quorum, dont certains chez les bactéries pathogènes. Chez Pseudomonas aeruginosa, par exemple, la détection de quorum déclenche l’expression d’un grand nombre de gènes indépendants lorsque la densité de population est suffisamment élevée. Ces gènes assistent les cellules de P. aeruginosa pour la transition de la croissance en suspension dans le milieu liquide à la croissance dans une matrice semi-solide appelée un biofilm (voir section 19.3). Le biofilm, qui résulte de la production de polysaccharides particuliers par P. aeruginosa, accroît la pathogénicité de cet organisme et empêche la pénétration des antibiotiques. La pathogénicité de Staphylococcus aureus (voir sections 25.7 et 26.9) implique, entre autres, la production et la sécrétion de petits peptides de surface extracellulaires qui endommagent les cellules hôtes et interfèrent avec le système immunitaire. Les

O H R

C H

Le mécanisme de la détection de quorum La détection de quorum est un mécanisme qui assure qu’un nombre suffisant de cellules d’une espèce donnée est présent avant de déclencher une réponse biologique particulière. Par exemple, une seule cellule d’une bactérie pathogène qui sécrète une toxine peut n’avoir aucun effet. La production de toxine par cette cellule sera alors un gaspillage de ressources. Par contre, si une population de cellules suffisamment importante est présente, l’expression coordonnée de la toxine pourra provoquer la maladie. La détection de quorum est très répandue chez les Bacteria Gram négatif. Chaque espèce qui utilise ce type de régulation synthétise une acyl-homosérine lactone spécifique (AHL) (voir figure 8.22a). Cette molécule diffuse librement à l’extérieur de la cellule. Pour cette raison, l’AHL n’atteindra des concentrations élevées dans la cellule que si de nombreuses autres cellules produisent la même AHL à proximité. Cette AHL spécifique fonctionne comme un inducteur qui se combine avec une protéine activatrice spécifique, déclenchant ainsi la transcription de gènes spécifiques (voir figure 8.22b). La détection de quorum a été initialement découverte comme un mécanisme de régulation de la bioluminescence chez les bactéries. Plusieurs procaryotes peuvent émettre de la lumière de cette façon – par exemple la bactérie marine Vibrio fischeri (voir section 12.12 et figure 12.28). La figure 8.23 montre des colonies bioluminescentes de V. fischeri. La lumière est un coproduit de l’activité d’une enzyme particulière, la luciférase.

O CH2

O

C N H

Acyl homosérine lactone (AHL) (a)

AHL

Autres cellules de la même espèce


AHL

Protéines spécifiques du quorum

Chromosome

AHL synthétase

(b) FIGURE 8.22 La détection de quorum (Quorum sensing). (a) Structure générale d’une acyl homosérine lactone (AHL). Les différentes AHL sont des variantes structurales de cette structure mère. R : groupe céto ou groupe hydroxyle. (b) Une cellule capable de pratiquer la détection de quorum transcrit et traduit les gènes codant l’acyl homosérine lactone synthétase à des niveaux de base. Cette enzyme produit l’AHL spécifique de la cellule. Quand le nombre de cellules de la même espèce atteint un certain niveau, la concentration en AHL augmente suffisamment pour se fixer à la protéine activatrice. Cette dernière active la transcription des protéines spécifiques du quorum.



222 Chapitre 8


signalement est atteinte, l’expression de certains gènes est déclenchée. •

Quelle est la principale classe de molécules de signalement pour la détection de quorum ?

•

Du point de vue des molécules de signalement, en quoi la détection de quorum est-elle différente entre Pseudomonas et Staphylococcus ?

Timothy C. Johnston

V

FIGURE 8.23 Bactéries bioluminescentes produisant l’enzyme luciférase. (Voir section 12.12.) Des cellules de la bactérie Vibrio fischeri ont été étalées sur une gélose nutritive en boîte de Petri et cultivées une nuit. La photographie a été prise en chambre noire et révèle la lumière produite par les bactéries.

gènes qui contrôlent ces facteurs de virulence sont sous le contrôle du système de détection de quorum qui répond à un peptide (plutôt qu’à une AHL) produit par cet organisme. La régulation de ces gènes est assez complexe et implique en partie une molécule d’ARN régulatrice. Bien que nous n’ayons présenté que des protéines de régulation dans ce chapitre, des molécules d’ARN régulatrices existent aussi (voir section 8.14). Le système de détection de quorum de S. aureus implique aussi des protéines régulatrices qui font partie d’un système régulateur de transduction de signal à deux composants. Ce type de régulation est présenté en section 8.12. La détection de quorum a été découverte chez au moins une espèce d’Archaea. Chez le micro-organisme halo-alcalophile Natronococcus occultus (qui requiert à la fois des concentrations en sel et un pH élevés, section 13.3), la synthèse d’une protéase extracellulaire est sous le contrôle d’une AHL spécifique. Ce contrôle assure que la protéase ne sera pas produite ni excrétée tant qu’un nombre de cellules suffisant ne sera pas atteint, de sorte que le niveau de protéase soit suffisant pour dégrader les protéines à un rythme raisonnable. Bien que ce soit le seul exemple connu de détection de quorum chez les Archaea, il serait surprenant que d’autres Archaea n’emploient pas le contrôle par détection de quorum pour des réactions qui ne peuvent leur bénéficier que lorsque les densités cellulaires sont suffisamment élevées pour produire un impact.

Contrôlez vos acquis La détection de quorum permet à des cellules de détecter la présence de cellules du même type dans leur environnement. La détection de quorum implique la mise en commun de petites molécules spécifiques. Lorsqu’une concentration suffisante de la molécule de

AUTRES MÉCANISMES DE RÉGULATION

Nous avons décrit plusieurs mécanismes que les cellules utilisent pour réguler la transcription de leurs gènes : répresseurs, activateurs, facteurs sigma alternatifs, molécules de détection de quorum. Restent encore quelques mécanismes de régulation importants que nous allons présenter maintenant.

8.11 Atténuation m n Quelques systèmes de contrôle, dont l’atténuation, n’utilisent pas de protéines de régulation se liant à l’ADN. Avec l’atténuation, le contrôle s’opère après l’initiation de la transcription mais avant son achèvement. Par conséquent, le nombre de transcrits produits par un opéron est réduit, même si le nombre de transcriptions initiées ne l’est pas. Les meilleurs exemples d’atténuation concernent la régulation de gènes contrôlant la biosynthèse de certains acides aminés chez des Bacteria Gram négatif. Le premier de ces systèmes à être décrit le fut pour l’opéron tryptophane d’Escherichia coli que nous allons voir maintenant.

L’atténuation dans le cas de l’opéron tryptophane L’opéron tryptophane contient les gènes de structure de cinq protéines de la voie de biosynthèse du tryptophane, plus les séquences promotrices et régulatrices usuelles au début de l’opéron (voir figure 8.24). Comme de nombreux opérons, l’opéron tryptophane a plusieurs types de régulation. La première enzyme de la vie de biosynthèse, l’anthranilate synthétase (une enzyme multimérique codée par trpD et trpE) est soumise à la rétro-inhibition par le tryptophane (voir section 8.2). La transcription de l’ensemble de l’opéron tryptophane est aussi sous contrôle négatif (voir section 8.5). Cependant, en plus des régions promotrice (P) et opératrice (O) nécessaires au contrôle négatif, on trouve une séquence de l’opéron appelée séquence leader. Le leader code un polypeptide qui compte une paire de codons tryptophane en zone terminale et fonctionne comme un atténuateur (voir figure 8.24). Le mode de contrôle est le suivant. Si le tryptophane est abondant dans la cellule, la quantité d’ARNt-tryptophane chargés sera suffisante et le peptide leader sera synthétisé. La synthèse du peptide leader provoque l’interruption de la transcription du reste de l’opéron trp qui inclut les gènes de structure des enzymes de biosynthèse. À l’inverse, si le peptide leader n’est pas synthétisé du fait du manque de tryptophane, la transcription du reste de l’opéron a lieu.



8.11 Atténuation 223

P O L

Gènes structuraux trp trpE

trpD

trpC

trpB

trpA

Séquence leader

Excès de tryptophane : transcription bloquée ADN

Sens de la transcription

Peptide leader de Trp Met-Lys-Ala-Ile-Phe-Val-Leu-Lys-Gly-Trp-Trp-Arg-Thr-Ser

Appariement

Ribosome

(a)

2 Met-Lys-Arg-Ile-Ser-Thr-Thr-Ile-Thr-Thr-Thr-Ile-ThrIle-Thr-Thr-Gly-Asn-Gly-Ala-Gly

Histidine

Met-Thr-Arg-Val-Gln-Phe-Lys-His-His-His-HisHis-His-His-Pro-Asp

Phénylalanine Met-Lys-His-Ile-Pro-Phe-Phe-Phe-Ala-Phe-Phe(b)

Phe-Thr-Phe-Pro

FIGURE 8.24 Atténuation et peptide leader. Structure de l’opéron tryptophane et du tryptophane ainsi que d’autres peptides leaders chez Escherichia coli. (a) Organisation de l’opéron tryptophane. Notez que le leader (L) code un petit peptide qui contient 2 résidus tryptophane près de son extrémité (un codon stop se situe après le codon Ser). P indique le promoteur et O, l’opérateur. Les gènes de TrpE à TrpA codent les enzymes impliquées dans la biosynthèse du tryptophane. (b) Séquences d’acides aminés de peptides leaders synthétisés par quelques autres opérons de biosynthèse d’acides aminés. L’isoleucine étant produite à partir de la thréonine, elle est un constituant important du peptide leader de la thréonine.

3

1

Peptide leader riche en Trp

4 trpE

Thréonine

5′

ARN polymérase bloquée

ARNm Sens de la traduction

Transcription bloquée

(a) Manque de tryptophane : la transcription a lieu

Séquence leader

Sens de la transcription

Traduction bloquée Peptide leader

2 5′

L’ARN polymérase continue

3

4

1 trpE

Le mécanisme de l’atténuation Comment la traduction d’un peptide leader peut-elle réguler la transcription des gènes du tryptophane en aval ? Considérons que dans les cellules procaryotes la transcription et la traduction sont deux processus simultanés ; dès lors que l’ARNm est libéré de l’ADN, le ribosome s’y fixe et la traduction commence (voir figure 7.39). C’est pourquoi, pendant que la transcription de l’aval de la séquence d’ADN est en cours, la traduction des séquences transcrites a déjà commencé (voir figure 8.25). L’atténuation a lieu (la transcription s’arrête) parce qu’une partie de l’ARNm néoformé se replie en une structure tige-boucle (ou en épingle à cheveux) particulière qui provoque l’arrêt de l’activité de l’ARN polymérase. Cette structure tige-boucle est formée par l’ARNm parce que deux séries de nucléotides voisines sont complémentaires et peuvent s’apparier. Si le tryptophane est abondant, le ribosome traduira la séquence leader jusqu’au codon stop. Le reste de l’ARN leader forme la structure tige-boucle, un site de pause de la transcription, suivi par une séquence riche en uracile qui provoque finalement la terminaison (voir figure 8.25). Si les réserves de tryptophane sont faibles, la transcription des gènes codant les enzymes de biosynthèse du tryptophane est évidemment souhaitable. Durant la transcription du leader, le ribosome s’arrête au niveau d’un codon tryptophane du fait de la pénurie d’ARNt-tryptophane chargés. Le blocage du ribosome dans cette position permet la formation d’une structure tige-boucle différente (sites 2 et 3 de la figure 8.25) ; cette

Les gènes de structure du tryptophane ne sont pas transcrits

Les gènes de structure du tryptophane sont transcrits

Sens de la traduction (b) FIGURE 8.25 Mécanisme de l’atténuation. Le contrôle de la transcription des gènes de structure de l’opéron tryptophane par atténuation chez Escherichia coli. Les régions 1 et 2 de l’ARNm codent le peptide leader. Deux régions de la chaîne d’ARNm en croissance peuvent former des doubles brins avec boucles, indiquées 2:3 et 3:4. (a) En présence d’un excès de tryptophane, le ribosome traduit le peptide leader complet et ainsi la région 2 ne peut pas s’apparier à la région 3. Les régions 3 et 4 s’apparient pour former une boucle qui arrête l’ARN polymérase. (b) Si la traduction est bloquée par le manque de tryptophane, l’appariement 2:3 forme une boucle, la boucle 3:4 ne se forme pas et la transcription se poursuit après la séquence leader.

structure tige-boucle alternative n’est pas un signal de terminaison de la transcription. Elle empêche la formation de la structure tige-boucle terminatrice (sites 3 et 4 de la figure 8.25). Ceci permet à l’ARN polymérase de franchir le site de terminaison et de commencer la transcription des gènes de structure du tryptophane. Ainsi, dans le contrôle par atténuation, transcription et traduction interagissent, le rythme de la transcription étant influencé par le rythme de la traduction. L’atténuation a aussi été mise en évidence chez Escherichia coli pour les voies de biosynthèse de l’histidine, de la thréonine, de l’isoleucine et de la phénylalanine ainsi que de plusieurs autres acides aminés et métabolites essentiels. Le peptide leader



224 Chapitre 8


de chaque opéron de biosynthèse d’un acide aminé est riche en cet acide aminé (voir la figure 8.24b). L’opéron his est spectaculaire de ce point de vue puisque son peptide leader contient sept histidines successives en fin de peptide (voir figure 8.23b). Cette plus longue suite de codons régulateurs confère à l’atténuation un rôle plus important dans la régulation, ce qui pourrait compenser le fait qu’à la différence de l’opéron trp, l’opéron his d’E. coli n’est pas sous contrôle négatif.

Les mécanismes d’atténuation indépendants de la traduction Les Bacteria Gram positif, telles que Bacillus, utilisent aussi l’atténuation pour réguler les opérons de biosynthèse de certains acides aminés. Comme pour les Bacteria Gram négatif, le mécanisme compte une atténuation de la transcription et des structures secondaires alternatives de l’ARNm qui, dans une configuration particulière, conduit à la terminaison. Cependant, le mécanisme est ici indépendant de la traduction et implique une protéine se liant à l’ARN. Dans le cas de l’opéron tryptophane de Bacillus subtilis, la protéine qui se fixe est nommée protéine d’atténuation de trp. En présence de quantités suffisantes de tryptophane, cette protéine de régulation se lie à l’ARNm leader et provoque la terminaison de la transcription. À l’inverse, lorsque le tryptophane est limitant, la protéine ne se fixe pas à l’ARNm. La structure secondaire favorable peut alors se former et la transcription a lieu. L’atténuation existe aussi pour des gènes sans rapport avec la biosynthèse des acides aminés. Quelques opérons impliqués dans la biosynthèse des pyrimidines (opéron pyr) chez Escherichia coli sont régulés par atténuation, c’est aussi le cas pour Bacillus. Les mécanismes décrits chez ces deux organismes sont assez différents bien qu’il s’agisse dans les deux cas de contrôler le niveau cellulaire de pyrimidines. Chez E. coli, le mécanisme assure le contrôle du rythme de transcription, pas de traduction. Si les pyrimidines ne sont pas limitantes, l’ARN polymérase peut circuler et traduire l’ADN leader à un rythme normal. Ceci conduit à la formation d’une structure tige-boucle terminatrice dans l’ARNm. À l’inverse, si les pyrimidines manquent, la polymérase marque une pause au niveau de séquences riches en pyrimidine, ce qui conduit à la formation d’une structure tige-boucle non terminatrice et permet la poursuite de la transcription. Chez Bacillus, le mécanisme utilisé est différent. Pour l’atténuation de pyr, une protéine affine de l’ARN contrôle les structures tige-boucle alternatives de l’ARNm et bloque la transcription lorsque les pyrimidines sont en excès dans la cellule. De cette façon, la cellule peut maintenir les niveaux des pyrimidines – composés dont la production requiert des ressources cellulaires significatives (voir section 5.16) – pour répondre aux besoins de la biosynthèse.

Contrôlez vos acquis L’atténuation est un mécanisme par lequel l’expression génétique (usuellement au niveau de la transcription) est contrôlée après initiation de la synthèse d’ARN. Les mécanismes d’atténuation impliquent le couplage de la transcription et de la traduction et sont donc spécifiques des procaryotes.

•

Pourquoi l’atténuation n’existe-t-elle pas chez les eucaryotes ?

•

Expliquez pourquoi la formation d’une structure tige-boucle dans l’ARN peut empêcher la formation d’une autre.

•

Comment l’atténuation de l’opéron tryptophane diffère-t-elle entre Escherichia coli et Bacillus subtilis ?

8.12 Transduction du signal m n et systèmes de régulation à deux composants

Les bactéries régulent leur métabolisme cellulaire en réponse à une large gamme de variations de l’environnement incluant les changements de température, de pH, les variations de la disponibilité de l’oxygène, des nutriments, et même du nombre de cellules présentes. Par conséquent, des mécanismes doivent exister par lesquels les bactéries perçoivent des signaux de l’environnement et les transmettent à des cibles spécifiques de la régulation. Nous avons vu dans les précédentes sections que certains signaux peuvent être des petites molécules qui entrent dans la cellule (souvent par des mécanismes d’assimilation spécifiques) et fonctionnent comme effecteurs. Cependant, dans de nombreux cas, les signaux extérieurs ne sont pas transmis directement à une protéine de régulation, mais à un détecteur qui transmet le signal au reste de la machinerie de régulation, un mécanisme nommé transduction du signal.

Les kinases de détection et les régulateurs de réponse La plupart des systèmes de transduction du signal comptent deux parties et sont de ce fait nommés systèmes de régulation à deux composants. Typiquement, de tels systèmes comprennent deux protéines différentes : 1) une protéine kinase de détection spécifique localisée dans la membrane cellulaire et 2) une protéine partenaire régulatrice de réponse. La kinase de détection est une enzyme qui phosphoryle des composés, habituellement avec un phosphate de l’ATP. Lorsqu’elles détectent un signal de l’environnement les kinases de détection se phosphorylent elles-mêmes (un processus nommé autophosphorylation) au niveau d’un résidu histidine spécifique de leur surface cytoplasmique (voir figure 8.26). Pour cette raison, les kinases de détection sont aussi appelées histidines kinases. Le groupe phosphate est ensuite transféré à une autre protéine intra-cellulaire, le régulateur de réponse. Le régulateur de réponse est usuellement une protéine qui se lie à l’ADN et régule la transcription négativement ou positivement selon le système (voir figure 8.26). Pour que le système de régulation soit équilibré, il faut une boucle de rétroaction ; c’est-à-dire une façon d’achever le circuit de régulation et de mettre fin au signal initial. Ceci réinitialise le système pour un autre cycle. Cette boucle de rétroaction implique une phosphatase, une enzyme qui supprime le groupe phosphate de la protéine régulatrice de



8.12 Transduction du signal et systèmes de régulation à deux composants 225

Exemples de systèmes de régulation à deux composants

Signal environnemental

Kinase de détection

Membrane cellulaire

ATP ADP P

Régulateur de réponse P

P

Phosphatase

ARN polymérase Promoteur

Transcription bloquée Opérateur

ADN

Gène

FIGURE 8.26 Le contrôle de l’expression génétique par un système de régulation à deux composants. Les composants principaux du système comptent une kinase de détection dans la membrane cellulaire capable d’autophosphorylation en réponse à un signal environnemental. Le groupe phosphoryle est ensuite transféré à un autre composant principal du système, un régulateur de réponse. Dans cette figure, le régulateur de réponse phosphorylé est une protéine répresseur. La phosphatase enlève lentement le phosphate, ce qui ferme la boucle.

réponse à un rythme constant. Dans quelques cas, cette réaction est effectuée par la kinase de détection elle-même, alors que dans d’autres systèmes une protéine différente assure cette réaction (voir figure 8.26). L’activité phosphatase est habituellement un processus plus lent que la phosphorylation du régulateur de réponse. Cependant, si la phosphorylation cesse du fait d’une activité réduite de la kinase de détection, l’activité phosphatase peut ramener le régulateur de réponse à un état totalement non phosphorylé.

TABLEAU 8.3

Les systèmes à deux composants régulent un grand nombre de gènes pour de nombreuses bactéries différentes. Ils semblent moins largement répandus parmi les Archaea que parmi les Bacteria, et sont quasiment absents chez les Bacteria parasites. Quelques exemples essentiels de systèmes à deux composants sont l’assimilation du phosphate chez Escherichia coli, la fixation de l’azote chez Klebsiella et Rhizobium, et la sporulation chez Bacillus. Chez E. coli, on estime que près de cinquante systèmes différents à deux composants fonctionnent, certains d’entre eux sont présentés dans le tableau 8.3. De nombreux systèmes de régulation à deux composants impliquent aussi des phénomènes de régulation globale (voir tableau 8.1). Par exemple, l’osmolarité de l’environnement détermine laquelle des deux protéines OmpC et OmpF est synthétisée pour intégrer la membrane externe d’E. coli. OmpC et OmpF sont des porines, protéines qui permettent aux métabolites de franchir la membrane externe des bactéries Gram négatif (voir section 4.9 et figure 4.29). Si la pression osmotique est faible, OmpF, une porine avec un grand pore, est synthétisée alors que si la pression osmotique est élevée, c’est OmpC, une porine avec un pore plus petit, qui l’est. Le régulateur de réponse de ce système est OmpR. Quand OmpR est phosphorylé, il active la transcription du gène ompC et réprime la transcription du gène ompF. Le gène ompF est aussi contrôlé par un ARN antisens chez E. coli (voir section 8.14). Dans quelques cas, des éléments de régulation multiples sont impliqués. Par exemple, dans le système de régulation Ntr, qui régule l’assimilation de l’azote chez de nombreuses Bacteria dont E. coli, le régulateur de réponse est une protéine activatrice, NRI (régulateur de l’azote I, nitrogen regulator I). NRI active la transcription en aval de promoteurs reconnus par l’ARN polymérase qui utilisent σ54, un facteur sigma alternatif (voir section 8.9 et tableau 8.2). Une kinase de détection du système Ntr, NRII (régulateur de l’azote II, nitrogen regulator II), remplit un double rôle, de kinase et de phosphatase. L’activité de NRII est à son tour régulée par l’état de phosphorylation d’une autre protéine, PII. Le système de régulation Nar (voir tableau 8.3) contrôle un ensemble de gènes induits par l’anaérobiose et comprend deux

EXEMPLES DE SYSTÈMES DE RÉGULATION À DEUX COMPOSANTS QUI CONTRÔLENT LA TRANSCRIPTION E. COLI

CHEZ

Système

Signal environnemental

Kinase de détection

Régulateur de réponse

Activité du régulateur de réponsea

Système Arc

O2

ArcB

ArcA

Répresseur / activateur

Régulation anaérobie de nitrate et nitrite (Nar)

Nitrate et nitrite

NarX et NarQ

NarL NarP

Activateur / répresseur Activateur / répresseur

Utilisation de l’azote (Ntr)

NH4+

NRII, le produit de glnL

NRI, le produit de glnG

Active l’ARN polymérase au niveau de promoteurs qui nécessitent σ54

Régulon Pho

Phosphate inorganique

PhoR

PhoB

Activateur

Régulation des porines

Pression osmotique

EnvZ

OmpR

Activateur / répresseur

a

Notez que plusieurs des protéines régulatrices de réponse agissent soit comme activateur, soit comme répresseur selon les gènes régulés. Bien que ce soit aussi le cas pour ArcA, cette protéine agit comme répresseur sur la plupart des opérons qu’elle régule.



226 Chapitre 8


kinases de détection différentes et deux régulateurs de réponse différents. De plus, tous les gènes régulés par ce système sont aussi sous le contrôle global de la protéine de régulation transcriptionnelle FNR activée par l’anaérobiose (voir tableau 8.1). On peut ainsi voir que la régulation de l’expression génétique chez les procaryotes peut rapidement devenir très compliquée ! Les analyses génomiques permettent la détection rapide des gènes codant des systèmes de régulation à deux composants car les histidines kinases présentent une conservation significative des séquences d’acides aminés. Des systèmes à deux composants apparentés à ceux connus pour une grande variété de Bacteria sont aussi présents chez les micro-organismes eucaryotes, tels que la levure Saccharomyces cerevisiae. Les eucaryotes plus évolués utilisent aussi la phosphorylation comme mécanisme de transduction du signal afin de répondre aux modifications de l’environnement. Quelques espèces d’Archaea incluant en particulier les halophiles extrêmes (espèces du genre Halobacterium, voir section 13.3) et les méthanogènes (voir section 13.4) utilisent des systèmes à deux composants pour réguler certains gènes, dont ceux qui codent des protéines de chimiotactisme (voir section 8.13).

Contrôlez vos acquis Les systèmes de transduction du signal transmettent des signaux environnementaux à la cellule. Chez les procaryotes, la transduction du signal met classiquement en œuvre des systèmes de régulation à deux composants qui comprennent une kinase de détection membranaire et un régulateur de réponse cytoplasmique. L’activité du régulateur de réponse dépend de son état de phosphorylation. •

Que sont les kinases et quel est leur rôle dans les systèmes de régulation à deux composants ?

•

Suite à la diminution d’un signal environnemental, comment les deux composants sont-ils réinitialisés pour pouvoir répondre à un second stimulus ?

8.13 Régulation du chimiotactisme m n Tous les systèmes à deux composants ne régulent pas la transcription. Nous avons vu précédemment comment les procaryotes peuvent se diriger vers des produits attractifs et s’écarter de répulsifs, un phénomène nommé chimiotactisme (voir section 4.12). Nous avons noté que les procaryotes sont trop petits pour détecter véritablement les gradients spatiaux d’un composé chimique mais ils peuvent répondre aux gradients temporels. Ils peuvent détecter les changements de concentration en produits chimiques au cours du temps plus que les concentrations absolues d’un stimulus chimique. Les procaryotes utilisent un système à deux composants pour détecter les changements temporels et traitent cette information pour réguler la rotation du flagelle.

Étape 1 : la réponse au signal Le mécanisme du chimiotactisme est complexe et met en œuvre toute une variété de protéines. Nombre de protéines de détection sont localisées dans la membrane cellulaire et détectent la

présence de molécules attractives et répulsives. Ces protéines de détection ne sont pas des kinases mais interagissent avec des kinases de détection cytoplasmiques. Ces protéines de détection permettent à la cellule de contrôler les concentrations d’une substance au cours du temps. Les protéines de détection sont nommées protéines du chimiotactisme acceptrices de méthyle (MCP, Methyl-accepting Chemotaxis Proteins). Chez Escherichia coli, cinq MCP différentes ont été identifiées et ce sont toutes des protéines transmembranaires (voir figure 8.27). Chaque MCP peut détecter différents composés. Par exemple, le transducteur Tar d’E. coli peut détecter les molécules attractives comme l’aspartate et le maltose ainsi que des métaux lourds répulsifs tels que le cobalt et le nickel. Les MCP se fixent directement aux molécules attractives ou répulsives, ou dans quelques cas, indirectement, via des interactions avec des protéines de liasion périplasmique. La fixation d’une molécule attractive ou répulsive déclenche une série d’interactions avec des protéines cytoplasmiques qui ont finalement une incidence sur la rotation du flagelle. Si la rotation du flagelle s’effectue dans le sens inverse des aiguilles d’une montre, la cellule avance tout droit alors que si le flagelle tourne dans le sens des aiguilles d’une montre, la cellule se retournera, se réorientera pour repartir au hasard dans une autre direction (voir section 4.14). Les MCP sont en contact avec les protéines cytoplasmiques CheW et CheA (voir figure 8.27). CheA est une kinase de détection pour le chimiotactisme. Lorsqu’une MCP se lie à un composé chimique, sa conformation change et elle provoque (à l’aide de CheW) l’autophosphorylation de CheA pour former CheA-P. Les molécules attractives diminuent le taux d’autophosphorylation alors que les molécules répulsives l’augmentent. CheA-P phosphoryle CheY (ce qui forme CheY-P), le régulateur de réponse. CheA-P peut aussi phosphoryler CheB, un autre régulateur de réponse, mais c’est une réaction beaucoup plus lente que la phosphorylation de CheY. Nous verrons ultérieurement l’activité de CheB-P.

Étape 2 : le contrôle de la rotation du flagelle CheY est une protéine clé du système parce qu’elle détermine la direction de rotation du flagelle. CheY-P interagit avec le moteur flagellaire pour induire la rotation du flagelle dans le sens des aiguilles d’une montre et le retournement de la cellule (les protéines codées par les gènes fla assurent l’inversion du moteur ; voir section 4.14). Non phosphorylée, CheY ne peut se lier, le moteur flagellaire continue sa rotation dans le sens inverse des aiguilles d’une montre et la cellule poursuit sa course. Une autre protéine, CheZ, déphosphoryle CheY, favorisant ainsi les déplacements au lieu des retournements. Les molécules répulsives augmentent le niveau de CheY-P et conduisent au retournement de la cellule, alors que les molécules attractives diminuent le niveau de CheY-P, ce qui conduit à un déplacement continu.

Étape 3 : l’adaptation Par-delà la production d’un signal et la régulation de la rotation du flagelle, le système doit être capable de détecter un changement de concentration d’un agent chimiotactique au cours du temps. Ce problème est résolu par un autre aspect du chimiotactisme, le processus d’adaptation. L’adaptation est la boucle de rétrocontrôle nécessaire à la réinitialisation du système. Ceci



8.14 ARN de régulation et riboswitchs 227 Substance attractive

Transducteur

CheW CheA

ATP ADP

+CH3

CheR

CheB

P

CheB

Paroi cellulaire

CheW CheA P

CheY

Moteur flagellaire

CheY

P

CheZ –CH3 Cytoplasme

Membrane cytoplasmique FIGURE 8.27 Interaction des MCP, des protéines du chimiotactisme (Che) et du moteur flagellaire dans le chimiotactisme bactérien. Les MCP forment un complexe avec la kinase de détection CheA et la protéine associée CheW. Cette combinaison résulte d’une autophosphorylation de CheA en CheA-P dépendante d’un signal. CheA-P peut ensuite phosphoryler les régulateurs de réponse CheB et CheY. CheY phosphorylé (CheY-P) interagit directement avec le démarrage du moteur flagellaire. CheZ déphosphoryle CheY-P. CheR ajoute continuellement des groupements méthyle au transducteur alors que CheB-P (mais pas Che-B) les enlève. Le degré de méthylation des MCP détermine leur aptitude à répondre aux substances attractives et répulsives, ce qui entraîne l’adaptation. La structure du moteur flagellaire a été présentée à la figure 4.56.

résulte de la modification covalente des MCP par CheB mentionnée précédemment. Comme leur nom l’indique, les MCP peuvent être méthylées. Une protéine cytoplasmique, CheR (voir figure 8.27), ajoute continuellement des groupements méthyle aux MCP à un faible rythme en utilisant la S-adénosylméthionine comme donneur de méthyle. La forme phosphorylée du régulateur de réponse CheB est une diméthylase qui élimine les groupements méthyle des MCP. Le niveau de méthylation des MCP a une incidence sur leur conformation et contrôle l’adaptation à un signal sensoriel. Si le niveau d’une molécule attractive reste élevé, le niveau de phosphorylation de CheA (et par conséquent de CheY et CheB) restera faible et la cellule se déplacera continûment. Le niveau de méthylation des MCP s’accroîtra pendant cette période (parce que CheB-P ne sera pas présente pour déméthyler). Cependant, les MCP ne répondent plus aux molécules attractives lorsqu’elles sont totalement méthylées. Ainsi, même si la concentration de la molécule attractive reste élevée, le niveau de CheA-P (et de CheB-P) augmente et la cellule commence à se retourner. Les MCP peuvent alors être déméthylées par CheBP et ainsi les récepteurs sont « réinitialisés » et peuvent à nouveau répondre aux molécules attractives. La succession des événements est juste inversée pour les molécules répulsives. Les MCP totalement méthylées répondent mieux à un gradient croissant de molécule répulsive et adressent un signal de retournement de cellule pour commencer. La cellule se déplace ensuite dans une direction choisie au

hasard pendant que les MCP sont lentement déméthylées. Grâce à ce mécanisme d’adaptation, le chimiotactisme permet le contrôle efficace de concentrations en molécules attractives et répulsives évoluant au cours du temps.

Contrôlez vos acquis Le chimiotactisme est soumis à une régulation complexe impliquant une transduction du signal régulée par l’activité des protéines concernées plus que par leur synthèse. L’adaptation par méthylation permet au système de se réinitialiser lors de la présence continue d’un signal. •

Quels sont le régulateur de réponse primaire et la kinase de détection primaire pour la régulation du chimiotactisme ?

•

Pourquoi l’adaptation est-elle importante ?

8.14 ARN de régulation et riboswitchs m n Dans ce chapitre, nous avons surtout présenté le contrôle transcriptionnel de la synthèse des protéines. Les gènes sont moins souvent contrôlés au niveau traductionnel. De toute manière, les protéines sont les éléments de régulation.



228 Chapitre 8


Toutefois, pour certaines formes de régulation, un ARN et non une protéine joue le rôle clé dans le contrôle de l’expression génétique. La régulation par les ARN est un domaine de la biologie moléculaire en expansion rapide aussi bien pour les procaryotes que pour les eucaryotes. Chez Escherichia coli, par exemple, il a été montré que des petits ARN régulent différents aspects de la physiologie cellulaire en se fixant à d’autres ARN et même à de petites molécules dans certains cas. Il s’agit de petits ARN (pARN) d’une longueur de 40 à 400 nucléotides qui ne codent ni protéines, ni ARN ribosomiques, ni ARN de transfert. Au moins trois mécanismes sont connus pour l’activité des pARN. Nous avons vu l’existence d’un pARN dans la particule de reconnaissance de signal, une ribo-nucléo-protéine qui identifie les protéines néosynthétisées qui doivent être excrétées par la cellule (voir section 7.17 et figure 7.41). Un second mécanisme de l’activité des pARN est la liaison à un ARNm par appariement des bases de séquences complémentaires. Ceci bloque l’ARNm et empêche sa traduction (voir figure 8.28a). Les petits ARN qui montrent cette activité sont appelés des ARN antisens ; ils sont ainsi nommés parce que le pARN a une séquence complémentaire du sens codant de l’ARNm. La transcription de l’ARN antisens est accrue par des conditions qui ne favorisent plus l’expression des gènes qu’ils régulent et les ARN antisens sont codés par des gènes complémentaires de ceux qui produisent les ARNm auxquels ils se fixent. Dans le cytoplasme, les ARN antisens forment des ARN double brin avec leurs ARNm complémentaires. Les ARNm double brin ne sont pas traduisibles et sont rapidement dégradés par des ribonucléases spécifiques (voir figure 8.28a).

Les riboswitchs Les riboswitchs (que l’on pourrait traduire par « riboinverseur ») sont une forme particulière de petits ARN. Ce sont des ARNm qui contiennent des séquences en amont de la séquence codante et peuvent se lier à des petites molécules (voir figure 8.28b). Les riboswitchs sont jusqu’à présent connus dans diverses voies de biosynthèse produisant des cofacteurs enzymatiques tels que les vitamines thiamine, riboflavine et B12 et Gène A

aussi pour quelques acides aminés et les bases puriques adénine et guanine. La molécule se liant à un riboswitch donné est la substance qui serait synthétisée par la protéine codée par l’ARNm du riboswitch. Par exemple, le riboswitch de la thiamine se lie à la thiamine en amont de la séquence qui code une enzyme de la voie de biosynthèse de la thiamine. La fixation à la thiamine conduit l’ARNm à former une structure secondaire tige-boucle qui empêche la traduction (voir figure 8.28b). Avec les riboswitchs, nous voyons un mécanisme de contrôle analogue à un autre vu précédemment. Au début du chapitre, nous avons vu le contrôle d’une enzyme préformée par un mécanisme nommé la rétro-inhibition (voir section 8.1). Dans ce cas, la modification conformationnelle d’une protéine allostérique, suite à la fixation d’un métabolite spécifique, empêche l’activité enzymatique d’une voie entière (voir figure 8.5). Un riboswitch se caractérise aussi par l’existence de deux structures. En absence de métabolite, le site Shine-Dalgarno de fixation du ribosome sur l’ARNm peut se lier au ribosome et la traduction peut commencer. Mais quand le métabolite se fixe à l’ARNm – un signal qui indique que le métabolite est en quantité suffisante –, la structure secondaire formée empêche la fixation de l’ARNm au ribosome, ce qui empêche la traduction. Les riboswitchs sont-ils répandus et comment ont-ils évolué ? Jusqu’à présent, les riboswitchs n’ont été trouvés que chez quelques bactéries, quelques plantes et des champignons. Certains scientifiques pensent qu’il s’agit de vestiges du monde à ARN, période hypothétique antérieure à l’existence des cellules, de l’ADN et des protéines, au cours de laquelle les ARN catalytiques auraient été les seules formes de vie autoréplicative (voir section 11.2). Dans un tel environnement, les riboswitchs auraient pu constituer un mécanisme primitif de contrôle du métabolisme, un mécanisme simple par lequel les formes de vie à ARN auraient pu contrôler la synthèse d’autres ARN. Lors de l’apparition des protéines, les riboswitchs auraient ainsi pu être l’un des premiers mécanismes de contrôle de leur synthèse. Si c’est bien vrai, les riboswitchs actuels seraient les derniers vestiges de cette forme simple de contrôle, puisque les contrôles cellulaires sont désormais majoritairement assurés par des protéines régulatrices.

Gène X Transcription

ARNm 5′′

La traduction a lieu Protéine A (a)

UCUGA-5′ ARN régulateur (antisens)

AGACU

5′

UCUGA-5′ AGACU La traduction est bloquée

Métabolite spécifique

ARN partiellement double brin

5′

5′

3′ Pas de métabolite spécifique

3′ La traduction a lieu La traduction est bloquée

(b)

FIGURE 8.28 ARN régulateur. (a) ARN antisens. Le gène A est transcrit à partir de son promoteur (section 7.10) pour donner un ARNm qui peut être traduit en protéine A. Le gène X est un petit gène dont la séquence est identique à une portion du gène A mais dont le promoteur est à l’extrémité opposée. Par conséquent, s’il est transcrit, l’ARN produit sera complémentaire de l’ARNm du gène A. Si ces deux ARN s’apparient, la traduction sera impossible. (b) Riboswitchs. La fixation d’un métabolite spécifique modifie la structure secondaire de la portion de l’ARNm du riboswitch, ce qui empêche la traduction.



Questions 229

QUESTIONS 1. Sachant qu’une enzyme peut être inhibée par rétro-inhibition, pourquoi les cellules ont-elles aussi des mécanismes pour en réguler la synthèse (voir section 8.1) ? 2. Comparez la régulation de la DAHP synthétase chez Escherichia coli avec celle d’un organisme utilisant une rétro-inhibition concertée. Lequel utilise le plus de protéines ? Comment le résultat final peut-il être le même dans chaque cas (voir section 8.2) ? 3. De quelles manières les événements conduisant à la production de la protéine GyrA chez Mycobacterium leprae sont-ils identiques ou différents de l’épissage des gènes des eucaryotes (voir section 8.3) ? 4. Précisez pourquoi il est peu probable qu’une protéine qui se lie à une séquence spécifique d’ADN double brin puisse se lier à la même séquence d’ADN simple brin (voir section 8.4). 5. La régulation de la plupart des opérons de biosynthèse ne nécessite qu’un contrôle négatif alors que celle de la plupart des opérons cataboliques nécessite à la fois un contrôle négatif et un contrôle positif. Pourquoi (voir sections 8.5 et 8.6) ? 6. Décrivez le mécanisme de fonctionnement de la protéine activatrice du catabolisme (CAP), la protéine de régulation de la répression catabolique, en utilisant l’opéron lactose comme exemple. Pour cet opéron, la protéine CAP n’est pas répressive. Décrivez la région régulatrice d’un gène pour lequel la protéine CAP agit comme répresseur (voir section 8.7). 7. Quels événements déclenchent la réponse stringente ? Pourquoi les événements qui se déroulent lors de la réponse stringente

sont-ils une conséquence logique du déclenchement de cette réponse (voir section 8.8) ? 8. Décrivez les protéines produites lorsque des cellules d’Escherichia coli sont soumises à un choc thermique. Quel est leur intérêt pour la cellule (voir section 8.9) ? 9. Pourquoi la détection de quorum peut-elle être considérée comme un mécanisme de régulation pour la conservation des ressources cellulaires (voir section 8.10) ? 10. Décrivez comment fonctionne l’atténuation transcriptionnelle. Qu’est-ce qui est « atténué » ? Pourquoi le type d’atténuation qui contrôle plusieurs voies de biosynthèse d’acides aminés différentes chez Escherichia coli n’a-t-il pas été trouvé chez les eucaryotes (voir section 8.11) ? 11. Quels sont les deux composants qui donnent leur nom à la régulation de la transduction du signal chez les procaryotes ? Quelle est la fonction de chacun de ces composants (voir section 8.12) ? 12. L’adaptation permet la réinitialisation du mécanisme de régulation qui contrôle la rotation flagellaire. Comment s’opère-t-elle (voir section 8.13) ? 13. En quoi la régulation par les ARN antisens diffère-t-elle de celle des riboswitchs ? Lequel de ces modes de régulation est le mieux adapté au contrôle de la production des enzymes d’une voie de biosynthèse ? Pourquoi (voir section 8.14) ? 14. Bien qu’il s’agisse de formes de régulation totalement différentes, l’une présentée en section 8.2 présente des similitudes avec l’autre mentionnée à la section 8.14. Expliquez pourquoi.

PROBLÈMES 1. Qu’arriverait-il à la régulation par un promoteur sous contrôle négatif si la région de fixation de la protéine régulatrice était délétée ? Que se passerait-il avec un promoteur sous contrôle positif ? 2. Les promoteurs d’Escherichia coli sous contrôle positif ne sont pas identiques à la séquence consensus d’E. coli (voir section 7.9). Pourquoi ? 3. Le contrôle par atténuation de certains gènes de la voie de biosynthèse de la pyrimidine chez Escherichia coli implique le couplage de la transcription et de la traduction. Décrivez le mécanisme par lequel la cellule pourrait, d’une manière ou d’une autre, utiliser la traduction pour apprécier le niveau de nucléotides pyrimidiques.

4. La plupart des systèmes de régulation décrits dans ce chapitre mettent en œuvre des protéines de régulation. Cependant, les ARN de régulation existent aussi. Décrivez comment le contrôle négatif de l’opéron lac pourrait être effectué par l’un ou l’autre des deux types d’ARN de régulation. 5. De nombreux opérons de biosynthèse d’acides aminés sous contrôle par atténuation sont aussi sous contrôle négatif. Considérant que l’environnement d’une bactérie peut être très dynamique, quel avantage pourrait résulter de l’utilisation de l’atténuation comme système de contrôle de second niveau ?





CHAPITRE NEUF


I

Virus et virion

232

9.1 9.2

Propriétés générales des virus Nature du virion

232 233

II

Croissance et titration

236

9.3 9.4

Les hôtes des virus Titration de virus

236 237

III

Réplication virale

239

9.5

Caractéristiques générales de la réplication virale 239 Multiplication virale : attachement et pénétration 240 Multiplication virale : production de l’acide nucléique et des protéines 241

9.6 9.7

Les virus sont des agents infectieux qui ont besoin des cellules pour se multiplier. Bien que le génome de nombreux virus soit de l’ADN double brin, le génome viral peut aussi être de l’ADN simple brin ou de l’ARN. La forme infectieuse d’un virus est appelée virion, comme ici le bactériophage T4.

IV

Diversité virale

243

9.8 9.9 9.10 9.11 9.12 9.13

Généralités sur les bactériophages Bactériophages virulents et T4 Bactériophages tempérés Bactériophage lambda Généralités sur les virus animaux Rétrovirus

243 244 246 247 250 252

V

Particules sous-virales

254

9.14

Viroïdes et prions

254



232 Chapitre 9


GLOSSAIRE Bactériophage (bacteriophage) Virus qui infecte une bactérie. Cycle lytique (lytic pathway) Série d’étapes après l’infection virale qui conduit à la réplication virale et à la destruction (lyse) de la cellule hôte. Lysogène (lysogen) Bactérie porteuse d’un prophage. Lysogénie (lysogenic pathway) Série d’étapes qui, après l’infection virale, conduit à un état où le génome viral est répliqué comme un prophage avec celui de l’hôte. Nucléocapside (nucleocapsid) Structure de base d’un virion constituée d’acide nucléique et de protéines. Oncogène (oncogene) Gène dont l’activité est associée à la transformation d’une cellule normale en cellule cancéreuse. Plage (plaque) Zone de lyse ou d’inhibition de croissance induite par un virus sur un tapis d’hôte sensible. Prion (prion) Protéine infectieuse dont la forme extracellulaire ne contient pas d’acide nucléique. Protéine précoce (early protein) Protéine synthétisée au début de l’infection virale. Protéine tardive (late protein) Protéine synthétisée vers la fin de l’infection virale. Provirus ou prophage (provirus ou prophage) Génome d’un virus ou d’un phage tempéré, habituellement intégré, qui se réplique avec le chromosome de l’hôte. Rétrovirus (retrovirus) Virus à ARN qui possède une transcriptase inverse et synthétise une copie ADN de son génome.

L

es virus sont des éléments génétiques qui se répliquent indépendamment du ou des chromosome(s) de la cellule mais non indépendamment de la cellule ellemême (voir section 7.4). Cependant, à la différence des éléments génétiques comme les plasmides (voir sections 7.4 et 10.9), les virus ont une forme extracellulaire qui leur permet d’exister à l’extérieur de l’hôte pour de longues périodes et qui facilite la transmission d’un hôte à un autre. Pour se multiplier, les virus doivent pénétrer dans une cellule dans laquelle ils peuvent se répliquer ; ce processus est appelé infection. La cellule infectée est appelée l’hôte. La virologie est une sousdiscipline majeure de la microbiologie. Les virus, comme les plasmides et d’autres éléments génétiques, exploitent la machinerie métabolique de la cellule. Comme ces autres éléments, les virus peuvent conférer à leur cellule hôte d’importantes et nouvelles propriétés. Celles-ci seront transmises lors de la division de la cellule hôte, si chaque nouvelle cellule hérite aussi du génome viral. Ces changements sont généralement inoffensifs et peuvent même être bénéfiques. Les virus peuvent aussi se répliquer d’une manière destructive pour la cellule hôte ; c’est la raison pour laquelle certains virus sont des agents pathogènes (voir chapitres 26 à 29). Ce chapitre est divisé en quatre parties. La première partie décrit rapidement la structure des virus. La deuxième porte sur la cellule hôte et la quantification des virus. La troisième traite de la multiplication virale du point de vue moléculaire. La dernière partie présente quelques virus infectant des bactéries et des animaux (voir aussi chapitre 16). Les virus sont parmi les entités biologiques les plus nombreuses sur notre planète et infectent tous les types d’organismes

Transcription inverse (reverse transcription) Processus impliquant une transcriptase inverse qui synthétise un ADN complémentaire à partir d’une matrice à ARN. Transformation (transformation) Processus chez les eucaryotes par lequel une cellule normale devient une cellule cancéreuse (voir chapitre 10 pour une autre définition). Virion (virion) Particule virale complète ; l’acide nucléique est entouré d’une capside protéique et, dans certains cas, d’autres composants. Viroïde (viroïde) Petit ARN simple brin circulaire qui induit différentes maladies de plantes. Virus (virus) Élément génétique contenant soit de l’ARN soit de l’ADN, qui se réplique dans des cellules hôtes mais qui présente aussi une forme extracellulaire. Virus à ARN simple brin négatif (minus (negative)-strand RNA virus) Virus dont le génome à ARN est complémentaire de la séquence en bases de l’ARNm viral. Virus à brin positif (plus (positive)-strand virus) Virus dont le génome à ARN ou à ADN a la même complémentarité que l’ARNm viral. Virus tempéré (temperate virus) Virus dont le génome se réplique avec celui de son hôte, dont il ne cause pas la mort dans un état dit de lysogénie. Virus virulent (virulent virus) Virus qui lyse ou tue la cellule hôte après l’infection.

cellulaires. Les biologistes les étudient pour eux-mêmes, mais aussi dans le but de mieux comprendre la génétique et la biochimie des processus cellulaires, ainsi que le développement de maladies. De plus, les virus constituent d’importants outils pour la génétique microbienne et le génie génétique (voir chapitres 10, 15 et 31).

I

VIRUS ET VIRION

m n9.1 Propriétés générales des virus Les virus peuvent exister sous une forme extracellulaire ou intracellulaire. Dans la forme extracellulaire, un virus est une particule qui contient de l’acide nucléique entouré de protéines et, dans certains cas, d’autres macromolécules. La particule virale, aussi appelée virion, est métaboliquement inerte et n’accomplit pas de fonctions respiratoires ou biosynthétiques. Le virion est la structure par laquelle le génome viral passe d’une cellule, dans laquelle il a été produit, à une autre, où l’acide nucléique viral peut être introduit. Une fois dans la nouvelle cellule, l’état intracellulaire est initié. La réplication virale se produit alors avec la synthèse de nouvelles copies du génome viral et des composants nécessaires à la capside du virus. Les génomes viraux sont très petits et ils codent principalement les fonctions qui ne peuvent l’être par leurs hôtes. Durant la réplication, les virus dépendent donc fortement des composants structuraux et métaboliques de la cellule hôte. Le virus



9.2 Nature du virion 233

réoriente les fonctions métaboliques de l’hôte pour permettre sa réplication et l’assemblage de nouveaux virions. Par la suite, les nouvelles particules virales sont libérées et le processus peut se répéter.

Contrôlez vos acquis Un virion est la forme extracellulaire d’un virus et contient un génome à ADN ou à ARN. Le génome viral est introduit dans un nouvel hôte au cours de l’infection. Le virus redirige le métabolisme de l’hôte pour permettre la réplication virale. Les virus sont classés selon la stratégie de réplication et le type d’hôte.

Les génomes viraux Toutes les cellules contiennent des génomes à ADN double brin (voir section 7.1). En revanche, les virus ont des génomes, soit à ADN, soit à ARN. Un groupe de virus utilise à la fois l’ADN et l’ARN comme matériel génétique, mais à des étapes différentes de leur cycle. Les virus peuvent être classés selon la nature de l’acide nucléique présent dans le virion et encore subdivisés selon que l’acide nucléique est simple ou double brin, linéaire ou circulaire (voir figure 9.1). Malgré les différentes structures de leurs génomes, les virus suivent le dogme central de la biologie moléculaire (voir section 7.1) : l’information génétique passe de l’acide nucléique à la protéine. De plus, tous les virus utilisent la machinerie traductionnelle de la cellule, donc quelle que soit la structure du génome viral, un ARN messager (ARNm) doit pouvoir être traduit par les ribosomes de l’hôte.

Les hôtes viraux et la taxinomie En plus de leur classement relatif au génome, les virus sont classés selon l’hôte infecté. Ainsi, il y a des virus d’animaux, des virus de végétaux et des virus bactériens. Les virus bactériens, aussi appelés bactériophages (ou phages en abrégé ; du grec phagein, signifiant « manger »), ont été très étudiés comme systèmes modèles pour la biologie moléculaire et la génétique de la reproduction virale. Les Bacteria et les Archaea sont infectées par des bactériophages ou des virus spécifiques. En effet, beaucoup des concepts de base de la virologie ont été établis avec les bactériophages et ensuite appliqués aux virus des organismes supérieurs. Du fait de leur importance médicale, les virus animaux ont aussi été intensivement étudiés. Les virus de plantes, bien que d’une importance capitale dans l’agriculture moderne, ont été les moins étudiés. Il existe un système formel de classification virale qui groupe les virus en taxa, comme les ordres, les familles, et parfois les genres et espèces, comme cela a été fait pour les procaryotes (voir section 11.10). Le taxon famille est particulièrement utilisé. Les membres d’une famille de virus ont tous une morphologie, une structure génomique et/ou une stratégie de réplication semblables. Les familles de virus ont un nom qui inclut le suffixe -viridae (comme Poxviridae) (voir chapitre 16).

Classes de virus

En quoi un virus diffère-t-il d’un plasmide ?

•

En quoi un virion diffère-t-il d’une cellule ?

•

Qu’est-ce qu’un bactériophage ?

m n9.2 Nature du virion Il y a de nombreuses tailles et morphologies de virions. Ceux-ci sont plus petits que les cellules procaryotiques, leurs tailles allant de 0,02 à 0,3 µm (20 à 300 nm). L’unité commune de mesure pour les virus est le nanomètre, qui est le millième d’un micromètre. Le virus smallpox, un des plus grands, mesure environ 200 nm de diamètre (à peu près la taille des plus petites cellules bactériennes). Le Poliovirus, un des plus petits, mesure 28 nm de diamètre (environ la taille d’un ribosome). Les génomes viraux sont plus petits que ceux de la plupart des cellules. La plupart des génomes bactériens ont une longueur comprise entre 1 000 et 5 000 kpb d’ADN ; les plus petits connus ont une longueur d’environ 500 kpb. (À noter, les Bacteria avec les plus petits génomes sont, comme les virus, des parasites qui se répliquent dans d’autres cellules ; voir sections 12.13, 12.27 et 13.11.) Jusqu’à la découverte du Mimivirus dont le génome comporte 1,2 Mpb, le plus grand génome viral était celui du bactériophage G, mesurant 670 kpb. Ce virus, qui infecte Bacillus megaterium, est l’un des rares dont le génome est plus grand que certains génomes cellulaires. Les tailles des génomes viraux les plus typiques sont listées dans le tableau 9.1. Certains virus ont des génomes si petits qu’ils contiennent moins de cinq gènes. Tandis que celui de certains virus, comme les Reovirus, est segmenté en plus d’une molécule.

La structure des virus Les structures des virus sont assez diverses, variant en taille, morphologie et en composition chimique. L’acide nucléique du virion est toujours à l’intérieur de la particule, entouré par une structure protéique appelée capside. La capside est

Virus à ADN

Génome dans le virion ADN sb

•

ARN ↔ ADN virus

Virus à ARN

ADN db

ARN sb

ARN db

ARN sb (Rétrovirus)

ADN db (Hepadnavirus)

FIGURE 9.1 Génomes viraux. Le génome des virus est composé soit d’ADN, soit d’ARN ; certains utilisent à la fois l’ADN et l’ARN comme matériel génétique, mais à des étapes différentes de leur cycle de réplication. Cependant, quel que soit le virus, un seul type d’acide nucléique est retrouvé dans le virion. Ce peut être du simple brin (sb), du double brin (db), ou du partiellement double brin dans le cas des Hepadnavirus. Certains génomes viraux sont circulaires, mais la plupart sont linéaires.



234 Chapitre 9


TABLEAU 9.1

QUELQUES TYPES DE GÉNOMES VIRAUX Génomes viraux Hôtes

Type d’acide nucléique dans le virion

H-1 parvovirus

Animaux

φX174

Structure

Nombre de molécules

ADN simple brin

Linéaire

1

5 176 bases

Bacteria

ADN simple brin

Circulaire

1

5 386 bases

Virus simien 40 (SV40)

Animaux

ADN double brin

Circulaire

1

5 243 paires de bases

Poliovirus

Animaux

ARN simple brin

Linéaire

1

7 433 bases

Virus de la mosaïque du chou-fleur

Plantes

ADN double brin

Circulaire

1


Virus de la mosaïque du niébé

Plantes

ARN simple brin

Linéaire

2 différentes

9 370 bases (total)

Reovirus type 3

Animaux

ARN double brin

Linéaire

10 différentes

23 549 paires de bases (total)

Bactériophage lambda

Bacteria

ADN double brin

Linéaire

1

48 514 paires de basesb

Herpes simplex virus type I

Animaux

ADN double brin

Linéaire

1


Bactériophage T4

Bacteria

ADN double brin

Linéaire

1


Cytomegalovirus humain

Animaux

ADN double brin

Linéaire

1


Virus

Taillea

a

Les tailles des génomes viraux choisis pour ce tableau sont connues avec exactitude car ils ont été séquencés. Cependant, seul un isolat particulier ou une souche du virus a été séquencé. Par conséquent, la séquence et le nombre exact de bases pour d’autres isolats peuvent être légèrement différents. Il ne s’agit pas ici de considérer les plus grands et les plus petits virus connus, mais de donner un échantillonnage assez représentatif des tailles et des structures des génomes viraux contenant de l’ARN ou de l’ADN, simple ou double brin. b Ce total inclut les extrémités simple brin de douze nucléotides de la forme linéaire de l’ADN (voir section 9.11).

composée de molécules protéiques individuelles, appelées sous-unités structurales, qui sont arrangées selon un motif précis et répété autour de l’acide nucléique (voir figure 9.2). La petite taille des génomes de la plupart des virus restreint le nombre de protéines virales différentes. Quelques virus ont un seul type de protéine au niveau de la capside, mais la plupart ont plusieurs sous-unités structurales chimiquement distinctes qui sont associées dans un ordre précis pour former de plus grands ensembles que sont les capsomères (voir figures 9.2 et 9.3). Le capsomère est la plus petite unité morphologique qui peut être observée au microscope électronique (voir figures 9.2 et 9.4). L’information pour un bon repliement et l’agrégation des protéines en capsomères est contenue dans la structure des protéines elles-mêmes, et le processus de l’assemblage du virion est appelé auto-assemblage. Un virion peut avoir un grand nombre de capsomères. Le complexe formé par l’acide nucléique et les protéines est appelé la nucléocapside virale. Dans le virion, il y a souvent une ou plusieurs enzymes virales. Ces enzymes jouent un rôle durant l’infection et la réplication. Certains virus sont nus tandis que d’autres, dits virus enveloppés, ont une nucléocapside entourée d’une membrane lipidique (voir figure 9.3). Des protéines virales sont associées à ces membranes et jouent un rôle lors de l’attachement du virus ou de sa sortie de l’hôte.

La symétrie des virus Les nucléocapsides des virus sont construites selon une symétrie précise. La symétrie est la manière dont les capsomères sont arrangés au niveau de la capside virale. Quand une structure symétrique tourne selon un axe, la même forme est vue à nouveau après un certain degré de rotation. Deux types de

symétries sont reconnus chez les virus, qui correspondent aux deux morphologies de base, le cylindre et la sphère. Les virus en forme de cylindre ont une symétrie hélicoïdale, les virus sphériques ont une symétrie icosaédrique. Dans tous les cas, la structure caractéristique du virus est déterminée par la structure des sous-unités protéiques qui le composent. Un virus type avec une symétrie hélicoïdale est le virus de la mosaïque du tabac (VMT) [voir figure 9.2]. C’est un virus à ARN dont les 2 130 capsomères sont arrangés en hélice. Les dimensions du virus VMT sont 18 × 300 nm. La longueur des virus à symétrie hélicoïdale est déterminée par la longueur de l’acide nucléique, et le diamètre est fonction de la taille, de la forme des sous-unités protéiques et des interactions entre celles-ci. Un icosaèdre est une structure symétrique avec 20 faces et apparaît sphérique. La symétrie icosaédrique est l’arrangement optimal des sous-unités dans une coque fermée car elle utilise le plus petit nombre d’unités. L’arrangement le plus simple des capsomères est de trois par face, pour un total de 60 unités par virion. La plupart des virus ont plus d’ADN qu’il n’en peut être empaqueté dans une coque faite de 60 unités. L’autre structure possible qui permet un empaquetage fermé contient 180 unités, et de nombreux virus ont adopté cette conformation. D’autres configurations communes contiennent 240 unités et 420 unités. La figure 9.4a montre un icosaèdre. La figure 9.4b montre une image obtenue au microscope électronique d’un virus icosaédrique type, le Papillomavirus humain, qui contient 360 unités. La figure 9.4c montre un modèle obtenu à l’ordinateur du même virus.

Les virus enveloppés Beaucoup de virus ont des structures membranaires entourant la nucléocapside (voir figure 9.5a). Ils sont dits enveloppés. La



9.2 Nature du virion 235 18 nm

Sous-unités protéiques (capsomères) ARN viral

membranes de l’hôte, mais les protéines sont codées par les virus. La symétrie des virus enveloppés est exprimée non en termes de virion dans son ensemble, mais en termes d’une nucléocapside entourée d’une enveloppe. Quelle est la fonction de l’enveloppe dans une particule virale ? Ceci sera détaillé plus tard, mais notez déjà que l’enveloppe est le composant structural de la particule virale qui entre le premier en contact avec la cellule. La spécificité de l’infection virale et certains aspects de la pénétration du virus sont contrôlés en partie par les caractéristiques des enveloppes virales.

J. T. Finch

Les virus complexes

(a)

(b)

FIGURE 9.2 Un exemple de la structure de l’acide nucléique viral et des sous-unités capsidiques du virus de la mosaïque du tabac. (a) Image au microscope électronique d’une portion de la particule virale. (b) Assemblage du virion de la mosaïque du tabac. La particule présente une structure tubulaire dans laquelle l’ARN entouré de sous-unités capsidiques adopte une configuration hélicoïdale. Le Néerlandais, Martinus Beijerinck, père de la technique de la culture d’enrichissement (section 1.7), fut le découvreur du virus de la mosaïque du tabac. Il s’est intéressé à la maladie elle-même et a conclu clairement que l’agent infectieux était plus petit qu’une bactérie.

plupart de ces virus infectent les animaux (par exemple, Influenzavirus), mais quelques virus enveloppés de plantes et de bactéries sont connus. L’enveloppe virale consiste en une bicouche lipidique où sont ancrées des protéines, habituellement des glycoprotéines. Les lipides de la membrane proviennent des

Capsomères

Nucléocapside Enveloppe Capside Acide nucléique

Acide nucléique

Capside (composée de capsomères) Virus nu

Virus enveloppé

FIGURE 9.3 Comparaison d’un virus nu et d’un virus enveloppé. De nombreux virus sont enveloppés, car ils sont recouverts par la membrane cytoplasmique de l’hôte lorsqu’ils sont libérés.

Certains virus sont parfois plus complexes que ce qui a été vu jusqu’ici, car ils sont composés de plusieurs parties, chacune avec des morphologies et des symétries différentes. Les virus les plus complexes en termes de structure sont ceux qui infectent les bactéries car ils possèdent non seulement des têtes icosaédriques mais en plus des queues hélicoïdales. Pour certains bactériophages comme le phage T4 d’Escherichia coli (voir figure 9.5b), la queue elle-même a une structure complexe. La queue complète du phage T4 est composée d’environ 20 protéines différentes, et la tête de quelques autres en plus. Dans ce type de virus, l’assemblage est également complexe. Par exemple, pour T4, la queue est formée en sous-ensemble, qui sera ensuite attaché à la tête contenant l’ADN. Finalement, les fibres caudales formées à partir d’une autre protéine sont ajoutées pour constituer le virion mature et infectieux.

Les enzymes dans les virions Les virions n’effectuent pas de processus métaboliques. Hors d’une cellule hôte, un virion est métaboliquement inerte. Néanmoins, certains virions contiennent des enzymes qui jouent des rôles importants dans l’infection. Certaines d’entre elles sont nécessaires pour les événements précoces lors de l’infection. Par exemple, certains bactériophages contiennent du lysozyme (voir section 4.8). Cette enzyme introduit un petit pore dans la paroi bactérienne, ceci permet l’introduction de l’ADN viral. Le lysozyme est aussi produit en grande quantité lors des étapes tardives de l’infection, causant la lyse de la cellule hôte et la libération des virions. Certains virus contiennent leurs propres polymérases. Par exemple, les rétrovirus sont des virus à ARN qui se répliquent via des intermédiaires à ADN. Ces virus possèdent une ADN polymérase ARN dépendante, appelée transcriptase inverse, qui transcrit l’ARN pour former un intermédiaire à ADN. D’autres virus, dont le génome est à ARN, ont leur propre ARN polymérase. Ces enzymes virales sont essentielles, car les cellules ne font pas d’ADN ou d’ARN à partir d’une matrice à ARN (voir sections 7.5 et 7.10). D’autres virus contiennent des enzymes nécessaires lors de leur libération de la cellule hôte. Par exemple, certains virus animaux contiennent des protéines de surface appelées neuraminidases, enzymes qui clivent les ponts glycosidiques au niveau des glycoprotéines et des glycolipides présents dans le tissu connectif des cellules animales, libérant ainsi les virions. La plupart des virus n’ont pas leurs propres enzymes, mais certains en possèdent pour une raison vraiment essentielle : la cellule ne pourrait pas produire de virions en absence de ces enzymes additionnelles.



Tim Baker et Norm Olson


W. F. Noyes

236 Chapitre 9

(a)

(b)

(c)

FIGURE 9.4 Symétrie icosaédrique. (a) Un modèle d’icosaèdre. (b) Image au microscope électronique du Papillomavirus humain, un virus à symétrie icosaédrique. Les particules ont un diamètre d’environ 55 nm. (c) Reconstruction tridimensionnelle du Papillomavirus humain calculée à partir d’images obtenues en cryomicroscopie.

Contrôlez vos acquis Dans les virus nus, seuls sont présents les acides nucléiques et les protéines, avec l’acide nucléique à l’intérieur ; l’ensemble est appelé nucléocapside. Les virus enveloppés ont une ou plusieurs couches lipoprotéiques entourant la nucléocapside. La nucléocapside est arrangée d’une manière symétrique, avec un nombre et un arrangement précis de sous-unités structurales entourant l’acide nucléique viral. Alors que les virus sont métaboliquement inertes, chez certains virus, une ou plusieurs enzymes clés sont présentes dans le virion. •

Quelle est la différence entre un virus nu et un virus enveloppé ?

•

Quels types d’enzymes peut-on trouver chez des virus spécifiques ?

II

CROISSANCE ET TITRATION

m n9.3 Les hôtes des virus Parce que les virus se répliquent seulement à l’intérieur de cellules vivantes, la multiplication des virus nécessite un hôte approprié. Des trois types d’hôtes (procaryotes, plantes, et animaux), les virus infectant les procaryotes sont les plus faciles à obtenir en laboratoire. Pour l’étude des bactériophages, des cultures pures sont utilisées en milieu liquide ou solide (agar). Il est plus difficile de travailler sur des virus de plantes car leur étude nécessite parfois la plante entière. C’est un problème car les plantes croissent bien plus lentement que les bactéries, et l’infection par les virus nécessite souvent qu’il y ait une brèche au niveau de la paroi de la cellule de la plante. Toutefois, la plupart des virus animaux et beaucoup de virus de plantes peuvent être cultivés sur des tissus ou des cultures cellulaires ;

l’utilisation de ces cultures a énormément facilité la recherche sur ces virus.

Les cultures cellulaires Une culture cellulaire est obtenue en permettant la croissance de cellules prélevées sur un organe d’un animal d’expérimentation. Ces cultures cellulaires sont réalisées en enlevant aseptiquement des morceaux de tissus, en dissociant les cellules par un traitement avec une enzyme qui casse le ciment intercellulaire, et en versant la suspension sur une surface plate, comme un flacon de culture ou une boîte de Petri. La couche peu épaisse de cellules adhérant au verre ou au plastique, appelée monocouche, est recouverte avec un milieu de culture approprié et incubée à la température adéquate (voir figure 9.7). Les milieux de culture utilisés pour les cultures cellulaires sont généralement assez complexes, étant composés d’un certain nombre d’acides aminés, de vitamines, de sels, de glucose, et d’un tampon bicarbonate. Pour obtenir une croissance optimale, l’addition d’une petite quantité d’un sérum à base de sang est souvent nécessaire, et plusieurs antibiotiques sont ajoutés pour prévenir d’une contamination bactérienne. Certaines cultures préparées de cette façon peuvent être repiquées et se développer indéfiniment comme des lignées cellulaires permanentes. Les lignées cellulaires sont utiles pour la recherche sur les virus, car le matériel est continuellement disponible. Dans d’autres cas, une croissance indéfinie n’est pas possible, mais la culture peut être maintenue pendant plusieurs jours. De telles cultures, nommées cultures cellulaires primaires, peuvent aussi être utiles pour la culture des virus, bien que de nouvelles cultures doivent être préparées à partir de sources fraîches de temps en temps : procédé coûteux et long. Dans certains cas, les lignées cellulaires primaires ou permanentes ne peuvent pas être obtenues, mais des organes entiers ou des morceaux d’organes peuvent multiplier les virus avec succès. Ces cultures d’organes sont utiles dans la recherche de virus car elles permettent la croissance des virus dans des conditions plus ou moins contrôlées de laboratoire.



9.4 Titration de virus 237

P. W. Choppin et W. Stoeckenius

m n9.4 Titration de virus

(a)

En virologie, il est souvent nécessaire de quantifier le nombre de virus dans une suspension. Il est possible de les compter avec un microscope électronique (voir figure 9.4), mais en général les virus sont plus facilement quantifiés en mesurant leurs effets sur l’hôte. Dans ce contexte une unité infectieuse virale est la plus petite unité qui cause un effet détectable sur un hôte sensible. Une seule particule virale peut être suffisante, mais le plus souvent un inoculum plus important est nécessaire. En déterminant le nombre d’unités infectieuses par volume de liquide, une mesure de la quantité de virus, appelée titre, peut être obtenue (voir figure 9.6).

Les plages de lyse Tête

Collier

Queue Crochets de la queue

Fibres de la queue

M. Wurtz

Plaque basale

(b) FIGURE 9.5 Virus animaux et bactériens observés en microscopie électronique. (a) Influenzavirus, un virus enveloppé. Les particules mesurent environ 80 nm de diamètre, mais n’ont pas une forme définie (section 16.8 et figure 16.15). L’Influenzavirus a un génome à ARN simple brin. (b) Le bactériophage T4 d’Escherichia coli. Les composants de la queue sont impliqués dans l’attachement du virion à l’hôte et dans l’injection de l’acide nucléique (voir figure 9.10). La tête mesure environ 85 nm de diamètre. Le phage T4 a un génome à ADN double brin.

Contrôlez vos acquis Les virus ne se répliquent que dans certains types de cellules ou dans des organismes entiers. Les bactériophages ont prouvé leur utilité en tant que systèmes modèles car les hôtes cellulaires sont faciles à obtenir en culture et à manipuler. De nombreux virus animaux et de plantes peuvent se multiplier dans des cultures cellulaires. •

En virologie, qu’est-ce qu’un hôte ?

•

Pourquoi est-il utile d’utiliser une culture cellulaire pour la recherche virale ?

Quand un virus initie une infection sur une couche ou un tapis de cellules hôtes, une zone de lyse, c’est-à-dire une zone claire, peut se former. Cette zone claire est appelée une plage, et il est admis que chaque plage provient des événements de réplication qui ont débuté à partir d’une seule particule virale. Les plages sont essentiellement « des fenêtres » dans le tapis de croissance cellulaire confluente. Avec les bactériophages, les plages peuvent être obtenues en mélangeant les particules virales avec l’hôte bactérien dans une surcouche d’agar qui sera étalée à la surface d’un milieu gélosé (voir figure 9.6a). Durant l’incubation de la culture, les bactéries se développent et forment une couche opaque visible à l’œil nu. Toutefois, partout où l’infection virale a été initiée, la lyse des cellules se produit, formant des plages (voir figure 9.6b). En comptant le nombre d’unités formant des plages, il est possible de calculer le nombre d’unités virales infectieuses présentes dans l’échantillon initial. Ce procédé permet aussi de purifier les virus. En effet, si une plage provient d’un seul virus, tous les virus de cette plage sont génétiquement identiques. Les virus de cette plage peuvent être prélevés et inoculés dans une culture bactérienne fraîche pour établir une lignée virale pure. Les plages peuvent être obtenues pour les virus animaux en utilisant des cultures cellulaires animales comme hôtes. Une monocouche de cellules animales est préparée sur une boîte ou une bouteille à fond plat, et recouverte par la suspension virale. Les plages sont révélées par des zones où les cellules animales sont détruites, et le titre viral peut être estimé du nombre de plages produites (voir figure 9.7).

L’efficacité des plages de lyse Un concept important dans la virologie quantitative est l’efficacité des plages. Dans tous les systèmes viraux, les unités formant des plages sont toujours sous-estimées par rapport aux comptages effectués avec un microscope électronique à partir d’une suspension virale. L’efficacité avec laquelle les virions infectent les cellules hôtes est rarement de 100 % et est souvent bien moindre encore. Ceci ne signifie pas toujours que les virions qui n’ont pas infecté les cellules hôtes sont inactifs. En effet, cela peut simplement venir du fait que les conditions utilisées ne sont pas optimales pour obtenir une infection. Avec les bactériophages, l’efficacité des plages de



238 Chapitre 9


1. Versez le mélange sur une gélose nutritive

Mélange contenant de l’agar fondu, les cellules bactériennes et une suspension diluée de phages

Gélose nutritive

Plages de lyse

Double couche agar/ gélose nutritive

Plages de phages

Jack Parker

2. Incubez Tapis de cellules hôtes

(a)

(b)

FIGURE 9.6 Titration d’un bactériophage par l’analyse de plages de lyse sur milieu gélosé. (a) Une dilution d’une suspension virale est mélangée dans une petite quantité d’agar fondu avec la bactérie hôte sensible ; le mélange est ensuite versé à la surface d’un milieu gélosé approprié. La bactérie hôte, uniformément répartie sur la couche supérieure, commence à croître et forme un tapis opaque après une nuit d’incubation. Un virion qui s’attache à une cellule et s’y reproduit peut conduire à la lyse de cette dernière ; les virions libérés peuvent infecter les cellules adjacentes, s’y multiplier à leur tour, formant ainsi une plage de lyse dont la taille dépend du virus, de l’hôte et des conditions de culture. (b) Photographie d’une boîte montrant les plages formées par un bactériophage sur un tapis bactérien. Les plages montrées mesurent de 1 à 2 mm de diamètre.

lyse est souvent de 50 % ou plus ; avec les virus animaux, c’est de l’ordre de 0,1 à 1 %. Notre connaissance sur l’efficacité des plages de lyse est utile car cela permet de jauger quelle densité doit avoir une suspension virale (c’est-à-dire son titre) pour obtenir un certain nombre de plages.

Les méthodes sur un animal entier Certains virus ne causent pas d’effets visibles sur les cultures cellulaires mais entraînent la mort sur l’animal « entier ». Dans certains cas, la quantification peut être

faite seulement par titration sur des animaux infectés. La procédure générale est de faire une série de dilutions au dixième de l’échantillon inconnu (voir section 6.5), et d’injecter des échantillons de chaque dilution à différents animaux sensibles. Après une période d’incubation, la fraction d’animaux morts et vivants obtenue à chaque dilution est classée et une dilution limite est calculée. C’est la dilution à laquelle, par exemple, la moitié des animaux injectés meurent (la DL50, voir section 21.8). Même si ces méthodes basées sur les séries de dilution sont plus incommodes et bien moins précises que les méthodes basées sur les cultures cellulaires, elles sont essentielles pour l’étude de certains types de virus.

Monocouche confluente d’une culture cellulaire Plages virales FIGURE 9.7 Culture cellulaire en monocouches sur boîte de Petri. Notez la présence de plages dues à la lyse des cellules induite par les virus. Une culture cellulaire observée en microscopie électronique est également présentée.

I. D. Brock

Paul Kaplan

Contrôlez vos acquis Même s’il faut simplement un seul virion pour initier un cycle infectieux, tous les virions ne sont pas infectieux de façon équivalente. Une des façons les plus précises pour mesurer l’infectiosité virale est la méthode des plages de lyse. Les plages sont des zones claires qui se développent sur des tapis d’hôtes cellulaires. Théoriquement, chaque plage est due à l’infection par une seule particule virale. La plage virale est équivalente à la colonie bactérienne. •

Donnez une définition de l’efficacité de plages.

•

Qu’est-ce qu’une unité formant une plage ?



9.5 Caractéristiques générales de la réplication virale 239

III

Virion

RÉPLICATION VIRALE

générales m n9.5 Caractéristiques de la réplication virale Pour qu’un virus puisse se répliquer, il doit conduire un hôte cellulaire vivant à synthétiser les composants essentiels nécessaires à la production d’autres virions. Ces composants doivent alors être assemblés en de nouveaux virions qui vont sortir de la cellule pour en infecter d’autres. Les différentes phases de ce processus de réplication peuvent être classées en cinq étapes (voir figure 9.8).

ADN Cellule (hôte)

La capside reste à l’extérieur 2. Pénétration (injection)

Pénétration de l’ADN viral

3. Synthèse de l’acide nucléique et des protéines

1. L’attachement (adsorption) du virion à une cellule hôte sensible. 2. La pénétration (injection) du virion ou de son acide nucléique dans la cellule.

4. Assemblage et encapsidation

3. La synthèse de l’acide nucléique et des protéines par le métabolisme cellulaire redirigé par le virus précocement lors de l’infection. Plus tardivement dans l’infection, les protéines structurales, qui sont des sous-unités de la capside virale, sont synthétisées.

5. Libération (lyse)

4. L’assemblage des capsomères (et des composants membranaires pour les virus enveloppés) et le remplissage des nouveaux virions par l’acide nucléique.

Ces étapes dans la réplication virale commencent quand les virions infectent les cellules (voir figure 9.9). Dans les premières minutes après l’infection, le virus passe par une phase d’éclipse. Durant cette période, l’acide nucléique viral est séparé des protéines de la capside, et de ce fait, si la cellule infectée éclate à ce stade, le virion n’existe plus en tant qu’entité infectieuse. La maturation commence quand l’acide nucléique nouvellement synthétisé est empaqueté dans les protéines de la capside. Durant la phase de maturation, le titre des virions actifs à l’intérieur de la cellule augmente énormément. Toutefois, comme les virions nouvellement synthétisés ne sont pas encore apparus à l’extérieur de la cellule, les périodes d’éclipse et de maturation sont aussi appelées période de latence. À la fin de la maturation, il y a libération des virions matures, soit par lyse cellulaire, soit par bourgeonnement ou excrétion, selon le virus. Le nombre de virions libérés, appelé le rendement de lyse (burst size), varie selon le virus et l’hôte cellulaire et peut aller de quelques virions à quelques milliers. La durée du cycle de réplication virale varie de 20 à 60 min pour beaucoup de bactériophages, de 8 à 40 h pour la plupart des virus animaux. La libération se faisant plus ou moins de façon simultanée, les virions suivent une courbe dite du cycle unique (voir figure 9.9). Dans les deux sections suivantes, quelques étapes clés du cycle de multiplication virale seront vues plus en détail.

Virions FIGURE 9.9 Le cycle de réplication d’un bactériophage. Les principales étapes de la réplication du virus sont indiquées.

Éclipse Nombre de virus (unités formant plages)

5. Libération des virions matures de la cellule.

1. Attachement (adsorption)

Maturation

Protéines Enzymes Acide de la précoces nucléique capside

Addition de virus

Assemblage et libération

Période de latence

Temps FIGURE 9.8 Réplication virale : la courbe de cycle unique. Ce graphique montre les résultats d’un cycle unique de réplication virale dans une population cellulaire. Après l’adsorption, débute la phase d’éclipse pendant laquelle le virus perd son infectiosité car son génome est décapsidé. Durant la phase de latence, il y a réplication de l’acide nucléique viral et synthèse des protéines. La maturation correspond à l’assemblage de l’acide nucléique et des protéines dans des virus matures. À cette étape, si la cellule éclate, des virus actifs peuvent être détectés. Enfin, arrive la libération avec ou sans lyse cellulaire. La durée des étapes de ce cycle unique varie suivant le virus et l’hôte. Comparez cette vue générale avec la figure 9.15 montrant la réplication spécifique du bactériophage T4.



240 Chapitre 9


Contrôlez vos acquis Le cycle viral peut être divisé en cinq étapes : attachement (adsorption), pénétration (injection), synthèse de l’acide nucléique et des protéines, assemblage et empaquetage, libération du virion. •

Qu’est-ce que l’empaquetage dans les virions ?

•

À quoi se rapporte le terme éclipse ?

•

Quels événements se produisent au cours de la période de latence lors de la réplication virale ?

virale : attachement m n9.6 Multiplication et pénétration Dans cette section, l’attachement et la pénétration du virus seront étudiés de même que le mécanisme par lequel certaines bactéries réagissent à la pénétration d’un bactériophage à ADN.

L’attachement Le spectre d’hôtes du virus implique, au moins partiellement, l’attachement. Le virus lui-même (qu’il soit nu ou enveloppé) a une ou plusieurs protéines externes qui interagissent avec des composants cellulaires spécifiques de surface appelés récepteurs. Les récepteurs de la cellule hôte sont des composants de surface normaux, comme des protéines, des carbohydrates, des glycoprotéines, des lipides, ou des complexes de ces derniers auxquels les virus s’attachent. Par exemple, le récepteur du bactériophage T1 est une protéine impliquée dans l’entrée du fer et celui du bactériophage lambda participe normalement à l’entrée de maltose. Les récepteurs des virus animaux peuvent être, entre autres, des macromolécules impliquées dans le contact cellulaire ou des protéines de surface impliquées dans la réponse immunitaire. En l’absence de récepteur spécifique, le virus ne peut pas s’adsorber et donc ne peut être infectieux. De plus, si le site récepteur est altéré, par exemple par mutation, l’hôte devient résistant à l’infection virale. Néanmoins, des mutations au niveau des virus peuvent se produire leur permettant de s’adsorber aux hôtes résistants. Enfin, certains virus animaux peuvent utiliser plus d’un récepteur, de ce fait la perte d’un récepteur n’empêche pas nécessairement l’attachement.

La pénétration L’attachement d’un virus à la cellule conduit à des changements de conformation du virus et/ou de la cellule pour permettre la pénétration. Pour se répliquer, le virus doit faire pénétrer son génome dans une cellule (voir figure 9.8). La réplication de certains virus demande aussi la pénétration de quelques protéines spécifiques (voir section 9.2). Il est important de noter que l’attachement et même la pénétration dans une cellule sensible ne conduiront pas à la multiplication virale si l’information portée par le génome viral ne peut être lue. Une cellule qui permet la multiplication d’un virus est dite permissive pour ce virus. Les virus ont différentes stratégies pour la pénétration. Pour certains virus animaux, le virus enveloppé est décapsidé au

niveau de la membrane cellulaire. Dans de nombreux autres cas, le virus entier entre dans la cellule. Dans ce cas, il doit ensuite être décapsidé (partiellement ou totalement) pour libérer le génome et permettre la réplication. Enfin, cette décapsidation peut se faire dans le cytoplasme ou au niveau de la membrane nucléaire.

L’attachement et la pénétration des bactériophages à queue Les cellules avec des parois cellulaires, comme la plupart des bactéries, sont infectées différemment des cellules animales qui, elles, n’en ont pas. Les mécanismes de pénétration les plus complexes sont retrouvés chez les bactériophages. Le bactériophage T4, qui infecte Escherichia coli, en est un bon exemple. La structure du bactériophage T4 est détaillée figure 9.5b. Le virion a une tête, dans laquelle l’ADN viral double brin et linéaire est replié, et une queue longue et complexe, à l’extrémité de laquelle se trouvent des fibres caudales et des crochets. Pendant l’attachement, les virions se fixent d’abord aux cellules par les fibres caudales (voir figure 9.10). Les extrémités des fibres interagissent spécifiquement avec les polysaccharides qui composent la couche externe de la paroi des bactéries Gram négatif (voir section 4.8). Ces fibres caudales alors se rétractent et le centre de la queue entre en contact avec la paroi cellulaire de la bactérie via une série de fins crochets. L’activité d’une enzyme de type lysozyme conduit à la formation d’un petit pore dans le peptidoglycane. La gaine de la queue se contracte, et l’ADN viral passe dans le cytoplasme au travers d’un pore formé au niveau du bout de la queue du phage ; la majorité des protéines de la capside restent à l’extérieur (voir figure 9.10).

(a)

(b)

(c)

Fibres caudales

Crochets de la queue Membrane externe Peptidoglycane Membrane cytoplasmique

Génome du bactériophage T4 FIGURE 9.10 Attachement du bactériophage T4 à la paroi d’Escherichia coli et injection de l’ADN. (a) Attachement d’un virion par ses longues fibres caudales aux polysaccharides de la paroi cellulaire. (b) Contact des crochets de la queue avec la paroi. (c) Contraction de la gaine de la queue et injection du génome de T4. Voir la section 4.9 pour une description détaillée de la paroi des bactéries Gram négatif.



9.7 Multiplication virale : production de l’acide nucléique et des protéines 241

La restriction virale et la modification par l’hôte Les animaux peuvent souvent éliminer les virus par différents mécanismes immunitaires de défense, avant que l’infection ne se généralise, ou même parfois avant la pénétration du virus dans les cellules cibles. Ces mécanismes seront discutés dans les chapitres 21 et 22. Les procaryotes n’ont pas ce type de défense. Néanmoins, les procaryotes ont des systèmes spécifiques qui peuvent détruire l’ADN viral double brin après qu’il ait été injecté. Cette destruction est réalisée par les endonucléases de restriction de l’hôte (voir section 7.7), ces enzymes coupent l’ADN viral à un ou plusieurs endroits, empêchant ainsi sa réplication. Ce phénomène est appelé restriction et fait partie d’un mécanisme général de l’hôte pour prévenir l’invasion d’un acide nucléique étranger. Pour qu’un tel système soit mis en place, l’hôte doit pouvoir protéger son propre ADN. Ceci est accompli par une modification spécifique de son ADN aux sites cibles des enzymes de restriction (voir section 7.7). Les enzymes de restriction sont spécifiques de l’ADN double brin, et de ce fait les virus à ADN simple brin et tous les virus à ARN échappent à ces systèmes de restriction. Même si le système de restriction de l’hôte confère une protection significative, certains virus à ADN ont surmonté les mécanismes de restriction de l’hôte en modifiant leurs propres acides nucléiques. Deux types de modifications chimiques de l’ADN viral sont reconnus : la glycosylation et la méthylation. Par exemple, les bactériophages T-pairs (T2, T4 et T6) ont leurs ADN glycosylés à différents degrés, ce qui prévient l’attaque par une endonucléase. De nombreux autres acides nucléiques viraux sont modifiés par méthylation. La modification de l’acide nucléique viral se produit après la réplication du génome par des protéines codées par le virus. D’autres virus, comme les bactériophages T3 et T7, évitent la restriction en synthétisant des protéines qui inhibent les systèmes de restriction de l’hôte. Pour en tenir compte, certains hôtes ont de multiples systèmes de restriction et de méthylation qui permettent ainsi d’éviter une infection par des virus qui ne peuvent en déjouer qu’un seul. Les hôtes contiennent aussi d’autres ADN méthylases en plus de celles impliquées dans leur protection contre leurs propres enzymes de restriction. Certaines de ces méthylases peuvent être impliquées dans la réparation de l’ADN ou dans la régulation des gènes, mais aussi dans la protection de l’hôte contre des endonucléases étrangères. Ceci parce que certains virus codent des systèmes de restriction destinés à détruire l’ADN de l’hôte. L’évolution a richement alimenté ce jeu du chat et de la souris entre les hôtes procaryotes et leurs virus !

Contrôlez vos acquis L’attachement d’un virus à une cellule hôte est un processus hautement spécifique impliquant des récepteurs complémentaires à la surface de l’hôte sensible et du virus infectieux. La résistance de l’hôte à l’infection par le virus peut impliquer des systèmes de restriction et de modification qui reconnaissent et détruisent l’ADN étranger double brin. •

Comment le processus d’attachement contribue-til à la spécificité hôte-virus ?

•

Pourquoi certains virus doivent-ils être décapsidés après la pénétration alors que d’autres non ?

virale : m n9.7 Multiplication production de l’acide nucléique et des protéines

Après l’infection de l’hôte, le génome viral doit être répliqué et des protéines spécifiques du virus doivent être synthétisées pour permettre sa multiplication. Classiquement, la production de quelques protéines commence très tôt après la pénétration du génome viral dans la cellule. La production de ces protéines nécessite un ARN messager spécifique du virus. Pour certains types de virus à ARN, le génome lui-même est l’ARNm. Néanmoins, pour la plupart des virus, l’ARNm doit d’abord être synthétisé à partir du génome à ADN ou ARN et ensuite le génome peut être répliqué.

La classification de Baltimore et les virus à ADN Le virologiste David Baltimore, lauréat du prix Nobel pour la découverte des rétrovirus et de la transcriptase inverse, a développé une classification des virus basée sur le lien entre le génome viral et l’ARNm. Dans cette classification de Baltimore (voir tableau 9.2), sept classes de virus sont reconnues. Les virus à ADN double brin (db) sont dans la classe I. La production d’ARNm et la réplication du génome viral se déroulent comme pour le génome de l’hôte. Cependant, certains virus utilisent différentes stratégies pour permettre l’expression de l’ARNm viral préférentiellement à celui de l’hôte. Les virus de la classe II sont des virus à ADN simple brin (sb). Avant la production de l’ARNm, un brin d’ADN complémentaire doit être synthétisé, car l’ARN polymérase nécessite une matrice à ADN double brin (voir sections 7.8 et 7.9). Ces virus forment un intermédiaire double brin durant la réplication, et c’est cet intermédiaire qui est utilisé lors de la transcription (voir figure 9.11). La synthèse de l’intermédiaire à ADN db et ensuite la transcription peuvent se faire via les enzymes cellulaires (même si des protéines virales peuvent être impliquées). L’intermédiaire double brin est aussi utilisé pour répliquer le génome ; un brin devient le génome tandis que l’autre est mis à l’écart (voir figure 9.11).

Les virus à ARN positif et à ARN négatif La production d’ARNm et la réplication du génome sont différentes pour les virus à ARN (Classes III-VI). Avant de présenter ces virus, un point sur la nomenclature relative à l’orientation du brin de l’acide nucléique est nécessaire. L’ARNm est complémentaire en séquence de bases du brin matrice de l’ADN. Par convention en virologie, l’ARNm est dit être dans la configuration positive (+). Son complémentaire est dit être dans la configuration négative (–). Cette nomenclature est aussi utilisée pour décrire la configuration du génome des virus simple brin, que le génome soit à ARN ou à ADN (voir figure 9.11). Par exemple, un virus qui a un génome à ARN simple brin avec la même orientation que son ARNm est dit virus de polarité positive ou à ARN positif. Un



242 Chapitre 9


TABLEAU 9.2

CLASSIFICATION DES VIRUS SELON BALTIMORE Exemples Description du génome et stratégie de réplication

Classe

Bactériophages

Virus animaux

I

Génome à ADN double brin

Lambda, T4

Virus de l’herpès, poxvirus

II

Génome à ADN simple brin

φX174

Virus de l’anémie du poulet

III

Génome à ARN double brin

φ6

Reovirus (voir section 16.9)

IV

Génome à ARN simple brin de polarité positive

MS2

Poliovirus

V

Génome à ARN simple brin de polarité négative

Virus de la grippe, virus de la rage

VI

Génome à ARN simple brin se répliquant avec un intermédiaire à ADN

Rétrovirus

VII

Génome à ADN double brin se répliquant avec un intermédiaire à ARN

Virus de l’hépatite B

virus dont le génome à ARN simple brin est complémentaire de son ARNm est dit virus de polarité négative ou à ARN négatif. Comment ces virus se répliquent-ils ? Les ARN polymérases cellulaires ne catalysent pas la formation d’ARN à partir d’une matrice à ARN, mais utilisent une matrice à ADN. Ainsi, les virus à ARN, qu’ils soient positifs, négatifs ou double brin, nécessitent une ARN polymérase ARN dépendante. Le cas le plus simple est celui des virus à ARN simple brin positif (Classe IV) pour lesquels le génome viral est en configuration positive et donc sert directement d’ARNm (voir figure 9.11). En plus d’autres protéines requises, cet ARNm code une ARN polymérase ARN dépendante

Virus à ADN db (+) Classe I Classe VII

Virus à ADN sb (+) Classe II

Virus à ARN db ( + ) Classe III

spécifique du virus (aussi appelée ARN réplicase). Une fois synthétisée, cette polymérase fabrique en premier les brins négatifs complémentaires de l’ARN, puis les utilise comme matrice pour faire davantage de brins positifs. Les brins positifs produits peuvent être soit transcrits comme ARNm, soit empaquetés en tant que génomes de nouveaux virions synthétisés (voir figure 9.11). Pour les virus à ARN simple brin négatif (classe V) ou les virus à ARN double brin (classe III), la situation est plus complexe. En aucun cas, l’ARN introduit ne peut servir d’ARNm, ce dernier doit donc être synthétisé en premier. Pourtant, comme mentionné plus haut, les cellules n’ont pas d’ARN

Virus à ARN sb (+) Classe IV

Virus à ARN sb (–) Classe V

Synthèse de l’autre brin

ADN db intermédiaire

Transcription du brin (–)

Utilisé directement comme ARNm


Rétrovirus à ARN sb (+) Classe VI Transcription inverse


ARNm (+)

ARNm (+) Réplication du génome : Classe I,

semi-conservative classique Classe II, semi-conservative classique mais sans utilisation du brin (–) Classe VII, transcription suivie d’une transcription inverse

Virus à ADN (a)


ADN db intermédiaire

Réplication du génome : Classe III, réplication semi-conservative classique, mais d’ARN et non d’ADN Classe IV, donne un ARN sb (–) retranscrit en ARN sb (+) génomique Classe V, donne un ARN sb (+) retranscrit en ARN sb (–) génomique Classe VI, donne un ARN sb (+) génomique par transcription du brin (–) de l’ADN db proviral

Virus à ARN (b)

FIGURE 9.11 Formation de l’ARNm et des nouveaux génomes dans (a) les virus à ADN et (b) les virus à ARN. Par convention, l’ARNm est toujours considéré comme le brin (+). Des exemples pour chaque classe de virus sont donnés dans le tableau 9.2.



9.8 Généralités sur les bactériophages 243

polymérase capable de le faire. Pour contourner ce problème, les virions contiennent cette enzyme qui pénètre dans la cellule en même temps que le génome à ARN. Alors, l’ARN complémentaire positif est synthétisé par cette ARN polymérase ARN dépendante et est utilisé comme ARNm. Cet ARNm positif est aussi utilisé comme matrice pour produire davantage de génomes de polarité négative (voir figure 9.11).

l’hôte, tandis que dans d’autres cas, les synthèses chez l’hôte font concurrence aux synthèses virales. Enfin, la régulation de la synthèse virale peut être sous le contrôle du virus plutôt que sous le contrôle de l’hôte. Il y a différents éléments de ce contrôle qui sont identiques aux mécanismes de régulation discutés au chapitre 8, mais il y a aussi des mécanismes de régulation virale uniques. Ces mécanismes de régulation seront discutés lors de la description de certains types de virus.

Les rétrovirus Les rétrovirus (agents de certains cancers et du syndrome de l’immunodéficience acquise, SIDA) sont des virus animaux à ARN qui se répliquent via un intermédiaire à ADN (classe VI). Le procédé pour copier l’information de l’ARN en ADN est appelé transcription inverse, et nécessite une enzyme appelée transcriptase inverse. Même si l’ARN introduit par les rétrovirus est le brin positif, il n’est pas utilisé comme messager, ces virus doivent donc avoir une transcriptase inverse. Après l’infection, l’ARN simple brin du virion est copié en ADN double brin via un intermédiaire ADN simple brin. L’ADN double brin est alors la matrice pour la synthèse de l’ARNm (ARNsb → ADNsb → ADNdb → ARNm). Enfin, les virus de la classe VII sont ceux qui ont un ADN double brin mais qui se répliquent via un intermédiaire à ARN. Ces virus particuliers utilisent aussi une transcriptase inverse (voir section 16.15). La stratégie utilisée par ces virus pour produire de l’ARNm est la même que celle utilisée par les virus de la classe I (voir figure 9.11), bien que la réplication de leur ADN soit très inhabituelle (voir section 16.15). Même si la classification de Baltimore semble couvrir toutes les possibilités, il y a des exceptions. Par exemple, les ambivirus contiennent un génome à ARN simple brin, dont une moitié a une orientation positive (et peut ainsi être utilisée comme ARNm) et l’autre moitié est dans la configuration négative (qui ne le peut pas). Un brin complémentaire doit être synthétisé pour la deuxième moitié avant que les gènes ne puissent être exprimés. L’évolution a poussé la diversité virale à la limite des possibilités !

Les protéines virales Une fois que l’ARNm viral est constitué (voir figure 9.11), les protéines virales peuvent être synthétisées. Celles-ci sont groupées en deux catégories : 1. Les protéines synthétisées rapidement après l’infection, appelées protéines précoces, sont nécessaires pour la réplication de l’acide nucléique viral. 2. Les protéines synthétisées plus tardivement, appelées protéines tardives, sont les composants de la capside. Généralement, la durée des différentes étapes ainsi que la quantité de protéines virales sont hautement régulées. Les protéines précoces sont des enzymes qui, parce qu’elles agissent catalytiquement, sont synthétisées en petites quantités. Au contraire, les protéines tardives, généralement des composants structuraux du virion, sont fabriquées en plus grandes quantités. L’infection virale bouleverse les mécanismes de régulation de l’hôte car il y a surproduction d’acide nucléique viral et de protéines dans la cellule infectée. Dans certains cas, l’infection virale conduit à un arrêt complet de la synthèse des macromolécules de

Contrôlez vos acquis Avant la réplication de l’acide nucléique, de nouvelles protéines virales sont nécessaires. Celles-ci sont codées par les molécules d’ARN messager transcrites à partir du génome viral. Dans certains virus à ARN, l’ARN luimême est l’ARNm. Pour d’autres, le génome viral est une matrice pour la formation de l’ARNm viral ; dans certains cas, les enzymes nécessaires pour la transcription sont contenues dans les virions. •

Pourquoi certains types de virus contiennent-ils des enzymes dans le virion pour permettre la production d’ARNm ?

•

Distinguez un virus à ARN positif d’un virus à ARN négatif.

•

Les virus à ARN simple brin positif et les rétrovirus contiennent des génomes à ARN de polarité positive. Comparez la production de l’ARNm pour ces deux classes de virus.

IV

DIVERSITÉ VIRALE

m n9.8 Généralités sur les bactériophages Les bactériophages sont assez divers ; des exemples de différentes classes de bactériophages sont illustrés figure 9.12. La plupart des bactériophages étudiés dans le détail infectent des entérobactéries, comme Escherichia coli et Salmonella typhimurium. Néanmoins, une grande variété de procaryotes, tant les Bacteria que les Archaea, sont infectés par des virus. La plupart des bactériophages étudiés contiennent des génomes à ADN double brin, et ce type de bactériophage semble être le plus commun dans la nature. Cependant, il en existe aussi avec des génomes à ARN simple brin, à ARN double brin, et à ADN simple brin (voir figure 9.11). Quelques bactériophages ont des enveloppes lipidiques, mais la plupart sont nus. Beaucoup de bactériophages ont une structure complexe. La figure 9.12 montre des exemples de bactériophages à ADN double brin possédant une queue. Les queues des bactériophages T2, T4 et Mu sont contractiles et sont impliquées dans la pénétration de l’acide nucléique dans l’hôte (voir figure 9.10), alors que la queue du phage lambda est non contractile. Les bactériophages à queue ont été en premier lieu étudiés comme des systèmes modèles pour comprendre les caractéristiques générales de la multiplication virale, certains d’entre



244 Chapitre 9

ARN


jusqu’à T7. Après avoir vu l’adsorption et la pénétration de l’ADN viral dans l’hôte, le phage T4 sera à nouveau pris en exemple (voir section 9.6, figure 9.10) pour illustrer le cycle de réplication des virus virulents.

φ6 db

MS2 sb

ADN sb φΧ174

fd, M13

ADN db

T3, T7 Mu Lambda

T2, T4

FIGURE 9.12 Représentations schématiques des principaux types de bactériophages. Les phages décrits en détail dans ce chapitre ou au chapitre 16 sont M13, φX174, MS2, T4, lambda, T7 et Mu. Les tailles sont à une échelle approximative. La nucléocapside de φ6 est entourée d’une membrane.

eux sont maintenant aussi utilisés comme outils génétiques (voir chapitres 10 et 31). Dans les deux prochaines sections, deux types de cycles viraux seront brièvement examinés : le cycle lytique et la lysogénie. Les virus virulents lysent ou tuent leurs hôtes après l’infection, tandis que les virus tempérés peuvent atteindre un état où leur génome se réplique en même temps que celui de l’hôte sans tuer ce dernier.

Contrôlez vos acquis Les virus de bactéries, ou bactériophages, sont très divers. Les bactériophages les plus étudiés infectent les entérobactéries comme Escherichia coli et sont structurellement assez complexes, avec une tête, une queue et d’autres composants. •

Quel est le type de génome le plus commun chez les bactériophages ?

m n9.9 Bactériophages virulents et T4 Les premiers virus à avoir été étudiés dans le détail sont les bactériophages à ADN double brin et linéaire qui infectent Escherichia coli et un certain nombre d’autres Bacteria. Les virologistes ont commencé à isoler et étudier ces bactériophages en tant que systèmes modèles pour comprendre la réplication virale et les ont utilisés pour établir de nombreux principes fondamentaux de biologie moléculaire et de génétique. Ces bactériophages sont désignés T1, T2, et ainsi de suite

Le génome des bactériophages T-pairs Les bactériophages T2, T4 et T6 sont proches, mais T4 est le mieux étudié. Le phage T4 a une structure complexe (voir figure 9.5b). Il consiste en une tête icosaédrique allongée mesurant 85 × 110 nm. À cette tête est attachée une queue complexe consistant en un tube hélicoïdal (25 × 110 nm) auquel sont connectés une gaine, un collier, et une plaque basale munie de longues fibres caudales (voir figure 9.5b). Ce phage contient plus de 25 types distincts de protéines structurales. Le génome de T4 est un ADN double brin linéaire de 168 903 paires de bases, codant plus de 250 protéines différentes. Alors qu’aucun virus connu ne code son propre appareil traductionnel, le phage T4 code plusieurs de ses propres ARNt. Le génome de T4 est une séquence linéaire unique, pourtant le génome dans un virion peut ne pas être exactement le même que dans un autre. L’ADN de T4 a des séquences répétées à chaque extrémité appelées répétitions terminales d’environ 3–6 kpb. L’ADN est tout d’abord répliqué dans la cellule hôte comme une unité, et ensuite plusieurs unités génomiques sont soudées bout à bout pour former une longue molécule d’ADN appelée concatémère (voir figure 9.13). Le mécanisme d’empaquetage de l’ADN de T4 implique la coupure à partir du concatémère d’un segment d’ADN suffisant pour remplir une tête phagique (au moins l’équivalent d’un génome) plutôt que de couper l’ADN à une séquence spécifique. Comme la tête de T4 contient un peu plus que la longueur d’un génome, « ce mécanisme de tête pleine » conduit à la permutation circulaire et à la redondance terminale. L’ADN de T4 contient la base modifiée 5-hydroxyméthylcytosine au lieu de la cytosine (voir figure 9.14). Ces résidus glycosylés (voir section 9.6) protègent l’ADN contre l’attaque par les enzymes de restriction de l’hôte.

Les événements au cours de l’infection par le phage T4 Rapidement au début de l’infection, le phage T4 dirige la synthèse de son propre ARN et commence aussi à répliquer son unique ADN (voir figure 9.14). Environ 1 minute après l’attachement et la pénétration de l’ADN de T4 dans l’hôte, les synthèses de l’ADN et de l’ARN de l’hôte cessent, tandis que la transcription de gènes spécifiques du phage débute. La traduction de l’ARNm viral commence rapidement après, et en 4 minutes d’infection, la réplication de l’ADN phagique a commencé. Le génome de T4 peut être divisé en trois parties, codant les protéines précoces, intermédiaires et tardives (voir figure 9.15). Les protéines précoces et intermédiaires sont essentiellement des enzymes impliquées dans la réplication de l’ADN et la transcription, tandis que les protéines tardives sont les protéines de structure et les enzymes impliquées dans la lyse cellulaire et la libération des particules de phages matures. Bien que le phage T4 ait un très grand génome pour un virus, il ne code pas sa propre ARN polymérase. Le contrôle



9.9 Bactériophages virulents et T4 245

A B C D E F G A B

A B C D E F G A B

A B C D E F G A B

Recombinaison

G A B C D E F G A B C D E F G A B C D E F G A B C D E F G A B

Coupures par l’endonucléase

Remplissage complet de la tête par l’ADN de T4

Copies du génome de T4 répliquées

A B C D EF G A B

B C D E F G A B C D E F G A B C D E F G A B C D E F G

Génomes de T4 générés

Concatémère coupé par une endonucléase

FIGURE 9.13 Permutation circulaire. Génération de molécules d’ADN du phage T4 avec des séquences permutées par une endonucléase qui coupe des longueurs constantes d’ADN indépendamment de la séquence. À gauche : les copies du génome T4 sont combinées pour former un concatémère. Au centre : les flèches indiquent les sites de coupure de l’endonucléase. À droite : molécules générées. Notez que chaque génome de T4 formé sur la droite contient les gènes A-G, mais que les extrémités sont uniques pour chaque molécule.

de la synthèse de l’ARNm de T4 implique la production de protéines qui modifient séquentiellement la spécificité de l’ARN polymérase de l’hôte qui reconnaît ainsi les promoteurs du phage. Les promoteurs précoces sont lus directement par l’ARN polymérase de l’hôte et impliquent le facteur sigma de l’hôte. La transcription de l’hôte est ensuite arrêtée rapidement par un facteur anti-sigma codé par le phage qui se lie au σ70 (voir section 8.9) de l’hôte et interfère dans sa reconnaissance des promoteurs de l’hôte.

Site de glycosylation

NH2 HOH2C

N N

Les protéines spécifiques du phage synthétisées à partir des gènes précoces apportent aussi des modifications covalentes aux sous-unités α de l’ARN polymérase de l’hôte (voir section 7.10), et quelques protéines codées par le phage se fixent aussi à la polymérase. Ces modifications changent la spécificité de la polymérase qui reconnaît ainsi maintenant les promoteurs intermédiaires de T4. Une des protéines précoces de T4, appelée MotA, reconnaît une séquence d’ADN particulière au niveau des promoteurs intermédiaires et guide l’ARN polymérase à ces sites. La transcription à partir des promoteurs tardifs nécessite un nouveau facteur sigma codé par T4. Une telle modification séquentielle de l’ARN polymérase de l’hôte illustrée ici pour le phage T4 est utilisée par de nombreux autres bactériophages pour réguler l’expression des gènes. T4 code plus de 20 nouvelles protéines qui sont synthétisées rapidement après l’infection. Celles-ci comprennent des enzymes pour la synthèse de la base inusuelle 5-hydroxyméthylcytosine (voir figure 9.14) et pour sa glycosylation, ainsi qu’une enzyme qui dégrade le déoxycytidine triphosphate le précurseur normal de l’ADN. De plus, T4 code des enzymes qui ont des fonctions identiques aux enzymes de l’hôte, comme celles impliquées dans la réplication de l’ADN, mais celles-ci sont formées en plus grande quantité pour permettre une synthèse plus rapide de l’ADN de T4. D’autres protéines précoces sont celles impliquées dans le traitement de l’ADN phagique nouvellement synthétisé (voir figure 9.13). La plupart des gènes tardifs codent les protéines de structure, comprenant celles pour la tête et la queue. L’assemblage des têtes et des queues se fait indépendamment ; l’ADN est d’abord empaqueté dans la tête assemblée (voir figure 9.15), la queue et les fibres caudales sont ensuite fixées. La sortie du virus hors de la cellule est le résultat de la lyse cellulaire. Le phage code une enzyme lytique, le lysozyme T4, qui attaque le peptidoglycane de la cellule hôte. Après un cycle lytique, qui prend seulement 25 minutes (voir figure 9.15), plus de 100 nouveaux virions seront relargués de la cellule hôte, qui est presque entièrement détruite.

Contrôlez vos acquis Après l’attachement d’un phage T4 à la cellule hôte et la pénétration de l’ADN dans le cytoplasme, l’expression des gènes viraux est régulée pour rediriger la machinerie de l’hôte vers la production d’acide nucléique et de protéines virales. Les nouveaux virions sont alors assemblés et relargués de la cellule par lyse cellulaire. T4 a un génome à ADN double brin qui est circulairement permuté et à redondance terminale. •

Le génome du bactériophage T4 est à la fois circulairement permuté et à redondance terminale. Expliquez.

•

Donnez l’exemple d’un mécanisme utilisé par T4 pour permettre à ses gènes d’être transcrits plutôt que ceux de l’hôte.

O

H FIGURE 9.14 Base modifiée dans l’ADN des bactériophages T-pairs : 5-hydroxyméthylcytosine. Le site de glycosylation est indiqué.



246 Chapitre 9


Nucléases ADN polymérase Nouveaux facteurs sigma Infection

Protéines de la tête du phage

Réplication de l’ADN phagique ARNm précoce

ARNm intermédiaire

Protéines précoces

0

ADN du phage

Prot. intermédiaires

5

10

Queue, collier, plaque basale, protéines des fibres caudales

ARNm tardif

Auto-assemblage

Protéines tardives

15

Particule phagique mature Production de lysozyme T4

Lyse 20

25

FIGURE 9.15 Séquence d’événements au cours de l’infection par le phage T4. Après l’injection de l’ADN, les ARNm précoce et intermédiaire sont produits. Ils codent les nucléases, l’ADN polymérase, les facteurs sigma spécifiques des nouveaux phages et d’autres protéines impliquées dans la réplication de l’ADN. L’ARNm tardif code les protéines de structure du virion et le lysozyme T4 qui est nécessaire à la lyse de la cellule et à la libération des nouvelles particules phagiques.

m n 9.10

Bactériophages tempérés

Les virus tempérés sont également capables de tuer les cellules via un cycle lytique, mais ils ont l’option d’un cycle alternatif basé sur une relation génétique stable avec l’hôte. Ces virus peuvent entrer dans un état appelé lysogénie, où la majorité des gènes viraux ne sont pas exprimés et le génome viral, appelé prophage, se réplique de façon synchrone avec le chromosome de l’hôte. Le génome d’un phage tempéré peut être répliqué avec celui de l’hôte et, pendant la division cellulaire, passer d’une génération à l’autre. Sous certaines conditions, les cellules qui portent un virus tempéré, appelées lysogènes, peuvent spontanément produire et relarguer des virions. La lysogénie a probablement une importance écologique, car la plupart des bactéries isolées de la nature sont lysogènes pour un ou plusieurs bactériophages. La lysogénie peut aussi conférer de nouvelles propriétés génétiques à la cellule bactérienne, et nous verrons plusieurs exemples dans les prochains chapitres de bactéries pathogènes dont la virulence est due, au moins en partie, au bactériophage tempéré qu’elles portent. Aussi, nous verrons que la lysogénie n’est pas limitée aux bactériophages. Beaucoup de virus animaux établissent des relations similaires avec leurs hôtes.

Le cycle d’un phage tempéré Chez un virus lytique type, ce n’est pas la présence (ou même la réplication) de l’ADN viral qui conduit à la production de nouveaux virions et à la mort de la cellule hôte, c’est plutôt l’expression du génome viral qui est délétère. Les cellules hôtes peuvent porter des génomes viraux sans peine si l’expression de ces derniers peut être contrôlée. C’est la situation retrouvée chez les lysogènes. Cependant, si le contrôle est perdu, le virus entre dans la voie lytique et produit de nouveaux virions,

conduisant éventuellement à la lyse de la cellule hôte. La lysogénie peut donc être considérée comme une caractéristique génétique de la souche bactérienne. Une vue générale du cycle d’un bactériophage tempéré est montrée figure 9.16. Le virus tempéré n’existe pas dans sa forme extracellulaire à l’intérieur de la cellule. En effet, le prophage est intégré dans le chromosome bactérien et se réplique avec la cellule hôte aussi longtemps que les gènes contrôlant la voie lytique ne sont pas exprimés. Ce contrôle est maintenu par une protéine répresseur codée par le phage (le gène codant la protéine répresseur est exprimé). Ce répresseur viral ne contrôle pas seulement les gènes lytiques du prophage. En effet, si un phage du même type tente d’infecter la cellule, l’expression de ses gènes sera inhibée, ainsi les lysogènes possèdent une immunité contre la surinfection. Si le répresseur du phage est inactivé ou si sa synthèse est empêchée, le prophage est induit (voir figure 9.16). L’induction résulte dans la production de nouveaux virions et la lyse de la cellule hôte. Dans certains cas (comme nous le verrons plus loin), l’induction peut être provoquée par des conditions environnementales. Si le virus perd la capacité de quitter le génome de l’hôte (à cause de mutations), il devient un virus cryptique. Les études génomiques (voir chapitre 15) ont montré que de nombreux chromosomes bactériens contiennent des séquences d’ADN qui sont clairement des parties de génomes viraux. L’établissement et la levée de l’état lysogène sont des processus dynamiques chez les procaryotes. Nous allons maintenant nous intéresser au bactériophage lambda dont les propriétés lysogéniques sont connues.

Contrôlez vos acquis La lysogénie est un état dans lequel les gènes viraux sont intégrés dans le chromosome de l’hôte et les événements lytiques sont réprimés. Les virus capables de



9.11 Bactériophage lambda 247

Virus tempéré ADN

Attachement Cellule (hôte)

Injection Cycle lytique

Lysogénie

Réplication de l’ADN viral

L’infection par lambda et la voie lytique

Induction ADN viral intégré dans l’ADN de l’hôte

Protéines de la capside synthétisées ; particules virales assemblées

Cellules lysogènes Prophage

Lyse

bien que contrairement au phage T4, aucune fibre caudale n’est présente (voir figures 9.12 et 9.17). Le génome de lambda consiste en une molécule d’ADN linéaire double brin, mais à l’extrémité 5’ de chacun des brins, il y a une queue simple brin de 12 nucléotides de long. Ces extrémités simple brin sont complémentaires (les extrémités de l’ADN sont dites cohésives). Donc, lorsque les deux extrémités de l’ADN sont libres dans la cellule hôte, elles s’associent (site cos), et l’ADN est ligaturé pour former une molécule circulaire double brin de 48 502 paires de bases. La figure 9.18 montre ce processus, ainsi que la carte génétique de lambda.

Division cellulaire

FIGURE 9.16 Infection par un bactériophage tempéré. Les alternatives lors de l’infection sont la réplication et la libération de virus matures (lyse) ou l’intégration de l’ADN viral dans le chromosome de l’hôte (lysogénie). La cellule lysogène peut être induite pour produire des virus matures conduisant à la lyse.

conduire à un état de lysogénie sont appelés virus tempérés. Lors de la lysogénie, le génome viral devient un prophage ; cependant, les événements lytiques peuvent être induits par certains stimuli environnementaux. •

Quelles sont les deux voies possibles pour un virus tempéré ?

•

Quel peut être l’avantage pour les hôtes de virus tempérés ?

Le phage lambda s’attache à une protéine réceptrice spécifique de la paroi cellulaire d’Escherichia coli (voir section 9.6) et injecte son ADN. L’ADN se circularise presque immédiatement (voir figure 9.18a), et l’expression du génome du phage commence. Les premières étapes dans l’expression des gènes sont les mêmes quels que soient le résultat final, la lyse ou la lysogénie. La production d’ARN, en utilisant l’ARN polymérase de l’hôte, commence au niveau de deux promoteurs clés appelés PL (promoteur gauche) et PR (promoteur droit) [voir figure 9.18b]. Ceci conduit à de courts transcrits qui sont traduits pour donner les produits des gènes N et cro, ces deux protéines sont impliquées dans les événements de régulation. La protéine N est un antiterminateur qui permet à l’ARN polymérase de transcrire au-delà des terminateurs spécifiques (voir figure 9.18b), prolongeant les transcrits à partir de PL et PR. Ces longs transcrits peuvent être traduits pour qu’il y ait plus de protéines, dont les produits des gènes cII et cIII. La protéine N n’est pas complètement efficace au terminateur avant le gène Q, et donc seulement une petite quantité de protéine Q est produite. La protéine Q est aussi une protéine antiterminateur. Si sa concentration est suffisante, elle permettra au transcrit d’un promoteur proche de synthétiser le transcrit noté R2 sur la figure 9.18. Ce transcrit est traduit en protéines tardives, c’està-dire toutes les protéines structurales nécessaires pour constituer un virion, et celles nécessaires pour la lyse cellulaire.

Capside Queue

L’un des phages tempérés les mieux étudiés est le phage lambda, qui infecte Escherichia coli. Comme pour les autres virus tempérés, les voies lytique et lysogénique sont possibles (voir figure 9.16). Morphologiquement, les virions lambda ressemblent aux nombreux autres bactériophages à queue,

D. Kaiser

9.11 Bactériophage lambda m n FIGURE 9.17 Bactériophage lambda. Image au microscope électronique obtenue par coloration négative des phages lambda. La tête de chaque virion mesure environ 65 nm de diamètre.



248 Chapitre 9


Virion lambda Paroi/ membrane Extrémités cohésives (cos)

ADN circularisé de lambda dans le cytoplasme

ADN linéaire dans le virion lambda

(a)

L2

R

tio nd e l’

AD

N

Q

Lyse

S R2

e

Tête o it

Gènes tardifs

dr

J

cos

lica

xis : ex ci int : int sion égra att t extr ion é du p mités roph age

r

N

cl PROR cro PE cII R1 O P

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E

A W B C D

(b) FIGURE 9.18 Le génome du phage lambda. (a) Le génome linéaire du phage lambda se circularise après l’infection. (b) Carte génétique et moléculaire de lambda. Les gènes sont désignés par des lettres ; att, site d’attachement du génome viral au chromosome de l’hôte. Les principaux gènes de régulation : cI, répresseur ; OR, opérateur droit ; PR, promoteur droit ; OL, opérateur gauche ; PL, promoteur gauche ; cro, gène pour le second répresseur ; N, antiterminateur. La région régulatrice de lambda (indiquée en jaune) est positionnée en haut de cette carte circulaire. Le site créé quand les bouts cohésifs du génome lambda se joignent est appelé cos (indiqué en rouge). La transcription précoce se déroule à gauche (dans le sens contraire des aiguilles d’une montre, L1) à partir de PL et à droite (dans le sens des aiguilles d’une montre, R1) à partir de PR. Les trois terminateurs de transcription interagissant avec la protéine N sont indiqués en bleu sur l’ADN. Le transcrit tardif de droite, qui code les protéines de la tête et de la queue et celles impliquées dans les fonctions lytiques, est noté R2 et commence à un promoteur près du gène Q. Le transcrit noté L2 qui code un répresseur est positivement régulé à partir de PE.

Cependant, en même temps que la protéine Q s’accumule, la protéine Cro atteint des niveaux qui lui permettent de bloquer la transcription à partir de PL et PR en se liant à la fois à OL (opérateur gauche) et OR (opérateur droit). De ce fait, Cro fonctionne comme un répresseur (voir section 8.5). Le mécanisme de la protéine Cro se liant à OR est détaillé figure 9.19. Il y a trois sites similaires mais non identiques au

niveau de l’opérateur où la protéine Cro peut se fixer. Elle se fixe en premier au site 3, puis au 2, et seulement quand ces deux sites sont remplis, au site 1. C’est seulement quand il y a fixation au site 1 que PR est bloqué. Une fois que PL et PR sont bloqués, les protéines cII et cIII ne peuvent plus être synthétisées. Ces protéines sont nécessaires pour entrer dans la voie lysogénique (voir plus loin). Donc, quand la protéine Cro est fabriquée en grandes quantités, lambda est irréversiblement engagé dans la voie lytique.

La réplication de l’ADN par cercle-roulant L’interruption de PL et PR conduit au changement de la réplication de l’ADN de lambda. La synthèse de l’ADN, en début de cycle, est bidirectionnelle à partir d’une origine avec la formation d’intermédiaires en thêta (voir section 7.6). Cependant, avant la production des protéines tardives, de longs et linéaires concatémères d’ADN sont synthétisés par une réplication en cercleroulant. Dans ce mécanisme, contrairement à la réplication semi-conservative, la réplication se fait dans seulement une direction et peut résulter en de très longues chaînes d’ADN répliqué (voir figure 9.20). La réplication en cercle-roulant permet une réplication rapide de l’ADN et donc est un mécanisme utile pour accumuler rapidement des copies du génome de lambda qui sera empaqueté dans les virions matures. Les longs concatémères sont coupés à des longueurs de la taille du virus par une enzyme coupant l’ADN. Dans le cas de lambda (au contraire de T4 ; voir section 9.9), l’enzyme coupe à des sites spécifiques sur les deux brins (les sites cos), engendrant des segments monocaténaires de 12 nucléotides, et constituant ainsi des extrémités cohésives impliquées dans le processus de circularisation (voir figure 9.18a). L’ADN linéaire est alors empaqueté dans les têtes des phages, puis les queues et les autres protéines sont ajoutées. La cellule est alors lysée par des enzymes codées par le phage, et le cycle lytique du phage lambda est complet.

Lyse ou lysogénie : le commutateur génétique Qu’est-ce qui contrôle l’entrée du phage lambda dans la voie lytique ou lysogénique ? Le phage lambda et d’autres virus Ordre de fixation de cro 3 2 1

OR

Événements lytiques

Site 3 Site 2 Site 1 cI

PM

Ordre de fixation de cI 1 2 3

PR

cro

PE

Protéine Cro

Événements lysogéniques FIGURE 9.19 Opérateur droit de Lambda (OR). La protéine régulatrice Cro et le répresseur de lambda se fixent à O R pour exercer leurs fonctions de régulation. La protéine Cro se fixe aux trois sites dans l’ordre site 3, puis 2, puis 1, arrête dans un premier temps la synthèse de cI puis sa propre synthèse. Le répresseur de lambda (cI) se fixe à ces sites dans l’ordre inverse, arrête dans un premier temps la synthèse de Cro puis sa propre synthèse. Comparez cette figure avec la figure 9.21 qui résume le choix entre lysogénie et lyse.



9.11 Bactériophage lambda 249 3′

Amorces

Une copie complète du génome du phage Déroulement

FIGURE 9.20 Réplication par cercle-roulant du génome du phage lambda. Pendant que le brin vert foncé se déroule, il est répliqué à son extrémité opposée. Notez que cette synthèse est asymétrique car seul l’un des deux brins parentaux est utilisé comme matrice.

tempérés ont un commutateur génétique qui oriente vers telle ou telle voie. Pour établir la lysogénie, deux événements sont nécessaires : 1) la production de toutes les protéines tardives doit être empêchée et 2) une copie du génome de lambda doit être intégrée dans le chromosome de l’hôte. Pour prévenir la synthèse des protéines tardives de lambda, la protéine cI doit être produite. Cette protéine est le répresseur de lambda (voir figure 8.9b). Si cI est synthétisée, elle réprimera la synthèse de toutes les autres protéines codées par lambda, et la lysogénie sera mise en place. Le gène cI est localisé entre PL et PR (voir figure 9.18), mais ces promoteurs sont orientés de telle façon que ni l’un ni l’autre ne transcrit le gène cI. Le promoteur qui peut produire de l’ARNm à partir du gène cI durant l’infection est appelé PE (promoteur d’établissement) et est localisé sur la carte, légèrement à la droite du gène cro, mais dans un sens opposé à celui de PR (voir figures 9.18b et 9.19). Cependant, contrairement aux autres promoteurs décrits, PE doit d’abord être activé. Après activation, la protéine répresseur de lambda est synthétisée et la voie lysogénique est suivie. Le produit du gène cII est la protéine activatrice du promoteur PE (voir section 8.6) [et d’un autre nécessaire pour la production d’une intégrase, voir plus loin]. Bien que la protéine cII soit synthétisée rapidement après l’infection, elle est instable chez Escherichia coli, car elle est dégradée par une protéase de l’hôte. Si la protéine cII est dégradée, la voie lysogénique est alors impossible. Cependant, cII peut être stabilisée par la protéine cIII codée par le phage s’il n’y a pas d’excès de la protéase de l’hôte (ou s’il y a un excès de protéine cIII). Si la protéine cII est stabilisée, alors elle va activer PE et le répresseur de lambda (cI) sera synthétisé. Le répresseur de lambda se lie à OL et OR, comme le fait la protéine Cro, mais dans le sens opposé (voir figure 9.19) ; ce qui veut dire qu’il se fixe en premier au site 1, inactivant PR (et PL par un mécanisme similaire). Quand cela arrive, la synthèse de toutes les autres protéines de lambda est stoppée, et lambda ne peut entrer dans la voie lytique. La protéine cII n’étant plus produite, PE ne fonctionne plus et le répresseur lambda n’est plus synthétisé. Toutefois, si l’état lysogénique doit être maintenu, il doit y avoir une autre voie pour transcrire le gène cI. Le génome de lambda a un autre promoteur, PM (promoteur de maintenance, figure 9.19). Ce

promoteur fait face au gène cI (dans la même orientation que PE). Il est activé quand le répresseur de lambda se lie au site 1 et il est réprimé seulement quand le répresseur est lié aux trois sites. De ce fait, le répresseur lambda est à la fois un répresseur et un activateur quand il se fixe au site 1, réprimant PR et activant PM. Quand PM est actif, davantage de répresseur lambda est synthétisé, ce qui maintient l’état de lysogénie. Un résumé des étapes de l’infection de lambda conduisant à l’état lytique ou lysogénique est montré figure 9.21. En un mot, la voie empruntée, lyse ou lysogénie, est déterminée suivant que la protéine Cro ou le répresseur de lambda (cI) prend le dessus dans les événements de régulation. Si Cro domine les événements de régulation, l’issue est la lyse, si c’est le répresseur de lambda qui domine, il y aura lysogénie.

L’intégration L’intégration de l’ADN de lambda se fait à un site unique sur le chromosome d’Escherichia coli et est nécessaire pour que l’état de lysogénie soit complet. L’intégration se fait par l’insertion du génome viral dans le génome de l’hôte (ceci rallonge le génome de l’hôte de la longueur de l’ADN viral). Après injection, les extrémités cohésives de la molécule linéaire de lambda se joignent pour former un cercle (voir figure 9.22), et c’est cet ADN circulaire qui est intégré dans le génome de l’hôte (le site créé quand ces extrémités se joignent est appelé cos). Pour établir la lysogénie, les gènes cI (répresseur de lambda) et int (codant une intégrase) doivent être exprimés. Le processus d’intégration nécessite l’intégrase de lambda, qui est une nucléase / intégrase site spécifique catalysant la recombinaison des sites d’attachement du phage et de la bactérie (notés att aux figures 9.18 et 9.22). Le gène int a un promoteur qui, comme PE, est activé par la protéine cII. Durant la croissance cellulaire, le système de répression empêche l’expression du génome intégré de lambda excepté le gène cI codant le répresseur. L’ADN intégré de lambda est Infection PL activé

PR activé

Lyse N favorisée Cro

Lysogénie favorisée Q

cII et cIII Dégradation de cII

Protéines tardives et lyse

Lysogénie favorisée

Stabilisation de cII Activation de PE cI (répresseur lambda)

FIGURE 9.21 Résumé des étapes de l’infection par lambda. Le choix entre lyse et lysogénie se fait en fonction de la synthèse ou non du répresseur (cI). L’accumulation de Cro empêche une synthèse suffisante de cII et cIII et le résultat en est la lyse. Si suffisamment de cII est présent, le promoteur de cI est activé et cI est synthétisé, aboutissant à la lysogénie. Voir le texte pour la désignation des gènes.



250 Chapitre 9


cos att Génome lambda Circularisation des extrémités cohésives

cos

gal


Gènes de l’hôte près du site d’attachement

att bio

moa ADN de l’hôte

La nucléase sitespécifique crée des extrémités décalées sur l’ADN du phage et de l’hôte gal

bio

moa Intégration de l’ADN de lambda et ligation par l’ADN ligase

gal

cos

bio

impliquée dans la recombinaison génétique, agit comme une protéase (voir figure 10.7) qui détruit, entre autres, le répresseur lambda. Une fois que ce répresseur est inactivé, son contrôle est aboli et la transcription spécifique du phage peut commencer. Ceci conduit inévitablement à l’accomplissement des événements lytiques et à la lyse cellulaire, car même si le répresseur lambda est synthétisé, il est rapidement inactivé. L’induction du bactériophage lambda est donc une conséquence indirecte de l’endommagement de l’ADN du chromosome de l’hôte.

moa

FIGURE 9.22 Intégration de l’ADN de lambda dans l’hôte. Voir la carte génétique, figure 9.18b, pour le détail sur l’ordre des gènes. L’intégration s’effectue toujours à un site précis sur l’ADN de l’hôte, impliquant un site d’attachement spécifique (att) sur le phage. Certains des gènes de l’hôte près du site d’attachement sont représentés : opéron gal, utilisation du galactose ; opéron bio, biosynthèse de la biotine ; opéron moa, biosynthèses du cofacteur molybdène. Une enzyme sitespécifique (intégrase) est impliquée et l’appariement spécifique des extrémités complémentaires conduit à l’intégration de l’ADN phagique.

répliqué en même temps que le génome de l’hôte et est transmis aux descendants. Un relâchement de la répression conduit au cycle lytique. Pour s’exciser du chromosome, une excisionase (le produit du gène xis) et le produit du gène int sont nécessaires.

La croissance lytique de lambda après induction Les causes qui induisent les lysogènes de lambda à produire le phage sont des agents qui endommagent l’ADN. Ceci inclut les ultraviolets, les rayons X et les agents chimiques. Quand l’ADN est endommagé, un mécanisme de défense de l’hôte, appelé la réponse SOS (voir section 10.3), est activé. Une batterie de gènes bactériens est activée par cette réponse, certains aidant la bactérie à survivre aux radiations. Cependant, un résultat de la réponse SOS est que la protéine bactérienne RecA, qui est normalement

Lambda est un phage tempéré à ADN double brin. La régulation chez lambda des événements conduisant soit à la lyse soit à la lysogénie est sous le contrôle de plusieurs promoteurs et de protéines régulatrices. La répression des événements lytiques de lambda est due à la protéine cI (le répresseur de lambda), tandis que l’activation des événements lytiques est sous le contrôle de la protéine Cro. Bien que le génome de lambda soit linéaire, il se circularise à l’intérieur de la cellule, où la synthèse d’ADN se fait par le mécanisme de cercle-roulant. •

Quels événements sont nécessaires pour que lambda devienne un prophage ?

•

Quels événements de régulation ont lieu au site OR sur le chromosome de lambda ?

9.12 Généralités sur les virus animaux m n Dans les sections 9.5 à 9.7 sur la reproduction virale, les « hôtes » des virus ont été traités d’une façon très générale. Cependant, il est important de se rappeler que l’hôte d’un bactériophage est une cellule procaryote tandis que l’hôte d’un virus animal est une cellule eucaryote. Nous accentuerons sur ces différences importantes au chapitre 16, où seront présentés plus en détail plusieurs types de virus animaux. Cependant, les points clés à garder en tête ici sont que : 1) contrairement aux procaryotes, le virus entier entre dans la cellule animale, et 2) les cellules eucaryotes contiennent un noyau, où la majorité des virus doivent se répliquer. De plus, il y a des détails sur l’épissage de l’ARN (voir section 14.8) qui affectent la réplication des virus animaux, mais ces points ne seront pas traités ici.

La classification des virus animaux Différents types de virus animaux sont illustrés figure 9.23. Les principes de classification des virus ont été discutés aux sections 9.1, 9.2 et 9.7. Les virus animaux enveloppés sont plus nombreux que les virus bactériens enveloppés (voir section 9.7). Contrairement aux cellules procaryotes, les cellules animales n’ont pas de paroi cellulaire, et donc les virus sont plus facilement excrétés de la cellule. De ce fait, ils emportent avec eux une partie de la bicouche lipidique cellulaire quand ils passent au travers de la membrane. La plupart des virus animaux qui ont été étudiés en détail sont ceux que l’on obtient relativement facilement en culture



9.12 Généralités sur les virus animaux 251

Non enveloppé

Enveloppé

Partiellement à ADN db Hepadnavirus

ADN sb Parvovirus ADN db

ADN db

Papovavirus ADN db Poxvirus Adenovirus

ADN db ADN db Herpèsvirus Iridovirus

100 nm

(a) Virus à ADN Non enveloppé

ARN sb Picornavirus

Enveloppé : ils sont tous à ARN simple brin

bourgeonnement, peut être lente, et la cellule hôte peut ne pas être lysée. La cellule infectée peut alors rester vivante et continue à produire des virus indéfiniment. Ces infections sont dites infections persistantes (voir figure 9.24). Les virus peuvent aussi causer une infection latente, il y a un délai entre l’infection par le virus et les événements lytiques. Les boutons de fièvre, causés par le virus Herpes simplex (voir section 16.12), sont un exemple typique d’une infection virale latente ; les symptômes (résultant de la lyse des cellules) réapparaissent sporadiquement quand le virus sort de sa phase de latence. L’étape latente dans l’infection virale d’une cellule animale n’est généralement pas due à l’intégration du génome viral dans le génome de la cellule animale, comme dans le cas des infections latentes par les bactériophages tempérés. Enfin, certains virus animaux peuvent catalyser la conversion d’une cellule normale en une cellule tumorale, un processus appelé transformation (voir figure 9.24). Les virus induisant des cancers seront présentés dans la section 16.12. De nombreux virus différents sont connus. Mais de tous les virus listés dans la figure 9.23, certains ont un mode de réplication très particulier. Ce sont les rétrovirus. Ils seront étudiés ici en tant que virus animaux complexes et très inhabituels avec d’importantes implications médicales.

Rhabdovirus

Transformation

Togavirus Orthomyxovirus

ARN db

Bunyavirus

Transformation en cellules tumorales

Division des cellules tumorales

Cellule

Coronavirus

Lyse

Virus

Réovirus 100 nm Paramyxovirus Arenavirus

Rétrovirus

(b) Virus à ARN FIGURE 9.23 Diversité des virus animaux. Formes et tailles relatives des virus de vertébrés des principaux groupes taxinomiques. Le génome de l’hepadnavirus est constitué d’une molécule d’ADN partiellement double brin (section 16.15).

cellulaire. Les virus animaux sont classés selon les mêmes schémas que les bactériophages, incluant le système de classification de Baltimore (voir tableau 9.2) qui classe les virus sur la base du type du génome et de la stratégie de reproduction. Les virus animaux sont présents dans toutes les catégories de réplication présentées au chapitre 16.

Les conséquences de l’infection virale sur les cellules animales Les virus peuvent avoir différents effets sur les cellules animales. L’infection lytique aboutit à la destruction de la cellule hôte (voir figure 9.24). Cependant, dans le cas de virus enveloppés, la libération des virions, qui se fait par une sorte de

Attachement et pénétration Multiplication

Mort des cellules et libération des virus Infection persistante Libération lente des virus sans mort cellulaire Infection latente

Virus présents mais non destructeurs pour la cellule ; possible évolution vers une infection lytique FIGURE 9.24 Effets possibles des virus animaux sur les cellules qu’ils infectent. Notez que la plupart des virus sont lytiques et que seulement quelques-uns sont connus pour causer des cancers. Beaucoup de virus oncogènes viennent du groupe Herpesvirus (section 16.12).



252 Chapitre 9


Contrôlez vos acquis ARN

Les virus animaux couvrent tous les modes connus de réplication du génome viral. Beaucoup de virus animaux sont enveloppés, prélevant des portions de la membrane cytoplasmique de l’hôte quand ils quittent la cellule. Toutes les infections des cellules hôtes animales ne conduisent pas à la lyse ou mort cellulaire ; des infections latentes ou persistantes sont communes, et certains virus animaux peuvent causer des cancers. •

Différenciez l’infection virale latente de l’infection persistante.

•

Opposez les mécanismes par lesquels les virus animaux entrent dans les cellules avec ceux utilisés par les bactériophages.

9.13 Rétrovirus m n Les rétrovirus contiennent un génome à ARN qui se réplique via un intermédiaire à ADN (voir section 9.1 et figure 9.11). Le terme rétrovirus est utilisé car l’information génétique passe d’un ARN à un ADN contrairement au sens habituel (voir section 7.1). Les rétrovirus utilisent l’enzyme transcriptase inverse pour réaliser cet intéressant processus. L’utilisation de la transcriptase inverse n’est pas restreinte aux rétrovirus. Le virus de l’hépatite B (un virus humain) et le virus de la mosaïque du chou-fleur (un virus de plante) utilisent aussi la transcription inverse dans leurs processus de réplication (voir section 16.15). Mais contrairement aux rétrovirus, ces virus encapsident de l’ADN pour leur génome et non de l’ARN. Les rétrovirus sont intéressants pour plusieurs autres raisons. Par exemple, ils sont les premiers virus à avoir été montrés comme cause de cancer et à avoir été étudiés intensivement pour leurs caractéristiques carcinogènes. Ainsi, un rétrovirus, le virus de l’immunodéficience humaine (VIH), est la cause du syndrome de l’immunodéficience acquise (SIDA). La principale cible du VIH est le lymphocyte TCD4 (cellule T-helper) qui est vital pour le fonctionnement propre du système immunitaire. Dans les chapitres suivants, les aspects médicaux et immunologiques du SIDA seront vus (voir sections 25.6 et 26.14). Les rétrovirus sont des virus enveloppés (voir figure 9.25a). Il y a plusieurs protéines dans la capside virale et classiquement 7 protéines internes, dont 4 sont des protéines de structure et 3 sont des enzymes. Les enzymes présentes dans la particule virale sont : la transcriptase inverse, une ADN endonucléase (intégrase) et une protéase. Le virion contient aussi des molécules d’ARNt cellulaires spécifiques utilisées lors de la réplication (voir plus loin dans cette section).

Les caractéristiques des génomes des rétrovirus et la réplication Le génome des rétrovirus est unique. Il est constitué de deux molécules identiques d’ARN simple brin de complémentarité positive. Une carte génétique d’un génome typique de rétrovirus est montrée figure 9.25b. Même s’il y a des différences entre les cartes

Protéine de surface de l’enveloppe Protéine transmembranaire de l’enveloppe

Transcriptase inverse

Bicouche lipidique membranaire Matrice protéique Protéine de la capside (a) R (b)

R gag

pol

env

FIGURE 9.25 Structure et fonction d’un rétrovirus. (a) Structure d’un rétrovirus. (b) Carte génétique d’un génome type de rétrovirus. Chaque extrémité de l’ARN génomique contient des répétitions directes (R). Voir le texte pour plus de détails.

génétiques de différents rétrovirus, tous contiennent les gènes suivants qui sont agencés dans le même ordre : gag, codant des protéines de structure ; pol, codant la transcriptase inverse et l’intégrase ; et env, codant les protéines d’enveloppe. Certains rétrovirus, comme le virus du sarcome de Rous, porte un quatrième gène en aval de env qui est impliqué dans la transformation cellulaire et le cancer. Les répétitions terminales montrées sur la carte jouent un rôle essentiel dans le processus de réplication (voir plus loin). Le processus complet de réplication d’un rétrovirus peut être résumé par les étapes suivantes (voir figure 9.26) : 1. Entrée dans la cellule par fusion avec la membrane cellulaire aux sites récepteurs spécifiques. 2. Décapsidation du virion au niveau de la membrane, de sorte que le génome et les enzymes restent dans le core. 3. Transcription inverse de l’un des deux génomes à ARN en un ADN simple brin qui est ensuite converti en un ADN double brin linéaire par une transcriptase inverse, cet ADN db entre ensuite dans le noyau. 4. Intégration de l’ADN rétroviral dans le génome de l’hôte. 5. Transcription de l’ADN rétroviral, conduisant à la formation d’ARNm viraux et à de l’ARN génomique viral. 6. Assemblage et encapsidation de l’ARN génomique dans les nucléocapsides au niveau du cytoplasme. 7. Bourgeonnement des virions enveloppés à travers la membrane cytoplasmique et libération hors de la cellule.



9.13 Rétrovirus 253

Particule virale à ARN simple brin (deux copies) 1. Entrée 2. Décapsidation R

R

ARN sb

3. Transcription inverse

LRT

ADN db LRT 4. Pénétration dans le noyau et intégration dans l’ADN de l’hôte ADN de l’hôte

LRT

Provirus

LRT 5. Transcription

ARN sb

R

R ARNm viral et ARN génomique 6. Encapsidation ARN sb

Nucléocapside

7. Bourgeonnement

Membrane cytoplasmique de l’hôte Libération

Particule virale

FIGURE 9.26 Réplication d’un rétrovirus. R, répétitions directes ; LRT, longues répétitions terminales. Pour plus de détails sur la conversion de l’ARN en ADN (étape 3), voir la figure 16.25.

L’activité de la transcriptase inverse Une étape précoce après l’entrée du génome à ARN dans la cellule est la transcription inverse : conversion de l’ARN en une copie d’ADN en utilisant l’enzyme transcriptase inverse présente dans le virion. L’ADN formé est une molécule linéaire double brin et est synthétisé dans le cytoplasme à l’intérieur d’une particule virale décapsidée. Les détails de ce processus sont donnés dans la section 16.15. À noter simplement que la transcriptase inverse est une

ADN polymérase et, comme toutes les ADN polymérases, elle nécessite une amorce (voir section 7.5). Cette amorce pour la transcription inverse des rétrovirus est un ARN de transfert cellulaire spécifique (ARNt). Le type d’ARNt utilisé comme amorce dépend du virus et a été fourni au virion par la cellule hôte précédente. Le processus complet de la transcription inverse résulte dans un produit qui a de longues répétitions terminales (LRT, figure 9.26) qui sont plus longues que celles présentes sur le génome lui-même (voir figure 9.25). Cette molécule entière d’ADN double brin entre dans le noyau en même temps qu’une intégrase ; l’ADN viral est alors intégré dans l’ADN de l’hôte. Les LRT contiennent de forts promoteurs de transcription et sont aussi impliquées dans le processus d’intégration. L’intégration de l’ADN viral dans le génome de l’hôte est analogue à l’intégration d’un phage à ADN dans le génome bactérien pour former un état de lysogénie (voir section 9.10). L’intégration de l’ADN viral peut se faire n’importe où dans l’ADN cellulaire, et une fois intégré, l’élément, maintenant appelé provirus, est un élément génétique stable qui peut se maintenir indéfiniment. Si les promoteurs de la LRT adéquate sont activés, l’ADN proviral intégré est transcrit par une ARN polymérase cellulaire. Ces transcrits à ARN peuvent soit être encapsidés dans des particules virales (en tant que génome) ou être traduits en protéines virales. Certaines protéines virales sont fabriquées initialement comme une grande protéine primaire gag, qui est divisée par protéolyse en protéines de la capside (voir figure 16.26). Occasionnellement, une lecture d’un bout à l’autre audelà de la région gag (impliquant soit l’insertion d’un acide aminé en réponse à un codon stop, soit à un décalage du cadre de lecture par un ribosome) conduit à la traduction de pol, le gène de la transcriptase inverse. Ceci permet à la transcriptase inverse d’être produite et d’être insérée dans les virions. Quand les protéines virales sont accumulées en quantité suffisante, l’assemblage des nucléocapsides se fait. L’encapsidation du génome à ARN conduit à la formation de nucléocapsides matures, qui se déplacent vers la membrane cytoplasmique pour l’assemblage final dans les particules virales enveloppées. Les nucléocapsides bourgeonnent à travers la membrane, puis sont libérées pour infecter des cellules voisines (voir figure 9.26).

Contrôlez vos acquis Les rétrovirus sont des virus à ARN qui se répliquent via un intermédiaire à ADN. Le rétrovirus appelé virus de l’immunodéficience humaine est la cause du SIDA. Le rétrovirus contient une enzyme, la transcriptase inverse, qui copie l’information du génome à ARN en ADN. L’ADN est intégré dans le chromosome de l’hôte à la manière d’un virus tempéré. L’ADN du rétrovirus peut être transcrit en ARNm (et en ARN génomique) ou peut rester en état de latence. •

Pourquoi ces virus sont-ils appelés des rétrovirus ?

•

Comment le cycle d’un bactériophage tempéré diffère-t-il de celui d’un rétrovirus ?



V


PARTICULES SOUS-VIRALES

Si ce bref aperçu de la diversité virale, qui sera développée au chapitre 16, n’est pas exhaustif quant aux schémas de réplication et aux particularités virales, ce chapitre sur l’essentiel de la virologie sera conclu en considérant deux agents infectieux de type viral, mais qui ne sont pas des virus : les viroïdes et les prions.

9.14 Viroïdes et prions m n Un virus est défini comme un élément génétique qui détourne les processus cellulaires normaux pour sa propre réplication et qui a une forme mature extracellulaire infectieuse. Il existe des agents infectieux qui ressemblent aux virus mais dont les propriétés ne rentrent pas dans la définition d’un virus et qui n’en sont donc pas. Deux des plus importants sont les viroïdes et les prions.

Les viroïdes Les viroïdes sont de petites molécules à ARN simple brin, circulaires qui sont les plus petits agents pathogènes connus. Les viroïdes, dont les tailles s’échelonnent entre 246 à 399 nucléotides, montrent un degré d’homologie considérable, suggérant qu’ils ont une origine évolutive commune. Ils induisent des maladies importantes chez les plantes et peuvent avoir un sévère impact sur l’agriculture. Les quelques viroïdes bien étudiés sont : le viroïde du « cadang-cadang » du cocotier (246 nucléotides), le viroïde de l’exocortis des Citrus (375 nucléotides), et le viroïde des tubercules en fuseau de la pomme de terre (359 nucléotides ; voir figure 9.28). La forme extracellulaire du viroïde est un ARN nu. Plus intéressante encore, la molécule d’ARN ne code aucune protéine ; il est donc totalement dépendant des fonctions de l’hôte pour sa réplication. Même si le viroïde est un ARN simple brin circulaire, il possède une structure secondaire sous la forme d’une courte molécule double brin avec des extrémités fermées (voir figure 9.27). Le viroïde entre dans la plante au niveau d’une blessure, causée par un insecte ou par un autre dommage mécanique. Il est répliqué dans le noyau cellulaire de l’hôte par une des ARN polymérases de la plante. Les plantes infectées par un viroïde peuvent ne pas présenter de symptômes alors que le même viroïde chez une autre espèce végétale sera responsable d’une maladie sévère (voir figure 9.28). Les symptômes les plus sévères sont relatifs à la croissance, suggérant que les viroïdes sont un type « d’ARN régulateur » (voir

A

A

C G A G U A G C A U U G C A C G UC A U C G U A A C G U G

FIGURE 9.27 Viroïdes. Structure de viroïdes, montrant comment de l’ARN circulaire simple brin peut former une structure s’apparentant au double brin par un appariement des bases entre elles.

section 8.14), dont des exemples sont bien connus chez les plantes et les animaux. Les viroïdes pourraient être des ARN régulateurs qui ont évolué d’un rôle bénéfique pour la cellule à un rôle maintenant destructeur. Aucune maladie d’animaux par viroïdes n’est connue, et les mécanismes précis par lesquels ils induisent les maladies des plantes restent obscurs.

Les prions Les prions représentent l’autre extrême par rapport aux viroïdes. Ils ont une forme extracellulaire distincte, entièrement protéique. Le prion ne contient pas d’acide nucléique. Cependant, il est infectieux et induit différentes maladies chez les animaux, comme la tremblante naturelle du mouton (« Scrapie »), l’encéphalopathie spongiforme bovine chez le bétail (ESB ou « maladie de la vache folle »), la maladie de dépérissement chronique chez le daim et l’élan, le kuru, et la maladie de Creutzfeldt-Jakob (Creutzfeldt-Jakob disease, CJD) chez l’humain. Aucune maladie à prion n’est signalée chez les plantes. Les maladies à prion sont connues en tant qu’encéphalopathies spongiformes transmissibles, ou EST. En 1997, le scientifique américain Stanley B. Pruisner a obtenu le prix Nobel pour son travail pionnier sur ces maladies et sur les protéines du prion. En 1996, il est devenu évident à partir du dépistage de la maladie en Angleterre que le prion causant l’ESB pouvait aussi infecter les humains, une variante de la CJD, appelée nouveau variant CJD (nvCJD). La transmission se faisant par des produits bovins contaminés, en seulement quelques années le nvCJD est devenu un problème de santé mondial avec un impact majeur dans la filière agricole animale (voir section 29.11). La plupart des cas d’ESB ont eu lieu au Royaume-Uni ou dans d’autres pays de l’Union Européenne et sont liés à des pratiques impropres d’alimentation des animaux par des farines d’origine animale préparées à partir de mouton. Depuis 1994, cette pratique est interdite dans tous les pays de l’UE et

Yijun Qi et Biao Ding

254 Chapitre 9

FIGURE 9.28 Viroïdes. Photographie d’un plant de tomate sain (à gauche) et d’un plant infecté (à droite) par le PSTV (Patato spindle tuber viroid). La gamme d’hôtes de la plupart des viroïdes est assez restreinte. Cependant, PSTV infecte aussi bien les tomates que les pommes de terre, causant un arrêt de la croissance et une mort prématurée du plant (à droite).



Questions 255

Cellule neuronale Gène PrPc

Fonction anormale Fonction normale PrPc Repliement de PrPc PrPSc

PrPSc FIGURE 9.29 Mécanisme d’action d’un prion. Les cellules neuronales produisent naturellement la forme normale de la protéine prion (PrPc). Le repliement anormal de cette protéine conduisant à la forme PrPsc peut catalyser le repliement d’autres PrPc en PrPsc. La forme PrPsc est résistante aux protéases, insoluble, et forme des aggrégats dans les cellules neuronales. Ceci conduit éventuellement à la destruction des tissus neuronaux et à des symptômes neurologiques.

les cas d’ESB ont beaucoup diminué. Jusqu’ici la transmission de l’EST via des animaux domestiques, comme les cochons, les poulets ou les poissons, n’a pas été prouvée. Même si un consensus n’a pas abouti sur la façon dont les prions causent la maladie, le scénario le plus plausible est indiqué figure 9.29. L’infection par le prion résulte dans l’accumulation de copies de la protéine prion, et ceci déclenche la maladie. Les symptômes sont invariablement neurologiques et, dans la plupart des cas, sont dus à une dégénérescence progressive du cerveau ou

des tissus nerveux par l’accumulation de protéines agrégées du prion (voir section 29.10 et figure 29.10). Mais si les prions ne contiennent pas d’acide nucléique, comment est codée la protéine dont ils sont constitués ? La cellule hôte contient un gène qui code une glycoprotéine appelée PrPC, qui est quasi identique à la protéine prion. PrPC est produite par les animaux sains et se retrouve souvent au niveau des neurones. Le prion appelé PrPSc est une forme structurellement modifiée de la protéine PrPC et peut altérer cette dernière et la convertir en PrPSc. La modification implique un profil de repliement alternatif. Ainsi la protéine perd sa fonction normale, pour devenir partiellement résistance aux protéases, et insoluble dans les cellules neuronales, ce qui conduit à une agrégation (voir figure 9.29). Dans cet état, la protéine prion s’accumule (voir figure 29.10) et les symptômes neurologiques commencent. Ainsi, les prions ne perturbent pas simplement les enzymes de l’hôte dans la cellule, mais convertissent une protéine cellulaire normale en une protéine anormale (état autopropagateur). Les viroïdes et les prions font plus qu’étendre la définition d’un virus. Ils démontrent aussi les possibilités inattendues qu’ont les éléments génétiques pour se répliquer et pour perturber les cellules. Cependant, les prions sont à part parmi tous les éléments génétiques considérés car l’agent infectieux transmissible est dépourvu d’acide nucléique.

Contrôlez vos acquis Les viroïdes sont des molécules circulaires d’ARN simple brin qui ne codent pas de protéines et sont complètement dépendants des enzymes codées par l’hôte. Les prions et les viroïdes sont les plus petits pathogènes connus. •

Si les viroïdes sont des molécules circulaires, pourquoi sont-ils dessinés comme dans la figure 9.27 ?

•

Comment un prion induit-il une maladie ?

QUESTIONS 1. En quoi les génomes viraux diffèrent-ils de ceux des cellules (voir section 9.1) ? 2. Définissez le terme virus. Quelles sont les caractéristiques minimales requises (voir section 9.2) ? 3. Définissez le terme hôte en tant qu’hôte d’un virus (voir section 9.3). 4. Décrivez les événements qui se produisent sur une boîte gélosée recouverte d’un tapis bactérien quand une seule particule de bactériophage cause la formation d’une plage (voir section 9.4). 5. Dans certaines conditions, il est possible d’obtenir les capsides de certains virus sans acide nucléique. Au microscope électronique, ces capsides ressemblent fortement aux virions complets. Que vous indique cette observation sur le rôle de l’acide nucléique viral dans l’assemblage des virus ? Vous attendriez-vous à ce que de tels virions soient infectieux ? Pourquoi (voir section 9.5) ? 6. Décrivez comment une endonucléase de restriction pourrait jouer un rôle dans la résistance à l’infection par un bactériophage. Pourquoi une endonucléase de restriction pourrait-elle

jouer un tel rôle tandis qu’une DNase classique ne le pourrait pas (voir section 9.5) ? 7. On peut diviser le processus de réplication d’un virus en cinq étapes. Décrivez les événements liés à chacune de ces étapes (voir sections 9.6 et 9.7). 8. Pourquoi le cycle de vie d’un virus à ARN positif est-il susceptible d’être plus simple que celui d’un virus à ARN négatif (voir section 9.8) ? 9. En termes de structure, en quoi le génome du bactériophage T4 ressemble et diffère-t-il de celui d’Escherichia coli (voir section 9.9) ? 10. Plusieurs des virus que nous avons considérés ont des gènes précoces et des gènes tardifs. Que signifient ces deux classifications ? Quels types de protéines tendent à être codés par les gènes précoces ? Quels types de protéines le sont par les gènes tardifs ? Pour les bactériophages T4 et lambda, décrivez comment l’expression des gènes tardifs est contrôlée (voir section 9.9).



256 Chapitre 9


11. Définissez les termes : virulent, lysogénie, prophage (voir section 9.10). 12. Une souche d’Escherichia coli qui n’a pas la protéine membranaire externe responsable de l’entrée de maltose est résistante à l’infection par lambda. Une cellule lysogène qui porte lambda est immunisée contre l’infection par ce même phage. Décrivez la différence fonctionnelle entre la résistance et l’immunité. Expliquez comment ces conditions sont provoquées dans les exemples donnés (voir sections 9.10 et 9.11).

13. Décrivez et différenciez les effets que l’infection virale peut avoir sur un animal (voir section 9.12). 14. Typiquement, l’ARN de transfert est utilisé lors de la traduction. Cependant, il joue également un rôle dans la réplication de l’acide nucléique rétroviral. Expliquez ce rôle (voir section 9.13). 15. Quelles sont les similitudes et les différences entre les prions, les virus, et les viroïdes (voir section 9.14) ?

PROBLÈMES 1. Qu’est-ce qui stoppe le développement des plages virales qui apparaissent sur un tapis bactérien ? 2. Les promoteurs permettant l’expression des protéines précoces dans les bactériophages comme T4 ont une séquence différente de ceux permettant l’expression des protéines tardives dans le même virion. Expliquez pourquoi ceci pourrait être vrai. 3. Une caractéristique des bactériophages tempérés est qu’ils causent plutôt des plages troubles que des plages claires sur les tapis bactériens. Expliquez pourquoi. (Rappelez-vous le processus par lequel une plage se développe.) 4. Il y a trois gènes de lambda qui, une fois rendus non fonctionnels, font que le phage lambda qui était tempéré devient un

phage virulent. Quels sont ces trois gènes et comment fonctionnent-ils normalement ? 5. La figure 9.19 montre deux promoteurs, PR et PE, de chaque côté du gène cro. Tous les deux transcrivent au-delà du gène cro, mais seul le transcrit à partir de PR peut être traduit pour donner une protéine fonctionnelle Cro. Expliquez. 6. Comparez la ou les enzyme(s) présente(s) dans les virions d’un rétrovirus et dans ceux d’un bactériophage à ARN positif. Pourquoi diffèrent-elles si chacun a pour génome un ARN simple brin de polarité positive ? 7. L’infection virale conduit à la production de davantage de particules virales, expliquez alors pourquoi la « courbe de production » virale a le profil de la figure 9.9 plutôt que celui de la figure 6.8.



CHAPITRE DIX

Génétique bactérienne

I

Mutation et recombinaison

258

10.1 10.2 10.3 10.4 10.5

Les mutations et les mutants Les bases moléculaires de la mutation Le taux de mutation La mutagenèse La mutagenèse et la carcinogenèse : le test de Ames La recombinaison génétique

259 261 263 264

10.6

II

Échanges génétiques chez les procaryotes

10.7 10.8 10.9 10.10

10.13 10.14

La transformation La transduction Les plasmides : principes généraux Les types de plasmides et leur signification biologique La conjugaison : les caractéristiques essentielles La formation des souches Hfr et la mobilisation du chromosome La complémentation Les transposons et les séquences d’insertion

III

Génétique bactérienne et clonage

10.11 10.12

Pour bien comprendre comment un organisme croît, se développe et se reproduit, il est nécessaire de bien connaître ses propriétés génétiques. L’analyse génétique contribue à l’avancement des connaissances tant sur le plan fondamental qu’appliqué. L’échange génétique, illustré par ces bactéries en cours de conjugaison, est au cœur de la génétique bactérienne.

10.15 Le clonage moléculaire 10.16 Les vecteurs de clonage : les plasmides 10.17 Les vecteurs de clonage : le bactériophage lambda 10.18 La mutagenèse dirigée

IV

Le chromosome bactérien

10.19 La carte génétique du chromosome d’Escherichia coli

268 269

270 271 274 276 278 281 282 285 286

290 290 291 293 295

296 297



258 Chapitre 10


GLOSSAIRE Auxotrophe (auxotroph) Un organisme qui, par mutation, a perdu la capacité de synthétiser un nutriment essentiel et doit, en conséquence, le trouver dans le milieu. Carte génétique (genetic map) Représentation graphique de la position des gènes les uns par rapport aux autres sur un génome. Clonage en aveugle (shotgun cloning) Fabrication d’une banque de gènes par clonage de fragments d’ADN engendrés de manière aléatoire. Clonage moléculaire (molecular cloning) Isolement d’un fragment d’ADN étranger et incorporation dans un vecteur dans le but de le reproduire de façon conforme. Conjugaison (conjugation) Chez les procaryotes, mode de transfert de gènes et de recombinaison entre deux cellules par un mécanisme impliquant un contact cellulaire et un plasmide. Criblage (screening) Méthode d’identification et de tri de clones en se fondant sur les caractères phénotypiques ou génotypiques. Disruption génique (gene disruption) Interruption de la séquence codante d’un gène par introduction d’une autre séquence d’ADN. Également appelé knockout. Élément transposable (transposable element) Fragment d’ADN susceptible de se déplacer d’un endroit du génome vers un autre. Génotype (genotype) Constitue le patrimoine génétique, héréditaire de tout organisme. C’est l’ensemble des gènes portés sur la séquence ADN d’un chromosome ou d’un plasmide. Mutagène (mutagen) Agent chimique ou physique causant des mutations. Mutagenèse dirigée (site-directed mutagenesis) Technique permettant l’introduction d’une mutation précise dans la séquence d’un gène, suivie de la réinsertion du gène muté en remplacement de l’ADN sauvage correspondant. Mutant (mutant) Organisme dont le génome porte une mutation. Mutation (mutation) Modification permanente et héréditaire au niveau du génome d’un organisme.

D

ans ce chapitre, nous allons découvrir les principes de base et les techniques d’études de la génétique bactérienne. Nous aborderons en premier lieu les phénomènes de mutation et de recombinaison, puis nous verrons comment les gènes peuvent être transférés entre deux organismes. Ensuite, nous explorerons quelques-unes des techniques usuelles de manipulation de l’ADN qui ont révolutionné les études de génétique chez tous les organismes, de la bactérie à l’homme. Nous finirons par l’étude détaillée du chromosome d’Escherichia coli.

I

MUTATION ET RECOMBINAISON

Chaque organisme vivant possède dans son génome une séquence nucléotidique qui lui est propre. La mutation est un changement stable et héréditaire qui intervient au niveau d’une paire de bases de cette séquence. Cette modification, généralement localisée, peut se traduire par un effet visible avantageux ou au contraire négatif sur l’information génétique portée par la séquence. La recombinaison génétique est un autre processus qui conduit à la modification de l’information génétique. Elle met

Mutation ponctuelle (point mutation) Mutation affectant seulement une paire de bases dans une séquence. Phénotype (phenotype) L’ensemble des caractères somatiques apparents d’un organisme. Plasmide (plasmid) Molécule d’ADN extrachromosomique capable de se répliquer indépendamment et portant des caractères génétiques non essentiels à la cellule hôte. N’a pas d’existence exclusivement extracellulaire. Prototrophe Organisme parental à partir duquel est dérivé par mutation un organisme auxotrophe. Recombinaison (recombination) Processus par lequel tout ou partie de deux molécules d’ADN différentes se recombinent pour former une seule molécule hybride. Sélection (selection) Méthode consistant à placer une population d’organismes dans des conditions de croissance qui favorisent un génotype par rapport aux autres. Souche sauvage (wild type) Souche non mutée, en général celle qui prédomine dans la nature. Transduction (transduction) Transfert de séquences d’ADN entre différents génomes cellulaires, par l’intermédiaire d’un virus. Transformation (transformation) Modification du patrimoine génétique d’une cellule bactérienne par introduction d’une séquence d’ADN libre (voir chapitre 9). Transposon (transposon) Type d’élément transposable porteur d’autres gènes en plus de ceux impliqués dans la transposition. Vecteur (vector) Une molécule d’ADN qui, lorsqu’elle est répliquée dans la cellule hôte, permet la duplication simultanée de gènes étrangers qui ont été intégrés dans sa séquence. Vecteur de clonage (cloning vector) Élément génétique capable de se répliquer et permettant le transfert dans une cellule réceptrice d’un fragment d’ADN étranger préalablement inséré dans le vecteur.

en jeu un échange réciproque d’un ou plusieurs gènes entre chromosomes homologues. Le brassage de gènes qui résulte de ce processus permet l’apparition de nouvelles combinaisons génétiques en l’absence de toute autre mutation. Alors que la mutation a un effet limité et ponctuel sur l’information génétique, la recombinaison peut concerner de larges fragments du génome ce qui implique des modifications beaucoup plus importantes. Des portions entières de séquences portant de nombreux gènes, voire le chromosome dans son entier, peuvent même être transférées entre cellules. Mutation et recombinaison génétiques sont deux des principaux moteurs de l’évolution des espèces. À la différence de la plupart des eucaryotes, les procaryotes n’ont pas de véritable reproduction sexuée. Pourtant, il existe chez les micro-organismes procaryotes des mécanismes d’échange d’information génétique qui utilisent à la fois le transfert de gènes et la recombinaison. Ces mécanismes conduisent à des flux latéraux de gènes (également appelés transferts horizontaux de gènes) dans la mesure où l’information génétique est transférée latéralement, de cellule donneuse à cellule receveuse, plutôt que verticalement, de cellule mère à cellule fille. La détection d’un tel échange de gènes nécessite de disposer d’un marqueur de transfert signant la modification génétique. L’utilisation de souches mutantes permet cela. La mutation



10.1 Les mutations et les mutants 259

génétique peut être soit la modification d’une base ou d’un petit nombre de paires de bases dans la séquence ou bien même correspondre à l’insertion ou la délétion de gènes entiers. Nous allons débuter ce chapitre consacré à la génétique microbienne en étudiant les mécanismes moléculaires de la mutation et les propriétés qui en résultent chez les micro-organismes avant d’aborder l’analyse des échanges génétiques.

10.1 Les mutations et les mutants m n Chaque cellule contient un génome fait de molécules d’ADN double brin (voir section 7.1). Les mutations, qui résultent du changement stable et héréditaire d’une séquence nucléotidique d’ADN, donnent naissance à un mutant. Par définition, le mutant diffère de la souche parentale au niveau de son génotype, qui est l’ensemble des gènes qu’il possède. Mais en plus, la mutation peut également modifier le phénotype, c’est-àdire l’ensemble des caractères visibles que peut détecter l’expérimentateur, de la souche mutante par rapport à la souche parentale, qui, par définition, est appelée souche sauvage. Une souche mutante dérive en général d’une souche sauvage mais peut tout aussi bien désigner un mutant issu d’une souche elle-même mutante.

sont pas sélectionnables même si elles conduisent à une modification phénotypique bien visible. Un bon exemple illustrant ce phénomène est l’acquisition d’une résistance à un antibiotique. Un mutant résistant à une substance antibiotique est capable de croître en présence de concentrations de la molécule antibiotique telles qu’elles inhibent la croissance de la souche parentale sensible (voir figure 10.1a). Les conditions font que ce mutant résistant s’en trouve sélectionné. On aboutira à une sélection efficace de mutants si l’on connaît les conditions d’incubation qui permettent la croissance du mutant. La sélection est un outil génétique très puissant qui permet de trier et repérer facilement un individu mutant parmi des millions voire des milliards de colonies parentales. D’autres mutations sont au contraire non sélectionnables dans le temps. Par exemple, les mutations consistant en la perte de coloration chez un micro-organisme pigmenté (voir figure 10.1b). En culture sur boîte, la perte de pigmentation

L’obtention de mutants : criblage versus sélection En théorie, tout caractère peut être susceptible de mutation. Cependant, certaines mutations peuvent être sélectionnées, conférant ainsi à la souche mutante un avantage qui s’exprimera sous certaines conditions environnementales au point que les mutants remplaceront progressivement la souche parentale qui lui a donné naissance. D’autres, au contraire, ne

Shiladitya DasSarma, Priya Arora, Lone Simonsen

(a)

Peter T. Borgia

Une mutation ne se voit que si elle donne lieu à un phénotype différent et détectable par rapport au phénotype de la souche sauvage. Par convention d’écriture, le génotype d’un organisme est désigné par l’association de trois lettres minuscules suivies d’une lettre majuscule, toutes en italique et désignant le gène impliqué. Par exemple, le gène hisC d’Escherichia coli code la protéine HisC, impliquée dans la biosynthèse de l’histidine. Notez au passage que le produit du gène est également soumis à convention d’écriture par l’association des mêmes quatre lettres, la première et la dernière en majuscule. Les mutations successives du gène hisC seront notées par convention hisC1, hisC2 et ainsi de suite en fonction de l’ordre d’isolement des mutants, chaque mutation étant différente. Le phénotype d’un organisme est représenté par convention d’écriture par trois lettres, la première en capital, les deux autres en minuscule, suivies du signe + ou – selon que la fonction encodée par le gène est exprimée ou absente. Prenons l’exemple d’une souche d’E. coli His+ capable de synthétiser de l’histidine à la différence de la souche His– qui en est incapable. Pour se développer, la souche His– devra trouver dans son milieu un apport exogène d’histidine. Ainsi les mutations qui affectent le gène hisC peuvent aboutir au phénotype His– si la fonction de la protéine HisC dans la synthèse d’histidine est abolie.

T. D. Brock

Génotype versus phénotype

(b)

(c)

FIGURE 10.1 Mutations sélectionnables et non sélectionnables. (a) Développement, dans la zone d’inhibition de croissance d’un disque d’antibiotiques, de colonies de mutants dont le caractère de résistance peut être fixé génétiquement. (b) Exemples de mutation spontanée sur des colonies d’Aspergillus nidulans pigmentées ou non. Le type sauvage est pigmenté en vert alors que le mutant jaune est incapable de produire le pigment naturel. Les colonies blanches sont totalement dépourvues de pigment. (c) Exemple de colonies de Halobacterium (Archaea) sauvage (blanche) et mutante (brun orangé) : la couleur brun orangé de la colonie mutante résulte de l’absence de vésicules à gaz qui, chez la souche sauvage, masque la pigmentation en réfléchissant la lumière (voir section 4.12).



260 Chapitre 10


chez une souche mutante ne représente pas un caractère sélectif avantageux ni désavantageux par rapport à une souche sauvage pigmentée, quand bien même la pigmentation conférerait pourtant un avantage sélectif dans le milieu naturel. Ces mutations non sélectives et issues d’un événement rare sont repérables uniquement par l’observation d’un grand nombre de souches, méthode d’analyse appelée criblage.

L’isolement de mutants nutritionnels auxotrophes L’emploi de méthodes de détection directes de mutation représente souvent un travail qui peut être considérable car cela nécessite l’observation de milliers de boîtes. Certains types de mutations sont plus aisés à détecter si l’on connaît les conditions d’incubation qui permettent la croissance du mutant, liée aux propriétés apportées par la mutation. C’est le cas par exemple des mutants nutritionnels qui peuvent être aisément détectés par la technique des répliques ou empreintes de Lederberg (voir figure 10.2). La technique consiste à réaliser, à l’aide d’un tampon de velours stérile, une empreinte à partir d’une gélose nutritive sur laquelle se sont développées des colonies et à reporter cette empreinte sur une nouvelle gélose dépourvue du facteur de croissance étudié. Dans ces conditions, les souches sauvages pourront se développer sur cette nouvelle gélose tandis que les mutants nutritionnels ne pousseront pas. Par comparaison des deux boîtes gélosées, il est facile de détecter sur ce milieu minimum les clones mutants (voir figure 10.2b). Les colonies mutantes poussant uniquement sur milieu riche sont repérées et peuvent être par la suite mises en culture, purifiées et enfin caractérisées. Développement de toutes les colonies

Un mutant nutritionnel qui a besoin de trouver dans son milieu un facteur de croissance est dit auxotrophe, par opposition à la souche parentale sauvage dite prototrophe car capable de synthétiser le facteur nutritionnel indispensable à la croissance. Par exemple, une souche d’Escherichia coli His– est auxotrophe pour l’histidine car elle se développera sur un milieu contenant une quantité adéquate d’histidine mais pas sur un milieu dépourvu de cet acide aminé puisque la bactérie n’est plus apte à le synthétiser. Malgré son efficacité, la technique des répliques reste une méthode de criblage qui est laborieuse dans la mesure où il est nécessaire de réaliser de nombreux repiquages. Il existe une autre méthode ingénieuse permettant de détecter rapidement les mutants auxotrophes basés sur une sélection par résistance à la pénicilline. En général, les colonies de mutants nutritionnels sont moins compétitives que les colonies sauvages. Dans une culture où l’on recherche par exemple des mutants His–, les clones auxotrophes seront rares et il sera difficile et long de les détecter par la méthode classique des empreintes. On peut grandement améliorer l’obtention de mutants par enrichissement de la population sauvage en mutants His– grâce à une étape de sélection par culture en présence de pénicilline. Quel est le principe de fonctionnement de cette méthode ? La pénicilline est un antibiotique qui n’agit que sur les cellules en cours de croissance. Si l’on ajoute de la pénicilline au milieu de culture dépourvu en facteur nutritionnel nécessaire à la croissance du mutant auxotrophe, les cellules de la souche sauvage vont mourir tandis que les cellules mutées, incapables de se développer sans facteur nutritionnel, ne seront pas tuées par la pénicilline. Par ce procédé, on a enrichi la population initiale en mutants nutritionnels et après un lavage permettant de débarrasser la culture de toute trace d’antibiotique, on peut transférer cette culture

Absence de croissance des mutants

T. D. Brock

Toutes les colonies se développent

Boîte mère (milieu complet)

Incubation

Milieu complet

Réplique à l’aide d’un tampon de velours

Absence de développement des mutants

Milieu minimum Transfert de l’empreinte sur milieu neuf

Surface de velours stérile Élastique Poignée

Empreinte des colonies sur le velours

FIGURE 10.2 Mise en évidence de mutants auxotrophes. Les mutants nutritionnels peuvent être révélés par la technique de réplique sur boîte. Cet exemple illustre la mise en évidence de clones auxotrophes pour la leucine. L’image de gauche montre la boîte mère (milieu complet). Sur celle-ci, les colonies marquées d’une croix représentent les colonies mutantes qui, après réplique sur le milieu minimum (sans leucine), ne se sont pas développées (photo de droite). Ces colonies sont donc auxotrophes pour la leucine.



10.2 Les bases moléculaires de la mutation 261

sur milieu riche additionné du facteur indispensable à la croissance des auxotrophes. Les colonies qui se forment sont, pour la plupart, des clones mutants même si une proportion de cellules sauvages, ayant échappé à l’effet létal de la pénicilline, se développent également. Ceci correspond finalement à une méthode de sélection soustractive, dans laquelle on ne cherche pas à sélectionner directement les mutants mais, au contraire, à faire disparaître la souche sauvage. Cette méthode est souvent utilisée en première approche afin d’optimiser les chances de production de mutants auxotrophes. Quelques exemples de différents types de mutants auxotrophes et les méthodes de détection appropriées sont présentés dans le tableau 10.1.

10.2 Les bases moléculaires m n de la mutation

Contrôlez vos acquis La mutation est une modification ponctuelle stable et héréditaire dans la séquence ADN qui peut conduire à un changement phénotypique. Les mutations issues de sélection confèrent généralement au mutant un avantage de croissance sous certaines conditions environnementales et sont en conséquence très utilisées en recherche pour la compréhension des phénomènes génétiques. Si aucune sélection n’est possible, la technique du criblage reste l’approche la plus simple mais la plus fastidieuse. •

Définissez : mutation et mutant.

•

Faites la distinction entre criblage et sélection.

TABLEAU 10.1

Les mutations peuvent revêtir un caractère spontané ou bien être induites. Les mutations spontanées peuvent résulter d’une exposition aux radiations (radiations cosmiques, par exemple) qui endommagent la structure de la double chaîne d’ADN. Les radicaux libres (voir section 6.16) sont également responsables de modifications chimiques de l’ADN. Par exemple, la guanine peut être modifiée en 8-hydroxyguanine conduisant ainsi à des mutations au niveau de l’appariement des bases de la molécule d’ADN. Cependant la majorité des mutations spontanées résultent d’erreurs d’appariement de base qui apparaissent pendant la réplication de l’ADN. Les mutations qui portent sur un changement dans une paire de bases sont des mutations dites ponctuelles. Ces mutations ponctuelles naissent par substitution d’une paire de bases par une autre au cours de la réplication et peuvent conduire à une variation phénotypique selon que la modification touche ou non une région codante de l’ADN et selon l’emplacement exact du changement de base dans la séquence nucléotidique du gène.

La substitution d’une paire de bases Si une mutation ponctuelle se produit dans la séquence codante d’un gène, alors tout changement du phénotype de la cellule peut être considéré comme la conséquence directe d’une modification dans la séquence primaire du produit encodé par ce gène. L’erreur dans la séquence ADN se répercute au niveau de la séquence de l’ARNm lors de la transcription qui, à son tour,

DIFFÉRENTS PHÉNOTYPES DE MUTANTS

Phénotype

Modification

Détection du mutant

Auxotrophie

Perte d’activité enzymatique ; voie de biosynthèse altérée

Incapacité à se développer en absence du nutriment

Cryosensibilité

Modification d’une protéine essentielle conduisant à une inactivation à basse température

Incapacité à se développer à une température qui permet habituellement la croissance (température permissive devenue restrictive)

Résistance aux drogues

Modification de la perméabilité membranaire, modification de la cible, détoxification

Croissance en présence d’une concentration de drogue normalement inhibitrice

Absence de capsule

Perte de la capsule ou modification biochimique de ses constituants

Petites colonies rugueuses au lieu de grosses colonies muqueuses

Immobilité

Flagelle absent ou non fonctionnel

Colonies compactes au lieu de colonies plates et étendues

Non pigmenté

Perte ou inactivation d’une enzyme conduisant à la perte de la pigmentation

Pigmentation différente ou absence de pigmentation

Colonie rugueuse

Perte ou modification biochimique des lipopolysaccharides de la membrane externe

Colonies granuleuses et irrégulières au lieu de colonies lisses et brillantes

Fermentation des sucres

Perte d’activité enzymatique

Absence de virage de l’indicateur coloré du milieu de culture

Thermosensibilité

Modification d’une protéine essentielle Sensibilité accrue à la chaleur

Incapacité à se développer à la température habituelle mais capable de croître à une température inférieure

Résistance aux virus

Perte des récepteurs viraux

Croissance en présence de virus



262 Chapitre 10


donnera naissance, lors de la traduction, à un polypeptide dont la séquence en acides aminés sera faussée. En effet, le changement d’un des trois nucléotides formant le codon peut induire une modification plus ou moins importante du sens du messager dont l’importance varie selon la position et la nature du changement de base dans le triplet (voir sections 7.15 et 7.16). La figure 10.3 résume les différents changements possibles résultant d’une substitution au niveau d’une paire de bases au niveau de l’ADN dans la séquence d’un gène. Comme le code génétique est dégénéré (voir section 7.14), on peut s’apercevoir que la substitution au niveau de la séquence ADN ne se traduit pas inéluctablement par une modification au niveau de la séquence polypeptidique qui en découle. Dans notre exemple de la figure 10.3, qui illustre les différentes possibilités de changement suite à une mutation ponctuelle touchant un codon tyrosine, on constate que la substitution du triplet UAC en UAU n’a aucune incidence visible sur la séquence en acides aminés puisque ce triplet code également une tyrosine. Bien que la substitution de bases existe réellement au niveau du génotype, cette mutation est dite silencieuse car elle ne modifie pas la séquence primaire du polypeptide et n’a, par conséquent, aucun effet sur le phénotype de l’organisme. Dans le cas où il y a plus d’un codon pour un acide aminé, c’est généralement le remplacement de la troisième base du triplet qui conduit à ce type de mutation silencieuse (à l’exception toutefois des codons arginine et leucine qui peuvent être le siège de mutations silencieuses au niveau de la première base du triplet). Au contraire, une substitution au niveau de la première ou de la seconde base du triplet conduit généralement à une modification de la séquence en acides aminés. Par exemple, le changement du codon UAC en AAC (voir figure 10.3) a pour effet le

ADN

5′

TAC ATG

5′

Réplication normale de l’ADN

M MUTATION U TAT I O N

AAC

TAG

TAT

5′ T A C

TTG

ATC

ATA

ATG

ADN Transcription

AAC

UAG

UAU

Codon asparagine

Codon stop

Codon tyrosine

ARNm

5′ U A C

Codon tyrosine Traduction

Protéine erronée

Protéine tronquée

Protéine normale

Protéine normale

Mutation faux-sens

Mutation non-sens

Mutation silencieuse

Type sauvage

Protéine

FIGURE 10.3 Conséquences d’une mutation ponctuelle par substitution sur l’information génétique. La modification d’une seule base d’un codon peut aboutir à l’expression de trois formes protéiques différentes.

remplacement d’une tyrosine par une asparagine ce qui modifie la séquence polypeptidique. Ce second type de mutation ponctuelle est appelé mutation faux-sens. L’impact d’une telle mutation sur la fonction de la protéine varie selon que la substitution touche une région plus ou moins importante de la séquence polypeptidique – par exemple, le site actif chez une enzyme ou encore qui induit une modification du repliement de la protéine dont l’activité sera modifiée. La fonction de la protéine peut être au mieux altérée ou bien totalement perdue. Un troisième type de mutation ponctuelle par substitution conduit à la formation d’un codon stop. Elle détermine l’arrêt précoce de la traduction et entraîne la synthèse d’un polypeptide tronqué qui sera le plus souvent non fonctionnel. Ces mutations portent le nom de mutations non-sens car elles impliquent la conversion d’un codon sens en un codon nonsens ou stop (voir tableau 7.5). Même si le point de mutation est localisé à l’extrémité de la séquence codante, l’effet sera tel que le polypeptide qui en est issu perdra sa fonction. Les termes transition et transversion sont utilisés pour désigner la nature de la substitution d’une base par une autre. Des changements tautomériques modifiant les caractéristiques de liaison hydrogène des bases permettent des substitutions d’une purine par une purine (A ou G) ou d’une pyrimidine par une autre pyrimidine (C ou T). De telles substitutions sont appelées mutation de transition. Les mutations de transversion correspondent à la substitution d’une purine par une pyrimidine ou inversement.

L’addition ou la délétion d’une paire de bases : mutation par décalage du cadre de lecture Comme le code génétique contenu dans la séquence d’ADN est constitué d’une succession de codons triplet, l’addition ou la délétion d’une paire de bases entraînera un décalage de cadre de lecture (reading frameshift) pour tous les codons situés en aval. Les mutations par décalage du cadre de lecture ont généralement un effet très néfaste et déterminent des changements majeurs dans la séquence des protéines synthétisées (voir figure 10.4). Le plus souvent, ces micro-insertions ou microdélétions sont le fait d’erreurs au cours de la réplication. La séquence d’ADN peut également être le siège de délétions ou d’insertions beaucoup plus importantes portant sur des centaines voire des milliers de paires de bases entraînant la perte de fonctionnalité du gène ainsi touché. Certaines délétions sont si grandes qu’elles peuvent même porter sur plusieurs cistrons. Si l’un de ces gènes est essentiel pour l’activité cellulaire, la mutation sera létale pour l’organisme. La perte d’information génétique consécutive à de tels événements de délétion ne peut pas être restaurée par simple mutation réverse, seul un événement de recombinaison pourrait restaurer l’intégrité de la séquence originelle. C’est d’ailleurs ce qui permet de distinguer la mutation ponctuelle qui peut être corrigée par un second événement de mutation réverse de la délétion massive qui ne l’est pas. Parallèlement, l’insertion de grandes séquences nucléotidiques résulte typiquement d’erreurs au cours de phénomènes de recombinaison entre brins d’ADN. La plupart des événements d’insertion de grandes séquences ADN correspondent à l’intégration de séquences ADN particulières d’une longueur généralement comprise entre 700 et 1 400 pb que l’on appelle séquences d’insertion



10.3 Le taux de mutation 263 ADN ...GTGCCCTGTT... ...CACGGGACAA...

Transcription

ARNm

Cadre de lecture

...GUG CCC UGU U...

+1

Insertion Codons ...GTGCCTGTT... ...CACGGACAA...

...GUG CCU GUU ...

0

Délétion ...GTGCTGTT... ...CACGACAA...

...GUG CUG UU...

–1

FIGURE 10.4 Modification du cadre de lecture dans l’ARNm (frame-shift) par insertion ou délétion dans l’ADN. Le ribosome traduit le cadre de lecture sur l’ARNm à partir de l’extrémité 5’ en utilisant les triplets de nucléotides (le codon, voir section 7.14). Toute insertion ou délétion d’un non-multiple de trois bases dans la séquence d’ADN entraîne, au niveau de l’ARNm, une modification du cadre de lecture reconnu par le ribosome (voir section 7.14). Ici, le cadre de lecture normal (au centre) est noté 0. Par rapport à ce cadre de lecture, la délétion d’une base (en bas) est notée –1 tandis que l’addition d’une base (en haut) est notée +1. Utilisez le tableau 7.5 pour déterminer l’impact de la modification sur la traduction.

ou séquences IS, un type d’éléments transposables (voir sections 7.4 et 10.14). D’autres événements impliquant des réarrangements au sein de la molécule d’ADN, comme les phénomènes de translocation où une portion d’ADN chromosomique est déplacée vers un autre endroit du chromosome, (voire sur un autre chromosome chez les eucaryotes) ou encore des inversions de séquences entières, sont également susceptibles de générer ce type de mutation.

Transposon et mutagenèse dirigée Les phénomènes de mutation que nous venons de décrire apparaissent en général de façon aléatoire sur le chromosome. Les mutations qui impliquent des éléments transposables entrent dans cette catégorie puisqu’ils peuvent se déplacer et s’insérer en plusieurs endroits du chromosome. Toutefois, il faut remarquer que lorsqu’un transposon s’insère dans un gène (voir section 10.14), il peut le rendre inactif, ce qui a conduit les généticiens à utiliser les transposons comme agents mutagènes. Grâce aux progrès réalisés en technologie de l’ADN recombinant (voir sections 10.15 à 10.17) et à l’emploi d’ADN synthétique (voir section 7.8), il est devenu possible de réaliser des mutations très ciblées en des sites spécifiques de la séquence ADN. C’est la mutagenèse dirigée dont nous parlerons plus en détail dans la section 10.18.

Mutation inverse ou réversion Les mutations ponctuelles sont habituellement réversibles et le phénotype initial restauré. C’est la réversion. Un révertant est une souche mutée qui semble avoir retrouvé son phénotype d’origine. Il existe deux possibilités de réversion. Une mutation réverse vraie reconvertit la séquence nucléotidique mutée en la séquence nucléotidique d’origine au nucléotide près. Le

phénotype sauvage peut aussi réapparaître suite à une seconde mutation qui corrige les effets de la première mutation. C’est la mutation suppresseur qui restaure le phénotype originel même si les séquences nucléotidiques (le génotype) ne sont pas identiques. Il existe plusieurs classes de mutation suppresseur : 1) la suppression intragénique qui correspond à une seconde mutation à proximité de la première dans le même gène et qui restaure la fonction protéique (un second décalage du cadre de lecture par exemple) ; 2) la suppression extragénique dans laquelle une nouvelle mutation touche un second gène et qui aboutit à la restauration de l’activité du premier ou bien 3) une mutation dans un autre gène qui donne naissance à une enzyme dont l’activité va remplacer celle de la première devenue déficiente. À la différence des mutations ponctuelles, les mutations qui impliquent de grandes portions de séquences ne sont pas réversibles. Toutefois, la simple délétion de la séquence qui s’est insérée permet de recouvrer le phénotype originel. Globalement, les mutations par décalage du cadre de lecture, quelle que soit leur importance, sont difficilement réversibles car elles sont génétiquement stables. C’est d’ailleurs l’une des raisons pour lesquelles on utilise souvent ce type de mutant dans les études de croisement génétique, afin d’éviter autant que possible les phénomènes de réversion fréquents et difficilement contrôlables qui caractérisent les autres mutations ponctuelles.

Contrôlez vos acquis Les mutations, spontanées ou induites, résultent de modifications dans la séquence du génome d’un organisme. Une mutation ponctuelle, qui correspond à un changement d’une seule paire de bases, peut conduire soit à la modification d’un acide aminé dans la séquence protéique (mutation faux-sens) soit à aucun changement selon la position de la base mutée dans le codon (mutation silencieuse). La mutation non-sens implique la conversion d’un codon sens en codon d’arrêt (codon stop) ce qui aboutit à la production d’une protéine tronquée. Les événements de délétions ou d’insertions, de même que les mutations par décalage du cadre de lecture qui en résultent, ont une incidence plus dommageable pour la séquence puisqu’ils aboutissent à des pertes de fonctions chez les gènes touchés. Définissez mutation et mutant. •

Expliquez pourquoi les mutations ponctuelles peuvent être spontanément réversibles.

•

Les gènes codant les ARN de transfert sont-ils susceptibles de mutations faux-sens ?

10.3 Le taux de mutation m n Le taux de mutation varie énormément selon le type de mutation. Certaines mutations sont si rares qu’elles sont pratiquement indétectables tandis que d’autres, au contraire, sont si fréquentes qu’elles posent problème lorsqu’il s’agit de maintenir durablement ce génotype particulier en culture. Le taux



264 Chapitre 10


usuel d’erreur lors d’un cycle de réplication est compris entre 10–7 et 10–11 par base. Si l’on considère qu’un gène est constitué en moyenne de 1 000 paires de bases, le taux de mutation d’un gène donné sera de l’ordre de 10–4 à 10–8 par génération. Par exemple, dans une culture bactérienne dont la concentration est de 108 cellules/mL, pour un gène donné, il y a assurément un certain nombre de mutants par millilitre de culture. Lorsqu’un changement de base se produit dans la séquence ADN, cela conduit le plus souvent à une mutation faux-sens plutôt que non-sens dans la mesure où la plupart des modifications dans les codons se traduisent par une substitution d’acide aminé (voir tableau 7.5). Ensuite, par ordre décroissant de fréquence, apparaissent les mutations silencieuses dans lesquelles la substitution touche préférentiellement la troisième base du triplet ce qui se traduit par un codon muté qui code le même acide aminé. Ainsi, par simple substitution d’une paire de bases, un codon peut être modifié en 27 autres codons différents. Sur ces 27 possibilités, en moyenne, deux de ces substitutions donneront une mutation silencieuse, une se traduira par une mutation non-sens tandis que toutes les autres seront des mutations faux-sens. Il existe aussi des séquences d’ADN, généralement celles dans lesquelles on trouve de nombreuses répétitions courtes, qui sont des points chauds de mutation où le taux de mutation est beaucoup plus élevé. Ces points chauds, au niveau desquels le taux d’erreur de l’ADN polymérase peut être beaucoup plus important, dépendent en grande partie de l’environnement nucléotidique dans lequel ils se situent. Mais, à moins que la mutation touche un caractère bien visible ou facile à quantifier, le généticien doit faire preuve de beaucoup d’ingéniosité pour rendre détectable la mutation qui, le plus souvent, demeure extrêmement discrète. Nous verrons dans le prochain paragraphe qu’il est possible d’augmenter significativement le taux de mutation par l’emploi d’agents mutagènes. Nous verrons également que la fréquence de mutation peut varier sous certaines conditions, comme dans des situations de stress dans lesquelles des mutations adaptatives, en partie générées par l’organisme lui-même, sont préférentiellement sélectionnées pour assurer sa survie (voir section 10.4).

Les mutations dans les génomes à ARN À la différence de tous les organismes cellulaires qui possèdent un génome à ADN, certains virus ont un génome à ARN qui peut également être le siège de mutations (voir sections 9.1, 16.1, 16.7 à 16.10, 16.15). Mais ces génomes à ARN ont la particularité d’avoir un taux de mutation qui est environ 1 000 fois supérieur à celui des génomes à ADN. Comment peut-on expliquer ce phénomène ? Comme les ADN polymérases, certaines ARN polymérases sont douées d’activité de correction d’erreur (voir section 7.6). Cependant, il n’existe pas de système de réparation de l’ARN équivalent aux systèmes de réparation de l’ADN capables de réparer les erreurs ou les mutations avant qu’elles ne soient définitivement fixées dans la séquence. Ceci concourt grandement à augmenter le taux de mutation chez ces génomes à ARN. Mais cette variabilité a des effets non négligeables, comme la capacité des virus pathogènes à évoluer rapidement et à donner naissance à

des populations virales dont la virulence fluctue énormément. C’est le cas du virus du SIDA (voir sections 16.15 et 26.14) qui pose de véritables défis à la médecine humaine.

Contrôlez vos acquis Le taux de mutation peut varier selon les types de mutations. Chez les procaryotes, le taux de mutation habituellement rencontré au niveau de la séquence nucléotidique est de l’ordre de 10–7 à 10–11. Quoique les ARN polymérases, tout comme les ADN polymérases, aient un taux d’erreur à peu près similaire, les génomes viraux à ARN cumulent un taux de mutation beaucoup plus important que les génomes à ADN. •

Des mutations faux-sens et non-sens, quelles sont celles qui sont les plus fréquentes ? Expliquez pourquoi.

•

Pour quelles raisons les génomes viraux à ARN sont-ils moins stables ?

10.4 La mutagenèse m n Si le taux de mutation naturelle est généralement faible, de nombreux produits chimiques, biologiques ou des traitements physiques, sont capables d’induire des mutations et d’augmenter ce taux. Ce sont les agents mutagènes.

Les agents chimiques Il existe de nombreux agents chimiques capables de provoquer des mutations. Les mutagènes peuvent être classés d’après leur mécanisme d’action (tableau 10.2). Trois modes d’action peuvent être distingués : l’incorporation d’analogues de bases, des appariements erronés et l’intercalation d’agents chimiques entre deux bases d’ADN. Les analogues de bases ressemblent aux bases puriques et pyrimidiques et peuvent être incorporés lors de la réplication qui se déroule normalement. Mais après incorporation, ces composés montrent un appariement différent de celui des bases auxquelles ils se substituent, ce qui conduit à des mutations stables qui sont révélées dans la descendance (voir figure 10.5). D’autres agents chimiques sont capables de modifier la structure d’une base et, en conséquence, ses propriétés d’appariement. Par exemple, les agents alkylants comme la nitrosoguanidine (les agents chimiques réagissent fortement avec les groupements amine, carboxyl ou hydroxyl des protéines ou des acides nucléiques en leur substituant des groupements alkyl) sont de plus puissants agents mutagènes que les analogues de bases. Ceci s’explique par le fait que ces agents mutagènes induisent les mutations même en absence de réplication contrairement aux analogues de bases. Les analogues de bases comme les agents alkylants conduisent finalement à des substitutions de bases (voir section 10.2). Un troisième type d’agents chimiques mutagènes regroupe les agents intercalants (acridine orange, proflavine), qui, par leur structure plane, déforment l’ADN lorsqu’ils viennent



10.4 La mutagenèse 265

TABLEAU 10.2

AGENTS MUTAGÈNES ET LEUR MODE D’ACTION

Agent

Action

Résultat

Analogues de base 5-Bromo-uracile

Mésappariement : incorporée à la place de la thymine, elle appelle l’incorporation de guanine plutôt que d’adénine

Transition AT → GC ; parfois GC → AT

2-Aminopurine

Mésappariement ; incorporée à la place de l’adénine, elle appelle l’incorporation de cytosine

Transition AT → GC ; parfois GC → AT

Acide nitreux

Désamination des bases A et C

AT→ GC et GC→ AT

Hydroxylamine

Hydroxylation des groupements 6-amino des C

GC → AT

Monofonctionnel (par exemple, sulfonate d’éthyl-méthane)

Introduit un groupement méthyle sur G ; mésappariement avec T

GC → AT

Bifonctionnel (moutarde à l’azote, mitomycine, nitrosoguanidine)

Mutation ponctuelle ou sur plusieurs bases, excision de portion d’ADN, formation d’adduits et de liaisons intra- et intercaténaires au niveau de l’ADN

Mutation ponctuelle, délétion, arrêt de la transcription

S’intercale entre deux paires de bases

Insertion ou délétion d’une paire de bases

UV

Formation de dimères de pyrimidines

La réparation peut conduire à une erreur ou à une délétion

Radiations ionisantes (par exemple, les rayons X)

Attaque d’un radical libre, cassure de l’ADN

La réparation peut conduire à une erreur ou à une délétion

Agents chimiques modifiant l’ADN

Agents alkylants

Agents intercalants Acridine orange, bromure d’éthidium Radiation

Analogue de base

Base substituée O

O H

Br

N

O

H O

N

N

H

(a)

CH3

N

H

5-Bromo-uracile

s’intercaler entre les bases de l’hélice. Ainsi lors de la réplication, la conformation anormale de l’hélice peut conduire à l’insertion ou la délétion d’une ou plusieurs paires de bases dans la molécule d’ADN. Les colorants d’acridine sont typiquement impliqués dans les mutations de type décalage du cadre de lecture. Le bromure d’éthidium, qui est classiquement utilisé pour révéler l’ADN ou l’ARN dans les gels d’électrophorèse (voir section 10.12), est lui aussi un agent intercalant capable d’agir comme agent mutagène.

Thymine

Les radiations

N

N H2N

N

N

2-Aminopurine

H2N

H

N

N N

H

N

Adénine

(b) FIGURE 10.5 Analogues de bases nucléotidiques. Exemple de deux analogues structuraux et des bases substituées. (a) Le 5-Bromo-uracile est capable de s’apparier avec une guanine provoquant la transition de AT vers GC. (b) Le 2-Aminopurine peut s’apparier avec la cytosine, ce qui aboutit à la transition AT vers GC.

De nombreuses formes de radiations sont extrêmement mutagènes. On distingue les radiations non ionisantes des radiations ionisantes ou électromagnétiques (voir figure 10.6). Des deux catégories, la seconde est la plus utilisée en génétique microbienne pour induire des mutations. Les bases puriques et pyrimidiques de l’ADN absorbent fortement les radiations ultraviolettes (UV) avec un maximum à la longueur d’onde de 260 nm (voir figure 7.9). Les effets qui résultent de cette absorption sont probablement la cause première de la mortalité des cellules. Parmi les effets constatés, le principal est la formation de dimères de pyrimidine. Deux bases pyrimidiques (cytosine ou thymine) adjacentes dans un brin d’ADN forment deux liaisons covalentes ce qui induit une erreur de lecture de l’ADN polymérase à cet endroit. Techniquement, pour induire des mutations, on emploie généralement



266 Chapitre 10

Génétique bactérienne Spectre électromagnétique

Rayons ionisants Rayons X Rayons cosmiques Longueur Rayons gamma d’onde –6 –4 –2 100 102 (nm) 10 10 10

200

Ultraviolet

400

Micro-ondes Ondes radar Ondes hertziennes Ondes radio 104 106 108 1010

600

Visible

800

Infrarouge

FIGURE 10.6 Le spectre électromagnétique. Les parties du spectre encadrant le visible sont agrandies en bas de la figure. Les radiations ultraviolettes ont des longueurs d’onde légèrement plus courtes que le rayonnement visible. Plus courte est la longueur d’onde de la radiation, plus forte est l’énergie de radiation. L’ADN absorbe à 260 nm.

une lampe à UV (germicide) dont le spectre d’émission est calé sur la longueur d’onde 260 nm. Une dose létale tuant environ 50 à 90 % des cellules est appliquée sur la culture. Les mutants sont ensuite recherchés parmi les cellules survivantes (voir section 20.2). Si une dose trop faible est appliquée, l’effet dommageable ne sera pas assez conséquent pour avoir des chances suffisantes de détecter les mutants. À l’opposé, une dose trop forte est si dommageable que le nombre de cellules viables sera alors trop faible pour espérer trouver des mutants. Bien maîtrisée, cette méthode simple est très efficace pour produire des mutants, sans avoir recours à d’autres produits chimiques.

Les radiations ionisantes Les radiations ionisantes, qui sont des radiations de longueur d’onde très courte ou à haute énergie comme les rayons X, les rayons cosmiques et les rayons gamma, ont un pouvoir mutagène encore plus puissant que les rayons UV (voir figure 10.6). Ces radiations agissent en faisant perdre des électrons aux atomes ou en les ionisant. Elles provoquent de nombreux changements dans les cellules en cassant les liaisons hydrogène ou en oxydant les doubles liaisons ce qui produit indirectement des mutations. Parmi les produits générés par les radiations ionisantes, on peut également citer les radicaux libres, dont les plus importants sont certainement les radicaux hydroxyles (OH–) (voir section 6.16). Ces radicaux libres interfèrent ou détruisent les macromolécules de la cellule dont l’ADN. Si des doses légères de radiations ionisantes induisent quelques cassures ou mutations sur la molécule d’ADN, à fortes doses, elles deviennent véritablement létales pour la cellule. Comme les radiations ionisantes pénètrent profondément les tissus et sont capables de traverser facilement les matériaux comme le verre, à la différence des UV,

elles sont plus souvent utilisées lors d’expériences de mutagenèse pour induire des mutations chez les plantes ou les animaux car elles pourront plus facilement atteindre les cellules reproductrices dans ces organismes. Au contraire, leur utilisation en génétique microbienne reste finalement peu développée en raison de leur dangerosité et de la facilité d’emploi qu’offrent les rayons UV et leur efficacité en tant qu’agents mutagènes sur ces organismes.

Les mutations engendrées au cours de la réparation de l’ADN : le système SOS Les mutations étant des phénomènes héréditaires, toute erreur produite lors de la synthèse d’ADN et qui sera corrigée avant que la cellule ne se divise, n’aura pas de conséquence au niveau du génotype de la descendance. Il est des dommages au niveau de l’ADN qui ne sont pas reproduits au cours de la réplication. C’est le cas, par exemple, des dimères de pyrimidine qui ne sont pas répliqués sous cette forme, aboutissant à deux molécules d’ADN porteuses chacune de dimères de pyrimidine. Ainsi, si ce type de dommage ne peut être réparé, le processus de réplication peut se trouver bloqué et conduire à la mort de la cellule. C’est la raison pour laquelle les cellules possèdent différents mécanismes de réparation qui permettent de corriger les erreurs ou les dommages subis par la molécule d’ADN. Si la plupart des processus de réparation sont virtuellement fidèles, certains mécanismes de réparation sont au contraire fautifs dans le sens où ils génèrent eux-mêmes des mutations. Chez E. coli, la plupart des lésions sont éliminées par des processus de réparation fidèles qui utilisent le brin complémentaire comme modèle (la réparation par réversion, la réparation par excision et la recombinaison). Mais si les dommages sont très importants, les agents qui provoquent des dommages à l’ADN, entraînent une réponse globale, dite réponse SOS. Cette réaction consiste en l’induction de l’expression de nombreux gènes, ce qui permet à la bactérie de réparer son ADN, de continuer la réplication et de se diviser. Dans ce cas, les lésions résiduelles sont prises en charge par un processus hautement mutagène appelé synthèse translésionnelle qui force la machinerie réplicative à utiliser une matrice endommagée et simple brin. Ces mécanismes, appelés aussi mécanismes de réparation fautifs, prennent le relais des systèmes de réparation conservatifs et fidèles. Ainsi, en cas d’agression massive, les systèmes de réparation conservatifs sont saturés et cela pourrait conduire à la mort cellulaire. Les systèmes fautifs suppléent au prix d’un manque de fidélité dans la transmission du code génétique. La mutation est donc le prix à payer par la bactérie pour survivre. Dans des conditions optimales de croissance bactérienne, les gènes des systèmes réparateurs sont réprimés. Ils sont soumis à l’action répressive d’un régulateur commun, le répresseur protéique LexA (voir figure 10.7). Quand les erreurs sont suffisamment graves pour arrêter la synthèse de l’ADN, l’arrêt de la réplication provoque l’apparition d’ADN monocaténaire. Celui-ci est reconnu par l’enzyme de réparation RecA. L’enzyme de réparation agit en détruisant, par son activité protéolytique, la protéine LexA. RecA est une enzyme bifonctionnelle qui va induire ainsi l’expression de plusieurs autres gènes, ayant tous un rôle important dans la réparation de



10.4 La mutagenèse 267

l’ADN. La protéine RecA, toujours présente en petite quantité, est attirée par l’ADN simple brin formé par la discontinuité de la double hélice. RecA forme un filament hélicoïdal autour du brin d’ADN. Le répresseur LexA s’attache au complexe ADN simple brin RecA sur lequel il est clivé par l’activité protéase ainsi activée. L’inactivation du répresseur LexA constitue un signal SOS. La vingtaine de gènes SOS, impliqués dans les divers processus de réparation, sont alors exprimés. Avec le déclenchement du système SOS, la réplication de l’ADN porteur de lésion, qui présente une discontinuité dans sa double hélice, reprend. Dans ces conditions d’urgence, le complexe de réplication ignore la lésion qui se trouve sur le brin parental et synthétise un brin fils en face de la lésion. On observe, entre autres, la synthèse de la protéine RecA qui induit donc sa propre activation, l’activation du gène uvrA, dont le produit est impliqué dans la réparation par excision, l’activation des gènes umuCD dont les produits participent à la synthèse de l’ADN polymérase V qui joue un rôle important dans la synthèse translésionnelle (voir figure 10.7). L’ADN polymérase IV est également produite de façon concomitante. L’ensemble de ces enzymes est également connu sous le nom d’ADN mutases. Les fonctions SOS s’éteignent, lorsque la réparation restaure la structure de la double hélice et fait ainsi disparaître le signal SOS. Outre son impact sur le taux de mutation dans la cellule, le système SOS joue également un rôle central dans la réplication des phages tempérés (voir section 9.10).

Un dommage à l’ADN induit l’action protéolytique de RecA

n

pa r

tie

lle

Inactivation de LexA par RecA

re s

sio

Olex

Ré p

Protéine LexA

Ré

pr

es

Olex

uvrA

Olex

UmuD : protéine impliquée dans la synthèse translésionnelle d’ADN umuD

sio

n

lexA

Opérateur Partie codante lexA

recA UvrA : protéine de réparation de l’ADN (excision de base)

Répression

Contrôle répressif de LexA Olex

Protéine RecA

FIGURE 10.7 Mécanisme de la réponse SOS. Tout dommage important de l’ADN conduit à l’activation de l’activité protéolytique de RecA qui va cliver la protéine LexA. La protéine LexA réprime habituellement le gène recA et les gènes de réparation de l’ADN uvrA et umuD (la protéine UmuD intervient dans la constitution de l’ADN polymérase V). Cependant la répression n’est pas complète. Le gène recA est donc exprimé à un faible niveau même en présence du répresseur LexA. Lorsque LexA est inactivé, tous ces gènes deviennent actifs.

Variation du taux de mutation Un taux de mutation le plus faible possible est nécessaire pour préserver la bonne stabilité des génomes et la perpétuation des espèces. Toutefois, une fidélité absolue est incompatible avec l’évolution. C’est pourquoi chaque espèce possède un taux de mutation faible mais décelable. Ceci permet à l’organisme de préserver son patrimoine génétique le plus fidèlement possible tout en lui donnant la possibilité d’évoluer favorablement au cours du temps. Le fait que des micro-organismes aussi différents que les Archaea hyperthermophiles (voir chapitre 13) et Escherichia coli possèdent à peu près le même taux de mutation pourrait faire penser que les organismes au taux de mutation le plus bas possible ont été sélectionnés au cours de l’évolution. Mais il n’en est rien. Il est possible de modifier ce taux de mutation. Par exemple, des mutants aux capacités de réplication et de réparation extrêmement performantes ont été sélectionnés au laboratoire. Mais cet avantage a un coût métabolique non négligeable au point que ces mutants sont en fait désavantagés en conditions naturelles. D’un autre côté, certains micro-organismes mutants paraissent au contraire profiter de leur phénotype très singulier qui leur confère la capacité d’occuper des niches écologiques très particulières. Deinococcus radiodurans en est un bon exemple (voir section 12.34). Ce micro-organisme est 20 fois plus résistant aux radiations UV et 200 fois plus résistant aux radiations ionisantes que ne l’est E. coli. Cette propriété, qui est due à la fois à la présence de systèmes de réparation de l’ADN très performants ainsi qu’à la capacité unique à exporter les nucléotides endommagés hors de la cellule, permet à cette bactérie de survivre dans des environnements où aucun autre organisme ne le pourrait, comme près de sources de radioactivité ou encore sur des poussières de particules exposées aux rayons cosmiques. À côté de ces phénotypes extrêmement particuliers, certains micro-organismes ont une meilleure capacité d’adaptation parce qu’ils ont un taux de mutation plus élevé. Comme les systèmes enzymatiques de réparation de l’ADN sont codés par des gènes, ils sont eux-mêmes sujets à mutation. Prenons le cas du gène dnaQ qui code la sous-unité de l’ADN polymérase III impliquée dans la fonction de correction d’erreur en cours de réplication (voir section 7.6). Certaines mutations touchant ce gène donnent des mutants viables mais dont l’instabilité génétique est plus grande en raison d’une capacité de correction d’erreur amoindrie. D’autres mutations touchant un certain nombre de gènes impliqués dans la réparation de l’ADN conduisent à ce phénotype hypermutateur ou mutator. Ce phénotype semble sélectionné dans les environnements très complexes et changeants, ce qui laisse supposer que, quel que soit le désavantage associé à cette hypermutabilité, celuici est compensé par sa capacité à générer un plus grand nombre de mutations potentiellement utiles rendant les microorganismes qui en sont porteurs fonctionnellement mieux adaptés à ces environnements. Si les mutations induites par le système SOS tout comme celles qui sont à l’origine du phénotype mutator sont subies par le micro-organisme, ce dernier est aussi capable d’augmenter son taux de mutation afin de gagner en adaptation en conditions de stress. Face à une situation de mort programmée, ces mutations adaptatives représentent l’alternative permettant la survie.



268 Chapitre 10


Le taux de mutation peut être augmenté en présence d’agents mutagènes dont la nature peut être chimique, biologique ou physique. Les modes d’action de ces agents mutagènes sont variés. Cependant, tant que les dommages causés à l’ADN sont réparés avant réplication, il ne peut y avoir mutation génétique. Dans certaines situations, s’ils ne sont pas réparés, les dommages à l’ADN sont si conséquents qu’ils deviennent létaux pour la cellule. Pour faire face, les organismes ont développé à la fois des systèmes de réparation fidèles ou conservatifs et des systèmes de réparation fautifs et infidèles comme le système SOS. •

Décrivez le mode d’action des différentes classes d’agents mutagènes.

•

Pour quelles raisons le phénotype mutator est-il bien adapté dans les environnements aux conditions très changeantes ?

10.5 La mutagenèse et la carcinogenèse : m n le test de Ames Les techniques de détection et de sélection des mutants ont été appliquées à l’étude des produits chimiques dangereux présents dans l’environnement. Parce qu’il est facile et rapide de détecter la présence de mutants au sein des populations, les bactéries représentent un bon outil pour détecter les substances chimiques mutagènes et potentiellement cancérogènes. Dans notre société moderne, où l’homme est en contact permanent avec une diversité impressionnante de substances chimiques naturelles ou artificielles tant dans l’agriculture qu’en industrie, il est devenu évident qu’une forte proportion des cancers était liée à cette exposition récurrente. Ainsi se doter de moyens pour détecter et identifier les substances potentiellement cancérogènes est devenu indispensable. Même si tous les produits mutagènes ne sont pas cancérigènes, on constate que presque tous les agents cancérogènes sont mutagènes. Aussi, on a mis à profit cette connaissance pour mettre au point des tests de détection qui exploitent les avantages des techniques de sélection ainsi que la rapidité de croissance des bactéries. On est redevable à Bruce Ames et à son équipe de l’université de Californie à Berkeley d’avoir imaginé et développé un test rapide et efficace de détection des produits potentiellement cancérogènes (voir figure 10.8).

Le principe du test de Ames Le principe du test de Ames repose sur la recherche d’une augmentation du taux de mutation inverse (phénomène de réversion) dans une population de bactéries auxotrophes mise en présence de la substance potentiellement cancérogène. Pour que le test ne soit pas biaisé, la mutation génétique analysée doit être une mutation ponctuelle de telle sorte que son taux de mutation ne soit pas différent de celui qui a donné naissance à la première mutation. Lorsqu’une suspension dense de cette souche bactérienne auxotrophe (pour un acide aminé, par exemple) est étalée sur milieu

T. D. Brock


FIGURE 10.8 Évaluation de l’effet mutagène d’une molécule par le test de Ames. Deux boîtes de Petri sont ensemencées par une culture d’un mutant de Salmonella enterica auxotrophe (histidine–). Le milieu ne contenant pas d’histidine, seules les cellules révertantes vers le type sauvage sont capables de se développer. Des colonies de bactéries révertant spontanément apparaissent sur les deux boîtes. Cependant la présence du produit chimique sur le disque de papier dans la boîte test (à droite) a eu pour effet d’augmenter le taux de mutation si l’on en juge par la quantité très importante de colonies autour du disque. La boîte de gauche, avec un disque imprégné d’eau, sert de témoin de contrôle. Dans la boîte test, les cellules révertantes ne se développent pas tout contre le disque en raison de la concentration trop importante du produit mutagène qui est létale.

minimum, aucune croissance n’apparaîtra à l’exception toutefois de quelques colonies qui seront issues de la croissance des cellules naturellement révertantes. En général, sur environ 108 cellules étalées sur milieu minimum, on s’attend à observer 10 à 20 cellules révertantes en moyenne (voir figure 10.8, photo de gauche). Si la substance chimique à tester possède un effet mutagène, alors le nombre de mutants révertants sera corrélativement accru dans la population bactérienne. On verra alors un nombre significativement plus important de colonies croître sur le milieu minimum en présence de la substance chimique. Des souches sélectionnées de Salmonella enterica (sérotype typhimurium) porteuses d’une mutation (His–) qui les rend incapables de se multiplier en milieu synthétique dépourvu d’histidine et des souches d’Escherichia coli auxotrophes pour le tryptophane sont utilisées dans ce test. Afin d’accroître la sensibilité du test, deux éléments additionnels ont été apportés. Le premier réside dans l’emploi de souches bactériennes défectueuses dans leur système de réparation fidèle de l’ADN (voir section 10.3). Ceci limite la capacité de réparation des mutations reverses engendrées par la présence de la substance chimique dont le pouvoir mutagène est testé. Le second consiste à ajouter des extraits enzymatiques de foie de telle sorte que la molécule chimique puisse apparaître sous une forme active. En effet, il a été démontré que, la plupart du temps, les composés chimiques ne deviennent mutagènes et donc cancérogènes qu’à la suite de modifications de leur structure chimique, une fois ingérés ou métabolisés dans le corps humain. Ces modifications interviennent précocement au niveau du foie où des enzymes de type oxygénase à fonction mixte, qui sont impliquées dans les processus de détoxification, sont capables, à partir des composés chimiques bruts, de générer des formes actives hautement réactionnelles (et donc mutagènes) avec l’ADN.



10.6 La recombinaison génétique 269

Pratiquement, la substance chimique à tester est mise en présence d’extraits enzymatiques de foie de rat, dans un premier temps. Ensuite, la matière active est reprise sur un disque de papier-filtre, qui sera déposé au centre d’une gélose de milieu minimum sur laquelle aura été préalablement étalée la suspension bactérienne auxotrophe. Après une nuit d’incubation, on peut constater le pouvoir mutagène (et potentiellement cancérogène) en comparant le nombre de colonies révertantes qui sont apparues à proximité du disque de papier imprégné de la substance chimique par rapport à un témoin (voir figure 10.8). Il est souvent nécessaire de pratiquer l’expérience à différentes concentrations en présence de témoins car, selon la dose utilisée, la substance peut s’avérer létale pour les bactéries. L’expérience, acquise au fil des années et répétée sur de très nombreuses substances, a démontré tout l’intérêt et l’efficacité du test de Ames dans la mise en évidence des cancérogènes.

Contrôlez vos acquis Le test de Ames est une méthode de choix simple, basée sur l’utilisation de bactéries auxotrophes, pour détecter le pouvoir cancérogène des substances chimiques dans l’environnement. •

Sur quel principe particulier repose le test de Ames ?

•

En quoi le fait de détecter le pouvoir mutagène d’un produit est-il important dans la prévention des cancers ?

10.6 La recombinaison génétique m n La recombinaison génétique est un processus dans lequel il y a un échange physique de gènes entre des éléments génétiques au sens large (chromosomes, plasmides, etc.). Dans cette section, nous aborderons la recombinaison générale (ou homologue), la forme la plus courante qui implique un échange réciproque entre une paire de séquences d’ADN homologues. Des séquences sont dites homologues lorsqu’elles possèdent une séquence nucléotidique très similaire sinon identique. Dans ces conditions, un échange de séquences plus ou moins longues peut se produire entre les deux molécules d’ADN. Ce type de recombinaison est impliqué dans le phénomène génétique appelé crossing-over.

La recombinaison homologue : bases moléculaires Le processus de la recombinaison a été particulièrement bien étudié chez les procaryotes, les virus et aussi certains champignons comme la levure. Chez les bactéries, la recombinaison générale implique la participation de la protéine RecA (d’où son nom Rec pour recombinaison), qui joue aussi un rôle fondamental dans le système SOS de réparation fautif de l’ADN (voir section 10.4). Cette protéine, dont des formes homologues et analogues ont été découvertes dans les trois domaines du vivant, Bacteria, Archaea et Eukarya, joue un rôle essentiel dans les premières phases du processus de recombinaison. Dans ce phénomène, dont le détail est décrit dans la figure 10.9, la recombinaison débute par une coupure simple brin,

générée par une endonucléase, dans l’une des deux séquences d’homoduplex homologues. Le brin coupé est séparé de son complémentaire par des protéines qui possèdent une activité hélicase (voir section 7.6). Chez Escherichia coli, l’enzyme RecBCD, qui est issue de l’association des produits des gènes recB, recC et recD, membres du système SOS, cumule les deux activités endonucléasique et hélicase. C’est elle qui déroule l’ADN puis coupe le simple brin. Puis des protéines de liaison à l’ADN simple brin (SSB : single strand binding) reconnaissent et se fixent sur le simple brin d’ADN. Avec l’aide de ces protéines SSB, la protéine RecA va, à son tour, venir se fixer à la portion d’ADN simple brin favorisant la reconnaissance, la déstabilisation puis le déplacement de la séquence homologue présente dans l’autre duplex d’ADN. C’est la phase d’invasion. Une autre coupure et deux soudures réalisées par l’ADN ligase aboutissent à la formation croisée entre un brin de chaque séquence : cela donne la structure de Holliday (hétéroduplex). Les protéines RuvAB (activité hélicase/ATPase) interviennent alors pour assurer la migration des branches et donner la structure en croix. RuvA lie l’ADN sous forme de tétramère et RuvB de dimère. L’ensemble a une forte affinité pour les jonctions de Holliday, dissocie RecA de l’ADN et sert de moteur à la migration de la jonction. Pour résoudre la jonction, une endonucléase, RuvC, coupe deux simples brins de même polarité au niveau d’un site de reconnaissance (A/T TT* G/C). Puis à nouveau, la ligase referme deux liens phosphodiester, ce qui finalement aboutit à la création de deux molécules d’ADN recombinantes.

L’effet de la recombinaison homologue sur le génotype L’apparition de nouveaux génotypes issus du phénomène de recombinaison homologue nécessite l’existence d’au moins deux homoduplex distincts. C’est le cas des cellules eucaryotes diploïdes qui possèdent deux jeux de chromosomes hérités de chacun des parents (voir section 14.7). La plupart des eucaryotes ont en effet un cycle biologique complet au cours duquel se déroule la méiose, un processus de grande importance durant lequel ont lieu des échanges chromosomiques résultant de crossing-over entre chromosomes homologues. Même s’il n’y a pas de reproduction sexuée avec formation d’un zygote suivi de méiose chez les procaryotes, les phénomènes de recombinaison n’en tiennent pas moins une place importante dans la génétique de la cellule procaryote. La recombinaison génétique peut avoir lieu parce que des fragments d’ADN homologues peuvent être transférés d’une cellule donneuse à une cellule receveuse selon trois modalités particulières : la transformation (voir section 10.7), la transduction (voir section 10.8) ou la conjugaison (voir section 10.11). Ce n’est qu’après que le fragment d’ADN donneur, l’exogénote, est rentré dans la cellule receveuse que la recombinaison peut avoir lieu et devenir une partie stable du génome de la cellule receveuse, l’endogénote. En effet, cette cellule devient temporairement diploïde pour une partie de son génome. Si le processus de recombinaison ne peut avoir lieu ou avorte, l’exogénote sera alors perdu puisqu’il est dans l’incapacité de se maintenir de façon autonome au sein de la cellule receveuse.



270 Chapitre 10

Génétique bactérienne Molécule d’ADN donneur Coupure simple brin par une endonucléase ADN donneur

Cassure

Liaison à l’ADN des protéines SSB

Protéine SSB

ADN donneur ADN receveur Intervention de la protéine RecA

RecA

Isomérisation et formation de la structure de Holliday

Clivage et ligation aux sites

Clivage et ligation aux sites

FIGURE 10.9 Exemple simplifié de recombinaison génétique : la recombinaison homologue. Les régions homologues de deux molécules d’ADN s’assemblent et échangent une portion de séquence. Le mécanisme implique une cassure suivie d’une réassociation des brins appariés. Seules deux des protéines intervenant dans le processus sont indiquées : la protéine SSB et la protéine RecA. Le schéma n’est pas à l’échelle : l’appariement peut se produire sur plusieurs centaines, voire plusieurs milliers de paires de bases. La résolution du crossingover est achevée par un nouveau processus de cassure et réunion des molécules d’ADN entrecroisés. Notez que ce mécanisme aboutit à deux possibilités de recombinaison, suivant les brins où s’effectuent les coupures-ligations.

La détection de la recombinaison Pour que le changement génétique résultant de la recombinaison homologue soit décelable, les cellules filles dont les génomes sont issus de la recombinaison doivent présenter un phénotype différent de celui des deux parents sous peine de passer inaperçu. En pratique, il est nécessaire d’utiliser des cellules parentales receveuses déficientes pour un caractère particulier qui sera apporté par la recombinaison aux cellules issues du croisement génétique. On peut, par exemple, utiliser des bactéries incapables de pousser sur milieu minimum et qui, après recombinaison,

récupéreront cette faculté (voir figure 10.10). D’autres marqueurs de la recombinaison sont disponibles comme la résistance aux antibiotiques, le besoin en facteur nutritionnel (voir section 10.1). La sensibilité de plus en plus grande des méthodes de détection rend la recherche des recombinants de plus en plus performante. Le seul point auquel il convient cependant de faire attention est le taux de mutation inverse pour le caractère sélectionné qui doit être le plus faible possible car les cellules révertantes pousseront en même temps que les cellules recombinantes. Il est possible de contourner le problème en utilisant des doubles mutants, portant deux mutations ponctuelles distinctes, puisque la probabilité d’obtenir des doubles révertants est statistiquement quasiment nulle. On peut aussi employer des souches porteuses de mutation par décalage du cadre de lecture puisque leur taux de réversion est typiquement faible (voir section 10.2). Parce que les études de recombinaison génétique sont d’une grande importance dans la compréhension de la génétique moléculaire, tout l’art du microbiologiste généticien consistera donc à choisir le mieux possible le meilleur génotype mutant associé aux meilleures conditions de croissance permettant de mener à bien les analyses génétiques (voir sections 10.7-10.12).

Contrôlez vos acquis La recombinaison homologue est le processus par lequel un nouvel homoduplex, ayant un génotype propre, est issu de la recombinaison de deux molécules d’ADN homologues mais génotypiquement différent. Le phénomène de recombinaison est un processus évolutif très important et les cellules possèdent des mécanismes permettant d’assurer son bon déroulement. Chez les procaryotes, la recombinaison requiert comme préalable le transfert d’un fragment d’ADN d’une cellule donneuse à une cellule receveuse, ceci étant réalisé lors des phénomènes spécifiques des procaryotes que sont la transformation, la transduction ou encore la conjugaison. •

Quelle protéine, commune à l’ensemble des procaryotes, est essentielle dans le processus de recombinaison homologue ?

•

En quoi diffère le processus de recombinaison chez les procaryotes comparativement aux eucaryotes ?

II

ÉCHANGES GÉNÉTIQUES CHEZ LES PROCARYOTES

Les analyses génétiques nécessitent de croiser les souches d’un organisme présentant différents génotypes (et phénotypes) et de rechercher des recombinants (voir figure 10.10). Trois mécanismes d’échanges génétiques sont connus chez les procaryotes : 1) la transformation, par laquelle l’ADN libéré d’une cellule est récupéré par une autre (voir section 10.7), 2) la transduction, où le transfert de l’ADN du donneur se fait via un virus (voir section 10.8) et 3) la conjugaison, pour laquelle le transfert implique un contact direct des cellules et un plasmide conjugatif dans la cellule donneuse (voir sections 10.9-10.12). Ces mécanismes sont présentés sur la figure 10.11.



10.7 La transformation 271

Cellule donneuse

ADN issu de bactéries Trp+

Milieu sans tryptophane Absence de croissance

Injection du virus, fragmentation du chromosome

Milieu sans tryptophane

Apparition de colonies de bactéries transformées FIGURE 10.10 Technique de détection de bactéries recombinantes sur milieu de culture. L’utilisation d’un milieu de culture sélectif (ici, milieu sans tryptophane) permet très facilement de révéler dans la population bactérienne, la présence de bactéries ayant acquis de nouveaux caractères génotypiques. L’exemple illustre la mise en évidence du phénomène de la transformation bactérienne (voir section 10.7). Culture de bactéries Trp–

Cellule donneuse

Culture de bactéries Trp–

Virus contenant un fragment d’ADN chromosomique

ADN libre

Cellule receveuse

Cellule receveuse

Transformation

10.7 La transformation m n La transformation est le processus par lequel de l’ADN libre est incorporé dans une cellule réceptrice et conduit à un changement génétique. Un certain nombre de procaryotes sont naturellement transformables, dont certaines espèces de Bacteria Gram négatif et Gram positif, ainsi que certaines espèces d’Archaea. Si l’ADN des procaryotes est présent dans la cellule sous la forme d’une grande molécule unique, quand la cellule est doucement lysée, l’ADN est libéré (voir figure 10.12). Du fait de leur longueur extrême (1 700 µm chez Bacillus subtilis, par exemple), les chromosomes bactériens se cassent facilement. Même après une extraction douce, le chromosome de B. subtilis de 4,2 Mpb est converti en fragments d’environ 10 kpb. Comme l’ADN correspondant à un gène fait en moyenne 1 000 nucléotides, chacun des fragments d’ADN de B. subtilis contient environ 10 gènes. Ceci est une taille qui se prête bien à la transformation. Une seule cellule incorpore habituellement un ou quelques fragments d’ADN, de ce fait seule une petite proportion de gènes d’une cellule peut être transférée à une autre au cours d’une seule expérience de transformation.

La transformation dans l’histoire de la biologie moléculaire Bien que la recombinaison génétique soit connue depuis longtemps chez les eucaryotes, sa mise en évidence chez les bactéries est plus récente. La découverte de la transformation a été l’un des événements majeurs en biologie, car elle a conduit aux expériences qui ont permis de démontrer que l’ADN est le support de l’information génétique (voir figure 10.13). Cette découverte est devenue la base de la biologie moléculaire et de la génétique moderne.

Transduction

Cellule donneuse contenant un plasmide

Cellule donneuse avec un plasmide intégré

Cellules receveuses Conjugaison : transfert du plasmide

Conjugaison : transfert du chromosome

FIGURE 10.11 Modalités de transfert de l’ADN d’une cellule bactérienne donneuse à une receveuse. Seules les étapes initiales du transfert sont indiquées. Pour plus de détails sur le mode d’intégration de l’ADN dans la cellule receveuse, voir le texte.

Les premières preuves sur la transformation bactérienne ont été obtenues par le scientifique britannique Frederick Griffith à la fin des années 1920. Il travaillait sur Streptococcus pneumoniae (le pneumocoque), une bactérie qui doit en partie sa capacité invasive à la présence d’une capsule polysaccharidique (voir section 4.10). Des mutants sans capsule peuvent être isolés, ils sont alors incapables de causer une infection. Ces mutants sont appelés les souches R, car leurs colonies apparaissent rugueuses (rough) sur la gélose, au contraire de l’apparence lisse des souches encapsulées, appelées souches S (smooth). Une souris infectée avec seulement quelques cellules d’une souche S succombe au bout d’un ou deux jours à une infection massive de pneumocoques. À l’opposé, l’injection d’un grand nombre de cellules R ne cause pas la mort. Griffith a montré que si des cellules S tuées par la chaleur sont injectées avec des cellules R vivantes, la souris développe une



272 Chapitre 10


M. Shioda and S. Takayanago

Griffith, biochimique par Avery et physico-chimique par Watson et Crick, qui ont conduit au concept de l’ADN en tant que support de l’information génétique. Des années après, ces travaux ont conduit à la biologie moléculaire et à la génétique moderne.

FIGURE 10.12 Image au microscope électronique d’un chromosome de procaryote. Le chromosome circulaire de l’Archaea hyperthermophile Sulfolobus (section 13.9). Voir aussi figure 10.17.

infection qui lui est fatale et la bactérie isolée de la souris morte est du type S (voir figure 10.13). Griffith a conclu que les cellules R avaient été transformées en un nouveau type. L’explication moléculaire de la transformation des types de pneumocoques a été donnée par Oswald T. Avery et ses associés de l’Institut Rockefeller à New York par une série d’études réalisées dans les années 1930, avec la publication d’un article de référence en 1944 par Avery, C. M. Macleod et M. McCarty. Avery et ses collègues ont montré que la transformation pouvait être réalisée dans un tube à essai et qu’un extrait sans cellule obtenu à partir de cellules tuées par la chaleur pouvait induire la transformation. Par une série d’expériences biochimiques, la fraction active des extraits sans cellule a été purifiée et a été identifiée comme étant de l’ADN. L’activité transformante des préparations d’ADN purifié est très forte, et seulement une petite quantité de matériel est nécessaire. Plus tard, d’autres scientifiques de l’Institut Rockefeller ont montré que la transformation pouvait modifier d’autres caractères génétiques comme la résistance aux antibiotiques et la fermentation des glucides. En 1953, James Watson et Francis Crick ont présenté leur modèle sur la structure de l’ADN, offrant ainsi une base théorique sur le rôle de l’ADN comme matériel génétique. C’est donc trois types d’études, bactériologique par

La compétence Même parmi les genres transformables, seules certaines souches ou espèces le sont. Une cellule qui est capable d’absorber de l’ADN et d’être transformée est dite compétente, et cette capacité est génétiquement déterminée. La compétence chez la plupart des bactéries naturellement transformables est régulée, et des protéines particulières jouent un rôle dans la capture et le traitement de l’ADN. Ces protéines spécifiques de la compétence incluent une protéine membranaire fixant l’ADN, une autolysine de la paroi cellulaire, et différentes nucléases. La compétence naturelle de Bacillus subtilis, une espèce facilement transformable, est liée au système de quorum-sensing (un système de régulation qui répond à la densité cellulaire, voir section 8.10) contrôlé par un système de régulation à deux composants (voir section 8.12). Les cellules produisent et excrètent un petit peptide durant leur croissance, et l’accumulation de ce peptide à de fortes concentrations induit la compétence des cellules. Chez Bacillus, environ 20 % des cellules deviennent compétentes et le restent durant plusieurs heures. Chez Streptococcus, 100 % des cellules peuvent devenir compétentes, mais seulement pendant une courte période durant le cycle de croissance. Une transformation naturelle de haute efficacité a été observée chez quelques genres bactériens. Par exemple, Acinetobacter, Azotobacter, Bacillus, Streptococcus, Haemophilus, Neisseria, et Thermus sont naturellement compétentes et facilement transformables. La plupart des procaryotes sont faiblement transformés en conditions naturelles. Escherichia coli et beaucoup d’autres bactéries Gram négatif appartiennent à cette catégorie. Cependant, quand les cellules d’E. coli sont traitées à l’aide de fortes concentrations en calcium, puis placées dans de la glace pendant quelques minutes, elles deviennent transformables. Les cellules d’E. coli ainsi traitées absorbent de l’ADN double brin, et de ce fait la transformation de cet organisme par de l’ADN plasmidique est relativement efficace. Cette découverte a été très importante dans les domaines du génie génétique et de la biotechnologie (voir chapitre 31).

+

Cellules S tuées par la chaleur

Cellules S vivantes

Cellules R vivantes

Cellules R vivantes + cellules S tuées par la chaleur

FIGURE 10.13 Les expériences de Griffith avec des pneumocoques. Des cellules lisses (S) vivantes contiennent une capsule et tuent les souris car les cellules immunitaires ne peuvent pas tuer les bactéries encapsulées ; les cellules prolifèrent dans les poumons et causent une pneumonie fatale. Les cellules rugueuses (R) n’ont pas de capsule et ne sont pas pathogènes. Mais un mélange de cellules vivantes (R) et de cellules mortes (S) tue les souris, et des cellules de type S peuvent être isolées des animaux. L’ADN codant la production de capsules est libéré des cellules S mortes et repris par les cellules R, les transformant en cellules de type S.



10.7 La transformation 273

L’absorption de l’ADN lors de la transformation Pendant la transformation, les bactéries compétentes fixent l’ADN de façon réversible. Mais cette fixation devient rapidement irréversible. Les cellules compétentes fixent beaucoup plus d’ADN que ne le font les cellules non compétentes, de l’ordre de 1 000 fois plus. Les tailles des fragments transformants sont bien plus petites que le génome entier, de plus les fragments sont modifiés lors de l’absorption. Chez Streptococcus pneumoniae, chaque cellule peut capter environ 10 molécules d’ADN double brin de 10 à 15 kpb. Ces fragments adsorbés sont ensuite convertis en fragment simple brin de 8 kb, et le brin complémentaire est dégradé. Les fragments d’ADN dans le mélange sont en compétition vis-à-vis de l’absorption, et si un excès d’ADN ne contenant pas de marqueur génétique est ajouté, il y a une diminution du nombre de transformants. Dans les préparations d’ADN transformant, seulement 1 sur 100-300 fragments d’ADN contient le marqueur génétique étudié. De ce fait, à de fortes concentrations en ADN, la compétition entre les molécules d’ADN conduit à la saturation du système, donc même dans les meilleures conditions, il est impossible de transformer toutes les cellules d’une population pour un marqueur donné. La fréquence de transformation maximale qui a pu être obtenue est de l’ordre de 20 % de la population ; les valeurs habituellement obtenues sont comprises entre 0,1 et 1 %. Mais sur une grande population réceptrice, cette faible fréquence est facilement détectable. La concentration minimale d’ADN permettant la détection de transformants est d’environ 0,01 ng/mL, ce qui est si faible que c’est chimiquement indétectable. Il est intéressant de constater que dans la transformation d’Haemophilus influenzae il est nécessaire que le fragment d’ADN ait une séquence particulière de 11 pb pour que la fixation irréversible puis l’absorption aient lieu. De façon surprenante, cette séquence est retrouvée à une haute fréquence dans le génome d’Haemophilus, dont on connaît la séquence complète (voir section 15.4). Le fait que certaines bactéries soient compétentes dans leur environnement naturel, suggère que la transformation n’est pas un artefact de laboratoire, mais joue un rôle important dans le transfert latéral de gènes dans la nature. En promouvant de nouvelles combinaisons de gènes, les bactéries naturellement transformables augmentent la diversité et l’adaptabilité de la communauté microbienne.

L’intégration de l’ADN transformant L’ADN transformant est adsorbé à la surface cellulaire par une protéine fixant l’ADN. Ensuite, soit le fragment double brin entier est absorbé, soit une nucléase dégrade un brin et seul le brin restant est absorbé, cela dépend de l’organisme (voir figure 10.14). Après l’absorption, l’ADN est attaché à une protéine spécifique de la compétence. Ceci protège l’ADN d’une attaque par une nucléase jusqu’à ce qu’il atteigne le chromosome, où il est pris en charge par la protéine RecA. L’ADN est intégré dans le génome de la cellule réceptrice par recombinaison (voir figures 10.14 et 10.9). Durant la réplication de cet ADN hétéroduplex, une molécule d’ADN parental et une molécule d’ADN recombinant sont formées. Pendant la ségrégation, lors de la division cellulaire, cette dernière est présente dans la cellule transformée, qui est maintenant

Chromosome bactérien

ADN transformant Protéine se liant l’ADN Protéine spécifique de la compétence se liant à l’ADN simple brin

(a)

Fixation de l’ADN Nucléase

Nucléotides libres

Protéine RecA (b)

Pénétration de l’ADN sb

(c)

Recombinaison homologue

(d)

Cellules transformées

FIGURE 10.14 Mécanismes de la transformation chez une bactérie Gram positif. (a) Adsorption d’un ADN double brin grâce à une protéine membranaire liant l’ADN. (b) Pénétration d’un des deux brins dans la cellule tandis qu’une nucléase dégrade l’autre brin. (c) Le simple brin dans la cellule s’associe avec des protéines spécifiques et la recombinaison avec des régions homologues du chromosome bactérien est réalisée sous le contrôle de la protéine RecA. (d) Cellules transformées.

génétiquement modifiée par rapport au type parental. Le mécanisme qui vient d’être décrit n’est possible qu’avec de petits fragments linéaires d’ADN. Beaucoup de Bacteria naturellement transformables ne sont transformées que faiblement par de l’ADN plasmidique car le plasmide doit rester double brin et circulaire pour être répliqué.

La transfection Une bactérie peut être transformée avec de l’ADN extrait d’un virus bactérien plutôt que par de l’ADN bactérien. Ce processus est connu sous le nom de transfection. Si l’ADN provient d’un bactériophage lytique, la transfection conduit à une production virale qui peut être mesurée par la méthode classique



274 Chapitre 10


des plages de lyse (voir section 9.4). La transfection est utile pour étudier les mécanismes de transformation et de recombinaison, car la petite taille des génomes de phages permet d’isoler une population assez homogène de molécules d’ADN. Par opposition, dans la transformation conventionnelle, l’ADN transformant est un assortiment hétérogène d’ADN chromosomiques de tailles variées, ce qui complique les études sur les mécanismes de transformation.

Contrôlez vos acquis Certains procaryotes sont compétents, un état dans lequel les cellules sont capables d’absorber de l’ADN libre provenant d’autres bactéries. L’incorporation de l’ADN dans une cellule réceptrice nécessite l’activité d’une protéine liant l’ADN simple brin, la protéine RecA, et plusieurs autres enzymes. Seules les cellules compétentes sont transformables. •

La cellule bactérienne donneuse lors de la transformation est probablement morte. Expliquez.

•

Même pour les cellules naturellement transformables, la compétence est normalement inductible. Qu’est-ce que cela signifie ?

m n

10.8 La transduction

Dans le phénomène de la transduction, l’ADN est transféré d’une cellule à une autre par un bactériophage. Le transfert de gènes de l’hôte par les phages peut se faire de deux façons. Dans le premier cas, appelé transduction généralisée, l’ADN peut théoriquement provenir de toutes les portions possibles du génome de l’hôte et devenir l’ADN du virion mature à la place du génome viral. Dans le second cas, la transduction spécialisée se fait seulement chez certains phages tempérés. Dans la transduction spécialisée, l’ADN d’une région spécifique du chromosome de l’hôte est directement intégré dans le génome viral, remplaçant habituellement certains gènes viraux. Le virion transducteur, aussi bien dans la transduction généralisée que spécialisée, est habituellement non infectieux car les gènes bactériens ont remplacé certains ou tous les gènes viraux impliqués dans sa virulence. Dans la transduction généralisée, si les gènes du donneur ne subissent pas une recombinaison homologue avec le chromosome bactérien de la cellule réceptrice, ils seront perdus. Ils ne peuvent se répliquer indépendamment et ne font pas partie d’un génome viral. Dans la transduction spécialisée, il peut y avoir aussi une recombinaison homologue. Cependant, comme l’ADN bactérien donneur constitue maintenant une partie du génome du phage tempéré, il y a deux possibilités : 1) l’ADN peut être intégré dans le chromosome de l’hôte lors de la lysogénisation (voir section 9.10), et 2) l’ADN peut être répliqué dans la cellule réceptrice lors de l’infection lytique. Différents genres chez les Bacteria sont susceptibles de subir la transduction, comme les genres Desulfovibrio, Escherichia, Pseudomonas, Rhodococcus, Rhodobacter, Salmonella,

Staphylococcus et Xanthobacter, ainsi qu’une espèce d’Archaea Methanothermobacter thermoautotrophicus. Tous les phages ne sont pas transducteurs et toutes les bactéries ne peuvent pas être transduites, mais ce phénomène est suffisamment répandu pour jouer un rôle dans les transferts génétiques dans la nature.

La transduction généralisée Dans la transduction généralisée, théoriquement tous les gènes du chromosome du donneur peuvent être transférés à une cellule receveuse. La transduction généralisée a été initialement découverte et bien étudiée chez la bactérie Salmonella enterica avec le phage P22, elle a aussi été étudiée avec le phage P1 d’Escherichia coli. Un exemple présentant la formation des particules transductrices est représenté sur la figure 10.15. Quand une cellule bactérienne est infectée par un phage, le cycle lytique peut être initié. Cependant, durant l’infection lytique, les enzymes responsables de l’empaquetage de l’ADN viral dans le bactériophage vont parfois encapsider accidentellement de l’ADN de l’hôte. Le virion est alors appelé particule transductrice. Avec la lyse de la cellule, ces particules sont libérées en même temps que les virions normaux (c’est-à-dire potentiellement lytiques), et donc le lysat contient un mélange de virions normaux et de particules transductrices.

ADN du phage

ADN de l’hôte

Phage

Cycle lytique

Cellule bactérienne

Phage normal

Particule transductrice (contenant l’ADN de l’hôte)

Transduction


Cellule transduite

FIGURE 10.15 Transduction généralisée. Notez que les virions « normaux » contiennent des gènes du phage tandis que la particule transductrice contient des gènes de l’hôte.



10.8 La transduction 275

Puisque les particules transductrices ne peuvent conduire à une infection virale normale (elles ne contiennent pas d’ADN viral), elles sont dites défectives. Quand ce lysat est utilisé pour infecter une population de cellules receveuses, la plupart des cellules sont infectées par les phages normaux. Cependant, une petite portion de la population reçoit des particules transductrices qui injectent l’ADN d’origine bactérienne qu’elles avaient encapsidé. Même si cet ADN ne peut pas se répliquer, il peut subir une recombinaison génétique avec l’ADN du nouvel hôte. Puisque seule une petite proportion des particules dans le lysat sont défectives, et que chacune d’entre elles contient seulement un petit fragment de l’ADN donneur, la probabilité d’avoir une particule transductrice contenant un gène particulier est forcément faible. Habituellement, seule une cellule sur 106 à 108 est transduite pour un marqueur donné. Les phages qui forment des particules transductrices peuvent être tempérés ou virulents. Quoi qu’il en soit, ils doivent nécessairement posséder un mécanisme d’empaquetage de l’ADN qui accepte de l’ADN de l’hôte et il faut également que l’empaquetage de l’ADN se fasse avant que le génome de l’hôte ne soit complètement dégradé. Enfin, il sera plus facile de repérer la transduction si on prend soin de faire en sorte que chaque cellule bactérienne ne soit infectée si possible que par une seule particule phagique, car en présence d’une infection multiple, la cellule sera probablement rapidement tuée par les virions non défectifs présents dans le lysat.

Cellule lysogène

Gènes galactose sur l’ADN de l’hôte

ADN du phage

Induction

Événement normal

Événement rare

1. L’ADN phagique se circularise et s’excise de l’ADN de l’hôte

1. Une portion de l’ADN de l’hôte est remplacée par de l’ADN phagique

2. Réplication de l’ADN excisé

2. Réplication de l’ADN excisé

3. Synthèse complète du phage

3. Synthèse complète du phage

4. Lyse des cellules et libération des phages normaux

4. Lyse des cellules et libération des phages défectifs qui peuvent transduire des gènes galactose

Le phage lambda et la transduction spécialisée La transduction généralisée permet le transfert de l’ADN d’une bactérie à une autre à une faible fréquence. Au contraire, la transduction spécialisée peut aboutir à un transfert extrêmement efficace tout en permettant à une petite région d’un chromosome bactérien d’être sélectivement transduite. L’exemple de transduction spécialisée le mieux étudié concerne le phage tempéré lambda d’Escherichia coli et implique la transduction des gènes de l’opéron galactose. Dans une cellule lysogène, le génome du phage lambda est intégré dans le chromosome de l’hôte à un site spécifique (voir section 9.10). La région dans laquelle le génome de lambda s’intègre dans le chromosome d’E. coli est immédiatement adjacente à un groupe de gènes qui codent un groupe d’enzymes impliquées dans l’utilisation du galactose (voir figure 9.21). Après l’insertion, la réplication de l’ADN viral est sous le contrôle du chromosome bactérien hôte. Avec une induction, l’ADN viral sort de l’ADN hôte par un procédé inverse à l’intégration (voir figure 10.16). Habituellement, quand la cellule lysogène est induite, l’ADN de lambda est excisé sous la forme d’une unité génomique complète. Cependant, il arrive parfois que le génome du phage ne s’excise pas correctement. Certains des gènes bactériens adjacents (par exemple, l’opéron galactose) sont excisés avec l’ADN du phage. Dans le même temps, certains gènes du phage restent dans le chromosome de l’hôte (voir figure 10.16). Un des types de particules phagiques modifiées est appelé lambda dgal (λdgal ; dgal signifie « défectif, galactose »), car il est défectif à cause des gènes phagiques qui ont été perdus. Il ne sera pas capable de produire de nouveaux virions infectieux au cours d’une prochaine infection. Cependant, un virion

(a)

(b)

FIGURE 10.16 Transduction spécialisée. (a) Événements du cycle lytique normal. (b) Production de particules pouvant transduire les gènes galactose dans une cellule d’Escherichia coli contenant un prophage lambda.

lambda viable, dans ce cas appelé phage auxiliaire (helper), peut venir complémenter les fonctions perdues par la particule défective. Quand les cellules sont coinfectées par λdgal et le phage auxiliaire, le lysat contient quelques particules λdgal en mélange avec un grand nombre de virions lambda infectieux. Quand une culture bactérienne galactose moins (Gal–) est infectée avec un tel lysat et que les transductants Gal+ sont



276 Chapitre 10


sélectionnés, beaucoup sont des doubles lysogènes, portant à la fois lambda et λdgal. Quand un double lysogène est induit, le lysat peut alors contenir un grand nombre de virions λdgal et peut transduire avec une haute efficacité, mais seulement le groupe de gènes gal. Pour qu’un virion lambda reste viable, la quantité d’ADN phagique qui peut être remplacée par de l’ADN de l’hôte est limitée. Il est nécessaire qu’une quantité suffisante d’ADN phagique soit conservée pour permettre la production de la capside du phage et d’autres protéines nécessaires à la lyse et à la lysogénie. Même si un phage auxiliaire est présent avec le phage défectif lors d’une infection, un minimum de gènes spécifiques de λdgal est nécessaire pour la transduction. Seuls la région att (attachement), le site cos (extrémités cohésives impliquées dans l’empaquetage), et l’origine de réplication du génome de lambda sont absolument nécessaires pour la production de particules transductrices, à condition qu’un phage helper soit utilisé (voir la carte génétique de lambda, figure 9.18 et sections 9.10 et 9.11). Des phages transducteurs spécialisés couvrant de nombreuses régions spécifiques du génome d’E. coli ont été isolés. De plus, les phages transducteurs peuvent être construits par des techniques d’ingénierie génétique pour contenir des gènes de n’importe quel organisme (voir section 10.17).

La conversion lysogénique Quand un phage tempéré infectieux (non défectif) réalise un cycle lysogénique, c’est-à-dire qu’il est présent à l’état de prophage, la cellule hôte se trouve immunisée contre l’infection par le même type de phage. L’acquisition de cette propriété peut être considérée comme un changement du phénotype. Cependant, d’autres altérations phénotypiques peuvent souvent être détectées dans les cellules lysogènes sans qu’il y ait de relation avec l’immunité. Un tel changement, qui est apporté par le phénomène de lysogénie, est appelé conversion lysogénique. Deux cas de conversion phagique ont été spécialement étudiés. L’un implique un changement dans la structure d’un polysaccharide de surface chez Salmonella anatum infectée par le bactériophage tempéré ε15. Le second implique la conversion de souches de Corynebacterium diphtheriae (la bactérie responsable de la diphtérie) ne produisant pas de toxines en des souches virulentes produisant une toxine en raison de la présence du phage tempéré β (voir section 26.3). Dans ces deux situations, les gènes codant les molécules impliquées dans ces processus font partie du génome phagique et donc sont automatiquement (et exclusivement) transférés à la suite de la lysogénie et de l’intégration du génome viral sous forme de prophage. La lysogénie apporte probablement une forte valeur sélective à la cellule hôte car elle confère une résistance contre l’infection par des virus du même type. La conversion phagique peut aussi avoir une signification évolutive considérable, car elle conduit à des modifications génétiques effectives chez les cellules hôtes. De très nombreuses bactéries isolées directement dans la nature sont des lysogènes naturels. On peut raisonnablement considérer, qu’en conditions naturelles, la lysogénie doit être souvent primordiale pour la survie de l’hôte.

Contrôlez vos acquis La transduction implique le transfert de gènes d’une bactérie à une autre par le biais des bactériophages. Dans la transduction généralisée, les particules virales défectives incorporent au hasard des fragments d’ADN chromosomiques cellulaires, mais l’efficacité de transduction est faible. Dans la transduction spécialisée, l’ADN d’un phage tempéré s’excise incorrectement et emporte avec lui les gènes adjacents de l’hôte, avec une efficacité de transduction qui peut être très forte. •

Quelle est la différence majeure entre la transduction généralisée et la transformation ?

•

Dans la transduction spécialisée, l’ADN du donneur peut se répliquer à l’intérieur de la cellule receveuse sans qu’il y ait eu une recombinaison homologue, ce qui n’est pas possible dans la transduction généralisée. Expliquez pourquoi.

10.9 Les plasmides : principes généraux m n Avant d’aborder la troisième méthode de transfert génétique, la conjugaison, il convient de présenter les plasmides. Les plasmides sont des éléments génétiques qui se répliquent indépendamment du chromosome de l’hôte (voir section 7.4). Contrairement aux virus, les plasmides n’ont pas de forme extracellulaire et existent à l’intérieur de la cellule simplement comme ADN libre le plus souvent circulaire. Les plasmides et les chromosomes peuvent être différenciés sur le fait que les plasmides portent seulement des gènes non essentiels (mais souvent très utiles). Les gènes essentiels pour la cellule sont portés par les chromosomes. Des milliers de plasmides différents sont connus. Plus de 300 plasmides différents et naturellement présents ont été isolés de souches d’Escherichia coli. Les propriétés de certains d’entre eux vont être discutées.

La nature physique et la réplication des plasmides La plupart des plasmides connus sont constitués d’ADN double brin. La majorité est circulaire, mais beaucoup de plasmides linéaires sont également connus. Les plasmides naturels varient en taille d’environ 1 kilobase à plus de 1 mégabase. Le plasmide type est une molécule d’ADN double brin circulaire qui représente moins de 5 % de la taille du chromosome (voir figure 10.17). La plupart de l’ADN plasmidique isolé des cellules est dans la configuration superenroulée, qui est la forme de l’ADN la plus compacte existant dans une cellule (voir figure 7.10). La réplication des plasmides est généralement réalisée par les enzymes cellulaires. De ce fait, les gènes portés par le plasmide lui-même concernent principalement le contrôle du processus d’initiation de la réplication et la répartition entre les cellules filles des plasmides répliqués. Différents plasmides dont le nombre peut également varier peuvent être présents conjointement dans les cellules. Le nombre de copies permet de quantifier la présence du plasmide. Certains plasmides sont



Huntington Potter et David Dressler

10.9 Les plasmides : principes généraux 277

FIGURE 10.17 Image au microscope électronique d’un chromosome bactérien et de plasmides. Les plasmides (flèches) sont les structures circulaires et sont plus petits que le chromosome. La cellule (la structure blanche et large) a été cassée délicatement pour que l’ADN reste intact.

présents dans la cellule à seulement 1 à 3 copies, tandis que d’autres peuvent être présents à plus de 100 copies. Le nombre de copies est contrôlé à la fois par des gènes portés par le plasmide et par les interactions entre le plasmide et son hôte. La plupart des plasmides des bactéries Gram négatif se répliquent à la façon des chromosomes (voir section 7.6). Ceci implique l’initiation à une origine de réplication et une réplication bidirectionnelle autour du cercle, conduisant à un intermédiaire thêta (voir figure 7.17). Cependant, certains plasmides ont une réplication unidirectionnelle. Du fait de la petite taille de l’ADN plasmidique comparé au chromosome, le processus entier de réplication se fait rapidement, ce qui correspond peut-être à un dixième ou moins encore du temps total du cycle de division cellulaire. La majorité des plasmides de bactéries Gram positif se répliquent par le mécanisme du cercle roulant à la manière du phage φX174 (voir section 16.2 et figure 16.4). Ce mécanisme conduit à un intermédiaire simple brin. La plupart des plasmides linéaires se répliquent en utilisant un mécanisme impliquant une protéine amorce liée à l’extrémité 5’ de chaque brin et qui est utilisée dans l’initiation de la synthèse de l’ADN (voir section 14.6).

Le phénomène d’incompatibilité et le curage des plasmides Certaines bactéries peuvent contenir différents types de plasmides. Par exemple, Borrelia burgdorferi (l’agent bactérien responsable de la maladie de Lyme, section 27.4) contient 17 plasmides circulaires et linéaires différents ! La capacité de deux plasmides différents à se répliquer chacun dans la même

cellule est contrôlée par les gènes plasmidiques impliqués dans la régulation de la réplication de l’ADN. Quand un plasmide est transféré dans une cellule qui en porte déjà un, il a été souvent observé que le second plasmide ne peut se maintenir et qu’il est rapidement perdu au cours des cycles successifs de réplication. Dans ce cas, les deux plasmides sont dits incompatibles. Un certain nombre de groupes d’incompatibilité (Inc) sont reconnus. Les plasmides d’un groupe d’incompatibilité s’excluent réciproquement lors de la réplication dans la cellule, mais peuvent coexister avec les plasmides d’autres groupes. Les plasmides d’un groupe d’incompatibilité partagent un mécanisme commun pour réguler leur réplication et sont donc apparentés. Donc, même si une cellule bactérienne peut contenir différents types de plasmides, chacun est génétiquement distinct. Certains plasmides, appelés épisomes, peuvent s’intégrer dans le chromosome, et dans de telles conditions leur réplication est sous le contrôle du chromosome. Cette situation est proche de celle des virus dont le génome peut être intégré dans le génome de l’hôte (prophages, sections 9.10, 16.5, 16.11 et 16.15). Les plasmides peuvent parfois être éliminés des cellules par différents traitements. Cette élimination, appelée curage, résulte de l’inhibition de la réplication plasmidique sans que celle du chromosome ne soit affectée. Au bout d’un certain nombre de divisions cellulaires, le plasmide se retrouve dilué au point de disparaître. Le curage peut se faire spontanément, mais il est grandement facilité par des traitements à l’aide de certains produits chimiques comme les colorants de type acridine qui s’insèrent dans l’ADN, ou d’autres traitements qui semblent interférer plus avec la réplication du plasmide qu’avec celle du chromosome. Beaucoup de ces caractéristiques sont observées chez un plasmide très bien étudié d’Escherichia coli, le plasmide F. Le plasmide F (« F » signifie « fertilité ») est une molécule d’ADN circulaire de 99 159 pb. Les cellules le contenant peuvent être facilement curées à l’aide d’acridine orange. La figure 10.18 montre une carte génétique du plasmide F. Une région du plasmide contient des gènes impliqués dans la régulation de la réplication de l’ADN. Il contient aussi un certain nombre d’éléments transposables (voir section 10.14) impliqués dans sa capacité à fonctionner comme un épisome. Enfin, il a une grande région d’ADN, la région tra, qui contient les gènes lui permettant d’être transféré d’une cellule à une autre (voir ci-après).

Le transfert de plasmides de cellule à cellule Puisqu’une des caractéristiques définissant un plasmide est l’absence d’une forme extracellulaire distincte, il est possible d’imaginer que les plasmides sont transférés seulement durant la division cellulaire. Comme certaines cellules procaryotes peuvent absorber de l’ADN libre de l’environnement (voir section 10.6), il est possible que la lyse de l’hôte puisse mettre le plasmide en contact avec un nouvel hôte. Néanmoins, ce processus se produit naturellement chez seulement quelques espèces bactériennes mais il n’explique pas la majorité des transferts plasmidiques de cellule à cellule. Le principal mécanisme de transfert de cellule à cellule est la conjugaison, une fonction codée par certains plasmides. La conjugaison est un processus réplicatif qui aboutit au final à la présence d’une copie du plasmide dans chacune des deux cellules (voir figure 10.19).



278 Chapitre 10

Génétique bactérienne IS3 Tn1000 99,2 kpb/0

Région tra

IS3 IS2 75 kpb

Plasmide F

25 kpb

oriT 50 kpb FIGURE 10.18 Carte génétique du plasmide F (fertilité) d’Escherichia coli. Les nombres à l’intérieur indiquent la taille du plasmide en kilopaires de bases (la taille exacte est de 99 159 pb). La région en vert foncé au bas de la carte indique les gènes responsables de la réplication et de la ségrégation du plasmide F dans des cellules à croissance normale. La région en vert clair, région tra, contient les gènes impliqués dans le transfert par conjugaison. La séquence oriT est l’origine de transfert durant la conjugaison. La flèche indique le sens du transfert (la région tra devrait être transférée en dernier). Les régions en jaune sont les éléments transposables nécessaires pour l’intégration de F au niveau d’éléments identiques dans le chromosome bactérien, conduisant à la formation de différentes souches Hfr (voir section 10.12).

Les plasmides capables de commander leur propre transfert par un contact de cellule à cellule sont appelés plasmides conjugatifs. Tous les plasmides ne sont pas conjugatifs. La transmission par conjugaison est contrôlée par un jeu de gènes se trouvant dans la région tra (pour transfert) du plasmide. La région tra contient des gènes codant des protéines qui interviennent dans le transfert de l’ADN et dans la réplication et d’autres qui ont un rôle dans la formation d’un couple de cellules. La présence de la région tra dans un plasmide peut avoir une autre conséquence importante si le plasmide est intégré dans le chromosome. Dans ce cas, le plasmide peut mobiliser

Chromosome Cellule receveuse

Plasmide Cellule donneuse FIGURE 10.19 Transfert d’un plasmide d’une cellule à une autre durant la conjugaison. Notez que, comme dans tous les procédés de transfert de gène chez les procaryotes, le transfert de l’ADN est unidirectionnel.

le transfert de l’ADN chromosomique d’une cellule vers l’autre. L’utilisation de la conjugaison pour transférer les gènes d’un hôte sera vue dans la prochaine section. Certains plasmides conjugatifs de Pseudomonas ont une large gamme d’hôtes. Ceci signifie qu’ils sont transférables à une grande variété d’autres genres bactériens Gram négatif. Ces plasmides peuvent ainsi transférer des informations génétiques entre des organismes phylogénétiquement éloignés. Il a été montré que les plasmides conjugatifs peuvent également être transférés de bactéries Gram négatif à des bactéries Gram positif, entre des Bacteria et des plantes ou des champignons. Même si le plasmide ne peut pas se répliquer indépendamment de son nouvel hôte, le transfert de ce plasmide lui-même peut avoir d’importantes conséquences évolutives, si ses gènes se recombinent avec le génome du nouvel hôte.

Contrôlez vos acquis Les plasmides sont de petites molécules d’ADN circulaire ou linéaire qui portent une variété de gènes non essentiels. Bien que la cellule puisse contenir plus d’un plasmide, ils ne peuvent être génétiquement proches. Les plasmides peuvent être transférés par un transfert latéral lors de la conjugaison. •

Comment un grand plasmide peut-il être différencié d’un petit chromosome ?

•

Quelle fonction portent les gènes tra du plasmide F?

10.10 Les types de plasmides m n et leur signification biologique Tous les plasmides portent des gènes qui leur permettent de se répliquer de manière autonome. Certains plasmides portent aussi des gènes nécessaires pour la conjugaison, et ils peuvent être parfois détectés biologiquement, soit par le transfert des fonctions elles-mêmes ou par leur sensibilité à certains virus (voir section 16.1). Bien que les plasmides ne portent pas de gènes essentiels pour l’hôte, ils peuvent porter des gènes qui ont une grande influence sur le phénotype de la cellule. Dans certains cas, les plasmides codent des propriétés considérées fondamentales pour la bactérie au niveau écologique. Par exemple, la capacité de Rhizobium d’interagir et de former des nodules de fixation de l’azote avec les plantes nécessite certaines fonctions plasmidiques (voir section 19.22). D’autres plasmides confèrent à la cellule des propriétés métaboliques spéciales, comme la dégradation de polluants toxiques. En effet, les plasmides semblent être un mécanisme majeur pour conférer des propriétés spéciales aux bactéries, et dans de nombreux cas pour exporter ces propriétés par un transfert horizontal de gènes. La seule limitation concernant les types de gènes présents sur un plasmide est qu’ils ne doivent pas interférer avec leur propre réplication ou sur la survie de l’hôte. Quelques phénotypes conférés aux procaryotes par les plasmides sont résumés dans le tableau 10.3.



10.10 Les types de plasmides et leur signification biologique 279

TABLEAU 10.3

EXEMPLES DE FONCTIONS CONFÉRÉES PAR LA PRÉSENCE D’UN PLASMIDE CHEZ LES PROCARYOTES Propriétésa

Micro-organismesb

Production d’antibiotique

Streptomyces

Conjugaison

Escherichia, Pseudomonas, Rhizobium, Staphylococcus, Streptococcus, Sulfolobus, Vibrio

Fonctions physiologiques Dégradation des octanes, du camphre, du naphtalène

Pseudomonas

Dégradation des herbicides

Alcaligenes

Production d’acétone et de butanol (voir section 12.20)

Clostridium

Utilisation du lactose, du saccharose, de l’urée ; fixation de l’azote

bactéries entériques

Fixation symbiotique de l’azote atmosphérique (voir section 19.22)

Rhizobium

Production de pigment

Erwinia, Staphylococcus

Résistance Résistance aux antibiotiques (voir section 20.12)

Campylobacter, bactéries entériques, Neisseria, Staphylococcus

Résistance aux cadmium, cobalt, mercure, nickel et/ou au zinc (voir section 19.16)

Acidocella, Alcaligenes, Listeria, Pseudomonas, Staphylococcus

Résistance aux bactériocines (et production)

Bacillus, bactéries entériques, Lactococcus, Propionibacterium

Virulence Invasion de la cellule hôte

Salmonella, Shigella, Yersinia

Coagulase, hémolysine, entérotoxine (voir sections 21.9 et 21.11)

Staphylococcus

Entérotoxine, antigène K (voir sections 12.11 et 21.11)

Escherichia

Tumorisation chez les végétaux (voir section 19.21)

Agrobacterium

a b

Quelques exemples de fonctions parmi les nombreuses possibilités décrites dans la littérature. Tous appartiennent au domaine bactérien à l’exception de Sulfolobus qui est une archée. Ne sont cités que les exemples les mieux connus.

Les plasmides de résistance Parmi les groupes de plasmides les plus répandus et les mieux étudiés, on retrouve les plasmides de résistance (plasmides R), qui confèrent une résistance aux antibiotiques et à d’autres inhibiteurs de croissance. Les plasmides R ont été initialement découverts au Japon dans des souches d’entérobactéries qui ont acquis une résistance à un certain nombre d’antibiotiques (résistance multiple) et ont depuis été retrouvées partout dans le monde. L’émergence de bactéries résistantes à plusieurs antibiotiques a une importance médicale considérable et est corrélée à l’augmentation de l’utilisation des antibiotiques pour le traitement des maladies infectieuses. Rapidement après l’isolement de ces souches résistantes, on s’est aperçu qu’elles pouvaient transférer la résistance à des souches sensibles par un simple contact de cellule à cellule. La nature infectieuse des plasmides R conjugatifs permet leur dispersion rapide dans les populations cellulaires. Les plasmides de résistance sont devenus aujourd’hui un problème majeur en médecine clinique (voir section 20.12). Plusieurs gènes de résistance aux antibiotiques peuvent être portés par un plasmide R. En général, ces gènes codent des protéines qui soit inactivent l’antibiotique, soit empêchent son entrée dans la cellule. Le plasmide R100, par exemple, est un plasmide de 94,3 kpb (voir figure 10.20) qui porte des gènes

codant une résistance aux sulfamides, à la streptomycine et la spectinomycine, à l’acide fusidique, au chloramphénicol et à la trétacycline. Le plasmide R100 porte aussi plusieurs gènes conférant une résistance au mercure (voir section 19.16). Le plasmide R100 peut être transféré entre les entérobactéries des genres Escherichia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, et Shigella, mais ne se transfère pas à la bactérie non entérique Gram négatif Pseudomonas. Différents plasmides R portant des gènes conférant une résistance à la plupart des antibiotiques sont connus. Sur les plasmides R, beaucoup d’éléments de résistance aux antibiotiques, comme sur R100, sont aussi des éléments transposables (voir section 10.14), ceci, plus le fait que beaucoup de ces plasmides sont conjugatifs, ont fait d’eux une sérieuse menace aux thérapies traditionnelles par antibiotiques.

Les plasmides codant des toxines et d’autres caractères de virulence Les caractères des micro-organismes pathogènes leur permettant de coloniser les hôtes et d’établir des infections seront vus au chapitre 21. Brièvement, les deux caractères majeurs impliqués dans la virulence (capacité à causer une maladie) des pathogènes sont : 1) la capacité du pathogène à s’attacher et à coloniser des tissus spécifiques de l’hôte, et 2) la production



280 Chapitre 10


Fonctions de réplication

mer sul str

IS1

94,3/0 kpb

75 kpb

cat

25 kpb

IS1

50 kpb

tra

IS10 IS10 oriT

tet

Tn10

FIGURE 10.20 Carte génétique du plasmide de résistance R100. Le cercle interne indique la taille du plasmide en kilopaires de bases. Le cercle externe indique la localisation des principaux gènes de résistance aux antibiotiques et autres fonctions clefs : cat, résistance au chloramphénicol ; oriT, origine du transfert lors de la conjugaison ; mer, résistance au mercure ; sul, résistance aux sulfamides ; str, résistance à la streptomycine ; tet, résistance à la tétracycline ; tra, fonctions de transfert. La localisation des séquences d’insertion (IS) et du transposon Tn10 est aussi indiquée. Plusieurs gènes impliqués dans la réplication du plasmide se trouvent dans la région comprise entre 88 et 92 kpb.

de substances (toxines, enzymes, et autres molécules) qui endommagent l’hôte. Chez plusieurs bactéries pathogènes, chacune de ces caractéristiques de virulence est portée par des plasmides. Par exemple, les souches entéropathogènes d’Escherichia coli sont caractérisées par leur capacité à coloniser l’intestin grêle et à produire une toxine qui cause les symptômes de la diarrhée (voir section 21.11). La colonisation nécessite la présence d’une protéine cellulaire de surface appelée facteur de colonisation, codée par un plasmide. Cette protéine confère aux cellules la capacité de s’attacher aux cellules épithéliales de l’intestin. Au moins deux toxines de l’entéropathogène E. coli sont connues pour être codées par un plasmide : l’hémolysine, qui lyse les globules rouges et l’entérotoxine qui induit une intensive excrétion d’eau et de sels. C’est l’entérotoxine qui est responsable des diarrhées (voir chapitre 21). Certains facteurs de virulence sont codés par des plasmides, alors que d’autres sont codés par d’autres types d’éléments génétiques mobiles, comme les transposons et les bactériophages ; certains facteurs de virulence, bien sûr, sont chromosomiques. Plusieurs exemples sont connus où les gènes de virulence sont présents sur différents éléments génétiques dans la même cellule. Par exemple, les gènes codant les déterminants de virulence des souches d’E. coli produisant la shigatoxine sont distribués entre le chromosome, un bactériophage et un plasmide.

Les bactériocines Beaucoup de bactéries produisent des protéines qui inhibent ou tuent les espèces proches ou même différentes souches de la

même espèce. Ces agents, appelés les bactériocines pour les distinguer des antibiotiques, ont un spectre d’activité plus étroit que les antibiotiques. Les gènes codant les bactériocines et les protéines impliquées dans leur traitement et leur transport (et dans l’immunité de l’organisme producteur) sont souvent portés par un plasmide ou un transposon. Les bactériocines sont nommées suivant l’espèce de l’organisme qui les produit. Donc, chez E. coli, il y a les colicines codées par les plasmides Col ; Bacillus subtilis produit la subtilisine, et ainsi de suite. Les plasmides Col d’Escherichia coli codent différentes colicines. Les colicines libérées de la cellule se fixent à des récepteurs spécifiques à la surface des cellules sensibles. Les récepteurs de colicines sont généralement des entités dont la fonction normale est le transport de certaines substances, fréquemment un facteur de croissance ou un micronutriment, à travers la membrane externe (la couche lipopolysaccharidique) de la cellule. Les colicines tuent les cellules en perturbant certaines fonctions critiques de la cellule. Par exemple, beaucoup de colicines forment des pores dans la membrane cellulaire qui permettent la fuite des ions potassium et des protons, conduisant à une perte de la capacité à produire de l’énergie pour la cellule. Cependant, la colicine E2 est une endonucléase qui coupe l’ADN, et la colicine E3 est une nucléase qui coupe à un site spécifique de l’ARNr 16S et qui inactive les ribosomes. Les plasmides Col peuvent être conjugatifs ou non. Les bactériocines ou les agents bactériocine-like des bactéries Gram positif sont assez différentes des colicines, mais sont aussi souvent codées par les plasmides ; certaines ont même une valeur commerciale. Par exemple, les bactéries lactiques produisent la bactériocine Nisin A, qui inhibe fortement la croissance d’une large gamme de bactéries Gram positif et est utilisée comme conservateur dans l’industrie alimentaire.

Les plasmides génétiquement modifiés Les outils de base de génie génétique, dont nous allons parler dans la suite de ce chapitre, ont rendu possible la construction au laboratoire d’innombrables nouveaux plasmides artificiels. L’incorporation dans de tels plasmides de gènes d’origines très variées permet le transfert de matériel génétique en franchissant les barrières d’espèces. De plus, il est aujourd’hui possible de synthétiser les gènes que l’on souhaite introduire dans les plasmides. Les seules contraintes pour la mise au point de plasmides artificiels sont : 1) qu’ils contiennent des gènes contrôlant leur propre réplication ; 2) qu’ils contiennent les fonctions de transfert (tra), s’ils sont conjugatifs ; et 3) qu’ils se maintiennent de façon stable dans l’hôte choisi.

Contrôlez vos acquis L’information génétique portée par les plasmides n’est pas essentielle pour la cellule, mais peut conférer un avantage sélectif de croissance sous certaines conditions. Les exemples connus incluent la résistance aux antibiotiques, les enzymes pour la dégradation de composés organiques inhabituels et les voies métaboliques particulières. Les facteurs de virulence de nombreuses bactéries pathogènes sont souvent codés par les plasmides.



10.11 La conjugaison : les caractéristiques essentielles 281

•

Énumérez les différences et les similitudes entre le plasmide R et le plasmide F.

•

En quoi les bactériocines diffèrent-elles des antibiotiques ?

10.11 La conjugaison : m n les caractéristiques essentielles

avec un récepteur situé sur la cellule receveuse, puis se rétractent, joignant les deux cellules ensemble. Les contacts entre les cellules donneuses et receveuses sont alors stabilisés, probablement par une fusion des membranes externes, et l’ADN est ensuite transféré d’une cellule à l’autre via un complexe protéique (système de sécrétion de type IV).

Les mécanismes du transfert de l’ADN durant la conjugaison

La conjugaison bactérienne est un procédé de transfert génétique qui nécessite un contact direct entre deux cellules. La conjugaison est un mécanisme qui implique un plasmide (voir section 10.9). Le plasmide conjugatif utilise ce mécanisme pour transférer une copie de lui-même à un nouvel hôte. Cependant, parfois, d’autres éléments génétiques peuvent être mobilisés (c’est-à-dire transférés) pendant la conjugaison. Ces autres éléments génétiques peuvent être d’autres plasmides, ou le chromosome de l’hôte. En effet, la conjugaison a été découverte parce que le plasmide F d’Escherichia coli (voir figure 10.17) peut mobiliser le chromosome de l’hôte. Les mécanismes du transfert conjugatif peuvent différer selon le plasmide impliqué, mais la plupart des plasmides des Bacteria Gram négatif semblent utiliser un mécanisme analogue à celui utilisé par le plasmide F. La conjugaison implique une cellule donneuse, qui contient un type particulier de plasmide conjugatif, et une cellule receveuse, qui n’en contient pas. Les gènes qui contrôlent la conjugaison sont contenus dans la région tra du plasmide (voir section 10.9). Beaucoup de gènes de la région tra sont impliqués dans la formation des couples de cellules, comme dans la synthèse d’un pilus sexuel (voir figure 10.21). Seules les cellules donneuses produisent ces pili. Des plasmides conjugatifs peuvent avoir des régions tra légèrement différentes, et les pili ne sont pas toujours semblables. Le plasmide F et les plasmides apparentés codent les pili F. Les pili permettent la mise en place d’un accouplement spécifique entre la cellule donneuse et la cellule receveuse. Toute conjugaison chez les bactéries Gram négatif semble impliquer les pili. Les pili permettent un contact spécifique

C. Brinton

Pilus avec des phages attachés

FIGURE 10.21 Contact direct entre deux bactéries conjugatives via un pilus. Les cellules forment une paire de conjugaison pour le transfert de l’ADN. Ceci se fait par rétraction du pilus (dépolymérisation). Notez sur le pilus la présence de bactériophages qui infectent spécifiquement les bactéries porteuses du plasmide F (section 16.1).

Une synthèse d’ADN est nécessaire pour qu’il y ait un transfert d’ADN au cours de la conjugaison. Un mécanisme de synthèse d’ADN dans certains bactériophages, appelé la réplication par cercle roulant (voir section 9.11), explique bien le transfert de l’ADN lors de la conjugaison, et ce processus est décrit figure 10.22. La conjugaison est déclenchée par le contact entre deux cellules, un brin de l’ADN plasmidique est coupé et est transféré dans la receveuse. L’enzyme nécessaire pour initier le processus, TraI, est codée par l’opéron tra du plasmide F. Cette protéine a aussi une activité hélicase et est donc impliquée dans le déroulement du brin transféré. Au cours de ce transfert, la synthèse d’ADN par le mécanisme du cercle roulant remplace dans le donneur le brin transféré, pendant que le brin d’ADN complémentaire est synthétisé dans la cellule receveuse. Alors, à la fin du processus, la cellule donneuse et la cellule receveuse possèdent des plasmides complets. Pour le transfert du plasmide F, la cellule F+ le possédant s’apparie avec une cellule F– ne le possédant pas, engendrant deux cellules F+ (voir figure 10.22). Le transfert de l’ADN plasmidique est hautement efficace ; dans des conditions appropriées, théoriquement, toute cellule qui s’apparie acquiert le plasmide. Quand les gènes du plasmide peuvent être exprimés dans la cellule receveuse, la cellule receveuse elle-même devient une cellule donneuse et peut transférer le plasmide à d’autres cellules receveuses. De cette façon, les plasmides conjugatifs peuvent se disperser rapidement entre les populations, se comportant ainsi comme des agents infectieux. La nature infectieuse du transfert plasmidique a un impact écologique important car l’introduction de quelques cellules contenant le plasmide dans une population appropriée de cellules receveuses peut, si elles contiennent des gènes qui confèrent un avantage sélectif, convertir très rapidement la population entière de receveuses en une population porteuse du plasmide (et donc donneuse). Les plasmides peuvent aussi être perdus par la cellule par un curage. Ceci peut survenir spontanément dans les populations naturelles quand il n’y a pas de pression de sélection pour maintenir le plasmide. Par exemple, les plasmides conférant une résistance à un antibiotique peuvent être perdus s’il n’y a pas d’antibiotiques dans l’environnement de la cellule sans affecter la viabilité de cette dernière.

Contrôlez vos acquis La conjugaison est un mécanisme de transfert d’ADN chez les procaryotes qui nécessite un contact de cellule à cellule. La conjugaison est contrôlée par des gènes portés par certains plasmides (comme le plasmide F) et implique le transfert du plasmide d’une cellule donneuse à une receveuse. Le transfert de l’ADN plasmidique implique une réplication par le mécanisme de cercle roulant.



282 Chapitre 10


Chromosome Plasmide F bactérien Pilus

Cellule F+ (donneuse)

Rétraction du pilus

Cellule F– (receveuse)

Cellule donneuse

Brin non transféré

Paire de cellules stabilisées. Plasmide F coupé sur un brin

Transfert d’un brin de la cellule F+ vers la cellule F–. Réplication simultanée du plasmide F dans la cellule F+

Amorce

Paroi

Début de la synthèse du brin complémentaire dans la cellule receveuse

3' 5'

ADN polymérase

ADN polymérase Protéine pour le déroulement (TraI) Protéines membranaires codées par le plasmide Protéine spécifique de la membrane externe de la receveuse Brin transféré

Amorce Achèvement du transfert et de la synthèse d’ADN. Séparation des cellules

Cellule F+

Cellule F+

(a)

Cellule receveuse

(b)

FIGURE 10.22 Transfert d’ADN plasmidique par conjugaison. (a) Dans cet exemple, le plasmide F d’une cellule F + est transféré à une cellule receveuse F–. Notez le mécanisme de réplication par cercle-roulant (figure 9.20 et figure 16.4). (b) Détails de la réplication et du procédé de transfert.

•

Dans la conjugaison, comment les cellules donneuse et receveuse sont-elles mises en contact ?

•

En quoi la réplication de l’ADN par cercle roulant diffère-t-elle de la réplication de l’ADN chromosomique (voir sections 7.5 et 7.6) ?

10.12 La formation des souches Hfr m n et la mobilisation du chromosome

Le plasmide F d’Escherichia coli (voir section 10.9) peut, dans certains cas, mobiliser le chromosome et conduire à son transfert durant le contact entre deux cellules. Le plasmide F est un épisome, c’est-à-dire qu’il peut s’intégrer dans le chromosome de l’hôte (voir section 10.9). Quand le plasmide F est intégré dans le chromosome, le chromosome est mobilisé, ce qui peut conduire au transfert de gènes chromosomiques. Suite à une recombinaison

génétique entre la cellule donneuse et la cellule receveuse, le transfert latéral de gènes par ce mécanisme peut être très important. Les cellules possédant un plasmide F non intégré sont appelées F+. Celles qui ont un plasmide intégré au niveau de leur chromosome sont appelées Hfr (pour Haute Fréquence de Recombinaison). Les cellules F+ et Hfr sont des donneuses et elles ne peuvent contenir une seconde copie du plasmide F ou des plasmides génétiquement proche. Mais à la différence de la conjugaison entre une F+ et une F–, la conjugaison entre une F– et une donneuse Hfr conduit au transfert de gènes chromosomiques de l’hôte car le plasmide fait partie du chromosome. Après la recombinaison, la cellule receveuse F– peut exprimer un nouveau phénotype. L’intégration du plasmide est donc un mécanisme pour mobiliser les principales ressources génétiques de la cellule. Le terme « haute fréquence de recombinaison » se réfère aux forts taux de recombinaison génétique entre les gènes chromosomiques de la cellule donneuse et de la cellule receveuse. La présence du plasmide F conduit donc à trois changements des propriétés de la cellule : 1) la capacité à synthétiser le pilus F, 2) la mobilisation de l’ADN pour le transfert à une



10.12 La formation des souches Hfr et la mobilisation du chromosome 283

autre cellule, et 3) la modification des récepteurs de surface faisant que la cellule n’est plus capable de se comporter comme une cellule receveuse dans la conjugaison.

Transfert à la cellule receveuse F– oriT rep IS3 pro

L’intégration de F et la mobilisation du chromosome L’intégration du plasmide F dans le chromosome de l’hôte peut se faire en plusieurs sites spécifiques, appelés IS (pour séquences d’insertion). Ces sites sont des régions d’ADN avec des homologies de séquences entre le chromosome et le plasmide F (voir section 10.13 les séquences d’insertion). La figure 10.23 montre l’intégration d’un plasmide F à un site IS. Une fois intégré, le plasmide ne contrôle plus sa propre réplication, mais la région tra fonctionne normalement et la souche synthétise les pili sexuels. Quand une cellule receveuse est présente, la conjugaison est déclenchée comme dans une cellule F+, et le transfert de l’ADN est initié au site oriT (origine de transfert). Cependant, comme le plasmide fait maintenant partie du chromosome, après le transfert d’une partie de l’ADN plasmidique, débute le transfert des gènes chromosomiques (voir figure 10.24). Comme dans le cas de la conjugaison avec le plasmide F (voir figure 10.22), le transfert de l’ADN chromosomique implique aussi une réplication. Donc, après le transfert, la souche Hfr reste génétiquement une Hfr car elle garde une copie des gènes transférés. Du fait du nombre de sites d’insertion différents présents sur le chromosome, il y a un certain nombre possible de souches Hfr différentes. Une souche Hfr donnée transmet toujours les gènes dans le même ordre, selon l’orientation du plasmide F intégré. Les souches Hfr qui diffèrent par la position du site d’intégration du plasmide F sur le chromosome transfèrent les gènes dans des ordres différents (voir figure 10.25). Comme il y a habituellement cassure du brin d’ADN au cours du transfert, seule une partie du chromosome de la cellule donneuse est transférée. De ce fait, il ne oriT rep Plasmide F

tra IS3

Recombinaison pro

lac Chromosome IS3

pro

IS3

rep

oriT

tra

IS3

lac

FIGURE 10.23 Intégration du plasmide F dans le chromosome et formation d’une souche Hfr. Le plasmide F peut s’intégrer dans le chromosome bactérien en de nombreux sites différents au niveau de séquences d’insertion, dans l’exemple il s’agit de IS3, localisée entre les gènes chromosomiques pro et lac. Certains des gènes du plasmide sont présentés. La flèche indique l’origine de transfert, oriT. Dans cette souche Hfr, pro serait le premier gène chromosomique à être transféré et lac serait le dernier (voir figure 10.24).

tra

leu thr

IS3

Plasmide F intégré

lac

Chromosome gal arg his

trp

FIGURE 10.24 Coupure du chromosome Hfr à l’origine de transfert puis transfert de l’ADN à la cellule receveuse. La réplication a lieu durant le transfert (voir figure 10.22). La figure n’est pas à l’échelle ; le plasmide F intégré représente réellement moins de 3 % de la taille du chromosome d’Escherichia coli.

peut se répliquer dans la cellule receveuse. Les gènes de la cellule donneuse ne peuvent normalement pas être détectés dans les cellules receveuses sans une recombinaison entre le nouveau fragment entrant et le chromosome de la cellule receveuse. Enfin, bien que les souches Hfr transmettent les gènes chromosomiques à haute fréquence, elles ne convertissent généralement pas les cellules F– en F+ ou Hfr car le plasmide est rarement transféré. Un croisement entre une Hfr et une F– conduit à une cellule Hfr et une cellule F– qui, maintenant, ont un nouveau génotype et parfois un nouveau phénotype. Comme pour la transformation et la transduction, la recombinaison génétique entre les gènes de la cellule Hfr et les gènes de la cellule F– implique une recombinaison homologue dans la cellule receveuse. À certains sites d’insertion, le plasmide F est intégré avec l’origine de transfert pointant dans une direction, tandis qu’à d’autres sites l’origine de transfert pointe dans une direction opposée. Le sens dans lequel le plasmide est inséré détermine quels gènes chromosomiques seront transférés en premier dans la cellule receveuse (voir figure 10.25). En utilisant différentes souches Hfr dans les expériences de conjugaison, il a été possible de déterminer l’arrangement et l’orientation de tous les gènes chromosomiques chez Escherichia coli (voir figure 10.42) bien avant que le chromosome de cette bactérie ne soit séquencé.

L’utilisation des souches Hfr dans les croisements génétiques Comme pour tous les systèmes de transfert de gènes bactériens, il faut sélectionner les recombinants issus de la conjugaison. Cependant, contrairement à la transformation ou la transduction, pendant la conjugaison, les cellules donneuse et receveuse sont vivantes. Il est donc nécessaire de choisir des conditions de sélection où les recombinants souhaités peuvent pousser mais où aucune souche parentale ne peut former de colonies. Habituellement, la cellule receveuse choisie est résistante à un antibiotique mais est auxotrophe pour une substance donnée, et la



284 Chapitre 10

Génétique bactérienne F

F Hfr 3

X

Y

W

me bac o so t

Ch r

om

B

Cellule donneuse Hfr : Thr+ Leu+ Lac+ Strs X Cellule receveuse F– : Thr– Leu– Lac– Strr

Hfr 1

C

D E

é

Mélange pour permettre la conjugaison, suivi d’un étalement sur milieux gélosés

F

n rie

V

Z

A

U

G

T

H

F Hfr 4

I

S J

R Q P

O

N M

L F

K

Hfr 2

Hfr 3

Hfr 4 (b)

XYZAB Gène C transféré en premier ; dans le sens des aiguilles d’une montre

CDE

LKJ

BAZYX

XYZAB

GFE

BAZYX

Sélection des recombinants

Hfr 2

(a) Hfr 1

Recombinants Lac+

Recombinants Thr+ Leu+

ONM Gène L transféré en premier ; dans le sens inverse des aiguilles d’une montre UVW Gène X transféré en premier ; dans le sens des aiguilles d’une montre JIH Gène G transféré en premier ; dans le sens inverse des aiguilles d’une montre

FIGURE 10.25 Formation de différentes souches Hfr capables de transférer les gènes dans un ordre différent selon le site d’insertion du plasmide F. Le chromosome bactérien (a) s’ouvre au niveau de différentes séquences d’insertion, où les plasmides F peuvent s’intégrer. L’ordre des gènes est donné dans la partie (b).

cellule donneuse est, elle, sensible à cet antibiotique mais est prototrophe pour la même substance. Donc sur un milieu minimum contenant l’antibiotique, seules les cellules receveuses pourront se développer après conjugaison. Dans l’expérience présentée figure 10.26, une donneuse Hfr, qui est sensible à la streptomycine (Strs) et est sauvage pour la synthèse des acides aminés thréonine et leucine (Thr+ et Leu+) ainsi que pour l’utilisation du lactose (Lac+), est mélangée avec une cellule receveuse qui ne peut produire ces acides aminés, mais qui est résistante à la streptomycine (Strr). Le milieu sélectif est un milieu minimum contenant de la streptomycine, donc seules les cellules recombinantes peuvent s’y développer. La composition de chaque milieu sélectif est différente et dépend des caractéristiques génotypiques recherchées chez le recombinant (voir figure 10.26). La fréquence du processus est mesurée en comptant les colonies formées sur le milieu sélectif. L’ordre des gènes sur le chromosome du donneur peut aussi être déterminé par des cinétiques de transfert de marqueurs individuels. Par exemple, ceci peut être obtenu lors d’expériences d’interruption de croisement qui consistent à séparer les cellules par une agitation dans un mixeur. Si les mélanges contenant les souches Hfr et F– sont agités à différents temps et que les recombinants sont comptabilisés, il est montré que plus le temps est long entre le croisement et l’agitation, plus grand est le nombre de gènes de Hfr

Milieu minimum gélosé avec de la streptomycine et du glucose ; sélection des recombinants Thr+ Leu+ ; Lac n’est pas sélectionné.

Milieu minimum gélosé avec de la streptomycine, du lactose, de la thréonine, de la leucine ; sélection des recombinants Lac+ ; Thr et Leu ne sont pas sélectionnés.

FIGURE 10.26 Expérience type de détection d’une conjugaison. Thr, thréonine ; Leu, leucine ; Lac, lactose ; Str, streptomycine. Notez que chaque milieu sélectionne une classe spécifique de recombinants. Les contrôles pour cette expérience sont l’étalement sur boîte des échantillons du donneur et du receveur avant leur mélange. Aucun des deux ne doit être capable de croître sur le milieu sélectif utilisé.

transmis au recombinant F–. Les gènes proches de l’origine de transfert entrent dans la cellule F– en premier. Ils sont donc présents dans un nombre plus élevé de recombinants contrairement aux gènes transférés plus tard (voir figure 10.27). De plus, comme le transfert de gènes d’un donneur à un receveur est un processus séquentiel, ce type d’expériences fournit une méthode pour déterminer l’ordre des gènes sur le chromosome bactérien (cartographie génétique). L’arrangement des loci de gènes sur le chromosome est appelé la carte génétique (voir section 10.19 et figure 10.42).

Le transfert de gènes chromosomiques au plasmide F Occasionnellement, les plasmides F intégrés peuvent s’exciser du chromosome, et il est parfois possible que des gènes chromosomiques s’incorporent au plasmide F libéré. Ceci peut survenir car le plasmide F intégré et le chromosome contiennent un nombre d’IS identiques où la recombinaison peut avoir lieu (voir figure 10.23). Ces plasmides F contenant des gènes chromosomiques sont appelés plasmides F’. Les plasmides F’ diffèrent des plasmides F normaux car ils contiennent des gènes chromosomiques identifiables, et ils transfèrent ces gènes à haute fréquence à des cellules receveuses. Le transfert via F’ ressemble à la transduction spécialisée (voir section 10.8) puisque seul un groupe restreint de gènes chromosomiques peut être transféré. Le transfert d’un plasmide F’ dans une cellule receveuse permet d’établir des diploïdes (deux copies de chaque gène) pour une région limitée du chromosome. Ces diploïdes partiels sont appelés mérodiploïdes (mérozygotes). Cette propriété joue un rôle important dans la réalisation de tests de complémentation (voir la prochaine section).



10.13 La complémentation 285

60

0

8 min

Nombre de recombinants pour 100 bactéries Hfr

Thr+Leu+

25 33

peut être utilisé pour cartographier l’ordre des gènes sur le chromosome. Les plasmides F’ sont dérivés des plasmides F intégrés qui se sont excisés en emportant des gènes chromosomiques.

Gal+ Trp+

50 Thr+Leu+

40

•

Dans la conjugaison impliquant le plasmide F d’Escherichia coli, comment est mobilisé le chromosome de la cellule hôte ?

•

Pourquoi le croisement d’une cellule Hfr avec une cellule F– ne conduit-il pas à deux cellules Hfr ?

•

À quels sites sur le chromosome le plasmide F peutil s’intégrer ?

30 Gal+ 20 Trp+

10

10

20

30

40

50

60

70

Temps, après mélange des cultures parentales (min) FIGURE 10.27 Taux de formation de recombinants contenant différents gènes après mélange d’une souche Hfr et d’une bactérie F– par croisement interrompu. La localisation des gènes le long du chromosome Hfr est indiquée en haut à gauche. Notez que les gènes les plus près de l’origine (0 min) sont les premiers détectés lors du transfert. L’expérience repose sur le mélange des cellules Hfr et F – dans des conditions qui permettent à la majorité des cellules Hfr de trouver des cellules receveuses. À différents temps, le mélange est soumis à une agitation vigoureuse pour arrêter le croisement, puis il est étalé sur un milieu sélectif sur lequel seuls les recombinants peuvent former des colonies.

D’autres systèmes de conjugaison Les plasmides conjugatifs sont retrouvés chez de nombreuses bactéries Gram négatif autres qu’Escherichia coli. Les plasmides conjugatifs appartenant au groupe d’incompatibilité IncP (voir section 10.9) peuvent être maintenus théoriquement dans toutes les Bacteria Gram négatif connues et même transférés entre différents genres. Les plasmides conjugatifs sont aussi connus chez les Bacteria Gram positif (par exemple, chez Streptococcus, Enterococcus, et Staphylococcus). Plusieurs plasmides conjugatifs ont aussi été trouvés chez le genre archaéen Sulfolobus. La conjugaison chez Sulfolobus est moins bien connue, même si l’on sait qu’il y a un contact cellulaire avant le transfert du plasmide et que ce transfert est unidirectionnel. Néanmoins, à une exception près, les gènes impliqués semblent avoir peu de similarités avec ceux des Bacteria Gram négatif. L’exception étant un gène similaire à traG, dont le produit chez un plasmide F, semble impliqué dans la stabilisation des couples de cellules. Il semble donc que la conjugaison chez les Archaea soit assez différente de celle des Bacteria.

Contrôlez vos acquis Le chromosome de la cellule donneuse peut être mobilisé pour être transféré à une cellule receveuse. Ceci nécessite que le plasmide F s’intègre au chromosome pour former un phénotype Hfr. Le transfert du chromosome de la cellule donneuse est rarement total mais

10.13 La complémentation m n Toutes les méthodes de transfert de gènes bactériens impliquent seulement une portion du chromosome du donneur. Alors, à moins qu’il y ait une recombinaison avec le chromosome de la cellule receveuse, l’ADN du donneur sera perdu dans la cellule receveuse car il ne peut se répliquer indépendamment. Dans deux cas vus précédemment, un état de diploïdie partielle peut être durablement maintenu. Un des cas est celui de la transduction spécialisée où les gènes du donneur sont maintenus en tant que partie intégrante du génome viral (voir section 10.8). L’autre cas est l’utilisation des plasmides F’ où les gènes du donneur font partie de l’ADN plasmidique (voir section 10.12). Comme il est possible de créer des phages réalisant la transduction spécialisée ou des plasmides spécifiques en utilisant des techniques d’ADN recombinant (voir sections 10.15-10.17), il est possible d’intégrer presque n’importe quelle portion de chromosome bactérien dans un phage ou plasmide. Ce qui est très utile pour les analyses génétiques bactériennes.

Test de complémentation et cistron Quand deux souches mutantes sont génétiquement croisées, une recombinaison homologue peut conduire à un recombinant sauvage à moins que les mutations soient sur les mêmes paires de bases. Par exemple, si deux souches auxotrophes différentes Trp– d’Escherichia coli (souches qui nécessitent l’acide aminé tryptophane dans le milieu) sont croisées et que des recombinants Trp+ sont obtenus, il est clair que les mutations dans les deux souches n’étaient pas situées aux mêmes paires de bases. Cependant, ce type d’expérience ne permet pas de déterminer si deux mutations sont localisées dans des régions différentes au niveau du même gène. Ceci ne peut être déterminé que par le test de complémentation. Si un des gènes tryptophane est inactivé par une mutation dans une souche particulière conduisant au phénotype Trp–, alors l’insertion d’une copie du gène sauvage par un plasmide ou un génome viral dans la même cellule devrait restaurer le phénotype sauvage de la cellule ; ce qui signifie que la cellule diploïde partielle résultante devrait être Trp+. Le gène sauvage complémente la mutation. Comment un test de complémentation peut-il être réalisé afin d’identifier des mutations sur le même gène ?



286 Chapitre 10


Même si seul un fragment chromosomique est transféré lors de la conjugaison, ce fragment peut contenir plusieurs gènes. Toujours avec l’exemple du tryptophane, les gènes impliqués dans la biosynthèse du tryptophane formant un opéron (voir figure 8.24), il est possible de transférer facilement l’opéron entier d’une cellule donneuse à une cellule receveuse. À noter que même si l’opéron du donneur porte aussi une mutation, il complémentera le gène muté dans la cellule receveuse si les deux mutations sont sur des gènes différents. Les deux mutations se complémentent (voir figure 10.28). Si chaque molécule d’ADN homologue apporte un gène nécessaire différent alors la cellule aura toutes les enzymes nécessaires pour synthétiser le tryptophane. Il est important de noter que la complémentation n’implique pas de recombinaison. Pour faire un test de complémentation, les mutations doivent être localisées sur deux molécules

A

Cellule de type sauvage, les deux gènes A et B sont fonctionnels et la cellule est Trp+

B

A 1

La cellule mutante souche 1 contient une mutation 1 et est Trp– (nécessite du tryptophane pour croître)

B

d’ADN différentes : le chromosome et l’élément extrachromosomique (ADN plasmidique ou viral). De telles mutations sont dites être en trans l’une par rapport à l’autre. Si une molécule porte les deux mutations à la fois, une configuration appelée cis, la seconde molécule ne peut complémenter que si elle est sauvage pour le gène donné. Donc, une mutation en cis sert de contrôle positif dans une telle expérience de complémentation. Ce type de test de complémentation, appelé test cis-trans, est utilisé pour déterminer si deux mutations sont sur la même unité génétique. L’unité génétique définie par le test cis-trans est appelée cistron (un terme équivalent à gène). Si deux mutations se produisent sur des gènes codant différentes enzymes, ou même différentes sous-unités de la même enzyme, la complémentation des deux mutations est possible, et les mutations ne sont donc pas localisées dans le même cistron (voir figure 10.28). Même si des croisements génétiques impliquant des analyses de complémentation sont encore réalisés en génétique bactérienne, dans de nombreux cas, il est plus simple de séquencer le gène en question et d’analyser la séquence pour identifier la nature et la localisation des mutations. Ceci est spécialement vrai si la séquence du gène sauvage est connue ; dès lors, des amorces spécifiques peuvent être utilisées et l’ADN rapidement séquencé. Le terme cistron est maintenant rarement utilisé en génétique microbienne excepté pour décrire un ARNm porteur de l’information génétique d’un gène (ARNm monocistronique) ou de plusieurs gènes (ARNm polycistronique) [voir section 7.13].

Contrôlez vos acquis A

La cellule mutante souche 2 contient une mutation 2 et est aussi Trp–

B 2

A

B

3

1

A

Test en configuration trans des mutations 1 et 2 ; il y a complémentation (la cellule est Trp+), les mutations sont donc sur des gènes différents

B

A

B 2

A A

La cellule mutante souche 3 contient une mutation 3 et est Trp–

2 B B 3

Test en configuration trans des mutations 2 et 3 ; il n’y a pas de complémentation (la cellule est Trp–), les mutations sont donc sur le même gène

FIGURE 10.28 Analyse par complémentation. Dans cet exemple, les produits des gènes A et B sont nécessaires pour la synthèse du tryptophane. Les mutations 1, 2 et 3 conduisent au même phénotype, un besoin en tryptophane (Trp –). L’analyse par complémentation indique que les mutations 2 et 3 sont sur le même gène tandis que la mutation 1 est sur un autre gène.

Si une cellule est traitée afin de contenir deux copies d’une région de son génome, il est possible de faire des tests de complémentation pour déterminer si deux mutations sont sur le même gène ou sur des gènes différents. Ceci est souvent nécessaire car des mutations sur différents gènes peuvent donner le même phénotype. Les tests de complémentation n’impliquent pas de recombinaison. •

Qu’est-ce qu’un mérodiploïde ?

•

Les tests de complémentation sont des tests cistrans. Expliquez.

10.14 Les transposons et les séquences m n d’insertion L’ordre des gènes sur un chromosome bactérien peut être déterminé par les méthodes de transfert de gènes, comme les gènes des chromosomes eucaryotes peuvent être cartographiés par des expériences de croisement. Cependant, l’arrangement exact des gènes sur un chromosome n’est pas nécessairement permanent, certains gènes sont mobiles. Le processus par lequel un gène se déplace d’un site à un autre dans le génome est appelé la transposition qui est très importante dans l’évolution et pour les analyses génétiques. La transposition est un événement rare, se faisant à une fréquence de 10–5–10–7 par génération. Donc, dans leur grande



10.14 Les transposons et les séquences d’insertion 287

majorité, les gènes sont des entités relativement stables. De plus, tous les gènes ne sont pas capables de réaliser la transposition. La transposition est d’ailleurs liée à la présence d’éléments génétiques spéciaux appelés éléments transposables. La transposition a d’abord été mise en évidence chez le maïs, puis chez les bactéries. Il est maintenant admis que les séquences d’ADN présentant les propriétés des éléments transposables sont répandues dans la nature.

Les transposons et les éléments transposables Il y a trois types d’éléments transposables chez les bactéries : les séquences d’insertion, les transposons, et certains virus particuliers (comme Mu) [voir section 16.5]. Dans cette section seront principalement examinés les séquences d’insertion (IS) et les transposons. Ces deux éléments ont deux caractéristiques importantes en commun : les deux portent des gènes codant une transposase, l’enzyme nécessaire pour la transposition, et ils ont de courtes répétitions terminales inversées aux extrémités de leur ADN. Les répétitions ont une longueur comprise entre quelques paires de bases jusqu’à 20 pb pour les éléments IS simples à plus de 1 kpb pour certains transposons, et chaque IS différente a un nombre spécifique de paires de bases dans ses répétitions terminales. Ces répétitions terminales inversées sont impliquées dans la transposition. La figure 10.29 montre une carte génétique d’un élément d’insertion commun appelé IS2 et du transposon Tn5. Les éléments transposables les plus simples sont les séquences d’insertion qui portent uniquement les gènes nécessaires

IS2 tnp

(a)

à la transposition. Les séquences d’insertion sont de courts segments d’ADN, environ 1 000 nucléotides de long, qui peuvent s’intégrer à des sites spécifiques dans le génome. Elles sont retrouvées à la fois sur l’ADN chromosomique et plasmidique, et chez certains bactériophages. Plusieurs centaines d’éléments IS distincts ont été caractérisés, et la plupart sont désignés par un nombre identifiant le type : IS1, IS2, IS3… Les éléments IS sont dispersés le long du chromosome, et les souches varient dans le nombre et la fréquence de ces éléments. Par exemple, une souche d’Escherichia coli a 5 copies de IS2 et 5 copies de IS3. Beaucoup de plasmides portent aussi ces séquences d’insertion (voir figures 10.18 et 10.20), et c’est une recombinaison homologue entre les séquences d’insertion identiques sur le plasmide F et le chromosome et non la transposition qui permet au plasmide F de s’intégrer dans le chromosome bactérien et plus tard de le mobiliser (voir section 10.12 et figure 10.23). Certaines espèces d’Archaea ont aussi un grand nombre d’éléments IS dans leurs chromosomes, suggérant que la transposition est caractéristique de tous les procaryotes. Les transposons sont plus grands que les séquences d’insertion et portent d’autres gènes, certains d’entre eux conférant des propriétés importantes à l’organisme qui les portent. Ceux-ci incluent souvent une résistance aux antibiotiques ou à d’autres gènes facilement sélectionnables. De plus, il y a des transposons conjugatifs qui peuvent se transférer entre espèces bactériennes par conjugaison. Ces transposons ont des gènes leur permettant non seulement de se déplacer d’un endroit du génome à un autre, mais ils portent également les gènes tra nécessaires pour le transfert d’une bactérie à une autre (voir section 10.11). Certains transposons sont des éléments génétiques composites, contenant un gène ou un groupe de gènes entre deux séquences d’insertion identiques. L’existence de ces transposons composites indique que de nouveaux transposons émergent périodiquement dans les cellules qui contiennent des séquences d’insertion proches.

La transposition et l’évolution microbienne

Tn5 IS50L kan

str

bleo

IS50R tnp

(b) FIGURE 10.29 Cartes des éléments transposables IS2 et Tn5. Les répétitions inverses sont indiquées en rouge. Les flèches audessus des cartes indiquent le sens de transcription des gènes. Le gène codant la transposase est tnp. (a) IS2 est une séquence d’insertion de 1 327 pb avec des répétitions inverses de 41 pb à chaque extrémité. (b) Tn5 est un transposon composite de 5,7 kpb contenant les séquences d’insertion IS50L et IS50R aux extrémités gauche et droite respectivement. Les deux éléments IS50 sont quasiment identiques. Toutefois, IS50L ne peut réaliser une transposition indépendante car il y a une mutation non-sens (voir section 10.2) marquée par une croix bleue dans sa transposase. Les gènes kan, str et bleo confèrent une résistance aux antibiotiques kanamycine (et néomycine), streptomycine et bléomycine. Tn5 est communément utilisé pour générer des mutants chez Escherichia coli et d’autres bactéries Gram négatif.

Les séquences répétées inversées trouvées aux extrémités des éléments transposables et la transposase sont essentielles pour la transposition. La transposase reconnaît, coupe, et éventuellement ligature l’ADN durant la transposition (voir figure 10.30). Quand un élément transposable est inséré dans un ADN cible, une courte séquence de la cible est dupliquée au site d’intégration durant l’insertion. Il y a duplication, car des coupures d’ADN simple brin sont générées par la transposase. Le transposon est alors attaché aux extrémités simple brin générées et la réparation des portions simple brin conduit à la duplication (voir figure 10.31). Si un gène entier ou un groupe de gènes sont dupliqués, l’organisme contiendra de multiples copies de ces gènes. Ces événements de duplication de gènes alimentent l’évolution microbienne. Ceci parce que les mutations ayant lieu sur une copie de gène(s) n’affecteront pas l’autre copie, la fonction de la protéine mutée est « couverte » par le produit du gène dupliqué non muté. Cependant, les mutations bénéfiques sur une copie peuvent conduire à la production d’une protéine qui a des propriétés plus intéressantes que la protéine normale. De cette façon, le processus évolutif peut « expérimenter » cette



288 Chapitre 10

Génétique bactérienne Séquence cible

Transposon

A B C D A' B' C' D'

= Sites de coupure

ADN cible IR IR

IR IR

Élément transposable (a)

Insertion A B C D IR A' B' C' D' IR

IR A B C D IR A' B' C' D'

Séquence cible dupliquée FIGURE 10.30 Transposition. L’insertion d’un élément transposable génère une duplication de la séquence cible. Notez la présence de répétitions inverses (IR) aux extrémités de l’élément transposable. La figure 10.31 montre des modèles plus détaillés du mécanisme de transposition.

(b) Conservative

Deux mécanismes de transposition sont connus, la transposition conservative et la transposition réplicative (voir figure 10.31). Dans la transposition conservative, comme dans le cas du transposon Tn5, l’élément transposable est excisé d’un endroit du chromosome et est réinséré à un second endroit. Le nombre de copies du transposon reste à 1. Par opposition, dans la transposition réplicative, comme dans le cas du bactériophage Mu (voir section 16.5), une nouvelle copie est produite et insérée à un autre endroit du chromosome. Donc, après la transposition réplicative, une copie de l’élément reste au site d’origine et une autre copie va à un nouveau site. Des coupures simple brin sont faites aux extrémités des transposons (au site des répétitions inverses) et d’autres sont réalisées de part et d’autre du site cible. Le transposon est maintenant joint au site cible via les extrémités simple brin. Dans la transposition conservative, le site donneur est coupé, les brèches simple brin au niveau du site cible sont comblées par la réplication. Ce processus résulte en la formation au site cible de répétitions directes aux extrémités du transposon. Dans la transposition réplicative, la réplication se fait alors que l’élément transposable est attaché à la fois au site d’origine et au site cible. Ceci conduit à la formation d’un cointégrat. La finalité est la résolution de cette structure, conduisant à la libération du transposon d’origine et à la présence d’une nouvelle copie de ce transposon au site cible (voir figure 10.32). La transposition est essentiellement un événement de recombinaison, mais qui ne se fait pas entre des séquences homologues ou par l’utilisation du système général de recombinaison de la cellule. La transposition implique la transposase plutôt que la protéine RecA (voir figure 10.9). Comme cette recombinaison implique une séquence de bases spécifique, elle est appelée recombinaison site-spécifique (par opposition à la recombinaison homologue, voir section 10.6).

Replicative Réplicative

Coupure

Réplication

Cointégrat

copie de gènes tandis que l’autre copie fournit la fonction de base nécessaire. Les analyses génomiques ont révélé de nombreux exemples de gènes qui dérivaient clairement du processus de duplication de gènes.

Les mécanismes de transposition

Transposon intégré

(e) (c)

(d)

Résolution du cointégrat

Réparation

(f)

FIGURE 10.31 Mécanismes de transposition. Pour simplifier, l’ADN donneur (portant le transposon) est en vert clair et l’ADN portant l’ADN cible est en vert foncé. (a) Dans la transposition conservative ou réplicative, la transposase clive (voir les flèches) les brins d’ADN à l’extrémité de l’élément transposable (bleu gris) et au site cible (rouge). Le nombre et la localisation des coupures peuvent varier selon le mécanisme. (b) Le site cible est ligaturé à l’élément transposable. Les ronds noirs indiquent les extrémités 3’ libres des brins d’ADN où a lieu la réplication (sections 7.5 et 7.6). (c) Dans la transposition conservative, il y a d’autres clivages avant la réplication/réparation de l’ADN, et l’ADN donneur perd l’élément transposable. (d) La réparation conduit à la duplication du site cible et à l’achèvement de la transposition au nouveau site. (e) Dans la transposition réplicative, il y a réplication sans clivage de l’élément transposable du site donneur conduisant à deux copies de l’élément transposable contenu dans un cointégrat. Notez que les molécules d’ADN du donneur et de la cible sont liées. (f) Ces molécules sont séparées (résolues) lors d’une autre réaction. La résolution des cointégrats est présentée en détail dans la figure 10.32.

La mutagenèse avec des éléments transposables Si le site d’insertion d’un élément transposable est à l’intérieur d’un gène, son insertion va engendrer une mutation (voir figure 10.33). Les transposons permettent ainsi la création de mutants. L’élément le plus utile pour la mutagenèse via un transposon est celui contenant un gène de résistance à un antibiotique. Les clones contenant le transposon peuvent être sélectionnés par l’isolement de colonies résistantes à l’antibiotique. Si les clones



10.14 Les transposons et les séquences d’insertion 289

Transposon

ADN contenant un transposon

Cible

Le clivage simple brin dans la cible et au niveau du transposon conduit à la duplication et la formation d’un cointégrat Formation d’un cointégrat

Résolution du cointégrat

résistants à un antibiotique ont été sélectionnés sur un milieu riche sur lequel se développent tous les auxotrophes, ils peuvent par la suite être criblés sur un milieu minimum supplémenté avec différents facteurs de croissance pour déterminer si un facteur de croissance est nécessaire. Les transposons sont aussi utiles pour incorporer un marqueur génétique d’auxotrophie dans un organisme sauvage. Normalement, les recombinants auxotrophes ne peuvent pas être isolés par une sélection positive (voir figure 10.2), mais si le marqueur d’auxotrophie introduit contient un élément transposable avec un marqueur de résistance à un antibiotique, il est alors possible de sélectionner des clones résistants à cet antibiotique – une procédure de sélection positive – et d’obtenir automatiquement des clones qui ont incorporé le marqueur d’auxotrophie. Deux transposons très utilisés en microbiologie pour la mutagenèse sont Tn5 qui confère des résistances à la néomycine et la kanamycine et Tn10 qui contient un marqueur de résistance à la tétracycline (voir figure 10.20).

Les intégrons

Appariement et recombinaison entre les transposons conduisant à la formation de deux cercles

Transposon d’origine

Cible avec insertion du transposon

FIGURE 10.32 Transposition réplicative. Après un clivage simple brin, il y a formation d’un cointégrat par association des deux molécules (voir figure 10.31). Après recombinaison, la résolution du cointégrat conduit à la formation du transposon d’origine et à la duplication du transposon dans la cellule cible.

Les intégrons sont des éléments génétiques non mobiles, incapables d’autoréplication et obligatoirement portés par un réplicon. Ils peuvent capturer et exprimer des gènes d’autres sources. Ils sont intégrés à des sites hautement spécifiques, fréquemment dans des plasmides. Les intégrons contiennent un gène qui code une protéine appelée intégrase, nécessaire pour la recombinaison site-spécifique. À noter que le génome du phage lambda est intégré dans le génome d’Escherichia coli à un site spécifique par l’activité d’une intégrase (voir section 9.11). Les intégrons contiennent aussi une séquence d’ADN spécifique qui permet à l’intégrase d’insérer des groupes de gènes appelés cassettes, avec un promoteur qui permet l’expression de la nouvelle cassette de gènes intégrée. Les intégrons font partie de transposons, de plasmides, ou même du chromosome bactérien. Certains intégrons contiennent jusqu’à 5 cassettes différentes de gènes. Plus de 40 gènes différents de résistance aux antibiotiques ont été identifiés sur de telles cassettes, comme des gènes de virulence chez certaines bactéries pathogènes. La figure 10.34 montre la structure de In0 intI1

Gène A Transposon

Gène 1 Transposition

Gène 2 Chromosome

Gène 2 interrompu Gène 1

Gène A

Gène 3

Chromosome FIGURE 10.33 Mutagenèse via un transposon. Le transposon s’intègre au milieu du gène 2. Le gène 2 est maintenant interrompu par le transposon et est inactivé. Le gène A du transposon sera exprimé dans les deux situations.

P

attI

sul1

In7 aadB FIGURE 10.34 Structure de deux intégrons naturellement présents chez Pseudomonas. L’intégron In0 a un jeu basique de gènes : intI1, code une intégrase ; attI, site où a lieu l’intégration site-spécifique ; P, un promoteur ; et sul1, un gène conférant une résistance aux sulfamides et qui contient son propre promoteur. L’intégron In7 contient l’ensemble de ces gènes et, en plus, une cassette génétique y a été intégrée. Toutes les cassettes contiennent un site (carré bleu) pour une recombinaison site-spécifique. Dans l’intégron In7, la cassette contient un gène aadB qui confère une résistance à certains antibiotiques de la famille des aminoglycosides.



290 Chapitre 10


deux intégrons du pathogène Pseudomonas aeruginosa. Les intégrons ont été trouvés dans différentes espèces de bactéries, souvent dans des isolats cliniques, et donc leur sélection par un transfert horizontal de gènes dans de tels environnements riches en antibiotiques comme les hôpitaux est évidente. Ce qui est moins évident, c’est l’origine des cassettes de gènes. Il n’y a pas simplement une capture de gènes faite au hasard, mais ces gènes doivent soit : 1) être fixés par des séquences d’ADN spécifiques reconnues par une intégrase, soit 2) être apparemment non exprimés jusqu’à ce qu’ils fassent partie d’un intégron et puissent être transcrits à partir du promoteur de ce dernier.

Contrôlez vos acquis Les transposons et les séquences d’insertion sont des éléments génétiques qui peuvent se déplacer d’un endroit du chromosome à un autre par un procédé appelé transposition, un type de recombinaison sitespécifique. La réplication peut soit être réplicative ou conservative. Les transposons portent souvent des gènes codant une résistance à un antibiotique. Les transposons peuvent être des mutagènes biologiques. •

Quelles caractéristiques ont en commun les séquences d’insertion et les transposons ?

•

Que sont les intégrons et comment diffèrent-ils des transposons ?

III

GÉNÉTIQUE BACTÉRIENNE ET CLONAGE

Les trois mécanismes d’échange génétique décrits dans les sections précédentes ont été mis à profit pour créer de la recombinaison chez les procaryotes dans le but de dresser des cartes génétiques du génome des espèces, mais aussi de créer de nouvelles souches afin d’améliorer notre compréhension de la génétique fondamentale, de la découverte des gènes et de leur fonction jusqu’à l’analyse de leur expression et de la régulation de celle-ci. Néanmoins, ces approches méthodologiques présentent des limitations qui ont été contournées avec l’avènement du génie génétique, qui consiste à modifier précisément l’information génétique d’un organisme en changeant directement une partie de l’ADN génomique. Dans les sections suivantes, nous allons aborder quelques-uns des aspects de cette technologie de l’ADN recombinant ou de manipulation in vitro de l’ADN. Parmi les technologies que nous retrouverons ci-après, beaucoup font partie de la panoplie usuelle du biologiste moléculaire : 1) emploi d’enzymes de restriction, 2) électrophorèse d’ADN sur gel et hybridation d’acides nucléiques, 3) séquençage d’ADN, synthèse de sondes nucléotidiques et PCR (voir sections 7.7 à 7.9).

10.15 Le clonage moléculaire m n La technologie de l’ADN recombinant regroupe un ensemble de méthodes de manipulation de l’ADN qui permet d’étudier dans le détail la structure des génomes et les fonctions associées à leurs séquences. Parmi ces méthodes, le clonage permet d’isoler et de

produire sous une forme pure un gène d’intérêt en copies multiples. Prenons l’exemple d’un organisme simple tel qu’Escherichia coli, dont le génome a une taille moyenne de 4 600 kpb, chaque gène représentant environ 1 à 2 kpb. Chaque gène représente donc moins de 0,05 % de l’ADN total de la cellule. Si l’on considère à présent le génome humain, la situation est encore plus contrastée puisque les régions codantes ne sont pas plus grandes que celles des gènes d’E. coli, que ces gènes ont en plus une structure morcelée (introns et exons) et que la taille globale du génome est au moins 1 000 fois plus importante que celui de la bactérie ! Comment, dans ces conditions, réussir à isoler et amplifier sélectivement un gène ? Si ce gène d’intérêt peut être isolé puis introduit dans un petit génome dont la réplication peut être contrôlée, alors il devient envisageable de produire de multiples copies de ce gène. C’est la technique du clonage moléculaire (voir figure 10.35). Heureusement, grâce à notre connaissance de la chimie de l’ADN ainsi qu’à la découverte d’une panoplie d’enzymes de modification de l’ADN (enzymes de restriction, ADN ligases, ADN polymérases, nucléases, kinases, etc.), il est possible de recombiner in vitro des molécules d’ADN.

Les principales étapes du clonage Le clonage compte plusieurs étapes comme le montre la figure 10.35.

ADN étranger

Coupure par une enzyme de restriction

Ajout du vecteur coupé par la même enzyme de restriction

Extrémités cohésives

Vecteur Ajout d’ADN ligase pour former une molécule recombinante

ADN cloné

Introduction du vecteur recombinant dans un hôte FIGURE 10.35 Principales étapes du clonage. Le vecteur est soit un plasmide, soit un génome viral. En coupant à la fois le fragment d’ADN étranger à insérer et le vecteur par une même enzyme de restriction, des extrémités cohésives complémentaires sont générées de part et d’autre, ce qui permet d’intégrer le fragment d’ADN étranger dans le vecteur.



10.16 Les vecteurs de clonage : les plasmides 291

1. Extraction et fragmentation de l’ADN contenant la séquence d’intérêt. Il peut s’agir de l’ADN génomique total d’un organisme, d’une molécule d’ADNc obtenue par transcription inverse à partir d’un ARNm (voir section 9.13), d’un gène ou d’une séquence plurigénique amplifié par PCR (voir section 7.9) ou encore d’une molécule d’ADN entièrement synthétique fabriquée in vitro (voir section 7.8). S’il s’agit d’un ADN génomique, celui-ci est en général réduit par digestion enzymatique à l’aide d’enzymes de restriction sous la forme de petits fragments facilement manipulables. 2. Insertion des fragments d’ADN dans un vecteur de clonage. Un vecteur de clonage est un petit élément génétique à réplication autonome, utilisé pour produire une multitude de copies du gène d’intérêt. Il dérive en général de plasmides ou de virus (voir sections 10.16 et 10.17 et chapitre 31). Ces vecteurs de clonage sont spécialement conçus pour permettre l’intégration de la portion d’ADN exogène dans un site spécifique sans que cela affecte sa propre réplication. Si le fragment d’ADN étranger et le vecteur de clonage ont été coupés à l’aide de la même enzyme de restriction, il est tout à fait possible de les associer par leurs extrémités cohésives (voir figures 10.35 et 7.21). Dans le cas où des bouts francs ont été générés, il convient d’utiliser des adaptateurs. Dans les deux situations, il sera finalement nécessaire d’utiliser une ADN ligase pour refermer la liaison phosphodiester. 3. Introduction de l’ADN cloné dans un organisme hôte. Après construction du vecteur recombinant, celui-ci peut être introduit par transformation dans une cellule bactérienne hôte capable d’assurer sa réplication – alors une population de micro-organismes recombinants se développe. Par cette méthode, dite de clonage en aveugle ou clonage aléatoire (shotgun cloning), on obtient généralement un mélange de différents clones, certaines cellules contenant le gène d’intérêt tandis que d’autres contiennent, au contraire, de multiples copies d’autres fragments issus de l’ADN source. On appelle cela une banque génomique ou une banque de gènes (voir sections 15.1 et 15.2). Intéressons-nous à présent aux propriétés des plasmides et des virus en tant que vecteurs de clonage.

Contrôlez vos acquis Pour isoler et amplifier un gène donné ou un fragment d’ADN particulier, on utilise un vecteur de clonage qui dérive le plus souvent d’un plasmide ou d’un virus. La recombinaison in vitro nécessite l’emploi d’enzymes de restriction pour couper l’ADN et d’ADN ligase pour lier l’insert au vecteur. L’ADN recombinant est ensuite reproduit en multiples copies dans une cellule hôte qui assure la réplication du vecteur de clonage et de son insert. •

Quel est le but du clonage de fragments d’ADN ?

•

Expliquez l’intérêt du vecteur de clonage, des enzymes de restriction et de l’ADN ligase dans la technologie de l’ADN recombinant.

10.16 Les vecteurs de clonage : m n les plasmides Les plasmides sont des petits éléments génétiques doués de réplication autonome. En plus de posséder les gènes nécessaires à leur propre réplication, ils portent souvent d’autres gènes importants conférant des propriétés particulières à la cellule hôte qui les héberge. Plusieurs propriétés en font d’excellents vecteurs de clonage. 1) Ils ont une petite taille, ce qui les rend faciles à isoler et à manipuler. 2) Ils possèdent leur propre origine de réplication, ce qui rend leur réplication autonome. 3) Ils peuvent être présents en copies multiples dans la cellule hôte amplifiant d’autant l’ADN d’intérêt qui y est inséré. 4) Ils portent des marqueurs de sélection comme des gènes de résistance aux antibiotiques qui facilitent grandement la détection des cellules hôtes qui les portent. Même si les plasmides conjugatifs ont la propriété de se transférer naturellement de cellule à cellule par simple contact, les plasmides utilisés en tant que vecteurs de clonage sont génétiquement modifiés pour éviter leur propagation et leur dissémination par conjugaison. Mais au laboratoire, leur transfert est réalisé soit par la méthode naturelle de transformation, soit par une méthode artificielle comme l’électroporation (voir sections 10.7 et 31.2). Selon le système cellule/ vecteur de clonage employé, le nombre de copies du fragment d’ADN d’intérêt produit sera plus ou moins important selon que la réplication du plasmide est sous contrôle strict ou, au contraire, lâche de la cellule hôte. En général, on tente de réaliser la sélection la plus adaptée possible afin d’obtenir le plus grand nombre de copies du plasmide, qui peut atteindre plusieurs milliers d’unités par cellule dans les meilleurs cas.

Le plasmide pBR322 Ce sont des plasmides spontanément rencontrés dans la nature qui furent utilisés pour les toutes premières expériences de génie génétique. En effet, nous avons vu précédemment (voir section 10.9) comment le plasmide F était capable de capter in vivo des gènes chromosomiques chez Escherichia coli. On pourrait donc facilement imaginer utiliser ce plasmide comme vecteur de clonage. À ceci près que ce plasmide est cependant beaucoup trop grand par la taille et aussi qu’il ne porte pas de marqueur de sélection facilement exploitable. Ce type de plasmide étant loin de posséder les propriétés indispensables à la solution des problèmes complexes du clonage, des vecteurs de clonage ont été construits artificiellement sur la base de nouveaux plasmides résultant de manipulation génétique. La figure 10.36 montre la structure de l’un des plus célèbres vecteurs de clonage capables de se multiplier chez E. coli, le plasmide pBR322, qui fut construit sur la base d’un plasmide chimère rassemblant les éléments intéressants des plasmides naturels et en augmentant le nombre de sites uniques de coupure par les enzymes de restriction. Ses caractéristiques sont les suivantes : 1. pBR322 est un petit plasmide constitué de 4 361 paires de bases, dont la séquence nucléotidique est complètement connue. 2. Il est maintenu de façon stable dans son hôte à un niveau voisin de 20 à 30 copies par cellule.



292 Chapitre 10


3. Sa production peut être portée à plusieurs milliers de copies (1 000 à 3 000 copies par cellule) lorsque l’on inhibe la synthèse protéique par l’addition de chloramphénicol dans la culture. 4. Il est facilement purifiable sous la forme superenroulée par les techniques usuelles d’extraction et d’isolement. 5. Il est possible d’y insérer un fragment d’ADN de bonne dimension sans toutefois dépasser la taille de 10 kpb sous peine d’instabilité plasmidique. 6. Il possède deux gènes de résistance aux antibiotiques ; l’un pour l’ampicilline (ApR), l’autre pour la tétracycline (TcR), ce qui permet de sélectionner facilement les cellules qui les portent puisqu’elles acquièrent ainsi la résistance. 7. Il possède également vingt sites uniques pour des enzymes de restriction dont une partie pour des enzymes couramment employées comme PstI, SalI, EcoRI, HindIII et BamHI. Le fait de porter des sites uniques est stratégiquement primordial puisque cela assure systématiquement la linéarisation du plasmide et non son morcellement. Parmi ces sites uniques, 11 sont localisés dans les gènes de résistance aux antibiotiques : SalI, BamHI ou encore EcoRV par exemple dans le gène TcR ; PstI, le site le plus utilisé, dans le gène ApR.

gènes de résistance à la tétracycline pour le premier et à l’ampicilline pour le second. Ainsi, si l’insert est intégré dans l’un ou l’autre de ces sites, il a pour effet d’abolir la résistance. Ce phénomène, appelé inactivation insertionnelle, permet de détecter la présence de l’insert dans le plasmide. Pratiquement, lorsque l’on procède à l’intégration d’un insert au niveau du site BamHI de pBR322, puis que l’on transforme des cellules d’E. coli à l’aide de ce vecteur, seules les cellules résistantes à l’ampicilline et sensibles à la tétracycline auront intégré et multiplié de nombreuses copies du vecteur contenant effectivement l’insert. En revanche, les cellules résistantes aux deux antibiotiques à la fois auront en réalité intégré et multiplié un plasmide qui n’aura pas intégré l’insert et qui se sera recircularisé sur lui-même. En utilisant la technique des réplicats (voir figure 10.2), il est possible de cultiver parallèlement et séparément les cellules transformées sur milieu additionné de tétracycline ou d’ampicilline et d’isoler sélectivement les clones ayant multiplié l’insert d’intérêt.

Site de coupure BamH1

ApR pBR322

TcR Sites de coupure BamH1

Digestion enzymatique par BamH1

8. Il est facilement transférable par transformation ou par électroporation (voir section 10.7).

ADN étranger Digestion enzymatique par BamH1

Le clonage dans pBR322 La méthode de construction d’un plasmide recombinant est décrite dans la figure 10.37. Comme nous l’avons précédemment indiqué, le vecteur est conçu de telle sorte que les sites de restriction BamHI et PstI soient contenus à l’intérieur des

ADN ligase

Résistance à l’ampicilline

ClaI EcoRI Hind III

Recircularisation de pBR322 sur lui-même

BamHI

Plasmide recombinant contenant l’ADN étranger TcS

ApR

Pst I

TcR

ApR

Sal I

pBR322 (4 361 pb)

Transformation d’E. coli Transformants doublement résistants à l’ampicilline et à la tétracycline


Résistance à la tétracycline

FIGURE 10.36 Carte génétique de pBR322, un vecteur de clonage très utilisé. Les principales caractéristiques de ce vecteur de clonage sont sa capacité à se répliquer (la flèche indique le sens de réplication), la présence de deux gènes de résistance aux antibiotiques (Ap R et TcR) ainsi que l’existence de vingt sites uniques de restriction dont certains sont localisés dans les gènes de résistance aux antibiotiques.

Transformants résistants à l’ampicilline et sensibles à la tétracycline

FIGURE 10.37 Clonage moléculaire à l’aide du vecteur plasmique pBR322. Principales étapes permettant de sélectionner les bactéries ayant incorporé le plasmide recombinant contenant l’ADN étranger. L’ADN étranger étant inséré dans le second gène de résistance, cela se traduit par une inactivation de ce gène et donc par la perte de la résistance à cet antibiotique. Les bactéries qui auront incorporé le plasmide recombinant seront résistantes à l’ampicilline, mais sensibles à la tétracycline. En revanche, les bactéries qui auront incorporé un plasmide sans insert seront résistantes aux deux antibiotiques.



10.17 Les vecteurs de clonage : le bactériophage lambda 293

Les vecteurs de clonage de seconde génération pBR322 appartient à une série de vecteurs de clonage de première génération, partiellement construits par génie génétique. De nouvelles générations de plasmides plus puissants aux performances sans cesse croissantes ont été développées depuis. C’est le cas de la famille pUC, petits plasmides d’environ 2 700 paires de bases. Le plasmide pUC19 contient le gène de résistance à l’ampicilline de pBR322, mais en plus il possède une partie du gène lacZ dans lequel a été introduit un site multiple de clonage (polylinker), contenant toute une série de sites de coupure uniques. Le fait que ce polylinker soit inséré dans le gène lacZ, qui intervient dans le catabolisme du lactose (voir section 8.5 et 8.7) permet de révéler facilement l’intégration d’un insert par inactivation insertionnelle. Lorsqu’un inducteur est ajouté (IPTG), le complexe lacZ-ADN inséré est exprimé. La protéine chimère, ou protéine de fusion, ainsi synthétisée comporte l’extrémité N-terminale de la β-galactosidase, laquelle se poursuit par la séquence correspondant au gène cloné. Cette chimère ne possédant pas d’activité β-galactosidique, ceci permet de détecter les vrais recombinants des faux grâce à un indicateur coloré, le X-gal. En effet, les colonies de cellules contenant le plasmide pUC19 recircularisé sur lui-même (activité β-galactosidase intacte) apparaîtront de couleur bleue tandis que celles qui possèdent un insert seront de couleur blanche. À la différence des cellules précédentes, celles qui n’auront pas intégré le plasmide seront incapables de se développer sur le milieu de culture enrichi en ampicilline puisqu’elles ne seront pas devenues résistantes. Cette stratégie a également été largement employée dans le développement de vecteurs de clonage de type viraux (voir section 15.1). Dans certains cas, l’inactivation insertionnelle est détectée par sélection plutôt que par criblage. Dans certains vecteurs, le polylinker est introduit dans un gène qui, lorsqu’il est exprimé, est létal pour la cellule. Donc, seules les cellules qui contiennent un plasmide dans lequel le gène létal est inactivé sont capables de se développer. Une méthode de sélection drastique s’il en est ! Nous verrons dans le chapitre 31 que les vecteurs de clonage peuvent aussi devenir des vecteurs permettant l’expression des gènes insérés si l’on y incorpore judicieusement, de part et d’autre du polylinker, des promoteurs pour des ARN polymérases spécifiques (voir section 31.4).

Contrôlez vos acquis Les plasmides sont de bons vecteurs de clonage parce qu’ils se multiplient en nombre de copies important et qu’ils sont aisément purifiables. Les gènes de résistance aux antibiotiques qu’ils portent servent de marqueurs permettant d’identifier les bactéries recombinantes. •

Expliquez l’intérêt des sites de restriction unique dans les vecteurs de clonage.

•

Expliquez en quoi consiste l’inactivation insertionnelle.

10.17 Les vecteurs de clonage : m n le bactériophage lambda Nous avons vu précédemment que certains bactériophages, comme le phage lambda, étaient capables d’acquérir naturellement de nouveaux gènes au détriment de leur hôte, Escherichia coli, et de les véhiculer par transduction (voir sections 9.11 et 10.8). Cela en fait d’excellents candidats comme vecteur de clonage. Le phage λ a donné naissance aux premiers vecteurs de type phagique car sa biologie est bien connue, la quantité d’ADN qu’il peut intégrer est plus importante que celle véhiculée par les vecteurs de type plasmidique et parce que l’on sait empaqueter in vitro l’ADN phagique nu recombinant dans les têtes des phages. Ces phages sont munis d’un système de pénétration qui leur confère la capacité d’infecter très rapidement leurs hôtes, le nombre de copies par cellule étant considérable. Le rendement de cette infection (transfection) est très supérieur à ce qui est obtenu lors de la transformation de la bactérie par les plasmides. L’une des particularités génétiques qui fait que les phages comme lambda sont d’excellents vecteurs de clonage est l’existence, dans la partie centrale de son génome comprise entre les gènes J et N, d’une portion de séquence non indispensable à son cycle de vie et qui peut être facilement remplacée par de l’ADN étranger (voir figure 10.38). En pratiquant une délétion de cette portion puis son remplacement par l’ADN à cloner, il est possible d’insérer jusqu’à 22 kb d’ADN étranger, ce qui représente une quantité doublée par rapport au vecteur plasmidique pBR322.

Les phages de première génération : la série des phages Charon Le phage lambda est devenu le phage le plus utilisé pour construire des vecteurs de clonage après avoir subi certaines modifications comme la suppression de certains sites de restriction. Ceci a donné la série des phages Charon. Le phage Charon 16, par exemple, ne contient plus qu’un seul site de restriction dans lequel peut être inséré l’ADN à cloner, alors que Charon 4A en possède deux (voir figure 10.38). Selon le type de vecteur phagique, deux stratégies différentes sont utilisables pour la construction d’un recombinant : l’insertion simple employant un vecteur d’insertion comme Charon 16 ou bien la stratégie de délétion-remplacement mise en œuvre à l’aide d’un vecteur de remplacement de type Charon 4A. Ces vecteurs peuvent également contenir des gènes rapporteurs, comme le gène de la β-galactosidase par exemple, ce qui permet d’opérer facilement la sélection des recombinants en analysant la coloration bleue ou blanche, lorsque la culture d’E. coli Lac– se fait en présence d’X-gal et d’IPTG (voir section 15.1).

Les principales étapes de construction d’un recombinant Les principales étapes permettant la construction d’un vecteur phagique recombinant sont les suivantes (voir figure 10.39) : 1. Produire une grande quantité de phages, la purifier, puis en extraire son ADN génomique qui sera digéré par une enzyme de restriction.



294 Chapitre 10 Gènes de la capside cos

Génétique bactérienne J

att int xis

N

Segment à déléter

QSR cos

Région non essentielle

Phage lambda (type sauvage)

Gène de la β-galactosidase

Charon 4A (vecteur utilisé Autre substitution en stratégie délétion-remplacement)

Gène de la β-galactosidase

Charon 16 (vecteur utilisé Autre en stratégie substitution d’insertion simple)

FIGURE 10.38 Clonage moléculaire à l’aide du phage lambda. Cartes génétiques simplifiées du phage lambda (48,5 kpb) (pour plus de détails, voir figure 9.18a) et de deux phages qui en dérivent, Charon 4A (45,4 kpb) et Charon 16 (41,7 kpb). Les extrémités simple brin cohésives (cos) des génomes sont figurées par les points rouges. Les flèches noires au-dessus indiquent les sites de coupure reconnus par l’enzyme de restriction EcoRI. À la différence de lambda, ces deux phages sont aussi des vecteurs d’expression car ils portent le gène lacZ, ce qui permet de détecter les recombinants qui ont intégré le fragment d’ADN étranger après ajout d’IPTG et de Xgal.

2. Hybrider les deux bras du phage avec les fragments d’ADN à cloner en utilisant une ADN ligase. Afin que les fragments d’ADN à introduire présentent une taille adéquate (environ 20 kpb), celui-ci est lui-même partiellement digéré. 3. Procéder à l’encapsidation in vitro de l’ADN recombinant en ajoutant les protéines phagiques de tête et de queue qui vont s’auto-assembler pour former de nouveaux virions recombinants infectieux. 4. Infecter des bactéries et les étaler sur boîte de Petri. Chaque plage de lyse correspond à un phage recombinant qui peut être récupéré. 5. Vérifier la présence d’un insert dans l’ADN recombinant par toute procédure appropriée (hybridation ADN-ADN, séquençage, test blanc-bleu). L’obtention et la sélection de recombinants sont beaucoup plus performantes en employant un vecteur de clonage de type phagique plutôt que plasmidique pour les deux raisons suivantes : 1) l’efficacité et le rendement de l’infection sont très largement supérieurs et 2) seuls les phages ayant encapsidé un ADN recombinant de taille suffisante donneront des virions viables et infectieux.

Les cosmides Les cosmides sont des vecteurs artificiels constitués d’un plasmide classique auquel ont été ajoutées les séquences cos

Bras gauche (L)

Bras droit (R)

Coupure par des enzymes de restriction

L

R Ligation de l’ADN étranger

L

ADN étranger

R

ADN recombinant Encapsidation in vitro de l’ADN recombinant

L

R

Assemblage du phage

Phage infectieux

FIGURE 10.39 Stratégie d’utilisation du phage lambda. Ce type de vecteur permet l’insertion de fragments d’ADN dont la taille peut atteindre 20 kpb.

du phage λ, permettant l’encapsidation d’un recombinant dans le virion. Ceci permet d’empaqueter in vitro le plasmide modifié dans des têtes de phages exactement comme s’il s’agissait de phages. E. coli est ensuite infectée par ce pseudo-phage, ce qui permet d’obtenir des rendements d’intégration bien supérieurs à ceux que donne une transformation bactérienne par un plasmide. Le second intérêt des cosmides est de permettre le clonage de fragments d’ADN très longs pouvant atteindre 50 kpb. Ainsi, la création d’une banque génomique en cosmides nécessitera moins de clones comparativement aux autres méthodes. L’ADN recombinant empaqueté est également plus stable que s’il était sous une



10.18 La mutagenèse dirigée 295

forme plasmidique ; ceci permet de le conserver intact beaucoup plus longtemps.

Contrôlez vos acquis Les bactériophages comme lambda ont été modifiés pour réaliser des vecteurs de clonage. Ils peuvent intégrer des fragments d’ADN de plus grande taille que les vecteurs plasmidiques et possèdent des rendements de production infiniment supérieurs à ceux obtenus par transformation. Les cosmides sont des vecteurs artificiels hybrides construits à partir de plasmides auxquels ont été ajoutées les séquences cos du phage λ. Ils permettent d’intégrer de très grands fragments d’ADN étranger. •

Expliquez l’intérêt de produire de l’ADN recombinant en conditions contrôlées à l’aide de vecteurs phagiques.

•

Qu’est-ce qu’un vecteur de remplacement ? Quels avantages présente son utilisation ?

10.18 La mutagenèse dirigée m n Les manipulations in vitro de l’ADN ont ouvert un nouveau champ d’investigations pour la mutagenèse, la mutagenèse in vitro, mieux connue sous le terme de mutagenèse dirigée. Alors que les mutagènes conventionnels (voir section 10.3) introduisent des mutations au hasard au niveau de l’organisme, la mutagenèse dirigée, par l’utilisation d’ADN synthétisé et des techniques de clonage, permet l’introduction de mutations à des sites précis dans les gènes.

et qui se réplique dans Escherichia coli (voir section 16.3 et chapitre 15). La mutagenèse dirigée peut être utilisée pour tester l’efficacité de protéines contenant des substitutions connues d’acides aminés. Par exemple, si l’on souhaite étudier le site actif d’une enzyme pour connaître l’importance d’acides aminés particuliers dans cette région, la mutagenèse dirigée peut être utilisée pour changer un acide aminé spécifique et l’enzyme ainsi modifiée est testée et comparée à l’enzyme sauvage. Dans ce type d’expérience, le vecteur contenant l’ADN muté devra être transféré dans une souche mutante incapable de produire l’enzyme en question. De ce fait, l’activité enzymatique mesurée sera seulement celle engendrée par l’enzyme mutée. L’utilisation de la mutagenèse dirigée a permis aux enzymologistes d’obtenir des informations par exemple sur les acides aminés essentiels pour qu’une enzyme soit fonctionnelle ; sur la façon dont les enzymes catalysent les réactions chimiques ; sur les interactions avec d’autres protéines, etc.

1. Clonage dans un vecteur simple brin

Source

ADN simple brin du phage M13

Appariement avec le gène d’origine

2. Addition de l’oligonucléotide avec une base modifiée

La mutagenèse dirigée La mutagenèse dirigée est un outil puissant, car elle permet de changer n’importe quelle paire de bases dans un gène spécifique. La procédure de base est de synthétiser un court oligonucléotide (voir section 7.8) contenant la base modifiée et de lui permettre de s’apparier avec un ADN simple brin contenant le gène d’intérêt. L’appariement est total, excepté pour la courte région de mésappariement (mismatch). Le court fragment simple brin, c’est-à-dire l’oligonucléotide de synthèse, sert alors d’amorce à l’ADN polymérase qui copie le reste du gène. La molécule double brin obtenue est alors insérée dans une cellule par transformation. Les mutants sont sélectionnés par une sélection positive, comme une résistance à un antibiotique (dans ce cas, l’ADN modifié doit aussi contenir un marqueur de résistance à un antibiotique). Le mutant obtenu est alors utilisé pour la production de la protéine modifiée (mutante). Un exemple de mutagenèse dirigée est illustré figure 10.40. Il est plus facile de commencer cette procédure avec le gène d’intérêt cloné dans un vecteur à ADN simple brin. L’ADN modifié peut alors se lier par un appariement complémentaire au gène d’intérêt (voir figure 10.40). Un vecteur très utilisé pour ce type d’expérience est le bactériophage M13, un phage à ADN simple brin dont le génome est facilement manipulable

3. Extension du simple

brin avec l’ADN polymérase

4. Transformation Clonage et sélection du mutant FIGURE 10.40 Mutagenèse dirigée en utilisant de courts oligonucléotides de synthèse. Notez que le clonage dans le bactériophage M13 permet de produire de l’ADN simple brin nécessaire dans les expériences de mutagenèse dirigée.



296 Chapitre 10


L’interruption de gènes par intégration d’une cassette Du fait du grand nombre d’enzymes de restriction et du nombre important de séquences d’ADN qui peuvent être coupées, il est habituellement possible de trouver plusieurs sites de restriction dans un gène d’intérêt. Si les sites d’une enzyme spécifique ne sont pas trouvés dans le gène, ou à l’endroit voulu, ils peuvent être insérés par mutagenèse dirigée (voir figure 10.40). Si les sites de restriction sont proches, le fragment d’ADN peut être excisé et remplacé par un fragment d’ADN de synthèse dans lequel un ou plusieurs nucléotides ont été modifiés. Ces fragments de synthèse sont appelés cassettes et le procédé est connu sous le nom de mutagenèse par insertion d’une cassette. Les mutations par insertion peuvent aussi être générées simplement par l’insertion d’une cassette à un site. Quand des cassettes sont utilisées pour remplacer des sections de gènes, elles ont habituellement la même taille que les fragments d’ADN sauvages. La cassette utilisée pour engendrer des mutations par insertion peut avoir n’importe quelle taille et même correspondre à un gène entier. En fait, pour faciliter la sélection, des cassettes qui codent des protéines qui confèrent à l’hôte une résistance à un antibiotique sont communément utilisées. Ce type de cassette est utilisé dans un procédé appelé interruption de gènes (voir figure 10.41). Dans ce cas, un fragment portant un gène conférant une résistance à la kanamycine, la cassette kan, est inséré au niveau d’un site de restriction dans un gène cloné. Le vecteur portant ce gène mutant est alors linéarisé par une enzyme de restriction différente, et l’ADN linéaire est introduit dans la cellule hôte. Le plasmide linéarisé ne peut se répliquer, et donc les cellules deviennent résistantes via une recombinaison homologue (voir section 10.6) entre le gène muté présent sur le plasmide et le gène sauvage présent sur le chromosome. À noter que lorsqu’une cassette est insérée, les cellules n’ont pas seulement gagné une résistance à la kanamycine mais ont aussi perdu la fonction du gène dans lequel la cassette a été insérée. Ces mutations sont appelées des mutations par invalidation (knockout). Ce procédé est analogue à l’insertion de mutations par les transposons (voir section 10.14), mais dans ce cas l’expérimentateur choisit exactement quel gène sera muté. Les mutations par invalidation chez les organismes haploïdes (comme les procaryotes) conduisent à des cellules vivantes si, et seulement si, le gène muté n’est pas essentiel. En fait, cette technique est utile pour déterminer si un gène est essentiel ou non.

Contrôlez vos acquis Des molécules d’ADN de synthèse d’une séquence désirée peuvent être fabriquées in vitro pour muter un gène directement ou pour changer des bases spécifiques à l’intérieur d’un gène via la mutagenèse dirigée. Les gènes peuvent aussi être interrompus par l’insertion de fragments d’ADN, appelés cassettes. La cassette insérée abolit la fonction du gène sauvage tout en conférant à la cellule un nouveau phénotype le plus souvent sélectionnable. • •

Comment la mutagenèse dirigée peut-elle être utile aux enzymologistes ? Que sont les mutations par invalidation (knockout) ?

Gène X

Sites de coupure par EcoRI ( ) x

Cassette kanamycine Clivage par EcoRI et ligation

(a) x

(b)

Site de coupure par BamHI

Plasmide linéarisé x

x

Clivage par BamHI et transformation dans une cellule contenant un gène X sauvage

x

Sites de recombinaison Chromosome (c)

Recombinaison et sélection des cellules résistantes à la kanamycine

x

x

Invalidation du gène X (knockout) (d) FIGURE 10.41 Interruption de gène par intégration d’une cassette. (a) Un plasmide contenant une copie clonée du gène sauvage X est clivé avec l’enzyme de restriction EcoRI et mélangé avec un fragment d’ADN (la cassette kanamycine) qui contient un gène capable de conférer à une cellule la résistance à la kanamycine et qui a été obtenu en utilisant la même enzyme de restriction. Le plasmide clivé et la cassette sont ligaturés. (b) Le produit de ligation est un plasmide qui contient maintenant la cassette kanamycine en tant que mutation par insertion dans le gène X. Ce nouveau plasmide est maintenant clivé avec une autre enzyme de restriction, BamHI, et introduit dans une cellule contenant un gène sauvage X. (c) La cellule transformée contient le plasmide linéarisé avec un gène X interrompu et son propre chromosome avec une copie du gène sauvage. Dans certaines cellules, il se produit une recombinaison homologue (figure 10.9) entre les formes sauvage et mutante du gène X. (d) Les cellules qui peuvent croître en présence de kanamycine ont la cassette kanamycine recombinée dans leur chromosome car le plasmide linéarisé ne peut se répliquer. Ces cellules ont maintenant une seule copie interrompue du gène X. Cette interruption abolit toute fonction du gène X.

IV

LE CHROMOSOME BACTÉRIEN

Les trois mécanismes d’échanges génétiques décrits dans ce chapitre – la transformation, la transduction et la conjugaison – en plus des outils puissants de clonage de gènes, peuvent




être utilisés pour cartographier la localisation des gènes sur un chromosome bactérien. Les gènes d’Escherichia coli ont été initialement cartographiés en utilisant la conjugaison. En utilisant différentes souches Hfr (voir figure 10.25), il a été possible de cartographier le génome entier d’Escherichia coli. Cependant, la conjugaison ne permet pas de positionner des gènes très rapprochés. La transduction généralisée a été utilisée pour une cartographie plus fine du chromosome d’Escherichia coli. Le bactériophage P1, qui peut porter de petits fragments d’ADN, a été d’une grande utilité pour une cartographie détaillée des gènes chez E. coli. Les techniques de génétique utilisées pour cartographier les chromosomes d’autres procaryotes ont été dictées selon l’efficacité avec laquelle le transfert génétique avait lieu dans un organisme particulier. Par exemple, la transformation est un procédé très efficace pour les bactéries Gram positif (voir section 10.7), elle a donc été utile pour cartographier les gènes chez Bacillus. Même si toutes ces techniques classiques sont toujours utiles pour la caractérisation et la construction de souches, elles ont été largement supplantées pour la construction des cartes génétiques par le clonage moléculaire et le séquençage. Le clonage moléculaire et le séquençage ont révolutionné l’étude de l’organisation des génomes chez les procaryotes et les eucaryotes (voir chapitre 15).

10.19 La carte génétique m n du chromosome d’Escherichia coli La carte génétique de la souche K-12 d’Escherichia coli est présentée figure 10.42. Les distances sur la carte sont données en « minutes » de transfert, le chromosome complet contenant 100 minutes et un « temps zéro » arbitrairement fixé au locus thréonine. La carte de la figure 10.42 contient seulement quelques-uns des milliers de gènes présents sur le chromosome d’E. coli et montre la localisation de sites reconnus par des enzymes de restriction. La taille du chromosome est donnée à la fois en minutes (unités définies par la conjugaison) et en kilopaires de bases. Le chromosome d’E. coli, comme ceux de nombreux autres procaryotes, a été entièrement séquencé. Le séquençage de chromosomes bactériens relativement petits de 3 à 4 mégabases est maintenant réalisé en routine sur des séquenceurs automatisés par le séquençage de clones aléatoires ou shotgun (voir section 15.2). Du fait des quantités énormes d’informations disponibles via les analyses génomiques, ces informations sont traitées par des ordinateurs et stockées sous la forme de bases de données. Ceci a conduit à la création d’une nouvelle discipline clé de la biologie moléculaire, la bioinformatique (voir chapitre 15).

Escherichia coli, un modèle de cellule procaryote Beaucoup de facteurs ont favorisé l’utilisation d’Escherichia coli comme modèle pour les études de biochimie, de génétique, et de physiologie bactérienne. Même les virus infectant E. coli ont servi de modèles d’études (voir les chapitres 9 et 16). Même si le chromosome d’E. coli n’a pas été parmi les premiers chromosomes procaryotes séquencés, cet organisme reste le micro-organisme le mieux caractérisé. En plus de son

rôle important comme organisme modèle, E. coli est toujours l’organisme de choix pour la recherche fondamentale et appliquée (voir chapitre 31). La souche d’E. coli dont le chromosome a originellement été séquencé, la souche MG1655, est dérivée de la souche K-12, traditionnellement utilisée en génétique. La souche sauvage K-12 d’E. coli est une cellule lysogène qui contient le bactériophage lambda (voir section 9.11) ainsi que le plasmide F (voir section 10.9). La souche MG1655 a été curée du phage lambda (par irradiation) et du plasmide F (par un traitement à l’acridine, voir section 10.9) avant d’être séquencée. Le chromosome de la souche MG1655 contient 4 639 221 pb. L’analyse de la séquence a mis en évidence 4 288 cadres ouverts de lecture possibles (ORF, sections 7.13 et 15.2) qui couvrent environ 88 % du génome. Approximativement 1 % du génome est composé de gènes codant des ARNt et des ARNr, et environ 0,5 % est non codant ou constitués de séquences répétées. Les 10 % restant du génome contiennent toutes les séquences de régulation : promoteurs, opérateurs, origine et terminus de réplication.

L’arrangement et l’expression des gènes sur le chromosome d’Escherichia coli Les expériences de cartographie et les études sur la régulation des gènes contrôlant les enzymes d’une voie biochimique unique ont montré chez E. coli que ces gènes sont souvent regroupés. Sur la carte génétique de la figure 10.42, quelques groupes sont indiqués : par exemple, le groupe de gènes gal à 18 minutes, le groupe de gènes trp à environ 28 minutes, et le groupe his à 44 minutes. Chacun de ces groupes de gènes comprend un opéron qui est transcrit comme un unique ARNm polycistronique (voir sections 7.13 et 10.13). Les gènes de certaines voies biochimiques chez E. coli ne sont pas groupés. Par exemple, les gènes impliqués dans la biosynthèse de l’arginine (gènes arg) sont dispersés le long du chromosome, et appartiennent au régulon arg (voir section 8.6). La découverte précoce des opérons multigènes et leur utilité pour l’étude de la régulation des gènes, par exemple l’opéron lac (voir sections 8.5 et 8.7), ont donné l’impression que ces opérons étaient une règle chez les procaryotes. Cependant, les analyses de séquences chez E. coli ont montré que sur les 2 584 unités de transcription prédites ou connues, plus de 70 % codent un gène unique. Seulement 6 % des opérons ont des ARNm polycistroniques codant 4 gènes ou plus. Dans un génome, tous les opérons ne sont pas transcrits dans le même sens. Chez E. coli, la transcription de certains opérons se fait dans un sens, alors que pour d’autres, c’est dans le sens inverse. Le sens de transcription de quelques opérons est indiqué par des flèches sur la figure 10.42. Les analyses génomiques ont montré qu’il y a un nombre à peu près égal d’opérons sur les deux brins. Beaucoup de gènes qui sont fortement exprimés chez E. coli sont orientés sur le chromosome de sorte qu’ils sont transcrits dans le même sens que le sens de déplacement de la fourche de réplication. Les deux fourches de réplication commencent à l’origine, oriC, vers 84 minutes et se déplacent bidirectionnellement vers le terminus qui est localisé approximativement vers 34 minutes. Le séquençage a confirmé que les 7 opérons ARNr et 53 des 86 gènes ARNt sont transcrits dans le sens de la réplication. Cet arrangement




D C B A

298 Chapitre 10

I argF

lac

g ar

HfrH

gU

E

100/0 P804

ar

C

l ma

B

A

rA

H

lex

uv

G

argI

Y Z

thr dnaK leu

A

M B K

E

F

Origine de réplication (oriC)

10

90

ar

ori gX C

312

4333 4082 4046 4005

malS

80

gal

678 787

Sites de restriction Not1 en kpb

3801

20

mal

Escherichia coli K-12

pyrD

1157 1252

argD rpsL

purB umuD

1350

70

argR

T E

942

gor

T P Q

K

HfrC

25

spoT

Opéron Lac (dégradation du lactose)

trp

30

1620

A B C D E

KL14

argG

2782

C

tol

2011

2523 2513 2309

60

P

50

A

Opéron His (biosynthèse de l’histidine)

G D C B H A F

argW

his

gyrA

argT

hisS

S

arg V

rec

A

gA

an

40 feo

th

sad m

Opéron Trp (biosynthèse du tryptophane)

arg

ar

2050

Hfr44

yA

g ar

1875

I E FIGURE 10.42 Carte génétique circulaire du chromosome d’Escherichia coli souche K 12. Sur la partie externe de la carte, la localisation de quelques gènes est indiquée. Le nombre actuel de cadres de lecture ouverts (ORF) est de 4 288 et le chromosome contient 4 639 221 pb. Quelques opérons sont aussi indiqués avec le sens dans lequel ils sont transcrits. La carte est divisée en 100 min (voir les nombres compris entre 0 et 100 sur la partie interne de la carte). L’origine de réplication de l’ADN est marquée oriC (84,3 min) ; la réplication est bidirectionnelle à partir de ce point (section 7.6 et figures 7.16-7.20). Le cercle le plus interne montre la localisation, en kilopaires de bases, des sites reconnus par l’enzyme de restriction NotI. Notez que 0 min et 0 kpb sont par convention au locus thr. Les origines et les sens de transferts de quelques souches Hfr sont aussi indiqués (flèches). Les positions où cinq copies de l’élément transposable IS3 ont été localisées dans une souche particulière sont indiquées en bleu. Cet élément est aussi retrouvé en deux copies sur le plasmide F et est impliqué dans la formation des souches Hfr (voir section 10.12). Le site où le prophage lambda s’intègre est indiqué en rouge (section 9.11). Si le prophage était présent, il faudrait ajouter 48,5 kpb (légèrement plus d’une minute) à la carte. Les gènes du régulon maltose (section 8.6), qui inclut plusieurs opérons, sont indiqués en vert. Bien que la plupart des gènes dans ce régulon aient une abréviation commençant par mal, notez qu’un de ces gènes est lamB ; ce gène code une protéine membranaire impliquée dans la prise de maltose par la cellule ; cette protéine est aussi le récepteur du bactériophage lambda. Le gène rpsL (73 min) code une protéine ribosomique. Il était nommé par le passé str car des mutations dans ce gène conduisent à une résistance à la streptomycine.

pour la transcription des gènes fortement exprimés permet probablement à l’ARN polymérase d’éviter une collision avec la fourche de réplication qui se déplacerait dans le même sens que l’ARN polymérase.

Presque 2 000 protéines, ou gènes codant des protéines, ont été identifiés chez E. coli avant le séquençage complet du chromosome. À partir d’analyses de séquences, nous savons maintenant que 4 288 protéines différentes peuvent théoriquement




être codées par cet organisme. Approximativement 38 % de ces protéines ont une fonction inconnue et/ou sont simplement des gènes codant des protéines hypothétiques. La protéine moyenne contient un peu plus de 300 acides aminés, mais beaucoup d’autres sont plus petites ou plus grandes. Le plus grand gène code une protéine de 2 383 acides aminés, mais cette protéine n’a pas encore été caractérisée. Cependant, d’après des analyses de génomique comparative, cette protéine géante montre des similarités avec des protéines trouvées chez des bactéries entéropathogènes proches d’E. coli. Cette grande protéine peut donc jouer un rôle dans les processus d’infection. Bien que E. coli ait très peu de gènes dupliqués, les analyses bioinformatiques ont montré que beaucoup des gènes codant des protéines sont apparus par une duplication de gènes durant l’évolution (voir section 10.14). Il y a aussi quelques grandes familles de gènes, qui sont des groupes de gènes avec des séquences apparentées codant des produits aux fonctions apparentées (voir section 15.8). Par exemple, il y a une famille de 70 gènes dont les produits sont tous des protéines de transport membranaire. Les familles de gènes sont communes, non seulement à l’intérieur d’une espèce, mais même parmi des lignées taxinomiques éloignées. Ceci accentue le fait que la duplication de gènes et le transfert latéral de gènes sont des mécanismes puissants pour contrôler le « pool de gènes » des procaryotes.

Les autres caractéristiques du chromosome d’Escherichia coli et le flux latéral de gènes Le génome d’E. coli contient beaucoup d’autres éléments génétiques qui se répliquent avec lui. Par exemple, il y a des copies de 10 éléments IS différents, incluant 7 copies d’IS2 et 5 copies d’IS3 (voir section 10.14). Ces deux éléments sont aussi retrouvés sur le plasmide F, et ils sont impliqués dans la formation des souches Hfr (voir section 10.12 et figure 10.23). Il y a aussi plusieurs prophages défectifs (dont trois sont apparentés à lambda) présents dans le génome d’E. coli ainsi que des génomes partiels de plusieurs autres. Il est donc vraisemblable que les bactériophages tempérés ont participé à la biologie d’E. coli. Les analyses génétiques ont montré qu’environ 20 % du génome d’E. coli provenait du génome d’autres organismes par transfert horizontal (latéral) de gènes. Les gènes transférés latéralement peuvent être reconnus soit par leurs ratios en GC significativement différents des gènes natifs, ou par le fait que les gènes codent des protéines utilisant des codons différents (biais de codon, section 7.14) par rapport aux protéines natives. Les changements à grande échelle dans le génome d’un organisme peuvent apparemment se faire par un flux de gènes latéral. Par exemple, les souches d’E. coli sont connues pour contenir des gènes de virulence localisés sur de grandes régions instables du chromosome appelées îlots de pathogénécité, qui peuvent être acquis par des transferts horizontaux. De façon surprenante, le transfert horizontal de gènes ne conduit pas nécessairement à une taille de génome plus grande. Beaucoup de gènes acquis par cette voie n’offrent pas d’avantage sélectif et sont perdus par délétion. Ceci maintient le chromosome

d’une espèce donnée à peu près à la même taille. Par exemple, des comparaisons de la taille du génome de plusieurs souches d’E. coli ont montré que tous étaient de l’ordre de 4,6 Mpb, malgré le fait que les génomes procaryotiques peuvent varier de moins de 0,5 à plus de 10 Mpb. La taille du génome est donc une caractéristique de l’espèce.

Les analyses de génomes procaryotes L’analyse d’une séquence complète d’un génome peut fournir une quantité incroyable d’informations (voir chapitre 15). Comme la génétique moléculaire d’E. coli a été largement explorée depuis plusieurs décennies, et que le génome est maintenant séquencé, cela signifie-t-il que les analyses à venir seront faites principalement par ordinateur et que les études génétiques et biochimiques traditionnelles sont finies ? Absolument pas ! Bien que les analyses par ordinateur d’une séquence puissent fournir beaucoup d’informations, dans le but de comprendre la fonction des gènes, et particulièrement des séquences régulatrices, il reste nécessaire d’isoler des mutants, de cartographier leurs mutations, et d’utiliser des analyses biochimiques et physiologiques pour déterminer leurs effets sur l’organisme. Ceci est particulièrement vrai pour 20 à 40 % des gènes (selon l’espèce) qui codent des « protéines aux fonctions inconnues » (voir chapitre 15). Cette immense mine de protéines hypothétiques détient certainement de nouveaux secrets biochimiques qui, collectivement, vont élargir les vastes capacités métaboliques des procaryotes déjà connues (voir chapitres 5 et 17). De plus, comme beaucoup de gènes de procaryotes ont des homologues chez les organismes eucaryotes dont les êtres humains, la compréhension de la fonction des gènes chez les procaryotes est d’une grande importance pour mieux comprendre la génétique humaine. Beaucoup de maladies humaines ont un lien génétique. De ce fait, mieux nous comprendrons la fonction des protéines bactériennes, mieux nous comprendrons leur fonction chez les humains. Ceci conduira, entre autres, au développement de nouveaux médicaments et autres traitements pour contrôler les maladies.

Contrôlez vos acquis Le chromosome d’Escherichia coli a été cartographié en utilisant la conjugaison, la transduction, le clonage et le séquençage. E. coli est un organisme modèle utile, et une quantité considérable d’informations a été obtenue grâce à cette espèce, non seulement sur la structure des gènes mais aussi sur leurs fonctions et leurs régulations. •

Les cartes génétiques des chromosomes de procaryotes sont maintenant généralement faites en utilisant seulement le clonage moléculaire et le séquençage de l’ADN. Pourquoi d’autres méthodes ont-t-elles également été utilisées dans le cas d’E. coli ?



300 Chapitre 10


QUESTIONS 1. Définissez, en une phrase, le terme génotype. Faites la même chose pour le terme phénotype. Le phénotype d’un organisme change-t-il automatiquement quand un changement de génotype se produit ? Pourquoi ou pourquoi pas ? Le phénotype peut-il changer sans changement de génotype ? Dans les deux cas, donnez quelques exemples pour étayer votre réponse (voir section 10.1). 2. Expliquez pourquoi une souche d’Escherichia coli qui est His– est auxotrophe et celle qui est Lac– ne l’est pas (voir section 10.1). [Pensez à ce que fait E. coli avec de l’histidine et du lactose.] 3. Que sont les mutations silencieuses ? De ce que vous connaissez du code génétique, expliquez pourquoi la plupart des mutations silencieuses affectent la troisième position au niveau d’un codon (voir section 10.2) ? 4. Les micro-insertions qui se produisent dans les promoteurs ne conduisent pas à un décalage du cadre de lecture. Expliquez pour quelles raisons cela est possible (voir section 10.2). Définissez les termes micro-insertion, décalage du cadre de lecture, mutation, et promoteur (voir section 7.10). 5. Expliquez comment il est possible qu’une mutation de type décalage du cadre de lecture située au début d’un gène puisse être corrigée par une autre mutation de même type se produisant plus loin dans la séquence du gène (voir section 10.2). 6. Quel est le taux moyen de mutation dans une cellule ? Ce taux peut-il changer (voir section 10.3) ? 7. Donnez un exemple d’agent mutagène biologique, chimique, et physique et décrivez le mécanisme par lequel chacun cause une mutation (voir section 10.4). 8. Comment le test d’Ames, une analyse utilisant des bactéries, peutil avoir un rapport avec le cancer humain (voir section 10.5) ? 9. En quoi la recombinaison homologue diffère-t-elle de la recombinaison site-spécifique (voir section 10.6) ? 10. Pourquoi est-il difficile via une seule expérience basée sur la transformation ou la transduction de transférer un grand nombre de gènes à une cellule (voir sections 10.7 et 10.8) ?

11. Expliquez pourquoi dans la transduction généralisée, on parle toujours de particule transductrice, mais de virus transducteur (ou de bactériophage transducteur) pour la transduction spécialisée (voir section 10.8). 12. Comment les plasmides se répliquent-ils et en quoi cela diffèret-il de la réplication chromosomique (voir section 10.9) ? 13. Que sont les facteurs R et pourquoi ont-ils un intérêt médical (voir section 10.10) ? 14. Qu’est-ce qu’un pilus sexuel et quel type de cellules, F– ou F+, produit cette structure (voir section 10.11) ? 15. Que doit faire une cellule F+ avant de pouvoir transférer des gènes chromosomiques (voir section 10.12) ? 16. Que signifie complémenter une mutation « en trans » (voir section 10.13) ? 17. Les transposons les plus utiles pour isoler une variété de mutants bactériens sont ceux contenant des gènes de résistance à un antibiotique. Pourquoi de tels transposons sont-ils si utiles (voir section 10.14) ? 18. Quelles sont les caractéristiques essentielles d’un vecteur de clonage ? Quelles sont les caractéristiques qui rendent les plasmides particulièrement utiles comme vecteurs pour le clonage moléculaire ? Quelle(s) caractéristique(s) du plasmide F le rend(ent) moins utile pour l’usage in vitro (voir sections 10.15 et 10.16) ? 19. Si la méthode d’inactivation insertionnelle dans un gène de résistance à un antibiotique est utilisée pour détecter la présence d’un plasmide contenant de l’ADN étranger, pourquoi est-il souhaitable d’avoir deux marqueurs de résistance à deux antibiotiques différents sur le vecteur (voir section 10.16) ? 20. Quels avantages y a-t-il à utiliser un vecteur de clonage phagique plutôt qu’un vecteur plasmidique (voir section 10.17) ? 21. Qu’est-ce que la mutagenèse dirigée permet de faire que la mutagenèse normale ne permet pas (voir section 10.18) ? 22. Quelle est la taille du chromosome d’Escherichia coli ? Combien de protéines peut-il coder environ ? Quelle proportion d’ADN non codant est présente dans le chromosome d’E. coli (voir section 10.19) ?

PROBLÈMES 1. Un mutant constitutif est une souche qui produit continuellement une protéine, cette dernière étant inductible chez le type sauvage. Décrivez deux façons d’obtenir, par un changement au niveau d’une molécule d’ADN, un mutant constitutif. Comment ces deux types de mutants constitutifs pourraient-ils être distingués génétiquement ? 2. Au chapitre 7, nous avons vu qu’il était essentiel pour le ribosome de se déplacer avec une grande exactitude afin de maintenir un cadre de lecture approprié. Cependant, les ribosomes font parfois des erreurs de décalage du cadre de lecture. Comparez l’impact sur une cellule, d’un ribosome faisant périodiquement une erreur de décalage de cadre de lecture sur l’ARNm d’un gène particulier avec l’impact de ce type de mutation sur le même gène. 3. Bien qu’un grand nombre de produits chimiques mutagènes soient connus, aucun produit chimique n’est connu pour induire des mutations dans un gène unique (mutagenèse gène-spécifique). De ce que vous savez des agents mutagènes, expliquez pourquoi il est peu probable qu’un agent mutagène chimique gène-spécifique soit trouvé. Comment alors la mutagenèse site-spécifique est-elle accomplie ?

4. Les éléments transposables causent des mutations quand l’élément est inséré dans un gène. Ces éléments interrompent la continuité du gène. On a pu également indiquer que les introns (voir section 7.13) interrompent également la continuité d’un gène, pourtant ce dernier reste fonctionnel. Expliquez pourquoi la présence d’un intron dans un gène ne l’inactive pas, mais qu’une insertion d’un élément transposable l’inactive. 5. Lorsque l’on utilise le vecteur pUC19, les fragments d’ADN obtenus après restriction par l’enzyme BamHI s’insèrent et inactivent le gène codant la β-galactosidase. En utilisant pBR322, le clonage des mêmes fragments inactive le gène de résistance à la tétracycline. Les deux vecteurs contiennent un gène de résistance à l’ampicilline qui est utile pour sélectionner les transformants bactériens après la recombinaison. Expliquez pourquoi il est beaucoup plus efficace d’utiliser pUC19 plutôt que pBR322 comme vecteur de clonage. (Indice : l’efficacité dépend de la manière dont on procède pour cribler les cellules recombinantes possédant les vecteurs contenant l’ADN cloné. La figure 15.1 vous aidera également ici.)



I

Terre primitive, origine de la vie et diversification microbienne

CHAPITRE ONZE

Évolution et systématique microbienne

302

11.1

L’évolution de la Terre et les premières formes de vie 11.2 La vie primitive : le monde à ARN et le codage moléculaire 11.3 La vie primitive : énergie et métabolisme du carbone 11.4 Les eucaryotes et les organelles : l’endosymbiose

309

II

311

Méthodes d’étude de l’évolution

11.5 Les chronomètres de l’évolution 11.6 Le séquençage de l’ARN ribosomique : un outil de l’évolution moléculaire 11.7 Les séquences signature, les sondes phylogénétiques et l’analyse des communautés microbiennes

L’histoire de l’évolution des procaryotes reflète l’histoire de l’évolution de la Terre elle-même. Les procaryotes ont vécu sur Terre pendant les quatre cinquièmes des 4,5 milliards d’années d’existence de la planète. Il existe diverses preuves de l’existence très ancienne des procaryotes, comme les formations géologiques très largement répandues qui contiennent des oxydes de fer.

302 305 306

311 312 314

III

Évolution microbienne

316

11.8

La phylogénie microbienne fondée sur les séquences d’ARN ribosomique Les caractéristiques des domaines du vivant

316 318

IV

Taxinomie microbienne et relations avec la phylogénie

320

11.10 11.11 11.12 11.13

La taxinomie conventionnelle La chimiotaxinomie Le concept d’espèce en microbiologie La nomenclature – le Bergey’s Manual

11.9

320 322 326 328



302 Chapitre 11


GLOSSAIRE Allèle (allele) Forme particulière d’un gène donné. Arbre phylogénétique universel (universal phylogenetic tree) Arbre indiquant la position d’organismes appartenant à tous les domaines du vivant. Archaea (archaea) Voir chapitre 2. ARN ribosomique 16S (16S ribosomal RNA) Polynucléotide de grande taille (environ 1 500 bases) faisant partie de la petite sous-unité du ribosome chez les procaryotes, et dont la séquence est utilisée en phylogénie ; l’équivalent chez les eucaryotes est l’ARNr 18S. Bacteria (Bacteria) Voir chapitre 2. Chronomètre de l’évolution (evolutionary chronometer) Molécule, comme l’ARNr, dont la séquence peut être utilisée comme mesure comparative de divergences évolutives. Distance évolutive (evolutionary distance) Dans les arbres phylogénétiques, somme des distances séparant les organismes ; cette distance est inversement proportionnelle à la similarité. Domaine (domain) Au sens taxinomique, le plus haut niveau de la classification biologique. Écotype (ecotype) Population de cellules génétiquement identiques, partageant une ressource particulière au sein d’une niche écologique. Endosymbiose (endosymbiosis) Voir chapitre 2. Espèce (species) En microbiologie, ensemble de souches partageant les mêmes caractéristiques majeures, mais différent par un ou plusieurs caractères importants, d’autres groupes de souches. Eukarya (Eukarya) Voir chapitre 2. FAME (FAME) Fatty acid methyl ester ou ester métrhylé d’acide gras. Famille (familly) Niveau intermédiaire en taxinomie. Les familles contiennent un ou plusieurs genres, eux-mêmes contenant une ou plusieurs espèces. FISH (FISH) Fluorescent in situ hybridization ou hybridation fluorescente in situ. Genre (genus) Ensemble de plusieurs espèces possédant une ou plusieurs propriétés en commun. Hybridation génomique (genomic hybridization) Détermination expérimentale des similitudes entre génomes par le degré d’hybridation entre les génomes de deux organismes. Métazoaires (Metazoa) Organismes multicellulaires.

I

TERRE PRIMITIVE, ORIGINE DE LA VIE

L’évolution est une thématique intégrative pour toute la biologie. Ce chapitre aborde la diversité microbienne telle qu’elle est connue aujourd’hui, résultant de près de quatre milliards d’années d’évolution. Nous verrons comment la biologie moléculaire a conduit à la vision actuelle des relations d’évolution entre les micro-organismes, comment cette phylogénie a permis d’établir leur taxinomie et leur classification, et comment le concept « d’espèce microbienne » commence désormais à prendre forme. Ce chapitre peut être considéré comme une introduction à la présentation des micro-organismes et de leurs génomes dans toute leur diversité (voir chapitres 12 à 16).

Nomenclature binomiale (binomial system) Système mis au point par Linné, et consistant à attribuer à chaque organisme un nom de genre et un nom d’espèce. Organelle (organelle) Voir chapitre 2. Petite sous-unité d’ARN [small subunit (SSU) RNA] ARN de la sous-unité 30S du ribosome des procaryotes, ou 40S du ribosome des eucaryotes. Phylogénie (phylogeny) Voir chapitre 2. Phylum (phylum) Lignée majeure d’organismes dans l’un des trois domaines du vivant. Pourcentage de GC (GC ratio) Pourcentage total dans l’ADN (ou dans l’ARN) d’un organisme des bases Guanine et Cytosine Protéobactéries (Proteobacteria) Voir chapitre 2. Ribosomal Database Project (RDP) Vaste base de données de séquences d’ARNr, accessible par Internet, et utilisée pour la comparaison des séquences d’ARNr. Ribotypage (ribotyping) Méthode d’identification des microorganismes par l’analyse de fragments d’ADN générés par la digestion par enzymes de restriction des gènes codant l’ARNr 16S. Séquence signature (signature sequence) Courte séquence oligonucléotidique de l’ARNr 16S ou 18S, caractéristique d’organismes particuliers ou d’un groupe d’organismes phylogénétiquement apparentés, et uilisée pour la confection de sondes. Sonde phylogénétique (phylogenetic probe) Oligonucléotide, souvent couplé à un fluorochrome, complémentaire d’une séquence signature d’un ARNr. Stromatolite (stromatolite) Tapis microbien stratifié, formé de plusieurs couches de procaryotes filamenteux et d’autres microorganismes, susceptible d’être fossilisé. Taxinomie (taxonomy) Science de l’identification, de la classification, de la nomenclature. Transfert de gène latéral (horizontal) [lateral (horizontal) gene transfer] Échanges de gènes entre cellules au sein d’une communauté microbienne. Typage de séquences multigéniques (multilocus sequence typing) Outil taxinomique basé sur les comparaisons de séquence de 5-6 gènes « de ménage ». Vie à ARN (RNA Life) Forme de vie sur la Terre primitive, ayant précédé l’invention de l’ADN et des protéines, dans laquelle l’ARN conservait l’information génétique et assurait des fonctions catalytiques.

11.1 L’évolution de la Terre m n et les premières formes de vie Les tout premiers paragraphes couvrent une période débutant avant que les cellules n’apparaissent et allant jusqu’aux cellules eucaryotes modernes. Les paragraphes suivants expliquent comment la chimie prébiotique a pu fournir les ingrédients nécessaires à l’origine de la vie, comment les premières « entités vivantes » autoréplicatives n’ont peut-être pas été construites sur le mode cellulaire, comment les premières sources d’énergie utilisées ont pu être inorganiques, et, enfin, que la cellule eucaryote est une chimère génétique résultant d’au moins deux organismes distincts.



11.1 L’évolution de la Terre et les premières formes de vie

La preuve d’une vie microbienne sur la Terre primitive

(a)

(b)

Malcolm Walter

(c)

T. D. Brock

Malcolm Walter

La preuve d’une vie microbienne dans les roches anciennes repose sur les restes fossilisés de cellules et la présence d’isotopes légers du carbone dans ces roches (l’utilisation des analyses isotopiques du carbone et du soufre en tant qu’indication des processus vivants est présentée dans la section 18.8). Quelques roches anciennes contiennent des microfossiles ressemblant beaucoup à des bactéries, en forme de bâtonnets ou de coques (voir figure 11.1).

Malcolm Walter

La Terre est âgée d’environ 4,6 milliards d’années. Notre système solaire s’est formé à la suite de l’explosion d’une étoile de grande taille, très chaude, donnant une nouvelle étoile (notre soleil) et les autres constituants de notre système solaire. Bien qu’aucune roche datant de l’origine de notre planète n’ait été découverte, sans doute en raison de l’érosion, des roches âgées de presque 4 milliards d’années (4 gigayears, GY) ont été trouvées dans plusieurs endroits de la Terre. Les plus vieilles roches ainsi découvertes font partie du complexe gneissique d’Itsaq, dans le sud-ouest du Groenland, qui date d’environ 3, 86 milliards d’années. D’autres roches anciennes (séries de Warrawoona, Towers Formation, Pilbara) ont été trouvées en Australie occidentale ou en Afrique du Sud (formations au Swaziland et à Barberton) ; toutes ces formations rocheuses sont âgées d’environ 3,5 milliards d’années (voir figure 11.1). Les roches anciennes sont de trois types : sédimentaire, volcanique, carbonacé. Les plus vieilles roches sédimentaires présentent un intérêt tout particulier, car la formation de roches sédimentaires nécessite de l’eau liquide. Ainsi, la présence de telles roches âgées de près de 4 GY implique la présence d’eau liquide à cette époque, probablement sous forme d’océans ou de lacs. La présence d’eau liquide signifie que les conditions à cette époque étaient compatibles avec la vie telle que nous la connaissons.

Dans les roches de 3,5 GY ou plus jeunes, existent d’abondantes formations microbiennes nommées stromatolites. Les stromatolites sont des tapis microbiens fossilisés, constitués de nombreuses couches de procaryotes filamenteux emprisonnant des sédiments (voir figure 11.2) ; quelques caractéristiques des tapis microbiens sont présentées dans la section 18.7. Quelle sorte d’organisme étaient ces bactéries des stromatolites anciens ? La comparaison des stromatolites anciens aux stromatolites actuels des baies peu profondes (voir figure 11.2c et e) ou des sources chaudes (voir figures 11.2d et 18.18a) a conduit à la conclusion que les anciens stromatolites étaient formés de bactéries phototrophes filamenteuses, peutêtre proches de la bactérie verte non sulfureuse Chloroflexus (voir section 12.35). La figure 11.3 montre des photographies de coupes fines réalisées dans des roches plus récentes, qui contiennent des structures ressemblant à des cellules, très semblables à des bactéries et des algues vertes filamenteuses (voir section 14.13). Ces organismes, présents dans les stromatolites les

Malcolm Walter

L’origine de la Terre

303

(e)

Frances Westall

(d)

FIGURE 11.1 Vie microbienne ancienne. Images en microscopie électronique à balayage de microfossiles procaryotes dans des roches âgées de 3,45 milliards d’années (Barberton Greenstone Belt, Afrique du Sud). La flèche indique des bactéries en bâtonnet attachées à des particules minérales. Les cellules ont un diamètre d’environ 0,7 µm.

FIGURE 11.2 Stromatolites anciens et actuels. (a) Les plus vieux stromatolites connus, trouvés dans une roche âgée de 3,5 milliards d’années (Warrawoona Group, Australie occidentale). L’image montre une coupe verticale au travers de structures stratifiées préservées dans la roche et indiquées par les flèches. (b) Stromatolites de forme conique dans une dolomite de 1,6 milliard d’années (Bassin Mac Arthur, Northern Territories, Australie). (c) Stromatolites actuels dans une baie en région tropicale (Shark Bay, Australie occidentale). (d) Stromatolites actuels composés de cyanobactéries thermophiles dans une source chaude du Parc national de Yellowstone (USA). Chaque structure mesure environ 2 cm de haut. (e) Autre vue de stromatolites actuels de grande taille (Shark Bay, Australie). Les structures individuelles ont un diamètre de 0,5 à 1 m.




J.W. Schopf

304 Chapitre 11

J.W. Schopf

(a)

(b) FIGURE 11.3 Procaryotes et eucaryotes fossiles dans des roches âgées d’un milliard d’années. (a) Micro-organismes procaryotes fossiles dans une roche âgée d’environ un milliard d’années (Bitter Springs Formation, Australie centrale). La ressemblance est frappante avec des cyanobactéries filamenteuses contemporaines, des phototrophes anoxygéniques ou des chimio-lithotrophes filamenteux sulfo-oxydants (chapitre 12). Diamètre des cellules : 5-7 µm. (b) Microfossiles de cellules eucaryotes dans la même formation rocheuse. La structure cellulaire ressemble remarquablement à celles de certaines algues vertes telles que l’espèce Chlorella (section 14.13). Diamètre des cellules : environ 15 µm.

plus anciens, étaient vraisemblablement des phototrophes anoxygéniques (non producteurs d’oxygène) [voir sections 12.2, 12.21, 12.32 et 12.35], plutôt que des cyanobactéries productrices de O2, dominantes dans les stromatolites actuels (voir figure 11.2c et e). Il n’en reste pas moins que les microorganismes procaryotes présentaient une importante diversité morphologique, déjà très tôt dans l’histoire de la Terre.

Les conditions sur la Terre primitive : chaleur élevée et anoxie L’atmosphère de la Terre primitive était dépourvue d’oxygène. Outre la vapeur d’eau, l’atmosphère contenait de nombreux

gaz, principalement du méthane, du gaz carbonique, de l’azote et de l’ammoniac. En outre, il y avait vraisemblablement des traces de monoxyde de carbone et d’hydrogène, ainsi qu’une grande quantité de sulfures sous forme d’un mélange de H2S et FeS. Il est aussi vraisemblable qu’une quantité considérable de cyanure d’hydrogène, HCN, était produite sur la Terre primitive par réaction entre NH3 et CH4. Il est très vraisemblable que la Terre primitive était plus chaude qu’aujourd’hui. Pendant environ les deux premières centaines de millions d’années, la température à la surface de la Terre excédait probablement 100 ˚C. De plus, la planète était fréquemment bombardée par des météorites. Dans ces conditions, l’eau libre ne pouvait pas exister. L’eau liquide s’est accumulée seulement lorsque la Terre s’est refroidie. On ne connaît pas la vitesse de ce refroidissement, mais l’hypothèse selon laquelle les premières entités autoréplicatives sont apparues sur une Terre encore assez chaude a été avancée. Dans ce cas, les premières formes de vie ont dû être vraisemblablement thermotolérantes, et ont peut-être ressemblé aux procaryotes hyperthermophiles (voir section 6.12 et chapitre 13). Cette hypothèse sera abordée dans les sections 11.8, 11.9 et 13.13.

L’origine de la Vie La synthèse de biomolécules peut se produire spontanément lorsque des atmosphères réduites, contenant les gaz mentionnés plus haut, sont soumises à d’intenses sources d’énergie. Parmi celles disponibles sur la Terre primitive, la plus importante était probablement celle résultant des radiations ultraviolettes (UV) solaires, car il n’existait pas à cette époque de couche d’ozone absorbant les UV. Cependant, les décharges provoquées par les éclairs, la radioactivité, la chaleur dégagée par les impacts météoritiques ainsi que l’énergie thermique résultant de l’activité volcanique étaient aussi vraisemblablement présentes. Si des mélanges gazeux tels que ceux existant sur la Terre primitive sont irradiés par des UV ou soumis au laboratoire à des décharges électriques, il se forme des biomolécules variées, parmi lesquelles des sucres, des acides aminés, des purines et des pyrimidines, des nucléotides variés, des thioesters et des acides gras. En outre, si l’on simule des conditions prébiotiques en laboratoire, certaines briques de construction biochimiques peuvent former des polypeptides, des polynucléotides et d’autres macromolécules importantes. Il est alors possible d’imaginer qu’un mélange de composés organiques a pu s’accumuler sur la Terre primitive, quel qu’en soit le processus, et ainsi mettre en place le décor pour l’origine de la vie. En raison de la stérilité de la Terre à cette époque, ces composés organiques étaient stables et n’étaient pas soumis à des biodégradations comme c’est le cas aujourd’hui.

La catalyse et l’importance de la montmorillonite Il est vraisemblable qu’un catalyseur devait être disponible pour permettre la synthèse spontanée de macromolécules sur la Terre primitive. Des surfaces telles que celles composées d’argiles ou de pyrites ont pu procurer un milieu relativement sec, propice à la synthèse et l’accumulation de macromolécules dans des films organiques. De ces films, et sur de longues périodes de temps, des structures primitives, autoréplicatives, ont pu émerger. Des expériences avec une argile comme la montmorillonite ont montré qu’elle constituait une excellente surface catalytique. Par



11.2 La vie primitive : le monde à ARN et le codage moléculaire 305

exemple, en présence d’acides gras, des particules de montmorillonite déclenchent la formation de petites vésicules lipidiques ressemblant beaucoup à de petites cellules (voir figure 11.4). Ces vésicules peuvent s’agrandir elles-mêmes en incorporant davantage d’acides gras et se « fragmenter » en passant au travers d’un filtre très fin. De telles particules d’argile se lient aussi aux ARN et les encapsulent dans des vésicules de lipides (voir figure 11.4). Si l’on ajoute en outre des ribonucléotides aux particules de montmorillonite, ces dernières catalysent la formation spontanée d’oligonucléotides d’ARN. Bien que ces vésicules catalysées par des argiles ne constituent pas des cellules contemporaines et que les oligonucléotides d’ARN ne soient pas des gènes actuels (quoique de nombreux virus aient des génomes formés d’ARN – voir chapitres 9 et 16), les vésicules contenant de l’ARN (voir figure 11.4) présentent plusieurs propriétés des cellules. Si de telles vésicules autoréplicatives ont été formées sur la Terre primitive, des versions améliorées contenant d’autres macromolécules, à l’architecture plus complexe, ont probablement vu le jour sur de longues périodes géologiques. De telles structures ont pu être les premières ébauches des premiers organismes cellulaires.

Contrôlez vos acquis La Terre est âgée d’environ 4,6 milliards d’années. La première preuve d’une vie microbienne peut être trouvée dans des roches âgées de 3,86 milliards d’années. La Terre primitive était anoxique et beaucoup plus chaude qu’aujourd’hui. Les premiers composés biochimiques ont été produits par synthèse abiotique, préalablement à l’origine de la vie. Quelles sont les différences entre l’atmosphère de la Terre primitive et l’atmosphère actuelle ?

•

Comment ont été formés les premiers composés biochimiques ?

•

Quel est le rôle présumé de la montmorillonite dans l’origine de la vie ?

Martin M. Hanczyc

•

FIGURE 11.4 Vésicules lipidiques obtenues en laboratoire à partir d’acide myristique et d’ARN. La vésicule est colorée en vert et l’ARN à l’intérieur de la vésicule en rouge. La synthèse des vésicules est catalysée par les surfaces de particules d’argile (montmorillonite).

11.2 La vie primitive : le monde à ARN m n et le codage moléculaire À quoi ressemblait la première entité autoréplicative ? D’après nos connaissances présentes de la vie, il est vraisemblable que les premières formes de vie étaient plus simples que les cellules actuelles, mais que les entités les plus simples possédaient au moins deux propriétés : 1) l’obtention d’énergie et 2) une certaine forme d’hérédité. Mais une structure cellulaire était-elle nécessaire pour cela ? Il est séduisant d’extrapoler sur le passé à partir du présent et de postuler que les organismes primitifs ressemblaient aux cellules modernes, mais s’en différenciaient par la présence de seulement quelques gènes et des possibilités réduites de transcription et de traduction. Cependant, même une structure de ce type devait être relativement complexe, sans doute beaucoup plus complexe que les premières entités autoréplicatives. À quoi ressemblaient donc ces premières entités ? À la suite de la découverte que certains types d’acides ribonucléiques (ARN) avaient des propriétés catalytiques (voir section 14.8), de nombreux scientifiques croient désormais que les premières formes de vie n’étaient pas du tout des cellules, mais plutôt des ARN nus. Dans ce cas, cette étape aurait constitué l’âge de la « vie à ARN », où l’ARN était à la fois l’agent responsable de la catalyse et du code génétique.

Une vie fondée sur l’ARN Dans un monde à ARN, si jamais il a existé, des ARN autocatalytiques variés ont catalysé les réactions nécessaires pour leur autoréplication (voir figure 11.5). Cette idée n’est pas exagérée, car des ARN fonctionnant ainsi sont même connus de nos jours. Il a été montré que divers ARN catalytiques (ribozymes – voir section 14.8) catalysaient différentes réactions, y compris l’autoréplication. De plus, certains ribozymes peuvent synthétiser des nucléotides à partir d’un sucre et d’une base azotée, ainsi que polymériser des acides aminés en polypeptides. Des formes de vie à ARN autoréplicatif ont pu évoluer vers les premières formes de vie cellulaires, lorsqu’elles ont été incluses dans des vésicules lipoprotéiques, peut-être semblables aux vésicules formées sur la montmorillonite (voir figure 11.4). Cette étape a pu se répéter, sans résultat, pendant de très longues périodes sur la Terre primitive, jusqu’à ce que les ingrédients appropriés et un ensemble de circonstances soient simultanément présents, et qu’une structure fermée primitive, capable d’autoréplication (voir figures 11.4 et 11.5) voit le jour. Bien que ne possédant pas encore d’ADN et de protéines, cette forme de vie protocellulaire commençait déjà à ressembler à une cellule moderne. Ces structures se répliquant, la sélection naturelle a favorisé leur perfectionnement au cours de l’évolution. La sélection de davantage de catalyseurs plus efficaces et la mise en place d’un code génétique plus stable constituent certaines de ces améliorations. Il est bien connu que les protéines ont de meilleures propriétés catalytiques spécifiques que les ARN. Ainsi, les organismes primitifs devenant plus complexes et les réactions catalytiques plus biochimiquement exigeantes, les protéines ont dû remplacer les ARN en tant que premiers biocatalyseurs des cellules. Cependant, cela ne s’est pas produit en un jour. Il est vraisemblable que les protéines sont apparues progressivement dans les cellules, peut-être d’abord complexées avec l’ARN



306 Chapitre 11


Terre stérile Synthèses prébiotiques (protéines et ARN produits de manière abiotique) ARN

Monde à ARN

ARN autoréplicatifs

+

Vésicule lipidique ou lipoprotéique

Vie cellulaire primitive (l’ARN a des fonctions codante et catalytique)

Protéine Vie cellulaire

Les protéines assurent les fonctions catalytiques (l’ARN a uniquement une fonction codante)

ADN

Évolution de l’ADN à partir de l’ARN Vie cellulaire moderne (l’ADN remplace l’ARN comme molécule codante ; désormais ARN protéine) ADN

FIGURE 11.5 Scénario possible de l’évolution de la vie cellulaire à partir d’une vie à ARN. Des ARN autoréplicatifs ont formé des entités cellulaires en intégrant de manière stable des vésicules lipoprotéiques. Au cours du temps, les protéines ont remplacé les fonctions catalytiques de l’ARN, et l’ADN a remplacé la fonction codante de l’ARN.

(comme les complexes ribonucléoprotéiques bien connus chez les cellules actuelles). Cependant, l’évolution sélectionnant des catalyseurs biochimiques de plus en plus précis, l’ARN a été finalement presque entièrement remplacé par les protéines, en tant qu’enzyme cellulaire (voir figure 11.5). À ce stade, les cellules modernes sont presque constituées.

La cellule moderne : ADN → ARN → Protéine Pourquoi la cellule à ADN est-elle apparue ? Il y a à cela plusieurs raisons possibles. La mise en place d’un génome à ADN

a pu résulter du besoin de rassembler l’information génétique en un endroit de la cellule et de la conserver sous une forme stable. À partir de là, les gènes ont pu être exprimés pour donner des protéines. L’évolution se poursuivant, l’expression sélective est apparue, permettant à la cellule des économies d’énergie. La suite des changements dus à l’évolution dans ce domaine, a conduit aux contrôles métaboliques nombreux et sophistiqués qui existent chez les procaryotes actuels (voir chapitre 8). L’instabilité de l’ARN en tant que matériel génétique a pu aussi mener à des systèmes fondés sur l’ADN. Un degré élevé de stabilité du système était nécessaire pour l’évolution des cellules, sans quoi les caractéristiques génétiques favorables n’auraient pas été transmises de génération en génération. Le besoin de stabilité génétique des cellules primitives a probablement été le facteur évolutif conduisant à l’utilisation de l’ADN au lieu de l’ARN, en tant que molécule génétique majeure des premières cellules. Pour des raisons probablement liées à la chimie de leurs substrats, les ARN polymérases sont par nature moins précises que les ADN polymérases. Ainsi, pour assurer le transfert fidèle de l’information génétique de génération en génération, les génomes à ADN auront été en définitive sélectionnés. Cependant, les ARN ont été conservés pour la synthèse des protéines, dans laquelle plusieurs de leurs rôles (même dans les cellules modernes) concernent la catalyse (voir section 7.16). Il est arrivé cependant, quelque part au cours des premiers stades de l’évolution microbienne, que le système tripartite ADN-ARN-protéine a été mis en place dans les cellules, car étant la meilleure solution pour traiter l’information biologique. Il est évident que ce système est un grand succès de l’évolution, car, sans exception, toutes les cellules modernes contiennent ces trois types de macromolécules.

Contrôlez vos acquis Les premières formes de vie ont peut-être été des ARN autoréplicatifs, dotés à la fois de propriétés catalytiques et informationnelles. En définitive, l’ADN est devenu le support génétique des cellules et le système tripartite ADN-ARN-protéines est devenu universel. •

Quels sont les arguments en faveur du concept d’une vie à ARN, et pourquoi les formes de vie à ARN n’ont-elles pas vraisemblablement survécu jusqu’à la période actuelle ?

11.3 La vie primitive : énergie m n et métabolisme du carbone La vie est un processus hautement organisé. L’assemblage d’un assortiment de molécules en une machine biologique complexe – la cellule – nécessite de l’énergie. Comment a été satisfaite cette demande en énergie des premières entités autoréplicatives ? Dans le cas des ARN catalytiques, l’énergie a pu provenir de la nature exothermique d’un grand nombre des réactions catalysées. Dans le cas des cellules, la conservation de l’énergie s’est imposée.



11.3 La vie primitive : énergie et métabolisme du carbone 307

Jusqu’à l’arrivée des cyanobactéries, l’oxygène moléculaire n’était pas disponible sur Terre en quantité significative (voir figure 17). En conséquence, seuls des mécanismes producteurs d’énergie possibles en conditions anoxiques pouvaient être exploités par les cellules primitives pour assurer leurs besoins. Cependant, comme cela sera détaillé au chapitre 17, les conditions anoxiques ne restreignent pas beaucoup la diversité métabolique des micro-organismes. En l’absence d’oxygène, toute une série de réactions chimio-organotrophes et chimiolithotrophes productrices d’énergie peuvent intervenir, de même que certaines réactions photosynthétiques. Tous ces mécanismes sont cependant complexes et certains plus simples ont vraisemblablement été à l’œuvre. Des réactions impliquant le fer ferreux (dont on sait qu’il était abondant sur la Terre primitive) ont souvent été proposées pour la fourniture d’énergie aux premiers organismes. Ainsi, la réaction : ∆G0’ = – 42 kJ/réaction

FeS + H2S → FeS2 + H2

est exergonique et libère de l’énergie. Cette réaction produit H2, et les cellules primitives ont pu utiliser ce donneur d’électrons puissant pour générer une force proton-motrice, alimentant une ATPase pour former de l’ATP (voir figure 11.6). D’autres sources de H2 produites aussi sous l’influence du fer ferreux ont pu être disponibles. Par exemple, Fe2+ peut réduire les protons en hydrogène en présence de radiations ultraviolettes. On suppose que les océans primitifs devaient être riches en fer et leurs surfaces exposées à d’intenses radiations UV. Un accepteur d’électrons était bien sûr nécessaire pour former un couple redox, avec le donneur d’électrons H2 (voir section 5.6) et, par exemple, le soufre élémentaire (S0).

Source alternative d’H2 UV 2 Fe2+ + 2H+

2H2 + 2 Fe3+ 2 H+

FeS + H2S

FeS2 + H2

Hydrogénase primitive

ATPase primitive Extérieur

2 e–

Membrane cytoplasmique 2 H2O + S0

S0reductase

ADP + Pi

ATP 2H+

Intérieur

H2S + 2 OH– 2 H2O

FIGURE 11.6 Schéma possible de la production d’énergie chez les cellules primitives. La formation de pyrite conduit à la production d’H2 et à la réduction de S0, alimentant ainsi une ATPase primitive. L’H2S joue seulement le rôle de catalyseur ; les substrats sont en réalité FeS et S 0. Seules deux protéines différentes sont nécessaires. Une autre source d’H 2 pourrait être la réduction de H+ par Fe2+, catalysée par les UV.

Comme l’illustre la figure 11.6, l’oxydation de H2 et la production de H2S ne nécessitent que peu d’enzymes. De plus, en raison de l’abondance de H2 et des composés soufrés sur la Terre primitive, les cellules auraient disposé de quantités d’énergie pratiquement illimitées. Il est intéressant de noter que de nombreuses Archaea hyperthermophiles (dont on verra plus loin qu’elles sont, avec les Bacteria hyperthermophiles, les plus proches parents actuels des organismes terrestres primitifs) peuvent oxyder H2 en utilisant S0 comme accepteur d’électrons. Les sources de carbone potentiellement utilisables par les organismes primitifs étaient variées, comprenant le carbone organique résultant des synthèses abiotiques, et même le CO2, un gaz abondant sur la Terre primitive. Toutefois, l’utilisation du dioxyde de carbone a dû être postérieure à l’autotrophie, processus permettant au CO2 d’être transformé en carbone organique cellulaire (voir sections 17.6 et 17.7). Bien que d’abord supposée improbable, l’hypothèse d’une autotrophie précoce a repris force avec la découverte de procaryotes autotrophes tel Aquifex. Ces représentants des Bacteria hyperthermophiles possèdent un petit génome et sont situés à proximité de la racine de l’arbre phylogénétique universel (voir figure 11.6). Ces caractères sont supposés primitifs, et il est donc possible que les premiers procaryotes aient utilisé le CO2 comme principale ou seule source de carbone.

L’oxygène moléculaire : formations de fer en rubans L’apparition de la photosynthèse oxygénique chez les cyanobactéries (voir figure 11.7) constitue une étape majeure dans l’histoire de la Terre. Les cyanobactéries sont apparues sur Terre il y a environ 2,8 milliards d’années, mais l’oxygène (O2) qu’elles ont produit ne s’est pas accumulé tout de suite dans l’atmosphère en raison de toutes les substances réductrices (telle FeS) présentes dans les océans, qui réagissaient spontanément avec O2 pour donner H2O. Dans le cas de l’oxydation de la pyrite, le Fe3+ formé a constitué un marqueur majeur dans les enregistrements géologiques. Les cyanobactéries ont probablement évolué à partir des phototrophes anoxygéniques, par suite de la mise en place d’un photosystème permettant d’utiliser H2O comme donneur d’électrons lors de la réduction photosynthétique du CO2, et libérant un sous-produit : O2. Le chapitre 17 présente la biochimie de la photosynthèse. Une grande partie du fer trouvé dans les roches du précambrien (> 0,5 milliard d’années – voir figure 11.8) se présente dans des formations de fer en rubans (banded iron formations, BIF) [voir figure 11.7]. Il s’agit de roches sédimentaires en lames où alternent des couches riches en fer et d’autres riches en silicates. Ces formations ont un âge compris entre 2,7 et 1,9 milliards d’années. La mise en place de la photosynthèse oxygénique (cyanobactéries) a dû intervenir il y a 2,75 à 3 milliards d’années. Le métabolisme des cyanobactéries a produit l’O2 qui a oxydé le Fe2+ présent (par exemple FeS2) en Fe3+. Les ions ferriques ont alors formé des oxydes divers qui se sont accumulés sous forme de fer en rubans (voir figure 11.7). Après consommation du Fe2+, O2 a pu commencer à s’accumuler dans l’atmosphère, déclenchant d’importants événements dans l’évolution des procaryotes et des eucaryotes (voir figure 11.8).



308 Chapitre 11


Cependant, à la suite de la production photosynthétique de O2 et de la mise en place du bouclier d’ozone qui lui a succédé, les organismes ont pu prendre pied à la surface de la Terre, permettant l’évolution d’une plus grande diversité d’organismes vivants. La figure 11.8 résume les événements majeurs de l’évolution biologique et les changements dans la géochimie de la Terre, fortement réduite à l’origine puis devenant fortement oxydée.

John M. Hayes


FIGURE 11.7 Formation de fer en rubans. Affleurement de 10 m de hauteur contenant des couches d’oxydes de fer, intercalées avec des couches de silicates, essentiellement de fer (Brockman Iron Formation, Hammersely Basin, Australie occidentale). Les oxydes de fer contiennent du fer ferrique (Fe3+) résultant de l’oxydation du fer ferreux (Fe 2+) par l’oxygène libéré par la photosynthèse des cyanobactéries.

Les métabolismes primitifs étaient anaérobies, vraisemblablement chimiolithotrophes, utilisant les ressources abondantes en FeS et H2S. Une partie du métabolisme du carbone a pu être autotrophe. La photosynthèse oxygénique a conduit à la mise en place des formations de fer en rubans, d’un environnement oxygéné et d’une accélération de l’évolution biologique. •

Comment les cellules primitives ont-elles pu obtenir de l’énergie de la réaction FeS + H2S ?

•

Pourquoi l’arrivée des cyanobactéries est-elle considérée comme une étape majeure dans l’évolution ?

0

1

Origine des eucaryotes modernes Endosymbiose 2

Mise en place du bouclier d’ozone

10 % 1% 0,1 % Oxygéné

3

4

Origine des phototrophes oxygéniques (cyanobactéries)

Premières traces de vie cellulaire Évolution Synthèse prébiotique Anoxique chimique de biomolécules Formation de la Terre (~ 4,6 × 109 années)

Pourcentage d’O2 dans l’atmosphère

L’apparition de la photosynthèse oxygénique a eu d’énormes conséquences pour la Terre : en raison de l’accumulation de O2, l’atmosphère est passée progressivement d’un état anoxique à un état oxygéné (voir figure 11.8). O2 étant désormais disponible comme accepteur d’électrons, les organismes aérobies ont pu se développer. Ces organismes, capables d’obtenir plus d’énergie de l’oxydation des molécules organiques que les anaérobies (voir chapitre 17), ont permis à des populations plus abondantes de se développer, augmentant ainsi les possibilités d’évolution de nouveaux types d’organismes et de nouveaux schémas métaboliques. L’étude des fossiles montre bien que la période d’oxygénation de l’atmosphère terrestre correspond à une forte accélération de l’évolution. Ces événements ont déclenché l’apparition des micro-organismes eucaryotes contenant des organelles, suivie d’une rapide diversification des organismes pluricellulaires. Les animaux et les plantes sont finalement apparus au cours des phases suivantes de l’évolution (voir figure 11.16 et section 11.9). Une conséquence majeure de l’apparition de O2 a été la formation de l’ozone, une substance qui a formé une barrière protégeant la Terre des intenses radiations ultraviolettes du soleil. Lorsque O2 est soumis à des radiations UV de courte longueur d’onde, il est transformé en O3, qui absorbe fortement les longueurs d’onde jusqu’à 300 nm. Avant la mise en place de ce bouclier d’ozone, l’évolution ne pouvait se poursuivre que dans des environnements protégés des radiations solaires directes, tels que les océans ou les faces inférieures des roches, les radiations UV entraînant des dommages létaux sur l’ADN.

Temps passé (milliards d’années)

L’oxygène de l’atmosphère : nouveaux métabolismes et bouclier d’ozone

Âge des dinosaures Limite Cambrien / Précambrien (0,5 milliard d’années) 20 % Plantes multicellulaires et animaux

FIGURE 11.8 Étapes majeures de l’évolution biologique et des modifications géochimiques de la Terre. L’oxygénation de l’atmosphère résultant du métabolisme des cyanobactéries a constitué un processus graduel qui s’étale sur une période d’environ 2 milliards d’années. Bien que les animaux et la plupart des organismes complexes nécessitent une atmosphère à 20 % d’oxygène, ce n’est pas le cas de tous les procaryotes, souvent anaérobies facultatifs ou microaérophiles (section 6.15, tableau 6.4). Les procaryotes vivant dans une atmosphère pauvre en oxygène ont vraisemblablement été majoritaires pendant un milliard d’années environ, avant que les concentrations actuelles en oxygène ne soient atteintes.



11.4 Les eucaryotes et les organelles : l’endosymbiose 309

•

Sous quelle forme le fer était-il présent dans les formations de fer en rubans ?

•

Quel rôle a joué l’ozone dans l’évolution biologique et comment les cyanobactéries ont-elles contribué à sa production ?

Plantes Animaux

11.4 Les eucaryotes et les organelles : m n l’endosymbiose La diversité des micro-organismes eucaryotes a été brièvement présentée dans le chapitre 2 (voir section 2.6) et sera détaillée dans le chapitre 14. La section qui suit est consacrée à la formation des cellules eucaryotes modernes et de leurs structures internes caractéristiques : le noyau et sa membrane nucléaire, ainsi que les organelles.

L’origine du noyau Les cellules eucaryotes primitives avaient vraisemblablement une structure très simple. Comme les procaryotes actuels, elles ne possédaient pas de mitochondries, de chloroplastes ni de noyau. Comment est apparu le premier noyau ? Les cellules de la lignée eucaryote augmentant en taille, le noyau et l’appareil mitotique sont apparus, en même temps que le partage de l’ADN en unités distinctes (les chromosomes). Les chromosomes ont sans doute eu pour rôle d’assurer une réplication et une séparation méthodique de l’ADN. Il est vraisemblable que l’augmentation de taille des génomes primitifs ne permettait plus la réplication (comme c’est le cas chez les procaryotes) d’une molécule unique d’ADN. Le développement du noyau a également facilité la maintenance des plus grands génomes nécessaires aux cellules eucaryotes plus complexes, et rendu possible les recombinaisons des génomes grâce à la reproduction sexuée (voir sections 2.2 et 14.7). Il n’y a pas de raison évidente pour que les eucaryotes primitifs aient eu besoin d’organelles autres que le noyau, particulièrement sur une Terre anoxique. Cependant, leur origine est un processus très intéressant qui va être maintenant détaillé.

L’endosymbiose Les cellules eucaryotes modernes (contenant des organelles) ne proviennent pas de la répartition progressive de fonctions cellulaires, dans des structures fermées, les organelles. Au contraire, les organelles ont pour origine l’incorporation stable de symbiotes chimio-organotrophes et phototrophes du domaine des Bacteria (voir figure 11.9). Ce processus, nommé endosymbiose (du grec endo, « à l’intérieur ») a probablement débuté lorsqu’une bactérie aérobie s’est installée de manière stable à l’intérieur du cytoplasme d’un eucaryote primitif, procurant à la cellule de l’énergie en échange d’un habitat protégé et d’une fourniture de nutriments (voir figure 11.9). Ce symbiote était le précurseur des mitochondries modernes. De même, l’installation d’un phototrophe oxygénique a apporté la photosynthèse à un eucaryote primitif ; une telle cellule ne dépendait plus de molécules organiques pour la production d’énergie et devenait phototrophe. Cet endosymbiote phototrophe était le précurseur du chloroplaste moderne (voir figure 11. 9).

Algues

Protozoaires

Perte des organelles Eucaryote moderne Eucaryotes modernes dépourvus de mitochondries Endosymbiose

Eucaryote primitif Origine du noyau

Intégration symbiotique d’une cellule phototrophe (chlorolaste primitif)

Intégration symbiotique d’une cellule aérobie (mitochondrie primitive)

Augmentation de la taille de la cellule Bacteria Archaea

Lignée à noyau

Ancêtre universel FIGURE 11.9 Origine des cellules eucaryotes modernes par le phénomène d’endosymbiose. Les organelles proviennent des Bacteria plutôt que des Archaea. Certains eucaryotes primitifs n’ont jamais été concernés par le phénomène d’endosymbiose ou ont perdu définitivement leurs symbiotes. Ils possèdent néanmoins toutes les autres caractéristiques des cellules eucaryotes. La figure 11.16 montre les lignées des Bacteria d’où proviennent les organelles (section 14.4).

Quelques cellules eucaryotes n’ont jamais incorporé d’endosymbiotes, ou plus vraisemblablement en ont possédé à une certaine période, puis les ont éliminés, sans doute parce que leur habitat était en permanence anoxique ; il en existe de nos jours (voir sections 14.2 et 14.9). La plupart des associations endosymbiotiques ont probablement amélioré les aptitudes de la cellule hôte, et à présent les cellules eucaryotes contenant des organelles sont dominantes. L’étude des microfossiles (voir figure 11.3) suggère que ces événements endosymbiotiques ont débuté il y a environ deux milliards d’années (voir figure 11.10). L’endosymbiose n’a sans doute pas été un épisode unique, mais plutôt une série d’événements, peut-être même communs,



310 Chapitre 11


0 Phanérozoique 0,5

Cambrien Précambrien

Plantes et animaux Eucaryotes modernes

1

1,5

Milliards d’années

2

2,5

3

Archaéen 3,5

Ère des Procaryotes (deux tiers de l’histoire de la vie sur Terre)

Vie microbienne uniquement

Protérozoique

4 Hadéen 4,5

Monde à ARN ? Formation de la planète Terre

FIGURE 11.10 Chronologie de l’apparition des entités autoréplicatives sur Terre. L’échelle à gauche situe les formes de vie selon les périodes géologiques majeures.

entre cellules procaryotes et eucaryotes. Les associations bénéfiques se sont maintenues, améliorées par suite de la sélection, tandis que celles plus instables ou néfastes disparaissaient. Ces adaptations ont concerné la structure des endosymbiotes (perte de la paroi par exemple), les modifications du génome et le transfert de gènes de l’endosymbiote au noyau de la cellule hôte (voir sections 14.9 et 15.7). La cellule eucaryote moderne est née de ces associations.

Les preuves de l’endosymbiose Il existe de nombreuses preuves de l’hypothèse de l’endosymbiose. Par exemple, les chloroplastes, comme les mitochondries contiennent des ribosomes de type très nettement procaryote (voir tableau 7.4) et possèdent des séquences d’ARNr 16S (voir section 11.6) caractéristiques du domaine des Bacteria. De plus, le fonctionnement des ribosomes des organelles est inhibé par les mêmes antibiotiques qui affectent le fonctionnement des ribosomes des Bacteria libres (voir section 14.5). Les chloroplastes et les mitochondries contiennent aussi de petites quantités d’ADN circulaire, clos par des liaisons covalentes, typiques des procaryotes (voir section 2.2). En fait, il existe de nombreux indices d’un passé procaryotique chez les organelles des cellules modernes actuelles (voir section 14.4).

Des événements endosymbiotiques se déroulent même de nos jours. Il y a par exemple de nombreux protozoaires, particulièrement anaérobies, qui contiennent des symbiotes procaryotes (voir figure 19.25). Bien que ces symbiotes soient des cellules tout à fait fonctionnelles et non fortement modifiées comme les mitochondries et les chloroplastes, ils démontrent que des cellules eucaryotes peuvent englober, et effectivement englobent, des cellules procaryotes, vraisemblablement dans l’intérêt mutuel des deux partenaires. L’endosymbiose a constitué une accélération majeure pour la lignée des cellules eucaryotes. La présence de systèmes respiratoires et photosynthétiques a conféré des propriétés si importantes aux cellules eucaryotes que tout était en place pour une explosion de la diversité biologique. La période qui a débuté il y a 1,5 milliard d’années a vu la naissance et la diversification des micro-organismes unicellulaires et des métazoaires, qui a culminé avec l’apparition des plantes complexes et des animaux (voir figures 11.8, 11.9 et 11. 16).

L’évolution biologique et les périodes géologiques La période comprise entre l’origine des premiers métazoaires et le présent correspond à environ un sixième de la durée totale de la vie sur Terre. En d’autres termes, cinq sixièmes de l’histoire biologique de la Terre ont concerné une vie exclusivement microbienne, et la plus grande partie de cette période n’a connu que des procaryotes. Auparavant, s’est écoulé l’âge des formes réplicatives non cellulaires, l’âge du monde à ARN, s’il a réellement existé. Encore avant, la planète Terre était stérile, dans le sens le plus exact du terme. Ces périodes de l’évolution de la vie sont résumées en fonction des échelles géologiques usuelles dans la figure 11.10. Les métazoaires ont laissé une grande quantité et une grande diversité de traces fossiles. Pour cette raison, l’évolution biologique de la période allant des premiers métazoaires à nos jours est relativement bien connue. L’histoire des micro-organismes est, elle, assez incomplète, surtout en ce qui concerne les procaryotes. En fait, l’évolution des procaryotes reste un mystère, jusqu’à environ le quart de siècle. L’avènement des méthodes moléculaires pour l’étude de l’évolution a ouvert de nouvelles voies pour les sciences de l’évolution, et particulièrement pour la compréhension des micro-organismes. Cette partie de l’histoire évolutive des micro-organismes, la façon dont les méthodes moléculaires ont permis la construction d’un arbre phylogénétique du vivant sont détaillées dans les sections suivantes.

Contrôlez vos acquis Le noyau eucaryote et l’appareil mitotique sont probablement apparus par nécessité d’assurer la partition ordonnée de l’ADN chez des organismes à grand génome. Les mitochondries et les chloroplastes, principales organelles productrices d’énergie de la cellule, proviennent d’associations symbiotiques de procaryotes du domaine des Bacteria avec des cellules eucaryotes, au cours d’un processus nommé endosymbiose. Si l’on admet l’existence passée d’un monde à ARN, des entités autoréplicatives ont peuplé la Terre depuis quatre milliards d’années.



11.5 Les chronomètres de l’évolution 311

•

À quelle époque géologique sont apparus les premiers eucaryotes ? les métazoaires ?

•

Quels arguments soutiennent l’idée que les organelles furent d’abord des espèces libres du domaine des Bacteria ?

II

MÉTHODES D’ÉTUDE DE L’ÉVOLUTION

Les sections suivantes seront consacrées à la phylogénie des micro-organismes et surtout à leurs relations d’évolution. Le point majeur concernera l’étude comparative des ARN ribosomiques. Ces études ont permis l’émergence de la première image révélant la phylogénie microbienne. En outre, les techniques employées ont conduit à la mise en place de nouveaux outils en écologie microbienne et en diagnostic clinique.

11.5 Les chronomètres de l’évolution m n Certains gènes et certaines protéines sont des chronomètres de l’évolution, dont ils mesurent les changements. En d’autres termes, les différences dans les séquences de nucléotides ou d’acides aminés de macromolécules de fonctions similaires (homologues) sont fonction de leur distance évolutive. Cependant, pour mesurer des distances évolutives à l’aide de séquences de molécules, il est essentiel de choisir les molécules adéquates.

Les critères des chronomètres moléculaires Un certain nombre de critères définissent le parfait chronomètre moléculaire. En premier lieu, un chronomètre moléculaire doit être distribué universellement dans le groupe d’organismes choisi pour l’étude, ceci pour faciliter la comparaison entre les organismes. Ensuite, la molécule choisie doit être fonctionnellement homologue chez chaque organisme ; des molécules aux fonctions distinctes n’auraient pas des séquences comparables. En troisième lieu, il est crucial que les molécules aient dans leurs séquences des régions conservées afin d’en permettre l’alignement pour l’analyse. Finalement, la séquence de la molécule choisie doit refléter l’ensemble des changements évolutifs de l’organisme. En fait, plus la distance phylogénétique à mesurer est grande, plus le taux de modification des séquences doit être lent, car trop de changements sur une trop longue période auraient pour conséquence de brouiller le signal. De nombreux gènes ont été proposés comme chronomètres moléculaires. Cependant, les gènes codant les ARN ribosomiques, éléments centraux du système de traduction (voir sections 7.14 à 7.16), les protéines ATPases, complexes enzymatiques synthétisant ou hydrolysant l’ATP (voir section 5.12), RecA, l’enzyme qui facilite les recombinaisons génétiques (voir section 10.6), et certaines protéines du système de traduction ont apporté les informations phylogénétiques les plus pertinentes à

propos des micro-organismes. Toutes ces molécules étaient probablement essentielles, même pour les cellules primitives, et les variations observées dans la séquence de leurs gènes ont permis une vision approfondie de leur passé évolutif. L’ARN ribosomique, le chronomètre moléculaire le plus utilisé, sera essentiellement abordé dans la suite (voir figure 11.11).

Les ARN ribosomiques : chronomètres de l’évolution Les ARN ribosomiques possèdent plusieurs caractéristiques qui en font d’excellents chronomètres de l’évolution. Les ARN ribosomiques sont des molécules relativement grandes, de fonction constante, universellement distribués et contenant plusieurs régions dans lesquelles la séquence nucléotidique est conservée chez toutes les cellules. Il y a trois molécules d’ARN ribosomique, qui ont chez les procaryotes les tailles respectives de 5S, 16S et 23S (S est l’abréviation de svedberg, une unité de masse fondée sur la sédimentation d’une particule dans une centrifugeuse). Les efforts de séquençage ont été concentrés sur l’ARNr 16S, ou chez les eucaryotes, sur une molécule légèrement plus grande mais de fonction similaire, l’ARNr 18S. Les ARN 16S et 18S font partie des petites sous-unités (30S ou 40S) du ribosome (voir figure 11.11b), et l’on utilise fréquemment pour les désigner l’acronyme SSU (pour small subunit, petite sous-unité). Il existe une énorme base de données de séquences d’ARNr. Par exemple, le projet RDP (Ribosomal Database Project) contient une collection de plus de cent mille séquences. Cette base de données est disponible sur Internet (http://rdp.cme.msu.edu/html) et, outre les séquences, contient des informations phylogénétiques, des références bibliographiques, des séquences nouvellement établies et de nombreuses autres données. L’utilisation des petites sous-unités de l’ARNr en tant qu’outils phylogénétiques a été amorcée au début des années soixante-dix par Carl Woese, de l’université de l’Illinois (États-Unis), et cette méthode est désormais très largement utilisée en biologie. Pour ses travaux scientifiques, Carl Woese a reçu en 2003 le prix Crafoord, la plus haute récompense pour des travaux scientifiques en biologie, de l’Académie royale des sciences de Suède.

Contrôlez vos acquis Les comparaisons de séquences d’ARN ribosomiques peuvent servir à déterminer les relations d’évolution entre les organismes. Des arbres phylogénétiques calculés à partir de ces séquences ont été établis pour la plupart des groupes de procaryotes et d’eucaryotes. •

Pourquoi l’ARN ribosomique est-il un bon chronomètre moléculaire ?

•

Que signifie RDP ?

•

Qui est Carl Woese ?



312 Chapitre 11


190

A U C G A G A C

Nucléotides : 16S (~1500) ~21 protéines

Nucléotides : 23S 5S Sous-unité 30S (~120) (~2900) ~34 protéines Sousunité 50S

Ribosome 70S

James Lake

A A 720 G U 1090 U U C G A G C G G 710 1110 C U A U C 1100 G 700 1130 A G G G C G 1120 GA A A A UGC GC G U A U C U G G A G U G C CA A A A A G AG C G U G ACGAGC C C U UA U C C U U U G U U C C C G G U C A A U G G A C C UU CGG U GG C G A A A G U G C G G UG A G G G GU A G G A A A C A GG GCCGG G UGC UC G U G C A 690 680 A U 730 1180 G U A G G C 670 U C G A G A U 790 G C 1070 C 1150 1140 A C A U G G C A 1080 A U G C G U G C A G A 1160 G G1190G C 740 G U U U G C A U U 1030 G A A U G C GA C G G A 1060 A U AA C U C A G U C G G G C U G U C G U C G 1200 UC G C G C G G C 660 U A A C A G C G AA U A 1020 G A 1170 AU U A AC A 800 G G G C A A U 780 CA U A A U U A U G A G A A U GU C 1040 GU G 750 C G A G C G 630 1050 C G C G U A A G A G U G G C G G A C U U U U G A A GG U UG 640 650 U G G C G G U C A A C UA C G G 1210 A C 1010 A A ACG A C CU GGC U GC A U C U G A C UG G C A A G C A U C UU 840 A C C C C 810 620 G G A C U U U C G C 770 C U G GG C C C 1000 GUGU A GA C U GA U U GU UU G G A G C GC U A C CC C GU C G U 760 A G C C C A A A A G GG A GU U G UAA A U G A 590 600 C G G UG G A A C A 980 U G G G CG C GC A 610 U A U 830 U A 850 G C G C 1220 CCU U C G G G G G A A A 580 C G A C C G A 820 U U G G G U 470 G GU C G A C U U C 1260 C A A U AC A CG A G C C G U A A U A A C C G A G CA GC U GGA UG U U G C C G UG U C G AC A 860 GC C U C 480 C U A AU G G U U G 970 C C 1250 G 530 G G U G CU G 880 A C C A C G U A G 960 U A A A 520 570 G U C A C A U G C A 1230 A C G AG A U AUU GA C A A C G A U G G G A A A 950 C G U CG C GU 460 890 870 G C C G U UA G C C A A U A A G A U G A 1270 U G C C G U U GG G A G UA CGG C C G C A 1240 G CU C G UA C CA C G C G U G C A A CG G U GGC A U A CA A 900 490 510 C G A G GG G 560 A A CUCA C UU GGA G U A A AU AU A 940 U G A C 1280 A A A GC A AC A U 540 G C 910 A 930 U GG A U G G C 920 1290 G G G AG G G AU U C GC C A C GA G G G G A G A U UG A C G GG GC C C G C A C A AG 450 C A G G C CU A G A 500 C 1300 G U G A U C G GU A C 430 U 550 A A AC A C G U A G C U U G C G A C U G U UC CGGGC U U AA A A A U C G C G U A C C U U C GU U G C U G GU A A GA A CG U G C A G AU G GGU U 1390 GUA C G G A A A U C C U G 30 A A C A 1400 1360 C A G 10 A U U C G UAUG UG C G U CCGG G U 1350 A U 1500 G G AA A G U U U U C C C U C A G A A 400 C G G A C U G A 1330 U A G C G 420 C G G U A A C G G A 410 G 390 U A C C G CU C G A G 1510 A 40 C C C G U G 1310 GA U U G A A A A G C CU G A U GC A G 1370 C G G U G C U C G A A C A U A A C C GU A G G G C C C A G U G C G A A C A CGU G C GGGU U AG C G A A AC A U G C G U U GG CG U C C AU C U A 50 A A U 1410 G AU 1530 380 CA A G C A A A 1520 C G C U G GG G A 1320 G A U C U G C 360 G A C G U U G A C A G 350 G C G C G C U G A CA A G C AG C U 330 G G 60 A A C C U U G G C 1420 U A 1480 C U C A C G 340 A U 1540 G C G UC A C CA G U U G 300 G G A U G A G C A A 70 U A AG U A GG U C A G U G A G A G A 320 C G A U G C A A U GU 310 C GU CA G CA C UC A G GC C G GG 80 UG A U G C A CA GA U GG U G GU A G GU AG G C AG CG 1430 C 1470 A U AA A CU G 290 A G C A C G UU 110 U 110 U CU A G U C UC 280 A C A C GU A C G U 90 C A U G U G C G U A G A C GA 120 A 240 G U A C G U A U U A U C G U G G C A G 1440 G C G G C C 270 U A C G G U U A A C 250 A 1460 C G G U 130 A C A G G C A A U G C U G 230 G C G U U U G GC U AU G G A G G A A C G G C C G C G 260 G C A A U U G G 1450 U G C U C A U 220 A 140 150 U C G A A C G AGGGG GA U G GG CC UCUU G CU ACU G G 210 C 160 A U GA UGGC AA C CC UA U C C GG G G A G A A AG AG A C U 180 U 200 A A A A 170 C C G C

(a)

(b)

(c) FIGURE 11.11 ARN ribosomique. (a) Vue en microscopie électronique des ribosomes (70S) d’Escherichia coli. (b) Les différentes parties du ribosome ; 5S, 16S et 23S correspondent aux différentes formes d’ARN dans la petite sous-unité du ribosome. (c) Structures primaire et secondaire de la sous-unité 16S de l’ARN ribosomique (ARNr) d’Escherichia coli (Bacteria). L’ARNr 16S des Archaea est identique en ce qui concerne la structure secondaire (repliement), mais il possède de nombreuses différences dans la structure primaire (séquence). Chez les eucaryotes, l’équivalent de l’ARNr 16S est l’ARNr 18S, présent également dans les ribosomes.

m n

11.6 Le séquençage de l’ARN ribosomique : un outil de l’évolution moléculaire

Les méthodes permettant d’obtenir des séquences d’ARN ribosomiques et de calculer des arbres phylogénétiques sont désormais courantes grâce aux techniques de biologie moléculaire et d’analyses informatiques. Les séquences venant d’être obtenues sont comparables avec celles de RDP et d’autres bases de données telles que GenBank (États-Unis), DDBS (Japon) ou EMBL (Allemagne). Ainsi, en utilisant un algorithme approprié, il est possible de produire un arbre phylogénétique qui décrit au mieux les informations contenues dans les séquences.

La méthodologie du séquençage Bien que des cultures pures d’organismes ne soient pas indispensables pour effectuer des comparaisons de séquences d’ARNr, la démarche exposée ici s’applique à une telle culture. La procédure débute par amplification par PCR (polymerase chain reaction – voir section 7.9) du gène codant l’ARNr 16S, à partir d’ADN génomique. Le produit de PCR est ensuite séquencé par la méthode de séquençage de l’ADN de Sanger (voir section 7.8 et figure 11.12). Cette procédure est à la fois rapide et spécifique. L’utilisation pour la PCR d’amorces complémentaires de séquences conservées de l’ARNr permet d’obtenir de grandes quantités d’ADN séquencé, à partir d’infimes quantités de matériel cellulaire (voir figure 11.12). Une fois le séquençage réalisé, l’étape suivante consiste en l’analyse informatique.



11.6 Le séquençage de l’ARN ribosomique : un outil de l’évolution moléculaire 313

1. Extraction de l’ADN Gène de l’ARNr 16S

2. Chauffage pour séparer les brins ; ajout des amorces spécifiques 3. Extension des amorces par l’ADN polymérase

longueur des branches est proportionnelle aux distances évolutives est ensuite calculé et dessiné (voir figure 11.13c et d). La méthode de parcimonie, également très employée, produit des arbres phylogénétiques fondés sur la supposition qu’un minimum de changements nécessaires pour que deux lignées divergent à partir d’un ancêtre commun se sont produits au cours de leur divergence évolutive. Comme pour la méthode précédente, le nombre de différences observées dans les séquences doit être pris en compte, mais l’analyse des données se fait par un algorithme différent. Cependant, les arbres

Organisme

+

4. Répétition des étapes précédentes pour obtenir de nombreuses copies du gène de l’ARNr 16S 5. Électrophorèse sur gel d’agarose ; vérification de la bonne taille de l’amplicon 6. Purification et séquençage du produit de la PCR FIGURE 11.12 Séquençage de l’ARN ribosomique d’une culture pure d’un micro-organisme par la technique de polymérisation en chaîne (polymerase chain reaction : PCR). Le gène codant l’ARNr 16S est amplifié puis séquencé selon la méthode de Sanger (section 7.8). Les amorces utilisées sont complémentaires des séquences conservées de l’ARNr 16S (voir figure 11.11c).

Séquence

Analyse

A

CGUAGACCUGAC

B

CCUAGAGCUGGC

C

CCAAGACGUGGC

D

GCUAGAUGUGCC

Entre A B, on observe 3 différences pour 12 nucléotides, soit 3 = 0,25 12

(a) Alignement des séquences et analyse Distance évolutive

Distance évolutive corrigée

ED

A

B 0,25

0,30

ED

A

C 0,33

0,44

ED

A

D 0,42

0,61

ED

B

C 0,25

0,30

ED

B

D 0,33

0,44

ED

C

D 0,33

0,44

(b) Calcul de la distance évolutive

La construction d’arbres phylogénétiques à partir de séquences d’ARN

A

Topologie en éventail

0, 31 0, 23 08 0,

Plusieurs algorithmes différents sont disponibles pour l’analyse des séquences d’ARNr et la construction d’arbres phylogénétiques. Toutefois, quelle que soit la méthode mathématique utilisée, les séquences brutes doivent d’abord être alignées avec des séquences préalablement établies, à l’aide d’un éditeur de séquences. Tous les ARNr n’ont pas exactement la même longueur. Ainsi, au cours de l’alignement, des lacunes doivent être insérées si nécessaire dans les régions où une séquence est plus courte que l’autre. Les séquences alignées sont alors importées dans un programme de construction d’arbres et les analyses sont effectuées. Deux algorithmes courants utilisent les méthodes de distance et de parcimonie. Avec les méthodes de distance, les séquences sont alignées et une distance évolutive (ED) est calculée, l’ordinateur tenant compte de chaque position pour laquelle existe une différence de séquence dans la série de données (voir figure 11.13). Ces données permettent la construction d’une matrice de distances qui indique les ED entre deux séquences des données étudiées. Une correction statistique est ensuite appliquée aux ED, tenant compte du fait que plus d’un changement a pu intervenir à une position donnée (voir figure 11.13). Un arbre phylogénétique dans lequel la

0,08

B

0,15

0,29

C D

(c) Arbre phylogénétique

Dichotomique (d) Topologie des arbres

FIGURE 11.13 Construction d’un arbre phylogénétique à partir de séquences d’ARNr 16S. Par souci de simplification, seules de courtes séquences sont présentées. La distance évolutive ED (b) est calculée comme le pourcentage de différences de séquences observées entre les ARN d’organismes, pris deux à deux. La valeur corrigée de ED est une correction statistique nécessaire tenant compte des mutations vers le phénotype original ou de mutations additionnelles qui ont pu se produire au même site. L’arbre phylogénétique (c) est finalement obtenu suite au traitement informatique des données donnant le meilleur ajustement. (d) Différentes topologies d’arbres phylogénétiques peuvent être obtenues (en éventail, dichotomiques, etc.). Quelle que soit la topologie, la longueur des branches séparant deux organismes est proportionnelle à leur distance évolutive.



314 Chapitre 11


phylogénétiques obtenus par la méthode de parcimonie ressemblent à ceux obtenus par la méthode des distances, bien que l’ordre des branchements puisse être différent dans les deux cas, à partir d’un même ensemble de données. Aussi il n’existe pas un arbre phylogénétique unique et définitif concernant l’évolution d’un organisme donné. Un arbre particulier peut seulement être considéré comme une approximation poussée de la vraie phylogénie d’un groupe.

Contrôlez vos acquis L’analyse comparée des séquences d’ARNr est désormais une procédure de routine incluant l’amplification du gène codant l’ARNr 16S, son séquençage et l’analyse comparée de la séquence. Le calcul des arbres phylogénétiques fait appel à deux algorithmes principaux : distance et parcimonie. •

Qu’est ce qu’une distance évolutive ?

•

Quel est l’intérêt de la PCR dans le séquençage comparatif de l’ARN ribosomique ?

11.7 Les séquences signature, m n les sondes phylogénétiques

et l’analyse des communautés microbiennes

Le séquençage des petites sous-unités de l’ARNr a été à l’origine de nombreux outils fondés sur cette technologie, et en particulier l’emploi des séquences signature et des sondes oligonucléotides déduites de ces séquences en écologie microbienne et en diagnostic médical.

Les séquences signature L’analyse informatique des séquences d’ARNr a révélé l’existence de séquences signature, en fait de petits oligonucléotides,

TABLEAU 11.1

spécifiques de certains groupes d’organismes. On connaît par exemple des séquences signature caractéristiques de chacun des domaines du monde vivant (voir tableau 11.1). De plus, des signatures spécifiques d’un groupe particulier dans un domaine, et dans certains cas d’un genre ou même d’une espèce, sont connues ou peuvent être déterminées par comparaison informatique de séquences alignées. En raison de leur exclusivité, les séquences signature sont très utiles. Elles peuvent par exemple aider à positionner des organismes récemment isolés ou préalablement mal classés dans leur groupe phylogénétique correct. Mais leur plus grande application est la conception de sondes oligonucléotidiques spécifiques, appelées sondes phylogénétiques.

Les sondes phylogénétiques et l’hybridation in situ (FISH) Une sonde est un brin d’acide nucléique qui peut être marqué et employé pour s’hybrider avec un acide nucléique complémentaire situé dans un mélange (voir section 7.7). Les sondes peuvent être générales ou spécifiques. Par exemple, des sondes ARNr universelles peuvent être synthétisées et s’hybrideront aux séquences conservées de tous les organismes, quel que soit leur domaine d’appartenance. À l’inverse, il est possible de concevoir des sondes spécifiques qui vont réagir seulement avec des cellules du domaine des Bacteria, en raison des signatures uniques de leur ARN (voir tableau 11.1). De même, des sondes spécifiques des Archaea et des Eukarya réagiront seulement avec des espèces appartenant au domaine correspondant. Des groupes importants dans un domaine, tels que des familles, peuvent être ciblés grâce à des sondes spécifiques (voir section 11.10). La liaison des sondes aux ribosomes cellulaires peut être visualisée au microscope lorsqu’un fluorochrome est fixé sur la sonde (voir figure 11.14). Le traitement des cellules par un réactif approprié rend la membrane perméable et permet la pénétration du mélange sonde/fluorochrome. Après hybridation de la sonde directement avec l’ARN ribosomique dans les ribosomes, les cellules deviennent uniformément fluorescentes et peuvent être observées au microscope à fluorescence (voir figures 11.14, 11.15 et 11.17). Cette technique a été nommée FISH (fluorescent in-situ hybridization, hybridation fluorescente in

SÉQUENCES « SIGNATURE » DE L’ARNR 16S ET 18S CARACTÉRISTIQUES DES TROIS DOMAINES DU VIVANT Occurrence chez lesc

Signatures oligonucléotidiquesa

Position approximativeb

Archaea

Bacteria

Eukarya

CACYYG

315

0

> 95

0

AAACUCAAA

910

3

100

0

AAACUUAAAG

910

100

0

100

YUYAAUUG

960

100

<1

100

CAACCYYCR

1110

0

> 95

0

UCCCUG

1380

> 95

0

100

UACACACCG

1400

0

> 99

100

CACACACCG

1400

100

0

0

a

Y, n’importe quelle pyrimidine ; R, n’importe quelle purine. Voir figure 11.11c pour le schéma de numérotation de l’ARNr 16S. c L’occurrence indique le pourcentage d’organismes examinés contenant cette séquence dans chaque domaine. b



11.7 Les séquences signature, les sondes phylogénétiques et l’analyse des communautés microbiennes 315

instantanée d’une communauté microbienne naturelle peut être prise en amplifiant par PCR les gènes codant l’ARNr chez tous les membres d’une communauté. Ces gènes peuvent être facilement triés, séquencés, et alignés. Ces données permettent le calcul d’un arbre de séquences « environnementales » montrant les différents ARNr présents dans la communauté. On peut déduire d’un tel arbre la présence d’organismes spécifiques, bien qu’aucun d’eux n’ait été cultivé ou identifié. Ces analyses de communautés microbiennes constituent un axe majeur de la recherche contemporaine en écologie microbienne et ont révélé des caractéristiques essentielles de la structure des communautés microbiennes et des interactions entre micro-organismes (voir chapitre 18).

(a)


(c) FIGURE 11.14 Sondes fluorescentes spécifiques de l’ARNr. (a) Image en microscopie à contraste de phase de cellules de Bacillus megaterium (bâtonnet, diamètre : 1,5 µm, membre des Bacteria) et de la levure Saccharomyces cerevisiae (cellules ovales, diamètre : 6 µm, Eukarya). (b) Même champ microscopique. Les cellules sont colorées par une sonde ARNr universelle vert-jaune (cette sonde réagit avec les représentants de n’importe quel domaine phylogénétique). (c) Même champ microscopique après coloration par une sonde eucaryote (seules les cellules de S. cerevisiae réagissent). Voir aussi section 18.4.

situ) et peut être employée soit directement sur des cellules en culture, soit sur des échantillons de l’environnement. En fait, la technique de FISH est une coloration phylogénétique. Cette technologie est largement utilisée en écologie microbienne ainsi qu’en diagnostic clinique. En écologie, elle est utilisée pour l’identification sous microscope et la recherche d’organismes dans des échantillons naturels. La technique de FISH permet également de déterminer sous microscope la composition d’une communauté microbienne (voir figure 11.15 et section 18.4). En diagnostic clinique, elle est employée pour l’identification rapide des pathogènes dans des échantillons provenant de patients. Cette technique évite d’avoir recours à la culture du micro-organisme, l’examen microscopique d’un spécimen pouvant confirmer la présence d’un pathogène particulier. Cela permet un diagnostic et un traitement plus rapides du patient souffrant d’une infection microbienne. Par contraste, les techniques d’isolement et d’identification conventionnelles prennent au moins vingt-quatre heures et parfois beaucoup plus.

Les analyses des communautés microbiennes Les gènes d’ARNr amplifiés par PCR ne doivent pas provenir obligatoirement d’une culture pure de laboratoire. Grâce aux méthodes décrites en détail au chapitre 18, une photographie

Les séquences signature, petits oligonucléotides d’une molécule d’ARNr, peuvent diagnostiquer puissamment un organisme particulier ou un groupe d’organismes. Les séquences signature peuvent être utilisées pour concevoir des sondes phylogénétiques spécifiques, utilisables dans la technique de FISH ou l’analyse des communautés microbiennes. •

À partir des données de séquences du tableau 11.1, choisissez une sonde phylogénétique spécifique permettant de distinguer une cellule d’Archaea d’une cellule de Bacteria.

•

Comment les sondes oligonucléotidiques peuventelles être rendues visibles au microscope ? Comment s’appelle cette technique ?

David A. Stahl

Norman Pace

(b)

FIGURE 11.15 Utilisation de sondes spécifiques mettant en évidence des bactéries nitrifiantes dans un échantillon de boues activées. Image en microscopie à contraste de phase (à gauche), image en couleur du même champ microscopique après coloration (à droite). La sonde à fluorescence rouge est spécifique de la séquence signature (voir tableau 11.1) de l’ARNr 16S des bactéries nitrosantes (ammonium-oxydantes). La sonde à fluorescence verte est spécifique d’une séquence présente seulement chez les bactéries nitratantes (nitriteoxydantes). Les bactéries nitrosantes et les bactéries nitratantes sont phylogénétiquement proches, appartiennent au domaine des Bacteria (sections 12.3 et 17.12) et réalisent des réactions chimiolithotrophes interdépendantes (section 19.12).



316 Chapitre 11

III


ÉVOLUTION MICROBIENNE

11.8 La phylogénie microbienne m n fondée sur les séquences d’ARN ribosomique

Par le passé, les biologistes ont regroupé les organismes vivants en cinq royaumes : plantes, animaux, champignons, protistes et monera (procaryotes). Récemment, la phylogénie moléculaire a révélé que les cinq royaumes ne représentaient pas cinq lignées majeures de l’évolution. Au contraire, comme cela a été souligné dans le chapitre 2, la vie cellulaire sur Terre a évolué selon trois lignées majeures, nommées domaines, deux d’entre eux étant exclusivement microbiens et composés de cellules procaryotes. La troisième lignée comprend les eucaryotes (voir figure 11.16) et inclut les royaumes originaux à l’exclusion des monera. Les deux groupes de procaryotes sont les Bacteria et les Archaea ; le domaine eucaryote est nommé Eukarya (voir figure 11.16). Ces termes définissent les trois domaines du vivant, le mot domaine correspondant au taxon biologique de plus haut rang. Ainsi, les plantes, les animaux, les champignons et les protistes sont-ils des royaumes dans le domaine des Eukarya.

L’arbre universel du vivant L’arbre phylogénétique universel du vivant (voir figure 11.16) est la feuille de route de la vie. Il décrit l’histoire de l’évolution des cellules de tous les organismes et révèle clairement

les trois domaines. La racine de l’arbre universel représente un point particulier de l’histoire de l’évolution, quand toute la vie sur Terre partage un ancêtre commun, l’ancêtre universel. Les séquences de génomes complets ont confirmé le concept d’Archaea – les organismes de ce domaine possèdent un ensemble de gènes sans contrepartie chez les Bacteria ou les Eukarya –, de même que le concept général des trois domaines. Mais, de manière tout aussi importante, les analyses de génomes complets ont montré que de nombreux gènes sont partagés par des espèces de Bacteria, d’Archaea ou d’Eukarya. Comment ces résultats apparemment conflictuels peuvent-ils s’accorder à la lumière du concept de l’ancêtre commun universel ? Une hypothèse en faveur de ces découvertes est que, très tôt dans l’histoire de la vie, avant que les trois domaines ne divergent, les transferts latéraux (horizontaux) de gènes étaient intenses (voir chapitre 10). Au cours de cette période, les gènes codant des protéines conféraient des aptitudes exceptionnelles : par exemple les gènes codant les fonctions cellulaires centrales de transcription et de traduction étaient très largement transférés dans une population d’organismes primitifs issus d’une cellule commune ancestrale. Si cela est vrai, cela expliquerait, ainsi que l’analyse des génomes l’a montré, pourquoi toutes les cellules, quel que soit leur domaine, partagent de nombreux gènes fonctionnels majeurs, comme on peut l’imaginer dans le cas de cellules issues d’un ancêtre commun (voir figure 11.16). Mais qu’en est-il des différences génétiques observées dans les séquences des génomes complets ? On peut émettre l’hypothèse qu’avec le temps des barrières aux transferts libres de

PROCARYOTES

Bacteria

EUCARYOTES

Archaea Bactéries vertes non sulfureuses

Eukarya

Euryarchaeota

Entamoebae Moisissures glaireuses

Methanosarcina Halophiles Bactéries Crenarchaeota Methanobacterium extrêmes Gram Thermoproteus Methanopositif coccus Pyrodictium Thermoplasma

Mitochondries Protéobactéries Chloroplaste Flavobacteria

Cyanobacteria

Thermotoga

Thermococcus Crénarchaéotes Pyrolobus marins

Animaux Champignons Plantes Cilliés

Flagellés Methanopyrus

Parabasiliens



Microsporidies

Aquifex Ancêtre universel

Diplomonadines (Giardia)

FIGURE 11.16 Arbre phylogénétique universel basé sur les séquences d’ARNr 16S. Pour chaque domaine, seuls quelques organismes représentatifs sont présentés. Pour les arbres détaillés de chaque domaine, voir les figures 12.1, 13.1 et 14.20. Seuls deux domaines sur trois (Bacteria et Archaea) comprennent uniquement des organismes procaryotes.



11.8 La phylogénie microbienne fondée sur les séquences d’ARN ribosomique 317

gènes ont été érigées, peut-être à la suite de la colonisation sélective de certains habitats (conduisant à l’isolement) ou en raison de l’existence de barrières structurales ou enzymatiques (par exemple, des endonucléases de restriction) qui, d’une certaine façon, empêchaient les échanges génétiques incontrôlés. Il en a résulté qu’une ancienne population génétiquement mélangée a lentement commencé à se répartir dans les premières lignées évolutives (voir figure 11.16). Chaque lignée continuant à évoluer, certaines caractéristiques biologiques ont été fixées dans chaque groupe. Aujourd’hui, après 3,8 milliards d’années d’évolution microbienne (voir figure 11.10), l’évolution cellulaire se traduit par trois domaines d’une vie cellulaire qui, d’un côté, partagent de nombreuses caractéristiques communes et, de l’autre, montrent des histoires évolutives distinctes.

Les organismes primitifs et modernes Aucun organisme vivant de nos jours et représenté sur l’arbre universel du vivant n’est un organisme primitif (voir figure 11.16). Toutes les formes de vie existantes sont des organismes modernes, adaptés avec succès à leur niche écologique. Il est possible que certains de ces organismes puissent être phénotypiquement semblables aux organismes primitifs, et les procaryotes hyperthermophiles (température optimale de croissance supérieure à 80 ˚C) en sont un bon exemple. Ainsi, des organismes comme Aquifex et Methanopyrus sont situés relativement près de la racine de l’arbre, respectivement dans les domaines des Bacteria et des Archaea (voir figure 11.16). Ces deux organismes sont capables de croissance à très haute température (voir sections 12.38 et 13.6), conditions que leurs parents ont probablement rencontrées en se développant sur une Terre primitive beaucoup plus chaude. Néanmoins, ces organismes situés à la base de l’arbre ne sont pas eux-mêmes primitifs. Ce sont des organismes modernes simplement phylogénétiquement moins anciens que ceux situés plus haut dans l’arbre, comme les protéobactéries (Bacteria) ou les halophiles extrêmes (Archaea) (voir figure 11.16).

Bacteria Parmi les Bacteria, au moins quarante divisions (nommées phyla, singulier phylum) ont été découvertes ce jour, dont la figure 11.16 représente les principales sur l’arbre universel. De nombreux phyla ont été définis à partir de séquences environnementales uniquement (voir section 11.7 et figure 12.1). Certaines lignées du domaine des Bacteria sont celles distinguées en premier lieu par des caractères phénotypiques comme la morphologie ou la physiologie ; les spirochètes et les cyanobactéries en sont de bons exemples. Mais la plupart des phyla sont constitués d’espèces qui, bien que spécifiquement apparentées du point de vue phylogénétique, manquent de cohésion au niveau phénotypique. Les protéobactéries en sont un bon exemple, le mélange de types physiologiques dans ce groupe couvrant toute la gamme de la physiologie microbienne (voir chapitre 17). Ceci indique clairement que physiologie et phylogénie ne sont pas nécessairement liées. Les organelles eucaryotes sont nettement originaires du domaine des Bacteria. Comme le montre l’arbre universel, les mitochondries viennent des protéobactéries, un groupe majeur des Bacteria, et plus spécifiquement d’organismes proches des Rhizobium et des rickettsies. Il est intéressant de

noter que, comme les mitochondries, ces organismes vivent aussi à l’intérieur de cellules soit de plantes (voir sections 19.21 et 19.22), soit d’animaux (voir sections 12.13 et 27.3). Le chloroplaste provient du phylum des cyanobactéries (voir figure 11.16), comme le prédisait le fait que chloroplastes et cyanobactéries réalisent la photosynthèse oxygénique.

Archaea Du point de vue phylogénétique, le domaine des Archaea est formé de quatre phyla, les Crenarchaeota, les Euryarchaeota, les Korarchaeota et les Nanoarchaeota (voir figure 11.16). Les Crenarchaeota hyperthermophiles tels que Thermoproteus, Pyrolobus et Pyrodictium sont situés près de la racine de l’arbre universel (voir figure 11.16). Viennent ensuite les Euryarchaeota, les méthanogènes et les halophiles extrêmes ; Thermoplasma, un thermo-acidophile dépourvu de paroi, est faiblement relié à ce dernier groupe (voir figure 11.16). Il existe quelques branches chez les Crenarchaeota (voir figures 11.16 et 13.1) qui ne sont connues que par des séquences environnementales (voir sections 11.7, 18.5 et 18.6). Il est intéressant de noter que ces séquences ont pour origine des organismes vivant en milieu océanique, tels que l’océan Antarctique, où les températures sont de loin beaucoup plus froides que dans les habitats connus des Crenarchaeota comme les sources chaudes continentales et marines (voir section 13.8). D’autres séquences de Crenarchaeota ont été obtenues de communautés vivant dans des sols ou des eaux lacustres. Ces Crenarchaeota adaptés aux eaux froides seront davantage détaillés dans la section 13.8. De même que les Crenarchaeota des milieux froids, un phylum complet d’Archaea, provisoirement nommé Korarchaeota, a été identifié après l’analyse de communautés microbiennes d’une source chaude inhabituelle (Obsidian Pool) du parc national de Yellowstone (Wyoming, ÉtatsUnis). Des cultures mixtes stables, contenant des Korarchaeota (identifiables par FISH – voir figure 11.17), peuvent être réalisées au laboratoire, prouvant que ces organismes sont hyperthermophiles. Il se pourrait qu’ils aient des propriétés semblables à celles des Crenarchaeota hyperthermophiles (voir sections 13.8 à 13.10). À la base de la branche des Crenarchaeota se trouve celle des Nanoarchaeota, un groupe qu’un organisme unique, Nanoarchaeum, représente à ce jour. Cette petite bactérie est un parasite d’une autre Archaea, nommée Ignicoccus, qui contient le plus petit génome connu de tous les procaryotes (voir sections 13.11 et 15.4). Les Nanoarchaeota et tous les phyla des Archaea sont détaillés dans le chapitre 13.

Eukarya Les arbres phylogénétiques représentant les espèces du domaine des Eukarya sont calculés à partir des comparaisons de séquence des ARNr 18S, l’équivalent fonctionnel de l’ARNr 16S, dans les ribosomes cytoplasmiques eucaryotes. Il est possible que les premiers eucaryotes aient été semblables aux microsporidies et diplomonadines actuelles. Ces organismes sont des parasites obligatoires qui vivent en association avec des espèces de nombreux groupes eucaryotes, des micro-organismes jusqu’à l’homme. Par exemple, le pathogène Giardia (voir section 28.6) appartient aux diplomonadines. Bien que possédant un noyau




Nicole Eis

318 Chapitre 11

Nicole Eis

(a)

(b) FIGURE 11.17 Identification de cellules de Korarchaeota par une sonde phylogénétique. (a) Microscopie en contraste de phase d’une culture d’enrichissement contenant des cellules de Korarchaeota (flèches). (b) Image en microscopie en fluorescence du même champ microscopique, traité par une sonde oligonucléotidique caractéristique d’une séquence signature de l’ARNr 16S des Korarchaeota (voir section 11.7). Les deux longues cellules en bâtonnets de couleur rouge sont donc des Korarchaeota.

entouré d’une membrane, les microsporidies et les diplomonadines ne disposent pas de mitochondries. De ce point de vue, elles ressemblent au type de cellule qui a accepté les premiers endosymbiotes stables (voir figure 11.9 et sections 14.5 et 14.9). [La section 14.9 aborde plusieurs questions récentes relatives à la phylogénie réelle des microsporidies.] Plus récents dans l’arbre phylogénétique des Eukarya figurent les organismes pluricellulaires, avec au sommet les groupes les plus grands et les plus complexes des Eukarya que sont les plantes et les animaux (voir figure 11.16). La comparaison des enregistrements fossiles avec l’arbre phylogénétique des Eukarya indique que le début de la radiation rapide remonte à environ 1,5 milliard d’années. Les données géochimiques suggèrent qu’à cette époque de l’histoire de la Terre, des concentrations significatives d’oxygène se sont accumulées dans l’atmosphère (voir figure 11.18). Il existe ainsi une bonne probabilité pour que le début des conditions oxygénées et la mise en place du bouclier d’ozone qui a suivi (augmentant ainsi considérablement le nombre d’habitats pouvant être colonisés) aient constitué le déclenchement majeur de la rapide diversification des Eukarya. Les principaux groupes de micro-organismes eucaryotes seront abordés dans le chapitre 14.

11.9 Les caractéristiques m n des domaines du vivant Bien que les trois domaines aient été découverts sur la base des comparaisons des séquences d’ARNr – critères génétiques –, chaque domaine peut aussi être caractérisé par certaines propriétés phénotypiques. Certaines de ces caractéristiques sont propres à un seul domaine, tandis que d’autres se rencontrent dans deux des trois domaines. Les principales caractéristiques phénotypiques d’importance phylogénétique sont présentées ci-dessous.

Les parois cellulaires En fait, toutes les Bacteria possèdent des parois contenant du peptidoglycane (voir section 4.8). Les seules exceptions connues sont les membres du groupe Planctomyces-Pirella (voir section 12.28), dont les parois sont composées de protéines, et les membres du groupe Mycoplasma-Chlamydia (voir sections 12.21 et 12.27), qui ne possèdent pas du tout de paroi. Le peptidoglycane peut être considéré comme molécule « signature » des espèces des Bacteria (en réalité, la détection du peptidoglycane est celle de l’acide muramique, qui en est un constituant spécifique – voir tableau 11.3). Les cellules des Eukarya et des Archaea ne possèdent pas de peptidoglycane. Chez les eucaryotes, lorsque les parois existent, elles sont formées de cellulose ou de chitine (voir chapitre 14). Chez les Archaea, il existe des parois aux compositions chimiques variées, depuis celles constituées d’un analogue du peptidoglycane, le pseudopeptidoglycane, à celles faites de polysaccharides, de protéines ou de glycoprotéines (voir section 4.8). Ainsi, il existe une grande diversité dans la composition chimique des parois microbiennes, mais la présence ou l’absence de peptidoglycane est le critère le plus utile pour distinguer les Bacteria des Archaea.

Les lipides La composition chimique des membranes lipidiques est une caractéristique essentielle pour différencier les Archaea des Bacteria. Bacteria et Eukarya synthétisent des lipides membranaires formés d’un squelette d’acides gras lié à une molécule de glycérol par une liaison ester (voir figure 11.18). La nature des

Ester

CH2OH O Chaîne latérale d’acide gras

HC O C

Contrôlez vos acquis La vie sur Terre a évolué selon trois lignées majeures, les domaines, tous dérivant d’un ancêtre commun. Chaque domaine contient plusieurs phyla. Deux des domaines, Bacteria et Archaea, ont gardé une structure procaryote, tandis que le troisième, celui des Eukarya, a évolué pour donner la cellule moderne eucaryote. •

Pourquoi l’arbre universel correspond-il à l’idée d’une Terre primitive très chaude ?

•

Quelles preuves de l’endosymbiose (voir figure 11.9) figurent sur l’arbre universel ?

CH2 (CH2)13 CH3

CH2OH

Bacteria, Eukarya Ether

Chaîne latérale de phytanyle H

H

H

H

HC O C CH2 C

(CH2)3 C

(CH2)3 C

(CH2)3 C

CH2OH CH2OH

CH3

CH3

CH3

CH3

CH3

Archaea FIGURE 11.18 Lipides des Bacteria, Eukarya et Archaea. Chez les Bacteria et les Eukarya, les lipides contiennent des acides gras (ici l’acide palmitique) reliés au glycérol par des liaisons ester. Chez les Archaea, les chaînes latérales sont des hydrocarbures ramifiés (ici, un phytanyle en C20) reliés au glycérol par des liaisons éther. Le phytanyle est synthétisé à partir d’isoprène (figure 4.18c).



11.9 Les caractéristiques des domaines du vivant 319

L’ARN polymérase La transcription est effectuée chez tous les organismes par des ARN polymérases ADN dépendantes ; l’ADN est le modèle et l’ARN, le produit. Les cellules des Bacteria contiennent un seul type d’ARN polymérase, possédant une structure quaternaire assez simple. C’est l’ARN polymérase classique formée de quatre polypeptides, α, β, β’ et σ, combinés respectivement dans un rapport 2–1–1–1, dans la polymérase active (voir figure 11.19 et voir section 7.10). Les ARN polymérases des Archaea sont structurellement plus complexes que celles des Bacteria. Les ARN polymérases des Archaea contiennent huit polypeptides ou plus, ressemblant davantage au modèle des Eukarya (voir figure 11.19). Les principales ARN polymérases des eucaryotes (il y en a trois) contiennent de dix à douze polypeptides, et leur taille est proche de celles rencontrées chez les Archaea hyperthermophiles (voir figure 11.19). Ainsi, en terme de signature phylogénétique, la polymérase α2ββ’σ diagnostique les Bacteria ; les ARN polymérases comportant plus de quatre sousunités n’ont pas de signification phylogénétique particulière, si ce n’est qu’elles n’appartiennent pas aux Bacteria.

La synthèse des protéines En raison des différences dans les séquences d’ARNr et les facteurs impliqués dans la synthèse protéique, il n’est pas surprenant que certains aspects de la machinerie de synthèse des protéines diffèrent chez des représentants des trois domaines. Bien que les ribosomes des Archaea et des Bacteria aient la même taille (70S, les ribosomes cytoplasmiques des eucaryotes ayant une taille de 80S), plusieurs étapes de la synthèse protéique des Archaea ressemblent davantage à celles des Eukarya qu’à celles des Bacteria. Ainsi, la traduction commence toujours par un codon unique nommé codon start. Chez les Bacteria, ce codon start (AUG) déclenche l’incorporation d’un ARNt

Ec

Hs

Sa

Sc

β β′ σ

α

W. Zillig

acides gras peut varier énormément, mais la liaison ester au glycérol est caractéristique. Par contre, les lipides archéens contiennent des liaisons éther (voir figure 11.18). Dans les lipides à liaisons ester, les acides gras sont habituellement linéaires, tandis que chez les Archaea, des hydrocarbures ramifiés à longue chaîne, de type phytanyle ou biphytanyle, remplacent les acides gras et sont reliés au glycérol par des liaisons éther. Il existe peu d’exceptions à ce modèle phylogénétique. La bactérie thermophile sulfato-réductrice Thermodesulfobacterium (voir section 12.36) et quelques autres bactéries sulfatoréductrices (voir section 12.18), ainsi que des espèces de Propionibacterium, possèdent des lipides avec des liaisons éther. Par contre, l’inverse n’est pas vrai, et l’on ne connaît pas d’espèces d’Archaea possédant des liaisons ester. Concernant la structure globale de la membrane, les membranes de certaines Archaea, principalement chez les hyperthermophiles, forment une monocouche lipidique au lieu d’une bicouche (voir section 4.5 et figure 4.20). Il est vraisemblable qu’une monocouche est moins sensible qu’une bicouche à la dénaturation aux températures élevées auxquelles vivent ces micro-organismes. La liaison éther entre le glycérol et les chaînes latérales hydrophobes (voir figure 11.18), combinée avec la structure en monocouche des membranes, protège les membranes de ces Archaea hyperthermophiles des conditions rudes de leurs habitats.

FIGURE 11.19 ARN polymérases et phylogénie. ARN polymérases d’organismes représentatifs des trois domaines : Ec, Escherichia coli (Bacteria) ; Hs, Halobacterium salinarum (Euryarchaeota, Archaea) ; Sa, Sulfolobus acidocaldarius (Crenarchaeota, Archaea) ; Sc, Saccharomyces cerevisiae (Eukarya). Les composants purifiés des ADN polymérases ont été séparés par électrophorèse sur gel de polyacrylamide. Les plus grandes sous-unités polypeptidiques sont en haut et les plus petites en bas. Seuls les membres du domaine des Bacteria contiennent une ARN polymérase simple (4 polypeptides).

initiateur contenant une méthionine modifiée, la formyl-méthionine (voir section 7.16). Par contre, chez les eucaryotes et les Archaea, l’ARNt initiateur porte une méthionine non modifiée. L’exotoxine produite par Corynebacterium diphtheriae est un puissant inhibiteur de la synthèse protéique eucaryote, car il ajoute un ADP-ribose au facteur d’élongation nécessaire à la translocation du ribosome le long de l’ARNm, le facteur d’élongation modifié étant inactif (voir section 21.10). La toxine diphtérique inhibe aussi la synthèse protéique chez des espèces d’Archaea, mais pas chez les Bacteria. La plupart des antibiotiques qui affectent spécifiquement la synthèse des protéines chez les Bacteria n’affectent pas les synthèses protéiques des Archaea et des Eukarya. La sensibilité de représentants des trois domaines à plusieurs inhibiteurs de la synthèse des protéines est présentée dans le tableau 11.2 (voir aussi section 7.16). Dans ce tableau, de nombreux antibiotiques sont regroupés selon leur mode d’action dans l’arrêt de la synthèse protéique des organismes des trois domaines. Dans leur ensemble, ces résultats suggèrent que les protéines ribosomiques des cellules d’Archaea et d’Eukarya sont fonctionnellement plus semblables les unes aux autres qu’elles ne le sont aux protéines ribosomiques des Bacteria. Ceci est à nouveau en faveur de la position relative des trois domaines dans l’arbre universel du vivant (voir figure 11.16).



320 Chapitre 11

TABLEAU 11.2


SENSIBILITÉ DES REPRÉSENTANTS DES TROIS DOMAINES À DIVERS INHIBITEURS a DE LA SYNTHÈSE PROTÉIQUE

Archaea

Antibiotiques

Mode d’action

Bacteria

Eukarya

Sulfolobus acidocaldarius

Escherichia coli


Euryarchaeota

Crenarchaeota

Methanobacterium thermoautotrophicum

Acide fusidique, sparsomycine

Inhibition des étapes de l’élongation

+

–

+

+

Anisomycine, narciclasine

Inhibition transpeptidation

+

–

–

+

Cycloheximide

Bloque l’initiation

–

–

Erythromycine, streptomycine, chloramphenicol

Augmentation des fréquences d’erreurs et autres effets

–

Virginiamycine, pulvomycin

Inhibition des étapes de l’élongation

+

Néomycine, puromycine

Provoque une terminaison prématurée

Rifamycine

Inhibition de sous-unités d’ARN polymérase

a

–

+

+

–

–

+

–

+

+

+

+

–

–

+

–

+ indique que la synthèse protéique (et la croissance) est inhibée.

Autres caractéristiques Différents caractères phénotypiques, physiologiques ou autres peuvent être utilisés pour distinguer les organismes au niveau du domaine (voir tableau 11.3). Pour l’examen du tableau 11.3, il faut comprendre que toutes les caractéristiques ne sont pas universellement présentes dans un domaine donné. Par exemple, la photosynthèse chlorophyllienne est caractéristique de seulement quelques représentants des Bacteria et des Eukarya (et chez ces derniers, seulement grâce à des bactéries endosymbiotiques – voir figure 11.9). Par contre, d’autres caractéristiques, comme la présence de peptidoglycane dans la paroi des Bacteria, sont pratiquement universelles.

Contrôlez vos acquis Bien que les trois domaines du vivant aient été d’abord définis par les séquences d’ARNr, d’autres études ont ensuite montré qu’ils se différenciaient de différentes façons. En particulier, les Bacteria et les Archaea sont très différentes au niveau de la paroi et des lipides membranaires, ainsi qu’au niveau de la transcription et de la synthèse protéique. •

En quoi les lipides des Bacteria et des Eukarya sontils différents de ceux des Archaea ?

•

À quel domaine de procaryotes appartiennent les organismes dont les ARN polymérases ressemblent le plus à celles des Eukarya ? Quel argument phylogénétique renforce cette observation ?

IV

TAXINOMIE MICROBIENNE ET RELATIONS AVEC LA PHYLOGÉNIE

La classification des micro-organismes, ou taxinomie, est une discipline majeure en microbiologie. La taxinomie permet aux microbiologistes de différencier les micro-organismes et de développer des procédures systématiques pour leur nomenclature. Les concepts de base de la taxinomie bactérienne sont présentés dans les paragraphes suivants.

11.10 La taxinomie conventionnelle m n La taxinomie, ou science de la classification, comprend deux sous-disciplines majeures, l’identification et la nomenclature. Il est important de faire la distinction entre la taxinomie et la phylogénie, sujet principal de ce chapitre jusqu’ici, car il s’agit de notions bien différentes. La taxinomie bactérienne s’appuie classiquement sur des données phénotypiques concernant la morphologie de l’organisme, le métabolisme énergétique, les enzymes et d’autres propriétés. Bien que la phylogénie des procaryotes ait été établie sur la base d’analyses génotypiques, les analyses phénotypiques continuent à jouer un rôle important dans l’identification et la classification bactériennes. Ceci est particulièrement vrai dans les secteurs d’application où l’identification peut constituer une fin en soi, par exemple le diagnostic clinique. La classification bactérienne traditionnelle et les apports de la biologie moléculaire seront successivement présentés. En taxinomie bactérienne classique, plusieurs caractéristiques phénotypiques sont évaluées, et les données sont



11.10 La taxinomie conventionnelle 321

TABLEAU 11.3

RÉSUMÉ DES CARACTÉRISTIQUES MAJEURES DIFFÉRENCIANT BACTERIA, ARCHAEA ET EUKARYAa

Caractéristiques

Bacteria

Archaea

Eukarya

Structure cellulaire procaryotique

Oui

Oui

Non

ADN circulaire clos par liaisons covalentes

Oui

Oui

Non

Présence de protéines Histone

Non

Oui

Oui

Noyau entouré d’une membrane

Absent

Absent

Présent

Paroi cellulaire

Acide muramique présent Acide muramique absent

Acide muramique absent

Lipides membranaires

Liaisons ester

Liaisons ether

Liaisons ester

Ribosomes (masse)

70S

70S

80S

Initiateur ARNt

Formylméthionine

Méthionine

Méthionine

Introns fréquents

Non

Non

Oui

Opérons

Oui

Oui

Non

Coiffe et addition de poly-A à l’ARNm

Non

Non

Oui

Plasmides

Oui

Oui

Rare

Sensibilité du ribosome à la toxine diphtérique

Non

Oui

Oui

ARN polymérases (figure 11.19)

Une (4 sous-unités)

Plusieurs (8 à 12 sousunités chacune)

Trois (12 à 14 sousunités chacune)

Besoins en facteurs de transcription (section 7.11)

Non

Oui

Oui

Structure du promoteur (sections 7.10 et 7.11)

Séquences – 10 et – 35 (boîte de Pribnow)

Boîte TATA

Boîte TATA

Sensibilité au chloramphenicol, à la streptomycine, et la kanamycine

Oui

Non

Non

Non

Oui

Non

Oui

Oui

Non

Nitrification

Oui

Nonb

Non

Dénitrification

Oui

Oui

Non

Fixation de l’azote

Oui

Oui

Non

Photosynthèse (chlorophylle)

Oui

Non

Oui (chloroplastes)

Métabolisme énegétique utilisant la rhodopsine

Oui

Oui

Non

Chimiolithotrophie (Fe, S, H2)

Oui

Oui

Non

Vésicules de gaz

Oui

Oui

Non

Synthèse de granules de stockage du carbone (poly-β-hydroxyalcanoates)

Oui

Oui

Non

Croissance au-delà de 80 ˚C

Oui

Oui

Non

Croissance au-delà de 100 ˚C

Non

Oui

Non

Morphologie et génétique

Physiologie/ structures spéciales Méthanogenèse Réduction dissimilative de S˚ ou SO4 Fe3+ en Fe2+

2–

en H2S ou

a

Pour de nombreuses caractéristiques, seuls quelques repésentants du domaine possèdent la propriété. b Les études de génomique environnementale en milieu marin suggèrent fortement l’existence d’Archaea nitrifiantes (section 18.6).

employées pour regrouper hiérarchiquement les organismes, de l’espèce au domaine (voir tableaux 11.5 et 11.6). Les caractéristiques d’intérêt taxinomique les plus employées sont la morphologie, la nutrition et la physiologie, ainsi que l’habitat (voir tableau 11.4). Pour identifier un organisme, il est nécessaire de déterminer ses caractéristiques phénotypiques, des plus générales aux plus spécifiques, comme le montre l’exemple de la figure 11.20 (voir aussi tableau 11.5). À partir des données disponibles, la liste des organismes potentiels se réduit

progressivement jusqu’à l’identification définitive (voir figure 11.20).

Le pourcentages de GC Le pourcentage de G et C dans le génome d’un organisme apporte une information importante en taxinomie. Le pourcentage de G+C est en fait le pourcentage de guanine et de cytosine dans l’ADN d’un organisme. Ce pourcentage peut être déterminé de différentes manières, en mesurant la température de fusion de l’ADN (voir section 7.2) ou par chromatographie.



322 Chapitre 11

TABLEAU 11.4


QUELQUES CARACTÉRISTIQUES PHÉNOTYPIQUES D’IMPORTANCE TAXINOMIQUE

Principale catégorie

Caractères

I. Morphologie

Forme ; taille ; coloration de Gram ; présence et disposition des flagelles

II. Mobilité

Mobilité par flagelles ; mobilité glissante ; mobilité par vésicules de gaz ; non mobile

III. Nutrition et physiologie

Métabolisme énergétique (phototrophe, chimio-organotrophe, chimiolithotrophe) ; besoin en oxygène ; temperature ; pH ; besoins/tolérance en sels ; utilisation de diverses sources de carbone ; azote ; soufre ; besoins en facteurs de croissance

IV. Autres catégories

Pigments ; inclusions cellulaires ; couches de surface ; pathogénicité ; sensibilité aux antibiotiques

Les pourcentages de G+C sont très variables, allant chez les procaryotes de 20 % à presque 80 %, soit une gamme plus étendue que chez les eucaryotes (voir figure 11.21). Les compositions en bases de l’ADN ont été déterminées pour de nombreux organismes, et cette information peut être, selon les cas, utile d’un point de vue taxinomique. Par exemple, deux organismes avec des pourcentages de G+C identiques peuvent s’avérer totalement différents sur les plans taxinomique ou phylogénétique, car cela n’empêche pas qu’ils aient des séquences très dissemblables. Dans ce cas, des pourcentages de G+C identiques n’ont aucun intérêt taxinomique. Par contre, si deux organismes possèdent des pourcentages de G+C différents à plus de 5 %, c’est qu’ils possèdent peu de séquences d’ADN communes et ne sont vraisemblablement pas apparentés.

Culture pure

coloration de Gram/ morphologie

Facultatif

Fermente le lactose en acide et gaz

Réalisation d’une série de tests biochimiques

Réponse positive : indol, rouge de méthyle, mucate ; Réponse négative : citrate, VogesProskauer, H2S

II. Physiologie générale Bacille Gram négatif

La taxinomie bactérienne conventionnelle favorise l’analyse des caractéristiques phénotypiques d’un organisme. La détermination du pourcentage en G+C (guanine + cytosine) dans l’ADN d’un organisme peut faire partie de ces caractéristiques. •

Citez trois propriétés phénotypiques pouvant être utilisées pour différencier les bactéries.

•

Comment deux organismes ayant des pourcentages de G+C très proches peuvent-ils en fait avoir peu de gènes en commun ?

11.11 La chimiotaxinomie m n

I. Isolement et microscopie Isolement


La taxinomie moléculaire, ou chimiotaxinomie implique l’analyse moléculaire d’un ou plusieurs constituants de la cellule. En tête des méthodes les plus utilisées : l’hybridation des ADN génomiques, le ribotypage, le typage de séquences multigéniques (multilocus sequence typing, MLST) et le profil lipidique.

III. Physiologie de détail

Fermenteur facultatif du lactose

IV. Conclusion

Escherichia coli

FIGURE 11.20 Exemple de méthodes permettant l’identification d’une bactérie entérique nouvellement isolée. Cette procédure utilise des méthodes de microbiologie classiques (l’exemple montre celles employées pour identifier Escherichia coli). La plupart des analyses utilisées nécessitent que les organismes aient été obtenus en culture pure et que seuls des caractères phénotypiques soient employés pour l’identification. Une description des tests biochimiques est présentée au chapitre 24 (section 24.2, tableau 24.3 et figure 24.7).

Procaryotes Bacteria Archaea Eucaryotes Animaux Plantes Algues Champignons Protozoaires 0

10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 GC (mol %)

FIGURE 11.21 Composition de l’ADN génomique de nombreux organismes. Les Bacteria montrent la plus grande gamme de pourcentage des bases G + C.



11.11 La chimiotaxinomie 323

L’hybridation ADN-ADN Le pourcentage de G+C indique le pourcentage de chaque nucléotide dans l’ADN génomique d’une espèce donnée, mais ne donne absolument aucune information sur la séquence de ces nucléotides. Les séquences sont en fait importantes car si deux organismes possèdent beaucoup de séquences identiques dans leurs ADN, il est vraisemblable qu’ils contiennent de nombreux gènes très semblables, sinon identiques. Deux ADN doivent donc s’hybrider l’un avec l’autre en proportion des similitudes dans les séquences de leurs gènes. L’hybridation génomique mesure le degré de similitude de séquences de deux ADN et s’avère très utile pour différencier des organismes très proches, lorsque le séquençage de l’ARNr ne permet pas de conclure. La théorie et la méthodologie de l’hybridation des acides nucléiques sont présentées dans la section 7.7. Lors d’une expérience d’hybridation, l’ADN isolé d’un organisme est marqué par un radiotraceur comme 32P ou 3H, coupé en petits fragments, dénaturé par chauffage et mélangé avec de l’ADN en excès d’un autre organisme (voir figure 11.22). Le mélange d’ADN est alors refroidi pour lui permettre de se réhybrider, et l’ADN double brin est alors séparé de l’ADN restant non hybridé. Ensuite, la quantité de radioactivité dans l’ADN hybridé est mesurée et comparée avec le témoin dont la valeur est 100 % (voir figure 11.22). Outre la radioactivité, il existe plusieurs procédés de marquage non radioactifs de l’ADN qui, bien sûr, ne génèrent pas de déchets radioactifs. Il n’y a pas de règle fixée par convention indiquant quel taux d’hybridation entre deux ADN est nécessaire pour attribuer le même rang taxinomique à deux organismes. Cependant, des valeurs d’hybridation égales à 70 % ou davantage sont recommandées pour considérer que deux isolats appartiennent à la même espèce. Des valeurs d’au moins 25 % sont nécessaires pour affirmer que deux organismes doivent être placés dans le même genre (voir section 11.12 pour la définition du genre et de l’espèce chez les bactéries). L’hybridation des ADN d’organismes plus éloignés, par exemple Clostridium (Gram positif) et Salmonella (Gram négatif), donnera une valeur proche du bruit de fond, de 10 % ou moins (voir figure 11.22). L’hybridation ADN-ADN est une méthode sensible pour révéler des différences minimes entre les gènes de deux organismes et s’avère donc très utile pour différencier des organismes très proches. En fait, une application commune de l’hybridation génomique en taxinomie est de comparer deux organismes suspectés d’appartenir à des espèces différentes, même si les analyses des phénotypes et des ARNr ont indiqué entre eux des différences significatives. Lorsque les séquences des génomes entiers sont disponibles, les hybridations ne sont pas nécessaires. Lorsque le génome d’une bactérie est séquencé, il est possible de comparer l’ensemble de ses gènes avec ceux d’une autre bactérie (voir chapitre 15). Actuellement, avec seulement quelques centaines de génomes procaryotiques disponibles, de telles comparaisons ne sont pas possibles dans la plupart des cas. Dans le futur, les microbiologistes disposeront, avec la comparaison des génomes complets, de l’outil ultime. Cependant, avant que cela soit possible, l’hybridation demeurera très utile pour différencier des organismes taxinomiquement proches.

Organismes à comparer : Préparation de l’ADN P

Organisme 1 ADN

ADN Fractionner l’ADN

Fractionner et marquer ( P ) P

P

P

P

P

P

Chauffer P pour dénaturer (a)

Organisme 2

P

P

P

P

P

P

P P

Hybridation :

Mélanger l’ADN des deux organismes ; de l’ADN non marqué est ajouté en excès P

1x1

P

P

P

P

P

P P

ADN hybridé P

P

1x2

P

P

P

P P

ADN hybridé

P

ADN non hybridé

(b) Résultats et interprétation : Même genre, 1x1 Même mais espèce Genre 100 % espèce différente différent 100

75

50

25

Pourcentage d’hybridation (c)

0

1x2

25 %

Même 1 et 2 sont souche vraisemblablement (témoin) des genres différents

FIGURE 11.22 L’hybridation ADN-ADN comme outil taxinomique. (a) L’ADN est isolé des deux organismes étudiés. L’ADN d’un des organismes est marqué (ici par du 32P). (b) Les ADN des deux organismes sont dénaturés, mélangés et de l’ADN non marqué est ajouté en excès pour éviter à l’ADN marqué de s’hybrider avec lui-même. Après hybridation, l’ADN hybridé est séparé de l’ADN non hybridé, et la radioactivité est mesurée. (c) Résultats. La radioactivité mesurée dans le témoin (autohybridation de l’ADN de l’organisme 1) correspond à un pourcentage d’hybridation de 100 %.

Le ribotypage Le ribotypage est une technique d’identification bactérienne qui emploie certaines des méthodes présentées à propos des caractérisations phylogénétiques fondées sur l’ARNr (voir section 11.6). Cependant, contrairement aux méthodes de séquençage, le ribotypage ne nécessite pas de séquencer. Cette méthode mesure en fait le profil électrophorétique généré lorsque l’ADN d’un organisme est digéré par une enzyme de restriction et que les fragments obtenus sont séparés et scrutés avec une sonde d’ARN ribosomique (voir figure 11.23a).



324 Chapitre 11


Les différences dans les séquences d’ARNr de deux organismes se traduisent par la présence ou l’absence de sites de restrictions spécifiques (voir la section 7.7 à propos des enzymes de restriction), ce qui donne pour chaque espèce bactérienne un profil de restriction unique (voir figure 11.23a). En réalité, le ribotypage est si spécifique qu’il produit des « empreintes moléculaires », une série de bandes unique pouvant être pratiquement associée à chaque organisme. Le ribotypage commence par l’extraction d’ADN d’une colonie ou d’une culture en milieu liquide. Les gènes codant l’ARNr 16S sont amplifiés par PCR, digérés par une ou plusieurs enzymes de restriction, séparés par électrophorèse et sondés (voir chapitre 7). Le profil électrophorétique engendré est alors numérisé, et une comparaison informatique de ce profil avec ceux conservés dans une base de données est effectuée (voir figure 11.23a). Le ribotypage est une méthode rapide (pas de séquençage, alignement et comparaison des

Carl A. Batt

Lactococcus lactis Lactobacillus acidophilus Lactobacillus brevis Lactobacillus kefir

(a) Nouvel isolat ou échantillon clinique

Isolement de l’ADN

0,6

Distance

0,4

0,2

0

Souches 1-5 Nouvelle souche Souche 6 Souche 7

Amplification de 6-7 gènes cible par PCR

Comparaison avec d’autres souches de la même espèce

Séquençage

Détermination des allèles

(b) FIGURE 11.23 Ribotypage et multilocus sequence typing (MLST). (a) Ribotypes obtenus pour quatre bactéries lactiques différentes. Le profil des fragments d’ADN, générés suite à la digestion par les enzymes de restriction de l’ADN extrait de chaque bactérie et hybridé avec une sonde ciblé sur les gènes codant l’ARNr 16S, est unique à chaque espèce voire à chaque source d’une espèce. Les profils générés sur un gel pour des organismes connus sont numérisés et conservés dans une base de données en vue de comparaison pour l’identification d’un isolat clinique ou environnemental. Les variations observées dans la position et l’intensité des bandes sont importantes pour l’identification. (b) Les étapes du multilocus sequence typing (MLST).

séquences) et spécifique en identification bactérienne. Pour ces raisons, le ribotypage a trouvé de nombreuses applications en diagnostic clinique et pour l’analyse microbiologique des aliments, eaux et boissons.

Le typage de séquences multigéniques Une des limites du séquençage de l’ARNr et du ribotypage est que l’analyse porte sur un seul gène. Le typage de séquences multigéniques (multilocus sequence typing, MLST) règle le problème et s’avère une technique puissante pour la caractérisation de souches à l’intérieur d’une même espèce. Cette technique implique le séquençage de fragments de six ou sept « gènes de ménage » d’un organisme et leur comparaison avec le même ensemble de gènes provenant de différentes souches du même organisme. Les « gènes de ménage » codent des fonctions cellulaires essentielles et sont situés sur le chromosome plutôt que sur un plasmide (voir section 7.4). Pour chaque gène, un fragment d’environ 450 pb est amplifié par PCR et séquencé. Les données obtenues sont présentées sous forme de dendrogramme (voir figure 11.23b). Dans cette méthode, les souches avec des séquences identiques pour un gène donné sont dites posséder le même allèle de ce gène, et on leur attribue le même nombre pour ce gène. Un gène donné peut avoir plusieurs allèles différents, soit environ dix à trente allèles d’un gène donné pour un groupe de souches de la même espèce. En définitive, chaque souche se voit attribuer une série de chiffres – son type de séquences multigéniques – qui lui est caractéristique. La ressemblance entre chaque type de séquence est alors exprimée dans un dendrogramme où les distances varient de 0 (souches identiques) à 1 (souches seulement apparentées) [voir figure 11.23b]. Cette méthode a un pouvoir de résolution suffisant pour distinguer des souches même très proches, et constitue donc un outil supérieur au séquençage de l’ARNr pour différencier des organismes au-dessous du niveau de l’espèce. Avec une analyse portant sur sept gènes, et avec vingt allèles par gène, il a été calculé qu’il est possible de différencier par cette méthode plusieurs milliards de génotypes. Par contre, cette méthode n’a pas d’intérêt pour comparer des organismes d’un niveau supérieur à l’espèce, car sa résolution est trop sensible. À ce jour, cette méthode a eu surtout un impact en microbiologie clinique pour différencier les souches d’un pathogène particulier. Ceci est très important si l’on considère que, dans une espèce comme Escherichia coli, certaines souches telles que K-12 peuvent être inoffensives, alors que d’autres, comme la souche O157:H7, peuvent causer des infections sérieuses et même fatales (voir section 29.8). La méthode est aussi très utile en épidémiologie. Il est par exemple possible de tracer la souche virulente d’un pathogène bactérien qui se déplace à l’intérieur d’une population et d’identifier cette souche sans équivoque, même si d’autres souches voisines sont présentes dans la population. Cette technique étant fondée sur l’amplification par PCR, elle peut être employée pour tester les échantillons cliniques sans isoler l’organisme en culture pure, à condition que de l’ADN du pathogène puisse être obtenu de l’échantillon clinique considéré. Cette technique a aussi révélé quelques traits génétiques intéressants chez les bactéries. Par exemple, certains procaryotes sont essentiellement de type clonal, et il y a peu de variabilité détectable par cette méthode. C’est ainsi le cas de Staphylococcus



11.11 La chimiotaxinomie 325

Analyses des esters méthylés d’acides gras Une autre méthode d’identification bactérienne est basée sur la caractérisation des types et proportions d’acides gras présents dans les lipides de la membrane cytoplasmique et de la membrane externe (bactéries Gram négatif – voir section 4.9) des cellules. Cette technique, nommée FAME (pour fatty acid methyl ester, esters méthylés d’acides gras) est largement utilisée dans les laboratoires de microbiologie médicale, de santé publique ou de contrôle des eaux et des aliments, là où l’identification des pathogènes et autres bactéries dangereuses doit être faite en routine. La composition en acides gras des procaryotes peut être très variable et concerner la longueur des chaînes d’acides gras, la présence ou l’absence de doubles liaisons, de noyaux aromatiques, de chaînes ramifiées ou de groupements hydroxyles (voir figure 11.24). Un profil d’acides gras peut donc souvent identifier une espèce bactérienne particulière. Pour l’analyse, les acides gras sont extraits d’hydrolysats des cellules d’une culture en conditions standardisées et leurs esters méthylés sont préparés chimiquement. Ces nouveaux dérivés volatiles sont ensuite identifiés par chromatographie en phase gazeuse. Le chromatogramme montrant les quantités des divers acides gras contenus chez une bactérie inconnue est alors comparé à une base de données contenant les profils de milliers de souches de référence cultivées dans les mêmes conditions, en vue de l’identification (voir figure 11.24b). L’analyse des acides gras membranaires par cette méthode présente néanmoins quelques inconvénients. Il est en particulier nécessaire d’adopter une stricte standardisation, car les profils d’acides gras d’un organisme peuvent varier en fonction de la température, de la phase de croissance (exponentielle ou stationnaire) et, dans une moindre mesure, du milieu de culture. Ainsi, pour obtenir des résultats fiables, est-il nécessaire de cultiver un organisme inconnu sur un milieu spécifique à une température précise, afin de comparer son profil d’acides gras à ceux d’organismes cultivés dans les mêmes conditions et dont les caractéristiques sont archivées en bases de données. Ceci est bien sûr impossible pour de nombreux organismes, et les analyses de FAME sont limitées à ceux pouvant être cultivés dans ces conditions standard.

Contrôlez vos acquis La taxinomie moléculaire concerne l’analyse moléculaire de composés cellulaires spécifiques. Parmi les méthodes employées, l’hybridation ADN-ADN, le ribotypage, le typage de séquences multigéniques et l’analyse des acides gras.

Classes d’acides gras chez les Bacteria Classe / Exemple

Structure chimique O

I. Saturé : acide tétradécanoïque

HO

C (CH2)12 CH3 O

II. Insaturé : acide omega-7-cis hexadécanoïque III. Cyclopropane : acide cis 7,8 méthyl-hexadécanoïque

HO

H H

C (CH2)6 C C (CH2)6 CH3

C (CH2)7

H H C C C (CH2)5 CH3

O

H H CH3

O HO

IV. Ramifié : C (CH2)10 C CH3 acide HO H 13-méthyltétradécanoïque O

H

V. Hydroxylé : C CH2 C (CH2)10 CH3 acide HO OH 3-hydroxytétradecanoïque (a) IDENTIFICATION DE L’ORGANISME

Comparaisons des pics avec les bases de données

Culture bactérienne Extraction des acides gras

Pics des esters méthylés d’acides gras

Dérivation pour former des esters méthylés Chromatographie en phase gazeuse

Quantité

aureus. D’autres organismes, comme Neisseria meningititis, sont faiblement clonaux et montrent une grande variabilité. Ces résultats indiquent que, pour différentes raisons, des organismes comme N. meningititis ont subi dans le passé un flux génique latéral plus important que S. aureus. Ces différences reflètent sans aucun doute des variations dans l’écologie de ces organismes et des facteurs qui les ont rendus compétitifs. De telles informations peuvent être utiles pour mettre au point des stratégies pharmacologiques et des vaccins fondés sur la stabilité ou l’instabilité génétique d’un pathogène particulier.

(b) FIGURE 11.24 Analyse des acides gras méthylés (Fatty acid methyl ester, FAME) pour l’identification bactérienne. (a) Classes d’acides gras chez les Bacteria. Un seul exemple est donné pour chaque classe mais, en fait, plus de 200 différents acides gras ont été découverts chez les bactéries. Un ester méthylé contient un groupe méthyle (CH 3) à la place du proton sur le groupe carboxyle de l’acide gras. (b) Procédure. Chaque pic fourni par le chromatographe en phase gazeuse est dû à un acide gras méthylé particulier, et la hauteur du pic est proportionnelle à sa quantité.

•

Un pourcentage d’hybridation inférieur à 10 % entre les ADN de deux organismes indique qu’ils sont …

•

En quoi le ribotypage diffère-t-il du séquençage de l’ARNr 16S ? de la méthode MLST ?

•

Que signifie l’analyse des FAME ?




m n

11.12 Le concept d’espèce en microbiologie

Dans le monde des plantes et des animaux, une espèce est définie comme une population : 1) dont les membres peuvent naturellement se croiser et produire une descendance fertile et 2) qui est isolée d’autres espèces au niveau de la reproduction. Cependant, cette définition ne convient pas aux procaryotes. Le concept de production de descendance fertile n’a ici aucun sens. Néanmoins, les microbiologistes font traditionnellement référence à des « espèces » bactériennes et décrivent régulièrement de nouveaux genres et de nouvelles espèces. Qu’est ce qu’une espèce bactérienne ? Bien que le concept d’une espèce procaryotique ne soit pas figé, les microbiologistes utilisent le séquençage des petites sous-unités de l’ARNr, l’hybridation génomique et des critères phénotypiques (voir section 11.11) pour décrire des espèces de procaryotes.

L’espèce bactérienne et les taxons supérieurs Il a été proposé qu’un procaryote dont la séquence d’ARNr 16S diffère par plus de 3 % de celle de tout autre organisme (soit une similitude inférieure à 97 % avec toute séquence disponible en base de données) soit considéré comme une nouvelle espèce. Il ne s’agit pas d’un nombre arbitraire. Cette valeur découle de l’observation du fait que les ADN génomiques de deux procaryotes dont les séquences d’ARNr 16S ont moins de 97 % de similitude hybrident à moins de 70 %, valeur considérée comme minimale pour que deux organismes appartiennent à la même espèce (voir section 11.11 et figure 11.22). Ces relations sont présentées dans la figure 11.25. Les données de la figure 11.25 montrent également comment, dans certains cas, le séquençage de l’ARNr 16S ne permet pas de différencier deux organismes au niveau de l’espèce comme le fait l’hybridation ADN-ADN. Bien qu’un organisme dont la séquence d’ARNr 16S diffère de celle de tout autre organisme par plus de 3 % doive logiquement s’avérer être une nouvelle espèce à la suite de l’hybridation ADNADN, il apparaît dans certains cas que des organismes aux séquences d’ARNr 16S très proches (voire identiques) soient peu apparentés (voir figure 11.25). Aussi, même lorsque les séquences d’ARNr montrent des similitudes supérieures à 97 %, l’hybridation ADN-ADN demeure un outil important pour l’identification au niveau spécifique. Une nouvelle espèce est habituellement définie à partir de la caractérisation de plusieurs souches. Le concept d’espèce en microbiologie est important car il donne aux souches obtenues une identité taxinomique formelle. Les groupes d’espèces sont regroupés en genres. La définition d’un genre, au niveau moléculaire, est plus une question d’appréciation que la définition d’une espèce. Néanmoins, plus de 5 % de différences entre deux séquences d’ARNr (ou moins de 95 % de similitude) permettent de constituer un nouveau genre. Les genres sont ensuite rassemblés en familles, les familles en ordres, les ordres en classes, et ainsi de suite jusqu’au niveau taxinomique le plus élevé, le domaine (voir tableaux 11.4 et 11.5). En 2004, presque 6 500 espèces de Bacteria et d’Archaea ont ainsi été formellement reconnues (voir tableau 11.5).

Similitude ARNr 16S (%)

326 Chapitre 11

100 98 96

94 92 90 88

0

20

40

60

80

100

Similitude ADN : ADN (%)

FIGURE 11.25 Relations entre similitudes des séquences d’ARNr 16S et hybridations ADN-ADN pour différents organismes. Ces données proviennent de plusieurs analyses indépendantes pour de nombreuses espèces du domaine des Bacteria. Les points dans le rectangle orange correspondent aux combinaisons pour lesquelles les similitudes entre ARNr 16S et ADN génomique sont très élevées ; ainsi, dans chaque cas, les deux organismes étudiés appartiennent clairement à la même espèce. Les points du rectangle vert correspondent aux combinaisons pour lesquelles différentes espèces sont détectées, et ceci est montré par les deux méthodes. Le rectangle bleu montre des exemples considérés comme des espèces différentes d’après l’hybridation ADN-ADN, mais pas d’après la comparaison des ARNr 16S. Notez que pour plus de 70 % de similitude dans l’hybridation ADN-ADN, aucune similitude entre ARNr 16S n’est inférieure à 97 %.

Lors de l’identification et de la dénomination d’un organisme nouvellement isolé, il est essentiel que celui-ci satisfasse tous les critères taxinomiques des niveaux supérieurs à celui de l’espèce. Un exemple de hiérarchie taxinomique est donné dans le tableau 11.4 pour la bactérie phototrophe Allochromatium warmingii. Toutes les espèces du genre Allochromatium doivent être des Bacteria, pourpres sulfureuses, Gram négatif, en forme de bâtonnet. Si l’un de ces critères n’est pas rempli, l’organisme ne peut être considéré comme une espèce du genre Allochromatium. De plus, le genre Allochromatium doit satisfaire à tous les critères de la famille des Chromatiaceae, et ainsi de suite jusqu’au sommet de l’échelle taxinomique. En d’autres termes, lorsque l’on descend la hiérarchie taxinomique du domaine à l’espèce, les critères utilisés pour distinguer deux organismes deviennent moins généraux et plus spécifiques (voir tableau 11.4).

La spéciation bactérienne Comment naît une nouvelle espèce bactérienne ? Ce point est toujours fréquemment débattu par les microbiologistes. Néanmoins, plusieurs modèles de spéciation bactérienne ont été proposés. L’un des plus courants suppose une population de cellules, provenant de la croissance d’une cellule unique et qui occupe une niche écologique particulière. Si les cellules de cette population partagent une ressource caractéristique (par exemple un nutriment essentiel), cette population cellulaire constitue un écotype. Différents écotypes peuvent coexister au sein d’un habitat, mais chacun y prospère seulement à l’intérieur de sa niche. Des erreurs dans la réplication de l’ADN (mutations) se produisent avec une fréquence faible mais régulière (voir section 10.3). Dans un écotype donné, une mutation conférant une meilleure



11.12 Le concept d’espèce en microbiologie 327

Division taxinomique

HIÉRARCHIE TAXINOMIQUE POUR LA BACTÉRIE POURPRE SULFUREUSE ALLOCHROMATIUM WARMINGII Nom

Propriété

Confirmé par

Domaine

Bacteria

Cellules procayotes ; séquences d’ARNr typiques des Bacteria

Microscopie ; séquençage ARNr 16S ; présence de biomarqueurs uniques, par exemple le peptidoglycane

Phylum

Proteobacteria

Séquences d’ARNr typiques des Proteobacteria

Séquençage d’ARNr 16S

Classe

Gammaproteobacteria

Bactéries Gram négatif ; séquences d’ARNr typiques des Gammaproteobacteria

Coloration de Gram, microscopie

Ordre

Chromatiales

Bactéries pourpres phototrophes

Caractérisation des pigments (figure 17.3)

Famille

Chromatiaceae

Bactéries pourpres sulfureuses

Capacité à oxyder H2S et stocker S˚ dans les cellules Observation microscopique pour la présence de S˚ (voir photo)

Genre

Allochromatium

Bactéries en batonnets poupres sulfureuses

Microscopie (voir photo)

Espèce

warmingii

Cellules 3,5 à 4 µm × 5 à 11 µm Soufre localisé surtout aux pôles des cellules (voir photo)

Mesure des cellules au microscope à l’aide d’un micromètre ; notez la position des globules de soufre dans les cellules (voir photo)

adaptation (mutation adaptative) déclenche une sélection périodique. Quand ceci se produit, l’ancien écotype est chassé par une population du nouvel écotype (voir figure 11.26). De cette façon, les populations cellulaires « s’éloignent » les unes des autres d’un point de vue génétique. Plusieurs séries de mutations et sélections répétées conduisent en fait à un écotype suffisamment distinct génétiquement de l’écotype original pour pouvoir être reconnu comme une nouvelle espèce (voir figure 11.26). Cette série d’événements à l’intérieur d’un écotype n’a aucun effet sur les autres écotypes, car différents écotypes ne sont pas en compétition pour la même ressource (voir figure 11.26). Le modèle de spéciation de la figure 11.26 est établi uniquement sur l’hypothèse d’un flux de gènes vertical (des « parents » aux « descendants »). Cependant, la spéciation bactérienne dépend aussi partiellement de transferts latéraux (horizontaux) de gènes. Ce type de transfert interspécifique se produit par conjugaison, transduction et transformation (voir chapitre 10). Les procaryotes sont sexuellement permissifs et peuvent échanger des gènes entre lignées phylogénétiques différentes. Ainsi, une nouvelle potentialité génétique d’un écotype peut provenir de gènes venant d’un autre écotype aussi bien que des mutations et sélections. L’étendue des flux génétiques horizontaux est variable. Le séquençage des génomes a révélé des exemples de transferts

Globules (S0) de soufre

Norbert Pfennig

TABLEAU 11.5

Photo de cellules de Allochromatium warmingii

horizontaux tantôt exubérants, tantôt rares (voir section 15.8). De plus, le séquençage multigénique (voir section 11.11) a montré que les échanges génétiques sont répandus pour certaines espèces, et sont pratiquement inexistants chez d’autres. En dépit de l’impact des transferts génétiques latéraux, la spéciation résulte cependant vraisemblablement davantage de la succession des mutations et sélections. En effet, les gènes issus de transferts latéraux sont relativement peu nombreux, confèrent des avantages seulement temporaires et peuvent souvent être perdus si la pression de sélection permettant de les retenir diminue.

Combien d’espèces de procaryotes ? Le monde microbien d’aujourd’hui est le résultat de presque quatre milliards d’années d’évolution bactérienne (voir figures 11.8 et 11.10). Les taxinomistes admettent qu’il n’est pas possible de donner actuellement le nombre des espèces de procaryotes, mais qu’il est certainement très élevé. Plusieurs milliers d’espèces de procaryotes sont déjà connues (voir tableau 11.6) et on suppose qu’il en existe plusieurs milliers, peut-être même cent mille à un million (ou dix fois plus selon certaines estimations) à découvrir, soit un nombre énorme. L’analyse des communautés microbiennes (voir sections 11.7 et 18.5) indique que la possibilité de cultiver des procaryotes de



328 Chapitre 11

Évolution et systématique microbienne Un habitat microbien

Ecotype II

Ecotype III

Cellule portant une mutation adaptative

Ecotype I

Sélection périodique


Le mutant adapté survit ; les cellules sauvages originales de l’écotype I sont éliminées

Le concept d’espèce s’applique aux procaryotes et aux eucaryotes, et il existe dans les deux cas une hiérarchie taxinomique, le domaine étant le niveau le plus élevé. La spéciation bactérienne peut résulter de sélections répétées en faveur d’une caractéristique favorable dans un écotype, ainsi que de transferts génétiques latéraux.

Population de l’écotype I mutant

Le processus se répète de nombreuses fois

Nouvelle espèce de l’écotype I FIGURE 11.26 Modèle de spéciation bactérienne. Plusieurs écotypes peuvent coexister dans un habitat microbien particulier, chacun occupant sa propre niche écologique. Lorsqu’une mutation bénéfique intervient chez un écotype, la cellule portant cette mutation peut éventuellement former une population remplaçant l’écotype original. Si ceci se répète dans un écotype donné, une population de cellules génétiquement distincte se met en place, correspondant à une nouvelle espèce. Les autres écotypes n’étant pas en compétition pour la même ressource, ils ne sont pas affectés par ces événements.

TABLEAU 11.6

RANGS TAXINOMIQUES ET NOMBRES D’ESPÈCES CONNUES a DE PROCARYOTES

Rang

Bacteria

Archaea

Total

Domaines

1

1

2

Phyla

25

4a

29

Classes

34

9

43

Ordres

78

13

91

Familles

230

23

243

Genres

1 227

79

1 306

Espèces

6 740

289

7 029

a

l’environnement est seulement effleurée. En utilisant des outils moléculaires et des techniques de culture plus performants, il n’est pas impossible que le grand nombre proposé à ce jour d’espèces de procaryotes restant à décrire apparaisse en fait sous-estimé. En fait, la technologie actuellement disponible ne permet absolument pas d’estimer le nombre d’espèces de procaryotes. Mais cela peut changer, et il reste énormément de découvertes à réaliser en ce qui concerne leur diversité.

Les nombres représentent les noms de genres et d’espèces validées chez les Bacteria et les Archaea en 2005. Chez les Archaea, les phyla comprennent les Korarchaeota et les Nanoarchaeota, phyla non encore reconnus officiellement. Source : Garrity, G.M., Libum, T.G., and Bell, J.A. 2005. Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology, 2d ed., Vol. 2, part A, pp159–220. SpringerVerlag, New York.

•

Un genre donné comprend plusieurs ____, un ____ comprend plusieurs genres.

•

Qu’est-ce qu’un écotype ?

•

Combien d’espèces de procaryotes connaît-on ? Combien en existe-t-il vraisemblablement ?

11.13 La nomenclature – le Bergey’s m n Manual Selon les règles de la nomenclature binomiale utilisée en biologie, chaque procaryote se voit attribuer un nom de genre et un nom d’espèce. Les termes employés sont en latin ou en grec latinisé et décrivent des propriétés de l’organisme. Noms de genre et d’espèce sont écrits en italique. On connaît par exemple plus de 100 espèces du genre Bacillus, et particulièrement Bacillus (B.) subtilis, B. megaterium, B. cereus. Ces noms d’espèces signifient respectivement « mince », « très grand » et « cireux », rappelant ainsi des caractéristiques morphologiques, physiologiques ou écologiques de chaque organisme. La nomenclature des procaryotes, Bacteria comme Archaea, suit les règles d’un code particulier, The International Code of Nomenclature of Bacteria. Ce code donne le cadre formel de nomenclature officielle des procaryotes et les procédures permettant de modifier les noms, par exemple en fonction de nouvelles données taxinomiques. Il existe même des règles pour rejeter des noms si des erreurs ont été commises dans la procédure originale de nomenclature, ou si un nom n’est plus validé. Le code donne les règles pour nommer toutes les espèces, genres, familles et ordres de procaryotes.

Les collections de souches types et la publications de nouveaux taxons Lorsqu’un nouvel organisme est isolé, et supposé nouveau, il s’agit de décider s’il convient de le décrire en tant que nouvelle espèce, ou éventuellement en tant que nouveau genre (ce qui revient à décrire aussi une nouvelle espèce). Pour ce faire, une



description détaillée de l’organisme doit être publiée, et une culture de l’organisme doit être déposée dans deux collections de référence. Parmi celles-ci, l’ATCC (American Type Culture Collection, Manassas, Virginie, États-Unis), la DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen, Braunschweig, Allemagne) ou la CIP (Collection de l’Institut Pasteur, Paris, France) [voir section 30.1]. La souche déposée devient la souche type de la nouvelle espèce et la référence à laquelle les nouvelles souches voisines doivent être comparées. Les collections de référence conservent la culture en dépôt par congélation à basse température (–80 à –196 ˚C), ou par lyophilisation. Cette pratique est différente des approches botanique ou zoologique. Ces dernières conservent des spécimens morts (séchés pour les végétaux, conservés chimiquement pour les animaux), qui servent de référence pour la description éventuelle de nouvelles espèces. Au contraire, les microbiologistes s’appuient toujours sur des souches type vivantes, qui peuvent être distribuées à la communauté scientifique, cultivées dans différents laboratoires, étudiées et comparées. Cette approche permet des comparaisons détaillées et reproductibles des propriétés des organismes, particulièrement au niveau moléculaire. Si la description d’un nouvel organisme est publiée dans un journal autre que l’International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology (IJSEM), la publication officielle pour l’enregistrement et la classification des procaryotes, une copie de l’article publié dans un autre journal doit être soumise à l’IJSEM et le nom validé avant que le nouveau taxon de procaryote ne soit formellement accepté. Dans chaque numéro de l’IJSEM, une liste officielle des nouvelles espèces est publiée et constitue la référence en taxinomie des procaryotes. Un site Internet dédié aux nouvelles espèces et à la nomenclature officielle des procaryotes est disponible à l’adresse http://www.bacterio.cict.fr.

Deux ouvrages majeurs : Bergey’s Manual et The Prokaryotes En validant la nomenclature de nouvelles espèces, l’IJSEM prépare leur intégration dans le Bergeys’s Manual of Sytematic Bacteriology (voir figure 11.27). Mondialement utilisé, le Bergey’s Manual est au service des microbiologistes depuis 1923 et constitue un précis majeur de taxinomie des procaryotes. Chaque chapitre, écrit par un spécialiste, contient des tableaux, figures et autres informations systématiques utiles à l’identification. Le volume I de la seconde édition a été publié en 2001 ; le volume II en 2005, et trois nouveaux volumes paraîtront en 2007. La deuxième édition a tenu compte de nouveaux concepts introduits par le séquençage de l’ARNr et des études génomiques et les a combinés avec les données phénotypiques. Un deuxième ouvrage de référence à propos de la diversité des procaryotes est The Prokaryotes. Cet ouvrage de plus de 4 100 pages (quatre volumes) pour sa seconde édition de 1992, est désormais disponible en ligne pour sa troisième édition

Cheryl L. Broadie

11.13 La nomenclature – le 329

FIGURE 11.27 Le Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology, 2e édition. Cet ouvrage en cinq volumes décrit les propriétés majeures de tous les procaryotes connus, Bacteria et Archaea.

(http://141.150.157.117:8080/prokPUB/index.htm). La version électronique comprend de fréquentes mises à jour, ce qui montre la rapidité avec laquelle de nouvelles données sur la phylogénie et la taxinomie des procaryotes sont publiées. Ces deux ouvrages fournissent aux microbiologistes à la fois les bases et les détails de la taxinomie et de la phylogénie des procaryotes, et constituent la référence de base pour les microbiologistes caractérisant de nouvelles espèces. De nombreux procaryotes ne peuvent actuellement être cultivés au laboratoire. Il ne s’agit probablement pas d’organismes incultivables, mais d’organismes trop mal connus pour pouvoir être cultivés. Lorsqu’ils seront finalement cultivés, caractérisés et nommés, les ouvrages de référence précités devront être notablement augmentés pour inclure un nombre considérable de nouvelles espèces.

Contrôlez vos acquis Les procaryotes reçoivent des noms de genre et d’espèce descriptifs. La reconnaissance formelle d’une nouvelle espèce procaryotique nécessite le dépôt d’une culture de l’organisme dans une collection de référence et la publication officielle du nom et de la description de la nouvelle espèce. Le Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology est le principal ouvrage consacré à la compilation des taxons bactériens. •

Qu’est l’IJSEM et quel rôle joue-t-il en taxinomie ?

•

Pourquoi les cultures cellulaires sont-elles plus utiles en taxinomie que les spécimens conservés « non vivants » ?



330 Chapitre 11


QUESTIONS 1. Quel est l’âge de la Terre ? Quel est l’âge des plus anciens microfossiles connus (voir section 11.1) ? 2. Quelles caractéristiques principales devaient avoir les organismes primitifs pour pouvoir se répliquer, et pourquoi (voir section 11.27) ? 3. Quelles propriétés de l’ARN ont pu rendre possible une vie fondée sur l’ARN ? Si des formes de vie à ARN ont existé, quels pourraient être leurs vestiges de nos jours (voir section 12.2) ? 4. Quels rôles le fer ferreux, FeS et H2 ont-ils vraisemblablement joué dans les premiers processus du vivant (voir section 11.3) ? 5. Pourquoi l’évolution des cyanobactéries a-t-elle eu autant d’importance pour la suite de la vie terrestre. Quelle donnée géologique est utilisée pour dater leur évolution (voir section 11.3) ? 6. Quelle est la preuve que l’enbosymbiose est à l’origine des cellules eucaryotes modernes contenant des organelles (voir section 11.4) ? 7. Pourquoi les ARN ribosomiques sont-ils de meilleures molécules que des protéines comme les cytochromes pour les études phylogénétiques (voir section 11.5) ? 8. Décrivez les méthodes permettant d’obtenir les séquences d’ARNr 16S. Quel est le rôle de la PCR en phylogénie (voir section 11.6) ? 9. Que sont les séquences signature ? Quelle est leur valeur phylogénétique ? Comment sont-elles distinguées (voir section 11.7) ? 10. Qu’est-ce que la technologie FISH ? Donnez un exemple d’utilisation (voir section 11.7).

11. Quelles sont les données majeures en évolution issues de l’étude des séquences d’ARNr ? Comment cela a-t-il modifié la vision classique de l’évolution ? Comment cette découverte a-t-elle conforté les hypothèses sur l’origine des eucaryotes (voir section 11.8) ? 12. Quelles propriétés physiologiques et biochimiques importantes sont présentes chez les Archaea et les Eukarya ? chez les Archaea et les Bacteria (voir section 11.9) ? 13. Quelles sont les caractéristiques phénotypiques principalement employées pour regrouper les organismes en taxinomie bactérienne classique ? Certaines d’entre elles ont-elles une valeur phylogénétique (voir section 11.10) ? 14. Pourquoi les pourcentages de G+C ne sont-ils pas utiles en phylogénie et en taxinomie ? Dans quels cas ce rapport a-t-il une signification taxinomique (voir section 11.10) ? 15. En quoi le ribotypage est-il différent du séquençage, en tant qu’outil taxinomique (voir section 11.11) ? 16. Que mesure-t-on dans les analyses de FAME (voir section 11.11) ? 17. Comment pense-t-on qu’une nouvelle espèce bactérienne apparaît ? Combien y a-t-il d’espèces bactériennes ? Pourquoi ce nombre n’est-il pas connu avec plus de précision (voir section 11.12) ? 18. Dans Pseudomona aeruginosa, quel est le nom d’espèce ? Quel est le niveau taxinomique de l’autre nom ? Selon la hiérarchie taxinomique, lequel de ces deux noms doit être associé à d’autres noms de niveau inférieur (voir section 11.13) ?

PROBLÈMES 1. Comparez et distinguez les conditions physico-chimiques sur Terre à l’origine de la vie et actuellement. Expliquez pourquoi, d’un point de vue physiologique, les animaux ne pouvaient pas exister sur la Terre primitive. 2. Pourquoi est-il fortement improbable que la vie émerge de nos jours comme elle le fit il y a des milliards d’années ? 3. Imaginez un débat avec un opposant à la théorie de l’endosymbiose. Donnez cinq arguments que vous pourriez utiliser pour convaincre votre interlocuteur que l’endosymbiose s’est bien produite. 4. Sur la base des séquences suivantes, calculez une distance évolutive entre ces trois organismes et indiquez les deux organismes les plus proches. Organisme 1 : AGGUACGUUA Organisme 2 : UGCCACGGUU Organisme 3 : AGGUACGGUA Dessinez un arbre phylogénétique montrant les distances évolutives approximatives entre ces trois organismes. 5. Imaginez que vous effectuez l’analyse des lipides de deux procaryotes, comme cela a été présenté dans la figure 11.24. Pour l’organisme A, vous trouvez une concentration importante

d’acides gras insaturés à courte chaîne. Pour l’organisme B, vous détectez des phytanyles possédant des liaisons éther. À partir de ces informations, à quels domaines phylogénétiques appartiennent ces deux organismes ? Les deux étant par ailleurs extrémophiles (voir section 2.4) et provenant, l’un d’une source chaude et l’autre de glace de mer, qui sont-ils ? Enfin, en fonction des analyses de lipides et de la localisation des lipides dans la cellule (voir section 3.4 et figure 3.3), expliquez pourquoi les composés que vous avez détectés permettent à ces organismes de vivre dans ces environnements extrêmes. 6. Déterminez le rapport G+C des deux séquences d’ADN suivantes : TAAGCCTGCAAGCTTAGCTA ATTCGGACGTTCGAATCGAT 7. Dans quels documents de référence doit-on vérifier une information sur la taxinomie et la phylogénie des procaryotes ? Une information sur l’enrichissement, l’isolement et la culture ? Si votre bibliothèque possède ces ouvrages, comparez leurs tables des matières et indiquez lequel est le plus spécialisé sur la classification et la nomenclature.



I

Phylogénie des Bacteria

333

12.1

Vue d’ensemble

333

II

Phylum 1 : les Protéobactéries

334

12.2 12.3 12.4 12.5 12.6 12.7 12.8 12.9 12.10

Bactéries pourpres phototrophes Bactéries nitrifiantes Bactéries sulfo-oxydantes et ferro-oxydantes Bactéries hydrogéno-oxydantes Méthanotrophes et méthylotrophes Pseudomonas et pseudomonades Bactéries acétiques Bactéries aérobies, libres, fixatrices d’azote Neisseria, Chromobacterium et genres apparentés Entérobactéries Vibrio et Photobacterium Rickettsiales Spirilles Protéobactéries gainées : Sphaerotilus et Leptothrix Bactéries bourgeonnantes, à prosthèques, et pédonculées Myxobactéries à mobilité glissante Protéobactéries sulfato- et sulfo-réductrices

334 337 339 342 344 348 351 352

12.11 12.12 12.13 12.14 12.15 12.16

Les espèces du domaine des Bacteria montrent une très grande diversité morphologique, physiologique et phylogénétique. Les fructifications de la myxobactérie Chondromyces crocatus, visibles sur la photo, contiennent des myxospores, produits au cours d’un cycle cellulaire assez complexe. Les myxospores peuvent germer et former une nouvelle population de cellules.

12.17 12.18

III

354 354 359 361 363 366 368 372 376

Phyla 2 et 3 : les bactéries Gram positif et les actinobactéries 378

12.19 Bactéries Gram positif, non sporulées, à faible % G+C : bactéries lactiques et apparentées 12.20 Bactéries Gram positif, sporulées, à faible % G+C : Bacillus, Clostridium et bactéries apparentées 12.21 Bactéries sans paroi cellulaire, apparentées aux bactéries Gram positif, à faible % G+C : mycoplasmes 12.22 Bactéries (actinobactéries) Gram positif, à fort % G+C : bactéries corynéformes et propioniques 12.23 Autres actinobactéries : Mycobacterium sp. 12.24 Actinobactéries filamenteuses : Streptomyces et autres actinomycètes

IV

CHAPITRE DOUZE

Diversité des procaryotes : les Bacteria

Phylum 4 : les cyanobactéries et les prochlorophytes

12.25 Cyanobactéries 12.26 « Prochlorophytes » et chloroplastes

378 384 389 391 393 395

400 400 403



V

Phylum 5 : Chlamydia

12.27 Chlamydia

VI

Phylum 6 : Planctomyces / Pirellula

405

XI

405

12.33 Spirochètes

413

XII

417

407

12.28 Planctomyces : une bactérie pédonculée phylogénétiquement distincte

407

VII

Phylum 7 : Verrucomicrobia

408

12.29 Verrucomicrobium et Prosthecobacter

408

VIII

Phylum 8 : les flavobactéries

409

X

409

Phylum 9 : le groupe des Cytophaga

12.31 Cytophaga et apparentés

Phylum 10 : les bactéries vertes sulfureuses

12.32 Chlorobium et autres bactéries vertes sulfureuses

Phylum 12 : Deinococci

12.34 Deinococcus / Thermus

12.30 Bacteroides et Flavobacterium

IX

Phylum 11 : spirochètes

410 410

411

XIII

Phylum 13 : les bactéries vertes non sulfureuses

12.35 Chloroflexus et genres apparentés

XIV Phyla 14 et 16 12.36 Thermotoga et Thermodesulfobacterium 12.37 Aquifex, Thermocrinis et genres apparentés

XV

Phyla 17 et 18 : Nitrospira et Deferribacter

12.38 Nitrospira, Deferribacter et genres apparentés

413

417

417 418

420 420 421

422 422

411

GLOSSAIRE Acido-alcoolo-résistance (acid-fastness) Propriété des espèces de Mycobacterium pour lesquelles les cellules colorées à la fuschine ne se décolorent pas facilement à l’alcool-acide. Bactérie entérique (enteric bacteria) Vaste groupe de bactéries Gram négatif en forme de bâtonnets caractérisées par un métabolisme aérobie facultatif. Bactérie nitrifiante (nitrifying bacteria) Chimiolithotrophe capable de convertir l’ammoniaque en nitrate et le nitrite en nitrate. Bactérie pourpre non sulfureuse (purple nonsulfur bacteria) Procaryote phototrophe contenant des bactériophylles a ou b, qui se développe en photohétérotrophie et qui présente une tolérance relativement faible à H2S. Bactérie pourpre sulfureuse (purple sulfur bacteria) Procaryote phototrophe contenant des bactériophylles a ou b, caractérisé par son aptitude à oxyder H2S et à stocker le soufre élémentaire à l’intérieur des cellules (ou à l’extérieur des cellules pour les genres Ectothiorhodospira et Halorhodospira). Bactéries sulfato-réductrices (sulfate-reducing bacteria) Vaste groupe de bactéries anaérobies présentant un métabolisme de respiration anaérobie avec réduction de SO42– et production de H2S. Bactéries vertes sulfureuses (green sulfur bacteria) Phototrophes anoxygéniques contenant des chlorosomes et des bactériophylles c, cs, d, ou e pour capter les photons. Carboxysome (carboxysome) Inclusion cellulaire polyédrique contenant la ribulose biphosphate carboxylase (RubisCO), enzyme clé du cycle de Calvin. Chimiolithotrophe (chemolithotroph) Voir chapitre 2. Chlorosome (chlorosome) Structure ellipsoïdale entourée d’une membrane monolipidique et contenant les bactériochlorophylles (c, d, ou e) responsables de la capture des photons chez les bactéries vertes et chez Chloroflexus. Consortium (consortium) Association physique de deux (ou plus) procaryotes qui vivent en symbiose. Cyanobactérie (cyanobacteria) Procaryote phototrophe oxygénique contenant de la chlorophylle a et des phycobilines mais pas de chlorophylle b.

Héliobactérie (heliobacterium) Phototrophes anoxygéniques contenant la bactériophylle g. Hétérocyste (heterocyst) Cellule différenciée de cyanobactérie qui permet la fixation de l’azote moléculaire mais pas la photosynthèse oxygénique. Hétérofermentatif (heterofermentative) En référence aux bactéries lactiques capables de produire plus d’un produit de fermentation. Homofermentatif (homofermentative) En référence aux bactéries lactiques produisant uniquement de l’acide lactique comme produit de fermentation. Hyperthermophile (hypertermophile) Organisme dont la température optimale de croissance est supérieure à 80 °C. Méthanotrophe (methanotroph) Organisme capable d’oxyder le méthane (CH4) pour son métabolisme énergétique. Méthylotrophe (methylotroph) Organisme capable d’oxyder des composés organiques monocarbonés ; est également méthanotrophe s’il est capable d’oxyder CH4. Mixotrophe (mixotroph) Organisme qui récupère l’énergie de composés inorganiques mais qui requiert des composés organiques comme source de carbone. Prochlorophyte (prochlorophyte) Procaryote phototrophe oxygénique contenant les chlorophylles a et b mais pas de phycobiline. Prosthèque (prosthecae) Extrusion du cytoplasme, formant généralement un appendice distinct entouré d’une enveloppe cellulaire. Protéobactérie (proteobacteria) Lignée majeure du domaine Bacteria qui contient un grand nombre de bacilles et coques Gram négatif. Réaction de Stickland (Stickland reaction) Fermentation de deux acides aminés, l’un servant de donneur d’électrons et l’autre d’accepteur d’électrons. Spirochète (spirochete) Procaryote Gram négatif dont la cellule est fine, en forme de spirale flexible, mobile grâce à des endoflagelles.



12.1 Vue d’ensemble 333

I

PHYLOGÉNIE DES BACTERIA

Dans le chapitre 11, nous avons abordé les notions d’évolution microbienne. Nous allons détailler les propriétés des principaux groupes microbiens, en nous concentrant sur les bactéries dans ce chapitre, puis sur les Archaea et les eucaryotes dans les deux chapitres suivants. Sur la base d’un arbre phylogénétique, nous décrirons les espèces les mieux connues, en particulier celles pour lesquelles nous disposons de plus de données phénotypiques – ce qui ne représente qu’une fraction des quelque 7 000 espèces connues de procaryotes. Pour plus de détail, le lecteur consultera le Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology et la section 11.13.

12.1 Vue d’ensemble m n Dix-huit phyla sont définis à partir des études de souches cultivées en laboratoire, d’autres ayant été définis à partir des séquences de gènes ribosomiques issus d’écosystèmes naturels. La figure 12.1 donne un aperçu de la phylogénie des Bacteria. Le phylum le plus ancien d’un point de vue phylogénétique contient les genres Aquifex et apparentés, tous hyperthermophiles, chimiolithotrophes et utilisant H2 comme

donneur d’électrons. D’autres phyla plus « récents » comme les Thermodesulfobacterium, Thermotoga et les bactéries vertes non sulfureuses (groupe des Chloroflexus), comprennent également des espèces thermophiles. Les groupes des Deinococci, des spirochètes, particuliers d’un point de vue morphologique, des bactéries vertes sulfureuses, des Flavobacterium et Cytophaga (chimio-organotrophes), des PlanctomycesPirella et des Verrumicrobium, des Chlamydia et les genres Nitrospira et Deferribacter, seront détaillés dans ce chapitre. Les autres phyla des bactéries cultivées, incluant les bactéries Gram positif, les cyanobactéries et les protéobactéries, constitueront l’essentiel de ce chapitre. Chacun de ces grands groupes compte de nombreux genres pour lesquels de nombreuses données phénotypiques sont disponibles. Les bactéries Gram positif se répartissent en deux groupes, les bactéries Gram positif à faible % G+C et à fort % G+C (actinobactéries). Ces bactéries ont en effet des pourcentages de bases G+C au niveau de l’ADN nettement inférieurs ou supérieurs à 50 %. Les bactéries Gram positif forment un groupe important de bactéries chimioorganotrophes (voir sections 12.19 à 12.24). Les cyanobactéries sont des bactéries oxygéniques phototrophes dont la racine sur l’arbre phylogénétique est proche de celle des bactéries Gram positif (voir sections 12.25 et 12.26). Le dernier phylum de l’arbre correspond aux Protéobactéries (voir figure 12.1). Ce groupe est de loin le plus grand et le plus diversifié parmi les Bacteria (voir sections 12.2

Deferribacter

Cytophaga Flavobactéries Spirochètes Bactéries vertes Deinococci

Planctomyces/

Verrucomicrobia

Pirella

sulfureuses

Bactéries vertes

Chlamydia

non sulfureuses Cyanobactéries Thermotoga


Aquifex

Actinobactéries Bactéries Gram positif Nitrospira ε δ α β

Protéobactéries

γ

FIGURE 12.1 Arbre phylogénétique détaillé des lignées majeures (phyla) des Bacteria, sur la base des comparaisons de séquences des ARN ribosomiques 16S. Quarante phyla sont répertoriés si l’on inclut les phyla pour lesquels seules des séquences issues d’échantillons environnementaux sont connues (voir section 11.7).



334 Chapitre 12


à 12.18). Cinq subdivisions regroupant chacune plusieurs genres constituent le groupe des protéobactéries. Chacune est désignée par une lettre grecque : alpha, bêta, gamma, delta, ou epsilon (voir tableau 12.1). Physiologiquement, les protéobactéries peuvent être phototrophes, chimiolithotrophes ou chimio-organotrophes. Cette grande diversité de mécanismes générateurs d’énergie, caractéristique des représentants de ce groupe, sera abordée au chapitre 17.

II

TABLEAU 12.1

Alpha

Les principaux genres appartenant aux Protéobactéries sont présentés dans le tableau 12.1. Ces organismes sont tous Gram négatif, possèdent une grande diversité métabolique et représentent la majorité des bactéries Gram négatif connues et d’intérêt dans les milieux médical, industriel ou agroalimentaire. Bêta

Genres principaux : Chromatium, Ectothiorhodospira, Rhodobacter, Rhodospirillum Chez les bactéries pourpres phototrophes, la photosynthèse est anoxygénique. Contrairement aux cyanobactéries (voir section 12.25), elles ne produisent pas d’O2. Les bactéries pourpres présentent des morphologies diverses. La taxinomie de ce groupe se fonde sur des critères phylogénétiques, morphologiques et physiologiques. Différents genres appartiennent aux groupes alpha, bêta, ou gamma des Protéobactéries. Les bactéries pourpres contiennent des bactériochlorophylles (pigments chlorophylliens) et un pigment de la famille des caroténoïdes (voir figures 17.4 et 17.9). Ensemble, ces pigments donnent aux bactéries pourpres leurs couleurs spectaculaires (voir figure 12.2), généralement pourpre, rouge ou marron (voir chapitre 17 pour l’analyse de la structure de ces pigments et leur implication dans la génération d’énergie à partir de la lumière, photophosphorylation). Les bactéries pourpres synthétisent des systèmes membranaires photosynthétiques intracytoplasmiques dans lesquels s’insèrent les pigments. Ces systèmes membranaires présentent des morphologies variées (voir figure 12.3) mais proviennent dans tous les cas d’invaginations de la membrane cytoplasmique. Ces membranes internes permettent aux bactéries pourpres d’augmenter la quantité de pigments spécifiques dans la cellule et d’optimiser ainsi l’utilisation de la lumière disponible. Lorsque les cellules sont cultivées sous forte intensité lumineuse, les membranes internes sont peu nombreuses et la quantité de pigments est faible. À l’inverse, à faible intensité lumineuse, de nombreuses membranes internes sont formées.

Genre Acetobacter

Nitrobacter

Agrobacterium

Paracoccus

Alcaligenes

Rhodospirillum

Azospirillum

Rhodopseudomonas

Beijerinckia

Rhodobacter

Bradyrhizobium

Rhodomicrobium

Brucella

Rhodovulum

Caulobacter

Rhodopila

Ehrlichia

Rhizobium

Gluconobacter

Rickettsia

Hyphomicrobium

Sphingomonas

Methylocystis

Zymomonas

Aquaspirillum

Oxalobacter

Bordetella

Polaromonas

Burkholderia

Ralstonia

Chromobacterium

Rhodocyclus

Dechloromonas

Rhodoferax

Gallionella

Sphaerotilus

Leptothrix

Spirillum

Methylophilus

Thiobacillus

Neisseria

Zoogloea

Nitrosomonas Gamma

Acetobacter

Photobacterium

Acinetobacter

Pseudomonas

Azotobacter

Methylococcus

Chromatium

Methylobacter

Escherichia

Nitrosococcus

Ectothiorhodospira

Nitrococcus

Erwinia

Thermochromatium

Francisella

Thiomicrospira

Halomonas

Thiospirillum et autres bactéries pourpres sulfureuses

Halorhodospira Halothiobacillus Leucothrix

Salmonella et autres bactéries entériques

Methylomonas

Vibrio

Oceanospirillum

Xanthomonas

Acinetobacter

Geobacter

Aeromonas

Halomonas

Bdellovibrio

Moraxella

Desulfuromonas

Myxococcus et autres myxobactéries

Legionella

Delta

Desulfovibrio et la plupart des autres bactéries sulfatoréductrices

Bactéries pourpres sulfureuses Les bactéries pourpres qui utilisent le sulfure d’hydrogène (H2S) comme donneur d’électrons pour la réduction du CO2 lors de la photosynthèse sont appelées bactéries pourpres sulfureuses (voir tableau 12.2). Le sulfure est oxydé en soufre (S0) qui est déposé sous forme de granules à l’intérieur de la cellule (voir figure 12.4) ; le soufre est ensuite oxydé en

a DE PROTÉOBACTÉRIES

Sous-division

PHYLUM 1 : LES PROTÉOBACTÉRIES

12.2 Bactéries pourpres phototrophes m n

PRINCIPAUX GENRES

Epsilon

Pelobacter Syntrophobacter Francisella

Campylobacter

Thiovulum

Helicobacter

Wolinella

a

Ce tableau non exhaustif liste les genres correctement décrits des protéobactéries. Pour une liste complète des genres de protéobactéries et des autres lignées du domaine Bacteria, voir l’annexe 2.



12.2 Bactéries pourpres phototrophes 335

Norbert Pfennig

sulfate (SO42–). De nombreuses bactéries pourpres sulfureuses peuvent également utiliser d’autres composés soufrés réduits comme donneurs d’électrons, comme le thiosulfate (S2O32–), utilisé dans les milieux de culture de laboratoire. Toutes les bactéries pourpres sulfureuses décrites à ce jour appartiennent à la subdivision gamma des Protéobactéries.

C. C. Remsen

FIGURE 12.2 Photographie de cultures liquides d’espèces de bactéries pourpres phototrophes contenant différents pigments caroténoïdes. La culture bleue, qui correspond à un mutant dépourvu de caroténoïde dérivé de Rhodospirillum rubrum, révèle la couleur bleue de la bactériochlorophylle a. La bouteille la plus à droite (Rhodobacter sphaeroides, souche G) est déficiente pour un caroténoïde de la souche sauvage et présente ainsi une couleur plus verte.

(b)

Jeffrey C. Burnham et S. C. Conti

(a)

FIGURE 12.3 Observation en microscopie électronique des systèmes membranaires des bactéries pourpres phototrophes. a) Membranes photosynthétiques en feuillets plats (structure lamellaire) chez la bactérie pourpre phototrophe Ectothiorhodospira mobilis. b) Membranes en forme de vésicules sphériques individuelles chez Allochromatium vinosum, une autre bactérie pourpre phototrophe.

TABLEAU 12.2

GENRES ET CARACTÉRISTIQUES DES

a BACTÉRIES POURPRES SULFUREUSES

Caractéristiques

Genre/ADN (% G+C)

Granules de soufre extracellulaires : Spirales, flagelles polaires

Ectothiorhodospira (62-67)

Spirales, alcalophiles extrêmes

Thiorhodospira (57)

Spirales, halophiles extrêmes

Halorhodospira (50-69)

Granules de soufre intracellulaires : Sans vésicule gazeuse Ovoïdes ou bâtonnets, flagelles polaires

Chromatium (48-70) Allochromatium ; Halochromatium ; Rhabdochromatium ; Thermochromatium ; Isochromatium ; Marichromatium

Sphériques, alcalophiles

Thioalkalicoccus (64)

Sphériques contenant la bacteriochlorophylle b

Thioflavicoccus (66)

Sphériques

Thiorhodococcus (67)

Sphériques, diplocoques, tétrades, non mobiles ; cellules de de 1,2 à 3 µm de diamètre

Thiocapsa (63-70)

Sphériques ou ovoïdes, flagelles polaires ; cellules de 2,5 à 3 µm de diamètre

Thiocystis (61-68)

Sphériques, cellules de 1,5 à 2,5 µm de diamètre

Thiohalocapsa (66)

Sphériques, cellules de 1 à 2 µm de diamètre

Thiorhodococcus (67)

Sphériques, cellules de 1,2 à 1,5 µm de diamètre

Thiococcus (69)

Grandes spirales, flagelles polaires

Thiospirillum (45)

Petites spirales

Thiorhodovibrio (61-62)

Avec vésicule gazeuse Sphères irrégulières regroupées en plaquettes de 4 à 16 cellules

Thiolamprovum

Bâtonnets

Lamprobacter (64)

Sphériques, ovoïdes, flagelles polaires

Lamprocystis (64)

Bâtonnets, non mobiles ; formant des réseaux irréguliers

Thiodictyon (65-66)

Sphériques, non mobiles ; formant des tétrades en feuillets plats

Thiopedia (62-64)

a D’un point de vue phylogénétique, toutes appartiennent à la sousdivision gamma des Protéobactéries (figure 12.1).



T. D. Brock

(a)

Norbert Pfennig


Norbert Pfennig

336 Chapitre 12

(b)

(d)

FIGURE 12.4 Observation au microscope à champ clair de bactéries pourpres sulfureuses (voir aussi tableau 12.2). a) Chromatium okenii ; les cellules mesurent environ 5 µm de large. Présence de granules de soufre élémentaire à l’intérieur des cellules. b) Thiospirillum jenense ; très longue spirale avec un flagelle polaire ; les cellules ont une longueur d’environ 30 µm. Présence de granules de soufre. c) Thiopedia rosea ; les cellules mesurent environ 1,5 µm de large. d) Photographie au microscope à contraste de phase de cellules d’Ectothiorhodospira mobilis. Les cellules mesurent environ 0,8 µm de large. Présence de granules de soufre à l’extérieur de la cellule (voir flèche). Comparez la photo de Chromatium okenii avec les dessins de bactéries pourpres sulfureuses réalisés par le célèbre microbiologiste russe Sergueï Winogradsky il y a cent quinze ans (voir section 1.7 et figure 1.15).

Les bactéries pourpres sulfureuses ont pour habitat les zones anoxiques euphotiques des lacs, les milieux aquatiques où s’accumule le sulfure d’hydrogène, ainsi que les « sources sulfureuses », où le sulfure d’hydrogène d’origine géochimique ou biologique peut déclencher le développement d’une efflorescence de bactéries pourpres sulfureuses (voir figure 12.5). Les lacs méromictiques (stratifiés de façon permanente) sont les plus favorables au développement des bactéries pourpres sulfureuses. Une eau plus dense (généralement salée) au fond du lac et moins dense (généralement douce) près de la surface assure une stratification permanente. En présence d’une quantité suffisante de sulfate, ce dernier est réduit et le sulfure produit dans les sédiments diffuse verticalement vers les eaux anoxiques où des bactéries pourpres sulfureuses peuvent former des agrégats denses, appelés efflorescences, en association avec des bactéries vertes phototrophes (voir figure 12.5c).

Douglas Caldwell

(c)

Jörg Overmann

Norbert Pfennig

Johannes F. Imhoff

(a)

(b)

(c)

FIGURE 12.5 Efflorescences de bactéries pourpres sulfureuses. a) Thiopedia roseopersicina, dans une source sulfureuse de Madison, dans le Wisconsin (États-Unis). Les bactéries se développent au fond du bassin de la source et remontent à la surface grâce à la présence de vésicules de gaz (voir section 4.12 pour des détails sur les vésicules gazeuses). La couleur verte vient des cellules de l’algue eucaryote Spirogyra (voir figure 14.35d). b) Échantillon d’eau (7 m de profondeur) du lac Mahoney, Colombie-Britannique. Amoebobacter purpureus domine dans cet échantillon. c) Observation au microscope à contraste de phase de bactéries pourpres sulfureuses d’un lac stratifié du Michigan. Sont visibles des espèces du genre Chromatium (longs bâtonnets) et Thiocystis (petits coques).

Contrairement aux autres bactéries pourpres sulfureuses, les genres Ectothiorhodospira et Halorhodospira oxydent H2S et produisent du soufre S0 qui est excrété dans le milieu extracellulaire (voir figure 12.4d). De nombreuses espèces appartenant à ces genres sont extrêmement halophiles et/ou alcalophiles et sont parmi les représentants les plus extrêmophiles des procaryotes connus. Les lacs salés, basiques, les eaux hypersalées utilisées pour la production de sel constituent les habitats de ces organismes.

Bactéries pourpres non sulfureuses Historiquement, les bactéries pourpres dites non sulfureuses étaient considérées comme incapables d’utiliser le sulfure comme donneur d’électrons pour la réduction du CO2. En fait, la plupart des espèces de ce groupe peuvent utiliser le sulfure, mais la concentration optimale en sulfure pour les bactéries pourpres sulfureuses



12.3 Bactéries nitrifiantes 337

(1-3 mM) est souvent toxique pour la plupart des bactéries pourpres non sulfureuses. Certaines bactéries pourpres non sulfureuses peuvent se développer en anaérobiose, à l’obscurité, grâce à des métabolismes fermentatifs ou de respiration anaérobie. Sous ces conditions, la synthèse de la machinerie photosynthétique est réprimée et les donneurs d’électrons sont des composés organiques ou chez certaines espèces des composés inorganiques comme H2. Cependant, c’est leur capacité de photohétérotrophie (lumière comme source d’énergie et composés organiques comme source de carbone, voir figure 17.1) qui vaut aux bactéries de ce groupe d’être compétitives dans la nature. Les bactéries pourpres non sulfureuses utilisent des substrats carbonés divers comme des acides gras, des acides organiques ou des acides aminés, des sucres, des alcools, des composés aromatiques comme le benzoate. La plupart des espèces peuvent également se développer de façon photoautotrophe en présence de CO2 et de H2 ou de CO2 et de faible concentration en H2S. Il est facile d’enrichir et d’isoler des bactéries pourpres non sulfureuses en utilisant un milieu minéral supplémenté avec un acide organique comme source de carbone. Un tel milieu ensemencé par un échantillon de vases, d’eau de lac ou d’eau d’égouts, et incubé en anaérobiose permet l’isolement systématique de bactéries pourpres non sulfureuses. Le remplacement des sources d’azote fixé (NH4+ par exemple) ou des sources d’azote organique (extrait de levure ou peptone par exemple) par une phase gazeuse riche en N2 permet d’augmenter la sélectivité des cultures d’enrichissement : toutes les bactéries pourpres non sulfureuses sont potentiellement capables de fixer l’azote moléculaire (voir section 17.28) et de se développer sous de telles conditions, contrairement aux autres organismes de ces milieux. Au sein des bactéries pourpres, les bactéries pourpres non sulfureuses présentent une grande diversité de morphologies (voir tableau 12.3 et figure 12.6), formant un groupe très hétérogène de ce point de vue. Toutes les bactéries pourpres non sulfureuses décrites à ce jour appartiennent au groupe alpha ou bêta des Protéobactéries.

Contrôlez vos acquis Les bactéries pourpres sont des bactéries phototrophes anoxygéniques utilisant du CO2 et de l’H2S (bactéries pourpres sulfureuses) ou des composés organiques (bactéries pourpres non sulfureuses) comme source de carbone. Les bactéries pourpres non sulfureuses présentent une grande diversité physiologique et la plupart se développent à l’obscurité comme chimioorganotrophe. Les bactéries pourpres appartiennent aux groupes alpha, bêta et gamma des Protéobactéries (voir figure 12.1). •

Donnez une raison majeure pour laquelle il n’y a pas de photosynthèse en aérobiose chez les bactéries pourpres.

•

Que signifie le terme anoxygénique ?

•

Les bactéries pourpres peuvent-elles se développer en absence de lumière ?

TABLEAU 12.3

GENRES ET CARACTÉRISTIQUES DES BACTÉRIES POURPRES a NON SULFUREUSES

Caractéristiques Alpha-protéobactéries Spirales, flagelles polaires

Genre/ADN (% G+C) Rhodospirillum (62–68) Phaeospirillum ; Rhodovibrio ; Rhodothalassium ; Roseospira ; Rhodospira ; (66) Roseospirillum (71)

Bâtonnets, flagelles polaires ; division par bourgeonemment

Rhodopseudomonas (64–72) Rhodoplanes (66–69) Rhodobium (61–65)

Bâtonnets ; division par fission binaire

Rhodobacter (62–71)

Cellules de formes ovoïdes à bâtonnets

Rhodovulum (64–68)

Ovoïdes, flagelles péritriches ; croissance par bourgeonnement et formation d'hyphes

Rhodomicrobium (61–63)

Grandes sphères, acidophiles (optimum pH 5)

Rhodopila (66)

Petites sphères, alcalophiles (optimum pH 9)

Rhodobaca (59)

Bêta-protéobactéries Cercles ou spirales

Rhodocyclus (64–66)

Bâtonnets incurvés

Rubrivivax (70–72)

Bâtonnets incurvés

Rhodoferax (59–60)

a

Toutes appartiennent aux Protéobactéries (voir figure 12.1 et tableau 12.1).

12.3 Bactéries nitrifiantes m n Genres principaux : Nitrosomonas, Nitrobacter De nombreuses espèces, au sein des Bacteria, peuvent croître en chimiolithotrophie. Les bactéries chimiolithotrophes ont physiologiquement en commun leur capacité à utiliser des donneurs d’électrons inorganiques comme source d’énergie (nous présenterons les bases conceptuelles de la chimiotrophie dans le chapitre 17). La plupart des chimiolithotrophes sont également capables de croître en autotrophie et partagent en ce sens la plupart de leurs caractéristiques physiologiques avec les bactéries phototrophes et les cyanobactéries. Nous nous concentrerons ici sur les plus étudiées parmi les chimiolithotrophes : ceux qui sont capables d’oxyder les composés soufrés ou azotés réduits et l’H2.

Bactéries nitrosantes et nitrifiantes Les bactéries capables de croître en chimiolithotrophie en utilisant des composés azotés réduits inorganiques sont appelées nitrifiantes. Plusieurs genres ont été identifiés sur des bases morphologiques, phylogénétiques et en fonction des étapes spécifiques qu’elles mettent en œuvre dans la séquence d’oxydation



(b)

Peter Hirsch

Norbert Pfennig

(f)

FIGURE 12.6 Membres de différents genres de bactéries pourpres non sulfureuses (voir aussi tableau 12.3). a) Phaeospirillum fulvum ; cellules d’environ 3 µm de long. b) Rhodopseudomonas acidophila ; cellules d’environ 4 µm de long. c) Rhodobacter sphaeroides ; cellules d’environ 1,5 µm de large. d) Rhodopila globiformis ; cellules d’environ 1,6 µm de large. e) Rhodocyclus purpureus ; cellules d’environ 0,7 µm de diamètre. f) Rhodomicrobium vannielii ; cellules d’environ 1,2 µm de large.

(voir tableau 12.4). D’un point de vue phylogénétique, les bactéries nitrifiantes se répartissent dans quatre des cinq divisions des Protéobactéries : alpha, bêta, gamma et delta. Le genre Nitrospira forme à lui seul une lignée au sein des Bacteria (voir figure 12.1 et voir section 12.38), qui n’est reliée aux autres bactéries nitrifiantes que d’un point de vue métabolique. On ne connaît pas de chimiolithotrophe capable de réaliser l’oxydation complète de l’ammonium en nitrate. Ainsi, dans la nature, la nitrification est le résultat de l’action séquentielle de deux groupes d’organismes : les bactéries amonium-oxydantes ou nitrosantes (voir figure 12.7) et les bactéries nitrite-oxydantes, les nitrifiantes vraies (qui produisent du nitrate, et parfois appelées nitratantes) [voir figure 12.8]. Les bactéries nitrosantes ont typiquement un nom commençant par nitroso- alors que le nom des nitrifiantes vraies commence habituellement par nitro- ; Nitrosomonas et Nitrobacter sont les genres principaux des bactéries nitrifiantes (voir tableau 12.4). D’un point de vue

historique, les bactéries nitrifiantes ont été les premiers organismes pour lesquels la croissance en chimiolithotrophie a été démontrée. Winogradsky a montré qu’elles étaient capables de produire de la matière organique et de la biomasse quand on leur fournissait du CO2 comme seule source de carbone (voir le focus « Winogradsky et la chimiolithotrophie », chapitre 17). De nombreuses espèces nitrifiantes possèdent un système de membranes internes complexe. À plusieurs égards, ceux-ci sont identiques aux membranes internes présentes chez les leurs voisins phylogénétiques, les bactéries phototrophes pourpres (voir section 12.2) et les bactéries méthano-oxydantes (méthanotrophes) [voir section 12.6]. Ces membranes sont le siège des enzymes clés de la nitrification : l’ammonium mono-oxygénase qui oxyde NH3 (ammonium) en NO2OH (hydroxylamine) et la nitrite oxydase, qui oxyde NO2– en NO3– (voir section 17.12). L’hydroxylamine est ensuite oxydée en NO2– (nitrite) par les bactéries nitrosantes, qui produisent ainsi le substrat pour les bactéries nitrifiantes vraies (voir figure 12.9).

Écologie, isolement et culture Les bactéries nitrifiantes sont répandues dans les sols et l’eau. Elles sont présentes en grand nombre dans les habitats qui contiennent des quantités importantes d’ammonium, tels les sites où se produit une dégradation massive de protéines (ammonification), et également dans les installations de traitement des eaux usées (voir section 28.2). Les bactéries nitrifiantes se développent particulièrement bien dans les lacs et les ruisseaux qui reçoivent les rejets des égouts ou d’autres eaux usées car ils sont fréquemment riches en ammonium (voir figure 19.10a).

S. W. Watson

(d)

(c)

(e)

FIGURE 12.7 La bactérie nitrosante Nitrosococcus oceani, observée en microscopie à contraste de phase (à gauche) et en microscopie électronique (à droite). Les cellules ont un diamètre d’environ 2 µm.

Norbert Pfennig

Norbert Pfennig

(a)

S. W. Watson

Norbert Pfennig


Norbert Pfennig

338 Chapitre 12

FIGURE 12.8 La bactérie nitrifiante Nitrobacter winogradskyi observée en microscopie à contraste de phase (à gauche) et en microscopie électronique (à droite). Les cellules ont un diamètre d’environ 0,7 µm.



12.4 Bactéries sulfo-oxydantes et ferro-oxydantes 339

TABLEAU 12.4

CARACTÉRISTIQUES DES BACTÉRIES NITRIFIANTES

Caractéristiques

Genres

Groupe phylogénétiquea

ADN (% G+C)

Habitats

Oxydent l’ammonium : Bâtonnets courts à longs, Gram négatif, mobiles (flagelles polaires) ou non mobiles ; systèmes de membranes périphériques

Nitrosomonas

Bêta

45-53

Sols, eaux usées, eaux douces, océans

Grandes coques, mobiles ; membranes périphériques ou vésiculaires

Nitrosococcus

Gamma

49-50

Eaux douces, océans

Spiralées, mobiles (flagelles péritriches) ; pas de système membranaire apparent

Nitrosospira

Bêta

54

Sols

Cellules pléomorphes, lobées, compartimentées ; mobiles (flagelles péritriches)

Nitrosolobus

Bêta

54

Sols

Bâtonnets courts, reproduction par bourgeonnement, parfois mobiles (unique flagelle subterminal) ; système de membranes organisé formant une cape polaire

Nitrobacter

Alpha

59-62

Sols, eaux douces,océans

Bâtonnets longs et fins, non mobiles ; pas de système membranaire apparent

Nitrospina

Delta

58

Océans

Grandes coques, mobiles (un ou deux flagelles subterminaux) ; système de membranes tubulaires disposé au hasard

Nitrococcus

Gamma

61

Océans

Cellules hélicoïdales ou en forme de vibrions, non mobiles ; pas de membrane interne

Nitrospira

Groupe de Nitrospira

50

Océans, sols

Oxydent les nitrites :

a

D’un point de vue phylogénétique, toutes les bactéries nitrifiantes étudiées jusqu’ici sont des Protéobactéries, à l’exception de Nitrospira qui constitue à elle seule un groupe phylogénétique (voir figure 12.1).

Les cultures d’enrichissement de bactéries nitrifiantes peuvent être aisément réalisées en utilisant un milieu de culture minéral contenant de l’ammonium ou des nitrites comme donneurs d’électrons et du bicarbonate (HCO3–) comme seule source de carbone. Du fait du rendement de croissance peu efficace de ces organismes (voir section 17.12), il se peut qu’aucune turbidité visible n’apparaisse en dépit de l’existence d’une nitrification active. Une façon simple de mesurer la croissance est donc de quantifier la production de nitrite (en présence d’ammonium comme donneur d’électrons) ou la

Bactéries nitrosantes 1. NH3 + O2 + 2 e– + 2 H+ 2. NH2OH + H2O + 12 O2

NH2OH + H2O NO2– + 2 H2O + H+

Somme : NH3 + 1 1 O2 NO2– + H2O 2 0 ∆G ′ = – 288 kJ/réaction

Bactéries nitrifiantes NO2– +

1 2

O2

NO3–

∆G0′ = – 74,1 kJ/réaction

FIGURE 12.9 Nitrification. Réactions impliquées dans l’oxydation des composés azotés inorganiques chez les bactéries chimiolithotrophes nitrifiantes (voir également les figures 17.32 et 17.33).

production de nitrate (en présence de nitrites comme donneurs d’électrons). La plupart des bactéries nitrifiantes sont des chimiolithotrophes aérobies obligatoires. Les espèces du genre Nitrobacter sont une exception et sont capables de croître en chimio-organotrophie en utilisant l’acétate et le pyruvate comme seule source de carbone et d’énergie. Les micro-organismes anammox qui oxydent l’ammonium en anaérobiose forment un groupe phylogénétiquement distinct.

12.4 Bactéries sulfo-oxydantes m n et ferro-oxydantes Genres principaux : Achromatium, Beggiatoa

Thiobacillus,

Acidithiobacillus,

La capacité à croître en chimiolithotrophie en utilisant des composés soufrés réduits est une propriété commune à divers groupes des Protéobactéries (voir tableau 12.5). Il existe deux groupes écologiques importants de bactéries sulfo-oxydantes, celles qui vivent à pH neutre et celles qui vivent à pH acide. Parmi les acidophiles, certaines ont la capacité à croître en chimiolithotrophie en utilisant le fer ferreux (Fe2+) comme donneur d’électrons. Nous aborderons la biogéochimie des bactéries sulfo-oxydantes et ferro-oxydantes dans les sections 19.13 à 19.16 et la biochimie de ces procédés dans les sections 17.10 et 17.11.



340 Chapitre 12


TABLEAU 12.5

CARACTÉRISTIQUES PHYSIOLOGIQUES DES PROCARYOTES CHIMIOLITHOTROPHES SULFO-OXYDANTS Gamme de pH de croissance


H2S, sulfures, S0, S2O32–

6-8

Bêta

61-66

H2S, S , S2O32– S0, S2O32– 0

6-8

Bêta

63-68

6-8

Gamma

52-56

2-4

Gamma

51-53

2-4

Gamma

55-65

Donneur d’électrons inorganique

Genres et espèces

ADN (% G+C)

Espèces croissant faiblement sur milieu organique : Thiobacillus thioparus

0

b

Thiobacillus denitrificans

Halothiobacillus neapolitanus

S

Acidothiobacillus thiooxidans

0

2+

S , sulfures métalliques, Fe

Acidothiobacillus ferrooxidans

Espèces croissant bien sur milieu organique : Starkeya novella

S2O32–

6-8

Bêta

66-68

Thiomonas intermedia

S2O32–

3-7

Bêta

64

Chimiolithotrophes filamenteuses sulfo-oxydantes : Beggiatoa

H2S, S2O32–

6-8

Gamma

37-51

Thiothrix

H2S

6-8

Gamma

52

H2S, S

–

Gamma

–

Achromatium

H2S

–

Gamma

–

Thiomicrospira

S2O32–, H2S

6-8

Gamma

36-44

H2

6-8

Alpha

66

SO3–

6,5-7,5

Bêta

–

6-8

Epsilon

–

0

c

Thioploca

Autres genres :

d

S2O32–, S2O32–, 0

Thiosphaera

H2S,

Thermothrix

H2S,

Thiovulum

H2S, S

a

Ce sont toutes des Protéobactéries. b Aérobies facultatives ; utilise NO3– comme donneur d’électrons en anaérobiose. c Il n’existe pas de culture pure. d La séquence de l’ARNr 16S de Thiosphaera pantotropha est identique à celle de Paracoccus denitrificans.

Thiobacillus et Achromatium Le genre Thiobacillus et les espèces proches comptent plusieurs espèces bactériennes Gram négatif, en forme de bâtonnets morphologiquement indiscernables de la plupart des autres bâtonnets Gram négatif (voir figure 12.10a) ; ce sont les organismes les plus étudiés parmi les chimiolithotrophes. D’un point de vue phylogénétique, les espèces du genre Thiobacillus se répartissent au sein des Protéobactéries avec des espèces appartenant aux sous-divisions alpha, bêta et gamma (voir tableau 12.5). Les composés soufrés le plus souvent utilisés comme donneurs d’électrons pour le métabolisme chimiolithotrophe chez Thiobacillus sont H2S, S0 et S2O32–. Les réactions énergétiques mises en œuvre sont les suivantes : H2S + 2 O2 → SO42– + 2 H+ ∆G0’ = – 798 kJ/réaction S0 + H2O + 1 1--- O2 → SO42– + 2 H+ 2 ∆G0’ = – 587 kJ/réaction S2O32– + H2O + 2 O2 → 2 SO42– + 2 H+ ∆G0’ = – 818 kJ/réaction Il est évident que de grandes quantités d’énergie sont produites lors de ces réactions et nous verrons dans la section 17.10 qu’une partie de cette énergie peut être stockée sous forme d’ATP grâce

à des réactions de transport d’électrons qui génèrent une force proton motrice. Ces réactions génèrent, en outre, de grandes quantités d’acide sulfurique et ainsi plusieurs thiobacilles sont acidophiles. Une des espèces acidophiles, Acidithiobacillus ferrooxydans, peut également croître en chimiolithotrophie en oxydant le fer ferreux et est l’un des agents biologiques majeurs de l’oxydation de ce métal (voir section 19.14). La pyrite (FeS2) est une des sources majeures aussi bien de Fe2+ que de sulfures. L’oxydation du FeS2, plus spécialement dans les opérations minières, peut être à la fois bénéfique (la lixivation du minerai sépare le fer du sulfure métallique) et désastreuse d’un point de vue écologique (l’acidification de l’environnement s’accompagne d’un relarguage des autres métaux lourds associés à la pyrite) [voir sections 19.14 et 19.15]. Achromatium est une bactérie chimiolithotrophe sulfo-oxydante de forme sphérique qui est fréquente dans les sédiments des eaux douces qui contiennent des sulfures. Les cellules d’Achromatium sont de grosses coques dont le diamètre peut atteindre 10 à 100 µm (voir figure 12.10b). L’analyse phylogénétique de populations naturelles d’Archromatium a montré qu’il existe vraisemblablement plusieurs espèces (chacune ayant probablement une taille différente), mais cet organisme n’a toujours pas été obtenu en culture pure. D’un point de vue phylogénétique, Achromatium appartient à la division gamma des Protéobactéries et est apparenté aux bactéries phototrophes



Jessup M. Shively

12.4 Bactéries sulfo-oxydantes et ferro-oxydantes 341

(a)

structures contiennent des quantités importantes des enzymes du cycle de Calvin et augmentent vraisemblablement le taux de fixation de CO2 chez ces organismes. D’autres chimiolithotrophes sulfo-oxydants sont des chimiolithotrophes facultatifs, en ce sens qu’ils peuvent croître soit en chimiolithotrophie (et donc en autotrophie) ou en chimio-organotrophie (voir tableau 12.5). La plupart des espèces du genre Beggiatoa, en revanche, peuvent produire de l’énergie à partir de l’oxydation des composés soufrés inorganiques mais ne possèdent pas les enzymes du cycle de Calvin. Elles ont donc besoin de composés organiques comme sources de carbone. Ce mode nutritionnel est appelé mixotrophie.

Hans-Dietrich Babenzien

Beggiatoa Les organismes de ce genre sont des bactéries filamenteuses, sulfo-oxydantes, capables de se mouvoir par glissement (gliding). Les cellules de Beggiatoa ont un diamètre et une longueur remarquablement importants, elles sont constituées de petites cellules attachées bout à bout (voir figure 12.11). Les filaments se courbent et se torsadent, plusieurs filaments entrelacés formant un faisceau complexe. Dans la nature, on trouve des Beggiatoa principalement dans les habitats riches en H2S comme les sources sulfureuses (voir

FIGURE 12.10 Chimiolithotrophes sulfo-oxydants non filamenteux. a) Cellules du sulfo-oxydant chimiolithotrophe Halothiobacillus neapolitanus. Une cellule a un diamètre d’environ 0,5 µm. Notez les structures polyédriques (carboxysomes) réparties dans la cellule (voir flèches). b) Achromatium. Cellules isolées d’un petit lac en Allemagne et observées au microscope optique en lumière de Nomarski. Les petites structures globulaires situées à la périphérie de la cellule (voir flèche) sont du soufre élémentaire, alors que les gros granules sont du carbonate de calcium. Une cellule d’Achromatium a un diamètre d’environ 25 µm.

Michael Richard

(b)

(a)

Culture Certains chimiolithotrophes sulfo-oxydants sont des chimiolithotrophes obligatoires, contraints à l’utilisation de composés inorganiques plutôt que de composés organiques comme donneurs d’électrons. Lors de ce mode de croissance, ils sont également autotrophes, transformant le CO2 en matériel cellulaire grâce aux réactions du cycle de Calvin (voir section 17.6). Des carboxysomes sont parfois présents à l’intérieur des cellules des chimiolithotrophes obligatoires (voir figure 12.10a). Ces

T.D. Brock

pourpres comme son équivalent phototrophe : Chromatium (voir section 12.2). Comme Chromatium, les cellules d’Achromatium stockent du soufre élémentaire (voir figure 12.10b), les granules disparaissent au fur et à mesure que le soufre est oxydé en sulfate. Les cellules d’Achromatium accumulent également de gros granules de calcite (CaCO3) [voir figure 12.10b], probablement comme source de carbone pour la croissance en autotrophie. (b)

FIGURE 12.11 Bactérie sulfo-oxydantes filamenteuses. a) Observation en microscopie optique d’espèces du genre Beggiatoa isolées d’une station d’épuration. Notez l’abondance des granules de soufre élémentaire dans certaines cellules. b) Bactéries sulfo-oxydantes dans l’écoulement d’une petite source sulfureuse. Les cellules filamenteuses s’entrelacent entre elles pour former d’épais rubans et la couleur blanche est due à la présence abondante de soufre dans les cellules.




figure 12.11b), les algues en décomposition, les couches de boues des lacs et les eaux polluées par les égouts. Dans ces environnements, de façon caractéristique, les filaments de Beggiatoa sont remplis de granules de soufre (voir figure 12.11a). Les Beggiatoa colonisent également les sources hydrothermales (voir section 19.8). C’est grâce aux Beggiatoa que Winogradsky a démontré pour la première fois qu’un organisme vivant pouvait oxyder H2S en S0 puis en SO42–, ce qui lui permit de formuler le concept de chimiolithotrophie (voir le focus « Winogradsky et la chimiolithotrophie », chapitre 17). Bien que quelques souches de Beggiatoa soit des chimiolithoautotrophes vrais, la plupart poussent mieux en mixotrophie avec des composés soufrés réduits comme donneurs d’électrons et des composés organiques comme sources de carbone. Un des habitats intéressants des Beggiatoa est la rizosphère des plantes (riz, roseaux et autres plantes des marais) qui vivent sur des sols inondés donc anoxiques. Ces plantes transportent de l’oxygène vers leurs racines générant ainsi une interface oxique / anoxique entre les racines et le sol. Les Beggiatoa (et probablement d’autres bactéries sulfo-oxydantes) se développent au niveau de cette interface et jouent un rôle bénéfique pour la plante en oxydant (donc en détoxifiant) l’H2S. Les Beggiatoa et d’autres bactéries filamenteuses comme Sphaerolitus (voir section 12.15) peuvent causer des problèmes de décantation dans les installations de traitement des eaux usées et dans les lagunes de traitement des rejets industriels tels ceux des usines de cannage, de fabrication du papier, les brasseries et les minoteries. Ces problèmes connus sous le nom de bulking (prise en masse) se produisent quand les bactéries filamenteuses comme les Beggiatoa deviennent dominantes par rapport à la microflore normale du système de traitement, entraînant la formation de floculats de détritus cotonneux au lieu des floculats denses normaux formés par des organismes comme les Zoogloea et d’autres bactéries des eaux usées et qui sédimentent facilement. En cas de bulking, les eaux usées sont traitées de façon incorrecte car l’effluent déversé contient toujours des quantités importantes de matière organique (voir section 28.2).

Thioploca et Thiothrix D’autres bactéries filamenteuses sulfo-oxydantes sont Thioploca et Thiothrix. Thioploca est une grande bactérie filamenteuse sulfo-oxydante chimiolithotrophe qui forme des faisceaux de cellules entourés par une enveloppe commune (voir figure 12.12). Des tapis denses formés par des espèces marines du genre Thioploca ont été trouvés sur le plancher océanique au large des côtes du Chili et du Pérou. L’étude de l’écologie de ces organismes a montré qu’elles réalisent l’oxydation anaérobie du H2S couplée à la réduction du nitrate (NO3–) en ammonium (NH4+) [voir sections 17.14 et 19.12]. De façon intéressante, il a été montré que les cellules de Thioploca peuvent accumuler d’importantes quantités de nitrate intracellulaire et que ce nitrate peut ensuite subvenir à de longues périodes de respiration anaérobie avec H2S comme donneur d’électrons. On pense que ces Thioploca marines fixent des quantités importantes de CO2 et jouent également un rôle majeur dans le cycle du soufre et le cycle de l’azote. Des tapis similaires constitués principalement de Beggiatoa sont présents à proximité des sources hydrothermales (voir section 19.8)

M. Hüttel

342 Chapitre 12

FIGURE 12.12 Cellules de la grande espèce marine Thioploca. Les cellules contiennent des granules de soufre (jaune) et ont une taille d’environ 40 à 50 µm de large.

mais la relation avec la respiration du nitrate dans ce cas n’est pas clairement établie. Thiothrix est un organisme sulfo-oxydant filamenteux chez lequel les filaments s’assemblent entre eux à leur extrémité pour former une organisation cellulaire appelée rosette (voir figure 12.13). D’un point de vue physiologique, Thiothrix est une espèce mixotrophe aérobie obligatoire, cette caractéristique ainsi que de nombreuses autres la font ressembler à Beggiatoa.

12.5 Bactéries hydrogéno-oxydantes m n Genres principaux : Ralstonia, Paracoccus De nombreuses bactéries peuvent croître en utilisant H2 comme unique donneur d’électrons et O2 comme accepteur d’électrons en utilisant la réaction de knallgas (terme allemand, « gaz détonnant » en français) de réduction d’O2 par H2, pour leur métabolisme énergétique : H2 +

1 --2

O2 → H2O

∆G0 = –237 kJ

Un grand nombre de ces organismes, mais pas tous, peuvent également croître en autotrophie (en utilisant les réactions du cycle de Calvin pour fixer le CO2) et forment le groupe des bactéries chimiolithotrophes hyrogéno-oxydantes. Il existe des espèces Gram positif et des espèces Gram négatif chez les hydrogénobactéries, et leurs représentants les plus étudiés appartiennent aux genres Ralstonia (voir figure 12.14), Pseudomonas et Paracoccus (voir tableau 12.6). Toutes les bactéries hydrogéno-oxydantes contiennent une ou plusieurs enzymes hydrogénases qui fonctionnent en fixant l’hydrogène et l’utilisent pour produire de l’ATP ou du pouvoir réducteur pour la croissance en autotrophie (voir tableau 12.6). La plupart des hydrogénobactéries sont des chimiolithotrophes facultatives, ce qui signifie qu’elles peuvent également croître en chimio-organotrophie en utilisant des composés organiques comme source d’énergie. Ceci est une des différences majeures entre les chimiolithotrophes hydrogéno-dépendants et la plupart des chimiolithotrophes soufre-dépendants ou des bactéries nitrifiantes. La majorité des représentants de ces groupes sont des chimiolithotrophes stricts – leur croissance ne peut avoir lieu en l’absence d’une source d’énergie inorganique. Au



Michael F. McGlannan, Florida International University

12.5 Bactéries hydrogéno-oxydantes 343

(b) FIGURE 12.13 Thiothrix. a) Un puits artésien contenant des sulfures en Floride, États-Unis. Les abords de la source sont recouverts par des tapis de Thiothrix. Les tapis ont un diamètre d’environ 1,5 m. b) Rosettes formées par des cellules de Thiothrix dans une culture pure observée en microscopie à contraste de phase. Notez les globules de soufre intracellulaires résultant de l’oxydation des sulfures. Chaque filament a un diamètre d’environ 4 µm.

contraire, les chimiolithotrophes à hydrogène peuvent passer d’un métabolisme chimiolithotrophe à un métabolisme chimioorganotrophe quand les conditions de leurs habitats varient.

La physiologie et l'écologie des hydrogénobactéries Lors de la croissance en chimiolithotrophie sur H2, la plupart des hydrogénobactéries croissent mieux en conditions de microaérophilie car les hydrogénases sont des enzymes sensibles à l’oxygène. De façon caractéristique, des concentrations de 5 à 10 % d’oxygène permettent une croissance optimale. Du nickel doit être présent dans le milieu pour la culture des hydrogénobactéries car toutes les hydrogénases contiennent du Ni2+ comme cofacteur métallique. Quelques hydrogénobactéries fixent le N2 moléculaire et, quand elles croîssent sur N2, ces organismes sont sensibles à l’oxygène car la nitrogénase, enzyme nécessaire à la réduction de l’azote moléculaire (voir section 17.28), est une enzyme sensible à l’oxygène.

Frank Mayer

Michael F. McGlannan, Florida International University

(a)

FIGURE 12.14 Hydrogénobactéries. Cellules de la bactérie hydrogéno-oxydante chimiolithotrophe Ralstonia eutropha observées en microscopie électronique à transmission après marquage négatif. Une cellule a un diamètre de 0,6 µm et compte plusieurs flagelles.

Des cultures d’enrichissement d’hydrogénobactéries peuvent être réalisées en ajoutant une petite quantité d’un milieu minéral contenant des métaux traces (plus spécialement Ni2+ et Fe2+) à un échantillon de sol ou d’eau et incubé dans un grand flacon scellé contenant une phase gazeuse avec 5 % O2, 10 % CO2 et 85 % H2. Quand le liquide devient trouble, des boîtes de Petri contenant le même milieu sont ensemencées et incubées dans des jarres contenant le même mélange gazeux (ceci doit être réalisé avec précaution car le mélange O2 et H2 est potentiellement explosif).

L'oxydation du CO Quelques hydrogénobactéries peuvent croître en utilisant du monoxyde de carbone (CO), comme donneur d’électrons. Les électrons résultant de l’oxydation du CO en CO2 entrent dans la chaîne de transport d’électrons pour conduire à la synthèse d’ATP. Les bactéries CO-oxydantes, appelées bactéries carboxydotrophes, croissent en autotrophie grâce aux réactions du cycle de Calvin (voir section 17.6) en fixant le CO2 généré grâce à l’oxydation du CO. Le monoxyde de carbone est oxydé en CO2 par le carbone monoxyde deshydrogénase, qui est une enzyme qui contient du molybdène. Le molybdène de la CO déshydrogénase est fixé à un petit cofacteur dont la structure multi-annelée, appelée ptérine, est semblable à celle de la nitrate réductase (voir section 17.14). La consommation de CO par les bactéries carboxydotrophes dans la nature a une signification écologique importante. Bien que de grandes quantités de CO soient produites par les activités humaines ou autres, les niveaux de CO dans l’air n’augmentent pas significativement en plusieurs années. Comme la plupart des rejets significatifs de CO (principalement des gaz d’échappements des automobiles, la combustion incomplète des combustibles fossiles et le catabolisme de la lignine) ont lieu dans des environnements oxiques, les bactéries carboxydotrophes des couches supérieures du sol représentent probablement le



344 Chapitre 12


TABLEAU 12.6

CARACTÉRISTIQUES PERMETTANT DE DIFFÉRENCIER QUELQUES HYDROGÉNOBACTÉRIES COMMUNES

Genres et espèces

Dénitri- Croissance Groupe Mobilité fication sur fructose phylogénétiquea

ADN (% G+C)

Autres caractéristiques

Gram négatif Acidovorax facilis

–

+

+

Bêta

64

Hydrogénase membranaire

Ralstonia eutropha

+

+

+

Bêta

66

Hydrogénases membranaires et cytoplasmiques

Achromobacter xylosoxidans

–

+

+

Bêta

–

Hydrogénases membranaires et cytoplasmiques

Aquaspirillum autotrophicum

–

–

+

Bêta

61


Pseudomonas carboxydovorans

–

–

+

Gamma

60

Hydrogénase membranaire ; oxyde également le CO

Hydrogenophaga flava

–

+

+

Bêta

67

Colonies jaune brillant

Paracoccus denitrificans

+

+

–

Alpha

66

Hydrogénase membranaire ; fortement dénitrifiante

Aquifex pyrophilus

+

–

+

Groupe Aquifexb

65

Hyperthermophile, microaérophile ou anaérobie (sur NO3–), chimiolithotrophe obligatoire ; utilise également S0 ou S2O32– comme donneurs d’électrons

Hydrogenobacter thermophilus

–

–

–

Groupe Aquifexb

37-46

Comme Aquifex, mais aérobie obligatoire (microaérophile)

Bacillus schlegelii

–

–

+

Gram positif faible Gcc

Arthrobacter sp.

–

+

–

Actinobacteriad

Gram positif

Mycobacterium gordonae

–

?

–

d e

Actinobacteria ,

66

Produit des endospores ; thermophile ; utilise également CO ou S2O32– comme donneurs d’électrons

70


–

Acido-alcoolo-résistant ; colonies jaune à orange

a

Les hydrogénobactéries sont (sauf indication contraire) des protéobactéries. Voir section 12.37. c Voir section 12.20. d Voir section 12.22. e Voir section 12.23. b

puits de CO le plus important dans la nature. Parmi les carboxydotrophes les plus étudiées, on trouve des espèces du genre Pseudomonas, tel P. carboxydovorans (voir tableau 12.6). Il existe au moins une espèce de bactérie carboxydotrophe capable de croître sur CO en anaérobiose, en utilisant le nitrate comme accepteur d’électrons, mais ceci ne semble pas être une propriété très répandue dans ce groupe. Comme les hydrogénobactéries, tous les isolats de bactéries carboxydotrophes peuvent théoriquement aussi bien croître en chimio-organotrophie avec des substrats organiques que sur CO.

Contrôlez vos acquis Les chimiolithotrophes sont des procaryotes qui peuvent oxyder des donneurs d’électrons inorganiques et qui, dans de nombreux cas, utilisent le CO2 comme seule source de carbone.

•

Comparez et différenciez les bactéries nitrifiantes des bactéries soufre-dépendantes, des bactéries ferro-dépendantes et des hydrogénobacétries en termes de donneurs d’électrons utilisés, de sources de carbone, d’E0’ des donneurs d’électrons (voir chapitre 17) et d’habitats.

•

Quelle est la voie principale de fixation du CO2 chez de nombreux chimiolithotrophes ?

12.6 Méthanotrophes m n et méthylotrophes Genres principaux : Methylomonas, Methylobacter Le méthane, CH4, est largement présent dans la nature. Il est produit dans les environnements anoxiques par les Archaea



12.6 Méthanotrophes et méthylotrophes 345

méthanogènes (voir sections 13.4 et 17.17) et est le gaz le plus important dans les boues anoxiques, les marais (voir figure 13.5), les zones anoxiques des lacs, le rumen et l’intestin des mammifères. Le méthane est le constituant principal du gaz naturel et il est également présent dans de nombreux gisements de charbon. Le méthane est une molécule chimiquement stable, mais certaines bactéries, les méthanotrophes, l’oxydent facilement. Ces bactéries utilisent le méthane ainsi que quelques composés à un carbone comme donneur d’électrons pour la production d’énergie et comme source de carbone. Ces bactéries sont toutes aérobies et sont largement répandues dans la nature, dans les sols et dans l’eau. Elles présentent différentes morphologies et se regroupent de par leur phylogénie et leur capacité à oxyder le méthane. Le méthane est rare dans les sédiments marins dans lesquels la forme la plus fréquente de respiration anaérobie est la sulfato-réduction et non la méthanogenèse (voir section 19.10).

Le métabolisme des composés en C1 En plus du méthane, quelques autres composés à un carbone peuvent être utilisés par ces micro-organismes. Une liste de ces composés est donnée dans le tableau 12.7. D’un point de vue biochimique, ces composants présentent une caractéristique commune : ils ne possèdent pas de liaison carbone-carbone. Ainsi toute liaison carbone-carbone de la cellule doit être synthétisée de novo. Les organismes capables de croître en utilisant uniquement des composés à un carbone sont appelés méthylotrophes. De nombreux méthylotrophes (mais pas tous) sont également méthanotrophes. Néanmoins, les méthanotrophes sont uniques du fait qu’ils peuvent non seulement utiliser les composés à un carbone les plus oxydés (voir tableau 12.7) mais également le méthane. Les méthanotrophes possèdent une enzyme spécifique, la méthane mono-oxygénase, qui réalise l’addition d’un atome d’oxygène dans la molécule de méthane, ce qui conduit à la formation de méthanol (voir section 17.24). La nécessité de l’oxygène comme réactif pour l’oxygénation initiale du méthane explique donc pourquoi ces méthanotrophes sont des micro-organismes aérobies stricts (le méthane peut être oxydé dans des conditions anoxiques par un consortium de micro-organismes spécifiques, voir section 17.24). Tous les méthanotrophes apparaissent comme étant également des utilisateurs obligatoires de composés en C1 incapables d’utiliser des composés contenant une liaison carbone-carbone. Par contre, de nombreux méthylotrophes non méthanotrophes sont capables d’utiliser des acides organiques, l’éthanol et des sucres. Les bactéries méthano-oxydantes sont des procaryotes uniques du fait qu’elles possèdent de grandes quantités de stérols. Les stérols sont présents dans les membranes des eucaryotes et ont un rôle fonctionnel dans la membrane, mais sont absents chez la plupart des procaryotes (voir section 4.5). Nous verrons que chez les méthanotrophes les stérols seraient un composant essentiel du système membranaire complexe interne impliqué dans l’oxydation du méthane. Le seul autre groupe de procaryotes dans lequel les stérols sont largement présents est celui des bactéries sans paroi, les mycoplasmes (voir section 12.21).

TABLEAU 12.7

SUBSTRATS UTILISÉS PAR

a LES BACTÉRIES MÉTHYLOTROPHES

I. Substrats utilisés pour la croissance Méthane, CH4b Méthanol, CH3OH Méthylamine, CH3NH2 Diméthylamine, (CH3)2NH Triméthylamine, (CH3)3N Tétraméthylammonium, (CH3)4N+ N-oxide de triméthylamine, (CH3)3NO(CH3)4N+ Triméthylsulfonium, (CH3)3S+

Formiate, HCOO-– Formamide, HCONH2 Monoxyde de carbone, CO Diméthyl éther, (CH3)2O Carbonate de diméthyle, CH3OCOOCH3 Diméthyl sulfoxide, (CH3)2SO Diméthylsulfure, (CH3)2S

II. Substrats oxydés mais non utilisés pour la croissance Ammonium, NH4+ Éthylène, H2C = CH2 Chlorométhane, CH3Cl

Bromométhane, CH3Br Hydrocarbures de plus haut poids moléculaire (éthane, propane)

a

Un isolat donné n’utilise pas tous les substrats mais il existe au moins une bactérie méthylotrophe capable d’oxyder chacun des composants de la liste. b Les méthylotrophes capables d’oxyder le méthane sont appelées méthanotrophes.

La classification des méthanotrophes Le tableau 12.8 présente un panorama des méthanotrophes. Ces bactéries ont été initialement identifiées grâce à leur morphologie et à la formation de formes de résistance. Néanmoins, elles sont maintenant réparties en deux groupes principaux en fonction de la structure interne des cellules, leur phylogénie et la voie d’assimilation du carbone. Les méthanotrophes de Type I assimilent les composés à un carbone via la voie du cycle du ribulose monophosphate, et sont des gamma-protéobactéries. À l’opposé, les méthanotrophes de Type II assimilent les composés en C1 par l’intermédiaire de la voie de la sérine et sont des alpha-protéobactéries (voir tableau 12.8). Les détails biochimiques de ces voies métaboliques seront abordés dans la section 17.24. Les méthanotrophes de chaque groupe contiennent d’importantes membranes internes impliquées dans l’oxydation du méthane. Chez les méthanotrophes de Type I, les membranes sont organisées en couches de vésicules discoïdales distribuées partout dans la cellule (voir figure 12.15b). Par contre, les espèces de Type II possèdent des membranes distribuées par paires à la périphérie de la cellule (voir figure 12.15a). L’enzyme clé de la méthanotrophie, la méthane mono-oxygénase, est localisée dans ces membranes. Les méthanotrophes de Type I se caractérisent également par l’absence d’un cycle de l’acide citrique complet (l’enzyme α-cétoglutarate deshydrogènase est absente), alors que les organismes de Type II possèdent un cycle complet. L’absence d’un cycle de l’acide citrique complet (voir figure 5.22) diminue de façon importante la capacité d’un organisme à croître en chimio-organotrophie. Si ces réactions ne peuvent être réalisées de façon cyclique, le NADH ne peut



346 Chapitre 12

TABLEAU 12.8


QUELQUES CARACTÉRISTIQUES DES BACTÉRIES MÉTHANOTROPHES Morphologie

Groupe Forme Cycle Membranes d’ARNr de de l’acide b internes 16Sa résistance citriquec

Voie d’assimilation du carboned

Fixation de N2

Methylomonas

Bâtonnets

Gamma

Kystes

I

Incomplet

Ribulose monophosphate

non

50–54

Methylomicrobium

Bâtonnets

Gamma

aucune

I

Incomplet


non

49–-60

Methylobacter

Coques et ellipsoïdes

Gamma

Kystes

I

Incomplet


non

50–-54

Methylococcus

Coques

Gamma

Kystes

I

Incomplet


oui

62–-64

Methylosinus

Bâtonnets

Alpha

Exospores

II

Complet

Serine

oui

63

Methylocystis

Bâtonnets

Alpha

Exospores

II

Complet

Serine

oui

63

e

Bâtonnets

Alpha

Exospores

II

Complet

Serine

oui

61

Organisme

ADN (% G+C)

ou vibrions Methylocella a

Ce sont toutes des Protéobacteries. b Membranes internes : type I, couches de vésicules discoïdales distribuées partout dans la cellule ; type II, membranes par paires distribuées à la périphérie de la cellule. Voir figure 12.15. c Les organismes dont le cycle de l’acide citrique est incomplet ne possèdent pas l’enzyme α-cétoglutarate déshydrogénase et ne peuvent donc pas oxyder l’acétate. d Voir figures 17.59 et 17.60. Contrairement aux autres méthylotrophes, les espèces du genre Methylococcus possèdent les enzymes du cycle de Calvin. e Acidophile, croissance optimale à pH 5.

être régénéré. Ceci empêche la croissance par l’utilisation des composés organiques métabolisés via le cycle de l’acide citrique. Les méthanotrophes de Type I sont donc des méthylotrophes obligatoires.

Écologie et isolement

D.W. Ribbons

Les bactéries méthanotrophes sont largement réparties dans les environnements aquatiques et terrestres, on les trouve dès que des sources stables de méthane sont présentes. Le méthane produit dans les parties anoxiques des lacs remonte

vers la surface au travers de la colonne d’eau et les méthanotrophes sont souvent concentrées dans une bande étroite au niveau de l’oxycline là où le méthane provenant de la zone anoxique rencontre l’oxygène provenant de la zone oxique. Les bactéries méthano-oxydantes jouent ainsi un rôle important dans le cycle du carbone en transformant le méthane issu de la décomposition anaérobie en nouveau matériel cellulaire (et en CO2). Pour réaliser des cultures d’enrichissement de bactéries méthanotrophes, un milieu minéral et une phase gazeuse

FIGURE 12.15 Bactéries méthanotrophes observées en microscopie électronique. a) Une espèce du genre Methylosinus, illustrant le système membranaire de type II. Les cellules ont un diamètre d’environ 0,6 µm. b) Methylococcus capsulatus, illustrant le système membranaire de type I. Les cellules ont un diamètre d’environ 1 µm.

D. W. Ribbons

(a)

(b)



contenant 80 % de méthane et 20 % d’air sont nécessaires. Une fois qu’une croissance nette est obtenue, l’isolement est réalisé par étalement sur un milieu minéral solide et incubation dans des jarres contenant le mélange gazeux air/méthane. Les colonies qui apparaissent sur les boîtes sont typiquement de deux types : les chimio-organotrophes non méthanotrophes qui poussent sur les traces de matière organique contenues dans le milieu qui apparaissent au bout d’1 à 2 jours et les méthanotrophes qui apparaissent au bout d’environ une semaine. De nombreuses méthanotrophes forment des colonies roses dues à la production de différents pigments caroténoïdes, et cette caractéristique peut faciliter leur isolement.

Charles R. Fisher


(a)

Les méthanotrophes sont capables d’oxyder l’ammonium, mais elles sont incapables de croître en chimiolithotrophie en utilisant l’ammonium comme seul donneur d’électrons. Outre l’oxydation du méthane, la méthane mono-oxygénase fonctionne aussi en oxydant l’ammonium, et il existe une interaction compétitive entre les deux substrats. Pour cette raison, l’ammonium est généralement toxique pour les méthanotrophes et leur source d’azote préférée est le nitrate. Il a été proposé que les bactéries méthanotrophes aient évolué à partir des bactéries nitrosantes grâce à des mutations qui auraient transformé l’ammonium mono-oxygénase en une méthane monooxygénase. Le fait que les organismes de ces deux groupes aient élaboré un système de membranes internes (voir section 12.3) et qu’elles soient phylogénétiquement proches étaye cette théorie. De plus, les méthanotrophes contiennent des gènes et synthétisent quelques protéines identiques à celles des procaryotes méthanogènes (productrices de méthane) qui sont toutes phylogénétiquement positionnées chez les Archaea (voir section 13.4). De tels résultats suggèrent que des transferts latéraux (horizontaux) de gènes ont eu lieu entre ces groupes, étant donné que la biochimie du métabolisme du méthane s’est développée il y a extrêmement longtemps. Nous verrons dans les sections 17.17 et 17.24 comment les processus opposés que sont la méthanogenèse et la méthanotrophie sont ainsi reliés.

Les symbiotes méthanotrophes des animaux Les bactéries méthanotrophes et certaines espèces marines de modioles et d’éponges développent des associations symbiotiques. Des modioles vivent à proximité d’émissions d’hydrocarbures (hydrocarbon seeps) sur le plancher océanique, là où du méthane est produit en quantité importante. Les tissus des branchies de modioles consomment du méthane à un taux élevé en présence d’O2. Ces tissus renferment de grandes quantités de procaryotes en forme de coques (voir figure 12.16a). Le symbiote bactérien comporte des empilements de membranes intracytoplasmiques (voir figure 12.16b) caractéristiques des méthanotrophes de type I. Les symbiotes sont situés dans des vacuoles des cellules de l’animal à proximité de la surface des branchies, ce qui assure des échanges gazeux efficaces avec l’eau de mer. Le séquençage des ARN ribosomiques a démontré que ces symbiotes étaient effectivement des méthanotrophes. Le méthane assimilé par les méthanotrophes à l’intérieur des modioles est transporté vers l’animal par l’excrétion de

Charles R. Fisher

Les méthanotrophes et les bactéries nitrosantes

(b) FIGURE 12.16 Symbiotes méthylotrophes de modioles marines. a) Observation en microscopie électronique à faible grossissement de tissus de branchies de modioles vivant à proximité des zones d’émission de fluides froids dans le golfe du Mexique. Notez les symbiotes méthanotrophes (voir flèches) dans les tissus. b) Observation à fort grossissement des tissus branchiaux montrant les méthanotrophes de type I. Remarquez les empilements de membranes (voir flèches). Les méthanotrophes ont un diamètre d’environ 1 µm. Comparez avec la figure 12.15b.

composés organiques. Les symbioses méthanotrophes sont ainsi conceptuellement semblables à celles qui s’établissent entre les chimiolithotrophes sulfo-oxydants et les vers tubicoles hydrothermaux et les bivalves géants (voir section 19.8). Les associations symbiotiques entre animaux et bactéries font donc des cellules procaryotes la base de la chaîne trophique en une étape linéaire.

Contrôlez vos acquis Les méthylotrophes sont des procaryotes capables de croître en utilisant des composés carbonés sans liaison carbone-carbone. Certains méthylotrophes sont également méthanotrophes capables de croître en utilisant du CH4. Il existe deux classes de méthanotrophes, ayant chacune des propriétés structurales et biochimiques communes. Les méthanotrophes vivent dans l’eau et les sols et peuvent aussi être les symbiotes de coquillages marins. •

Quelles sont les différences entre un méthanotrophe et un méthylotrophe ?

•

Quelles caractéristiques différencient les méthanotrophes de type I et les méthanotrophes de type II ?

•

Quels types d’animaux possèdent des symbiotes méthanotrophes et d’où provient le méthane qui leur est nécessaire ?



348 Chapitre 12

m n 12.7


Pseudomonas et pseudomonades

Genres principaux : Pseudomonas, Burkholderia, Zymomonas, Xanthomonas Ce groupe correspond à des bacilles chimio-organotrophes, aérobies, droits ou légèrement incurvés, à flagelles polaires (voir figure 12.17b). Les genres principaux sont : Pseudomonas, Commamonas, Ralstonia et Burkholderia qui seront présentés plus en détail. Les autres genres incluent Xanthomonas, Zoogloea et Gluconobacter. Xanthomonas est un micro-organisme pathogène des plantes, responsable de lésions nécrotiques et caractérisé par la production de pigments jaunes. Zoogloea produit un polymère extracellulaire fibreux qui provoque l’agrégation des cellules en flocs distincts (ce micro-organisme est un des constituants principaux des boues activées de stations d’épuration) [voir section 28.2]. Gluconobacter est caractérisé par son oxydation incomplète des sucres ou des alcools en acides, comme l’oxydation du glucose en acide gluconique ou de l’éthanol en acide acétique (voir section 12.8). Au niveau phylogénétique, les pseudomonades sont regroupées dans le phylum des Protéobactéries (voir tableau 12.1).

Les caractéristiques des pseudomonades Les caractères utilisés pour la distinction des membres du groupe des pseudomonades sont indiqués dans le tableau 12.9. Les caractéristiques minimales requises pour l’appartenance

d’une bactérie à ce groupe sont également précisées dans ce tableau. Les principaux caractères d’identification sont l’absence de formation de gaz à partir du glucose et l’oxydase positive, qui permettent de distinguer les pseudomonades des entérobactéries (voir section 12.11). Les espèces du genre Pseudomonas et des genres proches sont définies sur la base de la phylogénie et de diverses caractéristiques physiologiques, décrites dans les tableaux 12.10 et 12.11. Les pseudomonades, chimio-organotrophes, ont des besoins nutritionnels très limités, se développent à pH neutre et à des températures mésophiles. La capacité à utiliser une très grande variété de composés organiques comme sources de carbone et d’énergie est une des propriétés saisissantes de nombreuses espèces de pseudomonades. Certaines espèces utilisent plus de cent composés différents et rares sont celles à en utiliser moins de vingt. Exemple de cette polyvalence, une même souche de Burkholderia cepacia peut métaboliser de nombreux sucres, acides gras, acides dicarboxyliques et tricarboxyliques, alcools, polyols, glycols, composés aromatiques, acides aminés et amines différents, plus des composés organiques divers n’entrant dans aucune de ces catégories. D’un autre côté, les pseudomonades ne possèdent pas, en général, les enzymes d’hydrolyse des polymères en monomères. Ces pseudomonades adaptables au niveau nutritionnel possèdent de nombreux opérons inductibles (voir section 8.5) ; en effet le catabolisme de substrats organiques peu communs exige souvent l’activité de plusieurs enzymes différentes.

Glucose ATP

FIGURE 12.17 Colonies typiques, morphologie des cellules et voie biochimique commune des pseudomonades. a) Photographie de colonies de Burkholderia cepacia sur milieu gélosé. b) Préparation par réplique observée au MET de Pseudomonas sp. Les cellules mesurent environ 1 µm de diamètre. c) Voie d’Entner-Doudoroff : voie principale du catabolisme de glucose chez les pseudomonades.

6-Phosphogluconate NADP+ NADPH COOH H C OH HO C H

Acide 6-phosphogluconique

H C OH H C OH H2C OPO32– Déshydrase COOH James Shapiro

C O H C H H C OH

(a) CDPG aldolase

Arthur Kelman

Pyruvate

(b)

2-Céto-3-désoxy-6phosphogluconate (CDPG)

H C OH H2C OPO32–

COOH

H C O

C O

H C OH

CH3

Glycéraldéhyde 3-phosphate

H2C OPO32– Glycolyse Pyruvate + 2ATP

(c)




TABLEAU 12.9

CARACTÉRISTIQUES DES PSEUDOMONADES

Caractéristiques générales Bacilles droits ou incurvés mais pas vibrioïdes ; taille 0,5 à 1 µm par 1,5 à 4 µm ; non sporulés ; Gram négatif ; à flagelles polaires : uniques ou multiples ; aucun bourgeon, gaine ou annexe ; métabolisme respiratoire, jamais fermentaire, bien qu’elles puissent produire de petites quantités d’acide à partir du glucose en conditions aérobies ; utilisent les composés organiques de faible poids moléculaire, pas les polymères ; certains sont chimiolithotrophes, utilisant H2 ou CO en tant qu’unique donneur d’électrons ; certains peuvent utiliser les nitrates comme accepteur d’électrons en conditions anaérobies ; certains peuvent utiliser l’arginine comme source d’énergie en conditions anaérobies. Caractéristiques minimales pour l’identification Gram négatif, droits ou légèrement incurvés ; non sporulés ; mobiles (toujours) ; flagelles polaires (coloration des flagelles) ; milieu d’oxydation-fermentation du glucose : tube ouvert, production d’acide ; tube fermé, pas de production d’acide ; pas de gaz produit à partir du glucose (ce qui les distingue facilement des entérobactéries et d’Aeromonas) ; oxydase, presque toujours positive (les entérobactéries sont oxydase négative) ; catalase toujours positive ; absence de pigments photosynthétiques (ce qui les distingue des bactéries pourpres non sulfureuses) ; indole négatif ; rouge de méthyle négatif ; Voges-Proskauer négatif (pour la présentation de la majorité de ces tests biochimiques, voir section 24.2).

Les pseudomonades sont des micro-organismes écologiquement importants dans les sols et l’eau et sont probablement responsables de la dégradation de nombreux composés solubles issus de la décomposition des végétaux et des animaux dans les habitats oxyques. Ils sont également capables de dégrader de nombreux composés xénobiotiques (non naturels), tels que des pesticides et d’autres produits chimiques toxiques, et sont donc des agents importants de bioremédiation de l’environnement. Beaucoup de pseudomonades, comme diverses autres Bacteria Gram négatif, métabolisent le glucose par l’intermédiaire de la voie d’Entner-Doudoroff (voir figure 12.17c). Les deux enzymes principales de cette voie sont la 6-phosphogluconate déshydrase et la 2-ceto-3-désoxy-6-phosphogluconate aldolase (voir figure 12.17c). Une recherche de ces enzymes chez diverses bactéries a mis en évidence leur absence chez les bactéries Gram positif et leur présence, en général, chez les bactéries des genres Pseudomonas, Rhizobium, Agrobacterium, Zymomonas ainsi que chez d’autres bactéries Gram négatif.

Les pseudomonades pathogènes Un certain nombre de pseudomonades sont pathogènes (voir tableau 12.11). Parmi les pseudomonades fluorescentes, l’espèce Pseudomonas aeruginosa est fréquemment associée à des infections des tractus urinaires et respiratoires chez l’homme. Les infections à Pseudomonas aeruginosa

sont également fréquentes chez les patients traités pour des brûlures graves ou d’autres traumatismes de la peau ainsi que chez les personnes souffrant de fibrose cystique (voir section 31.7). Pseudomonas aeruginosa n’est pas un parasite obligatoire. En fait, c’est un pathogène opportuniste, provoquant des infections chez les individus affaiblis. En plus des infections urinaires, il peut également causer des infections systémiques, le plus souvent dans des cas de lésions étendues de la peau. P. aeruginosa est naturellement résistant à la majorité des antibiotiques les plus employés ; la chimiothérapie est donc souvent difficile. La résistance est due à un plasmide de transfert de résistance (plasmide R) [voir sections 10.9 et 20.12], qui porte des gènes codant des protéines capables de désactiver divers antibiotiques. Pseudomonas aeruginosa est généralement retrouvé dans l’environnement hospitalier et peut facilement infecter des patients déjà traités pour d’autres pathologies (voir section 25.7). La polymyxine, antibiotique inusité en thérapie humaine en raison de sa toxicité, est efficace contre P. aeruginosa et est employée dans certaines circonstances. Certaines espèces de Pseudomonas, Ralstonia et Burkholderia ainsi que le genre Xanthomonas sont des pathogènes bien connus des plantes (phytopathogènes) [voir tableau 12.11]. Dans de nombreux cas, ces micro-organismes sont si bien adaptés à l’environnement des plantes qu’ils sont rarement isolés dans d’autres habitats, y compris dans les sols. Ces phytopathogènes résident fréquemment sur des plantes non hôtes (pour lesquelles les symptômes de la maladie ne sont pas visibles) et de là sont transmis aux plantes hôtes où l’infection est initiée. Les symptômes de la maladie sont très variables selon le phytopathogène et la plante hôte. Le micro-organisme pathogène libère des toxines, des enzymes lytiques et des facteurs de croissance de plantes, ainsi que d’autres substances qui détruisent ou déforment les tissus végétaux. Dans de nombreux cas, les symptômes de la maladie permettent d’identifier le phytopathogène. Ainsi, Pseudomonas syringae est typiquement isolé de feuilles montrant des lésions de type chlorose (jaunissement), alors que P. marginalis est un pathogène typique de la « pourriture molle », infectant les pousses et les tiges mais rarement le feuillage.

Zymomonas Le genre Zymomonas se compose de bacilles de grande taille, Gram négatif, qui effectuent une fermentation vigoureuse des sucres en éthanol. Bien que strictement fermentaire, Zymomonas est proche des pseudomonades au niveau phylogénétique et utilise la voie d’Entner-Doudoroff (voir figure 12.17c). Zymomonas est fréquemment impliqué dans la fermentation alcoolique de diverses sèves végétales. Ainsi, dans les régions tropicales d’Amérique du Sud, d’Amérique centrale, d’Afrique et d’Asie, cet organisme occupe, dans l’industrie des boissons fermentées, une position semblable à celle de Saccharomyces cerevisiae (levure) en Amérique du Nord et en Europe. Zymomonas est, par exemple, impliqué dans la fermentation alcoolique de l’agave au Mexique pour fabriquer une boisson appelée pulque et dans la fermentation de la sève de palme dans d’autres régions



350 Chapitre 12


TABLEAU 12.10

SOUS-GROUPES ET CARACTÉRISTIQUES DES PSEUDOMONADES

Groupe


Sous-groupe fluorescent

Gamma

ADN (% G+C)

Caractéristiques La plupart produisent des pigments vert jaunâtre fluorescents hydrosolubles ; ne forment pas de β-polyhydroxybutyrate ; un seul groupe d’homologie d’ADN

Pseudomonas aeruginosa

Production de Pyocyanine ; croissance jusqu’à 43 ˚C ; flagelle polaire unique ; capable de dénitrification

67

Pseudomonas fluorescens

Ne produit pas de pyocyanine et ne se développe pas à 43 ˚C ; touffe de flagelles polaires

59–61

Pseudomonas putida

Semblable à P. fluorescens mais ne liquéfie pas la gélatine et se développe sur benzylamine

60–63

Pseudomonas syringae

Pas d’arginine dihydrolase ; oxydase négative ; pathogène des plantes

58–60

Pseudomonas stutzeri

Saprophyte du sol ; denitrificateur efficace ; non fluorescent

62

Sous-groupe Acidovorans

Bêta

Non pigmentés ; forment du β-polyhydroxybutyrate ; formant des touffes de flagelles polaires ; n’utilisent pas les hydrates de carbone ; un seul groupe d’homologie d’ADN

Commamonas acidovorans

Utilise l’acide muconique comme seule source de carbone et donneur d’électrons

67

Commamonas testosteroni

Utilise la testostérone comme unique source de carbone

62

Pas de pigments fluorescents ; touffe de flagelles polaires ; forment du β-polyhydroxybutyrate ; un seul groupe d’homologie d’ADN

62

Polyvalence nutritionnelle extrême ; certaines souches sont

67

Sous-groupe Pseudomallei-cepacia

Bêta

Burkholderia cepacia

pathogènes des plantes Burkholderia pseudomallei

Cause la mélioïdose chez les animaux ; adaptable au niveau nutritionnel

69

Burkholderia mallei

Responsable de la morve chez les animaux ; immobile ; nutritionnellement limité

69

Sous-groupe Diminutavesicularis

Alpha

Flagelle unique à très courtes ondulations ; exigeants en vitamines (pantothénate, biotine, B12) Non pigmenté ; n’utilise pas les sucres

66–67

Pigment caroténoïde ; utilise les sucres

66

Ralstonia solanacearum

Pathogène des plantes

66–68

Ralstonia saccharophila

Chimiolithotrophe en présence d’H2 ; digère l’amidon

Brevundimonas diminuta Brevundimonas vesicularis Sous-groupe Ralstonia

Stenotrophomonas maltophilia a

Bêta

Besoin en méthionine ; n’utilise pas d’azote ; oxydase négative

NO3–

comme source

69 67

Toutes les pseudomonades appartiennent aux Protéobactéries (voir tableau 12.1).

tropicales. Il est également impliqué dans la fermentation alcoolique de jus de canne à sucre et de miel. Bien que Zymomonas soit rarement l’unique micro-organisme impliqué dans ces fermentations alcooliques, il est souvent prédominant et est probablement responsable de la production de la majeure partie de l’éthanol de ces boissons. Zymomonas est aussi responsable d’altération de produits à base de fruits, tels que les cidres de pomme et de poire, et est également un constituant de la flore bactérienne de la bière corrompue.

Zymomonas se distingue de Pseudomonas par son métabolisme fermentatif, sa nature microaérophile à anaérobie, l’absence d’oxydase et d’autres caractéristiques de taxinomie moléculaire. Il ressemble également aux bactéries acétiques (voir section 12.8) et est souvent retrouvé associé à ces micro-organismes dans la nature. Ceci est intéressant car, comme la levure, Zymomonas fermente le glucose en éthanol tandis que les bactéries acétiques oxydent l’éthanol en acide acétique. Ainsi, les bactéries acétiques dépendent de l’activité de la levure et de Zymomonas pour la production de leur substrat de croissance : l’éthanol.



12.8 Bactéries acétiques 351

TABLEAU 12.11

PSEUDOMONADES PATHOGÈNES

Espèces

Pathologies liées

Pathogènes des animaux Pseudomonas aeruginosa

Pathogène opportuniste, particulièrement dans les hôpitaux ; chez les patients présentant des maladies métaboliques, hématologiques et malignes ; infections acquises à l’hôpital (nosocomiales) lors des poses de cathéters, des trachéotomies, des piqûres lombaires et des injections intraveineuses ; chez les patients subissant un traitement prolongé avec des agents immunosuppressifs, des corticostéroïdes, des antibiotiques et des rayons ; peut souiller les plaies chirurgicales, les abcès, les brûlures, provoquer des infections de l’oreille et des poumons chez les patients sous antibiothérapie ; fibrose cystique ; micro-organisme originaire du sol


Rarement pathogène, ne se développant pas bien à 37 ˚C ; peut contaminer et se développer dans le sang et les produits sanguins réfrigérés

Stenotrophomonas maltophilia

Ubiquitaire, micro-organisme libre pathogène nosocomial commun

Burkholderia cepacia

Cause la putréfaction des bulbes d’oignon ; a été également isolé chez des humains et dans des environnements d’importance médicale

Burkholderia pseudomallei

Responsable de la mélioïdose, maladie endémique chez les animaux et les humains dans le SudEst asiatique

Burkholderia mallei

Responsable de la morve, maladie des chevaux parfois transmissible à l’homme

Pseudomonas stutzeri

Fréquemment isolé à partir de sources humaines et environnementales ; peut vivre en tant que saprophyte dans le corps

Pathogènes des végétaux Ralstonia solanacearum

Cause le flétrissement du feuillage de nombreuses plantes cultivées (par exemple : pomme de terre, tomate, tabac, arachide)

Pseudomonas syringae

Attaque le feuillage, entraînant la chlorose et des lésions nécrotiques sur les feuilles ; rarement retrouvé à l’état libre dans le sol

Pseudomonas marginalis

Responsable de la pourriture molle de divers végétaux ; espèces pectinolytiques actives

Xanthomonas campestris

Cause des lésions nécrotiques sur le feuillage, les tiges et les fruits ; provoque également le flétrissement et la putréfaction des tissus ; rarement retrouvé à l’état libre dans le sol

m n

12.8 Bactéries acétiques Genres principaux : Acetobacter, Gluconobacter

À l’origine, les bactéries acétiques étaient définies comme un groupe de bacilles Gram négatif, aérobies, mobiles, réalisant une oxydation incomplète des alcools et des sucres, menant à l’accumulation d’acides organiques comme produits finaux. Lorsque le substrat est l’éthanol, de l’acide acétique est produit, ce qui a donné leur nom aux bactéries acétiques. Les bactéries acétiques ont une tolérance relativement élevée aux conditions acides ; la plupart des souches peuvent se développer à des valeurs de pH inférieures à 5. Cette tolérance à l’acidité semble bien sûr essentielle pour un micro-organisme produisant des quantités importantes d’acide. Les bactéries acétiques constituent un groupe hétérogène, comptant des micro-organismes à flagelles polaires et péritriches. Les espèces à flagelles polaires sont classées dans le genre Gluconobacter, tandis que celles à flagelles péritriches sont regroupées dans le genre Acetobacter. Toutes les bactéries acétiques connues se regroupent au niveau phylogénétique dans les alpha-protéobactéries (voir tableau 12.1). En plus du type de flagellation, Acetobacter diffère de Gluconobacter par sa capacité à oxyder l’acide acétique qu’il forme ;

cette différence est liée à la présence d’un cycle de l’acide citrique complet. Gluconobacter, qui ne possède pas le cycle complet, ne peut oxyder l’acide acétique, tandis qu’Acetobacter, qui possède toutes les enzymes du cycle, peut l’oxyder.

Écologie et utilisations industrielles Les bactéries acétiques sont généralement retrouvées dans les jus alcoolisés. Elles peuvent ainsi être isolées dans des jus de fruits fermentés tels que le cidre brut, le vin ou la bière. Les colonies des bactéries acétiques peuvent être identifiées sur gélose à l’éthanol et au CaCO3, car l’acide acétique produit cause une clarification par solubilisation du CaCO3 insoluble (voir figure 12.18). Des cultures de bactéries acétiques sont employées dans la production commerciale du vinaigre (voir section 30.11). En plus de l’éthanol, ces micro-organismes effectuent une oxydation incomplète de composés organiques tels que certains alcools supérieurs et sucres. Par exemple, le glucose est oxydé spécifiquement en acide gluconique, le galactose en acide galactonique, l’arabinose en acide arabinonique et ainsi de suite. Cette propriété est exploitée pour la fabrication d’acide ascorbique (vitamine C). L’acide ascorbique peut être formé à partir du sorbose, mais le sorbose est difficile à synthétiser par voie chimique. Il est, cependant, facilement disponible pour les bactéries acétiques, qui oxydent le sorbitol (alcool aisément



352 Chapitre 12


TABLEAU 12.12

GENRES DES BACTÉRIES LIBRES, AÉROBIES, FIXATRICES D’AZOTE Genre/ADN (% G+C)

Caractéristiques

T. D. Brock

Gamma-protéobactéries

FIGURE 12.18 Colonies d’Acetobacter aceti sur gélose au carbonate de calcium contenant de l’éthanol comme source d’énergie. Notez l’éclaircissement autour des colonies, dû à la solubilisation du carbonate de calcium (CaCO 3) par l’acide acétique produit par les bactéries.

obtenu à partir de sucre) uniquement en sorbose. Ce procédé est appelé biotransformation (voir section 30.8). Une autre propriété intéressante de certaines bactéries acétiques est leur capacité à synthétiser de la cellulose. La cellulose formée ne diffère pas de manière significative de la cellulose des plantes, excepté le fait qu’elle soit pure et non mélangée à d’autres polymères comme les hémicelluloses, la pectine ou les lignines végétales. La cellulose des bactéries acétiques se forme comme une matrice à l’extérieur de la paroi des cellules et emprisonne les cellules dans une masse enchevêtrée de microfibrilles de cellulose. Lorsque ces bactéries acétiques se développent dans un récipient sans agitation, elles forment en surface une pellicule de cellulose dans laquelle elles se développent. Puisque ces bactéries sont aérobies strictes, la capacité à former une telle pellicule peut être un moyen de rester en surface du liquide là où l’oxygène est facilement disponible.

12.9 Bactéries aérobies, libres, m n fixatrices d’azote

Bacille de grande taille ; produit des kystes ; principalement retrouvé dans les sols neutres à alcalins

Azotobacter (63-67)

Bacille de grande taille ; pas de kystes ; principalement aquatique

Azomonas (52-59)

Alpha-protéobactéries Bacille microaérophile ; associé aux végétaux

Azospirillum (69-71)

Bacille piriforme avec un corps lipidique de grande taille à chaque extrémité ; production abondante de matière visqueuse ; habite les sols acides

Beijerinckia (54-59)

Bacilles ; forment des colonies rêches et froissées

Derxia (69-73)

Bêta-protéobactéries Petites cellules incurvées ; pas de kystes

Azoarcus (65)

Cellules incurvées très minces ; pas de kystes

Azovibrio (64-65)

Bacilles très fins à vibrions ; pas de kystes Azospira (65-66) Cellules enroulées jusqu’à 50 µm de long ; pas de kystes

Azonexus (65-66)

2 à 4 µm ou plus. Le polymorphisme est commun et un grand nombre de formes et de tailles de cellules ont été décrites. Quelques souches sont mobiles grâce à des flagelles péritriches. Sur les milieux contenant des hydrates de carbone, des capsules ou des films visqueux abondants sont produits par ces bactéries (voir figures 12.20 et 17.71).

Taxinomie Les principales bactéries libres fixatrices d’azote étudiées incluent les genres Azotobacter, Azospirillum et Beijerinckia. Les cellules d’Azotobacter sont grandes, beaucoup d’isolats atteignant presque la taille de levures, avec des diamètres de

H. L. Sadoff

Certains micro-organismes vivent dans le sol et sont capables de fixer l’azote en conditions aérobies (voir tableau 12.12). Le genre Azotobacter est formé de bacilles de grande taille, Gram négatif, aérobies stricts, capables de fixer l’azote sous forme asymbiotique (voir figure 12.19). La première espèce de ce genre fut découverte par le microbiologiste hollandais Martinus Beijerinck au début du XXe siècle (voir section 1.7). Beijerinck employa une technique d’enrichissement par culture aérobie dans un milieu contenant de l’N2 (air) mais exempt de source d’azote combiné (voir section 18.1 et figure 18.1). Au niveau phylogénétique, la plupart des bactéries libres fixatrices d’azote sont des alpha-, bêta-, ou gamma-protéobactéries (voir tableau 12.12). (a)

H. L. Sadoff

Genres principaux : Azotobacter, Azomonas

(b)

FIGURE 12.19 Azotobacter vinelandii. a) Cellules végétatives et b) kystes observés par microscopie à contraste de phase. Une cellule mesure environ 2 µm de diamètre, un kyste environ 3 µm. Comparez avec la figure 1.14b.



12.9 Bactéries aérobies, libres, fixatrices d’azote 353

fixatrice d’azote de forme bacille à spiralée, qui s’associe symbiotiquement de manière non spécifique avec diverses plantes, en particulier le maïs (voir tableau 12.12), est exclue de ce groupe.

Azotobacter et nitrogénases alternatives

(b) FIGURE 12.20 Exemples de production de substance visqueuse par des bactéries libres fixatrices de N 2. a) Cellules de Derxia gummosa entourées de substance visqueuse. Les cellules mesurent environ 1 à 1,2 µm. b) Colonies de Beijerinckia sp. en croissance sur un milieu contenant des hydrates de carbone. Notez l’aspect surélevé et miroitant des colonies dû à l’abondant matériel capsulaire.

Malgré le fait qu’Azotobacter soit aérobie strict, sa nitrogénase, l’enzyme qui catalyse la fixation biologique de l’N2 (voir section 17.28), est, elle, sensible à l’oxygène. Le taux respiratoire élevé et la production de matériel capsulaire abondant, caractéristiques d’Azotobacter, pourraient aider à la protéger de l’O2. Azotobacter peut se développer sur une grande variété d’hydrates de carbone, d’alcools et d’acides organiques. Le métabolisme des composés carbonés est strictement oxydatif et des acides ou d’autres produits de fermentation sont rarement produits. Tous les membres du genre fixent l’azote, mais la croissance est également possible sur les formes simples d’azote combiné : ammoniaque, urée et nitrate. Azotobacter peut former des formes de repos appelées kystes. Comme les endospores bactériennes, les kystes d’Azotobacter (voir figure 12.19b) présentent une respiration endogène négligeable et sont résistants à la dessiccation, à la désintégration mécanique, aux ultra-violets et aux radiations ionisantes. Cependant, contrairement aux endospores, les kystes ne sont pas particulièrement thermorésistants et ne sont pas complètement dormants puisqu’ils oxydent rapidement les sources d’énergie exogènes. Les autres représentants des bactéries libres fixatrices de N2 incluent le genre Azomonas, constitué de grands bâtonnets ressemblant à Azotobacter sauf qu’ils ne produisent pas de kystes et sont principalement aquatiques, ainsi que les genres Beijerinckia (voir figure 12.20b) et Derxia (voir figure 12.21), genres se développant bien dans les sols acides. Azospirillum, bactérie

Contrôlez vos acquis Les pseudomonades comprennent de nombreux bacilles Gram négatif, aérobies chimio-organotrophes ; beaucoup d’espèces sont étroitement liées au niveau phylogénétique. Les bactéries acétiques sont également reliées au niveau phylogénétique aux pseudomonades et sont caractérisées par leur capacité à oxyder l’éthanol en acétate en conditions aérobies. •

Comparez et opposez les pseudomonades, Azotobacter et les bactéries acétiques en termes de besoins en O2 et en azote, donneurs d’électrons, pathogénicité et habitats.

•

Comparez et opposez Acetobacter et Gluconobacter dans tous les domaines possibles.

Corps lipidiques bipolaires

(a)

J. H. Becking

J. H. Becking

(a)

Michael K. Ochman

J. H. Becking

Le processus de fixation biologique de l’azote ainsi que l’importance centrale des métaux, molybdène (Mo) et fer (Fe), pour l’enzyme nitrogénase sont présentés dans la section 17.28. L’espèce Azotobacter chroococcum a été la première bactérie fixatrice d’azote pour laquelle a été mise en évidence la capacité à croître sur N2 en absence de molybdène. Il a été montré, en premier lieu chez A. chroococcum, qu’à la place de la nitrogénase au Mo, deux « nitrogénases alternatives » contenant soit du vanadium (v) et du fer ou uniquement du fer pouvaient être synthétisées dans certaines conditions de croissance (en absence de Mo). D’autres investigations ont prouvé que ces systèmes de nitrogénases « de secours » sont largement distribués parmi les bactéries fixatrices d’azote, y compris chez les Archaea, pour lesquelles il existe quelques espèces fixant le N2.

(b)

FIGURE 12.21 Observation au microscope à contraste de phase de deux genres de bactéries libres, tolérantes à l’acide et fixatrices d’azote. a) Beijerinckia indica. Les cellules sont grossièrement piriformes, d’environ 0,8 µm de diamètre et contiennent un large globule de β-polyhydroxybutyrate (voir section 4.11) à chaque extrémité. b) Derxia gummosa. Les cellules mesurent environ 1 µm de diamètre.



354 Chapitre 12


T. D. Brock

12.10 Neisseria, Chromobacterium m n et genres apparentés Genres principaux : Neisseria, Chromobacterium

TABLEAU 12.13

CARACTÉRISTIQUES DES GENRES GRAM NÉGATIFa

H N

(a)

O

O

T. D. Brock

Ce groupe de bêta- et gamma-protéobacteries rassemble des micro-organismes divers, proches au niveau phylogénétique ainsi que par les caractères de coloration de Gram et de morphologie, l’absence de mobilité et le métabolisme aérobie. Les genres Neisseria, Moraxella, Branhamella, Kingella et Acinetobacter peuvent être différenciés d’après les caractères décrits dans le tableau 12.13. Dans le genre Neisseria, les cellules sont toujours des coques (voir figures 12.22a et 26.28), tandis que les cellules des autres genres sont des bacilles, devenant coccoïdes en phase stationnaire de croissance. Ceci a amené à la désignation de ces bactéries comme coccobacilles. Les bactéries des genres Neisseria, Kingella et Moraxella sont généralement isolées chez les animaux et certaines d’entre elles sont pathogènes, en particulier Neisseria gonorrheae, agent de la gonorrhée (voir sections 24.1 et 26.12). Les espèces d’Acinetobacter sont des micro-organismes communs du sol et de l’eau, bien qu’elles soient de temps en temps retrouvées comme parasites des animaux ou impliquées dans quelques infections nosocomiales (associées à l’environnement hospitalier). Certaines souches de Moraxella et Acinetobacter possèdent une propriété intéressante : la mobilité par contraction, présentée comme de brefs mouvements translocatifs ou « sauts » couvrant des distances d’environ 1 à 5 µm. Ces bactéries possèdent des pili spéciaux (voir section 4.10) qui facilitent ce procédé de mouvement.

N H

OH N H

(b)

FIGURE 12.22 Neisseria et Chromobacterium. a) Observation au microscope électronique à transmission de cellules de Neisseria gonorrhoeae montrant les arrangements typiques en diplocoques, b) Colonie de grande taille de Chromobacterium violaceum. Le colorant violet est un composé aromatique appelé violacéine.

Chromobacterium est un proche parent de Neisseria au niveau phylogénétique, mais il a une morphologie de type bacille ressemblant aux pseudomonades ou aux entérobactéries. La plus connue des espèces de Chromobacterium est C. violaceum, bactérie pigmentée en violet (voir figure 12.22b), retrouvée principalement dans les sols et l’eau, ainsi qu’occasionnellement dans les infections purulentes humaines ou animales. C. violaceum et quelques autres chromobactéries produisent de la violacéine, pigment violet (voir figure 12.22b), insoluble dans l’eau et qui possède des propriétés de type antibiotique. Il est produit uniquement dans les milieux contenant du tryptophane. Comme les entérobactéries, Chromobacterium est aérobie facultatif et se développe par fermentation des sucres et par respiration sur d’autres sources de carbone variées.

DE COQUES

Caractéristiques

Genre / ADN (% G+C)

I. Oxydase positive, sensibles à la pénicilline Coques ; nutrition complexe, utilisent les hydrates de carbone, aérobies stricts ; bêta-protéobactéries ou gamma-protéobactéries

Neisseria (49-55) Moraxella (40-46)

Bacilles ou coques ; généralement aucun besoin en facteur de croissance et pas d’utilisation des hydrates de carbone ; ne possèdent pas de flagelle, mais quelques espèces présentent une mobilité par contraction ; beaucoup sont commensales ou pathogènes d’animaux ; bêta-protéobactéries

Branhamella (40-46)

Kingella (47-55)

II. Oxydase négative, résistants à la pénicilline Quelques souches peuvent utiliser une gamme restreinte de sucres, et certaines présentent une mobilité par contraction ; saprophytes dans le sol, l’eau, et les eaux d’égout ; gamma-protéobactéries a

Tous appartiennent aux Protéobactéries.

Acinetobacter (38-47)

12.11 Entérobactéries m n Genres principaux : Escherichia, Salmonella, Proteus, Enterobacter Les entérobactéries correspondent à un groupe relativement homogène au niveau phylogénétique parmi les gammaprotéobactéries. Au niveau phénotypique, ce sont des bacilles non sporulés, Gram négatif, aérobies facultatifs, immobiles ou mobiles par flagelles péritriches (voir figure 12.23a). Les entérobactéries sont également oxydase négative, ont des besoins nutritionnels relativement simples et fermentent les sucres en divers produits finaux. Les caractéristiques phénotypiques utilisées pour séparer les entérobactéries des autres bactéries de morphologie et physiologie semblables sont données dans le tableau 12.14. Parmi les entérobactéries, beaucoup d’espèces sont pathogènes pour les humains, les animaux ou les plantes ; d’autres ont une importance industrielle. La plus connue de toutes les espèces bactériennes est assurément Escherichia coli (voir section 10.19). En raison de l’importance médicale des entérobactéries, un nombre extrêmement important d’isolats ont été étudiés et caractérisés, et un bon nombre de genres distincts ont



12.11 Entérobactéries 355

TABLEAU 12.14

CARACTÉRISTIQUES DÉFINISSANT LES ENTÉROBACTÉRIES

Arthur Kelman

Caractéristiques générales

(a)

O

H3C C COO–

Pyruvate

Thiamine pyrophosphate (TPP)

CO2 H

O

H3C C TPP

H3C C COO–

+

Pyruvate

OH

Bacilles Gram négatif droits ; mobiles par flagelles péritriches, ou immobiles ; non sporulés ; aérobies facultatifs, produisant de l’acide à partir du glucose ; pas de besoin en sodium, ni de stimulation ; catalase positive ; oxydase négative ; réduisent habituellement les nitrates en nitrite (pas en N2) ; ARNr 16S de gamma-protéobactéries (voir tableau 12.1). Tests clés pour distinguer les entérobactéries des autres bactéries de morphologie semblablea Recherche de l’oxydase : entérobactéries toujours négatives – sépare les entérobactéries des bactéries oxydase positive des genres Pseudomonas, Aeromonas, Vibrio, Alcaligenes, Achromobacter, Flavobacterium, Cardiobacterium, qui peuvent présenter une morphologie semblable ; nitrate réduit seulement en nitrite (recherche des nitrites après croissance) – permet de distinguer les entérobactéries des bactéries qui réduisent les nitrates en N2 (détection de la formation de gaz), comme Pseudomonas et de nombreuses autres bactéries oxydase positive ; capacité à fermenter le glucose : distingue les entérobactéries des bactéries aérobies strictes. a

TPP

Voir section 24.2 et figure 24.7.

CH3

C O H3C C COO–

α-Acétolactate

OH CO2 CH3 Acétoïne

C O H3C C H OH NADH

Les types fermentaires chez les entérobactéries

CH3 H C

OH

2,3-Butanediol

H3C C H OH (b) Stœchiométrie : 2 pyruvate + NADH

été définis. Malgré une parenté génétique marquée parmi les entérobactéries, comme le prouvent une haute homologie d’ADN (voir section 11.11) et des recombinaisons génétiques fréquentes, des genres séparés sont maintenus, en grande partie pour des raisons pratiques, en particulier l’identification en microbiologie clinique. En effet, comme ces micro-organismes sont fréquemment isolés chez des malades, des moyens d’identification sont nécessaires afin de faciliter un traitement rapide, et les caractéristiques phénotypiques sont traditionnellement très importantes pour distinguer les genres d’entérobactéries.

2 CO2 + butanediol

(c) FIGURE 12.23 Production de butanediol. a) Observation en microscopie électronique d’une préparation par réplique de cellules d’Erwinia carotovora, entérobactérie productrice de butanediol. Les cellules mesurent environ 0,8 µm. Notez les flagelles péritriches (voir section 4.14). b) Voie biochimique de formation du butanediol à partir de deux molécules de pyruvate par les bactéries réalisant la fermentation butanediolique. c) Stœchiométrie globale. Notez que la production d’une molécule de butanediol nécessite un seul NADH, mais deux molécules de pyruvate.

Une des caractéristiques taxinomiques importantes pour la séparation des divers genres d’entérobactéries est le type et la proportion des produits de la fermentation anaérobie du glucose. Deux modèles sont identifiés, la fermentation acides mixtes et la fermentation butanediolique (voir figure 12.24). Dans la fermentation acide mixte, trois acides sont formés en quantité significative : acétique, lactique et succinique ; de l’éthanol, du CO2 et de l’hydrogène sont également formés, mais pas de 2,3-butanediol. Dans la fermentation butanediolique, une plus faible quantité d’acides est formée et le butanediol, l’éthanol, le CO2 et l’H2 sont les produits principaux. Lors d’une fermentation acide mixte, des quantités égales de CO2 et d’H2 sont produites, alors que lors d’une fermentation butanediolique, le CO2 produit est largement majoritaire par rapport à l’H2. Ceci parce qu’en fermentation acide mixte, le CO2 est produit uniquement à partir de l’acide formique au moyen du système d’enzymes de l’hydrogène formiate lyase : HCOOH → H2 + CO2 Cette réaction a pour conséquence la production de quantités égales de CO2 et H2. En fermentation butanediolique, du CO2



356 Chapitre 12


Cheryl L. Broadie et John Vercillo

Cheryl L. Broadie et John Vercillo

FIGURE 12.24 Fermentations (a) Fermentation acide mixte (ex. : Escherichia coli) Produits typiques (quantités molaires) entériques. Distinction entre les Glycolyse fermentations a) acide mixte et Acide : neutre Glucose Pyruvate Lactate 4:1 b) butanediolique chez les entéroCO2 : H2 bactéries. Les flèches à traits pleins CO2 1: 1 indiquent les réactions menant aux Succinate produits principaux. Les flèches en pointillés indiquent les produits mineurs. La photo du haut montre la production Éthanol Acétyl CoA d’acide (couleur jaune) et de gaz (dans la Acétate cloche de Durham) d’une culture d’E. coli + (le tube pourpre est un témoin non CO2 Formiate inoculé). La photo du bas montre la H2 coloration rouge-rose du test de VogesProskauer (VP), qui indique la production (b) Fermentation butanediolique (ex. : Enterobacter) Produits typiques (quantités molaires) de butanediol, après croissance d’Enterobacter aerogenes. Le tube à Acide : neutre 2,3-Butanediol + CO2 gauche (jaune) est un témoin non 1:6 CO2 : H2 inoculé. Notez la différence principale Éthanol 5:1 entre ces deux voies de production, la production de butanediol menant à des Lactate rendements en CO2 nettement plus Glycolyse Glucose Pyruvate importants. En effet, la production Succinate d’une molécule de butanediol à partir de deux pyruvates régénère un seul NADH (voir le cheminement dans la Acétate figure 12.23b et c), 0,5 molécule d’éthanol doit donc être engendrée pour CO2 + H2 chaque butanediol produit, afin de régénérer le deuxième NADH réduit lors de la glycolyse.

et de l’H2 sont également produits à partir de l’acide formique, mais deux molécules additionnelles de CO2 sont produites lors de la formation de chaque molécule de 2,3-butanediol (voir figure 12.23b).

L'dentification des entérobactéries Une grande variété de tests diagnostic et de milieux de différenciation est utilisée pour séparer les divers genres dans les deux grands groupes d’entérobactéries (voir tableaux 24.2 et 24.3). Sur la base de ces derniers et d’autres tests, les genres peuvent être définis conformément aux tableaux 12.15 et 12.16. En raison de la proximité génétique des entérobactéries, leur identification sans équivoque présente souvent une difficulté considérable. Dans les laboratoires cliniques, l’identification est souvent basée sur l’analyse informatisée d’un grand nombre de tests effectués en utilisant des kits miniaturisés de diagnostic rapide et des sondes immunologiques ou à acides nucléiques (voir figure 24.1), en prenant en compte les réactions variables des souches inhabituelles. Des méthodes moléculaires peuvent être employées comme alternative (voir sections 24.5 à 24.12). La séparation des genres, présentée dans les tableaux 12.15 et 12.16, doit être considérée comme approximative ; en effet, il est toujours possible d’isoler une souche qui ne possède pas l’un ou l’autre des caractères normalement considérés comme positifs pour l’ensemble du genre. En gardant ces limitations à l’esprit, une séparation simplifiée des genres principaux peut être proposée (voir figure 12.25). Cette clé permet une décision rapide sur le genre probable dans lequel placer un nouvel isolat entérique.

Le genre Escherichia Les membres du genre Escherichia sont des constituants presque universels de la flore intestinale des humains et des animaux à sang chaud, bien qu’ils ne soient nullement les microorganismes dominants dans ces habitats. Les Escherichia peuvent jouer un rôle nutritionnel dans le tractus intestinal en synthétisant des vitamines, en particulier la vitamine K. En tant qu’aéro-anaérobie facultatif, cette bactérie aide probablement aussi à consommer l’oxygène, rendant de ce fait le gros intestin anoxique. Les souches de type sauvage d’Escherichia présentent rarement des exigences nutritionnelles en facteur de croissance et peuvent se développer sur une grande variété de sources de carbone et d’énergie telles que des sucres, des acides aminés, des acides organiques, etc. Quelques souches d’Escherichia sont pathogènes. Celles-ci ont été impliquées dans des diarrhées chez les enfants en bas âge, parfois de nature épidémique dans les crèches ou les services d’obstétrique. Les Escherichia peuvent également causer des infections urinaires chez des personnes plus âgées ou chez celles dont la résistance a été abaissée par un traitement chirurgical ou une exposition à des radiations ionisantes. Les souches entéropathogènes d’E. coli sont de plus en plus fréquemment impliquées dans des infections de type dysenteries et des fièvres généralisées (voir sections 21.6, 21.11 et 29.8). Ces souches forment une structure appelée antigène K, permettant l’adhésion et la colonisation de l’intestin grêle, ainsi qu’une entérotoxine, responsable des symptômes de la diarrhée.




TABLEAU 12.15

PRINCIPALES RÉACTIONS DE DIAGNOSTIC UTILISÉES POUR LA DISTINCTION DES PRINCIPAUX GENRES a D’ENTÉROBACTÉRIES VPb

Indole

Mobilité

Gaz sur glucoseb

β−Galactosidase

–

–

+

+ ou –

+

+

–

+

–

+

+

+

–

–

–

+ ou –

–

–

+ ou –

Edwardsiella

+

–

–

+

+

+

–

Salmonella

+

–

–

–

+

+

+ ou –

Genre

H2S (TSI)

Uréase

Escherichia

–

Enterobacter

–

Shigella

–

+

+ ou –

–

–

+

+

Citrobacter

+ ou –

–

–

–

+

+

+

Proteus

+ ou –

+

–

+ ou –

+

+ ou –

–

Klebsiella

Providencia

–

–

–

+

+

–

–

Yersinia

–

+

–

–

+c

–

+

Hafnia

–

–

+

–

+

+

+ ou –

KCN

Citrate

Utilisation du mucate

Rouge de méthyle

Utilisation du tartrate

Alanine désaminase

ADN (% G+C)

Genre Escherichia

–

–

+

+

+

–

48–52

Enterobacter

+

+

+

–

–

–

52–60

Shigella

–

–

–

+

–

–

50

Edwardsiella

–

–

–

+ ou –

–

–

53–59

Salmonella

–

+ ou –

+ ou –

+

+ ou –

–

50–53

+

+

+

–

+ ou –

–

53–58

+ ou –

+

+

+

+

–

50–52

Proteus

+

+ ou –

–

+

+

+

38–41

Providencia

+

+

–

+

+

+

39–42

Yersinia

–

–

–

+

–

–

46–50

Hafnia

+

+

–

+

–

–

48–49

Klebsiella Citrobacter

a

Voir tableau 24.1 pour les procédures de ces réactions. b Voir figure 12.24 pour une illustration de cette réaction. c Mobile à température ambiante, immobile à 37 ˚C.

Salmonella et Shigella Salmonella et Escherichia sont très étroitement liés, ces deux genres présentant environ 50 % d’homologie génomique par hybridation ADN / ADN (voir section 11.11). Cependant,

TABLEAU 12.16

contrairement à la plupart des Escherichia, les membres du genre Salmonella sont habituellement pathogènes pour les humains ou d’autres animaux à sang chaud. Chez l’homme, les maladies les plus communément provoquées par des

PRINCIPALES RÉACTIONS DIAGNOSTIC UTILISÉES POUR DIFFÉRENCIER LES GENRES PRODUCTEURS 2,3-BUTANEDIOLa

DE

Genre

Ornithine Hydrolyse Température décarbode la optimale xylase gélatine (˚C)

Pigmentation

Mobilité Lactose ADNase Sorbitol

Klebsiella

–

–

37–40

Aucune

–

+

Enterobacter

+

lente

37–40

Jaune (ou aucune)

+

Serratia

+

+

37–40

Rouge (ou aucune)

+

Erwinia

–

+ ou –

27–30

Jaune (ou aucune)

Hafnia

+

–

35

Aucune

b

ADN (% G+C)

–

+

53–58

+

–

+

52–60

–

+

–

52–60

+

+ ou –

–

+

50–58

+

–

–

–

48–49

a

Voir tableau 24.3 pour une description de ces tests. b Voir figure 12.23a.



358 Chapitre 12


Test de différenciation 1 RM + ; VP – (fermenteurs d’acide mixte) RM - ; VP + (producteurs de butanediol)

Aller au n°

2 Uréase + Uréase –

Proteus 3

les humains et est responsable d’un type de gastro-entérite assez grave appelé dysenterie bacillaire. Shigella dysenteriae est transmise par l’eau ou les aliments et possède un caractère invasif par rapport aux cellules de l’épithélium intestinal (voir section 29.11). Une fois établie, elle produit une endotoxine et une neurotoxine qui provoquent des effets entérotoxiques (gastro-intestinaux).

3 H2S (TSI) + H2S (TSI) –

4 6

Proteus

4 KCN + KCN –

Citrobacter 5

5 Indole + ; citrate – Indole – ; citrate +

Edwardsiella Salmonella

6 Production de gaz sur glucose Pas de gaz sur glucose

Escherichia Shigella

7 Immobile ; ornithine – Mobile ; ornithine +

Klebsiella 8

Gélatinase + ; ADNase + 8 Gélatinase lente ; ADNase –

2 7

Serratia (pigment rouge) Enterobacter

Code couleur : Fermenteurs d’acide mixte Producteurs de butanediol FIGURE 12.25 Clé simplifiée de différenciation des principaux genres d’entérobactéries. Seuls les genres les plus communs sont repris. Se référer au texte pour les précautions d’utilisation de cette clé. Les tests de différenciation utilisés dans cette figure sont présentés dans le tableau 24.3. D’autres caractéristiques des genres sont indiquées dans les tableaux 12.14 à 12.16. Le code couleur est identique à celui de la figure 12.24.

salmonelles sont les fièvres typhoïdes et les gastro-entérites (voir sections 28.8 et 29.7). Les salmonelles sont caractérisées au niveau immunologique sur la base de trois antigènes externes, l’antigène O (somatique), ou antigène de paroi, l’antigène H ou flagellaire et l’antigène Vi (couche externe du polysaccharide), trouvé principalement chez les souches de Salmonella responsables de fièvres typhoïdes. Les antigènes O font partie des lipopolysaccharides que compte la couche extérieure de la membrane externe de ces organismes (voir sections 4.9 et 21.12). La structure chimique des lipopolysaccharides a été présentée dans la section 4.9 (voir figures 4.35 et 4.36). Le genre Salmonella contient plus de 1 000 sérotypes distincts ayant des spécificités antigéniques différentes au niveau des antigènes O. Des subdivisions antigéniques additionnelles sont basées sur les spécificités antigéniques flagellaires (H). Il existe peu ou pas de corrélations entre le type antigénique d’une salmonelle et les symptômes de la maladie, mais le sérotypage permet le suivi épidémiologique des souches impliquées. Les shigelles sont également génétiquement très proches d’Escherichia. Des essais d’homologie d’ADN montrent que des souches de Shigella présentent 70 % voire plus d’homologie génomique avec Escherichia coli. Cependant, contrairement à Escherichia, Shigella est généralement pathogène pour

Le genre Proteus est caractérisé par une mobilité importante (voir figure 12.26) et par la production d’uréase. Par l’homologie génomique d’ADN, il présente un rapport éloigné avec Escherichia coli. Proteus est une cause fréquente d’infections de l’appareil urinaire chez l’homme et est probablement avantagé à cet égard par sa capacité à dégrader l’urée. En raison de la mobilité rapide des cellules de Proteus, la croissance des colonies sur milieu gélosé présente souvent un phénomène caractéristique d’essaimage (voir figure 12.26b). Les cellules en bordure de la colonie ont une mobilité plus rapide que celles du centre. Celles-ci se déplacent à une distance assez faible de la colonie et subissent alors une réduction de la mobilité, se fixent et se divisent, formant ainsi une nouvelle population des cellules mobiles qui essaiment à leur tour. En conséquence, la colonie finale apparaît comme une série d’anneaux concentriques, avec des zones de concentration élevée en cellules alternant avec des zones de concentration plus faible (voir figure 12.26b).

La fermentation butanediolique : Enterobacter, Klebsiella et Serratia Les genres utilisant la fermentation butanediolique sont génétiquement plus étroitement liés entre eux qu’aux genres utilisant la fermentation acide mixte, en accord avec les différences physiologiques observées. Leur composition d’ADN en bases G+C est plus élevée, 53 à 58 % et une classification de ce groupe est décrite dans le tableau 12.16. Enterobacter aerogenes est une des espèces communes dans l’eau, les eaux d’égouts ainsi que le tractus intestinal des animaux à sang chaud. C’est un pathogène occasionnel dans les infections urinaires. Une des espèces de Klebsiella, K. pneumoniae, est occasionnellement responsable de pneumonies chez l’homme, mais les klebsielles sont plus généralement mises en évidence dans le sol et l’eau. La plupart des souches de Klebsiella fixent également l’azote (voir section 17.28), propriété absente chez les autres entérobactéries. Le genre Serratia produit une série de pigments rouges, contenant un noyau pyrrole, appelés prodigiosines (voir figure 12.27). Les prodigiosines sont des métabolites secondaires, produites en phase stationnaire (voir section 30.2) et sont intéressantes car elles contiennent le cycle pyrrole retrouvé dans les colorants impliqués dans les transferts d’énergie : porphyrines, chlorophylles et phycobilines (voir sections 17.2 et 17.3). Cependant, il n’y a aucune évidence du rôle des prodigiosines dans les transferts d’énergie et leur fonction exacte est inconnue. Des espèces de Serratia peuvent être isolées de l’eau et du sol, de même que du tube digestif de divers insectes et vertébrés ainsi qu’occasionnellement d’intestins humains.



D. E. Snyder

John Vercillo et Cheryl Broadie


(a)

James Shapiro

FIGURE 12.27 Colonies de Serratia marcescens. La pigmentation rouge-orange est due à la prodigiosine, pigment comptant un noyau pyrrole.

(b) FIGURE 12.26 Essaimage chez Proteus. a) Cellules de Proteus mirabilis traitées par un colorant flagellaire : les flagelles péritriches de chaque cellule se regroupent en paquet. b) Photo d’une colonie essaimante de Proteus vulgaris. Notez les anneaux concentriques.

12.12 Vibrio et Photobacterium m n Genres principaux : Vibrio, Photobacterium L’ordre des Vibrionales est composé de bacilles droits ou incurvés, Gram négatif, aérobies facultatifs possédant un métabolisme fermentatif. La plupart des espèces de l’ordre des Vibrionales possèdent des flagelles polaires, bien que certaines espèces aient leurs flagelles en position péritriche. La différence principale entre les bactéries entériques et celles du groupe Vibrio est que ces dernières présentent une réaction positive à l’oxydase (voir tableau 24.3), tandis que les bactéries entériques sont oxydase-négatives. Bien que les Pseudomonas possèdent également une ciliature polaire et soient oxydase-positif, ces bactéries ne sont pas fermentatives, par conséquent, elles peuvent être distinguées des bactéries du groupe des Vibrio par des essais simples de fermentation de sucre. Les genres les plus connus de l’ordre des Vibrionales incluent les genres Vibrio et le Photobacterium. La plupart des Vibrio et des espèces associées sont aquatiques et se retrouvent en eau douce ou en milieux marins. Le

Vibrio cholerae est la cause spécifique du choléra chez l’homme (voir sections 21.11 et 28.5) ; normalement ce micro-organisme n’infecte pas d’autres hôtes. Le choléra est l’une des maladies humaines infectieuses les plus communes dans les pays sous-développés et présente un long historique (le célèbre médecin et précurseur microbiologiste Robert Koch a isolé pour la première fois Vibrio cholerae en 1884). Cette bactérie pathogène est transmise presque exclusivement par l’intermédiaire de l’eau ; au XIXe siècle, les études sur sa propagation ont joué un rôle primordial dans la démonstration de l’importance de la purification d’eau dans des secteurs urbains. La pathogénicité de V. cholerae est discutée dans la section 21.11. Vibrio parahaemolyticus est un micro-organisme marin responsable d’importants cas de gastro-entérites au Japon (où le poisson cru est fortement consommé) et a été également impliqué dans des manifestations de gastro-entérite dans d’autres régions du monde, y compris aux États-Unis. Cette bactérie peut être fréquemment isolée de l’eau de mer, de mollusques ou de crustacés, mais doit probablement provenir des animaux marins, l’infection humaine étant un développement secondaire (voir section 28.1).

Photobacterium et bioluminescence Un certain nombre de bacilles Gram négatif, à ciliature polaire, possèdent la propriété intéressante d’émettre la lumière par un processus appelé bioluminescence. La plupart de ces bactéries ont été classifiées dans le genre Photobacterium, mais quelques souches de Vibrio sont également bioluminescentes (voir figure 12.28). La plupart des bactéries bioluminescentes sont marines et sont habituellement trouvées associées aux poissons. Quelques poissons possèdent un organe spécial dans lequel les bactéries bioluminescentes se développent (voir figure 12.28c-f). D’autres bactéries marines bioluminescentes vivent saprophytiquement sur les poissons morts et forment de temps en temps les colonies visibles sur la surface de poissons. (Pour voir aisément cette bioluminescence, il faut observer les échantillons dans une obscurité complète une fois que la vision est adaptée à l’obscurité, voir figure 12.28a, b.)



(d)

Kenneth H. Nealson

(c)

(e)

Kenneth H. Nealson

Kenneth H. Nealson

(b)

Kenneth H. Nealson

(a)

Kenneth H. Nealson


Kenneth H. Nealson

360 Chapitre 12

(f)

FIGURE 12.28 Bactéries bioluminescentes et leur rôle dans les organes photophores des poissons-lanternes. a) Deux boîtes de Petri de contenant ces bactéries ont été photographiées grâce à leur propre luminescence. Notez les différentes couleurs. À gauche, la souche MJ-1 de Vibrio fischeri présente une luminescence bleue ; à droite, la souche Y-1 de V. fischeri présente une luminescence verte. b) Les colonies de Photobacterium phosphoreum ont été photographiées grâce à leur propre luminescence c) Photoblepharon palpebratus poisson-lanterne ; le photophore est l’organe lumineux contenant les bactéries bioluminescentes. d) Les mêmes poissons, photographiés éclairés par leur propre lumière. e) Photographie sous-marine prise la nuit de P. palpebratus dans un récif de corail dans le golfe d’Eilat. f) Observation en microscopie électronique d’une coupe mince de l’organe luminescent du P. palpebratus, montrant la rangée dense de bactéries bioluminescentes (voir flèches).

Bien que les souches de Photobacterium soient aérobies facultatives, elles ne sont bioluminescentes qu’en présence d’oxygène. Plusieurs composants sont nécessaires pour créer cette bioluminescence. Ceux-ci incluent l’enzyme luciférase et un aldéhyde aliphatique à longue chaîne (par exemple, le dodécanal), ainsi que la flavine réduite (FMNH2) et l’oxygène. Le donneur primaire d’électrons est le NADH, et les électrons utilisent la luciférase comme suit : Luciférase FMNH2 + O2 + RCHO ⎯⎯⎯→ FMN + RCOOH + H2O + lumière

Le système produisant la lumière constitue une déviation dans le passage des électrons du FMNH2 à O2 sans impliquer d’autres porteurs d’électrons tels que des quinones ou des cytochromes.

La régulation de la bioluminescence L’enzyme luciférase est un genre unique de régulation de la synthèse appelé l’auto-induction. Les bactéries lumineuses produisent une molécule organique spécifique, l’auto-inducteur, qui s’accumule dans le milieu de culture pendant la croissance. Quand la quantité de cette substance atteint un niveau critique, l’induction de la luciférase se produit. L’effecteur auto-inducteur chez Vibrio fischeri a été identifié comme étant la N-β-ketocaproyl homosérine lactone. Ainsi, les cultures des bactéries luminescentes peu concentrées en cellules ne sont pas lumineuses. Elles

ne deviennent lumineuses que lorsque la croissance a amené une concentration de bactéries suffisante pour que l’auto-inducteur puisse s’accumuler et fonctionner. C’est un mécanisme appelé le quorum sensing, en raison de la nature concentration-dépendante du phénomène (voir section 8.10). Puisque l’auto-inducteur ne peut pas s’accumuler, les bactéries luminescentes vivant dispersées en eau de mer ne sont pas lumineuses, et la luminescence ne se développe que lorsque les conditions sont favorables pour le développement de densités de population élevées (voir figure 12.28). Bien que la luminescence, dépendant de la densité de la population, ne soit pas expliquée pour les bactéries dispersées en eau de mer (voir figure 12.28c-f), le raisonnement pour la luminescence des bactéries luminescentes dans des contraintes symbiotiques s’explique : la luminescence ne se développe que lorsque les densités de population suffisamment élevées sont atteintes dans l’organe lanterne des poissons pour permettre une lumière visible. La génétique du quorum sensing utilisant la bioluminescence comme système modèle expérimental a été activement explorée. Il est maintenant clair que cette forme de régulation ne se limite pas aux bactéries bioluminescentes, mais c’est un dispositif de régulation général, pour un certain nombre de bactéries différentes, pour les phénomènes dans lesquels une densité minimum de cellules (un quorum) est exigée (voir section 8.10).



12.13 Rickettsiales 361


•

Par quels critères physiologiques Escherichia coli se distingue-t-il d’Enterobacter aerogenes ?

•

Décrivez deux propriétés principales qui distinguent les espèces du genre Proteus des autres bactéries entériques.

•

Précisez ce qui est nécessaire aux micro-organismes du genre Photobacterium pour produire une lumière visible.

Willy Burgdorfer

Les bactéries entériques forment un large groupe de bacilles aérobies facultatifs d’importance biologique médicale et moléculaire. Les espèces de Vibrio et de Photobacterium sont des micro-organismes marins ; quelques espèces sont pathogènes, d’autres sont bioluminescentes.

(a)

G. Devauchelle

12.13 Rickettsiales m n Genres principaux : Rickettsia, Wolbachia Les rickettsies sont des Proteobacteria de petite taille, Gram négatif, en forme de coques ou de bacilles d’une taille de 0,3 à 0,7 µm de large et de 1 à 2 µm de long. Elles sont, à une exception près, des parasites intracellulaires stricts (voir figure 12.29a) et n’ont pu encore être cultivées en absence des cellules hôtes. Les rickettsies sont les agents responsables de plusieurs maladies humaines comprenant la fièvre typhoïde, la fièvre pourpre des Montagnes rocheuses et la fièvre Q (voir section 27.3). Les photographies en microscopie électronique de coupes minces de rickettsies montrent des cellules présentant une morphologie bactérienne normale (voir figure 12.29b) ; la paroi cellulaire et la membrane des cellules sont clairement présentes. La paroi cellulaire contient l’acide muramique et l’acide diaminopimélique, l’ARN et l’ADN sont présents. Les rickettsies se divisent par division binaire normale, avec des périodes de doublement d’environ 8 heures. La pénétration d’une cellule hôte par une cellule rickettsiale est un processus actif, exigeant des cellules hôtes et du parasite d’être vivants et métaboliquement actifs. Une fois à l’intérieur de la cellule hôte, les bactéries se multiplient principalement dans le cytoplasme et continuent à se dupliquer jusqu’à ce que la cellule hôte soit entièrement remplie par les parasites (voir les figures 12.29 et 27.3), puis la cellule hôte se lyse libérant les bactéries dans le milieu environnant. Plusieurs espèces de l’ordre des rickettsiales sont connues, et les propriétés des quatre genres principaux sont montrées dans le tableau 12.17.

Métabolisme et pathogénicité Beaucoup de recherches ont été faites sur les activités métaboliques et les voies biochimiques des rickettsies afin d’essayer d’expliquer pourquoi elles sont des parasites intracellulaires obligés. Beaucoup de rickettsies possèdent un métabolisme énergétique très spécifique : elles ne peuvent oxyder que le glutamate ou la glutamine mais ne peuvent pas oxyder le glucose ou les acides organiques. Cependant, Coxiella burnetii, l’agent responsable de la maladie de la fièvre Q, peut utiliser le glucose

(b) FIGURE 12.29 Rickettsies se développant dans des cellules hôtes. a) Rickettsia Rickettsii dans les cellules de la paroi vaginale du campagnol Microtus pennsylvanicus. Les cellules mesurent environ 0,3 µm de diamètre. b) Observation en microscopie électronique de cellules de Rickettsiella popilliae dans une cellule sanguine de son hôte, le coléoptère Melolontha melolontha. Notez que les bactéries se développent dans la vacuole de la cellule hôte.

et le pyruvate comme donneurs d’électrons. Les rickettsies possèdent une chaîne respiratoire complète avec des cytochromes et peuvent effectuer le transport d’électrons en utilisant le NADH comme donneur d’électrons. Elles peuvent également être en mesure de synthétiser certaines petites molécules requises pour la synthèse de macromolécules nécessaire à leur croissance ; elles obtiennent le reste de leurs nutriments de la cellule hôte. Ainsi, bien que parasites, les rickettsies conservent un certain nombre de fonctions métaboliques indépendantes. Les rickettsies ne survivent pas longtemps en dehors de leurs cellules hôtes, ce qui peut expliquer pourquoi elles doivent être transmises d’animal à animal par des arthropodes (vecteurs). Quand l’arthropode absorbe le sang d’un vertébré infecté, les rickettsies présentes dans le sang sont inoculées directement dans l’arthropode, où elles pénètrent dans les cellules épithéliales de l’appareil gastro-intestinal, se multiplient, puis apparaissent ensuite dans les fèces. Quand l’arthropode absorbe le sang sur un individu non infecté, il transmet alors les rickettsies directement avec ses trompes, la morsure étant contaminée avec les fèces. Cependant, C. burnetii (voir section 27.3) peut également être transmise au système respiratoire par des aérosols. C. burnetii est la plus résistante des rickettsies face aux facteurs physiques, probablement parce qu’elle prend une forme résistante sous forme de spores. Ceci explique probablement la capacité de C. burnetii à survivre dans l’air.



362 Chapitre 12

TABLEAU 12.17

Genres et espèces


CARACTÉRISTIQUES DES RICKETTSIES

Groupe rickettsial

Hôte alternatif

Localisation cellulaire

ADN (% G+C)


Hybridation de l’ADN par rapport à R. rickettsii ADN (%)b

Rickettsia R. rickettsii

Fièvre éruptive

Tiques

Cytoplasme et noyau

32-33

R. prowazekii c

Typhus

Poux

Cytoplasme

29-30

Alpha

100 53

R. typhi

Typhus

Puces

Cytoplasme

29-30

36

R. quintana

Fièvre des tranchées

Poux

Épicellulaire

39

R. vinsonii

–

Campagnols

Épicellulaire

39

Fièvre Q

Tiques

Vacuoles

43

E. chaffensis

Ehrlichiose (homme)

E. equi

Fièvre du Potomac (chevaux)

Tiques ou animaux domestiques

Leucocytes mononucléaires

–

Arthropodes

Cytoplasme

Rochalimaea Alpha

30 30

Coxiella C. burnetii

Gamma

–

–

Alpha

–

–

Alpha

–

30

Alpha

–

Ehrlichia

Wolbachiad W. pipientis a

Tous sont des Protéobactéries. Sur l’ADN et l’hybridation de l’ADN voir la section 11.11. c Le génome de cet organisme a été séquencé et montre plusieurs similarités avec celui des mitochondries. d Non pathogène de l’homme et des autres animaux. b

Wolbachia Le genre Wolbachia appartient aux alpha-Proteobacteria contenant les espèces en forme de bacilles qui sont des parasites intracellulaires d’insectes (voir figure 12.30). Les Wolbachia sont phylogénétiquement associés aux rickettsies et peuvent avoir plusieurs effets sur leurs insectes hôtes. Ceux-ci provoquent l’induction de la parthénogénèse (développement d’œuf stérile), la mort des insectes mâles et leur féminisation (la conversion des insectes masculins dans des femelles). Wolbachia pipientis est l’espèce du genre la plus étudiée. Les bactéries colonisent les œufs d’insectes (voir figure 12.30), où elles se multiplient dans des vacuoles des cellules hôtes entourées par une membrane. Des cellules de W. pipientis sont passées des insectes femelles infectées à leur progéniture par l’infection des

œufs. L’induction de la parthénogénèse par Wolbachia se produit chez un certain nombre d’espèces de guêpes. Normalement, chez ces insectes, les mâles sont issus des œufs non fertilisés (qui contiennent seulement un ensemble de chromosomes), alors que les femelles sont issues des œufs fertilisés (qui contiennent deux

Richard Stouthamer et Merijn Salverda

Rochalimaea est une rickettsie atypique parce cette bactérie peut se développer en milieu de culture et n’est ainsi pas un parasite intracellulaire obligatoire. En outre, cultivant les cellules de Rochalimaea dans une culture de tissu, elles se développent sur la surface extérieure des cellules hôtes eukaryotes plutôt que dans le cytoplasme ou le noyau. Rochalimaea quintana est l’agent responsable de la fièvre des tranchées, une maladie qui a décimé les troupes lors de la première guerre mondiale. Les espèces du genre Ehrlichia provoquent des maladies chez l’homme et les animaux, par exemple, l’Ehrlichiose chez l’homme et la fièvre équine du Potomac chez les chevaux (voir section 27.3).

FIGURE 12.30 Wolbachia. Observation microscopique d’un œuf marqué au 4', 6-diamidine-2' phénylindole dichlorhydrate (DAPI, voir section 18.3) de la guêpe parasitoide Trichogramma kaykai, infecté par Wolbachia pipientis, qui induit la parthénogénèse. Les cellules de W. pipientis sont principalement situées à l’extrémité la plus étroite de l’œuf (flèches).



12.14 Spirilles

Les rickettsies sont des parasites intracellulaires stricts, dont beaucoup sont la cause de maladies. Les rickettsies sont déficients en de nombreuses fonctions métaboliques et obtiennent les métabolites principaux de leurs cellules hôtes. •

Nommez une maladie provoquée par des espèces de rickettsies.

•

Que signifie l’expression le parasite intracellulaire strict ?

•

Quels effets Wolbachia peut-il avoir chez ses insectes hôtes ?

12.14 Spirilles m n Genres principaux : Spirillum, Bdellovibrio, Campylobacter Les spirilles sont des Protéobactéries Gram négatif, mobiles, en forme de spirale présentant une grande variété de caractéristiques physiologiques. Certains des critères taxinomiques

Spirillum, Aquaspirillum, Oceanospirillum et Azospirillum

Noel Krieg

Ces bacilles hélicoïdaux incurvés sont mobiles à l’aide des flagelles habituellement en position polaire (voir figure 12.31b). Le nombre de tours de la spirale peut varier de moins d’un tour

(a)

Stanley Erlandsen


principaux employés sont : la forme des cellules, leur taille, le type de flagellation polaire (simple ou multiple), leur relation vis-à-vis de l’oxygène (aérobies strictes ou micro-aérobies facultatives), leur relation avec les plantes (les relations symbiotiques ou la pathogénicité vis-à-vis des plantes) ou avec les animaux (microbes pathogènes), la capacité fermentative, ainsi que d’autres caractéristiques physiologiques (capacité à fixer l’azote, nature halophile ou thermophile). Les genres de l’ordre des spirilles sont donnés dans le tableau 12.18. On peut y voir que les genres du spirille peuvent être trouvés dans chacune des cinq subdivisions des Protéobactéries.

(b)

H. D. Raj

ensembles de chromosomes). Cependant, dans les œufs stériles contaminés par Wolbachia, le micro-organisme provoque le doublement du nombre de chromosomes, de ce fait seules des femelles sortent des œufs. Si les insectes femelles contiennent des antibiotiques tuant Wolbachia, il est prévisible que la parthénogénèse cessera. Dans certains cloportes (pillbugs), les espèces de Wolbachia font se développer de manière équivalente les mâles et les femelles, l’infection par Wolbachia endommage les glandes hormonales des mâles. Chez d’autres insectes, comme chez certaines coccinelles ou papillons, les infections par Wolbachia entraînent la mort des mâles mais pas de leur progéniture. En plus de ces anomalies lors de la reproduction, les infections par Wolbachia chez quelques insectes peuvent réellement être essentielles pour leur survie. Par exemple, chez les vers nématodes responsables des maladies comme l’éléphantiasis ou l’onchocercose (cécité des rivières), le traitement antibiotique tue les vers, apparemment en supprimant leurs symbioses avec Wolbachia. Comme les parasites procaryotes généralement, W. pipientis a un petit génome (environ 1,5 Mbp), qui a été entièrement séquencé. Bien que ce parasite ne cause pas la maladie chez les hôtes vertébrés ou invertébrés, ses divers effets sur leurs reproductions soulèvent la question de l’ampleur de son influence sur l’évolution et la spécification pour une classe importante d’insectes. Cependant, parce que l’association entre Wolbachia et des insectes est très commune, il pourrait s’avérer que les effets sur leur reproduction soient secondaires par rapport à une véritable symbiose entre Wolbachia et les insectes. Il est probable qu’en infectant les insectes, les cellules de Wolbachia en tirent un bénéfice, c’est un environnement protégé et une source de nutriments. D’ailleurs, de ces associations, les insectes doivent également en tirer bénéfice de manières jusqu’ici inconnues.

363

(c) FIGURE 12.31 Spirillum. a) Cellules de Spirillum Volutans, observées au microscope à fond noir, montrant les paquets de flagelles et les granules de volutine (polyphosphate). Les cellules font environ 1,5 × 25 µm. b) Observation en microscopie électronique à balayage d’un spirille intestinal. Notez les paquets de flagelles polaires et la structure en spirale de la surface de cellules. c) Observation en microscopie électronique à balayage des cellules d’Ancyclobacter aquaticus. Les cellules mesurent environ 0,5 µm de diamètre.



364 Chapitre 12

TABLEAU 12.18 Genre


CARACTÉRISTIQUES DU GENRE DES BACTÉRIES EN FORME DE SPIRALEa Groupe phylogénétiqueb

ADN (% G+C)

Caractéristiques

Spirillum

Bêta

Diamètre cellulaire 1,7 µm, micro-aérophile ; eaux douces

36–38

Aquaspirillum

Alpha ou bêta

Diamètre cellulaire 0,2–1,5 µm, aérobie ; eaux douces

49–66

Magnetospirillum

Alpha

Vibrio en forme de Spirillum ; diamètre cellulaire proche de 0,3 µm contient des magnétosomes ; micro-aérophile

65

Oceanospirillum

Gamma

Diamètre cellulaire 0,3–1,2 µm, aérobie ; milieu marin (requiert 3 % NaCl) 42–51

Azospirillum

Alpha

Diamètre cellulaire 1 µm micro-aérophile ; sol et rhizosphère ; fixe N2

Herbaspirillum

Bêta

Diamètre cellulaire 0,6–0,7 µm, micro-aérophile ; sol et rhizosphère ; fixe N2 66–67

Campylobacter

Epsilon

Diamètre cellulaire 0,2–0,8 µm, micro-aérophile à anaérobie ; pathogène ou commensale chez l’homme et les animaux ; flagelle polaire unique

30–38

Helicobacter

Epsilon

Diamètre cellulaire 0,5–1 µm ; flagelles polaires en touffe ; associée aux ulcères du pylore chez l’homme

36–38

Bdellovibrio

Delta

Diamètre cellulaire 0,25–0,4 µm, aérobie ; prédateur d’autres bactéries ; flagelle polaire unique

33–52

Ancyclobacter

Alpha

Diamètre cellulaire 0,5 µm bacilles incurves formant des anneaux ; non mobile, aérobie

66–69

a b

68–70

Toutes ces bactéries sont Gram négatif et présentent un métabolisme respiratoire mais jamais fermentatif. Toutes sont des Protéobactéries.

(dans ce cas des micro-organismes qui ressemblent à un vibrio) à plusieurs tours. Ces derniers peuvent ressembler au spirochète (voir la section 12.33), mais ils en diffèrent distinctement phylogénétiquement. En outre, les spirilles n’ont pas de gaine ni d’endoflagelles externes comme les spirochètes, mais possèdent les flagelles bactériens typiques. Quelques spirilles sont des bactéries de très grande taille et ont été observées très tôt par microscopie. Il est probable qu’Antoni van Leeuwenhoek ait observé la première fois des bactéries de l’espèce Spirillum dans les années 1670 (voir section 1.5), et le genre a été créé la première fois par le protozoologiste allemand Ehrenberg en 1832. Cet organisme observé par ces chercheurs est dénommé actuellement Spirillum volutans et c’est une bactérie de taille plutôt grande (voir figure 12.31a). Thiospirillum est un organisme phototrophe ressemblant à S. volutans (voir figure 12.4b). S. volutans est une bactérie micro-aérophile exigeante en O2, mais inhibée par O2 à des niveaux de concentration présents dans l’air. Une autre caractéristique importante des cellules de S. volutans est la formation de granules composés de polyphosphate (granules de volutin) [voir figure 12.31a et section 4.11]. Azospirillum lipoferum est un organisme fixateur d’azote, qui a été à l’origine décrit et appelé Spirillum lipoferum par Beijerinck en 1922. A. lipoferum présente un intérêt considérable parce qu’il entre dans un rapport symbiotique avec les herbes tropicales et les récoltes de grain. Bien que ne formant pas une association du type de celle existante entre les bactéries du nodule racinaire et les plantes légumineuses (voir section 19.22), l’association entre A. lipoferum et le maïs apporte clairement un bénéfice à cette plante pour la fixation de l’azote. Les spirilles de faible diamètre (qui ne sont pas micro-aérophiles) ont été séparés en deux genres, Aquaspirillum et Oceanospirillum. Le premier genre inclut des espèces d’eau douce

tandis que le second inclut les espèces qui vivent en eau de mer exigeant du NaCl pour leur croissance (voir tableau 12.18). De nombreuses espèces d’Aquaspirillum et d’Oceanospirillum ont été décrites, les diverses espèces étant distinguées sur des critères physiologiques et phylogénétiques. Ces organismes assurent un rôle important dans le recyclage de la matière organique dans les environnements aquatiques.

Spirilles magnétotactiques Des spirilles magnétiques, micro-aérophiles, fortement mobiles, ont été isolés dans des milieux d’eau douce. Ces organismes montrent, dans un champ magnétique, des mouvements fortement orientés désignés sous le nom de magnétotactismes. Le spirille s’oriente rapidement le long du moment nord-sud d’un champ magnétique artificiel. Dans les cellules, on peut observer des chaînes de 5 à 40 particules magnétiques appelées magnétosomes. Ils sont composés de magnétite (Fe3O4) et de greigite (Fe3S4) [voir section 4.11 et figure 4.42]. Les magnétosomes fonctionnent en tant qu’aimants internes qui orientent les cellules le long d’un champ magnétique spécifique. Les bactéries magnétiques peuvent avoir une des deux polarités magnétiques selon l’orientation des magnétosomes dans la cellule. Les cellules dans l’hémisphère nord ont le pôle de leurs magnétosomes dirigé vers le nord en position opposée à leurs fagelles et se déplacent en direction du nord. Dans l’hémisphère sud, ces bactéries présentent une polarité opposée et se déplacent au sud. Bien que le rôle écologique des bactéries magnétiques soit peu clair, la capacité à s’orienter dans un champ magnétique peut être un avantage sélectif en maintenant ces organismes micro-aérophiles dans les zones de la basse concentration en O2 au niveau des interfaces des zones oxiques/anoxiques. Le spirille Magnetospirillum magnetotacticum (voir figure 12.32 et tableau 12.18) est l’espèce majeure de ce groupe.



12.14 Spirilles

R. Blakemore

Flagelle

FIGURE 12.32 Observation en microscopie électronique (coloration négative) d’un spirille magnétotactique, Magnetospirillum magnetotacticum. Cette cellule mesure 0,3 × 2 µm. La bactérie contient des particules de Fe 3O4 (magnétite), appelées magnétosomes (voir figure 4.42), disposées en chaîne ; les particules alignent la cellule selon des lignes géomagnétiques. Cette bactérie a été isolée dans une installation de traitement d’effluents à Durham, dans le New Hampshire (États-Unis).

Bdellovibrio

(a)

isolées et on leur a donné des noms suggestifs tels que Vampirococcus. Cependant, Bdellovibrio a un mode unique d’attaque se développant dans l’espace intrapériplasmique. Après la fixation sur proie, la cellule de Bdellovibrio pénètre par paroi membranaire puis se réplique dans l’espace périplasmique, formant éventuellement une structure sphérique appelée un bdelloplaste. Les étapes de la fixation et de la pénétration sont montrées sur des photographies en microscopie électronique de la figure 12.33 et schématisées sur la figure 12.34. Une grande variété de bactéries Gram négatif peut être attaquée par des espèces uniques de Bdellovibrio ; les bactéries Gram positif ne sont pas attaquées. Bdellovibrio est une bactérie aérobie stricte, obtenant son énergie de l’oxydation des acides aminés et de l’acétate. En outre, Bdellovibrio assimile les nucléotides, les acides gras, les peptides et même les protéines intactes, directement de son hôte sans les prédégrader. Ainsi il est clair que le mode d’existence prédateur a apporté lors du développement de Bdellovibrio des processus biochimiques intéressants et peu communs. Cependant, en plus des bactéries prédatrices de Bdellovibrio, des souches non prédatrices de cette espèce peuvent être isolées, prouvant que la prédation n’est pas obligatoire. Des souches non prédatrices peuvent se développer sur des milieux complexes contenant l’extrait de levure et la peptone. Phylogénétiquement, les bactéries Bdellovibrio tombent dans la subdivision delta des Protéobactéries (voir figure 12.1) et contiennent un génome de moitié de la taille d’E. coli. Taxinomiquement, deux espèces de Bdellovibrio et une espèce du genre Bacteriovorax ont été identifiées ; ce qui a été confirmé par les résultats d’hybridation de l’ADN (voir section 11.11). Les bactéries du genre Bdellovibrio sont largement répandues dans le sol et dans l’eau, y compris dans l’environnement marin. Leur détection et leur isolement exigent des méthodes identiques à celles utilisées dans l’étude des virus bactériens (voir section 9.4). Des bactéries sont étalées sur la surface d’une boîte de Petri contenant du milieu gélosé pour former un tapis bactérien, cette surface est ensuite inoculée avec un peu de suspension de sol qui a été préalablement filtrée sur membrane ; cette dernière retient la plupart des bactéries mais permet aux petites cellules de Bdellovibrio de passer. Après

J. C. Burnham

J. C. Burnham

Ces petits organismes de forme vibroide ont la propriété peu commune de s’attaquer à d’autres bactéries, en utilisant comme nutriments les constituants cytoplasmiques de leurs hôtes. Ces bactéries prédatrices sont de petites cellules fortement motiles qui collent aux surfaces cellulaires de leurs proies. Pour cette raison, elles ont été nommées Bdellovibrio (le préfixe bdello signifie « sangsue »). D’autres bactéries prédatrices ont été

365

FIGURE 12.33 Étapes de l’attachement et pénétration de Bdellovibrio dans une cellule. Les cellules de Bdellovibrio mesurent environ 0,3 µm de diamètre. (a, b) Observation en microscopie électronique de coupes minces de Bdellovibrio attaquant Escherichia coli ; a) début de pénétration ; b) pénétration complète. La cellule de Bdellovibrio est enfermée dans une membrane à l’intérieur de la cellule cible (le bdelloplaste) et se multiplie dans l’espace périplasmique, entre la paroi cellulaire et la membrane (voir figure 12.34).

(b)



366 Chapitre 12


d’agar. Des cultures pures de Bdellovibrio peuvent alors être isolées sur ces boîtes de Petri. Des cultures de Bdellovibrio ont été obtenues à partir d’une grande variété de sols et sont ainsi considérées comme un genre bactérien très courant dans les populations microbiennes des sols.

Ancyclobacter Les membres du genre Ancyclobacter sont des bactéries de forme annulaire, non motiles, chimio-organotrophes et extrêmement diversifiées nutritionnellement (voir figure 12.31c). Ils ressemblent à des vibrio très étroitement lovés et sont très présents dans les environnements aquatiques. Des bactéries phototrophes correspondant à Ancyclobacter existent parmi les bactéries pourpres non sulfuriques comme Rhodocyclus purpureus (voir la figure 12.6e).

(a) Libération des bactéries multipliées

Lyse de la bactérie proie (2,5-4 h après la fixation)

Bdellovibrio

Cytoplasme de la bactérie proie Élongation de Bdellovibrio dans le bdelloplaste

40-60 min

(b)

Bactérie proie

Fixation

5-20 min

Espace Pénétration périplasmique dans la bactérie proie

FIGURE 12.34 Cycle cellulaire de Bdellovibrio, prédateur bactérien. a) Observation en microscopie électronique d’une cellule de Bdellovibrio. Notez le flagelle très épais de cet organisme (voir figure 4.54). b) Étapes de la prédation. Après un contact primaire entre une cellule fortement mobile de Bdellovibrio et une bactérie Gram négatif, l’attachement et la pénétration dans l’espace périplasmique de la bactérie proie se produisent. Une fois à l’intérieur, Bdellovibrio se reproduit et, dans un délai de quatre heures, les cellules multipliées sont libérées. Le nombre de cellules libérées change selon la taille de la bactérie attaquée. Par exemple, 5 ou 6 Bdellovibrios sont libérés de chaque cellule infectée d’Escherichia coli et de 20 à 30 le sont pour une plus grande cellule, telle que celle d’Aquaspirillum.

incubation, des plaques analogues aux plaques dues aux bactériophages apparaissent aux endroits où les cellules de Bdellovibrio se développent. Cependant, à la différence des plaques dues aux bactériophages, qui ne s’agrandissent que lorsque les bactéries hôtes se développent, les plaques dues aux Bdellovibrio continuent de s’agrandir même après l’arrêt de la croissance des bactéries proies. Ceci a comme conséquence un élargissement de ces plaques sur toute la surface

Campylobacter et Helicobacter Ces deux genres spirilles sont les représentants clés de la subdivision epsilon des Proteobacteria. Ils sont Gram négatif et motiles. La plupart de ces espèces sont pathogènes pour les humains ou les animaux. Campylobacter et Helicobacter sont micro-aérophiles et, pour les détecter, les isolats de prélèvements cliniques sont cultivés dans des milieux incubés à faibles teneurs en O2 (3-15 %) et fortes en CO2 (de 3-10 %). Campylobacter est une espèce qui cause des entérites aiguës menant (habituellement) à des diarrhées sanglantes. La pathogénicité est due à plusieurs facteurs, comprenant une entérotoxine semblable à la toxine du choléra (voir section 21.11). Helicobacter pylori est étroitement proche de Campylobacter causant des gastrites aiguës et chroniques, menant à la formation d’ulcères. Nous discutons en détail des maladies provoquées par Campylobacter et Helicobacter, y compris des modes de la transmission des bactéries et des symptômes cliniques, dans la section 29.9.

Contrôlez vos acquis Les spirilles en forme de spirales sont des procaryotes chimio-organotrophes très répandus dans l’environnement aquatique. Les genres Helicobacter et Campylobacter sont des spirilles pathogènes. Les spirilles sont présents dans chacune des cinq subdivisions du Proteobacteria. •

Qu’est-ce qu’un granule de volutine ?

•

Quels critères sont spécifiques des spirilles Bdellovibrio et Magnetospirillum ?

12.15 Protéobactéries gainées : m n Sphaerotilus et Leptothrix Genres principaux : Sphaerotilus, Leptothrix Elles appartiennent aux groupes des bêta-Proteobacteria filamenteuses engainées (voir tableau 12.1) avec un cycle de vie unique impliquant la formation de cellules essaimeuses flagellées dans un long tube ou gaine. Dans certaines conditions (généralement défavorables), les cellules essaimeuses



(a)

J. F. M. Hoeniger

sortent et se dispersent dans de nouveaux environnements, laissant la gaine vide. Dans des conditions favorables, la croissance végétative se produit dans le filament, menant à la formation de longs paquets de cellules dans les gaines. Les bactéries engainées sont communes dans les habitats d’eau douce qui sont riches en matière organique, tels que les courants pollués. Elles sont abondantes dans les filtres d’écoulement et les digesteurs de boues activées dans les usines de traitement des eaux d’égouts (voir section 28.2), et sont généralement trouvées dans les eaux courantes. Dans les milieux où les composés réduits de fer ou de manganèse sont présents, les gaines peuvent être enduites par de l’hydroxyde ferrique ou de l’oxyde de manganèse (voir figure 17.29). Les précipités de fer sont probablement dus à des réactions chimiques, mais quelques bactéries engainées ont la capacité biochimique d’oxyder les ions manganeux en oxyde de manganèse. Les deux genres principaux sont : Sphaerotilus, dans lequel l’oxydation du manganèse ne se produit pas, et Leptothrix dont les membres oxydent Mn2+.

Sphaerotilus (b)

J. F. M. Hoeniger

Le filament de Sphaerotilus se compose d’une chaîne de cellules en forme de bacilles aux extrémités arrondies, enfermées étroitement dans une gaine. Cette gaine mince et transparente est difficile à voir quand elle est remplie de cellules, mais quand elle est partiellement vide, la gaine peut facilement être vue par microscopie en contraste de phase (voir figure 12.35a) ou par coloration. Les cellules individuelles sont de 1 à 2 µm de large et 3 à 8 µm de long et elles sont Gram négatif. Les cellules dans la gaine se divisent par fission binaire (voir figure 12.35b), les cellules poussées aux extrémités synthétisent les nouveaux éléments de la gaine. Ainsi, les gaines se forment toujours aux bouts des filaments. Par la suite les cellules sont libérées des gaines, probablement quand l’apport nutritif est faible. Ces cellules libres sont activement motiles, les flagelles étant situées en position lophotriche à un pôle (voir figure 12.35c). Les flagelles sont synthétisés avant la libération des cellules de la gaine et peuvent ainsi probablement faciliter leur libération. Les cellules essaimeuses émigrent puis se fixent sur une certaine surface pleine et commencent à se développer, chaque cellule essaimeuse étant précurseur d’un nouveau filament. La gaine, qui est exempte d’acide muramique ou d’autres composants du peptidoglycane de la paroi cellulaire, est un complexe lipo-polysaccharide de protéine. Cependant, elle diffère des capsules constituées par beaucoup de bactéries Gram négatif (voir section 4.10) parce qu’elle forme une structure linéaire. Les cultures de Sphaerotilus ont des exigences nutritives souples, elles peuvent employer une grande variété de composés organiques simples comme sources de carbone et d’énergie, avec des sources inorganiques d’azote. Vivant dans les eaux agitées Sphaerotilus est une bactérie aérobie stricte. Les blooms de Sphaerotilus se produisent souvent en automne dans les ruisseaux quand la chute des feuilles amène une augmentation temporaire de la teneur organique de l’eau. Ses filaments sont les éléments principaux d’un complexe microbien que les ingénieurs appellent « la moisissure d’égouts, » qui est une boue filamenteuse trouvée sur les roches dans les courants recevant les eaux d’égouts polluées. Dans les boues activées

367

T. D. Brock

12.14 Spirilles

(c) FIGURE 12.35 Sphaerotilus natans. Une cellule mesure environ 2 µm. a) Observation en microscopie à contraste de phase de bactéries collectées dans un ruisseau contaminé. Étape de croissance active (en dessus) et cellules s’échappant de la gaine. b) Observation en microscopie électronique d’une coupe mince d’un filament. c) Observation en microscopie électronique (coloration négative) d’une cellule essaimante. Notez la touffe de flagelles polaires.

des usines de traitement des eaux d’égouts (voir section 28.2), les croissances de Sphaerotilus, comme celles de Beggiatoa (voir la section 12.4), sont souvent responsables d’un foisonnement. Les masses des filaments enchevêtrées de Sphaerotilus augmentent ainsi les volumes de boues qui ne peuvent pas être traitées correctement, ce qui entraîne des difficultés dans leur clarification.

Leptothrix La capacité de Sphaerotilus et de Leptothrix de précipiter des oxydes de fer sur leurs gaines est bien établie, et de telles gaines encroûtées de fer sont fréquemment vues dans les eaux riches en fer (voir figure 12.36). La précipitation du fer se produit quand il se chélate aux matériaux organiques tels que les acides humiques ou tanniques, et est métabolisé. Le fer se précipite



368 Chapitre 12


sur la gaine tandis que les constituants organiques sont utilisés comme source de carbone ou d’énergie. En plus de l’oxydation du Fe2+, Leptothrix est capable d’oxyder le Mn2+ en Mn4+. La réaction est exergonique :

W. C. Ghiorse

Mn2+ +

FIGURE 12.36 Leptothrix et la précipitation du fer. Observation en microscopie électronique à transmission d’une coupe mince d’une espèce de Leptothrix dans un échantillon provenant d’un film de ferromanganèse dans un marais à Ithaca, État de New York. Une cellule mesure environ 0,9 µm de diamètre. Notez les protubérances de l’enveloppe des cellules qui entrent en contact avec la gaine (voir flèches).

TABLEAU 12.19

1 --2

O2 + H2O → MnO2 + 2 H+ ∆G0’ = – 68 kJ

Il est évident que l’oxydation du Mn2+ est couplée aux réactions énergétiques dans la cellule impliquant probablement le transport d’électrons et la formation d’une force de proton-motrice. Le gène codant la protéine oxydant le manganèse chez Leptothrix a été isolé, et les études biochimiques ont prouvé que cette protéine se situe dans la gaine, et non à l’intérieur des cellules. Ainsi la gaine de Leptothrix est indispensable pour le métabolisme énergétique dans cette bactérie.

12.16 Bactéries bourgeonnantes, m n à prosthèques, et pédonculées Genres principaux : Hyphomicrobium, Caulobacter Ce vaste groupe hétérogène est principalement composé d’alpha-Proteobacteria et contient des micro-organismes qui possèdent différentes formes d’excroissances cytoplasmiques : tiges, hyphes, ou appendices (voir tableau 12.19). Ces types

CARACTÉRISTIQUES DES BACTÉRIES PÉDONCULÉES, À PROSTHÈQUES ET BOURGEONNANTES Caractéristiques

Genre


ADN (% G+C)

Bactéries à pédoncules : Pédonculé, extension du cytoplasme, impliqué dans la division cellulaire

Caulobacter

Alpha

62-67

Pédonculé, cellules fusiformes

Prosthecobacter

Alpha

54-60

Pédoncule accumulant du fer, cellule vibrioïde

Gallionella

Bêta

55

Pédoncule gélatineux formé latéralement, n’accumulant pas de fer

Nevskia

Gamma

60

Asticcacaulis

Alpha

55-61

Prosthèque court, multiplication par fission, quelques fois avec des vésicules gazeuses

Prosthecomicrobium Alpha

64-70

Cellules plates en forme d’étoile, quelquefois avec des vésicules gazeuses

Stella

Alpha

69-74

Long prosthèque, multiplication par bourgeonnement, quelquefois avec des vésicules gazeuses

Ancalomicrobium

Alpha

70-71

Phototrophe, produit des hyphes

Rhodomicrobium

Alpha

61-63

Phototrophe, bourgeonne sans former d’hyphes

Rhodopseudomonas

Alpha

64-72

Chimio-organotrophe, cellule en forme de bacille

Blastobacter

Alpha

59-66

Hyphe simple de la cellule parentale

Hyphomicrobium

Alpha

59-65

Hyphe multiple avec des bourgeons sur des bouts des hyphes minces

Pedomicrobium

Alpha

62-67

Pédonculé, mais les pédoncules, produits excrétoires, ne contiennent pas de cytoplasme :

Bactéries à prosthèques : Prosthèque simple ou double Prosthèque multiple

Bactéries bourgeonnantes :

Chimio-organotrophe, bourgeons à l’extrémité d’hyphes minces

a

Toutes sont des Protéobactéries.



12.16 Bactéries bourgeonnantes, à prosthèques, et pédonculées 369

Crampon

Prosthèque

Flagelle

J. L. Pate

Cellule mobile

J. T. Staley

(a)

d’excroissances sont de plus petit diamètre que la cellule, ils contiennent le cytoplasme, sont liés à la paroi cellulaire et sont appelés des prosthèques (voir figure 12.37). La division des cellules chez les bactéries bourgeonnantes est le résultat de la croissance inégale de la cellule. Contrairement à la division cellulaire dans une bactérie typique, où la formation de deux cellules équivalentes se produit par division binaire, la division des cellules dans les bactéries pédonculées et bourgeonnantes implique la formation d’une nouvelle cellule fille issue de la cellule mère, cette dernière maintenant son intégrité (voir figure 12.38). Les principaux genres des bactéries bourgeonnantes et un résumé de leurs processus de division sont montrés sur la figure 12.38. La différence fondamentale entre ces bactéries et les bactéries conventionnelles n’est pas la formation de bourgeons ou de tiges mais la formation de la nouvelle paroi cellulaire à un seul point (croissance polaire) plutôt que sur l’ensemble de la surface cellulaire (croissance intercalaire). Plusieurs genres bactériens, qui ne sont normalement pas considérés comme étant des bactéries bourgeonnantes, montrent une croissance polaire sans faire apparaître de différenciation dans la taille des cellules (voir figure 12.38). Une des conséquences importantes des croissances polaires est que les structures internes, comme des membranes complexes, ne sont pas impliquées dans le processus de division cellulaire. Cela permet de ce fait la formation de structures internes plus complexes que celles présentes dans les cellules subissant une croissance intercalaire. Beaucoup de bactéries bourgeonnantes, en particulier les espèces phototrophes, contiennent des systèmes de membranes internes étendus.

I. Produits de division cellulaire égaux

(b)

Fission binaire ; bactéries conventionnelles

II. Produits de division cellulaire inégaux

H. Schlesner

1. Simple bourgeonnement : Pirella, Blastobacter

2. Budding Bourgeonnement from hyphae: parHyphomicrobium, formation d’une hyphe : Hyphomicrobium, Rhodomicrobium, Pedomicrobium Rhodomicrobium, Pedomicrobium

(c) FIGURE 12.37 Bactéries à prosthèques. a) Observation en microscopie électronique à balayage d’une préparation d’Asticcacaulis biprosthecum, illustrant la position et l’agencement des prosthèques. Les cellules ont une taille d’environ 0,6 µm. Notez également le crampon et la cellule essaimante en cours de différenciation. b) Observation en microscopie électronique (coloration négative) d’une cellule de la bactérie à prosthèques Ancalomicrobium adetum. Les appendices (prosthèques) sont des éléments cellulaires lies à la paroi cellulaire, contenant du cytoplasme, et d’environ 0,2 µm de diamètre. c) Observation en microscopie électronique de la bactérie en forme d’étoile Stella. Les cellules ont environ 0,8 µm de diamètre.

3. Division cellulaire des bactéries pédonculées : Caulobacter

4. Croissance polaire sans différenciation de la taille cellulaire : Rhodospeudomonas, Nitrobacter, Methylosinus FIGURE 12.38 Division cellulaire. Comparaison de différentes formes de divisions cellulaires chez les bactéries conventionnelles, bourgeonnantes et pédonculées.



370 Chapitre 12


Bactéries bourgeonnantes : Hyphomicrobium Deux bactéries bourgeonnantes bien étudiées, Hyphomicrobium qui est chimio-organotrophe, et Rhodomicrobium qui est phototrophe, sont étroitement proches phylogénétiquement. Ces micro-organismes produisent des bourgeons aux extrémités de longues et fines hyphes. Les hyphes sont des prolongements cellulaires directs de la cellule mère (voir figures 12.39 et 12.40b) ; elles contiennent une paroi cellulaire, une membrane cytoplasmique, des ribosomes et parfois de l’ADN. La figure 12.39 montre le processus de la reproduction de Hyphomicrobium. La cellule mère, qui est souvent attachée par sa base à un substrat plein, forme une excroissance mince qui s’allonge pour devenir une hyphe. À l’extrémité de l’hyphe, un bourgeon se forme. Ce bourgeon grandit, forme un flagelle, se sépare de la cellule mère et nage pour se disséminer. Plus tard, la cellule fille perd son flagelle puis, après une période de maturation, forme une hyphe et des bourgeons.

ADN Cellule mère

Hyphe

Allongement de l’hyphe ; la réplication de l’ADN se produit

D’autres bourgeons peuvent également se former au bout de l’hyphe de la cellule mère formant des grappes de cellules reliées par des hyphes (voir figure 12.40a). Dans certains cas, un bourgeon commence à se former directement de la cellule mère sans formation préalable d’une hyphe, tandis que dans d’autres cas une cellule peut former des hyphes à chaque extrémité (voir figure 12.40a). Les événements de la réplication des nucléoïdes pendant le cycle de bourgeonnement sont très intéressants (voir figure 12.39). Tout d’abord, l’ADN est situé dans la cellule mère. Puis, une fois le bourgeon formé, une copie du chromosome circulaire est transportée le long de l’hyphe jusqu’au bourgeon. Une cloison se forme alors, séparant le bourgeon encore en développement de l’hyphe et de la cellule mère. Hyphomicrobium est une bactérie méthylotrophe (voir section 12.6) qui est très répandue dans les milieux d’eau douce, marins et terrestres. Les sources préférées de carbone sont des composés à un atome de carbone tels que le méthanol, la méthylamine, le formaldéhyde et le formiate. Des cultures d’enrichissement pour Hyphomicrobium peuvent être préparées en tirant profit de la capacité de ce micro-organisme à se développer en conditions très diluées. Les éléments nécessaires pour sa culture sont les sels minéraux des sources de carbone et d’azote organiques simples, auxquels un inoculum de sol, de boue, ou d’eau est ajouté. Après plusieurs semaines d’incubation, un film se développe en surface, lequel est ensuite ensemencé par la méthode des stries sur une gélose contenant de la méthylamine ou du méthanol comme source unique de carbone. Des colonies sont alors examinées au microscope pour assurer la morphologie cellulaire caractéristique d’Hyphomicrobium

La copie du chromosome entre dans le bourgeon

Peter Hirsch

Bourgeon

Formation du septum

Séparation cellulaire

La cellule mobile se développe et s’allonge Hyphe Cellule mère L’hyphe s’allonge à nouveau

FIGURE 12.39 Étapes du cycle cellulaire de Hyphomicrobium. L’unique chromosome de Hyphomicrobium est circulaire.

S. F. Conti and P. Hirsch

La cellule mère réplique à nouveau son ADN

(a)

(b) FIGURE 12.40 Morphologie de Hyphomicrobium. a) Observation au microscope à contraste de phase des cellules de Hyphomicrobium. Les cellules ont une taille d’environ 0,7 µm. b) Observation en microscopie électronique d’une coupe mince d’une cellule simple de Hyphomicrobium. L’hyphe mesure environ 0,2 µm de longueur.



12.16 Bactéries bourgeonnantes, à prosthèques, et pédonculées 371

(a)

Pédoncule

(b) Pédoncule

Caulobacter et Gallionella Caulobacter (voir figure 12.41) et Gallionella (voir figure 12.43) sont deux bactéries pédonculées communes. Caulobacter est une bactérie chimio-organotrophe qui produit une tige remplie de cytoplasme, c’est-à-dire un prosthèque, alors que Gallionella est une bactérie, chimiolithotrophe, oxydatrice du fer dont la tige se compose d’hydroxyde ferrique. Des cellules de Caulobacter sont souvent observées dans les milieux aquatiques avec les tiges de plusieurs cellules attachées formant des rosettes (voir figure 12.41a). À l’extrémité de la tige se trouve un organite de fixation par lequel la tige est attachée à une surface. Le cycle de division cellulaire de Caulobacter (voir

Crampon

G. Cohen-Bazire

Les bactéries à prosthèques et pédonculées (voir figures 12.37 et 12.41) sont des bactéries aérobies chimio-organotrophes pourvues d’appendices qui s’attachent à la matière particulaire, aux végétaux, ou à d’autres micro-organismes présents dans les habitats aquatiques. Bien qu’une fonction importante de ces appendices soit d’assurer une fixation, ils augmentent également de manière significative le rapport surface volume des cellules (les prosthèques présentent de grandes superficies mais presque aucun volume). Un rapport surface volume élevé pour des petites cellules comme des bactéries leur confère une capacité accrue pour prendre des nutriments et expulser des déchets (voir chapitre 4). La morphologie peu commune des appendices de ces bactéries (voir figure 12.37) amène cette caractéristique à un maximum qui peut s’expliquer par une adaptation à la vie dans les eaux oligotrophiques (pauvres en nutriments) où ces micro-organismes sont le plus généralement trouvés. Une autre fonction des prosthèques peut être de diminuer la vitesse de sédimentation dans les environnements aquatiques. On a montré qu’en laboratoire la centrifugation des cellules possédant des prosthèques exige une plus grande force centrifuge que pour des cellules non pourvues de prosthèques. Cette tendance inhérente à résister à descendre est probablement due aux prosthèques et pourrait présenter un avantage pour des cellules en possédant dans leurs milieux habituels. Puisque ces micro-organismes sont en général des bactéries aérobies strictes, les prosthèques peuvent éviter aux cellules de descendre dans les sédiments ou dans d’autres zones anoxiques où ils ne pourraient pas respirer. L’isolement sélectif des bactéries à prosthèques des bactéries pédonculées peut être réalisé en mélangeant un inoculum à une solution d’éléments nutritifs très diluée, à 0,01 % de peptone, et de laisser le mélange se reposer au calme. Quelques jours plus tard, un film se développe contenant souvent des bactéries à prosthèques et à pédoncules. L’isolement peut alors être réalisé par la méthode des stries sur des boîtes de Petri contenant un milieu gélosé très dilué identique au milieu de préculture.

G. Cohen-Bazire

Bactéries à prosthèques et pédonculées

figure 12.42) présente un intérêt particulier parce qu’il compte un processus de division binaire inégale. Beaucoup de recherches moléculaires ont été faites sur ce micro-organisme comme système modèle pour les études de la division cellulaire et des mécanismes de développement. La division cellulaire d’une cellule pédonculée de Caulobacter se produit par une élongation de la cellule suivie de la division ; un flagelle simple est formé à l’extrémité opposée à la tige. La cellule flagellée ainsi formée est appelée essaimeuse, séparée de la cellule mère non flagellée, elle se déplace en nageant, puis se fixe sur une nouvelle surface, formant une nouvelle tige au pôle flagellé ; le flagelle est alors libéré (voir figure 12.42). La formation de la tige est un précurseur nécessaire à la division cellulaire et est coordonnée avec la synthèse de l’ADN (voir figure 12.42). Le cycle de division cellulaire chez Caulobacter est ainsi plus complexe que la division binaire simple parce que les formes cellulaires pédonculées et essaimeuses sont structurellement différentes et le cycle de croissance doit inclure ces deux formes. Gallionella présente une structure tordue ressemblant à un pédoncule contenant l’hydroxyde ferrique [Fe(OH)3] (voir figure 12.43). Cependant, la tige de Gallionella n’est pas une partie intégrante de la cellule mais est simplement excrétée à la surface des cellules. Elle contient une matrice organique sur

Elnar Leifson

(voir figure 12.40). Un procédé assez spécifique d’enrichissement pour Hyphomicrobium utilise le méthanol comme donneur d’électrons avec du nitrate comme accepteur d’électrons dans des conditions anoxiques. Hyphomicrobium est pratiquement le seul micro-organisme dénitrifiant employant le méthanol (voir section 17.14), ainsi ce procédé permet d’isoler ce micro-organisme d’une grande variété d’environnements.

(c) FIGURE 12.41 Bactéries pédonculées. a) Rosette de Caulobacter. Une cellule mesure environ 0,5 µm. Les cinq cellules sont attachées par leurs tiges (prosthèques). Deux des cellules se sont divisées et les cellules filles ont formé des flagelles. b, c) Observation au microscope électronique de cellules de Caulobacter. b) Coloration négative d’une cellule en division. c) Coupe mince. Notez que les constituants cytoplasmiques sont présents dans la région du pédoncule.



372 Chapitre 12

Diversité des procaryotes : les Bacteria Élongation du pédoncule Synthèse d’ADN

Formation Division Initiation Synthèse du septum cellulaire de la synthèse de la Perte du d’ADN flagelline flagelle

Cellule essaimante 0

10

Cellule pédonculée Cellule pédonculée allongée 20

30

40

50

60

Cellule en prédivision 70

80

90

Temps (min)

W. C. Ghiorse

FIGURE 12.42 Croissance de Caulobacter. Étapes du cycle cellulaire de Caulobacter à partir de la cellule essaimante.

(a)

laquelle l’hydroxyde ferrique s’accumule. Gallionella est une bactérie commune des eaux s’écoulant des marais, des sources ferrugineuses, ou d’autres milieux naturels où le fer ferreux (Fe2+) est présent. On la trouve habituellement en association avec des bactéries engainées telles que Sphaerotilus. Gallionella est un chimiolithotrophe autotrophe contenant des enzymes du cycle de Calvin (voir section 17.6) par lequel du CO2 est incorporé au métabolisme cellulaire avec Fe2+ comme donneur d’électrons.

Contrôlez vos acquis Les bactéries engainées sont des Protéobacteries filamenteuses dans lesquelles les différentes chaînes de cellules sont entourées d’une couche externe formant une gaine. Les bactéries bourgeonnantes et à prosthèques sont des cellules avec des appendices qui forment des tiges ou prosthèques utilisés pour l’absorption d’éléments nutritifs ou pour se fixer, ce sont principalement des micro-organismes vivant en milieux aquatiques. •

Précisez ce qui est physiologiquement unique au sujet de la bactérie engainée Leptothrix.

•

Comment la division par bourgeonnement diffère de la division binaire ?

•

Comment la division binaire diffère-t-elle du processus de division chez Caulobacter ?

•

Quel avantage pourrait avoir un micro-organisme à prosthèques dans un environnement très pauvre en nutriments ?

W. C. Ghiorse

12.17 Myxobactéries à mobilité m n glissante

(b) FIGURE 12.43 La bactérie ferro-oxydante neutrophile Galionella ferruginea. a) Observation au microscope à contraste de phase de cellules dans un échantillon riche en fer, près d’Ithaca, État de New York. Notez le pédoncule torsadé lié aux deux cellules en forme de haricot (indiqué par la flèche). b) Observation en microscopie électronique en transmission d’une coupe fine d’une cellule (environ 0,6 µm de large). Notez le pédoncule torsadé formé d’hydroxyde de fer, provenant du centre de la cellule sur les deux photos.

Genres principaux : Myxococcus, Stigmatella De nombreux procaryotes présentent une forme particulière de mobilité nommée mobilité glissante (voir section 4.15). Ces micro-organismes sont habituellement de longs bacilles, ou des filaments, ne possédant pas de flagelle, mais néanmoins capables de se mouvoir au contact d’une surface. L’un de ces groupes de bactéries à mobilité glissante, les myxobactéries, forme des structures multicellulaires, nommées fructifications, et présente des cycles cellulaires complexes impliquant des phénomènes de communication intercellulaire (voir figure 12.47). D’un point de vue phylogénétique, ces organismes appartiennent à la subdivision delta des Protéobactéries (voir tableau 12.20). Les myxobactéries fructifiantes présentent les comportements et les cycles de développement les plus complexes des procaryotes. En relation avec cette complexité, le chromosome de plusieurs myxobactéries est très grand. Par exemple, Myxococcus xanthus possède un chromosome circulaire de 9,2 Mpb, soit deux fois plus grand que celui d’Escherichia coli (voir sections 15.4 et 10.19). Ceci représente deux tiers du génome total de la levure, qui est réparti sur 16 chromosomes (voir section 15.6). Les cellules végétatives des myxobactéries



12.17 Myxobactéries à mobilité glissante 373

TABLEAU 12.20

CLASSIFICATION DES MYXOBACTÉRIES

a À FRUCTIFICATION

Caractéristiques

Genre/ADN (% G+C)

Cellules végétatives effilées : Myxospores sphériques ou ovales, fructifications habituellement molles et mucoïdes, sans sporange défini ou pédoncule

Myxococcus (68-71)

Myxospores en bâtonnets : sans sporange, fructifications sans pédoncule

Archangium (67-68)

Myxospores incluses dans une enveloppe muqueuse : fructifications sans pédoncule

Cystobacter (68)

Fructifications pédonculées, sporanges simples

Melittangium (–)

Fructifications pédonculées, sporanges multiples

Stigmatella (68-69)

Fructifications formant des amas brun foncé formés de sporanges sphériques ou discoïdes sans paroi externe

Angiococcus (–)

Cellules végétatives non effilées (extrémités arrondies, émoussées) ; myxospores ressemblant aux cellules végétatives ; sporanges toujours présents : Fructifications sans pédoncule ; myxospores en bâtonnets

Polyangium (69)

Fructifications sans pédoncule ; myxospores ovales, cellulolytiques

Sorangium (–)

Fructifications sans pédoncule ; myxospores coccoïdes

Nannocystis (70-72)

Fructifications pédonculées

Chondromyces (69-70)

a

Du point de vue phylogénétique, les espèces examinées sont situées dans la subdivision delta des protéobactéries (voir tableau 12.1).

fructifiantes sont des bacilles simples, dépourvus de flagelles, Gram négatif (voir figure 12.44a) qui glissent sur les surfaces, et obtiennent leurs nutriments en lysant principalement d’autres bactéries. Sous certaines conditions, un essaim de

cellules végétatives peut s’agréger et former des fructifications au sein desquelles certaines cellules se transforment en structures dormantes nommées myxospores (voir figure 12.44b).

Les fructifications Les fructifications des myxobactéries vont d’une simple masse globuleuse et muqueuse de myxospores à des formes complexes possédant une fructification pourvue d’une paroi, et un pédoncule (voir figure 12.45). Les fructifications sont souvent fortement colorées et ont une morphologie bien élaborée (voir figures 12.45 et 12.46). Elles peuvent être observées à la loupe, manuelle ou binoculaire, sur des morceaux humides de plantes ou de bois en décomposition. Les fructifications des myxobactéries se développent souvent sur des crottes, par exemple de lapin, après quelques jours d’incubation en chambre humide. Une autre méthode pour isoler ces myxobactéries est de préparer des boîtes de Petri contenant de l’agar (1,5 % dans de l’eau distillée, sans ajout de nutriments) sur lesquelles une suspension bactérienne dense (peu importe laquelle) est étalée. Au centre de la boîte, on dispose une petite quantité de sol, d’écorce en décomposition ou d’un autre matériel. Les myxobactéries contenues dans l’inoculum lysent les cellules bactériennes et utilisent les produits libérés comme nutriments. En cours de croissance, elles essaiment sur la boîte à partir du point d’inoculation ; après plusieurs jours, les boîtes sont examinées sous la loupe binoculaire pour rechercher les essaimages ou les fructifications, et des cultures pures sont obtenues en transférant les cellules à partir des fructifications ou des bords des colonies dans des milieux contenant de la matière organique. De nombreuses myxobactéries peuvent croître au laboratoire sur des milieux contenant de la peptone ou des hydrolysats de caséine, qui apportent les nutriments sous forme de peptides ou d’acides aminés. Ces organismes sont typiquement aérobies, possèdent un cycle de l’acide citrique complet (voir figure 5.22) et une chaîne respiratoire.

Le cycle vital des myxobactéries à fructification Le cycle cellulaire typique de ces myxobactéries est présenté dans la figure 12.47. Une cellule végétative excrète une substance muqueuse et, en se déplaçant sur une surface solide, laisse derrière elle une trace muqueuse (voir figure 12.48). Cette trace est utilisée préférentiellement par d’autres cellules de l’essaim, formant ainsi une structure radiante typique, les

(a)

Herbert Voelz

Herbert Voelz

FIGURE 12.44 Myxococus. a) Observation en microscopie électronique d’une coupe fine d’une cellule de Myxococcus xanthus. Le diamètre de la cellule est d’environ 0,75 µm. b) Vue en coupe d’une myxospore de M. xanthus montrant les couches multiples de la paroi externe (diamètre : environ 2 µm).

(b)




Hans Reichenbach

374 Chapitre 12

Hans Reichenbach

(a)

(b) FIGURE 12.45 Stigmatella aurantiaca. a) Photographie couleur d’une fructification. Cette structure mesure environ 10 µm de haut. b) Vue en microscopie électronique à balayage d’une fructification se développant sur un morceau de bois. Notez les cellules individuelles visibles dans chaque structure de la fructification. La couleur de la fructification visible en a est due à la production de caroténoïdes (voir section 17.3).

cellules migrant le long de ces traces (voir figure 12.48). Les fructifications qui se forment (voir figures 12.45 et 12.46) consistent en une structure complexe produite par la différenciation des cellules dans la région du pédoncule et de la tête de la myxospore. La formation des fructifications ne se produit pas tant que les nutriments permettant la croissance végétative sont présents, mais à leur épuisement, les essaims végétatifs entament le processus. Les cellules s’agrègent, suite vraisemblablement à une réponse chimiotactique (voir sections 4.16 et 8.13), les cellules migrant les unes vers les autres et formant des amas cellulaires (voir figure 12.49). Une seule fructification peut comporter 109 cellules ou plus. L’amas de cellules devenant plus haut, la différenciation de la fructification en pédoncule et tête commence (voir figure 12.49b et c). La figure 12.49d montre nettement la différenciation de la fructification en pédoncule et tête. Le pédoncule est composé de mucus, à l’intérieur duquel quelques cellules sont piégées. La majorité

Hans Reichenbach

Hans Reichenbach

David White

(a)

(b)

(c)

FIGURE 12.46 Fructifications de trois espèces de myxobactéries. a) Myxococcus fulvus (hauteur : 125 µm). b) Myxococcus stipitatus (hauteur : 170 µm). c) Chondromyces crocatus 560 µm).

des cellules s’accumulent dans les fructifications et se différencient en myxospores (voir figures 12.44 à 12.47). Chez quelques genres, les myxospores sont enfermées dans de larges structures à paroi, nommées kystes. Par rapport aux cellules végétatives, les myxospores sont plus résistantes à la dessication, aux vibrations, aux UV et à la chaleur, mais le degré de résistance est bien moindre que celui des endospores bactériennes (voir section 4.13). La fonction principale des myxospores enkystées est cependant de permettre à l’organisme de survivre à la dessiccation au cours de la dispersion ou de l’assèchement de l’habitat. Suite à la dissémination dans un habitat convenable ou à la restauration de conditions de croissance favorables, les myxospores peuvent germer à un endroit localisé de la capsule, et donner une nouvelle cellule végétative. Les myxobactéries sont habituellement colorées par des pigments caroténoïdes, essentiellement glycosilés (voir figures 12.45a et 12.46). Les pigments sont synthétisés sous l’influence de la lumière, et au moins une fonction du pigment est la photoprotection. Ceci est en accord avec le fait que dans la nature, les myxobactéries synthétisent des pigments à la lumière. Chez le genre Stigmatella (voir figure 12.45), la lumière stimule beaucoup la formation des fructifications et



12.17 Myxobactéries à mobilité glissante 375 Trainées muqueuses

Formation des fructifications

Massif cellulaire

Fructification

Formation des myxospores

Croissance des spores

HansReichenbach

Germination (a)

FIGURE 12.48 Essaimage chez Myxococcus. a) Image en microscopie d’une colonie de Myxococcus (diamètre : 5 mm) en cours d’essaimage sur de l’agar. b) Cellules de Myxococcus fulvus dans une culture en cours de mobilité glissante, montrant les traînées muqueuses caractéristiques sur l’agar. Une cellule de M. fulvus a un diamètre d’environ 0,8 µm.

Cycle végétatif Germination FIGURE 12.47 Cycle vital de Myxococcus xanthus. a) Au cours de l’agrégation, les cellules végétatives s’assemblent pour former les fructifications et subissent une morphogénèse conduisant à des cellules dormantes nommées myxospores. Ces dernières germent lorsque les conditions nutritionnelles et physiques sont favorables pour donner des cellules végétatives. Les cellules végétatives peuvent être transformées directement en myxospores sans formation de fructifications, sous l’influence de certains inducteurs chimiques, particulièrement de fortes concentrations de glycérol. Les fructifications de Myxococcus sont illustrées dans les figures 12.45 et 12.46.

Contrôlez vos acquis Les myxobactéries à fructification sont des bactéries en forme de bâtonnets, à mobilité glissante, dont les cellules s’agrègent pour former des masses complexes de cellules appelées fructifications. Les myxobactéries sont des bactéries du sol chimio-organotrophes qui vivent en consommant la matière organique morte ou d’autres cellules bactériennes.

P. L. Grillone

P. L. Grillone

(b)

•

Quelles conditions environnementales déclenchent la formation des fructifications chez les myxobactéries ?

•

Qu’est-ce qu’une myxospore ? Comparez avec une endospore.

•

À quel groupe phylogénétique appartiennent les myxobactéries ?

P. L. Grillone

catalyse la production de la phéromone lipidique 2,5,8-timéthyl-8-hydroxy-nonane-4-un. Cette substance initie l’étape d’agrégation. Les myxobactéries à fructification sont classées en types morphologiques selon les caractéristiques des cellules végétatives, des myxospores et de la structure des fructifications (voir tableau 12.20), mais aussi selon les types phylogénétiques, basés sur les séquences d’ARNr 16S.

(a)

(b)

(c)

P. L. Grillone

Essaimage et agrégation

Hans Reichenbach

Myxospores

(d)

FIGURE 12.49 Images en microscopie électronique à balayage de la formation de fructifications chez Chondromyces crocatus. a) Stade primitif montrant l’agrégation et la formation du massif cellulaire. b) Stade initial de la formation du pédoncule. La formation de mucus au niveau de la tête n’a pas encore commencé et les cellules sont donc visibles. c) Trois stades de la formation de la tête. Notez que le diamètre du pédoncule augmente également. d) Fructifications matures. La structure entière de la fructification mesure environ 600 µm de haut (voir figure 12.46c).



376 Chapitre 12


(b)

Fritz Widdel

(a)

(d)

Norbert Pfennig

(c)

Fritz Widdel

(e)

(f)

Matthew Sattley et Deborah O. Jung

L’ion sulfate (SO42–) et le soufre élémentaire (S0) peuvent servir d’accepteurs d’électrons en conditions anoxiques pour un vaste groupe de delta-protéobactéries qui utilisent des composés organiques ou H2 comme donneurs d’électrons. L’hydrogène sulfuré (H2S) est le produit de l’oxydation du sulfate ou du soufre. Plus de 40 genres de ces organismes, classiquement nommés bactéries sulfato-réductrices et sulfo-réductrices, sont connus, et les principaux sont présentés dans le tableau 12.21. Les genres de bactéries sulfato-réductrices du groupe I, tels que Desulfovibrio (voir figure 12.50a), Desulfomonas, Desulfotomaculum et Desulfolobus (voir figure 12.50c), utilisent le lactate, le pyruvate, l’éthanol ou certains acides gras comme donneurs d’électrons et réduisent le sulfate en hydrogène sulfuré. Les genres du groupe II, comme Desulfobacter (voir figure 12.50d), Desulfococcus, Desulfosarcina (voir figure 12.50e) et Desulfonema (voir figure 12.50b), sont spécialisés dans l’oxydation des acides gras et en particulier de l’acétate, et réduisent le sulfate en sulfure. Les bactéries sulfato-réductrices sont pour la plupart des anaérobies obligatoires, et des techniques en anaérobiose stricte sont nécessaires pour leur culture (voir figure 12.50g). Les bactéries sulfato-réductrices sont très répandues dans les environnements aquatiques et terrestres qui deviennent anoxiques en raison des processus de décomposition microbienne. Le genre le mieux étudié est Desulfovibrio (voir figure 12.50a), commun dans les milieux aquatiques ou les sols gorgés d’eau contenant des matières organiques en abondance et des niveaux suffisants de sulfate. Desulfotomaculum, phylogénétiquement membre des Bacteria Gram positif, est un bacille sporulé trouvé essentiellement dans le sol. La croissance et la réduction du sulfate par Desulfotomaculum dans certaines boîtes de conserves conduisent à une détérioration des aliments, appelée en anglais sulfide stinker. Les autres genres de sulfato-réducteurs sont indigènes aux milieux dulçaquicoles anoxiques (groupe I) ou aux milieux marins (groupes I et II) et peuvent occasionnellement être isolés du tube digestif de mammifères.

Fritz Widdel

Genres principaux : Desulfovibrio, Desulfobacter, Desulfuromonas

Norbert Pfennig

Norbert Pfennig

12.18 Protéobactéries sulfato- et sulfom n réductrices

La réduction du soufre

(g)

Les bactéries sulfo-réductrices dissimilatives peuvent réduire le soufre élémentaire en sulfure, mais sont incapables de réduire le sulfate en sulfure. Les membres du genre Desulfuromonas (voir figure 12.50f) peuvent croître en anaérobiose en couplant l’oxydation de substrats tels que l’acétate ou l’éthanol à la réduction du soufre élémentaire en hydrogène sulfuré. Cependant, la capacité à réduire le soufre élémentaire (comme d’autres composés soufrés tels le thiosulfate, le sulfite ou le DMSO) est une propriété commune de nombreux chimio-organotrophes, généralement des bactéries aérobies facultatives (Proteus, Campylobacter, Pseudomonas et Salmonella). Desulfuromonas diffère de ces organismes en ce sens qu’il utilise seulement le soufre comme accepteur d’électrons (voir tableau 12.21). Les bactéries sulfo-réductrices comme Desulfuromonas vivent dans de nombreux habitats

FIGURE 12.50 Images en microscopie à contraste de phase de bactéries sulfato-réductrices (a-e) et sulfo-réductrices (f). a) Desulfovibrio desulfuricans ; le diamètre des cellules est d’environ 0,7 µm. b) Desulfonema limicola ; le diamètre des cellules est d’environ 3 µm. c) Desulfolobus propionicus ; le diamètre des cellules est d’environ 1,2 µm. d) Desulfobacter postgatei ; le diamètre des cellules est d’environ 1,5 µm. e) Desulfosarcina variabilis (microscopie à contraste interférentiel) ; le diamètre des cellules est d’environ 1,25 µm. f) Desulfuromonas acetoxidans ; le diamètre des cellules est d’environ 0,6 µm. g) Culture d’enrichissement de bactéries sulfato-réductrices. À gauche, milieu stérile ; au centre, enrichissement positif de couleur noire en raison de la formation de sulfure de fer (FeS) ; à droite, colonies de bactéries sulfato-réductrices en gélose molle (voir section 18.2).



12.18 Protéobactéries sulfato- et sulfo-réductrices 377

TABLEAU 12.21 Genre

CARACTÉRISTIQUES DE QUELQUES GENRES CLÉS DE BACTERIA SULFATO- ET SULFO-RÉDUCTRICESa Caractéristiques

ADN (% G+C)

Sulfato-réducteurs du Groupe I : pas d’oxydation de l’acétate Desulfovibrio Flagelle polaire, bacille courbe, non sporulé ; Gram négatif ; contient de la désulfoviridine, 46–61 une espèce thermophile Desulfomicrobium Bacille mobile, non sporulé ; Gram négatif ; pas de désulfoviridine 52–57 Desulfobotulus Vibrion ; Gram négatif ; mobile ; pas de désulfoviridine 53 Desulfofustis Bacille mobile, spécialisé dans la dégradation du glycolate et glyoxycolate 56 Desulfotomaculum Bacille droit ou courbe ; mobile par flagelles polaires ou pérotriches ; Gram négatif ; pas de 37–46 désulfoviridine ; endospores ; peut utiliser l’acétate comme source d’énergie Desulfomonile Bacille ; capable de réduction de déchloration réductrice du 3-chlorobenzoate en benzoate 49 (voir section 17.18) Desulfobacula Cellules ovales à coccoïdes, marin ; peut oxyder de nombreux composés aromatiques, dont 42 le toluène, en CO2 Archaeoglobus Archaea ; hyperthermophile, température optimale 83 ˚C ; contient des coenzymes des 41–46 méthanogènes, produit de petites quantités de méthane pendant la croissance ; H2, formate, glucose, lactate et pyruvate sont les donneurs d’électrons ; SO42–, S2O32– ou SO32– les accepteurs (voir section 13.7) Desulfobulbus Cellules ovoïdes ou en forme de citron ; non sporulé ; Gram négatif ; pas de 59–60 désulfoviridine ; en cas de mobilité, flagelle polaire ; utilise le propionate comme donneur d’électrons avec l’acétate + CO2 comme produits Desulforhopalus Bacilles courbes, vacuoles de gaz, psychrophile ; utilise propionate, lactate ou les alcools 48 comme donneurs d’électrons Thermodesulfobacterium Petits bacilles Gram négatif ; désulfoviridine présente ; thermophile, croissance optimale à 34 70 ˚C ; membre des Bacteria, mais contient des lipides avec liaisons éther (voir section 12.36) Sulfato-réducteurs du Groupe II : oxydent l’acétate Desulfobacter Bacilles ; non sporulé, Gram négatif ; pas de désulfoviridine ; en cas de mobilité, flagelle 45–46 polaire ; utilise seulement l’acétate comme donneur d’électrons et l’oxyde en CO2 via le cycle de l’acide citrique Desulfobacterium Bacilles, certains avec vésicules de gaz, marins ; capable de croissance autotrophe via la 41–59 voie de l’acétyl-CoA Desulfococcus Cellules sphériques ; non mobile ; Gram négatif, désulfoviridine ; non sporulés ; utilise les 57 acides gras en C1 à C14 comme donneurs d’électrons, et oxydation complète en CO2 ; croissance autotrophe possible via la voie de l’acétyl-CoA Desulfonema Grandes bactéries filamenteuses à mobilité glissante ; Gram positif, non sporulé ; présence 35–42 ou absence de désulfoviridine ; utilise les acides gras en C2 à C12 comme donneurs d’électrons avec oxydation complète en CO2 ; croissance autotrophe possible via la voie de l’acétyl-CoA (donneur d’électrons : H2) Desulfosarcina Cellules en paquets (typique des sarcines) ; Gram négatif ; non sporulé ; désulfoviridine 51 absente ; utilise les acides gras en C2 à C14 comme donneurs d’électrons avec oxydation complète en CO2 ; croissance autotrophe possible via la voie de l’acétyl-CoA (donneur d’électrons : H2) Desulfoarculus Vibrion ; Gram négatif, mobile ; pas de désulfoviridine ; utilise seulement les acides gras en 66 C1 à C18 comme donneurs d’électrons Desulfacinum Cellules coccoides à ovales ; Gram négatif ; utilise les acides gras en C1 à C18 ; nutrition 64 diversifiée, capable de croissance autotrophe, thermophile Desulforhabdus Bacilles ; non sporulé, Gram négatif ; utilise les acides gras avec oxydation complète en CO2 52 Thermodesulforhabdus Bacilles mobiles Gram négatif ; thermophile ; utilise les acides gras jusqu’en C18 51 Soufre-réducteurs Desulfuromonas Bacilles droits, flagelle latéral unique ; non sporulé ; Gram négatif ; ne réduit pas les sulfates ; 50–63 acétate, succinate, éthanol ou propanol comme donneurs d’électrons ; anaérobie obligatoire ; une espèce est capable de déchloration réductrice du trichloroéthylène (voir section 17.18) Desulfurella Bacilles courts mobiles ; Gram négatif ; nécessite de l’acétate ; thermophile 31 Sulfurospirillum Petits vibrions, réduit S0 avec H2 ou formate comme donneurs d’électrons – Campylobacter Bacilles courbes (vibrions) ; flagelles polaires ; Gram négatif ; non sporulé ; incapable de 40–42 réduire le sulfate, mais réduit soufre, sulfite, thiosulfate, nitrate ou fumarate avec l’acétate ou de nombreux autres donneurs d’électrons ; anaérobie facultatif a

Phylogénétiquement, la plupart des sulfato- et sulfo-réducteurs sont des delta-protéobactéries.



378 Chapitre 12


identiques à ceux des bactéries sulfato-réductrices et forment souvent des associations avec les bactéries qui oxydent H2S en S0 – telles que les bactéries vertes sulfureuses (voir section 12.32). Le soufre produit est alors réduit en retour en H2S par les soufres réducteurs, formant un cycle du soufre anaérobie simplifié (voir section 19.13).

La physiologie des bactéries sulfato-réductrices La gamme des donneurs d’électrons utilisée par les bactéries sulfato-réductrices est large. Hydrogène, lactate et pyruvate sont presque universellement utilisés, et de nombreuses espèces du groupe I utilisent malate, sulfonate et certains alcools primaires (éthanol, propanol et butanol). Certaines souches de Desulfotomaculum utilisent le glucose, mais ceci est assez rare chez les sulfato-réducteurs. Les sulfato-réducteurs du groupe I oxydent leur donneur d’électrons au niveau de l’acétate et excrètent cet acide gras comme produit final. Les organismes du groupe II diffèrent de ceux du groupe I par leur capacité à oxyder les acides gras (dont l’acétate), le lactate, le succinate et même le benzoate chez quelques espèces, jusqu’au stade CO2. Desulfosarcina, Desulfonema, Desulfococcus, Desulfobacterium, Desulfotomaculum et certaines espèces de Desulfovibrio sont uniques chez les sulfato-réducteurs par leur capacité à croître en chimiolitho-autotrophie avec H2 comme donneur d’électrons, le sulfate comme accepteur, et CO2 comme seule source de carbone. De rares sulfato-réducteurs spécialisés peuvent aussi utiliser les hydrocarbures, y compris le pétrole brut, comme donneurs d’électrons. Ce processus est remarquable, car avant que de tels organismes soient identifiés, on pensait que les hydrocarbures pouvaient être oxydés seulement en conditions aérobies (voir section 17.23). Outre l’utilisation du sulfate comme accepteur d’électrons, de nombreuses bactéries sulfato-réductrices peuvent croître en utilisant le nitrate comme accepteur d’électrons, réduisant NO3– en NH3, ou réduisant les sulfonates, comme l’iséthionate (HO-CH2-CH2-SO3–), en sulfure. Le soufre élémentaire peut aussi être réduit en sulfure par la plupart des bactéries sulfato-réductrices. Certains composés organiques peuvent être fermentés par les bactéries sulfato-réductrices. Le plus commun de ces composés fermentescibles est le pyruvate qui est converti en acétate, CO2 et H2 par une réaction dite phosphoroclastique (voir figure 17.51). De plus, bien que considérées comme anaérobies obligatoires, certaines souches de bactéries sulfatoréductrices, principalement celles isolées de tapis bactériens où elles coexistent avec les cyanobactéries productrices d’O2, sont assez tolérantes à l’oxygène et peuvent utiliser O2 comme accepteur d’électrons. Au moins une espèce de Desulfovibrio, D. oxyclinae, peut effectivement croître avec O2 comme accepteur d’électrons en conditions microaérophiles.

Isolement L’enrichissement de Desulfovibrio est relativement aisé sur un milieu anaérobie contenant lactate et sulfate, additionné de fer ferrique. Un agent réducteur tel que le thioglycolate ou l’ascorbate est aussi ajouté pour obtenir un E0’ faible. Lorsque les bactéries sulfato-réductrices se développent, le sulfure formé par la réduction des sulfates se combine avec le fer ferrique pour donner du sulfure de fer, noir, insoluble (voir

figure 12.50g). Ce noircissement indique non seulement la réduction des sulfates, mais le fer piège et détoxifie le sulfure, permettant un meilleur rendement cellulaire. Un début de croissance étant indiqué par le noircissement du milieu, la purification est effectuée par repiquage dans un tube dont la paroi interne est recouverte d’une fine couche d’agar (roll tube) ou sur boîte de Petri, incubée ensuite dans une enceinte anaérobie (voir figure 6.26). Une autre méthode consiste à utiliser des tubes de gélose molle. Dans ce cas, une petite quantité de liquide provenant de l’enrichissement original est ajoutée à un tube d’agar fondu contenant le milieu de culture, mélangée, et diluée en série dans des tubes du même milieu (voir section 18.2 et figure 18.3b). Après prise en masse de l’agar, les cellules de bactéries sulfato-réductrices distribuées dans la masse d’agar forment des colonies noires (voir figure 12.50g), qui peuvent être aseptiquement prélevées, et le processus entier est répété jusqu’à obtention de cultures pures.

Contrôlez vos acquis Les bactéries sulfato- et sulfo-réductrices forment un vaste groupe de delta-protéobactéries ayant en commun la propriété de réduire SO42– ou S0 en H2S en conditions anaérobies. Deux groupes physiologiques de bactéries sulfatoréductrices sont connus : le groupe I, incapable d’oxyder l’acétate en CO2, et le groupe II qui en est capable. •

Quel substrat organique utiliseriez-vous pour enrichir et isoler des sulfato-réducteurs du groupe II à partir d’un échantillon naturel ?

•

Pour les bactéries sulfato-réductrices capables de chimiolithotrophie et d’autotrophie : 1) Quel est le donneur d’électrons ? 2) Quel est l’accepteur d’électrons ? 3) Quelle est la source de carbone ?

•

Physiologiquement, en quoi Desulfuromonas diffère de Desulfovibrio ?

III

PHYLA 2 ET 3 : LES BACTÉRIES GRAM POSITIF ET LES ACTINOBACTÉRIES

12.19 Bactéries Gram positif, non m n sporulées, à faible % G+C :

bactéries lactiques et apparentées

Genres principaux : Staphylococcus, Micrococcus, Streptococcus, Lactobacillus, Sarcina Deux sous-divisions régissent les bactéries Gram positif : celles possédant un haut (actinobactéries) ou un faible taux de guanine et de cytosine (% G+C) ; cette section s’intéresse aux genres bactériens ayant un faible % G+C, ainsi qu’au genre Micrococcus, bien que membre des actinobactéries, du fait de leur morphologie semblable à celle du genre Staphylococcus. Les bactéries lactiques non sporulées, en forme de bâtonnets et de cocci sont également étudiées dans cette section (voir tableau 12.22).



12.19 Bactéries Gram positif, non sporulées, à faible % G+C : bactéries lactiques et apparentées 379

TABLEAU 12.22

Genre

SIGNES PARTICULIERS DES PRINCIPAUX GENRES DE COCCI GRAM POSITIF Mobilité

Arrangement cellulaire

Croissance ADN Groupe par la voie (% G+C) phylogénétique fermentaire


Micrococcus

–

Amas, tétrades

–

66–73

Actinobactéries

Aérobie strict

Staphylococcus

–

Amas, paires

+

30–39

faible % G+C

Présence d’acide téchoïque dans la paroi cellulaire

Stomatococcus

–

Amas, paires

+

56–60

Actinobactéries

Présence d’une capsule

Planococcus

+

Paires, tétrades

–

39–52

faible % G+C

Essentiellement marine

Sarcina

–

Paquets cuboïdes de 8 cellules, ou plus

+

28–31

faible % G+C

Fortement acido-tolérant. Présence de cellulose dans la paroi cellulaire

Ruminococcus

+

Paires, chaînes

+

39–46

faible % G+C

Anaérobie strict. Habitats : rumen, caeca et gros intestin de nombreux animaux

Peptococcus

–

Amas, paires

+

50–51

faible % G+C

Anaérobie strict. Fermentation des peptones mais pas des sucres

Peptostreptococcus

–

Bouquets, courtes chaînes

+

28–37

faible % G+C

Anaérobie strict. Fermentation des peptones. Habitat commun de la flore humaine, la peau, les intestins et le vagin. Isolement des écoulements vaginaux et purulents

Staphylococcus et Micrococcus Les bactéries appartenant à ces deux genres possèdent un métabolisme respiratoire normal et une catalase ; le test de la catalase permet de les différencier des bactéries du genre Streptococcus des autres cocci Gram positif. Ces formes coccidiques sont relativement résistantes à des environnements à activité de l’eau réduite et tolèrent très aisément des environnements desséchés ou fortement salés. Cette aptitude à se multiplier dans des milieux fortement salés est un moyen sélectif pour l’isolement ; ainsi, si un inoculum approprié est étalé sur un milieu gélosé riche, contenant 7,5 % de sel (NaCl), les cocci Gram positif formeront la population dominante après une incubation dans des conditions d’aérobiose. De plus, de nombreuses espèces sont pigmentées, ce qui apporte un élément supplémentaire dans la caractérisation de ces bactéries. Les genres Micrococcus et Staphylococcus sont facilement différenciables grâce à leur type respiratoire (voir tableau 24.3). En effet, les espèces du genre Micrococcus sont des bactéries aérobies strictes produisant de l’acide à partir du glucose uniquement dans ces conditions d’aérobiose. Au contraire, celles appartenant au genre Staphylococcus sont des bactéries aérobies facultatives, produisant de l’acide à partir du glucose indifféremment dans les conditions d’aérobiose ou d’anaérobiose. De plus, il peut être signalé, à l’inverse de Micrococcus sp., que les cellules de Staphylococcus sp. ont tendance à former des amas (voir figure 12.51a). Les staphylocoques sont des bactéries commensales et parasites pour les hommes et les animaux ; certaines espèces peuvent

être pathogènes. Chez l’homme, deux espèces sont particulièrement recherchées : Staphylococcus epidermidis, espèce non pigmentée, non pathogène et fréquemment retrouvée sur la peau et dans les muqueuses ; Staphylococcus aureus, pigmentée en jaune, reconnue comme une espèce pathogène et fortement associée à des infections telles que les furoncles, les abcès, les panaris, les pneumonies, les ostéomyélites, les méningites et les arthrites. La pathogénicité des souches de Staphylococcus aureus est discutée dans le chapitre 21 et les maladies staphylococciques dans les chapitres 26 et 29. Les espèces de Micrococcus peuvent également être isolées de la peau, mais sont plus fréquemment présentes sur des substrats inertes tels que les particules de poussières, et dans le sol.

Sarcina Le genre Sarcina compte les espèces bactériennes ayant la particularité de se diviser dans trois plans perpendiculaires pour former des paquets de huit cellules au plus (voir figure 12.52a). Ce sont des bactéries strictement anaérobies, très tolérantes aux acides, capables de fermenter différents sucres et de se développer à un pH voisin de 2. Les cellules de Sarcina ventriculi possèdent une épaisse couche de cellulose entourant leur paroi cellulaire (voir figure 12.52b). Les couches cellulosiques des cellules adjacentes ont tendance à s’attacher entre elles, permettant ainsi l’agrégation des paquets de cellules de Sarcina ventriculi. Sarcina sp. est présente dans le sol, la boue, les matières fécales et les contenus stomacaux. Sarcina ventriculi est l’une des seules bactéries




A. Umeda

380 Chapitre 12

T. Beveridge

Susan Koval

(a)

Ils sont dépourvus de porphyrines et de cytochromes, ne participent pas à la phosphorylation oxydative et par conséquent tirent leur énergie uniquement par la phosphorylation des substrats énergétiques. Les bactéries lactiques sont anaérobies, mais la plupart d’entre elles ne sont pas sensibles à l’oxygène et peuvent donc se développer en présence ou en absence de cette molécule (aéro-anaérobies). Elles produisent leur énergie principalement par la métabolisation des sucres ; en conséquence, leurs habitats se restreignent à des environnements sucrés. Leur capacité de biosynthèse est très limitée et leurs exigences nutritionnelles complexes nécessitent des besoins en acides aminés, en vitamines, en purines et pyrimidines (voir tableau 5.4). Une importante différence entre les sous-groupes des bactéries lactiques réside dans les profils fermentaires des produits issus de la fermentation des sucres. Le groupe des bactéries lactiques homofermentaires produit uniquement de l’acide lactique ; un autre groupe, hétérofermentaire, produit d’autres substances telles que, principalement, de l’éthanol, de l’acétate et du gaz carbonique, ainsi que du lactate (voir tableau 12.23). La figure 12.53 schématise les différentes voies de fermentation du glucose par ces deux sous-groupes homo- et hétérofermentaires, de bactéries lactiques. Les différences observées dans ces deux types de fermentation résultent principalement de la présence, ou non, d’une aldolase qui doit être considérée comme une enzyme clé de la

(b) FIGURE 12.51 Staphylococcus. a) Cellules typiques de S. aureus observées au microscope électronique à balayage, montrant l’arrangement irrégulier des amas cellulaires. Le diamètre d’une cellule est d’environ 0,8 µm. b) Cellule de S. aureus en phase de division au microscope électronique à transmission. Notez l’épaisseur de la paroi cellulaire des bactéries Gram positif (voir section 4.8).

(a)

Les bactéries lactiques (et les fermentations de l’acide lactique) Le groupe défini sous le terme de bactéries lactiques correspond à des bâtonnets ou des cocci Gram positif produisant, principalement ou uniquement, de l’acide lactique par la voie fermentaire.

T. Beveridge

actuellement capables de se multiplier dans l’estomac des humains et des autres animaux monogastriques, du fait de la tolérance importante aux acides ; ainsi, une croissance rapide de cette bactérie peut être observée dans l’estomac de personnes souffrant de troubles gastro-intestinaux tels que les ulcères pyloriques. Cette situation pathologique modifie l’écoulement du bol alimentaire vers l’intestin, nécessitant souvent une intervention chirurgicale. (b)

FIGURE 12.52 Sarcina. a) Cellules typiques de cocci Gram positif (Sarcina sp.) en microscopie à contraste de phase. b) Observation en microscopie électronique d’une coupe fine. La couche la plus externe de la cellule est constituée de cellulose.



12.19 Bactéries Gram positif, non sporulées, à faible % G+C : bactéries lactiques et apparentées 381 Homofermentaires

Hétérofermentaires

Glucose ATP

Glucose ATP

ADP

ADP Glucose 6-phosphate NAD+ NADH

ATP

Acide 6-phosphogluconique NAD+

ADP Fructose 1,6-bisphosphate

NADH Ribulose 5-phosphate + CO2 Pentoses

Aldolase

Xylulose 5-phosphate Pi Phosphocétolase


+

Dihydroxyacétone phosphate


Pi

Pi

NAD+

NAD+

NADH

NADH Acide 1,3-diphosphoglycérique

Acide 1,3-diphosphoglycérique ADP

ADP

ATP

ATP

ADP

ADP

ATP

Acétyl phosphate NADH NAD+ Acétaldéhyde NADH NAD+ Éthanol

ATP Pyruvate– NADH

Pyruvate– NADH NAD+ Lactate–

+

Gain net = 2 ATP 2 lactate par molécule de glucose fermentée

NAD+ Lactate–

Gain net = 1 ATP (1 lactate + 1 éthanol + 1 CO2) par molécule de glucose fermentée

FIGURE 12.53 Fermentation du glucose chez les bactéries lactiques homo- et hétérofermentaires. Notez qu’aucun ATP n’est produit dans les réactions menant à la formation d’éthanol. En présence d’oxygène, de nombreuses bactéries lactiques hétérofermentaires peuvent le réduire, grâce à la NADH, en produisant de l’eau ; ceci conduit à la formation d’acétate à la place de l’éthanol et permet ainsi la production d’un ATP supplémentaire.

glycolyse (voir figure 5.14). En effet, les bactéries hétérofermentaires, du fait de l’absence de cette aldolase, ne peuvent dégrader le fructose biphosphate en triose-phosphate ; en contrepartie, elles oxydent le glucose6-phosphate en 6-phosphogluconate qui est par la suite décarboxylé en pentose-phosphate, lui-même transformé en triose-phosphate et acétyl-phosphate grâce à une phosphocétolase (voir figure 12.53). Ce triose-phosphate, chez les bactéries hétérofermentaires, est, en définitif, transformé en acide lactique, avec la production d’une mole d’ATP. Cependant, pour équilibrer la balance, l’acétyl-phosphate produit doit accepter des électrons provenant du

NADH généré au cours de la production du pentose-phosphate, se transformant ainsi en éthanol ; cette réaction se réalise sans production d’ATP. La voie hétérofermentaire permet la libération, à partir du glucose, d’une seule mole d’ATP, contrairement à la voie homofermentaire qui permet d’en libérer deux. De plus, du fait de la décarboxylation du 6-phosphogluconate par les bactéries hétérofermentaires, celles-ci produisent du gaz carbonique ; au contraire, les bactéries homofermentaires n’en produisent pas, ou très peu. Par conséquent, une méthode simple pour détecter les bactéries hétérofermentaires est de mettre en évidence, en laboratoire, la production de gaz carbonique.



382 Chapitre 12

TABLEAU 12.23


CRITÈRES DE DIFFÉRENCIATION DES PRINCIPAUX GENRES

a DE BACTÉRIES LACTIQUES

Morphologie cellulaire et type d’arrangement

Hétérofermentaires Bâtonnets en chaînes caractéristiques Homofermentaires Hétérofermentaires

Streptococcus Enterococcus Lactococcus Pediococcus Leuconostoc

(34–46) (38–40) (38–41) (34–42) (38–41)

Lactobacillus (32–53) Lactobacillus (34–53)

a L’ensemble de ces bactéries appartient, d’un point de vue phylogénétique, à la subdivision des bactéries Gram positif à faible % G+C.

Les différents genres regroupant les bactéries lactiques ont été définis sur la base de leur morphologie, de la composition en bases de leur ADN, de leur phylogénie et du type de métabolisme fermentatif (voir tableau 12.23). Les espèces appartenant aux genres Streptococcus, Enterococcus, Lactococcus, Leuconostoc et Pediococcus ont des pourcentages en bases (% G+C) de leur ADN, très proches. De plus, les variations entre souches sont également très faibles. Par contre, les espèces du genre Lactobacillus ne présentent pas cette similitude dans la composition en bases de leur ADN ; en ce sens, il peut être considéré que ces espèces ne constituent pas un groupe homogène.

Streptococcus et autres cocci Le genre Streptococcus (voir figure 12.54) comprend une large variété d’espèces homofermentaires, vivant dans des

TABLEAU 12.24

Groupe

T. D. Brock

Cocci en chaînettes ou en tétrades Homofermentaires

BryanLarsen

Genre (% G+C)

(a)

(b)

FIGURE 12.54 Observation en microscopie à contraste de phase (a) et électronique à balayage (b) de cocci Gram positif . a) Lactococcus lactis. b) Streptococcus sp. Le diamètre des cellules est compris entre 0,5 et 1 µm.

environnements très variés et représentant une importance pour l’homme du fait de leurs activités métaboliques. Certaines espèces peuvent être considérées comme pathogènes pour l’homme et les animaux (voir section 26.2) ; les autres espèces jouent un rôle extrêmement important dans la fabrication des ensilages agricoles et dans les productions laitières et autres aliments fermentés (voir section 29.2). De plus, certaines espèces sont également étroitement associées à la formation des caries dentaires (voir section 21.3). Il est de coutume, au sein de ce groupe, de distinguer les espèces du genre Lactococcus qui correspondent aux bactéries laitières (lactocoques) et celles du genre Enterococcus (entérocoques) incluant les streptocoques d’origine fécale. De plus, les bactéries appartenant au genre Streptococcus (stretocoques) sont également séparées en deux sous-groupes (pyogènes et viridans) [voir tableau 12.24]. Le test de l’hémolyse sur un milieu gélosé au sang est très important pour la distinction de ces espèces bactériennes. En effet, certaines souches produisant une streptolysine O ou S sont entourées d’une zone importante correspondant à l’hémolyse des globules sanguins (hémolyse) [voir figure 21.17a]. Par

CARACTÈRES DIFFÉRENCIELS DES STREPTOCOQUES, ENTÉROCOQUES ET LACTOCOQUES

Test de Lancefield (groupe)

Température de croissance Espèces types

Test de l’hémolyse

10 °C

45 °C

Survie à 60 °C/ 30 min

Croissance en présence de Lait + Bouillon bleu de nutritif + méthylène bile (0,1 %) (40 %)

Habitat

Streptocoques Pyogènes

A, B, C, F, G

S. pyogenes

Lyse (β)

–

–

–

–

–

Viridans

–

S. mutans

Verdissement (α)

–

+

–

–

–

Entérocoques

D

E. faecalis

Lyse (β), verdissement (α) ou négatif

+

+

+

+

+

Intestins, vagins, plantes

Lactocoques

N

L. lactis (voir figure 12.54a)

Négatif

+

–

+

+

+

Plantes, produits laitiers

Appareil respiratoire Bouche et intestins




des fermentations lactiques. Aucune de ces espèces n’est reconnue pathogène pour l’homme et les animaux.

Listeria

Otto Kandler

Ces bactéries se présentent sous la forme de coccobacilles en courte chaînette composée de trois à cinq cellules (voir figure 29.9). Elles sont reliées phylogénétiquement aux espèces du genre Lactobacillus, et produisent, comme les bactéries homofermentaires, de l’acide mais pas de gaz, à partir du glucose. Cependant, à l’inverse des bactéries lactiques qui peuvent se multiplier dans des conditions dépourvues d’oxygène (anoxiques) et ne possèdent pas de catalase, les espèces du genre Listeria exigent la présence d’oxygène pour leur croissance et possèdent une catalase. Différentes espèces du genre Listeria ont été décrites, mais Listeria monocytogenes est la plus importante du fait de sa forte pathogénicité pour l’homme (listériose), notamment lors de la consommation d’aliments contaminés prêts à être

(a)

Otto Kandler

contre, d’autres souches de streptocoques, ainsi que les lactocoques et les entérocoques, ne produisent pas cette hémolysine, mais provoquent la formation d’une zone verte ou brune autour de la colonie isolée sur un milieu gélosé au sang ; cette zone ne doit pas être considérée comme une zone d’hémolyse, mais comme un processus de décoloration du milieu du fait de la perte du potassium à partir des globules sanguins (hémolyse). Ces bactéries sont également classées sur la base de leurs caractéristiques immunologiques et plus particulièrement sur la présence d’antigènes spécifiques. Ce classement en groupes, communément appelés les groupes de Lancefield, nom donné en hommage à Rebecca Lancefield, pionnière dans la taxinomie de Streptococcus sp., se réalise sous la forme de lettres alphabétiques, allant de A à O. Les streptocoques hémolytiques d’origine humaine, appartiennent au groupe A de Lancefield, les entérocoques se retrouvant dans le groupe D. Les streptocoques de groupe B sont fréquemment associés aux animaux et sont à l’origine de mammites (infection des mamelles) chez les vaches laitières ; ils ont également été associés à des épisodes infectieux en pathologie humaine. Les lactocoques appartiennent au groupe antigénique N et ne sont pas reconnus comme des micro-organismes pathogènes. Les bactéries hétérofermentaires en forme de coques sont placées dans le genre Leuconostoc ; les souches appartenant à ce genre ont la particularité de produire des substances aromatiques (diacétyle et acétoïne) à partir du citrate ; elles sont utilisées comme ferments lactiques (starters) pour certains produits laitiers. Certaines souches produisent des quantités importantes de polysaccharides (α-1,6-glucane) lorsqu’elles sont cultivées sur un substrat contenant du saccharose (voir figure 17.64) et certains d’entre eux sont utilisés dans le milieu médical notamment en substitution temporaire du plasma, au cours de transfusions sanguines. D’autres souches de Leuconostoc produisent d’autres polysaccharides polymères tels que les polymères de fructose, dénommés lévanes.

Lactobacillus (b)

V. Bottazi

Les lactocacilles ont des formes typiques en bâtonnets ; certains sont relativement longs et minces, d’autres plus courts et courbés (voir figure 12.55). La plupart des espèces sont homofermentaires (voir tableau 12.23). Ces bactéries sont très communément rencontrées dans les produits laitiers et certaines d’entre elles sont utilisées pour la fabrication de produits fermentés. Ainsi, Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus (voir figure 12.55c) est utilisé pour la fabrication de yogourt, L. acidophilus (voir figure 12.55a) pour la production de laits fermentés. D’autres espèces sont également associées à des productions telles que les ensilages de végétaux destinés à l’alimentation animale, les choucroutes et les produits saumurés (voir section 29.2). Ces bactéries résistent très bien aux conditions acides et peuvent se développer à des pH proches de 4 ; en conséquence, elles peuvent être isolées sélectivement, au laboratoire, sur des milieux acidifiés. De plus, cette particularité de résistance aux environnements acidifiés permet aux lactobacilles de poursuivre leur développement au cours du processus naturel de fermentation lactique, même si le pH du produit s’avère trop bas pour permettre la croissance des autres espèces de bactéries lactiques. En ce sens, les lactobacilles sont responsables des dernières étapes

(c) FIGURE 12.55 Observation en microscopie à contraste de phase et électronique d’espèces de Lactobacillus. a) Lactobacillus acidophilus : la longueur des cellules est approximativement de 0,75 µm. b) Lactobacillus brevis (microscopie électronique à transmission) : la taille de la cellule est de 2 × 0,8 µm. c) Lactobacillus delbrueckii (microscopie électronique à balayage) : les cellules ont un diamètre d’environ 0,7 µm. Des espèces de Lactobacillus homo- et hétérofermentaires ont été décrites (voir figure 12.53 et tableau 12.23).



384 Chapitre 12


consommés (voir section 29.10 et figure 29.9). Les symptômes de cette maladie sont variés, pouvant aller jusqu’à des méningites et des avortements.

12.20 Bactéries Gram positif, sporulées, m n à faible % G+C : Bacillus, Clostridium et bactéries apparentées

Genres principaux : Bacillus, Clostridium, Sporosarcina, Heliobacterium Plusieurs genres de bactéries sporulées ont été décrits (voir tableau 12.25), se différenciant principalement par la morphologie cellulaire, la forme et la position de la spore intracellulaire (voir figure 12.56), le type respiratoire et le métabolisme énergétique. La structure et la résistance thermique de la spore bactérienne lors de sa formation ont été présentées dans la section 4.13. L’ensemble de ces bactéries sporulées présente des relations phylogéniques avec ce groupe de bactéries Gram positif à faible taux de guanine et cytosine (% G+C). Les deux genres les plus fréquemment étudiés sont Bacillus d’une part et Clostridium d’autre part. Le premier comprend des espèces aérobies ou aérobies facultatives, le second des espèces fermentaires anaérobies strictes. Les bactéries du genre Heliobacterium sont phototrophes (helio signifiant « soleil » en grec). Il existe une hétérogénéité génétique au sein de ce groupe de bactéries sporulées : ainsi, le taux de guanine et cytosine (% G+C) des espèces du genre Bacillus, varie sur une échelle de 40 %. Cependant, il existe une relation écologique entre ces bactéries sporulées

TABLEAU 12.25

car elles sont toutes présentes dans les environnements naturels et plus particulièrement dans les sols. Ainsi, même les espèces pathogènes pour l’homme ou les animaux sont à l’origine des espèces saprophytes des organismes des sols qui infectent leurs hôtes incidemment. En effet, le fait de pouvoir produire une spore est un avantage certain pour les bactéries des sols car ces milieux sont des environnements très variables en termes de ressources nutritionnelles, de température et d’hygrométrie. Ainsi, une forme résistant à la chaleur et à la dessiccation, pouvant demeurer dans cet état de dormance pendant de longues périodes (peut-être même plusieurs millions d’années, section 4.13), doit présenter des conditions naturelles importantes de survie. Les bactéries sporulées sont isolées du sol, des aliments, de la poussière et de bien d’autres substrats, en réalisant un traitement thermique (par exemple à 80 °C pendant 10 min) afin de détruire les formes végétatives et de ne conserver que les formes sporulées. L’étalement de cet échantillon traité sur un milieu gélosé adapté, puis l’incubation dans des conditions d’aérobiose ou d’anaérobiose, permettront respectivement d’isoler les espèces de Bacillus ou de Clostridium.

Bacillus et Paenibacillus Les espèces appartenant à ces deux genres (voir tableau 12.26) se développent très bien à partir de différents milieux de culture contenant différentes sources de carbone. Beaucoup de ces espèces produisent des enzymes extracellulaires qui peuvent décomposer des polymères tels que les polysaccharides (voir figure 17.63), les acides nucléiques et les lipides. Cette propriété permet aux bactéries d’utiliser ces produits comme source de carbone et donneurs d’électrons. De nombreuses espèces produisent également des antibiotiques tels que la

PRINCIPAUX GENRES DE BACTÉRIES SPORULÉESa Caractéristiques

Genre

% G+C

Bâtonnets Aérobies ou aéro-anaérobies, catalase +

Bacillus Paenibacillus

32–69 40–54

Microaérophiles, catalase –, producteurs d’acide lactique par voie homofermentaire

Sporolactobacillus

46–47

Anaérobies : Réduction des sulfates + Réduction des sulfates –, fermentaires Thermophiles (optimum 65–70 °C), fermentaires Gram négatif, croissance sur H2 +CO2 (homoacétogène) Halophiles, isolées de la mer Morte Jusqu’à 5 spores par cellule, fixation N2

Desulfotomaculum Clostridium (voir figure 12.56) Thermoanaerobacter Sporomusa Sporohalobacter Anaerobacter

38–50 21–54 31–39 41–49 31 29

Acidophiles, optimum à pH 3

Alicyclobacillus

52–60

Alcalinophiles, optimum à pH 9

Amphibacillus

36–38

Phototrophes

Heliobacterium, Heliophilum, Heliorestis

50–58

Association syntrophe, dégradation des acides gras mais uniquement en coculture avec des bactéries utilisant H2 (voir section 17.21)

Syntrophosphora

37

Déchloruration des chlorophénols (voir section 17.18)

Desulfitobacterium

46

Cocci (arrangement en tétrades ou en paquets), aérobies

Sporosarcina (voir figure 12.60)

40–41

a

Ces micro-organismes appartiennent tous, phylogénétiquement, au groupe des bactéries Gram positif et à faible taux de guanine et cytosine (% G+C).



(a)

(b)

Hans Hippe

Hans Hippe

Hans Hippe


(c)

bacitracine, la polymyxine, la tyrocidine, la gramicidine et la circuline. Dans la majorité des cas, les antibiotiques sont libérés au cours de l’étape de sporulation, c’est-à-dire lorsque la bactérie atteint sa phase stationnaire de croissance et après le déclenchement de la sporulation. Certaines espèces, et plus particulièrement Paenibacillus popilliae et Bacillus thuringiensis, sécrètent également des substances contre les larves d’insectes. Ainsi, P. popilliae peut déclencher une maladie (milky disease) sur les larves de coccinelles japonaises ainsi que sur celles de la famille des Scarabaeidae. De même, B. thuringiensis est responsable d’une grave maladie des larves de différents groupes d’insectes, bien que certaines souches soient spécifiques de l’hôte infecté : certaines sont spécifiques des lépidoptères, tels que le ver à soie, le ver du chou, la chenille à tentes et le papillon disparate, d’autres sont pathogènes pour les diptères comme les

TABLEAU 12.26

FIGURE 12.56 Observation en microscopie à contraste de phase de différentes espèces de Clostridium, montrant les différents emplacements de l’endospore. a) Clostridium cadaveris : spores terminales ; la largeur des cellules est d’environ 0,9 µm. b) Clostridium sporogenes : spores subterminales ; la largeur des cellules d’environ 1 µm. c) Clostridium bifermentans : spores centrales ; la largeur des cellules d’environ 1,2 µm.

moustiques et les mouches noires, ou pour les coléoptères tels que les coccinelles de la pomme de terre du Colorado. Enfin, certaines souches de B. thuringiensis se sont également révélées toxiques vis-à-vis des coccinelles japonaises. Ainsi, des produits insecticides commerciaux ont été élaborés à partir de préparations de spores de B. thuringiensis et de P. popilliae. Le mode d’action de ces deux espèces est différent : P. popilliae provoque une septicémie, tandis que B. thuringiensis cause principalement une intoxication. Cependant, ces deux espèces pathogènes pour les insectes ont la particularité de synthétiser une protéine cristalline, appelée « cristal parasporal », au moment de la sporulation. Ce cristal se dépose dans la cellule, mais en dehors de la spore (voir figure 12.57). Dans le cas de B. thuringiensis, cette protéine est une protoxine qui sera transformée en une toxine grâce à une protéolyse qui se déroule dans l’intestin de l’insecte larvaire. La toxine s’attache aux cellules épithéliales de

PRINCIPALES CARACTÉRISTIQUES DES ESPÈCES REPRÉSENTATIVES DU GENRE BACILLUS Position de la spore

% G+C

Bacillus coagulans

Centrale ou terminale

47

Alicyclobacillus acidocaldarius

Terminale

60

Bacillus licheniformis

Centrale

46

Bacillus cereus

Centrale

35

Bacillus anthracis

Centrale

33

Bacillus megaterium

Centrale

37

Bacillus subtilis

Centrale

43

Bacillus thuringiensis

Centrale

34

Thermophiles

Geobacillus stearothermophilus

Terminale

52

Mésophiles

Paenibacillus polymyxa

Terminale

44

Bacillus macerans

Terminale

52

Bacillus circulans

Centrale ou terminale

35

Paenibacillus larvae Paenibacillus popilliae

Centrale ou terminale Centrale

– 41

Bacillus sphaericus

Terminale

37

Sporosarcina pasteurii

Terminale

38

Caractéristiques

Genre / espèce

I. Spores ovales ou cylindriques, aérobies facultatives, hydrolyse de la caséine et de l’amidon ; spore non déformante, paroi de la spore peu épaisse (mince) Thermophiles et acidophiles Mésophiles

Pathogènes des insectes Spore déformante, paroi épaisse

Pathogènes des insectes II. Spores sphériques, aérobies strictes, pas d’hydrolyse de la caséine et de l’amidon Spore déformante Spore non déformante



386 Chapitre 12

Diversité des procaryotes : les Bacteria Endospore

« naturellement » résistants aux insectes sensibles et indésirables. Différentes substances ont également été développées par les méthodes de génie génétique, à partir de ces toxines Bt, afin d’en augmenter la toxicité et de réduire la résistance (voir section 31.10).

Cristal

J.R. Norris

Clostridium

FIGURE 12.57 Cristal parasporal toxique observé chez Bacillus thuringiensis, bactérie pathogène des insectes. Observation d’une coupe mince de la cellule sporulante en microscopie électronique. La protéine cristalline (toxine Bt) est toxique pour certains insectes par une action lytique sur les cellules intestinales.

l’intestin et provoque la formation de pores entraînant l’écoulement du contenu cellulaire et la lyse des cellules de l’hôte. Les gènes codant la formation de ces protéines cristallines, appelées commercialement « toxine Bt », ont été identifiés pour de nombreuses souches de B. thuringiensis ; ils ont par la suite été introduits dans des végétaux afin de les rendre

TABLEAU 12.27

Les clostridies ne possèdent pas de chaîne respiratoire et, par conséquent, à l’inverse des bactéries du genre Bacillus, elles obtiennent leur ATP uniquement par la phosphorylation du substrat. Il existe une grande variété de mécanismes permettant d’acquérir cette énergie dans des conditions d’anaérobiose (voir section 17.20). La différenciation des espèces du genre Clostridium en deux sous-groupes est essentiellement basée sur ces propriétés et sur la nature des substrats utilisés pour cette fermentation (voir tableau 12.27). Certaines espèces fermentent les sucres, produisant principalement de l’acide butyrique comme produit final. D’autres produisent également de l’acétone et du butanol ; cette fermentation fut exploitée industriellement pour commercialiser ces deux sous-produits. Certaines espèces produisant de l’acétone et du butanol ont la particularité de fixer l’azote. Clostridium pasteurianum en particulier est probablement responsable de la majorité des phénomènes de fixation de l’azote dans les sols. Un groupe de clostridies est également

PRINCIPALES CARACTÉRISTIQUES DES ESPÈCES REPRÉSENTATIVES DU GENRE CLOSTRIDIUM

Caractéristiques majeures I. Fermentation des glucides Cellulose


Espècesa

% G+C

Produits de fermentation : acétate, lactate, succinate, éthanol, CO2

C. celliobioparum C. thermocellum

28 38–39

Sucres, amidon et pectine

Produits de fermentation : acétone, butanol, éthanol, isopropanol, butyrate, acétate, propionate, succinate, CO2, H2 ; certaines espèces fixent l’azote

C. butyricum C. acetobutylicum C. pasteurianum C. perfringens

27–28 28–29 26–28 24–27

Sucres essentiellement en acide acétique

Synthèse totale de l’acétate à partir du CO2 ; présence de cytochromes dans certaines espèces

C. aceticum Moorella thermoacetica C. formicaceticum

33 54 34

Pentoses et méthyl-pentoses uniquement

Cellule en forme d’anneau, chaînes hélicoïdes ; produits de fermentation : acétate, propionate, n-propanol, CO2, H2

C. methylpentosum

46

Produits de fermentation : acétate, autres acides gras, NH3, CO2, parfois H2 ; certaines souches peuvent également fermenter les sucres en butyrate et acétate ; peuvent produire des exotoxines (voir sections 21.10, 27.8 et 29.5)

C. sporogenes C. tetani C. botulinum C. tetanomorphum

26 25–26 26–28 25–28

Fermentation de 3 acides aminés carbonés (exemple, alanine) en propionate, acétate et CO2

C. propionicum

35

III. Fermentation des glucides ou des acides aminés

Produits de fermentation du glucose : acétate, formate, petites quantités d’isobutyrate et d’isovalérate

C. bifermentans

27

IV. Fermentation des purines

Fermentation de l’acide urique et autres purines en produisant de l’acétate, du CO2 et NH3

C. acidurici

27–30

V. Fermentation de l’éthanol en acides gras

Production de butyrate, de caproate et d’hydrogène ; nécessite de l’acétate comme accepteur d’électrons ; pas d’utilisation de sucres, ni d’acides aminés, ni de purines

C. kluyveri

30

II. Fermentation des acides aminés

a

Tous les noms d’espèces précédés de C. appartiennent au genre Clostridium.




connu pour fermenter la cellulose, avec production d’acides et d’alcools ; ces bactéries sont probablement les plus importantes populations de dégradation, en anaérobiose, de la cellulose présente dans les sols. Les différentes étapes biochimiques de production de l’acide butyrique et du butanol sont très bien comprises (voir figure 12.58). Le glucose est transformé en pyruvate par la voie d’Embden-Meyerhof, puis ce pyruvate est dégradé en acétylCoA, en gaz carbonique et en hydrogène grâce à une réaction phosphoroclastique (voir section 17.19 et figure 17.51). L’acétyl-CoA est ensuite réduit en produits de fermentation grâce au NADH issu des réactions glycolytiques. La durée de la réaction et les conditions de fermentation influencent les quantités des différents produits obtenus. Au moment des dernières étapes du processus de fermentation butyrique, les acides butyriques et acétiques sont les principaux produits élaborés. Mais, lorsque le pH du substrat

Glycolyse Glycolyse

Acétate–

Pyruvate–

ATP

Réaction phosphoroclastique

Pi

ADP Acétyle

P

Acetyl-CoA+ CO2 + Fdred

H2

2H

Acétyl CoA

Acétaldéhyde 2H

Éthanol

Acétoacétate–

Acétoacétyl CoA CH3 CO CH2 CO CoA

CO2

2H

Acétone CH3 2H

β-Hydroxybutyryl-CoA

CH3 CO

H2O Crotonyl-CoA

Isopropanol CH3 CHOH CH3

2H Butyryl-CoA

ADP ATP

2H

Butyraldéhyde 2H

Butyrate– CH3 CH2 CH2 COO–

Butanol CH3 CH2 CH2 CH2OH FIGURE 12.58 Voie de formation des produits de fermentation obtenus par les clostridies du groupe acide butyrique. La désignation « 2H » représente les deux électrons libérés d’une molécule de NADH. Notez que la production d’acétate et de butyrate est liée à la présence d’un ATP supplémentaire issu de la phosphorilation du substrat (voir section 17.19). A contrario, la formation de butanol et d’acétone réduit le rendement en ATP, car l’étape entre butyryl CoA et butyrate est contournée. Ces deux produits (butanol et acétone) se retrouvent typiquement selon un ratio 1:1 du fait que la production de butanol nécessite deux NADH et celle d’acétone, aucune.

s’abaisse, ces réactions s’arrêtent au profit de l’accumulation de produits à pH neutre (acétone et butanol). Cependant, si le pH du substrat est maintenu proche de la neutralité avec du carbonate de calcium (CaCo3), peu de ces substances à pH neutre sont produites, et les produits de fermentation consistent globalement en trois parts d’acide butyrique pour une part d’acide acétique. Cette répartition est logique car, à l’inverse de la formation des produits neutres, la production d’acides permet la synthèse d’une molécule d’ATP supplémentaire (voir figure 12.58). Un autre groupe de clostridies se procure de l’énergie par la fermentation des acides aminés. Certaines espèces fermentent des acides aminés particuliers, d’autres des paires d’acides aminés. Dans ce cas, l’un fonctionne comme un donneur d’électrons et sera oxydé, le second réagit comme un accepteur de ces électrons et sera réduit (réaction de Stickland). Ainsi, Clostridium sporogenes catabolise une paire composée de glycine et d’alanine (voir figure 12.59). Les différents acides aminés pouvant jouer le rôle de donneurs ou d’accepteurs d’électrons dans ces réactions de Stickland sont répertoriés dans la figure 12.59. Les produits d’oxydation résultant de cette réaction sont toujours l’ammoniac (NH3), le gaz carbonique (CO2) et l’acide carboxylique contenant un atome de carbone de moins que dans l’acide aminé qui a été oxydé (voir figure 12.59). Les acides aminés pouvant être fermentés séparément sont : l’alanine, la cystéine, le glutamate, la glycine, l’histidine, la sérine ou la thréonine. Les produits issus de ces fermentations sont généralement : l’acétate, le butyrate, le gaz carbonique (CO2) et l’hydrogène (H2). Cette fermentation des acides aminés par des espèces du genre Clostridium a la particularité de dégager de nombreuses substances à l’odeur nauséabonde. En plus de l’acide butyrique, les autres composés odorants produits sont : l’acide isobutyrique, l’acide isovalérique, l’acide caproïque, l’hydrogène sulfuré, le méthylmercaptan (issu des acides aminés sulfurés), la cadavérine (issue de la lysine), la putrescine (issue de l’ornithine) et l’ammoniac. Les sols sont reconnus comme étant l’habitat principal des espèces de Clostridium ; dans ces lieux, ces bactéries vivent principalement dans des niches anoxiques, dans lesquelles cette anoxie est réalisée par les métabolismes des organismes utilisant les composés organiques. D’autres espèces colonisent également les parties anoxiques du tractus intestinal des mammifères. De plus, dans certaines conditions, quelques espèces ont la particularité d’être pathogènes pour l’homme (voir section 21.8). Ainsi, Clostidium botulinum est l’espèce responsable du botulisme animal et humain, Clostridium tetani du tétanos et Clostridium perfringens et d’autres espèces fermentant le sucre et les acides aminés, de la gangrène gazeuse. Ces espèces pathogènes ne possèdent pas de systèmes métaboliques particuliers, mais ont la particularité d’élaborer des toxines spécifiques, ou un ensemble de toxines comme dans le cas des bactéries responsables de la gangrène gazeuse (voir section 21.10 et voir tableau 21.4). Clostridium perfringens et les espèces apparentées sont également responsables de troubles gastro-intestinaux chez l’homme et les animaux domestiques (voir section 29.6). Notons enfin que le rôle écologique que peuvent jouer ces toxines dans l’environnement naturel n’est pas encore éclairci.



388 Chapitre 12


Étapes d’oxydation

Étapes de réduction

Alanine

Glycine

H COO–

H3C C

NH2 COO–

COO–

NH2

NADH Pyruvate, NH3

H3C C

2 H2C

NAD+

Couples d’acides aminés participant à la réduction de Stickland

CoA NAD+

O CO2

2 Pi

Acides aminés oxydés : Alanine Leucine Isoleucine Valine Histidine

NADH

Acétyl-CoA Pi CoA Acétyl ~ P ADP ATP –

H3C COO

–

Acétate

2 Acétyl ~ P 2 ADP

Phosphorylation au milieu du substrat

2 ATP

2 Acétate–

Réaction globale : Alanine + 2 Glycine + 2 H2O + 3 ADP + 3 Pi

2 H3C

COO– + 2 NH3

3 Acétate– + CO2 + 3 NH4+ + 3 ATP

Sporosarcina

Dieter Claus

Ce genre est considéré comme unique parmi les bactéries sporulantes, car il est le seul à se présenter sous forme de cocci. Ce sont des bactéries aérobies strictes, ayant une morphologie en tétrades, ou en paquets de huit cellules ou plus, de forme ovoïde ou sphérique (voir figure 12.60). L’espèce principale du genre est S. urea (voir figure 12.60). Cet organisme peut être isolé du sol en réalisant des dilutions successives de l’échantillon traité thermiquement (pasteurisé) sur un milieu nutritif alcalin additionné d’urée à une concentration de 8 %, puis incubé à l’air. La plupart des bactéries présentes dans les sols sont inhibées pour des concentrations en urée inférieures à 2 % ; cependant, S. urea a la particularité de décomposer des taux élevés d’urée en gaz carbonique (CO2) et en ammoniac (NH3), augmentant ainsi considérablement le pH du substrat ; en effet, S. urea est

FIGURE 12.60 Observation en microscopie à contraste de phase de Sporosarcina ureae. La largeur de chaque cellule est de 2 µm environ. Remarquez la brillance des endospores. La plupart des amas cellulaires sont constitués de huit cellules.

Acides aminés réduits : Glycine Proline Hydroxyproline Tryptophane Arginine

FIGURE 12.59 Réaction couplée d’oxydation-réduction (réaction de Stickland) entre l’alanine et la glycine chez Clostridium sporogenes. Les formules des substrats initiaux, des produits intermédiaires et finaux sont exprimées entre parenthèses pour permettre de mieux suivre les réactions chimiques. Notez que l’alanine est un donneur d’électrons et la glycine, un accepteur.

une bactérie remarquablement tolérante aux milieux alcalins qui peut se développer à des pH voisins de 10. S. urea est une bactérie très commune des sols, notamment dans des environnements riches en urée – du fait de l’apport d’urine par exemple. Cette particularité donne à cette bactérie une place écologique importante dans la nature pour la dégradation de l’urée, d’autant que de nombreux autres micro-organismes présents dans ces environnements sont relativement sensibles à cette molécule.

Heliobactéries Les bactéries regroupées dans cet ensemble sont des organismes phototrophes, se développant en absence d’oxygène (anoxygéniques) et produisant une seule forme structurale de bactériochlorophylle, la bactériochlorophylle g (voir section 17.2). Quatre genres y sont décrits : Heliobacterium, Heliophilum, Heliorestis et Heliobacillus. Toutes les espèces connues ont une morphologie en forme de bâtonnets, courts ou longs, fréquemment avec des extrémités effilées (voir figure 12.61b). Il est intéressant de noter que les cellules bactériennes d’Heliophilum s’agrègent en paquets qui se déplacent d’une façon unitaire (voir figure 12.61b). Ces bactéries sont toutes anaérobies strictes, mais, outre leur croissance phototrophique en anaérobiose, elles peuvent se développer dans l’obscurité grâce à la fermentation du pyruvate, comme de nombreuses autres espèces de clostridies proches d’elles. Les spores (voir figure 12.61c) contiennent également, comme celles de Bacillus sp. et de Clostridium sp., de fortes concentrations de calcium (Ca2+) et de l’acide dipicolinique (voir section 4.13). Ces bactéries résident principalement dans les sols et plus particulièrement dans les rizières où leur forte activité de fixation de l’azote permet d’augmenter la productivité des cultures de riz. Elles peuvent également être présentes dans des environnements fortement alcalins, comme les lacs salés et les sols environnants.



John Ormerod et M. T. Madigan

F. Rudy Turner & Howard Gest

(b)

(a)

John Ormerod et M. T. Madigan

12.21 Bactéries sans paroi cellulaire, apparentées aux bactéries Gram positif, à faible % G+C : mycoplasmes 389

(c)

FIGURE 12.61 Cellules et endospores des héliobactéries. a) Observation en microscopie électronique d’Heliobacillus mobilis, possédant une ciliature flagellaire péritriche. b) Heliophilum fasciatum, amas caractéristiques en forme de bottes, observés en microscopie électronique. c) Endospores d’Heliobacterium gestii observés en microscopie à contraste de phase.

Contrôlez vos acquis Les bactéries Gram positif et à faible taux de guanine et cytosine (% G+C) correspondent à un groupe très diversifié d’un point de vue phylogénétique, ayant des morphologies en bâtonnets ou en cocci, sporulées ou non. La production d’endospores est une marque caractéristique pour les espèces des genres Bacillus et Clostridium. Les bactéries Gram positif sont les principaux agents de dégradation des matières organiques dans les sols ; peu d’entre elles sont reconnues pathogènes pour l’homme et les animaux. •

Quelles sont les principales différences entre Staphylococcus sp. et Bacillus sp. ?

•

Comment s’effectue la distinction entre les bactéries homo et hétérofermentaires ?

•

Quelle est la principale différence entre les espèces de Bacillus et de Clostridium ?

•

Quelle est la particularité des héliobactéries dans le groupe des espèces sporulantes ?

12.21 Bactéries sans paroi cellulaire, m n apparentées aux bactéries Gram positif, à faible % G+C : mycoplasmes

Genres principaux : Mycoplasma, Spiroplasma Les mycoplasmes sont des organismes qui ont totalement, de façon irréversible, perdu leur paroi cellulaire. Ce sont probablement les plus petits organismes capables d’un développement autonome et présentent un intérêt particulier dans l’étude de l’évolution du fait de leur structure cellulaire extrêmement simple et de leur génome relativement petit. Ces organismes, bien que ne présentant pas véritablement une coloration de Gram positif, du fait de l’absence de la paroi cellulaire, sont phylogénétiquement proches de ces bactéries Gram positif, ayant un faible taux de guanine et cytosine (G+C %). Les mycoplasmes possédaient autrefois une paroi cellulaire mais l’ont perdue en colonisant leurs

propres habitats ; ils se retrouvent, comme parasites, dans des hôtes animaux et végétaux.

Les propriétés des mycoplasmes L’absence de la paroi cellulaire est facilement observable en microscopie électronique ; elle a également été confirmée chimiquement en démontrant l’absence des composés élémentaires tels que le peptidoglycane, l’acide muramique et l’acide diaminopimélique (voir section 4.8). La manière dont les protoplastes sont produits lorsque les cellules sont traitées dans un milieu osmotique spécial, est décrite dans le chapitre 4 ; lorsque le régulateur osmotique est supprimé, les protoplastes s’imprègnent d’eau, enflent et éclatent (voir figure 4.33). Les mycoplasmes ressemblent à des protoplastes dans la perte de la paroi cellulaire, mais sont beaucoup plus résistants aux pressions osmotiques et peuvent survivre dans des conditions dans lesquelles les protoplastes se lysent. Cette aptitude à résister à cette lyse osmotique est expliquée, partiellement, par la présence de stérols qui rendent la membrane cytoplasmique plus stable que celle des autres procaryotes (voir section 4.5). Ainsi, pour certaines espèces de mycoplasmes, la présence de stérols dans le milieu de culture est nécessaire à leur croissance ; cette particularité permet le classement des mycoplasmes en deux groupes (voir tableau 12.28). Outre cette présence de stérols, certaines espèces de mycoplasmes possèdent des lipoglycanes (voir tableau 12.28). Ce sont des hétéropolysaccharides à longues chaînes liés par des liaisons covalentes aux lipides membranaires et intégrés dans la membrane cytoplasmique de nombreux mycoplasmes. Ces lipoglycanes ressemblent aux lipopolysaccharides (LPS) des bactéries Gram négatif (voir section 4.9), à l’exception de la perte de la structure principale du lipide A et du phosphate spécifique au LPS bactérien. Le rôle de ces lipoglycanes consiste en une aide pour maintenir la stabilité de la membrane, ainsi que pour faciliter l’attachement des mycoplasmes aux récepteurs cellulaires de surface des animaux. Ils ont également la particularité, comme le LPS, de stimuler la production d’anticorps lors d’inoculations expérimentales à des animaux.

La croissance des mycoplasmes Les cellules mycoplasmiques sont petites et fortement pléiomorphes du fait de l’absence de la paroi cellulaire et par conséquent de la rigidité cellulaire. Des formes coccoïdes,



390 Chapitre 12

TABLEAU 12.28


PRINCIPALES CARACTÉRISTIQUES DES ESPÈCES DE MYCOPLASMESa

Genre 1. Requièrent des stérols Mycoplasma Spiroplasma Ureaplasma

Entomoplasma 2. Ne requièrent pas de stérols Acholeplasma Asteroleplasma Mesoplasma

% G+C

Taille du Présence de génome (kpb) lypoglycanes

Pathogènes, aérobies facultatifs (voir figure 12.62) Formes spiralées ou en « tire-bouchons » ; phytopathogènes (voir figure 12.64) Formes coccoïdes, associées en grappes ou en courtes chaînettes ; croissance optimale à pH 6 ; uréase ++ ; inhibition par l’acétate de thallium ; pathogènes du tractus urinaire humain Aérobies facultatifs ; associés aux insectes et aux plantes

23–41 25–30

600–1 350 940–2 200

+ –

27–30

750

–

27–29

790–1 140

?

Aérobies facultatifs Anaérobies stricts ; isolés du rumen de bovins et d’ovins Apparentés phylogénétiquement et écologiquement à Entomoplasma sp.

27–36 40

1 500 1 500

+ +

27–30

870–1 100

Caractéristiques

3. Requièrent ou non des stérols Anaérobies stricts ; dégradent l’amidon ; produisent Anaeroplasma des acides acétiques, lactiques et formiques et de l’éthanol et CO2 ; inhibition par l’acétate de thallium ; isolés du rumen de bovins et d’ovins a

? 29–33

1 500–1 600

+

Ces micro-organismes appartiennent tous, phylogénétiquement, au groupe des bactéries Gram positif et à faible taux de guanine et cytosine (% G+C).

Alan Rodwell

plus larges et ballonnées, sont parfois associées, au sein d’une même colonie, à des éléments filamenteux, de taille variable, parfois fortement ramifiés (voir figure 12.62). Les structures coccoïdes de petite taille (0,2 à 0,3 µm) sont considérées comme les plus petites unités mycoplasmiques douées d’une aptitude de croissance autonome. Les éléments plus petits (0,1 µm) parfois observés en association dans les cultures ne sont pas viables. Ainsi, cette unité de reproduction d’une taille comprise entre 0,2 et 0,3 µm représente probablement la plus petite structure cellulaire autonome vivante (voir section 4.4). De plus, la taille du génome des mycoplasmes, comprise entre 500 et 1 100 kpb, est plus petite que celle de

FIGURE 12.62 Observation en microscopie électronique à balayage de Mycoplasma mycoides, après ombrage métallique. Notez la présence d’éléments coccoïdes et pseudofilamenteux. Le diamètre moyen des cellules en chaînettes est de 0,5 µm.

la plupart des autres procaryotes (voir tableau 12.28), comparable à celle des rickettsies et chlamydies parasites obligatoires (voir sections 12.27 et 12.13), et se situant entre le quart et le cinquième de celle du génome d’Escherichia coli. Le génome de Mycoplasma genitalium, composé de 580 kbp, a été totalement séquencé (voir section 15.3). Ce très petit génome est considéré comme celui possédant la plus petite quantité d’ADN qu’une espèce bactérienne doit posséder afin de pouvoir mettre en place les mécanismes nécessaires au développement de la vie ; cependant l’espèce d’Archaea, Nanoarchaeum, possède un génome encore plus petit (voir chapitre 13). Le mode de croissance des mycoplasmes est différent selon le substrat (milieu liquide ou gélosé). Sur un milieu gélosé, les colonies de mycoplasmes sont véritablement incrustées dans la gélose, présentant une forme caractéristique « d’œuf sur le plat », c’est-à-dire avec une partie centrale dense, intégrée dans la gélose, entourée d’une zone circulaire de diffusion plus claire (voir figure 12.63). La croissance ne peut évidemment pas être interrompue par des substances comme la pénicilline, la vancomycine et les autres antibiotiques ayant une action sur les mécanismes de synthèse de la paroi cellulaire bactérienne. Cependant, les mycoplasmes sont sensibles aux antibiotiques ayant une action sur d’autres cibles que cette dernière. Les milieux de culture utilisés sont très complexes. En effet, pour de nombreuses espèces, la croissance est très faible ou impossible même en présence de milieux composés de peptones, d’extraits de levure et de cœur de bœuf. Certaines espèces requièrent également la présence de différents types de sérums frais, de liquide ascitiques, de stérols ou d’acides gras insaturés. Cependant, d’autres peuvent être cultivées sur des milieux



T. D. Brock

12.22 Bactéries (actinobactéries) Gram positif, à fort % G+C : bactéries corynéformes et propioniques 391

FIGURE 12.63 Formes typiques « en œuf sur le plat » de colonies de mycoplasmes observées sur milieu gélosé. Le diamètre des colonies est d’environ 0,5 mm.

plus simples et mieux définis. La majorité des mycoplasmes utilisent des hydrates de carbone comme sources de carbone et d’énergie ; ces espèces requièrent également des vitamines, des acides aminés, des purines et pyrimidines. Le métabolisme énergétique des mycoplasmes est très variable ; certaines espèces sont considérées comme des bactéries aérobies strictes, d’autres sont plutôt anaérobies strictes ou facultatives (voir tableau 12.28).

Spiroplasma

David L. Williamson

Ce genre regroupe les espèces dépourvues de paroi, de formes spiralées ou en « tire-bouchons » (voir figure 12.64). Bien que dépourvues de paroi et de flagelles, ces espèces sont toujours mobiles grâce à un mouvement de rotation ou une lente ondulation. La présence de fibres intracellulaires, responsables de cette mobilité, a été démontrée. Ces micro-organismes ont été isolés de tiques, de l’hémolymphe et de l’intestin d’insectes, des sécrétions vasculaires des plantes et des insectes se nourrissant de ces substances, ainsi que de la surface de fleurs et d’autres parties de végétaux. Spiroplasma citri a été isolé de feuilles de citronniers sur lesquelles elle est responsable du « stubborn des agrumes » et de graines céréalières sur lesquelles elle est responsable d’une maladie de rabougrissement du maïs (corn stunt disease).

FIGURE 12.64 Observation au microscope à fond noir montrant la proportion de différentes formes de spiroplasmes isolées de la lymphe de Drosophila pseudo-obscura. Les insectes femelles infectés par ces différentes formes de spiroplasmes ne portent que des descendances femelles. Le diamètre cellulaire est d’environ 0,15 µm. La microscopie sur fond noir permet la visualisation de ces cellules extrêmement fines.

D’autres espèces apparentées aux mycoplasmes sont parfois observées, en microscopie électronique, dans le cas de maladies phytosanitaires, prouvant la forte implication de ces micro-organismes en pathologie végétale. Spiroplasma sp. peut être également associée à certaines maladies des insectes telles que la spiroplasmose des abeilles et la maladie léthargique des coléoptères (Melolontha).

Contrôlez vos acquis Les mycoplasmes sont des organismes ayant perdu leur paroi cellulaire et qui contiennent un génome très petit. De nombreuses espèces exigent des stérols pour consolider leur membrane. Certaines espèces sont pathogènes pour l’homme et les animaux, ainsi que pour les végétaux. •

Pourquoi les mycoplasmes ont-ils besoin d’une membrane cellulaire plus résistante que les autres bactéries procaryotes ?

•

Où se place, phylogénétiquement, le groupe des mycoplasmes ?

•

Pourquoi les spiroplasmes mobiles ne possèdent-ils pas un flagelle bactérien caractéristique ?

12.22 Bactéries (actinobactéries) Gram m n positif, à fort % G+C : bactéries corynéformes et propioniques

Genres principaux : Corynebacterium, Arthrobacter, Propionibacterium Ces bactéries Gram positif, possédant un fort pourcentage de guanine + cytosine (% G+C), appartiennent au phylum des actinobactéries, très varié et regroupant plus de 30 familles taxinomiques différentes (voir section 11.10). Les espèces d’actinobactéries ont une morphologie de bâtonnets ou de filaments, aérobies, se retrouvant plus particulièrement dans les sols et les plantes. Elles sont, dans la majorité des cas, commensales et inoffensives ; à l’exception de certaines d’entre elles, notamment celles appartenant au genre Mycobacterium et plus particulièrement Mycobacteruin tuberculosis. D’autres sont d’un fort intérêt économique, notamment par la production de molécules à activité antibiotique ou par leur importance dans la fermentation des produits laitiers.

Les corynébactéries Les bactéries corynéformes apparaissent sous forme de bâtonnets immobiles, aérobies, présentant des formes caractéristiques en massue, en palissades, en petits amas ou en « lettres chinoises ». L’arrangement en forme de V résulte du mouvement de rupture suivant la division cellulaire (voir figure 12.65). Cette division particulière est la résultante de la composition en double couche de la paroi cellulaire : seule la couche interne participe à la formation de la paroi mitoyenne et, en conséquence, les deux cellules « filles »




T.A. Krulwich

392 Chapitre 12

FIGURE 12.65 Division rapide horizontale (snapping) d’Arthrobacter. Cellules caractéristiques en forme de V d’Arthrobacter cristallopoietes, résultant d’une division rapide horizontale. Le diamètre des cellules est d’environ 0,9 µm.

T.A. Krulwich

demeurent attachées par la couche externe. L’endroit de la rupture ultérieure de cette couche externe entraînera cette morphologie particulière (voir figure 12.66). Corynebacterium et Arthrobacter constituent les deux principaux genres des corynébactéries. Les espèces appartenant au genre Corynebacterium sont très diverses : certaines sont pathogènes pour les animaux et les végétaux, d’autres sont saprophytes. Certaines espèces sont pathogènes pour l’homme, notamment C. diphtheriae, agent responsable de la diphtérie (voir section 26.3). Le genre Arthrobacter se distingue plus particulièrement par sa particularité de se transformer d’un bâtonnet en une sphère,

(a)

T.A. Krulwich

Rupture de la paroi

(b) FIGURE 12.66 Division cellulaire d’Arthrobacter. Observation en microscopie électronique montrant la division cellulaire d’Arthrobacter cristallopoietes et notamment la division « instantanée » ainsi que la formation de groupes cellulaires en forme de V. a) Avant la rupture de la paroi cellulaire externe (voir flèche). b) Après la rupture de la paroi externe sur l’un des côtés. Le diamètre des cellules est compris entre 0,9 et 1 µm.

puis à revenir sous sa forme initiale (voir figure 12.67). Cependant, certaines espèces du genre Corynebacterium sont également pléïomorphes et possèdent une phase sous la forme coccoïde ; en conséquence, la différenciation entre les espèces de ces deux genres sur la base morphologique n’est pas systématique. À l’inverse d’Arthrobacter, les extrémités des cellules des espèces du genre Corynebacterium sont fréquemment enflées, leur conférant une apparence en forme de massue qui fut à l’origine de ce nom (en grec, koryne désigne le terme « massue »). Les espèces du genre Arthrobacter correspondent aux bactéries le plus fréquemment rencontrées dans les sols. Elles résistent très fortement à la dessiccation et au manque de nourriture, sans pour autant émettre des formes sporulées ou de résistance. Il s’agit d’un groupe très hétérogène, avec différentes voies nutritives. Certaines espèces peuvent décomposer des herbicides, la caféine, la nicotine, les phénols et bien d’autres composés organiques inhabituels.

Les bactéries propioniques Ces bactéries appartiennent au genre Propionibacterium et ont été mises en évidence, pour la première fois, dans un fromage à pâte pressée cuite (type « Emmenthal »), dans lequel la production fermentative de CO2 entraînait la formation de trous caractéristiques. De plus, l’acide propionique produit par ces bactéries est considéré comme l’une des composantes de la saveur de ce type de fromage. Cet acide propionique peut être également élaboré par d’autres espèces bactériennes, mais il constitue l’une des caractéristiques importantes de ce genre. Ces bactéries anaérobies fermentent l’acide lactique, les glucides et les alcools polyhydroxylés en produisant de l’acide propionique, de l’acide acétique et du gaz carbonique. Leurs exigences nutritionnelles sont très complexes et leur temps de croissance est relativement lent. Comme pour les bactéries lactiques, le catabolisme du glucose en pyruvate suit la voie de la glycolyse (voir figure 12.68), mais le NADH formé est ensuite oxydé lors de la production de l’acide propionique. Le pyruvate accepte un groupe carboxyl issu du méthyl-malonyl-CoA grâce à une transcarboxylase issue de la formation de l’oxalacétate et du propionyl-CoA. Cette dernière substance réagit avec le succinate pour produire le succinyl-CoA et le propionate ; le succinyl-CoA est ensuite isomérisé en méthyl-malonyl-CoA (voir figure 12.68). Ces bactéries fermentent également le lactate en produisant du propionate, de l’acétate et du gaz carbonique. Cette fermentation anaérobie de l’acide lactique en propionate s’avère intéressante car cette molécule d’acide lactique est l’une des substances ultimes de la fermentation réalisée par de nombreuses bactéries (voir section 12.19). Les bactéries propioniques se procurent donc de l’énergie, en anaérobiose, dénommée fermentation secondaire, à partir de substances issues du processus de fermentation élaboré par d’autres bactéries. Cette fermentation du lactate en propionate est très importante dans la production des fromages suisses. En effet, les bactéries inoculées pour le démarrage du procédé (starter culture) consistent en un mélange de streptocoques et de lactobacilles homofermentaires, ainsi que de bactéries propioniques.



Hans Veldkamp

12.23 Autres actinobactéries : 393

(a)

(b)

(c)

(d)

(e)

(f)

(g)

FIGURE 12.67 Différentes étapes du cycle cellulaire d’Arthrobacter globiformis, observées en culture sur lame (slide culture). a) Élément coccoïde unique. b-e) Évolution en bâtonnets et croissance d’une microcolonie constituée essentiellement de bâtonnets. f-g) Évolution des bâtonnets vers des formes coccoïdes. Le diamètre des cellules est d’environ 0,9 µm.

La fermentation initiale du lactose en acide lactique pendant la formation du caillé est réalisée grâce à l’action des bactéries homofermentaires. Après cette phase et le drainage de l’eau, les bactéries propioniques se développent très rapidement ; les cavités formées par l’accumulation de gaz carbonique dans ce substrat en certains endroits sont caractéristiques de ce type de fromage. La fermentation du succinate par des bactéries du genre Propionigenium conduit également à la formation de propionate. Ces bactéries ne peuvent être assimilées, écologiquement et phylogénétiquement, au genre Propionibacterium, mais ces modalités énergétiques issues de la fermentation sont également d’un grand intérêt (voir section 17.20).

3 NAD+ 3 NADH 3 Pyruvate

2 NADH

ADP ATP

Acétate– + CO2 + NADH

2 NAD+ 2 Malate2– 2 H2O 2 Fumarate2– ADP 2 NADH

2 Propionate–

ATP

22 Propionyl~CoA Propionyl~CoA

2 NAD+ 2 Succinate2– 2 Succinyl~CoA

2 Méthylmalonyl~CoA

Stœchiométrie : 3 Lactate

Genre principal : Mycobacterium Ce genre correspond aux bactéries qui, à un moment de leur phase de croissance, possèdent une particularité de coloration, dénommée acido-alcoolo résistance. Cette propriété est due à la présence d’acides mycoliques à la surface des cellules. Cette particularité fut découverte par Robert Koch lors de ses recherches sur la tuberculose (voir section 1.6). Cette technique de coloration permettait en effet l’identification des micro-organismes responsables des lésions tuberculeuses et fut par la suite d’un grand intérêt taxinomique pour la détermination du genre Mycobacterium.

La coloration de Ziehl-Neelsen

3 Lactate–

2 CO2 2 Oxalacétate2–

12.23 Autres actinobactéries : m n Mycobacterium sp.

2 Propionate– + Acétate– + CO2 + 3-5ATP

FIGURE 12.68 Production d’acide propionique à partir de lactate par Propionibacterium. Notez que les 4 NADH produits à partir de l’oxydation de trois lactates en deux pyruvates et acétates + CO2 sont réoxydés par la réduction de l’oxalacétate et du fumarate. Le groupe CoA du propionyl CoA est transporté vers le succinate lors de la transformation du propionate en une forme énergétique neutre.

Cette technique consiste en un mélange de fuschine basique et de phénol qui sont utilisés pour la coloration cellulaire, au cours d’une phase de chauffage du frottis réalisé sur une lame de microscope ; cette phase dure environ 2 à 3 minutes. Le phénol a pour objectif de faciliter la pénétration de la fuschine dans les lipides. Après une phase de lavage en eau distillée, la préparation est soumise à une décoloration par un mélange d’alcool et d’acide. Une contre-coloration au bleu de méthylène est réalisée après une phase de lavage. Les bactéries caractéristiques sont alors colorées en rouge, alors que les autres sont bleues (voir figure 26.7). La présence d’acide mycolique (voir figure 12.69a) est nécessaire pour cette réaction : le groupe d’acide carboxylique associé à l’acide mycolique réagit avec la fuschine (voir figure 12.69b). L’acide mycolique est ainsi lié par une liaison covalente avec un peptidoglycane présent dans la paroi cellulaire et cette structure, hydrophobe et cireuse, migre de cette surface cellulaire. Les mycobactéries ne sont pas véritablement colorées par la coloration de Gram du fait de la quantité élevée de lipides dans cette paroi cellulaire ; cependant, si cette partie lipidique est enlevée par un mélange d’éthanol alcalin, les cellules perdent leur aptitude à cette coloration de Ziehl-Neelsen, et ont une coloration de Gram positif.

Les principaux caractères des mycobactéries Ces micro-organismes sont pléïomorphes et peuvent se développer en forme de branches ou de filaments ; cependant, lors d’une légère modification et contrairement aux autres actinomycètes (voir section 12.24), les filaments se divisent en



394 Chapitre 12


H2N

C

NH2+Cl –

H H R1 C C COO– OH R2

NH2

(a) Acide Mycolique ; R1 et R2 sont des hydrocarbures aliphatiques à longue chaine

(b) Fuschine basique

FIGURE 12.69 Coloration rapide à l’acide. Formule de a) l’acide mycolique et b) la fuschine basique, colorant se combinant avec l’acide mycolique par des liaisons ioniques entre COO– et NH2.

bâtonnets ou en éléments de forme coccoïde. Il ne s’agit donc pas d’un véritable mycélium. Les mycobactéries sont généralement divisées en deux groupes, en fonction de leur vitesse de croissance (voir tableau 12.29). Mycobacterium tuberculosis représente typiquement cette caractéristique de croissance lente : les colonies ne sont visibles sur les milieux de culture qu’après plusieurs jours ou semaines d’incubation. En effet, il est reconnu que Robert Koch découvrit Mycobacterium tuberculosis grâce au fait qu’il attendit longtemps après le moment de l’inoculation du milieu de culture (voir section 1.6). Sur des milieux solides, les colonies de Mycobacterium tuberculosis apparaissent étroites, compactes et fréquemment plissées (voir figure 12.70a). Cette morphologie est probablement la conséquence de la quantité élevée de lipides et du caractère hydrophobe de la surface cellulaire. Les mycobactéries ont, dans la plupart des cas, des exigences nutritives relativement simples. La croissance peut se réaliser sur des milieux salés, possédant de l’ammonium comme source d’azote et du glycérol ou de l’acétate comme source de carbone. La croissance de Mycobacterium tuberculosis est stimulée par la présence de lipides et d’acides gras ; c’est ainsi que du jaune d’œuf est parfois incorporé dans les milieux de culture afin d’obtenir un meilleur développement des colonies

TABLEAU 12.29

bactériennes. Par exemple, le milieu de Lowenstein-Jensen qui contient du glycérol et de l’œuf est fréquemment utilisé pour l’isolement de Mycobacterium tuberculosis à partir d’échantillons suspects. Cette présence lipidique dans la paroi cellulaire est probablement également responsable de la résistance de Mycobacterium tuberculosis aux agents chimiques alcalins et au phénol. Cette propriété est utilisée dans la procédure d’isolement de la bactérie à partir de prélèvements humains susceptibles d’être fortement contaminés. Ainsi, le prélèvement de crachat est préalablement traité par de la soude (NaOH, 1N) pendant 30 minutes, puis neutralisé avant la phase d’isolement sur un milieu adapté. De nombreuses espèces de mycobactéries ont la particularité de produire des pigments caroténoïdes de couleur jaune (voir figure 12.70c). Ceci permet de classer ces bactéries en trois groupes (voir tableau 12.29) : les bactéries non pigmentées (en particulier Mycobacterium tuberculosis et Mycobacterium bovis), celles, dénommées photochromogènes, produisant un pigment lorsqu’elles sont cultivées en présence de lumière (en particulier Mycobacterium kansasii et Mycobacterium marinum), et enfin, les bactéries pigmentées, cette production pouvant se réaliser à l’obscurité, phénomène appelé scotochromogénèse (par exemple Mycobacterium gordonae). La production des pigments caroténoïdes par photoinduction nécessite des impulsions d’une lumière bleue de faible longueur d’onde en présence d’oxygène. Cette photoinduction résulte d’une étape d’oxydation, catalysée par la lumière, permettant la production précoce d’une des enzymes nécessaires dans le processus de biosynthèse des caroténoïdes. Ces pigments caroténoïdes ont un rôle essentiel dans le système de protection des mycobactéries contre les phénomènes d’oxydation (voir section 6.16). L’expression de la virulence de Mycobacterium tuberculosis (voir section 26.5) est associée à la formation d’agencements particuliers en cordons sur les milieux de culture (voir figure 12.70b). Ceci résulte de la présence, au niveau de la paroi cellulaire, d’un glycolipide particulier, appelé cord factor (voir figure 12.71).

PRINCIPALES CARACTÉRISTIQUES DES MYCOBACTÉRIES Croissance dans un milieu enrichi en sel (NaCl) à 5 %

Espèces

Réduction des nitrates

Croissance à 45 °C

Pathogène pour l’homme

Pigmentation

Croissance lente Mycobacterium tuberculosis

–

+

–

+

Aucune

Mycobacterium avium

–

–

–

+

Colonies anciennes (voir figure 12.70c)

Mycobacterium bovis

–

–

+

+

Aucune

Mycobacterium kansasii

–

+

–

+

Photochromogène

Mycobacterium smegmatis

+

+

+

–

Aucune

Mycobacterium phlei

+

+

+

–

Pigmentation

Mycobacterium chelonae

+

–

–

+

Aucune

Mycobacterium parafortuitum

+

+

–

–

Photochromogène

Croissance rapide



N. Rist

V. Lorian

Centers for Disease Control


(a)

(c)

(b)

FIGURE 12.70 Morphologie caractéristique de colonies de mycobactéries. a) Mycobacterium tuberculosis montrant l’aspect compact et plissé de la colonie, d’un diamètre d’environ 7 mm. b) Colonie d’une espèce virulente de Mycobacterium tuberculosis, à un stade précoce montrant la croissance en forme de corde. Le diamètre des cellules est d’environ 0,5 µm (voir également les dessins de Robert Koch, figure 1.13). c) Colonie de Mycobacterium avium, souche pathogène opportuniste isolée chez un malade atteint du SIDA.


•

Qu’est-ce que la division par rupture et quels sont les micro-organismes pratiquant ce mode de division ?

•

Quels sont les micro-organismes impliqués dans le processus d’affinage des fromages à pâte pressée cuite ? Quels sont les composés chimiques produits favorisant leur saveur et la formation des trous ?

•

Qu’est-ce que l’acide mycolique et par quel groupe de micro-organismes est-il produit ? Quelles sont les propriétés cellulaires générées par cette substance ?

12.24 Actinobactéries filamenteuses : m n Streptomyces et autres actinomycètes

Genres principaux : Streptomyces, Actinomyces Les actinomycètes se composent d’un grand nombre d’espèces de bactéries filamenteuses, Gram positif. Cette aptitude à la filamentation et à la ramification permet la formation d’un réseau appelé mycélium (voir figure 12.72). Cette formation mycélienne est assimilée à celle élaborée par les moisissures (voir figure 14.25).

OH CH2O CO CH

CH C60H120(OH)

C24H49 OH

H H HO

O H OH H

H

H

H O

OH

H O CH2

H OH

O

OH

H OH OC

CH CH C60H120(OH) C24H49

FIGURE 12.71 Formule du cord factor glycolipide (6,6’-dimycolyltréhalose) produit par les mycobactéries. Les deux groupes dialcooliques identiques sont représentés en violet.

Hubert et Mary P. Lechevalier

Les bactéries Gram positif et à fort % G+C correspondent aux espèces des genres Corynebacterium, Arthrobacter, Propionibacterium et Mycobacterium. Ce sont principalement des micro-organismes présents dans les sols, saprophytes et non pathogènes ; cependant, Mycobacterium tuberculosis est l’agent responsable de la tuberculose. Les cellules de Mycobacterium tuberculosis possèdent une couche superficielle riche en lipides nécessitant une méthode de coloration spécifique (coloration de Ziehl-Neelsen pour bactéries acidoalcoolo résistantes) pour l’observation microscopique.

FIGURE 12.72 Nocardia. Jeune colonie appartenant au genre Nocardia, montrant des structures cellulaires filamenteuses typiques (mycélium). Le diamètre du filament est compris entre 0,8 et 1 µm.



396 Chapitre 12


La plupart des actinomycètes possèdent la propriété de sporuler, cependant, le mode de sporulation diffère et constitue un critère de classification (voir tableau 12.30). La composition en guanine et cytosine (% G+C) de la majorité des espèces affiliées à ce groupe se situe entre 63 et 78 %, seuil supérieur connu pour les bactéries. Les bactéries associées au groupe des actinomycètes filamenteux sont toutes très proches d’un point de vue phylogénétique.

Streptomyces Ce genre compte un très grand nombre d’espèces et de variétés. En effet, plus de 500 espèces sont actuellement associées dans ce genre, bien que le pourcentage guanine et cytosine se situe entre 69 et 73 %. Les filaments mycéliens ont un diamètre compris entre 0,5 et 1 µm et une longueur variable ; il est intéressant de noter que des cloisonnements cellulaires sont également observés. La croissance s’effectue au niveau des extrémités des filaments, en s’accompagnant fréquemment de ramifications. Ainsi, cette phase végétative résulte en la formation d’une matrice entremêlée et compacte du mycélium et des colonies. Dans les colonies âgées, des formations caractéristiques, appelées sporophores, se forment à partir du mycélium aérien. Cette structure s’élève au-dessus de la surface de la colonie pour former des spores (voir figure 12.73). Ces spores, dénommées conidies, sont très différentes de celles des genres Bacillus et Clostridium. À la différence du processus mis en œuvre pour former les endospores, celles de Streptomyces sp.

Phase Courbure FractionÉpaississement Maturation de de nement et constriction des spores croissance l’extrémité de l’extrémité des parois FIGURE 12.74 Formation des spores de Streptomyces. Principales étapes de la transformation d’une hyphe aérienne (sporophores) en spores (conidies).

résultent du cloisonnement d’une cellule plurinucléée suivi de la séparation directe (voir figure 12.74). Les différences dans la forme et les arrangements des filaments aériens, ainsi que des structures sporifères, sont à l’origine de la classification des espèces appartenant au genre Streptomyces (voir figure 12.75). Les conidies et les sporophores sont

Peter Hirsch

Rectiligne

Flexueux

Fasciculé

Monoverticillé, non spiralé

Spirales fermées

Monoverticillé, spiralé

Hubert et Mary P. Lechevalier

(a)

Boucles ouvertes, spirales simples, crochets

Spirales ouvertes

(b) FIGURE 12.73 Photographies en microscopie de différentes formes de sporulation des actinomycètes. a) Streptomyces, type monoverticillé. b) Streptomyces, type proche de la spirale. Pour ces deux formes, la largeur des filaments est d’environ 0,8 µm. Ces photographies sont à comparer avec les dessins de la figure 12.75.

Biverticillé, non spiralé

Biverticillé, spiralé

FIGURE 12.75 Différents types de sporulation des streptomycètes. Une espèce donnée de Streptomyces n’en produit qu’un seul type. Dessins à comparer avec les photographies de la figure 12.73.




TABLEAU 12.30

PRINCIPALES ESPÈCES D’ACTINOMYCÈTES ET GENRES ASSOCIÉS DES ACTINOBACTÉRIESa Principaux groupes

% G+C

Bactéries corynéformes : bâtonnets de morphologie variable, en forme de massue, pas de formation de filaments, coloration de Ziehl-Neelsen négative ; division cellulaire « instantanée » Corynebacterium : coloration irrégulière, aspect parfois granuleux, renflement fréquent de l’extrémité, pathogènes des plantes et des animaux et parfois saprophytes des sols

51–65

Arthrobacter : forme coccoïde allongée, présence dans les sols

59–70

Cellulomonas : morphologie corynéforme, bactéries aérobies facultatives dégradant la cellulose

71–73

Kurthia : bâtonnets en chaînes, aux extrémités arrondies, puis de forme coccoïde

36–38

Brevibacterium : forme coccoïde allongée, présence sur la peau, dans les fromages…

60–67

Bactéries propioniques : anaérobies ou aérotolérantes, en forme de bâtonnets ou de filaments ramifiés Propionibacterium : immobile, production d’acide propionique et d’acide lactique, présence dans les produits laitiers (fromages) et sur la peau ; certaines souches peuvent être pathogènes

53–68

Eubacterium : anaérobies strictes, produisant un mélange d’acides organiques dont l’acide butyrique, acétique, formique et lactique, présence dans les intestins (espèces dominantes) où elles peuvent infecter les tissus, dans les sols ; certaines souches peuvent être pathogènes

26–48

Bactéries anaérobies strictes Bifidobacterium : microcolonies lisses, non filamenteuses, morphologie corynéforme, présence dans le tractus digestif des nourrissons allaitants

55–67

Acetobacterium : bactéries homoacétogènes, présence dans les sédiments et les eaux usées

39–43

Butyrivibrio : bâtonnets incurvés, présence dans le rumen

36–42

Thermoanaerobacter : bâtonnets thermophiles retrouvés dans les sources thermales

37–39

Actinomycètes : bactéries filamenteuses, fréquemment ramifiées ; groupe très hétérogène Groupe I. Actinomycètes à coloration de Ziehl-Neelsen négative, aérobies facultatives, ne formant pas de mycélium, mais produisant parfois des filaments ramifiés ; morphologie cellulaire en forme de bâtonnets, coccoïde ou corynéforme Actinomyces : bactéries aérobies facultatives ou anaérobies, formant des microcolonies filamenteuses ; ces filaments demeurent fugaces et se fragmentent en cellules corynéformes ; certaines souches peuvent être pathogènes pour l’homme et les animaux ; présence dans les cavités oro-pharyngées Autres genres : Arachnia, Bacterionema, Rothia, Agromyces

57–69

Groupe II. Mycobactéries à coloration de Ziehl-Neelsen positive, parfois filamenteuses Mycobacterium : bactéries pathogènes (agents de différentes formes de la tuberculose, de la lèpre) ou saprophytes (présence dans les sols), aérobies strictes, possédant un taux élevé de lipides dans la cellule et les parois cellulaires

62–70

Groupe III. Actinomycètes fixant l’azote, symbiotes des végétaux, produisant un vrai mycélium Frankia : formation de nodules de deux types sur les racines de différents végétaux, probablement microaérophiles à croissance lente

67–72

Groupe IV. Actinoplanes : formation d’un vrai mycélium, production de spores à l’intérieur d’un sporange Actinoplanes, Streptosporangium Groupe V. Dermatophiles : mycélium filamenteux se divisant transversalement dans deux plans longitudinaux au moins, formant ainsi un amas d’éléments mobiles de forme coccoïde, absence de mycélium aérien, parfois responsables de certaines infections épidermiques Dermatophilus, Geodermatophilus Groupe VI. Nocardia : mycélium filamenteux se divisant fréquemment pour former des éléments allongés ou coccoïdes, formation occasionnelle de spores aériennes ; certaines souches ont une réaction de Ziehl-Neelsen positive ; taux lipidique élevé dans les cellules et les parois cellulaires Nocardia : bactéries fréquemment présentes dans les sols, aérobies strictes, utilisant les hydrocarbures Rhodococcus : bactéries saprophytes des sols, présentes également dans l’intestin de nombreux insectes ; utilisation des hydrocarbures Groupe VII. Streptomycètes : abondant mycélium aérien permanent accompagné de spores en longues chaînes Streptomyces : près de 500 espèces identifiées, dont beaucoup produisent des antibiotiques Autres genres identifiés par différenciation morphologique : Streptoverticillium, Sporichthya, Kitasatoa, Chainia Groupe VIII. Micronospores : mycélium permanent, spores uniques, en paires ou en courtes chaînes ; nombreuses espèces saprophytes retrouvées dans les sols, les débris végétaux en putréfaction ; une espèce produit des endospores Micromonospora, Microbispora, Themobispora, Thermoactinomyces, Thermomonospora

69–71

56–75

61–72 59–69 69–75 67–73 54–79

a

Toutes ces espèces, à l’exception de celles des genres Acetobacterium, Butyrivibrio et Thermoanaerobacter, appartiennent, phylogénétiquement, aux actinobactéries.



398 Chapitre 12


fréquemment pigmentés, contribuant ainsi à la coloration souvent caractéristique de la colonie (voir figure 12.76a). Cette coloration, associée à l’aspect compact et poussiéreux des colonies sur le milieu gélosé, permet d’identifier facilement Streptomyces sp. (voir figure 12.76b).

Écologie et isolement de Streptomyces sp.

M. T. Madigan

© Eli Lilly & Co. Used with permission.

Ces espèces bactériennes sont principalement retrouvées dans les sols, mais quelques espèces sont parfois présentes dans des milieux aquatiques. Les odeurs caractéristiques de sol résultent de la production de différents métabolites appelés géosmines, composés également produits par certaines cyanobactéries (voir section 12.25). Ces substances sont des composés sesquiterpénoides (composés cycliques insaturés) ; la géosmine la plus commune est la trans-1, 10-diméthyl-trans-9-décalol. Les sols à pH neutre ou alcalin sont les plus favorables au développement des Streptomyces. Ceux-ci sont particulièrement bien implantés dans des sols très bien drainés, tels que les terreaux sablonneux ou les sols calcaires. De plus, il a été démontré que le développement de ces bactéries ne demande pas un taux hygrométrique aussi élevé que beaucoup d’autres bactéries présentes dans les sols. L’isolement des Streptomyces à partir d’échantillons de sols est relativement aisé : après une phase de dilution en eau stérile, l’échantillon est ensemencé sur un milieu gélosé sélectif, puis incubé à une température de

25 °C (voir figure 30.7a). Les milieux utilisés contiennent fréquemment des sels inorganiques auxquels sont ajoutés de l’amidon, de l’asparagine ou du malate de calcium comme sources de carbone d’une part, et de la caséine non digérée ou du nitrate de potassium comme source d’azote, d’autre part. Après une durée d’incubation des milieux pendant 5 à 7 jours en atmosphère aérobie, les colonies apparaissent sous différents aspects (voir figures 12.76 et 12.77). Les spores formées peuvent alors être prélevées et ensemencées sur un nouveau milieu gélosé pour obtenir une culture pure. Ces bactéries ont des besoins nutritionnels rares mais variés : de nombreuses sources carbonées (les sucres, les alcools, les acides organiques, les acides aminés et quelques composés aromatiques) peuvent être utilisées. De nombreuses espèces produisent des enzymes hydrolytiques extracellulaires permettant l’utilisation des polysaccharides (amidon, cellulose et

(a)

David A. Hopwood

David A. Hopwood

(a)

(b) FIGURE 12.76 Streptomyces. a) Colonies de Streptomyces et autres bactéries du sol, obtenues après l’ensemencement d’une dilution de terre sur un milieu gélosé à base de caséine et d’amidon. Les colonies de Streptomyces ont des colorations variées (plusieurs colonies noires sont au premier plan), mais sont facilement identifiables par leurs caractéristiques morphologiques (opaques, rugueuses et peu étalées). b) Macrophotographie de colonies de Streptomyces coelicolor.

(b) FIGURE 12.77 Production d’antibiotiques par Streptomyces. a) Action antibactérienne sur certains micro-organismes présents sur milieu gélosé. Les colonies les plus étendues appartiennent au genre Bacillus. b) L’antibiotique coloré en rouge (undecylprodigiosine) est produit par des colonies de Streptomyces coelicolor.




hémicellulose) des protéines et des lipides. Certaines espèces peuvent même dégrader des hydrocarbures, la lignine, le tannin, ainsi que le caoutchouc. Ainsi, une espèce peut dégrader plus de 50 sources carbonées différentes. Ces bactéries sont aérobies strictes et leur croissance en milieu liquide est fortement favorisée par l’application d’une aération forcée. La phase de sporulation ne se réalise généralement qu’en milieu solide, mais également parfois au niveau de la pellicule formée à la surface d’un milieu liquide non agité.

Les antibiotiques produits par Streptomyces La propriété la plus impressionnante liée au genre Streptomyces réside probablement dans la production d’antibiotiques (voir tableau 12.31). La preuve de cette aptitude à produire des substances à activité antibiotique est fréquemment donnée dès l’isolement des souches de Streptomyces sur les milieux gélosés : les colonies bactériennes adjacentes présentent des zones d’inhibition caractéristiques (voir figures 12.76a, 12.77a et 30.7a). Près de 50 % des espèces de Streptomyces isolées sont reconnues comme productrices d’antibiotiques. Des travaux très importants ont été réalisés à partir de ces espèces car cette propriété représente un marché économique conséquent et revêt une très forte importance médicale. Plus de 500 substances à activité antibiotique ont été identifiées et beaucoup d’autres sont encore à l’état de recherche (voir sections 30.5 et 30.6). La plupart d’entre elles ont fait l’objet d’une caractérisation chimique (voir figure 12.77b). Certaines de ces bactéries produisent plus d’une substance à activité antibiotique, ces substances n’ayant pas nécessairement les mêmes structures moléculaires. De même, une substance

TABLEAU 12.31

identique peut être synthétisée par différentes espèces bactériennes découvertes dans divers environnements disséminés aux quatre coins de la terre. Il est également intéressant de noter qu’un micro-organisme, résistant aux antibiotiques élaborés par ses propres soins, demeure cependant souvent sensible aux autres molécules produites par d’autres espèces de Streptomyces. De nombreux gènes sont impliqués dans le mécanisme de production des enzymes nécessaires à la synthèse de ces antibiotiques ; en conséquence, les génomes des espèces de Streptomyces sont relativement importants (8 Mbp et plus, voir tableau 15.1). Plus de 60 substances à activité antibiotique produites par des espèces de Streptomyces sont utilisées non seulement dans le monde de la médecine vétérinaire et humaine, mais également dans celui de l’agriculture et de l’industrie. Les antibiotiques les plus utilisés, produits par Streptomyces sp., sont répertoriés dans le tableau 12.31. Ils sont regroupés en classes sur la base de la structure chimique. La recherche de nouvelles molécules continue car toutes les maladies infectieuses ne sont pas totalement maîtrisées par les antibiotiques existants. De plus, l’acquisition de résistance parfois multiple à ces molécules par des micro-organismes pathogènes nécessite une recherche pour découvrir et produire de nouvelles familles. Néanmoins, en dépit des importantes études réalisées sur ces micro-organismes du fait des potentialités commerciales énormes dans le domaine industriel de production de molécules à activité antibiotique, l’écologie de Streptomyces sp. demeure très mal connue – en particulier leurs interactions avec les autres organismes procaryotes et les raisons de production des antibiotiques. Pour cette dernière question, une hypothèse a été émise : cette production de substances inhibitrices, liée à

PRINCIPAUX ANTIBIOTIQUES ÉLABORÉS PAR LES ESPÈCES DE STREPTOMYCES

Classe d’antibiotiques

Dénomination commune

Espèces productrices

Spectre d’actiona

Streptomycine Spectinomycine

S. griseusb Streptomyces sp.

Néomycine

S. fradiae

Tétracyclines

Tétracycline

S. aureofaciens

Spectre large, Bacteria Gram positif et Gram négatif, rickettsies, chlamydies et mycoplasmes

Macrolides

Chlortétracycline Erythromycine

S. aureofaciens Saccharopolyspora erythrea

Clindamycine

S. lincolnensis

Bacteria Gram positif, Legionella sp., fréquemment utilisée en remplacement de la pénicilline Bacteria anaérobies strictes, notamment Bacteroides fragilis

Nystatine

S. noursei

Amphotéricine B

S. nodosus

Chloramphénicol

S. venezuelae

Aminoglycosides

Polyènes

Phénicolés

Bacteria Gram négatif M. tuberculosis et N. gonorrhoeae productrice de pénicillinase Spectre large à utilisation spécifique du fait de la toxicité de la molécule

Champignons, notamment les infections à Candida sp. Champignons Spectre large ; utilisation contre la fièvre typhoïde

a

La majorité des antibiotiques ont une efficacité contre différentes espèces bactériennes. Cette colonne indique les principales applications thérapeutiques de ces molécules. Les structures et les modes d’action sont présentés dans les sections 20.7 à 20.9. b Les espèces précédées de S. appartiennent au genre Streptomyces.



400 Chapitre 12


la phase de sporulation, elle-même déclenchée par l’absence de nutriments, peut être considérée comme un mécanisme visant à inhiber la croissance des autres micro-organismes en compétition pour les ressources nutritives. Cette procédure permettrait ainsi au streptomycètes d’achever la phase de sporulation et ainsi d’augmenter les chances de survie.

Structure et classification des cyanobactéries

Contrôlez vos acquis Les streptomycètes appartiennent à un très grand groupe de bactéries filamenteuses Gram positif, formant une spore terminale sur les filaments aériens. De nombreuses substances à activité antibiotique utilisées en médecine, comme les tétracyclines et la néomycine, sont produites par des espèces de Streptomyces. •

Quelles sont les différences entre les spores et le processus de sporulation des espèces bactériennes appartenant aux genres Streptomyces et Bacillus ?

•

Quel est le type respiratoire de Streptomyces sp. et quelles sont les sources d’obtention de leur énergie ?

•

Quelles sont les raisons de la production d’antibiotiques par Streptomyces sp. ?

IV

PHYLUM 4 : LES CYANOBACTÉRIES ET LES PROCHLOROPHYTES

12.25 Cyanobactéries m n

Genres principaux : Synechococcus, Oscillatoria, Nostoc Les cyanobactéries constituent un groupe important et morphologiquement hétérogène de bactéries phototrophes. Les cyanobactéries diffèrent de manière fondamentale à la fois des bactéries pourpres et des bactéries vertes (voir sections 12.2 et 12.32) car ce sont des phototrophes oxygéniques. Les cyanobactéries constituent l’une des divisions majeures des

TABLEAU 12.32

bactéries et présentent une relation distante avec les Bacteria Gram positif (voir figure 12.1). Comme nous l’avons vu dans la section 11.1, ces organismes ont été les premiers organismes phototrophes produisant de l’oxygène sur Terre et ils ont été responsables de la transformation de l’atmosphère de l’état anoxique à l’état oxique.

La diversité morphologique des cyanobactéries est impressionnante (voir figure 12.78). Il existe à la fois des formes unicellulaires et filamenteuses. À l’intérieur de chacun de ces types, une variabilité considérable est observée. Malgré tout, il est possible de diviser les cyanobactéries en cinq groupes morphologiques : 1) formes unicellulaires se divisant par scission binaire (voir figure 12.78a) ; 2) formes unicellulaires se divisant par scissions multiples (coloniales) [voir figure 12.78b] ; 3) formes filamenteuses contenant des cellules différenciées appelées hétérocystes qui interviennent dans la fixation de l’azote (voir figures 12.78d et 12.80) ; 4) formes filamenteuses sans hétérocystes (voir figure 12.78c) ; et 5) formes filamenteuses ramifiées (voir figure 12.78e). Le tableau 12.32 présente les principaux genres reconnus à l’heure actuelle dans chaque groupe. La taille des cellules de cyanobactéries varie entre la taille typique pour les bactéries (0,5 à 1 µm de diamètre) jusqu’à 40 µm de diamètre (chez l’espèce Oscillatoria princeps, voir figure 4.44a). La structure de la paroi des cyanobactéries est semblable à celle des Bacteria Gram négatif et contient des peptoglycanes (voir figure 12.79). De nombreuses cyanobactéries produisent d’importantes enveloppes mucilagineuses (sheath, en anglais) qui relient des cellules ou des filaments ensemble (voir par exemple la figure 12.78a). Le système de membranes photosynthétiques est souvent complexe, comprenant plusieurs couches (voir figure 17.10b), bien que chez certaines cyanobactéries très simples, les lamelles soient arrangées de manière régulière en cercles concentriques autour de la périphérie du cytoplasme (voir figure 12.79). Les cyanobactéries contiennent une seule forme de chlorophylle, la chlorophylle a, et toutes possèdent des pigments caractéristiques de type phycobiliprotéines, les phycobilines

LES DIFFÉRENTS GROUPES DE CYANOBACTÉRIES ET PRINCIPAUX GENRES Groupes

Genres

ADN (% G+C)

Groupe I. Unicellulaires : cellules isolées ou groupées

Gloeothece (voir figure 12.78a), Gloeobacter, Synechococcus, Cyanothece, Gloeocapsa, Synechocystis, Chamaesiphon, Merismopedia

35–71

Groupe II. Pleurocapsales : reproduction par formation de petites cellules sphériques appelées baeocytes produites par fissions multiples

Dermocarpa (voir figure 12.78b), Xenococcus, Dermocarpella, Pleurocapsa, Myxosarcina, Chroococcidiopsis

40–46

Groupe III. Oscillatoriales : filamenteuses, les cellules se divisent par fission binaire dans un plan unique

Oscillatoria (voir figure 12.78c), Spirulina, Arthrospira, Lyngbya, Microcoleus, Pseudanabaena

40–67

Groupe IV. Nostocales : filamenteuses, produisant des hétérocystes

Anabaena (voir figure 12.78d), Nostoc, Calothrix, Nodularia, Cylinodrosperum, Scytonema

38–46

Group V. Ramifiées, les cellules se divisent en formant des ramifications

Fischerella (voir figure 12.78e), Stigonema, Chlorogloeopsis, Hapalosiphon

42–46



FIGURE 12.78 Diversité morphologique des cyanobactéries : les cinq types majeurs de cyanobactéries. a) Unicellulaire, Gleothece, contraste de phase, le diamètre d’une cellule individuelle mesure 5 à 6 µm ; b) coloniale, Dermocarpa, contraste de phase ; c) filamenteuse, Oscillatoria, champ clair ; une cellule individuelle mesure environ 15 µm de large ; d) filamenteuse à hétérocyste, Anabaena, contraste de phase ; une cellule individuelle mesure environ 5 µm de large ; e) filamenteuse ramifiée, Fischerella, champ clair.

Susan Barns et Norman Pace

(c)

(d)


(b)


(a)



12.25 Cyanobactéries 401

(e)

(voir figure 17.10a), qui servent de pigments accessoires lors de la photosynthèse. La phycocyanine est une phycobiline bleue, qui, en conjonction avec la chlorophylle a qui est verte, est responsable de la couleur bleu-vert de ces bactéries. Certaines cyanobactéries produisent de la phycoérythrine, une phycobiline rouge, et les espèces qui possèdent ce pigment ont une couleur rouge ou verte.

Les variations structurelles : vacuoles gazeuses et hétérocystes

M. R. Edwards

Parmi les structures cytoplasmiques observées chez de nombreuses cyanobactéries, figurent les vacuoles gazeuses (voir section 4.12), qui sont particulièrement communes chez les espèces qui vivent dans la colonne d’eau (espèces planctoniques). Leur fonction est de régler la flottabilité des cellules afin qu’elles se maintiennent à une profondeur où la lumière est optimale pour

FIGURE 12.79 Thylacoïdes des cyanobactéries. Coupe mince de la cyanobactérie Synechococcus lividus observée en microscopie électronique. La cellule mesure environ 5 µm de diamètre. Notez le parallélisme entre les membranes des thylacoïdes et la paroi cellulaire.

la photosynthèse. Certaines cyanobactéries filamenteuses forment des hétérocystes, qui sont des cellules rondes, apparemment vides, souvent distribuées régulièrement le long d’un filament ou à la fin d’un filament (voir figure 12.80a). Les hétérocystes proviennent de la différenciation de cellules végétatives et sont les seuls sites de fixation de l’azote (réduction de N2 en NH3, voir section 17.28) chez les cyanobactéries à hétérocystes. Chez le genre Anabaena, une cyanobactérie à hétérocystes qui a été très bien étudiée, des réarrangements complexes de gènes ont lieu dans l’hétérocyste afin de produire une suite continue (cluster) de gènes nif pouvant être exprimés ensemble (les gènes nif codent la nitrogénase, voir section 17.28). Les hétérocystes sont connectées aux cellules végétatives adjacentes et il y a un échange mutuel de composés entre ces cellules. Les produits de la photosynthèse migrent des cellules végétatives vers les hétérocystes et les produits de la fixation de l’azote migrent des hétérocystes vers les cellules végétatives (voir figure 12.80b). Les hétérocystes contiennent peu de phycobilines et ne possèdent pas de photosystème II, le photosystème qui produit de l’oxygène et qui génère un pouvoir réducteur à partir de l’H20 (voir section 17.5). En l’absence de photosystème II, les hétérocystes ne peuvent pas fixer le CO2 et ne possèdent donc pas le donneur d’électrons nécessaire pour réduire le N2 en NH3. L’importation de carbone fixé à partir des cellules végétatives adjacentes résout ce problème (voir figure 12.80b). Les hétérocystes sont entourées d’une paroi cellulaire renforcée contenant des quantités importantes de glycolipides, qui ralentissent la diffusion de l’O2 dans la cellule. Du fait de la sensibilité de la nitrogénase à l’oxygène (voir section 17.29), les hétérocystes maintiennent un environnement anaérobique, et stabilisent ainsi le système de fixation d’azote, chez des organismes aérobiques qui en plus produisent de l’oxygène. En fait, certaines cyanobactéries filamenteuses sans hétérocystes synthétisent de la nitrogénase et fixent l’azote dans des cellules végétatives normales, pour peu qu’elles soient cultivées en



402 Chapitre 12


T. D. Brock

Hétérocyste

(a) O2

O2

O2

O2

NH3

N2

CO2 CH2O

O2

O2

CO2 CH2O

Glutamine Hétérocyste

Cellules végétatives (b)

Cellules végétatives

FIGURE 12.80 Hétérocystes. a) Hétérocystes chez la cyanobactérie Anabaena. Les hétérocystes sont les seuls sites de fixation de l’azote chez les cyanobactéries à hétérocystes. b) Modèle de fonctionnement d’un hétérocyste. Les hétérocystes n’ont pas la capacité de produire de l’oxygène (photosystème II, voir section 17.5) et obtiennent les composés réducteurs dont ils ont besoin pour la fixation d’azote à partir de la matière organique produite dans les cellules végétatives adjacentes. L’azote fixé est transporté des hétérocystes vers les cellules végétatives sous forme de glutamine.

conditions anaérobiques en présence d’un bullage vigoureux de N2 pour éliminer l’O2.

Cyanophycine et autres structures Une structure appelée cyanophycine peut être observée par microscopie électronique dans de nombreuses cyanobactéries. Cette structure est un polymère composé d’acide aspartique et d’arginine –

–

–

–

–

Asp – Asp – Asp – Asp – Asp – Arg

Arg

Arg

Arg

Arg

Il peut constituer jusqu’à 10 % de la masse cellulaire. La cyanophycine est un produit de stockage azoté, et quand l’azote vient à manquer dans l’environnement, ce polymère est dégradé et sert de source d’azote cellulaire. La cyanophycine constitue aussi une réserve énergétique. L’arginine, dérivant de la cyanophycine, peut être hydrolysée pour donner de l’ornithine avec production d’ATP grâce à l’enzyme arginine dihydrolase, le carbamyle de phosphate (voir section 17.9) servant d’intermédiaire. Arginine + ADP + Pi + H2O → Ornithine + 2 NH3 + CO2 + ATP

L’arginine dihydrolase est présente dans de nombreuses cyanobactéries et cette réaction sert de source d’ATP de maintenance pendant les périodes d’obscurité. De nombreuses cyanobactéries peuvent se déplacer par glissement (gliding mobility) ; par contre, un vrai flagelle rotatif n’a jamais été observé. Ce glissement se produit seulement lorsque la cellule ou le filament est en contact avec une surface solide ou bien avec une autre cellule ou un autre filament. Chez certaines cyanobactéries, le glissement n’est pas un simple mouvement de translation mais est accompagné par des rotations, des changements de directions et la courbure des filaments. La plupart des espèces mobiles se déplacent vers la lumière (phototactisme). Le chimiotactisme (voir section 4.16) peut aussi se produire. Chez les cyanobactéries filamenteuses, la fragmentation des filaments se produit souvent par formation d’une hormogonie, aussi appelée trichome (voir figures 12.81a, b), qui se sépare des filaments et s’en éloigne. Chez certaines espèces, des spores de dormance appelées akinètes (voir figure 12.81c) sont produites ; elles protègent l’organisme lors des périodes d’obscurité, de sécheresse ou de gel. Ces cellules à la paroi renforcée germent après rupture de la paroi et développement d’un nouveau filament. Cependant, même les cellules végétatives de cyanobactéries sont souvent résistantes à la dessication ou aux basses températures.

La physiologie des cyanobactéries La nutrition des cyanobactéries est simple. Les vitamines ne sont pas nécessaires, et les nitrates ou l’ammoniaque constituent la source d’azote. Les espèces fixant l’azote atmosphérique sont communes. La plupart des espèces qui ont été analysées sont des phototrophes obligatoires, ne pouvant pas pousser à l’obscurité en présence de composés organiques. Cependant, certaines cyanobactéries peuvent assimiler des substances organiques relativement simples comme le glucose et l’acétate, pourvu que la lumière soit présente (photoassimilation). Certaines cyanobactéries, surtout parmi les espèces filamenteuses, peuvent en fait pousser à l’obscurité en utilisant le glucose ou le sucrose, à la fois comme source de carbone et comme source d’énergie. Certains produits métaboliques des cyanobactéries revêtent une importance pratique considérable. De nombreuses cyanobactéries produisent de puissantes toxines. Lors des blooms aquatiques, des accumulations massives de cyanobactéries peuvent se développer et les animaux qui ingèrent l’eau contaminée peuvent mourir. De nombreuses cyanobactéries sont aussi responsables d’odeurs et de goûts désagréables en eau douce, ce qui peut poser des problèmes si ce type d’eau est utilisé pour la consommation. Le principal composé produit est la géosmine (trans-1,10-diméthyl-trans-9-décalol). Cette substance qui est aussi produite par certains actinomycètes (voir discussion dans la section 12.24) est responsable de l’odeur de « terre » caractéristique des sols humides fraîchement retournés.

Écologie et phylogénie des cyanobactéries Les cyanobactéries sont largement distribuées dans les habitats naturels terrestres, dulçaquicoles et marins. En général, elles résistent mieux aux conditions environnementales extrêmes que les algues et sont souvent les organismes phototrophes



12.26 « Prochlorophytes » et chloroplastes 403

T. D. Brock

Zone de séparation de l’hormogonie

(a)

T. D. Brock

Hormogonie

certain nombre constituent le composant phototrophe des lichens. Dans le cas de la fougère aquatique Azolla (voir sections 17.28 et 19.22), il a été démontré que l’endosymbiote cyanobactérien (appartenant au genre Anabaena) fixe l’azote qui devient alors disponible pour la plante. La composition en base de l’ADN génomique d’une variété de cyanobactéries a été déterminée. Pour les formes unicellulaires, elle varie entre 35 et 71 % de G+C, une plage si étendue que cela suggère que beaucoup de ces organismes sont très éloignés génétiquement. Par contre, les valeurs pour les cyanobactéries à hétérocystes varient beaucoup moins de 38 à 46 % de G+C. Le regroupement phylogénétique des cyanobactéries est en général cohérent avec leur morphologie. Les cyanobactéries filamenteuses avec et sans hétérocystes forment des groupes distincts, de même que les formes ramifiées. Par contre, les cyanobactéries unicellulaires sont phylogénétiquement très diversifiées, leurs représentants ayant des relations phylogénétiques avec des groupes morphologiquement différents.

12.26 « Prochlorophytes » m n et chloroplastes Genres importants : Prochlorococcus, Prochloron, Prochlorothrix

(b)

T. D. Brock

Akinète

(c) FIGURE 12.81 Différenciation structurelle chez les cyanobactéries filamenteuses. a) Stade initial de formation d’une hormogonie chez Oscillatoria. Notez l’espace vide à l’endroit où l’hormogonie se sépare du filament. b) Hormogonie d’une espèce plus petite d’Oscillatoria. Notez que les cellules sont arrondies aux deux extrémités. Microscopie de contraste interférentiel de Nomarski. c) Akinète (spore de dormance) d’Anabaena en contraste de phase.

dominant ou même uniques dans les sources chaudes (voir tableau 6.1), les lacs salés et les autres environnements extrêmes. On trouve beaucoup d’espèces à la surface des rochers ou des sols, et même dans certains cas à l’intérieur des rochers (voir figure 14.38). Dans les sols désertiques, soumis à une lumière solaire intense, les cyanobactéries forment souvent des croûtes superficielles étendues, restant en dormance la plupart de l’année et ne poussant que pendant le bref hiver et les pluies printanières. Dans les baies marines peu profondes, où l’eau présente des températures relativement élevées, des tapis très épais de cyanobactéries peuvent se former. Dans les lacs d’eau douce, en particulier ceux qui sont riches en éléments nutritifs, des efflorescences de cyanobactéries peuvent se développer (voir figure 19.10b). Certaines cyanobactéries sont des endosymbiotes d’hépatiques, de fougères ou de cycadales ; un

Les « prochlorophytes » sont des phototrophes oxygéniques qui contiennent des chlorophylles a et b mais pas de phycobilines. Les « prochlorophytes » ressemblent donc à la fois aux cyanobactéries (car ce sont des procaryotes et qu’ils contiennent de la chlorophylle a) et aux chloroplastes des plantes vertes et des algues vertes (car ils contiennent de la chlorophylle b au lieu des phycobilines). Il est désormais prouvé que les « prochlorophytes » forment un groupe polyphylétique au sein des cyanobactéries – on utilise donc ici ce terme entre guillemets pour indiquer clairement qu’il s’agit d’un regroupement purement phénotypique, mais absolument pas phylogénétique.

Prochloron Prochloron a été le premier « prochlorophyte » découvert. Dans le milieu naturel, c’est un symbiote d’invertébrés marins (ascidies de famille des Didemnidae), mais il n’a pas été cultivé à ce jour au laboratoire. Les cellules de Prochloron extraites des cavités des tissus d’ascidies sont plus au moins sphériques (voir figure 12.82) et font 8 à 10 µm de diamètre. Des coupes minces de Prochloron observées en microscopie électronique (voir figure 12.82) montrent un système étendu de membranes thylacoïdales qui ressemble à ce qui est observé dans le chloroplaste (voir figure 14.6). Une preuve supplémentaire de l’appartenance phylogénétique de Prochloron aux Bacteria est apportée par la présence d’acide muramique dans la paroi, et donc de peptidoglycanes (voir section 4.8). Les caroténoïdes de Prochloron sont semblables à ceux des cyanobactéries, principalement le β-carotène et la zéaxanthine. La composition en G+C de l’ADN génomique d’échantillons de Prochloron obtenus de différentes ascidies varie entre 31 et 41 %, suggérant une certaine hétérogénéité génétique. Il est donc probable que plusieurs espèces de




FIGURE 12.82 Le « prochlorophyte » Prochloron observé en microscopie électronique. Notez l’importance des membranes intracytoplasmiques (10 µm). Les cellules mesurent environ 10 µm de diamètre. Contrairement aux cyanobactéries « classiques », les « prochlorophytes » ne possèdent pas de phycobiliprotéines.

Prochloron existent, mais la confirmation de cette hypothèse doit attendre la mise en culture au laboratoire et l’étude de cultures pures.

Prochlorothrix et Prochlorococcus

(a)

Les « prochlorophytes », les chloroplastes et l’évolution Si on se reporte à notre discussion sur l’endosymbiose (voir sections 2.6, 11.4 et 14.4), la signification des « prochlorophytes » du point de vue de l’évolution est assez évidente. Avant la découverte des « prochlorophytes », on faisait l’hypothèse que les chloroplastes avaient pour origine l’endosymbiose d’une cyanobactérie avec une cellule eucaryote primitive. Cependant, cette hypothèse soulève une question majeure : comment le chloroplaste des plantes vertes a-t-il pu évoluer vers le complément pigmentaire qu’il possède à l’heure actuelle s’il provenait d’une endosymbiose de cyanobactérie contenant des phycobilines au lieu de la chlorophylle b ? L’hypothèse selon laquelle les « prochlorophytes » plutôt que les cyanobactéries étaient les ancêtres du chloroplaste des plantes vertes éliminait ce problème. Cependant, les analyses phylogénétiques n’ont pas démontré que

T. Burger-Wiersma

T. Burger-Wiersma

Prochlorothrix est un « prochlorophyte » filamenteux (voir figure 12.83) qui peut se développer en culture pure. Comme Prochloron, Prochlorothrix contient de la chlorophylle a et de la b, mais pas de phycobilines bien que les membranes thylacoïdales soient moins bien développées que chez Prochloron (comparez les figures 12.82 et 12.83b). Un autre « prochlorophyte », Prochlorococcus, est abondant dans la couche euphotique en milieu océanique. Les cellules de

ce phototrophe sont rondes et de petite taille, mesurant moins de 1 µm de diamètre (voir figure 19.11a). Comme les autres « prochlorophytes », Prochlorococcus contient de la chlorophylle b. Cependant, Prochlorococcus ne contient pas de chlorophylle a et produit à la place une forme modifiée de chlorophylle a, appelée divinyl chlorophylle a. Les cellules de Prochlorococcus contiennent aussi de l’α-carotène (au lieu du β-carotène), un pigment inconnu auparavant chez les procaryotes. Du fait de sa relativement grande abondance dans l’océan, Prochlorococcus a probablement une importance écologique considérable en tant que producteur primaire dans les eaux océaniques du large. D’autres organismes similaires ont été isolés, en particulier Acaryochloris (voir figure 12.83c), qui contient comme pigment majeur de la chlorophylle b. La chlorophylle est aussi présente dans une variété d’algues (cellules eucaryotes, voir section 14.13), certaines espèces étant extrêmement petites (voir figure 19.11c).

Juergen Marquardt

Kit W. Lee

404 Chapitre 12

(b)

(c)

FIGURE 12.83 Les prochlorophytes Prochlorothrix (filamenteux) et Acaryochloris, observés en microscopie à contraste de phase et électronique. a) Contraste de phase. b) Coupe mince observée en microscopie électronique montrant l’arrangement des membranes. Le diamètre des cellules mesure environ 2 µm. c) Acaryochloris. Ce prochlorophyte contient comme pigment chlorophyllien principal de la chlorophylle d. Le diamètre d’une cellule est d’environ 1,5 µm.




Prochloron, Prochlorococcus, ou Prochlorothrix soient les ancêtres immédiats du chloroplaste des plantes vertes. En fait, on sait désormais que les « prochlorophytes » sont polyphylétiques et constituent des lignées distinctes au sein des cyanobactéries. Une autre hypothèse explique les différences de pigmentation observées chez les phototrophes procaryotes oxygéniques. Les cyanobactéries auraient pu évoluer à partir d’ancêtres qui contenaient à la fois des phycobilines et des chlorophylles différentes de la chlorophylle a, soit de la chlorophylle b ou d. À partir de là, les lignées de cyanobactéries « classiques » ont évolué en perdant les chlorophylles accessoires alors que les lignées de « prochlorophytes » se sont débarrassées des phycobilines. Les pigments que nous trouvons dans chaque groupe à l’heure actuelle représentent donc la meilleure combinaison de pigments photosynthétiques permettant de s’adapter à un environnement spécifique.

Contrôlez vos acquis Les cyanobactéries sont des procaryotes phototrophes oxygéniques. La différence la plus marquée entre les « prochlorophytes » et les cyanobactéries « classiques » est la présence de chlorophylle b ou d, et l’absence de phycobilines chez les « prochlorophytes ». On pense que l’oxygène dans l’atmosphère de la terre a pour origine la photosynthèse des cyanobactéries. •

Décrivez au moins trois éléments qui distinguent les cyanobactéries des bactéries pourpres.

•

Qu’est-ce qu’un hétérocyste et quelle est sa fonction ?

•

Quelles sont les ressemblances et les différences entre les cyanobactéries classiques, les « prochlorophytes » et les chloroplastes du maïs ?

•

Quelle est l’importance écologique de Prochlorococcus ?

V

PHYLUM 5 : CHLAMYDIA

une scarification de la cornée. C’est la cause majeure de la cécité chez l’homme. D’autres souches de Chlamydia trachomatis infectent le tractus génito-urinaire, et les infections à Chlamydia constituent l’une des maladies sexuellement transmissibles les plus fréquentes (voir section 26.13). Une comparaison des propriétés de Chlamydia psittaci, Chlamydia trachomatis et Chlamydophila pneumoniae, ainsi que des maladies provoquées, est donnée dans le tableau 12.33.

Les propriétés moléculaires et métaboliques Outre leur rôle de pathogènes, les Chlamydia sont intéressantes en raison des problèmes de biologie, d’évolution et de métabolisme qu’elles posent. Les études biochimiques montrent que les Chlamydia ont des parois cellulaires de type Gram négatif, qu’elles possèdent ADN et ARN, et sont donc clairement des cellules. L’observation en microscopie électronique de coupes fines montre que la division cellulaire se fait par scission binaire (voir figure 12.84). Les capacités de biosynthèse des Chlamydia sont beaucoup plus limitées que celles des rickettsies, l’autre groupe de parasites intracellulaires connu chez les Bacteria (voir section 12.13). On pensait il y a quelque temps que les Chlamydia étaient des « parasites énergétiques », obtenant de leurs hôtes non seulement les composés intermédiaires de la biosynthèse, mais aussi l’ATP. Cependant, cette hypothèse a été remise en question suite au séquençage du génome de C. trachomatis (voir section 15.3). Le chromosome de C. trachomatis (approximativement 1 Mpb) contient des gènes facilement identifiables, impliqués dans la synthèse de l’ATP et même une série de gènes codant la biosynthèse du peptidoglycane. Cela suggère que cet organisme pourrait bien contenir du peptidoglycane, même si les analyses chimiques recherchant ce polymère sont négatives. Néanmoins, les Chlamydia possèdent probablement les capacités biochimiques les plus réduites chez les Bacteria (voir tableau 12.34). Il est intéressant de noter que le génome de C. trachomatis ne possède pas le gène codant la protéine FtsZ, une protéine clé impliquée dans la formation du septum au cours de la division cellulaire (voir section 6.2). Cette protéine était auparavant considérée comme indispensable à la croissance des

12.27 Chlamydia m n Les organismes des genres Chlamydia et Chlamydophila sont des bactéries parasites obligatoires possédant de faibles capacités métaboliques et forment un phylum distinct au sein des Bacteria (voir figure 12.1). Plusieurs espèces majeures sont reconnues (voir tableau 12.33) : Chlamydophila psittaci, agent de la maladie nommée psittacose ; Chlamydia trachomatis, agent du trachome et autres maladies humaines ; et Chlamydophila pneumoniae, responsable de plusieurs syndromes respiratoires (voir tableau 12.33). La psittacose est une maladie épidémique des oiseaux, occasionnellement transmise à l’homme, et donnant des symptômes ressemblant à ceux de la pneumonie. Le trachome est une maladie de l’œil, caractérisée par une vascularisation et

Robert R. Friis

Genres principaux : Chlamydia, Chlamydophila

FIGURE 12.84 Chlamydia. Image en microscopie électronique d’une coupe fine d’une cellule en division (corps réticulé, voir figure 12.85) de Chlamydia psittaci, l’un des agents de la psittacose, dans une culture cellulaire de tissu de souris. Le diamètre d’une cellule de Chlamydia est d’environ 1 µm.



406 Chapitre 12

TABLEAU 12.33


CARACTÉRISTIQUES DISTINGUANT LES ESPÈCES APPARTENANT AUX GENRES CHLAMYDIA ET CHLAMYDOPHILA

Caractéristiques

Chlamydia trachomatis

Chlamydophila pneumoniae

Chlamydophila psittaci

Hôtes

Hommes

Oiseaux, mammifères, hommes occasionellement

Hommes

Site usuel d’infection

Membranes muqueuses

Sites multiples

Muqueuses respiratoires

Transmission d’homme à homme

Commune

Rare

Probable

ADN (% G+C)

42–45

39–43

40

% homologie ADN:ADN avec C. trachomatisa

100

10

10

Taille du génome en kpb (Escherichia coli = 4 600)

1 000

550

~ 1 000

Maladies humaines

Trachome, otite, urethrite non gonoccique (mâles), inflammation de l’urètre (femmes), lymphogranulome vénérien, cervicites

Psittacose

Syndromes respiratoires

Maladies des animaux domestiques

–

Chlamydiose aviaire (perroquets, perruches), pneumonies, arthritis du tissu synovial, ou conjonctivites (moutons, veaux, chatons, porcelets, poulains)

–

a

Sur l’ADN et l’hybridation de l’ADN voir la section 11.11.

Archaea et des Bacteria. De plus, il existe chez C. trachomatis des gènes possédant des caractéristiques eucaryotes, suggérant que C. trachomatis a acquis certains gènes de son hôte, qui l’assistent dans son mode de vie parasitaire (voir tableau 12.33 et sections 21.7 et 26.13).

TABLEAU 12.34

Le cycle cellulaire de Chlamydia Le cycle cellulaire typique des Chlamydia est présenté dans la figure 12.85. Deux types cellulaires se succèdent au cours du cycle cellulaire : 1) une petite cellule, dense, nommée corps élémentaire, relativement résistante à la dessication, et mode

COMPARAISON DE PARASITES INTRACELLULAIRES OBLIGATOIRES : RICKETTSIES, CHLAMYDIA ET VIRUS

Propriétés

Rickettsies

Chlamydia

Virus

Structurales Acides nucléiques

ARN et ADN

ARN et ADN

Ribosomes

Présents

Présents

ARN ou ADN (simple ou double brin), jamais mixte (ADN et ARN) Absents a

Paroi cellulaire

Peptidoglycane présent

Peptidoglycane présent

Pas de paroi

Intégrité structurale pendant la multiplication

Maintenue

Maintenue

Perdue

Synthèse de macromolécules

Oui

Oui

Seulement en utilisant la machinerie de l’hôte

Système de génération d’ATP

Présent

Présenta

Absent

Oxydation du glutamate

Oui

Non

Non

Sensibilité aux antibiotiques bactériens

Sensible

Sensible (sauf pénicilline)

Résistant

Phylogénie

Alpha-protéobactéries

Phylum des Chlamydia

Non cellulaire

Capacités métaboliques

a

Le génome d’une espèce de Chlamydia, Chlamydia trachomatis, a été entièrement séquencé (voir section 15.4), et les gènes pour la synthèse du peptidoglycane et de l’ATP sont présents. Cependant, l’absence de sensibilité à la pénicilline chez les Chlamydia pose la question de la synthèse réelle du peptidoglycane.




Corps élémentaire

Corps réticulé ~1µm

~0.3 µm

Paroi cellulaire fragile, forme reproductrice, non infectieux

Paroi cellulaire rigide, pas de croissance, stade infectieux

1. Un corps élémentaire attaque la cellule de l’hôte

6. Libération des corps élémentaires

5. Conversion en corps élémentaires

2. Phagocytose du corps élémentaire

3. Conversion en corps réticulé

4. Multiplication des corps réticulés

de dispersion de l’agent pathogène et 2) une grande cellule moins dense, nommée corps réticulaire, qui se divise par fission binaire et constitue la forme végétative. Les corps élémentaires sont des cellules qui ne se divisent pas, spécialisées dans la transmission de l’infection. Par contraste, les corps réticulés, non infectieux, se multiplient à l’intérieur des cellules de l’hôte et assurent une inoculation massive. Contrairement aux rickettsies (voir section 12.13), les Chlamydia ne sont pas transmises par des arthropodes, mais sont surtout des envahisseurs aériens du système respiratoire, d’où l’importance de la résistance à la dessication des corps élémentaires. Un corps réticulé en division est présenté dans la figure 12.84. Après plusieurs divisions cellulaires, ces cellules végétatives sont transformées en corps élémentaires libérés lorsque la cellule hôte se désintègre, et peuvent alors infecter d’autres cellules. Des temps de génération de 2 à 3 heures ont été mesurés pour les corps élémentaires, ce qui est beaucoup plus rapide que chez les rickettsies. En résumé, les Chlamydia semblent avoir développé une réelle stratégie de survie très efficace, incluant le parasitage des ressources de l’hôte (voir tableau 12.34) et la production de formes résistantes destinées à la transmission. Il n’est pas surprenant que les Chlamydia aient été associées à autant de maladies différentes (voir tableau 12.33 et section 26.13).

Contrôlez vos acquis Les Chlamydia sont des bactéries parasites extrêmement petites qui peuvent provoquer diverses maladies chez l’homme. Les Chlamydia possèdent un très petit génome et il leur manque apparemment de nombreuses fonctions métaboliques.

(a) Corps élémentaires

•

En utilisant les données du tableau 12.34 comme guide, comment peut-on différencier les Chlamydia des rickettsies ? des virus ?

•

Quelle est la différence entre un corps élémentaire et un corps réticulé ?

•

Quelles ont été les surprises rencontrées suite au séquençage du génome de Chlamydia ?

VI

PHYLUM 6 : PLANCTOMYCES / PIRELLULA

Morris Cooper

12.28 Planctomyces : une bactérie m n pédonculée phylogénétiquement

(b) FIGURE 12.85 Cycle infectieux de Chlamydia. a) Représentation schématique du cycle : l’ensemble du processus dure environ quarante-huit heures. b) Infection à Chlamydia chez l’homme. Une cellule infectée des trompes de Fallope éclate, libérant des corps élémentaires matures.

distincte

Genres principaux : Planctomyces, Pirellula, Gemmata Ce phylum contient plusieurs genres de bactéries à la morphologie unique, dont Planctomyces, Pirellula, Gemmata et Isosphaera. Planctomyces (voir figure 12.86) est le plus étudié. Dans la section 12.16, des bactéries pédonculées comme Caulobacter ont été présentées. Planctomyces est aussi pédonculé. Cependant, contrairement à Caulobacter, le pédoncule de Planctomyces est fait de protéines et ne possède pas de paroi ou de cytoplasme (comparez les figures 12.86 et 12.41). Le pédoncule




Flagelle

Pilus

Pédoncule John Bauld

Pédoncule

FIGURE 12.86 Image en microscopie électronique d’une préparation (ombrage métallique) de Planctomyces maris. Une cellule mesure environ 1 à 1,5 µm de long. Notez la nature fibrillaire du pédoncule. Les pili sont aussi abondants. Remarquez également les flagelles (appendices courbes) sur chaque cellule et le bourgeon se formant à partir du pôle non pédonculé de la cellule.

de Planctomyces a vraisemblablement un rôle d’attachement, mais est beaucoup plus étroit et fin que celui de Caulobacter.

Les autres caractéristiques du groupe des Planctomyces Planctomyces et les genres apparentés présentent également l’intérêt de ne pas posséder de peptidoglycane, et leurs parois cellulaires sont de type couche-S (voir sections 4.8 et 4.10), et consistent en une protéine contenant de grandes quantités de cystéine (sous forme de cystine) et de proline. Comme on peut s’y attendre pour des organismes dépourvus de peptidoglycane, ces organismes sont résistants aux antibiotiques qui inhibent la synthèse du peptidoglycane comme la pénicilline et la céphalosporine. Comme chez Caulobacter (voir figure 12.41), Planctomyces est aussi une bactérie bourgeonnante et présente un type de « cycle cellulaire », dans lequel les cellules mobiles essaiment et se fixent à une surface, développe un pédoncule à partir du point de fixation, et forme une cellule nouvelle au pôle opposé par bourgeonnement. Cette cellule fille développe un flagelle, se détache de la cellule mère et entame un nouveau cycle. Physiologiquement, les espèces de Planctomyces sont des chimioorganotrophes aérobies facultatifs, se développant par respiration ou fermentation des sucres. Planctomyces vit essentiellement en milieu aquatique, dulçaquicole ou marin, et Isosphaera est une bactérie filamenteuse à mobilité glissante présente dans les sources chaudes. Comme pour Caulobacter (voir section 12.16), l’isolement de Planctomyces et des organismes apparentés nécessite un milieu dilu, et comme tous les membres connus de ce groupe ne possèdent pas de peptidoglycane, les enrichissements peuvent être rendus plus sélectifs par addition de pénicilline. Une caractéristique essentielle des eucaryotes est la présence d’un noyau délimité par une membrane (voir section 2.2). Les planctomycètes sont uniques chez les procaryotes car ils possèdent une compartimentalisation cellulaire, incluant une structure nucléaire délimitée par une membrane. Par exemple chez Gemmata (voir figure 12.87), le nucléoïde est entouré

d’une enveloppe. L’ADN de Gemmata est circulaire, clos de manière covalente et surenroulé, ce qui est classique chez les procaryotes (voir section 7.3), mais il est très condensé et demeure séparé du reste du cytolasme par une véritable unité membranaire (voir figure 12.87). D’autres compartiments intéressants existent comme l’anammoxosome de Brocadia anammoxidans, membre des Planctomyces. Cette bactérie réalise l’oxydation anaérobie de l’ammonium en azote, à l’intérieur de cette structure nommée anammoxosome (voir section 17.12). Jusqu’à présent, tous les planctomycètes révélent posséder des compartiments cellulaires internes, d’une sorte ou d’une autre. Plusieurs compartiments sont dépourvus d’ADN et ont donc d’autres fonctions, par exemple métaboliques (voir section 17.12). On ne connaît pas de compartiments ressemblant autant à ceux des eucaryotes chez aucun autre groupe de procaryotes. Cette compartimentalisation unique des cellules des planctomycètes tend à brouiller la distinction structurelle établie entre procaryotes et eucaryotes. Cependant, les planctomycètes se distinguent des eucaryotes par de nombreux points et en particulier la position phylogénétique qu’ils occupent au cœur du domaine des Bacteria (voir figure 12.1).

VII

PHYLUM 7 : VERRUCOMICROBIA

12.29 Verrucomicrobium m n et Prosthecobacter Genre principal : Verrucomicrobium Ce phylum des Bacteria partage avec les protéobactéries à prosthèques (voir section 12.16) la formation d’appendices

Nucléoïde


Margaret Lindsay et John Fuerst

408 Chapitre 12

FIGURE 12.87 Procaryotes nucléés. Observation en microscopie électronique à transmission d’une cellule de Gemmata obscuriglobus montrant le nucléoïde entouré par une enveloppe nucléaire. La cellule mesure environ 1,5 µm de diamètre.




cytoplasmiques nommés prosthèques. Les genres Verrucomicrobium et Prosthecobacter produisent de deux à plusieurs prosthèques par cellule (voir figure 12.88). Aussi, contrairement aux cellules de Caulobacter (voir figure 12.41) qui contiennent une prosthèque unique et produisent des cellules flagellées essaimantes dépourvues de prosthèque (voir section 12.16), Verrucomicrobium et Prosthecobacter se divisent de façon symétrique, et les cellules mère et fille possèdent des prosthèques au moment de la division cellulaire. Le genre Verrucomicrobium vient du grec et signifie « verrue », et cela correspond tout à fait à l’apparence de ces cellules de V. spinosum (voir figure 12.88) avec ses multiples prosthèques. Les membres des Verrucomicrobia partagent avec d’autres bactéries à prosthèques la présence de peptidoglycane dans leurs parois et sont aérobies ou aérobies facultatives, capables de fermenter de nombreux sucres. Les Verrucomicrobia sont très répandues dans la nature et peuplent les milieux dulçaquicoles et marins, comme les forêts et les sols agricoles. D’un point de vue phylogénétique, les Verrucomicrobia se distinguent de toutes les autres bactéries connues (voir figure 12.1). Le groupe montre quelques relations avec les phyla des Planctomyces et des Chlamydia, mais en est suffisamment distinct pour former une lignée séparée. Les espèces du genre Prosthecobacter possèdent deux gènes montrant une homologie significative avec les gènes de tubuline des cellules eucaryotes. La tubuline est la protéine clé constitutive du cytosquelette des cellules eucaryotes (voir section 14.5). Bien que la protéine impliquée dans la division cellulaire, ftsZ, soit aussi homologue de la tubuline (voir section 6.2), les protéines de Prosthecobacter sont structurellement plus proches des tubulines eucaryotes que ne l’est ftsZ. Le rôle de ces protéines chez Prosthecobacter est inconnu, car un cytosquelette ressemblant à celui des eucaryotes n’a jamais été observé chez ces organismes. Cependant, ces gènes indiquent vraisemblablement qu’il existe une relation entre les Verrucomicrobia et les cellules eucaryotes, soit en termes d’ancêtre commun, soit en termes de transfert latéral de gènes entre les deux domaines.

VIII

PHYLUM 8 : LES FLAVOBACTÉRIES

Les flavobactéries présentent une large gamme de types respiratoires, d’aérobie strict à anaérobie strict. Ces organismes sont présents dans des environnements divers. Seuls les deux principaux genres de ce groupe seront détaillés.

12.30 Bacteroides et Flavobacterium m n Genres principaux : Bacteroides, Flavobacterium Le genre Bacteroides contient des espèces anaérobies strictes, non sporulées, présentant une activité saccharolytique, fermentant les sucres ou les protéines en acétate primaire et en succinate selon les espèces. Les espèces du genre Bacteroides sont généralement commensales du tube digestif humain ou animal (voir sections 19.11 et 21.4). Ce sont les bactéries numériquement dominantes du gros intestin de l’homme, avec des niveaux de flore de 1010 par gramme de fécès. Certaines espèces du genre Bacteroides sont cependant pathogènes, et ce sont les bactéries anaérobies les plus fréquemment associées aux infections humaines. Les espèces du genre Bacteroides se distinguent dans le domaine des Bacteria par leur capacité à synthétiser des sphingolipides, ensemble hétérogène de lipides caractérisés par la présence d’une molécule de sphingosine (amino-alcool) à la place du glycérol (voir figure 12.89). On retrouve des sphingolipides tels que la sphingomyéline, les cérébrosides et les gangliosides dans les tissus des mammifères et plus particulièrement dans le cerveau et autres tissus nerveux. Les espèces du genre Flavobacterium se retrouvent dans les eaux douces ou marines, les aliments et les usines de transformation alimentaire. Les colonies de Flavobacterium sont en général pigmentées en jaune. Ce sont des organismes aérobies aux sources carbonées restreintes, utilisant peu d’autres composés carbonés que le glucose comme source de carbone et d’énergie. Les flavobactéries sont rarement pathogènes. Une espèce, F. meningosepticum, a été associée à un cas de méningite infantile. D’autres genres importants de ce groupe sont psychrophiles ou psychrotolérants (voir section 6.11), notamment les genres Polaribacter et Psychroflexus. Beaucoup d’autres genres de ce groupe sont également capables de se développer correctement à une température inférieure à 20 °C.

Heinz Schlesner

(a)

—

FIGURE 12.88 Image en microscopie électronique à transmission (coloration négative) d’une cellule en division de Verrucomicrobium spinosum. Notez les prolongements en forme de verrues. Une cellule mesure environ 1 µm de diamètre.

H2C—OH

H H H — H3C—(CH2 )12 —C—C—C—C—CH 2OH H OH NH + —

—

HC—OH

—

—

H2C—OH

3

(b)

FIGURE 12.89 Sphingolipides. Glycérol (a) et sphingosine (b). Dans les sphingolipides, caractéristiques des espèces du genre Bacteroides, la sphingosine est l’alcool estérifiant ; un acide gras est lié par liaison peptidique à l’atome d’azote (en rouge) et le groupement –OH terminal (en vert) peut réagir avec divers composés, dont la phosphatidylcholine (sphingomyéline), et divers sucres (cérébrosides et gangliosides).



410 Chapitre 12

IX


PHYLUM 9 : LE GROUPE DES CYTOPHAGA

Genres principaux : Cytophaga, Flexibacter, Rhodothermus, Salinibacter

Hans Reichenbach

(a)

(c)

Hans Reichenbach

(b)

Hans Reichenbach

Les organismes du groupe Cytophaga sont des bacilles longs et fins Gram négatif, à extrémités généralement pointues, mobiles par glissement (voir figure 12.90a, b). Le genre apparenté Sporocytophaga est morphologiquement et physiologiquement identique au genre Cytophaga, mais les cellules forment des structures sphériques quiescentes, les microcystes (voir figure 12.90d), comparables à celles produites lors de la fructification de certaines myxobactéries (voir section 12.17). Ces bactéries sont présentes et parfois très abondantes dans le sol et l’eau. Beaucoup de Cytophaga dégradent des polysaccharides comme la cellulose (voir figure 12.90c), l’agar (voir figure 12.90a), ou la chitine. Les bactéries qui dégradent la cellulose peuvent facilement être isolées en plaçant des particules de sol sur des morceaux de papier-filtre en cellulose disposés sur de l’agar contenant des sels minéraux. Les bactéries dégradent les fibres de cellulose et forment des colonies qui s’étalent (voir figure 12.90c). Les Cytophaga ne produisent pas d’enzymes cellulolytiques (cellulases) extracellulaires et solubles. Leurs cellulases sont fixées à l’enveloppe cellulaire, ce qui explique pourquoi les cellules doivent adhérer aux fibres de cellulose afin de les dégrader. En culture pure, Cytophaga peut se développer sur de l’agar contenant des fibres de cellulose. Les zones d’éclaircissement dues à la dégradation de la cellulose révèlent la présence de ces bactéries (voir figures 12.90c et 17.62). Les espèces des genres Cytophaga et Sporocytophaga sont aérobies strictes et assurent la majeure partie de la dégradation de la cellulose par les procaryotes dans les environnements aérobies. Des espèces du genre Cytophaga sont pathogènes des poissons d’eau douce et peuvent causer des dommages importants dans l’économie du poisson d’élevage. La columnariose, causée par C. columnaris, et la maladie de l’eau froide, causée par C. psychrophila, sont les deux maladies les plus importantes. Ces maladies affectent préférentiellement les poissons en état de stress (poissons vivants dans des eaux polluées, dans des situations de confinement et de forte densité comme lors des éclosions ou des manœuvres en aquaculture). Les poissons infectés présentent des destructions de tissus, souvent près des ouïes, les espèces de Cytophaga isolées de poissons infectés étant fortement protéolytiques. Contrairement aux Cytophaga, les espèces du genre Flexibacter nécessitent des milieux complexes pour se développer et ne sont pas cellulolytiques. Les cellules de Flexibacter présentent différentes morphologies, allant de longs filaments mobiles par glissement à de courts bâtonnets immobiles. De nombreuses espèces sont pigmentées de par la présence de caroténoïdes dans la membrane cytoplasmique, ou de pigments apparentés, les flexirubines, situés dans la membrane externe. Les espèces de Flexibacter sont des saprophytes

Hans Reichenbach

12.31 Cytophaga et apparentés m n

(d)

FIGURE 12.90 Cytophaga et Sporocytophaga. a) Inoculation en strie sur boîte de Petri d’une espèce marine de Cytophaga hydrolysant l’agarose. b) Colonies de Sporocytophaga se développant sur cellulose. Remarquez les zones claires (voir flèches) où la cellulose a été dégradée. c) Observation au microscope à contraste de phase de cellules de C. hutchinsonii développées sur du papier filtre en cellulose (les cellules ont un diamètre d’environ 1,5 µm). d) Observation au microscope à contraste de phase de cellules en forme de bâtonnets et de microcystes sphériques de Sporocytophaga myxococcoides (cellules et microcystes d’environ 0,5 µm et 1,5 µm de diamètre respectivement).




retrouvés dans le sol et les eaux douces et aucune n’a été identifiée comme pathogène.

•

Dans quel environnement naturel pouvez-vous trouver des Bacteroides en abondance ?

Rhodothermus / Salinibacter

•

Décrivez une méthode pour isoler des espèces de Cytophaga d’un environnement naturel.

•

Comparez l’habitat et la physiologie de Rhodothermus et Salinibacter.

X

PHYLUM 10 : LES BACTÉRIES VERTES SULFUREUSES

12.32 Chlorobium et autres bactéries m n vertes sulfureuses Genres principaux : Chlorobium, Chlorobaculum, Prosthecochloris, « Chlorochromatium » Les bactéries vertes sulfureuses forment un groupe phylogénétiquement distinct de bactéries phototrophes anoxygéniques, non mobiles, qui ne contient parmi les isolats cultivés que des espèces anaérobies obligatoires et phototrophes. La diversité morphologique de ce groupe est restreinte et comprend des bacilles courts à longs (voir tableau 12.35 et figure 12.91). Comme les bactéries pourpres sulfureuses, elles utilisent H2S

Norbert Pfennig

Les genres Rhodothermus et Salinibacter appartiennent au phylum Cytophaga, mais ils en sont des parents éloignés. Rhodothermus et Salinibacter sont des bactéries Gram négatif, pigmentées (jaune ou rouge), chimio-organotrophes, aérobies strictes. Rhodothermus est thermophile, avec une température optimale de 60 à 65 °C. La croissance de Rhodothermus est optimale sur des sucres ou des polysaccharides simples et complexes. Rhodothermus est présent dans les sources chaudes marines côtières et a également été détecté dans des sources chaudes terrestres. Rhodothermus produit des enzymes hydrolytiques thermostables d’intérêt biotechnologique, notamment une amylase (dégradation de l’amidon), une cellulase (cellulose), une xylanase (dégradation des hémicelluloses, abondantes dans les parois cellulaires des végétaux). Les bactéries du genre Salinibacter sont des bactéries halophiles extrêmes, probablement les plus tolérantes au sel et les plus exigeantes en sel des bactéries. Les concentrations en sel nécessaires à leur croissance rivalisent avec celles nécessaires aux Archaea halophiles extrêmes, comme Halobacterium (voir section 13.3). La seule espèce connue, Salinibacter ruber, vit dans les étangs de cristallisation des fabriques de sel et autres environnements fortement salés. Salinibacter partage avec Halobacterium la caractéristique d’utiliser l’ion K+ comme soluté compatible, propriété rare chez les halophiles du domaine Bacteria (la plupart des bactéries halophiles synthétisent ou accumulent des solutés organiques pour maintenir l’équilibre en eau dans leur environnement salé, voir section 6.14). À l’inverse de Rhodothermus, qui possède des activités fortement hydrolytiques, Salinibacter se développe de façon optimale en utilisant des acides aminés comme donneurs d’électrons, comme Halobacterium. Ainsi, bien que distincts phylogénétiquement, Halobacterium et Salinibacter présentent une évolution convergente. Les stratégies physiologiques ont convergé vers le même profil, probablement à cause des exigences uniques des environnements extrêmes que ces organismes ont partagés.

(a)

Le groupe des Planctomyces comprend des bactéries appendiculées, bourgeonnantes. Les flavobactéries comprennent un grand nombre de bactéries Gram négatif, mobiles par flagelle ou par glissement, qui sont associées à des animaux, à la nourriture ou au sol. Le groupe des Verrucomicrobia rassemble des bactéries prosthèques. Le groupe des Cytophaga comprend des bactéries chimioorganotrophes aérobies strictes du sol, de l’eau, des sources chaudes et d’environnements chauds. •

Qu’ont de particulier la paroi cellulaire et l’arrangement de l’ADN chez les Planctomyces ?

•

En quoi le pédoncule de Planctomyces diffère-t-il de celui de Caulobacter ?

Norbert Pfennig


(b) FIGURE 12.91 Bactéries vertes sulfureuses phototrophes. a) Chlorobium limicola ; cellules d’environ 0,8 µm de large. Granules de soufre déposés à l’extérieur de la cellule. b) Chlorobium clathratiforme, bactérie formant un réseau tridimensionnel ; cellules d’environ 0,8 µm de large.



412 Chapitre 12


comme donneur d’électrons, l’oxydant en S0 puis en SO42–. Mais, contrairement aux bactéries pourpres sulfureuses, le soufre produit par oxydation des sulfures est déposé à l’extérieur de la cellule (voir figures 12.91a et 17.17b). La plupart des espèces peuvent assimiler quelques composés organiques en présence de lumière (photohétérotrophie, voir section 17.4). Contrairement aux bactéries pourpres, l’autotrophie est assurée non pas par les réactions du cycle de Calvin mais par le cycle inversé de l’acide citrique (voir section 17.7).

périphérie de la cellule et fixés à la membrane cytoplasmique (voir figures 12.92 et 17.7). L’énergie absorbée par les bactériochlorophylles c, d, ou e dans le chlorosome est canalisée vers la bactériochlorophylle a localisée dans la membrane cytoplasmique (voir section 17.2). C’est là que se déroulent la conversion de l’énergie photosynthétique et la synthèse d’ATP (voir figure 17.7). Parmi les bactéries vertes sulfureuses, des espèces de couleur verte et brune sont connues, les espèces brunes contenant la bactériochlorophylle e et des caroténoïdes qui donnent à la cellule une couleur marron (voir figures 12.93 et 17.9). Comme les bactéries pourpres sulfureuses (voir section 12.2), les bactéries vertes sulfureuses se développent dans des milieux aquatiques anoxiques et particulièrement dans des environnements riches en H2S (les bactéries vertes sulfureuses sont de manière générale plus tolérantes au sulfure que les bactéries pourpres). Le chlorosome est une structure particulièrement efficace pour récupérer l’énergie lumineuse, peu de lumière est nécessaire à l’activité photosynthétique des bactéries vertes sulfureuses. Parmi les organismes phototrophes, ce sont ceux que l’on retrouve aux plus grandes profondeurs dans les lacs. Une espèce, Chlorobaculum tepidum (voir figure 12.92), est thermophile et forme des tapis microbiens denses dans les sources chaudes sulfureuses. C. tepidum est également remarquable car son génome (2,1 Mpb) a été le premier génome d’organisme phototrophe anoxygénique entièrement séquencé. C. tepidum croît rapidement et est génétiquement manipulable par conjugaison ou par transformation. C’est devenu l’organisme modèle pour l’étude moléculaire des bactéries vertes sulfureuses.

Pigments et écologie

Le consortium des bactéries vertes sulfureuses

Les bactériochlorophylles des bactéries vertes sulfureuses comprennent la bactériochlorophylle a et une des bactériochlorophylles c, d, ou e. Ces trois derniers pigments capturent les photons (voir section 17.2) et sont localisés dans des chlorosomes (voir figure 12.92). Les chlorosomes sont des corps oblongs, riches en bactériochlorophylles, délimités par une fine membrane monolipidique. Ils sont localisés à la

Certaines bactéries vertes sulfureuses peuvent s’associer avec une bactérie chimio-organotrophe pour former un consortium dont chaque partenaire tire un bénéfice. Ainsi, il existe probablement une grande variété de consortia associant différents organismes phototrophes et chimiotrophes. L’élément phototrophe, ici en position d’épibionte, est fixé aux cellules non phototrophes (voir figure 12.94), mais le mécanisme d’attachement n’est pas élucidé.

TABLEAU 12.35

GENRES ET CARACTÉRISTIQUES DES BACTÉRIES VERTES SULFUREUSES PHOTOTROPHES

Caractéristiques Bâtonnets droits ou incurvés, mobiles ;

Genre/ADN (% G+C) Chlorobium (49-58)

de couleur verte ou marron ; certains contiennent des vésicules gazeuses

Chlorobaculum (56-58)

Sphériques et ovoïdes, non mobiles ; forment des prosthèques ; de couleur verte ou marron

Prosthecochloris (50-56)

Bâtonnets, mobiles par glissement ; de couleur verte

Chloroherpeton (47)

FIGURE 12.92 Observation en microscopie électronique d’une coupe fine de cellule de Chlorobium tepidum, bactérie verte sulfureuse. Notez les chlorosomes (voir flèche) à la périphérie de la cellule. La cellule mesure environ 0,7 µm de large.

(b)

Deborah O. Jung

F. Rudy Turner et Michael T. Madigan

(a)

FIGURE 12.93 Chlorobia verte et brune. Cultures en tube de a) Chlorobium tepidum et b) Chlorobium phaeobacteroides. Les cellules de C. tepidum contiennent de la bactériochlorophylle c et un ensemble de caroténoïdes de couleur verte, alors que les cellules de C. phaeobacteroides contiennent de la bactériochlorophylle e et de l’isorenieratène, un caroténoïde de couleur marron. Voir figure 17.9 les structures particulières des caroténoïdes verts et bruns.



(b)

Charles Abella

(c)

Douglas Caldwell

(a)

Charles Abella

Douglas Caldwell

12.33 Spirochètes 413

(e)

(f)

Jörg Overmann

Jörg Overmann

Jörg Overmann

(d)

(g)

FIGURE 12.94 Consortia de bactéries vertes sulfureuses. a-c) Observation au microscope à contraste de phase et d) observation au microscope électronique à transmission de Chlorochromatium aggregatum ou Pelochromatium roseum, consortia de bactéries vertes ou brunes. Sur les photos (a) à (c), l’organisme central non phototrophe est plus clair que les bactéries phototrophes pigmentées. Remarquez les chlorosomes sur la photo d (voir flèches). Le consortium a un diamètre d’environ 3 µm. e) Observation au microscope à contraste différentiel de cellules de « Chlorochromatium aggregatum ». f,g) Observation au microscope à fluorescence. f) Cellules colorées au DAPI (fixation à l’ADN). g) Même préparation qu’en f, mais hybridation d’une sonde phylogénétique fluorescente ciblant les bactéries vertes

Le nom « Chlorochromatium aggregatum » est utilisé pour décrire un consortium communément observé, même s’il ne repose sur aucune base de taxinomie formelle, puisqu’il se réfère à deux organismes séparés et non un seul. Le consortium « C. aggregatum » est de couleur verte, l’épibionte constitué de bactéries vertes sulfureuses contenant des bactériochlorophylles c ou d et des caroténoïdes de couleur verte entourant une cellule

centrale non phototrophe (voir figure 12.94e). Un organisme de structure similaire, appelé « Pelochromatium roseum », est de couleur brune. Dans d’autres consortia, les cellules épibiontes sont de morphologie vibroïde (voir figure 12.94b, c). Certains consortia ont été cultivés en laboratoire. En moyenne, le consortium « C. aggregatum » contient 12 épibiontes par cellule centrale, alors que le consortium « P. roseum » en contient environ 20. Les chlorosomes sont visibles sur de fines coupes des épibiontes. Ces observations ainsi que des études moléculaires permettent d’affirmer que les épibiontes sont bien des bactéries vertes sulfureuses (voir figure 12.94d). L’hybridation du consortium avec une sonde oligonucléotidique fluorescente spécifique de l’ARNr 16S des bactéries vertes sulfureuses (technique FISH, voir sections 11.7 et 18.4) rend les épibiontes fluorescents, mais pas la cellule centrale (voir figure 12.94f, g). Des études sur les cultures de laboratoire ont également permis de mettre en évidence la division synchronisée des épibiontes et de la cellule centrale, suggérant une communication intercellulaire entre les partenaires. Le pourquoi et le comment de ces associations ne sont pas totalement élucidés. Selon des études de laboratoire et de terrain, les épibiontes du consortium seraient adaptés à une gamme étroite d’intensité lumineuse et de concentrations en sulfure. La cellule centrale permettrait aux phototrophes non mobiles de se positionner dans la colonne d’eau pour une photosynthèse optimale. La cellule centrale bénéficierait de cet arrangement en disposant de nutriments synthétisés lors de la photosynthèse et excrétés par les bactéries vertes sulfureuses.

Contrôlez vos acquis Les bactéries vertes sulfureuses sont des phototrophes anoxygéniques anaérobies stricts qui contiennent des structures particulières, les chlorosomes. Ces organismes se développent à de très faibles intensités lumineuses et oxydent le H2S en S0 et SO42–. Des consortia associant des bactéries vertes phototrophes et une cellule centrale non phototrophe se forment dans les environnements aquatiques sulfureux. •

Quels pigments le chlorosome contient-il ?

•

Qu’a de particulier l’autotrophie chez les bactéries vertes sulfureuses ?

•

Quels arguments permettent d’affirmer que les épibiontes des consortia de bactéries vertes sont réellement des bactéries vertes sulfureuses ?

XI

PHYLUM 11 : SPIROCHÈTES

12.33 Spirochètes m n Genres principaux : Spirochaeta, Treponema, Cristispira, Leptospira, Borrelia Les spirochètes sont des bactéries Gram négatif, mobiles, fines en forme d’hélice souple (voir figure 12.95). Ces procaryotes à la




E. Canale-Parola

E. Canale-Parola

414 Chapitre 12

(b)

(a)

FIGURE 12.95 Morphologie des spirochètes. Deux spirochètes observés au même grossissement, illustrant la large gamme de taille des bactéries de ce groupe. a) Spirochaeta stenostrepta, en microscopie de contraste de phase. La cellule a un diamètre de 0,25 µm. b) Spirochaeta plicatilis. La cellule a un diamètre de 0,75 µm et peut atteindre une longueur de 250 µm (0,25 mm).

morphologie particulière forment une division phylogénétique majeure dans le domaine des bactéries (voir figure 12.1). Les spirochètes sont répandus dans les environnements aquatiques et chez les animaux. Certains sont à l’origine de maladies comme la syphilis, maladie sexuellement transmissible chez l’homme (voir section 26.12). Le corps cylindrique protoplasmique, qui contient le cytoplasme et le nucléoïde, est délimité par une membrane plasmique et une paroi (voir figure 12.96) et correspond au corps de la cellule. L’appareil locomoteur est interne. Il est composé d’un à de très nombreux flagelles qui s’insèrent, par l’une de leurs extrémités, à un pôle du cylindre protoplasmique. Ces flagelles longent le cylindre protoplasmique en restant localisés dans le périplasme de la cellule, d’où leur appelation, les endoflagelles. Une membrane flexible composée de différents feuillets, le manteau externe, entoure les endoflagelles et le cylindre protoplasmique.

La mobilité des spirochètes La mobilité des spirochètes est particulière. Chaque endoflagelle est ancré à une extrémité de la cellule et court sur les deux tiers de la longueur du cylindre protoplasmique. Les endoflagelles ont un mouvement de rotation, de la même façon que les flagelles chez les autres bactéries (voir section 4.14). Cependant, le cylindre protoplasmique étant rigide, alors que le manteau extérieur est flexible, quand les endoflagelles des deux extrémités tournent dans le même sens, le cylindre protoplasmique tourne à l’opposé, générant

une torsion de la cellule (voir figure 12.96b). Cela confère aux spirochètes une mobilité par flexion, ou par reptation, de par le couple exercé à chaque extrémité du cylindre protoplasmique par les endoflagelles en rotation (voir figure 12.96b). Bien que non externalisés, les flagelles confèrent donc une mobilité aux cellules, de façon plus irrégulière et plus saccadée que chez les autres procaryotes.

Classification Les spirochètes sont répartis en huit genres, sur la base de l’habitat, de la pathogénicité, des caractères morphologiques et physiologiques. Les principaux genres et leurs caractéristiques sont listés dans le tableau 12.36.

Spirochaeta et Cristispira Le genre Spirochaeta regroupe des spirochètes anaérobies et aérobies facultatifs, vivant à l’état libre dans la nature. Ces organismes sont retrouvés dans les environnements aquatiques, comme les eaux et vases des rivières, étangs, lacs ou océans. S. plicatilis (voir figure 12.95b) est un représentant relativement long du genre Spirochaeta retrouvé dans les eaux douces et marines contenant de l’H2S. Les flagelles de S. plicatilis sont arrangés en une touffe qui court autour du cylindre protoplasmique torsadé. 18 à 20 flagelles sont insérés à chaque pôle de ce spirochète. La figure 12.95a représente une autre espèce, Spirochaeta stenostrepta, qui a été cultivée en laboratoire. Anaérobie stricte, elle est retrouvée dans les boues noires riches en

Endoflagelle (rigide, tournant, ancré à une extrémité du cylindre protoplasmique)

Endoflagelle

Manteau externe (souple)

Cylindre protoplasmique

E. Canale-Parola

Manteau externe

(a)

(b)

Cylindre protoplasmique (rigide, généralement hélicoïdal)

FIGURE 12.96 Mobilité chez les spirochètes. a) Observation au microscope électronique d’une préparation de Spirochaeta zuelzerae colorée négativement, mettant en évidence la localisation de l’endoflagelle. La cellule a un diamètre d’environ 0,3 µm. b) Coupe d’une cellule de spirochète montrant l’arrangement du cylindre protoplasmique, des endoflagelles, du manteau externe et la manière dont la rotation de l’endoflagelle rigide peut en engendrer une du cylindre protoplasmique et une autre (dans le sens opposé) du manteau externe. Si le manteau est libre, la cellule va tourner selon son axe longitudinal et va avancer selon cet axe. Si le manteau est en contact avec une surface solide, la cellule aura un mouvement de reptation.




TABLEAU 12.36

GENRES ET CARACTÉRISTIQUES DES SPIROCHÈTES

Genre

Dimensions (µm)

Caractéristiques générales

Nombre d’endoflagelles

ADN (% G+C)

Habitat

Maladies

Cristispira

30-150 × 0,5-3,0

3 à 10 spires ; touffe d’endoflagelles visible au microscope à contraste de phase

>100

–

Tube digestif des mollusques ; non cultivée

Aucune connue

Spirochaeta

5-250 × 0,2-0,75

Anaérobie ou aérobie facultatif ; spirale serrée ou lâche

2–40

50–65

Aquatique libre, eaux douces, eaux salées

Aucune connue

Treponema

5-15 × 0,1-0,4

Microaérophile ou anaérobie ; amplitude hélicoïdale jusqu’à 0,5 µm

2–32

25-53

Commensal ou parasite de l’homme et de l’animal

Syphilis, pian, dysenterie du porc, caratée

Borrelia

8-30 × 0,2-0,5

Microaérophile ; 5 à 7 spires d’une amplitude d’environ 1 µm

7–20

46

Homme et autres mammifères, arthropodes

Fièvre récurrente, maladie de Lyme, borreliose bovine et ovine

Leptospira

6-20 × 0,1

Aérobie, spirale fine et serrée, aux extrêmités courbées ou en crochet ; requiert des acides gras à longue chaîne

2

33–43

Libre ou parasite de l’homme et autres mammifères

Leptospirose

Leptonema

6-20 × 0,1

Aérobie ; ne requiert pas d’acides gras à longue chaîne

2

54

Libre

Aucune connue

Brachyspira

7-10 × 0,35-0,45

Anaérobie

8–28

25–27

Intestin des animaux à sang chaud

Diarrhée chez le poulet et le porc

Brevinema

4-5 × 0,2-0,3

Microaérophile, sur la base des séquences d’ARNr 16S forme une branche profonde dans la lignée des spirochètes (voir figure 12.1)

2

34–36

Sang et tissus de souris et de musaraignes

Contagieux pour les souris de laboratoire

H2S. S. stenostrepta fermente les sucres par la voie glycolytique, produisant de l’éthanol, de l’acétate, du lactate, du CO2 et du dihydrogène. L’espèce Spirochaeta aurantia est une bactérie pigmentée orange, aérobie facultative, fermentant les sucres via la glycolyse en anaérobiose et oxydant les sucres en CO2 et acétate en aérobiose. Les bactéries du genre Cristispira (voir figure 12.97) ont pour habitat unique le stylet cristallin de certains mollusques comme les palourdes ou les huîtres. Le stylet cristallin est une tige flexible semi-rigide située dans une poche close qui, par ses mouvements de rotation contre une paroi dure de l’appareil digestif, entraîne le mélange et l’écrasement des petites particules alimentaires. Au microscope, les Cristispira sont facilement identifiables au sein du stylet cristallin, de par leur mouvement de rotation rapide d’avant en arrière, à la façon d’un tire-bouchon. Les Cristispira se retrouvent chez certains mollusques d’eau douce et chez certains mollusques marins. Les bactéries du genre Cristispira n’ont pu être cultivées, les raisons physiologiques à cette restriction d’habitat restent inconnues.

Treponema Le genre Treponema comprend des spirochètes anaérobies, commensaux ou parasites de l’homme et de l’animal. Treponema pallidum, agent de la syphilis (voir section 26.12), est l’espèce la plus connue. Sa morphologie diffère de celle des autres spirochètes ; la cellule n’est pas hélicoïdale mais en forme de vague plate. La cellule de T. pallidum est particulièrement fine, avec un diamètre de seulement 0,2 µm. La microscopie à fond noir a donc été longtemps utilisée pour examiner les exsudats de lésions supposées syphilitiques (voir figure 26.28). Dans la nature, T. pallidum a pour unique hôte l’être humain, même si des infections artificielles ont été réalisées chez le lapin ou le singe. T. pallidum n’a jamais été cultivée en laboratoire, mais des études sur animaux ont permis d’établir que des cellules virulentes (purifiées à partir de lapins infectés) contiennent un système de cytochrome et sont de fait microaérophiles. Le génome de T. pallidum (1,14 Mpb) a été séquencé à partir d’ADN extrait de ces cellules virulentes (voir section 15.3).



416 Chapitre 12


A. Ryter

B. J. Paster et E. Canale-Parola

Endoflagelles

D’autres espèces du genre Treponema sont commensales de l’homme et se retrouvent particulièrement dans la cavité buccale. Elles peuvent être observées dans des échantillons prélevés entre les dents ou entre les dents et la gencive. Treponema denticola est un tréponème majeur de la cavité buccale ; il fermente des acides aminés comme la cystéine et la sérine, formant de l’acétate par fermentation acide, ainsi que du CO2, du NH3 et de l’H2S. Des espèces du genre Treponema présentant un métabolisme inhabituel ont été isolées de tubes digestifs de termites. Les termites vivant principalement sur le bois, cet environnement est fortement cellulolytique. La fermentation du glucose issu de la cellulose génère la production de H2 et de CO2. Treponema primitia convertit H2 et CO2 en acétate, ce qui en fait un homoacétogène (voir section 17.16 pour l’homoacétogénèse). C’est la première mise en évidence de cette forme de métabolisme énergétique dans un groupe phylogénétique bactérien en dehors des Clostridia et apparentés (voir section 12.20). En outre, Treponema azotonutricium, spirochète du tube digestif du termite, fixe l’azote moléculaire (fixation de N2, voir section 17.28), propriété jamais observée au préalable chez les spirochètes. Les spirochètes sont également présents dans le rumen, organe digestif des animaux ruminants (voir section 19.11). Treponema saccharophilum (voir figure 12.98) est un long spirochète pectinolytique du rumen. Anaérobie strict, ce microorganisme fermente la pectine, l’amidon, l’inuline et autres polysaccharides végétaux. Les spirochètes du rumen, dont T. saccharophilum, pourraient jouer un rôle important dans la conversion des polysaccharides des végétaux en acides gras volatiles, utilisables comme source d’énergie par les ruminants (voir section 19.11). Le genre Treponema est une unité phylogénétique, mais sur la base du ratio en bases G+C de l’ADN génomique, T. pallidum pourrait être éloigné des autres espèces de tréponèmes. Son ratio en bases G+C se situe en effet autour de 53 %, contre 38 à 40 %, voire 25 % pour les autres espèces.

Borrelia La majorité des espèces du genre Borrelia sont pathogènes pour l’homme ou l’animal. Borrelia recurrentis est l’agent de la fièvre récurrente chez l’homme et l’animal, et se transmet via un insecte vecteur, généralement le pou du corps. La fièvre récurrente se caractérise par une forte fièvre et des douleurs

(a) Susan Koval et George Chaconas

FIGURE 12.97 Cristispira. Observation au microscope électronique d’une coupe fine de Cristispira, un long spirochète. La cellule a un diamètre d’environ 2 µm. Notez le grand nombre d’endoflagelles.

(b) FIGURE 12.98 Treponema et Borrelia. a) Observation au microscope à contraste de phase de Treponema saccharophilum, spirochète pectinolytique du rumen bovin. La cellule a un diamètre d’environ 0,4 µm. À gauche, cellules en forme de spirale régulière ; à droite, cellules en forme de spirale irrégulière. b) Observation au microscope à balayage électronique de Borrelia burgdorferii, agent de la maladie de Lyme.

musculaires généralisées sur une période de 3 à 7 jours, suivie d’une période de rémission de 7 à 9 jours. En l’absence de traitement, la fièvre réapparaît. Deux ou trois cycles de phase fébrile suivie de phase apyrétique se succèdent (d’où le nom de fièvre récurrente), et provoquent la mort de 40 % des personnes infectées. B. recurrentis est sensible à la tétracycline, et si la maladie est correctement diagnostiquée, le traitement est efficace. D’autres Borrelia provoquent des maladies chez le bétail, les moutons, les chevaux et les oiseaux. Pour la plupart de ces maladies, l’agent est transmis par des tiques.

Leptospira et Leptonema Les genres Leptospira et Leptonema comprennent des spirochètes aérobies stricts utilisant des acides gras à longue chaîne (acide oléique par exemple) comme donneurs d’électrons et comme source de carbone. À quelques exceptions près, ce sont les seuls substrats utilisés par les leptospires pour leur croissance. La cellule de leptospire est mince, en forme d’hélice fine, et généralement coudée à chaque extrémité en un crochet semi-circulaire. Ce genre regroupe des espèces libres et des espèces parasites. Les deux espèces majeures sont Leptospira interrogans (parasite) et L. biflexa (libre). Les souches de L. interrogans sont parasites de l’homme ou de l’animal. Les hôtes naturels sont les rongeurs, même si les chiens et les cochons sont porteurs de certaines souches. Chez l’homme, la leptospirose est le syndrome le plus courant causé par les leptospires. Les leptospires pénètrent dans




l’organisme par les membranes des muqueuses ou via des lésions cutanées. Après une étape transitoire de multiplication dans diverses parties du corps, le leptospire se localise dans le rein et le foie et est à l’origine de néphrites et de jaunisses. Les leptospires présents dans le rein causent des défaillances rénales pouvant entraîner la mort de l’individu. Le micro-organisme est éliminé de l’organisme par les urines, et l’infection d’un autre individu se fait par contact avec l’urine contaminée. Une thérapie à base de pénicilline, de streptomycine ou de tétracycline existe, mais un long traitement est nécessaire pour assurer l’élimination complète des leptospires du rein. Les animaux domestiques comme le chien sont vaccinés contre la leptospirose dans le vaccin combiné maladie de Carré-leptospirose-hépatite. Chez l’homme, la prévention passe par l’élimination de la maladie chez les animaux.

Contrôlez vos acquis Les spirochètes sont des procaryotes finement torsadés, hélicoïdaux, mobiles, libres ou parasites pathogènes. •

Comparez le fonctionnement de l’endoflagelle des spirochètes avec celui des flagelles d’Escherichia coli en termes de structure et de fonction.

•

Citez deux maladies humaines causées par des spirochètes.

•

Quel est l’habitat du spirochète Cristispira ?

XII

PHYLUM 12 : DEINOCOCCI

12.34 Deinococcus / Thermus m n Genres principaux : Deinococcus, Thermus Ce phylum ne contient que quelques genres, les mieux étudiés étant Deinococcus et Thermus. Ce dernier comprend des bactéries chimio-organotrophes thermophiles dont Thermus aquaticus, organisme dont est issue la Taq DNA polymérase. De par sa thermostabilité, cette enzyme est la plus utilisée pour amplifier l’ADN par PCR (Polymerase Chain Reaction) (voir section 7.9). La coloration de Gram est négative chez ces bactéries qui contiennent une forme rare de peptidoglycane dans laquelle l’ornithine remplace l’acide diaminopimélique dans les chaînons peptidiques reliés aux acides muramiques (voir section 4.8). Un certain nombre d’espèces des genres Thermus et Deinococcus ont été décrites. Elles se développent en aérobiose grâce au catabolisme des sucres, d’acides aminés ou d’acides organiques, ou de divers mélanges complexes. Quatre espèces Gram positif forment le genre Deinococcus, D. radiodurans étant l’espèce la mieux étudiée. La structure de la paroi cellulaire de D. radiodurans est complexe, composée de plusieurs couches incluant une membrane externe (voir figure 12.99), membrane habituellement présente uniquement chez les bactéries Gram négatif (voir section 4.9). Cependant, contrairement à la membrane des bactéries Gram négatif comme

E. coli, la membrane externe de D. radiodurans ne contient pas de lipide A. Cet organisme est présent dans le sol et peut également être isolé à partir de particules de poussière.

La résistance aux radiations de Deinococcus radiodurans Les espèces de Deinococci sont généralement de couleur rouge ou rose (présence de caroténoïdes). De nombreuses souches sont très résistantes aux radiations UV et à la dessiccation. La résistance aux radiations est un critère d’isolement. Ces organismes peuvent être isolés de sol, de viande hachée, de poussière et d’air filtré après exposition de l’échantillon aux UV (ou même à des rayons gamma) et étalement sur un milieu riche contenant de la tryptone et de l’extrait de levure. De nombreuses souches de Deinococcus radiodurans étant bien plus résistantes aux radiations que les endospores bactériennes, le traitement d’un échantillon avec de fortes doses de radiations élimine les bactéries autres que D. radiodurans. L’isolement de D. radiodurans est donc particulièrement efficace. Les cellules de D. radiodurans peuvent survivre à une exposition de 15 000 grays (Gy) de radiation ionisante (1 Gy = 100 rad), dose suffisante pour couper l’ADN d’un organisme en centaines de fragments (une exposition de 10 Gy peut être létale pour l’homme). En plus de cette impressionnante résistance aux radiations, D. radiodurans est également résistant à de nombreux autres agents mutagènes. Les agents mutagènes comme la nitrosoguanidine, qui tend à induire des délétions dans l’ADN, semblent être les seuls efficaces chez D. radiodurans. Les délétions seraient réparées moins efficacement que les points de mutation, et des mutants de D. radiodurans peuvent être sélectionnés de cette façon. Des études ont révélé l’extrême efficacité du système de réparation d’ADN endommagé chez D. radiodurans. En plus de l’enzyme RecA (voir section 10.6), D. radiodurans possède plusieurs systèmes de réparation d’ADN RecA-indépendants qui peuvent réparer des coupures dans l’ADN simple ou double brin, et exciser et réparer des bases non correctement appariées. Ce système est si efficace que le chromosome fragmenté peut être réassemblé. L’arrangement particulier de l’ADN de D. radiodurans joue probablement un rôle dans cette résistance aux radiations. Les cellules de D. radiodurans sont toujours groupées, par paire ou en tétrade (voir figure 12.99a). Au lieu d’être dispersé, l’ADN de D. radiodurans est organisé en structure torique (voir figure 12.99c). Les réparations sont facilitées par la fusion de nucléotides de compartiments adjacents (recombinaison homologue). Un seul chromosome résulte de ces mécanismes de recombinaison, et la cellule contenant ce chromosome peut à nouveau se diviser.

XIII

PHYLUM 13 : LES BACTÉRIES VERTES NON SULFUREUSES

Ce phylum des Bacteria est phylogénétiquement distinct et contient seulement quelques genres, le plus connu étant le phototrophe anoxygénique Chloroflexus. Tous les exemplaires cultivés sont thermophiles. Thermomicrobium est un membre



418 Chapitre 12


R. G. E. Murray

chimiotrophe de ce groupe, bacille Gram négatif strictement aérobie, se développant optimalement à 75 °C sur milieu complexe. Outre sa position phylogénétique, Thermomicrobium est aussi intéressant par ses lipides membranaires. Tous les lipides des Bacteria et des Eukarya contiennent des acides gras reliés au glycérol par des liaisons ester (voir sections 3.4 et 4.5). Au contraire, les lipides de Thermomicrobium contiennent des 1,2-dialcools à la place du glycérol, et ne possèdent ni liaison ester, ni liaison éther (voir figure 12.100). De plus, les cellules de Thermomicrobium sont inhabituelles chez les Bacteria en ce sens qu’elles sont dépourvues de peptidoglycane, le polymère pariétal signature de ce domaine de procaryotes (voir section 11.9).

(a)

R. G. E. Murray

Membrane externe Peptidoglycane Membrane cytoplasmique

(b)

12.35 Chloroflexus et genres m n apparentés Genres principaux : Chloroflexus, Heliothrix, Roseiflexus Chloroflexus et la plupart des autres bactéries vertes non sulfureuses (ainsi nommées en raison de la physiologie de Chloroflexus) sont des procaryotes filamenteux qui, avec les cyanobactéries, forment des tapis microbiens dans des sources chaudes à pH neutre à alcalin (voir figures 12.101 et 18.18a). Des organismes de type Chloroflexus ont aussi été trouvés dans des tapis microbiens marins. Bien que ce soit un phototrophe anoxygénique, Chloroflexus est un phototrophe « hybride » en ce sens que son mécanisme de photosynthèse montre des caractéristiques typiques, à la fois des bactéries pourpres et des bactéries vertes sulfureuses. Comme ces dernières, Chloroflexus contient de la bactériochlorophylle c et des chlorosomes (voir figure 19.92). Cependant, la bactériochlorophylle a localisée dans les membranes cytoplasmiques des cellules de Chloroflexus est agencée pour

—

OH

—

CH3

OH

(a)

——

OH

CH3 H3C

——

Extérieur OH

Intérieur OH

OH

Abraham Minsky

Membrane

(c) FIGURE 12.99 Deinococcus radiodurans, coque résistant aux radiations. La cellule individuelle a un diamètre d’environ 2,5 µm. a) Observation au microscope électronique à transmission de D. radiodurans. Remarquez l’épaisseur de la membrane externe. b) Observation (fort grossissement) de la paroi. c) Observation au microscope électronique à transmission de cellules colorées de D. radiodurans pour mettre en évidence la morphologie torique du nucléoïde (en vert).

(b) FIGURE 12.100 Lipides particuliers de Thermomicrobium. a) Les lipides membranaires de T. roseum contiennent des diols à longue chaîne comme ceux représentés ici (13-méthyl-1,2 nonadécanédiol). Notez que, contrairement aux lipides des autres Bacteria et Archaea (voir section 4.5), il n’existe pas de chaîne latérale avec des liaisons ester ou éther. b) Pour former une membrane bicouche, les molécules de dialcool s’opposent vraisemblablement au niveau des groupes méthyles, les groupements -OH constituant les surfaces hydrophiles internes et externes. De petites quantités de diols possèdent des acides gras estérifiés sur le groupement –OH secondaire (en rouge) tandis que le groupement –OH primaire (en vert) peut se lier à une molécule hydrophile comme le phosphate.




former un centre réactionnel structurellement identique à ceux des bactéries pourpres (au contraire, le centre réactionnel des bactéries vertes sulfureuses est structurellement assez différent, voir figure 17.18). En raison de sa position phylogénétique et de son mécanisme unique d’autotrophie (voir ci-dessous), il est possible que Chloroflexus soit un vestige d’une forme primitive de phototrophe qui a peut-être développé le premier un centre réactionnel de la photosynthèse, et ensuite reçu des gènes spécifiques au chlorosome par transfert latéral. D’un point de vue phylogénétique, Chloroflexus est clairement le plus ancien phototrophe connu (voir figure 12.1).

La physiologie de Chloroflexus Sur le plan physiologique, Chloroflexus ressemble aux bactéries pourpres non sulfureuses car la photo-autotrophie est possible. En revanche, la croissance en photo-autotrophie est meilleure quand des composés organiques sont ajoutés comme source de carbone (photohétérotrophie). Chloroflexus croît également bien à l’obscurité, en tant que chimio-organotrophe, par respiration aérobie. De manière intéressante, et ceci doit être considéré par référence au fait que Chloroflexus est probablement le plus ancien des phototrophes anoxygéniques (voir figure 12.1), l’autotrophie chez Chloroflexus est basée sur une voie d’incorporation du CO2 particulière, la voie de l’hydroxypropionate, trouvée uniquement chez cet organisme et quelques autres organismes phylogénétiquement « anciens ». La biochimie de cette voie est présentée dans la section 17.7.

M. T. Madigan

V. M. Gorlenko

Les autres bactéries vertes non sulfureuses

Charles A. Abella

Deborah O. Jung

(b)

(a)

(c)

(d)

FIGURE 12.101 Bactéries vertes non sulfureuses. a) Image en microscopie à contraste de phase du phototrophe thermophile Chloroflexus aurantiacus. Les cellules mesurent environ 1 µm de diamètre. b) Image en microscopie à contraste de phase du phototrophe de grande taille Oscillochloris. Les cellules mesurent environ 5 µm de large. La partie très brillante est un crampon utilisé pour l’attachement. c) Image couleur en microscopie de filaments de Chloronema, se développant dans un lac stratifié. Ces cellules de Chloronema sont des filaments ondulants, d’un diamètre d’environ 2,5 µm. d) Tubes de culture de Chloroflexus aurantiacus (à droite) et Roseiflexus (à gauche). Roseiflexus ne possède pas de bactériochlorophylle c, ni de chlorosome (voir section 17.2 et figure 17.7), et n’a donc pas la couleur verte de Chloroflexus.

Outre Chloroflexus, il existe d’autres bactéries vertes phototrophes non sulfureuses dont le thermophile Heliothrix et les mésophiles de grande taille Oscillochloris (voir figure 12.101b) et Chloronema (voir figure 12.101c). Oscillochloris et Chloronema sont assez atypiques car il s’agit de cellules assez grandes, 2 à 5 µm de large, pouvant atteindre plusieurs centaines de microns de long (voir figure 12.101c). Ces deux organismes vivent dans les lacs d’eau douce contenant de faibles concentrations en sulfure, avec d’autres espèces de bactéries vertes et pourpres sulfureuses. Deux genres de bactéries vertes non sulfureuses diffèrent énormément de Chloroflexus. Roseiflexus et Heliothrix ne possèdent ni bactériochlorophylle c ni chlorosome, et ressemblent davantage aux bactéries pourpres phototrophes (voir section 12.2) qu’à Chloroflexus. Malgré ces différences pigmentaires, Chloroflexus, Roseiflexus et Heliothrix possèdent des points communs, dont une morphologie filamenteuse et un mode de vie thermophile. Si Chloroflexus a obtenu les gènes des chlorosomes et la possibilité de synthétiser la bactériochlorophylle c par transfert latéral à partir des bactéries vertes sulfureuses, comme cela est suspecté, Chloroflexus et Roseiflexus seraient alors phylogénétiquement indiscernables. Heliothrix n’a pas été obtenu en culture pure, mais Roseiflexus est cultivé. Les cellules de cette espèce sont filamenteuses et les cultures ont une couleur jaune / orange, en raison de la présence abondante de pigments caroténoïdes (voir figure 12.101d).

Contrôlez vos acquis Deinococcus et Chloroflexus sont chacun un genre clé représentatif de deux lignées distinctes des Bacteria. Deinococcus radiodurans est l’organisme le plus radiorésistant connu, et Chloroflexus est un phototrophe anoxygénique possédant des propriétés caractéristiques à la fois des bactéries vertes et des bactéries pourpres. •

Comment Deinococcus radiodurans évite d’être tué par de fortes doses d’irradiation ?



420 Chapitre 12


•

En quoi Chloroflexus et Roseiflexus ressemblent à un organisme comme Chlorobium ? À un organisme comme Rhodobacter ?

•

Quelle est la caractéristique unique de Thermomicrobium ?

XIV

PHYLA 14 ET 16

12.36 Thermotoga m n et Thermodesulfobacterium Genres principaux : Thermotoga, Thermodesulfobacterium

Thermodesulfobacterium Thermodesulfobacterium (voir figure 12.103a) est une bactérie thermophile, réduisant les sulfates, positionnée sur l’arbre phylogénétique comme un phylum distinct entre Thermotoga et Aquifex (voir figure 12.1). Même si Thermodesulfobacterium n’est pas véritablement hyperthermophile, puisque sa température optimale de croissance est seulement de 70 °C, c’est la plus thermophile de toutes les Bacteria réduisant le sulfate (l’Archaea Archaeoglobus réduisant les sulfates est un vrai hyperthermophile, voir section 13.7). Comme d’autres réducteurs de sulfate du « groupe I » (voir section 12.18), Thermodesulfobacterium, anaérobie strict, ne peut pas utiliser l’acétate comme donneur d’électrons pour son métabolisme énergétique, mais utilise des composés comme le lactate, le pyruvate et l’éthanol, réduisant le SO42– en H2S. Une caractéristique biochimique inhabituelle d’espèces de Thermodesulfobacterium est la présence de lipides avec des

R. Rachel et K. O. Stetter

Thermotoga est un bâtonnet hyperthermophile capable de croître à 90 °C (optimum, 80 °C). Les cellules de Thermotoga sont dotées d’une enveloppe semblable à un manchon (la « toge », voir figure 12.102a), elles sont Gram négatif et non sporulantes. Thermotoga est anaérobie, chimio-organotrophe et pratique la fermentation, catabolisant les sucres et les polymères comme l’amidon, et produisant du lactate, de l’acétate, du CO2 et de l’H2 comme produits de fermentation. Ce micro-organisme peut aussi croître par respiration anaérobie en utilisant l’H2 comme donneur d’électrons et le fer ferrique (Fe3+) comme accepteur d’électrons. Les espèces de Thermotoga ont été isolées de sources chaudes terrestres, comme de sources hydrothermales marines.

Le génome de Thermotoga a été entièrement séquencé, et de façon intéressante, ce micro-organisme contient beaucoup de gènes archaéens. En fait, plus de 20 % des gènes de Thermotoga proviennent probablement d’espèces hyperthermophiles d’Archaea via des transferts horizontaux (voir section 15.8). Dans son habitat très chaud, où beaucoup d’Archaea évoluent, Thermotoga a pu « subir » un large échange latéral de gènes avec des espèces d’Archaea. Certains de ces gènes « prélevés » ont pu être utiles pour survivre dans ces conditions extrêmes. Bien que quelques gènes de type archaéen aient été identifiés dans les génomes d’autres Bacteria et vice versa, jusqu’ici, c’est seulement chez Thermotoga qu’un transfert latéral de gènes à si grande échelle a pu être mis en évidence entre domaines.

Fritz Widdel


(a)

(a) Liaison éther

CH3 H2C—O HC—O

(b)

H2C—R

FIGURE 12.102 Bactéries hyperthermophiles. a) Thermotoga maritima, température optimale de 80 °C. Notez la membrane cellulaire externe couvrant la cellule (la « toge »). b) Aquifex pyrophilus, température optimale de 85 °C. Les cellules de Thermotoga (coupe fine) mesurent 0,6 × 3,5 µm ; les cellules d'Aquifex (image au microscope électronique par cryofracture) mesurent 0,5 × 2,5 µm. Thermotoga et Aquifex forment leurs propres lignées phylogénétiques sur l'arbre des Bacteria (voir figure 12.1).

CH3 Résidu hydrophile

(b) FIGURE 12.103 Thermodesulfobacterium. a) Image au microscope à contraste de phase de cellules de T. mobile. b) Structure d’un des lipides de T. mobile. Notez que, bien qu’il y ait des liaisons éther, les deux chaînes latérales hydrophobes ne sont pas des unités de phytanyle comme chez les Archaea (voir section 4.5). La désignation R signifie résidu hydrophile, comme un groupe phosphate.




liaisons éther. Rappelez-vous que ces derniers sont une signature des Archaea et qu’une chaîne hydrocarbonée isoprénique en C20 (phytanyl) remplace les acides gras au niveau des chaînes latérales dans les lipides archaéens (voir sections 4.5 et 11.9). Les lipides à liaison éther chez Thermodesulfobacterium sont inhabituels car les chaînes latérales liées au glycérol ne sont pas des groupes phytanyl, comme elles le sont chez les Archaea (voir section 4.5), mais sont composées d’une chaîne hydrocarbonnée en C17 unique avec des acides gras (voir figure 12.103b). Nous avons vu avec Thermodesulfobacterium à la fois une lignée phylogénétique ancienne et un profil lipidique combinant à la fois des caractéristiques d’Archaea et de Bacteria (voir figure 12.103b). Comme pour Thermotoga, il s’agit peut-être ici d’un autre cas de flux latéral de gène des Archaea vers les Bacteria. Cependant, la bactérie Gram positif, Ammonifex, un membre thermophile à faible % G+C, qui est anaérobie et croît par une oxydation de l’H2 couplée à une réduction du NO3– en NH3, contient aussi des lipides comme ceux de Thermodesulfobacterium. Les lipides avec des liaisons éther pourraient être plus fréquents parmi les Bacteria que ce que l’on supposait jusqu’alors.

sont chimiolithotrophes (H2), couplé avec le fait qu’ils branchent comme des lignées très anciennes sur leurs arbres phylogénétiques respectifs (voir figures 11.13, 12.1 et 13.1), suggèrent que l’H2 était un donneur d’électrons clef pour les organismes dans les conditions de la Terre primitive (voir section 13.13). Un modèle simple utilisant de l’H2 pour générer une force proton motrice et, par conséquent, une énergie utilisable comme l’ATP, est montré figure 11.6.

Thermocrinis Thermocrinis (voir figure 12.104) est apparenté à Aquifex et Hydrogenobacter. Ce micro-organisme est hyperthermophile (optimum de température, 80 °C), chimiolithotrophe capable d’oxyder l’H2, le thiosulfate ou le soufre comme donneurs d’électrons, avec l’O2 comme accepteur d’électrons. Thermocrinis ruber, la seule espèce connue, croît à la sortie de certaines sources chaudes du Parc national de Yellowstone, où elle forme de longs « filaments » roses consistant en une forme filamenteuse de cellules attachées à des agglomérats siliceux (voir figure 12.104a). Dans une culture statique, les cellules de T. ruber se développent en

12.37 Aquifex, Thermocrinis et genres m n apparentés

(a)


Les membres du genre Aquifex (voir figure 12.102b) sont hyperthermophiles, chimiolithotrophes et autotrophes obligatoires et sont les Bacteria les plus thermophiles connues. Diverses espèces d’Aquifex utilisent l’H2, le S0, ou le S2O32– comme donneurs d’électrons et l’O2 ou le NO3– comme accepteurs d’électrons. La température maximale de croissance d’Aquifex est de 95 °C (optimum, 85 °C). Seules de très faibles concentrations en O2 sont tolérées par Aquifex qui est néanmoins (avec quelques autres espèces d’Archaea, voir sections 13.5 et 13.9) l’un des quelques hyperthermophiles aérobies (ou plus exactement, microaérophiles) connus. Des études nutritionnelles menées sur des espèces d’Aquifex ont montré qu’elles sont totalement incapables de croître chimio-organotrophiquement sur des composés organiques, incluant des mélanges complexes comme des extraits de levure ou de viande. Hydrogenobacter, apparenté à Aquifex, présente la plupart des mêmes propriétés qu’Aquifex, mais est aérobie obligatoire. L’autotrophie chez Aquifex est réalisée par des enzymes du cycle inverse de l’acide citrique, une série de réactions retrouvées jusqu’alors uniquement chez les bactéries vertes sulfureuses (voir sections 12.32 et 17.7) du domaine des Bacteria. La séquence complète du génome d’Aquifex aeolicus a été déterminée (voir section 15.3), et son type nutritionnel entièrement chimiolithotrophe/autotrophe est codé par un génome étonnamment petit de seulement 1,55 Mpb (un tiers de la taille du génome d’E. coli). Ce fait a été discuté précédemment dans la section 11.2 sur les propriétés physiologiques des formes de vie primitives. La découverte que tant d’hyperthermophiles – à la fois des espèces d’Archaea et de Bacteria comme Aquifex –

Michael T. Madigan

Genres principaux : Aquifex, Thermocrinis

(b) FIGURE 12.104 Thermocrinis. a) Cellules de Thermocrinis ruber se développant sous la forme de filaments attachés à un agglomérat siliceux à la sortie de la source Octopus, Lower Geyser Basin, dans le parc national de Yellowstone (États-Unis). La couleur rose est due à un pigment caroténoïde. b) Image au microscope électronique de cellules en forme de bâtonnets de T. ruber se développant sur un verre recouvert de silicium. Les structures comme des cheveux sont du silicium. Une cellule de T. ruber mesure environ 0,4 µm de diamètre et de 1 à 3 µm de long.



422 Chapitre 12


cellules individuelles en forme de bâtonnets. Cependant, cultivé dans un système en flux continu dans lequel le milieu de culture s’écoule goutte-à-goutte au-dessus d’une surface en verre sur laquelle les cellules peuvent s’attacher, Thermocrinis prend alors la forme filamenteuse comme dans son habitat naturel (voir figure 12.104a). Thermocrinis ruber est d’importance historique en microbiologie, car c’était l’un des micro-organismes étudiés par Thomas Brock, un pionnier dans le domaine de la biologie des thermophiles. La découverte par Brock que les filaments roses (voir figure 12.104a) contenaient des protéines et des acides nucléiques indiquait clairement qu’ils étaient des organismes vivants et pas simplement des débris minéraux. De plus, la présence de filaments à la sortie des sources chaudes à 80-90 °C – mais pas à des températures plus basses – a étayé l’hypothèse de Brock selon laquelle les micro-organismes issus de sources chaudes exigeaient des températures élevées pour croître et étaient probablement présents même dans de l’eau bouillante. Ces deux conclusions ont été confortées plus tard par la découverte entre autres par Brock, d’une douzaine de genres de procaryotes hyperthermophiles colonisant les sources chaudes, les sources hydrothermales et d’autres environnements hydrothermaux. Pour plus de détails sur les hyperthermophiles, voir les sections 6.10, 6.12, 13.4 à 13.13 et 19.8.

XV

PHYLA 17 ET 18 : NITROSPIRA ET DEFERRIBACTER

12.38 Nitrospira, Deferribacter m n et genres apparentés Genres principaux : Nitrospira, Deferribacter Plusieurs autres phyla de Bacteria ont été identifiés par le séquençage de l’ARN ribosomique, mais on en connaît peu de chose. Deux de ces phyla contiennent les micro-organismes Nitrospira et Deferribacter (voir figure 12.1). Physiologiquement, ces micro-organismes sont chimiolithotrophes ou chimio-organotrophes et sont mésophiles à thermophiles. Comme les protéobactéries nitrifiantes (voir sections 12.3 et 17.12), Nitrospira oxyde le NO2– en NO3– et est autotrophe. Malgré cette physiologie proche des bactéries nitrifiantes classiques, Nitrospira est phylogénétiquement distincte d’elles. En outre, Nitrospira ne possède pas de membranes internes étendues présentes chez les espèces de protéobactéries nitrifiantes (voir figures 12.7 et 12.8). Néanmoins, Nitrospira colonise de nombreux environnements identiques à ceux des protéobactéries nitrifiantes, il a donc été suggéré que leurs capacités physiologiques aient pu leur être transférées de protéobactéries nitrifiantes par un flux de gène horizontal (ou vice versa). Comme nous le savons, ce mécanisme pour acquérir

des caractères physiologiques a été largement exploité dans le monde procaryotique (voir sections 10.6 à 10.12). Le groupe Nitrospira inclut d’autres genres comme Leptospirillum, un chimiolithotrophe oxydant le fer et responsable pour beaucoup du drainage minier acide lié à l’exploitation du charbon et du fer (voir section 19.15) et Thermodesulfovibrio, une bactérie thermophile réduisant les sulfates, qui colonise les tapis microbiens des sources chaudes (voir section 18.7). À noter que bien qu’ayant un nom et une physiologie similaires, Thermodesulfovibrio et Thermodesulfobacterium (voir section 12.36) sont des micro-organismes distincts.

Deferribacter Le genre Deferribacter forme une lignée distincte (voir figure 12.1) et est composé d’espèces avec un métabolisme énergétique anaérobie. Dans ce groupe, il y a d’autres genres comme Geovibrio et Flexistipes. Ce dernier genre comprend des bactéries anaérobies obligatoires et fermentatives. Deferribacter et Geovibrio sont extrêmement versatiles au niveau de la respiration anaérobie en utilisant une variété d’accepteurs d’électrons, comme les métaux Fe3+ et Mn4+. La respiration anaérobie est présentée au chapitre 17 et est liée à de nombreux et différents accepteurs d’électrons terminaux. Les membres du groupe des Deferribacter semblent être peu communs par rapport au grand nombre d’accepteurs alternatifs d’électrons qu’ils peuvent utiliser et dans le fait qu’ils sont anaérobies obligatoires. En revanche, la plupart des organismes capables de croître par respiration anaérobie avec le nitrate ou les métaux comme accepteurs d’électrons sont aérobies facultatifs, c’est-à-dire capables de croître en aérobiose comme en respiration anaérobie.

Contrôlez vos acquis Thermotoga, Thermodesulfobacterium et Aquifex se développent à haute température, chacun domine une lignée majeure de Bacteria. Aquifex et Thermocrinis sont des chimiolithotrophes oxydant l’H2, tandis que Thermotoga et Thermodesulfobacterium sont des chimio-organotrophes anaérobies. Nitrospira et Deferribacter forment chacun leur propre phylum. •

Comparez le catabolisme de Thermotoga et Thermodesulfobacterium.

•

Qu’y a-t-il d’inhabituel au sujet des lipides de Thermodesulfobacterium ?

•

D’un point de vue génomique, pourquoi le fait qu’Aquifex soit capable de croître avec les gaz H2 + CO2 + O2 semble surprenant ?

•

Comparez les caractéristiques métaboliques de Nitrospira et Deferribacter.



Questions 423

QUESTIONS 1. De tous les phyla des Bacteria étudiés dans ce chapitre, lesquels possèdent les physiologies les plus diversifiées ? Donnez des exemples en termes de besoins en O2, sources de carbone utilisées et métabolisme énergétique. 2. Donnez des exemples illustrant la valeur prédictive de la coloration de Gram. 3. Quels sont les points communs entre cyanobactéries et prochlorophytes ? avec les chloroplastes ? Comment tout ceci est-il lié sur le plan phylogénétique ? 4. Quel point commun y a-t-il entre les planctomycètes et les Archaea ? avec les cellules eucaryotes ? 5. En quoi Chlorobium et Chloroflexus sont-ils similaires ? différents ? 6. Décrivez une caractéristique physiologique essentielle des Bacteria suivantes, qui la différencierait des autres : Acetobacter, Methylococcus, Azotobacter, Desulfovibrio, Lactobacillus, Nitrobacter, Oscillatoria.

7. Décrivez une caractéristique morphologique essentielle différenciant les Bacteria suivantes : Streptococcus, Spirillum, Streptomyces, Verrucomicrobium et les Spirochaeta. 8. Quelles caractéristiques essentielles peut-on utiliser pour différencier les genres suivants de Bacteria Gram positif : Bacillus, Mycoplasma et Mycobacterium. 9. Quels sont les points communs entre Chlamydia et rickettsies ? Quelles sont les différences ? 10. Quelle caractéristique physiologique majeure est commune à Thermotoga, Aquifex et Thermocrinis ? 11. Comparez et différenciez le métabolisme, la morphologie et la phylogénie des bactéries vertes non sulfureuses et pourpres non sulfureuses. 12. Donnez une liste de donneurs d’électrons pour le métabolisme énergétique de chacune des Bacteria suivantes et indiquez si ces organismes sont aérobies ou anaérobies : Thiobacillus, Nitrosomonas, Ralstonia eutropha, Methylomonas, Acetobacter, Gallionella et Propionobacterium.

PROBLÈMES 1. Défendez l’affirmation suivante, en utilisant des arguments basés sur la phylogénie, la structure et la physiologie : « Escherichia coli est une bactérie plus évoluée que Thermodesulfobacterium. »

2. Défendez ou réfutez les affirmations suivantes en utilisant des exemples de ce chapitre : « La morphologie cellulaire n’a aucune valeur phylogénétique prédictive. » « La physiologie n’a aucune valeur phylogénétique. »





I

Phylogénie et métabolisme général

Chez les Archaea, il existe même des espèces parasites telles que Nanoarchaeum (en rouge). Cette espèce possède le plus petit génome connu chez un procaryote.

426

13.1 Panorama phylogénétique des Archaea 13.2 Conservation de l’énergie et autotrophie chez les Archaea

426

II

428

Euryarchaeota

13.3 13.4

427

Archaea halophiles extrêmes Archaea productrices de méthane : les méthanogènes 13.5 Termoplasmatales : Thermoplasma, Ferroplasma et Picrophilus 13.6 Euryarchaeota hyperthermophiles : Thermococcales et Methanopyrus 13.7 Euryarchaeota hyperthermophiles : Archaeoglobales

436

III

441

Crenarchaeota

CHAPITRE TREIZE

Diversité des procaryotes : les Archaea

428 433

438 439

13.8

Habitats et métabolisme énergétique des Crenarchaeota 441 13.9 Hyperthermophiles des habitats volcaniques terrestres : Sulfolobales et Thermoprotéales 444 13.10 Hyperthermophiles des habitats volcaniques sous-marins : Desulfurococcales 446

IV

Nanoarchaeota

13.11 Nanoarchaeum

V

L’évolution et la vie à haute température

13.12 Stabilité thermique des molécules biologiques 13.13 Archaea hyperthermophiles, H2 et évolution microbienne

448 448

450 450 452



426 Chapitre 13


GLOSSAIRE Acétotrophe (acetotrophic) Consommateur d’acétate. ADN gyrase reverse (reverse DNA gyrase) Voir chapitre 7. Bactériorhodopsine (bacteriorhodopsin) Protéine membranaire contenant du rétinal, produite par certains micro-organismes halophiles extrêmes et capable de générer une force protonmotrice photodépendante. Crenarchaeota Lignée des Archaea qui compte à la fois des organismes hyperthermophiles et des procaryotes psychrophiles. Euryarchaeota Lignée des Archaea qui compte essentiellement des méthanogènes, les Thermosplasma et des espèces marines. Halophile extrême (extreme halophile) Voir chapitre 6. Halorhodopsine (halorhodopsin) Pompe à chlorures photodépendante qui accumule des ions Cl– dans le cytoplasme. Hyperthermophile Procaryote dont la température optimale de croissance est supérieure ou égale à 80 °C. Korarchaeota Lignée d’Archaea hyperthermophiles située à proximité de la racine de l’arbre des Archaea. Méthanogène (methanogen) ou Methanoarchaea Procaryote producteur de méthane. Le CH4 est produit par la réduction du CO2 par H2 ou certains composés organiques.

C

onsidérons maintenant le domaine des Archaea. Dans le chapitre 11, nous avons mis l’accent sur les différences majeures, aussi bien phylogénétiques que phénotypiques, qui existent entre les Bacteria et les Archaea. Parmi les caractéristiques principales des Archaea (décrites dans le tableau 11.3), on note l’absence de peptidoglycane dans la paroi cellulaire, la présence de lipides possédant des liaisons éthers et la présence d’ARN polymérases complexes. Outre ces caractéristiques, le domaine des Archaea offre une diversité phénotypique considérable. Comme dans le chapitre 12 concernant les Bacteria, nous dresserons d’abord un panorama phylogénétique, afin de montrer les relations évolutives au sein de ce domaine.

I

PHYLOGÉNIE ET MÉTABOLISME GÉNÉRAL

13.1 Panorama phylogénétique m n des Archaea L’arbre phylogénétique des Archaea, présenté dans la figure 13.1, se divise en deux embranchements principaux : les Crenarchaeota et les Euryarchaeota. Deux autres embranchements, les Korarchaeota et les Nanoarchaeota, se positionnent à proximité de la racine. Parmi les Archaea cultivées, les Crenarchaeota contiennent principalement des espèces hyperthermophiles – des organismes dont la température optimale de croissance est supérieure à 80 °C –, et notamment celles dont les températures de croissance sont les plus élevées parmi tous les organismes connus. De nombreux hyperthermophiles sont des autotrophes chimiolithotrophes, et parce que leurs habitats sont dépourvus de production photosynthétique, ils sont les producteurs primaires de ces environnements inhospitaliers. Les

Nanoarchaeota Lignée composée de très petites Archaea parasites et située à proximité de la racine de l’arbre des Archaea. Phytanyle (phytanyl) Hydrocarbure ramifié contenant vingt atomes de carbone et communément présent dans les lipides des Archaea. Psychrophile (cold-dwelling) Voir chapitre 6. Solfatare (Solfatara) Environnement chaud, riche en soufre et généralement acide colonisé par les Archaea hyperthermophiles. Solutés compatibles ou osmorégulateurs (compatible solutes) Voir chapitre 6. Source hydrothermale (hydrothermal vent) Source chaude de l’océan profond desquelles jaillissent des fluides pouvant être de tièdes (~20 °C) à surchauffés (< 300 °C). Thermosome Protéine de choc thermique (chaperonne) complexe qui agit en repliant les protéines partiellement dénaturées par la chaleur chez les hyperthermophiles. Voie de l’acétyl-CoA (acetyl-CoA patway) Voie métabolique de fixation du CO2 largement répandue chez les micro-organismes anaérobies stricts incluant les méthanogènes, les homoacétogènes et les bactéries sulfato réductrices.

espèces hyperthermophiles, au sein des Crenarchaeota, se regroupent et occupent des branches courtes de l’arbre du vivant fondé sur les séquences des gènes codant les ARN ribosomiques 16S (voir figures 11.13 et 13.1). Ceci suggère que ces organismes ont une évolution plus lente que les autres lignées du domaine. Ils constituent donc d’excellents modèles pour l’étude des Archaea primitives et peut-être des formes de vie primitives en général (voir section 13.13). Par contre les organismes psychrophiles voisins des Crenarchaeota hyperthermophiles ont été identifiés par l’analyse des gènes codant les ARN ribosomiques 16S d’Archaea d’échantillons environnementaux océaniques (voir section 18.5). D’un point de vue phylogénétique ce sont des espèces qui ont une évolution plus rapide et occupent donc des branches plus longues de l’arbre (voir figure 13.1). Nous reviendrons sur les Crenarchaeota dans les sections 13.8 à 13.10. Les Euryarchaeota regroupent des Archaea physiologiquement diverses. De même que les Crenarchaeota, beaucoup sont endémiques des environnements extrêmes. Cette lignée inclut les Methanoarchaea ou méthanogènes – dont le métabolisme est lié à la production de méthane – et plusieurs genres d’Archaea halophiles extrêmes, les « halobactéries » (voir figure 13.1). D’un point de vue physiologique, ces deux groupes sont remarquables : les Methanoarchaea sont des anaérobies stricts alors que les halophiles sont, pour la plupart, des aérobies obligatoires. D’autres groupes parmi les Euryarchaeota comprennent les hyperthermophiles Thermococcus et Pyrococcus et le méthanogène Methanopyrus, qui se positionnent tous à proximité de la racine (voir figure 13.1), comme le procaryote sans paroi Thermoplasma, un organisme phénotypiquement proche des mycoplasmes (voir section 12.21). Enfin, de même que chez les Crenarchaeota, un important groupe d’Euryarchaeota incultivées forme de longues branches au sommet de l’arbre



13.2 Conservation de l’énergie et autotrophie chez les Archaea 427

Euryarchaeota marines Halobacterium

Archaeoglobus

Halococcus Halophiles extrêmes

Crenarchaeota marines

Euryarchaeota

Natronococcus Methanobacterium

Methanocaldococcus

Crenarchaeota


Methanothermus Sulfolobus

Methanosarcina

Thermococcus/ Pyrococcus

Methanospirillum

Pyrodictium

Thermoproteus

Thermoplasma

Hyperthermophiles

Methanopyrus Picrophilus

Desulfurococcus

Ferroplasma Acidophiles extrêmes


FIGURE 13.1 Arbre phylogénétique détaillé des Archaea basé sur la comparaison des séquences des gènes codant les ARN ribosomiques 16S . Les Euryarchaeota marines et les Crenarchaeota marines ne sont, jusqu’ici, connues qu’au travers de séquences environnementales (voir sections 11.7, 18.5 et 18.6). Les espèces du genre Methanobacterium ne sont pas toutes thermophiles.

des Archaea (voir figure 13.1). De nombreuses Euryarchaeota vivent également dans les eaux douces et les habitats terrestres. Nous reviendrons en détail sur les Euryarchaeota dans les sections 13.3 à 13.7. Les Korarchaeota (voir figure 13.1) ont été découvertes grâce à l’analyse des gènes codant les ARN ribosomiques 16S d’organismes vivant dans une source d’eau chaude atypique du parc de Yellowstone. Il n’existe aucune culture pure de ces organismes. Les Korarchaeota ne sont pas encore officiellement reconnues en taxinomie, cependant ces organismes sont clairement situés à proximité de la racine de l’arbre des Archaea. Pour cette raison, leurs propriétés biologiques pourraient ressembler à celles des Archaea anciennes. Les Nanoarchaeota sont la dernière découverte dans le domaine des Archaea. Nanoarchaeum, le seul genre de cette lignée, est un très petit procaryote parasite qui vit attaché aux cellules de la Crenarchaeota Ignicoccus. La très petite taille des cellules et la taille du génome (voir tableau 15.1) de cet organisme ainsi que sa phylogénie ancienne en font effectivement un organisme très intéressant. Nous discuterons des implications qui en découlent et des Nanoarchaeota en général dans la section 13.11. Après ce panorama de la phylogénie des Archaea nous ferons une brève description des caractéristiques métaboliques des Archaea puis nous en décrirons les principaux représentants cultivés.

13.2 Conservation de l’énergie m n et autotrophie chez les Archaea Le métabolisme énergétique chez les méthanogènes est différent de celui de tous les autres groupes de procaryotes Bacteria ou Archaea. Nous aborderons la discussion sur les nombreuses et nouvelles données concernant la méthanogenèse dans le chapitre 17, nous focalisant ici sur le métabolisme des Archaea non méthanogènes, qui est plus proche de celui des Bacteria.

Chimio-organotrophie et chimiolithotrophie chez les Archaea De nombreuses Archaea sont chimio-organotrophes et utilisent donc des composés organiques comme source d’énergie pour leur croissance. Le catabolisme du glucose chez les Archaea est réalisé grâce à une voie d’Entner-Doudoroff légèrement modifiée ou par la voie glycolytique (voir section 5.10). L’oxydation de l’acétate en CO2 se produit à travers le cycle de l’acide citrique (voir section 5.13) ou par de légères modifications de cette série de réactions, ou encore par la voie de l’acétyl-CoA (voir section 17.16). On ne connaît pas grand-chose en ce qui concerne la biosynthèse des acides aminés et des autres précurseurs des macromolécules, mais les monomères clés sont vraisemblablement



428 Chapitre 13


produits à partir des intermédiaires du métabolisme central, tel que cela est décrit chez les Bacteria (voir sections 5.15 à 5.17). Une chaîne de transport des électrons comptant des cytochromes de type a, b et c a été décrite chez les Archaea. Chez la plupart de celles-ci, le métabolisme chimio-organotrophe s’effectue par le transfert des électrons, à partir des donneurs d’électrons organiques, dans une chaîne de transport d’électrons, qui conduit à la réduction de O2, S0, ou d’autres accepteurs d’électrons. Simultanément l’établissement d’une force proton-motrice va permettre la synthèse d’adénosine triphosphate (ATP) par des ATPases membranaires (voir section 5.12 pour la description du fonctionnement des ATPases). La chimiolithotrophie est également bien établie chez les Archaea, avec fréquemment l’H2 comme donneur d’électrons (voir section 13.13). Nous aborderons le métabolisme chimiolithotrophe chez les Archaea hyperthermophiles dans la section 13.8.

L’autotrophie chez les Archaea La capacité à croître en autotrophie est largement répandue chez les Archaea, et ce au travers de différentes voies. Chez les méthanogènes, et vraisemblablement chez la plupart des espèces hyperthermophiles chimiolithotrophes, le CO2 est fixé par la voie de l’acétyl-CoA, ou bien par quelques modifications de cette dernière (voir section 17.16). Chez d’autres hyperthermophiles la fixation du CO2 a lieu par le biais du cycle de l’acide citrique inversé, une série de réactions qui est également utilisée comme voie autotrophe chez les bactéries vertes sulfureuses (voir sections 12.32 et 17.7), ou du cycle de Calvin, qui est la voie de fixation du CO2 la plus répandue chez les Bacteria et les eucaryotes (voir section 17.6). Les gènes codant une RubisCO fonctionnelle et très thermostable (la RubisCO catalyse la première étape du cycle de Calvin) ont été caractérisés chez la Methanoarchaea Methanocaldococcus jannashii et chez une espèce du genre Pyrococcus, deux espèces thermophiles. Nous verrons que de nombreuses séquences du catabolisme et de l’anabolisme chez les Archaea sont très similaires à celles décrites chez de nombreuses Bacteria, ce qui nous rappelle que le métabolisme a une longue histoire évolutive. Ces éléments de base étant posés nous allons aborder maintenant l’étude de la diversité des organismes de ce fascinant domaine du vivant.

Contrôlez vos acquis Les Archaea sont constituées de quatre phyla principaux : les Euryarchaeota, les Crenarchaeota, les Korarchaeota et les Nanoarchaeota. À l’exception de la méthanogenèse, la bioénergétique et le métabolisme intermédiaire chez les Archaea sont identiques à ceux de diverses Bacteria. •

Dans quel embranchement des Archaea trouve-ton la majorité des espèces hyperthermophiles cultivées ?

•

Quelles voies autotrophes trouve-t-on chez les Archaea ?

II

EURYARCHAEOTA

13.3 Archaea halophiles extrêmes m n Genres principaux : Halobacterium, Haloferax, Natronobacterium Les Archaea halophiles extrêmes (voir figure 13.1) forment un groupe diversifié de micro-organismes qui habitent les environnements à forte concentration en sels tels que les marais salants, les lacs salés naturels ou les habitats salins artificiels, ainsi que les surfaces de salaisons comme les poissons et les viandes. Ces habitats sont appelés hypersalés. Le terme halophile extrême est utilisé pour indiquer que ces organismes ne sont pas seulement halophiles, mais que leur besoin en sels est très élevé, parfois à une concentration proche de la saturation. Par définition un halophile extrême a besoin d’au moins 1,5 M (environ 9 %) de NaCl pour sa croissance. La plupart des espèces en requièrent de 2 à 4 M (de 12 à 23 %) pour une croissance optimale. Pratiquement tous les halophiles peuvent croître en présence de 5,5 M de NaCl (32 %, limite de saturation pour NaCl), bien que certaines espèces ne se développent que très lentement à ce niveau de salinité.

Les environnements hypersalés Les habitats hypersalés sont fréquents à travers le monde, mais les environnements extrêmes sont relativement rares. La plupart de ces environnements sont situés dans des zones chaudes et sèches de la planète. Les lacs salés ont des compositions en ions qui peuvent varier de façon considérable. La nature des ions dominants dans les lacs hypersalés dépend de la topographie environnante, de la géologie et des conditions climatiques. Le Grand Lac Salé dans l’Utah, aux États-Unis (voir figure 13.2a), est principalement constitué d’eau de mer concentrée ; les proportions relatives des différents ions y sont identiques à celle de l’eau de mer, mais la concentration totale en ions y est beaucoup plus élevée. Le sodium est le cation dominant et le chlorure, l’anion dominant ; des concentrations significatives en sulfate sont également présentes à un pH légèrement alcalin. Au contraire, dans la mer Morte, un autre bassin hypersalé, la concentration en sodium est relativement faible, alors que celle en magnésium est élevée (voir tableau 13.1). La chimie de l’eau des lacs alcalins ressemble à celle des lacs hypersalés tels que le Grand Lac Salé, mais, du fait de la présence de quantités importantes de carbonates dans les roches environnantes, le pH de ces lacs est relativement élevé. Des eaux dont le pH est compris entre 10 et 12 sont fréquentes dans ces environnements (voir tableau 13.1). De plus, les ions Ca2+ et Mg2+ sont absents des lacs alcalins, car ils précipitent à pH élevé et à des concentrations élevées en carbonates (voir tableau 13.1). La chimie très diverse des habitats hypersalés a sélectionné une importante diversité de micro-organismes halophiles. Certains sont endémiques de ces environnements, alors que d’autres sont répandus dans divers habitats. De plus, malgré ce qui semble être des conditions relativement rigoureuses, les lacs salés peuvent être des écosystèmes très productifs (« productif » signifiant ici



13.3 Archaea halophiles extrêmes 429

TABLEAU 13.1

COMPOSITION EN IONS DE QUELQUES ENVIRONNEMENTS a HYPERSALÉS

Concentration (g/l) Grand Lac Saléb

Mer Morte

Lac Zugmc

Na+

105

40,1

142

K+

6,7

7,7

2,3

11

44

< 0,1

Ca

0,3

17,2

< 0,1

Cl–

181

225

155

Br–

0,2

5,3

–

SO42–

27

0,5

23

HCO3–

0,7

0,2

67

pH

7,7

6,1

11

Ion

2+

Mg

2+

a

À titre de comparaison, l’eau de mer contient (en gramme par litre) : Na+ 10,6 ; K+, 0,38 ; Mg2+, 1,27 ; Ca2+, 0,4 ; Cl–, 19 ; Br–, 0,065 ; SO42–, 2,65 ; HCO3–, 0,14 ; pH 7,8. b Voir figure 13.2a. c Ouadi Natroum, Égypte (voir figure 13.2c).

comme étant le siège d’un niveau élevé de fixation autotrophe du CO2). Les Archaea ne sont pas les seuls micro-organismes présents. L’algue eucaryote Dunaliella est le principal, si ce n’est le seul, organisme aérobie phototrophe dans la plupart des lacs salés. Dans les lacs alcalins à pH très élevé, où Dunaliella est absente, les bactéries pourpres anaérobies phototrophes

TABLEAU 13.2 Genre

Ectothiorhodospira et Halorhodospira (voir section 12.2) prédominent. La matière organique qui résulte de la production primaire par les phototrophes aérobies ou anaérobies permet le développement des Archaea halophiles extrêmes, qui sont toutes chimio-organotrophes. De plus, quelques Bacteria halophiles chimio-organotrophes telles qu’Haloanaerobium et Halobacteroides colonisent ces environnements. Les marais salants sont également un habitat des procaryotes halophiles extrêmes. Ce sont des petits bassins fermés remplis d’eau de mer et qui, par suite de l’évaporation due au soleil, conduisent à la production de sel de mer (voir figure 13.2b, d). Comme les marais salants ont une salinité qui est proche de la limite minimale pour les halophiles extrêmes, l’eau a une couleur violet rougeâtre due à la croissance massive – nommée efflorescence (bloom) – d’Archaea halophiles (la coloration rouge visible sur les figures 13.2b et c provient des caroténoïdes et autres pigments, dont nous parlerons plus tard). Des Archaea ayant des morphologies inhabituelles sont parfois présentes dans les marais salants, telles que des espèces en forme de carré (voir figure 13.2d). Les halophiles extrêmes sont aussi présentes dans des aliments très salés tels que les saucissons, les poissons fumés salés et le porc salé.

taxinomie et physiologie des Archaea halophiles extrêmes Le tableau 13.2 présente la liste des espèces d’Archaea halophiles extrêmes actuellement reconnues. Le séquençage des gènes codant les ARN ribosomiques 16S et d’autres critères ont été utilisés pour définir quatorze genres d’halophiles extrêmes (voir tableau 13.2). Les Archaea halophiles extrêmes sont

QUELQUES GENRES D’ARCHAEA HALOPHILES EXTRÊMES Morphologie

Contenu en GC de l’ADN (mol %)

Habitats

Halophiles extrêmes Halobacterium

Bâtonnet

66-71

Poissons séchés salés ; peaux ; lacs hypersalés ; marais salants

Halorubrum

Bâtonnet

62-71

Mer Morte ; marais salants

Halobaculum

Bâtonnet

70

Haloferax

Disque aplati

60-66

Mer Morte ; marais salants

Haloarcula

Disque irrégulier

63-65

Bassins salés, Vallée de la Mort, Californie (États-Unis) ; marais salants

Halococcus

Coque

59-66

Poissons séchés salés ; marais salants

Halogeometricum

Bâtonnet

59-60

Marais salants

Haloterrigena

Bâtonnet, cellule ovale

59-60

Sols salins

Mer Morte

Haloalkaliphiles Natronobacterium

Bâtonnet

65

Lacs alcalins hypersalés

Natrinema

Bâtonnet

70

Poissons séchés salés ; peaux

Natrialba

Bâtonnet

60-63

Lacs alcalins ; plages

Natronomonas

Bâtonnet

61-64

Lacs alcalins

Natronococcus

Coque

63-64

Lacs alcalins

Natronorubrum

Cellule aplatie

59-60

Lacs alcalins




Francisco Rodriguez-Valera

(b)

Michael T. Madigan

(a)

NASA

T. D. Brock

430 Chapitre 13

(c)

(d)

FIGURE 13.2 Les habitats hypersalés des Archaea halophiles. (a) Le Grand Lac Salé, Utah, États-Unis. Un lac hypersalé dans lequel les proportions en ions sont identiques à celles de l’eau de mer, mais dont les concentrations absolues sont dix fois supérieures. La coloration verte est essentiellement due à une algue verte halophile, Dunaliella salina. (b) Vue aérienne de marais salants à proximité de la baie de San Francisco, États-Unis. La coloration rouge est principalement due aux bacteriorubérines et aux bactériorodopsines des cellules de Halobacterium. (c) Le lac Hamara, Ouadi Natroum, Égypte. Des efflorescences d’haloalkaliphiles pigmentées se produisent dans ce lac alcalin à pH 10. Remarquez les dépôts de Trona (NaHCO3, Na2 CO3, 2H2O) sur les berges du lac. (d) Procaryotes halophiles, parmi lesquels des bactéries de forme carrée, provenant de marais salants en Espagne, observés en miscroscopie électronique à balayage.

fréquemment appelées « halobactéries », car le genre Halobacterium (voir figure 13.3) a été le premier décrit dans ce groupe et en reste le représentant le plus étudié. Les genres Natronobacterium, Natronomonas et les espèces proches se différencient des autres halophiles extrêmes en étant également des alcalinophiles extrêmes. Du fait quelles colonisent les lacs alcalins (voir tableau 13.1 et figure 13.2c), les natronobactéries connaissent une croissance optimale pour des concentrations très faibles en Mg2+ et un pH élevé (9-11). Les Archaea halophiles extrêmes sont Gram négatif, se divisent par fission binaire et ne produisent pas de forme de résistance ou de spores. La plupart des halobactéries ne sont pas mobiles, mais quelques rares souches le sont faiblement grâce à des flagelles ou sont capables de flotter grâce à leurs vésicules gazeuses. La structure du génome de Halobacterium et Halococcus est inhabituelle du fait de la présence de gros plasmides pouvant contenir de 25 à 30 % de l’ADN total de la cellule, et dont le contenu en guanine

et cytosine (57-60 % GC) est significativement différent de celui de l’ADN chromosomique (66-68 % GC). Les plasmides des halophiles extrêmes sont les plus gros plasmides naturels connus (voir section 10.9). La plupart des espèces d’halobactéries sont aérobies stricts. Elles utilisent les acides aminés et les acides organiques comme sources d’énergie et requièrent de nombreux facteurs de croissances (principalement des vitamines) pour une croissance optimale. Quelques espèces du genre Halobacterium oxydent les sucres, mais cette capacité est relativement rare. Des chaînes de transport d’électrons comptant des cytochromes de type a, b et c sont présentes chez Halobacterium, et l’énergie est produite pendant la croissance aérobie, par l’intermédiaire d’une force proton-motrice provenant d’événements chimio-osmotiques membranaires. Chez quelques espèces, la croissance en anaérobiose, grâce à la fermentation des sucres et à la respiration anaérobie (voir section 17.13) liée à la réduction de nitrate ou de fumarate, a été mise en évidence.



13.3 Archaea halophiles extrêmes 431

TABLEAU 13.3

CONCENTRATIONS CELLULAIRES EN IONS CHEZ HALOBACTERIUM

Mary Reedy

SALINARUM

(a)

Concentrations du milieu (M)

Concentrations intracellulaires (M)

Na+

3,3

0,8

K+

0,05

5,3

0,13

0,12

3,3

3,3

Ions

2+

Mg

–

Mary Reedy

Cl

(b) FIGURE 13.3 Coupes fines de l’halophile extrême Halobacterium salinarum observées en microcroscopie électronique. Le diamètre des cellules est d’environ 0,8 µm. (a) Coupe longitudinale d’une cellule en division montrant le nucléoïde. (b) Observation à un grossissement supérieur montrant l’organisation des sous-unités glycoprotéiques de la paroi cellulaire.

L’équilibre hydrique chez les halophiles extrêmes Les Archaea halophiles extrêmes ont besoin de grandes quantités de sodium pour leur croissance. Dans le cas d’Halobacterium, pour laquelle des études détaillées de salinité ont été réalisées, les exigences en Na+ ne peuvent être satisfaites par aucun autre ion, même par K+, chimiquement le plus proche. Néanmoins, les cellules d’Halobacterium requièrent la présence de ces deux ions pour leur croissance, car ils jouent un rôle important dans le maintien de l’équilibre osmotique. Comme nous l’avons vu dans la section 6.14, les micro-organismes doivent maintenir la pression osmotique indispensable à la vie. Dans des environnements ayant une forte osmolarité, comme les habitats enrichis en NaCl des Halobacterium, les organismes doivent pour cela accumuler ou synthétiser des solutés intracellulaires. Ces solutés sont appelés solutés compatibles. Ils compensent la tendance de la cellule à se déshydrater dans des conditions de force osmotique élevée en la plaçant en équilibre hydrique positif par rapport à l’extérieur (voir section 6.14). Les cellules d’Halobacterium n’utilisent pas de composés organiques comme solutés compatibles, mais incorporent de grandes quantités de K+ de l’environnement vers le cytoplasme. Cela permet d’avoir une concentration intracellulaire en K+ supérieure à la concentration en Na+ extracellulaire (voir tableau 13.3), et donc le maintien d’une balance hydrique positive. La paroi cellulaire d’Halobacterium est composée de glycoprotéines, elle est stabilisée par des ions sodium qui se fixent sur la face extérieure de la paroi cellulaire et sont indispensables au maintien de l’intégrité de la cellule. Quand la concentration en Na+ est insuffisante, la paroi se rompt et la cellule se lyse. Ceci est dû à l’exceptionnelle richesse en aspartate et en glutamate (acides aminés acides chargés négativement) de la glycoprotéine de la paroi de

Halobacterium (voir figure 3.12). Les charges négatives résultant du groupe carboxyle de ces acides aminés sont neutralisées par les ions Na+. Quand ces derniers sont éliminés, les charges négatives se repoussent les unes les autres, ce qui conduit à la lyse des cellules.

Les composants cytoplasmiques des halophiles De même que les protéines de la paroi cellulaire, les protéines cytoplasmiques d’Halobacterium sont très acides, mais ce sont les ions K+, et non les ions Na+, qui sont nécessaires à leur activité, puisque K+ est le cation majoritaire à l’intérieur des cellules de Halobacterium (voir tableau 13.3). Outre leur contenu élevé en acides aminés acides, les protéines cytoplasmiques des halobactéries contiennent typiquement de faibles quantités d’acides aminés hydrophobes et de lysine (un acide aminé basique) par rapport à celles des organismes non halophiles. Ceci s’explique par le fait que, dans un cytoplasme fortement ionique, les protéines polaires vont avoir tendance à se maintenir en solutions alors que les protéines non polaires auront une propension à s’agglomérer et à perdre leur activité. Les ribosomes d’Halobacterium requièrent aussi des concentrations élevées en K+, ce qui n’est pas le cas pour les ribosomes des organismes non halophiles. Les Archaea halophiles extrêmes sont donc parfaitement adaptées à la vie dans des environnements dont la concentration ionique est élevée. Les composants cellulaires exposés aux conditions externes nécessitent des concentrations élevées en Na+ pour leur stabilité, alors que les composants intracellulaires nécessitent des concentrations élevées en K+. À l’exception de quelques espèces bactériennes halophiles qui utilisent également les ions K+ comme soluté compatible, il n’existe aucun autre groupe parmi les procaryotes qui ait une telle exigence pour un ion particulier à des concentrations aussi élevées.

Bactériorhodopsine et synthèse d’ATP photodépendante chez les halobactéries Certaines espèces d’Archaea halophiles extrêmes peuvent réaliser une synthèse d’ATP photodépendante, et ceci en l’absence de pigments chlorophylliens : il ne s’agit donc pas de photosynthèse. Néanmoins, d’autres pigments photosensibles sont impliqués, entre autres des caroténoïdes rouges et orange – principalement des pigments en C50 appelés bactériorubérines – et des pigments inductibles impliqués dans la conservation de l’énergie, auxquels nous allons nous intéresser



432 Chapitre 13


maintenant. Dans des conditions d’aération faible, Halobacterium salinarum et certaines autres halophiles extrêmes synthétisent et insèrent dans leur membrane une protéine appelée bactériorhodopsine. Elle est ainsi nommée car elle possède des similitudes structurales et fonctionnelles avec le pigment photosensible de l’œil, la rhodopsine. Une molécule de rétinal, molécule de type caroténoïde associée à la bactériorhodopsine, peut absorber l’énergie lumineuse et catalyser la formation d’une force proton-motrice (voir figure 13.4). Le rétinal confère à la bactériorhodopsine une teinte violette. Les cellules d’Halobacterium, qui passent d’une croissance dans un milieu aéré à une croissance dans des conditions limitantes en oxygène (condition déclenchante de la synthèse de bactériorhodopsine), passent progressivement d’une couleur orange ou rouge à une couleur violet rougeâtre au fur et à mesure qu’elles synthétisent et insèrent dans leur membrane la bactériorhodopsine. La bactériorhodopsine absorbe la lumière visible dans la région du vert (à environ 570 nm). Par suite de cette absorption, le rétinal, dont la forme naturelle est l’isomère trans, est excité et converti en isomère cis (voir figure 13.4). Cette transformation provoque le transfert d’un proton sur la surface externe de la membrane. Le rétinal reprend ensuite sa forme la plus stable (isomère trans) dans le noir en prélevant un proton dans le cytoplasme, ce qui complète le cycle (voir figure 13.4). Au fur et à mesure que les protons s’accumulent sur la surface externe de la membrane, la force proton-motrice augmente jusqu’à ce que la membrane soit suffisamment « chargée » pour engendrer la production d’ATP par l’activité d’une ATPase à transfert de protons (voir figure 13.4). La synthèse d’ATP photodépendante chez Halobacterium salinarum permet une croissance lente de cet organisme en conditions anoxiques. La pompe à protons photodépendante de H. salinarum peut également pomper des ions Na+ à l’extérieur,

hυ570

Extérieur

Intérieur Membrane

H+

grâce à l’activité d’un système antiport Na+/H+ (voir section 4.6) et prélever ainsi différents nutriments, dont le K+ nécessaire au maintien de l’équilibre osmotique. Le prélèvement d’acides aminés a été montré comme étant indirectement photodépendant chez H. salinarum ; en effet le transport des acides aminés est assuré par un symport acides aminés/Na+ (voir section 4.6). Le prélèvement continu d’acides aminés dépend de l’élimination des ions Na+ à travers l’antiport Na+/H+ photodépendant.

Les autres rhodopsines Outre la bactériorhodopsine, au moins trois autres rhodopsines sont présentes dans la membrane de H. salinarum. L’halorhodopsine est une pompe à chlorures (Cl–) photodépendante qui importe des ions Cl– dans les cellules et expulse des ions K+ vers l’extérieur. Le rétinal de la halorhodopsine fixe les ions Cl– et les transporte dans la cellule. Chez H. salinarum il existe deux capteurs lumineux, appelés rhodopsines sensorielles, qui contrôlent la phototaxie (mouvement vers la lumière – voir section 4.16) de l’organisme. Par l’activation en cascade d’une série de protéines identiques à celles impliquées dans le chimiotactisme (voir sections 4.16 et 8.13), la rhodopsine sensorielle modifie la rotation des flagelles, provoquant ainsi le déplacement des cellules vers la lumière, où la bactériorhodopsine pourra fonctionner pour fabriquer de l’ATP (voir figure 13.4). Nous verrons plus loin, au sujet de la microbiologie marine (voir section 19.6), qu’il existe dans la colonne d’eau océanique des Bacteria qui possèdent des protéines identiques à la bactériorhodopsine, appelées protéorhodopsines. Dans l’état actuel des connaissances, la protéorhodopsine aurait un fonctionnement analogue à celui de la bactériorhodopsine, mais il existerait différentes formes spectrales, chacune réagissant à différentes longueurs d’ondes. L’utilisation d’un système à protéorhodopsine pour la production d’énergie par les procaryotes marins a une signification écologique forte dans la mesure où les concentrations en matière organique dissoute sont particulièrement faibles dans les océans (voir section 19.6) et où, par conséquent, un mode de vie strictement chimio-organotrophe serait difficile.

H+ RetC


RetT

Bactériorhodopsine H+

ATP

H+

ADP + Pi

H+

ATPase FIGURE 13.4 Modèle de fonctionnement de la bactériorhodopsine. La lumière, à une longueur d’onde proche de 570 nm (hν570), provoque l’isomérisation du rétinal de la bactériorhodopsine, qui passe de la forme trans (RetT) à la forme cis (RetC) Le transfert d’un proton vers la surface externe de la membrane qui en résulte génère une force proton-motrice. L’activité ATPasique est actionnée par la force proton-motrice (voir section 5.12).

Les Archaea halophiles extrêmes requièrent de grandes quantités de NaCl pour leur croissance. Ces organismes accumulent des quantités élevées de KCl comme soluté compatible dans leur cytoplasme. Ces sels influencent la stabilité de la paroi et l’activité des enzymes. La bactériorhodopsine, pompe à protons photodépendante, contribue à la production d’ATP chez les halophiles extrêmes. •

Quelle est la différence physiologique majeure entre Halobacterium et Natronobacterium ?

•

Si les cellules d’Halobacterium requièrent de grandes quantités de Na+, pourquoi n’en va-t-il pas de même pour les enzymes cytoplasmiques (voir tableau 13.3) ?

•

Quels bénéfices la bactériorhodopsine confère-telle aux cellules de H. salinarum ? Qu’en est-il pour l’halorhodopsine ?



13.4 Archaea productrices de méthane : les méthanogènes 433

13.4 Archaea productrices m n de méthane : les méthanogènes

Un grand nombre d’Euryarchaeota produisent du méthane (CH4), au cours de leur métabolisme énergétique. Ces organismes sont appelés méthanogènes ou Methanoarchaea et le processus de formation de méthane : méthanogenèse. Le méthane a été décrit comme étant de « l’air combustible » par le physicien italien Alessandro Volta, qui a montré que les gaz récoltés à partir des sédiments d’un marais étaient inflammables. L’expérience de Volta, telle qu’on la connaît, peut être aisément reproduite si le méthane piégé dans les sédiments d’un marécage est récolté et enflammé avec précaution (voir figure 13.5). Dans les chapitres suivants, nous étudierons la biochimie du procédé, étonnamment complexe, de formation du méthane (voir section 17.17). Nous verrons aussi comment la méthanogenèse est l’étape terminale de la biodégradation de la matière organique dans un grand nombre d’habitats anoxiques naturels tels que le marécage de la figure 13.5 (voir section 19.10). Le tableau 13.4 présente la liste des principales sources de méthane biogénique dans la nature.

Diversité et physiologie des méthanogènes Les Methanoarchaea présentent des morphologies très variées (voir figure 13.6 et tableau 13.5). Leur taxinomie est fondée aussi bien sur des analyses phénotypiques que phylogénétiques (voir tableau 13.5) ; elle compte quelques ordres taxinomiques reconnus (en taxinomie, un ordre contient des familles proches, chacune pouvant contenir un ou plusieurs genres – voir tableau 11.6). Les parois des méthanogènes ont des chimies très diverses. On peut citer le pseudopeptidoglycane de

John A. Breznak

Genres principaux : Methanobacterium, Methanocaldococcus, Methanosarcina

FIGURE 13.5 L’expérience de Volta, reproduite lors d’une classe d’été en diversité microbienne à Woods Hole, Massachusetts, États-Unis. Un grand entonnoir inversé est placé sur le sédiment d’un marécage dans lequel se produit une décomposition anaérobie, à Cedar Swamps, Woods Hole. Après que l’eau a chassé l’air contenu dans l’entonnoir, celui-ci est fermé et le sédiment est mélangé avec un bâton, libérant ainsi les bulles de méthane qui vont s’accumuler dans l’entonnoir. Une flamme approchée de l’embouchure de l’entonnoir, immédiatement après son ouverture, va provoquer la combustion du méthane. Cette expérience a été réalisée il y a plus de 200 ans par le physicien italien Alessandro Volta, qui décrivit ainsi le méthane comme étant de « l’air combustible ».

III. Sources géothermiques de H2 et CO2 : sources hydrothermales (voir section 19.8)

la paroi des Methanobacterium et des espèces proches (voir figure 13.7a), la méthanochondroïtine (ainsi nommée du fait de sa ressemblance avec la chondroïtine, polymère du tissu conjonctif chez les vertébrés) de la paroi des Methanosarcina et des espèces proches (voir figure 13.7b), la paroi protéique ou glycoprotéique des Methanocaldococcus (voir figure 13.8a) et de Methanoplanus respectivement, et la paroi en couche S (S-layer) de Methanospirillum (voir figure 13.6 et section 4.8). En ce qui concerne leur physiologie, les méthanogènes sont des organismes anaérobies obligatoires, et des techniques anoxiques strictes doivent être mises en œuvre pour leur culture. Suivant les espèces, les cultures des méthanogènes peuvent être réalisées dans un milieu minéral sous une atmosphère de H2 et CO2 (dans un rapport 4/1 – voir la réaction présentée plus loin), ou bien sur des milieux complexes. La plupart des méthanogènes connus sont mésophiles et non halophiles, mais il existe des espèces « extrêmophiles » qui se développent de façon optimale à des températures très élevées (voir figures 13.8 et 13.13) ou très basses, ou même à des concentrations très élevées en sels.

IV. Stations d’épuration : digesteurs de boues anaérobies (voir section 28.2)

Les substrats de la méthanogenèse

TABLEAU 13.4

HABITATS DES MÉTHANOGÈNES

I. Sédiments anoxiques : sédiments des étangs, des marais (voir figure 13.5) et des lacs, rizières, terrains humides (voir section 19.10) II. Tractus digestif d’animaux : (a) rumen d’animaux tels que les bovins, les ovins, les cervidés et les camélidés (voir section 19.11) (b) cæcum d’animaux tels que les chevaux et les lapins (voir section 19.11) (c) gros intestin d’animaux monogastriques tels que l’homme, le porc et le chien (voir section 21.4) (d) panse rectale des insectes cellulolytiques (termites, par exemple)

V. Endosymbiotes de divers protozoaires anaérobies (voir figure 19.26)

Au moins onze substrats ont été identifiés comme pouvant être convertis en méthane par des cultures pures de méthanogènes



(b)

(a)

(c)

Alexander Zehnder

Alexander Zehnder

Alexander Zehnder


Alexander Zehnder

434 Chapitre 13

(d)

FIGURE 13.6 Vues en microscopie électronique à balayage de cellules d’Archaea méthanogènes, montrant leur considérable diversité morphologique. (a) Methanobrevibacter ruminantium. Le diamètre d’une cellule est d’environ 0,7 µm. (b) Methanobrevibacter arboriphilus. Le diamètre d’une cellule est d’environ 1 µm. (c) Methanospirillum hungatii. Le diamètre d’une cellule est d’environ 0,4 µm. (d) Methanosarcina barkeri. Le diamètre d’une cellule est d’environ 1,7 µm.

TABLEAU 13.5

CARACTÉRISTIQUES DE QUELQUES ARCHAEA MÉTHANOGÈNESa Morphologie

Substrats pour la méthanogenèse


Methanobacterium

Bâtonnets longs

H2 + CO2, formiate

30–55

Methanobrevibacter

Bâtonnets courts

H2 + CO2, formiate

27–31

Methanosphaera

Coques

Méthanol + H2 (les deux sont nécessaires)

23–26

Methanothermus

Bâtonnets

H2 + CO2, peut aussi réduire S0 hyperthermophile

33

Methanothermobacter

Bâtonnets

H2 + CO2, formiate, thermophile

32–61

Methanococcus

Coques irréguliers

H2 + CO2, pyruvate + CO2, formiate,

29–35

Methanothermococcus

Coques

H2 + CO2, formiate

31–34

Methanocaldococcus

Coques

H2 + CO2

31–33

Methanotorris

Coques

H2 + CO2

31

Methanomicrobium

Bâtonnets court

H2 + CO2, formiate

49

Methanogenium

Coques irréguliers

H2 + CO2, formiate

47–52

Methanospirillum

Spirilles

H2 + CO2, formiate

45–50

Methanoplanus

Cellules en forme d’assiette fine aux bordures aiguisées

H2 + CO2, formiate

39–50

Methanocorpusculum

Coques irréguliers

H2 + CO2, formiate, alcools

48–52

Methanoculleus

Coques irréguliers

H2 + CO2, alcools, formiate

49–61

Methanofollis

Coques irréguliers

H2 + CO2, formiate

54–60

Methanolacinia

Bâtonnets irréguliers

H2 + CO2, alcools

38–45

Methanosarcina

Gros coques irréguliers en amas

H2 + CO2, méthanol, méthylamines, acétate

36–43

Methanolobus

Coques irréguliers en amas

Méthanol, méthylamines

39–46

Methanohalobium

Coques irréguliers

Méthanol, méthylamines ; halophile

37

Methanococcoides

Coques irréguliers

Méthanol, méthylamines

42

Methanohalophilus

Coques irréguliers

Méthanol, méthylamines, méthyle-sulfures ; halophile

39–41

Methanosaeta

Bâtonnets longs et filaments

Acétate

52–61

Methanosalsum

Coques irréguliers

Méthanol, méthylamines, diméthylsulfure

38–40

Bâtonnets en chaînettes

H2 + CO2, hyperthermophile, croissance à 110 ˚C

60

Genre Methanobacteriales

Methanococcales

Methanomicrobiales

Methanosarcinales

Methanopyrales Methanopyrus a

Les ordres sont indiqués en gras.



J. G. Zeikus et V. G. Bowen

J. G. Zeikus et V. G. Bowen

13.4 Archaea productrices de méthane : les méthanogènes 435

(a)

(b)

(a)


Helmut König et K. O. Stetter

FIGURE 13.7 Coupes fines d’Archaea méthanogènes observées en microscopie électronique à transmission. (a) Methanobrevivacter ruminantium. Le diamètre d’une cellule est d’environ 0,7 µm (b) Methanosarcina barkeri. Notez la paroi cellulaire épaisse et la formation d’une paroi interne lors de la segmentation de la cellule. Le diamètre d’une cellule est d’environ 1,7 µm. La paroi cellulaire de M. ruminantium contient des pseudopeptidoglycanes (voir figure 4.33a), alors que la paroi de M. barkeri est constituée de protéines et de polysaccharides.

König/Stetter

Stephen Zinder

(b)

(c)

(d)

FIGURE 13.8 Méthanogènes hyperthermophiles et thermophiles. (a) Methanocaldococcus jannashii (température optimale 85 ˚C), observation en microscopie électronique après ombrage. Le diamètre d’une cellule est d’environ 1 µm. (b) Methanotorris igneus (température optimale 88 ˚C), coupe mince. Le diamètre d’une cellule est d’environ 1 µm. (c) Methanothermus fervidus (température optimale 88 ˚C), coupe mince. Le diamètre d’une cellule est d’environ 0,4 µm. (d) Methanosaeta thermophila (température optimale 60 ˚C), observation en microscopie optique en contraste de phase. Le diamètre d’une cellule est d’environ 1 µm. Les particules réfringentes à l’intérieur des cellules sont des vésicules de gaz (voir section 4.12).

(voir tableau 13.6). De façon intéressante, ces substrats ne sont aucun des substrats classiques tels que le glucose, les acides organiques (autres que l’acétate et le pyruvate) et les acides gras. Des composés tels que le glucose peuvent être transformés en méthane, mais seulement dans le cadre de réactions coopéra-

tives impliquant d’autres bactéries anaérobies. Par le biais de cultures mixtes, la plupart des composés organiques, même les hydrocarbures, peuvent être théoriquement changés en méthane et en CO2 (voir section 19.10). Les substrats pour la méthanogenèse se répartissent en trois classes de composés présentées



436 Chapitre 13


dans le tableau 13.6. Ce sont les substrats de type CO2, les substrats méthylés et l’acétate. Les substrats de type CO2 comprennent le CO2 lui-même, qui est réduit en méthane par l’utilisation de H2 comme donneur d’électrons : 0

CO2 + 4 H2 → CH4 + 2 H2O

∆G ’ = –131 kJ

Les autres substrats de ce groupe sont le formiate (qui est simplement une forme combinée de CO2 et H2) et le monoxyde de carbone (CO). La seconde classe de composés est celle des substances méthylées (voir tableau 13.6). En prenant le méthanol comme modèle, la formation de CH4 peut se faire de deux façons. Dans la première, CH3OH peut être réduit par un donneur d’électrons externe tel que H2 : CH3OH + H2 → CH4 + H2O

∆G0’ = – 113 kJ

De façon alternative, en l’absence de H2, une partie du CH3OH peut être oxydée en CO2, fournissant ainsi les électrons nécessaires à la réduction des autres molécules de CH3OH en CH4 : 4 CH3OH → 3 CH4 + CO2 + 2 H2O

∆G0’ = – 319 kJ

La dernière voie de formation de méthane est la coupure d’une molécule d’acétate en CO2 et CH4, appelée réaction acétotrophe : CH3COO– + H2O → CH4 + HCO3–

∆G0’ = – 31 kJ

Seuls quelques rares méthanogènes sont acétotrophes (voir tableau 13.5). Néanmoins, les mesures de production de méthane dans les habitats à forte activité méthanogénique tels que les boues des stations d’épuration (voir section 28.2) montrent que les deux tiers du méthane produit proviennent de l’acétate et un tiers de H2 et CO2. Donc, malgré un déficit apparent en terme de diversité, les méthanogènes acétotrophes sont écologiquement très importants. Comme on peut le voir pour chacune, les réactions ci-dessus sont toutes productrices d’énergie (exergoniques) et peuvent servir à la production d’ATP. Les détails de la biochimie de la méthanogenèse seront explicités dans le chapitre 17. Notons seulement que ce processus est couplé à la formation d’une force protonmotrice et à la synthèse d’ATP par l’intermédiaire de mécanismes chimio-osmotiques (voir section 5.12). L’étape de phosphorylation des substrats, telle qu’elle existe chez les bactéries fermentatives, n’existe vraisemblablement pas chez les méthanogènes.

Methanocaldococcus jannaschii : un modèle d’Archaea méthanogène Comme nous le verrons dans la section 15.3, le génome de la Methanoarchaea Methanocaldococcus jannaschii (voir figure 13.8a) et celui de plusieurs autres méthanogènes ont été séquencés. Le génome circulaire, d’environ 1,66 Mpb, contient environ 1 700 gènes, et les gènes codant les enzymes de la méthanogenèse ainsi que ceux codant plusieurs fonctions cellulaires clés ont été identifiés grâce à l’analyse des séquences et l’annotation du génome. De façon surprenante la majorité des gènes de M. jannaschii, qui codent des fonctions telles que les voies du métabolisme central, et la division cellulaire sont identiques à ceux des Bacteria.

TABLEAU 13.6

SUBSTRATS POUVANT ÊTRE TRANSFORMÉS EN MÉTHANE PAR LES

ARCHAEA MÉTHANOGÈNES

I.

Substrats de type CO2 Dioxyde de carbone CO2, (avec H2 comme donneur d’électrons, certains alcools ou le pyruvate) Formiate, HCOO– Monoxyde de carbone, CO II. Substrats méthylés Méthanol, CH3OH Méthylamine, CH3NH3+ Diméthylamine, (CH3)2NH2+ Triméthylamine, (CH3)3NH+ Méthylmercaptan, CH3SH Diméthylsulfure, (CH3)2S III. Substrats acétotrophes Acétate, CH3COO– Pyruvate, CH3 COCOO–

Par contre les gènes codant les processus moléculaires centraux tels que la transcription et la traduction sont plus proches de ceux des eucaryotes. Ces constatations s’expliquent si on regarde l’arbre phylogénétique du vivant, qui montre que le domaine des Archaea est positionné entre le domaine des Bacteria et celui des Eukarya (voir section 11.8 et figure 11.13). Cependant, l’analyse du génome de M. jannaschii indique que quasiment 50 % de ses gènes n’ont aucun équivalent dans aucun autre groupe d’organismes. Ce qui laisse supposer qu’il existerait, encodées dans l’ADN des Archaea, de nombreuses fonctions cellulaires nouvelles non encore élucidées ou bien que de nombreuses fonctions existantes sont codées par des ensembles de gènes redondants (et complètement différents).

Contrôlez vos acquis Les Archaea méthanogènes sont des procaryotes anaérobies stricts dont le métabolisme est lié à la production de méthane (CH4). •

Qu’a démontré l’expérience de Volta ?

•

Quels sont les substrats principaux pour la méthanogenèse ?

13.5 Termoplasmatales : m n Thermoplasma, Ferroplasma et Picrophilus

Genres principaux : Thermoplasma, Ferroplasma, Picrophilus Une lignée particulière des Archaea compte trois procaryotes thermophiles et acidophiles extrêmes : Thermoplasma, Ferroplasma et Picrophilus (voir figure 13.1). Ces microorganismes sont parmi les plus acidophiles connus et, dans le



13.5 Termoplasmatales : Thermoplasma, Ferroplasma et Picrophilus 437

cas de Picrophilus, capable de croissance à un pH inférieur à 0. Ils constituent à eux seuls un ordre au sein des Euryarchaeota, les Thermoplasmatales. Nous commencerons par la description des organismes qui ressemblent aux mycoplasmes : Thermoplasma et Ferroplasma.

Archaea sans paroi

T. D. Brock

Thermoplasma et Ferroplasma sont des Archaea sans paroi et qui, de ce fait, ressemblent aux mycoplasmes (voir section 12.21). Thermoplasma (voir figure 13.9a) est un organisme chimioorganotrophe qui croît de façon optimale à 55 °C et à pH 2 sur

A. Segerer et K. O. Stetter

(a)

milieu complexe. Deux espèces du genre Thermoplasma ont été décrites : T. acidophilum et T. volcanium. Ce sont des aérobies facultatifs qui croissent aussi bien en aérobiose qu’en anaérobiose par respiration du soufre. La plupart des souches de Termoplasma acidophilum ont été isolées de terrils (voir figure 13.10). Les terrils contiennent des fragments de charbon, de la pyrite (FeS2) et d’autres composés organiques extraits du charbon. Dans les mines, les déchets issus de l’exploitation du charbon s’échauffent par combustion spontanée, générant ainsi un environnement favorable au développement des Thermoplasma qui semblent métaboliser les composés organiques relargués par les déchets de charbon. La seconde espèce de Thermoplasma, T. volcanium, a été isolée à partir de sols acides chauds dans plusieurs endroits de la planète ; elle est très mobile grâce à une touffe de flagelles polaires (voir figure 13.9b). Pour survivre aux stress osmotiques liés à l’absence de paroi et pour supporter les conditions environnementales doublement extrêmes que sont les pH faibles et les températures élevées Thermoplasma a développé une membrane cellulaire dont la structure est unique. Cette membrane contient une molécule identique à une lipoprotéine appelée lipoglycane (voir section 12.21). Cette substance est constituée d’une molécule d’un tétraéther lipidique formant une monocouche lipidique associée à du glucose et du mannose (voir figure 13.11). Cette molécule représente une fraction importante de la totalité des lipides de Thermoplasma. La membrane contient aussi des glycoprotéines, mais pas de stérols. Ces molécules confèrent à Thermoplasma sa résistance aux conditions chaudes et acides. Le génome de Thermoplasma est intéressant : comme les autres mycoplasmes (voir sections 12.21 et 15.3), elle possède un petit génome (1,5 Mpb), qui est de plus associé à une protéine de liaison à l’ADN (DNA-binding protein), ce qui provoque l’organisation de l’ADN en structures globulaires analogues aux nucléosomes des cellules eucaryotes (voir section 7.3 pour l’organisation de l’ADN chez les eucaryotes). Cette protéine présente des homologies avec les protéines histones basiques des cellules eucaryotes. Des protéines identiques aux histones ont été mises en évidences chez plusieurs autres Euryarchaeota (voir section 13.12).

FIGURE 13.9 Espèces du genre Thermoplasma. (a) Thermoplasma acidophilum, une Archaea acidophile et thermophile dont la morphologie est identique à celle des mycoplasmes. Vue d’une d’une coupe fine en microscopie électronique. Le diamètre des cellules peut varier de 0,2 à 5 µm. La cellule présentée ici a un diamêtre de 1 µm. (b) Préparation par ombrage de cellules de Thermoplasma volcanium, isolées de sources chaudes. Les cellules ont un diamètre de 1 à 2 µm. Notez l’abondance des flagelles.

T. D. Brock

(b)

FIGURE 13.10 Un terril : habitat typique des Thermoplasma. Les terrils contiennent des débris de charbon, de la pyrite et d’autres substrats microbiens et sont le siège d’une combustion autonome.



438 Chapitre 13


Ferroplasma Ferroplasma est une espèce chimiolithotrophe proche de Termoplasma. C’est une espèce fortement acidophile, cependant elle n’est pas thermophile puisqu’elle croît à 35 °C. Ferroplasma (voir figure 19.35) oxyde le Fe2+ en Fe3+ pour produire de l’énergie (cette réaction entraîne une production d’acide – voir section 19.14 et figure 13.15d) et utilise le CO2 comme source de carbone (autotrophie). Ferroplasma se développe dans les résidus miniers qui contiennent de la pyrite (FeS2). L’acidophilie exceptionnelle de Ferroplasma lui permet d’abaisser le pH de son habitat jusqu’à des valeurs extrêmement basses. Après qu’une acidité modérée a été produite par l’oxydation du Fe2+ par des micro-organismes acidophiles modérés tels qu’Acidithiobacillus ferroxidans et Leptospirillum ferroxidans, Ferroplasma devient actif et engendre les faibles valeurs de pH typiques des rejets miniers acides. Son activité peut entraîner des eaux acides à pH 0 (voir figure 19.35 et sections 19.14 et 19.15).

Picrophilus Picrophilus est une espèce phylogénétiquement proche de Thermoplasma et Ferroplasma. Si Thermoplasma et Ferroplasma sont des acidophiles extrêmes, Picrophilus l’est encore plus, car cette espèce croit de façon optimale à pH 0,7 et est capable de croître à un pH aussi extrême que pH –0,06 ! Picrophilus possède en outre une paroi en couche S (S-layer) (voir section 4.10) et le contenu en guanine et cytosine de son ADN est bien plus bas que celui de Thermoplasma ou de Ferroplasma. Aussi, bien que phylogénétiquement proches Thermoplasma, Ferroplasma et Picrophilus possèdent des génomes très différents. Deux espèces du genre Picrophilus ont été isolées de solfatares acides au Japon et, comme Thermoplasma, les deux espèces sont hétérotrophes et se développent sur milieu complexe. La physiologie de Picrophilus présente un intérêt en tant que modèle pour l’étude de la tolérance aux conditions d’acidité extrême. Les études de sa membrane cytoplasmique suggèrent l’existence d’une organisation inhabituelle des lipides qui crée une membrane hautement acide imperméable, en conditions de pH optimales. Par contre, dans des conditions d’acidité modérées, à pH 4 par exemple, la membrane de Picrophilus devient rapidement fluide et se désagrège. Cet organisme a manifestement évolué afin de ne survivre que dans les habitats fortement acides.

Liaison éther

HO O

O

O

O [R]8 Glu (α1 1)

O R = Man (α1

2) Man (α1

4) Man (α1

3)

FIGURE 13.11 Structure du glycolipide à liaisons tetraéther de Thermoplasma acidophilum. Glu, glucose ; Man, Mannose. Notez la liaison éther (en vert) et le fait que ces lipides vont former une membrane monocouche plutôt qu’une membrane bicouche (comparez avec la figure 4.19b)

Contrôlez vos acquis Thermoplasma, Ferroplasma et Picrophilus sont des thermoacidophiles qui forment à eux seuls une famille phylogénétique au sein des Archaea. Ces espèces colonisent les terrils et les solfatares acides. Les cellules de Thermoplasma et Ferroplasma sont des cellules sans paroi et ressemblent de ce fait aux mycoplasmes. •

Par quels aspects Thermoplasma et Ferroplasma sont-ils similaires ? En quoi diffèrent-ils ?

•

De quelle façon Thermoplasma renforce-t-il sa membrane cellulaire pour survivre en l’absence de paroi cellulaire ?

•

Comment Ferroplasma produit-t-il l’énergie nécessaire à sa croissance ?

13.6 Euryarchaeota hyperthermophiles : m n Thermococcales et Methanopyrus Genres principaux : Thermococcus, Pyrococcus, Methanopyrus Quelques Euryarchaeota vivent dans des environnements chauds et certaines sont hyperthermophiles. Nous allons présenter ici trois exemples d’organismes hyperthermophiles dont la position dans l’arbre phylogénétique (voir figure 13.1) est très proche de la racine. Deux de ces organismes, Thermococcus et Pyrococcus, présentent des caractéristiques phénotypiques très similaires de celles des Crenarchaeota hyperthermophiles, qui seront présentées dans les sections 13.8 à 13.10, et forment un ordre distinct : les Thermococcales (voir tableau 13.9). L’autre organisme, Methanopyrus, est une Methanoarchaea qui ressemble beaucoup aux autres espèces méthanogènes (voir section 13.4 et tableau 13.5) en ce qui concerne sa physiologie de base, mais qui est différente de par son hyperthermophilie et sa position phylogénétique.

Thermococcus et Pyrococcus Thermococcus est une Euryarchaeota hyperthermophile de forme sphérique, indigène des sources thermales anoxiques de divers endroits dans le monde. Les cellules possèdent une touffe de flagelles polaires et sont ainsi très mobiles (voir figure 13.12a). Thermococcus est un organisme anaérobie strict, chimio-organotrophe, qui croît sur des protéines et d’autres substrats organiques complexes (y compris des sucres) et utilise S0 comme accepteur terminal d’électrons. Il se développe à des températures optimales comprises entre 75 et 95 °C. Pyrococcus présente une morphologie identique à celle de Thermococcus, mais s’en différencie essentiellement par sa croissance dans des conditions de température plus élevées. Pyrococcus (littéralement, en latin, la « boule de feu ») croît à des températures comprises entre 70 et 106 °C (température optimale à 100 °C). Thermococcus et Pyrococcus sont aussi physiologiquement semblables. Des protéines, l’amidon ou le maltose, sont oxydées en tant que donneurs d’électrons



13.7 Euryarchaeota hyperthermophiles : Archaeoglobales 439 R. Rachel et K. O. Stetter

et S0, l’accepteur terminal d’électron, est réduit en H2S. La plupart des propriétés de Thermococcus et Pyrococcus seront décrites plus loin (voir tableaux 13.8 et 13.9).

Methanopyrus

(a)

G. Fiala et K. O. Stetter

H. König et K. O. Stetter

Methanopyrus est un hyperthermophile en forme de bâtonnet (voir figure 13.13). Il a été isolé à partir de sédiments situés à proximité de sources hydrothermales océaniques et à partir de la paroi d’une cheminée hydrothermale de type « fumeur noir » (voir sections 13.8 et 19.8 pour la description des sources hydrothermales). Methanopyrus occupe une position phylogénétique unique dans l’arbre des Archaea (voir figure 13.1), se situe à la base de l’arbre des Archaea et partage les propriétés phénotypiques des hyperthermophiles (la température de croissance maximale de Methanopyrus est de 110 °C) et celles des méthanogènes. Methanopyrus ne produit du méthane qu’à partir de H2 et CO2, et sa croissance est rapide pour un organisme autotrophe (son temps de génération est d’une heure à sa température optimale de croissance, soit 100 °C). Par contre, à l’inverse des Methanoarchaea mésophiles, les cellules de Methanopyrus contiennent du 2,3-diphosphoglycérate cyclique, un produit de la glycolyse, en solution dans le cytoplasme. Ce composé présent à des concentrations supérieures à 1 M est supposé fonctionner comme un agent thermostabilisant qui pourrait empêcher la dénaturation des enzymes et de l’ADN à l’intérieur de la cellule (voir section 13.12). Methanopyrus est également unique par la présence dans sa membrane de lipides qui n’existent chez aucun autre organisme connu. Rappelons que dans les lipides des Archaea les chaînes latérales du glycérol contiennent des phytanyles plutôt que des acides gras, liés au glycérol par des liaisons éther (voir section 4.5). Chez Methanopyrus, le lipide lié au glycérol par une liaison éther est une forme insaturée des tétraéthers de dibiphytanyle, que l’on trouve chez les autres Archaea hyperthermophiles (voir figure 13.13b et aussi section 4.5 et

(b)

FIGURE 13.12 Archaea hyperthermophiles de forme sphérique des zones volcaniques sous-marines. (a) Thermococcus celer. Observation de cellules au microscope électronique après ombrage (notez la touffe de flagelles). (b) Cellules de Pyrococcus furiosus en division. Observation d’une coupe fine en microscopie électronique. Les cellules de ces deux

(a) CH3

O CH3

CH3

CH3

CH3 CH3

CH3

CH3

CH3

CH3

O OH

Liaison éther

(b) FIGURE 13.13 Methanopyrus. Methanopyrus croît de façon optimale à 100 ˚C et synthétise du méthane à partir de CO 2 et H2 uniquement. Vue au microscope électronique de Methanopyrus kandleri, le plus thermophile de tous les méthanogènes connus (température maximale 110 ˚C). Cette cellule mesure 0,5 × 8 µm. (b) Structure d’un lipide spécifique de M. kandleri. Il possède la liaison éther caractéristique des Archaea (voir section 4.5), mais la chaîne latérale est une forme insaturée de phytanyle, appelée géranylgéraniol. On suppose que ce lipide inhabituel préfigure la structure des phytanyles saturés et que Methanopyrus est, par conséquent, une lignée très ancienne au sein des Archaea, les données de la figure 13.1 soutenant cette hypothèse.

figure 4.19). En raison de la biochimie de la voie de biosynthèse de ces lipides, on pense qu’ils représentent une caractéristique primitive. En plus de sa position phylogénétique, de son hyperthermophilie et de son métabolisme anaérobie, les lipides primitifs de Methanopyrus font de cet organisme un fascinant modèle de forme de vie primitive. La découverte de Methanopyrus a permis d’apporter une explication à la présence de méthane dans les sédiments océaniques surchauffés, pour lesquels on pensait que la température était trop élevée pour permettre la synthèse biogénique de méthane. Methanopyrus a été isolé à partir d’un échantillon prélevé à environ 2 000 mètres de profondeur ; à cette profondeur l’eau reste liquide à des températures pouvant aller jusqu’à 350 °C. Ces conditions rendent possible l’existence d’autres espèces méthanogènes hyperthermophiles capables de se développer à 110 °C, voire à une plus haute température.

13.7 Euryarchaeota hyperthermophiles : m n Archaeoglobales Genres principaux : Archaeoglobus, Ferroglobus Nous verrons dans les sections qui leur sont consacrées que de nombreuses Crenarchaeota hyperthermophiles mettent en œuvre une respiration anaérobie dans laquelle le soufre élémentaire (S0), utilisé comme accepteur terminal d’électrons, est réduit en H2S (voir tableau 13.8). Curieusement, aucun de ces crenarchaeotes n’est sulfato-réducteur, capable de réduire SO42– en H2S. Par contre, l’euryarchaeote hyperthermophile, Archaeoglobus, est un



440 Chapitre 13


organisme sulfato-réducteur vrai qui forme une lignée distincte au sein des Euryarchaeota (voir figure 13.1).

Ferroglobus Ferroglobus (voir figure 13.14b) est phylogénétiquement proche d’Archaeoglobus, mais n’est pas un organisme sulfato-réducteur. Ferroglobus est un organisme chimiolithotrophe, autotrophe, oxydant le fer, qui produit son énergie grâce à l’oxydation du fer ferreux (Fe2+) en fer ferrique (Fe3+) en conditions anaérobies, couplée à la réduction de nitrate (NO3–) en nitrite (NO2–) et en monoxyde d’azote (NO) [voir tableau 13.8]. Ferroglobus peut également utiliser H2 ou H2S comme donneurs d’électrons. Ferroglobus a été isolé d’une source hydrothermale côtière et croît de façon optimale à 85 °C. C’est un organisme intéressant pour plusieurs raisons, mais plus spécialement par sa capacité à oxyder le Fe2+ en Fe3+ en conditions anoxiques. Ce procédé pourrait aider à expliquer la présence de Fe3+ dans les roches anciennes telles que les

(a)


Archaeaoglobus a été isolé à partir de sédiments marins surchauffés à proximité d’une source hydrothermale. Le métabolisme de Archaeaoglobus associe l’oxydation de H2, du lactate, du pyruvate, du glucose ou de substrats organiques complexes à la réduction des sulfates en sulfures. Les cellules d’Archaeoglobus sont des coques irréguliers (voir figure 13.14a) et les cultures se développent de façon optimale à 83 °C. Archaeaoglobus et les méthanogènes ont des propriétés communes. La biochimie unique des méthanogènes sera abordée dans le chapitre 17. Brièvement, ce procédé implique une série de nouveaux coenzymes, à quelques exceptions près, ces coenzymes n’ont été identifiés que chez les méthanogènes (voir section 17.17). Toutefois, de façon surprenante, Archaeaoglobus contient ces coenzymes et les cultures de cet organisme produisent effectivement de petites quantités de méthane durant la croissance. Ainsi Archaeaoglobus, dont la position phylogénétique est relativement proche de celle des méthanogènes (voir figure 13.1) pourrait être, d’un point de vue physiologique, un organisme intermédiaire qui rapprocherait les productions d’énergie par réduction du soufre et par la méthanogenèse. Cependant, le séquençage du génome d’Archaeaoglobus a mis en évidence une énigme concernant la méthanogenèse. Bien qu’Archaeaoglobus soit capable de produire du méthane, il ne possède pas les gènes d’une enzyme clé de la méthanogenèse : la méthyle CoM réductase (voir section 17.17). Ainsi, la petite quantité de méthane produite par Archaeaoglobus n’est pas le fait de cette enzyme clé et son origine reste donc inexpliquée. Le génome d’Archaeaoglobus compte environ 2 400 gènes, dont un grand nombre est commun avec les méthanogènes (voir section 13.4). Cependant le génome d’Archaeaoglobus contient des gènes spécifiques à cet organisme, ce qui confirme la très grande diversité qui existe chez les Archaea. De même que chez certaines espèces de Bacteria, approximativement un tiers des gènes sont uniques et présents chez aucun autre organisme (voir section 15.3).


Archaeaoglobus et son génome

(b) FIGURE 13.14 Les Archaeoglobales. (a) Observation en microscopie électronique en transmission de l’hyperthermophile sulfato-réducteur Archaeoglobus fulgidus. Les cellules ont un diamètre de 0,7 µm. (b) Observation en microscopie électronique après cryodécapage de Ferroglobus placidus, un hyperthermophile qui oxyde le fer ferreux et réduit le nitrate. Les cellules ont un diamètre d’environ 0,8 µm.

formations ferrifères rubannées (banded iron formations) (voir section 11.3), dont on a d’abord pensé qu’elles étaient dues à l’oxydation du fer ferreux par l’oxygène produit par les cyanobactéries (photosynthèse oxygénique). Le métabolisme de Ferroglobus a donc des implications en ce qui concerne la datation de l’origine des cyanobactéries, et par conséquent l’apparition de l’oxygène sur la Terre (voir sections 11.1 et 11.2). Certaines bactéries phototrophes anaérobies sont également capables d’oxyder le Fe2+ en conditions anoxiques (voir section 17.11). Il existe donc manifestement plusieurs voies anoxiques possibles pour la production de Fe3+ ancien ; il devient ainsi difficile d’estimer précisément à quel moment les cyanobactéries ont commencé à se développer.

Contrôlez vos acquis Les Euryarchaeota hyperthermophiles incluent les Thermococcales, les Archaeoglobales et Methanopyrus. Tous les organismes de ce groupe ont des températures optimales de croissance supérieures à 80 °C.



13.8 Habitats et métabolisme énergétique des Crenarchaeota 441

•

En quoi le métabolisme de Thermococcus diffère-til de celui de Methanopyrus ?

•

Quelle Euryarchaeota hyperthermophile est une sulfato-réductrice vraie ?

•

En quoi le métabolisme de Ferroglobus diffère-t-il de celui d’Archaeoglobus ?

III

CRENARCHAEOTA

Les Crenarchaeota sont phylogénétiquement distinctes des Euryarchaeota (voir figure 13.1), et les organismes de cet embranchement vivent aux deux extrémités des conditions de températures naturelles : l’eau en ébullition et l’eau glacée. Néanmoins, toutes les Crenarchaeota cultivées sont des hyperthermophiles (croissance optimale au-dessus de 80 °C) et certaines en fait possèdent une température optimale de croissance supérieure à la température d’ébullition de l’eau. Nous commencerons par une vue d’ensemble de leurs habitats et de leur métabolisme énergétique, puis nous décrirons les propriétés de quelques genres caractéristiques.

13.8 Habitats et métabolisme m n énergétique des Crenarchaeota Le tableau 13.7 présente les différents habitats des Crenarchaeota. Ce sont des environnements soit très chauds, soit très froids. La plupart des Archaea hyperthermophiles ont été isolées à partir de sols chauffés par l’activité géothermique ou bien d’eau contenant du soufre élémentaire ou des sulfures. (voir figure 13.15), et la majorité des espèces métabolisent le soufre d’une façon ou d’une autre. Dans les environnements terrestres, les sources sulfureuses, les boues bouillonnantes et les sols peuvent atteindre des températures proches de 100 °C

TABLEAU 13.7

et peuvent présenter une acidité moyenne à forte liée à la production d’acide sulfurique (H2SO4) par oxydation biologique de H2S et S0 (voir sections 17.10 et 19.13). De tels environnements riches en soufre, appelés solfatares sont présents partout dans le monde, comme en Italie, en Islande, en Nouvelle-Zélande et aux États-Unis (parc de Yellowstone, dans le Wyoming). En fonction de la géologie environnante, les solfatares peuvent être légèrement alcalins, à des pH compris entre 5 et 8 ou extrêmement acides avec des valeurs de pH inférieures à 1. Les Crenarchaeota hyperthermophiles proviennent de tous ces types d’environnements, mais la majorité de ces organismes colonisent les habitats chauds neutres ou légèrement acides. Les Archaea hyperthermophiles se développent non seulement dans ces habitats naturels, mais également dans des habitats chauds artificiels tels que les rejets chauds des centrales géothermiques. Les Crenarchaeota hyperthermophiles colonisent également les sources chaudes océaniques appelées sources hydrothermales. Nous aborderons la géologie et la microbiologie de ces habitats dans la section 19.8. Notons simplement à ce stade que les eaux sous-marines peuvent être beaucoup plus chaudes qu’en surface en raison de la pression hydrostatique liée à la profondeur. Ainsi, toutes les espèces hyperthermophiles dont la température optimale de croissance est supérieure à 100 °C proviennent de ces sources chaudes sous-marines. Ces dernières sont soit littorales, comme celles situées au large de Vulcano, en Italie, soit profondes, comme celles situés sur les dorsales océaniques (voir figure 19.8). Les sources hydrothermales profondes sont les habitats les plus chauds colonisés par des micro-organismes.

Crenarchaeota psychrophiles Contrairement aux hyperthermophiles, les Crenarchaeota psychrophiles (voir tableau 13.7) ont été identifiées par l’analyse des gènes codant les ARN ribosomiques 16S présents dans les communautés microbiennes de nombreux environnements

LES HABITATS DES CRENARCHAEOTA Zones thermalesa

Caractéristiques

Terrestres

Zones non thermalesb Marines

Localisation

Solfatares (sources chaudes, fumeroles, sources de boues, sols surchauffés) ; installations de production géothermique ; croûte terrestre profonde

Sources thermales sous-marines, sédiments chauds, sources hydrothermales (« fumeurs noirs ») ; puits de pétrole profonds

Plancton de l’océan mondial ; eaux antarctiques côtières et profondes, glaces de mer, symbiotes d’éponges marines

Température

En surface jusqu’à 100 ˚C ; en subsurface au-delà de 100 ˚C

Jusqu’à 400 ˚C (sources hydrothermales)

de –2 à +4 ˚C

Salinité/pH

Généralement moins de 1 % de NaCl ; pH 0,5 à 9

Modérée, environ 3 % de NaCl ; pH 5 à 9

de 3 à 8 % NaCl ; pH 7 à 9

Gaz et autres nutriments

CO2, CO, CH4, H2, H2S, S0, S2O32–, SO42–, NH4+, N2

Comme pour les espèces terrestres

Pour les chimiolithotrophes, substrats inorganiques tels que NH4+

a b

Voir figures 13.10 et 13.15 (voir aussi figures 19.19 à 19.21). Voir figure 13.16. Quelques espèces d’Euryarchaeota sont également présentes dans les eaux des océans.




(a)

T. D. Brock

T. D. Brock

442 Chapitre 13

T. D. Brock

T. D. Brock

(c)

(d)

(b) FIGURE 13.15 Les habitats des Archaea hyperthermophiles . (a) Un solfatare dans le parc national de Yellowstone, États-Unis. De la vapeur riche en hydrogène sulfuré s’échappe de la surface du sol. En raison de la chaleur et de l’acidité, seuls des procaryotes peuvent s’y développer. (b) Source chaude riche en sulfures, un habitat qui abrite des populations importantes de Sulfolobus. Dans les solfatares et les sources sufureuses, l’acidité provient de l’oxydation de H 2S et S˚ en H2SO4 (acide sulfurique) par Sulfolobus et d’autres procaryotes proches. (c) « Imperial Geyser », une source d’eau en ébullition, à pH neutre, du parc de Yellowstone. De nombreuses espèces d’Archaea hyperthermophiles colonisent cet habitat. (d) Une source géothermale acide, riche en fer, un autre habitat de Sulfolobus. Dans ce cas, c’est l’oxydation de Fe2+ en Fe3+ qui provoque l’acidification du milieu (Fe3+ + 3H20 → Fe(OH)3 + 3H+).

non géothermiques. Par exemple, l’utilisation de sondes phylogénétiques fluorescentes (voir sections 11.7 et 18.4) a permis de détecter des Crenarchaeota dans l’eau des océans partout dans le monde (voir figure 13.16b). Au contraire des hyperthermophiles, les Crenarchaeaota marines colonisent les eaux très froides et les glaces de mer telles qu’on les trouve dans l’océan Antarctique (voir figure 13.16a). Ces organismes sont planctoniques (libres ou fixés aux particules en suspension dans la colonne d’eau) et sont présents à des concentrations significatives (~104/mL) dans des eaux dont la concentration en nutriments est faible et qui sont très froides (2-4 °C dans l’eau de mer et moins de 0 °C dans la glace de mer). Bien que leur physiologie soit encore un mystère, les analyses des lipides membranaires des Crenarchaeota, obtenues par filtration d’eau de mer, montrent qu’elles contiennent des lipides liés par des liaisons éther, typiques des Archaea (voir sections 4.5 et 11.9). L’écologie des Crenarchaeota marines sera présentée dans la section 19.6.

Des Euryarchaeota psychrophiles sont également présentes dans l’environnement marin. D’après les études menées jusqu’ici, il apparaît que ces organismes sont plus abondants dans les eaux tempérées de surface, alors que les Crenarchaeota semblent plus abondantes dans les eaux froides (voir figure 13.16a) et dans les eaux très profondes (voir section 19.6 et figure 19.13).

Métabolisme énergétique À quelques exceptions près, les Crenarchaeota hyperthermophiles sont anaérobies stricts. Les mécanismes de production d’énergie sont soit la chimio-organotrophie soit la chimiolithotrophie (voire les deux, chez Sulfolobus par exemple), et impliquent une grande diversité d’accepteurs et de donneurs d’électrons (voir tableau 13.8). La fermentation est rare, et la stratégie énergétique la plus répandue est la respiration anaérobie (voir tableau 13.8). La production d’énergie lors de ces



Ed DeLong

Ed DeLong

13.8 Habitats et métabolisme énergétique des Crenarchaeota 443

(b)

(a)

FIGURE 13.16 Les Crenarchaeota des environnements froids. (a) Photographie de la péninsule Antarctique (prise à partir d’un bateau). Les eaux froides situées sous la couche de glace constituent l’habitat des Crenarchaeota psychrophiles. (b) Observation en microscopie à épifluorescence d’un échantillon d’eau de mer incubé en présence d’une sonde oligonucléotidique, marquée avec un fluorochrome vert et spécifique des gènes codant les ARNr 16S d’espèces appartenant aux Crenarchaeota (voir section 11.7 pour la description de la méthode utilisée). Les cellules en bleu sont colorées avec du DAPI, qui se fixe sur toutes les cellules (voir section 18.3 et figure 18.6). Les cellules colorées en vert sont donc des Crenarchaeota psychrophiles. Voir section 19.6 et figure 19.13 pour la description des Bacteria et des Archaea de la colonne d’eau dans les océans.

TABLEAU 13.8

RÉACTIONS PRODUCTRICES D’ÉNERGIE CHEZ LES ARCHAEA HYPERTHERMOPHILES

Type Chimioorganotrophe

Chimiolithotrophe

Réaction productrice d’énergie

Type métaboliquea

Exemple

Composé organique + S0 → H2S + CO2

RAn

Thermoproteus, Thermococcus, Desulfurococcus, Thermofilum, Pyrococcus

Composé organique + SO42– → H2S + CO2

RAn

Archaeoglobus

Composé organique + O2 → H2O + CO2

RAe

Sulfolobus

Composé organique → CO2 + H2 + acides gras

F

Staphylothermus, Pyrodictium

Composé organique + Fe 3+ → CO2 + Fe2+

RAn

Pyrodictium

Pyruvate → CO2 + H2 + acétate

F

Pyrococcus

H2 + S → H2S

RAn

Acidianus, Pyrodictium, Thermoproteus, Stygiolobus, Ignicoccus

H2 + NO3– → NO2– + H2O (NO2– est réduit en N2 par quelques espèces)

RAn

Pyrobaculum

4 H2 + NO3– + H+ → NH4+ + 2 H2O + OH–

RAn

Pyrolobus

RAn

Pyrobaculum, Pyrodictium, Archaeoglobus

RAe

Acidianus, Sulfolobus, Pyrobaculum

2 S + 3 O2 + 2 H2O → 2 H2OSO4

RAe

Sulfolobus, Acidianus

2 FeS2 + 7 O2 + 2 H2O → 2 FeSO4 + 2 H2OSO4

RAe

Sulfolobus, Acidianus, Metallosphaera

2 FeCO3 + NO3– + 6 H2O → 2 Fe(OH)3 + NO2– + 2 HCO3– + 2 H+ + H2O

RAn

Ferroglobus

4 H2 + SO42– + 2 H+ → 4 H2O + H2S

RAn

Archaeoglobus

4 H2 + CO2 → CH4 + 2 H2O

RAn

Methanopyrus, Methanocaldococcus, Methanothermus

0

3+

H2 + 2 Fe

2+

→ 2 Fe

+

+2H

2 H2 + O2 → 2 H2O 0

a

procédés respiratoires est réalisée par le même mécanisme général que celui largement répandu chez les Bacteria : le transfert des électrons à travers la membrane cytoplasmique menant à la formation d’une force proton-motrice à partir de laquelle de l’ATP est produit par des ATPases à translocation de protons (voir section 5.12). De nombreuses Crenarchaeota hyperthermophiles peuvent croître en chimiolithotrophie en condition anaérobie, avec H2 comme donneur d’électrons et S0 ou NO3– comme accepteur d’électrons ; quelques-unes peuvent cependant oxyder H2 en aérobiose (voir tableau 13.8). La respiration de H2 avec le fer ferrique (Fe3+) comme accepteur d’électrons existe également chez plusieurs hyperthermophiles. D’autres modes de vie chimiolithotrophes possibles sont l’oxydation de S0 et de Fe2+ en aérobiose ou de Fe2+ en anaérobiose avec NO3– comme accepteur d’électrons (voir tableau 13.8). Un seul sulfato-réducteur hyperthermophile est connu (l’euryote Archaeoglobus – voir section 13.7). La seule option bioénergétique absente est apparemment la photosynthèse. L’organisme photosynthétique le plus thermophile connu peut se développer jusqu’à 73 °C (voir tableau 6.1), cette température étant trop basse pour la plupart des hyperthermophiles (voir tableau 13.9). Après cette présentation générale des habitats et du métabolisme énergétique des Crenarchaeota hyperthermophiles, nous allons nous intéresser à quelques organismes représentatifs.

RAn, respiration anaérobie ; RAe, respiration aérobie ; F, fermentation.



444 Chapitre 13

TABLEAU 13.9


PROPRIÉTÉS DE QUELQUES CRENARCHAEOTA HYPERTHERMOPHILES Température

Groupe/Genrea

Morphologie

Relation à O2b


Minimum

Optimum

Maximum

pH optimal

Sulfolobales Sulfolobus

Coque lobé

Ae

37

55

75

87

2-3

Acidianus

Coque

Fac

31

60

88

95

2

Metallosphaera

Coque

Ae

45

50

75

80

2

Stygiolobus

Coque lobé

An

38

57

80

89

3

Stetteria

Coque

An

65

68

95

102

6

Sulfophobococcus

Disque

An

54-56

70

85

95

7,5

Thermosphaera

Coque

An

46

67

85

90

7

Thermoproteus

Bâtonnet

An

56

60

88

96

6

Thermophilum

Bâtonnet

An

57

70

88

95

5,5

Pyrobaculum

Bâtonnet

Fac

46

74

100

102

6

Caldivirga

Bâtonnet

An

43

60

85

92

4

Thermocladium

Bâtonnet

An

52

60

75

80

4,2

Desulfurococcus

Coque

An

51

70

85

95

6

Aeropyrum

Coque

Ae

56

70

95

100

7

Staphylothermus

Coques en amas

An

35

65

92

98

6-7

Pyrodictium

Disque avec filaments

An

62

82

105

110

6

Pyrolobus

Coque lobé

Fac

53

90

106

113

5,5

Thermodiscus

Disque

An

49

75

90

98

5,5

Ignicoccus

Coque irrégulier

An

35

65

90

103

5

Hyperthermus

Coque irrégulier

An

56

75

102

108

7

Sulfurisphaera

Coque

Fac

33

63

84

92

2

Sulfurococcus

Coque

Ae

43-46

40

75

85

2,5

Archaeoglobus

Coque

An

46

64

83

95

7

Ferroglobus

Coque irrégulier

An

43

65

85

95

7

Thermococcus

Coque

An

38–57

70

88

98

6-7

Pyrococcus

Coque

An

38

70

100

106

6-8

Thermoproteales

Desulfurococcales

c

Archaeoglobales

Thermococcalesd

a

Les noms se terminant en « ales » sont des noms d’ordres (voir section 11.10). b Ae, aérobie ; An, anaérobie ; Fac, aérobie facultatif. c Une espèce peut croître à 121 ˚C. d Phylogénétiquement, les genres de cet ordre d’hyperthermophiles appartiennent aux Euryarchaeota (voir sections 13.6 et 13.7).

m n

13.9 Hyperthermophiles des habitats volcaniques terrestres : Sulfolobales et Thermoprotéales

Genres principaux : Sulfolobus, Acidianus, Thermoproteus, Pyrobaculum

Les habitats volcaniques peuvent présenter des températures pouvant atteindre 100 °C et sont donc propices au développement des Archaea hyperthermophiles. Deux organismes phylogénétiquement proches ont été isolés de ces environnements : Sulfolobus et Acidianus. Ils représentent les deux genres majeurs de l’ordre des Sulfolobales (voir tableau 13.9).



13.9 Hyperthermophiles des habitats volcaniques terrestres : Sulfolobales et Thermoprotéales 445

Les Sulfolobales

(voir figure 13.17b) diffère de Sulfolobus principalement par sa capacité à croître en anaérobiose. De façon remarquable, cet organisme est capable d’utiliser le S0 en présence ou en l’absence d’oxygène. En conditions aérobies, il utilise S0 comme donneur d’électrons en l’oxydant en H2SO4 avec O2 comme accepteur d’électrons. En conditions anaérobies, Acidianus utilise le S0 comme accepteur d’électrons (avec H2 comme donneur d’électrons) et fournit du H2S comme produit de réduction. Ainsi, le devenir métabolique de S0 dans les cultures d’Acidianus va dépendre de la présence ou de l’absence de O2. Comme celles de Sulfolobus, les cellules d’Acidianus sont approximativement sphériques, mais ne sont pas lobées (voir figure 13.17b). Acidianus croît à des températures comprises entre 65 et 95 °C, avec une température optimale vers 90 °C.

Sulfolobus se développe dans des sources chaudes, acides et riches en soufre, à des températures pouvant atteindre 90 °C et à un pH compris entre 1 et 5*. Sulfolobus (voir figure 13.17a) est un organisme chimiolithotrophe aérobie qui oxyde H2S ou S0 en H2SO4 et qui utilise le CO2 comme source de carbone. Il peut également se développer en chimio-organotrophie. Ses cellules sont plus ou moins sphériques, mais lobées (voir figure 13.17a). Elles adhèrent étroitement aux cristaux de soufre, comme on peut l’observer au microscope après coloration avec un fluorochrome (voir figure 17.26b). Sulfolobus peut, en plus de la respiration des composés soufrés ou organiques, oxyder le Fe2+ en Fe3+, et ceci permet des applications possibles dans la lixiviation à haute température des minerais de fer ou de cuivre (voir section 19.15). Un organisme proche de Sulfolobus vit également dans les sources sulfureuses acides. Cet organisme, appelé Acidianus

Les Thermoprotéales

T. D. Brock

* Note historique : Sulfolobus a été découvert pour la première fois par Thomas Brock et ses collaborateurs en 1970, et formellement décrit en 1972. La découverte de Sulfolobus ainsi que l’isolement quelque temps auparavant de Thermus aquaticus (source de la très thermostable Taq ADNpolymérase – voir section 7.9) ont marqué les débuts de la microbiologie des hyperthermophiles. Sulfolobus, en particulier, est le premier procaryote décrit comme étant capable de croître à une température supérieure à 80 °C. Thomas Brock est l’auteur principal de la première édition de ce livre et il est actuellement professeur émérite de l’université du Wisconsin à Madison (États-Unis). Depuis 1980, Karl Stetter et ses collaborateurs, à l’université de Ragensburg (Allemagne), ont largement contribué à l’expansion de la microbiologie des hyperthermophiles avec la description de nombreux nouveaux genres et espèces.


Les genres principaux de l’ordre des Thermoprotéales sont Thermoproteus, Thermophilum et Pyrobaculum. Les organismes des genres Thermoproteus et Thermophilum colonisent des sources chaudes neutres ou légèrement acides. Les cellules de Thermoproteus sont des bâtonnets rigides d’environ 0,5 µm de diamètre et dont la longueur peut varier considérablement ; de cellules courtes de 1 ou 2 µm (voir figure 13.18) à des filaments de 70 à 80 µm de long. Les filaments de Thermophilum sont plus fins, avec une largeur de 0,17 à 0,35 µm et peuvent atteindre 100 µm de long (voir figure 13.18b). Thermoproteus et Thermophilum sont tous deux des anaérobies stricts qui respirent le S0 (voir tableau 13.8). Contrairement à la plupart des hyperthermophiles, leur sensibilité à

(a)

(b)

FIGURE 13.17 Des Archaea hyperthermophiles et acidophiles, les Sulfolobales. (a) Sulfolobus acidocaldarius. Observation d’une coupe fine en microscopie électronique. (b) Acidianus infernus. Observation d’une coupe fine en microscopie électronique. Les cellules de ces deux organismes ont un diamètre qui varie de 0,8 à 2 µm.





446 Chapitre 13

13.10 Hyperthermophiles des habitats m n volcaniques sous-marins : Desulfurococcales

Genres principaux : Pyrodictium, Pyrolobus, Ignocccus, Staphylothermus

(b)

Nous allons aborder maintenant les habitats volcaniques sousmarins, dont sont originaires les plus thermophiles des Archaea. Ces habitats sont les sources thermales sous-marines côtières et les sources hydrothermales océaniques profondes. Nous reviendrons sur la géologie de ces habitats microbiens fascinants dans la section 19.8. Ces organismes constituent au sein des Archaea l’ordre des Desulfurococcales (voir tableau 13.9).



(a)

(c) FIGURE 13.18 Des Archaea hyperthermophiles en bâtonnets, les Termoprotéales. (a) Thermoproteus neutrophilus. Observation d’une coupe fine en microscopie électronique. Le diamètre de la cellule est d’environ 0,5 µm. (b) Thermophilum librum. Le diamètre de la cellule est d’environ 0,25 µm. (c) Pyrobaculum aerophilum. Observation en microscopie électronique à transmission d’une coupe fine ; une cellule mesure 0,5 × 3,5 µm.

l’oxygène est extrême, comparable à celle des méthanogènes (voir section 13.4). Ainsi des précautions rigoureuses doivent être prises pour les cultiver. La plupart des isolats de Thermoproteus peuvent croître en chimiolithotrophie sur H2 ou en chimio-organotrophie sur des substrats carbonés complexes tels que l’extrait de levure, des petits peptides, l’amidon, le glucose, l’éthanol, le malate, le fumarate ou le formiate (voir tableau 13.8). Thermoproteus et Thermophilum possèdent des contenus en G et C de l’ADN similaire (56 à 58 %), mais des analyses d’hybridation ADN-ADN ont montré que leurs génomes sont différents (voir section 11.11). Pyrobaculum (voir figure 13.18c) est un hyperthermophile en forme de bâtonnet et sa physiologie est unique au sein des Thermoprotéales sur au moins un aspect : certaines espèces de Pyrobaculum sont capables de respiration aérobie. De plus, les cultures de Pyrobaculum peuvent mettre en œuvre une respiration anaérobie avec NO3–, Fe3+ ou S0 comme accepteur d’électrons et H2 comme donneur d’électrons, donc une croissance en chimiolithoautotrophie. D’autres espèces de Pyrobaculum peuvent croître en anaérobiose en utilisant un donneur d’électron organique et en réduisant S0 en H2S. La température optimale de croissance de Pyrobaculum est de 100 °C, et des espèces de ce genre ont été isolées aussi bien de sources chaudes terrestres que de sources hydrothermales.

Les genres Pyrodictium et Pyrolobus Pyrodictium et Pyrolobus sont des exemples de procaryotes dont les températures de croissance dépassent 100 °C. La température optimale de croissance de Pyrodictium est de 105 °C et celle de Pyrolobus, de 106 °C. Les cellules de Pyrodictium ont une forme de disque irrégulier et les cultures forment un réseau, ressemblant à du mycélium, fixé aux cristaux de soufre élémentaire. La biomasse est constituée d’un réseau de fibres auxquelles les cellules sont attachées (voir figure 13.19a et b). Les fibres sont creuses et constituées de protéines organisées de façon analogue à celles des flagelles bactériens (voir section 4.14). Ces filaments n’ont cependant pas de rôle dans la mobilité cellulaire, mais servent d’organes de fixation (voir figure 13.23). La paroi cellulaire de Pyrodictium est composée de glycoprotéines. En ce qui concerne sa physiologie, Pyrodictium est un anaérobie strict chimiolithotrophe utilisant H2 avec S0 comme accepteur d’électrons ou un chimio-organotrophe métabolisant un mélange complexe de composés organiques (voir tableau 13.8). Pyrolobus fumarii (voir figure 13.19c) détient actuellement le record du plus thermophile de tous les procaryotes caractérisés. Sa température maximale de croissance est de 113 °C (voir tableau 13.9). Pyrolobus a été isolé de la paroi d’une cheminée hydrothermale ou « fumeur noir » (voir section 19.8), dans laquelle sa capacité à croître en autotrophie contribue à la production de carbone organique dans cet environnement inorganique. D’autres espèces du genre Pyrolobus ont été isolées et peuvent apparemment se développer à des températures supérieures à 113 °C ; ce genre contient donc les plus hyperthermophiles de tous les microorganismes connus. Les cellules de Pyrolobus sont des coques (voir figure 13.19c) et leur paroi cellulaire est de nature protéique. Cet organisme est un chimiolithotrophe H2 dépendant obligatoire, qui se développe grâce à l’oxydation de H2 couplée à la réduction de NO3– (en NH4+), S2O32– (en H2S) ou à de très faibles concentrations en O2 (en H2O). Outre sa nature extrêmement thermophile, Pyrolobus est également capable de résister à des températures nettement supérieures à sa température maximale de croissance. Il peut par exemple survivre à l’autoclavage (121 °C) pendant une heure, des conditions auxquelles même les endospores bactériens (voir section 4.13) ne peuvent résister.





13.10 Hyperthermophiles des habitats volcaniques sous-marins : Desulfurococcales 447

(a)


(c)

(b)

Les genres Desulfurococcus et Ignicoccus Parmi les autres membres remarquables des Desulfurococcales, on trouve le genre Desulfurococcus, dont le nom de l’ordre est issu (voir figure 13.20a), et le genre Ignicoccus. Desulfurococcus est un anaérobie strict sulfo-réducteur comme Pyrodictium, dont il diffère en étant beaucoup moins thermophile, sa température optimale de croissance se situant vers 85 °C. Ignicoccus croit de façon optimale à 90 °C et son métabolisme est fondé sur le couple H2/S0 comme de nombreuses Archaea hyperthermophiles (voir tableau 13.8). Ignicoccus est un hyperthermophile d’un nouveau type, car il présente une membrane externe semblable à celle des Bacteria Gram négatif (voir section 13.20b). La membrane externe d’Ignicoccus est cependant inhabituelle par le fait qu’elle est éloignée du cytoplasme. Cette configuration engendre la présence d’un important espace périplasmique (voir figure 13.20b). Ainsi le volume du périplasme chez Ignicoccus est de 2 ou 3 fois supérieur au volume du cytoplasme, alors que chez les Bacteria Gram négatif le volume du périplasme équivaut à environ 25 % de celui du cytoplasme. Le périplasme d’Ignicoccus contient également des vésicules fixées à la membrane (voir figure 13.20b) qui pourraient servir à l’exportation de substances vers l’extérieur

FIGURE 13.19 Les Desulfurococales ont des températures optimales de croissance supérieures à 100 ˚C. (a) Pyrodictium occultum (température optimale de croissance, 105 ˚C), micrographie optique en fond noir. (b) Observation en microscopie électronique d’une coupe fine de P. occultum. Le diamètre des cellules peut varier de façon importante de 0,3 à 2,5 µm. (c) Coupe fine d’une cellule de Pyrolobus fumarii, le plus thermophile des procaryotes connus (température optimale de croissance, 106 ˚C) ; le diamètre d’une cellule est de 1,4 µm environ.

de la cellule. De plus, certaines espèces du genre Ignicoccus hébergent un petit procaryote parasite, Nanoarchaeum, dont nous parlerons dans la section suivante.

Le genre Staphylothermus Un des membres de l’ordre des Desulfurococcales, Staphylothermus, présente une morphologie particulière (voir figure 13.21). Les cellules de Staphylothermus sont sphériques, d’environ 1 µm de diamètre, et forment des agrégats de plus de cent cellules ressemblant à ceux formés par Staphylococcus (comparez la figure 13.21 avec la figure 4.4b). Staphylothermus n’est pas chimiolithotrophe comme de nombreux hyperthermophiles proches, mais chimio-organotrophe, et il croît de façon optimale à 92 °C. L’énergie est engendrée par la fermentation de peptides et les produits issus de la fermentation sont les acides gras acétate et isovalérate (voir tableau 13.8). Des isolats de Staphylothermus ont été obtenus aussi bien de sources hydrothermales côtières que de fumeurs noirs à haute température (voir section 19.8). Cet organisme est donc largement présent dans les zones hydrothermales sous-marines et serait un consommateur important des protéines relarguées par les organismes morts.




(a)

(b) FIGURE 13.20 Exemples de Desulfurococcales dont la température optimale de croissance est inférieure à la température d’ébullition. (a) Coupe fine de Desulfurococcus saccharovorans. Le diamètre d’une cellule est de 0,7 µm. (b) Coupe fine d’une cellule de Ignicoccus islandicus. La cellule est entourée par un important périplasme (voir section 4.9). La cellule proprement dite a un diamètre de 1 µm, mais la cellule entourée du périplasme mesure 1,4 µm.

Contrôlez vos acquis Les Crenarchaeota hyperthermophiles colonisent les habitats les plus chauds, favorables à la vie, actuellement connus. Des espèces psychrophiles phylogénétiquement proches ont été également identifiées. Des morphologies diverses sont présentes au sein des Crenarchaeota et différentes stratégies métaboliques de croissance ont été identifiées.




448 Chapitre 13

FIGURE 13.21 L’Archaea hyperthermophile Staphylothermus marinus (température optimale de croissance de 92 ˚C). Observation en microscopie électronique de cellules traitées par ombrage. Une cellule isolée a un diamètre de 1 µm.

•

Quelles sont les différences majeures entre Sulfolobus et Pyrolobus ? Entre Staphylothermus et Ignicoccus ?

•

Quelle originalité présente le métabolisme de S0 chez Acidianus ?

•

Dans quelle classe de métabolisme énergétique place-t-on les organismes qui utilisent H2 comme donneur d’électrons ? Établissez la liste des genres de Crenarchaeota qui peuvent utiliser H2 et précisez quels sont les accepteurs d’électrons associés.

IV

NANOARCHAEOTA

Des petites cellules parasites constituent une lignée unique au sein des Archaea : les Nanoarchaeota. Ces procaryotes fascinants présentent de surprenantes caractéristiques, avec notamment le plus petit génome procaryote connu.

13.11 Nanoarchaeum m n Les cellules du genre Nanoarchaeum sont de petits coques qui vivent comme parasites et peut-être comme symbiotes de la Crenarchaeota Ignicoccus (voir section 13.10). Les cellules de Nanoarchaeum ont un diamètre de 0,4 µm et leur volume cellulaire est équivalent à environ 1 % de celui d’Escherichia coli. Les cellules de Nanoarchaeum ne se dupliquent que lorsqu’elles sont attachées à la surface des cellules d’Ignicoccus. Les cellules de Nanoarchaeum peuvent être présentes seules, par paires ou bien par plus de dix cellules par cellule d’Ignicoccus (voir figure 13.22a). La paroi cellulaire de Nanoarchaeum est constituée par une couche S (S-layer – voir section 4.10) qui entoure ce qui semble être un espace périplasmique (voir figure 13.22b).



(a)

Reinhard Rachel et Harald Huber

Reinhard Rachel et Harald Huber

13.11 Nanoarchaeum 449

(b)

FIGURE 13.22 Nanoarchaeum. Observation en microscopie optique à épifluorescence de cellules de Nanoarchaeum (en rouge) fixées aux cellules d’Ignicoccus (en vert). Les cellules sont colorées par la technique du FISH (voir section 11.7), avec des sondes oligonucléotidiques spécifiques de chaque organisme. (b) Observation en microscopie électronique à transmission d’une coupe fine d’une cellule de Nanoarchaeum. Observez la paroi cellulaire bien distincte. Les cellules de Nanoarchaeum ont un diamètre d’environ 0,4 µm.

Nanoarchaeum ne peut se développer en culture qu’en présence d’Ignicoccus comme hôte. On ignore actuellement si Ignicoccus tire un bénéfice de cette association. Nanoarchaeum est hyperthermophile, avec une température optimale de croissance vers 90 °C. Le métabolisme de Nanoarchaeum n’est pas connu, mais son hôte est autotrophe et utilise H2 comme donneur d’électrons et S0 comme accepteur d’électrons. Des isolats de Nanoarchaeum ont été obtenus aussi bien à partir de sources hydrothermales sous-marines que de sources thermales terrestres, et cet organisme apparaît comme étant largement cosmopolite dans les environnements chauds qui lui conviennent. Il n’existe qu’une seule espèce connue, N. equitans.

Phylogénie et génomique de Nanoarchaeum Les Nanoarchaeaota constituent une lignée profondément ancrée au sein de l’arbre des Archaea, bien distincte des autres lignées (voir figure 13.1). Il a été difficile au départ de préciser l’exacte position phylogénétique de Nanoarchaeum, car les ARN ribosomiques 16S de ce groupe sont uniques, comptant un grand nombre de substitutions de bases, même dans les régions qui sont hautement conservées chez les autres lignées d’Archaea. En fait, les amorces oligonucléotidiques utilisées (en PCR) pour l’amplification des gènes codant les ARNr 16S de toutes les espèces d’Archaea connues, ne fonctionnent pas pour l’amplification des gènes de Nanoarchaeum. Le génome de Nanoarchaeum a une taille de 0,49 Mpb. C’est le plus petit génome cellulaire connu. De façon étonnante, il est dépourvu de gènes identifiables codant la plupart des fonctions métaboliques, incluant la biosynthèse des monomères tels que les acides aminés, les nucléotides et les coenzymes. Le génome de Nanoarchaeum est également dépourvu des gènes codant les protéines enzymatiques du catabolisme, telles celles de la glycolyse. Ces fonctions sont probablement assurées pour Nanoarchaeum, par son hôte Ignicoccus. Nanoarchaeum contient une

partie seulement des gènes codant une ATPase (voir section 5.12) et on ignore si cet organisme possède ou non une ATPase active. S’il n’existe pas d’ATPase ni d’étape de phosphorylation des substrats, il semblerait donc que Nanorachaeum soit un parasite, à la fois pour l’apport d’énergie et pour l’apport de carbone, de son hôte Ignicoccus. Nanoarchaeum serait donc dépendant de son hôte pour la plupart des métabolites dont il a besoin, et ce de la même façon que les Rickettsia et les Chlamydia, en infectant les cellules humaines (voir sections 12.13, 12.27, 26.13 et 27.3). Avec autant de gènes manquants, quels gènes demeurent donc chez Nanoarchaeum ? Nanoarchaeum possède des gènes identifiables pour toutes les enzymes nécessaires aux processus moléculaires centraux : la réplication de l’ADN, la transcription et la traduction. Ainsi, malgré un génome extrêmement réduit, Nanoarchaeum n’a pas (et de ce fait ne peut pas, restant ainsi une cellule) éliminé les gènes nécessaires pour satisfaire le dogme de la biologie moléculaire : ADN → ARN → protéines. En plus de sa petite taille, le génome de Nanoarchaeum est le plus compact (densité de gènes) de tous les organismes connus. Plus de 95 % du chromosome circulaire unique de Nanoarchaeum code des protéines.

Nanoarchaeum et l’évolution Comment Nanoarchaeum trouve-t-il sa place dans l’évolution des procaryotes ? Cet organisme est profondément établi dans l’arbre des Archaea (voir figure 13.1), ce qui suggère qu’il est la moins évoluée de toutes les Archaea. Cependant Nanoarchaeum a-t-il toujours été un parasite ? Probablement pas, dans la mesure où cela impliquerait l’existence d’un hôte autonome moins évolué qu’il aurait parasité. En occultant le fait que l’ancêtre de Nanoarchaeum ait pu être un organisme autonome, nous ne pouvons aujourd’hui qu’être étonnés de la petite taille de ses cellules et de son génome. De façon claire, Nanoarchaeum se situe – ou du moins en est très proche – aux conditions limites absolues de la vie en termes de volume cellulaire et de potentiel génétique. En fait, les seules structures capables de se répliquer de façon autonome et contenant moins de gènes que Nanoarchaeum sont les virus, qui ne sont pas, bien entendu, des cellules. Actuellement, le meilleur scénario pour l’évolution de Nanoarchaeum est qu’il serait un hyperthermophile qui aurait dérivé très tôt au sein des Archaea afin de profiter d’un mode de vie parasitique. Il n’existe pas de Nanoarcheota capable de vie autonome, et il semble donc, dans l’état des connaissances présentes, que le parasitisme soit la caractéristique typique de cette lignée telle que nous la comprenons aujourd’hui.

Contrôlez vos acquis Nanoarchaeum est un petit organisme parasite qui se situe très bas dans l’arbre des Archaea. Son génome est le plus petit parmi tous les organismes connus. Nanoarchaeum est déficient dans tous les gènes à l’exception de ceux nécessaires aux processus moléculaires centraux et, de ce fait, il est complètement dépendant de son hôte, Ignicoccus, pour la plupart des besoins cellulaires.




•

Quelles sont les caractéristiques qui rendent Nanoarchaeum particulièrement intéressant du point de vue de l’évolution ?

•

Comment savons-nous que Nanoarcheum est hyperthermophile ?

V

L’ÉVOLUTION ET LA VIE À HAUTE TEMPÉRATURE

Les Archaea hyperthermophiles vivent à des températures bien plus élevées que celles que peuvent tolérer la plupart des autres procaryotes. Quelle est la nature de cette tolérance extrême à la température ? Quelles sont les limites de température au-delà desquelles la vie est impossible ? Nous allons voir dans cette section que les réponses dont nous disposons aujourd’hui apportent des indices pour comprendre l’histoire primitive de la Terre.

13.12 Stabilité thermique m n des molécules biologiques La stabilité des protéines et de l’ADN chez les hyperthermophiles est un point crucial de la survie à haute température. La plupart des protéines se dénaturent à haute température, et de nombreuses recherches ont été menées afin d’identifier les propriétés des protéines thermostables. L’explication de la thermostabilité des protéines semble résider dans le repliement de la molécule. De même, en ce qui concerne les acides nucléiques, la température est également un élément important, et les hyperthermophiles ont développé des solutions uniques pour maintenir intact leur ADN.

Repliement des protéines et thermostabilité La composition en acides aminés des protéines thermostables des hyperthermophiles n’est pas particulièrement inhabituelle. En fait, les enzymes des hyperthermophiles présentent souvent les mêmes caractéristiques structurales majeures que leurs équivalents thermolabiles présents chez les bactéries mésophiles, que cela concerne leurs structures primaire, secondaire ou tertiaire (voir sections 3.6 à 3.8). Néanmoins les protéines thermostables présentent des caractéristiques spécifiques qui améliorent leur thermostabilité. Ces caractéristiques incluent la présence de centres très hydrophobes, qui diminuent la tendance de la protéine à se déplier, et la présence d’interactions ioniques plus nombreuses à la surface de la protéine, qui contribuent aussi au maintien des protéines entre elles et agissent également contre le dépliement. En fin de compte, c’est le repliement de la protéine elle-même qui va contribuer de façon la plus forte à sa résistance à la chaleur. De façon intéressante, des changements subtils dans la séquence des acides aminés suffisent parfois à provoquer des modifications significatives dans le repliement d’une partie de la molécule, modifications qui vont rendre une protéine thermostable ou au contraire thermolabile.

Les protéines chaperons : auxiliaires du maintien des protéines dans leur état natif Dans le chapitre 7, nous avons décrit un groupe particulier de protéines appelées « chaperons » (protéines de choc thermique – voir

section 7.17), qui interviennent en repliant les protéines partiellement dénaturées. Les procaryotes hyperthermophiles produisent un groupe particulier de protéines chaperons qui n’agissent qu’aux températures de croissance les plus élevées. Dans les cellules de Pyrodictium (voir figure 13.23), par exemple, le principal chaperon est un complexe protéique appelé thermosome. Ce complexe intervient en maintenant les autres protéines cellulaires dans un repliement correct et fonctionnel à haute température et peut aider la cellule à survivre dans des conditions de température situées audelà de leur optimum. Par exemple, lorsque Pyrodictium est cultivé à une température proche de sa température optimale de croissance (110 °C), il produit de grandes quantités de thermosomes. Grâce à cela, les cellules restent viables après un choc thermique, pouvant aller jusqu’à un traitement d’une heure en autoclave (121 °C). Dans les cellules soumises à ce traitement et replacées ensuite dans leur condition optimale de température, le thermosome, qui est lui-même thermorésistant, permet de ramener dans leur état initial de repliement suffisamment de copies des protéines indispensables dénaturées, permettant ainsi aux cellules de croître et de se diviser à nouveau. Ainsi, grâce à l’action des chaperons, la température supérieure limite de croissance de nombreux hyperthermophiles est inférieure à la température à laquelle ils peuvent survivre. Cette marge de sécurité permet probablement aux cellules qui subissent une exposition brève aux températures supérieures à leur température maximale de croissance de ne pas être détruites.

La stabilité de l’ADN à haute température : solutés et gyrase réverse Comment les molécules d’ADN restent-elles intactes à haute température et comment sont-elles préservées de la dénaturation ? Divers mécanismes peuvent être impliqués. Un de ces mécanismes fait intervenir une augmentation des composés cellulaires solubles. Par exemple, comme nous l’avons vu précédemment, le cytoplasme des méthanogènes hyperthermophiles comme Methanopyrus (voir

G. Rieger, R. Hermann, R. Rachel, K.O. Stetter

450 Chapitre 13

FIGURE 13.23 Pyrodictium abyssi, vue en microscopie électronique à balayage. Pyrodictium a été utilisée comme modèle pour l’étude de la stabilité des macromolécules à haute température. Les cellules sont enchâssées dans une matrice adhésive composée de glycoprotéines.



section 13.6) contient des concentrations élevées, pouvant aller jusqu’à 1 M, en 2,3-diphosphoglycérate de potassium cyclique. Ce soluté empêche les lésions chimiques de l’ADN telles que les dépurinations et les dépyrimidinations (perte de la base d’un nucléotide par hydrolyse de la liaison glycosidique) qui peuvent se produire à haute température. Ces changements chimiques peuvent conduire à des mutations (voir section 10.2). Toutefois, tous les hyperthermophiles ne possèdent pas de solutés de ce type, et il existe évidemment d’autres mécanismes de stabilisation de l’ADN. On pense qu’une protéine uniquement présente chez les espèces hyperthermophiles pourrait être responsable de l’absence de dénaturation de l’ADN chez les procaryotes. Tous les hyperthermophiles produisent une ADN topoisomérase appelée ADN gyrase reverse (reverse DNA gyrase). Cette topoisomérase provoque la formation de surenroulement positif de l’ADN (au contraire des ADN gyrases présentes chez tous les procaryotes non thermophiles, qui provoquent la formation d’un surenroulement négatif – voir section 7.3). Les surenroulements positifs stabilisent fortement l’ADN vis-à-vis de la chaleur et empêchent effectivement la dénaturation de la double hélice d’ADN. L’absence d’ADN gyrase reverse chez tous les organismes dont la température optimale de croissance est inférieure à 80 °C est une indication forte de son importance dans la stabilisation de l’ADN à haute température.

La stabilité de l’ADN : les protéines de liaison à l’ADN En plus des sels et de l’ADN gyrase reverse, d’autres protéines des hyperthermophiles peuvent intervenir dans le maintien de l’intégrité de la double hélice d’ADN. Par exemple, une petite protéine thermostable de liaison à l’ADN, présente chez Sulfolobus, se fixe dans le petit sillon de l’ADN (voir figure 7.5) de façon non spécifique et augmente ainsi la température de dénaturation de l’ADN de quelque 40 °C. Cette protéine, appelée Sac7d, augmente fortement la formation de boucles dans la molécule d’ADN et pourrait ainsi être impliquée dans la régulation génétique (sur l’ADN en boucle, voir section 8.4). Des espèces d’Euryarchaeota possèdent également des protéines de liaison à l’ADN. Mais contrairement à Sac7d, ce sont des protéines extrêmement basiques qui présentent des homologies de séquence et de conformation avec les protéines histones du noyau des Eukarya (voir section 7.3). Ces histones archaéennes ont été particulièrement étudiées chez l’espèce méthanogène hyperthermophile Methanothermus fervidus. Les histones de cet organisme enroulent et compactent l’ADN en des structures similaires à celles des nucléosomes (voir figure 13.24 et section 7.3). Il a été montré que ces structures permettent le maintien de l’ADN sous forme double brin à très hautes températures. Les histones archaéennes sont présentes chez la plupart des Euryarchaeota, même chez les Archaea halophiles extrêmes comme Halobacterium. Toutefois, les halophiles extrêmes n’étant pas thermophiles, ces histones archaéennes pourraient avoir d’autres fonctions que la stabilisation de l’ADN, par exemple dans la régulation de l’expression des gènes.

451

Suzette L. Pereira

13.12 Stabilité thermique des molécules biologiques

FIGURE 13.24 Les histones et les nucléosomes des Archaea. Observation en microscopie électronique d’ADN plasmidique linéarisé, issu de l’Archaea méthanogène Methanothermus fervidus (voir figure 13.8c), enveloppé par les histones archaéennes Hmf pour former une structure sphérique, qui apparaît ici colorée en noir : le nucléosome (indiqué par les flèches). Comparez cette micrographie avec la représentation artistique des histones et des nucléosomes des Eukarya de la figure 7.9.

La stabilité des lipides En ce qui concerne les lipides, comment les hyperthermophiles empêchent-ils la dissociation de leur membrane à haute température ? Théoriquement, tous les hyperthermophiles produisent des lipides construits sur le modèle tétraéther de dibiphytanyle (sur la structure de ces lipides, voir section 4.5). Les tétraéthers de dibiphytanyle sont naturellement résistants à la température du fait de la présence d’une liaison covalente entre les unités phytanyles, ce qui permet la formation d’une membrane monocouche, contrairement à la membrane bicouche lipidique classique (voir figure 4.19). Cette structure, étayée par des liaisons covalentes, est résistante à l’effet de la chaleur qui tend à séparer les deux couches lipidiques constituées d’acides gras.

La stabilité des monomères En plus de la stabilité des macromolécules, la stabilité thermique des monomères est également un des facteurs importants qui régissent les températures limites supérieures de croissance des hyperthermophiles. Quelle que soit la stabilité des macromolécules, la vie est impossible si les éléments de base qui servent à leur construction sont eux-mêmes instables. De façon intéressante, ce serait la stabilité des petites molécules plutôt que celle des macromolécules qui pourrait en fait conditionner la température limite supérieure de la vie. À une température aussi « basse » que 120 °C, certaines petites molécules importantes sont détruites rapidement. Par exemple, les deux molécules clés du métabolisme énergétique que sont l’ATP et le NAD+ (voir chapitre 5) sont rapidement hydrolysées à cette température. Le temps de demi-vie de



452 Chapitre 13


l’ATP ou du NAD+ in vitro est de moins de trente minutes à 120 °C et décroît rapidement aux températures supérieures (notons cependant que ces mesures ont été réalisées dans l’eau. La stabilité de ces molécules à l’intérieur du cytoplasme pourrait être significativement plus importante en raison de la présence d’agents protecteurs inconnus jusqu’ici). Donc, 120 °C est-t-elle la température limite de la vie ? Malgré les problèmes liés à la stabilité des petites molécules, il semble que la limite de la vie soit située à une température supérieure à 120 °C.

La température limite pour la présence de micro-organismes Puisque la vie telle que nous la connaissons est dépendante de la présence d’eau liquide, les habitats microbiens dont la température est supérieure à 100 °C ne peuvent se situer que dans des environnements sous pression, tels que le fonds des océans. Ainsi, toutes les Archaea hyperthermophiles capables de croître à des températures supérieures à 100 °C semblent cantonnées dans ces environnements surchauffés (voir tableau 13.9). Jusqu’à quelles températures ces habitats peuvent-ils abriter la vie ? Il existe d’ores et déjà des preuves qu’une espèce du genre Pyrodictium est capable de croître à 121 °C. L’extraordinaire température limite de croissance de Pyrolobus fumarii ne serait donc pas la température limite de la vie. Les fumeurs noirs des sources hydrothermales océaniques profondes sont un excellent modèle pour l’étude des habitats naturels surchauffés et de leur microflore. Les fumeurs noirs émettent du fluide hydrothermal à des températures allant de 250 à 350 °C et engendrent la formation de structures minérales appelées cheminées, qui résultent de la précipitation des sulfures métalliques contenus dans le fluide (voir figure 19.19). Plusieurs hyperthermophiles ont été isolés à partir d’échantillons de parois de ces cheminées ; ces espèces appartiennent aux genres Pyrodictium, Methanopyrus et Pyrolobus. La paroi des cheminées hydrothermales présente un gradient de température de 250-350 °C à l’intérieur à 2 °C à l’extérieur. Les organismes se distribuent probablement dans les régions de la cheminée dans lesquelles la température est proche de leur température optimale. Les études réalisées sur le fluide surchauffé montrent qu’il est stérile, ce qui est en accord avec les expériences qui montrent que les petites molécules, ainsi que les macromolécules, sont instantanément détruites à des températures aussi élevées. Des expériences en laboratoire sur la stabilité des molécules biologiques désignent les températures comprises entre 140 et 150 °C comme étant vraisemblablement les températures maximales autorisant la vie telle que nous la connaissons. De plus, les organismes seraient incapables de surmonter la labilité des molécules biologiques indispensables à la vie. L’ATP, par exemple, est instantanément détruit à 150 °C. Donc, si des organismes capables de vivre à des températures de 150 °C existent, leur gestion de l’énergie devra certainement être fondée sur autre chose que l’ATP. Est-ce cet obstacle que l’évolution est incapable de franchir ? Il est trop tôt pour l’affirmer. Quoi qu’il en soit, si

des super-hyperthermophiles capables de croître à des températures supérieures à 150 °C sont découverts un jour, ils révéleront certainement de nouveaux concepts en biologie et en biochimie.

13.13 Archaea hyperthermophiles, H m n et évolution microbienne

2

Pourquoi trouve-t-on autant d’Archaea dans les environnements extrêmes ? Bien que les études moléculaires de la diversité microbienne dans des environnements non extrêmes (tels que les sols et l’eau, les environnements aquatiques) indiquent que les Archaea sont présentes tout autour de nous (et même en nous, comme les méthanogènes de notre gros intestin), un des facteurs communs de toutes les Archaea cultivées est leur adaptation aux extrêmes environnementaux. Tant que nous n’aurons pas cultivé les insaisissables Archaea marines et celles des sols, nous ne pourrons affirmer que l’extrémophilie soit la « marque de fabrique » des Archaea. Mais, juste pour la discussion, considérons que c’est un fait établi. Que cela nous apprendrait-il à propos de la Terre et de l’évolution en général ? Différents types d’environnements extrêmes tels que nous les connaissons actuellement existaient sur la Terre primitive, et c’est dans ceux-ci que la vie a pu faire son apparition. Alors que la vie cellulaire a évolué depuis plus de quatre milliards d’années, il est à peu près certain que la Terre a été bien plus chaude que ce qu’elle est aujourd’hui (voir section 11.1) et probablement seulement favorable au développement des hyperthermophiles. Les hyperthermophiles existant actuellement sont-ils donc un vestige d’une forme de vie primitive de la Terre ? Observons ce que l’arbre phylogénétique des Archaea nous apprend à leur sujet.

Les hyperthermophiles et leur horloge moléculaire lente Le séquençage moléculaire des gènes codant les ARN ribosomiques 16S suggère que les Archaea hyperthermophiles ont une évolution plus lente que les autres organismes (voir figure 13.1). Une observation similaire peut être faite en ce qui concerne les Bacteria hyperthermophiles telles que Thermotoga et Aquifex (voir figure 12.1). Ces conclusions proviennent de l’examen des branches évolutives de l’arbre qui, pour les hyperthermophiles, sont longues et s’établissent à proximité de la racine (voir figures 12.1 et 13.1). Les habitats chauds eux-mêmes peuvent expliquer pourquoi l’horloge évolutive est lente chez les hyperthermophiles. Les organismes qui vivent à de très hautes températures sont sûrement soumis à des contraintes fortes pour le maintien des caractéristiques leur permettant de vivre dans de tels environnements. Le moindre changement dans la séquence en acides aminés d’une protéine, résultant d’une mutation spontanée, ne peut être un changement qui va affecter sa thermostabilité. Si c’est le cas, la mutation pourrait bien être létale. Pour les organismes qui vivent dans des environnements non extrêmes, une telle pression ne serait pas un facteur de contrôle suffisant dans la diversification de leurs protéines. En d’autres termes,



13.13 Archaea hyperthermophiles, H2 et évolution microbienne 453

au-delà d’un certain point, la survie des hyperthermophiles ne pourrait pas être récupérable après des changements évolutifs additionnels, dans la mesure où toute tentative d’amélioration doit être contrebalancée par la nécessité pour chaque molécule de maintenir sa thermostabilité. Si la vie est apparue sur une Terre « chaude », comme la plupart des scénarios de l’évolution le supposent, alors les Archaea et les Bacteria hyperthermophiles sont vraisemblablement les plus proches parents des formes de vie primitives qui persistent aujourd’hui. Ainsi, la biologie de ces hyperthermophiles est non seulement passionnante, mais elle peut aussi ouvrir une porte vers le passé.

L’hydrogène (H2) : une source d’énergie primitive Avant de clore ce chapitre, il nous faut évoquer un dernier aspect concernant la biologie des formes de vie primitives. Il est remarquable de constater que le métabolisme de l’hydrogène apparaît souvent dans le panorama que nous avons dressé du métabolisme des procaryotes hyperthermophiles, et plus spécialement de ceux qui vivent aux températures les plus élevées (voir figure 13.25). De nombreux hyperthermophiles se développent en anaérobiose en utilisant H2 comme donneur d’électrons et un ou plusieurs des accepteurs d’électrons S0, NO3–, Fe3+ ou O2 (voir tableau 13.8). Le métabolisme de H2 est vraisemblablement un vestige des schémas métaboliques anciens. Ces schémas se seraient développés chez les organismes primitifs en raison de la disponibilité de H2 et des accepteurs d’électrons inorganiques dans leur environnement primordial, et du fait que le catabolisme de H2 est un processus biologique relativement simple (voir figure 11.6). La figure 13.25 présente les températures maximales connues pour la croissance des procaryotes présentant les trois processus de production d’énergie connus en biologie. La photosynthèse est manifestement le processus le plus sensible à la chaleur, et on peut supposer que ceci est dû à l’instabilité des gros complexes multiprotéiques qui doivent interagir durant la photophosphorylation (voir figure 17.15). La chimio-organotrophie a lieu jusqu’à au moins 110 °C, qui est la

température limite de croissance pour Pyrodictium occultum, un organisme capable aussi bien de fermenter certains composés organiques que de croître en chimiolithotrophie avec H2 comme donneur d’électrons et S0 comme accepteur d’électrons (voir tableau 13.9). Au-delà de 110 °C, seules des Archaea hydrogéno-oxydantes sont connues, parmi lesquelles les genres Pyrolobus et une espèce du genre Pyrodictium, qui associe l’oxydation de H2 à la réduction de Fe3+ (voir tableau 13.9 et figure 13.25). Néanmoins, il y a des indications, d’après les analyses d’échantillons hydrothermaux, de l’existence d’Archaea à plus de 120 °C, mais des cultures de ces organismes n’ont cependant pas encore été obtenues. La diversité des Archaea hyperthermophiles hydrogénooxydantes (ainsi que de Bacteria – voir sections 12.5 et 12.37), telle qu’elle est connue à l’heure actuelle, témoigne que l’évolution de l’oxydation de H2 est une réussite métabolique. Effectivement, bien que nous ne sachions pas grandchose sur le métabolisme du parasite Nanoarchaeum (voir section 13.11), il a été montré que la présence d’H2 stimulait sa croissance en culture au laboratoire. Nanoarchaeum seraitil donc le plus génétiquement simple de tous les procaryotes hydrogéno-oxydants ? L’utilisation de H2 par des groupes de procaryotes physiologiquement si différents, incluant même ceux qui vivent dans les profondeurs de la croûte terrestre (voir section 19.4), indique l’ancienneté de cette source d’énergie. Les sources hydrothermales océaniques, habitats des plus extrêmes des hyperthermophiles, aussi bien que les couches profondes chaudes de la croûte terrestre, ont souvent été considérées comme des environnements dans lesquels la vie aurait été susceptible d’apparaître. Ces environnements renferment de l’H2 et de grandes quantités d’autres donneurs et accepteurs d’électrons inorganiques. Ils sont également exempts d’irradiation par les UV. Si cette hypothèse est vraie, alors les hyperthermophiles hydrogéno-oxydants présentés ici et dans le chapitre 12 sont probablement les vestiges de la biologie primitive de la Terre.

S0 ou Fe2+ H2

Chim iolit ho t ro p hie t herm o p hile 95°

Therm Chim io-o oprg h ilic a noCh t roepm hie o otrgan hermootro p hile phy

113°

121°

110°

T h e r m op hhie Phototrop ilic t herm Ph o tootro p hile phy 73° 40

50

60

70

80 90 Température (°°C)

100

110

120

130

FIGURE 13.25 Les températures maximales limites du métabolisme énergétique. Phototrophie, Synechoccus lividus (Bacteria, cyanobactérie) ; chimio-organotrophie, Pyrodictium occultum (Archaea) ; chimiolithotrophie avec S0 comme donneur d’électrons , Acidianus infernus (Archaea) ; chimiolithotrophie avec Fe2+ comme donneur d’électrons, Ferroglobus placidus (Archaea) ; chimiolithotrophie avec H2 comme donneur d’électrons, Pyrolobus fumarii (Archaea, 113 ˚C) ; Pyrodictium sp. souche 121 (Archaea, 121 ˚C). La souche 121 peut croître également sur formate, mais ce composé serait métabolisé via H2 + CO2.



454 Chapitre 13


Contrôlez vos acquis Bien que les hyperthermophiles puissent vivre à très haute température, parfois même à la température de l’eau en ébullition, il y a des températures limites audelà desquelles aucun organisme vivant ne peut survivre. Cette limite se situe vraisemblablement aux alentours de 140 à 150 °C. Le catabolisme de l’hydrogène (H2) a pu être la première voie du métabolisme cellulaire productrice d’énergie.

•

Comment les hyperthermophiles empêchent-ils les macromolécules importantes telles que les protéines et l’ADN d’être détruites par la chaleur ?

•

Donnez au moins trois raisons pour lesquelles il existe vraisemblablement une température limite pour la vie ?

•

Quelles constatations phylogénétiques et physiologiques suggèrent que les hyperthermophiles existant aujourd’hui sont plus proches des organismes anciens ?

QUESTIONS 1. Quelles sont les caractéristiques communes à toutes les Archaea (voir section 13.1) ? 2. Parmi ces organismes, Pyrodictium, Thermoplasma ou Methanosarcina, lequel est le plus proche de l’halophile extrême Halobacterium (Indice : la réponse se trouve dans la figure 13.1). Quel type de métabolisme énergétique possède chacun de ces organismes (voir sections 13.1 et 13.2) ? 3. Comment un organisme tel qu’Halobacterium peut-il survivre dans un environnement hypersalé, alors qu’un autre tel qu’Escherichia coli ne le peut pas (voir section 13.3) ? 4. Comparez les rôles de la bactériorhodopsine, de l’halorhodopsine et de la rhodopsine sensorielle chez Halobacterium salinarum (voir section 13.3). 5. Quel est le donneur d’électrons quand le CO2 est réduit en CH4 lors de la méthanogenèse (voir section 13.4) ? 6. Quelle caractéristique physiologique majeure est commune à tous les membres de l’ordre des Thermoplasmatales ?

Pourquoi cela permet-il à certaines d’entre elles de coloniser avec succès les rejets miniers (voir sections 13.5, 19.14 et 19.15) ? 7. Quelle est la caractéristique physiologique spécifique à Methanopyrus, comparé aux autres méthanogènes tels que Methanobacterium (voir section 13.6) ? Qui y a-t-il de physiologiquement unique chez Archaeoglobus (voir section 13.7) ? 8. Quels types de métabolismes énergétiques trouve-t-on chez les Crenarchaeota ? Lequel ne trouve-t-on pas (voir section 13.8) ? 9. Pourquoi Sulfolobus est-il remarquable dans l’histoire de la microbiologie (voir section 13.9) ? 10. Qu’est ce qui est inhabituel chez Pyrolobus fumarii (voir section 13.10) ? 11. Quelles sont les similitudes entre Nanoarchaeum et les autres Archaea ? Quelles sont les différences (voir section 13.11) ? 12. Qu’est ce que la gyrase reverse et pourquoi est-elle importante chez les hyperthermophiles (voir section 13.12) ?

PROBLÈMES 1. En utilisant les données de la figure 13.1 comme guide, expliquez pourquoi la bactériorhodopsine est vraisemblablement une invention tardive dans l’évolution.

2. Défendez ou rejetez l’affirmation suivante : la température maximale limite pour la vie est sans lien aucun avec la stabilité des macromolécules telles que les protéines et l’ADN.



CHAPITRE QUATORZE

Biologie de la cellule eucaryote et microorganismes eucaryotes I

Structure et fonction de la cellule eucaryote

14.1 14.2

Structure de la cellule eucaryote et noyau Organelles de la respiration et de la fermentation : mitochondrie et hydrogénosome Organelle photosynthétique : le chloroplaste Endosymbiose : relations entre mitochondries et chloroplastes, d’une part, et bactéries, d’autre part Autres organelles et structures de la cellule eucaryote

461

II

Notions de génétique et de biologie moléculaire eucaryotes

463

14.6 14.7 14.8

Réplication de l’ADN linéaire Notions de génétique eucaryote Maturation de l’ARN et ribozymes

463 465 466

III

Diversité microbienne eucaryote

469

14.9 14.10 14.11 14.12 14.13

Phylogénie des Eukarya Protozoaires Moisissures glaireuses Champignons Algues

469 472 476 478 481

14.3 14.4 14.5

Les cellules eucaryotes comprennent des microorganismes et aussi les cellules des plantes et des animaux. L’algue verte Dunaliella, observée ici au microscope, contient les organelles typiques d’une cellule eucaryote phototrophe, y compris un noyau entouré d’une membrane, des mitochondries et des chloroplastes.

456 456 457 459 460



456 Chapitre 14

Biologie de la cellule eucaryote et micro-organismes eucaryotes

GLOSSAIRE Algues (algae) Micro-organismes eucaryotes phototrophes. Champignons (fungi) Organismes eucaryotes non-phototrophes possédant une paroi cellulaire rigide. Champignon macroscopique (mushroom) Champignon filamenteux produisant de grandes structures souvent comestibles, appelées fructifications. Chitine (chitin) Polymère de N-acétylglucosamine communément présent dans la paroi des algues et des champignons. Chloroplaste (chloroplast) Organelle photosynthétique des phototrophes eucaryotes. Cilié (ciliate) Protozoaire caractérisé par une motilité rapide induite par de nombreux appendices courts appelés cils (cilia). Conidies (conidia) Spores asexuées de champignon. Crêtes (cristae) Membranes internes de la mitochondrie. Cytosquelette (cytoskeleton) Arrangement cellulaire typique des cellules eucaryotes, dans lequel un réseau de microfilaments définit la forme de la cellule. Endosymbiose (endosymbiosis) Voir chapitre 2. Eucaryote (eukaryote) Voir chapitre 2. Eukarya Voir chapitre 2. Flagellé (flagellate) Protozoaire caractérisé par une motilité induite par le mouvement similaire à celui d’un fouet d’un ou plusieurs flagelles. Hydrogénosome (hydrogenosome) Organelle d’origine endosymbiotique présente chez certains micro-organismes eucaryotes qui sert à oxyder le pyruvate en H2, CO2 et en acétate avec production d’une molécule d’ATP. Levure (yeast) Champignon unicellulaire. Maturation de l’ARN (RNA processing) Conversion d’un ARN précurseur en sa forme mature. Méiose (meiosis) Processus de division nucléaire durant la formation des gamètes au cours duquel le nombre de chromosomes

D

ans ce chapitre nous allons aborder la structure, la biologie moléculaire, la phylogénie et la diversité des micro-organismes eucaryotes. En d’autres termes, les principes de base de la biologie cellulaire des eucaryotes seront développés. Au-delà de leur intérêt d’un point de vue fondamental, ces principes seront utiles pour comprendre plusieurs aspects de la microbiologie présentés dans les chapitres suivants.

I

STRUCTURE ET FONCTION DE LA CELLULE EUCARYOTE

Les cinq sections suivantes explorent la structure de la cellule eucaryote et le lien ancestral entre organelles et Bacteria à travers la relation appelée endosymbiose (voir section 11.4).

14.1 Structure de la cellule eucaryote m n et noyau La figure 14.1 montre une cellule eucaryote type. À l’inverse des procaryotes, les eucaryotes contiennent un noyau entouré d’une membrane et plusieurs autres organelles, dont la présence

du stade diploïde est divisé par deux pour donner le nombre du stade haploïde, présent chez les gamètes. Microfilaments Polymères filamenteux de la protéine actine qui contribuent au maintien de la forme des cellules (voir cytosquelette). Mitochondrie (mitochondrion) Organelle respiratoire des organismes eucaryotes. Mitose (mitosis) Au cours de la division cellulaire chez les cellules eucaryotes, processus par lequel les chromosomes sont répliqués et partagés entre chaque cellule fille. Moisissure (mold) Champignon filamenteux. Moisissure glaireuse (slime mold) Eucaryote non-phototrophe apparenté aux protozoaires ne possédant pas de paroi cellulaire et s’agrégeant pour former des structures de fructification (moisissure glaireuse cellulaire) ou du protoplasme non différencié (moisissure glaireuse acellulaire). Mouvement amiboïde (amoeboid movement) Type de motilité résultant de courants cytoplasmiques (cytoplasmic streaming) qui induit un déplacement de l’organisme vers l’avant. Noyau (nucleus) Voir chapitre 2. Phagocytose (phagocytosis) Mécanisme d’ingestion de la nourriture particulaire par lequel une partie de la membrane cellulaire entoure la particule et l’incorpore dans la cellule. Protozoaire (protozoa) Micro-organisme eucaryote unicellulaire non-phototrophe, ne possédant en général pas de paroi cellulaire. Ribozyme ARN catalytique. Splicéosome (spliceosome) Complexe de ribo-nucléoprotéines catalysant l’ablation des introns à partir des transcrits primaires d’ARN. Sporozoaires (sporozoa) Protozoaires parasites non mobiles. Télomérase (telomerase) Complexe enzymatique répliquant l’ADN à l’extrémité des chromosomes eucaryotes. Thylacoïde (thylakoid) Couche membranaire contenant les pigments photosynthétiques dans les chloroplastes.

varie avec les organismes. Ainsi, les mitochondries sont présentes de manière quasi universelle chez les cellules eucaryotes, alors que les chloroplastes pigmentés ne sont présents que chez les cellules phototrophes. Les cellules eucaryotes peuvent posséder une paroi cellulaire (comme chez les cellules des plantes, les algues ou les champignons) ou en être dépourvues (comme chez les cellules animales ou la plupart des protozoaires). Les autres structures internes comprennent l’appareil de Golgi, les peroxysomes, les lysosomes, le réticulum endoplasmique et les microtubules et microfilaments (voir figure 14.1). Les flagelles et les cils – organes de la mobilité – sont présents chez certaines cellules eucaryotes, mais pas chez d’autres.

Le noyau Le noyau contient le génome de la cellule eucaryote (voir figure 14.2). Chez les eucaryotes, l’ADN du noyau est embobiné autour des histones pour former les nucléosomes (voir figure 7.9), qui eux-mêmes forment les chromosomes (voir figure 14.13). Chez beaucoup d’eucaryotes, le noyau possède un diamètre de plusieurs microns et est facilement visible en microscopie optique, sans qu’il soit utile de le colorer (voir figure 4.7a). Cependant, chez les eucaryotes de plus petite taille, des procédures spéciales de marquage sont souvent nécessaires pour apercevoir le noyau.



14.2 Organelles de la respiration et de la fermentation : mitochondrie et hydrogénosome 457 Microtubules

Réticulum endoplasmique lisse

Mitochondrie

Reticulum endoplasmique granuleux

Flagelle

Membrane cytoplasmique Ribosomes

Mitochondrie

Microfilaments Peroxisome

Lysosome

Appareil de Golgi

Chloroplaste


Noyau Pores nucléaires

Nucléole

FIGURE 14.1 Vue schématique en coupe d’une cellule eucaryote. Toutes les cellules eucaryotes contiennent un noyau, mais toutes les organelles et structures montrées ici ne sont pas présentes dans chaque cellule eucaryote.

Le noyau est entouré par deux membranes, chacune ayant sa propre fonction, séparées par un espace. La membrane intérieure est un simple sac, alors que la membrane extérieure forme en de nombreux endroits un continuum avec le réticulum endoplasmique. Les membranes nucléaires intérieure et extérieure entretiennent des interactions spécifiques avec respectivement le nucléoplasme et le cytoplasme. La membrane nucléaire contient aussi des pores (voir figure 14.2), constituées d’ouvertures par lesquelles les membranes intérieures et extérieures se rejoignent. Ces pores permettent à des complexes protéiques d’importer et d’exporter d’autres protéines et des acides nucléiques vers et depuis le noyau, selon un processus qui est appelé transport nucléaire. Comme dans le cas du transport à travers la membrane cytoplasmique (voir section 4.7), le transport nucléaire nécessite de l’énergie qui provient de l’hydrolyse d’un composé à forte énergie, la guanosine triphosphate (GTP). À l’intérieur du noyau, le nucléole (voir figure 14.1) est le site de synthèse de l’ARN ribosomique. Le nucléole est riche en ARN et souvent visible en microscopie optique. Les protéines ribosomiques synthétisées dans le cytoplasme sont transportées dans le nucléole et se combinent avec l’ARN ribosomique pour former les petite et grande sous-unités du ribosome eucaryote. Ces sous-unités sont ensuite exportées vers le cytoplasme, où elles s’associent pour former le ribosome servant à la synthèse protéique.

14.2 Organelles de la respiration m n et de la fermentation :

mitochondrie et hydrogénosome

La mitochondrie et l’hydrogénosome sont spécialisées dans le métabolisme de l’énergie de type chimiotrophe. Les deux organelles sont entourées de membranes mais ont des rôles bien distincts.

Les mitochondries Chez les cellules eucaryotes aérobies, la respiration et la phosphorylation oxydative (un mécanisme de formation de l’ATP – voir sections 5.11 et 5.12) sont localisées dans les mitochondries (en anglais mitochondria, singulier mitochondrion). Celles-ci ont la taille de procaryotes et peuvent être en forme de bâtonnet ou presque sphériques (voir figure 14.3). Une cellule animale typique peut contenir plus de mille mitochondries, mais leur nombre par cellule dépend du type et de la taille de cette dernière. Une levure peut en avoir bien moins (voir figure 14.2). Les mitochondries sont entourées de deux membranes. La membrane extérieure, composée à part égale de protéines et de lipides, est relativement perméable et contient de nombreux canaux minuscules qui permettent le passage des ions et des petites molécules organiques. La membrane intérieure est plus riche en



458 Chapitre 14


Membrane interne Matrice Noyau Pores nucléaires Vacuole

Crêtes

Vacuole lipidique

protéines que la membrane extérieure, mais aussi moins perméable. Les membranes mitochondriales ne possèdent pas de stérols (voir section 4.5), et sont donc moins rigides que la membrane cytoplasmique des eucaryotes, qui contient des stérols. Les mitochondries peuvent donc présenter des formes très variables (voir figure 14.3b et c). Les mitochondries possèdent aussi une série de membranes internes pliées appelées crêtes (cristae). Sur ces membranes, formées par l’invagination de la membrane intérieure, sont localisées les enzymes impliquées dans la respiration et la production d’ATP. Les crêtes contiennent aussi des protéines de transport spécifiques qui régulent le passage des métabolites, en particulier l’ATP, depuis et vers la matrice de la mitochondrie (voir figure 14.3a). La matrice contient un certain nombre d’enzymes impliquées dans l’oxydation des composés organiques – en particulier, les enzymes du cycle de l’acide citrique (voir section 5.13).

L’hydrogénosome Certains micro-organismes eucaryotes anaérobies ne possèdent pas de mitochondries mais contiennent à la place un hydrogénosome (voir figure 14.4a). Bien qu’ayant la taille d’une mitochondrie, l’hydrogénosome ne possède ni crêtes, ni enzymes du cycle de l’acide citrique. Une variété d’eucaryotes microbiens contient des hydrogénosomes : ils sont tous anaérobies, soit de manière obligatoire, soit pouvant

(b)

D. W. Fawcett

FIGURE 14.2 Le noyau. Cellule de levure observée en microscopie électronique après cryodécapage (freeze-etching), montrant la surface du noyau. Le cryodécapage est une technique de microscopie électronique en transmission (voir section 4.3) où le spécimen est congelé, puis fracturé. Une réplique mince est ensuite observée au microscope. La cellule a une largeur d’environ 8 µm et le noyau, une largeur d’environ 1,5 µm.

D. W. Fawcett

E. Guth, T. Hashimoto et S.F. Conti

Mitochondries

Membrane externe poreuse (a)

(c)

FIGURE 14.3 Structure de la mitochondrie. (a) Diagramme montrant la structure de la mitochondrie. Notez les membranes intérieures et extérieures. (b, c) Observation en microscopie électronique en transmission de mitochondries de tissu de rat, démontrant la variabilité de la morphologie. Notez les crêtes.

tolérer l’oxygène, et leur métabolisme est strictement fermentatif. Parmi ceux-ci, on trouve des parasites tels que le flagellé Trichomonas (voir section 14.10) et divers protozoaires ciliés qui peuplent le rumen des ruminants (voir section 19.11), les boues et les sédiments anoxiques. Les principales réactions biochimiques qui ont lieu dans l’hydrogénosome sont l’oxydation du pyruvate en H2, en CO2 et en acétate (voir figure 14.4b). Le pyruvate est oxydé en acétylCoA, un composé de haute énergie (à partir duquel de l’ATP additionnel est produit pendant la formation de l’acétate – voir section 17.19), en même temps que du H2 plus du CO2 (voir figure 14.4b). Chez certains eucaryotes anaérobies, des procaryotes symbiotiques tels que les méthanogènes résident dans le cytoplasme (voir figure 19.25b et c). Ces symbiotes consomment le H2 et le CO2 produits par l’hydrogénosome (voir figure 14.4b), donnant du méthane. Comme les hydrogénosomes ne possèdent pas de chaîne de transport d’électrons ni de cycle de l’acide citrique, ils ne peuvent pas oxyder l’acétate produit à partir du catabolisme du pyruvate, comme c’est le cas chez les mitochondries. L’acétate est donc excrété de l’hydrogénosome vers le cytoplasme de la cellule hôte (voir figure 14.4b).



14.3 Organelle photosynthétique : le chloroplaste 459

Helen Shio et Miklós Müller

•

(a) Membrane cellulaire

Cytoplasme Glucose Glycolyse

Pyruvate Pyruvate

CO2 + H2 Acetyl~CoA

ADP

ATP Hydrogénosome ATP

Acétate

(b) FIGURE 14.4 L’hydrogénosome. (a) Coupe mince à travers une cellule du flagellé anaérobique, Trichomonas vaginalis, observée en microscopie électronique montrant cinq hydrogénosomes. Comparez leur structure interne avec celle de la mitochondrie de la figure 14.3. (b) Biochimie de l’hydrogénosome. Le pyruvate est assimilé par l’hydrogénosome, et du H 2, du CO2, de l’acétate et de l’ATP (en rouge) sont produits. Les enzymes clés de l’hydrogénosome sont la pyruvate-ferrédoxine oxidoréductase et l’hydrogénase. Des méthanogènes endosymbiotes (voir section 13.4) sont souvent présents dans le cytoplasme des eucaryotes contenant des hydrogénosomes, produisant du méthane à partir de H2 + CO2 (voir figure 19.26c).

Comparez et différenciez le sort métabolique du pyruvate chez les mitochondries et l’hydrogénosome.

14.3 Organelle photosynthétique : m n le chloroplaste Les chloroplastes sont des organelles photosynthétiques que l’on trouve chez les eucaryotes phototrophes, les algues. Les chloroplastes de nombreuses algues sont de relativement grande taille et facilement visibles au microscope optique (voir figure 14.5). La taille, la forme et le nombre des chloroplastes varient de manière notable et, à l’opposé des mitochondries, les chloroplastes sont en général beaucoup plus grands que des cellules procaryotes. Comme les mitochondries, les chloroplastes ont une membrane extérieure perméable, une membrane intérieure beaucoup moins perméable et un espace intermembranaire. La membrane intérieure entoure le lumen (l’espace interne) du chloroplaste appelé stroma, mais elle n’est pas repliée en crêtes comme la membrane interne de la mitochondrie (voir figure 14.3a). À la place, la chlorophylle et tous les autres composants nécessaires à la photosynthèse sont localisés sur une série de disques membranaires aplatis appelés thylacoïdes (voir figure 14.6). La membrane des thylacoïdes est extrêmement perméable aux ions et aux autres métabolites, car sa fonction est d’établir la force proton-motrice nécessaire à la synthèse de l’ATP (voir section 5.12). Chez les algues vertes et les plantes vertes, les thylacoïdes sont empilés en unités structurales individuelles appelées grana (voir figure 17.5). Le stroma du chloroplaste contient de grandes quantités de l’enzyme ribulose bisphosphate carboxylase (RubisCO), qui est un catalyseur clé du cycle de Calvin, série de réactions biosynthétiques par lesquelles la plupart des organismes photosynthétiques convertissent le CO2 en composés organiques (voir section 17.6). La RubisCO constitue plus de 50 % des protéines chloroplastiques et catalyse la formation de l’acide

•

Quelles sont les réactions clés agissant chez la mitochondrie ? Quel composé déterminant est produit spécifiquement par la mitochondrie pour la cellule ?

(a)

T. D. Brock

La mitochondrie et l’hydrogénosome sont des organelles générant de l’énergie chez les cellules eucaryotes. Les mitochondries sont impliquées dans la respiration aérobie, alors que l’hydrogénosome, présent seulement chez certains eucaryotes obligatoirement anaérobies, fermente le pyruvate pour donner du H2 plus du CO2, de l’acétate et de l’ATP.

T. D. Brock


(b)

FIGURE 14.5 Cellules algales avec des chloroplastes. (a) La diatomée Stephanodiscus, observée en microscopie à fluorescence. La chlorophylle des chloroplastes (flèches) absorbe la lumière et fluoresce rouge. (b) Chloroplastes spiralés (flèches), caractéristiques du phototrophe Spyrogyra, observés en microscopie à contraste de phase.




Chloroplaste

T. Slankis et S. Gibbs

Thylacoïde

FIGURE 14.6 Le chloroplaste. Chloroplaste de l’algue chrysophycée Ochromonas danica, observé en microscopie électronique. Notez les thylacoïdes.

phosphoglycérique, composé essentiel de la biosynthèse du glucose (voir sections 5.10 et 5.15). La perméabilité de la membrane la plus externe du chloroplaste permet au glucose et à l’ATP produits pendant la photosynthèse de diffuser vers le cytoplasme, où ils peuvent être utilisés pour la fabrication de nouveau matériel cellulaire.

Contrôlez vos acquis Les chloroplastes sont le site de la production d’énergie photosynthétique et de la fixation du CO2 chez les eucaryotes photosynthétiques. •

Expliquez la différence entre le stroma et les thylacoïdes.

•

Quelle est la fonction de la RubisCO, et où est-elle localisée ?

m n

14.4 Endosymbiose : relations entre mitochondries et chloroplastes, d’une part, et bactéries, d’autre part

Sur la base de leur autonomie relative, de leur taille et de leur ressemblance morphologique avec les procaryotes, il a été suggéré depuis longtemps que les mitochondries et les chloroplastes étaient les descendants d’anciennes bactéries. On a postulé que la mise en place de ces organelles avait eu lieu par le procédé d’endosymbiose (endo signifie « à l’intérieur »), l’incorporation d’une cellule procaryote par une cellule plus grande (« l’hôte ») et la conversion de la cellule incorporée en organelle (voir section 11.4 et figure 11.9). Plusieurs types de données moléculaires supportent la théorie endosymbiotique, résumées ci-après. 1. Les mitochondries et les chloroplastes contiennent de l’ADN Bien que la plupart de leurs fonctions soient codées par l’ADN nucléaire, quelques composants des organelles sont codés par un petit génome contenu dans l’organelle ellemême. Ceux-ci incluent l’ARN ribosomique, les ARN de transfert et certaines protéines de la chaîne respiratoire (mitochondrie) et de l’appareil photosynthétique (chloroplaste).

Par conséquent, les cellules eucaryotes non phototrophes sont des chimères génétiques contenant de l’ADN de deux sources distinctes : l’endosymbiote et le noyau de la cellule hôte. Les eucaryotes phototrophes – les algues et les plantes supérieures – contiennent de l’ADN de trois sources différentes, les endosymbiotes chloroplastiques, mitochondriaux et le noyau. La plupart des ADN mitochondriaux et tous les ADN chloroplastiques revêtent une forme circulaire covalente, comme chez la plupart des procaryotes (voir sections 2.2, 7.2 et 7.2). Des méthodes de marquage spéciales permettent de visualiser l’ADN mitochondrial dans les cellules (voir figure 14.7). La section 15.7 présente beaucoup d’autres traits intéressants des génomes d’organelles. 2. Le noyau eucaryote renferme des gènes en provenance des bactéries Le séquençage de génomes (voir chapitre 15) ainsi que d’autres types d’études génétiques a clairement démontré que plusieurs gènes nucléaires codent des propriétés uniques aux organelles. Comme les séquences de ces gènes sont plus proches de celles des Bacteria que des Archaea ou des eucaryotes, on en a conclu que ces gènes ont été transférés vers le noyau à partir des symbiotes bactériens au cours de la transition entre la cellule initialement incorporée et l’organelle actuelle. 3. Les mitochondries et les chloroplastes possèdent leurs propres ribosomes Les ribosomes, structures cellulaires impliquées dans la synthèse protéique (voir section 7.16), existent sous deux formes, grande – 80 unités de Svedberg (S) –, typique des cellules eucaryotes, ou plus petite – 70S –, présente chez les procaryotes. Les mitochondries et les chloroplastes contiennent aussi des ribosomes ; leur taille est de 70S, comme chez les procaryotes. 4. Sensibilité aux antibiotiques Plusieurs antibiotiques (par exemple la streptomycine) tuent ou inhibent les Bacteria en interférant dans le fonctionnement du ribosome 70S. Les mêmes antibiotiques

Cellule Jian-Ming Li et Nancy Martin

460 Chapitre 14

Mitochondrie

FIGURE 14.7 Cellules de la levure Saccharomyces cerevisiae. Les cellules ont été marquées avec du 4’6-diamidine-2’phenylindole dihydrochloride (DAPI) (voir section 18.3) pour mettre en évidence l’ADN mitochondrial. Chaque mitochondrie possède de deux à quatre chromosomes circulaires, que le marqueur fluorescent utilisé révèle en bleu.



14.5 Autres organelles et structures de la cellule eucaryote 461

inhibent aussi la synthèse protéique chez les mitochondries et les chloroplastes. 5. Phylogénie moléculaire Les études phylogénétiques utilisant des méthodes comparatives de séquençage de l’ARN ribosomique (voir sections 11.4 à 11.8) et les études des génomes d’organelles (voir section 15.7) ont démontré de manière convaincante que le chloroplaste et la mitochondrie provenaient des Bacteria. La cellule eucaryote moderne provient donc de l’association d’au moins deux organismes bien distincts par le processus d’endosymbiose (voir section 11.3 et figure 11.7). Il est aussi fort probable que les hydrogénosomes soient des endosymbiotes. Par exemple, chez le protozoaire cilié Nyctotherus ovalis, qui vit dans l’intestin postérieur des termites (voir section 19.10), les mitochondries sont absentes et on a mis en évidence des hydrogénosomes contenant de l’ADN et des ribosomes. De plus, le noyau des eucaryotes contenant des hydrogénosomes contient des gènes codant des protéines d’origine bactérienne. Par conséquent, l’hydrogénosome a une origine endosymbiotique tout comme la mitochondrie. En fait, on pense que les hydrogénosomes sont des mitochondries dégénérées d’un point de vue métabolique qui se sont débarrassées de la respiration pour exploiter la fermentation du pyruvate comme moyen de conserver l’énergie dans une cellule hôte au mode de vie anaérobie. Bien que n’égalant pas l’énergie disponible à partir de la respiration dans la mitochondrie, la production d’acétate dans l’hydrogénosome fournit à la cellule plus d’énergie que si les produits de fermentation étaient le lactate ou l’éthanol (voir figure 14.4b et les sections 5.10 et 17.9). La mitochondrie et l’hydrogénosome peuvent donc être considérés comme des organelles apparentées d’un point de vue fonctionnel, spécialisées dans des stratégies métaboliques différentes pour produire de l’ATP. D’autres structures appelées mitosomes, présentes chez certaines cellules eucaryotes, sont probablement des mitochondries encore plus dégénérées, ayant perdu quasiment toutes les fonctions liées à la production d’énergie (voir section 14.9). Comme il est possible de le constater, de nombreuses données suggèrent que les organelles proviennent de l’assimilation endosymbiotique de Bacteria libres par des cellules eucaryotes hôtes. Dans cet arrangement, les cellules hôtes ont acquis des partenaires permanents spécialisés dans la production d’énergie, alors que les symbiotes ont gagné un environnement stable favorable à leur croissance. Le fait que l’endosymbiose soit un succès est démontré par la présence de mitochondries, d’hydrogénosomes ou bien de chloroplastes dans pratiquement toutes les cellules eucaryotes à l’heure actuelle.

Contrôlez vos acquis Les principales organelles des eucaryotes sont le chloroplaste, impliqué dans la photosynthèse, et la mitochondrie ou l’hydrogénosome, impliqués dans la respiration ou la fermentation. Ces organelles étaient à l’origine des Bacteria qui se sont établies de manière permanente à l’intérieur d’autres cellules (endosymbiose).

•

Faites un résumé des données moléculaires supportant l’hypothèse d’une relation entre organelles et Bacteria.

•

En quoi la possession d’hydrogénosomes à la place de mitochondries avantage-t-elle Nyctotherus ?

14.5 Autres organelles et structures m n de la cellule eucaryote Plusieurs autres structures cytoplasmiques sont présentes dans les cellules eucaryotes. Ces structures incluent le réticulum endoplasmique, l’appareil de Golgi, les lysosomes, les peroxysomes et les organelles liées à la motilité – les flagelles et les cils. À l’inverse des mitochondries et des chloroplastes, ces structures ne possèdent ni ADN ni ribosomes et n’ont pas une origine endosymbiotique.

Réticulum endoplasmique et appareil de Golgi Le réticulum endoplasmique (RE) est un réseau de membranes en continuité avec la membrane nucléaire. Deux types de réticulum endoplasmique sont reconnus : granuleux (rough), auquel sont attachés des ribosomes, et lisse (smooth), pour lequel ce n’est pas le cas (voir figure 14.1). Le RE lisse participe à la synthèse des lipides et à certains aspects du métabolisme des carbohydrates. Le RE granuleux, grâce à l’activité des ribosomes, est le principal producteur de glycoprotéines et fabrique aussi du nouveau matériel membranaire qui est transporté à travers la cellule pour accroître ses divers systèmes membranaires (voir figure 14.1) avant la division cellulaire. L’appareil de Golgi est composé d’un empilement de membranes distinctes du RE (voir figures 14.1 et 14.8), mais qui fonctionnent en coordination avec le RE. Dans l’appareil de Golgi, les produits du RE sont modifiés chimiquement et triés entre ceux qui sont destinés à être sécrétés – par exemple les hormones ou les enzymes digestives –, et ceux qui fonctionnent dans d’autres structures membranaires de la cellule. Les Golgi proviennent de la division de Golgi préexistants et contiennent diverses enzymes qui modifient différemment les protéines sécrétées et membranaires, en fonction de leur destination finale dans la cellule. Beaucoup de ces modifications impliquent une glycosylation (ajout de résidus sucrés) pour convertir les protéines en glycoprotéines.

Lysosomes et peroxysomes Les lysosomes (voir figure 14.1) sont des structures entourées par une membrane qui contiennent diverses enzymes digestives que la cellule utilise pour digérer les macromolécules telles que les protéines, les graisses et les polysaccharides. De ce fait, la cellule recycle ces matériaux pour de nouvelles biosynthèses. Le pH interne du lysosome est d’environ 5, soit deux unités de moins que celui du cytoplasme ; les enzymes hydrolytiques du lysosome fonctionnent de manière optimale à ce pH. Ces enzymes hydrolytiques ont une activité non spécifique et elles pourraient potentiellement détruire des macromolécules clés de la cellule si elles s’échappaient du lysosome.




FIGURE 14.8 L’appareil de Golgi. Portion de cellule du protozoaire Toxoplasma gondii observée en microscopie électronique. L’appareil de Golgi est coloré en rouge. Notez les nombreuses membranes invaginées qui le constituent (les empilements membranaires ont un diamètre de 0,5 à 1 µm). D’autres structures telles que les granules cytoplasmiques sont représentées dans d’autres couleurs. T. gondii est un organisme modèle pour étudier l’appareil de Golgi, car chaque cellule ne contient qu’une seule de ces structures.

Par conséquent, le lysosome permet aux activités lytiques d’être séparées physiquement du cytoplasme. Après l’hydrolyse des macromolécules dans le lysosome, les monomères résultants passent du lysosome au cytoplasme pour servir d’éléments nutritifs à la cellule. Le peroxysome est une structure entourée d’une membrane (voir figure 14.1) dont la fonction est de produire du peroxyde d’hydrogène (H2O2) à partir de la réduction d’O2 par divers donneurs d’hydrogène, incluant des alcools et des acides gras à longues chaînes. Le H2O2 produit dans le peroxysome est dégradé en H2O et O2 par l’enzyme catalase (voir section 6.16). Les peroxysomes jouent aussi d’autres rôles, tels que la synthèse des sels biliaires qui favorisent l’absorption et la digestion des graisses. À l’origine, les peroxysomes se développent dans la cellule en incorporant leurs protéines et leurs lipides à partir du cytoplasme, devenant au bout d’un certain temps des entités entourées d’une membrane qui peuvent grandir et se diviser de manière synchrone dans la cellule.

Microfilaments et microtubules De la même manière que les maisons sont soutenues par des renforcements structuraux, la grande taille des cellules eucaryotes et leur capacité à se déplacer nécessitent des renforcements structuraux. Le réseau structurel interne provient de protéines qui forment des structures filamenteuses appelées microfilaments et microtubules. L’ensemble de ces structures forment le cytosquelette cellulaire. Les microfilaments font environ 8 nm de diamètre et sont des polymères de la protéine actine. Ces fibres forment des réseaux dans la cellule, définissant et maintenant la forme de la cellule (voir figures 14.1 et 14.9). Les microtubules sont des filaments plus grands, d’environ 25 nm de diamètre, composés de la protéine tubuline. Les microtubules assistent les microfilaments pour maintenir la structure de la cellule. Ils jouent aussi un rôle important dans la motilité cellulaire, à la fois pour le mouvement des structures cellulaires internes (par

exemple, lors de la séparation des chromosomes au cours de la division cellulaire) et pour le mouvement de l’organisme lui-même (par exemple, le mouvement du flagelle chez les cellules flagellées – voir figures 14.1 et 14.10). Nous avons vu dans l’un des chapitres précédents que les cellules procaryotes produisent des homologues structuraux et fonctionnels de l’actine et de la tubuline sous la forme des protéines MreB et FtsZ (voir section 6.1). Bien que les procaryotes soient en général beaucoup plus petits que les eucaryotes, ils ont quand même besoin d’un niveau minimum de structuration interne. L’existence des protéines MreB et FtsZ chez les procaryotes démontre aussi que le cytosquelette eucaryote possède une origine ancestrale du point de vue de l’évolution.

Flagelles et cils Les flagelles et les cils sont présents chez les espèces de nombreux groupes de micro-organismes eucaryotes. Ils sont les organelles de la motilité, permettant aux cellules de se déplacer en nageant. Les cils sont en fait des flagelles qui battent de manière synchrone pour propulser la cellule – en général assez rapidement – à travers le milieu. Les flagelles sont de longs appendices, soit uniques, soit groupés, qui poussent la cellule – typiquement plus lentement que les cils – par un mouvement de fouet (voir figure 14.10a). Les flagelles des cellules eucaryotes sont structurellement très différents des flagelles bactériens (voir section 4.14) et ne peuvent pas effectuer de rotation comme ces derniers. Les sections des cils et des flagelles sont très similaires. Chacune contient un ensemble de neuf paires de microtubules entourant

Ohad Medalia et Wolfgang Baumeister

Laurence Pelletier, David Sheff, et Graham Warren

462 Chapitre 14

FIGURE 14.9 Les microfilaments et l’architecture de la cellule eucaryote. Image en tomographie électronique d’une cellule de la moisissure glaireuse Dictyostelium discoideum (voir aussi figure 14.28), montrant le réseau des microfilaments d’actine qui forment avec les microtubules le cytosquelette cellulaire. Les microfilaments mesurent environ 8 nm de diamètre. La tomographie électronique est une méthode de reconstruction tridimensionnelle des cellules à partir d’une série d’images prises avec un microscope électronique en transmission.



14.6 Réplication de l’ADN linéaire 463 Cils

Melvin S. Fuller

Flagelles

(a)

(b)

FIGURE 14.10 Les flagelles et les cils, organes de la motilité chez les cellules eucaryotes. (a) Les flagelles peuvent être présents en tant que filaments simples ou multiples. Les cils sont structurellement très analogues aux flagelles, mais beaucoup plus courts. Les flagelles eucaryotes bougent comme des fouets, à la différence des flagelles des procaryotes, qui déplacent la cellule par un mouvement de rotation ressemblant à celui de l’hélice d’un bateau à moteur (voir section 4.14, et figures 4.53 et 4.58). (b) Coupe transversale du flagelle du champignon Blastocladiella emersonii montrant l’enveloppe externe, les neuf paires externes de microtubules et la paire centrale de microtubules simples.

une autre paire centrale appelée axonème (voir figure 14.10b). Les microtubules sont composés de la protéine tubuline. Une seconde protéine, appelée dynéine, est attachée à la tubuline et fonctionne comme une ATPase, hydrolysant l’ATP pour fournir l’énergie nécessaire à la motilité. Les mouvements des flagelles et des cils sont semblables. Dans les deux cas, le mouvement implique le glissement coordonné des microtubules de l’axonème (voir figure 14.10b) l’un contre l’autre vers la base de la cellule ou dans la direction opposée. Ce mouvement génère le mouvement de fouetté du flagelle ou du cil, qui induit la propulsion cellulaire. Une distinction claire peut donc être faite entre les flagelles procaryotes et eucaryotes. Le filament du flagelle procaryote est formé par un réseau hélicoïdal constitué d’une seule protéine, la flagelline, et la structure elle-même est fermement ancrée dans un complexe protéique servant de moteur pour la rotation, inclus dans la paroi et la membrane (voir figure 4.56). De plus, le flagelle bactérien fonctionne comme une hélice, faisant appel à l’énergie de la force proton-motrice (voir sections 4.14 et 5.12). Par contre, le flagelle eucaryote déplace la cellule par un mouvement de fouet créé par le glissement de microtubules utilisant l’énergie de l’ATP. Néanmoins, chez toutes les cellules mobiles, la motilité a une valeur en terme de survie ; la capacité de se déplacer permet aux organismes mobiles d’explorer de nouveaux habitats et d’en exploiter les ressources.

Contrôlez vos acquis Outre les organelles majeures des eucaryotes, plusieurs autres structures ayant des fonctions bien définies sont présentes dans le cytoplasme, incluant le réticulum endoplasmique, site pour les ribosomes et la synthèse des lipides cellulaires, l’appareil de Golgi impliqué dans la modification et la sécrétion des protéines, les lysosomes

qui jouent un rôle dans la digestion des micromolécules et le peroxysome, une organelle participant à la production de H2O2. De plus, des éléments structuraux protéiques appelés microfilaments et microtubules sont présents, formant le cytosquelette. Les flagelles et les cils sont les organelles de la motilité, dont la structure fait appel de manière importante aux microtubules. •

Quelle est la différence entre les RE lisses et granuleux ?

•

Pourquoi les activités du lysosome sont-elles séparées du cytoplasme ?

•

À part le renforcement structurel de la cellule, quelles sont les autres fonctions des microtubules ?

II

NOTIONS DE GÉNÉTIQUE ET DE BIOLOGIE MOLÉCULAIRE EUCARYOTES

Plusieurs aspects de la génétique et de la biologie moléculaire des eucaryotes n’ont pas d’équivalent chez la plupart des cellules procaryotes. Cela inclut : 1) la réplication d’éléments génétiques linéaires (par opposition aux éléments circulaires), 2) la mitose et la méiose et 3) la maturation des ARN messagers. Nous explorerons brièvement ci-dessous chacun de ces sujets.

14.6 Réplication de l’ADN linéaire m n La plupart des chromosomes procaryotes sont circulaires, de même que la plupart des plasmides et certains virus, ainsi que le génome de la plupart des organelles (voir section 15.7). Par contre, les cellules eucaryotes contiennent de l’ADN linéaire. Pratiquement toutes les étapes de la réplication de l’ADN sont identiques, que le chromosome soit linéaire ou circulaire. Cependant, il y a un problème critique lors de la réplication des éléments génétiques linéaires qui ne se pose pas avec les éléments circulaires : la réplication de l’ADN à l’extrémité 5’ de chaque brin. Pour bien comprendre la nature du problème, commencez par regarder la figure 7.13. Imaginez que l’extrémité gauche de l’ADN sur ce diagramme soit en fait l’extrémité d’un chromosome linéaire. Même si l’amorce ARN est très courte et s’il existe une enzyme spéciale pour l’enlever, aucune ADN polymérase ne peut la remplacer avec de l’ADN puisque toutes les ADN polymérases connues nécessitent une amorce. Donc, si rien n’est fait, la molécule d’ADN sera raccourcie chaque fois qu’elle sera répliquée. La réplication de l’ADN linéaire nécessite donc un mécanisme spécial, et il y a au moins deux solutions à ce problème.

La réplication de l’ADN linéaire avec une amorce protéique Les virus contenant des génomes d’ADN linéaire (incluant la plupart des virus qui infectent les eucaryotes) et de nombreux plasmides linéaires résolvent le problème de la réplication de l’ADN linéaire en utilisant une amorce protéique au lieu d’une



464 Chapitre 14


amorce ARN. Bien que toutes les ADN polymérases doivent ajouter chaque nucléotide à un groupement hydroxyle (OH) libre, certains peuvent ajouter la première base à un groupement hydroxyle présent sur des protéines spécifiques qui se lient aux extrémités des chromosomes linéaires (voir figure 14.11). Ces protéines sont codées par le plasmide ou le virus et reconnaissent les extrémités des chromosomes. Ces protéines ne sont pas enlevées, si bien que ces plasmides ou ces virus ont des protéines attachées de manière permanente à leur ADN. Les amorces protéiques sont aussi utilisées pour la réplication de certains chromosomes linéaires de Bacteria (voir section 15.4).

5’ 3’

Brin retardé 3’ AACCCCAAC 5’ Matrice ARN

Protéine liée de manière covalente à l’extrémité 5’

5’

3’

3’

5’

Télomérase

(a)

Télomères et télomérases Une méthode spéciale est utilisée pour répliquer les extrémités des chromosomes eucaryotes, appelées télomères. Les télomères contiennent de l’ADN répétitif – une courte séquence (souvent 6 pb) répétée en tandems de vingt à plusieurs centaines de fois (voir figure 14.12a). Les séquences des télomères des différents eucaryotes sont très proches les unes des autres et un des brins contient toujours plusieurs guanines. Lors de la réplication, cette séquence riche en guanine est présente sur le brin avancé du duplex ADN et peut s’apparier avec l’extrémité d’un ARN complémentaire présent sur une enzyme appelée télomérase (voir figure 14.12a). La télomérase devient active une fois attachée à l’extrémité surplombante riche en G de l’ADN télomérique. La télomérase ne nécessite pas de matrice pour commencer la synthèse de l’ADN parce que l’enzyme elle-même contient une petite matrice ARN comme cofacteur. Par essence, la télomérase est une sorte de transcriptase inverse (voir section 9.13), fabriquant de l’ADN à partir d’une matrice ARN. La télomérase

Brin avancé ADN télométrique GGGGTT GGGGTT GGGGTTGGGGTT 3’ CCCCAA CCCCAA 5’

Extension des 6 premières bases

AACCCCAAC

La télomérase se déplace d’une extension AACCCCAAC

Répéter quatre fois

3’

5’ 3’

3’

(b)

5’

Amorce ARN

3’

AACCCCAAC

5’

FIGURE 14.12 Modèle de l’activité de la télomérase à l’extrémité d’un chromosome eucaryote. (a) Diagramme de la séquence à l’extrémité de l’ADN dans un télomère, avec quatre répétitions riches en guanine et l’enzyme télomérase, qui contient un court ARN matrice. (b) Étape d’élongation du brin riche en guanine catalysé par la télomérase. Une fois terminée l’action de la télomérase, le brin retardé peut être démarré avec une amorce ARN par une primase, suivie par la terminaison du brin retardé par une ADN polymérase et une ligase.

5’

HO

OH Nouvelle extrémité 5’

5’

fonctionne de manière répétée pour créer une longue extension du brin avancé. Une fois cette extension achevée, l’autre brin (brin retardé) peut être normalement amorcé avec un ARN et l’ADN répliqué (voir figure 14.12b). Les télomères n’ont pas besoin de posséder un nombre précis de répétitions ; ils doivent juste être assez longs pour qu’aucune portion de gène ne soit perdue pendant la réplication de l’ADN.

Contrôlez vos acquis +

FIGURE 14.11 Réplication de l’ADN linéaire à l’aide d’amorces protéiques. Des protéines attachées de manière covalente à leurs extrémités 5’ amorcent les nouveaux brins d’ADN. Notez le groupement OH libre sur la protéine. L’ADN polymérase III peut ajouter un nucléotide sur ce groupement OH.

Les extrémités des éléments génétiques linéaires posent un problème au mécanisme de réplication, ce qui n’est pas le cas pour les éléments génétiques circulaires. Certains éléments linéaires procaryotes ou viraux résolvent ce problème à l’aide d’une amorce protéique. Les eucaryotes le résolvent grâce à une enzyme spéciale appelée télomérase, qui étend un des brins de l’ADN.



14.7 Notions de génétique eucaryote 465

•

Comment une protéine peut-elle amorcer l’ADN lors de la réplication ?

•

Qu’est-ce que la télomérase et quelle est sa fonction ?

(a)

m n

Nous présenterons brièvement quelques principes de génétique eucaryote. Les cellules eucaryotes se divisent par mitose, puis se reproduisent sexuellement. Pendant cette phase, les gamètes mâles et femelles sont formés par méiose, puis fusionnent pour former le zygote. Cela est fondamentalement différent des processus de conjugaison unidirectionnelle des procaryotes (voir chapitre 10) et nous mettrons donc l’emphase sur ces événements dans notre discussion, en utilisant la levure de boulanger, Saccharomyces cerevisiae, comme notre modèle eucaryote.

Carolina Biological Supply Co.

14.7 Notions de génétique eucaryote

(b)

Mitose et méiose

FIGURE 14.13 Vue en microscopie optique d’une mitose. Cellules à l’extrémité des racines d’oignon qui ont reçu un marquage pour révéler les acides nucléiques et les chromosomes. (a) Métaphase. Les chromosomes sont par paires au centre de la cellule. (b) Anaphase. Les chromosomes se séparent.

D’un point de vue génétique, la cellule eucaryote peut exister sous deux formes : haploïde ou diploïde. Les cellules diploïdes ont deux copies de chaque chromosome alors que les cellules haploïdes n’en ont qu’une. Les cellules de S. cerevisiae peuvent exister indéfiniment en tant que stade haploïde (végétatif) contenant seize chromosomes. Mais de temps en temps, deux cellules haploïdes de levure peuvent fusionner (s’accoupler) pour donner une cellule diploïde à trente-deux chromosomes (voir figure 14.4). Ce processus ne doit pas être confondu avec ce qui se passe chez les cellules de plantes et d’animaux pluricellulaires. Chez ces organismes, la phase diploïde est présente chez les organismes eux-mêmes et la phase haploïde n’a lieu que chez les gamètes. La mitose est le processus qui suit la réplication de l’ADN chez la cellule pendant lequel les chromosomes se condensent,

se divisent et sont séparés en deux ensembles, un pour chaque cellule fille (voir figure 14.13). Chez les cellules haploïdes de S. cerevisiae (voir figure 14.14), la mitose a lieu avant chaque division cellulaire afin de maintenir les seize chromosomes par cellule. La méiose est le processus par lequel le stade diploïde est transformé en stade haploïde. La méiose implique deux divisions. Lors de la première division méiotique, les chromosomes homologues sont séparés dans des cellules distinctes, le stade génétique passant de diploïde en haploïde. La seconde division mitotique est en gros similaire à la mitose, les deux cellules haploïdes se scindant pour former un total de quatre gamètes haploïdes (ascospores, voir figure 14.4).

Conjugaison

Fusion cellulaire

Fusion nucléaire

a a a

Reproduction assexuée (mitose)

Haploïde

Reproduction assexuée (mitose) Germination

Méiose Ascospores (haploïdes)

Asque

FIGURE 14.14 Cycle vital d’une levure typique, Saccharomyces cerevisiae. Une cellule haploïde de S. cerevisiae contient seize chromosomes.



466 Chapitre 14


Le processus de conjugaison chez la levure : types sexuels Les levures ont deux formes différentes de cellules haploïdes appelées types sexuels (mating type), qui peuvent être considérées comme analogues aux gamètes mâles et femelles. La conjugaison de types sexuels opposés mène à la formation d’une cellule diploïde. À partir d’une seule cellule diploïde, une structure est formée, contenant quatre gamètes, deux de chaque type sexuel. La cellule dans laquelle les gamètes sont formés est appelée asque (ascus) et les cellules à l’intérieur de l’asque sont appelées ascospores (voir figure 14.14). Les deux types sexuels de Saccharomyces cerevisiae sont appelés α et a. Les cellules de type a ne se conjuguent qu’avec les cellules de type α, et le fait qu’une cellule soit α ou a est déterminé génétiquement. Certaines souches haploïdes de S. cerevisiae restent α ou a, alors que d’autres souches sont capables de changer de type sexuel. Ce changement de type sexuel est dû à l’insertion d’un gène selon un processus illustré dans la figure 14.15. Il y a un locus unique sur l’un des chromosomes de S. cerevisiae appelé locus MAT (pour mating type), où soit le gène a, soit le gène α peuvent être insérés. À ce locus, le promoteur MAT contrôle la transcription de celui des gènes qui est présent. Si le gène a est présent à ce locus, la cellule est de type sexuel a, et réciproquement. Des copies des gènes a et α sont présentes à d’autres endroits du génome de la levure, mais elles ne sont pas exprimées. Ces copies silencieuses sont les sources du gène inséré. Quand le changement se produit (voir figure 14.15), le gène approprié, a ou α, est copié à partir de son site silencieux et inséré au locus MAT, en remplaçant le gène déjà présent. L’ancien gène de type sexuel est excisé et supprimé, et le nouveau gène inséré. Ce processus a été appelé mécanisme de cassette car les gènes a et α peuvent être considérés comme analogues aux cassettes magnétiques. Celui des gènes qui est inséré au locus MAT est celui qui est transcrit.

Gène maître du type (silencieux)

Promoteur Locus MAT

Changement de type sexuel

Gène du type

Suppression du gène du type

Gène du type a

Gène maître du type a (silencieux) La cellule est de type sexuel

Copie du gène de type a

La cellule est de type sexuel a

FIGURE 14.15 Mécanisme de cassette impliqué dans le changement chez la levure d’un type sexuel (mating type) α en a. Le type de cassette inséré au locus actif (tête de lecture) détermine le type sexuel. Le processus est réversible et le type sexuel a peut donc aussi se transformer en type α.

Les gènes a et α de S. cerevisiae sont des gènes de régulation. Ils régulent entre autres la production des hormones peptidiques appelées facteur a ou facteur α qui sont excrétées par les cellules de levure lors de la conjugaison. Ces hormones se lient aux cellules de type sexuel opposé et induisent des changements à leur surface afin de permettre la fusion (voir figure 14.16). Une fois que les cellules de type sexuel opposé se sont associées, la fusion des cellules et des noyaux se produit, résultant en la formation d’un zygote diploïde (voir figure 14.16). À partir de ce dernier, la méiose régénère la forme haploïde végétative et le cycle vital est bouclé (voir figure 14.14).

Contrôlez vos acquis Les micro-organismes eucaryotes peuvent s’accoupler et échanger de l’ADN pendant la reproduction sexuelle. La mitose assure une ségrégation appropriée des chromosomes pendant la division cellulaire asexuelle. Les cellules haploïdes formées par méiose peuvent fusionner pour constituer un zygote diploïde. Il y a deux types sexuels chez la levure et les cellules de celle-ci peuvent changer de type sexuel. •

Si le nombre diploïde de chromosomes dans les cellules humaines est de 46, combien de chromosomes sont présents dans une cellule de sperme humain ?

•

Expliquez comment une seule cellule haploïde de Saccharomyces peut éventuellement donner une cellule diploïde ?

14.8 Maturation de l’ARN m n et ribozymes Dans le chapitre 7, nous avons appris que le processus de transcription produit plusieurs types d’ARN : l’ARN messager, l’ARN de transfert et l’ARN ribosomique (voir section 7.10). Chez les eucaryotes, et de façon moins commune chez les procaryotes, l’ARN est découpé pour enlever les introns, c’est-àdire l’ARN intercalé non codant. Ce processus est appelé maturation de l’ARN (RNA processing) et laisse intact les exons, c’est-à-dire l’ARN codant les protéines qui sont ensuite assemblées pour former l’ARNm mature (fonctionnel) [voir section 7.1]. Le processus par lequel les introns sont enlevés et les exons joints est appelé épissage (splicing).

Splicéosome, coiffage de l’ARN et queue de Poly-A L’épissage est accompli par un complexe de plusieurs ribonucléoprotéines (enzymes contenant à la fois de l’ARN et des protéines), appelé splicéosome (spliceosome). Le splicéosome est un complexe macromoléculaire de grande taille – à peu près de celle d’un ribosome – et environ cent protéines sont impliquées dans son activité, sans compter des facteurs protéiques ne faisant pas partie du splicéosome lui-même. Le splicéosome enlève les introns et effectue la jointure des exons pour former un ARNm mature (voir figure 14.17).




14.8 Maturation de l’ARN et ribozymes 467

(a)

Exon 1 Intron 5′ GU A (a) Bases conservées

AG

Assemblage du splicéosome

UG A AG

3′

(b)

Bourgeon diploïde

Découpage du site d’épissage 5’ Formation du lasso

5′ U G A AG

L’épissage de l’ARN a lieu alors que l’ARNm est encore dans le noyau. Certaines bases sont conservées aux points d’épissage et l’intron est enlevé sous la forme d’une structure en lasso (lariat structure) [voir figure 14.17]. Les introns excisés sont ensuite dégradés par la cellule, libérant des nucléotides libres. Chez beaucoup d’ARNm, il peut y avoir plus d’un intron pour un gène donné ; il est donc important qu’ils soient tous reconnus et enlevés par le splicéosome afin de générer l’ARN mature final. Deux autres étapes ont lieu pendant la maturation de l’ARN. Elles se situent dans le noyau avant l’épissage et le transport de l’ARNm mature vers le cytoplasme pour la traduction. La première étape est appelée coiffage (capping) et se déroule avant que la transcription ne soit terminée. Le coiffage consiste en l’addition d’une guanine méthylée à l’extrémité 5’-phosphate de l’ARNm. D’autres nucléotides situés près de l’extrémité 5’ de l’ARNm sont aussi modifiés occasionnellement pendant le coiffage. L’étape finale de la maturation consiste à éliminer l’extrémité 3’ du pré-ARNm et à ajouter environ deux cents adénines pour former la queue poly-A (poly-A tail). Ni la coiffe ni la queue poly-A ne sont traduites. La coiffe guanosine facilite la traduction en permettant la formation du complexe d’initiation entre l’ARNm et le ribosome (voir section 7.16) grâce des protéines spécifiques se liant à la coiffe. La fonction de la queue poly-A est moins claire. Elle

5′

Découpage du site d’épissage 3’ Assemblage des exons

U

(b) FIGURE 14.16 Observation en microscopie électronique du processus de conjugaison chez la levure Hanseluna wingei. (a) Deux cellules ont fusionné à leur point de contact et ont émis des protubérances l’une vers l’autre. (b) Stade avancé de la conjugaison. Les noyaux des deux cellules ont fusionné et un bourgeon diploïde s’est formé à angle droit par rapport aux cellules en conjugaison. Ce bourgeon finit par se séparer et donne naissance à une lignée cellulaire diploïde. Une cellule de Hanseluna wingei mesure environ 10 µm de diamètre.

3′

(c)

G


Anciennes cellules haploïdes

3′

5′

Splicéosome

Noyau diploïde

Exon 2

A

AG

3′

(d)

Intron (lasso)

Dégradé

5′ 3′ ARNm Exon 1 Exon 2 mature

Exporté vers le cytoplasme pour être traduit

(e) FIGURE 14.17 Activité du splicéosome. Excision d’un intron du transcrit d’un gène codant une protéine chez les eucaryotes. (a) Le pré-ARNm avec un seul intron. La séquence GU est conservée au site d’épissage en 5’ et la séquence AG au site d’épissage en 3’. Il y a aussi un A intérieur qui sert de boîte de branchement. (b) Plusieurs particules composées de petites ribonucléoprotéines (en brun) s’assemblent sur l’ARN pour former un splicéosome. Chacune de ces particules contient plusieurs petites molécules d’ARN différentes qui sont impliquées dans le mécanisme d’épissage. (c) Le site d’épissage en 5’ a été découpé et une boîte de branchement s’est formée. (d) Le site d’épissage en 3’ a été découpé et les deux exons sont maintenant assemblés. Notez qu’au final deux liens phosphodiester ont été détruits, mais que deux autres se sont formés. (e) Les produits finaux sont les exons assemblés (ARNm) et l’intron excisé.

pourrait affecter le taux de dégradation de l’ARNm eucaryote, le protégeant éventuellement d’une dégradation rapide par les RNases. Alternativement (ou en plus), la queue poly-A pourrait être un signal moléculaire indiquant à la machine de traduction qu’elle est en présence d’un ARNm plutôt qu’une autre forme d’ARN et que celui-ci est prêt à être traduit. Les trois étapes menant à la formation de l’ARNm eucaryote sont résumées dans la figure 14.18. La synthèse d’un ARNm mature et fonctionnel est un processus complexe et dynamique impliquant plusieurs étapes qui sont absentes lors de la



468 Chapitre 14


Pré-ARNm (transcrit primaire)

Guanosine Stop

Start Intron Exon 1

Intron

Exon 2

Start 1 Intron Coiffe 5′

3′ Exon 3

Ajout de la coiffe en 5′ Polyadénylation en 3′ Stop

2

Intron

3

1

Protéine

(a)

2

3

Exon 1

Exon 2

ARNr précurseur

Queue poly-A AAAAAAA 3′

Excision des introns

ARNm mature Start

HO

5′

Site poly-A

(b)

Stop

OH Intron excisé (le ribozyme)

AAAAAAA Exportation vers le cytoplasme et traduction

+

ARNr mature

FIGURE 14.18 Vue d’ensemble de l’épissage du pré-ARNm en ARNm mature chez les eucaryotes. Les étapes de l’épissage comprennent l’ajout d’une coiffe à l’extrémité 5’, l’excision des introns et le découpage de l’extrémité 3’ du transcrit, ainsi que l’addition d’une queue poly-A. Toutes ces opérations se déroulent dans le noyau. L’emplacement des codons start et stop utilisés pendant la traduction est aussi indiquée.

formation, assez directe par comparaison, d’ARNm fonctionnel lors de la transcription de la plupart des gènes chez les procaryotes (voir section 7.13).

Les ribozymes Certains types d’ARN fonctionnent dans la cellule à la fois comme enzymes et comme ARN. Ces ARN catalytiques, appelés ribozymes, sont impliqués dans un grand nombre de réactions cellulaires importantes. Bien que quelques ribozymes aient été trouvés chez les procaryotes, ils sont plus communs chez les eucaryotes. Les ribozymes fonctionnent comme les enzymes protéiques, en ce sens qu’ils possèdent un « site actif » qui lie le substrat et catalyse la formation d’un produit (voir section 5.5). La plupart des ribozymes eucaryotes sont des introns autoépissants (self-splicing introns), des enzymes qui s’excisent eux-mêmes d’une molécule d’ARN tout en joignant les exons adjacents. Un ribozyme particulièrement bien étudié est celui présent chez le protozoaire Tetrahymena. Le ribozyme est un intron de 413 nucléotides qui, en présence de guanosine, se sépare d’un ARN précurseur plus long. Pendant cet événement, le ribozyme joint deux exons adjacents pour former l’ARNr mature (voir figure 14.19). Ce ribozyme de Tetrahymena est donc une endoribonucléase spécifique d’une séquence donnée et réalise une réaction analogue à celle du splicéosome (voir figure 14.17). Après que le ribozyme s’est séparé de l’ARN précurseur, il se défait d’un petit oligonucléotide et se circularise (voir figure 14.19). Bien que catalysant une réaction spécifique tout comme une enzyme protéique, les ribozymes autoépissants diffèrent des enzymes protéiques sur un point clé. À l’inverse des enzymes

HO Fragment de 15 nucléotides + Dégradation (c) FIGURE 14.19 Intron ribozymal autoépissant du protozoaire Tetrahymena. Ce type de molécule présente une structure secondaire importante qui est critique pour la réaction d’épissage. (a) Un précurseur de l’ARN ribosomique contient un intron de 413 nucléotides. (b) À la suite de l’addition du nucléoside guanosine, l’intron s’autoélimine et induit la liaison des deux exons. (c) L’intron est éliminé, puis se circularise en perdant un fragment de 15 nucléotides.

protéiques, un ribozyme autoépissant ne catalyse sa réaction qu’une seule fois. Le fragment circulaire du ribozyme de Tetrahymena est ainsi, in fine, dégradé par la cellule (voir figure 14.19). D’autres ribozymes menant à bien le même processus d’autoépissage (appelés collectivement introns du groupe I à cause de la nécessité de la présence d’une guanosine extérieure pour la réaction) ont été trouvés chez une variété d’autres gènes d’eucaryotes et chez certains gènes de mitochondries et de chloroplastes. Pourquoi les ribozymes existent-ils dans un monde où les enzymes protéiques dominent ? On a proposé que les ribozymes soient les vestiges d’une forme plus simple de vie, « la vie ARN », qui auraient précédé l’ère des protéines en tant que catalyseurs majeurs de la cellule. En effet, il est possible qu’un monde ARN ait existé bien avant qu’une structure cellulaire ait évolué. Nous avons discuté ce concept dans le chapitre 11 (voir section 11.2). Bien que les protéines aient remplacé les enzymes ARN dans pratiquement tous les aspects de la biocatalyse, il reste quelques réactions pour lesquelles l’ARN catalyse la réaction. Soit ce sont les derniers reliquats du monde ARN, soit



14.9 Phylogénie des Eukarya 469

ce sont des réactions que les enzymes protéiques sont incapables de catalyser ou bien catalysent de manière très imparfaite.

Contrôlez vos acquis La maturation des pré-ARNm eucaryotes est particulière et implique trois phases distinctes : épissage, coiffage et ajout d’une queue poly-A. Les introns de certains autres transcrits sont autoépissants et l’ARN lui-même catalyse la réaction. Les molécules d’ARN ayant une activité catalytique sont appelées ribozymes et jouent un rôle important au sein de la cellule. •

Qu’est-ce que l’épissage, où a-t-il lieu et qu’est-ce qui est nécessaire pour son bon déroulement ?

•

Qu’est-ce qu’un ribozyme ? Quel substrat est nécessaire pour l’activité enzymatique chez tous les introns du groupe I ?

III

DIVERSITÉ MICROBIENNE EUCARYOTE

Nous explorons à présent la diversité des Eukarya microbiens. Ceux-ci incluent les protozoaires, les moisissures glaireuses, les champignons et les algues. Nous commençons par considérer la phylogénie de ces organismes. Nous verrons que les eucaryotes microbiens diffèrent par de nombreux aspects de leur biologie et que certains sont phylogénétiquement hautement dérivés par rapport à d’autres, qui conservent certaines propriétés des anciens eucaryotes.

14.9 Phylogénie des Eukarya m n À partir de l’arbre phylogénétique universel du vivant (voir figure 11.13), nous avons appris que les Eukarya forment leur propre domaine phylogénétique qui est plus proche des Archaea que des Bacteria. Cette phylogénie des Eukarya a été déduite du séquençage comparatif de l’ARN ribosomique 18S, provenant de la petite sous-unité (SSU pour small subunit) des ribosomes cytoplasmiques (voir section 11.5). La plupart des microbiologistes sont d’accord sur le fait que les arbres phylogénétiques fondés sur le séquençage comparatif – en particulier de la petite sous-unité de l’ARNr – constituent les meilleurs arbres moléculaires disponibles et fournissent en général une bonne image de la phylogénie microbienne. Cependant l’unanimité est plus forte pour les domaines procaryotes – Bacteria et Archaea – que pour les eucaryotes. Le séquençage comparatif de certains gènes et protéines a produit des arbres ayant une topologie différente pour les eucaryotes de celle fondée sur l’ARN 18S. À l’heure actuelle, il n’y a pas de consensus concernant l’arbre donnant la meilleure image de la phylogénie des Eukarya. Nous présenterons donc deux arbres phylogénétiques qui fournissent des vues différentes de la phylogénie des eucaryotes (voir figure 14.20). Nous commencerons par l’arbre fondé sur le 18S, qui distingue clairement les eucaryotes primitifs de ceux

plus dérivés. Nous présenterons ensuite un arbre alternatif qui suggère qu’une radiation phylogénétique majeure a eu lieu durant l’évolution des Eukarya. Les deux arbres confirment l’existence des trois domaines du vivant. Ce sont surtout au niveau des détails de la lignée eucaryote que les deux arbres diffèrent.

L’arbre des Eukarya fondé sur l’ARN ribosomique Avant l’aire de la phylogénie moléculaire, les organismes eucaryotes étaient groupés en quatre règnes (kingdoms) : les plantes, les animaux, les champignons et une variété d’eucaryotes microbiens appelés protistes. Ces quatre règnes, ainsi que les procaryotes (qui étaient rassemblés au sein d’un seul règne phylogénétique) formaient ce qu’on appelait les cinq règnes du vivant. Cependant, le séquençage de la petite sousunité de l’ARNr a montré de manière convaincante que le système des cinq règnes mettait trop en avant l’importance du point de vue de l’évolution des plantes et des animaux pluricellulaires et sous-estimait la grande diversité phylogénétique des procaryotes. L’arbre fondé sur l’ARNr a permis de rectifier cette situation, tout en révélant une phylogénie des eucaryotes très surprenante. La figure 14.20a montre certains détails de la phylogénie des Eukarya fondée sur le 18S. La mise en perspective de l’arbre eucaryote avec les lignées Bacteria et Archaea nous rappelle que les organelles majeures – la mitochondrie et le chloroplaste – ont leur origine chez les Bacteria et que, par beaucoup d’aspects, les Archaea ressemblent beaucoup plus aux eucaryotes que les Bacteria. Un grand nombre de données soutiennent ces conclusions. On peut aussi s’apercevoir que plusieurs eucaryotes microbiens constituent des lignées présentant une profonde divergence phylogénétique dans l’arbre 18S (voir figure 14.20a). Par contre, les plantes et les animaux sont des organismes hautement dérivés, qui forment une « couronne » (crown) en haut de l’arbre phylogénétique. Les algues sont dispersées au sein de l’arbre eucaryote (la plupart dans des lignées relativement récentes), alors que les champignons (à l’exception des Oomycètes) forment un groupe phylogénétique très resserré et plutôt récent (voir figure 14.20a).

Les eucaryotes « primitifs » L’arbre ARNr des eucaryotes montre un « échelonnement » des organismes depuis les eucaryotes microbiens les moins dérivés (les plus primitifs) jusqu’aux espèces de la « couronne » (voir figure 14.20a). Les eucaryotes placés en « bas » de l’arbre phylogénétique sont d’un grand intérêt. Ce sont des organismes modernes ayant apparemment peu évolué par rapport à leurs ancêtres. L’arbre ARNr identifie clairement des diplomonadines tels que Giardia, des microsporidies telles que Encephalitozoon et des parabasaliens tels que Trichomonas comme des eucaryotes primitifs. Quelles autres propriétés ces organismes possèdent-ils qui puissent permettre d’arriver à une telle conclusion ? Giardia, Trichomonas et Encephalitozoon diffèrent des autres eucaryotes par un élément majeur : ce sont tous des eucaryotes dépourvus de mitochondries (amitochondrial eukaryotes) bien qu’ils aient tous un noyau entouré d’une membrane. Certains, comme Trichomonas, contiennent des hydrogénosomes (voir section 14.2 et figure 14.4), alors que d’autres n’en possèdent pas. Ces organismes sont-ils les reliques



470 Chapitre 14


Microsporidies (Encephalitozoon) Trypanosomes (Trypanosoma) Euglénobiontes (Euglena)

Pas Amitochondriate de mitochondries Diplomonadines (Giardia)

Parabasaliens (Trichomonas)

ies s dr me n o o s c hé n o se bio m y os End tes roplas Chlo

Amoeba

Ciliés

« Couronne » des pluricellulaires Apicomplexés (Plasmodium)

Animaux

Dinoflagellés

Plantes Algues vertes Algues rouges Champignons

Hy M dr ito og

Bacteria

Moisissures Entamoeba glaireuses

Oomycètes Diatomées

Archaea

Algues brunes (a) Dinoflagellés Algues Apicomplexés brunes Ciliés (Plasmodium) Diatomées Oomycètes Algues vertes Algues rouges Animaux

Plantes

Microsporidies Champignons

Parabasaliens (Trichomonas) Diplomonadines (Giardia) Trypanosomes (Trypanosoma) Euglénobiontes (Euglena)

Moisissures glaireuses Amoeba

(b) FIGURE 14.20 Arbre phylogénétique des Eukarya. (a) Arbre phylogénétique basé sur la comparaison des séquences d’ARN ribosomique 18S. Notez comment on indique que les endosymbiotes (mitochondries et chloroplastes) proviennent du domaine Bacteria. (b) Arbre phylogénétique fondé sur d’autres gènes et protéines eucaryotes. Les lignées ancestrales apparaissent en gras sur les deux figures (a) et (b).

d’anciens eucaryotes qui n’ont jamais subi l’endosymbiose ? Bien que cette conclusion puisse être tirée de la topologie de l’arbre ARNr, diverses études, en particulier génétiques, ne la soutiennent pas. À l’aide de méthodes sensibles d’identification des acides nucléiques et des données de séquence génomique, il a été

démontré que les eucaryotes sans mitochondries contenaient dans leur noyau des gènes ayant pour origine les Bacteria. Ces gènes sont analogues aux gènes mitochondriaux présents à l’heure actuelle dans le noyau des eucaryotes aérobies (voir sections 14.4 et 15.7). Ces données suggèrent que les eucaryotes sans mitochondries ont hébergé à un moment donné des



14.9 Phylogénie des Eukarya 471

endosymbiotes dont ils se sont débarrassés pour une raison inconnue, gardant juste une trace de leur existence sous la forme de gènes bactériens dans leur noyau. Des preuves supplémentaires du fait que les eucaryotes sans mitochondries en ont possédé dans le passé ont été obtenues de manière visuelle. Les scientifiques ont découvert que Giardia, par exemple, produit des protéines ressemblant à celles des mitochondries et que ces protéines se rassemblent à l’intérieur de la cellule. Grâce à la microscopie électronique haute définition, on a pu montrer que ces protéines sont entourées de sacs membranaires. Ces reliques de mitochondries sont appelées mitosomes et ont depuis été observées chez plusieurs autres eucaryotes sans mitochondries, y compris Entamoeba, un organisme sans mitochondries beaucoup plus dérivé que Giardia sur la base du séquençage de l’ARNr (voir figure 14.20a). On a émis l’hypothèse que les mitosomes pourraient être des mitochondries hautement dégénérées qui ne contiennent que quelques protéines utiles pour la génération d’énergie. Au vu de l’existence des hydrogénosomes, des mitochondries et maintenant des mitosomes, il apparaît qu’aucun des organismes eucaryotes existant à l’heure actuelle et que l’on pensait dépourvus de mitochondries ne l’ont en fait jamais été. Si de tels organismes sans mitochondries existaient, ils ne devraient posséder ni organelles ni preuves de l’existence de gènes dérivant de bactéries dans leur noyau. De plus, sur la base du séquençage de l’ARNr 18S, ils devraient diverger plus tôt de l’arbre phylogénétique des eucaryotes que Giardia elle-même (voir figure 14.20a). Découvrir des cellules qui n’ont jamais contenu d’endosymbiotes, si de telles cellules existent, est un défi très stimulant pour les scientifiques intéressés par la diversité microbienne des eucaryotes. Une manière d’aborder ce problème consiste à échantillonner le gène de l’ARNr au sein de communautés microbiennes (voir section 11.7) appartenant à divers habitats, incluant en particulier des habitats anoxiques modérément chauds (c’est-à-dire proches des conditions régnant initialement sur Terre – voir section 11.1). Si de tels organismes existent encore à présent, ils pourraient être détectés à l’aide d’amorces de PCR spécifiques de l’ARNr 18S. La détection d’ARNr divergeant plus tôt que Giardia sur l’arbre de l’ARNr stimulerait les essais pour obtenir des cultures d’organismes contenant ces séquences. On peut supposer que ces organismes posséderaient de nombreuses propriétés surprenantes.

Le problème des microsporidies Les microsporidies constituent des énigmes du point de vue de l’évolution. Ces eucaryotes primitifs sur la base de l’arbre ARNr (voir figure 14.20a) sont de minuscules (2 à 5 µm) cellules parasites dont la structure est encore plus réduite que celle des autres eucaryotes sans mitochondries. Les microsporidies telles qu’Encephalitozoon ne possèdent aucune organelle, ni appareil de Golgi, ni hydrogénosomes (on ne sait pas si des mitosomes sont présents) et disposent d’un très petit génome. Le génome d’Encephalitozoon, par exemple, n’est que de 2,9 Mpb, c’est-à-dire 1,5 Mbp de moins que celui de la bactérie Escherichia coli ! En fait, les microsporidies possèdent une combinaison de propriétés que l’on pourrait supposer présentes chez un eucaryote « primitif », ce qui est confirmé par leur placement sur l’arbre ARNr (voir figure 14.20a).

Cependant, la position des microsporidies sur l’arbre ARNr a été remise en question, car l’ARNr de ce groupe a évolué très rapidement (cela est suggéré par la longueur de la branche des microsporidies sur l’arbre de la figure 14.20a). On pense que cela introduit des artefacts au niveau du positionnement de ces organismes dans un arbre phylogénétique. Pour essayer de résoudre ce problème, le séquençage d’autres gènes et protéines de microsporidies et d’autres eucaryotes sans mitochondries a été entrepris. Ces données suggèrent une histoire évolutive assez différente, comme nous le verrons ci-dessous.

Une vue alternative de l’évolution des eucaryotes Le séquençage de certains gènes et protéines d’eucaryotes produit des arbres qui diffèrent drastiquement de celui fondé sur l’ARNr (voir figure 14.20b). Les séquences de plusieurs molécules ont été utilisées pour construire ces arbres, en particulier les tubulines, l’ARN polymérase et les sous-unités de l’ATPase. Cependant, les informations les plus intéressantes ont été obtenues à partir des séquences de protéines de choc thermique (heat shock) et de chaperones apparentées (voir sections 7.17 et 8.9), des protéines dont on pense qu’elles sont d’excellents marqueurs phylogénétiques au même titre que l’ARNr. Comment ces arbres eucaryotes alternatifs se différencient-ils de l’arbre fondé sur l’ARNr 18S ? Premièrement, l’échelonnement évolutif partant des organismes les moins dérivés tels que Giardia vers la couronne des organismes multicellulaires, une caractéristique proéminente de l’arbre ARNr (voir figure 14.20a) disparaît. À la place, les arbres alternatifs révèlent qu’une radiation évolutive majeure des eucaryotes s’est produite quasi simultanément, cette radiation incluant la grande majorité des organismes eucaryotes connus (voir figure 14.20b). Bien que cela soit scientifiquement moins satisfaisant qu’un arbre phylogénétique présentant une ligne claire de descendance (voir figure 14.20a), cette vision résulte des données moléculaires actuelles. Deuxièmement, animaux et champignons sont fortement apparentés dans les arbres alternatifs. Troisièmement, les microsporidies, qui apparaissent très tôt dans l’arbre ARNr, semblent être proches des champignons, eux-mêmes fortement dérivés (voir figure 14.20). Il faut noter que les microsporidies sont transmises par des petites structures infectieuses ressemblant par beaucoup d’aspects aux spores de champignons. L’étude des gènes de choc thermique a conforté la relation entre les champignons et les microsporidies, de la même manière que des gènes de choc thermique (ressemblant à ceux de mitochondrie) ont été détectés chez Encephalitozoon. Cela suggère fortement que cet organisme possédait auparavant des mitochondries. Que pouvons-nous conclure de ces deux images différentes de la phylogénie des eucaryotes ? D’une part que leur véritable phylogénie n’est pas encore complètement résolue. En d’autres termes, aucun des deux arbres de la figure 14.20 ne peut être considéré comme définitif. Que ces deux arbres soient en désaccord reflète le fait qu’il y a encore beaucoup de choses que nous ne comprenons pas quant à l’histoire évolutive des eucaryotes et à l’information phylogénétique contenue dans les diverses molécules. Au fur et à mesure que des résultats de séquençage comparatif deviendront disponibles et que d’autres études (telles que la découverte des mitosomes mentionnée ci-dessus) révéleront de nouveaux aspects de la biologie des eucaryotes,




Sur la base du séquençage de l’ARN ribosomique, les cellules eucaryotes forment leur propre lignée du point de vue de l’évolution (les Eukarya). Certains eucaryotes microbiens, tels que Giardia et Trichomonas, sont des espèces qui divergent tôt, tandis que la « couronne » eucaryote de l’arbre contient les plantes et les animaux multicellulaires. Les arbres fondés sur le séquençage comparatif d’autres gènes et protéines donnent une image évolutive bien différente. •

D’un point de vue cellulaire, quels problèmes pose l’hypothèse des « cinq règnes » pour regrouper les eucaryotes ?

•

Résumez les données prouvant que Giardia est plus proche des eucaryotes primitifs que d’une cellule humaine.

•

En quoi les arbres phylogénétiques alternatifs des eucaryotes diffèrent-ils de manière fondamentale des arbres établis sur l’ARNr ?

Mastigophora : les flagellés Les membres de ce groupe de protozoaires sont tous mobiles grâce à des flagelles et sont donc appelés de manière collective flagellés (voir figures 14.21c et 14.22). Les protozoaires flagellés sont dispersés sur l’ensemble de l’arbre phylogénétique ARNr, depuis des organismes primitifs tels que Giardia, en passant par les euglènes, jusqu’aux dinoflagellés (voir figure 14.20a). Par conséquent, une grande diversité de microorganismes eucaryotes utilisent ce moyen de déplacement dans

14.10 Protozoaires m n Genres principaux : Amoeba, Paramecium, Trypanosoma

(b)

(a)

Arthur M. Nonomura

Les protozoaires sont des micro-organismes unicellulaires eucaryotes qui ne possèdent pas de paroi cellulaire (voir figure 14.21). Ils sont généralement incolores et mobiles. Les protozoaires se distinguent des procaryotes par leur nature eucaryote et leur taille en général plus grande, des algues par l’absence de chlorophylle, des levures et autres champignons par leur mobilité et l’absence de paroi cellulaire dans la plupart des cas, et des moisissures glaireuses par leur incapacité à former des corps de fructification. Comme mentionné cidessus, les protozoaires sont très divers phylogénétiquement et apparaissent dans plusieurs lignées de l’arbre des Eukarya (voir figure 14.20). On peut trouver les protozoaires dans une grande diversité d’habitats d’eaux douces et marines ; un grand nombre sont des parasites d’autres animaux, mais aussi de l’homme, et certains se développent dans le sol ou dans les habitats aériens, par exemple à la surface des arbres. La plupart des protozoaires se nourrissent en ingérant de la matière particulaire, d’habitude d’autres cellules, par phagocytose, un processus par lequel une particule de nourriture est entourée par une portion de la membrane cellulaire souple pour incorporer la particule et l’amener

Dr. Mae Melvin, CDC Public Health Image Library, PHIL


à l’intérieur de la cellule. Certains protozoaires peuvent littéralement avaler des cellules bactériennes ou des cellules eucaryotes de petite taille grâce à une structure spécialisée appelée cytostome (gullet) [voir figure 14.25]. Comme ces organismes « attrapent » leur propre nourriture, la plupart des protozoaires sont mobiles. En fait, leur mécanisme de motilité constitue une des caractéristiques essentielles pour les diviser en groupes taxinomiques (voir tableau 14.1). Les protozoaires qui se déplacent par un mouvement amibien sont appelés Sarcodina ; ceux qui utilisent des flagelles, les Mastigophora ; et ceux qui utilisent des cils, les Ciliophora. Constituant un quatrième groupe, les Apicomplexa sont généralement non mobiles et tous parasitiques d’animaux supérieurs.


leur véritable phylogénie émergera. Le consensus actuel parmi les microbiologistes est que l’arbre fondé sur l’ARNr et les arbres alternatifs apporteront certaines des réponses à ces questions et qu’une phylogénie finalisée des eucaryotes empruntera des concepts à chacun de ces arbres. Maintenant que nous avons une première perception de la phylogénie des eucaryotes microbiens et des nombreuses questions non résolues à ce sujet, nous allons aborder l’étude des organismes eux-mêmes, en commençant par les protozoaires.


472 Chapitre 14

(c)

(d)

FIGURE 14.21 Protozoaires typiques. (a) Amoeba. (b) Cilié typique, Paramecium (voir aussi figure 14.25). (c) Un flagellé, Dunaliella (ce flagellé contient des chloroplastes et peut donc être considéré comme une algue). (d) Plasmodium vivax, un sporozoaire apicomplexé, se développant dans un globule rouge humain.



14.10 Protozoaires 473

TABLEAU 14.1 Groupe

CARACTÈRES DES PRINCIPAUX GROUPES DE PROTOZOAIRES Nom commun

Genres représentatifs

Habitats

Maladies communes

Mastigophora

Flagellés

Trypanosoma, Giardia, Leishmania, Trichomonas

Eaux douces, parasites d’animaux

Maladie du sommeil africaine, giardase, leishmaniose

Euglènesa

Euglènes

Euglena

Eaux douces et parfois de mer

Aucune connue

Sarcodina

Amibes

Amoeba, Entamoeba

Eaux douces et de mer, parasites animaux

Dysenterie amibienne (amibiase)

Ciliophora

Ciliés

Balantidium, Paramecium

Eaux douces et de mer, parasites animaux, panse

Dysenterie

Apicomplexés

Sporozoaires

Plasmodium, Toxoplasma

Essentiellement parasites animaux, insectes (vecteurs des maladies parasitaires)

Malaria, toxoplasmose

a

Ce groupe est aussi traité avec les algues (voir section 14.13 et tableau 14.3).

leur habitat. Bien que beaucoup de protozoaires flagellés soient des organismes libres, certains sont des parasites ou des pathogènes d’animaux, tout comme de l’homme. Les pathogènes les plus importants chez les Mastigophora sont les trypanosomes. Ces organismes causent un grand nombre de maladies graves chez l’homme et les animaux vertébrés, y compris la maladie du sommeil africaine (African sleeping sickness). Les Trypanosoma qui infectent l’homme sont des organismes de petite taille (environ 20 µm de longueur), minces et en forme de croissant. Ils ont un seul flagelle qui a pour origine un corps basal et qui se replie latéralement le long de la cellule où il est enfermé par un repli de la membrane de surface (voir figure 14.22). À la fois le flagelle et la membrane participent à la propulsion de l’organisme, rendant le mouvement possible même dans des liquides relativement visqueux comme le sang. Trypanosoma brucei est l’espèce qui cause la maladie du sommeil africaine, une maladie chronique et en général mortelle. Chez l’homme, le parasite vit et se développe principalement dans le circuit sanguin. Mais, à un stade ultérieur de la maladie, se produit l’invasion du système nerveux central, ce qui cause

Repli de la membrane

Globule rouge

une inflammation du cerveau et de la moelle épinière responsables des symptômes neurologiques caractéristiques de la maladie. Le parasite est transmis d’un hôte à un autre par la mouche tsé-tsé, Glossina sp., une mouche suceuse de sang qu’on ne trouve que dans certaines parties d’Afrique. Le parasite prolifère dans l’intestin de la mouche et envahit les glandes salivaires et les pièces buccales de l’insecte, à partir desquelles il peut être transféré à un nouvel hôte humain par morsure. Parmi les autres flagellés parasites, on trouve Trichomonas, un parasite de l’homme sexuellement transmissible (voir section 26.13). Ce protozoaire parabasalien (appelé ainsi parce qu’il contient un corps parabasal qui, parmi d’autres fonctions, sert de structure de support à l’appareil de Golgi) vit dans l’intestin et le conduit uro-génital des vertébrés et invertébrés. De nombreuses espèces de Trichomonas habitent dans l’intestin des termites et d’autres insectes (voir section 19.10). Certains flagellés sont même phototrophes. C’est le cas des euglènes, qui sont des flagellés contenant des chloroplastes qui leur permettent une croissance photosynthétique. Cependant, dans l’obscurité, les cellules d’Euglena (voir figure 14.33a), une euglène typique, peuvent croître de manière chimio-organotrophe. Ainsi, ces organismes ne sont pas distinguables phénotypiquement des protozoaires flagellés. On connaît de nombreux types d’euglènes, tous exclusivement aquatiques, habitant principalement les eaux douces. Cependant, à la différence d’autres protozoaires flagellés, les euglènes ne sont pas pathogènes (voir section 14.13).

Arthur M. Siegelman

Sarcodina : les amibes

Cellule de trypanosome FIGURE 14.22 Trypanosomes. Vue au microscope du protozoaire flagellé Trypanosoma brucei, l’agent de la maladie du sommeil africaine, à partir d’un frottis sanguin.

On trouve parmi les sarcodines des organismes tels qu’Amoeba, qui ne possède pas de paroi dans la phase végétative (voir figure 14.21a) et les foraminifères, des amibes qui sécrètent une coquille pendant leur croissance végétative (voir figure 14.23). Amoeba est une espèce d’eau douce dont la taille cellulaire va de 15 µm – une taille microscopique – jusqu’à 750 µm, une dimension qui la rend pratiquement visible à l’œil nu. Les sarcodines à coquille présentent une grande variété de morphologies intéressantes. Les plus connues des formes à coquille sont les foraminifères, qui sont des organismes exclusivement marins, vivant principalement dans les eaux



FIGURE 14.23 Amibes à coquille : foraminifères. Notez l’enveloppe ornementée à plusieurs lobes.

côtières. Leurs coquilles, appelées tests, ont des caractéristiques bien distinctes et sont souvent très ornées (voir figure 14.23). Le test est en général constitué de carbonate de calcium. La cellule n’est pas fermement attachée au test, et la cellule amibienne peut s’étendre pour partie en dehors du test durant la phase de nourriture. Cependant, à cause du poids du test, la cellule sombre en général, au fond et on pense que ces organismes se nourrissent des dépôts particulaires des sédiments, principalement bactéries et détritus. Les tests de foraminifères sont relativement résistants à la décomposition et deviennent par conséquent facilement fossilisés (les falaises de Douvres en Angleterre, sont par exemple composées pour partie de coquilles de foraminifères ayant sédimenté dans une mer disparue aujourd’hui). Comme ces organismes ont laissé une très bonne trace fossile, on a une meilleure idée de leur distribution à l’échelle géologique que pour les autres protozoaires.

Les amibes pathogènes Un certain nombre d’amibes sans parois sont des parasites de l’homme et des autres vertébrés, leur habitat habituel étant la cavité buccale ou l’intestin. Elles se déplacent dans ces habitats par des mouvements amiboïdes (voir figure 14.24), un mécanisme qui est aussi utilisé par les moisissures glaireuses (voir section 14.11). Entamoeba histolytica (voir figure 28.13) est un bon exemple d’amibe parasite. Dans de nombreux cas, l’infection ne cause pas de symptômes évidents. Mais chez certains individus, E. histolytica cause une ulcération de l’intestin induisant des diarrhées saignantes appelées amibiase. E. histolytica se transmet d’individu à individu sous la forme de kystes par contamination fécale de l’eau et de la nourriture. Nous discutons l’étiologie et la pathogénie de l’amibiase dans la section 28.8.

Ciliophora : les ciliés Les ciliés sont des protozoaires qui, à un stade de leur cycle vital, possèdent des cils (voir figures 14.25 et 14.21b), structures qui servent à la motilité. Les ciliés sont aussi les seuls protozoaires à avoir deux types de noyau : le micronoyau (micronucleus), qui ne sert que pour l’héritage génétique et la

M. Haberey



474 Chapitre 14

FIGURE 14.24 Vue latérale du déplacement d’une amibe, Amoeba proteus (d’après un film). L’intervalle de temps entre l’image du haut et celle du bas est d’environ 6 secondes. La flèche indique un point de repère sur la surface de déplacement. Une cellule mesure environ 80 µm de diamètre.

reproduction sexuelle, et le macronoyau (macronucleus), qui ne sert qu’à la production d’ARN (transcription) et à divers aspects de la croissance et du fonctionnement cellulaires (voir figure 14.26). Les plus connus et les plus répandus des ciliés sont probablement ceux appartenant au genre Paramecium (voir figure 14.25), qui sera utilisé ici comme exemple de ce groupe. La plupart des ciliés obtiennent leur nourriture en ingérant la matière particulaire grâce à une région orale spécifique (une sorte de bouche) appelée péristome, connectée à un « œsophage » (cytostome – voir figure 14.25b). Une fois à l’intérieur de la cellule, les particules de nourriture transitent par le cytostome pour aller dans le cytoplasme, où elles sont enfermées dans une vacuole, structure dans laquelle sont sécrétées des enzymes digestives. En plus des cils qui servent à la motilité, beaucoup de ciliés ont des trichocystes. Ces filaments longs et fins, de nature contractile, sont ancrés sous la surface de la couche extérieure de la cellule. Ils permettent aux protozoaires de s’attacher à une surface et peuvent participer à la défense de la cellule en lui signalant qu’elle est attaquée par un prédateur, stimulant alors les défenses cellulaires. Dans le cas des ciliés qui sont des prédateurs, tels que Didinium, les trichocystes s’accrochent à la proie et la paralysent avant qu’elle ne soit ingérée. De nombreuses espèces de Paramecium (et bien d’autres protozoaires) servent d’hôtes à des bactéries endosymbiotiques qui résident soit dans le cytoplasme, soit dans le macronoyau. Dans certains cas, on possède la preuve que ces endosymbiotes jouent un rôle nutritionnel pour l’hôte, en synthétisant des vitamines ou d’autres facteurs de croissance qui autrement devraient être obtenus à partir de l’environnement. Dans le cas des protozoaires ciliés qui habitent le tube digestif des termites, des endosymbiotes méthanogènes consomment le H2 produit à partir de l’oxydation du pyruvate dans l’hydrogénosome (voir figure 14.4) en produisant du méthane qui est ensuite émis dans l’atmosphère (voir section 19.10 et figure 19.26b et c).



14.10 Protozoaires 475

bénéfique dans les processus de digestion et de fermentation qui se produisent à cet endroit.

Les apicomplexés (sporozoaires)

(a) Cils

Bouche (cytostome)

Sydney Tamm

Cellule de levure (donne l’échelle)

(b) FIGURE 14.25 Paramecium, un protozoaire cilié. (a) Microscopie à contraste de phase. (b) Microscopie électronique à balayage. Notez les cils sur les deux images. Une cellule de Paramecium mesure environ 60 µm de diamètre.

Bien que quelques ciliés soient des parasites d’animaux, ce mode d’existence est beaucoup moins développé chez les ciliés que chez d’autres groupes de protozoaires. L’espèce Balantidium coli (voir figure 14.26) est avant tout un parasite d’animaux domestiques, mais elle peut aussi occasionnellement infecter l’intestin de l’homme, produisant des symptômes dysentériques semblables à ceux causés par Entamoeba histolytica. De plus, on trouve d’habitude une faune caractéristique composée de ciliés obligatoirement anaérobies dans la panse (ou rumen, la première partie de l’estomac) des ruminants (voir section 19.11). Ces protozoaires jouent un rôle

Les apicomplexés, ou sporozoaires comme on les appelle aussi, (voir figure 14.21d), constituent un grand groupe de protozoaires obligatoirement parasites. Les parasites apicomplexés causent de graves maladies comme la malaria (Plasmodium), la toxoplasmose (Toxoplasma) et la coccidiose (Eimeria). Les apicomplexés sont caractérisés par l’absence de stade adulte mobile, et leur nourriture est absorbée sous forme soluble à travers la membrane, comme chez les procaryotes et les champignons. Bien que le terme « sporozoaires » suggère la formation de spores, ces organismes ne produisent pas de spores de résistance à proprement parler, comme celles des bactéries, des algues et des champignons, mais forment des structures ressemblant à des spores appelées sporozoïtes, qui sont impliqués dans la transmission à un nouvel hôte. De nombreux vertébrés et invertébrés servent d’hôtes pour les sporozoaires. Dans certains cas une alternance d’hôte a lieu, certains stades du cycle vital se déroulant dans un premier hôte et certains autres dans un second. Les membres les plus importants des sporozoaires sont les coccidies, en général parasites d’oiseaux, et le genre Plasmodium (parasite de la malaria) [voir figure 14.21d], qui infecte les oiseaux et les mammifères, ainsi que l’homme. Comme la malaria est une maladie majeure pour l’homme, en particulier dans les pays en voie de développement, nous l’aborderons, ainsi que les propriétés de ses parasites, de manière approfondie dans la section 27.5. Il est intéressant de noter que les parasites apicomplexés contiennent un plaste appelé apicoplaste. L’apicoplaste est un chloroplaste dégénéré qui ne possède ni les pigments, ni l’activité photosynthétique du chloroplaste. Cependant, comme le chloroplaste, l’apicoplaste contient son propre génome et exprime quelques gènes. La majorité des fonctions de l’apicoplaste sont codées par le noyau, comme c’est le cas pour la mitochondrie. L’apicoplaste synthétise des acides gras, des terpénoïdes et des hèmes, exportant ces produits vers le cytoplasme. On pense que l’apicoplaste provient de l’endo-symbiose d’une algue rouge par un apicomplexé dont le chloroplaste a éventuellement dégénéré pour jouer un rôle très spécialisé, non photosynthétique, dans la cellule apicomplexée.

American Society of Clinical Pathologists


FIGURE 14.26 Balantidium coli, un protozoaire cilié qui cause une maladie identique à la dysenterie chez l’homme. La structure marquée en bleu foncé est le macronoyau.

Les protozoaires sont des Eukarya unicellulaires microbiens qui, en général, ne possèdent pas de paroi cellulaire et présentent différent types de motilité. De nombreux protozoaires sont des pathogènes de l’homme et des animaux. •

Indiquez au moins deux différences principales entre les protozoaires Paramecium et Trypanosoma.

•

En quoi les sporozoaires diffèrent-t-ils de tous les autres protozoaires ?

•

Pourquoi peut-on considérer l’algue Euglena comme un protozoaire ?



476 Chapitre 14


m n

14.11 Moisissures glaireuses Principaux genres : Dictyostelium, Physarum

Les moisissures glaireuses sont des eucaryotes microbiens qui présentent certaines similitudes phénotypiques avec les champignons et les protozoaires. Comme les champignons (voir section 14.12), les moisissures glaireuses présentent un cycle vital et peuvent produire des spores. Toutefois, à l’instar des protozoaires, elles sont mobiles et peuvent se mouvoir assez rapidement sur une surface solide (voir figures 14.27 à 14.29). D’un point de vue phylogénétique, les moisissures glaireuses sont reliées aux protozoaires amiboïdes (voir figure 14.20a). Elles sont divisées en deux groupes : les moisissures glaireuses cellulaires, chez qui les formes végétatives sont des amibes isolées, et les moisissures glaireuses acellulaires, chez qui les formes végétatives correspondent à des masses protoplasmiques de taille et de forme non définies, masses dénommées plasmodes (voir figure 14.27). Les moisissures glaireuses vivent principalement sur des débris végétaux, tels que les déchets feuillus ou les brindilles et sur le sol. Elles se nourrissent principalement d’autres micro-organismes, en particulier de bactéries qu’elles ingèrent par phagocytose. Les moisissures glaireuses peuvent persister durant de longues périodes sous forme végétative, mais peuvent potentiellement former des structures différenciées de type « spores ». Ces spores sont capables de dormance avant de germer et de générer, à nouveau, un état amiboïde actif.

Les moisissures glaireuses acellulaires


Dans la phase végétative, les moisissures glaireuses acellulaires telles que les Physarum se présentent sous forme de masse protoplasmique en expansion dont la taille est non définie (voir figure 14.27). Cette structure est douée d’une grande mobilité que lui procurent ses mouvements amiboïdes, le plasmode glissant sur la surface du substrat et absorbant des particules nutritives durant son déplacement. Le mouvement amiboïde résulte de déplacements cytoplasmiques rythmiques. Le cytoplasme se déplace vers l’avant parce que l’extrémité du plasmode est moins dense et plus visqueuse ; ainsi, le cytoplasme migre vers la zone de moindre résistance.

FIGURE 14.27 Moisissure glaireuse. Plasmodes de Physarum, moisissure glaireuse vraie (ou acellulaire), développés sur milieu gélosé.

L’écoulement cytoplasmique est facilité par des microfilaments qui forment une fine couche sous la membrane plasmique des cellules eucaryotes (voir section 14.4 et figures 14.1 et 14.9). Chez les moisissures glaireuses acellulaires, l’écoulement cytoplasmique s’opère en filets bien définis, chacun étant entouré par la fine membrane plasmique (voir figure 14.27). Ce phénomène d’écoulement est en lui-même un mécanisme de distribution des métabolites cellulaires. Le plasmode d’une moisissure glaireuse acellulaire (voir figure 14.27) est génétiquement diploïde. Cette masse protoplasmique peut générer un sporange où des spores haploïdes peuvent se former. Dans des conditions favorables, les spores germent et donnent naissance à une multitude de cellules haploïdes. La fusion de deux de ces cellules régénérera ensuite un plasmode diploïde.

Les moisissures glaireuses cellulaires : Dictyostelium Dictyostelium discoideum, moisissure glaireuse cellulaire, a été utilisé comme modèle d’étude des communications intercellulaires et de la coopération entre micro-organismes. Cet organisme communautaire présente un cycle vital remarquable dans lequel les cellules végétatives s’agrègent, migrent en une masse cellulaire et, éventuellement, produisent des organes de fructification au sein desquels des cellules se différencient pour donner des spores (voir figures 14.28 et 14.29). Lorsqu’apparaissent des carences nutritionnelles, les cellules de Dictyostelium s’agrègent et forment un pseudoplasmode, structure où les cellules perdent leur individualité mais ne fusionnent pas. Cette agrégation est déclenchée par la production de deux composés : l’adénosine monophosphate cyclique (AMPc) et une glycoprotéine spécifique. Ces deux composés agissent comme agents de chimiotactisme (les détails de l’implication de l’AMPc dans différents systèmes de régulation chez les procaryotes figurent dans la section 8.7). Les premières cellules qui produisent ces composés deviennent les centres d’attraction d’autres cellules végétatives. Ce phénomène conduit à la formation de masses de cellules agrégées qui viennent constituer une masse visqueuse en mouvement appelée « limace » (slug). La formation d’organes de fructification débute quand la limace cesse de ramper et se réorganise perpendiculairement à la surface (voir figures 14.28 et 14.29). La fructification se différencie en une tige et une tête ; les cellules de l’extrémité antérieure de la limace deviennent les cellules de la tige, alors que celles de l’extrémité postérieure produisent les spores. Les cellules qui forment la tige commencent à sécréter la cellulose qui procure la rigidité de la tige. Les cellules de l’arrière de la limace migrent le long de la tige vers le sommet et forment la tête. À maturité de la tête, les spores sont relarguées et dispersées. Chaque spore germe alors et donne une amibe végétative. Le cycle de fructification et de formation des spores chez les Dictyostelium suit un processus asexué. Cependant, des spores sexuées appelées macrocystes peuvent également être produites. Les macrocystes résultent d’agrégats d’amibes qui s’entourent d’une paroi cellulosique. À la suite de la conjugaison de deux amibes, une grande amibe unique se développe et vient phagocyter les amibes résiduelles. À ce stade, une épaisse paroi cellulosique se forme autour de cette amibe géante, donnant le macrocyste adulte ; ce dernier peut présenter une dormance sur de longues périodes. Éventuellement, le noyau diploïde subit une méiose qui



Kenneth B. Raper

Kenneth B. Raper

Kenneth B. Raper

(d)

Kenneth B. Raper

(c)

(b)

(a)

477

Kenneth B. Raper

Kenneth B. Raper

Kenneth B. Raper

14.11 Moisissures glaireuses

(e)

(f)

(g)

FIGURE 14.28 Différentes phases du cycle vital de la moisissure glaireuse cellulaire Dictyostelium discoideum. (a) Formes amibes au stade de préagrégation. Notez la forme irrégulière et l’absence d’orientation. (b) Agrégation des amibes. Notez le caractère régulier de la forme et l’orientation. La masse pluricellulaire est en mouvement dans une direction. (c) Aspect des amibes agrégées. (d) Pseudoplasmode (masse muqueuse ou « limace ») en mouvement sur milieu gélosé et laissant des traînées de mucus dans son sillage. (e, f) Stades précoces de la fructification. (g) Fructification mûre (voir figure 14.29 pour les tailles de ces structures).

conduit à des noyaux haploïdes. Ceux-ci s’intègrent dans de nouvelles amibes qui peuvent à nouveau initier une croissance végétative (voir figures 14.28 et 14.29).

individuelles qui s’agrègent pour former des fructifications d’où les spores sont relarguées.


FIGURE 14.29 Étapes de formation de la fructification de la moisissure glaireuse cellulaire Distyostelium discoideum. (A-C) Agrégation des amibes ; l’agrégation est activée par l’AMPC. (D-G) Migration de la masse muqueuse formée par agrégation des amibes. (H-L) Culmination et formation de la fructification. (M) Fructification mature composée d’une tige et d’une tête. Les cellules situées à l’arrière de la masse muqueuse forment la tête et deviennent des spores. La fructification renferme des spores qui peuvent redonner des cellules végétatives, amorces d’un nouveau cycle vital.

Hauteur (mm)

Les moisissures glaireuses acellulaires sont des masses protoplasmiques mobiles, alors que les moisissures glaireuses cellulaires sont des masses de cellules

1,2 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0

•

Décrivez les étapes principales du cycle vital de Dictyostelium discoideum.

•

Qu’est-ce qu’un macrocyste ?

Fructification mûre Agrégation des amibes

1

A 2

B 3

D

C

Tem

4

ps (

h)

E

F

G

H

Migration de la masse muqueuse 5 6 7

I

J

K

L

Formation de la fructification

8

M ion

t cia en e r ffé ir Di llula ce



478 Chapitre 14


m n

14.12 Champignons

Principaux genres : Penicillium, Aspergillus, Saccharomyces, Candida À la différence des protozoaires, les champignons possèdent des parois. Les champignons forment un groupe phylogénétique homogène que les arbres soient fondés sur la petite sousunité de l’ARNr ou sur d’autres gènes (voir figure 14.20). On distingue trois groupes majeurs de champignons : les moisissures, les levures et les champignons macroscopiques. Les habitats des champignons sont très divers. Quelques-uns sont aquatiques, essentiellement d’eaux douces, et un petit nombre de champignons marins sont également connus. Cependant, la plupart des espèces sont terrestres. Ils colonisent le sol ou les débris végétaux et jouent un rôle essentiel dans la minéralisation du carbone organique. De nombreuses espèces sont parasites de plantes et provoquent la majorité des maladies de plantes cultivées à incidence économique marquée (voir tableau 14.2). Quelques champignons sont parasites des animaux et de l’homme, bien qu’en général les champignons soient moins fréquemment que d’autres micro-organismes des agents pathogènes d’animaux (voir section 27.8 pour une discussion sur les champignons pathogènes).

Les champignons filamenteux ou moisissures

Parois et métabolisme Bien que la cellulose, polysaccharide des parois végétales, soit présente dans les parois de certains champignons, la plupart

TABLEAU 14.2

Groupe

contiennent de la chitine, qui est un polymère formé d’unités de N-acetylglucosamine (voir figure 3.5). La chitine est disposée en réseaux de microfibrilles, comme la cellulose. D’autres polysaccharides tels les mannanes, galactosanes et chitosanes remplacent la chitine dans les parois de certains champignons. Les parois fongiques contiennent typiquement 80 à 90 % de polysaccharides associés à des protéines, des lipides, des polyphosphates et des ions inorganiques, l’ensemble constituant un réseau matériel dense. La connaissance de la biochimie des parois trouve son importance dans les nombreuses applications biotechnologiques des champignons (voir chapitres 30 et 31). Ces micro-organismes sont chimio-organotrophes et se caractérisent par des besoins nutritionnels élémentaires. Beaucoup d’espèces peuvent se développer dans des conditions extrêmes de pH bas ou de température élevée (jusqu’à 62 °C). Cette donnée, associée à l’omniprésence des spores fongiques, explique que ces organismes puissent être des contaminants banals de produits alimentaires, de milieux de culture de micro-organismes et de surfaces. Les moisissures et les levures ne sont pas cependant classées selon leurs milieux de développement, mais plutôt en fonction de la diversité des types de cycles de reproduction, en incluant la formation de spores sexuées différentes (voir tableau 14.2).

Les moisissures sont largement répandues dans la nature et sont communément observées sur le pain rassis, le fromage ou les fruits. La plupart sont des aérobies stricts. Chaque filament

CLASSIFICATION ET PRINCIPALES PROPRIÉTÉS DES CHAMPIGNONSa Nom commun

Hyphes

Genres de référence

Type de spore sexuée

Habitats

Maladies de référence

Ascomycètes

Champignons à asques

Septés

Neurospora, Saccharomyces, Morchella (morilles)

Ascospore

Sol, débris végétaux

Maladie hollandaise de l’orme, encre du châtaignier, ergot, pourritures

Basidiomycètes

Champignons à basides

Septés

Amanita (souvent toxiques), Agaricus (souvent comestibles)

Basidiospore


Tige noire, rouille, charbon

Zygomycètes

Moisissures de céréales et produits céréaliers

Coenocytiques Mucor, Rhizopus

Zygospore


Altération des aliments ; rarement impliqués dans des maladies parasitaires

Oomycètes

Moisissures aquatiques

Coenocytiques Phytophthora

Oospore

Eau et milieux humides

Mildiou de la pomme de terre, maladies de poissons

Inconnu

Sol, débris végétaux, épiderme des animaux

Dépérissement vasculaire de plantes, infections d’animaux, teigne, infections de surface ou systémique (Candida)

Deutéromycètes Champignons imparfaits

Septés

Penicillium, Aspergillus, Candida

a À l’exception des Oomycètes, qui sont phylogénétiquement distincts, les autres groupes sont proches (voir figure 14.20). Voir les photos de nombreux organismes cités dans les figures 14.30 à 14.34.



14.12 Champignons 479

Conidies (spores) Hyphes aériennes Hyphes intramatricielles

Germination

Hyphes

Barry Katz, Mycosearch

(a)

Conidies (spores)

(b)

FIGURE 14.30 Structure et développement d’une moisissure. (a) Moisissure type observée en microscopie. Les conidies apparaissent comme des structures sphériques à l’extrémité d’hyphes aériens. (b) Diagramme d’un cycle de levure. Les conidies peuvent être disséminées par l’air ou transportées par des animaux.

montre une croissance apicale (voir figure 14.30). Un filament est également dénommé hyphe. Le développement en masse compacte d’un ensemble d’hyphes sur un substrat donne le mycélium, qui est détectable à l’œil nu (voir figure 14.31). La formation du mycélium résulte de la ramification des filaments au cours de leur croissance. Les rameaux s’entremêlent et donnent un tapis compact. Dans la majorité des cas, la cellule végétative d’un hyphe contient plus d’un noyau, parfois des centaines. L’hyphe correspond alors à un tuyau contenant du cytoplasme où baignent des noyaux et est appelé coenocytique. D’autres filaments peuvent se dresser à la surface du mycélium. Des spores appelées conidies se forment à son niveau (voir figure 14.30). Les conidies sont des spores asexuées (leur formation ne requiert pas la fusion de gamètes), souvent pigmentées (voir figures 14.31 et 10.1a) et résistantes à la sécheresse. Les conidies permettent la dispersion du champignon vers de nouveaux habitats. Lorsque les conidies se forment, leur couleur vient masquer la coloration blanche du mycélium. Ces spores peuvent être noires, bleu-vert, rouges, jaunes ou brunes. Leur présence donne au mycélium un aspect poussiéreux (voir figure 14.31a). Quelques moisissures peuvent également produire des spores sexuées issues de la reproduction sexuée (voir tableau 14.2). La fusion de gamètes unicellulaires ou d’hyphes spécialisés appelés gamétanges donne une cellule diploïde qui subit méiose et mitose avant de différencier des spores. Selon le groupe, on observe différents types de spores (voir tableau 14.2). Les spores formées dans un sac fermé (asque) sont nommées ascospores (voir figure 14.14) et celles produites à l’extrémité de structures en forme de massue (baside) sont des basidiospores (voir tableau 14.2 et figure 14.32c). Les zygospores, produites par des Zygomycètes comme Rhizopus, sont des structures macroscopiques qui résultent de la fusion d’hyphes et d’échanges génétiques. Les zygospores peuvent germer et produire des spores asexuées en mesure de se disséminer dans un air humide.

Les spores sexuées sont caractérisées par leur résistance à la sécheresse, à la chaleur, au gel et à quelques composés chimiques. Toutefois, la résistance à la chaleur des spores sexuées fongiques est nettement inférieure à celle des endospores bactériennes (voir section 14.13). Qu’elles soient sexuées ou asexuées, les spores peuvent germer, puis donner un nouveau mycélium. Les principales incidences écologiques de l’activité de nombreux champignons, en particulier des Basidiomycètes (voir tableau 14.12), sont la décomposition du bois, du papier, des textiles et d’autres produits issus de sources naturelles. Les Basidiomycètes impliqués peuvent utiliser la cellulose ou la lignine comme sources de carbone et d’énergie. La lignine est un polymère complexe formé de composés phénoliques. Ce constituant important du bois, en association avec la cellulose, confère aux plantes ligneuses leur rigidité. La dégradation de la lignine dans la nature résulte quasi exclusivement de l’action de certains Basidiomycètes, nommés champignons de pourriture du bois. Deux types de pourriture sont séparés : la pourriture brune, caractérisée par une attaque préférentielle de la cellulose, la lignine restant intacte, et la pourriture blanche, où cellulose et lignine sont décomposées. Les agents de pourriture blanche jouent un rôle écologique important en forêt, car ils dégradent les déchets ligneux.

Les champignons macroscopiques Ce sont des Basidiomycètes filamenteux qui présentent de grands carpophores, parfois comestibles (voir figure 14.32a et b). Nous discuterons dans la section 30.14 de la culture industrielle des champignons macroscopiques comestibles. Durant la majeure partie de leur existence, ces champignons se présentent sous forme de mycélium développé dans le sol, sur déchets feuillus ou sur branches mortes. Cependant, lorsque les conditions environnementales favorables sont réunies (habituellement après une période humide et des températures fraîches),




Cheryl L. Broadie

480 Chapitre 14

(a)

USDA

W. Ormerod

CDC Public Health Image Library, PHIL

(a)

(b)

(b)

l’organe de reproduction se développe pour donner une fructification mature nommée carpophore (voir figure 14.32a). Les spores sexuées appelées basidiospores (voir figure 14.32c) naissent à la surface inférieure du carpophore, sous le chapeau, sur des lames portant les basides (voir figure 14.32b et d). Après dispersion par le vent, et parfois sous l’effet de la lumière, si les spores tombent sur un sol humide riche en matières organiques, un nouveau cycle peut débuter (voir figure 14.32d).

S L Fleger

FIGURE 14.31 Champignons. (a) Colonies d’une espèce d’Aspergillus sur milieu gélosé. Notez l’aspect de l’ensemble de filaments formant le mycélium et la présence de spores asexuées (voir figure 14.30b), qui confèrent aux colonies un aspect poussiéreux. (b) Conidiophore et conidies d’Aspergillus fumigatus.

(c)

Basidiospores Chapeau

Lamelles Pied

Les champignons unicellulaires : les levures Les levures sont unicellulaires et la plupart appartiennent aux Ascomycètes (voir tableau 14.2). Les cellules de levures sont sphériques, ovales ou cylindriques, et la division cellulaire s’opère typiquement par bourgeonnement (voir figure 14.33). Lors du processus de bourgeonnement, une petite excroissance se forme sur la cellule mère ; le bourgeon grossit progressivement avant de se séparer (voir figures 14.33 et 14.34). Bien que la reproduction de la plupart des levures conduise à des cellules isolées, quelques levures présentent des formes filamenteuses. Chez ces dernières, certains caractères ne peuvent s’exprimer que sous la forme filamenteuse. Par exemple, la pathogénicité de Candida albicans est liée à la phase filamenteuse. Cette levure peut provoquer des infections du vagin, de la bouche ou des poumons et, chez les patients atteints du syndrome d’immunodéficience acquise (SIDA), conduire à des atteintes tissulaires systémiques.

Anneau

Mycélium Germination des spores (d)

Champignon adulte

FIGURE 14.32 Champignons macroscopiques. (a) Amanita, genre comptant des espèces très toxiques. (b) Lames à la face inférieure du carpophore portant des basides génératrices de spores. (c) Basidiospores libérées à partir de basides de champignon observées en microscopie électronique à balayage. (d) Cycle vital d’un champignon type (pour la production de champignons alimentaires, voir section 30.14).



14.13 Algues 481

section 14.7), et cette levure est le premier eucaryote dont le génome ait été entièrement séquencé (voir section 15.6).

J. Forsdyke


FIGURE 14.33 Saccharomyces cerevisiae, levure des boulangers et des brasseurs, observée en microscopie électronique à balayage. Notez la division par bourgeonnement et les cicatrices laissées par les bourgeons précédents. Le diamètre d’une cellule mature est d’environ 8 µm.

T. D. Brock

Les cellules de levures peuvent être aisément distinguées des bactéries du fait de leur taille nettement supérieure et de la distinction nette de structures internes, comme le noyau (voir figure 14.34). Quelques levures montrent une reproduction sexuée qui fait intervenir des types sexuels déterminés par un locus MAT. L’association de cellules de type conjuguant opposé donne un zygote où peuvent se former des ascospores. Nous avons discuté de la reproduction sexuelle de la levure modèle, Saccharomyces, et des propriétés des types sexuels dans la section 14.7 (voir figures 14.14 à 14.16). Les levures prolifèrent en présence de sucre, par exemple sur les fruits, les fleurs ou l’écorce d’arbres. La plupart des levures sont des aérobies facultatifs, capables de développer un métabolisme totalement aérobie aussi bien que fermentaire. Plusieurs espèces développent une symbiose avec des animaux, en particulier des insectes, et quelques-unes sont pathogènes des animaux et de l’homme (voir section 27.7). Les levures industrielles majeures sont les levures de boulangerie et de brasserie, qui appartiennent au genre Saccharomyces (voir au chapitre 5 le focus « Les produits de la fermentation de la levure »). Les habitats d’origine de ces levures sont, sans aucun doute, les fruits et le jus des fruits. Mais les souches industrielles actuelles sont probablement très différentes des souches sauvages, car elles sont issues, au fil des ans, d’une sélection rigoureuse et de manipulations génétiques. La S. cerevisiae a été choisie comme modèle pendant de nombreuses années dans les études sur les eucaryotes (voir

FIGURE 14.34 Croissance par bourgeonnement chez Saccharomyces cerevisiae. Série de photos en microscopie à contraste de phase montrant la séquence de la division par bourgeonnement. Notez l’importance du noyau. Le diamètre d’une cellule de S. cerevisiae est d’environ 8 µm.

Les champignons comprennent les moisissures et les levures. Ils diffèrent des protozoaires par leur paroi rigide, la perte de mobilité et leur position phylogénétique. Les moisissures macroscopiques forment un vaste ensemble comprenant fréquemment des champignons comestibles. Leurs organes de fructification portent des basidiospores. •

En quoi les moisissures diffèrent-elles des levures ?

•

Qu’est-ce que la chitine et quelle est sa fonction chez les champignons ?

•

Chez les moisissures, quelle est la différence entre conidies et ascospores ?

14.13 Algues m n Principaux genres : Chlamydomonas, Euglena, Gonyaulax Les algues constituent un groupe important et divers d’organismes eucaryotes (voir figures 14.35 et 14.36) qui contiennent de la chlorophylle et qui utilisent la photosynthèse oxygénique (voir section 17.5). Les algues doivent être distinguées des cyanobactéries et des prochlorophytes (voir sections 12.25 et 12.26), qui sont aussi des phototrophes oxygéniques mais qui appartiennent aux Bacteria et donc distincts des algues (Eukarya) d’un point de vue évolutif. Bien que la plupart des algues soient de taille microscopique et donc clairement des micro-organismes, un certain nombre de formes sont pluricellulaires et macroscopiques, comme les laminaires, phylogénétiquement proches des diatomées, qui peuvent atteindre trente mètres de long.

La diversité des algues La plupart des algues sont soit unicellulaires (voir figure 14.35a et c), soit coloniales, ces dernières formant des agrégats de cellules (voir figure 14.35b). Quand les cellules sont arrangées bout à bout, on dit que l’algue est filamenteuse (voir figure 14.35d). Parmi les formes filamenteuses, il y a des espèces produisant des filaments sans ramification et celles produisant des ramifications plus complexes. Les algues contiennent de la chlorophylle et sont donc de couleur verte. Cependant, certaines algues assez communes ne sont pas vertes, mais apparaissent brunes ou rouges car, en plus de la chlorophylle, d’autres pigments sont présents, comme les xanthophylles et les caroténoïdes, qui masquent la couleur verte. Les cellules algales contiennent un ou plusieurs chloroplastes, structures membranaires qui contiennent les pigments photosynthétiques (voir section 14.3). Les chloroplastes peuvent souvent être identifiés à l’intérieur de cellules en microscopie grâce à leur couleur verte caractéristique. Nous avons discuté de la structure et des propriétés des chloroplastes dans la section 14.3 et de leur phylogénie dans les sections 12.27 et 14.4.



Dennis Kunkel


T.D. Brock

482 Chapitre 14



(b)

(a)

(d)

(c)

FIGURE 14.35 Algues vertes typiques observées en microscopie. (a) Micrasterias. Cellule isolée. (b) Colonie de Volvox, contenant un grand nombre de cellules. (c) Scenedesmus. Un paquet de quatre cellules. (d) Spirogyra. Une algue filamenteuse. Notez les chloroplastes verts en forme de spirale.

En examinant la figure 14.20 on s’aperçoit que les algues forment un groupe phylogénétiquement hétérogène. Bien que les algues vertes (Chlorophyta – voir tableau 14.3) et, de manière moindre, les algues rouges (Rhodophyta – voir tableau 14.3) soient proches des plantes vertes, les autres groupes d’algues, comme les algues brunes et les diatomées, sont des organismes moins dérivés sur la base de l’ARNr 18S (voir figure 14.20a). Les euglènes, comme l’algue Euglena (voir figure 14.36a), sont encore moins dérivées. Les euglènes sont reliées phylogénétiquement aux protozoaires flagellés comme Trypanosoma dans tous les arbres phylogénétiques (voir figure 14.20). Il n’est donc pas surprenant que les cellules d’Euglena puissent perdre de manière spontanée leurs chloroplastes et exister en tant qu’organismes complètement hétérotrophes (voir section 14.10). Les algues rouges (voir figure 14.36b) se distinguent par le fait que leurs chloroplastes ne possèdent pas de chlorophylle b et contiennent des phycobiliprotéines, qui sont les principaux pigments collecteurs de lumière chez les cyanobactéries (voir section 17.3). Par contre, le chloroplaste des algues vertes ne possède pas de phycobilines mais des chlorophylles a et b. Les dinoflagellés sont des algues flagellées, principalement marines, phylogénétiquement proches de certains protozoaires (voir figure 14.20). Certains dinoflagellés sont libres (voir figure 14.36f), alors que d’autres vivent en symbiose avec les animaux qui forment les récifs coralliens, obtenant ainsi un

habitat protégé en échange de l’apport de carbone fixé par la photosynthèse comme source de nourriture pour le récif.

Les dinoflagellés toxiques Les dinoflagellés comme Gonyaulax peuvent, à certains moments de l’année, former des concentrations très denses appelées efflorescences (blooms), ayant une couleur rouge intense due aux xanthophylles qui servent de pigments accessoires chez cet organisme. Ces efflorescences sont appelées « marées rouges (red tide) » (voir figure 14.37a) et se développent de manière occasionnelle dans les eaux côtières relativement chaudes et parfois polluées. Ces efflorescences sont souvent associées à des mortalités de poissons et des empoisonnements (voir section 28.4) chez l’homme à la suite de la consommation de coquillages contaminés. La toxicité est due à une puissante neurotoxine produite par Gonyaulax, dont quelques nanogrammes sont suffisants pour tuer un poisson. Pfiesteria est un autre genre de dinoflagellé toxique. Des spores toxiques de P. piscicida (voir figure 14.37b) infectent les poissons et éventuellement les tuent sous l’influence de neurotoxines qui affectent le mouvement et détruisent la peau. Les lésions se forment dans les parties du poisson où la peau a été enlevée, ce qui favorise la croissance de bactéries pathogènes opportunistes (voir figure 14.37c). Ainsi, en 1991, plus d’un milliard de poissons ont été tués par un développement de Pfiesteria dans l’estuaire de Nuese, en Caroline du Nord (États-Unis), et on



(e)

Irena Kaczmarska

(d)

Irena Kaczmarska

(c)

Irena Kaczmarska

(b)

Irena Kaczmarska

(a)



14.13 Algues 483

(f)

FIGURE 14.36 Algues autres que les algues vertes (Chlorophyta). (a-b) Microscopie optique. (a) Euglena, un membre des Euglenophyta (la cellule mesure environ 15 µm de large). Cet organisme est phylogénétiquement beaucoup moins dérivé que les algues vertes (voir figure 14.20) et partage de nombreuses autres propriétés avec les protozoaires flagellés (voir texte). (b) Poilysiphonia, une algue rouge marine (Rhodophyta) qui se développe, attachée à la surface des plantes marines (les cellules mesurent environ 150 µm de large). (c-f) Microscopie électronique à balayage. (c-e) Frustules de diatomées. Une frustule est l’enveloppe (ou paroi) de silice qui contient la cellule de diatomée. (c) Frustule de la diatomée marine Nitzschia présentant une symétrie pennée (la cellule mesure environ 10 µm de large). (d) Frustule de la diatomée marine Thalassiosira, présentant une symétrie radiale (la cellule mesure environ 5 µm de diamètre). (e) Frustule de la diatomée marine Asteriolampra, présentant une symétrie radiale (la cellule mesure environ 5 µm de large). (f) Cellule du dinoflagellé marin, Ornithocercus magnificus. La cellule elle-même correspond à la structure centrale globulaire ; les structures ornementées attachées sont appelées ailettes (lists) [la cellule mesure environ 30 µm de large].

suppose que d’autres événements de ce type ont eu lieu le long de la côte est des États-Unis. On suspecte qu’une toxémie humaine due à l’empoisonnement par Pfiesteria peut se produire, mais la relation de cause à effet n’est absolument pas établie comme c’est le cas pour le poisson.

Pigments, métabolisme énergétique et polymères de réserve Plusieurs caractères sont utilisés pour classer les algues, en particulier la nature des chlorophylles, celle des polymères carbonés de réserve (par exemple l’amidon et les dérivés de



484 Chapitre 14

TABLEAU 14.3

Groupe


PROPRIÉTÉS DES PRINCIPAUX GROUPES D’ALGUES Nom commun

Morphologie

Pigments spécifiques

Genre représentatif

Forme de stockage du carbone

Paroi

Habitats

Chlorophyta

Algues vertes

Unicellulaire, thalle

Chlorophylle a et b

Chlamydomonas Amidon (α-1,4 glucane), sucrose

Cellulose

Eaux douces et parfois de mer, sols

Euglenophytaa

Euglènes

Unicellulaire, flagellée

Chlorophylle a et b

Euglena (voir figure 14.36a)

Paramylon (β1,2 glucane)

Pas de paroi

Eaux douces et parfois de mer

Dinoflagellata

Dinoflagellés

Unicellulaire, flagellée

Chlorophylle a et c, xantophylle

Gonyaulax ; Pfiesteria

Amidon Cellulose (α-1,4 glucane)

Principalement marins

Bacillariophyta

Diatomées

Unicellulaire


Nitzschia (voir figure 14.36c)

Lipides

Deux parties en silice se recouvrant

Eaux douces et de mer, sols

Phaeophyta

Algues brunes

Filamenteuse, thalle, parfois massive et ressemblant à des plantes


Laminaria

Laminarine (β-1,3 glucane), mannitol

Cellulose

Eau de mer

Rhodophyta

Algues rouges

Unicellulaire, filamenteuse, thalle

Chlorophylle a et d, phycocyanine, phycoérythrine

Polysiphonia (voir figure 14.36b)

Amidon floridéen (α-1,4 et α-1,6 glucane)

Cellulose

Eau de mer

a

Ce groupe est aussi inclus dans les Protozoaires (voir section 14.10).

l’amidon), la structure de la paroi et le type de motilité. Toutes les algues contiennent de la chlorophylle a. Certaines contiennent cependant d’autres chlorophylles qui diffèrent de manière mineure de la chlorophylle a. La présence de ces chlorophylles caractérise certains groupes d’algues. La distribution des chlorophylles et des autres pigments photosynthétiques chez les différents types d’algues est synthétisée dans le tableau 14.3. Toutes les algues qui effectuent la photosynthèse libérant de l’oxygène (photosynthèse oxygénique) utilisent H2O comme donneur d’électrons (voir section 17.5). De plus, certaines algues effectuent la photosynthèse sans produire d’oxygène, en utilisant H2 comme donneur d’électrons. La plupart des algues sont des phototrophes obligatoires et donc ne peuvent pas croître dans l’obscurité en utilisant des composés carbonés organiques. Cependant, certaines espèces peuvent se développer de manière chimio-organotrophe et cataboliser des sucres simples ou des acides organiques dans l’obscurité. L’un des composés organiques les plus utilisés par les algues est l’acétate, qui peut être employé comme seule source de carbone et d’énergie par de nombreux flagellés et des algues vertes. De plus, certaines algues peuvent assimiler des composés organiques simples à la lumière (photohétérotrophie – voir figure 17.1 et section 17.4), mais ne peuvent pas se développer avec ces substrats dans l’obscurité. L’une des caractéristiques les plus importantes utilisées dans la classification des groupes d’algues est la nature du polymère de réserve, synthétisé à la suite de la photosynthèse. Les algues de la division des Chlorophyta produisent de l’amidon (glucose α-1,4) sous une forme très analogue à celle des

plantes supérieures. Par contre, les algues des autres groupes produisent de nombreuses substances de réserve, certaines étant des polymères et d’autres des monomères libres ; les principales substances sont listées dans le tableau 14.3.

La paroi des algues Les algues présentent une diversité considérable dans la structure et la chimie de leur paroi cellulaire. Dans de nombreux cas, la paroi cellulaire est composée d’un réseau de fibres de cellulose, mais d’autres polysaccharides sont aussi présents comme la pectine, les xylanes, les mannanes, les alginates ou les fucanes. Chez certaines algues, la paroi est de plus renforcée par la déposition de carbonate de calcium ; ces formes sont appelées algues calcaires ou coralligènes (c’est-à-dire ressemblant à du corail). Parfois la chitine, un polymère de N-acétyglucosamine (voir figure 3.5), est aussi présente dans la paroi cellulaire. Chez les euglènes, la paroi cellulaire est absente (voir figure 14.36a). Chez les diatomées (voir figure 14.36c à e), la paroi cellulaire est composée de silice, à laquelle s’ajoutent des protéines et des polysaccharides. Même après que la cellule est morte et que la matière organique a disparu, la structure externe, appelée frustule (voir figure 14. 36c à e), demeure souvent intacte, démontrant que cette partie siliceuse est en fait responsable de la rigidité de la cellule. Du fait de leur résistance à la décomposition, les frustules peuvent rester intactes pendant de très longues périodes et constituent donc parmi les meilleurs fossiles d’algues existants. À partir de cette excellente trace fossile, on sait que les diatomées sont apparues sur la Terre il y a



14.13 Algues 485

Rita R. Colwell

alors que les espèces flagellées de Chlorophyta en ont deux ou quatre. Les dinoflagellés (voir figure 14.36f et 14.37) ont deux flagelles de longueurs différentes ayant des points d’insertion distincts dans la cellule. Le flagelle transverse est attaché latéralement, alors que le flagelle longitudinal a son origine dans le sillon latéral de la cellule (voir figure 14.37b). Dans de nombreux cas, les algues sont non mobiles dans leur phase végétative et forment seulement des gamètes mobiles. Quelques algues, certaines diatomées par exemple, peuvent se déplacer en glissant. La mobilité par glissement est commune chez les cyanobactéries filamenteuses et chez une variété d’autres procaryotes (voir section 14.15).

(a) North Carolina State University Center for Applied Ecology

North Carolina State University Center for Applied Ecology

Écologie des algues et communautés algales endolithes Les algues sont très nombreuses dans les habitats aquatiques, à la fois dans les eaux douces et marines. On peut aussi les trouver dans des habitats aquatiques artificiels comme les aquariums ou les piscines, ainsi que dans des mares d’eau temporaires formées à partir d’eau de pluie et exposées à la lumière solaire. Les algues sont aussi communes dans la plupart des sols, tandis que quelques espèces se développent dans des sols secs ou même arides où l’activité de l’eau (voir section 6.14) peut être très faible. Les algues sont aussi souvent les micro-organismes phototrophes dominants ou même uniques dans les habitats extrêmement acides ; dans les habitats dont le pH est inférieur à 4, les cyanobactéries sont absentes et la photosynthèse oxygénique résulte

(c)

(b)

E. Imre Friedmann

FIGURE 14.37 Dinoflagellés toxiques. (a) Photographie d’une « marée rouge » (red tide) causée par le développement massif de dinoflagellés produisant des toxines, comme Goniaulax. La toxine est sécrétée dans l’eau et s’accumule dans les coquillages qui se nourrissent des dinoflagellés. La toxine est sans effet sur les coquillages mais peut empoisonner les poissons et les personnes qui mangent des coquillages infectés. (b-c) Le dinoflagellé toxique Pfiesteria. (b) Spore toxique de P. piscicida observée en microscopie électronique à balayage. (c) Poissons tués par P. piscicida. Notez les lésions produisant une décomposition de la chair.

La motilité des algues De nombreuses algues sont mobiles, en général grâce à des flagelles (voir figure 14.10). Pour l’instant ; on ne connaît pas de cils chez les algues. Les algues flagellées, comme Euglena (voir figure 14.36a), ont en général un seul flagelle polaire,

E. Imre Friedmann

(a)

à peu près deux cents millions d’années. Les diatomées ont une morphologie de frustule qui présente toujours une certaine symétrie. Les exemples de symétrie incluent les formes pennée (similarité de part et d’autre d’un axe) [voir figure 14.36c] et radiale (voir figure 14.36d et e). La paroi des algues contient des pores d’une dimension de 3 à 5 nm qui ne peuvent laisser passer que les substances de faible poids moléculaire comme l’eau, les ions inorganiques, les gaz et d’autres petites molécules de nutriments nécessaires au métabolisme et à la croissance. La phagocytose n’est donc pas possible, ce qui différencie de manière fondamentale les algues des protozoaires phagotrophes et des moisissures glaireuses.

(b) FIGURE 14.38 Cyanobactéries endolithes. (a) Photographie d’un rocher calcaire de Makhtesh Gadol, désert du Néguev, en Israël, montrant une couche de cellules de la cyanobactérie Chroococcidiopsis. (b) Cellules de Chroococcidiopsis, isolées d’un rocher en grès dans le désert du Néguev, observées en microscopie.



486 Chapitre 14


exclusivement de l’activité des algues et de certaines plantes tolérantes à l’acidité. Par exemple, l’algue rouge Cyanidium peut croître à un pH inférieur à 2. Certaines algues colonisent l’intérieur de rochers. Ces phototrophes endolithes (endo signifiant « à l’intérieur ») habitent des rochers poreux, par exemple ceux contenant du quartz, et sont en général observés en couches près de la surface. Les communautés phototrophes endolithes sont surtout communes dans les environnements secs tels que les déserts ou les environnements froids et secs comme en Antarctique (voir figure 14.38). Par exemple, dans les vallées sèches de l’Antarctique, où la température et l’humidité sont très basses, la vie à l’intérieur d’un rocher présente certains avantages. Les rochers sont chauffés par le soleil et l’eau provenant de la fonte de la neige peut être absorbée et retenue pendant des périodes relativement longues, apportant ainsi l’humidité nécessaire à la croissance. De plus, l’eau absorbée par un rocher poreux le rend plus transparent, canalisant ainsi plus de lumière vers les couches algales. Une grande diversité de phototrophes peut former des communautés endolithes, y compris les cyanobactéries (voir figure 14.38b) et diverses algues vertes. En plus des phototrophes

libres, les algues vertes et les cyanobactéries coexistent avec des champignons dans les communautés de lichens endolithes (voir section 19.20 pour une discussion de la symbiose des lichens). Le métabolisme et la croissance de ces communautés internes au rocher l’érodent lentement, permettant à des anfractuosités de se développer, dans lesquelles l’eau peut entrer, geler, dégeler et finalement provoquer une fissure dans le rocher, créant ainsi de nouveaux habitats pour la colonisation des microbes.

Contrôlez vos acquis Les algues sont des Eukarya qui contiennent de la chlorophylle et des caroténoïdes localisés à l’intérieur d’une structure appelée chloroplaste. Le chloroplaste lui-même a pour origine le domaine Bacteria. •

En quoi les algues diffèrent-elles des cyanobactéries ?

•

En quoi les algues rouges sont-elles différentes des autres algues ?

•

Quel est l’habitat principal des algues ?

QUESTIONS 1. Donnez au moins trois caractéristiques des cellules eucaryotes qui les distinguent clairement des cellules procaryotes (voir sections 4.1 à 4.5). 2. En quoi la mitochondrie et l’hydrogénosome sont-ils similaires structurellement. En quoi diffèrent-ils ? En quoi diffèrent-ils du point de vue métabolique (voir section 14.2) ? 3. Quels sont les processus physiologiques majeurs (en termes d’énergie et de carbone) qui se déroulent dans le chloroplaste (voir section 14.3) ? 4. En quoi le fait qu’un antibiotique comme la streptomycine inhibe la synthèse protéique dans les organelles nous renseignet-il sur leurs relations avec les Bacteria (voir section 14.4) ? 5. Quelles sont les différences chimiques entre les microfilaments et les microtubules ? De telles structures sont-elles réellement absentes chez les cellules procaryotes (voir la section 6.2 avant de répondre à cette question) [voir section 14.5] ? 6. Quelles sont les fonctions des structures suivantes de la cellule eucaryote : le réticulum endoplasmique, l’appareil de Golgi, le lysosome, le peroxysome (voir section 14.5) ? 7. En quoi l’action des flagelles est-elle différente chez les procaryotes et chez les eucaryotes (voir sections 14.4 et 14.5) ? 8. Expliquez comment, en l’absence de l’activité télomérase, des gènes seraient éventuellement perdus de l’ADN eucaryote (voir section 14.6).

9. Comparez et montrez les différences entre les processus de la mitose et de la méiose. Quel processus est absolument nécessaire à la croissance de Saccharomyces cerevisiae et pourquoi ? Comment le type sexuel d’une cellule de levure est-il déterminé (voir section 14.7) ? 10. Pourquoi l’ARNm eucaryote doit-il être « maturé » alors que ce n’est pas le cas de la plupart des ARN procaryotes (voir section 14.8) ? 11. La phylogénie des eucaryotes microbiens n’est pas encore bien résolue. Indiquez les différences majeures entre les deux arbres phylogénétiques présentés dans la figure 14.20 (voir section 14.9). 12. Quels sont les noms communs des principaux groupes de protozoaires (voir section 14.10) ? 13. Quels sont les différences majeures entre Physarum et Dictyostelium (voir section 14.11) ? 14. Comparez et donnez les différences entre les protozoaires d’une part et les champignons et les algues d’autre part, en indiquant aux moins deux manières de différencier les membres d’un de ces groupes des autres. Lequel de ces groupes ressemble-t-il le plus aux moisissures glaireuses, et pourquoi (voir sections 14.12 et 14.13) ? 15. Comment distingue-t-on les différents groupes d’algues (voir section 14.13) ? 16. Qu’est-ce qu’une frustule et par quel groupe d’algues est-elle produite (voir section 14.13) ?

PROBLÈMES 1. Si les organelles telles que les mitochondries et les chloroplastes avaient été initialement des cellules libres eucaryotes, en quoi les propriétés moléculaires de ces organelles indiquées dans la section 14.4 seraient-elles différentes ?

2. Dans le chapitre suivant, vous apprendrez que les cellules eucaryotes ont, en général, des génomes beaucoup plus grands que les cellules procaryotes. Indiquez trois raisons pour lesquelles ceci n’est pas surprenant.



CHAPITRE QUINZE

Génomique microbienne

I

Techniques de clonage pour la génomique

15.1 15.2 15.3

Vecteurs pour le clonage et le séquençage Séquençage du génome Annotation du génome

489 491 492

II

Génomes microbiens

493

15.4

Génomes procaryotes : tailles et cadres ouverts de lecture Génomes procaryotes : analyses bioinformatiques et distributions des gènes Génomes des micro-organismes eucaryotes

15.5 15.6

Le séquençage du génome révèle le potentiel génétique d’un organisme. Chaque projet de génomique commence par le clonage d’un génome en morceaux de tailles manipulables, par exemple dans un bactériophage, comme nous le montrons ici. Les plages blanches du bactériophage M13 répliqué dans les cellules d’Escherichia coli contiennent de l’ADN cloné.

488

494 496 499

III

Autres génomes et évolution des génomes

500

15.7 15.8 15.9

Les génomes des organites Évolution et familles de gènes L’exploitation des génomes

500 503 504

IV

Fonction et régulation des gènes

505

15.10 Protéomique 15.11 Puces à ADN et transcriptome

505 507



488 Chapitre 15


GLOSSAIRE Annotation (annotation) Dans le domaine de la génomique, conversion d’une séquence d’ADN de données brutes en une liste de gènes présents dans l’organisme (c’est « l’assignation des gènes »). Bioinformatique (bioinformatics) Utilisation d’outils informatiques pour obtenir, analyser, stocker et accéder aux séquences d’ADN et de protéines. Cadre ouvert de lecture (ORF, Open Reading Frame) Une séquence d’ADN sans codon stop à l’intérieur et qui, en cas de transcription, peut être traduite pour produire une protéine de longueur et de composition connues. Un cadre de lecture est dit fonctionnel s’il code vraiment une protéine de la cellule. Chromosome artificiel (artificial chromosome) Vecteur de clonage qui peut intégrer de très grands inserts d’ADN étranger et se comporte dans la cellule comme un chromosome cellulaire. Les chromosomes artificiels bactériens (BAC, Bacterial Artificial Chromosome) et les chromosomes artificiels de levures (YAC, Yeast Artificial Chromosome) sont les plus largement utilisés. Édition des ARN (RNA editing) Modification de l’ARN transcrit d’un gène codant une protéine par un procédé autre que l’épissage, pour obtenir les spécificités de codage souhaitées. Famille de gènes (gene family) Gènes d’un organisme dont les séquences nucléotidiques sont apparentées. Génome (genome) Ensemble des gènes d’une cellule ou d’un virus.

L

e génome d’un organisme est l’ensemble de ses gènes. La séquence du génome d’un organisme révèle non seulement ses gènes, mais fournit aussi des indices importants sur son mode de fonctionnement et sur son histoire évolutive. La connaissance du génome facilite aussi l’étude de l’expression génétique, c’est-à-dire la transcription et la traduction des informations génétiques. L’approche traditionnelle de l’étude de l’expression génétique se focalisait sur un seul gène ou un groupe de gènes apparentés. Aujourd’hui, l’expression de l’ensemble des gènes d’un organisme peut être étudiée en une seule expérience. La génomique correspond à la discipline qui cartographie, séquence, analyse et compare les génomes. Ce chapitre concerne la génomique microbienne. Le premier génome séquencé (3 569 nucléotides) a été celui du virus à ARN MS2 (voir section 16.1) en 1976. Le premier génome à ADN séquencé a été la séquence nucléotidique de 5 386 nucléotides du petit virus φX174 à ADN simple brin (voir section 16.2) en 1977. Cet exploit a été réalisé par un groupe conduit par Frederick Sanger, qui a mis au point la technique de séquençage de l’ADN, qui porte désormais son nom, établie sur l’utilisation de didéoxynucléotides (voir section 7.8). Le premier génome cellulaire séquencé a été le chromosome de 1 830 137 pb d’Haemophilus influenzae, décrit en 1995 par Hamilton O. Smith, J. Craig Venter et leurs collègues à l’Institut de recherche génomique (The Institute for Genomic Research, TIGR) de Rockville, dans le Maryland (État-Unis). Au printemps 2000, une première ébauche du génome humain haploïde de trois milliards de pb a été produite. Plusieurs centaines de génomes ont maintenant

Génomique (genomics) Discipline qui cartographie, séquence, analyse et compare les génomes. Homologue (homologous) Gène qui, dans une perspective évolutionniste, partage une même ascendance avec un ou plusieurs autres gènes. Orthologue (ortholog) Gène trouvé chez un organisme identique à celui d’un autre organisme mais qui diffère du fait de la spéciation (voir aussi Paralogue). Paralogue (paralog) Gène d’un organisme dont la similitude avec un ou plusieurs autres gènes du même organisme est le résultat de la duplication de gènes (voir aussi Orthologue). Protéome (proteome) Ensemble des protéines présentes simultanément dans une cellule, un tissu, un organisme. Protéomique (proteomics) Étude à grande échelle, ou au niveau du génome, de la structure, la fonction et la régulation des protéines d’un organisme. Séquençage aléatoire global (shotgun sequencing) Séquençage au hasard de petits fragments clonés d’un génome suivi de la reconstruction du génome entier par analyse informatique des données. Transcriptome (transcriptome) Ensemble des ARNm produits par un organisme dans des conditions données. Transfert horizontal de gènes (horizontal gene transfer) Voir chapitre 11.

été séquencés, et de nombreux autres sont en cours de séquençage. Nous sommes indiscutablement entrés dans « l’ère de la génomique », qui annonce des retombées en biologie dans divers domaines tels que la médecine clinique ou l’évolution des micro-organismes. Il eut été impossible de séquencer et d’analyser de grands génomes complexes sans développements technologiques en parallèle. L’automatisation du séquençage de l’ADN (voir section 7.8) a joué un rôle considérable tout comme le développement de méthodes informatiques performantes pour analyser, stocker et accéder aux séquences d’ADN et de protéines, un domaine nommé bioinformatique. Une autre avancée importante a été le développement du clonage de grands fragments d’ADN. Dans ce chapitre, nous verrons quelques génomes microbiens modèles, quelques techniques utilisées pour analyser ces génomes et ce que la génomique microbienne nous a montré jusqu’à présent. Nous commencerons par le clonage, car la réussite à ce niveau est un prérequis pour pouvoir débuter un projet de génomique.

I

TECHNIQUES DE CLONAGE POUR LA GÉNOMIQUE

La plupart des techniques que nous discuterons dans cette section sont des modifications ou des extensions des techniques in vitro discutées au chapitre 10. Les principes de ces technologies in vitro demeurent les mêmes, mais maintenant l’objectif est d’étudier le génome entier d’un organisme plutôt qu’un seul gène ou un ensemble de quelques gènes.



15.1 Vecteurs pour le clonage et le séquençage 489

m n

15.1 Vecteurs pour le clonage et le séquençage

Nous avons vu antérieurement quelques vecteurs plasmidiques et viraux utilisés pour le clonage moléculaire (voir sections 10.15 à 10.17). Le phage pBR322 et le phage Charon, dérivé du bactériophage lambda, ont été intensément utilisés pour le clonage et le séquençage, y compris à des fins d’analyse génomique. D’autres vecteurs plus spécialisés, que nous allons examiner maintenant, comprennent le bactériophage M13 et les chromosomes artificiels de bactéries et de levures.

Les vecteurs dérivés du bactériophage M13 M13 est un bactériophage en forme de filament qui se réplique sans tuer son hôte (voir section 16.3). Les particules matures de M13 sont libérées par bourgeonnement, sans lyse de la cellule hôte, et les cultures infectées constituent des sources permanentes d’ADN phagique. La plus grande partie du génome du phage M13 est constituée de gènes essentiels à la réplication du virus. Toutefois, une petite région, appelée séquence intergénique, peut être utilisée comme site de clonage. De l’ADN étranger de longueur variable, jusqu’à 5 kpb, peut être cloné sans affecter la viabilité du phage. Comme le génome s’agrandit, la croissance du virion est plus longue. Le phage M13mp18 est un dérivé de M13 dont la région intergénique a été modifiée pour faciliter le clonage (voir figure 15.1a). Une modification utile est l’insertion d’un fragment fonctionnel de lacZ, le gène d’Escherichia coli qui code la β-galactosidase. Les cellules infectées par M13mp18 peuvent être facilement détectées par leur couleur sur une boîte avec un milieu indicateur (hydrolyse d’un composé qui produit une couleur bleue parallèlement à l’hydrolyse du lactose en glucose et galactose – voir figure 15.1b). Le gène lacZ a lui-même été modifié et contient un fragment d’ADN de 54 pb qui constitue un site multiple de clonage (polylinker). Ce dernier contient plusieurs sites de coupure d’enzymes de restriction absents du génome de M13, qui peuvent être utilisés pour le clonage. Ce site multiple de clonage est localisé au début de la portion codante du gène lacZ et n’affecte pas l’activité enzymatique. Cependant, l’insertion d’ADN au niveau du site multiple de clonage inactive le gène. Les phages qui contiennent des inserts d’ADN produisent des plages incolores (pas d’activité), il est ainsi très simple d’identifier les clones (voir figure 15.1b et c). Des constructions similaires ont été utilisées pour d’autres vecteurs de clonage, phage lambda, plasmides, pour faciliter le repérage des plages ou des colonies contenant de l’ADN cloné.

L’utilisation de M13 en clonage moléculaire Pour cloner de l’ADN dans le vecteur M13, de l’ADN viral double brin est isolé de cellules hôtes infectées et traité par une enzyme de restriction. De l’ADN étranger est traité avec la même enzyme de restriction. Une ligation permet d’obtenir des molécules d’ADN double brin de M13 qui contiennent de l’ADN étranger. Ces molécules sont introduites dans des cellules hôtes par transformation (voir section 10.7), et

leur réplication produit des particules d’ADN simple brin phagique qui contiennent de l’ADN cloné. L’ADN simple brin de M13 peut ensuite être directement séquencé. Sachant que la séquence où l’ADN étranger a été inséré est connue (du fait de la spécificité de l’enzyme de restriction utilisée), il est possible de construire une amorce oligonucléotidique complémentaire de cette région et de déterminer ainsi la séquence d’ADN située en aval par la méthode de Sanger. Les dérivés de M13 se sont ainsi avérés extrêmement utiles pour le séquençage d’ADN cloné, même avec d’assez longues molécules, et ont contribué efficacement au séquençage de plusieurs génomes. Des vecteurs tels que M13 ou des vecteurs plasmidiques qui contiennent des séquences d’ADN cloné de l’ordre de 2 kb sont adaptés pour la construction de banques génomiques (voir section 10.15) en vue du séquençage de génomes procaryotes. Les vecteurs tels que le bactériophage lambda, qui peuvent recevoir des séquences de 20 kb et plus (voir section 10.17), sont aussi largement utilisés dans les projets de génomique. Mais le nombre de clones nécessaires à l’obtention d’une séquence complète s’accroît avec la taille du génome à séquencer. Ainsi, pour constituer des banques d’ADN de micro-organismes eucaryotes ou d’eucaryotes supérieurs, tels que l’homme, il est utile de disposer de vecteurs qui peuvent porter de très grands fragments d’ADN. Ceci permet de constituer une banque de clones qui reste gérable. De tels vecteurs ont été développés et sont appelés des chromosomes artificiels.

Les chromosomes artificiels bactériens (Bacterial Artificial Chromosomes) : BAC Beaucoup de bactéries contiennent de grands plasmides qui sont répliqués de manière stable dans la cellule. Le plasmide F d’Escherichia coli en est un exemple (voir sections 7.4 et 10.10). Ce plasmide peut produire naturellement des plasmides dérivés qui emportent de longues séquences d’ADN chromosomique (voir section 10.12). Du fait de cette propriété intéressante, le plasmide F a été utilisé pour construire des vecteurs de clonages appelés chromosomes artificiels bactériens (Bacterial Artificial Chromosomes, BAC). La figure 15.2 montre la structure d’un BAC construit avec le plasmide F. C’est un vecteur de seulement 6,7 kb, comparés aux 99,2 kb du plasmide F. Ce BAC ne contient que quelques gènes du plasmide F, dont oriS et repE, qui sont nécessaires à la réplication, et sopA et sopB, qui maintiennent un faible nombre de copies (voir section 10.9). Le gène cat, qui confère la résistance au chloramphénicol, et une région de clonage d’ADN qui contient plusieurs sites de restriction ont été introduits dans le plasmide. Jusqu’à plus de 300 kb d’ADN étranger peuvent être insérés et conservés de façon stable dans un tel vecteur BAC. L’hôte d’un BAC est typiquement une souche mutante d’E. coli qui ne dispose pas des systèmes de modification et de restriction de la souche sauvage (voir sections 7.7 et 9.6). Ceci empêche la destruction du BAC. La souche hôte a aussi généralement perdu les capacités de recombinaisons normales, ce qui interdit la recombinaison et les réarrangements de l’ADN cloné du BAC avec le chromosome de l’hôte.



490 Chapitre 15


BamHI SmaI EcoRI KpnI XbaI SalI PstI HindIII Site de clonage ... g aat tCG AGC TCG GTA CCC GGG GAT CCT CTA GAG TCG ACC TGC AGG CAT GCA AGC TT ... multiple (SCM) ... Asn Ser Ser Ser Val Pro Gly Asp Pro Leu Glu Ser Thr Cys Arg His Ala Ser ...

lacP lacZ'

ADN génomique de M13

(a)

(b)

J. Parker

J. Parker

le phage contient de l’ADN cloné le phage ne contient pas d’ADN cloné

(c)

FIGURE 15.1 Clonage avec le bactériophage M13. (a) Carte partielle de M13mp18, un dérivé de M13 construit pour être utilisé comme vecteur de clonage. Le vecteur contient le promoteur lac (lacP) et le gène lacZ’ qui code une partie fonctionnelle de la β-glucosidase. Le début de ce gène compte un site de clonage multiple (SCM), qui contient plusieurs sites de restriction mais maintient un cadre de lecture correct. Les acides aminés codés par le SCM sont indiqués. La plupart des fragments d’ADN clonés dans le SCM interrompent le gène lacZ’ et suppriment l’activité β-galactosidase. (b) Boîte avec des plages formées par M13mp18 et par des clones produits avec ce vecteur sur une couche de bactéries sensibles, étalées sur un milieu contenant du 5-bromo-4chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside, appelé X-gal. Quand la β-galactosidase hydrolyse le X-gal, elle libère un colorant bleu relativement insoluble. De nombreuses plages sur cette boîte sont bleues, révélant la présence du vecteur sans ADN cloné. Beaucoup d’autres plages sont incolores, ce qui indique que de l’ADN étranger a été inséré dans le vecteur et que le gène LacZ’ a été interrompu. Le clonage avec M13 combine donc sélection et criblage. La sélection des phages contenant de l’ADN cloné est possible grâce aux différences de couleur bleu/blanc. À moins que le produit PCR n’ait été cloné, il faut ensuite cribler les plages blanches pour trouver celles qui contiennent le gène d’intérêt. (c) Agrandissement d’une partie de la boîte.

Les chromosomes artificiels de levure (Yeast Artificial Chromosomes) : YAC L’expression « chromosome artificiel » n’est pas apparue avec les BAC, mais avec les chromosomes artificiels de levures (Yeast Artificial Chromosomes, YAC). Ces vecteurs ont des sites où de très grands fragments d’ADN peuvent être insérés et se répliquent dans les levures comme des chromosomes normaux. Pour fonctionner comme de tels chromosomes, les YAC doivent avoir : 1) une origine de réplication de l’ADN, 2) des télomères pour la réplication de l’ADN aux extrémités du chromosome (voir section 14.6) et 3) un centromère (la région du chromosome requise pour la ségrégation lors de la mitose). Ils doivent aussi contenir un site de clonage

et un gène utilisable pour la sélection après transformation de l’hôte, classiquement la levure Saccharomyces cerevisiae. La figure 15.3 montre un diagramme de vecteur YAC dans lequel de l’ADN étranger a été cloné. Les vecteurs YAC ont une taille d’environ 10 kpb, mais ils peuvent recevoir de 200 à 800 kpb d’ADN cloné. Après confirmation du clonage d’un fragment d’ADN dans un BAC ou un YAC, cette région peut être sous-clonée dans un plasmide ou dans un bactériophage pour une analyse plus détaillée ou pour séquençage. Bien que les YAC puissent porter de plus grands inserts que les BAC, les problèmes de recombinaison et de réarrangement de l’ADN cloné sont plus important avec la levure qu’avec E. coli. Ceci explique que les BAC soient maintenant plus utilisés que les YAC en clonage génomique.



15.2 Séquençage du génome 491 Zone de clonage

cat Maintien d’un faible nombre de copies

Marqueur de sélection

sopB

15.2 Séquençage du génome m n L’analyse d’un génome commence par la constitution d’une banque génomique, le clonage moléculaire de l’ensemble des fragments d’ADN générés par l’action d’une enzyme de restriction sur ce génome. Dès que la banque est constituée, le séquençage peut commencer.

BAC

sopA

Le séquençage aléatoire global (shotgun sequencing) oriS

repE

Nécessaires à la réplication

FIGURE 15.2 Carte génétique d’un chromosome bactérien artificiel (Bacterial Artificial Chromosome, BAC). Les BAC sont dérivés du plasmide F d’Escherichia coli. Le BAC représenté est de 6,7 kb. La zone de clonage compte plusieurs sites uniques d’enzymes de restriction. Le gène cat confère la résistance à l’antibiotique chloramphénicol. Les autres gènes mentionnés sont impliqués dans la réplication du plasmide. Dans le plasmide F de 99,2 kb (voir figure 10.18), ces gènes sont localisés dans une région de réplication assez compacte. Les BAC ne contiennent donc qu’une petite fraction du plasmide F.

Contrôlez vos acquis Des vecteurs de clonage spécialisés ont été construits et sont utilisés pour le séquençage de génomes et l’assemblage des séquences. Certains, comme les dérivés de M13, sont utiles pour le clonage et pour le séquençage direct d’ADN. D’autres, tels que les chromosomes artificiels, sont utiles pour cloner de très grands fragments d’ADN dont la taille est de l’ordre d’une mégabase. •

Comparez les capacités de clonage des M13, lambda, BAC et YAC.

•

Le chromosome artificiel de levure se comporte comme un chromosome dans une cellule de levure. Comment est-ce possible ?

Pratiquement tous les projets actuels de séquençage de génomes utilisent le séquençage aléatoire global. Cette technique est rendue possible par les plates-formes de séquençage à haut débit, la robotique et les moyens de calcul puissants. Le séquençage aléatoire global a été utilisé pour des chromosomes procaryotes et aussi eucaryotes, en particulier pour la version privée du séquençage du génome humain. Le séquençage aléatoire global suppose le clonage entier du génome au hasard et ensuite le séquençage des clones obtenus. Les clones sont donc séquencés sans connaître l’ordre ou l’orientation des séquences d’ADN clonées. Les séquences sont ensuite analysées par un calculateur qui recherche les séquences chevauchantes, celles-ci permettent au calculateur d’assembler les fragments séquencés dans le bon ordre. Une bonne part de séquences produites par cette méthode sont redondantes. Mais pour s’assurer que toutes les séquences ont été obtenues, il est nécessaire de séquencer un très grand nombre de clones parmi lesquels certains seront identiques ou quasi identiques. Ainsi, toute partie du génome sera incluse dans sept à dix séquences. Ces sept à dix réplicats réduisent fortement les erreurs dans la séquence ; en cas d’ambiguïté sur une position, le nucléotide le plus fréquent sera retenu. La réussite du séquençage aléatoire global suppose un clonage efficace (un grand nombre de clones est nécessaire) et, autant que possible, les séquences d’ADN clonées doivent être choisies au hasard. Les sites de restriction ne sont pas répartis aléatoirement, mais lorsque l’on coupe l’ADN génomique avec une enzyme qui reconnaît une courte séquence commune dans l’ADN, on approche une digestion au hasard. Pour obtenir plus exactement des fragments aléatoires, on peut soumettre l’ADN à un cisaillement mécanique en le passant dans un nébuliseur. Un tel équipement permet de réaliser une pulvérisation. Les fragments d’ADN peuvent ensuite être purifiés et séparés par taille dans un gel d’électrophorèse (voir section 7.7), puis clonés dans un vecteur et transformés dans un hôte.

Marqueur de sélection TEL YAC

Ori CEN O

Not I

Not I ADN

URA3

TEL

INSÉRÉ

FIGURE 15.3 Diagramme d’un chromosome artificiel de levure (Yeast Artificial Chromosome, YAC) contenant un ADN étranger. L’ADN étranger a été cloné dans le vecteur au niveau d’un site de restriction notI. TEL indique les télomères ; CEN, le centromètre ; Ori, l’origine de réplication et URA3, le marqueur de sélection. L’hôte récepteur du vecteur a une mutation dans le gène URA3 et nécessite de ce fait de l’uracyle pour sa croissance (Ura –). Les cellules hôtes qui intègrent le YAC deviennent Ura +. Le diagramme n’est pas à l’échelle : l’ADN inséré devrait normalement avoir une longueur de 200 à 800 kpb et le vecteur, de 10 kpb seulement.



492 Chapitre 15


L’assemblage du génome Une fois le séquençage aléatoire global effectué, tous les fragments doivent être ordonnés, opération que l’on nomme assemblage. L’assemblage du génome circulaire d’un procaryote, par exemple, suppose de mettre tous les fragments dans le bon ordre, d’éliminer les recouvrements et ensuite de produire un génome utilisable pour l’annotation, opération qui consiste à identifier les gènes et d’autres régions fonctionnelles (voir section 15.3). Parfois, le séquençage aléatoire global ne produit pas la séquence d’un génome complet. Dans de telles circonstances, il est possible de rechercher des clones susceptibles de combler la zone manquante. Une méthode pertinente consiste à effectuer des amplifications avec des amorces complémentaires des séquences flanquantes de la zone manquante. Les clones additionnels sont donc ciblés et non pas choisis au hasard. Les séquences ainsi obtenues permettent d’achever le séquençage du génome. Certains projets de séquençage de génome ont comme objectif de produire la séquence entière du génome. D’autres projets s’arrêtent sans chercher à compenser les petits manques. Puisque le séquençage aléatoire global et l’assemblage sont des procédures fortement automatisées, alors que la résolution des manques ne l’est pas, la production d’un génome entièrement résolu est beaucoup plus coûteuse que celle d’un génome présentant quelques manques.

Contrôlez vos acquis Le séquençage aléatoire global met en œuvre le clonage au hasard et le séquençage de fragments de génome relativement courts suivis d’un assemblage du génome effectué par un calculateur, en appuyant la reconstitution de la séquence complète sur les zones de recouvrement. •

Pourquoi considère-t-on que le séquençage aléatoire global produit une séquence génomique très juste ?

•

Que fait-on lors de l’assemblage du génome ?

15.3 Annotation du génome m n Le but ultime des projets de séquençage n’est pas de produire la séquence du génome, mais de déterminer les gènes que cette séquence contient. Après l’achèvement du séquençage et de l’assemblage des séquences, l’étape suivante de l’analyse génomique est l’annotation, c’est-à-dire la conversion de la séquence des données brutes en une liste de gènes présents dans le génome.

La localisation des gènes putatifs : identification des cadres ouverts de lecture La majorité des gènes d’un organisme code des protéines et, dans la plupart des génomes microbiens, la plus grande partie du génome est constituée de séquences codantes. Sachant que

les génomes des micro-organismes eucaryotes contiennent moins d’introns que les génomes de plantes ou d’animaux, et que les procaryotes n’en ont presque pas, les génomes microbiens sont principalement constitués de centaines à des milliers de cadres ouverts de lecture (open reading frames, ORF) [voir section 7.13] séparés par des régions régulatrices et des terminateurs de transcription. Un cadre ouvert de lecture est dit fonctionnel s’il code effectivement une protéine cellulaire. Par conséquent, la méthode la plus simple pour localiser les gènes qui codent effectivement ou potentiellement une protéine est de rechercher, à l’aide d’un logiciel adapté, la présence de cadres ouverts de lecture dans la séquence du génome.

Comment un logiciel trouve-t-il un cadre ouvert de lecture ? Dans la cellule, les ribosomes reconnaissent les cadres ouverts de lecture en débutant la traduction au niveau d’un codon d’initiation, usuellement AUG. Le ribosome assemble ensuite les acides aminés jusqu’à ce qu’il atteigne un codon stop (voir section 7.13). Par conséquent, la première étape de la recherche des ORF est de rechercher ces codons dans la séquence. Cependant, l’identification des ORF potentiellement fonctionnels est usuellement plus complexe que la seule recherche des séquences des codons d’initiation et d’arrêt de la traduction, dont la présence d’ordre aléatoire est assez fréquente. D’autres indices sont alors recherchés. La taille, par exemple, est un indicateur de fonctionnalité d’un cadre ouvert de lecture. La majorité des protéines cellulaires contiennent au moins 100 acides aminés ; par conséquent, la plupart des ORF fonctionnels ont une longueur d’au moins 100 codons (300 nucléotides). Mais un programme qui ignorerait les ORF de moins de 100 codons manquerait quelques gènes fonctionnels. D’autres facteurs doivent être pris en compte. Sachant que la plupart des organismes montrent des préférences parmi les codons synonymes (voir section 7.14), un biais d’usage des codons peut aussi constituer un indice de fonctionnalité. Si l’utilisation des codons d’un cadre ouvert de lecture est très différente du consensus observé, ce cadre ouvert pourra être non fonctionnel, ou fonctionnel mais acquis par transfert latéral de gènes (voir section 15.8). Il faut rappeler ici que les ribosomes procaryotes ne démarrent pas la traduction au niveau du premier codon d’initiation possible, mais au niveau de celui qui se situe immédiatement en aval d’une séquence Shine-Dalgarno sur l’ARNm (voir section 7.16). Par conséquent, la recherche de séquences Shine-Dalgarno potentielles d’un génome procaryote aide à établir si un cadre ouvert de lecture est fonctionnel et quel est le codon d’initiation utilisé. La figure 15.4 montre une région d’ADN qui présente des caractéristiques qu’un ordinateur reconnaîtrait comme celles d’un cadre ouvert de lecture. Bien que tout gène soit toujours transcrit à partir d’un seul brin, dans la plupart de cas des plus petits génomes viraux ou plasmidiques, les deux brins sont transcrits dans certaines parties du génome. Il en résulte que l’inspection des deux brins de l’ADN est requise. La figure 15.4 montre le diagramme d’une région du génome pour laquelle un gène est transcrit à partir d’un brin et un autre gène à partir de l’autre brin. Évidemment, quelques gènes



15.3 Annotation du génome 493

codent des ARN de transfert et des ARN ribosomiques, et ils ne sont pas reconnus par les programmes qui ne recherchent que les cadres ouverts de lecture. Toutefois les gènes qui codent les ARNt et les ARNr peuvent être assez facilement localisés, car les séquences codant ces ARN sont très conservées (voir sections 7.15 et 11.5 à 11.7).

La localisation des gènes putatifs : comparaison des génomes Un cadre ouvert de lecture est probablement fonctionnel si sa séquence est semblable à celles des génomes d’autres organismes ou si une partie correspond à une séquence qui code un domaine protéique fonctionnel. En effet, les protéines qui assurent les mêmes fonctions dans des cellules différentes sont phylogénétiquement liées et présentent des homologies de séquence et de structure. L’ordinateur peut rechercher de telles similarités des séquences lors du processus d’annotation. Il serait quasiment impossible d’assembler, même dans le cas de petits génomes procaryotes, et de localiser les gènes et les autres fonctions importantes sans disposer de logiciels complexes capables d’analyser des ensembles importants de données. L’utilisation d’ordinateurs permet d’effectuer des analyses dites in silico, un terme analogue à in vivo ou in vitro (in silico se réfère aux puces informatiques en silicone). La figure 15.5 montre une carte génétique construite par ordinateur à partir du séquençage aléatoire global du génome de 4,4 Mpb de Mycobacterium tuberculosis, l’agent de la tuberculose (voir section 26.5). Tous les ORF sont indiqués,

Terminateur

Promoteur 5′ 3′

Gène 1 Terminateur

Gène 2

Une fois le séquençage terminé, l’annotation du génome effectue la recherche informatique d’ORF et d’homologues de gènes codant des protéines. •

Qu’est-ce qu’un cadre ouvert de lecture (ORF) ?

•

Comment l’homologie des protéines peut-elle contribuer au processus d’annotation ?

II

GÉNOMES MICROBIENS

Plus de 250 génomes microbiens, principalement procaryotes, ont été séquencés et des centaines sont en cours de séquençage. Nous n’allons nous intéresser ici qu’à quelques-uns et examiner ce qu’enseigne leur analyse.

M. tuberculosis H37Rv 4 411 529 pb

ns

e n s-s tio on p a i d i o it St Sh In Co . . . AGGA . . . . . . TAC (XXX)n ATT . . . lg

Da

– ne


3′ 5′

TTA. . . . . . CAT Promoteur

FIGURE 15.4 Localisation de cadres ouverts de lecture potentiellement fonctionnels. La séquence du gène 1, localisée sur l’un des brins, comprend les bases d’une possible séquence Shine-Dalgarno (AGGA), séparée d’un codon d’initiation (ATG) par environ huit bases. Les bases du codon d’initiation sont suivies d’environ cent codons-sens et d’un codon-stop (nonsens) [UAA est le plus commun des codons-stop]. Notez que la molécule d’ADN présente un promoteur en amont du gène 1 et un terminateur de transcription en aval. Le gène 2 a les mêmes caractéristiques, mais il est transcrit en sens inverse. Séquences Shine-Dalgarno, codons d’initiation, codons-sens et codons-stop fonctionnent uniquement au niveau de l’ARN. Les bases (paires de bases) de l’ADN qui codent ces séquences fonctionnelles sont indiquées.

Julian Parkhill

o

n ar

ainsi que les gènes codant les ARNt, les ARNr ainsi que quelques autres séquences.

FIGURE 15.5 Carte chromosomique de Mycobacterium tuberculosis. Le cercle externe montre la taille du chromosome en Mpb, avec 0 placé au point de l’origine de réplication de l’ADN. Un anneau interne montre la localisation des gènes d’ARNt (bleu) et l’unique opéron ARNr (orange). L’anneau suivant montre les cadres de lecture transcrits dans le sens des aiguilles d’une montre (vert foncé) et dans le sens inverse (vert clair). L’anneau suivant montre la localisation de séquences répétées incluant des séquences d’insertion (orange). L’histogramme central montre les variations locales de pourcentage en GC (voir section 11.10), avec des rayons jaunes pour les régions au-dessous de 65 %, et orange pour les régions au-dessus de 65 %. Voir des informations complémentaires sur M. tuberculosis dans la section 12.23 et sur la tuberculose, dans la section 26.5. La figure a été réalisée avec un logiciel produit par DNASTAR et reproduite avec la permission de Nature, 393: 537-544 (1998). © Macmillan Magazines Ltd.




m n

15.4 Génomes procaryotes : tailles et cadres ouverts de lecture

Des informations actualisées sur les projets de séquençage de génomes sont disponibles à l’adresse suivante : http:// www.genomesonline.org ; pour les procaryotes, il s’agit de génomes circulaires et linéaires de Bacteria et d’Archaea. Bien que la vitesse de séquençage des génomes procaryotes se soit accrue, le séquençage et l’analyse d’un génome complet restent une opération lourde qui requiert des moyens humains et financiers importants. En conséquence, le lancement d’un projet de séquençage nécessite toujours de solides justifications scientifiques ou socio-économiques. Le tableau 15.1 fournit une liste de quelques exemples représentatifs où l’on note la présence d’agents pathogènes, de tels organismes étant naturellement prioritaires. Les hyperthermophiles présentent un intérêt biotechnologique lié à la stabilité thermique de leurs enzymes (voir sections 6.10, 6.12, 13.12 et 30.9). Les besoins des industries biomédicales et biotechnologiques jouent un rôle important dans l’orientation et le financement des travaux de séquençage. Cependant, la liste du tableau 15.1 comprend des organismes tels que Bacillus subtilis, Escherichia coli et Pseudomonas aeruginosa, largement étudiés comme systèmes modèles en génétique, ainsi que Caulobacter crescentus, système modèle pour la différenciation cellulaire (voir section 12.16).

La taille des génomes procaryotes À la différence des eucaryotes, pour lesquels une grande partie du génome (spécialement dans le cas des organismes à grand génome – voir tableau 15.3) est constituée d’ADN non codant, l’analyse des génomes procaryotes d’espèces de Bacteria et Archaea révèle une forte corrélation entre la taille du génome et le nombre d’ORF (voir figure 15.6). Chaque mégabase d’ADN procaryote compte de l’ordre de 1 000 ORF. L’analyse des séquences apporte des réponses à quelques questions fondamentales de la biologie. Par exemple, l’analyse des petits génomes de Mycoplasma genitalium et de Mycoplasma pneumoniae montre que les 470 ORF trouvés chez M. genitalium sont aussi présents chez M. pneumoniae. En cherchant des gènes homologues chez d’autres organismes et en déterminant lesquels sont essentiels avec des techniques telles que la mutagénèse par transposon (voir section 10.14), des chercheurs ont conclu qu’environ 300 gènes codant des protéines suffisaient afin de permettre une existence cellulaire. Aucun organisme ne se limite à ce faible nombre de gènes. Cependant, quelques organismes remarquables ont des génomes relativement petits. Par exemple, Methanocaldococcus jannashii (Archaea) est autotrophe (voir sections 13.4 et 17.17) et ne contient que 1 738 ORF. Ceci suffit non seulement à lui permettre une vie libre, mais aussi à synthétiser tous ses constituants cellulaires à partir de CO2 (voir section 13.4). Avec 1,5 Mpb, Aquifex aeolicus (Bacteria) contient le plus petit génome connu chez les autotrophes (voir tableau 15.1). Methanocaldococcus et Aquifex sont des hyperthermophiles. On peut donc en conclure qu’assez étonnamment la vie autotrophe à une température

voisine de celle de l’ébullition de l’eau est possible sans disposer d’un énorme génome. Ce n’est pas par hasard que le tableau 15.1 comporte plusieurs génomes relativement petits, car, les modalités de séquençage étant simplifiées, ils ont été privilégiés au début. Le génome de Mycoplasma genitalium est plus petit que celui de certains virus tels que les Chlorella virus (voir section 16.6) ou le bactériophage G (voir section 9.2). Le plus petit génome procaryote connu est celui de Nanoarchaeum equitans (Archaea), qui comporte 90 kpb de moins que celui de M. genitalium (voir tableau 15.1). N. equitans est un hyperthermophile parasite d’un second hyperthermophile, Ignicoccus (voir section 13.11). L’analyse de ses gènes montre qu’il ne possède quasiment pas de gènes du métabolisme ni du catabolisme, mais il contient plus d’ORF que le génome plus grand de M. genitallium (voir tableau 15.1). En effet, le génome de N. equitans est très compact et ne contient quasiment pas de séquences non codantes. Quelques procaryotes ont de très grands génomes. Par exemple, Bradyrhizobium japonicum, l’organisme qui forme les nodosités fixatrices d’azote des racines du soja (voir section 19.22), possède 2 800 ORF de plus que la levure Saccharomyces cerevisiae, un micro-organisme eucaryote (voir section 15.6 et tableau 15.1). La bactérie Streptomyces coelicolor, dont le chromosome linéaire de 8 Mpb est typique des espèces de Streptomyces, possède 7 846 ORF, presque 1 800 de plus que S. cerevisiae. Quelques génomes procaryotes encore plus grands sont connus, mais leurs séquences ne sont pas encore complètes. Myxococcus xanthus et Sorangium cellulosum, deux bactéries mobiles par glissement (voir section 12.17) ont respectivement des chromosomes de 9,2 Mpb et de 12,3 Mpb. Ce sont les plus grands génomes procaryotes connus. On ne connaît pas de génome de taille équivalente chez les Archaea (voir tableau 15.1). Par conséquent, la taille des génomes procaryotes varie de celle des grands virus à celle des petits eucaryotes.

Nombre total de cadres de lecture du génome

494 Chapitre 15

9000 8000 7000 6000 5000 4000 3000 2000 1000 0

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

Taille du génome (mégabases)

FIGURE 15.6 Corrélation entre la taille du génome et le nombre de cadres de lecture chez les procaryotes. Ces données résultent de l’analyse de 115 génomes procaryotes, appartenant aux Bacteria et aux Archaea. Données issues de Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 101: 3160-3165 (2004).



15.4 Génomes procaryotes : tailles et cadres ouverts de lecture 495

TABLEAU 11.1

SÉLECTION DE CHROMOSOMES PROCARYOTESa Taille (paires de bases)

ORFb

Mycoplasma genitalium

580 070

470

Plus petit génome cellulaire connu (voir section 12.21)


816 394

677

Provoque la pneumonie (voir section 12.21)


910 725

853

Spirochète à chromosome linéaire ; provoque la maladie de Lyme (voir sections 12.33 et 27.4)


1 042 519

894

Parasite intracellulaire obligatoire, pathogène commun de l’homme (voir sections 12.27 et 26.13)

Rickettsia prowazekii

1 111 523

834

Parasite intracellulaire obligatoire ; provoque les épidémies de typhus (voir sections 12.13 et 27.3)

Treponema pallidum

1 138 006

1 041

Spirochète, provoque la syphilis (voir sections 12.33 et 26.12)

Aquifex aeolicus

1 551 335

1 544

Autotrophe hyperthermophile (voir section 12.37)

Prochlorococcus marinus

1 657 867

1 716

Phototrophe le plus abondant dans les océans (voir sections 12.26 et 19.6)

Helicobacter pylori

1 667 867

1 590

Provoque des ulcères de l’estomac (voir section 26.10)

Streptococcus pyogenes

1 852 442

1 752

Pathogène ; provoque maux de gorge et scarlatine (voir section 26.2)

Thermotoga maritima

1 860 725

1 877

Hyperthermophile (voir section 12.36). Voir aussi figure 15.7

Chlorobium tepidum

2 154 946

2 288

Bactérie phototrophe modèle (voir section 12.32)

Staphylococcus aureus

2 814 816

2 593

Principal responsable des infections nosocomiales (voir sections 12.19 et 25.7)

Deinococcus radiodurans

3 284 156

2 185

Résistant aux radiations, chromosomes multiples (voir section 12.34)

Synechocystis sp.

3 573 470

3 168

Cyanobactérie (voir section 12.25)

Bdellovibrio bacteriovorus

3 782 139

3 584

Prédateur d’autres procaryotes (voir section 12.14)

Geobacter sulfurreducens

3 814 139

3 467

Modèle pour la bioremédiation (voir section 17.18)

Caulobacter crescentus

4 016 942

3 767

Cycle de vie complexe (voir section 12.16)

Bacillus subtilis

4 214 810

4 100

Modèle Gram positif pour la génétique (voir section 12.20)

Mycobacterium tuberculosis

4 411 529

3 924

Provoque la tuberculose (voir sections 12.23 et 26.5)

Escherichia coli

4 639 221

4 288

Modèle Gram négatif pour la génétique (voir section 12.11)

Bacillus anthracis

5 227 293

5 738

Pathogène, agent de la guerre bactériologique (voir section 12.20

Rhodopseudomonas palustris

5 459 213

4 836

Phototrophe anoxygénique au métabolisme flexible (voir section 12.2)


6 264 403

5 570

Pathogène opportuniste au métabolisme flexible (voir section 12.7)

Streptomyces coelicolor

8 667 507

7 825

Possède un chromosome linéaire ; produit des antibiotiques (voir section 12.24)

Bradyrhizobium japonicum

9 105 828

8 317

Fixation de l’azote au niveau des nodosités du soja (voir section 19.22)

Nanoarchaeum equitans

490 885

552

Plus petit génome connu (voir section 13.11)

Thermoplasma acidophilum

1 564 905

1 509

Thermophile et acidophile (voir section 13.5)

Methanocaldococcus jannashii

1 664 976

1 738

Méthanogène (voir section 13.4)

Aeropyrum pernix

1 669 695

1 841

Hyperthermophile (voir section 13.9)

Pyrococcus horikoshii

1 738 505

2 061


Methanothermobacter thermoautotrophicus

1 751 377

1 855

Méthanogène (voir section 13.4)

Archaeoglobus fulgidus

2 178 400

2 436


Halobacterium salinarum

2 571 010

2 630

Halophile extrême (voir section 13.3)

Sulfolobus solfataricus

2 992 245

2 977

Hyperthermophile chimiolithotrophe soufre dépendant (voir section 13.9)

Organisme

Commentaires

Bacteria

Archaea

a

Des informations sur ces génomes procaryotes et des centaines d’autres sont disponibles dans la base de données du TIGR (http://www.tigr.org/tdb), un site Internet entretenu par l’Institut de recherche génomique (The Institute for Genomic Research, TIGR), Rockville, Maryland (États-Unis), ainsi que sur http://www.genomesonline.org. Des liens conduisent vers d’autres sites sur le même sujet. b

Cadres ouverts de lecture. Le nombre d’ORF permet de prédire le nombre total de protéines que les gènes d’un organisme pourraient coder. Les gènes codant des protéines connues sont comptés, ainsi que les ORF qui pourraient coder des protéines d’au moins cent acides aminés. Les ORF de plus petite taille ne sont généralement pas considérés, sauf lorsqu’ils montrent des similitudes avec un gène d’un autre organisme ou que l’usage des codons est caractéristique de l’organisme étudié.



496 Chapitre 15


Contrôlez vos acquis Les tailles des génomes procaryotes séquencés vont de 0,49 Mpb à 9,1 Mpb. Les plus petits génomes procaryotes ont la taille de ceux des plus grands virus et les plus grands génomes eucaryotes ont plus de gènes que ceux de quelques eucaryotes. Chez les procaryotes, le nombre d’ORF est proportionnel à la taille du génome. •

Quelle est la différence de nombre de gènes entre Bradyrhizobium et Nanoarchaeum ? Comment cela affecte-t-il les modes de vie respectifs de ces organismes ?

•

Combien d’ORF contient approximativement un génome de 4 Mpb ?

15.5 Génomes procaryotes : analyses m n bioinformatiques et distributions des gènes

Après l’assemblage et l’annotation, une analyse génomique classique comprend une phase de comparaison de gènes de l’organisme séquencé à ceux des autres organismes, qu’ils soient proches ou distants. Ces activités sont une part importante de la bioinformatique.

Les gènes des génomes procaryotes Les gènes d’un organisme définissent de diverses manières sa biologie, ils correspondent à son style de vie. Par exemple, on imagine aisément que des organismes parasites obligatoires tels que Treponema pallidum (voir section 26.12) n’ont guère besoin de gènes de biosynthèse des acides aminés puisqu’ils sont fournis par leur hôte. C’est effectivement le cas, attendu que l’analyse du génome de T. pallidum a montré l’absence de gènes reconnaissables de biosynthèse d’acides aminés. Par

TABLEAU 11.2

contre, cet organisme code plusieurs protéases qui peuvent convertir des peptides de l’hôte en acides aminés libres. À l’opposé, Escherichia coli, micro-organisme non parasite, montre 131 gènes impliqués dans la biosynthèse et le métabolisme des acides aminés, et Bacillus subtilis en a plus de 200. De telles analyses comparatives justifient la recherche de gènes qui codent des enzymes vraisemblablement présentes, sachant les caractéristiques d’un organisme. Par exemple, Thermotoga maritima (Bacteria) est un hyperthermophile trouvé dans les sédiments marins chauds, qui catabolise un grand nombre de sucres. La figure 15.7 résume quelques voies métaboliques et systèmes de transport de T. maritima issus de l’analyse de son génome. Comme on pouvait le prévoir, ce génome est particulièrement riche en gènes impliqués dans le transport, en particulier des sucres et des acides aminés. Une proportion importante de ce génome (7 %) est aussi impliquée dans le métabolisme des sucres simples et complexes. Tout ceci suggère un environnement naturel riche en matières organiques. Le tableau 15.2 présente une analyse des groupes de gènes et de leurs activités chez les procaryotes. De telles données sont rassemblées lorsqu’un génome séquencé et annoté est publié. Il apparaît ainsi clairement que les procaryotes montrent une distribution des gènes spécifique. Les gènes métaboliques constituent par exemple le groupe le plus abondant des génomes procaryotes, bien que la proportion de gènes impliqués dans la traduction dépasse celle des gènes métaboliques lorsque la taille des génomes diminue (voir tableau 15.2 et figure 15.8). Chose étonnante, malgré leur importance dans la biologie de la cellule, les gènes impliqués dans la réplication et la transcription de l’ADN ne constituent qu’une fraction mineure d’un génome procaryote typique (voir tableau 15.2).

Les cadres ouverts de lecture non identifiés Bien que l’on observe des différences entre organismes, le nombre d’ORF identifiés est inférieur ou égal à 70 % du nombre total d’ORF. Les ORF non identifiés présentent tous les signes d’un gène codant une protéine – un site de fixation du ribosome (ou une localisation en aval d’une séquence Shine-Dalgarno),

FONCTIONS DES GÈNES DES GÉNOMES BACTÉRIENS Pourcentages de gènes du chromosome par catégorie fonctionnelle

Catégories fonctionnelles de gènes

Escherichia colia (4,64 Mpb)

Haemophilus influenzaea (1,83 Mpb)

Mycoplasma genitaliuma (0,58 Mpb)

Métabolisme

21,0

19,0

14,6

Structure

5,5

4,7

3,6

Transport

10,0

7,0

7,3

Régulation

8,5

6,6

6,0

Traduction

4,5

8,0

21,6

Transcription

1,3

1,5

2,6

Réplication

2,7

4,9

6,8

Autres fonctions connues

8,5

5,2

5,8

Fonctions inconnues

38,1

43,0

32,0

a

Taille du chromosome. Chacun de ces organismes n’a qu’un chromosome circulaire.



15.5 Génomes procaryotes : analyses bioinformatiques et distributions des gènes 497

Systèmes ABC de transport des peptides

Glucose

Gly-3-P

Fructose-6-P

VOIE D’ENTNER DOUDOROFF

6 Phosphogluconate

Glucose-6-P

KDPG

Glycolyse

Systèmes ABC de transport des sucres

VOIE DES PENTOSES PHOSPHATES

Gluconate

Glycérol-3-P

Pyruvate

Oxalo-acétate

OR 2-oxoglutarate Aldéhydes Cétoisovalérate

Polyamines

Phosphate Glycérol

33 gènes du flagelle et du moteur flagellaire

Aspartate

Flagelle

cheA/B/C/D/R/W/Y

Valine Lactate Acétyl-CoA

H2 et CO2

Acides aminés

NH3 + CO2 + H2

PEP Malate

Glycine Acétamide Thréonine

Gly-3-P + Pyruvate DHAP

Aspartate

Acides aminés à chaînes branchées

Zinc

7 MCPs

Histidine Glutamate

Proline Glutamine

Fer

PRPP

Signaux du chimiotactisme

Ribose-5-P

Leucine

Cations

Cations

Ribose Maltose Glycérol-3-P

+

H Assimilation Uracile du glycérol ATP synthétase

NH4+ Potassium Fer

Na+

FIGURE 15.7 Vue d’ensemble de quelques voies métaboliques et systèmes de transport de Thermotoga maritima, membre du domaine Bacteria. La figure schématise les capacités métaboliques de cet organisme. Elle comprend quelques voies de la production d’énergie et du métabolisme de certains composés organiques, ainsi que des protéines impliquées dans le transport qui ont été identifiées par l’analyse du génome. Les noms des gènes ne sont pas donnés. Le génome contient plusieurs systèmes de transport ABC (voir section 4.7) : 12 pour les sucres, 14 pour les peptides et les acides aminés, et d’autres encore pour les ions. Ils sont représentés sous la forme de structures à plusieurs sous-unités. D’autres types de protéines de transport ont été identifiés et sont représentés avec des formes ovales. Le flagelle qui est montré possède sept transducteurs (MCP) et plusieurs gènes de chimiotactisme (che) (voir section 8.13), ainsi que plusieurs gènes impliqués dans l’assemblage flagellaire (voir section 4.14). Quelques aspects du métabolisme des sucres sont aussi indiqués. Cette figure est adaptée d’un travail publié par The Institute for Genomic Research (TIGR).

un codon d’initiation et un codon d’arrêt de la traduction –, mais ne présentent pas d’homologie de séquence suffisante avec les protéines connues. On indique qu’ils codent des protéines hypothétiques, protéines qui existent probablement, bien qu’actuellement on ne connaisse pas leur fonction. Il convient de noter que, même dans le cas d’Escherichia coli, l’organisme le mieux compris au monde, des fonctions n’ont pu être assignées qu’à 2 700 gènes sur un total de 4 300. Cependant, la plupart des gènes impliqués dans la synthèse de macromolécules et le métabolisme central, essentiels pour la croissance, ont été identifiés. Il est probable que la plupart des

gènes non identifiés codent des protéines redondantes (système de secours pour les réactions métaboliques clés) ou qui ne sont pas essentielles (fonctions de régulation dans des conditions inhabituelles comme le catabolisme d’un substrat rare).

Les catégories de gènes en fonction de la taille du génome Comme l’indiquent les données du tableau 15.2, le pourcentage des gènes d’un organisme dédiés à l’une ou l’autre des fonctions cellulaires est, dans une certaine mesure, fonction de la taille du génome. La figure 15.8 le présente pour un grand nombre de




génomes d’espèces de Bacteria. Les pourcentages de gènes voués à la synthèse protéique et à la réplication de l’ADN augmentent radicalement chez les organismes à petits génomes. À l’opposé, les pourcentages des gènes de la transcription et de la régulation impliquant des systèmes à deux composants (transduction du signal – voir section 8.12), augmentent significativement chez les organismes à grands génomes. La production d’énergie est peu dépendante de la taille des génomes (voir figure 15.8). Les analyses génomiques synthétisées par la figure 15.8 suggèrent, en cohérence avec les résultats du tableau 15.2, que si certaines catégories de gènes peuvent être réduites, ce n’est pas le cas de l’appareil de synthèse des protéines. Les systèmes de régulation doivent permettre à la cellule de répondre plus efficacement à la disponibilité des ressources à travers une expression génétique adaptée. Les organismes à petits génomes peuvent se dispenser de ces processus de régulation parce qu’ils sont souvent parasites et obtiennent ce dont ils ont besoin de leurs hôtes. À l’opposé, les organismes à grands génomes ont de nombreux gènes de régulation et du métabolisme qui les rendent plus compétitifs dans leurs habitats respectifs, souvent le sol. Le sol est un habitat où les sources d’énergie et de carbone sont souvent diverses, rares et intermittentes (voir sections 19.2 et 19.4). Un grand génome codant plusieurs options métaboliques sera fortement sélectionné dans un tel habitat. Il est intéressant de noter que tous les procaryotes du tableau 15.1 dont les génomes dépassent 6 Mpb proviennent du sol.

La distribution des gènes chez les Bacteria et les Archaea La figure 15.9 présente les pourcentages moyens de différentes catégories de gènes des Bacteria et des Archaea. En moyenne, les espèces d’Archaea ont des pourcentages de gènes plus élevés que les Bacteria, vouées à la production d’énergie et de coenzymes (ces résultats sont un peu biaisés du fait du grand nombre de nouveaux coenzymes des Archaea méthanogènes – voir sections 13.4 et 17.17). D’autre part, les Archaea tendent

Réplication de l’ADN Traduction Transcription Transduction de signal Production d’énergie

Pourcentage des cadres de lecture

498 Chapitre 15

0

2 000

4 000

6 000

8 000

10 000

Nombre total de cadres de lecture dans le génome FIGURE 15.8 Pourcentages relatifs dans le génome de catégories fonctionnelles de gènes en fonction du nombre total de cadres ouverts de lecture. Notez que les pourcentages des gènes de traduction ou de réplication de l’ADN augmentent pour les organismes à petits génomes, alors que les pourcentages des gènes de régulation de la transcription augmentent chez les organismes à génomes importants. Données de Proc. Natl. Acad Sci. (USA), 101: 3160-3165 (2004).

à contenir moins de gènes du métabolisme des glucides et de fonctions membranaires, telles que le transport et la biosynthèse de la membrane, que les Bacteria. Les gènes de fonctions inconnues ou présumées sont en assez grand nombre dans les deux cas, leurs proportions étant plus élevées pour les Archaea que pour les Bacteria (voir figure 15.9). Ainsi, en plus de la relation de dépendance entre la taille du génome et le nombre de gènes (voir figure 15.8), des spécificités dépendantes du domaine cellulaire existent (voir figure 15.9). Elles reflètent probablement des différences de mode de vie entre Bacteria et Archaea qui restent à élucider.

Pourcentage de gènes

14 12

Bacteria Archaea

10 8 6 4 2 0

Métabolisme des glucides

Membrane cellulaire

Métabolisme des co-enzymes

Production d’énergie Fonction inconnue Prédiction générale

Catégorie fonctionnelle FIGURE 15.9 Variations des catégories de gènes chez les Bacteria et les Archaea. Ces données sont des moyennes de 34 espèces de Bacteria et de douze espèces d’Archaea. « Fonction inconnue » représente les gènes qui codent des protéines dont les fonctions ne sont pas connues. « Prédiction générale » représente des gènes qui codent des protéines hypothétiques, qui peuvent exister ou non. Données de Proc. Natl. Acad Sci. (USA), 101: 3160-3165 (2004).



15.6 Génomes des micro-organismes eucaryotes 499

Contrôlez vos acquis De nombreux gènes peuvent être identifiés par leur similarité de séquence aux gènes trouvés chez d’autres organismes. Cependant, des gènes en pourcentage significatif sont de fonctions inconnues. En moyenne, les gènes des Bacteria et des Archaea sont apparentés, mais montrent des différences. La bioinformatique joue un rôle important pour les analyses génomiques. •

Est-ce que chaque ORF fonctionnel code une protéine ?

•

Qu’est-ce qu’une protéine hypothétique ?

•

Quelle est la catégorie de gènes la plus fréquente chez les procaryotes ?

15.6 Génomes des micro-organismes m n eucaryotes De nombreux micro-organismes eucaryotes sont connus et divers génomes de micro-organismes et aussi d’eucaryotes supérieurs (voir tableau 15.3) ont été séquencés. La levure Saccharomyces cerevisiae est un eucaryote très important du fait de son utilisation industrielle largement répandue (voir chapitre 30) et de son intérêt comme modèle en biologie cellulaire.

Le génome de la levure Le génome haploïde de la levure contient seize chromosomes dont la taille varie de 220 kpb à environ 2 352 kpb. Le génome nucléaire total de la levure (à l’exclusion de la mitochondrie et de quelques éléments génétiques plasmidiques et viraux) mesure approximativement 13 392 kpb. La levure, comme de nombreux autres eucaryotes, a une grande quantité de séquences d’ADN répétées (voir section 7.4). Lorsque le génome de la levure a été publié en 1997, toutes les répétitions « identiques » n’avaient pas été séquencées. Il est difficile de séquencer une longue série de séquences identiques ou quasi identiques et d’assembler ensuite convenablement les données produites. Par exemple, le chromosome XII de la levure compte une zone d’environ 1 260 kb qui contient de 100 à 200 répétitions des gènes des ARNr de la levure. Cette région n’ayant pas été totalement séquencée, une incertitude subsiste sur la taille du génome de la levure. Le génome nucléaire de la levure contient aussi 275 gènes d’ARNt (peu sont identiques) et 80 gènes d’autres types d’ARN non codants (voir section 7.16). Si 6 340 cadres ouverts de lecture avaient été indiqués chez la levure, une analyse plus détaillée les a réduits à 5 570, moins que chez certains procaryotes (voir tableau 15.1). Presque 3 400 codent des protéines de fonctions connues. La variété des techniques de génétique et de biochimie disponibles pour l’étude de cet organisme a permis d’obtenir des avancées significatives dans la compréhension des fonctions des autres protéines (voir section 15.11).

Les gènes indispensables de la levure et la présence d’introns Parmi tous les gènes connus chez la levure, lesquels sont absolument essentiels ? Un mécanisme existe pour explorer cette

question dans le cas de la levure et de tout micro-organisme, qui repose sur l’inactivation (knockout) des gènes par mutation (voir section 10.14). Usuellement, ce type de mutation ne peut être obtenu dans un gène essentiel à la viabilité cellulaire chez un organisme haploïde. Mais la levure peut aussi être cultivée à l’état diploïde (voir section 14.7). La comparaison de l’effet d’une mutation aux états diploïde et haploïde de la levure permet de déterminer si un gène est indispensable ou non à la viabilité cellulaire. Il a ainsi été montré que 877 ORF de la levure sont indispensables et que 3 121 ne le sont pas. Ce nombre de gènes indispensables est beaucoup plus grand que les 300 annoncés comme constituant le nombre minimal requis pour la vie des cellules procaryotes (voir section 15.3). Puisque les eucaryotes sont des organismes plus complexes que les procaryotes, on pouvait s’attendre à un ensemble de gènes minimal plus important. Puisque la levure est un eucaryote, elle contient des introns (voir section 7.1). Dans les gènes de la levure codant des protéines, il n’y a que 225 introns. La plupart des gènes de la levure à introns ont un seul petit intron proche de la fin du gène. Cette situation est très différente de celle des génomes des organismes supérieurs présentés au tableau 15.3. Le ver Caenorhabditis elegans et la mouche du vinaigre, Drosophila, par exemple, ont en moyenne respectivement 5 et 4 introns par gène. Les introns sont aussi très communs chez la moutarde, Arabidopsis, qui présente en moyenne 5 introns par gène, sachant que plus de 75 % de ses gènes ont des introns. Chez l’homme, presque tous les gènes codant des protéines ont des introns, et il n’est pas rare qu’un gène ait dix introns ou plus. Chez tous ces organismes, les introns sont généralement plus grands que les exons.

Les autres micro-organismes eucaryotes Les génomes de plusieurs autres eucaryotes remarquables ont été séquencés. Plasmodium falciparum est le parasite responsable de la malaria (voir section 27.5). Le séquençage de son génome a été une opération internationale. Le génome de 27 Mpb de P. falciparum comprend 14 chromosomes de tailles comprises entre 0,7 et 3,4 Mpb. Encephalitozoon cuniculi est un pathogène de l’homme et des animaux qui provoque des infections pulmonaires. E. cuniculi n’a pas de mitochondrie (voir section 14.9), et bien que son génome haploïde contienne 11 chromosomes, la taille de son génome n’est que de 2,9 Mpb (voir tableau 15.3). Elle est plus petite que celle de nombreux génomes procaryotes (voir tableau 15.1). Ustilago maydis est un champignon phytopathogène, avec un génome d’environ 20 Mpb. Il provoque la pourriture sèche du maïs, une maladie à fort impact économique. Des progrès considérables ont été accomplis pour le séquençage d’autres micro-organismes eucaryotes, en priorité de pathogènes, dont Leishmania major (leishmaniose), Candida albicans (diverses infections levuriennes – voir section 27.8), Entamoeba histolytica (dysentrie amibienne – voir sections 14.9 et 28.8), Giardia lamblia (giardiose – voir section 28.6), et Pneumocystis carinii (pneumonie associée au SIDA – voir section 26.14). De plus, les séquences complètes des génomes de la souris et du rat sont connues. Le génome humain a été séquencé, mais il n’est pas encore complètement annoté (voir tableau 15.3).



500 Chapitre 15


Contrôlez vos acquis La séquence complète du génome de la levure Saccharomyces cerevisiae ainsi que celles de nombreux eucaryotes microbiens ont été déterminées. La levure pourrait coder 5 570 protéines, dont seulement 877 semblent indispensables pour la viabilité. Le nombre de gènes qui codent des protéines contenant des introns est assez faible. •

Comment pourriez-vous montrer qu’un gène est indispensable ?

•

Qu’est-ce qui est inhabituel dans le génome de l’eucaryote Encephalitozoon ?

III

AUTRES GÉNOMES ET ÉVOLUTION DES GÉNOMES

En plus des cellules, d’autres structures ont des génomes, telles que les organites et les virus.

15.7 Les génomes des organites m n Les principaux organites, les mitochondries et les chloroplastes qui ont une origine bactérienne par endosymbiose (voir sections 11.4 et 14.4), ont leur propre ADN. Il n’est donc guère surprenant que les protéines codées par leurs ADN soient plus proches de celle des Bacteria que des Eukarya ou

TABLEAU 11.3

des Archaea. Nous verrons que ceci est globalement exact mais que les génomes mitochondriaux sont à certains égards énigmatiques.

Les génomes des chloroplastes Les génomes connus de chloroplastes sont tous des molécules d’ADN circulaires. Bien qu’il y ait plusieurs copies du génome dans chaque chloroplaste, elles sont toutes identiques. Le génome typique d’un chloroplaste fait de 120 à 160 kpb et contient deux répétitions inversées de 6 à 76 kpb (voir figure 15.10). Plusieurs génomes chloroplastiques ont été complètement séquencés et quelques-uns sont présentés dans le tableau 15.4. Le protozoaire flagellé Mesostigma viride appartient à la première lignée divergente vers les plantes vertes. Son chloroplaste contient plus de gènes codant des protéines et des ARNt que tous les autres actuellement connus ; il présente la structure typique illustrée par la figure 15.10. De nombreux gènes du génome chloroplastique codent des protéines impliquées dans la photosynthèse et l’autotrophie. Ce génome code aussi des ARNr utilisés par les ribosomes du chloroplaste, des ARNt utilisés pour la traduction, quelquesunes des protéines utilisées pour la transcription et la traduction, ainsi que quelques autres protéines. Quelques protéines qui fonctionnent dans le chloroplaste sont codées par des gènes du noyau cellulaire, probablement des gènes qui ont migré là alors que le chloroplaste passait d’une vie libre à l’état d’endosymbiote photosynthétique. À la différence des procaryotes libres, les introns sont fréquents dans les gènes chloroplastiques et sont essentiellement éliminés par autoépissage (voir section 14.8). L’analyse des génomes chloroplastiques a fortement renforcé l’hypothèse endosymbiotique (voir

QUELQUES GÉNOMES NUCLÉAIRES EUCARYOTESa

Organisme

Commentaires

Taille du génome

Nombre de chromosomes

Gènes codant des protéinesb

Encephalitozoon cuniculi

Très petit génome ; pathogène humain

2,9 Mpb

11

1 997


Levure d’importance industrielle, modèle pour la biochimie et la génétique

13 Mpb

16

5 570

Caenorhabditis elegans

Ce ver est un modèle important pour l’étude du développement animal

97 Mpb

6

19 099

Drosophila melanogaster

La mouche du fruit est un organisme modèle intensément étudié

180 Mpb

4

13 601

Arabidopsis thaliana

Cette plante est un organisme modèle pour la génétique

125 Mpb

5

25 498

Mus musculus

La souris, un mammifère modèle

2 500 Mpb

23

30 000

Homo sapiens

Le génome humain est disponible sous une forme préliminaire

3 000 Mpb

23

25 000 à 35 000c

a

Toutes les données concernent les génomes nucléaires haploïdes de ces organismes. Le nombre de gènes codant des protéines est dans tous les cas une estimation fondée sur le nombre de gènes connus et de séquences qui codent probablement des protéines fonctionnelles. c Un débat subsiste encore concernant le nombre de gènes dans le génome humain malgré la production de séquences préliminaires par deux groupes différents. Le nombre de gènes pourrait atteindre 60 000. b



15.7 Les génomes des organites 501

section 11.4). Les génomes chloroplastiques contiennent des gènes homologues de ceux d’Escherichia coli, de cyanobactéries et d’autres Bacteria. Ils comprennent des gènes codant des protéines impliquées dans la division cellulaire (voir section 6.2), ce qui suggère que le mécanisme de division des chloroplastes est identique à celui des Bacteria.

des génomes mitochondriaux codent beaucoup moins de protéines que ceux des chloroplastes. Plus de 200 génomes mitochondriaux ont été séquencés. Le plus grand génome mitochondrial a 62 gènes codant des protéines sachant que d’autres peuvent ne coder que 3 protéines. Les mitochondries de presque tous les animaux, dont l’homme, ne codent que 13 protéines (plus 22 ARNt et 2 ARNr), et celle de la levure Saccharomyces cerevisiae, pour seulement 8 protéines. Alors que les chloroplastes utilisent le code génétique « universel », les mitochondries utilisent des codes simplifiés, légèrement différents (voir section 7.14). Ceci ressemble au résultat d’une pression de sélection pour de plus petits génomes. L’ensemble usuel des 22 ARNt mitochondriaux est insuffisant pour la lecture de l’ensemble du code génétique, même en prenant en considération le flottement « standard » dans l’appariement (code dégénéré). Ainsi, l’appariement entre l’anticodon et le codon (voir figure 7.34) est plus flexible dans les mitochondries que dans les cellules. À la différence des génomes chloroplastiques, tous constitués de molécules d’ADN circulaire uniques, les génomes mitochondriaux sont assez divers. Certains génomes mitochondriaux, dont ceux de quelques espèces d’algues, de protozoaires et de champignons sont linéaires. Dans d’autres cas, comme pour la levure Saccharomyces cerevisiae, bien que les cartes de restriction et génétiques aient révélé un génome mitochondrial circulaire, il semble qu’in vivo la forme majoritaire soit linéaire. (Souvenons-nous que le bactériophage T4 a un génome de structure génétiquement circulaire, mais est physiquement linéaire – voir section 9.9.) La figure 15.11 montre une carte du génome mitochondrial humain de 16 569 pb (13 gènes). Le génome mitochondrial de la levure est plus grand (85 779 pb), mais n’a que 8 gènes codant des protéines. À part les gènes codant les ARN et les protéines, le génome mitochondrial de la levure contient de grandes zones d’ADN très riches en AT, sans fonction apparente. Il convient d’indiquer enfin que des petits plasmides sont présents dans les mitochondries de plusieurs organismes, ce qui complique encore plus l’analyse de leurs génomes. Une complication supplémentaire dans l’analyse de quelques génomes

Les génomes mitochondriaux Les mitochondries sont impliquées dans la production d’énergie et sont présentes chez la plupart des organismes eucaryotes. Les génomes mitochondriaux codent essentiellement des protéines impliquées dans la phosphorylation oxydative et, à l’instar des génomes chloroplastiques, codent aussi des ARNr, des ARNt et des protéines de traduction nécessaires à la synthèse des protéines. Cependant, la plupart

LSC

IRA

IRB SSC

FIGURE 15.10 Carte d’un génome typique de chloroplaste. Les génomes des chloroplastes sont des molécules d’ADN circulaires double-brin. La plupart contiennent deux régions répétées inversées (IRA et IRB), qui bordent une petite région simple copie (SSR, small single copy region) et une grande région simple copie (LSR, large single copy region).

TABLEAU 11.4

QUELQUES GÉNOMES CHLOROPLASTIQUESa Gènes codant des

Organisme

Taille (pb)

Protéinesb

ARNt

ARNrc

Répétitions inverséesd

Chlorella vulgaris

Algue verte

150 613

77

31

1

Absence

Euglena gracilis

Protozoaire

143 170

67

27

3

Absence

Mesostigma viride

Protozoaire

118 360

92

37

2

Présence

Pinus thunbergii

Pin noir

119 707

72

32

1

Présencee

Oryza sativa

Riz

134 526

70

30

2

Présence

Zea mays

Maïs

140 387

70

30

2

Présence

a

Tous les génomes chloroplastiques sont circulaires et constitués d’ADN double brin (voir section 14.4). b Elles incluent les gènes codant des protéines de fonctions connues et les ORF potentiellement fonctionnels. c Chaque unité est un opéron ARNr qui contient chacun des gènes des différents ARNr. d Voir figure 5.10. e Bien que les répétitions inversées soient présentes, elles sont largement tronquées.



502 Chapitre 15


mitochondriaux et chloroplastiques est qu’il est parfois difficile de trouver le gène d’une protéine particulière même lorsque les séquences de la protéine et de l’ADN de l’organite sont toutes deux connues. Ceci est dû à l’édition des ARN (voir le focus « Édition des ARN »).

Organites et génome nucléaire Les chloroplastes et les mitochondries ont besoin de protéines plus nombreuses que celles que l’expression de leurs gènes peut produire. Par conséquent, de nombreuses fonctions des organites sont orchestrées par les gènes nucléaires. On estime que la mitochondrie de la levure contient plus de 400 protéines différentes, alors que nous avons vu qu’elle ne pouvait en produire que 8. Donc la quasi-totalité des protéines requises par la mitochondrie de la levure sont codées par les gènes du noyau. Il semblerait raisonnable que les gènes (et les protéines) qui fonctionnent pour certains processus du noyau

Thr

Phe Val 12S

boucle D

Cytb

Pro Glu

16S

ND6

Leu ND5

ND1 Ile Met

Gln ND2 Trp

ND4

Ala Asn Cys Tyr COI

Leu Ser His

ND4L Ser

COIII

COII Asp

Lys

Arg Gly ND3

ATPase 6 ATPase 8

FIGURE 15.11 Carte du génome mitochondrial de l’homme. Le génome circulaire de la mitochondrie humaine contient 16 569 pb. Le génome code les ARNr 16S et 12S (qui correspondent aux ARNr procaryotes 23S et 16S) et pour 22 ARNt. Ces gènes sont indiqués en orange : orange clair pour les gènes transcrits dans le sens des aiguilles d’une montre sur la carte, et orange foncé pour le sens inverse (l’indication des acides aminés pour les ARNt est mentionnée à l’intérieur de la carte pour les gènes transcrits dans le sens des aiguilles d’une montre, et à l’extérieur pour ceux qui sont transcrits en sens inverse). Les treize gènes codant des protéines sont en vert (là encore en vert clair pour les gènes transcrits dans le sens des aiguilles d’une montre, et en vert foncé pour ceux qui sont transcrits en sens inverse). Ces gènes codent : Cytb, cytochrome b ; ND1-6, constituants du complexe NADH-déshydrogénase ; COI-III, sous-unités du complexe cytochrome oxydase ; ATPase 6 et 8, polypeptides du complexe ATPase mitochondrial. Les deux promoteurs sont dans la région nommée boucle D, région aussi impliquée dans la réplication de l’ADN.

ou du cytoplasme eucaryote puissent avoir la même utilité dans les organites, mais en fait ce n’est pas le cas. Bien que les gènes de nombreuses protéines des organites soient présents et transcrits dans le noyau et traduits dans le cytoplasme cellulaire, les produits de ces gènes sont spécifiquement utilisés par les organites et doivent y être transportés. Les protéines impliquées dans la traduction ont été parmi les premières protéines mitochondriales à être étudiées et il était clair que ces protéines codées par le noyau étaient très apparentées aux protéines homologues des Bacteria et non pas des Eukarya. Il est apparu ainsi que la plupart des gènes codant les protéines mitochondriales avaient été transférés de la mitochondrie au noyau. Cependant, en absence d’approches génomiques, il était difficile d’avancer dans la compréhension de cette question. Pour conduire l’analyse, il a fallu la séquence d’un génome eucaryote, celle d’une espèce de Bacteria phylogénétiquement proche du génome mitochondrial et les séquences génomiques d’autres Bacteria dans un but comparatif. La connaissance du génome mitochondrial n’était pas véritablement nécessaire (car il code très peu de protéines), mais celle des protéines qui fonctionnent dans la mitochondrie l’était. Toutes ces exigences ont été atteintes avec la levure Saccharomyces cerevisiae. Étonnamment, parmi les 400 gènes nucléaires qui codent des protéines mitochondriales, seule une cinquantaine était très apparentée à la branche phylogénétique qui conduit à la mitochondrie (α Proteobacteria – voir section 12.1). Par ailleurs, 150 étaient clairement apparentés à des protéines de Bacteria, mais pas nécessairement aux Proteobacteria. Les 200 autres protéines étaient codées par des gènes sans homologues identifiables parmi les gènes de Bacteria. Les protéines homologues de celles de Bacteria étaient principalement impliquées dans les conversions d’énergie, la traduction et la biosynthèse, alors que les autres protéines l’étaient dans les membranes, la régulation et le transport. Ainsi, bien que la mitochondrie montre de nombreux signes indicateurs d’une origine endosymbiotique, les analyses génomiques ont montré que son histoire génétique est plus compliquée qu’on ne le pensait.

Contrôlez vos acquis Les chloroplastes et les mitochondries ont de petits génomes indépendants des génomes nucléaires. Ces génomes codent des ARNr, des ARNt et quelques protéines du métabolisme énergétique. Bien que les génomes des organites soient indépendants du génome nucléaire, les organites eux-mêmes ne le sont pas. De nombreux gènes du noyau codent des protéines nécessaires au fonctionnement des organites. Ces gènes ont différentes histoires phylogénétiques. •

Comment la taille du génome et le contenu en gènes sont-ils corrélés chez les mitochondries de la levure et de l’homme ?

•

Qu’est-ce qui est inhabituel au sujet des gènes qui codent les fonctions mitochondriales chez la levure ?

•

Qu’est-ce que l’édition des ARN ? En quoi est-ce différent de la maturation de l’ADN ?



15.8 Évolution et familles de gènes 503

FOCUS

Édition des ARN

Dans les chapitres 7 et 14, nous avons vu que certains gènes ont des régions codantes séparées par des régions non codantes, appelées introns. Classiquement, les introns sont éliminés après la transcription pour produire un ARN mature lors d’un processus appelé épissage (voir section 14.8). Dans les génomes des organites, on trouve un phénomène qui est presque l’opposé de l’épissage : l’édition des ARN. L’édition des ARN implique à la fois l’insertion ou la délétion de nucléotides pour produire un ARNm final différent de l’ADN transcrit. L’édition peut aussi impliquer des modifications chimiques des bases de l’ARNm. Dans les deux cas, l’édition des ARN peut altérer les codons, de sorte qu’un acide aminé ou plus, différents de ceux codés par le gène, soient insérés dans le polypeptide. Dans les mitochondries des trypanosomes et des protozoaires apparentés (voir section 14.10), quelques transcrits mitochondriaux sont édités de telle façon qu’un grand nombre (des centaines dans quelques cas) d’uridylates soient ajoutés et, plus rarement, délétés. Un exemple de ce type d’édition des ARN est montré dans la figure 1. L’édition des ARN est précisément contrôlée par des petites séquences de l’ARNm qui « guident » les enzymes assurant les éditions spécifiques. Ce processus doit évidemment être très précisément contrôlé. L’insertion de bases trop ou insuffisamment

m n

nombreuses engendrerait un produit probablement non fonctionnel. L’autre type d’édition des ARN, le remplacement d’une base par une autre, est fréquent dans les mitochondries et les chloroplastes des plantes supérieures. Dans certains sites spécifiques de quelques ARNm un C sera converti en U par désamination oxydative (la modification inverse est plus rare). Il y au moins vingt-cinq sites de conversion de C à U dans le chloroplaste du maïs. Bien que ceci concerne principalement les génomes des organites, un exemple de conversion programmée de C à U est aussi connu pour un gène nucléaire de mammifère. Selon la localisation de l’édi-

tion, un nouveau codon peut être formé, ce qui conduit à la formation d’une séquence protéique qui ne correspond pas à celle du gène dont elle résulte. Cette surprenante édition des ARN aurait pu constituer un obstacle significatif à l’analyse des génomes des organites. Dans les faits ce n’est pas le cas, car le nombre de protéines concerné est faible et ces protéines sont hautement conservées. La fonction et l’origine de l’édition des ARN sont inconnues. Certains scientifiques ont suggéré que ce puisse être une rémanence du monde à ARN, au même titre que les ribozymes (voir section 14.8) et autres ARN catalytiques (voir section 11.2).

Protéine ...Leu Cys Phe Trp Phe Arg Phe Phe Cys... ARNm

...uuG uGu UUU UGG uuu AGG uuu uuu uGu...

ADN

... ...

G G TTT TCC C C AAA AGG

AGG TCC

G ... C ...

Figure 1 Édition des ARN. La partie supérieure de la figure montre une partie de la séquence d’acides aminés de la sous-unité III de l’enzyme cytochrome oxydase du protozoaire Trypanozoma brucei (voir section 14.10). La mitochondrie code cette protéine. Sous cette séquence d’acides aminés, est visible la séquence d’ARN messager (ARNm) de cette zone. Les bases en lettres majuscules sont transcrites du gène présenté en dessous. Les lettres de l’ARNm en lettres minuscules ont été insérées dans le transcrit par un processus appelé édition de l’ARN. Bien que la séquence d’ADN soit présentée ici avec de nombreux espaces, la molécule n’en comporte pas. Les espaces introduits sur cette figure ont pour fonction de faciliter la compréhension.

15.8 Évolution et familles de gènes

La première priorité de la génomique est, bien sûr, de déterminer le nombre, les séquences et les fonctions des gènes d’un organisme. Toutefois, la génomique ne se limite pas à séquencer, annoter les gènes et interpréter les résultats en terme d’interaction d’un organisme avec son environnement. La génomique comparée nous aide à comprendre les relations évolutives entre les organismes. La reconstruction des relations évolutives à partir des séquences des génomes permet de séparer les caractéristiques primitives des caractéristiques dérivées et peut résoudre les ambiguïtés des arbres phylogénétiques fondés sur l’analyse d’un seul gène (par exemple l’ARNr 16S – voir sections 11.5 et 14.9). Ces connaissances contribuent à une meilleure compréhension des premières formes de vie et, à terme, pourraient apporter des réponses à la question la plus fondamentale de la biologie : comment la vie est-elle initialement apparue ?

Duplication et familles de gènes : paralogues et orthologues Les génomes procaryotes et eucaryotes comprennent des familles de gènes, des gènes apparentés à d’autres gènes du même organisme. Bien que les grandes familles de gènes ne soient pas la règle, la génomique comparative a montré que de nombreux gènes proviennent de la duplication d’autres gènes. De tels gènes sont dits paralogues, des gènes dont la similarité est le résultat d’une duplication de gène à un moment de l’évolution d’un organisme. Les gènes d’un organisme qui sont semblables à ceux d’un autre organisme, mais qui diffèrent du fait de la spéciation, sont dits orthologues. Les gènes qui codent les isoenzymes de la lactate déshydrogénase (LDH) chez l’homme constituent un exemple de gènes paralogues. Ces enzymes sont structuralement distinctes, mais toutes fortement apparentées et réalisent la même réaction enzymatique. Par ailleurs, les orthologues existent



504 Chapitre 15


par exemple entre la LDH d’Escherichia coli et une isoenzyme de la LDH de l’homme. L’étude des gènes et des familles de gènes est un travail important de la génétique comparative. Sachant que les chromosomes de nombreux micro-organismes différents ont déjà été séquencés, de telles comparaisons peuvent facilement être faites et les résultats sont souvent surprenants. Par exemple, les gènes des Archaea impliqués dans la réplication de l’ADN, la transcription et la traduction sont plus proches de ceux des Eukarya que de ceux des Bacteria. Étonnamment, cependant, de nombreux autres gènes des Archaea, par exemple ceux qui codent des fonctions métaboliques autres que les processus informationnels, sont plus proches de ceux des Bacteria que de ceux des Eukarya. Les puissants outils d’analyse bioinformatique nous permettent de déduire très rapidement de telles relations génétiques entre les grands domaines du vivant, aussi bien au niveau d’un gène que d’un groupe de gènes, ou encore au niveau du génome entier. Les résultats ainsi obtenus renforcent sérieusement la vision phylogénétique de la vie, initialement issue de l’analyse comparative de séquences d’ARNr (voir section 11.5) et suggèrent que de nombreux gènes, chez tous les organismes, ont des racines évolutives communes. Mais ces analyses ont aussi révélé des exemples de flux horizontaux de gènes.

Le transfert horizontal de gènes L’évolution est fondée sur le transfert des caractéristiques génétiques d’une génération à la suivante. Cependant, le transfert horizontal (latéral) de gènes s’effectue aussi, et il peut compliquer les études évolutionnistes, spécialement lorsqu’elles portent sur l’analyse des génomes entiers. Le transfert horizontal de gènes a lieu chaque fois que des gènes sont transmis d’une cellule à une autre autrement que par le processus usuel de transmission d’une cellule mère à une cellule fille. Chez les procaryotes, au moins trois méthodes de transfert horizontal de gènes sont connues : la transformation, la transduction et la conjugaison (voir chapitre 10). Le flux horizontal de gènes peut être étendu dans la nature et peut même franchir les domaines. Mais pour être détecté par la génomique comparative, il faut des différences importantes entre les organismes. Par exemple, plusieurs gènes d’origine eucaryote ont été trouvés chez Chlamydia (voir sections 15.3 et 26.13) et Rickettsia (voir sections 12.13 et 27.3), deux genres pathogènes de l’homme. De plus, les analyses génomiques ont montré que Thermotoga maritima (une espèce de Bacteria) contient plus de 400 gènes (plus de 20 % de son génome) qui ont clairement une origine archéenne. On en a relevé 81 qui constituent des groupes de gènes, ce qui suggère fortement qu’ils ont été obtenus par transfert horizontal de gènes, sans doute à partir des Archaea thermophiles qui partagent les environnements chauds habités par les Thermotoga. Les transferts horizontaux de gènes peuvent être reconnus dans les génomes dès que les gènes ont été annotés. La présence de gènes qui codent des protéines usuellement trouvées chez des espèces éloignées est un signe d’acquisition par transfert horizontal. Un autre indice est la présence d’un ou plusieurs

cadres de lecture dont le contenu (voir section 11.10) ou le biais de codon diffère significativement du reste du génome. En utilisant ces indices, de nombreux exemples de probables transferts horizontaux ont été décrits dans les génomes de procaryotes variés. Les gènes transférés horizontalement codent généralement des fonctions métaboliques autres que les processus moléculaires fondamentaux de réplication de l’ADN, de transcription et de traduction, et peuvent expliquer les similarités mentionnées précédemment entre les gènes des Archaea et ceux des Bacteria. Plusieurs exemples portent sur des gènes de virulence de pathogènes (voir sections 21.8 et 21.9). Manifestement, les procaryotes échangent des gènes dans la nature et le processus fonctionne probablement pour ajuster le génome à une situation particulière ou à un habitat. Le génome de Chlamydia trachomatis révèle un transfert potentiel à partir d’une source eucaryote, peut-être son hôte humain. C’est l’opposé de la situation où des gènes du noyau eucaryote sont issus d’un transfert en provenance de l’ancêtre de la mitochondrie (voir section 15.7). Si ces gènes de C. trachomatis ont bien une origine humaine, il en résulte que le transfert horizontal de gènes ne s’arrête pas à la frontière entre procaryotes et eucaryotes. Les analyses évolutionnistes des génomes ont aussi une composante pratique. La capacité à identifier des gènes clairement procaryotes, et en particulier des gènes caractéristiques des bactéries pathogènes, a aidé au développement d’outils de diagnostic puissants et très spécifiques, ainsi que d’agents thérapeutiques pour la médecine clinique qui visent les produits de ces gènes.

Contrôlez vos acquis La génomique peut servir à étudier l’histoire évolutive d’un organisme. Les organismes contiennent des familles de gènes, des gènes avec des séquences apparentées. Si cela résulte de la duplication de gènes, ces gènes sont dits paralogues ; si cela résulte de la spéciation, ils sont dits orthologues. Les organismes peuvent acquérir des gènes d’autres organismes de leur environnement par un processus appelé transfert horizontal de gènes. •

Expliquez la différence entre gènes paralogues et orthologues.

•

Décrivez un mécanisme permettant le transfert horizontal de gènes chez un procaryote.

15.9 L’exploitation des génomes m n Comme nous l’avons vu, l’analyse génomique révèle le potentiel génétique d’un organisme. L’analyse génomique offre ainsi un aperçu du métabolisme et, subséquemment, de l’écologie d’un organisme. Souvent, cependant, les analyses génomiques indiquent qu’un ou plusieurs gènes usuellement associés à une voie métabolique ou à un processus semblent absents. Ceci peut signifier que l’organisme utilise une nouvelle voie ou au minimum qu’une nouvelle réaction existe. Il



15.10 Protéomique 505

est alors souhaitable de rechercher un gène codant une protéine susceptible d’assurer la fonction absente, ce qui peut être aisément réalisé par ordinateur. La recherche d’un tel gène dans une base de données contenant la séquence complète du génome d’un organisme correspond à l’exploitation « minière » des génomes (genomic mining). La recherche de l’ADN polymérase de la cyanobactérie Synechocystis est un bon exemple (voir figure 15.12).

L’ADN polymérase de Synechocystis : les intéines et les fruits de l’exploitation génomique Toutes les espèces de Bacteria contiennent une ADN polymérase semblable à l’ADN polymérase III d’Escherichia coli, principale polymérase de la réplication de l’ADN (voir section 7.6). C’est une enzyme complexe qui regroupe de nombreuses sousunités différentes, la sous-unité qui catalyse la réaction de polymérisation est DnaE, produit du gène dnaE. Parce que les ADN polymérases sont des protéines très conservées et d’importance primordiale pour toutes les cellules, l’inspection du génome de tout membre des Bacteria révèle rapidement un gène orthologue, c’est-à-dire de séquence identique au gène dnaE de E. coli. Ce ne fut pas le cas lors de l’analyse initiale du génome de Synechocystis (voir tableau 15.1), mais deux ORF de fonction inconnue ont été trouvés, qui, rassemblés, ont montré une forte similarité avec dnaE. Ces deux ORF étaient séparés par 700 kpb et localisés sur les brins opposés de l’ADN chromosomique de Synechocystis, ce qui impliquait une transcription en sens inverse. S’agissait-il bien de deux parties de dnaE ? L’analyse attentive des séquences des deux ORF a révélé que c’était bien

le cas. Ces gènes codaient aussi les moitiés d’une intéine, une protéine d’autoépissage (voir section 8.3). Les deux ORF de Synechocystis ont ensuite été clonés. Après transcription et traduction, l’intéine catalysait une réaction d’épissage entre les deux moitiés de DnaE pour former une protéine enzymatique complète et active (voir figure 15.12). Pour quelle raison ce gène dnaE est-il morcelé chez Synechocystis ? On ne le sait pas, mais force est de constater que l’évolution a retenu cette solution pour l’expression de ce gène chez cet organisme. Synechocystis n’est pas un cas unique. Plusieurs gènes archéens de réplication de l’ADN contiennent aussi des intéines, y compris ceux de Nanoarchaeum equitans, une Archaea parasite au minuscule génome (voir tableau 15.1). Il est difficile d’imaginer comment ces mécanismes très inhabituels auraient été découverts sans l’analyse et la comparaison de séquences de génomes complets que l’on peut pratiquer en routine aujourd’hui. L’exploitation des données génomiques révèlera certainement encore de nombreuses surprises et pourrait aussi conduire à des découvertes débouchant sur des applications pratiques.

Contrôlez vos acquis Souvent, il est nécessaire de rechercher attentivement dans une base de données génomiques pour trouver un gène particulier. Cette démarche d’exploitation du génome (genomic mining) permet de trouver de nouveaux gènes ou de rechercher des gènes dont la présence est présumée. •

En quoi une intéine diffère-t-elle d’un intron ?

IV

745 kpb

ORF1

ORF2

Transcription et traduction

Auto-épissage de la protéine +

Intéines

Protéine DnaE FIGURE 15.12 Intéines : le gène DnaE morcelé de Synechocystis. Les deux cadres de lecture (ORF) sont transcrits dans des directions opposées, comme le précisent les flèches orange. Les protéines produites par ces ORF contiennent chacune une partie d’une intéine (la protéine produite par l’ORF2 a été synthétisée selon l’orientation standard de l’extrémité N-terminale à l’extrémité C-terminale). Plusieurs enzymes de réplication de l’ADN des Archaea présentent aussi des intéines, le phénomène n’est donc pas limité aux Bacteria.

FONCTION ET RÉGULATION DES GÈNES

15.10 Protéomique m n Un but supplémentaire des études de génomique est de déterminer quels gènes sont exprimés pour produire des protéines et aussi d’identifier la fonction de ces protéines. Le terme protéome correspond à l’ensemble des protéines présentes dans une cellule à un instant donné. Le protéome n’est donc pas « l’ensemble des protéines codées par le génome d’un organisme », car si les gènes d’un organisme sont continuellement présents, leur expression est régulée (voir chapitre 8). Le nombre et les types de protéines présents dans une cellule changent continuellement en réponse à l’environnement de l’organisme et à d’autres facteurs comme le stade de développement. L’étude de la structure, de la fonction et de la régulation des protéines d’un organisme à l’échelle du génome est la protéomique, que l’on appelle encore génomique fonctionnelle.

L’électrophorèse en gel bidimensionnel Une approche de la protéomique repose sur l’utilisation de l’électrophorèse bidimensionnelle en gel de polyacrylamide. Cette technique peut séparer, identifier et mesurer toutes les



506 Chapitre 15


protéines présentes dans un échantillon de cellules. La figure 15.13 montre la séparation des protéines d’Escherichia coli par un gel bidimensionnel. Dans la première dimension (horizontale sur la figure), les protéines sont séparées selon leur point isoélectrique, le pH pour lequel la charge nette de chaque protéine est nulle. Dans la seconde dimension, les protéines sont dénaturées de telle sorte que chaque résidu d’un acide aminé ait une charge fixe. Les protéines sont ensuite séparées par leur taille (de façon plus ou moins identique, les molécules d’ADN le sont aussi – voir figure 7.22). Dans le cas d’E. coli et de quelques autres organismes, des centaines de protéines séparées en gels bidimensionnels ont été identifiées par voie biochimique ou génétique et leur régulation a été étudiée dans différentes conditions. Les gels bidimensionnels permettent de visualiser l’apparition ou la disparition de protéines dans différentes conditions de croissance, et donc d’observer les variations du protéome en fonction des conditions environnementales. L’élution d’une protéine à partir du gel et son séquençage N-terminal peuvent être pratiqués pour tenter d’associer cette protéine à un gène. La séquence obtenue peut être suffisante pour définir une sonde oligonucléotidique et ainsi amplifier par PCR le gène qui code la protéine (voir section 7.9). Le séquençage et la génomique comparative fournissent des indices pour déterminer la fonction de cette protéine.

Mr (kDa) 160 81

43

Génomique fonctionnelle et génomique structurale Sachant que la protéomique requiert souvent des expérimentations lourdes (voir figure 15.13), les analyses in silico peuvent aussi être bien utiles. Après avoir obtenu la séquence du génome d’un organisme, l’analyse initiale peut la comparer à celles d’autres organismes pour localiser et identifier des gènes semblables à ceux qui sont déjà connus. Les « séquences » les plus importantes à ce niveau sont celles des acides aminés des protéines car, du fait de la dégénérescence du code génétique (voir section 7.14), des différences dans les séquences d’ADN ne conduisent pas nécessairement à des différences dans celles des acides aminés (voir figure 15.14). Les protéines avec plus de 50 % d’homologie de séquence ont fréquemment des fonctions semblables. Les protéines avec plus de 70 % d’homologie de séquence ont presque certainement des fonctions semblables. Un indice important de la fonction d’une protéine est l’identification de régions de la séquence codante présentes dans d’autres protéines qui codent des domaines qui ont des fonctions connues. Il peut s’agir de domaines de liaison à un métal, à un nucléotide ou à un cofacteur. Par exemple, une protéine avec un domaine de liaison à NAD+ (voir section 5.7) est presque certainement impliquée dans une réaction d’oxydoréduction. Les domaines protéiques spécifiques ont des séquences spécifiques, mais c’est leur structure tridimensionnelle qui les rend fonctionnels (voir section 3.8). La génomique structurale est la détermination des structures tridimensionnelles des protéines représentatives de la gamme des structures et fonctions protéiques trouvées chez un organisme. Le but ultime est la constitution d’un ensemble d’informations structurales permettant de prédire in silico la structure probable et la fonction potentielle de n’importe quelle protéine à partir de sa structure primaire. Ce but n’est pas encore atteint, mais il le sera à l’avenir grâce à l’accumulation et à l’analyse des données de séquençage. Le lien entre génomique et protéomique sera alors beaucoup plus fort. Le couplage de la génomique et de la protéomique apporte des informations importantes sur la relation entre les facteurs

Jack Parker

25

12 7

6 pH

5

FIGURE 15.13 Protéomique : électrophorèse bidimensionnelle de protéines en gel de polyacrylamide. Cette figure montre un autoradiogramme des protéines d’une culture d’Escherichia coli. Chaque tache sur le gel est une protéine particulière. De la méthionine radioactive sert à marquer les protéines pendant la croissance pour permettre leur visualisation et leur quantification. Une iso-électro-focalisation en conditions dénaturantes a d’abord séparé les protéines dans un gradient de pH de 5 à 7 où l’on trouve la majorité des protéines d’E. coli (les principales protéines ribosomiques sont absentes de cette figure). La seconde dimension sépare les protéines selon leur masse (M r ; donnée en kDa), les protéines de plus grande taille se situant dans la partie supérieure du gel.

1

2

3

Arg

Ser

Leu

AGA

UCA

CUU

Arg

Ser

Leu

CGA

UCG

CUG

Ser

Ala

Arg

AGU

GCA

CGU

FIGURE 15.14 Comparaison des séquences d’acides nucléiques et d’acides aminés. La figure montre trois séquences nucléotidiques différentes (avec indication, par commodité, des séquences d’ARN). Les séquences 2 et 3 diffèrent chacune de la séquence 1 en trois positions. Cependant, les séquences d’acides aminés codées par 1 et 2 sont identiques, alors que celle codée par la séquence 3 est sans rapport avec les deux autres.



15.11 Puces à ADN et transcriptome 507

de l’environnement et l’expression génétique chez différents organismes. Ces informations sont non seulement utiles au plan cognitif, mais elles offrent aussi des applications potentielles dans les domaines de la médecine, de l’environnement et de l’agriculture.

Contrôlez vos acquis Le protéome englobe toutes les protéines présentes dans un organisme à un instant donné. Le but de la protéomique est d’étudier ces protéines pour connaître leur structure, leur fonction et leur régulation. •

Un organisme peut-il avoir plus d’un protéome ?

•

Qu’est-ce que la génomique fonctionnelle ?

15.11 Puces à ADN et transcriptome m n Un des buts principaux de la protéomique est l’étude de l’expression génétique. Mais il y a deux autres façons d’étudier cette question. Souvenons-nous que l’expression génétique est souvent régulée au niveau de la transcription (voir chapitre 8). Pour être exprimé, un gène doit d’abord être transcrit. Connaître les conditions dans lesquelles un gène est transcrit peut aussi fournir de l’information sur sa fonction. Par analogie avec le protéome, l’ensemble des ARNm produits dans un contexte donné est appelé transcriptome. Et une technique puissante d’analyse du transcriptome existe : les puces à ADN.

génome humain entier (voir figure 15.16a). Cette puce peut analyser plus de 47 000 transcrits et dispose en plus de place pour 6 500 oligonucléotides supplémentaires pour les besoins de la médecine clinique ! La figure 15.16b montre une partie d’une puce utilisée pour étudier l’expression du génome de Saccharomyces cerevisiae. La puce à ADN de la figure 15.16b contient aisément les 5 600 gènes codant des protéines de S. cerevisiae, de telle sorte que l’expression génétique globale de cet organisme puisse être caractérisée en une seule expérience. La puce est hybridée avec les ARNm extraits de cellules de levure cultivées dans des conditions définies et marqués avec un fluorochrome. Chaque ARNm ne pourra se fixer qu’à un ADN de la puce complémentaire de sa séquence. Pour analyser l’hybridation, la puce est examinée avec un détecteur de fluorescence à laser et le signal obtenu est traité par ordinateur. Une image, qui résulte des hybridations entre les ARNm et les séquences d’ADN complémentaires, est alors produite (voir figures 15.15 et 15.16b). Une hybridation

Gène X

Gène Y

Gène Z Synthèse d’oligonucléotides sb courts, complémentaires des gènes X, Y et Z Fixation des ADNsb sur la puce à des emplacements définis Gène X

Les puces à ADN Dans le chapitre 7, nous avons vu comment les techniques d’hybridation d’acides nucléiques permettent de localiser des gènes sur des fragments d’ADN (voir section 7.7). Les techniques d’hybridation peuvent aussi être utilisées en lien avec les données de séquençage de génome pour mesurer l’expression des gènes par hybridation des ARNm à des fragments spécifiques d’ADN. Cette technique s’est radicalement améliorée et développée avec l’arrivée des puces à ADN. Ces puces sont des petits supports solides sur lesquels des gènes ou des portions de gènes qui représentent le génome entier d’un organisme sont déposés et fixés selon un plan précisément défini (voir figure 15.16a). Les gènes sont synthétisés par PCR, ou, alternativement, des oligonucléotides sont définis pour chaque gène sur la base de la séquence du génome. Après fixation au support solide, ces gènes (ou fragments de gènes) peuvent être hybridés avec les ARNm des cellules cultivées dans les conditions choisies, puis scannés et analysés par ordinateur. L’hybridation d’un ARNm particulier avec un des dépôts d’ADN sur la puce révèle l’expression du gène correspondant. Une méthode de réalisation et d’utilisation de puces est présentée dans la figure 15.15. Le procédé utilisé pour fabriquer des puces informatiques (la photolithographie) a été adapté pour produire des biopuces de silice de 1 à 2 cm, chacune pouvant supporter des milliers de fragments d’ADN différents (voir figures 15.15 et 15.16). Une compagnie, par exemple, a mis sur le marché une puce à ADN sur laquelle a été déposé le

Gène Y Gène Z

Puce à ADN Condition de croissance 1

Gène X exprimé Gènes Y et Z non exprimés

Sondage avec Condition de croissance les ARNm marqués, puis 2 analyse de la puce

Gène X non exprimé Gènes Y et Z exprimés

FIGURE 15.15 La mesure du transcriptome : fabrication et utilisation de puces à ADN. Des petits oligonucléotides simples brins (sb), correspondant à tous les gènes d’un organisme, sont synthétisés individuellement (voir section 7.8) et déposés en des positions connues afin de produire une puce à ADN (microarray). Cette puce est utilisée en hybridant aux sondes oligonucléotidiques des ARNm marqués issus de cellules cultivées dans des conditions spécifiques, puis en analysant la puce avec un laser.



508 Chapitre 15


Affymetrix

fournit un résultat qualitatif, l’expression d’un gène, et l’intensité du signal apporte une information quantitative sur le niveau d’expression (voir figure 15.16b). Par conséquent, l’ordinateur produit la liste des gènes exprimés et aussi leurs niveaux d’expression. Ainsi l’utilisation d’une puce à ADN permet de disposer d’une vision instantanée du transcriptome d’un organisme d’intérêt cultivé dans des conditions définies.

(a)

Les applications des puces à ADN : l’expression génétique L’utilisation des puces à ADN permet de traiter des questions scientifiques générales ou au contraire très spécifiques selon les gènes fixés. Par exemple, on peut mesurer l’expression génétique globale d’un organisme en utilisant la totalité des ARNm comme sonde (voir figure 15.16b). À l’opposé, on peut comparer l’expression de différents gènes, un par un ou ensemble, sous différentes conditions. La possibilité d’analyser assez rapidement l’expression simultanée de milliers de gènes qualitativement et quantitativement offre un énorme intérêt face à la complexité du métabolisme et des régulations. Ceci est aussi vrai pour des organismes « simples » comme les procaryotes, avec leur 400 à 8 000 gènes et plus, ou complexes comme les humains, avec environ 30 000 gènes différents. Par exemple, la puce des gènes de S. cerevisiae (voir figure 15.16b) a été utilisée pour une étude détaillée du contrôle du métabolisme chez cet organisme. La levure peut croître par fermentation et par respiration. L’analyse du transcriptome a permis de voir quels gènes étaient exprimés ou ne l’étaient pas lorsque les cellules de levure passaient d’un métabolisme fermentatif (anoxie) à un métabolisme respiratoire. Elle a montré que la levure subissait alors une « reprogrammation » métabolique majeure. Tout un ensemble de gènes qui contrôlent la production d’éthanol (un produit clé de la fermentation) étaient fortement réprimés, alors que les fonctions du cycle de l’acide citrique (nécessaire à la croissance aérobie) étaient fermement activées au moment du changement. En tout, plus de 700 gènes étaient activés et plus de 1 000 réprimés lors de cette transition métabolique. De plus, en utilisant une puce, les profils d’expression de plusieurs gènes de la levure de fonctions inconnues lors de ce changement métabolique ont pu être décrits, ce qui fournit des indices de possibles fonctions. À l’heure actuelle, aucune autre méthode ne peut donner autant d’informations sur l’expression génétique que les puces à ADN. Elles constituent un outil puissant d’exploration de l’expression génétique à l’échelle du génome.

Affymetrix

Les applications à l’identification

(b) FIGURE 15.16 La mesure du transcriptome : les puces à ADN et leur utilisation pour analyser l’expression des gènes. (a) Biopuce du génome humain. Cette biopuce comporte plus de 40 000 fragments de gènes. (b) Une biopuce hybridée. Cette photographie montre les fragments du quart du génome complet de la levure de boulanger, Saccharomyces cerevisiae, fixé sur une biopuce. Chaque gène est présent en plusieurs copies et a été sondé avec les ARNm de cellules de la levure cultivées dans des conditions spécifiques, marqués avec un fluorochrome. L’arrière-plan de la biopuce est bleu. Les emplacements où l’ARN s’est hybridé aux ADN sont repérables par une graduation de couleurs qui atteint le blanc dans les cas d’hybridation maximale. L’emplacement des différents gènes sur la biopuce étant connu, l’analyse de la puce révélera les gènes qui ont été exprimés.

À côté de leur utilisation pour l’étude de l’expression génétique, les puces peuvent être utilisées pour identifier les microorganismes. Par exemple, on peut utiliser l’ADN génomique fragmenté d’un organisme particulier comme sonde et le différencier de souches très proches par les caractéristiques de leurs profils d’hybridation. Ceci convient pour l’identification rapide des virus ou des bactéries pathogènes d’échantillons cliniques ou pour la détection de souches particulières de ces organismes dans diverses substances, tels les aliments. De telles puces à ADN ont été utilisées dans l’industrie alimentaire pour détecter des pathogènes particuliers, par exemple Escherichia coli O157:H7 (voir section 29.8). Des puces à ADN sont aussi commercialisées pour l’identification des macro-organismes. Une puce commerciale, FoodExpert-ID, contient 88 000 fragments de gènes de toute une variété d’animaux vertébrés et est utilisée dans l’industrie alimentaire pour s’assurer de la pureté des aliments. Cette puce peut, par exemple, confirmer la nature de la viande



Questions

indiquée sur l’étiquette d’un produit, mais elle peut aussi détecter la viande d’autres animaux qui aurait pu être ajoutée en supplément ou en substitution. Le but, à long terme, serait d’attribuer à chaque produit contenant de la viande une « carte d’identité » précisant la liste des espèces animales détectées, de sorte que les consommateurs aient une confiance accrue dans la qualité des aliments qu’ils consomment. Le FoodExpert-ID peut aussi être utilisé pour détecter les produits animaux dans l’alimentation animale, une préoccupation grandissante depuis la médiatisation des maladies à prions telles que la maladie « de la vache folle » (voir sections 9.14 et 29.11).

Les applications en génomique environnementale La technologie des puces à ADN est aussi utile pour identifier et contrôler les activités des communautés microbiennes dans l’environnement, objectif majeur des écologistes microbiens (voir chapitre 19). Ainsi, un domaine totalement nouveau de l’écologie microbienne s’ouvre : la génomique environnementale (voir section 18.6). Du fait de la capacité et de la puissance du séquençage aléatoire global de génomes et des puces d’analyse de l’expression génétique, il est désormais possible de séquencer l’ensemble des génomes des microorganismes présents dans un habitat, tel un échantillon de sol ou d’eau d’un lac, et d’identifier leurs profils d’expression génétique. L’ensemble des génomes, appelé le métagénome, définit le potentiel génétique d’un écosystème. Ensuite, à

509

l’aide de puces à ADN, il est possible d’explorer l’expression génétique de ces communautés microbiennes naturelles. Ces techniques ont donné aux écologistes microbiens l’opportunité de se poser des questions nouvelles et très complexes sur le fonctionnement des écosystèmes microbiens et la mesure des contributions des différents membres de la communauté microbienne à l’ensemble des activités de l’écosytème. La génomique environnementale et des exemples de cette technologie sont présentés dans la section 18.6.

Contrôlez vos acquis Les puces à ADN sont des gènes ou des fragments de gènes fixés à un support solide selon un plan connu. Ces puces peuvent être utilisées pour hybrider des ARNm et analysées pour caractériser des profils d’expression génétique. Les puces sont suffisamment grandes et denses pour que l’on puisse analyser tout le transcriptome d’un organisme. •

Quels sont les résultats fournis par les puces à ADN que l’étude de l’expression génétique par mesure d’activité d’une enzyme particulière, par exemple, ne peut produire ?

•

Quel peut être l’intérêt de connaître l’expression génétique d’un génome entier en réponse à une condition particulière ?

QUESTIONS 1. Précisez la signification du propos lorsque l’on dit que les gènes clonés dans le phage M13 peuvent être détectés « visuellement » (voir section 15.1). 2. Comparez et précisez les différences entre BAC et YAC pour ce qui concerne la taille, les caractéristiques nécessaires à la réplication et la quantité d’ADN pouvant être cloné (voir section 15.1). 3. Précisez comment les méthodes de séquençage aléatoire global peuvent produire la séquence complète d’un génome microbien, sachant que l’on procède au hasard (voir section 15.2). 4. Que signifie « l’annotation » du génome ? Comment est-elle effectuée ? En quoi l’annotation diffère-t-elle de l’assemblage ? Par quoi commence-t-elle (voir section 15.3) ? 5. Les organismes du tableau 15.1 sont classés selon l’ordre croissant de la taille du chromosome. Quelle relation existe-t-il entre la taille du génome et le nombre d’ORF (voir section 15.4) ? 6. Quelles sont les différences de taille et de nombre de gènes entre votre génome et celui de Nanoarchaeum (voir sections 15.4 et 15.6) ? 7. Quelle classe de gènes est la plus fréquente chez les organismes à petits génomes ? et chez les organismes à grands génomes (voir section 15.5) ? 8. Chez les Bacteria et les Archaea, l’acronyme ORF est presque synonyme du mot « gène ». Cependant, si l’on s’exprime

rigoureusement, ce n’est pas vrai chez les eucaryotes. Expliquez pourquoi (voir section 15.6). 9. Quels génomes sont les plus grands, ceux des chloroplastes ou ceux des mitochondries ? Décrivez une caractéristique inhabituelle pour un génome chloroplastique et un génome mitochondrial (voir section 15.7). 10. Le gène codant la sous-unité bêta de l’ARN polymérase d’Escherichia coli est dit orthologue du gène rpoB de Bacillus subtilis. Que cela signifie-t-il au sujet de ces deux gènes ? Quelle protéine peut-on supposer que le gène rpoB de Bacillus subtilis code ? Les gènes des différents facteurs sigma (voir tableau 8.2) d’Escherichia coli sont paralogues. Que cela signifie-t-il au sujet de ces deux gènes (voir section 15.8) ? 11. Expliquez comment il est possible de détecter dans un génome des gènes transférés horizontalement (voir section 15.8). 12. Qu’est-ce qu’une intéine ? Comment les intéines ont-elles été découvertes (voir section 15.9) ? 13. Que montre un gel bidimensionnel utilisé pour l’étude de protéines ? Comment les résultats obtenus avec un tel gel peuvent-ils être reliés aux fonctions des protéines (voir section 15.10) ? 14. Quelles distinctions faites-vous entre les termes génome, génomique, protéome, protéomique et transcriptome (voir section 15.11) ?



510 Chapitre 15


PROBLÈMES 1. Lorsque l’on utilise le séquençage aléatoire global, est-il possible que des « trous » subsistent dans la séquence ? Décrivez comment il est alors possible de « boucher » ces trous pour compléter la séquence. 2. La séquence du génome nucléaire de la levure a été publiée, mais en fait la séquence entière n’a pas été totalement résolue. Par ailleurs, le génome mitochondrial de la levure s’est avéré très difficile à séquencer. Décrivez dans les deux cas les difficultés pratiques rencontrées lors du séquençage.

3. Décrivez comment on pourrait déterminer quelles protéines sont réprimées (voir section 8.5) chez Escherichia coli lorsqu’une culture passe d’un milieu minimal (qui ne contient qu’une seule source de carbone) à un milieu riche contenant un grand nombre d’acides aminés, de bases et de vitamines. Précisez comment il serait possible de définir quels gènes sont exprimés dans chacune des conditions de croissance.



CHAPITRE SEIZE

Diversité du monde des virus I

Les virus de procaryotes

16.1 16.2

Bactériophages à ARN Bactériophages à ADN monocaténaire icosaédriques 16.3 Bactériophages à ADN monocaténaire filamenteux 16.4 Bactériophages à ADN bicaténaire : le phage T7 16.5 Mu : un bactériophage à ADN bicaténaire qui se transpose 16.6 Les virus des Archaea

512 514 516 517 519 521

II

Les virus d’eucaryotes

522

16.7 16.8

Virus végétaux Virus animaux à ARN monocaténaire positif : poliovirus et coronavirus Virus animaux à ARN monocaténaire négatif : la rage, la grippe et autres virus apparentés Virus à ARN bicaténaire : les Reoviridae Cycle réplicatif des virus animaux à ADN bicaténaire Virus à ADN bicaténaire : les Herpesviridae Virus à ADN bicaténaire : les Poxviridae Virus à ADN bicaténaire : les Adenoviridae Virus utilisant une transcriptase inverse : les Retroviridae et les Hepadnaviridae

523

16.9 16.10 16.11

Les virus parasitent tous les types d’organismes, des procaryotes aux hommes. Les virus présentent une très grande diversité de stratégies de réplication. La classification des virus s’appuie sur cette diversité moléculaire.

512

16.12 16.13 16.14 16.15

525 527 531 532 534 535 536 537



512 Chapitre 16

Diversité du monde des virus

GLOSSAIRE Acide nucléique de polarité négative (minus (negative)-strand nucleic acid) Brin d’ADN ou d’ARN de sens opposé (ou antimessager) et complémentaire d’un ARN messager. Acide nucléique de polarité positive (plus (positive)-strand nucleic acid) Brin d’ADN ou d’ARN de même sens qu’un ARN messager. ARN polymérase-ARN dépendante (RNA replicase) Enzyme qui réalise la synthèse d’ARN à partir d’un modèle ARN. Bactériophage (bacteriophage) Voir chapitre 9. Concatémère (concatemer) Longue molécule d’ADN formée de molécules d’ADN ou d’ARN semblables liés l’un à la file de l’autre. Enveloppé (enveloped) Désigne un virus qui contient une membrane lipoprotéique externe ou interne dans sa structure. Forme réplicative (replicative form) Molécule d’ADN ou d’ARN double brin qui sert d’intermédiaire de réplication chez certains virus à ADN ou à ARN. Gènes chevauchants (overlapping genes) Deux gènes ou plus dont tout ou partie de leur cadre de lecture se recouvre.

A

près avoir consacré les chapitres précédents à l’exploration de la diversité du monde cellulaire (les trois domaines du vivant : Bacteria, Archaea et Eucarya), nous nous intéresserons à présent à la virosphère et sa diversité. Ce chapitre complète le chapitre 9 dans lequel ont été introduits les grands principes de virologie. À la différence des organismes cellulaires dont le génome est universellement constitué d’une molécule d’ADN double brin (ADN db), les génomes viraux peuvent au contraire être sous forme d’ARN simple brin (ARN sb), ARN double brin (ARN db), ou encore d’ADN simple ou double brin (ADN sb, ADN db) [voir section 9.1]. Dans ce chapitre, nous verrons que ceci aboutit à des modes de réplication et d’expression des gènes extrêmement diversifiés et nous tenterons d’illustrer cette diversité génomique en décrivant les différentes stratégies de réplication adoptées par chaque groupe de virus. Toutefois, en raison de contraintes différentes imposées par la nature de la cellule hôte au cycle viral, nous serons amenés à distinguer dans notre propos les virus qui infectent la cellule procaryote de ceux parasitant la cellule eucaryote.

16.1 Bactériophages à ARN m n Un certain nombre de bactériophages possèdent un génome à ARN simple brin de polarité positive (ARN sb +). Ce génome possède les propriétés d’un ARN messager et peut être considéré comme l’équivalent des ARNm cellulaires (voir section 9.5). Nous connaissons, par exemple, les bactériophages à ARN qui parasitent les bactéries entériques. Ces derniers présentent la particularité d’infecter exclusivement les bactéries porteuses d’un plasmide conjugatif qui rend la cellule bactérienne douée de propriétés de transfert de gènes particulières (voir sections 10.9 et 10.11). Cette spécificité trouve son explication dans le fait que le cycle du virus passe impérativement par l’attachement de la particule virale sur les pili sexuels (voir figure 16.1) portés à la surface de la membrane externe de la bactérie et dont les déterminants géniques sont portés justement par ce plasmide conjugatif.

LES VIRUS DE PROCARYOTES

De très nombreux virus infectant les bactéries ont été décrits et le nombre de ceux qui parasitent les Archaea ne cesse de croître. Dans le chapitre 9, nous avions mentionné que la majorité des virus bactériens (ou bactériophages) possèdent un génome à ADN double brin (voir section 9.8). Il existe pourtant un certain nombre de bactériophages dont le génome est de nature différente. Nous débuterons notre description de la diversité génomique virale par les plus simples d’entre eux, les bactériophages à ARN.

R. C. Valentine

I

Hepadnavirus Virus à ADN qui utilise obligatoirement un intermédiaire de réplication de type ARN au cours de son cycle. Nucléocapside (nucleocapsid) Structure constituée par l’association du génome viral aux protéines de la capside à l’intérieur de la particule virale. Polyprotéine (polyprotein) Chez le poliovirus, polypeptide de grande taille susceptible de générer plusieurs protéines fonctionnelles après découpage par une protéase spécifique. Réplication par cercle roulant (rolling circle replication) Chez le bactériophage φX174, c’est la réplication de l’ADN génomique qui implique la formation d’une matrice circulaire de réplication correspondant à l’un des deux brins, tandis que l’autre, coupé, s’allonge du côté 3’. Rétrovirus (retrovirus) Voir chapitre 9. Transcription inverse (reverse transcription) Voir chapitre 9. Transposase Enzyme codée par un gène porté par un élément transposable et qui permet la transposition d’un site à un autre dans une molécule d’ADN. Virion Voir chapitre 9. Virus Voir chapitre 9.

FIGURE 16.1 Petits bactériophages à ARN. Particules virales d’un petit bactériophage à ARN attachées sur un pilus sexuel d’Escherichia coli observées en microscopie électronique à transmission.



16.1 Bactériophages à ARN 513

Le phage MS2 Les bactériophages à ARN sont généralement de petits virus d’une taille d’environ 25 nm et dont la particule est constituée d’un assemblage de 180 sous-unités protéiques formant une capside de symétrie icosaédrique (voir section 9.2). Les séquences complètes du génome de plusieurs de ces bactériophages sont aujourd’hui disponibles. Par exemple, celle du bactériophage à ARN MS2, qui infecte Escherichia coli, compte 3 569 nucléotides. La carte génétique de MS2 est représentée sur la figure 16.2a et le cycle de la réplication virale est illustré sur la figure 16.2b. Seules quatre protéines sont encodées par ce petit génome. Ce sont la protéine de maturation (présente dans les virions matures sous forme d’une copie unique), la protéine capside, la protéine de lyse (impliquée dans le processus de lyse aboutissant à la libération des nouveaux virions) et enfin une sousunité protéique constitutive de l’ARN polymérase, cette enzyme qui réalise la réplication du génome viral. La réplicase

Protéine de lyse

Protéine de la capside Protéine de maturation

5′ 1 130

3′

Réplicase

3395 3569

1308 1335 1724 1761

(a) Carte génétique de MS2 Génome viral à ARN sb (+) Synthèse du brin négatif

Réplicase

Brin parental directement codant (ARNm)

virale présente la particularité d’être composite, constituée par l’assemblage de deux polypeptides distincts, l’un d’origine virale, l’autre encodé par le chromosome bactérien. De son côté, la protéine de maturation, douée d’une activité protéasique, intervient dans le processus de maturation des protéines virales pour produire des virions infectieux. Puisque le génome de MS2 est un ARN monocaténaire de polarité positive (voir section 9.7), il peut être reconnu comme messager par les ribosomes et directement traduit dès son entrée dans la cellule hôte. Une fois l’ARN polymérase virale formée, celle-ci va synthétiser une molécule complémentaire de l’ARN génomique (ARN (+) infectieux) appelée ARN antimessager (ou ARN négatif) en utilisant ce dernier comme modèle (voir figure 9.11). Cet ARN de polarité négative sert alors de modèle de transcription pour néosynthétiser de nouveaux brins d’ARN positif, identique à l’ARN parental, et qui seront aussitôt utilisés pour la synthèse de nouvelles protéines virales. L’ARN génomique natif présente une conformation complexe avec de nombreuses structures secondaires (voir ci-dessous). Aussi, des quatre codons AUG d’initiation de la lecture, le plus accessible à la machinerie cellulaire est celui du gène de la capside, dont le produit est, par conséquent, formé très précocement. L’ARN polymérase est également synthétisée rapidement en début de cycle. Au fur et à mesure que les protéines structurales se forment, elles vont progressivement encapsider les ARN viraux, les soustrayant ainsi au champ réactionnel, ce qui aboutit rapidement à l’arrêt de la synthèse de l’ARN polymérase virale. Le gène codant la protéine de maturation, qui est localisé en région 5’ du génome, est traduit plus tardivement, donnant naissance à une quantité limitée de molécules. Ainsi, le produit viral majoritairement formé est la protéine capside dont des quantités importantes sont nécessaires à la réalisation de nouveaux virions.

Les gènes chevauchants et assemblage du bactériophage MS2

ARN sb (–) Synthèse Réplicase du brin positif

Traduction ARN pol

ARN sb (+)

Protéines virales

Assemblage Formation de la capside et maturation des virions

Production de la protéine de lyse Libération des nouveaux virions (b) Cascade d’événements lors du cycle de réplication de MS2 FIGURE 16.2 Le bactériophage MS2. (a) Carte génétique de MS2. Remarquez comment le gène de la protéine de lyse chevauche à la fois le gène codant la capside et celui de la réplicase. (a) Les nombres indiquent les positions respectives du début et de la fin de chaque gène sur l’ARN. (b) Cascade d’événements lors du cycle de réplication.

Une particularité du génome de MS2 réside dans le fait que le gène qui code la quatrième et dernière protéine virale, la protéine de lyse, présente un cadre de lecture qui chevauche ceux des gènes de la capside et de la réplicase (voir figure 16.2a). En réalité, le phénomène de gènes chevauchants est fréquemment observé chez les petits génomes viraux (voir section 16.2), car c’est une stratégie qui permet au virus d’augmenter la quantité d’information génétique portée sur son génome dont la taille est physiquement limitée. En raison de la présence de nombreuses structures secondaires sur l’ARN génomique, le codon d’initiation du gène de lyse n’est pas directement accessible par les ribosomes de l’hôte. Cependant, lorsque les ribosomes achèvent la synthèse de la protéine capside, les structures secondaires tendent à disparaître démasquant ainsi le codon d’initiation de la protéine de lyse qui devient accessible à la traduction. C’est un mécanisme de régulation très efficace qui permet d’éviter toute lyse prématurée de la cellule hôte avant qu’une quantité suffisante de virions ne soit produite. La libération des virions, qui est sous le contrôle de la protéine virale qui déclenche la lyse de la cellule hôte, constitue l’étape ultime du cycle de réplication.



514 Chapitre 16


de spicules (voir figure 9.12). Ces petits virus à ADN, qui ont la particularité de posséder un minuscule génome qui ne porte que quelques gènes, utilisent exclusivement la machinerie réplicative de leur hôte pour se multiplier.

Le génome du phage φX174 Le phage ΦX174 infecte Escherichia coli. Son génome, qui fut le tout premier génome séquencé par Frederick Sanger et ses collaborateurs en 1977, est constitué d’une molécule d’ADN simple brin circulaire de 5 386 nucléotides qui porte un très petit nombre de gènes. C’est aussi le premier élément

Origine de réplication m

ARN

A

H B

•

Gènes chevauchants

16.2 Bactériophages à ADN m n monocaténaire icosaédriques Un certain nombre de bactériophages ont un génome à ADN simple brin de polarité positive. Un brin complémentaire est formé avant toute transcription, ce qui donne naissance à une molécule double brin (voir section 9.7 et figure 9.11). Ensuite, ce génome peut être répliqué mais seuls les brins d’ADN monocaténaire positif seront encapsidés dans les virions néoformés (actuellement, nous ne connaissons pas de bactériophages dont le génome serait constitué d’une molécule d’ADN monocaténaire négatif). Nous prendrons comme exemple deux des phages les mieux connus, le phage ΦX174 ainsi que le phage M13 dont le génome simple brin linéaire présente un intérêt particulier en génie génétique (voir section 15.1). Le phage ΦX174, un des nombreux petits virus connus qui contient un génome à ADN simple brin circulaire, est un petit virus icosaédrique d’environ 25 nm de diamètre dont la capside est constituée par l’assemblage de 60 sous-unités protéiques, le plus petit nombre de protomères nécessaires à la formation de ce type de capside (voir figure 9.12). À chaque pointe de l’icosaèdre, plusieurs protéines forment des sortes

C D

G E J

Expliquez ce qui différencie un génome à ARN de polarité positive et un génome à ARN de polarité négative. Expliquez ce que sont les gènes chevauchants.

K

ARNm

•

Nm

A*

Contrôlez vos acquis Une variété de virus à ARN infecte les bactéries. Leur petit génome, qui code un nombre restreint de protéines, est directement traduit.

AR

La réplication des petits génomes viraux à ARN monocaténaire positif est somme toute relativement simple, s’appuyant d’une part sur le fait, qu’outre sa fonction génétique, l’ARN viral possède également une fonction messagère, et d’autre part sur un mécanisme de régulation traductionnel privilégiant un contrôle différentiel de l’accès aux sites d’initiation des gènes viraux par les ribosomes. Si, à l’image de MS2, on connaît quelques exemples de bactériophages à ARN monocaténaire positif dans le monde bactérien, aucun bactériophage à ARN monocaténaire négatif n’a encore été décrit à ce jour. La situation est différente chez les virus d’eucaryotes, où ce type de génome semble relativement fréquent (voir section 16.9). Cependant, à l’instar de la situation observée chez les virus d’eucaryotes, un petit nombre de bactériophages possèdent un génome ARN bicaténaire segmenté. C’est le cas du bactériophage φ6 qui infecte la bactérie Pseudomonas syringae et qui est le plus connu. Ce virus, qui est un virus enveloppé (il compte une enveloppe lipidique, voir figure 9.12), semble être apparenté à la famille des Reoviridae qui est inféodée aux eucaryotes (voir section 16.10).

F A Synthèse de la forme réplicative A* Arrêt de la synthèse de l’ADN cellulaire B Formation des précurseurs de la capside C Maturation de l’ADN D Assemblage de la capside

E F G H J

Lyse de la cellule hôte Protéine majeure de la capside Protéine majeure de spicule Protéine mineure de spicule Protéine d’empaquetage de l’ADN K Fonction inconnue

(a) Carte génétique de φX174 Transcription des brins (–)

+

ADN sb

+ –

ARNm (+) +

Forme réplicative (ADN db) ADN sb néoformé

(b) Cascade d’événements lors du cycle de réplication de φX174 FIGURE 16.3 Le bactériophage φX174, exemple de phage à ADN simple brin. (a) Carte génétique. Remarquez la présence de gènes chevauchants (A/B, K/B, K/C, K/A, D/E). La protéine A* est produite après réinitiation de la traduction. Les régions intergéniques ne sont pas colorées. (b) Cascade d’événements lors du cycle de réplication de φX174. La réplication par cercle roulant conduit à la formation de nouveaux ADN sb génomiques à partir de la forme réplicative intermédiaire (ADN db) [voir figure 16.4 pour plus de détails].



16.2 Bactériophages à ADN monocaténaire icosaédriques 515

génétique sur lequel a été observée la présence de gènes chevauchants. Cette stratégie de condensation de l’information par chevauchement du cadre de lecture de plusieurs gènes permet un gain de place chez les petits génomes. Le gène B, par exemple, est inclus dans le gène A tandis que le gène K chevauche à la fois les gènes A et C (voir figure 16.3). On remarque également que les gènes D et E se chevauchent complètement. De plus, le codon d’arrêt du gène D recouvre le codon d’initiation du gène J qui suit le gène D (voir figure 16.3a). Un autre phénomène très particulier est également observé avec la formation d’une petite protéine appelée A* : la lecture facultative de codon d’initiation ou leaky scanning. Cette protéine est produite par réinitiation de la traduction à partir d’un codon d’initiation interne et en position suboptimale, qui est contenu dans la séquence de la protéine A. Ceci permet l’expression de deux cadres de lecture co-terminaux en 5’.

Protéine A + –

Extrémité 3’ du brin + + –

Site d’élongation (extrémité 3’ du brin néoformé) 5′

La réplication par cercle roulant Dans la mesure où la totalité des génomes cellulaires à ADN bicaténaire se répliquent selon le modèle universel semiconservatif (voir section 7.5), le mécanisme de réplication utilisé par le génome simple brin du phage ΦX174 présente un grand intérêt. Lors de l’infection, l’ADN génomique viral est séparé de la capside. Une fois à l’intérieur de la cellule, celuici est converti en ADN double brin appelé forme réplicative (voir figure 16.3b), grâce aux enzymes bactériennes impliquées dans la réplication, la primase, l’ADN polymérase et la gyrase (voir section 7.5). Chez la cellule, la réplication sur le brin retardé nécessite la formation de proche en proche de petites amorces ARN (fabriquées par la primase) qui seront ultérieurement remplacées par de l’ADN grâce à l’activité spécifique de l’ADN polymérase I (voir figure 7.16). Chez ΦX174, la situation est à peu près identique si ce n’est que l’ADN est une molécule monocaténaire circulaire et close. La réplication débute par la fixation d’une amorce ARN sur l’un des différents sites d’initiation potentiels. Un brin d’ADN complémentaire est ensuite polymérisé par l’ADN polymérase III puis l’amorce est détruite par l’ADN polymérase I comme dans le processus classique de la réplication cellulaire. Ceci donne naissance à la forme réplicative (RF), cette molécule d’ADN double brin circulaire et close. Cette forme réplicative peut alors diriger la synthèse de nouvelles formes RF par réplication selon le mode théta (voir figure 7.16). Des ARNm sont aussi produits par transcription donnant naissance aux protéines virales. Cependant, la création de nouveaux génomes viraux sous forme simple brin s’effectue selon le mécanisme du cercle roulant à partir de la forme réplicative (voir figure 16.4). Sous l’effet de la protéine virale A qui crée une coupure, l’extrémité 3’ libérée du brin positif est utilisée comme point de départ pour polymériser une nouvelle chaîne nucléotidique linéaire et complémentaire du brin négatif. Lorsque le génome néosynthétisé est complet, la protéine A coupe la molécule d’ADN et ligature ses deux extrémités sous forme d’un ADN circulaire. Comme seul le brin négatif est utilisé comme matrice, il s’agit dans le cas de ce bactériophage d’un processus de réplication asymétrique, ce qui, comme nous le verrons plus tard, le différencie du

Site de coupure (origine de réplication)

Brin déplacé

+ –

Déroulement

+ –

Site d’élongation 5′

Extrémité 3’ du brin néoformé Génome viral néoformé

Déroulement

+ Un tour complet

5′

+ Coupure et ligature par la protéine A

FIGURE 16.4 Réplication de φX174 selon le modèle du cercle roulant. La réplication démarre suite à la coupure par la protéine A du brin de polarité + au niveau de l’origine de réplication. (Les brins d’ADN sont représentés schématiquement en vert.) Une fois la copie achevée, la protéine A coupe le brin d’ADN et ligature les deux extrémités pour donner une molécule circulaire.



516 Chapitre 16


phage lambda, chez qui la réplication par cercle roulant donne naissance au contraire à une molécule génomique bicaténaire (voir figure 9.20).

Transcription et traduction chez φX174 La synthèse des ARNm est réalisée à partir de la forme réplicative, donnant naissance à des ARN polycistroniques (voir section 7.13), qui eux-mêmes seront traduits sous la forme de dix protéines virales différentes. Seule la stratégie de chevauchement de plusieurs gènes, impliquant des phénomènes de frameshift et de leaky scanning, permet de produire autant de protéines virales différentes à partir d’un aussi petit génome (voir figure 16.3a). L’étape finale consiste en l’assemblage des nouveaux virions, puis en leur libération effective suite à la lyse de la cellule hôte. Cette lyse est contrôlée par la protéine virale E qui, en s’intégrant dans la membrane plasmique, crée une structure en forme de tunnel qui relie les membranes interne et externe et inhibe le gradient de proton transmembranaire. Le processus de lyse requiert également la participation des produits des gènes cellulaires ftsZ et ftsA qui sont normalement impliqués dans la division cellulaire.

Contrôlez vos acquis Le génome ADN simple brin du phage φX174 est si petit qu’il nécessite que les cadres de lecture se chevauchent pour que le virus puisse exprimer la totalité de ses gènes. C’est le premier exemple découvert de ce type de stratégie de régulation de la transcription. La réplication de ce virus s’effectue sur le mode du cercle roulant. •

•

Expliquez pourquoi le génome de φX174 qui est sous forme simple brin de polarité positive ne peut pas être directement transcrit sous forme d’ARNm comme dans le cas du phage MS2. Qu’est-ce qui différencie la forme réplicative de la forme génomique de φX174 ?

Le phage M13 M13 est un modèle d’étude. Parce qu’il est monobrin, il est extrêmement utilisé en génie génétique, en particulier comme vecteur de clonage pour la détermination de séquences ou pour la création de mutations ponctuelles dans une séquence clonée (mutagenèse dirigée). Les virions ont une longueur d’environ 860 nm pour un diamètre moyen de 6 nm. M13 a la particularité de ne pas provoquer la lyse de son hôte mais, au contraire, il a établi une relation de type état porteur (carrier state). Malgré sa présence, son hôte, dont la croissance se trouve légèrement ralentie, peut continuer à se développer tout en relarguant des virions. Ce virus ne permet donc pas d’obtenir des plages de lyse classiques comme dans le cas des virus lytiques (voir figure 9.6b), mais simplement des zones de moindre turbidité dans le tapis bactérien. Le processus de réplication de ce phage est quasiment identique à celui décrit chez φX174. Seule la sortie des virions est différente car elle s’effectue par bourgeonnement. Dans ce processus, l’extrémité du génome viral, sur laquelle sont fixées quelques unités de la protéine virale A, est externalisée tout en étant progressivement recouverte par les protéines capsidiales, qui ont la particularité d’être enchâssées dans la membrane plasmique de l’hôte (voir figure 16.5). Il n’y a donc pas d’accumulation de virions dans la cellule hôte.

Paroi

Protéines de la capside

Protéine A

16.3 Bactériophages à ADN m n monocaténaire filamenteux Les phages à ADN filamenteux diffèrent peu du phage icosaédrique φX174, si ce n’est par leur architecture et leur symétrie. Le plus étudié d’entre eux est le phage monobrin M13 qui infecte Escherichia coli. Il fait partie du groupe Ff qui comprend les phages filamenteux à ADN monocaténaire circulaire dont la taille du génome est de 6 408 nucléotides et est proche des phages Fl et Fd. Seules les bactéries mâles peuvent être infectées, car la pénétration du phage implique une interaction de la capside avec les F-pili bactériens (voir section 10.11 et figure 16.1). Même si ces phages ont une morphologie filamenteuse, comme chez ΦX174, leur génome est constitué d’une molécule d’ADN simple brin circulaire.

Extérieur

Membrane cytoplasmique Protéines capsidiales enchâssées dans la membrane interne Protéine C

Génome viral (ADN sb circulaire) Protéines externes déplacées Cytoplasme

FIGURE 16.5 Libération de bactériophages filamenteux sans lyse de la cellule hôte. Illustration de la manière dont est excrété un phage filamenteux comme M13 ou fd. Le génome du bactériophage est encapsidé lors de sa sortie au travers de la paroi de la bactérie. L’extrémité portant la protéine A s’externalise en premier en un point de la membrane cytoplasmique où les protéines capsidiales se sont préalablement accumulées. La partie intracytoplasmique du génome viral est enveloppée par les sousunités de la protéine externe qui sont déplacées dès que l’ADN traverse la membrane cytoplasmique.



16.4 Bactériophages à ADN bicaténaire : le phage T7 517

L’utilisation du phage M13 en biologie moléculaire Plusieurs caractéristiques du phage M13 font qu’il est très utilisé en biologie moléculaire. Le fait que son génome soit simple brin le rend facilement utilisable pour le séquençage par la méthode de Sanger aux di-désoxynucléotides (voir section 7.8). Sous sa forme intermédiaire double brin, il devient un vecteur de clonage parfait. Puisque M13 n’est pas lytique, aussi longtemps que son hôte peut être maintenu en croissance, il continue à produire de l’ADN recombinant en grande quantité. Enfin, comme chez le phage lambda (voir figures 9.17 et 9.18, et section 10.17), le génome de M13 contient une région intergénique qui peut être délétée et remplacée avantageusement par un fragment d’ADN étranger (voir section 15.1).

Contrôlez vos acquis Quelques virus à ADN simple brin comme M13 sont filamenteux. Ils ont la particularité de ne pas être lytiques. Ces propriétés ont été mises à profit pour développer, à partir de ces phages, d’excellents outils utilisables en biologie moléculaire. •

Décrivez la structure du génome de M13 et ses modes de réplication et d’expression.

•

Par quel processus les virions sont-ils libérés ?

16.4 Bactériophages à ADN m n bicaténaire : le phage T7 Les bactériophages à ADN double brin sont parmi les virus les mieux étudiés. Parce qu’ils sont des modèles extrêmement importants en biologie moléculaire ainsi que pour la compréhension des mécanismes de régulation génétique, nous décrirons deux autres de ces virus, le phage T7 dans cette section puis le phage Mu dans la suivante, en plus de ceux dont nous avons déjà parlé (T4 et lambda) dans le chapitre 9 (voir sections 9.9 et 9.10).

Les étapes précoces du cycle de multiplication du phage T7 Les bactériophages T7 et T3, qui ont une symétrie binaire avec une courte queue, sont très proches phylogénétiquement et sont les plus petits des phages T. Ils ont pour hôtes principaux les bactéries entériques comme E. coli ou encore Sighella (voir figure 16.6). Le génome du phage T7 est une molécule d’ADN double brin linéaire de 39 936 bp. T7 utilise plusieurs mécanismes de régulation de la transcription de son ARNm et de sa traduction comme le chevauchement des cadres de lecture, la translecture ou encore la lecture facultative de codons d’initiation, tous semblant concourir à l’optimisation de son information génétique. Il ressort également que l’expression des gènes est hautement régulée. Le long du génome, les gènes sont organisés dans un ordre qui assure un déroulement efficace du cycle de

multiplication virale. Après que la particule virale s’est accrochée à la paroi cellulaire de l’hôte, son ADN génomique pénètre dans la cellule de façon orientée, toujours par son extrémité gauche (voir figure 16.6). Aussitôt, plusieurs gènes présents à cette extrémité sont transcrits par l’ARN polymérase cellulaire à partir de trois promoteurs proches les uns des autres. L’un des produits de ces gènes précoces a pour fonction d’inhiber le système de restriction de l’hôte, ce qui permet à l’ADN génomique du virus d’échapper à la destruction (voir section 7.7). Il est produit de façon extrêmement rapide, puisqu’il apparaît alors que le génome viral n’est encore que partiellement entré dans la cellule. Une autre de ces protéines précocement produites est l’ARN polymérase virale. Parallèlement, deux autres ARNm précoces dirigent la synthèse de protéines qui ont pour rôle d’inhiber l’activité de l’ARN polymérase cellulaire, mettant ainsi fin à la fois à l’expression des gènes viraux précoces mais aussi à l’expression de l’ensemble des gènes cellulaires. L’ARN polymérase virale, qui vient d’être exprimée, prend alors le relais de l’ARN polymérase de l’hôte et se charge de la transcription de l’ensemble des messagers viraux. L’ARN polymérase de T7 est fonctionnellement différente de l’ARN polymérase cellulaire puisqu’elle reconnaît spécifiquement les promoteurs viraux de T7 mais pas ceux présents chez E. coli, ni même ceux d’autres phages comme T4, phage qui, de son côté, utilise l’ARN polymérase cellulaire en association avec des facteurs sigma spécifiques (voir section 9.9). D’autre part, elle s’en distingue aussi par son efficacité puisqu’elle est capable de générer trois longs transcrits viraux par seconde, ce qui est largement supérieur aux capacités de polymérisation de son homologue cellulaire. C’est l’une des raisons pour lesquelles les polymérases T3 et T7 sont largement exploitées dans les études d’expression (voir section 31.4).

La réplication du phage T7 La synthèse de l’ADN de T7 s’effectue à partir d’une molécule linéaire. Elle démarre à un site unique positionné non loin de l’extrémité gauche du génome et est bidirectionnelle lors des premiers cycles, comme le montre la figure 16.7. Au microscope électronique, cela donne une structure en Y typiquement reconnaissable (voir figure 16.7a). La réplication de l’ADN de T7 est un processus complexe qui requiert l’intervention de plusieurs protéines, certaines d’origine virale comme l’ADN polymérase, l’ADN ligase, d’autres cellulaires par exemple l’ADN polymérase I. En cela, il diffère du processus plus simple décrit chez le phage φX174 (voir section 16.2). Pour mener à bien sa réplication, l’ADN de T7 porte une redondance terminale, c’est-à-dire une séquence de 160 bases répétées directes à chaque extrémité. La réplication au niveau des extrémités 5’ terminales de la molécule d’ADN néosynthétisée ne peut être complète qu’après la suppression des amorces ARN (voir figure 16.7a). T7 utilise un mécanisme proche de celui employé par T4 et qui implique la présence de ces séquences répétées directes (voir section 9.9). Les extrémités 3’ opposées des deux molécules d’ADN double brin néoformées au cours du premier cycle de



518 Chapitre 16

Diversité du monde des virus Gène

Fonction

Extrémité gauche Promoteur Inhibe le mécanisme 0,3 précoce de restriction de l’hôte Kinase 0,7 ORF transcrits ARN polymérase T7 1 par l’ARN Inconnu 1,1 polymérase Promoteur Origine de réplication de l’hôte ADN ligase 1,3 Non essentiel 1,7 Inactive l’ARN polymérase de l’hôte 2 Endonucléase 3 Lysozyme 3,5 Hélicase, primase 4

Promoteur

Promoteur

5

ADN polymérase

6

Exonucléase

7 8 9 10

Protéine de structure Protéine de la tête Protéine d’assemblage de la tête Protéine majeure de tête

11 ORF transcrits 12 par l’ARN Promoteur polymérase 13 de T7 14 15

Le bactériophage T7 1. T7 se réplique en 25 min

Protéines impliquées dans la réplication et dans la lyse cellulaire

2. Son génome est constitué d’un ADN linéaire double brin de 39 737 pb 3. T7 code l’ensemble des protéines nécessaires à sa réplication et à sa transcription 4. Temps nécessaire à T7 pour produire 100 copies de son génome : 5 min 5. Rendement de lyse : environ 100 virions / cellule (chez Escherichia coli)

Protéine de queue Protéine de queue Protéine de structure Protéine de tête Protéine de tête

16

Protéine de tête

17

Protéine de queue

18

Protéine de maturation de l’ADN

19

Protéine de maturation de l’ADN

Protéines constitutives du virus et de maturation de l’ADN viral

Promoteur

FIGURE 16.6 Carte génétique du phage T7 (schéma figurant l’ensemble des gènes, leur taille relative et leur fonction). La transcription à partir des gènes précoces est sous la dépendance de l’ARN polymérase de l’hôte. Celle des autres gènes est réalisée par l’ARN polymérase virale. Les gènes sont numérotés.

réplication étant complémentaires, elles peuvent s’apparier et donner naissance à une molécule d’ADN génomique deux fois plus longue que la taille normale (voir figure 16.7b). Les extrémités simple brin peuvent alors être complétées grâce à l’intervention de l’ADN polymérase et de l’ADN ligase virales, ce qui donne naissance à un concatémère regroupant deux ADN génomiques. Quand un certain nombre de copies ont été synthétisées et concaténées, une endonucléase virale clive le concatémère en réalisant des coupures en un site précis, ce qui libère autant de copies de génomes viraux possédant toutes des séquences répétées directes terminales (voir figure 16.7c). Dans la mesure où, chez T7, la coupure du long concatémère s’effectue en un site spécifique, chaque virion néoformé possède bien un génome parfaitement identique, à l’instar de la situation rencontrée chez lambda mais à l’opposé de celle observée chez T4. Au moment de l’encapsidation, l’ADN génomique viral est circulairement permuté (voir section 9.9).

Contrôlez vos acquis L’ADN bicaténaire linéaire génomique du phage T7 pénètre invariablement dans la cellule hôte par la même extrémité. Il utilise sa propre ARN polymérase pour transcrire ses ARNm tardifs. La réplication du phage T7 du génome passe par la formation d’un concatémère, ce qui nécessite la présence de séquences répétées aux extrémités de l’ADN génomique. •

Expliquez ce qu’implique le fait que la pénétration de l’ADN phagique de T7 soit orientée ?

•

Que recouvre l’expression répétitions terminales ?

•

Quelles sont les similitudes et les différences entre les processus de réplication chez les phages T4 et T7.



16.5 Mu : un bactériophage à ADN bicaténaire qui se transpose 519


Séquence répétée terminale

5′

3′

3′

5′

Bras gauche 5′

3′

3′

5′

« œil » de réplication

5′ 3′

3′ Fourche de réplication 5′

5′

5′

3′

3′

3′ 5′

5′

3′

Brins achevés

(a) Action de l’ADN polymérase et de la ligase G A

B

C D E

F

G G′ A′ B′ C′ D′ E′

F′ G′

Appariement des séquences répétées terminales simple brin G A

B

C

D

E

F

G G′ A′ B′ C′ D′ E′ F′ G′

Formation d’un concatémère d’ADN résultant de la jonction des brins parentaux et néoformés réalisée par l’ADN polymérase et la ligase (b) B C D E F G A B C D E F G A B C D E

G′ A′ B′ C′ D′ E′ F′ G′ A′

Endonucléase

ADN polymérase

Site de coupure de l’endonucléase (flèche) générant des extrémités cohésives (c)

G A B C D E F

Le phage Mu compte parmi les phages les plus intéressants. Comme lambda, c’est un phage tempéré (voir section 9.11), mais qui présente la particularité de se répliquer comme un élément transposable (voir section 10.14). Mu, pour mutateur, est le plus connu d’un petit groupe de phages tempérés transposables aussi appelés phages mutateurs en raison des mutations créées lorsqu’ils s’intègrent au hasard dans le génome de la bactérie hôte. Ainsi, une cellule bactérienne infectée par Mu peut présenter un phénotype mutant. C’est la raison pour laquelle Mu est un phage particulièrement exploité en génie génétique pour créer une variété de mutants à partir d’une souche sauvage. Les éléments transposables sont des séquences d’ADN capables de se déplacer d’un endroit à un autre dans le génome de l’hôte. Ces éléments, qui sont retrouvés aussi bien chez les procaryotes que chez les eucaryotes, jouent un rôle considérable dans la plasticité et la variabilité génétique des génomes (voir section 10.14). Le phage Mu se comporte comme un grand élément transposable qui duplique son ADN par un mécanisme de transposition réplicative.

Les propriétés générales du phage Mu Mu est un phage de grande dimension présentant une tête icosaédrique, une queue contractile prolongée par six fibres caudales (voir figure 16.8). Mu possède un génome à ADN double brin linéaire, qui, lors de l’infection d’une cellule hôte, se circularise sous l’action d’une protéine virale. Comme le montre la carte génétique du génome viral (voir figure 16.9a), la majeure partie des gènes codent les protéines constitutives des virions tandis que les gènes localisés dans les régions distales sont impliqués soit dans la réplication soit dans le spectre (ou gamme) d’hôte. Le génome a une taille approximative de 39 kpb, mais seule une séquence de 37,2 kpb est typiquement virale. En effet, le génome de Mu contient toujours des séquences d’ADN de l’hôte à chacune de ses extrémités. L’extrémité gauche, encore appelée extrémité c, porte une courte séquence d’ADN cellulaire dont la taille est comprise entre environ 50 à 150 nucléotides (il s’agit toujours d’un multiple de 11 pb). À l’autre extrémité, la séquence d’ADN provenant de l’hôte

ADN polymérase

5′

5′

16.5 Mu : un bactériophage à ADN m n bicaténaire qui se transpose

A′ B′ C′ D′ E′ F′ G′

Formation d’ADN double brin par l’ADN polymérase

5′ 3′ G G′ A A′ B B′ C C′ D D′ E E′ F F′ G G′ 3′ 5′ ADN génomique mature de T7 (en rouge, les séquences répétées)

FIGURE 16.7 Principales étapes de la réplication du génome à ADN linéaire du phage T7. (a) Réplication bidirectionnelle donnant naissance à un œil de réplication suivi d’une fourche de réplication (les brins parentaux sont vert clair, les brins néoformés vert foncé). (b) Formation d’un concatémère d’ADN phagique. Annotation arbitraire des gènes viraux. (c) Maturation de l’ADN génomique (de gauche à droite) : l’endonucléase virale coupe l’ADN en générant des extrémités protrusives à partir desquelles l’ADN polymérase synthétise les brins manquants pour donner naissance à un génome double brin complet avec présence de séquences répétées terminales. Le phage T4 utilise également la recombinaison pour se répliquer ; comparez les figures 16.7c et 9.13.




F. Grundy et M. Howe

520 Chapitre 16

FIGURE 16.8 Le bactériophage Mu. Particules virales du phage à ADN db Mu (pour « mutateur ») vues en microscopie électronique à transmission.

ADN de l’hôte

Activateur transcriptionnel Région G inversible des gènes tardifs (gamme d’hôtes) Répresseur Lyse Région variable Gènes de structure Intégration, (ADN réplication de l’hôte) lys

c AB

attL

C

S U U′ S′

attR

Transposase

(a)

Site d’intégration A A G CA G C T T C GT C G

Coupure asymétrique générée par la transposase

A A G CA G C

G C C G A C G G C T T C G T C

ADN chromosomique de l’hôte

Mu

A G C A G C G T T G C A A

Intégration du génome viral

G C C G A A G CA G C G G C T T C GT C

(b)

Mu

A G C A G C G T T T C G T C G C A A

Réparation de l’ADN et création de séquences répétées directes

FIGURE 16.9 Cycle de réplication du phage Mu. (a) Carte génétique de Mu. Représentation discontinue du génome. Notez la présence de deux gènes, le premier (c) codant un répresseur (Repc) et le second (C), un activateur de transcription. (b) Détail de l’insertion du génome viral dans le chromosome de l’hôte générant l’apparition d’une séquence dupliquée de 5 pb.

est plus importante puisqu’elle atteint une longueur variant de 1 à 2 kpb. Le mécanisme de transposition par lequel l’ADN phagique s’excise du génome de l’hôte où il est intégré fait que les séquences d’ADN de l’hôte bordant le génome de Mu ne sont jamais exactement identiques. En effet, comme le phage Mu s’intègre pratiquement au hasard dans le génome de son hôte, lorsqu’il s’en extirpe, il emporte avec lui les séquences voisines de part et d’autre du site d’intégration. L’empaquetage de l’ADN génomique étant réalisé selon le mécanisme appelé « tête pleine » (headfull), il semble que l’encapsidation de l’ADN génomique débute toujours par l’extrémité c. Ceci expliquerait pourquoi, si pour une raison ou une autre la taille du génome venait à être modifiée (par insertion ou délétion dans la séquence), c’est la séquence ADN hôte terminale de l’extrémité droite qui varie en longueur (au-delà du site attR). C’est aussi la raison pour laquelle chaque virion est génétiquement unique même si tous les virions sont produits par une même cellule bactérienne.

La région inversible G L’extrémité droite du génome du phage Mu porte une séquence appelée région G inversible qui contient deux jeux de gènes codant des protéines de fibres caudales (S et U, S’ et U’) [voir figure 16.9a]. Selon l’orientation, elle est désignée région G+ ou en sens opposé, région G–. L’orientation de cette séquence détermine le type de fibres qui seront formées. Comme l’adsorption des virions à la surface cellulaire de l’hôte dépend d’un processus d’interactions moléculaires entre fibres caudales et récepteurs cellulaires, l’orientation de la région G détermine la gamme d’hôte du phage. En orientation G+, le phage est apte à infecter la souche K12 d’E. coli. En orientation G–, Mu infectera préférentiellement Citrobacter, Serratia ou encore la souche C d’E. coli. Le promoteur des gènes contenu dans la région inversible G se situe hors de cette même région, près de S ou de S’ selon l’orientation. En orientation G+, il gouverne la transcription des gènes S et U, tandis que dans l’orientation opposée G–, il active la transcription des gènes S’ et U’. Ce phénomène qui rappelle le mécanisme de régulation génique appelée inversion de phase est un événement plutôt rare qui est sous le contrôle d’un autre gène viral, le gène gin, localisé à proximité de la région G. Ce mécanisme semble simplement permettre au virus d’infecter une variété d’hôtes différents.

Le cycle de multiplication du phage Mu Si tous les bactériophages T4 (voir section 9.9), T7 (voir section 16.4), lambda (voir section 9.10) et Mu ont en commun un génome à ADN bicaténaire linéaire, ils utilisent pourtant trois stratégies de réplication différentes leur permettant de répliquer les extrémités de leur ADN (voir section 14.6). Les phages T4 et T7 présentent des séquences terminales répétées et forment des concatémères par recombinaison. Au contraire, le phage lambda circularise son génome après infection de son hôte. Mu utilise une troisième voie, la transposition réplicative. Après que l’ADN du phage Mu a pénétré dans la cellule hôte, il va subir une modification consistant au remplacement d’environ 15 % des résidus adénine en résidus acétylés. Cette



16.6 Les virus des Archaea 521

modification, qui est contrôlée par la protéine virale Mom, protège l’ADN de la destruction par les enzymes de restriction de l’hôte. Contrairement à la situation observée chez lambda, l’intégration du génome du phage Mu a toujours lieu, que le cycle viral soit lytique ou lysogénique. L’intégration est sous la dépendance du gène A qui est une transposase. Au site d’intégration, une courte séquence d’ADN chromosomique de 5 bp est dupliquée. Comme le montre la figure 16.9b, cette duplication est la conséquence d’une coupure en quinconce à l’endroit même où s’insère le génome viral. Les segments simple brin qui résultent de l’intégration sont eux-mêmes convertis en double brin. Ces courtes séquences répétées directes sont la signature typique de l’insertion d’un élément transposable (voir section 10.14). Mu peut réaliser son cycle lytique dès que l’infection est établie, si le répresseur C n’est pas produit, ou bien à la suite d’une induction qui met fin au cycle lysogénique du phage. Quelle que soit la situation, Mu se réplique, non pas comme une molécule d’ADN indépendante, mais en réalisant une succession de transpositions en de multiples sites sur le génome de la cellule hôte. Les premiers éléments transcrits sont les gènes précoces. Mais lorsque la protéine C, qui agit comme régulateur positif de la transcription tardive, est produite, alors la synthèse des protéines constitutives de la tête et de la queue est déclenchée. Finalement, les cellules hôtes finissent par se lyser libérant de nouveaux virions. Pour que Mu maintienne son cycle lysogénique et soit stable sous forme de propage intégré, il faut qu’une quantité suffisante du répresseur de la transcription tardive soit produite.

Contrôlez vos acquis Mu est un phage tempéré qui se comporte comme un élément transposable. Quel que soit le cycle lytique ou lysogénique dans lequel il est engagé, Mu intègre son génome dans celui de son hôte grâce à sa transposase. Même lors de la phase lytique, Mu se réplique par une succession de transpositions. Le génome viral, qui présente à chacune de ses extrémités de courtes séquences d’ADN de l’hôte du génome, est empaqueté selon le mécanisme dit « tête pleine », suite à la coupure d’une unité génomique dans le contatémère. •

Qu’est-ce qu’un élément transposable ?

•

Par quel mécanisme le phage Mu parvient-il à dupliquer les extrémités de son génome linéaire ?

16.6 Les virus des Archaea m n Un certain nombre de virus ont été découverts chez différents groupes d’Archaea comme les méthanogènes (voir section 13.4), les halophiles et les alcalophiles (voir section 13.3) ainsi que chez les hyperthermophiles (voir sections 13.6-13.10). La majorité des virus qui infectent les méthanogènes et les halophiles présentent une morphologie de type « tête queue » typique des bactériophages comme le phage modèle T4 (voir

section 9.9). De plus, à l’image de T4, certains d’entre eux, comme le phage φH qui infecte l’Archaea halophile Halobacterium salinarum ou encore le phage φCh1 présent chez l’Archaea alcalophile Natrialba magadii, possèdent également un génome à ADN bicaténaire linéaire aux extrémités redondantes et qui est circulairement permuté. Il est très vraisemblable que ces phages d’archées utilisent eux aussi le mécanisme d’empaquetage de l’ADN « tête pleine » décrit chez T4 (voir section 9.9 et figure 9.13).

Les virus des Archaea hyperthermophiles Sulfolobus et Pyrococcus Les virus découverts chez les Archaea hyperthermophiles appartenant au phylum des Crenarchaeota (voir chapitre 13) présentent une diversité tout à fait exceptionnelle et des morphologies vraiment inhabituelles. C’est le cas de l’Archaea thermoacidophile sulfo-oxydante Sulfolobus qui héberge une grande variété de virus aux morphologies hors du commun. Si l’on considère les conditions de milieu dans lesquelles Sulfolobus prospère – les sols chauds et acides et les sources chaudes (voir section 13.8) – ces virus doivent être particulièrement résistants pour survivre dans des conditions aussi hostiles. Parmi ceux-ci, le virus SSV, qui infecte plusieurs espèces du genre Sulfolobus, semble relativement commun. Il se caractérise par sa morphologie particulière en forme de fuseau et il est fréquemment observé en amas de quelques particules formant des rosettes (voir figure 16.10a). Ces virus ont une distribution très large dans les environnements chauds puisqu’ils ont été isolés aussi bien de sources chaudes en Islande, au Japon ou encore à Yellowstone aux États-Unis. Les différentes souches de SSV contiennent un génome à ADN bicaténaire circulaire d’environ 15 kpb, ce qui est dix fois plus petit que la taille du génome de T4 (environ 163 kpb). [Rappelons qu’aucun des bactériophages décrits à ce jour dans le domaine des Bacteria ne possède de génome à ADN bicaténaire circulaire.] Un second morphotype viral, à symétrie hélicoïdale et en forme de filaments plus ou moins rigides, est fréquemment observé chez Sulfolobus (voir figure 16.10b). Ces virus, comme SIFV ou TTV, contiennent un génome à ADN bicaténaire linéaire d’environ 35 kpb. Différentes variations morphologiques autour de ces deux principaux morphotypes ont été observées au cours d’expériences d’isolement. Ce sont par exemple des formes filamenteuses très longues rappelant certains bactériophages (voir section 16.3) ou encore des formes en fuseau se prolongeant à chaque extrémité par un appendice (voir figure 16.10). Mais à ce jour, aucun virus à ARN n’a encore été découvert chez Sulfolobus ni chez aucune autre Archaea. Chez les hyperthermophiles appartenant au phylum des Euryarchaeota (voir section 13.6), un virus présentant la forme typique d’un fuseau a également été découvert chez Pyrococcus abyssi. Ce virus, nommé PAV1, ressemble morphologiquement aux SSV mais il est légèrement plus grand et possède une courte queue munie de fibres (voir figure 16.10c). PAV1 contient un génome à ADN bicaténaire circulaire d’environ 18 kpb. Ce virus se maintient chez son hôte à l’état porteur et quelques particules sont relarguées sans lyse cellulaire, probablement selon un processus proche de celui décrit chez le coliphage M13 (voir section 16.3).



(b)

Claire Geslin

(a)

Mark Young


Mark Young

522 Chapitre 16

(c) FIGURE 16.10 Virus d’archées hyperthermophiles. Virus de Crenarchaeota (a, b) et d’Euryarchaeota (c) observés en microscopie électronique à transmission. Deux virus infectant Sulfolobus solfataricus (température optimale de croissance : 80 °C) : (a) le fusellovirus SSV1 (40 × 80 nm) et (b) le lipothrixvirus SIFV, virus filamenteux (50 × 900 – 1500 nm). (c) Le virus fuselliforme PAV1 (80 × 120 nm) découvert chez Pyrococcus abyssi (température optimale de croissance : 96 °C). Il existe également chez certaines Archaea des virus tête-queue ressemblant aux bactériophages à symétrie binaire.

Pyrococcus abyssi est une Archaea hyperthermophile dont l’optimum de température est proche de 100 °C, ce qui implique que les particules virales de PAV1 doivent être extrêmement stables à la chaleur. Bien que PAV1 et les SSV présentent une morphologie très similaire, les séquences génomiques de ces deux types de virus ne présentent aucune similitude, ce qui indique que ces virus n’ont probablement pas la même origine ancestrale.

Le cycle de multiplication et l’évolution chez les virus d’Archaea Comme la plupart de ces virus ont été découverts très récemment, leurs stratégies de réplication ainsi que les processus d’assemblage des virions chez ces virus restent à élucider. Toutefois, si l’on s’en tient à la nature de leur génome, tous

constitués d’ADN bicaténaire, il serait surprenant qu’ils mettent en œuvre des stratégies de réplication tout à fait nouvelles. Cependant, certains aspects moléculaires par exemple le fait de savoir dans quelle mesure ils codent et utilisent leur propre ADN polymérase, ainsi que différentes protéines impliquées dans la réplication plutôt que la polymérase de l’hôte, doivent faire l’objet d’études. Étant donné la taille réduite de leur génome, il est probable que ces virus sont très dépendants de leur hôte et qu’ils utilisent différentes stratégies leur permettant d’économiser ou d’optimiser l’information génétique contenue sur leur génome, comme le chevauchement de gènes. À ce jour, aucun virus fusiforme infectant une espèce des Bacteria n’a encore été décrit. Si l’on ajoute à cela le fait qu’ils partagent très peu de similitude au niveau de leur génome avec les bactériophages, il est probable que ces virus en forme de fuseau et les bactériophages ne dérivent pas d’un ancêtre commun. Ce n’est cependant pas le cas des virus archéens de type tête-queue pour lesquels des études structurales et de génomique comparée ont montré qu’ils ont des ancêtres communs avec ces mêmes bactériophages. Ceci peut être dû à une origine évolutive commune ou bien résulter de transferts latéraux de gènes viraux (voir chapitre 10) du domaine des Bacteria vers le domaine des Archaea (ou vice versa). S’il est clair que les Archaea hébergent des virus, on ne sait pas pour le moment quels effets ces virus ont sur leurs hôtes (excepté bien sûr dans le cas évident d’un virus lytique). Il ne serait pourtant pas surprenant que certains d’entre eux soient capables d’affecter les propriétés génétiques de leur hôte, comme on l’observe dans le domaine des Bacteria (voir chapitre 9). Par conséquent, même si cela n’a pas encore été démontré, on peut s’attendre à trouver aussi bien des virus tempérés (voir section 9.10) que des virus réalisant la transduction chez ces nouveaux virus (voir section 10.8).

Contrôlez vos acquis Un certain nombre de virus infectant les Archaea ont été découverts. Beaucoup ont un génome ADN db qui ne partage pas d’homologie de séquence avec les bactériophages infectant les représentants du domaine des Bacteria. Bien que le morphotype « tête queue » soit représenté, la plupart des virus archéens ont une forme inhabituelle en fuseau. •

Chez quels groupes physiologiques d’Archaea ont été découverts des virus à symétrie binaire ? Ont-ils des liens de parenté avec les bactériophages « têtequeue » ?

•

Comparez les morphologies des virus infectant les méthanogènes et les Archaea halophiles avec celles des virus d’Archaea hyperthermophiles.

II

LES VIRUS D’EUCARYOTES

Les différences structurales et cytologiques entre les cellules procaryote et eucaryote entraînent un certain nombre de contraintes et d’adaptation pour les virus qui infectent ces



16.7 Virus végétaux 523

dernières. C’est ainsi que dans la cellule procaryote, transcription et traduction sont deux processus couplés qui peuvent se dérouler simultanément. En revanche, dans la cellule eucaryote, si la transcription et la réplication se déroulent dans le noyau, la traduction est opérée dans le compartiment cytoplasmique. De plus, les ARNm cellulaires subissent des modifications post-transcriptionnelles comme l’addition d’une coiffe en 5’ et une polyadénylation en 3’ (voir sections 14.7 et 14.8). Nous verrons que ces détails ont une importance non négligeable pour les virus qui se multiplient chez les eucaryotes. Au-delà des propriétés générales de ces virus, déjà présentées dans le chapitre 9, il semble important de les étudier de façon détaillée en raison notamment de leur rôle dans de nombreuses maladies humaines importantes. C’est la raison pour laquelle nous focaliserons notre attention sur les virus animaux dans ce chapitre. Toutefois, tous les virus d’eucaryotes n’infectent pas uniquement les animaux mais également les plantes. C’est pourquoi nous débuterons ce chapitre par l’étude de deux virus végétaux particulièrement bien caractérisés.

16.7 Virus végétaux m n L’une des particularités de la cellule végétale réside dans la présence d’une paroi épaisse et rigide qui délimite chaque cellule. Pourtant, malgré cette barrière apparente, les virus végétaux qui infectent les organismes végétaux pluricellulaires sont capables de se propager de cellule à cellule dans les tissus végétaux. La grande majorité des virus végétaux décrits à ce jour sont des virus à ARN simple brin de polarité positive et l’on estime que ceci pourrait être relié au fait que ces génomes sont généralement très petits, ce qui facilite leur propagation de cellule à cellule dans la plante.

Le virus de la mosaïque du tabac : caractéristiques générales En 1892, le biologiste russe Dmitri Ivanovsky a montré que l’agent responsable de la maladie de la mosaïque du tabac était filtrable. En 1898, le microbiologiste hollandais Martinus Beijerinck (voir section 1.7) démontra que non seulement cet agent était filtrable mais qu’il possédait certaines propriétés caractéristiques des êtres vivants. Cet agent pathogène, le virus de la mosaïque du tabac (VMT), est le tout premier virus découvert. Le VMT est un virus de symétrie hélicoïdale (voir section 9.2) qui est formé par l’assemblage de 2 130 copies de la sous-unité de la protéine capside qui protège un génome constitué d’un ARN monocaténaire positif (voir figure 9.2). La démonstration en 1956 du caractère infectieux de l’ARN purifié du VMT ainsi que la mise en évidence de l’identité entre un ARN viral infectieux et l’ARN de sa descendance représentent des étapes importantes de la connaissance des molécules infectieuses. Il s’agissait du premier cas connu d’un ARN doué de continuité génétique et fonctionnant à ce titre comme un gène alors que dans une cellule ou chez d’autres virus, cette fonction génétique est dévolue normalement à l’ADN. Le VMT reste un agent phytopathogène important puisqu’il provoque de graves maladies

aussi bien chez le tabac que chez la tomate, mais également chez d’autres espèces d’intérêt économique. Comme tous les virus végétaux, le VMT ne peut infecter une plante qu’à la faveur d’une blessure qui permet au virus de pénétrer dans les cellules végétales. Ce n’est qu’une fois à l’intérieur de la cellule que le génome viral est libéré.

Le génome du VMT et son cycle de réplication Le génome du VMT est constitué d’une molécule d’ARN monocaténaire de polarité positive de 6 395 nucléotides (voir la carte génétique figure 16.11). Comme le bactériophage MS2 (voir section 16.1), le génome du VMT ne code que quatre protéines virales. À son extrémité 5’, le génome viral porte une coiffe (voir section 14.8), ainsi qu’une structure en forme d’ARN de transfert côté 3’ (voir figure 16.11), ce qui permet sa reconnaissance par les ribosomes cellulaires et sa traduction. Nous avons vu précédemment que le génome des bactériophages à ARN était aussi directement messager (voir section 9.7). Cependant à la différence de la cellule procaryote, la cellule eucaryote n’est pas capable de traduire un ARNm polycistronique (voir section 14.7). C’est pourquoi, le processus qui permet l’expression des gènes du VMT diffère de celui décrit chez les petits bactériophages de type MS2. Le premier gène viral code l’enzyme MTH qui possède deux activités catalytiques. La première est une activité méthyltransférase qui intervient dans la formation de la coiffe à l’extrémité 5’ de l’ARN génomique, la seconde étant une activité hélicase impliquée dans la réplication. Le gène RNP code la réplicase, une ARN polymérase-ARN dépendante qui est nécessaire pour la formation d’un ARN simple brin antimessager intermédiaire (la forme réplicative) qui servira de matrice pour la synthèse de nouveaux ARN positifs génomiques. La synthèse de cette protéine sous une forme fonctionnelle n’est possible que grâce à un mécanisme particulier de régulation dit de translecture qui se traduit par le fait que certains ribosomes passent le premier signal d’arrêt qui délimite le gène MTH et continue la synthèse

Coiffe MTH 5′

Structure terminale de type ARNt

Codon stop RNP

MP

CP 3′

FIGURE 16.11 Carte génétique du virus de la mosaïque du tabac. Le génome du VMT est constitué d’un ARN sb linéaire portant à son extrémité 5’ une structure en coiffe (guanosine méthylée) et une structure terminale en forme d’ARN de transfert en 3’. Lors de sa réplication, le VMT utilise la stratégie de transcription partielle, couplée à un phénomène de translecture du premier ORF. Le gène MTH code une protéine de 126 K à double activité : méthyltransférase et hélicase. Le gène RNP, dont le produit est obtenu à la suite du processus de translecture, code la réplicase (ARN polymérase ARN dépendante). Le gène MP code la protéine de mouvement et le gène CP, la protéine de la capside. Ces deux dernières protéines sont produites à partir d’ARN subgénomiques. Le VMT possède une large gamme d’hôtes (tomate, poivron, épinard, en plus du tabac).



524 Chapitre 16


du polypeptide jusqu’au second signal d’arrêt. Ce phénomène, qui est régulé par des ARN de transferts cellulaires spéciaux (suppresseurs), est relativement rare ce qui fait que cette protéine de 183 KDa n’est produite qu’en faible quantité. Les deux autres gènes codent respectivement la protéine de mouvement (MP) et la protéine capside (CP). Ils sont exprimés à partir de deux ARNm subgénomiques résultant de la transcription partielle de séquences situées du côté de l’extrémité 3’ de l’ARN génomique. Comme pour tous les virus, la protéine capsidiale est essentielle pour la formation des virions et joue un rôle fondamental à la fois dans le processus d’infection de la plante mais aussi dans l’expression des symptômes. Seules les particules virales encapsidées permettront en conditions naturelles la dissémination du virus de plante à plante. En revanche, à l’intérieur des tissus de la plante, la protéine de mouvement joue un rôle important en guidant le mouvement du virus qui se propage ainsi de cellule en cellule. Les cellules végétales possèdent des plasmodesmes qui traversent la paroi pectocellulosique et forment des petits canaux mettant en connexion les cellules les unes aux autres. Ces canaux sont si étroits que ni les particules virales complètes, ni les ARN viraux natifs ne peuvent les franchir. Le déplacement du virus implique la participation de cette protéine virale. La protéine MP se fixe à l’ARN viral et transfère celui-ci vers les plasmodesmes en interagissant avec les microtubules et les plasmodesmes dont elle augmente la limite d’exclusion. En outre, la protéine de mouvement, en se liant avec l’ARN, interagit avec celui-ci en le déroulant en un filament très fin (environ 2,5 nm). C’est ce complexe nucléoprotéique qui traverse les plasmodesmes et permet l’infection des cellules de proche en proche. Un très grand nombre de virus à ARN positif infectent les plantes, de même qu’il existe également des virus à ARN positif infectant les animaux (voir section 16.8) mais aussi les bactéries (voir section 16.1). Les analyses de génomique comparative révèlent que beaucoup de ces virus ont des liens de parenté, en particulier que les gènes codant leur réplicase sont homologues, même si leurs hôtes respectifs sont très différents. Pourtant, comme l’illustre le VMT, tous ces virus ont des stratégies de réplication légèrement différentes, probablement adaptées en fonction du contexte cellulaire de l’hôte.

la structure du virion, ce virus ne peut pas être défini comme un virus enveloppé. Les génomes des Chlorella virus sont extrêmement grands : tous ont une taille supérieure à 300 kpb (se référer au tableau 9.1 pour une comparaison avec d’autres virus). Dans bien des cas, l’ADN génomique porte de très nombreuses bases modifiées et méthylées. Le génome de PBCV-1 dont la taille est de 330 742 pb code plus de 370 protéines ainsi que 10 ARN de transfert. Les extrémités de l’ADN génomique forment des structures en épingle à cheveux monocaténaire (voir figure 7.8) très semblables à ce qui est rencontré chez les Poxviridae (voir section 16.13).

Le cycle de multiplication des Chlorella virus Le virus PBCV-1 entre dans la cellule de son hôte selon un processus qui n’est pas sans rappeler celui employé par les bactériophages. Les particules virales se fixent à la cellule au niveau de récepteurs spécifiques, puis au moins cinq enzymes virales différentes viennent littéralement digérer la paroi cellulaire au point de contact. L’ADN viral est libéré dans le compartiment cellulaire en laissant la capside à l’extérieur. Comme c’est le cas de la plupart des virus à ADN d’eucaryotes, la réplication virale se déroule dans le noyau de la cellule de même que les ARN y sont également produits. PBCV-1 code plusieurs protéines impliquées dans le processus de réplication dont une ADN polymérase. Cependant, si PBCV-1 encode plusieurs facteurs de transcription, il ne produit pas sa propre ARN polymérase mais détourne à son profit l’activité de celle de son hôte. Les ARNm subissent les processus

Capside

Membrane lipidique

Chlorella est une algue verte unicellulaire très largement répandue dans les écosystèmes d’eau douce. La plupart des espèces rattachées à ce genre vivent librement, mais il existe certaines formes qui établissent une relation endosymbiotique (voir section 14.4) avec des formes animales d’eau douce ou parfois marine comme les paramécies. Nous savons cultiver un grand nombre de ces endosymbiotes phototrophes indépendamment de leur hôte et certains d’entre eux sont porteurs de virus. Parmi ces virus, Paramecium bursaria Chlorella virus 1 (PBCV-1) est certainement le plus étudié. PBCV-1 est un virus de forme icosaédrique relativement grand (voir figure 16.12) qui possède un génome à ADN bicaténaire. La particule virale contient une composante lipidique interne à la capside qui joue un rôle essentiel dans le pouvoir infectieux du virus. Puisque la bicouche lipidique est interne à

Tim Baker et Xiaodong Yan

Les virus végétaux à ADN : Chlorella

FIGURE 16.12 Vue en coupe transversale du virus PBCV-1 de Chlorella. Reconstitution numérique de l’architecture du virus à partir de plusieurs vues en microscopie électronique. La particule virale (environ 170 nm de diamètre) est constituée d’une membrane lipidique interne surmontée de la capside protéique. Ce virus, qui infecte l’algue verte Chlorella (voir section 14.13), appartient au groupe des grands virus à ADN dont les génomes atteignent des tailles supérieures à 0,3 Mb.



16.8 Virus animaux à ARN monocaténaire positif : poliovirus et coronavirus 525

d’apprêtage habituellement observés dans les cellules. Quelques-uns des gènes de PBCV-1 contiennent des introns qui devront être supprimés (voir section 7.1). L’adjonction d’une coiffe en 5’ est réalisée par des enzymes qui sont pour certaines produites par le virus lui-même. Les ARNm précoces sont polyadénylés en 3’mais pas les ARNm tardifs. Enfin, à l’instar de T4, PBCV-1 code plusieurs ARNt spécifiques. Quoique les hôtes des virus de type PBCV-1 soient tous des endosymbiotes eux-mêmes présents dans d’autres organismes cellulaires, ces virus sont cependant très répandus dans la nature. Leurs hôtes naturels doivent donc être très abondants. D’autre part, les Chlorella virus ont des liens de parenté avec d’autres virus d’algues, qui ont pour caractéristique de posséder un gros génome à ADN bicaténaire, linéaire ou parfois circulaire. Ces virus présentent enfin une propriété très intéressante : leur génome code différents systèmes de restriction ou modification (voir sections 7.7 et 7.9). À ce titre, ils constituent donc une nouvelle et unique source d’enzymes de restriction à côté des procaryotes et de quelques rares bactériophages. Ainsi, les Chlorella virus présentent des caractéristiques typiques à la fois d’éléments génétiques de procaryotes mais aussi d’eucaryotes.

Contrôlez vos acquis La majorité des virus de plantes sont des virus à ARN. Le virus de la mosaïque du tabac fut le tout premier virus découvert. Ces virus sont capables de migrer de cellule à cellule au travers des plasmodesmes, petits canaux qui relient les cellules les unes aux autres. Il existe cependant d’autres types viraux, dont les Chlorella virus qui possèdent un très gros génome à ADN bicaténaire. •

La plupart des virus végétaux à ARN codent une protéine de mouvement. Expliquez quel est son rôle dans l’infection.

•

Bien que le génome du VMT soit messager, une partie des protéines encodées ne peuvent être directement synthétisées. Expliquez-en les raisons.

•

Quelles sont les caractéristiques de type procaryotique observées chez les Chlorella virus ?

16.8 Virus animaux à ARN m n monocaténaire positif :

poliovirus et coronavirus

Plusieurs virus animaux à ARN positif sont responsables de maladies chez l’homme et d’autres animaux, comme les poliovirus, ou les rhinovirus, les agents du rhume, ou encore les coronavirus qui sont la cause de syndromes respiratoires comme le SRAS, ainsi que le virus de l’hépatite A. Le tout premier virus animal découvert, le virus de la fièvre aphteuse, l’agent étiologique d’une maladie généralement bénigne mais qui parfois peut évoluer en maladie mortelle chez

les mammifères bi-ongulés, fait également partie de ce groupe de virus. Excepté les coronavirus qui sont plus grands, tous ces virus ont été dénommés les picornavirus en raison de leur très petite taille (environ 30 nm de diamètre) [pico signifiant « petit »] et de leur génome à ARN simple brin. Nous allons illustrer ce groupe de virus en prenant comme modèle le poliovirus et les coronavirus. Bien comprendre la biologie du poliovirus est particulièrement important. En effet, il fut un temps où la poliomyélite était une maladie très courante mais qui, depuis la mise au point d’un vaccin efficace (voir section 22.13), a pratiquement disparu. L’organisation mondiale de la santé (OMS) conduit un programme de vaccination visant à éradiquer totalement cette maladie de la planète, et à ce jour, il n’est plus fait état de la présence du virus que dans quelques rares pays d’Afrique et du sous-continent indien.

Les principales caractéristiques du cycle viral du poliovirus Le poliovirus est un virus icosaédrique dont la capside est formée par l’assemblage de 60 capsomères, chacun étant constitué de quatre protéines virales distinctes (voir figure 16.13a). Le génome viral est une molécule d’ARN monocaténaire linéaire de 7 440 nucléotides (voir tableau 9.1). À l’extrémité 5’, une protéine terminale, la VPg (viral protein genome linked), se lie de manière covalente au génome et, côté 3’, celui-ci se termine par une séquence poly-A. La figure 16.13b présente une vue d’ensemble du cycle de multiplication du poliovirus. Comme nous l’avons dit, l’ARN viral est directement messager et par conséquent il peut être traduit dès son entrée dans la cellule. L’initiation de la traduction, qui nécessite habituellement la présence d’une coiffe chez les ARN cellulaires, est rendue possible grâce à la présence au niveau de la région 5’ de la petite protéine VPg et d’une longue séquence non codante dont la structure secondaire est particulièrement complexe et qui donne naissance à des motifs en feuille de trèfle (IRES : internal ribosomal entry site). La protéine VPg et cette séquence forment le site qui permet la fixation des ribosomes. L’ARN viral, qui est de nature monocistronique puisqu’il ne comporte qu’un seul cadre de lecture ouvert, code une grande polyprotéine qui pourtant donnera naissance aux protéines virales fonctionnelles grâce à un processus de clivage protéolytique en cascade. L’ensemble du cycle viral se déroule dans le cytoplasme cellulaire. Pour initier l’infection, le virus commence par se fixer à la cellule sensible au niveau de récepteurs membranaires spécifiques puis il pénètre à l’intérieur. Une fois entré, le virus est décapsidé libérant son ARN génomique qui est aussitôt pris en charge par les ribosomes de la cellule. L’ARN viral est alors traduit en une seule polyprotéine à partir d’un unique codon de départ. Cette protéine géante (comprenant environ 2 200 acides aminés) subit ensuite des clivages successifs réalisés par des protéases cellulaires ou virales donnant ainsi naissance à une vingtaine de protéines de plus petite taille environ (y compris les polypeptides intermédiaires), dont quatre protéines constitutives de la capside. Les autres protéines virales sont la VPg, la réplicase qui réalise la synthèse des ARN antimessagers mais aussi des ARN positifs et au moins une protéase virale



526 Chapitre 16


protéique résulte de la destruction par le virus de la protéine cellulaire qui a pour fonction de coiffer les ARNm de l’hôte (voir section 14.8). En revanche, les ARN viraux échappent à ce mécanisme grâce à la formation à leur extrémité 5’ de la structure IRES qui est reconnue alternativement par les ribosomes de la cellule hôte.

La réplication du poliovirus

Les coronavirus et le SRAS

Le cycle viral débute rapidement après l’infection et la réplication est assurée par la réplicase qui est produite précocement par le mécanisme précédemment décrit. La réplicase transcrit l’ARN génomique en ARN monocaténaire antimessager, la forme réplicative précoce. Cet ARN antimessager sert alors de matrice à cette même réplicase pour la synthèse de nouveaux ARN positifs. À leur tour, ces brins messagers servent de modèle pour la création de nouveaux brins antimessagers et c’est ainsi que l’on peut dénombrer jusqu’à 1 000 brins d’ARN négatifs dans une cellule infectée. Finalement, c’est pratiquement un million de nouveaux brins d’ARN positifs qui pourront être produits dans la cellule par le biais de cette cascade de transcription. La petite protéine VPg (longue de 22 acides aminés) se lie aussi bien à l’extrémité des brins d’ARN positifs que négatifs et joue le rôle d’amorce pour la transcription. Dès que la multiplication du virus démarre, les synthèses d’ARN et protéique de l’hôte s’arrêtent. L’arrêt de la synthèse

À l’instar du poliovirus, les coronavirus sont des virus à ARN monocaténaire de polarité positive qui se répliquent dans le cytoplasme des cellules infectées. Cependant, ces virus sont plus grands et ils présentent quelques différences dans leur stratégie de réplication. Les coronavirus sont responsables de différentes affections respiratoires chez les animaux, y compris les hommes, et sont impliqués dans au moins 15 % des rhumes et bronchites (voir section 26.8). En 2003, un nouveau coronavirus a été identifié dans l’apparition d’une grave maladie émergente, le SRAS (syndrome respiratoire aigu sévère), qui occasionne une forme de pneumonie qui peut être mortelle chez l’homme (voir section 25.8). Les coronavirus sont constitués de particules enveloppées, plus ou moins sphériques de 60 à 220 nm de diamètre, présentant à leur surface des spicules globuleuses de nature glycoprotéique. C’est ce qui donne l’apparence si particulière à ce type de virus qui, à l’observation microscopique, présente une

Processus de réplication

qui intervient dans la maturation de la polyprotéine virale. Le processus de maturation post-traductionnelle du polypeptide est une stratégie de régulation des synthèses virales souvent employée chez un grand nombre de virus animaux (mais aussi végétaux) et fait partie des processus naturels du métabolisme des cellules animales.

+

5′

A A A A 3′

Synthèse d’ARN (+) infectieux –

3′

Génome du poliovirus

5′

Synthèse d’un ARN anti-messager (RF précoce)

+

5′

Vpg

A A A A 3′

Poly A

Traduction

Arthur J. Olson

Polyprotéine

(a)

Protéines fonctionnelles

Protéines de la capside

Clivage de la polyprotéine par les protéases

Protéases

Réplicase

(b) FIGURE 16.13 Le poliovirus. (a) Reconstitution tridimensionnelle du poliovirus par analyse de diffraction X sur laquelle les différentes protéines constitutives sont représentées en couleur. (b) Cycle de réplication du poliovirus. Le génome viral (ARN sb (+)) est directement traduit sous la forme d’une polyprotéine qui est clivée ultérieurement en protéines fonctionnelles. Parmi celles-ci, les protéines qui participent à l’élaboration de la capside (VP0, VP1 et VP3) ainsi que la réplicase (ARN polymérase ARN dépendante). S’ensuivent les phases de réplication stricto sensu puis d’assemblage des nouveaux virions. Le clivage d’une polyprotéine représente une stratégie de régulation des synthèses virales qui se retrouve chez d’autres virus (voir section 16.15).



16.9 Virus animaux à ARN monocaténaire négatif : la rage, la grippe et autres virus apparentés 527

CDC/PHIL

sorte de couronne (du latin corona) entourant les particules virales (voir figures 16.14 et aussi 25.9). Les génomes des coronavirus sont remarquables par leur taille : ils sont effectivement les plus grands parmi tous les génomes viraux à ARN connus (taille comprise entre 27 et 31 kb, avec une moyenne de 29 700 nucléotides pour les différentes souches de SRAS). Comme le génome des coronavirus possède une coiffe de type guanosine méthylée à l’extrémité 5’ ainsi qu’une séquence poly-A à l’extrémité 3’, il fonctionne comme un ARNm cellulaire en étant directement messager. Toutefois, toutes les protéines virales ne résultent pas directement de la

traduction de ce messager comme cela a été décrit pour le poliovirus. En effet, au début de l’infection, seul le gène codant la réplicase est traduit, donnant naissance à plusieurs unités d’ARN polymérase-ARN dépendante. Ces unités de réplicase vont à leur tour synthétiser de l’ARN simple brin antimessager qui servira à produire des ARN positifs subgénomiques résultant de la transcription partielle de séquences situées du côté de l’extrémité 3’ de l’ARN génomique. Bien que tous, sauf le plus petit des ARNm du coronavirus, soient polycistroniques, seul l’ORF en 5’ de chaque ARNm est traduite sous forme de protéine virale. Les futurs génomes viraux sont également transcrits à partir de l’ARN négatif. L’assemblage des particules virales s’effectue au niveau de l’appareil de Golgi (voir section 14.5) puis les virions néoformés sont libérés à la surface de la cellule. Les coronavirus diffèrent donc des poliovirus par la taille de leurs particules, la taille de leurs génomes, par la nature de la coiffe qui n’est pas une VPg, ainsi que par la stratégie de régulation et d’expression des gènes qui procède sans formation d’une polyprotéine maturée par clivage protéolytique. Néanmoins, comme le poliovirus, les coronavirus sont des agents infectieux causant de sévères maladies voire une affection aiguë mortelle, ce qui est rarement observé dans le cas de la poliomyélite. Le taux de mortalité dû au SRAS varie de 13 % à presque 45 % selon que le patient est âgé de moins ou de plus de 60 ans (voir section 25.8).


(a)

Infection et libération du génome viral 5′

3′

(+)

AAAA

Production de molécules de réplicase Réplicase

Gène de la réplicase

Coiffe

Synthèse d’ARN (–) 3′

5′

(–)

Synthèse d’ARNm monocistroniques 5′ 5′

Production des protéines virales

5′

Chez les petits virus à ARN comme le poliovirus, l’ARN génomique est traduit directement sous la forme d’une polyprotéine qui est maturée par clivage enzymatique donnant ainsi naissance à une multitude de petites protéines virales fonctionnelles impliquées dans la réplication et la formation de nouveaux virions. Les coronavirus sont de grands virus à ARN qui partagent quelques caractéristiques communes avec le poliovirus notamment dans certains aspects de la réplication. •

Comment l’ARN viral du poliovirus peut-il être synthétisé dans le compartiment cytoplasmique alors que l’ARN de l’hôte est nécessairement produit dans le noyau de la cellule ?

•

Quels sont les points communs et les différences entre le processus de réplication du poliovirus et celui des coronavirus ?

Synthèse de nouvelles copies d’ARN (+) génomique 3′

(+)

AAAA

(+)

AAAA

(+)

AAAA

3′ 3′

Assemblage des virions (b) FIGURE 16.14 Les coronavirus. (a) Coronavirus observés en microscopie électronique à transmission. (b) Principales étapes du cycle de réplication. Les ARNm qui donneront naissance aux protéines virales sont synthétisés par la réplicase virale à partir d’ARN (–), eux-mêmes transcrits à partir de l’ARN (+) génomique.

16.9 Virus animaux à ARN m n monocaténaire négatif : la rage, la grippe et autres virus apparentés

Le mécanisme réplicatif des virus comme le poliovirus ou les coronavirus nécessite une conversion de l’ARN génomique de polarité positive en ARN de polarité négative, intermédiaire réplicatif servant de matrice pour la production des nouveaux



528 Chapitre 16


génomes viraux de polarité positive. Pourtant, un certain nombre de virus animaux possèdent un génome constitué d’ARN monocaténaire de polarité négative. Nous illustrerons ce groupe de virus par la description de deux exemples, les Rhabdoviridae, dont fait partie le virus de la rage, et les Orthomyxoviridae, comme le virus influenza. Le virus Ebola, agent causal chez l’homme d’une maladie émergente (voir section 25.10), est également un virus à ARN simple brin négatif. Il n’existe pas de virus de ce type décrits chez les bactériophages ou chez les virus archéens.

Les Rhabdoviridae : caractéristiques générales L’un des agents pathogènes les plus redoutables parmi les virus à ARN monocaténaire négatif est sans doute le virus de la rage qui infecte les animaux et l’homme. Chaque année, on ne dénombre pas moins de 30 000 cas de rage humaine (la plupart mortels) à travers le monde auxquels il faut ajouter un nombre incalculable de cas chez les animaux domestiques et sauvages (voir section 27.1). L’étymologie du mot rhabdovirus vient de rhabdo qui signifie « bâton », en référence à la forme des particules virales. Un autre membre de la famille des Rhabdoviridae particulièrement bien étudié est le virus de la stomatite vésiculaire (VSV) [voir figure 16.15], agent causal de la stomatite vésiculeuse chez les bovins, les porcs, les chevaux et parfois même chez les hommes. Les rhabdovirus phytopathogènes, comme le virus de la jaunisse nanisante de la pomme de terre (potato yellow dwarf virus), ont la particularité de se multiplier à la fois dans les plantes mais aussi dans leurs vecteurs naturels que sont les insectes et ils sont responsables d’importants problèmes agronomiques. Les rhabdovirus sont des virus enveloppés constitués d’une nucléocapside recouverte par une enveloppe lipidoprotéique relativement complexe. La particule virale des rhabdovirus se présente sous la forme d’un bâtonnet, d’environ 70 nm de diamètre et 175 nm de longueur, avec une extrémité plate et

l’autre arrondie lui conférant un aspect de « balle de revolver » caractéristique (voir figure 16.15). La nucléocapside a une symétrie hélicoïdale et ne représente qu’une infime fraction du poids de la particule, l’ARN ne constituant à lui seul pas plus de 2 à 3 % du virion.

Le cycle de multiplication des Rhabdoviridae La particule virale contient plusieurs protéines qui jouent un rôle essentiel dans le déroulement global du cycle viral. L’une d’entre elles est la réplicase (ARN polymérase ARN-dépendante), absolument nécessaire comme chez tous les virus à ARN négatif (voir section 9.7), et qui agit en tant que transcriptase et réplicase. L’ARN génomique non segmenté est constitué de gènes séparés par des séquences intergéniques qui contiennent un signal de polyadénylation, de terminaison et d’initiation pour la transcription du gène suivant. L’ARN génomique est transcrit au niveau du cytoplasme sous deux formes d’ARN (voir figure 16.16). Dans un premier temps, la transcription des gènes est réalisée par l’ARN polymérase associée au virion ce qui donne naissance à la première classe d’ARNm. La quantité de messagers varie selon la localisation des gènes (diminution de 3’ en 5’). Chaque gène est exprimé sous la forme d’ARNm monocistroniques. Ces ARNm sont traduits en protéines de structure et en ARN polymérase (par exemple, le VSV possède 5 gènes constitutifs). La seconde classe d’ARN, produite secondairement, est constituée d’ARNm complémentaires du génome viral dans son intégralité (le génome de VSV a une longueur de 11 162 nucléotides). Ces ARN antigénomes servent de matrice pour la synthèse de nouveaux ARN génomiques de polarité négative lors de la phase réplicative. Les ARNm codant l’ARN polymérase virale produits lors de la phase de transcription primaire donnent naissance à de nombreuses molécules d’ARN polymérase qui, à leur tour, vont amplifier la synthèse des ARNm, d’abord sous forme monocistronique puis, lorsque le taux d’une protéine virale, la protéine N, atteint un certain seuil, sous la forme antigénomique (voir figure 16.16).

Erskine Caldwell

L’assemblage des particules virales chez les Rhabdoviridae

FIGURE 16.15 Image d’un rhabdovirus vu en microscopie électronique à transmission (le virus de la stomatite vésiculaire). Une particule virale mesure environ 65 nm de largeur. Le virus de la rage est aussi un rhabdovirus (voir section 27.1).

La traduction des messagers donne naissance à l’ensemble des protéines constitutives du virion. L’assemblage des constituants des virus enveloppés est beaucoup plus complexe que celui d’un virus nu. Chez ce type de virus, deux classes de protéines de structures sont produites : celles participant à la formation de la nucléocapside et celles qui formeront l’enveloppe externe. La nucléocapside est constituée de l’association étroite entre les protéines capsidiales et l’ARN génomique. Les protéines d’enveloppe possèdent une séquence leader composée d’acides aminés hydrophobes en position terminale (voir section 7.16). Après synthèse, ces protéines sont glycosylées pour donner des glycoprotéines. Grâce à leur séquence leader, elles sont adressées en différents points de la membrane cytoplasmique où cette même séquence leader est alors clivée. Au niveau de leur insertion dans la membrane, ces glycoprotéines virales remplacent les protéines membranaires de



16.9 Virus animaux à ARN monocaténaire négatif : la rage, la grippe et autres virus apparentés 529

Transcriptase ARN sb (–) génomique

ARNm (+) Traduction (réalisée par la machinerie cellulaire) ARN pol

ARN sb (+)

Protéines

Enveloppe ARN sb (–) génomiques –

–

–

Virions néosynthétisés FIGURE 16.16 Cycle de réplication d’un virus à ARN antimessager. Notez l’importance de la présence de l’ARN polymérase virale à l’intérieur du virion. C’est indispensable car l’ARN polymérase-ADN dépendante cellulaire n’est pas capable de transcrire de l’ARN en ARN.

l’hôte. Certaines d’entre elles sont enchâssées dans la membrane tandis que d’autres peuvent tapisser la face interne de la membrane plasmique. Les nucléocapsides migrent vers les endroits où sont localisées les glycoprotéines de surface et interagissent avec ces dernières de façon très spécifique. Les nucléocapsides s’associent avec les glycoprotéines puis sortent de la cellule par bourgeonnement. Ce processus d’assemblage donne naissance à des virions à la structure complexe, où le cœur est représenté par la nucléocapside qui, lors du bourgeonnement, acquiert son enveloppe qui est elle-même constituée d’une bicouche lipidique membranaire d’origine cellulaire, hérissée de spicules glycoprotéiques de nature virale. Le bourgeonnement des virions ne provoque pas de dégâts apparents à la cellule infectée, qui continue d’excréter quantité de virions pendant un laps de temps parfois considérable. L’hôte peut bien sûr être affecté par la présence du virus mais pour des raisons autres que la simple production des particules virales.

Le virus influenza et les autres membres de la famille des Orthomyxoviridae Les Orthomyxoviridae constituent une autre famille de virus à ARN monocaténaire négatif, dont l’un des représentants pathogènes pour l’homme est le virus influenza (virus de la grippe). Le terme myxo employé dans Orthomyxoviridae fait référence au fait que les virus de cette famille interagissent avec le mucus des cellules épithéliales. Dans le cas du virus de la grippe, il s’agit principalement des cellules des muqueuses

du tractus respiratoire puisque le virus se propage essentiellement par les voies respiratoires (voir section 26.8). Le terme ortho permet de distinguer ce groupe de virus d’une autre famille, les paramyxoviridae, qui sont aussi des virus à ARN simple brin négatif. Les paramyxoviridae, dont certains membres sont d’importants pathogènes humains comme le virus de la rougeole ou le virus des oreillons (voir section 26.7), ressemblent plus aux Rhabdoviridae qu’aux Orthomyxoviridae dans leurs propriétés moléculaires en raison notamment de la nature non segmentée de leur génome. Les orthomyxovirus font l’objet de très nombreuses études depuis pratiquement un siècle, les premiers travaux remontant à la pandémie de grippe humaine en 1918, pandémie qui a provoqué la mort de plusieurs dizaines de millions de personnes dans le monde (voir section 26.8). Les virus composant la famille des Orthomyxoviridae sont enveloppés et leur génome est fragmenté en plusieurs pièces toutes réunies dans une même particule virale. On dit que le génome viral est segmenté. Les virus grippaux de type A contiennent par exemple huit segments génomiques simple brin linéaires dont la taille varie de 890 à 2 341 nucléotides. La nucléocapside des virus influenza possède une symétrie hélicoïdale, d’environ 6-9 nm de diamètre et 60 nm de longueur. Cette nucléocapside est recouverte d’une enveloppe glucido-lipido-protéique provenant de la membrane cytoplasmique de la cellule dans laquelle sont enchâssés plusieurs types de protéines virales (voir figure 16.17a). Les particules enveloppées du virus influenza n’ont pas de forme bien définie. En raison de leur mode de libération par bourgeonnement, elles sont plus ou moins rondes, parfois légèrement allongées ; on dit qu’elles sont pléiomorphes (voir figure 16.17a). À leur surface, des protéines virales sont capables d’interagir avec la surface des cellules hôtes. L’une d’entre elles, l’hémagglutinine, est ainsi nommée en raison de son pouvoir agglutinant au contact d’hématies. Les globules rouges ne sont pas les cellules naturellement infectées par le virus, mais ils possèdent à leur périphérie un type de constituant de surface, l’acide sialique, qui est aussi présent chez les cellules épithéliales de la muqueuse des voies respiratoires. L’emploi d’hématies représente donc un moyen de diagnostic très pratique pour tester l’activité d’agglutination du virus. D’autre part, on a constaté que des anticorps qui seraient dirigés contre les hémagglutinines virales empêchent que le virus n’infecte les cellules. Ainsi, ces anticorps neutralisent le virus, et c’est de cette manière qu’agit le système immunitaire en réponse à l’infection par le virus de la grippe (voir section 22.13 et 26.8). La neuraminidase est le deuxième type de protéine virale transmembranaire présent à la surface des virions (voir figure 26.19). Cette enzyme a pour fonction de décrocher les résidus d’acides sialiques (qui dérivent de l’acide neuraminidique) présents sur les récepteurs à la surface de la membrane cytoplasmique des cellules infectées. Les neuraminidases permettent donc la libération complète des virions dans le milieu extracellulaire en supprimant la relation entre hémagglutinine et glycoprotéines de surface de la cellule : l’enzyme décroche les résidus glucidiques (acide sialique) de ces glycoprotéines et rend peu à peu impossible l’accrochage du virus aux récepteurs rendus inefficaces.




P. W. Choppin et W. Stoeckenius

530 Chapitre 16

(a) Neuraminidase Hémagglutinine Transcriptase Endonucléase (PB1) Enveloppe

Génome à ARN sb (–) segmenté (8 fragments) (b) FIGURE 16.17 Les influenzavirus (virus de la grippe). (a) Virus influenza humain observé en microscopie électronique à transmission. (b) Schéma de la particule virale et de ses principaux constituants dont le génome segmenté. La maladie provoquée par ce virus est décrite dans la section 26.8.

génome. L’ARN génomique est alors transcrit en trois types d’ARN : les ARNm viraux (vmRNA), les ARN viraux génomiques de polarité positive (cRNA) qui eux-mêmes serviront à la synthèse des ARN viraux génomiques de polarité négative (vRNA). La production des ARNm viraux est rendue possible grâce à l’activité de l’endonucléase qui, à partir de l’extrémité 5’d’un ARNm cellulaire qui vient s’hybrider sur l’extrémité 3’ de l’ARN génomique viral après capture, réalise par coupure une amorce à partir de laquelle l’ARN polymérase virale synthétise les ARNm viraux. Après ajout d’une séquence poly-A, les ARNm viraux migrent dans le cytoplasme où ils sont traduits. Ainsi, bien que la réplication du virus influenza se déroule dans le noyau, l’ensemble de ses protéines est synthétisé dans le cytoplasme, à l’instar de tous les virus. Dix protéines virales sont générées à partir des huit segments génomiques. Six des ARNm donnent naissance à une seule protéine tandis que les deux autres encodent deux protéines chacun. Ces dernières ne proviennent pas d’un vrai ARNm polycistronique comme ceux qui existent chez les procaryotes dans la mesure où les ribosomes eucaryotiques ne reconnaissent en tant que codon de départ que le codon AUG le plus proche de l’extrémité 5’ de l’ARNm (voir section 7.16). C’est la raison pour laquelle il ne code qu’une seule protéine par messager. Dans le cas du virus grippal, chacun des deux segments génomiques est transcrit sous la forme d’un ARNm de longueur équivalente. Ils sont ensuite traduits pour ne donner naissance qu’à une protéine. Cependant chacun des deux, par épissage alternatif, permet l’expression d’une seconde protéine. Ainsi, avec les gènes chevauchants (voir section 16.2), ceci est un autre exemple de stratégie permettant aux virus d’optimiser la capacité codante de l’information génétique contenue sur un petit génome. Parmi les protéines encodées par le virus influenza, certaines participent à la réplication tandis que d’autres sont impliquées dans la structure des virions. La stratégie globale de synthèse de l’ARN génomique du virus influenza présente des similitudes avec celle des rhabdovirus, comme la transcription sous forme d’ARN positifs qui servent de matrices pour la synthèse de nouveaux ARN génomiques négatifs. De même, le cycle du virus influenza s’achève par la libération des particules par bourgeonnement selon un processus très similaire.

Le cycle de multiplication du virus de la grippe En plus des enzymes précédemment décrites, le virus code deux autres enzymes qui jouent un rôle fondamental dans la multiplication du virus. Il s’agit de l’ARN polymérase ARNdépendante (ou réplicase), qui a pour fonction de transcrire et de répliquer l’ARN génomique négatif en ARN positif (comme cela a été vu chez les rhabdovirus) et d’une ARN endonucléase qui intervient dans la création d’une amorce empruntée à la coiffe des ARNm cellulaires nécessaire à la transcriptase du virus pour lui permettre de synthétiser les ARNm viraux. Le virus pénètre dans la cellule par endocytose et les segments ribonucléoprotéiques qui sont libérés dans le cytosol migrent vers le noyau, où se déroule finalement la réplication. La décapsidation de l’ARN génomique conduit à l’activation du complexe de l’ARN polymérase virale qui est associée au

Les variations antigéniques : glissement antigénique / saut antigénique La nature segmentée du génome du virus de la grippe a une incidence pratique très importante dans la variabilité antigénique du virus. Les influenzavirus comme les autres virus de la famille subissent au cours du temps des mutations antigéniques majeures appelées sauts antigéniques. Ces mutations sont provoquées par le réassortiment de fragments d’ARN génomiques issus de deux souches virales distinctes qui coinfectent une même cellule. Ceci donne naissance à des populations virales mutantes qui, par rapport aux souches parentales, présentent des modifications dans les séquences des glycoprotéines d’enveloppe, hémagglutinine ou neuraminidase, provoquant un changement de leur spécificité antigénique. Or les protéines de surface sont la cible principale des



16.10 Virus à ARN bicaténaire : les Reoviridae 531

anticorps qui résultent des processus d’immunisation artificielle (voir section 22.13) ou bien naturelle comme lors d’une infection. Cependant, dans le phénomène de saut antigénique, l’immunité qui était active à l’encontre des souches originelles se révèle insuffisante pour neutraliser les nouveaux variants. Le phénomène de saut antigénique conduit à l’apparition de nouvelles épidémies de grippe voire à une forme majeure d’épidémie mondiale ou pandémie (voir section 28.6) dans des populations totalement dépourvues d’immunité à l’encontre de ces nouvelles formes virales. Le phénomène de glissement antigénique (ou dérive antigénique) est différent du saut antigénique. En effet, lors de la dérive antigénique, des mutations mineures apparaissent au niveau de la séquence des glycoprotéines de surface, l’hémagglutinine ou la neuraminidase. Elles modifient de façon subtile et progressive leur spécificité antigénique au point que les anticorps capables de neutraliser le virus circulant précédemment ne reconnaissent plus que partiellement, voire plus du tout, les nouveaux variants qui partagent de moins en moins de communautés antigéniques avec la souche d’origine au cours du temps. Pour que l’immunité soit efficace, de nouveaux anticorps doivent être produits. C’est la raison principale pour laquelle un vaccin ne confère une protection efficace que rarement plus d’une année (voir section 26.8). La dérive antigénique conduit en cours d’année à l’apparition de formes virales légèrement modifiées contre lesquelles, pour être efficace, de nouveaux vaccins sont nécessaires.

virions sont généralement constitués d’une nucléocapside non enveloppée d’environ 60 à 80 nm de diamètre, présentant une double capside protéique de symétrie icosaédrique avec une partie centrale (core) entourée d’une coque externe (voir figure 16.18). Comme l’on peut s’y attendre, les virions contiennent les enzymes d’origine virale nécessaires à la synthèse des ARNm et des nouveaux ARN génomiques.

Le cycle de multiplication des Reoviridae Le génome des réovirus est segmenté en 10 à 12 molécules d’ARN double brin linéaire. La réplication se déroule exclusivement dans le cytoplasme de la cellule hôte. Comme l’ARN simple brin négatif, l’ARN bicaténaire n’est pas directement messager et la première étape du cycle de réplication consiste en la transcription du génome en ARNm positif grâce l’ARN polymérase ARN-dépendante virale qui utilise comme matrice le brin négatif génomique. Les ARNm viraux sont ensuite coiffés et méthylés par les enzymes virales puis traduits en protéines. Généralement, chaque molécule d’ARN génomique encode une seule protéine, bien que dans certains cas, cette protéine soit maturée par clivage post-traductionnel. Pourtant, l’un des


•

Pour quelle raison la réplicase doit-elle être obligatoirement présente dans les virions des virus ARN négatif ?

•

Qu’est-ce qu’un génome segmenté ?

•

Quelle est la différence entre le phénomène de saut antigénique et celui de glissement antigénique ?


Chez les virus à ARN négatif, l’ARN génomique n’est pas directement messager et doit par conséquent être transcrit sous forme d’ARNm positif grâce à une enzyme virale présente dans le virion. Parmi les virus à ARN négatif important en pathologie animale, on trouve le virus de la rage ainsi que le virus de la grippe. (a)

Les Reoviridae représentent une importante famille de virus animaux dont le génome est constitué d’un ARN double brin. Les rotavirus, qui font typiquement partie de cette famille, sont les principaux agents responsables des diarrhées chez les enfants âgés de 6 à 24 mois. On connaît également dans cette famille des virus responsables d’affections respiratoires, d’autres qui ont aussi la capacité d’infecter les plantes, et nous avons eu l’occasion d’évoquer précédemment la parenté du bactériophage φ6 à cette famille (voir section 16.1). Les


16.10 Virus à ARN bicaténaire : m n les Reoviridae

(b) FIGURE 16.18 Virus à ARN bicaténaire : les réovirus. (a) Particules icosaédriques de réovirus (environ 70 nm de diamètre) vues en microscopie électronique à transmission. (b) Reconstitution tridimensionnelle d’une particule virale à partir de coupes en cryomicroscopie.



532 Chapitre 16


ARNm produits code en fait deux protéines, mais la molécule d’ARN n’a pas besoin d’être maturée pour qu’un seul cadre de lecture soit traduit. En réalité, un ribosome « oublie » parfois le premier codon d’initiation de la traduction et avance jusqu’au second codon d’initiation qui sera alors reconnu. Il existe donc des exceptions au principe général qui postule que les ribosomes d’eucaryotes démarrent toujours la traduction d’un messager à partir du premier codon AUG d’initiation. Dans la phase initiale d’infection, le virion reconnaît son récepteur cellulaire auquel il se lie. Une fois fixé, le virus pénètre dans la cellule par endocytose et il est transporté à l’intérieur de lysosomes (voir section 14.5), où normalement il devrait être détruit. Pourtant, dans le lysosome, la couche externe de la capside subit des modifications consistant au retrait de deux protéines de structure et au clivage d’une troisième par les enzymes du lysosome. Ce processus de décapsidation partiel conduit à l’activation de l’ARN polymérase virale qui initie la phase de réplication. Chez les réovirus, la réplication se déroule à l’intérieur du core viral, appelé sous-particule, qui reste intact dans la cellule. Tous les ARNm positifs sont synthétisés dans cette structure à partir des segments d’ARN bicaténaire génomique puis ils sont coiffés (mais pas polyadénylés) avant de migrer dans le cytoplasme où ils seront traduits en protéines. Ces mêmes ARNm servent également à la synthèse d’ARN négatifs qui donnent naissance à de nouveaux ARN bicaténaires génomiques eux-mêmes encapsidés en sous-particules. Lorsqu’une quantité suffisante de protéines structurales est produite, la coque externe du virion est assemblée puis les virions matures sont relargués par lyse de la cellule.

Contrôlez vos acquis Les virus appartenant à la famille des Reoviridae possèdent un génome à ARN bicaténaire segmenté. À l’instar des virus à ARN monocaténaire négatif, les Reoviridae portent leur ARN polymérase à l’intérieur des particules virales.

Comme l’indique le suffixe oma, qui signifie tumeur, plusieurs polyomavirus sont susceptibles d’induire des tumeurs chez les animaux. L’un des premiers virus à ADN à pouvoir transformant fut isolé à partir du singe rhésus et fut appelé virus simien 40 (simian virus 40) ou SV40. Ce virus fut également l’un des tout premiers éléments génétiques à être manipulé par des approches de génie génétique et il a été largement employé comme vecteur de clonage pour introduire des gènes dans les cellules eucaryotes (voir section 31.4). SV40 est un virus non enveloppé à symétrie icosaédrique de 45 nm de diamètre dont la capside est constituée par l’assemblage de 72 sous-unités protéiques. À la différence des virus à ARN étudiés précédemment, la particule virale de SV40 ne renferme pas d’enzymes comme la réplicase. Le génome de ce virus est constitué d’une molécule d’ARN bicaténaire de 5 243 paires de bases. Le génome, qui est circulaire (voir figure 16.19), est présent dans le virion sous une forme surenroulée appelée minichromosome. Il a été entièrement séquencé et sa carte génétique est présentée sur la figure 16.20. La réplication du génome de SV40 se déroule dans le noyau tandis que les protéines virales sont synthétisées dans le cytoplasme des cellules infectées. La réplication de ce type de virus s’effectue en deux étapes, une phase précoce et une phase tardive. Lors de la première phase, la région précoce est transcrite (voir figure 16.20). L’ARN polymérase cellulaire synthétise un transcrit primaire qui sera ensuite maturé par épissage différentiel pour donner deux ARNm, un grand et un petit. En effet, le génome de SV40 contient des introns qui seront excisés du transcrit primaire. Ces ARNm seront ensuite coiffés et polyadénylés dans le cytoplasme pour donner naissance, une fois traduits, à deux protéines nommées petit T et grand T. Cette dernière, également appelée antigène grand T, se comporte comme un facteur transactivateur de la région précoce et, après fixation au niveau de la région non codante qui contient l’origine de réplication, elle participe au déclenchement de la réplication du génome viral. Comme le génome

Expliquez quels sont les points communs et les différences entre le processus de réplication des Reoviridae et celui des influenzavirus.

16.11 Cycle réplicatif des virus animaux m n à ADN bicaténaire On dénombre un grand nombre de virus animaux à ADN double brin parmi lesquels beaucoup sont pathogènes pour l’homme. On peut citer par exemple les polyomavirus et les papillomavirus de la famille des Papovaviridae, ainsi que les familles des Herpesviridae, des Poxviridae ou encore des Adenoviridae. À l’exception des Poxviridae qui se répliquent dans le cytoplasme cellulaire, tous les autres membres de ces familles ont une réplication intranucléaire. Nous allons présenter dans ce paragraphe et les suivants les cycles réplicatifs de chacun de ces groupes.

Alexander Eb et Jerome Vinograd

•

Les polyomavirus : le virus SV40

FIGURE 16.19 Les polyomavirus. Molécule d’ADN génomique circulaire relaxé (longueur approximative : 1,5 µm) d’un virus oncogène observée en microscopie électronique à transmission. Ce type de virus utilise l’ADN polymérase de son hôte pour sa propre réplication.



16.11 Cycle réplicatif des virus animaux à ADN bicaténaire 533

pénétrer mais ne s’y multipliera pas. Il pourra cependant s’intégrer au sein du génome de la cellule non permissive, à la manière d’un prophage (voir section 9.10). De cette intégration peut résulter un phénomène d’altération génétique de la cellule hôte (voir figure 16.21) conduisant à la transformation, c’est-à-dire l’acquisition des caractères de malignité, comme la capacité à se diviser indéfiniment (voir figure 9.24). À l’instar de certains rétrovirus oncogènes (voir sections 9.13 et 16.15), le pouvoir transformant des polyomavirus résulte de l’expression des gènes spécifiques, en l’occurrence les gènes de la région précoce et T (T = tumeur) [voir figure 9.24].

VP1

P3

gio

n tardive

e

Intron VP3

Ré

Int ro n VP V

1 VP 2

oc

Ré gion préc Origine de réplication

Agn té

in

t

Intron t

tig èn

ro

eT

op

e

An

Intron T FIGURE 16.20 Carte génétique du virus SV40. Les gènes VP1, VP2 et VP3 codent les trois protéines qui formeront la capside de SV40. Les flèches indiquent le sens de transcription. Notez comment les gènes codant les protéines VP1, VP2 et VP3 se chevauchent.

de SV40 est trop petit pour encoder sa propre ADN polymérase, ce sont les ADN polymérases cellulaires qui réalisent la réplication du génome viral. Comme les gènes se répartissent le long du génome en deux unités de transcription de sens opposé, la réplication s’effectue de façon bidirectionnelle (voir figure 7.16) à partir d’une seule origine de réplication. Le processus réplicatif du virus se rapproche de celui observé pour les gènes cellulaires (voir sections 7.5 et 7.6). Après réplication, la région tardive est transcrite à partir du brin complémentaire de celui qui a servi à la transcription de la région précoce (voir figure 16.20). La transcription débute au niveau de la région promotrice située à proximité de l’origine de réplication. L’ARNm tardif est maturé par épissage différentiel puis les ARNm secondaires ainsi générés sont coiffés et polyadénylés pour donner naissance aux trois protéines de capside VP1, VP2 et VP3. Nous remarquerons qu’une fois encore les gènes codant ces trois protéines présentent la particularité d’être chevauchants (voir figure 16.20), un phénomène que nous avons déjà rencontré à plusieurs reprises dans ce chapitre (voir sections 16.1, 16.2 et 16.4). Les ARNm codant les trois protéines structurales sont ensuite transportés vers le cytoplasme où ils sont traduits en protéines de capside. Ces dernières sont à leur tour rapatriées dans le noyau où se déroulera alors l’assemblage des virions qui seront ensuite libérés par lyse de la cellule. Certains polyomavirus induisent des cancers. Lorsqu’un polyomavirus infecte une cellule, deux possibilités de cycle viral peuvent se produire selon que l’hôte est permissif ou non. Chez la cellule hôte dite permissive, l’infection conduit à la multiplication du virus et à sa libération par lyse cellulaire. Au contraire, chez une cellule non permissive, le virus pourra

Contrôlez vos acquis La majorité des virus animaux à ADN bicaténaire, comme SV40, se multiplient dans le noyau de la cellule hôte. SV40, dont le génome est petit, recourt à la stratégie de chevauchement de ses gènes pour optimiser sa capacité codante. Certains de ces virus provoquent des tumeurs. •

Pour quelle(s) raison(s) un virus tel que SV40 n’a-til pas besoin de la présence d’enzymes de réplication dans sa particule virale comme c’est le cas chez les influenzavirus par exemple ?

•

Expliquez comment, chez SV40, un transcrit primaire peut donner naissance à plus d’un ARNm.

ADN virus oncogène

Infection

ADN chromosomique de l’hôte

Intégration du génome viral dans l’ADN chromosomique de l’hôte

Intégration

Transcription

Apparition des ARNm transformants Traduction Induction de cellules tumorales par les protéines virales FIGURE 16.21 Principales étapes du processus de transformation provoqué par un polyomavirus comme SV40. Après l’intégration de tout ou partie du génome viral, les gènes impliqués dans le processus de transformation cellulaire sont transcrits puis leurs ARNm transportés vers le cytoplasme où ils s’exprimeront, déclenchant ainsi la transformation des cellules de l’hôte en cellules tumorales (voir figure 9.24).



534 Chapitre 16


La famille des Herpesviridae est composée de virus enveloppés à ADN bicaténaire qui sont responsables de nombreuses maladies animales et humaines comme les boutons de fièvre, l’herpès génital, la varicelle et le zona ou bien encore la mononucléose infectieuse, autant d’affections qui seront présentées dans le chapitre 26. L’une des caractéristiques des Herpesviridae est leur capacité à rester latents dans l’organisme pendant des périodes de temps parfois très longues puis de redevenir actifs à la faveur de conditions de stress. C’est ainsi que l’herpes simplex virus, l’agent étiologique des boutons de fièvre (herpès labial) et de l’herpès génital, tout comme le virus de la varicelle et du zona peuvent entrer en latence dans les neurones des ganglions sensitifs, puis, de façon périodique, se manifester cliniquement lors de résurgences pour provoquer les différentes atteintes cutanées. On trouve également dans cette famille un groupe de virus importants en raison de leur capacité à provoquer des tumeurs. Par exemple, le virus d’Epstein-Barr (EBV) est associé au lymphome de Burkitt, une forme tumorale fréquente chez les enfants en Afrique équatoriale et en Guinée. Le lymphome de Burkitt fut l’une des premières formes de cancer reconnue comme étant associée à une infection virale. L’EBV est également l’agent étiologique d’une autre affection humaine non maligne, la mononucléose infectieuse.

R. W. Horne

16.12 Virus à ADN bicaténaire : m n les Herpesviridae

(a) ADN viral ARNm

Transcription précoce

Transcription tardive Réplication par cercle roulant

ADN génomique néoformé

Les Herpesviridae : caractéristiques générales La particule virale des herpèsvirus présente une structure complexe constituée par l’assemblage de quatre parties distinctes. L’herpes simplex virus type 1 (HSV1) est un virus enveloppé d’environ 150 nm de diamètre (voir figure 16.22a) ; la partie centrale, encore appelée le core (ou le nucléoïde), contient l’ADN viral bicaténaire et linéaire sous la forme d’un tore. Le core est inclus dans une capside icosaédrique constituée de 162 capsomères, eux-mêmes composés de plusieurs protéines virales différentes. La nucléocapside est entourée par le tégument, une structure amorphe de composition variable, caractéristique des Herpesviridae. Le tégument est lui-même recouvert de l’enveloppe composée de membranes cytoplasmiques altérées et à la surface de laquelle sont ancrées les glycoprotéines virales formant de petits spicules. La particule virale contient au moins 30 protéines, dont certaines n’ont pas encore été caractérisées. Le génome de HSV1 est une grande molécule d’ADN bicaténaire linéaire de 152 260 paires de bases (pratiquement 30 fois plus grande que le génome de SV40) qui code au moins 84 polypeptides différents.

Le cycle de multiplication des Herpesviridae L’infection débute à la suite de la fixation sur la cellule du virus au niveau de récepteurs membranaires spécifiques. Consécutivement à la fusion des membranes cellulaires avec l’enveloppe virale, la nucléocapside est libérée dans la cellule. La capside est ensuite transportée à travers le cytoplasme jusqu’au noyau où elle se lie avec le complexe du pore nucléaire puis l’ADN

Protéines Transcription très précoce

(b)

Nouveaux virions

FIGURE 16.22 Les Herpèsvirus. Déroulement du cycle de réplication de l’herpes simplex virus à partir d’une particule virale photographiée (a) (taille approximative : 150 nm). (b) Les herpèsvirus réalisent la réplication de leur ADN dans le noyau de la cellule hôte en utilisant leur propre ADN polymérase.

viral décapsidé est injecté dans le noyau. Dès l’entrée du virion, les protéines associées à la nucléoprotéine inhibent la synthèse protéique de la cellule infectée. Suite à l’infection, trois classes d’ARNm sont produites par le virus : les ARN messagers très précoces transcrits à partir des gènes α et qui codent cinq protéines de régulation, les ARN messagers précoces (gènes β) codant les enzymes impliquées dans la réplication dont l’ADN polymérase virale et enfin les ARN messagers tardifs (gènes γ) qui codent les protéines structurales du virion (voir figure 16.22b). Lors de la phase d’expression très précoce, environ un tiers du génome viral est transcrit par l’ARN polymérase de l’hôte. Les gènes α codent des protéines qui ont des fonctions de contrôle sur la transcription et qui activent l’expression des gènes β et γ. Les protéines codées par les gènes précoces β apparaissent donc uniquement après l’expression des gènes α. C’est environ 40 % du génome viral qui sont exprimés durant cette phase. Parmi les différentes protéines importantes qui sont synthétisées, on trouve en particulier des enzymes impliquées



16.13 Virus à ADN bicaténaire : les Poxviridae 535

Le cytomégalovirus Le cytomégalovirus (CMV) est l’un des herpèsvirus les plus répandu. Le CMV, qui fait partie de la sous-famille des betaherpesvirinae, est présent chez plus de 50 % des sujets adultes en France. La primo-infection est le plus souvent asymptomatique ou bien ne peut seulement avoir des conséquences sur la santé qu’à long terme. Cependant, chez les patients immunodéprimés (ceux qui par exemple ont subi une greffe d’organes, en présence de certains cancers, chez les personnes sous dialyse) ou bien encore chez les personnes atteintes du SIDA et porteuses du VIH, la primo-infection et les résurgences liées au CMV peuvent entraîner des atteintes sévères : pneumopathie, colite et rétinite. Ceci peut parfois entraîner la mort du patient. Chez la personne en bonne santé, le système immunitaire va limiter l’infection en éliminant les cellules répliquant activement le virus ; mais celui-ci va cependant rester dans l’organisme dans un état de latence avec la possibilité d’être réactivé lorsque l’efficacité du système immunitaire sera affaiblie, ce qui se traduira par l’apparition de symptômes plus ou moins graves. Comme dans le cas de l’infection par le virus d’Epstein-Barr, la primo-infection peut revêtir l’aspect d’un syndrome mononucléosique.

Contrôlez vos acquis Les Herpesviridae sont de grands virus enveloppés à ADN bicaténaire linéaire. Le génome viral se circularise et se réplique selon le mode du cercle roulant. Ces virus sont les agents étiologiques de nombreuses pathologies qui présentent la particularité de rester indéfiniment dans l’organisme sous forme latente, avec la possibilité de se répliquer de façon épisodique.

•

Pour quelle raison les Herpesviridae procèdent-ils à la circularisation de leur génome avant la réplication ?

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À quel endroit s’assemble la nucléocapside des Herpesviridae et quelles implications cela a-t-il sur le contenu en protéines de l’enveloppe virale ?

16.13 Virus à ADN bicaténaire : m n les Poxviridae La famille des Poxviridae est composée de virus qui sont parmi les plus grands et les plus complexes au plan structural (voir figure 16.23). Ils sont également remarquables dans la mesure où ces virus à ADN se répliquent dans le cytoplasme cellulaire. Une cellule infectée par ce type de virus montera donc une activité de réplication hors du noyau, chose qui, par ailleurs, n’existe normalement que dans certaines organelles de la cellule eucaryote.

Les Poxviridae : caractéristiques générales Les virus de cette famille (ou poxvirus) ont joué un rôle fondamental aussi bien dans le domaine médical que du point de vue historique. En effet, le virus de la variole est le tout premier virus qui fut étudié en détail et pour lequel un vaccin a été développé (par Edward Jenner en 1798). C’est ainsi que la variole est la première maladie qui fut éradiquée grâce à la mise en œuvre au plan mondial d’un vaccin. Le virus de la vaccine est également membre de cette importante famille tout comme le virus de la myxomatose, agent responsable d’une maladie mortelle chez le lapin, qui fut utilisé intentionnellement dans la lutte contre la prolifération de ce rongeur en Australie (voir section 25.5). Parmi ces virus, certains sont également oncogènes.

D. Dales et F. Fenner

dans le métabolisme des acides nucléiques (thymidine kinase, dUTPase…) et dans la synthèse de l’ADN (ADN polymérase virale, primase, hélicase…) ainsi qu’une protéine de liaison à l’ADN (ICP8). Toutes ces enzymes participent à la réplication du virus. La réplication de l’ADN génomique viral se déroule dans le nucléoplasme. Immédiatement après son entrée dans le noyau, l’ADN viral se circularise (aussi étonnant que cela puisse paraître, comme celui du bactériophage lambda) [voir section 9.11] et se réplique sur le mode du cercle roulant (voir figure 9.20). Mais dans le cas des Herpesviridae, ce sont trois origines de réplication qui sont actives. La réplication donne naissance à de grands concatémères d’ADN viraux qui seront ensuite clivés sous la forme d’unités génomiques prêtes à être empaquetées pendant le processus d’assemblage des virions, un peu à la manière de ce qui a été décrit chez les bactériophages à ADN (voir sections 9.9 et 16.4). Ensuite, la nucléocapside acquiert son enveloppe au niveau de la membrane nucléaire interne par bourgeonnement. Les virions nouvellement enveloppés empruntent alors, à l’intérieur de vésicules de transport, la voie de sécrétion du réticulum endoplasmique et atteignent finalement la membrane plasmique où ils sont libérés par exocytose. Le processus d’assemblage des Herpesviridae diffère donc de celui des virus à ARN enveloppés chez qui l’enveloppe est acquise au niveau de la membrane plasmique et non pas nucléaire.

FIGURE 16.23 Les poxvirus. Le virus de la vaccine observé en microscopie électronique à transmission (coloration négative). La taille de la particule virale mesurée est de 400 nm (0,4 µm) environ. Le virus de la vaccine est à l’origine de la vaccination contre la variole et est utilisé comme vecteur viral de vaccins recombinants (voir section 31.8).



536 Chapitre 16


Les poxvirus sont de grands virus, si grands, qu’il est possible de les observer en microscopie optique. Les recherches concernant les Poxviridae ont en réalité été entreprises sur le virus de la vaccine, qui est très proche du virus de la variole et à partir duquel ont été réalisés les premiers essais d’immunisation croisée contre l’agent responsable de la variole. Le virus de la vaccine possède une structure en forme de quadrilatère aux angles arrondis de 400 × 240 × 200 nm (voir figure 16.23). Quoique non enveloppée, la particule virale présente à sa surface une sorte de membrane constituée d’un maillage de tubules de nature protéine (voir figure 16.23). L’intérieur de la particule contient deux corps latéraux de composition non déterminée qui flanquent de part et d’autre le core central ou nucléocapside en forme d’haltère qui contient l’ADN génomique entouré par une couche de sous-unités protéiques. Le génome viral consiste en une molécule d’ADN bicaténaire linéaire d’environ 185 kpb auquel est associée une ARN polymérase virale. Il contient à peu près 180 gènes. L’ADN génomique des Poxviridae est vraiment particulier dans la mesure où il prend une forme circularisée, les deux extrémités étant liées entre elles par des liaisons phosphodiester. Le génome des Poxviridae présente donc des similitudes importantes avec celui des Chlorella virus (voir section 16.7).

ce qui aura pour effet de l’immuniser lorsque ce dernier sera de nouveau en contact avec l’agent pathogène (voir chapitre 22). Chez l’homme, le virus de la vaccine n’induit qu’une maladie bénigne, cependant il est hautement immunogène. C’est pourquoi il représente un vecteur qui possède les propriétés souhaitées d’innocuité et d’efficacité. Les techniques de la biologie moléculaire (voir chapitres 10 et 31) ont permis de cloner et de faire exprimer dans le virus de la vaccine certaines protéines immunogènes clés de virus pathogènes aussi différents que le virus de la grippe, le virus de la rage, le virus de l’herpès type 1 ainsi que le virus de l’hépatite B et d’utiliser ce virus recombinant comme vaccin vivant conférant une protection à l’égard de ces différents agents infectieux (voir section 31.8). Un système vaccinal équivalent a également été développé à partir d’adénovirus (voir la section suivante) parce que ces virus sont aussi responsables d’affections bénignes chez l’homme.

Contrôlez vos acquis À la différence des autres virus à ADN, les Poxviridae sont les seuls qui se multiplient dans le cytoplasme. Ces virus sont également responsables de plusieurs maladies humaines, mais grâce à une campagne mondiale de vaccination, la variole a été totalement éradiquée.

Le cycle de multiplication des Poxviridae Le virus de la vaccine pénètre dans la cellule par endocytose puis, sous l’effet d’enzymes du lysosome, la nucléocapside est libérée dans le cytoplasme. La nucléocapside subit à son tour une décapsidation qui est provoquée par une protéine virale, la décapsidase, enzyme qui est synthétisée juste après le début de l’infection. Cette protéine est produite à partir d’un ARNm viral lui-même synthétisé par l’ARN polymérase virale qui est contenue dans la particule. Un certain nombre d’autres gènes précoces sont exprimés en même temps que la décapsidase. Les transcrits issus de tous ces gènes sont apprêtés (ajout d’une coiffe et d’une queue) alors qu’ils se trouvent encore dans la nucléocapside. La réplication du génome viral est réalisée grâce à l’ADN polymérase virale néosynthétisée. Une fois l’ADN génomique libéré dans le cytoplasme, apparaissent des corps d’inclusion. La transcription puis l’expression des gènes tardifs en protéines structurales et enzymes ainsi que la réplication et l’assemblage des particules se déroulent dans ces corps d’inclusion. Comme chaque particule infectieuse initie son propre corps d’inclusion, leur nombre varie en fonction de la quantité d’inoculum initial. Chaque nouveau génome viral donnera naissance à un nouveau virion et tous ces virus nouvellement formés s’accumulent dans le cytoplasme, jusqu’au moment où ils seront finalement libérés. Il ne semble pas que cette libération suive un processus particulier, les virions étant plutôt libérés lorsque la cellule meurt par désintégration.

•

En quoi le fait que les Poxviridae réalisent l’intégralité de leur cycle dans le cytoplasme est-il remarquable ?

•

Quelle application biotechnologique mettent en œuvre les Poxviridae ?

16.14 Virus à ADN bicaténaire : m n les Adenoviridae La famille des Adenoviridae constitue un groupe d’importants virus icosaédriques à ADN bicaténaire linéaire. Le préfixe latin adeno signifie « glande », faisant référence au fait que ces virus furent isolés pour la première fois au niveau du tissu lymphoïde des amygdales (tissu adénoïdien) chez l’homme. Les adénovirus sont responsables d’affections bénignes ou latentes au niveau de l’arbre respiratoire. Leur génome est constitué d’une molécule d’ADN bicaténaire linéaire d’environ 36 kpb. Une protéine virale, appelée protéine terminale, est fixée de manière covalente à l’extrémité 5’ des brins. Elle joue un rôle essentiel dans la réplication. À ces extrémités, le génome des adénovirus possède également des séquences inversées répétées dont la taille varie d’une centaine de paires de bases à 1 800 paires de bases selon le virus, et qui jouent aussi un rôle important lors de la réplication.

Poxvirus et vaccins recombinants

Le cycle de multiplication des Adenoviridae : phase précoce

Le virus de la vaccine a été utilisé comme vecteur viral de vaccins recombinants exprimant des protéines génétiquement altérées provenant de virus tiers (voir section 31.8). Un vaccin a pour rôle d’éliciter une réponse immunitaire chez l’animal,

À la différence des poxvirus, la réplication des adénovirus se déroule dans le noyau de la cellule infectée (voir figure 16.24). Une fois transportée vers le noyau, la nucléocapside est relarguée laissant place à l’ADN génomique associé à des protéines



16.15 Virus utilisant une transcriptase inverse : les Retroviridae et les Hepadnaviridae 537

basiques de type histone. La transcription des messagers précoces est réalisée par une ARN polymérase cellulaire donnant naissance à un certain nombre de pré-ARNm. Les transcrits contiennent des introns, ils sont donc maturés par épissage différentiel puis coiffés et polyadénylés avant d’être finalement traduits. Comme chez la plupart des virus, les produits d’expression des gènes précoces sont impliqués dans la réplication et son contrôle, tandis que les gènes tardifs codent les protéines structurales. La réplication de l’ADN viral utilise la protéine terminale comme amorce, et une autre protéine codée par le virus comme ADN polymérase. Lors de l’étape d’initiation de la réplication, un résidu sérine de la protéine terminale se lie de manière covalente à une cytosine (dCMP) de l’ADN.

Le cycle de multiplication des Adenoviridae : réplication de l’ADN La réplication des adénovirus est particulière en ce sens où elle s’effectue de manière asymétrique puisque l’un des brins

5′

Protéine terminale

3′ 5′

+ –

3′

Synthèse d’un premier brin (–) –

5′

+

–

+ – –

Sens de circularisation –

5′ 5′

16.15 Virus utilisant une transcriptase m n inverse : les Retroviridae

5′

Synthèse d’un brin (+) – 5′ + 3′

ADN db linéaire néosynthétisé + –

Les virus animaux à ADN présentent différentes stratégies de réplication. Les virus de la famille des Adenoviridae, qui ont une réplication intranucléaire, se singularisent par un mode réplicatif qui utilise une protéine amorce pour son initiation et qui, de surcroît, ne fait pas appel à la synthèse d’un brin retardé. Décrivez comment les Adenoviridae réalisent la duplication de leur ADN génomique sans faire appel à la synthèse d’un brin retardé.

5′

5′


3′ 5′

Circularisation de l’ADN grâce aux séquences répétées inversées – terminales

5′

est répliqué en totalité avant que l’autre ne le soit (voir figure 16.24). Un cycle de réplication donne naissance à une molécule bicaténaire et à une molécule simple brin (voir figure 16.24). Ensuite, intervient un processus de réplication unique en son genre : le monobrin déplacé se circularise grâce à la séquence répétée inversée présente à ses extrémités. Un brin complémentaire est alors synthétisé démarrant par l’extrémité 5’ (voir figure 16.24). Ce mécanisme de réplication est tout à fait remarquable puisqu’il ne fait pas appel à la création d’un brin retardé (pas de fragments d’Okasaki) comme c’est le cas dans le mécanisme conventionnel de réplication de l’ADN double brin (voir section 7.6). Au contraire, la synthèse de l’ADN est donc continue et unidirectionnelle sur les deux brins.

5′

FIGURE 16.24 Cycle de réplication des adénovirus. Notez la réplication tout à fait particulière de ces virus qui s’effectue de manière continue sur les deux brins puisque l’un des brins est répliqué en totalité avant que l’autre ne le soit (pas de fragments d’Okasaki avec un brin retardé).

•

et les Hepadnaviridae

Nous avons eu l’occasion de décrire dans la section 9.12 les virus de la famille des Retroviridae qui se répliquent par rétrotranscription grâce à une enzyme particulière, la transcriptase inverse. Il existe en réalité deux familles virales distinctes qui utilisent une transcriptase inverse et qui se différencient l’une de l’autre par la nature de leur génome. Les Retroviridae ont un génome à ARN tandis que les Hepadnaviridae ont un génome à ADN. Nous allons illustrer les mécanismes réplicatifs de ces deux familles par des exemples.

Les Retroviridae : caractéristiques générales Comme cela a déjà été évoqué, les virus de cette famille possèdent un génome diploïde constitué de deux copies d’un ARN monocaténaire (voir figure 9.24). La particule virale contient en plus un certain nombre d’enzymes, dont la transcriptase inverse qui nécessite un ARNt spécifique pour initier son travail. Quoique les ARN génomiques soient sous une forme monobrin de polarité positive, coiffés et polyadénylés, ils ne sont pas pour autant directement utilisés comme messagers. En réalité, une des deux copies du génome est convertie en ADN par la transcriptase inverse du virus puis intégrée au génome de l’hôte. Cet ADN de nature bicaténaire et linéaire est synthétisé dans le cytoplasme de la cellule au niveau du nucléoïde viral. Un aperçu des différentes étapes du processus de transcription inverse est présenté sur la figure 16.25.



538 Chapitre 16


+

5′

5′

ARN génomique viral

Séquences répétées directes

R

PB –

3′

R

+

3′

Synthèse d’une courte séquence ADN (100 pb) par rétrotranscription à l’extrémité 5’ terminale

Amorce ARNt

ADN néosynthétisé

+

–

Dégradation du brin d’ARN viral de l’hybride ARN/ADN par l’activité RNase H de la transcriptase inverse

ADN néosynthétisé 5′

+

5′ 3′

+ –

–

3′

–

5′

Translocation et hybridation du fragment d’ADN néosynthétisé à l’extrémité complémentaire 3’

–

3′

Élongation du brin d’ADN (brin –)

ADN néosynthétisé

Amorce 3′

3′

3′

Dégradation de la matrice ARN par l’activité RNase H à l’exception d’un petit fragment (PBS) jouant le rôle d’amorce

5′ +

5′

+

5′

3′

Synthèse d’un court fragment d’ADN complémentaire (+) et dégradation des amorces

+ 5′ –

Seconde translocation (intramoléculaire) avec hybridation des régions PBS des brins (+) et (–) suivie de l’élongation du brin (+) 5′ 3′

3′

+ 5′

–

LTR 5′ 3′

+ –

LTR

3′ 5′

Virus sous forme d’un ADN double brin avec ses deux LTR (U3-R-U5) prêt à être intégré

Intégration de l’ADN db sous forme de provirus dans l’ADN chromosomique de l’hôte FIGURE 16.25 Ensemble des étapes du cycle de réplication d’un rétrovirus conduisant à la formation de l’ADN proviral. Les séquences R présentes à chaque extrémité du génome sont des séquences répétées. PB est une courte séquence qui est utilisée lors de la rétro-transcription et avec laquelle s’hybride l’ARNt cellulaire amorce. On peut voir que le processus de formation du provirus aboutit à la création de deux LTR (long terminal repeats) aux extrémités de l’ADN proviral.



16.15 Virus utilisant une transcriptase inverse : les Retroviridae et les Hepadnaviridae 539

Le rôle de la transcriptase inverse La transcriptase inverse est fondamentalement une ADN polymérase mais elle possède en fait trois activités différentes : 1) l’activité transcriptase inverse proprement dite qui lui permet de synthétiser de l’ADN à partir d’ARN, 2) une activité d’ADN polymérase ADN-dépendante lui permettant de dupliquer de l’ADN, et 3) une activité de type ARNase H, c’est-àdire une activité de type ARNasique vis-à-vis des ARN hybridés à de l’ADN (les hétéroduplex ARN-ADN). Comme toutes les ADN polymérases, la transcriptase inverse nécessite la présence d’une amorce pour initier la synthèse d’ADN. Dans ce cas précis, c’est un ARN de transfert cellulaire spécifique qui servira à réaliser cette amorce (voir figure 16.25). Cet ARNt est apporté par le virion, empaqueté dans la particule virale lors de son assemblage au cours du précédent cycle infectieux. Grâce à cette amorce qui s’hybride au niveau d’une séquence complémentaire appelée PB (pour primer binding site), une centaine de nucléotides environ sont rétrotranscrits en ADN du côté 5’ de l’ARN génomique. Une fois l’extrémité 5’ atteinte, la rétrotranscription s’arrête. La transcription du reste du génome, ce qui représente la plus grande partie tout de même, est réalisée en faisant intervenir un autre processus. Tout d’abord, l’ARN de l’hybride ARN-ADN de l’extrémité 5’ est dégradé par l’activité ARNase H de la transcriptase inverse, ce qui conduit à la formation d’une petite séquence d’ADN simple brin complémentaire de l’autre extrémité de l’ARN génomique. Ceci permet la translocation et l’hybridation du fragment d’ADN nouvellement synthétisé sur l’extrémité complémentaire 3’ du génome viral à partir duquel l’élongation de la chaîne d’ADN (–) peut se poursuivre. Comme cela est résumé sur la figure 16.25, durant l’élongation de la chaîne ADN (–), il y a élimination de la matrice d’ARN par l’ARNase H à l’exception d’une région PB (+) utilisée pour la synthèse du brin d’ADN (+) complémentaire. Ceci aboutit à la formation d’une molécule d’ADN bicaténaire dont les extrémités sont dotées de longues répétitions terminales (LTR pour Long Terminal Repeats). Ces LTR sont impliquées dans le processus d’intégration de la copie ADN du génome viral dans le génome de la cellule hôte et jouent en outre un rôle de promoteur fort de transcription. Le processus d’intégration de l’ADN viral dans le génome de l’hôte présente des analogies avec celui du phage Mu (voir section 16.5). L’intégration peut avoir lieu à n’importe quel endroit dans l’ADN cellulaire et une fois intégré, cet ADN viral, que l’on nomme alors provirus, devient un élément génétique intégré stable (voir figure 16.25).

Expression et maturation des protéines rétrovirales, assemblage des virions Sous forme provirale, le génome du rétrovirus peut être exprimé ou bien rester silencieux. Si les promoteurs localisés dans le LTR droit sont activés, l’ADN proviral est alors transcrit par une ARN polymérase cellulaire en plusieurs ARNm qui sont coiffés et polyadénylés. Ces transcrits peuvent soit servir de nouveaux génomes et être encapsidés, soit également être maturés et traduits en protéines. Le processus de traduction et de maturation est représenté dans la figure 16.26. Tous les rétrovirus possèdent au moins

les trois gènes gag, pol et env organisés dans cet ordre. Le gène gag du côté 5’ fournit une série de petites protéines structurales. Elles sont d’abord synthétisées sous la forme d’une polyprotéine précurseur (gag), elle-même clivée par une protéase codée par gag, pour donner l’ensemble des protéines fonctionnelles. Les protéines de structure participent à la formation de la capside virale tandis que la protéase est empaquetée dans les virions néoformés. Ensuite, le gène pol est traduit à son tour sous la forme d’une grande polyprotéine qui contient aussi le polypeptide précurseur issu du gène gag (gag-pol). Comparativement

Coiffe

*

gag

pol

env AAAAA...

GAG

Protéines capsidiales

Protéase GAG - POL POL RT

IN

(a) Coiffe

env

.............................................

AAAAA...

ENV EP1 EP2

(b) FIGURE 16.26 Expression des messagers viraux et maturation des protéines codées par le génome d’un rétrovirus. (a) L’ARNm complet portant les trois gènes gag, pol et env est représenté en haut du schéma. L’astérisque indique l’emplacement où s’effectue la translecture ou le décalage du cadre de lecture aboutissant à la production de la polyprotéine GAG-POL. Les flèches bleues larges indiquent les produits de traduction tandis que les flèches bleues fines montrent les protéines fonctionnelles dérivant de la maturation des polyprotéines. L’un des produits du gène gag est une protéase. La protéolyse de la polyprotéine POL donne naissance à la transcriptase inverse (RT) et à l’intégrase (IN). (b) L’ARNm subit un épissage qui supprime une bonne partie de la région gag-pol. Cet ARNm raccourci est traduit en la polyprotéine ENV qui est clivée en deux protéines d’enveloppe (EP), EP1 et EP2.



540 Chapitre 16


aux protéines issues de gag qui sont produites en grandes quantités, les produits découlant de pol ne sont exprimés qu’en faible quantité. Ceci est réalisé de façon opportune par certains ribosomes qui font une erreur et « oublient » de lire un codon d’arrêt de traduction. L’expression du gène pol fait donc appel soit à un mécanisme de translecture, soit à un décalage du cadre de lecture au niveau de cette région, événements qui sont relativement rares. Une fois exprimé, le polypeptide précurseur (gag-pol) est d’abord protéolysé en deux portions et débarrassé de la partie gag, puis le polypeptide restant (pol) est clivé à son tour en deux protéines fonctionnelles, la transcriptase inverse et l’intégrase, cette dernière intervenant dans la formation du provirus. Ces deux protéines seront également empaquetées dans les nouveaux virions. Enfin, l’expression du gène env donne naissance à un ARNm précurseur qui sera protéolysé de sorte que les polypeptides correspondant aux régions gag et pol soient retirés. Le polypeptide restant (env) est lui-même protéolysé en deux protéines d’enveloppes différentes (voir figure 16.26).

taille de l’ordre de 3-4 kpb, sont parmi les plus petits génomes que l’on connaisse. Comme les rétrovirus, les hépadnavirus utilisent une transcriptase inverse dans leur cycle de réplication. Mais à la différence des premiers, les hépadnavirus, qui ont un génome à ADN, se répliquent en utilisant comme intermédiaire un ARN antigénomique. Le génome de ces virus présente la particularité d’être partiellement bicaténaire ; l’un des deux brins est incomplet et de surcroît les deux présentent en plus des interruptions de séquences (voir figure 16.27b). Quoi qu’il en soit, les deux

Quoique le processus réplicatif décrit précédemment soit particulièrement complexe, il ne s’agit en réalité que du cas de figure le plus simple chez les rétrovirus. Comparativement, le génome du virus de l’immunodéficience humaine 1 (VIH-1), l’agent responsable du syndrome d’immunodéficience acquise (le SIDA), a un mode de réplication encore plus compliqué et fait intervenir six petits gènes supplémentaires absents chez les autres rétrovirus. L’expression du génome fait non seulement appel à de nombreux processus de maturation polypeptidiques mais aussi à des phénomènes complexes d’épissage différentiel des introns. Toutefois, l’important phénomène de maturation protéique par une cascade de protéolyses successives dont fait l’objet l’ARNm viral est vraiment une caractéristique fondamentale des rétrovirus. C’est la raison pour laquelle, la chimiothérapie antivirale à base d’inhibiteurs de protéase virale a été si largement développée pour combattre les infections dues aux rétrovirus, dont le VIH-1 (voir sections 20.10 et 26.14).

CDC/PHIL

Le VIH, un rétrovirus humain

(a) Transcrits

2,4 kb

– +

Au cours de ce chapitre, nous avons pu voir à quel point les virus présentent des cycles de multiplication qui reposent sur des structures et des organisations génomiques ainsi que sur des stratégies de réplication plus variées les unes que les autres. Mais aucune n’est plus surprenante que celles des Hepadnaviridae, dont fait partie le virus de l’hépatite B (VHB), agent responsable d’une grave maladie transmise par voie sanguine chez l’homme (voir section 26.11). « Hepadnaviridae », qui est la contraction de hepatitis DNA viridae, vient du fait que le virus de l’hépatite B infecte le foie (hepaticus en latin) et que son génome est constitué d’une molécule d’ADN. Les particules virales du VHB sont petites, irrégulières, certaines sphériques, d’autres de forme tubulaire ou filamenteuse (voir figure 16.27a). Bien que le cycle viral des hépadnavirus soit très complexe et unique en son genre, les génomes de ces virus, avec une

Amorce ARN du brin +

5′

Les virus à ADN réalisant de la rétrotranscription : les Hepadnadviridae

2,1 kb Amorce protéique du brin –

5′

3,4 kb 0,7 kb

(b) FIGURE 16.27 Les hépadnavirus. (a) Virus de l’hépatite B vu en microscopie électronique à transmission. (b) Le génome est représenté en vert tandis que les transcrits sont indiqués en orange. Ce virus possède un génome à ADN circulaire partiellement double brin, le brin long (L) correspondant au brin (–), le brin court (S) étant le brin (+). Bien que la molécule d’ADN soit partiellement monocaténaire, l’ensemble des produits des gènes couvre l’intégralité du génome (avec recouvrement des phases de lecture, ce qui augmente les possibilités de codage). L’ARN polymérase II cellulaire transcrit un grand nombre de copies du brin L (–). La réplication du génome viral est assurée par la transcriptase inverse du virus qui rétro-transcrit l’ARNm.



Questions

brins se circularisent et se ferment par hybridation, la fermeture étant assurée au niveau de ses extrémités cohésives par des liaisons hydrogène. Une fois le virus entré dans la cellule, une ADN polymérase virale présente au niveau de la particule vient compléter les discontinuités. Il en résulte un ADN circulaire bicaténaire complet surenroulé. Cette polymérase virale est extrêmement polyvalente puisqu’elle combine à la fois une activité ADN polymérase, une activité transcriptase inverse et enfin elle sert également d’amorce pour la synthèse d’un des deux brins ! En dépit de la petite taille de leur génome, ces virus ont la capacité de coder plusieurs protéines en utilisant encore une fois la stratégie des gènes chevauchants (figure 16.27b) comme beaucoup de petits virus (voir sections 16.1, 16.2 et 16.4). Le cycle viral passe par une étape de transcription du génome qui se déroule dans le noyau et qui fait intervenir notamment l’ARN polymérase II de la cellule hôte. Il en résulte la production de transcrits qui présentent des répétitions terminales (voir figure 16.27b). Ces répétitions sont dues au fait que l’ARN polymérase, qui utilise comme matrice un ADN circulaire, réalise une élongation un peu plus longue que la taille unitaire du génome viral. Certains de ces transcrits serviront à la synthèse, par la transcriptase inverse, d’ADN génomique, de façon tout à fait comparable à ce qui se passe chez les rétrovirus, sauf que dans le cas présent, l’ADN néosynthétisé (comme l’ARN chez les rétrovirus) sera encapsidé pour donner naissance aux nouveaux virions (voir figure 17.27b).

541

Les hépadnavirus sont vraiment les exemples les plus démonstratifs de ce que peut faire un virus à petit génome. Avec ses 3,4 kpb, le virus de l’hépatite B, par exemple, a un génome encore plus petit que celui des bactériophages à ARN monocaténaire ou même à ADN monocaténaire que nous avons présentés en début de chapitre (voir sections 16.1 à 16.3). Cela n’empêche pas ce petit virus d’être responsable d’une affection particulière grave chez l’homme, affection qui sera présentée dans un prochain chapitre (voir section 26.11).

Contrôlez vos acquis Les Retroviridae contiennent un génome à ARN et se servent d’une transcriptase inverse pour synthétiser une copie ADN au cours de leur cycle réplicatif. Les Hepadnaviridae possèdent un génome à ADN et utilisent une transcriptase inverse pour synthétiser de l’ADN génomique à partir d’une copie d’ARN. Ces deux familles de virus ont des stratégies d’expression de leurs gènes qui sont hautement élaborées. •

Pour quelle raison les inhibiteurs protéasiques représentent-ils une voie thérapeutique efficace dans le traitement du SIDA ?

•

Décrivez les différentes activités de la transcriptase inverse lors du cycle viral chez les rétrovirus et chez les hépadnavirus.

QUESTIONS 1. Décrivez les différents types de génomes rencontrés chez les virus. Donnez au moins un exemple de virus ou de famille virale illustrant chaque type (voir l’ensemble du chapitre). 2. Que sont les gènes chevauchants ? Donnez quelques exemples de virus possédant des gènes chevauchants (voir sections 16.1, 16.2, 16.4, 16.11 et 16.15). 3. De nombreux bactériophages ont un génome à ADN monocaténaire. Décrivez les processus de transcription et de traduction des gènes présents sur ce type de génome (voir sections 16.2 et 16.3). 4. Des virus à ARN positif sont retrouvés aussi bien chez les bactéries, les plantes et les animaux. Quelle différence fondamentale existe-t-il entre l’expression des gènes portés par ces virus, en particulier entre les bactériophages et les virus d’eucaryotes (voir sections 16.1 et 16.8) ? 5. L’ADN génomique du phage T7 pénètre invariablement dans la cellule hôte par la même extrémité. C’est une étape nécessaire pour que l’infection ait lieu. Expliquez-en les raisons (voir section 16.4). 6. Pour quelle raison le phage Mu est-il considéré comme mutagène ? Quelles sont les propriétés nécessaires permettant à Mu de s’insérer dans un fragment d’ADN (voir section 16.15) ? 7. Quelles sont les caractéristiques inhabituelles des génomes de virus d’archées, comme PAV1, qui les distinguent des bactériophages à ADN double brin (voir section 16.6) ?

8. Quel type de génome le virus de la mosaïque du tabac possèdet-il ? Quelles différences au niveau de sa structure et de sa taille présente-t-il par rapport au génome des Chlorella virus (voir section 16.7) ? 9. Quel est le rôle de la protéine VPg du poliovirus et comment les coronavirus, qui possèdent aussi un génome à ARN positif, font-ils pour se répliquer sans VPg (voir section 16.8) ? 10. Les Rhabdoviridae ont une structure génomique inhabituelle. Quelle est la nature de ce génome et pour quelle raison le virion doit-il nécessairement contenir une enzyme impliquée dans sa réplication (voir section 16.9) ? 11. Le génome des virus de la famille des Reoviridae est unique en son genre. Expliquez-en les raisons (voir section 16.10). 12. Bien que les virus animaux ne soient pas considérés comme tempérés – comme c’est le cas pour certains bactériophages (voir section 9.10) –, un bon nombre d’entre eux sont pourtant capables d’infections dites latentes. Décrivez deux de ces virus animaux (voir sections 16.11 et 16.15). 13. Bien que les génomes des Herpesviridae et des Adenoviridae soient constitués d’ADN bicaténaire, leurs mécanismes de réplication sont différents. Développez (voir sections 16.12 et 16.14). 14. De tous les virus animaux à ADN bicaténaire, les Poxviridae se distinguent par au moins une caractéristique unique concernant leur cycle de réplication. Quelle est cette caractéristique et



542 Chapitre 16


comment ces virus font-ils pour réaliser leur cycle réplicatif sans la présence d’une enzyme spéciale à l’intérieur des virions (voir section 16.13) ?

15. Pour quelle raison, liée à l’expression de leurs gènes, les rétrovirus en cours de réplication sont-ils sensibles aux inhibiteurs de protéase (voir section 16.15) ?

PROBLÈMES 1. Toutes les protéines virales du phage MS2 ne sont pas produites en quantité équivalente. Pouvez-vous expliquer quelles en sont les raisons ? L’une de ces protéines joue le rôle de répresseur (voir section 8.5) traductionnel. Quelle est-elle et comment fonctionne ce mécanisme ? 2. Donnez une raison purement mécanique permettant d’expliquer pourquoi le génome des virus à ARN bicaténaire est segmenté. 3. Le processus réplicatif de l’ADN génomique de certains virus comme les adénovirus est continu sur les deux brins.

Expliquez comment cela est rendu possible sans violer la « règle » établie au chapitre 7 et qui stipule que la synthèse de l’ADN s’effectue invariablement dans le sens 5’ vers 3’. 4. La plupart des éléments génétiques qui codent une transcriptase inverse en produisent soit en quantité limitée d’unités ou soit à partir d’une polyprotéine. Pour quelle(s) raison(s) doit-il en être ainsi d’après vous ?



I

Phototrophie

544

17.1 17.2

Photosynthèse Pigments photosynthétiques et leur localisation dans la cellule Caroténoïdes et phycobilines Photosynthèse anoxygénique Photosynthèse oxygénique Fixation autotrophe du CO2 : le cycle de Calvin Fixation autotrophe du CO2 : cycle inverse de l’acide citrique et cycle de l’hydroxypropionate

545

17.3 17.4 17.5 17.6 17.7

II

546 549 550 555 557

CHAPITRE DIX-SEPT

Diversité métabolique

559

Chimiolithotrophie : énergie obtenue de l’oxydation de donneurs d’électrons inorganiques 561

17.8

Donneurs d’électrons inorganiques et énergétique 17.9 Oxydation de l’hydrogène 17.10 Oxydation des composés soufrés réduits 17.11 Oxydation du fer 17.12 Nitrification et Anammox

L’énorme diversité génétique des procaryotes n’a d’égal que leur énorme diversité métabolique. Les bactéries vertes sulfureuses sont des phototrophes, possédant des chlorosomes, visibles sur la photographie comme ces structures en forme de cigares situées à la périphérie d’une cellule de Chlorobium tepidum. Les chlorosomes permettent aux bactéries vertes de croître sous des intensités lumineuses plus faibles que pour n’importe quel organisme.

561 561 562 565 567

III

La vie en anaérobiose : les respirations anaérobies

17.13 17.14 17.15 17.16 17.17 17.18

Respiration anaérobie Réduction des nitrates et dénitrification Réduction des sulfates Acétogénèse Méthanogenèse Fer ferrique, manganèse, chlorate et accepteurs d’électrons organiques

581

Modes de vie anaérobies : fermentations et syntrophie

584

IV

570 570 571 573 575 577

17.19 Fermentations : énergétique et équilibre redox 584 17.20 Diversité des fermentations 586 17.21 Syntrophie 588

V

Oxydation des hydrocarbures et rôle d’O2 dans le catabolisme des composés organiques

17.22 Le rôle de l’oxygène moléculaire (O2) dans les processus biochimiques 17.23 Oxydation des hydrocarbures 17.24 Méthanotrophie et méthylotrophie 17.25 Métabolisme des hexoses, des pentoses et des polysacharides 17.26 Métabolisme des acides organiques 17.27 Utilisation des lipides

VI

Fixation de l’azote

17.28 Nitrogénase et processus de fixation d’azote 17.29 Génétique et régulation de la fixation d’azote

590 590 591 592 594 597 598

599 599 603



544 Chapitre 17


GLOSSAIRE Anammox Oxydation anaérobie de l’ammoniaque. Anoxique (anoxic) Sans oxygène. Antennes (antenna) Complexes des pigments collecteurs de lumière qui redirigent l’énergie vers le centre réactionnel. Autotrophe (autotroph) Voir chapitre 5. Bactériochlorophylle (bacteriochlorophyll) Pigment chlorophyllien des phototrophes anoxygéniques. Carboxysomes Inclusions cristallines de RubisCo. Caroténoïdes (carotenoids) Pigments accessoires hydrophobes présents avec la chlorophylle dans les membranes photosynthétiques. Centre réactionnel (reaction center) Complexe photosynthétique contenant de la chlorophylle (ou de la bactériochlorophylle) et plusieurs autres composés où se déroule les réactions initiales de transfert d’électrons de la chaîne de transport des électrons photosynthétiques. Chimiolithotrophe (chemolithotroph) Voir chapitre 5. Chlorophylle (chlorophyll) Porphyrine contenant du Mg sensible à la lumière présente chez les organismes photosynthétiques et initiant le processus de photophosphorylation. Chlorosome (chlorosome) Structure en forme de cigare présente à la périphérie des cellules de bactéries vertes soufrées et non soufrées et contenant les bactériochlorophylles de l’antenne (c, d, ou e). Cycle de Calvin (Calvin cycle) Voie biochimique de fixation du CO2 chez de nombreux organismes autotrophes. Déchlorination réductrice (reductive dechlorination) Respiration anaérobie au cours de laquelle un composé organique chloré est utilisé en tant qu’accepteur électrons, d’habitude avec libération de Cl–. Dénitrification (denitrification) Respiration anaérobie au cours de laquelle le NO3– est réduit en composés azotés gazeux, essentiellement du N2. Dismutation (disproportionation) Séparation d’un composé en deux nouveaux composés, l’un plus réduit, l’autre plus oxydé que le composé original. Fermentation (fermentation) Catabolisme anaérobie d’un composé organique dans lequel le composé sert à la fois de donneur et d’accepteur d’électrons et dans lequel de l’ATP est produit par phosphorylation au niveau du substrat. Fixation de l’azote (nitrogen fixation) Réduction biologique de N2 en NH3 par la nitrogénase. Homoacétogénèse (acétogénèse) [Homoacetogenesis (acetogenesis)] Métabolisme énergétique impliquant la production d’acétate à partir de H2 et de CO2 ou à partir de composés organiques. Hydrogénase (hydrogenase) Enzyme très largement répandue chez les micro-organismes anaérobies et capable d’assimiler ou de produire du H2.

L

es chapitres précédents ont traité de la très vaste diversité phylogénétique de la vie microbienne sur Terre. Maintenant nous nous concentrons sur leur diversité métabolique, en insistant spécialement sur les processus biochimiques qui soustendent cette diversité. Nous pourrons ensuite étudier l’écologie microbienne – c’est-à-dire les interactions des micro-organismes entre eux et avec leur environnement. Diversité métabolique et écologie microbienne sont étroitement couplées ; la diversité métabolique que nous allons décrire dans ce chapitre nourrit les cycles des éléments nutritifs ainsi que les autres activités microbiennes que nous présenterons dans les chapitres 18 et 19. En fait, comme nous le verrons, les micro-organismes et les réactions métaboliques jouent un rôle clé dans le maintien de la vie sur Terre et ont une

Méthanogenèse (methanogenesis) Production biologique de méthane (CH4). Méthanotrophe (methanotroph) Organisme pouvant oxyder le méthane. Méthylotrophe (methylotroph) Organisme capable de croître sur des composés ne contenant pas de liaison C-C. Mixotrophe (mixotrophic) État nutritionnel dans lequel un composé inorganique sert de source d’énergie (donneur d’électron) et des composés organiques servent de source de carbone. Mono-oxygénase (monooxygenase) Enzyme catalysant l’incorporation de l’un des atomes de l’O2 dans un substrat, alors que l’autre atome est réduit en H2O. Nitrification Conversion microbienne de NH3 en NO3–. Nitrogénase (nitrogenase) Enzyme capable de réduire N2 en NH3 lors du processus de fixation de l’azote. Photosynthèse oxygénique (oxygenic photosynthesis) Photosynthèse des cyanobactéries et des plantes vertes au cours de laquelle de l’O2 est produit. Photophosphorylation Voir chapitre 5. Photosynthèse (photosynthesis) Série de réactions pendant lesquelles de l’ATP est synthétisé par des réactions induites par la lumière et du CO2 est fixé dans le matériel cellulaire. Phototrophe (phototroph) Organisme pouvant utiliser la lumière comme source d’énergie. Phycobiliprotéine (phycobiliprotein) Complexe pigmentaire des cyanobactéries et des algues rouges composé de deux sousunités protéiques organisés en hexamères et fixant des chromophores spécifiques appelés phycobilines. Respiration anaérobie (anaerobic respiration) Mode de respiration pour lequel certains composés tels que SO42– ou NO3– sont utilisés comme accepteur terminal d’électrons à la place de O2. RubisCO Acronyme de la ribulose biphosphate carboxylase, une enzyme clé du cycle de Calvin. Syntrophie (syntrophy) Processus par lequel deux micro-organismes ou plus coopèrent pour dégrader un substrat qu’aucun ne peut dégrader seul. Transport d’électrons inverse (reverse electron transport) Mouvement d’électrons nécessitant de l’énergie et se produisant à l’inverse du gradient thermodynamique afin de former un réducteur fort à partir d’un donneur d’électrons plus faible. Voie de l’hydroxyproprianate (hydroxyproprianate pathway) Voie métabolique autotrophe observée chez Chloroflexus et quelques Archaea.

importance cruciale en agriculture ainsi que pour d’autres aspects de la vie humaine (voir section 1.4).

I

PHOTOTROPHIE

La phototrophie, c’est-à-dire l’utilisation de lumière comme source d’énergie, est extrêmement répandue dans le monde microbien. Dans les cinq premières sections de ce chapitre, nous allons examiner les formes principales de phototrophie, y compris celles qui résultent en la formation de l’oxygène que nous respirons. Puis nous verrons comment la plupart des phototrophes satisfont l’ensemble de leurs besoins en carbone à partir du CO2.



17.1 Photosynthèse 545

PHOTOTROPHES (utilisent la lumière comme source d’énergie)

Photoautotrophes (utilisent du CO2)

Photohétérotrophes (utilisent du carbone organique)

FIGURE 17.1 Classification des organismes phototrophes en termes d’énergie et de sources de carbone. Dans la nature, les organismes phototrophes changent de mode métabolique en fonction des ressources disponibles dans leur habitat. La photohétérotrophie réprime en général la photoautotrophie.

17.1 Photosynthèse m n Le processus biologique le plus important sur Terre est la photosynthèse, c’est-à-dire la conversion de l’énergie lumineuse en énergie chimique. Les organismes qui peuvent faire la photosynthèse sont appelés phototrophes (voir figure 17.1). La plupart des organismes phototrophes sont aussi autotrophes, c’est-à-dire capables de croître en utilisant le CO2 comme seule source de carbone. L’énergie lumineuse est utilisée pour réduire le CO2 en composés organiques (photo-autotrophie). Cependant, certains phototrophes peuvent aussi utiliser le carbone organique comme source de carbone ; ce type de métabolisme est appelé photohétérotrophie (voir figure 17.1). La capacité de photosynthétiser nécessite des pigments sensibles à la lumière, les chlorophylles, que l’on trouve chez les plantes, les algues et plusieurs groupes de procaryotes. La lumière atteint les organismes phototrophes sous forme d’unités discrètes d’énergie appelées quanta. L’absorption des quanta de lumière par la chlorophylle démarre le processus de conversion de l’énergie photosynthétique, le résultat net étant l’ATP.

La production d’énergie et l’assimilation du CO2 La croissance d’un photo-autotrophe peut être caractérisée par deux ensembles distincts de réactions : 1) la production

d’ATP, et 2) la réduction du CO2 en composés organiques. Lors de la croissance autotrophe, l’énergie est fournie par l’ATP, alors que les électrons nécessaires à la réduction du CO2 viennent du NADH (ou du NADPH). Ils sont produits par la réduction du NAD+ (ou du NADP+) par des électrons provenant de divers donneurs d’électrons qui seront présentés plus loin. Afin de mener à bien les réactions autotrophes, certaines bactéries phototrophes obtiennent leur pouvoir réducteur de donneurs d’électrons qu’elles trouvent dans l’environnement, en général des sources de soufre réduit (H2S, S0, S2O32–) ou du H2. En revanche, les plantes vertes, les algues et les cyanobactéries utilisent H2O, un donneur d’électrons peu performant (voir figure 5.9), comme source de pouvoir réducteur pour réduire NADP+ en NADPH. L’oxydation de H20 produit de l’oxygène moléculaire (O2) comme sous-produit (voir figure 17.2). Comme il y a production d’oxygène, la photosynthèse chez ces organismes est appelée oxygénique. Chez beaucoup de bactéries phototrophes, il n’y a pas de production d’oxygène, et donc le processus est appelé photosynthèse anoxygénique. La production de NADH à partir de substances comme le H2S par les phototrophes anoxygéniques peut, selon les organismes, être ou ne pas être induite par la lumière. Par contre, l’oxydation de l’H2O en O2 par les phototrophes oxygéniques est toujours induite par la lumière (voir figure 17.2). Les phototrophes oxygéniques ont donc besoin de lumière à la fois pour le pouvoir réducteur et pour la conservation de l’énergie.

Contrôlez vos acquis Les phototrophes obtiennent leur énergie à partir de la lumière. La photosynthèse implique des réactions dans lesquelles de l’ATP est produit et des réactions dans lesquelles de l’ATP est consommé pour la réduction du CO2 par le NADH. •

En quoi les photo-autotrophes et les photohétérotrophes sont-ils similaires et en quoi diffèrent-ils ?

•

Quelle est la différence fondamentale entre un phototrophe oxygénique et un phototrophe anoxygénique ?

Oxygénique

Anoxygénique Pouvoir réducteur H2S

Carbone

Énergie

CO2

ADP

S0

SO42– (a)

H2O

hv

(CH2O)n

Pouvoir réducteur

Carbone

Énergie

CO2

ADP

hv

hv

1/2 O2

ATP

(CH2O)n

ATP

(b)

FIGURE 17.2 Les types de photosynthèse. Énergie et synthèse de pouvoir réducteur chez les phototrophes (a) anoxygéniques et (b) oxygéniques. Bien que les deux types de phototrophes obtiennent leur énergie à partir de lumière (hν), la lumière est aussi responsable de l’oxydation de l’eau en oxygène chez les phototrophes oxygéniques.



546 Chapitre 17


m n

17.2 Pigments photosynthétiques et leur localisation dans la cellule

La photosynthèse ne se produit que chez des organismes possédant de la chlorophylle (phototrophes oxygéniques) ou de la bactériochlorophylle (phototrophes anoxygéniques). La chlorophylle est une porphyrine, comme les cytochromes (voir section 5.11). Mais à la différence des cytochromes, la chlorophylle contient un atome de magnésium à la place d’un atome de fer au centre de l’anneau de porphyrine. La chlorophylle contient aussi des substituts spécifiques liés à l’anneau de porphyrine, ainsi qu’une chaîne alcool hydrophobe qui permet à la chlorophylle de s’associer avec les lipides et les protéines hydrophobes des membranes photosynthétiques. La structure de la chlorophylle a, la principale chlorophylle des plantes supérieures, de la plupart des algues et des cyanobactéries, est présentée dans la figure 17.3a. La chlorophylle a est verte parce qu’elle absorbe la lumière rouge et la lumière bleue de manière préférentielle et transmet la lumière verte. Nous avons déjà parlé du spectre électromagnétique dans la section 10.4. Les propriétés spectrales d’un pigment peuvent être représentées par son spectre d’absorption, une mesure du degré d’absorption par le pigment de la lumière à différentes longueurs d’onde. Le spectre d’absorption de cellules contenant de la chlorophylle a révèle une absorption très forte pour la lumière rouge (maximum d’absorption à une longueur d’onde de 680 nm) et la lumière bleue (maximum à 430 nm) [voir figure 17.3b].

CH2 CH H3C

C2H5

N

H

N Mg

H3C H H2C H

H N

N

CH3 H

CH2

O COOCH3

Anneau cyclopentanone

COOC20H39 Phytol

Chlorophylle a CH3 O

C

H3C

H H 3C H N

N

H C2H5

Mg

H H3C H H2C H CH2

H N

N

CH3 H

O COOCH3

Anneau cyclopentanone

COOC20H39 Phytol

La diversité des chlorophylles

Bactériochlorophylle a (a)

0,9 870

0,8 360 0,7 Absorbance

Il existe un certain nombre de chlorophylles et de bactériochlorophylles (la bactériochlorophylle est la forme de chlorophylle présente chez les phototrophes anoxygéniques) qui diffèrent chimiquement et peuvent être distinguées par les différences de leurs spectres d’absorption. La chlorophylle b, par exemple, absorbe de manière maximale à 660 nm au lieu de 680 nm. De nombreuses plantes possèdent plusieurs types de chlorophylles, mais les plus communes sont les chlorophylles a et b. Parmi les procaryotes, les cyanobactéries possèdent de la chlorophylle a, mais les phototrophes anoxygéniques, tels que les bactéries pourpres et les bactéries vertes, peuvent avoir une parmi plusieurs bactériochlorophylles (voir figures 17.3 et 17.4). La bactériochlorophylle a (voir figure 17.3), qui est présente chez la plupart des bactéries pourpres (voir section 12.2), absorbe de manière maximale entre 800 et 925 nm, en fonction du type de phototrophes. Différentes espèces possèdent différentes protéines se liant aux pigments, et les maxima d’absorption de la bactériochlorophylle a dépendent en partie de la nature de ces protéines et de leurs arrangements dans les complexes photosynthétiques. D’autres bactériochlorophylles, dont la distribution varie en fonction de la phylogénie, absorbent dans d’autres régions des spectres visibles et infrarouges (voir figure 17.4). Pourquoi différents organismes ont-ils différents types de chlorophylles absorbant la lumière à des longueurs d’onde différentes ? C’est sans doute une stratégie pour mieux utiliser l’énergie du spectre électromagnétique. Seule l’énergie lumineuse qui est réellement absorbée peut être utilisée pour la conversion énergétique. En ayant des pigments différents, deux organismes peuvent coexister dans le même habitat, chacun utilisant des

CH3

H

0,6

805

430 480

0,5

475 475

680 525

0,4

590

0,3 0,2 0,1 0 340 400

500

600

700

800

900

Longueur d’onde (nm) (b) FIGURE 17.3 Structures et spectres de la chlorophylle a et de la bactériochlorophylle a. (a) Les deux molécules sont identiques excepté pour les portions marquées en jaune et en vert. (b) Spectre d’absorption des cellules (courbe verte) de l’algue verte Chlamydomonas (voir section 14.13). Les pics à 680 et 430 nm sont dus à la chlorophylle a et le pic à 480 nm est dû aux caroténoïdes. La courbe rouge correspond aux cellules de la bactérie pourpre phototrophe Rhodopseudomonas palustris (voir section 12.2). Les pics à 870, 805, 590 et 360 nm sont dus à la bactériochlorophylle a, alors que les pics à 525 et 475 nm sont dus aux caroténoïdes.



17.2 Pigments photosynthétiques et leur localisation dans la cellule 547

Pigment/maximum d’absorption R1 (in vivo)

R2

Bchl a

—C—CH3 (Bactéries pourpres)/ O 805, 830–890

Bchl b

—C—CH3 (Bactéries pourpres)/ 835–850, 1020–1040 O

—CH3b

(Bactéries vertes sulfureuses)/ 745–755

—CH2—CH3

R4 —CH3

R5 —C—O—CH3

R6

R7

P/Gga—H

O —CH3c

C—CH3

—CH3

—C—O— CH3

P

—H

—C—CH3

—CH3

OH

—C2H5

—C4H9

—CH3

—H

3

N

F

—CH3

R3

Mg

R7 H 3C HH

4

N

N

—C2H5 —C3H7d

R2

R1 H3C

O

H

H

Bchl c

R3

N R4

CH 2

CH 2 H R 5 C

O

O

O

Bchl cs

(Bactéries vertes non sulfureuses)/ 740

Bchl d


Bchl e


Bchl g

(Héliobactéries)/ 670, 788

H —C—CH3

—CH3

—C2H5

—CH3

—H

S

—CH3

R6

OH H

aP, Ester de phytyle (C H O—) ; F, 20 39

—C2H5 —C3H7

—C2H5

OH

—C4H9

—CH3

H

—C2H5

—C—CH3

—C—CH3 OH

—CH3

—C—H

—C3H7

O

—C4H9

—C2H5

—H

F

—H

bPas de double liaison entre C et 3

—H

F

—CH3

C4 ; des atomes H supplémentaires sont aux positions C3 et C4.

cPas de double liaison entre C et 3

C4 ; un atome H supplémentaire est à la position C3.

H —C

ester de farnésyle (C15H25O—) ; Gg, ester de géranylgéraniole (C10H17O—) ; S, alcool de stéaryle (C18H37O—).

dLes bactériochlorophylles c, d, et e

CH2

—CH3 b

—C2H5

—CH3

—C—O—CH3 O

F

—H

sont des mélanges isomères avec les substitutions possibles montrées sur R3.

FIGURE 17.4 Structure de toutes les bactériochlorophylles connues (Bchl). Les différents groupes de substitution présents aux positions R1 à R7 dans la structure de droite sont listés. Les propriétés d’absorption peuvent être déterminées en resuspendant des cellules intactes dans un liquide visqueux tel que le sucrose à 60 % (cela diminue la diffusion de la lumière et lisse les spectres) et en déterminant les spectres d’absorption comme sur la figure 17.3. Les maxima d’absorption in vivo sont les pics d’absorption importants d’un point de vue physiologique. Les spectres des bactériochlorophylles dissoutes dans des solvants organiques sont souvent bien différents.

longueurs d’onde de lumière que l’autre n’utilise pas. Par conséquent, la diversité pigmentaire a une signification écologique.

Les membranes photosynthétiques et les chloroplastes Les pigments chlorophylliens et tous les autres composants de l’appareil collecteur de lumière sont localisés à l’intérieur de la cellule au sein d’un système de membranes spéciales, les membranes photosynthétiques. La localisation des membranes photosynthétiques n’est pas la même chez les micro-organismes procaryotes et eucaryotes. Chez les eucaryotes, la photosynthèse est associée à des organelles intracellulaires spéciales, les chloroplastes (voir figure 17.5a ; voir section 14.3). Les pigments chlorophylliens sont liés à des structures membranaires feuilletées (lamellaires) du chloroplaste (voir figure 17.5b). Ces systèmes de membranes photosynthétiques sont appelés thylacoïdes ; les empilements de thylacoïdes sont appelés

grana (voir figure 17.5b). Les thylacoïdes sont arrangés de telle manière que le chloroplaste soit divisé en deux régions, la matrice qui entoure les thylacoïdes, et l’espace intérieur au sein du réseau de thylacoïdes (voir figure 17.5b). Cet arrangement rend possible le développement d’une force proton-motrice induite par la lumière et pouvant être utilisée pour synthétiser de l’ATP, comme cela sera montré dans la section 17.5. Chez les procaryotes, les chloroplastes sont absents. Pour ces organismes, les pigments photosynthétiques sont intégrés dans des systèmes de membranes internes. Ces systèmes proviennent : 1) de l’invagination de la membrane cytoplasmique (bactéries pourpres) [voir figures 12.3 et 17.12], 2) de la membrane cytoplasmique elle-même (héliobactéries ; voir section 12.20), 3) à la fois de la membrane cytoplasmique et de structures spécialisées incluses dans des membranes appelées chlorosomes (bactéries vertes ; voir figure 17.7 et section 12.32), ou 4) des membranes thylacoïdales (cyanobactéries, voir section 12.25).




Hilda Canter-Lund

548 Chapitre 17

(a)

Membrane extérieure

Stroma

Membrane intérieure

Membrane du thylacoïde

(b)

Empilements de thylacoïdes formant les grana

FIGURE 17.5 Le chloroplaste. (a) Cellule algale montrant les chloroplastes. (b) Détail de la structure du chloroplaste montrant comment les convolutions des membranes des thylacoïdes définissent un espace intérieur appelé stroma et forment des empilements de membranes appelés grana.

Centres réactionnels et pigments de l’antenne Au sein de la membrane photosynthétique, les molécules de chlorophylle ou de bactériochlorophylle sont associées à des protéines pour former des complexes composés de 50 à 300 molécules (voir figure 17.6). Seul un très petit nombre de ces molécules pigmentaires, appelées centres réactionnels, participent directement à la conversion de l’énergie lumineuse

hv hv

CR

CR

CR

CR

CR

CR

CR

en ATP (voir figure 17.6). Les chlorophylles ou les bactériochlorophylles du centre réactionnel sont entourées par des chlorophylles ou des bactériochlorophylles beaucoup plus nombreuses qui collectent la lumière, formant ce qu’on appelle l’antenne. Les pigments de l’antenne servent à récupérer la lumière et à rediriger l’énergie lumineuse vers le centre réactionnel (voir figure 17.6). Aux basses intensités lumineuses souvent rencontrées dans la nature, cette organisation des molécules de pigments permet la capture et l’utilisation des photons qui autrement ne seraient pas suffisants à eux seuls pour mener à bien la photochimie du centre réactionnel. Le nec plus ultra en termes d’efficacité aux basses lumières est trouvé dans le chlorosome des bactéries vertes sulfureuses et chez Chloroflexus (voir figure 17.7). Sa structure est un système d’antenne géant. Mais à la différence des antennes des autres phototrophes, les molécules de bactériochlorophylles présentes dans le chlorosome ne sont pas liées à des protéines mais fonctionnent plutôt comme un circuit intégré. Les bactériochlorophylles du chlorosome (bactériochlorophylles c, d et e, voir figure 17.4) absorbent la lumière et transfèrent l’énergie à de la bactériochlorophylle a située dans le centre réactionnel de la membrane cytoplasmique (voir figure 17.7). Cette organisation est extrêmement efficace pour absorber la lumière aux basses intensités. On a ainsi montré que les bactéries vertes sulfureuses se développent aux plus basses intensités lumineuses possibles pour des phototrophes.

Contrôlez vos acquis FIGURE 17.6 Modèle de l’arrangement des chlorophylles / bactériochlorophylles collectrices de lumière et des centres réactionnels dans la membrane photosynthétique. L’énergie lumineuse, absorbée par les molécules collectrices de lumière (vert clair), est transférée vers les centres réactionnels (vert foncé, CR) où les réactions photosynthétiques de transport d’électrons commencent. Toutes les molécules de pigments sont maintenues en place dans la membrane par des protéines spécifiques liant les pigments. Comparez cette figure avec les figures 17.13 et 17.15.

Le principal pigment pour la photosynthèse est la chlorophylle (ou la bactériochlorophylle). Les chlorophylles sont localisées dans des membranes photosynthétiques où se déroulent les réactions claires de la photosynthèse. Les molécules de chlorophylle de l’antenne collectent l’énergie lumineuse et la transfèrent aux chlorophylles du centre réactionnel. •

Vu leur fonction, pourquoi est-il nécessaire que les pigments chlorophylliens soient localisés dans des membranes ?



17.3 Caroténoïdes et phycobilines 549

•

•

17.3 Caroténoïdes et phycobilines m n

Quelle est la différence entre le nombre de molécules de chlorophylle dans l’antenne et dans le centre réactionnel d’un complexe photosynthétique ? Expliquez la raison de cette différence ?

Bien que la présence de chlorophylle ou de bactériochlorophylle soit indispensable pour la photosynthèse, les organismes phototrophes contiennent en plus une grande diversité de pigments accessoires impliqués dans la capture et la transformation de l’énergie lumineuse. Ces pigments incluent les caroténoïdes et les phycobilines. Ces pigments jouent principalement un rôle dans la photoprotection (caroténoïdes) ou dans la collecte de la lumière (phycobilines).

Quels pigments trouve-t-on dans le chlorosome ?

Niels-Ulrik Frigarrd

Les caroténoïdes

(a)

PB

Bchl

Intérieur

Extérieur (b)

ATPase

CL

CR

Protéines de la membrane

FIGURE 17.7 Le chlorosome des bactéries vertes sulfureuses et vertes non sulfureuses. (a) Cellule de la bactérie verte sulfureuse Chlorobium tepidum observée par microscopie électronique. Notez les chlorosomes (flèches). (b) Modèle de la structure du chlorosome. Le chlorosome (vert) est compressé sur la surface interne de la membrane cytoplasmique. Les molécules de bactériochlorophylle (Bchl c, d, ou e) de l’antenne sont arrangées en réseaux de forme tubulaire à l’intérieur du chlorosome, et l’énergie est transférée de ces bactériochlorophylles par l’intermédiaire de molécules de Bchl a collectrices de lumière (CL) jusqu’aux Bchl a des centres réactionnels (CR) situées dans la membrane cytoplasmique (bleu). Les protéines de la plaque basale (PB) servent de connecteurs entre le chlorosome et la membrane cytoplasmique.

Les pigments accessoires les plus répandus sont les caroténoïdes, que l’on retrouve toujours chez les organismes phototrophes. Les caroténoïdes sont des pigments hydrophobes qui sont fermement ancrés dans la membrane. La figure 17.8 présente la structure d’un caroténoïde typique, le β-carotène. Les caroténoïdes possèdent de longues chaînes hydrocarbonées avec une alternance de liaisons C–C et C=C, un arrangement appelé système de doubles liaisons conjuguées. Les caroténoïdes sont en général de couleur jaune, rouge, brune ou verte (voir figure 12.2) et absorbent la lumière dans la région bleue du spectre (voir figure 17.3). Les types et les structures de caroténoïdes des divers phototrophes ont été bien étudiés et les principaux caroténoïdes des phototrophes anoxygéniques sont présentés dans la figure 17.9. Ces pigments sont responsables de l’intense coloration rouge, pourpre, rose, vert, jaune, ou brune qui est observée chez différentes espèces de phototrophes anoxygéniques (voir figures 12.2 et 12.5). Les caroténoïdes sont étroitement associés à la chlorophylle ou à la bactériochlorophylle dans des complexes pigmentaires photosynthétiques, mais ne sont pas impliqués directement dans la synthèse de l’ATP. Ils peuvent cependant transférer l’énergie vers le centre réactionnel et cette énergie transférée peut ensuite être utilisée pour fabriquer de l’ATP de la même manière que l’énergie lumineuse capturée directement par la chlorophylle. Les caroténoïdes servent aussi d’agents photoprotecteurs. Une intensité lumineuse trop forte peut endommager les cellules en catalysant des réactions de photooxydation pouvant induire la production de formes toxiques de l’oxygène tels des singulets d’oxygène (1O2) [voir section 6.16]. Ces derniers peuvent oxyder et donc endommager certains composants de l’appareil photosynthétique luimême. Les caroténoïdes neutralisent les formes toxiques d’oxygène et absorbent une grande partie de la lumière nocive. Comme les organismes phototrophes doivent vivre à la lumière de par leur nature même, le rôle photoprotecteur des caroténoïdes est un avantage évident.

H3C CH3

CH3

CH3

H3C

CH3 CH3

CH3

H3C CH3

FIGURE 17.8 Structure du β-carotène, un caroténoïde typique. Le système de doubles liaisons conjuguées est surligné en orange.



550 Chapitre 17


I. Caroténoïdes aliphatiques Diaponeurosporène

Neurosporène

Lycopène H3CO

OCH3

Spirilloxanthine

β-Carotène

γ-Carotène

II. Caroténoïdes à groupement aryle H3CO O

OH

OH-Sphéroidénone

O OCH3

Okénone Chlorobactène

β-Isorenieratène

Isorenieratène Légende Héliobactéries Bactéries vertes non sulfureuses (Chloroflexus) Bactéries vertes sulfureuses

Bactéries pourpres Bactéries pourpres (en présence d’air) Bactéries vertes sulfureuses (espèces de couleur brune)

Céto caroténoïdes FIGURE 17.9 Structures de quelques caroténoïdes communs trouvés chez les phototrophes anoxygéniques. Comparez la structure du β-carotène de la figure 17.8 avec ce qui est représenté ici. Par souci de simplicité, les groupes méthyle (CH 3) des structures montrées ici sont seulement indiqués par leurs liaisons. Les caroténoïdes à groupement aryle se différencient des caroténoïdes aliphatiques par la présence d’un noyau aromatique à l’une des extrémités. Les bactéries pourpres sont présentées dans la section 12.2, les héliobactéries dans la section 12.20, les bactéries vertes sulfureuses dans la section 12.32, et les bactéries vertes non sulfureuses dans la section 12.35.

bleus consistant en des tétrapyrroles en chaîne ouverte couplés à des protéines (voir figure 17.10a). Le pigment rouge appelé phycoérythrine absorbe la lumière de manière maximale à des longueurs d’onde autour de 550 nm, alors que le pigment bleu appelé phycocyanine (voir figure 17.10a) absorbe de manière maximale à 620 nm (voir figure 17.11). Un troisième pigment appelé allophycocyanine absorbe à environ 650 nm. Les phycobiliprotéines forment des agrégats de hauts poids moléculaires appelés phycobilisomes qui sont reliés à la membrane photosynthétique (voir figure 17.10b, c). Les phycobilisomes sont construits de telle manière que les molécules d’allophycocyanine sont en contact physique avec la membrane photosynthétique. L’allophycocyanine est entourée par des molécules de phycocyanine ou de phycoérythrine (ou les deux, selon l’organisme considéré). Ces derniers pigments absorbent des longueurs d’onde plus courtes (donc de plus haute énergie) et transfèrent l’énergie vers l’allophycocyanine qui est étroitement associée à la chlorophylle du centre réactionnel et qui transfère l’énergie vers ce site. Les phycobilisomes permettent donc un transfert d’énergie très efficace du complexe de biliprotéines vers la chlorophylle a, favorisant la croissance des cyanobactéries à des intensités lumineuses relativement faibles. En effet, le contenu en phycobilisomes augmente dans les cellules de cyanobactéries quand l’intensité lumineuse décroît. La fonction de collecte de lumière des pigments accessoires comme les caroténoïdes et les phycobiliprotéines est un avantage évident pour les organismes. La lumière du soleil couvre l’ensemble du spectre visible (voir figure 10.6), alors que les chlorophylles n’absorbent de manière efficace qu’une partie restreinte de ce spectre. Les pigments accessoires permettent donc aux organismes de capturer une plus grande fraction de la lumière disponible (voir figure 17.3 et 17.11).

Contrôlez vos acquis Les pigments accessoires comme les caroténoïdes et les phycobilines absorbent la lumière et transfèrent l’énergie vers la chlorophylle du centre réactionnel, élargissant ainsi les longueurs d’onde de lumière qui peuvent être utilisées pour la photosynthèse. Les caroténoïdes jouent aussi un rôle important dans la photoprotection afin d’éviter des dommages photo-oxydatifs aux cellules. •

Chez quels organismes trouve-t-on des phycobiliprotéines ?

•

Comparez la structure d’une phycobiline avec celle d’une chlorophylle et avec celle d’un caroténoïde.

•

La phycocyanine possède une couleur bleu vert ; quelle longueur d’onde de lumière absorbe-t-elle (voir figure 10.6) ?

Phycobiliprotéines et phycobilisomes

17.4 Photosynthèse anoxygénique m n

Les cyanobactéries et les chloroplastes des algues rouges contiennent des phycobiliprotéines. Ce sont les principaux pigments collecteurs de lumière (antenne) chez ces organismes. Les phycobiliprotéines sont des pigments rouges ou

Chez les organismes phototrophes, le processus de synthèse de l’ATP induit par la lumière implique un transport d’électrons faisant appel à une série de transporteurs d’électrons. Ces transporteurs sont organisés en série dans le complexe photosynthétique



17.4 Photosynthèse anoxygénique 551

O

CH3

HN

Allophycocyanine

CH—CH3

HC

Phycocyanine

CH3

HN

Protéine

CH2—CH2—COOH

HC

CH2—CH2—COOH

N

CH3

Membrane du thylacoïde

HN

(a)

O

CH2—CH3

Transfert de l’énergie vers les centres réactionnels

(b)

Phycocyanine

(c)

Kaori Ohki

CH3

HC

FIGURE 17.10 Phycobiliprotéines et phycobilisomes. (a) Phycobiline typique. Ce composé est un tétrapyrrole à chaîne ouverte dérivé biosynthétiquement d’un anneau fermé de porphyrine par la perte d’un atome de carbone sous forme de monoxyde de carbone. La structure illustrée est le groupe prosthétique de la phycocyanine présent chez les cyanobactéries (voir section 12.25) et les algues rouges (voir section 14.13). (b) Structure d’un phycobilisome. La phycocyanine absorbe à des énergies plus fortes (des longueurs d’ondes plus basses) que l’allophycocyanine. La chlorophylle a absorbe à des longueurs d’ondes plus élevées que l’allophycocyanine. Le flux d’énergie est donc le suivant : phycocyanine → allophycocyanine → chlorophylle a. (c) Observation en microscopie électronique d’une coupe mince de la cyanobactérie Synechocystis. Notez les boules foncées, ressemblant à des phycobilisomes, attachées aux membranes lamellaires.

depuis ceux qui ont le potentiel réducteur le plus électronégatif vers ceux qui ont le potentiel le plus électropositif (E0’, voir section 5.6). Comme nous le verrons plus loin, cela permet la synthèse de l’ATP à partir d’une force proton-motrice.

Les centres réactionnels photosynthétiques L’appareil photosynthétique des bactéries phototrophes pourpres est inclus à l’intérieur de systèmes de membranes intracytoplasmiques ayant des morphologies diverses. Des vésicules membranaires (chromatophores) ou des lamelles sont les types de membranes le plus souvent observés (voir figure 17.12). Le centre réactionnel des bactéries pourpres est composé de trois polypeptides appelés sous-unités L, M et H. Ces protéines sont

solidement arrimées à la membrane photosynthétique, traversant la membrane plusieurs fois (voir figure 17.13b). Les polypeptides L, M et H sont liés aux photocomplexes du centre réactionnel. Ce dernier est composé de deux molécules de bactériochlorophylle a, appelées paire spéciale, de deux molécules supplémentaires de bactériochlorophylle a dont la fonction est inconnue, de deux molécules de bactériophéophytine (bactériochlorophylle a privée de son atome de magnésium), de deux molécules de quinone et de deux molécules de caroténoïdes (voir figure 17.13a). Tous les composants du centre réactionnel sont liés entre eux de manière à pouvoir interagir dans des réactions très rapides de transfert d’électrons qui résultent in fine en une production d’ATP.

Les flux d’électrons photosynthétiques chez les bactéries pourpres 0,9

Pics de la chlorophylle a

0,8

Absorbance

0,7

Pic de la phycocyanine

0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 340 400

500

600

700

800

Longueur d’onde (nm) FIGURE 17.11 Spectre d’absorption d’une cyanobactérie possédant une phycobiliprotéine (phycocyanine) comme pigment accessoire. Notez comment la présence de la phycocyanine élargit la gamme de longueurs d’ondes de l’énergie lumineuse utilisable (entre 600 et 700 nm). Comparez avec la figure 17.3b.

Rappelez-vous que le centre réactionnel photosynthétique est entouré de complexes de bactériochlorophylle a servant d’antenne collectrice canalisant l’énergie lumineuse vers le centre réactionnel (voir figure 17.6). L’énergie lumineuse des photons est transférée de l’antenne vers le centre réactionnel en paquets appelés excitons, constituant des formes mobiles d’énergie qui migrent très efficacement des pigments de l’antenne vers le centre réactionnel. La photosynthèse commence quand l’énergie des excitons arrive à la paire spéciale de molécules de bactériochlorophylle a (voir figure 17.13a). L’absorption d’énergie excite la paire spéciale, la convertissant en un donneur d’électrons fort avec un potentiel réducteur très bas. Une fois que ce donneur fort a été produit, les étapes suivantes du flux d’électrons photosynthétiques visent à conserver l’énergie libérée, tandis que les électrons sont transportés à travers une membrane depuis des transporteurs ayant un E0’ bas vers d’autres ayant un E0’ élevé (voir figure 17.14). Avant l’excitation, le centre réactionnel bactérien, appelé P870, possède un E0’ d’environ +0,5 V ; après excitation, il a un potentiel




M.T. Madigan

Vésicules

Membranes lamellaires

Steven J. Schmitt et M.T. Madigan

552 Chapitre 17

(b)

(a)

FIGURE 17.12 Membranes des phototrophes anoxygéniques. (a) Chromatophores. Coupe à travers une cellule de la bactérie pourpre phototrophe Rhodobacter capsulatus contenant un grand nombre de membranes photosynthétiques vésiculaires. Les vésicules naissent de l’invagination de la membrane cytoplasmique. Les zones plus claires correspondent aux régions de la cellule dans lesquelles est stocké le polymère de réserve poly-β-hydroxybutyrate (voir section 4.13). Une cellule mesure environ 1 µm de large. (b) Membranes lamellaires dans une bactérie pourpre halophile. Une cellule mesure environ 1,5 µm de large. Ces membranes naissent aussi de l’invagination de la membrane cytoplasmique, mais elles s’organisent en piles de membranes, identiques aux thylacoïdes des cyanobactéries (figure 17.5).

(b)

quinone localisées au sein de la membrane. Cette transition est aussi très rapide, moins d’un milliardième de seconde (voir figures 17.14 et 17.15). Comparées à ce qui se produit dans le centre réactionnel, les réactions suivantes de transport d’électrons se déroulent relativement lentement, avec des durées de l’ordre de la microseconde ou de la milliseconde.

Marianne Schiffer et James R. Norris

(a)

George Feher

d’environ –1,0 V (voir figure 17.14). L’électron excité au sein de P870 réduit alors une molécule de bactériophéophytine a du centre réactionnel (voir figures 17.13a et 17.14). Cette transition se produit à une vitesse incroyablement rapide, durant seulement environ 3 milliardièmes de seconde (3 × 10–12). Une fois réduite, la bactériophéophytine a réduit plusieurs molécules intermédiaires de

FIGURE 17.13 Structure du centre réactionnel des bactéries pourpres phototrophes. (a) Arrangement des molécules de pigments dans le centre réactionnel. Les deux molécules de bactériochlorophylle formant la « paire spéciale » (en rouge) se recouvrent l’une l’autre. Les molécules de quinone (en vert foncé) sont orientées vers le bas dans la figure. Les bactériochlorophylles accessoires (en jaune clair) sont près de la « paire spéciale », et les molécules de bactériophéophytine sont en bleu. (b) Structure protéique du centre réactionnel. Les pigments présentés sur la figure (a) sont liés aux membranes grâce à trois protéines du centre réactionnel appelées protéine H (en bleu),



17.4 Photosynthèse anoxygénique 553 –1,0 Donneur d’électrons fort

Extérieur (périplasme)

Lumière P870*

2 H+

Flux d’électrons cyclique e– Bph

–0,75

CL CL

–0,5

CL QA

E0′ (V) –0,25

NAD(P)+

NAD(P)H

CL

CL

CR P870 e– P870* e– Bph e–

c2 Q Q Pool de Q Q quinones Q Q Q Q e– QH2

2 H+ Intérieur (cytoplasme)

0,0

Flux d’électrons inverse (consommateur d’énergie)

Cyt bc1

+0,25 Cyt c2

Donneur d’électrons faible +0,5

P870

Lumière rouge ou infrarouge

Fe-S bc1

Q

QB

Q pool

3 H+

c2

ATPase ADP + Pi

ATP

3 H+ FIGURE 17.15 Agencement des complexes protéiques dans la membrane photosynthétique d’une bactérie pourpre phototrophe. Le gradient de protons généré par la lumière est utilisé pour la synthèse de l’ATP par l’ATP synthétase (ATPase). CL, complexe de bactériochlorophylle collecteur de lumière ; CR, centre réactionnel ; Bph, bactériophéophytine ; Q, quinone ; FeS, protéine fer-soufre ; bc1, complexe cytochrome ; c2, cytochrome. Pour la description du fonctionnement du complexe cytochrome bc1 et du cycle Q, dont les détails ne sont pas montrés ici, voir la figure 5.20. Pour une description de la fonction ATPase, voir la figure 5.21.

Donneurs externes d’électrons (H2S, S2O32-, S0, Fe2+)

FIGURE 17.14 Schéma général du flux d’électrons lors de la photosynthèse anoxygénique chez une bactérie pourpre. Une seule réaction se produit lors de la phase claire. Notez comment l’énergie lumineuse convertit un donneur d’électrons faible, P870, en un donneur d’électrons très fort, P870*, et qu’à la suite de cet événement, les étapes restant du flux d’électrons photosynthétiques sont presque identiques à celles du flux d’électrons de la respiration (figure 5.20). Bph, Bactériophéophytine ; QA, QB, quinones intermédiaires ; Q pool, pool de quinones dans la membrane ; Cyt, cytochrome.

À partir de la quinone, les électrons sont transportés dans la membrane par l’intermédiaire d’une série de protéines fer-soufre et de cytochromes (voir figures 17.14 et 17.15), retournant finalement au centre réactionnel. Les protéines clés du transport d’électrons incluent le cytochrome bc1 et le cytochrome c2 (voir figure 17.14). Le cytochrome c2 est un cytochrome périplasmique jouant le rôle de navette d’électrons entre le complexe bc1 qui est attaché à la membrane et le centre réactionnel (voir section 5.11 et figures 5.20, 17.14 et 17.15).

La photophosphorylation La synthèse d’ATP au cours du flux d’électrons photosynthétiques résulte de la formation d’une force proton-motrice générée durant le transport d’électrons et de l’activité d’ATPases couplant la dissipation de la force proton-motrice avec la formation d’ATP (voir section 5.12). La série de réactions est terminée quand le cytochrome c2 fournit un électron à la paire spéciale de

bactériochlorophylles (voir figure 17.13) ; cela restaure ces molécules à leur potentiel original de base (E0’ = + 0,5 V). Le centre réactionnel est alors capable d’absorber de l’énergie à nouveau et de répéter le processus. Cette méthode de formation d’ATP est appelée photophosphorylation, ou plus spécifiquement photophosphorylation cyclique, car les électrons se déplacent à l’intérieur d’une boucle fermée. La photophosphorylation cyclique ressemble à la respiration par le fait que le flux d’électrons à travers la membrane permet d’établir une force proton-motrice. Cependant, à la différence de la respiration, lors de la photophosphorylation cyclique, il n’y a ni apport ni consommation d’électrons ; les électrons se déplacent simplement à l’intérieur d’un circuit fermé. L’organisation spatiale des composants du transport d’électrons au sein de la membrane photosynthétique des bactéries pourpres est illustrée dans la figure 17.15. Notez que, comme dans le cas du flux d’électrons de la respiration (voir section 5.11), l’interaction du complexe cytochrome bc1 avec le pool de quinone au cours du flux d’électrons photosynthétiques (voir figure 5.20) constitue le moyen principal pour établir la force proton-motrice utilisée pour induire la synthèse d’ATP (voir figure 17.15).

La génétique de la photosynthèse bactérienne Les bactéries pourpres phototrophes sont des procaryotes Gram négatif (voir section 12.2) et certaines des espèces peuvent être facilement manipulées génétiquement. Les espèces du genre Rhodobacter, en particulier R. capsulatus et R. sphaeroides, constituent les principaux modèles pour la recherche génétique



554 Chapitre 17

A


ML

H

B N

F

J

E

J

G

PD I A

I B K CDE F

C X Y Z Q BA L M

FIGURE 17.16 Cartographie de la zone des gènes photosynthétiques de la bactérie pourpre phototrophe Rhodobacter capsulatus. Les gènes bch qui codent les protéines de la synthèse de bactériochlorophylle sont en vert tandis que les gènes crt qui codent les protéines qui synthétisent les caroténoïdes sont en rouge. Les gènes qui codent les polypeptides du centre réactionnel (puh et puf) sont en bleu, les gènes qui codent les polypeptides de l’antenne I (complexe B870) [gènes puf] sont en jaune. Les gènes qui sont marqués par des lignes diagonales n’ont pas de fonction connue. Les flèches indiquent la direction de transcription.

Cependant, E’0 pour les quinones (environ 0 V) n’est pas assez négatif pour réduire directement NAD+ (– 0,32 V). Au lieu de cela, les électrons du pool de quinone doivent remonter le gradient thermodynamique, afin de réduire NAD+ en NADH (voir figure 17.14). Ce processus qui demande de l’énergie est appelé flux d’électrons inverse et est induit par l’énergie de la force proton-motrice. Le flux d’électrons inverse est aussi le mécanisme par lequel les chimiolithotrophes produisent du pouvoir réducteur, dans beaucoup de cas à partir des donneurs d’électrons ayant un E’0 très positif (voir sections 17.8 à 17.12).

La photosynthèse chez d’autres phototrophes anoxygéniques Notre discussion sur le flux d’électrons photosynthétiques a surtout concerné les bactéries pourpres. Bien que des composants membranaires similaires induisent la photophosphorylation chez d’autres phototrophes anoxygéniques, on observe aussi des différences pour certaines réactions photochimiques qui ont des conséquences sur la biosynthèse du pouvoir réducteur. La figure 17.18 compare le flux d’électrons photosynthétiques chez les bactéries pourpres, les bactéries vertes et les héliobactéries. Notez que chez les deux derniers groupes, l’état excité des bactériochlorophylles du centre réactionnel possède un E’0

Pour qu’une bactérie pourpre puisse croître de manière autotrophe, la seule formation d’ATP n’est pas suffisante. Du pouvoir réducteur (NADH) doit être produit afin que le CO2 puisse être réduit jusqu’au niveau de la matière organique. Comme on l’a évoqué ci-dessus, pour les bactéries pourpres sulfureuses, celui-ci vient d’habitude du H2S bien que S0, S2O32– ou même Fe2+ puissent être utilisés par certaines espèces. Quand le H2S est le donneur d’électrons chez les bactéries pourpres sulfureuses, des globules de S0 sont stockés à l’intérieur des cellules (voir figure 17.17a). Des substances réduites telles que le H2S sont oxydées par des cytochromes de type c et leurs électrons finissent dans le « pool de quinone » de la membrane photosynthétique (voir figure 17.14).

Norbert Pfennig

L’autotrophie chez les bactéries pourpres : donneurs d’électrons et flux d’électrons inverse

(a)

Norbert Pfennig

sur la photosynthèse bactérienne. Les génomes de ces deux bactéries pourpres non sulfureuses (voir section 12.2) ont été séquencés. Chez Rhodobacter, la plupart des gènes impliqués dans la photosynthèse sont regroupés en plusieurs opérons qui couvrent une région de 50 kpb du chromosome (photosynthetic gene cluster) [voir figure 17.16]. Les gènes d’un de ces regroupements de gènes photosynthétiques codent des protéines impliquées dans : 1) la biosynthèse de la bactériochlorophylle (gènes bch), 2) la biosynthèse des caroténoïdes (gènes crt), et 3) des polypeptides qui lient les molécules de pigments dans le centre réactionnel et les complexes collecteurs de lumière (gènes puf et puh) [voir figure 17.16]. Ce regroupement des gènes facilite la synthèse coordonnée de la bactériochlorophylle, des caroténoïdes et des protéines se liant aux pigments afin que des proportions correctes de chaque composant soient synthétisées pour l’assemblage final dans les photocomplexes. Le principal signal de régulation régissant la transcription des gènes photosynthétiques du groupe des gènes photosynthétiques chez les phototrophes anoxygéniques est l’O2. L’oxygène moléculaire réprime la synthèse des pigments chez ces organismes de telle manière que la photosynthèse ne se produit qu’en conditions anoxiques. L’analyse génétique de la photosynthèse chez les bactéries pourpres a été grandement facilitée par la diversité bioénergétique des espèces de Rhodobacter. En plus de leur capacité à photosynthétiser, ces organismes peuvent croître à l’obscurité en utilisant la respiration en présence ou non d’oxygène. Par conséquent, on peut facilement obtenir des mutants incapables de photosynthétiser ; de tels mutants ont été utilisés dans des expériences génétiques (voir chapitre 10) afin de caractériser le nombre, l’organisation, les relations et l’expression des gènes photosynthétiques (voir figure 17.16).

(b)

FIGURE 17.17 Bactéries phototrophes sulfureuses observées en microscopie en champ clair. (a) Bactérie pourpre Chromatium okenii. Notez les granules de soufre déposés à l’intérieur de la cellule (flèches). (b) Bactéries vertes : Chlorobium limicola. Les corps réfringents sont des granules de soufre déposés à l’extérieur de la cellule (flèches). Dans les deux cas, les granules de soufre proviennent de l’oxydation du H 2S pour obtenir un potentiel réducteur. Les cellules de C. okenii mesurent environ 5 µm de diamètre et celles de C. limnicola, environ 0,9 µm de diamètre.



17.5 Photosynthèse oxygénique 555

significativement plus négatif que celui des bactéries pourpres. De plus, on trouve de la chlorophylle a vraie (bactéries vertes) ou une forme structurellement modifiée de la chlorophylle a appelée hydroxychlorophylle a (héliobactéries) dans leur centre réactionnel. Donc, à la différence des bactéries pourpres pour lesquelles la première molécule accepteuse stable (quinone) possède un E’0 d’environ 0 V, les accepteurs des bactéries vertes et des héliobactéries (protéines FeS) ont un E’0 beaucoup plus électronégatif que NADH. Chez les bactéries vertes, une protéine appelée ferredoxine (réduite par une protéine FeS, voir figure 17.18) est le donneur d’électrons direct pour les réactions de fixation du CO2 dans le cycle de l’acide citrique inverse (voir figure 17.24a). Donc chez les bactéries vertes et les héliobactéries, tout comme chez les phototrophes oxygéniques (dont nous parlerons juste après), l’ATP et le pouvoir réducteur sont tous deux des produits directs des réactions de la phase claire. Quand, chez les bactéries vertes, le sulfure est le donneur d’électrons pour la synthèse de pouvoir réducteur, des globules de S0 sont produits comme chez les bactéries pourpres, mais ces globules sont localisés à l’extérieur plutôt qu’à l’intérieur des cellules (voir figure 17.17b).

Une série de réactions de transport d’électrons se produit dans le centre réactionnel photosynthétique des phototrophes anoxygéniques. Cela induit la formation d’une force proton-motrice et la synthèse d’ATP. Le pouvoir réducteur pour la fixation du CO2 vient de composés réducteurs présents dans l’environnement et nécessite un transport d’électrons inverse chez les phototrophes pourpres.

–1,25 –1,0

Comparez les flux d’électrons lors de la photophosphorylation et lors de la phosphorylation respiratoire.

•

Qu’est-ce que le flux d’électrons inverse ? Pourquoi est-il nécessaire ? Quels sont les phototrophes qui ont besoin d’utiliser le flux d’électrons inverse ?

17.5 Photosynthèse oxygénique m n


Bactéries pourpres

•

À l’inverse des phototrophes anoxygéniques, le flux d’électrons chez les phototrophes oxygéniques implique deux réactions photochimiques distinctes, mais interconnectées. Les phototrophes oxygéniques utilisent la lumière pour générer à la fois de l’ATP et du NADPH, les électrons nécessaires au second provenant de la fragmentation de l’eau en oxygène et en électrons (voir figure 17.2). Les deux systèmes des réactions de la phase claire sont appelés photosystème I et photosystème II, chaque photosystème possédant une forme spectrale différente de la chlorophylle a constituant le centre réactionnel. La chlorophylle du photosystème I, appelée P700, absorbe la lumière à des longueurs d’onde élevées (rouge lointain), alors que la chlorophylle du photosystème II, appelée P680, absorbe à des longueurs d’onde plus courtes (rouge proche). Comme c’est le cas pour la photosynthèse anoxygénique, les réactions photochimiques oxygéniques se produisent dans des membranes. Chez les cellules eucaryotes, on trouve ces membranes dans le chloroplaste (voir figure 17.5), alors que chez les cyanobactéries les membranes photosynthétiques sont organisées en piles à l’intérieur du cytoplasme (voir figure 17.6). Chez les deux groupes de phototrophes, les membranes sont arrangées

Bactéries vertes sulfureuses P840*

BChl BPh

–0,75

FeS

–0,5 E0′ (V)

0 +0,25 + 0,5

P870

Q Flux Cyt Cyt d’électrons c bc1 inverse P840 553 Cyt c2

FeS

Fd

NADH

–0,25

Héliobactéries Chl a–OH

Chl a

P870*

P798*

Cyt bc1

Fd Cyt bc1

Q

Lumière

Q

Cyt P798 c553 Lumière

Lumière FIGURE 17.18 Comparaison du flux d’électrons chez les bactéries pourpres, les bactéries vertes sulfureuses et les héliobactéries . Notez comment un flux inverse d’électrons est nécessaire chez les bactéries pourpres car le premier accepteur (quinone, Q) possède un potentiel plus positif que le couple NAD +/NADH. Chez les bactéries vertes et les héliobactéries, la ferrédoxine (Fd), dont le E0’ est en fait plus négatif que celui de NADH, est produite par les réactions de la phase claire. Chez les bactéries vertes, la ferrédoxine induit les réactions de carboxylation de l’autotrophie (voir figure 17.24a). Bchl, bactériochlorophylle ; BPh, bactériophéophytine. P870 et P840 sont les centres réactionnels respectifs des bactéries pourpres et vertes, et sont composés de Bchl a. Le centre réactionnel des héliobactéries (P798) contient de la Bchl g. Le centre réactionnel de Chloroflexus est identique à celui de bactéries pourpres. Notez la présence de formes de chlorophylle a dans les centres réactionnels des bactéries vertes et des héliobactéries.



556 Chapitre 17


P700*

–1,25 Schéma en Z : PSII

–1,0

–0,75

QA P680*

FeS

–0,5

(V)

Flux d’électrons cyclique (produit une force proton-motrice)

Ph

Fd Fp NAD(P)+

QB Q pool

0,0

Cyt bf Flux d’électrons non cyclique (produit une force proton-motrice)

+0,25

PC P700

+0,5

Lumière

Photosystème I

+0,75 e–

+1,0

NAD(P)H

QA

–0,25

E0′

Chl a0

PSI

P680 Photosystème II

H2O 1 –O + 2 2

2H

Lumière

FIGURE 17.19 Flux d’électrons lors de la photosynthèse oxygénique (plantes vertes), le schéma en Z. Deux photosystèmes (PS) sont impliqués, PS I et PS II. Ph, phéophytine ; Q, quinone ; Chl, chlorophylle a ; Cyt, cytochrome ; PC, plastocyanine ; FeS, protéines fer-soufre sans hème ; Fd, ferrédoxine ; Fp, flavoprotéine ; P680 et P700 sont respectivement les chlorophylles des centres réactionnels PS II et PS I. Comparez avec la figure 17.14.

de la même manière, les deux formes de chlorophylle a sont liées à des protéines spécifiques de la membrane et interagissent comme on le voit sur la figure 17.19.

Les flux d’électrons lors de la photosynthèse oxygénique Le trajet du flux d’électrons chez les phototrophes oxygéniques ressemble à la lettre Z couchée sur le côté et la figure 17.19 montre ce trajet que l’on appelle « schéma en Z ». Le potentiel de réduction de la molécule de chlorophylle a P680 dans le photosystème II est très électropositif, plus positif même que celui du couple H2O/O2. Cela facilite la première étape du flux d’électrons oxygénique, la séparation de la molécule d’eau en atomes d’oxygène et d’hydrogène (voir figure 17.19), une réaction thermodynamiquement peu favorable. Un électron de l’eau est donné à la molécule P680 oxydée après l’absorption d’un quanta de lumière proche de 680 nm. L’énergie lumineuse convertit P680 en un réducteur modéré, capable de réduire une molécule ayant un E’0 d’environ – 0,5 V. La nature de cette molécule n’est pas vraiment connue, mais on pense que c’est une phéophytine a (chlorophylle a sans son atome de magnésium).

L’électron passe ensuite par plusieurs transporteurs membranaires incluant des quinones, des cytochromes et une protéine contenant du cuivre appelée plastocyanine. Cette dernière transfère les électrons au photosystème I. L’électron est accepté par la chlorophylle du centre réactionnel du photosystème I, P700, qui a auparavant absorbé des quanta de lumière et a démarré les étapes menant à la réduction du NADP+ (voir figure 17.18). Ces étapes impliquent un transfert d’électrons à travers plusieurs transporteurs possédant des E’0 de plus en plus positifs pour se terminer avec la réduction de NADP+ (voir figure 17.19).

La synthèse de l’ATP lors de la photosynthèse oxygénique En plus de la synthèse nette de pouvoir réducteur (c’est-à-dire NADPH), d’autres événements importants ont lieu lors du flux d’électrons dans la membrane d’un photosystème à l’autre. Lors du transfert d’un électron de l’accepteur du photosystème II à la molécule de chlorophylle du centre réactionnel du photosystème I, le transport d’électrons se déroule dans une direction favorable d’un point de vue thermodynamique (du négatif vers le positif). Cela



17.6 Fixation autotrophe du CO2 : le cycle de Calvin 557

produit une force proton-motrice à partir de laquelle de l’ATP peut être produit. Ce type de production d’ATP est appelé photophosphorylation non cyclique. En effet, lors de ce processus, les électrons ne sont pas recyclés pour réduire le P680 oxydé mais ils sont utilisés pour la réduction de NADP+. Quand il y a suffisamment de pouvoir réducteur, l’ATP peut être aussi produit chez les phototrophes oxygéniques par une photophosphorylation cyclique dans laquelle seul le photosystème I est impliqué (voir figure 17.18). Cela se produit quand les électrons passent de la ferrédoxine au complexe cytochrome bf à partir duquel le transport d’électrons renvoie l’électron sur le P700. Ce flux génère un potentiel de membranes et la synthèse de molécules supplémentaires d’ATP (voir la ligne en pointillé sur la figure 17.19).

La photosynthèse anoxygénique chez les phototrophes oxygéniques

Yehuda Cohen et Moshe Shilo

Normalement, les photosystèmes I et II fonctionnent ensemble dans le processus oxygénique. Cependant, sous certaines conditions, certaines algues et cyanobactéries peuvent mener à bien la photophosphorylation cyclique en utilisant le seul photosystème I et en obtenant le pouvoir réducteur pour la réduction du CO2 à partir d’autres sources que l’eau. Dans ce cas, c’est en fait de la photosynthèse anoxygénique. Un certain nombre de cyanobactéries peut utiliser le H2S comme donneur d’électrons pour la photosynthèse anoxygénique, tandis que les algues vertes peuvent utiliser le H2. Quand c’est du H2S qui est utilisé, il est oxydé en soufre élémentaire (S0) et des granules de soufre semblables à ceux produits par les bactéries vertes sulfureuses (voir figure 17.17b) sont déposés à l’extérieur des cellules. La figure 17.20 illustre ce phénomène chez la cyanobactérie Oscillatoria limnetica. Cette bactérie filamenteuse vit dans des mares salées riches en sulfure où elle mène à bien la photosynthèse anoxygénique en même temps que des bactéries photosynthétiques vertes et pourpres et génère du soufre comme produit d’oxydation du sulfure (voir figure 17.20). Dans des cultures d’O. limnetica,

FIGURE 17.20 Cellules de la cyanobactérie filamenteuse Oscillatoria limnetica cultivée en conditions anaérobies en présence de sulfite comme donneur d’électrons photosynthétiques. Notez les globules de soufre élémentaire (flèches), produits d’oxydation du sulfite, se formant en dehors des cellules.

le flux d’électrons en direction du photosystème II est fortement inhibé par le H2S et cet organisme doit mettre en œuvre la photosynthèse anoxygénique s’il veut survivre. D’un point de vue évolutif, l’existence de la photophosphorylation cyclique à la fois chez les phototrophes oxygéniques et anoxygéniques est une bonne indication de leur proche parenté. Les phototrophes oxygéniques comme Oscillatoria limnetica ont acquis le photosystème II et, par conséquent, la capacité de dissocier l’eau. Cependant, ils gardent quand même la capacité, sous certaines conditions, d’utiliser le seul photosystème I, tout comme les phototrophes anoxygéniques le font pendant la croissance phototrophe.

Contrôlez vos acquis Lors de la photosynthèse oxygénique, l’eau fournit les électrons pour mener à bien l’autotrophie ; l’oxygène en est un sous-produit. Deux réactions séparées de la phase claire sont impliquées, les photosystèmes I et II. Le photosystème I ressemble au système impliqué dans la photosynthèse anoxygénique. Le photosystème II est responsable de la dissociation de l’H2O pour produire de l’O2. •

Pourquoi le terme flux d’électrons non cyclique estil utilisé pour faire référence à la photosynthèse oxygénique ?

•

Quelles sont les différences principales entre les molécules de chlorophylle des deux centres réactionnels dans les photosystèmes I et II du point de vue de leurs propriétés d’absorption et leur E’0 ?

17.6 Fixation autotrophe du CO : m n le cycle de Calvin 2

On connaît plusieurs mécanismes biochimiques impliqués dans la fixation de CO2 et son incorporation dans le matériel cellulaire et donc nécessaires à la croissance autotrophe. Le plus répandu est le cycle de Calvin, nommé d’après son découvreur Melvin Calvin. Le cycle de Calvin nécessite du NAD(P)H et de l’ATP ainsi que deux enzymes clés : la ribulose bisphosphate carboxylase et la phosphoribulokinase. Le reste du cycle est mené à bien par une série d’enzymes qui sont présentes chez de nombreux organismes, à la fois autotrophes et hétérotrophes.

La RubisCO et la formation de PGA La première étape de la réduction du CO2 dans le cycle de Calvin est catalysée par l’enzyme ribulose bisphosphate carboxylase, ou RubisCO. La RubisCO est largement présente dans la nature, chez les bactéries pourpres, les cyanobactéries, les algues, les plantes vertes, la plupart des Bacteria chimiolithotrophes et même chez certaines Archaea halophiles et hyperthermophiles. La RubisCO catalyse la formation de deux molécules d’acide 3-phosphoglycérique (PGA) à partir du ribulose bisphosphate et du CO2, comme on le voit sur la figure 17.21. Le PGA est ensuite phosphorylé et réduit en un



558 Chapitre 17


H2C

(a)

H 2C

O

C

O

CO2 + H

C

OH

H

C

OH

H 2C

O

–OOC

PO3H2

H2C –OOC

PO3H2

Ribulose bisphosphate carboxylase (RubisCO)

H

PO3H2

O

C

OH

C

O

C

OH

H2C

O

PO3H2

OH

H COO– H

H2O

C

OH

H2C

PO3H2

Intermédiaire instable

Ribulose bisphosphate

O

C

O

PO3H2

Deux acides phosphoglycériques (PGA)

(b) HO

H2C

O

C

H

H2C

PO3H2 + ATP

COO–

H2O3P

H2C

OH

C

O

H

C

OH

H

C

OH

H2C

O

C

H

O

C

O

NADPH

PO3H2

+ ATP Phosphoribulokinase

PO3H2

Ribulose 5-phosphate

H2C

O

C

O

H

C

OH

H

C

OH

H2C

O

H2C HO

+ ADP

Acide 1,3-biphosphoglycérique

Acide phosphoglycérique (c)

O

HO

PO3H2

H

HC

O

PO3H2 + Pi + NADP+


PO3H2

+

O

C

Vers la biosynthèse

ADP

Le cycle se répète en partant de (a)

Ribulose bisphosphate

FIGURE 17.21 Réactions clés du cycle de Calvin. (a) Réaction catalysée par l’enzyme ribulose bisphosphate carboxylase. (b) Étape de la conversion de l’acide 3-phosphoglycérique (PGA) en 3-phosphoglycéraldéhyde. Notez qu’à la fois de l’ATP et du NADPH sont nécessaires. (c) Conversion du ribulose 5-phosphate en ribulose bisphosphate, une molécule accepteur de CO 2, par l’enzyme phosphoribulokinase.

intermédiaire clé de la glycolyse, le glycéraldéhyde 3-phosphate (voir section 5.10). À partir de là, le glucose peut être formé par l’inversion des premières étapes de la glycolyse (voir figure 5.14).

La stœchiométrie du cycle de Calvin Il est commode de considérer que les réactions du cycle de Calvin consistent en l’incorporation de six molécules de CO2, nécessaires à la production d’une molécule de glucose (C6H12O6). Pour que la RubisCO puisse incorporer 6 molécules de CO2, 6 molécules de ribulose bisphosphate sont nécessaires en tant que molécules acceptrices (voir figure 17.22). Cela produit 12 molécules d’acide 3-phosphoglycérique (c’est-à-dire 36 atomes de carbone). Ces 12 molécules forment les squelettes carbonés pour 6 nouvelles molécules de ribulose bisphosphate (30 atomes de carbone) et une molécule d’hexose (6 carbones) pour la biosynthèse cellulaire. Une série complexe de réarrangements impliquant des intermédiaires en C3, C4, C5, C6 et C7 produit finalement les 6 molécules de ribulose 5-phosphate à partir desquelles les 6 molécules de ribulose bisphosphate sont générées. L’étape finale de cette régénération est la phosphorylation du ribulose 5-phosphate par l’ATP grâce à l’enzyme phosphoribulokinase (voir figure 17.21c). Comme la RubisCO, cette enzyme est aussi spécifique du cycle de Calvin.

Si l’on considère la stœchiométrie globale du cycle de Calvin (voir figure 17.22), 12 molécules d’ATP et 12 de NADPH sont nécessaires pour la réduction de 12 molécules d’acide phosphoglycérique (PGA) en glycéraldéhyde 3-phosphate. Six molécules d’ATP de plus sont nécessaires pour la conversion du ribulose phosphate en ribulose bisphosphate. Par conséquent, 12 NADPH et 18 ATP sont nécessaires pour synthétiser 1 hexose à partir de 6 molécules de CO2 par le cycle de Calvin. Les molécules d’hexose peuvent être converties en polymères de stockage tels que le glycogène, l’amidon, ou les poly-β-hydroxyalkanoates (voir section 4.11) qui seront utilisés plus tard pour fabriquer du nouveau matériel cellulaire.

Les carboxysomes Plusieurs procaryotes autotrophes qui utilisent le cycle de Calvin pour la fixation du CO2 produisent des inclusions cellulaires en forme de polyèdre appelées carboxysomes. Ces inclusions, qui mesurent environ 100 nm de diamètre, sont entourées par une membrane mince et consistent en un réseau cristallin dense de molécules de RubisCO (voir figures 17.23 et 12.10a). On pense que les carboxysomes constituent un mécanisme pour accroître la quantité de RubisCO dans la cellule afin de permettre une fixation du CO2 plus rapide sans



17.7 Fixation autotrophe du CO2 : cycle inverse de l’acide citrique et cycle de l’hydroxypropionate 559

6 CO2

12 3-Phosphoglycérate (36 carbones)

12 1,3-Biphosphoglycérate (36 carbones) 12 NAD(P)H

Jessup M. Shively

6 Ribulose 1,5-bisphosphate (30 carbones)

12 ATP

12 Glycéraldéhyde 3-phosphate (36 carbones)

FIGURE 17.23 Enzymes du cycle de Calvin sous forme cristalline : les carboxysomes. Carboxysomes purifiés à partir de la bactérie chimiolithotrophe oxydant le soufre, Thiobacillus neapolitanus, observés en microscopie électronique. Ces structures font environ 100 nm de diamètre. Les carboxysomes sont présents dans une grande variété de procaryotes obligatoirement phototrophes.

6 ATP 6 Ribulose 5-phosphate (30 carbones) Réarrangements des sucres

10 Glycéraldéhyde 3-phosphate (30 carbones)

Fructose 6-phosphate (6 carbones)

Vers la biosynthèse Stœchiométrie globale : 6 CO2 + 12 NADPH + 18 ATP C6H12O6(PO3H2) + 12 NADP+ + 18 ADP + 17 Pi

FIGURE 17.22 Le cycle de Calvin. On voit la production d’une molécule d’hexose à partir du CO2. Pour six molécules de CO2 incorporées, une molécule de fructose 6-phosphate est produite. Chez les phototrophes, l’ATP provient de la photophosphorylation et le NAD(P)H, d’un flux d’électrons inverse ou de la lumière. Utilisez le code couleur pour suivre les réactions biochimiques de la figure 17.21.

influer sur l’osmolarité du cytoplasme (la pression osmotique n’est pas affectée parce que le carboxysome est insoluble). Des carboxysomes ont été observés chez les bactéries chimiolithotrophes obligatoires oxydant le soufre, les bactéries nitrifiantes et les cyanobactéries (voir sections 12.3, 12.4, 12.26 et 12.27). Ils sont absents chez les phototrophes facultatifs (les organismes qui peuvent pousser soit comme des autotrophes, soit comme des hétérotrophes) tels que les phototrophes oxygéniques pourpres. Par conséquent, le carboxysome apparaît être une adaptation évolutive à la vie sous des conditions strictement autotrophes.

Contrôlez vos acquis La fixation du CO2 par la plupart des organismes phototrophes et certains autotrophes se produit grâce au cycle de Calvin dans lequel l’enzyme ribulose bisphosphate carboxylase (RubisCO) joue un rôle clé. Le cycle de Calvin est un processus qui nécessite de l’énergie et dans lequel le CO2 est converti en sucre. •

Quelle est la réaction effectuée par l’enzyme ribulose bisphosphate carboxylase ?

•

Pourquoi la croissance autotrophe nécessite-t-elle du pouvoir réducteur ?

•

Qu’est-ce qu’un carboxysome ?

17.7 Fixation autotrophe du CO : m n cycle inverse de l’acide citrique 2

et cycle de l’hydroxypropionate

Des mécanismes alternatifs de fixation autotrophe du CO2 sont présents chez les bactéries vertes sulfureuses et non sulfureuses. Chez la bactérie verte sulfureuse Chlorobium (voir figures 17.7a et b), la fixation du CO2 se déroule grâce à une inversion des étapes du cycle de l’acide citrique (voir figure 5.22), une voie métabolique appelée cycle inverse de l’acide citrique (voir figure 17.24a). Chlorobium contient deux enzymes ferrédoxine liées qui catalysent la réduction du CO2 en des intermédiaires du cycle de l’acide citrique. Les deux réactions catalysées impliquent la carboxylation de l’acétyl-CoA en α-cétoglutarate et la carboxylation de l’acétyl-CoA en pyruvate (figure 17.24a). La plupart des autres réactions du cycle inverse de l’acide citrique sont catalysées par des enzymes qui fonctionnent à l’envers de la direction oxydative normale. Une exception est constituée par le citrate lyase, une enzyme dépendant de l’ATP qui sépare le citrate en acétyl-CoA et en oxaloacétate chez les bactéries vertes soufrées. Dans la direction oxydative du cycle, le citrate est produit à partir des mêmes précurseurs par l’enzyme citrate synthétase (voir figure 5.22). Le cycle inverse de l’acide citrique en tant que mécanisme d’autotrophie a été observé chez certains hyperthermophiles, y compris des Archaea comme Thermoproteus (voir section 13.9), et chez Aquifex, un autotrophe qui se trouve sur une branche située à la base de l’arbre phylogénétique des Bacteria (voir figure 12.1 et section 12.37). Ces découvertes indiquent que cette voie métabolique pourrait être plus répandue que l’on ne le pensait auparavant et suggèrent même qu’elle pourrait représenter une forme d’autotrophie très ancienne d’un point de vue évolutif.

L’autotrophie chez Chloroflexus Le phototrophe vert non sulfureux Chloroflexus (voir section 12.35) croît de manière autotrophe en utilisant soit de l’H2, soit de l’H2S comme donneurs d’électrons. Cependant ni le cycle de Calvin ni le cycle inverse de l’acide citrique n’existent



560 Chapitre 17

Diversité métabolique Matériel cellulaire

Héxose-P

Triose-P

FIGURE 17.24 Voies métaboliques spéciales chez les bactéries vertes ADP phototrophes. (a) Le cycle de l’acide 2H 2H citrique inverse est le mécanisme de ATP Oxaloacétate Phosphoénolpyruvate fixation du CO2 chez la bactérie verte sulfureuse Chlorobium (voir aussi AMP figure 17.17b ; section 12.32). La ferréMalate ATP doxinerouge indique les réactions de carboxylation qui nécessitent de la Fumarate Pyruvate 2H ferrédoxine réduite (2 H à chaque fois). La ferrédoxine réduite est généSuccinate CO2 Ferrédoxinered rée chez Chlorobium par des ATP Succinyl-CoA réactions de la phase claire (voir Acétyl-CoA figure 17.18). En partant de Ferredoxinred CO2 Citrate l’oxaloacétate, chaque cycle résulte ATP α-cétoglutarate 2 H en l’incorporation de trois molécules Réaction nette : de CO2 et la pro-duction de pyruvate. Isocitrate 3 CO2 + 12 H + 5 ATP triose-P CO2 Le clivage par l’enzyme citrate lyase, dépendant de l’ATP, régénère (a) l’accepteur C4 oxalo-acétate et produit de l’acétyl-CoA pour la biosynthèse. La conversion du CO2 Matériel cellulaire pyruvate en phosphoénolpyruvate O consomme l’équivalent de deux liaisons phos-phate haute-énergie. CH3 C CoA O (b) La voie bio-chimique de l’hydroATP (Acétyl-CoA) HOOC CH2 C CoA xypropionate est la voie privilégiée de COOH l’autotrophie chez la bactérie verte ATP CHO 4H non sulfureuse Chloroflexus (section Malyl CoA 12.35). L’acétyl-CoA est carboxylé Glyoxylate O deux fois afin de produire du méthylCH2OH CH2 C CoA malonyl-CoA. Cet intermédiaire est Succinyl CoA (Hydroxypropionyl-CoA) réarrangé pour pro-duire de l’acétylCoA et du glyoxylate. Ce dernier est 2H CO2 O converti en matériel cellulaire probaH O Réaction nette : CoA blement grâce à une glycine ou une CH3CH2C COOH C C CoA 2 CO2 + 6 H + 3 ATP glyoxylate (Propionyl-CoA) sérine intermédiaires. La source du CH3 pouvoir réducteur dans la voie de ATP (b) (Méthylmalonyl-CoA) l’hydroxypropionate est le NADPH.

chez cet organisme. À la place, des molécules de CO2 sont réduites en glyoxylate par une voie métabolique cyclique spécifique, la voie de l’hydroxypropionate (voir figure 17.24b). Cette voie métabolique résulte en la synthèse d’hydroxypropionate comme intermédiaire clé. Chez les bactéries phototrophes, l’existence de la voie de l’hydroxypropionate n’a été démontrée que chez Chloroflexus, le phototrophe anoxygénique qui se trouve le plus près de la base de l’arbre des Bacteria (voir figure 12.1). Cela suggère que la voie de l’hydroxypropionate pourrait avoir été le premier essai d’autotrophie chez les phototrophes anoxygéniques. Si Chloroflexus est apparu longtemps avant les autres organismes phototrophes, comme l’arbre des Bacteria le suggère (voir figure 12.20), la voie de l’hydroxypropionate a peut-être constitué la première voie autotrophe chez les organismes phototrophes. Mais en plus de Chloroflexus, la voie de l’hydroxypropionate fonctionne aussi chez certaines Archaea hyperthermophiles, en particulier Metallosphaera, Acidianus et Sulfolobus (voir section 13.9). Tous ces organismes sont des procaryotes non phototrophes et se trouvent à la base de

l’arbre des Archaea. Les racines de la voie de l’hydroxypropionate doivent donc être très profondes du point de vue de l’évolution ; c’est peut-être le premier essai d’autotrophie dans la nature.

Contrôlez vos acquis Le cycle inverse de l’acide citrique et le cycle de l’hydroxypropionate sont des voies métaboliques de fixation du CO2 que l’on trouve respectivement chez les bactéries vertes sulfureuses et non sulfureuses. •

En incluant le mode de fixation du CO2, présentez au moins trois aspects permettant de distinguer une bactérie pourpre sulfureuse d’une bactérie verte sulfureuse.

•

En incluant le mode de fixation du CO2, quelles sont les similitudes et les différences entre les bactéries vertes sulfureuses et non sulfureuses ?



17.8 Donneurs d’électrons inorganiques et énergétique 561

II

CHIMIOLITHOTROPHIE : ÉNERGIE OBTENUE DE L’OXYDATION DE DONNEURS D’ÉLECTRONS INORGANIQUES

Le chapitre 5 a traité des micro-organismes dont le métabolisme énergétique est basé sur la chimio-organotrophie, c’està-dire l’utilisation de composés organiques comme sources d’énergie. Les quatre sections qui suivent seront consacrées aux chimiolithotrophes, en soulignant les stratégies, les problèmes et les avantages d’un mode de vie conçu pour utiliser les molécules inorganiques comme source d’énergie.

17.8 Donneurs d’électrons m n inorganiques et énergétique Les organismes qui obtiennent de l’énergie en oxydant des composés inorganiques sont appelés chimiolithotrophes. La plupart des bactéries chimiolithotrophes obtiennent également leur carbone du CO2 et sont appelées autotrophes. Comme cela a été précisé, un organisme se développant en utilisant le CO2 comme seule source de carbone requiert : 1) de l’énergie (ATP), et 2) un pouvoir réducteur. Certains chimiolithotrophes sont mixotrophes, c’est-à-dire que bien qu’ils obtiennent de l’énergie de l’oxydation de composés inorganiques, ils requièrent un composé organique comme source de carbone. Chez les chimiolithotrophes, la génération d’ATP est en principe identique à celle des chimio-organotrophes, à la différence près que le donneur d’électrons est inorganique et non organique. La synthèse d’ATP est couplée à l’oxydation du donneur d’électrons. Chez les chimiolithotrophes, le pouvoir réducteur provient soit directement du composé inorganique, si son potentiel de réduction est suffisamment bas, ou des réactions du transport inverse d’électrons, comme cela a été présenté dans la section 17.5 à propos des bactéries pourpres phototrophes.

Les sources de donneurs d’électrons inorganiques Les chimiolithotrophes utilisent plusieurs sources de donneurs d’électrons inorganiques, de nature géologique, biologique ou anthropogénique. L’activité volcanique représente la source principale de composés soufrés réduits, essentiellement de l’H2S. L’agriculture et les activités minières apportent dans l’environnement des donneurs d’électrons inorganiques, particulièrement des composés contenant de l’azote et du fer, via la combustion de carburants fossiles et les rejets industriels. Les sources biologiques sont également importantes et concernent la production d’H2S, H2 et NH3. La réussite écologique (voir chapitre 19) et la diversité métabolique des chimiolithotrophes soulignent l’abondance des sources et des réserves de donneurs d’électrons inorganiques dans la nature.

L’énergétique des chimiolithotrophes La lecture des potentiels de réduction présentés dans le tableau A1.2 montre qu’un nombre important de composés inorganiques peuvent produire assez d’énergie pour la synthèse d’ATP, lors de leur oxydation par O2, comme accepteur d’électrons. Dans le chapitre 5, il a été montré que plus les deux demi-réactions présentent une grande différence de potentiel (E0’), plus la quantité d’énergie libérée est grande.

Par exemple, la différence de potentiel entre le couple H+/H2 et le couple 1--- O2/H2O est égale à – 1,23 V, ce qui correspond 2 à une quantité d’énergie libre de – 237 kJ/mole (voir l’annexe 1 pour le calcul). D’autre part, la différence de potentiel entre le couple H+/H2 et le couple NO3–/NO2– est inférieure, –0,84 V, soit une énergie libre de –163 kJ/mole. Ceci est encore suffisant pour la production d’ATP (la liaison phosphate riche en énergie de l’ATP a une énergie libre de –31,8 kJ/mole, tableau 17.6). Cependant, le même genre de calcul montrera que l’oxydation de H2S par CO2, ici accepteur d’électrons, ne produira pas assez d’énergie pour la synthèse d’un ATP. De tels calculs permettent de prévoir quels types de chimiolithotrophes peuvent exister dans la nature. Les organismes devant obéir aux lois de la thermodynamique, seules les réactions thermodynamiquement favorables sont des réactions potentiellement génératrices d’énergie (voir aussi section 17.21). Le tableau 17.1 résume les quantités d’énergie libre produites par des réactions effectuées par des micro-organismes chimiolithototrophes. Les organismes eux-mêmes seront présentés dans les chapitres 12 et 13, tandis que les aspects écologiques de la chimiolithotrophie seront abordés dans le chapitre 19. Nous y verrons que les réactions chimiolithotrophes sont au cœur de la plupart des cycles nutritionnels.

Contrôlez vos acquis Les chimiolithotrophes sont capables d’oxyder les composés inorganiques comme seule source d’énergie et de pouvoir réducteur. La plupart des chimiolithotrophes sont aussi capables de croissance en autotrophie. •

Quelles sont les deux raisons pour lesquelles les chimiolithotrophes utilisent des composés inorganiques ?

•

Pourquoi l’oxydation de H2 produit-elle plus d’énergie avec O2 comme accepteur d’électrons qu’avec SO42– ?

17.9 Oxydation de l’hydrogène m n L’hydrogène est un produit courant du métabolisme microbien et de nombreux chimiolithotrophes sont capables de l’utiliser comme donneur d’électrons au cours du métabolisme énergétique. Il existe de nombreuses Bacteria et Archaea oxydant l’hydrogène et se différenciant selon l’accepteur d’électrons utilisé (nitrate, sulfate, fer ferrique ou autres). Ces organismes seront présentés plus tard dans ce chapitre (voir sections 17.14-17.18). Seules les hydrogénobactéries aérobies seront traitées ici.

L’énergétique de l’oxydation de H2 La génération d’ATP au cours de l’oxydation de H2 résulte de l’oxydation de H2 par O2, ce qui conduit à la formation d’une force proton-motrice. La réaction s’écrit : H2 +

1 --2

O2 → H2O

∆G0’ = –237 kJ



562 Chapitre 17


TABLEAU 17.1

QUANTITÉS D’ÉNERGIE LIBRE PRODUITES PAR OXYDATION DE DIFFÉRENTS DONNEURS D’ÉLECTRONS a INORGANIQUES

Donneur d’électrons

Type de E0’ du ∆G0’ Nombre ∆G0’ chimiolithotrophe couple (V) (kJ/réaction) d’électrons (kJ/2e–)

Réaction

Phosphiteb

4 HPO32– + SO42– + H+ → 4 HPO42– + HS–

Phosphito-bactéries

– 0,69

– 91

2

– 91

Hydrogène

H2 + 1 --- O2 → H2O

Hydrogéno-bactéries

– 0,42

– 237,2

2

– 237,2

Sulfure

0 HS– + H+ + 1 --- O2 → S + H2O

Sulfo-bactéries

– 0,27

– 209,4

2

– 209,4

Soufre

2– + S0 + 1 1 --- O2 + H2O → SO4 + 2 H

Sulfo-bactéries

– 0,20

– 587,1

6

– 195,7

Ammoniumc

– + NH4+ + 1 1 --- O2 → NO2 + 2 H + H2O

Bactéries nitrifiantes

+ 0,34

– 274,7

6

– 91,6

Nitrite

– NO2– + 1 1 --- O2 → NO3

Bactéries nitrifiantes

+ 0,43

– 74,1

2

– 74,1

Fer ferrique

1 3+ Fe2+ + H+ + 1 --- O2 → Fe + --- H2O

Ferro-bactéries

+ 0,77

– 32,9

1

– 65,8

2

2

2

2

2

4 2 a Données calculées d’après les valeurs de l’annexe 1. Les valeurs données pour Fe2+ correspondent à pH = 2 ; les autres valeurs, à pH = 7. À pH = 7, le E0’ du couple Fe3+/Fe2+ est d’environ + 0,2 V. b À l’exception du phosphite, toutes les réactions ont lieu avec O2 comme accepteur d’électrons. L’oxydation du phosphite est seulement connue avec SO4 2– comme accepteur d’électrons. c L’ammonium peut aussi être oxydé avec NO2– comme accepteur d’électrons par les organismes anammox (voir section 17.12).

Cette réaction est très exergonique et permet la synthèse d’au moins un ATP. La réaction est catalysée par une enzyme nommée hydrogénase. Les électrons libérés par H2 sont transférés à une quinone, puis passent par une série de cytochromes pour finalement réduire O2 en eau (voir figure 17.25). Quelques hydrogénobactéries ont deux hydrogénases, l’une soluble et l’autre membranaire (voir tableau 12.6). Dans ce cas, l’enzyme membranaire est impliquée dans les processus énergétiques, tandis que l’hydrogénase soluble réduit NAD+ en NADH (le potentiel de réduction de H2, – 0,42 V, est si bas que le flux

inverse d’électrons n’est pas nécessaire pour assurer le pouvoir réducteur) [voir figure 17.25]. Ralstonia eutropha est un modèle pour l’étude de l’oxydation de H2 et quelques-unes de ses propriétés ont été présentées dans la section 12.5.

L’autotrophie chez les hydrogénobactéries Bien que la plupart des hydrogénobactéries puissent aussi croître en chimio-organotrophie, en chimiolithotrophie, elles fixent le CO2 via le cycle de Calvin (voir section 17.6). La réaction globale s’écrit : 6 H2 + 2 O2 + CO2 → (CH2O) + 5 H2O

Extérieur

H2

H+

H+

H+

H+

H2ase Q

ATPase Intérieur

e–

cyt b

NAD+ H2ase

cyt c

cyt a

1/ O 2 2

CO2 + ATP

NADH

Cycle de Calvin

H2O ADP

ATP

Matériel cellulaire FIGURE 17.25 Bioénergétique et fonction des deux hydrogénases des hydrogénobactéries aérobies. Chez Ralstonia eutropha, lorsque deux hydrogénases sont présentes, l’hydrogénase membranaire est impliquée dans la production d’énergie, tandis que l’hydrogénase cytoplasmique fabrique NADH pour le cycle de Calvin. Notez comment l’hydrogénase membranaire initie le flux d’électrons conduisant à la formation d’une force proton-motrice. Quelques hydrogénobactéries possèdent seulement l’hydrogénase membranaire et, chez ces organismes, le pouvoir réducteur provient du flux inverse d’électrons. H2ase, hydrogénase ; cyt, cytochrome ; Q, quinone.

Dans cette réaction (CH2O) représente le matériel cellulaire. Cependant, lorsque des composés organiques utilisables sont présents, la synthèse des enzymes du cycle de Calvin et de l’hydrogénase est réprimée chez les hydrogénobactéries aérobies typiques. Dans la nature, les concentrations en H2 sont variables dans les environnements oxygénés et plutôt faibles. Aussi est-il vraisemblable que les hydrogénobactéries aérobies régulent précisément leurs enzymes cataboliques. Ces organismes passent vraisemblablement souvent de la chimio-organotrophie à la chimiolithotrophie, selon les concentrations disponibles de composés organiques et d’hydrogène dans leurs habitats. De plus, de nombreuses hydrogénobactéries aérobies se développent mieux en microaérophilie. Il est alors vraisemblable que ces organismes réussissent mieux que les hydrogénobactéries chimiolithotrophes aux interfaces oxique/anoxique, où l’H2 produit par le métabolisme fermentatif sera plus abondant et plus régulier que dans les milieux fortement oxygénés.

17.10 Oxydation des composés soufrés m n réduits De nombreux composés soufrés réduits peuvent être utilisés comme donneurs d’électrons par diverses bactéries sulfo-oxydantes, nommées parfois incolores pour les distinguer des bactéries sulfureuses vertes et pourpres contenant de la bactériochlorophylle (pigmentées) présentées au début de ce chapitre (voir



17.10 Oxydation des composés soufrés réduits 563

figure 17.7). En fait, le concept de chimiolithotrophie émergea des travaux sur les bactéries du soufre réalisés par le célèbre microbiologiste russe Sergei Winogradsky (voir le focus « Winogradsky et la chimiolithotrophie », et section 1.7).

L’énergétique de l’oxydation du soufre Les composés soufrés les plus couramment utilisés comme donneurs d’électrons sont l’hydrogène sulfuré (H2S), le soufre élémentaire (S0) et le thiosulfate (S2O32–). Le produit final de l’oxydation des composés soufrés est le plus souvent l’ion sulfate (SO42–), et le nombre total d’électrons impliqués entre H2S (degré d’oxydation –2) et le sulfate (degré d’oxydation + 6) est de 8 (voir tableau 17.3 pour un résumé des degrés d’oxydation du soufre). L’utilisation de l’un des intermédiaires de l’oxydation du soufre produit moins d’énergie :

Cellules

Cristal de souffre

H2S + 2 O2 → +2H (produit final, sulfate)

∆G0’ = – 798,2 kJ/ réaction

HS– + 1--- O2 + H+ → S0 + H2O 2 (produit final, soufre)

∆G0’ = – 209,4 kJ/réaction

1 --2

2–

+

S + H2O + 1 O2 → SO4 + 2 H (produit final, sulfate) ∆G0’ = – 587,1 kJ/réaction S2O32– + H2O + 2 O2 → 2 SO42– + 2 H+ (produit final, sulfate) ∆G0’ = – 818,3 kJ/réaction (– 409,1 kJ/S atome de S oxydé) L’oxydation du composé soufré le plus fréquemment réduit (H2S) se déroule en plusieurs étapes et la première donne du soufre élémentaire S0. Quelques bactéries oxydant H2S déposent le S0 à l’intérieur de la cellule (voir figure 17.26a). Le soufre ainsi déposé constitue une réserve d’énergie. Lorsque H2S aura été épuisé, de l’énergie supplémentaire sera obtenue de l’oxydation du soufre en sulfate. Lorsque le soufre élémentaire en temps que donneur d’électrons a une origine extérieure, l’organisme peut croître attaché à une particule de soufre, en raison de la forte insolubilité du soufre élémentaire (voir figure 17.26b). L’adhésion à la particule permet à l’organisme de prélever les atomes de soufre pour l’oxydation en sulfate. Ce processus se réalise vraisemblablement grâce à l’action de la membrane ou de protéines périplasmiques qui solubilisent le soufre, sans doute en le réduisant en H2S, ce qui permet le transport dans la cellule et son entrée dans le métabolisme chimiolithotrophe (voir figure 17.27). L’un des produits des réactions d’oxydation du soufre est H+. La production de protons diminue le pH. En conséquence, l’un des résultats de l’oxydation du soufre est l’acidification du milieu. L’acide ainsi formé est un acide fort, l’acide sulfurique H2SO4, et les bactéries sulfo-oxydantes sont souvent capables d’entraîner une réduction de pH du milieu.

Biochimie et énergétique de l’oxydation du soufre Les étapes biochimiques de l’oxydation de divers composés soufrés sont résumées dans la figure 17.27. En partant des sulfures, des sulfites (SO32–) sont produits, ce qui implique 6 électrons. Si le substrat de départ est S0, du sulfite est aussi produit, bien que S0 soit d’abord réduit en sulfures (voir figure 17.27a). Il y a deux voies d’oxydation de SO32– en

T.D. Brock

+

SO42–

0

(a)

(b) FIGURE 17.26 Sulfo-bactéries. (a) Dépôts de granules de soufre intracellulaires par Beggiatoa. (b) Sulfolobus acidocaldarius (Archaea) sur un cristal de soufre élémentaire. Les cellules sont observées au microscope à fluorescence après coloration à l’acridine orange. Le cristal de soufre n’est pas fluorescent. La figure 17.27 décrit l’oxydation du soufre et des sulfures pour former de l’ATP.

SO42–. La voie la plus commune utilise l’enzyme sulfite oxydase. La sulfite oxydase transfère les électrons directement de SO32– au cytochrome c, et de l’ATP est formé au cours du transfert d’électrons suite à la formation d’une force protonmotrice (voir figure 17.27b). Outre la sulfite oxydase, quelques bactéries sulfo-oxydantes oxydent SO32– en SO42– via l’activité inverse de l’adénosine phosphosulfate (APS) réductase, une enzyme essentielle pour le métabolisme des bactéries sulfato-réductrices (comparez les figures 17.27a et 17.38). Cette réaction qui conduit à la production de SO42– par ces chimiolithotrophes donne une liaison phosphate haute énergie, lorsque l’AMP est converti en ATP (voir figure 17.27a). Lorsque le thiosulfate est le donneur d’électrons, il est partagé entre S0 et SO32–, les deux formes étant finalement oxydées en SO42–. Tous les électrons venant des composés soufrés réduits atteignent finalement le système de transport d’électrons comme cela est montré dans la figure 17.27b. En fonction du E0’ du couple, les électrons entrent dans la chaîne de transport soit au niveau de la flavoprotéine (E0’ = –0,2) ou du cytochrome c (E0’ = +0,3), et sont transférés à O2, générant une force protonmotrice qui conduit à la synthèse d’ATP par une ATPase. Les électrons nécessaires à la fixation autotrophe du CO2 viennent du flux inverse d’électrons (voir section 17.5), donnant finalement NADH, et le CO2 est fixé au cours du cycle de Calvin (voir figure 17.27b). Bien que les chimiolithotrophes sulfooxydants soient essentiellement un groupe aérobie (voir section 12.4), quelques espèces peuvent croître en anaérobiose en utilisant le nitrate comme accepteur d’électrons ; Thiobacillus denitrificans est un exemple classique pour ce métabolisme.



564 Chapitre 17

FOCUS


Winogradsky et la chimiolithotrophie

Le concept d’autotrophie chimiolithotrophe a été imaginé par le célèbre microbiologiste russe Sergei Winogradsky (voir section 1.7). Winogradsky étudiait les bactéries sulfureuses, car certaines bactéries sulfureuses incolores (Beggiatoa, Thiotrix) sont très grandes (voir figure 1) et faciles à étudier, même en l’absence de cultures pures. Les sources dont l’eau contient de l’hydrogène sulfuré sont fréquentes dans le monde. Dans le district d’Oberland en Suisse, d’abondantes populations de Beggiatoa et Thiotrix se développent dans les ruisseaux issus des sources sulfureuses. C’est là que Winogradsky a trouvé le matériel idéal pour des études de microscopie et physiologie en prélevant simplement les masses filamenteuses blanchâtres constituées de cellules (voir section 12.4 et figures 12.11 et 12.13) et en expérimentant directement sur le terrain. Winogradsky montra en premier que les bactéries sulfureuses incolores étaient présentes seulement dans l’eau contenant H2S. Quand l’eau s’écoule de la source, l’H2S diminue progressivement, ainsi que les bactéries sulfureuses incolores. Ceci suggérait que leur développement dépendait de la présence d’H2S. Winogradsky montra alors que lorsque les filaments de Beggiatoa étaient privés de sulfures, ils perdaient leurs granules de soufre. Il trouva cependant que les granules étaient rapidement reformés si on ajoutait une petite quantité d’H2S (voir figure 1). Il en conclut que H2S était oxydé en soufre élémentaire. Mais qu’arrive-t-il aux granules de soufre lorsque les filaments sont privés d’H 2S ? Winogradsky montra grâce à quelques tests habiles que lorsque les granules de soufre disparaissaient, du sulfate apparaissait dans le milieu. Il conclut que Beggiatoa (et par extrapolation les autres bactéries sulfureuses incolores) oxydaient H2S en soufre élémentaire, puis en sulfate (H2S → S0 → SO42–). Cet organisme sem-

blant nécessiter H2S pour son développement dans les sources, il proposa plus tard que cette oxydation représentait la source d’énergie principale de ces organismes. Les travaux de Winogradsky sur Beggiatoa démontraient ainsi pour la première fois qu’un organisme pouvait oxyder une substance inorganique en temps que source d’énergie. Ces observations furent à l’origine du concept de chimiolithotrophie. Winogradsky s’intéressa ensuite aux bactéries nitrifiantes, et c’est sur ce groupe qu’il montra pour la première fois que la fixation autotrophe du CO2 était couplée à l’oxydation d’un composé inorganique. Le processus de nitrification était connu avant le travail de Winogradsky par les études consacrées au devenir des eaux usées ajoutées au sol. Par exemple, les effluents passant au travers d’une colonne de sol montraient la conversion de l’ammoniac en nitrate. Winogradsky partit de ces observations pour isoler des bactéries nitrifiantes en utilisant un milieu de culture strictement minéral dans lequel le CO 2 était la seule source de carbone et l’ammoniac le seul donneur d’électrons. L’ammoniac étant chimiquement stable, il était facile de montrer que l’oxydation de l’ammoniac en nitrite, puis en nitrate, était un processus strictement bactérien. En fait, Winogradsky montra ensuite que la nitrification était un processus en deux étapes, avec un groupe d’organismes transformant NH4+ en NO2– et un second transformant NO2– en NO3– (voir section 17.12). Aucune matière organique n’étant présente dans le milieu, il était aussi possible de montrer que la matière organique (le matériel cellulaire bactérien) était formée à partir du CO2. Lorsque l’ammoniac ou le nitrite était supprimé du milieu, aucune croissance n’intervenait. Des analyses chimiques fines montrèrent que la quantité de matière organique formée par les bactéries était proportionnelle à la quantité d’ammoniac ou de nitrite

oxydée. Winogradsky conclut : « ce processus est en contradiction avec la doctrine fondamentale de la physiologie qui dit qu’une synthèse complète de matière organique ne peut s’effectuer dans la nature, sauf par les plantes contenant de la chlorophylle sous l’action de la lumière. » Le concept de chimiolitho-autotrophie était né. Nous savons maintenant que l’autotrophie est d’une certaine façon semblable chez la plupart des chimiolithotrophes et les phototrophes. Dans les deux groupes, la voie de fixation du CO2 suit les mêmes étapes (le cycle de Calvin) impliquant l’enzyme ribulose-biphosphate carboxylase (voir section 17.6).

Figure 1 Beggiatoa et la chimiolithotrophie. Dessins de Beggiatoa par Winogradsky, dans Winogradsky, S. 1949. Microbiologie du Sol. Masson, Paris. Fig.1. Un bout de filament de Beggiatoa alba : a, dans l’eau sulfureuse, b, après 24 heures dans l’eau privée de H2S, c, après encore 48 heures dans l’eau sans H2S Fig.2. Bout de filament de Beggiatoa media Fig.3. Bout de filament de Beggiatoa minima


chimiolithotrophes sont aussi autotrophes et fixent le CO2 par le cycle de Calvin.

L’hydrogène (H2) et les composés soufrés réduits tels que H2S et S0 sont d’excellents donneurs d’électrons pour les chimiolithotrophes. Ces composés peuvent être oxydés par les hydrogénobactéries ou les bactéries sulfato-réductrices, générant ainsi une force proton-motrice et permettant la synthèse d’ATP. Ces

•

Quelle enzyme particulière est nécessaire pour la croissance sur H2 ?

•

Combien d’électrons sont-ils disponibles pour l’oxydation de H2S si S0 est le produit final ? si SO42– est le produit final ?



17.11 Oxydation du fer 565 Sulfure H2S

Soufre élémentaire

S0

Complexe R soufré cellulaire

S

Thiosulfate

S2O32–

S

Chaîne de transport d’électrons

e– SO32–

Sulfite

AMP APS réductase

2e–

2e–

Adénosine phosphosulfate (APS)

Sulfite oxidase

Pi

ADP

Phosphorylation au niveau du substrat SO42–

ferrobactéries doivent oxyder de grandes quantités de fer afin d’assurer leur croissance. Le fer ferrique produit forme des précipités insolubles d’hydroxydes ferriques [Fe(OH)3] dans l’eau (voir figure 17.28). Ceci est dû en partie au fait qu’à pH neutre, le fer ferreux est rapidement oxydé en fer ferrique par des processus abiotiques. Il est ainsi stable pour de longues périodes seulement en conditions anoxiques. Cependant, à pH acide, le fer ferreux est stable en conditions oxygénées. Cela explique pourquoi la plupart des bactéries ferro-oxydantes sont des acidophiles obligatoires. Les bactéries ferro-oxydantes les mieux connues, Acidithiobacillus ferrooxidans et Leptospirillum ferrooxidans peuvent toutes deux croître en autotrophie en utilisant le fer ferreux (voir figure 17.28b) comme donneur d’électrons. Les deux espèces peuvent croître à des pH inférieurs à 1. Ces organismes sont très communs dans des environnements soumis à des pollutions acides comme les déchets de mines de charbon (voir figure 17.28a). Ferroplasma, du domaine des Archaea, est un organisme ferro-oxydant extrêmement acidophile, qui est même capable de croître à des valeurs de pH inférieures à 0

SO42–

(a) + H+ H H+

Extérieur

H+

Flux d’électrons inverse FP

Intérieur

HS– CO2 + ATP

NADH

Q

e–

cyt b

cyt c

S2O32– or S0

Cycle de Calvin

cyt aa3

1/ O 2 2

H2O

ADP

Bill Strode

NAD+

ATP

(b)

17.11 Oxydation du fer m n L’oxydation aérobie du fer de l’état ferreux (Fe2+) à l’état ferrique (Fe3+) est une réaction génératrice d’énergie pour certains procaryotes ; cette oxydation libère seulement une faible quantité d’énergie (voir tableau 17.1), et pour cette raison les

(a)

T. D. Brock

FIGURE 17.27 Oxydation des composés soufrés réduits par les chimiolithotrophes sulfo-oxydants. (a) Étapes de l’oxydation de différents composés. La majorité des sulfites sont oxydés par la voie de la sulfite-oxydase. (b) Les électrons provenant des composés soufrés alimentent la chaîne de transport d’électrons permettant l’établissement d’une force proton-motrice ; les électrons venant du thiosulfate et du soufre élémentaire entrent au niveau du cytochrome c. NADH est produit par les réactions, consommatrices d’énergie, du flux d’électrons inverse, car les donneurs d’électrons ont un E0’ plus électropositif que le couple NAD+/NADH. Cyt, cytochrome ; FP, flavoprotéine ; Q, quinone. Voir la figure 17.38 pour la structure de l’APS.

(b) FIGURE 17.28 Bactéries ferro-oxydantes. (a) Ruissellement acide provenant d’une exploitation minière au confluent d’une rivière et d’un ruisseau venant d’une mine de charbon. Le ruisseau acide est très riche en fer ferreux (Fe 2+). À faible pH, le fer ferreux n’est pas oxydé spontanément à l’air, mais cette réaction est effectuée par Thiobacillus ferro-oxidans. L’hydroxyde ferrique et les sels de fer complexes précipitent, formant un précipité nommé yellow boy par les mineurs américains. (b) Cultures de A. ferrooxidans. L’image montre une série de dilutions, sans croissance dans le tube de gauche, et une croissance de plus en plus forte de gauche à droite. La croissance est détectée par la production de Fe 3+ qui forme immédiatement Fe(OH)3 et acidifie le milieu, donnant cette couleur jaune orange (Fe3+ + 3 H2O → Fe (OH)3 + 3 H+).



566 Chapitre 17


(voir section 13.5). Le rôle de ces organismes dans les pollutions minières et l’oxydation des minéraux seront étudiés dans les sections 19.14 et 19.15. Malgré l’instabilité de Fe2+ à pH neutre, il existe de nombreuses bactéries ferro-oxydantes qui vivent dans de tels environnements, mais en fait, il s’agit de zones dans lesquelles le fer ferreux passe de conditions anoxiques à des conditions oxygénées. Aux interfaces entre ces zones, les ferrobactéries peuvent oxyder Fe2+ lorsqu’il vient d’une zone anaérobie, avant qu’il ne s’oxyde spontanément. Gallionella ferruginea et Sphaerotilus natans sont de bons exemples de ces organismes vivant aux interfaces. On les rencontre typiquement mélangés aux dépôts caractéristiques qu’ils forment (voir figures 17.29 et 12.43a).

Rusticyanine Extérieur (pH 2) (périplasme)

Fe3+

Fe2+

+ H + H H+

Flux d’électrons inverse NAD+

cyt c

cyt a

Intérieur (pH 6) (cytoplasme)

1/ O 2 2

H+

CO2 + ATP

Cycle de Calvin

NADH

H+

H2O

ADP

ATP

(b)

La bioénergétique de l’oxydation du fer par Acidithiobacillus ferrooxidans est intéressante en raison de la valeur très positive du potentiel de réduction du couple Fe3+/Fe2+ (+0,77 V à pH 2). La chaîne respiratoire d’A. ferrooxidans contient des cytochromes de types c et a, ainsi qu’une protéine périplasmique contenant du cuivre, la rusticyanine (voir figure 17.30). Le potentiel de réduction du couple Fe3+/Fe2+ étant très élevé, le chemin parcouru par les électrons jusqu’à l’oxygène ( 1--- O2/H2O, E0’ = +0,82 V) est 2 forcément très court. L’oxydation du fer commence dans le périplasme où la rusticyanine oxyde Fe2+ en Fe3+, une transition qui implique un électron. Cette protéine réduit alors le cytochrome c, qui réduit ensuite le cytochrome a. Ce dernier interagit directement avec O2 pour former H2O (voir figure 17.30). L’ATP est alors synthétisé par les ATPases membranaires. Les quantités d’ATP produites sont faibles en raison du potentiel élevé du donneur d’électrons. En raison du fort gradient de protons naturels de part et d’autre de la membrane d’A. ferrooxidans (le périplasme est à pH 1-2, le cytolasme à pH 5,5-6), les protons entrant dans le cytoplasme via les ATPases doivent être consommés afin de

FIGURE 17.30 Flux d’électrons pendant l’oxydation de Fe 2+ chez la bactérie acidophile Acidithiobacillus ferrooxidans. La rusticyanine, protéine périplasmique contenant du cuivre, est l’accepteur immédiat des électrons venant de Fe 2+. Puis, les électrons parcourent une courte chaîne de transport d’électrons qui s’achève par la réduction de O2 en H2O. Le pouvoir réducteur nécessaire au cycle de Calvin vient des réactions du flux d’électrons inverse. Notez le fort gradient de pH (– 4 unités) de part et d’autre de la membrane.

T. D. Brock

L’oxydation du fer et énergie

FIGURE 17.29 Bactéries ferro-oxydantes à pH neutre : Sphaerotilus. Image au microscope à contraste de phase de gaines (fourreaux) de Sphaerotilus incrustés de fer, prélevés d’un suitement au bord d’un marais. Sphaerotilus est un organisme typique d’interface, vivant dans des habitats où des eaux anoxiques contenant du fer atteignent des zones oxygénées.

maintenir le pH interne dans des limites acceptables (voir figure 17.30). Les protons sont consommés durant la production de H2O, mais cette réaction nécessite aussi des électrons. Ils proviennent du fer selon la réaction : 2 Fe2+ + 1--- O2 + 2 H+ → 2 Fe3+ + H2O 2

Ainsi, tant que A. ferrooxidans dispose de Fe2+, la synthèse d’ATP peut se produire aux dépens de la force proton-motrice existant de part et d’autre de la membrane (voir figure 17.30). L’autotrophie chez A. ferrooxidans s’effectue via le cycle de Calvin. En raison de la forte valeur du potentiel de réduction du donneur d’électrons, une grande quantité d’énergie est consommée dans les réactions de flux inverse d’électrons pour l’obtention du pouvoir réducteur (NADH) nécessaire à la fixation du CO2. Aussi, la production d’une faible quantité d’énergie couplée à une grande demande pour la biosynthèse fait que A. ferrooxidans doit oxyder de grandes quantités de Fe2+ pour produire une faible quantité de matériel cellulaire. Pour cette raison, dans les environnements où vivent les bactéries ferrooxydantes acidophiles, leur présence n’est pas indiquée par la formation de matériel cellulaire abondant, mais par la présence de grandes quantités de précipités de fer ferrique (voir figures 17.28 et 19.37). L’importance écologique de ce processus associé aux bactéries ferro-oxydantes sera étudiée dans les sections 19.14 et 19.15.

L’oxydation du fer par les phototrophes anoxygéniques Le fer ferreux peut être oxydé en conditions anaérobies par certaines bactéries phototrophes anoxygéniques (voir figure 17.31). Le fer ferreux est alors utilisé non pas comme



17.12 Nitrification et Anammox 567

donneur d’électrons dans le métabolisme énergétique, mais comme donneur d’électrons pour la réduction du CO2 (autotrophie). Dans les conditions de pH neutre où vivent ces organismes, le couple Fe3+/Fe2+ est beaucoup moins électropositif (environ +0,2 V) qu’à pH 2. Aussi, les électrons venant de Fe2+ peuvent-ils réduire le cytochrome c présent dans le photosystème des bactéries pourpres (voir section 17.5 à propos de la photosynthèse anoxygénique). Les organismes impliqués, des bactéries pourpres phototrophes (voir figure 17.31b), peuvent aussi utiliser FeS comme donneur d’électrons ; dans ces conditions à la fois Fe2+ et S2– sont oxydés en temps que donneurs d’électrons. Certaines bactéries phototrophes vertes sulfureuses (genre Chlorobium, section 12.32) peuvent aussi utiliser Fe2+ comme donneur d’électrons dans la photosynthèse. De plus, diverses bactéries chimio-organotrophes dénitrifiantes qui couplent l’oxydation de Fe2+ à la réduction de NO3– en N2, et qui croissent en anaérobiose ont été isolées. Cependant, comme pour les bactéries ferro-oxydantes aérobies, chez ces organismes, le fer est un donneur d’électrons à la fois pour les besoins en énergie et le pouvoir réducteur. La découverte des phototrophes ferro-oxydants a d’importantes conséquences dans la compréhension à la fois de l’évolution de la photosynthèse et l’explication de vastes dépôts de fer ferrique trouvés dans des sédiments anciens. On pensait auparavant que ce fer ferrique s’était formé par l’oxydation de Fe2+ par l’O2 produit par les phototrophes oxygéniques (voir section 11.1). Cependant, compte tenu de l’âge de ces sédiments, il est plus vraisemblable que ce fer ferrique ait été

formé par des phototrophes anoxygéniques oxydant Fe2+ dans un environnement anaérobie.

Contrôlez vos acquis Les ferrobactéries sont des chimiolithotrophes capables d’utiliser le fer ferreux (Fe2+) comme seule source d’énergie. La plupart des ferrobactéries croissent seulement à pH acide et sont souvent associées aux pollutions acides produites par l’exploitation minière des métaux et du charbon. Certaines bactéries pourpres phototrophes peuvent oxyder Fe2+ en Fe3+ en anaérobiose. •

Pourquoi l’oxydation de Fe2+ en Fe3+, à pH acide, produit-elle seulement une faible quantité d’énergie ?

•

Quel est le rôle de la rusticyanine et où est-elle localisée dans la cellule ?

•

Comment Fe2+ peut-il être oxydé en anaérobiose ?

17.12 Nitrification et Anammox m n Les composés inorganiques azotés utilisés le plus communément comme donneurs d’électrons sont l’ammoniac (NH3) et le nitrite (NO2–). Ces composés sont oxydés en aérobiose par les bactéries nitrifiantes chimiolithotrophes (voir section 12.3), au cours du processus de nitrification. Les bactéries nitrifiantes sont largement distribuées dans les sols et les eaux. Un groupe de bactéries, les nitrosantes (dont le genre Nitrosomonas), oxyde l’ammoniac en nitrite, et un autre groupe, les nitratantes (dont le genre Nitrobacter), oxyde les nitrites en nitrate. L’oxydation complète de l’ammoniac en nitrate, ce qui implique huit électrons, est ainsi effectuée par deux groupes d’organismes fonctionnant de conserve (voir le focus « Winogradsky et la chimiolithotrophie »).

(a)

Armin Ehrenreich et Fritz Widdel

Armin Ehrenreich et Fritz Widdel

Bioénergétique et enzymologie de la nitrification

(b)

FIGURE 17.31 Oxydation du fer ferreux par les bactéries phototrophes anoxygéniques. (a) Oxydation de Fe2+ en conditions anérobies. De gauche à droite : milieu stérile, milieu inoculé, culture en croissance. La couleur rouge brune est due principalement aux précipités de Fe(OH)3. (b) Image en microscopie à contraste de phase d’une bactérie pourpre ferro-oxydante. Les zones réfringentes à l’intérieur des cellules sont des vaculoles de gaz (section 4.12). Les granules à l’extérieur des cellules sont des précipités de fer. Cet organisme est phylogénétiquement voisin de la bactérie pourpre sulfureuse Chromatium (section 12.2).

Les électrons venant des composés azotés entrent dans la chaîne de transport d’électrons, et un flux d’électrons établit une force proton-motrice couplée à la synthèse d’ATP. Cependant, en raison du potentiel de réduction de leur donneur d’électrons, les bactéries nitrifiantes sont confrontées à des problèmes de bioénergétiques semblables à ceux des chimiolithotrophes sulfo-oxydants. Le E0’ du couple NO2–/NH3 (première étape dans l’oxydation de NH3) est +0,34 V. Le E0’ du couple NO3–/NO2– est même plus élevé, environ + 0,43 V. Ces potentiels relativement élevés signifient que les bactéries nitrifiantes doivent donner des électrons aux chaînes de transport d’électrons, à des étapes relativement tardives du processus. Ceci limite effectivement l’énergie libérée et la quantité d’ATP qui peut être produite par chaque paire d’électrons. Plusieurs enzymes clés sont impliquées dans l’oxydation des composés azotés réduits. Chez les bactéries ammonium-oxydantes, NH3 est oxydé par une ammonium mono-oxygénase (voir section 17.22) qui produit NH2OH et H2O (voir figure 17.32). L’hydroxylamine oxydo-réductase oxyde alors



568 Chapitre 17


NH2OH en NO2–, extrayant quatre électrons. L’ammonium mono-oxygénase est une protéine membranaire, tandis que l’hydroxylamine oxydo-réductase est périplasmique (voir figure 17.32). Dans la réaction catalysée par l’ammonium mono-oxygénase, deux électrons exogènes et deux protons sont nécessaires pour réduire un atome d’oxygène en eau. Ces électrons viennent de l’oxydation de l’hydroxylamine et sont fournis à l’ammonium mono-oxygénase par l’hydroxylamine oxydoréductase via le cytochrome c et l’ubiquinone (voir figure 17.32). Ainsi, pour quatre électrons générés de l’oxydation de NH3 en NO2–, seulement deux atteignent en fait l’oxydase terminale (le cytochrome aa3, figure 17.32). Les bactéries oxydant les nitrites emploient l’enzyme nitrite oxydoréductase pour oxyder les nitrites en nitrate, les électrons parcourant une très courte partie de la chaîne de transport d’électrons (en raison du potentiel élevé du couple NO3–/NO2–) vers l’oxydase terminale (voir figure 17.33). Les cytochromes de types a et c sont présents dans la chaîne de transport d’électrons des nitriteoxydants, et la formation d’une force proton-motrice (qui permet la synthèse d’ATP) se produit grâce à l’activité des cytochromes aa3 (voir figure 17.33). Comme dans le cas de l’oxydation du fer (voir section 17.11), seulement une petite quantité d’énergie est produite par cette réaction et le rendement de croissance des bactéries nitrifiantes est faible.

O N + 5 H+ O–

HAO

4

e–

Cyt c 2 e–

AMO

2 e–

Q

2 H+

2 e–

2 e–

NH3 + O2 + 2 H+

Oxydation de l’ammonium

+ 4 H+

Réduction de l’oxygène

Oxydation du nitrite Cytoplasme

2

HO–

H 2O

ADP ATP + Pi Réduction de l’oxygène 2 H2O

FIGURE 17.33 Oxydation du nitrite en nitrate chez les bactéries nitrifiantes. Les réactifs et produits de cette série de réactions sont surlignés. NOR, nitrite oxydoréductase.

Le métabolisme du carbone chez les bactéries nitrifiantes Comme les chimiolithotrophes sulfo et ferro-oxydants, les bactéries nitrifiantes aérobies emploient le cycle de Calvin pour la fixation du CO2. Les besoins en ATP et en pouvoir réducteur de cette voie contraignent encore davantage un processus faiblement générateur d’énergie (NADH nécessaire au cycle de Calvin est formé via le cycle inverse d’électrons). Les contraintes énergétiques sont particulièrement sévères pour les nitrite-oxydants, et c’est peut-être pour cette raison que la plupart des nitrite-oxydants peuvent aussi croître en chimioorganotrophie en utilisant du glucose et d’autres substrats organiques (voir section 12.3).

Bien que les bactéries nitrifiantes classiques soient des aérobies strictes, au moins en croissance sur des composés azotés réduits, l’ammonium peut aussi être oxydé en conditions anoxiques. Ce processus nommé anammox (anoxic ammonium oxydation) est fortement exergonique et couplé au métabolisme énergétique des organismes impliqués. La réaction anammox consiste en l’oxydation de l’ammonium en utilisant les nitrites comme accepteurs d’électrons pour donner de l’azote gazeux :

Cyt aa3

H2O

NO3– + 2 H+

+ 2 H+

L’oxydation anaérobie de l’ammonium : anammox

H+

Cyt c

1 2 O2

NH2OH + H2O

Périplasme

Oxydation de l’hydroxylamine

Cyt aa3

1 2 O2

H2O + NO2–

H+

Cyt c

NOR

NH3 + O2 + 2 H+ + 2 e– → NH2OH + H2O

NH2OH + H2O

2 H+

Périplasme

ADP + Pi

ATP H+

Cytoplasme FIGURE 17.32 Oxydation de l’ammonium et flux d’électrons chez les bactéries ammonium-oxydantes. Les réactifs et produits de cette série de réactions sont surlignés. Le cytochrome c (cyt c) dans le périplasme est différent du cytochrome c membranaire. AMO, ammonium mono-oxygénase ; HAO, hydroxylamine oxidoréductase ; Q, ubiquinone.

NH4+ + NO2– → N2 + 2 H2O ∆G0’ = – 357 kJ L’organisme qui catalyse anammox, Brocadia anammoxidans, est un membre particulier du phylum des Planctomyces, dans le domaine des Bacteria (voir section 12.28 et figure 17.34). Les planctomyces sont des membres atypiques des Bacteria, dépourvus de peptidoglycane, et comptant des compartiments intracellulaires délimités par une membrane, dont parfois une structure ressemblant au noyau des cellules eucaryotes (voir section 12.28). Chez B. anammoxidans, il existe un compartiment important nommé anammoxosome dans lequel se déroule la réaction anammox (voir figure 17.34b).



Marc Strous

17.12 Nitrification et Anammox 569

(a)

les particules en suspension contiennent à la fois des zones oxygénées et des zones anoxiques où les deux groupes d’ammonium-oxydant peuvent coexister. En cultures mixtes au laboratoire, de fortes concentrations en oxygène inhibent anammox et favorisent la nitrification classique, et il est vraisemblable que dans la nature, l’importance de l’oxydation de l’ammonium par la réaction anammox soit régulée par la concentration en oxygène de l’écosystème. Comme les bactéries nitrifiantes classiques, Brocadia est aussi autotrophe. Cet organisme peut utiliser le CO2 comme seule source de carbone, et les nitrites comme donneurs d’électrons pour fabriquer du matériel cellulaire :

Anammoxosome

Richard Webb et John A. Fuerst

CO2 + 2 NO2– + H2O → CH2O + 2 NO3–

(b) FIGURE 17.34 Brocadia anammoxidans, organisme effectuant la réaction anammox. (a) Image en microscopie en contraste de phase. Une cellule mesure environ 1 µm de diamètre. (b) Image d’une cellule en microscopie électronique en transmission. Notez, dans la partie centrale de la cellule, les compartiments délimités par une membrane et contenant l’anammoxosome fibrillaire (flèche). Brocadia est phylogénétiquement proche des Planctomyces, des organismes chez lesquels existent plusieurs types de compartiments clos par des membranes, à l’intérieur du cytoplasme (section 12.28 et figure 12.87).

L’anammoxosome est une structure délimitée par une membrane — en d’autres termes une organelle (voir figure 17.34b). Mais, Brocadia est clairement un procaryote. L’anammoxosome est un compartiment délimité par une membrane, différent du « noyau » mentionné ci-dessus. Les lipides de la membrane de l’anammoxosome sont également uniques. Ces lipides consistent en des acides gras contenant des cycles de cyclobutane (voir figure 11.24) qui sont reliés au glycérol à la fois par des liaisons ester et des liaisons éther. Les lipides s’aggrègent pour former une structure membranaire particulièrement dense, très résistante à la diffusion. La solide membrane de l’anammoxosome protège vraisemblablement la cellule des intermédiaires toxiques produits au cours de la réaction anammox. La source de NO2– dans la réaction anammox est le produit de l’oxydation de l’ammonium par les bactéries nitrifiantes aérobies (voir figure 17.32). Deux groupes de nitrifiants, aérobies (comme Nitrosomonas) et anaérobies (comme Brocadia), vivent ensemble dans des habitats riches en ammonium comme les eaux d’égouts et autres eaux usées. Dans ces environnements,

Bien qu’autotrophe, Brocadia ne possède pas les enzymes du cycle de Calvin, et le mécanisme de fixation du CO2 n’est pas élucidé. Cependant, l’utilisation des nitrites comme donneurs d’électrons pour la fixation du CO2, avec production de nitrate, est exactement la même réaction que celle effectuée par les nitratants aérobies comme Nitrobacter (voir figure 17.33). Ainsi, bien que phylogénétiquement distincts, les nitrifiants aérobies et les organismes anammox partagent des substrats communs et ont des relations écologiques. Avant que la réaction anammox ne soit bien comprise, on pensait que l’ammonium était stable en conditions anoxiques. Désormais, il est clair que l’ammonium peut être oxydé en l’absence d’O2. D’un point de vue environnemental, anammox est un processus bénéfique dans le traitement anaérobie des eaux usées. L’élimination de l’ammonium et des amines voisines contribue à réduire la pollution azotée des rivières et cours d’eaux, et à maintenir une bonne qualité de l’eau. Les études écologiques consacrées à anammox ont montré que ce processus se déroule aussi dans les sédiments grâce à des organismes identiques à Brocadia. Cette découverte a fourni une explication pour une fraction significative de l’ammonium que l’on pensait perdue par le milieu marin, mais dont on ne connaissait pas le devenir, faute de mécanisme approprié.

Contrôlez vos acquis L’ammonium et le nitrite peuvent être utilisés comme donneurs d’électrons par les bactéries nitrifiantes. Les bactéries ammonium oxydantes produisent des nitrites, qui sont oxydés par les bactéries nitrite-oxydantes en nitrate. L’oxydation anaérobie de l’ammonium est couplée à la production de N2 et NO3– dans l’anammoxosome. •

Quel est le donneur d’électrons inorganique pour Nitrosomonas ? pour Nitrobacter ?

•

Quels sont les substrats de l’enzyme ammonium mono-oxygénase ?

•

Qu’utilisent les bactéries nitrifiantes comme source de carbone ?

•

Qu’est-ce que la réaction anammox et en quoi diffère-t-elle de la nitrification aérobie ?



570 Chapitre 17

III

Diversité métabolique Anoxique

LA VIE EN ANAÉROBIOSE : LES RESPIRATIONS ANAÉROBIES

Chez les eucaryotes, la croissance anaérobie est rare. Chez les procaryotes au contraire, la croissance anaérobie est fréquente et les mécanismes du métabolisme anaérobie très diversifiés. Les prochaines sections seront consacrées à la respiration anaérobie et aux différentes voies utilisées par les procaryotes pour la conservation de l’énergie en utilisant d’autres accepteurs d’électrons que l’oxygène.

–0,3

CH3—COO– Respiration du carbonate ; bactéries homoacétogènes, CO2 anaérobies obligatoires HS–

–0,27 S0 –0,25

CH4

17.13 Respiration anaérobie m n Les processus de respiration aérobie ont été étudiés en détail au chapitre 5. Comme cela a été noté, l’oxygène moléculaire fonctionne comme accepteur terminal d’électrons, acceptant les électrons amenés par les transporteurs d’électrons au sein d’une chaîne de transport d’électrons. Cependant, il existe de nombreux accepteurs d’électrons autres qu’O2, susceptibles d’être utilisés dans des processus nommés respirations anaérobies, dont quelques exemples seront présentés. Les bactéries réalisant la respiration anaérobie possèdent des systèmes de transport d’électrons contenant des cytochromes, quinones, protéines fer-soufre et autres protéines typiques du transport des électrons. Leurs systèmes respiratoires sont donc analogues à ceux des aérobies classiques. Dans certains cas, comme pour les bactéries dénitrifiantes, la respiration anaéorobie est en compétition chez le même organisme avec la respiration aérobie. Dans ces situations, si O2 est présent, la respiration aérobie est favorisée, et lorsqu’O2 est épuisé dans l’environnement, les accepteurs d’électrons alternatifs sont réduits. D’autres organismes réalisant la respiration anaérobie sont des anaérobies obligatoires et incapables d’utiliser O2.

Accepteurs d’électrons alternatifs et tour des électrons L’énergie libérée par l’oxydation d’un donneur d’électrons en utilisant O2 comme accepteur d’électrons est plus importante que si le même composé est oxydé par un accepteur d’électrons alternatif (voir figure 5.9). Ces différences d’énergie apparaissent si l’on examine les potentiels de réduction de chaque accepteur (voir figure 17.35). Le couple O2/H2O étant le plus électropositif, davantage d’énergie est disponible lorsque l’accepteur utilisé est O2. À proximité du couple O2/H2O, se trouvent des accepteurs tels que Fe3+, NO3– et NO2–. SO42–, S0 et CO2 sont d’autres accepteurs plus électronégatifs. Un résumé des respirations anaérobies les plus communes est donné dans la figure 17.35.

Les métabolismes assimilatif et dissimilatif Les composés organiques comme NO3–, SO42– et CO2 sont réduits par de nombreux organismes comme sources d’azote, de soufre ou de carbone cellulaire. Les produits terminaux de ces réductions sont essentiellement des groupements aminés (–NH2), sulfhydriles (–SH) et des composés carbonés organiques. Lorsqu’un composé inorganique comme NO3–, SO42– ou CO2 est réduit en vue de son utilisation dans la biosynthèse,

CO2 –0,22

HS– SO42–

E 0′ (V)

Succinate

0

Respiration du soufre ; aérobies facultatifs et anaérobies obligatoires

Respiration du carbonate ; Archaea méthanogènes ; anaérobies obligatoires

Respiration du sulfate (réduction du sulfate) ; anaérobies obligatoires

Respiration du fumarate (aérobies facultatifs)

Fumarate NO2–, N2O, N2

+0,4 NO3– Fe2+

+0,75

+0,82

Oxygéné (aérobie) présence d’oxygène

Fe3+

H2O O2

Respiration du nitrate (dénitrification) ; aérobies facultatifs Respiration du fer ; aérobies facultatifs et obligatoires

Respiration aérobie ; aérobies obligatoires et facultatifs

FIGURE 17.35 Exemples de respirations anaérobies. Les couples redox sont positionnés en partant des E0’ les plus électronégatifs (sommet) vers les plus électropositifs (bas). Voir la figure 5.9 pour les variations de rendements énergétiques de ces respirations anaérobies.

il est dit être assimilé, et le processus de réduction est alors un métabolisme assimilatif. Le métabolisme assimilatif de NO3–, SO42– et CO2 est conceptuellement différent de l’utilisation de ces composés comme accepteurs d’électrons dans les métabolismes énergétiques de la respiration anaérobie. Afin de distinguer ces deux processus de réduction, l’utilisation de ces composés comme accepteurs d’électrons dans le métabolisme énergétique est appelé métabolisme dissimilatif. Les métabolismes assimilatif et dissimilatif sont très différents. Dans le métabolisme assimilatif, seule une partie des composés (NO3–, SO42– et CO2) est réduite pour satisfaire les besoins de la cellule en croissance. Les produits sont finalement convertis en matériel cellulaire sous forme de macromolécules. Dans le métabolisme dissimilatif, une grande quantité



17.14 Réduction des nitrates et dénitrification 571

d’accepteurs d’électrons est réduite, et le produit réduit est excrété dans l’environnement. De nombreux organismes effectuent le métabolisme assimilatif de composés comme NO3–, SO42– et CO2 (par exemple de nombreuses Bacteria et Archaea, des champignons, des algues et des plantes supérieures), tandis que seulement quelques organismes, et essentiellement des procaryotes, réalisent les métabolismes dissimilatifs.

Contrôlez vos acquis Bien que l’oxygène soit l’accepteur d’électrons le plus largement utilisé dans les métabolismes générateurs d’énergie, de nombreux autres composés peuvent être utilisés comme accepteurs d’électrons. Ce processus de respiration anaérobie est moins efficace énergétiquement mais il permet la respiration dans des environnements où l’oxygène est absent. •

Qu’est-ce que la respiration anaérobie ?

•

H2 étant le donneur d’électrons, pourquoi la réduction de NO3– est-elle une réaction plus favorable que celle de S0 ?

17.14 Réduction des nitrates m n et dénitrification Les composés inorganiques azotés sont parmi les accepteurs d’électrons les plus communs de la respiration anaérobie. Le tableau 17.2 résume les diverses espèces d’azote inorganique et leurs degrés d’oxydation. Les composés azotés inorganiques les plus répandus dans la nature sont l’ammoniac et le nitrate, tous deux formés dans l’atmosphère par des processus chimiques inorganiques, ainsi que l’azote gazeux (N2), qui est la forme d’azote la plus stable dans la nature. La fixation d’azote, et son utilisation comme source d’azote dans les processus de biosynthèse, sera abordée dans la section 17.28. L’ion nitrate est l’un des accepteurs alternatifs les plus communs, et NO3– est réduit en N2O, NO et N2. Parce que ces produits de la réduction des nitrates sont tous des gaz, et peuvent

ainsi être perdus d’un environnement donné, le processus a été nommé dénitrification (voir figure 17.36). Le processus est la voie essentielle de formation biologique de l’azote gazeux N2. N2 est beaucoup moins disponible pour les organismes que le nitrate en temps que source d’azote. Aussi, en ce qui concerne l’agriculture, la dénitrification est un processus nuisible. Dans le cas du traitement des effluents (voir section 28.2), cependant, la dénitrification est bénéfique car elle convertit NO3– en N2. Ceci diminue la charge d’azote fixé dans l’effluent et qui serait susceptible de stimuler la croissance algale (voir section 19.5).

La biochimie de la réduction dissimilative des nitrates L’enzyme impliquée dans la première étape de la réduction dissimilative des nitrates, le nitrate réductase, est une enzyme membranaire à molybdène dont la synthèse est réprimée par l’oxygène moléculaire. Toutes les enzymes suivantes de la voie métabolique (voir figure 17.37) sont régulées de manière coordonnée et aussi réprimées par O2, mais en plus des conditions anoxiques, le nitrate doit aussi être présent pour que ces enzymes soient totalement exprimées. Le premier produit de la réduction des nitrates est le nitrite (NO2–) et le nitrite réductase le réduit en oxyde nitrique (NO) (voir figure 17.37c). Quelques organismes peuvent réduire NO2– en ammoniac (NH3) au cours d’un processus dissimilatif, mais la production des produits gazeux – la dénitrification – a une importance globale plus grande, car elle consomme une forme fixée d’azote (NO3–) facilement disponible pour les plantes et produit des composés azotés gazeux, dont certains ont une importance environnementale. Par exemple, N2O peut être converti en NO par la lumière solaire et NO réagit avec l’ozone dans les couches supérieures de l’atmosphère pour former du nitrite (NO2–) qui revient sur terre sous forme de pluie acide (acide nitreux, HNO2). Les étapes suivantes de la biochimie de la dénitrification sont montrées dans la figure 17.37c.

Nitrate (NO3– ) Nitrate réductase

Nitrite (NO2– ) Nitrite réductase

TABLEAU 17.2

NIVEAU D’OXYDATION DES COMPOSÉS AZOTÉS MAJEURS

Composé

Niveau d’oxydation

N organique (R-NH2)

–3

Ammoniac (NH3)

–3

Azote gazeux (N2)

0

Oxyde nitreux (N2O)

+ 1 (moyenne par N)

Oxyde d’azote (NO)

+2

Nitrite (NO2–)

+3

Dioxyde d’azote (NO2)

+4

(NO3–)

+5

Nitrate

Oxyde nitrique (NO) Oxyde nitrique réductase

Oxyde nitreux (N2O)

gaz, libérés dans l’atmosphère (dénitrification)

Oxyde nitreux réductase

Azote (N2) FIGURE 17.36 Étapes de la réduction dissimilative du nitrate. Quelques organismes, par exemple Escherichia coli, réalisent seulement la première étape. Tous les enzymes impliquées sont déréprimées en conditions anoxiques. Quelques procaryotes sont également capables de réduire NO 3– en NH4+ au cours d’un métabolisme dissimilatif.



572 Chapitre 17


2 H+

2 H+

2 H+

Extérieur

2 H+ Extérieur

2e–

2 H+

Nitrate réductase

2e– Fe–S

Fp

Q

2e–

Fe–S

Cyt b556 Cyt b562

Fp

Cyt o 2 H+ 3

1 H+ + 2– O2

Cyt b556 2e

–

Intérieur

Intérieur NADH + H+

Q

2 H+

NADH + H+

H2O

(a)

NO3–+ 2 H+ NO2– + H2O

(b)

2 H+

NO

2 H+

NO3–

Extérieur

NO2–

NO2– réductase

N2O réductase

2 H+ NO

N2 N2O

2e– Fe–S Fp

Q

Intérieur NADH + H+

2 H+

Cyt b 2e

Cyt cd

Cyt bc1

–

NO réductase

Nitrate-réductase

(c) FIGURE 17.37 Respiration. Transports d’électrons dans la membrane d’Escherichia coli lorsque (a) O2 ou (b) NO3– est l’accepteur d’électrons et NADH le donneur. Fp, flavoprotéine ; Q, ubiquinone. En présence d’une forte concentration d’oxygène, la séquence des transporteurs est cyt b562 → cyt o → O2. Cependant, pour une faible concentration d’oxygène (cas non présenté), la séquence est cyt b568 → cyt d → O2. Notez que davantage de protons sont transférés pour deux électrons oxydés en aérobiose, par rapport à l’anaérobiose lorsque le nitrate est l’accepteur d’électrons. (c) Schéma possible du transport d’électrons dans la membrane de Pseudomonas stutzeri au cours de la dénitrification. Les nitrate-réductase et NO-réductase sont situées dans la membrane cytoplasmique, tandis que les nitrite-réductase et N 2O réductase sont périplasmiques. À l’exception de la nitrate-réductase, les donneurs d’électrons précédant les réductases n’ont pas été complètement identifiés.

La biochimie de la réduction dissimilative du nitrate a été étudiée en détail chez plusieurs organismes dont Escherichia coli, qui réduit NO3– seulement en NO2– (voir figure 17.37b) et Paracoccus denitrificans et Pseudomonas stutzeri, qui réalisent la dénitrification complète (voir figure 17.37c). Le nitrate réductase d’E. coli accepte les électrons venant d’un cytochrome de type b ; une comparaison des chaînes de transport d’électrons au cours des respirations aérobie et anaérobie chez E. coli est présentée dans la figure 17.37a, b. Comme on le voit, en raison du potentiel de réduction du couple NO3–/NO2– (+0,43 V), il y a seulement deux étapes de translocation de protons au cours de la respiration du nitrate contre trois au cours de la respiration aérobie ( 1--- O2/H2O, +0,82 V). Chez P. denitrificans et 2 P. stutzeri, les oxydes d’azote formés à partir du nitrite par le nitrite réductase, l’oxyde nitrique réductase et l’oxyde nitreux réductase sont résumés dans la figure 17.37c. Au cours du transport d’électrons, une force proton-motrice s’établit et de l’ATP est produit de manière habituelle par l’ATPase. De l’ATP supplémentaire est produit lorsque NO3– est réduit en N2 car la NO réductase est couplée à une extrusion de protons (voir figure 17.37c).

Les autres propriétés des procaryotes dénitrifiants La plupart des procaryotes dénitrifiants appartiennent sur le plan phylogénétique aux membres des protéobactéries (voir sections 12.2 à 12.18) et sont des aérobies facultatifs. La respiration aérobie intervient en présence d’air, même s’il y a des nitrates dans le milieu. De nombreuses bactéries dénitrifiantes peuvent aussi réduire d’autres accepteurs d’électrons en anaérobioses, telles que le fer ferrique (Fe3+), ainsi que certains accepteurs d’électrons organiques (voir section 17.18). De plus, de nombreuses bactéries dénitrifiantes sont métaboliquement versatiles en ce qui concerne les mécanismes alternatifs de génération d’énergie.

Contrôlez vos acquis Le nitrate est fréquemment utilisé comme accepteur d’électrons dans la respiration anaérobie. Le nitrate réductase qui réduit le nitrate en nitrite est nécessaire. De nombreuses bactéries qui utilisent le nitrate dans la respiration anaérobie produisent finalement N2, dans un processus nommé dénitrification.



17.15 Réduction des sulfates 573

•

Pour Escherichia coli, pourquoi davantage d’énergie est-elle libérée au cours de la respiration aérobie que durant la réduction de NO3– ?

•

Où est localisé dans la cellule la nitrate réductase dissimilative ? Quel métal peu commun contientelle ?

•

Pourquoi un organisme comme Pseudomonas stutzeri obtient-il plus d’énergie de la respiration des nitrates qu’E. coli ?

17.15 Réduction des sulfates m n Plusieurs composés soufrés inorganiques sont d’importants accepteurs d’électrons pour la respiration anaérobie. Un résumé des degrés d’oxydation des composés soufrés essentiels est donné dans le tableau 17.3. Le sulfate, la forme la plus oxydée du soufre, est l’un des anions majeurs de l’eau de mer, et est utilisé par les bactéries sulfato-réductrices, un groupe très largement répandu dans la nature. Le produit final de la réduction des sulfates est H2S, un important produit naturel, impliqué dans de nombreux processus biogéochimiques (voir section 19.13). À nouveau, comme pour l’azote, il est important de distinguer entre métabolismes assimilatif et dissimilatif. De nombreux organismes, y compris les plantes supérieures, les algues, les champignons et de nombreux procaryotes, utilisent le sulfate comme source de soufre pour la biosynthèse. La capacité à utiliser le sulfate comme accepteur d’électrons

TABLEAU 17.3

COMPOSÉS SOUFRÉS ET DONNEURS D’ÉLECTRONS POUR LA RÉDUCTION DES SULFATES

Composé

Niveau d’oxydation

Niveau d’oxydation des composés soufrés S organique (R-SH)

–2

Sulfure (H2S)

–2 0

Soufre élémentaire (S )

0

Thiosulfate (S2O32–)

+2 (moyenne par S)

Dioxyde de soufre (SO2)

+4

Sulfite (SO32–) Sulfate (SO42–)

+4 +6

Quelques donneurs d’électrons pour la réduction des sulfates H2

Acétate

Lactate

Propionate

Pyruvate

Butyrate

Éthanol et autres alcools

Acides gras à longue chaîne

Fumarate

Benzoate

Malate

Indole

Choline

Hexadécane

dans des processus générateurs d’énergie implique la réduction de SO42– à grande échelle et est restreinte aux bactéries sulfato-réductrices. Au cours de la réduction assimilative, l’H2S formé est immédiatement converti en soufre organique sous forme d’acides aminés, mais dans la réduction dissimilative, l’H2S est excrété. Comme le montrent les potentiels de réduction présentés dans le tableau A1.2 et la figure 17.35, le sulfate est beaucoup moins favorable comme accepteur d’électrons qu’O2 ou NO3–. Cependant, suffisamment d’énergie pour faire un ATP est produite, lorsqu’un donneur d’électrons produisant NADH ou FADH est utilisé. En raison d’une énergétique moins favorable, les rendements de croissance sont plus faibles pour un organisme utilisant SO42– que pour un organisme utilisant O2 ou NO3–. Le tableau 17.3 présente certains des donneurs d’électrons utilisés par les bactéries sulfato-réductrices. H2, lactate et pyruvate sont utilisés par de nombreux sulfato-réduteurs, tandis que les autres ont un usage plus restreint. On connaît cependant une grande diversité morphologique et physiologique de bactéries sulfato-réductrices (voir sections 12.18 et 13.17). À l’exception d’Archaeoglobus, un membre des Archaea, tous les procaryotes sulfato-réducteurs connus appartiennent au domaine des Bacteria.

Biochimie et énergétique de la réduction des sulfates La réduction de SO42– en H2S, un processus impliquant 8 électrons (voir tableau 17.3), est réalisée en plusieurs étapes. L’ion sulfate est stable et ne peut être réduit sans avoir auparavant été activé. Le sulfate est activé grâce à l’ATP. L’enzyme ATP sulfurylase catalyse l’attachement de l’ion sulfate à un phosphate de l’ATP, ce qui donne de l’adénosine phosphosulfate (APS) comme cela est montré dans la figure 17.38. Dans la réduction dissimilative des sulfates, le sulfate de l’APS est réduit directement en sulfite (SO32–) par l’APS réductase, avec libération d’AMP. Dans la réduction assimilative, un autre P est ajouté à l’APS pour former la phosphoadénosine phosphosulfate (PAPS) (voir figure 17.38a), et c’est alors que le sulfate est réduit. Dans les deux cas, le premier produit de la réduction des sulfates est le sulfite, SO32–. Une fois SO32– créé, le sulfure est formé grâce à l’intervention d’un sulfite réductase (voir figure 17.38b). Au cours du processus de réduction dissimilative des sulfates, les réactions de transport d’électrons s’effectuent ; conduisant à une force proton-motrice et à la synthèse d’ATP par une ATPase. Un transporteur essentiel d’électrons est le cytochrome c3, un cytochrome périplasmique à faible potentiel (voir figure 17.39). Le cytochrome c3 accepte les électrons en provenance d’une hydrogénase localisée dans le périplasme et les transfère à un complexe protéique membranaire. Ce complexe, nommé Hmc, transporte les électrons au travers de la membrane cytoplasmique, ce qui les rend disponibles pour l’APS réductase et la sulfite réductase qui sont des enzymes cytoplasmiques (voir figure 17.39). L’hydrogénase joue un rôle central dans la réduction des sulfates, que la croissance d’un organisme comme Desulfovibrio se fasse à partir de H2 ou d’un composé organique comme l’acétate. En effet, le lactate est converti en acétate via le pyruvate (l’acétate est surtout excrété car Desulfovibrio est un sulfato-réducteur qui n’oxyde pas l’acétate, section 12.18) avec



574 Chapitre 17

H

OH

O

Adénine H

H

OH

OH

APS

Diversité métabolique O

CH2 O P

O S

O

O

H

8H+

4H2

OH

8e–

Extérieur H2ase

cyt c3

Utilisé dans le métabolisme dissimilatif

H+

Hmc

(Adénosine 5’-phosphosulfate) e–

H

H

OH

O

Adénine

H

OH

O

CH2 O P

O S

O

O

H OH

O P

OH

LDH 2e–

OH Utilisé dans le métabolisme assimilatif

O

Lactate

APS

Pyruvate H2

PAPS (Phosphoadénosine 5’-phosphosulfate) (a)

Acétate + CO2 + ATP ATP

SO42–

FeS

SO42–

Intérieur

ATP ADP

PPi APS

ATP sulfurylase

2 e–

PAPS

APS kinase

APS réductase

AMP

NADPH 2 e– NADP+

SO32– 6 e–

Sulfite réductase

PAP

SO32– 6 e–

H2S

Excrétion

Composés organiques soufrés (cystéine, méthionine, etc.)

Réduction dissimilative du sulfate

Réduction assimilative du sulfate

(b) FIGURE 17.38 Biochimie de la réduction du sulfate. (a) Deux formes de sulfate actives peuvent être produites, l’adénosine 5’-phosphosulfate (APS) et la phosphoaénosine 5’-phosphosulfate (PAPS). Les deux formes dérivent de l’adénosine biphosphate (ADP), dans laquelle le second phosphate est remplacé par un sulfate. (b) Schéma des réductions assimilatives et dissimilatives du sulfate.

production d’H2. L’H2 produit traverse la membrane cytoplasmique et est oxydé par l’hydrogénase périplasmique, ce qui engendre une force proton-motrice (voir figure 17.39). Les rendements de croissance des bactéries sulfato-réductrices suggèrent qu’un ATP est produit pour chaque SO42– réduit en HS–. Avec H2, la réaction s’écrit :

ADP

ATP

SO32–

H2S

FIGURE 17.39 Transport d’électrons et conservation de l’énergie chez les bactéries sulfato-réductrices. En complément de l’hydrogène externe (H2), du H2, produit par le catabolisme de composés organiques tels que le lactate et le pyruvate, peut alimenter l’hydrogénase. Les hydrogénases (H2ase), le cytochrome c3, et le complexe cytochromique (Hmc) sont des protéines périplasmiques. Une protéine différente conduit les électrons au travers de la membrane du complexe Hmc vers une protéine fer-soufre du cytoplasme qui fournit les électrons à l’APS réductase (en formant SO32–) et au sulfite réductase (en formant H2S, voir figure 17.38b). LDH, lactate déshydrogénase.

4 H2 + SO42– + H+ → HS– + 4 H2O H2S

6e–

∆G0’ = – 152 kJ

Lorsque le lactate ou le pyruvate est le donneur d’électrons, l’ATP est produit via la force proton-motrice, mais en plus lors de l’oxydation du pyruvate en acétate et CO2, via l’acétylCoA et l’acétyl-phosphate (voir section 17.19).

Utilisation de l’acétate et autotrophie De nombreux sulfato-réducteurs peuvent oxyder complètement l’acétate en CO2 en temps que donneur d’électrons pour la réduction des sulfates (voir section 12.18) : CH3COO– + SO42– + 3 H+ → 2 CO2 + H2S + 2 H2O ∆G0’ = – 57,5 kJ Bien que l’énergétique de ce processus ne soit pas aussi bien comprise que dans le cas du métabolisme de H2 ou du lactate, le mécanisme de l’oxydation de l’acétate est connu. À de rares exceptions près, l’acétate est oxydé en CO2 par la voie de l’acétyl-CoA, une série de réactions réversibles utilisée par de nombreux anaérobies pour la synthèse ou l’oxydation de l’acétate (voir section 17.16). Cette voie métabolique emploie l’enzyme clé monoxyde de carbone déshydrogénase et a été découverte en premier chez les bactéries homoacétogènes qui génèrent de l’acétate à partir d’H2 et de CO2, au cours d’un mécanisme permettant la conservation d’énergie (voir



17.16 Acétogénèse 575

section 17.16). Quelques bactéries sulfato-réductrices peuvent aussi croître en autotrophie dans un milieu anoxique contenant des sels minéraux, avec H2 (donneur d’électrons), SO42– (accepteur d’électrons) et CO2 (source de carbone). Dans ces conditions de croissance, les sulfato-réducteurs autotrophes utilisent la voie de l’acétyl-CoA pour synthétiser du matériel cellulaire. La bactérie sulfato-réductrice oxydant l’acétate, Desulfobacter, ne possède pas les enzymes de la voie de l’acétyl-CoA et oxyde l’acétate via le cycle de l’acide citrique (voir figure 5.22), mais ceci semble être l’exception à la règle.

La dismutation du soufre Certaines bactéries sulfato-réductrices sont capables de mettre en œuvre une forme de métabolisme énergétique nommé dismutation, en utilisant des composés soufrés de niveau d’oxydation intermédiaire. Ce terme de dismutation se réfère à la séparation d’un composé en deux nouveaux composés, l’un étant plus oxydé et l’autre plus réduit que le substrat originel. Par exemple, Desulfovibrio sulfodismutans peut dismuter le thiosulfate comme suit : S2O32– + H2O → SO42– + H2S

∆G0’ = – 21,9 kJ/ réaction

Dans cette réaction, un atome de soufre de S2O32– devient plus oxydé (il forme SO42–) tandis que l’autre est plus réduit (il forme H2S). L’oxydation du thiosulfate par D. sulfodismutans conduit à la formation d’une force proton-motrice utilisée par l’organisme pour faire de l’ATP. D’autres composés soufrés réduits comme le sulfite (SO32–) et le soufre (S0) peuvent aussi être dismutés par un sulfato-réducteur ou un autre. Ces formes de métabolisme permettent aux sulfato-réducteurs de récupérer de l’énergie de composés intermédiaires soufrés produits lors de l’oxydation de H 2S par les chimiolithotrophes sufo-oxydants avec lesquels ils coexistent dans la nature (voir section 19.13).

L’oxydation des phosphites Au moins une bactérie sulfato-réductrice est capable de coupler l’oxydation de phosphite (HPO3–) à la réduction des sulfates. Cette réaction est chimiolithotrophe et les produits sont les ions phosphate et sulfure : 4 HPO3– + SO42– + H+ → 4 HPO42– + HS–

Contrôlez vos acquis Les bactéries sulfato-réductrices réduisent les sulfates en hydrogène sulfuré. La réduction des sulfates nécessite en premier lieu l’activation par une réaction avec l’ATP pour donner l’adénosine phosphosulfate (APS). Les donneurs d’électrons pour la réduction des sulfates comprennent H2, des composés organiques et même le phosphite. La dismutation des composés soufrés représente une stratégie additionnelle pour l’obtention d’énergie par certains membres de ce groupe. •

Identifiez les composés suivants : S0, SO42–, SO32–, S2O32–, H2S.

•

Comment le sulfate est-il converti en sulfite pendant la réduction dissimilative du sulfate ?

•

Pourquoi H2 est-il important pour les bactéries sulfato-réductrices ?

•

Donnez un exemple de dismutation.

17.16 Acétogénèse m n Le dioxyde de carbone, CO2, est commun dans la nature et habituellement abondant dans les habitats anoxiques car c’est le produit principal du métabolisme énergétique des chimioorganotrophes. Deux groupes essentiels de procaryotes anaérobies stricts peuvent utiliser le CO2 comme accepteur d’électrons dans un métabolisme énergétique, les homoacétogènes et les méthanogènes. L’hydrogène est un donneur d’électrons essentiel pour ces deux types d’organismes et une vue globale de ces processus est présentée dans la figure 17.40. Les deux processus se traduisent par la génération de gradients ioniques, H+ ou Na+, qui alimentent les ATPases membranaires. L’acétogénèse implique aussi la conservation de l’énergie par phosphorylation au niveau du substrat.

Organismes et voies métaboliques Les homoacétogènes réalisent la réaction suivante : 4 H2 + H+ + 2 HCO3– → CH3COO– + 4 H2O

∆G0’ = – 364 kJ

L’organisme impliqué, Desulfotignum phosphitoxidans, nécessite seulement CO2 pour ses besoins en carbone (il est autotrophe). C’est un anaérobie strict par la force des choses, car le phosphite s’oxyde spontanément à l’air. La source de phosphite dans la nature n’est pas claire. Cependant, comme D. phosphitoxidans peut utiliser le phosphite comme seule source d’énergie, il est vraisemblablement produit dans les environnements anoxiques, sans doute à partir de la dégradation des organophosphates. Avec la dismutation du soufre (également un processus chimiolithotrophe) et l’utilisation de H2, l’oxydation du phosphite renforce la diversité chimiolithotrophe des bactéries sulfato-réductrices.

HCO3– + H+

4 H2

2 HCO3– + H+

∆G0 = –136 kJ

∆G0 = –105 kJ ATP O Force proton Force proton motrice ou sodium CH4 + CH3—C—O– motrice, plus 3 H2O phosphorylation + 4 H O 2 au niveau Méthanogénèse Acétogénèse du substrat FIGURE 17.40 Processus comparés de l’acétogénèse et de la méthanogenèse. Notez la différence entre les quantités d’énergie libre libérées par chacune des réactions.



576 Chapitre 17


Outre H2, les donneurs d’électrons permettant l’acétogénèse comprennent une grande diversité de composés en C1, des sucres, acides organiques et aminés, des alcools, certaines bases azotées, ceci en fonction des organismes. De nombreux homoacétogènes peuvent également réduire NO3– et S2O32–. Cependant, la réduction du CO2 est probablement la principale réaction significative du point de vue écologique. Le trait commun essentiel des homoacétogènes est la réduction du CO2. Les homoacétogènes convertissent le CO2 en acétate par la voie de l’acétyl-CoA et chez de nombreux acétogènes, la croissance autotrophe utilise également cette voie. Les principaux organismes qui produisent de l’acétate par la voie de l’acétyl-CoA sont listés dans le tableau 17.4. Des organismes comme Acetobacterium woodii et Clostridium aceticum peuvent croître soit en chimio-organotrophie en fermentant les sucres (réaction 1) ou chimiolithotrophie par la réduction du CO2 en acétate avec H2 comme donneur d’électrons (réaction 2). Dans l’un ou l’autre cas, le produit majeur est l’acétate : (1) C6H12O6 → 3 CH3COO– + 3 H+ (2) 2 HCO3– + 4 H2 + H+ → CH3COO– + 4 H2O Les homoacétogènes fermentent le glucose via la voie de la glycolyse et convertissent le glucose en deux molécules de

TABLEAU 17.4

ORGANISMES EMPLOYANT LA VOIE DE L’ACÉTYL-COA POUR LA FIXATION DU CO2

I. Synthèse d’acétate, résultat du métabolisme énergétique Acetoanaerobium noterae Acetobacterium woodii Acetobacterium wieringae Acetogenium kivui Acetitomaculum ruminis Clostridium aceticum Clostridium thermaceticum Clostridium formicaceticum Desulfotomaculum orientis Sporomusa paucivorans Eubacterium limosum (produit aussi du butyrate) Treponema primitia (dans le tube digestif des termites) II. Synthèse d’acétate dans le métabolisme autotrophe Bactéries autotrophes homoacétogènes Méthanogènes autotrophes Bactéries sulfato-réductrices autotrophes III. Oxydation de l’acétate dans le métabolisme énergétique Réaction : Acétate + 2 H2O → 2 CO2 + 8 H Groupe II des sulfato-réducteurs (autres que Desulfobacter) Réaction : Acétate → CO2 + CH4 Méthanogènes acétoclastiques (Methanosarcina, Methanosaeta)

pyruvate et deux molécules de NADH (soit 4 H). À partir de là, deux molécules d’acétate sont produites : (3) 2 pyruvate– → 2 acétate– + 2 CO2 + 4 H Le troisième acétate de la fermentation homoacétique vient de la réduction de deux molécules de CO2 générées par la réaction (3) en utilisant les quatre électrons générés par la glycolyse, plus les quatre électrons venant de l’oxydation de deux pyruvates en deux acétates (réaction 3). En partant du pyruvate, la production globale d’acétate s’écrit : 2 pyruvate– + 4 H → 3 acétate– + H+ La plupart des bactéries homoacétogènes qui produisent et excrètent de l’acétate au cours de leur métabolisme énergétique sont des bactéries Gram positif, dont beaucoup appartiennent au genre Clostridium. Quelques autres Gram positif et de nombreux Gram négatif différents utilisent la voie de l’acétylCoA pour l’autotrophie et réduisent le CO2 en acétate pour fabriquer du carbone cellulaire. La voie de l’acétyl-CoA est utilisée pour la croissance autotrophe de certaines bactéries sulfato-réductrices (voir sections 12.18 et 19.13). Elle est aussi utilisée par les méthanogènes, dont la plupart peuvent croître en autotrophie sur H2 et CO2 (voir sections 13.14, 17.17 et 19.10). Par contraste, certaines bactéries emploient les réactions de l’Acétyl-CoA surtout dans le sens inverse afin d’oxyder l’acétate en CO2. Il s’agit des méthanogènes acétotrophes (voir section 13.4) et des bactéries sulfato-réductrices (voir section 12.18).

La voie de l’acétyl-CoA Contrairement aux autres voies métaboliques autotrophes telles que le cycle de Calvin (voir section 17.6), le cycle inverse de l’acide citrique, celui de l’hydroxypropionate (voir section 17.7), la voie de l’acétyl-CoA n’est pas un cycle. Elle est au contraire constituée de voies linéaires pour la réduction du CO2– ; une molécule de CO2 est réduite dans le groupe méthyle de l’acétate et l’autre molécule de CO2 est réduite dans le groupe carbonyle. Elles s’assemblent à la fin pour forme l’acétyl-CoA (voir figure 17.41). Une enzyme clé de la voie de l’acétyl-CoA est le monoxyde de carbone déshydrogénase. La CO déshydrogénase est une enzyme complexe qui contient les métaux Ni, Zn et Fe comme cofacteurs. La CO déshydrogénase catalyse la réaction suivante : CO2 + H2 → CO + H2O Le CO produit se trouve en définitive dans la partie carbonyle de l’acétate. Le groupe méthyle de l’acétate provient de la réduction du CO2 au cours d’une série de réactions impliquant la coenzyme tetrahydrofolate (voir figure 17.41). Le groupement méthyle ainsi formé est alors transféré du tetrahydrofolate à une enzyme contenant de la vitamine B1 comme cofacteur (voir figure 17.41). Dans l’étape finale de cette voie, le groupement CH3 est combiné avec CO dans la CO déshydrogénase pour former de l’acétate. Le mécanisme réactionnel implique ici le groupement CH3, lié dans l’enzyme à un atome de nickel, qui se combine avec CO, qui est, lui, lié dans l’enzyme à un atome de fer, et avec la coenzyme A pour donner le produit final acétyl-CoA. Ce mécanisme a été la première réaction alkyl-nickel découverte en biochimie.



17.17 Méthanogenèse 577 Formyl tétrahydrofolate

2H2

CO2 H2

CHO

CH3

ATP THF

Réduction de CO2 en groupement CO2 H2O CO méthyle Réduction de CO2 en groupement carbonyle

THF

B12

CH3

Méthyl tétrahydrofolate

Méthyl-B12

Fe Ni CH3

Ni Ni

CoA

CO-déshydrogénase

Force Na+

motrice

O

O

CH3—C —O–

Acétate

Net : 4 H2 + 2 CO2

CH3 ATP

C

ATP SCoA

Acétyl-CoA

Acétate– + 2 H2O + H+

FIGURE 17.41 Réactions de la voie de l’acétyl-CoA. THF, Tétrahydrofolate ; B12, la vitamine B12 est ici un cofacteur enzymatique. CO est lié à un atome de fer dans la CO-déshydrogénase et le groupement CH3 fait groupe avec un atome de nickel dans un composé organique contenant du nickel dans la CO-déshydrogénase. Notez que la formation de l’acétyl-CoA alimente une pompe à Na+, utilisée pour la synthèse d’ATP qui se produit lors de la conversion de l’acétyl-CoA en acétate.

Les homoacétogènes pouvant croître en utilisant la voie de l’acétyl-CoA, cette séquence de réaction doit être globalement une réaction de conservation de l’énergie (voir figure 17.41). Un des sites de synthèse d’ATP se situe au cours de la conversion de l’acétyl-CoA en acétate plus ATP (via l’acétyl-P) [voir section 17.19]. Cependant, des étapes supplémentaires de conservation de l’énergie sont observées car une force sodium-motrice (analogue à une force proton-motrice, mais impliquant Na+ au lieu de H+) s’établit de part et d’autre de la membrane cytoplasmique au cours de l’acétogénèse et permet la synthèse d’ATP via une ATPase alimentée par Na+. Une situation similaire existe chez le fermenteur de succinate Propionigenium, dont la conservation de l’énergie à partir d’un gradient de Na+ sera présentée dans la section 17.20.

Contrôlez vos acquis Les homoacétogènes sont des anaérobies qui réduisent le CO2 en acétate, habituellement avec H2 comme donneur d’électrons. Le mécanisme de la formation d’acétate est la voie de l’acétyl-CoA, un ensemble de réactions largement répandu chez les anaérobies obligatoires soit pour l’autotrophie, soit pour le catabolisme de l’acétate. •

•

Si le catabolisme du fructose via la glycolyse donne seulement deux molécules d’acétate, comment Clostridium aceticum peut-il fermenter le glucose selon cette voie et produire trois molécules d’acétate ?

CO

Fe Fe

Comment les homoacétogènes font-ils de l’ATP au cours de la synthèse de l’acétate ?

B12

THF

H2

•

Dessinez la structure de l’acétate et identifiez les groupements carbonyle et méthyle. Quelle enzyme clé de la voie de l’acétyl-CoA produit le groupement carbonyle de l’acétate ?

17.17 Méthanogenèse m n La production biologique de méthane – la méthanogenèse – est réalisée par un groupe d’Archaea anaérobies strictes, les méthanogènes. Les propriétés générales, la phylogénie et la taxinomie des méthanogènes ont été examinées dans la section 13.4, cette section étant consacrée à la biochimie et à la bioénergétique. La production biologique de méthane se produit au travers d’une série de réactions impliquant de nouvelles coenzymes et d’une étonnante complexité. Nous commencerons par la présentation de ces coenzymes qui jouent un rôle central dans la méthanogenèse, puis par la production de méthane à partir des substrats H2 et CO2.

Les transporteurs de C1 dans la méthanogenèse Les enzymes clés de la méthanogenèse peuvent être réparties en deux classes : 1) celles impliquées dans le transport des unités en C1, à partir du substrat initial, le CO2, jusqu’au produit final, et 2) celles qui fonctionnent dans les réactions redox pour fournir les électrons nécessaires à la réduction du CO2 en CH4 (voir figures 17.42 et 17.44). La coenzyme méthanofurane est impliquée dans la première étape de la méthanogenèse. Le méthanofurane contient le noyau furane et un groupement aminé qui se fixe au CO2 (voir figure 17.42a). La méthanoptérine (voir figure 17.42b) est une coenzyme de la méthanogenèse qui ressemble à la vitamine acide folique (voir figure 20.17c) et qui est le transporteur de C1 dans les étapes intermédiaires de la réduction de CO2 en CH4. La coenzyme M (CoM) [voir figure 17.42c] est une petite molécule impliquée dans l’étape terminale de la méthanogenèse, la conversion d’un groupement méthyle en CH4. Bien qu’il ne s’agisse pas d’un transporteur de C1, la coenzyme F430 (tetrapyrolle à nickel) [voir figure 17.42d] est aussi impliquée dans l’étape finale de la méthanogenèse en temps que composant du complexe enzymatique méthyleréductase (voir plus loin).

Les coenzymes redox Les coenzymes F420 et 7-mercaptoheptanoylthréonine phosphate, ou coenzyme B (CoB), sont des donneurs d’électrons dans la méthanogenèse. La coenzyme F420 (voir figure 17.42e) est un dérivé de la flavine, ressemblant structurellement à la coenzyme flavine mononucléotide (FMN) [voir figure 5.15]. F420 joue aussi un rôle dans la méthanogenèse comme donneur d’électrons dans plusieurs étapes de la réduction du CO2 (voir figure 17.44). La forme oxydée de F420 absorbe la lumière à 420 nm et fluoresce en bleu vert. Cette fluorescence est utile pour l’identification au microscope d’un organisme en tant que méthanogène (voir figure 17.43). CoB



578 Chapitre 17

Diversité métabolique COO– CH2 CH2

O

H2N—CH2

CH2—CH2 [ — NH —C—CH2—CH2—CH]3—CH

CH2—O —

O

COO– COO–

Méthanofurane

COO–

(a) O HN H2N

H N

CH2

O

CH2[—CHOH]3 — CH2 —O

NH

OH HO

HC CH3

N

N H

O

CH2

CH2—O— P —O—CH O–

CH3

COO–

Méthanoptérine (b) O

OH OH OH

H2C—CH—CH—CH—CH2—O—P—O—CH—C—NH—CH

O HS

CH2—CH2 — S—O–

N

HO

N

O

Coenzyme M (CoM)

H

(c)

CH2 CH2 H2NOC—H2C

O NH

O–

CH2 CH2

Oxydé

C

O

O

NH HC—COO–

2H+ 2e–

COO–

H3C

COO–

CH3 O

CH2 CH2

O

R CH3

HN

CH2—CH2—COO–

N

H

Ni+ –OOC—H C 2

CH2—COO– O

H

COO– O NH

Réduit

O

Coenzyme F420

N

N

N

HO

N

H N

(e)

CH2 CH2 COO–

O

O

HS—CH2—CH2—CH2 —CH2—CH2—CH2—C—NH—CH—CH—O—P—O– COO–

Coenzyme F430 (d)

CH3

O

Coenzyme B (CoB) (f)

FIGURE 17.42 Coenzymes des Archaea méthanogènes. Les atomes colorés en brun ou jaune correspondent aux sites des réactions d’oxydo-réduction (F420 brun) ou aux positions auxquelles se trouvent les groupements en C1 lors de la réduction de CO 2 en CH4 (méthanofurane, méthanoptérine et coenzyme M-jaune). Les couleurs employées pour surligner une coenzyme particulière (par exemple CoB est en orange) sont employées tout au long des figures 17.44 à 17.46 et permettent de suivre les réactions présentées dans chaque figure.

est impliqué dans l’étape terminale de la méthanogenèse catalysée par le complexe enzymatique méthyle-réductase. Comme indiqué dans la figure 17.42f, la structure du CoB ressemble à la vitamine acide pantothénique (qui fait partie de l’acétyl-CoA) [voir figure 5.12].

La biochimie de la réduction de CO2 en CH4 La réduction de CO2 en CH4 se fait en général à partir de H2, mais le formate, le monoxyde de carbone et même certains composés organiques peuvent aussi fournir des électrons pour la réduction du CO2. La figure 17.44 présente les étapes de la réduction de CO2 par H2 :

1. CO2 est activé par une enzyme contenant le méthanofurane et réduit au niveau formyle. 2. Le groupement formyle est transféré du méthanofurane à une enzyme contenant la méthanoptérine (MP dans la figure 17.44). Il est ensuite déshydraté et réduit en deux étapes aux niveaux méthylène et méthyle. 3. Le groupement méthyle est transféré de la méthanopétrine à une enzyme contenant CoM. 4. Le méthyle-CoM est réduit en méthane par le complexe méthyle-réductase dans lequel F430 et CoB sont intimement impliqués. La coenzyme F430 enlève le groupement



17.17 Méthanogenèse 579

Réduction de CO2 en formyle

MF

CO2

2H

O

H2O MF

C

H Formyle

(a)

T. D. Brock

T. D. Brock

MP

(b)

FIGURE 17.43 Fluorescence verte de la coenzyme F 420, impliquée dans la méthanogenèse. (a) Autofluorescence des cellules du méthanogène Methanosarcina barkeri due à la présence d’un transporteur d’électrons particulier : F 420. Le diamètre d’une cellule est d’environ 1,7 µm. Observation en lumière bleue en microscopie à fluorescence (section 4.1 et figure 4.6). (b) Fluorescence du composé F 420 dans les cellules du méthanogène Methanobacterium formicidum. Le diamètre d’une cellule est d’environ 0,6 µm.

O MP

Réduction du formyle en méthylène puis en méthyle

C

H

H2

F420 red

H2O MP

CH2 Méthylène

F420 ox

F420 red MP

CH3 Méthyle

CoM-SH

2H

Force Na+ motrice

CoM-S

CH3

HS-CoB

CH3 du complexe CH3-CoM, formant un autre complexe Ni2+-CH. Celui-ci est réduit par les électrons provenant de CoB, produisant du méthane et un complexe bisoufré de CoM et CoB (CoM-S–S-CoB). 5. Les coenzymes CoB et CoM libres sont régénérées via la réduction (CoM-S-S-CoB) de par H2. C’est au niveau de cette réaction que s’effectue la conservation de l’énergie dans la méthanogenèse.

Méthanogenèse à partir des composés méthylés et de l’acétate Le méthane peut être formé à partir de H2 et CO2, mais aussi à partir de divers composés méthylés. Les composés méthylés comme le méthanol sont catabolisés en transférant les groupements méthyle à une protéine corrinoïde (voir figure 17.45) pour former un complexe CH3-corrinoïde. Les corrinoïdes sont parents structurellement de composés comme la vitamine B12 et contiennent un noyau corrine de type porphyrine avec un atome central de cobalt (voir figure 30.12). Le complexe CH3-corrinoïde donne le groupement méthyle au CoM pour former CH3-CoM à partir duquel est formé le méthane comme dans l’étape finale de réduction du CO2 décrite plus haut (comparez les figures 17.44 et 17.45a). Si le pouvoir réducteur, ici H2, n’est pas disponible pour effectuer l’étape terminale, une partie du méthanol peut être oxydée pour fournir les électrons. Ceci se produit via les étapes inversées de la méthanogenèse (voir figure 17.45a). Quand l’acétate est le substrat de la méthanogenèse, il est d’abord activé en acétyl-CoA. Ce dernier composé interagit avec le monoxyde de carbone de la voie de l’acétyl-CoA (voir section 17.16). Le groupement méthyle de l’acétate est alors transféré à l’enzyme corrinoïde pour donner le complexe CH3-corrinoïde, puis arrive à l’étape finale de la méthanogenèse catalysée par le CoM (voir figure 17.45b). En même temps, le groupement CO est oxydé en CO2.

CoM-S-S-CoB

Réduction du groupe méthyle en méthane

Méthyle réductase ; complexe F430

CH4 Méthane

Force proton motrice

ATP FIGURE 17.44 Voie de la méthanogenèse à partir de CO2, avec H2 comme donneur d’électrons. MF, méthanofurane ; MP, méthanoptérine ; CoM, coenzyme M ; F420rouge, coenzyme F420 réduit ; F430, coenzyme F430 ; coB, coenzyme B. L’atome de carbone réduit est colorié en jaune, la source d’électrons est surlignée en brun. Voir la figure 17.42 pour la structure des coenzymes et le texte pour la discussion concernant la pompe à Na+ réversible. Le premier donneur d’électrons dans la première étape de la méthanogenèse est inconnu. Les électrons pour la réduction du CO2 viennent en général de H2 mais, chez certains méthanogènes, quelques composés organiques peuvent être oxydés et donner les électrons nécessaires à la réduction du CO2 (section 13.4).

L’autotrophie Chez les méthanogènes, l’autotrophie s’effectue via la voie de l’acétyl-CoA (voir section 17.16). Plusieurs parties de cette voie sont déjà intégrées dans le catabolisme du méthanol et de l’acétate (voir figure 17.45). Cependant, les méthanogènes ne possèdent pas la série de réactions conduites par le tetrahydrofolate de la voie de l’acétyl-CoA, qui conduit à la formation d’un groupement méthyle (voir figure 17.41). Ce n’est pas en fait un problème car les méthanogènes soit prennent les groupements méthyle directement de leur donneur d’électrons (voir figure 17.45), soit les fabriquent durant la méthanogenèse à partir de H2 et CO2 (voir figure 17.44). Les groupements méthyle sont donc abondants dans la cellule. Le groupement carbonyle de l’acétate produit durant la croissance autotrophe des méthanogènes provient du monoxyde de carbone déshydrognénase, et l’étape finale dans la synthèse de l’acétate se produit comme chez les homoacétogènes (voir section 17.16 et figure 17.41).



580 Chapitre 17

Diversité métabolique CH3OH + Corr

CH3COOH ATP

CH3

MP

CH3

Corr

O

CoM

CH3

CH3

MP

Utilisation 2H du pouvoir ATP réducteur par réducteur pour la réduction oxydation CH4 du méthanol du méthanol en méthane en CO2 Méthanogénèse Génération

O MF

C H 2H

O C

Biosynthèse

C

CODH

Corr O CH3

CODH H2O

CO déshydrogénase

CoA

O CH3

C

CO2

2H

C~S

CO déshydrogénase

CoM

4 H du pouvoir MF

CoA

Corr CoM

2H CO2

CODH

CH3

CoM ATP

O CH3 CoA CH3

C

CH4 CODH

Formation de l’acétyl-CoA pour la biosynthèse

O C

CoA

Biosynthèse

(a) Conversion du méthanol en méthane

Méthanogénèse (b) Conversion de l’acétate en méthane

FIGURE 17.45 Conversion du méthanol et de l’acétate en méthane. Des portions de la voie de l’acétyl-CoA sont impliquées dans les deux séries de réactions (section 17.41). Dans le cas de la croissance sur méthanol, la plupart du méthanol est converti en CH4, le reste étant converti soit en CO2, soit assimilé dans le matériel cellulaire via la formation de l’acétyl-CoA. Les abréviations et les couleurs sont celles des figures 17.42 et 17.44. Corr, protéine corrinoïde ; CODH, monoxyde de carbone déshydrogénase.

La conservation de l’énergie chez les méthanogènes En conditions standard, le changement d’énergie libre au cours de la réduction de CO2 en CH4 par H2 est –131 kJ/mol. Cela est suffisant pour la synthèse d’au moins un ATP. La conservation de l’énergie chez les méthanogènes est liée à l’étape terminale, l’étape de la méthyle-réductase (voir figure 17.44). L’interaction de CoB avec CH3-CoM dans cette étape terminale donne CH4 et un hétérodisulfure, CoM-SS–CoB. Ce dernier complexe est alors réduit par les électrons venant de F420 pour régénérer CoM-SH et CoB-SH (voir figure 17.44). Cette réduction réalisée par l’enzyme hétérodisulfure réductase est exergonique et est associée à une extrusion de protons à l’extérieur de la membrane, ce qui crée une force proton-motrice (voir figure 17.46). La dissipation du gradient de protons par une ATPase à translocation de protons (voir section 5.12) permet la synthèse d’ATP au cours de la méthanogenèse de la même façon que dans d’autres formes de respiration. Le flux d’électrons vers l’hétérodisulfure réductase implique un transporteur d’électrons membranaire particulier, nommé méthanophenazine (voir figure 17.4). Dans le processus de transport d’électrons de l’étape terminale, la méthanophénazine est alternativement réduite (par F420), puis

oxydée (par un cytochrome de type b), qui est le donneur ultime d’électrons à l’hétérodisulfure réductase (voir figure 17.46). La méthanogenèse à partir des composés méthylés est aussi liée à la pompe à protons hétérodisulfure réductase, mais un facteur supplémentaire intervient. En l’absence de H2, la méthanogenèse à partir de composés comme CH3OH nécessite qu’une partie de ces molécules soit oxydée en CO2 afin de générer les électrons nécessaires à la réduction du groupement méthyle en méthane (voir figure 17.45). Ceci nécessite un apport d’énergie et se produit aux dépens d’une force sodium-motrice (potentiel de membrane à Na+, section 17.20). L’énergie inhérente à ce potentiel de membrane provient de la conversion de CH3-MP en CH3-CoM au cours de la méthanogenèse. L’action inverse consomme de l’énergie et est pilotée par la pompe à Na+. Les étapes suivantes d’oxydation dans la conversion des groupements méthyle en CO2 se font en inversant les étapes enzymatiques conduisant à CH4 à partir de CO2 (voir figure 17.44). Chez les méthanogènes, il y a donc deux types d’ATPases : une pompe à protons typique utilisée pour la synthèse d’ATP, et une pompe à Na+ pour piloter l’oxydation du groupement méthyle.



17.18 Fer ferrique, manganèse, chlorate et accepteurs d’électrons organiques 581 H

17.18 Fer ferrique, manganèse, chlorate m n et accepteurs d’électrons organiques

H

H

N

H

O–C25H43

N H

H

(a)

MPHox

Site de la réduction pour MPHrouge

H+

H+ Extérieur

H2

F420-ox

MPHred

cyt bred

F420-red

MPHox

cyt box

Hétérodisulfide réductase

Intérieur CoM–S– S–CoB + 2 H2O ADP

ATP

CoM-SH + HS-CoB + 2 OH–

(b) FIGURE 17.46 Conservation de l’énergie au cours de la méthanogenèse. (a) Structure de la méthanophénazine (MPH dans la partie b de la figure), un transporteur d’électrons de la chaîne de transport conduisant à la synthèse d’ATP. Le noyau central de la molécule peut être alternativement réduit ou oxydé. (b) Étapes du transport d’électrons. Les électrons provenant de H 2 réduisent F 420, puis la méthanophénazine. Cette dernière, via un cytochrome de type b, réduit l’hétérodisulfure réductase, avec extrusion de protons à l’extérieur de la membrane. Dans l’étape finale, l’hétérodisulfure réductase réduit le complexe Co-M-S–S-CoB en HS-CoM et HS-CoB. Voir la figure 17.42 pour les structures de CoM et CoB.

En addition des accepteurs d’électrons pour la respiration anaérobie étudiés jusqu’ici, le fer ferrique (Fe3+), l’ion manganèse (Mn4+), l’ion chlorate (ClO3–) et de nombreux composés organiques sont d’importants accepteurs d’électrons pour les bactéries en milieu naturel (voir figure 17.47). Une grande diversité de bactéries sont capables de les réduire, particulièrement Fe3+, et beaucoup d’autres réduisent d’autres accepteurs comme NO3– et S0 (voir sections 17.14 et 17.15).

La réduction du fer ferrique Le fer ferrique est un accepteur d’électrons pour de nombreuses bactéries chimio-oganotrophes et chimiolithotrophes, et comme cet ion est abondant dans la nature, sa réduction constitue une forme importante de respiration anaérobie. Le potentiel de réduction du couple Fe3+/Fe2+ est assez électropositif (E0’ = +0,2 V à pH 7) et pour cela, la réduction de Fe3+ peut être couplée à l’oxydation de plusieurs donneurs d’électrons organiques et inorganiques. Des composés organiques variés, y compris aromatiques, peuvent être oxydés en anaérobiose par les ferroréducteurs. Dans tous les cas, les électrons parcourent une chaîne de transport d’électrons qui se termine par un complexe de réductase ferrrique. Le flux d’électrons établit une force proton-motrice qui peut être utilisée pour générer de

Accepteur/Produit (E0′)

Réaction

Chlorate / Chlorure (+1,03) Ion manganique / ion manganeux (ou ion Mn4+ / ion Mn2+) (+0,798) Sélénate/ Sélénite (+0,475)

La méthanogenèse est la production biologique de méthane soit à partir de H2 et CO2, soit à partir de composés méthylés. Une série de coenzymes particulières intervient dans la méthanogenèse et le processus est strictement anaérobie. La conservation d’énergie chez les méthanogènes implique à la fois des gradients de protons et d’ions sodium. •

•

•

O

–O

O–

Se

2 e– 2 H+

Fer ferrique/ Fer ferreux (+0,2)

2 e–

Diméthyl-sulfoxyde (DMSO)/ H3C S Diméthyl-sulfure (DMS) (+0,16)

CH3

O O–

Arsenate/ Arsenite (+0,139)

–O

As

O

O–

2 e– 2 H+

Se

O + H2O

O– e–

Fe2+

(CH3)2S + H2O

O–

2 e– 2 H+

CH3

Mn2+

O–

Fe3+

O– + H2O

As O–

•

–

Quelles coenzymes fonctionnent comme transporteurs d’électrons dans la méthanogenèse ? comme donneurs ?

Triméthylamine-N-oxyde (TMAO)/ H C N CH 2 e 3 3 Triméthylamine (TMA) (+0,13) 2 H+

Pourquoi les étapes du catabolisme de CH3OH au cours de la méthanogenèse diffèrent-elles selon la présence ou non d’H2 ?

Fumarate/ Succinate (+0,03)

Comment une force proton-motrice est-elle produite dans la méthanogenèse ?

Cl– + 3 H2O

6 H+

Mn4+

O


6 e–

ClO3–

(CH3)3N + H2O

O

–O

O

H

C

C

O C H

C

2 e– + – O– 2 H O

O

O

C

CH2 CH2 C

O–

FIGURE 17.47 D’autres accepteurs d’électrons pour la respiration anaérobie. Notez la différence des E0’ des différents accepteurs.




l’ATP. De nombreux travaux de recherche sur l’énergétique de la réduction du fer ont été réalisés avec la bactérie Shewanella putrefaciens, chez qui la croissance anaérobie basée sur la réduction de Fe3+ peut intervenir avec divers donneurs d’électrons. D’autres ferroréducteurs importants sont : Geobacter, Geospirillum ou Geovibrio. Geobacter metallireducens a servi de modèle pour la physiologie de la réduction du fer. Cet organisme peut oxyder l’acétate avec Fe3+ comme accepteur d’électrons selon la réaction : Acétate– + 8 Fe3+ + 4 H20 → 2 HCO3– + 8 Fe2+ + 9 H+ ∆G0’ = – 233 kJ Geobacter peut aussi utiliser H2 ou des donneurs d’électrons organiques, y compris des hydrocarbures aromatiques comme le toluène (voir figure 17.56c). Ceci peut avoir un intérêt environnemental car le toluène provenant de déversements accidentels ou de fuites de réservoirs de stockage contamine souvent des aquifères riches en fer, et des organismes tel Geobacter peuvent être des agents naturels de nettoyage de ces environnements.

La réduction du manganèse (Mn4+) et des autres composés inorganiques Le manganèse peut se présenter à différents niveaux d’oxydation parmi lesquels Mn4+ et Mn 2+ sont les plus stables et les plus importants biologiquement. La réduction anaérobie du Mn4+ en Mn2+ est réalisée par de nombreux micro-organismes, essentiellement chimio-organotrophes. Chez Shewanella putrefaciens et quelques autres bactéries, la croissance anaérobie sur acétate et d’autres sources de carbone non fermentescibles peut s’effectuer avec Mn4+ comme accepteur d’électrons. Le potentiel de réduction du couple Mn4+/Mn2+ est très élevé (voir figure 17.47) ; aussi plusieurs composés devraient être capables de donner des électrons pour sa réduction. Il en est de même pour le chlorate, car son potentiel de réduction est très positif (voir figure 17.47). Plusieurs bactéries chlororéductrices ont été isolées et la plupart d’entre elles sont anaérobies facultatives et aussi capables de croissance aérobie. D’autres substances inorganiques peuvent fonctionner comme accepteurs d’électrons pour la respiration anaérobie – dont les composés contiennent de l’arsenic ou du sélénium (voir figure 17.47). Bien que peu abondants dans les écosystèmes naturels, les composés à base d’arsenic et de sélénium sont des polluants occasionnels, et peuvent permettre la croissance anaérobie de diverses bactéries. La réduction de SeO42– en SeO32– et finalement Se0 (sélénium métal) est un moyen important d’éliminer le sélénium de l’eau et le principe a été utilisé en bioremédiation (voir section 19.19) des sols contaminés par le sélénium. Réciproquement, la réduction de l’arsenate en arsenite peut causer un problème de toxicité. Des eaux souterraines coulent au travers de roches contenant des minéraux arseniqués relativement insolubles. Cependant, si l’arsenate est réduit en arsenite par les bactéries, l’arsenite devient plus mobile et peut contaminer les eaux souterraines. Il y a eu ainsi un sérieux problème de contamination à l’arsenic des eaux de puits au Bangladesh ces dernières années. D’autres formes de réduction de l’arsenate sont bénéfiques. Par exemple, la bactérie sulfato-réductrice Desulfotomaculum peut réduire l’arsenate (AsO43–) en arsenite (AsO33–) en

même temps que SO42– en HS–. Au cours de ce procédé, il se forme un minéral complexe contenant arsenic et sulfures – As2S3 – qui précipite spontanément (voir figure 17.48). Le minéral est formé à la fois dans et à l’extérieur des cellules et sa formation est un exemple de biominéralisation. Dans ce cas, la formation de As2S3 (voir figure 17.48) est aussi un moyen de détoxifier ce qui serait sans cela un composé toxique (l’arsenic) ; ce genre d’activité peut avoir des applications pratiques pour nettoyer les déchets contaminés à l’arsenic.

Les accepteurs d’électrons organiques Plusieurs composés organiques peuvent fonctionner comme accepteurs d’électrons externes dans la respiration anaérobie. Parmi ceux figurant dans la figure 17.47, le composé le plus étudié est le fumarate, qui est réduit en succinate. Fumarate et succinate sont d’importants intermédiaires du cycle de l’acide citrique (voir figure 5.22). Le rôle du fumarate comme accepteur d’électrons dans la respiration anaérobie vient du fait que le couple succinate / succinate a un potentiel de réduction proche de 0 V (voir figure 17.35), ce qui permet de coupler la réduction du fumarate à l’oxydation de NADH ou de H2. L’énergie produite est suffisante pour la synthèse d’un ATP. Parmi les bactéries capables d’utiliser le fumarate comme accepteur d’électrons figurent Wolinella succinogenes (qui peut croître en utilisant H2 comme donneur d’électrons et le fumarate comme accepteur), Desulfovibrio gigas (une bactérie sulfato-réductrice qui peut aussi croître sans réduire les sulfates), certains Clostridia, Escherichia coli et de nombreuses autres. L’oxyde de triméthylamine (voir figure 17.47) est un important accepteur d’électrons organique. L’oxyde de triméthylamine (TMAO) est produit par les poissons marins, chez qui il permet l’excrétion d’un excès d’azote. De nombreuses bactéries peuvent réduite le TMAO en triméthylamine (TMA), qui a une odeur et une saveur fortes. Une partie des

Dianne K. Newman et Stephen Tay

582 Chapitre 17

FIGURE 17.48 Production de trisulfure minéral d’arsenic (As 2S3) pendant la réduction de l’arsenate par la bactérie sulfato-réductrice Desulfotomaculum auripigmentum. À gauche, un flacon de culture après l’inoclation. À droite, après deux semaines de croissance. Au centre, échantillon synthétique de As 2S3. La production d’un minéral par un micro-organisme se nomme biominéralisation.



17.18 Fer ferrique, manganèse, chlorate et accepteurs d’électrons organiques 583

fortes odeurs résultant du poisson avarié est due à la production de TMA par les bactéries. De nombreuses bactéries anaérobies facultatives sont capables d’utiliser TMAO comme accepteur d’électrons alternatif. De plus, plusieurs bactéries pourpres phototrophes (voir section 12.2) sont capables d’utiliser le TMAO comme accepteur d’électrons lors de leur métabolisme anaérobie à l’obscurité. Le diméthyl-sulfoxyde (DMSO) est un composé analogue au TMAO, et est réduit par de nombreuses bactéries en diméthyle-sulfure (DMS). Le DMSO est un produit naturel commun, que l’on rencontre en eau douce comme en eau de mer. Le DMS a une odeur forte, irritante, et la réduction bactérienne de DMSO en DMS est signalée par cette odeur. De nombreuses bactéries dont Campylobacter, Escherichia et de nombreuses bactéries pourpres peuvent utiliser le DMSO comme accepteur d’électrons dans leur métabolisme énergétique (voir section 19.13). Les potentiels de réduction des couples TMAO/TMA et DMSO/DMS sont proches, voisins de +0,15 V, ce qui signifie qu’une chaîne de transport d’électrons se terminant par TMAO ou DMSO doit être assez courte. Comme pour la réduction du fumarate, dans la plupart des cas de réduction de TMAO ou DMSO, des cytochromes de type b (potentiel de réduction proche de 0) ont été identifiés comme oxydases terminales.

composés organiques comme donneurs d’électrons et le chlorobenzote comme accepteur : C7H4O2Cl– + 2 H → C7H5O2– + HCl

3-Chlorobenzoate

À côté de Desulfomonile, qui est aussi une bactérie sulfatoréductrice (voir tableau 17.5), une grande diversité d’autres bactéries peut réduire des composés chlorés – certaines utilisant exclusivement des composés chlorés comme accepteurs d’électrons (voir tableau 17.5). De nombreux composés chlorés réduits sont toxiques pour les poissons et d’autres animaux, alors que de nombreux produits résultant de la déchloration le sont moins, voire inoffensifs. Par exemple, la bactérie Dehalococcoides réduit le tri- et tetra-chloroéthylène en éthène, un gaz sans danger (voir tableau 17.5). Le microorganisme déchlorant Dehalobacterium convertit le composé toxique di-chlorométhane (CH2Cl2) en acétate et formate. Ainsi, la déchloration réductrice est non seulement une forme de métabolisme énergétique, mais un processus de bioremédiation significatif (voir section 19.18). De nombreuses bactéries déchloratrices sont aussi capables de réduire les nitrates ou des composés soufrés (voir tableau 17.5). Ce groupe métabolique est donc formé d’opportunistes et de spécialistes.


Les composés halogénés comme accepteurs d’électrons : déchloration réductrice Plusieurs composés chlorés peuvent fonctionner comme accepteurs d’électrons dans la respiration anaérobie au cours d’un processus appelé déchloration réductrice ou déhalorespiration. Par exemple, les bactéries sulfato-réductrices Desulfomonile croîent en anérobiose avec H2 ou des

TABLEAU 17.5

Benzoate

À côté des composés inorganiques soufrés, azotés ou du CO2, de nombreuses substances, organiques et inorganiques, peuvent fonctionner comme accepteurs d’électrons pour la respiration anaérobie. Parmi ces composés, Fe3+, Mn4+, le fumarate et certains composés chlorés.

CARACTERISTIQUES DES PRINCIPAUX GENRES DE BACTÉRIES CAPABLES DE DÉCHLORATION RÉDUCTRICE

Genre Propriété

Dehalobacter

Desulfomonile

Desulfitobacterium

Dehalococcoides

Donneurs d’électrons

H2

H2, formiate, pyruvate, lactate, benzoate

H2, formiate, pyruvate, lactate

H2, lactate

Accepteurs d’électrons

Trichloroéthylène, tétrachloroéthylène

Métachlorobenzoates, tétrachloroéthylène, SO42–, SO32–, S2O32–

Ortho-, meta- ou parachlorophénols, NO3–, fumarate, SO32–, S2O32–, S0

Trichloroéthylène, tétrachloroéthylène

Produit de la réduction du tétrachloroéthylène

Dichloroéthylène

Dichloroéthylène

Trichloroéthylène

Éthène

Autres propriétésa

Contient le cytochrome b

Contient le cytochrome c3 ; besoin en carbone organique ; peut croître par fermentation du pyruvate

Peut aussi croître par fermentation

Pas de peptidoglycane

Phylogénieb

Proche des Bacteria Gram positif à faible G+C

Proche des delta Proteobacteria

Proche des Bacteria Gram positif à faible G+C

Proche des bactéries vertes non sulfureuses (Chloroflexus)

a b

Tous les organismes sont des anaérobies obligatoires. Voir chapitre 12 et figure 12.1 pour la phylogénie des procaryotes.



584 Chapitre 17

•


Avec H2 comme donneur d’électrons, pourquoi la réduction de Fe3+ est-elle plus favorable que la réduction du fumarate ?

•

Donnez un exemple de biominéralisation.

•

Dans la nature, où peuvent être abondantes les bactéries dégradant TMAO ? Pourquoi ?

•

Qu’est-ce que la déchloration réductrice ?

IV

MODES DE VIE ANAÉROBIES : FERMENTATIONS ET SYNTROPHIE

17.19 Fermentations : énergétique m n et équilibre redox Beaucoup de biotopes deviennent facilement anoxiques parce que l’oxygène n’est pas très soluble dans l’eau (9,6 mg/L d’eau distillée en équilibre avec l’air, à 25 °C). Dans de tels environnements, la décomposition de la matière organique doit se produire de façon anaérobie. Si, dans de tels milieux anoxiques, les accepteurs d’électrons – par exemple SO42–, NO3–, Fe3+ et beaucoup d’autres – ne sont pas disponibles en quantité suffisante, une grande partie du carbone sera catabolisée par fermentation (voir figure 17.49). [CO2 accepte exceptionnellement des électrons. Il est rarement limitant dans les habitats anoxiques mais est converti en méthane en présence de H2, ce dernier étant lui-même un produit de fermentation.] Un organisme qui dégrade des composés organiques pour se procurer de l’énergie doit faire face à deux problèmes : 1) conserver une partie de l’énergie libérée sous forme d’ATP et 2) se débarrasser des électrons libérés par le donneur d’électrons. Dans la fermentation, la synthèse d’ATP se produit généralement par phosphorylation au niveau du substrat : des groupements phosphates riches en énergie, liés à des composés intermédiaires organiques, sont transférés à l’ADP (voir section 5.9). Le deuxième problème, celui de l’équilibre redox, est résolu par la production et l’excrétion des produits de fermentation formés à partir du substrat de départ (voir figures 17.49 et 17.50).

Substrats organiques ADP ATP

Biomasse cellulaire

Phosphorylation ADP ATP au niveau du substrat

Produits de fermentation (acides, alcools, CO2, H2, NH3)

FIGURE 17.49 Vue d’ensemble de la fermentation. Dans une fermentation typique, la majeure partie du carbone est excrétée en tant que produit terminal du métabolisme énergétique, sous une forme partiellement réduite, et seule une petite partie du carbone est utilisée pour les biosynthèses.

Les composés riches en énergie et la phosphorylation au niveau du substrat De nombreux types de fermentations produisent de l’énergie à partir de la phosphorylation au niveau du substrat. Cependant, la production de composés riches en énergie est indispensable à la synthèse d’ATP. Ces composés sont des molécules organiques contenant un groupement phosphate ou une molécule de coenzyme-A, dont l’hydrolyse est hautement exergonique. Le tableau 17.6 présente la liste de quelques intermédiaires riches en énergie formés au cours de processus biochimiques. La plupart des composés listés dans ce tableau peuvent être directement couplés à la synthèse d’ATP (–31,8 kJ/mol). Si un organisme forme un de ces composés pendant la fermentation, il peut synthétiser de l’ATP. La phosphorylation au niveau du substrat est une voie plus directe que la phosphorylation oxydative pour synthétiser l’ATP (voir figure 5.13), mais la source d’énergie doit être couplée à un composé intermédiaire riche en énergie. La figure 17.50 présente plusieurs voies de dégradation anaérobie de diverses substances fermentescibles en composés intermédiaires riches en énergie.

Les rendements énergétiques des organismes fermenteurs Combien d’ATP peut produire un organisme fermenteur ? Les organismes qui fermentent le glucose produisent 2 ou 3 ATP

TABLEAU 17.6

COMPOSÉS RICHES EN ÉNERGIE IMPLIQUÉS DANS LA PHOSPHORYLATION a AU NIVEAU DU SUBSTRAT

Composé

Énergie libre d’hydrolyse, ∆G0’ (kJ/mol)b

Acétyl-CoA

– 35,7

Propionyl-CoA

– 35,6

Butyryl-CoA

– 35,6

Succinyl-CoA

– 35,1

Acétylphosphate

– 44,8

Butyrylphosphate

– 44,8

1,3-Diphosphoglycérate

– 51,9

Carbamyl phosphate

– 39,3


– 51,6

Adénosine-phosphosulfate (APS) 10

– 88

N -Formyltétrahydrofolate

– 23,4

Énergie d’hydrolyse de l’ATP (ATP → ADP + Pi)

– 31,8

a

Données d’après Thauer, R. K., K. Jungermann et K. Decker. 1977. “Energy conservation in chemotrophic anaerobic bacteria”. Bacteriol. Rev. 41, p. 100-180. b Les valeurs indiquées ici sont celles des « conditions standard », qui ne reflètent pas obligatoirement les conditions cellulaires. En incluant la perte d’énergie par chaleur, les coûts énergétiques pour la synthèse d’un ATP sont plus proches de 60 que de 32 kJ, et l’énergie d’hydrolyse des composés riches en énergie figurant ici est, par conséquent, sensiblement plus élevée. Mais pour des raisons de simplification et afin de les comparer, les valeurs indiquées dans ce tableau seront considérées comme étant celles correspondant à l’énergie libérée par la réaction.



17.19 Fermentations : énergétique et équilibre redox 585 Purines Acides Pyrimidines organiques : Lactate Acrylate Malate Fumarate Succinate Citrate Divers

Acides aminés : Alanine Glutamate Histidine Aspartate Glycine Sérine Cystéine Sucres : Tryptophane Hexoses

Alcools : Purines Éthanol Méthanol Éthylène Crotonate glycol Arginine Lysine Agmatine Glutamate Allantoïne γ -AminoPyrimidines butyrate

3-Cétoacyl-CoA Butyryl-CoA Carbamyl-P Formyl- ButyrylFH4 phosphate

CO2

ADP

ADP

ADP

ATP

ATP

ATP

Formiate Butyrate

Acides aminés Thréonine Leucine Homosérine Isoleucine HomoValine cystéine Méthionine Pentoses

Tryosine Phénylalanine Tryptophane

Voie des Voie des hexoses hexoses monophosphates diphosphates Fructose-1,6-PP

Gluconate-6-P Xylulose-5-P

Glycérate-1,3-PP ADP ATP Glycérate-3-P

Pyruvate Acétyl-CoA

Phosphoénolpyruvate ADP ATP Succinyl-CoA

Acétylphosphate ADP ATP Acétate

2-Cétobutyrate

3-Alkylpyruvate

3-Arylpyruvate

PropionylCoA

2-AlkylacétylCoA

2-ArylacétylCoA

2-Alkyl2-Arylacétylacétylphosphate phosphate ADP ADP ADP

Propionylphosphate

ATP ATP ATP Propionate 2-Alkyl-acétate Propionate

FIGURE 17.50 Les voies principales de la dégradation anaérobie de diverses substances fermentées. Les sites de la phosphorylation au niveau du substrat sont indiqués. Les dérivés du CoA riches en énergie et les autres composés riches en énergie sont surlignés en bleu (voir tableau 17.6).

par molécule de glucose au cours de la glycolyse (voir figure 5.14). C’est la quantité maximale d’ATP produite par fermentation ; beaucoup d’autres substrats sont moins énergétiques. L’énergie potentielle libérée au cours d’une fermentation peut être calculée à partir de la stoéchiométrie de la réaction équilibrée et des valeurs d’énergie libre données dans l’annexe 1. La fermentation du glucose en éthanol et CO2, par exemple, a un rendement énergétique théorique de –235 kJ/ mol, assez pour produire environ 7 ATP. Cependant, seulement 2 ATP sont réellement produits, ce qui veut dire que le rendement du métabolisme énergétique de l’organisme est bien en deçà de 100 %, une quantité non négligeable d’énergie étant perdue sous forme de chaleur.

L’équilibre d’oxydo-réduction et la production de H2 Dans toute réaction de fermentation, il doit y avoir un équilibre entre oxydation et réduction. Le nombre total d’électrons des produits situés du côté droit de l’équation doit équilibrer le nombre d’électrons des substrats situés du côté gauche de cette même équation. Quand on étudie une fermentation, il faut, pour calculer l’équilibre de la réaction de fermentation, s’assurer qu’aucun produit ne manque. On peut également prévoir, de façon théorique, l’équilibre d’une réaction de

fermentation, si l’on connaît l’état d’oxydation des substrats et des produits (voir annexe 1 pour les calculs). Dans un certain nombre de fermentations, l’équilibre des électrons est maintenu par la production d’hydrogène moléculaire, H2. Lors de la production de H2, les protons provenant de l’eau servent d’accepteurs d’électrons. La production de H2 est généralement associée à la présence de ferrédoxine, protéine fer-soufre transporteuse d’électrons, à potentiel très bas. Le transfert des électrons de la ferrédoxine vers H+ est catalysé par l’hydrogénase (voir figure 17.51). La production d’hydrogène est en réalité légèrement défavorable du point de vue énergétique, et la plupart des organismes fermenteurs produisent peu d’hydrogène au cours de la fermentation des autres produits. La production d’hydrogène sert essentiellement à maintenir l’équilibre redox. L’acétate est un des produits de fermentation chez beaucoup de bactéries anaérobies. La production d’acétate ou de certains autres acides gras (voir tableau 17.6) présente un avantage du point de vue énergétique parce qu’elle permet la synthèse d’ATP par phosphorylation au niveau du substrat. L’acétylCoA est le principal intermédiaire riche en énergie formé au cours de la production d’acétate (voir tableau 17.6 et figure 17.50). L’acétyl-CoA peut être converti en acétyl-phosphate (voir tableau 17.6), le groupement phosphate de ce



586 Chapitre 17


H2 Acétate + ATP

2 H+

ADP

Hydrogénase

Acétyl~P

Ferrédoxine

Pi Acétyl-CoA + CO2

2 e–

CoA

Pyruvate FIGURE 17.51 Production d’hydrogène moléculaire et d’acétate à partir du pyruvate. Notez comment la production d’acétate conduit à la synthèse d’ATP à partir de l’hydrolyse d’un composé intermédiaire riche en énergie, l’acétyl-phosphate (voir tableau 17.6).

dernier pouvant ensuite être transféré à l’adénosine diphosphate (ADP) par l’acétate kinase, pour former de l’ATP. Le pyruvate, produit clé de la glycolyse, est un des principaux substrats convertis en acétyl-CoA par oxydation (voir figure 17.51). Les électrons produits en excès sont soit utilisés pour former un produit terminal plus réduit, soit libérés sous forme de H2.

Contrôlez vos acquis Les composés organiques peuvent être catabolisés par fermentation uniquement, en absence d’un accepteur d’électrons exogène. Seuls certains composés sont fermentescibles. Dans la plupart des fermentations, la production d’ATP par phosphorylation au niveau du substrat requiert un intermédiaire organique riche en énergie. L’équilibre redox doit également être respecté dans les fermentations, la production de H2 constituant un des moyens d’éliminer les électrons produits en excès. •

Qu’est-ce que la phosphorylation au niveau du substrat ?

•

Pourquoi la formation d’acétate au cours de la fermentation est-elle énergétiquement bénéfique ?

17.20 Diversité des fermentations m n La diversité des fermentations Le tableau 17.7 présente les principaux types de fermentations, classées en fonction des produits formés (alcool, acide lactique, acide propionique, mélanges d’acides, acide butyrique et acide homoacétique). Certaines fermentations sont classées en fonction du substrat fermenté plutôt que du produit de fermentation. Ainsi, beaucoup de bactéries anaérobies formant des endospores (du genre Clostridium) fermentent des acides aminés en produisant de l’acétate,

de l’ammoniaque et H2 (voir figure 12.59). D’autres espèces de Clostridium, comme C. acidiurici et C. purinolyticum, fermentent les purines xanthine ou adénine et forment de l’acétate, du formiate, du CO2 et de l’ammoniaque. D’autres bactéries anaérobies fermentent des composés aromatiques. Par exemple, la bactérie Pelobacter acidigallici fermente le phloroglucinol (1,3,5benzènetriol, C6H6O3) et produit de l’acétate, l’énergie étant libérée lors de l’étape de conversion de l’acétyl-CoA en acétate (voir tableau 17.7). Beaucoup de fermentations rares sont effectuées par quelques groupes de bactéries anaérobies, et dans certains cas, par une seule espèce bactérienne. Le tableau 17.8 présente quelques exemples de fermentations rares. Plusieurs de ces bactéries qui ont développé des voies biochimiques leur permettant de cataboliser un substrat ou des substrats qui ne peuvent pas être catabolisés par d’autres bactéries, peuvent être considérées comme des spécialistes métaboliques. Cependant, de même que pour les substances énumérées dans le tableau 17.7, la fermentation de ces substrats est liée à la production par l’organisme d’un intermédiaire riche en énergie du même type que ceux présentés dans le tableau 17.6, de manière à stocker une partie de l’énergie libérée sous forme d’ATP.

Les fermentations sans phosphorylation au niveau du substrat Certains substrats ne libèrent pas suffisamment d’énergie pour synthétiser l’ATP par phosphorylation au niveau du substrat, et pourtant ces composés peuvent encore subvenir à la croissance de certains micro-organismes. Dans ce cas, par exemple chez Propionigenium modestum et Oxalobacter formigenes, le catabolisme du substrat est lié à des pompes ioniques qui génèrent un gradient de proton ou de sodium à travers la membrane ; ces deux organismes couplent la fermentation des acides dicarboxyliques à des pompes ioniques membranaires reliées à la fourniture d’énergie. La bactérie Propionigenium modestum effectue la réaction suivante : Succinate2– + H2O → propionate– + HCO3– ∆G0’ = – 20,5 kJ Cette réaction n’apporte pas assez d’énergie libre pour synthétiser l’ATP par phosphorylation au niveau du substrat, mais c’est néanmoins la seule réaction qui produit l’énergie nécessaire à la croissance de l’organisme. En effet, la décarboxylation du succinate (via le méthylmalonyl-CoA et sa décarboxylase fixée à la membrane) par Propionigenium modestum est couplée à l’exportation de sodium (Na+) à travers la membrane cytoplasmique (voir figure 17.52a). Une Na+-ATPase située dans la membrane de P. modestum utilise ce gradient de Na+ pour synthétiser l’ATP (voir figure 17.52a). La bactérie Oxalobacter formigenes effectue la fermentation de l’oxalate : Oxalate2– + H2O → formiate– + HCO3–

∆G0’ = – 26,7 kJ

À pH neutre, l’oxalate existe sous sa forme ionisée oxalate2–. Sa décarboxylation en formiate consomme un proton. L’exportation de formiate hors de la cellule entraîne la formation d’une



17.20 Diversité des fermentations 587

TABLEAU 17.7

EXEMPLES DE FERMENTATIONS BACTÉRIENNES COURANTES ET DE QUELQUES ORGANISMES QUI LES UTILISENT Réaction globalea

Type

Organismes

Alcoolique

Hexose → 2 éthanol + 2 CO2

Levure Zymomonas

Homolactique

Hexose → 2 lactate– + 2 H+

Streptococcus Certains Lactobacillus

Hétérolactique

Hexose → lactate– + éthanol + CO2 + H+

Leuconostoc Certains Lactobacillus

Propionique

Lactate → propionate– + acétate– + CO2

Propionibacterium Clostridium propionicum

Acide mixte

Hexose → éthanol + 2,3-butanediol + succinate2– + lactate– + acétate– + formiate– + H2 + CO2

Bactéries entériquesb Escherichia Salmonella Shigella Klebsiella Enterobacter

Butyrique

Hexose → butyrate– + acétate– + H2 + CO2

Clostridium butyricum

–

–

Butanolique

Hexose → butyrate + acétate + acétone + éthanol + H2 + CO2

Clostridium acetobutylicum

Caproïque

Éthanol + acétate– + CO2 → caproate– + butyrate– + H2

Clostridium kluyveri

–

+

Homoacétogénique

Fructose → 3 acétate + 3 H 2 H2O 4 H2 + 2CO2 + H+ → acétate–

Clostridium aceticum Acetobacterium

Méthanogénique

Acétate– + H2O → CH4 + HCO3–

Methanosaeta Methanosarcina

a b

Les réactions illustrent le processus global mais ne sont pas nécessairement équilibrées. Chaque organisme ne fabrique pas tous les produits. En particulier, la production de butanediol est limitée à certaines bactéries entériques.

force proton-motrice qui peut être couplée à la synthèse d’ATP grâce à une H+-ATPase membranaire (voir figure 17.52b). Fait intéressant et unique des fermentations de Propionigenium et d’Oxalobacter, la synthèse d’ATP se produit sans phosphorylation au niveau du substrat et sans transport d’électrons.

TABLEAU 17.8

QUELQUES FERMENTATIONS BACTÉRIENNES RARES

Type Acétylène

Dans les deux cas, cependant, la formation chimiosmotique d’ATP se produit grâce à l’existence d’une pompe à Na+ ou H+ reliée à la décarboxylation d’acides organiques. Ces organismes nous donnent ainsi une leçon importante en bioénergétique : si l’on considère la croissance bactérienne, toutes les réactions

Réaction globale équilibrée –

+

2 C2H2 + 3 H2O → éthanol + acétate + H HCO3–

–

Organismes Pelobacter acetylenicus

+

→ 7 acétate + 5 H + 4 H2O

Glycérol

4 glycérol + 2

Résorcinol (composé aromatique)

2 C6H4(OH)2 + 6 H2O → 4 acétate– + butyrate– + 5 H+

Clostridium sp.

Phloroglucinol (composé aromatique)

C6H6O3 + 3 H2O → 3 acétate– + 3 H+

Pelobacter massiliensis Pelobacter acidigallici

Putrescine

10 C4H12N2 + 26 H2O → 6 acétate– + 7 butyrate– + 20 NH4+ + 16 H2 + 13 H+

Bactéries Gram positif, anaérobies, ne formant pas de spores

Citrate

Citrate3+ + 2 H2O → Formiate– + 2 acétate– + HCO3– + H+

Bacteroides sp.

3–

+

–

+ H + 2 H2O → 2 CO2 + 2 acétate + H2

Acetobacterium sp.

Aconitate

Aconitate

Glyoxylate

4 glyoxylate– + 3 H+ + 3 H2O → 6 CO2 + 5 H2 + glycolate–

Bactérie Gram négatif non classée

Succinate

Propionigenium modestum

Malonate

Succinate + H2O → propionate + HCO3– Oxalate2– + 3 H2O → formiate– + HCO3– Malonate2– + H2O → acétate– + HCO3–

Benzoate

2 benzoate– → cyclohexane carboxylate– + 3 acétate– + HCO3– + 3H+

Syntrophus aciditrophicus

Oxalate

2–

–

Acidaminococcus fermentans

Oxalobacter formigenes Malonomonas rubra Sporomusa malonica



588 Chapitre 17

Na+

ATPase

Na+


Décarboxylase expulsant le sodium Succinate2–

Succinate2– ADP + Pi

ATP

H2O

Na+

H+

ATPase

Antiport Formiate/ Oxalate

H+

Formiate– Oxalate2–

Na+

Formiate– Oxalate2–

HCO3–

ADP + Pi

ATP

Propionate–

HCO3–

Na+ (a)

H2O

(b)

FIGURE 17.52 Le cas particulier des fermentations du succinate et de l’oxalate. (a) Fermentation du succinate par Propionigenium modestum. Une Na+-ATPase produit de l’ATP ; la sortie de sodium est reliée à l’énergie libérée par la décarboxylation du succinate. (b) Fermentation d’oxalate par Oxalobacter formigenes. L’entrée d’oxalate et la sortie de formiate par un antiport formiate-oxalate consomment des protons. La synthèse d’ATP est effectuée par une H +-ATPase. Tous les substrats et produits d’une réaction donnée sont en couleurs.

chimiques qui libèrent moins de 31,8 kJ, énergie nécessaire pour synthétiser un ATP (voir tableau 17.6), ne doivent pas être éliminées pour autant. La production d’ATP est possible à condition que la réaction soit couplée à un gradient ionique. Cependant, comme l’entrée d’environ 3H+ (ou 3Na+) est nécessaire à l’activité de l’ATPase membranaire, une réaction doit apporter au moins une quantité d’énergie suffisante pour pomper un H+ ou un Na+, afin de permettre, théoriquement, la croissance.

Contrôlez vos acquis Il existe une grande variété de fermentations, et dans de nombreux cas, le produit de la fermentation d’un organisme est fermenté à son tour par un deuxième organisme. Quelques fermentations utilisent des gradients ioniques (H+ ou Na+) pour produire de l’énergie. •

Quelle est la particularité de la fermentation du succinate et de l’oxalate ?

•

Un acide gras, l’acétate (voir tableaux 17.7 et 17.8), est un produit de fermentation courant. Pourquoi est-il important du point de vue énergétique ?

m n

17.21 Syntrophie

La syntrophie, situation où deux organismes différents dégradent une substance que ni l’un ni l’autre ne pourraient dégrader séparément et, ce faisant, produisent de l’énergie, est couramment rencontrée en microbiologie. La syntrophie est extrêmement importante dans le catabolisme anoxique menant à la production du méthane (voir section 19.10).

La consommation d’hydrogène dans les réactions syntrophiques Généralement, dans une réaction syntrophique, la production de H2 par un des partenaires est liée à la consommation de H2 par l’autre partenaire. Aussi, la syntrophie est-elle également appelée transfert de H2 entre espèces. Le consommateur de H2 peut appartenir à la catégorie des bactéries dénitrifiantes, des bactéries réduisant les sulfates, des homoacétogènes, ou des méthanogènes. Considérons le cas de la syntrophie impliquant la fermentation d’éthanol en acétate avec, éventuellement, production de méthane (voir figure 17.53). Le fermenteur d’éthanol effectue une réaction énergétiquement défavorable (c’est-àdire qui a une énergie libre standard positive). Cependant, le H2 qu’il produit peut servir de donneur d’électrons à un méthanogène, pour les besoins de la méthanogenèse (voir figure 17.53). Quand les deux réactions sont couplées, la réaction globale est exergonique (voir figure 17.53) et permet la croissance des deux partenaires présents dans le mélange syntrophique. Un autre exemple type de syntrophie est l’oxydation du butyrate en acétate et H2 par Syntrophomonas, bactérie syntrophique oxydant des acides gras (voir figure 17.54). Butyrate– + 2 H2O → 2 acétate– + H+ + 2 H2 ∆G0’ = + 48,2 kJ La variation d’énergie libre de cette réaction est hautement défavorable et, en culture pure, Syntrophomonas ne peut pas se développer sur butyrate. Mais en co-culture avec un partenaire (un méthanogène, par exemple), qui consomme le H2 produit dans la réaction, Syntrophomonas pousse très bien.



17.21 Syntrophie 589 Fermentation de l’éthanol :

– − Butyrate

COO–

2 CH3CH2OH + 2 H2O

4 H2 + 2 CH3

+2

H+

∇ 0 G ′= + 19,4 kJ/réaction

Méthanogenèse : 4 H2 + CO2

CH4 + 2 H2O

∇ 0 G ′= – 130,7 kJ/réaction

Transfert de CoA

Butyryl~CoA FAD FADH2

H2

Crotonyl~CoA

Réactions couplées : 2 CH3CH2OH + CO2

CH4 + 2

CH3COO–

(a) Réactions

+2

H+

3–Hydroxybutyryl~CoA NAD+ H2 NADH2

∇ 0 G ′= – 111,3 kJ/réaction

Vers le consommateur de H2

Acétoacétyl~CoA Fermenteur d’éthanol 2 Éthanol

Méthanogène

Transfert d’hydrogène entre espèces 4 H2

2 Acétate

CoA

CO2

CH4

(b) Transfert synthophique de H2 FIGURE 17.53 Le transfert de H2 entre espèces. Fermentation de l’éthanol en méthane et acétate par association syntrophique d’une bactérie oxydant de l’éthanol avec sa partenaire consommant du H2 (ici, une bactérie méthanogène). (a) Réactions impliquées. Les deux organismes partagent ainsi l’énergie libérée par la réaction couplée. (b) Schéma du transfert syntrophique de H2.

L’énergétique de la syntrophie Si la croissance des organismes syntrophiques n’est possible que lorsque H2 est consommé par un organisme partenaire, la disparition de cet H2 influence évidemment l’énergétique de la réaction. La concentration réelle des réactifs et des produits d’une réaction peut modifier sévèrement l’énergétique d’une réaction (voir annexe 1) ; en effet, le ∆G0’ est calculé pour les conditions standard – concentration des produits et des réactifs d’un molaire – tandis que le ∆G relatif à la réaction est calculé à partir des concentrations réelles des produits et des réactifs en présence. Dans les habitats anoxiques, H2 est immédiatement consommé parce qu’il est un excellent donneur d’électrons pour les respirations anaérobies. Ceci permet de maintenir H2 à des concentrations extrêmement basses, généralement au-dessous de 10–4 atm (voir tableau 19.4). Si la concentration de H2 est très faible et que l’on utilise ∆G pour calculer l’énergétique d’une réaction (voir annexe 1 pour le calcul de ∆G), la variation d’énergie libre associée à l’oxydation de substances telles que l’éthanol, ou des acides gras en acétate et H2 devient exergonique. Par exemple, si la concentration de H2 est maintenue extrêmement basse grâce à l’activité d’un deuxième organisme consommateur de H2, l’oxydation du butyrate par Syntrophomonas libère environ –18 kJ. La production d’ATP par les organismes syntrophiques met en jeu la phosphorylation au niveau du substrat ou la phosphorylation oxydative, suivant le mode de croissance des organismes. La phosphorylation au niveau du substrat peut avoir lieu pendant la conversion d’acétyl-CoA

Acétyl~CoA

Acétyl~CoA

Acétate–

Acétyl~P

Acétate– + ATP (a) Culture syntrophique 1. Oxydation du crotonate O

CH3HC CH C + H 2O – Crotonate– O

2 acétate– + H2 + H+

2. Réduction du crotonate O

CH3HC

CH

C

O–

Bilan : 2 crotonate– + H2O

+ H2

butyrate–

Force proton-motrice 2 acétate– + butyrate– + H+ ∆G0′ = –340 kJ

(b) Culture pure FIGURE 17.54 Énergétique de la croissance de Syntrophomonas wolfei en culture syntrophique et en culture pure. (a) En culture syntrophique, la croissance dépend de la présence d’un organisme consommant du H2, par exemple un méthanogène. La production de H2 implique probablement une force protonmotrice conduite par un flux d’électrons fonctionnant en sens inverse (voir section 17.4) parce que la E0’ des couples FAD/ FADH2 ou NAD+/NADH est plus électropositive que celle du couple 2H+/H2 (voir figure 5.9). (b) En culture pure, la production d’énergie est liée à la réduction du crotonate en butyrate.

(produit par β-oxydation de l’éthanol ou d’acide gras) en acétate (voir figure 17.54a), et peut être la seule voie de production d’ATP en conditions syntrophiques. Cependant, Syntrophomonas peut également effectuer une respiration anaérobie, parce qu’il peut croître en culture pure à condition de métaboliser un acide gras insaturé de différentes façons. Syntrophomonas, par exemple, peut utiliser pour sa croissance le crotonate, une partie de celui-ci étant oxydée en acétate, tandis qu’une autre partie est réduite en



590 Chapitre 17


butyrate (voir figure 17.54b). La réduction du crotonate par Syntrophomonas est couplée à la formation d’une force proton-motrice et à la synthèse d’ATP, comme dans les respirations anaérobies utilisant des accepteurs d’électrons organiques – par exemple, la réduction de fumarate en succinate (voir section 17.18). Indépendamment de la façon dont l’ATP est synthétisé en syntrophie, ce mode de croissance rencontré chez Syntrophomonas entraîne des dépenses énergiques supplémentaires parce que l’organisme doit produire H2 à partir d’un donneur d’électrons plus électropositif que H2, comme le FADH2 et le NADH2 (voir figure 17.54a). Pour produire H2, une partie de l’ATP synthétisé doit donc être utilisée pour effectuer des réactions de transfert d’électrons dans l’autre sens (voir section 17.4). Il est clair que les bactéries syntrophiques oxydant l’alcool et des acides gras se situent, au moins du point de vue énergétique, aux frontières de la vie. En effet, l’énergie fournie par des réactions syntrophiques, même en co-culture, peut être de quelques kilojoules seulement. Du point de vue écologique, les bactéries syntrophiques sont les chaînons clés du cycle du carbone. Elles ont développé, au cours de l’évolution, des mécanismes leur permettant d’utiliser les produits de fermentation des fermenteurs primaires et de s’associer avec d’autres organismes anaérobies pour fournir à ces derniers un substrat indispensable, H2. En revanche, la syntrophie n’est pas une stratégie utilisée par les organismes aérobies parce que, en présence d’O2 comme accepteur d’électrons, l’énergétique de la réaction pour un substrat donné est beaucoup plus favorable que le catabolisme par fermentation. C’est pourquoi les relations syntrophiques sont caractéristiques de transformations anoxiques dans lesquelles l’énergie disponible est en quantité très faible et les organismes hautement spécialisés pour tirer profit de réactions de faible rendement énergétique.

Contrôlez vos acquis La syntrophie est l’association de deux organismes pour dégrader des composés que ni l’un ni l’autre ne peuvent dégrader à eux seuls. Généralement, un des deux organismes produit du H2 qui est consommé par son partenaire. La consommation de H2 peut modifier l’énergétique de la réaction effectuée par le producteur de H2, lui permettant de synthétiser de l’ATP, ce qui ne serait pas possible autrement. •

Donnez un exemple de syntrophie. Pourquoi peuton dire que la syntrophie est bénéfique pour les deux organismes dans cet exemple ?

•

Expliquez comment l’ATP est formé pendant la dégradation syntrophique de l’éthanol, représentée dans la figure 17.53.

•

Un organisme syntrophique oxydant un acide gras peut-il croître en culture pure ? Donnez-en un exemple et décrivez comment l’organisme peut synthétiser l’ATP dans ces conditions.

V

OXYDATION DES HYDROCARBURES ET RÔLE D’O2 DANS LE CATABOLISME DES COMPOSÉS ORGANIQUES

Les hydrocarbures sont abondants sur terre et sont d’excellents substrats pour de nombreux organismes chimio-organotrophes. Leur dégradation aérobie pose cependant certains problèmes. Ce chapitre sera également consacré à la dégradation des polysaccharides, des graisses et de quelques autres substances d’intérêt métabolique. Mais voyons en premier lieu le rôle de l’oxygène dans ces réactions.

17.22 Le rôle de l’oxygène moléculaire m n (O ) dans les processus 2

biochimiques

O2 joue le rôle d’accepteur d’électrons dans des réactions produisant de l’énergie (voir section 5.11). Bien que ce soit, de loin, sa fonction la plus importante dans le métabolisme cellulaire, O2 joue également un rôle non négligeable de réactif dans certains types de processus anaboliques et cataboliques.

Les oxygénases Les oxygénases sont des enzymes qui catalysent l’incorporation de l’oxygène sous forme d’O2 dans les composés organiques. Il existe deux classes d’oxygénases : les dioxygénases, qui catalysent l’incorporation des deux atomes d’O2 dans une molécule, et les mono-oxygénases, qui catalysent le transfert d’un des deux atomes d’oxygène d’O2 dans un composé organique ; le deuxième atome d’O2 est réduit en eau, H2O. Le donneur d’électrons de la plupart des mono-oxygénases est le NADH ou le NADPH, bien qu’O2 soit couplé directement à une flavine qui est ensuite réduite par NADH ou NADPH (voir figure 17.55). Dans le cas de la mono-oxygénase de l’ammoniac (voir section 17.12), le donneur d’électrons est le cytochrome c. Plusieurs types de réactions effectuées par les organismes vivants utilisent O2. Un des meilleurs exemples est la participation d’O2 dans la biosynthèse de stérols. La formation du noyau stérol (voir figure 4.18) nécessite de l’oxygène moléculaire. Une telle réaction ne peut évidemment pas avoir lieu dans des conditions anoxiques, aussi les organismes qui se développent dans des conditions anaérobies doivent soit utiliser une autre voie, soit obtenir la substance requise (stérol) préformée à partir de leur environnement. L’utilisation d’O2 dans les réactions de biosynthèse revêt une importance considérable du point de vue évolutif, car l’oxygène, absent de l’atmosphère terrestre au début de l’évolution des êtres vivants, est devenu disponible seulement après l’apparition des cyanobactéries (voir chapitre 11).

Contrôlez vos acquis L’oxygène est, non seulement, un accepteur d’électrons, mais aussi un réactif dans certains processus biochimiques. Des enzymes appelées oxygénases introduisent O2 dans un composé biochimique. •

De quelle manière le fonctionnement des monooxygénases diffère-t-il de celui des dioxygénases ?



17.23 Oxydation des hydrocarbures 591 C7H15 CH3 n-Octane

+

NADH

+

O:O (O2)

Mono-oxygénase C7H15CH2OH +

NAD+

+

H2O

n-Octanol NAD+ NADH H C7H15C O n-Octanal NAD+

H2O

NADH OH C7H15C

O

n-Acide octanoïque ATP

CoA

AMP + PP i β-Oxydation conduisant à l’acétyl-CoA (voir figure 17.69) FIGURE 17.55 Activité de la mono-oxygénase. Étapes de l’oxydation d’un hydrocarbure aliphatique ; la première réaction est catalysée par une mono-oxygénase. Quelques bactéries sulfatoréductrices et dénitrifiantes peuvent dégrader, en conditions anoxiques, les hydrocarbures aliphatiques.

17.23 Oxydation des hydrocarbures m n Les hydrocarbures sont des composés organiques contenant seulement du carbone et de l’hydrogène et hautement insolubles dans l’eau. Les hydrocarbures de faible poids moléculaire sont gazeux, tandis que ceux d’un poids moléculaire plus élevé sont liquides, ou solides, à la température ambiante. Dans les hydrocarbures aliphatiques, les atomes de carbone sont associés en chaînes ouvertes. Les hydrocarbures aliphatiques présentent une très grande diversité de longueur de chaîne, de degré de ramification et de nombre de doubles liaisons. Les hydrocarbures aromatiques contiennent un noyau aromatique et peuvent être considérés comme des dérivés du benzène (voir figure 17.56).

Le métabolisme des hydrocarbures aliphatiques Un certain nombre de bactéries et plusieurs espèces de moisissures et de levures peuvent utiliser des hydrocarbures comme donneurs d’électrons pour croître en conditions aérobies. Le réactif pour l’étape initiale de l’oxydation des hydrocarbures aliphatiques saturés est l’oxygène moléculaire (O2) ; un des atomes de la molécule d’oxygène est incorporé en oxydant

l’hydrocarbure, généralement au niveau de l’atome de carbone terminal. Cette réaction est effectuée par une mono-oxygénase (voir section 17.22) ; la séquence typique des réactions est présentée dans la figure 17.55. Le produit final de cette séquence est l’acétyl-CoA, qui est ensuite catabolisé dans le cycle de l’acide citrique. Les hydrocarbures aliphatiques, saturés et insaturés, peuvent également, en conditions anoxiques, être oxydés en CO2. Ceci est réalisé par un petit groupe de bactéries dénitrifiantes et de bactéries sulfatoréductrices. De toute évidence, des monooxygénases ne peuvent pas être impliquées ici. Le mécanisme de la dégradation met en jeu la carboxylation (addition de CO2) de l’hydrocarbure pour former un acide gras. Ensuite, la dégradation se poursuit par β-oxydation, processus qui ne nécessite pas d’oxygène (voir figure 17.69).

Les hydrocarbures aromatiques En conditions aérobies, beaucoup de donneurs d’électrons sont des hydrocarbures aromatiques ; parmi les micro-organismes concernés, les bactéries du genre Pseudomonas ont été le mieux étudiées. Le métabolisme de ces composés, dont certains sont de très grosses molécules, a généralement comme étape initiale la formation de catéchol ou d’un composé structuralement proche (voir figure 17.56a). Ces composés à un seul noyau sont désignés sous le nom de substrats de départ parce que le catabolisme oxydatif débute seulement après que les grandes molécules aromatiques ont été converties en ces formes plus simples. Le protocatéchuate et le catéchol peuvent ensuite être dégradés en composés pouvant entrer dans le cycle de l’acide citrique : succinate, acétylCoA et pyruvate (voir figure 5.22). Plusieurs étapes du catabolisme des hydrocarbures aromatiques nécessitent habituellement des oxygénases. Les figures 17.56a, b et c montrent des réactions catalysées par des oxygénases différentes, l’une d’elles utilisant une mono-oxygénase et les deux autres, une dioxygénase.

La dégradation anoxique des composés aromatiques Si les composés aromatiques contiennent un atome d’oxygène, ils peuvent également être dégradés en conditions anaérobies par des bactéries aérobies facultatives. De tels composés phénoliques sont dégradés par certaines bactéries dénitrifiantes, phototrophes, ferriréductrices et sulfatoréductrices. D’un point de vue biochimique, le catabolisme anoxique des composés aromatiques met en jeu une rupture du noyau par réduction plutôt que par oxydation (voir figure 17.57). Ceci implique la réduction du noyau, puis sa rupture, formant un acide gras à chaîne droite, ou un acide dicarboxylique. Ces composés intermédiaires peuvent être convertis en acétyl-CoA et être utilisés pour les biosynthèses et les processus produisant de l’énergie. Le benzoate et les dérivés du benzoate sont des produits naturels courants et sont facilement dégradés en conditions anaérobies. Le benzène et le toluène, composés aromatiques dépourvus d’atomes d’oxygène (voir figure 17.56), sont également dégradés en conditions anoxiques. Le catabolisme du benzène est réalisé par certaines bactéries dénitrifiantes et le catabolisme du toluène par certaines bactéries ferriréductrices, des



592 Chapitre 17


H2O + NAD+

(a) O:O

H

H OH H OH

O

NADH

H

Benzène mono-oxygénase

Benzène

H2O

Benzène époxyde

OH

NAD+

+ NADH OH

Benzènediol

Catéchol

Mono-oxygénase (b)

OH OH

Catéchol

OH O

O:O

C

O Catéchol OH 1,2-dioxygénase Catéchol dioxétane (hypothétique)

C

OH O O OH

Cis, cis-muconate

Dioxygénase CH3

CH3

(c) CH3 O:O

OH OH

NADH

Toluène

OH

Toluène dioxygénase

NAD+

OH

Contrôlez vos acquis Beaucoup de micro-organismes sont capables de dégrader les hydrocarbures aliphatiques et aromatiques. En conditions aérobies, le catabolisme de ces composés implique l’activité d’oxygénases. La dégradation anoxique des composés aromatiques se fait par des voies réductrices plutôt que par des voies oxydantes. •

Dessinez la structure chimique du benzène. Faites de même pour le benzoate. Ces composés sont-ils aliphatiques ou aromatiques ?

•

Quelle différence fondamentale existe-t-il entre la dégradation anaérobie d’un composé aromatique et le métabolisme aérobie du même composé ? Donnez un exemple.

O CoA

ATP

Benzoate

O

Méthylcatéchol 2,3-dioxygénase

C

OH OH

Dioxygénases

bactéries phototrophes et des bactéries dénitrifiantes. Le toluène est ensuite converti en benzoyl-CoA, dérivé du benzoate, puis vraisemblablement catabolisé via la réduction de son noyau (voir figure 17.57).

COOH

CH3 O O:O

C

O

O CoA

6H

Benzoyl CoA

C

CoA

2H

C

17.24 Méthanotrophie m n et méthylotrophie Bien qu’ils ne soient pas autotrophes, les méthylotrophes utilisent des composés à un atome de carbone (ou d’autres composés organiques ne possédant pas de liaisons C-C) pour leur métabolisme énergétique et leurs biosynthèses.

La biochimie de l’oxydation du méthane Les différentes étapes de l’oxydation du méthane en CO2 peuvent être résumées comme suit : CH4 → CH3OH → CH2O → HCOO– → CO2 Les méthanotrophes sont des méthylotrophes qui peuvent utiliser le CH4 (voir section 12.6). Ils assimilent soit la totalité, soit la moitié de leur carbone (selon la voie utilisée) sous forme de formaldéhyde (CH2O). Ceci apporte un avantage énergétique majeur, par comparaison avec les autotrophes chez lesquels le carbone est assimilé à partir de formes plus oxydées du CO2.

O CoA

H2O

FIGURE 17.56 Rôle des oxygénases dans le catabolisme des composés aromatiques. (a) Hydroxylation du benzène en catéchol par une mono-oxygénase qui accepte les électrons du NADH. (b) Coupure du catéchol en cis,cis-muconate par une dioxygénase. Les atomes d’oxygène participant aux deux réactions sont indiqués en couleurs afin de mettre en évidence les différences entre les deux mécanismes. (c) Activité de la toluène dioxygénase et de la méthylcatéchol 2,3-dioxygénase dans la dégradation du toluène. Les atomes d’oxygène introduits par chaque enzyme sont indiqués dans des couleurs différentes. Le catéchol et le proto-catéchuate sont des intermédiaires communs du catabolisme aérobie des composés aromatiques. Le proto-catéchuate contient un groupe carboxylique (COO–) situé sur le carbone n° 1 du noyau benzène du catéchol.

C

O

O CoA OH

2H

C

CoA O H2O

C

CoA COOH

3 Acétate + CO2 β-Oxydation

Pimélyl-CoA

FIGURE 17.57 Dégradation anoxique du benzoate par coupure réductrice du noyau benzène. Notez que tous les intermédiaires de la voie sont liés au coenzyme A. L’acétate produit est ensuite catabolisé dans le cycle de l’acide citrique (voir section 5.13 et figure 5.22).



17.24 Méthanotrophie et méthylotrophie 593

En présence d’oxygène, la première étape de l’oxydation du méthane met en jeu une enzyme appelée le méthane monooxygénase. Les oxygénases catalysent l’incorporation d’O2 dans des composés carbonés (voir section 17.22) [et quelques composés azotés, voir section 17.12] et semblent être largement impliquées dans le métabolisme des hydrocarbures. Les mono-oxygénases incorporent dans le substrat un des deux atomes d’oxygène du O2, tandis que le deuxième atome est réduit en H2O. Le processus d’oxydation du méthane a été particulièrement étudié chez la bactérie méthanotrophe Methylosinus ; chez cette espèce, les électrons nécessaires à l’oxydation du CH4 en CH3OH proviennent du cytochrome c (voir figure 17.58). Ceci empêche la synthèse d’ATP durant l’oxydation du méthane en méthanol. En conséquence, les rendements de croissance (grammes de cellules produites par mole de substrat consommé) des méthanotrophes sont les mêmes, que ce soit le méthane ou le méthanol qui servent de substrat pour la croissance. Les autres étapes de l’oxydation du CH3OH en CO2 utilisent des cofacteurs redox typiques qui entrent dans la chaîne de transport d’électrons, comme les quinones ou le NADH. L’ATP est formé à partir de ces derniers, grâce à la force proton-motrice qui est générée (voir figure 17.58). En plus du catabolisme aérobie du CH4, celui-ci peut également être oxydé en anoxie au cours d’un processus syntrophique impliquant la coopération de bactéries anaérobies strictes, sulfatoréductrices, ou méthanogènes (voir section 19.10).

L’assimilation de composés à un atome de carbone dans le matériel cellulaire On connaît deux classes de méthanotrophes, de type I et de type II (voir section 12.6). Les membres de chaque classe ont en commun un certain nombre de propriétés phénotypiques, et chaque classe se distingue par son mécanisme d’assimilation des composés à un atome de carbone. Dans la voie de la sérine, utilisée par les méthanotrophes de type II (voir figure 17.59), une unité à deux carbones, l’acétylCoA, est synthétisée à partir d’une molécule de formaldéhyde (produite à partir de l’oxydation de CH4, voir figure 17.58) et d’une molécule de CO2. La voie de la sérine nécessite un pouvoir réducteur sous la forme de deux molécules de NADH et de l’énergie sous la forme de deux molécules d’ATP, pour chaque molécule d’acétyl-CoA synthétisée. La voie de la sérine utilise un certain nombre d’enzymes du cycle de l’acide citrique et une enzyme, la sérine transhydroxyméthylase, spécifique de la voie (voir figure 17.59). La voie du ribulose monophosphate, rencontrée chez les méthanotrophe de type I (voir figure 17.60), a un meilleur rendement que la voie de la sérine parce que tous les atomes de carbone nécessaires pour synthétiser la matière cellulaire

Substrat C1

HCHO

Formaldéhyde H+

H+

Méthylène tétrahydrofolate

+ H+ H H+

Extérieur

Hydroxypyruvate

HOCH2 CH COOH NH2 Sérine

NADH

FP

Q

cyt b

NAD+

NH3

Glycérate

Sérine transhydroxyméthylase

cyt c

cyt a

Recyclage


NH3 O2

1/

CH4

CH3OH

CH2O

O

2O2

Vers Q

H2O

H2O HCOO–

MMO

ADP

CO2

FIGURE 17.58 Oxydation du méthane par les bactéries méthanotrophes. Le méthane est converti en méthanol par la méthane mono-oxygénase. Les électrons nécessaires à l’accomplissement de cette première étape proviennent du cytochrome c ; cette réaction ne produit pas d’énergie. Une force proton-motrice, générée par un flux d’électrons intramembranaire, fournit l’énergie à l’ATPase. Notez que le carbone utilisé pour les biosynthèses provient essentiellement du formaldéhyde CH2O. MMO, méthane mono-oxygénase ; FP, flavoprotéine ; cyt, cytochrome ; Q, quinone. Contrairement à ce qu’indique le schéma, la MMO est réellement une enzyme associée à la membrane.

O

Glyoxylate

ATP

HOOC C CH2 COOH

OH

Oxaloacétate

O

HOOC CH2 CH2

C ~S CoA

Malyl CoA

O CH3

CO2

Pi

HC COOH

NADH Carbone cellulaire

ATP

H2N CH2 COOH

Glycine

Intérieur

NADH

C ~S CoA

Acétyl-CoA

NADH

ATP

Malate

NAD+

CoA Vers les biosynthèses

Bilan global : formaldéhyde + CO2 + CoA + 2 NADH + 2 H+ + 2 ATP → Acétyl~CoA + 2 NAD+ + 2 ADP + 2 Pi + 2 H2O

FIGURE 17.59 La voie de la sérine utilisée par les bactéries méthylotrophes de type II pour l’assimilation d’unités carbonées dans les composants cellulaires. L’acétyl-CoA, produit de la voie, sert de point de départ pour la synthèse de nouveaux composants cellulaires. L’enzyme clé de la voie est la sérine transhydroxyméthylase.



594 Chapitre 17


proviennent du formaldéhyde. Comme le formaldéhyde a un niveau d’oxydation égal à celui des composants cellulaires, un pouvoir réducteur n’est pas nécessaire. La voie du ribulose monophosphate consomme une molécule d’ATP pour chaque molécule de glycéraldéhyde-3-phosphate synthétisée (voir figure 17.60). Comme la voie du ribulose monophosphate a de plus faibles besoins énergétiques, le rendement en cellules (grammes de cellules produites par mole de CH4 oxydée) est supérieur à celui des méthanotrophes de type I. L’hexulose phosphate synthase qui effectue la condensation d’une molécule de formaldéhyde avec une molécule de ribulose5-phosphate et l’hexulose-6-P isomérase (voir figure 17.60) sont spécifiques de la voie du ribulose monophosphate. Les autres enzymes de cette voie sont impliquées dans des réarrangements de sucres chez de nombreux organismes. Le ribulose-5-P, substrat de la première réaction de cette voie, ressemble au ribulose 1,5-diphosphate, accepteur des composés à un atome de carbone du cycle de Calvin (voir section 17.6), ce qui est en faveur d’une origine commune de ces deux cycles.

HCHO

3 Hexulose-6-P CH2OH

CH2OH

H C

O OH

H C

OH

CH2OPO3

2–

C

O

H

C

OH

H

C

OH

CH2OPO32– Réarrangement de sucres

ATP

2 Fructose-6-P + Fructose 1,6-diphosphate

H

C

OH

CH2OPO32– Vers les biosynthèses

Quels sont les besoins en énergie et en pouvoir réducteur de la voie du ribulose monophosphate ? de la voie de la sérine ? Pourquoi diffèrent-ils ?

•

Pourquoi l’oxydation de CH4 en CH3OH nécessite-telle un pouvoir réducteur ?

•

Laquelle de ces deux voies, le cycle de Calvin ou la voie du ribulose monophosphate, nécessite le plus d’énergie ? Pourquoi ?

L’utilisation des hexoses et des polysaccharides

OH

Isomérase

Glycéraldéhyde-3-P CHO

•

Chez les chimio-organotrophes, les polymères doivent d’abord être hydrolysés en monomères avant la mise en œuvre des mécanismes de production d’énergie.

Hexulose-P-synthase

3 Ribulose-5-P

H C

La méthanotrophie est l’utilisation de CH4 comme source de carbone et d’énergie. Le méthane mono-oxygénase est l’enzyme clé du catabolisme du méthane. Chez les méthanotrophes, les unités à un carbone sont assimilées dans la matière cellulaire sous forme de formaldéhyde par la voie du ribulose monophosphate ou par la voie de la sérine.

17.25 Métabolisme des hexoses, m n des pentoses et des polysacharides

3 Formaldéhyde

C


CH2OH

CH2OPO32–

C

O

C

O

HO

C

H

HO

C

H

H

C

OH

H

C

OH

H

C

OH

H

C

OH

CH2OPO32–

CH2OPO32–

Bilan global : 3 Formaldéhyde + ATP → Glycéraldéhyde-3-P + ADP FIGURE 17.60 La voie du ribulose monophosphate pour l’assimilation de composés à un atome de carbone. Cette voie est utilisée, par exemple, par les bactéries méthylotrophes de type I. Le nom complet de l’hexulose (un sucre) est D-érythro-L-glycéro3-hexulose 6-phosphate. Trois formaldéhydes sont nécessaires à l’accomplissement du cycle avec, pour résultat net, la formation d’une molécule de glycéraldéhyde-3-P. L’enzyme clé de cette voie est l’hexulose-P-synthase. Les « réarrangements des sucres » impliquent des enzymes de la voie des pentoses phosphates (voir figure 17.65).

Les sucres à six atomes de carbone, appelés hexoses, sont les donneurs d’électrons les plus importants pour beaucoup de chimio-organotrophes ; ce sont également des composants structuraux des parois des cellules, des capsules, des slimes microbiennes et des produits de stockage. Les sources d’hexoses les plus communes dans le milieu naturel sont essentiellement des polysaccharides, mais aussi parfois des disaccharides (voir tableau 17.9). La cellulose et l’amidon figurent parmi les polysaccharides naturels les plus importants. L’amidon et la cellulose sont composés d’unités de glucose assemblées de façon différente (voir tableau 17.9 et figure 3.6), ce qui influence énormément leurs propriétés. La cellulose est beaucoup plus insoluble que l’amidon et est habituellement digérée moins rapidement. Elle forme de longues fibres, et les organismes qui digèrent la cellulose sont souvent étroitement liés à ces fibres (voir figure 17.61). Beaucoup de champignons sont capables de digérer la cellulose, et sont les premiers responsables de la décomposition des matières végétales du tapis forestier. Peu de groupes bactériens, cependant, digèrent la cellulose ; les genres les plus communs sont représentés par les bactéries se déplaçant par glissement telles que Sporocytophaga et Cytophaga (voir figures 17.61, 17.62 et 12.90), les bactéries du genre Clostridium et les actinomycètes. Les sédiments des lacs, le tractus intestinal des animaux et les systèmes anoxiques de traitement des eaux d’égout abritent quelques espèces de Clostridium pratiquant la digestion anoxique de la cellulose. La digestion de la cellulose est également un processus important dans le rumen des ruminants où les espèces Fibrobacter et Ruminococcus dégradent activement la cellulose (voir section 19.11).



17.25 Métabolisme des hexoses, des pentoses et des polysacharides 595

TABLEAU 17.9 Substance

POLYSACCHARIDES NATURELS DONNANT DES SUCRES DE TYPES HEXOSE ET PENTOSEa Composition

Sources

Enzymes de dégradation

Cellulose

Polymère de glucose (β-1,4-)

Plantes (feuilles, tiges)

Cellulases (β-1-4-glucanases)

Amidon


Plantes (feuilles, racines)

Amylase

Glycogène

Polymère de glucose (α-1,4-) et (α-1,6-)

Animaux (muscle)

Amylase, phosphorylase

Laminarine


Algues marines (Phaeophyta)

β-1,3-glucanase (laminarinase)

Paramylon


Algues (Euglenophyta et Xanthophyta)

β-1,3-glucanase

Agar

Galactose et polymère de l’acide galacturonique

Algues marines (Rhodophyta)

Agarase

Chitine

Polymère (β-1,4-) de la N-Acétylglucosamine

Champignons (parois cellulaires) Insectes (exosquelettes)

Chitinase

Pectine

Polymère de l’acide galacturonique (du galactose)

Plantes (feuilles, racines)

Pectinase (polygalacturonase)

Dextrane

Polymère de glucose

Capsules ou slimes des bactéries

Dextranase

Xylane

Hétéropolymère de xylose et autres sucres (β-1,4- et α-1,2 ou groupements latéraux α-1,3)

Plantes

Xylanases

Sucrose

Disaccharide glucose-fructose

Plantes (fruits, légumes)

Invertase

Lactose

Disaccharide glucose-galactose

Lait

β-galactosidase

Chacune de ces substances peut être dégradée par des micro-organismes.

Beaucoup de champignons et de bactéries digèrent l’amidon (voir figure 17.63). Les enzymes qui digèrent l’amidon, appelées amylases, ont un intérêt pratique considérable dans beaucoup d’industries où l’amidon doit être digéré, comme l’industrie textile, les blanchisseries, l’industrie du papier et l’industrie alimentaire. Les champignons et les bactéries sont les sources commerciales de ces enzymes (voir section 30.9). Tous les polysaccharides extracellulaires utilisés comme substrats sont d’abord décomposés en monomères par

(C6H12O6)n + Pi → (C6H12O6)n–1 + glucose 1-phosphate

Bactéries

B. V. Hofsten

Fibre de cellulose

hydrolyse. En revanche, les polysaccharides de stockage, synthétisés à l’intérieur des cellules, sont dégradés par phosphorolyse. Ce processus, qui implique l’addition d’un phosphate inorganique, conduit à la formation d’un hexose phosphate à la place d’un hexose. Le processus de dégradation de l’amidon, polymère du glucose en α-1,4, peut être représenté comme suit :

FIGURE 17.61 Digestion de la cellulose. Observation au microscope électronique à transmission de bactéries qui digèrent la cellulose, Sporocytophaga myxococcoides, fixées aux fibres de cellulose. Les cellules mesurent environ 0,5 µm de diamètre (voir figure 12.90).

Katherine M. Brock

a

FIGURE 17.62 Colonies de Cytophaga hutchinsonii sur boîte de cellulose gélosée. Les zones claires correspondent à celles où la cellulose a été hydrolysée.




T. D. Brock

T. D. Brock

596 Chapitre 17

FIGURE 17.63 Mise en évidence de l’hydrolyse de l’amidon par des colonies de Bacillus subtilis. Après incubation, le milieu a été recouvert d’une solution d’iodine de Lugol. La couleur pourpre caractéristique du complexe amidon-iode n’apparaît pas aux endroits où l’amidon a été hydrolysé. L’hydrolyse de l’amidon est visible à une certaine distance des colonies bactériennes car l’amylase extracellulaire produite diffuse dans le milieu environnant.

Comme le glucose 1-phosphate peut être facilement converti, sans dépense énergétique, en glucose 6-phosphate – intermédiaire clé de la glycolyse (voir figure 5.14) –, la phosphorolyse représente une économie nette d’énergie pour la cellule.

Les disaccharides Beaucoup de micro-organismes peuvent utiliser des disaccharides pour leur croissance (voir tableau 17.9). L’utilisation de lactose par des micro-organismes est d’une importance économique considérable parce que les micro-organismes qui transforment le lait produisent de l’acide lactique à partir du lactose. Le sucrose, disaccharide commun chez les plantes supérieures, est généralement hydrolysé en ses composants monosaccharidiques (glucose et fructose) par l’invertase, et ces monomères sont ensuite métabolisés par les voies normales. La cellobiose, ou β-1,4 diglucose, est un produit important de la digestion de la cellulose et est également facilement dégradée par de nombreuses bactéries qui ne peuvent pas dégrader la cellulose. Le dextrane est un polysaccharide microbien synthétisé par quelques bactéries qui utilisent le sucrose comme produit de départ et la dextrane sucrase : n sucrose (glucose)n + n fructose dextrane

Leuconostoc mesenteroides et quelques autres bactéries produisent du dextrane de cette manière, et le polymère formé s’accumule autour des cellules en formant une slime ou une capsule (voir figure 17.64). Le sucrose étant nécessaire à la formation de dextrane, aucun dextrane ne peut être synthétisé quand les bactéries sont cultivées sur un milieu contenant du glucose ou du fructose. Dans l’environnement, quand les cellules contenant du dextrane ou d’autres polysaccharides dans leur capsule meurent, ces matériaux sont de nouveau disponibles et sont attaqués par des microorganismes fermenteurs ou d’autres chimio-organotrophes.

FIGURE 17.64 Colonies gluantes. Colonie gluante formée par la bactérie productrice de dextrane Leuconostoc mesenteroides, cultivée dans un milieu contenant du sucrose. Quand le même organisme se développe sur un milieu glucosé, les colonies sont petites et non gluantes, parce que la synthèse de dextrane n’est possible qu’en présence de sucrose (voir section 21.3).

La voie des pentoses phosphates Les pentoses sont souvent apportés par le milieu naturel. Dans le cas contraire, ils doivent être synthétisés, car ils entrent dans la constitution du squelette des acides nucléiques. Les pentoses sont formés à partir des hexoses. La principale voie de synthèse des pentoses est la voie des pentoses phosphates. La figure 17.65 montre les différentes étapes de cette voie. Plusieurs caractéristiques importantes doivent être soulignées. D’abord, le glucose est converti en pentose en perdant un atome de carbone par oxydation puis décarboxylation. Ces réactions produisent du NADPH et un composé intermédiaire clé de la voie, le ribulose-5-phosphate (voir figure 17.65). Le ribose et le désoxyribose (voir section 5.16) formés à partir de ce dernier sont utilisés pour la synthèse des acides nucléiques. Des pentoses peuvent également entrer dans la voie des pentoses phosphates et donner leurs électrons ; généralement, ils se phosphorylent pour former du ribose phosphate ou un composé apparenté (voir figure 17.65) avant d’être catabolisés. La diversité des sucres formés constitue la deuxième caractéristique importante de la voie des pentoses phosphates. Des réactions annexes synthétisent différents dérivés de sucres – C4, C5, C6 et C7 – (voir figure 17.65). C’est ainsi que les pentoses peuvent éventuellement produire des hexoses qui seront soit catabolisés, soit utilisés pour les biosynthèses (gluconéogenèse, voir section 5.15). Enfin, la production de NADPH est un point important de la voie des pentoses phosphates. Cette coenzyme est utilisée, sous sa forme réduite, pour les biosynthèses réductrices de la cellule. Bien que la plupart des cellules peuvent convertir le NADH en NADPH, la voie des pentoses phosphates est la première voie de synthèse de cette coenzyme essentielle.

Contrôlez vos acquis Les polysaccharides sont abondants dans la nature et peuvent être dégradés en monomères (hexoses ou pentoses), généralement par phosphorolyse, pour être utilisés comme sources d’énergie. L’amidon et la cellulose sont des polysaccharides communs. La voie des pentoses phosphates est la première voie de production des pentoses pour les biosynthèses.



17.26 Métabolisme des acides organiques 597

ATP

NADP+ NADPH

ADP

GLUCOSE

Glucose 6-phosphate

Glucose 6-phosphate déshydrogénase H

CH2O P H

C

OH

H

C

OH

HO

C

H

H

C

OH

HO

CH2O P O OH

H OH 6-Phosphogluconolactone CO2

Le cycle du glyoxylate

C 6-Phosphogluconate déshydrogénase Acide O O– 6-phosphogluconique CH 2O P NADP+ NADPH HC OH PENTOSES ATP HC OH ADP CH2O P C O HC

OH

HC

OH

HC

OH

O

H

CH2OH Ribulose 5-phosphate

CH2O P HC HO

Transcétolase

C7

OH

CH C

CHO Ribose 5-phosphate

O

CH2OH Xylulose-5-phosphate

C3

Transaldolase

C5 C6 + C3

C4

Transcétolase

aérobiose, des enzymes du cycle de l’acide citrique peuvent utiliser des acides à quatre, cinq et six atomes de carbone et former de l’ATP par phosphorylation oxydative. En anaérobiose, l’utilisation des acides organiques met en jeu leur conversion en pyruvate, suivie de la formation d’acétate via l’acétyl phosphate, avec production d’ATP par phosphorylation au niveau du substrat (voir section 17.19).

Le cycle de l’acide citrique ne permet pas, à lui seul, l’utilisation des acides à deux ou trois atomes de carbone comme sources de carbone. Il faut que l’oxaloacétate, molécule acceptrice à quatre carbones, soit régénéré à chaque tour de cycle ; n’importe quel composé carboné qui quitte le cycle pour participer à des réactions de biosynthèse empêche l’accomplissement du cycle (voir figure 5.22). En présence d’acétate, l’oxaloacétate est régénéré par le cycle du glyoxylate (voir figure 17.66), appelé ainsi parce que le glyoxylate est un intermédiaire clé de ce cycle. Le cycle du glyoxylate est un cycle de l’acide citrique modifié, avec deux enzymes supplémentaires : l’isocitrate lyase, qui coupe l’isocitrate en succinate et glyoxylate et la malate synthase, qui convertit le glyoxylate et l’acétyl-CoA en malate (voir figure 17.66). Le cycle du glyoxylate fonctionne de la façon suivante : l’isocitrate se scinde en succinate et glyoxylate ; une molécule de succinate (ou un autre intermédiaire du cycle de l’acide citrique dérivé de ce dernier) peut donc quitter le cycle pour fournir les précurseurs pour les biosynthèses, tandis que le

C6 (Gluconéogenèse)

FIGURE 17.65 La voie des pentoses phosphates. La voie peut être utilisée : 1) pour produire des pentoses à partir des hexoses ; 2) pour produire des hexoses à partir des pentoses (gluconéogenèse) ; 3) pour cataboliser des pentoses comme source d’énergie ; et 4) pour produire du NADPH. Quelques enzymes clés de la voie sont indiquées.

•

Qu’est-ce que la phosphorolyse ?

•

Quels sont les disaccharides communs dans le milieu naturel ?

•

Quelles sont les fonctions de la voie des pentoses phosphates dans la cellule ?

Acétate–

2 Pyruvate–

CoA

Acétate– CoA

CO2

CO2

Acétyl-CoA (2 C)

Acétyl-CoA (2 C)

Malate2– (4 C)

Oxaloacétate2– (4 C)

Malate synthase

Glyoxylate– (2 C)

Citrate3– (6 C)

Isocitrate lyase

17.26 Métabolisme des acides m n organiques Les micro-organismes utilisent divers acides organiques comme sources de carbone et d’électrons. Les acides du cycle de l’acide citrique, comme le citrate, le malate, le fumarate et le succinate, sont des produits naturels communs formés par les plantes et les micro-organismes fermentatifs. On trouve le cycle de l’acide citrique sous forme complète ou partielle chez presque tous les micro-organismes, car il assure d’importantes fonctions biosynthétiques (voir section 5.16) et énergétiques (voir section 5.13). Ainsi, beaucoup de micro-organismes utilisent ces acides comme sources de carbone et d’électrons. En

Isocitrate3– (6 C) Succinate2– (4 C) Bilan : 2 Pyruvate– Biosynthèse

(C6)

Succinate2– + 2 CO2 (C4)

(C1

2)

FIGURE 17.66 Le cycle du glyoxylate, menant à la synthèse de l’oxaloacétate à partir de l’acétate. Deux enzymes particulières, l’isocitrate lyase et la malate synthase, fonctionnent avec la majorité des réactions du cycle de l’acide citrique. Le pyruvate et toutes les molécules qui produisent de l’acétate peuvent fournir du carbone au cycle du glyoxylate.



598 Chapitre 17


glyoxylate se combine avec l’acétyl-CoA pour former du malate. Après le départ d’un intermédiaire à quatre atomes de carbone (le succinate), le cycle se poursuit par la conversion du malate en oxaloacétate. La molécule de succinate peut être utilisée directement pour la synthèse des porphyrines (entrant dans la composition des cytochromes, de la chlorophylle et d’autres tétrapyrroles). Elle peut également être oxydée en oxaloacétate pour former le squelette carboné des acides aminés ou être convertie en glucose (via l’oxaloacétate et le phosphoénolpyruvate).

(voir figures 17.67 et 17.68). Les lipases attaquent les graisses contenant des acides gras de différentes longueurs. Les phospholipides sont hydrolysés par des enzymes appelées phospholipases, désignées par des lettres correspondant à la liaison ester qui est coupée (voir figure 17.68). Les phospholipases A et B coupent des esters d’acide gras tandis que les phospholipases C et D clivent les liaisons phosphoesters et, par conséquent, sont des enzymes de type différent. Les acides gras libres et le glycérol libérés peuvent alors être attaqués par divers microorganismes chimio-organotrophes.

L’utilisation du pyruvate et des composés à trois atomes de carbone

L’oxydation des acides gras

Le cycle de l’acide citrique ne permet pas non plus l’utilisation des composés à trois atomes de carbone, tels que le pyruvate, ou les composés qui peuvent être convertis en pyruvate (par exemple, le lactate ou les hydrates de carbone), comme sources d’énergie. Comme certains des intermédiaires de ce cycle sont utilisés pour les biosynthèses, l’oxaloacétate nécessaire au cycle est synthétisé à partir du pyruvate ou du phosphoénolpyruvate par addition d’un atome de carbone provenant du CO2. Chez quelques organismes, cette étape est catalysée par la pyruvate carboxylase : Pyruvate + ATP + CO2 → oxaloacétate + ADP +Pi tandis que chez d’autres organismes, la réaction est catalysée par la phosphoénolpyruvate carboxylase : Phosphoénolpyruvate + CO2 → oxaloacétate + Pi

Les acides gras sont oxydés par un processus appelé bêta oxydation, dans lequel deux carbones de l’acide gras sont coupés à la fois (voir figure 17.69). Les enzymes des eucaryotes sont situées dans les mitochondries, tandis que celles des procaryotes sont cytoplasmiques. L’acide gras est d’abord activé par la coenzyme A ; l’oxydation entraîne la libération d’acétyl-CoA et la formation d’un acide gras raccourci de deux carbones (voir figure 17.69). Le processus de la bêta oxydation est alors répété, et une autre molécule d’acétyl-CoA est libérée. Deux réactions de déshydrogénation se produisent au cours de la bêta oxydation. La première transfère des électrons à la flavine-adénine dinucléotide (FAD), tandis que la seconde transfère des électrons au NAD+. La plupart des acides gras ont un nombre pair d’atomes de carbone et l’oxydation complète donne de l’acétyl-CoA. L’acétyl-CoA formé est alors oxydé par le cycle de l’acide citrique, ou est converti en hexose et en autres constituants cellulaires, via le cycle du glyoxylate.

Contrôlez vos acquis Les acides organiques sont souvent métabolisés via le cycle de l’acide citrique ou le cycle du glyoxylate. L’isocitrate lyase et la malate synthase sont les enzymes clés du cycle du glyoxylate. •

Clostridium perfringens

Action de la phospholipase : précipitation du jaune d’œuf par les acides gras libérés

Pourquoi le cycle de glyoxylate est-il nécessaire à la croissance sur acétate mais pas sur succinate ?

17.27 Utilisation des lipides m n

L’hydrolyse des graisses et des phospholipides Les graisses sont des esters de glycérol et d’acides gras (voir section 3.4) et sont facilement fournies par la libération des lipides provenant des organismes morts. Les micro-organismes ne peuvent utiliser les graisses qu’après hydrolyse de la liaison ester par des enzymes extracellulaires, appelées lipases (voir figure 17.67), qui libèrent du glycérol et des acides gras libres

G. Hobbs

Les lipides sont abondants dans la nature. Les membranes cytoplasmiques de toutes les cellules contiennent des lipides et beaucoup de micro-organismes, comme les macro-organismes, produisent des lipides de réserve. Ces substances sont toutes biodégradables et sont d’excellents substrats pour le métabolisme énergétique microbien. Quand les cellules meurent, leurs lipides sont catabolisés en CO2. Addition d’un inhibiteur : phospholipase inactive, le jaune d’œuf ne précipite pas

FIGURE 17.67 Activité de la phospholipase. Action de la phospholipase autour d’une strie de Clostridium perfringens cultivée sur un milieu gélosé contenant du jaune d’œuf. Sur la moitié de la boîte, un inhibiteur de phospholipase a été ajouté, empêchant l’enzyme de fonctionner.



17.28 Nitrogénase et processus de fixation d’azote 599 Glycérol

H3C

H2C

O

Acide gras

HC

O

Acide gras

H2C

O

Acide gras

(CH 2)n

CH2

Acide gras à

Activation par le CoA

AMP + PPi H3C

(a)

(CH 2)n

β CH2

Phospholipase B O

Acide gras

HC

O

Acide gras O

H2C

O

P

O

O

α CH 2

C

CoA

FAD

Phospholipase A

Formation d’une double liaison

FADH

Phospholipase C H3C

(X)

OH

COOH

ATP

Lipase

H2C

CH 2

(n + 4) carbones

(CH 2)n

β CH

O

α CH

Phospholipase D

C

CoA

H 2O

Addition d’un hydroxyle

(b) FIGURE 17.68 Les lipases. (a) Effet des lipases sur un corps gras. (b) Effet des phospholipases sur un phospholipide. Les sites de coupure de quatre phospholipases différentes, A, B, C et D, sont indiqués. X se rapporte à un certain nombre de petites molécules organiques qui peuvent être situées à cet endroit dans différents phospholipides. Comparez ce schéma à la description plus complète d’un phospholipide dans la figure 3.7.

Les acides gras sont d’excellents donneurs d’électrons. Par exemple, l’oxydation de l’acide palmitique à 16 atomes de carbone produit 129 molécules d’ATP. Parmi ces oxydations, figurent la phosphorylation liée au transport des électrons produits pendant la formation d’acétyl-CoA par la bêta oxydation, ainsi que l’oxydation des unités d’acétyl-CoA pendant le cycle de l’acide citrique (voir section 5.13).

Contrôlez vos acquis Les graisses sont hydrolysées en acides gras libres par des lipases ou des phospholipases. Les acides gras sont ensuite oxydés, par bêta oxydation, en unités d’acétylCoA qui sont oxydées à leur tour dans le cycle de l’acide citrique. •

À quoi servent les phospholipases ?

•

Qu’appelle-t-on bêta oxydation ?

VI

FIXATION DE L’AZOTE

L’utilisation de N2 comme source d’azote cellulaire se nomme fixation d’azote. La capacité à fixer l’azote libère un organisme d’une dépendance vis-à-vis des formes fixées d’azote. Ces formes fixées étant l’objet d’une forte demande dans les écosystèmes microbiens, la capacité de fixer N2 confère un avantage écologique significatif aux organismes capables de réaliser le processus. De plus, certaines formes de fixation d’azote ont une importance énorme en agriculture, à la base de la culture de certains végétaux comme le soja.

H3C

(CH 2)n

OH β CH

O

α CH 2

C

CoA

NAD+

Oxydation en céto

NADH

H3C

(CH 2)n

O β C

O

α CH 2

C

CoA Coupure pour former l’acétyl-CoA

CoA

O H3C

(CH 2)n

C

O CoA + H3C

Acide gras à (n + 2) carbones, activé, prêt pour l’étape suivante

C

CoA

Acétyl-CoA

FIGURE 17.69 Bêta oxydation. Mécanisme de la bêta oxydation d’un acide gras qui mène à la formation d’unités acétyl-CoA à deux carbones.

17.28 Nitrogénase et processus m n de fixation d’azote Seuls certains procaryotes – certains aérobies, d’autres anaérobies – peuvent fixer N2. Une liste abrégée des organismes fixateurs d’azote est donnée dans le tableau 17.10. Quelques bactéries fixatrices d’azote sont libres et ne requièrent pas d’hôte pour effectuer le processus. En revanche, d’autres fixateurs d’azote sont symbiotiques et fixent l’azote seulement en association avec certaines plantes (voir section 19.22). Mais c’est la bactérie, et non la plante, qui fixe N2. À ce jour, on ne connaît pas d’organisme eucaryote capable de fixer l’azote.

La nitrogénase Au cours de la fixation d’azote, N2 est réduit en ammoniac qui est ensuite converti en molécule organique. Le processus de réduction est catalysé par le complexe enzymatique hydrogénase, qui



600 Chapitre 17


TABLEAU 17.10

QUELQUES ORGANISMES FIXATEURS a D’AZOTE Aérobies libres

Chimioorganotrophes Bacteria :

Chimiolithotrophes

Phototrophes Cyanobactéries

Alcaligenes

Azotobacter

Thiobacillus

Azomonas

Acidithiobacillus

Agrobacterium

Streptomyces

b

Klebsiella

thermoau-

Beijerinckia

totrophicus

Bacillus polymyxa Mycobacterium flavum Azospirillum lipoferum Citrobacter freundii Acetobacter diazotrophicus

est formé de deux protéines nommées dinitrogénase et dinitrogénase réductase. Les deux composants contiennent du fer, et la dinitrogénase contient également du molybdène. Le fer et le molybdène de la dinitrogénase sont situés dans un cofacteur nommé FeMo-co (voir figure 17.70), et la réduction effective de N2 s’effectue sur ce centre fer-molybdène. La composition exacte du complexe FeMo-co est MoFe7S8.homocitrate (voir figure 17.70), et FeMo-co est présent en deux copies par molécule de nitrogénase. Compte tenu de la stabilité de la triple liaison du diazote, N2 est extrêmement inerte ; son activation est cependant très consommatrice d’énergie. Six électrons doivent être transférés pour réduire N2 en NH3. Les trois étapes de réduction successive s’effectuent directement sur la nitrogénase, sans accumulation d’intermédiaires libres (voir figure 17.71). La fixation d’azote est inhibée par l’oxygène car la dinitrogénase réductase est rapidement, et de manière irréversible, inhibée par O2, même dans le cas des fixateurs d’azote aérobies. Chez les bactéries aérobies fixatrices d’azote, la fixation de N2 se produit même en présence d’O2 dans les cellules, mais pas

Methylomonas Methylococcus

Protéine

Methylosinus

S

Pseudomonas

Anaérobies libres Chimioorganotrophes Bacteria :

Fe

Chimiolithotrophes

Phototrophes Bacteria :

Archaea :

Clostridium

Chromatium

Methanosarcina

Desulfovibrio

Ectothiorhodospira

Methanococcus

Desulfobacter

Thiocapsa

Methanobacterium

Desulfotomaculum

Chlorobium

Methanospirillum

Chlorobaculum

Methanolobus

S

S Fe

S Fe

Fe

S

S Fe

Fe S

Fe S

S

Rhodospirillum Rhodopseudomonas

Mo

Rhodomicrobium Rhodopila

Protéine

N

O

O

Rhodobacter Heliobacterium

H

Heliobacillus Heliophilum

Soja, pois, trèfle, acacia,etc., association avec une bactérie du genre Rhizobium, Bradyrhizobium, Sinorhizobium, ou Azorhizobium

H

O

Symbiotes Plantes légumineuses

O

C C

a Pour certains des genres cités, la fixation de N2 n’est effectuée que par quelques espèces. b La fixation de N2 se produit seulement en conditions anaérobies.

C

C

C C

H H

Autres plantes Alnus, Myrica, Ceanothus, Comptonia, Casuarina ; en association avec des actinomycètes du genre Frankia

C H

O–

O–

H

O–

FIGURE 17.70 Structure de FeMo-co, le cofacteur fer-molybdène de la nitrogénase. Au sommet, le cube Fe7S8 est lié au molybdène ainsi qu’aux atomes d’oxygène de l’homocitrate (en bas, tous les atomes d’oxygène sont représentés en vert) et aux atomes de N et S de la dinitrogénase. Il y a deux molécules de FeMo-co par molécule de dinitrogénase. Les interactions entre les composés nitrogénase-dinitrogénase et dinitrogénase réductase sont présentées dans la figure 17.71.



17.28 Nitrogénase et processus de fixation d’azote 601

Pyruvate + CoA

Acétyl-CoA + CO2

Pyruvate flavodoxine oxydo-réductase Flavodoxine (oxydée)

Flavodoxine (réduite)

Dinitrogénase réductase (réduite) ATP

Dinitrogénase

(oxydée)

(réduite)

(a) 2 NH3

N2

C2H4

C2H2

H2

2 H+

Produits

Substrats de la nitrogénase

(a)

H2 N N

4H

HN NH

8

H+

2H

H2N NH2

2H

+8

(16–24 ATP

(b)

FIGURE 17.72 Induction de la formation de mucus (slime) par l’oxygène chez la bactérie fixatrice d’azote Azotobacter vinelandii. (a) Image en microscopie électronique en transmission de cellules incubées en conditions microaérophiles avec 2,5 % de O2. Très peu de mucus est présent. (b) Cellules incubées à l’air (21 % de O2). Notez l’épaisse couche de mucus en noir (flèche). Le mucus ralentit la diffusion d’O2 dans la cellule, empêchant ainsi l’inactivation de la nitrogénase par l’oxygène.

H3N NH3

Réaction globale

e–

Wael Sabra

Dinitrogénase

Wael Sabra

Complexe enzymatique de la nitrogénase

Dinitrogénase réductase (oxydée) ADP + Pi

+ N2

2 NH3 + H2 16–24 ADP + 16–24 Pi)

(b) FIGURE 17.71 Fonctionnement de la nitrogénase. (a) Étapes de la fixation de N2 à partir du pyruvate. Les électrons sont donnés un par un de la dinitrogénase réductase à la dinitrogénase et chaque électron fourni est associé à l’hydrolyse de 2-3 ATP. (b) Étapes hypothétiques dans la réduction de N2, montrant l’évolution de H2 ; résumé de l’activité nitrogénase.

dans les préparations enzymatiques purifiées. Chez ces organismes, la nitrogénase est protégée de l’inactivation par O2 par plusieurs mécanismes dont l’élimination rapide d’O2 suite à la respiration, la production de mucus freinant la diffusion d’O2 (voir figure 17.72), ou chez certaines cyanobactéries par la compartimentalisation de la nitrogénase dans des cellules spécialisées (les hétérocystes) [voir section 12.25]. En plus, bien que la fixation de N2 ne se produise pas dans les extraits cellulaires exposés à l’oxygène, chez les fixateurs d’azote aérobies comme Azotobacter, la nitrogénase est protégée de l’inactivation causée par l’oxygène par une protéine spécifique ; ce processus se nomme protection conformationnelle.

Les flux d’électrons au cours de la fixation d’azote La séquence de transferts d’électrons dans la nitrogénase se passe comme suit : donneur d’électrons → dinitrogénase réductase → dinitrogénase → N2 (voir figure 17.71). Les électrons pour la réduction de la nitrogénase sont transférés à la dinitrogénse réductase à partir d’une ferrodoxine ou d’une flavodoxine, toutes deux étant des protéines fer-soufre à faible potentiel

(voir section 5.11). Chez Clostridium pasteurianum, la ferrodoxine est le donneur d’électrons et elle est réduite par le clivage du pyruvate en acétyl-CoA et CO2. Outre de la ferredoxine ou flavodoxine réduite, de l’ATP est nécessaire pour la fixation de N2. Dans chaque cycle de transfert d’électrons, la dinitrogénase réductase est réduite par la ferrodoxine / flavodoxine et fixe deux molécules d’ATP. La fixation d’ATP altère la conformation de la dinitrogénase réductase, et abaisse son potentiel de réduction, lui permettant d’interagir avec la dinitrogénase. Une fois l’électron transféré à la dinitrogénase, l’ATP est hydrolysé, la dinitrogénase réductase se dissocie de la dinitrogénase et débute un autre cycle de réduction et de liaison à l’ATP (voir figure 17.71). Lorsqu’elle est réduite, la dinitrogénase réduit N2 en NH3, la réduction se passant au niveau du centre FeMo-co (voir figure 17.70). Bien que seulement six électrons soient nécessaires pour réduire N2 en NH3, huit électrons sont en fait consommés dans le processus, deux électrons étant perdus sous forme de H2 pour chaque mole de N2 réduite (voir figure 17.71). La raison de ce déchet apparent n’est pas connue, mais il est clair que le dégagement de H2 est une partie intime du mécanisme réactionnel de la nitrogénase.

Les nitrogénases alternatives Quelques bactéries fixatrices d’azote produisent des nitrogénases sans molybdène dans certaines conditions de croissance. Ces nitrogénases alternatives contiennent soit du vanadium et du fer, soit du fer seul à la place du molybdène. Des cofacteurs semblables à FeMo-co sont présents chez ces nitrogénases alternatives. FeVa-co est présent dans la nitrogénase à vanadium, et un ensemble fer-soufre ressemblant à Femo-co et FeVa-co, mais dépourvu de Mo et Va, est présent dans la nitrogénase à fer. Les nitrogénases alternatives ne sont pas synthétisées lorsque suffisamment de molybdène est présent,



602 Chapitre 17


la nitrogénase à molybdène étant la nitrogénase principale dans la cellule. Les nitrogénases alternatives fonctionnent comme une sauvegarde assurant que la fixation de N2 peut toujours se produire quand le molybdène est limitant dans un habitat (voir section 12.9). Les Archaea fixatrices d’azote ne possèdent pas de systèmes à Mo et Va et contiennent seulement des nitrogénases à fer.

moitié de l’ATP consommé par les nitrogénases classiques et ne réduise pas d’autres composés à triple liaison, comme l’acétylène (voir figure 17.74). Ensemble, ces propriétés, particulièrement celles de l’insensibilité à l’oxygène, sont encourageantes pour les biotechnologistes des plantes qui essaient de modifier génétiquement des plantes comme le maïs, naturellement dépourvues de symbiotes, en leur transférant la propriété de fixation d’azote.

La nitrogénase de Streptomyces thermoautotrophicus

Mesurer l’activité de la nitrogénase : la réduction de l’acétylène

Il existe chez le streptomycète thermophile Streptomyces thermoautotrophicus une nitrogénase à molybdène stucturellement et fonctionnellement nouvelle. Cet organisme est thermophile (optimum 65 °C), filamenteux et appartient aux actinobactéries (voir section 12.24). S. thermoautotrophicus est une hydrogénobactérie pouvant aussi utiliser le monoxyde de carbone (CO) comme donneur d’électrons. S. thermoautotrophicus fixe l’azote, et sa nitrogénase contient Mo. Mais contrairement aux nitrogénases classiques à Mo, celle de S. thermoautotrophicus est totalement insensible à O2. Le composant dinitrogénase de la nitrogénase de S. thermoautotrophicus, nommé Str1, contient trois polypeptides différents qui montrent quelque similitude structurale avec les polypeptides des nitrogénases d’autres fixateurs d’azote. Au contraire, le composant dinitrogénase réductase, Str2, ne montre pas de similitude avec les autres dinitrogénases réductases. Str2 est cependant fortement homologue aux enzymes à manganèse superoxyde dismutases (voir section 6.16), et c’est son rôle dans cette nitrogénase inhabituelle (voir figure 17.73). Le type de flux d’électrons dans le système nitrogénase de S. thermoautotrophicus imite celui des nitrogénases classiques. Str2 fournit des électrons à Str1 dans la nitrogénase de S. thermoautotrophicus. La source d’électrons est l’ion superoxyde (O2–), qui est formé par la réduction d’O2 par une CO déshydrogénase (voir figure 17.73). Ainsi, par analogie à la séquence classique de la fixaton d’azote : pyruvate → flavodoxine → dinitrogénase réductase → dinitrogénase (voir figure 17.71), la séquence chez S. thermoautotrophicus est : CO → O2– → str2 → Str1. Et de manière remarquable, chez S. thermoautotrophicus, l’oxygène est nécessaire pour le fonctionnement de cette enzyme, ce qui est contraire à tous les exemples de nitrogénase connus à ce jour. Parmi les autres propriétés uniques de S. thermoautotrophicus, il faut signaler le fait que l’enzyme consomme moins que la

La nitrogénase n’est pas uniquement spécifique de N2, car elle réduit aussi d’autres composés à triple liaison comme l’ion CN– et l’acétylène (HC=CH). La réduction de l’acétylène par la nitrogénase implique seulement deux électrons, et l’éthylène (H2C=CH2) est produite. La réduction de l’acétylène en éthylène est un moyen simple et rapide de mesurer l’activité de systèmes fixateurs d’azote par chromatographie gazeuse

CO

Mo

Mo

O2

N2

Atmosphère, 10 % C2H2 dans l’air (aérobies) ou 10 % C2H2 dans N2 ou Ar (anaérobies)

Flacon bouché contenant une suspension cellulaire

Incubation

O 2–

CO déshydrogénase

Str1

2 NH3

Nitrogénase

FIGURE 17.73 Réactions de la fixation d’azote chez Streptomyces thermoautotrophicus. Bien que s’agissant de protéines assez différentes de la dinitrogénase réductase et de la dinitrogénase, Str2 et Str1 sont fonctionnellement équivalentes à ces deux protéines.

Acétylène

)

CH2

Éthylène

Un échantillon de la phase gazeuse est injecté périodiquement dans le chromatographe en phase gazeuse Enregistrement du chromatographe en phase gazeuse

C2H2

C2H2 C2H4

Str2

2H CH H2C

Nitrogénase

Formation de superoxyde CO2

(

HC

Temps 0

1h

C2H4

C2H2

2h

FIGURE 17.74 Test de la réduction de l’acétylène pour la mesure d’activité nitrogénase. Il n’y a pas de C2H4 au début de l’expérience (temps 0), mais la production augmente au cours du test. Notez la consommation de C 2H2 au cours de la production de C2H4. Si le flacon contient un extrait enzymatique, les conditions sont anaérobies, même si la nitrogénase provient d’une bactérie aérobie.



17.29 Génétique et régulation de la fixation d’azote 603

(voir figure 17.74). Cette technique de réduction de l’acétylène est largement utilisée pour détecter la fixation d’azote dans des écosystèmes nouvellement étudiés. La preuve définitive de la fixation d’azote est obtenue en utilisant un isotope de l’azote, 15N, comme traceur. 15N est un isotope stable que l’on peut analyser à l’aide d’un spectromètre de masse. La phase gazeuse d’une culture est enrichie avec 15 N2, et après incubation, les cellules et le milieu sont digérés, l’ammoniac produit est distillé et analysé pour son contenu en 15 N. S’il y a eu une production significative de NH3 marqué au 15N, c’est une preuve de fixation d’azote. Bien que l’assimilation de 15N2 soit considérée comme l’étalon-or pour la fixation d’azote, la réduction de l’acétylène est une méthode plus rapide et sensible, quoiqu’indirecte, pour mesurer ce processus. L’échantillon, qui peut être un sol, de l’eau, une culture, ou un extrait cellulaire, est incubé en présence d’acétylène, et la phase gazeuse du mélange réactionnel est analysée ensuite en chromatographie en phase gazeuse pour la mesure de l’éthylène (voir figure 17.73). Cette méthode est beaucoup plus simple et plus rapide que les autres méthodes, et peut être facilement adaptée pour des mesures sur le terrain lors d’études écologiques des bactéries fixatrices d’azote dans leurs habitats.

17.29 Génétique et régulation m n de la fixation d’azote La fixation d’azote étant un processus fortement consommateur d’énergie, la synthèse et l’activité de la nitrogénase sont fortement régulées. Ces agents de la régulation de même que les enzymes impliquées dans la fixation de N2 proprement dite (voir figure 17.71) nécessitent de nombreux gènes pour les coder.

La génétique de la fixation d’azote Chez Klebsiella pneunomiae, un fixateur d’azote qui a été bien étudié, les gènes de la dinitrogénase et de la dinitrogénase réductase font partie d’un régulon complexe (réseau d’opérons, section 8.6) appelé le régulon nif. Chez K. pneumoniae, le régulon nif est constitué de 24 kpb d’ADN et contient 20 gènes organisés en plusieurs unités transcriptionnelles (voir figure 17.75). Outre les gènes structurels de la nitrogénase, les gènes codant FeMo-co, ceux contrôlant les protéines de transport d’électrons, et plusieurs gènes de régulation sont également présents dans le régulon nif. La dinitrogénase est une protéine complexe formée de deux sous-unités, α (produit de nifD) et β (produit de nifK), chacune d’entre elles étant présente en deux copies dans le complexe enzymatique nitrogénase. La dinitrogénase réductase est une protéine dimère formée de sous-unités identiques, produit de nifH. FeMo-co est synthétisé à l’aide de plusieurs gènes, dont nifN, V, Z, W, E et B, ainsi que Q, qui code un produit impliqué dans le traitement du molybdène. Le gène nifA code une protéine régulatrice positive qui active la transcription des autres gènes nif (voir figure 17.75). La nitrogénase est une protéine très conservée, et les gènes nifHDK qui codent ses composants ont été utilisés comme sondes moléculaires pour cribler l’ADN de nombreux procaryotes pour y rechercher des gènes homologues, indiquant la possibilité de fixer l’azote. Chez tous les fixateurs d’azote examinés à ce jour (à l’exception de l’atypique S. thermoautotrophicus, section 19.28), les gènes de type nifHDK sont présents, suggérant que les besoins génétiques pour la nitrogénase sont assez spécifiques. Les nitrogénases alternatives sont codées (voir section 17.28) par leurs propres gènes, vnfHDK pour le système au vanadium, et anfHDK pour le système au fer, qui présentent une homologie de séquence significative avec nifHDK.

Dinitrogénase réductase Synthèse Synthèse de FeMo-co de FeMo-co Dinitrogénase Formation de la Synthèse dinitrogénase Synthèse de β α l’homocitrate de FeMo-co réductase Transport (processing) d’électrons Insertion Régulateurs PyruvateBiosynthèse de FeMo-co Transformation flavodoxine du noyau dans la Positif Négatif de Mo oxydométallique dinitrogénase Flavodoxine réductase nif Q

B

A

L

F

M Z W V S U

X

N

E

Y T K D H

J

ADN

Unités transcriptionnelles FIGURE 17.75 Le régulon nif chez Klebsiella pneumoniae, la bactérie fixatrice d’azote la mieux étudiée. Les fonctions de plusieurs gènes sont incertaines. Les ARNm transcrits (unités transcriptionnelles) sont indiqués au-dessous des gènes ; les flèches indiquent la direction de la transcription. Les protéines impliquées dans la synthèse de FeMo-co sont indiquées en jaune. Les autres couleurs correspondent à celles de la figure 17.71. Bien que cette bactérie soit capable de croissance aérobie en utilisant l’ammonium comme source d’azote, la fixation d’azote chez Klebsiella se produit seulement en anaérobiose.



604 Chapitre 17


La régulation de la fixation d’azote La nitrogénase est soumise à une régulation stricte. La fixation de l’azote est réprimée par O2, ainsi que par l’azote fixé, c’està-dire NH3, NO2– et certains acides aminés. Une partie essentielle de cette régulation se situe au niveau de la transcription, comme cela est indiqué dans la figure 17.75. Alors que la transcription des gènes structurels nif est activée par la protéine nifA (régulation positive), nifL est un régulateur négatif de l’expression des gènes nif. NifL contient une molécule de FAD (FAD est une enzyme redox des flavoprotéines, section 5.11) qui est impliquée dans la détection d’O2 par la protéine. Lorsque l’oxygène est en quantité suffisante, nifL fonctionne en arrêtant la transcription des gènes nif afin d’empêcher la synthèse de la nitrogénase sensible à l’oxygène. L’ammoniac réprime la fixation de N2 par l’intermédiaire d’une seconde protéine, nommée Ntrc, dont l’activité est régulée par la teneur en azote de la cellule. Lorsque l’ammoniac est limitant, NtrC est active, et promeut la transcription de nifA. La protéine d’activation de la fixation d’azote, nifA, est alors produite, et la transcription de nif commence. L’ammoniac produit par la nitrogénase ne réprime pas la synthèse d’enzyme, car aussitôt formé, il est incorporé dans des formes organiques de l’azote et utilisé pour la biosynthèse. Mais lorsque l’ammoniac est en excès (comme dans les milieux naturels ou les milieux de culture), la synthèse de la nitrogénase est rapidement réprimée. De cette façon, l’ATP n’est pas gaspillé en fabriquant un produit déjà disponible en grandes quantités. Chez certaines bactéries fixatrices d’azote, l’activité de la nitrogénase est aussi régulée par l’ammoniac, dans un phénomène nommé ammonia switch-off effect. Dans ce cas, l’excès d’ammoniac produit une modification covalente (voir section 8.3) de la dinitrogénase réductase, ce qui se traduit par une perte d’activité de l’enzyme. Lorsque l’ammonium devient à nouveau limitant, cette protéine modifiée est reconvertie en sa forme active, et la

fixation de N2 reprend. Le « rupteur à ammoniac » est donc un procédé rapide et réversible permettant de contrôler la consommation d’ATP par la nitrogénase. Toutes les bactéries fixatrices d’azote ne possèdent pas ce système, mais des systèmes basés sur le même principe existent dans certains groupes, comme les bactéries phototrophes chez lesquelles il fut découvert.

Contrôlez vos acquis La fixation d’azote – réduction de N2 en NH3 – nécessite un complexe enzymatique nommé nitrogénase, qui consiste en une dinitrogénase et une dinitrogénase réductase. La plupart des nitrogénases contiennent du molybdène ou du vanadium et du fer comme cofacteurs métalliques, et le processus de fixation de l’azote consomme beaucoup d’énergie. La nitrogénase et la plupart des protéines régulatrices associées sont codées par le régulon nif. Certaines substances structurellement similaires à N2, comme l’acétylène et le cyanure, sont aussi réduites par la nitrogénase. La nitrogénase et la fixation d’azote sont très régulées, O2 et NH3 étant les principaux effecteurs de ces régulations. •

Écrivez une équation équilibrée de la réaction réalisée par la nitrogénase.

•

Qu’est-ce que FeMo-co, et quels métaux contient ce composé ?

•

En quoi C2H2 est-il utile pour l’étude de la fixation d’azote ?

•

Quels facteurs physiques et chimiques affectent la fonction de la nitrogénase ? En quoi le système nitrogénase de Streptomyces thermoautotrophicus est-il différent ?

QUESTIONS 1. Quelles sont les différences majeures entre les phototrophes oxygéniques et anoxygéniques (voir sections 17.1-17.5) ? 2. Quelles sont les fonctions respectives des chlorophylles de l’antenne collectrice de lumière et du centre réactionnel ? Pourquoi un mutant incapable de synthétiser les chlorophylles de l’antenne collectrice (de tels mutants sont facilement isolables au laboratoire) ne serait-il pas un bon compétiteur dans le milieu naturel (voir section 17.2) ? 3. Quels seront les pigments photosynthétiques des bactéries pourpres ? des cyanobactéries ? des algues vertes ? Au vu de leur fonction, pourquoi les pigments chlorophylliens ne sont-ils pas localisés à un autre endroit de la cellule, par exemple dans le cytoplasme ou dans la paroi (voir section 17.3) ? 4. Quels sont les pigments accessoires présents chez les phototrophes et quelle est leur fonction (voir section 17.3) ? 5. Comment la lumière induit-elle la production d’ATP chez les phototrophes anoxygéniques ? En quoi les flux d’électrons photosynthétiques et respiratoires sont-ils similaires ? En quoi diffèrent-ils (voir section 17.4) ?

6. Comment est fabriqué le pouvoir réducteur nécessaire à la croissance autotrophe des bactéries pourpres ? des cyanobactéries (voir section 17.4) ? 7. En quoi le potentiel réducteur de la chlorophylle a diffère-t-il entre les photosystèmes I et II ? Pourquoi le potentiel réducteur de la chlorophylle du photosystème II doit-il être aussi électropositif (voir section 17.5) ? 8. Quels sont les deux enzymes que l’on ne trouve que chez les organismes qui utilisent le cycle de Calvin ? Quelles sont les réactions effectuées par ces enzymes ? Quelles seraient les conséquences si un mutant ne possédait pas l’une de ces deux enzymes (voir section 17.6) ? 9. Quels organismes emploient le cycle de l’hydroxypropionate ou le cycle inverse de l’acide citrique en temps que voie de l’autotrophie (voir section 17.7) ? 10. Comparez et différenciez l’utilisation de H2S par une bactérie pourpre phototrophe et par une bactérie sulfo-oxydante incolore comme Beggiatoa. Quel rôle joue H2S dans le métabolisme de chaque organisme (voir section 17.8) ?



Problèmes 605 11. Quels donneurs d’électrons inorganiques sont utilisés par Ralstonia et Thiobacillus (voir sections 17.9 et 17.10) ? 12. Quelle particularité inhabituelle de l’environnement d’Acidithiobacillus ferroxidans affecte l’énergétique de son métabolisme (voir section 17.11) ? 13. Comparez la nitrification classique et anammox en termes de besoins en oxygène, les organismes impliqués et le besoin en mono-oxygénase (voir section 17.12) ? 14. Chez Escherichia coli, la synthèse du nitrate réductase est réprimée par l’oxygène. Sur la base d’arguments relevant de la bioénergétique, pourquoi pensez-vous que ce système de répression s’est mis en place (voir sections 17.3 et 17.4) ? 15. Pourquoi l’hydrogénase est-elle une enzyme constitutive de Desulfovibrio (voir section 17.15) ? 16. Comparez les homoacétogènes et les méthanogènes en termes de : 1) substrats et produits de leurs métabolismes énergétiques, 2) capacité à utiliser des composés organiques comme donneurs d’électrons dans le métabolisme énergétique, 3) mécanismes d’autotrophie, et 4) capacité à croître par respiration aérobie (voir sections 17.16 et 17.17, éventuellement section 13.4) ? 17. Comparez la réduction des ions ferriques avec la déchloration réductrice en termes de : 1) produit de la réduction et 2) signification environnementale (voir section 17.18). 18. Donnez la définition de la phosphorylation au niveau du substrat. En quoi diffère-t-elle de la phosphorylation oxydative ? Chez un organisme aérobie facultatif, dans quelles conditions nutritionnelles la phosphorylation au niveau du substrat, plutôt que de la phosphorylation oxydative, est-elle utilisée pour la production d’énergie (voir section 17.19) ? 19. Bien que beaucoup de composés différents soient théoriquement fermentescibles, dans la fermentation, la plupart des

composés organiques doivent par la suite être convertis en un groupe relativement restreint de molécules. Quelles sont ces molécules et pourquoi doivent-elles être produites (voir sections 17.19 et 17.20) ? 20. Comment les fermentations peuvent-elles se produire en absence de phosphorylation au niveau du substrat (voir section 17.20) ? 21. Pourquoi la syntrophie est-elle parfois appelée « transfert interespèces » (voir section 17.21) ? 22. En quoi les réactions catalysées par les mono-oxygénases diffèrent-elles de celles catalysées par les dioxygénases (voir sections 17.22 et 17.23) ? 23. En quoi un méthanotrophe diffère-t-il d’un méthanogène ? De quelle manière les méthanotrophes de type I et ceux de type II diffèrent-ils dans leur mode d’assimilation du carbone (voir section 17.24) ? 24. Comparez et énoncez les différences existant dans les processus de conversion de la cellulose et de l’amidon intracellulaire en unités de glucose. Quelles sont les enzymes impliquées et quel est le processus le plus énergétique (voir section 17.25) ? 25. Quelle est la fonction principale du cycle du glyoxalate (voir section 17.26) ? 26. Pourquoi les oxygénases sont-elles requises pour le catabolisme aérobie du décahexane (C16) mais pas pour celui du palmitate, acide gras à 16C (voir sections 17.22 et 17.27) ? 27. Écrivez la réaction catalysée par la nitrogénase. Combien d’électrons sont impliqués dans cette réaction ? Combien d’électrons sont réellement utilisés ? Expliquez (voir section 17.28). 28. Quelle est la différence entre la nitrogénase de Streptomyces thermoautotrophicus et celle d’Azotobacter (voir section 17.28) ? 29. Quels sont les gènes du régulon nif qui codent réellement les nitrogénases (voir section 17.29) ?

PROBLÈMES 1. Montrez les différences entre le spectre d’absorption de la chlorophylle a et celui de la bactériochlorophylle a. Quelles sont les longueurs d’onde préférentiellement absorbées par chacun de ces pigments et comment les propriétés d’absorption de ces molécules correspondent-elles aux régions du spectre de la lumière visible ? Pourquoi la plupart des plantes sontelles vertes ? 2. Le taux de croissance de la bactérie pourpre phototrophe Rhodobacter est à peu près deux fois plus rapide quand cet organisme est cultivé en conditions phototrophes dans un milieu contenant du malate comme source de carbone que quand le CO2 est utilisé comme source de carbone (avec H2 comme donneur d’électrons). Expliquez la raison de ce phénomène et indiquez la classe nutritionnelle dans laquelle se trouve Rhodobacter quand il pousse dans chacune de ces conditions. 3. Bien que physiologiquement distincts, les chimiolithotrophes et les chimio-organotrophes partagent certaines caractéristiques quant à la production d’ATP. Discutez ces points communs ainsi que les raisons pour lesquelles la croissance (exprimée en grammes de cellules par mole de substrat) est plus importante

pour un chimio-organotrophe respirant le glucose que pour un chimiolithotrophe respirant le soufre. 4. Lorsque le méthane est synthétisé à partir du CO2 (plus H2), ou à partir du méthanol (en l’absence de H2), de nombreuses étapes de la voie métabolique (voir figures 17.44 et 17.45) sont utilisées. Comparez la méthanogenèse à partir de ces deux substrats, et expliquez pourquoi ils doivent être métabolisés dans des directions opposées. 5. Bien que le dextrane soit un polymère de glucose, le glucose ne peut pas être utilisé pour fabriquer du dextrane. Expliquez. Pourquoi la synthèse de dextrane est-elle importante pour l’hygiène buccale (voir section 21.3) ? 6. Pseudomonas fluorescens peut se développer sur du benzoate en conditions aérobies, tandis que la bactérie phototrophe Rhodopseudomonas palustris peut se développer sur du benzoate en conditions anaérobies. Comparez et mettez en évidence les différences dans le métabolisme du benzoate chez ces deux espèces, en vous focalisant sur les considérations suivantes : les conditions requises pour les oxygénases, les réactions initiales menant à l’ouverture du noyau, et le(s) produit(s) formé(s) qui peuvent être introduits dans les voies métaboliques centrales.





CHAPITRE DIX-HUIT

Méthodes en écologie microbienne

I

Analyse des communautés microbiennes par les méthodes de culture 608

18.1 18.2

Enrichissement et isolement Isolement en culture pure

II

Analyse des communautés microbiennes par les méthodes moléculaires 614

18.3

Techniques de coloration pour la viabilité et la quantification Colorations génétiques Utilisation de la PCR Écogénomique (métagénomique)

614 617 618 620

III

Mesures de l’activité microbienne dans l’environnement

621

18.7 18.8

Radio-isotopes et microélectrodes Isotopes stables

622 624

18.4 18.5 18.6

Les colorants fluorescents peuvent être utilisés en écologie microbienne de manière qualitative ou quantitative. Dans certains cas, des colorations très spécifiques sont nécessaires pour identifier un organisme avec précision, tandis que dans d’autres cas, des colorations non spécifiques sont suffisantes pour dénombrer des cellules dans l’environnement. La photographie montre des cellules colorées avec un colorant non spécifique, nommé DAPI, qui colore en bleu l’ADN et rend les cellules plus faciles à dénombrer.

608 612



608 Chapitre 18


GLOSSAIRE Colonne de Winogradsky (Winogradsky column) Colonne remplie de boue et recouverte d’eau, pour reproduire les gradients physico-chimiques d’un lac ou d’un étang, dans laquelle des bactéries variées se développent au cours du temps (semaines ou mois). Culture d’enrichissement (enrichment culture) Voir chapitre 1. DAPI Colorant fluorescent non spécifique utilisé pour colorer les bactéries dans un échantillon naturel en vue de leur dénombrement. DGGE (denaturing gradient gel electrophoresis) Électrophorèse sur gel en gradient dénaturant. Cette technique permet de séparer des acides nucléiques de même taille, mais de séquences différentes. Écologie microbienne (microbial ecology) Étude des interactions des micro-organismes entre eux et avec leur environnement. FISH (fluorescent in situ hybridization) Hybridation fluorescente in situ. La méthode emploie un fluorochrome lié de façon covalente à une sonde nucléique spécifique, pour l’identification ou le repérage d’un organisme dans un échantillon. Fractionation isotopique (isotope fractionation) Discrimination par les enzymes en faveur de l’isotope le plus léger du carbone ou du soufre par exemple, ce qui conduit à un enrichissement en faveur de l’isotope le plus léger lors du métabolisme de CO2 ou SO42–. Génomique environnementale (environmental genomics) Utilisation des méthodes de la génomique (séquençage et analyse

L’

écologie microbienne s’intéresse aux interactions des micro-organismes entre eux et avec leur environnement et se concentre sur la biodiversité et l’activité microbienne. L’étude de la biodiversité nécessite l’isolement, l’identification et la quantification des micro-organismes dans de nombreux habitats. L’analyse de l’activité microbienne emploie diverses techniques pour mesurer ce que font les micro-organismes dans leurs habitats. Ces méthodes permettent d’aborder les questions complexes de structure et fonction des communautés microbiennes. Les méthodes décrites dans ce chapitre comprennent les techniques d’enrichissement et d’isolement, les colorations cellulaires spécifiques et non spécifiques, l’isolement et la caractérisation des gènes, ainsi que les méthodes pour mesurer les activités des micro-organismes in situ. Le chapitre suivant abordera l’écologie microbienne à grande échelle (eaux, sols, etc.) ou dans des habitats plus spécialisés comme le rumen (panse) des ruminants ou les nodules racinaires des plantes légumineuses.

I

ANALYSE DES COMMUNAUTÉS MICROBIENNES PAR LES MÉTHODES DE CULTURE

Il est rare qu’un environnement naturel contienne un seul type de micro-organisme. En effet, les micro-organismes forment des communautés microbiennes (voir section 19.1 et figure 19.1) et les microbiologistes doivent, pour les étudier, isoler et caractériser leurs constituants.

des génomes) pour caractériser les communautés microbiennes des environnements naturels. GFP (green fluorescent protein) Protéine fluorescente verte. Cette protéine fluorescente confère la couleur verte à une cellule, ce qui permet de la repérer dans un échantillon. Métagénome (metagenome) Totalité des gènes présents dans un environnement donné. Microautoradiograpie (microautoradiography, MAR) Permet la mesure de la consommation d’un substrat radioactif par l’observation des cellules l’ayant consommé, la radioactivité impressionnant une émulsion photographique à l’emplacement de la cellule. Microélectrode (microelectrode) Petite électrode de verre permettant de mesurer le pH ou des composés spécifiques comme H2S ou O2 par immersion dans un échantillon naturel à intervalles millimétriques. Nombre le plus probable (most probable number, MPN) Méthode statistique de dénombrement des cellules viables d’un échantillon, basée sur des dilutions en série. Pinces optiques (laser tweezers) Appareillage utilisé pour obtenir des cultures pures : une cellule est piégée optiquement dans un faisceau laser, déplacée à l’écart des cellules voisines et transferée dans un milieu de culture stérile. Sonde nucléique (nucleic acid probe) Oligonucléotide (10-20 bases) complémentaire d’une séquence d’un gène cible.

18.1 Enrichissement et isolement m n Une des approches permettant d’étudier un écosystème microbien consiste à en isoler les micro-organismes, et à étudier leurs propriétés par des cultures au laboratoire. Cette approche nécessite d’« extraire » l’organisme intéressant de sa communauté, par une méthode dite d’enrichissement, puis à l’isoler en culture pure. L’isolement permet ensuite des études détaillées en laboratoire ainsi que des applications en biotechnologie, ou en microbiologie industrielle et environnementale. Afin d’isoler des micro-organismes de leur environnement naturel, on réalise une culture d’enrichissement. Pour ce faire, un milieu et un ensemble de conditions d’incubation sont définis pour sélectionner l’organisme souhaité au détriment des autres. Une culture d’enrichissement s’efforce de reproduire aussi fidèlement que possible les ressources et les conditions physico-chimiques d’une niche écologique particulière. Des centaines de procédures d’enrichissement ont été mises au point, telles que celles présentées dans le tableau 18.1.

Inoculum et cultures d’enrichissement La réussite d’une culture d’enrichissement nécessite en fait de disposer de l’échantillon d’un habitat approprié qui servira d’inoculum pour un milieu très sélectif, qui sera incubé dans des conditions bien définies. Beaucoup de procaryotes communs peuvent ainsi être isolés. Par cette approche, le célèbre microbiologiste hollandais Martinus Beijerinck, un pionnier



18.1 Enrichissement et isolement 609

TABLEAU 18.1

MÉTHODES DE CULTURES D’ENRICHISSEMENT DE PROCARYOTESa

Bactéries phototrophes : source de carbone principale, CO2 Incubation à l’air

Organismes enrichis

Inoculum

Source d’azote : N2

Cyanobactéries

Eau d’un étang ou d’un lac ; boues riches en sulfures ; eaux stagnantes ; effluents bruts ; végétation humide en décomposition ; sol humide exposé à la lumière

Source d’azote : NO3–, 55 °C

Cyanobactéries thermophiles

Tapis microbien de source chaude

H2 ou acides organiques ; source d’azote : N2

Bactéries pourpres non sulfureuses ; héliobactéries

Donneur d’électrons : H2S

Bactéries et pourpres sulfureuses vertes

Tapis microbien de source chaude ; eau d’un lac hypolimnétique ; sol pasteurisé (héliobactéries)

Incubation en anaérobiose

Bactéries chimiolithotrophes à l’obscurité : source de carbone principale, CO2 (le milieu doit être dépourvu de matière organique) Incubation à l’air : respiration aérobie Donneur d’électrons

Accepteur d’électrons

Organismes enrichis

Inoculum

NH4+

O2

Bactéries nitrosantes (Nitrosomonas)

Sol, boue ; effluent d’égout

NO2–

O2

Bactéries nitratantes (Nitrobacter)

H2

O2

Hydrogénobactéries (divers genres)

O2

Thiobacillus spp.

O2

Acidithiobacillus ferrooxidans

S0, S2O3 2–

NO3–

Thiobacillus denitrificans

H2

NO3–

H2S, S0, S2O3 2– 2+

Fe , pH acide Incubation anaérobie

Inoculum + extrait de levure

Boue, sédiments lacustres, sol

Paracoccus denitrificans

Bactéries chimio-organotrophes et méthanogènes à l’obscurité : source de carbone principale, matière organique Incubation à l’air : respiration aérobie Donneur d’électrons


Organismes classiquement enrichis

Inoculum et source d’azote

Lactate + NH4+

O2


Sol, boue ; sédiments lacustres ; végétation en décomposition ; inoculum pasteurisé (15 minutes à 80 °C) pour l’enrichissement de Bacillus

Benzoate + NH4+

O2


Amidon + NH4+

O2

Bacillus polymyxa, autre Bacillus spp.

Éthanol (4 %) + 1 % d’extrait de levure, pH 6,0

O2

Acetobacter, Gluconobacter

Urée (5 %) + 1 % d’extrait de levure

O2

Sporosarcina ureae

Hydrocarbures (huile minérale, essence, toluène) + NH4+

O2

Mycobacterium, Nocardia, Pseudomonas (voir figure 19.42)

Cellulose + NH4+

O2

Cytophaga, Sporocytophaga (voir figure 12.90)

Mannitol ou benzoate, source d’azote : N2

O2

Azotobacter



610 Chapitre 18

TABLEAU 18.1


MÉTHODES DE CULTURES D’ENRICHISSEMENT DE PROCARYOTESa (suite)

Incubation en anaérobiose : respiration anaérobie Donneur d’électrons


Organismes enrichis

Inoculum

Acides organiques

KNO3 (0,2 %)

Pseudomonas (espèces dénitrifiantes)

Sol, boue ; sédiments lacustres

Extrait de levure

KNO3 (0,1 %)

Bacillus (espèces dénitrifiantes)

Acides organiques

Na2SO4

Desulfovibrio, Desulfotomaculum

Acétate, propionate, butyrate

Na2SO4

Sulfato-réducteurs oxydant les acides gras

Acétate, éthanol

S0

Desulfuromonas 3+

Acétate

Fe

Geobacter, Geospirillum

Acétate

ClO3–

Bactéries réduisant les chlorures

H2

Na2CO3

Méthanogènes (chimiolithotrophes), homoacétogènes

CH3OH

Na2CO3

Methanosarcina barkeri

CH3NH2 ou CH3OH

KNO3

Hyphomicrobium

Comme ci-dessus ; résidus de digesteurs d’effluents ; contenus intestinaux de rumen ; sédiments marins

Boue, sédiments ; résidus d’effluents

Incubation en anaérobiose : fermentation Donneur d’électrons et source d’azote


Organismes enrichis

Inoculum

Glutamate ou histidine

Pas d’accepteur d’électrons externe

Clostridium tetanomorphum

Boue, sédiments lacustres ; végétaux en décomposition, produits laitiers (bactéries lactiques et propionobactéries) ; contenus d’intestins ou de rumens (bactéries entériques) ; résidus d’effluents ; sol

Amidon NH4+

Aucun

Clostridium spp.

Amidon + N2 (source d’azote)

Aucun

Clostridium pasteurianum

Lactate + extrait de levure

Aucun

Veillonella spp.

Glucose ou lactose + NH4+

Aucun

Escherichia, Enterobacter, autres organismes fermentatifs

Glucose + extrait de levure (pH 5)

Aucun

Bactéries lactiques (Lactobacillus)

Lactate + extrait de levure

Aucun

Propionobactéries

Succinate + NaCl

Aucun

Propionigenium

Oxalate

Aucun

Oxalobacter

Tous les milieux doivent contenir un assortiment de sels minéraux, dont N, P, S, Mg2+, Mn2+, Fe2+, Ca2+, et d’autres éléments trace (voir sections 5.1 à 5.3). Certains organismes peuvent avoir des besoins en vitamines ou autres facteurs de croissance. Ce tableau représente une vue d’ensemble des méthodes d’enrichissement et n’aborde pas le rôle de la température d’incubation dans l’isolement des thermophiles (haute température), hyperthermophiles (très haute tempéraure) et des psychrophiles (basse température), ni les effets de pH ou de salinités extrêmes, pour peu que l’on traite un inoculum approprié. a

des cultures d’enrichissement (voir section 1.6), fut le premier à isoler la bactérie fixatrice d’azote Azotobacter, en utilisant une stratégie désormais classique (voir figure 18.1). Azotobacter étant capable de fixer l’azote (N2) de l’air, les techniques d’enrichissement utilisent des milieux dépourvus d’ammoniac ou d’autres formes d’azote, et l’incubation en présence d’air sélectionne ce type d’organisme. Les organismes non fixateurs d’azote, ainsi que les bactéries fixatrices d’azote anaérobies, sont dans ces conditions contre-sélectionnés (voir figure 18.1). Il faut noter que le milieu de culture et les conditions d’incubation sont critiques pour le succès d’une culture d’enrichissement. Ce sont à la fois les ressources et les conditions qu’il convient d’optimiser pour avoir la meilleure chance d’enrichir

l’organisme souhaité. Certaines cultures d’enrichissement sont infructueuses, ce qui indique que les organismes nécessitant l’ensemble des conditions fournies sont absents de l’habitat étudié. Cela peut aussi signifier que ces organismes existent, mais que les conditions de culture permettant leur enrichissement ne sont pas toutes réunies. Une culture d’enrichissement peut démontrer la présence d’un micro-organisme, mais ne peut pas prouver son absence. De plus, l’isolement d’un organisme particulier à partir d’une culture d’enrichissement n’apporte aucune information sur l’importance écologique ou l’abondance de l’organisme dans l’inoculum ; un enrichissement positif prouve seulement que l’organisme était présent dans l’échantillon, et même en théorie, qu’une seule cellule était présente.



18.1 Enrichissement et isolement 611

N2 (source d’azote)

Air

Colonies d’Azotobacter O2 fixatrices d’azote (permet la respiration)

Sol

1. Incuber à l’air Sels minéraux plus milieu au mannitol ; pas de NH4+, NO3–, ou azote organique

N2 (source d’azote)

2. Étaler sur une boîte du même milieu Air

Pas de croissance

O2 (permet la respiration)

Sol

Milieu sans NH4+

3. Même milieu, 4. mais ajouter NH4+, incuber à l’air NH4+ (source d’azote)

Étaler sur un milieu avec NH4+ ou sans NH4+

Colonies de bactéries non fixatrices d’azote

Milieu avec NH4+

FIGURE 18.1 Isolement d’Azotobacter. Les enrichissements favorisant les bactéries aérobies fixatrices d’azote conduisent habituellement à l’isolement d’Azotobacter ou d’organismes proches. En revanche, les enrichissements utilisant des formes d’azote telles que NH4+ permettent rarement d’obtenir des bactéries fixatrices d’azote, la pression de sélection pour l’azote n’étant plus présente.

La colonne de Winogradsky La colonne de Winogradsky est un écosystème anoxique miniature qui peut être utilisé comme une source à long terme de bactéries en vue de cultures d’enrichissement. Elle a été employée pour l’isolement de bactéries phototrophes vertes et pourpres, de bactéries sulfato-réductrices et de nombreux autres anaérobies (voir figure 18.2). Cette colonne, du nom du célèbre microbiologiste russe Sergei Winogradsky (voir le focus « Winogradsky et la chimiolithotrophie », chapitre 17 et section 1.7), a été utilisée la première fois par son inventeur à la fin du XIXe siècle, pour l’étude des micro-organismes du sol. Une colonne de Winogradsky consiste en un cylindre de verre, rempli à moitié de boue, riche en matière organique et si possible en sulfures (voir figure 18.2), à laquelle on mélange des substrats carbonés. Ces substrats vont déterminer quels microorganismes seront enrichis, mais on évite l’emploi de substrats fermentescibles, qui conduisent à la formation de gaz en grandes quantités. La boue est additionnée de CaCO3 et de CaSO4, comme tampon et source de sulfate respectivement. La boue est tassée légèrement dans son récipient en verre, en prenant soin d’éviter d’emprisonner de l’air (voir figure 18.2). La boue est alors recouverte avec de l’eau prélevée dans un lac, un étang, ou de l’eau de mer, et le sommet du tube est fermé pour éviter l’évaporation. Le cylindre est ensuite placé près d’une fenêtre éclairée et laissé en incubation pendant quelques semaines. Dans une colonne de Winogradsky typique, les micro-organismes vont se développer. Les algues et les cyanobactéries apparaissent rapidement dans les parties supérieures de la

colonne d’eau ; en produisant de l’O2, ces organismes maintiennent cette zone oxygénée. La décomposition de la matière organique dans la boue conduit à la production d’acides organiques, d’alcools, d’H2, tous des substrats pouvant être couplés à la réduction des sulfates (voir sections 12.18, 13.7, 17.15 et 19.13). Les sulfures résultant de la réduction des sulfates déclenchent le développement des bactéries vertes et pourpres (phototrophes anoxygéniques, sections 12.2 et 12.32), qui utilisent les sulfures comme donneurs d’électrons. Ces organismes apparaissent typiquement en taches, dans la boue, sur les côtés de la colonne, mais peuvent se développer dans l’eau si les phototrophes oxygéniques sont peu abondants (voir figure 18.2). Une longue et fine pipette, insérée dans la boue, permet d’échantillonner les bactéries phototrophes, en vue d’observations au microscope, ou d’inoculations de milieux d’enrichissement, préalablement à l’isolement et à la caractérisation. Les colonnes de Winogradsky ont été utilisées pour enrichir de nombreux procaryotes, aérobies et anaérobies. Ces colonnes qui peuvent servir de source d’inoculums pour des cultures d’enrichissement peuvent être aussi enrichies d’un composé particulier afin de tester l’hypothèse de l’existence dans l’échantillon d’organisme(s) capable(s) de dégrader ce composé.

Le biais des cultures d’enrichissement Bien que les cultures d’enrichissement soient des outils puissants, elles donnent parfois des résultats fortement biaisés. Dans une culture d’enrichissement en milieu liquide, l’organisme le mieux adapté aux conditions choisies pour l’enrichissement devient dominant. Malheureusement, il se peut que cet organisme ne soit qu’un composant mineur de l’écosystème microbien étudié, et non pas l’organisme le plus abondant ou le plus significatif du point de vue écologique. Le biais des cultures d’enrichissement peut être démontré en comparant les résultats obtenus dans les cultures par dilution (voir section 18.2) avec les enrichissements classiques en milieu liquide. La dilution de l’inoculum, suivie de l’enrichissement ou de l’étalement sur boîte, donne souvent des organismes différents de ceux obtenus par la méthode sans dilution. Il est vraisemblable que la dilution élimine de l’inoculum les espèces à croissance rapide, permettant ainsi aux autres de se développer. La dilution de l’inoculum est ainsi une pratique commune des méthodes actuelles de cultures microbiennes d’enrichissement.

Contrôlez vos acquis La technique de culture d’enrichissement est un moyen d’obtenir des micro-organismes à partir d’échantillons des milieux naturels. Le choix du milieu et des conditions d’incubation permet de sélectionner des organismes particuliers réalisant des réactions spécifiques. •

Décrivez la stratégie d’enrichissement utilisée par Beijerinck pour l’isolement d’Azotobacter.

•

Pourquoi du sulfate (SO42–) est-il ajouté dans la colonne de Winogradsky ?

•

Que signifie un biais dans l’enrichissement ?



Méthodes en écologie microbienne Gradients Colonne O2

Bouchon

Eau d’un lac ou d’un étang

Algues et cyanobactéries

Boue enrichie de matière organique et CaSO4

Taches de bactéries pourpres sulfureuses ou de bactéries vertes sulfureuses

Bactéries pourpres non sulfureuses Chimiolithotrophes sulfo-oxydants

H2S

(a)

Décomposition anaérobie et réduction des sulfates

FIGURE 18.2 La colonne de Winogradsky. (a) Vue schématique d’une colonne typique. La colonne est exposée à la lumière solaire adoucie. Les bactéries chimio-organotrophes se développent dans toute la colonne, les aérobies et microaérophiles, dans la partie supérieure, les anaérobies dans les zones contenant de l’H2S. La décomposition anaérobie conduisant à la réduction des sulfates forme le gradient d’H2S. Les bactéries sulfureuses vertes et pourpres se positionnent dans le gradient selon leur tolérance à l’H2S. (b) Photographies de colonnes de Winogradsky demeurées anoxiques jusqu’au sommet où des efflorescences de trois bactéries photrophes différentes se sont développées dans la boue et au-dessus dans la colonne d’eau. De gauche à droite : Thiospirillum jenense, Chromatium okenii (bactéries pourpres sulfureuses, sections 12.2) et Chlorobium limicola (bactérie verte sulfureuse, sections 12.32).

m n

18.2 Isolement en culture pure

Les cultures pures – qui contiennent un seul type de microorganisme – peuvent être obtenues de différentes façons à partir de cultures d’enrichissement. Les procédures classiques d’isolement sont l’étalement sur boîte, l’inclusion dans un tube de gélose et la dilution en milieu liquide. Pour les organismes qui se développent bien en boîte de Petri, l’étalement sur boîte, rapide, facile, constitue la méthode de choix (voir figure 18.3a). En répétant repiquage et étalement d’une colonie bien séparée des autres, il est aisé d’obtenir une culture pure qui peut alors être transférée en milieu liquide. En utilisant un matériel d’incubation approprié, par exemple une jarre pour les anaérobies (voir section 6.13), il est possible de purifier par cette méthode aussi bien les aérobies que les anaérobies.

Gélose molle et nombre le plus probable La méthode du tube de gélose molle (agar shake-tube method) consiste à diluer une culture mixte dans un tube contenant de l’agar mou, à agiter l’ensemble, ce qui conduit après incubation à des colonies qui sont incluses dans l’agar, au lieu de se développer à la surface de la gélose (voir figure 18.3b). Cette méthode est utile pour la purification de procaryotes anaérobies comme les bactéries phototrophes sulfureuses ou les bactéries sulfato-réductrices (voir figure 12.50g) provenant de colonnes de Winogradsky (voir figure 18.2). La purification s’obtient par des dilutions successives de suspensions cellulaires en tubes de

Norbert Pfennig

612 Chapitre 18

(b)

milieu liquide (voir figure 18.3b). Une colonie venant d’un tube correspondant à la dilution la plus forte, ainsi transférée plusieurs fois dans une série de dilutions, conduit finalement à une culture pure. Une procédure similaire consiste en série de dilutions en milieu liquide, jusqu’à ce que le dernier tube ne présente pas de croissance (voir figure 18.4). Dans le cas de dilutions au dixième, le dernier tube sans croissance doit correspondre à un inoculum de dix cellules ou moins. Des cultures pures peuvent être obtenues en répétant plusieurs fois cette procédure. Cette méthode connue sous le nom de la technique du nombre le plus probable (NPP = MPN ou Most Probable Number) [voir figure 18.4] a été utilisée pour dénombrer les micro-organismes dans les aliments, les eaux usées ou d’autres échantillons, pour lesquels l’abondance bactérienne doit être déterminée en routine. La méthode du NPP peut être mise en œuvre en utilisant des milieux et des conditions d’incubation très sélectifs, afin de cibler un organisme ou un petit groupe d’organismes comme un pathogène. Il est aussi possible d’employer un milieu complexe pour obtenir une estimation du nombre total de cellules d’un échantillon (voir dans la section 6.7 l’avertissement correspondant). Quelle que soit la méthode utilisée pour purifier une culture, il est essentiel de vérifier la pureté de la culture obtenue. La vérification se fait en combinant : 1) l’observation microscopique, 2) l’observation des caractéristiques des colonies sur boîte ou en gélose molle, 3) les essais de croissance de la culture sur d’autres milieux. Pour ce dernier point, il est important



18.2 Isolement en culture pure 613

1 ml (liquide) ou 1 g (solide)

Culture d’enrichissement ou échantillon naturel Dilution 1 ml

1 ml

1 ml

1 ml

Pas de croissance

Croissance James Shapiro

Milieu de culture (bouillon) 1/10 (10–1)

Colonies

Sceau de paraffine

Norbert Pfennig

(a)

(b) FIGURE 18.3 Méthodes d’obtention de cultures pures. (a) Les organismes qui forment sur boîte des colonies distinctes comme celles montrées ici sont en général très faciles à purifier. (b) Colonies d’anaérobies sensibles à l’oxygène par la technique des géloses molles. Une série de dilutions a été établie (de droite à gauche), ce qui peut conduire à la formation de colonies bien isolées. Les tubes sont scellés d’un mélange de paraffine et d’huile minérale afin de maintenir l’anaérobiose.

de réaliser une culture dans un milieu qui ne devrait pas permettre une bonne croissance de la culture purifiée, mais une forte croissance de contaminants éventuels. En définitive, l’observation microscopique d’un type de cellule présentant une morphologie unique, associée à des colonies aux caractéristiques uniformes et à l’absence de contaminants dans les cultures de contrôle en milieux variés, constitue une bonne preuve que la culture est axénique (pure).

Les pinces optiques En addition aux méthodes les plus classiques qui viennent d’être décrites, les récents développements technologiques en microscopie ont conduit à la mise en œuvre de nouveaux outils pour l’obtention des cultures pures, tels que les pinces optiques. Cet équipement est formé d’un microscope inversé, équipé d’un laser infrarouge et d’un dispositif de micromanipulation (voir figure 18.5). Une cellule unique, présente

10–2

1 ml

10–3

10–4

10–5

10–6

FIGURE 18.4 Méthode du nombre le plus probable (NPP) ou most probable number (MPN). Une culture d’enrichissement ou un échantillon naturel (eau, sol, etc.) est ajouté à un milieu de culture sélectif, et des dilutions en séries sont réalisées. Dans le dernier tube montrant une croissance (ici celui correspondant à la dilution 10–4), il ne devrait y avoir initialement que 10 cellules ou moins encore. Afin d’obtenir des cultures pures, la plus forte dilution présentant une croissance est utilisée comme inoculum et la procédure est répétée. Pour déterminer le nombre de bactéries dans un échantillon, le nombre le plus probable est défini comme la plus forte dilution présentant une croissance. Si le milieu utilisé dans cet exemple est très sélectif pour les bactéries sulfato-réductrices, on peut conclure que de 10 4 à 105 cellules cultivables de ces organismes sont présents par gramme d’échantillon de sol analysé. L’utilisation de plusieurs tubes réplicats par dilution améliore la précision du nombre le plus probable obtenu.

dans un champ microscopique, peut être optiquement piégée dans le faisceau du laser et éloignée des cellules voisines. Le piégeage est possible car le laser produit une force qui appuie sur un objet de petite taille (comme une cellule microbienne), et la maintient en place. Lorsque le faisceau laser se déplace, la bactérie piégée se déplace également. Si l’échantillon se trouve dans un tube capillaire, une cellule unique peut être ainsi piégée et isolée en cassant le tube en un point précis pour la séparer du reste de la population. La cellule piégée peut alors être transférée dans un petit tube de milieu stérile, en vue d’obtenir une culture pure (voir figure 18.5). La technologie des pinces optiques est particulièrement utile pour isoler des micro-organismes à croissance lente qui peuvent être envahis dans des cultures d’enrichissement, ou des organismes présents en si petit nombre qu’ils pourraient être « oubliés » par les techniques d’enrichissement basées sur les dilutions. Couplées avec l’utilisation de colorants spécifiques pouvant identifier au microscope (voir section 18.4) un microorganisme particulier, les pinces optiques peuvent être employées pour sélectionner des micro-organismes remarquables dans un mélange, en vue de leur purification et d’études ultérieures.



614 Chapitre 18


II

a

b

Fb

O

Fa

Cellule Foyer du faisceau

a

b

Lentille objectif du microscope

Faisceau laser

(a)

Cellule piégée (immobilisée) optiquement

Tube capillaire (b)

Point de rupture

Mélange de cellules Laser

FIGURE 18.5 Utilisation des pinces optiques pour l’isolement des bactéries. (a) Principe des pinces optiques. Un faisceau laser fortement concentré sur un objet aussi petit qu’une cellule bactérienne crée des forces « radiatives » dirigées vers le bas (Fa, Fb) qui permettent de déplacer la cellule dans n’importe quelle direction. (b) Isolement. Le faisceau laser peut se bloquer sur une seule cellule d’un mélange placé dans un tube capillaire et déplacer la cellule piégée optiquement (ici, la cellule choisie est déplacée de la droite vers la gauche), loin des autres cellules. Dès que la cellule choisie est suffisamment éloignée, le capillaire est rompu et la cellule inoculée dans un tube de milieu de culture stérile.


ANALYSE DES COMMUNAUTÉS MICROBIENNES PAR LES MÉTHODES MOLÉCULAIRES

L’écologiste microbien doit souvent quantifier les cellules présentes dans un habitat microbien, afin de savoir quels organismes sont présents et en quel nombre. Une telle information permet de comprendre la dynamique de l’écosystème et aide à localiser les organismes les plus significatifs du point de vue écologique. La coloration des cellules aide les microbiologistes dans ces dénombrements et les méthodes correspondantes sont détaillées ici. Les organismes des environnements naturels peuvent aussi être détectés grâce à leurs gènes ; les gènes codant l’ARN ribosomique (voir sections 11.5-11.7) ou des processus métaboliques particuliers sont des cibles très utilisées dans ce type d’études, mais la génomique environnementale (voir section 18.6) ouvre de nouvelles voies passionnantes en abordant l’ensemble des génomes des communautés microbiennes.

18.3 Techniques de coloration m n pour la viabilité et la quantification De nombreuses méthodes de coloration ont été mises au point pour quantifier les micro-organismes des échantillons naturels ; bien que ces méthodes ne révèlent pas la physiologie ou la phylogénie des cellules, elles sont largement utilisées et sont suffisamment fiables pour obtenir une information quantitative sur le nombre total de cellules présentes dans un habitat particulier.

La coloration fluorescente au DAPI Les colorants fluorescents ont été largement employés pour colorer les micro-organismes. Le DAPI (4’,6-diaminodo2phénylindole) est très fréquemment utilisé. Les cellules colorées au DAPI fluorescent en bleu clair et sont aisées à distinguer et à dénombrer (voir figure 18.6). Cette technique est très employée pour le dénombrement des cellules dans l’environnement, les aliments, les échantillons cliniques.

•

En quoi la méthode d’inclusion en gélose molle diffère-t-elle de l’étalement sur boîte pour l’obtention de colonies ?

•

Dans un dénombrement par NPP (voir figure 18.4), pourquoi le nombre réel de cellules cultivables par échantillon est-il vraisemblablement compris entre l’inverse de la plus forte dilution dans laquelle une croissance s’est produite et la plus forte dilution suivante ?

•

Comment peut-on isoler une bactérie à morphologie unique, présente en relativement petit nombre, dans une culture d’enrichissement ?

Nancy J. Trun

Suite à une culture d’enrichissement réussie, il est possible d’obtenir une culture pure en utilisant des méthodes microbiologiques conventionnelles comme l’étalement sur boîte, l’inclusion en gélose molle ou les méthodes de dilution. Les pinces optiques permettent d’attraper une cellule unique dans le champ d’un microscope et de l’éloigner des contaminants.

FIGURE 18.6 Cellules d’Escherichia coli rendues fluorescentes par une coloration au DAPI. Cette technique de coloration est régulièrement employée pour effectuer les comptages totaux de cellules microbiennes. Le DAPI pénètre dans les cellules et se fixe à l’ADN, rendant les cellules de procaryotes uniformément fluorescentes.



18.3 Techniques de coloration pour la viabilité et la quantification 615

La coloration viable Une méthode utilisant un colorant fluorescent a été développée pour différencier les cellules vivantes des cellules mortes. On obtient ainsi non seulement le nombre d’organismes présents dans un échantillon, mais aussi une information sur leur viabilité. Le principe de cette méthode repose sur l’intégrité ou non de la membrane cytoplasmique. Deux colorants, l’un vert, l’autre rouge, sont ajoutés à l’échantillon ; le colorant vert pénètre toutes les cellules, vivantes ou mortes, tandis que le colorant rouge, qui contient de l’iodure de propinium, pénètre seulement les cellules dont la membrane est endommagée, et qui donc sont mortes. Ainsi, les cellules vertes sont vivantes et les cellules rouges sont mortes (voir figure 18.7). Bien qu’utile pour des recherches sur des cultures de laboratoire, la méthode de coloration vivant/mort est moins utile pour l’examen au microscope d’échantillons naturels dans lesquels des colorations non spécifiques de divers matériaux peuvent se produire.

Les anticorps fluorescents

Molecular Probes, Inc., Eugene, OR

Les techniques de coloration peuvent être rendues plus spécifiques par l’emploi d’anticorps fluorescents. Les anticorps sont des réactifs biologiques spécifiques, et les anticorps fluorescents sont

FIGURE 18.7 Détermination de la viabilité par coloration. Cellules vivantes (vertes) et mortes (rouges) de Micrococcus luteus (coques) et Bacillus cereus (bâtonnets) colorées par le colorant indicateur de viabilité « LIVE / DEAD Bac Light TM ».

présentés d’un point de vue théorique dans la section 24.9. La grande spécificité des anticorps vis-à-vis des composés de surface d’un organisme particulier peut être utilisée pour identifier ou repérer un organisme dans un habitat complexe contenant un mélange de nombreux organismes comme le sol (voir figure 18.8) ou un échantillon clinique. La méthode nécessite de préparer des anticorps spécifiques contre l’organisme d’intérêt, ce qui est une procédure souvent longue et laborieuse. Cependant, dans le cas des micro-organismes d’intérêt clinique, il est possible d’acheter dans le commerce des anticorps hautement spécifiques, et cette technique est très largement utilisée en microbiologie médicale (voir section 24.9 et figure 24.9).

Le marquage cellulaire par la protéine verte fluorescente Les cellules bactériennes peuvent être modifiées par génie génétique et rendues fluorescentes. Comme cela sera présenté dans le chapitre 31, un gène codant une protéine nommée protéine fluorescente verte (green fluorescent protein, GFP) peut être inséré dans le génome de pratiquement n’importe quelle bactérie. Lorsqu’elle est exprimée, les cellules contenant cette protéine apparaissent en vert au microscope sous UV (voir figure 18.9). Bien qu’inutiles pour l’étude des populations naturelles (dont les cellules ne possèdent pas le gène de la GFP), des cellules marquées par la GFP peuvent être introduites dans un environnement, telles que des racines de plantes (voir figure 18.9), et les souches marquées recherchées en microscopie. Par cette méthode, l’écologiste microbien étudie la compétition entre une communauté microbienne autochtone et la souche marquée introduite in situ, ou encore les effets de perturbations environnementales sur la bactérie introduite. Le gène de la GFP a aussi été beaucoup employé sur des cultures de laboratoire comme gène rapporteur. Lorsqu’il est fusionné avec un opéron sous le contrôle d’un répresseur spécifique, le contrôle de la transcription des gènes peut être étudié en utilisant la fluorescence comme indice de la

T. D. Brock

Selon l’échantillon, la coloration non spécifique du fond de la préparation peut être parfois un problème rencontré dans l’utilisation des colorants fluorescents. Mais le DAPI qui colore les acides nucléiques réagit peu avec la matière inerte. Ainsi, pour de nombreux échantillons de sols ou d’eaux, la coloration au DAPI donne une bonne estimation du nombre de cellules présentes dans un échantillon. Dans le cas des échantillons d’eaux à faible abondance bactérienne, les cellules sont colorées après concentration sur un filtre d’un volume connu. Les cellules peuvent également être concentrées par centrifugation. Les techniques utilisant des colorants comme le DAPI ont l’intérêt de ne pas être spécifiques : tous les micro-organismes d’un échantillon sont colorés. Par contre, ces techniques ne permettent pas la distinction entre cellules mortes et vivantes, entre différentes espèces, et ne repèrent pas d’organismes particuliers dans un échantillon.

FIGURE 18.8 Utilisation d’anticorps fluorescents comme marquage cellulaire. Visualisation des cellules de l’Archaea hyperthermophile Sulfolobus acidocaldarius dans des microcolonies (les cellules apparaissent comme des points jaune-vert), à la surface de particules de sol d’une solfatare, par utilisation d’un anticorps fluorescent. Les cellules ont un diamètre d’environ 1 µm.



transcription. Ainsi, lorsque les gènes fusionnés au gène de la GFP sont transcrits, ce dernier l’est également. La protéine verte fluorescente est alors exprimée et les cellules fluorescent en vert (voir section 31.4 et figure 31.7).

Les limites de la microscopie Le microscope est un outil indéniable pour la numération et l’identification des micro-organismes dans les échantillons environnementaux, mais est-il suffisant pour étudier les micro-organismes dans leurs habitats naturels ? Non bien sûr, et ceci pour plusieurs raisons. Les petites cellules constituent un problème. La taille des procaryotes est variable (voir section 4.4 et tableau 4.1), et certains sont proches des limites de résolution des microscopes optiques. Lors de l’observation d’échantillons de l’environnement, de tels organismes peuvent facilement être laissés de côté, particulièrement si l’échantillon contient de fortes concentrations de particules ou de nombreuses cellules de grande taille. De plus, dans les échantillons naturels, il est souvent difficile de différencier les cellules vivantes, des mortes et même les cellules, de la matière non vivante. Même si l’objectif est seulement la quantification, tous ces facteurs peuvent affecter, parfois fortement, les résultats. Cependant, la plus grande limite des techniques de coloration qui viennent d’être évoquées est sans doute le fait qu’elles ne permettent pas de mesurer la diversité des micro-organismes d’un environnement. En d’autres termes, qui sont les microorganismes dénombrés au microscope ? Il est facile d’être induit en erreur par de simples observations microscopiques. Par exemple, deux cellules morphologiquement semblables peuvent représenter en fait deux espèces génétiquement différentes, qui jouent des rôles également différents dans l’écosystème (voir figure 18.10). Ce problème ne peut être réglé par des techniques simples de coloration. Ainsi, l’observation de populations naturelles de micro-organismes, colorées ou non, au microscope, doit se faire en gardant à l’esprit que l’échantillon

Alex T. Nielsen

FIGURE 18.9 La protéine verte fluorescente (GFP, green fluorescent protein). Les cellules de Pseudomonas fluorescens, génétiquement modifiées pour exprimer la protéine verte fluorescente, sont observées au microscope confocal (section 4.2). Les cellules sont fixées sur des racines d’orge et fluorescent en vert. Les cellules colorées en bleu appartiennent aux communautés usuelles des racines d’orge et ont été colorées au DAPI (sections 18.3, figure 18.6). L’utilisation de la protéine GFP permet de suivre des cellules introduites expérimentalement dans un écosystème particulier.

(a)

Alex T. Nielsen


Bo Normander

616 Chapitre 18

(b)

FIGURE 18.10 Morphologie et diversité génétique. Les deux photos présentées, (a) contraste de phase et (b) coloration phylogénétique (voir section 18.4), concernent le même amas de cellules. Bien que les grandes cellules ovales aient une morphologie, une taille inhabituelles pour des cellules procaryotes et se ressemblent en microscopie à contraste de phase, les colorations phylogénétiques révèlent l’existence de deux types de cellules génétiquement distinctes, colorées respectivement en jaune et bleu. Une simple observation en microscopie photonique d’échantillons naturels doit donc être interprétée avec précaution car il est facile d’affirmer que des cellules de morphologie inhabituelle observées dans le même champ microscopique appartiennent au même organisme. Les cellules ovales colorées en bleu ou jaune ont environ 2,25 µm de diamètre. Les cellules vertes, en paires ou en grappes, mesurent environ 1 µm de diamètre.

contient très vraisemblablement une très grande diversité génétique, même si toutes les cellules se ressemblent (voir figure 18.10). Cette diversité peut être révélée par des méthodes de coloration spécifiques (voir figure 18.10b). Bien que le microscope soit un outil de choix pour l’écologiste microbien, il doit être complété par des cultures et des méthodes moléculaires, afin de bien comprendre l’écosystème étudié. Les méthodes moléculaires ciblent des gènes spécifiques correspondant à des micro-organismes spécifiques ; la présence du gène implique la présence de l’organisme. Ces méthodes moléculaires, dont certaines utilisent aussi la microscopie, seront détaillées maintenant (voir figure 18.10).

Contrôlez vos acquis Le DAPI est un colorant permettant le repérage des micro-organismes dans les échantillons naturels. Quelques colorants permettent de différencier les cellules vivantes, des mortes et des anticorps fluorescents spécifiques d’un type ou d’un petit groupe de cellules proches peuvent être préparés. La protéine fluorescente verte rend les cellules autofluorescentes et ceci permet de repérer des cellules introduites dans un milieu naturel. Contrairement aux cultures pures, dans les échantillons naturels, des cellules aux morphologies semblables peuvent être en fait très différentes génétiquement.



18.4 Colorations génétiques 617

•

Pourquoi est-il incorrect de dire que la technique de « GFP » est une technique de « coloration » ?

•

En quoi les colorants, comme le DAPI, sont-ils différents des anticorps fluorescents en termes de spécificité ?

FISH : coloration phylogénétique Les colorants phylogénétiques sont en fait des oligonucléotides fluorescents dont la séquence est complémentaire de séquences signatures contenues dans les ARN ribosomiques 16S (procaryotes) et 18S (eucaryotes) [voir section 11.7]. Ces colorants phylogénétiques pénètrent dans la cellule et s’hybrident avec les ARNr directement au niveau des ribosomes (voir figure 11.4). Ces sondes phylogénétiques sont conçues aussi bien pour des espèces microbiennes que pour des domaines entiers d’organismes, c’est donc la séquence de la sonde qui détermine son niveau de spécificité. Cette technique de FISH, en fonction de la spécificité de la sonde, identifie ou suit un organisme particulier (ou un groupe d’organismes apparentés) dans un échantillon environnemental. Ces échantillons environnementaux peuvent aussi être traités par des sondes phylogénétiques multiples. L’utilisation d’une série de sondes, chacune étant conçue pour réagir avec un organisme particulier ou un groupe d’organismes et étant associée à un fluorochrome particulier, caractérise en détail un habitat microbien (voir figure 18.11). En combinant la technique de FISH avec la microscopie confocale à balayage laser (voir section 3.2), il est possible d’explorer les populations microbiennes dans l’épaisseur d’un échantillon et en particulier dans un biofilm (voir section 19.3 et figures 18.11 et 19.4). La technique de FISH n’est pas seulement employée en écologie microbienne, mais aussi pour l’identification de pathogènes spécifiques dans l’industrie agroalimentaire et les diagnostics cliniques.

La coloration du chromosome et transcription inverse in situ La coloration du chromosome et la transcription inverse in situ sont deux autres techniques dérivées du FISH. La première permet l’identification de gènes spécifiques dans une

(a)

Jiri Snaidr

Les sondes nucléiques sont des outils puissants pour l’identification et la quantification des organismes dans les milieux naturels. Une sonde nucléique est un oligonucléotide d’ADN ou d’ARN complémentaire d’une séquence d’un gène cible, et pouvant donc s’hybrider au gène cible (voir sections 7.7 et 11.7). Comme cela a été présenté dans la section 11.6, les sondes oligonucléotidiques peuvent être rendues fluorescentes par certains fluorochromes. Ces sondes fluorescentes sont alors utilisées pour identifier des organismes contenant une séquence d’acide nucléique complémentaire de celle de la sonde. Cette technique est nommée hybridation fluorescente in situ (fluorescent in situ hybridization, FISH, section 11.6), et trois applications différentes sont présentées ici.

David A. Stahl

18.4 Colorations génétiques m n

(b)

FIGURE 18.11 Analyse d’un échantillon d’eau d’égout par la technique du FISH. (a) Bactéries nitrifiantes dans un échantillon de boues de station d’épuration. En rouge, les bactéries ammonium-oxydantes (NH3 → NO2–) ; en vert, les bactéries nitriteoxydantes (NO2– → NO3–). Notez la proximité de ces deux types métaboliques, probablement pour permettre l’échange de NO 2– des producteurs (bactéries ammonium-oxydantes) vers les consommateurs (bactéries nitrites oxydantes). (b) Image en microscopie laser confocal d’un échantillon de boues de stations d’épuration. L’échantillon a été traité avec trois sondes oligonucléotidiques spécifiques, chacune associée à un fluorochrome différent (vert, rouge ou pourpre), et ciblant chacun un groupe différent de protéobactéries (l’une des lignées majeures dans le domaine des Bacteria) [chapitre 12]. Les cellules colorées en vert, rouge ou pourpre ont réagi avec seulement une sonde, tandis que les cellules colorées en bleu ou jaune ont réagi avec deux sondes pour donner ces différentes couleurs.

communauté d’un échantillon environnemental, la seconde cible des ARNm spécifiques (soit des gènes exprimés). La coloration du chromosome débute par le marquage fluorescent d’une sonde oligonucléotidique ou d’un gène entier, d’un ensemble de gènes, ou même d’un génome entier, digéré pour donner de petits fragments qui sont autant de sondes. Les sondes sont alors hybridées avec l’ADN d’organismes présents dans un échantillon (voir figure 18.12a). La coloration du chromosome est typiquement utilisée pour identifier des bactéries qui contiennent des gènes spécifiques, hautement conservés, tels que ceux codant la nitrogénase (responsable de la fixation de l’azote, section 17.28), ceux codant le centre réactionnel de la photosynthèse (voir section 17.4) ou encore ceux codant les voies métaboliques de l’autotrophie (fixation du CO2, sections 17.6 et 17.7). Le nombre de cellules fluorescentes dans l’échantillon examiné donnera une estimation du nombre de bactéries fixatrices d’azote, de bactéries phototrophes ou de bactéries autotrophes, selon le cas, qu’il contient. Contrairement à la coloration du chromosome, la transcription inverse in situ (in situ reverse transcription, ISRT) combinée au FISH est utilisée pour mesurer l’expression d’un ou de gènes dans un échantillon environnemental (voir figure 18.12b, c). La méthode implique une sonde s’hybridant avec un ARNm spécifique, transcrit au préalable par les cellules présentes dans un échantillon. Dès que la sonde réagit, la



618 Chapitre 18


Brian D. Lanoil

Contrôlez vos acquis Il existe toute une variété de méthodes utilisant des fluorochromes et basées sur les sondes nucléiques, et qui sont donc hautement spécifiques. Parmi elles, les colorations phylogénétiques, la coloration du chromosome, ou la transcription inverse couplée à l’hybridation fluorescente in situ (FISH). •

Quelle partie de la cellule est la cible des sondes fluorescentes dans la version phylogénétique de la technique de FISH ?

•

La coloration du chromosome et la technique ISRT FISH révèlent différents aspects de la biologie des cellules dans l’environnement. Expliquez.

•

Quelle technique basée sur la fluorescence utiliseriez-vous pour dénombrer les bactéries fixatrices d’azote dans un échantillon de sol ?

(a)

(b)

Feng Chen

Feng Chen

18.5 Utilisation de la PCR m n

(c)

FIGURE 18.12 Techniques de fluorescence utilisant la coloration du chromosome et la transcription inverse in situ (ISRT). (a) Coloration du chromosome. Mélange de cellules d’Escherichia coli (rouge) et d’Oceanospirillum linum (bleu). Chaque colorant fluorescent a été lié à des oligonucléotides d’ADN formés à partir de l’ADN génomique des deux organismes. En raison des différences de séquence significatives dans les génomes des deux organismes, les gènes ainsi marqués s’hybrident seulement avec l’ADN génomique de l’organisme correspondant. (b, c) ISRT. Les deux photographies montrent une culture mixte des bactéries Microbulbifer hydrolyticus (bâtonnets courts et épais) et Sagittula stellata (bâtonnets longs et minces). La transcription inverse (section 9.13) d’un ARNm spécifique produit uniquement par M. hydrolyticus conduit à la production d’un ADNc qui a été ultérieurement amplifié par PCR et hybridé avec une sonde fluorescente marquée. (b) Toutes les cellules ont été colorées au DAPI, un colorant non spécifique (voir figure 18.6). (c) Cellules colorées avec la sonde ISRT. Les données obtenues par ISRT sont utiles pour comprendre quels organismes d’une communauté microbienne réalisent une activité métabolique particulière.

transcription inverse (voir section 9.13) est réalisée pour produire un ADN complémentaire, qui est ensuite amplifié par PCR (voir section 7.9). L’ADN amplifié réagit alors avec une sonde fluorescente (voir figure 18.12b, c). La méthode ISRT FISH est particulièrement utilisée pour étudier les facteurs contrôlant l’expression des gènes dans les populations naturelles et observer l’effet de perturbations expérimentales d’un échantillon sur la transcription de gènes spécifiques.

Il n’est pas nécessaire pour toutes les études d’écologie microbienne d’isoler les organismes ou même de les quantifier ou de les identifier sous microscope en utilisant les colorations décrites dans les sections 18.3 et 18.4. En fait, il est possible d’étudier la biodiversité d’un habitat sans cultiver ou même observer les cellules. Dans ce but, des gènes spécifiques sont caractérisés pour apprécier la biodiversité d’une communauté microbienne. Le fondement de cette approche est le suivant. Les gènes spécifiques sont souvent liés à des organismes particuliers. Aussi, la détection d’un gène implique la présence de l’organisme. Les principales techniques employées dans ce type d’analyse des communautés microbiennes sont la réaction de polymérisation en chaîne (PCR), l’électrophorèse sur gel en gradient dénaturant (DGGE) ou le clonage moléculaire, le séquençage de l’ADN et l’analyse des séquences. En outre, les méthodes basées sur l’analyse du génome sont aussi employées pour déterminer la composition des communautés microbiennes.

PCR et analyse des communautés microbiennes Le principe de la PCR a été présenté au chapitre 7 (voir section 7.9). Les étapes principales sont : 1) deux amorces d’acide nucléique sont hybridées aux séquences complémentaires d’un gène cible, 2) l’ADN polymérase copie le gène cible et 3) des copies multiples du gène cible sont fabriquées suite à la répétition du cycle : dénaturation par la chaleur des brins complémentaires, accrochage des amorces, nouvelle synthèse (voir figure 7.28). À partir d’une copie unique d’un gène, plusieurs millions de copies sont fabriquées (voir figure 18.13). Quels sont les gènes cibles ? Le gène codant l’ARN ribosomique 16S est fréquemment amplifié. Comme cela a été vu précédemment, l’analyse des séquences des gènes codant l’ARNr 16S peut être utilisée pour déterminer les relations



18.5 Utilisation de la PCR 619 Communauté microbienne

Extraction de l’ADN ADN total de la communauté Amplification des gènes codant l’ARNr 16S à l’aide d’amorces générales ou spécifiques

PCR Échantillon 1 2 3 4

–

Ensemble des gènes codant l’ARNr 16S +

Excision des bandes et clonage des gènes codant l’ARNr 16S

Séquence Construction d’un arbre

Échantillon 1 2 3 4

Gènes différents codant l’ARNr 16S

Excision des bandes

DGGE

Bacillus subtilis Espèce inconnue de Bacillus Bacillus cereus

Séquence Construction d’un arbre

Bacillus megaterium Organisme Gram positif à faible GC inconnu Clostridium histolyticum Espèce inconnue de Clostridium

FIGURE 18.13 Étapes de l’analyse de la biodiversité d’une communauté microbienne par la technique de PCR. À partir de l’ADN total d’une communauté, les gènes codant l’ARNr 16S sont amplifiés en utilisant, dans cet exemple particulier, des amorces spécifiques des Bacteria Gram positif à faible GC (section 12.20). Les bandes obtenues sont excisées et séparées soit par clonage, soit par DGGE (voir figure 18.14 b). Notez comment, dans le gel obtenu par DGGE, les échantillons 1, 2 et 4 présentent une bande commune, tandis que les échantillons 2 et 3 contiennent chacun une bande unique. Après séquençage, un arbre phylogénétique est calculé. Notez que de nombreuses séquences ne correspondent pas à une séquence d’espèce connue, et correspondent donc à de nouvelles espèces qui attendent d’être isolées. De tels résultats sont très fréquents dans les analyses moléculaires des communautés, ce qui souligne le fait que de nombreux micro-organismes présents dans la nature n’ont pas encore été cultivés.

phylogénétiques existant entre des organismes disponibles en culture pure (voir section 11.5 et figure 11.13). De même, l’analyse des séquences des gènes 16S amplifiés à partir d’une communauté microbienne peut donner une image phylogénétique de cette communauté (voir figure 18.13). D’une autre façon, les gènes métaboliques codant des protéines spécifiques du métabolisme d’un organisme spécifique (ou d’un groupe d’organismes) peuvent aussi servir de gènes cibles. Cependant, en fonction du ou des gènes retenus pour l’amplification par PCR, la spécificité des amorces est essentielle. En

partant d’échantillons environnementaux comme source d’ADN, le choix des amorces est primordial par l’obtention de résultats de PCR clairs et interprétables sans ambiguïté. Lors de l’analyse classique d’une communauté, l’ADN total de la communauté est isolé d’un habitat microbien (voir figure 18.13). Des kits disponibles dans le commerce permettent l’obtention d’ADN très pur à partir de sols ou d’autres habitats complexes. L’ADN obtenu est en fait un mélange des ADN génomiques de tous les micro-organismes originellement présents dans l’habitat (voir figure 18.13). Le rôle de la PCR est de « pêcher » les gènes cibles dans ce mélange et d’en faire des copies en nombre suffisant pour l’analyse. La figure 18.13 montre la série d’étapes dans l’analyse moléculaire d’une communauté microbienne. Le résultat se présente sous forme de bandes contenant le gène cible sur un gel d’électrophorèse (voir figures 18.13 et 18.14). De manière idéale, une bande unique de taille appropriée doit apparaître (la taille du fragment d’ADN amplifié est déterminée par la distance entre les amorces) ; si le séquençage est le but final, les produits de PCR doivent d’abord être triés. Une des principales méthodes permettant de séparer les produits de PCR est l’électrophorèse sur gel en gradient dénaturant.

DGGE : séparation des gènes similaires L’amplification par PCR à partir de communautés microbiennes de l’environnement à l’aide d’un jeu d’amorces pour l’ARNr 16S produit typiquement une bande unique sur le gel d’électrophorèse qui contient des fragments amplifiés d’ADN, d’une seule taille (voir figures 18.13 et 18.14a). Cependant, malgré une pureté apparente, cette bande contient de nombreux gènes très voisins, mais non identiques. En fait, bien que les sites d’amorçage sur le gène cible soient très conservés, la séquence nucléotidique entre ces sites peut varier en fonction des divergences évolutives du gène cible dans les différentes espèces de l’organisme qui le contient. Aussi, si l’objectif est de séquencer les gènes amplifiés, comme pour les analyses phylogénétiques, une étape additionnelle est nécessaire pour séparer les différentes formes du gène, avant de les séquencer. Pour ce faire, l’une des possibilités est le clonage moléculaire (voir figure 18.13, section 10.15). Alternativement, on peut utiliser la DGGE, une méthode d’électrophorèse sur gel qui sépare les gènes qui ont une taille identique, mais qui diffèrent selon leur profil de dénaturation, qui dépend de leur séquence en nucléotides (voir figures 18.13 et 18.14b). La DGGE utilise un agent dénaturant de l’ADN, et, par exemple, un mélange d’urée et de formamide. Lorsqu’un fragment d’ADN double brin en migration dans le gel atteint une région contenant une concentration suffisante d’agents dénaturants, les brins commencent à « fondre », et la migration s’arrête à cet endroit (voir figures 18.13 et 18.14b). Les différences dans les propriétés de dénaturation sont essentiellement contrôlées par des différences de séquence. Ainsi, les différentes bandes observées dans un gel de DGGE correspondent aux différentes formes d’un gène donné dont les séquences varient, parfois très légèrement. Une fois effectuée la DGGE, les bandes obtenues peuvent être excisées et séquencées (voir figures 18.13 et 18.14). En utilisant, par exemple, les gènes de l’ARNr 16S, l’analyse en




2

3

4

5

6

7

8

(a) 1

2

3

4

5

6

7

8 Jennifer A. Fagg et Michael J. Ferris

1

Jennifer A. Fagg et Michael J. Ferris

620 Chapitre 18

(b) FIGURE 18.14 Analyses utilisant PCR et DGGE. La totalité de l’ADN d’une communauté microbienne a été isolée et amplifiée par PCR en utilisant des amorces spécifiques des gènes de l’ARNr 16S des Bacteria (a ; pistes 1 et 8). Les produits de PCR consistent en une bande unique, mais ces produits correspondent en fait à six gènes différents d’ARNr 16S, comme cela est montré par la DGGE (b ; pistes 1 et 8). Chacune de ces six bandes a été ensuite purifiée, réamplifiée par PCR (a ; pistes 2-7). Notez comme toutes les bandes sont situées au même niveau dans le gel de PCR (a), car bien qu’elles diffèrent dans leurs séquences, elles sont toutes de la même taille. Chaque bande des pistes 2-7 (b) peut aussi être séquencée et un arbre phylogénétique calculé (figure 18.13).

DGGE donne une description détaillée du nombre de phylotypes (les différents gènes d’ARNr 16S) présents dans un habitat (voir figure 18.14b). En séquençant ces bandes, les espèces réellement présentes dans la communauté peuvent être déterminées par comparaison des séquences obtenues avec celles des séquences d’espèces connues, présentes dans les bases de données appropriées (voir figure 18.13b). L’utilisation d’amorces spécifiques de gènes autres que l’ARNr 16S, par exemple des gènes du métabolisme, donne des informations sur les phylotypes présents dans la communauté et qui contiennent le gène particulier. Le nombre de bandes obtenues sur un gel de DGGE est un indice de la biocomplexité d’un habitat, en ce qui concerne un gène particulier (voir figures 18.13 et 18.14b).

Les résultats des analyses phylogénétiques utilisant la PCR Les analyses phylogénétiques des communautés microbiennes ont été améliorées pour permettre des analyses à la fois qualitatives (qui est présent ?) et quantitatives (combien y a-t-il d’organismes de chaque type ?). Ces analyses ont conduit aussi à des résultats surprenants. L’utilisation du gène de l’ARNr 16S comme gène cible a révélé que la plupart des communautés microbiennes contenaient plusieurs organismes phylogénétiquement différents dont les séquences d’ARNr ne correspondent à aucune séquence obtenue d’organismes cultivés en laboratoire (voir figures 18.13 et 18.14). En fait, dans de

nombreux cas, il apparaît que les membres les plus abondants d’une communauté sont des espèces qui ont défié la mise en culture au laboratoire. Ces résultats indiquent clairement que notre connaissance de la diversité microbienne déduite des cultures d’enrichissement est très incomplète, et que les biais induits par les enrichissements constituent un sérieux problème dans les études de biodiversité basées sur les cultures.

Contrôlez vos acquis La réaction de polymérisation en chaîne (PCR) peut être utilisée pour amplifier des gènes cibles tels que celui codant la petite sous-unité de l’ARNr ou des gènes importants du métabolisme. La technique de DGGE peut aussi être utilisée pour distinguer les différentes formes de ces gènes présents dans les différentes espèces présentes dans un échantillon. •

Pourquoi peut-on dire que la spécificité des amorces est essentielle pour l’analyse réussie de communautés microbiennes par PCR ?

•

Que peut-on conclure de l’analyse par PCR / DGGE d’un échantillon qui a donné une bande en PCR et une bande en DGGE ? une bande en PCR et quatre bandes en DGGE ?

•

Quels résultats surprenants ont été obtenus à la suite de nombreuses études moléculaires d’habitats naturels employant le gène de l’ARNr 16S comme gène cible ?

18.6 Écogénomique (métagénomique) m n La génomique environnementale ou métagénomique représente une approche plus large de l’étude moléculaire des communautés microbiennes. Dans cette approche, le séquençage aléatoire de la totalité de l’ADN cloné à partir d’une communauté microbienne (voir section 15.2) est utilisé pour révéler la totalité des gènes de cette communauté (voir figure 18.15). L’objectif de la génomique environnementale n’est pas de produire des séquences de génomes complètes et achevées, comme cela est fait dans le cas d’organismes cultivés (voir chapitre 15). L’idée est plutôt de détecter autant de gènes que possible qui codent des protéines identifiables et de déterminer à quel ensemble phylogénétique elles appartiennent. Ceci est obtenu en séquençant les régions qui chevauchent les gènes comptant des marqueurs phylogénétiques comme les gènes de l’ARNr 16S (voir figure 18.15). Il est aussi important de distinguer la génomique environnementale de l’analyse moléculaire des communautés, présentée dans la section précédente. Cette dernière approche est centrée sur la biodiversité d’un seul gène. Par contre, en génomique environnementale, tous les gènes d’une communauté microbienne – le métagénome – sont pris en compte, ce qui donne une image génétique beaucoup plus robuste de la communauté. Malgré l’échelle beaucoup plus grande et le coût de la génomique environnementale si on la compare avec l’analyse d’un



18.6 Écogénomique (métagénomique) 621 Communauté microbienne

Extraction de l’ADN ADN total de la communauté Échantillonnage Génomique de la communauté environnementale Amplification d’un gène particulier, par exemple le gène codant l’ARNr 16S séquençage, arbre phylogénétique

Digestion de l’ADN total par enzymes de restriction puis séquençage assemblage des séquences, annotation

Produits de l’analyse

Génomes

Ensemble des gènes de la communauté 1. Instantané phylogénétique 1. Identification de toutes de la plupart des membres les catégories de gènes de la communauté 2. Découverte de nouveaux 2. Identification de nouveaux gènes phylotypes 3. Attribution des gènes à des phylotypes particuliers Arbre phylogénétique

FIGURE 18.15 Analyse moléculaire des communautés microbiennes : comparaison des approches monogénique et métagénomique. Dans l’approche métagénomique, tout l’ADN de la communauté est séquencé. Cependant, l’assemblage et l’annotation ne sont pas réalisés jusqu’au stade du génome complet, comme c’est habituellement le cas pour les espèces identifiées (section 15.4). Aussi, les chromosomes reconstitués peuvent présenter de petites lacunes.

gène unique, l’approche métagénomique est de par sa conception d’une portée beaucoup plus grande. De plus, la métagénomique peut révéler des caractéristiques d’une communauté microbienne omises par une approche via un seul gène. Par exemple, l’étude métagénomique des procaryotes de la mer des Sargasses a révélé une énorme diversité auparavant ignorée par les analyses basées sur l’ARNr. La raison en est que tous les gènes d’ARN 16S ne sont pas amplifiés en utilisant les amorces universelles ou domaines spécifiques employés en PCR. Les gènes non amplifiés demeurent bien sûr non détectés. La génomique environnementale contourne ce problème en séquençant de manière aléatoire tout l’ADN d’une communauté, sans amplification préalable par PCR (voir figure 18.15). Tous les gènes sont séquencés, qu’ils soient amplifiables ou non.

Les potentialités de la métagénomique Parmi d’autres possibilités, la génomique environnementale peut détecter de nouveaux gènes dans des organismes connus et des gènes connus, dans de nouveaux organismes. Dans l’étude de la

mer des Sargasses par exemple, des gènes codant des métabolismes particuliers ont été parfois trouvés dans des génomes de groupes phylogénétiques dont on ne savait pas auparavant qu’ils pouvaient les posséder. Par exemple, les gènes codant l’ammonium mono-oxygénase, l’enzyme clé des Bacteria ammoniumoxydantes (voir sections 12.3 et 17.12), ont été trouvés au beau milieu d’Archaea. Aussi, bien que des Archaea ammoniumoxydantes n’aient jamais été décrites, la génomique environnementale a montré qu’elles existaient très vraisemblablement. Dans un autre exemple, les gènes codant la protéorhodopsine, une pompe à protons photo-dépendante de certaines protéobactéries (voir section 13.3), se sont révélés être liés à de nouveaux groupes phylogénétiques de la mer des Sargasses. Aucune culture de ces organismes n’ayant été obtenue à ce jour, le lien entre ce type de métabolisme et ces groupes particuliers n’aurait pas pu être suspecté. Ces exemples montrent comment la génomique environnementale offre une nouvelle approche à l’écologie microbienne pour explorer la diversité microbienne comme les autres approches ne le permettent pas. La génomique environnementale est un outil puissant pour déterminer à la fois la diversité phylogénétique et la diversité métabolique des communautés microbiennes, toutes deux constituant des objectifs majeurs de l’écologie microbienne. Cependant, en plus du séquençage aléatoire de génomes complets, des approches plus ciblées sont possibles. Elles comprennent en particulier l’utilisation des micropuces pour inventorier l’expression des gènes dans une communauté microbienne (voir section 15.11). L’utilisation des micropuces permet de mesurer l’effet de paramètres environnementaux sur la transcription de composants individuels de la communauté, ou même de la communauté entière, selon la manière dont la micropuce a été conçue.

Contrôlez vos acquis La génomique environnementale implique le séquençage aléatoire et l’analyse de l’ensemble des génomes des organismes présents dans une communauté microbienne. •

Qu’est-ce qu’un métagénome ?

•

En quoi les approches de génomique environnementale sont-elles différentes de l’analyse des communautés microbiennes, telles que celles basées sur l’analyse des gènes de l’ARNr 16S ?

III

MESURES DE L’ACTIVITÉ MICROBIENNE DANS L’ENVIRONNEMENT

Ce chapitre a pour l’instant porté sur la biodiversité. Il se poursuit par les mesures d’activité microbienne, en utilisant : 1) les Radio-isotopes, 2) les microélectrodes, et 3) les isotopes stables. Les mesures d’activité dans un échantillon naturel constituent une estimation globale pour l’ensemble de la communauté, bien que l’une des techniques employées, FISH-MAR, permette des mesures plus ciblées. Cependant, les mesures



622 Chapitre 18


d’activité bien conduites révèlent à la fois les types et les taux des réactions métaboliques principales se produisant dans un habitat. Avec l’estimation de la biodiversité, ces paramètres définissent l’écologie microbienne d’un habitat. Ils apportent aussi des informations importantes pour la conception des milieux de culture d’enrichissement.

18.7 Radio-isotopes et microélectrodes m n

Lactate ou H2S

Réduction du sulfate H2S

Lactate (a)

Temps

Incorporation de 14CO2

Dans de nombreux cas, la mesure chimique directe des transformations microbiennes est suffisante pour établir les activités microbiennes existant dans un environnement. Par exemple, le devenir de l’oxydation du lactate par les bactéries sulfato-réductrices dans un sédiment peut être suivi facilement. Le lactate est consommé, et l’ion SO42– est réduit en H2S (voir figure 18.16a). Toutes ces substances sont faciles à mesurer par des méthodes chimiques. Cependant, lorsqu’une très forte sensibilité est souhaitée, lorsque le taux de renouvellement (turn over) doit être déterminé, lorsque le devenir d’une partie de la molécule doit être connu, les radio-isotopes sont très utiles. Par exemple, si la photoautotrophie doit être mesurée, l’entrée photodépendante du 14CO2 dans la cellule peut être mesurée (voir figure 18.16b). Si l’on s’intéresse à la réduction des sulfates, le taux de conversion de 35SO42– en H235S peut être déterminé (voir figure 18.16c). L’activité chimio-organotrophe se détermine facilement en mesurant la libération de 14CO2 à partir de composés organiques marqués au 14C (voir figure 18.16d) et ainsi de suite.

(b)

Présence de H2 Présence de H2

(c)

Temps

Évolution de 14CO2

H235S

Réduction du sulfate

(d)

Photosynthèse Lumière

Obscurité Temps

Respiration de 14C-glucose

Témoin formolé (cellules tuées) Temps

FIGURE 18.16 Mesures d’activités microbiennes. (a) Mesure des concentrations en lactate et H 2S pendant la réduction des sulfates. (b-d) Utilisation de radio-isotopes. (b) Mesure de la photosynthèse dans de l’eau de mer avec du 14CO2. (c) Mesure de la réduction des sulfates dans de la boue en utilisant du 35 SO42–. (d) Production de 14CO2 à partir de 14C-glucose.

L’utilisation des isotopes est très répandue en écologie microbienne. Toutefois, il est nécessaire d’employer des témoins appropriés, car quelques transformations de composés marqués peuvent être dues à un processus strictement chimique ; la solution ici est le témoin mort. Il est absolument nécessaire de savoir que la transformation à mesurer est rendue impossible par un traitement chimique ou thermique, qui soit bloque l’action des micro-organismes, soit les tue. Le formol, à une concentration de 4 %, est fréquemment utilisé comme stérilisant chimique lors des études d’écologie microbienne. Cette concentration de formol tue toutes les cellules, et les transformations de molécules marquées qui se produisent en sa présence sont donc le résultat de processus non biologiques (voir figure 18.16d).

Combinaison FISH et radio-isotopes : FISH-MAR Les radio-isotopes peuvent être utilisés pour mesurer l’activité microbienne à l’échelle microscopique dans une technique nommée microautoradiographie (MAR). Dans cette méthode, les cellules issues d’une culture pure ou d’une communauté microbienne sont mises en présence d’un radio-isotope tel qu’un composé organique pour les chimio-organotrophes, ou le CO2 pour les autotrophes. À la suite de la mise en contact, les cellules sont fixées sur une lame de verre qui est recouverte d’une émulsion photographique. Après incubation à l’obscurité, les substances radioactives incorporées impressionnent les grains d’argent de l’émulsion qui, après révélation, apparaissent comme des points noirs à l’intérieur et autour des cellules (voir figure 18.17a). Cette technique de MAR peut être combinée avec le FISH (voir section 18.4), devenant alors le FISH-MAR, une technique performante combinant l’identification et la mesure d’activité. FISH-MAR à la fois repère les organismes qui, dans un environnement particulier, métabolisent une substance particulière (marquée, MAR) et les identifie (FISH) [voir figure 18.17b]. FISHMAR va donc au-delà de la simple identification. Cette technique donne également une information utile sur les composés euxmêmes, information utile non seulement pour comprendre l’activité de l’écosystème microbien, mais aussi pour mieux choisir les milieux de culture d’enrichissement. La connaissance des organismes qui métabolisent un substrat particulier peut servir à mettre au point un protocole d’enrichissement spécifique.

Les microélectrodes Les écologistes microbiens utilisent également de petites électrodes de verre nommées microélectrodes, pour étudier l’activité des micro-organismes dans la nature. Les microélectrodes les plus utiles sont celles qui mesurent pH, oxygène, N2O, CO2, H2 ou H2S. Comme leur nom l’indique, les microélectrodes sont très petites, la pointe mesurant de 2 à 100 µm (voir figure 18.18a). Ces électrodes doivent être soigneusement insérées dans l’échantillon, millimètre (ou moins) par millimètre, de manière à suivre l’activité microbienne à l’échelle microenvironnementale (voir figure 18.18b). Les microélectrodes ont été intensément utilisées pour l’étude des activités microbiennes, comme la photosynthèse dans les tapis bactériens. Les tapis bactériens sont en fait des communautés microbiennes disposées en couches et contenant classiquement des cyanobactéries dans les couches supérieures, des



18.7 Radio-isotopes et microélectrodes 623

Michael Wagner, Kilian Stöcker, et Holger Daims

Platine

David M. Ward

Verre

(a) Or

(b)

Michael Wagner, Per Nielsen, et Natuscka Lee

Michael Wagner, Per Nielsen, et Natuscka Lee

5 µm

(c)

FIGURE 18.17 Couplage FISH-microautoradiographie. Hybridisation fluorescente in situ (FISH) combinée à la microautoradiographie (MAR). (a) Une cellule filamenteuse non cultivée appartenant à la subdivision gamma des protéobactéries (selon l’analyse en FISH) révèle son autotrophie (incorporation de 14 CO2 démontrée par MAR). Les émissions radioactives impressionnent l’émulsion photographique, générant des points noirs. (b) Incorporation de 14C-glucose par une culture en mélange d’Escherichia coli (cellules jaunes) et Herpetosiphon aurantiacus (cellule filamenteuse, verte). (c) MAR du même champ microscopique que celui montré en (b). Les molécules radioactives incorporées impressionnent le film et montrent que le glucose a été assimilé par les cellules d’E. coli, mais pas par celles de H. aurantiacus.

bactéries phototrophes anoxygéniques dans les couches sousjacentes (jusqu’à ce que la lumière ne pénètre plus suffisamment) et enfin des chimio-organotrophes, surtout des bactéries sulfato-réductrices dans les couches les plus inférieures (voir figures 18.18b et 18.19). Les tapis microbiens existent dans de nombreux environnements, particulièrement les sources chaudes (voir figure 18.19) et les zones intertidales. En utilisant des microélectrodes à O2, les concentrations en oxygène dans les tapis bactériens (voir figure 18.19b) ou les sols (voir figure 19.2) peuvent être mesurés avec précision à de très petits intervalles. Un micromanipulateur est employé pour enfoncer progressivement l’électrode dans l’échantillon de telle façon que des mesures puissent être faites tous les 0,050,1 mm (voir figures 18.18b et 18.19b). En utilisant une série de microélectrodes, chacune sensible à un paramètre différent,

(a)

(b)

FIGURE 18.18 Microélectrodes. (a) Représentation schématique d’une microélectrode à oxygène. La pointe de platine fonctionne comme une cathode et, lorsqu’elle est sous tension, O2 est réduit en H2O, ce qui produit un courant. Le courant résultant de la réduction du CO2 à la surface en or de la cathode est proportionnel à la concentration en oxygène dans l’échantillon. Remarquez la dimension de l’électrode. (b) Utilisation des microélectrodes pour l’étude de tapis bactériens (voir figure 18.19a).

des mesures simultanées de plusieurs transformations microbiennes peuvent être réalisées. Par exemple, des mesures d’oxygène et de sulfure sont fréquemment réalisées ensemble, car les gradients de ces composés dans de nombreux écosystèmes microbiens résultent de la photosynthèse et de la réduction de sulfates (voir figure 18.18b). Près de la zone où O2 et H2S commencent à se mélanger, l’activité intense des bactéries phototrophes et des bactéries sulfo-oxydantes chimiolithotrophes (voir sections 12.2 et 12.4) consomme ces deux substrats, au moins jusqu’aux limites de détection des microélectrodes (voir figure 18.19b). Les microélectrodes étant employées comme outil expérimental, si l’on perturbe l’écosystème alors que les microélectrodes sont en place, en ajoutant un composé organique ou en ombrageant le tapis bactérien, on peut mesurer les effets induits par ces perturbations sur la production ou la consommation de composés, et ce en temps réel. Avec de telles études, on déduit les types d’interactions microbiennes qui se déroulent dans un milieu particulier. On pose aussi des questions spécifiques, dont les réponses sont obtenues expérimentalement. De cette façon, il devient possible de modéliser in situ le métabolisme d’un environnement microbien.

Contrôlez vos acquis L’activité des micro-organismes dans les échantillons environnementaux peut être établie avec grande précision en utilisant des radio-isotopes et/ou des microélectrodes. Dans la plupart des cas, les mesures donnent une activité globale de la communauté plutôt que celle d’une espèce particulière.



624 Chapitre 18


•

Pourquoi les radio-isotopes sont-ils utiles pour mesurer les activités microbiennes ?

•

Que signifie l’acronyme MAR et comment sont détectées les réactions de MAR ?

•

Expliquez comment fonctionnent les microélectrodes.

18.8 Isotopes stables m n Pour de nombreux éléments chimiques, il existe plusieurs isotopes, différents les uns des autres par le nombre de neutrons. Certains isotopes sont instables et se désintègrent. D’autres nommés isotopes stables ne sont pas radioactifs, mais sont métabolisés différentiellement par les micro-organismes. Les isotopes stables sont employés pour étudier de nombreuses transformations microbiennes dans la nature.

Deux éléments se sont révélés très utiles pour les études utilisant les isotopes stables en écologie microbienne : le carbone et particulièrement CO2, et le soufre sous les formes SO42– et H2S. Le carbone existe dans la nature essentiellement sous forme de 12C, mais il existe aussi une petite quantité (environ 5 %) de 13C. De la même façon, le soufre existe surtout sous forme de 32S, mais il existe de petites quantités de 34 S. L’abondance naturelle de ces isotopes dans un composé donné change lorsque C ou S sont métabolisés par un organisme, car les réactions biochimiques favorisent l’isotope le plus léger. Par conséquent, l’isotope le plus lourd est relativement discriminé négativement par rapport au plus léger lorsqu’un composé est métabolisé par des enzymes (voir figure 18.20). Par exemple, lorsqu’un organisme phototrophe se nourrit de CO2, le carbone cellulaire devient enrichi en 12C et épuisé en 13C, par rapport à du carbone standard. De la même façon, le sulfure produit lors de la réduction bactérienne du sulfate est plus « léger » que le sulfure produit de manière abiotique. Ce processus, connu sous le nom de fractionnement isotopique (voir figure 18.20), est un phénomène biologique unique et peut être employé pour déterminer si une transformation particulière est d’origine microbienne ou non.

David M. Ward

L’utilisation du fractionnement isotopique en écologie microbienne

Profondeur

(a) pH

O2

La composition isotopique d’un échantillon contient l’enregistrement de son activité biologique passée. Dans le cas du carbone, les plantes et le pétrole (qui provient de matériel végétal) ont les mêmes compositions isotopiques. Le carbone de ces deux sources est isotopiquement plus léger qu’un standard non biologique, car il a été fixé en temps que CO2 par une voie métabolique discriminante vis-à-vis du 13C (voir figure 18.21). De plus, le méthane d’origine microbienne est extrêmement léger, indiquant que les Archaea méthanogènes (voir section 13.4) sont négativement discriminantes vis-à-vis du 13 C. En contraste, les carbonates marins ont clairement une origine abiotique (voir figure 18.21). En raison des différences

0 1

H2S

2

Substrats de l’enzyme

Enzyme fixant le CO2

Carbone fixé

3 6

7

8

9

pH 0 (b)

200

400

600

12CO 2 12C

800

1 000

O2 ou H2S (µM)

FIGURE 18.19 Utilisation des microélectrodes pour l’étude des tapis microbiens. (a) Photographie d’une carotte prélevée au travers d’un tapis microbien d’une source chaude, comme celle analysée en (b). La couche supérieure (vert foncé) contient des cyanobactéries (section 12.25), au-dessous desquelles on trouve plusieurs couches de bactéries phototrophes anoxygéniques (orange), essentiellement du genre Chloroflexus (section 12.35). L’épaisseur totale du tapis est d’environ 2 cm. (b) Microprofils d’oxygène, d’hydrogène sulfuré et du pH dans un tapis microbien d’une source chaude. Notez l’échelle en mm en ordonnées.

13CO

2

13C

FIGURE 18.20 Mécanisme de fractionnement isotopique dans le cas du carbone. Bien que le rapport des abondances naturelles des isotopes 12C et 13C du carbone soit d’environ 19 pour 1, les enzymes qui fixent le CO 2 fixent de préférence l’isotope le plus léger (12C). Ceci conduit à un carbone fixé enrichi en 12C et appauvri en 13C par rapport au substrat initial. Le degré d’appauvrissement en 13C est dénommé fractionnement isotopique (voir la légende de la figure 18.21 pour le calcul). La taille des flèches indique l’abondance relative de chaque isotope du carbone.



18.8 Isotopes stables 625

dans les proportions de 12C et de 13C dans le carbone d’origine biologique et non biologique, le rapport 13C/12C mesuré dans les couches géologiques a été utilisé pour détecter le début des processus biologiques dans les roches anciennes. Il est intéressant de noter que le carbone organique présent dans des roches âgées de 3,5 milliards d’années montre un certain fractionnement (voir figure 18.21), ce qui est en faveur de l’existence de la vie à cette époque. Les activités des bactéries sulfato-réductrices dans la nature sont aisément reconnaissables à partir du fractionnement du 34 32 S/ S (voir figure 18.22). Comparés à un sulfure standard, les sulfures des sédiments sont très enrichis en 32S, tandis que les sulfures non biogéniques (par exemple, dans les roches ignées des dépôts volcaniques) sont significativement plus lourds (voir figure 18.22). Le fractionnement a pour but de contrôler ces parties importantes du cycle du soufre et de retracer les activités des procaryotes du cycle du soufre au cours des temps géologiques. L’analyse des isotopes du soufre a aussi été utilisée pour démontrer l’absence de vie sur la lune. Par exemple, la figure 18.22 montre que la composition isotopique des sulfures des roches lunaires est très proche de celle des sulfures standard, et pas des sulfures biogéniques. L’analyse des isotopes de l’oxygène (18O/16O) a été employée pour déterminer la transition de la Terre d’un environnement anoxique à un environnement oxygéné, car l’oxygène moléculaire de la Terre a pour origine la photosynthèse

Carbonate marin

oxygénique des cyanobactéries (voir section 11.11). Grâce à cet outil, il a été possible de montrer que la Terre s’est oxygénée seulement très progressivement et que les concentrations actuelles d’oxygène ne sont effectives que depuis environ 750 millions d’années (voir section 11.13 et figure 11.8).

Épilogue Ces techniques, présentes dans la boîte à outils de l’écologiste microbien étant comprises, il est possible d’explorer la discipline qu’est l’écologie microbienne (voir chapitre 19). La composition des communautés microbiennes et leurs activités dans la nature seront abordées. Dans de nombreux cas, un ou plusieurs de ces outils décrits dans ce chapitre seront employés pour illustrer les principes importants et identifier les espèces microbiennes les plus actives dans des communautés microbiennes fortement diversifiées.

Contrôlez vos acquis Le fractionnement isotopique révèle l’origine biologique de nombreuses substances. Le fractionnement résulte de l’activité des enzymes qui ont une discrimination négative vis-à-vis de la forme la plus lourde d’un élément, lorsqu’elles se fixent à leurs substrats. •

Comment le rapport 12C/13C d’une substance peutil révéler sa possible origine biologique ?

•

Quelle est l’explication la plus simple pour la teneur des sulfures lunaires en isotopes lourds ?

CO2 atmosphérique Plantes utilisant le cycle de Calvin Roches ignéees

Pétrole

Méthane

Sulfates marins Sulfures sédimentaires

Cyanobactéries

Sulfures de météorites

Bactéries pourpres sulfureuses

Sulfures lunaires


Sulfures de boues marines

Sédiments marins récents

Soufre élémentaire

Roches âgées de 3,5 milliards d’années – 80

– 70

– 60

– 50

– 40 δ

– 30

13

– 20

– 10

0

+ 10

12

– 20

13

12

( C ⁄ C échantillon ) – ( C ⁄ C standard ) ---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- × 1000 13 12 ( C ⁄ C standard ) Le standard utilisé est un échantillon de belemnite d’une formation rocheuse nommée PeeDee Rock. Notez que le carbone fixé par les organismes autotrophes est enrichi en 12 C et appauvri en 13C.

– 10

0 δ

C ( /00)

FIGURE 18.21 Compositions isotopiques de composés carbonés. Les valeurs sont données en partie par millier ( ‰) et calculées selon la formule : 13

– 30

0

34

10

20

30

0

S ( /00)

FIGURE 18.22 Géochimie isotopique du soufre : composition isotopique de composés soufrés. Les valeurs sont données en partie par millier (‰) et calculées selon la formule : 34

32

34

32

( S ⁄ S échantillon ) – ( S ⁄ S standard ) ---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- × 1000 34 32 ( S ⁄ S standard ) Le standard utilisé est un sulfure de fer provenant d’une météorite du Canyon Diablo. Notez que les sulfures et le soufre d’origine biogénique ont tendance à être appauvris en 34S (enrichis en 32S).



626 Chapitre 18


QUESTIONS 1. Quel est le principe de la technique de culture d’enrichissement ? Pourquoi un milieu d’enrichissement est-il habituellement convenable pour l’enrichissement de seulement un groupe particulier de bactéries (voir section 18.1) ? 2. Quel est le principe de la colonne de Winogradsky et quels types d’organismes permet-elle d’enrichir ? Comment une colonne de Winogradsky peut-elle être utilisée pour l’enrichissement d’organismes présents dans un environnement extrême, tel un tapis bactérien d’une source chaude (voir section 18.1) ? 3. Décrivez le principe de la méthode de NPP pour dénombrer les bactéries dans un échantillon (voir section 18.2). 4. Pourquoi la méthode des pinces optiques est-elle supérieure aux méthodes de dilution et d’enrichissement en milieu liquide pour isoler un organisme présent en petit nombre dans un échantillon (voir section 18.2) ? 5. Comparez et distinguez l’utilisation des colorants fluorescents et des anticorps fluorescents pour le dénombrement des bactéries dans les milieux naturels. Quels sont les avantages et limites de chaque méthode (voir section 18.3) ? 6. En écologie microbienne, les sondes nucléiques peuvent-elles être aussi sensibles que les méthodes de culture ? Quels sont les avantages des méthodes basées sur les acides nucléiques sur les méthodes de culture ? Quels sont les inconvénients (voir section 18.4) ? 7. Quel est le principe de la coloration du chromosome ? En quoi pourrait-il s’agir d’une bonne méthode pour dénombrer des

micro-organismes capables de réaliser un processus métabolique particulier dans un habitat (voir section 18.4) ? 8. Qu’est-ce que la protéine verte fluorescente ? En quoi une cellule fluorescente verte est-elle différente d’une cellule rendue fluorescente par un colorant phylogénétique (voir section 18.4) ? 9. Comment obtenir une image phylogénétique d’une communauté microbienne sans cultiver ses habitants (voir section 18.5) ? 10. Après une amplification par PCR de l’ADN de toute une communauté, pourquoi est-il en général nécessaire de procéder à un clonage ou d’effectuer une DGGE sur les produits d’amplification avant de les séquencer (voir section 18.5) ? 11. Donnez un exemple montrant comment la génomique environnementale a permis la découverte d’un métabolisme connu dans un nouvel organisme (voir section 18.6). 12. Quels sont les avantages majeurs des méthodes utilisant les radio-isotopes en écologie microbienne ? Quels types de témoins (en citer au moins deux) doit-on inclure dans une expérience utilisant les radio-isotopes et destinée à montrer l’incorporation de 14CO2 par des bactéries phototrophes, ou la réduction de 35SO42– par des bactéries sulfato-réductrices (voir section 18.7) ? 13. Quelle information la technique de FISH-MAR peut-elle donner, et que la technique FISH seule ne peut pas (voir section 18.7) ? 14. Les organismes autotrophes contiennent-ils plus ou moins de 12 C que le CO2 dont ils se nourrissent (voir section 18.8) ?

PROBLÈMES 1. Quel est l’enrichissement pour les bactéries nitrifiantes décrit dans le tableau 18.1 ? Pourquoi chacune des ressources et des conditions est-elle nécessaire ? (Revoir si nécessaire les sections 12.3 et 17.12 avant de répondre.) 2. Concevez une expérience pour mesurer l’activité de bactéries sulfo-oxydantes dans le sol. Si seulement quelques espèces de bactéries sulfo-oxydantes sont métaboliquement actives, comment le déterminer ? Comment prouver que l’activité mesurée est due à un processus biologique ? 3. Vous voulez savoir si des Archaea existent dans un échantillon de l’eau d’un lac, mais vos essais de culture sont infructueux. En utilisant les techniques décrites dans ce chapitre, pouvez-vous déterminer si des Archaea existent dans l’échantillon, et si oui, quelle proportion des cellules du lac correspond à des Archaea ?

4. Vous voulez savoir si des organismes sont capables de croissance autotrophe en utilisant le cycle de Calvin et sont présents dans divers échantillons de sol (voir section 17.6). Cette voie métabolique nécessite une enzyme particulière, la ribulose biphosphate carboxylase (RubisCO). Décrivez deux méthodes pour résoudre le problème, l’une microscopique, l’autre n’utilisant ni microscopie, ni culture. 5. En concevant une expérience, déterminez le taux de méthanogenèse (CO2 + 4 H2 → CH4 + H2O) dans les sédiments anoxiques d’un lac, et si la méthanogenèse est ou non limitée par H2. Déterminez la morphologie des méthanogènes dominants (Archaea, section 13.4). Enfin, calculez le pourcentage des méthanogènes dominants parmi toutes les Archaea et parmi toute la population procaryotique des sédiments.



CHAPITRE DIX-NEUF

Écologie microbienne

Dans la nature, les microorganismes interagissent entre eux, ainsi qu’avec les plantes et les animaux. La photographie illustre une association bénéfique entre la fougère aquatique Azolla et des cyanobactéries symbiotes fixatrices d’azote du genre Anabaena, dont les cellules vivent dans des cavités à l’intérieur des feuilles de la plante.

I

Écosystèmes microbiens

628

19.1 19.2 19.3

Populations, guildes, communautés Environnements et microenvironnements Croissance microbienne sur les surfaces et biofilms

628 629 631

II

Habitats microbiens du sol et des eaux douces 633

19.4 19.5

Environnements terrestres Environnements d’eaux douces

633 637

III

Microbiologie marine

638

19.6 19.7 19.8

Habitats marins et distribution des microorganismes Microbiologie abyssale Sources hydrothermales

639 640 643

IV

Cycles du carbone et de l’oxygène

646

19.9 Cycle du carbone 19.10 Syntrophie et méthanogenèse 19.11 Cycle du carbone chez les ruminants

V

646 648 651

Autres cycles biogéochimiques majeurs 655

19.12 Cycle de l’azote 19.13 Cycle du soufre 19.14 Cycle du fer

655 657 658

VI

661

Bioremédiation microbienne

19.15 Biolixiviation des minerais 19.16 Le mercure et les transformations des métaux lourds 19.17 Biodégradation du pétrole 19.18 Biodégradation des xénobiotiques

661 664 665 667

VII

Interactions entre plantes et microorganismes 670

19.19 19.20 19.21 19.22

L’environnement des plantes Lichens et mycorhizes Agrobacterium et la maladie du crown gall Association symbiotique des bactéries des nodosités racinaires chez les Légumineuses

670 671 673 676



628 Chapitre 19


GLOSSAIRE Acides gras volatiles (volatile fatty acids, VFA) Principaux acides gras (acétate, propionate et butyrate) produits par fermentation dans le rumen. Anoxique (anoxic) Voir chapitre 17. Bactéroïde (bacteroid) Cellules déformées de Rhizobium présentes dans les nodosités racinaires chez les légumineuses et capables de fixer l’azote atmosphérique. Barotolérant (barotolerant) Organisme pouvant croître sous pression hydrostatique élevée, mais moins bien qu’à la pression atmosphérique. Biofilm (biofilm) Colonies de cellules microbiennes fixées sur une surface et enfouies dans une couche muqueuse. Biogéochimie (biogeochemistry) Étude des transformations chimiques réalisées par des organismes vivants. Biolixiviation (microbial leaching) Récupération de métaux d’intérêt économique comme le cuivre à partir de minerais, grâce à l’activité de micro-organismes. Bioremédiation (bioremediation) Nettoyage par des microorganismes de milieux pollués par des hydrocarbures, des métaux ou autres polluants. Cométabolisme (cometabolisme) Métabolisme d’un composé en présence d’un second composé organique utilisé comme source d’énergie primaire. Cordon d’infection (infection thread) Lors de la formation du primordium nodulaire, tube cellulosique au travers duquel les cellules de Rhizobium passent pour atteindre et infecter les cellules du cortex racinaire. Déchloration réductrice (reductive dechlorination) Retrait de chlore sous forme de Cl– d’un composé organique par réduction de l’atome de carbone de C-Cl en C-H. Demande biologique en oxygène, DBO (biochemical oxygen demand, BOD) Quantité d’oxygène nécessaire aux micro-organismes pour oxyder la matière organique présente dans un échantillon d’eau. Dénitrification (denitrification) Voir chapitre 17. Écosystème (ecosystem) Voir chapitre 1. Effluent minier acide (acide mine drainage) Eau acide contenant de l’acide sulfurique provenant de l’oxydation microbienne de minerais contenant des sulfures de fer. Fixation d’azote (nitrogen fixation) Réduction microbienne de N2 en NH3.

L

es micro-organismes ne sont pas seuls dans la nature. Chaque micro-organisme, dans un écosystème, interagit avec tout ce qui l’entoure et avec les autres organismes. Ces interactions peuvent mener à d’importantes modifications physiques et chimiques de l’environnement, modifications bénéfiques ou défavorables aux autres organismes. Qu’elles soient néfastes, bénéfiques ou sans effet, les activités collectives des micro-organismes contrôlent en grande partie le fonctionnement de la biosphère. Dans ce chapitre, les activités microbiennes essentielles seront examinées. Nous aborderons tout d’abord les écosystèmes microbiens en général, puis certains environnements particuliers seront explorés : sols, eaux douces, océans. Ensuite, des processus majeurs en écologie microbienne seront abordés et en particulier les cycles biogéochimiques qui sont à la base de la vie végétale sur Terre. Enfin, quelques interactions entre les microorganismes et les plantes ou les animaux seront présentées.

Fumeur noir ou cheminée hydrothermale (black smoker) Dans une source hydrothermale océanique, édifice minéral d’où s’échappe le fluide hydrothermal surchauffé (250-350 °C). Guilde (guild) Population de micro-organismes métaboliquement apparentés. Leghémoglobine (leghemoglobin) Protéine se liant à l’oxygène dans les nodules racinaires. Lichen (lichen) Association symbiotique d’un champignon et d’une algue (ou une cyanobactérie). Microenvironement (microenvironment) Environnement immédiat (à l’échelle micrométrique) d’une ou d’un ensemble de cellules microbiennes. Mycorhizes (mycorrhizae) Association symbiotique entre un champignon et les racines d’une plante. Nitrification (nitrification) Voir chapitre 17. Nodosité racinaire (root nodule) Excroissance ressemblant à une tumeur et localisée au niveau des racines d’une plante ; renferme les cellules symbiotiques fixatrices d’azote. Oxygéné (oxic) Environnement contenant de l’oxygène et donc un E’0 élevé. Plasmide Ti (Ti plasmid) Plasmide conjugatif présent chez la bactérie Agrobacterium tumefaciens, pouvant transférer des gènes aux plantes. Producteur primaire (primary producer) Organisme utilisant la lumière pour synthétiser de la matière organique à partir de CO2. Protéorhodpsine (proteorhodopsin) Protéine photo-sensible présente chez certaines bactéries des milieux pélagiques et catalysant la formation d’ATP. Pyrite (pyrite) Minerai commun, contenant du fer (FeS2). Rhizosphère (rhizosphere) Région immédiatement adjacente aux racines des plantes. Rumen ou panse (rumen) Première cavité dans l’estomac multiple des ruminants, où se produit la digestion de la cellulose. Source hydrothermale (hydrothermal vent) Émission de fluide surchauffé au niveau du plancher océanique. Syntrophie (syntrophy) Voir chapitre 17. Xénobiotique (xenobiotic) Produit totalement synthétique qui n’existe pas naturellement dans l’environnent.

I

ÉCOSYSTÈMES MICROBIENS

19.1 Populations, guildes, communautés m n Dans la nature, les cellules microbiennes se divisent pour former des populations. Des populations proches du point de vue métabolique sont appelées des guildes, et les guildes interagissent au sein des communautés microbiennes (voir figure 19.1). À leur tour, les communautés microbiennes interagissent avec les communautés de macro-organismes et l’environnement, constituant ainsi l’écosystème complet. L’énergie entre dans les écosystèmes sous forme de lumière, de carbone organique et de substances inorganiques réduites. La lumière est utilisée par les phototrophes (voir sections 17.117.5) pour synthétiser de la matière organique nouvelle (voir



19.2 Environnements et microenvironnements 629

Communauté 1 Zone photique Phototrophes oxygéniques 6 CO2 + 6 H2O C6H12O6 + 6 O2

Communauté 2 Zone oxygénée Aérobies et aérobies facultatifs C6H12O6 + 6 O2 6 CO2 + 6 H2O

Communauté 3 (sédiments) Zone anoxique : bactéries fermentatives et autres anaérobies CH4) 1. Guilde 1 : Archaea méthanogènes (CO2 bactéries homoacétogènes (CO2 acétate) 2. Guilde 2 : bactéries sulfato-réductrices (SO42– H2S) bactéries soufre-réductrices (SO0 H2S) 3. Guilde 3 : bactéries dénitrifiantes (NO3– N2) bactéries ferro-réductrices (Fe3+ Fe2+) 4. Guilde 4 : bactéries fermentatives (fermentation des sucres, acides aminés, acides gras, etc.)

FIGURE 19.1 Populations, guildes et communautés – un exemple de structure d’une communauté microbienne dans un écosystème lacustre. Les communautés microbiennes sont constituées de populations de cellules appartenant à différentes espèces. La figure illustre les différentes communautés présentes dans un écosystème lacustre. Les principales guildes sont indiquées pour les communautés du sédiment. Les réductions de CO2, SO42–, S0, NO3– et Fe3+ sont des exemples de respirations anaéobies (voir sections 17.13-17.18).

figure 19.1) formée de carbone, mais aussi d’azote, de soufre, de phosphore, de fer et d’autres éléments. Ce matériel organique néosynthétisé, ainsi que la matière organique allochtone qui entre dans l’écosystème, pilote les activités métaboliques des chimio-organotrophes. Quant aux chimiolithotrophes, ils obtiennent leur énergie de donneurs d’électrons inorganiques tels que H2, Fe2+, S0, ou NH3 (voir chapitre 17).

Les cycles biogéochimiques Les micro-organismes jouent un rôle important dans le recyclage de plusieurs éléments dans l’environnement, et en particulier le carbone, le soufre, l’azote et le fer. L’étude de ces transformations chimiques est l’objet de la biogéochimie. Un cycle biogéochimique décrit les transformations catalysées à la fois par les agents chimiques et biologiques au cours du recyclage de ces éléments clés des systèmes vivants. Souvent, ces cycles font intervenir des réactions d’oxydo-réduction (voir section 5.6) au cours du déplacement de l’élément dans l’écosystème (voir figure 19.1). Le soufre, par exemple, sous forme d’hydrogène sulfuré (H2S) peut être oxydé par plusieurs micro-organismes variés, chimiotrophes et phototrophes, pour donner du soufre (S0) et des sulfates (SO42–). Le sulfate est un nutriment clé pour les plantes. À son tour, le sulfate peut être

réduit en sulfures par les bactéries sulfato-réductrices. Cette étape achève le cycle du soufre en régénérant les sulfures (voir figure 19.29). Les micro-organismes de nombreux types sont intimement impliqués dans les cycles biogéochimiques et, dans de nombreux cas, sont les seuls agents biologiques capables de régénérer les éléments sous des formes utilisables par les autres organismes, et en particulier par les plantes. Plusieurs cycles biogéochimiques et en particulier ceux du carbone, de l’azote, du soufre et du fer seront étudiés dans ce chapitre.

Contrôlez vos acquis Les communautés microbiennes sont formées de guildes d’organismes métaboliquement apparentés. Les micro-organismes jouent un rôle majeur dans les transformations énergétiques et les processus biogéochimiques, recyclant les éléments essentiels aux systèmes vivants. •

En quoi une guilde microbienne est-elle différente d’une communauté microbienne ?

•

Qu’est-ce qu’un cycle biogéochimique ?

19.2 Environnements m n et microenvironnements Les micro-organismes peuplent tous les habitats susceptibles de permettre la vie. Les habitats microbiens sont extrêmement diversifiés et changent souvent très rapidement. Outre les habitats communs que sont les sols et les eaux, les micro-organismes vivent à la surface d’organismes plus complexes, et dans de nombreux cas, vivent à l’intérieur. Les micro-organismes atteignent fréquemment de très grands nombres dans ces habitats, et peuvent contribuer de manière significative aux besoins nutritionnels de la plante ou de l’animal.

Micro-organisme et microenvironnement La croissance des micro-organismes, dans la nature comme au laboratoire, dépend des ressources (nutriments) disponibles et des conditions de croissance (voir tableau 19.1). Les différences dans le type et la quantité des ressources, ainsi que les conditions physico-chimiques définissent la niche d’un microorganisme particulier. La théorie de l’écologie affirme que pour chaque organisme existe au moins une niche, la niche principale, dans laquelle cet organisme a le plus de succès. L’organisme peuple la niche principale, mais aussi d’autres niches, dans lesquelles il a en général moins de succès que dans sa niche principale. Les niches microbiennes sur Terre sont innombrables et sont en partie responsables de la grande diversité métabolique (voir chapitre 17) et de la biodiversité (voir chapitres 12 à 14) actuelle des micro-organismes. Les micro-organismes étant petits, leurs habitats sont également petits ; les écologistes microbiens emploient le terme de microenvironnement pour décrire l’habitat dans lequel le micro-organisme vit effectivement et métabolise. Les microbiologistes doivent apprendre à « penser petit », lorsqu’ils



630 Chapitre 19

TABLEAU 19.1


PRINCIPALES RESSOURCES ET CONDITIONS CONTRÔLANT LA CROISSANCE MICROBIENNE EN MILIEU NATUREL

Ressources

Conditions

Carbone (organique, CO2)

Température : froid → chaud → très chaud

Azote (organique, inorganique)

Eau : sec → humide → très humide

Autres macronutriments (S, P, K, Mg)

pH : 0 → 7 → 14

Micronutriments (Fe, Mn, Co, Cu, Zn, Mn, Ni)

O2 : oxygéné → microaérobiose → anoxique 2+

Donneurs d’électrons inorganiques (H2, H2S, Fe ,

NH4+,

NO2–,

etc.)

considèrent le micro-organisme dans son environnement. Par exemple, pour une bactérie en forme de bâtonnet, d’une longueur de 3 µm, une distance de 3 mm est énorme. Cela représente l’équivalent d’une distance de 2 km pour un homme. Sur une distance de 3 mm, il peut exister des gradients chimiques et physiques pouvant beaucoup affecter les activités de l’organisme considéré. Dans une particule de sol de 3 mm par exemple, plusieurs microenvironnements différents du point de vue chimique ou physique peuvent exister. Considérons, par exemple, les concentrations d’un nutriment important comme l’oxygène dans une particule de sol, dont il est possible de mesurer les concentrations en oxygène à l’aide d’une microélectrode (voir section 18.7). La figure 19.2, établie d’après des mesures réelles, montre qu’une particule de sol n’est pas homogène en ce qui concerne les concentrations en oxygène. Les zones extérieures d’une telle particule peuvent être totalement oxygénées, et donc O2 est présent, alors que le centre, à une très faible distance, est totalement anoxique (dépourvu d’O2). Ainsi, différentes niches peuvent exister le long d’une courte distance, et en conséquence, divers types physiologiques de micro-organismes coexistent dans une seule « particule de sol », telle que celle de la figure 19.2. Les organismes anaérobies peuvent être actifs à proximité du centre, les microaérophiles (aérobies nécessitant de faibles concentrations en oxygène) actifs un peu plus vers l’extérieur, tandis que les aérobies obligatoires fonctionnent à la périphérie, dans la zone complètement oxygénée. Quant aux bactéries aérobies facultatives, elles sont distribuées dans l’ensemble de la particule (voir section 6.15). Les conditions physico-chimiques dans un microenvironnement peuvent changer rapidement, à la fois dans le temps et l’espace. Par exemple, les concentrations en oxygène présentées dans la figure 19.2 représentent des mesures « instantanées ». Des mesures effectuées après une période de respiration microbienne, ou après une augmentation de la teneur en eau du sol, pourraient révéler des changements importants de la concentration en oxygène à divers endroits de la particule. Il est ainsi possible de conclure que les microenvironnements sont hétérogènes et les conditions au sein d’un microenvironnement donné changent rapidement. Les microenvironnements favorisent ainsi une forte diversité microbienne dans un espace relativement réduit.

Lumière : forte → faible → obscurité Conditions osmotiques : eau douce → eau de mer → hypersaline

Le niveau des nutriments et taux de croissance Les nutriments (ou en termes d’écologie les ressources, voir tableau 19.1) entrent de manière intermittente dans un écosystème. Un apport massif de nutriments – par exemple un tas de feuilles en décomposition ou le cadavre d’un animal ou d’un poisson – peut être suivi d’une période sans apport nutritionnel. Dans la nature, les micro-organismes sont souvent confrontés à une alternance de périodes de festins et de famines, et beaucoup d’entre eux produisent des polymères de réserve quand les ressources le permettent. Ces polymères de réserve stockent les nutriments en excès présents pendant les périodes favorables, pour les utiliser pendant les périodes de pauvreté nutritionnelle. Les poly-β-hydroxybutyrates et d’autres alcanoates, les polysaccharides, les polyphosphates, etc. (voir section 4.11) constituent de bons exemples de ces matériaux de réserve.

21

6

15 10 5

3 Distance (mm)

O2 et autres accepteurs d’ électrons ( NO3–, SO4 2–, Fe 3+, etc.)

1

1 0

0

3

6

6

3

0

3

6

Distance (mm) FIGURE 19.2 Représentation des concentrations en oxygène dans une particule de sol. Les dimensions de la particule sont indiquées en abscisse et en ordonnée. Les nombres figurés sur les auréoles concentriques correspondent aux concentrations en oxygène exprimées en pourcentages (21 % dans l’air). En termes de relation à l’oxygène pour les micro-organismes, chaque zone correspond à un environnement différent.



19.3 Croissance microbienne sur les surfaces et biofilms 631

La compétition pour les ressources disponibles peut être intense entre micro-organismes, le résultat dépendant de plusieurs facteurs tels que les taux de prélèvement des nutriments, les vitesses de métabolisme et en définitive les taux de croissance. Un habitat typique contient un mélange de différents micro-organismes (voir figure 19.1), dont les densités de population dépendent de la ressemblance de l’habitat considéré avec les niches principales de chacun d’entre eux. Au lieu de rivaliser pour les mêmes ressources, certains micro-organismes travaillent ensemble pour réaliser des transformations qu’ils ne pourraient effectuer seuls. Ces partenariats microbiens, nommés syntrophies (voir section 17.21), sont cruciaux pour le succès de certaines bactéries anérobies telles que celles décrites dans la section 19.10. La coopération métabolique peut aussi être observée chez des micro-organismes réalisant des métabolismes complémentaires. Par exemple, au chapitre 17, des transformations métaboliques impliquant deux groupes distincts d’organismes, comme les bactéries nitrosantes et les bactéries nitratantes, ont été présentéess. Ensemble, ces organismes peuvent oxyder NH3 en NO3–, aucun des deux groupes ne pouvant faire seul cette transformation (voir section 17.12). Le produit des bactéries nitrosantes (NO2–) étant le substrat des bactéries nitratantes, de tels organismes vivent dans la nature en très étroite association (voir figure 18.12a).

Contrôlez vos acquis Les micro-organismes sont très petits et leurs habitats également. Un microenvironnement est l’endroit où vivent les micro-organismes. Dans la nature, les micro-organismes vivent des successions de festins / famines ; ainsi seules les espèces les mieux adaptées sont florissantes dans une

•

Quels aspects définissent la niche d’un micro-organisme particulier ?

•

Pourquoi différents groupes physiologiques d’organismes vivent dans un même habitat ?

19.3 Croissance microbienne m n sur les surfaces et biofilms Les surfaces sont d’importants habitats microbiens car les nutriments y sont adsorbés. Dans le microenvironnement que constitue une surface, les concentrations de nutriments peuvent être beaucoup plus élevées que dans la solution avoisinante. En conséquence, l’abondance des micro-organismes et leurs activités sont en général plus importantes sur une surface que dans l’eau environnante. Des lames de verre pour observation microscopique peuvent être employées comme surfaces expérimentales sur lesquelles les organismes se fixent et se développent. En pratique, une lame de verre est immergée pour une période déterminée dans un habitat microbien, récupérée et examinée au microscope (voir figure 19.3a). Des microcolonies se développent aisément sur de telles surfaces, plus qu’elles ne le font dans la nature sur des surfaces naturelles. L’examen microscopique à intervalles réguliers de lames de verre immergées a été employé pour mesurer les taux de croissance d’organismes fixés, en milieu naturel (voir figure 6.20b). La surface peut elle-même constituer un nutriment, s’il s’agit d’une particule de matière organique, sur laquelle des microorganismes catabolisent directement des nutriments. Du matériel végétal, par exemple, peut être rapidement colonisé par des micro-organismes du sol, et de simples techniques de coloration permettent de détecter des populations microbiennes attachées à des surfaces solides (voir figure 19.3b).

Racine Microcolonies

Frank Dazzo

Compétition microbienne et coopération

niche donnée. La coopération entre micro-organismes est aussi importante dans de nombreuses interactions microbiennes.

T. D. Brock

Les longues périodes de croissance exponentielle des microorganismes sont rares dans la nature. La croissance se produit classiquement par à-coups, en fonction de la disponibilité des ressources. Toutes les conditions physico-chimiques étant rarement optimales simultanément, les taux de croissance des microorganismes dans la nature sont bien inférieurs la plupart du temps à ceux déterminés au laboratoire. Par exemple, le temps de génération d’Escherichia coli dans le tractus digestif est d’environ 12 h (deux divisions par jour), tandis qu’en culture pure la croissance est beaucoup plus rapide, avec un temps de génération minimum de 20 minutes en conditions optimales. De plus, plusieurs estimations montrent que les bactéries habituelles du sol croissent dans la nature à moins de 1 % du taux de croissance mesuré au laboratoire. En moyenne, ces taux de croissance lents reflètent le fait que : 1) les nutriments sont fréquemment en faibles concentrations et/ou les conditions de croissance suboptimales ; 2) la distribution des nutriments n’est pas uniforme dans l’habitat ; et 3) sauf de rares exceptions, les micro-organismes croissent au sein de populations mixtes, et non en cultures pures dans les milieux naturels. Ainsi, un organisme qui se développe rapidement en culture pure peut se développer lentement dans un milieu naturel où il doit rivaliser avec d’autres organismes mieux adaptés aux ressources et aux conditions de croissance effectives.

(a) (b) FIGURE 19.3 Micro-organismes sur des surfaces. (a) Microcolonies bactériennes sur une lame de verre immergées dans une rivière. Les particules brillantes sont minérales. Les cellules en forme de bâtonnets courts mesurent environ 3 µm. (b) Image en microscopie à fluorescence d’une communauté microbienne naturelle colonisant des racines de plantes dans le sol. Notez les microcolonies. La préparation a été colorée à l’acridine orange.



632 Chapitre 19


Les biofilms

(a)

Cellule

Colonisation (interactions cellulaires, croissance, formation de polysaccharides) Flu x

Développement (intensification de la croissance et de la formation des polysaccharides) Chenaux de circulation de l’eau

Polysaccharide

Rodney M. Donlan et Emerging Infectious Diseases

Surface (a)

(b) Cindy E. Morris

Surface

(b)

J.M. Sánchez, J.J. deLope, et Ricardo Amils

Cellules

C.-T. Huang, Karen Xu, Gordon McFeters, et Philip S. Stewart

Très souvent, les micro-organismes se développent sur des surfaces, incluses dans des biofilms, qui sont des assemblages de cellules bactériennes fixées sur une surface et incluses dans des polysaccharides adhésifs excrétés par les cellules ellesmêmes (voir figure 19.4). Les biofilms piègent les nutriments permettant la croissance de la population microbienne et contribuent à empêcher le détachement des cellules fixées aux surfaces, dans les milieux circulants (voir figure 19.5). Les biofilms contiennent typiquement de nombreuses couches poreuses, et l’examen microscopique des micro-organismes dans ces couches peut se faire à l’aide d’un microscope confocal à balayage laser (voir section 4.2 et figure 19.4). Les communications entre cellules sont critiques dans le développement et le maintien d’un biofilm. L’attachement d’une cellule à une surface constitue un signal pour l’expression de

Attachement (adhésion de quelques cellules sur une surface solide)

(c) FIGURE 19.4 Biofilms bactériens. (a) Coupe transversale d’un biofilm expérimental constitué de cellules de Pseudomonas aeruginosa. La couche vert-jaune (environ 15 µm d’épaisseur) contient des cellules et a été traitée par un colorant spécifique des phosphatases alcalines. La bande rouge correspond à la surface colonisée. (b) Vue en microscopie laser confocale (section 4.2) d’un biofilm naturel (vue de dessus) formé sur la surface d’une feuille. La couleur des cellules indique la position des cellules dans l’épaisseur du biofilm : rouge, cellule en surface ; vert, 9 µm en profondeur ; bleu, 18 µm en profondeur. (c) Biofilm de procaryotes ferro-oxydants sur la surface de roches du fleuve riche en fer Rio Tinto (Espagne). Les micro-organismes du biofilm utilisent le Fe2+ abondant dans l’eau de la rivière comme source d’énergie et l’oxydent en Fe 3+ (section 17.11).

FIGURE 19.5 Biofilms. (a) Formation d’un biofilm bactérien. Le biofilm est initié par l’attachement de quelques cellules, qui ensuite se divisent et interagissent. La formation des polysaccharides intervient ensuite et s’intensifie au cours de la croissance du biofilm. (b) Image en microscopie en fluorescence d’un biofilm coloré au DAPI (section 18.3), qui s’est formé sur un tube d’acier. Notez les chenaux de circulation de l’eau.

gènes spécifiques des biofilms. Ces gènes codent des protéines qui synthétisent des molécules de communication intercellulaires et amorcent la formation des polysaccharides (voir figure 19.5a). Chez Pseudomonas aeruginosa, une espèce formant régulièrement des biofilms (voir figure 19.4a), les molécules signal principales sont des composés nommés homosérines lactones. Quand ces molécules s’accumulent, elles fonctionnent comme des agents de chimiotactisme pour recruter des cellules proches de P. aeruginosa (un mécanisme nommé quorum sensing, section 8.10), et le biofilm se développe (voir figure 19.4a). P. aeruginosa a été impliqué dans la maladie nommée mucoviscidose, dans laquelle un biofilm tenace se forme au niveau des poumons, produisant les symptômes de la pneumonie (voir sections 8.10 et 31.7).

Pourquoi les bactéries forment-elles des biofilms ? Les bactéries forment des biofilms car ce mode de croissance améliore indiscutablement la survie et la croissance des organismes. Au moins quatre raisons sont à la base de la formation des biofilms. En premier, les biofilms constituent une sorte de



19.4 Environnements terrestres 633

défense. Les biofilms résistent aux forces physiques capables d’emporter les cellules non fixées, à la phagocytose des cellules par les défenses immunitaires et empêchent la pénétration de molécules toxiques comme les antibiotiques. En second lieu, la formation d’un biofilm permet aux cellules de rester dans une niche favorable. Les biofilms fixés sur des surfaces riches en nutriments telles que les tissus animaux, ou sur les surfaces immergées en eaux circulantes, comme les rochers d’une rivière (voir figure 19.4c), fixent les cellules bactériennes à un endroit où les nutriments sont souvent plus abondants, ou constamment renouvelés. Troisièmement, les biofilms se forment car ils permettent aux cellules bactériennes de vivre en étroite association les unes avec les autres. Comme cela a déjà été vu dans le cas de Pseudomonas aeruginosa, cela facilite les communications intercellulaires par les molécules signal, ce qui est bénéfique pour les cellules. De plus, lorsque les cellules sont très proches, les possibilités d’échanges génétiques sont augmentées. Enfin, quatrième raison, les biofilms constituent sans doute le processus typique de croissance des cellules dans la nature, où les concentrations en nutriments sont loin d’être celles des milieux de culture. En d’autres termes, le biofilm est le mode de croissance en situation de « carence » des procaryotes dans la nature, par opposition à l’approche du riche milieu de culture pratiquée au laboratoire.

Le contrôle des biofilms Les biofilms ont des implications importantes en médecine humaine et dans certaines activités commerciales. À l’intérieur du corps, les cellules bactériennes dans un biofilm sont protégées des attaques venant du système immunitaire, et les antibiotiques et d’autres antimicrobiens échouent souvent à pénétrer le biofilm. Les biofilms ont été impliqués dans divers problèmes médicaux et dentaires, en plus de la mucoviscidose, comme les maladies péridontales, la tuberculose, la maladie du légionnaire et les infections à staphylocoques. Les implants chirurgicaux sont d’excellentes surfaces propices au développement des biofilms. Il s’agit en particulier des cathéters urinaires, ou aussi des implants de plus longue durée comme les implants d’articulation. Aux États-Unis, on estime qu’il y a 10 millions de personnes par an qui souffrent de biofilms infectieux suite à des implants ou à des examens médicaux invasifs. Les biofilms expliquent pourquoi l’hygiène buccale est si importante. La plaque dentaire est un biofilm typique qui contient des bactéries productrices d’acides et responsables de caries (voir section 21.3). Dans les exploitations industrielles, les biofilms peuvent ralentir la circulation de l’eau, du pétrole ou d’autres liquides dans les canalisations et accélérer la corrosion de ces conduits. Les biofilms initient aussi la dégradation des structures immergées telles que les composants des plateformes offshore, les bateaux ou les infrastructures portuaires. La salubrité de l’eau potable peut être compromise par des biofilms qui se développent dans les canalisations, dont certaines aux États-Unis sont âgées de presque un siècle. Bien que les conduites d’eau contiennent surtout des bactéries inoffensives, si des pathogènes colonisent le biofilm, les protocoles standard de chloration peuvent se révéler insuffisants pour les tuer. Des relargages périodiques de cellules peuvent produire

des manifestations de maladies. Il existe quelques indices qui tentent à prouver que le Vibrio cholerae, l’agent du choléra (voir section 28.5), puisse être propagé de cette manière. Le contrôle des biofilms constitue une activité économique importante et assez peu d’outils sont disponibles. Globalement, les industries dépensent des milliards de dollars chaque année pour traiter les canalisations et autres surfaces afin de les débarrasser des biofilms. De nouveaux antibiotiques pouvant pénétrer les biofilms et d’autres substances empêchant leur formation sont en cours de développement. Des composés chimiques, comme les furanones, se sont montrés prometteurs pour prévenir l’installation des biofilms au cours d’essais sur des surfaces non biologiques. Les furanones étant stables, et non toxiques chez l’homme, ces composés pourraient aussi avoir des applications antibiofilms en médecine humaine.

Contrôlez vos acquis Les biofilms sont des assemblages bactériens enfermés dans du mucus et qui se forment sur des surfaces. Les biofilms peuvent conduire à la destruction de surfaces inertes ou vivantes via les produits excrétés par les bactéries. La formation du biofilm est un processus complexe impliquant des communications intercellulaires. •

Quelle est la nature chimique de la matrice du biofilm ?

•

Pourquoi un biofilm est-il un bon habitat pour des cellules vivant en eaux circulantes ?

•

Donnez un exemple de biofilm d’importance médicale chez l’homme.

II

HABITATS MICROBIENS DU SOL ET DES EAUX DOUCES

Les sols et les eaux douces (lacs, étangs, rivières) figurent parmi les principaux habitats des micro-organismes. Les sols et les eaux ont des caractéristiques physiques, des compositions en nutriments, des températures ou des teneurs en eau très variables. Tous ces facteurs combinés influent sur la diversité et l’abondance des micro-organismes présents.

19.4 Environnements terrestres m n

Le terme sols s’applique aux matériaux externes de la surface terrestre, une couche distincte des roches sous-jacentes (voir figure 19.6). La formation du sol implique des interactions complexes entre le matériel d’origine (roches, sables, moraines glaciaires, etc.), la topographie, le climat et les organismes vivants. Deux principaux groupes de sols peuvent être distingués – les sols minéraux et les sols organiques – selon qu’ils dérivent initialement de l’érosion de roches, ou d’autres matériaux inorganiques, ou de la sédimentation dans les marécages. Les sols minéraux, prédominants dans la plupart des environnements terrestres, seront essentiellement abordés.



634 Chapitre 19


Michael T. Madigan

Horizon O Couche de matériel végétal non décomposé Horizon A Sol superficiel (riche en matière organique, de couleur sombre, convient à l’agriculture ; nombreuses plantes et nombreux micro-organismes ; activité microbienne élevée) Horizon B Sous-sol (matières minérales, humus, les produits lessivés du sol superficiel s’accumulent ici ; (b) peu de matière organique ; activité microbienne détectable FIGURE 19.6 Sols. (a) Profil d’un sol mature. Les spécialistes mais plus faible que dans des sols distinguent dans un sol plusieurs zones, nommées l’horizon A) horizons. (b) Photographie d’une coupe de sol montrant les Horizon C horizons 0, A et B. Ce sol (Carbondale, Illinois, États-Unis) Base du sol (formé directement à est riche en argile, formé de petites particules, et est donc partir des roches sous-jacentes, très compact. Ces sols ne sont pas aussi bien drainés que activité microbienne généralement très faible) ceux comptant principalement du sable.

(a)

La formation des sols La formation des sols résulte de la combinaison de processus physiques, chimiques et biologiques. L’examen de pratiquement n’importe quelle roche exposée révèle la présence d’algues, lichens (voir section 19.20), ou de mousses. Ces organismes sont dormants sur la roche sèche et croissent lorqu’existe un peu d’humidité. Ils sont phototrophes et produisent de la matière organique, qui permet la croissance des bactéries et champignons chimio-organotrophes. Le nombre des chimio-organotrophes augmente directement en relation de l’importance de la couverture végétale. Le dioxyde de carbone produit pendant la respiration des chimio-organotrophes est !! transformé en acide carbonique (CO2 + H2O ↽ !⇀ ! H2CO3), qui joue un rôle important dans la dissolution des roches et particulièrement des calcaires. De nombreux chimio-organotrophes excrètent aussi des acides organiques qui poursuivent la dissolution des roches en particules plus petites. Le gel, la fonte et d’autres processus physiques provoquent des cassures dans les roches. Un sol brut se forme dans ces crevasses et les plantes pionnières s’y développent. Les racines des plantes pénètrent plus en profondeur, augmentent la fragmentation des roches, et leurs excrétats favorisent le développement d’une microflore dans la rhizosphère (partie du sol entourant les racines des plantes, figure 19.3b). Lorsque les plantes meurent, leurs restes s’ajoutent au sol et deviennent des nutriments permettant un développement microbien encore plus important. Les minéraux sont solubilisés, et par percolation, l’eau transporte ces substances chimiques en profondeur. Avec l’érosion, l’épaisseur du sol augmente, permettant le développement de plantes plus grandes ainsi que d’arbres. Les animaux du sol s’installent et interviennent dans le mélange et l’oxygénation des couches superficielles. Finalement, les mouvements descendants de matériaux conduisent à la formation

de couches, déterminant le profil du sol. Le taux de formation d’un sol dépend de facteurs climatiques et autres, mais peut prendre en général des centaines d’années.

Le sol : habitat microbien La croissance microbienne la plus importante intervient sur les surfaces des particules de sols, habituellement au niveau de la rhizosphère (voir figures 19.2, 19.3b et 19.6b). Comme cela a été signalé dans la section 19.2, même un petit agrégat de sol peut compter divers microenvironnements (comparez les figures 19.2 et 19.7), et ainsi, plusieurs types de microorganismes différents peuvent y être présents. La microscopie à fluorescence est souvent utilisée pour observer directement les micro-organismes du sol, après les avoir traités avec un fluorochrome (voir figure 19.3b). Pour observer un microorganisme particulier dans une particule de sol, des anticorps fluorescents (voir figure 18.8) ou des colorations phylogénétiques (voir section 18.4) peuvent être mis en œuvre. Le microscope électronique à balayage donne une excellente information sur la morphologie des bactéries du sol (voir figure 19.8), et peut aussi être utilisé pour dénombrer les bactéries sur la surface des particules. L’un des principaux facteurs influant sur l’activité microbienne des sols est la disponibilité de l’eau, et l’importance de l’eau dans la croissance microbienne a été présentée auparavant (voir section 6.14). L’eau est un composant du sol dont la teneur varie énormément selon la composition du sol, la pluviosité, l’écoulement et la couverture végétale. L’eau se maintient dans le sol de deux façons – adsorption sur les surfaces, ou eau libre en minces couches entre les particules du sol. L’eau présente dans les sols contient une grande diversité de composés dissous, et ce mélange constitue l’eau interstitielle. Dans les sols bien drainés, l’air pénètre facilement et la con-



19.4 Environnements terrestres 635

Microcolonies

Quartz

Air Quartz

Matière organique

Particule d’argile Eau Air

Quartz

Particule d’argile

FIGURE 19.7 Aggrégat de sol composé de matières organiques et minérales, montrant la localisation des micro-organismes du sol. Très peu de micro-organismes vivent libres dans les sols ; la plupart forment des microcolonies fixées sur les particules de sol.

centration en oxygène peut être élevée. Dans les sols détrempés, l’oxygène est présent seulement sous forme dissoute dans l’eau, et il est rapidement consommé par les micro-organismes. De tels sols deviennent rapidement anoxiques, ce qui induit de profonds changements dans leurs propriétés biologiques. Ce point a été abordé dans la section 19.2 (voir figure 19.2). La teneur en nutriments (les ressources, tableau 19.1) d’un sol est l’autre facteur important pour l’activité microbienne. La plus forte activité se situe dans les couches de surface riches en matière organique, particulièrement dans et autour de la rhizosphère (voir figure 19.6b). Le nombre et l’activité des micro-organismes du sol dépendent en grande partie de l’équilibre des nutriments présents. Dans certains sols, le carbone n’est pas le nutriment limitant, et ce sont plutôt les nutriments inorganiques comme le phosphore et l’azote qui limitent la productivité microbienne.

Bien que le nombre de cellules soit plus faible que dans l’horizon superficiel du sol (horizon A, figure 19.6), des microorganismes divers, surtout des bactéries, sont présents. Par exemple, dans des échantillons prélevés aseptiquement lors de forages à 300 m de profondeur, de nombreux procaryotes ont été détectés, y compris des anaérobies sulfato-réducteurs, des méthanogènes ou des acétogènes (voir sections 17.15-17.17), mais aussi des aérobies et des anaérobies facultatifs. Les micro-organismes de subsurface ont accès aux nutriments grâce à la circulation des eaux souterraines, mais les mesures d’activité effectuées suggèrent que le métabolisme in situ de ces bactéries est assez faible (voir le focus « La vie microbienne souterraine »). Par comparaison avec les microorganismes des couches superficielles du sol, le rôle biogéochimique des micro-organismes de subsurface doit être minime. Mais sur de très longues périodes, les activités métaboliques de ces organismes enfouis peuvent être responsables de la lente minéralisation de composés organiques et du relargage de molécules dans les eaux souterraines. Le potentiel de bioremédiation in situ de substances toxiques (par exemple, le benzène et les engrais chimiques) lessivées du sol vers les eaux souterraines par les micro-organismes de subsurface présente un certain intérêt. L’addition de nutriments inorganiques, ainsi que l’introduction de micro-organismes spécifiques dans des aquifères contaminés pourraient faciliter la biodégradation.

Contrôlez vos acquis Le sol est un habitat complexe comptant de nombreux microenvironnements et niches écologiques. Les microorganismes sont présents dans les sols, et surtout fixés aux particules. Le facteur le plus important influant sur l’activité microbienne des sols superficiels est la teneur en eau, tandis qu’en subsurface, la disponibilité des nutriments joue le rôle majeur.

La microbiologie de la subsurface

(a)

(b)

Quelle différence y a-t-il entre des sols minéraux et des sols organiques ?

•

Quels facteurs gouvernent les activités microbiennes dans les sols ?

•

Quelle région d’un sol est la plus active microbiologiquement ?

T. R. G. Gray

T. R. G. Gray

T. R. G. Gray

L’intérêt pour la chimie des eaux souterraines, ainsi que le lessivage potentiel des polluants et leur transformation dans les aquifères souterrains, ont conduit à étudier le rôle des microorganismes dans les environnements terrestres de subsurface. La subsurface, qui peut s’étendre à plusieurs centaines de mètres sous la surface du sol, n’est pas un désert biologique.

•

FIGURE 19.8 Images en microscopie électronique à balayage de micro-organismes à la surface de particules de sol. (a) Microcolonie de bactéries en forme de bâtonnets courts. (b) Spores d’actinomycètes (section 12.24). Les cellules (a) et les spores (b) mesurent 1-2 µm. (c) Hyphes fongiques. Ces hyphes ont une largeur d’environ 4 µm et sont recouverts de matière minérale.

(c)



636 Chapitre 19

FOCUS


Acides aminés non conventionnels

Les microbiologistes étudiant la subsurface continentale ont trouvé des procaryotes viables à des profondeurs de plusieurs milliers de mètres sous la surface, dans des environnements physicochimiques variés. Comment vivent ces micro-organismes ? Les premiers résultats ont indiqué que ces micro-organismes enfouis étaient des bactéries chimio-organotrophes à croissance très lente, survivant grâce au catabolisme lent du carbone organique déposé avec les sédiments. Cependant, des études sur l’écologie microbienne d’aquifères basaltiques montrèrent que ces procaryotes « paresseux » n’étaient pas les seuls à vivre dans ces environnements. Des procaryotes chimiolithotrophes sont aussi présents et pourraient même s’avérer dominants. Les basaltes sont des roches volcaniques riches en fer, sans matière organique. Dans certains basaltes du bassin de la rivière Columbia (États-Unis) à 1 500 m de profondeur, de nombreuses bactéries chimiolithotrophes anaérobies, dont des sulfato-réducteurs, des méthanogènes et des acétogènes1, ont été trouvées (voir figure 1a). Ainsi, des espèces de Bacteria et d’Archaea cohabitent dans ces écosystèmes de subsurface. L’analyse des isotopes stables du méthane dans les roches et eaux voisines a montré que les méthanogènes étaient métaboliquement actifs. Les analyses ont montré un fort enrichissement en isotope léger du carbone ( 12C), typique de la méthanogenèse biologique (voir section 18.8). Si les méthanogènes sont actifs, il est vraisemblable que les

autres groupes le sont aussi. Cependant, leurs produits, H2S pour les sulfato-réducteurs et l’acétate pour les acétogènes (voir figure 1b), ne s’accumulent pas car ils sont consommés par d’autres micro-organismes, dont des chimiolothotrophes sulfooxydants et des chimio-organotrophes qui utilisent l’acétate. Un lien métabolique commun entre ces procaryotes anaérobies est l’utilisation de H2 comme donneur d’électrons pour leur métabolisme énergétique (voir sections 13.3, 17.9, 17.14-17.18, et figure 1b ci-dessous). L’hydrogène est un produit commun de la décomposition de la matière organique par fermentation (voir sections 17.19-17.21). Mais si le basalte contient très peu de matière organique, d’où vient l’hydrogène qui permet la croissance des consommateurs de cet élément ? Dans les basaltes de la rivière Columbia, l’hydrogène provient apparemment de réactions strictement chimiques entre l’eau et les minéraux contenant du fer présent (voir la réaction proposée dans la figure 1b). De telles réactions sont connues en chimie minérale, et au laboratoire, lorsque du basalte de la rivière Columbia est concassé et mélangé à de l’eau stérile, un dégagement rapide d’hydrogène se produit2. H2 est aussi détecté in situ dans l’eau souterraine percolant les basaltes. Il est donc possible que l’hydrogène formé dans ces basaltes profonds soit le donneur d’électrons qui permette la croissance des importantes populations de procaryotes anaérobies trouvées dans ce milieu. Si cela est vrai, ces organismes auraient une vie strictement géochimique,

car leurs accepteurs d’électrons (CO 2 pour les méthanogènes et les acétogènes, et SO42– pour les sulfato-réducteurs), et H2 leur donneur d’électrons, proviennent de matériaux inorganiques. Ces chimiolithotrophes enfouis seraient aussi nouveaux en ce sens qu’ils sont totalement indépendants de la production primaire photosynthétique. Ce processus est en effet la source de l’oxygène moléculaire et/ou de la matière organique requise par pratiquement tous les organismes de surface. Comme cela arrive parfois en sciences, des recherches complémentaires ont été menées. Bien qu’il n’y ait pas beaucoup de matière organique dans ces basaltes, il y en a un peu, et ainsi, la fermentation pourrait être la source d’une partie de l’hydrogène utilisé par ces chimiolithotrophes. L’étendue et la signification écologique des écosystèmes microbiens de subsurface basés sur l’hydrogène sont encore, quant à l’origine de l’hydrogène, de vastes sujets de recherche. Mais il est clair que des micro-organismes utilisant l’hydrogène et métaboliquement actifs vivent en subsurface, et pourraient être des agents biogéochimiques très importants dans ces environnements. En fait, on suspecte désormais que le nombre total des procaryotes terrestres vivant en subsurface est plus important que celui des procaryotes vivant dans tous les autres environnements. Les activités de ces organismes de subsurface sont encore pour une grande partie un mystère, mais elles pourraient avoir un rôle important dans le recyclage des nutriments sur Terre.

Todd O. Stevens

Figure 1 La vie microbienne en subsurface. (a) Image en microscopie laser confocale d’un biofilm microbien fixé à la surface d’un fragment de basalte échantilloné à 1 500 m de profondeur. La couleur verte correspond au basalte (lumière réfléchie), le rouge correspondant à des bactéries colorées au rouge Nil. Les cellules du biofilm utilisent H 2 comme source d’énergie, produit par la dernière réaction de la figure 1.b. (b) Réactions métaboliques des procaryotes anaérobies vivant dans les aquifères anoxiques basaltiques profonds.

(a)

1. 2.

Méthanogénèse : 4 H2 + CO2 CH4 + 2 H2O Acétogénèse : 4 H2 + 2 HCO3– + H+ CH3COO– + 4 H2O 2– Réduction des sulfates : 4 H2 + SO4 + H+ HS– + 4 H2O Processus proposé pour la production H2 + FeO2 inorganique de H2 : FeO + H2O

(b)

Stevens, T.O., et J.P. McKinley. 1995. Lithoautotrophic microbial ecosystems in deep basalt aquifers. Science 270 : 450-454. Anderson, R.T., H. Chapelle, et D.R. Lovely. 1998. Evidence against hydrogen-based microbial ecosystems in basalt aquifers. Science 281 : 976-977.



19.5 Environnements d’eaux douces 637

Les eaux douces sont représentées par les lacs, les étangs, les rivières et les fleuves. Ces milieux sont très différents les uns des autres en ce qui concerne les ressources disponibles et autres propriétés physiques et chimiques, et il n’est pas étonnant que les activités microbiennes varient en conséquence. Les organismes phototrophes prédominants dans les environnements aquatiques sont les micro-organismes : cyanobactéries et algues dans les eaux oxygénées, bactéries phototrophes anoxygéniques dans les zones anoxiques. Les algues qui flottent ou en suspension dans l’eau forment le phytoplancton ; celles attachées au fond ou sur les bords forment les algues benthiques. Ces organismes pouvant utiliser l’énergie lumineuse pour la production initiale de matière organique sont nommés producteurs primaires. En définitive, l’activité microbienne d’un écosystème aquatique dépend du taux de production primaire par les organismes phototrophes. Les phototrophes oxygéniques produisent à la fois de la matière organique nouvelle et de l’oxygène. Si l’activité photosynthétique est très élevée, l’excès de matière organique conduit à un épuisement de l’oxygène et à des conditions anoxiques. Ceci déclenche des formes alternatives de métabolisme des procaryotes, et en particulier la respiration aérobie et la fermentation (voir sections 17.13-17.21).

L’oxygène dans les lacs et les rivières Les besoins en oxygène et l’anaérobiose ont été abordés dans la section 6.15, la production d’oxygène via la photosynthèse dans la section 17.5 et l’oxygène dans les microenvironnements dans la section 19.2. Bien que l’oxygène soit l’un des gaz les plus abondants de l’atmosphère (environ 21 % de l’air), sa solubilité dans l’eau est limitée, et pour une grande masse d’eau, les échanges avec l’atmosphère sont lents. La production significative d’oxygène se produit seulement dans les couches superficielles des lacs et des océans, là où la lumière est disponible (voir figure 19.1). La matière organique qui n’est pas consommée dans ces couches de surface sombre dans les profondeurs est en partie décomposée par des micro-organismes aérobies facultatifs qui utilisent l’oxygène dissous dans l’eau. Dans les lacs d’eau douce une fois l’oxygène consommé, les couches profondes deviennent anoxiques. Les organismes aérobies stricts comme les plantes ou les animaux ne peuvent y vivre, et les couches proches du fond contiennent seulement des procaryotes anaérobies et quelques sortes d’eucaryotes anaérobies, et en particulier certains protozoaires. De plus, on passe de métabolismes respiratoires à la fermentation et à la méthanogenèse, avec des conséquences importantes pour le cycle du carbone et des autres nutriments (voir sections 19.9-19.11). Le fait qu’une masse d’eau soit épuisée en oxygène dépend de plusieurs facteurs, dont la quantité de matière organique présente et le mélange. Si la matière organique est en faible concentration, comme dans les lacs isolés, ou dans l’océan au large, il est possible qu’il n’y ait pas assez de substrat disponible pour que les chimio-organotrophes consomment tout l’oxygène. Les microorganismes présents dans ces environnements sont des oligotrophes, qui sont adaptés à croître dans des milieux très dilués. De

forts courants ou des turbulences provoquées sous l’action du vent permettent le mélange des masses d’eau et l’oxygène peut être transféré aux couches les plus profondes. Par contre, dans de nombreux lacs de pays tempérés, les masses d’eau peuvent être stratifiées pendant l’été, avec les eaux plus chaudes et moins denses en surface (épilimnion) et les eaux plus froides et plus denses en profondeur (hypolimnion) [voir figure 19.9]. La thermocline est la zone de transition entre l’épilimnion et l’hypolimnion. Après la mise en place de la stratification, en général au début de l’été, les couches profondes deviennent anoxiques (voir figure 19.9). De tels lacs contiennent souvent de plus fortes concentrations en matière organique dissoute provenant du ruissellement des terrains voisins. Ceci peut déclencher des efflorescences d’algues et de cyanobactéries, qui augmentent encore la teneur en matière organique du lac. Dans les lacs tempérés, à la fin de l’automne et au début de l’hiver, les eaux de surface deviennent plus froides et donc plus denses que les eaux profondes. Ceci permet le renouvellement des masses d’eau et la réoxygénation des eaux profondes. Ce cycle annuel permet aux eaux de fond de passer d’un état oxygéné à un état anoxique et de revenir à l’état oxygéné. L’activité microbienne est altérée par ces changements de la concentration en oxygène, mais d’autres facteurs et surtout la température pilotent également l’activité microbienne.

Les rivières Les teneurs en oxygène dans une rivière ont une importance particulière, surtout dans les régions où les rivières subissent des rejets en matière organique sous forme d’eaux d’égouts, ou de pollution agricole et/ou industrielle. Même dans une

Surface du lac 0 O2

2

Profondeur (m)

m n

19.5 Environnements d’eaux douces

Température

4

Epilimnion

6

Thermocline

8

Hypolimnion

10 H 2S

12 14 16

Sédiments 0

2

4

6

8

10

O2 (mg/l)

0 0

1 4

2 8

3 12

4 16

5 20

H2S (mg/l) Temp (°C)

FIGURE 19.9 Mise en place des conditions anoxiques dans un lac tempéré, suite à la stratification estivale. Les eaux de fond, plus froides, sont plus denses et contiennent de l’H 2S résultant de la réduction des sulfates. La zone où la température change rapidement est nommée thermocline. Lorsque les eaux de surface se refroidissent en automne et au début de l’hiver, elles atteignent la température et la densité des eaux hypolimniques, s’enfoncent et déplacent les eaux de fond, ce qui conduit à un renouvellement des eaux. Ces données proviennent d’un lac d’eau douce du Nord du Wisconsin (États-Unis).



638 Chapitre 19


Nombre de cellules / concentration en nutriments

rivière dont les eaux sont mélangées en raison du courant et des turbulences induites, des apports conséquents en matière organique peuvent conduire à un déficit marqué en oxygène résultant de la respiration bactérienne (voir figure 19.10a). L’eau se déplaçant au-delà du point de rejet, la matière organique est progressivement consommée, et la teneur en oxygène redevient normale. L’épuisement en oxygène d’une masse d’eau n’est pas acceptable car de nombreux animaux aquatiques meurent en conditions anoxiques, même temporaires. De plus, le passage à l’anoxie se

Déversement (égouts, autres eaux usées)

Bactéries, carbone organique et DBO Algues et cyanobactéries

O2

O2

NO3– NH4+ et PO43–

Vers l’aval (a)

traduit par la production de composés malodorants (amines, H2S, mercaptans, acides gras) dont certains sont toxiques pour les organismes complexes, suite au développement de bactéries anaérobies. Comme dans les lacs, l’apport de nutriments par les égouts ou d’autres sources polluantes peut aussi déclencher des efflorescences massives de cyanobactéries et d’algues (voir figure 19.10b). Ceci augmente encore la charge en matière organique et conduit finalement à l’épuisement en oxygène.

La demande biologique en oxygène La capacité des micro-organismes d’une masse d’eau à consommer l’oxygène s’exprime par la demande biologique en oxygène (DBO). Pour déterminer la DBO, un échantillon d’eau est prélevé, bien aéré, placé dans un flacon scellé et incubé selon des normes précises (en général 5 jours à 20 °C). La concentration en oxygène restante est mesurée à la fin de l’incubation. La DBO ainsi déterminée donne une mesure de la quantité de matière organique présente dans l’eau et susceptible d’être oxydée par les micro-organismes. Lorsqu’une rivière récupère d’une contamination par des polluants organiques, la chute de la DBO s’accompagne d’une augmentation de la concentration en oxygène dissous (voir figure 19.10a). On voit ainsi que, dans une masse d’eau, les cycles du carbone et de l’oxygène sont liés, les niveaux de carbone organique et d’oxygène étant inversés. Ceci est particulièrement évident dans les environnements anoxiques qui sont fréquemment riches en carbone (voir sections 19.9-19.11).

T. D. Brock


(b) FIGURE 19.10 Effets du déversement d’eaux usées riches en matière organique dans les écosystèmes aquatiques. (a) Dans une rivière, une augmentation de l’abondance bactérienne et une diminution de la concentration en O2 sont observées immédiatement après un apport de matière organique. Si NH 4+ est présent dans le rejet, en provenance par exemple d’un égout, NH4+ est oxydé en NO3– par les bactéries nitrifiantes (sections 12.3, 17.12 et 19.12). L’augmentation de la concentration en NH4+ est immédiatement suivie de l’augmentation en NO3– car les deux étapes de la nitrification sont réalisées. L’augmentation du nombre d’algues et de cyanobactéries est d’abord une réponse à l’augmentation de PO 43–. (b) Vue d’un lac eutrophisé (riche en nutriments) (Lake Mendota, Madison, Wisconsin, États-Unis) montrant des micro et macro-algues ainsi que des cyanobactéries proliférant en réponse à une pollution par des nutriments inorganiques provenant d’activités agricoles. Les plantes mortes et le matériel algal ont une très forte DBO si bien que leur dégradation a pour conséquence un important déficit d’oxygène, quand bien même ces phototrophes en produisent lors de la photosynthèse.

Dans les écosystèmes aquatiques, les micro-organismes phototrophes sont habituellement les producteurs primaires. La plupart de la matière organique produite est consommée par les bactéries, ce qui peut conduire à l’épuisement de l’oxygène dans l’environnement. La DBO est une mesure des potentialités de consommation de l’oxygène par une masse d’eau. •

Qu’est-ce qu’un producteur primaire ?

•

Dans un lac, qu’est-ce que l’épilimnion, et où se trouve l’hypolimnion ?

•

Est-ce que l’addition de matière organique dans un échantillon d’eau augmente ou diminue la DBO ?

III

MICROBIOLOGIE MARINE

Les océans diffèrent des environnements dulçaquicoles par plusieurs points dont la salinité, la température moyenne, la profondeur et les teneurs en nutriments. L’utilisation des outils moléculaires en écologie microbienne, et particulièrement les colorations génétiques et le séquençage (voir sections 18.4-18.6), a fourni de nombreuses nouvelles données sur les micro-organismes marins ; trois points seront principalement abordés ici : 1) les procaryotes en milieu océanique, 2) la microbiologie abyssale, et 3) la vie animale basée sur les écosystèmes microbiens au voisinage des sources hydrothermales océaniques.



19.6 Habitats marins et distribution des micro-organismes 639

L’essentiel de la productivité primaire des océans, même à des profondeurs significatives, est dû à l’activité photosynthétique des prochlorophytes, de minuscules procaryotes phototrophes oxygéniques qui contiennent des chlorophylles a et b. Prochlorococcus, proche des cyanobactéries, est un producteur primaire particulièrement important (voir figure 19.11a et section 12.26). Dans les eaux océaniques tropicales et subtropicales, la cyanobactérie marine planctonique, de forme filamenteuse, Trichodesmium (voir figure 19.11b), est aussi largement répandue. Les cellules de Trichodesmium forment des touffes de filaments qui constituent une fraction significative de la biomasse vivant dans ces masses d’eaux. Trichodesmium est une cyanobactérie fixatrice d’azote, et la production d’azote fixé par cet organisme est sans doute l’une des parties importantes du cycle de l’azote en milieu marin. Avec les prochlorophytes, on trouve dans les eaux côtières de petits eucaryotes photosynthétiques, certains figurant parmi les plus petites cellules eucaryotes connues. Ostreococcus, par exemple, est une algue très petite qui mesure seulement 0,7 µm de diamètre (voir figure 19.11c), soit une taille inférieure à celle d’Escherichia coli ! Les mers fermées sont typiquement plus riches du point de vue nutritionnel que les eaux océaniques du large, et abritent donc des populations plus denses d’organismes phototrophes (voir figure 19.12). On y trouve en conséquence de plus fortes densités de bactéries chimiotrophes et d’animaux marins, poissons, coquillages et crustacés. Les baies marines et les bras de mer recevant des rejets domestiques ou industriels peuvent aussi présenter des populations élevées de phytoplancton et de bactéries. Dans le cas de pollutions sévères, les eaux marines peu profondes peuvent même devenir anoxiques, et impropres à la vie marine en raison de l’utilisation de l’oxygène par la respiration aérobie, et la production d’H2S par les bactéries sulfato-réductrices (voir section 19.13).

La microbiologie des océans Malgré de faibles concentrations en nutriments inorganiques et en carbone organique, un nombre significatif (entre 105 et 106 / mL) de cellules procaryotiques vivent en suspension dans ces eaux. De plus, on y trouve également de l’ordre

(a)

(b)

Alexandra Z. Worden, Brian P. Palenik

La productivité primaire

Alexandra Z. Worden, Mya E. Breitbart

Par comparaison avec les environnements d’eau douce, les concentrations en nutriments des milieux océaniques sont en général très faibles. Ceci est particulièrement vrai pour des nutriments essentiels comme l’azote, le phosphore et le fer. L’activité des producteurs primaires (surtout la fixation photosynthétique du CO2) est limitée par ces déficits en nutriments, et les cellules microbiennes sont classiquement moins nombreuses dans les océans que dans les écosystèmes d’eau douce. Cependant, en raison du volume énorme des océans, la photosynthèse et la production d’oxygène totale sont des facteurs majeurs dans l’équilibre du carbone sur Terre. L’influence des communautés microbiennes marines s’étend de la chaîne alimentaire marine au climat de la Terre.

Hans W. Paerl, Université de Californie du nord, Chapel Hill

19.6 Habitats marins et distribution m n des micro-organismes

(c) FIGURE 19.11 Phototrophes oxygéniques marins. (a) Coloration phylogénétique (FISH) (section 18.4) de cellules du prochlorophyte Prochlorococcus, le phototrophe dominant des eaux océaniques subtropicales. (b) La cyanobactérie fixatrice d’azote Trichodesmium. Les cellules forment des touffes qui fixent intensément N2 dans les eaux tropicales du monde entier. Un filament de Trichodesmium mesure environ 6 µm de diamètre. Pour plus de détails sur les prochlorophytes, les algues et les cyanobactéries, voir les sections 12.26, 14.13 et 12.25. (c) Image en microscopie électronique en transmission d’une cellule d’Ostreococcus, une très petite algue (eucaryote) très présente dans les eaux marines côtières. La flèche désigne le chloroplaste. Les cellules de Prochlorococcus et Ostreococcus ont un diamètre d’environ 0,7 µm.

de 104 cellules / mL de très petits eucaryotes. Comment vivent ces organismes ? De nombreux résultats concordent sur le fait que les métabolismes phototrophes sont à la base de toutes ces communautés planctoniques hauturières. Certains de ces organismes tels Prochlorococcus, Trichodesmium et d’autres minuscules phototrophes eucaryotes ont été présentés (voir figure 19.11). Il existe dans ces environnements d’autres phototrophes qui réalisent la photosynthèse anoxygénique. Il ne s’agit pas cependant de bactéries pourpres et vertes classiques



640 Chapitre 19


métabolisme semble être très répandue chez les Bacteria et peut avoir évolué (ou aussi avoir été obtenue de transferts latéraux) en raison des faibles concentrations en donneurs d’électrons organiques et inorganiques disponibles dans ces eaux marines.

La distribution des Bacteria et des Archaea

Baie de Chesapeake

Otis Brown et Robert Evans, NASA

Grands Lacs

FIGURE 19.12 Image satellite de la distribution de la chlorophylle dans l’Atlantique nord-ouest. La côte est des États-Unis (de la Floride au Nord du Maine) est indiquée en pointillé. La baie de Chesapeake est située au centre de la photographie ; les Grands Lacs en haut à gauche. Les zones riches en phytoplancon sont colorées en rouge (concentration en chlorophylle supérieure à 1 mg/m 3) ; les zones bleu et mauve sont de plus faibles concentrations en chlorophylle (inférieures à 0,01 mg/m3). Notez la forte production primaire des zones côtières et des Grands Lacs.

(voir sections 12.2 et 12.33), qui fonctionnent en conditions anaérobies. Ici, il s’agit de phototrophes anoxygéniques aérobies, des organismes réalisant la photosynthèse anoxygénique, mais seulement en conditions aérobies. On y trouve des protéobactéries des genres Erythrobacter et Roseobacter, qui réalisent la photosynthèse et vraisemblablement utilisent l’ATP produit pour leur métabolisme et leur croissance. La diversité de ces micro-organismes semble être assez élevée en milieu marin, particulièrement dans les baies. On les rencontre également dans les lacs d’eau douce. Outre ces phototrophes, de nombreux procaryotes vivant en mer dans la zone euphotique (les 300 premiers mètres) contiennent une forme du pigment de la vision, la rhodopsine. Les cellules utilisent ce pigment pour transformer l’énergie lumineuse en ATP. La bactériorhodopsine, présente chez les Archaea halophiles extrêmes du genre Halobacterium, est bien connue, et est impliquée dans la synthèse d’ATP (voir section 13.3). Chez les procaryotes des eaux océaniques, on trouve une forme proche de bactériorhodopsine, mais les cellules qui en contiennent sont cette fois des Bacteria (lignée des protéobactéries) et non des Archaea. Cette molécule, nommée protéorhodopsine, est vraisemblablement à la base du métabolisme énergétique de ces bactéries, qui ne peuvent bénéficier que de faibles ressources en matière organique. La génomique environnementale (voir section 18.6) a montré qu’il existe des gènes codant diverses protéines de type rhodopsine dans plusieurs phyla de Bacteria, différentes des protéobactéries, présents dans les océans. Cette forme particulière de

Le nombre de procaryotes dans les océans décroît avec la profondeur. Comme indiqué précédemment, dans les eaux de surface, l’abondance cellulaire moyenne se situe entre 105 et 106 cellules / mL. L’utilisation de colorations phylogénétiques différenciant les cellules de chaque domaine (voir section 18.4) montre une intéressante distribution des Bacteria et des Archaea en fonction de la profondeur. En général, les espèces de Bacteria prédominent dans les eaux de surface (< 1 000 m), tandis que leurs nombres sont à peu près équivalents, avec une faible prédominance des Archaea dans les eaux plus profondes (voir figure 19.13). Ces Archaea des eaux les plus profondes sont exclusivement des membres des Crenarchaeota, un phylum contenant des hyperthermophiles (voir sections 13.8-13.11). En extrapolant les données de la figure 19.13, il a été estimé que 1,3 × 1028 cellules d’Archaea et 3,1 × 1028 cellules de Bacteria existent dans l’ensemble des océans, soit la plus forte biomasse microbienne à la surface de la Terre (voir section 1.3).

Contrôlez vos acquis Les eaux marines sont plus pauvres en nutriments que la plupart des eaux douces, bien qu’il y existe un très grand nombre de micro-organismes. Beaucoup d’entre eux utilisent la lumière pour permettre la synthèse d’ATP. En ce qui concerne les procaryotes, les espèces du domaine des Bacteria prédominent dans les eaux océaniques de surface, tandis que les Archaea sont plus abondantes en profondeur. •

Comment Prochlorococcus contribue-t-il à la fois aux cycles du carbone et de l’oxygène dans l’océan ?

•

Qu’est-ce que la protéorhodopsine et pourquoi est-elle nommée ainsi ? En quoi la découverte de la protéorhodopsine résout-elle le mystère du grand nombre de cellules bactériennes existant dans des eaux océaniques pratiquement dépourvues de matière organique dissoute ?

•

Comment sont distribuées les Bacteria et les Archaea dans les eaux océaniques ?

19.7 Microbiologie abyssale m n La lumière visible ne pénètre pas au-delà de 300 m dans l’océan ; cette région est appelée la zone euphotique (voir figure 19.13). Au-dessous de la zone euphotique, jusqu’à une profondeur d’environ 1 000 m, il existe une activité biologique très importante résultant des activités des animaux et bactéries chimioorganotrophes. Au-dessous de 1 000 m, l’activité biologique est plus faible et ces régions constituent les océans profonds ou



19.7 Microbiologie abyssale 641 Surface

Profondeur

Zone euphotique

Archaea

Archaea Bacteria Cellules/mL

Bacteria 5m

3 X 104 3 X 105

10

100 m

100

500 m

3 X 104 2 X 105

2 X 104 3 X 104

1 000 m 7 X 103 1 X 104

1 000

2 000 m 5 X 103 3 X 103 5 000 m 4 X 103 4 X 103

5 000 0

20

40

60

80

100

Pourcentage du nombre total (a)

(b)

FIGURE 19.13 Pourcentages des procaryotes appartenant aux domaines des Bacteria et des Archaea dans les eaux du Pacifique nord. (a) Distribution des Bacteria et des Archaea en fonction de la profondeur. (b) Abondance des Archaea et des Bacteria en fonction de la profondeur (par mL). D’après Nature, 409 : 507-510, 2000.

ce sont les barotolérants. D’autres se développent mieux lorsque la pression est élevée : ce sont les barophiles. Les organismes isolés des profondeurs d’environ 3 000 m et testés pour leur croissance ou leur activité métabolique en fonction de la pression sont typiquement barotolérants ; chez ces organismes, les plus fortes activités métaboliques sont observées pour 1 atmosphère plutôt que pour 300 atmosphères, bien que les taux de croissance aux deux conditions de pression soient à peu près identiques (voir figure 19.14). Cependant, les isolats barotolérants ne se développent pas à des pressions supérieures à 500 atm ; par contre, les cultures obtenues d’échantillons prélevés à de plus grandes profondeurs, 4 000-6 000 m, sont typiquement barophiles et croissent optimalement à des pressions supérieures à 400 atmosphères. Cependant, bien que les barophiles se développent mieux sous pression, ils sont encore capables de croître à 1 atm (voir figure 19.14). Dans les eaux les plus profondes (10 000 m), on peut trouver des barophiles extrêmes (obligatoires). Ces organismes requièrent effectivement de fortes pressions pour leur croissance. Par exemple, la bactérie Moritella, isolée de la Fosse des Mariannes (océan Pacifique, profondeur > 10 000 m), se développe plus vite à une pression de 700-800 atm, et presque aussi bien à 1 035 atm, la pression existant dans son habitat naturel (voir figures 19.14 et 19.15). Mais contrairement aux procaryotes barotolérants et barophiles, Moritella ne se développe pas à des pressions inférieures à 400 atm (voir figure 19.14). Il est intéressant de noter que Moritella n’est pas tuée par la décompression et peut tolérer de courtes périodes à de faibles pressions. Cependant, la viabilité est perdue lorsque les cultures demeurent plusieurs heures à la pression atmosphérique. Moritella est aussi sensible à la température. Sa température optimale de croissance est 2 °C, température de son habitat, et la viabilité de cet organisme décroît significativement au-delà de 10 °C.

abysses (deep sea). Plus de 75 % de toutes les eaux des océans correspondent à ces océans profonds, aux profondeurs surtout comprises entre 1 000 et 6 000 m.

5

Les caractéristiques des eaux abyssales

4

Les bactéries barotolérantes et barophiles Les procaryotes abyssaux montrent des réponses différentes à la pression. Certains simplement tolèrent les fortes pressions ;

Barotolérant Taux de croissance

Les organismes habitant les eaux abyssales sont confrontés à trois caractéristiques environnementales extrêmes : basse température, forte pression et faible teneur en nutriments. Au-dessous d’une profondeur de 1 000 m environ, la température des océans est constamment de 2-3 °C. La réponse des micro-organismes aux changements de température a été présentée dans la section 6.10. En conséquence, les bactéries isolées de zones de plus de 1 000 m de profondeur sont psychrophiles (qui aiment le froid). Certaines sont des psychrophiles extrêmes, se développant seulement dans une étroite gamme de température proche de la température in situ. Les micro-organismes abyssaux doivent aussi être capables de résister à la pression hydrostatique associée aux grandes profondeurs. La pression augmente de 1 atm pour environ 10 m. Ainsi, un organisme vivant à 5 000 m doit aussi supporter une pression de 500 atm.

1,0

Barophile

Barophile extrême

0,8

3

0,6

2

0,4

1

0,2

0

200

400

600

800

1 000 1 200

Pression (atm) FIGURE 19.14 Taux de croissance des bactéries barotolérantes, barophiles et barophiles extrêmes. La bactérie barophile extrême (Moritella) a été isolée de la fosse des Mariannes (voir figure 19.15). Notez le taux de croissance lent de ce barophile extrême (échelle des ordonnées à droite), par rapport aux bactéries barotolérantes et barophiles (échelle des ordonnées à gauche). Notez également l’impossibilité de la souche barophile extrême à croître aux faibles pressions.



642 Chapitre 19


FeS, Mn2++ O2

FeO(OH), MnO2

Source chaude (6-23 °C) Fumeur noir (environ 350 °C)

Hideto Takami

Eau de mer

Pénétration 20–100 ºC

FIGURE 19.15 Échantillonnage en milieu abyssal. Le bras du robot submersible Kaiko plonge un carottier dans le sédiment marin au fond de la fosse des Mariannes (au large des Philippines, océan Pacifique), à une profondeur de 10 897 m, en vue d’en récolter un échantillon. Les échantillons de sédiments sont utilisés pour l’enrichissement et l’isolement de bactéries barophiles.

FeS H2S

H 2S

Fluide hydrothermal SO42–

Les effets moléculaires des fortes pressions La pression affecte la physiologie et la biochimie des cellules car elle diminue la capacité des enzymes à se fixer à leurs substrats. Ainsi, les enzymes des barophiles extrêmes doivent se replier de telle façon qu’elles minimisent les effets liés à la pression. Parmi les autres processus potentiellement affectés par la pression, se trouvent la synthèse des protéines et les activités membranaires telles que le transport. Un organisme cultivé sous pression possède une plus forte proportion d’acides gras insaturés dans sa membrane cytoplasmique. Cette modification a vraisemblablement un rôle adaptatif car elle permet à la membrane de conserver sa fluidité aux fortes pressions. Les taux de croissance relativement faibles observés chez les barophiles extrêmes comme Moritella (voir figure 19.14) sont probablement dus à la combinaison des effets de la pression sur la biochimie cellulaire et des effets des basses températures qui diminuent considérablement la vitesse des réactions (voir figure 6.16). Chez les barophiles capables de croître jusqu’à 500-600 atm (voir figure 19.14), il a été montré que la croissance aux fortes pressions s’accompagne d’un changement de la composition protéique de la paroi. Chez une barophile particulièrement bien étudiée, une protéine spécifique de la membrane externe (voir section 4.9), nommée OmpH (outer membrane protein H), est synthétisée par les cellules cultivées sous pression, mais pas chez les cellules cultivées à 1 atm. La protéine OmpH appartient à la catégorie des porines. Les porines sont des protéines de structure qui forment des canaux permettant la diffusion de petites molécules au travers de la membrane externe, vers le périplasme (voir section 4.9 et figure 4.35b). Vraisemblablement, la porine des cellules de cet organisme barophile cultivées à faible pression ne peut fonctionner convenablement lorsque la pression est élevée, et un nouveau type de porine doit être synthétisé. Curieusement, relativement peu de protéines semblent être contrôlées par la pression chez les barophiles, beaucoup de protéines étant identiques quelles que

Sédimentation

S2– HCO3–

Limite des 350 °C

Fe2++S2–

FeS

CO2, CH4 Mn2+ Ca2+ Fe2+ Cu2+

Basalte FIGURE 19.16 Les sources hydrothermales océaniques. Représentation schématique des formations géologiques et des composés chimiques majeurs présents au niveau des sources chaudes et des fumeurs noirs. Au niveau des sources chaudes (voir figure 19.17), le fluide hydrothermal à très haute température est refroidi par l’eau de mer froide (2-3 °C) qui s’enfonce sous le plancher océanique. Au niveau des fumeurs noirs (voir figure 19.19), le fluide hydrothemal d’une température voisine de 350 °C jaillit directement au fond de la mer. Les sources hydrothermales et les fumeurs noirs sont généralement observés à des profondeurs d’environ 2 km. De telles profondeurs peuvent être explorées par des submersibles habités tels l’Alvin, utilisés par des chercheurs du Woods Hole Oceanoraphic Institution (Woods Hole, Massachusetts, États-Unis), ou le Nautile (Ifremer, France).

soient les conditions de culture. La paroi et les protéines de structure associées, ainsi que les protéines de transport, semblent être celles qui varient le plus en réponse à la pression, ce qui suggère qu’elles sont sans doute les clés de ce mode de vie.

Contrôlez vos acquis L’océan profond est un habitat froid, sans lumière, où les fortes pressions hydrostatiques et les faibles disponibilités en nutriments dominent. Les barophiles se développent mieux sous pression, et les barophiles extrêmes, isolés des plus grandes profondeurs, nécessitent de fortes pressions pour se développer. •

Comment évolue la pression en fonction de la profondeur ?

•

Quelles adaptations moléculaires rencontre-t-on chez les barophiles qui leur permettent de croître optimalement sous pression ?



19.8 Sources hydrothermales 643

Les animaux des sources hydrothermales Il est possible d’explorer les sources hydrothermales à l’aide de petits sous-marins habités, ou robotisés, et d’étudier les animaux qui y sont associés. Les communautés d’invertébrés liés aux sources hydrothermales du Pacifique oriental sont constituées principalement de vers tubiformes (vestimentifères) de plus de 2 m de longueur, ainsi que de divers mollusques bivalves (voir figure 19.17). Si l’on considère que les autres régions abyssales sont biologiquement improductives, comment des communautés animales avec de telles densités peuvent-elles exister en l’absence de phototrophes producteurs primaires ? Quelles sont leurs sources d’énergie ? Les analyses chimiques des fluides hydrothermaux ont montré la présence de grandes quantités de composés inorganiques réduits, comprenant de l’H2S, Mn2+, H2 et CO. Certaines sources présentent de faibles concentrations de H2S, mais de fortes concentrations de NH4+. Il n’y a pas de matière organique dans les fluides hydrothermaux. Il est clair que les animaux sont dépendants de l’activité des bactéries chimiolithotrophes (voir sections 12.312-5 et 17.8-17.12) qui croissent aux dépens des sources d’énergie inorganiques émises par les sources. Le dioxyde de carbone, abondant dans l’eau de mer sous forme de CO32– et HCO3–, est transformé en carbone organique par les chimiolithotrophes, et une partie est utilisée pour la nutrition des animaux.

Les micro-organismes des sources hydrothermales De nombreux chimiolithotrophes sulfo-oxydants sont présents dans les cheminées hydrothermales et aux alentours. Des échantillons collectés à proximité des sources ont conduit à des

James Agviar, Woods Hole Oceanographic Institution

(a)

(b) Carl Wirsen, Woods Hole Oceanographic Institution

Bien que l’océan profond soit considéré comme un environnement éloigné, soumis à de basses températures et de fortes pressions, capable de permettre seulement le développement de bactéries barophiles et barotolérantes, il existe quelques exceptions surprenantes. Des communautés animales luxuriantes, vivant grâce à l’activité de micro-organismes, s’assemblent autour des sources hydrothermales, dans de nombreuses régions de l’océan profond. D’un point de vue géologique, ces sources sont associées aux zones d’expansion du plancher océanique, au niveau des dorsales, des régions situées à la limite de plaques tectoniques. L’eau de mer pénètre dans les crevasses au fond des océans, se réchauffe à l’approche du magma, lessive les roches traversées et rejaillit du fond de l’océan (voir figure 19.16). Ces sources chaudes sous-marines portent le nom de sources hydrothermales. Deux types principaux de sources ont été découverts. Les sources de températures modérées émettent des fluides hydrothermaux à des températures allant de 6 à 23 °C (la température de l’eau de mer est 2 °C). Les sources ultra-chaudes, plus connues sous le nom de fumeurs noirs (le fluide hydrothermal très chaud, riche en minéraux, se mélange à l’eau de mer froide et oxygénée, produisant des précipités chimiques de couleur sombre), émettent des fluides dont les températures atteignent 270 à 380 °C (voir figures 19.16 et 19.19). Ces sources ont des flux allant de 0,5-2 cm/s pour les moins chaudes à 1-2 m/s pour les fumeurs noirs.

Dudley Foster, Woods Hole Oceanographic Institution

19.8 Sources hydrothermales m n

(c) FIGURE 19.17 Invertébrés peuplant les sources hydrothermales océaniques. (a) Vers tubiformes (famille des Pogonophora), dans leurs tubes (blancs) d’où sortent les branchies (en rouge). (b) Vue rapprochée des branchies. Les branchies collectent les nutriments des sources hydrothermales, et en particulier l’H 2S. Ce dernier est transporté vers les bactéries symbiotes qui vivent dans les tissus du ver. Voir le texte pour plus de détails. (c) Un banc de moules au voisinage des sources hydrothermales. Notez le dépôt jaune de soufre élémentaire (résultant de l’oxydation d’H2S par les symbiotes chimiolithotrophes) autour des moules. Quelques animaux des sources hydrothermales peuvent dépendre de bactéries nitrifiantes (voir sections 12.3 et 17.12) ou méthylotrophes (sections 12.6 et 17.24) pour leurs nutritions.



644 Chapitre 19

TABLEAU 19.2


PROCARYOTES CHIMIOLITOTROPHES INTERVENANT DANS LA PRODUCTION PRIMAIRE DES SOURCES a HYDROTHERMALES OCÉANIQUES

Chimiolithotrophes

Donneur d’électrons HS , S , S2O32– NH4+, NO2– –

Sulfo-oxydant Nitrifiant

0


Produit de la réaction

O2, NO3–

S , SO4–

O2

NO2–, NO3–

0

0

2–

Sulfato-réducteur

H2

S , SO4

Méthanogène

H2

CO2

CH4

Hydrogèno-oxydant

H2

O2, NO3–

H2O

Fe , Mn

O2

Fe3+, Mn4+

CH4, CO

O2

CO2

Fer et mangano-oxydant b

Méthylotrophe

Voir sections 12.3 à 12.5 et 17.8 à 17.12 (métabolismes chimiolithotrophes). Voir sections 12.6 et 17.24 (méthylotrophie).

cultures de Thiobacillus, Thiomicrospira, Thiotrix et Beggiatoa (voir sections 12.4 et 17.10). De plus des expérimentations in situ ont montré que ces populations de bactéries étaient capables de fixer le CO2, ainsi que d’oxyder H2S et S2O32–. Certaines sources abritent des bactéries nitrifiantes, hydrogénooxydantes, ferro et mangano-oxydantes, ou méthylotrophes, ces dernières se développant sur le monoxyde de carbone ou le méthane émis par les sources (voir chapitre 12). Le tableau 19.2 résume les donneurs et accepteurs d’électrons utilisables par les chimiolithotrophes qui jouent vraisemblablement un rôle dans l’écologie des animaux des sources hydrothermales.

La nutrition des communautés animales De nombreux chimiolithotrophes vivent en associations symbiotiques avec les animaux des sources hydrothermales. Par exemple, les vers tubiformes de 2 m de long (voir figure 19.17) sont dépourvus de tube digestif, d’intestin, d’anus, mais contiennent un tissu gastro-intestinal modifié, constitué d’un tissu spongiforme, nommé le trophosome ; cette structure, qui représente environ la moitié du poids du ver, est remplie de granules de soufre et de très nombreuses cellules procaryotes (voir figure 19.18), environ 3,7 × 109 cellules / g de tissu de trophosome. Ces grandes cellules sphériques sont structurellement semblables à la bactérie marine sulfo-oxydante Thiovulum. Les cellules bactériennes présentent également une activité de l’enzyme RubisCo, et d’autres enzymes du cycle de Calvin, la voie métabolique par laquelle la plupart des autotrophes fixent le CO2 (voir section 17.6). Les bactéries chimiolithotrophes fournissent ainsi la nourriture au ver, l’animal vivant probablement des produits excrétés et des cellules mortes de ses symbiotes. Le panache rouge vif du ver (voir figure 19.17b) est riche en vaisseaux sanguins et capture O2 et H2S, pour les transporter aux chimiolithotrophes du trophosome. Les bivalves (moules et autres) [voir figure 19.17c] sont aussi présents autour des sources, possèdent également des symbiotes sulfo-oxydants, cette fois localisés dans les branchies. Des analyses phylogénétiques (voir chapitre 11) ont montré que chaque espèce animale de ces sources possédait une espèce de symbiote principale, et que les espèces bactériennes étaient différentes selon les animaux considérés.

Les vers tubiformes possèdent une hémoglobine particulière qui se lie aussi bien à l’H2S qu’à l’O2. Cette hémoglobine transporte ces deux composés à la fois, vers le trophosome, en vue de leur utilisation par les symbiotes bactériens. Le piégeage et le transport des sulfures sont nécessaires pour éviter que ce composé n’empoisonne l’animal. La teneur en CO2 du sang du ver est également élevée, environ 20-30 mM et il est probablement libéré dans le trophosome pour servir de source de carbone aux symbiotes. De plus, l’analyse des isotopes stables (voir section 18.8) du soufre élémentaire trouvé à l’intérieur des symbiotes a montré que le rapport 34S/32S pour cet élément était identique à celui des sulfures émis par les sources. Ce rapport est distinct de celui des sulfates présents dans l’eau de mer, ce qui constitue une preuve supplémentaire de la pénétration des sulfures des fluides hydrothermaux dans les tissus du ver.

(a)

Colleen Cavanaugh

b

2+

Colleen Cavanaugh

a

2+

H2S

(b)

FIGURE 19.18 Bactéries chimiolithotrophes sulfo-oxydantes dans le trophosome des vers tubiformes des sources hydrothermales. (a) Image en microscopie électronique à balayage du trophosome montrant les bactéries sphériques chimiolithotrophes sulfo-oxydantes. Les cellules mesurent de 3 à 5 µm de diamètre. (b) Image en microscopie électronique en transmission des bactéries dans une coupe du trophosome. Les cellules sont fréquemment groupées par paire à l’intérieur d’une membrane d’origine inconnue. Les bactéries chimiolithotrophes sulfo-oxydantes sont présentées dans les sections 12.4, 17.8 et 17.10. Reproduit avec l’autorisation de Science, 213 : 340-342, 1981, © AAAS.



19.8 Sources hydrothermales 645

D’autres animaux marins dépendent également de chimiolithotrophes pour leur nutrition. Par exemple, il a été montré que des symbiotes méthanotrophes jouent également un rôle nutritionnel dans le cas de grands bivalves avec lesquels ils vivent en association symbiotique dans des zones de suitements froids relativement peu profondes du Golfe du Mexique (voir figure 12.16). Bien qu’ils ne soient pas strictement des autotrophes (le méthane est un composé organique), ces symbiotes permettent la croissance de l’animal, grâce à l’utilisation de CH4 comme source d’énergie.

Les fumeurs noirs

Contrôlez vos acquis Les sources hydrothermales océaniques sont des sources chaudes abyssales dans lesquelles l’activité volcanique génère des fluides contenant de fortes concentrations de sources d’énergie inorganiques que peuvent utiliser les bactéries chimiolithotrophes. Ces dernières fixent le CO2 en carbone organique, dont une partie est utilisée par les animaux vivant dans ces environnements. Les sources hydrothermales océaniques constituent des habitats dans lesquels les producteurs primaires sont plutôt des chimiolithotrophes que des phototrophes.

Robert D. Ballard

Christian Jeanthon

Les grandes profondeurs océaniques sont soumises à de très fortes pressions hydrostatiques. Par exemple, à une profondeur de 2 600 m, l’eau ne bout pas avant d’atteindre la température de 450 °C. Certaines sources hydrothermales océaniques émettent des fluides à des températures atteignant 350 °C (voir figure 19.16) ; cette eau surchauffée, mais non en ébullition, pourrait en théorie constituer un habitat pour des bactéries hyperthermohiles (voir sections 6.10, 6.12 et chapitre 13). Le fluide hydrothermal émis par les fumeurs noirs contient en abondance des sulfures polymétalliques, et particulièrement des sulfures de fer, et se refroidit rapidement en se mélangeant à l’eau de mer froide. Les sulfures métalliques précipités forment un édifice appelé « cheminée » d’où jaillit le fluide (voir figure 19.19). Bien qu’il soit clair que des procaryotes ne vivent pas dans le fluide hydrothermal surchauffé lui-même, des bactéries thermophiles et hyperthermophiles vivent dans le gradient thermique qui se forme entre le fluide et l’eau de mer lors du mélange. Par exemple, les parois des cheminées hydrothermales contiennent

des procaryotes hyperthermophiles tels que Methanopyrus, un organisme qui oxyde H2 et produit du méthane (voir sections 13.4 et 13.6). La technologie de FISH (voir section 18.4) a permis de détecter des cellules de Bacteria et d’Archaea dans les parois de cheminées hydrothermales (voir figure 19.20). Les plus thermophiles de tous les procaryotes connus, appartenant aux genres Pyrolobus et Pyrodictium (voir sections 13.10-13.13), vivent aussi dans les parois des cheminées hydrothermales. Lorsque les cheminées sont obstruées par des débris minéraux, il est vraisemblable que les hyperthermophiles sont dispersés et colonisent des cheminées néoformées et s’intègrent à leurs parois. De manière surprenante, bien que nécessitant des températures très élevées pour leur croissance, les hyperthermophiles tolèrent remarquablement bien les basses températures et l’oxygène. Aussi, le transport des cellules d’un site hydrothermal à un autre, dans une eau froide et oxygénée, n’est apparemment pas un problème.

FIGURE 19.19 Un fumeur noir d’où jaillit un fluide hydrothermal riche en sulfures et minéraux, à des températures voisines de 350 °C. Les parois du fumeur noir présentent un fort gradient de température et contiennent plusieurs espèces de procaryotes (voir figure 19.20).

FIGURE 19.20 Coloration spécifique de matériel provenant d’un fumeur noir du champ hydrothermal de « Snake Pit » sur la dorsale médio-Atlantique (profondeur : 3 500 m). Un colorant vert fluorescent a été combiné à une sonde caractéristique de l’ARNr 16S de toutes les Bacteria et un colorant rouge a été combiné à une sonde spécifique de l’ARNr 16S des Archaea (sections 11.17 et 18.4). L’abondance des cellules est plus importante dans les parties externes des parois de la cheminée hydrothermale (baignant dans l’eau de mer à 2 °C), et plus faible dans la partie centrale de la cheminée. Le fluide hydrothermal qui circule au centre de la cheminée à une température de 300 °C est stérile. Il est en général admis que la vie microbienne peut exister jusqu’à 150 °C, mais qu’au-delà de cette température, les biomolécules essentielles sont instables (section 13.12).



646 Chapitre 19


•

En quoi une source hydrothermale à température modérée est-elle différente d’un fumeur noir, sur les plans chimique et physique ?

•

Comment se nourrissent les vers tubiformes géants ?

•

Pourquoi l’eau émise à 350 °C par les fumeurs noirs ne bout-elle pas ?

IV

TABLEAU 19.3

Réservoir

19.9 Cycle du carbone m n Globalement, le carbone est recyclé dans tous les réservoirs majeurs de la Terre : l’atmosphère, la terre, les océans et les autres milieux aquatiques, les sédiments et les roches, ainsi que la biomasse (voir figure 19.21). Comme cela a déjà été vu dans le cas des environnements aquatiques, les cycles du carbone et de l’oxygène sont intimement liés, quel que soit l’environnement terrestre considéré.

Les réservoirs de carbone

Ac tiv ité sh

Le plus grand réservoir de carbone est situé dans les sédiments et les roches de la croûte terrestre (voir tableau 19.3), mais le renouvellement est si long que le flux qui en sort est relativement

um

ain

Plantes terrestres

Combustibles fossiles

Animaux et micro-organismes

Humus Formation du sol

Pourcentage du carbone terrestre total

38 × 103 (> 95 % est inorganique)

0,05

Roches et sédiments

75 × 106 (> 80 % est inorganique)

> 99,5b

Biosphère terrestre

2 × 103

0,003

Biosphère aquatique

1–2

0,000002

Combustibles fossiles

4,2 × 103

0,006

Hydrates de méthane

4

10

0,014

Une gigatonne = 109 tonnes. D’après Science 290, p. 291-295 (2000). b L’essentiel du carbone organique se trouve dans les cellules des procaryotes. a

insignifiant à l’échelle d’une vie humaine. Concernant les organismes vivants, une grande quantité de carbone organique se trouve dans les plantes terrestres. Ceci correspond aux forêts et étendues herbeuses, qui constituent le principal site de fixation du CO2 par la photosynthèse. Cependant, encore davantage de carbone est présent dans le matériel organique mort, l’humus, que dans les organismes vivants. L’humus est un mélange complexe de matières organiques. Il dérive en partie des constituants protoplasmiques des microorganismes du sol qui ont résisté à la décomposition et des matériaux végétaux réfractaires. Certaines substances humiques sont très stables, avec un temps de renouvellement d’environ 40 ans, bien que certaines substances humiques puissent être décomposées plus rapidement. La voie la plus rapide de transfert de carbone fait intervenir le CO2 de l’atmosphère. Le dioxyde de carbone est retiré de l’atmosphère essentiellement par la photosynthèse des plantes et y retourne suite à la respiration des animaux et des microorganismes chimio-organotrophes. L’analyse des nombreux

CO2 atmosphérique

es

Carbone (gigatonnes)a

Océans

CYCLES DU CARBONE ET DE L’OXYGÈNE

Le cycle global du carbone implique les activités à la fois des micro-organismes et des macro-organismes, et est intimement lié au cycle de l’oxygène. En raison de l’accélération des rejets de CO2 dans l’atmosphère consécutivement aux activités humaines, le cycle du carbone est depuis longtemps l’objet de travaux scientifiques. Le cycle du carbone est étudié afin de mieux comprendre l’étendue des réservoirs de cet élément, de déterminer les principaux puits de CO2, les taux de recyclage à l’intérieur et entre les compartiments dans le but de modéliser les transformations du carbone et de prévenir des catastrophes planétaires telles que le réchauffement global.

PRINCIPAUX RÉSERVOIRS DE CARBONE SUR TERRE

CO2 dissous Plantes aquatiques et algues

Animaux aquatiques

Croûte terrestre

Formation des roches

Mort et minéralisation dans les sédiments

FIGURE 19.21 Le cycle du carbone. Les cycles du carbone et de l’oxygène sont étroitement liés, car la photosynthèse oxygénique consomme du CO2 et produit de l’O2, tandis que les processus respiratoires produisent du CO2 et consomment de l’oxygène (voir aussi section 19.5). La transformation du carbone dans la biosphère de subsurface pourrait être aussi significative que celle se produisant à la surface de la Terre, mais il n’existe pas encore d’estimation fiable de ce phénomène. On pense que la plus grande partie des cellules procaryotiques vivant sur Terre sont localisées dans les subsurfaces continentale et océanique (voir sections 1.3 et 19.4).



19.9 Cycle du carbone 647

processus suggère que la plus importante contribution en CO2 vers l’atmosphère est la décomposition microbienne des matières organiques mortes, humus compris. Cependant, ces derniers temps, les activités humaines ont contribué considérablement au réservoir atmosphérique de CO2. Par exemple, ces 40 dernières années, les niveaux de CO2 dans l’atmosphère ont augmenté de presque 14 %.

(CH2O)n

Matière organique Photosynthèse oxygénique

Chimiolithotrophie

L’importance de la photosynthèse dans le cycle du carbone Les seules principales voies par lesquelles du carbone organique nouveau est synthétisé sur Terre sont la photosynthèse et la chimiosynthèse (fixation du CO2 par les chimiolithotrophes) ; la plupart du carbone organique provient de la photosynthèse. Les organismes photosynthétiques sont donc à la base du cycle du carbone (voir figure 19.21). Les organismes phototrophes vivent dans la nature, presque exclusivement dans les habitats où la lumière est disponible. Ainsi, l’océan profond et d’autres habitats en permanence à l’obscurité sont dépourvus de phototrophes indigènes. Les phototrophes oxygéniques peuvent être divisés en deux principaux groupes : les plantes supérieures et les microorganismes. Les plantes supérieures sont les organismes phototrophes dominant dans les environnements terrestres, tandis que les micro-organismes phototrophes sont les organismes photosynthétiques les plus abondants des environnements aquatiques. Le cycle redox du carbone (voir figure 19.22) commence par la photosynthèse : CO2 + H2O → (CH2O) + O2 Lumière Dans cette réaction, (CH2O) représente la matière organique au niveau d’oxydation du matériel cellulaire, tel que les polysaccharides (la principale forme sous laquelle la matière organique résultant de la photosynthèse est conservée dans la cellule). Les organismes phototrophes réalisent aussi la respiration, à la fois à la lumière et à l’obscurité. L’équation globale pour la respiration est l’inverse de celle de la photosynthèse oxygénique : (CH2O) + O2 →CO2 + H2O Lumière ou obscurité Dans cette réaction, (CH2O) représente à nouveau les polysaccharides de réserve. Si un organisme phototrophe doit augmenter sa masse ou son nombre de cellules, alors le taux de photosynthèse doit excéder le taux de respiration. Si la croissance se produit, une partie du carbone fixé à partir du CO2 en polysaccharides doit devenir le matériel de départ pour la biosynthèse. Le cycle complet du carbone est bâti sur un bilan net positif du taux de la photosynthèse sur celui de la respiration.

La décomposition Le carbone fixé par photosynthèse est finalement dégradé par les micro-organismes et il en résulte deux formes majeures : le méthane (CH4) et le dioxyde de carbone (CO2)

Processus aérobies

Méthanotrophie Methanotrophy CO2

CH4

Zone oxique Zone anoxique

Méthanogénèse Acétogénèse Composés méthylés et acétate

Respiration anaérobie et fermentation

Photosynthèse anoxygénique Matière organique (CH2O)n

FIGURE 19.22 Cycle biogéochimique du carbone. La figure distingue les processus autotrophes (CO2 → composés organiques) et les processus hétérotrophes (composés organiques → CO2). Les flèches jaunes indiquent les oxydations et les rouges, les réductions.

(voir figure 19.22). Ces deux gaz sont formés par l’activité des méthanogènes (CH4) et des chimio-organotrophes via la fermentation, la respiration aérobie ou anaérobie (CO2). Dans les habitats anoxiques, CH4 est produit à la fois par la réduction de CO2 par H2, et à partir de certains composés organiques comme l’acétate. Cependant, pratiquement n’importe quel composé organique peut être converti en CH4 suite aux activités combinées des bactéries syntrophes et des méthanogènes : H2, généré au cours de la dégradation des composés organiques par la fermentation, est consommé par les méthanogènes et converti en CH4 (voir section 17.17 et section suivante). Le méthane produit dans les environnements anoxiques est insoluble et migre vers les environnements oxygénés où il est oxydé en CO2 par les méthanotrophes (voir figure 19.22). Ainsi, tout le carbone organique retourne finalement en CO2 et le cycle du carbone est achevé. L’équilibre entre les parties oxydantes et réductrices du cycle du carbone est critique : les produits du métabolisme de quelques organismes sont les substrats pour d’autres. Ainsi, le cycle doit demeurer équilibré s’il doit se poursuivre comme il a fonctionné depuis des milliards d’années. N’importe quels changements significatifs dans les niveaux des formes gazeuses du carbone pourraient avoir des conséquences globales sérieuses (c’est le cas du réchauffement global dû à l’augmentation des niveaux de CO2 dans l’atmosphère, suite à la déforestation et à la combustion des carburants fossiles). En termes de décomposition, le CO2 libéré par les activités microbiennes excède de loin celui libéré par les eucaryotes, et ceci est particulièrement vrai pour les environnements anoxiques.



648 Chapitre 19


Polymères complexes

Contrôlez vos acquis Les cycles du carbone et de l’oxygène sont interconnectés via les activités complémentaires des organismes autotrophes et hétérotrophes. La décomposition microbienne est la seule grande source du CO2 libéré dans l’atmosphère. •

Comment est fabriquée la matière organique nouvelle dans la nature ?

•

Comment la photosynthèse oxygénique et la respiration sont-elles liées ?

m n

19.10 Syntrophie et méthanogenèse

Le méthane issu des processus biologiques (méthanogenèse) a une grande importance dans le flux de carbone au sein de nombreux environnements anoxiques. La méthanogenèse est réalisée par un groupe d’Archaea, les méthanogènes, qui sont des anaérobies stricts. La biochimie des méthanogènes a été étudiée dans la section 17.17, et les méthanogènes eux-mêmes dans la section 13.4. La plupart des méthanogènes utilisent le CO2 comme accepteur terminal d’électrons dans la respiration anaérobie, et le réduisent en méthane avec H2 comme donneur d’électrons (voir figure 19.22). Seuls quelques autres substrats, le principal étant l’acétate, peuvent être directement convertis en méthane par les méthanogènes. Aussi, pour convertir la plupart des molécules organiques en méthane, les méthanogènes doivent faire équipe avec des partenaires qui leur fournissent les substrats nécessaires. Ces partenaires sont les synthrophes.

Décomposition anaérobie et syntrophie Le concept de syntrophie et les questions d’énergétique afférentes ont été présentés dans la section 17.21 ; c’est un processus dans lequel deux organismes ou plus coopèrent dans la dégradation d’un composé particulier. Les interactions écologiques des bactéries syntrophes avec les autres organismes, et leur rôle dans la partie anaérobie du cycle du carbone seront abordés maintenant. L’exemple choisi est celui des sédiments anoxiques d’eau douce où se déroulent de nombreux métabolismes anaérobies. Les polymères tels que les polysaccharides, les protéines et les graisses subsistent à la mort d’un organisme, et sont convertis en CO2 et CH4 par les interactions coopératives de plusieurs groupes physiologiques de procaryotes. Lors de la dégradation d’un polysaccharide typique comme la cellulose (voir figure 19.23 et tableau 19.4), le processus débute avec des bactéries cellulolytiques, qui clivent la molécule de cellulose en cellobiose (glucose-glucose), puis en glucose simple. Le glucose est alors fermenté par des fermenteurs primaires pour donner divers produits de fermentation dont l’acétate, le propionate, le butyrate, le succinate, des alcools, H2 et CO2. H2, ainsi produit lors des fermentations primaires, est employé par les consommateurs d’H2 que sont les méthanogènes, les homoacétogènes, les sulfato-réducteurs (ces derniers ne fonctionnent que dans des environnements contenant des sulfates). En plus, l’acétate peut être transformé en méthane par certains

Cellulose et autres polysaccharides, protéines Bactéries cellulolyiques et hydrolytiques

Hydrolyse

Monomères Sucres, acides aminés Bactéries Fermentation fermentatives

Acétate–

H2 + CO2 HomoaAcétogénèse cétogènes Acétate–

Méthanogènes

Propionate– Butyrate– Succinate2– Alcools

Bactéries productrices d’H2, oxydant Fermentation les acides gras (syntrophes)

H2 + CO2

Acétate–

Méthanogènes Méthanogènes Méthanogénèse CH4 + CO2

FIGURE 19.23 Décomposition anaérobie. La figure présente une vue d’ensemble des processus de décomposition anaérobie dans lesquels coopèrent de nombreux groupes de bactéries fermentatives anaérobies pour la conversion de matière organique complexe en méthane (CH 4) et CO2. L’acétate, ainsi que H2 et CO2 résultant des fermentations primaires, peuvent être directement convertis en méthane, mais H 2 et CO2 peuvent aussi être utilisés par les homoacétogènes. L’activité des microorganismes syntrophes transforme les acides gras et les alcools en substrats pour la méthanogenèse et l’acétogénèse. Ce processus est valable pour les environnements où les bactéries sulfato-réductrices jouent seulement un rôle mineur, par exemple dans les sédiments des lacs d’eau douce, les bioréacteurs à eaux usées ou le rumen.

méthanogènes. Mais tous ces processus laissent néanmoins une grande quantité de carbone sous forme d’acides gras et d’alcools. Le catabolisme de ces composés fait intervenir les syntrophes (voir figure 19.23).

Le rôle des syntrophes Les organismes clés dans la conversion des composés organiques complexes en méthane sont les syntrophes. Ces organismes sont en fait des fermenteurs secondaires. Les syntrophes fermentent les produits de fermentation des fermenteurs primaires, produisant H2 et d’autres composés. Par exemple,



19.10 Syntrophie et méthanogenèse 649

TABLEAU 19.4

PRINCIPALES RÉACTIONS INTERVENANT DANS LA CONVERSION ANAÉROBIE DES COMPOSÉS a ORGANIQUES EN MÉTHANE

Réaction type

Énergie libre libérée (kJ/réaction)

Réaction

∆G0’b Fermentation du glucose en acétate, H2 et CO2

Glucose + 4 H2O → 2 acétate– + 2 HCO3– + 4 H+ + 4 H2 –

HCO3– +

Fermentation du glucose en butyrate, CO2 et H2

Glucose + 2 H2O → Butyrate + 2

Fermentation du butyrate en acétate et H2

Butyrate– + 2 H2O → 2 Acétate– +H + H2

Fermentation du propionate en acétate, CO2 et H2

–

–

Propionate + 3 H2O → Acétate +

+

+ 2 H2 + 3 H

HCO3–

–

+

+ H + H2 +

∆Gc

– 207

– 319

– 135

– 284

+ 48,2

– 17,6

+ 76,2

– 5,5

Fermentation de l’éthanol en acétate et H2

2 Éthanol + 2 H2O → 2 Acétate + 4 H2 + 2 H

+ 19,4

– 37

Fermentation du benzoate en acétate, CO2 et H2

Benzoate– + 7 H2O → 3 Acétate– + 3 H+ + HCO3– + 3 H2

+ 70,1

– 18

Méthanogenèse à partir de H2 et CO2

4 H2 + HCO3– + H+ → CH4 + 3 H2O Acétate– + H2O → CH4 + HCO3– 4 H2 + 2 HCO3– + H+ → Acétate– +

– 136

– 3,2

– 31

– 24,7

– 105

– 7,1

Méthanogenèse à partir de l’acétate Acétogénèse à partir de H2 et CO2

4 H2O

a

D’après Zinder, S. 1984. “Microbiology of anaerobic conversion of organic wastes to methane: Recent developments”. Am. Soc. Microbiol. News 50, p. 294298. b Conditions standard : composés solubles, 1 M ; gaz, 1 atm. c Concentrations des réactifs dans un écosystème d’eau douce anoxique typique : acides gras, 1 mM; HCO3–, 20 mM; glucose, 10 µM; CH4, 0,6 atm ; H2, 10–4 atm. Voir Annexe 1 pour le calcul de ∆G à partir de ∆G0’.

Syntrophomonas wolfei oxyde les acides gras en C4 à C8 pour donner de l’acétate, du CO2 (si l’acide gras contient un nombre impair d’atomes de carbone) et H2 (voir tableau 19.4). D’autres espèces de Syntrophomonas utilisent des acides gras comportant jusqu’à 18 carbones, y compris quelques acides gras insaturés. Syntrophobacter wolinii est spécialisé dans l’oxydation du propionate, ce qui donne de l’acétate, CO2 et H2, tandis que Syntrophus gentianae dégrade le benzoate (composé aromatique) en acétate, H2 et CO2 (voir tableau 19.4). En fait, avec la bonne combinaison d’organismes, pratiquement n’importe quelle molécule organique peut être convertie en méthane. Cependant, il faut se rappeler que les producteurs d’H2, les syntrophes, sont incapables d’effectuer leurs réactions de syntrophie en culture pure ; leur croissance n’est possible qu’en présence d’un partenaire consommateur d’H2, compte tenu de l’énergétique du processus. Comme cela a été expliqué dans la section 17.21, la consommation d’H2 par l’organisme partenaire est absolument essentielle pour la croissance des syntrophes. Lorsque les réactions du tableau 19.4 sont écrites avec tous les réactifs en conditions standard (solutés, IM ; gaz, 1 atm), les réactions donnent des changements d’énergie libre positifs. Cela signifie que le ∆G0’ (voir section 5.4) de ces réactions n’est pas exergonique (voir tableau 19.4). Mais la consommation d’H2 par le partenaire change énormément le tableau énergétique, donnant une énergie suffisante pour la croissance des syntrophes. On peut le voir dans le tableau 19.4, dans lequel les valeurs de ∆G (changements d’énergie libre mesurés dans les conditions réelles de l’environnement) sont favorables pour la conservation de l’énergie si les concentrations de H2 sont maintenues très basses par les activités du partenaire. Les produits terminaux de ces coopérations métaboliques sont CO2 et CH4. La liste des substances catabolisées par syntrophie est presque infinie et inclut même des hydrocarbures saturés.

L’oxydation anaérobie du méthane Dans les écosystèmes d’eau douce, le méthane, produit dans les sédiments anoxiques, est oxydé en CO2 par les méthanotrophes lorsqu’il atteint les zones oxygénées (voir figure 19.22). Ces procaryotes méthano-oxydants nécessitent O2 pour cataboliser le méthane, car la première étape de l’oxydation du méthane fait intervenir une enzyme, la mono-oxygénase (voir sections 17.22 et 17.24 et figures 17.55 et 17.58). Cependant, le méthane peut être oxydé en conditions anaérobies dans les sédiments marins par des agrégats cellulaires contenant certaines bactéries sulfato-réductrices et des méthanogènes (voir figure 19.24a). La façon dont le méthane peut être oxydé par ces agrégats n’est pas encore connue avec précision, mais deux hypothèses ont été suggérées. Selon l’une, les méthanogènes oxydent le méthane en CO2 en inversant les étapes de la méthanogenèse (voir section 17.17 et figure 19.24b). Cette réaction est défavorable du point de vue énergétique, sauf si H2 produit est consommé par un second organisme, soit un type de métabolisme syntrophe. Ceci pourrait être le rôle joué par les sulfatoréducteurs, qui consomment H2 et produisent H2S (voir figure 19.24). Ce processus libère une très petite quantité d’énergie (voir figure 19.24b), et la manière dont cette énergie peut être répartie entre les deux composants de l’agrégat n’est pas claire. L’autre hypothèse serait que les méthanogènes convertissent CH4 en acétate, qui serait alors oxydé en CO2 par les sulfatoréducteurs. Quelle que soit la façon dont fonctionne ce partenariat, l’oxydation anaérobie du méthane est indiscutablement un mécanisme de syntrophie dans lequel deux organismes coopèrent pour réaliser une réaction qu’aucun des deux ne peut réaliser seul. Des travaux récents de génomique environnementale (voir section 18.6) portant sur ces agrégats cellulaires réalisant l’oxydation anaérobie du méthane penchent en faveur de l’hypothèse de la méthanogenèse inverse.



650 Chapitre 19


TABLEAU 19.5

ESTIMATIONS DES ÉMISSIONS a DE MÉTHANE DANS L’ATMOSPHÈRE Émission de méthane (1012 g/an)

Antje Boetius et Armin Gieseke

Source Biogénique

(a) Organisme ∆G0′(kJ)

Réaction CH4 + 2 H2O SO 42- + 4 H2 + H+ Total : SO 42- + CH4

Méthanogène +131 SulfatoHS- + 4 H2O réducteur –156 CO2 + 4 H2

HCO3– + HS+ H 2O

Réaction syntrophique

–25

(b) FIGURE 19.24 Oxydation anaérobie du méthane. (a) Aggrégats de cellules méthano-oxydantes dans des sédiments marins. Les aggrégats contiennent des méthanogènes (en rouge) entourés de bactéries sulfato-réductrices (en vert). Chaque type cellulaire est coloré par un fluorochrome spécifique (FISH) différent (section 18.4). Le diamètre de l’aggrégat est d’environ 30 µm. (b) Mécanisme possible pour l’oxydation anaérobie du méthane par syntrophie dans les aggrégats cellulaires.

Les habitats des méthanogènes Bien que les méthanogènes effectuent un métabolisme très spécialisé, en conditions strictement anaérobies, ils sont très répandus sur Terre. De fortes activités de méthanogenèse existent dans les environnements anoxiques, tels que les marais et zones humides, ou dans le rumen (voir section 19.11), et ce processus se rencontre aussi dans des habitats que l’on considère habituellement comme oxygénés, comme les forêts et les prairies. Dans ces habitats, la méthanogenèse se produit seulement dans des microenvironnements anoxiques comme au milieu de grains de sol (voir figure 19.2). Le tableau 19.5 montre les taux de méthanogenèse dans différents habitats. Notez que la production biogénique de méthane excède la production de gaz naturels et autres sources abiogéniques. L’éructation des ruminants (voir section 19.11) ainsi que le CH4 libéré par les termites, les tourbières et les zones humides naturelles représentent les plus importantes sources de méthane biogénique. Des méthanogènes endosymbiotes de certains protozoaires sont également connus. Plusieurs types de protozoaires incluant des amibes aquatiques libres et des flagellés vivant dans les tractus digestifs d’insectes, abritent des méthanogènes. Chez les termites par exemple, les méthanogènes sont présents essentiellement dans les cellules des protozoaires habitant l’intestin postérieur (voir figure 19.25). Les symbiotes méthanogènes des protozoaires ressemblent aux espèces en forme de bâtonnets des genres Methanobacterium et

Ruminants

80–100

Termites

25–150b

Rizières

70–120

Zones humides

120–200

Décharges

5–70

Océans et lacs

1–20

Toundras

1–5

Abiogénique Mines de charbon

10–35

Gaz naturels

10–30

Pertes industrielles

15–45

Combustion de biomasse

10–40

Hydrates de méthane

2–4

Volcans

0,5

Automobiles

0,5

Total

350–820

Total biogénique

302–665

81–86 % du total

Total abiogénique

48–155

13–19 % du total

a

D’après les estimations de Tyler, S. C. 1991. “The global methane budget”, p. 7-58, in E. J. Rogers and W. B. Whitman (eds.), Microbial Production and Consumption of Greenhouse Gases: Methane, Nitrogen Oxides, and Halomethanes, American Society for Microbiology, Washington, DC. b Des estimations plus récentes indiquent que les valeurs les plus faibles sont probablement les plus précises.

Methanobrevibacter (voir section 13.4), mais leurs relations avec les méthanogènes libres ne sont pas bien établies. On pense que dans l’intestin postérieur du termite, les méthanogènes rendent service à leurs hôtes en consommant H2 produit lors de la fermentation du glucose par des protozoaires cellulolytiques. Les termites n’en sont pas moins une source importante de CH4 biogénique.

Les habitats des acétogènes L’acétogénèse est un processus rival de la méthanogenèse (voir section 17.16). Dans certains habitats, par exemple le rumen (voir section 19.11), les homoacétogènes apparaissent comme de pauvres compétiteurs vis-à-vis des méthanogènes, et la méthanogenèse est donc le processus majeur de consommation d’H2 ; mais dans d’autres habitats, comme l’intestin postérieur des termites, où la méthanogenèse existe, l’acétogénèse semble être un processus plus important. Quel est le facteur déterminant la forme principale de métabolisme anaérobie dans l’intestin postérieur du termite ? Si l’on considère simplement les données énergétiques, la méthanogenèse à partir de H2 est plus favorable que l’acétogénèse (–131 kJ contre –105 kJ), les méthanogènes étant donc avantagés. Cependant, ce n’est pas le cas chez les termites.



19.11 Cycle du carbone chez les ruminants 651

Méthanogenèse ou réduction des sulfates

John A. Breznak

La méthanogenèse et l’acétogénèse sont plus intenses dans les environnements terrestres et dulçaquicoles anoxiques que dans les sédiments marins. La raison en est que les bactéries sulfato-réductrices sont abondantes dans les sédiments marins et rivalisent avec les méthanogènes et les acétogènes pour H2. La base biochimique de ceci est que l’énergétique de la réduction des sulfates par H2 est meilleure que la réduction de CO2 par H2, en CH4 ou en acétate (voir sections 17.15-17.17), ce qui favorise la réduction des sulfates. Dans les eaux douces cependant, lorsque la sulfurogénèse est faible, les sulfates étant limitants, la méthanogenèse et l’acétogénèse dominent.

(a)

Monica Lee et Stephen Zinder

Monica Lee et Stephen Zinder


(b)

En conditions anoxiques, la matière organique est dégradée principalement en CH4 et CO2. Beaucoup de CH4 est formé par la réduction de CO2 par l’hydrogène fourni par les bactéries syntrophes productrices d’H2 ; ces organismes dépendent de la consommation de H2 pour équilibrer leur bilan énergétique. Globalement, le CH4 biogénique est plus abondant que le CH4 abiogénique. •

Quelles sortes d’organismes peuvent croître en coculture avec Syntrophomonas ?

•

Quel est le produit final de l’acétogénèse ? Dans quel habitat anoxique y a-t-il plus d’acétogénèse que de méthanogenèse ?

•

Pourquoi la méthanogenèse à partir de H2 n’est pas un processus majeur dans les sédiments marins ?

•

Comment CH4 est-il oxydé en l’absence d’O2 ?

(c)

FIGURE 19.25 Métabolisme du carbone chez les termites. (a) Larve d’un ouvrier de termite commun de l’Est des États-Unis, représenté au-dessous d’un intestin postérieur d’ouvrier extrait d’un autre animal. L’animal mesure environ 0,5 cm de long. L’acétogénèse est la forme majeure du métabolisme anaérobie du carbone chez ces termites, où l’on rencontre également la méthanogenèse. (b, c) Micro-organismes de l’intestin postérieur du termite Zootermopsis angusticolis. Le même champ microscopique est observé par deux méthodes différentes. (b) Contraste de phase. (c) Épifluorescence montrant la couleur typique des méthanogènes due à la forte concentration du coenzyme F 420, naturellement fluorescent (section 17.17 et figures 17.42 et 17.43). Les méthanogènes sont localisés à l’intérieur des cellules du protozoaire Tricercomitis sp. Les particules végétales fluorescent en jaune. Le diamètre moyen des cellules de protozoaires est de 15-20 µm. Voir section 4.1 pour une explication de la microscopie à fluorescence.

Trois raisons – chacune vérifiée expérimentalement – expliquent cette situation. En premier lieu, les homoacétogènes sont capables de se localiser dans le tube digestif du termite plus près de la source d’H2 que les méthanogènes, et consomment ainsi la majorité de l’hydrogène produit lors de la fermentation de la cellulose. Ensuite, contrairement aux méthanogènes, les homoacétogènes peuvent fermenter le glucose (provenant de la cellulose). Enfin, les termites mangent du bois, qui contient une forte proportion de lignine mélangée à la cellulose, et ce type de matériel est dégradé de telle façon qu’il favorise l’acétogénèse. Ainsi, la combinaison de plusieurs facteurs dans l’habitat particulier qu’est l’intestin postérieur du termite contribue à la domination de l’acétogénèse sur la méthanogenèse, ce qui est une situation atypique dans les environnements anoxiques.

19.11 Cycle du carbone m n chez les ruminants Les ruminants sont des mammifères herbivores qui possèdent un organe digestif particulier, le rumen (ou panse). Dans le rumen, la digestion de la cellulose et d’autres polysaccharides végétaux est effectuée par des micro-organismes. Plusieurs animaux domestiques importants sont des ruminants : vaches, moutons, chèvres. L’alimentation humaine dépendant en grande partie de ces animaux, la connaissance de la microbiologie du rumen a une importance économique considérable.

Anatomie et rôle du rumen L’essentiel de la matière organique constituant les plantes terrestres se présente sous forme de polysaccharides, la cellulose étant le plus important. Les mammifères, et en fait presque tous les animaux, sont dépourvus des enzymes nécessaires à la digestion de la cellulose ; par contre, les ruminants peuvent métaboliser la cellulose grâce à des micro-organismes, agissant en tant qu’agents de la digestion. Les caractéristiques essentielles du rumen en tant que lieu où se fait la digestion de la cellulose sont son volume important (100-150 l chez la vache,




6 l chez le mouton) et sa position dans le tractus digestif, en avant de l’estomac acide. La température chaude et permanente (39 °C), le pH stable (6,5) et la nature anaérobie du rumen sont aussi d’importants facteurs de son fonctionnement. La figure 19.26a montre les relations entre le rumen et les autres parties de l’appareil digestif des ruminants. Les processus digestifs et la microbiologie du rumen sont bien connus, en partie car il est possible de mettre en place une fenêtre d’échantillonnage, nommée fistule, dans le rumen d’une vache ou d’un mouton, et de prélever des échantillons pour l’analyse (voir figure 19.26b). La nourriture pénètre d’abord dans le réticulum (ou réseau) et est transférée dans le rumen, où elle est mélangée avec la salive, qui contient du bicarbonate, et brassée par un mouvement de rotation. Ces mouvements broient la cellulose en une fine suspension qui facilite l’intervention des microorganismes et la fermentation. La nourriture migre alors dans le réticulum où elle est fragmentée en petits amas ; ces derniers sont régurgités dans la bouche et mâchés à nouveau. Ces petites bouchées, bien mélangées avec la salive, sont à nouveau avalées, mais ce matériel passe maintenant dans l’omasum (feuillet), puis dans l’abomasum (caillette), un organe ressemblant à l’estomac habituel (acide). Dans la caillette, la digestion chimique intervient et se poursuit dans l’intestin grêle et le gros intestin.

La fermentation microbienne dans le rumen La nourriture reste dans le rumen entre 9 et 12 h. Pendant cette période, les micro-organismes cellulolytiques hydrolysent la cellulose en cellobiose (disaccharide) et en glucose. Le glucose est alors fermenté avec production d’acides gras volatils, essentiellement les acides acétiques, propioniques et butyriques et de gaz, dioxyde de carbone et méthane (voir figure 19.27). Les acides gras passent alors la paroi du rumen et entrent dans le circuit sanguin, et sont oxydés par l’animal dont c’est la source principale d’énergie. Le rumen contient d’énormes quantités de procaryotes (1010-1011 bactéries / g de contenu du rumen). En plus de leurs fonctions digestives, les micro-organismes du rumen synthétisent des acides aminés et des vitamines dont c’est la source essentielle pour l’animal. La plupart des bactéries adhèrent fortement au matériel végétal et aux particules alimentaires. Tout ce matériel passe dans le tractus digestif de l’animal où il subit une digestion complémentaire selon des procédés semblables à ceux existant chez les non-ruminants. De nombreuses cellules microbiennes du rumen sont digérées dans la caillette et constituent une source importante de protéines et de vitamines pour l’animal. Ces protéines microbiennes pouvant être récupérées et utilisées par l’animal, un ruminant est, du point de vue nutritionnel, supérieur à un nonruminant, lorsqu’il se nourrit de produits déficitaires en protéines, tels que l’herbe.

Les bactéries du rumen Les réactions biochimiques qui se déroulent dans le rumen sont complexes et impliquent les activités combinées de micro-organismes divers. Le rumen étant anoxique, les bactéries anaérobies dominent naturellement. De plus, la conversion de la cellulose en CO2 et CH4 impliquant plusieurs étapes

Bol alimentaire

Œsophage

Rumen Intestin grêle

Nourriture

Réticulum (réseau) Omasum (feuillet) (a)

Rumen Abomasum (caillette) Sharisa D. Beek, Département Animal Science, Southern Illinois Univ.

652 Chapitre 19

(b) FIGURE 19.26 Le rumen. (a) Représentation schématique du rumen et du système gastro-intestinal d’une vache. La nourriture transite de l’œsophage au rumen, est ensuite régurgitée et passe successivement dans le réticulum (réseau), l’omasum (feuillet), l’abomasum (caillette) et les intestins. L’abomasum est un compartiment acide, identique à l’estomac des animaux monogastriques comme le porc ou l’homme. (b) Image d’une fistule chez une vache de race Holstein. La fistule, ici ouverte, permet d’échantillonner le rumen. Les moutons ou les vaches munis d’une fistule ont été très utiles dans l’étude de la microbiologie du rumen et la nutrition des ruminants.

microbiennes interdépendantes, on peut s’attendre à rencontrer une grande diversité d’anaérobies (voir tableau 19.6). Différentes bactéries du rumen hydrolysent la cellulose en sucres et fermentent les sucres en acides gras volatils. Fibrobacter succinogenes et Ruminicocus albus sont les deux plus importants organismes cellulolytiques anaérobies du rumen. Bien que tous deux produisent des cellulases, Fibrobacter, une bactérie Gram négatif, contient une cellulase périplasmique (voir section 4.9) pour casser la cellulose. Pour cette raison, les cellules de Fibrobacter doivent rester attachées aux fibres de cellulose pendant la digestion. Ruminicoccus, par contre, produit une cellulase qui est excrétée dans le contenu du rumen (donc une exoenzyme) où elle dégrade la cellulose à l’extérieur de la bactérie. Cependant, le résultat final est le même dans les deux cas : du glucose est rendu disponible pour la fermentation. Si un ruminant passe progressivement d’une alimentation riche en cellulose à un régime riche en amidon (par exemple des graines), les bactéries amylolytiques telles que Ruminobacter



19.11 Cycle du carbone chez les ruminants 653 Nourriture, paille, etc.

Cellulose, amidon, sucres Cellulolyse, amylolyse Fermentation

Fermentation

Sucres

Pyruvate-

Succinate2–

Formate–

H2 + CO2

Acetate– Propionate– Rumenduwall Paroi rumen

Vaisseau sanguin du ruminant

– Lactate- Propionate + CO2

Butyrate–

Acétate– CO2 CH4 Rejetés dans l’atmosphère (éructation)

AGVs

Stœchiométrie totale de la fermentation dans le rumen : 57,5 glucose

65 acétate– + 20 propionate– + 15 butyrate– +

60 CO2 + 35 CH4 + 25 H2O

FIGURE 19.27 Réactions biochimiques dans le rumen. Les principaux substrats de départ, le glucose (venant de la cellulose) et les produits finaux sont figurés dans des rectangles de couleur. Les lignes pointillées indiquent les voies métaboliques mineures. Les quantités moyennes d’acides gras volatiles dans le rumen sont : acétate, 60 mM ; propionate, 20 mM ; butyrate, 10 mM. Les acides gras volatiles (AGV) sont consommés par les ruminants et convertis en protéines animales. Pour cette raison, les bactéries syntrophes oxydant les acides gras (section 19.10) ne sont pas utiles dans l’écosystème microbien du rumen.

amylophilus et Succimonas amylolytica se développent en grand nombre dans le rumen. Ces organismes sont des composants mineurs des communautés microbiennes si le régime est pauvre en amidon. Si un animal est nourri de légumineuses, riches en pectine, en polysaccharides, les bactéries pectinolytiques comme Lachnospira multiparus (voir tableau 19.6) augmentent dans la communauté. Occasionnellement, des changements dans la composition des communautés microbiennes du rumen causent des maladies, ou même la mort de l’animal. Par exemple, si une vache passe brutalement du fourrage aux grains, une croissance explosive de Stretococcus bovis est observée dans le rumen. La concentration habituelle de S. bovis, environ 107 cellules / g (ce qui n’est pas significatif compte tenu du nombre total de bactéries du rumen), dépasse rapidement 1010 cellules / g. Ceci se produit car S. bovis se développe rapidement sur l’amidon, et les grains en contiennent beaucoup, alors que l’herbe contient surtout de la cellulose.

S. bovis est une bactérie lactique (voir section 12.19) et produit de grandes quantités d’acide lactique lors de la fermentation de l’amidon ; ceci acidifie le rumen (acidose), et tue la microflore normale du rumen. Une acidose sévère peut provoquer la mort de l’animal. Pour éviter les acidoses, les animaux doivent passer progressivement d’un régime à l’autre sur une période de quelques jours. L’introduction lente d’amidon permet la sélection de bactéries dégradant l’amidon et produisant des acides gras, au lieu de S. bovis : ainsi, les processus biochimiques normaux du rumen ne sont pas interrompus. Quelques produits de la fermentation des bactéries saccharolytiques du rumen sont utilisés comme sources d’énergie dans le rumen par des fermenteurs secondaires. Ainsi, le succinate est fermenté en propionate et CO2 (voir figure 19.27) par Schwartzia, et le lactate est fermenté en acétate et autres acides par Selenomonas et Megasphaera (voir tableau 19.6). L’hydrogène produit dans le rumen par les processus de fermentation ne s’accumule jamais car il est rapidement consommé par les méthanogènes. Malgré les fortes concentrations en acides gras volatils du rumen, les syntrophes (voir section 19.10) ne jouent pas de rôle majeur car l’animal lui-même constitue un puits pour ces acides gras (voir figure 19.27) ; le propionate et le butyrate étant consommés par l’animal (voir figure 19.27), les processus syntrophiques de conversion (voir tableau 19.4 et figure 19.23) ne sont pas nécessaires dans le rumen.

Les protozoaires et les champignons du rumen Outre les procaryotes, le rumen possède une faune caractéristique (environ 106/mL), composée presque exclusivement de ciliés (voir section 14.10). Beaucoup de ces protozoaires sont des anaérobies obligatoires, ce qui est rare chez les eucaryotes. Bien que les protozoaires ne soient pas indispensables à la fermentation dans le rumen, ils contribuent à l’ensemble du processus. En fait, certains protozoaires sont capables d’hydrolyser la cellulose et l’amidon, et de fermenter le glucose en produisant les mêmes acides organiques que les bactéries (voir tableau 19.6). Les protozoaires du rumen ingèrent également les bactéries du rumen en tant que nourriture et jouent vraisemblablement un rôle dans le contrôle des densités bactériennes dans le rumen. Les champignons anaérobies vivent aussi dans le rumen et sont connus pour jouer un rôle dans les processus qui s’y déroulent. Les champignons du rumen sont généralement des espèces qui alternent entre une forme flagellée et une forme de thalle, et il a été montré sur des cultures pures qu’ils peuvent fermenter la cellulose en acides gras volatils. Neocalimastix, par exemple, est un champignon anaérobie obligatoire qui fermente le glucose en formate, acétate, lactate, éthanol, CO2 et H2. Bien qu’eucaryote, ce champignon ne possède pas de mitochondrie et de cytochromes et a donc un mode de vie exclusivement fermentatif. Cependant, Neocalimastix contient une organelle nommée hydrogénosome qui fonctionne pour donner de l’hydrogène et a pour l’instant été trouvé seulement chez quelques organismes situés à la base de l’arbre des Eukarya (voir sections 14.2, 14.4 et 14.9). Les champignons du rumen jouent un rôle important dans la dégradation de polysaccharides autres que la cellulose, comme la lignine (qui contribue au renfort de la paroi cellulaire des plantes ligneuses) qui est dégradée partiellement, les hémicelluloses et les pectines.



654 Chapitre 19


TABLEAU 19.6

CARACTÉRISTIQUES DE QUELQUES PROCARYOTES DU RUMEN Gram

Domaine phylogénétiquea

Mobilité

Produits de fermentation

ADN (mol % GC)

Fibrobacter succinigeneb

Négatif

B

Butyrivibrio fibrisolvensc

Négatif

B

Bacille

–

Succinate, acétate, formiate

41–51

Bacilles courbes

+

Acétate, formiate, lactate, butyrate, H2, CO2

41

Ruminicoccus albusb

Positif

B

Coque

–

Acétate, formiate, H2, CO2

43–46

Clostridium locheadii

Positif

B

Bacille (endospores)

+

Acétate, formiate, butyrate, H2, CO2

–

Prevotella ruminicola

Négatif

B

Bacille

–

Formiate, acétate, succinate

40–42

Ruminobacter amylophilus

Négatif

B

Bacille

–

Formiate, acétate, succinate

49

Selenomonas ruminantium

Négatif

B

Bacille courbe

+

Acétate, propionate, lactate

49

Succinimonas amylolytica

Négatif

B

Ovale

+

Acétate, propionate, succinate

–

Streptococcus bovis

Positif

B

Coque

–

Lactate

37–39

Selenomonas lactilytica

Négatif

B

Bacille courbe

+

Acétate, succinate

50

Megasphaera elsdenii

Positif

B

Coque

–

Acétate, propionate, butyrate, valérate, caproate, H2, CO2

54

Négatif

B

Bacille

+

Propionate, CO2

46

Positif

B

Bacille courbe

+

Acétate, formiate, lactate, H2, CO2

–

ruminantium

Positif

A

Bacille

–

CH4 (à partir d’H2 + CO2 ou formiate)

31

Methanomicrobium mobile

Négatif

A

Bacille

+

CH4 (à partir d’H2 + CO2 ou formiate)

49

Organisme

Morphologie

Cellulolytiques

Amylolytiques

Décomposeurs de lactate

Décomposeur de succinate Schwartzia succinovorans Décomposeur de pectine Lachnospira multiparus Méthanogènes Methanobrevibacter

a

B, Bacteria; A, Archaea. Ces espèces dégradent aussi le xylane, un polysaccharide majeur de la paroi des cellules des plantes. c Dégrade aussi l’amidon. b

L’alimentation des ruminants et les maladies d’origine alimentaire Ces dernières années, des questions de sécurité se sont élevées à propos des pratiques d’alimentation des ruminants, et particulièrement les bovins, et leur impact sur les microflores de l’animal. Les éleveurs ont profondément modifié l’alimentation des ruminants domestiques en passant du fourrage, régime pour lequel est conçu le rumen, à des régimes de grains riches en amidon. Les grains permettent un gain de poids rapide et tendent à rendre la viande plus tendre. Ainsi, les animaux nourris aux grains sont commercialisables plus rapidement et leur viande a plus de valeur marchande. Cependant, un régime riche en amidon non

seulement affecte la microflore du rumen, mais aussi la composition microbienne du tractus digestif au-delà du rumen (figure 19.26a). En particulier, le pH du tractus digestif est plus acide chez les animaux nourris aux grains. Ceci permet alors aux souches acido-tolérantes entéropathogènes d’Escherichia coli O157:H7 (voir section 29.8) de devenir prédominantes par rapport aux souches non pathogènes et moins acido-tolérantes. Lorsque les animaux nourris aux grains sont abattus, les cellules de ces souches d’E. coli peuvent adhérer aux carcasses, être introduites dans les produits à base de viande et particulièrement les viandes hachées ou les saucisses, augmentant ainsi le risque de maladies d’origine alimentaire (voir section 29.8).



19.12 Cycle de l’azote 655

Les autres animaux herbivores : les animaux à cæcum Les vaches et les moutons sont les ruminants les plus familiers. Les chèvres, chameaux, cerfs, rennes, caribous, élans sont aussi des ruminants. Cependant, les chevaux et les lapins, également herbivores, ne sont pas des ruminants. Ces animaux possèdent seulement un estomac, mais emploient un autre organe appelé cæcum, situé postérieurement à l’intestin grêle et antérieurement au gros intestin comme organe de fermentation de la cellulose. Le cæcum contient des micro-organismes cellulolytiques et la digestion de la cellulose s’y déroule. Du point de vue nutritionnel, les ruminants ont un avantage sur les animaux à cæcum en ce sens que les bactéries cellulolytiques des ruminants passent finalement au travers d’un véritable estomac (acide) et sont donc tuées, ce qui constitue une source de protéines pour l’animal. Au contraire, chez les chevaux ou les lapins, les bactéries cellulolytiques sont éliminées dans les fèces.

Contrôlez vos acquis Les ruminants sont des animaux qui possèdent un organe digestif particulier, le rumen. C’est un écosystème unique dans lequel les micro-organismes anaérobies digèrent les aliments insolubles comme la cellulose et l’amidon. Les bactéries, protozoaires et champignons du rumen, produisent des acides gras volatils qui sont utilisés par les ruminants. En addition de leur rôle dans les processus de digestion, les micro-organismes du rumen synthétisent des vitamines et des acides aminés, et sont aussi une source importante de protéines pour l’animal. •

Quelles sont les conditions physiques et chimiques qui dominent dans le rumen ?

•

Citez des acides gras volatils ayant un intérêt pour le ruminant.

•

Pourquoi le métabolisme de Streptococcus bovis at-il un rapport avec la nutrition des ruminants ? Comment une maladie humaine d’origine alimentaire est-elle due aux pratiques alimentaires chez les éleveurs de ruminants ?

•

En quoi les animaux à cæcum diffèrent-ils des ruminants en ce qui concerne l’anatomie de leur tractus digestif ?

V

AUTRES CYCLES BIOGÉOCHIMIQUES MAJEURS

Sur un plan seulement quantitatif, le cycle du carbone est le plus important dans la nature. Cependant, de nombreux autres éléments importants dans le métabolisme des plantes et des animaux sont recyclés par les micro-organismes. Il s’agit de l’azote, du soufre et du fer dont les cycles biogéochimiques vont être maintenant étudiés.

19.12 Cycle de l’azote m n L’élément azote (N), un constituant essentiel du protoplasme, peut se présenter à différents niveaux d’oxydation (voir tableau 17.2). Il existe trois principaux processus de transformation microbienne de l’azote : la nitrification (voir section 17.12), la dénitrification (voir section 17.14) et la fixation d’azote (voir section 17.28). Ces transformations, et quelques autres, sont résumées dans le cycle redox de l’azote de la figure 19.28.

La fixation de l’azote Les procaryotes sont les seuls à effectuer, dans la nature, plusieurs des réactions redox majeures impliquant l’azote (voir figure 19.28). L’azote gazeux (N2) est la forme la plus stable de l’azote et constitue le réservoir principal de l’azote sur Terre. Cependant, seulement très peu d’organismes sont capables d’utiliser N2 comme source d’azote dans le processus de fixation d’azote (N2 + 8 H → 2 NH3 + H2) [voir section 17.28]. Le recyclage de l’azote sur Terre implique surtout les formes d’azote fixé les plus facilement disponibles que sont l’ammoniac et les nitrates. Dans de nombreux environnements, cependant, la faible disponibilité de ces composés donne l’avantage à la fixation d’azote. Ce processus important sera à nouveau abordé plus tard dans ce chapitre, à propos de la fixation de N2 par les symbiotes des plantes légumineuses.

La dénitrification Le rôle du nitrate en temps qu’accepteur d’électrons alternatif dans la respiration anaérobie a été abordé dans la section 17.14. Dans la plupart des conditions, le produit terminal de la réduction du nitrate est N2 ou N2O. La conversion du nitrate en azote gazeux se nomme la dénitrification (voir figure 19.28). C’est la principale voie de formation biologique de N2. D’un autre côté, la dénitrification est un processus nuisible. Par exemple, des champs fertilisés par des engrais nitratés deviennent typiquement gorgés d’eau suite aux fortes pluies. Des conditions anoxiques s’installent alors et la dénitrification peut être intense. Ce processus élimine l’azote fixé dans le sol. Mais par contre, la dénitrification peut être utile dans le traitement des eaux usées (voir section 28.2). En éliminant les nitrates, la dénitrification diminue la croissance algale lorsque les eaux traitées sont rejetées dans les lacs et les rivières.

Flux d’ammoniac, nitrification et Anammox L’ammoniac est produit lors de la décomposition des composés azotés organiques (ammonification, voir figure 19.28) tels que les acides aminés et les nucléotides. À pH neutre, l’ammoniac se trouve sous forme d’ions ammonium (NH4+). En conditions anoxiques, l’ammoniac est relativement stable (voir cependant section 17.12) et c’est sous cette forme que l’azote prédomine dans la plupart des sédiments anoxiques. Dans les sols, une grande partie de l’ammoniac rejeté par la décomposition anaérobie est rapidement recyclée et convertie en acides aminés par les plantes et les micro-organismes. L’ammoniac étant volatil, les sols (surtout les sols très alcalins) peuvent en perdre une partie par évaporation, et les plus



656 Chapitre 19


Processus clé et procaryotes impliqués dans le cycle de l’azote Processus Nitrification (NH4+ NH4+ NO2–

Nitrification NO2–

Organismes types NO3–)

Fixation du N2 (N2 + 8H Libre Aérobie

Nitrosomonas Nitrobacter

N2)

Bacillus, Paracoccus, Pseudomonas NH3 + H2)

Azotobacter Cyanobactéries Clostridium, bactéries vertes Anaérobie et pourpres Rhizobium Symbiote Bradyrhizobium Frankia Ammonification (N-organique NH4+) De nombreux organismes ammonifient Anammox (NO2– + NH3 2N2) Brocadia

NO3–

NO2–

sim As

on NH Groupement As sim 2 Fixation ila aminé des tio d’azote n protéines on if i ca Aérobiose tio n NH3 Anaérobiose n ilatio NH2 Groupement sim s aminé des protéines A n tio fica Fixation Ammoni

ilati

m Am

NO2– NO3– Dénitrification (NO3–

N2

d’azote

NO, Anammox N2O

N2

Dénitrification

FIGURE 19.28 Cycle biogéochimique de l’azote. Les réactions d’oxydation sont représentées par des flèches jaunes, celles de réduction sont en rouge. Les réactions dans lesquelles il n’y a pas de changement redox sont indiquées en blanc. Pour une liste détaillée des procaryotes fixateurs d’azote, voir le tableau 17.10.

grandes pertes d’ammoniac vers l’atmosphère se produisent dans les régions de fortes densités animales (par exemple, les zones d’élevage intensif). Globalement, l’ammoniac représente seulement à peu près 15 % de l’azote libéré dans l’atmosphère, le reste l’étant principalement sous forme de N2 ou N2O (dénitrification). La nitrification, soit l’oxydation de NH3 en NO3–, est couramment réalisée dans les sols bien drainés, à pH neutre, suite à l’activité des bactéries nitrifiantes (voir sections 12.3 et 17.12 et figure 19.28). Alors que la dénitrification consomme du nitrate, la nitrification en produit. Si des matériaux riches en protéines, tels que des engrais naturels ou des rejets, sont ajoutés aux sols, le taux de nitrification augmente. Bien que le nitrate soit facilement assimilé par les plantes, il est très soluble et rapidement lessivé des sols soumis à de fortes pluies. En conséquence, la nitrification n’est pas bénéfique à l’agriculture. Mais d’autre part, l’ammoniac, chargé positivement, se lie fortement aux particules chargées négativement dans les sols riches en argile. L’ammoniac anhydre est largement utilisé comme engrais azoté, et des additifs chimiques sont couramment ajoutés aux engrais pour inhiber la nitrification. L’un des inhibiteurs les plus communs de la nitrification est un substitut de la pyridine nommé nitrapyrine (2-chloro-6-trichlorométhylpyridine). La nitrapyrine inhibe de manière spécifique la première étape de la nitrification, soit l’oxydation de NH3 en NO2– (voir section 17.12). Ceci inhibe en fait les deux étapes de la nitrification, car la deuxième dépend de la première. L’addition d’inhibiteurs de la nitrification a ainsi beaucoup augmenté l’efficacité de l’amendement azoté et contribué à prévenir la pollution des eaux par les nitrates lessivés des sols ainsi traités.

L’ammoniac peut aussi être catabolisé en anaérobiose par Brocadia et des organismes proches au cours d’un processus nommé anammox. Au cours de cette réaction, l’ammoniac est oxydé par les nitrites (NO2) qui jouent le rôle d’accepteur d’électrons, donnant N2 comme produit terminal (voir figure 19.28). La microbiologie et la biochimie de la réaction anammox sont présentées dans la section 17.12.

Contrôlez vos acquis La principale forme d’azote sur Terre est le gaz diazote (N2), qui peut être utilisé comme source d’azote seulement par les bactéries fixatrices d’azote. L’ammoniac produit par ce processus ou par ammonification à partir de composés organiques azotés peut être assimilé en matière organique, ou bien oxydé en nitrate par les bactéries nitrifiantes. Les pertes d’azote par la biosphère résultent de la dénitrification, au cours de laquelle les nitrates sont convertis en N2. •

Qu’est-ce que la fixation d’azote et pourquoi est-ce important ?

•

Comment se nomme le processus correspondant à cette réaction : NO3– → N2 ?

•

En quoi la nitrapyrine est-elle bénéfique à la fois à l’agriculture et à l’environnement ?

•

En quoi diffèrent les processus de nitrification et de dénitrification ? En quoi la nitrification est-elle différente d’anammox ?



19.13 Cycle du soufre 657

m n

Les transformations du soufre sont beaucoup plus complexes que celles de l’azote car il existe de nombreux niveaux d’oxydation du soufre (voir figure 19.29 et tableau 17.3). De plus, contrairement à l’azote, quelques transformations du soufre peuvent se produire chimiquement autant que biologiquement. La réduction des sulfates et l’oxydation chimiolithotrophe du soufre ont été présentées dans les sections 17.10 et 17.15. Le cycle redox du soufre et l’implication des micro-organismes dans les transformations de cet élément sont présentés dans la figure 19.29. Bien que de nombreux niveaux d’oxydation du soufre soient possibles, seulement trois sont significatifs dans la nature : –2 (groupes sulfhydriles, R-SH et sulfure, HS–), 0 (soufre élémentaire, S0) et +6 (sulfate, SO42–). L’essentiel du soufre sur Terre se trouve dans les sédiments et dans les roches sous forme de minéraux sulfatés (gypse, CaSO4) et sulfurés (pyrite, FeS2), bien que les océans constituent le réservoir le plus significatif de soufre (sous forme de sulfate) pour la biosphère.

nature. Cependant, dans de nombreux habitats anoxiques, tels que les eaux douces et les sols, leurs activités sont limitées par les faibles concentrations de sulfate. De plus, en raison du besoin en donneurs d’électrons organiques (ou d’hydrogène moléculaire qui est un produit de la fermentation de la matière organique) pour réduire les sulfates, cette réduction se produit seulement si de fortes quantités de matière organique sont présentes. Dans la plupart des sédiments marins, le taux de réduction des sulfates est limité par le carbone, et peut être beaucoup augmenté par l’addition de matière organique. Ce point est important, car les rejets d’égouts, de boues et de déchets en mer augmentent la teneur en matière organique des sédiments, déclenchant une pollution par les sulfures. De plus, l’ion sulfure (HS–) étant toxique pour de nombreux organismes, la formation de HS– par la réduction des sulfates est potentiellement nuisible. L’ion sulfure est toxique car il se combine avec le fer des cytochromes ou d’autres composés cellulaires contenant du fer, pour donner les produits insolubles que sont FeS et FeS2 (pyrite), qui contribuent à la couleur noire de nombreux sédiments.

Sulfure d’hydrogène et réduction de sulfate

Sulfures et oxydo-réduction du soufre

L’hydrogène sulfuré (H2S) est un gaz soufré majeur. Le sulfure est produit par la réduction bactérienne des sulfates (SO42– + 8 H+ → H2S + 2 H2O + 2 OH–) [voir figure 19.29], ou a une origine géochimique et est émis par les sources chaudes et les volcans. Bien que H2S soit volatil, la forme de sulfure présent dans l’atmosphère dépend du pH : H2S domine au-dessous de pH 7 tandis que HS– et S2– dominent pour des pH supérieurs à 7. Les bactéries sulfato-réductrices forment un groupe très diversifié (voir section 12.18) et sont très répandues dans la

En conditions oxygénées, l’ion sulfure (HS–) est rapidement oxydé spontanément à pH neutre (voir section 17.10). Les bactéries sulfo-oxydantes, dont la plupart sont aérobies, peuvent catalyser l’oxydation des sulfures. En raison de la vitesse de la réaction spontanée, l’oxydation bactérienne significative des sulfures se produit seulement dans les zones dans lesquelles H2S venant de zones anaérobies rencontre l’O2 des zones oxygénées. De plus, si de la lumière est disponible, l’oxydation anaérobie de HS– peut aussi se produire, catalysée par les bactéries phototrophes sulfureuses (voir sections 12.2, 12.32 et 17.4).

19.13 Cycle du soufre

yda Ox

Processus clé et procaryotes impliqués dans le cycle du soufre

imiolithotro phe S0

Organismes types

H2S + SO42–) Dismutation du soufre (S2O32– Desulfovibrio, et d’autres Oxydation ou réduction de composés organiques soufrés (DMSO DMS) (CH3SH CO2 + H2S) De nombreux organismes effectuent ce processus Désulfurylation (S–organique H2S) De nombreux organismes effectuent ce processus

du su

SH

DMS

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H2S) Réduction du soufre (anaérobie) ( S0 Desulfuromonas, nombreux Archaea hyperthermophiles

ate SH Groupement Dé sulf su soufré des

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soufré des Dis protéines oufre de mutation du s i on t c Rédu S0

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H2S) Réduction du sulfate (anaérobie) ( SO42– Desulfovibrio, Desulfobacter

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SO42–) S0 Oxydation du soufre/sulfure (H2S Chimiolithotrophes sulfo-oxydants Aérobie (Thiobacillus, Beggiatoa, et beaucoup d’autres) Bacteria phototrophes pourpres Anaérobie et vertes ; quelques chimiolithotrophes

As si

Processus

h tion c

FIGURE 19.29 Cycle biogéochimique du soufre. Les réactions d’oxydation sont représentées par des flèches jaunes, celles de réduction sont en rouge. Les réactions dans lesquelles il n’y a pas de changement redox sont indiquées en blanc. DMSO, diméthylsulfoxyde ; DMS, diméthylsulfure.



658 Chapitre 19


Le soufre élémentaire (S0) est chimiquement stable mais aisément oxydé par les bactéries sulfo-oxydantes comme Thiobacillus et Acidithiobacillus (voir sections 12.4 et 17.10). Le soufre élémentaire est insoluble, et les bactéries qui l’oxydent sont fortement attachées aux cristaux de soufre (voir figure 17.26b). L’oxydation du soufre élémentaire se traduit par la formation de sulfate (SO42–) et de protons, ce qui conduit à un abaissement du pH. Le soufre élémentaire est parfois ajouté aux sols alcalins pour abaisser le pH, cette procédure étant basée sur le fait que les thiobacilles qui réalisent l’oxydation et donc l’acidifiaction ont une distribution ubiquiste. S0 peut être réduit aussi bien qu’oxydé. La réduction du soufre en sulfure (une forme de respiration anaérobie, voir section 17.15) est un processus écologique majeur, particulièrement chez les Archaea hyperthermophiles (voir chapitre 13). Bien que les bactéries sulfato-réductrices puissent aussi réaliser cette réaction, l’essentiel de la réduction du soufre dans la nature est probablement effectué par des organismes soufre-réducteurs phylogénétiquement distincts qui sont incapables de réduire SO42– en H2S. Cependant, les habitats des soufre-réducteurs sont généralement les mêmes que ceux des sulfato-réducteurs, ce qui, d’un point de vue écologique, signifie que les deux groupes forment une guilde et coexistent (voir section 19.1).

Les composés organiques soufrés En plus des formes inorganiques de soufre dont la biogéochimie vient d’être présentée, il existe une grande diversité de composés soufrés organiques qui sont également synthétisés par des organismes vivants, et entrent ainsi dans le cycle biogéochimique du soufre. Beaucoup de ces composés à l’odeur forte sont volatils et s’échappent donc dans l’atmosphère. Le composé organique soufré le plus abondant dans la nature est le diméthylsulfure (H3C-S-CH3). Il est surtout produit en milieu marin suite à la dégradation du diméthylsulfoniopropionate, un soluté osmorégulateur majeur des algues marines (voir section 6.14). Le diméthylsulfoniopropionate peut être utilisé comme source de carbone et d’énergie par les microorganismes et est catabolisé en diméthylsulfure et acrylate. Ce dernier composé, dérivé de l’acide gras propionate, est utilisé pour la croissance. Le diméthylsulfure relâché dans l’atmosphère est transformé en méthane sulfonate (CH3SO3–), SO2 et SO42– par oxydation photochimique. Par contre, le diméthylsulfure produit dans les habitats anoxiques peut être transformé par voie microbienne selon au moins trois processus : 1) au cours de la méthanogenèse (en donnant CH4 et H2S), 2) en tant que donneur d’électrons pour la fixation photosynthétique du CO2 par les bactéries pourpres phototrophes (avec production de diméthylsulfoxyde (DMSO) et 3) comme donneur d’électrons dans le métabolisme énergétique de certains chimio-organotrophes et chimiolithotrophes (donnant aussi du DMSO). Le DMSO produit peut servir d’accepteur d’électrons pour la respiration anaérobie (voir section 17.18), donnant à nouveau du diméthylsulfure. De nombreux autres composés organiques soufrés affectent le cycle global du soufre, en particulier le méthanéthiol (CH3SH), le diméthyldisulfure (H3C-S-S-CH3) et le bisulfure de carbone (CS2), mais globalement, le diméthylsulfure est le plus significatif.

Contrôlez vos acquis Les bactéries jouent des rôles majeurs dans les parties oxydatrices et réductrices du cycle du soufre. Les bactéries soufre- et sulfo-oxydantes produisent du sulfate, tandis que les bactéries sulfato-réductrices consomment le sulfate comme accepteur d’électrons au cours de la respiration anaérobie, produisant de l’hydrogène sulfuré. Le sulfure étant toxique et réagissant aussi avec de nombreux métaux, la réduction des sulfates est un important processus biogéochimique. Le diméthylsulfure est un composé soufré organique majeur d’importance écologique dans la nature. •

H2S est-il un substrat ou un produit des bactéries sulfato-réductrices ? des bactéries chimiolithotrophes ?

•

Pourquoi l’oxydation des sulfures produit-elle une chute de pH ?

•

Quel composé organique soufré est le plus abondant dans la nature ?

19.14 Cycle du fer m n Le fer est l’un des éléments les plus abondants de la croûte terrestre. À la surface de la Terre, le fer existe naturellement à deux niveaux d’oxydation, le fer ferreux (Fe2+) et le fer ferrique (Fe3+). Fe0 est un produit résultant essentiellement des activités humaines par la fonte des minerais de fer pour former de la fonte. Dans la nature, le fer va donc se déplacer entre les formes ferreuses et ferriques. La réduction de Fe3+ se produit à la fois chimiquement et biologiquement (respiration anaérobie), et l’oxydation de Fe2+ également chimiquement et biologiquement (métabolisme chimiolithotrophe) [voir figure 19.30].

La réduction bactérienne du fer De nombreux organismes peuvent utiliser le fer ferrique comme accepteur d’électrons (voir section 17.18). La réduction du fer ferrique est commune dans les sols gorgés d’eau, les marais et les sédiments des lacs anoxiques. Le déplacement des eaux souterraines riches en fer des marais anoxiques ou des sols détrempés peut amener au transport de grandes quantités de fer ferreux. Quand cette eau chargée en fer atteint des zones oxygénées, le fer ferreux est oxydé chimiquement ou par des bactéries ferro-oxydantes (voir section 17.11). Les composés ferriques précipitent, conduisant à la formation de dépôts bruns de fer (voir figure 17.28c) : Fe2+ + 1--- O2 + 2 1---H2O → Fe(OH)3 + 2 H+ 4

2

L’hydroxyde ferrique précipité peut interagir avec d’autres substances non biologiques, comme les substances humiques (voir section 19.9) pour réduire Fe3+ en Fe2+ (voir figure 19.30). Le fer ferrique peut aussi former des complexes avec de nombreux composés organiques. De cette façon, il devient soluble et à nouveau disponible comme accepteur d’électrons pour les bactéries réductrices de fer ferrique.



19.14 Cycle du fer 659

Fer ferreux et oxydation de la pyrite à pH acide

Atmosphère : air pH acide-stérile Fer ferreux

pH neutrestérile ou non stérile

pH acide-bactéries

Temps (a)

Ricardo Amils

Le seul accepteur d’électrons capable d’oxyder spontanément Fe2+ est O2. Dans les habitats à pH neutre, Fe2+ peut être oxydé par les ferro-bactéries comme Gallionella et Leptothrix (voir sections 12.15 et 12.16). Ceci se produit surtout aux interfaces entre les eaux souterraines anoxiques riches en fer ferreux et l’air. Cependant, l’oxydation bactérienne la plus importante du fer ferreux s’effectue à pH acide, car dans ces conditions, Fe2+ est stable et n’est pas oxydé spontanément. Dans les habitats très acides, le chimiolithotrophe Acidithiobacillus ferrooxidans et des acidophiles proches oxydent Fe2+ en Fe3+ (voir figure 19.31). Très peu d’énergie est générée par l’oxydation du fer ferreux en fer ferrique (voir section 17.11) et ces bactéries doivent donc oxyder de grandes quantités de fer pour leur croissance ; en conséquence, même un petit nombre de cellules peut être responsable de la précipitation d’une grande quantité de fer. A. ferrooxidans est un acidophile strict très commun dans les écoulements acides de mines et dans les sources acides ; il est probablement responsable de la plus grande partie du fer ferrique précipité en conditions moyennement acides (pH 2-4). Acidithiobacillus ferrooxidans et Leptospirillum ferrooxidans vivent dans des environnements dans lesquels l’acide sulfurique est l’acide dominant, et où de grandes quantités de sulfates sont présentes. À 20-30 °C et pH modérément acide, A. ferrooxidans semble dominer, tandis qu’à 30-50 °C et pH plus acide (1-2), L. ferrooxidans est l’organisme dominant. Dans ces conditions, le fer ferrique ne précipite pas sous forme d’hydroxyde, mais comme

(b)

Ferrique Oxydation du fer ferreux (bactérienne ou chimique)

Réduction du fer ferrique (bactérienne ou chimique)

Fe3+

Fonte du minerai

Fe0

Oxydation chimique

Fe2+ Ferreux FIGURE 19.30 Cycle biogéochimique du fer. Les principales formes du fer dans la nature sont Fe 2+ et Fe3+ ; Fe0 est essentiellement un produit de l’activité humaine dans la fonte des minerais de fer. L’oxydation du fer ferrique est réalisée en aérobiose par les chimiolithotrophes ferro-oxydants (ou chimiquement à pH neutre), et en anaérobiose par certaines bactéries phototrophes anoxygéniques et des bactéries dénitrifiantes. Les oxydations sont indiquées par des flèches jaunes et les réductions par des flèches rouges.

FIGURE 19.31 Oxydation de Fe2+. (a) Oxydation du fer ferreux en fonction du pH et de la présence de la bactérie Acidithiobacillus ferrooxidans. Notez la stabilité de Fe2+ en conditions acides et en l’absence de cellules bactériennes. (b) Tapis microbien contenant des algues vertes acidophiles et de nombreux procaryotes ferrooxydants dans la rivière Rio Tinto (Espagne). La rivière est très acide et contient de fortes concentrations de métaux dissous, et en particulier Fe2+. Les précipités rouge brun contiennent Fe3+.

minéral sulfaté complexe, nommé jarosite [HFe3(SO4)2(OH)6]. La jarosite est un précipité jaunâtre à brun, et l’un des majeurs polluants dans les écoulements miniers acides, un produit jaune d’aspect peu agréable appelé yellow boy par les mineurs américains (voir figures 17.28a et 19.34). A. ferrooxidans et L. ferrooxidans sont phylogénétiquement et morphologiquemet distincts, mais diffèrent également par leurs métabolismes. Alors que L. ferrooxidans croît seulement sur le Fe2+, A. ferrooxidans croît en chimiolithotrophie sur Fe2+ ou S0. La pyrite (FeS2) est l’une des formes les plus communes de fer dans la nature. La pyrite est formée par réaction du soufre avec le sulfure de fer (FeS) pour former une structure cristalline insoluble, très commune dans les charbons bitumineux et d’autres formations (voir figure 19.32a). L’oxydation bactérienne de la pyrite joue un rôle important dans le développement des conditions acides dans l’exploitation minière du charbon (voir figure 19.32b). De plus, l’oxydation de la pyrite par les bactéries a une très grande importance dans la biolixiviation des minerais (voir section 19.15). L’oxydation de la pyrite combine des



660 Chapitre 19


réactions chimiques et des réactions catalysées par les bactéries. Deux accepteurs d’électrons sont impliqués dans ce processus : l’oxygène moléculaire (O2) et le fer ferrique (Fe3+). Lorsque la pyrite vient à l’air libre, au cours d’une opération minière (voir figure 19.32b), il se produit une lente réaction avec l’oxygène moléculaire (voir figure 19.33). Cette réaction, appelée réaction d’initiation, conduit à l’oxydation du sulfure en sulfate et à la mise en place de conditions acides dans lesquelles le fer ferreux libéré est relativement stable en présence d’oxygène. Acidithiobacillus ferrooxidans et L. ferrooxidans catalysent alors l’oxydation du fer ferreux en ions fer ferrique. Les ions ferriques formés dans ces conditions acides sont solubles et peuvent

réagir spontanément avec davantage de pyrite et l’oxyder en ions ferreux et ions sulfate : FeS2 + 14 Fe3+ + 8 H2O → 15 Fe2+ + 2 SO42– + 16 H+ Les ions ferreux formés sont de nouveau oxydés en ions ferriques par les bactéries, et ces ions ferriques à nouveau réagissent avec davantage de pyrite. Ainsi, le taux d’oxydation de la pyrite augmente rapidement ; c’est le cycle de propagation illustré dans la figure 19.33. En conditions naturelles, certains des ions ferreux générés par les bactéries sont lessivés et transportés par les eaux de ruissellement dans les ruisseaux environnants ; cependant, l’oxygène étant présent dans ces écoulements, l’oxydation bactérienne du fer ferreux intervient et un précipité de fer ferrique insoluble est formé.

Les effluents miniers acides Gisement de charbon

T. D. Brock

Ravin Donald

Pyrite

(b)

(a)

FIGURE 19.32 Pyrite et charbon. (a) La pyrite contenue dans le charbon peut être oxydée par des bactéries sulfo et ferrooxydantes. Image d’une coupe dans un morceau de charbon provenant de la formation « Black Mesa », en Arizona (ÉtatsUnis). Les disques de couleur or (environ 1 mm de diamètre) correspondent à des sections de particules sphériques de pyrite, FeS2. (b) Gisement de charbon dans une exploitation de charbon à ciel ouvert. L’exposition du charbon à l’oxygène et à l’humidité stimule l’activité des bactéries ferro-oxydantes qui se développent sur la pyrite contenue dans le charbon.

1

FeS2 (pyrite) + 3 –2 O2 + H2O

Fe2+ + 2 SO42– + 2 H+ Réaction spontanée (catalyse possible par les bactéries)

(a) Réaction d’initiation

Réaction rapide spontanée (catalyse possible par les bactéries) FeS2

Fe3+ (b) Cycle de propagation

FIGURE 19.33 Rôle des bactéries ferro-oxydantes dans l’oxydation de la pyrite. (a) Réaction primaire non biologique d’initiation. (b) Cycle de propagation, incluant des parties biotiques et abiotiques.

T. D. Brock

Réaction lente Fe2+ spontanée (catalyse O2 par les bactéries)

L’oxydation bactérienne des sulfures minéraux est la principale cause des effluents miniers acides, un problème d’environnement des régions à mines de charbon (voir figure 19.34). Le mélange des eaux minières acides avec les eaux naturelles des rivières et des lacs produit de sérieuses dégradations de la qualité des eaux naturelles, en raison à la fois de l’acidité et des métaux toxiques pour les organismes aquatiques (voir figure 17.28a). De plus, ces eaux polluées ne sont pas utilisables pour la consommation humaine ou l’usage industriel. La dégradation de la pyrite conduit finalement à la formation d’acide sulfurique et d’ions de fer ferreux, et des valeurs de pH pouvant être inférieures à 1. L’acide formé attaque d’autres minéraux associés au charbon et à la pyrite, provoquant la cassure de la roche ellemême. L’aluminium, un élément majeur des roches, est soluble seulement à pH faible, et souvent de fortes concentrations d’Al3+, très toxiques pour les organismes aquatiques, sont présentes dans les effluents miniers acides. Le besoin en O2 pour l’oxydation du fer ferreux en fer ferrique permet d’expliquer pourquoi les effluents miniers acides se forment. Aussi longtemps que le charbon n’est pas exploité, l’oxydation de la pyrite ne peut pas se faire car ni l’air, ni les bactéries

FIGURE 19.34 Effluents miniers acides provenant d’un gisement de schistes bitumineux. La couleur rouge jaunâtre est due à des précipitations d’oxyde de fer (figure 17.28a).



ne peuvent l’atteindre. Dès que le charbon est exposé (voir figure 19.32b), il est rapidement contaminé par Acidithiobacillus ferrooxidans, O2 et l’eau sont introduits et rendent possible l’oxydation de la pyrite. L’acide formé peut alors s’écouler dans les ruisseaux environnants (voir figure 19.34). Lorsque ces effluents sont abondants, on trouve une espèce d’Archaea fortement acidophile, Ferroplasma. Ce procaryote ferro-oxydant aérobie est capable de croissance à pH 0 et à des températures allant jusqu’à 50 °C. F. acidarmanus forme des masses muqueuses de cellules attachées aux surfaces de cristaux de pyrite dans les minerais de fer (voir figure 19.35a). À Iron Mountain, en Californie (voir figure 19.35a), où les effluents miniers ont été particulièrement bien étudiés, un épais biofilm de F. acidarmanus maintient le pH au voisinage de 0. Avec des concentrations en fer de presque 30 g/L à cet endroit, le tapis de F. acidarmanus baigne en permanence dans une solution de substrat frais (Fe2+), ce qui permet la formation d’encore plus d’acide par les réactions qui viennent d’être décrites. Ferroplasma est un procaryote dépourvu de paroi, morphologiquement et phylogénétiquement proche de Thermoplasma (voir figure 19.35b et section 13.5).

Katrina J. Edwards

19.15 Biolixiviation des minerais 661

(a)

Le fer existe dans la nature essentiellement sous deux degrés d’oxydation, le fer ferreux (Fe2+) et le fer ferrique (Fe3+), et les transformations bactériennes et chimiques de ces formes ont une importance à la fois géologique et écologique. La réduction bactérienne du fer ferrique intervient dans des milieux anoxiques et se traduit par la mobilisation du fer à partir des marais et autres habitats riches en fer. L’oxydation bactérienne du fer ferreux se déroule à large échelle à pH faible et est très commune dans les régions de mines de charbon, où elle est responsable d’une pollution venant des effluents miniers acides. •

Quel est le degré d’oxydation du fer dans le minéral Fe(OH)3, FeS ? Comment est formé Fe(OH)3 ?

•

Pourquoi l’oxydation biologique du fer ferreux en conditions oxygénées se produit-elle principalement à pH acide ?

VI

BIOREMÉDIATION MICROBIENNE

Le potentiel biogéochimique de l’ensemble des micro-organismes est énorme. En fait, les micro-organismes sont les plus grands chimistes de la Terre. C’est pourquoi ils ont été employés pour aider à l’extraction de métaux précieux de minerais à faible teneur (biolixiviation microbienne) et à dépolluer l’environnement. Le terme de bioremédiation s’applique au nettoyage du pétrole, produits chimiques toxiques et autres polluants par les micro-organismes. La bioremédiation est une méthode de nettoyage des polluants coûteuse et effective, et dans certains cas, la seule façon pratique de dépolluer.

Katrina J. Edwards

Contrôlez vos acquis (b)

FIGURE 19.35 Ferroplasma acidarmanus. Archaea acidophile extrême, ferro-oxydante, responsable de l’acidification d’effluents miniers. (a) Serpentins formés de cellules de Ferroplasma dans un effluent minier acide (pH voisin de 0), Iron Mountain, Californie (États-Unis). (b) Image en microscopie électronique à balayage d’une cellule de F. acidarmanus dans de la matière minérale.

19.15 Biolixiviation des minerais m n La production d’acide et la mise en solution des minéraux par les bactéries acidophiles (voir section 19.14) peuvent être bénéfiques dans l’exploitation minière de certains métaux. Les sulfures se combinent avec de nombreux métaux pour former des minéraux très insolubles, et de nombreux minerais utilisés comme source de ces métaux sont des sulfures. Si la concentration en métal du minerai est faible, il peut ne pas être économiquement rentable de concentrer le minéral par des procédés chimiques conventionnels. Dans ce cas, la lixiviation microbienne est mise en œuvre. La lixiviation est surtout employée dans le cas des minerais de cuivre, car le sulfate de cuivre, formé pendant l’oxydation des minerais de sulfures de cuivre, est très soluble dans l’eau. Ainsi, environ un quart de tout le cuivre extrait dans le monde est obtenu par lixiviation. Il a été signalé que les sulfures s’oxydent spontanément dans l’air. C’est aussi le cas de la plupart des sulfures métalliques, mais l’oxydation est beaucoup plus lente que dans le cas de H2S et HS–. Cependant, Acidithiobacillus ferrooxidans et d’autres procaryotes métallo-oxydants peuvent catalyser l’oxydation des



Cuivre soluble libéré (%)

662 Chapitre 19


Le processus de lixiviation

100

Dans le processus de lixiviation, les minerais à faible teneur ou les débris rocheux sont déversés pour former un terril et une solution diluée d’acide sulfurique percole le terril de haut en bas (voir figure 19.37a). Le liquide qui s’écoule à la base du terril, riche en métaux dissous, est collecté et transporté dans une installation de précipitation (voir figure 19.37c), où le métal recherché est précipité et purifié. Le liquide percolé est alors pompé vers le sommet du terril et le cycle se répète. Si nécessaire, de l’acide est ajouté pour maintenir le pH faible. Les bactéries peuvent catalyser l’oxydation des minéraux sulfurés de différentes façons. La covellite (CuS), minéral dans lequel le cuivre a une valence de +2, servira d’exemple pour illustrer le procédé. Acidithiobacillus ferrooxidans peut oxyder le sulfure CuS en SO42– (voir figure 19.38), une réaction qui peut aussi se produire spontanément. Cependant, la réaction la plus importante dans la lixiviation du cuivre implique l’oxydation chimique du minerai de cuivre par les ions ferriques formés lors de l’oxydation bactérienne des ions ferreux (voir figure 19.38). Dans la plupart des minerais, la pyrite (FeS2) est présente, et son oxydation conduit à la formation de fer ferrique (voir figure 19.33). Le fer ferrique est un excellent accepteur d’électrons pour les minéraux contenant des sulfures, et la réaction spontanée de CuS avec le fer ferrique se traduit par la mise en solution du cuivre et la formation de fer ferreux. Ce phénomène peut aussi se produire au cœur du terril, en conditions anaérobies.

En présence de bactéries

50

Stérile 0

1

10

5 Temps

FIGURE 19.36 Effets de la bactérie Acidithiobacillus ferrooxidans sur la lixiviation du cuivre à partir de la covellite (CuS). La lixiviation a eu lieu dans une colonne de laboratoire et la solution acide contenait les composés inorganiques nécessaires à la croissance de la bactérie. L’activité de lixiviation a été mesurée en analysant le cuivre soluble présent dans la solution acide s’écoulant à la base de la colonne. Cette solution circule en permanence dans un circuit fermé.

T. D. Brock

T. D. Brock

T. D. Brock

sulfures minéraux à un taux plus élevé, contribuant ainsi à la mise en solution du métal (voir figure 19.33). Les taux relatifs d’oxydation des minerais de cuivre en présence ou en absence de bactéries sont illustrés dans la figure 19.36. Les minéraux sont différemment sensibles à l’oxydation, et ceux qui sont le plus facilement oxydés sont les plus adaptés à la lixiviation microbienne. C’est ainsi que les minerais de sulfures de fer et de cuivre, tels que la pyrrhotite (FeS) et la covellite (CuS), sont facilement lessivés, tandis que les minerais de plomb et de molybdène le sont beaucoup moins.

(b)

FIGURE 19.37 Lixiviation de minerais à faible teneur en cuivre à l’aide de bactéries. (a) Site typique de lixiviation. Le minerai à faible teneur a été concassé et entassé de telle sorte que la surface exposée soit aussi haute que possible. Des tuyaux distribuent la solution acide à la surface du terril. La solution acide percole lentement au travers du tas de minerais et s’en échappe à la base. (b) Effluent d’un lessivage de cuivre. L’eau acide est très riche en cuivre dissous. (c) Le cuivre dissous est récupéré en faisant passer l’eau riche en cuivre sur du fer (Fe 0) dans un long caniveau. (d) Un petit tas de cuivre métal récupéré à la sortie du caniveau est prêt pour les étapes suivantes de purification.

T. D. Brock

(a)

(c)

(d)



19.15 Biolixiviation des minerais 663 Arrosage du minerai de cuivre par la solution acide de lixiviation

La biolixiviation de l’uranium et de l’or

Le minerai de cuivre peut être oxydé lors de réactions oxygène-dépendante (1) et oxygène-indépendante (2), qui solubilisent le cuivre :

Cu2+ + SO42–

1. CuS + 2 O2

2. CuS + 8 Fe3+ + 4 H2O Cu2+ + 8 Fe2+ + SO42–+ 8 H+ Cuivre en solution

ferrooxidans et Sulfobacillus, et à des températures encore plus élevées (60-80 °C), Sulfolobus (voir section 13.9), interviennent dans le processus de lixiviation.

La solution acide est pompée vers le sommet du terril de lixiviation

Cu2+

Récupération du cuivre métal (Cu°) Fe0 + Cu2+ Cu0 + Fe2+ (Fe° provient de boîtes en fer blanc)

Cuivre métal (Cu°)

Addition de H2SO4 Solution acide

Fe2+ + 14O2 + H+ Fe3+ + 12 H2O Leptospirillum ferrooxidans Acidithiobacillus ferrooxidans Bassin d’oxydation

FIGURE 19.38 Représentation schématique d’un terril de lixiviation et réactions impliquées dans la biolixiviation des minerais de sulfures de cuivre pour l’obtention de Cu 0 (cuivre métal) [voir figure 19.37]. La réaction 1 est à la fois biologique et chimique. La réaction 2 est strictement chimique, mais il s’agit de la réaction la plus importante dans les processus de biolixiviation du cuivre. Notez comme il est essentiel pour la réalisation de la réaction 2 que le Fe 2+ produit (par l’oxydation du sulfure CuS en sulfate) soit oxydé en retour en Fe 3+ par Acidithiobacillus ferrooxidans et Leptospirillum ferrooxidans.

La récupération du métal Le cuivre soluble est récupéré du liquide de lixiviation dans l’installation de précipitation (voir figure 19.37c, d). Des copeaux de fer (Fe0) sont ajoutés pour récupérer le cuivre du liquide de lixiviation selon la réaction indiquée au bas de la figure 19.38, ce qui conduit à la formation de Fe2+. Le liquide riche en Fe2+ est alors transféré dans un bassin d’oxydation où Acidithiobacillus ferrooxidans se développe et l’oxyde en Fe3+. De l’acide est ajouté dans le bassin pour maintenir un pH faible – ce qui maintient Fe3+ en solution – et ce liquide riche en fer ferrique est alors pompé vers le sommet du terril, et le Fe3+ contribue à oxyder davantage de sulfure du minerai (voir figure 19.38). Ainsi, l’ensemble du processus de lixiviation est entretenu par l’oxydation de Fe2+ en Fe3+ par les bactéries. Les températures élevées peuvent être un problème pour les opérations de lixiviation. A. ferrooxidans est mésophile, mais la température au cœur d’un terril peut augmenter spontanément suite à la chaleur résultant de l’activité microbienne. Dans ce cas, des chimiolithotrophes ferro-oxydants thermophiles, comme des espèces de Thiobacillus, Leptospirillum

Les micro-organismes sont aussi utilisés pour la lixiviation de minerais contenant de l’or et de l’uranium. Acidithiobacillus ferrooxidans peut oxyder U4+ en U6+ en utilisant O2 comme accepteur d’électrons. Cependant, la lixiviation de l’uranium dépend probablement plus de l’oxydation de l’uranium par Fe3+, A. ferrooxidans contribuant surtout à la réoxydation de Fe2+ en Fe3+ comme dans la lixiviation du cuivre (voir figure 19.38). La réaction observée est : UO2 + Fe2(SO4)3 → UO2SO4 + 2 FeSO4 (U 4+)

(Fe3+)

(U6+)

(Fe2+)

Contrairement à UO2, l’uranium oxydé est soluble et peut être récupéré par d’autres procédés. L’or est trouvé dans la nature associé à des minéraux contenant de l’arsenic et de la pyrite. A. ferrooxidans et les organismes apparentés peuvent attaquer et solubiliser les minéraux arsénopyriteux, libérant l’or piégé (Au) : 2 FeAsS[Au] + 7 O2 + 2 H2O + H2SO4 → Fe2(SO4)3 + 2 H3AsO4 + [Au] L’or est alors complexé avec du cyanure selon les méthodes traditionnelles d’exploitation minière de l’or. Contrairement au cuivre pour lequel la lixiviation est pratiquée dans d’énormes terrils (voir figure 19.37a), la lixiviation de l’or est pratiquée dans des réacteurs relativement petits (voir figure 19.39). Ce procédé de biolixiviation libère environ 95 % de l’or piégé. De plus, bien que le processus rejette de l’arsenic et du cyanure qui sont des résidus toxiques, tous deux sont éliminés dans le bioréacteur. L’arsenic est éliminé comme précipité ferrique, et le cyanure (CN–) par son oxydation microbienne qui donne du CO2 et de l’urée, aux derniers stades du processus de récupération de l’or. La lixiviation microbienne de l’or à petite échelle est devenue une alternative aux techniques conventionnelles, plus coûteuses et néfastes à l’environnement. Des installations pilotes destinées à la lixiviation du zinc, du plomb et du nickel sont en cours de développement.

Ashanti Goldfields Corp., Ghana

Minerais de cuivre à faible teneur : sulfure de cuivre, CuS

FIGURE 19.39 Biolixiviation de l’or. Réservoirs de lixiviation de l’or (Ashanti Gold-fields, Ghana). À l’intérieur des réservoirs, un mélange de cellules d’Acidithiobacillus ferrooxidans, Acidithiobacillus thiooxidans et Leptospirillum ferrooxidans solubilise le minéral formé de pyrite et d’arsenic contenant de l’or et libère ce dernier. Voir le texte pour le détail des réactions.



664 Chapitre 19


Contrôlez vos acquis L’oxydation des minerais de cuivre par les bactéries conduit à la mise en solution du cuivre, un procédé nommé biolixiviation. La lixiviation est importante pour la récupération du cuivre, de l’uranium et de l’or à partir de minerais à faible teneur. L’oxydation bactérienne du fer dans la pyrite, un sulfure de fer, est aussi une part importante du processus de biolixiviation car le fer ferrique produit est lui-même un oxydant des minerais. •

Comment le CuS est-il oxydé en conditions anaérobies ?

•

Pourquoi est-il important de maintenir acide la solution de lixiviation dans le processus de biolixiviation du cuivre ?

•

En ce qui concerne l’oxydation du métal, en quoi le procédé de lixiviation du cuivre est-il différent de celui de l’or ?

19.16 Le mercure et les transformations m n des métaux lourds Les métaux sont présents en faibles concentrations dans les roches, les sols, les eaux et l’atmosphère. Certains de ces éléments trace (cobalt, cuivre, zinc, nickel, molybdène) sont indispensables aux cellules (voir section 5.1). À de fortes concentrations cependant, ces mêmes métaux peuvent être toxiques aux organismes vivants. Parmi eux, certains sont suffisamment volatils pour contaminer également l’air. Il s’agit du mercure, du plomb, de l’arsenic, du cadmium et du sélénium. Beaucoup de métaux lourds font l’objet de réactions d’oxydo-réductions catalysées par des micro-organismes. Plusieurs sont aussi convertis en une forme organique suite à l’activité microbienne. En raison des conséquences environnementales et du rôle significatif des micro-organismes, l’accent sera porté sur la biogéochimie du mercure.

Le cycle du mercure et le méthyl-mercure Bien que le mercure soit présent en très faibles concentrations dans la plupart des environnements naturels avec une moyenne d’environ 1 ng par litre, il est largement employé dans des processus industriels et est le principe actif de nombreux pesticides. En raison de sa propension inhabituelle à se concentrer dans les tissus vivants et de sa forte toxicité, le mercure a une importance environnementale considérable. Par exemple, l’exploitation des minerais de mercure et la combustion des combustibles fossiles libèrent environ 40 000 tonnes de mercure dans l’environnement chaque année. Une plus grande quantité est même libérée par les processus géochimiques naturels. Le mercure est aussi un sousproduit des industries électroniques, particulièrement la production de piles et de câbles, de l’industrie chimique et de l’incinération de déchets.

Hg0

Hg2+

CH3HgCH3

Air

Poissons

Hg0

Hg2+

CH3Hg+

CH3HgCH3

Hg2+

CH3Hg+

CH3HgCH3

Eau Sédiment Hg0

H2S

Complexes organiques et inorganiques HgS contenant Hg

CH4 + Hg0

FIGURE 19.40 Cycle biogéochimique du mercure. L’essentiel du mercure terrestre se situe dans l’eau et les sédiments où il peut être concentré dans les tissus animaux ou précipité sous forme de HgS. Les diverses formes du mercure rencontrées dans les environnements aquatiques sont indiquées par des couleurs différentes.

La principale forme de mercure dans l’atmosphère est le mercure élémentaire Hg0, volatil, et oxydé par photochimie en ion mercurique Hg2+ (voir figure 19.40). L’ion mercurique s’adsorbe facilement sur la matière particulaire et peut alors être métabolisé par les micro-organismes. L’activité microbienne conduit à la méthylation du mercure, ce qui donne du méthyl-mercure (CH3Hg+) [voir figure 19.40]. Du point de vue métabolique, la méthylation du mercure s’effectue par transfert de groupes méthyle à partir de méthyl-B12. Le méthyl-mercure est particulièrement toxique car il peut être absorbé au travers de la peau. Mais de plus, il est soluble et peut être concentré au long de la chaîne alimentaire en milieu aquatique, principalement chez les poissons. Le méthyl-mercure peut être ensuite à nouveau méthylé par des micro-organismes pour donner le composé volatil diméthyl-mercure (CH3-Hg-CH3). Le méthyl-mercure et le diméthyl-mercure s’accumulent dans les tissus animaux et en particulier dans les muscles. Le méthyl-mercure est environ cent fois plus toxique que Hg0 ou Hg+, et se concentre chez les poissons pour qui il est un puissant neurotoxique. Le méhyl-mercure constitue donc une toxine environnementale majeure, et son accumulation semble être particulièrement problématique dans les lacs d’eau douce où de fortes concentrations de méthyl-mercure ont été observées chez des poissons destinés à l’alimentation humaine. Le mercure peut aussi provoquer des dommages au niveau du foie et des reins chez l’homme et les animaux. Plusieurs autres transformations du mercure se produisent à l’échelle globale, incluant des réactions impliquant les bactéries sulfato-réductrices (H2S + Hg2+ → HgS) et méthanogènes (CH3Hg+ → CH4 + Hg0) [voir figure 19.40]. La solubilité de HgS est très faible, aussi dans les sédiments anoxiques où se déroule la sulfato-réduction, la plupart du mercure se trouve sous forme de HgS. Mais en cas d’aération, l’oxydation de



19.17 Biodégradation du pétrole 665

HgS se produit, principalement sous l’influence des thiobacilles, ce qui conduit à la formation de Hg2+ et SO42–, et finalement de méthyl-mercure.

La résistance au mercure À des concentrations suffisamment élevées, Hg2+ et CH3Hg+ peuvent être non seulement toxiques pour les organismes complexes, mais aussi pour les micro-organismes. Cependant, plusieurs bactéries peuvent réaliser la biotransformation de formes toxiques du mercure en formes non toxiques. Chez les bactéries Gram négatif résistantes au mercure, une enzyme liée au NADPH nommée réductase mercurique réduit Hg2+ en Hg0. L’Hg0 produit dans cette réaction est volatil, mais n’est pas toxique pour l’homme et les micro-organismes. La conversion bactérienne de Hg2+ en Hg0 permet à davantage de CH3Hg+ d’être converti en Hg2+ (voir figure 19.41). Chez la bactérie Gram négatif Pseudomonas aeruginosa, les gènes impliqués dans la résistance au mercure sont portés par un plasmide. Ces gènes, les gènes mer, sont organisés en un opéron sous le contrôle de la protéine régulatrice MerR (voir figure 19.41a). Il est intéressant de noter que MerR fonctionne à la fois comme un répresseur et comme un activateur (voir chapitre 8). En l’absence de Hg2+, MerR se fixe à la région opératrice de l’opéron mer, et empêche la transcription des gènes merTPCAD (voir figure 19.41a). Cependant, lorsque Hg2+ est présent, il forme un complexe avec MerR, qui fonctionne alors comme un activateur de la transcription de l’opéron mer.

O

P

T

A

D

(a) Hg2+ MerP SS

Hg2+

Hg0

Périplasme MerT SS

MerA

•

Quelles formes du mercure sont les plus toxiques pour les organismes ?

•

Comment le mercure est-il détoxifié par les bactéries ?

Hg2+

Hg

2+


2 e– Hg0

(b)

Divers plasmides (voir section 10.8) isolés de bactéries Gram positif et de bactéries Gram négatif codent des résistances aux métaux lourds. Certains plasmides de résistance aux antibiotiques possèdent aussi des gènes de résistance au mercure et à l’arsenic. D’autres plasmides codent seulement des résistances aux métaux lourds, et particulièrement des multirésistances. Les mécanismes de résistance à ces métaux sont variables. Par exemple, les résistances à l’arsenate et au cadmium sont dues à l’activité d’enzymes qui pompent vers l’extérieur l’arsenate et le cadmium incorporés, empêchant ainsi les métaux de dénaturer les protéines. D’autres mécanismes peuvent impliquer des changements de potentiel redox (voir figure 19.41). Les bactéries qui résistent naturellement à de fortes concentrations de plusieurs métaux contiennent souvent des plasmides codant de multiples résistances. Ces organismes multirésistants sont communs dans les rejets d’industries métallurgiques ou d’exploitations minières, dans lesquelles les métaux lourds sont lessivés en même temps que le fer ou le cuivre (voir section 19.15).

Le méthyl-mercure est une des formes les plus toxiques du mercure. Ce composé peut être transformé en Hg2+, qui est réduit en Hg0 par les bactéries. L’aptitude des bactéries à résister à la toxicité des métaux lourds est souvent due à la présence de plasmides spécifiques qui codent des enzymes capables de détoxifier ou d’éliminer ces métaux.

Régulation Transport Fonction inconnue

MerP SS

Les autres résistances aux métaux


Régulation : répression et activation Protéine de liaison périplasmique Réductase mercurique (Hg2+) R

La protéine MerP est une protéine périplasmique se fixant à Hg2+ (voir figure 19.41b). MerP se fixe à Hg2+ et le transfère à une protéine membranaire MerT, qui transporte Hg2+ dans la cellule en vue de la réduction par la réductase mercurique (voir figure 19.41b). Le résultat final est la réduction de Hg2+ en Hg0, qui est volatil et s’échappe de la cellule (voir figure 19.41b).

MerA

FIGURE 19.41 Mécanisme de la réduction de Hg 2+ en Hg° chez Pseudomonas aeruginosa. (a) L’opéron mer. MerR fonctionne soit comme répresseur (absence de Hg2+), soit comme activateur de la transcription (présence de Hg2+). (b) Transport et réduction de Hg2+. Hg2+ est lié à des résidus cystéine dans les protéines MerP et MerT.

19.17 Biodégradation du pétrole m n Le pétrole est très riche en matière organique, et pour cette raison, les micro-organismes attaquent facilement les hydrocarubures en conditions aérobies, lorsqu’ils sont amenés au contact de l’air et de l’humidité. Dans certaines conditions, comme dans les réservoirs de stockage, la croissance microbienne n’est pas souhaitable. Cependant, lors des déversements accidentels, la bioremédiation du pétrole est appréciée et peut être facilitée par l’addition de nutriments inorganiques. L’importance des procaryotes dans la bioremédiation du pétrole a été démontrée ces dernières années lors de plusieurs accidents pétroliers majeurs (voir figure 19.43).



666 Chapitre 19


US Environmental Protection Agency

La biochimie de la dégradation du pétrole a été étudiée dans la section 17.23 et l’accent a été mis sur le rôle important joué par les enzymes oxygénases dont la fonction est l’introduction d’un atome d’oxygène dans la molécule d’hydrocarbure (voir figure 17.55). La partie qui suit sera centrée sur les processus aérobies dans lesquels ces enzymes sont impliquées et l’oxydation, dans la nature, des hydrocarbures les plus significatifs.

La décomposition des hydrocarbures

Bactéries

T. D. Brock

Gouttelettes d’eau

FIGURE 19.42 Bactéries oxydant les hydrocarbures associées à des gouttelettes de pétrole. Les bactéries sont concentrées en grand nombre à l’interface eau-pétrole, mais pas à l’intérieur des gouttelettes.

(a)

US Environmental Protection Agency

Une grande diversité de bactéries, plusieurs moisissures et levures, certaines cyanobactéries et algues vertes peuvent oxyder les produits pétroliers en aérobiose. Les pollutions pétrolières à petite échelle d’écosystèmes aquatiques et terrestres par des activités humaines ou des processus naturels sont communes. Il existe ainsi des communautés microbiennes diversifiées dans ces environnements qui utilisent le pétrole comme donneur d’électrons. Le méthane, l’hydrocarbure le plus simple, est catabolisé seulement par un groupe spécialisé de bactéries, les méthanotrophes (voir sections 12.6 et 17.24), et ces organismes ne se développent pas sur les hydrocarbures plus lourds. Les micro-organismes oxydant le pétrole se développent rapidement sur les nappes de pétrole. L’activité d’oxydation du pétrole est plus intense si la température et les nutriments inorganiques (surtout l’azote et le phosphore) sont aux valeurs idéales (voir figure 19.43). Le pétrole étant insoluble dans l’eau, et plus léger, il flotte à la surface et forme des nappes. Les bactéries qui l’oxydent sont souvent attachées en grand nombre aux gouttelettes d’hydrocarbures (voir figure 19.42). Ces bactéries décomposent finalement le pétrole et dispersent les nappes. Les micro-organismes dégradent le pétrole (voir figure 19.43) en l’oxydant en CO2. Lorsque se produit un déversement important, les fractions d’hydrocarbures volatils s’évaporent rapidement, laissant la place à des composés aliphatiques et aromatiques plus lourds offerts à la dégradation des micro-organismes. En dégradant les hydrocarbures, les bactéries impliquées dans le processus peuvent augmenter d’un facteur 103 à 106 peu de temps après le déversement accidentel. Des expériences utilisant des hydrocarbures marqués comme traceurs, ou des mesures de consommation d’oxygène indicatrices de l’activité respiratoire ont montré, qu’en conditions optimales, jusqu’à 80 % des composés non volatils du pétrole sont oxydés par les bactéries dans l’année qui suit l’accident pétrolier. Certaines fractions d’hydrocarbures, tels que les hydrocarbures ramifiés et polycycliques, cependant,

(b) FIGURE 19.43 Conséquences environnementales des marées noires et effets de la bioremédiation. (a) Plage contaminée de la côte de l’Alaska, suite à la marée noire provoquée par l’Exxon Valdez en 1989. (b) La zone rectangulaire (marquée d’une flèche) a été traitée par des nutriments inorganiques pour stimuler la bioremédiation du pétrole par des microorganismes ; les zones situées à gauche et à droite n’ont pas été traitées.

demeurent beaucoup plus longtemps dans l’environnement. Le pétrole déversé qui se trouve incorporé aux sédiments est dégradé très lentement et peut avoir un impact significatif à long terme sur les pêcheries et activités similaires qui exigent des eaux non polluées pour être réellement productives. Les interfaces entre le pétrole et l’eau se rencontrent souvent à de grandes échelles. Par exemple, il est pratiquement impossible d’empêcher l’humidité de s’accumuler dans les réservoirs de stockage d’hydrocarbures, car l’eau forme une couche au-dessous du pétrole. Les réservoirs d’essence et de pétrole brut (voir figure 19.44) constituent des habitats potentiels pour les micro-organismes oxydant les hydrocarbures. S’il y a suffisamment de sulfates dans l’eau de mer, les bactéries sulfato-réductrices peuvent se développer dans ces réservoirs et consommer les hydrocarbures en conditions anaérobies (voir section 17.23). L’hydrogène sulfure (H2S) produit est très corrosif et peut causer la perforation et par conséquent des fuites dans ces réservoirs.

La production du pétrole Bien que la dégradation du pétrole puisse être assez intense, la production microbienne d’hydrocarbures se produit également grâce à l’action en particulier de certaines algues vertes. Par



Standard Oil Company

19.18 Biodégradation des xénobiotiques 667

FIGURE 19.44 Biodégradation du pétrole. Réservoirs de grand volume pour le stockage des hydrocarbures, dans lesquels se développent d’importantes quantités de micro-organismes aux interfaces eau-hydrocarbures.

•

Qu’est-ce que la bioremédiation ?

•

Pourquoi l’addition de nutriments inorganiques stimule-t-elle la dégradation du pétrole, et pas le glucose ?

19.18 Biodégradation des xénobiotiques m n Les xénobiotiques sont des composés chimiques de synthèse qui n’existent pas naturellement. Parmi les xénobiotiques, on trouve les pesticides, les polychloro-biphényls (PCBs, utilisés dans l’industrie électrique), les munitions, colorants et solvants chlorés et beaucoup d’autres. De nombreux xénobiotiques ont une structure chimique proche de celles de composés naturels et peuvent donc être lentement dégradés par les enzymes qui existent déjà et dégradent ces composés naturels. Cependant, certains xénobiotiques diffèrent tellement, chimiquement parlant, des composés auxquels les micro-organismes sont confrontés naturellement, qu’ils ne sont dégradés qu’extrêmement lentement, voire pas du tout. Les pesticides sont un bon exemple des possibilités de dégradation des micro-organismes.

Arthur Nonomura

Le catabolisme des pesticides

FIGURE 19.45 Production de pétrole par phototrophie. Vue en microscopie (contraste interférenciel de Nomarski) de cellules de l’algue verte Botryococcus braunii. Notez les gouttelettes d’hydrocarbure, produites et excrétées par cette algue à l’extrémité des cellules.

exemple, chez l’algue coloniale Botryococcus braunii, la croissance s’accompagne de l’excrétion d’hydrocarbures à longue chaîne (C30-C36) qui ont la consistance du pétrole (voir figure 19.45). Chez B. braunii, environ 30 % du poids sec des cellules est du pétrole, et l’utilisation de cet organisme ainsi que d’autres algues productrices, comme sources alternatives de pétrole, ont été envisagées. Il est certain que le pétrole de certaines formations de schistes bitumineux a pour origine des algues vertes comme B. braunii, qui se sont développées par le passé au fond des lacs.

Contrôlez vos acquis Les hydrocarbures peuvent être dégradés par les bactéries. Les micro-organismes oxydant les hydrocarbures sont utilisés pour la bioremédiation de déversements accidentels de pétrole, et leur activité est favorisée par l’addition de nutriments inorganiques, de manière à équilibrer l’apport de carbone par le pétrole. Quelques algues peuvent produire des hydrocarbures.

Les pesticides sont parmi les xénobiotiques les plus largement distribués et sont trouvés fréquemment dans les rejets toxiques. Plus de 1 000 pesticides ont été mis sur le marché dans le but de contrôler chimiquement les organismes nuisibles. On y trouve des herbicides, insecticides et fongicides. Les pesticides appartiennent à des familles chimiques variées, et parmi eux des composés chlorés, des noyaux aromatiques, des composés azotés et phosphorés et beaucoup d’autres (voir figure 19.46). Certaines de ces substances sont des sources de carbone et des donneurs d’électrons convenables pour des micro-organismes du sol, d’autres non. Si une substance peut être attaquée par des micro-organismes, elle peut finalement disparaître du sol. De telles dégradations sont souhaitables car elles évitent l’accumulation de substances toxiques dans le sol. Cependant, des composés relativement proches peuvent fortement différer dans leur biodégradabilité (voir tableau 19.7). Aussi, quelques composés persistent relativement intacts pendant des années, tandis que d’autres sont significativement dégradés en seulement quelques semaines ou quelques mois. Les taux relatifs de rémanence des xénobiotiques sont seulement approximatifs car de nombreux facteurs environnementaux – température, pH, aération, teneur en matière organique du sol – influencent aussi la décomposition. Certains insecticides chlorés sont si récalcitrants (voir figure 19.46) qu’ils peuvent persister plus de 10 ans. Cependant, même la disparition complète d’un pesticide d’un écosystème ne signifie pas nécessairement qu’il a été dégradé par les micro-organismes ; la perte d’un pesticide peut aussi se produire par évaporation, lessivage, ou dégradation chimique spontanée. La biodisponibilité pilote aussi d’une certaine façon l’attaque microbienne de composés xénobiotiques. De nombreux xénobiotiques sont assez hydrophobes et donc pas très solubles dans l’eau.



668 Chapitre 19


CCl3

CH3O S P CH3O

Cl

C

Cl

H

SCHCOOC2H5

TABLEAU 19.7

INSECTICIDES DANS LES SOLS

CH2COOC2H5

DDT ; dichlorodiphényltrichloéthane Malathion ; acide diéthyl (organochloré) ester mercaptosuccinique (organophsphaté) OCH2COOH

Cl

Cl

C

H H N Site de l’addition de Cl pour 2, 4, 5-T

H3C

C N

Cl

CH3

2,4-D ; acide dichlorophénoxy acétique (dérivé de l’acide chlorophénoxy acétique) Cl

N H N C2H5

N

Cl

Cl Cl

O

N CH3 CH3

Monuron ; 3-(4-chlorophényl)-1 -diméthylurée

Chloro biphényl (PCB) ; ici le 2, 3, 4, 2’, 4’, 5’-hexachlorobiphényle

4 ans

Aldrine

3 ans

Chlordane

5 ans

Heptachlore

2 ans

Lindane (hexachlorocyclohxane)

3 ans

Diazinon

12 semaines

Malathion

1 semaine

Parathion

1 semaine

Herbicides Cl

Cl Cl

DDT [1,1,1-trichloro-2,2-bis(ρ-chlorophényl) éthane]a

Insecticides organophosphatés

Cl

C

Substance

Temps nécessaire pour une disparition à 75–100 %

Insecticides chlorés

Atrazine ; 2-chloro-4-éthylamino-6 -isopropylaminotriazine (dérivé de la triazine)

N H

PERSISTENCE DES HERBICIDES ET DES

H

C C

Cl

2,4-D (2,4-acide dichlorophenoxyacétique)

4 semaines

Cl

2,4,5-T (2,4,5-acide trichlorophénoxyacetique)

20 semaines

Dalapon

8 semaines

Atrazine

40 semaines

Simazine

48 semaines

Propazine

1,5 an

Trichloroéthylène

FIGURE 19.46 Exemples de composés xénobiotiques. Bien qu’aucun de ces composés n’existe naturellement, de nombreux micro-organismes sont capables de les décomposer (voir la durée de vie de ces composés dans le tableau 19.7 et les voies de biodégradation du 2, 4, 5-T dans la figure 19.47).

L’adsorption de ces composés sur la matière organique et l’argile dans les sols et les sédiments diminue l’accessibilité aux micro-organismes. L’addition de surfactants ou d’émulsifiants augmente souvent la biodisponibilité et finalement la biodégradation du composé xénobiotique. De nombreux organismes métabolisent les pesticides et les herbicides, y compris plusieurs genres de bactéries et de champignons. Certains pesticides constituent à la fois des sources de carbone et d’énergie, et peuvent être oxydés en CO2. Cependant, d’autres composés sont attaqués seulement faiblement ou pas du tout. Certains composés peuvent être dégradés partiellement ou en totalité, à condition qu’une autre substance organique soit présente en tant que source d’énergie primaire. Ce phénomène se nomme cométabolisme ou cooxydation. Cependant, si la dégradation est seulement partielle, le produit de la dégradation microbienne d’un pesticide peut parfois être même plus toxique que le composé original.

La respiration anaérobie des composés chlorés La déchloration réductrice est une forme de respiration anaérobie qui a été décrite dans le chapitre 17. Au cours de ce procédé, les composés organo-chlorés sont employés comme accepteurs terminaux d’électrons en conditions anaérobies (voir section 17.18). La réduction du chlorobenzoate en benzoate par

a

Voir structure figure 19.46.

la bactérie Desulfomonile est un bon modèle de laboratoire pour l’étude de la déchloration réductrice : C7H4O2Cl– + 2 H → C7H5O2– + HCl Du point de vue de la bioremédiation, d’autres composés chlorés sont écologiquement plus importants que le chlorobenzoate. Par exemple, la déchloration réductrice peut se produire avec les composés dichloro-, trichloro- et tetrachloro- (perchloro-) éthylène, chloroforme, dichlorométhane, certains polychloro-biphényls (PCBs, voir figure 19.46), et de nombreux composés bromés et fluorés. Ces composés toxiques, dont certains (particulièrement le trichloréthylène, voir figure 19.46) ont été associés au cancer, sont largement utilisés comme solvants industriels, agents dégraissants et isolants dans les transformateurs électriques. Ils pénètrent dans les environnements anoxiques lors de déversements accidentels, ou à la suite de fuites lentes de réservoirs de stockage, ou de transformateurs abandonnés. Finalement, ils atteignent les eaux souterraines, où ils constituent les contaminants les plus fréquemment détectés dans les nappes phréatiques aux ÉtatsUnis. Il existe plusieurs genres bactériens (voir section 17.18) capables de déchloration qui peuvent transformer de nombreux composés chlorés en métabolites inoffensifs. Il est



19.18 Biodégradation des xénobiotiques 669

extrêmement intéressant de stimuler les activités de bioremédiation de ces procaryotes en tant que stratégie pour l’élimination de ces composés très toxiques de l’environnement.

La déchloration aérobie La déchloration aérobie des composés chlorés est aussi possible (voir figure 19.47), mais ici, des mécanismes biochimiques impliquant l’oxygène sont mis en œuvre (voir figure 19.47). Dans ces conditions, la déchloration de composés chlorés aromatiques se produit grâce à des enzymes nommées oxygénases (voir section 17.22). Par exemple, dans la déchloration aérobie du pesticide 2,4,5-T, après la déchloration, une dioxygénase rompt le noyau aromatique. Ceci génère des composés qui sont métabolisés via le cycle de l’acide citrique (voir figure 19.47b).

100 7

Croissance

75

Cellules/mL

107

Cl50

5 x 106

25

2 x 106 106

0

1

2

3

4

5

Chlorure libéré (%)

2 x 10

0

6

Temps (j) (a) OCH2COO– Cl

Cl–

OH

Cl

Cl

Cl

–O

O2

Cl

OH Cl

Cl

Cl 2,4,5,-T

Dioxygénase

Cl–

OH

C

O

O C H

OH

Bien que la dégradation aérobie des xénobiotiques chlorés soit sans aucun doute importante sur le plan écologique, la déchloration réductive revêt un intérêt environnemental en raison de la rapidité avec laquelle des conditions anaérobies peuvent se mettre en place dans les habitats naturels microbiens pollués et des contraintes biochimiques (voir figure 19.47b) qui s’en suivent sur les organismes aérobies.

La biodégradation des plastiques Un domaine majeur des questions environnementales, au-delà de la biodégradation des déchets toxiques comme les pesticides et autres hydrocarbures chlorés, est le devenir des déchets solides et particulièrement des plastiques. Les décharges sont pleines de papier, nourriture, gravas et plastiques. Les taux de dégradation de ces matériels sont en général très bas car les conditions, manque d’oxygène et d’humidité, ne permettent pas une activité microbienne rapide. De plus, des produits comme les plastiques sont par nature récalcitrants à la dégradation. L’industrie des plastiques produit en moyenne près de 40 milliards de kilos de plastiques par an, dont environ la moitié est déversée dans les décharges. Les plastiques sont des polymères xénobiotiques de types variés : polyéthylène, polypropylène et polystyrène par exemple (voir figure 19.48). Beaucoup de ces polymères synthétiques restent pratiquement inaltérés pendant des décades dans les décharges. Ce problème a alimenté la recherche de substituts biodégradables, les biopolymères. Certains ont connu un réel succès commercial, et parmi eux les polymères photodégradables et contenant de l’amidon, et les plastiques microbiens. Les plastiques photobiodégradables sont des polymères dont la structure est altérée par l’exposition aux radiations ultraviolettes du soleil, ce qui donne des polymères sensibles à l’attaque microbienne. L’amidon (voir figure 3.6a) est incorporé dans certains plastiques comme liaison entre des fragments courts d’un deuxième polymère biodégradable. Cette configuration accélère la biodégradation car les bactéries amylolytiques du sol attaquent l’amidon, libérant les fragments de polymères qui sont alors dégradés par d’autres micro-organismes. Les plastiques synthétisés par voie microbienne sont calqués sur le polymère de stockage poly-β-hydroxyalcanoate

Cl– O O– H

Succinate2– + Acétate–

– CH2 – CH2 –

– CH2– CH –

n

– CH2 – CHCI –

CH3

Polyéthylène

n

Polypropylène

(b) FIGURE 19.47 Biodégradation de l’herbicide 2, 4, 5-T. (a) Croissance de Burkholderia cepacia sur 2, 4, 5-T comme seule source de carbone et d’énergie. La souche a été enrichie à partir d’un échantillon naturel, en utilisant un chémostat pour maintenir une faible concentration de l’herbicide. La croissance est aérobie en présence de 1,5 g/L de 2, 4, 5-T. La libération de chlore prouve la biodégradation. (b) Voie de la dégradation aérobie de 2, 4, 5-T. Le mécanisme de l’action de la dioxygénase est présenté dans la chapitre 17 (figure 17.56c). Plusieurs bactéries peuvent cataboliser des composés aromatiques en conditions anaérobies, mais le mécanisme utilisé est assez différent de celui présenté ici (figure 17.57).

– CH2– CH(C6H5)–

n

Polystyrène

C6H7O5(OC– CH3)3

R1 – NH– CO – O – R2

Polyuréthane

n

Chlorure de polyvinyle (PVC)

n

– CF2 – CF2 –

n

Téflon

R n

– Si – O –

R

Acétate de cellulose

n

Silicones

FIGURE 19.48 Composition chimique de polymères synthétiques. Structure monomérique de quelques polymères synthétiques courants.



670 Chapitre 19

PHV CH3

O

les végétaux. Nous illustrerons ce cas d’interaction par l’exemple du crown gall qui présente des caractéristiques tout à fait uniques à la fois au niveau du mode de transmission par un microorganisme et dans certains aspects de sa physiopathologie.

PHB

CH2

O

CH

C CH2


O

CH3 CH O

C CH2

O

19.19 L’environnement des plantes m n

FIGURE 19.49 Plastiques d’origine bactérienne. (a) Copolymère de PHV/ PHB. (b) Une marque de shampoing commercialisée en Europe dans un flacon fait d’un copolymère de poly- βhydroxybutyrate (PHB) et poly-βhydroxyvalérate (PHV, voir a). Ce matériel étant un produit naturel, le flacon est biodégradable en conditions aérobies et anaérobies.

Helmut Brandl

(a)

(b)

(PHA, section 4.11) [voir figure 19.49]. Les PHA possèdent plusieurs des propriétés générales des plastiques synthétiques et peuvent être synthétisés selon des formules chimiques variées. Un copolymère contenant approximativement des quantités égales de PHB (poly-β-hydroxybutyrate) et de PHV (poly-β-hydroxyvalérate) [voir figure 19.49a] a connu un grand succès commercial à ce jour dans ce domaine. Cependant, parce qu’ils sont plus rentables économiquement, les plastiques dérivés du pétrole occupent pratiquement tout le marché actuel des plastiques.

Contrôlez vos acquis De nombreux composés chimiques de synthèse tels que les insecticides, herbicides et plastiques (tous appelés xénobiotiques) sont complètement étrangers aux micro-organismes, mais ils peuvent souvent être dégradés par un procaryote particulier. Des mécanismes aérobies et anaérobies sont connus. •

Quels sont les caractères chimiques partagés par les composés de la figure 19.46 ?

•

Qu’est-ce que la déchloration réductrice et en quoi diffère-t-elle des réactions montrées dans la figure 19.47 ?

•

Quels avantages ont les biopolymères par rapport aux polymères synthétiques ?

VII

INTERACTIONS ENTRE PLANTES ET MICRO-ORGANISMES

Nous allons clore ce chapitre par l’étude de trois exemples d’interactions entre les micro-organismes et les plantes. Il existe de nombreux cas de symbiose à bénéfice réciproque entre plantes et micro-organismes comme les lichens, les mycorhizes et les nodosités racinaires des Légumineuses. Il y a aussi des microorganismes pathogènes qui sont responsables de maladie chez

Comme habitats microbiens, les plantes sont extrêmement différentes des animaux. Par comparaison aux animaux à sang chaud, la température d’une plante varie énormément à la fois tout au long de la journée mais aussi au cours de l’année. De même, comparativement à la sophistication du système circulatoire animal, les systèmes de communication interne chez les végétaux apparaissent très peu développés, ce qui, dans bien des cas, limite la propagation des micro-organismes dans la plante. Les parties aériennes du végétal, les tiges et les feuilles en particulier, sont soumises à la dessiccation de façon intermittente. C’est la raison pour laquelle de nombreuses plantes possèdent une cuticule à la surface de leurs organes foliaires, ce qui leur permet de retenir l’eau d’une part et d’autre part les protège contre l’intrusion des micro-organismes. Les racines représentent au contraire un habitat privilégié pour l’activité microbienne. À ce niveau, la teneur en eau est plus régulière et les nutriments en concentrations plus élevées.

Rhizosphère et phyllosphère La rhizosphère qui correspond à la partie du sol qui entoure le système racinaire (voir figure 19.6b) est une zone dans laquelle l’activité microbienne est habituellement intense. Les micro-organismes du rhizoplan sont ceux qui sont directement liés à la surface externe des racines. Comparativement, l’abondance bactérienne est toujours supérieure dans la zone rhizosphère / rhizoplan, souvent de plusieurs puissances, par rapport aux zones du sol dépourvues de racines (voir figure 19.50). La raison en est que les racines exsudent d’importantes quantités de sucres, d’acides aminés, d’hormones et de vitamines. C’est pourquoi les bactéries comme les champignons forment souvent des microcolonies à la surface des racines. La surface des feuilles représente la phyllosphère. En condition de forte hygrométrie comme dans les forêts humides des zones tropicales ou tempérées, la microflore, constituée aussi bien de champignons (voir figure 19.50a) que de bactéries, peut être relativement abondante. De nombreuses bactéries de la phyllosphère fixent l’azote (voir sections 17.28 et 19.22), tandis que les feuilles fournissent en retour des hydrates de carbone ainsi que d’autres nutriments à ces bactéries.

Contrôlez vos acquis La rhizosphère et le rhizoplan ainsi que la phyllosphère représentent les habitats majeurs des micro-organismes. •

Pour quelles raisons les racines des plantes représentent-elles un environnement beaucoup plus attractif pour les bactéries comparativement aux sols dépourvus de plantes ?



John H. Andrews

T. D. Brock

19.20 Lichens et mycorhizes 671

(a)

M. T. Madigan

(a)

(b)

Frank B. Dazzo

Frank B. Dazzo

(b)

(c)

FIGURE 19.50 Exemples de vie microbienne dans la phyllosphère et la rhizosphère. (a) Image en microscopie à fluorescence du champignon Aureobasidium pullulans sur la surface d’une feuille de pommier. Les cellules sont colorées par la technique du FISH (section 18.4) et les filaments comme les spores apparaissent en vert. Un filament fongique mesure environ 7 µm de diamètre. (b) Image en microscopie confocale laser (section 4.2) de cellules bactériennes de la rhizo-phyllosphère de trèfle. L’association de bactéries fixatrices d’azote avec les racines des Légumineuses est présentée dans la section 19.22. (c) Vue en microscopie électronique à balayage de cellules de Rhizobium leguminosarum biovar trifolii, attachées à des poils racinaires de trèfle. Les cellules bactériennes en (b) et (c) mesurent environ 1 µm de diamètre.

19.20 Lichens et mycorhizes m n Les lichens forment des structures luxuriantes ou bien encroutantes que l’on trouve en général à la surface des rochers, sur le tronc des arbres, sur le toit des maisons ou encore sur les sols nus (voir figure 19.51). Les lichens sont une association symbiotique entre deux organismes, un champignon et une algue ou une cyanobactérie. Cependant, un champignon donné (appelé le mycobionte) est capable de réaliser une symbiose avec différents organismes phototrophes (le phycobionte) et vice versa. L’algue qui est photosynthétique est capable de produire de la matière organique qui est ensuite utilisée comme source nutritionnelle par le champignon. Le champignon, incapable

FIGURE 19.51 Lichens. (a) Lichen sur la branche morte d’un arbre. (b) Lichens recouvrant la surface d’un rocher.

d’activité photosynthétique, forme un substrat fixe dans lequel le phycobionte peut se développer à l’abri des stress de l’environnement comme la pluie ou le vent. De plus, le mycobionte facilite l’apport en eau et en minéraux au phycobionte à partir du substrat sur lequel vit le lichen. Les lichens sont habituellement trouvés sur des surfaces où ne se développent pas d’autres organismes et leur aptitude particulière à croître dans de tels environnements découle directement des interactions mutualistes entretenues par les deux partenaires.

Structure des lichens et écologie Les lichens sont constitués de l’association étroite entre des cellules fongiques parmi lesquelles les cellules du phototrophe sont enchâssées (voir figure 19.52). De nombreuses espèces de champignons sont capables de réaliser cette association symbiotique et la morphologie du lichen dépend essentiellement du mycobionte. Le nombre d’espèces d’algues capables de former ce type d’association symbiotique est beaucoup plus faible et souvent, différents lichens contiennent le même partenaire algal. Certains lichens contiennent au contraire des cyanobactéries fixatrices d’azote (comme phycobionte) à la place d’une algue. Le phycobionte se répartit sous forme de strates ou bien encore de massifs au sein de la structure intime du lichen (voir figure 19.52). Si le champignon tire clairement profit de cette association symbiotique, qu’en est-il pour l’autre partenaire ? Les acides licheniques, qui sont des composés organiques complexes excrétés par le mycobionte, favorisent la dissolution et la chélation de nutriments minéraux qui sont essentiels pour le phycobionte. La plupart des habitats dans lesquels vivent les lichens étant secs, un autre rôle du champignon est de protéger le phototrophe de la dessiccation, les mycètes étant généralement plus aptes que les algues à supporter la sécheresse.



672 Chapitre 19


Les Mycorhizes

Couche de cellules d’algues

T. D. Brock

Hyphes fongiques

Liaison au substrat ressemblant à une racine

FIGURE 19.52 Structure d’un lichen. Vue au microscope d’une coupe au travers d’un lichen. La couche d’algue est située à l’intérieur du lichen de telle manière qu’elle reçoive le maximum de lumière.

La plupart des lichens ont un développement extrêmement lent. Par exemple, un lichen couvrant une surface de 2 cm sur un rocher peut en fait être âgé de plusieurs années. La croissance d’un lichen varie d’environ 1 mm ou moins à 3 cm par an, selon les espèces constituant l’association symbiotique ainsi qu’en fonction de la pluviométrie et de l’intensité lumineuse auxquelles est exposé le lichen.

Les mycorhizes (littéralement « les champignons racinaires ») désignent l’association symbiotique entre les racines des plantes et des mycètes. La majorité des plantes terrestres ont leurs racines mycorhizées. On a décrit deux formes d’associations mycorhiziennes principales, l’ectomycorhize et l’endomycorhize. Dans l’ectomycorhize (voir figure 19.53), les filaments mycéliens forment un manchon externe autour de l’extrémité de la racine, avec une pénétration intercellulaire limitée du mycète dans les tissus racinaires. Au contraire, dans l’endomycorhize, les hyphes mycéliennes pénètrent profondément dans les tissus racinaires. Les ectomycorhizes sont essentiellement observées associées aux arbres de la forêt des régions tempérées et boréales, principalement aux conifères, aux hêtres et aux chênes. Pratiquement toutes les racines de chaque arbre de ces forêts sont mycorhizées. Le système racinaire d’un arbre mycorhizé comme le pin (du genre Pinus) est constitué à la fois de longues racines et d’autres plus courtes. Les racines courtes, qui font l’objet d’une colonisation fongique typique, présentent des ramifications dichotomiques caractéristiques (voir figure 19.53a), les racines longues étant elles-mêmes fréquemment colonisées. Les endomycorhizes sont encore plus fréquentes que les ectomycorhizes. L’endomycorhize Arbuscular mycorrhizae a été détectée dans les racines de plus de 80 % des espèces végétales terrestres examinées à ce jour. Pour assurer leur croissance, la plupart des espèces fongiques mycorhiziennes ne catabolisent ni la cellulose ni la litière de feuilles mais utilisent des hydrates de carbone simples et ont des exigences à l’égard d’une ou plusieurs vitamines. Elles

Mycorhize fourchue

J. R. Schramm

Rhizomorphes de champignon

FIGURE 19.53 Mycorhizes. (a) Ectomycorhize typique de la racine du Pin, Pinus rigida, formée par les rhizomorphes du champignon Telephora terrestris. (b) Plantules (seedling) de Pinus contorta présentant un important développement du mycélium de son champignon associé Suillus bovinus. La croissance se traduit par une forme en éventail de l’ectomycorhize racinaire qui prélève les nutriments dans le sol.

D. J. Read

(a)

(b)



19.20 Lichens et mycorhizes 673

tirent leur source carbonée de l’exsudation racinaire mais puisent les éléments minéraux dont elles ont besoin directement dans le sol. Les champignons mycorhiziens sont rarement trouvés sous forme libre dans la nature mais pratiquement toujours en association symbiotique au point que la majorité d’entre eux peuvent être considérés comme des symbiotes obligatoires. Les mycètes produisent à leur tour des substances de croissance bénéfiques pour la plante, qui induisent des altérations morphologiques élicitant la formation du mycorhize. Malgré les relations étroites qui caractérisent la symbiose mycorhizienne, une seule espèce de pin est pourtant capable de réaliser une association de ce type avec plus de quarante espèces fongiques différentes. L’effet bénéfique de la présence symbiotique du champignon sur la plante s’observe mieux sur sols pauvres, les arbres mycorhizés étant capables de s’y développer là où les autres ne le pourront pas. Par exemple, lorsque l’on plante des arbres dans une prairie, dont le sol est dépourvu de l’inoculum fongique adéquat, les arbres qui auront été préalablement inoculés artificiellement au moment de la plantation auront une croissance beaucoup plus rapide que ceux qui ne l’auront pas été (voir figure 19.54). Les plants mycorhizés ont une meilleure capacité d’absorption des nutriments à partir de cet environnement, ce qui leur confère un avantage compétitif. Cette amélioration de la capacité d’absorption est directement liée à l’augmentation de la surface d’échange due à la présence du champignon. Par exemple, chez la plantule de pin présentée sur la figure 19.53b, le mycélium de

l’ectomycorhize constitue la plus grande partie de la zone d’absorption du système racinaire. Outre le fait que les champignons mycorhiziens aident à l’absorption des nutriments, il semble qu’ils jouent en plus un rôle prépondérant dans le contrôle de la diversité des espèces. En effet, les expériences ont montré qu’il existe une corrélation positive entre l’abondance et la diversité des espèces mycorhiziennes présentes dans un sol et l’étendue de la diversité des espèces végétales qui s’y développent. Ainsi, les mycorhizes sont un très bon exemple de symbiose entre plante et micro-organismes au bénéfice réciproque des deux partenaires : la plante mycorhizée présente une aptitude physiologique plus performante, ce qui lui permet d’être plus compétitive au sein d’une communauté végétale diversifiée, tandis que le champignon est assuré d’un apport régulier en nutriments organiques.

Contrôlez vos acquis Les lichens sont des associations symbiotiques entre un champignon et une algue ou une cyanobactérie. Les mycorhizes se développent à la suite de l’association d’un champignon au niveau du système racinaire d’une plante, ce qui favorise leur capacité d’absorption des nutriments. Les mycorhizes ont un réel effet bénéfique tant au niveau de la santé que de la compétitivité de la plante. •

Quelles différences y a-t-il entre les endomycorhizes et les ectomycorhizes ?

•

Pour quelle(s) raison(s) l’association mycorhizienne est-elle considérée comme une forme de symbiose ?

S. A. Wilde

19.21 Agrobacterium et la maladie m n du crown gall

FIGURE 19.54 Effets de champignons « mycorhizes » sur la croissance de plantes. Plantules de six mois de pins de Monterey (Pinus radiata) sur un sol de prairie : à gauche, absence de mycorhizes ; à droite, présence de mycorhizes.

Certains micro-organismes sont des pathogènes de plantes. Ils provoquent donc des maladies chez les végétaux. Agrobacterium, qui est un genre bactérien proche de Rhizobium, une bactérie responsable de la formation de nodosités racinaires (voir la section suivante), comprend des espèces qui ont la capacité de provoquer des excroissances tumorales chez un certain nombre d’espèces végétales. Les espèces les mieux décrites sont A. tumefaciens, agent causal de la maladie de la galle du collet (crown gall), et A. rhizogenes, responsable de la maladie du chevelu racinaire (hairy root). Bien qu’à la suite d’une blessure, les plantes soient capables de former de légères excroissances tissulaires appelées cals, les galles issues de l’infection par A. tumefaciens (voir figure 19.55) en diffèrent par leur croissance incontrôlée. En cela, elles s’apparentent aux excroissances tumorales des animaux. Une fois induites, ces tumeurs poursuivent leur développement même en l’absence d’Agrobacterium, ce qui indique que la présence de la bactérie n’est plus nécessaire après la phase d’induction de la maladie. Chez les cellules d’Agrobacterium tumefaciens, la présence d’un plasmide de grande taille, appelé plasmide Ti pour



674 Chapitre 19

Écologie microbienne ADN-T

G C D E A B

onc

Jo Handelsman

Gènes vir (codent les facteurs de virulence)

FIGURE 19.55 Tumeur végétale. Photographie d’une tumeur végétale sur une plante de tabac provoquée par une bactérie du genre Agrobacterium. A. tumefaciens provoque ces excroissances brunes, évoquant du bois, sur de nombreuses plantes. Cette maladie se rencontre chez les arbres fruitiers et des plantes ornementales comme les roses et les marguerites. La maladie ne tue généralement pas la plante, mais l’affaiblit et la rend sensible à d’autres maladies. Les tumeurs, mêmes séparées de la plante, constituent un réservoir pour A. tumefaciens.

tumor induction, est nécessaire pour induire la formation d’une tumeur (voir figure 19.56). A. rhizogenes porte également un plasmide, nommé Ri, responsable de la prolifération racinaire. Lors de l’infection, une partie du plasmide Ti, l’ADN-T (ADN transféré), est intégrée dans le génome des cellules végétales. L’ADN-T porte l’information génétique qui code d’une part l’induction de la tumeur mais aussi la production d’acides aminés modifiés, les opines. L’octopine [N2-(1,3-dicarboxyethyl)-L-arginine] et la nopaline [N2-(1,3-dicarboxypropyl)-L-arginine] sont les deux opines les plus communément produites. Ces opines sont produites par le végétal à partir de l’ADN-T intégré et servent de sources de carbone et d’azote aux cellules d’Agrobacterium.

Reconnaissance et transfert de l’ADN-T L’initiation du processus de tumorisation nécessite que les cellules d’Agrobacterium pénètrent et se fixent au sein des tissus du végétal à la faveur d’une blessure. Cela s’effectue grâce à la présence de récepteurs complémentaires présents à la fois à la surface des cellules bactériennes et des cellules du végétal. Il semble que le récepteur végétal soit de nature pectique (un polysaccharide complexe) tandis que le récepteur bactérien serait de nature polysaccharidique de type β-glucane et présent au niveau du LPS de la paroi bactérienne. Les études réalisées à l’aide de souches mutantes d’Agrobacterium tumefaciens non tumorigènes ont permis de montrer que la plupart des fonctions nécessaires à la reconnaissance et à la fixation des bactéries au niveau de la blessure sont portées par

Oncogènes

ops

Synthèse d’opine

Gènes transmissibles

Gènes du catabolisme de l’opine

FIGURE 19.56 Carte génétique du plasmide Ti d’Agrobacterium tumefaciens. ADN-T est la région transferée à la plante. La flèche indique la direction de la transcription de chaque gène. Le plasmide Ti complet mesure environ 200 kbp et l’ADN-T, environ 20 kbp (voir section 31.10).

le génome nucléaire de la bactérie. Suite à l’attachement des cellules bactériennes au niveau de la blessure, on observe la formation par la bactérie de microfibrilles de cellulose qui vont littéralement ancrer les cellules d’Agrobacterium sous forme d’agrégats à la surface des cellules végétales. Cette phase de conditionnement permet le transfert plasmidique de la bactérie à la cellule végétale. La structure du plasmide Ti est représentée sur la figure 19.56. Bien qu’un certain nombre de gènes soient nécessaires à l’infection, seule une petite région du plasmide, l’ADN-T, est en fait transférée. L’ADN-T porte les gènes nécessaires au processus de tumorisation. À côté de cette portion ADN-T, on trouve une région appelée VIR contenant les gènes vir qui contrôlent le système protéique par lequel l’ADN-T est transféré (voir figure 19.56). L’expression des gènes plasmidiques vir est induite par des molécules signal produites par les cellules des tissus blessés de la plante. Parmi les substances élicitrices produites par la plante blessée, on peut citer l’exemple de composés phénoliques comme l’acétosyringone, l’acide p-hydroxybenzoïque et la vanilline. Les gènes vir sont essentiels pour le transfert de l’ADN-T. Le gène virA code une protéine kinase (VirA) qui interagit avec les substances élicitrices de la plante, ce qui entraîne la phosphorylation du produit du gène virG. Cette activation aboutit à la transcription des gènes de virulence des autres gènes vir (virB, virC, virD et virE). Le produit du gène virD (VirD) possède une activité endonucléasique qui lui permet d’ouvrir la molécule plasmidique à proximité immédiate de l’ADN-T au niveau du bord droit (voir figure 19.57). Le produit du gène virE est une protéine qui possède une forte affinité pour l’ADN et dont le rôle est de se lier à l’ADN-T simple brin généré à la suite de l’action de VirD. Ce complexe ADN monocaténaire de l’ADN-T et VirE est ensuite transporté de la cellule bactérienne vers la cellule végétale au travers d’un canal où intervient VirB. Le transfert de l’ADN-T présente donc des similitudes avec la conjugaison bactérienne (voir figure 10.11). L’ADN-T migre vers le noyau où il s’intègre dans le génome de la cellule



19.20 Lichens et mycorhizes 675 Blessure de la plante

Composés phénoliques

VirA VirA ATP

Cellule d’Agrobacterium

ADP

tumorisation résulte directement de l’expression de ces gènes. Le plasmide Ri présent chez Agrobacterium rhizogenes porte également des gènes onc. Cependant, dans ce cas, les cellules végétales infectées vont être beaucoup plus réceptives à la production d’auxine, ce qui va aboutir à une prolifération de tissus racinaires, caractéristique de la maladie du hairy root. Le plasmide Ri code également des enzymes impliquées dans la production de différentes opines.

Génie génétique utilisant le plasmide Ti VirG

VirG

Transcription des autres gènes vir

P

(a) ADN-T

ADN-T

Coupure simple-brin

Vir D

E

E VirE (protéine se liant E à l’ADN simple-brin)

E

(b) E

E E

E

(c)

Les maladies du crown gall et du hairy root représentent un type d’interactions tout à fait unique en microbiologie et en phytopathologie dans lequel un fragment d’ADN bactérien est physiquement transféré à une cellule végétale. Une fois ce processus de tumorisation naturelle compris, il est rapidement apparu que le système du plasmide Ti pouvait être utilisé comme vecteur de gènes intégrables dans les génomes des végétaux. Ti est tout simplement un système naturel de transformation des plantes. C’est ainsi que l’intérêt porté à ce mécanisme de transformation s’est déplacé de la compréhension de la maladie vers la possibilité de développer des nouvelles applications biotechnologiques. Grâce aux développements en ingénierie génétique, des souches d’Agrobacterium porteuses de plasmides Ti désarmés sont maintenant disponibles pour produire des plantes transgéniques. Ceci a d’ores et déjà aboutit à des succès, notamment dans l’obtention de plantes résistantes aux herbicides ou encore aux insectes et bien d’autres domaines de transformation restent encore à explorer. Nous verrons plus en détail l’utilisation du plasmide Ti en tant que vecteur de transformation des plantes dans la section 31.10 consacrée à l’ingénierie génétique et aux biotechnologies.

Cellule de la plante


VirB

Cellule d’Agrobacterium E (d)

E

E

E

FIGURE 19.57 Mécanisme de transfert de l’ADN-T à la plante par Agrobacterium tumefaciens. (a) VirA active VirG par phosphorylation et VirG active la transcription d’autres gènes vir. (b) VirD est une endonucléase. (c) VirE est une protéine se liant à l’ADN simple brin. (d) VirB établit comme un pont de conjugaison entre Agrobacterium et la cellule de la plante. L’ADN polymérase de la plante produit le brin complémentaire au simple brin de l’ADN-T qui est transferé avant que l’ADN ne soit intégré au génome de la plante.

végétale dans les sites où sont présentes des séquences inversées répétées ou répétées directes spécifiques en tandem. Une fois intégré, l’ADN-T exprime ses oncogènes (onc) dont une partie est impliquée dans la production d’hormones végétales d’une part et le reste dans celle d’au moins une enzyme clé nécessaire à la biosynthèse d’une opine. Le processus de

Agrobacterium tumefaciens, la bactérie phytopathogène responsable de la galle du collet établit une relation trophique tout à fait unique avec les végétaux supérieurs. Le plasmide Ti porté par cette bactérie est capable de réaliser le transfert d’une partie de luimême et son intégration dans les chromosomes des cellules végétales conduisant ainsi à une véritable transformation tumorale, le crown gall. Le plasmide Ti est également à la base du développement de méthodes innovantes en matière d’obtention de plantes transgéniques d’intérêt économique. •

Que sont les opines et pour quelles raisons sontelles produites ?

•

Quelle est la différence entre l’ADN-T et les gènes vir chez le plasmide Ti ?

•

Dans quelle mesure peut-on considérer que le domaine de la biologie moléculaire des plantes a pu bénéficier des connaissances acquises sur le processus de formation de la galle du collet induite par Agrobacterium tumefaciens ?



676 Chapitre 19


19.22 Association symbiotique m n des bactéries des nodosités

Joe Burton

L’association symbiotique entre certaines bactéries à Gram négatif fixatrices d’azote atmosphérique et les Légumineuses représente l’un des modèles les plus importants d’interactions entre bactéries et plantes. Les Légumineuses représentent la troisième plus grande famille de plantes à fleurs (numériquement parlant) qui regroupe les espèces végétales qui produisent leurs graines dans des gousses. Des espèces végétales comme le soja, le trèfle, la luzerne, le haricot et le pois font partie de cette famille (aussi appelée Fabacées). Ces végétaux constituent la matière première de l’industrie de transformation du soja, de celle de l’alimentation du bétail et sont également considérés comme des végétaux de toute première importance dans l’alimentation humaine. L’exploitation de ces végétaux a généré le développement d’une véritable filière industrielle. Le fait que les Légumineuses soient capables de pousser sans apport extérieur d’azote représente, pour les agriculteurs, une source d’économie en fertilisants azotés qui se chiffre en millions de dollars par an. Rhizobium, Bradyrhizobium, Sinorhizobium, Mesorhizobium, Azorhizobium et Photorhizobium sont des bacilles mobiles à Gram négatif faisant partie des Proteobacteria qui vivent aussi bien à l’état libre dans le sol ou bien qui peuvent infecter les Légumineuses et établir une association symbiotique. L’infection des racines d’une Légumineuse donnée par une espèce appropriée de Rhizobiacées précédemment citées aboutit à la formation de nodosités (ou nodules) racinaires (voir figure 19.58) ou caulinaires qui sont le siège de la fixation de l’azote moléculaire (voir section 17.28). La fixation de l’azote atmosphérique par cette symbiose a une importance capitale en

FIGURE 19.58 Nodules racinaires du soja. Les nodules se développent suite à l’infection par Bradyrhizobium japonicum. La tige principale de ce plan de soja a un diamètre d’environ 0,5 cm.

Ben B. Bohlool

racinaires chez les Légumineuses

FIGURE 19.59 Effets de la nodulation sur la croissance des plantes. Champ de plants de soja non inoculés (à gauche) et inoculés (à droite) dans un sol pauvre en azote.

agronomie puisqu’elle permet d’augmenter considérablement la teneur d’un sol en azote assimilable par les plantes. Dans la mesure où les sols pauvres et nus sont souvent déficients en azote, seules les Légumineuses se développent dans ce type de sol, là où les autres plantes ne le peuvent pas (voir figure 19.59).

Leghémoglobine et groupes d’inoculation croisée En conditions normales, ni la plante légumineuse, ni la bactérie symbiote ne sont capables de fixer l’azote atmosphérique. Comment est-il possible que l’association symbiotique des deux protagonistes aboutisse à cette fixation ? En culture pure, Rhizobium n’est capable de fixer l’azote atmosphérique qu’en condition de microaérophilie uniquement. Bien que leurs nitrogénases (à l’instar de celles des autres micro-organismes fixateurs d’azote) soient inhibées en présence d’O2, il semble que Rhizobium ait pourtant besoin d’une faible pression partielle en O2 pour produire l’énergie nécessaire à la fixation d’azote moléculaire. C’est la leghémoglobine qui a pour rôle de réguler précisément la teneur en O2 à l’intérieur de la nodosité. De couleur rose, la leghémoglobine est une hémoprotéine constituée d’un groupement prothétique associé à une globine qui est retrouvée dans tous les nodules sains fixateurs d’azote (voir figure 19.60). Elle est produite en réponse à l’interaction des deux partenaires, la globine étant codée par le génome de la plante, l’hème étant au contraire sous le contrôle du génome de la bactérie symbiotique. La leghémoglobine fonctionne comme une sorte de « tampon oxygène », alternant entre la forme oxydée (Fe3+) et la forme réduite (Fe2+), ce qui permet de maintenir une faible teneur en O2 à l’intérieur du nodule. Le ratio entre O2 fixé et O2 libre à l’intérieur des nodules est de l’ordre de 10 000:1. 90 % des Légumineuses sont capables de former des nodosités. Cependant il existe une spécificité d’hôte bien marquée entre les espèces végétales et les espèces bactériennes. Une seule espèce de Rhizobium est généralement capable d’infecter certaines Légumineuses mais pas les autres. Cette espèce ou un petit groupe d’espèces de Rhizobium capables d’infecter un ensemble d’espèces de Légumineuses apparentées forment un groupe



19.22 Association symbiotique des bactéries des nodosités racinaires chez les Légumineuses 677

1. Reconnaissance de part et d’autre du bon partenaire (compatible), puis attachement de la bactérie au niveau des poils absorbants. 2. Excrétion de facteurs nod par la bactérie. 3. Invasion des poils absorbants par les bactéries.

Joe Burton

4. Formation d’un cordon d’infection et transfert vers le cortex racinaire.

FIGURE 19.60 Structure de nodules racinaires. Coupes de nodules racinaires de la légumineuse Coronilla varia, montrant la pigmentation rougeâtre due à la léghémoglobine.

5. Transformation des cellules bactériennes en bactéroïdes à l’intérieur des cellules végétales et développement de l’aptitude à fixer l’azote atmosphérique. 6. Prolifération des bactéroïdes qui s’accompagne d’une division mitotique des cellules corticales intense chez la plante et conduisant à la formation de nodosités racinaires fonctionnelles. Explorons plus en détail le processus de la nodulation.

d’inoculation croisée (voir tableau 19.8). Cependant, même si une souche de Rhizobium est apte à infecter une Légumineuse donnée, elle n’est pas toujours capable d’induire la formation des nodules fixateurs d’azote. Si la souche est génétiquement inefficiente, nous verrons se développer de petits nodules verdâtres à blanc incapables de fixer l’azote moléculaire. Au contraire, si la souche bactérienne est efficiente, les mêmes nodules de grandes dimensions apparaîtront alors, roses (voir figure 19.60) et montreront une activité de fixation d’azote. La fixation de l’azote moléculaire est sous le contrôle génétique du symbiote (voir la partie consacrée aux gènes nod ci-après) et peut être mesurée par la méthode de la réduction de l’acétylène (voir section 17.28).

Les principales étapes de la formation des nodosités L’organogénèse des nodosités, depuis l’infection jusqu’au développement, est aujourd’hui parfaitement bien connue (voir figure 19.61). Les étapes sont :

TABLEAU 19.8

PRINCIPAUX GROUPES D’INOCULATION CROISÉE DE PLANTES LÉGUMINEUSES

Plante hôte

Nodulation par

Pois

Rhizobium leguminosarum biovar viciaea

Haricot

Rhizobium leguminosarum biovar phaseoli a

Haricot

Rhizobium tropici

Lotus

Mesorhizobium loti

Trèfle

Rhizobium leguminosarum biovar trifolii a

Luzerne

Sinorhizobium meliloti

Soja

Bradyrhizobium japonicum

Soja

Bradyrhizobium elkanii

Soja

Rhizobium fredii

Sesbania rostrata (légume tropical)

Azorhizobium caulinodans

a Il existe plusieurs variétés (biovars) de Rhizobium leguminosarum, chacune capable de noduler une plante différente.

Attachement et infection Les racines des Légumineuses sécrètent une variété de composés organiques qui stimulent la croissance de la microflore de la rhizosphère. Cette stimulation n’est pas seulement active sur les Rhizobium mais elle profite également aux autres bactéries de la rhizosphère. Si des Rhizobium sont présents dans le sol, on observe leur prolifération dans la rhizosphère, leurs populations pouvant alors atteindre des densités importantes. La première étape dans l’installation de la symbiose consiste en la reconnaissance et l’attachement des bactéries sur la plante (voir figure 19.61). Une protéine d’adhésion spécifique, la rhicadhésine, est présente à la surface des cellules des espèces de Rhizobium et de Bradyrhizobium. La rhicadhésine est une protéine affine pour le calcium et elle opère en se fixant sur des complexes calciques à la surface des poils absorbants générant ainsi une oscillation en ions Ca2+. D’autres substances comme les lectines, qui sont des glycoprotéines végétales, ainsi que des récepteurs spécifiques présents au niveau de la paroi des cellules végétales jouent également un rôle dans la reconnaissance et l’attachement des bactéries à la plante. Les bactéries pénètrent le poil absorbant par son extrémité. À la suite de leur attachement, l’extrémité du poil absorbant se courbe en forme de crosse sous l’action des substances excrétées par les bactéries, les facteurs nod (voir plus loin). Les cellules bactériennes peuvent alors pénétrer dans le poil ainsi altéré où elles induisent la formation par la plante d’un cylindre de cellulose et d’hémicellulose qui constitue un cordon d’infection (voir figure 19.62a) et qui court au travers du poil vers le cortex racinaire. Les cellules végétales adjacentes sont à leur tour touchées par l’infestation bactérienne et parallèlement, les facteurs nod stimulent les cellules du cortex qui entrent alors dans une phase de divisions mitotiques intenses. C’est cette division cellulaire qui aboutit à la formation d’une nodosité (voir figures 19.62, 19.63, 19.58 et 19.60).

Les bactéroïdes Les bactéries prolifèrent rapidement à l’intérieur des cellules végétales où elles prennent des formes plus ou moins globuleuses, boursouflées parfois branchées, devenant ainsi des bactéroïdes. Les bactéroïdes sont enfermés individuellement



678 Chapitre 19


Poil racinaire

1. Reconnaissance et attachement (médiation par la rhicadhésine) Cellule de Rhizobium

Rhizobium en dormance au sein du nodule. Ce sont elles qui, en utilisant certains des produits issus de la dégradation du nodule, se mettent à se diviser. Ces bactéries peuvent, à leur tour, aller coloniser d’autres racines ou bien se maintenir dans le sol à l’état libre.

La formation de la nodosité : les gènes, les protéines et les facteurs nod 2. Excrétion des facteurs de nodulation par la bactérie, provoquant la courbure du poil racinaire 3. Invasion. Les Rhizobium pénètrent le poil racinaire et se multiplient à l’intérieur du cordon d’infection 4. Les bactéries dans le cordon d’infection se multiplient en direction du cortex racinaire Les cellules Cordon d’infection envahies de la plante et leurs voisines sont stimulées et se divisent

5. Formation des bactéroïdes à l’intérieur des cellules de la plante

Nodules

6. Division continue des

cellules de la plante et des bactéries

FIGURE 19.61 Étapes de la formation d’un nodule racinaire chez une légumineuse infectée par Rhizobium. Voir la photographie d’un cordon d’infection à la figure 19.62a. Des images de nodules racinaires sont présentées aux figures 19.58 et 19.60. La formation d’un stade bactéroïde est un prérequis pour la fixation de l’azote.

ou à plusieurs dans des vésicules limitées par une membrane dérivant de la cellule végétale pour former un ensemble nommé symbiosome (voir figure 19.67). Ce n’est qu’une fois le symbiosome constitué que débute la fixation de l’azote moléculaire. (Les nodules dans lesquels la fixation de l’azote est effective peuvent être repérés par la réduction de l’acétylène en éthylène, voir section 17.28 et figure 17.71.) Lorsque la plante vient à mourir, le nodule se détériore, libérant les micro-organismes dans le sol. Même si les bactéroïdes sont incapables de se multiplier, il y a toujours quelques cellules de

Ce sont les gènes nod qui, chez une souche définie de Rhizobium, contrôlent les étapes de la nodulation chez une Légumineuse (voir figure 19.64). La plupart des gènes nod, qui sont généralement localisés sur des plasmides de grande taille appelés pSym (pour symbiose), sont hautement conservés entre les différentes espèces de rhizobia. En plus des gènes nod, qui contrôlent directement la nodulation, les plasmides pSym portent d’autres gènes impliqués dans la spécificité d’hôte et qui jouent donc un rôle essentiel dans la détermination du spectre d’hôtes. En effet, la spécificité des groupes d’inoculation croisée (voir tableau 19.8) peut être transférée d’une espèce de Rhizobium vers une autre en procédant simplement au transfert de pSym correspondant. Sur le plasmide pSym de Rhizobium leguminosarum biovar viciae, les gènes nod, organisés en opérons, sont localisés entre deux groupes de gènes impliqués dans la fixation de l’azote, les gènes nif (voir figure 19.64). Dix gènes nod ont été identifiés chez cette espèce. Parmi ceux-ci, les gènes nodA, nodB et nodC sont impliqués dans la production d’oligosaccharides, appelés les facteurs nod, qui sont notamment responsables de la déformation en crosse des poils absorbants, de la division des cellules du cortex de la racine aboutissant finalement à la formation des nodules (voir figure 19.62). Le squelette de la structure des facteurs nod est constitué par un oligomère d’N-acétyl-glucosamine présentant divers substituants (voir figure 19.65). C’est la structure précise des différents facteurs nod produits par chaque espèce de Rhizobium qui détermine la spécificité d’hôte. Ainsi, hormis les gènes nodA, nodB et nodC fonctionnellement interchangeables entre toutes les espèces de Rhizobium et dont les produits vont constituer le squelette des facteurs nod, chaque espèce de Rhizobium possède en plus plusieurs gènes nod additionnels dont les produits sont impliqués dans les variations chimiques des substituants sur le squelette. C’est la nature de ces substituants qui contribue à la spécificité d’hôte (voir figure 19.65). Chez Rhizobium leguminosarum biovar viciae, le gène nodD code une protéine régulatrice, NodD, qui acquiert des propriétés d’activateur transcriptionnel et contrôle ainsi la transcription des autres gènes nod (voir figure 19.64). Le gène nodF code une protéine spécifique de transport des groupements acyl qui sont greffés sous l’action de NodA sur le squelette du facteur nod (voir figure 19.65b). NodE et NodL sont pour leur part impliquées dans le spectre d’hôtes tandis que NodM, qui possède une activité glucosamine synthase, participe à la formation du squelette. Enfin, NodI et NodJ sont deux protéines membranaires impliquées dans l’exportation des facteurs nod synthétisés hors des cellules bactériennes. La protéine NodD se fixe sur l’ADN en amont des opérons des gènes nod, au niveau d’éléments localisés en cis des régions promotrices de ces gènes nod (les boîtes nod). Après interaction avec des molécules inductrices, NodD active la



Ben B. Bohlool

Jacques Vasse, Jean Dénarié, et Georges Truchet



(b)


(a)

avec l’autorisation de Nature, Macmillan Magazines Ltd, 351 : 670673, 1991.

de

nodD

nodA n odB

Direc tion

no

dC

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a

dI

no

dE

no

nodF

no

dL

Di re

n io ct

tion scrip r an t la

J

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nod

n tra ion ip t

nif

Nous avons vu dans la section 17.28 que la fixation de l’azote atmosphérique était réalisée par la nitrogénase, une enzyme de grande dimension constituée par l’assemblage de deux sous-unités contenant du fer et du molybdène. La nitrogénase retrouvée au niveau des nodosités racinaires présente des caractéristiques identiques à celles présentes chez les formes libres des bactéries fixatrices d’azote, à savoir la sensibilité à l’oxygène et l’aptitude à réduire aussi bien l’acétylène que N2 (voir figure 17.71). Cette nitrogénase reste localisée à l’intérieur des bactéroïdes et n’est pas exportée vers le cytoplasme des cellules végétales. Les bactéroïdes dépendent totalement de la plante qui leur fournit les sources d’énergie indispensables pour réaliser la fixation de l’azote. Les principaux composés organiques qui sont transportés au travers de la membrane du symbiosome jusqu’à l’intérieur des bactéroïdes sont des produits intermédiaires du cycle de l’acide citrique, en particulier des acides organiques en C4 comme le succinate, le malate et le fumarate

dM

La biochimie de la fixation d’azote dans les nodosités

FIGURE 19.63 Coupe d’un nodule racinaire de légumineuse. Image en microscopie électronique d’une coupe fine d’une cellule d’un nodule souterrain de trèfle remplie de bactéries. Les cellules de Rhizobium leguminosarum biovar trifolii mesurent environ 2 µm de long.

no

transcription de ces derniers. Ainsi NodD est un élément impliqué dans la régulation positive de la transcription (voir section 8.6). Les inducteurs interagissant avec NodD sont des flavonoïdes, des molécules organiques très répandues dans le monde végétal (voir figure 19.66a). Il est intéressant de constater que certains flavonoïdes, dont la structure chimique est très proche de celle des flavonoïdes inducteurs chez R. leguminosarum biovar viciae (voir figure 19.66a), sont capables d’inhiber l’induction des gènes nod d’autres espèces de Rhizobium (voir figure 19.66b). Ceci montre que la spécificité d’hôte existant dans l’association symbiotique entre Rhizobium et Légumineuses réside en partie dans la nature chimique des flavonoïdes produits par chaque Légumineuse.

P. J. Dart et F. V. Mercer

(d)

nif

(c)

FIGURE 19.62 Le cordon d’infection et la formation des nodules. (a) Un filament infectieux de cellules de Rhizobium leguminosarum biovar trifoli formé sur un poil racinaire de trèfle blanc (Trifoilium repens). Le cordon d’infection est formé d’un tube cellulosique dans lequel les bactéries se déplacent vers les cellules de la racine. (b-d) Nodules racinai-res de luzerne infectés par des cellules de Sinorhizobium meliloti, à différents stades de développement. Les cellules de R. leguminosarum biovar trifoli et de Sinorhizobium meliloti mesurent environ 2 µm de long. Les différentes étapes de la nodulation durent environ un mois chez le soja et la luzerne. Photos b-d reproduites

FIGURE 19.64 Les gènes nod. Organisation des gènes nod sur le plasmide Sym de Rhizobium leguminosarum biovar viciae, espèce nodulatrice des pois. Le produit de nodD contrôle la transcription des autres gènes nod. Les boîtes nod sont surlignées en rouge et les flèches indiquent la direction de la transcription des gènes nod. Les gènes nif codent des protéines impliquées dans la fixation de l’azote (section 17.28).



680 Chapitre 19

Écologie microbienne R2

Ac O

O

O CH2–O HN

CH2OH HNAc O

OH

OH

R1

Photosynthèse

O

O

CH2O HNAc

Membrane du symbiosome

(a) R1

Espèces Sinorhizobium meliloti Rhizobium leguminosarum biovar viciae

Membrane du bactéroïde

R2

C16 : 2 ou C16 : 3

SO42–

C18 : 1 ou C18 : 4

H ou Ac

Acides organiques

OH

OH

n

FIGURE 19.65 Les facteurs nod. (a) Structure générale des facteurs nod produits par Sinorhizobium meliloti et Rhizobium leguminosarum biovar viciae et (b) tableau des différentes structures (R1, R2) qui caractérisent le facteur nod de chaque espèce. Le sucre central à 6 carbones peut être répété jusqu’à trois fois. C16:2, acide palmitique avec deux doubles liaisons ; C16:3, acide palmitique avec trois doubles liaisons ; C18:1, acide oléique avec une double liaison ; C18:4, acide oléique avec quatre doubles liaisons ; AC, acétyl.

(voir figure 19.67). Ces composés sont utilisés comme donneurs d’électrons pour la production d’ATP et, après conversion en pyruvate, comme la source ultime d’électrons pour la réduction de N2 (voir figure 17.71). L’ammoniac est le premier produit dérivant de la fixation biologique de N2 et son assimilation sous forme de composés organiques azotés est essentiellement réalisée par le végétal au niveau des nodosités racinaires. Bien que les bactéroïdes soient capables d’assimiler l’ammoniac sous

OH

HO O

O

O

OH OH 5, 7, 3′, 4′-Tétrahydroxyflavone (a)

Pyruvate–

Électrons

e–

ADP Chaîne de transport d’électrons

O2 + Lb

ATP O2

Acides aminés

Nitrogénase N2 NH3

H2O

O2-Lb

Lb = Léghémoglobine

O2-Lb

Lb

Glutamine Asparagine

Vers la plante

FIGURE 19.67 Bactéroïde d’un nodule racinaire. Représentation schématique des réactions métaboliques majeures et des échanges de nutriments se produisant dans le bactéroïde. Le symbiosome est un ensemble de bactéroïdes entourées par une membrane unique provenant de la plante.

Inducteur Inhibiteur

HO O

Bactéroïde Cycle de l’acide citrique Succinate2– Malate2– Fumarate2–

(b)

OH

Sucres

Cytoplasme de la plante

OH 5, 7, 4′-Trihydroxyisoflavone (b)

FIGURE 19.66 Les flavonoïdes des plantes et la nodulation. Structure d’une molécule de flavonoïde (a) inductrice de l’expression du gène nod et (b) inhibitrice de l’expression du gène nod chez Rhizobium leguminosarum biovar viciae, espèce nodulatrice des pois. Notez les ressemblances dans les structures des deux molécules. La structure présentée en (a) est nommée lutéoline ; c’est un dérivé de la flavone. La structure en (b) est nommée genistein ; c’est un dérivé de l’isoflavone.

une forme organique, le niveau d’activité des enzymes d’assimilation de l’ammoniac est relativement bas chez ces derniers. Au contraire, la teneur en glutamine synthétase, enzyme clé de l’assimilation de l’ammoniac (voir figure 5.27b), est importante dans le cytoplasme de la cellule végétale. L’ammoniac transporté des bactéroïdes vers la cellule végétale est donc essentiellement assimilé sous la forme d’aminoacides tels que la glutamine et l’asparagine (voir figure 19.67).

La nodulation des tiges par les Rhizobium Quoique la plupart des Légumineuses forment des nodosités racinaires, quelques espèces portent toutefois des nodosités au niveau de leur tige. Ces Légumineuses à nodosités caulinaires sont généralement répandues en région tropicale, région où les sols sont souvent pauvres en azote en raison notamment du lessivage et de l’intense activité biologique. La principale association symbiotique développée dans ces régions est la



B. Dreyfus


FIGURE 19.68 Nodules sur une tige provoqués par Azorhizobium. Photographie d’une tige de la légumineuse tropicale Sesbania rostrata. À gauche de la tige, les sites non inoculés. À droite, sites inoculés par des Rhizobium formant des nodules sur les tiges.

Légumineuse aquatique Sesbania, associée à la bactérie Azorhizobium caulinodans (voir figure 19.68). Les nodosités caulinaires se forment typiquement au niveau de la portion de tige submergée ou bien juste au-dessus (voir figure 19.68). L’organogénèse des nodosités caulinaires chez Sesbania ressemble trait pour trait à celle qui préside à la formation des nodules racinaires. Un cordon d’infection est formé qui donne naissance à des bactéroïdes, sièges de l’activité de fixation de l’azote moléculaire. Curieusement, certaines espèces de Rhizobium associées aux nodosités caulinaires produisent de la bactériochlorophylle a et sont donc potentiellement aptes à réaliser la photosynthèse anoxygénique (voir section 17.4). Ces espèces à bactériochlorophylle, regroupées dans le genre Photorhizobium, sont largement répandues dans la nature, en particulier en association avec les Légumineuses tropicales. Chez ces espèces, la lumière peut pourvoir à une partie de l’énergie nécessaire à la fixation de l’azote moléculaire.

riz. En répétant cette opération régulièrement à chaque nouvelle mise en culture du riz, ils obtiennent d’excellents rendements en riz sans apport extérieur d’engrais azotés. L’aulne (genre Alnus) porte lui aussi des nodules racinaires (voir figure 19.70a) qui sont colonisés par une bactérie proche des streptomycètes appartenant au genre Frankia. Bien que la nitrogénase de Frankia apparaisse expérimentalement sensible à l’oxygène moléculaire sous forme d’extraits cellulaires, à l’instar de celle présente dans les cellules intactes d’Azotobacter (voir section 12.9), elle est au contraire tout à fait apte à fixer l’azote moléculaire sous une pression en oxygène normale dans les cellules intactes de Frankia. Ceci s’explique par le fait que Frankia fait en sorte de protéger l’intégrité de sa nitrogénase en la confinant dans un renflement terminal porté par des cellules particulières nommées vésicules (voir figure 19.70b). Ces vésicules ont des parois épaisses qui retardent la diffusion de l’O2, ce qui a pour conséquence de maintenir la pression partielle en O2 à un niveau compatible avec le fonctionnement de la nitrogénase. De ce point de vue, on peut dire que les vésicules observées chez Frankia ressemblent tout à fait aux hétérocystes, sièges de la fixation de l’azote moléculaire, de certaines cyanobactéries filamenteuses (voir figure 19.69b ; section 12.25 et figure 12.80). C’est certainement grâce à son association symbiotique avec Frankia que l’aulne est un arbre pionnier capable de coloniser les sols nus dans des zones pauvres en nutriments. On a constaté qu’un certain nombre d’autres arbustes sont colonisés par Frankia. À la différence de ce que nous avons pu voir dans la symbiose associant les Rhizobium aux Légumineuses, il semble que la spécificité d’hôte soit moins grande dans le cas de la symbiose impliquant le genre Frankia.

J-H. Becking

Des symbioses fixatrices d’azote atmosphérique impliquant des micro-organismes autres que les Rhizobium existent chez un certain nombre de plantes ne faisant pas partie des Légumineuses. Par exemple, des cyanobactéries fixatrices d’azote forment des associations symbiotiques avec une grande variété de plantes. La fougère aquatique Azolla est colonisée par une cyanobactérie hétérocystée fixatrice d’azote appelée Anabaena azollae logée dans de petites cavités au niveau des frondes (voir figure 19.69). Azolla est utilisée depuis des siècles pour enrichir les rizières en azote. Avant de planter le riz, les agriculteurs installent au préalable une couverture végétale dense faite d’Azolla sur l’intégralité de la parcelle. Ils fauchent l’Azolla et en font des tas dans lesquels les fougères colonisées meurent, libérant leur azote qui est alors assimilé par les plants de

J-H. Becking

Les symbioses fixatrices d’azote hors des Légumineuses : Azolla-Anabaena et Frankia

(a)

(b)

FIGURE 19.69 Symbiose Azolla-Anabaena. (a) Association intacte chez un plant d’Azolla pinnata. Le diamètre de la plante est d’approximativement 1 cm. (b) La cyanobactérie symbiote Anabaena azollae observée dans un broyat de feuilles d’A. pinnata. Les cellules d’Anabaena azollae mesurent environ 5 µm de large. Notez les hétérocystes de forme ovale (couleur plus claire), sites de la fixation d’azote chez les cyanobactéries. Voir la section 12.25 et la figure 12.80 pour plus de détails concernant les hétérocystes.



682 Chapitre 19


J-H. Becking


J-H. Becking

(a)

(b) FIGURE 19.70 Nodules et cellules de Frankia. (a) Nodules racinaires de l’Aulne commun Alnus glutinosa. (b) Culture pure de Frankia obtenues de nodules de Comptonia peregrina. Notez les vésicules (structures sphériques) au sommet des hyphes.

L’une des symbioses entre micro-organismes et végétaux les plus répandues et les plus importantes est celle associant les Légumineuses à certaines espèces bactériennes fixatrices d’azote atmosphérique. Les bactéries symbiotiques induisent la formation de nodules racinaires à l’intérieur desquels se déroule la fixation biologique de l’azote. Le végétal procure l’énergie nécessaire à la bactérie symbiotique tandis que cette dernière fournit l’azote sous une forme directement assimilable par le végétal pour sa croissance. Ces bactéries symbiotiques jouent un rôle majeur en agriculture dans la mesure où de nombreuses espèces végétales agronomiquement importantes font partie de la famille des Légumineuses. Il existe d’autres symbioses fixatrices d’azote comme celle de la fougère aquatique Azolla avec Arabaena et celle de l’aulne avec Frankia. •

Quels effets les facteurs nod ont-ils sur la Légumineuse ?

•

Qu’est-ce que la leghémoglobine et quelle est sa fonction ?

•

Définissez ce qu’est un bactéroïde et de quoi il est le siège.

•

Expliquez quelles sont les similitudes et les différences entre Rhizobium et Frankia.

QUESTIONS 1. Citez quelques ressources et conditions essentielles dont les micro-organismes ont besoin pour prospérer dans leur habitat (voir sections 19.1 et 19.2). 2. Expliquez pourquoi des bactéries aérobies obligatoires et des bactéries anaérobies obligatoires peuvent être isolées à la fois d’un même échantillon de sol (voir section 19.2). 3. La surface d’une roche dans un ruisseau est souvent recouverte d’un biofilm. Quels avantages cela confère-t-il aux bactéries de ce biofilm par rapport à celles vivant dans l’eau du ruisseau (voir section 19.3) ? 4. En quoi les biofilms compliquent-ils le traitement des maladies infectieuses (voir section 19.3) ? 5. Dans quel horizon du sol les micro-organismes sont-ils les plus nombreux et les plus actifs, et pourquoi (voir section 19.4) ? 6. Comment et en quoi un apport de matière organique, tel un égout, affecte-t-il la teneur en oxygène d’un ruisseau ou d’une rivière (voir section 19.5) ? 7. Si la protéorhodopsine a une fonction analogue à la bactériorhodopsine, décrivez comment cette molécule peut être bénéfique à une cellule vivant dans un milieu très pauvre en matière organique comme l’océan hauturier (voir section 19.6). 8. Quelle est la différence entre une bactérie barotolérante et une bactérie barophile ? entre ces deux catégories et les barophiles extrêmes ? Quelles propriétés ces trois catégories ont en commun (voir section 19.7) ?

9. Quelle est la preuve, venant des sources hydrothermales, que les procaryotes se développent à très hautes températures (voir section 19.8) ? 10. Pourquoi peut-on dire que les cycles du carbone et de l’oxygène sont interconnectés (voir section 19.9) ? 11. Comment des organismes comme Syntrophobacter et Syntrophomonas se développent-ils lorsque leurs métabolismes sont basés sur des réactions thermodynamiquement défavorables ? Comment ces organismes croissent-ils en culture de laboratoire (voir section 19.10) ? 12. Qu’est-ce que le rumen et comment s’effectuent les processus digestifs chez les ruminants ? Quels sont les principaux bénéfices et désavantages du système du rumen ? Comparez la digestion chez un animal à cæcum et un ruminant (voir section 19.11). 13. Comparez les processus de nitrification et de dénitrification en termes d’organismes impliqués, de conditions environnementales favorables à chaque processus, et les changements dans la disponibilité des nutriments qui accompagnent chacun des processus (voir section 19.12). 14. Pourquoi la réduction des sulfates est-elle la principale forme de respiration anaérobie en milieu marin, tandis que la méthanogenèse domine en eaux douces ? Y a-t-il de la méthanogenèse en milieu marin ? Si oui, comment (voir section 19.13) ?



Problèmes 683 15. Quels organismes sont impliqués dans la partie anaérobie du cycle du soufre ? Si les chimiolithotrophes sulfo-oxydants n’existaient pas, quel serait le problème dans le recyclage microbien des composés soufrés ? Quels composés organiques soufrés sont importants dans la nature (voir section 19.13) ? 16. Pourquoi la plupart des chimiolithotrophes ferro-oxydants sontils des aérobies obligatoires, et pourquoi la plupart des ferrooxydants sont-ils acidophiles (voir section 19.14) ? 17. Expliquez comment des réactions chimiques spontanées peuvent acidifier un gisement de charbon, et comment les réactions chimiques et l’activité d’Acidithiobacillus ferroooxidans poursuivent la production d’acide (voir section 19.14). 18. En quoi Acidithiobacillus ferrooxidans est-il utile dans l’exploitation des minerais de cuivre ? Quelle étape cruciale dans l’oxydation indirecte des minerais de cuivre est réalisée par cet organisme ? Comment le cuivre est-il récupéré des solutions de cuivre produites par la lixiviation (voir section 19.15) ? 19. Comment le mercure est-il détoxifié par le système mer (voir section 19.16) ? 20. Quelles conditions physico-chimiques sont nécessaires pour une dégradation microbienne rapide du pétrole dans les milieux aquatiques ? Concevez une expérience qui permettrait de tester les conditions optimales pour l’oxydation du pétrole (voir section 19.17).

21. Qu’est-ce que des composés xénobiotiques et pourquoi les micro-organismes ont-ils des difficultés à les cataboliser (voir section 19.18) ? 22. En quoi les micro-organismes effectuant la déchloration réductrice sont-ils utiles pour résoudre des questions de pollution environnementale (voir section 19.19) ? 23. En quoi les mycorhizes améliorent-elles la croissance des arbres (voir section 19.20) ? 24. Quelles sont les informations génétiques portées par le plasmide Ti ? Quel(s) gène(s) peuvent être supprimés du plasmide Ti sans pour autant affecter son pouvoir de tumorisation (voir section 19.21) ? 25. Comparez et soulignez les différences existant entre l’induction d’une tumeur végétale par Agrobacterium tumefaciens et la formation de nodosités racinaires par un Rhizobium. Dans quelle mesure ces structures sont-elles similaires ? Sur quels aspects diffèrent-elles ? Quel est le rôle joué par les plasmides dans le développement de chacune de ces structures (voir sections 19.21 et 19.22) ? 26. Décrivez les principales étapes de la formation d’une nodosité racinaire chez une Légumineuse. Quelle est la nature des interactions entre le micro-organisme et la plante et comment les facteurs nod interviennent-ils dans le contrôle de celles-ci ? En quoi ceci est-il comparable au système Agrobacterium-plante (voir section 19.22) ?

PROBLÈMES 1. Comparez un écosystème lacustre et un écosystème hydrothermal. Comment l’énergie entre-t-elle dans chaque écosystème ? Quelle est la base de la production primaire dans chaque écosystème ? Quelles classes nutritionnelles d’organismes existent dans chaque écosystème et comment se nourrissent-ils ? 2. Imaginez une station d’épuration qui relâche des effluents contenant de fortes teneurs en ammoniac et en phosphate, mais très peu de carbone organique. Quels types d’organismes verront leur croissance stimulée par cet effluent ? En quoi le profil d’oxygène à proximité et en aval du point de rejet serait différent de celui de la figure 19.10a ? 3. Regardez les données de la figure 19.13. Les eaux océaniques étant fortement oxygénées, quels types métaboliques peut-on rencontrer chez les Bacteria et les Archaea de ces milieux océaniques ? Pourquoi la protéorhodopsine serait-elle présente chez un groupe d’organismes, et pas chez l’autre ?

4. De la cellulose marquée au 14C est ajoutée à un flacon contenant une petite quantité d’effluent, et scellée, en conditions anaérobies. Quelques heures plus tard, du 14CH4 apparaît dans le flacon. Que s’est-il passé pour donner un tel résultat ? 5. Imaginez que vous avez découvert un nouvel animal qui consomme seulement de l’herbe pour son alimentation. Vous le suspectez d’être un ruminant et vous disposez d’un spécimen pour une étude anatomique. Si cet animal est un ruminant, décrivez la position et les organes de son tube digestif que vous vous attendez à observer, et quels types de micro-organismes et de substances vous devriez rechercher. 6. Les effluents miniers acides sont le résultat d’un processus chimique et d’un processus biologique. Exposez les phénomènes chimiques et biologiques impliqués et indiquez les réactions biologiques clés.





I

Contrôle antimicrobien, les méthodes physiques 687

20.1 20.2 20.3

Stérilisation par la chaleur Stérilisation par rayonnement Filtration stérilisante

687 690 692

II

Contrôle antimicrobien chimique

694

20.4 Contrôle chimique de la croissance 20.5 Agents antimicrobiens chimiques à usage externe

695

III

Agents antimicrobiens utilisés in vivo

698

20.6 20.7

Molécules antimicrobiennes de synthèse Molécules antimicrobiennes naturelles : les antibiotiques Antibiotiques à cycle b-lactame : pénicillines et céphalosporines Antibiotiques produits par les procaryotes

698

703 704

Contrôle des virus pathogènes des organismes eucaryotes

706

20.8

Diverses méthodes physiques, chimiques ou biologiques servent à contrôler la croissance bactérienne. Les filtres piègent les populations de micro-organismes et sont souvent utilisés pour isoler des micro-organismes de milieux liquides ou pour stériliser les liquides.

20.9

IV

20.10 Molécules antivirales 20.11 Molécules antifongiques

V

Résistances aux molécules antimicrobiennes et découvertes de nouvelles molécules

20.12 Résistance aux molécules antimicrobiennes 20.13 Recherche de nouvelles molécules antimicrobiennes

CHAPITRE VINGT

Contrôle de la croissance des micro-organismes

694

702

706 708

710 710 715



686 Chapitre 20


GLOSSAIRE Agent antimicrobien (antimicrobial agent) Composé chimique détruisant ou empêchant la croissance des micro-organismes. Agent bactéricide (bacteriocidal agent) Agent détruisant des bactéries. Agent bactériostatique (bacteriostatic agent) Agent empêchant la croissance bactérienne. Agent chimiothérapeutique (chemiotherapeutic agent) Agent antimicrobien pouvant être utilisé en usage interne. Agent désinfectant (desinfectant) Agent réduisant le nombre de microbes jusqu’à un certain niveau de sécurité sans les éliminer complètement. Agent fongicide (fungicidal agent) Agent détruisant les champignons. Agent fongistatique (fungistatic agent) Agent empêchant la croissance des champignons. Agent stérilisant (sporicide) [sterilant (sterilizer)(sporicide)] Agent chimique détruisant toute les formes de micro-organismes vivants. Aminoglycoside (aminoglycoside) Antibiotique contenant des sucres aminés associés par des liaisons glycosidiques. Analogue de facteur de croissance (growth factor analog) Agent chimique apparenté à un facteur de croissance. Antibiotique (antibiotic) Substance chimique produite par un micro-organisme détruisant ou empêchant la croissance d’un autre micro-organisme. Antibiotique à cycle β-lactame (β-lactame antibiotic) Antibiotique comme la pénicilline contenant le cycle β-lactame. Antibiotique à large spectre (board-spectrum antibiotic) Antibiotique agissant sur les Bacteria Gram positif et Gram négatif, et donc efficace dans le traitement de maladies d’origine bactérienne diverses Antiseptique (germicide) [antiseptic (germicide)] Agent chimique antiseptique détruisant ou empêchant la croissance des micro-organismes et suffisamment non toxique pour être appliqué sur les tissus vivants. Autoclave (autoclave) Stérilisateur qui détruit des micro-organismes par la chaleur en produisant de la vapeur d’eau sous pression. CMI (IMC) Concentration minimale inhibitrice ou concentration minimale d’une substance nécessaire pour empêcher la croissance bactérienne. Décontamination (decontamination) Traitement rendant un objet ou une surface stérile. Désinfectant (desinfectant) Agent antimicrobien utilisé seulement sur les objets.

N

ous débutons avec ce chapitre l’étude des relations entre les micro-organismes et les humains. Nous commencerons par l’étude des agents et des méthodes utilisés pour contrôler les populations microbiennes. Dans quelques cas, il est possible d’éliminer complètement les développements bactériens par la stérilisation en tuant ou en éliminant tous les organismes d’un milieu de croissance. Les agents qui détruisent ou tuent les bactéries sont appelés bactéricides. Souvent, cependant, la stérilisation n’est pas réalisable, mais il est encore possible de contrôler efficacement les micro-organismes en limitant leur croissance par des procédés d’inhibition. Les agents qui inhibent la croissance bactérienne sont dits bactériostatiques. Les méthodes pour inhiber rapidement la croissance bactérienne incluent la décontamination et la désinfection. La

Désinfection (desinfection) Élimination des micro-organismes des objets ou des surfaces inanimés. Inhibiteur de fusion (fusion inhibitor) Polypeptide synthétique se fixant sur les glycoprotéines virales et inhibant la fusion entre les membranes virales et celles de la cellule hôte. Inhibition (inhibition) Réduction de la croissance microbienne en raison d’une diminution du nombre de micro-organismes par changements dans l’environnement microbien. Interféron (interferon) Protéine cytokine produite par une cellule infectée par le virus qui induit un signal de transcription dans les cellules proches. Il en résulte la transcription de gènes antiviraux et l’expression de protéines antivirales. Filtre de HEPA (HEPA Filter) Filtre à air de rendement élevé utilisé dans les laboratoires et l’industrie pour enlever des particules, en entrée ou sortie d’air, y compris des microbes. Lyse (lysis) Perte de l’intégrité cellulaire avec libération du contenu du cytoplasme. NNRTI (non-nucleoside reverse transcriptase inhibitor) Inhibiteur non nucléosidique de la transcriptase réverse. NRTI (nucleoside reverse transcriptase inhibitor) Inhibiteur nucléosidique de la transcriptase réverse. Pasteurisation (pasteurization) Procédé de réduction de la charge microbienne dans les liquides thermosensibles permettant de tuer les micro-organismes pathogènes et de réduire le nombre des germes d’altération. Pénicilline (penicilline) Classe d’antibiotiques qui inhibent la synthèse de la paroi cellulaire, caractérisée par la présence d’un cycle β-lactame. Pénicilline semi-synthétique (semisynthetic Penicillin) Pénicilline produite par fermentation microbienne et synthèse chimique PI (protease inhibitor) Inhibiteur de protéases. Quinolone Composé synthétique antibactérien, qui interagit avec l’ADN gyrase et empêche l’enroulement de l’ADN bactérien. Résistance aux molécules antimicrobiennes (antimicrobial drug resistance) Capacité acquise d’un micro-organisme à se développer en présence d’une molécule antimicrobienne pour laquelle ce micro-organisme est habituellement sensible. Stérilisation (sterilization) Destruction ou élimination de toutes formes d’organismes et des virus d’un milieu de croissance. Tétracycline (tetracycline) Antibiotique caractérisé par la présence de la structure Naphtacène à quatre cycles. Virucide Agent arrêtant la réplication virale et son activité. Virostatique (virostatic) Agent inhibant la réplication virale.

décontamination est le traitement d’un objet ou d’une surface pour les rendre sûrs à manipuler. Par exemple, essuyer simplement la table après un repas enlève les micro-organismes contaminants et leurs nutriments potentiels. La désinfection, en revanche, vise principalement les microbes pathogènes mais n’élimine pas tous les micro-organismes. Les agents chimiques ou physiques spécialisés appelés désinfectants peuvent tuer les micro-organismes ou inhiber leur développement. Des solutions d’eau de Javel diluée (hypochlorite de sodium) sont utilisées en routine pour nettoyer et désinfecter les surfaces de préparation des aliments. Parfois, il peut encore être nécessaire de détruire tous les micro-organismes. La stérilisation, difficile cependant à réaliser, empêche complètement la contamination et la croissance



I

CONTRÔLE ANTIMICROBIEN, LES MÉTHODES PHYSIQUES

Les méthodes physiques sont employées souvent pour réaliser les décontaminations, les désinfections et les stérilisations microbiennes. La chaleur, le rayonnement et la filtration peuvent détruire ou éliminer les micro-organismes indésirables. Ces méthodes empêchent les développements microbiens ou permettent de décontaminer des secteurs ou des matériaux hébergeant des microbes.

20.1 Stérilisation par la chaleur m n Le traitement thermique est la méthode la plus employée pour contrôler les développements microbiens, et nous considérons ici le processus de la stérilisation par la chaleur.

L’évaluation des stérilisations thermiques Pour tous les micro-organismes, il y a une croissance à une température optimale au-delà de laquelle la croissance puis la viabilité diminuent. Aux très hautes températures, pratiquement toutes les macromolécules perdent leur structure et leur capacité à fonctionner ; c’est un processus connu sous le nom de dénaturation. Suivant la figure 20.1, l’inactivation thermique des bactéries est une fonction (de premier ordre) exponentielle, qui est plus rapide quand la température s’élève. Ceci signifie que le taux de la destruction est proportionnel à tout moment à la concentration des micro-organismes présents ; le temps nécessaire pour détruire une fraction définie (90 %) des cellules viables est indépendant de la concentration initiale en cellules. Ainsi, si nous souhaitons stériliser une population microbienne, cela prendra plus longtemps aux basses températures qu’aux températures élevées. Il est donc nécessaire d’ajuster le temps et la température pour adapter la stérilisation à chaque condition spécifique. La nature de la source de chaleur est également importante : la chaleur humide a une meilleure efficacité que la chaleur sèche, produisant une réduction plus rapide du nombre de micro-organismes pour une température donnée. Le temps requis pour une réduction d’un facteur 10 de la densité de population à une température donnée est appelé

Temps de réduction décimale (D)

100

50 °C 10

70 °C 60 °C

1

0,1 10

20

30

40

50

Temps (min) FIGURE 20.1 Effet de la température sur la survie des bactéries mésophiles. Le temps de réduction décimale D a été obtenu pour le même micro-organisme mésophile à trois températures de traitement différentes. Le paramètre D est le temps, à une température donnée, pour lequel la population de microorganismes viables est réduite à 10 % de la population initiale. À 70 °C, D = 3 min ; à 60 °C, D = 12 min ; à 50 °C, D = 42 min.

temps de réduction décimal ou D. C’est la méthode usuelle pour quantifier l’efficacité d’un traitement thermique. Dans la gamme des températures habituellement utilisées pour la préparation des aliments (c’est-à-dire cuissons ou conserves), le rapport entre les valeurs de D et la température est exponentiel. Ainsi, le logarithme de la valeur de D en fonction de la température est une relation linéaire (voir figure 20.2). L’inverse de la pente détermine le paramètre zT, augmentation de température réduisant le temps de traitement thermique

Temps de réduction décimale (min)

des micro-organismes. De telles mesures sont nécessaires pour réaliser des milieux en microbiologie ou pour la préparation des instruments chirurgicaux. Le but de toutes ces procédures de décontamination et de stérilisation est de réduire ou d’éliminer la charge microbienne ou le nombre de microorganismes viables. Le contrôle microbien in vivo est beaucoup plus difficile : les agents bactériostatiques ou bactéricides médicalement utilisés doivent réduire ou empêcher la croissance microbienne, tout en n’entraînant aucun dommage chez la cellule hôte. Cet objectif peut être réalisé par une grande variété d’agents chimiothérapeutiques. Dans ce chapitre, nous examinerons d’abord les méthodes de contrôle des micro-organismes employées in vitro. Nous discuterons ensuite des molécules antimicrobiennes utilisées in vivo chez l’homme.

Fraction survivante (échelle log)

20.1 Stérilisation par la chaleur 687

100 (b)

10 1

(a)

0,1

105 110 115 120 125 130 Température (°C) FIGURE 20.2 La relation entre la température et le taux de mortalité, définie par le temps de réduction décimale, pour deux micro-organismes différents. Les données sont obtenues pour le temps de réduction décimale D à plusieurs températures, comme sur la figure 20.1. Pour le micro-organisme (a), une bactérie mésophile sporulée typique, une exposition à 110 °C de 20 s correspond à une réduction décimale alors que pour un organisme (b), une bactérie thermophile sporulée, 10 min sont nécessaires pour obtenir cette réduction décimale.



688 Chapitre 20


d’un facteur 10 en gardant la même efficacité léthale. Ce paramètre zT est employé pour calculer les barèmes à appliquer pour la stérilisation, dans les opérations de mise en conserve par exemple (voir section 29.2). Une manière usuelle pour caractériser la sensibilité de la chaleur d’un micro-organisme est de déterminer le temps de réduction décimal D. La détermination d’un temps décimal de réduction exige un grand nombre de dénombrements (voir la section 6.5). Pour déterminer ce temps, les échantillons d’une suspension de cellules sont traités thermiquement à différents temps étalés sur un milieu de culture, mis à incuber puis dénombrés. Une relation linéaire est généralement observée entre le logarithme de la population dénombrée et le temps de traitement. D est l’inverse de la pente observée. Cependant il faut noter que la relation linéaire décrite précédemment n’est pas constatée pour l’ensemble des cinétiques de destructions thermiques. Des cinétiques concaves ou convexes sont également fréquemment observées.

Endospores et stérilisation par la chaleur La résistance thermique des cellules végétatives et des endospores bactériennes d’une même espèce est très variable. Par exemple, dans l’autoclave (voir figure 20.3), à une température de 121 °C, les endospores ont un temps de réduction décimal de 4 à 5 minutes, tandis que les cellules végétatives ont des valeurs de D de 0,1 à 0,5 minute à 65 °C. En raison de cette grande différence, les procédés de stérilisation par la chaleur sont conçus pour détruire des endospores. Les endospores bactériennes peuvent survivre à des traitements thermiques qui inactiveraient rapidement les formes végétatives de la même espèce. La quantité et l’état de l’eau dans l’endospore constituent un facteur important de résistance thermique. Pendant la formation d’endospore, le protoplasme est réduit à un volume minimum en raison de l’accumulation des complexes de Ca2+-acide dipicolinique et des petites protéines acides solubles de spores (SASP) [voir section 4.13]. Ce mélange forme un gel dans le cytoplasme et un cortex épais se forme alors autour du protoplaste. La contraction du cortex a comme conséquence un protoplaste rétréci et déshydraté, avec une teneur en eau de seulement 10 à 30 % par rapport à une cellule végétative. La teneur en eau du protoplaste couplée à la concentration des SASP détermine la résistance thermique de l’endospore. Si les endospores ont une basse concentration en SASP et une forte teneur en eau, elles ont une faible thermorésistance. Si elles ont une concentration élevée en SASP et une basse teneur en eau, elles sont plus thermorésistantes. L’eau passe librement de l’extérieur à l’intérieur des endospores, ainsi ce n’est pas l’imperméabilité du manteau d’endospore qui exclut l’eau, mais du matériel colloïdal dans le protoplaste de l’endospore. La nature du milieu de traitement influence également l’inactivation thermique des bactéries végétatives ou sporulées. L’inactivation microbienne est plus rapide aux pH acides, et il est beaucoup plus facile de stériliser les nourritures acides telles que les tomates, les fruits et les conserves avec du vinaigre que les nourritures à pH neutre telles que le maïs et les haricots. Les aliments présentant de faibles valeurs d’activité de l’eau, liées à des concentrations élevées en sucres, font

apparaître une augmentation de la résistance des micro-organismes à la chaleur. Les concentrations élevées en sel peuvent soit augmenter, soit diminuer la résistance thermique selon l’organisme. Les endospores sont plus thermorésistantes en milieu sec qu’en milieu humide ; par conséquent, la stérilisation par la chaleur des objets secs requiert des températures plus élevées et des périodes de traitement plus longues que la stérilisation des objets humides. Il faut également noter que le milieu dans lequel se trouvent les bactéries immédiatement après le traitement thermique affecte également leur thermorésistance apparente.

Autoclave L’autoclave est composé d’une cuve hermétique résistante associée à un dispositif de chauffage qui permet l’entrée de la vapeur sous pression (voir figure 20.3). La destruction des endospores thermorésistantes exige un chauffage à des températures au-dessus de 100 °C par l’utilisation de la vapeur sous pression (voir figure 20.3a). Le procédé habituel pour stériliser les milieux de culture est de chauffer à 1 bar (kg/cm2) de pression de vapeur, ce qui correspond à une température de 121,1 °C, avec un barème de stérilisation (temps de stérilisation) de dix à quinze minutes (voir figure 20.3b). C’est le point le plus froid du produit à stériliser qui est à prendre en compte. Si des objets volumineux sont stérilisés, le transfert thermique à l’intérieur sera retardé et le temps de chauffage devra être prolongé pour s’assurer que le point le plus froid subisse un traitement thermique à 121 °C durant dix à quinze minutes. Les barèmes de stérilisation doivent être augmentés pour les grands volumes de liquide car les temps de montée en température à cœur sont plus longs que pour des faibles volumes. Il faut noter que ce n’est pas la pression à l’intérieur de l’autoclave qui détruit les microorganismes, mais la haute température de la vapeur sous pression.

La pasteurisation La pasteurisation est un traitement thermique qui a pour objectif de réduire les populations microbiennes (charge microbienne) dans le lait ou dans d’autres liquides thermosensibles. Le processus a été découvert par Louis Pasteur et a été utilisé pour la première fois afin de contrôler l’altération du vin. La pasteurisation ne détruit pas tous les micro-organismes, n’étant pas une stérilisation. À l’origine, la pasteurisation du lait a servi à éliminer les bactéries pathogènes, particulièrement les micro-organismes responsables de la tuberculose, de la brucellose, de la fièvre Q et de la fièvre typhoïde. Si ces microbes pathogènes ne sont plus fréquemment rencontrés dans les pays développés, la pasteurisation élimine également d’autres pathogènes tels que Listeria monocytogenes, Campylobacter, Salmonella et Escherichia coli O157:H7 (voir sections 29.7 à 29.10) des produits laitiers et jus de fruit, entre autres. La pasteurisation retarde également la croissance des micro-organismes d’altération, augmentant considérablement la durée de conservation des liquides périssables (voir sections 29.1 et 29.2). La pasteurisation du lait est habituellement réalisée en passant le lait dans un échangeur de chaleur. Le lait est pompé par la tuyauterie qui est en contact avec une source de chaleur. Le



20.1 Stérilisation par la chaleur 689

Manomètre de pression vapeur

Sortie de la vapeur

Valve de sortie de vapeur

Paroi de l’autoclave

Porte Thermomètre et valve

Sortie de l’air

J. Martinko

Vanne d’arrivée de vapeur Entrée de vapeur (a)

(c)

Barème de stérilisation

Température °C

130

Arrêt de la vapeur

120

110

100

Début de montée en pression Température Température de l’autoclave au cœur de l’objet au cours de la stérilisation

Flux de vapeur 0

10

20

30

40

50

60

Durée totale du cycle de stérilisation (min) (b) FIGURE 20.3 Utilisation d’un autoclave pour la stérilisation. (a) Circulation de la vapeur dans l’autoclave. (b) Cycle typique de température d’un autoclave. La stérilisation d’un objet assez volumineux est montrée. La température au cœur de l’objet monte plus lentement que la température dans l’autoclave. (c) Autoclave moderne de laboratoire. Notez la porte résistant à la pression et le système de contrôle automatique des cycles sur la droite du panneau. Les installations d’entrée et de sortie de la vapeur sont sur la droite de l’autoclave.

contrôle du débit du lait et de la température permet des traitements thermiques de quinze secondes à 71 °C. Le lait alors est ensuite immédiatement refroidi. Le processus entier s’appelle la flash pasteurisation. Le lait peut également être traité thermiquement dans de grandes cuves entre 63 et 66 °C pendant trente minutes. Cependant, cette méthode de pasteurisation est moins satisfaisante parce que le lait chauffe et se refroidit lentement, et doit être maintenu à des températures élevées pendant des temps plus longs. Les flash pasteurisations peuvent également être réalisées à des températures plus élevées pour des temps plus courts, conservant mieux les qualités organoleptiques des aliments en éliminant plus efficacement les micro-organismes thermorésistants. Ces opérations sont réalisées en continu et correspondent aux procédés de fabrications usuels rencontrés dans les laiteries.

Contrôlez vos acquis La stérilisation est la destruction de tous les microorganismes, y compris des virus. Le traitement thermique est la méthode de stérilisation la plus employée. La température doit éliminer les microorganismes les plus thermorésistants, endospores principalement bactériennes. Un autoclave permet un traitement thermique par de la vapeur sous pression à des températures supérieures à la température d’ébullition de l’eau, détruisant des endospores. La pasteurisation ne stérilise pas les liquides, mais réduit la charge microbienne, éliminant la plupart des microbes pathogènes et empêchant la croissance des micro-organismes d’altération.



690 Chapitre 20


•

Pourquoi la chaleur est-elle un agent de stérilisation efficace ?

•

Quelles étapes sont nécessaires pour assurer la stérilité du matériel qui peut être contaminé avec les endospores bactériennes ?

•

Distinguez la nécessité de stériliser des milieux microbiologiques et la nécessité de pasteuriser le jus de pomme.

20.2 Stérilisation par rayonnement m n Les micro-ondes, infrarouges, ultraviolets (UV), rayons X, rayons γ (gamma) sont tous des formes de rayonnement électromagnétique (voir section 10.4) et peuvent tous affecter la croissance microbienne. Cependant, chaque type de rayonnement a un mode d’action différent. Par exemple, les effets antimicrobiens des rayonnements micro-ondes, comme des rayonnements infrarouges, sont dus à leurs effets thermiques. Le rayonnement UV pour une longueur d’onde comprise entre 220 et 300 nm a une énergie suffisante pour modifier ou casser l’ADN cellulaire, menant parfois à la rupture du matériel génétique et à la mort du micro-organisme exposé (voir section 10.4). Ces UV, proches de la lumière visible, sont utilisés pour désinfecter les surfaces, l’air et les matériaux tels que l’eau qui n’absorbent pas les rayonnements ultraviolets. Par exemple, des postes de sécurité biologique (hottes à flux laminaire) sont équipés d’une lampe UV pour décontaminer les surfaces après utilisation (voir figure 20.4). Le rayonnement UV ne peut pas pénétrer les surfaces pleines, opaques ou absorbant la lumière, ce qui limite son utilisation à la désinfection des seules surfaces exposables aux UV.

La radiation ionisante

auxquelles les particules de rayonnement se heurtent. La radiation ionisante produit des électrons, e–, des radicaux d’hydroxyle, OH• et des radicaux libres H• (voir section 6.16). Chacune de ces molécules, fortement réactive, est capable de changer et de perturber des biopolymères tels que l’acide désoxyribonucléique (ADN) et les protéines. L’ionisation et la dégradation des molécules biologiquement importantes telles que l’ADN et les protéines mènent à la mort des cellules irradiées. Plusieurs sources de rayonnement sont potentiellement utiles pour la stérilisation. L’unité du rayonnement est le röntgen (symbole R), qui est la mesure de l’exposition aux rayons X. La norme pour des applications biologiques telles que la stérilisation est la dose absorbée de rayonnement, mesurée en rads (100 erg/g), ou en grays (1 Gy = 100 rads). Certains micro-organismes sont beaucoup plus résistants au rayonnement que d’autres. Le tableau 20.1 montre la dose de rayonnement nécessaire pour la réduction d’un facteur 10 du nombre de micro-organismes ou des fonctions biologiques. Par exemple, la quantité d’énergie nécessaire pour réaliser une réduction décimale, ou D10, de bactéries Gram négatif sensibles au rayonnement telles que Salmonella typhimurium est de 200 Gy. Les données dans le tableau 20.1 fournissent des informations semblables aux temps de réduction décimaux correspondant à la stérilisation par la chaleur (voir section 20.1). La relation entre le logarithme de la population survivante et la dose de rayonnement reçue (grays) est généralement linéaire (voir figure 20.5). La dose létale standard pour une stérilisation par radiation correspond à douze fois la valeur de D10. Pour la destruction des endospores radiorésistantes de Clostridium botulinum, 39 600 Gy sont exigés (voir tableau 20.1). Pour Salmonella typhimurium, la dose à appliquer est de 2 400 Gy. Généralement, les micro-organismes sont beaucoup plus résistants aux rayonnements ionisants que les micro-organismes multicellulaires ; la dose mortelle de rayonnement pour des humains n’est seulement que de 10 Gy !

J. Martinko

Fraction des survivants (échelle log)

La radiation ionisante est un rayonnement électromagnétique possédant une énergie suffisante pour produire des ions et d’autres espèces moléculaires réactives à partir des molécules

FIGURE 20.4 Poste de sécurité biologique. Le poste est présenté avec une source de radiations ultraviolettes UV (lampe à vapeur de mercure) utilisée pour décontaminer les surfaces internes.

1

10–1

10 % de survivants

10–2

Radiation (Grays) FIGURE 20.5 Relation entre la fraction survivante et la dose de radiation. La valeur D10, ou dose de réduction décimale, peut être déterminée de ces résultats ci-dessus. La dose en Grays diffère significativement d’un organisme à un autre.



20.2 Stérilisation par rayonnement 691

TABLEAU 20.1

SENSIBILITÉ AUX RADIATIONS DES MICRO-ORGANISMES ET DES FONCTIONS BIOLOGIQUES

Espèce ou fonction

Type de micro-organisme

D10a(Gy)

Clostridium botulinum

Bactérie Gram positif anaérobie et sporulante

3 300

Clostridium tetani


2 400

Bacillus subtilis


600

Salmonella typhimurium

Bactérie Gram négatif

200

Lactobacillus brevis

Bactérie Gram positif

1 200

Deinococcus radiodurans

Bactérie Gram négatif résistante aux radiations

2 200

Aspergillus niger

Moisissure

500


Levure

500

Virus de la fièvre aphteuse

Virus

13 000

Coxsackie

Virus

4 500

Inactivation des enzymes Désinsectisation a

20 000–50 000 –

1 000–5 000

D10 est la dose de radiations nécessaire pour réduire une population initiale ou un niveau d'activité d'un facteur 10. Gy = grays, 1 gray = 100 rads.

La pratique en matière d’ionisation Les sources communes de radiations ionisantes incluent des générateurs de rayon X, des tubes cathodiques ou des sources radioactives. Ces sources produisent les rayons X ou les rayons γ, qui ont l’énergie et la puissance pénétrante suffisante pour empêcher efficacement la croissance microbienne en milieux solides et liquides. Les principales sources de rayonnement commercialement utilisées sont des sources radioactives qui émettent des rayons γ. Les deux radio-isotopes les plus couramment utilisés sont le 60Co et le 137Cs, deux sous-produits de la fission nucléaire. L’ionisation est actuellement employée pour la stérilisation et la décontamination des matériels médicaux et dans les industries agroalimentaires. Aux États-Unis, la Food and Drug Administration a approuvé l’utilisation du rayonnement pour la stérilisation d’objets divers comme les matériels chirurgicaux, les consommables de laboratoires, les médicaments et même les greffes de tissus (voir tableau 20.2). Cependant, en raison des coûts et des risques des équipements d’ionisation, ce type de stérilisation est limité à de

TABLEAU 20.2

PRODUITS À USAGE MÉDICAL ET DE LABORATOIRE STÉRILISÉS PAR RADIATION

Tissus pour greffes

Médicaments

Fournitures médicales et de laboratoire

Cartilages

Chloramphénicol

Matériel de laboratoire à usage unique

Tendons

Ampicilline

Milieux de cultures

Peau

Tétracycline

Seringues

Valves cardiaques

Atropine

Équipement chirurgical

Vaccins

Matériel pour sutures

Pommades

grandes applications industrielles ou pour des équipements très spécialisés. La nourriture et les produits alimentaires sont également irradiés (voir section 29.2). La stérilisation, la pasteurisation et la désinsectisation peuvent être accomplies en ajustant la dose de rayonnement appliquée. Le rayonnement est approuvé par l’Organisation mondiale de la santé pour la décontamination des aliments particulièrement susceptibles à la contamination microbienne, comme les épices. Les États-Unis l’autorisent pour la décontamination de la viande hachée, employée par exemple dans les hamburgers, ou du poulet (voir section 29.2). L’utilisation de l’ionisation dans tous ces traitements est une technologie établie et admise dans beaucoup de pays. Cependant, la pratique n’a pas été aisément acceptée dans d’autres pays par crainte d’une possible contamination radioactive, du changement des valeurs nutritives, de la production de produits toxiques ou cancérogènes et de la modification du goût liée à l’ionisation des aliments.

Contrôlez vos acquis Les doses contrôlées de rayonnement électromagnétique inhibent efficacement la croissance microbienne. Le rayonnement ultraviolet est employé pour décontaminer les surfaces et les matériaux qui n’absorbent pas la lumière, tel que l’air et l’eau. Les radiations ionisantes, nécessaires pour pénétrer les matériaux solides ou absorbant la lumière sont employées couramment pour la stérilisation et la décontamination dans les industries médicales et agroalimentaires. •

Définissez la dose décimale de réduction et la dose mortelle pour le traitement radioactif des microorganismes.

•

Pourquoi les radiations ionisantes sont-elles plus efficaces que les radiations UV pour la stérilisation des produits alimentaires ?



692 Chapitre 20


La filtration en épaisseur

m n

20.3 Filtration stérilisante

T.D. Brock

Comme nous l’avons vu, la chaleur est une manière très efficace de stériliser la plupart des liquides. Cependant, les liquides sensibles à la chaleur peuvent être stérilisés par filtration. Un filtre est un dispositif avec des pores trop étroits pour le passage des micro-organismes, mais assez larges pour permettre le passage du liquide ou du gaz. Le choix des filtres pour la stérilisation dépend des dimensions des contaminants à exclure. Certaines des plus grandes cellules microbiennes ont un diamètre supérieur à 10 µm, mais celui des plus petites bactéries est inférieur à 0,3 µm. Historiquement, des méthodes sélectives par filtration ont été employées pour isoler et caractériser des virus, dont la gamme de diamètres s’étend de 25 à 200 nanomètres (voir section 9.2). La figure 20.6 illustre ces trois types principaux de filtres.

T.D. Brock

(a)

(b)

Un des types de filtres les plus simples est le filtre épais. C’est une feuille épaisse fibreuse composée de couches de papier, d’amiante ou de fibres de borosilicate (verre) [voir figure 20.6a]. Le filtre épais emprisonne des particules dans toute la profondeur de la structure composée par le réseau de fibres. Puisqu’ils sont très poreux, les filtres épais sont souvent employés comme préfiltres pour éliminer de plus grosses particules en suspension dans les liquides, afin que les filtres de porosité plus faible, comme ceux utilisés dans le processus de stérilisation, ne soient pas obstrués. Les filtres épais servent également pour la stérilisation des gaz, comme les filtres à air dans les processus industriels (voir section 30.4). Dans la maison, la plupart des chauffages et systèmes de refroidissement à air forcé utilisent des filtres pièges simples pour emprisonner les particules composées de poussières, de spores et d’allergènes. Les filtres épais sont importants dans de nombreuses applications en sécurité biologique. Par exemple, les manipulations de cultures cellulaires, de cultures microbiennes ou de milieux de croissance exigent que les sources de contamination amenées par le manipulateur ou par les matériaux soient réduites au minimum. Ces opérations peuvent être efficacement effectuées dans une hotte à flux laminaire, par une circulation d’air traversant un filtre high efficiency particulate air, ou filtre HEPA (voir figure 20.4). À plus grande échelle, l’utilisation de filtres HEPA permet la construction de salles blanches et de salles d’isolement (pour mise en quarantaine), ainsi que de laboratoires biologiques de haute sécurité (voir section 24.4). Les filtres HEPA sont élaborés pour retenir des particules d’une taille de 0,3 µm, avec une efficacité d’au moins 99,97 % ; ils sont bien entendu également efficaces pour éliminer de l’air de plus petites et de plus grandes tailles de particules. La structure typique d’un HEPA est une feuille de fibres de borosilicate (verre) traitée avec une reliure hydrofuge. Le filtre est plissé pour augmenter la superficie globale et monté à l’intérieur d’une armature rigide pour empêcher les plis de se déformer. Les filtres HEPA présentent une grande variété de formes et de tailles, de plusieurs centimètres carrés pour des filtres sur les conduites d’air à un ou plusieurs mètres carrés pour les hottes à flux laminaire (voir figure 20.4) ou les salles blanches.

T.D. Brock

La filtration membranaire

(c) FIGURE 20.6 Filtres microbiologiques. (a) Structure d’un filtre en profondeur, (b) membrane filtrante conventionnelle, (c) filtre nucléopore. Les filtres en profondeur sont utilisés comme préfiltres ou pour la filtration de liquides fortement chargés en particules en suspension. Les membranes filtrantes sont utilisées pour de nombreuses applications en laboratoire et en industrie, sont disponibles dans une large variété de tailles et de porosités, sont économiques et sont utilisables pour la plupart des besoins de filtration. Les filtres nucléopores sont utilisés pour isoler des spécimens pour la microscopie parce que les matériaux filtrés sont retenus sur une surface plane à la surface du filtre.

Le filtre le plus commun pour la stérilisation des liquides en laboratoire de microbiologie est le filtre membranaire (voir figure 20.6b). Ces membranes filtrantes se composent de polymères à haute résistance mécanique telle que l’acétate de cellulose, le nitrate de cellulose ou le polysulfone. Le procédé utilisé pour réaliser ces membranes permet d’obtenir un grand nombre de pores minuscules. En ajustant les conditions de polymérisation pendant la fabrication, la taille des pores de la membrane (et ainsi la taille des molécules pouvant passer à travers) peut être contrôlée avec précision. La membrane filtrante diffère du filtre épais car qu’elle fonctionne plutôt comme une passoire, retenant des particules sur la surface de filtre. Les pores recouvrant environ 80 à 85 % de la surface de la membrane, cette porosité permet des débits de liquide relativement élevés. Diverses utilisations de filtres membranaires pour la stérilisation d’un liquide sont présentées dans la figure 20.7. L’appareillage de



20.3 Filtration stérilisante

693

Milieu non stérile Entonnoir

Pince de fixation

Filtre membranaire

Carlos Pedrós-Alió et T. D. Brock

Support en verre Base Bouchon percé Vide

Flacon stérile Milieu stérile

(a)

J. Martinko

CDC/NCID/HIP/ Janice Carr et Rob Weyant

(a)

(b)

FIGURE 20.7 Filtres membranaires. (a) Assemblage d’un système de filtration réutilisable. (b) Unité de filtration stérile à usage unique. À gauche, système utilisé pour de faibles volumes ; à droite, système pour les volumes importants.

(b)

filtration est généralement stérilisé séparément du filtre et le système est assemblé aseptiquement au moment de la filtration. Le système montré dans la figure 20.7a convient pour de petits volumes de liquide. Pour filtrer de plus grandes quantités, la membrane de filtration est insérée dans une cartouche placée dans un logement d’acier inoxydable. Dans l’industrie pharmaceutique, la filtration est utilisée pour stériliser de grands volumes de produits liquides thermosensibles. Des filtres membranaires préstérilisés servent couramment dans les laboratoires de recherche ou hospitaliers pour la stérilisation de petits volumes (voir figure 20.7b). La filtration est réalisée en utilisant une seringue, une pompe péristaltique ou une pompe à vide pour forcer le liquide à passer à travers le filtre. Un autre type de membrane filtrante, le filtre Nucléopore, est très employé. Ces filtres sont créés en traitant les membranes très minces de polycarbonate (10 µm) par irradiation suivi d’une gravure à l’eau-forte. Les radiations traversent la couche de polycarbonate, créant des voies sensibles à l’eau-forte. Dans un second temps, les voies créées dans le polymère sont dissoutes avec la solution de gravure à l’eau-forte pour former les pores cylindriques. En modifiant la température, la force de la solution gravure à l’eau-forte et le temps d’exposition, il est possible de maîtriser avec précision la taille des pores. La membrane résultante est un mince film, translucide et microporeux

FIGURE 20.8 Images en microscopie électronique de bactéries retenues sur des membranes de filtration nucléopore. (a) Bactéries et algues aquatiques. La taille des pores est de 5 µm. (b) Leptospira interrogans. La bactérie a un diamètre de 0,1 µm environ et une longueur de 20 µm. La taille des pores du filtre est de 0,2 µm.

de polycarbonate, avec une surface douce et plate (voir figure 20.6c). Les filtres Nucléopore sont utilisés généralement pour la microscopie électronique à balayage. Un micro-organisme peut être isolé d’un liquide, retenu sur la surface plane du filtre, puis être observé par microscopie (voir figure 20.8).

Contrôlez vos acquis Les filtres éliminent les micro-organismes de l’air ou des liquides. Des filtres pièges, y compris des filtres HEPA, sont utilisés pour retenir des micro-organismes et d’autres contaminants des liquides ou de l’air. Les filtres membranaires servent pour la stérilisation des liquides sensibles à la chaleur, et les filtres Nucléopore pour isoler des spécimens (petits objets, cellules) en vue de l’observation en microscopie électronique.



694 Chapitre 20


•

Décrivez l’utilisation potentielle des filtres HEPA pour maintenir l’air propre dans les hôpitaux.

•

Pourquoi les filtres membranaires sont-ils utilisés pour la stérilisation des liquides thermosensibles ?

ajouté (voir figure 20.9c). Les agents bactériolytiques regroupent les antibiotiques qui empêchent la synthèse de la paroi cellulaire (bactériostase) comme la pénicilline (voir sections 4.8 et 20.8), ou les produits chimiques de type détergents qui rompent la membrane cytoplasmique.

La mesure de l’activité antimicrobienne

20.4 Contrôle chimique m n de la croissance Les agents antimicrobiens se différencient en fonction de la sélectivité de leur toxicité. Certains sont non sélectifs et ont des effets semblables sur toutes les cellules. D’autres sont nettement plus sélectifs et sont plus toxiques pour des microorganismes que pour des tissus animaux. Les agents antimicrobiens à la toxicité sélective sont particulièrement utiles pour traiter les maladies infectieuses parce qu’ils tuent des micro-organismes in vivo sans nuire aux organismes hôtes. Ils seront décrits plus tard dans ce chapitre. Ici, nous présentons les agents chimiques qui ont une toxicité relativement large, mais qui sont utiles pour limiter la croissance microbienne in vitro.

L’effet des agents antimicrobiens sur la croissance Quand un agent antimicrobien est ajouté à une culture bactérienne en phase exponentielle de croissance, on peut observer trois effets distincts : bactériostatique, bactéricide et bactériolytique (voir figure 20.9). Les agents bactériostatiques sont fréquemment des inhibiteurs de la synthèse des protéines et agissent en se liant aux ribosomes. Si la concentration de l’agent est réduite, il est libéré du ribosome et la croissance reprend (voir figure 20.9a). Beaucoup d’antibiotiques fonctionnent selon ce mécanisme, ce qui sera discuté dans les sections 20.6 à 20.9. Les agents bactéricides se lient étroitement à leurs cibles cellulaires et ne sont pas enlevés par dilution, mais la lyse, la perte d’intégrité des cellules et le dégagement du contenu ne se produisent pas (voir figure 20.9b). Les agents bactériolytiques induisent la mort par la lyse des cellules, qui peut être observée par la diminution du nombre de cellules cultivables ou de la turbidité après que l’agent a été

Bactériostatique Log du nombre de cellules

À la maison, sur le lieu de travail et au laboratoire, des agents chimiques sont employés en routine pour empêcher les développements microbiens. Un agent antimicrobien est un produit chimique naturel ou synthétique qui tue ou inhibe la croissance des micro-organismes. Des agents qui tuent des micro-organismes s’appellent les agents cides, avec un préfixe indiquant le genre du micro-organisme tué. Ainsi, ces agents se nomment les agents bactéricides, fongicides et virucides, tuant respectivement les bactéries, les moisissures et les virus. Les agents qui ne tuent pas mais empêchent seulement la croissance s’appellent les agents statiques, incluant les agents bactériostatiques, fongistatiques et virustatiques.

L’activité antimicrobienne est mesurée en déterminant la concentration de composés antimicrobiens requise pour empêcher la croissance d’un micro-organisme étudié, une valeur appelée la concentration minimale inhibitrice (CMI). Pour déterminer la CMI d’un composé antimicrobien, une série de tubes de culture est préparée et inoculée, chaque tube contenant le milieu avec une concentration différente de l’agent antimicrobien. Après incubation, les tubes sont examinés pour observer s’il y a eu croissance ou non-croissance déterminée par la turbidité du milieu. La CMI est la plus basse concentration du

Dénombrement total des cellules Dénombrement des cellules viables

Temps (a)

Bactéricide Log du nombre de cellules

CONTRÔLE ANTIMICROBIEN CHIMIQUE

Temps (b)

Bactériolytique Log du nombre de cellules

II

Temps (c) FIGURE 20.9 Trois types d’action des agents antimicrobiens. Au temps indiqué par la flèche, un inhibiteur de croissance a été ajouté à des cultures en phase exponentielle de croissance. Notez la relation entre les cellules viables et le comptage total des cellules.



20.5 Agents antimicrobiens chimiques à usage externe 695

composé antimicrobien qui empêche complètement la croissance du micro-organisme étudié (voir figure 20.10). Ce procédé simple et efficace est souvent appelé technique par dilution. La CMI n’est pas constante pour un agent antimicrobien donné, parce que son effet dépend de la nature du micro-organisme, de la taille de l’inoculum, de la composition du milieu de culture, de la période d’incubation et des conditions de l’incubation telles que la température, le pH et l’aération. Cependant, quand toutes les conditions sont rigoureusement normalisées, différents agents antimicrobiens peuvent être comparés pour déterminer celui qui est le plus efficace contre un micro-organisme donné. Une méthode standardisée employée pour comparer les agents antimicrobiens est la méthode du coefficient de phénol, un rapport entre la CMI de l’agent antimicrobien étudié et la CMI du phénol, en utilisant les mêmes micro-organismes, milieux et conditions de croissance. Une autre méthode d’analyse courante pour déterminer l’activité antimicrobienne est la diffusion en milieu gélosé (voir figure 20.11). Une boîte de Petri contenant un milieu gélosé est ensemencée sur toute sa surface par la bactérie étudiée. Des quantités connues de composés antimicrobiens sont déposées sur des disques de papier-filtre qui sont ensuite placés en surface de la gélose. Pendant l’incubation, l’agent antimicrobien se diffuse du papier-filtre dans la gélose ; plus l’on s’éloigne du disque, plus la concentration de l’agent diminue. À une certaine distance du disque, la CMI est atteinte. Au-delà de cette limite les bactéries se développent alors que, plus près du disque, la croissance est inhibée. Une zone d’inhibition est créée avec un diamètre proportionnel à la quantité d’agent antimicrobien déposée sur le disque de papier, à la solubilité de cet agent, au coefficient de diffusion et à l’activité globale de l’agent. Cette méthode est habituellement employée pour déterminer l’efficacité des antibiotiques sur les bactéries pathogènes (voir section 24.3).

T. D. Brock

Concentration minimale inhibitrice

FIGURE 20.10 Détermination de la sensibilité aux antibiotiques par la méthode des dilutions. L’essai permet de déterminer la concentration minimale inhibitrice (CMI) d’un antibiotique. Des concentrations croissantes de l’antibiotique sont ajoutées dans des tubes de milieu de culture. Chaque tube est inoculé et mis en incubation. La croissance (révélée par la turbidité) se produit dans les tubes dont la concentration en antibiotique est inférieure à la CMI.

Boîte de milieu nutritif gélosé Culture inoculée dans 5 ml d’agar en fusion pour recouvrir le milieu nutritif gélosé

Boîte recouverte

Des disques imprégnés d’antibiotiques sont placés en surface Incubation de 24 à 48 h L’organisme testé montre sa susceptibilité aux antibiotiques, indiquée par une zone d’inhibition de croissance bactérienne autour des disques (zone d’inhibition) après l’incubation FIGURE 20.11 Mesure de l’activité des antibiotiques. Méthode de diffusion dans la gélose pour tester l’activité des antibiotiques.

Contrôlez vos acquis Les produits chimiques sont souvent employés pour contrôler la croissance microbienne. Des produits chimiques qui tuent des micro-organismes s’appellent les agents cides ; ceux qui empêchent la croissance s’appellent les agents statiques. L’efficacité d’un agent chimique antibactérien est évaluée en déterminant la concentration minimale nécessaire pour empêcher complètement la croissance bactérienne. •

En ce qui concerne les agents antibactériens, distinguez les agents statiques, cides et lytiques.

•

Décrivez comment la concentration inhibitrice minimale d’un agent antibactérien est déterminée.

20.5 Agents antimicrobiens chimiques m n à usage externe Les agents antimicrobiens chimiques sont divisés en deux catégories. La première catégorie contient les produits antimicrobiens qui sont employés pour contrôler les micro-organismes non pathogènes chez l’homme. Ces agents peuvent être utilisés pour contrôler les micro-organismes affectant la santé des animaux, mais également, industriellement, pour maîtriser



696 Chapitre 20


les contaminations microbiennes dans la nourriture, dans les tours de refroidissement de climatisation, dans les produits textiles ou dans le papier et même dans les réservoirs de carburant ! Le tableau 20.3 fournit quelques exemples d’applications industrielles pour lesquelles des produits chimiques sont employés afin de maîtriser les développements microbiens. La deuxième catégorie des agents antimicrobiens chimiques contient des produits prévus pour empêcher la croissance des microbes pathogènes humains dans l’environnement. Cette catégorie d’agents antimicrobiens est subdivisée en stérilisants, désinfectants, aseptisants et antiseptiques.

Les stérilisants Les stérilisants chimiques, également appelés stérilisateurs, ou les sporicides détruisent toutes les formes de la vie microbienne, y compris les endospores. Les stérilisants chimiques sont utilisés dans les situations où il est impossible d’avoir recours à la chaleur (voir section 20.1) ou au rayonnement (voir section 20.2) pour la décontamination ou la stérilisation. Les hôpitaux et les laboratoires doivent pouvoir stériliser les matériaux thermosensibles tels que les thermomètres, les instruments en verre, les tuyaux en polyéthylène, les cathéters et les équipements médicaux réutilisables. C’est alors une méthode de stérilisation froide qui est employée. La stérilisation froide est réalisée dans des dispositifs clos ressemblant à des autoclaves et utilise un agent chimique gazeux tel que l’oxyde d’éthylène, le formaldéhyde, l’acide péroxyacétique, ou le péroxyde d’hydrogène. Des stérilisants liquides tels que le chlorate de sodium en solution ou l’amylphénol sont employés pour traiter les instruments sensibles qui ne peuvent pas résister aux températures ou aux gaz (voir tableau 20.4).

TABLEAU 20.3

Les désinfectants, les aseptisants et les antiseptiques Les désinfectants sont des produits chimiques utilisés sur les objets, qui détruisent les micro-organismes mais pas obligatoirement les spores bactériennes. Les désinfectants usuels en hôpitaux tels que l’éthanol et les détergents cationiques sont employés pour décontaminer toutes les surfaces – planchers, sièges, tables, murs –, ainsi que les instruments médicaux. Des désinfectants généraux sont employés dans les foyers pour le ménage, dans les piscines et dans les épurateurs d’eau (voir tableau 20.4). Les aseptisants sont des agents qui réduisent, mais peuvent ne pas éliminer, les populations microbiennes à des niveaux considérés comme sûrs. Les aseptisants de contact alimentaire sont largement employés dans l’industrie alimentaire pour traiter les surfaces rencontrées dans les équipements de cuisine, les mixeurs ou les appareils de cuisson, les plats et les ustensiles. Une catégorie séparée d’aseptisants de contact non alimentaire est utilisée pour traiter des surfaces telles que des comptoirs, des planchers, des murs, des tapis, l’air, ainsi qu’en blanchisserie (voir tableau 20.4). Les antiseptiques et les germicides sont des agents chimiques qui tuent ou empêchent la croissance des micro-organismes et sont suffisamment peu toxiques pour être appliqués sur des tissus vivants. La plupart de ces composés entrant dans cette catégorie sont employés pour le lavage des mains ou pour traiter les blessures externes (voir tableau 20.4). Dans certaines circonstances, quelques antiseptiques sont également des désinfectants efficaces. Ces produits sont considérés comme des drogues tombant sous le coup des règlements de la Food and Drug Administration aux États-Unis.

UTILISATIONS INDUSTRIELLES DES ANTIMICROBIENS CHIMIQUES

Industrie

Composé chimique a

Utilisations

Papeterie

Mercures organiques, phénols , méthylisothiazolinone

Pour éviter les développements microbiens dans l’usine

Tannerie

Métaux lourds, phénolsa

Les agents antimicrobiens sont présents dans le produit final

Plasturgie

Détergents cationiques

Pour éviter la croissance bactérienne dans les dispersions aqueuses de plastiques

Textile


Pour éviter les détériorations microbiennes des produits fabriqués lors de leur exposition aux conditions environnementales, comme les toiles de tentes

Bois


Pour protéger la détérioration des structures en bois

Métallurgie

Détergents cationiques

Pour éviter la croissance des bactéries dans les émulsions de coupe

Pétrochimie

Mercures, phénols, détergents cationiques, méthylisothiazolinone

Pour éviter la croissance des bactéries durant la récupération et le stockage du pétrole et de ses dérivés

Air conditionné

Chlore, phénolsa, méthylisothiazolinone

Pour éviter la croissance des bactéries (par exemple Legionella) dans les tours de refroidissement

Électricité

Chlore

Pour éviter la croissance des bactéries dans les condensateurs et les tours de refroidissement

Nucléaire

Chlore

Pour éviter la croissance des bactéries résistantes aux radiations dans les réacteurs nucléaires

a

Les métaux lourds (mercure et arsenic) et les composés phénoliques produisent des déchets dangereux pour l’environnement, et peuvent constituer des risques pour la santé.



20.5 Agents antimicrobiens chimiques à usage externe 697

TABLEAU 20.4

ANTISEPTIQUES, STÉRILISANTS ET DÉSINFECTANTS Agent

Utilisation

Mode d’action

Antiseptiques Alcool (60 à 85 % d’éthanol ou d’isopropanol dans l’eau)a

Antiseptique local

Solvant des lipides et dénaturant des protéines

Solutions contenant du phénol (hexachlorophène, triclosan, chloroxylénol, chlorhexidine)b

Savons, lotions, cosmétiques, déodorants corporels, désinfectants locaux

Perturbe la membrane cellulaire

Détergents cationiques, spécifiquement composés d’ammonium quaternaire (chlorure de benzalkonium)

Savons, lotions, désinfectants locaux

Interaction avec les phospholipides de la membrane cellulaire

Peroxyde d’hydrogène (solution à 3 %)

Antiseptique local

Agent oxydant

Iodures, composés iodophores en solution (Betadine®)

Antiseptique local

Iodation de la tyrosine résidus de protéines ; agent oxydant

Octenidine

Antiseptique local

Perturbe la membrane cellulaire

Nitrate d’argent

Yeux des nouveau-nés pour éviter les cécités dues aux infections à Neisseria gonorrhoeae

Précipite les protéines

Alcool (60 à 85 % d’éthanol ou d’isopropanol dans l’eau)b

Désinfectant pour instruments médicaux et les surfaces de laboratoire

Solvant des lipides et dénaturant des protéines

Détergents cationiques (composés d’ammonium quaternaire)

Désinfectant pour les instruments médicaux, équipements alimentaires et laitiers

Interaction avec les phospholipides

Chlore (gazeux)

Désinfectant pour la purification des réserves d’eau

Agent oxydant

Composés chlorés (chloramines, hypochlorite de sodium, dioxyde de chlore)

Désinfectant des équipements industriels alimentaires et laitiers et des réserves d’eau

Agent oxydant

Sulfate de cuivre

Algicide, désinfectant des piscines et des réserves d’eau

Précipite les protéines

Oxyde d’éthylène (gazeux)

Stérilisant pour les matériaux sensibles à la température comme les plastiques ou les instruments d’optique

Agent alcalin

Formaldéhyde

3 % à 8 % en solution utilisée comme désinfectant de surface, 37 % (formol) ou sous forme de vapeur utilisés comme stérilisant

Agent alcalin

Glutaraldéhyde

2 % en solution utilisée comme désinfectant ou stérilisant puissant

Agent alcalin

Peroxyde d’hydrogènea

Vapeur utilisée comme stérilisant

Agent oxydant

Iodures, composés iodophores en solution (Wescodyne®)

Désinfectant pour les instruments médicaux et les surfaces de laboratoire

Iodation de la tyrosine

Dichloride de mercureb

Désinfectant pour les surfaces de laboratoire

Se combine avec les groupements -SH

OPA (orthophalaldéhyde)

Désinfectant puissant pour les instruments médicaux

Agent alcalin

Ozone

Désinfection de l’eau potable

Puissant oxydant

Acide péroxyacétique

Solution utilisée comme puissant désinfectant ou stérilisant

Puissant oxydant

Composés phénoliquesb

Désinfectant pour les surfaces de laboratoire

Dénaturant des protéines

Stérilants, désinfectantsc

a

Alcools, peroxyde d’hydrogène et composés iodés contenant des iodophores peuvent agir comme antiseptiques, désinfectants ou stérilisants, leurs actions dépendant des concentrations, des temps d’exposition et des formes de présentation. b Utiliser des composés avec des métaux lourds (mercure) et des composés phénoliques produit des déchets dangereux pour l’environnement et peuvent constituer des risques pour la santé. c Plusieurs composés antimicrobiens hydrosolubles, à l’exception de ceux contenant des métaux lourds, peuvent être utilisés comme désinfectants pour les équipements alimentaires et laitiers, les surfaces de préparation ; leur utilisation doit être suivie de rinçages adéquats avant les contacts avec les aliments.



698 Chapitre 20


L’efficacité antimicrobienne Plusieurs facteurs affectent l’efficacité de ces agents antimicrobiens chimiques. Par exemple, beaucoup de désinfectants sont neutralisés par les matières organiques, ce qui réduit les concentrations effectives des désinfectants et leurs capacités de destruction des micro-organismes. En outre, des micro-organismes pathogènes sont souvent entourés de particules ou se multiplient, formant des biofilms, couvrant les surfaces d’un tissu de plusieurs couches de cellules microbiennes (voir section 19.3). En conséquence, la pénétration d’un agent chimique jusqu’aux cellules peut être ralentie ou même complètement empêchée. Seuls les stérilisants sont efficaces contre les endospores bactériennes. Les endospores sont beaucoup plus résistantes aux autres agents que les cellules végétatives en raison de leur faible teneur en eau et de leur métabolisme réduit (voir sections 20.1 et 4.13). Certaines cellules végétatives, comme celles de Mycobacterium tuberculosis, l’agent responsable de la tuberculose, sont résistantes à l’action des désinfectants communs en raison de la nature cireuse de leur paroi cellulaire (voir sections 12.23 et 26.5). Ainsi, l’efficacité des traitements antimicrobiens est très variable et ne peut être réellement déterminée que dans les conditions réelles de leur utilisation.

Contrôlez vos acquis Les stérilisants, les désinfectants et les aseptisants sont des composés employés pour décontaminer le matériel. Des antiseptiques et des germicides sont utilisés pour réduire les développements microbiens sur les tissus vivants. Les composés antimicrobiens ont des applications commerciales, industrielles et dans le domaine de la santé. •

Distinguez entre un stérilisant, un désinfectant, un aseptisant et un antiseptique.

•

Quels désinfectants sont habituellement employés pour la stérilisation de l’eau ?

•

Pourquoi ces désinfectants ne sont-ils pas nocifs pour les humains ?

même les antiseptiques, relativement doux, ne peuvent être employés que sur la peau. Pour le contrôle des maladies infectieuses, les composés chimiques employables in vivo sont essentiels. De tels composés s’appellent les agents chimiothérapeutiques antimicrobiens et jouent un rôle essentiel en médecine clinique et vétérinaire, ainsi que dans l’agriculture. Les travaux sur les agents chimiothérapeutiques antimicrobiens ont été entrepris par le scientifique allemand Paul Ehrlich. Au début des années 1900, Ehrlich a développé le concept de la toxicité sélective, soit la capacité d’empêcher ou de tuer des micro-organismes pathogènes sans affecter l’organisme hôte. Dans ses travaux en quête d’« une arme magique » qui ne tuerait que les microbes pathogènes, Ehrlich a examiné un grand nombre de colorants chimiques pour évaluer leur toxicité sélective et a découvert les premières molécules antimicrobiennes efficaces, dont le Salvarsan. Ce composé contenant de l’arsenic, utilisé pour le traitement de la syphilis, a connu un grand succès (voir figure 20.12). Les agents chimiothérapeutiques sont classés selon leur structure (voir figure 20.13), leur mécanisme d’action (voir figure 20.14) ou leur spectre d’activité antimicrobienne (voir figure 20.15). Dans le monde entier, plus de cinq cents tonnes de différents agents chimiothérapeutiques sont fabriquées annuellement (voir figure 20.16). Les agents antimicrobiens se classent en deux grandes catégories, agents synthétiques et antibiotiques. Ici, nous nous concentrerons sur les agents synthétiques. Nous discuterons des antibiotiques dans les trois prochaines sections.

Les analogues de facteur de croissance Dans la section 5.1, nous avons défini les facteurs de croissance en tant que substances chimiques spécifiques nécessairement présentes dans le milieu, car non synthétisées par les organismes. Les analogues de facteur de croissance sont des composés synthétiques structurellement semblables à un facteur de croissance, mais de subtiles différences structurales entre les analogues et les réels facteurs de croissance empêchent les premiers de fonctionner dans la cellule. Des analogues sont connus pour des vitamines, des acides

OH

III

NH2

AGENTS ANTIMICROBIENS UTILISÉS IN VIVO

Un certain nombre d’agents antimicrobiens, synthétiques et naturels, sont employés pour traiter des infections microbiennes in vivo. Ces composés ont révolutionné le traitement des maladies infectieuses.

20.6 Molécules antimicrobiennes m n de synthèse La section précédente a traité des agents chimiques employés pour empêcher la croissance microbienne en dehors du corps humain. La plupart des produits chimiques mentionnés sont trop toxiques pour être utilisés à l’intérieur des organismes ;

As

NH2 HO

As As

H2N

OH

As NH2

OH

FIGURE 20.12 Salvarsan. Ce composé contenant de l’arsenic a été la première molécule antimicrobienne chimiothérapeutique utilisée. Le Savarsan a été utilisé depuis le début des années 1900 pour soigner la syphilis.



20.6 Molécules antimicrobiennes de synthèse 699

Classification des antibiotiques I

II

Carbohydrates

Lactones macrocycliques

III Quinones et composés associés

Sous-classification

Exemples

Structure représentative NH

Sucres purs Aminoglycosides Orthosomycines N-Glycosides C-Glycosides Glycolipides

Nojirimycine Streptomycine Everninomicine Streptothricine Vancomycine Moenomycine

Antibiotiques macrolides Antibiotiques polyène Ansamycines Macrotétrolides

Érythromycine Candicidine Rifampine Tétranactine

Tétracyclines Anthracyclines Naphtoquinones Benzoquinones

Tétracyclines Adriamycine Actinorhodine Mitomycine

NH

NHCNH2 H H2NCNH H OH H H HO H OH O

H

CHO H

H3C

H

O

CH2OH H

H

H

OH

O

N N

Rifampine

CH3

Streptomycine O

H2COCONH2

H2N

Cyclosporine Pénicilline, Ceftriaxone Antibiotiques peptidiques Bacitracine Actinomycine Chromopeptides Valinomycine Depsipeptides Bléomycine Peptides chelatés

IV Acides aminés et peptides Dérivés d’acides aminés Antibiotiques β-lactames analogues

Composé hétérocyclique azoté

Antibiotiques nucléosidiques

OCH3

H3C

N

S

Mitomycine C

N

H H C CONH N

N

O

H3C

S

CH2S COOH

N

N

OH

N

O

Ceftriaxone

Polyoxine

O

COOH O

COHNCH HCOH H

Antibiotiques polyéther

HOCH

Monensine

CH2OH

HN

H2NCH

VI Composé hétérocyclique oxygéné

NH

O

NH2

OCH3

V

CH3

N

O

CH3

H NH

CH3

CH3

O

O

HO

CH3

HO CH3 OH O CH3COO OH OH CH3 CH3 NH CH3O

HO H

CH3

H

O

N

O H

H

OH

OH

H

CH2OCONH2

Polyoxine B VII Dérivés alicycliques

VIII Composés aromatiques

Dérivés de cycloalcanes Antibiotiques stéroïdiens

Dérivés du benzène Aromatiques condensés Éthers aromatiques

Cycloheximide Acide fusidique

Chloramphénicol Griséofulvine Novobiovine

HO H3C CH3O

O

O

Fosfomycine

H

O

CH3O

4-Quinolone Fluoro-4-quinolone

Acide nalidixique Ciprofloxacine

H

C2H5 H3C

PO3H2

2-Oxazolidinone

N COOH

O

Lactone cyclique

N

Fosfomycine O

O

XI Oxazolidinone

CH3

Cl

Griséofulvine

C O

OCH3

O

OH

H3C

CH2OH OH

O

O

C

CH3

H O

OCH3 O

CH3

H

Composés quinolone

H O

Cycloheximide

X

H3C

Monensine

HN

Composés phosphorés

O

H

H CH3 CH(CH3)COOH

H3C O

IX Composés aliphatiques

H3C CH2CH3

CH3

NH

Acide nalidixique

2-Oxazolidinone

FIGURE 20.13 Agents chimiothérapeutiques antibactériens. Les agents sont classés selon leur structure chimique. Un exemple représentatif de chaque groupe est donné.

aminés, des purines, des pyrimidines, ainsi que pour d’autres composés. Nous présentons dans un premier temps les analogues de facteur de croissance bactériens. Des

analogues de facteur de croissance efficaces pour le traitement des infections virales et fongiques seront discutés dans les sections 20.10 et 20.11.



700 Chapitre 20


Synthèse de la paroi Cyclosérine Vancomycine Bacitracine Pénicillines Céphalosoprines Monobactames Carbapénèmes

Quinolones

DNA gyrase Acide nalidixique Ciprofloxacine Novobiocine

Élongation de l’ARN Actinomycine

THF

Rifampine Streptovaricines Synthèse protéique (inhibition du 50S) Érythromycine (macrolides) Chloramphénicol Clindamycine Lincomycine

ADN

Métabolisme de l’acide folique Trimethroprime Sulfonamides

ADN, ARN polymérase dirigée

ARNm

Synthèse protéique (inhibition du 30S)

Ribosomes

DHF

50

50

30

30

50

Tétracyclines Spectinomycine Streptomycine Gentamicine Kanamycine Amikacine Nitrofuranes

30

Structure de la membrane cytoplasmique Polymyxines Daptomycine PABA

Membrane Paroi cellulaire cytoplamique

Synthèse protéique (ARNt) Mupirocine Puromycine

FIGURE 20.14 Mode d’action des agents majeurs chimiothérapeutiques antimicrobiens. THF, Tétrahydrofolate ; DHF, Dihydrofolate ; ARN messager (ARNm), ARN de transfert (ARNt).

Les sulfamides Découverts par Gerhard Domagk dans les années 1930, les sulfamides ont été les premiers analogues de facteur de croissance largement employés pour empêcher spécifiquement la croissance des bactéries. La découverte du premier composé de la famille des sulfamides a résulté du criblage à grande échelle de produits chimiques pour détecter leur activité afin de traiter les maladies à streptocoques chez des animaux de laboratoire. Le sulfanilamide, le sulfamide le plus simple, est un analogue de l’acide p-aminobenzoïque, qui correspond à une partie de la molécule d’acide folique, vitamine précurseur d’acide nucléique (voir figure 20.17). Le sulfanilamide bloque la

Eucaryotes Moisissures

Bactéries parasites obligatoires

Bactéries Mycobactéries

Bactéries Gram négatif

Tobramycine Azoles Allymines Cycloheximide Polyènes Polyoxines Analogues d’acides nucléiques Echinocandines

synthèse de l’acide folique, empêchant la synthèse d’acide nucléique. Le sulfanilamide n’est actif que sur les bactéries, car elles synthétisent leur propre acide folique, tandis que la plupart des animaux obtiennent cet acide de leur alimentation. Parce que les sulfamides sont largement employés pour le traitement des infections à streptocoques (voir section 26.2), les résistances aux sulfonamides sont maintenant très courantes, principalement parce que les micro-organismes sont devenus résistants en développant la capacité à employer des sources exogènes d’acide folique (voir section 20.12). Cependant, le traitement avec le sulfaméthaxazole (un sulfamide très utile cliniquement), associé au triméthoprime, un composé de synthèse proche et compétiteur de l’acide folique, demeure

Streptomycine

Bactéries Gram positif

Chlamydies

Pénicillines Sulfonamides Céphalosporines Quinolones Tétracycline

Izoniazide

Polymyxines

Vancomycine Daptomycine

Rickettsies

Virus Virus à ARN

Virus à ADN

Inhibiteurs non nucléosides de la transcriptase inverse Inhibiteurs de protéase Inhibiteurs de la fusion Analogues de nucléosides Interféron

FIGURE 20.15 Spectre d’action des agents antimicrobiens. Chaque agent chimiothérapeutique antimicrobien affecte un groupe limité de micro-organismes.



20.6 Molécules antimicrobiennes de synthèse 701

3%

3%

15 %

Céphalosporines

17 %

Macrolides Quinolones

ressemble à la base nucléique, uracile ; le bromo-uracile ressemble à une autre base, la thymine. Des analogues de facteur de croissance ressemblant aux acides nucléiques sont employés dans le traitement des infections virales et fongiques et sont également utilisés comme agents mutagènes (voir sections 20.10, 20.11 et 10.4).

Pénicillines Aminoglycosides 14 %

Tétracyclines

37 %

Autres 11 %

FIGURE 20.16 Production et utilisation mondiale annuelle des antibiotiques. Chaque année, plus de 500 tonnes d’agents antimicrobiens chimiothérapeutiques sont fabriquées.

efficace parce que la combinaison de ces deux composés produit un blocage séquentiel de la voie de synthèse de l’acide folique ; la résistance à ces deux composés exige l’association de deux mutations dans le même micro-organisme.

L’isoniazide L’isoniazide (voir figure 26.9) est un analogue de facteur de croissance important, mais avec un spectre étroit d’activité (voir figure 20.15). Efficace seulement contre Mycobacterium tuberculosis, l’isoniazide interfère avec la synthèse de l’acide mycolique, un composant mycobactérien de la paroi cellulaire. L’isoniazide est un analogue de la nicotinamide (vitamine) et est la molécule la plus efficace utilisée pour le contrôle et le traitement de la tuberculose (voir figure 20.15 et section 26.5).

Dans les exemples représentés à la figure 20.18, les analogues des bases d’acide nucléique ont été obtenus par l’addition d’un fluor ou d’un atome de brome. Le fluor est un atome relativement petit qui ne change pas la forme globale des bases, mais les propriétés chimiques du composé ; la base modifiée ne fonctionne plus dans le métabolisme cellulaire. Le fluoro-uracile

SO2NH2

H2N

(a) Sulfanilamide

N

HN H2N

N

N

COOH

(b) Acide p-aminobenzoïque

O CH2

H N

Facteurs de croissance

Analogue

CH2 C

NH2

COOH

CH2 C

H

COOH

H

F

Phénylalanine (acide aminé)

p-Fluorophénylalanine

O

O

HN

F

HN

O

O

N H Uracile (base pyrimidique ARN)

N H 5-Fluorouracile (analogue de l’uracile)

O

O

O C

COOH HN C H CH2 CH2

(c) Acide folique

Les quinolones forment une classe distincte de composés antibactériens synthétiques qui interagissent avec l’ADN gyrase bactérienne empêchant l’activité de l’enzyme et donc l’enroulement de l’ADN bactérien, une étape requise pour la conformation topographique de l’ADN dans la cellule bactérienne (voir section 7.3). L’acide nalidixique a été la première quinolone directement synthétisée (voir figures 20.13 et 20.14). Des fluoroquinolones dérivées de l’acide nalidixique telles que la ciprofloxacine (voir figure 20.19) sont usuellement employées pour traiter des infections de l’appareil urinaire chez l’homme. La ciprofloxacine est également le composé choisi pour traiter des infections des espèces bactériennes résistantes à la pénicilline comme Bacillus anthracis, responsable de la maladie du charbon ou anthrax (voir section 25.13). L’ADN gyrase étant présente chez toutes les Bacteria, les fluoroquinolones sont efficaces pour traiter des infections bactériennes à la fois pour les bactéries Gram positif et Gram négatif (voir figure 20.15). Les fluoroquinolones sont également intensivement employées

NH2

Les analogues d’acide nucléique

H2N

Les quinolones

COOH

FIGURE 20.17 Les sulfamides. (a) Le plus simple des sulfamides, le sulfanilamide. Le sulfanilamide est un analogue de l’acide p-aminobenzoïque (b), un précurseur de l’acide folique (c), facteur de croissance (section 5.1).

HN O

CH3

N H Thymine (base pyrimidique ADN)

HN

Br

O

N H 5-Bromouracil (analogue de la thymine)

FIGURE 20.18 Facteurs de croissance. Comparaison des facteurs de croissance et de leurs structures analogues. Les facteurs de croissance sont discutés en section 5.1, tableau 5.3.



702 Chapitre 20


O COOH

F HN

N

N

FIGURE 20.19 Ciprofloxacine, un antibiotique quinolone. La ciprofloxacine est un dérivé fluoré de l’acide nalidixique (figure 20.13). Ce dérivé est plus soluble que l’acide nalidixique et est utilisé en thérapie clinique au niveau du sang et des tissus. La ciprofloxacine est utilisée pour traiter les infections de l’appareil urinaire et l’anthrax causé par des souches de Bacillus anthracis résistantes à la pénicilline.

dans les élevages bovins et dans les poulaillers pour prévenir et traiter des maladies respiratoires.

Contrôlez vos acquis Les agents antimicrobiens synthétiques sont sélectifs pour des Bacteria, des virus et des champignons. Les analogues de facteur de croissance tels que les sulfamides, l’isoniazide et les analogues d’acide nucléique sont les inhibiteurs métaboliques synthétiques. Les quinolones empêchent l’action de l’ADN gyrase chez les Bacteria. •

Définissez la notion de toxicité sélective.

•

Distinguez les agents chimiothérapeutiques synthétiques des antiseptiques et des désinfectants.

•

Décrivez l’action des analogues de facteur de croissance.

20.7 Molécules antimicrobiennes m n naturelles : les antibiotiques Les antibiotiques sont des composés antimicrobiens et sont plutôt des substances naturelles que synthétiques. Ils sont produits par un large éventail de micro-organismes fongiques et bactériens, et inhibent ou tuent d’autres micro-organismes. Un grand nombre d’antibiotiques a été identifié en milieu naturel, mais moins de 1 % sont médicalement utiles. Cependant, ceux qui le sont ont eu un impact déterminant sur le traitement des maladies infectieuses. Beaucoup d’antibiotiques naturels ont été structurellement modifiés en laboratoire pour augmenter leur efficacité formant la classe des antibiotiques semi-synthétiques. La production industrielle à grande échelle des antibiotiques sera discutée dans le chapitre 30.

Antibiotiques et toxicité antimicrobienne sélective La sensibilité des micro-organismes aux différents antibiotiques et autres agents chimiothérapeutiques est très diverse (voir figure 20.15). Les Bacteria Gram positif et les Bacteria Gram négatif peuvent différer dans leur sensibilité pour un antibiotique spécifique, alors que certains antibiotiques à large

spectre présentent la même efficacité sur ces deux groupes. Généralement, un antibiotique à large spectre trouve une utilisation médicale plus large qu’un antibiotique à spectre étroit. Cependant, un antibiotique présentant un spectre d’activité limité peut être tout à fait efficace pour contrôler le développement de micro-organismes ne répondant pas à d’autres antibiotiques. Par exemple, la vancomycine, antibiotique glycopeptidique à spectre étroit, est un agent bactéricide fortement efficace sur les Bacteria Gram positif résistantes à la pénicilline des genres Staphylococcus, Bacillus et Clostridium (voir figures 20.13, 20.14 et 20.15). Les cibles principales des antibiotiques chez les Bacteria sont les ribosomes (traduction), la paroi cellulaire, la membrane cytoplasmique, la réplication de l’ADN et la transcription (voir figure 20.14). Ici, nous discuterons des mécanismes des antibiotiques qui empêchent la synthèse des protéines et la transcription.

Les antibiotiques affectant la synthèse des protéines Beaucoup d’antibiotiques empêchent la synthèse de protéines par leur interaction avec les ribosomes (voir figure 20.14). Ces interactions sont relativement spécifiques, impliquant généralement l’ARNt. Plusieurs de ces antibiotiques sont médicalement utiles et plusieurs d’entre eux sont également des outils de recherche efficaces parce qu’ils bloquent spécifiquement différentes étapes de la synthèse des protéines (voir section 7.16). La streptomycine empêche l’initiation des chaînes de protéine, tandis que la puromycine, le chloramphénicol, le cycloheximide et la tétracycline empêchent leur élongation. Même lorsque deux antibiotiques empêchent la même étape dans la synthèse des protéines, les mécanismes d’inhibition peuvent être assez différents. Par exemple, la puromycine se fixe sur le site A du ribosome, et la chaîne polypeptide en cours d’élongation est transférée sur la puromycine à la place de l’extrémité 3’ des Aminoacyl ARNt (voir figures 7.37 et 7.38). Le complexe puromycine-peptide est alors libéré du ribosome, stoppant prématurément l’élongation. D’autre part, le chloramphénicol empêche l’élongation en bloquant la formation de liaisons peptidiques. Beaucoup d’antibiotiques inhibent spécifiquement les ribosomes des organismes pour seulement un ou deux groupes phylogénétiques. Le chloramphénicol et la streptomycine n’agissent que sur les ribosomes des Bacteria, alors que la cycloheximide n’affecte que les ribosomes des cellules des Eukarya. Cependant les mitochondries et des chloroplastes possèdent des ribosomes du type procaryote, et les antibiotiques qui empêchent la synthèse de protéine chez les Bacteria l’empêchent également chez ces organites (voir section 14.4). Plusieurs de ces antibiotiques, tels que la tétracycline, sont médicalement utiles parce que les mitochondries présentes dans les cellules eucaryotes ne sont pas affectées aux concentrations utilisées pour la thérapie antimicrobienne.

Les antibiotiques affectant la transcription Un certain nombre d’antibiotiques empêchent spécifiquement la transcription en bloquant la synthèse de l’ARN (voir section 7.10 et figure 20.14). Par exemple, la rifampine et les



20.8 Antibiotiques à cycle β-lactame : pénicillines et céphalosporines

Contrôlez vos acquis Les antibiotiques sont un groupe de composés antimicrobiens produits par une grande diversité de microorganismes, présentant de grandes variétés aux plans de leur composition et leur structure chimique. Bien que beaucoup d’antibiotiques soient connus, la plupart d’entre eux ne sont pas utilisés chez l’homme ou les animaux en raison de leur faible impact ou de leur toxicité. Beaucoup d’antibiotiques fonctionnent en empêchant la transcription ou la traduction dans les microorganismes de cible. •

Distinguez les antibiotiques des analogues de facteur de croissance.

•

Qu’est-ce qu’un antibiotique à large spectre ?

•

Identifiez les cibles potentielles pour les antibiotiques qui inhibent la synthèse et la transcription des protéines.

20.8 Antibiotiques à cycle β-lactame : m n pénicillines et céphalosporines Un des groupes d’antibiotiques les plus importants, historiquement et médicalement, est le groupe des antibiotiques à cycle β-lactame (ou β-lactamines), qui compte les composés médicalement importants que sont les pénicillines, les céphalosporines et les céphamycines. Ces antibiotiques ont en commun d’avoir une structure chimique caractéristique, le cycle β-lactame (voir figure 20.20). Les pénicillines et les céphalosporines représentent, ensemble, plus de la moitié de tous les antibiotiques produits et utilisés dans le monde entier (voir figure 20.16).

Les pénicillines En 1929, le scientifique anglais Alexander Fleming a caractérisé un composé antibactérien produit par la moisissure de Penicillium chrysogenum comme un antibiotique à cycle β-lactame, la pénicilline G (voir figure 20.20). La pénicilline G a été le premier antibiotique découvert et est devenue le premier antibiotique cliniquement efficace. Même avec l’utilisation des sulfamides, la plupart des maladies infectieuses n’étaient pas guérissables dans les années 1930. Cependant, en 1939, Howard Florey et ses collègues, incités par le commencement de la Seconde Guerre

H R—C—N — — O

H

6

— —

streptovaricines empêchent la synthèse d’ARN en se liant à la sous-unité β de l’ARN polymérase. Ces antibiotiques sont spécifiques des bactéries, des chloroplastes et des mitochondries. L’actinomycine empêche la synthèse d’ARN en se combinant avec l’ADN et en bloquant l’élongation d’ARN. L’actinomycine se fixe fortement à l’ADN au niveau des paires de base de guanine-cytosine, en se plaçant à l’ouverture des doubles brins où l’ARN est synthétisé. Certains des antibiotiques les plus utiles sont dirigés contre les dispositifs structuraux uniques des bactéries, tels que leurs parois cellulaires. Nous discuterons de ces antibiotiques et de leurs cibles dans la prochaine section.

O

Groupement N-Acyl

5

N 4

Cycle β-lactame

S H

703

CH3 2 3

CH3 COO–(Na+, K+)

H Cycle thiazolidine

Acide 6-Aminopenicillanique

Appellation

Groupe N-Acyl

Pénicilline naturelle Benzylpénicilline (pénicilline G)

—CH2—CO—

Activité contre les bactéries Gram positif, sensible aux β-lactamases

Pénicillines semi-synthétiques Méthicilline Acide stable, résistant aux β-lactamases

Oxacilline Acide stable, résistant aux β-lactamases

Ampicilline Large spectre d’activité (spécialement contre les bactéries Gram négatif) Acide stable, résistant aux β-lactamases

Carbénicilline Large spectre d’activité (spécialement contre Pseudomonas aeruginosa) Acide stable mais inefficace par voie orale, sensible aux β-lactamases

OCH3 —CO— OCH3 —CO— N

CH3

O

—CH—CO— NH2

D(–)

—CH—CO— COOH

FIGURE 20.20 Les pénicillines. La flèche rouge indique le site d’action de la plupart des β-lactamases.

mondiale, ont développé un procédé pour la production à grande échelle de la pénicilline. Le nouvel antibiotique était très efficace pour soigner les infections à staphylocoques et à pneumocoques parmi le personnel militaire et était plus actif que les sulfamides pour traiter les infections à streptocoques. Depuis 1945 et la fin de la deuxième guerre mondiale, la pénicilline est devenue disponible pour une utilisation généralisée, et les compagnies pharmaceutiques ont commencé à rechercher d’autres antibiotiques, menant à la découverte des médicaments qui ont révolutionné le traitement des maladies infectieuses. La pénicilline G est active principalement contre les Bacteria Gram positif, les Bacteria Gram négatifs étant imperméables à cet antibiotique. Cependant, beaucoup de pénicillines semi-synthétiques sont tout à fait efficaces contre les Bacteria Gram négatif. La figure 20.20 montre les structures chimiques de certaines de ces pénicillines. Les modifications de la structure de la pénicilline G changent de manière significative les propriétés de cet antibiotique. Par exemple, l’ampicilline et



704 Chapitre 20


la carbénicilline, pénicillines semi-synthétiques, sont efficaces contre quelques Bacteria Gram négatif. Les différences structurales de ces pénicillines semi-synthétiques au niveau des groupements N-acyle leur permettent d’être transportées à l’intérieur de la membrane externe des Bacteria Gram négatif (voir section 4.9) où elles empêchent la synthèse de la paroi cellulaire. Notez également que la pénicilline G est sensible à la β-lactamase (pénicillinase), une enzyme produite par un certain nombre de bactéries résistantes à la pénicilline (voir section 20.12). Les pénicillines semi-synthétiques, l’oxacilline et la méthicilline sont sensibles à la β-lactamase.

Les mécanismes d’action Les antibiotiques à cycle β-lactame (ou β-lactamines) sont des inhibiteurs efficaces de la synthèse de la paroi cellulaire. Un dispositif important de la synthèse de la paroi cellulaire est l’action de la transpeptidase, qui a comme conséquence la formation de la liaison entre deux chaînes de peptidoglycanes (voir figure 6.5). Ces enzymes, transpeptidases, sont capables de se fixer à la pénicilline ou à d’autres antibiotiques à cycle β-lactame. Ainsi, ces transpeptidases sont connues comme protéines fixant la pénicilline (PBP ou penicillin binding proteins). Quand ces transpeptidases se fixent à la pénicilline, elles perdent leur activité catalytique, mais la paroi cellulaire continue à être formée. Cependant la paroi nouvellement synthétisée n’est plus réticulée et perd ainsi son rôle de structure. En outre, le complexe antibiotique-PBP stimule la production d’autolysines qui digèrent la paroi cellulaire. Le résultat de ces mécanismes est une paroi cellulaire affaiblie et s’autodégradant (voir sections 4.8 et 6.3). Cela amène, dans des conditions normales, à la lyse de la cellule due à la différence de pression osmotique entre l’intérieur et l’extérieur de la bactérie. En revanche, la vancomycine, un glycopeptide (voir figure 20.13), ne se lie pas au PBP, mais directement à la partie D-alanyl-D-alanine terminale du peptide précurseur du peptidoglycane (voir section 6.3 et figure 6.5), bloquant la réaction de la transpeptidase. Puisque la paroi cellulaire et ses mécanismes de synthèse sont spécifiques des Bacteria, les antibiotiques à cycle β-lactame ont une sélectivité très élevée et ne sont pas toxiques pour les cellules hôtes. Cependant, en raison de la structure complexe de ces antibiotiques, certaines personnes développent des allergies à certains de ces composés au cours de thérapies antibiotiques répétées (voir section 22.15).

Les céphalosporines Les céphalosporines sont un autre groupe d’antibiotiques cliniquement importants qui contiennent le cycle β-lactame. La céphalosporine est produite par des champignons de l’espèce Cephalosporium sp. (voir section 30.6). Les céphalosporines diffèrent structurellement des pénicillines. Elles possèdent le cycle β-lactame mais présentent un cycle dihydrothiazine composé de six atomes au lieu d’un cycle de thiazolidine à cinq atomes. Les céphalosporines ont le même mode d’action que les pénicillines, se liant irréversiblement au PBP et empêchant la synthèse du peptidoglycane. Médicalement importantes, les céphalosporines sont des antibiotiques semi-synthétiques ayant un spectre d’activité antibiotique plus large que les pénicillines. En outre, elles sont généralement plus résistantes aux β-lactamases (pénicillinase), enzymes qui détruisent les cycles β-lactame (mais qui sont sensibles aux céphalosporinases). Par exemple, la

ceftriaxone (voir figure 20.13), qui présente de fortes résistances à ces enzymes, a remplacé la pénicilline pour le traitement des infections dues à Neisseria gonorrhoeae (voir sections 20.12 et 26.12), parce que beaucoup de souches de N. gonorrhoeae sont devenues résistantes à la pénicilline.

Contrôlez vos acquis Les composés à cycle β-lactame, comprenant les pénicillines et les céphalosporines, sont les antibiotiques cliniques les plus importants. Ces antibiotiques agissent sur la synthèse de la paroi cellulaire des bactéries. Ils ont une faible toxicité pour les cellules hôtes et présentent un large spectre d’activité. •

Dessinez la structure du cycle β-lactame et indiquez le site d’action des β-lactamases.

•

Quelle est l’action des antibiotiques à cycle β-lactame.

•

Quels avantages présentent les céphalosporines par rapport aux pénicillines pour traiter des infections dues aux Bacteria Gram négatif ?

20.9 Antibiotiques produits m n par les procaryotes Beaucoup d’antibiotiques actifs contre des Bacteria sont également produits par des Bacteria. Parmi ceux-ci, les aminoglycosides, les macrolides et les tétracyclines. Plusieurs de ces antibiotiques trouvent des applications cliniques importantes ; leurs propriétés générales sont présentées dans ce chapitre.

Les aminoglycosides Les antibiotiques aminoglycosides (ou aminosides) contiennent des sucres aminés reliés par des liaisons glycosidiques (voir section 3.3) à d’autres sucres aminés. Cliniquement utiles, les aminoglycosides regroupent la streptomycine (produite par Streptomyces griseus) [voir figure 20.13] et ses dérivés, la kanamycine (voir figure 20.21), la néomycine, la gentamicine, la tobramycine, la netilmycine, la spectinomycine et l’amikacine. Les aminoglycosides empêchent la synthèse des protéines au niveau de la sousunité 30S du ribosome (voir figure 20.14) et sont utilisés comme médicaments contre les Bacteria Gram négatif (voir figure 20.15). La streptomycine a été le premier antibiotique efficace pour le traitement de la tuberculose. Cependant, aucun des antibiotiques de type aminoglycoside n’est plus aujourd’hui employé couramment, et les aminoglycosides ne représentent qu’environ 3 % des antibiotiques produits et utilisés (voir figure 20.16). La streptomycine, en raison d’effets secondaires sérieux tels que la neurotoxicité et la néphrotoxicité (toxicité rénale), a été supplantée par plusieurs antimicrobiens synthétiques pour le traitement de la tuberculose. La résistance bactérienne à cette classe d’antibiotique se développe également aisément. L’utilisation des aminoglycosides pour le traitement des infections à bactéries Gram négatif a diminué depuis le développement des pénicillines semisynthétiques (voir section 20.8) et des tétracyclines (voir plus loin



20.9 Antibiotiques produits par les procaryotes

705

Les tétracyclines

N-acétyltransférase H2C—NH2

NH2

O

NH2

OH

OH

O

HO OH

CH2OH

O

O

HO

NH2 OH

FIGURE 20.21 Kanamycine, un antibiotique aminoglycoside. Les amino glucides sont en jaune. Le site de modification sur lequel agit une N-acétyltransférase, codé par un plasmide de résistance, est indiqué (section 20.12). Après l’acétylation, l’antibiotique est inactivé.

dans cette section). Ces antibiotiques, du fait de leur toxicité, sont réservés pour les infections graves, administrés par voie injectable en association avec les β-lactamines (effet synergique).

Les macrolides Les antibiotiques macrolides tels que l’érythromycine contiennent de grands cycles lactone reliés aux molécules de sucre (voir figure 20.22). Les variantes, à la fois des cycles macrolides et des sucres associés, créent une grande variété d’antibiotiques macrolides. Le plus connu est l’érythromycine (produite par Streptomyces erythreus). D’autres macrolides cliniquement utilisés incluent la dirithromycine, la clarithromycine et l’azithromycine. Les macrolides représentent 11 % de la production et de l’utilisation mondiale des antibiotiques (voir figure 20.16). L’érythromycine est un inhibiteur de synthèse de protéine au niveau de la sous-unité 50S du ribosome (voir figure 20.14). Elle est utilisée généralement en remplacement de la pénicilline pour les patients allergiques à celle-ci ou à d’autres antibiotiques à cycle β-lactame et a été particulièrement utilisée pour le traitement de la légionellose (voir section 28.7).

Les tétracyclines, produites par plusieurs espèces du genre Streptomyces (section 30.6), forment un groupe important d’antibiotiques qui sont très utilisés comme médicament pour l’homme. Elles étaient les premiers antibiotiques à large spectre, inhibant presque toutes les Bacteria Gram positif et Gram négatif. La structure de base des tétracyclines se compose d’un cycle naphthacène (voir figure 20.23). Les groupements présents sur la structure du cycle naphthacène peuvent être substitués en plusieurs endroits pour former de nouveaux analogues de tétracycline. La chlortétracycline, par exemple, a un atome de chlore, tandis que l’oxytétracycline n’a qu’un groupe additionnel sur l’hydroxyle (OH) et aucun chlore. Ces trois tétracyclines sont produites naturellement, mais des tétracyclines semi-synthétiques ayant des substitutions dans le cycle naphthacène ont été également développées. Comme l’érythromycine et les aminoglycosides, la tétracycline est un inhibiteur de synthèse des protéines, interférant avec la fonction ribosomique de la sous-unité 30S (voir figure 20.14). Les tétracyclines, avec les antibiotiques à cycle β-lactame, constituent les deux groupes les plus importants des antibiotiques dans le domaine médical. Les tétracyclines sont aussi utilisées couramment en médecine vétérinaire et sont employées dans quelques pays en tant que suppléments alimentaires dans les élevages de volailles et de porcs. Les recours élargis à des applications non médicales des antibiotiques ont contribué largement à l’expansion des résistances bactériennes aux antibiotiques et, de ce fait, sont maintenant découragés (voir section 20.12).

La daptomycine La daptomycine est un autre antibiotique produit par une bactérie du genre Streptomyces. Ce nouvel antibiotique est un lipopeptide cyclique avec un mode d’action unique (voir figure 20.14). Utilisée principalement pour traiter des infections à Bacteria Gram positif telles que les staphylocoques et les streptocoques pathogènes, la daptomycine se fixe aux membranes bactériennes de cellules et induit la dépolarisation rapide du potentiel de membrane. La cellule dépolarisée perd sa capacité à synthétiser des macromolécules telles que les acides nucléiques et les protéines,

H3C R4

N

R2 R3 R1 H

CH3 OH

Cycle macrolide O H3C HO

HO

N

H3C

CH3 O

O

CH3 O

OH

HO CH3 O

OH H3C H2C

CH3

H3C

CH3

H3C

O

OH OH O

CO NH2

O

CH3

Analogue de la tétracycline

R1

R2

R3

R4

O

CH3

Tétracycline

H

OH

CH3

H

7-Chlortétracycline (auréomycine)

H

OH

CH3

Cl

5-Oxytétracycline (terramycine)

OH

OH

CH3

H

OH OCH3

FIGURE 20.22 Érythromycine, un antibiotique macrolide. L‘érythromycine est un antibiotique à large spectre couramment employé.

FIGURE 20.23 Tétracycline. Les analogues semi-synthétiques de la tétracycline sont d’importants antibiotiques.



706 Chapitre 20


ce qui entraîne sa mort. En raison de ce mécanisme de fixation unique à la membrane, il n’y a aucun processus identifiable et transmissible de résistance.

Contrôlez vos acquis Les aminoglycosides, les macrolides et les tétracyclines sont structurellement des molécules complexes produites par les bactéries et sont actives contre d’autres bactéries. Tous ces antibiotiques agissent par interférence avec la synthèse de protéine. La daptomycine est un antibiotique nouveau qui dépolarise la membrane de la cellule. •

Quelles sont les origines biologiques des aminoglycosides, des tétracyclines, des macrolides et de la daptomycine ?

•

Comment chaque classe d’antibiotiques agit-elle pour inhiber les bactéries ?

IV

CONTRÔLE DES VIRUS PATHOGÈNES DES ORGANISMES EUCARYOTES

Les molécules qui contrôlent la croissance des virus pathogènes des organismes eucaryotes comme les champignons affectent également toutes les cellules hôtes eucaryotes. En conséquence, il est très difficile d’avoir une toxicité sélective limitée aux microbes pathogènes des eucaryotes ; seuls les agents chimiothérapeutiques affectant préférentiellement des voies métaboliques spécifiques ou des composants structuraux des microbes pathogènes sont utiles. Il y a donc un nombre restreint de ces composés utilisables, dont nous allons discuter le mode d’action de certains.

20.10 Molécules antivirales m n Les succès thérapeutiques obtenus avec les agents antiviraux contre les virus ne sont pas identiques aux effets des agents antibactériens contre les bactéries parce que les virus utilisent leurs hôtes, les cellules eucaryotes, pour se reproduire et exécuter leurs fonctions métaboliques (voir chapitre 9). La plupart des molécules qui contrôlent les virus visent également des structures des cellules hôtes et ainsi sont toxiques pour elles. Cependant, le choix de ces agents est conditionné par une plus grande toxicité pour le virus que pour les cellules hôtes, voire pas de toxicité cellulaire. En grande partie en raison des efforts faits pour trouver des mesures efficaces de contrôler le virus de l’immunodéficience humaine (VIH), l’agent responsable du SIDA (voir section 26.14), des résultats significatifs ont été obtenus dans le contrôle des virus par les agents chimiques.

Les agents chimiothérapeutiques antiviraux Les agents les plus efficaces et les plus utilisés pour la chimiothérapie antivirale sont les analogues de nucléoside (voir tableau 20.5). Le premier composé universellement reconnu depuis 1988 dans cette catégorie est la zidovudine, ou azidothymidine (AZT). L’AZT inhibe les rétrovirus tels que le VIH

(voir figure 26.38). Elle est chimiquement proche de la thymidine mais en diffère car le groupement 3’-hydroxyle est remplacé par un groupement azoture. L’AZT inhibe la multiplication des rétrovirus en bloquant la rétrotranscription et la croissance de l’ADN proviral. Ce processus empêche la multiplication du virus VIH. Un certain nombre d’autres analogues de nucléoside ayant des mécanismes semblables ont été développés pour le traitement contre le virus VIH et d’autres virus présentés dans le tableau 20.5. Presque tous les analogues de nucléoside, ou inhibiteurs nucléosidiques de la transcriptase inverse (NRTI, pour nucleoside reverse transcriptase inhibitors), utilisent le même mécanisme par inhibition de l’élongation de la chaîne virale d’acide nucléique par une ADN polymérase après leur phosphorylation dans la cellule hôte. Le ténofovir, analogue de nucléotide, fonctionne de la même manière, mais directement sans phosphorylation (voir tableau 20.5). Puisque la fonction normale de la réplication de l’ADN des cellules est visée, ces drogues induisent habituellement un niveau de toxicité pour la cellule hôte. Beaucoup de nucléosides inhibiteurs de la transcriptase inverse (NRTI) perdent leur potentiel antiviral par l’apparition au cours du temps de virus résistant à ces molécules (voir section 26.14). Plusieurs autres agents antiviraux visent la transcriptase inverse. La névirapine, un inhibiteur non nucléosidique de la transcriptase inverse (NNRTI, pour non nucleoside reverse transcriptase inhibitors), se fixe directement sur la transcriptase inverse et inhibe son action. L’acide phosphonoformique est un analogue du pyrophosphate inorganique qui empêche les liaisons entre les nucléotides, inhibant la synthèse des acides nucléiques viraux. Comme avec les NRTI, les NNRTI induisent généralement un certain niveau de toxicité parce que leur action affecte également la synthèse normale d’acide nucléique de la cellule hôte. Une nouvelle classe de molécules a été décrite en 1995, les inhibiteurs de protéases (PI, pour protease inhibitors) et a montré des propriétés antivirales (voir tableau 20.5 et figure 20.28). Ces molécules sont particulièrement efficaces pour le traitement du virus VIH. Elles empêchent la maturation virale en se liant à l’emplacement actif de la protéase du virus VIH, empêchant la synthèse des polypeptides viraux et l’encapsidation du virus (voir sections 20.13 et 26.15). Une dernière catégorie de molécules anti-VIH est représentée par une molécule, l’enfuvirtide, un inhibiteur de fusions, peptide synthétique de trente-six acides aminés, qui se fixe à la protéine membranaire gp41 du virus VIH (voir tableau 20.5 et section 26.14). La fixation de la protéine bloque les changements conformationnels nécessaires à la fusion du virus et des membranes cellulaires des lymphocytes T CD4 cibles.

Les agents antiviraux des virus de la grippe Deux catégories de molécules limitent efficacement les infections de la grippe. Dérivées de l’adamantane, l’amantadine et la rimantadine sont des amines synthétiques qui interfèrent avec la protéine virale M2 et bloqueraient son activité canal ionique nécessaire aux mécanismes de fusion et de désassemblage de la particule virale après son endocytose par la cellule ciblée par le virus. L’acidification à l’intérieur du virion n’ayant plus lieu, la protéine de matrice M1 et les ribonucléoparticules



20.10 Molécules antivirales 707

TABLEAU 20.5

COMPOSÉS CHIMIOTHÉRAPEUTIQUES ANTIVIRAUX

Catégorie/molécule

Mécanisme d’action

Virus affecté

Inhibiteur de fusion Bloque la fusion entre VIH et la membrane des lymphocytes T

VIHa

Induit des protéines qui inhibent la réplication virale

Large spectre (hôte spécifique)

Oseltamivir

Bloque le site actif de la neuraminidase

Grippes A et B

Zanamivir

du virus de la grippe

Grippes A et B

Enfuvirtide Interférons Interféron α Interféron β Interféron γ Inhibiteurs de neuraminidase

Inhibiteur non nucléosidique de la transcriptase inverse (NNRTI) Névirapine

Inhibiteur de la transcriptase inverse

VIH

Inhibiteurs de la polymérase virale

Virus de l’herpès, Varicella zoster

Analogues nucléosides Acyclovir Ganciclovir

Cytomégalovirus

Trifluridine

Virus de l’herpès

Valacyclovir

Virus de l’herpès

Vidarabine

Virus de l’herpès, virus vaccine, virus de l’hépatite B

Abacavir (ABC)


VIH

Didanosine (dideoxyinosine ou ddI)

VIH

Emtricitabine (FTC)

VIH

Lamivudine (3TC)

VIH, virus de l’hépatite B

Stavudine (d4T)

VIH

Zalcitabine (ddC)

VIH

Zidovudine (AZT) (voir figure 26.38)

VIH

Ribavirin

Bloque la capsule de l’ARN viral

Virus respiratoire syncytial, virus des grippes A et B, fièvre de Lassa

Cidofovir

Inhibiteur de la polymérase virale

Cytomégalovirus, virus de l’herpès

Tenofovir (TDF)


VIH

Inhibiteur de la protéase virale

VIH

Analogues nucléotides

Inhibiteurs de protéase Amprenavir Indinavir (voir figure 20.28)

VIH

Lopinavir

VIH

Nelfinavir

VIH

Saquinavir (voir figure 20.28)

VIH

Analogue du pyrophosphate Acide phosphonoformique (Foscarnet)

Inhibiteur de la polymérase virale

Virus de l’herpès, VIH, virus de l’hépatite B

Inhibiteur de l’ARN polymérase

Virus vaccine, poxvirus

Inhibiteur de décapsidation virale

Grippe A

Inhibiteur de l’ARN polymérase Rifamycine Amines synthétiques Amantadine Rimantadine a

Grippe A

Virus immunodéficitaire humain.



708 Chapitre 20


ne se dissocieraient plus : ces dernières resteraient alors fixées aux membranes lysosomiales après fusion des membranes, bloquant le cycle viral. Les inhibiteurs de neuraminidase l’oseltamivir et le zanamivir bloquent l’emplacement actif de la neuraminidase chez les virus A et B de la grippe. En inhibant l’hydrolyse de l’acide sialique au niveau des glycoprotéines cellulaires, ils empêchent la libération des particules virales de la surface des cellules infectées. Ces dernières molécules sont les plus employées en traitement curatif et prophylactique des infections de la grippe, les dérivés de l’adamantane, dotés d’un plus haut niveau de résistance, étant réservés en cas d’endémie (voir section 26.8).

L’interféron Les interférons sont des protéines de faible poids moléculaire (17 000 MW) qui empêchent la multiplication virale en stimulant la production des protéines antivirales dans les cellules normales. Les interférons des cellules infectées par les virus interagissent avec des récepteurs sur les cellules non infectées, favorisant la synthèse des protéines antivirales qui agissent pour empêcher de nouvelles infections de virus. Les interférons sont des cytokines et sont produits sous trois formes moléculaires : IFN-α est produit par des leucocytes, IFN-β est produit par des fibroblastes et IFN-γ est produit par les lymphocytes immunisés (voir section 23.11). Chacune des trois formes est un inhibiteur antiviral efficace. Les études des interférences entre virus, un phénomène où l’infection par un virus interfère avec une infection ultérieure due à un autre virus, ont permis d’identifier plusieurs petites protéines intervenant dans ces interférences. Ces protéines, appelées depuis interférons, sont formées en réponse aux virus vivants, aux acides nucléiques viraux et aux virus inactivés par rayonnement. L’interféron est produit en grande quantité par les cellules infectées par des virus de faible virulence, mais il l’est peu contre les virus fortement virulents. Ces derniers empêchent apparemment la synthèse cellulaire des protéines avant que l’interféron puisse être produit. L’interféron est également induit par une variété de molécules d’ARN double brin (ARNdb), normal ou synthétique. Naturellement, les ARN doubles brins n’existent que sous la forme réplicative dans les cellules infectées par certains virus à ARN tels que des rhinovirus (virus froids) [voir sections 16.10 et 26.8]. L’ARN double brin signale apparemment l’infection virale dans la cellule animale et stimule la production d’interféron. L’activité de l’interféron est plus hôte-spécifique que virusspécifique. L’interféron produit par une espèce reconnaît spécifiquement les récepteurs des cellules de la même espèce. En conséquence, l’interféron produit par les cellules d’un animal en réponse à un rhinovirus peut également empêcher la multiplication des virus grippaux dans les cellules de la même espèce, mais il n’a aucun effet sur la multiplication d’un quelconque virus dans les cellules d’autres espèces animales. Les interférons ont un potentiel possible en tant qu’agents antiviraux et anticancéreux. Il y a maintenant plusieurs combinaisons approuvées de préparations d’interféron disponibles. Cependant, l’utilisation des interférons en tant qu’agents chimiothérapeutiques généraux n’est pas répandue parce que l’interféron doit être délivré localement à de fortes concentrations pour stimuler la production des protéines antivirales

dans les cellules hôtes non infectées. Ainsi, l’utilité clinique de ces agents antiviraux dépend de la capacité à délivrer l’interféron localement dans la cellule hôte par des injections ou des aérosols, mais aussi de la tolérance individuelle, cette molécule étant très difficilement tolérée à forte dose. Par contre l’interféron alpha associé à la ribavirine est le traitement majeur de l’hépatite C, avec 50 % de guérison après 6 à 12 mois. De manière alternative, les signaux interféron-stimulant spécifiques (c’est-à-dire la stimulation par des nucléotides viraux, des virus non virulents ou même des nucléotides synthétiques) donnés aux cellules hôtes avant l’infection virale pourraient réaliser cet objectif.

Contrôlez vos acquis Les agents antiviraux efficaces doivent viser les enzymes spécifiques des virus et les mécanismes de synthèse. Cliniquement, les agents antiviraux efficaces incluent les analogues de nucléoside et d’autres molécules qui inhibent l’acide nucléique polymérase et la réplication du génome viral. Les agents tels que les inhibiteurs de protéase interfèrent avec les étapes virales de maturation. Les cellules hôtes produisent également les protéines antivirales, comme l’interféron, qui arrêtent la réplique virale. •

Pourquoi y a-t-il relativement peu d’agents chimiothérapeutiques antiviraux efficaces ?

•

Pourquoi de tels agents ne sont-ils pas employés pour traiter des maladies virales communes telles que les rhumes ?

•

Quelles étapes dans le procédé viral de maturation sont empêchées par des analogues de nucléoside ? par des inhibiteurs de protéase ? par des interférons ?

20.11 Molécules antifongiques m n Comme les virus, les champignons posent des problèmes en chimiothérapie. Puisque les champignons sont des Eukarya, beaucoup de leurs métabolismes cellulaires sont communs aux animaux et aux humains. Ainsi, les agents chimiothérapeutiques qui affectent des voies métaboliques dans les champignons affectent également des voies métaboliques identiques dans les cellules hôtes, conséquence de la toxicité de ces agents. Pour cette raison, beaucoup de molécules antifongiques ne peuvent être employées que pour des applications locales extérieures. Cependant, quelques molécules sont toxiques spécifiquement pour des champignons parce qu’elles visent les structures fongiques ou les processus métaboliques spécifiques de ces organismes. Les molécules pour les traitements antifongiques deviennent de plus en plus importantes parce que les infections fongiques chez les individus immunodéprimés deviennent plus répandues (voir sections 26.14 et 27.8). Nous allons voir en détail la toxicité spécifique de plusieurs classes de molécules efficaces contre les champignons.



20.11 Molécules antifongiques

TABLEAU 20.6

709

AGENTS ANTIFONGIQUES

Catégorie

Cible

Exemples

Utilisation

Allylamines

Synthèse de l’ergostérol

Terbinafine

Orale, locale

Antibiotique aromatique

Inhibiteur de mitoses

Griséofulvine

Orale

Azoles


Clortrimazole

Locale

Fluconazole

Orale

Itraconazole

Orale

Kétoconazole

Orale

Miconazole

Locale

Posoconazole

Expérimentale

Ravuconazole

Expérimentale

Voriconazole

Orale

Inhibiteur de la synthase de la chitine

Synthèse de la chitine

Nikkomycine Z

Expérimentale

Échinocandines

Synthèse de la paroi cellulaire

Caspofungine

Intraveineuse

Analogues d’acides nucléiques

Synthèse de l’ADN

5-Fluorocytosine

Orale

Polyènes


Amphotéricine B

Orale, intraveineuse

Nystatine

Orale, locale

Polyoxines

Synthèse de la chitine

Polyoxine A

Agricole

Polyoxin B

Agricole

Les inhibiteurs de l’ergostérol Dans les membranes des cellules fongiques, l’ergostérol remplace le cholestérol des membranes cytoplasmiques des cellules eucaryotes des espèces supérieures (voir section 4.5). Deux groupes de composés antifongiques fonctionnent soit par interaction avec l’ergostérol, soit en inhibant sa synthèse (voir tableau 20.6). Un premier groupe inclut les polyènes, des antibiotiques produits par des bactéries du genre Streptomyces. Les polyènes se fixent à l’ergostérol, perturbant la membrane, entraînant sa perméabilité et la mort de la cellule (voir figure 20.24). Un deuxième groupe de composés antifongiques inclut les azoles et les allylamines. Ces agents synthétiques empêchent spécifiquement la biosynthèse de l’ergostérol, ce qui leur apporte une large activité antifongique. Le traitement avec les azoles a pour conséquence l’incapacité des champignons à produire une membrane normale, amenant une dégradation de celle-ci et une altération des transports membranaires. Les allylamines empêchent également la biosynthèse de l’ergostérol, mais sont limitées à des utilisations spécifiques parce qu’elles ne sont pas aisément assimilées par les cellules animales et les tissus.

Les échinocandines Les échinocandines sont une nouvelle classe de molécules antifongiques (voir tableau 20.6). Elles agissent en empêchant l’activité de la 1.3 β-D glucane synthase, enzyme qui synthétise les polymères de ce glucane formant la paroi des cellules (voir figure 20.24). Puisque les cellules des mammifères ne possèdent pas de 1.3 β-D glucane synthase, l’action de ces agents est spécifique, amenant la mort rapide des cellules fongiques. Ces agents sont employés pour traiter des infections avec des mycoses à candida et sont actifs contre quelques champignons qui sont résistants à d’autres agents (voir sections 26.14 et 27.8.).

Fonction des membranes : les polyènes se fixent à l’ergostérol et perturbent l’intégrité de la membrane

Synthèse de la paroi cellulaire : les polyoxines inhibent la synthèse de la chitine. Les échinocandines inhibent la synthèse des glucanes Synthèse de l’ergostérol : azolés et allylamines inhibent la synthèse

Synthèse des acides nucléiques : la 5-fluorocytosine est un analogue de nucléotide qui inhibe la synthèse des acides nucléiques

Formation de microtubes : la griséofulvine perturbe l’agrégation des microtubes durant la mitose

FIGURE 20.24 Sites d’action d’agents chimiothérapeutiques antifongiques. Les cellules des moisissures étant eucaryotes, les antibiotiques sont généralement inopérants.

Les autres agents antifongiques D’autres molécules antifongiques interfèrent avec les structures et les fonctions spécifiques des champignons (voir tableau 20.6). Les parois des cellules fongiques contiennent de la chitine, un polymère de N-acetylglucosamine trouvé



710 Chapitre 20


seulement chez les champignons et les insectes (voir tableau 17.9). Plusieurs polyoxines empêchent la synthèse de la paroi cellulaire par interférence avec la biosynthèse de la chitine. Les polyoxines sont employées couramment en tant que fongicides agricoles, mais ne sont pas utilisées médicalement. D’autres molécules empêchant la biosynthèse de l’acide folique interfèrent avec la configuration de l’ADN pendant la réplication ou, comme la griséofulvine, perturbent l’agrégation des microtubules pendant la mitose (voir la section 14.7). La fluorocytosine pénètre dans le cytoplasme fongique par une cytosine perméase, puis se transforme en 5-fluoro-uracile qui se substitue à l’uracile dans la synthèse des ARN, amenant le blocage de la synthèse protéique. La spécificité d’action sur les cellules fongiques est due à la spécificité de la cytosine perméase, qui n’existe pas chez les mammifères. D’autres molécules antifongiques très efficaces ont également d’autres applications biologiques. Par exemple, la vincristine, la vinblastine et le taxol sont des agents antifongiques efficaces qui sont également connus pour des propriétés anticancéreuses. Malheureusement, l’utilisation des drogues antifongiques a eu comme conséquence l’apparition de populations de champignons résistantes et de nouveaux micro-organismes pathogènes fongiques. Par exemple, les espèces Candida, qui ne sont pas habituellement pathogènes, sont responsables maintenant de maladies chez les individus immunodéprimés, traités avec des médicaments antifongiques ; plusieurs souches de Candida pathogènes sont devenues résistantes à tous les agents antifongiques actuellement utilisés.

Contrôlez vos acquis Les agents antifongiques appartiennent à une grande variété de catégories de composés chimiques. Puisque les champignons sont des organismes eucaryotes, il est difficile d’obtenir une toxicité sélective, mais quelques agents chimiothérapeutiques efficaces sont disponibles. Le traitement des infections fongiques est une question émergente en santé humaine. •

Pourquoi y a-t-il très peu d’antibiotiques antifongiques médicalement efficaces ?

•

Quels facteurs contribuent à l’augmentation apparente des infections fongiques ?

V

RÉSISTANCES AUX MOLÉCULES ANTIMICROBIENNES ET DÉCOUVERTES DE NOUVELLES MOLÉCULES

Les résistances antimicrobiennes aux molécules constituent un problème important lorsqu’elles concernent des microorganismes pathogènes, particulièrement dans des établissements de soins. Nous explorerons dans cette partie certaines des raisons expliquant les résistances des micro-organismes aux molécules antimicrobiennes et nous présenterons les stratégies pour le développement de nouveaux agents antimicrobiens. Les méthodes pratiques pour préserver et augmenter l’efficacité des molécules antimicrobiennes actuellement utilisées sont présentées dans le focus « Prévention des résistances aux molécules antimicrobiennes ».

20.12 Résistance aux molécules m n antimicrobiennes La résistance aux molécules antimicrobiennes est la capacité acquise d’un micro-organisme à résister aux effets d’un agent chimiothérapeutique pour lequel il est normalement sensible. La résistance antimicrobienne aux molécules ne dépend pas de la cellule hôte, mais des micro-organismes qui y résident. Comme nous en avons discuté, les producteurs d’antibiotiques sont des micro-organismes, et les mécanismes de résistance ont été développés par ces micro-organismes pour neutraliser ou détruire leurs propres antibiotiques afin de survivre. En outre, des gènes codant ces mécanismes de résistance peuvent être transférés à d’autres micro-organismes associés naturellement. En conséquence, la plupart des résistances antimicrobiennes aux molécules impliquent que les gènes de résistance soient transférés entre micro-organismes par échange génétique.

Les mécanismes de résistance Aucun antibiotique n’inhibe l’ensemble des micro-organismes et quelques micro-organismes sont naturellement résistants à certains antibiotiques. Il y a plusieurs raisons pour lesquelles un micro-organisme peut avoir une résistance naturelle à un antibiotique. 1) Le micro-organisme peut ne pas posséder la structure ciblée par l’antibiotique. Par exemple, certaines bactéries, telles que les mycoplasmes, ne possèdent pas de paroi bactérienne typique et sont résistantes aux pénicillines. 2) Le microorganisme peut être imperméable à l’antibiotique. Ainsi, la plupart des Bacteria Gram négatif sont imperméables à la pénicilline G. 3) Le micro-organisme peut modifier la structure chimique de l’antibiotique en une forme inactive. Beaucoup de staphylocoques contiennent des β-lactamases qui peuvent couper le cycle β-lactame de la plupart des pénicillines (voir figure 20.25). 4) Le micro-organisme peut modifier la cible de l’antibiotique. Par exemple, Streptococcus pneumoniae est susceptible de modifier l’affinité de ses PLP, qui confère des niveaux variables de résistance aux pénicillines. 5) Le microorganisme peut développer une voie biochimique résistante. Par exemple, de nombreux microbes pathogènes développent la résistance aux molécules de sulfonamide (voir section 20.6 et figure 20.17), empêchant la production d’acide folique chez les Bacteria. Les Bacteria résistantes modifient leur métabolisme pour assimiler l’acide folique présent dans l’environnement, évitant l’utilisation de la voie métabolique bloquée par des sulfonamides. 6) Le micro-organisme peut être capable de relarguer un antibiotique entré dans la cellule (mécanisme d’efflux), comme décrit dans la multirésistance de Pseudomonas aeruginosa à de nombreux antibiotiques. Quelques exemples spécifiques de résistance bactérienne aux antibiotiques sont montrés dans le tableau 20.7. Comme nous l’avons vu dans les sections 10.9 et 10.10, la résistance aux antibiotiques peut être génétiquement codée par le micro-organisme au niveau chromosomique ou plasmidique sur des plasmides de résistance (facteurs R). Les types spécifiques de résistance ont caractéristiquement une base génétique codée sur le chromosome ou sur le plasmide (voir tableau 20.7). En raison du développement de la résistance aux antibiotiques, des bactéries isolées d’échantillons cliniques doivent être testées



20.12 Résistance aux molécules antimicrobiennes 711

TABLEAU 20.7

MÉCANISMES DE RÉSISTANCE BACTÉRIENNE AUX ANTIBIOTIQUES Exemple d’antibiotique

Mécanisme de résistance

Origine génétique de la résistance

Mécanisme présent chez :

Réduction de la perméabilité

Pénicillines

Chromosomes

Pseudomonas aeruginosa Bactéries entériques

Inactivation des antibiotiques (par exemple, pénicillinase ; enzymes modifiées méthylases, acétylases, tels que phosphorylases ; autres)

Pénicillines

Plasmides et chromosomes

Staphylococcus aureus Bactéries entériques Neisseria gonorrhoeae

Chloramphénicol

Plasmides et chromosomes

Staphylococcus aureus Bactéries entériques

Aminoglycosides

Plasmides


Modification de la cible (par exemple, ARN polymérase, rifamycine ; ribosome, érythromycine et streptomycine ; ADN gyrase, quinolones)

Érythromycine

Chromosomes


Développement de résistance des voies métaboliques

Sulfonamides

Chromosomes

Excrétion (pompage vers l’extérieur de la cellule)

Tétracyclines

Plasmides

Bactéries entériques

Chloramphénicol

Chromosomes


Rifamycine


Streptomycine


Norfloxacine

Bactéries entériques Staphylococcus aureus Bactéries entériques Staphylococcus aureus

Bacillus subtilis Érythromycine

NH H2NC

H N

H N CNH2

OH

O

O

OH

H3C CHO Streptomycine HO

HO

Staphylococcus spp.

pour évaluer leur sensibilité aux antibiotiques en déterminant la concentration minimale inhibitrice (CMI) utilisant une méthode de diffusion en gélose (voir la section 20.4 et les figures 20.10 et 20.11). Les détails de la détermination des sensibilités aux antibiotiques des micro-organismes isolés de prélèvements sont décrits dans la section 24.3. En conditions de laboratoire, les cellules résistantes aux antibiotiques sont souvent isolées de cultures globalement sensibles aux antibiotiques. La résistance de ces isolats est habituellement due à des mutations génétiques. Dans la plupart des cas, la résistance aux antibiotiques obtenue par mutation génétique résulte d’une modification de la cible de l’activité.

NH

HO

Chromosomes

O O

Mécanisme de résistance, les plasmides R RNH

H3C

S

CH3 CH3 COOH

HN O

N

OH

Pénicilline β-lactamase

Phosphorylation Adénylation

O C

H O2N

H

N H

C

C

C

CHCl2 OH

HO H H

Chloramphénicol

La plupart des bactéries, résistantes aux molécules antibactériennes, isolées chez des patients, contiennent des gènes de résistance situés sur des plasmides R (résistance), plutôt que sur le chromosome (voir section 10.10). La résistance liée aux plasmides R est habituellement due à la présence, sur ce plasmide R, de gènes codant soit de nouvelles enzymes qui inactivent la molécule (voir figure 20.25), soit d’enzymes qui empêchent l’entrée de ces molécules ou les excrètent. Par exemple, la streptomycine, la néomycine, la kanamycine et la

Acétylation

FIGURE 20.25 Sites sur lesquels les antibiotiques sont attaqués par les enzymes codés par les gènes du plasmide R. Les antibiotiques peuvent être inactivés sélectivement, soit par modification chimique, par coupure (voir également la figure 20.20).



FOCUS


Prévention des résistances aux molécules antimicrobiennes

La résistance aux molécules antimicrobiennes est une résistance acquise vis-à-vis des composés utilisés pour la prévention et le traitement des maladies infectieuses. Les molécules antimicrobiennes agissent en perturbant une voie métabolique unique, souvent pour un nombre restreint de micro-organismes. Les micro-organismes développent ou acquièrent la résistance à une molécule par modification ou acquisition d’un gène unique, souvent très rapidement. Par exemple, pour les agents antimicrobiens utilisés dans les années 1930 (sulfanilamide) et 1940 (pénicilline), beaucoup de micro-organismes ont, dans les années 1950, montré une résistance. Les centres pour le contrôle et la prévention des maladies (CDC, Centers for Disease Control and Prevention) à Atlanta, en Géorgie (ÉtatsUnis), estiment que les résistances se répandent et affecteront bientôt chaque personne, soit en tant que porteur sain soit en tant que malade. Tous les ans, presque deux millions de patients américains développent une infection nosocomiale contractée à l’hôpital. Il est difficile de traiter les infections nosocomiales parce que jusqu’à 70 % des micro-organismes responsables de ces infections sont résistants aux molécules antimicrobiennes. Pour Staphylococcus aureus, espèce en cause dans plus de 10 % des infections contractées dans les services de réanimation, la figure ci-dessous montre que, sur une période de treize ans, un doublement de la résistance à la méthicilline et à l’oxacilline, derniers dérivés de la pénicilline, est observé. Puisque les isolats de S. aureus peuvent être résistants à un certain nombre d’autres molécules, les souches de S. aureus résistantes au couple oxacilline-méthicilline (MRSA) limitent le choix des molécules thérapeutiques efficaces. Au moins une souche respectivement de Mycobacterium tuberculosis et de Streptococcus faecium est résistante même pour les antibiotiques utilisés les plus complexes ; quelques microbes pathogènes ne peuvent plus être contrôlables par thérapie antibiotique. Un programme d’instruction du CDC en douze étapes pour empêcher la résistance antimicrobienne est récapitulé ci-dessous (http:// www.cdc.gov/drugresistance/healthcare/ha/ 12steps_HA.htm). 12 étapes pour empêcher la résistance antimicrobienne Prévenir l’infection 1. Immuniser pour empêcher les maladies communes. Maintenir les immunisations à jour, particulièrement pour des expositions probables à la maladie. En plus des vaccinations exigées (voir section 22.12), ceci devrait inclure la vaccination annuelle contre la grippe pour presque toutes les personnes. Les vaccins contre la méningite et les immunisations contre les pneumocoques devraient être délivrés aux personnels de la santé ou à ceux exposés à un grand nombre de personnes, comme dans les écoles, les universités et l’armée.

2. Éviter l’introduction inutile de dispositifs médicaux tels que des tubes et des cathéters, qui augmente le risque de favoriser l’entrée d’agents infectieux dans le corps. Si de tels dispositifs sont nécessaires, les enlever dès que possible. Diagnostiquer et traiter l’infection efficacement 3. Cibler le pathogène. Cultiver l’infection pour récupérer et caractériser si possible le microbe pathogène responsable. Fournir le traitement antimicrobien pour les microbes les plus susceptibles d’être pathogènes. Après des résultats de culture positifs, ajuster la thérapie définitive sur le microbe pathogène reconnu. Surveiller la réponse à la thérapie et ajuster le traitement si nécessaire. Accomplir la durée totale de la thérapie. 4. Accès aux experts. Pour des infections sérieuses, se faire suivre par un médecin spécialiste et demander une deuxième opinion si les conditions ne s’améliorent pas rapidement après le début du traitement. Employer les agents antimicrobiens modérément 5. Pratiquer le contrôle antimicrobien. Être averti et se tenir au courant de nouvelles molécules antimicrobiennes appropriées et de leur utilisation. Être sûr que le traitement proposé est courant et recommandé pour le microbe pathogène ciblé. 6. Employer les données locales. Obtenir et comprendre les données du profil d’antibiogramme (susceptibilité aux antibiotiques) de l’agent infectieux et les confronter aux données des agences locales de santé. 7. Traiter l’infection, pas la contamination. Les techniques respectant les règles de stérilité doivent être suivies pour obtenir les échantillons appropriés provenant des tissus infectés. Les micro-organismes contaminants peuvent être présents dans les cathéters. N’isoler les cultures qu’à l’emplacement de l’infection. Quand il y a des doutes, refaire des prélèvements et les cultures.

Pourcentage de résistance

712 Chapitre 20

60 50 40 30 20 10 1989 1991 1993 1995 1997 1999 2001

Année Cas d’infections nosocomiales dues à des Staphylococcus aureus résistants à la méthicilline rencontrés dans des unités de soins intensifs de 1989 à 2001. Données du National Nosocomial lnfections Surveillance (NNIS), des centres de contrôle et de prévention des maladies (CDC, Centers for Disease Control and Prevention), Atlanta, Géorgie, États-unis.

8. Traiter l’infection, pas la colonisation. Traiter le microbe pathogène et non les autres micro-organismes associés qui ne sont pas responsables de la maladie. Par exemple, des cultures habituelles de prélèvement de la peau et de la gorge sont souvent colonisées par les microbes pathogènes potentiels tels que les espèces de staphylocoque, qui ne sont pas responsables de l’infection étudiée. 9. Traiter avec l’agent antimicrobien le plus approprié qui éliminera le pathogène. Le traitement avec le dernier antibiotique à large spectre, bien qu’efficace, ne peut être justifié si d’autres molécules sont encore efficaces. Plus une molécule est employée, plus grande est la probabilité que des microorganismes résistants se développeront. Par exemple, quelques souches d’entérocoques sont déjà résistantes à la vancomycine, un antibiotique relativement nouveau à large spectre, en grande partie parce que la vancomycine a été prescrite pour traiter des infections de MRSA dès que son utilisation a été autorisée. Arrêter le traitement antimicrobien quand il s’avère inutile 10. Le traitement antimicrobien pour une infection diagnostiquée devra être arrêté dès que la durée du traitement prescrit sera accomplie. Si une infection ne peut être diagnostiquée, le traitement devra être suspendu. Par exemple, dans le cas de la pharyngite (gorge endolorie), le traitement antibiotique pour l’infection de Streptococcus pyogenes (angine) est souvent commencé avant que des résultats de la culture du prélèvement de la muqueuse de gorge ne soient analysés. Si les cultures se révèlent négatives pour S. pyogenes, le traitement avec l’antibiotique doit être arrêté. Les antibiotiques sont inefficaces pour les virus, cause la plus probable de la pharyngite. Empêcher la transmission du pathogène 11. Isoler le pathogène. Maintenir des secteurs dégagés de toute contamination autour des personnes infectées. Nettoyer et recueillir les fluides corporels convenablement. Décontaminer les linges, les vêtements et les autres sources potentielles de contamination. Dans le cadre des hôpitaux, les experts en matière de contrôle des infections devront être consultés. 12. Casser la chaîne de la contagion. Éviter le contact avec d’autres personnes, même au travail ou à l’école, quand on est malade. Maintenir la propreté, particulièrement par le lavage des mains, si vous êtes malade ou si vous vous occupez de personnes malades. Ces étapes sont des directives pour un usage intelligent des molécules antimicrobiennes. De telles mesures devraient ralentir le développement de la résistance et prolonger la durée de vie de beaucoup de molécules utiles.



La diffusion de résistance antimicrobienne L’utilisation répandue des antibiotiques médicaux, vétérinaires et agricoles continue à fournir des conditions sélectives pour la diffusion des plasmides R avec des gènes de résistance aux antibiotiques, en sélectionnant et favorisant les bactéries contenant ces plasmides. La résistance aux antibiotiques due aux plasmides R est une évolution prévisible par la sélection naturelle. Les plasmides R et les autres sources des gènes de résistance apportent d’importantes limites pour l’usage à long terme de n’importe quel antibiotique comme agent chimiothérapeutique efficace. L’utilisation inadéquate et étendue des molécules antimicrobiennes est la principale cause du développement rapide des résistances dans les maladies causées par les microbes. La découverte et l’utilisation clinique des nombreux antibiotiques connus ont été mises en parallèle par l’apparition des bactéries qui leur résistent. La figure 20.26a montre une corrélation entre le nombre de tonnes d’antibiotiques utilisé et le pourcentage des bactéries résistantes pour chaque type d’antibiotique. Il y a de nombreux exemples d’abus d’antibiotiques ayant pour résultat le développement de résistances. De plus en plus, l’agent antimicrobien prescrit pour le traitement d’une infection

20

80

100

125

Tétracycline

Ampicilline

Chloramphénicol

40

Acide nalidixique

60

20

L’origine des plasmides de résistance

150

Utilisation des antibiotiques (tonnes) (a) 9%

Pourcentage de souches résistantes de N. gonorrhoeae

Bien que les données sur l’origine des plasmides R codant de multiples résistances ne soient pas accessibles, il semble évident que ces plasmides R aient existé avant l’ère antibiotique. Par exemple, une souche d’Escherichia coli lyophilisée en 1946 contient un plasmide portant des gènes de résistance à la tétracycline et à la streptomycine, bien que ces deux antibiotiques aient été employés médicalement plusieurs années après sa mise en conservation. De plus, il a été montré que des souches portant, sur le plasmide R, des gènes pour la résistance aux pénicillines semi-synthétiques existaient avant que cellesci n’aient été synthétisées. Dans le domaine de l’écologie microbienne du sol, des plasmides R avec les gènes antibiotiques de résistance ont été détectés dans quelques bactéries Gram négatif non pathogènes. Dans le sol, les plasmides R peuvent conférer des avantages sélectifs pour des bactéries parce que les principaux micro-organismes produisant des antibiotiques (Streptomyces et Penicillium) sont également les micro-organismes habituels du sol. Ainsi, il semble que les plasmides R ont existé dans la population microbienne bien avant que les antibiotiques n’aient été découverts et employés en médecine ou dans l’agriculture.

80

Gentamicine

Pourcentage de résistance des souches d’origine fécale

spectinomycine possèdent des structures chimiques semblables. Les souches bactériennes possédant les plasmides R pour ces molécules peuvent produire des enzymes qui modifient chimiquement ces antibiotiques par phosphorylation, acétylation ou adénylation. La molécule modifiée perd alors son activité antibiotique. Dans le cas des pénicillines, les plasmides R codent une enzyme, la pénicillinase (β-lactamase), qui coupe le cycle β-lactame, inactivant ainsi l’antibiotique. La résistance au chloramphénicol est due à une enzyme codée par le plasmide R qui acétyle l’antibiotique. Beaucoup de plasmides R confèrent des résistances multiples aux antibiotiques ; un simple plasmide R peut contenir plusieurs gènes différents, codant chacun une enzyme d’inactivation d’antibiotique différente (voir section 10.10).

Sulfonamides Kanamycine Streptomycine

20.12 Résistance aux molécules antimicrobiennes 713

8% 7% 6% 5% 4% 3% 2% 1% 0%

1981 1983 1985 1987 1989 1980 1982 1984 1986 1988 1990

Année (b) FIGURE 20.26 Apparition des bactéries résistant aux antibiotiques. (a) Relation entre l’utilisation des antibiotiques et le pourcentage de bactéries résistant aux antibiotiques, isolées de patients diarrhéiques. Les antibiotiques qui ont été les plus employés sont ceux pour lesquels les résistances bactériennes sont les plus fréquentes. (b) Pourcentage des cas rapportés de gonorrhée provoqués par des souches bactériennes antibiorésistantes. Le nombre réel de cas résistant aux antibiotiques rapportés en 1955 était de 9 000. Ce nombre approchait les 59 000 en 1990. Plus de 95 % des cas de résistance rapportés sont dus à des souches de Neisseria gonorrhoeae productrices de pénicillinase. Depuis 1990, l’utilisation de la pénicilline n’est plus recommandée pour le traitement de la gonorrhée en raison de la résistance naissante à cet antibiotique. (Source : centres de contrôle et de prévention des maladies (CDC, Centers for Disease Control and Prevention, Atlanta, GA).

particulière doit être changé en raison de la plus grande résistance du micro-organisme responsable de la maladie. Un exemple classique est le développement de la résistance à la pénicilline des Neisseria gonorrhoeae, bactérie responsable de la gonorrhée (voir figure 20.26b). Avant 1980, la pénicilline a été le traitement habituel pour cette infection, étant utilisée en continu pour cette application depuis sa disponibilité dans les



714 Chapitre 20


années 1940. Cependant, la pénicilline n’est plus un antibiotique efficace pour le traitement de la gonorrhée parce qu’un grand pourcentage des isolats cliniques de Neisseria gonorrhoeae produit maintenant des β-lactamases, créant une résistance à la pénicilline. Pratiquement toutes les souches résistantes se sont développées depuis 1980. La molécule actuellement utilisée est la ceftriaxone, mais des directives pour ce traitement sont mises à jour presque chaque année pour contrôler si des émergences de résistance de souches de Neisseria gonorrhoeae à cet antibiotique n’apparaissent pas (voir section 26.12). Un certain nombre de données suggèrent que, dans le monde entier, les antibiotiques sont employés dans la pratique clinique bien plus souvent qu’il n’est nécessaire. Les données indiquent que le traitement antibiotique est justifié dans 20 % des cas pour les individus soignés pour une maladie infectieuse clinique. Cependant, des antibiotiques sont prescrits jusqu’à 80 % des cas. En outre, jusque dans 50 % des cas, les doses ou les durées recommandées des traitements ne sont pas respectées. Ceci est dû au mauvais comportement des malades : beaucoup de patients cessent de prendre leurs médicaments, en particulier les antibiotiques, dès qu’ils se sentent mieux. L’apparition du bacille de la tuberculose isoniazide-résistant se corrèle avec le non-respect par les patients de la prise quotidienne orale du médicament pendant les six à neuf mois prescrits (voir section 26.5). Ainsi, des microbes pathogènes virulents sont souvent soumis à des doses sous-létales d’antibiotiques pendant des périodes courtes, sélectionnant les souches résistantes. D’autres études plus récentes indiquent cependant que cette tendance change aux États-Unis. Les médecins prescrivent environ un tiers de moins d’antibiotiques qu’il y a dix ans pour le traitement des infections des enfants. Cette réduction a été permise en grande partie par des efforts d’information envers les médecins, les professionnels de santé et les patients (voir le focus « Prévention des résistances aux molécules antimicrobiennes » au sujet de l’utilisation appropriée de la thérapie antibiotique). L’utilisation non médicale et inconsidérée des antibiotiques a également contribué à l’apparition des résistances. Des antibiotiques sont employés dans l’agriculture en tant que compléments à l’alimentation des animaux, comme substances de croissance et additifs prophylactiques pour empêcher les apparitions de maladies plutôt que pour traiter de réelles infections. En conséquence, plusieurs manifestations récentes d’infection par la nourriture ont fait suite à l’utilisation des antibiotiques dans l’alimentation animale. Des fluoroquinolones ont été intensivement employées pendant plus de vingt années en tant qu’agents prophylactiques et de croissance dans l’agriculture. Cependant, des souches de Campylobacter jejuni résistantes à la fluoroquinolone ont émergé comme microbes pathogènes dans les aliments (voir section 29.9), vraisemblablement en raison du traitement routinier par fluoroquinolones dans les élevages de volailles pour empêcher les maladies respiratoires. Des directives volontaristes sont appliquées par les producteurs de volailles et de médicaments pour surveiller l’utilisation des fluoroquinolones dans l’agriculture et pour empêcher l’apparition rapide de résistances bactériennes à de nouvelles molécules de fluoroquinolones.

Les microbes pathogènes résistants aux antibiotiques Depuis que l’utilisation répandue de la chimiothérapie antimicrobienne a commencé dans les années 1950 (voir figure 20.27), il est apparu, grâce à la surveillance des résistances, que presque tous les micro-organismes pathogènes avaient développé une résistance à des agents chimiothérapeutiques, ceci en grande partie en raison de leur mauvaise utilisation. Les molécules de pénicilline et de sulfamide, les premiers agents chimiothérapeutiques couramment employés, connaissent aujourd’hui une utilisation plus limitée parce que beaucoup de microbes pathogènes y sont résistants. Même les organismes où toutes les souches restent sensibles à la pénicilline, comme Streptococcus pyogenes (la bactérie responsable d’angines, de la scarlatine et de rhumatismes articulaires – voir section 26.2), exigent maintenant des doses plus fortes de pénicilline qu’il y a dix ans, pour une efficacité de traitement égale. Quelques microbes pathogènes ont développé une résistance à tous les agents antimicrobiens connus (voir figure 20.27). Parmi ces derniers on peut recenser plusieurs souches de Staphylococcus aureus résistantes à la méthicilline (MRSA) [voir section 26.9], d’Enterococcus faecium résistantes à la vancomycine (VRE), ainsi que des souches de Mycobacterium tuberculosis (voir section 26.5). Un nombre croissant de souches dérivées de MRSA ont développé une sensibilité réduite à la vancomycine ; elles sont dénommées souches de Staphylococcus aureus intermédiaires à la vancomycine (VISA). La résistance aux antibiotiques peut être réduite au minimum si ces molécules ne sont employées que pour le traitement de maladies nécessitant leur utilisation et si elles sont données à des doses suffisamment élevées et des durées suffisamment longues pour que la population microbienne soit réduite avant

Légende

Acinetobacter sp.

Gram négatif Gram positif Gram positif / acido-résistante

Enterococcus faecalis* Streptococcus pneumoniae Mycobacterium tuberculosis* Haemophilus ducreyi Salmonella typhi Haemophilus influenzae Neisseria gonorrhoeae

Pseudomonas aeruginosa* Salmonella sp. Shigella dysenteriae Shigella sp. Autres bactériocoques gram négatif Staphylococcus aureus 1950

1960

1970

1980

1990

2000

2010

FIGURE 20.27 Observation de l’évolution des résistances pour différentes espèces bactériennes pathogènes de l’homme. L’astérisque indique que des souches de cette espèce présentent des multirésistances aux antibiotiques et ne sont maintenant plus traitables avec des antibiotiques connus.



20.13 Recherche de nouvelles molécules antimicrobiennes

que des mutants résistants n’aient une chance d’apparaître. La combinaison de deux agents chimiothérapeutiques différents peut également réduire la résistance. Il paraît peu probable qu’une souche mutante résistante à un premier antibiotique soit également résistante au second. Cependant, la prédominance de plasmides R possédant de multiples gènes de résistance rend la thérapie antibiotique multiple moins pertinente dans la stratégie des traitements cliniques. Quelques rapports suggèrent que si l’utilisation d’un antibiotique spécifique est arrêtée, la résistance microbienne à cet antibiotique peut être annulée après plusieurs années. Cependant, les micro-organismes résistant aux antibiotiques peuvent persister dans l’intestin pendant un certain temps. Ceci indique que l’efficacité de quelques antibiotiques peut être rétablie en arrêtant leur utilisation pendant un certain temps, puis en les réintroduisant prudemment, selon un plan soigneusement contrôlé. Par ailleurs, de nouveaux agents chimiothérapeutiques sont constamment produits en utilisant plusieurs méthodes pour découvrir et concevoir de nouvelles molécules.

Contrôlez vos acquis L’utilisation des molécules antimicrobiennes a stimulé le développement de la résistance des micro-organismes visés. La résistance résulte de la présence de gènes de résistance et peut être accélérée par les utilisations abusives de molécules antimicrobiennes. Quelques organismes ont développé des résistances multiples à toutes les molécules antimicrobiennes connues. •

Identifiez les six mécanismes de base de la résistance antibiotique parmi des bactéries.

•

Identifiez les sources primaires des gènes antibiotiques de résistance.

•

Quelles pratiques amènent le développement des microbes pathogènes résistant aux antibiotiques ?

20.13 Recherche de nouvelles m n molécules antimicrobiennes Nous avons présenté les efficacités, les temps d’expositions ainsi que les développements de résistances concernant toutes les molécules antimicrobiennes connues. En conséquence, l’utilisation appropriée des antibiotiques est absolument nécessaire pour prolonger la durée de validité clinique de ces molécules. Cependant, la solution à long terme pour contrer les résistances microbiennes est de développer de nouvelles molécules. Plusieurs stratégies existent pour identifier et produire des analogues de composés existants efficaces ou pour concevoir et découvrir de nouveaux composés antimicrobiens.

Les nouveaux analogues des composés antimicrobiens existants La production de nouveaux analogues de composés antimicrobiens existants est généralement simple et souvent efficace, en grande partie parce que les nouveaux composés ont des structures

715

semblables aux plus anciens et que leur mécanisme d’action est prévisible. Dans beaucoup de cas, des paramètres tels que la solubilité et l’affinité peuvent être optimisés en apportant des modifications mineures à la structure chimique d’une molécule, tout en conservant les sites actifs de cette molécule. Le nouveau composé peut réellement être plus efficace que le composé originel. La résistance étant basée sur l’identification structurale, le nouveau composé ne peut plus être identifié par les facteurs de résistance. Par exemple, la figure 20.23 montre la structure de base de la tétracycline et de deux dérivés bioactifs. En utilisant la tétracycline comme composé primaire (un composé biologiquement actif sur lequel des modifications seront apportées), des substitutions chimiques systématiques peuvent être faites sur les quatre sites spécifiques des groupes de résistance, produisant une série presque sans fin d’analogues de la tétracycline. En utilisant cette stratégie de base, de nouveaux antibiotiques à cycle β-lactame (voir section 20.8), de nouveaux analogues de la tétracycline (voir section 20.9) et de la vancomycine (voir figure 20.13) sont régulièrement synthétisés et testés, étant cent fois plus puissants que la molécule d’origine. L’application de méthodes robotisées et automatisées pour la découverte de nouvelles molécules a considérablement augmenté la capacité à produire rapidement de nouveaux composés potentiellement antimicrobiens. Ces méthodes, désignées sous le nom de chimie combinatoire, appliquent à un produit antimicrobien connu des modifications systématiques pour produire un grand nombre de nouveaux analogues. Par exemple, en utilisant des méthodes combinatoires automatisées de la chimie sur le composé primaire de tétracycline (voir figure 20.23), cinq réactifs différents pouvant être employés pour présenter des substitutions aux quatre groupes différents de la tétracycline R. Les emplacements substitués amèneraient 5 × 5 × 5 × 5 (cinq dérivés à chacun de quatre emplacements), soit 625 dérivés différents de tétracycline avec seulement six réactifs différents, le tout réalisé en quelques heures ! On analyse alors chacun de ces composés pour évaluer son activité biologique in vitro sur différents micro-organismes en utilisant des méthodes d’essais automatisées pour quantifier les sensibilités bactériennes aux nouveaux antibiotiques (voir section 20.4). Les processus automatisés de synthèse et de criblage raccourcissent fortement les temps de découverte de nouvelles molécules et augmentent, tous les ans, le nombre de nouvelles molécules candidates d’un facteur 10 ou plus. Selon des évaluations données par l’industrie pharmaceutique, environ sept millions de nouveaux composés sont candidats pour être examinés afin de trouver une molécule simple et efficace cliniquement. Les molécules efficaces en laboratoire doivent alors être examinées pour évaluer leur efficacité et leur toxicité chez les animaux avant d’être finalement validées par des épreuves cliniques chez l’homme. Les évaluations chez l’animal impliquent habituellement de nombreux essais s’étalant sur plusieurs années pour s’assurer que la molécule candidate est efficace et sûre. Les épreuves cliniques chez l’homme nécessitent également plusieurs années pour chaque nouvelle molécule. Tous les ans, l’industrie pharmaceutique dépense jusqu’à quatre milliards de dollars pour le développement de nouvelles molécules antimicrobiennes. Entre le moment de la découverte et le développement, entre dix et vingt-cinq ans sont nécessaires avant l’approbation pour l’usage clinique d’une nouvelle molécule. On estime que le



716 Chapitre 20


coût de la découverte et du développement, des tests en laboratoire et des épreuves cliniques s’élève au moins à 400 millions d’euros pour chaque nouvel antibiotique autorisé en traitement médical (AMM ou autorisation de mise sur le marché aux normes de l’Union européenne et de la Food and Drug Administration aux États-Unis).

La conception de molécules assistée par ordinateur Les nouveaux composés antimicrobiens sont beaucoup plus difficiles à identifier que des analogues des molécules existantes, parce que ces nouveaux composés antimicrobiens doivent agir sur des sites spécifiques dans le métabolisme ou dans la biosynthèse. Ils sont structurellement différents des composés existants, évitant d’induire les mécanismes connus de résistance. Dans le passé, des molécules intéressantes ont été isolées de conditions ou milieux naturels tels que des cultures de Streptomyces ou de Penicillium, qui ont été systématiquement examinées pour détecter l’activité antimicrobienne de nouveaux composés. Cependant, les avancées récentes en informatique, associées aux technologies structurales et graphiques, permettent maintenant de concevoir une molécule pouvant agir spécifiquement sur un site ou sur un autre. Les outils informatiques rendent désormais possible la découverte de nouvelles molécules, qui peuvent être rapidement « créées » et « testées » pour évaluer par simulation leur capacité de fixation et leur efficacité. Toutes ces démarches se réalisent à un coût relativement réduit (voir sections 30.5 et 26.8). Un des succès les plus spectaculaires dans la conception de molécules assistée par ordinateur est le développement en 1995 du saquinavir, un inhibiteur de protéase qui est employé pour ralentir la croissance du virus immunodéficitaire humain (VIH) chez les individus infectés (voir figure 20.28). Le saquinavir a été conçu par ordinateur pour se lier à l’emplacement actif de l’enzyme protéase du virus VIH, fondé sur la structure tridimensionnelle connue du complexe protéasesubstrat. La protéase du virus VIH coupe normalement une protéine précurseur codée par le virus pour produire la capside virale mature et pour activer l’enzyme transcriptase inverse nécessaire pour la réplication (voir section 16.15). Le saquinavir est un analogue de peptide qui supplante la protéine précurseur de VIH, empêchant la maturation du virus et ralentissant sa croissance dans l’hôte humain. Un certain nombre d’autres inhibiteurs de protéase conçus par ordinateur comme le saquinavir sont en service en tant que molécules chimiothérapeutiques pour le traitement du SIDA (voir tableau 20.5, figures 20.28 et 26.38). La conception et les essais assistés par ordinateur reposant sur des modèles structuraux et biochimiques sont une méthodologie pratique, rapide et rentable pour concevoir les nouvelles molécules antimicrobiennes. Naturellement, ces molécules doivent subir l’essai chez l’animal et les épreuves cliniques avant d’être employées en thérapeutique.

Les agents antimicrobiens nouveaux Les bactériophages sont des virus qui visent différentes espèces bactériennes (voir sections 16.1 à 16.6). La thérapie par l’utilisation de bactériophages a été employée de manière limitée

(a)

NH2 O H N

N O

H N O

N OH

O

NHC(CH3)2

Saquinavir

N N O

OH

NHC(CH3)2

H N

OH

O

Indinavir (b) FIGURE 20.28 Drogues antivirales modélisées par ordinateur. (a) La protéase homodimérique du VIH. Les chaînes polypeptidiques sont montrées en vert et en bleu. Un peptide (en jaune) est lié au site catalytique. Cette protéase coupe une protéine précurseur du VIH – étape nécessaire dans la matu-ration du virus (voir section 16.15 et figure 16.26). Quand on bloque le site de la protéase à l’aide du peptide présenté, on inhibe la maturation du précurseur et celle du VIH. Cette structure découle des informations des banques de données concernant les protéines. (b) Ces drogues anti-VIH sont des analogues de peptide qui ont été conçus à l’aide d’outils informatiques pour bloquer le site actif de la protéase du VIH. Les secteurs surlignés en orange correspondent aux régions analogues aux sites de fixation du peptide. La liaison de ces composés avec la protéase du VIH empêche les étapes préalables de la formation du VIH et la maturation du virus. Ces composés représentent une classe de médicaments appelés inhibiteurs de protéases. La concentration de ces composés dans les cellules infectées par le VIH, associée à leur forte affinité pour la protéase du VIH, en font des inhibiteurs puissants par la fixation compétitive sur les sites actifs de la protéase. Ces inhibiteurs de protéases sont couramment employés pour le traitement de l’infection du VIH (voir tableau 20.5 et section 26.14).



Questions 717

pendant plus de quatre-vingts années pour traiter des infections chez les animaux et, dans quelques cas, chez l’homme. Les bactériophages se lient aux bactéries en interagissant avec des composants spécifiques de la surface des cellules bactériennes. Les interactions phages-bactéries sont relativement spécifiques, visant généralement différentes espèces bactériennes. Le bactériophage entre dans la cellule, se réplique et lyse la cellule bactérienne, entraînant sa mort. L’efficacité et la capacité de ces agents dans leurs applications pour le traitement humain sont en grande partie non testées et quelque peu controversées, bien que les épreuves cliniques de plusieurs produits soient poursuivies. Cependant, les bactéries peuvent devenir résistantes à un bactériophage par des mutations modifiant les récepteurs, supprimant ainsi la sensibilité de la paroi cellulaire aux enzymes bactériophages. Cette thérapie n’est probablement pas protégée contre les problèmes de résistance.

Contrôlez vos acquis De nouveaux composés antimicrobiens sont découverts et constamment développés pour lutter contre les microbes pathogènes résistants aux antibiotiques, augmentant notre capacité pour traiter les maladies infectieuses. Des analogues des molécules existantes sont constamment développés pour être employés en tant que composés antimicrobiens de nouvelle génération. La conception de molécules assistée par ordinateur est un nouvel outil important pour la découverte de molécules à usage thérapeutique. •

Expliquez les avantages et les inconvénients à développer de nouvelles molécules fondées sur des molécules analogues existantes.

•

Comment la conception assistée de molécules par ordinateur permet-elle d’économiser du temps et de l’argent ?

QUESTIONS 1. Pourquoi le temps de réduction décimal (D) est-il important lors de la stérilisation par la chaleur ? Comment la présence des endospores bactériennes affecterait-elle la valeur de D (voir section 20.1) ? 2. Décrivez les effets d’une dose mortelle de radiation ionisante au niveau moléculaire (voir section 20.2). 3. Quels principaux avantages présente l’utilisation des filtres à membrane par rapport aux filtres épais (voir section 20.3) ? 4. Pourquoi les filtres Nucléopore sont-ils particulièrement utiles pour isoler des spécimens pour la microscopie (voir section 20.4) ? 5. Décrivez la procédure pour obtenir la concentration minimale inhibitrice (CMI) dans le cas d’un produit chimique qui est bactéricide pour Escherichia coli (voir section 20.5). 6. Différenciez l’action des désinfectants et des antiseptiques. Pourquoi les désinfectants ne peuvent-ils pas normalement être employés sur les tissus vivants (voir section 20.6) ?

7. Les analogues de facteur de croissance se distinguent généralement des antibiotiques par un critère important simple. Expliquez cela (voir section 20.7). 8. Décrivez le mode d’action qui caractérise un antibiotique (voir section 20.8). 9. Distinguez le mode d’action d’au moins trois antibiotiques empêchant la synthèse de protéines (voir section 20.9). 10. Pourquoi les molécules antivirales montrent-elles généralement une toxicité vis-à-vis des cellules hôtes (voir section 20.10) ? 11. Identifiez les cibles qui permettent une toxicité sélective des agents chimiothérapeutiques chez les champignons (voir section 20.11). 12. Identifiez six mécanismes responsables de la résistance aux antibiotiques (voir section 20.12). 13. En commençant par une molécule primaire, décrivez les méthodes de la chimie combinatoire employées pour la production de nouveaux analogues de la molécule (voir section 20.13).

PROBLÈMES 1. Quels sont quelques inconvénients potentiels à l’utilisation du rayonnement dans la conservation des aliments ? Pensez-vous que ces inconvénients peuvent être considérés comme des risques sanitaires ? Pourquoi ou pourquoi pas ? Comment distingueriez-vous un aliment ionisé dégradé d’un aliment ionisé contaminé ? 2. La filtration est un des moyens acceptables de pasteurisation pour quelques liquides. Concevez un système de filtration pour la pasteurisation d’un liquide sensible à la chaleur. Pourquoi un système de filtration pourrait-il être souhaitable en plus d’un système de pasteurisation de la chaleur ? 3. Bien que les analogues de facteur de croissance puissent inhiber le métabolisme microbien, seul quelques-uns de ces agents sont

pratiquement utilisés. Beaucoup d’agents potentiels, dont certains sont largement employés, comme l’azidothymidine (voir tableau 20.5), montrent une toxicité significative vis-à-vis des cellules hôtes. Décrivez un analogue de facteur de croissance efficace et présentant une faible toxicité pour des cellules hôtes. Pourquoi la toxicité de l’agent que vous avez choisi est-elle faible ? Décrivez également un analogue de facteur de croissance efficace contre une maladie infectieuse, mais montrant une toxicité pour les cellules hôtes. Pourquoi un agent toxique tel que l’AZT est-il encore employé dans certaines situations pour traiter les maladies infectieuses ? Quelles précautions prendriez-vous pour limiter les effets toxiques d’une telle molécule, tout en maximisant son activité thérapeutique ? Argumentez votre réponse.



718 Chapitre 20


4. Concevez une expérience pour examiner des micro-organismes en vue de la production de nouveaux antibiotiques. Quels groupes de micro-organismes choisiriez-vous d’examiner pour la production antibiotique ? Où pourriez-vous trouver et isoler ces organismes dans un environnement naturel ? Quels avantages doit fournir la production d’un antibiotique pour ces organismes en conditions naturelles ? Quelles méthodes in vitro utiliseriez-vous pour examiner l’efficacité de vos nouveaux antibiotiques potentiels ? 5. Bien que les antibiotiques à cycle β-lactame démontrent une toxicité sélective claire pour des bactéries, beaucoup de groupes de bactéries sont de manière innée résistants à leurs effets. Indiquez pourquoi les Bacteria Gram négatif sont résistantes à la plupart des effets des antibiotiques à cycle β-lactame, mais pas à tous. Expliquez ensuite pourquoi quelques antibiotiques à cycle β-lactame sont utiles contre ces organismes. 6. Énumérez les caractéristiques d’une molécule antivirale idéale, particulièrement en ce qui concerne sa toxicité sélective. De

telles molécules existent-elles ? Quels facteurs pourraient limiter l’utilisation d’une telle molécule ? 7. Comme les virus, les champignons présentent des problèmes chimiothérapeutiques spécifiques. Expliquez les problèmes en chimiothérapie inhérents à chacun des deux groupes et expliquez en quoi vous êtes ou non d’accord avec la déclaration précédente. Donnez les exemples spécifiques et proposez au moins un groupe d’agents chimiothérapeutiques pouvant viser ces deux types d’agents infectieux. 8. Expliquez la base génétique de la résistance acquise aux antibiotiques à cycle β-lactame pour Staphylococcus aureus. Concevez des expériences pour inverser la résistance bactérienne aux antibiotiques à cycle β-lactame. Pensez-vous qu’elles puissent être réalisées en laboratoire ? Votre expérience peut-elle être appliquée sur le terrain pour favoriser la sélection de micro-organismes résistant aux antibiotiques ?



I

Interactions favorables entre les microorganismes et l’homme 720

21.1

Généralités sur les interactions hôte–microorganisme Flore bactérienne normale de la peau Flore bactérienne normale de la cavité buccale Flore bactérienne normale du tractus gastrointestinal Flore bactérienne normale des autres voies cutanéomuqueuses

21.2 21.3 21.4 21.5

Le Bacillus anthracis, agent de l’anthrax (maladie du charbon), produit une capsule épaisse polysaccharidique (en vert) ; la capsule protège la bactérie de la réponse immunitaire de l’hôte.

720 722 722 725 726

II

Interactions néfastes entre les microorganismes et l’homme 728

21.6 21.7 21.8

Porte d’entrée du pathogène chez l’hôte Colonisation et croissance Virulence

728 730 730

III

Facteurs de virulence et toxines

733

21.9 21.10 21.11 21.12

Facteurs de virulence Exotoxines Entérotoxines Endotoxines

733 733 735 736

IV

Facteurs de l’hôte

737

21.13 Facteurs de risque d’infection 21.14 Résistance innée à l’infection

CHAPITRE VINGT-ET-UN

Interactions homme– micro-organismes

737 739



720 Chapitre 21

Interactions homme–micro-organismes

GLOSSAIRE Atténuation (attenuation) Baisse ou perte de la virulence. Bactériémie (bacteremia) Présence de bactéries dans le sang. Capsule Voir chapitre 4. Caries dentaires (dental caries) Dégradation du tissu dentaire lors d’une infection bactérienne. Colonisation (colonization) Croissance bactérienne au niveau de la porte d’entrée tissulaire. Couche muqueuse (slime layer) Couche diffuse de polymères fibreux et polysaccharidiques, libérés à la surface externe des bactéries. Endotoxine (endotoxin) Produit polysaccharidique solubilisé issu de la paroi de certaines bactéries Gram négatif. Entérotoxine (enterotoxin) Protéine sécrétée lors de la croissance de certaines bactéries, qui provoque des lésions au niveau de l’intestin grêle de l’hôte. Exotoxine (exotoxin) Protéine sécrétée lors de la croissance de certaines bactéries, qui provoque une destruction rapide des cellules de l’hôte. Flore bactérienne normale (normal microbial flora) Regroupement de bactéries habituellement retrouvées au contact de l’hôte sain (peau et muqueuses). Hémolysine (hemolysin) Toxine bactérienne susceptible d’induire une hémolyse (destruction des hématies, cellules de la lignée rouge du sang). Hôte (host) Organisme (homme, animal, végétal, micro-organisme…) susceptible de porter un micro-organisme parasite. Infection Issue de la croissance d’un micro-organisme chez l’hôte. Infections nosocomiales (nosocomial infections) Infections à la suite de soins médicaux ou contractées à l’hôpital (au moins 48 heures après hospitalisation).

L’

homme héberge un très grand nombre de bactéries (cent fois plus que de cellules) au niveau de la peau et des muqueuses constitutives de la bouche, des intestins et des voies sécrétrices et génitales. Ces micro-organismes sont le plus souvent indispensables à la bonne santé de l’hôte. Cependant, certains d’entre eux peuvent se reproduire et envahir les tissus de l’hôte, dans un contexte particulier (notamment lors d’une diminution de ses défenses), entraînant des lésions et traduisant la maladie infectieuse. Ces bactéries, appelées pathogènes, utilisent différentes stratégies pour se reproduire chez l’hôte, avec la production de molécules d’adhésion, de facteurs de croissance, d’enzymes d’invasion ou de toxines. Ces facteurs contribuent aux lésions et, occasionnellement, à la mort de l’hôte. En réponse à ces bactéries pathogènes, l’hôte développe des stratégies de défense pour limiter leur prolifération ou les détruire, avec des barrières physiques, anatomiques ou biochimiques non spécifiques. Les microbiologistes ont aussi développé des stratégies (antibiotiques, vaccins, etc.) pour renforcer ces défenses naturelles (voir chapitre 20).

I

INTERACTIONS FAVORABLES ENTRE LES MICRO-ORGANISMES ET L’HOMME

Elles concernent les bactéries qui sont hébergées par l’hôte et qui contribuent à sa bonne santé.

Invasion (invasiveness) Capacité d’un agent pathogène à entrer chez l’hôte et à diffuser. Maladie (disease) Lésion chez l’hôte entraînant une modification ou une perte fonctionnelle. Mucus Glycoprotéine soluble sécrétée par les cellules épithéliales constituant la muqueuse. Muqueuse (mucous membrane) Couche cellulaire en interaction avec le milieu extérieur, localisée dans une cavité interne de l’hôte. Parasite Organisme se reproduisant au dépend d’un autre organisme (hôte) et pouvant provoquer une maladie (sujet fragilisé). Pathogène (pathogen) Micro-organisme provoquant une maladie. Pathogène opportuniste (opportunistic pathogen) Micro-organisme pouvant provoquer une maladie en l’absence ou lors d’une baisse des défenses naturelles de l’hôte mais pas chez le sujet sain. Pathogénicité (pathogenicity) Capacité d’un pathogène à provoquer une maladie. Plaque dentaire (dental plaque) Prolifération bactérienne au niveau de la matrice extracellulaire dentaire, au contact des produits de la digestion salivaire. Toxicité (toxicity) Pathogénicité liée à l’action d’une toxine produite par une bactérie pathogène. Virulence Niveau de pathogénicité défini par un micro-organisme. Voie (ou tractus) respiratoire basse (lower respiratory tract) Constituée de la trachée, des bronches et des poumons. Voie (ou tractus) respiratoire haute (upper respiratory tract) Constituée du nasopharynx, de la cavité buccale et de la gorge.

21.1 Généralités sur les interactions m n hôte–micro-organisme L’homme est constamment exposé à la contamination par des micro-organismes de l’environnement. Nombre d’entre eux, en s’y reproduisant, constituent la flore microbienne normale et ne sont pas pathogènes chez l’homme.

Les agents pathogènes Les micro-organismes qui se développent chez l’hôte sont des parasites et, lorsqu’ils provoquent des lésions, sont des pathogènes. Le devenir de l’équilibre entre le micro-organisme et son hôte dépend de la pathogénicité du micro-organisme et de la résistance ou de la sensibilité de l’hôte à l’infection. En cas de défaut de défenses chez l’hôte, un pathogène opportuniste peut s’y développer et provoquer des lésions. La pathogénicité varie selon les pathogènes et son niveau définit la virulence. Celle-ci correspond au nombre de micro-organismes qui déterminent la pathogénicité chez l’hôte sur une période donnée. Ni la virulence des microorganismes, ni la résistance de l’hôte ne sont des facteurs constants ; l’interaction entre les deux constitue une relation dynamique, influencée par les conditions environnementales.



21.1 Généralités sur les interactions hôte–micro-organisme 721

Infection et maladie L’infection est la conséquence du développement d’un microorganisme chez l’hôte, indépendamment du niveau des lésions. La maladie est la conséquence des lésions associées à l’infection, modifiant des fonctions chez l’hôte et se traduisant par l’apparition de symptômes. L’infection n’est pas synonyme de maladie, les micro-organismes pouvant se reproduire sans créer de lésions. Ainsi, les bactéries issues de la flore microbienne normale peuvent développer une infection, mais rarement une maladie. Celle-ci peut se révéler lors de l’affaiblissement des défenses de l’hôte, dans le cadre d’un cancer ou du SIDA par exemple (voir section 26.14).

TABLEAU 21.1

DANS LA FLORE NORMALE CHEZ L’HOMME

Site anatomique

Bactéries

Mucus

Cellule épithéliale (a)

(b)

(c)

FIGURE 21.1 Interactions entre bactéries et membranes des muqueuses. (a) Perte de contact. (b) Adhérence. (c) Invasion des cellules épithéliales sous-muqueuses.

Genrea

Peau

Acinetobacter, Corynebacterium, Enterobacter, Klebsiella, Malassezia (f), Micrococcus, Pityrosporum (f), Propionibacterium, Proteus, Pseudomonas, Staphylococcus

Bouche

Streptococcus, Lactobacillus, Fusobacterium, Veillonella, Corynebacterium, Neisseria, Actinomyces, Geotrichum (f), Candida (f), Capnocytophaga, Eikenella, Prevotella, spirochètes (plusieurs genres)

Tractus respiratoire

Streptococcus, Staphylococcus, Corynebacterium, Neisseria, Haemophilus

Tractus gastrointestinal

Lactobacillus, Streptococcus, Bacteroides, Bifidobacterium, Eubacterium, Peptococcus, Peptostreptococcus, Ruminococcus, Clostridium, Escherichia, Klebsiella, Proteus, Enterococcus, Staphylococcus

Tractus urogénital

Escherichia, Klebsiella, Proteus, Neisseria, Lactobacillus, Corynebacterium, Staphylococcus, Candida (f), Prevotella, Clostridium, Peptostreptococcus, Ureaplasma, Mycoplasma, Mycobacterium, Streptococcus, Torulopsis (f)

Les interactions hôte–parasite L’hôte constitue un organisme favorable à la reproduction des micro-organismes, car il est riche en nutriments organiques et en facteurs de croissance, et présente un environnement propice (pH, pression osmotique et température). Cependant, l’hôte est un organisme complexe et hétérogène, et ses organes présentent un environnement chimique et physique différent, favorisant la sélection et la croissance de certains micro-organismes. La peau ainsi que les voies respiratoire et gastro-intestinale contribuent à cette large diversité et permettent la croissance de bactéries différentes : cocci Gram positif tels que Staphylococcus aureus, résistant aux conditions de déshydratation sur la peau (voir section 26.9), bactéries à croissance en aérobiose telles que Mycobacterium tuberculosis dans les poumons fortement oxygénés (voir section 26.5), bactéries anaérobies telles que le genre Clostridium dans l’environnement en anaérobiose des intestins (voir section 12.20). Les micro-organismes persistant chez l’hôte sont ceux qui ont développé un mécanisme de résistance à ses défenses naturelles et diversifiées. L’infection débute le plus souvent au niveau des muqueuses de l’hôte. Ces muqueuses sont constituées par une couche cellulaire dense, épithéliale, simple ou multiple, au contact avec l’environnement externe. Elles sont largement présentes chez l’hôte, au niveau de la bouche, du pharynx, de l’œsophage, des voies urogénitale, respiratoire et gastro-intestinale. Les muqueuses produisent une couche protectrice, visqueuse et superficielle, constituée de glycoprotéines solubles : le mucus. La bactérie entre en contact avec la muqueuse, s’y fixe faiblement et peut être rejetée ou y adhérer fortement en créant une interaction avec les cellules épithéliales de l’hôte. L’infection peut se poursuivre, créer une brèche dans la barrière mucosale et diffuser dans les tissus sous-muqueux (voir figure 21.1).

PRINCIPALES BACTÉRIES PRÉSENTES

a Cette liste n’est pas exhaustive. Toutes ces bactéries ne se retrouvent pas chez chaque individu. Pour plusieurs d’entre elles, la localisation varie. Certaines bactéries apparaissent plus fréquemment selon l’âge (spécifiquement pour l’adulte ou l’enfant) et selon le sexe. La plupart de ces germes sont des pathogènes opportunistes apparaissant dans certaines conditions. f = fungi (champignon).

Les micro-organismes apparaissent presque toujours à la surface des muqueuses de l’hôte (voir tableau 21.1). Cette surface importante représente près de 400 m2 et porte une grande diversité de micro-organismes en fonction de leur nature. Ils ne sont normalement pas retrouvés dans les tissus sous-muqueux, les organes, le sang, les systèmes lymphoïde et nerveux. Leur présence dans ces sites témoigne d’une maladie infectieuse grave.

Contrôlez vos acquis Les organismes animaux présentent un environnement favorable à la croissance des micro-organismes, mais ces derniers sont le plus souvent sans danger pour l’hôte. La présence d’un pathogène au niveau de la muqueuse de l’hôte contribue au développement de l’infection et de la maladie. Cette capacité à induire ou non la maladie est dépendante des interactions entre l’hôte et le parasite. •

Distinguez l’infection de la maladie.

•

Indiquez les régions de l’hôte favorables à la croissance microbienne.



722 Chapitre 21


m n

21.2 Flore bactérienne normale de la peau

La surface cutanée chez un adulte jeune est d’environ 2 m2. L’anatomie de la peau, avec la localisation des micro-organismes, est indiquée dans la figure 21.2. La couche superficielle (l’épiderme) se prête mal à la croissance bactérienne du fait de la sécheresse périodique qui s’y manifeste. La plupart des micro-organismes de la flore cutanée se localisent dans les glandes apocrines (glandes sudoripares). Ces glandes sécrétrices se situent dans le derme, notamment au niveau des aisselles, des régions génitales, des mamelons et de l’ombilic. Leur activité est faible pendant l’enfance et croît à la puberté. Ces zones plus humides et chaudes du corps favorisent la croissance bactérienne ; celle-ci contribue à l’odeur caractéristique des sécrétions issues des aisselles. Dans le derme sous-jacent, les follicules pileux associés aux glandes sébacées, productrices de sébum (riche en urée, sels, acides aminés, acide lactique et lipides, avec un milieu plutôt acide, d’un pH situé entre 4 et 6), favorisent aussi la croissance bactérienne. La flore cutanée normale est constituée d’une population microbienne transitoire ou permanente. Les micro-organismes transitoires sont incapables de s’y reproduire et meurent, alors que les formes permanentes s’y reproduisent. Il s’agit essentiellement de bactéries Gram positif, notamment des staphylocoques et des corynébactéries telles que Propionibacterium acnes, qui contribue à l’acné (voir tableau 21.1). Des bactéries Gram négatif telles que Escherichia coli sont occasionnellement retrouvées lors de contamination cutanée régulière d’origine fécale. Cependant, elles ne s’y reproduisent généralement pas (sauf Acinetobacter), étant en compétition avec les bactéries Gram positif, mieux adaptées aux conditions de sécheresse. Des levures sont rarement rencontrées sur la peau et les muqueuses, à l’exception de Pityrosporum ovalis, levure lipophylique parfois isolée sur le cuir chevelu ; des candida peuvent être aussi retrouvés lors de l’affaiblissement des défenses chez l’hôte (SIDA, voir partie 26.14) ou

Poil Épiderme Couche cornée Canal excréteur Glande apocrine sudoripare

Glande sébacée

Derme

lors de l’absence de flore cutanée bactérienne, occasionnant des lésions cutanéo-muqueuses sérieuses. Différents facteurs peuvent contribuer à modifier cette flore cutanée : 1) certaines conditions météorologiques favorisent la montée de température et du taux d’humidité de la peau, augmentant la densité de la flore microbienne ; 2) l’âge de l’hôte, les sujets jeunes ayant une microflore plus complexe, avec un risque de portage de bactéries Gram négatif pathogènes plus important que chez l’adulte ; 3) le niveau d’hygiène de l’hôte, une peau moins propre présentant une densité microbienne plus élevée. Les bactéries transitoires disparaissent le plus souvent avec une diminution du taux d’humidité ou du pH en présence d’acides organiques.

Contrôlez vos acquis La peau présente en général une surface sèche et acide limitant la croissance des micro-organismes. Cependant, des zones plus humides, notamment autour des glandes sudoripares, peuvent être colonisées majoritairement par des bactéries Gram positif, constitutives de la flore cutanée normale dont la composition varie en fonction de facteurs environnementaux et de l’hôte. •

Comparez la surface de la peau à celle des muqueuses.

•

Décrivez les propriétés des micro-organismes à croissance cutanée.

21.3 Flore bactérienne normale m n de la cavité buccale La cavité buccale présente un habitat microbien varié et complexe. La salive contient de nombreux nutriments pour la croissance microbienne, mais ils sont présents en trop faible concentration. Elle possède aussi des enzymes à activité antimicrobienne : le lysozyme permet le clivage des ponts glycosidiques du peptidoglycane de la paroi bactérienne (voir section 4.8) ; la lactoperoxydase, présente aussi dans le lait, détruit les bactéries par oxydation (voir sections 6.15 et 22.2). Malgré la présence de ces facteurs antimicrobiens, l’apport important de nutriments à partir des débris alimentaires et de la desquamation cellulaire buccale contribue à la croissance microbienne locale autour des dents et des gencives, favorisant ainsi le développement de lésions et de maladies.

Les dents et la plaque dentaire Tissu sous-cutané

Follicules pilo-sébacés FIGURE 21.2 Structure cutanée de l’homme. Les microorganismes sont initialement présents dans les canaux sudoripares et les follicules pilo-sébacés.

La dent est constituée d’une couche minérale de phosphate de calcium superficielle (l’émail), protégeant la partie vitale, constituée de l’ivoire et de la pulpe (voir figure 21.3). Chez l’enfant, avant l’apparition des dents, les bactéries présentes au niveau buccal sont des anaérobies aérotolérantes telles que les streptocoques et les lactobacilles. Lors de la pousse dentaire, la flore buccale se trouve modifiée avec l’émergence d’anaérobies prépondérants, dont la croissance est favorisée sur les dents et au niveau du collet (voir tableau 21.1).



21.3 Flore bactérienne normale de la cavité buccale 723

Émail Dentine ou ivoire Collet

Couronne

Pulpe dentaire Gencive Os alvéolaire Racine

T. Lie

Membrane périodontale

(a) Moelle osseuse

La colonisation bactérienne débute avec une bactérie au contact d’une fine couche organique sur la surface dentaire. Ce biofilm de quelques micromètres est constamment reconstitué en glycoprotéines à partir des nutriments salivaires, et permet l’attachement de streptocoques (Streptococcus sanguis, Streptococcus sobrinus, Streptococcus mutans, Streptococcus mitis), formant des microcolonies bactériennes (voir figure 21.4), à l’origine de la plaque dentaire (voir figures 21.5 et 21.6). Des bactéries filamenteuses (Fusobacterium), mais aussi des spirochètes (Borrelia) [voir section 12.33], des bacilles Gram positif et des cocci Gram négatif, se fixent et se développent sur la plaque de streptocoques, augmentant l’épaisseur de celle-ci. Sur la plaque devenue plus épaisse d’autres bactéries filamenteuses, anaérobies strictes (Actinomyces), prédominent. L’apparition de bactéries anaérobies peut surprendre dans la cavité buccale, largement oxygénée. Cependant, la formation de la plaque dentaire avec des bactéries capables de croître en aérobiose favorise l’anoxie. L’épaisseur de la plaque limite la diffusion de l’oxygène et favorise un microenvironnement en anaérobiose, avec la constitution d’une microflore dentaire au contact de l’environnement buccal.

Les caries dentaires Avec la constitution de la plaque dentaire, la microflore permanente produit de fortes concentrations d’acides organiques favorisant la décalcification de l’émail et la carie (pourriture) dentaire (voir figure 21.3). La carie est donc une maladie infectieuse. La surface lisse dentaire est relativement résistante à la carie, que le lavage salivaire, le nettoyage lingual, la mastication alimentaire et le brossage dentaire limitent. Mais la zone du collet, où s’accumulent les débris alimentaires, est en général le point de départ de cette carie. Les régimes riches en sucre sont cariogènes, car ils assurent la croissance de certaines bactéries qui transforment le sucre

T. Lie

FIGURE 21.3 Coupe dentaire. Le schéma montre l’architecture dentaire et les tissus environnants d’ancrage de la dent à la gencive.

(b) FIGURE 21.4 Microcolonies bactériennes. (a) Les colonies se développent dans un modèle de surface dentaire introduit pendant six heures dans la bouche. (b) Grossissement de la préparation (a) qui montre une morphologie hétérogène des bactéries et de fines connections fibreuses les reliant (indiquées par les flèches).

en acide lactique, celui-ci favorisant la dégradation de l’émail. Une fois l’émail entamé, la dégradation de la matrice dentaire se poursuit en présence d’enzymes produites par les bactéries, permettant la pénétration de celles-ci. Le processus plus tardif de dégradation est plus lent et complexe. L’incorporation de fluorure à partir d’eau de boisson ou de dentifrice, au niveau de la couche phosphocalcique de l’émail, augmente sa résistance à l’acide lactique et limite l’apparition de la carie. Streptococcus sobrinus et Streptococcus mutans sont les principales bactéries cariogènes, productrices d’acide lactique. S. sobrinus est sans doute l’agent principal, car elle présente une forte affinité pour les glycoprotéines formant le film dentaire (voir figure 21.6). S. mutans se fixe à l’occasion d’une brèche au niveau de la matrice dentaire et en présence de dextrane polysaccharidique, qui agit comme une colle (voir figure 21.7). La production de dextrane à partir de saccharose est assurée par l’enzyme dextransucrase de S. mutans, selon la réaction chimique suivante : Dextransucrase

n-saccharose ⎯⎯⎯⎯→ dextrane (n-glucose) + n-fructose



724 Chapitre 21


Streptocoques Jour 10 : 22 522 mm2

I. L. Shechmeister et J. Bozzola

Jour 1 : 1 436 mm2

FIGURE 21.7 Observation de Streptococcus mutans, bactérie cariogène, en microscopie électronique par balayage. Des filaments épais, constitués de dextrane, relient les bactéries (1 µm de diamètre, indiquées par les flèches) entre elles.

C. Lai, M.A. Listgarten, et B. Rosan

C. Lai, M.A. Listgarten, et B. Rosan

FIGURE 21.5 Répartition de la plaque dentaire. Comparaison de l’état de la plaque (en violet) entre le brossage des dents (en haut) et l’avant-brossage (en bas). Les chiffres indiquent la surface de la plaque dentaire dans les deux situations. La plaque dentaire se fixe au niveau du collet, au contact de la membrane gingivale.

(b) (a) FIGURE 21.6 Observation en microscopie électronique de coupes fines de la plaque dentaire. (a) Coupe de 50 µm d’épaisseur. La base de la plaque se situe en bas, l’interface avec la cavité buccale est en haut. Les micro-organismes observés sont essentiellement des streptocoques. Le marquage spécifique en immunohistochimie montre la présence de Streptococcus sobrinus, apparaissant en noir (indiqués par les flèches). (b) Fort grossissement montrant une région contenant des cellules S. sobrinus (flèche). Notez l’épaisse couche de mucus (voir section 21.6) entourant les cellules S. sobrinus. Chaque cellule mesure environ 1 µm de diamètre.

La sensibilité à la carie dépend de facteurs de l’hôte, de son régime alimentaire (plus ou moins riche en saccharose) et d’autres facteurs extérieurs. Les régimes riches en sucre sont plus fréquents dans les pays industrialisés et favorisent le développement de bactéries cariogènes. Aux États-Unis et en Europe occidentale, 80 à 90 % des individus sont colonisés au niveau des dents par S. mutans, la carie dentaire y étant très fréquente. Par contre, S. mutans est absente de la plaque dentaire des enfants de Tanzanie qui ne présentent pas de caries ; cette absence est sans doute liée à la très faible teneur en sucre de leur alimentation. Les micro-organismes de la cavité buccale peuvent être à l’origine d’autres maladies, par atteinte de la membrane périodontale, dans la zone du collet (gingivite), et une atteinte plus profonde de l’os dentaire (maladie périodontale), impliquant certaines bactéries Gram négatif et fusiformes (Capnocytophaga), des bactéries aérobies (Rothia) et des méthanogènes du domaine des Archaea (Methanobrevibacter) [voir section 13.4].

Contrôlez vos acquis Les bactéries dont la croissance est assurée sur la surface dentaire forment la plaque dentaire. Ces bactéries produisent des substances adhérentes et des acides ; ceux-ci favorisent la dégradation de la surface dentaire et contribuent à la carie. De nombreuses bactéries sont ainsi impliquées dans la carie dentaire et la maladie périodontale. •

Comment les bactéries anaérobies se développentelles dans la cavité buccale ?

•

La carie dentaire est-elle une maladie infectieuse ? Argumentez votre réponse.

•

Quelle est la contribution des bactéries productrices d’acide lactique à la carie dentaire ?



21.4 Flore bactérienne normale du tractus gastro-intestinal 725

m n

21.4 Flore bactérienne normale du tractus gastro-intestinal

Le tractus gastro-intestinal de l’homme est le site de la digestion ; il comprend l’estomac, l’intestin grêle et le gros intestin (voir figure 21.8). L’estomac produit un liquide acide (pH = 2) efficace contre l’entrée des micro-organismes dans le tractus digestif. Il est généralement pauvre en bactéries. Certaines bactéries (Helicobacter pylori) peuvent coloniser l’épithélium gastrique et provoquer des lésions à type d’ulcères (voir section 26.10). La flore digestive de l’homme varie selon le régime alimentaire. Une forte consommation de viande favorise le développement de bactéries très protéolytiques (Bacteroides) aux dépens de bactéries coliformes ou lactogènes qui se retrouvent davantage chez les végétariens.

La flore de l’intestin grêle L’intestin grêle est constitué du duodénum, adjacent à l’estomac, du jéjunum et de l’iléon. L’acidité gastrique diminue du duodénum à l’iléon, favorisant le développement de micro-organismes (105 à 107/g de matières digestives dans l’iléon).

La flore du gros intestin L’iléon est relié au caecum et au côlon, constitutifs du gros intestin. La digestion des aliments se poursuit par fermentation dans le colon en présence d’un très grand nombre de micro-organismes (voir tableau 21.1). Les bactéries aérobies

Principales bactéries présentes

Œsophage

facultatives (Escherichia coli) sont en nombre plus restreint (moins de 107/g de matières digestives), mais favorisent l’anaérobiose en consommant l’oxygène, et donc le développement d’un grand nombre d’anaérobies stricts (1010 à 1011/g), majoritairement des espèces Bacteroides, mais aussi Clostridium et des bactéries fusiformes (voir figure 21.9). Enterococcus faecalis est aussi très représenté.

Les produits et fonctions de la flore intestinale Les micro-organismes de la flore intestinale, par la consommation des nutriments de la digestion et selon le régime alimentaire, réalisent un grand nombre de réactions métaboliques qui libèrent de nombreux produits (voir tableau 21.2). Parmi ceux-ci, les vitamines essentielles B12 et K, non produites par l’homme, sont apportées lors de la fermentation bactérienne digestive et sont absorbées par les muqueuses intestinales. Des dérivés stéroïdiens, produits par le foie et libérés avec la bile, sont transformés par les micro-organismes de cette flore et réabsorbés. D’autres produits, gaz et substances odorantes, sont issus du métabolisme des microorganismes fermentatifs et des méthanogènes. Plusieurs centaines de millilitres de gaz sont exhalés chaque jour par l’adulte, contenant pour plus de la moitié du N2 provenant de l’air aspiré. Certains aliments sont aussi métabolisés par ces micro-organismes fermentants en H2 et CO2, transformés en CH4 par les méthanogènes. Les méthanogènes représentent un tiers des micro-organismes de la flore intestinale et produisent du méthane pour un quart de la production issue du rumen chez les bovins (voir sections 13.4 et 19.10).

Organes

Principaux processus physiologiques

Prevotella Streptococcus Veillonella

Œsophage

Helicobacter

Estomac

Sécrétion acide (HCl) Digestion de macromolécules à pH 2

Intestin grêle

Digestion Absorption de monosaccharides, d’amino-acides, d’acides gras, d’eau à pH 4 à 5

Gros intestin

Absorption d’acides biliaires, de vitamine B12 à pH 7

Duodénum Entérocoques Lactobacilles Bacteroides Bifidobacterium Clostridium Entérobactéries Enterococcus Escherichia Eubacterium Klebsiella Lactobacillus Peptococcus Peptostreptococcus Proteus Ruminococcus Staphylococcus Streptococcus

Jéjunum

Iléon

Côlon

Anus

FIGURE 21.8 Le tube digestif de l’homme. Le schéma indique la répartition et les fonctions des bactéries non pathogènes habituellement trouvées chez un sujet sain.



726 Chapitre 21


Dwayne Savage et R. V. H. Blumershine

Dwayne Savage et R. V. H. Blumershine


(b)

(a)

FIGURE 21.9 Observation en microscopie électronique à balayage de la flore bactérienne vivant à la surface de l’épithélium d’iléon de souris. (a) Aspect fusiforme des bactéries à la surface de l’épithélium. (b) À plus fort grossissement, il apparaît que les bactéries (10 à 15 µm de long) sont reliées par leurs seules extrémités dans les dépressions de l’épithélium.

Lors de la digestion, l’eau issue des aliments est absorbée par la muqueuse gastro-intestinale, et les matières digérées sont concentrées au fur et à mesure du transit en selles, dont un tiers est représenté par les bactéries. Celles-ci sont continuellement éliminées avec les selles et reproduites dans les intestins (voir section 6.9). Le temps de transit chez l’homme est de 24 heures ; le taux de renouvellement de la population bactérienne est d’un à deux dédoublements par jour. Les antibiotiques inhibent la croissance des pathogènes comme des bactéries sensibles de la flore, favorisant l’émergence de bactéries résistantes opportunistes (Staphylococcus, Proteus, Clostridium difficile) ou parfois de levures (Candida albicans). Cette émergence peut conduire à des altérations des muqueuses intestinales et des fonctions digestives, pouvant induire une maladie (colite à C. difficile). L’arrêt de l’antibiothérapie permet la reconstitution de la flore gastro-intestinale.

TABLEAU 21.2

L’estomac contient un liquide acide et s’avère une barrière chimique efficace contre la croissance de la plupart des micro-organismes. Par contre, le tractus intestinal, contenant un milieu faiblement acide à neutre, permet la prolifération d’une population microbienne importante et variable. •

Indiquez pourquoi l’intestin grêle est plus favorable à la croissance de bactéries aérobies facultatives que le gros intestin.

•

Identifiez plusieurs produits issus du métabolisme de la flore intestinale. Que se passe t-il en cas d’antibiothérapie massive ?

21.5 Flore bactérienne normale m n des autres voies cutanéomuqueuses

Chaque muqueuse est susceptible d’héberger des microorganismes. Ceux-ci font partie de l’environnement normal du tissu sain. Dans ce contexte, les pathogènes ne peuvent pas s’y reproduire.

La voie respiratoire Cette voie se distingue en voies respiratoires haute et basse (voir figure 21.10). La voie respiratoire haute normale (nasopharynx, cavité buccale et gorge) contient dans les sécrétions muqueuses des micro-organismes (staphylocoques, streptocoques, cocci Gram négatif, corynébactéries, etc.) apportés par l’air, notamment les grains de poussière, lors de la respiration (voir tableau 21.1). Un grand nombre d’entre eux est capté par les voies nasales et refoulé par ses sécrétions. Certains pathogènes (comme Staphylococcus aureus ou Streptococcus pneumoniae) sont souvent présents en minorité dans la flore

APPORTS MÉTABOLIQUE ET BIOCHIMIQUE DES BACTÉRIES INTESTINALES

Synthèse de vitamine

Produit : thiamine, riboflavine, pyridoxine, vit. B12, vit. K

Production de gaz

Produit : CO2, CH4, H2

Production d’odeur

Produit : H2S, NH3, amines, indole, scatole (β-méthyl indole), acide butyrique

Production d’acide organique

Produit : acides acétique, propionique, butyrique

Réactions de glycosidase

Enzyme : β-glucuronidase, β-galactosidase, β-glucosidase, α-glucosidase, α- galactosidase

Métabolisme stéroïdien (acides biliaires)

Procédé : estérification, déhydroxylation, oxydation, réduction, inversion

Voies respiratoires hautes Voies respiratoires basses

Nasopharynx Cavité orale Gorge Trachée

Poumons

FIGURE 21.10 Le tractus respiratoire de l’homme. Les voies respiratoires hautes sont colonisées par une grande variété de micro-organismes, alors que les voies basses en sont pauvres, sauf dans les infections aiguës (voir section 26.2).



21.5 Flore bactérienne normale des autres voies cutanéomuqueuses 727

normale de sujets sains. L’infection ne se développe pas tant que la flore persiste à ce niveau par compétition de croissance avec ces pathogènes. Le système immunitaire inné (voir sections 22.2 et 23.1) et la réponse spécifique de type IgA (voir section 22.9), très active au niveau des muqueuses, participent aussi à limiter la croissance des pathogènes. La voie respiratoire basse normale (trachée, bronches et poumons) ne présente pas de flore persistante malgré l’apport important de l’air inspiré. En effet, les grains de poussière, relativement larges, restent localisés dans la voie haute et déposent les micro-organismes sur la paroi mucosale. Seules des particules de moins de 10 µm parviennent dans la voie basse. La présence d’un épithélium cilié contribue aussi à repousser ces particules vers la voie haute et à les rejeter par la salive et les sécrétions nasales.

Dans les voies génitales normales, le vagin de la femme adulte présente un milieu légèrement acide contenant une grande quantité de glycogène polysaccharidique. Celui-ci favorise la persistance de Lactobacillus acidophilus, qui fermente le glycogène en acide lactique et contribue à maintenir un milieu acide (voir figure 21.11b et section 12.19). D’autres micro-organismes s’y trouvent également (Torulopsis, Candida, streptocoques, E. coli, etc.). Avant la puberté et après la ménopause, le milieu vaginal, plus alcalin, ne contient pas de glycogène et de lactobacilles. La flore prédominante à ces stades est constituée de staphylocoques, de streptocoques, de corynebactéries et d’E. coli.

Contrôlez vos acquis La présence de micro-organismes non pathogènes dans les voies respiratoires et urogénitales est indispensable aux fonctions normales de ces organes et limite souvent l’expansion de pathogènes.

La voie urogénitale Dans les voies urinaires normales de l’homme et de la femme, la vessie reste stérile alors que l’urètre est colonisé par des cocci et des bacilles Gram négatif, aérobies facultatifs (voir tableau 21.1 et figure 21.11a). Des pathogènes tels qu’Escherichia coli ou Proteus mirabilis, normalement présents, peuvent s’y développer lors de la modification de facteurs locaux (comme le pH) et provoquer une infection.

•

Indiquez pourquoi les pathogènes normalement présents dans la voie respiratoire haute ne provoquent pas d’infection.

Vessie Ovaire Utérus

Col utérin

Vessie

Pubis

Prostate Rectum

Urètre

Pubis

Rectum Urètre

Pénis Testicules

Vagin

John Durham

(a)

(b)

FIGURE 21.11 Croissance bactérienne dans les voies génitourinaires. La couleur rouge localise les voies basses génitourinaires chez la femme (à droite) et chez l’homme (à gauche), où se concentrent les bactéries. Les voies hautes sont en général stériles sauf dans les infections génito-urinaires. (b) Coloration de Gram montrant des filaments violets de 3 à 4 µm de long, les lactobacilles (Lactobacillus acidophilus), bactéries prédominantes chez la femme de la puberté à la ménopause. La diminution de l’acidité de la flore bactérienne chez les sujets plus jeunes ou plus âgés contribue à une plus grande hétérogénéité de la flore, avec des bactéries dont la croissance est favorisée à pH neutre ou légèrement alcalin.



728 Chapitre 21

•

II


Expliquez les mécanismes favorisant la persistance de lactobacilles dans la voie génitale de la femme adulte et leur absence chez la femme ménopausée.

INTERACTIONS NÉFASTES ENTRE LES MICRO-ORGANISMES ET L’HOMME

La présence de pathogènes chez l’homme peut conduire à des infections qui passent par leur adhésion sur les cellules de l’hôte, leur croissance, l’envahissement et la colonisation du tissu. Ce développement non contrôlé peut aboutir à la maladie selon différentes stratégies de pathogénèse (voir figure 21.12).

21.6 Porte d’entrée du pathogène m n chez l’hôte Le pathogène doit envahir la peau ou les muqueuses des voies respiratoires, digestives ou urogénitales qui habituellement agissent comme barrière antimicrobienne en présence de la flore normale : ce point de départ défini la porte d’entrée du pathogène.

L’adhésion Le plus souvent, une lésion de la peau ou de la muqueuse favorise l’adhésion aux cellules épithéliales du pathogène Exposition aux pathogènes

par interaction moléculaire entre leurs surfaces (voir figure 21.13). Le pathogène ne se fixe pas sur toutes les cellules épithéliales, mais adhère spécifiquement à des cellules d’une partie précise du corps. Ainsi Neisseria gonorrhoeae, l’agent de l’urétrite gonococcique, maladie sexuellement transmissible (voir section 26.12), adhère spécifiquement via une protéine de surface Opa (opacity associated proteins) au récepteur CD66 des cellules de l’épithélium urogénital. L’hôte intervient aussi dans cette adhésion spécifique. Les bactéries qui habituellement infectent l’homme adhèrent plus fortement à l’épithélium humain qu’à celui d’autres animaux (comme le rat). Certaines macromolécules (comme les polysaccharides ou les protéines) impliquées dans ces adhésions ne sont pas liées de manière covalente aux bactéries, mais sécrétées par celles-ci (voir section 4.10). Elles constituent autour de la bactérie un réseau fibreux de polymères, appelé slime ou glycocalyx, favorisant la constitution d’un biofilm (voir figure 21.4). L’enveloppe dense de polymère autour de la bactérie constitue la capsule (voir figures 21.13 et 21.14). Ces structures polymériques sont importantes non seulement pour l’adhésion des bactéries aux tissus, mais aussi pour la fixation d’autres bactéries. Elles protègent aussi les bactéries des défenses de l’hôte (phagocytose, voir section 22.2). Les fimbriae et les pili sont des protéines de surface bactérienne impliquées dans l’adhésion aux glycoprotéines des cellules de l’hôte (voir chapitre 4.10). Les pili de Neisseria gonorrhoeae et les fimbriae d’Escherichia coli permettent l’adhésion à l’épithélium urogénital et sont plus fréquemment présents dans les infections urogénitales (voir figure 21.15). Les fimbriae de type 1 des entérobactéries (Escherichia, Klebsiella,

Adhérence cutanée ou mucosale

Réexposition Invasion à travers l’épithélium

Colonisation et croissance : production de facteurs de virulence

Toxicité : effet local ou systémique des toxines

Invasion : croissance au site d’entrée et à distance sur d’autres sites (diffusion)

Lésions tissulaires et maladies

FIGURE 21.12 Micro-organismes et pathogénèse. La présence voire la croissance de bactéries chez l’hôte ne signe pas forcément une infection.

(a)

J. W. Costerton

E. T. Nelson, J. D. Clements, et R. A. Finkelstein

Réexposition aux sites locaux d’entrée

(b)

FIGURE 21.13 Adhérence aux tissus des pathogènes bactériens. (a) Adhérence de Vibrio cholerae à la bordure en brosse des villosités chez le lapin (observation en microscopie électronique à transmission). Notez l’absence de capsule autour de la bactérie (en haut). (b) Escherichia coli, entéropathogène dans un modèle d’infection fatale chez le veau nouveau-né. Les bactéries (à droite) adhèrent à la bordure en brosse des villosités chez le veau via une capsule bien délimitée (en gris foncé autour de la bactérie ; diamètre : 0,5 µm).



(a)

James A. Roberts

CDC / Larry Stauffer, Oregon State PHL/PHIL

21.6 Porte d’entrée du pathogène chez l’hôte 729

FIGURE 21.15 Fimbriae. Une microscopie électronique en contraste de phase révèle des fimbriae de type P chez Escherichia coli. Ils ressemblent aux fimbriae de type I mais sont un peu plus grands (diamètre : 0,5 µm)

Escherichia coli est une bactérie le plus souvent non pathogène, que l’on trouve dans la flore normale du caecum et du côlon et qui est éliminée par les selles (voir figure 21.18). De nombreuses souches différentes sont identifiables. Les souches productrices d’entérotoxines expriment des fimbriae particulières appelées CFA (colonization factor antigens), qui adhèrent aux cellules épithéliales de l’intestin grêle. Elles colonisent alors la muqueuse et produisent leurs entérotoxines favorisant la diarrhée (voir sections 21.11 et 29.8). Les principaux facteurs d’adhésion des micro-organismes sont rapportés dans le tableau 21.3.

CDC / Larry Stauffer, Oregon State PHL/PHIL

L’envahissement

(b) FIGURE 21.14 Capsule de Bacillus anthracis. (a) Colonies de B. anthracis encapsulés sur milieu bicarbonaté ; aspect typique mucoïde et large (diamètre 0,5 cm). (b) Capsule marquée en fluorescence directe, en présence d’anticorps spécifiques marqués par l’isothiocyanate de fluorescéine (FITC, voir section 24.9). La capsule se distingue nettement de la bactérie (diamètre : 0,5 µm), entraînant un élargissement de 1 µm. Cette bactérie, responsable de la maladie du charbon ou anthrax, fait partie de l’arsenal de guerre bactériologique (voir sections 25.12 et 25.13).

Salmonella, Shigella, etc.) sont répartis uniformément à la surface de la bactérie. Les pili sont en général plus longs et moins nombreux. La présence de flagelles peut aussi faciliter l’adhésion à la cellule (voir section 4.14 et figure 21.17).

La plupart des micro-organismes développent leur pathogénicité par l’envahissement du tissu colonisé au niveau de la porte d’entrée (brèche, lésion, etc.). Ils peuvent aussi se développer sur un tissu sain lors d’une réduction, voire une complète élimination, de la flore normale (antibiothérapie). L’envahissement peut aussi se produire à distance de la porte d’entrée, sur des tissus profonds, notamment après une dissémination sanguine ou lymphatique (voir section 22.1). Enfin, quelques micro-organismes développent leur pathogénicité sans contact direct avec le tissu, par la production et la diffusion de toxines (voir sections 21.10 et 21.11).

Contrôlez vos acquis Les pathogènes atteignent les tissus de l’hôte après adhésion aux cellules épithéliales des muqueuses par des interactions macromoléculaires. L’envahissement commence à ce stade et peut s’étendre via la circulation sanguine. •

Indiquez en quoi les molécules CFA d’Escherichia coli et OPA de Neisseria gonorrhoeae influencent l’adhésion aux cellules.

•

Comment l’adhésion prépare-t-elle l’envahissement ?



730 Chapitre 21

TABLEAU 21.3


PRINCIPAUX FACTEURS D’ADHÉSION PERMETTANT L’ATTACHEMENT a DES BACTÉRIES AUX TISSUS DE L’HÔTE

Facteur

Exemple

Capsule/dextrane (voir section 4.10, figures 21.4, 21.13 et 21.14)

Escherichia coli pathogène – capsule induisant l’adhésion à la bordure en brosse des villosités intestinales

Protéines d’adhésion

Streptococcus pyogenes – protéine M se liant aux récepteurs sur la muqueuse respiratoire

Streptococcus mutans – dextrane, couche collante favorisant l’adhésion à la surface dentaire

Neisseria gonorrhoeae – protéine Opa se liant aux récepteurs sur l’épithélium urogénital Acide lipotéichoïque (voir section 4.8 et figure 4.31)

Streptococcus pyogenes – favorisant la fixation au récepteur de la muqueuse respiratoire (avec la protéine M)

Fimbriae et pili (voir section 4.10 et figure 21.15)

Neisseria gonorrhoeae – pili favorisant l’adhésion à l’épithélium urogénital Espèce Salmonella – pili type I favorisant l’adhésion à l’épithélium de l’intestin grêle Escherichia coli pathogène – colonisation facteur antigènes (CFA) favorisant l’adhésion à l’épithélium de l’intestin grêle

a

La plupart des sites récepteurs sur les tissus de l’hôte sont des glycoprotéines ou des lipides complexes tels que les gangliosides ou les globosides.

Localisation et diffusion chez l’hôte Le pathogène reste très souvent localisé à la porte d’entrée. Il s’y reproduit en foyers localisés, tels les furoncles développés par Staphylococcus (voir section 26.9). Cependant, la bactérie peut soit pénétrer dans le système lymphatique et se localiser dans les ganglions, soit passer dans le sang et diffuser dans les tissus plus profonds (le plus souvent le foie et la rate). La diffusion par voie sanguine ou lymphatique contribue à l’infection généralisée ou systémique de l’hôte. Si l’envahissement des tissus s’avère important, les bactéries peuvent être relarguées dans le sang, provoquant la bactériémie. Ces infections sévères ont toujours un point de départ tissulaire (le plus souvent reins, intestins, poumons) avec une infection localisée qui se généralise. La mise en évidence de cette infection initiale est capitale pour la prise en charge de l’infection systémique, qui constitue une situation d’urgence thérapeutique.

Contrôlez vos acquis Le pathogène doit accéder aux nutriments pour se développer et coloniser les différents tissus de l’hôte. Il peut soit se développer localement au point d’entrée, soit diffuser chez l’hôte. •

Indiquez en quoi la colonisation et la croissance sont indispensables au développement de la plupart des pathogènes.

•

Citez les facteurs de l’hôte qui limitent ou favorisent la colonisation et la croissance des pathogènes.

21.7 Colonisation et croissance m n

21.8 Virulence m n

La colonisation est l’étape de croissance du pathogène dans le tissu après adhésion, lors de conditions environnementales favorables (nutriments, température, pH, oxygénation ou anoxie). Les nutriments disponibles (sucre, acides aminés, acides organiques, etc.) sont limités chez l’hôte. Les micro-organismes doivent alors consommer des nutriments plus complexes (glycogène). L’apport en vitamines et en facteurs de croissance peut être aussi limité. Ainsi, Brucella abortus se développe lentement dans la plupart des tissus chez la vache, mais plus rapidement dans le placenta, en présence d’érythritol, et sera à l’origine d’un avortement spontané (voir tableau 21.6). Une plus forte concentration en fer favorise aussi la croissance bactérienne (voir section 5.1). De même, les protéines de l’hôte, transferrine et lactoferrine, fixent le fer avec une forte affinité et favorisent son déplacement, limitant la croissance des bactéries. Pour cela, les bactéries produisent des molécules chélatant le fer dans leur environnement, les sidérophores (voir section 5.1). Ceux-ci, chez certains pathogènes, sont capables de dissocier les liaisons du fer aux protéines de l’hôte. Le plasmide ColV d’Escherichia coli code un sidérophore appelé aérobactine capable de déplacer le fer de la transferrine (voir partie 10.9). Ce phénomène est aussi observé chez les bactéries du genre Neisseria.

La virulence est la capacité d’un micro-organisme à développer une maladie.

L’étude de la virulence La virulence d’un pathogène est exprimée en dose létale 50 (DL50) à partir des études expérimentales. C’est la dose permettant la mort de 50 % des animaux du groupe testé. Un pathogène est très virulent lorsqu’un faible nombre de bactéries (inoculum) est nécessaire pour tuer 100 % des animaux. L’infection expérimentale à Streptoccoccus pneumoniae et à Salmonella typhimurium chez la souris montre qu’il faut très peu de streptocoques pour entraîner la mort des souris, alors qu’il faut cent fois plus de salmonelles pour obtenir la même DL50 (voir figure 21.16). Cette virulence peut diminuer, voire disparaître, après culture au laboratoire : il s’agit de souches atténuées. L’atténuation se produit avec l’apparition de mutants dont la croissance est plus rapide en culture et qui seront sélectionnés lors de réisolement en culture dans des conditions sous-optimales. Lors de la réintroduction de la souche atténuée chez l’animal, la virulence peut éventuellement s’exprimer à nouveau, mais le plus souvent elle est perdue. Cette approche est utilisée pour



Pourcentage de mortalité chez la souris

21.8 Virulence 731

100

Bactérie de virulence modérée (Salmonella typhimurium)

Bactérie de forte virulence (Streptococcus pneumoniae)

80 60 40 20

101

102

103

104

105

106

107

Nombre de cellules bactériennes inoculées par souris FIGURE 21.16 Virulence microbienne. Variation de la virulence selon le nombre de cellules bactériennes entraînant la mort des souris.

la constitution de vaccins à souche atténuée, tel le BCG, le bacille de Calmette et Guérin, forme apparentée au bacille de la tuberculose (voir section 22.13). Des virus vivants atténués sont aussi préparés par passage en culture cellulaire pour la constitution des vaccins contre la rubéole, les oreillons et la rougeole (voir section 26.7).

Toxicité et invasion La virulence du micro-organisme s’exprime par sa toxicité et sa capacité d’invasion de l’hôte. La toxicité se caractérise par la faculté d’un micro-organisme à développer la maladie via la production de toxines. Ainsi, Clostridium tetani se développe

FIGURE 21.17 Facteurs de virulence dans la pathogénèse des salmonelles. Le schéma indique les principaux facteurs structuraux impliqués dans la pathogénèse. Les protéines exprimées par le système génétique pho n’ont pas été identifiées, mais elles neutralisent les effets détergents des défensines produites par les macrophages.

lentement et reste localisé le plus souvent dans le tissu lésé au point d’entrée, provoquant le tétanos par la production d’une exotoxine (toxine tétanique), qui diffuse à partir de ce site (voir section 21.10). Cette toxine provoque une contraction musculaire irréversible (tétanos), très souvent mortelle (voir figure 21.21). L’invasion se caractérise par la capacité d’un micro-organisme à induire la maladie en se développant directement dans le tissu et en bloquant ses fonctions, en l’absence de toxine. Ainsi, Streptococcus pneumoniae produit une capsule polysaccharidique qui le protège de la phagocytose chez l’hôte (voir sections 21.6 et 26.2 et figure 26.3). Cette protection lui permet l’envahissement du tissu pulmonaire et entraîne une pneumopathie sévère (voir section 26.2). Par contre, les souches non capsulées sont rapidement phagocytées et éliminées par l’hôte. La plupart des bactéries utilisent ces deux mécanismes, toxicité et invasion, pour exprimer leur pathogénicité.

La virulence des salmonelles Le genre Salmonella utilise ces mécanismes de toxicité et d’invasion, ainsi que d’autres facteurs de virulence, pour développer la maladie (voir figure 21.17). Trois toxines sont produites : entérotoxine (voir tableau 21.4), endotoxine (voir section 4.9 et figure 4.35) et cytotoxine. Cette dernière inhibe la synthèse des protéines cellulaires et favorise la libération du Ca2+ des cellules. Les facteurs d’invasion produits par les salmonelles, l’antigène O polysaccharidique (voir figure 4.35), l’antigène flagellaire H et les fimbriae, favorisent l’adhésion. L’antigène capsulaire Vi polysaccharidique inhibe la fixation du complément et la lyse médiée par les anticorps (voir section 22.11). Le gène inv (invasion) de la salmonelle code au moins dix protéines impliquées dans l’invasion (invH, une protéine de surface d’adhésion, invC, invG, invI et invJ, protéines impliquées dans un complexe interagissant avec la surface cellulaire de l’hôte).

Sidérophores Entérotoxine (diarrhées) Endotoxine dans la couche des LPS (fièvre)

Protéine antiphagocytose induite par oxyR

Antigène O (inhibe la phagocytose)

Fimbriae de type 1 (adhérence)

Protéine inv de surface (adhérence) Plasmide de virulence Cytotoxine (inhibe la synthèse des protéines de l’hôte ; influx calcique intracellulaire ; adhérence) Antigène de capsule Vi (inhibe la fixation du complément) Flagelle (mobilité) et antigène H (adhérence ; inhibe la phagocytose)



732 Chapitre 21


TABLEAU 21.4

EXOTOXINES ET FACTEURS EXTRACELLULAIRES DE VIRULENCE BACTÉRIENNE

Bactérie

Maladie

Toxine ou facteura

Activité

Bacillus anthracis

Anthrax ou charbon

Facteur létal (FL) Facteur œdèmateux (FO) Antigène de protection (AP) (AB)

AP est le site de liaison du composant B, FO induit l’œdème, FL entraîne la mort cellulaire

Bacillus cereus

Intoxication alimentaire

Complexe entérotoxique

Induit une perte d’eau des cellules intestinales

Bordetella pertussis

Coqueluche/toux

Toxine (AB)

Bloque la transduction du signal de la protéine G = mort cellulaire


Botulisme

Neurotoxine (AB)

Paralysie flasque (voir figure 21.20)

Clostridium tetani

Tétanos

Neurotoxine (AB)

Paralysie spastique (voir figure 21.21)


Gangrène gazeuse, intoxication alimentaire

α-toxine (TC)

Hémolyse (lécithinase, voir figure 21.18b) Hémolyse Hémolyse Hémolyse (cardiotoxine) Collagénase Protéase Altère la perméabilité de l’épithélium intestinal

β-toxine (TC) γ-toxine (TC) δ-toxine (TC) κ-toxine (E) λ-toxine (E) Entérotoxine (TC)

Corynebacterium diphtheriae

Diphtérie

Toxine diphtérique (AB)

Inhibe la synthèse protéique des eukaryotes (voir figure 21.19)

Escherichia coli (souche entérotoxique)

Gastro-entérite

Entérotoxine (AB)


Haemophilus ducreyi

Chancre mou

Toxine CDb (AB)

Génotoxine (lésions ADN induisant l’apoptose cellulaire)


Infections pyocyaniques

Exotoxine A (AB)

Inhibe la synthèse protéique

Salmonella sp.

Salmonellose, fièvre typhoïde, fièvre paratyphoïde

Entérotoxine (AB)

Inhibe la synthèse protéique et lyse les cellules

Cytotoxine (TC)


Shigella dysenteriae

Dysenterie

Toxine dysentérique (AB)

Inhibe la synthèse protéique


Infections pyogène (pus), cutanée (furoncle, panaris…), respiratoire, alimentaire ; syndrome choc toxique, syndrome cutané

α-toxine (TC) Toxine du syndrome de choc toxique (SA) Toxine exfoliatine A et B (SA) Leukocidine (TC) β-toxine (TC) γ-toxine (TC) δ-toxine (TC) Entérotoxine A, B, C, D, et E (SA) Coagulase (E)

Hémolyse Choc systémique

Infection pyogène,

Streptolysine O (TC)

Hémolysine

angine, scarlatine

Streptolysine S (TC)

Hémolysine (voir figure 21.18a)

Toxine érythrogène (SA)

Éruption fébrile

Streptokinase (E)

Fibrinolyse

Hyaluronidase (E)

Dissolution de l’acide hyaluronique dans les tissus

Entérotoxine (AB)

Induit une perte d’eau des cellules intestinales (voir figure 21.22)


Vibrio cholerae

Choléra

Décollement cutané, choc Destruction des leukocytes Hémolyse Mort cellulaire Hémolyse, leukolyse Vomissement, diarrhée, choc Induit la coagulation sanguine

a

AB = toxine A-B ; TC = toxine cytolytique ; E = facteur enzymatique de virulence ; SA = toxine superantigénique. La toxine CD se retrouve chez d’autres bactéries Gram négatif telles qu’Actinobacillus actinomycetemcomitans, Campylobacter sp., Escherichia coli, Helicobacter sp., Salmonella typhi et Shigella dysenteriae.

b



21.9 Facteurs de virulence 733

Les salmonelles se développent dans les cellules intestinales de l’hôte, ainsi que dans les macrophages et les leucocytes qui les phagocytent afin de les éliminer (voir section 22.2). Le gène oxyR des salmonelles code une protéine, neutralisant l’effet toxique de l’oxygène produit par les macrophages en réaction à l’infection. Les macrophages produisent aussi des défensines, à activité antibactérienne, qui sont neutralisées par les protéines des gènes phoP et phoQ des salmonelles. Ainsi, les produits des gènes oxy et pho contribuent à neutraliser les défenses de l’hôte contre l’infection des salmonelles. Cellesci possèdent aussi des plasmides offrant une résistance aux antibiotiques. Elles produisent aussi des sidérophores, protéines chélatant le fer (voir sections 5.1 et 21.7). Les salmonelles développent différentes stratégies pour forger leur virulence et induire la maladie, des stratégies qui sont aussi développées par les autres entérobactéries (voir section 12.11).

Contrôlez vos acquis La virulence est déterminée par l’invasion, la toxicité et d’autres facteurs produits par le pathogène, le plus souvent de manière conjuguée (Salmonella). L’atténuation correspond à une perte de virulence. •

Différenciez toxicité et invasion. Illustrez à l’aide d’exemples de bactéries développant exclusivement l’une ou l’autre de ces propriétés.

•

Expliquez comment s’obtient l’atténuation et quel est le rôle des micro-organismes atténués dans la vaccination.

III

Fibrine, caillot et virulence Un caillot de fibrine se forme très souvent sur le site d’invasion du micro-organisme chez l’hôte. Le tissu constitue ce caillot en réaction à l’infection, pour isoler le pathogène. Streptococcus pyogenes produit une streptokinase qui agit en dégradant le caillot (activité de fibrinolyse). À l’opposé, Staphylococcus aureus produit une coagulase qui favorise la formation du caillot (fibrinogène) afin de protéger la bactérie des défenses de l’hôte ; dans ce cas, l’infection (furoncle, panaris, etc.) reste localisée (voir tableau 21.4 et figure 26.21). Ces staphylocoques à coagulase positive (S. aureus ou staphylocoques dorés) sont donc beaucoup plus virulents que ceux à coagulase négative (staphylocoques blancs).

Contrôlez vos acquis Les pathogènes produisent différentes enzymes qui contribuent à leur virulence en dégradant le tissu de l’hôte, en favorisant la diffusion des pathogènes dans un environnement riche en nutriments et en les protégeant des défenses de l’hôte. Ces facteurs de virulence facilitent la colonisation et l’invasion. •

Indiquez quel avantage trouve le micro-organisme à produire des enzymes qui lysent les composants structuraux des tissus.

•

Montrez en quoi l’activité de la coagulase facilite la croissance de Staphylococcus aureus.

21.10 Exotoxines m n FACTEURS DE VIRULENCE ET TOXINES

Les micro-organismes pathogènes produisent des facteurs de virulence et/ou des toxines qui permettent le développement de leur pathogénicité. Il existe un grand nombre de facteurs et de toxines mais ils partagent des caractères moléculaires et des modes d’action semblables.

21.9 Facteurs de virulence m n Les facteurs de virulence sont des protéines sécrétées par les pathogènes. Ce sont le plus souvent des enzymes qui facilitent la colonisation et la croissance des pathogènes chez l’hôte. L’hyaluronidase produite par les streptocoques, les staphylocoques et certains Clostridium, permet la diffusion de la bactérie dans le tissu en clivant l’acide hyaluronique constitutif du ciment intercellulaire polysaccharidique (voir tableau 21.4). Les streptocoques et les staphylocoques produisent aussi des protéases, des nucléases et des lipases qui dégradent les protéines, les acides nucléiques et les lipides. Les Clostridium à l’origine de la gangrène gazeuse produisent une collagénase (toxine κ), qui permet la dégradation du collagène dans la matrice extracellulaire et la diffusion de la bactérie.

Les exotoxines sont des protéines toxiques sécrétées par des micro-organismes lors de leur croissance. Ces toxines diffusent, circulent et provoquent des lésions tissulaires à distance de l’infection (tableau 21.4). Elles se répartissent en trois catégories : 1) les toxines cytolytiques, qui sont des enzymes provoquant la lyse cellulaire ; 2) les toxines A-B, qui sont deux sous-unités A et B unies par liaison covalente ; la sousunité B se lie au récepteur cellulaire et permet le passage de la sous-unité A dans la cellule pour y exercer son action néfaste ; 3) les toxines superantigéniques, qui stimulent un grand nombre de cellules de la réponse immunitaire de l’hôte, créant une réaction inflammatoire étendue (voir section 22.16).

Les toxines cytolytiques Ces toxines présentent une activité cytolytique facilement détectée par lyse des hématies (érythrocytes) dans une gélose au sang, au contact des colonies des bactéries sécrétant ces toxines (zone d’hémolyse, voir figure 21.18a) ; elles sont appelées hémolysines (voir tableau 21.4). Elles sont aussi capables de lyser d’autres cellules. Certaines hémolysines dégradent les phospholipides des membranes cellulaires et sont appelées phospholipases ou lécithinases ; leur substrat est la lécithine phospholipide (phosphatidylcholine). Clostridium perfringens produit une lécithinase (toxine α) qui dissout les




T. D. Brock

FIGURE 21.18 Hémolyse. (a) Zone d’hémolyse (auréole claire) autour de colonies de Streptococcus pyogenes sur gélose au sang. (b) Action de la lécithinase, une phospholipase, autour des colonies de Clostridium perfringens dans un milieu gélosé à base de jaune d’œuf, riche en lécithine. La lécithinase exprimée par les bactéries dégrade les membranes des hématies, entraînant une large hémolyse autour des colonies.

Leon J. LeBeau

734 Chapitre 21

(a)

(b)

lipides membranaires conduisant à la lyse cellulaire (voir figure 21.18b et tableau 21.4). Ces phospholipases peuvent aussi dégrader certaines bactéries ; en effet, les membranes bactériennes contiennent aussi des phospholipides. Les streptocoques produisent des hémolysines (streptolysine O) qui dégradent les stérols membranaires des cellules de l’hôte. Les leucocidines lysent les leucocytes et réduisent la résistance de l’hôte (voir tableau 21.4).

La toxine diphtérique Elle est produite par Corynebacterium diphtheriae et contribue à la pathogénèse de cette bactérie (voir section 26.3). La toxine est transmise à la bactérie par le phage qui contient le gène tox qui code cette toxine (lysogenèse). Seules les souches bactériennes lysogènes sont pathogènes ; les souches non pathogènes et non toxinogènes peuvent devenir pathogènes après infection par le phage (conversion phagique, voir section 10.8). La souris et le rat sont résistants à l’action de cette toxine, alors que l’homme, le lapin, le cobaye et les

oiseaux y sont très sensibles. C’est une toxine A-B, constituée d’un seul polypeptide. Son mode d’action sur la cellule épithéliale est décrit dans la figure 21.19. L’exotoxine A de Pseudomonas aeruginosa présente une activité identique à la toxine diphtérique (voir tableau 21.4).

Les toxines botulinique et tétanique Ces toxines sont produites par deux bactéries Gram positif anaérobies, Clostridium botulinum et Clostridium tetani. Ces bactéries sont habituellement présentes dans le sol et occasionnellement chez l’homme, où elles peuvent provoquer le botulisme et le tétanos. Le botulisme ne s’exprime pas chez l’hôte par une invasion de Clostridium botulinum, mais, plus souvent, par l’absorption de toxines produites lors de la croissance de cette bactérie dans les aliments (voir section 29.6). La mort survient après une détresse respiratoire sérieuse, causée par une paralysie musculaire flasque. Le tétanos s’exprime après le développement de Clostridium tetani sur une lésion profonde cutanée et la libération de toxines au

B

A

Extérieur

B

Membrane bactérienne

A

Intérieur

A

Légende B Toxine diphtérique

EF—2

Acide aminé

EF—2*

2*

EF—

2 EF—

ARN

A

ARN

t

t

Ribosome

(a)

Synthèse protéique normale

(b)

Arrêt de la synthèse protéique

FIGURE 21.19 Action de la toxine diphtérique de Corynebacterium diphtheriae. (a) Le facteur d’élongation 2 (EF-2) se fixe normalement au ribosome et apporte l’ARN de transfert chargé en acide aminé (ARNt–AA) pour la synthèse protéique. (b) La toxine diphtérique se fixe à la membrane bactérienne, où elle est clivée en deux peptides, dont le peptide A qui est internalisé. Ce dernier catalyse le site ADP-ribosylation de EF-2, bloquant sa capacité à apporter l’ARNt–AA au ribosome, inhibant ainsi la synthèse protéique et conduisant à la mort de la bactérie.



21.11 Entérotoxines 735

contact des cellules neuronales, conduisant à la mort par paralysie musculaire spastique (voir section 27.9). La toxine botulinique est constituée de sept toxines A-B ; c’est une des plus toxiques, capable de tuer plus d’un million de cobayes à partir d’un milligramme de substance. Deux des toxines sont codées par le bactériophage lysogénique de C. botulinum. La principale toxine est une protéine qui devient toxique en s’associant en hétérodimère avec d’autres protéines bactériennes non toxiques. Son mode d’action conduisant à la paralysie flasque est décrit dans la figure 21.20. La toxine tétanique est aussi une toxine A-B. Son mode d’action, conduisant à la paralysie spastique, est décrit dans la figure 21.21. La contraction musculaire qui en résulte est irréversible ; au niveau facial, elle provoque une contraction locale, appelée trismus, et, au niveau respiratoire, la contraction prolongée entraîne la mort par asphyxie.

Contrôlez vos acquis Les toxines les plus actives sont les exotoxines produites par certains micro-organismes. Chaque exotoxine est active sur une cible cellulaire spécifique de l’hôte, entraînant un dysfonctionnement des cellules cibles. •

Indiquez les caractères communs aux exotoxines. Quels sont les caractères spécifiques des toxines A-B ?

•

Précisez si les bactéries doivent obligatoirement se développer et provoquer une infection pour produire des exotoxines.

21.11 Entérotoxines m n Les entérotoxines sont des exotoxines dont l’activité s’exerce dans l’intestin grêle, produisant en général une sécrétion de liquide massive dans la lumière intestinale et se traduisant par des vomissements et des diarrhées. Elles sont produites par des bactéries d’origine alimentaire (Staphylococcus aureus, Clostridium perfringens, Bacillus cereus) ou des pathogènes intestinaux (Vibrio cholerae, Escherichia coli, Salmonella enteritidis).

La toxine cholérique L’entérotoxine la mieux connue est celle produite par Vibrio cholerae, l’agent du choléra (voir section 28.5). C’est une toxine A-B constituée d’une sous-unité A et de cinq sous-unités B (voir section 21.10). Ces dernières se fixent spécifiquement au ganglioside GM1, un complexe glycolipidique localisé dans la membrane des cellules épithéliales intestinales. L’activité toxique est médiée par la sous-unité A selon le mécanisme d’action décrit dans la figure 21.22. Après fixation spécifique des sous-unités B, la sous-unité A stimule l’adényl cyclase, présente dans un grand nombre de cellules et tissus, mais plus spécialement ceux des muqueuses de l’intestin grêle. L’adényl cyclase provoque une inversion du flux sodique qui s’accompagne d’une fuite hydrique vers la lumière intestinale, provoquant des diarrhées importantes en phase aiguë de la maladie. Le décès est dû à la déshydratation qui s’ensuit. Le traitement symptomatique passe par une réhydratation par perfusion de solutions hypertoniques. L’expression de cette toxine, codée par les gènes ctxA et ctxB de Vibrio cholerae, est sous le contrôle d’une protéine de régulation, présente dans la

Stimulation du système nerveux central

AA A

A A AA A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A

AA A

AA A

AA A

A AA

Muscle

Situation normale L’acétylcholine (A) induit la contraction des fibres musculaires (a)

Botulisme La toxine botulinique empêche la libération de A et inhibe la contraction (b)

FIGURE 21.20 Action de la toxine botulinique de Corynebacterium botulinum. (a) Sous l’influence de stimulation des voies nerveuses centrales et périphériques, des vésicules neuronales sécrètent normalement l’acétylcholine (A) au contact des voies motrices musculaires ; elle se fixe à des récepteurs sur les cellules musculaires, conduisant à leur contraction. (b) La toxine botulinique bloque la sécrétion de A et donc la stimulation des cellules musculaires de manière irréversible, conduisant à la paralysie flasque, typique du botulisme (voir section 29.6).



736 Chapitre 21

G


Cellules interneuronales inhibitrices

GG G G GG G GG GG GG

AA A

AA A

GG G

G GG

Inhibition

G GG

Stimulation du système nerveux central A AA

Toxine tétanique

AA A A

G

AA A

AA A

A

A

A A

A

A

A

A

A

AA

A

A A

AA A A

A

A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A

Muscle

Situation normale La glycine (G), produite par les interneurones, bloque la libération de l’acétylcholine (A) et favorise la relaxation musculaire.

Tétanos La toxine tétanique se fixe sur les interneurones, empêche la libération de G et favorise la contraction musculaire par A.

(a)

(b)

FIGURE 21.21 Action de la toxine tétanique de Corynebacterium tetani. (a) Le relâchement musculaire est induit par la glycine (G), produite par des cellules interneuronales inhibitrices. La glycine agit sur le moteur neuronal en bloquant sa stimulation et donc la sécrétion de l’acétylcholine (A). (b) La toxine tétanique se fixe sur l’interneurone, bloquant ainsi la libération de G ; celle-ci ne régule plus négativement la sécrétion de A, qui agit alors sur la fibre musculaire par contraction, de manière continue et irréversible, conduisant à la paralysie spastique, typique du tétanos (voir section 27.9 et figure 27.19).

membrane bactérienne, codée par le gène toxR. Cette protéine favorise l’expression des protéines de la membrane externe et la production des pili, indispensable à l’adhésion et la colonisation de la bactérie sur l’épithélium intestinal.

Les autres entérotoxines Les souches pathogènes entérotoxiques d’autres entérobactéries, Escherichia et Salmonella, produisent des entérotoxines de structure et de fonction semblables à celle de Vibrio cholerae. Elles sont aussi produites dans les intestins lors de la croissance bactérienne. Par contre, les entérotoxines produites par les bactéries d’origine alimentaire ont des modes d’action différents, cytotoxique pour Clostridium perfringens et superantigénique pour Staphylococcus aureus (voir tableau 21.4 et section 22.16). Les toxines d’origine alimentaire peuvent aussi être acquises après ingestion des aliments, dans lesquels se développe la bactérie toxinogène, et ne nécessitent pas obligatoirement une croissance bactérienne dans les intestins.

•

Indiquez les points communs de toutes les entérotoxines, des entérotoxines A-B.

•

Décrivez le mode d’action de l’entérotoxine de Vibrio cholerae dans l’intestin grêle. Pourquoi observe-t-on une fuite d’eau massive ?

21.12 Endotoxines m n Ce sont des lipopolysaccharides (LPS) produits par de nombreuses bactéries Gram négatif (Escherichia, Shigella, Salmonella, etc.) au niveau de leur paroi (face externe). Elles sont libérées en grande quantité lors de la lyse bactérienne seulement, alors que les exotoxines sont sécrétées par des bactéries vivantes (voir tableau 21.5).

Structure et fonction des endotoxines

Contrôlez vos acquis Les entérotoxines sont des exotoxines qui touchent spécifiquement l’intestin grêle et sont à l’origine d’une perméabilité de la muqueuse intestinale au flux ionique et à l’eau, conduisant à la diarrhée. Elles sont constituées surtout de toxines A-B, mais aussi de cytotoxines ou de superantigènes.

Les LPS sont constitués de trois sous-unités (lipide A, polysaccharide central et polysaccharide O) reliées par des liaisons covalentes (voir figures 4.34 et 4.35). Le lipide A est porteur de la fraction active, alors que la région lipopolysaccharidique permet l’hydrosolubilité et l’immunogénicité, l’ensemble étant indispensable à l’effet toxique (voir section 22.5). Ces endotoxines ont des effets variables. Elles provoquent la fièvre, par



21.13 Facteurs de risque d’infection 737 1. Flux ionique normal : Na+ de la lumière intestinale

vers le sang, sans déplacement net du Cl– Sang

Cellule épithéliale intestinale

Lumière de l’intestin grêle GM1

Na+

Na+

2. Colonisation et production toxinique

GM1

Toxine cholérique A-B Bactérie Vibrio cholerae

3. Activation de l’adényl-cyclase des cellules épithéliales par la toxine cholérique Sous-unités A

Sousunités B

Adényl-cyclase ATP

AMP cyclique

stimulation des cellules de l’hôte libérant des protéines endogènes pyrogènes, actives sur le centre de contrôle de la température au niveau du cerveau. Elles sont aussi à l’origine de diarrhées, d’une lymphocytopénie, d’une leucopénie, d’une thrombopénie, d’une libération de cytokines et de facteurs d’inflammation (voir section 22.3). De fortes doses d’endotoxines peuvent provoquer le décès par choc hémorragique et nécrose tissulaire. Cependant leur toxicité est beaucoup moins importante que celle des exotoxines ; la dose létale DL50 d’une endotoxine chez la souris est environ dix millions de fois plus faible que celle de la toxine botulinique (200 à 400 µg par souris contre 25 pg).

Test Limulus des endotoxines Les endotoxines étant pyrogènes, il est important de s’assurer de leur absence dans les préparations pharmaceutiques (antibiotiques, solutions intraveineuses, etc.). Un test a été développé pour cela, utilisant la lyse des amébocytes (cellules sanguines) d’un arthropode marin, Limulus polyphemus, très sensibles aux endotoxines (voir figure 21.23). En présence d’une endotoxine, les amébocytes sont lysés, gélifiés et précipités, modifiant la turbidité du milieu qui est mesurable en spectrophotométrie (seuil à 10 pg/mL de LPS). Ce test est très sensible à la contamination bactérienne et son application nécessite de grandes précautions. Il est aussi applicable pour la recherche d’endotoxines dans le sérum, le liquide céphalorachidien et les eaux de source.


4. Inhibition du flux sodique (Na+) et passage net du Cl– vers la lumière intestinale Na+

Cl–

Les endotoxines sont des lipopolysaccharides issus de la paroi des bactéries Gram négatif. Libérées après lyse bactérienne, elles déclenchent de la fièvre et divers effets toxiques systémiques chez l’hôte. Elles sont en général moins toxiques que les exotoxines. Leur présence est révélée par un test Limulus positif. •

Pourquoi les bactéries Gram positif ne produisentelles pas d’endotoxines ?

•

Pourquoi faut-il évaluer les préparations médicamenteuses ?

HCO3–

5. Transfert massif d’eau vers la lumière intestinale Na+

Cl– H2O HCO3–

FIGURE 21.22 Action de l'entérotoxine du choléra. (1) Transfert ionique normal dans les intestins. (2) Adhérence et colonisation des microvillosités intestinales par Vibrio cholerae, après production de l’entérotoxine A-B et fixation de la sousunité B (en vert) sur le ganglioside GM1 des cellules intestinales. (3) La sous-unité A est libérée dans la cellule et active l’adényl-cyclase. (4) Le flux sodique (Na +) est alors interrompu, (5) favorisant un passage d’eau (H 2O) dans la lumière intestinale, conduisant à la déshydratation et à la diarrhée. Le traitement du choléra se fait par rééquilibrage du flux ionique et réhydratation par perfusion. Le traitement antibiotique réduit l’infection bactérienne, et donc la maladie, mais n’a pas d’effet sur l’action de la toxine.

IV

FACTEURS DE L’HÔTE

Les facteurs de l’hôte peuvent limiter ou faciliter la pathogénicité des micro-organismes. Certains facteurs, comme l’âge, le terrain génétique ou la spécificité tissulaire ne sont pas contrôlables par l’hôte, contrairement à d’autres comme le régime alimentaire ou le stress.

21.13 Facteurs de risque d’infection m n Un certain nombre de facteurs de l’hôte le sensibilise aux maladies infectieuses.

Âge, stress et régime alimentaire Le risque de maladies infectieuses augmente chez les sujets jeunes et âgés. Chez le sujet jeune, la microflore intestinale se



738 Chapitre 21

TABLEAU 21.5


CARACTÉRISTIQUES DES EXOTOXINES ET DES ENDOTOXINES

Propriétés

Exotoxines

Endotoxines

Chimiques

Protéines excrétées par certaines bactéries Gram positif ou Gram négatif, souvent sensibles à la chaleur

Lipopolysaccharide, complexes lipoprotéiques (voir figures 4.34 et 4.35) ; libérés par la membrane des bactéries Gram négatif, dans la lyse cellulaire, très stables à la chaleur.

Action et symptômes

Spécifiques ; liées à des récepteurs cellulaires ; cytotoxine, entérotoxine ou neurotoxine ; action spécifique sur les cellules ou les tissus

Générales ; fièvre, diarrhée, vomissement

Toxicité

Souvent très toxiques, parfois fatales

Peu toxiques, rarement fatales.

Immunogénicité

Très immunogènes ; stimulent la production d’anticorps neutralisants (antitoxines)

Peu immunogènes ; pas de neutralisation des toxines (immunité insuffisante)

Anatoxine

Traitées par formaldéhyde ; perte de toxicité, mais persistance immunogène (anatoxine)

Impossibles

Fièvre

Pas de fièvre chez l’hôte

Pyrogènes, fièvre fréquente

(a)

A. O. Tzianabos et R. D. Millham

A. O. Tzianabos et R. D. Millham

développe rapidement, mais sa constitution est différente de celle du sujet adulte. La survenue de pathogènes est facilitée dans les premiers jours de vie avant la mise en place d’une flore qui agit comme barrière naturelle. Ainsi, les diarrhées dues à Escherichia coli ou à Pseudomonas aeruginosa sont fréquentes chez l’enfant de moins d’un an (voir section 29.8). De même, la croissance de Clostridium botulinum après ingestion d’aliments avariés, contaminés par le sol ou l’air, est facilitée chez l’enfant de moins de un an, sans doute en raison du défaut de flore intestinale ; cette croissance permet la production de la toxine botulinique et le développement d’une paralysie flasque (voir sections 21.10 et 29.6). Les sujets de

(b)

FIGURE 21.23 Test lipopolysaccharidique sur amébocyte de Limulus. (a) Amébocytes (cellules sanguines) normales isolées de la limule, un arthropode marin, Limulus polyphemus. (b) Dégranulation des amébocytes après traitement par lipopolysaccharide bactérien ; ce test permet de mesurer l’activité lipopolysaccharidique (endotoxine) des bactéries.

plus de 65 ans sont aussi plus sensibles à l’infection par des pathogènes, probablement du fait d’une baisse de leurs défenses antimicrobiennes (plus grande sensibilité aux infections respiratoires, notamment grippales) ; un retard de la réponse immunitaire se remarque souvent chez le sujet âgé par rapport au sujet adulte, ce qui l’expose au développement de la maladie (voir section 26.8). Les changements anatomiques, très souvent liés à l’âge, contribuent à favoriser l’infection. Ainsi, l’hypertrophie de la glande prostatique du sujet de plus de 50 ans diminue la miction urinaire, facilite la colonisation et l’infection des voies urinaires par des bactéries pathogènes opportunistes (voir figure 21.11). Le stress peut faciliter l’infection chez un sujet sain. Des études chez le rat et la souris exposés au stress (fatigue, exercice, baisse nutritionnelle, déshydratation ou changement climatique) montrent un surrisque d’infections quand l’animal est exposé à un micro-organisme (Salmonella par exemple) par rapport à un animal non stressé. Les hormones produites sous l’influence du stress peuvent aussi limiter les défenses immunitaires. Ainsi, la cortisone, produite en grande quantité en période de stress, réduit la réponse anti-inflammatoire et donc inhibe la stimulation de la réponse immunitaire, favorisant le développement de l’infection (voir section 22.2). Le régime alimentaire joue aussi un rôle dans la sensibilité de l’hôte à l’infection. La malnutrition facilite l’émergence de maladies infectieuses dans les pays en voie de développement. La diminution des apports en protéines et en calories modifie la constitution de la flore normale, favorisant l’émergence des pathogènes. Il faut beaucoup moins de Vibrio cholerae pour provoquer le choléra chez les sujets malnutris par rapport aux sujets normalement alimentés. Par contre, l’apport alimentaire contribue à protéger la bactérie lors du passage gastrique en neutralisant l’acidité gastrique (voir section 28.5). Le déficit en saccharose avec une bonne hygiène dentaire protège contre la carie (voir section 21.3). Cet apport en saccharose est indispensable à la constitution du biofilm polysaccharidique produit par Streptococcus mutans et Streptococcus sobrinus, nécessaire pour l’adhésion des bactéries aux dents.



21.14 Résistance innée à l’infection 739

Hôte déficient Le déficit d’un ou plusieurs mécanismes de défense de l’hôte face à l’infection conduit à la notion de déficience. De nombreux patients hospitalisés pour cancers, maladies cardiovasculaires ou autres pathologies sont plus sensibles à l’infection (voir section 25.7). Ces infections acquises à l’hôpital, dites nosocomiales, touchent deux millions d’individus chaque année aux États-Unis, causant 100 000 décès (données des Centers for Disease Control and Prevention, CDC). En France, le rapport de juin 2006 de l’OPEPS (Observatoire parlementaire d’évaluation des politiques de santé) indique que 6 à 7 % des 15 millions de sujets hospitalisés par an, seraient concernés par une infection nosocomiale, à l’origine de 4 200 décès déclarés (données INVS). Les actes hospitaliers invasifs, tels que cathétérisation, injection hypodermique, ponction lombaire, biopsie, chirurgie, endoscopie, favorisent l’introduction de pathogènes chez l’hôte. L’enjeu des procédures de soin vise à limiter le risque de contamination lors des gestes à risque (hygiène des mains, désinfection des instruments, utilisation du matériel à usage unique, évaluation des risques, etc.). Le stress lié à l’intervention peut aussi favoriser la diffusion du pathogène. Les antiinflammatoires utilisés dans le traitement des patients diminuent leurs capacités de résistance (voir sections 22.2 et 22.3). Des immunosuppresseurs sont utilisés pour limiter les rejets de greffe chez les patients transplantés d’organe, mais réduisent aussi la réponse immunitaire de l’hôte, favorisant l’émergence de nombreux pathogènes. Des sujets non hospitalisés peuvent aussi présenter une déficience des défenses due à la tabagie, à l’excès d’alcool, à la toxicomanie, à l’insomnie, à la malnutrition, à des infections aiguës ou chroniques. En effet, l’infection chronique par le virus de l’immunodéficience humaine (VIH) contribue à dégrader la réponse immunitaire de l’hôte, notamment par la déplétion des lymphocytes T CD4+; celle-ci favorise alors l’émergence d’un grand nombre de pathogènes opportunistes, absents chez le sujet sain, qui marque le syndrome d’immunodéficience acquise (SIDA), ces pathogènes étant le plus souvent à l’origine du décès des patients (voir sections 22.7, 25.6, 26.14). Enfin, certaines prédispositions génétiques, touchant notamment le système immunitaire mais aussi la barrière muqueuse, favorisent les infections et causent le décès chez des sujets jeunes. C’est le cas de la mucoviscidose, une maladie génétique qui touche 1 nouveau-né pour 4 500 en France et est associée à plus de 1 500 mutations dont la mutation F508del, la plus fréquente, sur le gène CFTR (cystic fibrosis transmembrane conductance regulator). Ce gène code une protéine constitutive d’un canal d’ions chlorure, localisé dans la membrane des cellules épithéliales des muqueuses. La présence de mutations altère la synthèse de cette protéine, ce qui conduit à une diminution de sécrétion en chlore et en eau et donc à un épaississement du mucus. Cet environnement muqueux dans les voies pulmonaires est favorable à l’émergence de pathogènes (Haemophilus influenzae, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Burkholderia cepacia, mycobactéries atypiques, etc.). L’ensemble constitue un biofilm qui contribue à amplifier la détresse respiratoire du sujet malade et à provoquer le décès de sujets jeunes. La kinésithérapie respiratoire et l’utilisation des antibiotiques permettent de reculer cette échéance.

Contrôlez vos acquis L’âge du sujet, le stress, son régime alimentaire, son état de santé général, ses conditions de vie, une infection antérieure ou en cours et un terrain génétique déficitaire contribuent à diminuer les capacités de résistance de l’hôte à l’infection. •

Indiquez les facteurs permettant de contrôler la sensibilité à l’infection et qui ne sont pas contrôlables par l’hôte.

•

Indiquez ceux qui sont contrôlables par l’hôte.

Action de lysozyme inhibant la colonisation bactérienne (larmes et sécrétion nasale) Flore bactérienne normale limitant l’infection par des pathogènes (tractus respiratoire haut) Flore bactérienne cutanée normale et production d’acide gras antibactérien (peau) Modification rapide du pH modifiant la croissance des bactéries (intestin grêle) Miction urinaire évacuant les bactéries (voie urinaire)

Déplacement des bactéries par passage rapide d’air (nasopharynx) Action des cils et mucus limitant la colonisation (trachée) Protéines sanguines limitant l’infection (sang) Mucus et cellules phagocytes empêchant la colonisation (poumon) Acidité gastrique (pH 2) inhibant la croissance bactérienne (estomac) Flore bactérienne normale limitant la croissance des pathogènes (intestin, vagin)

FIGURE 21.24 Barrières physique, chimique et anatomique contre l’infection. Ces barrières procurent à l’enfant nouveauné une protection contre la colonisation et l’infection bactériennes.

21.14 Résistance innée à l’infection m n Tous les animaux présentent des systèmes de défense innée, physiques ou chimiques, contre les pathogènes (voir figure 21.24 et tableau 21.6).

La résistance naturelle de l’hôte Dans certaines conditions, des animaux d’espèces proches ou au sein d’une même espèce peuvent développer une sensibilité différente à l’infection. L’infection par le virus de la rage est létale chez tous les animaux, mais certaines espèces sont beaucoup plus sensibles au virus, comme le raton laveur et la moufette. L’agent de la maladie du charbon infecte un grand



740 Chapitre 21


TABLEAU 21.6

SPÉCIFICITÉ TISSULAIRE DES MALADIES INFECTIEUSES Maladie

Tissu/cellule infectés

Micro-organisme

Syndrome d’immunodéficience acquise (SIDA)

Lymphocytes T helper

Virus de l’immunodéficience humaine (VIH)

Botulisme

Terminaison neuromotrice


Choléra

Épithélium de l’intestin grêle

Vibrio cholerae

Caries dentaires

Épithélium buccal

Streptococcus mutans, S. sobrinus, S. sanguis, S. mitis

Diphtérie

Épithélium de la gorge


Gonorrhée

Épithélium urogénital

Neisseria gonorrhoeae

Paludisme (malaria)

Sang (érythrocytes)

Plasmodium sp.

Pyélonéphrite

Tissu médullaire rénal

Proteus sp.

Avortement spontané (vache)

Placenta

Brucella abortus

Tétanos

Cellule interneuronale inhibitrice

Clostridium tetani

nombre d’espèces, avec une grande variété de symptômes allant de simples pustules chez l’homme à l’hémorragie fatale chez le bovin. Cependant, les symptômes varient aussi selon la souche en présence (niveau de virulence), la forme pulmonaire du charbon – celle utilisable dans les armes biologiques – étant presque toujours fatale chez l’homme (voir section 25.13). À l’opposé, les oiseaux sont résistants à cet agent. Cela témoigne d’une interaction spécifique entre le micro-organisme et son hôte. Ainsi, les animaux à sang chaud ne sont pas infectables en général par les micro-organismes qui touchent les animaux à sang-froid, et inversement. De même, les virus animaux n’infectent pas le monde végétal, et inversement. Certains virus comme le VIH n’infectent que les primates supérieurs et l’homme. De fait, les corécepteurs CXCR4 et CCR5, associés aux récepteurs CD4, ne sont présents que sur les lymphocytes des primates et de l’homme. Cet ensemble récepteur-corécepteur est indispensable à la fixation sur la cellule du VIH, via sa glycoprotéine 120, pour réaliser le cycle infectieux (voir section 26.14).

Les barrières chimiques et physiques L’intégrité de la peau et des muqueuses constitue un élément de défense naturelle de l’hôte à l’infection par un micro-organisme. Celle-ci ne permet pas la colonisation, et donc l’infection, par un pathogène. C’est en cas de lésions, blessures, plaies, piqûres, que l’adhésion, la colonisation et l’invasion du tissu peuvent se réaliser. Ces défenses associent des éléments anatomiques, physiques et chimiques (voir figure 21.4). Une peau saine est une barrière efficace contre l’infection par les pathogènes ; c’est une barrière physique mais aussi chimique, avec la sécrétion d’acides gras et d’acide lactique par les glandes sébacées, diminuant le pH à 5, ce qui limite la croissance bactérienne (croissance favorisée dans le sang et les organes profonds à pH = 7,4). Au niveau des muqueuses, les cellules ciliées à la surface de l’épithélium du nasopharynx et de la trachée repoussent les micro-organismes aspirés ou inhalés dans les sécrétions sali-

vaires ou nasales. Ils sont refoulés et évacués par la toux, les éternuements, les expectorations, ou avalés et détruits dans l’estomac. Les sécrétions acides de l’estomac (pH = 2) détruisent un grand nombre de micro-organismes ; ceux qui passent à travers cette barrière entrent en compétition avec ceux présents dans la flore intestinale, dont la constitution varie avec l’augmentation du pH (de 5 à 7, de l’intestin grêle au gros intestin), avec un nombre croissant de bactéries (1010 par gramme dans le gros intestin d’un adulte sain). Ce nombre important rend difficile l’adhésion et la colonisation par un nouveau pathogène. Des lysozymes sont produits dans la lumière rénale ainsi que dans les sécrétions oculaires, limitant les populations microbiennes dans ces sites (voir section 4.8). Le plasma sanguin contient aussi des protéines, appelées lysines β, se fixant et détruisant la paroi bactérienne.

La spécificité tissulaire Au-delà de l’adhésion et de la colonisation sur le site d’entrée, le pathogène doit trouver des conditions favorables (comme le pH) et les nutriments pour se développer dans le tissu. Il existe une certaine spécificité tissulaire de l’hôte à l’infection (voir tableau 21.6). Ainsi, l’ingestion de Clostridium tetani conduit à sa destruction dans l’estomac, alors que son introduction dans une plaie profonde permet son développement à l’abri de l’oxygène de l’air et de la sécrétion de toxines tétaniques (voir sections 21.10 et 27.9). Par contre, Salmonella et Shigella parviennent à coloniser la voie digestive dans certaines conditions et ne développent pas, ou rarement, d’infections sur blessure. Les interactions entre le micro-organisme et son hôte sont multifactorielles et résultent d’un équilibre fragile entre eux, avec la mise en place de stratégies de survie pour le micro-organisme dans cet environnement hostile et de défenses naturelles, non spécifiques ou spécifiques, de l’hôte à la progression de l’infection par des pathogènes (voir chapitre 22).



Questions 741

Contrôlez vos acquis Des barrières non spécifiques de l’hôte, anatomiques, physiques et chimiques, le protègent de la majorité des infections par un pathogène. Un déficit de ces défenses le rend plus sensible à l’infection.

•

Indiquez ces barrières physiques et chimiques. Comment peuvent-elles devenir déficientes ?

•

Comment une infection préexistante peut-elle favoriser le développement d’un pathogène chez un sujet sain par ailleurs ?

QUESTIONS 1. Indiquez la différence entre parasite et pathogène, entre infection et maladie (voir section 21.1). 2. Précisez quels sont les organes habituellement colonisés par des micro-organismes et ceux qui demeurent indemnes. Indiquez leurs points communs (voir section 21.1). 3. Différenciez les micro-organismes permanents et transitoires au niveau de la porte d’entrée. Comment y parvenir expérimentalement (voir section 21.2) ? 4. Expliquez pourquoi le genre Streptococcus est plus particulièrement impliqué dans la carie dentaire (voir section 21.3). 5. Indiquez en quoi le pH et la concentration en oxygène influent sur le développement des micro-organismes dans les différentes régions du tractus gastro-intestinal (voir section 21.4). 6. Expliquez le lien entre glycogène et Lactobacillus acidophilus au niveau vaginal, et la différence observée entre une femme adulte et une adolescente prépubère (voir section 21.5). 7. Précisez la différence entre capsule, couche fibreuse slime et glycocalyx des bactéries, et leur implication dans l’adhésion bactérienne (voir section 21.6). 8. Donnez un exemple de micro-organisme pathogène par la production de toxine uniquement et un exemple de pathogène

invasif ; rapportez leur mode d’action et les facteurs d’invasion (voir section 21.8). 9. Différenciez les toxines A-B, les cytotoxines et les superantigènes ; donnez un exemple de micro-organisme pour chacune et indiquez leur mode d’action (voir section 21.10). 10. Décrivez le mode d’action des toxines tétanique et botulinique et expliquez en quoi elles sont dangereuses (voir section 21.10). 11. Rapportez le mode d’action de l’entérotoxine cholérique (voir figure 21.22) et indiquez pourquoi le traitement antibiotique est peu actif contre son action pathogène (voir section 21.11). 12. Décrivez la structure particulière des endotoxines ; comment activent-elles la fièvre ? Quelles sont les bactéries qui les produisent (voir section 21.12) ? 13. Indiquez les facteurs de risque d’infection chez l’hôte ; quels sont ceux qu’il contrôle et ceux qu’il ne contrôle pas (voir section 21.13) ? 14. Montrez comment le pH régule l’infection, quels sont les régions de l’hôte et les micro-organismes concernés (voir section 21.14).

PROBLÈMES 1. Les muqueuses sont des barrières efficaces contre la colonisation et le développement de micro-organismes. Cependant, une muqueuse comme celle de la gorge est colonisée par un grand nombre de micro-organismes, qui peuvent occasionnellement induire une infection. Expliquez dans quelles circonstances les micro-organismes non pathogènes peuvent devenir pathogènes. 2. Le traitement antibiotique réduit le nombre de micro-organismes de la flore normale gastro-intestinale. Indiquez les symptômes associés à la réduction de cette flore. Un traitement durable favorise le développement d’infections opportunistes, notamment chez des sujets déficients, atteints du SIDA par exemple (voir section 26.14). Indiquez les pathogènes opportunistes impliqués et les facteurs de l’hôte favorisant leur émergence.

3. Identifiez les facteurs qui facilitent la virulence et la pathogénicité de Streptococcus pneumoniae et de Clostridium tetani. Si l’on considère leur habitat normal, une plus grande virulence peut-elle apporter un avantage sélectif pour ces pathogènes ? 4. La coagulase se révèle un facteur de virulence de Staphylococcus aureus en favorisant la formation du caillot sur le site de l’infection, alors que la streptokinase de Streptococcus pyogenes induit la dissolution du caillot. En quoi ces deux stratégies opposées favorisent-elles la pathogénicité de ces bactéries ? 5. Les micro-organismes mutants incapables de produire des exotoxines sont relativement faciles à isoler en culture, alors que ceux incapables de produire des endotoxines ne le sont pas. Quelles en sont les raisons les plus probables au vu de la structure et des fonctions de ces toxines (voir sections 21.10 à 21.12) ?





I

Panorama du système immunitaire

745

22.1 22.2 22.3 22.4

Cellules et organes du système immunitaire Réponse immunitaire innée Inflammation, fièvre et choc septique Réponse immunitaire adaptative

745 748 751 752

II

Antigène, lymphocyte T et immunité à médiation cellulaire 753

22.5 22.6 22.7

Antigènes et immunogènes 753 Présentation de l’antigène aux lymphocytes T 754 Lymphocytes T cytotoxiques et cellules natural killer 757 Lymphocytes TH : activation de la réponse immunitaire 758

22.8

III

Anticorps dans la réponse immunitaire 759

22.9 Anticorps (ou immunoglobulines) 22.10 Production des anticorps 22.11 Complément, anticorps et destruction du pathogène

IV

La réponse immunitaire commence par la réponse innée des phagocytes : sur cette figure ils internalisent des Neisseria gonorrhoeae. Qu’elle soit innée ou qu’elle soit adaptative, cette réponse occasionne une réaction inflammatoire destinée à circonscrire l’agent pathogène.

CHAPITRE VINGT-DEUX

Immunologie générale

759 762 764

Immunité et prévention des maladies infectieuses 765

22.12 Immunité naturelle 22.13 Immunité artificielle 22.14 Nouvelles techniques de vaccination

766 766 768

V

769

Maladies de la réponse immunitaire

22.15 Allergie, hypersensibilité et auto-immunité 22.16 Superantigènes

769 772



744 Chapitre 22


GLOSSAIRE Anatoxine (toxoid) Forme atténuée d’une toxine, elle garde son immunogénicité mais pas sa toxicité. Anticorps (Ac) (antibody) Protéine soluble sécrétée par les plasmocytes et réagissant avec l’Ag. On l’appelle également immunoglobuline. Antigène (Ag) (antigen) Molécule réagissant de façon spécifique ou non avec certains composants du système immunitaire. Auto-anticorps (autoantibody) Ac dirigé contre les Ag du « soi ». Cellule dendritique (dendritic cell) Leucocyte capable de phagocyter et de présenter l’Ag dans la rate et dans les ganglions lymphatiques. Cellule Natural killer (natural killer cell) Lymphocyte spécialisé dans la reconnaissance et dans la destruction non spécifique de cellules étrangères ou de cellules infectées. Cellule présentatrice d’Ag (CPA) (antigen-presenting cell) Macrophages, cellules dendritiques et lymphocytes B sont des CPA puisqu’elles présentent les reliquats peptidiques de l’Ag à un lymphocyte T. Complément (complement) Système de protéines activées de façon séquentielle par un complexe Ag-Ac pour permettre l’activité d’un Ac. Complexe majeur d’histocompatibilité (major histocompatibility complex, MHC) Ensemble de gènes codant plusieurs protéines exprimées à la surface des cellules et jouant un rôle important dans la présentation de l’Ag. Cytokine Substance modulant la réponse immunitaire et produite par des leucocytes. Déterminant antigénique (épitope) (antigenic determinant [epitope]) Partie d’un Ag qui réagit avec l’Ac ou avec le récepteur du lymphocyte T. Domaine (domain) Région d’une protéine dotée d’une structure définie et investie d’une certaine fonction. Haptène (hapten) Molécule de petit poids moléculaire qui se combine avec des Ac qui en sont spécifiques, mais incapable de susciter cette réponse par elle-même. Hypersensibilité (hypersensitivity) Réponse immunitaire responsable de lésions des tissus. Immunité (immunity) Aptitude d’un organisme à résister à une infection. Immunité à médiation cellulaire (cell-mediated immunity) Réponse immunitaire due à l’action directe des lymphocytes T spécifiques avec l’Ag. Immunité à médiation humorale (antibody-mediated immunity (humoral immunity)) Réponse immunitaire due à l’intervention directe des Ac. Immunité adaptative (adaptative immunity) Cette immunité spécifique de l’Ag est la capacité active de reconnaître et de détruire un pathogène ou ses produits. Cette réponse implique un contact préalable avec le pathogène ou avec ses produits. Immunité innée (innate immunity) Immunité non spécifique ou aptitude non inductible à reconnaître et à détruire un agent pathogène ou ses produits. Cette réponse n’implique aucun contact antérieur avec ce pathogène ou avec ses produits. Immunogène (immunogen) Molécule suscitant une réponse immunitaire. Immunoglobuline (immunoglobulin) Protéine soluble synthétisée par les lymphocytes B et sécrétée par les plasmocytes pour réagir avec des Ag. On parle aussi d’Ac. Inflammation Réaction non spécifique à des stimuli, comme des toxines ou des pathogènes. Elle est caractérisée par une rougeur (érythème), un gonflement (œdème), une douleur et une chaleur (fièvre), habituellement limitée au site de l’infection. Interleukine (interleukin) Cytokine soluble (ou chemokine) sécrétée par des leucocytes. Leucocyte (leukocyte) Cellule nucléée circulant dans le sang (globule blanc). Lymphe (lymph) Fluide analogue au sang mais démuni de globules rouges et circulant dans un système séparé. Ce système lymphatique est jalonné par des ganglions lymphatiques.

Lymphocyte Sous-population de cellules nucléées qui circulent dans le sang et interviennent dans la réponse immunitaire spécifique. Lymphocyte à mémoire (memory B cell) Lymphocyte à longue durée de vie et détenteur de la mémoire d’un Ag. Lymphocyte B (B Cell) Lymphocyte doté d’Ig de surface comme récepteurs d’Ag, capable de les secréter et de présenter des Ag aux lymphocytes T. Lymphocyte T (T Cell) Lymphocyte responsable d’interactions cellulaires spécifiques avec un Ag. Les lymphocytes T se distribuent en sous-populations fonctionnelles, les cellules T cytotoxiques et les cellules T helper. Ces derniers se subdivisent en TH1 inflammatoires et en TH2 mobilisés par les cellules B pour produire des Ac. Macrophage Leucocyte de grande taille et prédominant dans les tissus. C’est un phagocyte et une cellule présentatrice d’Ag. Mémoire immunologique (memory [immunologic memory]) Capacité de répondre par de grandes quantités d’Ac ou de lymphocytes à un Ag que le système a déjà rencontré. Molécule HLA de classe I (class I MHC protein) Molécule présentatrice de l’Ag à la surface de toutes les cellules nucléées chez les vertébrés. Molécule HLA de classe II (class II MHC protein) Molécule présentatrice de l’Ag à la surface des macrophages, des lymphocytes B et des cellules dendritiques. Pathogen-associated molecular pattern (PAMP) Élément de structure particulier sur un micro-organisme ou sur un virus et, de ce fait, reconnu par une molécule destinée à cet usage à la surface de certaines cellules. Pattern recognition molecule (PRM) Protéine enchâssée dans la membrane et reconnaissant un PAMP à la surface d’un micro-organisme. Phagocyte Une des catégories de cellules capables de reconnaître, d’ingérer et de dégrader un pathogène ou ses produits. Plasma Composant liquide du sang, une fois que les cellules ont été prélevées et les protéines de la coagulation désactivées. Plasmocyte (plasma cell) Lymphocyte B arrivé au terme de sa maturation pour sécréter de grandes quantités d’Ac. Polynucléaire neutrophile (neutrophil [polymorphonuclear leukocyte], PMN) Leucocyte à noyau polylobé et granulations cytoplasmiques. C’est un phagocyte. Récepteur des cellules T (T-cell receptor, TCR) Récepteur protéique spécifique d’un Ag à la surface d’un lymphocyte T. Réponse primaire en Ac (primary antibody response) Ac sécrété contre un Ag lors d’une première rencontre, surtout des IgM. Réponse secondaire en Ac (secondary antibody response) Ac sécrété contre un Ag rencontré une deuxième fois, surtout des IgG. Sérologie (serology) Étude in vitro des réactions entre les Ag et les Ac. Sérum (serum) Composant liquide du sang qui reste après l’extraction des cellules et des protéines de la coagulation. Spécificité (specificity) Capacité de la réponse immunitaire de ne se développer qu’à l’égard d’un seul Ag. Cellule susceptible de se différencier dans un grand nombre de cellules différentes. Superantigène (super-Ag) (superantigen) Produit pathogène provoquant une réponse immunitaire disproportionnée en mobilisant plus de lymphocytes T qu’un Ag conventionnel. Tolérance (tolerance) Inaptitude à développer une réponse immunitaire vis-à-vis d’Ag particuliers. Toll-Like Receptor (TLR) Une des catégories de PRM capables de reconnaître un PAMP. Ils se trouvent à la surface des phagocytes. Vaccin (vaccine) Agent pathogène inactivé ou affaibli, ou produit inoffensif d’un agent pathogène, utilisé pour susciter le développement d’une immunité protectrice. Vaccination (immunization or vaccination) Injection d’un pathogène inactivé ou affaibli ou de ses produits pour susciter une protection immunitaire.



22.1 Cellules et organes du système immunitaire 745

L

a défense d’un organisme multicellulaire contre les agents pathogènes repose sur des interactions entre de nombreuses catégories de cellules, et entre celles-ci et les multiples substances variées qu’elles produisent. Nous avons envisagé la protection passive (physique ou chimique). Nous abordons maintenant la protection active. Il sera d’abord question d’immunité innée ou non spécifique. Dans ce cas, l’organisme détruit les pathogènes et leurs produits, sans qu’il y ait eu de contact préalable entre l’arsenal défensif et l’agent pathogène. L’immunité innée repose en grande partie sur les phagocytes. Ces cellules internalisent, tuent et digèrent la plupart des pathogènes. Comme cela ne suffit pas toujours, les phagocytes mobilisent le système de l’immunité adaptative ou spécifique. L’immunité adaptative est la capacité acquise de reconnaître et de détruire un pathogène ou ses produits. Elle exige un contact antérieur entre le système immunitaire et cet agent. Les phagocytes utilisent les fragments partiellement digérés de molécules pathogènes pour activer les lymphocytes, auxquels est dévolue cette immunité spécifique. Chaque lymphocyte est programmé pour ne reconnaître qu’une seule molécule pathogénique, l’antigène (Ag). C’est n’importe quelle molécule, pour laquelle il existe un récepteur spécifique à la surface d’un lymphocyte (voir section 22.4). Dès qu’un récepteur a capté son Ag, le lymphocyte correspondant se divise en autant de copies de lui-même. L’ensemble constitue un clone de lymphocytes susceptibles de réagir avec l’Ag et de le détruire directement, ou par le truchement d’anticorps (Ac). Ces protéines solubles sont spécifiques de cet Ag. C’est l’immunité spécifique. Certains de ces lymphocytes vivent pendant des années. S’ils rencontrent le même pathogène, ils se multiplient plus rapidement et leur réponse est plus efficace que la première fois. C’est la mémoire immunitaire qui permet de réagir plus fortement la deuxième fois que la première. Elle est spécifique. Le système réagit fortement aux Ag des agents pathogènes. Il est conçu pour ne pas réagir aux cellules de l’organisme auquel il appartient. Cette capacité à détruire les pathogènes dangereux du « non-soi », mais à ignorer les Ag inoffensifs du « soi » est la tolérance immunitaire. Elle peut échouer et le système immunitaire répondre, alors qu’il ne devrait pas le faire. Il en découle une maladie auto-immune et des lésions tissulaires. Nous décrirons d’abord la rencontre entre les phagocytes du système inné et la plupart des pathogènes. Puis, nous traiterons de la présentation de l’Ag aux lymphocytes par ces phagocytes, ce qui induit une réponse immunitaire adaptative. Qu’elle soit innée ou adaptative, l’immunité s’est améliorée au fil de l’évolution pour protéger les êtres vivants des pathogènes étrangers.

I

22.1 Cellules et organes du système m n immunitaire Immunités innée et adaptative sont assurées par des cellules qui circulent dans le sang et dans la lymphe, fluides directement ou indirectement en contact avec tous les organes majeurs du système. Toutes les cellules de l’immunité dérivent d’éléments précurseurs de la moelle osseuse, appelés cellules souches.

Les composants du sang et de la lymphe Le sang transporte des molécules et des cellules. Beaucoup d’entre elles participent à la réponse immune. Comme il est facile et inoffensif de le prélever, le sang s’est avéré incomparable comme source de cellules de la réponse immunitaire. Les plus nombreuses sont les globules rouges ou érythrocytes : ils n’ont pas de noyau et transportent l’oxygène des poumons aux tissus (voir tableau 22.1). Une cellule sanguine sur mille est un globule blanc, ou leucocyte. On distingue les phagocytes (monocytes) des lymphocytes (agents de l’immunité humorale par Ac et de l’immunité cellulaire par cellules). La lymphe est un fluide qui ressemble au sang, mais dans lequel il n’y a pas de globules rouges. Toutes les cellules sanguines dérivent des cellules souches de la moelle osseuse (voir figure 22.1) et s’y différencient en cellules mûres sous l’influence des cytokines. L’élément liquide du sang où baignent des protéines, ou autres molécules, et des cellules est le plasma. Une fois prélevé, il se transforme rapidement en caillot où le fibrinogène soluble devient de la fibrine insoluble. Les anticoagulants (oxalate de potassium, citrate de potassium ou héparine) bloquent la coagulation en empêchant le fibrinogène de se transformer en fibrine. Lors de la coagulation, les cellules sanguines sont retenues en un agrégat insoluble dans le liquide qui reste. C’est le sérum, qui ne contient ni cellules ni protéines de la coagulation, mais garde nombre de protéines solubles comme les Ac. Deux approches sérologiques y recourent : la détection des Ag par des Ac, et celle des Ac par des Ag.

Les circulations sanguine et lymphatique À partir du cœur, le sang est propulsé dans les artères, puis à travers les capillaires. Pour en revenir, il passe par les veines

TABLEAU 22.1

PANORAMA DU SYSTÈME IMMUNITAIRE

La réponse immune a évolué de façon à reconnaître n’importe quelle molécule étrangère, surtout n’importe quel Ag des agents pathogènes. La réponse à cet Ag est destinée à le détruire. Le système immunitaire inné reconnaît tous les pathogènes ou toutes les molécules étrangères, tandis qu’une réponse adaptative n’en reconnaît qu’un seul ou qu’une seule. Après avoir passé en revue les cellules et organes du système immunitaire, nous envisagerons les cellules et les mécanismes en cause dans l’immunité innée ; enfin, nous brosserons un tableau de l’immunité adaptative.

CELLULES SANGUINES IMPORTANTES CHEZ L’HOMME

Type cellulaire Érythrocytes a

Leucocytes

Cellules par mL 4,2 – 6,2 × 109 4,5 – 11 × 106

Lymphocytes

1,0 – 4,8 × 106

Myélocytes

7,0 × 106

a

Les leucocytes comprennent toutes les cellules nucléées du sang et se répartissent en lymphocytes et en myélocytes. Ceux-ci comprennent des monocytes et des granulocytes. Source : Henry, J. B. 1996. Clinical Diagnosis and Management by Laboratory Methods, 19e édition. W. B. Saunders, Philadelphie.



746 Chapitre 22


Cellule souche de la moelle osseuse

Précurseur lymphoïde

Précurseur myéloïde

Maturation dans le thymus

Mastocyte

Cellule dendritique

Monocyte

Polynucléaire

Macrophage

Lymphocyte T

Plasmocyte

Maturation dans la moelle osseuse

Lymphocyte B

Cellule mémoire

FIGURE 22.1 Origine des principales cellules intervenant dans la réponse immunitaire. Les cellules de l’immunité dérivent de deux précurseurs. Le précurseur myéloïde donne des phagocytes, cellules de l’immunité innée capables de présenter l’Ag. Le précurseur lymphoïde donne des lymphocytes T et B, cellules directement responsables de la réponse immunitaire spécifique d’un Ag.

(voir figure 22.2a et b). Le réseau lymphatique dans lequel circule la lymphe est séparé de celui du sang. Les leucocytes font le va-et-vient entre le sang et la lymphe dans le lit capillaire (voir figures 22.2b et 22.2c). La lymphe parvient aux ganglions lymphatiques à partir des tissus extravasculaires en passant par les capillaires lymphatiques (voir figure 22.2d). Ces ganglions renferment beaucoup de leucocytes et de phagocytes, disposés de manière à cueillir les Ag dès leur sortie des canaux lymphatiques. La rate joue le même rôle dans le réseau sanguin. C’est donc dans les ganglions et dans la rate que se déroulent les réponses immunitaires adaptatives. La lymphe, qui contient Ac et cellules immunitaires, reflue éventuellement dans la circulation en passant par le canal lymphatique thoracique.

Les leucocytes Les leucocytes sont des globules blancs dotés d’un noyau et circulant dans le sang et dans la lymphe. Il y en a plusieurs sortes (voir tableau 22.1 et figure 22.1). Certains participent à la réponse innée, d’autres à la réponse adaptative. Les lymphocytes sont les leucocytes auxquels est réservée la réponse

spécifique. Les lymphocytes mûrs s’accumulent dans les ganglions lymphatiques et dans la rate : c’est là qu’ils rencontrent l’Ag. Ils se répartissent en cellules B et en cellules T (voir figure 22.1). Cellules B et cellules T naissent dans la moelle osseuse. Les premières gagnent les organes lymphoïdes secondaires (ganglions lymphatiques et rate), où elles se transforment en plasmocytes sécréteurs d’Ac. Les secondes gagnent le thymus pour y subir leur maturation. Les cellules myélo-monocytaires descendent d’un précurseur myéloïde commun (voir figure 22.1) et se répartissent, selon leurs fonctions, en monocytes et en myélocytes (ou granulocytes). Des techniques adaptées colorent les granules cytoplasmiques des myélocytes. Les polynucléaires neutrophiles sont des granulocytes capables de phagocytose (voir section 22.2). Les granules des polynucléaires basophiles contiennent des substances toxiques pour les pathogènes. Une fois sécrétée, cette dégranulation des basophiles déclenche les symptômes de l’allergie (voir section 22.15). Les monocytes sont les précurseurs des macrophages et des cellules dendritiques que l’on trouve en abondance dans les tissus, la rate et les ganglions lymphatiques. Ce sont des cellules présentatrices



22.1 Cellules et organes du système immunitaire 747

Circulation pulmonaire Poumons

La veine sous-clavière gauche

Ganglions lymphatiques

Thymus Vaisseaux lymphatiques Tissu lymphoïde associé aux muqueuses (MALT)

Cœur Veines Capillaires sanguins

Artères Circulation systémique

Canal thoracique Rate Ganglions lymphatiques

(b)

Moelle Cellules traversant osseuse la paroi d’un capillaire sanguin pour en sortir ou pour y rentrer

Capillaires lymphatiques Fibres et faisceaux de fibres Capillaires lymphatiques Cellules sortant des capillaires et y revenant

Capillaires sanguins

Fluide entrant dans les capillaires lymphatiques (c) Cellules et Ag dans un canal afférent (pour entrer) Cellules T paracorticales

Plasmocytes médullaires

Cellules B et CPA du cortex (d)

(a)

Cellules et anticorps dans un canal efférent (pour sortir)

FIGURE 22.2 Circulation sanguine et lymphatique. (a) Système lymphoïde et localisation des organes majeurs. (b) Relation entre la circulation sanguine et la circulation lymphatique. Le sang parvient au cœur à travers les veines, puis gagne les poumons où il est oxygéné. Il gagne les tissus en passant par les artères. La lymphe passe du canal thoracique dans la veine sous-clavière gauche de la circulation sanguine. (c) Détail des relations entre le sang et la lymphe. Les capillaires sanguins et lymphatiques sont fermés, mais les fluides et les cellules passent d’un vaisseau à l’autre par extravasation. (d) Le schéma présente les sites anatomiques majeurs d’un ganglion lymphatique, y situant les cellules immunitaires.

d’Ag (CPA), car elles peuvent débiter un Ag en peptides et en présenter les reliquats à un lymphocyte (voir section 22.5). Les leucocytes circulent dans tout l’organisme, sortent du sang pour gagner les espaces interstitiels, puis la lymphe, avant de revenir dans le sang. C’est le va-et-vient de l’extravasation (voir figure 22.2c).

Contrôlez vos acquis Toutes les cellules du système immunitaire descendent des mêmes cellules souches de la moelle osseuse. Des

cellules, mais également des protéines importantes pour le fonctionnement du système immunitaire circulent dans le sang et dans la lymphe. Il y a plusieurs catégories de leucocytes. •

Retracez le parcours d’un leucocyte du sang vers la lymphe et de la lymphe vers le sang.

•

Décrivez l’évolution des cellules B, des cellules T et des macrophages à partir de la cellule souche commune.



748 Chapitre 22


22.2 Réponse immunitaire innée m n Il est exceptionnel que les pathogènes forcent les barrières physiques et chimiques de l’organisme (voir chapitre 21). Comme ils peuvent infecter leur victime, c’est immédiatement que le système immunitaire doit réagir. Cette réponse est innée, non spécifique, constituant la « première ligne de défense ». C’est le contact entre le phagocyte et un pathogène ou son produit qui la déclenche. En résulte habituellement une séquence complexe d’événements conduisant à l’inflammation. Nous allons d’abord présenter les cellules et molécules qui amorcent cette séquence, après contact avec les pathogènes. Nous verrons ensuite les mécanismes auxquels ces agents recourent pour esquiver l’effet des phagocytes. Nous terminerons en analysant en détail la réaction inflammatoire.

Habituellement, ce sont des phagocytes (étymologiquement, des cellules qui mangent) qui amorcent la réaction inflammatoire. Leur mission se limite à l’internalisation et à la destruction des pathogènes. Néanmoins, certains d’entre eux se comportent comme des CPA : ils débitent l’Ag en peptides qui suscitent la réponse immunitaire adaptative qui s’ensuit. Parmi eux, on trouve des macrophages, des monocytes, des neutrophiles et des cellules dendritiques, aussi bien dans les tissus que dans les fluides. Ils recourent souvent à des mouvements améboïdes pour se mobiliser. La plupart d’entre eux contiennent des lysosomes où sont stockés peroxyde d’hydrogène, lysozyme, protéases, phosphatases, nucléases et lipases, qui sont des molécules bactéricides. Pour internaliser un pathogène, le phagocyte commence par y adhérer quand il est fixé sur la paroi d’un vaisseau ou sur un caillot de fibrine. Sa membrane enceint le pathogène pour l’enfermer dans un phagosome qui s’internalise et fusionne avec un lysosome pour former un phagolysosome. Les toxiques et les enzymes de ce phagolysosome réussissent souvent à digérer la cellule microbienne qui y a été internalisée (voir figure 22.3). Les polynucléaires neutrophiles font partie des phagocytes. Ils sont mobiles et bondés de lysosomes (voir figure 22.4a). Ils descendent des cellules souches myéloïdes (voir figure 22.1) et logent surtout dans le sang et dans la moelle osseuse. En cas d’infection, ils émigrent dans les tissus. Quand il y a beaucoup de neutrophiles dans le sang et au niveau d’une inflammation, il faut d’ailleurs suspecter une infection. Les précurseurs des phagocytes majeurs, macrophages et cellules dendritiques, circulent sous forme de monocytes (voir figures 22.4a et 22.3). Les macrophages sont de grandes cellules siégeant dans les ganglions et dans la rate. Ils sont capables non seulement d’ingérer et de détruire la plupart des Ag, mais également de collaborer avec les lymphocytes pour lancer une réponse immunitaire adaptative. Parmi les phagocytes, il y a aussi les cellules dendritiques (voir figure 22.1), donc des cellules dérivant du même progéniteur que les macrophages. Ces CPA sont efficaces dans les ganglions et dans la rate.

J. G. Hirsch

Les phagocytes

FIGURE 22.3 Phagocytose. Séquences de la phagocytose et de la digestion d’un bacille par un macrophage humain observées au microscope à contraste de phase. La chaîne bactérienne mesure environ 19 à 20 µm. Le macrophage est l’une des cellules capables d’internaliser et de dégrader les pathogènes et les produits de ces agents.



22.2 Réponse immunitaire innée 749

entraîne la cascade de la transduction (voir section 8.12) et se termine par l’activation du phagocyte. Ces signaux induits par l’agent pathogène promeuvent les propriétés phagocytaires et destructrices du phagocyte.

J. Martinko et M. T. Madigan

L’activation des phagocytes dépend de l’oxygène

J. Martinko et M. T. Madigan

(a)

(b) FIGURE 22.4 Principales cellules du système immunitaire. (a) Les phagocytes. En bas et à gauche, un polynucléaire neutrophile (PNN) caractérisé par un noyau polylobé (coloré en violet) et par un cytoplasme granuleux. Légèrement au-dessus et à droite du PNN, un monocyte. Le diamètre des phagocytes varie entre 12 à 15 µm, alors que celui des érythrocytes est d’environ 6 µm. (b) La cellule nucléée est un lymphocyte circulant, pratiquement dénué de cytoplasme et dont le diamètre est de 10 µm.

Les phagocytes reconnaissant des agents pathogènes Les phagocytes disposent d’un système de reconnaissance des pathogènes destiné à susciter une réponse inflammatoire appropriée en temps et en amplitude. Ce système comprend plusieurs molécules conservées au cours de l’évolution des espèces. Depuis la surface des phagocytes, elles reconnaissent un groupement moléculaire sur les micro-organismes ou les virus (voir figure 22.5). Les structures de reconnaissance ont d’abord été décrites chez la mouche drosophile, sous le nom de récepteur Toll. À chaque catégorie de Toll-like receptor (TLR) correspond une structure des agents pathogènes. Par exemple, les TLR-4 reconnaissent les lipopolysaccharides (LPS) de la surface de toutes les bactéries Gram négatif (voir sections 4.9 et 23.1). D’autres TLR reconnaissent le zymosan à la surface des levures, les peptidoglycanes bactériens et les CpG, qui sont des oligonucléotides non méthylés (voir section 23.1). La reconnaissance d’un ligand infectieux par un récepteur phagocytaire déclenche un signal à travers la membrane, lequel

L’ingestion d’un pathogène active le phagocyte et en améliore les capacités de phagocytose et de destruction. Nombre de réactions aboutissent à la production de composés toxiques qui contiennent de l’oxygène. Ce sont le peroxyde d’hydrogène (H2O2), les anions superoxydes (O2–), les radicaux hydroxyles (OH–), les singulets d’oxygène (1O2), l’acide hypochlorique (HOCl) et l’oxyde nitrique (NO). Le pH acide des phagolysosomes favorise l’apparition des dérivés toxiques de l’oxygène et en améliore l’efficacité. Ces phagocytes peuvent donc utiliser des formes toxiques d’oxygène pour tuer les bactéries qu’ils ont ingérées. Cette efflorescence d’enzymes dépendants de l’oxygène aboutit à suffisamment de composés toxiques pour tuer les bactéries. Ces réactions se déroulent à l’intérieur même des phagocytes, qui ne sont donc pas sensibles aux dérivés de l’oxygène (voir figure 22.6). Les phagocytes ont besoin de plus d’oxygène, quand ils sont activés que quand ils sont quiescents, pour produire ces dérivés toxiques. Cette augmentation de la consommation d’oxygène par des phagocytes activés s’appelle l’explosion respiratoire.

La neutralisation des phagocytes Certains pathogènes ont développé des mécanismes pour tuer le phagocyte, l’esquiver ou en neutraliser les effets. Par exemple, Staphylococcus aureus (voir section 26.9) produit des substances pigmentées, les caroténoïdes, qui neutralisent l’effet bactéricide des singulets d’oxygène (voir section 6.15). D’autres bactéries intracellulaires, comme Mycobacterium tuberculosis (l’agent de la tuberculose), survivent et se multiplient à l’intérieur des phagocytes (voir section 26.5). Ils utilisent des composants de leur paroi (voir section 12.23) pour intercepter les composés oxygénés toxiques, en particulier les radicaux hydroxyles et les anions superoxydes qui sont les produits oxygénés les plus toxiques dont dispose le phagocyte. D’autres agents intracellulaires synthétisent des leucocidines, ou protéines capables de tuer des phagocytes. Ils sont ingérés comme les autres pathogènes, mais subsistent puisqu’ils tuent les phagocytes. Les plus grands producteurs de leucocidines sont Streptococcus pyogenes et S. aureus. Comme le pus est surtout formé de phagocytes morts et donne souvent des furoncles ou des abcès, ces bactéries sont pyogéniques (voir section 26.9). La capsule est un autre moyen de défense (voir section 4.10). En effet, c’est à cause d’elle que la cellule ne peut adhérer à la bactérie et que celle-ci échappe à la phagocytose. Le meilleur exemple est celui du Streptococcus pneumoniae. D’ailleurs, les bactéries ayant perdu leur capsule par mutation ont également perdu leur virulence (voir figure 21.16). Mais, il y a d’autres composants que la capsule pour conjurer la phagocytose. Par exemple, la souche pathogène de S. pyogenes fabrique la protéine M (voir section 26.2), qui modifie sa surface et la protège de la phagocytose. Les Ac contre la capsule de la bactérie ou contre certaines molécules de surface servent de parade contre ces armes défensives. Ils facilitent la phagocytose par l’opsonisation (voir section 22.11).



750 Chapitre 22

Immunologie générale Pathogènes avec PAMP et Ag

Destruction de l’Ag

PRM

PRM

Destruction de l’Ag 1 Immunité innée

Dégradation de l’Ag

Destruction de l’Ag Cellule présentatrice d’Ag

Opsonisation et action du complément

Présentation de l’Ag

CMH TCR

Lymphocyte T Inflammation

3

Immunité adaptative

Liaison de l’Ag

Immunité à médiation cellulaire 2

Lymphocyte B activé

Immunité humorale spécifique de l’Ag

Production de cytokines Lymphocyte activé Production d’Ac

FIGURE 22.5 Résumé de la réponse immunitaire. Trois mécanismes permettent de détruire les pathogènes. 1) L’immunité innée résulte de l’interaction entre les Pathogen-Associated Molecular Patterns (PAMP) situés à la surface des pathogènes et à la surface des pathogènes et les Pattern Recognition Molecules (PRM) situées à la surface des phagocytes. L’immunité adaptative, orchestrée par des lymphocytes T spécifiques de l’antigène (Ag) emprunte deux voies effectrices ; 2) l’immunité à médiation cellulaire est due à des anticorps (Ac) spécifiques d’Ag que produisent les lymphocytes B stimulés par ces Ag ; 3) l’immunité à médiation humorale est assurée par des lymphocytes effecteurs spécifiques de l’Ag.

Membrane plasmique de phagocyte

Noyau

H2O + Cl– Myéloperoxydase

H2O2 + e– OH• + H2O

HOCl H2O2

NADPH N2+ O2 Synthase d’oxyde nitrique

NO

2 O2

2 O2–

H2O2 1O

Phagolysosome

NAPDH oxydase

2

Bactérie phagocytée

FIGURE 22.6 Production de radicaux oxygénés toxiques par les enzymes du phagocyte. Ils comprennent des peroxydes d’hydrogènes (H2O2). Le radical hydroxyle (OH•), l’acide hypochlorique (HOC l), l’ion superoxyde (O 2–), les singlets d’oxygène (1O2) et l’oxyde nitrique (NO). La synthèse de ces composés toxiques nécessite une augmentation substantielle de la captation et de l’utilisation des molécules d’oxygène dans l’explosion respiratoire (voir section 6.15 pour des informations supplémentaires).



22.3 Inflammation, fièvre et choc septique 751

•

Situez les molécules de reconnaissance spécifique du phagocyte et les structures moléculaires associées aux agents pathogènes.

•

Citez les dérivés toxiques de l’oxygène et décrivez l’explosion respiratoire des phagocytes activés.

•

Décrivez l’un des mécanismes par lesquels les agents pathogènes échappent à la phagocytose.

22.3 Inflammation, fièvre et choc m n septique L’inflammation est un moyen de défense non spécifique contre les toxines, ou contre les pathogènes qui les ont sécrétées. Elle se traduit par une rougeur (érythème), un gonflement (œdème), une douleur et de la fièvre. Ses médiateurs sont les cytokines et les chimiokines (voir section 23.11), que produisent diverses cellules, mais au premier chef les phagocytes (voir section 22.1). Une réaction immunitaire innée, mais également adaptative, aboutit souvent à l’inflammation. En effet, ces deux réponses recourent aux mêmes médiateurs de l’inflammation qui recrutent et activent les mêmes cellules et les mêmes molécules. Quand elle est efficace, l’inflammation circonscrit les lésions, limite les dégâts tissulaires et détruit pathogènes et cellules. Il arrive cependant qu’elle cause des dégâts cellulaires considérables et essaime dans l’organisme.

Cellules de l’inflammation et inflammation locale La cellule inflammatoire qui arrive la première sur les lieux d’une infection ou d’une lésion tissulaire est le polynucléaire neutrophile (voir figure 22.7a), attiré par les chimiokines (voir section 23.11). L’interleukine 8 (IL-8), par exemple, est une petite protéine sécrétée par les cellules qui ont été lésées les premières par l’infection. Les neutrophiles sont activés par l’IL-8 et attirés par les cellules qui l’ont sécrétée. Une fois activés, ils deviennent des phagocytes. Leur rôle est d’autant plus important dans la phagocytose qu’ils recrutent les macrophages (voir figure 22.7b) en produisant d’autres chimiokines comme la macrophage inflammatory protein (MIP)-α et MIPβ. Ces chimiokines attirent les macrophages. Ceux-ci remontent le gradient chimiokinique jusqu’aux neutrophiles, qui les attendent sur le site de la lésion. En y étant à leur tour activés, ils améliorent leur capacité de phagocytose (voir section 22.2) et produisent nombre d’autres cytokines (voir section 23.11) qui sollicitent d’autres cellules. Les cytokines macrophages

(a) CDC / NCID / Division of Parasitic Diseases / PHIL

La réponse immunitaire innée est due aux phagocytes. Leur membrane est armée de molécules de reconnaissance qui s’adaptent à des structures moléculaires à la surface des agents pathogènes. Pour activer un phagocyte, l’interaction entre les récepteurs de sa paroi et les ligands du pathogène suscite une production de substances capables de tuer les pathogènes, ou du moins d’en limiter les effets. Beaucoup d’agents ont développé des mécanismes pour parer aux effets des phagocytes.

CDC / Joe Millar / PHIL


(b) FIGURE 22.7 Phagocyte activé. (a) Les polynucléaires neutrophiles (PNN) phagocytent activement et tuent les Nesseria gonorrhoeae. Leur diamètre varie entre 12 et 15 µm. Notez que leur noyau est polylobé et que tous les PNN n’ont pas phagocyté de bactérie. (b) Une cellule de Langerhans ayant phagocyté de nombreux Leishmania (indiqués par les flèches). Une fois activés, les macrophages sont capables de tuer ces protozoaires intracellulaires.

les plus importantes pour l’inflammation sont l’IL-1, l’IL-6 et le tumor necrosis factor-alpha (TNF-α). Les médiateurs émis par les cellules lésées par les phagocytes participent à l’inflammation. Par exemple, l’IL-1, l’IL-6 et le TNF-α augmentent la perméabilité des vaisseaux, exagèrent le volume des sécrétions locales (œdèmes) et causent la rougeur et la chaleur locale de l’inflammation. À son tour, l’œdème déclenche la douleur en stimulant les terminaisons nerveuses locales. D’habitude, l’inflammation finit par cantonner le pathogène et par le faire détruire par les neutrophiles et les macrophages. Dès lors, les cellules inflammatoires ne sont plus stimulées, leur nombre diminue dans le foyer, la sécrétion des cytokines se tarit et l’inflammation s’apaise. Non seulement les macrophages sont les acteurs de l’immunité innée, mais en plus ce sont les initiateurs de l’immunité adaptative. En effet, ils peuvent sécréter des cytokines qui attirent les lymphocytes T sur place et auxquels les macrophages sont susceptibles de présenter l’Ag (voir section 22.5).

Inflammation spécifique et choc septique Cette réponse inflammatoire peut se solder par un échec. L’agent pathogène n’est pas localisé. La réaction ne peut pas être limitée, puisque cellules et médiateurs sont activés sur une plus grande échelle. Une réaction qui essaime les cellules et médiateurs à travers le système circulatoire et le système lymphatique (voir section 22.1) peut engager le pronostic vital au cours d’un choc



752 Chapitre 22


septique. La cause la plus fréquente est l’infection systémique par des bactéries Gram négatif comme Salmonella ou Escherichia coli. L’origine se trouve souvent dans l’intestin qui laisse échapper ces bactéries dans la cavité péritonéale ou dans le courant sanguin. L’infection initiale a souvent été éliminée par les phagocytes ou éradiquée par des antibiotiques. Cependant, leurs LPS (voir section 4.9) peuvent s’insérer dans les TLR-4 des phagocytes (voir sections 22.2 et 23.1) et favoriser la fuite d’IL-1, d’IL-6, d’IL-8 et de TNF-α dans la circulation. Ces cytokines provoquent ensuite des réponses systémiques variées. Par exemple, IL-1, IL-6 et TNF-α sont des pyrogènes endogènes qui suscitent de la fièvre en distillant des prostaglandines dans le cerveau. Les cytokines pro-inflammatoires induisent aussi une production des protéines de la phase aiguë de l’inflammation dans le foie : la C-reactive protein et certaines protéines du complément (C), par exemple. Les réactions inflammatoires systémiques peuvent avoir des conséquences fâcheuses. Une production soutenue de pyrogènes endogènes hausse la température de façon incontrôlable, au lieu de se borner à augmenter la chaleur locale. L’œdème local par vasodilatation et par augmentation de la perméabilité vasculaire laisse sourdre des quantités massives de fluides à partir des vaisseaux. D’où une hypotension artérielle et un œdème des tissus alentours. Le choc septique qui en résulte donne une baisse du volume sanguin et une hausse de la température. Cet état est sérieux et même mortel dans 30 % des cas. Bref, une inflammation qui échappe à tout contrôle peut s’avérer plus dangereuse que l’infection qui l’a déclenchée.

Contrôlez vos acquis Douleur, œdème, érythème et chaleur caractérisent l’inflammation. C’est une réaction normale et son évolution est en général favorable. En revanche, une inflammation systémique et non contrôlée peut évoluer jusqu’au choc septique, causer une maladie sérieuse, voire entraîner la mort. •

Quelles sont les cellules à l’origine de l’inflammation ?

•

Citez les médiateurs de l’inflammation et décrivez leur rôle dans cette inflammation.

22.4 Réponse immunitaire adaptative m n L’ensemble de la réponse immunitaire adaptative ou spécifique est représenté dans la figure 22.5. Les phagocytes, c’est-à-dire les macrophages et les cellules dendritiques, mais également les lymphocytes B, captent, ingèrent et digèrent les pathogènes. Toutes ces cellules peuvent jouer un rôle de CPA et présenter les reliquats de la digestion des Ag aux lymphocytes T. Ces lymphocytes T possèdent des récepteurs spécifiques, appelés récepteurs des cellules T ou T-cell receptors (TCR), qui captent les peptides Ag que leur présentent les CPA. Pour un lymphocyte T donné, les TCR sont spécifiques d’un seul peptide. D’autres lymphocytes T, les cellules T cytotoxiques (TC) attaquent directement et détruisent les cellules affichant des Ag sur leur membrane. D’autres

lymphocytes T activés par des Ag, les T-helper 1 (Th1), produisent des cytokines activant d’autres cellules comme les macrophages, chargés de détruire les cellules qui en sont pourvues. Cette immunité à médiation cellulaire est consommée par la destruction des cellules infectées par les pathogènes. Une autre sous-population de lymphocytes T, les cellules TH2, intervient sur des lymphocytes B spécifiques d’Ag et les stimulent à produire des immunoglobulines (Ig), ou Ac. Chaque lymphocyte B est spécifique d’un Ag unique. Les Ac sont des protéines solubles qui agissent de façon spécifique avec leurs Ag dans le sang ou dans n’importe quel fluide. Ces Ac neutralisent les Ag ou les désignent aux agents destructeurs. Cette immunité, dite à médiation humorale, est particulièrement efficace contre les virus et les bactéries du sang ou de la lymphe, mais également contre les toxines et autres substances des produits pathogènes solubles. L’immunité innée est dirigée contre des pathogènes courants, alors que l’immunité spécifique est réservée à des macromolécules particulières. Cette immunité spécifique se caractérise par sa spécificité, sa faculté à mémoriser et, à l’inverse, par sa capacité à tolérer un Ag.

Spécificité Quand un Ag réagit avec un Ac ou avec un lymphocyte T, il le fait de façon spécifique ; ce qui n’est pas le cas des mécanismes de l’immunité innée dont il a été question. Ceux-là réagissent face à n’importe quel micro-organisme, y compris ceux qu’ils rencontrent pour la première fois. La réponse immunitaire adaptative a besoin de plusieurs jours après le contact avec le pathogène pour être effective. Mais une fois lancée, elle est exclusivement et spécifiquement dirigée contre l’agent qui l’a suscitée, puisqu’elle succède à la reconnaissance de motifs moléculaires précis sur cet Ag (voir figure 22.8a).

Mémoire Quand le système immunitaire a produit un Ac ou un lymphocyte T spécifique d’un Ag, la réintroduction de ce même Ag suscite rapidement l’abondante production des Ac ou des lymphocytes T qui en sont spécifiques. Cette faculté à répondre plus rapidement et plus vigoureusement la deuxième fois que la première est la mémoire immunologique (voir figure 22.8b). Elle permet à un individu de résister de façon spécifique à une maladie que causerait chez lui un agent pathogène s’il ne l’avait déjà rencontré. La vaccination est l’application de ce principe. Elle consiste à stimuler artificiellement un système immunitaire par des pathogènes morts ou affaiblis, ou par leurs produits, pour améliorer la réponse à des pathogènes virtuellement dangereux (voir section 22.11).

Tolérance La tolérance est un phénomène acquis. C’est l’absence spécifique de réaction aux Ag du « soi ». C’est évidemment indispensable puisque toutes les macromolécules d’un organisme sont des Ag potentiels. Le système doit donc apprendre à les ignorer, puisque si les Ac ou les lymphocytes T les reconnaissaient, les cellules du « soi » en seraient endommagées (voir figure 22.8). La réponse immunitaire spécifique est capable de distinguer le « non-soi » externe (et dangereux) du « soi » interne (et non dangereux).



22.5 Antigènes et immunogènes 753

Fixation spécifique de l’Ag

Récepteur d’Ag Cellule immunologique

Réponse immunitaire

Antigènes (Ag) Spécificité : des cellules immunitaires reconnaissent et réagissent avec des Ag par des interactions moléculaires directes entre elles-mêmes et ces Ag. Ag

Cellules mémoires

Réponse immunitaire d’ensemble Mémoire : la réponse immunitaire à un Ag est rapide et plus forte la deuxième fois que la première. En effet, le premier contact de cellules avec l’Ag a induit la prolifération et la différenciation des cellules réagissant avec lui, lesquelles sont en conséquence présentes en de multiples copies.

Auto-Ag

Cellules immunes spécifiques d’exo-Ag Tolérance : les cellules immunitaires ne peuvent pas réagir avec les auto-Ag. Celles qui sont spécifiques des auto-Ag ont été détruites pendant l’ontogénèse de ce système immunitaire. FIGURE 22.8 Réponse immunitaire adaptative. Acteurs importants de l’immunité à médiation cellulaire et de l’immunité à médiation humorale.

Contrôlez vos acquis Les phagocytes non spécifiques présentent l’Ag aux lymphocytes spécifiques. Ainsi sont mobilisées des cellules TC à cytokines et des cellules B productrices d’Ac. Les unes et les autres concourent directement ou indirectement à neutraliser ou à détruire l’Ag. Cette adaptation se caractérise par sa spécificité vis-à-vis de l’Ag, son aptitude à le mémoriser et donc à mieux répondre la deuxième fois que la première, et par sa capacité à distinguer les Ag du « soi » et les Ag du « non-soi » et d’appliquer le principe de la tolérance. •

•

Quelles sont les cellules spécifiques d’Ag mises en cause dans l’immunité à médiation cellulaire et dans l’immunité à médiation humorale ? Quelles sont les conséquences d’un défaut de spécificité, de mémorisation ou d’une rupture de la tolérance sur la réponse à un agent pathogène ?

II

ANTIGÈNE, LYMPHOCYTE T ET IMMUNITÉ À MÉDIATION CELLULAIRE

La réponse immunitaire adaptative a évolué de manière à élargir l’éventail de molécules et de structures dérivées des pathogènes qu’elle serait capable de reconnaître : ce sont les Ag. Nous commencerons par les présenter, puis nous nous pencherons sur les lymphocytes T. Ils sont à l’origine de réactions spécifiques de l’Ag, détruisent cet Ag ou développent une réaction inflammatoire et fournissent une « aide » aux lymphocytes B. En absence de cellules T, il n’y a donc pas de réponse immunitaire adaptative spécifique de l’Ag.

22.5 Antigènes et immunogènes m n Les Ag sont les structures qui réagissent avec les Ac s’il s’agit de lymphocytes B, et avec les TCR s’il s’agit de lymphocytes T. La plupart d’entre eux sont des immunogènes. Dans ce cas, non seulement ils sont reconnus, mais ils suscitent une réponse immunitaire.

Les fondements de l’immunogénicité Pour être efficacement reconnus par les Ac ou par les TCR, les immunogènes doivent remplir plusieurs conditions : la taille, la complexité et la forme de la molécule. La taille est un facteur important d’immunogénicité. En effet, les haptènes, qui ont un faible poids moléculaire (PM), n’induisent pas de réponse immunitaire en eux-mêmes, alors qu’ils se lient aux Ac, à la condition que ceux-ci soient déjà présents. Comme ils se fixent aux Ac, ce sont des Ag, quand bien même ne sont-ils pas immunogènes. Parmi eux, on trouve des sucres, des acides aminés et une grande variété de composés organiques de faible PM. Ils deviennent des immunogènes efficaces quand ils sont fixés à des haptènes de PM élevé. Celui de la plupart de ces immunogènes atteint ou dépasse 10 kD. La taille de la molécule constitue donc un facteur d’immunogénicité. Les polymères complexes mais non répétitifs, comme les protéines et les polysaccharides, sont souvent des immunogènes efficaces. En revanche, acides nucléiques, polysaccharides simples et lipides se comportent souvent comme de piètres immunogènes, puisque leur structure est répétitive. La complexité de la molécule est donc un deuxième facteur d’immunogénicité. Habituellement, les macromolécules complexes et insolubles (agrégées par la chaleur par exemple) font d’excellents immunogènes. Rapidement capté par les phagocytes, ce matériel insoluble déclenche une réponse immunitaire. Par contre, la forme soluble de la même molécule perd souvent cette immunogénicité, puisque le phagocyte ne peut plus la capter. L’organisation de l’Ag dans l’espace est donc un troisième et dernier facteur d’immunogénicité.

Les propriétés extrinsèques des immunogènes De nombreuses substances ont tout pour être immunogènes, mais plusieurs facteurs extrinsèques influent également sur cette immunogénicité : la dose de l’Ag, la voie par laquelle il s’introduit dans l’organisme et son caractère plus ou moins étranger par rapport à l’hôte.



754 Chapitre 22


La dose de l’immunogène est importante pour que la réponse immunitaire soit efficace. Elle est satisfaisante pour un large éventail de doses. En général des doses de 10 µg à 1 g sont efficaces chez la plupart des mammifères. Il arrive que des doses de plus de 1 g ou de moins de 10 m non seulement ne suscitent pas de réponse immunitaire, mais déclenchent même une tolérance active. La voie par laquelle l’Ag pénètre est également importante. La voie parentérale, c’est-à-dire autre que le tractus gastrointestinal, en particulier par injection, est normalement plus efficace que le contact direct ou l’entrée par voie orale. Dans ces deux cas, l’Ag est parfois significativement dégradé avant le contact avec le phagocyte. Mais le facteur le plus important de l’immunogénicité est la distance entre l’Ag et l’hôte. En effet, le système immunitaire adaptatif reconnaît et élimine uniquement les Ag étrangers du « non-soi ». Ceux du « soi » ne le sont pas, si bien que chaque individu tolère ses propres molécules, même si elles sont immunogènes pour d’autres individus de la même espèce.

La fixation de l’antigène aux anticorps ou aux TCR Un Ac ou un TCR ne réagit pas avec la globalité de la macromolécule que constitue un Ag, mais avec un segment limité de celle-ci, le déterminant antigénique ou épitope (voir figure 22.9). Il peut s’agir de sucres, d’acides aminés ou d’autres molécules. Les Ac réagissent contre les épitopes qui leur sont accessibles à la surface des Ag. S’il s’agit d’une protéine, la taille optimale d’un déterminant antigénique est de quatre acides aminés. Les protéines, qui associent habituellement des centaines ou même des milliers d’acides aminés, exhibent donc un éventail d’épitopes qui se chevauchent les uns les autres. Il arrive même que certains soient constitués d’acides aminés éloignés les uns des autres sur la chaîne primaire de la molécule, mais rapprochés par ses repliements secondaires, tertiaires ou même quaternaires (voir figure 22.9, et sections 3.7 et 3.8).

Protéine (Ag)

Déterminant antigénique

Contrôlez vos acquis Un immunogène est une macromolécule étrangère qui induit une réponse immunitaire. Ses standards intrinsèques sont la taille, la complexité et la forme dans l’espace. Quand un immunogène s’introduit dans un hôte à une dose appropriée par une voie adaptée, il suscite une réponse immunitaire. Les Ag sont des molécules reconnues par des récepteurs d’Ag de lymphocytes B, ou Ac, ou par des récepteurs d’Ag de lymphocytes T, ou TCR. Les premiers reconnaissent des déterminants conformationnels, alors que pour les seconds ce sont des déterminants linéaires. •

Quelles sont les différences entre un immunogène et un Ag ?

•

Quels sont les critères intrinsèques et les conditions extrinsèques pour qu’un Ag se comporte comme immunogène ?

•

Décrivez un épitope pour Ac et comparez-le à l’épitope pour TCR.


Ac3


De tels déterminants conformationnels élargissent le potentiel antigénique de ces macromolécules. La surface d’une bactérie ou d’un virus arbore une mosaïque de protéines, de polysaccharides et autres macromolécules, chacun étant nanti de ses épitopes. Au total, l’organisation antigénique d’un micro-organisme tout-venant, ou même d’une simple macromolécule, est d’une complexité extrême. Alors que les Ac sont généralement destinés à des épitopes accessibles à la surface des macromolécules, les TCR ne distinguent leur épitope qu’à la condition que les immunogènes qui les portent aient été partiellement dégradés. L’Ag est débité en peptides et ceux-ci sont présentés à des lymphocytes T à la surface de CPA ou sur la membrane de cellules cibles (voir section 22.5 et figure 22.12). Normalement, le traitement de l’Ag en abolit la structure conformationnelle, puisqu’il est débité en peptides de moins de vingt acides aminés. Bref, un épitope T est une structure linéaire, alors qu’un épitope B est un déterminant conformationnel. Le pouvoir de résolution d’un Ac ou d’un TCR suffit pour distinguer un glucose d’un galactose, alors que la seule différence entre ces deux sucres est l’orientation d’un radical hydroxyle. Cette spécificité n’est pourtant pas absolue, car Ac ou TCR réagissent plus ou moins avec plusieurs épitopes quand ils ont certaines analogies entre eux. Le premier Ag de cette réaction croisée est l’Ag homologue, et le second l’Ag hétérologue.

Ac1 Ac2 Ac

FIGURE 22.9 Antigènes (Ag) et déterminants antigéniques. Un Ag peut contenir plusieurs déterminants antigéniques qui réagissent chacun avec l’anticorps (Ac) qui leur est spécifique. Le déterminant reconnu par l’Ac 1 est conformationnel puisqu’il est formé par deux segments du même polypeptide. En se repliant, celui-ci rapproche deux segments éloignés sur la molécule pour en faire un déterminant antigénique.

22.6 Présentation de l’antigène m n aux lymphocytes T Les TCR exprimés à la surface des lymphocytes T réagissent de façon spécifique avec leurs Ag. Plus précisément, les TCR réagissent avec les peptides présentés par les protéines du complexe majeur d’histocompatibilité (CMH), situées sur la membrane des cellules infectées par le pathogène.



22.6 Présentation de l’antigène aux lymphocytes T 755

Le récepteur des cellules T (T-cell receptor, TCR) Le TCR est une protéine transmembranaire qui se déploie dans l’environnement extracellulaire à partir de la membrane des lymphocytes T. Chacun d’entre eux affiche le même TCR à des milliers d’exemplaires. Celui-ci compte une chaîne α et une chaîne β. Chacune d’entre elles possède un domaine variable (V) et un domaine constant (C) [voir figure 22.10]. Les domaines Vα et Vβ se conjuguent pour former un site de liaison de l’Ag complet (voir figure 22.10). Comme nous l’observerons, la réponse immunitaire adaptative peut générer des TCR susceptibles de se lier à des Ag peu connus (voir section 23.7). D’autres, tels les polysaccharides complexes, ne peuvent pas être reconnus par les TCR. Ils se fixent aux Ig des lymphocytes B (voir section 22.10). Ils doivent d’abord s’être fixés aux protéines du CMH.

α1

Ag Vα

Vβ

Variable Constant

Cα

Cβ

FIGURE 22.10 Structure du récepteur d’antigène (Ag) ou T-cell receptor (TCR). Le domaine variable de la chaîne α se combine avec celui de la chaîne β pour former un site de liaison pour le peptide antigénique.

Ag Variable Constant

β2m

α3

α1

β1

α2

β2

(a)

Les protéines du complexe majeur d’histocompatibilité Les protéines du CMH, ou Human Leukocyte Antigens (HLA), sont codées par de nombreux gènes. En fait, on les a repérées parce qu’elles étaient les cibles majeures des réactions de rejet de greffe. L’organe d’un donneur est rejeté par le receveur chez lequel il a été transplanté quand les protéines du CMH du premier diffèrent de celles du CMH du second. Nous avons appris que ces protéines avaient pour fonction de présenter l’Ag aux TCR des lymphocytes T. Les chaînes du CMH codent les protéines de classe I à la surface de toutes les cellules nucléées, et les protéines de classe II restreintes aux lymphocytes B, aux macrophages et aux cellules dendritiques, brefs aux CPA. Les protéines de classe I (voir figure 22.11a) unissent une chaîne α enchâssée dans la membrane et codée par l’un des gènes de la région HLA à la bêta-2 microglobuline (β2m) codée par un gène extérieur à la région HLA. Les protéines de classe II comprennent deux peptides unis par des liaisons non covalentes, le peptide α et le peptide β. Comme la chaîne α des molécules HLA-I, les deux peptides des molécules HLA-II sont enchâssés dans la membrane plasmique d’un côté, et se projettent à l’extérieur de la surface cellulaire de l’autre (voir figure 22.10b). Les protéines du CMH varient d’un individu à l’autre au sein d’une même espèce. Les différences sont souvent subtiles d’une série d’acides aminés à une autre. C’est le polymorphisme.

α2

(b) FIGURE 22.11 Composition des molécules HLA. (a) Molécules HLA de classe I. Les domaines α1 et α2 forment ensemble un site de liaison pour le peptide antigénique. (b) Molécule HLA de classe II. Les domaines α1 et β1 forment ensemble un site de liaison pour le peptide antigénique.

L’espèce humaine possède plusieurs centaines d’allèles CMH différents. Ce polymorphisme HLA est l’obstacle antigénique majeur à la greffe de tissu d’un sujet à un autre. En conséquence, un greffon dont les molécules HLA ne sont pas conformes à celles du receveur est considéré comme étranger et donc rejeté par lui.

La présentation de l’antigène Les protéines du CMH ayant pour fonction de présenter les Ag permettent aux lymphocytes T de repérer ceux qui n’appartiennent pas au « soi ». Ces lymphocytes T contrôlent le paysage moléculaire à la surface des autres cellules, de manière à identifier celles qui portent des Ag étrangers. Un TCR ne se lie à des molécules HLA qu’à condition que celles-ci soient pourvues d’Ag étrangers et, à l’inverse, un TCR ne reconnaît un Ag étranger qu’à la condition que celui-ci lui ait été présenté dans le contexte d’une molécule HLA. Comment cela se passe-t-il ? Nombre de cellules de l’organisme sont susceptibles d’acquérir les Ag étrangers qui les ont infectées ou qu’elles ont phagocytés. Dès lors, elles les débitent en peptides et en déposent les reliquats au creux des molécules HLA. Le complexe peptides-CMH est arboré à la surface de la membrane plasmique et présenté aux lymphocytes T. On distingue deux systèmes d’apprêtement des Ag : le premier est réservé aux Ag présentés par les molécules HLA-I et le second aux Ag présentés par les molécules HLA-II (voir figure 22.12). Les molécules HLA-I présentent des peptides dérivés de protéines pathogènes et situés dans le cytoplasme des phagocytes (voir figure 22.12a). Ces protéines d’agents pathogènes proviennent d’infections intracellulaires par des virus ou par



756 Chapitre 22


Lymphocyte Tc

Lymphocyte TH TH cell

TCR CD8

Protéine étrangère CD4 de l’extérieur

3

TCR

5

4

4

Endocytose Peptide

Peptide

2

Phagolysosome Molécule de classe I

Chaperon

3

2

β2m Réticulum endoplasmique

Protéine Ii

Cellule présentatrice d’Ag

Molécule de classe II 1

Protéine étrangère internalisée

TAP 1

Peptide Réticulum endoplasmique

Protéasome Cellule cible (a)

(b)

FIGURE 22.12 Présentation des antigènes (Ag) par les molécules HLA de classe I et II. (a) Les HLA I sont assemblées dans le réticulum endoplasmique (RE). Des molécules chaperonnes les stabilisent jusqu’à l’arrivée de l’Ag. 1) Les protéines antigéniques produites à l’intérieur de la cellule, par exemple à partir d’un virus, sont dégradées par le protéasome dans le cytoplasme puis transportées à travers la membrane du RE, en passant par un pertuis constitué par les protéines TAP. 2) Ensuite, les peptides se lient aux molécules HLA et l’ensemble est transporté jusqu’à la membrane plasmique. 3) Le complexe réagit avec les récepteurs d’Ag, ou T-cell receptor (TCR) exposés à la surface de lymphocytes T C. 4) Le corécepteur CD8 du lymphocyte T c se fixe aux molécules HLA I pour étayer la liaison. Les cellules T C sécrètent alors des cytokines et des cytotoxines pour tuer les cellules cibles, celles-ci pouvant être constituées par n’importe quelle cellule nucléée à la surface de laquelle le TCR reconnaît le peptide présenté par HLA. (b) Le mode de présentation de l’Ag par les molécules HLA II est différent. 1) Les protéines HLA II sont produites dans le RE et assujetties à la chaîne invariante qui est une protéine empêchant les molécules HLA II de se complexer avec les peptides du RE. 2) Les lysosomes contenant les molécules HLA II fusionnent avec les phagosomes pour former des phagolysosomes où sont digérés les Ag phagocytés. 3) Les molécules HLA II se fixent aux reliquats peptidiques et le complexe peptide-HLA II est transporté à la surface de la cellule. 4) Ce complexe y réagit avec le TCR et 5) le corécepteur CD4 des lymphocytes T H. Ceux-ci sécrètent des cytokines agissant sur d’autres cellules pour activer la réponse immunitaire. Seules les cellules présentatrices d’Ag servent de cibles aux lymphocytes T au moment de la reconnaissance des complexes peptides-HLA II. Ce sont des macrophages, des cellules dendritiques et des lymphocytes B.

d’autres pathogènes. Celles qui dérivent des virus sont logées et digérées dans les protéosomes du cytoplasme. La longueur d’un Ag peptidique est d’environ dix acides aminés, il est transporté par des réactions consommant de l’énergie dans le réticulum endoplasmique (RE), où il accède, à travers un pore constitué par deux TAP (transporters associated with antigen processing). À l’intérieur du RE, ces peptides se lient aux molécules HLA de classe I qui sont maintenues à proximité des TAP par des protéines chaperons. Des complexes Ag-CMH-I se détachent alors des chaperons et gagnent la membrane pour y être insérés et présentés aux cellules TC. Ainsi, les protéines du CMH constituent une plate-forme à laquelle se lient les Ag viraux. Ensuite, le TCR interagit depuis la surface d’un lymphocyte T avec l’Ag qui fait partie du « non-soi » et avec les molécules du CMH qui appartiennent

au « soi » à la surface des cellules cibles. Cette rencontre entre lymphocyte T et cellule cible incite les cellules TC à produire des perforines (voir section 22.6) qui tuent la cellule infectée. Un deuxième mode de présentation de l’Ag utilise les molécules HLA-II (voir figure 22.12b). Elles sont restreintes aux APCs où leur rôle est de prendre en charge les peptides résultant de la dégradation d’agents extracellulaires, telles les bactéries, qui ont été phagocytés. Les molécules HLA-II, comme les molécules HLA-I sont d’abord assemblées dans le RE. Mais la suite diffère de ce qui se passe pour les molécules HLA-I, car une protéine chaperon appelée Ii (la chaîne invariante) se fixe aux molécules HLA-II, occupe leur site de liaison aux peptides, les empêchant de capter ces peptides à l’intérieur du RE. Ces complexes CMH II-Ii gagnent les lysosomes à partir du RE (voir section 22.2). Le phagosome



22.7 Lymphocytes T cytotoxiques et cellules 757

qui contient l’Ag étranger fusionne avec le lysosome pour former un phagolysosome à l’intérieur duquel l’Ag mais aussi le peptide Ii sont digérés par les enzymes lysosomiaux. Les peptides résiduels, d’environ 11 à 15 acides aminés (légèrement plus que les peptides qui se lient aux molécules HLA-I) sont ensuite captés par les sites de liaison à l’Ag nouvellement rendus accessibles sur les CMH-II. Le complexe est ensuite transporté jusqu’à la membrane plasmique où il est présenté à des TH. Leur TCR reconnaît le complexe CMH II-peptide. Après cette interaction, le TH sécrète des cytokines qui favorisent la production d’Ac par les lymphocytes B ou suscitent une inflammation (voir sections 22.8 et 22.10).

Les corécepteurs CD4 et CD8 En plus de son TCR, chaque lymphocyte T exprime une protéine qui se comporte comme un corécepteur. Pour les lymphocytes TH, c’est CD4 ; pour les lymphocytes TC, c’est CD8 (voir figure 22.12). Sitôt le TCR uni au complexe CMH-peptide, son corécepteur se lie également aux protéines du CMH, renforçant les interactions moléculaires entre les deux cellules et augmentant l’activation du lymphocyte T. S’il s’agit de CD4, la liaison ne se fait qu’avec les molécules HLA-II, étayant les liaisons entre les lymphocytes TH et les CPA qui expriment les molécules HLA-II. En revanche, s’il s’agit de CD8, la liaison ne se fait qu’avec les molécules HLA-I, étayant les liens entre les lymphocytes TC et leurs cellules cibles pourvues de molécules HLA-I. CD4 et CD8 servent à distinguer un TH d’un TC (voir section 24.9).

Contrôlez vos acquis Les lymphocytes T reconnaissent des Ag présentés par des CPA ou des cellules infectées par un pathogène. Au niveau moléculaire, les TCR se fixent aux peptides présentés par les molécules HLA. Ces interactions stimulent les lymphocytes T à lyser les cellules pourvues de ces Ag ou à produire les cytokines qui stimulent les cellules. •

Quelles sont les cellules qui expriment les molécules HLA-I sur leur surface ? celles qui expriment les molécules HLA-II ?

•

Décrivez le processus de la présentation de l’Ag provenant d’un agent pathogène intracellulaire et d’un Ag provenant d’un agent pathogène extracellulaire.

le contexte des molécules HLA-I. Une cellule présentant un Ag étranger dans ce contexte peut être tuée par des lymphocytes TC (voir section 22.6). Toute lyse cellulaire requiert un contact entre le lymphocyte TC et sa cible. Il s’établit entre le TCR et le complexe CMH Ipeptide (voir figure 22.12a). Les granules rejoignent alors ce point de contact à l’intérieur du lymphocyte TC et y dégranulent leur contenu. Ces granules contiennent la perforine qui pénètre à l’intérieur de la membrane de la cellule cible et y fore un pertuis. Ils contiennent également les granzymes qui provoquent l’apoptose, ou mort cellulaire programmée. Quand les granzymes se sont introduits à l’intérieur de la cellule cible, à travers les pertuis creusés par les perforines, celles-ci entrent en apoptose. Elles se dégradent de l’intérieur (voir figure 22.13a). Ce phénomène épargne les lymphocytes TC, dont les membranes sont insensibles à la perforine. Il lyse uniquement les cellules exprimant des Ag étrangers, puisque cette granulation ne se produit qu’au point de contact entre lui et la cellule cible dotée des Ag. Les cellules qui en sont dépourvues n’établissent donc pas de contact avec ceux-ci et ne peuvent pas être lysées.

Les cellules natural killer Les cellules NK forment une famille de lymphocytes distincts des lymphocytes TC. Il n’empêche, elles ont également pour rôle de détruire des cellules infectées par des actions pathogènes extracellulaires. Ce ne sont ni des lymphocytes T, ni des lymphocytes B. Leur nombre est constant, elles ne gardent pas la mémoire des Ag qui les ont stimulées. Néanmoins, ces NK rappellent les lymphocytes TC par leur aptitude à détruire des cellules infectées. En effet, ces cellules NK utilisent aussi la perforine et les granzymes pour lyser leurs cellules cibles. En revanche, elles le font en l’absence d’Ag spécifique, puisqu’elles peuvent détruire des cellules malignes, des cellules infectées par un virus in vitro sans qu’il y ait eu le moindre contact préalable avec un Ag. Il semble que leurs récepteurs reconnaissent les molécules HLA-I à la surface des cellules normales. Cela désactive les processus lytiques. Si cette reconnaissance ne se produit pas, les cellules NK tuent les cellules cibles qu’elles n’ont pas reconnues. Ce sont des cellules malignes ou des cellules infectées par des virus, lesquels réduisent leur expression de molécule HLA-I ou en altèrent la structure.

Contrôlez vos acquis 22.7 Lymphocytes T cytotoxiques m n et cellules natural killer Nous avons décrit deux familles de lymphocytes T, les cellules TC et les cellules TH. Nous allons voir en détail la lyse cellulaire par les lymphocytes TC. Nous présenterons également les cellules natural killer (NK) qui reconnaissent également et tuent les cellules infectées par des agents pathogènes intracellulaires.

Les lymphocytes T cytotoxiques Les lymphocytes TC lysent directement la cellule dont la membrane arbore des Ag étrangers. Ils les reconnaissent dans

Les lymphocytes TC reconnaissent les Ag à la surface des cellules infectées par un virus ou des cellules cancéreuses grâce à leur TCR. Cette reconnaissance spécifique de l’Ag provoque une lyse due à la perforine et aux granzymes. Les cellules NK recourent aux mêmes effecteurs, mais se passent de stimulation et sont dépourvues de la faculté de mémorisation. Elles réagissent en l’absence de molécules du CMH. •

Comparez les mécanismes de reconnaissance par les lymphocytes TC et les cellules NK.

•

Décrivez les systèmes de lyse communs aux lymphocytes TC et aux cellules NK.



758 Chapitre 22


22.8 Lymphocytes T : activation m n de la réponse immunitaire H

Lymphocyte cytotoxique (Tc)

TCR Ag CD8

Granules contenant des perforines et des granzymes Libération du contenu des granules

Cellules TH1 et activation des macrophages

Molécule HLA I Mort cellulaire par apoptose

(a)

Lymphocyte T inflammatoire (TH1) TCR Ag CD4 Molécule HLA II

Nous allons révéler le rôle décisif des lymphocytes T dans la production de cytokines. Les lymphocytes TH se répartissent en TH1 et en TH2. Les premiers participent à l’activation des macrophages et à l’inflammation, les seconds agissent sur les lymphocytes B et leur production d’Ac.

Sécrétion de cytokines (TNF-α, GM-CSF et INF-γ)

Macrophage

Activation par des cytokines

Amélioration de la phagocytose de tous les pathogènes et inflammation (b) FIGURE 22.13 Lymphocytes T effecteurs. (a) Lymphocytes T cytotoxiques ou cellules Tc activés par des antigènes (Ag) que présentent des molécules HLA II. Ces cellules T réagissent en libérant des granules bondés de perforines et de granzymes. Les premières perforent la membrane de la cellule cible et les secondes en provoquent l’apoptose. (b) Lymphocytes T inflammatoires ou cellules TH1 activés par les Ag que présentent des molécules HLA II à la surface de macrophages. Ces cellules TH1 réagissent en sécrétant des cytokines qui améliorent la phagocytose des macrophages et promeuvent l’inflammation.

Les macrophages peuvent tuer certaines des cellules étrangères qu’ils ont ingérées, mais leur rôle de CPA est essentiel à l’immunité cellulaire, comme à l’immunité humorale (voir figure 22.12b). Leur activité est stimulée par les TH1, qui leur permettent de tuer les bactéries intracellulaires qui se multiplient dans des macrophages quiescents et dans les autres phagocytes. La plupart d’entre elles sont tuées et digérées (voir section 22.2), mais certaines survivent et se multiplient. C’est le cas de Mycobacterium tuberculosis, agent de la tuberculose, de M. leprae, agent de la lèpre, et de Listeria monocytogenes, agent de la listériose (voir section 29.10). Les animaux auxquels on injecte des doses modérées de M. tuberculosis arrivent à les maîtriser et à développer une résistance grâce à leur immunité à médiation cellulaire. Les cellules en cause sont les lymphocytes TH1 de l’inflammation. Ils activent les macrophages et autres phagocytes en sécrétant de nombreuses cytokines. On y trouve l’interféron gamma (IFN-), le granulocytemonocyte colony-stimulating factor et le TNF-. Une fois sensibilisées, ces cellules phagocytent et tuent également d’autres organismes comme Listeria, étant donné qu’une fois activés, leurs macrophages tuent plus facilement un pathogène, quel qu’il soit. Les macrophages activés par les TH1 ont le pouvoir de tuer non seulement des pathogènes étrangers, mais également d’autres cellules de mammifères. Les cellules tumorales, par exemple, expriment des Ag qui sont propres à la cancérogenèse, puisqu’ils n’existent pas sur les cellules normales. La plupart d’entre elles sont considérées comme étrangères par le système immunitaire et sont détruites par des macrophages activés eux-mêmes par les cytokines des TH1 spécifiques de ces cellules tumorales. Le rejet d’un greffon est également dû à des macrophages activés par des TH1. En l’occurrence, les lymphocytes TH1 qui ont détecté les Ag HLA du greffon activent les macrophages qui déterminent ce greffon.

Lymphocytes TH2 et activation des lymphocytes B Le rôle des TH2 dans l’activation des cellules B et dans leur production d’Ac est décisif (voir section 22.3). Comment sont-ils mobilisés ? Les cellules B sont équipées d’Ac qui sont leurs récepteurs d’Ag. Mais il ne suffit pas que des Ag se soient insérés dans ces Ac pour que les lymphocytes B sécrètent leurs Ac. En fait, une cellule B se comporte comme une CPA quand elle coopère avec un lymphocyte TH2. L’Ag qui vient d’être intercepté est d’abord internalisé et dégradé à l’intérieur de la cellule. Les restes de peptides sont présentés par les molécules HLA-II à un lymphocyte TH2 (voir figures 22.12b et 22.14). Celui-ci sécrète de l’IL-4 et de l’IL-5, qui permettent au lymphocyte B de fabriquer et de secréter des Ac solubles (voir section 22.10). Ce lymphocyte TH2 est donc une cellule helper, puisqu’elle favorise la production d’Ac par le lymphocyte B.



22.9 Anticorps (ou immunoglobulines) 759

Lymphocyte T-helper (TH2)

Récepteur des cellules T Secrétion d’IL-4 et d’IL-5 par les cellules TH2

Peptide antigénique Molécule HLA II Dégradation de l’Ag par le lymphocyte B

Réponse immunitaire primaire

Ig à laquelle était lié un Ag

Plasmocyte de courte durée de vie

Cellule mémoire de longue durée de vie

III

ANTICORPS DANS LA RÉPONSE IMMUNITAIRE

Les Ac sont indispensables pour qu’une réponse immunitaire soit efficace, en particulier quand cette réaction est spécifique d’un facteur extracellulaire, comme une toxine. Après en avoir décrit la structure, nous verrons comment les Ac sont produits par les cellules B et conclurons en vérifiant leur aptitude à neutraliser ou à détruire les Ag.

22.9 Anticorps (ou immunoglobulines) m n

Les anticorps (Ac) ou immunoglobulines (Ig) sont des protéines susceptibles de se combiner à des déterminants d’Ag. Il y en a dans le sérum et dans les autres fluides de l’organisme, comme les sécrétions digestives et le lait. Un sérum qui contient des Ac spécifiques d’Ag s’appelle un antisérum. Les Ig se distribuent en cinq classes d’Ac en fonction de leurs propriétés physiques, chimiques et immunologiques : les IgG, les IgA, les IgM, les IgD et les IgE (voir tableau 22.2). Chez la plupart d’entre nous, les IgG représentent 80 % des Ig du sérum.

La structure des immunoglobulines G

Sécrétion des Ac

Les IgG sont les Ac les plus abondants du sérum. Leur PM est d’environ 150 kD et elles comprennent quatre chaînes polypeptidiques (voir figure 22.15) unies entre elles par des ponts disulfures intercaténaires : deux chaînes légères rigoureusement identiques

Réexposition au même Ag et différenciation rapide en plasmocytes Réponse immunitaire secondaire

FIGURE 22.14 Coopération entre lymphocytes T et lymphocytes B pour produire des anticorps (Ac). Le lymphocyte B joue le rôle de cellule présentatrice d’antigène (Ag), ou CPA interceptant d’abord l’Ag par ses immunoglobulines Ig de membrane. Après l’avoir internalisé et dégradé, il présente ses reliquats à des cellules TH2 sur des molécules HLA II. Les cellules TH2 incitent ensuite les lymphocytes B initiaux à proliférer et à se différencier en plasmocytes ou en cellules mémoire. Si le même Ag survient, ces cellules mémoire peuvent se différencier en plasmocytes.

VH

VL

CH1

CL

CH2 Ag

Contrôlez vos acquis Le rôle des lymphocytes TH1 dans l’immunité à médiation cellulaire est aussi important que celui des lymphocytes TH2 dans l’immunité à médiation humorale. Les TH1 inflammatoires et les TH2 helper se servent de cytokines pour stimuler chacun leurs cellules. •

Décrivez le rôle des lymphocytes TH1 dans l’activation des macrophages.

•

Décrivez le rôle des lymphocytes TH2 dans celle des cellules B.

CH3

Variable Constant

FIGURE 22.15 Immunoglobuline (Ig) G. La molécule comprend deux chaînes lourdes de 50 kD et deux chaînes légères de 25 kD. Ce qui donne un poids moléculaire total de 150 kD. Chaque chaîne lourde s’unit à l’une des chaînes légères pour former un site de liaison à l’antigène (Ag). Le domaine variable de la chaîne lourde, VH, et celui de la chaîne légère, VL, se lient à l’Ag. Ces domaines variables diffèrent d’une molécule d’Ig à une autre. En revanche, les domaines constants CH1, CH2 et CH3 sont les mêmes pour toutes les IgG. Des ponts disulfures unissent de façon covalente les chaînes les unes aux autres.



760 Chapitre 22

TABLEAU 22.2 Classe/ chaîne lourdea IgG γ


CARACTÉRISTIQUES DES IMMUNOGLOBULINES HUMAINES

Poids moléculaire/ formuleb 150 000 2(H + L)

Sérum (mg/mL)

Sites de liaison à l’antigène

13,5

2

Propriétés

Distribution

Anticorps (Ac) majeur de la circulation ; quatre sous-classes : IgG1, IgG2, IgG3, IgG4. IgG et

Liquide extracellulaire : sang et lymphe ; traversent le placenta

1

IgM µ

IgG3 activent le complément (C) Premier Ac apparaissant après une immunisation ; activateur puissant du C

970 000 (pentamère) 5[2(H + L)] + J

1,5

10

175 000 (monomère) 2(H + L)

0

2

150 000 2(H + L)

3,5

2

Ac circulant

385 000 (dimère sécrété) 2[2(H + L)] + J + CS

0,05

4

Ac majeur dans les sécrétions

IgD δ

180 000 2(H + L)

0,03

2

Ac mineur dans la circulation

Sang et lymphe ; membranes des lymphocytes B

IgE ε

190 000 2(H + L)

0,00005

2

Impliquées dans les réactions allergiques ; le CH4 compte le site de liaison aux mastocytes

Sang et lymphe ; se lient aux mastocytes

IgA α

Sang et lymphe ; les récepteurs de membrane des cellules B sont des monomères

Sécrétions (salive, colostrum, larmes, lait, sécrétions diverses) ; monomères dans le sang et dimères dans les sécrétions

a

Les immunoglobulines ont deux chaînes légères λ ou deux chaînes légères κ, pas les deux à la fois. Fondée sur le nombre de chaînes et les réarrangements des chaînes lourdes – ou heavy (H) – et des chaînes légères – ou light (L). J est la pièce de jonction des IgM sériques et des IgA sécrétoires. CS est le composant sécrétoire des IgA. Voir Figures 22.15, 22.17, 22.18, et 22.19 pour le diagramme de chaque immunoglobuline.

b

l’une à l’autre, d’environ 220 acides aminés et d’un PM de 25 kD, et deux chaînes lourdes tout aussi rigoureusement identiques l’une à l’autre, d’environ 440 acides aminés et d’un PM de 50 kD. Au total, une molécule d’IgG possède deux sites de liaison à l’Ag, chacun d’entre eux comptant une chaîne légère et l’extrémité de la chaîne lourde correspondante. Un Ac est donc bivalent, mais ses deux sites reconnaissent le même épitope.

Les chaînes légères Une chaîne légère est formée de deux domaines de même taille (voir figure 22.15) : le domaine amino-terminal est variable et le domaine carboxy-terminal est constant. Variable signifie que la séquence d’acides aminés varie d’un Ac à un autre (ce domaine se lie à l’Ag), et constant signifie que les acides aminés sont les mêmes pour toutes les chaînes légères d’un même type.

Les chaînes lourdes Une chaîne lourde d’IgG comprend un domaine variable amino-terminal et trois domaines constants carboxy-terminaux. Chacun de ces quatre domaines est formé d’environ 110 acides aminés. Comme pour les chaînes légères, le domaine variable change d’un Ac à l’autre, et les domaines constants sont les mêmes pour tous les Ac de la même classe.

Le site de liaison à l’antigène Le site de liaison de n’importe quelle molécule d’Ig consiste en l’union de la partie variable d’une chaîne lourde à la partie variable d’une chaîne légère (voir figure 22.16). Ce site se fixe fortement,

bien que de façon non covalente, avec l’Ag. L’intensité de cette liaison s’appelle l’affinité de la liaison de l’Ac avec l’Ag. Notre système immunitaire est capable de reconnaître d’innombrables Ag, et chacun de ces Ag correspond à un seul site de reconnaissance d’Ac. Pour affronter tous les Ag possibles, il faut donc fabriquer des milliards de sites de liaison aux Ag. Comment se diversifient les sites de liaison à l’Ag ? De nouveaux Ac apparaissent en permanence à la suite de recombinaisons aléatoires et de mutations des trois cents gènes codant les domaines V des chaînes légères et des chaînes lourdes. Chaque gène d’Ig code un seul site de liaison d’Ag. C’est l’Ag qui, en activant les Ig de membrane du lymphocyte B, le contraint à en produire des copies et à les sécréter sous forme d’Ac (voir section 23.5).

Les autres classes d’immunoglobulines Une classe d’Ig est définie par le domaine constant de ses chaînes lourdes : gamma (γ), alpha (α), mu (µ), delta (δ), ou epsilon (ε). Ces domaines constants représentent trois des quatre domaines des chaînes lourdes des IgG, IgA et IgD, et quatre des cinq domaines des chaînes lourdes des IgM et des IgE (voir figure 22.17). Lors d’une réponse immunitaire classique, les Ig de deux classes différentes (souvent IgM puis IgG) peuvent se lier aux mêmes épitopes. Si tel est le cas, les domaines V des chaînes légères, et même les domaines variables des chaînes lourdes des IgM et des IgG, doivent être identiques, mais les domaines constants de la classe de chaînes lourdes diffèrent d’une classe à l’autre : ce sont des µ dans une molécule d’IgM, et des γ dans une molécule d’IgG.



22.9 Anticorps (ou immunoglobulines) 761

Antigène Variable

Richard J. Feldman

Constant

(a)

(a)

(b)

R. J. Poijak

FIGURE 22.17 Les classes d’immunoglobuline (Ig). Toutes les classes d’Ig ont des domaines variables et des domaines constants (rouge) pour accueillir l’Ag (marron). (a) Les IgG, les IgA et les IgD ont trois domaines constants (bleu). (b) Les IgM et les IgE possèdent un quatrième domaine constant.

(b)

du tractus génito-urinaire. Leurs surfaces sont désignées par le terme générique de mucosal-associated lymphoid tissue (MALT), et ces muqueuses produisent des IgA (voir figure 22.2). Leur surface avoisine les 400 m2, sécrétant environ 10 g par jour d’IgA sécrétoires ; ce qui est considérable. À titre de comparaison, l’organisme ne produit que 5 g d’IgG sériques par jour. Il fabrique donc plus d’IgA sécrétoires que d’IgG sériques. Dans

FIGURE 22.16 Structure d’une immunoglobuline (Ig) et de son site de liaison à l’antigène (Ag). (a) Structure tridimensionnelle d’une molécule d’IgG. Les chaînes lourdes sont en rouge et en bleu foncé, les chaînes légères en vert et en bleu clair. (b) Interaction entre un Ag et son site de liaison sur l’Ig. L’Ag est en vert (lysozyme), la région variable de la chaîne lourde en bleu et celle de la chaîne légère en jaune. La glutamine est en rouge sur le lysozyme, il s’introduit dans une poche ménagée dans la molécule d’Ig. L’ensemble de la reconnaissance implique plusieurs autres acides aminés sur l’Ig et sur l’Ag.

Habituellement (voir figure 22.18), une molécule d’IgM adopte la forme d’un pentamère de cinq monomères reliés par au moins une chaîne J. Chaque chaîne µ possède un quatrième domaine constant, le CH4. C’est la classe d’Ig qui est produite en premier lors d’une infection bactérienne, mais, en général, l’affinité est insuffisante, même si la force de liaison à l’Ag est multipliée par dix, puisqu’il y a dix sites de liaison (voir tableau 22.2 et figure 22.18). Par avidité, on entend la somme des forces de liaison des différents sites de liaison d’Ag. Une molécule d’IgM a donc une affinité faible pour l’Ag, mais son avidité est élevée. Environ 10 % des Ac du sérum sont des IgM pentamériques, mais il existe des IgM monomériques à la surface des cellules B, précisément là où l’Ag est capté. Des IgA dimériques (voir figure 22.19) circulent dans les fluides de l’organisme : salive, larmes, colostrum, lait et sécrétions de muqueuses du tube gastro-intestinal, de l’arbre respiratoire et

Antigène Variable Constant

Pièce J

FIGURE 22.18 Immunoglobuline M. L’IgM circule dans le sérum sous la forme d’un pentamère formé de cinq monomères unis de façon covalente par des ponts disulfures et par une chaîne J. Comme c’est un pentamère, cette IgM peut se lier à dix antigènes Ag.



762 Chapitre 22


les sécrétions, les IgA prennent une forme de dimères, dont les constituants sont unis l’un à l’autre par la chaîne J, et s’équipent d’une pièce sécrétoire qui en facilite le transport à travers les muqueuses (voir figure 22.19). On les trouve également, mais sous forme de monomères, dans le sérum normal (voir tableau 22.2). Il y a très peu d’IgE dans le sérum, puisqu’une seule molécule d’IG sur cinquante mille est une IgE. En dépit de leur faible quantité, les IgE jouent un rôle déterminant dans les allergies ou hypersensibilités de type immédiat (voir section 22.15). Leur PM est plus élevé que celui des autres classes d’Ig (voir tableau 22.2), car elles ont un quatrième domaine C comme les IgM (voir figure 22.17). Ce domaine C supplémentaire leur sert à s’insérer dans leurs récepteurs à la surface des mastocytes (voir figure 22.25). Ce qui est le prérequis des réactions allergiques. Les IgD existent à de faibles concentrations dans le sérum et n’ont pas de fonction connue qui leur soit spécifique, du moins dans le sérum. Cependant, ce sont les IgD, assorties ou non d’IgM, qui prédominent à la surface des cellules B.

Contrôlez vos acquis Une molécule d’Ig comprend deux chaînes légères et deux chaînes lourdes. Pour constituer chacun de ses sites de liaison à l’Ag, le domaine V d’une chaîne lourde s’unit au domaine V d’une chaîne légère. Chaque classe d’Ig se caractérise par sa structure et sa fonction. •

Dans une molécule d’Ig, quels sont les domaines intervenant dans la liaison à l’Ag ?

•

Quelles sont les caractéristiques structurelles et fonctionnelles de chaque classe d’Ig ?

22.10 Production des anticorps m n Nous allons étudier une réponse typique par Ac en commençant par revoir les interactions complexes nécessaires à une réponse efficace et spécifique. Nous verrons ensuite les mécanismes auxquels recourt le génome pour engendrer la diversité des Ac. Nous terminerons en revoyant les facteurs qui suscitent une réponse à l’Ac.

Pièce J

Antigène Variable Constant

FIGURE 22.19 Immunoglobuline A. Les IgA sécrétoires se présentent souvent sous la forme de dimère, dont les deux composants sont liés de façon covalente par une pièce J. Le composant sécrétoire (absent sur la figure) facilite le transport de ces IgA à travers les membranes.

Les interactions entre les cellules T et les cellules B La production d’Ig en réponse à un Ag implique que cellules T et cellules B interagissent. Pour cela, il faut des molécules de reconnaissance des Ag, les TCR pour les cellules T et les Ig de membrane pour les cellules B (voir figure 22.14). Chaque étape recourt à des mécanismes hautement spécifiques. Dès sa première apparition, l’Ag est capté par l’Ig de membrane d’une cellule B. Ce complexe Ag-Ig est internalisé et l’Ag apprêté pour charger ses peptides résiduels sur les molécules HLA-II. La cellule B se comporte comme une APC, en utilisant ses Ig de membrane pour capter l’Ag. Le complexe antigène-CMH est ensuite transloqué à la membrane, où l’Ag est présenté au TCR d’un lymphocyte TH2 (voir figure 22.12b). Cette interaction aboutit à l’activation de ce TH2 et à la production de cytokines. Celles-ci stimulent les cellules B spécifiques d’Ag qui réagit en fabriquant et en sécrétant des Ac spécifiques de cet Ag.

Les mécanismes génétiques de la diversité des Ac et des TCR Nous savons produire des milliards d’Ac différents. Comment le système immunitaire fait-il pour sélectionner l’Ac le mieux adapté à chaque Ag ? On a d’abord prétendu qu’à chaque gène correspondait un Ac, mais maintenant nous savons que l’organisme a besoin de très peu de gènes pour engendrer une fantastique diversité d’Ac. Cette production d’Ac commence par des réarrangements séquentiels des gènes nécessaires au codage d’une molécule d’Ig. Ils se déroulent dans la moelle osseuse au cours de l’ontogenèse et concernent les chaînes légères et les chaînes lourdes des cellules B. Les gènes sont redistribués par épissage dans les lymphocytes B en cours de maturation. Ce sont les recombinaisons somatiques. Un exemple typique de réarrangement d’une chaîne légère kappa est montré sur la figure 22.20. Les gènes codant les domaines variables des chaînes lourdes se distribuent d’une façon analogue mais plus complexe que pour les chaînes légères. Au total, une cellule B donnée exprime un seul gène fonctionnel pour le domaine variable de ses chaînes lourdes et un seul gène fonctionnel pour celui de ses chaînes légères. Ces gènes réarrangés sont transcrits, puis traduits en protéines, et leurs produits inclus dans les Ig de membrane des cellules B. Après contact avec l’Ag, des Ig solubles sont sécrétées par ces cellules B. De plus, l’Ag déclenche l’hypermutation des gènes des Ig. Ce qui modifie encore et diversifie davantage les Ac qui sont sécrétés. La multitude de réarrangements géniques et l’infinité de mutations somatiques après exposition à l’Ag se conjuguent pour que la diversité des Ig soit presque illimitée (voir section 23.6). Des réarrangements analogues, sans hypermutations, affectent les lymphocytes T, pour donner une diversité considérable des TCR.

Production des anticorps et mémoire immunitaire La production des Ac démarre dès que les Ig de membrane d’une cellule B sont sollicitées par l’Ag et finit par la production, puis par la sécrétion des Ac qui en sont spécifiques. Voici la séquence des événements : 1. Les Ag gagnent les organes lymphoïdes secondaires limitrophes en passant par les vaisseaux lymphatiques ou sanguins. Il s’agit des ganglions lymphatiques, de la rate et du MALT



22.10 Production des anticorps 763

V1

V2

V3

V4

V5

V3 J2 V3 J2

(voir section 22.1 et figure 22.2). La nature de la voie par laquelle entre cet Ag retentit sur la production des Ac correspondants. S’il s’est introduit par voie intraveineuse, il se rend dans la rate, où sont fabriquées la plupart des IgM, des IgG et des IgA. En revanche, si cet Ag pénètre par voie souscutanée, intradermique, percutanée ou intrapéritonéale, il progresse vers le ganglion lymphatique le plus proche, suscitant une production d’Ac constituée essentiellement d’IgM, mais également d’IgG et d’IgA. Quand il est passé par les voies muqueuses, l’Ag aboutit au MALT le plus proche. En entrant par la bouche, il parvient au MALT du tube digestif et suscite une réponse primaire en IgM et une réponse secondaire en IgA sécrétoires et spécifiques. 2. Les cellules B qui ont été stimulées par ce premier contact avec l’Ag se multiplient et se différencient en plasmocytes producteurs d’Ac et en cellules mémoire (voir figure 22.14). Ces plasmocytes vivent moins d’une semaine et fabriquent de grandes quantités d’IgM quand la réponse est primaire (voir figure 22.21). Il faut une certaine latence pour que ces Ac parviennent au sang et que leur titre augmente progressivement avant de diminuer. 3. Les cellules B mémoire provenant d’un premier contact avec l’Ag vivent pendant plusieurs années. Si elles rencontrent le même Ag, elles n’ont pas besoin de l’aide des lymphocytes T pour se transformer rapidement en plasmocytes et produire des IgG. Leur titre grimpe rapidement à un niveau dix à cent fois supérieur à celui qu’avaient atteint celles du premier contact avec l’Ag. C’est la réponse secondaire en Ac (voir figure 22.21). Elle est due à la mémoire immunologique et produit plus rapidement davantage d’Ac que la réponse primaire. De plus, les IgM s’y transforment en IgG au cours de la transmutation de classes. 4. Le titre des Ac baisse lentement, mais une troisième exposition au même Ag peut susciter une deuxième réponse secondaire. C’est le principe des injections de rappel, celles du vaccin antirabique des animaux domestiques, par exemple. Ces rappels permettent de garder des taux élevés d’Ac contre un Ag donné dans le sérum et protègent longtemps le sujet contre les maladies infectieuses (voir section 22.12).

Contrôlez vos acquis C’est le premier contact de l’Ag avec la cellule B spécifique qui déclenche la production des Ac. Elle apprête l’Ag et en restitue les reliquats à un lymphocyte TH2 spécifique. Celui-ci est activé afin de stimuler la cellule B responsable pour produire les Ac spécifiques de l’Ag de départ. Les cellules B activées survivent plusieurs années sous forme de cellules mémoires qui produisent rapidement de grandes quantités d’Ac, quand revient le même Ag. •

Comment font les cellules B pour présenter l’Ag ?

•

Comment les lymphocytes TH2 activent-ils les cellules B spécifiques de cet Ag ?

•

Comment justifie-t-on les injections de rappel d’un vaccin ?

Réponse primaire

Anticorps sérique : titre

Gènes des régions variables

FIGURE 22.20 Réarrangement des gènes d’une chaîne kappa d’immunoglobuline (Ig) dans un lymphocyte B humain. Les gènes de la chaîne Gènes de jonction kappa (κ) se recombinent en tandem sur le V150 J1 J2 J5 ADN germinal chromosome n˚ 2. Les réarrangements d’ADN κ se produisent dans les lymphocytes B en cours de maturation. N’importe quel gène variable (V) se combine avec n’importe quel gène J. Cela κ ADN recombiné donne 750 combinaisons codant autant de Transcription chaînes κ différentes. Chaque cellule B n’en exprime évidemment qu’une seule. Le même κ ARN primaire processus se déroule sur les chaînes lourdes de Épissage ce lymphocyte B. Comme il y a plus de familles de gènes, il y a plus de recombinaisons possibles V3 J2 κ ARN messager et de chaînes lourdes potentielles. Comme pour Traduction les chaînes légères, un seul réarrangement de chaînes lourdes existe par lymphocyte B mûr. La Protéine des chaînes kappa molécule d’Ig finale comprend deux chaînes légères et deux chaînes lourdes.

Gènes des régions constantes

Réponse secondaire

Surtout des IgG Ag réinjecté Ag injecté Surtout des IgM

0

100 Temps (jours)

200

FIGURE 22.21 Réponse humorale primaire et secondaire dans le sérum. Pour qu’apparaisse une réponse secondaire, l’antigène (Ag) doit être le même le jour 1 et le jour 100. Cette réponse secondaire est au moins dix fois plus forte que la réponse primaire. Notez la transmutation de classe des IgM dans la réponse primaire aux IgG dans la réponse secondaire.



764 Chapitre 22


m n

22.11 Complément, anticorps et destruction du pathogène

Le complément (C) est une famille de protéines mobilisées séquentiellement. Leurs effets sont importants dans la réponse immunitaire innée ou adaptative. La première réaction de cette séquence est souvent l’interaction entre le C et les complexes Ag-Ac, mais le C peut être activé par des mécanismes innés, donc en l’absence d’Ac. L’activation séquentielle des protéines du C peut lyser une bactérie ou désigner une cellule pourvue d’Ag à la reconnaissance par des phagocytes, ce qui en favorise la destruction.

Voie d’activation classique du complément et lésions cellulaires Le système du C comprend de nombreuses protéines. Une fois lancée la cascade par le complexe Ag-Ac à la surface des bactéries, ces protéines sont activées de façon séquentielle. Cela endommage la membrane à la surface de laquelle se trouve le C. Le contenu de la cellule s’échappe et, parfois, la bactérie est lysée. Le taux des protéines du C est identique dans le sérum de tous les individus. L’une des fonctions des Ac est d’identifier les intrus, puis d’activer le C, qui passera à l’attaque de ces cellules. Ainsi, beaucoup d’Ac, chacun étant spécifique d’un Ag unique, ont la capacité de recruter les protéines ubiquitaires du C. Le système immunitaire n’a donc pas besoin d’enzymes spécifiques de chaque agent envahisseur. Les protéines de ce système sont désignées par C1, C2, C3, etc. L’activation du C par la voie classique n’est possible qu’à partir d’IgG et/ou d’IgM (voir tableau 22.2). Il suffit que ces Ac se fixent à l’Ag, en particulier à la surface des cellules, pour que les Ac retiennent les protéines du C qui, elles, sont toujours là (voir figure 22.22). S’ébranle alors une cascade de réactions où l’activation d’un composant lui confère la capacité d’activer celui qui le suit dans la chaîne… La séquence commence par la rencontre entre l’Ac et son Ag. Les composants C1q, C1r et C1s se fixent à ce complexe et accrochent le C4, puis le C2, tout près sur la membrane, puis ils activent et retiennent le C3. Une fois lié à la membrane, le C3 catalyse le regroupement de C5, C6 et C7 dans un autre site membranaire, puis le dépôt de C8 et de C9. L’ensemble forme le complexe d’attaque de la membrane (voir figure 22.23). Des pertuis y sont alors forés. Parmi les produits de dégradation du C, il y a les anaphylatoxines, qui sont des chimiokines. Elles suscitent des réactions inflammatoires là où le C s’est déposé (voir section 22.15). Les réactions mobilisant le C3 attirent les phagocytes, puis les activent, ce qui favorise la phagocytose. Les réactions avec le C5 attirent des lymphocytes T et provoquent une sécrétion de cytokines. Le C est un agent lytique, et même bactéricide, pour beaucoup de bactéries Gram négatif, de concert avec les Ac spécifiques. Cependant, les bactéries Gram positif, y étant insensibles, peuvent bénéficier de l’opsonisation pour être détruites.

L’opsonisation La probabilité pour une cellule d’être phagocytée s’accroît quand des Ac se sont liés à des Ag sur sa membrane. Quand le C s’y agrège, cette probabilité est encore plus grande parce que la plupart des phagocytes portent des récepteurs pour les

Ac (FcR) et des récepteurs pour le C3 (C3R). Ceux-ci captent le domaine constant de l’Ac, et ceux-là le fragment C3. La phagocytose est améliorée d’un facteur 10 par l’Ac, et d’un autre facteur 10 par le C3. C’est l’opsonisation. Les bactéries Gram positif peuvent être opsonisées de cette manière, puis phagocytées et détruites. Mais, comme pour les bactéries Gram négatif, les Ac doivent d’abord se fixer sur leurs Ag membranaires pour activer le C par la voie classique et promouvoir l’opsonisation.

Activation du complément indépendante des anticorps Le C peut également être activé par la voie alterne. Beaucoup des composants de la voie classique y sont recrutés pour favoriser l’opsonisation et former le complexe d’attaque C5-9. Cette voie alterne profite de plusieurs protéines méconnues dans le sérum par la voie classique (voir figure 22.22b). Elle remplace les Ac par d’autres protéines pour diriger les molécules vers la surface des bactéries. La première étape fixe la properdine sur la membrane des bactéries. Elle recrute alors le C3B qui associe la protéine C3 du C et le facteur B de la voie alterne. Le C3BP qui en résulte joue le même rôle que le complexe C4-2-3 de la voie classique, en catalysant l’agencement du complexe d’attaque C5-9 et la destruction de la cellule. La récupération du C3, après mise en jeu de la voie alterne d’activation, peut également favoriser l’opsonisation. Le recrutement de la mannan-binding lectin (MBL) est une autre façon d’activer le C. Elle est fondée sur l’association de la MBL sérique au mannose des polysaccharides que l’on ne trouve que sur la membrane de certaines bactéries (voir figure 22.22c). Le complexe polysaccharides-MBL rappelle l’agrégat C1q-C1r-C1s de la voie classique d’activation. Il retient les composants C4, C2 et C3, catalyse également la formation du complexe d’attaque et conduit à la lyse ou à l’opsonisation de la bactérie. La voie alterne et la voie des lectines évoquent le mode d’action des TLR, puisque la properdine et la MBL n’interviennent que contre des structures moléculaires associées aux pathogènes (voir section 22.2 et 23.1). En plus, elles appartiennent toutes les deux au système inné, ne requérant ni l’une ni l’autre une rencontre préparatrice avec l’Ag ou une intervention des Ac.

Contrôlez vos acquis Le C aboutit à la lyse des membranes bactériennes et à l’opsonisation de ses particules. Il est mobilisé par l’interaction avec les Ac ou par l’intervention d’activateurs non spécifiques. C’est un acteur essentiel de l’immunité innée et de l’immunité adaptative. •

Quelles sont les classes d’Ig qui fixent le C ?

•

Distinguez les composants du C qui promeuvent l’opsonisation de ceux qui induisent la lyse de la cellule cible.

•

Quels sont les deux mécanismes qui activent le C de façon non spécifique ?



22.11 Complément, anticorps et destruction du pathogène 765

1

Surface cellulaire

2

Surface cellulaire

3 C7

C4

C3 C4 C5

C4

C1q

Surface cellulaire

C1q

2

C3

Phagocytose, anaphylaxie

C3 C4 MBL

C2

C2

MBL

B

C4

(b) Activation du C par la voie alterne C6 C5

C7 C8

C9

(c) Activation du C par la voie des lectines (MBL) FIGURE 22.22 Activation du complément (C). (a) Séquences d’intervention du C activé par la voie classique et s’achevant par la lyse cellulaire. Cartouche 1 : fixation de l’anticorps et du complexe C1 (C1q, C1r et C1s). Cartouche 2 : le complexe C42 réagit avec le C3. Cartouche 3 : le complexe C423 attire le C5 qui se fixe tout près sur la membrane. Cartouche 4 : fixation séquentielle du C6, du C7, du C8 et du C9 au C5 pour forer un pertuis dans la membrane. L’association de C5 aux composants qui suivent constitue le complexe membranaire d’attaque (CMA). (b) Dans la voie alterne d’activation, la properdine (P) se lie à la membrane suivie du complexe C3B. Celui-ci active C5 comme dans le cartouche 3, et suscite la formation du CMA, comme dans le cartouche 4. (c) La mannan-binding lectin (MBL) capte le mannose présent sur la surface de certaines bactéries, ce qui permet la formation du complexe C423. Celui-ci active C5 comme dans le cartouche 3 et initie la formation du CMA comme dans le cartouche 4. (d) Schéma du pertuis foré dans la membrane par les composants de C5 à C9 du complément.

IV

Pertuis

E. Munn

(d)

Attraction de leucocytes

2

C3 B

Lésion membranaire et lyse cellulaire

C1s

C1q

1

P

Pertuis dans la membrane

C1r

C1s

C3 P

C3 C4

C1r

C1s

(a) Activation du C par la voie classique

1

C5 C7

C2

C1q

C9

C2

C2

C1r

C1r

C6

C6

C5

C1s

C8

C8

C3

C2

C9

4

IMMUNITÉ ET PRÉVENTION DES MALADIES INFECTIEUSES

Nous passons à une immunité fondée sur des moyens artificiels. Les techniques conventionnelles et expérimentales pour préparer des immunogènes seront décrites. Leur application révolutionne la réponse immunitaire adaptative vis-à-vis d’un grand nombre d’agents pathogènes. Cette immunisation artificielle est encore notre arme la plus efficace contre beaucoup de maladies infectieuses. FIGURE 22.23 L’effet du complément sur la membrane d’une bactérie. Cette image de Salmonella paratyphi au microscope électronique montre les pertuis forés dans la membrane bactérienne après interaction entre ses antigènes, les anticorps correspondants et le complément.



766 Chapitre 22


22.12 Immunité naturelle m n


L’immunité innée et l’immunité adaptative protègent l’organisme contre les conséquences d’une infection. Elles sont donc essentielles pour sa survie. Par exemple, les phagocytes des sujets dont les neutrophiles ou les macrophages ne se développent pas pour des raisons génétiques ne sont pas fonctionnels, car ils ne peuvent ni ingérer ni détruire certains pathogènes. Les malades ont donc besoin d’une assistance médicale. Il faut parfois les couper de tout contact avec l’environnement. Autrement, les infections dues à de nombreuses bactéries, virus et champignons se répètent, et les patients meurent souvent très tôt.

•

Quelles sont les conséquences d’une absence d’immunité innée ?

•

Quelles sont les conséquences d’une absence de réponse par les cellules T ou par les cellules B ?

L’immunité adaptative dans la maladie infectieuse Les sujets normaux acquièrent de façon naturelle les défenses contre beaucoup de maladies, puisqu’elles sont provoquées par des infections spontanées. L’importance de cette immunité active dans la résistance aux maladies est illustrée de façon dramatique par le destin des sujets souffrant de déficit immunitaire d’origine génétique. Comme leurs cellules B sont déficientes, les malades souffrant d’agammaglobulinémie ne produisent pas d’Ac et souffrent d’infections récidivantes et potentiellement mortelles. Les réactions vis-à-vis des bactéries en sont la cause, alors que les réactions vis-à-vis du virus sont normales. L’immunité à médiation humorale est donc cruciale dans la protection contre les pathogènes extracellulaires, surtout les bactéries. Dans le syndrome de Di George, il n’y a pas de lymphocyte T puisqu’il n’y a pas de thymus. Les malades souffrent d’infections à répétition, dues à des virus et à d’autres organismes intracellulaires. L’immunité à médiation cellulaire est donc essentielle dans la protection contre les pathogènes intracellulaires. L’absence de toute réponse immunitaire adaptative caractérise les malades souffrant du syndrome d’immunodéficience acquis (SIDA). En l’occurrence, si l’infection par le virus d’immunodéficience humain (VIH) n’est pas contrôlée, on peut aboutir à une perte totale des lymphocytes TH, et donc à l’absence de toute immunité cellulaire et humorale. Ces malades souffrent d’infections répétées, sérieuses, dues à des virus, à des bactéries et à des champignons. Le décès est causé par l’une ou l’autre de ces maladies.

TABLEAU 22.3

Les réactions immunitaires innées et adaptatives sont indispensables à la vie. L’absence d’immunité innée aboutit à la mort par infections incontrôlables et répétées. Celle de l’immunité adaptative aboutit également à des maladies infectieuses incontrôlables.

22.13 Immunité artificielle m n La création intentionnelle d’une immunité vis-à-vis d’un pathogène, est une arme maîtresse dans le traitement et dans la prévention des maladies infectieuses. Il y a plusieurs manières de procéder : 1) par l’introduction d’un Ag qui induit une production d’Ac aboutissant à l’immunité adoptive et active, car le sujet fabrique lui-même ses Ac. C’est la vaccination ; 2) par l’immunité adoptive mais passive, qui consiste à injecter un antisérum ou des Ig purifiées – ou gamma-globulines – provenant d’un individu ayant préalablement synthétisé des Ac contre l’Ag d’intérêt ; 3) par l’immunité parfois passive mais naturelle et non adoptive. Les nouveau-nés bénéficient des IgG maternelles pendant plusieurs mois après leur naissance. Elles leur ont été transférées à travers le placenta pendant la grossesse et leur confèrent une certaine protection quand leur système immunitaire est immature (voir tableau 22.3). Au cours de l’immunisation active, l’intrusion de l’Ag suscite des changements radicaux. On voit apparaître de grandes quantités de cellules et d’Ig spécifiques de l’Ag. Un rappel de vaccination par le même Ag accélère la réponse et augmente le titre (voir figure 22.21). Cette immunité active persiste souvent pendant toute la vie. En revanche, un sujet immunisé de façon passive n’a pas d’autres Ac que ceux qui lui ont été administrés par l’injection initiale, si bien qu’ils vont progressivement disparaître de la circulation. D’ailleurs, un contact ultérieur avec le même Ag n’entraîne pas de réponse secondaire.

IMMUNITÉS ACTIVE ET PASSIVE Immunité active

Immunité passive

Contact avec l’antigène ; obtenue par l’injection d’antigène (Ag)

Pas de contact avec l’Ag ; immunité obtenu en injectant des anticorps ou des lymphocytes T

Réponse spécifique conférant l’immunité

Réponse immunitaire spécifique d’un hôte transmise à un autre

Activation du système immunitaire par l’Ag ; mémoire immunitaire

Pas d’activation du système immunitaire ; pas de mémoire immunologique

Réponse immunitaire maintenue par des rappels agissant sur les cellules mémoires

L’immunité ne peut être maintenue et disparaît rapidement

Immunisation en place après plusieurs semaines

L’immunité se développe immédiatement



22.13 Immunité artificielle 767

L’immunité adoptive et passive vise donc souvent à soigner le malade. Par exemple, l’anatoxine tétanique immunise activement l’individu contre l’exotoxine de Clostridium tetani qu’il peut rencontrer, alors que le sérum antitétanique protège passivement celui que l’on suspecte d’avoir déjà été exposé à C. tetani. L’immunité adoptive mais active est donc prophylactique, et non thérapeutique : elle protège le sujet d’une agression ultérieure.

TABLEAU 22.4

MALADIES INFECTIEUSES HUMAINES ET VACCINS CORRESPONDANTS

Maladie

Vaccin

Maladies bactériennes Anthrax (charbon)

Anatoxine

Diphtérie

Anatoxine

L’immunisation

Tétanos

Anatoxine

La préparation ou le mélange d’Ag qui induit une immunité adoptive active est un vaccin et son administration, une immunisation. Cela provoque une immunité active, mais présente des risques d’infection et compte des effets indésirables. Les pathogènes sont souvent inactivés pour les réduire. Ainsi, beaucoup d’immunogènes sont des bactéries originalement pathogènes et tuées par des agents chimiques comme le phénol ou le formaldéhyde, ou encore par des agents physiques comme la chaleur. Le formaldéhyde permet aussi d’inactiver certains virus vaccinants, comme celui du vaccin de Salk contre la poliomyélite. Quant aux maladies dues à des exotoxines, elles bénéficient comme immunogènes d’exotoxines traitées chimiquement de manière à perdre leur toxicité tout en gardant leur antigénicité. Ce que l’on appelle une anatoxine. Habituellement, elle n’est pas aussi efficace que l’exotoxine dont elle dérive, mais elle peut sans risques être administrée à fortes doses. La vaccination est souvent plus efficace quand elle est faite avec des bactéries ou des virus vivants qu’avec des bactéries ou des virus morts ou inactivés. Il est possible d’isoler la souche mutante d’un agent pathogène qui garde ses Ag immunisants tout en perdant sa virulence : ce sont des souches atténuées (voir section 21.8). Néanmoins, comme les souches atténuées de pathogènes restent viables, certains sujets (en particulier ceux qui souffrent d’un déficit immunitaire) développent la maladie causée par l’agent pathogène contre lequel on veut les immuniser. Ainsi connaît-on des exemples de maladies infectieuses sérieuses provoquées par des formes atténuées de vaccins contre la poliomyélite ou contre la variole (voir section 25.11). La majorité des vaccins viraux efficaces sont des formes atténuées de virus (voir tableau 22.4). Ils suscitent une immunité cellulaire prolongée, mais également des titres élevés d’Ac et une forte réponse secondaire au moment du rappel. Ces souches atténuées sont difficiles à sélectionner, à standardiser et à cultiver. La durée de vie des vaccins vivants est plus limitée, impliquant des conditions de conservation adéquates. Par ailleurs, les vaccins à base de virus tués suscitent une réponse immunitaire transitoire, sans que se développe une réponse prolongée due à la mémoire immunologique. Les vaccins bactériens sont presque toujours constitués de la forme inactivée de ces bactéries. Celles-ci induisent une immunité mais n’exposent évidemment pas leur bénéficiaire à un risque d’infection.

Coqueluche

Bactérie tuée (Bordetella pertussis) ou protéines

Fièvre typhoïde

Bactérie tuée (Salmonella typhi)

Fièvre paratyphoïde

Bactérie tuée (Salmonella paratyphi)

Choléra

Bactérie tuée ou extrait cellulaire (Vibrio cholerae)

Peste

Bactérie tuée ou extrait cellulaire (Yersinia pestis)

Tuberculose

Souche atténuée de Mycobacterium tuberculosis (BCG)

Méningite

Polysaccharide purifié à partir de Neisseria meningitidis

Pneumonie bactérienne

Polysaccharide purifié à partir de Streptococcus pneumoniae

Typhus

Bactérie tuée (Rickettsia prowazekii)

Méningite Haemophilus influenzae

Vaccin conjugué (polysaccharide d’Haemophilus influenzae conjugué à une protéine)

La vaccination en pratique Les nouveau-nés bénéficient de l’immunité passive des Ac que leur mère leur a transférés à travers le placenta ou apportés par le lait maternel. Ils sont donc relativement protégés contre les maladies infectieuses durant les six premiers mois, avant

Maladies virales Fièvre jaune

Virus atténué

Oreillons

Virus atténué

Rougeole

Virus atténué

Rubéole

Virus atténué

Poliomyélite

Virus atténué (Sabin) ou virus atténué (Salk)

Grippe

Virus inactivé

Rage

Virus inactivé (pour l’homme) ou virus atténué (pour le chien)

Variole

Réaction croisée avec le virus de la vaccine (voir section 16.13)

Hépatite A

ADN recombinant

Hépatite B

ADN recombinant ou virus inactivé

Varicelle

Virus atténué

de substituer à cette immunité passive leur propre immunité active par la vaccination. Un contact unique avec un Ag n’induit pas beaucoup d’Ac (voir section 22.10), ce qui justifie les injections de rappel pour parvenir à une réponse secondaire et hausser le titre des Ac. Le schéma des vaccinations est représenté dans la figure 22.24. La plupart de ces vaccins requièrent des rappels pour maintenir une immunité efficace. Leur importance dans le contrôle des maladies infectieuses n’est plus discutée. En effet, l’application d’un vaccin efficace diminue de façon spectaculaire l’incidence de la maladie sur



768 Chapitre 22


une population (voir figures 26.13 et 26.23). Toutefois, le degré d’immunité conféré par la vaccination varie beaucoup d’un individu à l’autre et d’un vaccin à l’autre en fonction de sa qualité et de sa quantité. Il est rare que la protection conférée par une injection unique ou même une série d’injections dure toute la vie, car les cellules qui en sont dépositaires disparaissent progressivement. Par ailleurs, certaines infections surviennent naturellement, donc en l’absence d’immunisation. Une telle infection naturelle induit une réponse secondaire. Cela favorise la réponse en l’absence de stimulation Ag, mais la durée de cette protection varie d’un Ag à l’autre. Elle persiste pendant beaucoup d’années pour l’anatoxine tétanique, alors qu’elle ne dure qu’un an ou deux pour le virus de la grippe. L’individu tire bénéfice de ces vaccinations, mais cela est aussi vrai pour la population générale.

L’immunisation passive L’immunisation passive consiste à fournir des Ac. Ces préparations d’Ac sont des sérums, des antisérums, ou même des antitoxines quand les Ac sont dirigés contre une toxine en particulier. On les obtient en immunisant un cheval par exemple, ou en récupérant le sérum de donneurs hyperimmunisés. Cet antisérum est standardisé pour que les Ac atteignent un titre défini à l’avance et l’Ac est administré plusieurs fois pour neutraliser l’Ag. Les Ig préparées à partir du mélange de

Calendrier des vaccinations en fonction de l’âge (États-Unis, 2004) Vaccins

De la naissance à 18 ans

19–49

50–64

>65

Hépatite B Diphtérie, Tétanos Haemophilus influenzae de type B Virus inactivé de la poliomyélite Rougeole, oreillons et rubéole Varicelle Pneumocoque Hépatite A Grippe Recommandé pour tous Recommandé pour les sujets à risques (pour des raisons médicales, de comportement, professionnelles ou autre). FIGURE 22.24 Calendrier des vaccinations pour les enfants et les adultes aux États-Unis.. Ce calendrier est proposé par le Center for Disease Control (CDC) and Prevention, Atlanta, en 2004. Pour des informations plus précises sur des sujets de n’importe quel âge, y compris les conseils pour les voyageurs, consultez le site Internet du CDC (http://www.cdc.gov)

sérums d’un grand nombre de donneurs permettent également cette immunisation passive. Ces sérums contiennent un nombre d’Ac induits par les contacts artificiels ou naturels avec des Ag variés.

Contrôlez vos acquis L’immunité anti-infectieuse peut-être passive ou active, naturelle ou adoptive. La vaccination est une immunisation adoptive et active largement utilisée pour prévenir les maladies infectieuses. La plupart des agents vaccinants sont des pathogènes atténués ou inactivés, ou des formes inactivées de produits microbiens. •

Donnez un exemple d’immunité passive et naturelle. Comment un individu en bénéficie-t-il ?

•

Donnez un exemple d’immunité active et adoptive. Comment un individu en bénéficie-t-il ?

22.14 Nouvelles techniques m n de vaccination La majorité des vaccins sont des organismes complets ou des anatoxines. Mais il y a d’autres méthodes pour obtenir des Ag immunisants.

Les vaccins synthétiques ou fabriqués par génie génétique Le plus simple est de recourir à des peptides synthétiques qui reproduisent les agents infectieux, puisque la protéine immunisante de certains virus est connue. Un peptide de vingt acides aminés a donc été synthétisé, puis fixé à une molécule porteuse efficace. Ce vaccin de synthèse induit une excellente réponse en Ac neutralisants contre le virus de la maladie « du pied et de la bouche ». Cependant, cette démarche pose un problème majeur, puisqu’il faut connaître la nature précise de l’Ag pour fabriquer un vaccin efficace. C’est le cas de la maladie du pied et de la bouche et d’autres pathogènes (voir section 15.3). La biologie moléculaire, permet de fabriquer les vaccins à partir de ce que l’on sait des gènes des agents pathogènes. Les gènes codant les Ag de pratiquement tous les virus peuvent être insérés dans le génome du virus de la vaccine, puis clonés et exprimés. Une fois manipulé, ce virus peut induire une réponse contre la protéine codée par le gène que l’on a cloné. C’est un vaccin recombinant. Il faut que le gène ait été identifié, cloné et que la vaccine en exprime la protéine sous la forme d’un Ag. Le vaccin recombinant contre la rage est efficace chez l’animal. Une autre stratégie utilise comme source de protéines immunogènes l’ADN recombinant. Le gène doit d’abord être cloné dans un micro-organisme apte à exprimer la protéine correspondante. La protéine sert alors de vaccin. C’est un vaccin par Ag recombinant, dont le meilleur exemple est le vaccin contre le virus de l’hépatite B. La protéine de surface Hcs y est exprimée par des levures.



22.15 Allergie, hypersensibilité et auto-immunité 769

La vaccination par ADN Une autre méthode consiste à cloner l’un des gènes de l’agent et à en faire exprimer le produit dans les cellules de l’hôte. Pour cela, les plasmides contenant l’ADN cloné sont injectés à l’hôte, qui réagit quelques semaines plus tard par des lymphocytes TC, des lymphocytes TH1 et des Ac contre la protéine. En effet, cet ADN est transcrit et son ARN traduit en Ag dans les cellules de l’hôte. C’est la vaccination par ADN. Elle offre d’énormes avantages par rapport aux techniques conventionnelles de vaccination. Il n’y a aucun risque d’infection puisque l’on n’injecte qu’un gène de l’agent pathogène. De plus, ceux des Ag spécifiques, par exemple d’une tumeur, peuvent être clonés, ce qui concentre la réponse sur le composant que l’on a sélectionné dans l’agent. Autre manière de concentrer cette réponse : on peut insérer le promoteur du gène des molécules HLA-II dans la construction. Ce promoteur en cantonnera l’expression dans les cellules armées de molécules HLA-II (cellules dendritiques, lymphocytes B et macrophages). Une fois exprimés et apprêtés, les Ag peuvent être présentés par les molécules HLA-I et HLA-II. Un plasmide suffit pour coder l’Ag et susciter à son encontre une réponse cT.

Contrôlez vos acquis Les stratégies alternatives de vaccination recourent au génie génétique pour fabriquer les Ag, éviter le contact avec les micro-organismes d’origine et, parfois, avec la protéine antigénique de départ. Ainsi la vaccination est-elle inoffensive et ciblée. •

Donnez deux exemples de stratégie alternative de vaccination.

•

Quel est l’avantage de chacune de ces deux stratégies sur les procédés actuels de vaccination ?

V

MALADIES DE LA RÉPONSE IMMUNITAIRE

Les réactions immunologiques peuvent léser les cellules de l’hôte dans lequel elles se déroulent, ce qui provoque des maladies. Les réactions d’hypersensibilité sont disproportionnées par rapport à l’agent qui les déclenche. On les classe

TABLEAU 22.5 Classification

en fonction des Ag responsables (voir tableau 22.5). Les super-Ag sont des protéines produites par certaines bactéries et certains virus, et stimulent un éventail de cellules.

22.15 Allergie, hypersensibilité et autom n immunité On assimile allergie et hypersensibilité immédiate. Ce qui est inexact, car l’immunité cellulaire en cause dans l’hypersensibilité retardée procède aussi d’une allergie. Quant aux maladies auto-immunes, elles traduisent une agression contre les Ag du « soi ».

L’hypersensibilité immédiate ou de type I L’hypersensibilité immédiate (HSI) est due aux substances vaso-actives que sécrètent les mastocytes quand ils ont été sensibilisés par des IgE (voir tableau 22.5). Ces réactions, souvent qualifiées d’allergiques, surviennent dans les minutes qui suivent l’exposition à l’Ag. En fonction de l’individu et selon l’Ag, elles sont bénignes ou sérieuses, jusqu’à engager le pronostic vital. C’est l’anaphylaxie dont les Ag sont des allergènes. L’allergie touche environ 20 % de la population. Elle est dirigée contre les pollens, les poils d’animaux, certains aliments et nombre d’autres éléments (voir tableau 22.6). C’est par le poumon et le tube digestif que la plupart des allergènes entrent en contact avec l’organisme. Ils forcent les lymphocytes TH2 à sécréter des cytokines qui mobilisent plutôt les cellules B productrices d’IgE. Au lieu de s’engouffrer dans la circulation comme les IgG et les IgM, ces IgE insèrent leur domaine C dans les récepteurs correspondants à la surface des mastocytes (voir section 22.8, et figure 22.25). Ce sont des granulocytes établis dans le manchon conjonctif des capillaires de tout l’organisme (voir section 22.2). Quand un allergène ayant fait l’objet d’une sensibilisation réapparaît, il est intercepté par les IgE fixées sur la membrane des cellules. En reliant au moins deux molécules d’IgE, cet allergène déclenche l’exclusion de plusieurs médiateurs par les mastocytes. Ceux-ci sont responsables des symptômes apparaissant dans les minutes qui suivent le contact avec l’allergène. Le plus souvent, ils ne durent pas, mais un individu est susceptible de réagir chaque fois qu’il rencontre l’allergène auquel il a été sensibilisé.

RÉACTION D’HYPERSENSIBILITÉ Description

Mécanisme immunologique

Latence

Exemples

Type I

Immédiate

Sensibilisation des mastocytes par des IgE

Minutes

Réaction au venin d’abeille Rhume des foins

Type II

Cytotoxiquea

Interaction entre des IgG et des antigènes de surface

Heures

Réaction à des médicaments (pénicilline)

Type III

Complexe immun

Interaction entre des IgG et des antigènes solubles ou circulants

Heures

Lupus Érythémateux disséminé (LED)

Type IV

Retardé

Lymphocytes TH1 inflammatoires

Jours

Poison du lierre Test à la tuberculine

a

Les maladies auto-immunes peuvent être provoquées par des réactions de types II, III ou IV.



770 Chapitre 22


TABLEAU 22.6

LES ALLERGÈNES EN CAUSE DANS L’HYPERSENSIBILITÉ IMMÉDIATE

Pollen et spores de champignons (rhume des foins) Venin d’insectes (abeille) Aliments Poils d’animaux Acariens dans la poussière de maison

Les médiateurs les plus importants sont l’histamine et la sérotonine, qui déclenchent la dilatation des vaisseaux et la contraction des muscles lisses, inaugurant l’anaphylaxie systémique. On observe une hypotension artérielle, une détresse respiratoire, une éruption cutanée, une production de mucus et des éternuements. Quand le choc est sérieux, il doit être immédiatement traité par l’adrénaline pour réduire la contraction des muscles lisses, élever la tension artérielle et permettre la respiration, car ces symptômes peuvent conduire à la mort. Heureusement, la majorité des réactions allergiques se limitent à des symptômes locaux, des démangeaisons ou des larmoiements par exemple. Ils sont moins sérieux que ceux du choc anaphylactique et sensibles aux anti-histaminiques qui neutralisent les effets des médiateurs histaminiques. Quand la situation est plus inquiétante, on recourt à des corticoïdes. Finalement, il est possible de tenter une désensibilisation à l’allergène en l’administrant à des doses infinitésimales mais croissantes, dans le but de remplacer les IgE par des IgG. En s’emparant de l’Ag, ces IgG bloquent tout contact avec les IgE et préviennent toute manifestation allergique.

L’hypersensibilité retardée ou de type IV L’hypersensibilité retardée (HSR) ou hypersensibilité de type IV est due à des lymphocytes inflammatoires THI (voir tableau 22.5). Il faut attendre plusieurs heures après le contact déclenchant avec l’allergène pour que s’installent les symptômes qui culminent au bout de 24 à 48 heures. Parmi les Ag en cause, on trouve des micro-organismes, quelques Ag du « soi » (voir tableau 22.7), et plusieurs molécules chimiques qui se lient de façon covalente aux protéines de la peau pour créer de nouveaux Ag. Cette HSR à des Ag composites est la dermite de contact. Les Ag sont le poison du lierre, ou proviennent de bijoux, de cosmétiques, de latex ou d’autres produits chimiques (voir figure 22.26). Quelques heures après le contact, surviennent des démangeaisons ; la peau rougit et gonfle, ce qui suggère une réponse inflammatoire généralisée. La destruction des tissus locaux explique la formation de bulles en réponse à une agression par les cellules immunologiques au bout de 24 à 48 heures. La réaction à la tuberculine est un exemple d’HSR (voir figure 22.24). Cette réponse cellulaire protectrice a été découverte par Robert Koch (voir section 1.6), puis étudiée de façon exhaustive. Quand ils sont injectés en sous-cutané à un sujet qui a déjà été infecté par le bacille de Koch (BK), les Ag de ce BK suscitent une réaction cutanée caractéristique 24 à 48 heures plus tard. Par contre, une réaction HSI par IgE apparaît sur la peau dans les minutes qui suivent l’injection des Ag. L’Ag stimule les TH1 locaux qui sécrètent des cytokines. Celles-ci attirent et activent de nombreux macrophages, ces derniers développant une réaction au site de l’injection. Cette réaction est caractérisée par une induration, un œdème, un érythème, une douleur et une chaleur, toutes manifestations de la réponse

Pontage entre deux anticorps par l’Ag

Antigène (Ag) Lymphocyte B

Lymphocyte TH

Mastocyte

Mastocyte

Le lymphocyte B produit Segment des lgE de l’IgE contre l’Ag qui se fixe Fonction au mastocyte helper Cellule présentatrice d’Ag

Récepteur pour les IgE

IgE

Le lymphocyte T possède des récepteurs pour l’Ag

Rencontre ultérieure avec l’Ag

Les IgE sensibilisent les mastocytes tissulaires en se liant à leur récepteur membranaire

Sécrétion de médiateurs allergiques (histamines, sérotonine, etc.)

Allergies FIGURE 22.25 Hypersensibilité immédiate. Les IgE insèrent leur domaine CH4 dans des récepteurs de forte affinité à la surface des mastocytes. La survenue de l’allergène réalisant un pontage entre ces IgE provoque la libération de médiateurs vaso-actifs. Il en résulte des symptômes systémiques variant de l’allergie modérée à l’anaphylaxie engageant le pronostic vital.

Rhume des foins, asthme



22.15 Allergie, hypersensibilité et auto-immunité 771

TABLEAU 22.7

LES MALADIES AUTO-IMMUNES CHEZ L’HOMME

Maladies

Organes affectés

Mécanisme

Diabète juvénile insulinodépendant

Pancréas

Immunité à médiation cellulaire et auto-anticorps (Ac) contre les antigènes (Ag) de la surface et du cytoplasme des îlots de Langerhans (II et IV)

Myasthénie

Muscles squelettiques

Auto-Ac contre les récepteurs pour l’acétylcholine des plaques motrices des muscles striés (II)

Maladie de Goodpasture

Rein

Auto-Ac contre la membrane basale des glomérules du rein

Polyarthrite rhumatoïde

Cartilage

Auto-anticorps contre les IgG formant des complexes qui se déposent dans les articulations, suscitent une inflammation et détruisent le cartilage (III)

Thyroïdite de Hashimoto

Thyroïde

Auto-Ac contre les Ag de surface de la glande thyroïde

Stérilité masculine (anémie de Birmer)

Spermatozoïdes

Auto-Ac agglutinant les spermatozoïdes (II)

Facteur intrinsèque

Auto-Ac empêchant l’absorption digestive de la vitamine B12 (III)

Lupus érythémateux disséminé

ADN, cardiolipides, nucléoprotéines, protéines de la coagulation

Production massive d’auto-Ac contre divers constituants cellulaires, formant des complexes immuns (III)

Maladie d’Addison

Glandes surrénales

Auto-Ac contre les Ag des glandes surrénales (II)

Encéphalite allergique

Cerveau

Immunité à médiation cellulaire contre le tissu cérébral (IV)

Sclérose en plaques

Cerveau

Immunité à médiation cellulaire et humorale contre le système nerveux central (II et IV)

inflammatoire (voir section 22.3). Puis, les macrophages activés ingèrent et détruisent l’Ag. Cette réaction cutanée est le test à la tuberculine qui sert à vérifier si le sujet a déjà été en contact avec M. tuberculosis (voir figure 22.26). Beaucoup de micro-organismes suscitent des HSR. En plus du BK, citons pour les bactéries la lèpre, la brucellose et la psittacose, pour les virus celui de la rougeole et pour les champignons celui de la candidose. Tous ces micro-organismes causent des réactions qui rappellent la réaction cutanée à la tuberculine (voir figure 22.26) quand le sujet a déjà été en contact avec l’agent. L’HSR due aux lymphocytes TH1 peut également provoquer certaines réponses auto-immunes. C’est le cas de l’encéphalite allergique expérimentale et du diabète juvénile insulinodépendant (voir tableau 22.6). Mais, dans beaucoup de ces maladies auto-immunes, ce sont les Ac qui sont en cause.

Les maladies auto-immunes (hypersensibilité de types II et III) Les maladies auto-immunes (MAI) sont des réactions d’HS de type II et de type III. Normalement, les lymphocytes T et B sont éliminés au cours de l’ontogenèse, quand ils sont dirigés contre un Ag du « soi ». Cependant, certains sujets développent des réactions immunitaires contre leurs propres protéines en activant leurs lymphocytes autoréactifs T ou B (voir tableau 22.7). Ces MAI sont dues à des auto-Ac contre les Ag du « soi », ou à des lymphocytes T contre les constituants du « soi ». Certaines d’entre elles sont spécifiques d’organe ; c’est le cas de la thyroïdite d’Hashimoto, où apparaissent des auto-Ac contre la thyroglobuline. Il s’agit d’une réaction d’HS de type II qui perturbe le fonctionnement de la thyroïde. Enfin, ces auto-Ac

tiennent lieu de marqueurs de la maladie, puisque ce sont des lymphocytes TC qui détruisent la glande thyroïde. De même, des Ac contre les cellules productrices d’insuline dans les îlots de Langerhans du pancréas caractérisent le diabète juvénile insulinodépendant, mais la destruction de ces cellules est due à des TH1 stimulant eux-mêmes des TC. Le lupus érythémateux disséminé (LED) est l’archétype des maladies par HS de type III. Les Ac reconnaissent des protéines solubles ou insolubles du noyau pour former des complexes immuns insolubles, activer le C et déclencher une réaction inflammatoire. Ce LED est donc une maladie par complexes immuns (voir tableau 22.5). Parmi les auto-Ag, on trouve l’ADN et autres nucléoprotéines. Les symptômes s’expliquent par le dépôt de ces complexes immuns dans différents organes, les reins, les poumons et la rate. Le C étant activé, lyse et inflammation causent souvent des dommages tissulaires. Les MAI, qui sont spécifiques d’organe, sont plus faciles à contrôler que celles qui ne le sont pas. En effet, un traitement substitutif pallie la carence en thyroxine de l’hypothyroïdie, ou l’absence d’insuline du diabète. En revanche, le LED touche de multiples organes et n’est contrôlé que par un traitement immunosuppresseur par voie générale (des corticoïdes, par exemple). Ceux-ci présentent cependant des risques qui leur sont propres. Évidemment, une immunosuppression générale augmente la probabilité de faire une infection opportuniste. Une certaine prédisposition génétique favorise la survenue, influence le type et exagère la gravité des MAI. Beaucoup d’entre elles sont associées à certains allèles du CMH (voir sections 22.6 et 23.3). Cette prédisposition a été confirmée dans les modèles murins de MAI, mais il y a bien d’autres facteurs que l’hérédité. Le sexe en est un, puisque vingt fois plus de femmes que d’hommes souffrent du LED.



772 Chapitre 22


22.16 Superantigènes m n

Centers for Disease Control/PHIL

La plupart des toxines bactériennes dont nous avons parlé dans le chapitre 21 agressent directement les cellules de l’hôte. Les endotoxines, par exemple, agissent sur de nombreuses cellules et suscitent la sécrétion de pyrogènes, endogènes et autres médiateurs (voir section 22.2). Les exotoxines, elles aussi, agissent directement sur les cellules dont elles causent les lésions (voir sections 21.10 et 21.11). Les super-Ag sont à part, car ils produisent indirectement leurs effets.

Ken Greer/Visuals Unlimited

(a)

(b) FIGURE 22.26 Immunité à médiation cellulaire. (a) Bulles provoquées sur un bras par le poison du lierre. Cette éruption est maximale 24 à 48 heures après le contact chez les sujets sensibilisés. (b) Réaction cutanée à la tuberculine, exemple d’hypersensibilité retardée. L’inflammation sur l’avant-bras couvre une surface de 1,5 cm de diamètre. Ces deux réactions sont dues aux lymphocytes TH1 spécifiques de l’Ag.

Contrôlez vos acquis On parle d’HS quand les réponses cellulaires ou humorales à un Ag étranger provoquent des lésions des tissus de l’hôte. Il s’agit d’auto-immunité quand ces réponses immunitaires, étant dirigées contre les Ag du « soi », produisent le même type de dégâts tissulaires.

L’activation des lymphocytes T par un superantigène Les super-Ag sont des protéines induisant une réponse très forte car ils mobilisent beaucoup plus de lymphocytes T qu’une réponse conventionnelle. Ces super-Ag ne se lient pas aux TC1 de la même façon que les Ag classiques. La plupart d’entre eux sont secrétés par des bactéries et par des virus. C’est le cas des streptocoques et des staphylocoques qui sécrètent beaucoup de puissants super-Ag (voir tableau 21.4). Les Ag classiques se fixent au site liant l’Ag du domaine Vβ du TCR. Une réponse classique mobilise moins de 0,01 % des lymphocytes T (voir section 22.5). En revanche, le super-Ag adhère à un site du domaine Vβ du TCR en dehors de son site de liaison. Il mobilise donc tous les lymphocytes T dotés de TCR ayant cette structure ; ce qui est le cas de beaucoup de TCR différents. Il arrive qu’un super-Ag se lie et active 5 à 25 % de tous les lymphocytes T. Il peut même se fixer aux molécules HLA-II sur les CPA, dans une région également extérieure au site normal de fixation des peptides (voir figure 22.27). Ces interactions entre la surface de deux cellules rappellent la présentation conventionnelle d’Ag (voir section 22.7), mais elle se résout par l’activation de nombreux lymphocytes T. En conséquence, ces lymphocytes T activés produisent des cytokines qui elles-mêmes stimulent d’autres cellules comme les macrophages et autres phagocytes. À cause de la démesure de cette production de cytokines, la réponse cellulaire provoque une inflammation systémique, avec fièvre, diarrhées, vomissements, mucus et choc toxique. À l’extrême, ces réactions peuvent entraîner la mort (voir section 22.3). Plusieurs maladies imputables à des super-Ag ont déjà été mentionnées (voir section 22.10 et tableau 21.4). Citons l’aliment qui contient S. aureus et que l’on accuse de fièvre, vomissements et diarrhées. C’est l’un des super-Ag des entérotoxines du staphylocoque. D’ailleurs, il produit aussi le super-Ag du choc toxique. S. pyogenes sécrète le super-Ag de la scarlatine (voir figure 26.6).

Contrôlez vos acquis Après s’y être fixé de façon originale, le super-Ag active de nombreux lymphocytes T. Ceux-ci peuvent être à l’origine des maladies systémiques où l’inflammation est massive.

•

Quelles sont les différences d’Ag et d’effecteurs entre l’HSI et l’HSR ?

•

Quelles sont les différences d’activation de lymphocytes T par un Ag conventionnel et par un super-Ag ?

•

Quelles sont les deux grandes catégories de MAI concernant les Ag et les effecteurs ?

•

Quels sont les sites de fixation d’un super-Ag au lymphocyte T et à CPA ?



Questions 773

Lymphocyte TH TH cell

CD4

TCR Super-Ag

FIGURE 22.27 Les super-antigènes (Ag) bactériens. Les superAg opèrent en se fixant aux molécules HLA et aux récepteurs d’Ag des lymphocytes T (T-cell receptor ou TCR) à l’extérieur des sites de liaison conventionnelle. Comme ces super-Ag adhèrent à des segments conservés des molécules HLA et des protéines du TCR, ils réagissent avec un grand nombre de cellules suscitant une activation massive, une sécrétion de cytokines, voire une inflammation systémique.

CMH

Cellule présentatrice d’Ag

QUESTIONS 1. Quelle est l’origine des phagocytes et des cellules spécifiques d’antigènes (Ag) qui interviennent dans la réponse immunitaire ? Décrivez les étapes successives de la maturation des cellules B et des cellules T (section 22.1). 2. Décrivez quelques PAMP (« pathogen-associated molecular patterns ») qui sont reconnus par des PRM (« pattern recognition molecules ») ? Que signifient les interactions entre ces deux types de molécules (section 22.2) ? 3. Expliquez comment les phagocytes internalisent et tuent les micro-organismes, en particulier, par des mécanismes dépendant de l’oxygène (section 22.3). 4. Citez les facteurs les plus importants de la réponse immune adaptative (section 22.4). 5. Quelles sont les molécules qui induisent une réponse immunitaire ? Quelles sont les propriétés nécessaires à cette molécule pour le faire (section 22.5) ? 6. Décrivez la structure de base des protéines de classe I et de classe II du CMH (complexe majeur d’histocompatibilité). Quelles sont les différences entre ces deux voies fonctionnelles (section 22.6) ? 7. Décrivez les différences entre des cellules T cytotoxiques et des cellules NK. Quel est le signe d’activation de ces deux types cellulaires (section 22.7) ?

8. Quelles sont les différences entre les cellules T helper et les cellules T cytotoxiques ? Donnez les différences entre les fonctions des TH1 et celles des TH2 (section 22.8). 9. Décrivez les différences structurelles et fonctionnelles entre les cinq classes d’anticorps (section 22.9). 10. Décrivez les interactions cellulaires intervenant dans la production des anticorps (Ac) par des cellules B (section 22.10). 11. Décrivez la cascade d’activation du complément (C). L’ordre dans lequel se produisent ces interactions est-il important ? Pourquoi oui, ou pourquoi non ? Quels sont les composants de la voie alterne de l’activation du C ? Quels sont les composants de la voie d’activation du C passant par les lectines se liant aux mannanes (section 22.11) ? 12. Donnez la liste des maladies contre lesquelles vous avez été immunisé(e)s. Donnez la liste des maladies contre lesquelles vous pouvez avoir été immunisé(e)s de façon naturelle (section 22.12 et 22.13). 13. Décrivez au moins une stratégie d’immunisation dérivée des biotechnologies. En quoi diffère-t-elle d’une stratégie conventionnelle d’immunisation (section 22.14) ? 14. Décrivez les différences d’effecteurs immunologiques, de cibles cellulaires, d’Ag et d’évolution clinique entre l’hypersensibilité immédiate et l’hypersensibilité retardée (section 22.15). 15. Décrivez le mécanisme général par lequel les super-Ag activent les cellules T. En quoi cette activation par un super-Ag diffère de l’activation de la cellule T par des Ag conventionnels (section 22.16) ?

PROBLÈMES 1. Décrivez les problèmes que rencontrerait un sujet dont les cellules auraient perdu leur aptitude à phagocyter des pathogènes. Ce sujet survivrait-il dans l’environnement d’un campus universitaire ? Quelles carences du phagocyte pourraient empêcher la phagocytose ? Expliquez. 2. Spécificité et tolérance sont des qualités nécessaires pour une réponse immunitaire adaptative. Cependant, la mémoire semble moins essentielle, au moins en première analyse. Décrivez le rôle de la mémoire immunitaire et expliquez pourquoi, à long terme, le développement et le maintien de ces cellules immunitaires profitent à leur hôte. 3. Décrivez les problèmes possibles que rencontrerait un sujet souffrant d’un déficit héréditaire de la présentation des Ag aux cellules T cytotoxiques. Aux cellules T helper ? À la fois aux cellules T cytotoxiques et aux cellules T helper ? Quelles molécules pourraient être déficitaires chez un individu donné ? Celui-ci survivrait-il dans un environnement normal ? Expliquez.

4. Les Ac de classe IgA sont probablement plus fréquents que ceux de classe IgG. Expliquez pourquoi c’est vrai et quels avantages cela confère-t-il à l’hôte. 5. On considère le C comme un mécanisme de défense essentiel à la réaction humorale. Êtes-vous d’accord avec ce point de vue ? Expliquez votre réponse. Qu’arriverait-il à des sujets déficitaires en C3, C5, ou en properdine de la voie alterne d’activation et/ou en lectines se liant aux mannanes ? 6. Beaucoup de maladies infectieuses manquent de vaccins efficaces. Citez plusieurs de ces maladies (par exemple le syndrome d’immuno-déficience acquis, le paludisme et le rhume) et expliquez pourquoi les stratégies actuelles de fabrication d’un vaccin ont échoué. Préparez et proposez quelques stratégies alternatives pour immuniser contre les maladies que vous avez choisies.





CHAPITRE VINGT-TROIS

Immunologie moléculaire

La reconnaissance immunitaire repose sur des interactions entre les molécules et se déroule à la surface des cellules. Les molécules du complexe majeur d’histocompatibilité présentent des peptides antigéniques. Le complexe est, à son tour, reconnu par les récepteurs de certains lymphocytes T. Cette association suscite une réponse immunitaire spécifique de l’antigène.

I

Récepteurs du système immunitaire

776

23.1 23.2

Immunité innée et PRM Immunité adaptative et superfamille des immunoglobulines

776 777

II

Complexe majeur d’histocompatibilité 778

23.3 23.4

Structure des protéines du CMH Le polymorphisme des gènes du CMH

778 779

III

Anticorps

781

23.5 23.6

Structure des anticorps et de leur liaison aux antigènes Diversité des gènes des anticorps

781 782

IV

Récepteurs d’antigène des cellules T

783

23.7 23.8

TCR et liaison à l’antigène La diversité des gènes du TCR

783 784

V

Signaux moléculaires de l’auto-immunité 785

23.9 Réaction clonale et tolérance 23.10 Seconds signaux 23.11 Cytokines et chimiokines

785 786 787



776 Chapitre 23


GLOSSAIRE Agrégotope (agretotope) Segment d’un antigène (Ag) reconnu par les molécules HLA, une fois que l’Ag a été débité en peptides. Anergie (anergy) Blocage de la réponse immunitaire vis-à-vis de certains Ag par neutralisation des cellules susceptibles de leur répondre. Anticorps (Ac) (antibody) Voir chapitre 22. Apoptose (apoptosis) Mort cellulaire programmée. Chemokine Petite protéine soluble sécrétée par de nombreuses cellules et influençant la réaction inflammatoire et le comportement de leurs cellules cibles. Complementary-determining region (CDR) Séquence d’acides aminés au sein des domaines variables d’une Ig ou d’un TCR, assurant l’essentiel des contacts avec l’Ag (également connu comme la région hypervariable). Complexe majeur d’histocompatibilité (major histocompatibility complex, MHC) Voir chapitre 22. Cytokine Voir chapitre 22. Délétion clonale (clonal deletion) Élimination des cellules inutiles ou dirigées contre les protéines du « soi », lors de la sélection des lymphocytes T dans le thymus. Domaine (domain) Voir chapitre 22. Épitope (epitope) Partie d’un Ag qui réagit avec l’Ac ou avec le récepteur du lymphocyte T. HLA (Human leukocyte antigen) Ou CMH dans l’espèce humaine. Hypermutation somatique (somatic hypermutation) Taux de mutation des gènes des immunoglobulines beaucoup plus élevé que celui des autres gènes.

N

ous avons vu que le système immunitaire recourait à de nombreuses protéines pour riposter contre les pathogènes. Maintenant, nous allons décrire ces protéines et les interactions qu’elles entretiennent les unes avec les autres. Examinons d’abord les pattern recognition molecules (PRM) du système immunitaire inné, puis passons à la réponse immunitaire adaptative en considérant la superfamille des Ig, les molécules du CMH, les TCR et toute protéine en contact avec l’Ag, et terminons par les facteurs modulant la signalisation consommée par la réponse immunitaire.

I

RÉCEPTEURS DU SYSTÈME IMMUNITAIRE

23.1 Immunité innée et PRM m n Macrophages et polynucléaires neutrophiles de l’immunité innée se livrent à la phagocytose, c’est-à-dire à l’internalisation et la destruction du pathogène. Ces phagocytes expriment des protéines capables de réagir avec un grand nombre de protéines.

Pathogen-Associated Molecular Patterns (PAMP), Pattern Recognition Molecules (PRM) et Toll-Like Receptors (TLR) Au cours de l’évolution, les phagocytes ont pourvu leur membrane de PRM pour repérer les pathogènes. Ces PRM reconnaissent les PAMP à la surface des micro-organismes. Nous en

Immunoglobuline (immunoglobulin) Voir chapitre 22. Molécule HLA de classe I (class I MHC protein) Voir chapitre 22. Molécule HLA de classe II (class II MHC protein) Voir chapitre 22. Motif Séquence d’acides aminés partagés par tous les Ag peptidiques qui se lient à une protéine donnée du CMH. Pathogen-associated molecular pattern (PAMP) Voir chapitre 22. Pattern recognition molecule (PRM) Voir chapitre 22. Polymorphisme (polymorphism) Caractéristique d’un locus capable d’accueillir de multiples allèles, dont l’existence n’est pas expliquée par des mutations aléatoires récentes. Région hypervariable (hypervariable region) Voir CDR. Sélection clonale (clonal selection) Chaque lymphocyte (T ou B) se multiplie pour produire des copies de lui-même quand il a été stimulé par un Ag. Sélection négative (negative selection) Voir sélection clonale. Sélection positive (positive selection) Au cours de la sélection des lymphocytes T, ceux qui reconnaissent les molécules HLA du thymus sont sélectionnés. Superfamille génique des immunoglobulines (immunoglobulin gene superfamily) Famille de gènes dérivés structurellement et fonctionnellement des gènes des Ig. Récepteur des cellules T (T-cell receptor, TCR) Voir chapitre 22. Tolérance (tolerance) Inaptitude à développer une réponse immunitaire vis-à-vis d’Ag particuliers. Toll-like receptor (TLR) Voir chapitre 22.

avons déjà identifié deux dans le système du C, où la MBL et la properdine sont d’authentiques PRM. Après avoir adhéré à la surface des micro-organismes, la première emprunte la voie des lectines et la seconde, la voie alterne pour activer le C (voir tableau 23.1). Les compléments de ces PRM sont les PAMP, structures particulières à la surface des agents infectieux. Celui qui est destiné aux MBL est le mannose, que l’on ne trouve que dans une unité répétitive des polysaccharides bactériens. Quant à la properdine, elle reconnaît le zymosan, un complexe protéopolysaccharidique entrant dans la composition de la membrane de beaucoup de levures pathogènes. D’autres PRM intramembranaires sont presque l’apanage des phagocytes. Initialement découverts chez la drosophile, les TLR se trouvent sur les cellules des mammifères. On les classe en dix catégories qui reconnaissent les PAMP des virus des bactéries et des champignons, sans oublier des molécules enchâssées dans des membranes cellulaires et plusieurs produits solubles du métabolisme des pathogènes (voir tableau 23.1). Certains TLR correspondent à plusieurs PAMP. Par exemple, les TLR-4 interviennent contre les lipopolysaccharides (LPS) des bactéries Gram négatif, mais également contre les protéines de choc thermique ou heat shock proteins (HSP). Ni les LPS ni les HSP n’agissent directement avec les TLR-4 puisqu’ils s’insèrent dans un récepteur. C’est lui qui réagit avec les TLR-4. D’autres TLR, comme les TLR-5, captent directement la flagelline qui en est le PAMP. Le contact entre les TLR d’un phagocyte et les PAMP d’un agent déclenche un signal membranaire. Sa transduction conduit à la synthèse de nombreuses protéines et aboutit à l’activation du



23.2 Immunité adaptative et superfamille des immunoglobulines 777

TABLEAU 23.1

RÉCEPTEURS DE LA RÉPONSE IMMUNITAIRE INNÉE ET LEURS CIBLES

Pattern recognition molecules (PRM)

Pathogen-associated molecular patterns (PAMP)

Résultat des interactions

MBL (mannan-binding lectin) (soluble)

Micro-organisme dont la membrane contient du mannose

Activation du complément par la voie MBL (voir section 22.11)

Properdine (soluble)

Zymosan et autres complexes moléculaires des membranes de micro-organismes

Activation du complément par la voie alterne (voir section 22.11)

TLR-2a (Toll-like receptor 2) (membranes liées)

Peptidoglycanes sur bactéries Gram positif Zymosan sur des levures

TLR-3 (membranes liées)

ARN à double brin (réplication virale)


LPS (lipopolysaccharides)


Flagelline sur une bactérie

L’interaction de tous les TLR avec des macromolécules pathogènes peut donner un signal qui est transduit, conduisant à l’activation du phagocyte, à l’inflammation et à la destruction des pathogènes


Oligonucléotides CpG non méthylés sur des bactéries

a

Les Toll-like receptors se trouvent presque exclusivement sur les phagocytes.

phagocyte. Celle-ci favorise la phagocytose et améliore la bactéricidie des pathogènes ou participe au développement de l’inflammation (voir sections 22.2 et 22.3).

Contrôlez vos acquis La rencontre entre PAMP et PRM fait partie intégrante de la réponse innée. Ces PRM réagissent avec les PAMP communs à plusieurs pathogènes. Ce qui active le C et améliore la phagocytose. •

Quelles sont la cible de la voie d’activation des lectines et l’évolution du pathogène qui a été reconnue ?

•

Quelles sont les cellules qui expriment les TLR-4 et les PAMP bactériens qu’ils reconnaissent ?

23.2 Immunité adaptative m n et superfamille

des immunoglobulines

La superfamille des Ig réunit des gènes et les produits de ces gènes. Ils ont les mêmes caractéristiques structurales et fonctionnelles. Les protéines qui se fixent à l’Ag dans la réponse immunitaire adaptative en font partie. Il s’agit des Ig, des TCR et des molécules du CMH. Les protéines de chacune de ces trois familles ont leur siège, leur structure et leur fonction. Celles de CMH se trouvent sur les CPA et sur les cellules cibles. Elles présentent leurs Ag aux TCR des lymphocytes T ou aux Ig des lymphocytes B.

Structure et évolution des protéines qui se lient à l’antigène Ig, TCR et protéines du CMH ayant des éléments de structure en commun, on pense que ces protéines procèdent de duplications suivies de sélections de gènes ancestraux codant les récepteurs d’Ag (voir figure 23.1). Elles offrent plusieurs domaines distincts. Il y en a au moins un dont la séquence

d’acides aminés est conservée, le domaine constant, comportant environ 100 acides aminés, parmi lesquels 50 à 70 sont isolés par un pont disulfure intracaténaire. La β2m, qui est l’une des protéines du CMH-I (voir section 23.2), n’a qu’un seul domaine constant. Les domaines variables des Ig, des TCR et des molécules HLA ont à peu près la même taille que les domaines constants, mais leur structure est extrêmement variable, alors que ce n’est évidemment pas le cas des domaines constants. Les domaines constants assurent une certaine permanence aux molécules d’Ig, qui s’enfoncent dans la membrane à partir de laquelle elles exposent leurs domaines variables. Ces domaines constants stabilisent la forme de la protéine et servent de cible à certaines molécules accessoires. Par exemple, ce sont les domaines constants des IgG et des IgM qui activent le C (voir section 22.11). Ce sont les domaines constants des molécules HLA-I qui retiennent les corécepteurs CD8 sur les lymphocytes TC et les domaines constants des molécules HLA-II qui s’assujettissent aux corécepteurs CD4 sur les lymphocytes TH (voir section 22.6). Au contraire, les domaines variables se sont diversifiés pour correspondre au plus grand nombre possible d’Ag. Ig, TCR et protéines du CMH sont tous des hétérodimères. Ces récepteurs sont opérationnels, bien que leurs fonctions diffèrent d’une structure à l’autre. Les Ig sont ancrées dans la membrane des cellules B pour capter les pathogènes et leurs toxines par exemple. Elles passent également en grande quantité dans le sérum. Les TCR des lymphocytes T réagissent avec les peptides que leur tendent les molécules HLA à la surface des CPA. Le lymphocyte T, activé par un Ag, va tuer la cellule qui le lui a présenté ou sécréter des protéines pour activer la réponse immunitaire (voir sections 22.7 et 22.8).

Contrôlez vos acquis Les gènes de la superfamille des Ig codent les protéines liées structurellement et fonctionnellement à ces Ig. On y trouve les Ig, les TCR et les molécules HLA, tous capables de se lier à l’Ag.



778 Chapitre 23


Ag

HLA I

HLA II

Ig

Récepteur des cellules T

Bêta-2 microglobuline Membrane

FIGURE 23.1 Protéines de la superfamille des immunoglobulines (Ig). Les domaines constants (C) ont en commun leur séquence d’acides aminés et leur structure dans l’espace. Les domaines C permettent de cataloguer les protéines comme membres de la superfamille des Ig, suggérant des rapports entre ces protéines au cours de l’évolution. Les domaines variables (V) des Ig et des récepteurs des cellules T (TCR) ainsi que les domaines de liaison à l’antigène (Ag) des molécules HLA de classe I et de classe II ne font pas partie de cette superfamille, puisque leurs structures ne sont pas conservées. Les domaines de liaison à l’Ag ont probablement évolué à partir de domaine Ig-like, mais l’évolution a sélectionné certaines formes de liaison à l’Ag. Beaucoup d’autres protéines utilisées par le système immunitaire, dont des cytokines et des composants du complément, appartiennent également à cette superfamille, mais seules les protéines montrées sur la figure réagissent directement avec l’Ag.

•

Décrivez la structure du domaine constant d’une molécule d’Ig.

•

Pourquoi la structure du domaine variable est-elle différente de celle du domaine constant ?

•

Quels sont les Ag captés par les Ig, par les TCR et par les molécules HLA ?

II

par les gènes HLA, mais la β2m qui lui est associée de façon non covalente ne l’est pas. La structure tridimensionnelle de la chaîne α dévoile son interaction avec le peptide antigénique d’une part et le TCR d’autre part (voir figure 23.3). La chaîne α se plie pour ménager un sillon où s’emboîte le peptide. Fermé à ses deux extrémités, ce sillon ne peut accueillir que des peptides de huit à dix acides aminés. La protéine du CMH compte deux hélices α coiffant un feuillet β.

Les molécules HLA de classe II COMPLEXE MAJEUR D’HISTOCOMPATIBILITÉ

Le CMH est une famille de gènes présente chez tous les vertébrés. Le complexe HLA de l’homme couvre environ quatre millions de paires de bases sur le chromosome numéro 6 (voir figure 23.2).

23.3 Structure des protéines du CMH m n C’est l’importance des protéines du CMH dans le rejet de greffe qui a permis de les découvrir. Évidemment ce n’est pas leur fonction naturelle qui est plutôt de capter et de présenter les Ag aux lymphocytes T (voir section 22.6). Il en existe deux classes. Les molécules HLA-I se trouvent sur toutes les cellules nucléées. En général, elles présentent des peptides aux lymphocytes TC. Si ceux-ci sont étrangers, les cellules dont ils proviennent sont détruites par les TC (voir section 22.7). Les CPA ont le monopole des molécules HLAII (voir section 22.6), qui suscitent une réaction inflammatoire ou provoquent une sécrétion d’Ac (voir 22.8).

Les molécules HLA de classe I Ces molécules associent deux polypeptides (voir figures 23.1 et 23.3). La chaîne α est enchâssée dans la membrane et codée

Des liaisons non covalentes unissent la chaîne α et la chaîne β, dont les racines sont plantées dans la membrane (voir figures 23.1 et 23.3). Ces complexes HLA-II s’appareillent souvent sous forme de paires, ce qui en améliore la capacité à adhérer aux TCR. Les domaines α1 et α2 se disposent de manière à libérer un site de liaison pour le peptide. Les extrémités de ce sillon restent ouvertes, pour que les molécules HLA-II présentent des peptides de plus de dix acides aminés (voir figure 23.3). En général, ce sont les fragments de la protéolyse des pathogènes dans les CPA. Leur longueur oscille de dix à vingt acides aminés au moins (voir section 22.6).

Contrôlez vos acquis Les molécules HLA-I s’expriment sur toutes les cellules nucléées et présentent des peptides du cytosol au TCR des lymphocytes TC. On ne trouve des molécules HLA-II que sur les CPA pour présenter des peptides de l’extérieur au TCR des lymphocytes TH. •

Qu’ont en commun les molécules HLA-I et les molécules HLA-II ? Et qu’ont-elles de différent ?

•

Comparez les sites de liaison pour le peptide antigénique sur les molécules HLA-I et sur les molécules HLA-II. Qu’ont-elles en commun ? Qu’ont-elles de différent ?



23.4 Le polymorphisme des gènes du CMH 779

FOCUS

Toll Receptors et Drosophila : une réponse archaïque aux infections

La mouche du fruit, Drosophila melanogaster, sert de modèle aux biologistes depuis presque un siècle. Plus récemment, l’étude du système immunitaire de cet invertébré a aidé à comprendre le fonctionnement de l’immunité innée des vertébrés (également des autres invertébrés et même des plantes). Plusieurs protéines impliquées dans le développement de la mouche jouent aussi le rôle de récepteur pour les bactéries ; ce sont les pattern-recognition molecules (PRM). Le meilleur exemple est celui de Toll, un récepteur de surface intervenant non seulement dans le développement de l’axe

dorso-ventral, mais également dans la réponse immunitaire. La mobilisation de Toll par le système immunitaire commence à la surface des phagocytes par la rencontre entre la protéine Toll et un pathogène (complet ou limité à certains de ces composants). Ce n’est pas le pathogène lui-même qui entre en contact avec le Toll, mais des molécules dérivées de ce pathogène telles que les lipopolysaccharides (LPS) des bactéries Gram négatif, liés par exemple à une ou plusieurs protéines annexes. C’est le complexe entre le LPS et ces protéines annexes qui se lient

Bactéries Gram négatif Lipopolysaccharide (LPS) LPS-binding protein (LBP)

CD14

TLR-4

NF-κB

Transduction du signal

Transcription

Traduction

Inflammation

Activation de IL-1, IL-6, IL-8, TNFα Figure 1 – Activation du TLR-4 des macrophages chez l’homme. Les lipopolysaccharides (LPS) relargués par les bactéries Gram négatif se lient à la LPS-binding proteine (LBP) dans la circulation. Puis, le complexe LPS-LBP s’accroche à CD14, LPS est libéré et le nouveau complexe LPS-CD14 s’insère dans le TLR-4. L’ensemble TLR-4-LPS-CD14 déclenche la transduction qui emprunte le TLR-4, active le facteur de transcription NF κB, suscite la transcription de gène codant des cytokines inflammatoires et des chimiokines, et la synthèse IL-1, IL-6, IL-8 et TNF-α. À leur tour, ces médiateurs activent d’autres cellules, entraînant la phagocytose du pathogène et sa destruction (voir sections 22.2 et 22.3).

23.4 Le polymorphisme des gènes m n du CMH Le CMH compte au moins trois groupes de gènes : HLA-A, -B et -C. Les trois sont hautement polymorphes, c’est-à-dire susceptibles d’accueillir de multiples allèles dans un locus donné :

au récepteur Toll. Le récepteur Toll étant transmembranaire il envoie un signal jusqu’au cytoplasme, active un facteur de transcription nucléaire et provoque la transcription de plusieurs gènes codant des peptides antimicrobiens. Chez la drosophile, ces facteurs induisent la transcription de drosomycine (un peptide antifongique), de diphtéricine (molécule active contre les bactéries Gram négatif) et de défensine (molécule active contre les bactéries Gram positif). Ces protéines sont synthétisées à partir de corps gras dans un organe qui correspond au foie, et sécrétées dans la circulation à partir de laquelle elles pénètrent dans l’organisme cible et le lysent. La structure des Toll ressemble à celle des lectines. Ces protéines se lient de façon très spécifique, avec des monomères oligosaccharidiques. Les Toll-like receptors (TLR) accueillent beaucoup de pathogenassociated molecular patterns (PAMP), dont la liste figure dans le tableau 23.1. Chez l’homme, TLR-4 intervient dans l’immunité innée contre les bactéries Gram négatif en captant ces LPS. Comme pour le Toll de la drosophile, le pathogène ou le LPS ne s’insèrent pas directement dans le TLR-4 mais commencent par se fixer aux LPS-binding proteins (LBP) avant de se planter dans les récepteurs CD14 sur les phagocytes. C’est le complexe LPSCD14 qui s’insère dans les TLR-4. Comme c’est une protéine transmembranaire, une fois que le complexe l’a activée, elle déclenche la cascade de la transduction, qui aboutit à l’activation du facteur NF κB. Celui-ci suscite la transcription de cytokines ou d’autres protéines. Un phagocyte activé peut détruire le pathogène et sécréter des protéines de l’inflammation. Le Toll de la drosophile est l’ancêtre structurel et fonctionnel de ceux des vertébrés en général et de l’homme en particulier. Les récepteurs Toll et leur ligand sont des composants hautement conservés de la réponse innée et archaïque. Cette machinerie existe chez une grande variété d’animaux ; on peut même la trouver chez les plantes.

95 allèles pour HLA-A, 207 pour HLA-B et 50 pour HLA-C. Leur fréquence ne s’explique pas par des mutations récentes et aléatoires. Le polymorphisme est donc considérable à l’intérieur de l’espèce humaine, mais, pour un locus donné, chacun d’entre nous n’a que deux allèles, l’un d’origine paternelle, l’autre d’origine maternelle. Tous deux sont dominants.



780 Chapitre 23 DPA

Immunologie moléculaire DPB DQB

DRB DQA

DRA

C4 Bf C2

B TNF

C

A

Complexe génétique Région Taille (Mpb)

Classe II

Classe III 1

Classe I 2

3

4

FIGURE 23.2 Carte génétique du complexe majeur d’histocompatibilité (CMH). Le CMH s’appelle HLA (human leukocyte antigen) chez l’homme. Il se trouve sur le chromosome 6 et comprend 4 millions de bases. Les gènes de classe II, DPA et DPB, codent les protéines de classe II, DPa et DPb ; DQA et DQB codent DQa et DQb ; DRA et DRB codent DRa et DRb. Les gènes de classe III codent plusieurs protéines associées à la fonction de reconnaissance immunitaire, mais aussi des protéines qui n’ont aucun rapport avec cette reconnaissance. C4 et C2 codent les composants C4 et C2 du complément (voir section 22.11). Le gène TNF code une cytokine, le tumor necrosis factor (voir section 23.10). Les protéines HLA-A, HLA-B et HLA-C de classe I sont codées par les gènes A, B et C du CMH. Plus de 200 gènes se trouvent dans ce complexe HLA, beaucoup d’entre eux étant impliqués dans la reconnaissance d’un antigène, son apprêtement et sa présentation.

De même, des gènes hautement polymorphiques codent les protéines HLA-DR, -DP et -DQ. Leurs produits s’expriment également de façon codominante. Au total, une cellule exprime six molécules HLA-I (HLA-A, -B et -C) et six molécules HLA-II (HLA-DR, -DP et -DQ). Ce polymorphisme est l’obstacle majeur à la transplantation d’organe, car les molécules HLA du greffon sont considérées comme des Ag étrangers par le système immunitaire du receveur. Il s’ensuit une réaction dirigée contre les protéines HLA elles-mêmes de la part du greffon, la mort des cellules qui les porte et le rejet de ce greffon. Chaque gène du CMH ne code qu’une protéine. Cependant, le polymorphisme de ces gènes est tel que la population humaine dispose d’un large éventail de molécules HLA pour présenter les Ag. Les molécules HLA diffèrent les unes des autres par des changements d’acides aminés qui se cantonnent dans le sillon destiné à recueillir le peptide (voir figure 23.3),

chaque variation dans les acides aminés des molécules HLA entraînant la liaison des peptides différents. Tous les peptides correspondant à une molécule HLA donnée partagent des caractéristiques structurales. C’est un motif et chaque molécule HLA convient à un motif qui lui est propre. Par exemple, tous les octapeptides conformes à une molécule HLA-I ont une cinquième phénylalanine et une huitième leucine en commun. Ainsi, tous les peptides X-X-X-X-phénylalanine-X-X-leucine (où X représente n’importe quel acide aminé) peuvent se lier à cette molécule HLA. Une autre protéine HLA-I accueille plutôt un motif comptant une valine en cinquième position et une proline en huitième position (X-X-X-valine-XX-X-proline). Les acides aminés requis par ces deux motifs sont leurs résidus d’ancrage puisque ce sont eux qui fixent le peptide dans le sillon d’une molécule HLA. Au total, la molécule présente beaucoup de peptides différents, mais pourvus des résidus d’ancrage appropriés. Chaque molécule HLA capte son motif et

Site de liaison du peptide α1

Aideen C. M. Young

α2

(a)

α3

D. Wiley

β2m

D. Wiley

(c)

(b)

FIGURE 23.3 Structure des molécules HLA dans les trois dimensions. (a) Protéine de classe I. (b) Protéine de classe II sous la forme d’un dimère. Les flèches jaunes pointent le peptide et son logement dans la région de liaison. Un peptide de neuf acides aminés est enchâssé dans une molécule de classe I du CMH de la souris. Ces protéines de classe I sont fermées aux deux extrémités, n’accueillant donc que des peptides de 9 à 10 acides aminés. En revanche, les protéines de classe II, étant ouvertes à leurs deux extrémités, peuvent accueillir des peptides mesurant jusqu’à 20 acides aminés.



23.5 Structure des anticorps et de leur liaison aux antigènes 781

donc ses résidus d’ancrage. Au bout du compte, les six molécules HLA-I d’un individu présentent un grand nombre de peptides différents. La situation des molécules HLA-II est la même. Toutefois, les autres protéines susceptibles de se lier aux Ag, notamment les Ig et les TCR réagissent de façon beaucoup plus spécifique que les molécules HLA avec un nombre presque infini d’Ag. Donc, ces mécanismes différents engendrent encore plus de récepteurs (voir sections 23.5 et 23.7).

VH (CDR1) VH (CDR2)

Régions J (de jonction)

CH1 S

Comment le polymorphisme des protéines correspondantes élargit-il l’éventail des peptides que le CMH présente aux TCR ?

VL (CDR1) S

•

Domaine variable de la chaîne légère

Région D (diversité)

Le CMH groupe les gènes codant les protéines qui apprêtent et présentent l’Ag. Les gènes HLA-I et HLA-II sont les plus polymorphes des gènes. Les protéines qui en résultent présentent les peptides qui ont certains motifs en commun. À quoi correspond le polymorphisme des gènes du CMH ?

Ag

VH (CDR3)


•

Domaine variable de la chaîne lourde

VL (CDR2)

CL

VL (CDR3)

CH2

Chaîne légère

Chaîne lourde CH3

(a) VL (CDR2)

III

VH (CDR1) VH (CDR3)

ANTICORPS

Les Ac font office de récepteurs d’Ag à la surface des cellules B, pour neutraliser et opsoniser les Ag qui circulent dans le sérum et les autres fluides (voir sections 22.11 et 24.6).

VL (CDR1)

VL (CDR3)

Ag

VH (CDR2)

23.5 Structure des anticorps m n et de leur liaison aux antigènes Une molécule d’Ig comprend deux chaînes lourdes et deux chaînes légères. Son unité de liaison à l’Ag est l’hétérodimère que forme chacune de ses chaînes légères avec l’extrémité de chacune de ses chaînes lourdes. Celles-ci sont constituées d’un domaine V qui abrite le site de fixation d’Ag et de un ou plusieurs domaines C chargés de fonction comme l’activation du complément.

Les domaines variables La nature des acides aminés diffère d’un domaine V à un autre (voir figure 23.4). Cette variabilité est patente dans les régions que l’on qualifie d’hypervariables ou de régions déterminant la complémentarité (CDR) avec l’Ag. Pour chaque chaîne légère et chaque chaîne lourde, le domaine V possède un CDR1 et un CDR2 différant légèrement et un CDR3 différant radicalement d’une Ig à une autre. La structure du CDR3 de chaque chaîne lourde est complexe. En comparant la séquence protéique, on s’aperçoit qu’elle réunit l’extrémité 3' du domaine V, les trois acides aminés du segment D (pour diversité) et les treize à quinze acides aminés de la région J (pour jonction). La structure du CDR3 de chaque chaîne légère est identique, mais la région D absente, tous ces CDR étant impliqués dans la liaison à l’Ag.

(b) FIGURE 23.4 Régions variables des chaînes légères et des chaînes lourdes d’une immunoglobuline (Ig). (a) La moitié de l’Ig est schématisée. CH et CL sont les domaines constants respectivement pour les chaînes lourdes (heavy, ou H) et les légères (light, ou L). (b) La région déterminant la complémentarité avec l’antigène (Ag) (CDR) s’organise à partir d’une chaîne lourde et d’une chaîne légère pour constituer un seul site de liaison à l’Ag. Les segments en rouge sont ceux des chaînes lourdes et les segments en bleu, ceux des chaînes légères. Les sites de liaison sont numérotés pour indiquer la chaîne et l’emplacement du CDR. Par exemple, L1 est le premier CDR de la chaîne légère. Les CDR3 hypervariables des chaînes lourdes et des chaînes légères sont associés au centre du site de liaison à l’Ag. Celui-ci est dessiné en gris, adhérant à tous les CDR. La vraie forme de ce site peut être une rainure superficielle ou une poche profonde selon le couple Ag-anticorps.

La liaison à l’antigène Le principe d’une réaction entre un Ag et un Ac repose sur la combinaison spécifique d’un déterminant du premier avec la région variable du second. Le site de liaison à l’Ag d’un Ac associe chaînes lourdes et chaînes légères et mesure environ 2 × 3 nm,



782 Chapitre 23


pour accueillir dix à quinze acides aminés. Cette liaison à l’Ag est le résultat du repliement final des chaînes lourdes et des chaînes légères dans l’espace. Ce faisant, la molécule projette les trois CDR de la chaîne lourde et les trois CDR de la chaîne légère à l’une de ses extrémités. Ce qui donne un site unique et spécifique de liaison à l’Ag (voir figures 22.16 et 23.4b).

Contrôlez vos acquis Le site de liaison à l’Ag d’une molécule d’Ig est constitué par le regroupement du domaine variable d’une chaîne lourde et le domaine variable d’une chaîne légère. Chacun d’entre eux contient trois CDR que rapproche le repliement de la molécule dans l’espace pour former le site de liaison à l’Ag. •

Quelles sont les contributions de V, D et J à la structure de la chaîne lourde, et de V et J à celle de la chaîne légère ?

•

Dessinez une molécule complète d’Ig en y situant les sites de liaison à l’Ag.

23.6 Diversité des gènes des anticorps m n Si on admet qu’un gène code une protéine, un lymphocyte B produit une molécule d’Ig et, pour le faire, choisit un gène pour coder sa chaîne légère et un autre pour coder sa chaîne lourde. C’est impossible, puisque les Ac doivent reconnaître de façon spécifique une infinie variété d’Ag. Le système a donc évolué de manière à produire une infinie variété d’Ac à partir d’un petit nombre de gènes. Les recombinaisons aléatoires de chaînes lourdes et de chaînes légères ainsi que les hypermutations contribuent à amplifier cette diversité.

Les différents segments des gènes d’immunoglobuline Une chaîne d’Ig est codée par plusieurs segments géniques qui sont recombinés puis débarrassés de leurs segments intermédiaires. Ces réarrangements somatiques multiplient le nombre des Ac grâce aux combinaisons entre quatre cents gènes différents. On a démontré à l’échelon moléculaire que ces gènes appartenaient à des familles séparées les unes des autres sur le chromosome, mais dont un membre se rapproche des autres pour former un seul gène, un segment V, un segment D et un segment J (voir figure 23.5). Un gène V code le CDR1 et le CDR2 d’une chaîne lourde, mais le CDR3 résulte d’un rapprochement entre l’extrémité 3' du gène V, le gène D et le gène J en entier. Quant au domaine C, qui définit la classe de la molécule, il est codé par un gène C d’aval. Donc, quatre gènes concourent à former une seule chaîne lourde d’Ig. Les chaînes légères sont codées de la même façon par V, J et C. Les gènes de toutes les Ig existent dans chaque lymphocyte B en cours de développement (voir figure 23.5). Chacun d’entre eux dispose d’environ 150 gènes VL en tandem et 5 gènes J pour les chaînes légères, et de 200 gènes VH en tandem, 50 gènes D et 4 gènes J. Entre les gènes V et les gènes D, les gènes J et les gènes C, il y a des séquences non codantes, ou

introns (voir sections 7.1 et 14.8). Au cours de leur ontogenèse, chaque lymphocyte B peut être le siège de recombinaisons génétiques. Des segments V, D et J pris au hasard ont fusionné, donnant un gène fonctionnel pour la chaîne lourde et un autre pour la chaîne légère. Ce gène fonctionnel, avec des séquences intermédiaires séparées des gènes V, des gènes D, des gènes J, est transcrit, et l’ARN primaire est excisé pour donner l’ARN messager, lequel est traduit en chaînes légères et en chaînes lourdes pour former la molécule d’Ig.

L’épissage des segments V, D et J, et des segments V et J Jusqu’à présent, toute la diversité des Ig reflète la recombinaison de gènes qui existent déjà. Un lymphocyte B exprime donc des gènes de chaînes lourdes et des gènes de chaînes légères recombinées au hasard. Pour les chaînes légères, 150 gènes V et 5 gènes J, donnent 750 chaînes κ. Pour les chaînes lourdes, 200 gènes V, 50 gènes D et 4 gènes J donnent 4 000 chaînes lourdes. L’association au hasard des chaînes lourdes et des chaînes légères donne 3 000 000 d’Ac (voir figure 23.5). Une autre source de diversité est l’épissage des segments d’ADN, car la liaison des gènes V, D et J ou des gènes D et J est imprécise. Ces variations de quelques nucléotides suffisent pour changer un acide aminé ou deux et augmenter encore la diversité des Ac. Chaque lymphocyte B ne retient qu’un seul réarrangement de chaînes lourdes et de chaînes légères dans le mécanisme de l’exclusion allélique qui astreint ce lymphocyte T à la production d’une seule sorte d’Ig.

Les hypermutations Les hypermutations somatiques, survenant à un taux accéléré par rapport à celui des mutations conventionnelles, ajoutent à la diversité des Ig. Elles sont évidentes après une deuxième exposition à l’Ag, alors que la classe a transmuté de l’IgM à l’IgG (voir section 22.10). Ce changement améliore l’affinité. La maturation de l’affinité est l’un des facteurs permettant une meilleure réponse secondaire en Ac que la réponse primaire en Ac (voir section 22.10 et figure 22.21). Une telle maturation de l’affinité augmente la diversité des Ig à l’infini, puisqu’elle offre au moins 1012 Ig possibles.

Contrôlez vos acquis Les réarrangements géniques permettent de combiner les divers segments géniques d’Ig. En se déroulant au hasard, ce phénomène porte la diversité à son maximum. Les imprécisions dans l’épissage entre les segments V, D et J et entre les segments V et J, ainsi que le phénomène des hypermutations et de la maturation d’affinité se conjuguent pour rendre cette diversité quasiment illimitée. •

Quelles sont les recombinaisons qui aboutissent à un gène mature de chaîne lourde ?

•

Décrivez les mutations somatiques qui augmentent encore cette diversité des Ac.

•

Comment autant de sites de liaison à l’Ag peuventils être produits au niveau des Ac ?



23.7 TCR et liaison à l’antigène 783

Gène V V1

V2

V3

V4

Gène J

Gène D V5

V200

D1

D2

J1

D3

J2

Gène C J4

µ

Introns Recombinaison somatique produisant un gène V3 D1 J2 fonctionnel pendant l’ontogénèse du lymphocyte B V3 D1 J2

µ Transcription

µ

δ

γ

ε α ADN germinal

ADN recombiné ARN primaire

Épissage V3 D1 J2 µ

ARN messager

Traduction

(a) Chaîne lourde

Gène V V1

V2

V3

V4

Gène C

Gène J V5

V150

J2

J1

V2 J1

κ

J5

ADN germinal

κ

ADN recombiné

κ

ARN primaire

Transcription V 2 J1 Épissage V2 J1

κ

ARN messager

Traduction (b) Chaîne légère kappa

+ IgM (c) Sommation de A et B

IV

FIGURE 23.5 Réarrangement des gènes d’immunoglobuline (Ig) dans un lymphocyte B humain. Les gènes sont réarrangés en tandem sur trois chromosomes. (a) Le complexe de la chaîne lourde, ou heavy (H), se trouve sur le chromosome 14. Les rectangles représentent des gènes codant des Ig ; les lignes en pointillé représentent les séquences intermédiaires (elles ne sont pas figurées à l’échelle). (b) Les gènes de la chaîne légère kappa (κ) se trouvent sur le chromosome 2. Les gènes des chaînes légères lambda (λ) sont sur le chromosome 22. (c) Reconstitution de la moitié d’une molécule d’anticorps.

RÉCEPTEURS D’ANTIGÈNE DES CELLULES T

Les TCR sont des récepteurs d’Ag qui, à partir de la surface des lymphocytes T, reconnaissent les peptides antigéniques présentés par les molécules HLA (voir section 22.6).

23.7 TCR et liaison à l’antigène m n Le TCR, protéine enchâssée dans la membrane, n’existe qu’à la surface des lymphocytes T. Il est formé d’une chaîne α et d’une chaîne β. Ce TCR-αβ capte de façon spécifique les

peptides étrangers présentés par les molécules HLA à la surface des CPA ou exhibés sur la membrane des cellules cibles (voir section 22.6). Le TCR se fixe donc aux CMH du « soi » et aux peptides du « non-soi ». Cette double liaison s’opère à partir des domaines V des chaînes α et β. Comme dans les Ig, ceux-ci possèdent des CDR1, CDR2 et CDR3 qui se fixent à l’Ag. La structure de ce complexe TCR-peptide-CMH peut être représentée en trois dimensions (voir figure 23.6). Les protéines du TCR et du CMH se fixent directement à l’Ag. Les premières à l’épitope, les secondes à l’agrégotope. Ces CDR sont directement impliqués dans la fixation au complexe peptideCMH et chacun d’entre eux est spécifique de l’Ag. Les CDR3



784 Chapitre 23

Immunologie moléculaire Lymphocyte T

Membrane TCR Cβ

Cα TCR Vβ

Cβ Récepteur des cellules T

Épitope

TCR Vα

Peptide antigénique Peptide antigénique

Vα

Vβ α1

α2

Agrégotope

CMH-protéines

CMH α1

β2m

CMH α2

α3

β2m Membrane

CMH α3

Cellule présentatrice d’antigène

(b) FIGURE 23.6 Association entre un récepteur des cellules T (TCR), un peptide antigénique et les molécules du complexe majeur d’histocompatibilité (CMH). (a) Vue tridimensionnelle présentant l’orientation du TCR, du peptide (en rouge) et du CMH. (b) Schéma interprétant la structure du complexe TCR-peptides-CMH.

(a)

des chaînes α et β du TCR entrent en contact avec l’épitope, tandis que les CDR1 et CDR2 entrent en contact avec les hélices chargées de ce peptide dans les molécules HLA.

Contrôlez vos acquis Le TCR est un récepteur pour les Ag présentés par les molécules HLA. Les CDR3 des chaînes α et β entrent en contact avec l’épitope de cet Ag, tandis que les CDR2 le font avec les molécules HLA. •

Quelles sont les fonctions des CDR1, CDR2 et CDR3 du TCR ?

•

Quelle est la différence entre un épitope et un agrégotope ?

23.8 La diversité des gènes du TCR m n Les domaines C et V des chaînes α et β du TCR sont codés par des segments génétiques distincts. Comme dans le cas des Ig, il y a un grand nombre de gènes V en tandem. La chaîne α dispose de 80 gènes V et de 61 gènes J, et la chaîne β de 50 gènes V, de 2 gènes D et de 13 gènes J (voir figure 23.7). On assiste donc à des recombinaisons entre les gènes V et gènes J des chaînes α et entre les gènes V et les gènes D, les gènes J des chaînes β,

pour constituer les gènes des régions V. Un facteur supplémentaire de diversité, la diversification de la région N-terminale, résulte de l’addition au hasard de un à six nucléotides entre les gènes V et les gènes D, et entre les gènes D et les gènes J. De plus, comme la transcription du gène D de la chaîne β peut se faire dans les trois cadres de lecture, la diversité est encore plus grande que les segments géniques D le laissaient prévoir. Comme pour les Ig, ces réarrangements se font au hasard et le regroupement final donne un hétérodimère αβ complet. En revanche, il n’y a pas d’hypermutation somatique pour les TCR. La diversité potentielle n’en est pas moins énorme, puisque l’on compte 1015 combinaisons différentes.

Contrôlez vos acquis Le domaine V de la chaîne β et du TCR est codé par les segments V, D et J ; celui de la chaîne α par les segments V et J. La diversité résultant des combinaisons, des réarrangements, de la transcription des segments D dans trois cadres de lecture et de l’addition aléatoire de nucléotide est pratiquement illimitée. •

Expliquez pourquoi la transcription des trois cadres de lecture du segment D est source de diversité.

•

Expliquez comment l’addition de nucléotides aux extrémités N-terminales ajoute à la diversité du TCR.



23.9 Réaction clonale et tolérance 785 Chaînes-α Vα1

Vα2

Vα80

Vβ2

Vβ50

Jα1 Jα2

Jα61

Cα

Chaînes-β Vβ1

Dβ 1

Jβ1(1-6)

C β1

D β2

Jβ2(1-7)

Cβ2

FIGURE 23.7 Organisation des gènes des chaînes et des gènes des chaînes β du T-cell-receptor (TCR). Les gènes des chaînes α se trouvent sur le chromosome 14, et ceux des chaînes β, sur le chromosome 6. Les espaces en blanc indiquent que de longs segments d’ADN ne sont pas présentés, puisqu’ils ne codent ni les chaînes-α, ni les chaînes-β.

V

SIGNAUX MOLÉCULAIRES DE L’AUTO-IMMUNITÉ

Le premier signal que reçoit un lymphocyte est la reconnaissance d’un Ag par des Ig de membrane ou par ses TCR. Pour qu’ils puissent y répondre, il a besoin d’autres signaux. Nous allons étudier certains d’entre eux : les mécanismes de sélection des cellules qui répondront à l’Ag étranger et ignoreront l’Ag du « soi », la nature des seconds signaux indispensables à l’activation des lymphocytes T, et les cytokines et chimiokines susceptibles d’activer d’autres cellules.

23.9 Réaction clonale et tolérance m n Pour qu’une réponse immunitaire soit efficace, les cellules T doivent distinguer les Ag du « non-soi », qui sont dangereux, des Ag du « soi », qui ne le sont pas. Cette tolérance est l’absence spécifique de réponse aux Ag du « soi ». En accomplissant cette tolérance, le système sélectionne les cellules immunitaires ne réagissant qu’avec les Ag du « non-soi ».

La sélection clonale La sélection clonale est une hypothèse selon laquelle le récepteur de chaque lymphocyte est destiné à un seul Ag. Après la rencontre de celui-ci, ce lymphocyte se reproduit et les cellules B et T se multiplient et se différencient. La cellule stimulée par l’Ag aboutit donc à une famille de cellules descendant d’une seule cellule et dotées du même récepteur d’Ag : il s’agit d’un clone (voir figure 23.8). Évidemment, les cellules qui n’ont pas réagi ne se multiplient pas. Pour riposter à la variété des Ag, l’organisme a besoin de beaucoup de lymphocytes. Toutefois, ceux-ci ne doivent pas réagir en présence des Ag du « soi ». Il faut donc les éliminer en épargnant les lymphocytes dirigés contre les Ag extérieurs.

Sélection des lymphocytes T et tolérance Les lymphocytes T sont sélectionnés de façon positive quand ils reconnaissent les exo-Ag et de façon négative quand ce sont des auto-Ag. La sélection négative mène à la tolérance,

c’est-à-dire à l’absence de réponse immunitaire contre le « soi ». La rupture de cette tolérance permet à des MAI de se développer (voir section 22.15). À partir de la moelle osseuse, les lymphocytes pré-T gagnent l’organe lymphoïde primaire qu’est le thymus en passant par les canaux lymphatiques (voir figures 23.9 et 22.2). Les TCR des lymphocytes T immatures se lient aux molécules du CMH à la surface des cellules épithéliales du thymus. C’est une sélection positive : les cellules qui reconnaissent les molécules HLA sont retenues, alors que celles qui ne le font pas sont vouées à la mort par apoptose. La sélection négative s’opère dans un deuxième temps. Les cellules T qui ont été sélectionnées continuent à réagir avec les complexes d’Ag et de molécules HLA. Les Ag du thymus sont évidemment des auto-Ag et les lymphocytes T correspondants sont potentiellement dangereux. Si la liaison entre ces cellules et les auto-Ag est forte, les cellules sont éliminées. Par contre, les cellules destinées aux exo-Ag ne s’y fixent pas aussi fortement, puisque les auto-Ag ne font que reproduire de façon approximative les exo-Ag. Ces lymphocytes T gagnent les organes lymphoïdes secondaires, rate et ganglions lymphatiques, où se noue le contact avec les Ag étrangers présentés par des lymphocytes B et autres CPA. Ce processus en deux étapes sélectionne les lymphocytes T, tout en ménageant la tolérance. C’est la délétion clonale. Les cellules T inutiles ou dangereuses sont détruites, ce qui représente plus de 99 % des lymphocytes pré-T qui sont entrés dans le thymus.

La tolérance B Il est également nécessaire de tolérer les lymphocytes B autoréactifs, puisque leurs Ac peuvent léser les tissus (voir section 22.15). Ces cellules B subissent leur délétion clonale. Beaucoup de celles qui sont autoréactives sont éliminées dans la moelle osseuse, qui est l’organe lymphoïde primaire des lymphocytes B chez l’homme (voir section 22.1). Cette délétion est complétée par l’anergie clonale, qui revient à une absence de réponse. Les cellules B immatures autoréactives ne se développent pas, même en présence de fortes concentrations d’auto-Ag, dans la moelle osseuse. Ces lymphocytes B peuvent reconnaître un auto-Ag, mais ils dépendent du second signal des cellules T pour se développer (voir section 23.10). Si le lymphocyte T qui le produit a été éliminé, la cellule B reste anergique.



786 Chapitre 23


sont éliminés par délétion clonale. Il s’agit respectivement d’une sélection positive et d’une sélection négative. Les cellules T qui survivent à ces deux épreuves quittent le thymus pour participer aux réactions immunologiques. Les lymphocytes B dirigés contre les auto-Ag sont contrôlés par délétion clonale, sélection et anergie.

Cellule souche médullaire

Lymphocytes B1

Lymphocytes B2

Lymphocytes B3

Interaction spécifique avec l’Ag

Ag

•

Donnez un exemple de protéine du « soi » à laquelle vous seriez tolérant et d’une autre à laquelle vous ne le seriez pas.

•

Quelles sont les différences entre la sélection positive et la sélection négative des lymphocytes T ?

•

Décrivez, pour les lymphocytes B, la délétion et l’anergie clonales.

Ac Lymphocytes B1

Lymphocytes B2

Interaction avec les lymphocytes T

Lymphocytes B2

Lymphocytes B2

Lymphocytes B3

23.10 Seconds signaux m n

Sélection d’une seule cellule pour constituer un clone Lymphocytes B2

Lymphocytes B2

Prolifération et différenciation en plasmocytes ou en cellules mémoire

Lymphocytes B2

Lymphocytes B2

Ac

FIGURE 23.8 Sélection clonale. Chaque lymphocyte B prolifère sous la forme d’un clone, dès qu’il a rencontré l’unique antigène (Ag) dont il est spécifique. L’antigène joue le rôle d’un agent de sélection et contrôle la sélection puis la prolifération du lymphocyte B spécifique κ. Les copies de la cellule réagissant avec l’Ag expriment toutes les mêmes anticorps spécifiques de l’Ag initial sur leur membrane. Si le contact avec l’Ag persiste, l’expansion du clone continue. Le comportement des lymphocytes T est analogue à celui des lymphocytes B.

Contrôlez vos acquis L’environnement de l’organe lymphoïde primaire qu’est le thymus permet aux lymphocytes T de mûrir. Ceux qui ne réagissent pas avec les molécules HLA et ceux qui réagissent fortement avec les Ag du « soi »

Dans le thymus, les lymphocytes T sont sélectionnés puisqu’ils ne reconnaissent pas les auto-Ag ou puisqu’ils ont été rendus tolérants. Or beaucoup d’auto-Ag n’existent pas dans le thymus. Pour être contrôlés, ces lymphocytes T recourent donc à l’anergie. Ce processus repose sur la nécessité de deux signaux pour activer les lymphocytes T.

Activation des cellules T et second signal Les lymphocytes T qui ont été sélectionnés quittent le thymus pour émigrer dans les ganglions lymphatiques, la rate ou le MALT. Il s’agit de lymphocytes T dits naïfs, puisqu’ils n’ont pas encore rencontré leur Ag. Ils doivent être activés par les CPA (voir section 22.6) pour devenir des cellules compétentes. La première étape de cette activation est la liaison du TCR (voir figure 23.10) au complexe peptide-HLA, à la surface des CPA. C’est le premier signal de l’activation. Le second signal mobilise la protéine B7 sur les CPA et la protéine CD28 sur les cellules T, et les unit l’une à l’autre. En l’absence de ce signal, il n’y a pas d’activation (voir figure 23.11). S’il y en a, les lymphocytes T deviennent effecteurs. Un lymphocyte TC tue n’importe quelle cellule qui exprime l’Ag, même quand elle n’est pas assortie de CD28. Les cellules déjà activées n’ont besoin que du premier signal pour que se produise cet effet (voir figure 23.10). Ce deuxième signal a des conséquences majeures sur l’anergie. Par exemple, un lymphocyte TC naïf qui reconnaît un autoAg sur une cellule non CPA ne reçoit que le premier signal, puisque cette cellule est dépourvue de la protéine B7 nécessaire pour que soit lancé le second. Ce lymphocyte TC s’anergise et n’est plus activable (voir figure 23.10). Le second signal entre B7 et CD28 est donc indispensable. Les lymphocytes TH1 et TH2 sont activés de la même façon, car leur second signal passe également par la liaison entre B7 et CD28.

Contrôlez vos acquis Beaucoup de lymphocytes T autoréactifs sont éliminés dans le thymus pendant leur maturation. Les cellules T naïves sont activées dans les organes lymphoïdes



23.11 Cytokines et chimiokines 787

Lymphocyte pré-T sortant de la moelle osseuse

1

Développement des TCR (en bleu) à la surface des cellules T dans le thymus

2

Sélection positive : les cellules qui reconnaissent HLA (en rouge) prolifèrent Les cellules qui ne reconnaissent pas HLA cessent de proliférer et sont éventuellement éliminées

Clone délété 3

Sélection négative : les cellules T qui réagissent avec les auto-Ag (violet) et les molécules HLA sont éliminées. Celles qui ne réagissent pas continuent à proliférer.

4

À la périphérie : les cellules T qui réagissent avec des Ag étrangers quittent le thymus et retournent dans la circulation lymphatique.

Thymus

Clone délété

Vers les ganglions lymphatiques FIGURE 23.9 Sélection et délétion des lymphocytes T. La sélection des lymphocytes T dans le thymus est un processus séquentiel. 1) Les cellules pré-T entrent dans le thymus et expriment des récepteurs des cellules T (TCR). 2) Les cellules T sont retenues en fonction de leur aptitude à reconnaître les molécules HLA. Celles qui ne le font pas peuvent être éliminées : c’est la sélection positive. 3) Certaines des cellules qui ont été sélectionnées positivement peuvent ensuite reconnaître les auto-antigènes (Ag) du thymus. Celles dont c’est le cas sont éliminées : c’est la sélection négative. 4) Les cellules qui résistent à la sélection positive et à la sélection négative quittent ensuite le thymus. Leurs TCR réagissent avec des Ag étrangers à l’extérieur du thymus.

secondaires par la liaison de leur TCR au complexe peptide-CMH (premier signal) et par la liaison entre la protéine B7 des CPA et la protéine CD28 des lymphocytes T (second signal). Sans second signal, les lymphocytes T sont anergisés dans les organes lymphoïdes secondaires. •

Décrivez les premier et second signaux que reçoit un lymphocyte T naif.

•

Quels sont les signaux nécessaires pour induire les fonctions d’un lymphocyte T activé ?

23.11 Cytokines et chimiokines m n Les communications intercellulaires nécessaires à l’activation du système immunitaire empruntent la voie des cytokines. Ces protéines sont produites par des leucocytes et assurent la régulation de beaucoup des fonctions des cellules immunitaires. Certaines d’entre elles ont des effets très larges, intervenant sur des cellules variées. Néanmoins, le point commun de toutes ces protéines hétérogènes est d’être produites par des leucocytes. On parle de



788 Chapitre 23


Lymphocyte TC effecteur

Lymphocyte TC naïf

Signal 1

Activation CD28 Signal 1 Signal 2

CMH

B7

TCR

CPA (a)

Lésion de la membrane apoptose, mort

TCR Récepteur de l’IL-1 Cellule TH IL-2

IL-1 Expansion clonale et mémoire

Lymphocyte B activé

IL-4

Récepteur pour l’IL-4

Récepteur pour l’IL-2 Expansion clonale

Différenciation

Plasmocyte

Pas d’activation

Signal 1

Aucun effet

N’importe quelle cellule (c)

Sécrétion de perforines et de granzymes

Lymphocyte TC anergisé

Lymphocyte TC naïf

CD4

HLA II

Cellule cible (b)

Macrophage

Production d’IgE

N’importe quelle cellule (d)

FIGURE 23.10 Il faut deux signaux pour activer un lymphocyte T naïf. (a) Le TCR d’une cellule TC naïve réagit avec le complexe peptides-CMH sur une CPA. C’est le signal n° 1. Cette cellule T C exprime également CD28, qui réagit avec B7 sur la CPA. C’est le signal n° 2. Ces deux signaux lancés par la CPA à la cellule T C entraînent l’activation de cette cellule naïve. (b) Ce lymphocyte TC activé devient capable de lyser n’importe quelle cellule cible, à la condition de recevoir le signal n° 1. (c) Le TCR d’une cellule TC naïve réagit avec le complexe peptide-CMH à la surface de n’importe quelle cellule. Cependant, le signal n° 2 ne se produit pas puisque les CPA sont les seules cellules pourvues de B7. (d) En l’absence du signal n° 2, la cellule T C est anergisée.

FIGURE 23.11 Production de cytokines et d’anticorps. Effets majeurs et interaction de l’IL-1, de l’IL-2 et de l’IL-4 avec la réponse en anticorps. Ces cytokines constituent des signaux pour les macrophages, les lymphocytes T et les lymphocytes B. Elles stimulent l’endocytose de l’antigène par les macrophages, ainsi que la prolifération et la différenciation des lymphocytes T et des lymphocytes B.

lymphokines quand elles sont sécrétées par des lymphocytes et d’interleukines quand elles assurent les communications entre des leucocytes. Idéalement, les cytokines sont sécrétées par une seule cellule et insèrent dans le récepteur qui leur est destiné à la surface d’une seule cellule cible. Certaines trouvent leur récepteur sur les cellules qui les ont produites, dans un mécanisme autocrine. L’insertion d’une cytokine dans son récepteur lance généralement une séquence transductionnelle (voir section 8.12) pour relayer l’information qui est parvenue à travers la membrane jusqu’au contrôle d’activité comme la synthèse des protéines ou la division des cellules. Les signaux ultimes aboutissent à la croissance cellulaire, la différenciation et la prolifération clonale. Au total, on ne connaît que quarante cytokines (voir tableau 23.2), la plupart d’entre elles étant produites par des lymphocytes TH, des monocytes ou des macrophages.

IL-1, IL-2 et IL-4 En plus de la phagocytose, de l’apprêtement et de la présentation de l’Ag, les macrophages sécrètent l’IL-1, qui agit sur plusieurs types cellulaires (voir tableau 23.2 et figure 23.11). Celle-ci est une actrice essentielle de la réponse immunitaire puisqu’elle active les lymphocytes TH. En raison de leur proximité avec les macrophages dans les ganglions, les lymphocytes TH2 ont toutes les chances d’être activés. L’insertion de l’IL-1 dans ses récepteurs sur les TH2 constitue, en ellemême, un signal d’activation. À leur tour, les cellules TH2 produisent de l’IL-2, qui se lie à ses récepteurs sur les lymphocytes TH2. Sous son influence, la cellule se multiplie jusqu’à former un clone. Il y a aussi l’IL-4, qui se fixe à son récepteur sur les lymphocytes B. Cette association de l’IL-4 stimule la cellule B, qui se différencie en plasmocytes (voir section 22.10). Ainsi, IL-1, IL-2 et IL-4 sont des médiateurs activant les macrophages, les cellules T et les cellules B.



23.11 Cytokines et chimiokines 789

TABLEAU 23.2 Cytokine a

PROPRIÉTÉS DES CYTOKINES ET DES CHIMIOKINES MAJEURES Cellules productrices

Cibles majeures

Effets

IL-1

Monocytes

TH1

Activation

IL-2

Cellules T activées

Cellules T

Croissance, différenciation

IL-3

TH1

Cellules souches hématopoïétiques

Facteur de croissance

IL-4

TH2

Cellules B

Synthèse d’IgG1 et d’gE

IL-5

TH2

Cellules B

Synthèse d’IgA

IL-10

TH2

IL-12

Macrophages, cellules dendritiques

Cellules NK

Différenciation, action

IFN-αb

Leucocytes

Cellules normales

Antivirale

IFN-γ

TH1

Macrophages

Activation

GM-CSFc

TH1

Cellules souches myéloïdes

Différenciation en granulocytes et en monocytes

TGF-βd

TH1 et TH2

Macrophages

Inhibition de l’activation

TNF-αe

TH1, macrophages, cellules NK

Macrophages

Activation

TNF-β

TH1

Macrophages

Activation

Macrophages, fibroblastes, kératinocytes

Neutrophiles, cellules T

Attraction et activation

Macrophages, fibroblastes, kératinocytes

Macrophages, cellules T

Inhibition des TH1

Chimiokines IL-8 f

MCP-1 a

IL, interleukine ; b IFN, interféron ; c GM-CSF, granulocyte, monocyte-colony stimulating factor ; factor ; f MCP, macrophage chemoattractant protein.

Les autres cytokines Beaucoup de cytokines (voir tableau 23.2) agissent sur les cellules de l’immunité spécifique. Par exemple, l’IL-4 agit surtout sur les cellules T. Cependant, il y en a qui n’agissent ni sur les T ni sur les B, mais sur des cellules impliquées dans la réponse immunitaire innée. Par exemple, les IFN α et γ viennent des leucocytes et bloquent la réplication virale. Les TNF-α et β peuvent tuer nombre de cellules tumorales si les cellules qui les produisent ont accès à la tumeur. Le TNF-α est également décisif dans le cours de l’activation (voir section 22.3). Ni les IFN, ni les TNF n’ont de cellules cibles qui leur soient spécifiques. Étant sécrétés par des cellules T et par des phagocytes, ils amplifient l’effet des cellules qui les ont produits.

Les chimiokines Les chimiokines sont un groupe de petites protéines attirant les phagocytes et les lymphocytes T. Elles proviennent des lymphocytes et d’une grande variété d’autres cellules en réponse à des produits bactériens ou viraux et à d’autres agents susceptibles d’endommager les cellules de l’hôte. Les chimiokines stimulent la réponse inflammatoire et augmentent la réponse immunitaire spécifique. On connaît environ quarante chimiokines (voir tableau 23.2). Les plus connues sont l’IL-8 et le macrophage chemoattractant protein-1 (MCP-1). La première provient de nombreuses cellules, parmi lesquelles les monocytes, les macrophages, les fibroblastes du tissu conjonctif et les kératinocytes de la peau. Elle est sécrétée par les cellules lésées et agit sur les tissus limitrophes comme chimio-attractifs pour les lymphocytes B et les neutrophiles (voir section 22.1). En résulte une inflammation médiée par les neutrophiles, puis une réponse immunitaire spécifique médiée

d

Attraction et activation TGF, T-cell growth factor ;

e

TNF, tumor necrosis

par les lymphocytes T. L’engagement des récepteurs des chimiokines comme celui des récepteurs des cytokines transduit un signal à l’intérieur de la cellule (voir section 8.12), ce qui active les phagocytes et les lymphocytes T qui en sont la cible. Le MCP-1 est produit par nombre de cellules. Attirant macrophages et lymphocytes T, il favorise la production de médiateurs pro-inflammatoires et le développement d’une réponse immunitaire spécifique de l’Ag. Ce sont donc de puissants initiateurs des réactions inflammatoires non spécifiques et d’efficaces recruteurs de cellules T des réactions immunitaires spécifiques de l’Ag.

Contrôlez vos acquis Les cytokines sont des médiatrices solubles produites par des leucocytes qui régissent les interactions entre les cellules. Plusieurs d’entre elles, IL-1, IL-2 et IL-4, agissent sur les leucocytes et sont ainsi décisives pour les réponses immunitaires spécifiques. D’autres, l’IFN et le TNF, affectent une large variété de cellules. Les chimiokines proviennent de nombreuses cellules en réponse à une agression immunitaire et sont des attractifs puissants pour les cellules de l’immunité spécifique et pour celles de l’immunité non spécifique. •

Quelles sont les cellules cibles de l’IL-1, l’IL-4, l’IL-12, l’IFN-γ et le TNF-β ?

•

Quelles sont les différences de cellules sources et de cellules cibles entre les cytokines et les chimiokines ?

•

Comment sont stimulées la production d’une cytokine et celle d’une chimiokine ?



790 Chapitre 23


QUESTIONS 1. Définissez les PRM et les PAMPs qui leur sont associés (voir section 23.1). 2. Sur quels critères assigne-t-on un gène et sa protéine à la superfamille des Ig (voir section 23.2) ? 3. Quels sont les facteurs structurels majeurs des molécules HLAI et HLA-II (voir section 23.3) ? 4. Le polymorphisme suggère que chaque molécule du CMH a l’exclusivité d’un motif peptidique. En ce qui concerne les molécules HLA-I, combien de protéines différentes peuvent êtres exprimées chez un individu ? Combien peuvent être exprimées par la population humaine dans son entier (voir section 23.4) ? 5. Quelles sont les chaînes utilisées pour constituer un site de liaison complet à l’Ag dans une molécule d’Ig ? Quels sont les domaines CDR (voir section 23.5) ? 6. Calculez le nombre total de domaines VH et VL obtenus à partir des gènes d’Ig disponibles chez l’homme. Combien de molécules complètes d’Ig peuvent être produites par réarrangement des

gènes des chaînes lourdes et des chaînes légères (voir section 23.6) ? 7. Décrivez l’interaction entre un TCR et un complexe peptideCMH. Situez les CDR au sein du TCR (voir section 23.7). 8. La diversité des TCR résulte de recombinaisons analogues à celles qui se déroulent entre les gènes des Ig. Une diversité supplémentaire résulte de l’addition de nucléotides N-terminaux et de la possibilité de lire le segment génétique D dans trois cadres de lecture. Expliquez comment fonctionnent ces mécanismes de diversification (voir section 23.8). 9. Expliquez les sélections positives et négatives des lymphocytes T (voir section 23.9). 10. Les interactions moléculaires sont-elles nécessaires à l’activation de lymphocytes T naïfs ? à l’activation de cellules effectrices (voir section 23.10) ? 11. Quels sont les principaux effets des cytokines et des chimiokines ? Quelles sont les principales différences entre ces deux catégories de substances solubles (voir section 23.11).

PROBLÈMES 1. Quelles sont les conséquences d’une mutation génétique qui élimine un PRM ? Est-ce vrai pour tous les PRM ? 2. Dressez le tableau des caractéristiques communes à toutes les protéines codées par des gènes de la superfamille des Ig. Pour les Ig des TCR et les protéines du CMH, décrivez les structures qui partagent ces facteurs. 3. Par polymorphisme, on entend que chaque molécule HLA a l’exclusivité d’un seul peptide. Cependant, les molécules HLA de classe I ne reconnaissent que 6 motifs peptidiques à l’échelle d’un individu et 350 à l’échelle de la population humaine. Quels sont les avantages de cette diversité pour la population humaine ? Quels sont les avantages pour l’individu ?

4. Les réarrangements génétiques sont importants pour assurer une diversité satisfaisante des sites de liaison à l’Ag des Ig. Mais les événements somatiques sont peut-être plus importants encore dans l’avènement de cette diversité. Êtes-vous d’accord avec cette assertion ? Expliquez pourquoi. 5. Comment serait le répertoire des lymphocytes T en l’absence de sélection positive ? Comment serait-il en l’absence de sélection négative ? 6. Quels sont les résultats de l’activation de tous les lymphocytes T qui se lient à l’Ag ? De quelle manière le deuxième signal empêche-t-il cette activation générale de se dérouler ?



I

Méthodes diagnostiques fondées sur la croissance bactérienne

24.1

Isolement des agents pathogènes à partir des échantillons cliniques 792 Méthodes d’identification basées sur les caractéristiques de croissance 798 Étude de la résistance aux antimicrobiens 800 Sécurité dans les laboratoires de microbiologie 803

24.2 24.3 24.4

II

Méthodes immunologiques et de diagnostic clinique

805

24.5

Des précautions doivent être prises pour protéger le personnel des laboratoires des infections. La photographie représente un biologiste travaillant dans un laboratoire de confinement de niveau 4 (NSB4, P4), et manipulant un pathogène mortel pour l’homme.

Immunoanalyses pour le diagnostic des maladies infectieuses 24.6 Anticorps polyclonaux et monoclonaux 24.7 Réactions antigène-anticorps in vitro : sérologie 24.8 Agglutination 24.9 Anticorps fluorescents 24.10 Tests immunoenzymatiques (ELISA) et dosages radio-immunologiques (RIA) 24.11 Procédés d’Immunoblot

792

CHAPITRE VINGT-QUATRE

Diagnostic microbiologique et immunologique

III

Méthodes de diagnostic moléculaire et de diagnostic virologique

24.12 Méthodes moléculaires 24.13 Diagnostic virologique

805 808 810 812 814 817 821

822 822 826



792 Chapitre 24


GLOSSAIRE Agglutination (agglutination) Réaction entre un anticorps et un antigène particulaire résultant en un agglutinat visible de particules. Antibiogramme (antibiogram) Test qui permet de déterminer la sensibilité d’une souche bactérienne aux antibiotiques habituellement actifs contre celle-ci. Anticorps fluorescent (fluorescent antibody) Modification covalente d’une molécule d’anticorps avec un marqueur fluorescent ; le marqueur permet de visualiser sous lumière fluorescente l’anticorps fixé. Anticorps monoclonal (monoclonal antibody) Anticorps de structure uniforme et spécifique fabriqué à partir d’un clone unique de cellule B. Anticorps polyclonal (polyclonal antibodies) Mélange d’anticorps fabriqués par différents clones de cellules B. Bactériémie (bacteremia) Voir chapitre 21. Culture d’enrichissement (enrichment culture) Voir chapitre 1. Test ELISA Test immunoenzymatique utilisant des anticorps spécifiques pour détecter des antigènes ou des anticorps dans un liquide de l’organisme. Les complexes formés sont détectés grâce à l’enzyme couplée à l’anticorps. L’addition du substrat de l’enzyme au complexe enzyme-anticorps-antigène résulte en un produit coloré. Immunoblot ou Western blot (Immunoblot – Western blot) Electrophorèse de protéines suivie d’un transfert sur une membrane filtrante, les protéines immobilisées sur la membrane sont détectées par l’addition d’anticorps spécifiques de ces protéines. À différencier du Southern blot (ADN) et du Northern blot (ARN). Milieu différentiel (differential media) Milieu de culture contribuant à l’identification des bactéries grâce à la mise en évidence de certaines caractéristiques phénotypiques.

L

es microbiologistes interviennent dans l’identification des agents responsables des maladies infectieuses. Les laboratoires de microbiologie médicale procèdent à la culture, à l’isolement et à l’identification de la plupart des agents pathogènes dans les quarante-huit heures suivant le prélèvement. Les méthodes immunologiques et moléculaires sont également des méthodes de diagnostic microbiologique. Comme elles ne nécessitent pas la culture de l’agent pathogène, elles sont particulièrement adaptées au diagnostic des infections virales et parasitaires.

I

MÉTHODES DIAGNOSTIQUES FONDÉES SUR LA CROISSANCE BACTÉRIENNE

Les méthodes diagnostiques établies sur les caractéristiques culturales sont très importantes pour l’identification de la plupart des micro-organismes pathogènes.

24.1 Isolement des agents pathogènes m n à partir des échantillons cliniques En cas de suspicion d’infection chez un patient, des échantillons biologiques sont prélevés et adressés au laboratoire de

Milieu enrichi (enrichment culture) Milieu contenant des facteurs de croissance spécifiques permettant la culture des bactéries exigeantes. Milieu non sélectif (general purpose media) Milieu permettant la culture de la plupart des bactéries aérobies et anaérobies facultatives. Milieu sélectif (selective media) Milieu qui permet l’enrichissement sélectif de certaines bactéries en favorisant leur croissance au détriment d’autres bactéries grâce à l’addition de composé(s) spécifique(s) dans le milieu. Neutralisation (neutralization) Interaction d’un anticorps avec un antigène, la réaction réduit ou bloque l’activité biologique de l’antigène. Précipitation (precipitation) Réaction entre un anticorps et un antigène soluble résultant en un complexe visible insoluble. RIA (radioimmunoassay) Test radio-immunologique utilisant un anticorps ou un antigène radioactif pour la détection d’une liaison à un antigène ou à un anticorps respectif. Sensibilité (sensitivity) Quantité minimale d’antigène pouvant être détectée dans un test immunodiagnostique. Sepsis (sepsis) Bactériémie associée à un syndrome de réponse inflammatoire systémique présentant au moins deux signes de gravité, comme la température corporelle (inférieure à 36 °C ou supérieure à 38,3 °C), les pulsations cardiaques (supérieures à 90 battements par minute) ou la fréquence respiratoire. Sérologie (serology) Étude in vitro des réactions antigène-anticorps. Spécificité (specificity) Lors de la réponse immune ou d’un test immunologique, capacité d’un anticorps à reconnaître un antigène unique. Titre (titer) Dans un contexte immunologique, quantité d’anticorps présents en solution.

microbiologie pour analyses microbiologique et/ou immunologique, et/ou moléculaire (voir figure 24.1). Les échantillons peuvent être de toutes sortes : sang, urine, fèces, crachat, liquide céphalo-rachidien ou pus prélevé à partir d’une plaie par exemple. Un écouvillon stérile peut servir pour prélever le site infecté (voir figure 24.2). Cet écouvillon est ensuite déchargé à la surface d’une gélose et/ou dans un milieu de culture liquide ; ce milieu est ensuite incubé. Des biopsies tissulaires peuvent être également prélevées et mises en culture de la même manière. Le tableau 24.1 résume les recommandations à suivre pour la primoculture des échantillons cliniques les plus courants. Une fois le micro-organisme isolé et identifié, le clinicien doit s’assurer de sa réelle mise en cause dans la maladie infectieuse diagnostiquée. C’est pour cela que les conditions de réalisation des prélèvements sont primordiales. Les risques de contamination doivent être évités au maximum, notamment par la réalisation de l’asepsie. De plus, les conditions de prélèvements doivent permettre d’optimiser l’inoculum prélevé. Enfin, certaines précautions sont indispensables par rapport aux exigences culturales des micro-organismes, comme le maintien de l’anaérobiose pour les bactéries anaérobies strictes. Une fois prélevés, les échantillons doivent être mis en culture le plus rapidement possible.



24.1 Isolement des agents pathogènes à partir des échantillons cliniques 793

Patient (pathologie infectieuse suspectée)

Démarche immunologique

Démarche microbiologique

Échantillon de sang Recherche d’anticorps dirigés contre l’agent infectieux suspecté

Sang Fèces Urine Biopsie tissulaire Prélèvement de mucosités Microbiologie conventionnelle

Dosage des anticorps (agglutination, RIA, ELISA, etc.)

Approche moléculaire

Culture, milieux d’enrichissement, sélectifs et différentiels

Culture pure Isolement

Méthodes immunologiques (recherche des particules virales ou des cellules bactériennes) Anticorps fluorescents ELISA

Identification Tests métaboliques Identification immunologique Identification moléculaire

Méthodes moléculaires (recherche du génome viral ou bactérien) Hybridation des acides nucléiques PCR

Tests de sensibilité aux antibiotiques (choix d’une antibiothérapie adaptée)

FIGURE 24.1 Isolement et identification des pathogènes. Démarche diagnostique pour l’isolement et l’identification des pathogènes infectieux.

(a)

(b)

(c)

FIGURE 24.2 Méthodes de prélèvement du tractus respiratoire supérieur. (a) Écouvillonnage pharyngé. (b) Écouvillonnage nasopharyngé. (c) Écouvillonnage des fosses nasales.

Les milieux de culture La culture d’enrichissement, grâce au choix des milieux de culture et des conditions d’incubation appliquées pour l’isolement des micro-organismes à partir des échantillons biologiques (voir section 18.1), constitue une part importante de la microbiologie médicale. La plupart des micro-organismes importants en clinique peuvent être cultivés, donc isolés et identifiés, et cela grâce à la grande variété des milieux de culture existants. La plupart des échantillons cliniques sont d’abord cultivés sur des milieux non sélectifs, comme les géloses au sang (voir figure 21.18 et tableau 24.1) qui permettent la croissance de la plupart des organismes aérobies et anaérobies facultatifs. L’utilisation des milieux d’enrichissement, qui contiennent des facteurs permettant la croissance des microorganismes exigeants, est souvent nécessaire ; c’est par exemple le cas pour l’isolement de Neisseria gonorrhoeae, agent responsable de l’urétrite gonococcique (voir tableau 24.1). Certains milieux sont dits sélectifs car ils permettent, grâce à l’addition de composés dans le milieu, de favoriser la croissance de certains micro-organismes, tout en inhibant la croissance d’autres micro-organismes (voir tableau 24.1). Enfin, les milieux différentiels sont des milieux spécialisés qui permettent l’identification des micro-organismes à partir des caractéristiques culturales révélées sur ces milieux (voir figure 24.7).

Le sang La bactériémie correspond à la présence de bactéries dans le sang (voir section 21.7). Ce phénomène est rare chez l’individu sain, arrivent occasionnellement et de manière transitoire en réponse à des actes invasifs, lors de soins dentaires ou lors de traumatismes. La présence prolongée de bactéries dans le sang est généralement indicatrice d’infection systémique. Les bactéries les plus fréquemment retrouvées dans le sang sont les entérobactéries, notamment Escherichia coli ou Klebsiella pneumoniae, les cocci Gram positif comme Staphylococcus aureus et Streptococcus pyogenes, et le bacille Gram négatif Pseudomonas aeruginosa. La septicémie ou sepsis est une infection générale grave de l’organisme qui résulte de l’association d’une bactériémie et d’un syndrome de réponse inflammatoire systémique. Les signes cliniques sont souvent une hyperthermie accompagnée de frissons et d’accélération du rythme respiratoire. Les formes les plus graves sont le sepsis sévère (sepsis avec dysfonctionnement aigu d’un ou plusieurs organes vitaux comme les reins, le cœur ou les poumons) et le choc septique, caractérisé par une hypotension artérielle majeure. Les hémocultures sont le seul moyen d’isoler et d’identifier l’agent causal ; le diagnostic et le traitement dépendent alors de la bonne réalisation des cultures du sang. La procédure standard de culture du sang, appelée hémoculture, consiste à prélever aseptiquement 20 mL de sang veineux et à les injecter dans deux flacons, dits d’hémoculture, qui contiennent à la fois des anticoagulants et du milieu de culture conventionnel. Un des flacons est incubé en aérobiose, l’autre en anaérobiose. L’incubation se fait à 35 °C et la lecture des flacons se fait plusieurs fois par heure pendant au moins cinq jours, ceci le plus souvent grâce à des systèmes automatisés. La majorité des micro-organismes ayant une réelle signification clinique sont détectés dans les deux



794 Chapitre 24

TABLEAU 24.1


MILIEUX D’ENRICHISSEMENT ET MILIEUX SÉLECTIFS RECOMMANDÉS POUR L’ISOLEMENT EN PRIMOCULTURE DES BACTÉRIES PATHOGÈNES Milieua

Échantillon

GS

ME

CA

MTM

ANA

Liquides de ponction (articulaire, péricardique, péritonéal, pleural)

+

+

+

–

+

Selles ou écouvillonnages rectaux

+

+

+

–

–

Biopsies

+

+

–

–

+

Prélèvements respiratoires (pharyngé, bronchique), ganglions

+

+

+

–

–

Urètre, endocol, prélèvement vaginal

+

+

+

+

–

Urine

+

+

–

–

–

Sangc

+

+

+

–

+

Plaies, abcès, exsudats

+

+

+

–

+

b

Source : Adapté de Murray, P. R., E. J. Baron, J. H. Jorgenson, M. A. Pfaller et R. H. Yolken. 2003. Manual of Clinical Microbiology, 8e édition, American Society for Microbiology, Washington, DC. a GS, gélose au sang (5 % de sang de mouton ajouté au milieu agar) ; ME, milieu pour entérobactéries : milieu EMB (éosine et bleu de méthylène) ou gélose MacConkey ; CA, gélose chocolat (sang cuit) ; MTM, milieu modifié de Thayer-Martin ; ANA, milieu anaérobie, gélose au sang contenant du thioglycolate ou gélose au thioglycolate enrichie en facteurs et incubée en anaérobiose. b Le milieu SMAC (gélose MacConkey au sorbitol) est utilisé pour la culture de selles ou les écouvillonnages rectaux. La gélose SMAC est un milieu sélectif et différentiel utilisé pour l’isolement et l’identification des bactéries entéropathogènes sorbitol –négatif telles qu’Escherichia coli O157:H7. c Le sang est cultivé initialement dans un bouillon (hémoculture). En cas de culture positive et en fonction de l’examen direct à la coloration de Gram, des subcultures sont réalisées sur différents milieux ; par exemple, en plus des milieux non sélectifs, pour les bacilles Gram négatif, une gélose Mac Conkey est ensemencée en plus.

premiers jours, alors que d’autres, plus exigeants, le sont entre le troisième et le cinquième jour d’incubation. Certains systèmes d’hémoculture emploient des agents chimiques lysant les globules rouges et les globules blancs de manière à libérer les pathogènes intracellulaires. Des indicateurs de croissance détectent les microorganismes présents dans les flacons d’hémoculture, puis l’observation microscopique et la réalisation de subcultures les identifient. Les automates d’hémoculture détectent la croissance microbienne par l’augmentation de la production de dioxyde de carbone ou par turbidimétrie, une lecture étant réalisée toutes les dix minutes. Sur l’ensemble des prélèvements de sang, un taux de contamination, incompressible, est attendu ; celui-ci est de l’ordre de 2 à 3 %. Les contaminants les plus courants appartiennent à la flore cutanée normale, comme Staphylococcus epidermidis, Propionibacterium acnes ou les bactéries corynéformes. Cependant, ces contaminants sont aussi occasionnellement responsables d’infections touchant le système cardiaque (endocardite bactérienne subaiguë) ou peuvent coloniser des dispositifs intravasculaires tels que les valves cardiaques artificielles. C’est pourquoi, la validation clinico-microbiologique est indispensable pour une bonne interprétation des résultats d’hémoculture.

Les urines Les infections du tractus urinaire sont très fréquentes, notamment chez les femmes. Sachant que les agents impliqués dans ce type d’infection proviennent le plus souvent de la flore digestive normale (Escherichia coli par exemple), l’analyse cyto-bactériologique des urines requiert de grandes précautions. Dans la plupart des cas, l’infection des voies urinaires se fait par voie ascendante après colonisation progressive de l’urètre jusqu’à l’infection de la vessie. Les infections urinaires sont aussi la première cause d’infections nosocomiales (acquises à l’hôpital) [voir section 25.7].

Une infection urinaire significative implique en général au moins 105 bactéries par millilitre d’urines recueillies en milieu de jet après lavage soigneux de la sphère génitale externe. En l’absence d’infection, une contamination du prélèvement apporte moins de 103 bactéries par millilitre. Les agents pathogènes urinaires les plus courants sont des entérobactéries, avec notamment E. coli, qui compte pour plus de 90 % des cas. Les autres bactéries habituellement retrouvées sont Klebsiella, Enterobacter, Proteus, Pseudomonas, Staphylococcus saprophyticus et Enterococcus faecalis. Neisseria gonorrhoeae, agent de l’urétrite gonococcique, ne se développe pas dans l’urine en elle-même, mais sur l’épithélium urétral et est diagnostiqué par d’autres méthodes (voir ci-après). Un examen microscopique direct des urines permet de dépister la présence anormale de bactéries, c’est-à-dire une bactériurie. Cependant, cette bactériurie est plus communément dépistée au moyen de bandelettes urinaires qui testent certains paramètres témoins de la croissance bactérienne et de l’infection (voir figure 24.3). Ainsi, la détection des entérobactéries peut être objectivée par la mise en évidence de nitrites (activité nitrate réductase propre aux entérobactéries) dans l’urine, cette réaction n’étant positive qu’au-delà d’un certain seuil (> 105 par millilitre), ce qui permet ainsi l’utilisation de ce test comme un moyen simple de dépistage des infections urinaires. Sur les bandelettes urinaires, d’autres tests sont associés : détection de l’activité estérase (des leucocytes – voir section 22.1), et de l’activité peroxydase (présente chez une grande variété de bactéries – voir sections 6.15 et 17.22). Une mise en culture de l’urine doit suivre une bandelette urinaire positive. En cas de bactériurie, une coloration de Gram (voir section 4.1) peut être réalisée directement à partir des échantillons urinaires, de manière à identifier les caractéristiques morphologiques des pathogènes. Sont retrouvés entre autres, des bacilles Gram négatif



John Martinko et Cheryl Broadie


(entérobactéries – voir section 12.11), des cocci Gram négatif (Neisseria – voir section 12.10) ou des cocci Gram positif (Staphylococcus, Enterococcus – voir section 12.19). La coloration de Gram ou d’autres méthodes de coloration sont souvent utiles pour la détection des bactéries directement dans les échantillons biologiques ; c’est par exemple le cas pour le liquide céphalo-rachidien prélevé en cas de suspicion de méningite (voir section 26.5). Pour la culture des échantillons urinaires, on utilise deux types de milieux : 1) géloses au sang non sélectives et 2) milieux sélectifs pour les entérobactéries, comme le milieu Mac Conkey ou le milieu à l’éosine et au bleu de méthylène (milieu EMB) [voir section 24.2 et figure 24.4]. Ces derniers milieux permettent la différenciation initiale entre les souches d’entérobactéries fermentant le lactose et celles ne le fermentant pas, tout en inhibant la croissance des bactéries Gram positif telles que Staphylococcus spp. (contaminant cutané classique). Avec l’expérience, une identification présomptive de la bactérie, fondée sur la couleur et la morphologie des colonies obtenues sur les milieux (décrits au tableau 24.2), est possible. Une telle identification doit être étayée par des tests complémentaires, et le diagnostic microbiologique doit être la conjonction cohérente de tous les tests réalisés. La culture d’urine peut être quantitative par comptage des colonies retrouvées sur les milieux ensemencés après inoculation d’un volume urinaire calibré, généralement à 1 µL. Finalement, si aucune culture bactérienne n’est obtenue malgré des signes urinaires fonctionnels persistants, il faut envisager la recherche de bactéries de croissance difficile comme Neisseria gonorrhoeae, de bactéries intracellulaires comme Chlamydia trachomatis, de bactéries de croissance lente comme Mycobacterium tuberculosis, ou enfin de bactéries anaérobies.

Les fèces Un recueil et une conservation appropriés des fèces sont importants pour l’isolement des pathogènes intestinaux. Durant la conservation, l’acidité fécale augmente si bien que le délai entre le


FIGURE 24.3 Bandelette urinaire pour l’analyse d’urine. La bandelette de contrôle est située sous la bandelette test. De gauche à droite sur la bandelette sont testés le glucose, la bilirubine, les cétones, la densité, le sang, le pH, les protéines, l’urobilinogène, les nitrites et les leucocytes (mesure de l’activité estérase) présents ou non dans l’échantillon d’urine. Sur la bandelette test, la détection d’une activité estérase anormale (test positif faible, à l’extrême droite) et la présence de nitrites (test fortement positif, deuxième en partant de la droite) indique une bactériurie. La culture de cet échantillon d’urine a confirmé le dépistage de la bandelette urinaire en montrant la présence d’Escherichia coli.

FIGURE 24.4 Gélose éosine bleu de méthylène (EMB). La gélose permet de différencier les bactéries fermentant le lactose et/ou le saccharose, comme Escherichia coli (à gauche), et des bactéries non fermentatives, comme Pseudomonas aeruginosa (à droite). Notez le reflet métallique pris par les colonies d’Escherichia coli sur ce milieu.

recueil de l’échantillon et la mise en route de l’analyse bactériologique doit être le plus court possible. Ceci est particulièrement important pour l’isolement de Shigella et Salmonella, deux genres sensibles aux pH acides. Les selles fraîchement émises sont placées dans un pot (contenant éventuellement un tampon phosphate destiné à contrecarrer l’acidification) adapté au transport jusqu’au laboratoire. Les selles hémorragiques ou glaireuses (pus) et les selles de patients suspects d’infections alimentaires ou liées à la consommation d’eau impropre sont ensemencées sur différents milieux sélectifs (voir section 24.2) adaptés à l’isolement de bactéries spécifiques. Les parasites intestinaux sont identifiés par l’observation microscopique des kystes ou par la détection d’antigènes (voir section 24.5 à 24.11). De nombreux laboratoires utilisent également des milieux différentiels et spécifiques, avec des conditions d’incubation adaptées à l’identification d’Escherichia coli O157:H7 et de Campylobacter, deux bactéries pathogènes intestinales majeures transmises généralement par les aliments et l’eau contaminés (voir sections 29.8 et 29.9).

Les plaies et abcès Les infections survenant sur des plaies traumatiques à la suite de morsures humaines ou animales, de brûlures, de coupures ou de la pénétration de corps étrangers, doivent être documentées par des échantillonnages soigneusement réalisés ; l’interprétation des résultats obtenus exige des précautions. En effet, la flore locale colonise souvent les plaies et les abcès, et les écouvillonnages de telles lésions sont fréquemment souillés. Pour les abcès et autres types de lésions purulentes, la meilleure méthode de prélèvement est l’aspiration à l’aide d’une seringue et d’une aiguille stériles après désinfection



796 Chapitre 24

TABLEAU 24.2


CARACTÉRISTIQUES DES COLONIES DES BACILLES GRAM NÉGATIF FRÉQUEMMENT ISOLÉS DES MILIEUX ENSEMENCÉS EN BACTÉRIOLOGIE MÉDICALE

Gélosea Bactérie

EMB

MC

SS

BS

HE

Escherichia coli

Centre noir et reflet vert métallique (voir figure 24.4)

Rouge ou rose

Rouge ou rose

Inhibée le plus souvent

Jaune-rose

Enterobacter

Proche d’E. coli, mais colonie plus large

Rouge ou rose

Blanche ou beige avec un reflet argent

Mucoïde,

Jaune-rose

Klebsiella

Large, mucoïde, marron

Rose

Rouge à rose


Jaune-rose

Proteus

Translucide, non colorée


Centre noir, bord clair

Verte

Claire

Pseudomonas

Translucide, non colorée à dorée (voir figure 24.4)



Pas de croissance

Claire

Salmonella

Translucide, non colorée à dorée


Opaque

Noire à vert foncé

Verte ou translucide à centre noir

Shigella



Opaque

Marron ou inhibée

Verte ou translucide

Source : Adapté de Murray, P. R., E. J. Baron, J. H. Jorgenson, M. A. Pfaller et R. H. Yolken. 2003. Manual of Clinical Microbiology, 8e édition, American Society for Microbiology, Washington, DC. a EMB, gélose éosine bleu de méthylène ; MC, gélose MacConkey ; SS, gélose Salmonella-Shigella ; BS, gélose au sulfate de bismuth ; HE, gélose Hektoen.

préalable de la peau. Les lésions purulentes profondes sont prélevées chirurgicalement par la réalisation de biopsie(s). Une grande variété de pathogènes est associée à ce type de lésions purulentes, parmi lesquels figurent de nombreuses bactéries anaérobies. Les conditions de prélèvements, de transport et de culture en aérobiose et en anaérobiose sont donc primordiales pour une bonne évaluation microbiologique de ce type d’infection. Les pathogènes que révèlent fréquemment les prélèvements de pus sont des entérobactéries, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, et des bactéries anaérobies comme Bacteroides et Clostridium. Les milieux habituellement utilisés sont les géloses au sang, les milieux spécifiques des entérobactéries (voir tableaux 24.1 et 24.2) et des milieux au sang additionnés de composés spécifiques et d’agents réducteurs nécessaires à l’isolement des bactéries anaérobies strictes. Une coloration de Gram permet d’observer de tels échantillons directement au microscope.

Prélèvements génitaux et diagnostic microbiologique des infections sexuellement transmissibles dues à Neisseria gonorrhoeae Chez les hommes, l’écoulement urétral purulent est le symptôme classique de l’infection sexuellement transmissible (IST) appelée urétrite gonococcique ou gonorrhée (voir section 26.12). En l’absence d’écoulement urétral, un prélèvement est réalisé à l’aide d’un écouvillon stérile fin inséré dans la partie antérieure de l’urètre et ensemencé le plus rapidement possible sur un milieu adapté à la culture de Neisseria gonorrhoeae. De manière alternative, un recueil des premières urines du matin est possible pour la recherche de ce pathogène. Chez les femmes, devant la suspicion

d’IST, il est nécessaire de réaliser à la fois un prélèvement du col utérin et de l’urètre. La mise en œuvre des procédures adaptées est décisive pour le diagnostic microbiologique d’infection à N. gonorrhoeae. N. gonorrhoeae (ou gonocoque) colonise les muqueuses urétrales, du col utérin, de l’anus, de la gorge et des conjonctives. Cette bactérie est sensible à la dessiccation et se transmet ainsi presque exclusivement par contact direct entre personnes, habituellement au cours de relations sexuelles. Les mesures de santé publique pour contrôler les cas de gonococcie passent par l’identification des porteurs asymptomatiques, ce qui nécessite le recours à des analyses microbiologiques. N. gonorrhoeae se présente comme un diplocoque Gram négatif, parfois pléiomorphe. Aucun autre micro-organisme similaire morphologiquement ne se retrouve dans la flore du tractus urogénital. Ainsi, l’examen direct d’un frottis vaginal ou cervical montrant après coloration de Gram des diplocoques Gram négatif est en faveur d’une urétrite gonococcique. Dans un tel cas, l’examen microscopique des sécrétions purulentes montre fréquemment des diplocoques Gram négatif phagocytés par les neutrophiles (voir section 22.2 et figure 24.5a). Certains laboratoires analysant les échantillons génito-urinaires pour la recherche de N. gonorrhoeae (et de Chlamydia trachomatis – voir section 26.13) utilisent des sondes nucléiques ou l’amplification par PCR (voir section 24.12). Cependant, les échantillons provenant des sites extragénitaux, comme les yeux ou le rectum, doivent être quand même mis en culture. Les milieux non sélectifs d’enrichissement de N. gonorrhoeae contiennent du sang cuit et sont appelés géloses « chocolat » en raison de leur couleur marron foncé. Le sang cuit interagit avec les composants du milieu et absorbe les composés normalement




Leon J. LeBeau

Theodor Rosebury

Cellules de N. gonorrhoeae

(b)

(a)

FIGURE 24.5 Identification de Neisseria gonorrhoeae. (a) Formes intracellulaires de Neisseria gonorrhoeae (situées à l’intérieur de polynucléaires humains) retrouvées dans des sérosités urétrales. Notez l’arrangement en diplocoques (indiqué par les flèches). (b) Culture de Neisseria gonorrhoeae sur un milieu de Thayer et Martin. Un réactif, déposé au milieu de la boîte de Petri, a fait virer les bactéries en bleu, signe qu’elles possèdent un cytochrome c (test de l’oxydase). Neisseria gonorrhoeae est donc positive pour l’oxydase.

toxiques pour N. gonorrhoeae. Un des milieux sélectifs utilisés pour la primoculture est le milieu modifié de Thayer et Martin (MTM) [voir figure 24.5]. Ce milieu contient de la vancomycine, de la nystatine, du triméthoprime et de la colistine ; ces quatre antibiotiques inhibent la croissance des bactéries de la flore normale, mais pas celle de N. gonorrhoeae ou de N. meningitidis (agent de méningite bactérienne – voir section 26.6). Les milieux inoculés sont incubés à 37 °C en atmosphère aérobie humide contenant entre 3 et 7 % de CO2, nécessaire à la croissance du gonocoque. Les boîtes de Petri sont examinées après 24 à 48 heures de culture et testées pour la recherche de l’oxydase, car toutes les espèces de Neisseria sont oxydase positif (voir figure 24.5b et section 24.2). L’identification définitive nécessite la détermination d’un panel complémentaire de tests phénotypiques (utilisation des sucres) et/ou des tests immunologiques ou moléculaires (voir sections 24.5 à 24.12).

Les cultures des bactéries anaérobies Les bactéries anaérobies strictes sont des causes fréquentes d’infection. L’isolement et l’identification des pathogènes anaérobies nécessitent des méthodes de culture et d’isolement spécifiques. En général, les milieux pour les anaérobies ne diffèrent pas énormément de ceux utilisés pour les bactéries aérobies, excepté : 1) qu’ils sont habituellement plus riches en constituants organiques, 2) qu’ils contiennent des agents réducteurs (cystéine ou thioglycolate le plus souvent) et 3) qu’ils possèdent des indicateurs redox (voir section 6.15). Les procédures de maniement et de traitement des échantillons sont élaborées de manière à exclure toute contamination par l’oxygène, celui-ci étant toxique pour les bactéries anaérobies strictes. Dans l’organisme, il existe différentes niches naturellement anoxiques (par exemple, certaines portions de la cavité buccale ou le tractus intestinal bas – voir sections 21.3 et 21.4), dont les constituants habituels de la flore locale sont en partie des bactéries anaérobies strictes. Par ailleurs, d’autres sites anatomiques, à la suite de destruction tissulaire (par plaie ou traumatisme) qui conduit à la réduction de l’apport sanguin et donc de la perfusion en oxygène, peuvent devenir anoxiques. Ce phénomène favorise alors l’installation de bactéries anaérobies strictes. De manière générale, les bactéries anaérobies strictes, appartenant aux flores normales, sont des pathogènes opportunistes. Il existe cependant

deux exceptions majeures : Clostridium tetani (responsable du tétanos – voir section 27.9) et Clostridium perfringens (responsable de la gangrène gazeuse et d’intoxication alimentaire – voir section 29.6), toutes deux capables de former des endospores, formes de résistance bactérienne retrouvées dans les sols. Les méthodes de culture en anaérobiose cumulent le problème habituel de la contamination des prélèvements et celui du maintien d’une atmosphère strictement anoxique. Les échantillons cliniques prélevés par aspiration à la seringue ou par biopsie doivent être immédiatement placés dans un tube dépourvu d’oxygène (possibilité d’utiliser une solution contenant un agent réducteur comme le thioglycolate et un indicateur rédox comme la résazurine, laquelle se colore en rose en présence d’oxygène). La seringue peut servir de système de transport à condition d’enlever l’aiguille et de bien boucher la seringue. Pour l’incubation en anaérobiose, les boîtes de Petri sont placées dans une jarre, où l’anoxie est obtenue par remplacement de l’air par un mélange N2-CO2 dépourvu d’oxygène, ou par ajout de composés consommant l’O2 présent dans la jarre (voir figure 24.6). Par exemple, il y a production de H2 qui, en présence d’un catalyseur comme le palladium, se combine à l’O2 libre pour former de l’H2O. D’autres alternatives existent, comme l’utilisation de milieux de culture qui contiennent des agents réducteurs ou l’utilisation de « boîtes à gants » anaérobies remplies d’un gaz dépourvu d’O2 comme le N2 ou l’H2 (voir figure 6.26b).

Contrôlez vos acquis Un prélèvement soigneux associé à une mise en culture adaptée à l’agent pathogène suspecté sont les moyens les plus sûrs pour identifier le micro-organisme responsable de la maladie infectieuse. Le choix des méthodes d’échantillonnage et des conditions de culture requiert une connaissance approfondie de l’écologie et de la physiologie bactériennes. •

Pourquoi les cultures urinaires montrent-elles très souvent une croissance bactérienne ?

•

Décrivez les précautions nécessaires à l’isolement des bactéries anaérobies.



798 Chapitre 24


Catalyseur chimique

Jarre d’anaérobiose

Générateur d’hydrogène

T. D. Brock

Milieu de culture en boîtes de Petri

FIGURE 24.6 Jarre d’incubation pour la culture en anaérobiose. Le sachet générateur d’hydrogène et le catalyseur permettent de produire et de maintenir un environnement réducteur, c’està-dire une atmosphère anaérobie.

24.2 Méthodes d’identification m n basées sur les caractéristiques de croissance

Si les primocultures, c’est-à-dire les cultures issues de l’ensemencement des prélèvements biologiques, montrent une croissance de bactéries, le travail du microbiologiste médical est alors de les identifier. Les méthodes d’identification fondées sur leurs caractéristiques de croissance sont souvent utilisées à cet effet.

Culture sur milieux sélectifs et différentiels Après primoculture, les bactéries à identifier sont habituellement repiquées en subculture sur des milieux permettant la mise en évidence de différentes réactions biochimiques. Les tests biochimiques les plus importants sont référencés dans le tableau 24.3. La plupart des tests biochimiques sont actuellement réalisés à l’aide de kits miniaturisés appelés galeries d’identification biochimique ; celles-ci contiennent différents substrats déposés sous forme lyophilisée dans des petites cupules, le tout étant inoculé en une fois (voir figure 24.7). Les milieux utilisés sont soit sélectifs, soit différentiels, ou les deux à la fois. Un milieu sélectif contient des composés inhibant la croissance de certaines bactéries. Un milieu différentiel contient un indicateur, habituellement coloré, permettant la différenciation des espèces bactériennes sur la base de différentes réactions chimiques survenant au cours de la croissance bactérienne. Par exemple, le milieu gélosé EMB est un milieu à la fois sélectif et différentiel. Il est utilisé pour l’isolement des bacilles Gram négatif de type entérobactéries. Le bleu de méthylène est un colorant qui inhibe la plupart des bactéries Gram positif. L’éosine est un indicateur de pH coloré, allant de l’incolore au noir en conditions acides. La gélose EMB

contient également des substrats carbonés, lactose et saccharose (mais pas de glucose). Les espèces fermentant le lactose comme Escherichia coli, Klebsiella et Enterobacter, provoquent une acidification du milieu et leurs colonies apparaissent noires avec un reflet vert. Les espèces ne fermentant pas le lactose, comme Salmonella, Shigella et Pseudomonas, restent translucides ou rosées (voir figure 24.4). Ainsi, le milieu EMB permet de sélectionner les bactéries Gram négatif et d’en différencier les différentes espèces. Ces tests biochimiques individuels mesurent la présence ou l’absence des enzymes impliquées dans le catabolisme des substrats incorporés dans le milieu. La fermentation des sucres est évaluée grâce à la présence d’un indicateur de pH qui change de couleur après acidification du milieu (voir figure 24.7a). La production d’hydrogène et/ou de dioxyde de carbone pendant la fermentation des sucres est mesurée par l’observation de gaz soit dans des petits tubes collecteurs, soit directement au sein de la gélose (voir figure 24.7a et b). La production de sulfure d’hydrogène (H2S) est évaluée grâce à la culture dans un milieu contenant de l’ion ferrique. En cas de production d’H2S, l’ion ferrique réagit pour former un précipité noir de sulfure de fer (voir figure 24.7b). L’utilisation d’acide citrique, un acide organique qui contient trois groupements acides carboxyliques, s’accompagne d’une augmentation du pH, qu’un changement de couleur du milieu objective (voir figure 24.7c). Des centaines de tests différentiels ont été développés, parmi lesquels une vingtaine est utilisée en routine (voir figure 24.7d). Une base de données informatique compile les profils biochimiques des différentes espèces bactériennes. Les résultats des différents tests pratiqués sur une souche sont soumis au logiciel qui gère la base de données ; après comparaison du profil biochimique de la souche inconnue avec ceux référencés dans la base de données, le logiciel fournit l’identification la plus probable. Pour la plupart des espèces bactériennes, seulement trois à quatre tests clés sont généralement suffisants pour une identification de la souche isolée. En cas d’ambiguïté, des systèmes d’identification plus sophistiqués doivent alors être mis en œuvre.

Le diagnostic clinique Les systèmes d’identification rapide des entérobactéries sont souvent utilisés car ces bactéries sont fréquemment impliquées dans les infections urinaires et digestives (voir figure 24.7 et section 24.1). Des galeries d’identification rapide sont également disponibles pour d’autres groupes ou espèces bactériennes. Par exemple, des galeries d’identification ont été développées pour Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes, Neisseria gonorrhoeae, Haemophilus influenzae et Mycobacterium tuberculosis. Des galeries d’identification des levures Candida albicans et Cryptococcus neoformans existent également (voir section 27.8). La décision d’utiliser un test diagnostique spécifique incombe au microbiologiste, qui doit prendre en considération la nature de l’échantillon clinique, les caractéristiques bactériologiques (morphologie et coloration au Gram) obtenues à la suite de la primoculture et son expérience rencontrée devant des cas similaires.



24.2 Méthodes d’identification basées sur les caractéristiques de croissance 799

TABLEAU 24.3 Test

TESTS DIAGNOSTIQUES IMPORTANTS EN BACTÉRIOLOGIE MÉDICALE Principe

Procédure

Utilisation courante

Fermentation des sucres

Production d’acide et/ou de gaz pendant la fermentation

Bouillon contenant différents sucres et un indicateur de pH, le rouge de phénol ; tube renversé pour le gaz

Différenciation des entérobactéries

Catalase

Enzyme décomposant le peroxyde d’hydrogène (H2O2)

Ajouter une goutte de H2O2 sur une colonie et observer des bulles (O2) [voir figure 6.29]

De Bacillus (+) à Clostridium (–) ; de Streptococcus (–) à Micrococcus-Staphylococcus (+)

Utilisation du citrate

Utilisation du citrate comme seule source carbonée, provoquant une alcalinisation du milieu

Milieu au citrate contenant du bleu de bromothymolcomme indicateur de pH Observer une couleur bleu foncé (pH alcalin)

De Klebsiella-Enterobacter (+) à Escherichia (–), d’Edwardsiella (–) à Salmonella (+) [voir figure 24.7]

Coagulase

Enzyme provoquant la coagulation du plasma

Suspension bactérienne mélangée à du plasma et incubée. Observer la formation d’un coagulum de fibrine

De Staphylococcus aureus (+) à S. epidermidis (–)

Décarboxylases (lysine, ornithine, arginine)

La décarboxylation de ces acides aminés libère de l’amine et du CO2

Milieu enrichi avec des acides aminés. Aide à déterminer le groupe L’indicateur de pH, le violet de bactérien parmi les bromocrésol, devient violet (pH entérobactéries alcalin) en cas d’hydrolyse par l’enzyme

Test de la β-galactosidase (ONPG)

L’orthonitrophényl- β-galactoside (ONPG) est un substrat artificiel de l’enzyme. En cas d’hydrolyse, du nitrophénol (jaune) est formé

Incuber une suspension dense de lysat bactérien avec de l’ONPG. Observer l’apparition d’une couleur jaune

De Citrobacter (+) à Salmonella (–). Identifie certaines espèces de Shigella ou de Pseudomonas.

Hydrolyse de la gélatine

De nombreuses enzymes hydrolysent la gélatine

Incubation en bouillon avec 12 % de gélatine. Refroidir pour la prise en masse. Si la gélatine a été hydrolysée, le milieu reste liquide

Aide à l’identification de Serratia, Pseudomonas, Flavobacterium, Clostridium

Production du sulfure d’hydrogène (H2S)

H2S est produit par hydrolyse des acides aminés soufrés ou par réduction du thiosulfate

Détection de H2S dans un milieu riche en fer à partir de la synthèse du sulfure de fer noir (il existe de nombreuses déclinaisons : le milieu de Kliger, le milieu triple sucre fer – TCS –, détectant aussi la fermentation des sucres)

Pour les entérobactéries ; aide à l’identification de Salmonella, Edwardsiella et Proteus (voir figure 24.7)

Test de l’indole

Transformation du tryptophane des protéines en indole

Détection de l’indole dans le milieu de culture avec du diméthylaminobenzaldéhyde (couleur rouge) ou avec une colonie déposée sur un papier contenant du diméthylaminocinnamaldéhyde (couleur bleue)

Pour différencier Klebsiella oxytoca (+) de K. pneumoniae (–) et d’Enterobacter (–) ; Edwardsiella (+) de Salmonella (–) ; Proteus vulgaris (+) de Proteus mirabilis

Test du rouge méthyle

Les fermenteurs mixtes produisent suffisamment d’acides pour passer à un pH inférieur à 4,3

Bouillon au lactose. Rajouter l’indicateur rouge de méthyle après l’incubation

Pour différencier Escherichia (+ ; couleur rouge) d’Enterobacter et de Klebsiella (– habituellement ; couleur jaune)

Réduction des nitrates

L’ion nitrate (NO3–), accepteur d’électrons, est réduit en NO2– ou en N2

Bouillon avec des nitrates. Après incubation, détecter les nitrites avec de l’acide α-naphtylaminesulfanilique (couleur rouge). Si négatif, confirmer la présence de NO3– par l’addition de poudre de zinc qui va réduire NO3– en NO2–. Si aucune couleur n’apparaît, NO3- est transformé en N2

Aide à l’identification des entérobactéries (le plus souvent +)

Test de l’oxydase

Le cytochrome c oxyde un accepteur d’électrons artificiel : le tétraméthyl p-phénylènediamine (réactif de Kovac), ou le diméthyl p-phénylènediamine (réactif de Gordon et McLeod)

Les colonies sont déposées sur un papier imprégné avec le réactif. Les colonies oxydase- positives produisent une coloration violet foncé à noire en 10 à 15 s avec le réactif de Kovac, ou bleue en 10 à 30 min avec le réactif de Gordon et McLeod.

Différenciation de Neisseria et Moraxella (+) d’Acinetobacter (–) et des Pseudomonas (+) et Vibrionaceae (+) des Enterobacteriaceae (–). Pour aider à l’identification des Aeromonas (+)



800 Chapitre 24

TABLEAU 24.3 Test


TESTS DIAGNOSTIQUES IMPORTANTS EN BACTÉRIOLOGIE MÉDICALE (SUITE) Principe

Procédure

Utilisation courante

Test d’oxydationfermentation (O/F)

Certaines bactéries ne produisent de l’acide qu’en aérobiose

Production d’acide uniquement dans la partie supérieure du tube de culture ; une gélose semi-solide est utilisée pour éviter le mélange durant l’incubation des entérobactéries

Differenciation de Micrococcus (acide produit en aérobiose uniquement) de Staphylococcus (acide produit en anaérobiose). Différenciation de Pseudomonas (acide produit en aérobiose) des entérobactéries (acide produit en anaérobiose)

Test de la phénylalanine désaminase

La désamination produit de l’acide phénylpyruvique, détecté par un test colorimétrique

Le milieu est enrichi en phénylalanine. Après incubation, ajouter du chlorure de fer et observer l’apparition d’une couleur verte

Caractérisation des genres Proteus et Providencia

Test d’hydrolyse de l’amidon

L’iode donne une couleur bleue avec l’amidon

Cultiver la bactérie sur une gélose contenant de l’amidon. Recouvrir la culture avec de l’iode et regarder l’apparition de zones claires autour des colonies

Identification des bactéries hydrolysant l’amidon telles que Bacillus spp.

Test de l’uréase L’urée, H2N-CO-NH2, se dissocie en 2NH3 + CO2

Un milieu à 2 % d’urée et du rouge de phénol comme indicateur coloré. L’ammoniac libéré produit une augmentation du pH qui intensifie la couleur rouge-rose

Distinction de Klebsiella (+) d’Escherichia (–) et Proteus (+) de Providencia (–). Identification de Helicobacter pylori

Test de VogesProskauer

Test chimique pour détecter l’acétoïne utilisant l’α-naphtol

Distinction de Klebsiella et Enterobacter (+) d’Escherichia (–). Pour caractériser les espèces du genre Bacillus

Production d’acétoïne à partir de la fermentation des sucres

Contrôlez vos acquis Les méthodes traditionnelles d’identification des bactéries dépendent de l’observation des caractéristiques métaboliques objectivées pendant la croissance. Les méthodes basées sur les conditions de croissance permettent en général une identification rapide et exacte. •

Établissez la distinction entre milieux sélectif et différentiel. Citez un exemple pour chaque type de milieu.

•

Suggérez un milieu non sélectif, sélectif et différentiel approprié à l’isolement et à l’identification des bactéries : 1) de l’urine, et 2) du sang.

24.3 Étude de la résistance m n aux antimicrobiens L’isolement des micro-organismes pathogènes permet de confirmer le diagnostic clinique et d’adapter le traitement antimicrobien. La question de la détermination de la résistance aux antimicrobiens est un problème aigu de santé publique. La détermination des concentrations minimales inhibitrices (CMI) se fait soit par la méthode de diffusion en milieu gélosé, soit par la technique de dilution en tubes (voir section 20.4). Les procédures pour la détermination de la sensibilité des bactéries aux antibiotiques sont régies par des

documents émanant des divers comités nationaux reconnus par l’OMS : pour les États-Unis, le National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS) ; pour la France, le Comité de l’antibiogramme de la Société française de microbiologie (CA-SFM). Ces comités mettent à jour régulièrement les valeurs critiques qui délimitent les catégories cliniques de chaque espèce bactérienne vis-à-vis de chaque antibiotique utilisable. Au niveau européen, les méthodologies des tests de sensibilité aux antibiotiques et leur interprétation sont en voie d’harmonisation par le biais de l’EUCAST (European Commitee on Antimicrobial Susceptibility Testing). La procédure de détermination des CMI pour tester la sensibilité aux antibiotiques implique la mise en œuvre de dilutions de l’antibiotique réalisées soit en tubes (voir figure 20.10), soit en plaques de microtitration (voir figure 24.8e). Les puits contenant les dilutions en série sont inoculés avec une quantité titrée de la souche bactérienne testée. La croissance en présence de différents antibiotiques est mesurée dans chaque puits par turbidimétrie. La concentration minimale inhibitrice (CMI) est définie par la dilution la plus forte (soit la concentration d’antibiotique la plus faible), capable d’inhiber complètement la croissance bactérienne. La procédure standard permettant d’évaluer l’activité antimicrobienne est appelée méthode de Kirby-Bauer (voir figure 24.8). Un milieu gélosé est ensemencé en surface par un inoculum standardisé. Des disques d’antibiotiques contenant une quantité définie d’antibiotique (µg/disque) sont déposés à la surface. Après une durée d’incubation définie, le diamètre de la zone d’inhibition autour de chaque disque est mesuré (voir



24.3 Étude de la résistance aux antimicrobiens 801

Leon J. LeBeau

(a)

(e)

(b)

Leon J. LeBeau

(c)

(d)

tableau 24.4). Les diamètres d’inhibition sont ensuite interprétés en termes de catégorie de sensibilité. Les valeurs critiques des différents antibiotiques vis-à-vis des groupes bactériens sont régies par les comités nationaux cités précédemment.

FIGURE 24.7 Méthodes d’identification des isolats cliniques par l’étude des caractéristiques métaboliques objectivées par des changements de couleur de milieux spécifiques. (a) Milieu utilisé pour la fermentation de sucres. Le changement de couleur de l’indicateur de pH présent dans le milieu liquide indique la production d’acide. S’il y a production de gaz, une bulle apparaît dans le petit tube retourné. De gauche à droite : acide, acide et gaz, négatif, non ensemencé. (b) Test diagnostic conventionnel des entérobactéries sur un milieu appelé gélose TSI (triple sugar iron). Ce milieu s’ensemence à la fois au niveau de la surface de la pente de la gélose et par piqûre profonde dans le culot gélosé. Il contient de petites quantités de glucose et de grandes quantités de lactose et de saccharose. Les bactéries fermentant seulement le glucose provoquent uniquement l’acidification du culot gélosé, alors que les bactéries fermentant le lactose et le saccharose provoquent en plus l’acidification de la pente. La formation de gaz se repère à l’apparition de fissures dans le culot gélosé. La formation du sulfure d’hydrogène (provenant soit de la dégradation des protéines, soit de la réduction du thiosulfate du milieu) est objectivée par un noircissement provenant de la réaction de l’H 2S avec l’ion ferreux. De gauche à droite : fermentation du glucose uniquement ; pas de réaction ; synthèse de sulfure d’hydrogène ; fermentation du glucose et d’un autre sucre. (c) Détection de l’utilisation du citrate par Salmonella avec le milieu citrate de Simmons en tube incliné. Le changement de pH provoque un virement de l’indicateur coloré. De gauche à droite : positif, négatif, non ensemencé. (d) Galeries d’identification rapide d’isolats cliniques. Le principe est le même qu’en (a), mais le tout a été miniaturisé de manière à pouvoir réaliser de nombreux tests en même temps. La photographie montre quatre galeries ensemencées avec des suspensions bactériennes différentes. (e) Une autre forme de présentation de test miniaturisé. Celui-ci sert à l’étude de l’acidification des sucres chez les micro-organismes non fermentatifs.

La technique Etest® (AB BIODISK, Solna, Suède) est une méthode de diffusion en gélose utilisant des bandelettes qui contiennent un gradient de l’antibiotique à tester. Le gradient de concentration de l’antibiotique couvre une gamme de CMI



802 Chapitre 24

Diagnostic microbiologique et immunologique 1 2 3 4 5 6 7 8 Leon J. LeBeau

9 10 11 12

(c)

(b)

(e)

(d)

AB BIODISK

Miles/ScienceVu

(a)

(f)

FIGURE 24.8 Tests de sensibilité aux antibiotiques. (a-e) Méthode de Kirby-Bauer utilisée pour déterminer la sensibilité des bactéries aux antibiotiques. (a) Après mise en suspension et homogénéisation des colonies dans un milieu liquide approprié, l’inoculum est ajusté à un standard par turbidimétrie. (b) Un écouvillon sec stérile est plongé dans la suspension bactérienne, puis exprimé contre la paroi du tube pour enlever l’excès de liquide. (c) L’écouvillon est déchargé par des stries réalisées à la surface d’un milieu gélosé approprié. (d) La technique de dilution permet de déterminer la sensibilité aux antibiotiques. La bactérie testée est Pseudomonas aeruginosa. Chaque ligne correspond à un antibiotique différent. Les plaques de microtitration autorisent l’automatisation de ces tests. La concentration minimale inhibitrice (CMI) correspond, pour une bactérie donnée, au puits contenant la plus petite concentration d’antibiotique et où aucune croissance bactérienne n’est visible (voir section 20.4). La concentration la plus forte d’antibiotique correspond au puits le plus à gauche, à partir duquel des dilutions itératives de deux en deux sont réalisées et déposées dans les puits suivants de la même ligne. Par exemple, aux lignes 1 et 2, la CMI correspond au troisième puits. À la ligne 3, l’antibiotique est inefficace aux concentrations testées, car il existe une croissance bactérienne dans tous les puits. À la ligne 4, la CMI correspond au premier puits. (e) Des disques imprégnés des antibiotiques à tester (quantité fixée) sont déposés sur la gélose. Après incubation, des zones d’inhibition apparaissent. Des abaques interprétant le diamètre d’inhibition (voir tableau 24.4) permettent de déterminer la sensibilité de chaque espèce bactérienne. (f) Détermination de la sensibilité à différents antibiotiques (à 8 heures, PTc-pipéracilline/tazobactam ; AT-aztréonam ; CT-céfotaxime ; CI-ciprofloxacine ; GM-gentamicine ; IP-imipénème) par la méthode du Etest® (AB BIODISK, Solna, Suède). Chaque bandelette est calibrée en termes de CMI en µg/mL (concentration la plus faible au centre de la boîte de Petri). Par exemple, la CMI du céfotaxime (CT) est égale à 16 µg/mL. Cet isolat est résistant à l’imipénème (IP) ; CMI > 32 µg/mL.

s’échelonnant sur quinze dilutions (de raison 2) testées par la méthode conventionnelle. Une fois la bandelette déposée à la surface de la gélose préalablement ensemencée, le gradient d’antibiotique diffuse de la bandelette dans la gélose et reste stable pour une durée suffisamment grande pour couvrir le temps nécessaire à la croissance d’une grande variété de bactéries. Après une nuit d’incubation ou plus, une zone d’inhibition elliptique, centrée sur l’axe de la bandelette, se développe. La valeur de la CMI en µg/mL est lue au point d’intersection de l’ellipse avec la bandelette Etest® précalibrée. Cette

valeur est ensuite interprétée grâce aux valeurs critiques données par le CA-SFM pour les laboratoires français (voir figure 24.8f). En raison de l’émergence des résistances aux antimicrobiens (voir section 20.12), il est recommandé de procéder systématiquement à l’étude de la sensibilité de la plupart des pathogènes isolés des échantillons cliniques. Les données telles que celles référencées au tableau 24.4 sont utiles pour le choix de la meilleure antibiothérapie. Si la majorité des bactéries communautaires sont sensibles à de nombreux antibiotiques, certaines,



24.4 Sécurité dans les laboratoires de microbiologie 803

TABLEAU 24.4

EXEMPLES DE CHARGES EN ANTIBIOTIQUES, DE DIAMÈTRES CRITIQUES ET DE RÈGLES INTERPRÉTATIVES POUR L’ÉTUDE DE LA SENSIBILITÉ DES BACTÉRIES AUX ANTIBIOTIQUES PAR LA MÉTHODE DE DIFFUSION EN GÉLOSE Diamètre de la zone d’inhibition (mm)*

Antibiotique Ampicillinea

Charge du disque

Résistant

Intermédiaire

Sensible

10 µg

13 ou moins

14–18

19 ou plus

Oxacilline

5 µg

19 ou moins

–

20 ou plus

Ceftriaxonec

30 µg

13 ou moins

14–20

21 ou plus

30 µg

18 ou moins

19–22

23 ou plus

Clindamycine

15 µg

16 ou moins

17–21

22 ou plus

Érythromycinef

15 UI

16 ou moins

17–21

22 ou plus

Gentamicine

10 UI

15 ou moins

16–17

18 ou plus

Nitrofurantoïne

300 µg

13 ou moins

14–16

17 ou plus

Pénicilline G

10 UI

28 ou moins

–

29 ou plus

Pénicilline Gi

10 µg

13 ou moins

14–18

19 ou plus

Streptomycine

10 UI

12 ou moins

13–14

15 ou plus

Sulfamide

200 µg

11 ou moins

12–16

17 ou plus

Tétracycline

30 UI

16 ou moins

17–18

19 ou plus

Triméthoprime-sulfaméthoxazole

1,25 µg + 25,75 µg

9 ou moins

10–15

16 ou plus

Tobramycine

10 µg

15 ou moins

16–17

18 ou plus

j

Vancomycine

30 µg

16 ou moins

–

17 ou plus

Vancomycinek

30 µg

16 ou moins (test par CMI)

–

17 ou plus

b

d

Chloramphénicol e

g

h

*Les diamètres critiques sont définis et régulièment mis à jour par le CA-SFM (Comité de l’antibiogramme de la Société française de microbiologie). Ces données sont téléchargeables à partir du site Internet de la SFM (http://www.sfm.asso.fr/) UI, unité internationale. Voir figure 24.8 pour une illustration des méthodes standard d’étude de sensibilité aux antibiotiques. a, c, g, Pour les Enterobacteriaceae. b, d, e, f, h, j Pour Staphylococcus spp. i, k Pour Enterococcus spp.

comme Pseudomonas aeruginosa, sont d’emblée sensibles à un nombre limité d’antibiotiques. Les pathogènes nosocomiaux sont ceux acquis lors d’un séjour hospitalier. Beaucoup de ces pathogènes ont développé des résistances aux antibiotiques, et certains sont résistants à tous les antibiotiques actuellement disponibles (voir section 20.12). Ainsi, l’étude de la sensibilité de ces pathogènes hospitaliers est indispensable pour une antibiothérapie efficace. Au sein des hôpitaux, des rapports sur l’épidémiologie locale, prenant en compte les profils de résistance des bactéries isolées au cours des mois précédents, sont régulièrement publiés et permettent l’instauration d’une antibiothérapie adaptée à l’épidémiologie locale, ainsi que la surveillance de l’émergence de nouvelles résistances.

Contrôlez vos acquis Les agents antimicrobiens sont largement utilisés pour le traitement des maladies infectieuses. Les bactéries pathogènes doivent être testées pour leur sensibilité aux antibiotiques de manière à appliquer un traitement adapté. Une approche rigoureuse de l’antibiothérapie est généralement appliquée dans les services de soins médicaux.

•

Décrivez la méthode de Kirby-Bauer. Pour une bactérie donnée associée à un antibiotique donné, quels sont les résultats fournis ?

•

Quelle est la valeur de l’étude de sensibilité aux antibiotiques pour un microbiologiste, pour un médecin et pour le patient, en ce qui concerne des bactéries responsables d’infections nosocomiales et d’infections communautaires ?

24.4 Sécurité dans les laboratoires m n de microbiologie Les laboratoires de microbiologie, et en particulier les laboratoires hospitaliers, suscitent des questions en matière de gestion du risque infectieux pour le personnel hospitalier. C’est pourquoi des réglementations concernant le traitement des échantillons cliniques ont été établies, notamment pour éviter les accidents de laboratoire. Les principales causes d’accidents en laboratoire sont avant tout dues à l’ignorance et au manque de vigilance. Des mesures appropriées d’entraînement et de renforcement des procédures de sécurité établies pourraient prévenir la plupart de ces



804 Chapitre 24


événements. Malheureusement, la plupart des infections acquises par le personnel de laboratoire ne proviennent pas d’accidents d’exposition identifiables, mais plutôt du maniement routinier des échantillons. Les aérosols infectieux produits par le traitement des prélèvements sont la principale cause de ces contaminations. Les laboratoires hospitaliers doivent suivre les règles de sécurité décrites ci-après (et légales) pour minimiser le risque d’exposition du personnel aux agents infectieux et ainsi diminuer le nombre de cas engendrés par la pratique routinière. 1. Les laboratoires prenant en charge des prélèvements à risque doivent restreindre l’accès au seul personnel du laboratoire. Le personnel doit être avisé du risque biologique impliqué par le travail dans le laboratoire et doit agir en conséquence. 2. Des procédures efficaces de décontamination des déchets ou des matériels contaminés, tels que les échantillons, les seringues et aiguilles, les milieux inoculés, les cultures bactériennes, les cultures cellulaires, les animaux d’expérimentation, la verrerie, les instruments et les surfaces inertes doivent être traités sans aucun compromis. L’utilisation d’une solution chlorée à 5,25 % (solution forte) ou d’autres types de désinfectants est recommandée pour la décontamination du matériel potentiellement souillé et donc contaminant. Tous les déchets virtuellement infectieux doivent être brûlés dans un incinérateur agréé ou pris en charge par une société agréée. 3. Le personnel en contact avec les agents infectieux dangereux ou avec des vaccins (par exemple vaccins antirabiques, contre la poliomyélite, contre la diphtérie, le tétanos et la coqueluche) doit être vacciné contre ces agents. Le personnel travaillant avec des prélèvements humains ou de primates doit être vacciné contre l’hépatite B. 4. Tous les échantillons cliniques doivent être considérés comme infectieux et manipulés en conséquence. Ceci est particulièrement vrai pour la prévention des risques de contamination par les virus des hépatites fréquemment présents dans les échantillons sanguins (voir section 26.11). 5. Des dispositifs de pipetage mécanique doivent être utilisés (le pipetage à la bouche est proscrit). 6. Les animaux doivent être manipulés par du personnel qualifié, et des anesthésiques et/ou des tranquillisants doivent être utilisés pour éviter les blessures de ceux-ci et du personnel. 7. Le personnel de laboratoire doit porter une blouse ou une casaque, des chaussures fermées, des gants souples, des masques, des lunettes de protection, ou d’autres dispositifs de protection, en fonction du risque d’exposition et de la sévérité de l’infection potentielle. Ces dispositifs de protection doivent être correctement rangés, conservés et décontaminés après utilisation. Le personnel de laboratoire doit respecter des conditions d’hygiène personnelle, notamment par rapport au lavage des mains. Toute forme de nourriture, de boisson, de même que l’application de cosmétiques sont interdits dans les laboratoires médicaux.

8. Du fait des risques propres à l’infection par le virus de l’immunodéficience humaine (VIH), tous les échantillons cliniques (humains) doivent être traités comme s’ils étaient porteurs du VIH. Des gants de protection doivent être utilisés à chaque maniement d’échantillons quel que soit leur type. Au minimum, un masque doit être porté à chaque traitement d’échantillons engendrant des aérosols. Les aiguilles ne doivent jamais être recapuchonnées, pliées ou cassées ; elles doivent être jetées dans une poubelle désignée à cet effet, qui sera scellée et décontaminée avant son élimination. Ces règles de sécurité doivent être effectives dans tous les laboratoires manipulant des agents infectieux dangereux. Les laboratoires hospitaliers peuvent appliquer des règles supplémentaires comme il sera vu plus loin. En définitive, assurer la sécurité au laboratoire relève de la responsabilité du personnel. Tout laboratoire hospitalier est une zone dangereuse pour tout personnel non formé ou n’appliquant pas les consignes nécessaires à la prévention du risque infectieux inhérent au travail en laboratoire.

Niveaux de confinement biologique et biosécurité Le niveau de confinement appliqué pour prévenir les risques d’accidents d’exposition des personnes aux agents infectieux ou de contamination de l’environnement (à la suite d’une fuite) concerne les laboratoires hospitaliers, de développement, d’enseignement ou de recherche. Il doit être ajusté pour contrer le potentiel infectieux des micro-organismes manipulés dans le laboratoire concerné. Les laboratoires sont classés selon le potentiel de confinement en quatre niveaux de sécurité biologique (NSB) : NSB1, NSB2, NSB3 et NSB4, correspondant respectivement aux laboratoires de type P1, P2, P3 et P4. Les laboratoires NSB1 correspondent au niveau de confinement le plus faible. Le travail est réalisé sur des paillasses avec des micro-organismes qui présentent un faible risque infectieux ; ces micro-organismes ne sont pas pathogènes pour les individus sains, comme Bacillus subtilis par exemple. Il s’agit classiquement des laboratoires dédiés à l’enseignement pratique de la microbiologie aux étudiants. Les laboratoires NSB2 sont destinés à la manipulation de micro-organismes présentant un risque modéré en cas d’ingestion accidentelle, d’injection sous-cutanée ou d’exposition des muqueuses à des aérosols. Par exemple, la manipulation d’Escherichia coli ou de Streptococcus pyogenes peut être réalisée dans un laboratoire P2. Les procédures normales se font sur la paillasse, mais des dispositifs de protection du visage et des yeux, des gants et des blouses ou des casaques peuvent être utilisés si nécessaire. La plupart des laboratoires se situent à ce niveau de confinement. Les laboratoires NSB3 sont destinés à manipuler des pathogènes à haut risque infectieux, spécialement du fait des aérosols. Par exemple, en cas de manipulation de pathogènes véhiculés par l’air tels que Mycobacterium tuberculosis (agent de la tuberculose), le laboratoire doit être équipé de dispositifs spécifiques comme une pièce sous pression négative et des filtres à air pour prévenir le risque de propagation accidentelle



du pathogène en dehors du laboratoire. Un poste de sécurité microbiologique (voir figure 20.4) est nécessaire aux manipulations ; celles-ci ne doivent pas être réalisées sur paillasse ouverte. Dans quelques cas particuliers, des microorganismes qui sont normalement manipulés en laboratoires P2 doivent l’être dans un laboratoire P3. Par exemple, Staphylococcus aureus peut être cultivé en boîtes de Petri en laboratoire P2 ; mais, quand de grandes quantités sont cultivées et centrifugées notamment, les manipulations doivent être pratiquées en laboratoires P3 en raison du risque de propagation par les aérosols. Ce sont le plus souvent les laboratoires de recherche ou des centres hospitaliers universitaires qui sont équipés de ce genre de dispositifs. Les laboratoires P4 sont dédiés à la manipulation des microorganismes pathogènes, caractérisés par leur haute dangerosité, ayant un pouvoir de dissémination par les aérosols et pour lesquels il n’existe ni vaccin protecteur, ni traitement médical efficace. Le confinement physique dans les laboratoires P4 inclut un isolement total du micro-organisme, à travers une enceinte de sécurité microbiologique à gants ou par le port d’une combinaison intégrale équipée d’un dispositif d’approvisionnement en air (voir figure 24.9). L’air rejeté est filtré. Parmi les micro-organismes nécessitant un laboratoire P4, on trouve les virus responsables de fièvres hémorragiques (Lassa, Marbourg, Ebola – voir section 25.11), le virus de la variole (voir section 25.12) et les souches de Mycobacterium tuberculosis multirésistantes (voir section 26.5). Les laboratoires P4 sont uniquement des laboratoires de recherche et de développement spécifiquement désignés et équipés pour manipuler les micro-organismes les plus dangereux.

Contrôlez vos acquis La sécurité dans les laboratoires hospitaliers demande un entraînement spécifique et des dispositifs pour prévenir les risques de contamination du personnel. Les échantillons tels que les cultures cellulaires, les milieux de culture inoculés, les aiguilles et les échantillons biologiques requièrent des précautions particulières pour leur manipulation. •

Quelles sont les précautions majeures pour prévenir la dissémination des pathogènes sanguins au sein du personnel ?

•

Quelles sont les causes principales des contaminations accidentelles en laboratoire ?

•

Identifiez les principales caractéristiques des dispositifs des laboratoires P1, P2, P3 et P4.

II

MÉTHODES IMMUNOLOGIQUES ET DE DIAGNOSTIC CLINIQUE

Les techniques d’immunoanalyse sont largement utilisées dans les laboratoires d’analyses médicales, en recherche ainsi que dans les centres de référence pour la recherche spécifique de micro-organismes pathogènes ou de constituants caractéristiques de ces pathogènes. Ces tests sont utilisés pour confirmer

CDC/Jim Gathany/PHIL

24.5 Immunoanalyses pour le diagnostic des maladies infectieuses 805

FIGURE 24.9 Travail en laboratoire NSB4 (niveau de sécurité biologique 4). NSB4 correspond au niveau supérieur de sécurité biologique, garantissant de façon maximale la protection du personnel et le confinement des agents infectieux manipulés. Une combinaison intégrale, comptant un système de ventilation et d’approvisionnement de l’air, protège le personnel. Tous les matériaux quittant ce type de laboratoire sont autoclavés ou décontaminés par des agents chimiques.

l’existence d’une infection lorsque l’agent responsable ne peut être identifié en culture ou n’est pas cultivable. Quand les méthodes de culture ne sont pas disponibles en routine ou sont difficiles à mettre en œuvre, notamment pour de nombreuses infections virales, dont l’infection par le virus de l’immunodéficience humaine (VIH), les techniques d’immunoanalyse constituent un moyen efficace et relativement simple pour l’identification spécifique de pathogènes.

24.5 Immunoanalyses pour le diagnostic m n des maladies infectieuses Des anticorps spécifiques de pathogènes sont utilisés in vitro pour le diagnostic de maladies infectieuses. L’identification de l’agent responsable se fait, dans certains cas, par la recherche de la réponse immune humorale ou cellulaire développée par l’organisme du patient en réaction à l’infection ; dans d’autres cas par l’utilisation de tests diagnostiques à base d’anticorps spécifiques de l’agent infectieux. La réponse immune a été discutée au chapitre 22 et les mécanismes principaux de l’immunité sont résumés dans la figure 24.10.

L’immunité innée Lorsque l’organisme hôte n’a jamais été en contact avec l’agent infectieux, les phagocytes (voir section 22.1) reconnaîtront cet agent. Des récepteurs spécifiques présents à la surface des phagocytes reconnaissent un ou plusieurs motifs macromoléculaires répétés, comme les chaînes répétées de



806 Chapitre 24

Diagnostic microbiologique et immunologique Antigènes

Adressage de l’antigène 1

Cellule présentatrice d’antigène Peptide antigénique

Immunité non spécifique

CMH Présentation de l’antigène TCR ou Récepteur des cellules T Cellule T

3

Liaison à l’antigène et destruction

Immunité à médiation cellulaire

2 Immunité

Cellules TH1 activées

Activation des cellules B

antigène-spécifique, à médiation humorale

Cellules TC activées Inflammation Production d’anticorps

Lyse des cellules cibles FIGURE 24.10 La réponse immune. L’exposition à des pathogènes stimule l’immunité innée (1) via des cellules phagocytaires non spécifiques et via l’immunité antigène-spécifique. L’immunité spécifique est adaptée à la reconnaissance de pathogènes, étant mise en œuvre par les anticorps spécifiques des antigènes du pathogène cible (2) ou par les cellules T spécifiques (3), dont les cellules inflammatoires TH1 et les cellules T cytotoxiques (T C).

groupes saccharidiques à la surface de la paroi cellulaire, par exemple (voir section 22.2). La reconnaissance de ces motifs active le phagocyte pour l’ingestion et la destruction des micro-organismes pathogènes cibles, c’est le processus de la phagocytose. Ce processus de reconnaissance puis de destruction du pathogène correspond à l’immunité innée ou immunité non spécifique, point de départ pour la résistance de l’organisme à une infection pathogène invasive.

Immunité antigène-spécifique et anticorps Au cours de la seconde phase de la réponse immune, les phagocytes présentent les antigènes dérivés de l’agent infectieux (protéines issues de la destruction du pathogène) aux lymphocytes antigène-spécifiques connus sous le nom de cellules T (voir figure 24.10 et section 22.1). Les cellules T helper (TH),

en général CD4+, n’ont pas d’action directe sur le micro-organisme, mais recrutent et stimulent (help) d’autres cellules. Les cellules TH2, sous-classe particulière des TH, activent d’autres lymphocytes antigène-spécifiques, les cellules B. Ces cellules B répondent alors par la production de protéines solubles se liant aux antigènes : les anticorps (voir figure 24.10 et sections 22.9 et 22.10). Une réponse anticorps primaire apparaît généralement en cinq jours, mais le pic des anticorps n’est atteint qu’après plusieurs semaines. Les anticorps sont spécifiques du pathogène, ils reconnaissent de manière conformationnelle exclusivement les déterminants antigéniques caractéristiques du pathogène et se lient aux antigènes par liaison hydrogène ou électrostatique. Les anticorps spécifiques interagissent avec l’antigène sur les cellules cibles mais ne peuvent pas tuer ces cellules. Un groupe



24.5 Immunoanalyses pour le diagnostic des maladies infectieuses 807

Dans la plupart des cas, l’immunité dépendante des anticorps (immunité humorale) ne permet pas un contrôle efficace de la diffusion de l’infection. Certains agents infectieux sont des parasites intracellulaires de l’organisme. Ainsi, les virus animaux se répliquent en utilisant la machinerie cellulaire de l’hôte qu’ils infectent (voir section 9.12). De même, certaines bactéries telles que Mycobacterium tuberculosis, agent de la tuberculose, infectent les cellules phagocytaires (voir sections 22.2 et 26.5). Alors que les anticorps sont adaptés pour la reconnaissance de pathogènes libres dans le sang, circulant ou fixés à la surface de cellules muqueuses, les cellules hôtes infectées devront être détectées et détruites par d’autres moyens, impliquant le plus souvent les interactions cellulaires de l’immunité à médiation cellulaire. Les cellules TH1 antigène-spécifiques, attirent et activent les phagocytes tels que les macrophages et les neutrophiles ; elles sont à l’origine de réactions inflammatoires et limitent ainsi l’infection (voir section 22.8). De plus, les pathogènes intracellulaires produisent des antigènes qui seront alors présentés à la surface des cellules infectées. Les cellules T cytotoxiques (TC), en général CD8+, reconnaissent l’antigène et agissent directement sur la cellule infectée en sécrétant des protéines cytolytiques, les perforines, qui la lysent (voir figure 24.10 et section 22.7). Il n’existe pas d’immunité antigène-spécifique avant que l’organisme ne soit exposé à l’antigène, néanmoins, après une première exposition, les cellules immunes réactives T et B sont produites et peuvent persister des années, conférant alors une immunité spécifique à long terme. Une seconde stimulation antigénique de ces cellules antigène-réactives génère une réponse immune très rapide et puissante qui demeure élevée pendant plusieurs jours (voir section 22.10). Les cellules T et les anticorps produits lors de cette seconde réponse ciblent rapidement le pathogène et le détruisent. C’est la mémoire immunitaire, souvent caractérisée par une augmentation rapide de la réponse immune pour le contrôle des infections.

Titres anticorps, tests cutanés et diagnostic des maladies infectieuses Le diagnostic d’une maladie infectieuse ne peut pas toujours être confirmé par l’isolement du micro-organisme responsable. Une alternative est de mesurer le titre (quantité) des

Température corporelle (°C)

Immunité à médiation cellulaire et mémoire immunitaire

anticorps spécifiques de l’agent infectieux suspecté. Si un individu immunocompétent est infecté par un pathogène suspect, le titre des anticorps spécifiques du pathogène doit être élevé. Ce titre peut être mesuré par des techniques de précipitation, d’agglutination ou par l’une des méthodes discutées dans les sections 24.7 à 24.11. La procédure classique consiste à préparer des dilutions en série du sérum du patient, le « titre anticorps » correspond à la dilution la plus forte à laquelle la réaction antigène-anticorps est détectable (voir figure 24.11). Ces méthodes sont des tests sérologiques dans le sens où elles utilisent les anticorps potentiellement présents dans le sérum du patient. Une seule mesure du titre des anticorps ne peut être utilisée pour affirmer une infection active parce que, dans la plupart des infections guéries, les anticorps peuvent rester à des titres relativement élevés pendant de nombreuses années. Ainsi, pour confirmer le diagnostic d’une infection aiguë, il est essentiel de montrer une augmentation du titre des anticorps sériques entre la phase aiguë et la phase de convalescence de la maladie. Le plus souvent, le titre des anticorps est bas (voire non détectable en réaction de fixation du complément ou en immunofluorescence) à la phase aiguë et augmente au cours de la convalescence (voir figure 24.11). Cette augmentation du titre des anticorps est

40 39 38 37 Température normale

Cultures des urines

– – – ± ± ± ± ± ±– – – – – – – – – – –

Cultures des selles – – ± ++ + ++ + ++± ± – – – – – – – Cultures des prélève- + + + + ± ± – – – – – – – – – – – – – – ments sanguins Titre anticorps (agglutination)

de protéines, connues collectivement sous le nom de complément (voir section 22.11), est capable de se fixer aux anticorps liés au pathogène et de lyser toutes les cellules sur lesquelles sont fixés les anticorps. L’interaction complément-anticorps ne concerne que les cellules cibles des anticorps. Par exemple, les anticorps spécifiques des protéines de surface de Salmonella spp. n’interagissent qu’avec Salmonella : le complément peut être à l’origine de la lyse de la bactérie Salmonella sensibilisée par les anticorps, mais pas d’une bactérie voisine, Escherichia coli, non sensibilisée par les anticorps. Ainsi, la réponse immune est spécifique de déterminants antigéniques du pathogène à travers la production d’anticorps spécifiques, mais la destruction du pathogène peut se produire par des mécanismes non spécifiques, tels que l’action du complément.

2 048 512 128 32 8 2

1

2

3

4

5

6

Semaines FIGURE 24.11 Évolution d’une fièvre typhoïde typique chez un patient non traité. L’évolution de la température corporelle suit l’évolution des symptômes cliniques. Le titre des anticorps est mesuré par la plus forte dilution du sérum (séries en dilutions au demi) agglutinant une souche témoin de Salmonella typhi. Le titre est donné par l’inverse de la dernière dilution donnant une réaction d’agglutination. Des cultures séquentielles des prélèvements mettent en évidence la présence de bactéries viables dans le sang, les selles et les urines du patient. Le pathogène n’est plus détecté dans le sang lorsque le titre des anticorps augmente ; son élimination des selles et des urines est plus longue. La fièvre diminue progressivement avec l’augmentation du titre des anticorps.



808 Chapitre 24


la meilleure preuve que la maladie est liée à l’agent infectieux suspecté. Dans certains cas cependant, notamment lorsque la prévalence du pathogène est faible dans la population, la seule présence d’anticorps spécifiques peut suffire au diagnostic de l’infection. Ces anticorps sont alors révélateurs d’une infection récente ou active. Ces notions seront reprises dans les sections 26.14, 24.11 et 24.12, consacrées respectivement au syndrome d’immunodéficience active (SIDA) et aux méthodes de diagnostic sérologique de l’infection par le VIH. Toutes les infections ne sont malheureusement pas à l’origine d’une immunité systémique. Si un pathogène reste très localisé dans l’organisme hôte, l’induction d’une réponse immune peut être faible, sans augmentation du titre des anticorps, alors que le pathogène prolifère abondamment au site de l’infection. L’infection par Neisseria gonorrhoeae, bactérie responsable de l’urétrite gonococcique, n’entraîne pas de réponse immune systémique ou protectrice, la réinfection d’un individu guéri est donc possible (voir sections 24.1et 26.12). Dans certains cas, la présence d’anticorps dans le sérum peut être due à une immunisation récente. L’évaluation de l’augmentation du titre des anticorps consécutive à une vaccination est en fait un des meilleurs moyens d’affirmer que l’immunisation a fonctionné. Les tests cutanés permettent aussi de détecter l’exposition à un pathogène. Le test cutané à la tuberculine est le plus communément utilisé. Il consiste en l’injection intradermique d’un dérivé purifié protéique soluble de culture de Mycobacterium tuberculosis. Une réaction inflammatoire positive se manifeste par un érythème et une induration atteignant leur développement maximal quarante-huit heures après l’injection ; elle révèle une infection active ou une exposition préalable à Mycobacterium tuberculosis. Ce test identifie les phénomènes d’hypersensibilité retardée causés par les lymphocytes TH1 pathogène-spécifiques (voir section 22.15). Les tests cutanés sont utilisés en routine pour le diagnostic de la tuberculose, de la lèpre (voir section 26.5), d’un certain nombre de maladies fongiques (voir section 27.8) et d’autres infections dans lesquelles la réponse anticorps est faible ou inexistante. Le tableau 24.5 liste les tests d’immunodiagnostic les plus courants.

Contrôlez vos acquis La réponse immune régit l’évolution de l’infection. L’évaluation des réponses immunes spécifiques en particulier, par les mesures des titres des anticorps et les tests cutanés, renseigne sur le stade de l’infection (infections ancienne, active et convalescence). •

Pour un agent infectieux donné, décrivez la cinétique du titre des anticorps de la phase aiguë à la phase de convalescence de l’infection.

•

Décrivez le principe et la méthodologie du test cutané à la tuberculine. Quel composant de la réponse immune ce test détecte-t-il ?

24.6 Anticorps polyclonaux m n et monoclonaux La réponse immune contre un antigène donné est à l’origine de la production d’immunoglobulines (Ig) [voir sections 22.9 et 22.10] dirigées contre les nombreux déterminants présents à la surface de l’antigène (voir section 22.5). Seules quelquesunes de ces Ig sont spécifiques d’un même déterminant antigénique. L’antisérum produit, mélange complexe de différents anticorps, est un antisérum polyclonal. Les anticorps polyclonaux confèrent une protection immune adaptée à l’hôte, étant généralement spécifiques d’un grand nombre de déterminants. La production de ces antisérums n’est généralement pas reproductible, correspondant en effet à la réponse anticorps développée par un individu donné à un temps donné. Chaque Ig est produite par une cellule B unique (voir section 22.10), après clonage in vitro, les cellules B sont capables de produire en quantité illimitée un seul type d’Ig monospécifique. Les anticorps fabriqués par un seul clone de cellules B sont des anticorps monoclonaux. Les clones de cellules B ont une longue durée de vie et peuvent être congelés et reconstitués ultérieurement, fournissant alors une source reproductible d’anticorps spécifiques. De fait, les techniques de synthèse d’anticorps monoclonaux ont supplanté les techniques de production d’anticorps polyclonaux pour de nombreuses applications immunodiagnostiques (voir tableau 24.6).

Anticorps monoclonaux et hybridomes Les cellules B productrices d’anticorps meurent en quelques semaines en culture cellulaire (in vitro). Une hybridation avec une cellule B tumorale (lignée immortelle de myélome) peut immortaliser ces lymphocytes. Les cellules hybrides résultant de cette fusion sont appelées hybridomes, elles possèdent les propriétés de chacun des deux « partenaires » de la fusion. Elles se divisent indéfiniment in vitro et produisent des anticorps monoclonaux (voir figure 24.12). La première étape pour la production d’un anticorps monoclonal est l’immunisation d’une souris contre un antigène d’intérêt. Lors des quelques semaines qui suivent cette immunisation, les cellules B spécifiques de l’antigène prolifèrent et commencent à produire des anticorps murins (voir section 22.10). Du tissu splénique, riche en lymphocytes B, est prélevé, les cellules B étant fusionnées avec des cellules de myélome (voir figure 24.12). Seule une faible fraction des hybridomes obtenus sera finalement capable de produire des anticorps viables. Les hybridomes sont d’abord sélectionnés par l’addition d’hypoxanthine, d’aminoptérine et de thymidine au milieu de culture cellulaire (milieu HAT). Ce milieu stoppe la croissance des cellules myélomateuses non fusionnées car, bien qu’ayant une multiplication indéfinie in vitro, elles sont incapables d’utiliser les métabolites hypoxanthine et thymidine pour contourner le blocage métabolique engendré par le poison cellulaire qu’est l’aminoptérine ; elles mourront donc en quelques jours (déficit enzymatique de la cellule myélomateuse en HGPRT – hypoxantine guanine phosphoribosyl transférase). À l’inverse, les hybridomes prolifèrent normalement en milieu HAT, puisqu’ils ont reçu de leur cellule B partenaire l’information génétique nécessaire à l’utilisation de l’hypoxanthine et de la thymidine.



24.6 Anticorps polyclonaux et monoclonaux 809

TABLEAU 24.5

MÉTHODES D’IMMUNOANALYSE POUR L’IDENTIFICATION D’AGENTS INFECTIEUX

Pathogène/maladie

Méthodea

Antigène

VIH (SIDA) Borrelia burgdorferi (maladie de Lyme)

Virus de l’immunodéficience humaine (VIH) Flagelline Protéines de surface

ELISA ELISA Immunoblot Test de bactéricidie (voir section 27.4)

Brucella (brucellose)

Antigène de la paroi cellulaire

Agglutination

Candida albicans (candidose)

Extrait soluble de protéines fongiques

Test cutané

Corynebacterium diphtheriae (diphtérie)

Toxine

Test cutané (test de Schick)

Virus influenza (grippe)

Suspensions de virus de la grippe Cellules nasopharyngées infectées par le virus de la grippe

Fixation du complément Immunofluorescence

Mycobacterium leprae (lèpre)

Lépromine (extrait soluble de protéines bactériennes)

Test cutané

Mycobacterium tuberculosis (tuberculose)

Tuberculine (dérivé protéique purifié, PPD)

Test cutané

Neisseria meningitidis (méningite)

Polysaccharide de capside

Hémagglutination passive (polysaccharide de N. meningitidis adsorbé sur des hématies)

Pneumocystis jiroveci (infection pulmonaire)

Cellules infectées par P. jiroveci

Immunofluorescence

Rickettsioses (fièvre Q, typhus, fièvre pourprée des Montagnes Rocheuses)

Rickettsies tuées

Fixation du complément ou tests d’agglutination cellulaire ELISA

Salmonella (gastro-entérite)

Antigènes O et H

Agglutination (test de Widal) ELISA

Streptococcus (groupe A) [angine streptococcique, scarlatine]

Streptolysine O (exotoxine), DNase (protéine extracellulaire)

Neutralisation de l’hémolyse Neutralisation de l’enzyme

Treponema pallidum (syphilis)

Cardiolipine-lécithine-cholestérol

Flocculation [test Venereal Disease Research Laboratory (VDRL)]

Vibrio cholerae (choléra)

Antigène O

Agglutination Test de bactéricidie (en présence de complément) ELISA

a Les tests d’immunofluorescence utilisent des anticorps synthétiques spécifiques d’un micro-organisme potentiellement présent dans le prélèvement du patient. Les tests cutanés pour la recherche de C. albicans, M. tuberculosis et M. leprae révèlent une hypersensibilité retardée de type TH1. Le test cutané de Schick détecte les anticorps sériques par une réaction de neutralisation d’une toxine de C. diphteriae. Tous les autres tests mesurent le titre des anticorps sériques.

L’identification des hybridomes producteurs d’anticorps monoclonaux peut se faire par un test ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) [voir section 24.10]. À partir d’une fusion, de nombreux clones distincts sont isolés, chacun produisant un anticorps monoclonal différent. Lorsque les clones

TABLEAU 24.6

d’intérêt sont identifiés, ils peuvent croître in vivo comme une tumeur productrice d’anticorps ou en culture cellulaire. L’anticorps peut être obtenu à partir de la tumeur ou du surnageant de culture cellulaire. Les hybridomes sont reproduits indéfiniment en culture ou sont congelés.

CARACTÉRISTIQUES DE LA PRODUCTION D’ANTICORPS POLYCLONAUX ET MONOCLONAUX Polyclonaux

Monoclonaux

Mélange d’anticorps reconnaissant de nombreux déterminants différents sur un même antigène

Mélange d’un seul type d’anticorps spécifique d’un déterminant antigénique unique

Anticorps de différentes classes (IgG, IgM, etc.)

Anticorps d’une seule classe

Production d’anticorps spécifiques exclusivement à partir d’un antigène hautement purifié

Production d’anticorps spécifiques à partir d’un antigène non purifié

Reproductibilité et standardisation difficiles

Hautement reproductible



810 Chapitre 24


Antigène Cellules de myélome

Fusion des cellules pour la formation d’hybridomes

Cellules B spléniques produisant des anticorps

Multiplication des cellules en culture in vitro

Clonage individuel des hybridomes en plaques de microtitration

Test des clones pour l’anticorps requis

Perpétuation sous forme de Hybridome tumoral murin

Culture cellulaire

Anticorps monoclonaux FIGURE 24.12 Technique des hybridomes et production d’anticorps monoclonaux. Les hybridomes peuvent être cultivés indéfiniment ou injectés à l’animal sous forme de tumeur. Les cellules de l’hybridome peuvent être conservées congelées et reconstituées à la demande, en culture tissulaire ou chez un animal hôte.

Applications diagnostiques et thérapeutiques Les anticorps monoclonaux sont des réactifs biologiques hautement spécifiques utilisés dans de nombreux tests : diagnostic clinique, typage immunologique de bactéries, identification d’antigènes étrangers à la surface de cellules (infections virales cellulaires), identification et quantification de produits

d’expression génique. L’utilisation de ces anticorps monoclonaux permet également d’augmenter la spécificité de tests cliniques existants (typage sanguin, tissulaire). Par leur spécificité, les anticorps monoclonaux servent au diagnostic et au traitement de cancers humains. Les cellules malignes portent à leur surface divers antigènes non exprimés par les cellules normales. Ces antigènes tumoraux sont des protéines cellulaires uniques, tumeur-spécifiques. Des anticorps monoclonaux synthétiques dirigés contre les antigènes tumoraux et liés de façon covalente à des toxines sont en cours d’essais cliniques. Ils ciblent particulièrement les cellules malignes et permettent la libération directe de toxines spécifiquement dirigées contre les cellules malignes. La spécificité de ces traitements par anticorps monoclonaux peut fortement améliorer les chimiothérapies actuelles, offrant une alternative aux traitements chimiques et de radiothérapie qui altèrent aussi bien les cellules normales de l’hôte que les cellules cancéreuses.

Contrôlez vos acquis Les anticorps polyclonaux et monoclonaux sont utilisés dans le diagnostic clinique et en recherche. La technique des hybridomes permet la synthèse reproductible d’anticorps monospécifiques utiles à des fins cliniques, diagnostiques ainsi qu’en recherche. •

Indiquez comment un mélange d’anticorps polyclonaux peut reconnaître un grand nombre de déterminants.

•

Précisez quels sont les avantages des anticorps monoclonaux comparés aux anticorps polyclonaux, et inversement.

24.7 Réactions antigène-anticorps m n in vitro : sérologie La sérologie est l’étude des réactions antigène-anticorps in vitro (en général dans le sérum). Les réactions sérologiques sont à la base de tous les tests immunodiagnostiques. Les principes de la réaction antigène-anticorps résident dans l’interaction spécifique de déterminants antigéniques avec la région variable de la molécule anticorps. Divers tests sérologiques sont utilisés pour l’identification d’antigènes, ils dépendent des propriétés de l’antigène et des conditions choisies pour la réaction (voir tableau 24.7).

Spécificité et sensibilité L’intérêt d’un test de diagnostic sérologique dépend de sa spécificité et de sa sensibilité. La spécificité est la capacité d’une préparation d’anticorps à reconnaître un antigène unique. Pour une spécificité optimale sans résultat faussement positif, aucune réactivité croisée avec d’autres antigènes ne doit être observée. L’utilisation de contrôles antigéniques positifs et négatifs est incontournable. La spécificité de chaque test doit être déterminée expérimentalement et vérifiée à chaque utilisation du test.



24.7 Réactions antigène-anticorps in vitro : sérologie 811

TABLEAU 24.7

DIFFÉRENTS TYPES DE RÉACTIONS ANTIGÈNE-ANTICORPS

Localisation de l’antigène

Facteurs auxiliaires requis

Type de réaction

Soluble

Aucun

Précipitation (voir section 24.7)

Surface cellulaire ou particule inerte

Aucun

Agglutination (voir section 24.8)

Flagelle

Aucun

Immobilisation ou agglutination (voir section 24.8)

Surface bactérienne

Complément

Lyse (voir section 22.11)


Complément

Opsonisation-lyse (voir section 22.11)

Surface des érythrocytes

Complément

Hémolyse (voir section 22.11)

Toxine

Aucun

Neutralisation (voir section 24.7)

Virus

Aucun

Neutralisation (voir section 24.7)


Phagocyte, complément

Phagocytose (opsonisation ; voir section 22.11)

La sensibilité définit le niveau le plus faible auquel un antigène peut être détecté. Le plus haut niveau de sensibilité correspond à la capacité du réactif anticorps à identifier une seule molécule d’antigène. Quand la sensibilité est élevée, le risque de résultats faussement négatifs est faible (voir tableau 24.8). La quantité seuil d’antigène détectée par chaque test est proportionnelle à la quantité d’anticorps utilisée. Les réactions d’immunoprécipitation sont parmi les tests sérologiques les moins sensibles ; elles nécessitent de forts niveaux d’anticorps et détectent généralement 0,1 à 1 mg d’antigène. Les ELISA (voir section 24.10) font partie des tests les plus sensibles et, avec 100 000 fois moins d’anticorps nécessaires, ils détectent des quantités d’antigène un million de fois moindres (0,1 à 1 ng) que les antigènes précipitants. Toxine + antitoxine

Cellule

La neutralisation La neutralisation est l’interaction in vivo ou in vitro d’un anticorps avec un antigène, conduisant à la réduction ou à l’inhibition de l’activité biologique de l’antigène. Ainsi, un anticorps spécifique est capable de neutraliser une toxine microbienne en bloquant la partie active de la toxine (voir figure 24.13) [cas des exotoxines bactériennes, voir tableau 21.4]. Un antisérum contenant des anticorps neutralisant une toxine est une antitoxine. Des antitoxines sont utilisées dans le traitement du botulisme (voir section 29.6), du tétanos (voir section 27.9) et de la diphtérie (voir section 26.3), toutes ces maladies étant liées à la production d’exotoxines bactériennes. Certains virus peuvent aussi être neutralisés par des anticorps spécifiques. Les anticorps spécifiques de l’hémagglutinine et de la neuraminidase des virus de la grippe empêchent l’adsorption des virus sur les récepteurs des cellules hôtes (voir section 26.8). Les réactions de neutralisation sont utilisées dans des tests in vitro à partir du sérum du patient dans des centres

Toxines

TABLEAU 24.8

SENSIBILITÉ DES TESTS IMMUNODIAGNOSTIQUES

Test Toxine neutralisée Destruction cellulaire

(a)

Absence de destruction cellulaire (b)

FIGURE 24.13 Neutralisation d’une exotoxine par des anticorps. L’utilisation des antitoxines est un recours dans le traitement de cas aigus de diphtérie (voir section 26.3), de tétanos (voir section 27.9) et de botulisme (voir section 29.6). (a) En l’absence de traitement, les toxines détruisent les cellules. (b) Les antitoxines neutralisent les toxines et inhibent la destruction cellulaire.

Sensibilité (µg d’anticorps/mL)a

Réaction de précipitation en solution

24–160

sur gels (immunodiffusion double)

24–160

Réactions d’agglutination directe

0,4

passive

0,08

Test radio-immunologique (RIA ou Radioimmunoassay)

0,0008–0,008

ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay)

0,0008–0,008

Immunofluorescence

8

a

Quantité minimale d’anticorps nécessaire à l’obtention d’une réaction positive en présence de l’antigène.



812 Chapitre 24


spécialisés, mais pas dans les laboratoires de diagnostic de routine, parce que ces tests de neutralisation nécessitent des systèmes biologiquement actifs.

La précipitation La précipitation est la formation d’un complexe insoluble résultant de l’interaction d’un anticorps soluble avec un antigène soluble. Les molécules d’anticorps ont généralement deux sites de liaison à l’antigène (voir section 22.9), chacun de ces sites pouvant se fixer sur deux molécules d’antigène. Si l’antigène a plus d’un déterminant libre, un précipité d’agrégats d’anticorps et d’antigènes peut se développer (voir figure 24.14a). Les réactions de précipitation sont facilement analysables in vitro ; ce sont des tests sérologiques très informatifs, particulièrement pour la quantification de concentrations en anticorps. Les proportions des deux substances réactives doivent être optimales, un excès d’anticorps ou d’antigène conduisant à la formation de petits complexes immuns solubles. Les réactions de précipitation en gels d’agarose ou tests d’immunodiffusion (ou « immunodiffusion double » ou « réaction d’Ouchterlony ») étudient la spécificité des réactions

Zone d’excès d’anticorps

Équivalence Zone d’excès d’antigène

Intensité du précipité

Concentration en antigène

antigène-anticorps. Les solutions d’antigène et d’anticorps sont déposées dans des puits percés à distance dans le gel et diffusent, des lignes de précipitation apparaissant au niveau où ils interagissent dans des proportions optimales (voir figure 24.14b). Ces lignes sont caractéristiques des deux substances réactives. Les interactions moléculaires de deux antigènes différents avec un antisérum peuvent être évaluées par l’observation des lignes formées lorsque les deux antigènes sont déposés dans deux puits adjacents, à proximité du puits de l’antisérum. Si les deux antigènes sont identiques, il se forme une seule ligne de précipité (ligne d’identité). Si les puits adjacents contiennent un antigène commun et l’un des puits un second antigène, une ligne d’identité partielle apparaît (voir figure 24.14b). L’extension de la ligne de précipité (représentant l’interaction de l’antisérum avec le second antigène) est appelée éperon. L’immunodiffusion est un outil de recherche en biochimie pour évaluer les relations entre des protéines issues de sources différentes. Si les réactions de précipitations se lisent aisément, elles sont néanmoins peu sensibles et s’utilisent seulement en recherche ou dans les laboratoires de référence. En effet, des quantités d’anticorps spécifiques de l’ordre du microgramme sont nécessaires pour la visualisation du précipité (voir tableau 24.8), mais la plupart des tests de diagnostic usuels nécessitent des niveaux de sensibilité de l’ordre du nanogramme.

Contrôlez vos acquis Les réactions antigène-anticorps dépendent de la liaison de l’anticorps à l’antigène. La spécificité et la sensibilité définissent la précision des tests sérologiques. Les réactions de neutralisation et de précipitation sont des tests de lecture aisée basés sur l’interaction antigène-anticorps. •

En sérologie, une forte spécificité prévient des réactions faussement positives. Une forte sensibilité diminue le risque de réactions faussement négatives. Expliquez.

•

Expliquez le principe de la réaction de neutralisation.

•

Indiquez les quantités minimales d’antigène et d’anticorps requises pour une réaction de précipitation.

(a)

B C

F A

S

E

A S

C. Weibull, W. D. Bickel, W. T. Hashius, K. C. Milner, et E. Ribi

Éperon

(b) FIGURE 24.14 Réactions de précipitation entre des anticorps et des antigènes solubles. La courbe (a) montre l’intensité de la réaction de précipitation en fonction de la concentration en antigène et anticorps. (b) Précipitation en gel d’agarose ou immunodiffusion. Puits S : anticorps de Proteus mirabilis. Puits A, B et C : extraits solubles de Proteus mirabilis. À gauche, présence d’une ligne d’identité. À droite, l’antigène E ne réagit pas ; identité partielle entre les antigènes A et F (présence d’un éperon).

24.8 Agglutination m n L’agglutination est une réaction entre un antigène et un anticorps spécifique qui forme un agglutinat visible. Bien que moins sensible que certains tests sérologiques, les tests d’agglutination sont environ cent fois plus sensibles que les tests de précipitation (voir tableau 24.8). Simples d’utilisation, très spécifiques, peu coûteux, rapides et relativement sensibles, ces tests sont largement utilisés en laboratoire de diagnostic clinique et biologique (identification des antigènes de groupe sanguin et de pathogènes).



24.8 Agglutination 813

L’agglutination directe L’agglutination directe est le résultat de l’interaction d’un anticorps soluble avec un antigène de surface cellulaire ou une autre particule insoluble. On utilise ces réactions pour la classification des antigènes de surface des globules rouges (érythrocytes). L’agglutination des érythrocytes, appelée hémagglutination, est à la base du groupage sanguin (détermination des groupes sanguins). Les globules rouges portent toute une variété d’antigènes de surface, et il existe un polymorphisme des divers éléments du sang entre les individus, ce qui rend impossible la transfusion entre certains groupes de personnes. Les antigènes majeurs des érythrocytes humains sont appelés A, B et O. Les antigènes A et B, ainsi que leurs anticorps respectifs, sont à la base du groupage sanguin. Les anticorps spécifiques de ces antigènes érythrocytaires créent un agglutinat visible dès qu’une goutte de sang est mélangée sur une lame avec un antisérum réagissant avec l’un ou l’autre des antigènes A ou B (voir figure 24.15). Les antisérums proviennent de donneurs humains immunisés naturellement ou artificiellement avec les antigènes A ou B. Le groupage sanguin doit être fait avant toute transfusion afin d’empêcher la destruction des globules rouges, qui pourrait avoir lieu si les anticorps sanguins de la personne transfusée réagissaient avec les globules rouges du sang transfusé, ou vice versa. Une hémolyse se produirait alors (lyse des érythrocytes cibles des anticorps) à travers l’action du complément (voir section 22.11), résultant en une anémie grave.

L’agglutination passive

Norman L. Morris

L’agglutination passive est l’agglutination d’antigènes ou d’anticorps solubles, adsorbés ou couplés chimiquement soit à des cellules, soit à des billes de latex ou à des

particules de charbon. La cellule ou la particule se définit dans ce cas comme un porteur inerte. Les réactions d’agglutination passive ont une sensibilité pouvant être jusqu’à cinq fois supérieure à celle des tests d’agglutination directe (voir tableau 24.8). Ces réactions sont des techniques de diagnostic rapide. De petites billes de latex (8 µm) sur lesquelles est fixé un antigène spécifique sont mélangées avec le sérum du patient sur une lame de microscope et incubées pendant un temps très court. Si les anticorps du patient se lient à l’antigène présent à la surface des billes, un agglutinat blanc laiteux apparaît, indiquant une réaction d’agglutination positive. L’agglutination latex est aussi utilisée pour la détection d’antigènes de surface bactérienne en mélangeant une fraction d’une colonie bactérienne avec des billes, sur lesquelles sont fixés des anticorps. L’identification de souches cliniques de Staphylococcus aureus par agglutination avec une spécificité proche de 100 % en est un exemple (voir figure 24.16) ; le test est réalisé en seulement trente secondes, avantage non négligeable par rapport aux délais de la culture classique. D’autres tests d’agglutination de billes de latex permettent l’identification de différents streptocoques β-hémolytiques du groupe A de Lancefield (Streptococcus pyogenes), B, C, D, F et G (voir section 12.19), Neisseria gonorrhoeae et Neisseria menigitidis, Haemophilus influenza, Escherichia coli O157:H7, des virus responsables de gastroentérites (rotavirus, adénovirus) et les champignons Cryptococcus neoformans et Candida albicans. Le test d’agglutination latex pour la détection d’anticorps sériques spécifiques du facteur rhumatoïde est largement utilisé (auto-anticorps associé à la polyarthrite rhumatoïde – voir section 22.15). Des immunoglobulines humaines sont fixées sur les billes de latex, elles-mêmes mélangées avec du sang total ou du sérum, et l’agglutination obtenue est comparée aux contrôles positifs et négatifs. La sensibilité et la spécificité des tests d’agglutination passive sont souvent élevées. Aucun équipement coûteux ni de compétence particulière ne sont nécessaires pour leur mise en œuvre, ce qui en fait des tests adaptés aux programmes de dépistage à grande échelle, utilisés largement en diagnostic clinique et en recherche.

(a) Pourcentage Type de la population sanguin aux États-Unis Anti A Type O Type A Type B Type AB

47 42 8 3

– + – +


Sérum Anti B – – + +

(b) FIGURE 24.15 Agglutination directe de globules rouges humains pour le typage sanguin ABO. (a) À gauche : absence d’agglutination. Au centre : agglutination diffuse correspondant à une réaction positive pour le groupe sanguin B. À droite : forte agglutination avec présence de grands agglutinats typiques du groupe sanguin A. (b) Tableau des caractéristiques du groupage sanguin dans la population des États-Unis (– : absence d’agglutination ; + : agglutination).

Les tests d’agglutination sont largement utilisés pour la détermination des groupes sanguins. Un grand nombre de tests d’agglutination passive sont disponibles pour l’identification de différents pathogènes et produits de pathogènes. Ces tests sont rapides, relativement sensibles, hautement spécifiques, simples à mettre en œuvre et peu coûteux. •

Précisez quelle est la différence entre l’agglutination directe et passive. Quels sont les tests les plus sensibles ?

•

Précisez quels sont les avantages et les inconvénients des tests d’agglutination par rapport à d’autres immunoanalyses.





814 Chapitre 24

FIGURE 24.16 Agglutination de billes de latex pour l’identification de Staphylococcus aureus. Réaction 1 : témoin négatif. La couleur rose uniforme correspond aux billes de latex sur lesquelles sont fixés des anticorps dirigés contre la protéine A et la coagulase liée (clumping factor), deux antigènes présents exclusivement à la surface de S. aureus. Réaction 2 : correspond à la même suspension, mais après ajout de colonies de S. aureus. Les agglutinats rouge vif correspondent à une réaction d’agglutination positive révélant que la colonie correspond à S. aureus.

queur utilisé. Ces anticorps fluorescents permettent l’identification de micro-organismes directement dans les prélèvements pathologiques (in situ), dans des échantillons pour études d’écologie microbienne, sans passer par des techniques d’isolement et de culture (voir ci-dessous et section 18.3). On parle de marquage fluorescent direct ou indirect. Dans la technique directe, l’anticorps, dirigé contre l’antigène de surface, est lié de façon covalente au marqueur fluorescent. Dans la technique indirecte, la présence d’un anticorps non fluorescent à la surface cellulaire est détectée par un anticorps fluorescent dirigé contre l’anticorps non fluorescent (voir figure 24.18). Antigène Bactérie

Anticorps antibactériens marqués par un fluorochrome

24.9 Anticorps fluorescents m n Des marqueurs fluorescents peuvent modifier les anticorps chimiquement pour la détection d’antigènes à la surface cellulaire. Ces anticorps fluorescents sont utilisés en diagnostic et en recherche, et sont souvent mis à contribution pour l’identification de nouveaux virus en culture.

(a) Antigène

Les techniques de fluorescence Des marqueurs fluorescents peuvent être liés de façon covalente à des anticorps : la rhodamine B, qui fluoresce en rouge, ou l’isothiocyanate de fluorescéine, qui fluoresce en jaune-vert. Ce marquage ne modifie pas la spécificité de l’anticorps, mais permet la lecture avec un microscope à fluorescence (voir figure 24.17). Les anticorps fluorescents liés à une cellule émettent une fluorescence lorsqu’ils sont excités par une lumière de longueur d’onde définie. La lumière fluorescente émise est le plus souvent rouge-orange ou jaune-vert en fonction du mar-

Anticorps antibactériens de lapin (non marqués)

Immunoglobuline anti-lapin marquée par un fluorochrome

Wellcome Research Laboratories

FIGURE 24.17 Réactions utilisant des anticorps fluorescents. Des anticorps conjugués avec l’isothiocyanate de fluorescéine, à la fluorescence jaune-vert, marquent les bactéries Clostridium septicum. Des anticorps conjugués avec la rhodamine B, à la fluorescence rouge-orange, marquent les Clostridium chauvoei.

Bactérie

(b) FIGURE 24.18 Méthodes de fluorescence pour la détection d’antigènes à la surface des micro-organismes. (a) Marquage direct ; (b) marquage indirect.



24.9 Anticorps fluorescents 815

Les applications

William B. Cherry

Dharam Ablashi et Robert C. Gallo

(a)

(b)

FIGURE 24.19 Exemples d’utilisation d’anticorps fluorescents en microbiologie clinique. (a) Marquage immunofluorescent de Legionella pneumophila (longueur de 2 à 5 µm), agent de la légionellose. L’échantillon provient d’une biopsie de tissu pulmonaire. (b) Détection par immunofluorescence de cellules infectées par des virus. Les cellules spléniques infectées par le virus lymphotrope B humain (HBLV) sont incubées avec un sérum contenant des anticorps spécifiques de HBLV provenant d’un patient souffrant d’un désordre lymphoprolifératif. Les cellules sont ensuite incubées avec des IgG antihumaines conjuguées à l’isothiocyanate de fluorescéine. Les cellules infectées par le virus HBLV fluorescent en jaune brillant. Les cellules en arrière-plan n’ont pas réagi avec le sérum du patient. Chaque cellule a un diamètre d’environ 10 µm.

(a)

G. Bradley

Dans un test classique, un anticorps fluorescent est mis en présence d’un échantillon suspect de contenir un agent pathogène. Si le pathogène en question a des antigènes de surface reconnus par l’anticorps, la microscopie à fluorescence autorise la visualisation des cellules fluorescentes (voir figure 24.19). Des anticorps fluorescents sont aussi utilisés pour un marquage direct de tissus infectés, ce qui permet d’obtenir un diagnostic bien avant les techniques d’isolement primaire. Par exemple, le diagnostic de légionellose (voir section 28.7) est mis en œuvre par marquage du tissu pulmonaire avec des anticorps fluorescents spécifiques des antigènes de paroi de Legionella pneumophila (voir figure 24.19a). De même, un test d’immunofluorescence directe identifie un antigène de capsule de Bacillus anthracis et confirme le diagnostic d’anthrax (voir figure 21.14). C’est aussi par cette méthodologie que l’on peut identifier une infection par Bordetella pertussis, agent de la coqueluche (voir section 26.4). Les tests de fluorescence directe sont aussi utilisés dans le diagnostic d’infections virales (voir figure 24.19b). Les virus respiratoires communs, grippe A et B, virus parainfluenza, virus respiratoire syncitial (VRS), adénovirus, sont identifiés au sein de prélèvements respiratoires avec des anticorps spécifiques par immunofluorescence directe. Ces techniques utilisant des anticorps fluorescents permettent aussi l’identification de virus se répliquant dans des cultures cellulaires. Le diagnostic de certaines maladies non infectieuses a aussi recours aux anticorps fluorescents, notamment pour l’identification de cellules interagissant avec un antigène particulier. Ainsi, des anticorps fluorescents dirigés contre des antigènes tumoraux exprimés par des cellules malignes identifient des cellules malignes et permettent le suivi de l’évolution de la maladie (voir figure 24.20).

(b) FIGURE 24.20 Utilisation d’anticorps fluorescents dans le diagnostic de maladies non infectieuses. (a) Cellules humaines leucémiques (10 à 12 µm de diamètre), dont certaines sont sensibles à une molécule toxique anticancéreuse, d’autres non, qu’on ne peut différencier. (b) Si les cellules en (a) sont traitées avec un anticorps monoclonal spécifique d’une protéine présente exclusivement à la surface des cellules résistantes à l’anticancéreux, elles fluorescent, mais pas les cellules sensibles.

Des anticorps fluorescents servent à la séparation de cellules en populations relativement pures ou au dénombrement des différents types cellulaires au sein de mélanges complexes tels que le sang (cas des anticorps monoclonaux dirigés contre les antigènes CD4 et CD8 à la surface des lymphocytes T) [voir section 22.6 et voir figure 24.21]. Le stade SIDA de l’infection par le VIH est défini par un taux de CD4 bas (soit un taux inférieur à 200/mm3). La numération des cellules T CD4 est un élément important dans le suivi de l’évolution de l’infection (voir section 26.14). Un appareil, le cytomètre de flux ou « fluorescence-activated cell sorter » (FACS), permet de compter et de trier les cellules marquées par des anticorps fluorescents. Un faisceau laser active les anticorps fluorescents fixés sur les cellules, plaçant une charge sur celles qui sont marquées. Un champ électrique est ensuite appliqué au mélange cellulaire. Les cellules fluorescentes et non fluorescentes sont alors dirigées aux pôles opposés du champ électrique, où chaque population est comptée et triée dans un tube. Lors de l’utilisation de différents anticorps portant des marqueurs fluorescents distincts, divers marqueurs cellulaires peuvent être simultanément identifiés (voir figure 24.22). Les immunologistes utilisent fréquemment le FACS pour séparer des mélanges complexes de cellules immunes. Ils étudient alors les propriétés de populations cellulaires fortement enrichies. La cytométrie de flux a aussi des applications en virologie, pour la recherche d’antigènes viraux.




Richard Lewis

816 Chapitre 24

FIGURE 24.21 Lymphocytes T marqués avec des anticorps fluorescents spécifiques de marqueurs de surface. Les cellules jaune-vert sont des cellules TC (CD8) ; les cellules orange-rouge sont des cellules TH (CD4). Un cytomètre de flux trieur de cellules peut séparer ces cellules les unes des autres afin d’enrichir chacune des populations cellulaires. Chaque cellule a un diamètre d’environ 10 à 12 µm. Publié avec la permission de Science, 239 (couverture), 12 février 1988, © AAAS.

1000

FITC\PE

1

L’utilisation des techniques à base d’anticorps fluorescents n’est cependant pas dénuée de pièges, comme des marquages non spécifiques lors de réactions croisées entre antigènes de surface de diverses espèces bactériennes, dont certaines appartiennent à la flore normale. C’est un problème majeur parmi les bactéries entériques dont les antigènes lipopolysaccharidiques (voir section 4.9) sont suffisamment similaires entre espèces pour que la sonde fluorescente se lie à plusieurs organismes différents. Le microbiologiste doit alors opérer des contrôles avec des sérums non spécifiques et confirmer les résultats positifs en immunofluorescence par d’autres tests immunologiques ou microbiologiques.

Contrôlez vos acquis Les anticorps fluorescents sont utilisés pour l’identification rapide et précise de pathogènes et de substances antigéniques d’échantillons tissulaires ou de l’environnement. Ces méthodes permettent aussi l’identification, la numération et le tri de divers types cellulaires. •

Expliquez les principes, avantages et inconvénients des tests d’immunofluorescence directe et indirecte.

•

Comment des anticorps fluorescents peuvent-ils spécifiquement identifier des cellules dans des mélanges complexes tels que le sang ?

1000

2

1

FITC\PE

100

100

2,7 % cellules TH

56,3 % cellules TH

B

1

(a)

3

.1

1

1

4

10 CD3-FITC

100

.1

1000

3

.1

1

4

10 CD3-FITC

100

Peter McConnachie

CD4-PE 10

CD4-PE 10

.1

2

1000

(b)

FIGURE 24.22 Numération des cellules CD3 et CD4. Les échantillons, qu’un cytomètre de flux trieur de cellules a analysés, proviennent d’un individu sain (a) et d’un patient souffrant du syndrome d’immuno-déficience acquise (SIDA) (b). Chaque point représente une seule cellule. Les cellules du sang périphérique ont été marquées simultanément avec des anticorps anti-CD4, conjugués à la phycoérythrine (PE), et avec des anticorps anti-CD3, conjugués à l’isothiocyanate de fluorescéine (FITC). Toutes les cellules T portent le marqueur CD3 ; seules les cellules T-helper (TH) portent le marqueur CD4. Le quadrant 3 montre les cellules non marquées. Le quadrant 1 montre les cellules uniquement marquées par les anti-CD4. Le quadrant 4 montre les cellules uniquement marquées avec les anti-CD3. Le quadrant 2 montre les cellules doublement marquées par les anti-CD3 et les anti-CD4. (a) Homme sain. 56,3 % des cellules T sont des cellules T H (profil de marquage dense dans le quadrant 2). (b) Patient au stade SIDA. Seules 2,7 % des cellules T sont des T H (très faible intensité de marquage dans le quadrant 2). Données originales de Peter McConnachie, utilisées après autorisation.



24.10 Tests immunoenzymatiques (ELISA) et dosages radio-immunologiques (RIA) 817

m n

24.10 Tests immunoenzymatiques (ELISA) et dosages radioimmunologiques (RIA)

Les tests immunologiques utilisés en diagnostic doivent avoir une forte sensibilité et donc la capacité de détecter de très faibles quantités de complexes antigène-anticorps (voir section 24.5 et tableau 24.8). Par leur forte sensibilité, les tests ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) et RIA (radioimmunoassay) sont largement utilisés. Dans ces tests, des enzymes et des radio-isotopes marquent respectivement les anticorps. La fixation covalente de ces molécules sur les anticorps diminue la quantité de complexes antigène-anticorps requise pour être détectés. Ces tests ont des applications en diagnostic clinique et en recherche.

Les tests ELISA La liaison covalente enzyme-anticorps utilisée dans les tests ELISA n’altère ni l’activité catalytique de l’enzyme ni la spécificité de l’anticorps. Généralement ces enzymes sont la peroxydase, la phosphatase alcaline et la β-galactosidase. Chacune catalyse des réactions produisant des substances colorées qui sont détectées à des taux très faibles par un spectrophotomètre. Ces tests immunologiques sont fortement spécifiques et surtout sensibles. La méthode ELISA directe détecte des antigènes, et la méthode ELISA indirecte détecte des anticorps. Des particules virales sériques ou fécales sont par exemple recherchées par des méthodes directes dans lesquelles l’antigène est « piégé » entre deux couches d’anticorps (voir figure 24.23), on parle aussi d’ELISA sandwich. L’échantillon est ajouté dans les puits d’une microplaque au fond desquels des anticorps spécifiques de l’antigène recherché ont été préalablement fixés (étape de coating). Si l’antigène (une particule virale, par exemple) est présent dans l’échantillon, il est capté par les sites de liaison à l’antigène présents à la surface des anticorps. Après élimination des molécules non fixées, un deuxième anticorps conjugué à une enzyme et également spécifique de l’antigène est ajouté et se lie aux autres déterminants restant exposés à la surface de l’antigène. Après lavage, l’addition d’un substrat incolore de l’enzyme détermine l’activité enzymatique des complexes présents dans chacun des puits de la microplaque. La coloration produite est proportionnelle à la quantité d’antigènes présents (voir figure 24.23). La méthode ELISA indirecte est largement utilisée pour la recherche d’anticorps anti-VIH dans différents fluides de l’organisme, le principe de ce diagnostic s’appliquant à l’ensemble des tests ELISA indirects (voir figure 24.24). Des procédés ELISA rapides utilisent des réactifs adsorbés sur un support matériel comme des bandelettes de papier, des membranes plastiques ou de nitrocellulose, ou des bâtonnets en plastique (dipstick). Une réaction colorée apparaît sur ces supports en un temps très court. Ces tests rapides servent au diagnostic d’urgence de maladies infectieuses comme l’infection par le VIH (voir section 26.14) ou l’angine streptococcique (infection pharyngée à Streptococcus pyogenes – voir section 26.2). Ces tests rapides sont aussi utilisés, en dehors de maladies infectieuses, pour le diagnostic de grossesse ou la recherche

de toxiques (voir figure 24.25). Généralement, un échantillon urinaire ou sanguin est déposé sur la matrice support des réactifs. Après un bref temps d’incubation puis un lavage, un second réactif révèle la matrice, identifie l’antigène (test direct) ou l’anticorps (test indirect) lié à cette matrice. Ces tests sont particulièrement adaptés lorsqu’un petit nombre d’échantillons doivent être analysés notamment sur le lieu de prélèvement, en dehors du laboratoire d’analyse par exemple. Ces tests ont l’intérêt de ne pas nécessiter de compétences techniques pour être mis en œuvre. Les résultats sont alors obtenus in situ, limitant les délais de prise en charge du patient et évitant toute convocation ultérieure pour le rendu de résultats. L’inconvénient de ces tests est leur moindre spécificité par rapport aux tests plus élaborés. Aussi ces tests doivent-ils le plus souvent être confirmés par une technique standard.

Les tests ELISA VIH Le VIH (virus de l’immunodéficience humaine), virus responsable du syndrome d’immunodéficience acquise (SIDA – voir section 26.14) est entre autres transmis par le sang. Des outils de criblage sensibles, spécifiques, rapides et peu coûteux sont requis pour tester des sérums d’individus exposés au VIH ou pour s’assurer de l’absence de risque de transmission du VIH lors d’une transfusion sanguine ou de produits sanguins. Des tests ELISA sont utilisés en routine pour le dépistage de l’infection par VIH sur des échantillons sanguins. Ces tests sont des ELISA indirects recherchant des anticorps anti-VIH dans le sérum. Dès le début de l’infection, des anticorps dirigés contre divers antigènes sont produits, notamment des antigènes de l’enveloppe virale, que les tests ELISA VIH détectent (voir figure 24.24). Une réaction positive indique que les anticorps présents dans le sérum du patient reconnaissent les antigènes VIH, que le patient a des anticorps anti-VIH et que ce virus l’infecte. Des sérums contrôles (VIH positif et négatif) sont inclus en parallèle du sérum du patient pour établir la spécificité (contrôle positif) et pour mesurer le bruit de fond d’absorbance du test (contrôle négatif). Le test ELISA VIH est une technique rapide, très sensible, spécifique pour la recherche d’une exposition au VIH. Les tests ELISA conviennent au dépistage en série et sont facilement automatisables. Dans ce sens le test ELISA VIH est une technique standard de criblage d’échantillons sanguins. Dans certaines conditions, ce test peut néanmoins donner des résultats faussement positifs qu’une technique différente doit confirmer, le plus souvent une technique de Western blot (ou immunoblot – voir section 24.11). Une technique Western blot VIH positive associée à un ELISA VIH positif est la preuve d’une infection par le VIH. Le test ELISA VIH présente aussi l’inconvénient de pouvoir donner des résultats faussement négatifs. Le système immunitaire développe une réponse anticorps dont le titre n’est détectable que plusieurs semaines après l’exposition à l’antigène (voir section 24.5). Dans le cas de l’infection par le VIH, ce délai peut atteindre six semaines (en moyenne trois semaines). Pour limiter ce délai à une ou deux semaines, des tests ELISA combinés (antigène et anticorps) ont été développés. Ainsi, des individus infectés récemment par le VIH sont susceptibles de ne pas produire un titre détectable d’anticorps au moment du test. Rarement, des résultats faussement négatifs peuvent aussi être obtenus au stade SIDA, où le système



818 Chapitre 24


Test positif

Procédure

Test négatif

1. Fixation des anticorps ( ) dirigés contre le virus ( ) au fond des puits d’une microplaque de titration Surface des puits de la microplaque 2. Addition du prélèvement (sécrétions, sérum, etc.) contenant potentiellement des particules virales ou des antigènes viraux. Lavage des puits avec du tampon.

3. Addition de l’anticorps antiviral conjugué à une enzyme (E

E

EE

EE

EE

E

E

EE

EE

EE

E

E

EE

EE

EE

E

E

E

E

E E

E

E)

4. Lavage

5. Addition du substrat de l’enzyme, quantification du produit coloré ( )

Résultats Produit coloré

++

–

La quantité de produit coloré est proportionnelle à la quantité d’antigène

Couleur

Quantification

Antigène FIGURE 24.23 Test ELISA direct. Ce test peut servir pour la recherche de constituants et de métabolites antigéniques de pathogènes dans le sang, les urines ou tout autre fluide de l’organisme.

immunitaire est complètement détruit et ne produit plus d’anticorps. Le test ELISA n’a alors plus aucun intérêt, le diagnostic de SIDA est cependant défini à partir d’arguments cliniques (voir section 26.14).

Les autres tests ELISA d’importance clinique Des centaines de tests ELISA ont un intérêt en clinique. Des ELISA directs détectent des toxines bactériennes (toxine cholérique, toxines d’Escherichia coli entéropathogènes et de Staphylococcus aureus), des virus (rotavirus, virus des hépatites, virus de la rubéole, bunyavirus, virus de la rougeole, virus des

oreillons et les virus parainfluenza). Des tests ELISA indirects détectent des anticorps sériques antibactériens : Salmonella (gastro-entérites), Yersinia (peste), Brucella (brucellose), rickettsies (fièvre pourprée des Montagnes Rocheuses, typhus, fièvre Q), Vibrio cholerae (choléra), Mycobacterium tuberculosis (tuberculose), Mycobacterium leprae (lèpre), Legionella pneumophila (légionellose), Borrelia burgdorferi (maladie de Lyme) et Treponema pallidum (syphilis). Des ELISA indirects ont aussi été développés pour la détection de levures (Candida) et de divers parasites agents d’amibiases, de la maladie de Chagas, de schistosomiose, de toxoplasmose ou du paludisme.



24.10 Tests immunoenzymatiques (ELISA) et dosages radio-immunologiques (RIA) 819

Procédure 1. Fixation de particules antigéniques de VIH ( ) sur les puits de la microplaque

Test positif

Test négatif

Surface des puits de la microplaque

2. Addition du sérum du patient. Les anticorps spécifiques se lient aux antigènes du VIH, les autres anticorps ne se fixent pas

3. Lavage

4. Addition des anticorps anti-IgG humaines conjugués à une enzyme (E E)

E EE EE EE EE E

E

E

E

E

E

E

E EE EE EE EE E

5. Lavage

6. Addition du substrat de l’enzyme et quantification du produit coloré ( ).

Résultats Produit coloré

E EE EE EE EE E

++

–

La quantité de produit coloré est proportionnelle à la concentration en anticorps

Couleur

Quantification

Anticorps FIGURE 24.24 Test ELISA indirect. Ce test peut être utilisé pour la recherche d’anticorps anti-VIH, virus responsable du syndrome d’immunodéficience acquise (SIDA).

Les laboratoires d’analyse utilisent largement les tests ELISA en raison de la rapidité de leur mise en œuvre, de leur faible coût, d’absence de déchets radioactifs et de leur longue durée de conservation. C’est avant tout la forte sensibilité de ces tests qui en fait un important outil immunodiagnostique.

les analyses radio-immunologiques (RIA) La technique de RIA utilise des isotopes radioactifs comme conjugués d’anticorps ou d’antigènes, et non des enzymes ainsi que pour les tests ELISA. L’isotope iode-125 (125I) est souvent utilisé, le marquage se faisant en effet sans modification de la spécificité des anticorps ou des antigènes. Les tests RIA mesurent des




John M. Martinko

820 Chapitre 24

Keystone Diagnostics, Inc.

(a)

fond d’une série de puits de la microplaque sont déposées différentes concentrations connues d’antigène pur (hormone). Des anticorps spécifiques de l’antigène conjugués à un radio-isotope sont ajoutés ; la radioactivité fixée dans chacun des puits standard est quantifiée et permet l’établissement d’une courbe étalon des concentrations en antigène. Puis un autre puits recueille l’échantillon sérique contenant l’antigène à quantifier, les anticorps sont ajoutés et la radioactivité est mesurée. Cette dernière est comparée aux radioactivités des différentes concentrations de l’antigène pur utilisées comme standards, et la concentration de l’antigène du patient est déduite de la courbe étalon obtenue avec les standards (voir figure 24.26). Le RIA est aussi sensible que l’ELISA et peut également bénéficier d’une mise en œuvre rapide. L’équipement pour la détection de la radioactivité est néanmoins spécialisé et cher. Des quantités importantes de déchets radioactifs sont engendrées, et la décroissance de la radioactivité (demi-vie) des radio-isotopes restreint les dates limites d’utilisation des trousses de réactifs. Ainsi les tests RIA sont utilisés seulement quand les tests ELISA ne sont pas suffisamment adaptés ou sensibles. Le RIA est préféré à l’ELISA pour la quantification de protéines sériques, certains composants du sérum inhibant certains substrats enzymatiques des ELISA ou des interactions antigène-anticorps.


(b) FIGURE 24.25 Trousses de tests ELISA rapides. Les tests de grossesse (a) et de recherche de stupéfiants (b) sont disponibles sous forme de tests rapides. D’autres tests servent au diagnostic de maladies infectieuses telles que l’angine streptococcique et l’infection par le VIH.

Les techniques ELISA et RIA représentent les immunoanalyses les plus sensibles. Les deux impliquent la liaison d’un système de détection, enzyme ou radio-isotope, à un anticorps ou à un antigène, augmentant significativement la sensibilité. Ces tests sont utilisés en recherche ou en clinique ; ils détectent soit un anticorps, soit un antigène.

quantités très faibles de protéines sériques telles que l’hormone de croissance, le glucagon, la vasopressine, la testostérone et l’insuline (voir figure 24.26). Des recherches de stupéfiants peuvent aussi être menées par des tests RIA. Dans la plupart des cas, on a recours à des tests RIA directs. Deux étapes se succèdent. Au

•

Pourquoi les techniques ELISA et RIA sont-elles plus sensibles que les tests de précipitation ou d’agglutination ?

•

Comparez l’ELISA et le RIA en fonction de leurs utilisations, avantages et inconvénients respectifs.

1. Liaison de l’insuline aux puits d’une microplaque

1 Concentration croissante

Puits de la microplaque

2

4

Échantillon sérique

2. Addition d’un excès d’anticorps anti-insuline marqués avec de l’125I ; lavages pour l’élimination des anticorps non fixés

Radioactivité

Insuline

Anticorps radioactifs 1

1

2

4

Échantillon sérique

2 Échantillon 4

Insuline dans l’échantillon sérique

3. Comptage de la radioactivité dans un compteur de radiations gamma. Une courbe étalon est déterminée à partir de concentrations connues d’insuline dans les puits 1, 2 et 4. La radioactivité dans le dernier puits indique, après comparaison avec la courbe étalon, la concentration sérique d’insuline FIGURE 24.26 Dosages radio-immunologiques (Radioimmunoassay, RIA). Utilisation du RIA pour la détermination des concentrations sériques d’insuline. La construction d’une courbe d’étalonnage permet d’estimer ces concentrations.



24.11 Procédés d’Immunoblot 821

m n

transférées sur une membrane par un procédé électrophorétique éluant les protéines du gel sur la membrane. Les anticorps dirigés contre certains composants du pathogène sont alors ajoutés. Après une courte incubation permettant aux anticorps de se fixer, un marqueur radioactif se liant aux complexes antigène-anticorps est ajouté. Ce marqueur est le plus souvent la protéine A de Staphylococcus, marquée à l’iode 125, qui a une forte affinité pour les anticorps et est détectée après exposition de la membrane à un film d’autoradiographie. Les rayons gamma émis par l’iode 125 exposent le film uniquement dans la région où l’anticorps radioactif s’est lié aux complexes antigène-anticorps (voir figure 24.27). Dans de nombreuses applications cliniques, l’ELISA détecte les complexes antigène-anticorps des immunoblots (voir section 24.10). Après traitement des protéines tansférées avec un anticorps spécifique, la membrane est lavée et traitée avec un second anticorps se fixant au premier et sur lequel est liée de façon covalente une enzyme. L‘exposition de l’enzyme à son substrat permet de visualiser les complexes

24.11 Procédés d’Immunoblot

Les techniques d’immunoblot utilisent des anticorps pour l’identification discriminante de protéines spécifiques de certains pathogènes, même dans des mélanges complexes comme le sang ou les lysats cellulaires. Trois techniques précédemment discutées sont utilisées : 1) séparation des protéines sur gel de polyacrylamide ; 2) transfert des protéines du gel sur une membrane de nitrocellulose ou de nylon ; 3) identification des protéines par des anticorps spécifiques. L’association des deux dernières étapes correspond à la technique de western blot (protéines), distincte de celle du Southern blot (ADN) ou du northern blot (ARN) (voir section 7.7). Lors de la première étape de l’immunoblot, un mélange de protéines est soumis à une électrophorèse sur gel de polyacrylamide. Les protéines sont alors séparées en bandes distinctes, chacune représentant une seule protéine d’un poids moléculaire donné (voir figure 24.27). Les protéines sont

1. Dénaturation des protéines par chauffage dans un détergent, migration électrophorétique ; séparation des protéines en fonction de leur poids moléculaire

2. Transfert des protéines séparées du gel sur une membrane

3. Traitement de la membrane avec des anticorps, reconnaissant et se fixant à une protéine spécifique

Gel de polyacrylamide

– –

Membrane +

+

4. Addition d’un marqueur des complexes antigène-anticorps, soit (à gauche) la protéine radioactive A-125I de Staphylococcus, soit (à droite) un anticorps conjugué à une enzyme.

125I

E E

125I

5. Exposition au film (125I) ou au substrat de l’enzyme, révélation de la protéine marquée

E E

Film d’autoradiographie (a) GP41-45

4

(b)

Victor Tsang

3

1

Membrane avec une tache colorée

P24

5

2

Anticorps ( ) liés à une protéine

FIGURE 24.27 Western blot (ou immunoblot). Exemple du diagnostic de confirmation de l’infection par le VIH. (a) Protocole d’immunoblot. (b) Immunoblot VIH. La visualisation des protéines de capside P24 et d’enveloppe GP41-45 du VIH permet le diagnostic. Ligne 1, sérum témoin positif (de patients infectés par le VIH) ; ligne 2, sérum témoin négatif (d’un volontaire sain) ; ligne 3, échantillon fortement positif ; ligne 4, échantillon faiblement positif ; ligne 5, réactif blanc pour éliminer le bruit de fond de fixation.



822 Chapitre 24


antigène-anticorps : la réaction enzymatique laisse un produit coloré sur la membrane à chaque site où les anticorps secondaires sont fixés aux anticorps spécifiques de l’antigène. L’identification d’une protéine d’un pathogène donné est alors possible en comparant la position des bandes colorées respectives de l’échantillon et du contrôle. Les techniques d’immunoblot détectent soit des antigènes (mise en évidence directe du pathogène) ou des anticorps (mise en évidence indirecte d’une exposition au pathogène).

L’immunoblot VIH Les immunoblots servent au diagnostic de confirmation d’une exposition au VIH. Parce que la mise en œuvre d’un immunoblot est plus laborieuse, plus longue, et qu’il est moins sensible et plus cher qu’une technique ELISA, le dépistage VIH en série utilise largement les tests ELISA. Mais, occasionnellement, les tests ELISA VIH donnent des résultats faussement positifs, aussi la forte spécificité de l’immunoblot est-elle mise à profit pour confirmer tous les résultats positifs. Comme avec l’ELISA VIH, l’immunoblot détecte les anticorps sériques spécifiques du VIH. Une suspension purifiée de VIH est traitée avec un détergent qui solubilise les protéines virales et inactive le virus, le dodécyl sulfate de sodium (SDS). Les protéines virales (sept protéines majeures au minimum) sont séparées par électrophorèse sur gel de polyacrylamide et transférées du gel sur la membrane (voir figure 24.26). Parmi elles, deux protéines, la P24 (protéine de capside) et la GP4145 (glycoprotéine d’enveloppe), sont considérées comme des protéines spécifiques pour le diagnostic de l’infection (si la P24 est la seule protéine détectée, le résultat a de fortes chances d’être faussement positif). Après transfert des protéines, la bandelette membrane est incubée avec le sérum du patient. En cas de séropositivité VIH, les anticorps dirigés contre les protéines du VIH se lient à ces protéines sur la membrane (voir figure 24.27). Leur présence est révélée par l’addition d’un anticorps de détection anti-IgG humaine, conjugué à la peroxydase dont l’activité catalytique, après addition de son substrat, donne une bande brun-violet sur la bandelette aux sites de fixation des anticorps sériques. Si les positions des bandes respectives des sérums du patient et du contrôle positif sont identiques, elles confirment la séropositivité VIH du patient. Un sérum contrôle négatif est analysé en parallèle et ne doit montrer aucune bande (voir figure 24.27). Bien que l’intensité des bandes varie d’un échantillon à l’autre (voir figure 24.27b), l’interprétation d’un immunoblot est généralement sans équivoque et permet la confirmation de résultats ELISA VIH positifs et l’élimination de faux positifs. Afin que les immunoblots VIH soient utilisés en diagnostic clinique, des bandelettes membrane portant des antigènes inactivés du VIH (préalablement séparés par électrophorèse) sont commercialisées. Chaque bandelette peut être incubée directement avec le sérum du patient ou du contrôle, puis traitée avec l’anticorps de détection. La technique d’immunoblot est aussi utilisée pour confirmer la spécificité des tests sérologiques de la maladie de Lyme (voir tableau 24.5), de l’hépatite C, des infections à virus Epstein Barr (EBV)… Néanmoins, par leur coût élevé, les impératifs techniques et le temps requis, leur sensibilité plus faible (mais une spécificité supérieure), les tests immunoblot sont

moins utilisés que les techniques ELISA pour le criblage de larges échantillonnages.

Contrôlez vos acquis Les techniques d’immunoblot servent à la détection d’antigènes ou d’anticorps spécifiques d’antigènes. Les antigènes sont séparés par électrophorèse, transférés sur une membrane et exposés à un anticorps. Les immuns complexes sont visualisés par des anticorps secondaires marqués par une enzyme ou un isotope radioactif. Ce sont des tests extrêmement spécifiques, mais de procédé complexe et long à mettre en œuvre. •

Quels sont les avantages de l’immunoblot par rapport aux tests ELISA et RIA ?

•

Pourquoi l’immunoblot n’est-il pas utilisé pour un dépistage de masse de l’infection par VIH ?

III

MÉTHODES DE DIAGNOSTIC MOLÉCULAIRE ET DE DIAGNOSTIC VIROLOGIQUE

Des techniques moléculaires ou de microscopie électronique, extrêmement sensibles, sont disponibles et largement utilisées pour la détection de pathogènes. Elles ne sont pas dépendantes de la détection de la réponse immune dirigée contre le pathogène, ni de l’isolement ou de la croissance du pathogène, méthodes souvent difficiles voire parfois impossibles à réaliser.

24.12 Méthodes moléculaires m n Les techniques moléculaires utilisent les caractères génotypiques plutôt que phénotypiques pour l’identification de pathogènes. L’intérêt des méthodes de diagnostic génétique ou de détection des acides nucléiques réside en différents points : 1) les acides nucléiques peuvent être aisément isolés de tissus infectieux ; 2) il est possible de les visualiser et de les quantifier ; 3) la séquence nucléotidique du génome d’un pathogène est unique, ainsi son analyse conduit avec certitude à son identification ; 4) les séquences peuvent être amplifiées pour augmenter la quantité de matériel disponible pour l’analyse.

Les diagnostics utilisant des sondes nucléiques Un des plus puissants outils analytiques disponibles pour les microbiologistes médicaux est l’hybridation d’acides nucléiques. Au lieu de détecter un organisme complet ou ses produits, l’hybridation détecte la présence de séquences ADN spécifiques d’un organisme donné. Les sondes d’acides nucléiques correspondent généralement à de l’ADN simple brin complémentaire d’une séquence unique d’un gène d’intérêt. Typiquement, une sonde a une taille de plusieurs kilobases. Si un micro-organisme présent dans un échantillon clinique contient des séquences ADN ou ARN complémentaires de la sonde, la séquence de la sonde peut s’hybrider (après préparation appropriée de l’échantillon pour l’obtention de l’ADN



24.12 Méthodes moléculaires 823 Sonde Rapporteur Détecteur de radioactivité Fluorimètre Colorimètre/ lecture visuelle Mesure directe de l’hybridation si le rapporteur est radioactif ou fluorescent. Addition du substrat si le rapporteur est une enzyme.

(b)

A

ADN cible

T AA TT A T

Capture avec la jauge

T AA TT A T

Hybridation de Région l’ADN échantillon aux complémentaire sondes en solution. de l’ADN cible Destruction par les nucléases des sondes non hybridées

A

A A

A A

A

Lyse et dénaturation de l’échantillon dans NaOH

Détection

Sonde de capture A

Sonde rapporteur

Addition de la sonde marquée par le rapporteur, fixation sur la cible

A

T AA TT A T

(a)

Lyse des cellules et synthèse de l’ADN simple brin cible

A

Cellules de l’échantillon fixées sur le filtre

A

Mesure du signal du rapporteur FIGURE 24.28 Technique diagnostique par sondes oligonucléotidiques. (a) Test sur membrane filtre. Le système de détection (rapporteur) est un radio-isotope, un fluorochrome ou une enzyme. (b) Jauge-test. Utilisation d’une sonde de capture couplée à un rapporteur. La sonde de capture porte une queue poly-dA qui s’hybride à un oligonucléotide poly-dT fixé à la jauge, liant ainsi le complexe oligonucléotide – cible – rapporteur. Le schéma (a) montre comment détecter ce complexe.

simple brin du micro-organisme), formant ainsi une molécule double brin (voir figure 24.28). La sonde est marquée par une molécule traçante (isotope radioactif, enzyme ou composé fluorescent permettant la détection de son hybridation à une cible donnée. En fonction de la molécule (les isotopes radioactifs sont les plus sensibles), un minimum de 0,25 µg d’ADN par échantillon peut être utilisé pour l’identification. Les sondes d’acides nucléiques présentent différents avantages par rapport aux immunoanalyses. Les acides nucléiques sont plus stables que les protéines à de fortes températures et à des pH élevés, et sont plus résistants aux solvants organiques et autres produits chimiques. Par cette relative stabilité chimique, les techniques utilisant des sondes nucléotidiques peuvent identifier des organismes qui ne sont plus vivants. Certaines sondes nucléiques sont plus spécifiques que les anticorps et détectent des différences d’un seul nucléotide entre deux séquences d’ADN.

Les sondes utilisées en laboratoire de diagnostic clinique Dans la plupart des cas, les colonies issues de boîtes de Petri ou les fragments de tissus infectés sont traités avec des produits alcalins puissants, le plus souvent NaOH, pour lyser les cellules et dénaturer partiellement l’ADN afin d’obtenir des molécules simple brin (voir figure 24.28a). Le mélange est apposé sur une matrice (bâtonnet filtre) ou laissé en solution,

puis marqué par une sonde. L’hybridation est menée à une température permettant la formation d’un complexe stable entre les séquences homologues de l’ADN cible et de l’ADN de la sonde (la température dépend de la longueur et de la composition nucléotidique de la sonde et de l’ADN cible). Un lavage élimine les sondes non hybridées, l’hybridation étant quantifiée grâce à la molécule marquée liée à la sonde (mesure de radioactivité, d’activité enzymatique ou de fluorescence, selon le marqueur). Des sondes nucléotidiques sont commercialisées pour l’identification de micro-organismes pathogènes majeurs comme Neisseria gonorrhoeae, Chlamydia trachomatis (voir tableau 24.9 et sections 26.12 et 26.13) et Mycobacterium tuberculosis. En plus de leur utilisation en diagnostic clinique, les sondes moléculaires ont des applications dans le domaine de l’industrie alimentaire ainsi que dans les organismes de contrôle de la nourriture : recherche de pathogènes tels que Salmonella ou Staphylococcus. Une période d’enrichissement a généralement lieu afin de permettre à de faibles quantités de bactéries présentes dans les aliments de se multiplier jusqu’à un niveau détectable par la sonde. Les sondes utilisées dans l’industrie alimentaire utilisent des bâtonnets (dipsticks) sur lesquels est fixé de l’ADN spécifique d’un pathogène connu et susceptible de s’hybrider avec l’ADN du pathogène présent dans le prélèvement à analyser. Dans ces conditions, des sondes portant deux composants sont utilisées, l’un sert de sonde marquée et l’autre de




sonde de capture (voir figure 24.28b). Après hybridation de la sonde marquée ou de la sonde de capture à l’ADN cible, le bâtonnet qui porte une séquence complémentaire de la sonde de capture (le plus souvent des poly dT complémentaires des poly dA sur la sonde) est placé dans la solution d’hybridation, où il capte l’ADN hybridé qui est alors récupéré et quantifié. Les avancées en termes de phylogénie bactérienne basée sur les séquences de l’ARN 16S ribosomique (ARNr – voir section 11.6) ont permis la construction de sondes spécifiques d’espèces ou de souches. Le typage basé sur les différences de séquence ARNr est appelé ribotypage. Il permet la visualisation des profils de restriction ADN des gènes ARNr après digestion de l’ADN d’un organisme donné par des endonucléases de restriction (voir section 7.7). L’ADN digéré est séparé sur gel d’agarose et une sonde marquée permet l’observation des profils de restriction uniques des gènes codés par l’ARNr (voir section 11.11 et figure 11.23). Au sein d’une espèce, voire d’une souche, le profil de restriction est fortement conservé et correspond à l’empreinte moléculaire de l’organisme. Tous les organismes ont des gènes ribosomiques, aussi le ribotypage a-t-il été appliqué à une large variété d’études cliniques et phylogénétiques. Les sondes nucléiques détectant moins de 1 µg d’acide nucléique par échantillon peuvent identifier l’ADN extrait de 106 bactéries ou d’environ 108 particules virales. Bien que ces sondes moléculaires soient moins sensibles que les cultures (pour lesquelles jusqu’à une à dix bactéries par échantillon peuvent être détectées), les techniques utilisant les sondes ont un intérêt lorsque la culture des micro-organismes est difficile voire impossible. D’autres applications fondées sur des techniques de détection de l’ADN rivalisent avec la sensibilité des méthodes de culture. Cette approche est aussi appliquée sur tissu pour la recherche de pathogènes (hybridation in situ).

Les diagnostics moléculaires utilisant la PCR (polymerase chain reaction) Des oligonucléotides spécifiques et de très courte séquence (généralement de quinze à vingt-quatre nucléotides) servent d’amorces pour l’amplification par PCR de l’ADN de pathogènes donnés. La recherche biologique utilise largement la PCR, qui est aussi un outil majeur pour le diagnostic clinique (voir section 7.9). La PCR amplifie l’ADN environ un milliard de fois. En théorie, elle permet la visualisation d’une seule molécule d’ADN issue d’une seule cellule bactérienne. Par exemple, les amorces dont les séquences sont spécifiques d’un gène d’un micro-organisme donné peuvent servir à tester l’ADN issu de tissus potentiellement infectés, même si ce micro-organisme ne peut être ni visualisé ni cultivé. Ces méthodes ont un intérêt majeur pour l’identification d’infections virales et intracellulaires. La présence d’un segment spécifique du gène amplifié confirme la présence du pathogène (voir figure 24.29). Sa spécificité est apportée par hybridation d’une sonde sur le produit amplifié. Le tableau 24.9 répertorie divers organismes pour lesquels des méthodes de diagnostic par hybridation ou par PCR sont disponibles. Actuellement, de nombreux tests sont des PCR en temps réel. Cette technique nécessite l’utilisation d’amorces marquées par des fluorochromes. Les automates de PCR en

1

2

3

4

5

6

7

8

9 10 11 12 13 14 15

439 pb

Udo Reischl

824 Chapitre 24

FIGURE 24.29 Recherche par PCR de Mycobacterium tuberculosis dans les crachats d’un patient pour le diagnostic de tuberculose. . Les crachats de patients constituent la source d’ADN. L’amplification est initiée avec une paire d’amorces ciblant une région de 439 paires de bases (pb) de l’ADN de M. tuberculosis obtenu par culture pure (ligne 15). Lignes 2 à 9, 11 et 12, crachats positifs pour M. tuberculosis (ligne 12, positivité faible). Lignes 13 et 14, crachats négatifs pour M. tuberculosis. Lignes 1 et 10, marqueurs de poids moléculaire. La section 10.17 décrit la technique de PCR.

temps réel ont des systèmes optiques de précision qui suivent, à chaque cycle, l’incorporation d’amorces ou de sondes marquées dans les produits de PCR. Une courbe d’amplification permet de visualiser en temps réel cette incorporation, ce qui permet de s’affranchir des étapes de détection comme l’électrophorèse. La technique de RT-PCR (Reverse-Transcriptase PCR) permet par exemple de suivre l’évolution de l’infection par le VIH (voir section 26.14). Cette méthode inclut une étape préalable de production d’ADNc directement à partir de l’extrait d’ARN de l’échantillon à analyser (exemple de l’ARN des rétrovirus tels que le VIH – voir section 9.13).

Contrôlez vos acquis L’hybridation d’acides nucléiques est un outil puissant pour l’identification de micro-organismes. La séquence spécifique du micro-organisme à rechercher doit être connue pour la conception de la sonde. Les techniques à base de sondes les plus répandues sont probablement les méthodes d’amplification génique (PCR). Elles sont utilisées par les laboratoires médicaux, de contrôle alimentaire et de recherche. •

Indiquez quels sont les avantages et les inconvénients de l’hybridation d’acides nucléiques par rapport aux méthodes de culture standard pour l’identification de micro-organismes.

•

Citez un exemple dans lequel l’information sur un micro-organisme peut être obtenue grâce à une sonde nucléique ou par PCR lorsque les tests standards de croissance en culture ne sont pas disponibles.



24.12 Méthodes moléculaires 825

TABLEAU 24.9

AGENTS PATHOGÈNES IDENTIFIÉS PAR DES MÉTHODES UTILISANT DES SONDES NUCLÉIQUES ET PAR PCR Agent pathogène

Maladies

Bactéries Campylobacter sp.

Intoxications alimentaires


Maladies vénériennes ; trachome

Enterococcus sp.

Infections nosocomiales

Escherichia coli (souches entéropathogènes)

Gastro-entérite


Méningite infectieuse

Legionella pneumophila

Pneumonie

Listeria monocytogenes

Listériose

Mycobacterium avium

Tuberculose


Tuberculose

Mycoplasma hominis

Infection urinaire ; infection gynécologique


Pneumonie

Neisseria gonorrhoeae

Gonorrhée

Neisseria meningitidis

Méningite

Rickettsia sp.

Typhus, fièvre hémorragique, etc.

Salmonella sp.

Gastro-entérite

Shigella sp.

Gastro-entérite


Infections cutanées purulentes (furoncles, impétigos)


Scarlatine ; fièvre rhumatismale ; angine streptococcique

Streptococcus pneumoniae

Pneumonie

Treponema pallidum

Syphilis

Levures Blastomyces dermatitidis

Blastomycose

Candida sp.

Candidose, muguet

Coccidioides immitis

Coccidioïdomycose

Histoplasma capsulatum

Histoplasmose

Virus Cytomégalovirus

Infections congénitales virales

Virus Epstein-Barr

Lymphome de Burkitt ; mononucléose

Virus des hépatites A, B, C, D, E

Hépatite

Virus herpes simplex (types 1 et 2)

Lésions cutanées douloureuses ; herpès génital

Virus de l'immunodéficience humaine (VIH)

Syndrome d'immunodéficience acquise (SIDA)

Papillomavirus humains

Verrues génitales ; cancer cervical

Virus de la grippe

Infection respiratoire

Polyomavirus

Maladie neurologique

Rotavirus

Gastro-entérite

Protozoaires Leishmania donovani

Leishmaniose

Plasmodium sp.

Paludisme

Pneumocystis jiroveci

Pneumonie

Trichomonas vaginalis

Trichomonose

Trypanosoma sp.

Trypanosomiose



826 Chapitre 24


24.13 Diagnostic virologique m n

S. E. Miller

La problématique de l’identification et du diagnostic des infections par les virus animaux pathogènes est différente de celle liée aux infections pathogènes bactériennes. Les virus sont tous des parasites intracellulaires obligatoires (voir chapitre 9), qui ne peuvent se répliquer en dehors de cellules hôtes et ne peuvent donc pas être directement cultivés sur des milieux artificiels, mais doivent croître dans des cellules de mammifères. La microscopie permet l’observation directe des virus ou de leur effet cytopathique ; divers tests in vitro, directs ou indirects, sont disponibles pour l’identification des virus pathogènes.

La croissance des virus in vitro (a)

CDC/PHIL

En laboratoire, la culture des virus animaux à partir de prélèvements cliniques est plus difficile, plus longue et plus spécialisée que la culture de la plupart des bactéries pathogènes. Cela s’explique par le fait que les virus ne poussent que sur des cellules vivantes. L’utilisation des cultures cellulaires pour la croissance des virus a été discutée dans la section 9.3. Plusieurs lignées cellulaires humaines à durée de vie longue sont disponibles pour la croissance des virus : ce sont des lignées de cellules immortalisées, croissant rapidement et se divisant indéfiniment dans les milieux de culture cellulaire, certaines étant aisément infectées par des virus de mammifères. Les virus peuvent aussi se répliquer sur des cellules de rein de singe Rhésus. Ce sont des cellules primaires qui meurent après un nombre limité de divisions cellulaires et ne peuvent être maintenues indéfiniment en laboratoire. Elles supportent la croissance de nombreux virus pathogènes et représentent un intérêt majeur pour l’isolement initial de virus inconnus (15 à 30 % d’infections respiratoires aiguës n’ont pas d’étiologie connue).

La microscopie électronique Le diagnostic virologique peut aussi être fait par microscopie électronique. Les virus présentent des caractéristiques morphologiques différentes (voir chapitre 9) visualisées en microscopie électronique à partir d’échantillons cliniques (voir figure 24.30). Des méthodes de centrifugation et filtration doivent préalablement concentrer et séparer les particules virales des tissus humains. Bien que moins fiable que les méthodes immunologiques ou de sondage nucléique, l’observation de particules virales d’une morphologie spécifique dans un tissu humain donné est prédictive d’une infection. Des anticorps spécifiques de virus peuvent être utilisés pour augmenter la sensibilité et la spécificité de la technique : des anticorps agglutinants permettent l’agrégation des particules virales, qui sont alors plus facilement différenciées des débris cellulaires. Des anticorps conjugués à des métaux lourds favorisent aussi la visualisation des virus en microscopie électronique (voir section 24.9). Le résultat de l’analyse en microscopie électronique peut être obtenu en vingt minutes après recours à des techniques de marquage négatif (voir figure 24.30). L’utilisation de la microscopie électronique est néanmoins limitée par le coût et la complexité du microscope.

(b) FIGURE 24.30 Observation de virus en microscopie électronique dans des échantillons cliniques. (a) Rotavirus humains dans une selle (75 nm de diamètre). L’observation de particules virales sphériques dans les matières fécales est un argument diagnostique puissant. (b) Norovirus chez un patient diarrhéique. Leur surface rugueuse et leur petite taille (27 nm de diamètre) rattachent ces particules virales au genre Norovirus.

Les autres tests de diagnostic virologique Des exemples d’isolement et d’identification de virus infectieux sur culture cellulaire sont listés dans le tableau 24.10. Dans la plupart des cas, le diagnostic virologique repose sur des tests d’immunoanalyse (voir sections 24.5 à 24.12) ou des techniques d’hybridation d’acides nucléiques (voir section 24.13). Des tests ELISA directs détectent des particules virales (voir section 24.11 et figure 24.24), des anticorps immunofluorescents spécifiques d’antigènes viraux détectent des cellules infectées (voir section 24.10 et figure 24.19b).



Questions 827

TABLEAU 24.10

TECHNIQUES UTILISÉES EN LABORATOIRE DE DIAGNOSTIC VIROLOGIQUEa Étiologie virale probable

Contexte clinique Infection respiratoire haute

Rhinovirus

Prélèvement

Lignées cellulaires/ techniques d’observation

Nasopharyngé ou aspiration trachéale

Culture de fibroblastes humains

Coronavirus Adénovirus Pneumonie

Virus de la grippe

Aspiration ou écouvillonnage nasopharyngés

Culture de fibroblastes humains ou œufs embryonnés

Rougeole

Virus de la rougeole

Aspiration ou écouvillonnage nasopharyngés

Cellules de rein de singe

Éruption vésiculeuse

Virus de l’herpès simplex

Aspiration du fluide vésiculaire

Culture de fibroblastes humains

Diarrhée

Rotavirus (enfants) Norwalk-like virus

Selles ou écouvillon rectal

Observation des particules virales en microscopie électronique (voir figure 24.30)

Méningite non bactérienne

Entérovirus

Liquide céphalo-rachidien

Culture de fibroblastes humains ou de rein de singe

Oreillons Virus de l’herpès simplex a

Les techniques d’immunoanalyse et les méthodes utilisant des sondes nucléiques sont largement employées pour le diagnostic des infections virales (voir sections 24.5 à 24.12). Les techniques listées ici concernent l’isolement initial et l'identification de virus infectieux en laboratoires de recherche et de référence.

Les tests indirects n’identifient pas le virus mais des anticorps spécifiques du virus et prédictifs de l’infection virale (exemple du dépistage de l’infection due au VIH par ELISA et immunoblot – voir sections 24.10 et 24.11). À l’opposé, l’évaluation de la charge virale (voir section 26.15), détecte l’ARN du VIH lui-même. Les tests d’agglutination peuvent également servir à la détection directe des virus (exemple des rotavirus). Les virus libérés par des échantillons tissulaires lysés peuvent être détectés directement par agglutination avec des anticorps spécifiques conjugués à des billes de latex ou à du charbon activé (voir section 24.8). Les sondes nucléiques et les tests de PCR pour la détection et l’identification de virus responsables d’infections cliniques constituent également un outil diagnostic majeur en virologie médicale (voir section 24.11 et tableau 24.9). De nombreuses procédures de diagnostic virologique ne sont utilisées que dans des circonstances précises. Le diagnostic de certaines infections virales courantes est simplement posé face à des symptômes cliniques. En France, chaque centre

hospitalier universitaire, les centres nationaux de référence et les centres de recherche et de développement disposent d’un laboratoire de diagnostic virologique.

Contrôlez vos acquis La propagation des virus en culture ne peut être accomplie qu’en culture cellulaire. Ainsi, la plupart des techniques de diagnostic viral n’utilisent pas la culture cellulaire mais dépendent en routine d’immunoanalyses et de techniques moléculaires. La microscopie électronique sert à l’observation directe de virus au sein d’échantillons cliniques. •

Pourquoi les virus doivent-ils être cultivés sur des systèmes cellulaires ?

•

Comment identifie-t-on des virus pathogènes en laboratoire ?

QUESTIONS 1. Décrivez les méthodes standard d’obtention et de culture d’un échantillon de gorge et d’un prélèvement sanguin. Quelles précautions faut-il prendre pour la réalisation d’une hémoculture (voir section 24.1) ? 2. Pourquoi les cultures bactériennes d’urines sont-elles pratiquement toujours possibles ? Pourquoi le nombre de bactéries dans les urines est-il généralement important ? Quel est le microorganisme responsable de la majorité des infections urinaires ? Pourquoi (voir section 24.1) ?

3. Décrivez les méthodes de culture des bactéries anaérobies. Pourquoi est-il important de traiter tous les prélèvements cliniques rapidement ? Quels sont les procédés et précautions spécifiques nécessaires pour l’isolement et la culture d’anaérobies (voir section 24.1) ? 4. Différenciez les milieux sélectifs des milieux différentiels. La gélose éosine-bleu de méthylène (EMB) est-elle un milieu sélectif ou différentiel ? Pourquoi et comment est-elle utilisée en laboratoire de bactériologie médicale d’analyse clinique (voir section 24.2) ?



828 Chapitre 24


5. Décrivez le test de Kirby-Bauer utilisé pour la détermination de la sensibilité aux antibiotiques. Pourquoi les isolats cliniques doivent-ils être testés par cette technique (voir section 24.3) ? 6. Comment sont contractées la plupart des infections associées aux manipulations de laboratoire ? Que peut-on mettre en œuvre pour les prévenir (voir section 24.4) ? 7. Pourquoi le titre d’anticorps augmente-t-il après une infection ? Un titre d’anticorps élevé indique-t-il une infection active ? Expliquez. Pourquoi est-il nécessaire d’obtenir deux échantillons sanguins, respectivement à la phase aiguë et à la phase de convalescence, pour le suivi des infections (voir section 24.5) ? 8. Quels sont les avantages des préparations d’anticorps monoclonaux par rapport à celles d’anticorps polyclonaux, notamment en termes de standardisation des préparations (voir section 24.6) ? 9. Décrivez une réaction de neutralisation en prenant l’exemple des toxines bactériennes et d’antisérums (voir section 24.7).

10. Les tests d’agglutination sont plus largement utilisés en diagnostic clinique que les tests de précipitation. Pourquoi (voir section 24.8) ? 11. Comment sont utilisés les anticorps fluorescents pour le diagnostic d’infection virale ? 12. Les analyses radio-immunologiques (RIA) et les tests immunoenzymatiques (ELISA) sont très sensibles comparés à l’agglutination. Pourquoi ? 13. Pourquoi utilise-t-on la méthode d’immunoblot (Western blot) pour confirmer des résultats d’ELISA positifs pour le virus de l’immunodéficience humaine (VIH) [voir section 24.11] ? 14. Quelle information est essentielle pour la synthèse d’une sonde nucléique spécifique d’un pathogène ? Où peut être obtenue cette information ? Est-elle disponible pour tous les micro-organismes pathogènes (voir section 24.12) ? 15. Qu’est ce qu’une culture de cellules primaires ? Pourquoi les virus animaux ne poussent-ils qu’en culture cellulaire (voir section 24.13) ?

PROBLÈMES 1. Une hémoculture est positive à Staphylococcus epidermidis. Interprétez et expliquez le résultat. Cela signifie-t-il que le patient a une bactériémie à Staphylococcus epidermidis ? Préparez une liste d’explications et de questions pour une discussion avec le clinicien en charge du patient. Quelles informations supplémentaires seront nécessaires pour confirmer ou éliminer une bactériémie ? 2. En tenant compte des conséquences à court et long terme, pourquoi la pratique médicale commune est-elle de traiter une maladie infectieuse avec des antibiotiques avant d’avoir isolé le pathogène suspect ? Après l’isolement et l’identification de l’agent pathogène, quelles sont les étapes pour la confirmation de la bonne sensibilité à l’antibiotique prescrit ? Pourquoi ces mesures ne sont-elles que rarement employées en dehors d’un environnement hospitalier ? 3. Expliquez l’intérêt d’obtenir des prélèvements sanguins de patients à la phase aiguë de l’infection et environ deux semaines plus tard (voir section 24.5). Quelle information attendez-vous d’obtenir du sérum d’un patient guéri ?

4. Quels sont les avantages des systèmes d’identification rapide comme les tests d’agglutination et les immunoanalyses de type ELISA comparés aux méthodes de diagnostic clinique ? Quels sont les inconvénients potentiels des tests ne dépendant pas de la culture cellulaire ? 5. Quels sont les avantages majeurs de l’utilisation de sondes en diagnostic microbiologique ? De quelle information doiton disposer pour la synthèse de sondes spécifiques d’un micro-organisme et utilisées dans une réaction de polymérisation en chaîne (PCR) ? Où pouvez-vous trouver cette information ? 6. Définissez les méthodologies que vous appliqueriez pour isoler et identifier un nouveau virus pathogène. N’oubliez pas les techniques de culture, les méthodes moléculaires et de visualisation telles que la microscopie électronique. Où rapporterez-vous vos résultats ? Lequel de vos tests pourrait être adapté pour un diagnostic clinique de routine, rapide et de bon rendement ?



CHAPITRE VINGT-CINQ

Épidémiologie

I

Principes en épidémiologie

830

25.1 25.2 25.3 25.4 25.5

Science de l’épidémiologie Vocabulaire en épidémiologie Réservoirs et épidémie Transmission des infections Communauté de l’hôte

831 831 833 836 837

II

Épidémies actuelles

839

25.6 25.7 25.8

Pandémie du SIDA Infections acquises à l’hôpital (nosocomiales) Syndrome respiratoire aigu sévère (SRAS)

839 840 841

III

Épidémiologie et santé publique

842

25.9

Mesures de santé publique pour le contrôle des maladies infectieuses Considérations générales en santé publique Infections émergentes et réémergentes Guerre et armes biologiques Le bacille du charbon en tant qu’arme biologique

25.10 25.11 25.12 25.13

Le syndrome respiratoire aigu sévère (SRAS) est une infection respiratoire émergente (photo du coronavirus du SRAS).

842 845 845 851 852



830 Chapitre 25

Épidémiologie

GLOSSAIRE

I

PRINCIPES EN ÉPIDÉMIOLOGIE

Les maladies infectieuses concernent des individus dans une population donnée. L’épidémiologie est l’étude de l’apparition, de la répartition et du contrôle de ces maladies dans la population, dans le cadre de la Santé publique. Le contrôle des maladies infectieuses dans les pays industrialisés est très efficace. La figure 1.7 montre une forte réduction des causes de décès liées aux maladies infectieuses aux États-Unis, comparées à celles du début du XXe siècle. Cependant, près de 30 % des 56 millions de décès dans le monde sont attribués à des maladies infectieuses, notamment dans les pays en voie de développement. Même dans les pays industrialisés, on observe des infections émergentes telles que le syndrome respiratoire aigu sévère (SRAS), et d’autres maladies jusqu’alors contrôlées comme la tuberculose sont réémergentes. Ainsi, les décès par maladies infectieuses augmentent depuis les années 1980 (voir figure 25.1). Le contrôle des maladies infectieuses reste un enjeu mondial, requérant des solutions scientifiques, médicales, économiques, politiques et éducatives.

Infection émergente (emerging infection) Nouvelle infection ou infection dont l’incidence a augmenté dans les vingt dernières années ou dont l’incidence tend à croître dans les années à venir. Infection nosocomiale (nosocomial infection) Infection acquise à l’hôpital (au moins 48 heures après hospitalisation). Infection réémergente (reemerging infection) Maladies infectieuses connues et a priori contrôlées, produisant de nouvelles épidémies. Morbidité (morbidity) Incidence de la maladie dans la population. Mortalité (mortality) Incidence de décès dans la population. Pandémie (pandemic) Épidémie mondiale. Porteur (carrier) Sujet sain (asymptomatique), porteur d’une infection susceptible d’être transmise. Prévalence (prevalence) Pourcentage d’individus malades dans la population. Quarantaine (quarantine) Isolement d’individus hautement contagieux pour limiter la diffusion de la maladie. Réservoir (reservoir) Site localisé et persistant de l’agent pathogène (dans la population ou l’environnement) à partir duquel peut se propager l’infection. Santé publique (public health) S’intéresse à la santé de la population au niveau d’une nation. Surveillance Système d’observation, d’identification et de relevé des maladies émergentes ou réémergentes. Vecteur (vector) Agent intermédiaire vivant (insecte, mammifère…) permettant la persistance et le transfert d’un agent pathogène Véhicule (vehicle) Source inerte (le plus souvent aliment et eau) de contamination d’un agent pathogène. Zoonose (zoonosis) Infection animale pouvant éventuellement infecter l’homme.

Taux de mortalité pour 100 000 individus

Centre de contrôle et de prévention des maladies infectieuses (Centers for Disease Control and Prevention, CDC) Agence des services de santé des États-Unis ayant pour objectifs la surveillance des maladies infectieuses émergentes, l’information au public et aux professionnels de santé, la mise en place des mesures de prévention et d’intervention des infections (Institut de veille sanitaire, INVS, en France). Endémie (endemic) Infection ou maladie toujours présente, en général chez un faible nombre d’individus. Épidémie (epidemic, outbreaks) Apparition d’une infection ou maladie chez un grand nombre d’individus dans une zone géographique déterminée et une période donnée. Épidémie de source commune (common-source epidemic) Épidémie à partir d’une même source de contamination. Épidémie de transmission inter-individuelle (host-to-host epidemic) Épidémie résultant de contacts interhumains, caractérisée par une élévation graduelle et une chute du nombre de cas infectés. Épidémiologie (epidemiology) Étude de l’apparition, de la répartition et du contrôle des maladies. Fomite Objet inerte pouvant, lorsqu’il est contaminé, transmettre l’agent pathogène à l’hôte. Guerre biologique (biological warfare) Utilisation d’agents biologiques en vue de neutraliser ou tuer des individus. Immunité de population (herd immunity) Résistance de la population à un agent pathogène résultant de l’immunité acquise par une large proportion d’individus. Incidence Nombre de cas de malades survenus dans la population rapportée en général à une période. Infection aiguë (acute infection) Infection récente et transitoire (inférieure à six mois), symptomatique ou asymptomatique. Infection chronique (chronic infection) Infection persistante (au-delà de six mois).

1 000 80 60

800

40 20

600

0 1970

1980

1990

400

200 0 1900

1920

1940

1960

1980

Année FIGURE 25.1 Mortalité par maladies infectieuses aux ÉtatsUnis. Bien que cette mortalité tende à diminuer au cours du XXe siècle (hormis durant la période 1918-1919, lors de la grippe espagnole), elle augmente depuis les années 1980. D’après (Hughes, J.M. 2001. Emerging infectious diseases: a CDC perspective. Emerg. Infect. Dis. 17: 494-496).



25.1 Science de l’épidémiologie 831

25.1 Science de l’épidémiologie m n L’épidémiologiste doit comprendre, pour la prévenir, l’histoire naturelle de l’infection. Un agent pathogène doit se développer chez son hôte pour provoquer l’infection et la maladie. Dans de nombreux cas, cet agent ne peut se développer hors de l’hôte et meurt avec ce dernier, devant, pour persister, passer chez un nouvel hôte. Un micro-organisme bien adapté à son hôte vit en équilibre avec celui-ci, consommant ce qui lui est nécessaire pour sa survie sans causer de dommage majeur chez l’hôte (agent saprophyte). Il peut persister chez cet hôte et définir une infection chronique, mais des atteintes plus graves chez l’hôte peuvent survenir en présence de nouveaux pathogènes non adaptés, par défaut de résistance de l’hôte (absence d’immunité contre cet agent ou baisse de l’immunité chez des sujets fragilisés, malnutris, âgés ou subissant divers stress – voir section 21.13). Ainsi, l’agent et son hôte contribuent à exercer une pression de sélection dans l’évolution des deux espèces en présence. Le plus souvent, ces pathogènes occasionnent une infection aiguë, caractérisée par une évolution rapide, plus ou moins grave, avec guérison, mais qui est parfois fatale pour l’hôte. Dans les situations où la survie de l’hôte n’est pas indispensable à celle du pathogène, ce dernier peut être à l’origine de lésions dévastatrices, comme le tétanos ou le botulisme, induit par le genre Clostridium, présent dans le sol et occasionnellement retrouvé chez l’homme (voir sections 21.10, 27.9 et 29.6). L’épidémiologiste évalue la survenue de la maladie infectieuse pour en identifier son origine et son mode de transmission. Il utilise pour cela les données épidémiologiques issues d’études cliniques et des réseaux de surveillance (à l’aide de questionnaires auprès des patients). Il se distingue dans son approche globale des études cliniques ou biologiques qui s’intéressent à l’infection chez les individus. La connaissance tant clinique qu’écologique de l’infection est importante à acquérir pour le contrôle efficace de la maladie.

FIGURE 25.2 Classification des maladies par incidence. Chaque point représente de nombreux cas d’une maladie particulière. Une maladie endémique touche une population dans une zone géographique restreinte. Une maladie épidémique montre une incidence élevée dans une zone géographique plus large, souvent à partir d’un foyer endémique. Une maladie pandémique se répartit mondialement. La grippe est une maladie endémique dans certaines régions et peut se développer de manière épidémique dans les régions surpeuplées. Certaines années cette épidémie grippale peut évoluer vers un mode pandémique.

(a) Maladie endémique

Contrôlez vos acquis L’épidémiologie est l’étude des maladies dans les populations. Pour l’appréhender, les épidémiologistes évaluent les interactions entre l’agent pathogène et son hôte au sein de la population. •

Comment se distingue dans son approche l’épidémiologiste du microbiologiste ?

•

Pourquoi l’épidémiologiste accumule-t-il des données sur les maladies infectieuses dans la population ?

25.2 Vocabulaire en épidémiologie m n La prévalence de la maladie (ou de l’infection) dans la population est définie par la proportion de sujets atteints sur une période donnée. L’incidence de la maladie est le nombre de cas atteints survenant sur une période donnée. L’épidémie est définie par l’apparition de la maladie dans une proportion inattendue de cas en même temps ; la pandémie est une extension mondiale de l’épidémie, et l’endémie caractérise le maintien de la maladie de manière constante et, en général, avec une faible incidence, dans une région donnée (voir figure 25.2). Lors d’une infection endémique, l’agent pathogène est en général moins virulent ou son hôte témoigne d’une résistance plus grande à l’infection (immunité acquise), ce qui implique une incidence moindre de cette infection, mais favorise la constitution d’un réservoir pour cet agent tant que l’endémie persiste. Des cas sporadiques sont rapportés lorsque l’infection est retrouvée chez des individus localisés dans des zones géographiques différentes, ce qui implique des infections non reliées. Des situations épidémiques peuvent émerger de ces cas isolés (outbreaks). L’absence de symptômes ou la présence de symptômes frustres peut définir des infections infracliniques chez des sujets porteurs de l’agent pathogène (voir section 25.3).

(b) Maladie épidémique

(c) Maladie pandémique



832 Chapitre 25

Épidémiologie

Mortalité et morbidité

La progression de la maladie

L’incidence et la prévalence d’une maladie sont déterminées par l’analyse statistique de la maladie et des décès. L’analyse peut porter sur la population globale ou localisée dans une ville, une région ou un pays. Elle prend en compte un problème de santé publique à un moment donnée d’une situation dynamique. L’analyse sur plusieurs années permet d’évaluer l’évolution des mesures de politique prises en santé publique, qui peuvent influencer l’incidence de la maladie. La mortalité est l’incidence des décès dans la population étudiée. Cause majeure de mortalité dans les années 1900 (figure 1.7), les maladies infectieuses ont décru au cours du siècle dernier aux dépens de maladies non infectieuses (maladies cardiaques, cancer, etc.). Cette situation pourrait s’inverser si une baisse des mesures de contrôle était observée, problème récurrent dans les pays en voie de développement (voir tableau 25.1 et section 25.10). La morbidité se rapporte à l’incidence de la maladie, fatale ou non, dans la population étudiée. Celle-ci reflète mieux l’état de santé de la population dans la mesure où de nombreuses maladies, telles que les infections respiratoires ou digestives, présentent un faible taux de mortalité, notamment dans les pays industrialisés.

Sur le plan clinique, l’infection aiguë s’individualise en cinq étapes :

TABLEAU 25.1

1. L’infection : le micro-organisme se développe chez l’hôte. 2. Le temps d’incubation : c’est la durée entre la contamination et l’apparition des symptômes de la maladie, qui peut s’étaler de quelques jours (pour la grippe – voir section 26.8) à quelques années (pour le SIDA – voir section 26.14). Ce laps de temps dépend de la taille de l’inoculum, de la virulence et du cycle du pathogène, de sa porte d’entrée chez l’hôte et de la distance du site d’infection, enfin de la résistance de l’hôte à l’infection (voir sections 21.6 à 21.8). 3. La phase aiguë : la maladie est à sa phase maximale avec différents symptômes (fièvre, frissons, etc.). 4. La phase de déclin : elle se traduit par une disparition progressive des symptômes, une diminution de la température souvent précédée par une phase de sudation intense et un sentiment de mieux-être. Cette phase peut être de rapide (un jour) à lente (quelques jours), constituant dans ce cas une étape de crise ou de lyse.

MORTALITÉ MONDIALE LIÉE AUX MALADIES INFECTIEUSES EN 2002

Maladie infectieuse

Décès

Cause

Infections respiratoires aiguës a, b

3 963 000

Bactéries, virus, champignons

Syndrome d'immunodeficience acquise (SIDA)

2 777 000

Virus

Diarrhée

1 798 000

Bactéries, virus

Tuberculose a

1 566 000

Mycobactérie

Paludisme

1 272 000

Protozoaire

Rougeole a Coqueluche

a

Tétanos a Méningite bactérienne

a

611 000

Virus

294 000

Bactérie

214 000

Bactérie

173 000

Bactérie

Hépatites A à E a,c

157 000

Virus

Syphilis

153 000

Bactérie

Leishmaniose

51 000

Protozoaire

Trypanosomiase (maladie du sommeil)

48 000

Protozoaire

Chlamydiose

16 000

Bactérie

Schistosomiase

15 000

Parasite

Maladie de Chagas

14 000

Parasites

Encéphalite japonaise

14 000

Virus

Dengue

13 000

Virus

12 000

Parasites

Infections intestinales à nématodes Autres maladies transmissibles

1 700 000

Différents agents

Il y a eu au total 57 millions de décès d’origine diverse en 2002. Environ 14,9 millions de décès étaient dus à des maladies transmissibles, majoritairement dans les pays en voie de développement. Les données ci-dessus concernent les vingt maladies infectieuses les plus fréquentes. La population mondiale en 2002 était de 6,2 milliards d’individus. Données de l’Organisation mondiale de la santé (OMS) ou de la World Health Organization (WHO), Genève, Suisse. a Maladies pour lesquelles il existe un vaccin. b Infections respiratoires aiguës pour lesquelles il existe un vaccin (virus de la grippe et pneumopathie à Streptococcus pneumoniae). c Hépatites (A et B) pour lesquelles il existe un vaccin.



25.3 Réservoirs et épidémie 833

5. La phase de convalescence : le patient récupère et retrouve son état initial. Lors des étapes plus tardives de l’infection, la réponse immunitaire de l’hôte se fait de manière plus intensive, favorisant la guérison rapide.

Contrôlez vos acquis Une maladie endémique est toujours présente avec une incidence faible parmi la population étudiée. Lors d’épidémie, l’incidence de la maladie est inhabituellement élevée. Les maladies infectieuses sont des facteurs de morbidité (maladie) et contribuent à la mortalité (décès). Elles sont précédées par un tableau clinique prévisible chez l’hôte. •

Distinguez entre une maladie endémique, épidémique ou pandémique.

•

Distinguez la morbidité de la mortalité chez l’hôte. En quoi la morbidité est-elle un avantage pour l’agent pathogène ? La mortalité est-elle aussi avantageuse pour cet agent ?

25.3 Réservoirs et épidémie m n Les réservoirs sont les sites dans lesquels persistent les agents infectieux et représentent des sources de contamination humaine. Ces réservoirs sont des organismes vivants ou des sites inertes. Le tableau 25.2 indique les infections les plus courantes et leurs réservoirs. Certains pathogènes tels que Clostridium tetanii (agent du tétanos) sont des agents saprophytes (sur matière inerte, en l’occurrence le sol pour C. tetanii) et infectent accidentellement l’homme (hôte non obligatoire pour la survie de ces pathogènes). Par contre, pour de nombreux pathogènes, les organismes vivants sont les seuls réservoirs, indispensables à leur survie. Certains ne survivent que chez l’homme et se transmettent de manière interhumaine (infections respiratoires bactériennes et virales, infections sexuellement transmissibles, infections à staphylocoque, à streptocoque, diphtérie, fièvre typhoïde, oreillons, etc. – voir chapitre 26). Dans ces situations d’hôte unique, l’éradication de l’infection est plus facilement envisageable (voir section 25.8).

Les zoonoses Les infections se présentant préférentiellement chez l’animal et occasionnellement chez l’homme sont des zoonoses. Le taux d’infections y est très important. Leur transmission est essentiellement interanimale et parfois entre l’animal et l’homme ; la transmission interhumaine est alors possible mais reste rare (voir section 25.8). Dans ce contexte, le contrôle de l’infection en termes de politique de santé publique est très difficile, car il revient à éradiquer l’infection dans le réservoir animal au sein duquel persiste l’agent infectieux. La peste est une maladie transmise par les rongeurs (voir section 27.7) ; dans ce cas, le contrôle de

l’infection chez ces animaux et les insectes vecteurs est beaucoup plus efficace que la prévention par vaccination de ces infections chez l’homme. Le contrôle de la tuberculose bovine, par identification des animaux infectés, leur abattage et la pasteurisation du lait, a aussi largement contribué à réduire la transmission à l’homme (voir section 26.5). Le paludisme, dont le cycle est plus complexe, est transmis par les moustiques à l’animal, mais aussi fréquemment à l’homme (voir section 27.5) ; son contrôle passera aussi bien par celui du vecteur que de l’animal ou de l’homme.

Les porteurs sains Les sujets porteurs sont des individus infectés par un microorganisme mais ne présentant pas de symptômes, et sont donc apparemment sains. Ils constituent une source potentielle de transmission de l’infection d’autant plus importante qu’elle n’est pas – ou difficilement – identifiable. Il peut s’agir de sujets présentant une infection débutante ou aiguë, en cours d’incubation, avant l’apparition des symptômes (cas des infections respiratoires notamment). Cette période de portage de l’infection est en général courte. Il peut aussi s’agir d’un portage chronique, sur une période beaucoup plus longue, ce qui favorise la diffusion importante de l’infection (cas de l’hépatite B – voir section 26.11 – et de la fièvre typhoïde – voir section 29.7). Ces porteurs sont identifiables dans la population à l’aide des méthodes d’investigation diagnostique utilisant les techniques de culture, de sérologie ou de biologie moléculaire (voir sections 24.1 et 24.5). La mise en évidence d’une hypersensibilité avec le test antigénique in vivo de Mycobacterium tuberculosis témoigne d’une infection en cours ou passée, et permet de repérer les porteurs de l’agent de la tuberculose (voir sections 22.15 et 26.5). L’étude sérologique chez le personnel de restauration permet aussi d’identifier des sujets porteurs d’infections susceptibles d’être transmises par l’alimentation. Ainsi, une épidémie de typhoïde a été rapportée à New York en 1906 : une cuisinière, Mary Mallon, a été identifiée comme source pour chacun des cas malades. Elle présentait un portage sain de Salmonella typhi, l’agent de la typhoïde, qu’elle conserva toute sa vie. Elle fut emprisonnée car elle refusa de se faire opérer de la vésicule biliaire, sans doute infectée et à l’origine d’une production continuelle de la bactérie. Après sa libération, elle changea de nom et poursuivit son métier, engendrant de nouvelles épidémies ; elle fut à nouveau enfermée et placée sous surveillance jusqu’à son décès en 1938.

Contrôlez vos acquis La notion de réservoir de pathogènes est importante pour appréhender la diffusion des maladies infectieuses. Certains pathogènes persistent dans le sol, l’eau ou chez l’animal. D’autres ne persistent que chez l’homme par transmission interhumaine. La connaissance du cycle infectieux et des porteurs sains est aussi importante pour contrôler l’infection. •

Définissez la notion de réservoir.

•

Distinguez le portage chronique de la forme aiguë en donnant un exemple de chaque.



834 Chapitre 25

Épidémiologie

TABLEAU 25.2

ÉPIDÉMIES : AGENTS, ORIGINES, RÉSERVOIRS ET MESURES DE CONTRÔLE Agent causala

Maladie

Origines de l’infection

Réservoirs

Mesures de contrôle

Épidémies de source communeb Charbon (anthrax)

Bacillus anthracis (B)

Viande ou lait d’animaux infectés

Bovins, porcs, chèvres, moutons, chevaux

Abattage des animaux infectés

Dysenterie

Shigella dysenteriae (B)

Contamination fécale des aliments ou de l’eau

Humain

Détection et surveillance des sujets porteurs, traitement des aliments et épuration de l’eau

Botulisme

Clostridium botulinum (B)

Aliment contaminé par le sol

Sol

Conservation appropriée des aliments (chaîne du froid)

Brucellose

Brucella melitensis (B)

Viande ou lait d’animaux infectés

Bovins, porcs, chèvres, moutons, chevaux

Pasteurisation du lait ; surveillance de l’infection chez les animaux

Choléra

Vibrio cholerae (B)


Humain

Épuration de l’eau ; immunisation

Contamination alimentaire à

Escherichia coli O157:H7 (B)


Humain, bovins

Traitement des aliments et épuration de l’eau ; pasteurisation des boissons

Giardiose

Giardia spp. (P)

Contamination fécale de l’eau

Mammifères sauvages

Épuration de l’eau

Hépatites

Virus des hépatites A, B, C, D, E (V)

Infection humaine

Humain

Décontamination des fluides et matériels contaminés ; contrôle alimentaire ; contrôle des donneurs de sang et d’organe ; vaccination (A et B)

Maladie du légionnaire

Legionella pneumophila (B)

Eau contaminée

Zones humides

Décontamination des zones contaminées et des systèmes à air conditionné

Fièvre paratyphoïde

Salmonella paratyphi (B)

Contamination fécale

Humain

Traitement des aliments et épuration de l’eau ; vaccination

Fièvre typhoïde

Salmonella typhi (B)

Contamination fécale

Humain

Traitement des aliments et épuration de l’eau ; pasteurisation du lait ; vaccination

Épidémies interhumaines Infections respiratoires Diphtérie

Corynebacterium diphtheriae (B)

Homme et aliments

Humain

Vaccination ; quarantaine

Pneumopathie à

Hantavirus (V)

Inhalation de produits de contamination fécale

Rongeurs

Surveillance des rongeurs et des produits et sujets au contact

Fièvre hémorragique

Virus Ebola (V)

Liquide et sécrétions corporels (humain)

Inconnu

Quarantaine

Méningite à méningocoque

Neisseria meningitidis (B)

Humaine

Humain

Traitement antibiotique des sujets exposés (céfotaxime) ; vaccination (souches A, B14, C, Y, W135)

Pneumopathie à pneumocoque

Streptococcus pneumoniae (B)

Humaine

Humain

Traitement antibiotique (amoxicilline, vancomycine) ; isolement

Tuberculose

Mycobacterium tuberculosis (B)

Toux d’origine humaine

Humain, bovins

Traitement antibiotique (rifampicine + isoniazide, azithromycine) ; pasteurisation du lait ; isolement ; vaccination

Coqueluche

Bordetella pertussis (B)

Humaine

Humain

Vaccination ; isolement

Rubéole

Virus de la rubéole (V)

Humaine

Humain

Vaccination ; isolement ; éviter contact (femme enceinte notamment)

Grippe

Virus de la grippe (V)

Humaine

Humain, animaux, oiseaux

Vaccination ; isolement ; traitement (tamiflu)

Rougeole

Virus de la rougeole (V)

Humaine

Humain

Vaccination



25.3 Réservoirs et épidémie 835

TABLEAU 25.2 Maladie

ÉPIDÉMIES : AGENTS, ORIGINES, RÉSERVOIRS ET MESURES DE CONTRÔLE (SUITE) Agent causala

Origines de l’infection

Réservoirs

Mesures de contrôle

Maladies sexuellement transmissiblesc Syndrome d’immunodéficience acquise (SIDA)


Liquide et sécrétions corporels (sang, sperme)

Humain

Décontamination des fluides et matériels contaminés ; contrôle des donneurs de sang et d’organe ; traitement antirétroviral suspensif, non curatif (inhibiteurs de la transcriptase inverse, de la protéase, de fusion et de l’intégrase ; voir partie 26.14)

Chlamydiose

Chlamydia trachomatis (B)

Sécrétions uréthrale, vaginale et anale

Humain

Dépistage moléculaire chez sujets à risque ; traitement antibiotique (azithromycine)

Gonorrhée

Neisseria gonorrhoeae (B)

Sécrétions uréthrale et vaginale

Humain

Dépistage bactériologique chez sujets à risque ; traitement antibiotique (ofloxacine, amoxicilline)

Syphilis

Treponema pallidum (B)

Exsudat (chancre) ou sang

Humain

Dépistage sérologique chez sujets à risque ; traitement antibiotique (pénicilline G)

Trichomoniase

Trichomonas vaginalis (P)

Sécrétions uréthrale, vaginale et prostatique

Humain

Traitement antiparasitaire (métronidazole)

Maladies transmises par vecteur Typhus

Rickettsia prowazekii (B)

Piqûre de poux

Humain, poux

Traitement des poux ; antibiotique (tétracycline)

Maladie de Lyme

Borrelia burgdorferi (B)

Piqûre de tique

Rongeurs, cerfs, tiques

Surveillance des rongeurs ; traitement des tiques ; antibiotique (amoxicilline)

Paludisme (malaria)

Plasmodium spp. (P)

Piqûre de moustique du genre Anopheles

Humain, moustique

Traitement des moustiques ; moustiquaire et répulsifs ; traitement antipalustre (chloroquine, méfloquine, proguanil)

Peste

Yersinia pestis (B)

Piqûre de puce

Rongeurs

Surveillance des rongeurs ; traitement des puces ; antibiotique (tétracycline, ciprofloxacine) ; vaccination

Fièvre des Montagnes Rocheuses

Rickettsia rickettsii (B)

Piqûre de tique

Tiques, lapins, souris

Traitement des tiques ; antibiotique (tétracycline)

Psittacose

Chlamydia psittaci (B) Contact avec les oiseaux

Excrément d’oiseaux sauvages ou domestiques

Attention au contact des oiseaux ; traitement des oiseaux domestiques ; antibiotique (tétracycline)

Rage

Virus rabique (V)

Morsure par animaux carnivores, contact avec du tissu neuronal infecté

Animaux mordeurs sauvages (renard, chien) et domestiques (chien)

Euthanasie des animaux enragés ou suspects ; vaccination des animaux sauvages et domestiques, des sujets à risque et mordus (avec immunothérapie)

Tularémie

Francisella tularensis (B)

Contact de lapins

Lapins

Attention au contact des lapins ; traitement antibiotique (gentamycine, ciprofloxacine)

a

B = bactérie ; V = virus ; P = protozoaire. Certaines maladies à source commune se transmettent aussi de manière interhumaine. c Les maladies sexuellement transmissibles (MST) peuvent être aussi évitées par l’utilisation de préservatifs ou par abstinence sexuelle. b



836 Chapitre 25

Épidémiologie

m n

25.4 Transmission des infections

L’épidémiologiste identifie la transmission d’une infection en y reliant une aire géographique, une période ou un caractère saisonnier et la tranche d’âge des sujets atteints. Une infection restreinte à une zone géographique peut être liée à un animal vecteur (comme le moustique et le paludisme en zone tropicale). Le caractère saisonnier de la grippe ou des infections virales respiratoires en général, chaque hiver, est lié à la scolarité des enfants et au rapprochement des sujets pendant les périodes froides, favorisant la transmission par contact interhumain de ces virus. La transmission des micro-organismes est liée à leur habitat chez l’hôte (infection respiratoire par voie aérienne, infection digestive par voie orofécale avec la contamination de l’eau et des aliments, etc.). Leur survie dépend de leur capacité à se transmettre. Les facteurs environnementaux sont parfois indispensables à cette transmission. L’encéphalite de Californie, due à un bunyavirus, un virus à ARN monocaténaire, survient essentiellement l’été et à l’automne, car la transmission de l’agent en cause dépend d’un moustique qui survit pendant cette période (caractères prévisibles cycliques, saisonniers et géographiques, voir section 16.9 et figure 25.3). Ces conditions sont indispensables au maintien de l’infection dans cette région et l’infection peut se reproduire ailleurs si ces conditions y sont remplies. Les micro-organismes peuvent ainsi être classés selon leur mode de transmission, mais ils ont tous en commun : 1) leur libération d’un hôte infecté, 2) leur transfert et 3) leur entrée chez un nouvel hôte.

50 45

Nombre de cas

40

La transmission interhumaine directe Elle se produit à chaque fois que la transmission de l’infection à partir d’un sujet source nécessite le contact avec un sujet réceptif (voir chapitre 26). Ce mode est habituel pour les infections respiratoires (rhume, grippe, bronchiolite, etc.) qui se transmettent par aérosol autour du sujet infecté (toux et éternuements). Cependant, ces pathogènes ne survivent en général pas longtemps dans l’environnement s’ils ne trouvent pas de nouvel hôte proche. C’est le cas notamment des infections sexuellement transmissibles, syphilis (Treponema pallidum) ou urétrite gonococcique (Neisseria gonorrheae), dont les agents sont très sensibles à la dessiccation dans l’environnement et ne survivent que par transmission interhumaine étroite. C’est aussi le cas des pathogènes de la peau comme des staphylocoques (furoncles et panaris) et des champignons (teigne), mais ceux-ci supportent mieux la dessiccation et peuvent se transmettre à distance (manuportage, matériel médical contaminé).

La transmission interhumaine indirecte La transmission interhumaine peut se produire indirectement au travers de vecteurs (voir chapitre 27), arthropodes (insectes, tiques, puces ou acariens) ou vertébrés (chiens, chats ou rongeurs). Les arthropodes peuvent être de simples véhicules de microorganismes sans être des hôtes infectables par ces agents. Ceux-ci se nourrissent par piqûre du sang de sujets infectés ; le micro-organisme présent dans le sang est ingéré par l’arthropode et retransmis par piqûre chez un nouvel hôte. Certains pathogènes (comme le Plasmodium, agent du paludisme) se reproduisent chez l’arthropode, augmentant le risque de contamination ultérieure. Le matériel médical et les surfaces inertes (appelées aussi les fomites), l’eau et les aliments, après contamination au contact de sujets infectés, peuvent aussi véhiculer les pathogènes jusqu’à un nouvel hôte. L’eau et les aliments contaminés sont à l’origine de grandes épidémies, car consommés par un plus grand nombre d’individus (voir chapitres 28 et 29).

Les épidémies

35 30 25 20 15 10 5 0 1993 1994 1995 1996 1997 1998 1999 2000 2001 2002

Année FIGURE 25.3 Incidence des encéphalites de Californie aux États-Unis. Notez les pics d’incidence à la fin de l’été et la disparition chaque hiver. Chaque année, les cycles des encéphalites suivent ceux des moustiques vecteurs. En 2002, on a rapporté 167 cas dans seize États. Un grand nombre d’encéphalites virales transmises par moustique, tels que les encéphalites équines de l’est et de l’ouest des États-Unis, l’encéphalite de Saint Louis, l’encéphalite West Nile, suit un cycle saisonnier comparable. (Centers of Disease Control and Prevention, Atlanta, GA, États-Unis).

Les épidémies se répartissent en général en deux classes selon leur mode de propagation : les épidémies de source commune et les épidémies interhumaines (voir figure 25.4 et tableau 25.2). Les épidémies de source commune résultent de l’infection (ou de l’intoxication) d’un grand nombre de sujets dans une population à partir d’une source commune infectée, souvent l’eau ou les aliments. Elles apparaissent très souvent lors de dysfonctionnements du traitement de l’eau ou des aliments (rupture de la chaîne du froid, contamination des eaux de consommation par de l’eau sale après rupture des canalisations d’évacuation, absence de stations d’épuration d’eau, etc.) ; ces altérations peuvent être corrigées selon des mesures de santé publique (voir chapitres 28 et 29). Ainsi, la diffusion du choléra par l’eau a été démontrée la première fois par l’Anglais John Slow en 1855, la contamination de l’eau s’étant faite à partir de selles de sujets infectés par Vibrio cholerae, qui était transmis par la consommation de cette eau. Ces épidémies se caractérisent par une apparition brutale de l’infection dans la population atteinte avec un grand nombre de sujets infectés et malades en même temps, puis disparaissent assez rapidement avec l’élimination du pathogène de la source contaminante (voir figure 25.4).



25.5 Communauté de l’hôte 837

Épidémie de source commune (par exemple, choléra)

Nombre de cas rapportés par jour –2

25.5 Communauté de l’hôte m n

Épidémie interhumaine (par exemple, grippe)

–1

0

1

2

3

Début de l’épidémie

4

5

6

7

8

9

10 11 12

Jours

FIGURE 25.4 Origine des épidémies. La forme de la courbe épidémique permet d’évaluer son origine. Dans les épidémies de même source, telles que les contaminations par l’eau ou par les aliments, la courbe se caractérise par une ascension rapide et une décroissance un peu plus lente. Les cas de contamination sont rapportés sur une période courte. Par contre, dans les épidémies interhumaines, la forme de la courbe est plus écrasée ; les cas sont rapportés sur plusieurs périodes d’incubation de la maladie.

Les épidémies interhumaines se traduisent par une apparition progressive des cas infectés dans la population et une disparition plus lente (voir figure 25.4). L’apparition progressive des cas est liée au faible nombre de sujets infectés à l’origine de l’épidémie, qui se développe au fur et à mesure de l’infection des cas contacts (cas primaires) ; ces derniers sont alors autant de nouvelles sources de contamination pour de nouveaux cas (cas secondaires). La disparition progressive des cas infectés est le témoin d’une immunisation croissante dans la population, et donc résistante à la progression du pathogène ; ce dernier disparaît lorsque cette immunisation touche l’ensemble de la population (voir chapitre 26).

Contrôlez vos acquis Un pathogène peut être transmis d’un hôte à l’autre directement ou à travers un vecteur, du matériel ou une surface contaminée, de l’eau ou des aliments contaminés. Les épidémies qui en découlent proviennent d’une source commune contaminante ou sont interhumaines. •

Faites la différence entre les deux modes épidémiques en citant un exemple de chaque.

•

Montrez par quelles approches préventives une épidémie de source commune et une épidémie interhumaine peuvent être évitées.

La colonisation par un pathogène d’un hôte sensible et non immunisé (non protégé par des anticorps) peut se développer rapidement en une infection importante et la diffusion rapide chez de nouveaux hôtes non immunisés peut être à l’origine d’épidémie. La population atteinte est en mesure de développer contre le pathogène une immunité qui vise à limiter cette diffusion en créant un état d’équilibre entre le pathogène et l’hôte, entre les sujets infectés et les sujets immunisés, résistants à l’infection. À l’extrême, si aucune immunité n’était acquise, le développement de l’infection dans la population pourrait conduire à la disparition de l’hôte et éventuellement du pathogène si celui-ci ne dispose pas d’une autre espèce hôte. Ainsi le pathogène est contraint à coévoluer en équilibre avec son hôte.

La coévolution entre le pathogène et son hôte Le virus de la myxomatose a été introduit en Australie en 1950 pour contrôler la prolifération des lapins importés d’Europe en 1859, ceux-ci provoquant de nombreux dommages environnementaux. Ce virus diffusa rapidement en quelques mois, avec un pic en été et une décroissance en hiver, par le biais des moustiques et d’autres insectes piqueurs, dans la population de lapins australiens, entraînant une forte mortalité (95 % la première année). Cette mortalité passa à 84 % après six ans. L’étude de la virulence des souches isolées chez des lapins sauvages infectés et inoculées chez des lapins nouveau-nés, élevés en laboratoire, montrait une baisse de la virulence ; celle-ci favorisait l’immunisation des lapins survivants (voir figure 25.5). Dans les années 1980, tous les lapins étaient résistants à l’infection et la population de lapins avait quasiment retrouvé son niveau de 1950, créant à nouveau des dommages. En 1995, les autorités australiennes ont introduit un nouveau virus très pathogène pour les lapins, le virus de la maladie hémorragique du lapin (RHDV), un virus à ARN monocaténaire et de polarité positive (voir section 16.8). Ce virus devait se transmettre très rapidement, en quelques jours, chez les lapins par contact direct et entraîner la mort de tous les lapins infectés. Cependant, des lapins ayant déjà été en contact avec un virus similaire en Australie avaient acquis une immunité leur conférant une résistance naturelle croisée à l’infection par le RHDV, limitant l’efficacité de ce programme à certaines régions d’Australie. Un équilibre s’était instauré entre le pathogène et son hôte. La coévolution avec équilibre semble la norme pour les pathogènes se transmettant d’un hôte à l’autre. Par contre, pour ceux qui ne passent pas par ce mode de transmission interhôte, comme les Clostridium spp (voir section 25.1) ou ceux transmis par un vecteur, l’absence de sélection hors de l’hôte ne permet pas une réduction de la virulence, le pathogène introduit chez l’hôte à partir du vecteur étant toujours virulent. Plasmodium spp, l’agent du paludisme, subit aussi des variations antigéniques de surface échappant à l’immunité de l’hôte et favorisant sa virulence (voir section 27.5). En situation hospitalière, certaines souches d’Escherichia coli peuvent provoquer des diarrhées importantes, éventuellement mortelles, avec une virulence accrue à chaque nouvelle infection. Ces souches sont transmises entre les malades par l’intermédiaire des soignants, du matériel ou d’une surface,



838 Chapitre 25

Épidémiologie

100

100

B

Mortalité des lapins

A

60

90

40

Virulence des virus

20

Virulence des virus (%)

Mortalité des lapins (%)

80

(b)

(a) 80

0

C

0

1

2

3

4

5

6

Années FIGURE 25.5 Évolutions de la virulence du virus de la myxomatose et de la sensibilité chez le lapin d’Australie. Ces données remontent à la période suivant l’introduction du virus en Australie, en 1950. La virulence est définie par la moyenne de mortalité chez des lapins de laboratoire avec des virus prélevés chaque année. La sensibilité est mesurée chez de jeunes lapins pris sur le terrain avec une souche virale de virulence modérée, entraînant de 90 à 95 % de mortalité chez les lapins de laboratoire.

contaminés au contact des malades, assurant une transmission indirecte. Des mesures d’hygiène strictes peuvent limiter la survenue de nouvelles infections.

FIGURE 25.6 Immunité de population et transmission de l’infection. L’immunité acquise chez certains individus protège les sujets non immunisés de l’infection. (a) Dans une population non protégée, un individu infecté (en rouge) peut infecter successivement tous les sujets non immunisés, ces derniers pouvant alors retransmettre l’agent infectieux (indiqué par les flèches). (b) Pour un pathogène de transmissibilité moyenne tel que Corynebacterium diphtheriae (agent de la diphtérie), la transmission à partir d’un sujet infecté est limitée par la présence dans son entourage de sujets immunisés lors d’un contact antérieur (jaune). Même si certains sujets A sensibles à l’infection deviennent malades (en bleu), d’autres sujets sensibles (B et C), à distance du sujet infecté, sont protégés par les sujets immunisés. Ainsi, une immunité de 70 % de la population suffit pour en protéger l’ensemble devant une infection de transmission moyenne (diphtérie), alors qu’il faut une immunité de 90 % de la population face à une infection de forte transmission (varicelle).

L’immunité de population

Le cycle de l’infection

Cette immunité prend en compte la résistance d’un grand nombre de sujets dans une population face à l’infection. Celleci est importante à considérer pour toute infection et sa gestion préventive en santé publique. Elle doit être d’autant plus à prendre en compte que la virulence est forte, afin de limiter la mortalité due au pathogène. La mise en place des programmes de vaccination dépend de la proportion de sujets immunisés dans la population visée. Ainsi, le programme de vaccination contre l’infection au poliovirus aux États-Unis montra qu’avec 70 % de la population vaccinée l’éradication de la maladie était possible. En effet, la proportion de sujets immunisés permettait de protéger le reste de la population de l’infection au regard du mode de transmission et de la virulence du poliovirus (voir figure 25.6). Pour des infections fortement transmissibles (grippe, rougeole, varicelle, etc.), l’immunité dans la population doit être plus importante, soit de 90 à 95 %. Pour la diphtérie, une immunité de 70 % est estimée comme suffisante ; cependant des épidémies isolées ont montré que, dans des zones plus denses de population, il faut augmenter le taux d’immunité à plus de 80 % pour éviter le risque de propagation de l’infection. Le risque de contamination interhumaine reste plus élevé avec la possibilité de portage de la bactérie chez les sujets immunisés, l’immunité acquise de manière naturelle ou après vaccination protégeant contre la diffusion de la toxine chez l’hôte et non contre le portage digestif (voir section 26.3).

L’étude épidémiologique et l’immunité acquise dans la population montrent que certaines infections évoluent par cycle. Ainsi, la grippe réapparaît tous les hivers dans les collectivités d’enfants ; la transmission par voie respiratoire facilite la diffusion du virus dans ces populations et la variation continue des antigènes viraux de surface leur permet d’échapper à l’immunité acquise l’année précédente. Tous les sujets peuvent donc être infectés et une immunité se développe en parallèle, réduisant la diffusion de la grippe.

Contrôlez vos acquis Les pathogènes coévoluent dans le temps avec leurs hôtes jusqu’à un niveau d’équilibre permettant la survie des deux. Selon le niveau d’immunité contre l’infection dans la population, la diffusion du pathogène sera plus ou moins limitée. Celui-ci peut évoluer éventuellement par cycle lorsqu’une grande proportion de la population reste non immunisée. •

Expliquez le mécanisme de coévolution du pathogène et de son hôte en citant un exemple.

•

Indiquez comment l’immunité de population peut protéger les sujets non immunisés contre l’infection.



25.6 Pandémie du SIDA

II

ÉPIDÉMIES ACTUELLES

L’étude épidémiologique des infections émergentes – SIDA, SRAS et infections nosocomiales – apporte des informations aux professionnels de santé et donne des axes pour la mise en place de stratégies de prévention.

m n

25.6 Pandémie du SIDA

Le SIDA (syndrome d’immunodéficience acquise est une maladie d’origine virale, le virus de l’immunodéficience humaine (VIH), s’attaquant aux défenses immunitaires de l’hôte (voir section 26.14). Les premiers cas furent rapportés à San Francisco, aux États-Unis, en 1981. Jusqu’en 2003, 928 407 cas ont été rapportés dans ce pays, avec 531 669 décès cumulés en 2002, et environ 40 000 nouveaux cas par an (voir figure 25.7). En France, l’Institut de veille sanitaire (INVS) s’est vu notifier 3 294 nouveaux cas en 2003 et 3 165 en 2005, avec respectivement 1 469 et 633 décès. Cette stabilité des nouveaux cas s’observe aussi en Europe, avec 72 903 cas en 2003 et 77 553 en 2005, avec une baisse du nombre de cas de 11 940 à 8 346 pour cette période (www.invs.sante.fr et www.eurovih.org). Dans le monde, de 1981 à 2003, plus de 70 millions de cas de SIDA ont été rapportés, avec 25 millions de décès, 40 millions de survivants et 5 millions de nouveaux cas par an (14 000 cas par jour, dont 2 000 enfants), 90 % des cas étant localisés dans les pays en voie de développement (voir tableau 25.3). En effet, l’Afrique subsaharienne détient le plus gros contingent avec 26,6 millions de cas, des pics de prévalence de près de 39 % au Botswana et au Swaziland, et 2,3 millions de décès sur les 3 millions recensés dans le monde en 2003. 80 000

Nombre total de cas de SIDA

70 000

Cas de SIDA

60 000 50 000 40 000 30 000 20 000 10 000

81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 00 01 02 03

Année FIGURE 25.7 Cas de syndrome d’immunodéficience acquise (SIDA) rapportés chaque année, depuis 1981, aux États-Unis. En 2003, 928 407 cas cumulés de SIDA ont été rapportés, avec une estimation de 531 669 cas de décès. (Centers of Disease Control and Prevention, division de prévention du VIH/SIDA, Atlanta, GA, États-Unis).

TABLEAU 25.3

839

INFECTIONS PAR LE VIH/AGENT DU SIDA, RÉPARTITION MONDIALE, 2003

Localisation

Infections par le VIH

Amérique du Nord

1 million

Caraïbes

460 000

Amérique latine

1,6 million

Europe de l’Ouest

600 000

Europe de l’Est et Asie centrale

1,5 million

Afrique du Nord et Moyen-Orient

600 000

Afrique subsaharienne

26,6 millions

Asie et Pacifique

1 million

Asie du Sud-Est

6,4 millions

Australie et Nouvelle-Zélande

15 000

Le nombre total d’individus infectés par le VIH est estimé à 40 millions (données de l’Organisation mondiale de la santé et du programme des Nations unies sur l’infection par le VIH, 2003).

La mise en évidence de l’épidémie Au début des années 1980, les premiers cas ont été identifiés avec une forte prévalence dans la population homosexuelle de San Francisco, puis chez les toxicomanes usant de drogue par voie intraveineuse. Il pouvait donc s’agir d’un agent transmissible par voie sexuelle et par des aiguilles contaminées par le sang. Les hémophiles, recevant régulièrement des fractions de sang, étaient fortement à risque, ainsi que tous les receveurs de sang et d’organes avant 1985, année de mise en place du dépistage sérologique de cette infection (voir sections 24.10 et 24.11). Aujourd’hui, moins de 1 % des cas de SIDA ont été contaminés par transfusion, les donneurs séropositifs étant exclus des dons de sang. Le dépistage a mis en évidence d’autres modes de contamination, mais essentiellement restreints au sang et aux sécrétions corporelles : sperme, sécrétions génitales et lait maternel (voir figure 25.8). La transmission est interhumaine et directe ; elle n’est pas respiratoire ni ne se fait à partir de l’eau et des aliments. Aux États-Unis, une prévalence anormalement élevée de l’infection avait été rapportée chez les sujets homosexuels masculins. Mais, l’infection fut retrouvée chez les femmes (transmission hétérosexuelle), les enfants (transmission maternofoetale) et de manière plus fréquente dans certaines populations, notamment d’origine africaine. Aujourd’hui, la transmission hétérosexuelle est de loin la plus importante. Les sujets à risque d’infection par le VIH présentent deux profils spécifiques : 1) une activité sexuelle ou l’usage de drogue par voie intraveineuse permettant la transmission de sécrétions ou de sang contaminés, 2) un échange avec des partenaires multiples de manière non protégée (absence de préservatifs ou de seringue à usage unique). En 2002, 158 nouveaux cas de SIDA ont été rapportés chez les enfants aux États-Unis ; 678 cas l’ont été en Europe en 2003 et 467 cas en 2005. Le virus peut être transmis, dans 20 à 40 % en l’absence de traitement, de la mère à l’enfant in utero par le sang, à la naissance par les sécrétions génitales et



840 Chapitre 25

Épidémiologie

Hommes

Légende : Homosexuel masculin (MSM)

1% 6%

Toxicomanes intraveineux (IVDU)

16 %

MSM et IVDU 55 %

Hétérosexuel Autre/inconnu

22 %

Femmes 3%

29 %

68 %

25.7 Infections acquises à l’hôpital m n (nosocomiales) Le milieu hospitalier est un environnement propice à la propagation des infections depuis des malades infectés vers des malades non infectés devenant alors encore plus malades. Ces infections se transmettent d’autant plus facilement que les sujets sont proches et qu’ils sont fragilisés par leur maladie. La transmission de ces infections se fait au hasard des contacts entre patients ou par le personnel soignant. Ces infections acquises à l’hôpital dans près de 5 % des cas sont dites nosocomiales, du nom latin nosocomium, pour hôpital. Dans certains services plus exposés au risque nosocomial avec des malades plus fragilisés – en unité de soins intensifs, en réanimation, au bloc opératoire –, leur taux peut atteindre 10 %. Ces infections représentent au total 2 millions de cas, avec 80 000 décès chaque année aux États-Unis ; en France, 750 000 cas, avec de 7 000 à 10 000 décès, 4 200 d’entre eux sans autre cause qu’une infection nosocomiale. Le développement de pathogènes multirésistants aux traitements anti-infectieux est un réel problème, propre aux structures hospitalières qui favorisent leur émergence et leur maintien. Ces pathogènes peuvent être retrouvés dans la flore des soignants à l’état de portage, favorisant la transmission aux malades à leur contact.

L’environnement hospitalier FIGURE 25.8 Répartition des cas de SIDA, selon le sexe et les facteurs de risque, chez des adolescents et des adultes en 2002 aux États-Unis. Un total de 42 745 cas de SIDA a été rapporté cette année (31 712 hommes, soit 74 %, et 11 059 femmes, soit 26 %). [Centers of Disease Control and Prevention, division de prévention du VIH/SIDA, Atlanta, GA, États-Unis].

après la naissance par le lait maternel ; ce mode de transmission très fréquent en Afrique est à l’origine des trois millions de cas infantiles rapportés. La mise en évidence de ce mode propre à l’Afrique, en plus de la voie hétérosexuelle, permet d’orienter les programmes d’information et de prévention du SIDA afin de limiter la diffusion de cette infection dans ces pays à forte prévalence.

Contrôlez vos acquis Le SIDA est une des maladies infectieuses les mieux étudiées. Il reste un problème majeur de santé publique, notamment pour les pays en voie de développement. Il n’existe pas de traitement curatif de la maladie, ni de vaccin pour endiguer sa diffusion. •

Indiquez les principaux facteurs de risque de contracter l’infection.

•

Estimez le nombre de cas de SIDA aujourd’hui aux États-Unis et le nombre de nouveaux cas pour les deux années à venir.

Les infections diffusent facilement et rapidement à l’hôpital pour différentes raisons : 1) les malades sont moins résistants à l’infection (baisse des défenses immunitaires, hôtes déficients – voir section 21.13) ; 2) les malades infectés constituent un réservoir pour des pathogènes très virulents ; 3) la proximité des malades dans une même pièce et les plaies favorisent la transmission et la diffusion du pathogène ; 4) le personnel soignant passe d’un patient à l’autre, ce qui facilite la transmission interhumaine ; 5) le matériel médical réutilisable et les procédures invasives telles que les injections hypodermiques, les ponctions lombaires, les ponctions biopsiques de tissu et de liquide, favorisent l’entrée du pathogène chez un nouvel hôte ; 6) la contamination des nouveau-nés est plus grande à partir des plaies de la mère du fait d’une immunité immature ; 7) les interventions chirurgicales exposent les sites organiques stériles à la flore du sujet opéré et éventuellement aux pathogènes ; 8) les traitements immunosuppresseurs (corticoïdes, ciclosporine chez les sujets transplantés d’organe ou de moelle osseuse) augmentent le risque infectieux ; 9) l’utilisation intensive d’antibiotiques augmente la résistance des pathogènes circulants (voir tableau 25.4 et section 20.12).

Les pathogènes hospitaliers Ces pathogènes infectent préférentiellement les voies urinaires et respiratoires ainsi que le sang. Quelques pathogènes, moins d’une dizaine, sont responsables de la plupart des infections nosocomiales (plus des trois quarts des cas, voir tableau 25.4). Un des plus important, Staphylococcus aureus, est fréquemment rencontré dans les pneumopathies, les infections sur plaies, les bactériémies nosocomiales et les infections en maternité (voir



25.8 Syndrome respiratoire aigu sévère (SRAS) 841

NOMBRE D’INFECTIONS NOSOCOMIALES PAR SITE ET PAR MICRO-ORGANISME,

•

Indiquez en quoi les malades sont plus sensibles à l’infection.

EN UNITÉ DE SOINS INTENSIFS

•

Expliquez pourquoi la résistance aux antibiotiques est un problème à l’hôpital.

•

Précisez la source des pathogènes opportunistes.

AUX

ÉTATS-UNIS

Sang

Pneumopathie

Voie urinaire

Nombre

Nombre

Nombre

1 083

4 444

1 560

Escherichia coli

514

1 725

5 393

Klebsiella pneumoniae

735

2 865

1 891

Pathogène Enterobacter spp.

1 738

Haemophilus influenzae 841

6 752

3 365


2 758

7 205

497

Staphylococcus spp.

8 181

Enterococcus spp.

2 967

Candida albicans Autres pathogènes


a

Nombre total Total %

838 682

4 226

1 090

1 862

4 856

3 774

12 537

8 075

21 943

39 810

30 701

23,7

43,1

33,2

a

Le nombre total des infections nosocomiales en unité de soins intensifs au début des années 1980 était de 92 454. Source : National Nosocomial Infections Surveillance System Report, Centers for Disease Control, Atlanta, Géorgie, États-Unis.

section 20.12). S. aureus présente dans ces situations une virulence accrue et souvent un niveau élevé de résistance aux antibiotiques, notamment à la méticilline, les SARM (S. aureus méticilline résistants). Les SARM sont très fréquents dans les infections nosocomiales, avec près de 20 % de cas rapportés en France. D’autres staphylocoques sont aussi fréquemment retrouvés dans le sang, les cathéters et les plaies, étant présents dans la flore cutanée normale des malades comme des soignants. Escherichia coli est le pathogène le plus fréquemment retrouvé dans les infections urinaires nosocomiales, mais aussi les entérocoques, Pseudomonas aeruginosa, Candida albicans et Klebsiella pneumoniae. Candida et Pseudomonas sont des pathogènes opportunistes provenant de l’environnement et se développent chez des sujets fragilisés ; les autres micro-organismes s’y développent à partir de la flore normale de l’hôte (voir section 21.13). Ces micro-organismes, sous la pression de la sélection thérapeutique à l’hôpital, sont de plus en plus résistants aux antibiotiques et rendent ainsi problématique la mise en œuvre contre les infections (voir section 20.12).

Contrôlez vos acquis De nombreux micro-organismes sont des pathogènes potentiels dans l’environnement hospitalier. Les malades sont plus sensibles à l’infection par ces pathogènes opportunistes. Leur traitement est rendu plus difficile par leur résistance accrue aux antibiotiques.

25.8 Syndrome respiratoire aigu m n sévère (SRAS) Le SRAS est une zoonose émergente qui est apparue en novembre 2002 en Chine centrale, dans la région du Guangdong. En février 2003, cette infection était identifiée dans trente-deux pays. L’agent en cause est un coronavirus isolé chez un mammifère carnivore, la civette, vendu sur les marchés et consommé en Chine.

Le coronavirus SRAS Le coronavirus du SRAS, SRAS-CoV, est un virus à ARN monocaténaire. Les coronavirus sont en général à l’origine d’infections modérées des voies respiratoires hautes chez l’homme et digestives chez l’animal (voir section 9.12). Le SRAS-CoV induit une pneumopathie grave atypique. Il s’agit d’un virus sphérique de 120 à 160 nm, avec des spicules protéiques caractéristiques à sa surface (voir figure 25.9). Sa séquence, identifiée moins de deux mois après son isolement par culture cellulaire, montrait qu’il ne s’agissait pas d’un coronavirus sauvage muté, ni d’un recombinant de deux coronavirus humain et animal. Ne présentant pas d’homologie avec un virus connu, il est peu probable qu’il

CDC/C.S. Goldsmith, T.G. Ksiazek, S.R. Zaki/Public Health Image Library

TABLEAU 25.4

FIGURE 25.9 Syndrome respiratoire aigu sévère à coronavirus (virus du SRAS). L’encadré du haut montre le virus du SRAS, dont le diamètre est de 125 nm, observé par microscopie électronique. En bas, des coronavirus en cours de réplication sont associés aux membranes des vacuoles cytoplasmiques et retrouvés dans le réticulum endoplasmique d’une cellule infectée.



842 Chapitre 25

Épidémiologie

s’agisse d’un virus issu d’une manipulation génétique ou du bioterrorisme. Il était fort probablement localisé dans un réservoir animal et s’est transmis accidentellement chez l’homme.

L’épidémiologie du SRAS Le SRAS-CoV se transmet chez l’homme par aérosol, par contact interhumain, par contamination fécale et par les fomites. Comme la plupart des virus respiratoires, le SRAS-CoV est relativement résistant, facile à transmettre et difficile à enrayer. Cependant, au contraire des virus respiratoires courants qui occasionnent des infections bénignes, le SRAS-CoV induit une maladie mortelle. Sur les 8 459 infections recensées, plus de 800 cas mortels ont été rapportés, soit près de 10 %. Environ 20 % de ces infections ont touché des personnels soignants, montrant une infectivité plus importante. La mortalité a été plus grande chez les sujets de plus de 65 ans, avec près de 50 %, indiquant une virulence plus élevée en cas d’immunité plus faible. Les patients atteints de SRAS sont isolés dans des chambres à pression négative pour limiter la transmission et les soignants portent des masques et des gants. Le diagnostic de l’infection se fait à l’aide de tests sérologiques, montrant une élévation du titre des anticorps, et le diagnostic direct, par RT-PCR ; l’isolement est réalisé sur culture cellulaire à partir de prélèvements respiratoires (voir sections 24.7, 24.12 et 24.13). Le SRAS est une infection grave qui a émergé très rapidement à partir d’une source unique et dont la diffusion a été facilitée par les voyages. Cependant, l’identification rapide de l’agent en cause, de son origine et de son mode de transmission, ainsi que le développement rapide de tests diagnostiques ont permis un contrôle rapide de cette infection.

Contrôlez vos acquis Un nouveau virus impliqué dans une zoonose, le SRASCoV, induit un syndrome respiratoire aigu sévère (SRAS). La transmission interhumaine est respiratoire. Le contrôle de cette infection mortelle s’est fait par un diagnostic rapide et l’isolement des malades. •

Identifiez l’origine du SRAS-CoV.

•

Indiquez les modalités permettant d’enrayer la diffusion de l’infection.

III

ÉPIDÉMIOLOGIE ET SANTÉ PUBLIQUE

Le présent chapitre aborde les méthodes d’identification et d’éviction des maladies infectieuses dans la population, ainsi que les risques à venir.

25.9 Mesures de santé publique m n pour le contrôle des maladies infectieuses

La Santé publique s’intéresse à la santé de la population et au contrôle des infections. Ce dernier siècle a vu disparaître un

grand nombre d’infections, notamment dans les pays développés, avec une amélioration du niveau de vie et de l’hygiène, due à une meilleure alimentation, un accès à l’eau potable, un système d’épuration des eaux usées, une diminution de la surpopulation en zone urbaine, une réduction des charges de travail, etc. Ces améliorations ont contribué à diminuer les facteurs de risque d’infections (voir section 21.13). D’autres maladies infectieuses comme la variole, la fièvre typhoïde, la diphtérie, la brucellose et la poliomyélite ont été ou sont contrôlées par des mesures de prévention de santé publique, et notamment par la vaccination.

Le contrôle des réservoirs de pathogènes Si le réservoir du pathogène se situe principalement chez les animaux domestiques, il est possible de contrôler l’infection chez l’animal et donc le risque de transmission à l’homme (abattage ou traitement antibiotique des animaux atteints, vaccination des animaux non infectés). La brucellose et la tuberculose bovine ont été ainsi largement réduites chez l’homme, le risque de transmission de prions, agent de l’encéphalite bovine (ou maladie de la vache folle) a été éliminé en GrandeBretagne, en France, au Canada et aux États-Unis. Parallèlement, l’état sanitaire des animaux domestiques et d’élevage a été largement amélioré et les abattages réduits, ce qui représente un bénéfice économique pour les fermiers et de santé pour le consommateur. Si le réservoir est un animal sauvage, le contrôle de l’infection est beaucoup plus compliqué. La rage sévit chez les animaux sauvages et domestiques, se transmettant essentiellement des premiers aux seconds, et accidentellement à l’homme. Son contrôle passe donc par la vaccination des animaux domestiques dans les zones à risque (voir section 27.1). Il passe aussi par l’abattage des animaux sauvages malades et la vaccination des animaux sains (renards, chiens errants, chauves-souris, moufettes…). Cependant, l’accès à ces animaux reste difficile, les résultats ayant été incertains dans les populations animales sauvages des États-Unis en raison de l’étendue des zones à couvrir. Par contre, la vaccination orale antirabique par largage de viandes imbibées de vaccin dans le nord-est de la France dans les années 1980 a permis l’éradication de la rage sylvestre. Les derniers cas rapportés en France dans les années 1990 étaient dus à des chiens errants provenant d’Afrique du Nord. Si le réservoir est un insecte (moustique dans le cas du paludisme et la fièvre West Nile), le contrôle de l’infection passe par l’utilisation d’insecticides, de répulsifs ou de moustiquaires (voir sections 27.5 et 27.6). L’application des insecticides chimiques doit tenir compte du risque environnemental, certains produits étant trop toxiques. Ainsi, le dichlorodiphényltrichloroéthane (DDT), toujours utilisé dans les pays en voie de développement et efficace pour limiter la transmission du paludisme et de la fièvre jaune, est interdit aux États-Unis (voir section 19.18). Si le réservoir est l’homme (cas du virus du SIDA), le contrôle de l’infection peut être difficile, notamment pour les infections chroniques avec porteurs asymptomatiques. La vaccination et le traitement, quand ils sont possibles, avec l’isolement des patients à risque ou atteints, sont les moyens d’éradication de l’infection. Cette stratégie, coordonnée par l’OMS, a été un succès pour l’éradication de la variole dans



25.9 Mesures de santé publique pour le contrôle des maladies infectieuses 843

les années 1970. Elle a aussi été mise en œuvre avec un certain succès depuis les années 1980 pour l’éradication de la poliomyélite (quasiment disparue dans le monde), de la rougeole (presque disparue aux États-Unis), de la rubéole, des oreillons et de l’hépatite B (voir chapitre 26).

Le contrôle de la transmission des pathogènes La prévention de la contamination de l’eau et des aliments par un pathogène est réalisée par le traitement de l’eau et des aliments, l’épuration des eaux usées, la pasteurisation du lait et le contrôle microbiologique des aliments (voir section 28.3). Ces mesures ont permis de contenir la fièvre typhoïde, la tuberculose bovine et les salmonelloses (voir chapitre 29). Les pathogènes transmis par voie respiratoire sont beaucoup plus difficiles à éradiquer. La désinfection chimique ou la filtration de l’air est limitée à des espaces restreints (voir section 20.3). Le port de masque au Japon limite la transmission des infections respiratoires, mais cette mesure préventive, fondée sur le volontariat, ne constitue pas une stratégie fiable de santé publique.

La vaccination La variole, la diphtérie, le tétanos, la coqueluche, la rougeole, les oreillons, la rubéole et la poliomyélite ont été principalement contrôlés par la vaccination (voir section 22.13). Une protection de 100 % n’est pas obligatoire pour protéger la population du risque infectieux, ce pourcentage est dépendant du niveau d’infectivité et de virulence du pathogène ainsi que de la densité de population (voir section 25.5). Avant 1963 et la disponibilité du vaccin contre la rougeole, le nombre de cas de rougeole était de 400 000 par an aux ÉtatsUnis. Ce nombre a diminué très rapidement avec l’introduction du vaccin pour atteindre 1 497 cas en 1983 (voir section 26.7). Cependant, en 1990, le pourcentage des enfants vaccinés était descendu à 70 % et le nombre de sujets infectés restait plus élevé, avec 27 786 cas. Les efforts de santé publique pour vacciner plus de 90 % de la population dans les trois ans qui suivirent ont permis la réduction des cas à 312 en 1993. Depuis, une centaine de cas est rapportée chaque année, dont la moitié par importation aux États-Unis. L’infection persiste tant que l’ensemble de la population n’est pas protégé ; les enfants sont sensés être tous vaccinés dans le cadre de ces programmes nationaux mais encore près de 80 % de sujets adultes ne sont pas protégés car le taux de vaccination diminue avec l’âge. Les infections de l’enfance (rougeole, oreillon, rubéole) peuvent être très graves chez l’adulte. Dans certaines situations, une vaccination de rattrapage est proposée. Ainsi le vaccin ROR, qui assure la protection contre la rubéole, les oreillons et la rougeole, est proposé, avant grossesse, chez les femmes non immunisées contre la rubéole. En effet, ces femmes présentent un risque très grave d’atteinte fœtale en cas d’infection en début de grossesse, la rubéole congénitale (voir section 26.7). La vaccination doit être contrôlée chez chaque sujet avec des rappels éventuels (tous les dix ans pour le tétanos). Les enquêtes d’immunisation contre le tétanos, comme pour la rougeole, montrent que plus de 10 % des adultes de moins de 40 ans et plus de 50 % de ceux de plus de 60 ans ne sont pas protégés. Le rappel vaccinal est recommandé lors d’un risque d’exposition à l’infection, celui contre la poliomyélite étant proposé pour les

sujets voyageant dans les zones à risque d’Afrique et d’Asie, où des cas persistent et non aux États-Unis (voir recommandations, section 22.12 et discussions, chapitres 26 à 29).

La quarantaine La quarantaine impose la restriction de déplacement aux sujets infectés ou exposés au risque d’infection par un pathogène pour en éviter sa diffusion. La durée de la quarantaine dépend du temps d’incubation de l’infection pour que la maladie se déclare. Elle concerne, d’après un accord international six maladies infectieuses : variole (disparue aujourd’hui), choléra, peste, fièvre jaune, fièvre typhoïde et fièvres récidivantes, ainsi que, dans certaines situations épidémiques, les fièvres hémorragiques et les méningites (voir tableau 25.5 et section 25.10). En cas d’infections émergentes graves, comme le SRAS ou la grippe aviaire, il est nécessaire d’isoler les sujets à risque de manière plus stricte en milieu hospitalier.

La surveillance La surveillance épidémiologique comprend la mise en évidence, l’identification, la déclaration et la notification des infections émergentes. La liste des infections surveillées aux États-Unis, indiquée dans le tableau 25.5, est globalement la même en France. Certaines infections rapportées dans les tableaux 25.2 et 25.7 ne figurent pas dans cette liste, mais sont notifiées dans des laboratoires régionaux aux États-Unis. Elles sont aussi notifiées en France par les laboratoires de microbiologie médicale des hôpitaux en liaison avec les directions départementales des affaires sanitaires et sociales (DDASS) et l’Institut de veille sanitaire (INVS). Aux États-Unis, cette surveillance est assurée par les centres de contrôle et de prévention des maladies (Centers for Disease Control and Prevention ou CDC) dans le cadre du Centre national des maladies infectieuses (National Center for Infectious Disease ou NCID), qui coordonnent un certain nombre de programmes (grippe, West Nile, hépatite, SIDA, tuberculose, paludisme, résistance aux antibiotiques, infections émergentes, infections nosocomiales, contamination par l’eau et les aliments,…). L’équivalent en France repose sur quarante-six centres nationaux de référence (CNR hépatite, VIH, chlamydia, coqueluche, entérovirus, cytomégalovirus, rotavirus…). Chaque centre identifie le pathogène en cause et collige les données pour chaque infection déclarée par les différents laboratoires de microbiologie médicale en France. Ces informations sont centralisées par l’INVS, qui coordonne aussi un certain nombre de programmes, en liaison avec la Direction générale de la Santé (DGS) et le Ministère de la Santé français (voir sur le site www.invs.sante.fr). Ces infections sont souvent rapportées dans différents programmes dont les finalités sont différentes mais permettent par croisement de redéfinir des stratégies de prévention, de diagnostic, d’isolement et de traitement. Ainsi, l’émergence aux États-Unis des staphylocoques résistant à la vancomycine, encore rare en France en raison d’une utilisation plus contrôlée de cet antibiotique, fait l’objet d’une veille par le Système de surveillance des infections nosocomiales (National Nosocomial Infections Surveillance System ou NNIS), notifiée par les CDC (voir tableau 25.5) ; le recensement profite aux professionnels hospitaliers pour prendre en charge les nouveaux cas émergents. En France, les infections



844 Chapitre 25

TABLEAU 25.5

Épidémiologie

INFECTIONS ET MALADIES RAPPORTÉES AUX ÉTATS-UNIS ET EXISTANTES EN FRANCE

Maladies dues à des bactéries

Charbon ou anthraxa Botulisme Brucellose Chancre Chlamydia trachomatis Choléra Diphtérie Ehrlichiose Escherichia coli entérohémorragique Escherichia coli O157:H7 Gonorrhée Infection invasive à Haemophilus influenzae Maladie de Hansen (lèpre) a Syndrome hémolytique urémique Légionellose Listériose Maladie de Lyme Méningite à méningocoque Coqueluche Peste Psittacose Fièvre Q Fièvre isolée des montagnes Rocheusesa Salmonellose Shigellose Infection invasive à streptocoque du groupe A Syndrome de choc toxique à streptocoque Infection invasive à Streptococcus pneumoniae, résistant à la pénicilline Syphilis Tétanos Syndrome de choc toxique Tuberculose Tularémie Fièvre typhoïde Staphylococcus aureus Intermediaire à la Vancomycine (VISA) Staphylococcus aureus Résistant à la Vancomycine (VRSA) a

Maladies dues à des champignons (filamenteux, levure) Coccidiomycose Cryptosporidiose Maladies dues à des virus Syndrome d’immunodéficience acquise (SIDA) et infection pédiatrique à VIH Encéphalite/méningite (transmises par moustique) de Californiea Équine de l’Est a De Powassana De Saint Louisa Équine de l’Ouesta West Nile Syndrome pulmonaire à Hantavirus Hépatite A, B, C Infection à VIH Adulte Pédiatrique (< 13 ans) Rougeole Oreillons Poliomyélite Rage animale et humaine Rubéole aiguë et congénitale Syndrome respiratoire aigu sévère (SRAS) Variole Varicelle Fièvre jaunea Maladies dues à des

protozoaires Cyclosporidiose Paludisme ou malaria Giardiose Maladie dues à des helminthes Trichinose

Infections et maladies non implantées en France.

nosocomiales sont recensées et les stratégies de prévention et la formation du personnel soignant sont assurées par les centres de lutte contre les infections nosocomiales (CLIN) dans chaque établissement hospitalier ; les CLIN sont coordonnés par des centres régionaux (C-CLIN) et, au niveau national, par l’INVS [réseau d’alerte, d’investigation et de surveillance des infections nosocomiales (Raisin)].

L’éradication des pathogènes L’éradication d’un pathogène est possible puisqu’elle a été obtenue pour la variole dans les années 1970 grâce à un programme de vaccination systématique lancé en 1967 par l’Organisation mondiale de la santé (OMS ou WHO pour World Health Organization). Cette vaccination avec un virus du bovin apparenté à celui de la variole humaine, la vaccine, a été conduite au niveau mondial, notamment dans les zones endémiques d’Afrique, du Moyen-Orient et d’Asie, et poursuivie lors de chaque épidémie, avec placement en quarantaine des sujets atteints et vaccination des sujets contacts afin d’obtenir la rupture de la chaîne de transmission. Cela n’est possible que dans le cas d’une infection strictement de transmission interhumaine, sans réservoir extérieur, comme pour la variole. La dernière épidémie a été observée en France en 1954 à Vannes, avec 16 décès sur 73 infections. Le dernier cas a été rapporté en 1977 en Somalie, et la déclaration d’éradication a été faite par l’OMS en 1980. L’éradication de la poliomyélite fait parti des objectifs de l’OMS depuis les années 1980, avec un programme de vaccination systématique. Ce programme a permis la disparition des endémies dans les pays occidentaux et dans certains pays d’Afrique et d’Asie. Par contre, elle persiste encore en 2004 au Nigéria et en Afrique de l’Ouest, aux Indes, au Pakistan, en Afghanistan et en Égypte (un cas en 2003), avec une recrudescence ces dernières années (800 cas en 2003, plus de 1 760 cas en 2006). L’éradication de la lèpre, une autre maladie de transmission strictement interhumaine, fait aussi parti des objectifs de l’OMS avec le traitement antibiotique des cas rapportés, permettant la guérison et la prévention de la diffusion de l’agent causal, Mycobacterium leprae (voir section 26.5). D’autres maladies infectieuses font l’objet d’un programme d’éradication, comme la rougeole et la rubéole (vaccination ROR), la syphilis (dépistage et traitement antibiotique), la rage (dépistage et vaccination antirabique des cas contacts), la maladie de Chagas (traitement antiparasitaire contre Trypanosoma cruzi et destruction des insectes vecteurs) et la dracunculose (traitement antiparasitaire de l’eau contaminée par Dracunculus medinensis) [voir sections 26.7, 26.12 et 27.1].

Contrôlez vos acquis Le contrôle de l’infection de l’eau et des aliments, de la transmission par vecteurs, l’application des programmes de santé publique visant la surveillance et l’éradication de certaines infections, l’utilisation de la vaccination et l’isolement en quarantaine devraient contribuer à réduire le risque infectieux. •

Comparez les programmes de prévention des infections à partir de réservoir d’insectes ou d’humains, porteurs asymptomatiques.

•

Précisez les méthodes permettant de limiter la diffusion de l’infection en cas d’épidémie.



25.10 Considérations générales en santé publique 845

m n

25.10 Considérations générales en santé publique

L’OMS a réparti le monde en six zones géographiques pour le recensement des données épidémiologiques des infections : Amériques, Europe, Afrique, Moyen-Orient, Asie du Sud-Est et l’ouest du Pacifique.

Comparaisons des maladies infectieuses en Afrique et aux Amériques Aux Amériques, il y a environ 853 millions d’habitants et 6 millions de morts chaque année (soit 7 ‰). En Afrique, il y a environ 672 millions d’habitants et 10,7 millions de décès par an (soit 15,9 ‰). Le taux de décès est donc deux fois plus élevé en Afrique, et il est essentiellement dû aux maladies infectieuses (69 %), alors qu’aux Amériques, les maladies cardiovasculaires et le cancer prédominent (51 %) [voir figure 25.10]. Sur la base des programmes appliqués dans les pays en voie de développement au siècle dernier, cette différence sur l’origine infectieuse de la mortalité dans les deux continents est sans doute due aux instances de santé publique Afrique en 2002 : 10,7 millions de décès Intentionnel 2%

Autre 5 %

Blessure 7% Respiratoire 2% Cardiovasculaire 10 % Maternel et périnatal 7 %

Infections 63 %

Cancer 4% Amérique en 2002 : 6,0 millions de décès Intentionnel 2% Blessure 7%

Autre 14 %

Infections 11 % Cancer 19 %

Diabètes 4% Respiratoire 7%

Cardiovasculaire 32 %

Maternel et périnatal 4 %

FIGURE 25.10 Causes de décès en pourcentage en Amérique et en Afrique, en 2002. On a relevé près de 10,7 millions de décès dont 6,7 millions dus à des maladies infectieuses en Afrique et 6 millions de décès dont 623 000 par maladies infectieuses en Amérique. Les décès intentionnels comprennent les meurtres, les suicides et les guerres.

en charge de la prévention de ces maladies. Le défaut de moyens en Afrique limite l’accès au soin et à la prévention par la vaccination, à l’hygiène de l’eau et des aliments.

Voyage en pays d’endémie La forte incidence de certaines infections dans certaines régions du monde fait courir le risque d’acquisition de l’infection pour les voyageurs. Ces voyageurs peuvent se protéger par la vaccination contre un grand nombre d’infections avant leur départ (voir tableau 25.6). Dans les situations où aucun vaccin n’est disponible (SIDA, fièvre hémorragique, dengue, amibiase, encéphalite, paludisme, typhus, etc.), le voyageur est amené à prendre des précautions d’hygiène (eau décontaminée ou de source, aliments bien conservés et cuits), à éviter les piqûres d’insectes (répulsifs, moustiquaire) et les morsures d’animaux (par évitement du contact avec des animaux suspects de maladies), à prévenir le risque sexuel (préservatif) et à prendre des traitements anti-infectieux prophylactiques pour prévenir le développement de toute infection.

Contrôlez vos acquis Les maladies infectieuses sont à l’origine de près de 30 % de la mortalité mondiale, notamment dans les pays en voie de développement (plus de 60 %). Les voyageurs dans les zones d’endémies doivent se protéger par vaccination quand cela est possible, sinon par des mesures appropriées. •

Comparez la mortalité due aux infections en Afrique à celle aux Amériques.

•

Individualisez les infections pour lesquelles vous n’êtes pas vacciné et définissez le risque infectieux pour l’année à venir ainsi que les modalités de prévention vous concernant.

25.11 Infections émergentes m n et réémergentes La survenue de maladies infectieuses est un phénomène global et dynamique. La répartition mondiale des infections est un phénomène transitoire pouvant évoluer très rapidement. Des modifications génétiques du pathogène, de son habitat, de l’environnement, des vecteurs ou de l’hôte peuvent contribuer à faire apparaître une nouvelle infection dans une zone donnée sur un plan épidémique, voire pandémique. Ces nouvelles infections sont dites émergentes. Elles sont dites réémergentes lorsque l’infection était connue et contrôlée, et qu’elle réapparaît (après apparition d’une résistance à un antibiotique par exemple). De nombreuses infections ont la possibilité d’émerger ou de réémerger (voir tableaux 25.2, 25.7 et figure 25.11). Ces phénomènes d’émergence ont été rapportés dans le passé pour différentes maladies : la peste, due à Yersinia pestis, qui a entraîné au Moyen Âge la mortalité d’un tiers de la population en Europe, Afrique et Asie par périodes épidémiques (voir section 27.7) ; la syphilis, due à



846 Chapitre 25

TABLEAU 25.6 Maladie

Épidémiologie

VACCINATIONS REQUISES OU RECOMMANDÉES AUX VOYAGEURS INTERNATIONAUX Recommandationb

Destination

Fièvre jaune

Zones tropicales et subtropicales, notamment Afrique subsaharienne et Amérique du Sud

Vaccination requise à l’entrée

Rage

Zones rurales et montagneuses, Europe de l’Est et Afrique du Nord

Vaccination recommandée si contact direct avec des animaux mordeurs et sauvages

Fièvre typhoïde

La plupart des pays d’Afrique, d’Asie, d’Amérique centrale et du Sud

Vaccination recommandée dans les zones endémiques pour la fièvre typhoïde

a

National Center for Infectious Diseases Travelers’ Health, États-Unis. Département de la santé publique, http://www.cdc.gov/travel. Les vaccinations sont en général recommandées pour la diphtérie, la coqueluche, les hépatites A et B, le tétanos, la polio, la rougeole, les oreillons, la rubéole et la grippe, selon l’âge du voyageur (voir section 22.13). La plupart des individus sont immunisés contre ces infections. Les recommandations de vaccinations spécifiques pour chaque pays sont rapportées sur le site Internet. Les recommandations de mesures préventives y sont aussi données pour chaque maladie infectieuse, tels le traitement prophylactique contre le paludisme ou la prévention de la peste dans les zones à risque. Il n’y a pas de prérequis pour le retour aux États-Unis ou en Europe.

b

Treponema pallidum, qui a été à l’origine de nombreuses infections et décès jusqu’au XXe siècle (voir section 26.12) ; la grippe, due au virus influenza, qui a été à l’origine de la grande pandémie de 1918-1919, appelée grippe espagnole, et qui fit plus de morts, avec trente millions de cas estimés, que la Première Guerre mondiale (voir figure 25.1 et section 26.8). Dans les années 1980 ont été décrits la légionellose, due à Legionella pneumophila (voir section 28.7), le SIDA (voir section 26.14), la maladie de Lyme (voir section 27.4), l’hépatite C (voir section 26.11), plus récemment, depuis 2000, aux États-Unis, le virus West Nile (voir section 27.6), et potentiellement, au niveau mondial, le SRAS (voir section 25.8).

Les facteurs d’émergence Les facteurs d’émergence de nouveaux pathogènes sont : 1) la démographie et les comportements humains à risque, 2) la technologie et l’industrie, 3) le développement économique et l’aménagement du territoire, 4) les voyages internationaux et la mondialisation des échanges commerciaux, 5) l’évolution et l’adaptation des micro-organismes, 6) l’arrêt de mesures de santé publique et 7) tous les éléments contribuant à la rupture de l’équilibre entre le pathogène et son hôte. La démographie humaine a beaucoup changé depuis 1800, avec des concentrations en zones urbaines allant de 2 % à près de 50 % de la population mondiale aujourd’hui, facilitant la transmission interhumaine de certains pathogènes. Ainsi, la

Légionellose 2003 Tularémie 2003 Diphtérie et coqueluche 2003 Peste 2003 Choléra SRAS 2002 Peste Choléra 2003 SRAS 2003 2002 2003 Fièvre jaune Polio Grippe 2003 Rougeole 2003 aviaire Ebola 2003 2003 2004 Dengue 2002

SRAS 2003 West Nile 2004

Choléra 2003

FIGURE 25.11 Épidémies récentes d’infections émergentes ou réémergentes. La carte mondiale indique des épidémies rares mais significatives. Elles sont locales, mais peuvent aussi se diffuser dans d’autres régions de manière épidémique, voire pandémique. La distribution de pandémies établies comme celle de l’infection par le VIH/SIDA et d’épidémies annuelles et prévisibles comme celle de la grippe n’est pas montrée ici.



25.11 Infections émergentes et réémergentes 847

TABLEAU 25.7

INFECTIONS ÉPIDÉMIQUES ÉMERGENTES ET RÉÉMERGENTES

Micro-organisme

Maladie et symptômes

Mode de transmission

Origine de l’émergence

Bactéries, rickettsies et chlamydia Bacillus anthracis

Charbon ou anthrax : détresse respiratoire, hémorragie

Inhalation ou contact avec des endospores

Bioterrorisme


Maladie de Lyme : érythème, fièvre, altérations neurologiques et cardiaques, arthrite

Piqûre de tiques Ixodes infectés

Cerfs et hommes dans des zones forestières

Campylobacter jejuni

Gastro-entérite à Campylobacter : douleur abdominale, diarrhée, fièvre

Ingestion d’aliment, d’eau ou de lait contaminés ; transmission oro-fécale à partir de sujet ou d’animal infecté

Consommation de volailles mal cuites ; dépistage accru


Trachome, infections génitales, conjonctivite, pneumopathie infantile

Transmission sexuelle

Activité sexuelle accrue ; risque sanitaire

Ingestion d’aliment contaminé, bœuf mal cuit et lait cru

Développement d’un nouveau pathogène et dépistage

Escherichia coli O157:H7 Colite hémorragique ; thrombocytopénie ; syndrome urémique hémolytique Haemophilus influenzae biogroupe aegyptus

Fièvre purpurique brésilienne ; conjonctivite purulente, fièvre, vomissement

Contamination à partir de sujet infectés ; possiblement par des moustiques

Virulence accrue sans doute par mutation

Helicobacter pylori

Gastrite, ulcères, cancer gastrique probable

Contamination par aliment ou eau, lait cru, contact avec des chiots porteurs

Dépistage accru lors d’ulcère

Legionella pneumophila

Maladie du légionnaire : malaise, myalgie, fièvre, névralgie, pneumopathie

Systèmes d’air conditionné et d’apport en eau

Situation épidémique


Tuberculose : toux, perte de poids, lésions pulmonaires et diffusion à d’autres organes

Aérosol à partir de toux ou éternuement de sujet porteur

Immunosuppression, immunodéficience, niveau d’hygiène faible

Neisseria meningitidis

Méningite bactérienne

Transmission interhumaine

Urbanisation et baisse de la surveillance locale


Abcès, pneumopathie, endocardite, choc toxique

Contact de lésions purulentes et manuportage

Situation épidémique et mutation probable


Fièvre scarlatine, atteinte articulaire, choc toxique

Contact de sujets porteurs ; ingestion d’aliment contaminé

Virulence accrue par mutation probable

Vibrio cholerae

Choléra : diarrhée sérieuse, déshydratation rapide

Eau contaminée par les selles de sujets infectés ; aliment exposé à l’eau contaminée

Faible niveau d’hygiène ; introduit sans doute par l’eau de cale des cargos

Dengue

Fièvre hémorragique

Piqûre par moustique infecté (surtout Aedes aegypti)

Prolifération des moustiques ; urbanisation des zones tropicales ; voyages accrus

Filovirus (Marburg, Ebola)

Fièvre hémorragique, fulminante et mortelle

Contact avec du sang, des organes, des sécrétions ou du sperme infectés

Inconnu ; contamination en Europe et aux États-Unis par des singes infectés, importés

Virus Hendra

Atteintes respiratoire et neurologique chez les chevaux et l’homme

Contact avec des chauves-souris ou des chevaux

Présence de l’homme dans les sites naturels de ces animaux

Hantavirus

Douleur abdominale, vomissement, fièvre hémorragique

Inhalation d’aérosol d’urine et de selles de rongeurs

Présence de l’homme dans la niche écologique des rongeurs

Hépatite B

Nausée, vomissement, ictère ; infection chronique (5 à –10 %) pouvant évoluer vers la cirrhose et le carcinome hépatocellulaire

Contact avec la salive, le sang, le sperme ou les sécrétions vaginales d’un sujet infecté ; transmission mère-enfant

Activité sexuelle accrue ; usage de drogue intraveineuse ; déficit vaccinal ; transfusion avant 1978

Hépatite C

Nausée, vomissement, asthénie ; infection chronique (80 %) pouvant évoluer vers la cirrhose et le carcinome hépatocellulaire

Exposition percutanée au sang ou au plasma contaminé ; transmissions sexuelle et mèreenfant faible

Découvert par biologie moléculaire ; donneurs de sang non dépistés avant 1991

Virus



848 Chapitre 25

Épidémiologie

TABLEAU 25.7

INFECTIONS ÉPIDÉMIQUES ÉMERGENTES ET RÉÉMERGENTES (SUITE)

Micro-organisme

Maladie et symptômes



Virus (suite) Hépatite E

Fièvre, douleur abdominale, jaunisse

Eau contaminée ; réservoir animal possible

Découverte récente (1995)

Virus de l’immunodéficience humaine : VIH-1 et VIH-2

SIDA : altération grave du système immunitaire, infections opportunistes

Contact sexuel ; exposition au sang ou aux tissus infectés ; transmission mère-enfant

Urbanisation ; voyage international ; modification de comportement ; usage de drogue intraveineuse ; transfusions avant 1985

Papillomavirus humain

Lésions de la peau et des muqueuses (verrues) ; très liées aux cancers du col de l’utérus et du pénis

Contact sexuel ou avec des surfaces contaminées

Activité sexuelle accrue, multipartenaire ; développement technologique ; vaccination

Virus humain à lymphotropisme T : HTLV-I et HTLV-II

Leucémie et lymphome

Transmission mère-enfant; contact sanguin et sexuel

Usage de drogue intraveineuse ; voyages (Antilles, Guyane) ; transfusions avant 1983

Virus de la grippe

Fièvre, maux de tête, toux, pneumopathie

Contact aérien, surtout dans des espaces clos et peuplés ; réservoir animal (oiseaux, porc)

Réassortiment entre virus animal et humain ; variation par mutation

Virus Lassa

Fièvre, maux de tête et de gorge, nausée

Contact de rongeurs infectés (aérosol d’urine ou selles)

Urbanisation ; conditions favorables d’infestation par les rongeurs

Rougeole

Fièvre, conjonctivite, toux, pétéchies

Contact aérien, en présence de sujets infectés (toux)

Détérioration de la prévention vaccinale

Monkey pox (variole du singe)

Érythème, lymphadénopathie, détresse respiratoire

Contact de singes infectés

Voyage en zone d’endémie ; exposition aux singes

Virus Nipah

Fièvre, encéphalite

Contact avec des chauves-souris et des porcs

Voyage en Malaisie, aux Indes, au Bangladesh, et exposition aux animaux infectés

Agents de Norwalk et apparentés

Gastro-entérite, diarrhée

Transmission oro-fécale ; eau, aliments et piscine contaminés

Identification accrue avec le développement technologique

Rage

Encéphalomyélite aiguë

Morsure par un animal enragé ; contact avec du tissu nerveux

Voyage en zone à risque ; introduction d’animaux à risque provenant de ces régions

Virus de la vallée du Rift

Syndrome fébrile

Piqûre de moustique infecté

Importation de moustiques ou d’animaux infectés ; construction de barrages et irrigation

Rotavirus

Gastro-entérite : diarrhée, vomissement, déshydratation et fièvre modérée

Transmission oro-fécale

Identification accrue ; vaccination

Syndrome respiratoire aigu sévère à coronavirus (SRAS-CoV)

Infection respiratoire, pneumopathie mortelle

Zoonose : contact avec animaux infectés ; transmission interhumaine possible

Proximité avec les animaux infectés et importés de Chine (civette) ; voyage en zone à risque

Encéphalite équine du Venezuela

Encéphalite

Piqûre de moustique infecté

Importation de moustiques ou d’animaux infectés (chevaux)

Virus West Nile

Méningite, encéphalite

Piqûre de moustique Culex pipiens et réservoir animal (oiseaux, chevaux) ; transfusion possible

Développement agricole ; diffusion des moustiques dans les zones d’élevage ; contrôle aux États-Unis

Fièvre jaune

Fièvre, maux de tête, douleur musculaire, nausée, vomissement

Piqûre de moustique infecté (Aedes aegypti)

Défaut de contrôle des moustiques et de vaccination ; voyage et urbanisation en zones tropicales

Flore endogène perturbée ; transmission interhumaine

Immunosuppression (SIDA, greffe) ; matériel médical (cathéters) ; antibiothérapie intensive

Protozoaires et champignons (fungi) Candida

Candidose buccale, gastro intestinale et génitale



25.11 Infections émergentes et réémergentes 849

TABLEAU 25.7 Micro-organisme

INFECTIONS ÉPIDÉMIQUES ÉMERGENTES ET RÉÉMERGENTES (SUITE) Maladie et symptômes



Protozoaires et champignons (fungi) [suite] Cryptococcus

Cryptococcose : méningite ; rares infections des poumons, reins, prostate, foie

Inhalation ; réservoir humain et environnement

Immunosuppression (SIDA, greffe)

Cryptosporidium

Cryptosporidiose : infections respiratoires, gastro-intestinales

Transmission oro-fécale, interhumaine; eau contaminée

Développement proche des bassins d’eau ; immunosuppression

Giardia lamblia

Giardiose : infection de l’intestin grêle, diarrhée, ballonnements

Transmission oro-fécale, eau et aliments contaminés

Contrôle inadapté de l’eau ; immunosuppression ; voyage international

Microsporidies

Infection gastro-intestinale, diarrhée ; perte de poids

Inconnu ; ingestion probable d’eau et d’aliments contaminés par les selles de sujets infectés


Plasmodium

Paludisme ou malaria : fièvre, anémie, ictère, coma

Piqûre de moustique infecté Anopheles

Urbanisation ; voyage en zone à risque ; évolution du parasite ; résistance aux antipaludéens

Pneumocystis carinii

Pneumocystose : pneumopathie aiguë

Inconnu ; réactivation d’infection latente possible


Toxoplasma gondii

Toxoplasmose ; fièvre, adénopathie, lymphocytose

Contact avec les chats (selles) ; aliments contaminés

Immunosuppression ; incidence accrue chez les chats et chiots

Encéphalite spongiforme bovine (ESB, bovin) et variant de la maladie de Creutzfeld-Jacob du sujet jeune (vCJD, humain)

Contamination alimentaire (viande bovine infectée) ; injection d’hormones de croissance

Alimentation des bovins avec des farines animales (avant 1990) ; hormone de croissance d’origine humaine (avant 1985)

Autres agents Prions

dengue, un arbovirus transmis par un moustique, Aedes aegypti, à l’origine de fièvres hémorragiques, a diffusé dans les villes américaines des zones tropicales (voir tableau 25.7), alors qu’elle était rare avant les années 1950, sans doute du fait de la dispersion de la population. Le comportement humain dans les grandes zones urbaines a été aussi modifié, avec des contacts sexuels accrus, à l’origine de la dissémination du SIDA (voir tableau 25.7 et section 26.14). Le développement technologique et industriel énorme des trente dernières années a contribué à l’amélioration de la qualité de vie, mais aussi à l’émergence de nouvelles infections, notamment en milieu hospitalier, dans le cadre de prise en charge invasive des malades et avec l’utilisation importante de matériel (infections nosocomiales), l’indication plus fréquente des antibiotiques avec de nouvelles générations de molécules facilitant l’émergence de pathogènes résistants (entérocoque résistant à la vancomycine) et le recours à la transfusion sanguine (diffusion large du SIDA et de l’hépatite C) [voir section 25.7 et chapitre 26]. La gestion alimentaire est devenue planétaire et industrielle avec le transport des aliments, dont le conditionnement, le stockage et la distribution, pour respecter la chaîne du froid, nécessitent un suivi de qualité tout au long du processus les menant au consommateur. Une rupture de cette chaîne sans contrôle peut être à l’origine d’une épidémie de source commune. Ainsi, la diffusion d’Escherichia coli O157:H7 à partir d’un seul aliment a été observée chez au moins 500 personnes dans quatre états des États-Unis ; le retrait de l’aliment contaminé, de la viande, a permis de stopper la dissémination de

cette infection (voir tableau 25.7 et section 29.8). De même, le SRAS a diffusé dans plus de trente-deux pays, probablement à partir d’un réservoir animal en Chine, près de la ville de Canton (voir section 25.8). Le développement économique et les réaménagements de terrain ont contribué à la dissémination de certaines infections. Ainsi, depuis la construction du grand barrage d’Assouan en 1970, la fièvre de la vallée du Rift, une infection virale transmise par un moustique, est en augmentation dans ces régions. Les bordures du lac formé par le barrage sont devenues un espace favorable à la prolifération du moustique vecteur, créant un nouveau réservoir. Une première épidémie est survenue en 1977, avec une estimation de 200 000 sujets infectés et 598 décès rapportés. De nombreuses épidémies ont été décrites depuis et la région du barrage est devenue une zone d’endémie pour cette infection. La maladie de Lyme, produite par une rickettsie transmise par les tiques, évolue aux États-Unis avec la reforestation de certaines régions et le développement des cerfs et des souris, réservoirs naturels de ce pathogène. La construction de maisons en forêt et de zones de plein air pour les enfants a favorisé le contact avec le vecteur et les animaux réservoirs, et donc le développement de l’infection chez l’homme (voir tableau 25.7 et section 27.4). Les voyages et le commerce international facilitent la diffusion des pathogènes avec leur hôte. Certains filovirus (virus Ebola) sont à l’origine de fièvres hémorragiques pouvant entraîner 20 à 50 % de mortalité. Ces infections ne sont pas traitables ni ne définissent une immunité. La plupart des épidémies sont limitées à l’Afrique centrale où vivent les primates et d’autres



850 Chapitre 25

Épidémiologie

vecteurs, réservoirs de cette infection. La présence de voyageurs dans ces régions d’endémie ou en provenance de ces pays favorise la propagation de l’infection. Ainsi, un filovirus a été importé à Marburg en Allemagne en 1967, lors du transfert de singes verts d’Afrique (Ouganda) pour l’essai de vaccins dans un laboratoire, contaminant vingt-six personnes au contact (cas primaires). Six autres individus, au contact de cas primaires, ont contracté l’infection (cas secondaires) ; sept décès liés à ce virus, appelé virus de Marburg ont été rapportés. Un autre filovirus a été ainsi importé avec un singe infecté à Reston, en Virginie, aux États-Unis. Ce virus n’était pas pathogène pour l’homme, mais il s’est disséminé par voie respiratoire chez les singes élevés dans ce centre en quelques jours. Ces deux filovirus sont apparentés à celui d’Ebola (voir tableau 25.7). L’adaptation des pathogènes à leur environnement peut être très rapide à l’image des virus à ARN (grippe, SIDA, hépatite C, etc.). En effet, ces virus ne disposent pas de système de correction des erreurs induites de façon aléatoire lors de la synthèse de l’ARN et la réplication virale, avec un taux d’erreur d’incorporation de l’ordre de 10-4 contre 10-6 pour les virus à ADN. Ainsi, les virus à ARN se retrouvent souvent dans les infections posant des problèmes majeurs épidémiologiques et de santé publique, avec la survenue de nouveaux variants et une immunité progressivement défaillante à enrayer leur dissémination. Les mécanismes génétiques des bactéries permettent l’émergence de pathogènes plus virulents et de nouvelles épidémies. Les éléments génétiques mobiles, les bactériophages, les plasmides et les transposons favorisent cette plasticité et la dissémination de l’information génétique parmi de nombreuses espèces bactériennes (voir tableau 25.8 et sections 10.9, 10.11 et 16.1 à 16.5). La résistance aux anti-infectieux contribue aussi à l’émergence de nouvelles souches bactériennes et virales (entérocoque résistant à la vancomycine,VIH résistant à l’AZT) [voir sections 20.12 et 26.14]. Une rupture des mesures de santé publique peut faciliter la réémergence de certaines infections. Ainsi, le choléra, maladie jusqu’alors contrôlée même dans les régions d’endémie avec

TABLEAU 25.8

l’évacuation spécifique et le traitement des eaux usées, a resurgi au Pérou en 1991, après une contamination de l’eau de consommation ; cela a été la première observation de la pandémie de choléra sur le continent américain (voir section 28.5). En 1993, à Milwaukee, dans le Wisconsin, aux États-Unis, l’eau de ville a été contaminée par un protozoaire, Cryptosporidium, à l’origine de plus de 400 000 atteintes digestives et 4 000 hospitalisations. Le système de filtration de l’eau a dû être renforcé pour éliminer le pathogène (voir section 28.6). Un programme mal adapté peut aussi favoriser l’émergence d’infections jusqu’alors contrôlées. Cela a été le cas lors d’une épidémie de diphtérie dans l’ex-Union soviétique, à la suite de l’arrêt du programme vaccinal chez les enfants (voir section 26.3). Des dysfonctionnements d’un programme similaire en Europe de l’Est et aux États-Unis ont été à l’origine d’épidémies de coqueluche (voir section 26.4). Un déséquilibre entre l’hôte et son pathogène peut être aussi à l’origine de son émergence. Ainsi, un certain nombre de cas d’infections létales à hantavirus, un virus à ARN transmis par des rongeurs, a été observé en 1993 en Amérique du Sud. Cette année-là, après un hiver doux, une longue période de croissance et de pluie a favorisé le développement des souris et le contact des hommes avec les crottes infestées de ces animaux à l’origine de la transmission humaine.

Le recensement des maladies émergentes Nombre de ces maladies ne sont pas notifiées aux États-Unis. La prise en charge de ces infections émergentes par les systèmes de santé publique passe par la surveillance, l’identification de l’infection et la mise en place d’une stratégie de prévention. Cette surveillance sera d’autant plus aisée que l’infection est symptomatique (maladie) et que les mêmes symptômes sont retrouvés chez différents malades habitants dans une même région : 1) atteintes respiratoires aiguës, 2) encéphalites et méningites, 3) fièvres hémorragiques, 4) diarrhées aiguës, 5) fièvres intenses, 6) tout autre maladie et décès, 7) résistance

FACTEURS DE VIRULENCE PORTÉS PAR LES BACTÉRIOPHAGES, LES PLASMIDES ET LES TRANSPOSONSa

Élément génétique

Micro-organisme

Bactériophage


Toxine érythrogène

Escherichia coli

Toxine Shiga-like


Entérotoxines A, D, E, staphylokinase, toxine-1 du syndrome de choc toxique (TSST-1)


Neurotoxines C, D, E


Toxine diphtérique

Escherichia coli

Entérotoxines, pili (facteur de colonisation), hémolysine, uréase, facteur de résistance, facteurs d’adhésion et d’invasion

Bacillus anthracis

Facteur œdémateux, facteur létal, antigène protecteur, capsule d’acide poly-D-glutamique

Yersinia pestis

Coagulase, fibrinolysine, toxine murine

Escherichia coli

Entérotoxines thermostables, aérobactines sidérophores, hémolysine et pili (opérons)

Shigella dysenteriae

Shigatoxine

Vibrio cholerae

Toxine du choléra

Plasmide

Transposon

a

Facteurs de virulence

Les bactériophages, plasmides et transposons sont discutés respectivement dans les sections 9.8 à 9.11, 16.1 à 16.5 ; 10.9 et 10.14.



25.12 Guerre et armes biologiques 851

à un même traitement. Lorsque la pathologie émergente est définie, avec sa prévalence et son incidence dans la population, celle-ci est inscrite sur la liste de notification (voir tableau 25.5). Le SIDA a été rapporté en 1981 et notifié en 1984 ; la maladie de Lyme a été identifiée au début des années 1980 et notifiée en 1991 ; les gastro-entérites à Escherichia coli O157:H7 dans les années 1990, et notifiées en 1995. Le contrôle de ces épidémies passe par des interventions spécifiques de la maladie (quarantaine, vaccination, traitement, etc.). Les vecteurs et les animaux réservoirs doivent être identifiés pour bloquer le cycle du pathogène et sa transmission à l’homme.

Contrôlez vos acquis Des modifications chez l’hôte, le vecteur et/ou le pathogène peuvent favoriser l’émergence ou la réémergence de certaines infections, qui nécessite la mise en place d’une surveillance globale et des procédures d’intervention pour enrayer l’effet de dissémination. •

Indiquez les facteurs importants dans l’émergence ou la réémergence d’un pathogène.

•

Précisez les modes spécifiques et généraux de prise en charge des infections.

significative et sont parfois hautement létales. Les toxines bactériennes comme la toxine botulinique peuvent être utilisées comme armes biologiques (voir tableau 25.7 et sections 21.10 et 29.5). La dose létale est de 2 µg ; la toxine se diffuse facilement par l’eau contaminée.

Le virus de la variole Ce virus est une arme biologique potentielle dans la mesure où il se transmet rapidement par voie aérienne, avec un fort taux de mortalité de plus de 30 % (voir section 16.13). Cependant, son application est limitée car seuls deux pays, les États-Unis et la

TABLEAU 25.9

AGENTS POTENTIELS DU BIOTERRORISME ET MALADIES

Bactéries et rickettsies Bacillus anthracis (anthrax) Brucella sp. (brucellose) Burkholderia mallei (morve) Burkholderia pseudomallei (melioïdose) Chlamydia psittaci (psittacose) Vibrio cholerae (choléra) Toxine de Clostridium botulinum (botulismea) Clostridium perfringens (toxine epsilona)

m n

25.12 Guerre et armes biologiques

La guerre biologique consiste en l’usage d’agents biologiques dans le but de nuire à une population civile ou militaire. Ces armes biologiques dont disposent de nombreux États et de groupes terroristes ont déjà été utilisées dans le passé.

Les caractéristiques des armes biologiques Les armes utilisées sont des micro-organismes ou des toxines qui doivent être : 1) faciles à produire et à fournir, 2) inoffensifs pour l’utilisateur et 3) capables d’immobiliser ou de tuer l’adversaire, de manière constante et reproductible. De nombreux agents biologiques présentent ces caractéristiques et peuvent être facilement utilisés par les militaires, mais ils intéressent surtout les groupes terroristes car leur accès est relativement aisé, leur production peu chère, et ils sont faciles à transporter.

Coxiella burnetii (fièvre Q) Escherichia coli O157:H7 (atteinte gastro-intestinale) Francisella tularensis (tularemie) Yersinia pestis (peste) Entérotoxine B de Staphylococcus aureusa Salmonella typhi (fièvre typhoïde) Salmonella sp. (salmonellose) Shigella (shigellose) Rickettsia prowazekii (typhus) Virus Virus de la variole Alphavirus (encéphalite) Virus de l’encéphalite équine du Venezuela Virus de l’encéphalite équine de l’Est Virus de l’encéphalite équine de l’Ouest Virus Nipah

Les armes biologiques candidates

Virus des fièvres hémorragiques

Tous les pathogènes bactériens et viraux sont potentiellement des candidats, notamment ceux dont la reproduction et la dissémination posent peu de difficultés (voir tableau 25.9). Le candidat le plus couramment employé est Bacillus anthracis, l’agent de la maladie du charbon ou Anthrax. Les autres bactéries candidates sont Yersinia pestis, agent responsable de la peste (voir section 27.7), Brucella abortus, l’agent de la brucellose, Francisella tularensis, l’agent de la tularémie et Salmonella, responsable d’atteinte digestive sérieuse (voir section 29.7). Les virus candidats sont ceux des fièvres hémorragiques (Ebola, Marburg, etc.) et des encéphalites (Saint-Louis, japonaise, etc.). Ces agents provoquent des maladies qui présentent une morbidité

filovirus : Ebola, Marburg arenavirus : Lassa, Machupo hantavirus Protozoaires Cryptosporidium parvum (gastro-entérite transmise par l’eau) Plantes Toxine de Ricinus communis (ricine extraite des graines de ricin)a a

Toxine préformée ; tous les autres agents nécessitent une infection pour développer la maladie. Source : Données du Centers for Disease Control (CDC), Atlanta, Géorgie, États-Unis.



852 Chapitre 25

Épidémiologie

Russie, ont conservé un stock de virus, très protégé. Le risque d’acquisition de ce virus par un groupe terroriste n’étant pas totalement exclu, des stocks du virus de la variole du bovin, la vaccine, ont été constitués aux États-Unis et en Europe pour protéger la population contre le risque de réémergence de cette maladie. La vaccination n’est plus appliquée depuis 1980, date de déclaration de l’éradication de la variole par l’OMS (le dernier cas ayant été recensé en Somalie en 1977). Les sujets de moins de 30 ans ne sont pas immunisés contre cette maladie aujourd’hui (en raison d’importants effets secondaires du vaccin) et sans doute près de 90 % de la population mondiale n’est pas vaccinée. Il a été proposé de vacciner en priorité les sujets au contact de malades (personnel soignant, personnel de laboratoire, transporteur, garde à domicile, etc.). La vaccination n’est pas totalement dénuée d’effets indésirables comme la formation éventuelle de pustules et de croûtes qui tombent au bout de deux à trois semaines, la survenue possible d’une fièvre, d’un érythème ; elle est contre-indiquée en cas d’eczéma, d’atteintes cutanées, de maladies cardiaques, d’immunodéficience (sujets traités par corticoïdes ou infectés par le VIH) et chez la femme enceinte (vaccin vivant). Des complications graves (myocardites, érythèmes diffus, allergies, manifestations cutanées de type variole, notamment chez les sujets immunodéficients) surviennent dans environ un cas sur mille individus vaccinés (mortalité due au vaccin dans un à deux cas par million de sujets vaccinés).

La dissémination des armes biologiques La plupart de ces armes diffusent rapidement par voie aérienne. En 1962, lors d’une des dernières épidémies de variole dans les pays industrialisés, en Allemagne, le virus fut importé par un travailleur allemand de retour du Pakistan, où la variole était endémique. Celui-ci fut rapidement hospitalisé et isolé en quarantaine mais, à l’occasion d’une toux, il contamina dix-neuf personnes vaccinées, parmi lesquelles une décéda. Des attaques terroristes ont eu lieu avant celle utilisant le bacille du charbon en 2001 (voir section 25.13). En 1984, dans les Dalles, en Oregon (États-Unis), une culture de Salmonella typhimurium fut introduite par aérosol dans des salades distribuées dans dix restaurants locaux. On rapporta 751 cas de salmonellose dans une région qui compte moins de 10 cas par an (voir section 29.7). En 1995, un groupe politique extrémiste utilisa du gaz Saran dans le métro de Tokyo, tuant ou blessant de nombreuses personnes ; en plus de cette arme chimique, ce groupe disposait du bacille du charbon, de milieux de cultures bactériologiques, de drones volants et d’aérosols en flacon. L’application à grande échelle des toxines botuliniques ou les entérotoxines staphylococciques comme armes biologiques est limitée par leur dégradation après dilution dans l’environnement, notamment dans l’eau de boisson (voir tableau 25.5). Mais elles pourraient être distribuées dans de plus petits groupes d’individus, de manière plus concentrée pour favoriser un courant de panique.

Prévention et lutte contre les armes biologiques Depuis 1972, des efforts réguliers des pays et instances internationales visent à faire évoluer les accords définis lors de la Convention sur les armes biologiques et chimiques, la cinquième et plus récente version a été réalisée en 2002. Les États

sont capables d’assurer la production et la distribution de vaccins, et de développer des plans de défense contre ces attaques. Les CDC, à la demande du gouvernement américain, ont mis en place un programme de surveillance et d’identification des possesseurs d’agents biologiques (Select Agent Program). Les réseaux des laboratoires des CDC (CDC Laboratory Response Network) et d’alerte de santé (Health Alert Network) ont été créés pour faciliter le diagnostic de ces agents impliqués dans les infections émergentes et le bioterrorisme dans les centres locaux et régionaux de santé. En France, des laboratoires de microbiologie médicale dans les centres hospitalo-universitaires régionaux et dans les hôpitaux militaires de région, coordonnés par la Direction générale de la santé et le ministère de la Défense, sont habilités à faire le diagnostic de ces agents dans des locaux de niveau 3 de protection.

Contrôlez vos acquis Le bioterrorisme est une menace mondiale favorisée par les voyages internationaux et l’accès à des techniques relativement facile. Les agents biologiques en cause peuvent être aisément utilisés par les militaires et les groupes terroristes. Les aérosols et les sources communes, comme l’eau et les aliments, sont les vecteurs les plus probables de ces agents. La prévention et la lutte contre ces risques dépendent du niveau des infrastructures des pays impliqués ou menacés. •

Définissez les caractéristiques des pathogènes employés comme armes biologiques.

•

Indiquez deux pathogènes applicables et leur mode de dissémination.

25.13 Le bacille du charbon en tant m n qu’arme biologique Bacillus anthracis, responsable de la maladie du charbon ou anthrax, est un agent privilégié dans la guerre biologique et le bioterrorisme.

Caractéristiques et croissance Ce bacille aérobie, Gram positif de 1 µm de diamètre et de 3 à 4 µm de long, est un saprophyte ubiquiste du sol. Il produit des endospores résistant à la chaleur et à la déshydratation (voir figure 25.12a et sections 4.13 et 12.20). Les endospores viables peuvent recouvrir la peau et la fourrure des animaux contaminés. La croissance sur gélose donne des colonies caractéristiques, larges et un aspect en givrage (voir figure 25.12b). Les souches, portant une capsule constituée d’acide poly-D-glutamique, sont résistantes à la phagocytose (voir section 21.6).

Infection et pathogénèse Les endospores de Bacillus anthracis sont à l’origine de l’infection et de la maladie du charbon ou anthrax, qui touche habituellement les animaux domestiques, notamment les ongulés



CDC/PHIL

CDC/James H. Steele/Public Health Image Library

25.13 Le bacille du charbon en tant qu’arme biologique 853

(a)

CDC/Public Health Image Library

CDC/Larry Stauffer, Oregon State Public Health Laboratory/PHIL

(a)

(b) FIGURE 25.12 Bacillus anthracis, agent du charbon. (a) B. anthracis est un bacille Gram positif sporulé d’environ 1 µm de diamètre et de 3 à 4 µm de long (voir section 12.20). Les spores (indiquées par les flèches) favorisent la dissémination par aérosols du micro-organisme (voir section 4.13). (b) Colonies de B. anthracis sur gélose au sang ; elles sont non hémolytiques et prennent un aspect caractéristique en givrage ou en mica.

(vaches, moutons, chèvres, etc.). L’infection chez l’animal est fréquente, mais le nombre n’est pas connu. Elle est acquise à partir du sol et des plantes dans les pâturages. Trois formes la caractérisent chez l’animal comme chez l’homme : 1) l’anthrax cutané, lors de contamination par les endospores de lésions cutanées ; 2) l’anthrax gastro-intestinal, maladie rare acquise par ingestion de plantes ou de carcasses contaminées par des endospores ; 3) l’anthrax pulmonaire, caractérisé par des hémorragies pulmonaires et cérébrales, après inhalation des endospores (voir figure 25.13). Non traité, l’anthrax pulmonaire est mortel dans 100 % des cas. Les formes cutanées et pulmonaires sont rares, le dernier cas naturel d’anthrax pulmonaire aux États-Unis remontant à 1976. Cependant, de nombreux cas dus au bioterrorisme y ont été rapportés en 2001. La pathogénèse de l’infection résulte de l’inhalation de 8 000 à 50 000 spores de souches encapsulées. Celles-ci produisent trois protéines, l’antigène protecteur (PA), le facteur létal (LF) et le facteur d’œdème (EF). PA et LF forment la toxine létale, PA et EF, la toxine d’œdème. Ce sont des toxines

(b) FIGURE 25.13 Maladie du charbon ou anthrax. (a) Charbon

cutané : lésion noire de 2 cm de diamètre, localisée sur le bras d’un patient infecté, qui résulte de la nécrose du tissu cutané. La forme cutanée, même non traitée, est habituellement localisée et non létale. (b) Charbon inhalé : coupe de cerveau fixé montrant une méningite hémorragique (coloration noire) après inhalation fatale de Bacillus anthracis, agent du charbon.

A-B dont PA est le site de liaison de B à la cellule (voir section 21.10 et tableau 21.4). EF est responsable de l’œdème, LF de la mort cellulaire. La croissance du bacille se fait dans les ganglions et le tissu lymphatique pulmonaire, entraînant une destruction tissulaire, un choc et le décès. Les symptômes cliniques sont une sécheresse de la bouche, une fièvre et des myalgies. Ceux-ci évoluent après plusieurs jours en détresse respiratoire et choc systémique, avec un décès dans plus de 90 % des cas, voire 100 % si le traitement n’est pas débuté dès les premiers symptômes.

Application comme arme biologique La préparation des souches de Bacillus anthracis comme arme biologique vise à n’obtenir que les formes productrices d’endospores. Elles ont été produites dès le lendemain de la Deuxième Guerre mondiale par différents États, jusqu’au traité de 1972 qui



854 Chapitre 25

Épidémiologie

y mit fin. Ces préparations contiennent en général des particules de petite taille, séparées par une fine couche de particules inertes comme le talc. La finesse de ces particules favorise leur transmission aérienne, notamment si elles sont incluses dans une enveloppe, à l’ouverture de celle-ci par le sujet visé. C’est le mode de transmission utilisé lors des attaques de bioterrorisme en 2001 aux États-Unis, qui visaient les médias en Floride, le gouvernement américain à Washington et la région de NewYork. Il y eut 22 infections, 11 anthrax cutanés dont 5 cas mortels. Le service postal fut grandement perturbé jusqu’en 2003 ; des tests de dépistage moléculaire de l’anthrax ont été mis en place à cette occasion. Les terroristes à l’origine de ces expéditions d’enveloppes n’ont jamais été identifiés. Des cas de contaminations de spores de B. anthracis utilisées comme arme biologique avaient déjà été rapportés, avec un accident de préparation à Sverdlorsk, en Russie, en 1979. Moins de 1 g de spores fut dispersé ; tout le personnel était vacciné et les cas de contacts furent traités avec des antibiotiques dès le premier cas diagnostiqué. À l’extérieur du site, 77 personnes développèrent un anthrax pulmonaire, avec 66 décès.

Vaccination, prophylaxie, traitement et diagnostic La vaccination contre l’anthrax a été retenue pour les sujets à risque (éleveurs, militaires…). Le vaccin AVA (anthrax vaccine adsorbed) est préparé par filtration de culture de Bacillus

anthracis. Le traitement antibiotique préconise pendant au moins 8 jours l’utilisation d’une quinolone à large spectre, la Ciprofloxacine en cas de souche résistante à la pénicilline et en prophylaxie chez les sujets exposés (voir figure 20.19). Des tests rapides pour rechercher les endospores ont été développés. L’identification de Bacillus anthracis repose sur l’isolement en culture, avec l’aspect caractéristique des colonies en givrage et la présence de bacilles Gram positif en chaîne (figure 25.12a).

Contrôlez vos acquis Bacillus anthracis est apparu comme un pathogène important en tant qu’arme biologique, à partir de préparation d’endospores hautement infectieuses. Le taux de décès par inhalation est d’environ 90 % chez les sujets non traités par antibiotique. Le traitement ne garantit pas la survie de tous les sujets traités ; il est d’autant plus efficace qu’il est appliqué précocement, dès les premiers cas d’infection. •

Indiquez les facteurs favorisant l’usage de Bacillus anthracis comme arme biologique.

•

Précisez les étapes d’identification et de lutte contre une attaque bioterroriste par B. anthracis.

QUESTIONS 1. Indiquez les cinq causes les plus courantes de mortalité due à une maladie infectieuse ; est-il possible de protéger la population de ces maladies par vaccination (voir section 25.1) ? 2. Distinguez la mortalité de la morbidité, la prévalence de l’incidence, l’épidémie de l’endémie (voir section 25.2). 3. Expliquez la différence entre porteur chronique et infection aiguë (voir section 25.3). 4. Donnez des exemples de transmission interhumaine par contact direct, par un vecteur et par les fomites (voir section 25.4). 5. Indiquez comment l’immunité acquise contre un pathogène chez un grand nombre d’individus peut protéger le reste de la population non vaccinée ; peut-elle protéger aussi contre les contaminations de source commune (voir section 25.5) ? 6. Précisez quel est le facteur de risque principal d’infection par le virus de l’immunodéficience humaine (VIH) aux États-Unis ; est-ce valable pour tous les États (voir section 25.6) ? 7. Recensez les raisons d’infections à l’hôpital (nosocomiales) et leurs principales origines (voir section 25.7).

8. Décrivez l’origine, le pathogène en cause et le traitement du syndrome respiratoire aigu sévère (SRAS), et précisez son potentiel à devenir une épidémie majeure (voir section 25.8). 9. Indiquez les principales mesures médicales et de santé publique prises au XXe siècle pour limiter la diffusion des maladies infectieuses dans les pays en voie de développement (voir section 25.9). 10. Comparez la part de mortalité due aux maladies infectieuses entre les pays industrialisés et les pays en voie de développement (voir section 25.10). 11. Recensez les principaux facteurs d’émergence de nouvelles infections ; indiquez les méthodes disponibles pour identifier et contrôler l’émergence de ces infections (voir section 25.11). 12. Décrivez les propriétés principales d’un pathogène utilisé dans la guerre biologique ; définissez si le virus de la variole remplit ces propriétés et indiquez d’autres pathogènes ayant ces caractères (voir section 25.12). 13. Décrivez le mode d’utilisation de Bacillus anthracis comme arme biologique et les moyens de s’en protéger (voir section 25.13).

PROBLÈMES 1. La variole, une maladie restreinte à l’homme, a été éradiquée alors que la peste, une maladie ayant le rongeur comme réservoir, n’a pu être éradiquée (voir tableau 25.2). Expliquez cet état et s’il est possible d’obtenir son éradication ; précisez-en le plan limité à une ville, en tenant en compte du réservoir, du pathogène et de l’hôte.

2. Le syndrome d’immunodéficience acquise (SIDA) est une maladie à transmission interhumaine par contact, sans réservoir animal connu, et donc un candidat à l’éradication. Indiquez le programme à développer pour obtenir son élimination dans un pays développé ou en voie de développement, et la différence de



Problèmes 855 programmes entre les deux. Quels sont les facteurs du pathogène et de l’hôte s’opposant à ces programmes ? Quelles sont les raisons du développement de l’infection, notamment dans les pays en voie de développement ? 3. Les voyages dans les pays en voie de développement exposent le voyageur au risque d’infections. Quelles sont les précautions à prendre avant de partir, pendant le séjour et au retour ? Où pouvez-vous obtenir l’information concernant le risque infectieux dans un pays donné ? Au retour d’un voyage à l’étranger, êtes-vous un risque pour votre entourage ? Précisez.

4. Identifiez un pathogène idéal comme arme biologique efficace. Quelles en seraient les caractéristiques ? Décrivez les conditions de production du pathogène à large échelle et la méthode idéale de diffusion. Quelles seraient les précautions à prendre dans la préparation de cette arme ? À l’inverse, en tant que représentant d’un organisme de santé publique d’une ville, comment pourriezvous identifier l’infection et son agent ? Indiquez les traitements que vous mettriez en place. Comment limiter la diffusion de l’infection ? La quarantaine, l’isolement des malades, la vaccination, l’usage des antibiotiques sont-ils une réponse à ce risque ?





I

Maladies transmissibles par voie Mérienne

26.1 26.2 26.3 26.4 26.5 26.6

Pathogènes aériens Maladies streptococciques Corynebacterium spp. et diphtérie Bordetella spp. et coqueluche Mycobacterium, tuberculose et lèpre Neisseria meningitidis, méningite et méningococcémie Virus et infections respiratoires Rhumes et grippe

26.7 26.8

II

Les infections dues à des mycobactéries sont diagnostiquées, lors de la coloration de ces pathogènes dans des échantillons de tissus ou de crachats, grâce à leurs propriétés d’acido-alcoolorésistance.

858 858 860 862 863 864 867 869 871

Maladies transmissibles par contact direct 874

26.9 Staphylococcus spp. 26.10 Helicobacter pylori et ulcères gastriques 26.11 Virus des hépatites

III

CHAPITRE VINGT-SIX

Maladies infectieuses à transmission interhumaine

874 876 877

Maladies sexuellement transmissibles 879

26.12 Gonococcie et syphilis 26.13 Chlamydiose, herpès et trichomonose 26.14 Syndrome d’immunodéficience acquise : SIDA et VIH

880 883 885



858 Chapitre 26


GLOSSAIRE Cassure antigénique (antigenic shift) Modifications antigéniques majeures dues à des réassortiments entre des gènes de virus influenza d’origine différente et à l’origine de l’émergence de nouveaux sous-types. Charge virale (viral load) Évaluation de la quantité de virus présente dans un organisme hôte, dans le sang, le plus souvent. Cirrhose (cirrhosis) Modification de l’architecture normale du foie résultant en une fibrose extensive. Glissement ou dérive antigénique (antigenic drift) Modifications antigéniques mineures dues à l’accumulation de mutations dans certains gènes du virus influenza à l’origine de l’émergence de nouveaux variants. Hépatite (hepatitis) Inflammation du foie fréquemment due à un agent infectieux. Infection opportuniste (opportunistic infection) Infection généralement observée chez des patients immunodéprimés. Infection sexuellement transmissible (IST) (sexually transmitted infection, STI) Infection habituellement transmise par relation sexuelle entre deux partenaires, dont l’un est infecté. Inhibiteur de fusion (fusion inhibitor) Polypeptide synthétique se fixant sur les glycoprotéines virales pour inhiber la fusion entre les membranes du virus et celles de la cellule hôte. Inhibiteurs non nucléosidiques de la transcriptase inverse (INNTI) (non nucleoside reverse transcriptase inhibitor) Composé non nucléosidique inhibant l’action de la transcriptase inverse du VIH en se fixant à proximité de son site catalytique. Inhibiteurs nucléos(t)idiques de la transcriptase inverse (INTI) (nucleos(t)ide reverse transcriptase inhibitor) Analogue

S

ur les 500 000 espèces microbiennes identifiées dans l’environnement (voir chapitre 11), quelques centaines d’espèces seulement sont pathogènes. La plupart des micro-organismes vivent indépendamment les uns des autres. Certains, cependant, vivent en association étroite avec des plantes ou des animaux, engagés dans des relations symbiotiques stables (voir chapitre 19). Les pathogènes sont des micro-organismes provoquant une maladie chez un hôte sain. Les quatre chapitres suivants sont consacrés à l’étude de pathogènes humains représentatifs, regroupés en fonction de leur mode de transmission. Le chapitre 26 traite des maladies à transmission interhumaine directe. Les chapitres 27 à 29 étudient les maladies dont le mode de transmission implique différents vecteurs (animal, arthropode) ou des réservoirs communs comme le sol, l’eau ou les aliments. En effet, étudier les pathogènes en fonction de leur mode de transmission et des maladies qu’ils provoquent permet de regrouper des micro-organismes de biologie différente, mais d’écologie et de pathogénicité semblables. Par exemple, des virus (virus de la grippe) et des bactéries (certains streptocoques) ont pour organe cible commun l’arbre respiratoire. Transmis d’humain à humain par voie respiratoire, ils seront étudiés ensemble au cours de ce chapitre.

nucléos(t)idique inhibant l’action de la transcriptase inverse du VIH par compétition avec les nucléos(t)ides naturels. Jaunisse (jaundice) Production et excrétion d’un excès de bilirubine dans le foie après destruction des hépatocytes et résultant en un jaunissement de la peau et du blanc de l’œil. Méningite (meningitis) Inflammation des méninges (membranes protectrices du cerveau et de la moelle épinière), diagnostiquée par des céphalées brutales, des vomissements et une raideur de nuque, pouvant progresser vers le coma en quelques heures. Méningococcémie (meningococcemia) Infection du sang par Neisseria meningitidis, pouvant être fulminante, caractérisée par une septicémie, une coagulation intravasculaire disséminée et un état de choc. Inhibiteur de protéase (protease inhibitor) Composé inhibant l’action d’une protéase virale en se fixant directement sur son site catalytique, empêchant ainsi la maturation des protéines virales. Rhumatisme articulaire aigu (rheumatic fever) Maladie autoimmune inflammatoire, séquelle d’une infection à Streptococcus pyogenes. Scarlatine (scarlet fever) Angine sévère caractérisée par une éruption, due à Streptococcus pyogenes toxinogène. Syndrome de choc toxique staphylococcique (TSS) (toxic shock syndrome, TSS) Atteinte systémique due à la libération d’exotoxines par Staphylococcus aureus. Syphilis congénitale (congenital syphilis) Syphilis acquise in utero ou à la naissance par un nourrisson né de mère infectée. Test à la tuberculine (tuberculin test) Test cutané permettant de détecter une infection antérieure à Mycobacterium tuberculosis.

I

MALADIES TRANSMISSIBLES PAR VOIE MÉRIENNE

La figure 26.1 montre un aérosol généré par éternuement. Ces aérosols sont importants dans la transmission interhumaine de nombreuses maladies infectieuses. La plupart des infections respiratoires sont transmises presque exclusivement de cette façon. Mycobacterium tuberculosis a infecté, par voie aérienne, au moins un tiers de la population mondiale (voir section 25.1). Les syndromes grippaux et les rhumes sont transmis par voie aérienne si fréquemment que chacun est susceptible de contracter plus d’un de ces syndromes chaque année.

26.1 Pathogènes aériens m n

L’air n’est pas un milieu permettant la croissance des microorganismes. Ceux retrouvés dans l’air proviennent du sol, de l’eau, des plantes, des animaux, des humains et d’autres sources. Dans l’air extérieur, les micro-organismes du sol sont majoritaires. En milieux confinés, la concentration des microorganismes est considérablement plus élevée qu’à l’extérieur, particulièrement pour ceux provenant du tractus respiratoire humain.



26.1 Pathogènes aériens 859

sporulation. Ces endospores ne sont cependant pas directement transmissibles par voie aérienne. Une quantité extrêmement importante de gouttelettes d’eau est expectorée lors d’un éternuement (voir figure 26.1), une quantité moindre, quoiqu’encore considérable, est rejetée lors de la toux ou de la parole. Chaque gouttelette infectieuse, d’un diamètre voisin de 10 µm, contient un ou deux corps bactériens ou particules virales. La vitesse initiale de ces gouttelettes est d’environ 100 m/s pour un éternuement. Elle varie de 16 à 48 m/s lors d’une toux ou d’un cri. Ainsi, le nombre de bactéries rejetées lors d’un simple éternuement varie de 10 000 à 100 000. À cause de leur petite taille, ces gouttelettes s’évaporent rapidement, laissant un résidu de matière organique et de mucus auquel restent fixées les bactéries.

T. D. Brock

Les infections respiratoires

FIGURE 26.1 Photographie haute vitesse d’un éternuement non contenu.

La plupart des micro-organismes survivant difficilement dans l’air, la transmission effective d’une maladie n’est possible que sur une courte distance. Certains pathogènes humains (Staphylococcus, Streptococcus) résistent cependant assez bien à la dessiccation et peuvent rester vivants assez longtemps dans les aérosols. De façon générale, certaines structures bactériennes permettent une bonne résistance à la dessiccation : la paroi épaisse et rigide des bactéries Gram positif, la paroi particulière des mycobactéries, très riche en lipides, de même que les endospores des bactéries capables de

150

180

20

65

10

14 2 1

6 4

Taille des particules inhalées (µm)

Vitesse de l’air (cm/s)

Supérieure à 60

Inférieure à3

Un être humain respire, au cours de son existence, environ 500 millions de litres d’air contenant des particules chargées en micro-organismes, source potentielle d’infections respiratoires. La vitesse à laquelle l’air se déplace le long de l’arbre respiratoire est variable. Comme elle est lente au niveau de l’arbre respiratoire inférieur, les particules peuvent se déposer. Les particules de grand diamètre se déposent en premier, puis les plus petites. Seules les particules de diamètre inférieur à 3 µm peuvent atteindre les bronchioles, dans le tractus respiratoire inférieur (figure 26.2). La plupart des pathogènes sont plus petits que ces particules. Ces bactéries colonisent l’arbre respiratoire au niveau qui leur est le plus favorable, c’est-àdire correspondant à leurs exigences métaboliques et aux facteurs de virulence sécrétés. Les tractus respiratoires supérieur et inférieur constituent des environnements différents, favorisant l’implantation de certains micro-organismes, commensaux ou pathogènes.

Organes

Pathogènes

Fosses nasales


Cavité orale Pharynx

Neisseria meningitidis Streptococcus pyogenes Corynebacterium diphteriae

Larynx


Trachée Bronche souche

Virus Influenza

Tractus respiratoire supérieur

Tractus respiratoire inférieur

Bronche secondaire

Coccidioides immitis Bronchiole respiratoire Bordetella pertussis Streptococcus pneumoniae Bronchiole terminale Canaux alvéolaires Sacs alvéolaires

Coxiella burnetii

Alvéoles

Chlamydia psittaci

FIGURE 26.2 Arbre respiratoire humain. Les micro-organismes pathogènes infectent en général les sites indiqués.



860 Chapitre 26


Ce chapitre présentera quelques infections respiratoires bactériennes fréquentes, ainsi que des maladies d’étiologie virale, dont le traitement et la prévention sont plus difficiles. La plupart des pathogènes bactériens infectant l’arbre respiratoire ont un habitat strictement humain et sont transmis d’humain à humain par voie aérienne. L’être humain étant l’unique réservoir de ces bactéries, leur survie, en tant que pathogènes, dépend de leur diffusion, par voie aérienne, de personne à personne. Seuls quelques pathogènes respiratoires, comme Legionella pneumophila, sont transmis directement par l’eau ou le sol, sans transmission interhumaine connue (voir chapitre 28). Les infections respiratoires bactériennes peuvent être graves et entraîner des complications engageant le pronostic vital. Un diagnostic rapide et précis ainsi qu’un traitement précoce doivent être institués. La plupart de ces pathogènes respiratoires bactériens restent heureusement sensibles aux antibiotiques. La vaccination est également recommandée chez les sujets à risque.

Contrôlez vos acquis De nombreux pathogènes respiratoires sont des bactéries Gram positif. Résistantes à la dessiccation, elles sont facilement transmises par l’air. La plupart des pathogènes respiratoires sont à transmission interhumaine, transportés par les aérosols respiratoires, disséminés par la toux, l’éternuement, la parole ou la respiration. •

Quelles sont les caractéristiques physiques des bactéries Gram positif leur permettant de survivre longtemps dans l’air et les poussières ?

•

Identifiez les micro-organismes le plus fréquemment retrouvés dans le tractus respiratoire supérieur. Identifiez ceux le plus fréquemment retrouvés dans le tractus respiratoire inférieur.

26.2 Maladies streptococciques m n Streptococcus pyogenes et Streptococcus pneumoniae sont des pathogènes majeurs du tractus respiratoire. Streptococcus pyogenes est transmis par voie aérienne ou par contact direct. Streptococcus pneumoniae se retrouve dans la flore respiratoire de plus de 40 % des individus sains (bactérie commensale) ; cependant, les souches endogènes peuvent être à l’origine d’atteinte respiratoire sérieuse chez les individus immunodéprimés. Les streptocoques sont des cocci Gram positif, anaérobies aérotolérants, non sporulés et homofermentaires (voir section 12.19). Streptococcus pyogenes se présente sous la forme de cocci disposés en chaînettes (voir figure 12.54). Streptococcus pneumoniae se présente sous la forme de cocci agencés par paires (diplocoques) ou en courtes chaînettes ; les souches virulentes produisent généralement une capsule polysaccharidique importante (voir figure 26.3).

Isaac Shechmeister

Les pathogènes respiratoires

FIGURE 26.3 Streptococcus pneumoniae coloré négativement à l’encre de Chine. Notez la capsule épaisse entourant les bactéries. Elles mesurent environ 0,5 µm de diamètre.

Streptococcus pyogenes : épidémiologie et pathogenèse Streptococcus pyogenes, ou streptocoque du groupe A, est fréquemment isolé du tractus respiratoire supérieur des adultes sains. Bien que le nombre de S. pyogenes endogènes soit généralement faible, si les défenses de l’hôte sont affaiblies ou si une nouvelle souche hautement virulente est introduite, les infections aiguës streptococciques sont possibles. S. pyogenes est le principal agent responsable des pharyngites streptococciques, appelées aussi angines streptococciques (voir figure 26.2). La plupart des souches cliniques isolées d’angine produisent une toxine, appelée β-hémolysine, qui lyse les globules rouges (voir figure 21.18). La pharyngite streptococcique est caractérisée par une douleur aiguë de la gorge, une inflammation des amygdales, l’apparition de ganglions cervicaux, d’un exsudat des amygdales, d’une fièvre modérée et d’un malaise général. S. pyogenes peut aussi provoquer des infections de l’oreille moyenne (otite moyenne), des glandes mammaires (mastite) et de la couche cutanée superficielle, infection appelée impétigo (l’impétigo peut être dû aussi à Staphylococcus aureus) [voir figure 26.4]. Moins de la moitié des angines aiguës (10 à 25 % chez les adultes et 25 à 40 % chez les enfants) sont dues à S. pyogenes, le reste étant d’origine virale. Un diagnostic précis et rapide est important car, pour les angines virales, les antibiotiques, traitements antibactériens, sont inutiles. Au contraire, dans les cas d’angines à S. pyogenes, le traitement antibactérien est important, surtout pour prévenir les risques de complications représentées par les syndromes post-streptococciques tels que la scarlatine, le rhumatisme articulaire aigu, la glomérulonéphrite aiguë et le syndrome de choc toxique streptococcique. Certaines souches de S. pyogenes sont infectées par un bactériophage lysogénique porteur de matériel génétique codant la production d’exotoxines pyrogènes responsables de la scarlatine et de la plupart des syndromes de choc toxique streptococcique. L’exotoxine A est un superantigène qui agit par recrutement massif des cellules T au niveau des tissus infectés (voir section 22.16). Les cellules T vont sécréter des cytokines,



26.2 Maladies streptococciques 861

FIGURE 26.4 Lésions typiques d’impétigo. L’impétigo est généralement dû à Streptococcus pyogenes ou à Staphylococcus aureus.

lesquelles activent un grand nombre de cellules effectrices, ce qui aboutit à une inflammation systémique et une destruction tissulaire. Le syndrome de choc toxique streptococcique est le terme donné pour caractériser cette réaction systémique mettant en jeu le pronostic vital. L’exotoxine A et l’exotoxine C peuvent provoquer une éruption rosée à rouge caractéristique de la scarlatine (voir figure 26.5), ainsi qu’une atteinte des petits vaisseaux sanguins et de la fièvre. S. pyogenes peut aussi être responsable d’infections invasives fulminantes, comme la fasciite nécrosante, qui se caractérise par une destruction extensive des tissus sous-cutanés. Ces infections, rares, illustrent l’image de la « bactérie mangeuse de chair ». Dans ces cas, les exotoxines streptococciques A et B et la protéine de surface M agissent comme des superantigènes. L’inflammation consécutive et la destruction tissulaire extensive sont responsables de décès dans plus de 30 % des cas. Les infections à Streptococcus pyogenes non ou mal traitées peuvent aboutir à des maladies post-streptococciques. Le rhumatisme articulaire aigu, complication post-streptococcique, est dû aux souches rhumatogènes de S. pyogenes, qui contiennent des antigènes de surface ayant des communautés antigéniques avec des antigènes de surface humains. La réponse immunitaire contre l’agent pathogène produit des anticorps qui interagissent avec les antigènes humains des tissus cardiaques, articulaires et rénaux, provoquant d’importantes atteintes tissulaires. Le rhumatisme articulaire aigu est une sorte de maladie auto-immune résultant des réactions entre les anticorps et des autoantigènes (voir section 22.15). L’atteinte peut être chronique et est souvent accélérée par des accès récurrents de rhumatisme articulaire. Un autre syndrome post-streptococcique est la glomérulonéphrite aiguë post-streptococcique, caractérisée par une

Le diagnostic de Streptococcus pyogenes Sachant que de sérieuses complications peuvent suivre les angines streptococciques, des tests de diagnostic rapide (TDR) ont été élaborés pour la détection des antigènes de S. pyogenes. Les antigènes de surface sont tout d’abord extraits par des méthodes chimiques ou enzymatiques directement à partir d’un prélèvement de gorge du patient. Des méthodes immunologiques telles que les agglutinations de particules de latex, les tests ELISA (enzyme-linked immunoassay) ou de marquage par des anticorps fluorescents (voir section 24.9) en utilisant des anticorps spécifiques des protéines de surface de S. pyogenes. Les échantillons prélevés sont

Franklin H. Top

Franklin H. Top

atteinte rénale douloureuse. La maladie à complexes immuns (voir section 22.15) résulte de la formation des complexes anticorps-antigènes streptococciques dans le sang. Les complexes immuns se logent dans les glomérules ou dans les membranes de filtration du rein, causant son inflammation (néphrite), qui se manifeste par une douleur aiguë. En quelques jours, ces complexes sont en général dissous et le patient revient à un état normal. Malheureusement, même un traitement antibactérien adapté et précoce ne peut prévenir la glomérulonéphrite. Cependant, seul un petit nombre de souches de S. pyogenes – les souches néphritogènes – produisent cette maladie douloureuse. Sachant que les infections induisent une immunité spécifique de souche, la réinfection par une souche particulière de S. pyogenes est rare. Cependant, il existe plus de soixante souches différentes définies par des protéines M de surface. Ainsi, un individu peut être infecté plusieurs fois par différentes souches de S. pyogenes.

FIGURE 26.5 Fièvre scarlatine . L’éruption typique de la scarlatine est due à l’action de la toxine érythrogène produite par Streptococcus pyogenes.



862 Chapitre 26


analysés en quelques minutes. Ces TDR permettent aux médecins de débuter immédiatement un traitement antibiotique approprié pour éviter les complications telles que le rhumatisme articulaire aigu. Dans certains cas bien précis (facteurs de risque de rhumatisme articulaire aigu), une confirmation du TDR peut nécessiter la mise en culture du prélèvement de gorge sur une gélose au sang de mouton (voir figure 21.18 et section 24.7). Sachant que la culture prend au moins vingt-quatre heures et devant les très bonnes spécificité et sensibilité des TDR, le diagnostic des angines à S. pyogenes a été révolutionné par les TDR (voir section 24.7). Le diagnostic indirect par des tests sérologiques peut être indiqué pour les syndromes post-streptococciques, au cours desquels la présence ou l’augmentation des anticorps spécifiques d’antigènes streptococciques est recherchée (voir section 24.7). La présence des nouveaux anticorps ou une augmentation de la quantité des anticorps confirme une infection streptococcique récente.

Streptococcus pneumoniae L’autre streptocoque pathogène important, Streptococcus pneumoniae (ou pneumocoque), est responsable d’infections pulmonaires qui sont parfois le point de départ d’autres localisations infectieuses. Les souches capsulées de S. pneumoniae sont particulièrement pathogènes car elles sont potentiellement très invasives. Les bactéries envahissent les tissus alvéolaires (tractus respiratoire bas) du poumon où les capsules permettent aux bactéries de résister à la phagocytose et engendrent une forte réponse inflammatoire de l’hôte. Une atteinte de la fonction pulmonaire (pneumonie) peut résulter de l’accumulation des cellules phagocytaires recrutées et de liquide inflammatoire. Les pneumocoques peuvent disséminer à partir du site primaire de l’infection par une phase bactériémique pour donner des infections osseuses, des infections de l’oreille moyenne et des endocardites. La pneumonie à pneumocoque est une infection grave et, sans traitement, le taux de mortalité est de l’ordre de 30 %. Même avec des traitements antibiotiques adéquats chez les patients hospitalisés pour une pneumonie à pneumocoque, la mortalité atteint les 10 %. Le diagnostic bactériologique de S. pneumoniae implique la mise en culture d’expectorations et/ou la réalisation d’hémocultures. Il y a plus de quatre-vingt-dix sérotypes différents (variants de l’antigène capsulaire) et, comme pour S. pyogenes, l’infection induit une immunité uniquement contre le sérotype de la souche infectante.

Prévention et traitement Deux vaccins multivalents (heptavalent et 23-valent) sont actuellement disponibles pour la prévention des infections invasives à pneumocoque. Les vaccins consistent en un mélange de polysaccharides capsulaires des souches pathogènes les plus répandues. Le vaccin heptavalent est recommandé pour tous les nourrissons de moins de 2 ans. Le vaccin 23-valent est notamment recommandé pour les personnes âgées institutionnalisées, les patients immunodéprimés et les patients à risque d’infections respiratoires (voir section 22.13). Les pénicillines (voir sections 20.8 et 30.6) sont des agents de choix pour le traitement des infections à S. pyogenes. L’érythromycine ou d’autres molécules antibactériennes sont

utilisées pour les patients ayant acquis une allergie aux pénicillines (voir section 22.15). La plupart des infections à S. pneumoniae répondent aux traitements par les pénicillines. Cependant, il existe des souches résistantes à la pénicilline, notamment les souches isolées de patients ayant déjà reçu un traitement par des β-lactamines (voir section 25.7). C’est pourquoi les souches isolées des patients doivent faire l’objet d’une étude de leur sensibilité aux β-lactamines (voir section 24.3). Les céphalosporines (céfotaxime ou ceftriaxone), certaines fluoroquinolones (antipneumococciques), l’érythromycine ou la vancomycine (voir sections 20.6 à 20.9) peuvent être utilisées pour les souches résistantes aux pénicillines. Cependant, certaines souches ont acquis des résistances isolées à ces antibiotiques et certaines souches ont même acquis des multirésistances, soulignant ainsi la nécessité de tester chaque souche.

Contrôlez vos acquis Parmi les infections causées par les streptocoques, on retrouve les angines et les pneumonies. Parfois, les pharyngites à S. pyogenes se compliquent de scarlatine ou de rhumatisme articulaire aigu. Les pneumonies à S. pneumoniae sont des infections graves à forte mortalité. Certaines souches sont résistantes aux antibiotiques, surtout chez S. pneumoniae. •

Comment les infections à S. pyogenes peuventelles donner des rhumatismes articulaires aigus ?

•

Quel est le principal facteur de virulence de S. pneumoniae ?

26.3 Corynebacterium spp. m n et diphtérie Corynebacterium diphteriae est l’agent de la diphtérie, maladie respiratoire sérieuse atteignant surtout les enfants. La diphtérie est une maladie que l’on peut prévenir et traiter. C. diphteriae est un bacille Gram positif, aérobie, immobile, se présentant sous forme de bâtonnets irréguliers, parfois en forme de massue (voir figure 26.6a et section 12.22).

Épidémiologie et pathologie Corynebacterium diphteriae colonise l’arbre respiratoire, avec une prédilection pour la sphère oro-pharyngée. L’infection est habituellement transmise d’humain à humain, par des gouttelettes aériennes expectorées par des porteurs sains ou par des sujets infectés. Une infection antérieure ou la vaccination (voir ci-dessous) protègent des effets puissants de l’exotoxine diphtérique. Bien que le mécanisme d’adhérence de C. diphteriae aux tissus oro-pharyngés ne soit pas totalement élucidé, il semble que la production par ce micro-organisme de neuraminidase lysant l’acide N-acétylneuraminique (un composant des glycoprotéines retrouvées sur les surfaces cellulaires animales) augmente le pouvoir invasif. La réponse inflammatoire des tissus infectés du tractus respiratoire supérieur conduit à la formation de lésions caractéristiques appelées fausses membranes (voir




par défaut des programmes de vaccination. Des épidémies se sont récemment déclarées dans des camps de réfugiés en Afghanistan, où une campagne massive de vaccination a été déclenchée.

CDC/PHIL

Diagnostic, prévention et traitement

Franklin H. Top

(a)

(b) FIGURE 26.6 Diphtérie. (a) Cellules de Corynebacterium diphteriae d’aspect « en massue » typique (diamètre des bactéries : 0,5 à 1 µm ; longueur : quelques micromètres). (b) Dans le cas d’une dipthérie active à C. diphteriae, on observe de fausses membranes (indiquées par les flèches).

figure 26.6b), formées d’amas de cellules provenant de l’hôte et du pathogène. Certaines souches de C. diphteriae sont lysogènes pour le bactériophage β. Ces souches lysogènes sont pathogènes car elles produisent une exotoxine puissante : la toxine diphtérique, laquelle, inhibitrice des synthèses protéiques, entraîne la mort cellulaire (voir section 21.10). Les débris cellulaires engendrés par l’effet de la toxine forment des fausses membranes extensives, tapissant la gorge du patient. Lorsque celles-ci sont adhérentes, elles peuvent obstruer le nasopharynx. La mort intervient par asphyxie et intoxication. Si le patient n’est pas traité, la toxine exerce des effets systémiques cardiaques (25 % des patients atteints de diphtérie développent une myocardite), rénaux, hépatiques et surrénaliens. La diminution de l’incidence de la diphtérie, autrefois maladie majeure de l’enfance, est liée à une vaccination massive des populations dans les pays de niveau socio-économique élevé. Aux États-Unis, la maladie est quasiment éradiquée. Dans de nombreuses régions du monde, plus de cinquante mille cas annuels de diphtérie sont recensés, principalement

Le diagnostic repose sur l’isolement de Corynebacterium diphteriae, toxinogène, à partir de prélèvements réalisés par écouvillonnage des zones inflammatoires du nasopharynx. La recherche du bacille diphtérique se fait sur gélose au sang, sur milieu tellurite et sur milieu de Loeffler, milieu sélectif inhibant la croissance de certains autres pathogènes respiratoires. Le vaccin consiste en l’administration d’une anatoxine diphtérique, détoxifiée par le formaldéhyde. L’anatoxine diphtérique entre, par exemple, dans la composition du vaccin pentavalent protégeant contre la diphtérie, le tétanos, la coqueluche, la poliomyélite et les infections à Haemophilus de type b (voir section 22.13). Le traitement de la diphtérie repose sur l’administration la plus précoce possible d’un sérum antidiphtérique (anticorps neutralisant la toxine ou antitoxine, obtenus par immunisation chez l’animal) [voir sections 24.7 et 22.13] et d’une antibiothérapie simultanée. Lorsque la toxine est fixée sur ses cibles, elle ne peut plus être neutralisée par l’antisérum. La pénicilline, l’érythromycine et la gentamicine sont efficaces. Ces antibiotiques permettent d’éliminer la bactérie et de stopper la production de toxine.

Contrôlez vos acquis La diphtérie est une infection aiguë des voies respiratoires supérieures, due à la bactérie Gram positif Corynebacterium diphteriae. La vaccination précoce, dans l’enfance, protège très efficacement de la maladie. •

La gravité de la diphtérie est-elle due à l’infection seule ?

•

Comment peut-on prévenir la transmission de la diphtérie ?

26.4 Bordetella spp. et coqueluche m n La coqueluche est une maladie respiratoire sérieuse affectant principalement les enfants, dont l’agent infectieux est Bordetella pertussis. B. pertussis, identifié en 1906 par Bordet et Gengou, est un petit coccobacille Gram négatif, aérobie strict.

Épidémiologie et pathologie La coqueluche est une infection respiratoire aiguë, hautement contagieuse, affectant principalement les enfants de moins de 5 ans. B. pertussis adhère aux cellules du tractus respiratoire supérieur, car elle produit un facteur d’adhérence spécifique, appelé hémagglutinine filamenteuse, reconnaissant une molécule complémentaire sur les cellules de l’hôte. Cette adhésion est suivie d’une multiplication locale, pendant laquelle B. pertussis produit plusieurs exotoxines, dont une adényl



864 Chapitre 26


cyclase-hémolysine qui dérégule les fonctions cellulaires de l’hôte en augmentant la concentration intracellulaire d’adénosine monophosphate cyclique (AMPc) [voir section 8.7]. B. pertussis synthétise également plusieurs endotoxines, dont la toxine coquelucheuse, en partie responsable des symptômes de la coqueluche. La coqueluche se caractérise par des quintes de toux violentes et récurrentes, qui peuvent se prolonger pendant six semaines. La toux spastique spécifique de la coqueluche est appelée « chant du coq », car les quintes de toux sont suivies d’une reprise inspiratoire longue et sifflante. Plus de 50 millions de cas et 350 000 décès dus à la coqueluche sont recensés chaque année à travers le monde. Aux États-Unis, malgré le taux de vaccination de plus en plus élevé chez les enfants, le nombre de cas signalés de coqueluche augmente depuis les années 1980. En 2003, 8 489 cas ont été signalés, contre seulement 1 010 en 1976, année de très faible incidence. Plus de 60 % des cas (soit 4 000 cas annuels) sont signalés chez des sujets de plus de 5 ans, dont de nombreux adolescents et adultes mal immunisés. 24 % des cas sont signalés chez des enfants de moins de 6 mois, n’ayant pas reçu la totalité des doses vaccinales nécessaires. Environ 32 % des toux persistant d’une à deux semaines peuvent être dues à B. pertussis. Or, les adultes et les adolescents, chez qui le diagnostic est souvent méconnu, peuvent transmettre la coqueluche avec un risque maximal de complications. En France, la vaccination des enfants est recommandée dès l’âge de 2 mois. D’après les statistiques mondiales, les programmes de vaccination doivent cibler les jeunes enfants, mais l’immunité des adolescents et des adultes doit être également renforcée (voir section 25.4).

Diagnostic, prévention et traitement Le diagnostic biologique de la coqueluche se fait par culture de la bactérie, par la coloration de frottis d’écouvillons nasopharyngés à l’aide d’anticorps fluorescents et par des tests sérologiques. La culture s’effectue à partir d’une aspiration nasopharyngée sur milieu particulier, non sélectif, permettant la croissance des Bordetella, à base de gélose au sang, d’infusion de pomme de terre et de 10 % de glycérol. L’identification des colonies de petits coccobacilles Gram négatif, βhémolytiques, est confirmée par agglutination avec un antisérum spécifique ou par immunofluorescence utilisant des anticorps marqués (voir sections 24.8 et 24.9). Un test par réaction de polymérisation en chaîne (PCR), spécifique, sensible, est disponible dans certains laboratoires (voir section 24.12). L’amélioration des méthodes de diagnostic et des réseaux de surveillance facilitent la détection des cas d’infection. En France, comme dans de nombreux autres pays, deux types de vaccin coquelucheux étaient disponibles : le vaccin à germes entiers tués et le vaccin acellulaire (composé de protéines inactivées). Le vaccin à germes entiers a été responsable de réactions générales (œdème, rougeur au point d’injection, fièvre) assez fréquentes (environ un quart des individus vaccinés). Les enfants ayant des antécédents neurologiques ou d’anciens prématurés couraient un risque de complications liées à ce vaccin (risque de convulsions : 1 sur 14 000 ; risque d’hyperthermie prolongée : 1 sur 16 000). Le changement de transmission de la maladie (qui ne se fait plus d’enfant à enfant, mais d’adolescent ou adulte à nouveau-né)

a été imputé principalement à l’absence de rappel vaccinal après 18 mois, à la suite de l’augmentation des effets secondaires dus à des vaccinations répétées avec le vaccin à germes entiers. Depuis 2006, seul le vaccin acellulaire est disponible. Il entraîne beaucoup moins de réactions. Les vaccinations de la petite enfance s’effectuent à deux, trois et quatre mois de vie, suivies d’un rappel à 16-18 mois. Ce calendrier vaccinal doit être respecté pour une protection efficace (voir section 22.13). Depuis 1998, un rappel tardif à 11-13 ans est recommandé pour les adolescents et, depuis octobre 2004, pour les jeunes parents, les adultes à risque et le personnel de santé. Aux États-Unis, plus de 50 % des enfants contractant une coqueluche n’ont pas été convenablement vaccinés. B. pertussis est sensible in vitro à l’ampicilline, aux tétracyclines et à l’érythromycine. Même sous antibiotiques, un patient atteint de coqueluche demeure contagieux plus de deux semaines après le début du traitement.

Contrôlez vos acquis Aux États-Unis, une recrudescence de la coqueluche est observée. Deux mille cas annuels de coqueluche ont été signalés dans les années 1970, contre huit mille actuellement Les enfants mal immunisés sont à haut risque de cette maladie. •

Quelles mesures peuvent être mises en place pour diminuer l’incidence de la coqueluche dans la population ?

•

Quelles sont les difficultés liées à l’utilisation des vaccins coquelucheux ?

26.5 Mycobacterium, tuberculose m n et lèpre La tuberculose est due à un bacille acido-alcoolo-résistant, Mycobacterium tuberculosis (voir section 12.23). Le microbiologiste allemand Robert Koch a isolé et décrit ce dernier en 1882 (voir section 1.6). La propriété d’acido-alcoolo-résistance commune à toutes les espèces de Mycobacterium est favorisée par les acides mycoliques (cire) constituant la paroi. Communs à toutes les espèces de ce genre, les acides mycoliques permettent à ces organismes de retenir la fuschine phéniquée, un colorant rose, même après décoloration par une solution alcoolique d’acide chlorhydrique à 3 % (voir figure 26.7).

L’épidémiologie Mycobacterium tuberculosis est transmis par voie respiratoire ; le simple fait de parler peut être à l’origine de la transmission de la bactérie d’une personne à l’autre. Pendant longtemps, la tuberculose a été la première maladie infectieuse humaine, représentant un septième des causes de décès mondiaux. Actuellement, près de 11 000 nouveaux cas de tuberculose (près de 6 000 nouveaux cas en France en 2004) et près de 750 décès surviennent chaque année aux États-Unis (près de



CDC/Dr. Edwin P. Ewing, Jr./PHIL


FIGURE 26.7 Observation de Mycobacterium avium après coloration acido-alcoolo-résistante d’une biopsie de ganglion d’un patient atteint du SIDA . De nombreux bacilles sont mis en évidence dans chaque cellule. Les bacilles colorés en rouge avec la fuschine (flèches) mesurent environ 0,4 µm de diamètre et plus de 4 µm de longueur.

700 en France en 1999). Dans le monde entier, la tuberculose représente 1,6 million de morts par an, soit près de 11 % de toutes les causes de décès par maladies infectieuses. Près d’un tiers de la population mondiale est infecté par M. tuberculosis (voir tableau 25.1). Récemment, aux États-Unis, de nombreux cas de tuberculose ont été observés chez des patients souffrant du syndrome d’immunodéficience acquise (SIDA).

La pathologie L’interaction de Mycobacterium tuberculosis avec l’hôte humain est extrêmement complexe et est déterminée à la fois par la bactérie et le niveau de défense de l’hôte. Les cellules de l’immunité jouent un rôle important dans la prévention de la maladie survenant après la primo-infection. La tuberculose se définit en deux stades : la primo-infection (infection initiale) et la tuberculose maladie (activation de l’infection initiale). La primo-infection résulte en général de l’inhalation de gouttelettes ou de particules de poussière contenant des bacilles viables de M. tuberculosis provenant d’un individu présentant une tuberculose pulmonaire active. La bactérie inhalée s’installe dans les poumons et s’y développe. Une réponse immunitaire de l’hôte contre M. tuberculosis se manifeste par une réaction d’hypersensibilité retardée (voir section 22.15) et la formation d’agrégats de macrophages activés, appelés tubercules (granulomes) [voir figure 1.13]. La bactérie peut survivre et se développer dans les macrophages, même en cas de réponse immunitaire. Chez les individus

immunodéprimés, la maladie infectieuse n’est pas contrôlée et aboutit à une infection pulmonaire aiguë responsable d’une destruction des tissus pulmonaires et de la dissémination du bacille vers d’autres aires corporelles, ce qui entraîne à terme le décès. M. tuberculosis est capable de survivre à la fois à des pH bas et à des composés oxydatifs antibactériens contenus dans les lysosomes des macrophages (voir section 22.2). Dans la plupart des cas, l’infection par M. tuberculosis n’évolue pas en tuberculose maladie. L’infection reste localisée, inapparente et finit par s’arrêter. L’infection initiale provoque simplement une hypersensibilité des individus à la bactérie et à ses dérivés, et ainsi modifie la réponse de l’individu aux expositions ultérieures à M. tuberculosis. Un test diagnostic appelé test tuberculinique (intradermoréaction ou IDR) peut être réalisé pour mesurer cette hypersensibilité. De la tuberculine, une fraction protéique extraite de M. tuberculosis, est injectée en intradermique chez un individu hypersensibilisé, ce qui engendre au bout d’un à trois jours une réaction immunitaire locale au point d’injection. La réaction est caractérisée par une induration et un œdème (voir figure 22.26). Un individu présentant ce type de réaction est dit positif à la tuberculine (IDR positive), et de nombreux adultes sains ont des IDR positives, témoins d’infections inapparentes antérieures. Un test tuberculinique positif n’indique donc pas une maladie active, mais seulement le fait que l’individu a été exposé à la bactérie dans le passé et a bénéficié d’une réponse immunitaire cellulaire. Pour la plupart des individus, cette immunité est protectrice et à vie. Cependant quelques patients ayant une IDR positive développent la tuberculose maladie du fait de réinfections exogènes ou de réactivation des bacilles restés latents, souvent pendant des années, à l’intérieur des macrophages. À cause du caractère latent de l’infection tuberculeuse, les patients ayant un test tuberculinique positif sont généralement traités. Des facteurs tels que l’âge, la malnutrition, la promiscuité, le stress et les changements hormonaux peuvent induire une baisse de l’immunité chez les patients non traités et permettre la réactivation des infections latentes. Les infections pulmonaires secondaires progressent sous la forme d’une infection chronique qui aboutit à la destruction des tissus pulmonaires, suivie par une atteinte et une calcification au point d’infection. Ainsi, la tuberculose chronique (tuberculose maladie) aboutit à une extension progressive des lésions tuberculeuses dans les poumons. Les bactéries sont retrouvées dans les expectorations des patients souffrant de tuberculose maladie et des zones de destruction tissulaire peuvent être observées à la radiographie pulmonaire (voir figure 26.8).

Prévention et traitement Les individus présentant une tuberculose maladie peuvent disséminer la bactérie simplement en toussant ou en parlant à des individus sains. Comme la tuberculose est très contagieuse, le « United States Occupational Safety and Health Administration » aux Etats-Unis et le « Conseil Supérieur d’Hygiène Publique » en France ont établi des recommandations pour la protection des personnels soignants ayant en charge des patients tuberculeux. Par exemple, les patients atteints de tuberculose doivent être hospitalisés dans des chambres à pression négative. De plus, le personnel soignant doit se protéger en portant un masque de



Aaron Friedman


Aaron Friedman

866 Chapitre 26

(a)

(b)

FIGURE 26.8 Tuberculose et diagnostic par radiographie. (a) Radiographie pulmonaire normale. Les fines lignes blanches sont des artères ou d’autres vaisseaux sanguins. Le cœur correspond au bombement blanc situé dans le cadrant inférieur droit. (b) Cas de tuberculose avancée ; les amas blancs (pointés par les flèches) indiquent les zones de la maladie. Ces taches ou tubercules peuvent contenir des bacilles vivants de Mycobacterium tuberculosis. Le tissu et les fonctions pulmonaires sont altérés par ces lésions.

protection respiratoire de type FFP. Ces filtres spéciaux préviennent la transmission de M. tuberculosis par les expectorations ou les particules de poussière. Le traitement antituberculeux est un facteur important du contrôle de la maladie. Le succès initial de l’antibiothérapie s’est produit grâce à l’introduction de la streptomycine, mais la révolution réelle des traitements antituberculeux vient de la découverte de l’hydrazide de l’acide isonicotinique (isoniazide ou INH – voir figure 26.9). Cet antituberculeux est efficace, peu coûteux et il est bien absorbé par voie orale. Bien que le mode d’action de l’isoniazide ne soit pas entièrement compris, on sait qu’elle affecte la synthèse des acides mycoliques de Mycobacterium (les acides mycoliques sont des lipides qui se complexent au peptidoglycane dans la paroi des mycobactéries – voir section 12.23). L’isoniazide pourrait mimer l’activité d’une molécule proche structurellement, le nicotinamide (voir figure 26.9), et être incorporé à la place de cette dernière et ainsi inactiver les enzymes requérant cette molécule pour leur activité. Le traitement des mycobactéries par de très petites doses d’isoniazide (aussi faibles que 5 picomoles [pmol] pour 109 bactéries) aboutit à une inhibition complète de la synthèse des acides mycoliques, et le traitement continu aboutit à la perte des zones externes de la

O

H C N NH2

O C NH2

N Isoniazide

N Nicotinamide

FIGURE 26.9 Structure de l’isoniazide (hydrazide de l’acide isonicotinique). L’isoniazide est un agent chimiothérapeutique actif contre la tuberculose. Notez la similitude de structure avec le nicotinamide.

membrane, à une perte de l’intégrité cellulaire et finalement à la mort cellulaire. Après un traitement par l’isoniazide, les mycobactéries perdent leur acido-alcoolo-résistance, ce qui prouve le rôle des acides mycoliques dans les propriétés de coloration (voir section 12.23). Cependant, la résistance des mycobactéries à l’isoniazide et aux autres antituberculeux augmente jusqu’à un seuil alarmant, notamment chez les patients atteints du SIDA (voir section 26.14). Aux États-Unis, le traitement implique classiquement des doses journalières d’isoniazide et de rifampicine pendant deux mois, suivies de doses bihebdomadaires pour une durée totale de neuf mois, de manière à éradiquer le bacille tuberculeux et prévenir l’émergence de souches résistantes aux antibiotiques. Des échecs de traitement (traitements mal conduits ou inachevés) permettent à l’infection de se réactiver ; les bacilles tuberculeux ont alors acquis des résistances aux molécules du traitement original. Des traitements inappropriés favorisent la survenue de résistance aux antibiotiques car de nombreuses mutations spontanées surviennent chez M. tuberculosis, conférant rapidement des résistances à des antibiotiques spécifiques. Pour assurer le traitement et ainsi empêcher le développement de cette résistance, la mise en place de mesures de « direct observation of » (DOT) est nécessaire pour les personnes qui ne sont pas fidèles au traitement. De manière générale, pour les patients hospitalisés ou institutionnalisés, chez lesquels les souches résistantes sont plus fréquemment rencontrées, le traitement repose sur l’administration quotidienne de quatre molécules antituberculeuses pendant deux mois, suivie de l’association rifampicine-isoniazide pour une durée totale de six mois. L’association d’antibiotiques permet de réduire l’émergence des souches multirésistantes. Dans de nombreux pays, la vaccination avec une souche atténuée de M. bovis, le bacille de Calmette-Guérin (BCG), est utilisée pour la prévention de la tuberculose. Cependant, aux ÉtatsUnis et dans d’autres pays où la prévalence de la tuberculose est faible, la vaccination par le BCG n’est pas préconisée. Le vaccin vivant à BCG induit une hypersensibilité retardée (voir section 22.15) et tous les individus vaccinés développent un test à la tuberculine positif, neutralisant ainsi la valeur de ce test pour le diagnostic et comme indicateur épidémiologique de la prévalence des infections à M. tuberculosis.

Mycobacterium leprae et la maladie de Hansen (lèpre) Mycobacterium leprae, découvert par G. A. Hansen en 1873, est l’agent responsable de la maladie de Hansen, ou lèpre. M. leprae est la seule espèce de Mycobacterium qui ne se cultive pas sur des milieux artificiels. Le seul modèle expérimental animal qui a été utilisé avec succès pour cultiver M. leprae et reproduire la pathologie infectieuse est le tatou. La forme la plus sérieuse de lèpre se caractérise par des lésions mutilantes, surtout du visage et des extrémités (voir figure 26.10), provoquées par la croissance de M. leprae dans la peau. Les lésions contiennent jusqu’à 109 bacilles par gramme de tissu. Comme les autres mycobactéries, M. leprae est un bacille acido-alcoolo-résistant, démontrant alors de façon rapide le diagnostic d’infection active (voir section 12.23). Cette forme lépromateuse de la lèpre est de mauvais pronostic. Dans les cas graves, les lésions défigurantes provoquent une




destruction des nerfs périphériques et une perte des fonctions motrices. De nombreux patients présentent des lésions sans que la bactérie soit retrouvée ; ils souffrent de la forme tuberculoïde. La lèpre tuberculoïde se caractérise par une réaction d’hypersensibilité retardée (voir section 22.15) et est de bon pronostic, avec généralement une guérison spontanée. La maladie de Hansen ou ses autres formes, continuum entre les formes intermédiaires, est traitée par une multi-antibiothérapie incluant une combinaison de dapsone (4, 4’-sulfonylbisbenzeneamine), de rifampicine et de clofazimine. Comme dans le cas des tuberculoses, des souches multirésistantes sont apparues, notamment après des traitements inadéquats ou par monothérapie. Une multi-antibiothérapie prolongée pendant plus de un an est nécessaire pour obtenir l’éradication du bacille de la lèpre. La pathogénicité de M. leprae est due à la combinaison d’une réaction d’hypersensibilité retardée (voir section 22.15) et du pouvoir invasif du bacille. La transmission se fait par contact direct et par voie respiratoire ; l’incubation varie de quelques semaines à quelques années, ou même quelques dizaines d’années. M. leprae se développe à l’intérieur des macrophages, causant une infection intracellulaire qui entraîne la présence d’un grand nombre de bacilles dans la peau. Dans de nombreuses parties du globe, l’incidence de la lèpre est très faible. Dans le monde entier, il y a eu 763 917 nouveaux cas rapportés en 2002, mais seulement 96 aux États-Unis. Pour 90 %, ces cas surviennent à Madagascar, au Mozambique, en Tanzanie et au Népal. Près de deux millions de personnes sont handicapées du fait de la lèpre ; mais, à cause de sa nature chronique et de sa longue période de latence, la maladie serait non diagnostiquée chez douze millions d’individus.

Les autres espèces du genre Mycobacterium

(a)

C. H. Binford

C. H. Binford

Un pathogène fréquent dans les élevages laitiers, Mycobacterium bovis, est aussi pathogène pour l’homme et pour les animaux. M. bovis infecte le tractus intestinal de l’homme, en général après l’ingestion de lait cru. Le bacille dissémine éventuellement

(b)

FIGURE 26.10 Lésions cutanées de la lèpre lépromateuse . La lèpre lépromateuse est due à l’infection par Mycobacterium leprae. Les lésions peuvent contenir plus de 10 9 bactéries par gramme de tissu, indiquant une infection active non contrôlée de mauvais pronostic.

ensuite au niveau du tractus respiratoire et provoque les symptômes classiques de tuberculose. M. bovis diffère de M. tuberculosis même si les deux espèces ont des homologies ADN-ADN très fortes. Bien que M. bovis présente de nombreuses délétions de ses gènes, il n’est pas différent dans son pouvoir infectieux et dans sa pathogenèse chez l’homme. La pasteurisation du lait et l’élimination de la maladie dans le bétail ont permis d’éradiquer en partie les cas de contamination des hommes par les bovins dans les pays développés. D’autres espèces de mycobactéries sont occasionnellement pathogènes pour l’homme : M. kansasii, M. scrofulaceum, M. chelonae et d’autres espèces de ce genre (voir section 12.23). Les infections pulmonaires dues aux différentes espèces du complexe M. avium (MAC) sont particulièrement redoutables pour les patients souffrant du SIDA (voir figure 26.7 et section 26.14).

Contrôlez vos acquis La tuberculose est une des maladies les plus répandues et dangereuses au monde. Son incidence est en augmentation dans les pays en voie de développement, en partie à cause de l’émergence des souches résistantes. La tuberculose et la lèpre sont des maladies influencées par la réponse immune cellulaire. •

Pourquoi Mycobacterium tuberculosis est-il un agent pathogène respiratoire aussi répandu ?

•

Décrivez les facteurs contribuant à l’émergence des résistances aux antituberculeux.

•

Identifiez les autres espèces de Mycobacterium responsables de maladies chez l’homme.

26.6 Neisseria meningitidis, m n méningite et méningococcémie La méningite est une inflammation des méninges, membranes enveloppant le système nerveux central, le cerveau et la moelle épinière. La méningite peut être d’étiologie virale, bactérienne, fongique ou due à des protozoaires. Nous présentons ici la forme bactérienne imputable à Neisseria meningitidis et l’infection associée appelée méningococcémie. Neisseria meningitidis, appelé souvent méningocoque, est un diplocoque Gram négatif, capsulé, non sporulé, aérobie strict, oxydase positif, de diamètre variant entre 0,6 et 1 µm (voir figure 26.11). Au moins treize sérogroupes pathogènes sont connus, caractérisés par leurs antigènes polysaccharidiques capsulaires.

Épidémiologie et pathologie Les méningites méningococciques se manifestent sous forme d’épidémies, touchant des populations vivant en milieu clos (installations militaires, campus scolaires ou universitaires) et atteignant préférentiellement les adolescents ou les jeunes adultes. De 10 à 30 % des individus sains sont porteurs de Neisseria meningitidis, au niveau du nasopharynx. En situation




CDC/Dr. M.S. Mitchell/PHIL

868 Chapitre 26

FIGURE 26.11 Marquage en immunofluorescence de Neisseria meningitidis. Ce micro-organisme est responsable de méningites, en particulier chez les jeunes adultes, et de méningococcémies. Il est observé ici dans le liquide céphalorachidien d’un patient infecté (diamètre des cocci : 0,6 à 1 µm).

épidémique, la prévalence du portage atteint 80 %. Les facteurs déclenchant l’infection aiguë chez un sujet préalablement porteur sain ne sont pas connus. En cas d’infection aiguë, la bactérie est habituellement transmise à l’hôte par voie aérienne. Après pénétration par les voies respiratoires, les bactéries colonisent le rhino-pharynx, où elles peuvent soit persister de manière asymptomatique ou symptomatique (infection du tractus respiratoire supérieur), soit se disséminer par voie sanguine, entraînant une bactériémie. La bactériémie peut conduire à une forme particulière de méningococcémie, le purpura fulminans, caractérisé par une septicémie, une coagulation intravasculaire disséminée et un état de choc, de létalité voisine de 10 %. La méningite, autre évolution défavorable de cette infection, se manifeste par des maux de tête subits, des vomissements et une raideur de la nuque, pouvant mener, dans plus de 3 % des méningites aiguës méningococciques, au coma et à la mort en quelques heures. Aux États-Unis, en 2002, 1 814 cas d’infections méningococciques ont été recensés, chiffre le plus bas depuis 1977. Cette diminution d’incidence est due en partie à l’efficacité de la vaccination, disponible contre certains sérogroupes. Le taux de mortalité de cette infection se maintient cependant aux alentours de 12 %.

Diagnostic, prévention et traitement Le diagnostic peut être effectué par culture d’écouvillons nasopharyngés, de sang ou de liquide céphalo-rachidien, ensemencés sur milieu MTM (milieu de Thayer-Martin modifié) [voir section 24.1]. Inhibiteur de la croissance des flores commensales normales, ce milieu sélectif permet l’isolement de Neisseria meningitidis et de Neisseria gonorrhoeae. Les colonies de diplocoques Gram négatif, oxydase positive, sont présomptivement des Neisseria. Cependant, compte tenu de la rapidité d’installation des symptômes menaçant le pronostic vital, le diagnostic initial est essentiellement clinique. Le traitement est donc institué avant que la culture ne permette l’isolement de Neisseria meningitidis. Quelques souches de Neisseria meningitidis résistantes à la pénicilline G ont été signalées. Le traitement recommandé fait

appel à des céphalosporines de troisième génération ou à la pénicilline A (amoxicilline) [voir section 20.8]. Certains pays en situation d’épidémie utilisent le chloramphénicol. La plupart des adultes possèdent des anticorps protecteurs spécifiques, acquis lors d’infections subcliniques. Il n’y a pas de vaccin disponible protégeant contre tous les sérogroupes du méningocoque, en particulier contre le sérogroupe B, contre lequel ne sont mis au point que des vaccins spécifiques d’un clone épidémique particulier. En France, les vaccins méningococciques polysaccharidiques (à base de polysaccharides capsulaires purifiés), dirigés contre les sérogroupes A, C, Y et W135, peuvent être utilisés pour protéger des voyageurs, des pèlerins ou des militaires se rendant en zones d’endémie. Le vaccin méningococcique conjugué C (à base de polysaccharides capsulaires conjugués à une protéine porteuse) est utilisé pour protéger les sujets contacts (sujets très proches ou vivant en communautés particulières, étudiants, militaires) d’un cas d’infection à méningocoque C, et, sur décision des autorités sanitaires, dans des zones délimitées où l’incidence du méningocoque C est particulièrement élevée. Ces vaccins réduisent le taux d’infection à méningocoque, mais non le portage rhinopharyngé. La rifampicine est utilisée à titre chimioprophylactique, pour prévenir la contamination des sujets contacts et des membres de la famille d’un sujet infecté.

Les autres causes de méningite De nombreux autres micro-organismes sont susceptibles d’être responsables de méningite. Les méningites bactériennes aiguës sont habituellement dues à des bactéries pyogènes, comme Staphylococcus, Streptococcus ou Haemophilus influenzae, sérotype b. Haemophilus influenzae infecte surtout les enfants. Un vaccin très efficace contre la méningite à Haemophilus influenzae, sérotype b, est recommandé en France avant l’âge de six mois (voir section 22.13). Certains virus sont également responsables de méningites, par exemple le virus de l’herpès simplex (HSV), le virus de la chorioméningite lymphocytaire (Lcnv), le virus des oreillons et les entérovirus. De façon générale, les méningites virales sont moins sérieuses que les méningites bactériennes.

Contrôlez vos acquis Neisseria meningitidis est fréquemment responsable de méningococcémie et de méningite chez les adultes jeunes, ainsi que d’épidémies sporadiques chez des sujets vivant en communauté proche. Le taux de mortalité des méningites bactériennes et des méningococcémies est élevé. Un traitement très précoce ainsi que l’application de stratégies de prévention sont nécessaires pour enrayer les épidémies. Il n’existe pas de vaccin protégeant contre les sérogroupes de la bactérie responsables de méningites. •

Décrivez l’infection à Neisseria meningitidis et les conséquences d’une méningococcémie.

•

Quelles sont les stratégies de prévention des méningococcémies ? Expliquez.



26.7 Virus et infections respiratoires 869

26.7 Virus et infections respiratoires m n

La rougeole (rubeola, 7-day measles) est une maladie infantile aiguë très contagieuse, caractérisée par un écoulement nasal, une rougeur oculaire, un rhume et de la fièvre. Le virus de la rougeole est un paramyxovirus (voir section 16.9) transmis par voie aérienne, dont les portes d’entrée sont le nez et la gorge ; une virémie systémique s’ensuit très rapidement. Au cours de l’évolution de l’infection, une fièvre et un rhume apparaissent et s’intensifient rapidement, une éruption apparaît (voir figure 26.12) ; les symptômes durent en moyenne de sept à dix jours. Les anticorps circulants spécifiques du virus sont détectables cinq jours après le début de l’infection ; avec les lymphocytes T cytotoxiques (voir sections 22.9 et 22.7), ils permettent l’élimination du virus de l’organisme. Diverses complications peuvent survenir : infection de l’oreille interne, pneumonie et, dans de rares cas, une encéphalomyélite à l’origine de désordres neurologiques, d’épilepsie, avec un taux de mortalité d’environ 20 %. Au départ connue comme une maladie infantile courante, de nos jours la rougeole se manifeste seulement sous forme de foyers épidémiques grâce à la mise en place au milieu des années 1960 de vastes programmes de vaccination (voir figure 26.13a). De par sa forte contagiosité, tous les systèmes publics scolaires des États-Unis demandent des certificats de vaccination avant l’entrée des enfants à l’école. Le vaccin ROR (rougeole, oreillons, rubéole) est l’instrument de cette immunisation active (voir section 22.13). Une rougeole déclarée dans l’enfance confère en général une immunité à vie contre une réinfection.

Les oreillons Les oreillons, tout comme la rougeole, sont liés à un paramyxovirus et sont aussi hautement contagieux. La dissémination se fait par les gouttelettes aéroportées, l’infection se caractérise par une inflammation des glandes salivaires conduisant à un gonflement des parotides et du cou (voir figure 26.14). Le virus se dissémine par la circulation sanguine et peut infecter d’autres organes comme le cerveau, les testicules et le pancréas. De graves complications peuvent se manifester sous forme d’encéphalite et, très rarement, de stérilité. La réponse immunitaire de l’hôte produit des anticorps

(a)

CDC/PHIL

La rougeole


La réplication des virus est complètement dépendante des fonctions de la cellule hôte, aussi le traitement des infections virales est-il moins évident que celui des infections liées à d’autres micro-organismes (voir section 20.10). La plupart des traitements antiviraux spécifiques sont susceptibles de causer des dommages cellulaires. Il n’est donc pas surprenant de constater que les maladies infectieuses de forte prévalence, notamment dans les pays développés, sont dues à des virus. La plupart des infections virales sont aiguës, limitées, certaines pouvant se compliquer chez l’adulte en bonne santé. La vaccination a permis de contrôler efficacement la variole et la rage, maladies virales sérieuses. Nous décrivons dans ce chapitre des infections virales transmises par voie aérienne via des gouttelettes infectieuses.

(b) FIGURE 26.12 Rougeole chez un enfant. (a) L’exanthème maculopapuleux débute à la face et au cou, et (b) atteint la poitrine, le tronc et les membres. La progression de l’éruption dure plusieurs jours.

dirigés contre des protéines virales de surface et conduit le plus souvent à une guérison rapide. Un vaccin atténué prévient très efficacement les oreillons (voir figure 26.13b). Ces trois dernières décennies, la prévalence des oreillons dans les pays développés a été fortement réduite, l’infection ne touchant que les individus non vaccinés par le ROR.

La rubéole La rubéole, ou « rougeole allemande », ou « rougeole des trois jours » (« rubella »), est due à un virus à ARN simple brin de polarité positive du genre Togavirus (voir section 16.8). Les symptômes sont proches de ceux de la rougeole, mais plus modérés. La rubéole est moins contagieuse que la rougeole, et une bonne proportion de la population n’a jamais été infectée.



400

Nombre de cas d’oreillons pour 100 000

Vaccin

200

1965

1970

1975

1980

1985

1990

1995

2000

2005 (b)

150 100 50 0

Vaccin 1965

1970

1975

1980

1985

1990

1995

2000

2005 (c)

20

Vaccin

10 0 1960

1965

1970

1975

1980

1985

1995

1990

2000

Année

2005

Nombre de cas

(a)

0

Nombre de cas de rubéole pour 100 000


Nombre de cas Nombre de cas répertoriés répertoriés pour 100 000 individus pour 100 000 individus

Nombre de cas de rougeole pour 100 000

870 Chapitre 26

30 25 20 15 10 5 0 1987 7 6 5 4 3 2 1 0 1987 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0,0 1987

1992

1997

2002

1992

1997

2002

1992

1997

2002

FIGURE 26.13 Infections virales et vaccins. Les principales maladies virales de l’enfant sont désormais contrôlées par l’utilisation du vaccin rougeole-oreillons-rubéole, depuis sa mise sur le marché aux États-Unis. (a) Rougeole. (b) Oreillons. (c) Rubéole. Les courbes de droite précisent l’évolution plus récente de ces infections. Données des centres de contrôle et de prévention des maladies (CDC, Centers for Disease Control and Prevention), Atlanta, Géorgie, États-Unis.


Lors des trois premiers mois de la grossesse, le virus de la rubéole peut infecter le fœtus par transmission placentaire et être à l’origine d’anomalies fœtales sérieuses (mort fœtale tardive, surdité, anomalies cardiaques et oculaires, atteintes cérébrales chez le nouveau-né). Le ROR étant un vaccin composé en partie de souches atténuées du virus de la rubéole (vaccin vivant atténué) [voir figure 26.13c et section 22.13], les femmes enceintes ne doivent donc pas être vaccinées ni contracter

FIGURE 26.14 Oreillons. Tuméfaction glandulaire typique de l’infection par le virus des oreillons.

le virus pendant cette période. Aussi, la vaccination contre la rubéole doit-elle être faite pendant l’enfance.

La varicelle et le zona La varicelle est une maladie infantile courante due à un virus de l’herpès, le virus de la varicelle et du zona (VZV) (voir section 16.12). Le VZV est très contagieux ; il est transmis par voie aérienne via des gouttelettes infectieuses, notamment lorsque des individus sensibles sont en contact rapproché. Chez les enfants scolarisés, par exemple, la dissémination du virus entre élèves, ainsi que par contact avec des fomites contaminés, est favorisée par le confinement dans les classes lors des mois d’hiver. Le virus entre par le tractus respiratoire, s’y multiplie et est rapidement disséminé par la circulation sanguine, provoquant une éruption papuleuse généralisée qui guérit rapidement, ne laissant que rarement des cicatrices défigurantes (voir figure 26.15). Un vaccin à virus atténué est désormais recommandé aux États-Unis depuis 1996 (voir section 22.13). En France, depuis 2004, le vaccin VZV est recommandé chez les personnes sans antécédents de varicelle et dont la sérologie est négative, chez les professionnels en contact avec la petite enfance, les professionnels de santé des services accueillant des sujets à risque de varicelle grave (immunodéprimés, services de gynéco-obstétrique, néonatalogie, maladies infectieuses, néphrologie). Aux États-Unis, l’incidence annuelle de la varicelle est désormais équivalente au tiers de ce qu’elle était avant 1994, année à partir de laquelle la vaccination fut largement répandue. Le virus VZV peut rester latent dans les cellules neuronales pendant des années sans manifestations symptomatiques. Le



26.8 Rhumes et grippe 871

Toute autre maladie infectieuse Rhumes Grippe 0

100

200

300

400

CDC/PHIL

Cas pour 100 individus par an

FIGURE 26.15 Varicelle. Éruption maculopapulaire caractéristique de l’infection par le virus de la varicelle et du zona (VZV), herpesvirus responsable de la varicelle.

virus migre occasionnellement de ce réservoir vers la surface cutanée ; il est alors responsable d’une éruption douloureuse appelée zona, qui touche particulièrement les individus immunodéprimés et les personnes âgées. Des études sur des volontaires suggèrent que les cellules T jouent un rôle important dans la destruction du virus. L’utilisation prophylactique d’immunoglobulines humaines hyperimmunes dirigées contre le VZV prévient l’installation des symptômes. Cette prophylaxie est recommandée uniquement lorsque des infections secondaires occasionnellement associées au zona (pneumonie ou encéphalite) sont susceptibles de mettre en danger la vie du patient.

Contrôlez vos acquis Les infections virales respiratoires sont très contagieuses et peuvent être à l’origine de problèmes de santé sérieux. Les maladies virales infantiles courantes, rougeole, oreillons, rubéole et varicelle, sont néanmoins toutes contrôlables par une vaccination appropriée. •

Décrivez les complications graves potentielles de l’infection pour chacun de ces virus.

•

Identifiez la date de disponibilité (en France) des vaccins contre chacune de ces infections virales.

FIGURE 26.16 Rhumes et grippe. Ces infections virales sont les premières causes de maladies infectieuses aiguës aux ÉtatsUnis. Données caractéristiques de ces dernières années.

proches, bien que dus à des virus différents. Un rhume typique imputable à un rhinovirus s’accompagne d’écoulement nasal, de toux, de frissons et parfois de maux de gorge. La grippe, due à un orthomyxovirus, est généralement associée à des symptômes différents. Bien que la maladie puisse avoir d’autres origines, le rhume dure généralement moins longtemps et les symptômes sont plus modérés (voir tableau 26.1).

Le rhume commun Chaque individu contracterait en moyenne plus de trois rhumes par an au cours de sa vie (voir figure 26.16). Les symptômes correspondent à une rhinite (inflammation de la muqueuse nasale), une obstruction nasale, un écoulement nasal aqueux, une sensation de malaise général, le plus souvent sans fièvre. Les rhinovirus, virus à ARN simple brin appartenant à la famille des Picornaviridae (voir figure 26.17a et section 16.8), sont les micro-organismes responsables du rhume les plus fréquents. Au moins 115 sérotypes différents de rhinovirus ont été identifiés. Un autre groupe de virus à ARN simple brin, les coronavirus (voir figure 26.17b), sont responsables d’environ 15 % des rhumes chez l’adulte. D’autres virus, dont les adénovirus, les Coxsackie virus, le virus respiratoire syncytial (VRS) et les orthomyxovirus sont impliqués dans environ 10 % des rhumes communs. Les rhumes induisent une réponse IgA

TABLEAU 26.1 Symptômes

m n

26.8 Rhumes et grippe

Le rhume et la grippe correspondent aux maladies infectieuses les plus courantes. Proportionnellement, il y a environ deux cas de grippe et environ quinze rhumes pour chaque maladie infectieuse d’une autre origine (voir figure 26.16). Ces infections virales sont transmises par voie aérienne via des gouttelettes se disséminant d’un individu à l’autre par la toux, l’éternuement et les sécrétions respiratoires. Les symptômes d’un rhume commun et ceux de la grippe sont souvent

RHUMES ET GRIPPE Rhume commun

Grippe

Fièvre

Rare

Fréquente (39–40 ˚C) et subite

Maux de tête

Rares

Fréquents

Malaise général

Léger

Fréquent ; assez sérieux ; plus d’une semaine

Sécrétions nasales

Souvent abondantes

Habituellement peu abondantes

Maux de gorge

Fréquents

Rares

Vomissements, diarrhées

Rares

Fréquents chez les enfants



872 Chapitre 26


N

CH3

N N

CH3O

N

(a) CH3

CF3

N

B. Dowsett et D. Tyrell

O

(a)

H3C

N

O

O

CH3

N

(b) FIGURE 26.18 Molécules antirhinovirus en cours d’expérimentation. (a) Structure du 3-méthoxy-6-[4-(3méthylphényl)]-1-pipérazinyl. (b) Structure du WIN 52084, molécule antivirale bloquant le récepteur des rhinovirus.

(b) FIGURE 26.17 Images en microscopie électronique de virus responsables du rhume commun. (a) Rhinovirus humain (30 nm de diamètre). (b) Coronavirus humain (60 nm de diamètre).

locale spécifique neutralisante (voir section 22.9). Le nombre d’agents infectieux potentiellement impliqués rend très improbable l’efficacité de l’immunité de vaccination ou de postexposition à un virus donné. Si les rhumes se propagent le plus fréquemment par transmission aérienne du virus, il est néanmoins suggéré qu’un contact direct et/ou un contact avec des fomites peut être un mode de transmission important. La plupart des antiviraux sont inefficaces, mais un dérivé de la pirazidine a montré des résultats prometteurs en prophylaxie après exposition virale. De nouvelles molécules sont en cours de synthèse d’après les données de modélisation des structures tridimensionnelles de protéines virales. La molécule antirhinovirus WIN 52084 (voir figure 26.18b) se lie au virus, changeant sa configuration tridimensionnelle de surface et perturbant sa liaison à son récepteur à la surface de la cellule hôte ICAM1 (Intercellular Adhesion Molecule-1), et prévenant ainsi l’infection. L’interféron-α est une cytokine (voir section 23.11) efficace dans la prévention du rhume. Aucune de ces diverses alternatives expérimentales prophylactiques et thérapeutiques du rhume n’a jusque-là été validée. Face à la brièveté des rhumes et leur non-évolution pathologique, le traitement est le plus souvent symptomatique, fondé sur l’utilisation d’antihistaminiques et de décongestionnants pour réduire les écoulements nasaux.

La grippe est due à un orthomyxovirus (voir section 16.9), un virus à ARN simple brin, négatif, à capside hélicoïdale entourée d’une enveloppe lipidoprotéique portant des glycoprotéines externes (voir figures 26.19 et 16.17). Trois types de virus grippaux, A, B et C, sont connus. Seul le virus de la grippe de type A sera abordé ici, car c’est le plus fréquent des trois pathogènes chez l’homme. Le génome du virus de la grippe est segmenté (voir section 16.9 et figure 16.17), ce qui facilite les réassortiments de fragments génomiques entre différentes souches virales lors de co-infections d’une même cellule. Dans ce contexte, l’encapsidation des segments d’ARN se fera au hasard pour la formation de virus ayant un assortiment de segments génomiques de chacun des virus. Lorsque le génome viral obtenu est différent de celui des virus connus, on est face à un nouveau virus. On parle de cassure ou saut antigénique. Ce phénomène correspond à des modifications majeures des glycoprotéines de l’enveloppe virale, l’hémagglutinine (HA ou H) et la neuraminidase (NA ou N), impliquées respectivement dans la fixation

Trimère d’HA Bicouche lipidique Protéine M Tétramère de NA

ARN NP PA, PB1, PB2

Irene T. Schulze

Heather Davies et D. Tyrell

La grippe

FIGURE 26.19 Virus de la grippe en microscopie électronique. Localisation des principales protéines virales et de l’ARN. Chaque virion a un diamètre d’environ 100 nm. HA, hémagglutinine (chaque spicule d’HA est un trimère) ; NA, neuraminidase (chaque spicule de NA est un tétramère) ; M, protéine de matrice ; NP, nucléoprotéine ; PA, PB1, PB2, protéines à fonction de polymérase.




du virus à la cellule hôte et dans sa libération (voir figures 16.17 et 26.19). Des variations antigéniques mineures peuvent également affecter ces glycoprotéines HA et NA, conséquences de mutations survenues dans leurs gènes respectifs : phénomène de glissement ou dérive antigénique.

L’épidémiologie de la grippe Les virus de la grippe humains sont transmis entre individus par voie aérienne via les gouttelettes expectorées lors de la toux ou d’éternuement. Le virus infecte la muqueuse du tractus respiratoire supérieur et envahit occasionnellement les poumons. Les symptômes associent une fièvre durant de trois à sept jours, des frissons, une fatigue, des céphalées et un état de malaise général (voir tableau 26.1). La guérison est généralement spontanée et rapide. La plupart des complications sérieuses de l’infection apparaissent lors d’infections bactériennes secondaires telles que les pneumonies, particulièrement chez les enfants et les personnes âgées, avec des cas de décès directement liés à l’infection bactérienne. Chaque année, la grippe est responsable de trois à cinq millions de cas sérieux et de 250 000 à 500 000 décès dans le monde. La plupart des individus infectés développent une immunité contre le virus, une souche de type antigénique similaire sera alors incapable de causer une épidémie pendant environ deux ou trois ans. L’immunité est largement dépendante de la production d’IgA sécrétoires (voir section 22.9), particulièrement contre les déterminants antigéniques de l’HA et de la NA. Chez l’homme, la grippe est une infection virale endémique ; des épidémies touchent un grand nombre d’individus chaque année depuis la fin de l’automne et pendant l’hiver. Les glissements antigéniques sont à l’origine d’une diminution de l’immunité de la population, ils sont responsables de réapparitions d’épidémies de grippe, sérieuses et localisées,

tous les deux ou trois ans. Les pandémies, épidémies touchant la population mondiale, émergent moins fréquemment, tous les dix à quarante ans ; elles sont le résultat de cassures antigéniques (voir section 25.5). L’émergence, en 1957, de la grippe « asiatique » a permis d’étudier la propagation d’une pandémie (voir figure 26.20). La pandémie est apparue quand une souche virale mutante virulente, différente antigéniquement des souches circulant jusqu’alors, a émergé dans la population. Comme aucune immunité n’avait été développée contre une telle souche, le virus s’est disséminé rapidement de par le monde. Il est apparu en premier en Chine en février 1957 et s’est propagé jusqu’à Hong Kong dès avril. De là, il s’est disséminé par le biais des membres d’équipage de bateaux militaires à San Diego, en Californie. En mai, une épidémie s’est déclarée à Newport, Rhode Island, sur un navire militaire. À partir de là, des épidémies se sont manifestées continuellement dans différentes régions des États-Unis. Le pic d’incidence a été atteint en octobre, lorsque vingt-deux millions de nouveaux cas se sont développés. Au cours de la pandémie de 1918, la grippe « espagnole » (virus de la grippe de type A) avait tué trente millions d’individus infectés à travers le monde (voir figure 25.1). Bien que les pandémies apparaissent périodiquement, aucune ne fut aussi catastrophique que la grippe de 1918. Les pandémies de 1918 et 1957 sont liées par l’évidence d’un réassortiment entre des virus de la grippe aviaire et des virus humains chez le porc. Les cellules porcines expriment des récepteurs à la fois pour les orthomyxovirus humains et aviaires, elles peuvent donc héberger et propager ces deux types de virus. Lorsque les porcs sont infectés en même temps par une souche humaine et une souche aviaire, les deux virus peuvent se réassortir par échange de fragments génomiques d’ARN (cassure antigénique), un virus de la grippe unique

Légende Pays d’origine Épidémie s’étendant à l’ensemble du pays

Épidémie localisée Voies de dissémination

FIGURE 26.20 Pandémie grippale. Dissémination de la pandémie de grippe asiatique en 1957. Le foyer épidémique à l’origine de la pandémie se situait probablement en Chine. Les contacts de l’homme avec des élevages de volailles et de porcs auraient permis le réassortiment des génomes des virus grippaux issus des trois espèces hôtes. De nouvelles souches, contre lesquelles l’homme n’est pas immunisé, peuvent apparaître, conduisant à une dissémination rapide et incontrôlable de la pandémie.



874 Chapitre 26


peut être produit et pourra infecter l’homme chez qui aucun contact antigénique n’a eu lieu précédemment. Ce réassortiment entre des souches animales et humaines survient périodiquement, mais de façon imprédictible, présentant constamment la possibilité de l’émergence rapide d’une souche de la grippe extrêmement virulente et pour laquelle aucune immunité ne préexiste dans la population humaine. Une nouvelle souche aviaire est apparue à Hong Kong en 1997, probablement passée directement d’un hôte aviaire à l’homme. La souche résultante, grippe A H5N1, appelée virus de la grippe aviaire, a été responsable de nombreuses infections et de quelques décès, et a réémergé au Viêt Nam en 2004. Cette souche ne peut se propager entre individus qu’après un contact étroit et prolongé. Quelques éléments indiquent que le virus H5N1 a aussi infecté des porcs, donnant la possibilité d’une étape de réassortiment avec des souches humaines de la grippe infectant aussi le porc. Ce réassortiment pourrait créer un nouveau virus, débutant une nouvelle pandémie de grippe. Des vaccins sont en cours de développement dans le but de conférer une immunité contre cette souche émergente potentielle.

Mesures prophylactiques et traitement de la grippe Les épidémies de grippe peuvent être contrôlées par la vaccination. La définition de vaccins efficaces se heurte au grand nombre de souches existantes et à leur capacité permanente à subir des glissements ou des cassures antigéniques. Lorsque de nouvelles souches émergent, des vaccins adaptés ne sont pas immédiatement disponibles. Néanmoins, grâce à la vigilance mondiale (voir section 25.9), les souches majeures de virus de la grippe émergentes sont généralement isolées avant que les épidémies ne se déclarent. Aux États-Unis et en France, les souches candidates pour la fabrication des vaccins sont choisies à la fin de chaque saison de grippe et cultivées sur œufs embryonnés et inactivées. Ces souches inactivées sont ensuite utilisées pour la préparation d’un vaccin polyvalent utilisé en prévention de la prochaine saison de grippe. La vaccination est recommandée chez les individus les plus susceptibles de succomber ou d’être exposés à des manifestations secondaires graves, telles les personnes de plus de 50 ans, celles souffrant de maladies chroniques débilitantes (SIDA, par exemple – voir section 26.14) et chez les professionnels de santé. L’immunité vaccinale ne persiste que quelques années et est souche-spécifique. Aussi les préparations vaccinales sont-elles mises à jour annuellement. Des amines synthétiques bloquant la protéine virale M2, l’amantadine et la rimantadine, sont actives sur le virus de la grippe A ; du fait de la haute fréquence de résistance induite, ces antiviraux ne sont plus utilisés en France. Les inhibiteurs de la neuraminidase, oseltamivir et zanamivir, bloquent la libération cellulaire des virus de la grippe A et B (voir section 20.10 et tableau 20.5). Ces molécules sont utilisées dans le traitement de la grippe afin d’écourter son évolution et de diminuer la gravité des symptômes. Ils sont surtout efficaces lorsqu’ils sont pris très tôt au cours de l’infection (dans les douze à vingt-quatre premières heures). L’amantadine, la rimantadine et l’oseltamivir sont aussi efficaces en prophylaxie de l’instauration et de la dissémination de l’infection. Le traitement symptomatique de la grippe par l’aspirine, en

particulier chez les enfants, n’est pas recommandé. La prise d’aspirine au cours de la grippe est fortement liée à la survenue d’un syndrome de Reye, complication touchant le système nerveux central, rare mais occasionnellement fatale.

Contrôlez vos acquis Le rhume et la grippe sont les maladies infectieuses les plus courantes. Bien que ne présentant pas un danger vital par elles seules, elles peuvent diminuer la résistance de l’organisme et être des portes ouvertes à des infections secondaires bactériennes sérieuses. Les épidémies de grippe se déclarent chaque année, des épidémies plus graves ainsi que des pandémies apparaissent périodiquement. •

Définissez et comparez les étiologies et les symptômes de la grippe et des rhumes communs ; discutez les possibilités de vaccination efficace pour chacune d’entre elles.

•

Différenciez une cassure antigénique d’un glissement antigénique.

II

MALADIES TRANSMISSIBLES PAR CONTACT DIRECT

Certaines maladies sont transmises essentiellement par contact direct avec une personne infectée ou par contact avec le sang ou les excreta de cette personne infectée. De nombreuses maladies respiratoires discutées ci-dessus peuvent également être transmises par contact direct. Dans cette section, nous détaillons les infections staphylococciques, les ulcères et les hépatites, maladies transmises essentiellement par contact direct avec des sujets infectés.

26.9 Staphylococcus spp. m n Le genre Staphylococcus comprend des pathogènes fréquents, humains et animaux, responsables exceptionnellement de maladies menaçant le pronostic vital. Les staphylocoques infectent la peau et les plaies. La plupart des infections staphylococciques résultent du transfert des staphylocoques de la flore normale d’un individu infecté mais asymptomatique à un individu sensible. Les staphylocoques sont des cocci Gram positif, d’environ 0,8 à 1 µm de diamètre, se divisant selon plusieurs plans dans l’espace de façon à former des amas irréguliers (voir section 12.19 et figure 12.51). Les staphylocoques ne sporulent pas mais sont résistants à la dessiccation. Ils sont largement présents dans les poussières dispersées dans l’air et les surfaces. En pathologie humaine, deux espèces sont importantes : Staphylococcus epidermidis, une espèce non pigmentée retrouvée sur la peau et les muqueuses, et Staphylococcus aureus, une espèce pigmentée en jaune, plus fréquemment impliquée dans les infections humaines. Ces deux espèces font partie des flores commensales normales du tractus respiratoire supérieur et de la peau.




Épidémiologie et pathologie Les staphylocoques sont responsables de troubles variés : acné, furoncles (voir figure 26.21), impétigo (voir figure 26.4), pneumonie, ostéomyélite, endocardite, méningite et arthrite. Entraînant pour la plupart la formation de pus, ces infections sont dites pyogènes (formant du pus). Staphylococcus aureus colonise habituellement le tractus respiratoire supérieur, particulièrement le nez et la gorge, et la peau. Les individus en bonne santé sont souvent porteurs sains. Les enfants sont colonisés, généralement pendant la première semaine de vie, par des staphylocoques d’origine maternelle ou provenant de personnes proches. Les infections staphylococciques surviennent lors d’une baisse des défenses immunitaires de l’hôte, par exemple, à la suite de variations hormonales, d’une maladie débilitante, de plaies ou de traitements immunosuppresseurs tels les stéroïdes. Les souches de S. aureus virulentes produisent de nombreuses enzymes extracellulaires ou des toxines (voir section 21.9). Au moins quatre types différents d’hémolysines sont connus, une même souche pouvant en produire plusieurs. La production d’hémolysines est responsable des zones d’hémolyse visibles autour de colonies de staphylocoques, après culture sur gélose au sang. S. aureus est également capable de produire une entérotoxine, responsable de maladies d’origine alimentaire (voir sections 21.11, 22.16 et 29.5). Tous les staphylocoques sont également munis d’une catalase, enzyme capable de décomposer H2O2 en H2O et O2. La catalase n’est pas un facteur de virulence. Le test de cette enzyme est cependant important pour différencier les staphylocoques des streptocoques (catalase négatif). S. aureus produit également une coagulase, enzyme activant la coagulation de la fibrine et conduisant à la formation d’un thrombus (voir section 21.9). La production de coagulase est généralement associée à la virulence. La coagulation induite par la coagulase entraîne l’accumulation de fibrine autour de la bactérie, la rendant inaccessible au système de défense de l’hôte et empêchant la phagocytose (voir figure 26.21). Certaines souches de S. aureus produisent de la leucocidine,

Poil

enzyme détruisant les leucocytes. La production de leucocidine dans des lésions cutanées (furoncles, boutons) entraîne la destruction de nombreuses cellules de l’hôte et est l’un des facteurs expliquant la formation de pus (voir figure 26.21). Certaines souches de S. aureus produisent d’autres facteurs de virulence extracellulaires, dont des enzymes protéolytiques, hyaluronidase, fibrinolysine, lipase, ribonucléase et désoxyribonucléase (voir tableau 21.4). Certaines souches de S. aureus sont responsables du choc toxique staphylococcique (CTS), infection staphylococcique grave, caractérisée par une fièvre élevée, une éruption, des vomissements et une diarrhée, pouvant exceptionnellement conduire à la mort. Le choc toxique a été initialement identifié chez des femmes en période menstruelle, associé à l’usage de tampons hautement absorbants. Le sang et le mucus des menstruations peuvent contenir des souches de S. aureus en provenance de la peau. La présence d’un tampon concentre les bactéries et constitue une niche à l’abri de laquelle les souches de S. aureus peuvent se multiplier. Depuis l’information apportée aux utilisatrices et la modification des matériaux contenus dans les tampons, le choc toxique dû à leur usage est relativement rare de nos jours. Cependant, le syndrome de choc toxique en tant que complication d’une infection staphylococcique post-chirurgicale est encore observé, aussi bien chez les hommes que chez les femmes. Les symptômes du CTS sont dus à la synthèse par les staphylocoques d’une exotoxine appelée toxine du choc toxique staphylococcique (TSST1), à activité superantigène (voir section 22.16). La TSST1 provoque une activation polyclonale des lymphocytes T, suivie d’une réponse inflammatoire caractéristique de l’activité superantigène. D’autres bactéries pathogènes, dont Streptococcus pyogenes (voir section 26.2) sont également capables de produire des toxines proches de la TSST1, à activité superantigène, entraînant des troubles identiques au CTS. L’entérotoxine A staphylococcique, autre superantigène, est à l’origine de toxi-infections alimentaires. Après ingestion

Libération de pus

Furoncle mûr

Furoncle ouvert

La leucocidine et différentes enzymes conduisent à la formation de pus Glande sudoripare apocrine (a)

La coagulase conduit à la formation de fibrine, délimitant le foyer infectieux (b)

FIGURE 26.21 Structure d’un furoncle. (a) Infection suppurée localisée de la peau, due au staphylocoque doré. Le foyer infectieux est délimité par un caillot de sang coagulé et de fibrine formé sous l’action de la coagulase. (b) La rupture du furoncle laisse échapper du pus et des bactéries.



876 Chapitre 26


d’aliments contaminés par la toxine, celle-ci stimule les lymphocytes T dispersés le long du tractus intestinal, provoquant leur activation massive, le relargage de cytokines inflammatoires et l’augmentation de la perméabilité intestinale. L’intoxication alimentaire staphylococcique évolue sous forme d’une diarrhée sérieuse, mais de courte durée, associée à des vomissements (voir section 29.5).

Traitement et prévention L’utilisation intensive des antibiotiques a entraîné la sélection de souches résistantes de S. aureus et S. epidermidis. Les infections nosocomiales (acquises à l’hôpital) dues à des staphylocoques multirésistants aux antibiotiques surviennent chez des patients dont les défenses immunitaires sont affaiblies, à la suite d’une autre maladie, d’une intervention chirurgicale ou de différents traitements médicamenteux (voir section 25.7). La transmission de ces souches résistantes peut se faire par l’intermédiaire du personnel hospitalier, lui-même porteur asymptomatique. Le choix d’une antibiothérapie adaptée pour traiter des infections staphylococciques est donc un problème majeur à l’hôpital. Bien que quelques infections staphylococciques communautaires puissent être traitées par de l’amoxicilline, la sensibilité aux antibiotiques de chaque isolat de S. aureus pathogène doit être testée par un antibiogramme (voir section 24.3). La prévention des infections staphylococciques est difficile, car la plupart des individus sont porteurs asymptomatiques et que des infections cutanées comme l’acné ou l’impétigo peuvent être transmises par simple contact avec des mains contaminées. Dans certains services hospitaliers, comme la chirurgie ou la néonatologie, le personnel porteur de souches pathogènes doit être mis en quarantaine ou traité (par antibiothérapie systémique ou locale) afin d’en éradiquer le portage.

section 29.9). Il est très mobile, grâce à un à six flagelles polaires engainés. H. pylori colonise la muqueuse gastrique et le tractus intestinal supérieur, en particulier le duodénum (voir section 21.4).

L’épidémiologie L’infection à H. pylori est l’une des infections chroniques les plus répandues dans le monde. L’infection est plus fréquente dans les pays en développement (80 à 90 %) que dans les pays industrialisés (25 à 30 %). Plus de 80 % des patients souffrant d’un ulcère gastrique sont infectés par H. pylori. La bactérie se transmet directement d’humain à humain par voie orale, principalement pendant l’enfance. La contamination par ingestion d’aliments ou d’eau contaminés est possible. Bien que H. pylori soit strictement adapté à l’homme, la bactérie a été parfois isolée de chats domestiques, indiquant que la transmission par les animaux de compagnie est possible. La prévalence de cette infection est plus élevée dans certaines familles ; elle augmente également avec l’âge de la population considérée, suggérant une transmission de personne à personne ou un effet génération (le risque d’infection des sujets âgés était plus grand à l’époque de leur enfance) [voir sections 25.3, 25.4 et 25.5]. Cette infection peut également se manifester sous forme de petites épidémies, vraisemblablement liées à une source commune, aliments ou eau souillés.

Pathologie, diagnostic et traitement Il est maintenant démontré que H. pylori est à l’origine de lésions inflammatoires de l’estomac pouvant évoluer vers l’ulcère. Le pouvoir faiblement invasif de la bactérie lui


•

Quel est l’habitat normal de S. aureus ? Comment ce pathogène est-il transmis de personne à personne ?

•

Décrivez les mécanismes de la toxi-infection alimentaire et du choc toxique staphylococcique.

26.10 Helicobacter pylori et ulcères m n gastriques Helicobacter pylori a été identifié pour la première fois en 1982, dans des biopsies intestinales humaines. Ce micro-organisme est un pathogène associé à des gastrites, des ulcères et des cancers gastriques. H. pylori est un bacille Gram négatif, spiralé, proche des Campylobacter, mesurant de 2,5 à 3,5 µm de long et de 0,5 à 1 µm de diamètre (voir figure 26.22 et

CDC/P. Fields, C. Fitzgerald, J. Carr/PHIL

Bien que les staphylocoques soient habituellement des commensaux du tractus respiratoire supérieur et de la peau, ils peuvent être responsables d’infections pyogènes sérieuses, dont certaines sont liées à l’action de superantigènes.

FIGURE 26.22 Observation d’Helicobacter en microscopie électronique à balayage. Les bactéries du genre Helicobacter mesurent de 1,5 à 10 µm de longueur et de 0,3 à 1 µm de diamètre. Les Helicobacter spp. sont retrouvées dans le tractus intestinal et hépatique des mammifères et des oiseaux. Notez la présence d’un flagelle entouré d’une gaine. Longueur de la bactérie en bas à gauche de la photographie : 3,2 µm.



26.11 Virus des hépatites 877

permet de coloniser la muqueuse gastrique, où elle est protégée de l’acidité environnante par la couche de mucus. La production de facteurs de pathogénicité combinés à la réponse de l’hôte provoque une réaction inflammatoire locale, la destruction des tissus et l’ulcère. La cytotoxine codée par le gène vacA (voir tableau 21.4), l’uréase et l’îlot de pathogénicité cag contribuent à la destruction localisée des tissus. Des anticorps dirigés contre H. pylori sont détectés chez les sujets infectés, mais ils ne sont pas protecteurs (IgG) et n’empêchent pas la colonisation (IgA). L’infection à H. pylori, acquise pendant l’enfance, devient chronique et peut perdurer pendant toute la vie du sujet infecté si elle n’est pas traitée par des antibiotiques. Chez la plupart des sujets infectés, la gastrite chronique reste asymptomatique. Un petit nombre évolue cependant vers une maladie grave : ulcère duodénal ou gastrique, cancer gastrique. Les patients infectés par H. pylori présentent des signes de gastrite chronique (éructations, douleurs épigastriques). L’infection est prouvée par une culture positive sur biopsies d’ulcère gastrique. Cette culture est cependant de réalisation difficile, donc non pratiquée en routine. L’infection est hautement probable en présence d’une sérologie positive. La sérologie reste positive, dans la plupart des cas, pendant plusieurs années après la disparition de H. pylori (voir section 24.7). Elle n’est donc pas utilisable pour dépister une infection aiguë active. Un test in vivo simple, le test respiratoire à l’urée, est employé en diagnostic initial, en l’absence de symptomatologie digestive. Après avoir expiré dans un tube, le patient boit un verre de jus d’orange mélangé à de l’urée marquée à l’aide d’un isotope stable et non radioactif du carbone, 13C ou 14C. L’uréase très forte de H. pylori métabolise l’urée en CO2. Après trente minutes, le patient expire dans un autre tube, et la différence de CO2 obtenue dans l’air expiré, avant et après l’administration de l’urée, est mesurée. Le diagnostic par détection d’antigènes de H. pylori dans les selles est également possible. L’éradication de H. pylori par un traitement antibiotique permet la régression des lésions ulcéreuses. Les ulcères gastriques ont été traités pendant longtemps avec des préparations anti-acides, avec un risque important de récidive après un an. En traitant la maladie ulcéreuse comme une maladie infectieuse, des guérisons définitives sont possibles. Le traitement de l’infection à Helicobacter pylori actuellement recommandé en France est une trithérapie de sept jours associant un inhibiteur puissant de l’acidité gastrique (inhibiteurs

TABLEAU 26.2 Maladie Hépatite A

de la pompe à protons) et deux antibiotiques, le plus souvent l’amoxicilline et la clarithromycine.

Contrôlez vos acquis L’infection à Helicobacter pylori est la cause la plus fréquente d’ulcères gastriques. Le traitement de la maladie ulcéreuse repose sur l’administration d’antibiotiques, permettant la guérison définitive. •

Décrivez l’infection à H. pylori et le développement d’un ulcère.

•

Donnez les arguments qui permettent d’affirmer que l’infection à H. pylori est transmise de personne à personne ou provient d’une source alimentaire commune.

26.11 Virus des hépatites m n Une hépatite est une inflammation du foie le plus fréquemment causée par un agent infectieux. L’hépatite peut prendre une forme aiguë suivie d’une destruction de l’anatomie fonctionnelle du foie et de ses cellules, situation connue sous le nom de cirrhose. Une hépatite infectieuse peut être aiguë ou chronique, certaines formes évoluant en cancer du foie (carcinome hépatocellulaire ou CHC). Bien que de nombreux virus et seulement quelques bactéries soient responsables d’hépatite, seul un groupe restreint de virus est communément associé à la maladie hépatique. Les virus des hépatites sont différents les uns des autres, ils ne sont pas liés génétiquement, mais tous infectent les cellules du foie pour ensuite générer une hépatite. Les cinq virus des hépatites connus sont répertoriés dans le tableau 26.2.

L’épidémiologie Le virus de l’hépatite A (VHA) se transmet d’un individu à un autre ou par l’ingestion de nourriture ou d’eau contaminées par des matières fécales. Le virus est responsable d’infections modérées, voire subcliniques mais rarement d’hépatites graves, les formes les plus sérieuses étant observées surtout chez l’adulte non immunisé. Les aliments véhiculant le plus

VIRUS DES HÉPATITES Virus et génome

Vaccin

a

Hepatovirus (VHA) ARN sb

b

Maladie

Transmission

Oui

Aiguë

Entérique

Hépatite B

Hepadnavirus (VHB) ADN db

Oui

Aiguë, chronique, oncogène

Parentérale, sexuelle

Hépatite C

Hepacivirus (VHC) ARN sba

Non

Chronique, oncogène

Parentérale

a

Hépatite D

Deltavirus (VHD) ARN sb

Non

Fulminante, associée au VHB

Parentérale

Hépatite E

Famille des Caliciviridae (VHE) ARN sba

Non

Fulminante chez les femmes enceintes

Entérique

Hépatite G

a

Non

Asymptomatique

Parentérale

Famille des Flaviviridae (VHG) ARN sb

a

sb, simple brin. b db, double brin.




souvent le VHA sont les coquillages, généralement les huîtres et les palourdes, collectés dans des eaux polluées par des matières fécales humaines. Ces dernières années cependant, le VHA a aussi été transmis à partir de produits frais. En 2003, l’ingestion d’oignons verts crus ou insuffisamment cuits a été à l’origine d’une épidémie dans l’est des États-Unis. La tendance générale pour le nombre de cas d’infections par le VHA est à la baisse (voir figure 26.23), en partie grâce à la disponibilité d’un vaccin efficace. La prévalence du VHA dans les infections virales hépatiques est supérieure à celle des autres virus, et plus de 30 % de la population des États-Unis ont des anticorps contre le VHA, indiquant qu’ils ont été infectés à un moment donné dans leur vie. La séroprévalence en France augmente avec l’âge (70 % chez les plus de 60 ans et moins de 10 % chez les moins de 20 ans). Le virus de l’hépatite B (VHB) est un hépadnavirus (voir section 16.15), virus à ADN partiellement double brin. La particule virale mature contenant le génome viral est appelée particule de Dane (voir figure 26.24). Le VHB est responsable d’une infection aiguë souvent grave pouvant conduire à une insuffisance hépatique avec décompensation et au décès. L’infection chronique par le VHB peut évoluer en cirrhose et en CHC. Le VHB est habituellement transmis par voie parentérale lors de transfusion sanguine ou de partage d’aiguilles hypodermiques contaminées par du sang infecté. Le VHB peut aussi être transmis par contact avec toutes les sécrétions corporelles, lors de procédés d’hémodialyse ainsi que lors de rapports sexuels. Le nombre de nouvelles infections par le VHB diminue, grâce à l’utilisation d’un vaccin efficace. La prévalence était néanmoins de 0,6 % en France en 2004, avec une recrudescence depuis 2000 (0,2 %), car seuls 30 % d’individus sont vaccinés. Cependant, approximativement 5 000 personnes meurent chaque année de complications de l’hépatite B chronique, telles que le cancer. Le virus de l’hépatite D ou delta (VHD) est un virus défectif ne possédant pas de gène codant sa propre enveloppe (voir section 16.15). Le VHD est aussi transmis par voie parentérale,

Cas pour 100 000 individus

35

Hépatites A aiguës Hépatites B aiguës Hépatites C, D, E et G

30 25 20 15 10 5 0 1972

1977

1982

1987

1992

1997

2002

Année FIGURE 26.23 Prévalence des hépatites virales aux États-Unis. En 2002 ont été répertoriés : 8795 cas d’hépatite A, 7996 cas d’hépatite B et 1835 cas d’autres hépatites virales, principalement liées au VHC. Données des centres de contrôle et de prévention des maladies (CDC, Centers for Disease Control and Prevention), Atlanta, Géorgie, États-Unis.

CDC/Dr. Erskine Palmer/PHIL

878 Chapitre 26

FIGURE 26.24 Virus de l’hépatite B (VHB). La flèche montre une particule complète de VHB, ou particule de Dane (42 nm de diamètre) [section 16.15 et figure 16.27].

mais, étant un virus défectif, il ne peut se répliquer et produire un virus complet tant que la cellule hôte n’est pas co-infectée par le VHB ; le VHD se réplique de façon indépendante mais utilise l’enveloppe du VHB pour s’exprimer. Ainsi, les infections par le VHD sont toujours observées dans un contexte de co-infection par le VHB. Le vaccin contre le VHB protège aussi contre le VHD. Le virus de l’hépatite C (VHC) est aussi transmis par voie parentérale. Le VHC est responsable d’infections modérées voire asymptomatiques au début, mais jusqu’à 85 % des individus développent une hépatite chronique, dont près de 20 % des cas évoluant en cirrhose. L’hépatite C chronique progresse en CHC chez 3 à 5 % des individus infectés par an. La période de latence avant l’apparition du cancer peut être de plusieurs dizaines d’années à partir de la primo-infection. Le nombre de nouveaux cas d’hépatite C rapportés aux États-Unis (voir figure 26.23) représente seulement une fraction d’approximativement 25 000 nouvelles infections annuelles. La prévalence en France est autour de 1 % avec 600 000 individus infectés. Un grand nombre de décès liés au VHC surviennent chaque année à la suite d’hépatites C chroniques ayant progressé en CHC. La maladie hépatique liée au VHC est l’hépatite la plus fréquemment observée aux États-Unis, comme en France, et représente jusqu’à 10 000 cas sur les 25 000 décès annuels liés au cancer du foie, à d’autres maladies chroniques hépatiques et à la cirrhose. Le virus de l’hépatite E (VHE) est transmis par voie entérique. Le VHE est responsable d’une hépatite aiguë, de guérison spontanée, dont la gravité varie d’un cas à l’autre mais est souvent à l’origine d’une forme rapide fulminante chez les femmes enceintes. Le VHE est endémique au Mexique, ainsi que dans les régions tropicales et subtropicales d’Afrique et d’Asie. Le virus de l’hépatite G (VHG) se retrouve fréquemment dans le sang de patients présentant d’autres formes d’hépatite aiguë, mais le VHG seul semble n’être à l’origine que de symptômes très modérés ou d’une infection complètement asymptomatique. Le VHG a été détecté dans 8,1 % d’échantillons de donneurs de sang volontaires ; comme le VHG n’est



26.11 Virus des hépatites 879

associé à aucune pathologie clinique avérée, son implication dans les hépatites virales est encore sujette à caution.

Pathologie et diagnostic L’hépatite est une maladie aiguë du foie. Les symptômes incluent une fièvre, une jaunisse (ou ictère) avec production et libération d’un excès de bilirubine par le foie, à la suite de la destruction des cellules hépatiques entraînant un jaunissement de la peau et du blanc des yeux, une hépatomégalie (gros foie), et une cirrhose (modification de l’architecture normale du tissu hépatique, fibrose). Une hépatite modérée est caractérisée par une augmentation mineure des enzymes hépatiques telles que l’alanine aminotransférase (ALAT). L’hépatite fulminante se distingue par l’apparition rapide de symptômes sérieux (jaunisse et cirrhose) et met souvent en jeu le pronostic vital. Les différents virus des hépatites causent des symptômes aigus similaires et ne peuvent donc être aisément distingués uniquement sur des arguments cliniques. Les infections hépatiques chroniques, le plus souvent liées au VHB ou au VHC, sont fréquemment pauci- ou a-symptomatiques mais peuvent être à l’origine de maladies hépatiques graves, même en dehors du CHC. Le diagnostic d’une hépatite est fondé principalement sur des arguments cliniques et des analyses biologiques déterminant une perturbation des fonctions hépatiques. La cirrhose est diagnostiquée par l’analyse anatomopathologique à partir de biopsies du tissu hépatique. Un test virus-spécifique est aussi utilisé pour la confirmation du diagnostic par l’identification de l’agent infectieux et la détermination du traitement à mettre en œuvre. La culture directe des virus des hépatites est très difficile. Les méthodes les plus largement utilisées pour l’identification du virus responsable sont les tests immunoenzymatiques (ELISA) [voir section 24.10]. Des tests sont disponibles pour la détection d’anticorps IgM ou IgG anti-VHB. L’identification de la classe de l’anticorps peut déterminer si l’hépatite B est ou pas une infection récente (IgM), ou si l’infection virale B est chronique ou latente (IgG) [voir section 22.9]. D’autres immunoanalyses comme les immunoblots (voir section 24.11), l’immunomicroscopie électronique (IEM) [voir section 24.13] et l’immunofluorescence (voir section 24.9) peuvent être utilisées pour la détection des virus des hépatites. La PCR (voir section 24.9) est également très employée pour la détection du génome viral dans le sang ou sur des biopsies de tissu hépatique.

Prophylaxie et traitement Les infections par le VHA et le VHB peuvent être prévenues par des vaccins efficaces. La vaccination contre le VHB est recommandée et est, dans la plupart des cas, obligatoire chez les enfants en âge scolaire aux États-Unis (voir section 22.13). En France, elle est recommandée chez le nourrisson, le personnel de santé et les sujets au contact de malades. Aucun vaccin n’est disponible pour la prévention des infections par les autres virus des hépatites. Des « procédures universelles » pour la prévention de la dissémination des maladies liées à des pathogènes à diffusion hématogène sont exigées par la loi, principalement pour la prophylaxie des infections par le VHB et le VIH (voir section 24.4). Ces normes recommandent les précautions

d’aseptie que doit prendre le personnel en contact avec les patients et/ou manipulant des déchets infectieux et des liquides de l’organisme, et celles relatives à la prévention des infections par l’ensemble des virus des hépatites transmis par voie parentérale (VHB, VHC, VHD et VHG). L’hépatite A peut se disséminer par l’intermédiaire des aliments ou de l’eau contaminés, la survenue d’épidémies pouvant être prévenue par le contrôle de l’absence de pathogènes dans ces sources potentielles de contamination (voir chapitres 28 et 29). Il est parfois possible de traiter une hépatite en post-exposition. Un mélange de gamma globulines humaines administré rapidement après une exposition au VHA peut être utilisé en prévention de l’hépatite A. Des immunoglobulines spécifiques du VHB couplées à l’administration du vaccin VHB sont efficaces en post-exposition pour la prophylaxie de l’hépatite B, notamment chez le nouveau-né de mère porteuse du VHB (voir section 22.13). La plupart des traitements des hépatites sont symptomatiques, laissant le temps au tissu hépatique de se régénérer. Des molécules antivirales sont efficaces dans certaines situations. Le traitement de l’hépatite C repose sur la combinaison de l’interféron α avec la ribavirine. Des inhibiteurs de la protéase et de la polymérase du VHC sont à l’étude. Les molécules antivirales disponibles pour le traitement de l’hépatite B sont des inhibiteurs de la polymérase du VHB comme la lamivudine, l’adéfovir et l’entécavir (voir section 20.10).

Contrôlez vos acquis Les virus des hépatites peuvent être à l’origine d’hépatites aiguës, de cirrhose. Le VHB et le VHC peuvent être responsables d’hépatites chroniques susceptibles d’évoluer en cancer du foie. Des vaccins sont disponibles pour la prévention des hépatites A et B. La prévalence générale des hépatites a diminué significativement ces vingt dernières années aux États-Unis ; les infections hépatiques restent cependant un problème majeur de santé publique en raison du fort pouvoir infectieux des virus. •

Décrivez le mode de transmission du VHA, du VHB et du VHC.

•

Décrivez les traitements prophylactiques et curatifs potentiels pour les hépatites A et B.

III

MALADIES SEXUELLEMENT TRANSMISSIBLES

Une infection sexuellement transmissible (IST) est une maladie infectieuse transmissible par voie sexuelle. Certaines d’entre elles sont également transmises par contacts sanguins. Les infections sexuellement transmissibles, appelées auparavant maladies sexuellement transmissibles (MST) ou maladies vénériennes, sont des infections provoquées par des pathogènes variés (bactéries, virus, protozoaires et levures) [voir tableau 26.3]. Contrairement aux pathogènes respiratoires, qui sont largement diffusés par les sujets infectés sous forme d’aérosols, les pathogènes transmis par voie sexuelle



880 Chapitre 26

TABLEAU 26.3


INFECTIONS SEXUELLEMENT TRANSMISSIBLES ET TRAITEMENTS RECOMMANDÉS

Infection

Micro-organisme(s)a

Traitement recommandéb

Gonococcie

Neisseria gonorrhoeae (B)

Céfixime ou ceftriaxone, et azithromycine ou doxycycline

Syphilis

Treponema pallidum (B)

Benzathine pénicilline G

Chlamydiose

Chlamydia trachomatis (B)

Doxycycline ou azithromycine

Urétrite non gonococcique

C. trachomatis (B) ou Ureaplasma urealyticum (B) ou Mycoplasma genitalium (B) ou Trichomonas vaginalis (P)

Azithromycine

Lymphogranulomatose vénérienne

C. trachomatis (B)

Doxycycline

Chancre mou

Haemophilus ducreyi (B)

Azithromycine

Herpès génital

Herpes simplex type 2 (V)

Éradication virale impossible ; contrôle des symptômes par l’aciclovir (voie orale) [voir figure 26.31]

Verrues génitales

Papillomavirus (certaines souches)

Éradication virale impossible ; traitement par application de topiques, par cryothérapie ou par exérèse chirurgicale

Trichomonose

Trichomonas vaginalis (P)

Métronidazole

Syndrome d’immunodéficience acquise (SIDA)


Éradication virale non prouvée, inhibiteurs nucléosidiques et non nucléosidiques de la transcriptase inverse, inhibiteurs de la protéase, inhibiteurs de fusion (voir tableau 26.4)

Maladie inflammatoire pelvienne

N. gonorrhoeae (B) ou C. trachomatis (B)

Céfotétan

Candidose vulvovaginale

Candida albicans (F)

Antifongique

a

B, bactérie; V, virus; P, protozoaire; F, champignon. Pour de nombreux traitements, des alternatives sont possibles. Recommandations du Department of Health and Human Services, Public Health Service, États-Unis. b

apparaissent dans les fluides génitaux échangés au cours de l’activité sexuelle. Ces pathogènes, très sensibles à la dessiccation et aux facteurs environnementaux (chaleur, lumière), colonisent préférentiellement le tractus génito-urinaire humain, milieu protégé et humide. Le dépistage des IST est difficile pour de multiples raisons sociales et biologiques. Plus d’un tiers des IST concerne des adolescents, aux partenaires parfois multiples, rendant difficile l’identification du partenaire à l’origine de la contamination. La transmission des IST est, en outre, favorisée par la symptomatologie discrète de la maladie. Les sujets atteints ne ressentent pas l’effet de la maladie et ne consultent donc pas de médecin. Enfin, la stigmatisation sociale encore attachée aux IST favorise parfois le déni de la maladie. Un traitement efficace et précoce est pourtant souhaitable. La plupart des IST sont curables ou contrôlables par une intervention médicale appropriée. Un retard ou une absence de traitement peut entraîner des complications à long terme telles que stérilité, malformations fœtales ou mort in utero, cancer, atteintes cardiaques et nerveuses. La transmission des IST étant principalement limitée aux contacts sexuels, elle peut être contrôlée par l’abstinence sexuelle ou par l’usage de préservatifs, empêchant l’échange des fluides génitaux. La prévalence élevée des IST en fait cependant un problème de santé publique.

26.12 Gonococcie et syphilis m n La gonococcie et la syphilis sont des IST d’origine bactérienne, parfaitement curables grâce à un traitement approprié. L’intensité des symptômes ressentis, très différente pour ces deux maladies, conditionne leur épidémiologie (voir figure 26.25). La gonococcie est de prévalence élevée ; elle est souvent asymptomatique, particulièrement chez les femmes. La maladie demeure souvent méconnue, donc non traitée. La prévalence de la syphilis est faible, en partie parce que la phase primaire de la maladie est caractérisée par des symptômes évidents, poussant les individus infectés à se faire traiter.

La gonococcie Neisseria gonorrhoeae, plus communément appelé gonocoque, est l’agent de la gonococcie. N. gonorrhoeae est un diplocoque Gram négatif, non sporulé, aérobie strict, oxydase positive (voir section 12.10), biochimiquement et phylogénétiquement proche de Neisseria meningitidis (voir section 26.6). N. gonorrhoeae est très sensible à la dessiccation et ne peut survivre longtemps en dehors des muqueuses urogénitales (voir figure 26.26). Les gonocoques sont rapidement tués par la dessiccation, la lumière et les rayons ultraviolets. À cause de son extrême fragilité aux conditions environnementales, la



26.12 Gonococcie et syphilis 881

Cas rapportés pour 100 000 habitants

500 400

Seconde Guerre mondiale

Pilule contraceptive

Syphilis

300

Gonococcie 200 100

Pénicilline 0

1920 1925 1930 1935 1940 1945 1950 1955 1960 1965 1970 1975 1980 1985 1990 1995 2000 2005

Année FIGURE 26.25 Cas de gonococcie et de syphilis rapportés aux États-Unis. Évolution de l’incidence de ces maladies : tendance à la baisse après l’introduction des antibiotiques, tendance à la hausse de la gonococcie après l’introduction de la pilule contraceptive. En 2002, on a relevé aux États-Unis 351 852 cas de gonococcie contre 6 892 cas de syphilis.

Morris D. Cooper

transmission interhumaine de N. gonorrhoeae ne peut se faire que par contacts intimes. La bactérie pénètre dans l’organisme par les muqueuses urogénitales. Les symptômes de la gonococcie sont totalement différents chez l’homme et chez la femme. Chez la femme, la gonococcie se présente sous forme d’une discrète vaginite, de symptomatologie voisine d’infections vaginales dues à d’autres micro-organismes, rendant le diagnostic difficile. Une gonococcie non traitée peut aboutir à des complications de type maladie inflammatoire pelvienne, entraînant à long terme une stérilité. Chez l’homme, N. gonorrhoeae provoque une infection douloureuse de l’urètre (voir figure 21.11). Chez l’homme comme chez la femme, une gonococcie non traitée peut entraîner des lésions des valves cardiaques et des articulations dues à des dépôts de complexes immuns (voir section 22.15).

FIGURE 26.26 Neisseria gonorrhoeae, agent causal de la gonococcie. Observation en microscopie électronique à balayage des microvillosités de la muqueuse des trompes de Fallope humaines, montrant l’attachement de N. gonorrhoeae (morphologie en diplocoques d’environ 0,8 µm de diamètre) à la surface des cellules épithéliales.

N. gonorrhoeae peut aussi être responsable d’infections oculaires chez les nouveau-nés de mère infectée, contaminés pendant l’accouchement. Afin de prévenir une infection gonococcique néonatale, un traitement prophylactique par un collyre à base d’érythromycine est préconisé. Le diagnostic clinique et microbiologique de la gonococcie est détaillé dans la section 24.1. Le traitement de la gonococcie par la pénicilline a été un succès par le passé. Cependant, des souches de N. gonorrhoeae, apparues au début des années 1980, sont maintenant répandues mondialement. Ces souches productrices de pénicillinase répondent heureusement à un traitement par une β-lactamine en dose unique (céfixime ou ceftriaxone). Une fluoroquinolone comme la ciprofloxacine peut être également utilisée, sous réserve d’une documentation bactériologique. Les autres quinolones (ofloxacine, lévofloxacine) ne peuvent pas être recommandées du fait d’une résistance croisée entre toutes les quinolones. En 2001, 14,3 % des souches de N. gonorrhoeae isolées à Hawaii étaient résistantes aux quinolones, ceci impliquant la nécessité de tester la sensibilité des souches aux antibiotiques. Un antibiotique actif sur les Chlamydia, azithromycine ou doxycycline, est souvent administré simultanément, car près de 50 % des patients atteints de gonococcie sont également infectés par Chlamydia trachomatis, de diagnostic difficile (voir tableau 26.3). L’incidence de l’infection gonococcique demeure relativement élevée pour de multiples raisons : 1) il n’y a pas d’immunité acquise et les réinfections répétées sont possibles. Les anticorps produits ne sont pas protecteurs ou sont spécifiques d’une souche, sans immunité croisée. La persistance de l’infection par Neisseria gonorrhoeae est favorisée par un phénomène de variation antigénique, concernant plusieurs antigènes de la bactérie, notamment la piline et la protéine Opa, dite protéine d’opacité. Ces variations entraînent l’apparition de nouveaux sérotypes, empêchant une immunité effective. 2) L’utilisation de contraceptifs oraux modifie l’état physiologique de la muqueuse vaginale, avec une moindre production de glycogène et une augmentation du pH vaginal. Les bactéries lactiques, qui composent la flore normale résidente, sont défavorisées par cet environnement, permettant alors la colonisation de la muqueuse vaginale par N. gonorrhoeae, transmis par un partenaire infecté (voir section 21.5). 3) Les symptômes chez la femme sont discrets. La maladie peut ne pas être diagnostiquée.




Theodor Rosebury

882 Chapitre 26


(a)

(b) FIGURE 26.27 Le tréponème syphilitique, Treponema pallidum. (a) Examen d’un exsudat au microscope à fond noir. Treponema pallidum mesure 0,15 µm de large et de 10 à 15 µm de long. (b) Observation de T. pallidum en microscopie électronique à transmission, après ombrage métallique. Notez la présence d’un endoflagelle, typique des spirochètes.

Une femme infectée peut, par exemple, contaminer plusieurs partenaires. Le contrôle de la maladie passe par une identification et un traitement rapides des différents partenaires. Une prophylaxie doit être préconisée.

La syphilis

(a)

S. Olansky et L. W. Shaffer


La syphilis est due à un spirochète, Treponema pallidum. T. pallidum mesure de 10 à 15 µm de long et environ 0,15 µm de diamètre (voir figure 26.27). Le spirochète étant très sensible au stress environnemental, la syphilis est transmise d’humain à humain par contact sexuel.

T. pallidum n’est pas capable de traverser la peau saine, mais pénètre vraisemblablement au niveau de petites lésions épidermiques. Chez l’homme, la lésion initiale est souvent localisée sur le pénis ; chez la femme, elle est retrouvée le plus souvent sur la muqueuse vaginale, sur le col utérin ou dans la région périnéale. Dans 10 % des cas, l’infection est extragénitale, localisée généralement dans la cavité buccale. Pendant la grossesse, un fœtus contaminé par sa mère infectée est atteint de syphilis congénitale. La syphilis est une maladie très complexe, évoluant habituellement en trois phases. Elle débute toujours par une infection locale, appelée syphilis primaire. La bactérie se multiplie au niveau du site d’entrée, provoquant, après une incubation variant entre deux semaines et deux mois, l’apparition d’une lésion caractéristique appelée chancre (voir figure 26.28). Des spirochètes très mobiles peuvent être observés, par examen d’un exsudat de chancre syphilitique, au microscope à fond noir (figure 26.27a). Dans la plupart des cas, le chancre guérit spontanément. Bien que les micro-organismes disparaissent du site d’entrée, quelques bactéries sont disséminées vers les muqueuses, les yeux, les articulations, les os ou le système nerveux central, où elles se multiplient activement. Une réaction d’hypersensibilité au tréponème se développe, révélée par l’apparition d’une éruption cutanée généralisée, caractéristique de la syphilis secondaire. Les signes visibles peuvent disparaître même sans traitement, mais la syphilis reste présente dans l’organisme et transmissible. L’évolution de la maladie en l’absence de traitement est très variable. Environ un quart des individus infectés guérissent spontanément et leur titre d’anticorps décroît. Un quart ne manifestent aucun symptôme de la maladie, malgré un titre d’anticorps élevé, synonyme d’une infection persistante et active. La moitié des patients environ développent une syphilis tertiaire, se manifestant soit par une atteinte relativement discrète de la peau et des os, soit par des infections sérieuses ou même fatales du système cardiovasculaire ou du système nerveux central. L’atteinte du système nerveux central peut engendrer une paralysie généralisée ou de graves désordres neurologiques. Le nombre de tréponèmes retrouvés chez les patients atteints de syphilis tertiaire étant relativement faible, les symptômes observés résultent probablement de l’inflammation due à des réactions d’hypersensibilité retardée vis-à-vis des spirochètes (voir sections 22.3 et 22.15).

(b)

FIGURE 26.28 Lésions syphilitiques primaires. (a) Chancre labial. (b) Chancres sur le pénis. Le chancre est une lésion caractéristique de la syphilis primaire, siégeant au point d’inoculation de Treponema pallidum. Au vu de telles lésions, les patients recherchent en général une intervention médicale. La présence évidente du chancre accélère le diagnostic et le traitement. La syphilis est curable par une injection unique de pénicilline G (voir tableau 26.3). La biologie du genre Treponema est discutée à la section 12.33.



26.13 Chlamydiose, herpès et trichomonose 883

Le diagnostic biologique de la syphilis est développé dans la section 24.1. Le symptôme le plus évident de la maladie est le chancre, motif de consultation médicale et dont l’examen de la sérosité est utilisable pour le diagnostic. La pénicilline G est l’antibiotique de référence. La phase primaire de la maladie peut être traitée par une injection unique de benzathine-pénicilline G. En cas de syphilis secondaire ou tertiaire, la durée du traitement par la pénicilline doit être allongée. La séroprévalence de la syphilis en France, stable et relativement faible depuis les années 1990, est en augmentation depuis 2000. Elle augmente également, depuis quelques années, dans les grandes villes des États-Unis.

Contrôlez vos acquis La gonococcie et la syphilis, dues respectivement à Neisseria gonorrhoeae et Treponema pallidum, sont des IST aux complications parfois sérieuses, si non traitées. Après une baisse et une stabilisation de l’incidence de ces maladies, une recrudescence semble observée depuis quelques années. 350 000 cas de gonococcie et 6 000 cas de syphilis sont déclarés annuellement aux États-Unis. •

Donnez au moins une raison pour laquelle l’incidence de la gonococcie est supérieure à celle de la syphilis.

•

Décrivez la progression d’une gonococcie et d’une syphilis non traitées. Ces maladies sont-elles curables ?

26.13 Chlamydiose, herpès m n et trichomonose La chlamydiose, l’herpès et la trichomonose sont des IST très fréquentes, transmises respectivement par une bactérie, un virus et un protozoaire, et qui sont beaucoup plus difficiles à diagnostiquer et à traiter que la syphilis et la gonococcie.

La chlamydiose Chlamydia trachomatis, bactérie intracellulaire obligatoire, est responsable de très nombreuses IST (voir figure 26.29 et section 12.27). Avec aux États-Unis 600 000 cas annuels signalés (voir tableau 25.5) d’infections à C. trachomatis et probablement plus de trois millions de nouveaux cas, les chlamydioses sont les plus fréquentes des infections sexuellement transmises, d’incidence supérieure à la gonococcie. Certaines souches de C. trachomatis, différentes de celles impliquées dans les IST, sont responsables d’infections oculaires sérieuses, appelées trachomes (voir section 12.27). Chez le nouveau-né, C. trachomatis est responsable de conjonctivites et de pneumonies, qui sont transmises de la mère à l’enfant à la naissance. L’urétrite non gonococcique (UNG) due à C. trachomatis est l’une des IST les plus fréquentes chez l’homme et chez la femme. Cette infection est souvent asymptomatique, mais elle peut devenir chronique, entraînant des complications graves,

dont une prostatite ou une épididymite chez l’homme, une cervicite, une salpingite et une maladie inflammatoire pelvienne chez la femme. Après attachement et pénétration dans les microvillosités des trompes de Fallope, les bactéries se multiplient dans les cellules et les lysent (voir figure 26.29). L’UNG non traitée peut conduire à la stérilité. Le diagnostic microbiologique d’une UNG à C. trachomatis par isolement et identification traditionnelle est assez difficile. De nombreux tests permettent cependant l’identification directe de la bactérie à partir d’un écouvillonnage vaginal, d’endocol ou de différentes sécrétions, par méthodes immunologiques (immunofluorescence directe, ELISA détectant les antigènes spécifiques de C. trachomatis) ou par biologie moléculaire. Une chlamydiose non compliquée peut être efficacement traitée par des antibiotiques, l’azithromycine ou la doxycycline (voir tableau 26.3). Les co-infections par Neisseria gonorrhoeae et Chlamydia trachomatis sont fréquentes. Le traitement de la gonococcie par du céfixime ou de la ceftriaxone n’élimine pas les Chlamydiae, se manifestant par une récurrence de l’urétrite. Le traitement antigonococcique est donc systématiquement associé au traitement anti-Chlamydia pour traiter une éventuelle chlamydiose non diagnostiquée. La lymphogranulomatose vénérienne est une IST due à des souches particulières de C. trachomatis (LGV1, 2 ou 3). La maladie est très répandue dans les régions tropicales, plus rare dans les pays industrialisés. Elle atteint essentiellement les hommes, débutant par un chancre génital, souvent inaperçu, et évoluant sous forme d’adénite inguinale. À partir des ganglions infectés, les Chlamydiae peuvent migrer jusqu’au rectum, provoquant une inflammation douloureuse des tissus ou une rectite aiguë. Non traitée, la lymphogranulomatose vénérienne entraîne des complications importantes.

L’herpès Les virus de l’herpès appartiennent à un groupe de virus complexes à ADN double brin (voir section 16.12) dont un grand nombre sont des pathogènes humains. Les virus du sousgroupe des virus herpes simplex sont responsables de lésions cutanées douloureuses et d’infections génitales. Le virus herpes simplex type 1 (HSV-1) infecte les cellules épithéliales autour de la bouche et des lèvres, engendrant des lésions cutanées (vésicules) douloureuses (boutons de fièvre) [voir figure 26.30a]. HSV-1 peut aussi infecter occasionnellement d’autres sites cutanéomuqueux, y compris les régions anogénitales. HSV-1 est transmis par contact direct (principalement avec des lésions infectieuses) ou par la salive. La période d’incubation est courte (trois à cinq jours), les lésions guérissent sans traitement en deux ou trois semaines. Les récurrences des infections par HSV-1 sont courantes. Les infections herpétiques latentes sont très fréquentes et le virus persiste en petit nombre dans le tissu nerveux. Les infections récurrentes aiguës sont dues à des réactivations virales périodiques sous la dépendance de facteurs inconnus ou liés à des co-infections, au stress, etc. L’herpès buccal lié à HSV-1 est relativement fréquent et n’a apparemment pas d’effet nocif sur l’hôte, en dehors des désagréments imputables aux vésicules. Les infections par le virus herpes simplex type 2 (HSV-2) sont principalement localisées dans la région anogénitale, où le virus



Morris D. Cooper


Morris D. Cooper

884 Chapitre 26

(b)

(a)

FIGURE 26.29 Fixation de Chlamydia trachomatis (indiquée par les flèches) sur les tissus des trompes de Fallope humaines. (a) Bactéries fixées aux microvillosités d’une trompe de Fallope. (b) Trompe de Fallope endommagée contenant une bactérie de l’espèce Chlamydia trachomatis (flèche) dans la lésion.

est responsable de lésions vésiculeuses douloureuses sur le pénis, le col de l’utérus, la vulve ou le vagin (voir figure 26.30b). Les infections par HSV-2 sont le plus souvent transmises par contact sexuel direct, plus aisément en présence de vésicules que lors d’infections inapparentes (probablement latentes). Sa fréquence est donc plus faible que l’infection à HSV-1 (20 % contre 60 %, chez l’adulte). HSV-2 infecte occasionnellement d’autres sites tels que la muqueuse buccale. Il peut aussi être transmis à la naissance par contact avec des lésions herpétiques lors du passage du nouveau-né par la filière génitale. Chez le nouveau-né, l’infection peut être latente sans lésions apparentes jusqu’à être systémique, avec des atteintes cérébrales pouvant conduire au décès. Afin d’éviter les infections herpétiques des nouveau-nés, un accouchement par césarienne est préconisé chez les femmes enceintes ayant des lésions herpétiques génitales. Les effets à long terme des infections génitales herpétiques ne sont pas complètement compris.

La trichomonose Des urétrites non gonococciques peuvent être dues à des infections par le protozoaire Trichomonas vaginalis (voir figure 26.30c, sections 14.2, 14.9 et 14.10). T. vaginalis ne

(b)

David Phillips


Gordon A. Tuffli

(a)

Néanmoins, des études ont montré chez les femmes, une corrélation significative entre les infections génitales herpétiques et le cancer cervical. Les infections génitales herpétiques sont incurables, bien qu’un nombre limité de molécules antivirales réussisse à contrôler le stade d’infection active. L’aciclovir, un analogue de la guanine (voir figure 26.31), pris par voie orale ou appliqué localement, est particulièrement efficace pour limiter la libération de virus actifs par les vésicules et promouvoir la guérison de ces lésions. L’aciclovir interfère spécifiquement avec la thymidine kinase et l’ADN polymérase virale des virus de l’herpès, inhibant la réplication de l’ADN viral.

(c)

FIGURE 26.30 Herpèsvirus et Trichomonas. (a) Infection grave à virus Herpes simplex de type 1, avec présence de vésicules herpétiques sur la face. (b) Herpès génital à virus Herpes simplex de type 2 sur le pénis. (c) Protozoaire flagellé Trichomonas vaginalis.



26.14 Syndrome d’immunodéficience acquise : SIDA et VIH 885 O

O N

H N H2N

N

N

Guanine

H

N

H N H2N

N

Aciclovir

N CH2OCH2CH2OH

FIGURE 26.31 Guanine et aciclovir (analogue de la guanine). Le traitement par aciclovir limite la dissémination des vésicules herpétiques génitales à HSV-2.

produit pas de kystes, formes pourtant importantes pour le cycle de vie de nombreux protozoaires. La transmission est en général interindividuelle, lors de rapports sexuels. Les cellules de T. vaginalis survivent une ou deux heures sur des surfaces humides, trente à quarante minutes dans l’eau, et jusqu’à vingt-quatre heures dans les urines ou dans le sperme. La transmission de T. vaginalis est donc possible par l’intermédiaire de surfaces contaminées (sièges des toilettes, bancs de sauna, papier hygiénique). T. vaginalis est responsable d’infections vaginales chez la femme, prostatiques ou des vésicules séminales chez l’homme, et urétrales chez les deux. La plupart des cas de trichomonose sont asymptomatiques chez l’homme. Chez la femme, on observe une leucorrhée vaginale, une vaginite et des mictions urinaires douloureuses. L’infection est plus fréquente chez la femme, avec 25 à 50 % des femmes sexuellement actives qui sont infectées, contre seulement 5 % des hommes (action destructrice des liquides prostatiques). Chez le partenaire masculin d’une femme infectée, T. vaginalis doit être recherché et un traitement doit être instauré si besoin, limitant ainsi la transmission de l’infection à d’autres femmes par les hommes asymptomatiques. Le diagnostic de trichomonose repose sur l’observation du protozoaire mobile à partir de sécrétions génitales (voir figure 26.30c). Le métronidazole est particulièrement efficace dans le traitement de la trichomonose (voir tableau 26.3).

Contrôlez vos acquis L’urétrite à Chlamydia, infection sexuellement transmissible la plus fréquente, est due à Chlamydia trachomatis. Les urétrites non gonococciques à Chlamydia non traitées sont responsables de complications sérieuses chez les hommes et les femmes. Les infections herpétiques peuvent aussi être transmises par voie sexuelle, elles sont liées aux virus herpes simplex de type 1 ou 2 (plus fréquemment HSV-2). Il n’existe pas de traitement permettant l’éradication du virus de l’organisme. Le protozoaire Trichomonas vaginalis est à l’origine d’une autre IST, la trichomonose. Ces IST sont en général répandues et plus difficiles à diagnostiquer que l’urétrite gonococcique ou la syphilis.

26.14 Syndrome d’immunodéficience m n acquise : SIDA et VIH Le syndrome d’immunodéficience acquise (SIDA), connu depuis 1981, a touché plus de 900 000 individus jusqu’à présent aux États-Unis et tué plus de 500 000 d’entre eux (voir section 25.6). Plus de 1,4 million d’infections par le virus de l’immunodéficience humaine (VIH) ont été rapportées aux États-Unis et environ 1 million d’individus vivent actuellement avec l’infection. En France, la prévalence de l’infection par le VIH était estimée, fin 2003, à 134 000 ; elle augmente d’environ 3 500 cas par an (données de l’Institut de veille sanitaire – www.invs.sante.fr). Au niveau mondial, la situation est plus sérieuse, avec plus de 50 millions de personnes infectées par le VIH. Plus de 16 millions d’individus sont déjà morts du SIDA. Les isolats du VIH sont génétiquement polymorphes et sont classés en deux types ayant globalement 42 % d’homologie : le VIH-1 et le VIH-2. Ce dernier est de virulence plus modérée et reste localisé en Afrique de l’Ouest, où il a été découvert en 1985. Actuellement plus de 99 % des cas de SIDA sont dus au VIH-1. Le VIH est un rétrovirus (voir section 16.15). Son génome est composé de deux molécules d’ARN monocaténaire identiques de chacune 9 749 nucléotides. À partir de la matrice ARN, la transcriptase inverse virale permet la synthèse d’ADN complémentaire simple brin, puis d’un second brin d’ADN ; l’ADN double brin résultant est ensuite intégré dans le génome de la cellule hôte. Aux États-Unis comme en France, le nombre d’infections nouvellement diagnostiquées augmente, le déclin de la morbidité et de la mortalité du SIDA observé dans les années 1990, et alors attribué aux traitements antirétroviraux, s’est arrêté (voir section 25.6). Alors que le diagnostic virologique de l’infection par le VIH a été détaillé dans les sections 24.10 à 24.11, cette section se concentre sur la pathogenèse, l’évolution de l’infection et son impact sur le système immunitaire.

La définition du SIDA Au départ, le SIDA a été considéré comme une maladie affectant le système immunitaire. En effet, un grand nombre d’infections opportunistes (infections observées dans un contexte de dysfonctionnement immunitaire) ont été observées chez certaines populations (voir section 25.6). Cette définition a été adoptée en 1993 par les CDC (Centers for Disease Control and Prevention, Atlanta, Géorgie, États-Unis) et est utilisée pour définir le SIDA aux États-Unis. Actuellement, la définition d’un cas de SIDA correspond aux patients qui : a) présentent un dépistage positif pour le VIH et b) relèvent d’un des critères suivants :

•

Décrivez les caractéristiques cliniques et les protocoles thérapeutiques des infections à Chlamydia, au virus de l’herpès et à Trichomonas.

1. un nombre de cellules T-CD4 inférieur à 200/mm3 de sang total (normale entre 600 et 1 000/mm3) ou un pourcentage de cellules T-CD4 sur le nombre total de lymphocytes inférieur à 14 % ;

•

Pourquoi ces infections sont-elles plus difficiles à diagnostiquer que l’urétrite gonococcique ou la syphilis ?

2. un nombre de cellules T-CD4 supérieur à 200/mm3 associé à l’une des situations suivantes : infections fongiques type candidose (voir figure 26.32a), coccidiomycose,




cryptococcose (voir figure 26.32b), histoplasmose (voir figure 26.32c), isosporose, pneumonie à Pneumocystis jiroveci (anciennement P. carinii) [voir figure 26.32d], cryptosporidiose (voir figure 26.32e), ou toxoplasmose cérébrale (voir figure 26.32f) ; infections bactériennes dont la tuberculose pulmonaire ou autres infections à Mycobacterium spp. (voir figure 26.32g), ou septicémie récurrente à Salmonella ; infections virales à cytomegalovirus, encéphalopathie VIH, syndrome de dépérissement lié au VIH, ulcères chroniques ou pneumopathies à virus herpes simplex (voir section 16.12) ; leucoencéphalopathie multifocale progressive à virus JC, syndromes malins tels que le cancer cervical invasif, le sarcome de Kaposi (voir figure 26.33), le lymphome de Burkitt, le lymphome primaire du cerveau ou un lymphome immunoblastique ; une pneumonie récurrente due à tout agent infectieux.

(a)

Le VIH infecte les cellules portant à leur surface la protéine CD4. Les macrophages et les lymphocytes T-helper (TH), composants essentiels du système immunitaire, sont les deux types cellulaires les plus fréquemment infectés (voir sections 22.1 et 22.8). Quand ces cellules sont infectées, elles produisent et libèrent des particules de VIH en grande quantité qui infectent à leur tour d’autres cellules CD4 positives (voir figure 26.34). Le VIH interagit non seulement avec la molécule CD4, mais aussi avec des corécepteurs présents à la surface des cellules cibles. Le VIH infecte en premier les macrophages, cellules présentatrices d’antigène (CPA) ayant un faible nombre de molécules CD4 à leur surface (voir figure 26.35). À la surface cellulaire, la molécule CD4 se lie à la glycoprotéine gp120 du VIH. Cette dernière interagit alors avec une autre protéine, indispensable à l’entrée du virus dans le macrophage, le récepteur de chimiokine CCR5 (voir section 23.11). Le corécepteur CCR5 forme avec la molécule CD4 le site d’amarrage à partir duquel l’enveloppe du VIH fusionne avec la membrane de la cellule cible, pour la libération intracellulaire de la nucléocapside virale.

(e)



(c)



(b)

(d)

(g)

La pathogenèse de l’infection par le VIH



L’infection opportuniste la plus fréquente chez les patients atteints de SIDA est la pneumonie imputable au protozoaire Pneumocystis jiroveci. Le sarcome de Kaposi, une maladie fréquente au stade SIDA, est un cancer atypique des cellules sanguines observé avec une grande fréquence chez les homosexuels masculins infectés par le VIH. Des taches cutanées pourpres apparaissent, particulièrement au niveau des extrémités (voir figure 26.33). Le sarcome de Kaposi est dû à la coinfection des patients par le VIH et le virus de l’herpès humain de type 8 (VHH-8) ; il est 20 000 fois plus fréquent chez les patients atteints de SIDA que dans la population générale.

En résumé, un patient est atteint du SIDA si : 1) les tests de diagnostic montrent la présence du VIH ou d’anticorps antiVIH et 2) s’il a un taux de lymphocytes T CD4 extrêmement réduit ou 3) s’il souffre d’au moins une des diverses infections opportunistes ou d’un des cancers atypiques précédemment cités.


886 Chapitre 26

(f)

FIGURE 26.32 Pathogènes opportunistes dans le cadre du syndrome d’immunodéficience acquise (SIDA). (a) Infection systémique à Candida albicans (tissu cardiaque). (b) Cryptococcose à Cryptococcus neoformans (tissu hépatique). (c) Histoplasmose à Histoplasma capsulatum (tissu hépatique). (d) Pneumocystose pulmonaire à Pneumocystis jiroveci. (e) Cryptosporidiose à Cryptosporidium sp. (intestin grêle). (f) Toxoplasmose à Toxoplasma gondi (tissu cérébral). (g) Infection à Mycobacterium spp. dans l’intestin grêle, coloration acido-alcoolo-résistante.




(a)

(b) FIGURE 26.33 Sarcome de Kaposi. Lésions (a) du talon, (b) de la jambe et de la cheville.

Chez certains individus, les cellules expriment un variant de la protéine CCR5, le VIH étant alors incapable de se fixer et l’infection impossible. Suite à l’infection des cellules macrophagiques CPA par le VIH, une forme différente de gp120 est produite, elle se lie à un autre corécepteur, le récepteur de chimiokine CXCR4 présent à la surface des lymphocytes T. Le VIH pénètre et détruit les lymphocytes T-helper, TH1 et TH2, responsables respectivement des réponses inflammatoires à médiation cellulaire et de la coopération des cellules B (voir section 22.8). Ainsi, l’infection par le VIH est d’abord une infection des macrophages qui évolue par la suite en infection des cellules T. Il en résulte une destruction systématique des deux types cellulaires à l’origine d’une immunodépression sérieuse. Actuellement, un certain nombre d’études concerne la mise au point de traitements visant à bloquer la fixation du VIH sur les récepteurs de chimiokines à la surface des macrophages et des lymphocytes T, empêchant ainsi l’infection. L’infection par le VIH ne détruit pas immédiatement les cellules cibles. Le génome viral, après transcription inverse et synthèse d’ADN double brin, s’intègre dans l’ADN chromosomique de la cellule hôte : on parle de provirus, et à ce stade le virus n’est pas infectieux. La cellule ne montre pas de signe extérieur d’infection, la latence virale pouvant durer plusieurs années et la réplication ne reprenant que lorsque l’ADN de l’hôte se réplique. Sous certains stimuli, la synthèse virale reprend et de nouveaux virions sont libérés par la cellule hôte. Les cellules T produisant du VIH ne se divisent plus et meurent éventuellement. La destruction accélérée des cellules CD4 se produit à la suite de la maturation moléculaire des antigènes du VIH par les cellules T infectées. Des molécules de gp120 néosynthétisées s’insèrent à la surface des cellules hôtes, elles peuvent se fixer à des cellules T voisines non infectées en se liant à la

molécule CD4. Les deux cellules, infectée et non infectée, peuvent alors fusionner, engendrant alors des cellules géantes multinuclées ou syncytia. Une seule cellule T infectée par le VIH peut se fixer et se lier à cinquante cellules T non infectées. Peu après la formation de ces syncytia, les cellules fusionnées perdent leurs fonctions immunitaires et meurent. L’infection par le VIH entraîne un déclin progressif du nombre des cellules CD4. Chez un individu non infecté, les cellules CD4 représentent environ 70 % de la population lymphocytaire T totale. Au stade SIDA, le nombre de cellules CD4 diminue progressivement, et à l’établissement des infections opportunistes ces cellules peuvent avoir quasiment disparu (voir figures 24.22 et 26.36). La déplétion sérieuse en cellules T CD4 s’accompagne d’une chute de la production de cytokines qui provoque la diminution progressive des cellules T non infectées et des autres lymphocytes. Ces événements ont des conséquences graves sur la santé des patients au stade SIDA. L’immunité cellulaire et humorale est détruite. Les infections systémiques fongiques et à mycobactéries (voir figure 26.30) surviennent à la chute de l’immunité cellulaire TH1 (voir section 22.8). Les infections opportunistes virales et bactériennes associées au stade SIDA annoncent le déclin de la production d’anticorps dû à la perte de cellules TH2 indispensables au déclenchement de la production d’anticorps par les cellules B (voir section 22.8). En dehors de tout traitement antirétroviral, l’évolution de l’infection vers le stade SIDA suit un profil prédictible. Lors de la phase de latence, l’infection est quand même très active et progresse. La réponse immune spécifique du VIH est très intense : environ un milliard de virions sont détruits quotidiennement. Néanmoins, cela prouve que le virus se réplique intensément entraînant la destruction d’environ cent millions de cellules T CD4 chaque jour. La réponse immune est dépassée, la charge virale augmente et les cellules T sont détruites, paralysant la réponse immune, laissant la porte ouverte à l’émergence d’infections opportunistes (voir figure 26.36).

Forme mature

Particules bourgeonnantes



26.14 Syndrome d’immunodéficience acquise : SIDA et VIH 887

FIGURE 26.34 Image en microscopie électronique à transmission d’une coupe fine de lymphocyte relarguant des virus de l’immunodéficience humaine (VIH). Cellules d’un patient hémophile au stade SIDA. Les particules virales ont un diamètre de 90 à 120 nm (voir figure 9.25).



888 Chapitre 26


Nucléocapside Virion VIH

1

gp 120 CD4

Cellule

CCR5

Cellule cible (a)

2

FIGURE 26.35 Infection d’une cellule cible CD4 par le virus de l’immunodéficience humaine (VIH). (a) Interaction du VIH avec une cellule cible par liaison spécifique de la gp 120 du VIH au récepteur CD4 et au corécepteur sur les macrophages ou les cellules T. Le corécepteur est le récepteur membranaire de chimiokine CCR5, présent à la surface des macrophages. Un corécepteur similaire, CXCR4, est présent à la surface des cellules T CD4. (b) La fusion de l’enveloppe du VIH avec la membrane de la cellule hôte commence avec : 1) l’interaction du virus avec la paire récepteur/ corécepteur sur la cellule hôte. En l’absence du récepteur ou du corécepteur, le VIH ne peut pas se fixer sur la cellule, qui n’est alors pas infectée. Après liaison à la surface cellulaire, 2) l’enveloppe virale et la membrane cellulaire fusionnent. Enfin, 3) la nucléocapside est introduite dans la cellule hôte et l’infection virale active est initiée. Pour la biologie et la réplication des rétrovirus, voir les sections 9.13 et 16.1, ainsi que les figures 9.25, 9.26, 16.25 et 16.26.

Absence de symptômes

Gonflement des ganglions lymphatiques

3

(b)

Dysfonctionnement immun subclinique

Infections Déficit opportu- immun nistes systémique

1000 106

900

Valeurs normales des cellules T

Diminution significative des cellules T Déficit grave en cellules T

800 700

Cellules T 600 CD4 par 500 mm3 de sang 400

104

Copies d’ARN VIH par mL

Décès 102

300 200 100 0

0

6

12

18

24

30

36

42

48

54

60

66

72

78

84

Temps (mois) après la contamination par le VIH FIGURE 26.36 Déclin des lymphocytes T CD4 et progression de l’infection VIH. En dehors de tout traitement, la progression typique de l’infection par le VIH s’accompagne d’une chute graduelle du nombre et de la fonctionnalité des cellules T CD4, alors que la charge virale, mesurée par le nombre de copies de l’ARN du VIH par millilitre de plasma augmente après un déclin initial.




Le diagnostic Des tests immunoenzymatiques (ELISA) sont utilisés pour le dépistage des anticorps anti-VIH dans les échantillons sanguins (voir section 24.10). Les tests ELISA sont particulièrement intéressants pour le criblage de larges échantillonnages de dons de sang, afin de prévenir la transmission du VIH lors de transfusions. Environ 0,25 % (2 ou 3 ‰) de tous les dons de sang de donneurs volontaires aux États-Unis sont dépistés positifs pour le VIH par les tests ELISA. En France, le risque résiduel de transmission du VIH par le biais d’un don de sang a été estimé sur la période 2003-2005 à 1 sur 2 600 000 dons. Un test ELISA positif doit être confirmé par une technique d’immunoblot (Western blot) [voir section 24.11]. Un certain nombre d’autres tests rapides sont en cours de développement pour l’identification des individus infectés par le VIH. Un de ces tests utilise une seule goutte de sang du patient et un seul réactif. Ce dernier est un anticorps synthétique dont un site de liaison est dirigé contre un antigène de globule rouge, alors que l’autre site est dirigé contre la glycoprotéine de surface gp41 du VIH. Dans un test positif, l’anticorps bifonctionnel forme des réseaux entre les globules rouges et le VIH, entraînant une agglutination visible (voir section 24.8). Un autre test utilise la salive comme source d’anticorps sécrétés contre le VIH. La salive est déposée sur une cartouche où sont immobilisés des antigènes du VIH. Un deuxième anticorps, réagissant avec l’anticorps et conjugué à une enzyme est ajouté. Après l’addition du substrat de l’enzyme, une réaction positive est révélée par l’apparition d’un produit coloré, comme dans une réaction ELISA (voir section 24.10). Les tests rapides sont élaborés dans un but de grande facilité de mise en œuvre, de rapidité (en quelques minutes contre plusieurs heures pour les tests ELISA ou d’immunoblot), de durée de conservation prolongée, de transportabilité et de facilité d’utilisation. Ces tests rapides sont cependant en général moins sensibles ou précis que les tests ELISA-VIH standard et l’immunoblot VIH (voir sections 24.10 et 24.11). Tous les tests, quelle que soit leur sensibilité ou leur précision, donnent des résultats négatifs pour les prélèvements d’individus récemment infectés par le virus et n’ayant pas encore développé de réponse anticorps détectable. Cette période de fenêtre sérologique peut durer plus de six semaines après l’exposition au VIH. La réduction de ce délai est apportée par la détection combinée de l’antigène de capside P24 du VIH et des anticorps dans ces tests ELISA (détection à 1 ou 2 semaines). Malgré cet inconvénient, ces tests assurent l’innocuité des dons de sang, les statistiques montrant en effet que le risque de contracter le VIH par du sang contaminé ou des produits sanguins est désormais très faible. Les relations sexuelles et la toxicomanie intraveineuse en groupe sont de nos jours les modes majeurs de contamination (voir section 25.8). La présence d’anticorps anti-VIH dans le sang est l’indicateur habituel d’une exposition et d’une infection par le VIH (voir sections 24.10 et 24.11). Un certain nombre de tests de laboratoire fondés sur une transcription inverse suivie d’une PCR (RT-PCR, reverse transcriptase-PCR) ont été développés (voir section 18.5). La RT-PCR estime le nombre de virus présents dans le sang ou charge virale. Ce test indique le niveau de réplication du VIH et est corrélé au taux de destruction des cellules T CD4. La numération des lymphocytes CD4

est un indicateur direct de l’étendue de la dépression immunitaire induite par le VIH. De par son coût élevé et ses exigences techniques, la réaction de RT-PCR n’est pas utilisée en routine pour le dépistage VIH. Après la découverte initiale de l’infection, le test de RT-PCR permet le suivi de l’évolution de l’infection et la réponse au traitement antirétroviral (voir figure 26.37). Le pronostic d’un patient infecté par le VIH mais non traité est mauvais. La plupart des patients au stade SIDA sont susceptibles de mourir à la suite du développement d’infections opportunistes ou de cancers (voir figures 26.32 et 26.33). L’infection par le VIH évolue en différentes étapes durant lesquelles la fonction immunitaire diminue, avec des cellules CD4 chutant de 600 à 1 000/mm3 de sang à presque zéro sur une période de cinq à sept ans (voir figure 26.36). Le taux d’immunodépression est variable d’un individu à un autre, mais il est rare qu’un patient vive plus de dix ans sans aucune prise en charge thérapeutique.

Le traitement Plusieurs molécules diminuant les symptômes de l’infection VIH et prolongeant significativement la vie des patients sont disponibles (voir tableau 26.4). Le traitement a pour objectif de réduire la charge virale au-dessous du seuil de détectabilité des techniques moléculaires utilisées. On parle de traitement antirétroviral hautement actif (HAART, highly active antiretroviral therapy), des combinaisons d’au moins deux molécules antirétrovirales sont nécessaires pour éviter au maximum l’émergence de résistance virale au traitement. Depuis l’instauration des thérapies antirétrovirales, jamais le virus n’a été éradiqué de l’organisme. Même chez les patients ayant une charge virale indétectable après traitement, une remontée de cette dernière est inéluctable si le traitement est interrompu ou discontinu, ou si une résistance à divers antirétroviraux se développe. Les molécules antirétrovirales appartiennent à quatre classes distinctes. La première correspond à des analogues nucléosidiques inhibiteurs de la transcriptase inverse du virus (voir section 16.15 pour les fonctions de cette enzyme). La molécule anti-VIH la plus ancienne, l’azidothymidine (AZT), est un inhibiteur de la réplication du VIH ; sa structure est identique à celle d’un nucléoside, la thymidine, mais elle ne possède pas d’hydroxyle libre en 3', site de fixation de la base suivante dans la chaîne de synthèse de l’ADN. Ainsi, son incorporation entraîne la terminaison de la chaîne d’ADN en cours de synthèse. L’AZT et les autres inhibiteurs nucléosidiques de la transcriptase inverse (INTI) bloquent la réplication du VIH (voir figure 26.38a et tableau 26.4). Ces traitements permettent une chute rapide de la charge virale des patients infectés par le VIH. Dans certaines conditions et en quelques semaines, des souches du VIH portant des mutations de résistance au traitement peuvent cependant être sélectionnées. Le VIH se réplique très rapidement (voir ci-dessus) et l’accumulation de mutations nucléotidiques peut conférer une résistance à un analogue nucléosidique donné. La deuxième classe de molécules antirétrovirales correspond aux inhibiteurs non nucléosidiques de la transcriptase inverse (INNTI) [voir figure 26.38b et tableau 26.4]. Ces composés inhibent directement l’activité de la transcriptase inverse en interagissant avec elle à proximité de son site



890 Chapitre 26


Lyse du VIH

Plasma VIH positif (a)

Transcription inverse ARN génomique du VIH

PCR Nombreuses copies ADN

ADN complémentaire

Test

Mauvais pronostic

1000

ARN

800

CD4

Décès

600 400

Copies ARN VIH/mL

104

200

102

0

Bon pronostic

1000 800

106

Cellules CD4/mm3

FIGURE 26.37 Mesure de la charge virale. (a) Détection du VIH par RT-PCR (Reverse transcription-polymerase chain reaction – voir sections 7.9 et 16.15). Le nombre de copies d’ARN VIH est comparé au nombre de copies d’ADN d’un contrôle interne amplifié dans la même PCR. La charge virale est exprimée en nombre de copies d’ARN VIH par millilitre de plasma. (b) Évolution de l’infection VIH et charge virale plasmatique. Sur le graphe du haut, une charge virale supérieure à 104 copies par millilitre est corrélée à un nombre de cellules T CD4 au-dessous de la normale (qui est de 600 à 1500/mm3), en relation avec un mauvais pronostic et un décès précoce. Sur le graphe du bas, une charge virale inférieure à 10 4 copies par millilitre est associée à un taux de cellules T CD4 normal, en relation avec un bon pronostic et une survie prolongée du patient. Ce test permet de suivre la progression de l’infection VIH et se révèle comme essentiel pour l’évaluation de l’efficacité des traitements antirétroviraux.

106

600

104

400 102

200 1 2 3 4 5 6

2

Mois post-contamination

4

6

8

10

0

Années post-contamination

(b)

catalytique, dont la conformation se trouve altérée. Malheureusement, une seule mutation dans le gène codant la transcriptase inverse est le plus souvent suffisante pour diminuer l’efficacité de ces molécules. Les inhibiteurs de la protéase du VIH appartiennent à une troisième classe d’antirétroviraux (voir figure 26.38c et tableau 26.4). Ce sont des analogues peptidiques inhibant la maturation des polypeptides viraux en se fixant au niveau du site actif de la protéase du VIH (voir section 20.13). Tout comme pour les autres antirétroviraux, une seule mutation dans le gène de la protéase peut altérer l’efficacité de ces molécules. L’enfuvirtide, est le représentant de la classe des inhibiteurs de fusion. C’est un peptide synthétique de trente-six acides aminés se fixant à la glycoprotéine transmembranaire gp41 du VIH (voir tableau 26.4). La liaison de ce peptide bloque les modifications conformationnelles nécessaires à la fusion des membranes du virus et des cellules CD4. L’enfuvirtide est utilisé en cas de résistance aux autres antirétroviraux ou de rebond de la charge virale après un traitement HAART conventionnel. De par le risque d’émergence de résistance, le traitement type inclut au moins un inhibiteur de protéase associé à une combinaison de deux molécules analogues nucléosidiques

(voir tableau 26.4). Ces associations d’antirétroviraux réduisent la probabilité d’émergence d’un virus résistant. L’efficacité du traitement est évaluée par la quantification régulière de la charge virale. Un protocole efficace permet d’obtenir une charge virale indétectable (moins de cinquante copies par millilitre de sang) en quelques jours (voir figure 26.37). Le traitement et le suivi de la charge virale sont poursuivis indéfiniment. Lorsque la charge virale est à nouveau détectable, signe d’une probable émergence d’une souche du VIH résistante, la combinaison d’antirétroviraux est modifiée. Certains antirétroviraux sont toxiques pour le patient. Le plus souvent, les analogues nucléosidiques sont mal tolérés, probablement en raison de leur interaction avec certaines fonctions de l’organisme comme la division cellulaire (voir tableau 26.4). Les NNRTI et les inhibiteurs de la protéase sont souvent mieux tolérés puisqu’ils n’interfèrent qu’avec des fonctions spécifiques du virus. La résistance et la toxicité des antirétroviraux couplées constituent des problèmes majeurs pour la gestion du traitement, de nouvelles classes thérapeutiques (inhibiteurs d’intégrase, inhibiteurs d’entrée, etc.), et de nouveaux protocoles sont constamment en cours d’évaluation dans l’objectif d’améliorer la prise en charge des patients.




TABLEAU 26.4

MOLÉCULES ANTIRÉTROVIRALES VALIDÉES POUR LA PRISE EN CHARGE DE L’INFECTION VIH

Molécule

Mécanisme d’action

Azidothymidine (AZT, ZDV ou zidovudine) (voir figure 26.38a) Didéoxyinosine (ddI ou didanosine) Stavudine (d4T) Lamivudine (3TC) Emtricitabine (FTC) Abacavir (ABC) Tenofovir (TDF) (inhibiteur nucléotidique)

Analogues nucléosidiques ; inhibiteurs de la transcriptase inverse ; terminateurs de chaîne ; augmentent l’espérance de vie et diminuent l’incidence des infections opportunistes chez le patients au stade SIDA ; peuvent être utilisés en combinaison avec d’autres antirétroviraux dans divers protocoles thérapeutiques.

Efavirenz Névirapine (voir figure 26.38b) Delavirdine (non autorisée en France)

Inhibiteurs non nucléosidiques de la transcriptase inverse (INNTI) ; se fixent à proximité du site catalytique et le modifient ; absence de compétition avec les nucléosides ; peuvent être utilisés en combinaison avec d’autres antirétroviraux dans divers protocoles thérapeutiques.

Indinavir (IDV) Nelfinavir (NFV) Saquinavir (SQV) + r (voir figure 26.38c) FosAmprénavir (fosAPV) + r Lopinavir (LPV) + r Atazanavir (ATV) + r Tipranavir (TPV) + r

Inhibiteurs de protéase ; analogues peptidiques se liant au site actif de la protéase du VIH ; inhibent la maturation des polypeptides viraux et du virus ; peuvent être utilisés en combinaison avec d’autres antirétroviraux dans divers protocoles thérapeutiques.

Enfuvirtide

Inhibiteur de fusion ; polypeptide synthétique se fixant à la gp41 et inhibant la fusion des membranes du VIH avec celles des cellules de l’hôte.

r : ritonavir, inhibiteur de protéase utilisé à faible dose en association avec d’autres inhibiteurs de la protéase du VIH, pour ses propriétés d’inhibition métabolique sur ces molécules.

La vaccination VIH La variabilité génétique du VIH a entravé le développement d’un vaccin VIH. Une des stratégies est d’induire la production d’anticorps dirigés contre la glycoprotéine d’enveloppe gp120. Ces anticorps bloqueraient les interactions CD4-gp120 O

HOCH2 H Carbone 3’

H

H

N

H

3

(a)

Thymine H Désoxyribose CH3

Azidothymidine

O

H N

N

N

N

Névirapine

(b)

Liaison peptidique

H N

N O

Ph O N H

N OH

CONH2 (c)

Saquinavir

O

N

(voir figure 26.35) et donc l’infection. Un vaccin à base de sous-unités de la gp120 est actuellement en cours d’essais cliniques humains de phase III, stade précédant l’utilisation publique des molécules. Le vaccin est composé de deux variants de la gp120 prédominants parmi la population thaïlandaise, où ce vaccin est actuellement testé. Cette approche ne conviendra malheureusement pas pour un vaccin universel, car le gène codant la gp120 mute fréquemment, produisant des variants antigéniques de la protéine non reconnus par les anticorps produits contre des formes différentes. Les essais cliniques de vaccination se poursuivent avec des sous-unités virales (voir section 31.8). Dans ces vaccins, les gènes de plusieurs protéines d’enveloppe du VIH ont été insérés dans des particules du virus de la vaccine ou d’adénovirus. En utilisant ces virus inoffensifs en tant que vecteurs d’expression

H

FIGURE 26.38 Exemples de molécules antirétrovirales. (a) Azidothymidine (AZT), analogue nucléosidique. Lorsque cet analogue est incorporé dans la chaîne de synthèse de l’ADN viral, l’absence d’OH libre sur le carbone 3’ empêche l’élongation de l’ADN, inhibant ainsi la réplication virale. (b) La Névirapine, inhibiteur non nucléosidique de la transcriptase inverse, se fixe directement à proximité du site catalytique et inhibe également l’élongation de la chaîne nucléotidique. (c) Le saquinavir, inhibiteur de protéase, se loge au niveau du site actif de la protéase du VIH (section 20.13). C’est un analogue peptidique dont le site de fixation à la protéase est visualisé en jaune. Le blocage de l’activité de la protéase du VIH inhibe le clivage des protéines du VIH et la maturation du virus (figure 20.28).



892 Chapitre 26


permettant la libération d’antigènes de VIH, quelques vaccins induisent une réponse immune humorale et cellulaire efficace contre le VIH. D’autres candidats potentiels pour la vaccination incluent des particules de VIH intactes tuées. L’utilisation de ces vaccins est restreinte aux individus infectés par le VIH parce que les procédures d’inactivation peuvent ne pas désactiver 100 % des particules de VIH. Il ne serait donc pas éthique de prendre le risque d’exposer des individus non infectés à un risque d’infection par le VIH, aussi faible soit-il. Certains laboratoires explorent les possibilités de produire des virus vivants atténués en tant qu’agents immunogènes. La stratégie est soutenue par le fait que l’infection des individus par le VIH-2, virus proche du VIH-1 mais responsable de formes cliniques modérées après une longue période de latence, empêche l’infection par le VIH-1, responsable de formes graves de SIDA. Ces stratégies demeurent néanmoins non dénuées de risques, comme la survenue de cancer après intégration du virus, la réactivation de la virulence par sélection de mutations, etc. Au total, il existe une vingtaine de protocoles de vaccination contre le VIH en cours de développement, mais jusquelà aucun ne s’est avéré protecteur et sûr. De plus, la vaccination ne permettra probablement pas de traiter la plupart des patients déjà infectés, car ils sont immunodéprimés et incapables de répondre à un vaccin. Ainsi, malgré la masse de connaissances accumulées sur la structure, les mécanismes fonctionnels de l’infection par le VIH ainsi que sur la

FOCUS

physiopathologie du SIDA, aucune stratégie médicale interventionelle n’a fait ses preuves pour la prévention ou la guérison de l’infection par le VIH. Les mesures publiques d’information et d’éducation concernant les comportements à risques demeurent les meilleurs outils pour la prévention de l’infection par le VIH (voir le focus « Pratiques sexuelles et SIDA »).

Contrôlez vos acquis Le SIDA est actuellement l’une des maladies infectieuses les plus prévalentes parmi la population humaine. Le VIH détruit le système immunitaire, puis les pathogènes opportunistes tuent l’organisme hôte. Il n’existe pas de vaccin anti-VIH efficace, mais les molécules antirétrovirales ralentissent la progression vers le stade SIDA. La seule prévention de la transmission de l’infection concerne les comportements à risque tels que la toxicomanie intraveineuse (partage d’aiguille) et les pratiques sexuelles non protégées. •

Rappelez la définition du SIDA. Quelles caractéristiques diagnostiques partagent tous les patients ?

•

Quel est le traitement courant de l’infection par le VIH ? Est-il efficace ? Quels sont ses effets secondaires ?

Sexualité et SIDA Sex

La multiplicité des partenaires sexuels a toujours été associée aux maladies sexuellement transmissibles. L’épidémie de l’infection VIH fait prendre conscience des dangers à avoir des partenaires sexuels multiples et des risques de certaines pratiques sexuelles. Les autres infections sexuellement transmissibles (IST) sont l’urétrite gonococcique, la syphilis, les infections génitales à virus herpes simplex, les urétrites non spécifiques dues à Chlamydia, la vaginite due au protozoaire Trichomonas vaginalis ou à la levure Candida albicans, les verrues génitales imputables aux papillomavirus humains. Parmi toutes ces IST, le SIDA est un cas particulier. Aucun traitement ni vaccin n’a jusque-là permis de guérir ou de prévenir l’infection par le VIH. Les molécules antirétrovirales sont chères, disponibles surtout dans les pays développés ; ainsi 90 % des cinquante millions ou plus d’individus infectés dans le monde ont peu accès au traitement (développement de génériques). Le SIDA tue deux millions de personnes chaque année et ces chiffres devraient augmenter quand les individus infectés

depuis dix ans développeront réellement le SIDA. Les autorités de santé américaines ont édité des recommandations spécifiques concernant certaines pratiques sexuelles et la prévention de la contamination par le VIH. 1 Éviter tout contact oro-pénien, -vaginal ou -rectal. 2 Éviter toute activité sexuelle susceptible de provoquer une érosion de la muqueuse rectale, vaginale ou pénienne. 3 Éviter toute activité sexuelle avec des personnes à haut risque : prostitué(e)s, homosexuels masculins à partenaires multiples, bisexuels et toxicomanes par voie intraveineuse. 4 Tout individu ayant eu des relations sexuelles avec une personne appartenant à l’un de ces groupes à risque doit effectuer un dépistage sanguin à la recherche d’une éventuelle contamination par le VIH. Ce test doit être répété à intervalle d’un, puis de trois mois, à cause du délai de détection des anticorps anti-VIH (fenêtre sérologique). Si le test est positif, les partenaires sexuels

de l’individu séropositif doivent se protéger en utilisant des préservatifs lors des rapports sexuels. Le SIDA ne concerne pas que les homosexuels masculins. Dans certains pays, il est aussi fréquent chez les femmes que chez les hommes, et désormais, aux États-Unis, la transmission la plus fréquente est hétérosexuelle. Est-il possible d’avoir des relations sexuelles sans encourir le risque d’être contaminé par le VIH ? Certaines pratiques sexuelles sont fondamentalement plus sûres que d’autres : masturbation réciproque (sans érosion cutanéomuqueuse), rapport sexuel avec préservatif. Les pratiques sexuelles à risque incluent la masturbation générant des lésions cutanéo-muqueuses, les rapports oro-sexuels (masculins ou féminins), les rapports sexuels non protégés (vaginaux ou anaux). Les autorités de santé américaine recommandent l’usage de préservatif quel que soit le type de relation sexuelle lorsque le statut VIH du partenaire est inconnu.



Questions 893

Sexualité et SIDA (suite)

L’épidémie de SIDA attire l’attention sur l’usage du préservatif (voir photo), qui joue deux rôles : protecteur contre la transmission d’IST et contraceptif. Les autorités de santé américaines recommandent fortement l’usage de préservatif en latex pour toute relation sexuelle extraconjugale. Dans certains pays, des campagnes d’information de grande envergure mettent en avant de façon très explicite l’utilité des préservatifs. Les rapports et programmes préconisant la monogamie, l’abstinence, l’absence de relations sexuelles extraconjugales ainsi que les avertissements quant aux conséquences potentiellement fatales de l’infection par le

VIH ne permettront pas à eux seuls de maîtriser l’épidémie de SIDA. Les connaissances acquises au sujet des autres maladies sexuellement transmissibles montrent que la peur de la maladie n’est pas suffisante pour empêcher les activités sexuelles à risque. Le désir sexuel de certains individus est si fort qu’il peut même dépasser la peur d’une maladie telle que le SIDA. Chaque individu doit prendre la responsabilité de se protéger contre l’infection. Pour de plus amples informations sur le SIDA, le Service de santé publique américaine propose une ligne téléphonique gratuite, la hotline du CDC National STD et SIDA au 800-342-2437, et un site internet

à l’adresse http://www.ashastd.org/nah. En France, voir les sites www.invs.sante.fr et www.who.int/topics/hiv_infections/fr.

John M. Martinko et Cheryl L. Broadie

FOCUS

QUESTIONS 1. Pourquoi les bactéries Gram positif sont-elles plus fréquemment responsables d’infections respiratoires que les bactéries Gram négatif (voir section 26.1) ? 2. Quels sont les symptômes typiques d’une infection respiratoire streptococcique ? Pourquoi les infections streptococciques doivent-elles être traitées très rapidement (voir section 26.2) ? 3. Décrivez l’agent responsable et les symptômes de la diphtérie. Les symptômes sont-ils dus à l’infection ou à sa toxine ? Expliquez. Quelles sont les mesures préventives contre la diphtérie (voir section 26.3) ? 4. Décrivez l’agent étiologique et les symptômes de la coqueluche. Décrivez les modifications de la technique vaccinale ayant conduit à des vaccins contre la coqueluche plus sûrs (voir section 26.4). 5. Décrivez le processus physiopathologique de l’infection par Mycobacterium tuberculosis. L’infection est-elle toujours responsable de tuberculose active ? Pourquoi ? Aux États-Unis, pourquoi ne vaccine-t-on pas avec le BCG (voir section 26.5) ? 6. Décrivez les symptômes de la méningococcémie et de la méningite. Pourquoi traite-t-on ces infections ? Quel est le pronostic de chacune (voir section 26.6) ? 7. Comparez et différenciez la rougeole, les oreillons et la rubéole. Incluez dans votre discussion une description du pathogène, des principaux symptômes et des conséquences potentielles de ces infections. Pourquoi la vaccination des

femmes contre la rubéole avant la puberté est-elle importante (voir section 26.7) ? 8. Pourquoi les rhumes et la grippe sont-ils des infections respiratoires aussi fréquentes ? Donnez au moins deux raisons à la forte incidence de chacune de ces maladies (voir section 26.8). 9. Différenciez les staphylocoques pathogènes des staphylocoques commensaux (voir section 26.9). 10. Expliquez le lien entre Helicobacter pylori et les ulcères gastriques. Comment traiteriez-vous un patient souffrant d’un ulcère (voir section 26.10) ? 11. Décrivez les principaux virus pathogènes responsables d’hépatites. Quels sont leurs points communs ? Quelle est leur voie de transmission (voir section 26.11) ? 12. Pourquoi l’incidence de l’urétrite gonococcique a-t-elle fortement augmenté au milieu des années 1960, alors que celle de la syphilis a véritablement diminué à la même période (voir section 26.12) ? 13. Décrivez le traitement des infections sexuellement transmissibles telles que la chlamydiose, l’herpès génital et la trichomonose. Le traitement permet-il une guérison définitive de chacune de ces infections ? Pourquoi (voir section 26.13) ? 14. Pourquoi le virus de l’immunodéficience humaine (VIH) réduitil de façon significative l’immunité humorale et cellulaire ? Pourquoi les vaccins anti-VIH sont-ils si difficiles à développer (voir section 26.14) ?

PROBLÈMES 1. Comment peut-on contrôler une épidémie de coqueluche ? Comment peut-on la prévenir ? L’incidence de cette infection ne diminuant plus, quelles méthodes préventives proposez-vous pour contrer l’actuelle « mini-épidémie » (voir section 26.4) ? Ces méthodes seraient-elles rentables ? 2. Pourquoi la tuberculose est-elle souvent responsable d’une insuffisance respiratoire chronique alors que la plupart des

infections respiratoires causent seulement des symptômes respiratoires transitoires ? 3. Votre compagnon de chambre à l’université rentre chez lui pour le week-end et tombe très malade : une méningite bactérienne est diagnostiquée à l’hôpital local. Puisqu’il était parti, les fonctionnaires de l’université ne sont pas au courant de sa maladie. Que devriez-vous faire pour vous protéger contre la



894 Chapitre 26


méningite ? Devriez-vous avertir le personnel médical de l’université ? 4. La rougeole, les oreillons et la rubéole ont toutes été des maladies infantiles très courantes. La survenue d’épidémies de ces infections est cependant actuellement considérée comme un événement important nécessitant la vigilance immédiate des organismes de santé publique. Expliquez ce changement d’attitude dans le cadre de la prévalence de ces infections, la disponibilité des vaccins et les conséquences potentielles en terme de santé publique de chacune d’entre elles. 5. Discutez le versant moléculaire du glissement antigénique des virus de la grippe et quelles en sont les conséquences immunologiques pour l’hôte. Pourquoi cette dérive antigénique empêche-t-elle la production d’un vaccin universel efficace unique pour le contrôle de la grippe ? Comparez les phénomènes de glissement et de cassure antigéniques. Lequel de ces mécanismes est le plus important pour l’évolution des virus de

la grippe ? Lequel est responsable du plus fort changement antigénique ? Lequel est à l’origine des plus grandes entraves au développement des vaccins ? Pourquoi ? 6. Classez les virus des hépatites en fonction de la gravité de la maladie dont ils sont responsables, à court et long termes. 7. En tant que responsable du groupe réalisant le bulletin de renseignements de la santé publique de votre campus, vous êtes chargé de transmettre des informations concernant les infections à Chlamydia, au virus de l’herpès, à Trichomonas et toutes les autres IST. En dehors de ce manuel, où pouvezvous obtenir des informations fiables sur les IST ? Détaillez la prévention, les symptômes et le traitement de chaque IST. Ces données se superposent-elles pour l’ensemble de ces IST ? Pour chacune de ces infections, discutez les questions sociales, légales et de santé publique qui doivent être prises en compte pour identifier les partenaires sexuels des individus infectés.



I

Maladies transmises par des animaux 896

27.1 27.2

Rage Syndrome pulmonaire à hantavirus

II

Maladies transmises par des arthropodes

27.3 27.4 27.5 27.6 27.7

Rickettsioses Maladie de Lyme Paludisme Virus West Nile Peste

900 902 905 908 909

III

Maladies d’origine tellurique

911

27.8 27.9

Champignons microscopiques pathogènes Tétanos

911 914

896 898

CHAPITRE VINGT-SEPT

Maladies microbiennes transmises par des animaux, par des arthropodes ou d’origine tellurique 900

Le moustique est l’agent vecteur du paludisme, la plus importante maladie infectieuse mortelle de tous les temps, ainsi que du virus West Nile, un pathogène émergent.



896 Chapitre 27

Maladies microbiennes transmises par des animaux, par des arthropodes ou d’origine tellurique

GLOSSAIRE Anémie à hématies falciformes (sickle cell anemia) Trait génétique qui confère une résistance au paludisme, mais entraîne une diminution d’efficacité des globules rouges, en réduisant l’affinité de l’oxygène pour l’hémoglobine. Ehrlichiose (ehrlichiosis) Un des groupes de maladies émergentes transmises par des tiques, provoquées par des rickettsies du genre Ehrlichia. Fièvre à virus West Nile (West Nile fever) Maladie neurologique provoquée par le virus West Nile et transmise des oiseaux à l’homme par des moustiques. Fièvre pourprée des Montagnes Rocheuses (Rocky Mountain spotted fever) Maladie transmise par des tiques, provoquée par Rickettsia rickettsii, entraînant de la fièvre, des céphalées, une éruption et des symptômes gastro-intestinaux. Maladie de Lyme (Lyme disease) Maladie émergente transmise par des tiques, provoquée par le spirochète Borrelia burgdorferi. Mycose (mycosis) Infection provoquée par un champignon microscopique. Paludisme (malaria) Maladie transmise par des insectes, caractérisée par des épisodes récurrents de fièvre et d’anémie, provoquée par des protozaires du genre Plasmodium sp, généralement transmise entre mammifères par la piqûre de moustiques du genre Anopheles.

travers les siècles, les maladies transmises par des insectes telles que la peste et le paludisme ont tué des millions de personnes, modifiant le cours et l’évolution de l’histoire de l’humanité. Aujourd’hui, des maladies à transmission vectorielle telles que la maladie de Lyme, le syndrome respiratoire à hantavirus ou les infections à virus West Nile sont des maladies émergentes phares, même dans les régions les plus développées du monde. Les maladies transmises à partir du sol constituent également des problèmes majeurs parce que les micro-organismes du sol ne peuvent pas être effectivement contrôlés. Le tétanos, par exemple, bien que l’on puisse le prévenir efficacement, reste une maladie grave, menaçant la vie. Toutes ces maladies ont des réservoirs non humains. Dans ce chapitre, nous examinerons les agents pathogènes transmis par des animaux, par des vecteurs et à partir du sol, et les maladies dont ils sont responsables. Les hôtes naturels des agents pathogènes transmis par des animaux sont des vertébrés non humains. Lorsque les populations animales infectées entrent en contact avec des hommes, il en résulte souvent des infections humaines. Les agents pathogènes transmis par un vecteur sont propagés à d’autres hôtes par la piqûre d’un arthropode vecteur qui s’est récemment nourri sur un hôte infecté. Les humains sont souvent des hôtes accidentels du cycle naturel de ces agents pathogènes, mais ils peuvent aussi constituer un réservoir de la maladie, comme dans le cas du paludisme. Les agents pathogènes transmis à partir du sol rassemblent différents champignons, en même temps que des bactéries du genre Clostridium.

À

I

MALADIES TRANSMISES PAR DES ANIMAUX

Une zoonose est une maladie animale transmissible à l’homme par contact direct, aérosols ou morsures. La vaccination et les soins vétérinaires préviennent la plupart des maladies

Peste (plague) Maladie endémique chez les rongeurs due à Yersinia pestis, pouvant être occasionnellement transmise à l’homme par la piqûre d’une puce. Rage (rabies) Maladie neurologique habituellement fatale provoquée par le virus rabique, généralement transmise par la morsure ou la salive d’un animal infecté. Rickettsia Genre de parasites intracellulaires obligatoires responsables de maladies telles que le typhus, la fièvre pourprée des Montagnes Rocheuses et les ehrlichioses. Syndrome respiratoire à hantavirus (SRH) (hantavirus pulmonary syndrome, HPS) Maladie virale émergente caractérisée par une pneumonie et consécutive à la transmission d’un hantavirus provenant de rongeurs. Tétanos (tetanus) Maladie provoquant des contractures des muscles squelettiques, par action de l’exotoxine de Clostridium tetani. Thalassémie (thalasemia) Trait génétique qui confère une résistance au paludisme, mais provoque une diminution de l’efficacité des globules rouges en altérant une enzyme érythrocytaire. Typhus Maladie transmise par les poux, due à Rickettsia prowazekii, entraînant de la fièvre, des céphalées, un affaiblissement, une éruption, des lésions du système nerveux central et des viscères. Zoonose (zoonosis) Voir chapitre 25.

infectieuses chez les animaux domestiques, empêchant ainsi beaucoup de maladies zoonotiques d’atteindre l’homme. Toutefois, les animaux sauvages ne peuvent pas être immunisés, pas plus qu’ils ne reçoivent de soins vétérinaires. Les maladies dans ces populations surviennent de façon cyclique, périodique. Dans les paragraphes suivants, nous examinerons deux exemples importants de maladies transmises par des animaux, la rage et le syndrome pulmonaire à hantavirus.

27.1 Rage m n La rage est un modèle de maladie zoonotique qui se rencontre principalement chez les animaux, mais qui est propagé à l’homme, dans certaines conditions. Le réservoir principal de la rage aux États-Unis est constitué d’animaux sauvages, principalement des ratons laveurs, des mouffettes, des coyotes, des renards et des chauves-souris. Toutefois, dans un nombre de cas faible mais significatif, la contamination provient d’animaux domestiques (voir figure 27.1).

L’épidémiologie La rage est la principale maladie infectieuse évitable pour l’homme dans l’ensemble du monde. Et pourtant, environ 52 000 personnes en meurent chaque année, essentiellement dans les pays en voie de développement, où elle est endémique chez les animaux domestiques tels que le chien. Dans le monde, environ un million de personnes reçoivent annuellement un traitement antirabique à la suite de morsures d’animaux. La rage est provoquée par un membre de la famille des Rhabdoviridae (des virus à ARN de polarité négative – voir



27.1 Rage 897

Diagnostic, traitement et prévention

9 000

Nombre de cas

8 000

Total Animaux sauvages Animaux domestiques

7 000 6 000 5 000 4 000 3 000 2 000 1 000 0 1972

1977

1982

1987

1992

1997

2002

Année FIGURE 27.1 Cas de rage chez les animaux sauvages et domestiques aux États-Unis. Depuis 1990, il y a eu trente cas de rage chez l’homme, avec huit décès. La rage est endémique chez les populations d’animaux sauvages, particulièrement chez les ratons laveurs des États de l’Est. L’augmentation périodique du nombre de cas rapportés, faisant suite à plusieurs années de déclin, résulte de fluctuations chez la population hôte et à des décès provoqués par la rage. La population est décimée par l’infection et, pour plusieurs années, le nombre plus restreint d’hôtes empêche alors la diffusion de la rage et le nombre de cas diminue. Mais lorsque la population se reconstitue, la rage réémerge, le nombre de cas augmente et la population hôte diminue de nouveau, répétant le cycle. Plus de cinq cents cas de rage surviennent chaque année chez les animaux domestiques, pratiquement tous acquis par contact avec des animaux sauvages. Données fournies par les centres de contrôle et de prévention des maladies (CDC, Centers for Disease Control and Prevention), Atlanta, Géorgie, États-Unis.

section 16.9) qui infectent les cellules du système nerveux central de la plupart des animaux à sang chaud, conduisant inévitablement à la mort sans un traitement adéquat. Le virus est présent dans la salive des animaux rabiques, pénètre dans l’organisme à travers une plaie provoquée par une morsure ou par contamination d’une muqueuse par la salive infectée. Le virus rabique se multiplie au point d’inoculation, puis gagne le système nerveux central. La période d’incubation, avant l’apparition des symptômes, est extrêmement variable, dépendant de l’animal, de sa taille, de la localisation et de la profondeur de la blessure, et du nombre de particules virales transmises lors de la morsure. Chez le chien, la période d’incubation est en moyenne de dix à quatorze jours. Chez l’homme, neuf mois ou plus peuvent s’écouler avant que les symptômes de la rage n’apparaissent. Le virus se multiplie dans le cerveau (spécialement dans le thalamus et l’hypothalamus), entraînant de la fièvre, de l’agitation, une dilatation des pupilles, une hypersalivation et de l’anxiété. La crainte d’avaler (hydrophobie) résulte de spasmes incontrôlables des muscles de la gorge. Finalement, le décès survient par paralysie respiratoire. Chez l’homme, une infection rabique non traitée, évoluant vers le stade symptomatique, est presque toujours fatale.

Le diagnostic de rage est réalisé au laboratoire par l’examen d’échantillons de tissus. Des tests sérologiques par immunofluorescence (voir section 24.9) ou immunoperoxydase, utilisant des anticorps monoclonaux qui identifient dans le cerveau ou la cornée l’infection rabique, sont utilisés pour confirmer un diagnostic clinique de rage, que ce soit chez un animal potentiellement rabique ou lors de l’examen post mortem d’un cas humain. De plus, les inclusions virales caractéristiques observées dans le cytoplasme des cellules nerveuses et connues sous le nom de corps de Negri (voir figure 27.2), observées sur une biopsie ou post mortem, sont considérées comme des éléments permettant de confirmer la rage. La PCR après rétrotranscription et le séquençage sont également réalisés pour confirmer la présence d’une souche particulière de virus rabique dans un échantillon clinique. Du fait de la nature mortelle de la rage, le moindre contact avec un animal potentiellement rabique doit être pris sérieusement en considération. Un animal sauvage suspect de rage doit être capturé, sacrifié et immédiatement examiné pour rechercher la rage. Si un animal domestique, habituellement un chien, un chat ou un furet, mord un homme, et particulièrement si la morsure était inattendue, cet animal doit être maintenu pendant dix jours dans des conditions permettant de rechercher des signes cliniques de rage. Si l’animal est sauvage, manifestant des signes de rage, ou qu’une décision ne peut être prise après dix jours, le patient sera immunisé de façon passive par une immunoglobuline antirabique (anticorps antirabiques purifiés provenant d’un donneur hyperimmunisé) [voir section 22.13], injectée à la fois au niveau de la morsure et par voie intramusculaire. Le patient doit également

CDC/Mekonnen Fekadu/PHIL

10 000

FIGURE 27.2 Coupe histologique d’un cerveau humain atteint de rage, colorée à l’hématoxyline-éosine. La rage provoque la formation d’inclusions cytoplasmiques caractéristiques, connues sous le nom de corps de Negri. Elles apparaissent ici comme des masses de 2 à 3 µm de diamètre, colorées en rouge, nettement différenciées, grossièrement sphériques et siégeant dans le cytoplasme (flèche). Les corps de Negri contiennent les antigènes du virus rabique.



898 Chapitre 27

TABLEAU 27.1


DIRECTIVES EN CAS D’EXPOSITION HUMAINE AU VIRUS RABIQUE

Morsure inattendue par un animal domestique Animal suspect de rage

Animal non suspect de rage

1. Sacrifier l’animal et rechercher la rage.

1. Isoler dix jours. Si pas de symptômes, ne pas traiter.

2. Traiter la personne immédiatementa.

2. Si apparition de symptômes, traiter immédiatementa.

Morsure par un carnivore sauvage (mouffette, chauve-souris, renard, raton laveur, coyote) Considérer l'animal comme rabique 1. Sacrifier l’animal et rechercher la rage. 2. Traiter la personne immédiatementa. Morsure par rongeur sauvage, écureuil, bétail, lapin Consulter les autorités sanitaires locales sur l’éventualité de cas récents de rage transmis par ces animaux (rarement transmetteurs). S'il n’y a pas de cas avéré, ne pas traiter. a Toute plaie par morsure doit être soigneusement nettoyée au savon et à l’eau. Le traitement consiste généralement à associer des immunoglobulines antirabiques à un vaccin préparé sur des cellules diploïdes humaines.

être immunisé au moyen d’un vaccin antirabique inactivé. Un résumé des consignes à observer pour le traitement chez l’homme lors d’une exposition possible à la rage est donné dans le tableau 27.1. Du fait de la progression très lente de la rage chez l’homme, cette combinaison immunothérapeutique est pratiquement efficace à 100 %, stoppant le début de la maladie déclarée. La prophylaxie de la rage est largement assurée grâce à l’immunisation. Des vaccins antirabiques inactivés sont utilisés aux États-Unis à la fois pour l’immunisation de l’homme et pour celle des animaux domestiques, et une grande variété de préparations virales inactivées ou atténuées sont également utilisées dans le monde. Du fait de la longue période d’incubation, l’immunisation passive et active des individus potentiellement exposés est suffisante pour prévenir la maladie. Par conséquent, la vaccination antirabique préventive n’est généralement pas recommandée chez l’homme, à l’exception des individus à risque élevé, tels que les vétérinaires ou le personnel chargé du contrôle des animaux. Cette stratégie de prévention de la rage s’est montrée extrêmement efficace, et moins de trois cas de rage humaine sont rapportés annuellement aux États-Unis, résultant presque toujours de morsures d’animaux sauvages. Comme les animaux domestiques sont souvent en contact avec des animaux sauvages, tous les chiens et les chats doivent être vaccinés à partir de l’âge de 3 mois et une injection de rappel doit être administrée chaque année ou tous les trois ans. Les autres animaux domestiques, y compris ceux de la ferme, doivent aussi être immunisés. Toutefois, la clé d’une prévention efficace de la rage et de son éventuelle éradication, au moins pour les États-Unis, dépend du contrôle du vaste réservoir constitué par les animaux sauvages (voir figure 27.1) et de la capacité à les immuniser. Des vaccins subunitaires dans lesquels les gènes codant les protéines de surface du virus sont exprimés par le virus vaccinal recombinant (voir section 31.8) sont disponibles. Puisque des doses efficaces peuvent être administrées oralement, ces vaccins subunitaires ont été inclus dans des « appâts » alimentaires et utilisés pour immuniser les populations locales d’animaux sauvages, réduisant ainsi l’incidence et la diffusion de la rage. De tels vaccins

représentent des moyens absolument sans danger pour contrôler la rage des animaux sauvages et peuvent conduire à une éventuelle éradication.

Contrôlez vos acquis Primitivement, la rage sévit chez les animaux sauvages et c’est une importante zoonose endémique dans les pays en développement. Aux États-Unis, la rage est transmise aux animaux domestiques ou, très exceptionnellement, à l’homme, à partir du réservoir animal sauvage. La vaccination des chiens et des chats est une mesure efficace pour le contrôle de la rage. •

Quelle est la procédure à suivre pour traiter un homme mordu par un animal si celui-ci n’a pu être retrouvé ?

•

Quel avantage peut avoir un vaccin oral par rapport à un vaccin parentéral pour contrôler la rage des animaux sauvages ?

27.2 Syndrome pulmonaire m n à hantavirus Les hantavirus sont responsables d’un syndrome respiratoire aigu, le syndrome pulmonaire à hantavirus (SPH). Le nom des hantavirus leur provient de la rivière Hantaan, en Corée du Sud, où le virus responsable d’une épidémie de fièvre hémorragique a été reconnu initialement comme pathogène en 1976. Une épidémie d’hantavirose est apparue aux États-Unis en 1993, dans la région des Quatre Frontières entre l’Arizona, le Colorado, le Nouveau-Mexique et l’Utah, et fut associée à des souris sauvages (Peromyscus maniculatus). L’épidémie toucha 53 adultes et en tua 32, car l’on avait sous-estimé le danger potentiel représenté par des épidémies transmises directement à partir d’une grande variété de réservoirs animaux, survenant dans des circonstances nouvelles ou inhabituelles.



27.2 Syndrome pulmonaire à hantavirus 899

Les hantavirus sont proches d’autres virus responsables de fièvres hémorragiques tels que Lassa et Ebola (voir section 25.11), et tous sont transmis occasionnellement à l’homme à partir de réservoirs animaux. Le genre Hantavirus appartient à la famille des Bunyaviridae qui rassemble des virus à ARN simple brin enveloppé (voir section 16.8 et figure 27.3). Ces virus sont responsables soit du syndrome pulmonaire à hantavirus (SPH), soit de fièvre hémorragique avec syndrome rénal (FHSR).

L’épidémiologie

Le syndrome pulmonaire à hantavirus est caractérisé par de la fièvre survenant brutalement, des myalgies, de la thrombopénie, de la leucocytose et une fuite du plasma dans les poumons. Le décès survient en quelques jours dans 50 % des cas, habituellement du fait d’un choc et d’une défaillance cardiaque précipitée par un œdème pulmonaire (la fuite plasmatique dans les poumons provoquant l’asphyxie du malade). Ces symptômes sont caractéristiques de l’infection par l’hantavirus Sin Nombre qui a provoqué l’épidémie des Quatre Frontières, mais une grande variété de symptômes peut être observée suivant le virus responsable. Par exemple, le virus Bayou, qui infecte couramment les rongeurs du sud-est des États-Unis, entraîne aussi une défaillance rénale. Si l’hantavirus infectant peut être multiplié en cultures cellulaires (voir section 9.3), on pourra l’identifier par les techniques sérologiques comme le test de réduction-neutralisation des plages. Dans ce test, on recherche dans le sérum du patient les anticorps qui empêchent la formation des plages de lyse dans les cultures cellulaires (voir section 9.3). Il est plus facile d’utiliser un test immunoenzymatique ELISA pour déceler les anticorps spécifiques résultant d’une exposition au virus (voir section 24.10). La réaction de polymérisation en chaîne (PCR) appliquée aux tissus ou au sang du malade permet d’y déceler le génome viral et d’affirmer l’infection. Il n’existe aucun traitement spécifique ou vaccin contre les hantavirus. Toutefois, on peut se protéger de la maladie en évitant les contacts avec les rongeurs ou leur habitat, puisque la transmission est habituellement assurée par les excréments des rongeurs. On peut réduire cette exposition en détruisant l’habitat des souris, en limitant leur accès à la nourriture (par exemple en enfermant celle-ci dans des récipients clos) et par des mesures de destruction des rongeurs. Toutefois, les chances de succès à long terme des mesures visant à éradiquer la maladie sont faibles, car un pourcentage considérable de

(a)

Natalie Dolan, CDC

Cynthia Goldsmith et Luanne Elliot, CDC

Les hantavirus infectent habituellement des rongeurs tels que des souris et des rats d’espèces diverses, des lemmings et des campagnols, et éventuellement d’autres animaux. Les souches responsables de FHSR sont communes dans l’hémisphère oriental et elles ont été récemment responsables de plusieurs épidémies. Jusqu’à 200 000 cas sont enregistrés chaque année, principalement en Chine, en Corée et en Russie. Les souches responsables du SPH sont surtout présentes dans l’hémisphère occidental, et les recherches poursuivies sur l’écologie de ces virus conduiront vraisemblablement à découvrir d’autres souches pathogènes. En France, quelques cas de FHSR ont été enregistrés dans le nord-est du pays. Les hantavirus sont transmis le plus souvent par inhalation d’excréments de rongeurs infectieux. L’homme est un hôte accidentel et il n’est infecté que lorsqu’il entre en contact avec des rongeurs et leurs fèces. Par exemple, les personnes qui ont contracté un SPH lors de l’épidémie des Quatre Frontières avaient été en contact avec des souris et avec leurs crottes, à la suite d’un hiver pluvieux et d’une prolifération inhabituelle de ces rongeurs en 1993 (voir section 21.11). La contamination par aérosols est la plus courante et ces aérosols se constituent à partir des crottes et des urines des souris. Toutefois, il existe de rares observations de transmission interhumaine, de même que quelques cas de transmission d’un SPH ou d’une FHSR après morsure de rongeurs.

Pathologie, diagnostic, traitement et prévention

(b)

FIGURE 27.3 Hantavirus. (a) Image de l’hantavirus Sin Nombre en microscopie électronique. La flèche indique l’un des nombreux virions. Le virus a un diamètre d’environ 0,1 µm. (b) Immunomarquage des antigènes de l’hantavirus Andes dans des macrophages alvéolaires. Chaque zone granuleuse marquée en rouge foncé correspond à l’infection d’un macrophage particulier (d’un diamètre d’environ 15 µm). Les hantavirus appartiennent à la famille des Bunyaviridae et, comme beaucoup de virus similaires phylogénétiquement apparentés (par exemple les virus de la vallée du Rift et Ebola), ils provoquent des fièvres hémorragiques avec des taux de létalité très élevés.



900 Chapitre 27


rongeurs était infecté dans la région des Quatre Frontières en 1993, où 30 % des souris hébergeaient le virus Sin Nombre.

Contrôlez vos acquis Les hantavirus infectent des populations de rongeurs dans le monde entier et provoquent des maladies graves, telles que le syndrome respiratoire à hantavirus (SRH), lorsqu’ils atteignent accidentellement l’homme. Aux États-Unis, les infections à hantavirus n’avaient pas été identifiées avant 1993. •

Pourquoi les hantavirus n’ont-ils pas été identifiés comme un problème majeur de santé publique avant 1993 ?

•

Décrivez la façon dont les hantavirus infectent l’homme. Quelles sont les mesures effectives pour se protéger des infections à hantavirus ?

II

MALADIES TRANSMISES PAR DES ARTHROPODES

Des agents pathogènes peuvent être transmis à un hôte par la piqûre d’un arthropode vecteur infecté. Dans plusieurs cas, comme dans les rickettsioses, l’homme est un hôte accidentel. Mais il peut aussi jouer un rôle essentiel dans le cycle évolutif de l’agent pathogène, comme dans le paludisme.

27.3 Rickettsioses m n Les rickettsies sont de petites bactéries du domaine des Bacteria à développement intracellulaire obligatoire chez les vertébrés, habituellement des mammifères. Elles sont aussi associées à certains moments de leur cycle naturel à des arthropodes hématophages comme les puces, les poux ou les tiques. La biologie des rickettsies a été discutée en section 12.13. Elles provoquent diverses maladies chez l’homme et chez les animaux, dont les plus importantes sont le typhus épidémique, la fièvre pourprée des Montagnes Rocheuses et l’ehrlichiose. Les rickettsies tirent leur nom de Howard Ricketts, un scientifique de l’université de Chicago, qui les a mises en évidence le premier et qui mourut d’une infection accidentelle à Rickettsia prowazekii, l’agent du typhus épidémique. Les rickettsies n’ont jamais été cultivées en milieux artificiels, mais elles peuvent être multipliées chez des animaux de laboratoire, des poux, des cultures cellulaires et le sac vitellin de l’œuf de poule embryonné. Chez les animaux, leur multiplication a lieu principalement dans les phagocytes (voir section 22.1). Bien que les rickettsies n’aient jamais été obtenues en cultures pures, le génome de 1,1 Mpb de Rickettsia prowazekii a été séquencé (voir section 15.5). En se basant sur des homologies avec d’autres séquences génomiques, on a montré que ces parasites intracellulaires sont étroitement apparentés aux mitochondries humaines. Comme pour les mitochondries, le génome des rickettsies est réduit à un ensemble de gènes adaptés à la vie intra-

cellulaire. Les rickettsies ne disposent pas de beaucoup de gènes nécessaires à un métabolisme énergétique indépendant et à la biosynthèse structurale. Le génome des rickettsies contient aussi des gènes de virulence étroitement apparentés à l’opéron vir B d’Agrobacterium tumefaciens, un pathogène des végétaux (voir section 19.21). Cet opéron code des facteurs de virulence impliqués dans le transfert de l’ADN et les systèmes d’exportation des protéines. Ainsi, la séquence génomique de R. prowazekii apporte la preuve de la dépendance intracellulaire et de la virulence de ces agents. Les rickettsies sont divisées en trois groupes, indépendants de la maladie clinique dont ils sont responsables : 1) le groupe typhus, avec comme espèce type Rickettsia prowazekii, 2) le groupe fièvres pourprées, avec comme espèce type Rickettsia rickettsii et 3) le groupe ehrlichiose, avec comme espèce type Ehrlichia chaffeensis. Nous allons examiner un exemple pour chacun de ces groupes.

Le groupe typhus : Rickettsia prowazekii Le typhus épidémique est provoqué par Rickettsia prowazekii. Il est transmis d’un homme à un autre par les poux de corps et de tête. L’homme est le seul hôte commun parmi les mammifères. Pendant la Première Guerre mondiale, une épidémie s’est développée dans toute l’Europe de l’Est, provoquant la mort d’à peu près trois millions de personnes. Le typhus épidémique a été un problème fréquent pour les troupes en temps de guerre. Du fait du manque d’hygiène, de la promiscuité propre aux opérations militaires, notamment d’infanterie, les poux se propageaient facilement parmi les soldats et le typhus a atteint des proportions épidémiques. R. prowazekii pénètre à travers la peau lorsque le point de piqûre du pou est souillé par les excréments du pou, très riches en rickettsies. Pendant la période d’incubation, qui dure d’une à trois semaines, l’organisme se multiplie dans les cellules bordant les petits vaisseaux sanguins. Les symptômes du typhus épidémique (fièvre, céphalées et faiblesse générale) commencent alors à apparaître. Cinq à neuf jours plus tard, une éruption caractéristique débute au niveau des aisselles, s’étend habituellement à l’ensemble du corps, à l’exception de la face, de la paume des mains et de la plante des pieds. En l’absence de traitement, des complications peuvent survenir, touchant le système nerveux central, les poumons, les reins et le cœur. Le typhus épidémique a un taux de létalité de 6 à 30 %. La tétracycline et le chloramphénicol sont les antibiotiques les plus couramment utilisés pour traiter les infections à R. prowazekii. Rickettsia typhi, l’agent du typhus murin, est un autre membre du groupe typhus.

Le groupe fièvres pourprées : Rickettsia rickettsii La fièvre pourprée des Montagnes Rocheuses fut d’abord identifiée dans l’ouest des États-Unis vers 1900, mais elle est actuellement plus répandue dans le sud-est du pays. Elle est provoquée par Rickettsia rickettsii et est transmise à l’homme par différentes tiques du chien ou de la forêt. Son incidence est relativement faible, mais entre cinq cents et mille personnes sont infectées chaque année. L’homme acquiert cette rickettsiose lors de la morsure d’une tique infectée ou à la suite du grattage de la peau souillée par les déjections infectieuses de la tique. R. rickettsii, à la différence des autres rickettsies, se



développe à la fois dans le noyau et dans le cytoplasme de la cellule hôte (voir figures 27.4a et 27.4b). Après une incubation de trois à douze jours, le début de la maladie est brutal avec l’apparition de fièvre et d’une forte céphalée. Dans les trois à cinq jours, survient une éruption qui atteint tout le corps (voir figure 24.4c). On relève habituellement des troubles digestifs de type diarrhée et vomissements, et les symptômes de la maladie peuvent persister jusqu’à deux semaines si le patient n’est pas traité. La tétracycline et le chloramphénicol sont les antibiotiques qui assurent généralement une guérison rapide, à condition d’être administrés précocement. Mais même chez les malades traités, la létalité se situe autour de 5 %. Elle atteint 30 % en l’absence de traitement.

Willy Burgdorfer

27.3 Rickettsioses 901

(a)

(b)

Kenneth E. Greer, Univ. of Virginia School of Medicine

Le genre Ehrlichia (voir section 12.13) est responsable de deux maladies émergentes transmises par des tiques aux ÉtatsUnis, l’ehrlichiose monocytaire humaine (EMH) et l’ehrlichiose granulocytaire humaine (EGH). Les rickettsies responsables de ces maladies sont respectivement Ehrlichia chaffeensis et un agent très proche, Ehrlichia equi. Le début de ces ehrlichioses, cliniquement indiscernables, est de type pseudo-grippal, avec de la fièvre, des céphalées, un malaise et, fréquemment, de la leucopénie ou de la thrombopénie. Les examens de laboratoire montrent habituellement une altération des fonctions hépatiques avec une augmentation des transaminases hépatiques. De plus, les leucocytes du sang périphérique contiennent des inclusions riches en Ehrlichia (voir figure 27.5). Les symptômes, mis à part la présence d’inclusions, sont identiques à ceux des autres rickettsioses, mais le genre Ehrlichia est antigéniquement distinct de celui des autres rickettsies. Dans leur expression clinique, ces infections varient de la forme inapparente à la forme mortelle. Les complications à long terme des cas non traités sont représentées par de l’insuffisance respiratoire ou rénale et des atteintes neurologiques sérieuses. Le diagnostic est établi sur un test d’immunofluorescence indirect (voir section 24.9) appliqué au sérum des malades et sur la PCR, cette dernière étant effectuée sur sang total ou sérum afin de déceler l’ADN d’Ehrlichia (voir section 24.12). Les ehrlichioses sont propagées par la morsure des tiques infectées, les mammifères réservoirs étant le daim et probablement des rongeurs, ainsi que l’homme. Des enquêtes sérologiques rétrospectives, effectuées dans des zones à incidence relativement élevée de maladie transmise par des tiques, ont montré que l’EGH peut avoir une prévalence plus forte que celle de la fièvre pourprée des Montagnes Rocheuses. Depuis 1998, les ehrlichioses sont des maladies à déclaration obligatoire aux États-Unis (voir section 25.9). En moyenne, quelque cinq cents cas sont déclarés chaque année. L’EGH est responsable d’environ 60 % des cas et l’EMH de 40 %. Les ehrlichioses seront plus fréquemment déclarées lorsque les médecins seront plus familiarisés avec cette maladie émergente. Comme pour les autres maladies transmises par des tiques, les activités extérieures dans des zones infestées de tiques représentent le principal facteur prédisposant à l’acquisition d’une ehrlichiose. Les golfeurs et les randonneurs sont particulièrement exposés. La prévention des ehrlichioses consiste à éviter de s’exposer aux tiques et à leurs morsures en portant des vêtements protecteurs et en utilisant des répulsifs

Willy Burgdorfer

Le groupe ehrlichiose : Ehrlichia

(c) FIGURE 27.4 Rickettsia rickettsii, l’agent étiologique de la fièvre pourprée des Montagnes Rocheuses. (a) Cellules de R. rickettsii se multipliant dans le cytoplasme et le noyau d’hématocytes de tiques. Les cellules rickettsiennes ont un diamètre de 0,4 µm. (b) Cellules de R. rickettsii dans un hémocyte granuleux d’une tique forestière infectée, Dermacentor andersoni. Microscopie électronique à transmission. (c) Éruption cutanée de la maladie au niveau des pieds. L’apparition d’une éruption recouvrant entièrement le corps est en faveur d’une fièvre pourprée des Montagnes Rocheuses et permet de différencier cliniquement cette maladie du typhus, dans lequel l’éruption n’est pas généralisée. Les rickettsies sont de petites bactéries à développement intracellulaire obligatoire dans les cellules de mammifères. Leur métabolisme dépend de celui de l’hôte (voir section 12.13). Le génome de R. rickettsii, dont la taille est de 1,1 Mpb, a été séquencé (voir section 15.5).



902 Chapitre 27


est le test sérologique de choix (voir section 24.9). Les infections à C. burnetii réagissent généralement bien à la tétracycline, mais le traitement doit être entrepris rapidement en cas de suspicion de fièvre Q, afin d’éviter toute attaque cardiaque. La fièvre Q est une des maladies infectieuses étudiées en vue de la guerre biologique (voir section 25.12). Le Scrub typhus (« typhus des broussailles »), ou tsutsugamushi, provoqué par Orientia tsutsugamushi est géographiquement limité à l’Asie, au sous-continent indien et à l’Australie. Bien que la maladie ressemble au typhus, elle est transmise par des acariens chez ses hôtes naturels, des rongeurs.

D. H. Walker

Diagnostic et prévention

FIGURE 27.5 Ehrlichia chaffeensis, l’agent étiologique de l’ehrlichiose monocytaire humaine (EMH). L’image montre les inclusions provoquées dans un monocyte humain par l’accumulation d’E. chaffeensis en microscopie électronique. Les flèches indiquent deux des nombreuses bactéries formant chaque inclusion. Les cellules d’E. chaffeensis ont un diamètre de 300 à 900 nm.

Dans le passé, le diagnostic des rickettsioses était difficile parce que leur éruption pouvait être confondue avec celles de la rougeole, de la scarlatine ou d’une intolérance médicamenteuse. Leur diagnostic est aujourd’hui facilité par l’emploi de tests immunologiques et moléculaires spécifiques. C’est le cas pour l’agglutination de microbilles de latex sensibilisées, pour la réaction immunoenzymatique ELISA (voir sections 24.8, 24.9 et 24.10) et pour la PCR (voir section 24.12). La prévention de la plupart des rickettsioses passe par le contrôle de leurs vecteurs : poux, puces et tiques. Pour les personnes fréquentant des régions boisées ou herbeuses, l’emploi de répulsifs contenant du diéthyl-m-toluamide (DEET) évite habituellement la fixation des tiques. Les tiques solidement fixées doivent être retirées doucement avec des pinces, en prenant la précaution de bien extraire les pièces buccales. L’éthanol appliqué sur la tique au moyen d’un écouvillon accélère le détachement. Bien qu’il existe un vaccin contre le typhus, les rares cas de cette maladie déclarés aux États-Unis ne justifient pas son administration généralisée. Il n’y a pas de vaccin contre la fièvre pourprée des Montagnes Rocheuses ou les ehrlichioses.

contenant du diéthyl-m-toluamide (DEET). Au niveau communautaire, on peut réduire la densité des tiques par l’usage d’acaricides (composés chimiques toxiques pour les tiques et les acariens) et par l’élimination des repaires de tiques tels que les tas de feuilles et les broussailles. La doxycycline est l’antibiotique de choix dans le traitement des ehrlichioses.


Les autres maladies rickettsiennes

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Quels sont les arthropodes vecteurs et les animaux hôtes du typhus, de la fièvre pourprée des Montagnes Rocheuses et des ehrlichioses ?

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Quelles précautions doit-on prendre pour éviter les infections à rickettsies ?

La fièvre Q est une infection provoquant souvent une pneumonie. Elle est due à un micro-organisme intracellulaire obligatoire, Coxiella burnetii, proche des rickettsies (voir section 12.13). Bien qu’elle ne soit pas transmise directement à l’homme par la piqûre d’un arthropode, C. burnetii est transmise aux animaux par des arthropodes qui servent de réservoirs à l’infection. Les animaux domestiques présentent généralement des infections inapparentes, mais ils éliminent d’importantes quantités de C. burnetii par l’urine, les fèces et d’autres fluides organiques. Les contacts avec des animaux ou des produits d’origine animale sont à l’origine des infections humaines. La maladie de type pseudo-grippal qui en résulte peut évoluer vers un état fébrile prolongé, céphalalgique, s’accompagnant de frissons et de douleurs thoraciques, et vers la pneumonie et l’endocardite. Le diagnostic biologique fait appel à un certain nombre de tests immunologiques. L’immunofluorescence indirecte (IFI)

Les rickettsies sont des Bacteria à développement intracellulaire obligatoire, transmises par des arthropodes. La plupart des infections rickettsiennes sont traitées efficacement par certains antibiotiques.

27.4 Maladie de Lyme m n La maladie de Lyme est une infection émergente transmise par des tiques, affectant l’homme et les animaux. Elle tire son nom du comté de Old Lyme, dans le Connecticut, où les premiers cas furent reconnus. C’est l’infection transmise par les tiques la plus fréquente aux États-Unis. Elle est provoquée par le spirochète Borrelia burgdorferi (voir figure 27.6 et section 12.33) qui est propagé par la tique du daim, Ixodes



Dano Corwin

27.4 Maladie de Lyme 903

FIGURE 27.6 Image en microscopie électronique du spirochète de Lyme, Borrelia burgdorferi. Le diamètre d’une cellule individuelle est approximativement de 0,4 µm.

scapularis (voir figure 27.7). Les tiques qui hébergent B. burgdorferi se nourrissent de sang d’oiseaux, d’animaux domestiques, d’animaux sauvages et de sang humain.

L’épidémiologie

Pfizer Research

Les daims et les souris champêtres sont les réservoirs primaires de B. burgdorferi dans le nord-est des États-Unis. Toutefois, dans d’autres régions du pays, d’autres espèces de rongeurs et de tiques sont impliquées dans la transmission. Dans l’ouest des États-Unis, Ixodes pacificus et un rat forestier sont respectivement le vecteur et l’hôte habituels de l’infection. La maladie de Lyme a également été identifiée en Europe et en Asie. En Europe c’est Ixodes ricinus qui héberge Borrelia

FIGURE 27.7 Tiques du daim (Ixodes scapularis), les vecteurs principaux de la maladie de Lyme. De gauche à droite, tiques adultes mâle et femelle, nymphe et larve. La taille d’une femelle est d’environ 3 mm. Toutes ces formes se nourrissent sur l’homme et sont capables de lui transmettre Borrelia burgdorferi.

garinii, un micro-organisme proche et responsable de symptômes voisins. En Asie, c’est Borrelia afzelli, transmis par Ixodes persulcatus. Dans ces circonstances, d’autres rongeurs ont été identifiés comme réservoirs locaux de la maladie. Ainsi, la maladie de Lyme connaît une large distribution géographique. Elle est provoquée par des Borrelia étroitement apparentés, transmis par des tiques voisines et a pour réservoir différents rongeurs et autres mammifères. La tique du daim et les autres espèces du genre Ixodes ont une taille plus réduite que celle de la plupart des autres espèces, ce qui les rend difficiles à repérer (voir figure 27.7). À la différence d’autres maladies à tique, un pourcentage très élevé de tiques du daim (jusqu’à 50 % dans certaines régions du Nord-Est des États-Unis) héberge B. burgdorferi. Les contacts fréquents avec des tiques infectées augmentent la probabilité de contracter l’infection. Aux États-Unis, la plupart des cas ont été déclarés dans le Nord-Est et le Middle West septentrional, mais des cas ont été observés dans presque tous les États, tandis que la maladie gagne du terrain vers l’est et vers le sud. La figure 27.8 montre cette diffusion sur l’ensemble des États-Unis et l’augmentation rapide du nombre total de cas annuels.

La pathogénie B. burgdorferi est transmis à l’homme lors d’un repas sanguin de la tique (voir figure 27.9a). Il s’ensuit une infection systémique se traduisant par des céphalées, des lombalgies, des frissons et de la fatigue. Dans environ 75 % des cas, une éruption localisée, connue sous le nom d’erythema migrans (EM) est observée au point de fixation de la tique (voir figure 27.9b). À ce stade, la maladie peut être traitée par la tétracycline ou la pénicilline. Sans traitement, la maladie peut évoluer vers la chronicité et se prolonger pendant des semaines ou des mois après la morsure de la tique. La maladie de Lyme chronique se caractérise par des arthrites frappant 40 à 60 % des malades. Les atteintes neurologiques de type paralysies, faiblesse des membres inférieurs ou paralysie faciale à tiques peuvent survenir chez 15 à 20 % des malades. Les atteintes tardives se voient chez 8 % de l’ensemble des malades. Chez les patients non traités, B. burgdorferi, infectant le système nerveux central, peut demeurer sous forme latente pendant de longues périodes avant que n’apparaisse une grande variété de symptômes additionnels de l’infection chronique : troubles de la vue, paralysie faciale ou crise épileptiforme. Aucune toxine ni aucun facteur de virulence n’ont jusqu’à présent été identifiés pour expliquer la pathogénie. Par bien des aspects, la maladie de Lyme latente ressemble à la syphilis latente, bien que cette dernière soit due à un autre spirochète, Treponema pallidum. Bien plus, certains symptômes de la maladie de Lyme ressemblent à ceux de la syphilis chronique (voir section 26.12). Toutefois, à la différence de la syphilis, la maladie de Lyme n’est pas transmise lors des rapports sexuels ou d’autres contacts entre humains. Un petit nombre de B. burgdorferi est éliminé par les urines des sujets infectés et il existe de fortes présomptions que la maladie puisse se propager chez les animaux domestiques, notamment le bétail, par les urines infectées.




Nombre de cas (en milliers)

904 Chapitre 27

0 1-14 ≥15

24 22 20 18 16 14 12 10 8 6 4 2 0

1982 1984 1986 1988 1980 1992 1994 1996 1998 2000 2002

Année (a)

(b)

FIGURE 27.8 La maladie de Lyme aux États-Unis. (a) Incidence de la maladie de Lyme aux États-Unis en 2002. Chaque comté ayant déclaré des cas en 2002 est indiqué ; les comtés ayant déclaré plus de quinze cas apparaissent en rouge. La maladie de Lyme, bien que plus fortement prévalente dans le Nord-Est et la partie septentrionale du Middle West, est répandue sur l’ensemble des ÉtatsUnis. (b) Nombre de cas déclarés par année aux États-Unis. En 2002, il y a eu 23 763 cas, plus que lors d’aucune autre année précédente. La maladie de Lyme est déclarée par l’intermédiaire du Système national de surveillance des maladies à déclaration obligatoire des centres de contrôle et de prévention des maladies.

Pfizer Research

Le diagnostic

Pfizer Research

(a)

(b) FIGURE 27.9 Maladie de Lyme. (a) Tique du daim prenant un repas sanguin sur l’homme. (b) Éruption circulaire caractéristique de la maladie de Lyme. Cette éruption, connue comme erythema migrans (EM), débute de façon typique au niveau de la morsure de la tique et se développe de façon concentrique pendant plusieurs jours. Cet exemple typique d’EM mesure environ 5 cm.

Des tests sérologiques ont été mis au point pour la détection des anticorps dirigés contre B. burgdorferi. Ceux-ci apparaissent quatre à six semaines après l’infection et peuvent être mis en évidence par un test immunoenzymatique ELISA ou un test d’imunofluorescence (voir sections 24.9 et 24.10). Toutefois, le test confirmatif est le Western blot (voir section 24.11). Du fait de la persistance pendant des années des anticorps après l’infection, leur présence n’indique cependant pas que les malades sont immunisés ni qu’ils présentent une infection récente. Un test PCR (voir section 24.12) est également utilisable pour la détection de B. burgdorferi dans les liquides biologiques ou les tissus. Bien qu’il s’agisse de tests rapides et sensibles, les méthodes de PCR ne permettent pas de distinguer les B. burgdorferi vivants des B. burgdorferi morts trouvés dans les formes traitées ou inactives de la maladie. Dans presque 80 % des cas, B. burgdorferi peut être cultivé à partir des lésions initiales de l’érythème migrant, mais cette culture est rarement pratiquée parce que le micro-organisme se multiplie très lentement et nécessite des milieux de culture hautement spécialisés. Finalement, le diagnostic est généralement posé après examen clinique. Si un patient présente des symptômes typiques et qu’il a été exposé récemment à la morsure d’une tique, surtout s’il y a eu un érythème migrant, un diagnostic présomptif peut être posé et le traitement antibiotique peut être commencé.

Prévention et traitement La prévention de la maladie de Lyme consiste à éviter la fixation des tiques. Dans les régions infestées telles que les bois, les hautes herbes et les feuillus, il est souhaitable de porter des vêtements fermés, des pantalons longs, des manches



27.5 Paludisme 905

longues et un col montant serré. Le geste de rentrer ses bas de pantalons dans des chaussettes serrées introduites dans des chaussures fermées constitue une mesure efficace contre les tiques. Après avoir fréquenté une zone infestée, chacun doit procéder à un examen attentif de sa peau et à l’extraction immédiate de toute tique fixée, y compris de la tête. Les répulsifs contenant du diéthyl-m- toluamide (DEET) sont très efficaces si on les utilise à la fois sur la peau et sur les vêtements. Un vaccin à usage humain efficace contre la maladie a dû être retiré du marché en 2001 car il n’avait pas de succès et entraînait des effets secondaires. Il existe aussi un vaccin à usage vétérinaire. Le traitement de la maladie de Lyme consiste à administrer de la doxycycline (voir section 20.9) ou de l’amoxicilline (une β-lactamine – voir section 20.8) pendant vingt à trente jours. Une arthrite de Lyme installée ou tout autre symptôme d’une infection chronique à B. burgdorferi seront traités par des doses élevées de pénicilline ou de ceftriaxone, une β-lactamine qui franchit la barrière hémoméningée et attaque les spirochètes installés dans le système nerveux central. L’arthrite chronique de Lyme sera traitée par doxycycline ou amoxicilline associée au probénécide, une substance qui maintient des taux sériques élevés de cet antibiotique pendant trente jours ou plus.

Contrôlez vos acquis La maladie de Lyme est actuellement la maladie transmise par des arthropodes la plus fréquente aux ÉtatsUnis. Elle est transmise à partir de nombreux hôtes mammifères et par des tiques. La prévention et le traitement de cette maladie sont bien codifiés, mais un bon diagnostic précoce reste problématique. •

Quels sont les symptômes initiaux de la maladie de Lyme ?

•

Quels antibiotiques peuvent être utilisés dans le traitement de cette maladie ?

27.5 Paludisme m n Le paludisme est une maladie due à un protozoaire appartenant au groupe des apicomplexés (voir section 14.10). Le parasite du paludisme est l’un des agents pathogènes les plus importants pour l’homme, et il a joué un rôle décisif dans le développement de la culture humaine. Le paludisme reste une maladie d’importance majeure même s’il existe plusieurs traitements efficaces. Plus de cent millions de personnes sont touchées dans le monde, et chaque année plus d’un million en meurent (voir section 25.1). Le réservoir vertébré du paludisme est purement humain. Le parasite le plus répandu est Plasmodium vivax et le plus dangereux est Plasmodium falciparum. Ces parasites effectuent une partie de leur cycle vital chez l’homme et une autre partie chez le moustique vecteur qui les transmet d’une personne à une autre. Seuls les moustiques femelles du genre Anopheles transmettent le paludisme (voir figure 27.12a).

L’épidémiologie Les moustiques du genre Anopheles étant abondants dans les pays chauds, on rencontre le paludisme principalement dans les régions tropicales et subtropicales. Le paludisme n’existait pas dans les régions septentrionales de l’Amérique du Nord avant l’arrivée des Européens, mais constituait un problème sanitaire majeur dans le Sud. La maladie est associée à de basses terres humides et le mot malaria dérive de l’italien « mauvais air ». Le cycle vital des parasites du paludisme est complexe (voir figure 27.10). Initialement, le sujet réceptif est infecté par des sporozoïtes, de petites cellules allongées produites et localisées dans les glandes salivaires du moustique. Le moustique injecte sa salive anticoagulante en même temps que les sporozoïtes. Par la circulation sanguine, ceux-ci gagnent le foie, où ils peuvent rester quiescents ou se multiplier en augmentant de taille pour donner des schizontes. Les schizontes se divisent alors en un certain nombre de cellules plus petites, les mérozoïtes, et ceuxci sont libérés par le foie dans la circulation sanguine. Ces mérozoïtes infectent alors les globules rouges ou érythrocytes. Le cycle parasitaire intraérythrocytaire de P. vivax se répète à des intervalles réguliers de quarante-huit heures, pendant lesquels les signes cliniques du paludisme apparaissent sous forme de frissons, suivis de fièvre pouvant atteindre 40 °C (104 °F). L’alternance de frissons et de fièvre découle de la libération synchrone des mérozoïtes de P. vivax à partir des érythrocytes, au cours de ce cycle de reproduction asexué. Des vomissements et des céphalées sérieuses peuvent accompagner les cycles frissons-fièvre, et des périodes asymptomatiques alternent généralement avec des périodes symptomatiques. Du fait de la destruction des érythrocytes, le paludisme provoque habituellement de l’anémie et de la splénomégalie.

Diagnostic et traitement L’établissement d’un diagnostic ferme de paludisme chez l’homme requiert l’identification du Plasmodium sur frottis sanguin (voir figure 27.11). La détection de l’acide nucléique par la fluorescence, l’hybridation moléculaire, la PCR ou la détection des antigènes spécifiques sont des méthodes susceptibles de confirmer les infections par Plasmodium ou de différencier les différentes espèces plasmodiales. La prophylaxie (pour les sujets voyageant en zone d’endémie) et le traitement du paludisme font habituellement appel à la chloroquine. Ce médicament détruit les parasites intraérythrocytaires, mais pas ceux qui se développent en dehors des hématies. Un médicament voisin, dénommé primaquine, élimine les sporozoïtes, les mérozoïtes et les gamètes en dehors des hématies. Le traitement associant chloroquine et primaquine est curatif. Toutefois, même chez les patients ayant reçu ce traitement, des récurrences du paludisme peuvent survenir. Apparemment, un petit nombre de sporozoïtes survit dans le foie et se trouve à l’origine de ces récurrences plusieurs mois ou années après la primo-infection. Dans plusieurs régions du monde, les Plasmodium ont développé des résistances à la chloroquine, à la primaquine ou à ces deux médicaments. Il sera alors nécessaire d’utiliser dans ces régions de la méfloquine ou de la doxycycline en chimioprophylaxie, et du malarone (un combiné d’atovaquone et de



906 Chapitre 27

Maladies microbiennes transmises par des animaux, par des arthropodes ou d’origine tellurique Croissance Développement des sporozoïtes

Fécondation

Maturation des gamètes chez le moustique Transmission par la piqûre de moustique

Formation des gamètes

Libération des sporozoïtes Évolution chez le moustique Transmission par la piqûre du moustique. Les sporozoïtes sont transférés du sang vers le foie

Évolution chez l’homme

Le sporozoïte pénètre dans une cellule hépatique Foie Cycle érythrocytaire Les mérozoïtes infectent les globules rouges et s’y reproduisent

Cycle exoérythrocytaire Formation de schizontes et de mérozoïtes

Infection des globules rouges

FIGURE 27.10 Cycle de Plasmodium vivax, un parasite du paludisme. Le genre Plasmodium comprend les protozoaires (voir section 14.10), pathogènes du paludisme, qui ont tous un cycle parasitaire dépendant pour leur croissance à la fois d’un hôte à sang chaud et d’un moustique vecteur. C’est la piqûre d’un moustique qui assure la transmission du protozoaire à un hôte à sang chaud et à partir de celui-ci.

proguanyl) à la fois dans le traitement et pour la chimioprophylaxie. Une nouvelle classe de médicaments est constituée de dérivés synthétiques de l’artémisine, une substance naturelle d’origine végétale qui contient des groupements peroxydes générateurs de radicaux libres. Ces dérivés ont une activité antiparasitaire in vivo et font actuellement l’objet d’essais cliniques.

T. D. Brock

Globules rouges infestés

FIGURE 27.11 Plasmodium vivax, l’un des agents étiologiques du paludisme. Le parasite se multiplie à l’intérieur des globules rouges.

La prévention L’emploi des antipaludéens est une solution coûteuse et de court terme pour la prévention et le contrôle du paludisme, tandis que les résistances des souches de parasites compliquent davantage le problème. La méthode la plus efficace de contrôle consiste à interrompre la transmission chez le moustique Anopheles. Deux approches dans le contrôle des moustiques sont possibles : 1) l’élimination de leur habitat par le drainage des marécages et la destruction des autres gîtes ou 2) l’élimination des moustiques eux-mêmes par des insecticides, suivie par le traitement des malades par la primaquine. Au cours des années 1930, environ 53 000 km de canaux ont été construits dans seize États du sud des États-Unis, éliminant 2,2 millions de km2 de gîtes larvaires. Des millions de litres de pétrole ont été déversés à la surface des marécages privant les larves de moustiques d’oxygène. Avec la découverte de l’insecticide dichlorodiphényl-trichloréthane, ou DDT (voir figure 19.49), le contrôle chimique des larves et des moustiques adultes est devenu possible. Pendant la Seconde Guerre mondiale, les services de la Santé publique ont créé un office pour le contrôle des moustiques dans les zones d’opérations, et comme beaucoup de troupes américaines étaient stationnées dans les États du Sud, cette organisation a réalisé un programme soutenu d’éradication du paludisme tant aux États-Unis qu’outremer. En 1946, année où il y a eu 48 000 cas aux États-Unis, le Congrès a établi un programme d’éradication sur cinq ans. Dans la zone d’endémie, ce programme associait l’usage des antipaludéens chez les individus et du DDT pour la lutte antimoustiques. En 1953, il n’y avait plus que 1 310 cas déclarés.



27.5 Paludisme 907

Alors qu’en 1935 on avait déploré environ 4 000 décès par paludisme, ce chiffre n’était plus que de 25 en 1952. Bien que le poids sanitaire du paludisme aux États-Unis soit actuellement minime, quelques cas sont réapparus ces dernières années y compris dans la ville de New York. Une augmentation périodique de l’incidence du paludisme peut aussi provenir de militaires ou d’immigrants venant de zones d’endémie. En moyenne, quelque 1 500 cas de paludisme et cinq décès surviennent aux États-Unis chaque année. Dans d’autres régions du monde, l’éradication n’est pas effective bien que les mêmes mesures de contrôle soient appliquées. La destruction des gîtes larvaires, le contrôle des adultes par les insecticides et l’emploi d’antipaludéens à la fois en chimioprophylaxie et pour le traitement des malades, sont encore de bonnes stratégies pour lutter contre le paludisme. Plusieurs vaccins contre cette maladie sont en cours de développement : vaccins à base de peptides synthétiques, recombinants ou à ADN (voir sections 22.13 et 31.8).

Paludisme et évolution humaine Le paludisme a certainement été endémique en Afrique depuis des millions d’années. En Afrique de l’Ouest, la résistance à P. falciparum est associée à une hémoglobine anormale, l’hémoglobine S, qui ne diffère de l’hémoglobine normale A que par un seul acide aminé. Dans la chaîne bêta de l’hémoglobine S, la valine remplace l’acide glutamique de l’hémoglobine A. Il en résulte que l’hémoglobine S fixe moins bien l’oxygène. Lorsque la concentration en oxygène baisse, l’hémoglobine S forme des chaînes rigides qui transforment les érythrocytes normaux biconcaves (voir figure 22.4) en globules en forme de faucilles, les hématies falciformes. Les individus homozygotes pour le trait falciforme sont particulièrement sensibles aux changements de concentration en oxygène et souffrent d’anémie à hématies falciformes ou drépanocytose homozygote. Les individus hétérozygotes possèdent le trait drépanocytaire, mais ils sont résistants au paludisme. Chez eux, l’hémoglobine S provoque aussi la formation d’hématies falciformes, mais la falciformation y est moins prononcée que chez les homozygotes. Toutefois, la falciformation est plus intense chez les érythrocytes infectés par P. falciparum que chez ceux qui ne sont pas infectés. La formation de chaînes rigides d’hémoglobine S altère la membrane érythrocytaire, conduisant à une fuite du potassium. P. falciparum ne peut pas se développer dans un environnement pauvre en potassium. Ainsi les individus porteurs du trait drépanocytaire sont résistants au paludisme. Dans certaines régions méditerranéennes où le paludisme est endémique, la résistance à P. falciparum est associée à une déficience des érythrocytes en glucose-6-phosphate deshydrogénase (G6PD), une enzyme à action antioxydante intracellulaire. Le déficit en G6PD entraîne une augmentation de la quantité d’oxydants intracellulaires telle que le H2O2 produite lors du développement intraérythrocytaire de P. falciparum. Ces oxydants qui sont normalement éliminés par la G6PD, altèrent la membrane du parasite et empêchent son développement. Chez de nombreux peuples méditerranéens, diverses anomalies génétiques affectent la production et l’efficacité de l’hémoglobine. Elles sont connues sous le nom de thalassémie et sont aussi associées statistiquement et géographiquement à une

augmentation de la résistance au paludisme. Comme pour le déficit en G6PD, elles sont liées à des taux diminués d’antioxydants dans les érythrocytes. L’hémoglobine S, le déficit en G6PD et les thalassémies résultent de mutations qui confèrent une résistance au paludisme, et ces mutations sont sélectionnées dans la population bien que fournissant aux érythrocytes des capacités amoindries pour le transfert de l’oxygène. Un autre cas dans lequel les parasites du paludisme ont joué un rôle dans l’évolution est celui des complexes majeurs d’histocompatibilité (CMH) et du système immunitaire (voir sections 23.3 et 23.4). Comme il a été indiqué précédemment, les CMH de classe I et de classe II présentent les antigènes aux cellules T afin de débuter la réaction immune. En Afrique tropicale de l’Ouest, où le paludisme est très répandu, les populations possèdent très probablement un gène particulier du CMH de classe I et un ensemble original de gènes du CMH de classe II. Ces gènes sont plus répandus dans la population de l’Ouest africain et sont pratiquement inconnus dans les autres groupes de populations. Les personnes possédant ces gènes résistent mieux aux infections paludéennes mortelles que celles qui sont porteuses du trait drépanocytaire. Les protéines des CMH codées par ces gènes sélectionnés par l’évolution sont des molécules exceptionnellement efficaces dans la présentation des antigènes des hématozoaires et ils induisent une immunité protectrice forte contre les infections à P. falciparum. Comme pour l’hémoglobine S, P. falciparum constitue un facteur de sélection des gènes de CMH favorable à la survie de l’hôte. Les individus possédant ces gènes de résistance ont un avantage vital, vivent plus longtemps et transmettent ainsi à leur descendance ces gènes favorables. Ainsi, le paludisme a été de différentes façons un agent sélectif dans l’évolution humaine. D’autres agents pathogènes, tels que Mycobacterium tuberculosis (l’agent de la tuberculose – voir section 26.5) et Yersinia pestis (celui de la peste – voir section 27.7), ont pu également avoir des effets sélectifs sur l’espèce humaine, mais sans que ce soit aussi clair que dans le cas du paludisme.

Contrôlez vos acquis Le paludisme est une maladie parasitaire transmise par des moustiques et rencontrée dans les régions tropicales et subtropicales du monde. C’est une cause majeure de morbidité et de mortalité dans les pays en voie de développement. Chez l’homme, le paludisme a provoqué la sélection de plusieurs gènes de résistance à cette maladie. Cette dernière peut être contrôlée en associant des mesures de santé publique et la chimiothérapie. •

Quel est le réservoir naturel des Plasmodium ? Comment le paludisme peut-il être évité ou éradiqué ?

•

Passez en revue les mécanismes génétiques responsables de la résistance au paludisme. Quels gènes de résistance au paludisme ne sont pas représentés chez tous les hommes ?



908 Chapitre 27


m n

27.6 Virus West Nile

Le virus West Nile (VWN) est responsable de la fièvre à virus West Nile, une virose humaine émergente transmise par la piqûre d’un moustique. Le VWN appartient au genre flavivirus, est enveloppé et possède une capside icosaédrale renfermant un ARN génomique simple brin de polarité positive, d’environ 11 000 nucléotides (voir section 16.8). L’icosaèdre a un diamètre de 40 à 60 nm. Le virus peut attaquer le système nerveux de son hôte à sang chaud (voir figure 27.12).

L’épidémiologie L’infection humaine par le VWN a d’abord été identifiée en Ouganda en 1937. Au cours des années 1950, le virus s’est étendu en Égypte et en Israël. Dans les années 1990, des épidémies ont atteint des chevaux, des oiseaux et l’homme dans plu-

sieurs pays africains et européens. En 1999, les premiers cas sont apparus aux États-Unis, les principaux étant localisés dans le nord-est du pays, autour de la ville de New York. De 1999 à 2001, il y a eu 149 cas humains confirmés, entraînant 18 décès. En 2002, en fonction de l’apparition ou de la disparition saisonnière des moustiques vecteurs, cette maladie émergente s’est déplacée de la côte est vers le Middle West, avec un pic de 884 cas dans l’Illinois, sur un total national de 4 156 cas. En 2003, il y a eu 9 186 cas confirmés, centrés sur le Middle West et l’ouest du pays. Le Colorado a présenté l’incidence la plus forte avec 2 477 cas (voir figure 27.13), tandis que l’Illinois n’enregistrait que 53 cas. Les décès dus aux infections par le VWN sont passés de 284 en 2002 à 231 en 2003, alors que le nombre de cas diagnostiqués avait doublé. Ceci s’explique par un diagnostic plus précoce des infections à VWN chez les malades présentant des formes bénignes. Le VWN entraîne une maladie patente chez les oiseaux et il est transmis à des hôtes réceptifs par la piqûre d’un moustique infecté. Un certain nombre d’espèces de moustiques ont été identifiées comme des vecteurs et au moins 130 espèces d’oiseaux se comportent en réservoirs. Les oiseaux infectés développent une virémie qui dure d’un à quatre jours et les survivants acquièrent une immunité de longue durée. Les moustiques se gorgeant sur des oiseaux virémiques sont infectés et peuvent, à leur tour, infecter d’autres oiseaux, démarrant un nouveau cycle infectieux. Localement, l’incidence de la maladie parmi la faune aviaire diminue lorsqu’il y a des décès ou qu’une immunité s’est établie. Mais les moustiques infectant de nouveaux hôtes peuvent étendre géographiquement l’épidémie qui progresse par vagues successives traversant le continent. Des informations fragmentaires font état d’une progression de l’épidémie vers la côte ouest et le Sud-Ouest.

(a) WA MT (222) OR

ID (1) WY (375)

NV (2) UT (1)

CA (3)

ND (559) MN (148)

WI (17)

SD (1039)

NE (1867) IA (147)

CO (2447)

AZ (13) NM (209)

KS (88) OK (78)

TX (663)

VT (3) MI (19)

NY (66)

IN OH IL (107) (47) (53) MO KY (14) (61)

PA (247)

NC (24) TN (26) SC (6) AR (25) MS AL GA (87) (33) (48) LA (123) FL

HI

FIGURE 27.12 Virus West Nile. Le moustique Culex quinquefasciatus, ici en train de se gorger de sang humain, est le vecteur du virus West Nile. (b) Image du virus West Nile en microscopie électronique. Le virion icosaédral a un diamètre d’environ 40 à 60 nm.

NH (3) MA (16) RI (7) CT (17) NJ (34) DE (17) MD (73) DC (3) WV (2)

(93)

AK

(b)

VA (23)

ME

0

>100

>0

>1000

FIGURE 27.13 Le virus West Nile aux États-Unis en 2003. Ce virus a provoqué 9 186 cas humains, dont 231 décès. De 1999 à 2003, l’incidence maximale de la maladie aux États-Unis s’est déplacée de la côte Est vers le Middle West, sa partie septentrionale et l’ouest du pays. Chaque année, des foyers apparaissent là où le virus infecte de nouvelles populations d’hôtes réceptifs. Données des centres de contrôle et de prévention des maladies (CDC, Centers for Disease Control and Prevention), Atlanta, Géorgie, États-Unis.



27.7 Peste 909

L’incidence la plus élevée en 2004 a été enregistrée en Californie et dans l’Arizona, alors que le nombre de cas diminuait dans le Middle West septentrional et le Colorado. Au cours des prochaines années la maladie pourrait cesser d’être épidémique dans les régions attenantes aux États-Unis, tandis que le VWN deviendrait endémique chez les populations aviaires d’Amérique du Nord. L’homme et divers animaux sont des hôtes accidentels, terminaux de l’infection, car ils développent des virémies insuffisantes pour infecter les moustiques. Le taux de létalité chez l’homme, dans les infections diagnostiquées, est considéré comme très élevé lorsqu’il atteint 2 ou 3 %, alors que chez le cheval il peut atteindre jusqu’à 40 %. De nombreuses infections humaines sont inapparentes ou très légères. À peu près 20 % des personnes infectées présentent une infection bénigne dénommée fièvre à virus West Nile, dont l’incubation dure de trois à treize jours et dont la durée totale est de trois à six jours. La fièvre s’accompagne de céphalées, de nausées, de myalgies, d’une éruption, de polyadénopathies et d’un malaise. Moins de 1 % des sujets infectés présente des complications neurologiques graves de type encéphalite ou méningite. Les adultes âgés de plus de 50 ans font plus fréquemment des complications neurologiques que les sujets plus jeunes. Le diagnostic d’infection à VWN est fondé sur l’examen clinique et il est confirmé par un test ELISA à la recherche des anticorps spécifiques dans le sérum ou le liquide céphalorachidien (voir section 24.10).

Prévention et contrôle Comme pour le virus de l’encéphalite de Saint-Louis ou d’autres arboviroses responsables d’encéphalites (voir figure 25.3), la transmission du VWN est saisonnière aux États-Unis et dépend d’une exposition à des moustiques. Le principe fondamental pour éviter la diffusion du VWN est de ne pas s’exposer aux moustiques vecteurs. Chacun peut aussi éviter les contacts infectants en restant chez soi la nuit (la période d’activité des moustiques), en portant des vêtements protecteurs et en utilisant des répulsifss à base de DEET, comme c’est le cas pour la maladie de Lyme (voir section 27.4). Au niveau communautaire, l’élimination des moustiques par la destruction de leur habitat et par l’utilisation d’insecticides est une mesure adéquate pour le contrôle du VWN. Il n’existe pas de vaccin à usage humain efficace, bien que plusieurs soient en cours de développement. Des vaccins à usage vétérinaire sont utilisés mais leur efficacité réelle n’est pas connue. Le traitement, comme pour la plupart des maladies virales, consiste à maintenir les constantes vitales par le repos, l’administration de perfusions et un traitement symptomatique de la fièvre et des douleurs. Il n’existe pas d’antiviral reconnu efficace in vivo.

Contrôlez vos acquis L’infection due au virus West Nile est une maladie virale émergente transmise par des moustiques. Le cycle naturel de la maladie fait intervenir des oiseaux infectés par la piqûre de moustiques infectés. L’homme et d’autres animaux sont des hôtes accidentels et terminaux. Alors

que la plupart des infections humaines sont inapparentes et non diagnostiquées, les complications survenant dans les cas confirmés peuvent entraîner une létalité atteignant 3 %, par encéphalite ou méningite. •

Identifiez les vecteurs et les réservoirs du virus West Nile.

•

Retracez la progression du virus West Nile aux États-Unis depuis 1999.

27.7 Peste m n Les pandémies de peste ont été directement responsables de plus de décès chez l’homme qu’aucune autre maladie infectieuse, exceptés le paludisme et la tuberculose. Au Moyen Âge, les épidémies de peste ont tué entre 25 et 33 % de la population de l’Europe. La peste est due à Yersinia pestis, un bacille aérobie facultatif Gram négatif appartenant au groupe des entérobactéries (voir section 12.11 et figure 27.14). La peste est une maladie naturelle des rongeurs domestiques et sauvages, les rats représentant le réservoir primaire de la maladie. L’homme est seulement un hôte accidentel et il ne joue aucun rôle essentiel dans la conservation de la maladie. Les puces sont des hôtes intermédiaires et des vecteurs, diffusant la peste à d’autres hôtes (voir figure 27.15). La plupart des rats infectés meurent rapidement après l’apparition des symptômes, mais une faible proportion d’entre eux survit et développe une infection chronique, constituant un réservoir permanent de Y. pestis virulent.

L’épidémiologie La majorité des cas de peste humaine aux États-Unis survient dans les États du Sud-Ouest où la maladie, dénommée peste sylvatique, est enzootique chez les rongeurs sauvages. La peste est transmise par la puce du rat (Xenopsylla cheopis), qui ingère Y. pestis en se gorgeant du sang d’un animal infecté. Le bacille se multiplie alors dans l’intestin de la puce et peut être transmis à un animal sain lors de la piqûre suivante. Alors que la maladie s’étend, la mortalité chez les rats devient telle que les puces infectées fuient pour rechercher de nouveaux hôtes, y compris des êtres humains. Parvenu chez l’homme, Y. pestis gagne les ganglions lymphatiques où il provoque la formation d’intumescences molles appelées bubons. De ce fait, on parle alors de peste bubonique (voir figure 27.14b). Les bubons hébergent de nombreux Y. pestis dont la capsule empêche qu’ils soient phagocytés par le système immunitaire (voir section 22.2). Des bubons secondaires apparaissent au niveau des ganglions périphériques et le bacille peut pénétrer dans la circulation sanguine provoquant une septicémie. De multiples hémorragies entraînent la formation de taches sombres sur la peau ; elles sont à l’origine du nom historique de la maladie, la « peste noire » (voir figure 27.14c). Si le patient n’est pas traité avant l’apparition de la septicémie, les symptômes de la peste (engorgement et douleurs ganglionnaires, prostration, délire et choc) s’accentuent et la mort survient habituellement en trois à cinq jours. La peste est un problème majeur de santé





CDC/Dr. Jack Poland/PHIL

910 Chapitre 27

(c) FIGURE 27.14 La peste humaine. (a)Yersinia pestis, l’agent étiologique de la peste, est un bâtonnet Gram négatif d’environ 2 µm de long et mesurant jusqu’à 1 µm de diamètre. L’organisme, tel que le montrent les flèches sur ce frottis sanguin, présente une coloration bipolaire caractéristique. (b) Un bubon situé au niveau de l’aine. (c) Peau gangrenée et détachée de la main chez une victime de la peste. La peste bubonique peut être traitée efficacement par antibiothérapie si elle est diagnostiquée précocement, mais pas la peste pulmonaire ni la peste septicémique, dont la létalité est élevée.


(a)

(b)

publique dans beaucoup de pays en voie de développement, comme l’Inde, le Vietnam ou Madagascar.

La pathologie La pathologie de la peste n’est pas clairement élucidée, mais Y. pestis est pourvu d’un certain nombre de facteurs de virulence, y compris des toxines, qui contribuent à la genèse des processus pathologiques. Les antigènes V et W de Y. pestis sont des complexes lipoprotéiques qui inhibent la phagocytose. D’autres protéines d’enveloppe sont également présentes. Une

exotoxine dénommée la toxine murine est produite par les souches virulentes de Y. pestis. C’est un inhibiteur des fonctions respiratoires qui bloque les transferts d’électrons au niveau du coenzyme Q des mitochondries (voir section 5.11). Bien qu’il ne soit pas démontré que la toxine murine intervient dans la pathogénie de la peste humaine (elle n’est pas toxique pour toutes les espèces animales), elle entraîne chez la souris un choc, des altérations hépatiques et de la détresse respiratoire. Ces symptômes sont également observés dans la peste humaine. Y. pestis produit aussi une endotoxine fortement immunogène qui pourrait également jouer un rôle dans les processus pathologiques. La peste pulmonaire survient après que Y. pestis a été directement inhalé ou qu’il a atteint les poumons durant une peste bubonique. Les symptômes sont généralement absents jusqu’aux deux derniers jours de la maladie, moment où des crachats sanglants sont expectorés. Sans traitement, les malades ne survivent pas plus de deux jours. La peste pulmonaire est extrêmement contagieuse et peut diffuser rapidement par voie directe respiratoire d’une personne à une autre si le malade n’est pas immédiatement placé en quarantaine. La peste septicémique est provoquée par la diffusion rapide de Y. pestis dans tout l’organisme par voie sanguine, sans apparition de bubons, le décès survenant habituellement avant que le diagnostic soit posé.

Traitement et contrôle La peste bubonique peut être traitée efficacement si le diagnostic est établi rapidement. On fait appel à la streptomycine ou à la gentamicine administrées par voie parentérale. On peut aussi utiliser la doxycycline, la ciprofloxacine ou le chloramphénicol



27.8 Champignons microscopiques pathogènes 911

Transmission par voie aérienne Peste pulmonaire Peste bubonique Maladie humaine mortelle Peste septicémique Puce infectée

Réservoir domestique (mortel)

Rongeur infecté

Puce infectée

Rat infecté mort

Réservoir sauvage (non mortel)

Faites la distinction entre pestes sylvatique, bubonique, septicémique et pulmonaire.

•

Quels sont les hôtes naturels et les vecteurs de la peste, ainsi que son traitement ?

III

Homme infecté

Rats, souris infectés

•

Puce infectée

Rongeur infecté

FIGURE 27.15 Épidémiologie de la peste (Yersinia pestis). Chez la plupart des rongeurs sauvages, la peste est une infection généralement autolimitée et bénigne. La peste est fréquemment mortelle chez le rat et l’homme. Les puces infectées quittent les cadavres infectieux des rongeurs et cherchent d’autres hôtes tels que les êtres humains, qui sont des hôtes accidentels.

par voie intraveineuse. Si le traitement débute précocement, la létalité de la peste bubonique peut-être abaissée à entre 1 et 5 %. Les pestes septicémique et pulmonaire peuvent également être traitées, mais ces formes cliniques progressent si rapidement que les antibiotiques, même administrés précocement, peuvent arriver trop tard. Bien qu’il s’agisse d’une maladie particulièrement dévastatrice, il n’y a eu que 97 cas déclarés aux États-Unis depuis 1990. Malheureusement, huit de ces malades sont décédés. Sur le plan mondial, il y a généralement moins de 1 500 cas confirmés et 300 décès chaque année. Y. pestis est un microorganisme qui pourrait éventuellement être utilisé pour une attaque bioterroriste (voir section 25.12) et, dans cette éventualité, la doxycycline et la ciprofloxacine sont recommandées comme antibiotiques prophylactiques.

Contrôlez vos acquis La peste frappe essentiellement les personnes en contact avec des rongeurs qui sont les réservoirs enzootiques de Yersinia pestis. Une infection pesteuse septicémique ou pneumonique conduit rapidement à la mort, tandis que la peste bubonique peut-être traitée par des antibiotiques si le diagnostic est établi suffisamment tôt.

MALADIES D’ORIGINE TELLURIQUE

Nous allons maintenant étudier plusieurs maladies qui sont habituellement transmises à partir du sol. Les champignons microscopiques sont des micro-organismes communs, ubiquitaires, rencontrés partout dans le monde, mais peu d’entre eux sont pathogènes. Quelques bactéries sont également d’importants agents pathogènes telluriques. À la différence des microorganismes transmis d’une personne à une autre ou par l’intermédiaire d’un vecteur, les micro-organismes telluriques sont des agents accidentels d’infection, sans dépendance vitale visà-vis de leur hôte accidentel. Le sol constitue un réservoir inépuisable de ces agents pathogènes et, par conséquent, on ne peut les éliminer.

27.8 Champignons microscopiques m n pathogènes Les champignons microscopiques sont des organismes eucaryotes courants comme les levures, se développant normalement sous forme d’une cellule unique (voir figure 27.16a), et les moisissures qui croissent sous forme de filaments branchés ou hyphes (voir figure 27.16b). La taxinomie et la biodiversité de ces micro-organismes ont été présentées dans la section 14.12. Heureusement, la plupart des champignons microscopiques sont inoffensifs pour l’homme. Seulement une cinquantaine d’espèces sont pathogènes pour lui, et l’incidence globale des infections fongiques reste faible, bien que certaines mycoses superficielles soient très répandues.

L’épidémiologie Les champignons microscopiques provoquent des maladies par trois mécanismes. D’abord, certains entraînent des réactions allergiques (ou d’hypersensibilité) consécutives à une exposition à leurs antigènes (voir section 22.15). La réexposition à ces champignons, qu’ils se soient développés chez l’hôte ou dans l’environnement, peut être à l’origine de manifestations allergiques. Par exemple, Aspergillus sp., un saprophyte banal souvent rencontré dans la nature sous forme d’une moisissure, produit de puissants antigènes responsables de crises d’asthme ou d’autres réactions d’hypersensibilité. Aspergillus peut aussi être pathogène par d’autres mécanismes. Le deuxième mécanisme producteur de maladies fongiques fait appel à la production de mycotoxines, un vaste groupe d’exotoxines fongiques diverses. Les plus connues de ces mycotoxines sont produites par Aspergillus flavus, une espèce qui se multiplie souvent sur des aliments stockés dans de mauvaises conditions, par exemple des graines. Les toxines de A. flavus sont connues sous le nom générique d’aflatoxines (voir figure 27.17). Elles sont extrêmement toxiques et





David E. Snyder

912 Chapitre 27

(b)

(a)

FIGURE 27.16 Formes typiques de champignons pathogènes. (a) Forme levure de Cryptococcus neoformans colorée par l’encre de Chine, qui met en évidence la capsule. Les cellules font de 2 à 20 µm de diamètre. (b) Sporothrix schenckii, avec des formes branchées ou hyphes, caractéristiques de la forme moisissure du champignon. Les basidiospores arrondies ont un diamètre d’environ 2 mm. Les champignons microscopiques sont étudiés à la section 14.12.

induisent la formation de tumeurs chez les animaux, en particulier les oiseaux se nourrissant de graines contaminées. Leur rôle éventuel en pathologie humaine reste à préciser. Le troisième mécanisme est celui des infections connues sous le nom de mycoses.

Les mycoses Le développement d’un champignon à la surface du corps ou dans les tissus provoque des mycoses. Ce sont des infections fongiques dont la gravité va de l’innocuité relative de lésions superficielles à la gravité d’infections profondes menaçant la vie. Les mycoses sont divisées en trois catégories. La première est celle des mycoses superficielles, qui sont dues à la colonisation par le champignon de la peau, des cheveux ou des ongles, l’infection étant limitée aux couches cellulaires superficielles (voir figure 27.18a). Le tableau 27.2 donne la liste des mycoses superficielles communes. En général ces maladies sont relativement bénignes et autolimitées. Certaines, comme les infections du pied à Trichophyton (ou « pied d’athlète ») sont très courantes. Leur propagation est assurée par des contacts avec une personne infectée ou avec des surfaces contaminées telles que des baignoires, douches, sols ou des serviettes et des draps de lit infectés. Le traitement des cas sérieux fera appel à des applications locales de nitrate de niconazole ou de griséofulvine. Cette dernière peut également être administrée par voie orale. Après avoir gagné la circulation sanguine, cet antifongique atteint la peau où il inhibe la croissance des champignons. O

O

O

O

O

OCH3

FIGURE 27.17 Structure de l’aflatoxine B1. Cette toxine appartient à un groupe de composée voisins produits par Aspergillus flavus.

Les mycoses sous-cutanées sont une deuxième catégorie d’infections fongiques. Elles atteignent les couches profondes de la peau (voir figure 27.18b) et elles correspondent à un groupe différent de micro-organismes (voir tableau 27.2). Dans cette catégorie, on trouve la sporotrichose, une maladie professionnelle des agriculteurs, des mineurs et d’autres travailleurs en contact avec le sol. L’agent pathogène est un saprophyte ubiquitaire se développant sur le bois et dans le sol. Les lésions débutent au niveau d’une petite blessure ou d’une excoriation. Sporothrix schenckii peut être isolé facilement à partir des lésions et cultivé in vitro. Le traitement consiste à administrer de l’iodure de potassium ou du kétoconazole par voie orale. Les mycoses systémiques (profondes) représentent la troisième catégorie et la plus dangereuse des infections fongiques. La prolifération des champignons y atteint les viscères et on les subdivise en mycoses primaires et secondaires. Les mycoses systémiques primaires correspondent à l’infection directe par un champignon pathogène d’individus par ailleurs normaux. Les mycoses systémiques secondaires sont observées chez des personnes fragilisées par des facteurs prédisposants tels qu’une antibiothérapie ou une immunodépression. Aux États-Unis, les mycoses systémiques primaires les plus répandues sont l’histoplasmose et la coccidioïdomycose (fièvre de la vallée de San Joaquin), dues respectivement à Histoplasma capsulatum et à Coccidioides immitis, deux micro-organismes telluriques provoquant des infections respiratoires consécutives à l’inhalation de spores qui germent et se développent dans les poumons. Aux États-Unis, l’histoplasmose est surtout une maladie des zones rurales du Middle West, en particulier des vallées de l’Ohio et du Mississippi. La plupart des cas sont bénins et sont confondus avec des infections respiratoires banales. La coccidioïdomycose est ordinairement limitée aux régions semi-désertiques du sud-ouest des États-Unis. Le champignon vit dans les sols désertiques et les spores sont disséminées sous forme de particules desséchées, dispersées par le vent. Dans certaines régions du sud-ouest des États-Unis, jusqu’à 80 % des habitants



27.8 Champignons microscopiques pathogènes 913

TABLEAU 27.2

QUELQUES CHAMPIGNONS PATHOGÈNES ET MALADIES CORRESPONDANTES

Maladie

Champignons microscopiques

Localisation

Mycoses superficielles (dermatomycoses) Teigne

Microsporum

Cuir chevelu des enfants

Favus

Trichophyton

Cuir chevelu

Pied d’athlète

Epidermophyton, Trichophyton

Peau entre les orteils

Eczéma marginé

Trichophyton, Epidermophyton

Région génitale

Sporotrichose

Sporothrix schenckii

Bras, mains

Chromoblastomycose

Plusieurs genres différents

Jambes, pieds

Cryptococcosea

Cryptococcus neoformans

Poumons, méninges

Coccidioïdomycosea

Coccidioides immitis

Poumons

Histoplasmose

Histoplasma capsulatum

Poumons

Blastomycose

Blastomyces dermatitidis

Poumons, peau

Candidosea

Candida albicans

Cavité buccale, intestin

Mycoses sous-cutanées

Mycoses systémiques

a

a

Considérées comme des maladies opportunistes dans le contexte du SIDA (voir section 26.14).

Traitement et contrôle Le traitement des mycoses systémiques est très difficile (voir section 20.11). La plupart des antibiotiques qui inhibent les champignons sont aussi agressifs pour les autres eucaryotes, y compris l’homme. Un des antibiotiques les plus efficaces, l’amphotéricine B, est largement utilisé, mais il entraîne des effets secondaires importants, notamment au niveau du rein. Tenter de contrôler ces infections en éliminant les champignons pathogènes de l’environnement est irréaliste. Comme c’est le cas pour beaucoup d’agents pathogènes ayant une origine courante, contrôler le développement des champignons microscopiques est très difficile, leur réservoir étant sans limites. On ne peut éviter l’exposition aux champignons microscopiques, mais l’on peut diminuer les risques en décontaminant et en filtrant l’air pour des environnements particuliers.

(a)

Gordon C. Sauer

Gordon C. Sauer

peuvent être infectés, mais la plupart d’entre eux ne présentent aucun signe de maladie. Un certain nombre de mycoses systémiques, y compris l’histoplasmose et la coccidioïdomycose, sont tout particulièrement fréquentes et graves chez les individus immunodéprimés, par exemple les malades atteints du syndrome d’immunodéficience acquise (SIDA) [voir section 26.14] ou sous traitement immunosuppresseur. Ce sont des infections fongiques secondaires, car les individus normaux soit ne sont pas atteints, soit en développent des formes bénignes. D’autres exemples d’infections fongiques secondaires sont répertoriés dans le tableau 27.2. Ces champignons sont des pathogènes opportunistes ne produisant des infections sérieuses que chez des sujets fragilisés, par exemple par le SIDA.

(b)

FIGURE 27.18 Infections mycosiques. (a) Mycose superficielle du pied (« pied d’athlète ») provoquée par Trichophyton rubrum. (b) Sporotrichose, une mycose sous-cutanée due à Sporothrix schenckii.



914 Chapitre 27



• •

Décrivez les mycoses superficielles, sous-cutanées et systémiques. Faites la distinction entre infections fongiques primaires et secondaires.

27.9 Tétanos m n Le tétanos est une maladie grave qui menace la vie du patient. Bien que l’on puisse s’en protéger par l’immunisation (voir section 22.13), 473 personnes ont été atteintes de tétanos aux États-Unis au cours de la dernière décade et 68 en sont mortes.

Biologie et épidémiologie Le tétanos est provoqué par l’exotoxine de Clostridium tetani, un bacille anaérobie sporulé et mobile (voir section 12.20). Le réservoir naturel de C. tetani est le sol dont il est un résident ubiquitaire bien que l’on puisse aussi le rencontrer dans le tube digestif des mammifères, avec d’autres Clostridium. Normalement, C. tetani s’introduit dans notre organisme par une plaie souillée de terre ou une piqûre profonde. Dans la blessure, les conditions anoxiques conduisent à la germination des spores et au développement du micro-organisme. C. tetani produit la puissante toxine tétanique et ce n’est pas un micro-organisme invasif ; il provoque la maladie par action directe de sa toxine sur les cellules de l’hôte. L’incubation a une durée variable, suivant la quantité de spores inoculées. Le tétanos ne se transmet pas de personne à personne.

La pathogénie L’activité de la toxique tétanique a déjà été étudiée au plan cellulaire et moléculaire (voir section 21.10). Elle affecte directement les mécanismes de la transmission de l’influx nerveux vers les muscles, et par conséquent de la contraction musculaire. Il en résulte des contractures des muscles squelettiques, par exemple le trismus maxillaire, car les muscles de la mâchoire et de la face sont atteints les premiers (voir figure 27.19). Le décès survient en général par arrêt respiratoire et la létalité est très élevée (15 % lors de la dernière décennie aux États-Unis).

Diagnostic, contrôle, prévention et traitement Le diagnostic du tétanos repose sur la notion d’exposition, la symptomatologie et, rarement, sur la mise en évidence de la toxine dans le sang ou les tissus du malade. Le

Collège royal de chirurgie d’Édimbourg

Un certain nombre de champignons telluriques provoquent des maladies chez l’homme. Les mycoses superficielles, sous-cutanées et systémiques sont des infections difficiles à contrôler du fait du manque d’antifongiques spécifiques et de la nature ubiquitaire de ces agents. Les infections fongiques peuvent provoquer des maladies systémiques graves, en particulier chez des sujets dont les défenses immunitaires sont affaiblies, comme dans le cas du SIDA.

FIGURE 27.19 Un soldat mourant du tétanos. Notez les contractures intenses (opisthotonos). D’après une toile de Charles Bell, Collège royal de chirurgie, Édimbourg, Écosse.

micro-organisme peut aussi, mais exceptionnellement, être cultivé à partir de la plaie. Le réservoir naturel de C. tetani est le sol. Comme ce bacille est un pathogène accidentel de l’homme et qu’il ne dépend ni de l’homme ni des animaux pour sa propagation, il est impossible de l’éradiquer. Les mesures de contrôle reposent donc sur la prévention. Le tétanos peut être évité. L’anatoxine utilisée comme vaccin (voir section 22.13) est très efficace pour la prévention. En effet, tous les cas de tétanos surviennent chez des personnes insuffisamment immunisées. En matière de tétanos, le groupe d’âge le plus exposé et qui s’accroît le plus vite, est celui des 25-59 ans, probablement parce que les programmes de vaccination visent prioritairement les enfants d’âge scolaire et les seniors âgés de 60 ans ou plus. Le traitement approprié des coupures, des délabrements tissulaires et des piqûres consiste à faire une injection de « rappel » d’anatoxine tétanique. Si la plaie est grave et souillée de terre, le traitement peut aussi compter une injection d’antitoxine tétanique, en particulier si le statut vaccinal du sujet est inconnu ou semble dépassé dans le temps. L’antitoxine contient des anticorps antitétaniques, généralement obtenus chez le cheval, capables de neutraliser la toxine tétanique (voir section 22.13). Ces mesures préventives sont efficaces. Le traitement du tétanos déclaré comprend : l’administration d’antibiotiques, comme la pénicilline, pour stopper la multiplication du bacille et la production de toxine ; l’administration d’antitoxine afin d’éviter la fixation sur les cellules de la toxine nouvellement produite ; l’administration de sédatifs, de myorelaxants et la mise sous respiration artificielle pour combattre les effets des contractures. Le traitement entrepris à ce stade ne peut pas faire régresser les symptômes, car la toxine déjà fixée ne peut plus être neutralisée, d’où de fortes morbidité et létalité. Plusieurs autres espèces de Clostridium sont pathogènes et font partie de la flore tellurique normale, rendant leur éradication impossible. Tous produisent de puissantes exotoxines pathogènes. Alors que C. tetani est rencontré presque exclusivement dans le sol, C. botulinum et C. difficile sont parfois présents dans le tube digestif de l’homme et des animaux comme constituants de la flore microbienne normale (voir section 21.4). C. perfringens et C. botulinum sont des pathogènes potentiels



Questions 915

importants en hygiène alimentaire (voir chapitre 29). Les spores de ces Clostridium sont d’origine tellurique et peuvent souiller les aliments. Elles peuvent germer lorsque les conditions d’hygiène et de conservation des aliments ne sont pas adéquates. Elles produisent de puissantes exotoxines pathogènes.

Contrôlez vos acquis Clostridium tetani est un micro-organisme tellurique ubiquitaire responsable du tétanos, une maladie provoquée par la production de la toxine tétanique qui est

responsable des contractures. Le tétanos peut être évité par une immunisation appropriée. Le traitement du tétanos déclaré est habituellement inefficace et la maladie est génératrice de fortes morbidité et létalité. •

Décrivez l’infection par C. tetani et l’élaboration de la toxine tétanique.

•

Décrivez les effets généraux de la toxine tétanique sur l’hôte et précisez les étapes à suivre pour prévenir le tétanos chez une personne blessée par une piqûre.

QUESTIONS 1. Identifiez les animaux les plus susceptibles de propager la rage aux États-Unis. Quels programmes d’immunisation ont leur place dans le traitement de la rage ? pour sa prévention (voir section 27.1) ? 2. Pourquoi le syndrome respiratoire à hantavirus (SPH) a-t-il émergé aux États-Unis ? Comment le prévenir (voir section 27.2) ? 3. Quelles sont les trois principales catégories de micro-organismes responsables des rickettsioses ? Identifiez les principaux réservoirs et vecteurs du typhus, de la fièvre pourprée des Montagnes Rocheuses et des ehrlichioses (voir section 27.3). 4. Identifiez le principal réservoir et le vecteur de la maladie de Lyme aux États-Unis. Comment empêcher la diffusion de cette maladie ? Comment peut-on la traiter (voir section 27.4) ? 5. Le paludisme se manifeste par une fièvre importante et de longue durée, entrecoupée de frissons. Ces symptômes sont liés à l’activité de Plasmodium vivax et de P. falciparum. Décrivez les stades évolutifs de ces parasites dans le corps humain et rapprochez-les du cycle fièvre-frissons. Pourquoi une personne originaire

6.

7.

8.

9.

d’Europe occidentale peut-elle être plus sensible au paludisme qu’une personne issue d’une population africaine ou méditerranéenne (voir section 27.5) ? Expliquez le cycle vital du virus West Nile et le rôle du moustique dans sa propagation. Les humains peuvent-ils constituer des hôtes alternatifs ? Expliquez pourquoi (voir section 27.6). Face à une maladie aussi grave que la peste, pourquoi la vaccination n’est-elle pas étendue à toute la population ? Quelles sont les mesures de santé publique utilisées pour contrôler cette maladie (voir section 27.7) ? Quel est le réservoir de la majorité des agents pathogènes fongiques ? Comment peut-on éviter l’exposition aux champignons microscopiques ? Quels problèmes particuliers pose au clinicien le traitement des mycoses (voir section 27.8) ? Distinguez les capacités invasives et toxiques de Clostridium tetani. Discutez du mécanisme pathogénique du tétanos et exposez les mesures préventives et le traitement de cette maladie (voir section 27.9).

PROBLÈMES 1. Décrivez les mesures nécessaires à prendre chez un enfant à la suite de la morsure (provoquée ou non) d’un chien errant dont on ignore s’il a été vacciné. Décrivez les scénarios possibles selon que l’on a pu capturer le chien et l’isoler ou qu’il a disparu. Quelles mesures sont appliquées lorsque le statut vaccinal du chien est connu et à jour ? 2. Trouvez au moins trois propriétés communes aux agents pathogènes de la fièvre pourprée des Montagnes Rocheuses, du typhus et des ehrlichioses, et passez en revue l’évolution de ces maladies. Pourquoi les ehrlichioses émergent-elles comme des maladies rickettsiennes importantes ? Comparez leur émergence avec celle de la maladie de Lyme.

3. L’éradication du paludisme a été l’objectif de programmes de santé publique depuis au moins cent ans. Quels facteurs empêchent de l’éradiquer ? Si un vaccin efficace était mis au point, le paludisme pourrait-il être éradiqué ? Comparez cette possibilité avec celles existant dans le cas de la peste. 4. Imaginez un plan de prévention des infections dues au virus West Nile chez l’homme dans votre région. Appréciez le coût d’un tel plan, à la fois au niveau individuel et communautaire. Renseignez-vous pour savoir si le programme de réduction des populations de moustiques est activement conduit dans votre région. Quelles méthodes sont utilisées pour réduire ces populations de moustiques ?





I

Microbiologie des eaux usées et purification de l’eau

918

28.1 28.2 28.3

Santé publique et qualité de l’eau Traitement des eaux usées Purification de l’eau potable

918 920 924

II

Maladies infectieuses à transmission hydrique 925

28.4 28.5 28.6 28.7 28.8

Eau et risques sanitaires Choléra Giardiase et cryptosporidiose Légionellose (maladie des légionnaires) Fièvre typhoïde et autres maladies à transmission hydrique

CHAPITRE VINGT-HUIT

Traitement des eaux usées et purification de l’eau, maladies microbiennes d’origine hydrique 925 926 928 930 931

L’eau est la principale source de maladies infectieuses. Les traitements classiques de l’eau sont conçus pour éviter les infections causées par des bactéries, des virus ou des protozoaires tels que Giardia, observé ici en microscopie électronique à balayage.



918 Chapitre 28

Traitement des eaux usées et purification de l’eau, maladies microbiennes d’origine hydrique

GLOSSAIRE Bassin de coagulation (clarifier, coagulation basin) Bassin dans lequel les matières solides des effluents bruts coagulent avant élimination. Chloramine (chloramine) Composé produit par un mélange de chlore et d’ammoniac dans les stations d’épuration, et utilisé dans la désinfection de l’eau. Chlore (chlorine) Gaz utilisé pour la désinfection de l’eau. Coagulation (coagulation) Formation de grandes particules insolubles à partir de plus petites par addition de sulfate d’aluminium et de polymères anioniques. Coliforme (coliform) Bactérie Gram négatif, aérobie facultatif, non sporulée et fermentant le lactose. Demande biologique en oxygène (biochemical oxygen demand, BOD) Voir chapitre 19. Eau brute (raw water) Eaux superficielles ou souterraines n’ayant pas été traitées Eaux usées, ou eaux d’égouts (sewage) Effluents liquides contaminés par des matières fécales d’origines animale ou humaine. Effluent (effluent water) Eau usée après traitement, sortant d’une station d’épuration. Filtration (filtration) Élimination des particules en suspension dans l’eau par passge au travers de matériaux filtrants Flocculation (flocculation) Traitement de l’eau faisant suite à la coagulation et permettant par agitation douce de former des agrégats de grande taille. Kyste (cyst) Forme infectieuse d’un protozoaire parasite, entourée d’une paroi épaisse, lui conférant une résistance chimique et physique.

L

es eaux usées résultent des usages domestiques et industriels de l’eau, et ne peuvent être rejetées sans traitement dans les lacs, les rivières ou la mer pour des raisons de santé publique, d’économie, d’environnement ainsi que pour des raisons d’esthétique. L’eau propre, pure, est absolument indispensable à la santé publique, et il est nécessaire de contrôler, d’estimer et de remédier à la qualité des eaux. Cependant, la qualité de l’eau est parfois altérée, même dans des installations publiques de traitement et de purification. Des défauts dans la qualité de l’eau peuvent entraîner des maladies infectieuses aux conséquences dramatiques et parfois même mortelles. Ce chapitre est consacré aux méthodes usuelles de traitement et de purification de l’eau, ainsi qu’à plusieurs maladies d’origine hydrique.

I

MICROBIOLOGIE DES EAUX USÉES ET PURIFICATION DE L’EAU

L’eau est la source courante potentiellement la plus importante de maladies infectieuses, et sa purification est l’unique mesure permettant d’assurer la santé publique. Les méthodes les plus fréquemment employées pour déterminer la qualité de l’eau dépendent de techniques microbiologiques normalisées. En plus des procédés physiques et chimiques de purification, le processus de traitement et de purification de l’eau a recours à plusieurs méthodes standardisées utilisant les micro-organismes pour identifier, éliminer ou dégrader les polluants.

Matières en suspension (suspended solid) Particules de petite taille polluantes, ne pouvant être séparées de la phase liquide par un simple dépôt. Meningo-encéphalite (meningoencephalitis) Invasion, inflammation et destruction du tissu cérébral due à l’amibe Naegleria fowleri ou à d’autres pathogènes. Polymère (polymer) Composé chimique liquide utilisé en traitement de l’eau pour permettre la coagulation des particules. Potable (potable) Eau saine, apte à la consommation humaine. Sédiments (sediment) Particules de sol, sable, minéraux, etc., présentes dans l’eau brute. Système de distribution de l’eau (distribution system) Ensemble des conduites, réservoirs, etc., permettant de conserver l’eau potable et de la distribuer aux consommateurs. Traitement primaire (primary wastewater treatment) Séparation physique des déchets solides des eaux d’égout, par filtration grossière et sédimentation. Traitement secondaire aérobie (aerobic secondary wastewater treatment) Dégradation en aérobiose d’effluents à faibles concentrations en matière organique par des micro-organismes. Traitement secondaire anaérobie (anoxic secondary wastewater treatment) Dégradation en anaérobiose d’effluents à forte concentration de matière organique par des micro-organismes essentiellement fermentatifs. Traitement tertiaire (tertiary wastewater treatment) Traitement physico-chimique des eaux usées sortant du traitement secondaire pour diminuer la concentration de composés inorganiques. Turbidité (turbidity) Mesure des particules en suspension.

28.1 Santé publique et qualité de l’eau m n Comment assurer, en routine, que l’eau potable est sans danger ? Même l’eau d’apparence limpide et propre peut être contaminée par des micro-organismes pathogènes et poser de sérieux risques pour la santé. Malheureusement, il est impossible de passer au crible l’eau pour détecter tous les organismes pathogènes susceptibles d’être présents, et d’ailleurs quelques micro-organismes non pathogènes sont en général tolérables, et même inévitables, dans un circuit de distribution. Il est cependant possible d’analyser l’eau distribuée pour y rechercher la présence de certains groupes de micro-organismes pouvant compter des pathogènes. Nous présentons ici les méthodes classiquement employées pour identifier les microorganismes potentiellement dangereux dans l’eau.

Les coliformes La présence d’organismes indicateurs spécifiques indique qu’une eau donnée peut être contaminée par des pathogènes. L’indicateur le plus largement utilisé en ce qui concerne la contamination microbienne de l’eau est le groupe de microorganismes constitué par les coliformes. Les coliformes sont utilisés comme indicateurs de la contamination de l’eau car nombre d’entre eux vivent en abondance dans le tractus digestif de l’homme et d’autres animaux. Ainsi, leur présence dans l’eau indique une contamination fécale. Les coliformes sont



définis comme des Bacteria en forme de bacilles, Gram négatif, aérobies facultatifs, non sporulés, qui fermentent le lactose avec production de gaz en quarante-huit heures à 35 °C. Cette définition est plus opérationnelle que taxinomique, et en fait le groupe des coliformes comprend divers organismes. La plupart des coliformes appartiennent au groupe des bactéries entériques (voir section 12.11). Par exemple, le groupe des coliformes comprend Escherichia coli, un organisme habituel des tractus digestifs, ainsi que Klebsiella pneumoniae, un habitant moins fréquent des tubes digestifs, et pathogène. Cependant, Enterobacter aerogenes, un organisme n’appartenant pas au groupe des bactéries entériques et n’habitant pas les tractus digestifs, trouve aussi sa place parmi les coliformes en raison de ses propriétés de fermentation. En général, il est admis que la présence de coliformes dans un échantillon d’eau indique une contamination fécale et rend l’eau concernée impropre à la consommation humaine. Lorsqu’ils sont excrétés dans l’eau, les coliformes finissent par mourir, mais ils meurent moins rapidement que plusieurs pathogènes. Les coliformes et les pathogènes se comportent de manière identique au cours des traitements de purification.

La détection des coliformes Deux méthodes sont habituellement employées pour la détection des coliformes dans l’eau. Il s’agit de la méthode du NPP (nombre le plus probable) et de la filtration sur membrane. La méthode du NPP utilise des milieux de culture liquides en tubes à essais inoculés par des échantillons de l’eau à analyser. La croissance indique une contamination bactérienne de l’eau. Dans la numération sur membrane, au moins 100 ml d’eau sont décantés au travers d’une membrane filtrante stérile, qui retient les bactéries (voir section 20.3). Le filtre est placé sur une boîte de Petri contenant le milieu éosine-bleu de méthylène (EMB), très sélectif pour les coliformes (voir figure 28.1 et section 24.2). Après incubation, les colonies de coliformes sont comptées, et le nombre de coliformes dans l’échantillon est calculé. Dans des systèmes de distribution de l’eau parfaitement contrôlés, la détection de coliformes doit être négative. Si des coliformes sont détectés, c’est qu’un incident s’est produit dans le système de purification ou de distribution. Les critères de potabilité de l’eau aux États-Unis sont précisés dans le « Safe Drinking Water Act », qui précise les normes applicables pour l’eau potable. Dans la technique de filtration sur membrane, des échantillons de 100 ml sont décantés. L’eau est considérée comme saine si le nombre de coliformes dans les échantillons d’eau potable analysés n’excède pas l’une des trois limites suivantes : 1) 1 pour 100 mL en moyenne pour tous les échantillons analysés au cours d’un mois ; 2) 4 pour 100 mL dans plus d’un échantillon sur 20 analysés dans un mois ; ou 3) 4 pour 100 mL dans plus de 5 % d’échantillons ou plus de 20 analysés dans un mois. Les services de traitement de l’eau publient leurs résultats auprès de l’Agence de protection de l’environnement des États-Unis, et si les normes ne sont pas respectées, les services doivent avertir le public et prendre les mesures nécessaires pour régler le problème. Nombreux sont les services des petites et grandes agglomérations qui ne répondent pas toujours à ces normes.

T. D. Brock

28.1 Santé publique et qualité de l’eau 919

FIGURE 28.1 Colonies de coliformes sur une membrane filtrante. Un échantillon d’eau potable a été filtré et le filtre placé sur une boîte de Petri contenant le milieu éosine-bleu de méthylène (EMB), milieu à la fois sélectif et différentiel pour les bactéries fermentant le lactose (coliformes) [voir section 24.2]. La couleur sombre des colonies est caractéristique des coliformes. Chaque colonie provient d’une cellule de coliforme viable, présente dans l’échantillon analysé.

Santé publique et purification de l’eau potable De nos jours, l’incidence des maladies d’origine hydrique dans les pays développés est si faible qu’il est difficile de mesurer directement l’efficacité d’un traitement au regard des normes officielles. La plupart des infections intestinales dans les pays développés ne sont plus transmises par l’eau, mais par l’alimentation (voir chapitre 29). Cependant, ce n’est qu’à partir du XXe siècle que des procédés ultra-efficaces de traitement de l’eau ont été employés. Les méthodes de culture microbienne pour l’évaluation des risques sanitaires dus à la contamination des eaux potables n’étaient pas performantes jusqu’à la mise au point et l’amélioration des techniques de dénombrement des coliformes aux alentours de 1905. Jusqu’à cette époque, la purification de l’eau s’est limitée à la filtration, destinée à réduire la turbidité. Bien que la filtration décroisse significativement la charge bactérienne d’une eau, de nombreux micro-organismes passaient au travers des filtres. Vers 1910, on a découvert que le chlore était un désinfectant extrêmement efficace pour de grandes quantités d’eau. Le gaz chlore était si efficace et bon marché que son utilisation comme désinfectant pour l’eau potable s’est largement répandue et qu’il a eu un rôle essentiel dans la réduction de l’incidence des maladies d’origine hydrique. La figure 28.2 illustre la chute impressionnante de l’incidence de la fièvre typhoïde (infection à Salmonella typhi) dans la plupart des villes américaines après l’introduction des méthodes de filtration et de chloration. Des résultats similaires ont été obtenus ailleurs. Les premières améliorations remarquables de la santé publique aux États-Unis datent du début du XXe siècle et sont dues essentiellement à l’emploi à large échelle des procédures de traitement des eaux dans les stations d’épuration et usines de fourniture en eau potable publiques. L’efficacité de la filtration et de la chloration n’aurait pu être établie si des méthodes normalisées de



920 Chapitre 28


Nombre de cas de typhoïde

10 000

dans des eaux naturelles comme les lacs ou les rivières, ou leur traitement ultérieur pour en faire de l’eau potable.

Filtration, 1906

La diversité des eaux usées Chloration, 1913

1 000

100

1885

1895

1905

1915

1925

1935

1945

Année FIGURE 28.2 Effet de la purification de l’eau sur l’incidence des maladies d’origine hydrique. Le graphique montre l’incidence de la fièvre typhoïde à Philadelphie (Pennsylvanie, États-Unis) avant et après l’introduction des procédés de filtration et de chlorination dans les installations de fourniture d’eau potable. Notez la très nette diminution du nombre de cas de typhoïde, après l’introduction de ces procédés. Des résultats identiques ont été obtenus quant à la diminution des cas d’autres maladies d’origine hydrique.

dénombrement des coliformes n’avaient pas été mises au point. Ainsi, la santé publique, la microbiologie et l’ingénierie ont progressé simultanément.

Contrôlez vos acquis La qualité de l’eau potable est déterminée par le dénombrement des coliformes. Le respect strict des normes microbiologiques rend cette méthode fiable et reproductible pour la détection de la contamination fécale dans les services publics des eaux aux États-Unis. La filtration et la chloration de l’eau ont diminué significativement la charge microbienne. L’application des méthodes de purification de l’eau aux eaux potables est la mesure de santé publique la plus importante jamais décidée. •

Pourquoi les colonies bactériennes se développant sur un milieu EMB indiquent-elles une contamination fécale de l’eau analysée ?

•

Quels sont les procédés généralement employés pour réduire la charge microbienne des eaux traitées ?

28.2 Traitement des eaux usées m n Le traitement des eaux usées implique l’utilisation à échelle industrielle des micro-organismes pour réaliser des bioconversions. Les eaux usées sont admises dans une usine de traitement et, à la sortie, les effluents – les eaux usées traitées rejetées par l’usine de traitement – ont des propriétés permettant leur réincorporation

Les eaux usées provenant de rejets domestiques ou industriels ne peuvent être répandues sans traitement dans les lacs et les rivières. Les eaux d’égouts sont en fait des effluents liquides contaminés par des matières fécales humaines ou animales. Les eaux usées contiennent fréquemment des composés inorganiques et organiques nocifs, ainsi que des micro-organismes pathogènes. Un traitement complet des eaux usées comprend des traitements physique, chimique et biologique (microbiologique) pour éliminer ou neutraliser les contaminants. Environ 16 000 installations publiques de traitement des eaux usées existent aux États-Unis. La plupart de ces stations d’épuration sont de petite dimension et traitent chacune 3,8 millions de litres d’eaux usées (ou moins) par jour. Mais l’ensemble représente le traitement quotidien de 120 milliards de litres d’eaux usées. Les usines de traitement des eaux usées sont en général conçues pour recevoir à la fois les rejets domestiques et industriels. Les rejets domestiques comprennent les eaux d’égouts et les « eaux grises » (lessive, toilette, cuisine, pour lesquelles un citoyen américain utilise en moyenne, quotidiennement, entre 400 et 800 litres d’eau). Les rejets industriels comprennent les rejets des usines pétrochimiques, chimiques, agroalimentaires, pharmaceutiques ou métallurgiques. Les rejets industriels contiennent des substances toxiques, et des installations de prétraitement sont exigées par l’Agence de protection de l’environnement avant le traitement dans les stations d’épuration. Le prétraitement peut simplement consister en des procédés mécaniques qui éliminent les gros débris susceptibles de boucher les canalisations. Cependant, certains rejets sont prétraités biologiquement ou chimiquement pour éliminer les substances hautement toxiques telles que le cyanure, les métaux lourds (arsenic, plomb, mercure) ou les composés organiques comme l’acrylamide, l’atrazine (herbicide) ou le benzène. La toxicité de ces substances est amoindrie par des traitements chimiques ou microbiologiques qui permettent de les neutraliser, les oxyder, les précipiter ou les volatiliser.

Traitement des eaux usées et demande biologique en oxygène Le but d’une station d’épuration est de réduire la teneur en matériaux organiques et inorganiques jusqu’à un niveau interdisant la croissance microbienne et éliminant d’autres matériaux potentiellement toxiques. L’efficacité du traitement est exprimée en terme de réduction de la DBO, soit la demande biologique en oxygène quantité d’oxygène dissous consommée par des micro-organismes pour oxyder la totalité des composés organiques et inorganiques présents dans l’eau (voir section 19.5). Plus la concentration en matières organiques et inorganiques est élevée dans un échantillon, plus la DBO est élevée. Dans le cas des eaux usées domestiques, y compris les eaux d’égouts, les valeurs typiques de DBO sont de 200 unités. Dans le cas de rejets industriels, tels que ceux des industries laitières, les valeurs peuvent atteindre 1 500 unités DBO. Une station d’épuration efficace doit réduire la DBO à moins de 5 unités au niveau de l’effluent rejeté. Les stations doivent être conçues pour traiter à la fois des effluents faiblement et fortement chargés.



28.2 Traitement des eaux usées 921

John M. Martinko et Deborah O. Jung

Le traitement se fait en plusieurs étapes, qui utilisent des procédés physiques, chimiques et biologiques indépendants (voir figure 28.3). Des traitements primaire, secondaire et parfois tertiaire sont utilisés pour réduire la contamination fécale et chimique de l’eau à traiter. Chaque étape du traitement emploie des technologies plus complexes et plus coûteuses.

Le traitement primaire Le traitement primaire utilise seulement des méthodes physiques de séparation pour retenir les matériaux solides ainsi que les particules organiques et inorganiques. Les eaux usées entrant dans la station d’épuration passent au travers d’une série de grilles et de filtres retenant les objets les plus gros. L’effluent est ensuite laissé au repos plusieurs heures pour permettre aux matériaux solides de sédimenter au fond du bassin de séparation (voir figure 28.4). Les collectivités qui pratiquent uniquement le traitement primaire ont de sérieux problèmes avec les eaux très polluées lorsque l’effluent est rejeté dans les canaux proches, car il reste de fortes concentrations en matériaux organiques dissous et particulaires, ainsi que d’autres composés dans cette eau. Ces nutriments résiduaires peuvent permettre des développements bactériens ultérieurs indésirables (voir figure 19.10) et nuire à la

Eaux usées

Filtration grossière

qualité de l’eau. Aussi, la majorité des stations d’épuration emploient-elles un traitement secondaire, et parfois même tertiaire, pour réduire la teneur en matière organique des eaux usées avant le rejet des effluents dans l’environnement. Les procédés de traitement secondaire sont fondés sur une digestion microbienne à la fois en présence et en absence d’oxygène pour réduire la concentration en matières organiques.

Le traitement secondaire anaérobie

Sédimentation Boues (insoluble)

Liquide, composés solubles

Digestion anaérobie

Oxydation

Boues activées

par Filtration

Boues résiduelles ; Désinfection séchage ; incinération ; utilisation comme engrais ou enfouissement

Aération

Traitement de l’effluent et rejet Légende : Eaux usées

FIGURE 28.4 Traitement primaire des eaux usées. Les eaux usées sont pompées dans un bassin (à gauche), dans lequel les matières solides sédimentent. Lorsque le niveau de l’eau s’élève, le trop-plein est évacué au travers de grilles vers les niveaux inférieurs. Les eaux usées, désormais dépourvues de solides, pénètrent dans les déversoirs (flèche) et sont alors pompées vers les installations de traitement secondaire.

Traitement primaire

Traitement secondaire

FIGURE 28.3 Processus de traitement des eaux usées. Les usines de traitement des eaux utilisent successivement les traitements primaire et secondaire. Les eaux usées peuvent contenir de 200 unités de DBO pour les égouts et eaux usées domestiques à 1 500 unités de DBO ou plus dans le cas d’effluents industriels. À la sortie, les effluents contiennent en général 5 unités de DBO, et parfois moins. Le traitement tertiaire des effluents pour la diminution de la DBO est rarement mis en œuvre, car il n’a que peu d’effets.

Le traitement secondaire anaérobie implique une série de réactions de digestion et de fermentation réalisées par de nombreuses espèces de Bacteria et d’Archaea en conditions anaérobies. Le traitement anoxique est typiquement employé pour traiter des eaux usées contenant de grandes quantités de matières organiques insolubles (et donc de forte DBO), telles que les fibres, la cellulose résultant des industries laitière et agroalimentaire. Le processus de dégradation anoxique proprement dit se déroule dans de grands réservoirs clos appelés digesteurs ou bioréacteurs (voir figure 28.5a et b). Le procédé nécessite les activités collectives de nombreux et différents types de micro-organismes. Les réactions principales sont résumées dans la figure 28.5c. Grâce à l’action des micro-organismes anaérobies présents, les composés macromoléculaires des eaux usées sont d’abord digérés par des polysaccharases, des protéases et des lipases pour donner des composés solubles. Ces composés solubles sont alors fermentés pour fournir un mélange d’acides gras, d’H2 et de CO2, qui sont ensuite fermentés en acétate, CO2 et H2. Ces produits sont alors utilisés comme substrats par les Archaea méthanogènes (voir sections 12.6 et 17.17), capables de réaliser les réactions suivantes : CH3COOH → CH4 + CO2 et 4 H2 + CO2 → CH4 + 2 H2O (voir figure 28.5c). Ainsi, les produits principaux du traitement anaérobie des eaux usées sont le CH4 (méthane) et le CO2. Le méthane peut être collecté puis brûlé, ou utilisé comme combustible pour le chauffage et l’énergie de la station d’épuration.



922 Chapitre 28


Polymères complexes (polysaccharides, lipides, protéines) Hydrolyse par les enzymes microbiennes Monomères (sucres, acides gras, acides aminés)

T.D. Brock

Fermentation

Fermentation

Acétate

H2 + CO2 Méthanogénèse

(a) Sortie des gaz

CH4 + CO2 CH4/CO2 Injection des boues

Couche d’écume

Écumage

Surnageant

CH4

(c)

Élimination du surnageant

Boues en cours de digestion Boues stabilisées

Évacuation des boues (b)

Le traitement secondaire aérobie Le traitement secondaire aérobie utilise des réactions réalisées par des micro-organismes, en conditions aérobies, pour traiter les eaux usées contenant de faibles concentrations de matière organique. En général, les eaux usées non industrielles peuvent être traitées par ces procédés. Plusieurs procédés de digestion aérobies sont utilisés, mais les principales méthodes sont la filtration goutte-à-goutte et l’activation des boues. Le système de filtration (voir figure 28.6a) est formé d’un lit de roches concassées, de deux mètres d’épaisseur, sur le dessus duquel les eaux usées sont pulvérisées. Le liquide passe lentement au travers du lit de roches, la matière organique s’adsorbe sur les roches et la croissance microbienne se met en place sur les surfaces des fragments rocheux exposés. La minéralisation complète de la matière organique en dioxyde de carbone, ammoniac, nitrate, sulfate et phosphate s’effectue dans le biofilm microbien fixé sur les roches. Le traitement aérobie le plus courant est le procédé dit des boues activées. Les eaux usées sont mélangées et aérées dans de grands réservoirs (voir figure 28.6b). Des bactéries produisant des substances muqueuses, comme Zoogloea ramigera, se développent et forment des floculats (voir figure 28.7). Ces floculats forment un substrat sur lequel des protozoaires, de petits animaux et parfois des bactéries filamenteuses et des champignons se fixent. Le principe de base de l’oxydation est identique à celui des filtrations sur roches. L’effluent aéré contenant les floculats est pompé dans

FIGURE 28.5 Traitement secondaire anaérobie des eaux usées. (a) Digesteur anaérobie. Seul le sommet du digesteur est visible ; la partie inférieure est enterrée. (b) Principaux processus microbiens intervenant au cours de la digestion anaérobie. (c) Les principaux produits sont le méthane (CH 4) et le gaz carbonique (CO2) [voir section 17.17]. La figure 19.23 présente les principaux groupes microbiens impliqués dans la décomposition anaérobie, ainsi que les interactions entre micro-organismes au cours de la méthanogenèse.

un réservoir où ces floculats sédimentent. Une partie de ce matériau (nommé boues activées) est alors renvoyée vers le réservoir d’aération pour servir d’inoculum, et le reste est transféré dans le digesteur anaérobie (voir figure 28.5), ou bien éliminé, séché, brûlé, ou encore utilisé comme engrais. Les eaux usées restent normalement de cinq à dix heures dans un réservoir de boues activées, un temps trop court pour une oxydation complète de toute la matière organique. Cependant, durant cette période, la plupart de la matière organique dissoute est adsorbée sur les floculats et incorporée dans les cellules microbiennes. La DBO de l’effluent liquide est considérablement réduite (jusqu’à 95 %) par ce procédé, avec la plupart de la DBO désormais concentrée dans les floculats sédimentés. Une réduction presque totale de la DBO peut être obtenue si les floculats sont transférés dans un digesteur anaérobie pour être convertis en CO2 et CH4.

Le traitement tertiaire Le traitement tertiaire est en fait identique aux procédés physico-chimiques ou biologiques mis en œuvre dans des bioréacteurs et/ou utilisant la précipitation, la filtration ou la chloration, employés pour la purification de l’eau destinée à la consommation (voir section 28.3). L’objectif est simplement de réduire les niveaux de nutriments inorganiques, et particulièrement de phosphate, nitrite et nitrate dans l’effluent terminal.





28.2 Traitement des eaux usées 923

(b)

(a) Eaux usées sortant du traitement primaire

Bassin d’aération

Bassin de sédimentation Effluent épuré

Boues activées Air Digesteur anaérobie Réinjection des boues activées

Boues en excès

(c)

La plupart des installations de traitement chlorent désormais les effluents issus des installations de traitement secondaire (pour réduire davantage les possibilités de contamination microbienne) afin de pouvoir les rejeter dans les rivières et les lacs. Aux États-unis (côte est), de nombreux traitements emploient les radiations ultraviolettes (UV) pour désinfecter les effluents. L’ozone (O3), un oxydant puissant, est un agent bactéricide et virocide efficace aussi utilisé dans une cinquantaine d’installations des États-Unis. Les eaux usées bénéficiant d’un traitement tertiaire contiennent si peu de nutriments qu’elles ne peuvent permettre une forte croissance microbienne. Le traitement tertiaire est la méthode la plus complète pour traiter les eaux d’égouts, mais elle n’a pas été généralisée en raison de son coût.

Contrôlez vos acquis Le traitement des eaux usées concerne essentiellement le traitement des eaux d’égouts et des rejets industriels

FIGURE 28.6 Traitement secondaire aérobie des eaux usées. Installations de traitement à Carbondale, une petite ville de l’Illinois (ÉtatsUnis). (a) Filtres sur graviers. La buse d’arrosage en rotation distribue lentement les eaux usées sur le lit de roches. Les fragments rocheux mesurent de 10 à 15 cm de diamètre et forment une couche épaisse de 2 m. (b-c) Procédé des boues activées. (b) Bassin d’aération d’une installation à boues activées d’une station d’épuration. Le bassin mesure 30 m de long sur 10 m de large et 5 m de profondeur. (c) Flux d’eaux usées dans une installation à boues activées. La recirculation des boues activées vers le bassin d’aération permet l’introduction de micro-organismes responsables de la digestion aérobie de la matière organique. Le réacteur anaérobie est détaillé dans la figure 28.5 et les principales interactions microbiennes sont décrites dans la figure 19.23.

en vue de réduire la DBO (demande biologique en oxygène) à des niveaux acceptables. Les traitements primaire, secondaire et tertiaire de l’eau impliquent des procédés physiques, biologiques et physico-chimiques. Après un traitement secondaire, ou optionnellement tertiaire, l’eau peut être déversée directement dans une installation de fabrication d’eau potable. •

Qu’est-ce que la DBO ? Pourquoi la réduction de la DBO est-elle nécessaire dans le traitement des eaux usées ?

•

Identifiez les procédés de traitement primaire, secondaire (aérobie et anaérobie) et tertiaire des eaux usées.

•

Identifiez les produits terminaux du traitement des eaux usées. Comment ces produits peuvent-ils être utilisés ?



924 Chapitre 28


sédiments, sols, sables, particules minérales et autres grosses particules se déposent. L’eau, débarrassée des particules, est alors pompée dans un vaste bassin de coagulation. Les aluns et les polymères anioniques contribuent à agglomérer les petites particules en suspension. Après mélange, les particules poursuivent leurs interactions et forment de plus grands agrégats, en un processus nommé floculation. Les grandes particules agrégées forment un floc, qui se dépose au fond par gravité, piégeant les micro-organismes et absorbant les matières organiques en suspension et le sédiment. Après coagulation et floculation, les eaux clarifiées sont soumises à la filtration. L’eau passe au travers d’une série de filtres conçus pour éliminer les solutés organiques et inorganiques, mais aussi toutes les particules en suspension et les micro-organismes. Les filtres sont habituellement faits d’épaisses couches de sable, de charbon actif et de matériaux échangeurs d’ions. Combinée aux étapes précédentes, la filtration produit une eau débarrassée de toute matière particulaire, de la plupart des composés organiques et inorganiques, et de pratiquement tous les micro-organismes.

Richard Unz

La désinfection

FIGURE 28.7 Floculats formés par la bactérie Zooglea ramigera. Les floculats des boues activées sont constitués de très nombreuses cellules en bâtonnets de Z. ramigera, entourées d’une couche de polysaccharides, disposées en ramifications caractéristiques en forme de doigts. Coloration négative à l’encre de Chine. Pour la biologie de Zooglea, voir section 12.7.

28.3 Purification de l’eau potable m n Les eaux usées soumises au traitement secondaire ont en général une qualité telle qu’elles peuvent être directement déversées dans les rivières et les fleuves. Cependant, une telle eau n’est pas potable ou saine pour la consommation humaine. La production d’eau potable nécessite un traitement complémentaire pour éliminer les micro-organismes potentiellement pathogènes, éliminer les mauvais goûts et odeurs, réduire les nuisances chimiques dues au fer et au manganèse, et diminuer la turbidité (matières en suspension). Les matières en suspension sont de petites particules de polluants insolubles qui résistent à la séparation par des moyens physiques ordinaires.

Purification physique et chimique La figure 28.8a représente une installation classique de fabrication d’eau potable. La figure 28.8b indique le circuit de l’eau brute (non traitée) dans une installation typique. L’eau brute est d’abord pompée de la source, ici une rivière, vers un bassin de sédimentation où des polymères anioniques, des sulfates d’aluminium (aluns) et du chlore sont ajoutés. Les

L’eau clarifiée, filtrée peut alors être désinfectée avant son admission dans le circuit de distribution comme eau pure et potable. La chloration constitue la méthode la plus commune de désinfection. À doses suffisantes, le chlore tue tous les micro-organismes en trente minutes (certains protozoaires pathogènes comme Cryptosporidium ne sont toutefois pas aussi facilement tués et demeurent un problème – voir section 28.6). En plus de tuer les micro-organismes, le chlore réagit avec les composés organiques, les oxyde, et en fait les neutralise. Cependant, de nombreux composés à l’origine de goût désagréable et de mauvaises odeurs étant de nature organique, le traitement au chlore améliore aussi le goût et l’odeur de l’eau. Il est ajouté à l’eau à partir d’une solution concentrée d’hypochlorite de sodium ou de calcium, ou sous forme de gaz provenant de réservoirs pressurisés. Cette dernière méthode est le plus souvent employée dans les grandes stations d’épuration, car son automatisation est plus facile. Le chlore est consommé par réaction avec la matière organique ; aussi faut-il ajouter des quantités suffisantes de chlore aux eaux contenant de la matière organique, de telle sorte qu’une petite quantité, le chlore résiduel, soit disponible pour agir sur les micro-organismes. Ce taux de chlore résiduel est déterminé par analyse. Un taux de 0,2 à 0,6 µg/mL convient dans la plupart des cas. Après traitement au chlore, l’eau désormais potable est pompée vers des réservoirs de stockage, d’où elle est acheminée par gravité ou pompage dans le circuit de distribution et chez les consommateurs. Les niveaux de chlore résiduel sont tels que l’eau atteindra le consommateur sans avoir été contaminée (sauf incident, comme une rupture de canalisation). Le gaz chlore, même dissous dans l’eau, est extrêmement volatil et s’élimine en quelques heures. Afin d’assurer des niveaux suffisants de chlore résiduel dans le circuit de distribution, de l’ammoniac est fréquemment ajouté au chlore pour former de la chloramine, un composé chloré non volatile, HOCl + NH3 → NH2Cl + H2O. Les radiations ultraviolettes (UV) sont également utilisées comme moyen de désinfection. Comme cela a été précisé dans



28.4 Eau et risques sanitaires 925

Élimination des graviers, sables et grosses particules

Formation et élimination Coagulation des floculats contenant des matières insolubles et des micro-organismes

Station de pompage

Rivière Ohio

Bassin de coagulation

Eau non traitée Sédimentation

Bassins de sédimentation

Réservoir souterrain d’eau potable

Chloration

Louisville Water Company

Filtration

Installations de filtration

(a)

Chloration Stockage

Élimination de toutes les particules restantes, des composés organiques et inorganiques Les micro-organismes restants sont tués Toute nouvelle croissance microbienne est impossible Eau potable Distribution

(b)

FIGURE 28.8 Installation de production d’eau potable. (a) Vue aérienne de l’usine de production d’eau potable de Louisville, dans le Kentucky (États-Unis). Les flèches indiquent la direction de circulation de l’eau dans l’usine. (b) Représentation schématique d’une installation classique de production d’eau potable.

la section 22.2, les UV sont employés à la fin du traitement secondaire. En Europe, l’irradiation aux UV est couramment employée pour la préparation de l’eau potable et cette méthode est envisagée aux États-Unis. Pour un usage de désinfection, les rayonnements UV sont engendrés par des lampes à vapeur de mercure. L’énergie maximale est obtenue pour une longueur d’onde de 253,7 nm, qui est bactéricide et virocide (voir section 10.4). Cependant, en utilisation courante, les UV ne tuent pas les cystes et les oocystes des protozoaires comme Giardia et Cryptosporidium (voir section 28.6). Les avantages de l’utilisation des rayons UV sur la désinfection chimique comme la chloration sont multiples. Il s’agit tout d’abord d’un procédé physique, qui n’introduit pas de molécules chimiques nouvelles dans l’eau. De plus, le temps de contact utile est très court, ce qui permet l’emploi des UV sur de l’eau circulante, et donc un coût minime. Enfin, de nombreuses études montrent qu’il n’y a pas de formation de sous-produits. Dans de petites installations à la sortie desquelles l’eau n’est pas pompée sur une grande distance ou conservée trop longtemps, la désinfection aux UV est préférable à la chloration.

Contrôlez vos acquis Les usines d’eau potable emploient des procédés physiques et chimiques à l’échelle industrielle pour éliminer ou neutraliser les contaminants biologiques, organiques et inorganiques d’origines domestique et industrielle. Les usines d’eau potable utilisent des processus de clarification, filtration et désinfection. L’eau potable distribuée est dépourvue de contamination biologique ou chimique. •

Décrivez les étapes du traitement de l’eau dans une usine d’eau potable, de l’entrée de l’eau dans l’usine jusqu’au robinet chez le consommateur.

•

II

Dans le traitement de l’eau, quels sont les rôles respectifs de la sédimentation, de la coagulation, de la filtration et de la désinfection ?

MALADIES INFECTIEUSES À TRANSMISSION HYDRIQUE

Les maladies infectieuses d’origine ou de source commune sont dues à la contamination microbienne de milieux ou d’équipement utilisés par un grand nombre d’individus. L’eau contaminée est une source commune d’infections très importante. Une défaillance dans une seule étape de la filière de traitement de l’eau potable peut exposer des milliers voire des millions d’individus à un agent infectieux. Les maladies infectieuses à transmission hydrique sont à l’origine de la mortalité très élevée des populations des pays en voie de développement. L’eau peut véhiculer des microorganismes, bactéries, virus et protozoaires, engendrant des maladies parfois graves lorsqu’ils pénètrent dans le corps humain, même en petites quantités. La dose minimale infectante, nécessaire au déclenchement de la maladie, est fonction de la virulence du pathogène et de la capacité de l’hôte à résister aux infections (voir sections 21.8 et 21.14).

28.4 Eau et risques sanitaires m n La transmission de micro-organismes pathogènes à l’homme peut se faire par ingestion d’eau de boisson ou de cuisson contaminée. L’eau destinée à des usages récréatifs (natation, baignade) peut être également contaminante.



926 Chapitre 28


L’eau potable Pour nombre de populations ne disposant pas d’installations sanitaires, l’eau biologiquement contaminée est à l’origine d’épidémies pouvant être catastrophiques. Dans les pays industrialisés, la collecte des eaux usées et la production d’eau potable sont soumises à des normes strictes, limitant la dissémination des maladies hydriques à quelques foyers sporadiques, dus à une contamination exceptionnelle des filières de production. Des épisodes isolés affectant un petit nombre d’individus peuvent survenir après ingestion d’eau non contrôlée, provenant de puits privés, de ruisseaux ou de lacs. Ces sources peuvent être contaminées par des déjections humaines ou animales. Les contaminations fécales doivent être systématiquement détectées (sur l’identification des coliformes fécaux, voir section 28.1) et éliminées par désinfection (voir section 28.3). Aux États-Unis, quelques pathogènes bactériens et quelques protozoaires sont occasionnellement transmis par l’eau de boisson (voir tableau 28.1). La giardiase et la cryptosporidiose sont développées dans la section 28.7, les salmonelloses et les infections à Escherichia coli O157:H7 dans le chapitre 29, l’infection par voie alimentaire étant leur mode de transmission principal.

Les eaux à usage récréatif L’eau récréative est celle des aires publiques de baignade, des étangs, des ruisseaux, des lacs, ainsi que des piscines et des pataugeoires. Les piscines et baignades aménagées publiques font l’objet d’une importante réglementation nationale et locale concernant leur hygiène et leur sécurité. D’après le Code de la santé publique, le nombre de bactéries aérobies

TABLEAU 28.1

Maladie

ÉPISODES ÉPIDÉMIQUES ASSOCIÉS À a L’EAU DE BOISSON AUX ÉTATS-UNIS Agent

Épisodes

Nombre de cas

Salmonellose

Salmonella spp.

2

208

Giardiase

Giardia intestinalis

6

52

Cryptosporidiose

Cryptosporidium parvum

1

5

Gastro-entérites aiguës

Escherichia coli O157:H7

4

60


2

117

E. coli O157:H7 et C. jejuni

1

781

Picornavirus

1

70

Virus Norwalk-like

3

356

Inconnu

17

416

a

Compilation des données du Center for Diseases Control, États-Unis, 1999-2000. On a signalé 37 épisodes épidémiques et 2 065 cas d’infection dus à la contamination de l’eau de boisson. L’eau est fournie par la municipalité dans 237 cas (11,5 %) , par des systèmes privés (certaines industries, écoles, bateaux de croisière) dans 1 425 cas (69 %). L’approvisionnement en eau individuel (puits, sources, rivières) représente 403 cas (19,5 %).

revivifiables, à 37 °C, dans un millilitre d’eau, doit être inférieur à 100 ; le nombre de coliformes totaux, dans 100 millilitres d’eau, doit être inférieur à 10 avec absence de coliformes fécaux dans 100 millilitres. Les échantillons prélevés ne contiennent pas de germes pathogènes, notamment pas de staphylocoques pathogènes, dans 100 ml, pour 95 % des échantillons. La fréquence d’échantillonnage est au moins mensuelle. Les piscines privées, spas et bains bouillonnants, moins contrôlés, peuvent être occasionnellement à l’origine de maladies à transmission hydrique. Aux États-Unis, durant les douze dernières années (données complètes), une moyenne de treize épisodes épidémiques annuels liés à des eaux récréatives a été enregistrée. Ces épisodes épidémiques sont classés selon les maladies signalées dans le tableau 28.2.

Les maladies à transmission hydrique dans les pays en développement Dans le monde, les maladies liées à l’eau sont à l’origine de la mortalité très élevée parmi les populations des pays en voie de développement, qui ne disposent pas des infrastructures nécessaires à la collecte et au traitement des eaux usées (péril fécal). Les populations sont parfois privées d’accès à l’eau potable, avec pour conséquences des épidémies de choléra, de fièvre typhoïde ou d’amibiase (voir section 28.8).

Contrôlez vos acquis L’eau de boisson et les eaux récréatives peuvent être des sources de pathogènes transmis par voie hydrique. Aux États-Unis et dans les pays industrialisés, le nombre d’épisodes épidémiques liés à l’eau est relativement faible par rapport à la fréquence d’utilisation. Dans le monde, le manque d’équipements nécessaires au traitement des eaux et la difficulté d’accès à l’eau potable expliquent la transmission massive de ces maladies. •

Identifiez le micro-organisme le plus souvent impliqué dans les épidémies liées à la contamination de l’eau de boisson.

•

Identifiez le micro-organisme responsable du plus grand nombre d’infections (incidence élevée) liées à la contamination de l’eau de boisson.

•

Identifiez les micro-organismes susceptibles d’être à l’origine d’une épidémie liée à l’usage d’eau récréative contaminée.

28.5 Choléra m n Le choléra est une maladie diarrhéique grave, principalement répandue, de nos jours, dans les pays en voie de développement. C’est un exemple de maladie à transmission hydrique majeure, de type épidémique, pouvant être contrôlée par l’application de mesures d’hygiène et par le traitement des eaux usées.



28.5 Choléra 927

TABLEAU 28.2

ÉPISODES ÉPIDÉMIQUES ASSOCIÉS AUX EAUX À USAGE RÉCRÉATIF a AUX ÉTATS-UNIS

Nombre d’épisodes Pourcentage

Gastro-entériteb Dermatite/kératite

c

Méningo-encéphalite Autrese

d

74

46,8

50

31,6

22

13,9

12

7,6

Mark L. Tamplin

Maladie

a

Compilation des données du Center for Diseases Control, États-Unis, 1989-2000. Cent cinquante-huit épisodes d’infection hydrique dus à l’eau récréative ont été signalés, soit environ treize épisodes annuels. b La plupart des cas de gastro-entérite sont dus à Cryptosporidium parvum (voir section 28.6), Escherichia coli O157:H7 (voir section 29.8), ou au virus Norwalk-like (voir section 28.8). c La plupart des cas de dermatite sont dus à Pseudomonas aeruginosa. d Méningo-encéphalites dues à l’amibe Naegleria fowleri (voir section 28.8). e Les autres maladies correspondent à la leptospirose, due à Leptospira interrogans, la fièvre de Pontiac, due à Legionella spp. (voir section 28.7), ainsi qu’à des infections respiratoires aiguës d’étiologie inconnue.

Biologie et épidémiologie L’agent du choléra est Vibrio cholerae, un bacille Gram négatif transmis par ingestion d’eau contaminée, ou, plus rarement, par ingestion de fruits de mer ou de végétaux crus ayant été lavés ou en contact avec de l’eau contaminée. Depuis 1817, sept pandémies de choléra ont frappé les populations mondiales. Deux biotypes ou souches de V. cholerae distincts sont connus : le biotype cholerae, agent du choléra classique, et le biotype El Tor. Vibrio cholerae sérogroupe O1, biotype El Tor, est responsable de la septième pandémie, qui a débuté en Indonésie en 1961, entraînant cinq millions de cas de choléra et de plus de 250 000 morts. En 1992, est apparu au Bangladesh un nouveau sérogroupe, variant génétique du biotype El Tor, appelé cholerae O139 Bengale. Ce nouveau sérogroupe est en expansion en Inde et au Bangladesh, et pourrait être à l’origine d’une huitième pandémie. En 2001, 184 311 cas de choléra, ayant entraîné 2 728 décès, ont été notifiés à l’OMS, l’Afrique regroupant 94 % de ces cas. Ces chiffres sont vraisemblablement inférieurs à la réalité en raison de la sous-notification des cas et des insuffisances des différents systèmes de surveillance. Le choléra sévit de façon endémique dans les zones tropicales humides d’Afrique, de l’Asie du Sud-Est, en Inde, en Amérique centrale et latine. Les épidémies surviennent dans les régions où les équipements sanitaires et le traitement des eaux usées sont insuffisants. Les pays industrialisés ne sont pas totalement épargnés. Ces dix dernières années, quelques cas sporadiques ont été signalés aux États-Unis (moins de 250 au total), pour la plupart le long du golfe de Floride. La plupart des cas sont dus à l’ingestion de coquillages crus, contaminés par V. cholerae, vivant de façon endémique en association avec le zooplancton des eaux côtières (voir figure 28.9).

La pathogenèse Après ingestion d’une dose infectante assez élevée, les vibrions cholériques se multiplient dans la lumière de l’intestin grêle.

FIGURE 28.9 Bactéries de l’espèce Vibrio cholerae fixées à la surface de l’algue d’eau douce Volvox. L’isolat provient d’une région du Bangladesh, où le choléra sévit de façon endémique. Un Ac monoclonal, dirigé contre des protéines bactériennes de surface, colore les vibrions cholériques en vert. C’est la fluorescence de la chlorophylle a dans l’algue qui provoque la coloration rouge.

Les sujets sains, sans facteurs de risque particuliers, sont partiellement protégés de l’infection par l’acidité gastrique. L’ingestion de 108 à 109 vibrions est nécessaire pour déclencher la diarrhée. En présence de bicarbonate de soude ou absorbées avec des aliments qui protègent les vibrions de l’acidité gastrique, des doses de 103 ou 104 bactéries sont infectantes. Dans l’intestin grêle, les vibrions cholériques adhèrent aux cellules épithéliales et sécrètent une entérotoxine protéique. Cette entérotoxine provoque des pertes d’eau et d’électrolytes massifs, d’où une diarrhée hydrique sérieuse menant à la déshydratation, voire au décès du malade, en l’absence de réhydratation d’urgence par des solutés hydroélectrolytiques. L’entérotoxine provoque des pertes liquidiennes parfois supérieures à vingt litres (ou vingt kilos) par jour. En l’absence de traitement, 25 à 50 % des sujets atteints de choléra grave, favorisé par la malnutrition et la promiscuité, décèdent.

Diagnostic, prévention et traitement Les vibrions sont visibles en très grande abondance, sous forme de bacilles Gram négatif incurvés, très mobiles, dans les selles aqueuses et riziformes de patients souffrant de choléra sérieux (voir figure 28.10). La vaccination anticholérique n’est pas systématiquement recommandée. Les vaccins sont peu efficaces et n’assurent qu’une protection partielle pour une durée de six mois à un an. Les vaccins disponibles ne protègent pas contre V. cholerae O139 et n’empêchent pas le portage des bactéries, et donc la dissémination de la maladie aux sujets réceptifs. Les mesures de prévention collectives les plus efficaces reposent sur l’amélioration des conditions sanitaires, le traitement des eaux usées et l’approvisionnement des populations en eau de boisson convenablement désinfectée. V. cholerae est totalement éliminé des eaux par les procédés de désinfection habituels. Les voyageurs se rendant en zone d’endémie ne doivent boire que de l’eau de provenance sûre, ou bouillie, et ne consommer que des aliments bien cuits. Les aliments crus, le poisson et les coquillages sont à éviter.



928 Chapitre 28


Afrique. En zone d’endémie, l’application de précautions d’hygiène permet d’éviter efficacement la contamination par de l’eau ou des aliments souillés. Le traitement le plus efficace du choléra est la réhydratation orale par des solutés d’électrolytes. Ce traitement réduit la mortalité de la maladie à environ 1 % des cas. •

Décrivez les mesures susceptibles de prévenir le choléra en zone d’endémie.

•

De quelles façons le choléra est-il le plus fréquemment transmis ?

•

Comment le choléra peut-il être traité ?

CDC/PHIL

28.6 Giardiase et cryptosporidiose m n

FIGURE 28.10 Échantillon de selles de patient cholérique. Les selles « eau de riz » sont liquides. La fraction solide à la surface de l’échantillon est constituée par du mucus. Les selles de ces patients sont isotoniques au sang, contenant des quantités importantes d’ions Na+, K+ et HCO3– (bicarbonate) et de vibrions cholériques. La biologie et le métabolisme de Vibrio cholerae sont expliqués dans la section 12.12 ; l’action de la toxine cholérique est détaillée dans la figure 21.22.

Le traitement du choléra est fondé sur la réhydratation d’urgence par des solutés hydroélectrolytiques, administrés par voie intraveineuse dans les cas graves (20 g de glucose, 4,2 g de NaCl, 4 g de NaHCO3, 1,8 g de KCl, dissous dans un litre d’eau). Dans les autres cas, l’administration de ces sels de réhydratation par voie orale permet un traitement très efficace et peu coûteux (thérapie non invasive ne demandant pas un personnel médical formé). Un traitement rapide et approprié réduit la mortalité à moins de 1 % des cas. Le traitement par réhydratation suffit seul à guérir du choléra. Une antibiothérapie par les tétracyclines ou le triméthoprime-sulfaméthoxazole hâte cependant la guérison et réduit le risque de dissémination du pathogène, qui disparaît des selles en quelques heures.

Contrôlez vos acquis Vibrio cholerae est l’agent du choléra, une maladie diarrhéique aiguë entraînant une déshydratation grave. Le choléra se manifeste sous forme de pandémie. La pandémie actuelle se maintient à travers des foyers endémiques dans les Amériques, en Inde, Asie et

La giardiase et la cryptosporidiose sont des maladies respectivement dues aux protozoaires Giardia intestinalis et Cryptosporidium parvum. Ces micro-organismes, retrouvés à la surface de toutes les eaux, sont difficiles à éliminer car ils sont très résistants au chlore.

Giardiase Giardia intestinalis est un protozoaire flagellé (voir section 14.10), agent de la giardiase, gastro-entérite aiguë à transmission oro-fécale. La transmission par voie alimentaire ou par voie sexuelle a également été décrite (voir figure 28.11). Ces protozoaires se présentent sous deux formes : les trophozoïtes, ou formes végétatives, (voir figure 28.11a) et les kystes, formes de résistance (voir figure 28.11b). Les kystes sont entourés d’une paroi protectrice épaisse, leur permettant de résister à la dessiccation et à la désinfection chimique. L’infection se contracte par ingestion de kystes, suivie de leur dékystement sous l’action du pH gastrique. Les trophozoïtes libérés colonisent la partie supérieure de l’intestin grêle. La symptomatologie est d’autant plus bruyante que la charge parasitaire est élevée : diarrhée aqueuse nauséabonde au début de l’infestation, syndrome douloureux abdominal, troubles digestifs (nausées, crampes, flatulences) et syndrome de malabsorption intestinale, caractérisé par une diarrhée chronique (selles pâteuses et graisseuses) et un amaigrissement. La diarrhée nauséabonde et l’absence de sang ou de mucus dans les selles sont des éléments diagnostiques orientant vers une giardiase plutôt que vers une diarrhée bactérienne ou virale. Le portage asymptomatique est fréquent. Giardia intestinalis a été impliqué dans six des trente-sept épisodes récents de maladies liées à l’eau signalés aux ÉtatsUnis (voir tableau 28.1). La giardiase peut également être contractée par ingestion accidentelle d’eau provenant d’une piscine ou d’un lac contaminé. Aux États-Unis, les kystes de Giardia ont été détectés dans 97 % des prélèvements d’eaux de surface (lacs, étangs, cours d’eau). La paroi épaisse des kystes leur permettant de résister au chlore et aux ultraviolets, la plupart des épisodes épidémiques ont été associés à l’utilisation d’eau désinfectée par chloration seule. L’eau traitée par



(a)

S. L. Erlandsen

D. E. Feely, S. L. Erlandsen, et D. G. Case

28.6 Giardiase et cryptosporidiose 929

(b)

FIGURE 28.11 Observation en microscopie électronique à balayage du parasite Giardia. (a) Trophozoïte mobile, d’environ 15 µm de long. (b) Cyste, d’une longueur d’environ 11 µm. La phylogénie de ce protozoaire est abordée dans la section 14.9 et celle des protozoaires en général, dans la section 14.10.

clarification, filtration et chloration, ou par d’autres moyens de désinfection (voir section 28.3), est en général exempte de kystes de Giardia. Des cas isolés de giardiase ont été décrits dans certaines régions reculées, associés à la consommation d’eau de boisson non traitée. Les castors et les rats musqués sont fréquemment porteurs de Giardia et contaminent les cours d’eau par leurs déjections. L’eau de rivière, consommée en randonnée ou en camping, doit être filtrée et traitée par de l’iode ou du chlore, ou filtrée et bouillie. L’ébullition est la méthode la plus fiable pour éliminer les pathogènes de l’eau. Au laboratoire, le diagnostic de certitude repose sur la mise en évidence, dans les selles, de kystes de Giardia ou d’antigènes de Giardia par ELISA (technique immunoenzymatique – voir section 24.10). Le métronidazole, la mépacrine et la quinacrine sont utilisés pour traiter les formes aiguës.

grand nombre de personnes, soit plus de 403 000 malades diarrhéiques, parmi 1,6 million d’habitants, à la suite d’une contamination par Cryptosporidium parvum d’un secteur du lac Michigan. Les pluies de printemps ont drainé les effluents des fermes environnantes vers le lac Michigan et débordé le système municipal de traitement des eaux, conduisant à la contamination par C. parvum. Le protozoaire parasite fréquemment les intestins des animaux d’élevage laitier, source de la contamination la plus probable. Chez les sujets sains, la cryptosporidiose se manifeste sous forme d’une gastro-entérite banale, voire asymptomatique, dépassant rarement deux semaines. Les sujets immunodéprimés, ou atteint d’immunodépression acquise (SIDA), les sujets âgés ou les très jeunes enfants peuvent cependant développer des complications sérieuses. Lors de l’épidémie de Milwaukee,

Parasite des animaux à sang chaud, Cryptosporidium parvum est un protozoaire se présentant sous forme de petites coccidies rondes, de 2 à 5 µm de diamètre, capables d’envahir et de se multiplier dans les cellules muqueuses de l’épithélium gastrique et dans les entérocytes. Les oocystes infectieux, disséminés en quantités importantes dans les eaux par les déjections des animaux infectés, sont protégés par une paroi épaisse qui les rend résistants au chlore (voir figure 28.12). L’infection d’un individu se fait par ingestion des kystes. En raison du grand nombre de kystes excrétés, il est possible de contaminer à la fois le milieu extérieur et l’entourage d’un malade. Le parasite se transmet par l’intermédiaire des mains sales d’individu à individu, et tout particulièrement dans les collectivités (hôpitaux, crèches). La consommation d’eau contaminée explique également la survenue de certaines épidémies massives. Les kystes de Cryptosporidium sont très résistants au chlore (quatorze fois plus résistants que les kystes de Giardia), ainsi qu’aux rayons ultraviolets. Les méthodes de traitement des eaux par sédimentation et filtration sont les plus efficaces pour éliminer les Cryptosporidium. Aux États-Unis, l’épidémie hydrique de Milwaukee, survenue en 1993 dans le Wisconsin, est celle ayant touché le plus

University of Chicago Press/Pearl Ma/PHIL

Cryptosporidiose

FIGURE 28.12 Frottis mince de selles après coloration de ZiehlNielsen montrant des oocystes de Cryptosporidium. Ces oocystes à paroi mince (diamètre de 3 à 5 µm) sont colorés en rouge. Cryptosporidium, parasite intracellulaire obligatoire, fait partie des sporozoaires, un groupe de protozoaires (voir section 14.10).




4 400 personnes ont été hospitalisées et plusieurs dizaines sont décédées des complications de la maladie, de déshydratation sérieuse surtout. Cette épidémie a mis en évidence la vulnérabilité des systèmes de purification des eaux et la nécessité impérative d’une surveillance constante. La défaillance de l’approvisionnement en eau potable d’une large fraction de la population peut également avoir des conséquences économiques catastrophiques, tant en examens de laboratoire et en soins médicaux qu’en perte de productivité (déficit économique évalué à plus de 96 millions de dollars à Milwaukee). Le diagnostic de laboratoire repose sur la mise en évidence d’oocystes de Cryptosporidium dans les selles. Chez le sujet immunocompétent, le traitement est inutile. Chez l’immunocompromis, il est préférable d’arrêter tout traitement immunosuppresseur (prednisone, par exemple). Les diarrhées fébriles graves, parfois cholériformes, de l’immunodéprimé doivent être traitées par réhydratation intraveineuse.

Contrôlez vos acquis La giardiase et la cryptosporidiose sont transmises par l’ingestion de kystes de Giardia intestinalis et de Cryptosporidium parvum, présents dans les eaux de boisson ou récréatives contaminées par des fèces provenant d’humains ou d’animaux infectés. Ces parasites sont responsables de diarrhées pouvant être graves chez les sujets immunodéprimés. •

Expliquez pourquoi les kystes jouent un rôle important dans la survie et l’infectiosité de Giardia intestinalis et de Cryptosporidium parvum.

•

Pourquoi les protozoaires sont-ils souvent associés à des maladies à transmission hydrique, même dans les pays développés ? Par quels procédés peut-on les éliminer ?

28.7 Légionellose (maladie m n des légionnaires) La légionellose est une infection respiratoire à transmission hydrique, provoquée par des bactéries du genre Legionella. L’homme s’infecte en inhalant un aérosol d’eau contaminée. L’espèce la plus importante en pathologie humaine est Legionella pneumophila.

Biologie et épidémiologie Legionella pneumophila a été reconnue pour la première fois en 1976, à l’occasion d’une épidémie survenue à Philadelphie, lors d’un congrès d’anciens combattants de l’armée américaine, d’où le nom de « Maladie des légionnaires ». L. pneumophila est un fin bacille Gram négatif, aérobie strict (voir figure 28.13), dont la culture requiert des milieux complexes, enrichis en fer. L. pneumophila peut être détectée par des techniques d’immunofluorescence (voir section 24.9) et isolée de prélèvements environnementaux (terre, eau) ou de produits pathologiques (patients ayant contracté une légionellose).

Carey S. Callaway

930 Chapitre 28

FIGURE 28.13 Legionella pneumophila, agent de la maladie des légionnaires. Coupe mince de la bactérie Legionella pneumophila (diamètre de 0,3 à 0,6 µm, longueur de plus de 2 µm), observée en microscopie électronique à transmission. Les zones claires dans les corps bactériens sont des granules de β-hydroxybutyrate, un polymère de stockage du carbone (voir section 4.11).

Les légionelles sont des bactéries d’origine hydrotellurique présentes à l’état naturel dans les eaux douces (lacs et rivières) et les sols humides. Ces bactéries, relativement résistantes à la chaleur et à la chloration, peuvent être disséminées par le système de distribution d’eau. À partir du milieu naturel, les bactéries colonisent les systèmes comptant de l’eau stagnante (tours aéroréfrigérantes, humidificateurs, condenseurs des climatiseurs). Elles sont également retrouvées dans des chauffeeau ou des bains bouillonnants, où l’eau tiède et stagnante (35 à 45 °C) leur permet une multiplication rapide. La contamination se fait essentiellement par inhalation d’eau contaminée diffusée en aérosol (à proximité d’un climatiseur, dans les bains, les douches). Il n’y a pas de transmission interhumaine. La légionellose s’observe toute l’année avec un pic saisonnier en été et en automne, correspondant à une période de réchauffement des eaux. En France, en 2005, l’incidence annuelle de la légionellose était de 2,5 cas pour 100 000 habitants, contre 1 cas pour 100 000 habitants en moyenne, en Europe. L’augmentation, par rapport aux années précédentes, du nombre de cas déclarés reflète une meilleure sensibilité du système de surveillance, liée à l’amélioration des pratiques de diagnostic. Aux États-Unis, les cas déclarés de légionellose correspondent à une incidence annuelle de 4 à 6 cas par million d’habitants, mais plus de 90 % des cas échappent vraisemblablement au diagnostic ou ne sont pas déclarés. La prévention de la légionellose repose sur la maintenance régulière des réseaux de chauffage ou de refroidissement d’eau. Les légionelles peuvent être éliminées de l’eau par hyperchloration ou par choc thermique à plus de 63 °C.

La pathogenèse L. pneumophila est un parasite intracellulaire qui infecte et se multiplie dans les macrophages alvéolaires et les monocytes (voir section 22.2). L’infection est souvent asymptomatique ou se manifeste sous forme d’une toux, d’une dysphagie accompagnée



28.8 Fièvre typhoïde et autres maladies à transmission hydrique 931

de céphalées et d’une fièvre élevée. Cette forme bénigne de la maladie, appelée fièvre de Pontiac, guérit spontanément en deux à cinq jours. La légionellose proprement dite, ou maladie des légionnaires, est caractérisée par une pneumonie aiguë atteignant préférentiellement les sujets âgés ou immunodéprimés. Le sérogroupe 1 (dix sérogroupes sont connus) est retrouvé dans 80 % des cas de pneumonie. Le début de la pneumonie est souvent associé à des signes digestifs de type diarrhéique, avec des douleurs musculaires, suivis d’une fièvre élevée, de frissons, d’une dyspnée et d’une toux importante pouvant s’accompagner d’expectorations et de signes confusionnels. Elle peut s’accompagner dans les formes sérieuses de signes de défaillance multiviscérale. Le décès survient dans plus de 10 % des cas, par suite d’une incapacité respiratoire.

Diagnostic et traitement Le diagnostic biologique de légionellose repose habituellement sur l’isolement de L. pneumophila, par culture de prélèvements appropriés : lavage brocho-alvéolaire, liquide pleural ou autres sécrétions. La sérologie (titre en anticorps) est utilisée pour le diagnostic rétrospectif d’une infection à Legionella (voir section 24.7). La mise en évidence d’antigènes solubles de Legionella pneumophila sérogroupe 1 dans les urines du patient est un test sensible et précoce, précieux pour le diagnostic. Legionella pneumophila est sensible à la rifampicine et l’érythromycine. L’érythromycine administrée par voie intraveineuse est le traitement de première intention.

infectées (voir section 25.4), la maladie sévit à l’échelle mondiale par le biais de l’eau. La fièvre typhoïde est heureusement très rare dans les pays industrialisés grâce à l’efficacité des filières de traitement de l’eau (voir figure 28.2). Environ 90 cas annuels sont déclarés en France métropolitaine, 400 cas aux États-Unis. Dans les pays industrialisés, une épidémie de fièvre typhoïde est cependant toujours possible, lors d’une défaillance des systèmes de traitement de l’eau, à la suite de catastrophes naturelles (inondations, tremblements de terre), ou lors d’une pollution accidentelle par retour d’eau d’égouts.

Les virus Les virus transmis par voie oro-fécale peuvent également provoquer de grandes épidémies. L’eau joue un rôle majeur dans leur transmission. Les entérovirus comme le poliovirus (voir section 16.8), le virus Norwalk-like (voir tableau 25.8) et le virus de l’hépatite A (voir section 26.11) sont éliminés par les selles des sujets infectés et disséminés dans les eaux usées. La poliomyélite est une maladie hautement contagieuse, due au poliovirus, touchant principalement les enfants de moins de 5 ans. De nos jours, le virus sauvage a été éradiqué dans de nombreux pays. La maladie reste endémique dans moins d’une dizaine de pays en développement. Bien que ces virus puissent survivre assez longtemps dans l’eau, ils sont inactivés par le chlore. Le maintien dans l’eau potable d’un résiduel de chlore égal à 0,6 partie par million (ppm) assure leur neutralisation.

L’amibiase

Contrôlez vos acquis Legionella pneumophila est un pathogène respiratoire, agent de la légionellose et de la fièvre de Pontiac, capable de se multiplier en grand nombre dans l’eau chaude. L’homme s’infecte par inhalation d’aérosols contaminés. La prévalence de la légionellose est en augmentation. De plus, ces infections sont souvent sous-déclarées. •

Indiquez la source de Legionella pneumophila.

•

Donnez des mesures spécifiques permettant le contrôle de Legionella pneumophila.

Des amibes peuvent coloniser la cavité orale et le tractus gastro-intestinal des humains et des vertébrés. Certaines sont potentiellement pathogènes. Les propriétés générales des protozoaires amiboïdes sont discutées dans la section 14.10. L’amibiase est une maladie parasitaire cosmopolite due à un protozoaire, Entamoeba histolytica, seule espèce parasite de l’homme réellement pathogène. Liée au manque d’hygiène (péril fécal), elle est transmise par l’eau contaminée et, plus rarement, par des aliments souillés par des selles humaines (voir figure 28.14). L’incidence de la maladie est très faible dans les pays développés.

Les maladies à transmission hydrique sont dues à une grande variété de bactéries, virus et protozoaires. Nous présentons ici brièvement d’autres maladies hydriques importantes.

La fièvre typhoïde D’incidence majeure dans les pays en voie de développement, les bactéries pathogènes les plus fréquemment transmises par l’eau sont Salmonella typhi, responsable de la fièvre typhoïde, et Vibrio cholerae, agent du choléra. Bien que Salmonella typhi puisse être également transmise par des aliments contaminés (voir section 29.7) ou par contact direct avec des personnes


28.8 Fièvre typhoïde et autres m n maladies à transmission hydrique

FIGURE 28.14 Trophozoïte d’Entamoeba histolytica, amibe responsable de l’amibiase. Notez la présence discrète de noyaux de coloration plus foncée. Les petites structures colorées en rouge sont des hématies. La longueur des trophozoïtes varie entre 12 et 60 µm (voir section 14.10 pour la biologie des amibes).




E. histolytica est une amibe anaérobie. Les trophozoïtes ne possèdent pas de mitochondrie. E. histolytica existe également sous forme kystique, dont la survie dans le milieu extérieur permet la propagation de l’affection. L’homme s’infeste en ingérant des kystes, qui libèrent des trophozoïtes capables de se multiplier dans la lumière et dans la paroi du côlon. Les infestations latentes sont plus fréquentes que les formes symptomatiques. La multiplication active des trophozoïtes peut conduire, dans certaines circonstances, à l’invasion et à l’ulcération de la muqueuse colique, provoquant des diarrhées et des contractures intestinales sérieuses. L’amibiase intestinale aiguë ou dysenterie amibienne est caractérisée par une inflammation colique, de la fièvre et des exonérations fréquentes de mucus striées de sang. En l’absence de traitement, la multiplication des trophozoïtes invasifs conduit à des métastases infectieuses pouvant entraîner le décès du patient par abcès du foie, abcès du poumon secondaire à l’atteinte hépatique et, exceptionnellement, abcès du cerveau. L’amibiase est endémique, fréquente, parfois mortelle dans les régions tropicales et subtropicales, avec annuellement, environ cinquante millions de cas de diarrhées symptomatiques (dix fois plus de formes asymptomatiques) et cent mille décès par dysenterie amibienne invasive. En France, la maladie se rencontre surtout chez les migrants. Quelques centaines de cas annuels sont recensés, près des frontières, dans le sud des États-Unis. L’amibiase aiguë intestinale est traitée par des amoebicides tissulaires (tinidazole ou métronidazole). Les amoebicides de contact (tilbroquinol, tiliquinol) sont actifs dans la lumière intestinale, dans le cas d’une amibiase chronique asymptomatique. Les diarrhées amibiennes se résolvent spontanément en quelques semaines si la réponse immunitaire de l’hôte est normale. L’immunité conférée n’est pas protectrice et les infestations répétées sont fréquentes. Le diagnostic de laboratoire repose sur la mise en évidence de kystes de E. histolytica dans les selles ou de trophozoïtes dans les tissus. Dans les formes viscérales ou tissulaires, des anticorps dirigés contre E. histolytica sont mis en évidence dans le sang par technique ELISA (voir section 24.10). Naegleria fowleri est une amibe libre, vivant en petites quantités dans les lacs et rivières, et dans les eaux tièdes. N. fowleri est transportée par le vent dans des gouttelettes d’eau et se retrouve ainsi dans des égouts, des piscines ou des aires récréatives. Les infections à N. fowleri surviennent de façon brutale, après un bain en eau polluée. L’amibe pénètre directement par le nez jusqu’au cerveau, où elle provoque des hémorragies et une destruction extensive du tissu cérébral (voir figure 28.15). La méningo-encéphalite amibienne primitive à N. fowleri, est fatale en quelques jours. Elle s’observe souvent chez un adulte jeune ou un enfant immunocompétent. Aux États-Unis, vingt-deux cas de méningo-encéphalite amibienne primitive ont été rapportés pendant les douze dernières années, liés à des baignades en eau récréative (voir tableau 28.2). Le diagnostic biologique d’une infection à N. fowleri repose sur la mise en évidence de l’amibe dans le liquide

céphalorachidien. Si le diagnostic est posé très rapidement, un traitement par amphotéricine B peut influencer le cours de l’infection.

Contrôlez vos acquis La fièvre typhoïde, les infections virales et l’amibiase sont des maladies à transmission hydrique importantes. La fièvre typhoïde et les maladies virales sont contrôlées dans les pays développés par le traitement efficace des eaux usées. La dysenterie amibienne, due à Entamoeba histolytica, est une affection mondialement répandue. La méningo-encéphalite amibienne à Naegleria est très rare, mais fatale. •

Expliquez l’impact des mesures d’hygiène visant à réduire la contamination fécale de l’eau sur la dissémination de maladies telles que la fièvre typhoïde et la poliomyélite.

•

Indiquez des mesures de santé publique qui pourraient réduire ou éliminer les cas d’amibiase dus à Entamoeba histolytica ou de méningo-encéphalite dus à Naegleria fowleri.

CDC/PHIL

932 Chapitre 28

FIGURE 28.15 Trophozoïtes de Naegleria fowleri, amibe responsable de méningoencéphalites, dans du tissu cérébral. Un grand nombre de trophozoïtes, de forme irrégulière, améboide, ovale ou ronde, se présentent comme des structures de coloration foncée, plus dense au niveau des noyaux (longueur d’un trophozoïte : de 10 à 35 µm). La coupe montre la destruction extensive du tissu cérébral environnant (voir section 14.10 pour la biologie des amibes).



Questions 933

QUESTIONS 1. Définissez le terme coliforme et expliquez le test du même nom. Pourquoi ce test est-il employé pour déterminer la pureté de l’eau potable (voir section 28.1) ? 2. Indiquez les étapes de traitement de l’eau dans une station d’épuration. Qu’est-ce que la réduction globale de la DBO (voir section 28.2) ? 3. Identifiez les différentes étapes utilisées pour faire de l’eau potable. Quels sont les contaminants ciblés par chacune d’entre elles (voir section 28.3) ? 4. Identifiez les sources majeures d’infection hydrique. Pourquoi ces sources communes d’infection sont-elles si dangereuses pour la santé publique (voir section 28.4) ?

5. Pourquoi les antibiotiques sont-ils inutiles pour traiter le choléra ? Quelles méthodes de traitement sont habituellement utilisées (voir section 28.5) ? 6. La giardiase et la cryptosporidiose restent des problèmes de santé publique, même dans les pays disposant d’équipements sanitaires performants. Expliquez pourquoi (voir section 28.6). 7. Donnez les caractéristiques principales de la légionellose. En quoi cette maladie se différencie-t-elle des autres maladies à transmission hydrique (voir section 28.7) ? 8. Indiquez les méthodes utilisées pour contrôler la salmonellose, le virus de Norwalk et l’amibiase dans les filières de traitement de l’eau dans les pays développés (voir section 28.8).

PROBLÈMES 1. Pourquoi la réduction de la DBO est-elle le premier objectif du traitement des eaux usées ? Que se passe-t-il si la DBO d’une eau usée n’est pas suffisamment réduite avant son rejet dans un lac ou une rivière ? 2. Aux États-Unis, le gouvernement fédéral a défini des normes strictes pour l’eau potable. Ces normes sont régies par la loi. Cependant, les eaux destinées aux loisirs ne sont pas réglementées si sévèrement. Expliquez pourquoi les normes pour les eaux destinées aux activités récréatives sont plus souples et décrivez les normes applicables à ce sujet dans votre région. 3. L’histoire du choléra est longue et complexe. Le choléra demeure une maladie hydrique extrêmement importante. Une pandémie est en cours d’évolution. En utilisant des données épidémiologiques mondiales (Organisation mondiale de la santé, Centres de contrôle et de prévention des maladies américains), donnez les caractéristiques de la pandémie actuelle (distribution géographique, flambées épidémiques récentes). Quelles méthodes pourrait-on utiliser pour freiner

la dissémination du choléra et contrôler les flambées épidémiques survenant dans les zones d’endémie. Peut-on éradiquer le choléra ? 4. Vous vous rendez dans en zone d’endémie cholérique. Quelles précautions prendriez-vous pour vous protéger du choléra ? Ces précautions vous protègent-elles des autres maladies à transmission hydrique ? Lesquelles ? Malgré ces précautions, quelles maladies hydriques pourriez-vous alors contracter ? Quelles sont les précautions supplémentaires nécessaires ? 5. Pourquoi les eaux de surface sont-elles contaminées par les kystes de différents protozoaires ? Quelles sont les mesures de santé publique permettant leur élimination ? 6. Discutez des filières de traitement des eaux usées et d’approvisionnement en eau potable devant être mises en place pour contrôler des maladies telles que la fièvre typhoïde. Le poliovirus a été éradiqué dans de nombreux pays. Est-il possible d’éliminer Salmonella typhi ? Est-il possible d’éliminer Naegleria fowleri ou Entamoeba histolytica ? Expliquez.





I

Conservation des aliments et croissance microbienne

936

29.1 Croissance microbienne et altération des aliments 29.2 Conservation des aliments 29.3 Aliments fermentés

936 937 940

II

Analyse bactériologique des aliments et toxi-infections alimentaires 942

29.4 29.5 29.6

Maladies infectieuses d’origine alimentaire et analyse bactériologique Toxi-infections alimentaires à staphylocoques Toxi-infections alimentaires à Clostridium

942 944 945

III

Infection alimentaire

947

29.7 29.8 29.9 29.10 29.11

Salmonellose Escherichia coli pathogènes Campylobacter Listériose Autres maladies infectieuses d’origine alimentaire

947 948 949 950

CHAPITRE VINGT-NEUF

Conservation des aliments et maladies d’origine alimentaire

951

Les intoxications et toxiinfections alimentaires sont des causes importantes de morbidité et de mortalité dans le monde entier. Les toxi-infections alimentaires par Campylobacter jejuni (photographie au microscope électronique à balayage) sont dues surtout à des aliments crus et prêts à consommer contaminés.



936 Chapitre 29


GLOSSAIRE Activité de l’eau (aw) (water activity) Disponibilité de l’eau pour les processus métaboliques. Aliment non périssable (nonperishable, stable food) Aliment à faible activité d’eau, à longue durée de vie, résistant à l’altération microbienne. Aliment périssable (perishable food) En général, produit frais à activité d’eau élevée, à courte durée de vie due à une altération potentielle par prolifération microbienne. Altération alimentaire (food spoilage) Changement d’apparence, d’odeur, ou de goût d’un aliment qui le rend inconsommable. Botulisme (botulism) Intoxication alimentaire due à l’ingestion d’aliments contenant de la toxine botulinique produite par Clostridium botulinum. Conserve au vinaigre (pickling) Produit du procédé d’acidification d’un aliment par le vinaigre, pour empêcher la croissance microbienne et l’altération (condiments). Conserve en boîte (canning) Produit du procédé de conditionnement d’un aliment en emballage hermétiquement clos et chauffé pour détruire les micro-organismes vivants.

L

es maladies d’origine alimentaire sont un domaine émergent de la microbiologie. Les micro-organismes sont un facteur important de notre alimentation ; ils sont ubiquistes dans notre environnement, se trouvant dans l’eau, l’air et les aliments. Les aliments frais, la plupart des aliments préparés et même en conserve sont contaminés par des micro-organismes. Cependant l’activité microbienne est fortement recherchée dans certains aliments. Nombre d’entre eux sont produits ou améliorés par l’activité microbienne. Par exemple, les produits laitiers tels que le fromage, le beurre, la crème et le yaourt sont tous produits par fermentation microbienne. Les produits carnés comprenant certaines sauces, pâtés et pâtés de foie le sont aussi. Le vinaigre de cidre est produit par des bactéries lactiques (voir section 30.11) et les boissons alcoolisées selon des procédés de fermentation par des levures (voir section 30.12). Nous discuterons de l’utilisation des micro-organismes pour produire des aliments comestibles à l’échelle industrielle dans le chapitre 30.

I

CONSERVATION DES ALIMENTS ET CROISSANCE MICROBIENNE

Nous commencerons par examiner les micro-organismes en tant qu’agents d’altération des aliments et verrons tout d’abord une variété de méthodes utilisées pour préserver les aliments par un contrôle de la prolifération microbienne indésirable.

m n

29.1 Croissance microbienne et altération des aliments

Une grande variété de micro-organismes, comprenant quelques agents pathogènes humains, colonisent et se multiplient dans les aliments habituels. La plupart des aliments constituent un bon

Fermentation Voir chapitre 17. Intoxication alimentaire (food poisoning, food intoxication) Maladie causée par l’ingestion d’aliments contenant des toxines microbiennes préformées (parfois appelée intoxination). Irradiation (irradiation) Exposition d’un aliment à des rayonnements ionisants pour inhiber le développement de micro-organismes et d’insectes ou pour retarder son altération. Listériose (listeriosis) Toxi-infection alimentaire due à Listeria monocytogenes, qui peut entraîner une septicémie et une méningite. Lyophilisation (lyophilization, freeze-drying) Procédé de séchage des aliments par sublimation de la glace. Salmonellose (salmonellosis) Toxi-infection alimentaire de type entérocolite, causée par un des plus de 2 000 sérotypes de Salmonella spp. Toxi-infection alimentaire (food infection) Maladie causée par la multiplication de bactéries pathogènes après l’ingestion d’aliments contaminés.

milieu de culture pour la croissance de nombreux micro-organismes, qui réduit la qualité et la durée de vie des aliments.

L’altération des aliments L’altération des aliments se traduit par un changement d’apparence, d’odeur ou de goût qui les rend impropres à la consommation. Les aliments altérés ne sont pas forcément insalubres, mais ils sont souvent considérés comme désagréables et ne sont ni achetés ni consommés. L’altération des aliments est un facteur de pertes économiques pour les producteurs, distributeurs et consommateurs par la réduction de la qualité et de la quantité produite ainsi que par des prix élevés. Les aliments sont constitués de matière organique et fournissent les nutriments nécessaires à la croissance d’une grande variété de bactéries chimio-organotrophes. Les caractéristiques physiques et chimiques de l’aliment déterminent sa susceptibilité à l’activité microbienne. En fonction de l’altération, les aliments peuvent être classés en deux catégories majeures : 1) aliments périssables comprenant la plupart des produits frais ; 2) aliments non périssables, stables, tels que la farine, les noix, les noisettes, les amandes et le sucre (voir tableau 29.1).

TABLEAU 29.1 Classification des aliments

CLASSIFICATION DES ALIMENTS SELON LEUR POTENTIEL D’ALTÉRATION Exemples

Périssables

Viandes, poissons, volaille, œufs, lait, la plupart des fruits et légumes (pommes de terre, pommes…)

Non périssables

Sucre, farine, riz, noix, noisettes, amandes, haricots secs



29.2 Conservation des aliments 937

Ces catégories d’aliments varient beaucoup en fonction de l’humidité qui est reliée à l’activité de l’eau, aw (voir section 6.14). L’activité de l’eau représente sa disponibilité pour le métabolisme. Les aliments non périssables ont une faible activité d’eau et peuvent être conservés de longues périodes sans être altérés. Les aliments périssables ont une activité d’eau élevée et doivent être conservés dans des conditions qui ralentissent ou stoppent la croissance microbienne. Les aliments frais sont altérés par une grande variété de bactéries et de champignons, et chaque type de produit est colonisé par des micro-organismes particuliers (voir tableau 29.2). Les aliments, ayant des propriétés chimiques très variées, sont colonisés par des micro-organismes contaminants les mieux adaptés pour utiliser les nutriments disponibles. Par exemple, les bactéries entériques comme les Salmonella, Shigella et Escherichia coli, toutes potentiellement pathogènes, vivant dans l’intestin des animaux, sont rarement impliquées dans l’altération des fruits et légumes, mais contaminent et altèrent souvent la viande. À l’abattage, le contenu intestinal, avec des bactéries vivantes, peut s’écouler et contaminer la viande. De même, les bactéries lactiques, micro-organismes les plus communs des produits laitiers, sont des agents d’altération majeurs pour le lait et les produits laitiers. Les espèces de Pseudomonas, rencontrées dans le sol et chez les animaux, sont largement impliquées dans l’altération des produits frais. La multiplication microbienne dans les aliments suit le modèle normal de la croissance bactérienne (voir sections 6.4 à 6.6). La phase de latence dans un aliment peut être de durée variable ; elle dépend du contaminant et de son histoire. Le temps nécessaire pour atteindre une densité cellulaire significative dans un produit alimentaire donné est fonction de la taille de l’inoculum et de la vitesse de croissance durant la phase exponentielle. La vitesse de croissance pendant la phase exponentielle dépend de la température, de la valeur nutritive de l’aliment et d’autres conditions de croissance. Les effets de l’altération sont observés seulement lorsque la densité cellulaire atteint un niveau élevé. L’essentiel de la croissance

TABLEAU 29.2

exponentielle ne conduit pas à une multiplication suffisante pour provoquer une altération visible, et seules les dernières divisions donnent des effets observables (voir section 6.6). Ainsi, pour l’essentiel de la période de croissance microbienne dans un aliment, il n’y a pas de changement visible ni facile à détecter de la qualité de celui-ci.

Contrôlez vos acquis L’altération des aliments est souvent due à la multiplication de micro-organismes contaminants. Il existe une grande variabilité dans la capacité des aliments à assurer la croissance des micro-organismes, en fonction de leur valeur nutritive et de leur humidité. Les denrées périssables ou semi-périssables ont des durées de vie limitées en raison de l’altération. Un grand nombre de micro-organismes produisent une altération des aliments ; certains d’entre eux sont aussi potentiellement pathogènes. •

Listez les principaux types d’aliments en fonction de leur activité d’eau. Indiquez les conditions de stockage pour chaque catégorie.

•

Indiquez au moins trois genres bactériens responsables à la fois d’altération et de maladie humaine.

29.2 Conservation des aliments m n Nous allons examiner maintenant les procédés de stockage et de conservation. La plupart des méthodes ralentissent la croissance des micro-organismes responsables d’altération ou de toxi-infections alimentaires humaines. Dans certains cas, les procédés de conservation sont utilisés pour détruire tous les micro-organismes.

ALTÉRATION MICROBIENNE D’ALIMENTS FRAISa

Aliment Fruits et légumes

Type de microorganisme

Genres de micro-organismes d’altération communs

Bactéries

Erwinia, Pseudomonas, Corynebacterium (surtout phytopathogènes ; altèrent rarement les fruits)

Champignons

Aspergillus, Botrytis, Geotrichum, Rhizopus, Penicillium, Cladosporium, Alternaria, Phytophthora, diverses levures

Bactéries

Acinetobacter, Aeromonas, Pseudomonas, Micrococcus, Achromobacter, Flavobacterium, Proteus, Salmonella, Escherichia, Campylobacter, Listeria

Champignons

Cladosporium, Mucor, Rhizopus, Penicillium, Geotrichium, Sporotrichum, Candida, Torula, Rhodotorula

Lait

Bactéries

Streptococcus, Leuconostoc, Lactococcus, Lactobacillus, Pseudomonas, Proteus

Aliments très sucrés

Bactéries

Clostridium, Bacillus, Flavobacterium

Champignons

Saccharomyces, Torula, Penicillium

Viande fraîche, volaille et fruits de mer

a

Les organismes cités sont le plus souvent des agents d’altération de produits périssables frais. Les genres en caractères gras comprennent des pathogènes humains potentiels.



938 Chapitre 29


Le froid Avec l’humidité, un des facteurs essentiels de la multiplication microbienne est la température (voir section 6.10). En général une température de conservation basse ralentit la croissance microbienne et l’altération. Des micro-organismes psychrotolérants (tolérant le froid) (voir section 6.11) peuvent survivre et se multiplier aux températures de réfrigération. Cependant, la conservation des denrées périssables pour de longues durées (plus que quelques jours) n’est possible qu’à des températures négatives. La congélation et la décongélation altèrent la structure physique de bon nombre d’aliments, et ce procédé n’est pas valable pour beaucoup de produits frais, mais il est largement utilisé pour la conservation des viandes et beaucoup de fruits et légumes. Les congélateurs à – 20 °C sont les plus communs ; la conservation y est possible pour plusieurs semaines ou mois, mais la croissance microbienne dans des poches de liquide piégées dans la masse congelée reste possible. Pour un stockage de longue durée, une température de – 80 °C (température de la glace sèche) est nécessaire. Le maintien de températures aussi basses est coûteux et n’est donc pas utilisé de façon courante.

Conserves au vinaigre et acidité Un autre facteur majeur affectant la croissance microbienne dans les aliments est le pH ou l’acidité. Le pH des aliments varie, mais la plupart sont neutres ou acides. Les micro-organismes se distinguent dans leur capacité à se développer en conditions acides, mais des pH de 5 ou inférieurs inhibent la croissance de la plupart des micro-organismes d’altération (voir section 6.13). L’acidification est souvent utilisée comme moyen de conservation dans la fabrication de conserves au vinaigre. Le vinaigre, acide acétique dilué, est ajouté dans les procédés de fabrication de ces types de condiments (le vinaigre est un produit de fermentation par les bactéries acétiques ; sa production industrielle est décrite à la section 30.11). En plus du vinaigre, les procédés de fabrication ajoutent de grandes quantités de sel ou de sucre pour abaisser l’activité de l’eau (voir ci-dessous) et inhiber la croissance microbienne. Les aliments communément mis sous forme de conserve au vinaigre sont les concombres (doux, aigre), le fenouil, les poivrons, les viandes, les poissons et les fruits.

Séchage et déshydratation L’activité de l’eau ou aw est la mesure de la disponibilité de l’eau pour son utilisation par les micro-organismes dans les processus métaboliques. L’aw de l’eau pure est de 1,00, les molécules sont peu ordonnées et se réarrangent librement. Quand un soluté est ajouté, l’aw décroît. Comme les molécules d’eau se réorganisent autour du soluté, leur libre réarrangement devient énergétiquement défavorable. Les cellules microbiennes doivent alors entrer en compétition avec le soluté pour la quantité d’eau libre réduite. En général, les bactéries sont de mauvais compétiteurs pour l’eau libre, mais les champignons en sont de bons. En pratique, l’addition de fortes concentrations de solutés comme les sucres ou les sels réduisent l’aw et la croissance bactérienne est inhibée. Par exemple, la croissance de presque toutes les bactéries est stoppée à 7,5 % de NaCl (aw = 0,957), sauf certains cocci Gram positif

comme des espèces de Staphylococcus. Les champignons, qui sont de bons compétiteurs pour l’eau libre, dans des conditions de faible aw, prolifèrent souvent dans les sirops sucrés. De nombreuses préparations commerciales d’aliments sont conservées par addition de sel ou de sucre. Les aliments conservés par addition de sucre sont surtout les fruits (gelées, marmelades et confitures). Les produits salés sont d’abord les viandes et poissons. Les saucissons et jambons sont conservés par divers sels de salaison comme NaCl et, pour certains, également par des procédés de fumage. Les produits familiaux ont une aw très variable, dépendant du taux de sel ajouté et du mode de séchage de la viande. Des salaisons de viandes comme le jambon de campagne peuvent être conservées à température ambiante pour de longues périodes. D’autres, avec une aw élevée, nécessitent une réfrigération pour une conservation prolongée. La croissance microbienne peut aussi être contrôlée en abaissant l’activité de l’eau du produit par séchage. Le lait, la viande, le poisson, les légumes, les fruits, les œufs et de nombreux aliments d’importance économique sont conservés par un procédé de séchage. Le procédé de séchage le moins dénaturant vis-à-vis de la structure physique est la lyophilisation (sublimation), dans laquelle les aliments sont congelés et la glace évaporée sous vide. Ce procédé très coûteux est utilisé dans des cas très précis comme la préparation de rations militaires, où les durées de conservation dans des conditions hostiles doivent être longues.

Le chauffage L’application de la chaleur pour réduire la charge de bactéries ou pour les tuer toutes est aussi employée pour la conservation de liquides et d’aliments humides. La pasteurisation, un procédé dans lequel les liquides sont chauffés à un couple temps/ température très précis, a été décrite à la section 20.1. La pasteurisation ne stérilise pas les liquides mais réduit les charges microbiennes des micro-organismes d’altération et des pathogènes, augmentant significativement la durée de conservation des produits. Le séchage par pulvérisation est le procédé d’atomisation par lequel les liquides comme le lait sont séchés dans une atmosphère chauffée. L’atomisation augmente la surface interfaciale des fines gouttelettes, permettant un séchage rapide dans des conditions de chauffage rigoureusement contrôlées, sans détruire le produit. Cette technique est largement utilisée pour produire la poudre de lait, certains produits laitiers concentrés et des ingrédients alimentaires comme les agents de flaveur. La conservation en boîte est un procédé par lequel l’aliment est réparti dans des contenants scellés, tels des boîtes ou des récipients de verre, puis chauffé. Le procédé tue tous les organismes vivants ou au moins assure qu’il n’y aura pas de croissance d’organismes survivants. Quand la boîte est correctement scellée et chauffée, l’aliment peut rester stable et ne pas s’altérer indéfiniment, même en conservation à température ambiante. Le couple temps/température utilisé pour la mise en conserve dépend du type d’aliment, de son pH, de la taille du contenant, de la consistance et de la densité de l’aliment. Pour de grands récipients ou pour des produits denses, les



T. D. Brock

29.2 Conservation des aliments 939

(a)

(b)

(c)

durées de chauffage sont allongées en raison de la vitesse de pénétration de la chaleur au cœur du produit. Les aliments acides sont souvent traités par un chauffage à ébullition, limité juste à 100 °C, alors que les aliments non acides doivent être chauffés à des températures d’autoclavage (121 °C). Malheureusement, des temps de chauffage assez longs pour garantir la stérilité absolue de chaque contenant peuvent modifier l’aliment, de sorte qu’il peut devenir impropre à la consommation et perdre sa valeur nutritive (par exemple avec un autoclave – voir section 20.1). Pourtant, même bien mis en conserve, des aliments peuvent ne pas être stériles. La croissance microbienne dans une boîte d’aliment scellée provient fréquemment d’organismes forts producteurs de gaz. Ceci peut créer une pression dans la boîte, provoquant des gonflements ou même dans des cas sérieux, une explosion de la boîte (voir figure 29.1). L’intérieur d’une boîte est anoxique et certaines bactéries anaérobies strictes du genre Clostridium, productrices de toxines, sont capables de se développer dans les aliments en conserve (voir sections 12.20, 21.10 et 29.6). Ainsi, une conserve en boîte visiblement altérée ne doit jamais être consommée. D’un autre côté, l’absence de production de gaz n’est pas une garantie absolue de salubrité de l’aliment.

FIGURE 29.1 Modifications de boîtes métalliques serties dues à une prolifération microbienne. (a) Boîte normale : le haut de la boîte est légèrement déprimé, en raison d’un léger vide à l’intérieur. (b) Gonflement résultant d’une faible production de gaz. Le haut est légèrement bombé. (c) Gonflement important dû à une forte production de gaz. (d) La boîte (c) a cédé et la pression du gaz l’a fait exploser, arrachant le couvercle.

(d)

Cependant, l’utilisation d’additifs retardant l’altération augmente de façon significative la durée de vie des produits élaborés. Ainsi, les additifs alimentaires chimiques contribuent de façon notable à l’augmentation et à l’appréciation de la production alimentaire. En raison de la longueur et du coût des études pour tester de nouvelles molécules et les proposer comme conservateurs alimentaires, très peu de nouveaux produits pourront être ajoutés dans un futur proche à la liste des molécules sûres et autorisées du tableau 29.3.

L’irradiation L’irradiation des aliments par des rayonnements ionisants est actuellement une méthode standard de réduction des contaminants bactériens, fongiques et même ceux véhiculés par des insectes (voir section 20.2). Le tableau 29.4 donne la liste des aliments dont le traitement par ionisation a été autorisé. Les épices sont couramment ionisées. Aux États-Unis, les produits à base de viande fraîche comme les hamburgers, peuvent maintenant être ionisés pour limiter la contamination par

TABLEAU 29.3

CONSERVATEURS ALIMENTAIRES

Les procédés chimiques de conservation Plus de 3 000 substances sont utilisées comme additifs alimentaires. Ceux-ci sont reconnus par la Food and Drug Administration (États-Unis) comme GRAS (generally recognized as safe) et sont très utilisés dans l’industrie alimentaire pour améliorer ou préserver la texture, la couleur, la fraîcheur ou la flaveur. Un petit nombre de ces substances sont utilisées pour contrôler le développement microbien dans les aliments (voir tableau 29.3). Beaucoup de ces inhibiteurs de croissance, comme le propioniate de sodium, ont été utilisés depuis de nombreuses années sans toxicité humaine avérée. D’autres, comme les nitrites (précurseurs de cancérigènes), l’oxyde d’éthylène et l’oxyde de propylène (mutagènes – voir sections 10.4 et 10.5), sont plus controversés car des études statistiques montrent un effet négatif sur la santé humaine.

Substance

Aliments

Propionate de sodium ou calcium

Pain

Benzoate de sodium

Boissons gazeuses, fruits, jus de fruits, condiments, margarines, conserves

Acide sorbique

Agrumes, fromages, condiments, salades

Anhydride sulfureux, sulfites, bisulfites

Fruits secs et légumes, vin

Formol (du fumage des aliments )

Viande, poisson

Oxydes d’éthylène et de propylène

Épices, fruits secs, noix

Nitrite de sodium

Jambon fumé, bacon



940 Chapitre 29


CATÉGORIES D’ALIMENTS IONISÉS ET OBJECTIFSa

TABLEAU 29.4

Catégorie d’aliment

Objectifs de l’ionisation

Viande de porc fraîche

Maîtrise du parasite Trichinella spiralis

Fruits et légumes frais

Inhibition de la croissance et de la maturation (mûrissement)

Épices séchées, fines herbes et agents de flaveur

Destruction des micro-organismes

Produits carnés non cuits réfrigérés ou congelés, y compris la viande hachée

Maîtrise des pathogènes d’origine alimentaire Augmentation de la durée de vie

Viandes congelées emballées, utilisées pour les programmes spatiaux de la NASA

Stérilisation

Volaille et produits à base de volaille congelés, non cuits

Maîtrise des pathogènes d’origine alimentaire

a

Aux États-Unis, la réglementation de l’étiquetage pour les consommateurs stipule que tous les produits irradiés doivent être marqués du logo « radura » (voir figure 29.2) et porter l’indication : « Traité avec des radiations » ou « Traité par irradiation », en plus des autres informations légales.

Escherichia coli O157:H7 et d’autres bactéries entéropathogènes (viande de boeuf) et par Campylobacter jejuni (volaille). L’irradiation des aliments par une dose contrôlée est obtenue par les rayons , produits par des sources de [ 60Co] ou de [137Cs] ou par des électrons accélérés à haute énergie, produits dans des accélérateurs linéaires. Cette dose varie fortement en fonction des catégories d’aliments et de leur utilisation. Par exemple, une dose de 44 kilograys (kGy) est utilisée pour stériliser les produits à base de viande consommés dans les vols spatiaux américains de la NASA, soit dix fois plus que pour maîtriser les agents pathogènes des hamburgers (voir tableau 29.4). Aux États-Unis, le consommateur doit être informé par l’apposition d’un logo sur les produits traités par rayonnement ionisant (voir figure 29.2).

Contrôlez vos acquis La microbiologie des aliments traite des méthodes limitant l’altération des aliments et la croissance des microorganismes pathogènes au cours de la fabrication et du stockage des produits. Les aliments varient beaucoup

FIGURE 29.2 Le logo « radura », symbole international pour les radiations. L’emballage des aliments ionisés doit être marqué du « radura » et étiqueté : « produit traité par rayonnement ionisant » ou « produit traité par ionisation ».

dans leur sensibilité à la prolifération microbienne en fonction de leur valeur nutritive, leur activité d’eau, leur pH. La croissance des micro-organismes dans les denrées périssables peut être maîtrisée par la réfrigération, la congélation, la mise en conserve, sous forme de condiment, la déshydratation, l’utilisation de conservateurs chimiques ou l’irradiation. •

Citez au moins quatre méthodes de conservation des aliments. Comment chacune d’elles agit-elle sur la croissance microbienne ?

•

Identifiez les micro-organismes d’altération également pathogènes.

29.3 Aliments fermentés m n Nous considérons ici les aliments qui sont conservés, produits ou améliorés par l’action de micro-organismes. Les micro-organismes entrent dans la fabrication d’une grande variété d’aliments de grande consommation et de boissons. Les processus microbiens peuvent produire des transformations des matières premières et le produit ainsi formé est appelé aliment fermenté. La fermentation est le catabolisme anaérobie de substrats organiques, généralement des sucres, en l’absence d’accepteur d’électrons externe (voir sections 5.9 et 5.10). Les micro-organismes impliqués dans les aliments fermentés comprennent les bactéries lactiques (voir section 12.8), propioniques (voir section 12.22) et ceux du tableau 29.5. Les bactéries ne peuvent se multiplier en dessous de pH voisins de 4 et la fermentation des aliments est ainsi un processus autolimitant. Un des aliments fermentés les plus communs est le pain à la levure, dans lequel la fermentation des sucres simples du grain par la levure Saccharomyces cerevisiae (voir tableau 29.5) produit du gaz carbonique faisant gonfler la pâte et produisant les alvéoles du pain (voir figure 29.3). Les boissons fermentées comme le vin, la bière et le whisky sont décrites plus en détail au chapitre 30, comme des applications industrielles de procédés microbiologiques (voir focus du chapitre 5 : « Les produits de la fermentation de la levure »).



29.3 Aliments fermentés 941

TABLEAU 29.5

ALIMENTS FERMENTÉS ET MICRO-ORGANISMES

a DES FERMENTATIONS PRIMAIRES

Catégorie d’aliment

Micro-organisme de fermentation primaire

Produits laitiers Fromages

Lactococcus Lactobacillus Streptococcus thermophilus

Produits laitiers fermentés Beurre

Lactococcus

Crème aigre

Lactococcus

Yaourt

Lactobacillus Streptococcus thermophilus

Boissons alcoolisées

Zymomonas Saccharomycesb

Pains levurés

Saccharomyces cerevisiaec

Produits carnés Saucisses séchées (pepperoni, salami) et semiséchées (bolognaises, saucisses pour barbecue)

Pediococcus

Lactobacillus Micrococcus Staphylococcus Légumes Chou (choucroute)

Leuconostoc Lactobacillus

Concombres (conserves au vinaigre) Sauce de soja

Bactéries lactiques Aspergillus Tetragenococcus halophilus Levures

a

La plupart des bactéries citées sont des lactiques (voir section 12.19). Zymomonas est relié au genre Pseudomonas (voir section 12.7). b Levures (voir section 30.13). Des espèces variées de Saccharomyces sont utilisées dans les fermentations alcooliques. c Levure de boulangerie

Les produits laitiers À l’origine, la fermentation des produits laitiers a été développée comme moyen de conservation du lait, aliment frais d’importance économique qui s’altère rapidement (voir section 29.2). Les produits laitiers comprennent les fromages et laits fermentés tels le yaourt, le beurre et la crème aigre (voir figure 29.3). Le lait contient du lactose, disaccharide hydrolysé par la β-galactosidase en glucose et galactose. Le produit final de la fermentation de ces monosaccharides est l’acide lactique (voir figure 5.14). Cette fermentation provoque une chute importante du pH du lait frais, voisin de la neutralité, en dessous

FIGURE 29.3 Aliments fermentés. Le pain, les saucisses de viande, les fromages, d’autres produits laitiers et végétaux sont tous des aliments produits ou améliorés par des fermentations dues à des micro-organismes.

de 5,3 dans les fromages et de 4,6 dans les autres laits fermentés. Les micro-organismes responsables de cette fermentation sont des bactéries lactiques, toutes productrices d’acide lactique comme composé majoritaire de la fermentation (voir section 12.19 et tableau 29.5). Les cultures (starters) des différentes bactéries lactiques sont introduites dans le lait, et la fermentation commence, pour une durée dépendant des produits désirés (voir tableau 29.5). Pour certains fromages, un second inoculum peut être introduit pour produire une autre fermentation. Par exemple, les fromages de type gruyère sont ensemencés par Propionibacterium. La fermentation secondaire qui s’ensuit transforme l’acide lactique en acides propionique, acétique et CO2 (voir section 12.22 et figure 12.68). Le gaz carbonique produit les trous caractéristiques des fromages de type gruyère. L’addition secondaire de Lactobacillus et du champignon Penicillium roqueforti produit les veines bleues, le goût et l’arôme caractéristiques des fromages bleus. Chaque type de fromage est produit dans des conditions soigneusement contrôlées. Le temps, la température, les durées de la fermentation et de l’affinage ainsi que la nature des micro-organismes doivent être rigoureusement maîtrisés pour assurer la typicité et la reproductibilité des produits.

Les produits carnés Les produits carnés se classent en différentes catégories. Les saucisses proviennent généralement de porc ou de bœuf, accessoirement de viandes de volaille. Les plus communes sont les saucisses sèches comme les salamis, les pepperoni, les semi-sèches comme les bolognaises et les saucisses à barbecue (voir figure 29.3). Les saucisses sont fabriquées à partir d’un mélange homogène de viande hachée, de sel et d’assaisonnements. Une culture de bactéries lactiques est ajoutée et la fermentation abaisse le pH des saucisses en dessous de 5. Après la fermentation, elles sont souvent fumées puis séchées. L’humidité des saucisses séchées est d’environ 30 %. Après le séchage, les saucisses peuvent être conservées à température ambiante pour de longues périodes. Les saucisses semi-sèches ont une



942 Chapitre 29


humidité d’environ 50 % et sont moins résistantes à l’altération si elles ne sont pas réfrigérées. Le poisson, souvent mélangé à du riz, des crevettes et des épices, est aussi fermenté pour fabriquer une grande variété de pâtés et de produits aromatisants.

Les légumes et produits à base de légumes De nombreux aliments à base de légumes sont fabriqués par fermentation et la variété de leurs spécialités est quasiment infinie. Les aliments végétaux fermentés économiquement les plus importants sont la choucroute (chou fermenté) et certains condiments (concombre fermenté). Les olives, oignons, tomates, piments ainsi qu’une grande variété de fruits sont également fermentés. Les légumes sont souvent fermentés dans une saumure de sel pour aider à la conservation et améliorer la flaveur. La fermentation peut aussi augmenter la digestibilité des tissus végétaux en les ramollissant. Ainsi, les légumes fermentés (haricots, petits pois, lentilles) montrent une réduction importante des oligosaccharides responsables de flatulence par rapport aux légumes frais. La sauce de soja résulte d’une fermentation complexe de graines de soja et de blé. Le soja cuit est mélangé avec une préparation enzymatique provenant d’une culture d’Aspergillus sur du riz ou d’autres céréales (voir tableau 29.5). Cette culture est pulvérisée sur le mélange de graines de soja et de blé puis fermentée pendant deux à trois jours. Cette préparation, appelée koji, est mélangée à une saumure (17 à 19 % de NaCl) et la fermentation se poursuit pendant deux à quatre mois ou plus. Des espèces microbiennes variées appartenant aux genres Lactobacillus et Pediococcus, ainsi que diverses levures et moisissures synthétisent des produits de fermentation contribuant aux caractéristiques recherchées du produit final. Après fermentation, la sauce de soja liquide est décantée, filtrée, pasteurisée (voir section 30.1) et conditionnée en bouteilles.

Contrôlez vos acquis La fermentation microbienne est un important procédé utilisé pour conserver et augmenter le nombre des aliments tels que les produits laitiers, carnés et végétaux. •

Citez d’importants produits laitiers, carnés et végétaux fabriqués ou améliorés par un processus de fermentation.

•

Citez le ou les groupes microbiens les plus importants pour les aliments fermentés.

II

ANALYSE BACTÉRIOLOGIQUE DES ALIMENTS ET TOXI-INFECTIONS ALIMENTAIRES

Lorsque les aliments sont mal décontaminés ou mal conservés, la croissance de certains pathogènes est possible, entraînant des maladies de morbidité et de mortalité significatives. Les troubles d’origine alimentaire, comme les maladies d’origine hydrique, ont habituellement une source commune. Une

source alimentaire unique, par exemple dans un processus de préparation industrielle ou dans un restaurant, peut affecter un grand nombre d’individus. Chaque année, aux États-Unis, près de 25 000 épisodes de toxi-infections alimentaires sont rapportés, soit 13 millions de cas estimés. La plupart de des épisodes rapportés, ayant lieu à domicile, n’affectent qu’un très petit nombre d’individus. Ces épisodes sont en général liés à un mode de conservation ou de préparation de la nourriture inadéquat au niveau du consommateur. La plupart de ces épisodes d’origine alimentaire ne sont pas signalés, car la relation entre l’aliment en cause et la maladie n’est pas établie.

29.4 Maladies infectieuses d’origine m n alimentaire et analyse bactériologique

Le tableau 29.6 recense les maladies d’origine alimentaire les plus fréquentes aux États-Unis et les micro-organismes qui en sont responsables. Ces maladies très communes peuvent être séparées en deux catégories : les toxi-infections alimentaires (ou intoxications alimentaires) et les infections alimentaires. Des techniques d’échantillonnage bactériologique particulières sont nécessaires pour en isoler les pathogènes responsables.

Les maladies infectieuses d’origine alimentaire La toxi-infection ou intoxication alimentaire résulte de l’ingestion d’aliments contenant une toxine microbienne préformée. Les micro-organismes toxinogènes n’infectent pas l’hôte et sont souvent morts lorsque l’aliment contaminé est consommé. La maladie est due à l’ingestion et à l’action d’une toxine préformée bioactive. L’exotoxine de Clostridium botulinum a été étudiée section 21.10, la toxine superantigène de Staphylococcus aureus, section 22.16. L’infection alimentaire résulte de l’ingestion de nourriture contaminée par un pathogène. Les infections alimentaires les plus fréquentes sont développées aux sections 29.7 à 29.11.

Le contrôle bactériologique des aliments Les micro-organismes sont toujours présents dans les aliments frais (voir section 29.1). Parce que des pathogènes peuvent coexister avec beaucoup d’autres micro-organismes inoffensifs, des méthodes rapides, sans culture bactérienne, ont été développées afin de détecter des pathogènes importants tels qu’Escherichia coli O157:H7, Salmonella, Staphylococcus et Clostridium botulinum. Des méthodes moléculaires et immunologiques sont utilisées pour tester à la fois la présence des toxines et des pathogènes pouvant contaminer des aliments ou d’autres produits (médicaments, cosmétiques). L’utilisation de sondes nucléotidiques et de la PCR pour la détection de pathogènes spécifiques, incluant les pathogènes alimentaires, est développée section 24.12. La présence d’un pathogène potentiel ou de sa toxine dans un aliment n’est cependant pas suffisante pour affirmer la relation entre un épisode épidémique d’origine alimentaire et l’aliment suspect. Pour compléter l’investigation de l’épisode épidémique, il est souhaitable d’isoler et d’identifier l’agent causal. L’isolement et la croissance de pathogènes piégés dans des aliments non liquides nécessitent un traitement préliminaire afin



29.4 Maladies infectieuses d’origine alimentaire et analyse bactériologique 943

TABLEAU 29.6

MALADIES INFECTIEUSES D’ORIGINE ALIMENTAIRE : CAS ANNUELS ESTIMÉS AUX ÉTATS-UNISa

Micro-organismes

Maladie

Nombre de cas annuels

Aliments

Bactéries Bacillus cereus

TA et IA


IA


TA et IA

Escherichia coli O157:H7

IA

63 000

Viandes, viande de bœuf

Escherichia coli entéropathogènes

IA

110 000

Viandes, viande de bœuf

Listeria monocytogenes

IA

2 500

Salmonella spp.

IA

1 340 000


TA

185 000

Streptococcus spp.

IA

50 000

Produits laitiers, viande

Yersinia enterocolitica

IA

87 000

Porc, lait

Autres bactéries

TA et IA

Total

27 000 1 963 000 248 000

Riz et aliments amylacés, aliments sucrés, viandes, sauces, gâteaux, lait en poudre Volailles, produits laitiers Viandes et dérivés cuits et réchauffés

Viande et produits laitiers Volailles, viande, produits laitiers, œufs Viandes, pâtisseries

102 000

4 177 500

Protozoaires Cryptosporidium parvum

IA

30 000

Viande crue ou insuffisamment cuite

Cyclospora cayetanensis

IA

16 000

Produits frais

Giardia lamblia

IA

200 000

Viande contaminée ou infectée

Toxoplasma gondii

IA

113 000

Viande crue ou insuffisamment cuite

Total

359 000

Virus Virus Norwalk-like

IA

9 200 000

Autres virus

IA

82 000

Total

Coquillages, autres aliments

9 282 000

Total annuel maladies alimentaires

13 818 500

a

Ces estimations se basent sur les données des Centers for Disease Control and Prevention, Atlanta, GA, États-Unis, et sont caractéristiques de ces dernières années. b TA, intoxication alimentaire ; IA, infection alimentaire.

de remettre ces pathogènes en suspension. La méthode la plus adéquate utilise un broyeur spécifique de type Stomacher, qui broie et homogénéise l’échantillon alimentaire. L’échantillon doit être analysé le plus rapidement possible après avoir été prélevé. Si cet examen intervient plus d’une heure après prélèvement, l’échantillon doit être conservé au réfrigérateur. Un aliment congelé doit être décongelé dans son emballage initial et examiné ou cultivé dès que la décongélation est complète. En plus de l’isolement des pathogènes présents dans l’aliment, il est nécessaire d’isoler ces pathogènes à partir de prélèvements provenant du patient pour établir une relation de cause à effet entre le pathogène et la maladie. Dans la plupart des cas, des échantillons de selles seront cultivés pour analyse bactériologique (voir section 24.1). Les échantillons alimentaires ou humains sont ensemencés sur milieux enrichis, puis repiqués sur milieux sélectifs pour isolement et identification, selon les méthodes utilisables pour les pathogènes humains (voir

section 24.2). L’identification finale du pathogène alimentaire, nécessaire à l’investigation d’un épisode épidémique, fait appel à des techniques phénotypiques et génotypiques (PCR, sondes nucléotidiques, séquençage des acides nucléiques – voir section 24.12).

Contrôlez vos acquis Les maladies infectieuses d’origine alimentaire comprennent les toxi-infections et les infections alimentaires. La toxi-infection résulte de l’ingestion d’une toxine microbienne préformée dans l’aliment, l’infection alimentaire est due à l’ingestion de pathogènes contaminant l’aliment et se multipliant chez le sujet atteint. Des techniques spécialisées sont utilisées pour prélever et analyser les aliments suspects.



944 Chapitre 29


•

Différenciez une infection d’une toxi-infection alimentaire.

•

Décrivez la technique d’analyse d’un aliment solide (par exemple de la viande) en vue d’un contrôle bactériologique.

•

Quelles sont les méthodes utilisées pour l’identification des pathogènes des aliments ?

29.5 Toxi-infections alimentaires m n à staphylocoques Staphylococcus aureus est à l’origine de toxi-infections alimentaires très fréquentes. Les bactéries du genre Staphylococcus (voir figure 29.4) sont de petits cocci Gram positif (voir section 12.19). Les staphylocoques colonisent la peau et le tractus respiratoire d’un grand nombre d’individus et sont souvent des pathogènes opportunistes. Ils sont fréquemment responsables de toxi-infections alimentaires, car ils peuvent se multiplier dans des aliments variés, certaines souches produisant des entérotoxines thermostables à activité superantigénique (voir section 22.16). L’ingestion de l’aliment contenant les toxines entraîne, après une incubation courte (une à six heures), une gastro-entérite caractérisée par des nausées, des vomissements et des diarrhées.

avant consommation, celle-ci est relativement thermostable et peut demeurer active alors que toutes formes viables de la bactérie ont disparu. L’ingestion de la toxine préformée est à l’origine des troubles observés. Staphylococcus aureus produit au moins sept types d’entérotoxines, différents mais proches. La plupart des souches ne produisant qu’un ou deux types de toxines, celles-ci peuvent être à l’origine d’une intoxication. D’autres souches ne sont pas toxinogènes. Ces entérotoxines sont également classées en fonction de leur activité superantigénique : la stimulation d’un grand nombre de lymphocytes T conduit à la libération de cytokines, médiatrices cellulaires, et à l’activation de la réponse inflammatoire de l’intestin, puis à la gastroentérite, avec pertes liquidiennes intestinales massives (voir section 22.16). L’entérotoxine la plus fréquemment produite par S. aureus est l’entérotoxine A, un peptide codé par un gène chromosomique. Le clonage et le séquençage de ce gène, le gène entA, ainsi que celui d’autres entérotoxines staphylococciques, montrent que ces entérotoxines sont génétiquement reliées. La production d’entérotoxines des types B et C peut être codée par des plasmides, des transposons ou des bactériophages lysogéniques. L’importance d’éléments génétiques tels que les plasmides et les bactériophages en tant que vecteurs de production de toxines est développée sections 21.10 et 21.11.

Diagnostic, traitement et prévention

L’épidémiologie

CDC/PHIL

Le nombre de cas estimés de toxi-infections alimentaires staphylococciques est de 185 000 par an, aux États-Unis. Les aliments les plus fréquemment incriminés sont les pâtisseries à la crème (crème anglaise), les volailles, la viande et les produits dérivés, les sauces, les œufs et salades composées (mayonnaise), les puddings. Par ailleurs, les aliments de ce type sont souvent laissés à domicile à température ambiante ou à l’extérieur lors de buffets froids. Un aliment, contaminé par S. aureus lors de manipulations par un porteur sain, permet une croissance bactérienne rapide et la production d’entérotoxine. Même si l’aliment renfermant la toxine est réchauffé

FIGURE 29.4 Staphylococcus aureus. En coloration de Gram, les cocci Gram positif ont un diamètre d’environ 0,8 µm. Les staphylocoques peuvent se diviser suivant différents axes, donnant des amas à l’aspect typique de grappe de raisin.

Des méthodes fondées sur la détection des entérotoxines (voir section 24.10) ou de l’exonucléase (enzyme de dégradation de l’ADN) sont utilisables pour la recherche de S. aureus dans les aliments. Ces tests rapides sont qualitatifs, confirmant seulement la présence ou l’absence des produits de S. aureus au-delà du seuil de détection de la technique employée. De plus, le test de détection de l’exonucléase n’indique pas la présence d’exotoxines et n’est donc pas prédictif de toxi-infection alimentaire. Pour déterminer l’importance de la contamination bactérienne, il est nécessaire d’obtenir des données quantitatives en dénombrant les bactéries sur gélose. Le dénombrement des staphylocoques s’effectue sur milieu sélectif hypersalé (à 7,5 % de chlorure de sodium ou de chlorure de lithium). Contrairement à la plupart des bactéries présentes dans les aliments, les staphylocoques peuvent se multiplier en milieu hypersalé et à faible teneur en eau (voir section 29.1). Les toxi-infections alimentaires dues à S. aureus peuvent être assez sérieuses, mais sont habituellement spontanément résolutives dans les quarante-huit heures. La réhydratation peut être nécessaire pour les atteintes les plus graves. L’antibiothérapie est inutile, les troubles étant liés à l’ingestion d’une toxine préformée et non pas à une infection active. Les toxi-infections alimentaires staphylococciques peuvent être prévenues par des mesures d’hygiène et le respect des bonnes pratiques de production et de préparation des aliments, ainsi que leur stockage à basse température, celui-ci inhibant la croissance bactérienne. Les aliments susceptibles d’être contaminés par S. aureus et qui ont été laissés quelques heures à une température supérieure à 4 °C doivent être jetés plutôt que consommés.



29.6 Toxi-infections alimentaires à 945

Contrôlez vos acquis La toxi-infection alimentaire staphylococcique résulte de l’ingestion d’entérotoxines préformées à activités diarrhéique, émétique et superantigénique produites par Staphylococcus aureus lors de sa multiplication dans les aliments. •

Identifiez les symptômes d’une toxi-infection alimentaire staphylococcique et expliquez le mode d’action des entérotoxines.

•

Les antibiotiques modifient-ils l’évolution ou la gravité d’une toxi-infection alimentaire staphylococcique ? Expliquez.

29.6 Toxi-infections alimentaires m n à Clostridium Clostridium perfringens et Clostridium botulinum sont également responsables de toxi-infections alimentaires. Les membres du genre Clostridium sont des anaérobies sporulés (voir section 12.20). Les processus de préparation et de conservation des aliments tuent les micro-organismes viables, mais ne détruisent pas les endospores. Sous certaines conditions anaérobies appropriées, les endospores germent et la toxine est produite.

Les toxi-infections alimentaires à Clostridium perfringens

John M. Martinko

Clostridium perfringens est un bacille Gram positif anaérobie, capable de sporuler, fréquemment présent dans les sols (voir figure 29.5). Il colonise le tractus intestinal des humains et des animaux ; il se retrouve donc dans les eaux usées (voir section 12.20). C. perfringens est l’agent le plus fréquemment mis en cause dans les toxi-infections alimentaires survenues aux États-Unis, avec 248 000 cas annuels estimés (voir tableau 29.6).

FIGURE 29.5 Clostridium perfringens en coloration de Gram. Les bâtonnets Gram positif ont un diamètre d’environ 1 µm.

Les troubles résultent de l’ingestion d’une dose infectieuse importante de Clostridium perfringens (> 108 cellules végétatives) dans des aliments contaminés, cuits ou non, particulièrement la viande et le poisson. C. perfringens peut se multiplier en nombre dans de la viande cuite en masse (la pénétration de la chaleur est, dans ce cas, souvent lente et insuffisante) puis refroidie lentement entre 20 et 40 °C. Placées en conditions anoxiques (par exemple dans un emballage scellé), les endospores germent et se multiplient rapidement dans la viande. La toxine n’est pas encore produite. Après ingestion de l’aliment contaminé, les formes viables de C. perfringens sporulent dans l’intestin, entraînant la production de l’entérotoxine du Clostridium (voir tableau 21.4). L’entérotoxine altère la perméabilité de l’épithélium intestinal, déclenchant des diarrhées et des spasmes intestinaux, habituellement sans fièvre, ni vomissements. La toxi-infection alimentaire à C. perfringens se manifeste sept à quinze heures après consommation de l’aliment contaminé. Elle se résout habituellement en vingt-quatre heures, la mortalité étant exceptionnelle.

Diagnostic, traitement et prévention Le diagnostic biologique de toxi-infection alimentaire à C. perfringens se base sur l’isolement du pathogène à partir du tractus intestinal ou, de façon plus fiable, par la détection de l’entérotoxine dans les selles par un test immuno-enzymatique direct (ELISA – voir section 24.10). Les symptômes étant limités, un traitement n’est habituellement pas nécessaire, bien que des antitoxines soient disponibles (voir section 22.13). La prévention des toxi-infections alimentaires à C. perfringens repose sur des mesures destinées à éviter la contamination des différents types d’aliments (crus et cuits), ainsi que le contrôle des processus de préparation et de conservation pour garantir un traitement thermique adéquat. Les aliments doivent être réfrigérés le plus tôt possible après cuisson pour inhiber la croissance de C. perfringens.

Le botulisme Le botulisme est une toxi-infection alimentaire grave, souvent mortelle, due à l’ingestion d’aliments contenant une exotoxine produite par le bacille Gram positif anaérobie Clostridium botulinum. Cette bactérie colonise normalement le sol et les eaux, mais ses endospores peuvent contaminer les aliments crus avant récolte ou abattage. Si les aliments sont préparés en suivant des procédures convenables, les endospores sont éliminées ou détruites. Dans le cas contraire, si des endospores restent viables, la germination permet la multiplication et la synthèse de la neurotoxine, qui, même présente en petite quantité, est hautement toxique. La nature et le type d’activité de la toxine botulique sont développés section 21.20 (se reporter également à la figure 21.20). La toxine botulique est une neurotoxine responsable de paralysie flasque, affectant le système nerveux autonome qui contrôle les fonctions végétatives du corps (respiration, battements cardiaques). Au moins sept types sérologiques de toxine botulique sont connus. Cette toxine étant détruite par chauffage à haute température (80 °C pendant dix minutes), la cuisson complète des aliments initialement contaminés les rend inoffensifs.



946 Chapitre 29


Nombre total de cas

La plupart des cas de botulisme sont liés à la consommation d’aliments qui n’ont pas été cuits après préparation (voir figure 29.6a). Par exemple des conserves familiales de légumes peu acides (maïs, haricots) sont souvent utilisées sans cuisson dans des salades composées. Le poisson frais fumé, conditionné en film plastique sous vide, est également souvent consommé sans cuisson préalable. Ces conditions de conservation permettent la germination des spores de C. botulinum et la production de toxine qui, même ingérée en quantité minime, entraîne une intoxication grave. Le botulisme est lié à l’ingestion d’endospores de Clostridium botulinum, parfois présentes dans du miel, ou, cas le plus fréquent, provenant d’une source non identifiée (voir figure 29.6b). Si la flore commensale digestive du nourrisson est peu développée ou modifiée à la suite d’un traitement antibiotique, les endospores peuvent germer dans le tube digestif du nourrisson, entraînant une multiplication des cellules végétatives et la sécrétion de toxine. La plupart

110 100 Pic dû à des oignons 90 sautés, IL Pic dû à des pommes Pic dû à des poissons 80 de terre cuites, TX fermentés et à des 70 fruits de mer, AK 60 Pic dû à une sauce chilienne, TX 50 40 30 20 10 0 1987 1992 1997 2002 1982

Nombre total de cas

Année (a) Botulisme d’origine alimentaire 110 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 1992

Botulisme infantile

Botulisme par blessure et autres formes

1997

Diagnostic, traitement et prévention Le diagnostic de botulisme est confirmé en montrant la présence de la toxine dans le sérum du patient ou par la présence de la toxine ou de formes viables de Clostridium botulinum dans les aliments suspects. Les tests de laboratoire sont couplés aux observations cliniques, en particulier à des signes neurologiques de paralysie locale (gêne visuelle, de la parole), débutant dix-huit à vingt-quatre heures, après l’ingestion de l’aliment contaminé. Le traitement symptomatique repose sur la ventilation assistée contre la paralysie respiratoire flasque (voir section 21.10). L’administration d’antitoxine est possible si le diagnostic est précoce (voir section 22.13). La prévention demande le maintien de contrôles soigneux des méthodes de préparation et de conservation des aliments. Le chauffage des aliments détruit les endospores, l’ébullition maintenue pendant vingt minutes détruit la toxine. Les aliments préparés à domicile sont les sources les plus courantes de manifestation individuelle de botulisme alimentaire. Dans les cas de botulisme infantile, C. botulinum et sa toxine sont souvent retrouvés dans le contenu intestinal. Le botulisme infantile est en général limité et la plupart des nourrissons se rétablissent grâce à au traitement symptomatique seul, de type ventilation assistée. Les décès, exceptionnels, sont dus à une défaillance respiratoire. Le miel étant une source occasionnelle d’endospores de C. botulinum, il n’est pas conseillé d’en donner aux enfants de moins de 2 ans.

Contrôlez vos acquis 2002

Année (b) Botulisme infantile, par blessure et autres formes FIGURE 29.6 Incidence du botulisme aux États-unis. (a) Botulisme d’origine alimentaire. Dans les années présentant de nombreux cas, l’origine de la majorité des cas impliqués dans l’augmentation est indiquée. (b) Autres cas de botulisme incluant le botulisme infantile. Plus de la moitié des cas de botulisme infantile aux États-Unis sont localisés en Californie. Le botulisme par blessure et les autres formes incluent toutes les autres sources. Données du CDC (Centers for Disease Control and Prevention), Atlanta, GA, États-Unis.

des cas de botulisme infantile surviennent entre la première semaine et deux mois de vie. Ces formes de botulisme sont rares chez les enfants de plus de six mois, lorsque la flore normale intestinale est plus développée (voir section 21.4). Le botulisme infantile représente aux États-Unis 70 % des cas de botulisme. Le botulisme des plaies est occasionnel, vraisemblablement dû à l’introduction d’endospores par voie parentérale à travers un corps étranger. Cette forme de botulisme est couramment associée à la toxicomanie intraveineuse (voir figure 29.6b). Le botulisme est une maladie rare, avec ces dernières années, aux États-Unis, au plus six cas pour dix millions d’habitants par an. Pendant les dix dernières années, moins de 155 cas ont été signalés, mais 25 % de ces cas ont été fatals. La mort survient par paralysie respiratoire ou arrêt cardiaque, dus à l’action paralysante de la neurotoxine botulique (voir section 21.10).

La toxi-infection alimentaire à Clostridium résulte de l’ingestion de toxines produites par la multiplication bactérienne dans les aliments ou par la multiplication bactérienne et la production de toxines dans l’organisme. La toxi-infection alimentaire à C. perfringens, assez courante, donne habituellement des symptômes limités. Le botulisme est une maladie rare, mais grave, de mortalité significative. •

Décrivez les événements conduisant à une toxiinfection alimentaire à C. perfringens. Quelle est l’évolution la plus probable de la maladie ?



•

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Décrivez les événements conduisant au botulisme. Quelle est l’évolution la plus probable du botulisme ? Pourquoi le botulisme infantile est-il plus prévalent que les autres formes de botulisme ?

III

INFECTION ALIMENTAIRE

Une infection alimentaire est une infection active résultant de l’ingestion d’aliments contaminés par des pathogènes. Les aliments peuvent contenir un nombre suffisant de pathogènes viables pour entraîner une infection et la maladie de l’hôte. Les infections alimentaires sont très courantes (voir tableau 29.6), les salmonelloses en sont un exemple typique, très répandu. Beaucoup de pathogènes alimentaires sont également responsables de maladies liées à la contamination de l’eau (voir chapitre 28).

29.7 Salmonellose m n Bien qu’elle soit quelquefois confondue avec une toxi-infection, la salmonellose est une maladie gastro-intestinale due à une infection par Salmonella d’origine alimentaire. Les symptômes ne se manifestent qu’après la colonisation de l’épithélium intestinal par le pathogène. Les Salmonella sont des bacilles Gram négatif, aéroanaérobies facultatifs, proches d’Escherichia coli, de Shigella et d’autres bactéries entériques (voir section 12.11). Les Salmonella sont des parasites intestinaux des animaux, qui se retrouvent dans les eaux usées. Toutes les salmonelles sont potentiellement pathogènes pour l’homme. Salmonella Typhi est responsable de la fièvre typhoïde, maladie grave mais très rare aux États-Unis (la plupart des 500 cas d’origine alimentaire sont importés). L’espèce Salmonella enterica comprend plusieurs sous-espèces, subdivisées, sur la base de caractères antigéniques, en plus de deux mille serovars responsables de gastro-entérites. S. enterica sérotype Typhimurium est l’agent le plus courant de salmonelloses.

L’épidémiologie L’incidence et la prévalence des cas rapportés de salmonellose sont restées stables pendant la dernière décennie, avec environ 40 000 à 45 000 cas documentés chaque année (voir figure 29.7). Cependant, probablement moins de 4 % des cas totaux de salmonelloses sont déclarés et l’on estime à plus de 1,3 million le nombre réel de cas annuels (voir tableau 29.6). Les réservoirs de salmonelles responsables de gastro-entérites sont le tractus intestinal humain et celui des animaux à sang chaud. Plusieurs mécanismes permettent leur passage dans les aliments. Ces bactéries peuvent contaminer les aliments lors de manipulations par des mains sales (péril fécal). Les animaux d’élevage (poulets, bétail) peuvent héberger des souches de salmonelles pathogènes pour les humains, pouvant contaminer les produits frais (œufs, viande, produits laitiers). Les aliments les

Nombre de cas pour 100 000 individus

29.7 Salmonellose 947

30

Pic dû à du lait pasteurisé contaminé, IL

25 20 15 10 5 0 1972

1977

1982

1987

1992

1997

2002

Année FIGURE 29.7 Prévalence des salmonelloses aux États-Unis de 1972 à 2002. Les valeurs représentent le nombre de cas pour 100 000 individus. En 2002, le nombre total de cas rapportés était de 44 264. Les investigations épidémiologiques suggèrent que 3 % seulement de ces cas de salmonelloses sont bien identifiés et signalés, indiquant qu’il y a donc environ 1,3 million de cas annuels. Le pic de 1984 résulte de plusieurs milliers de cas dus à une contamination de lait pasteurisé mélangé à du lait cru, dans une laiterie importante. Environ 95 % des cas sont d’origine alimentaire. Données des CDC (Centers for Disease Control and Prevention), Atlanta GA, États-Unis.

plus susceptibles de contenir des Salmonella sont les crèmes anglaises et les pâtisseries à la crème, les meringues, pâtés, le lait de poule contenant des œufs crus. D’autres aliments sont fréquemment impliqués dans les salmonelloses : les viandes et produits dérivés comme les pâtés en croûte, les saucisses fumées non cuites, les volailles, le lait et les produits laitiers. La salmonellose la plus courante est l’entérocolite à Salmonella. L’ingestion d’aliments contenant des Salmonella viables entraîne la colonisation de l’intestin grêle et du colon. Les symptômes apparaissent progressivement, de huit à quarante-huit heures après la contamination (maux de tête, frissons, vomissements, diarrhée accompagnée de fièvre pendant quelques jours). L’évolution est spontanément favorable sans traitement en deux ou trois jours. L’excrétion des Salmonella se maintient cependant pendant quelques semaines. Quelques patients, bien que guéris et asymptomatiques, excrètent ces micro-organismes pendant des mois, voire des années, et sont alors porteurs sains chroniques (voir section 25.3). Les Salmonella sont également agent de la fièvre typhoïde, septicémie (infection du sang) à point de départ intestinal, caractérisée par une infection systémique et une fièvre élevée pendant plusieurs semaines. La mortalité due à la fièvre typhoïde non traitée approche les 15 %.

Diagnostic, traitement et prévention Le diagnostic de salmonellose se fonde sur les symptômes observés, l’interrogatoire du patient concernant les aliments récemment consommés et la coproculture. La culture sur milieux sélectifs (voir section 24.2) et différents tests sont couramment utilisés pour contrôler la présence des Salmonella dans les produits alimentaires d’origine animale (viande, volailles, œufs, lait en poudre).



948 Chapitre 29


Le traitement de l’entérocolite est habituellement inutile, car l’antibiothérapie ne réduit pas la durée d’évolution de la maladie et n’élimine pas le portage chronique. L’antibiothérapie limite cependant significativement la durée et la gravité d’une forme septicémique ou de la fièvre typhoïde. La mortalité de la fièvre typhoïde peut être abaissée à moins de 1 % avec une antibiothérapie adaptée. Quelques souches de salmonelles sont multirésistantes aux antibiotiques. Les Salmonella peuvent se multiplier dans un aliment cuit ou conservé si celui-ci est contaminé par manipulation avec des mains sales et laissé longtemps à température ambiante. Des aliments cuits, chauffés à 70 °C pendant au moins 10 minutes, sont considérés comme propres à une consommation immédiate ou à une conservation à 50 °C, ou à un stockage à moins de 10 °C. Les infections à Salmonella sont plus fréquentes en été qu’en hiver, probablement parce qu’une température extérieure élevée favorise la multiplication des micro-organismes dans les aliments (voir figure 29.4). Compte tenu de la durée du portage chronique de Salmonella, les règlements locaux demandent souvent l’éviction du personnel de cuisine infecté jusqu’à obtention de trois coprocultures négatives successives.

Contrôlez vos acquis Il y a plus de 1,3 million de cas de salmonelloses annuels aux États-Unis. La maladie résulte de l’ingestion de Salmonella, introduites dans la chaîne alimentaire par des matières premières d’origine animales ou par le personnel de cuisine. •

Décrivez l’infection alimentaire à salmonelles. Pourquoi diffère-t-elle de la toxi-infection alimentaire ?

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Comment la contamination des matières premières d’origine alimentaire par des salmonelles peut-elle être évitée ?

29.8 Escherichia coli pathogènes m n La plupart des souches d’Escherichia coli ne sont pas pathogènes. Ce sont des bactéries commensales colonisant le tractus intestinal humain. Quelques souches sont cependant des pathogènes alimentaires potentiels. Toutes les souches pathogènes ont une action sur le colon, et quelques-unes se caractérisent par leur capacité à produire des entérotoxines puissantes (voir section 21.11). Ces bacilles courts, Gram négatif, appartiennent à la famille des Entérobactéries (voir section 12.11). Il y a environ deux cents types d’Escherichia coli pathogènes, responsables de diarrhées potentiellement mortelles et d’infections du tractus urinaire. Les souches pathogènes sont regroupées en différentes catégories, selon les toxines produites et la maladie qu’elles provoquent.

Les Escherichia coli entéro-hémorragiques (EHEC) Les Escherichia coli entéro-hémorragiques produisent une vérotoxine qui est une entérotoxine voisine de la toxine Shiga,

de Shigella dysenteriae (voir tableau 21.4). Après ingestion de nourriture ou d’eau contaminée par une souche d’EHEC bien connue, E. coli O157:H7, le micro-organisme se multiplie dans l’intestin grêle et produit la vérotoxine. Celle-ci est responsable d’une diarrhée sanglante et peut se compliquer d’une insuffisance rénale (SHU, ou syndrome hémolytique et urémique). E. coli O157:H7 est responsable d’au moins 60 000 infections et de cinquante décès par maladie infectieuse d’origine alimentaire chaque année, aux États-Unis (voir tableau 29.5). Cette infection, cause majeure d’insuffisance rénale chez les enfants, est le plus fréquemment due à la consommation de viande crue ou mal cuite, en particulier de la viande hachée préparée industriellement. L’investigation de plusieurs épisodes épidémiques survenus aux États-Unis a montré que des centres régionaux de distribution, approvisionnés en viande de bœuf contaminée par E. coli O157:H7, étaient la source de l’épidémie. D’autres épisodes avaient pour origine des saucisses à base de viande de bœuf, prêtes à consommer, fumées mais non cuites (voir section 29.3). E. coli O157:H7 provenait probablement de carcasses de bœuf. En 2001, aux États-Unis toujours, seize épisodes d’infections alimentaires étaient documentés à E. coli O157:H7. Parmi eux, cinq étaient précisément liés à de la viande de bœuf contaminée. En 2003, une étude de l’Agence de sécurité alimentaire américaine montre que, sur 6 584 échantillons de viande de bœuf analysés, vingt contenaient E. coli O157:H7, soit 0,03 % de ces échantillons. E. coli O157:H7 a également été impliqué dans des épidémies d’infections alimentaires liées à la consommation de produits laitiers, de fruits et de légumes crus. E. coli O157:H7, se multipliant dans le tractus intestinal, est retrouvé dans les matières fécales ; c’est un contaminant potentiel des eaux. Quelques cas d’infections sérieuses à E. coli O157:H7 ont été rapportés, qui ont été contractées par baignade dans de l’eau fécalement contaminée (piscines, aires récréatives publiques). Quelques épisodes épidémiques ont également été signalés dans les établissements de long séjour, le mode de transmission étant probablement de type oro-fécal.

Les autres Escherichia coli pathogènes Les diarrhées sont fréquentes chez les enfants des pays en voie de développement. La « diarrhée du voyageur » est une infection entérique très courante, se manifestant sous forme de diarrhée aqueuse, atteignant les individus voyageant en pays tropical ou tempéré chaud, principalement due aux Escherichia coli entérotoxinogènes (ETEC). Les souches ETEC produisent habituellement une ou deux entérotoxines thermosensibles responsables de la diarrhée aqueuse. Par exemple, le taux d’infection à ETEC est souvent supérieur à 50 % chez les Américains se rendant au Mexique. Ces infections sont transmises par certains aliments comme les légumes frais (salade verte, par exemple) et par l’eau. Le taux d’infection très élevé chez les voyageurs est dû à la contamination des points d’approvisionnement locaux en eau potable. Les populations autochtones, exposées depuis longtemps à ces souches, ont développé une immunité naturelle les rendant résistantes. La présence d’anticorps sécrétoires (voir section 22.9) au niveau de la muqueuse intestinale prévient l’implantation du



29.7 Salmonellose 949

Diagnostic, traitement et prévention L’infection à Escherichia coli O157:H7 est une maladie à déclaration obligatoire aux États-Unis (voir tableau 25.5). Le schéma général établi pour le diagnostic, le traitement et la prévention des infections à Escherichia coli O157:H7 est le reflet des procédures courantes utilisées pour tous les Escherichia coli pathogènes. Le diagnostic d’une infection à E. coli O157:H7 repose sur l’isolement et l’identification de la souche à partir d’une coproculture ainsi que sur l’identification des antigènes O et H et des toxines par des techniques sérologiques (voir sections 4.9 et 24.7). Le sous-typage des souches est également effectué par méthodes moléculaires, comme le polymorphisme de longueur des fragments de restriction (RFLP) et l’électrophorèse en champ pulsé (PFGE) [voir section 24.12]. Le traitement de toutes les infections à E. coli pathogènes est symptomatique. Dans les cas graves, l’antibiothérapie réduit la durée d’évolution de l’infection. Le moyen le plus efficace de prévenir une infection à Escherichia coli O157:H7 d’origine alimentaire est de s’assurer que toute viande prête à la consommation a été cuite convenablement. Aux États-Unis, l’irradiation de la viande hachée est largement utilisée pour éliminer ou réduire la contamination par E. coli O157:H7, responsable de plusieurs épidémies d’origine alimentaire. En effet, la contamination d’une viande ou d’un animal peut potentiellement entraîner la contamination des viandes issues d’autres animaux, si ces produits sont mélangés lors du processus de broyage. L’irradiation est considérée comme étant le seul moyen efficace de décontamination après broyage, car celui-ci distribue les pathogènes dans l’épaisseur de la viande et pas seulement à sa surface. De façon générale, le lavage des mains, la purification de l’eau ainsi que des habitudes d’hygiène appropriées préviennent la diffusion des E. coli pathogènes. La diarrhée du voyageur peut être prévenue en évitant la consommation d’eau locale et d’aliments crus.

Contrôlez vos acquis Les Escherichia coli entéropathogènes peuvent causer des infections d’origine alimentaire sérieuses. Des mesures spécifiques, comme l’irradiation de la viande hachée de bœuf, ont été mises en place pour limiter la diffusion de ces pathogènes. Les méthodes à grande

échelle de préparation de la viande et de ses dérivés permettent aux contaminants provenant d’un petit nombre de carcasses de contaminer/infecter un grand nombre de produits. •

Infections à Escherichia coli d’origine alimentaire : décrivez les maladies dues aux souches EHEC, ETEC, EPEC et EIEC.

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Comment la contamination des produits alimentaires d’origine animale par Escherichia coli peutelle être prévenue ?

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Pourquoi Escherichia coli O157:H7 est-il considéré comme un pathogène dangereux, devant être signalé ?

29.9 Campylobacter m n Campylobacter spp. est l’agent d’infections alimentaires le plus prévalent aux États-Unis. Les Campylobacter sont des bacilles Gram négatif, mobiles, de forme incurvée ou spirillaire, microaérophiles, c’est-à-dire se multipliant sous concentration d’oxygène réduite (voir section 12.14). Quelques espèces pathogènes sont connues, Campylobacter jejuni (voir figure 29.8), C. coli et C. fetus. C. jejuni et C. coli sont responsables d’environ deux millions de cas annuels de diarrhées bactériennes (voir tableau 29.6). Campylobacter fetus, cause majeure de stérilité et d’avortements spontanés chez les bovins et ovins, a des conséquences économiques importantes.

L’épidémiologie Les Campylobacter spp. sont transmis aux humains par des aliments contaminés, plus fréquemment les volailles, le porc, les palourdes crues et autres coquillages, ou des eaux de surface non chlorées. C. jejuni est un commensal du tractus intestinal des volailles. Les poulets et les dindes en sont potentiellement tous porteurs. Selon le ministère américain de l’Agriculture, plus de 90 % des carcasses de dindes, 88 % des carcasses de poulets et 32 % des carcasses de porcs seraient contaminées par Campylobacter spp. Le bœuf est cependant rarement contaminé. Les différentes espèces de Campylobacter infectent également les animaux domestiques comme les chiens, entraînant des diarrhées moins sévères que celles

CDC/P. Fields, C. Fitzgerald, J. Carr/PHIL

pathogène dans la flore résidente. Le micro-organisme peut, par contre, coloniser le tractus intestinal d’un individu non immun, entraînant la maladie. Les E. coli entéropathogènes (EPEC) sont responsables de diarrhées chez le nourrisson et le petit enfant, mais ne sont pas invasifs, ni producteurs de toxines. Les E. coli entéro-invasifs (EIEC) sont capables d’envahir la muqueuse colique, entraînant une diarrhée mucopurulente. Les bactéries sont internalisées dans des vacuoles d’endocytose (phagolysosomes – voir section 22.2) qu’elles vont lyser, avant de se multiplier dans le cytoplasme et d’envahir les cellules adjacentes. Cette maladie invasive, responsable de diarrhées, est fréquente dans les pays en voie de développement.

FIGURE 29.8 Observation en microscopie électronique d’une cellule de Campylobacter jejuni. Les bâtonnets hélicoïdaux, Gram négatif, ont un diamètre d’environ 1 µm.




observées chez les humains. Les cas d’infection à Campylobacter du nourrisson sont souvent liés à un animal domestique infecté, particulièrement un chien. Lorsqu’elles sont ingérées, les bactéries du genre Campylobacter se multiplient dans l’intestin grêle et envahissent l’épithélium intestinal, entraînant une inflammation et donc la maladie. C. jejuni étant sensible à l’acidité gastrique, des doses infectantes d’au moins 104 sont nécessaires au déclenchement de l’infection. Cependant, l’ingestion directe du pathogène à travers un aliment ou son ingestion par un sujet sous traitement destiné à réduire l’acidité gastrique permettent d’abaisser la dose infectante à moins de cinq cents bactéries. Les symptômes d’une infection à Campylobacter sont une forte fièvre (habituellement supérieure à 40 °C), des maux de tête, un malaise général accompagné de nausées, de crampes abdominales et de diarrhées aqueuses profuses, parfois sanglantes. Les symptômes persistent de sept à dix jours. La guérison spontanée des infections à Campylobacter est souvent complète, avec cependant des rechutes dans 25 % des cas.

Diagnostic, traitement et prévention Le diagnostic repose sur l’isolement du micro-organisme à partir de prélèvements de selles et son identification par des tests phénotypiques ou immunologiques. L’infection à C. jejuni étant très fréquente chez les enfants, des milieux sélectifs et des méthodes immunologiques spécifiques ont été développés pour l’identification de ce micro-organisme. Le traitement de ces infections par l’érythromycine ne réduit pas la durée de la phase diarrhéique, mais peut amenuiser la durée d’excrétion des Campylobacter par le patient. L’hygiène personnelle, le lavage soigneux des volailles avant cuisson (et de tous les ustensiles à leur contact) suivi d’une cuisson convenable de la viande éliminent tout risque d’infection à Campylobacter.

Contrôlez vos acquis L’infection à Campylobacter est de loin l’infection bactérienne d’origine alimentaire la plus fréquente. Bien qu’elle soit habituellement limitée, cette infection touche près de deux millions d’individus par an. •

Décrivez les signes cliniques d’une infection alimentaire à Campylobacter. Quelle en est l’évolution la plus probable ?

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Comment la contamination par Campylobacter des produits alimentaires d’origine animale peut-elle être contrôlée ?

29.10 Listériose m n Listeria monocytogenes est l’agent causal de la listériose, une infection gastro-intestinale d’origine alimentaire se manifestant par une bactériémie et une méningite. C’est un bacille Gram positif court, ne formant pas de spores, aérobie facultatif, psychrotrophe (tolérant au froid), acidotolérant et halotolérant (voir section 12.19 et figure 29.9).

L’épidémiologie Largement retrouvé dans le sol et l’eau, Listeria monocytogenes est susceptible de contaminer tous les aliments frais à tous les stades de leur croissance ou de leur fabrication. La réfrigération, qui stoppe habituellement la multiplication bactérienne, est inefficace car ce micro-organisme est psychrotrophe. La viande, les produits laitiers et les produits frais peuvent être contaminés par ce pathogène. Les aliments les plus fréquemment incriminés dans les épidémies de listériose sont des produits alimentaires prêts à consommer comme certaines viandes ou des produits laitiers non pasteurisés stockés pendant une longue durée, même s’ils ont été réfrigérés à 4 °C. Listeria monocytogenes est un pathogène intracellulaire. L’ingestion d’aliments contaminés permet son passage dans le tractus gastro-intestinal. Le pathogène est alors capté par les cellules phagocytaires, où il se multiplie. Cette multiplication entraîne la lyse des phagocytes et la colonisation des cellules voisines. L. monocytogenes déclenche une réponse immunitaire à médiation cellulaire à travers les lymphocytes TH1 (voir section 22.8). Les individus présentant des troubles de l’immunité cellulaire, tels les sujets âgés, les nouveau-nés, les patients sous thérapeutiques immunosuppressives (corticoïdes, par exemple) ou souffrant d’immunodépression acquise (SIDA) sont soumis à un risque plus élevé d’atteinte par la listériose (voir section 26.14). Bien que l’exposition à L. monocytogenes soit très fréquente, la listériose est une maladie rare. C’est une septicémie d’origine digestive conduisant souvent à la méningite. La mortalité peut atteindre 20 %. On dénombre environ 2 500 cas de listériose par an, entraînant 500 décès. La quasi-totalité des cas nouvellement diagnostiqués nécessite l’hospitalisation du patient.

Diagnostic, traitement et prévention Le diagnostic de listériose repose sur l’isolement et l’identification de Listeria monocytogenes à partir de produits pathologiques (sang, liquide céphalo-rachidien). L. monocytogenes

John M. Martinko

950 Chapitre 29

FIGURE 29.9 Coloration de Gram de Listeria monocytogenes. Les bâtonnets courts, Gram positif, ont un diamètre d’environ 0,5 µm.



29.11 Autres maladies infectieuses d’origine alimentaire 951

peut être identifié dans les aliments par culture directe ou par différentes méthodes moléculaires : ribotypage (voir section 11.11) et réaction de polymérisation en chaîne (PCR) (voir sections 7.9 et 24.12, et tableau 24.9). Le traitement antibiotique par pénicilline, ampicilline ou par l’association triméthoprime-sulfaméthoxazole est, en général, efficace. Les mesures de prévention comprennent le rappel des lots d’aliments contaminés et différentes procédures destinées à limiter la contamination par L. monocytogenes sur le site de fabrication. L. monocytogenes étant sensible à la chaleur et au rayonnement, les denrées alimentaires et les matériels de préparation peuvent être désinfectés. Cependant, si le produit fini n’est pas stérilisé, le risque de contamination de l’aliment ne peut être totalement écarté, du fait de la très large distribution du pathogène. Les sujets immunodéprimés doivent éviter de consommer des produits laitiers non pasteurisés et des viandes prêtes à consommer. L’avortement spontané est également une conséquence fréquente de la listériose. Pour protéger l’enfant à naître, il est conseillé aux femmes enceintes d’éviter systématiquement tous les aliments pouvant transmettre L. monocytogenes.

Réchauffer l’aliment peut tuer B. cereus, mais les toxines restent actives. B. cereus est également responsable d’une infection alimentaire analogue à celle due à Clostridium perfringens (voir section 29.6). Shigella spp. est l’agent de près de 100 000 cas annuels de gastro-entérites invasives sérieuses d’origine alimentaire appelées shigelloses. Quelques membres du genre Vibrio sont responsables d’intoxications alimentaires après consommation de coquillages contaminés.

Les virus

Listeria monocytogenes est un micro-organisme ubiquiste de l’environnement. Chez les individus bien portants, Listeria est rarement la cause d’infections. Chez les individus immunodéprimés, Listeria peut être responsable d’infections sérieuses, parfois mortelles.

Les virus sont responsables du plus grand nombre de cas annuels d’infections alimentaires. En général, ces troubles d’origine alimentaire sont des gastro-entérites, caractérisées par des diarrhées, souvent accompagnées de nausées et de vomissements. La guérison est spontanée et rapide, en général dans les vingt-quatre à quarante-huit heures (« dérangement » de vingt-quatre heures). Les virus Norwalk-like (voir tableau 25.8 et section 28.8) sont responsables de la plupart de ces infections alimentaires bénignes aux États-Unis (voir tableau 29.6), soit de plus de neuf millions sur les treize millions de cas annuels d’infections alimentaires. Les rotavirus, astrovirus et virus de l’hépatite A représentent collectivement cent mille cas annuels de maladies infectieuses d’origine alimentaire. Ces virus colonisent le tractus gastro-intestinal et souillent souvent les aliments ou l’eau par l’intermédiaire des matières fécales. Comme pour beaucoup d’infections d’origine alimentaire, le respect des règles d’hygiène lors de la manipulation des aliments, le lavage des mains, l’utilisation d’eau propre pour laver les produits frais sont essentiels à la prévention.

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Quelle est l’évolution la plus probable d’une exposition à Listeria chez les individus sains ?

Les protozoaires

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Quelles sont les populations les plus sensibles à l’infection par Listeria ? Pourquoi ?

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Listériose humaine : décrivez la maladie.


29.11 Autres maladies infectieuses m n d’origine alimentaire D’autres micro-organismes et agents infectieux, bactéries, virus et parasites sont également impliqués dans les infections d’origine alimentaire.

Les bactéries La liste des principales bactéries responsables d’infections alimentaires humaines est présentée dans le tableau 29.6. Yersinia enterocolitica, fréquemment retrouvée dans le tractus gastro-intestinal des animaux domestiques, est responsable d’infections alimentaires liées à la consommation de viandes ou de produits laitiers contaminés. Y. enterocolitica est responsable d’entérocolites fébriles pouvant être mortelles. Bacillus cereus sécrète deux toxines entraînant des diarrhées et des vomissements. B. cereus se multiplie dans des aliments riches en amidon comme le riz. Les endospores de ce bacille Gram positif germent et, lorsque le microorganisme se multiplie dans l’aliment laissé à température ambiante, les quantités de toxines sécrétées deviennent pathogènes.

Les infections alimentaires les plus importantes, dues à des protozoaires, sont reportées dans le tableau 29.6. Les parasites protozoaires comme Giardia lamblia, Cryptosporidium parvum et Cyclospora cayetanensis peuvent être disséminés par l’alimentation, probablement contaminée par des matières fécales souillant de l’eau non traitée, utilisée pour laver, irriguer ou être pulvérisée sur des cultures. Certains produits frais (fruits) sont souvent la source de ces protozoaires. La giardiase et la cryptosporidiose sont développées dans le chapitre précédent (voir section 28.6, figures 28.11 et 28.12). La cyclosporose est une gastro-entérite aiguë, actuellement en émergence. Aux États-Unis, la plupart des cas semblent transmis par ingestion de produits frais, souvent d’origine exotique. Toxoplasma gondii est un protozoaire transmis par les fèces de chat, mais également retrouvé dans la viande crue ou insuffisamment cuite. Chez la plupart des individus, la toxoplasmose se manifeste sous forme d’une gastro-entérite bénigne. La toxoplasmose contractée pendant la grossesse peut conduire à des malformations graves de l’enfant (cécité) ou à la mort à la naissance. Chez les sujets immunodéprimés, la toxoplasmose est toujours symptomatique (toxoplasmose aiguë).

Prions, ESB et nvMCJ Les prions sont des protéines, probablement originaires de l’hôte, qui adoptent des conformations nouvelles, inhibant les fonctions protéiques normales et entraînant la spongiose du tissu nerveux (voir section 9.14). Les maladies humaines à prions




sont caractérisées par des symptômes neurologiques, dont la dépression, la perte de coordination motrice et la démence. Une forme de maladie humaine à prions d’origine alimentaire est connue sous le nom de « nouveau variant de la maladie de Creutzfeld-Jacob » (nvMCJ). Elle a été reliée à la consommation de viande de bovins atteints de l’encéphalopathie bovine spongiforme (ESB), une maladie à prions communément appelée « maladie de la vache folle ». La nvMCJ est une maladie neurodégénérative lente, apparaissant après une latence de plusieurs années après l’exposition aux prions agents de l’ESB (voir section 9.14). Près de deux cents cas de nvMCJ ont été signalés en Grande-Bretagne et dans les autres pays européens. Aucun cas de nvMCJ lié à la consommation de viande bovine n’a été signalé aux États-Unis. Bien que le mécanisme de l’infection à prions n’ait pas été totalement élucidé, les prions agents de l’ESB ingérés avec les produits bovins contaminés ont pour cible des protéines humaines, dont ils modifient la conformation structurelle et fonctionnelle, conduisant à leur dysfonctionnement et à la maladie (voir figure 9.29). Les stades terminaux de l’ESB et de la nvMCJ sont caractérisés par la présence de larges vacuoles dans le tissu cérébral, donnant au cerveau son aspect « spongiforme » (voir figure 29.10). En Grande-Bretagne et en Europe, environ 180 000 bovins ont été atteints par l’ESB. Quelques cas ont été signalés au Canada. Un petit nombre d’animaux infectés a également été retrouvé aux États-Unis, grâce à des tests systématiques sur le cerveau des animaux abattus. En Europe et en Amérique du Nord, tous les troupeaux connus ou suspects d’ESB ont été abattus. L’interdiction d’alimenter le bétail avec des farines animales semble avoir stoppé l’apparition de nouveaux cas d’ESB en Europe et maintenu cette maladie à un très faible niveau d’incidence en Amérique du Nord. Les prions infectieux ont été probablement transmis aux animaux de production par l’intermédiaire de farines animales fabriquées à partir de déchets (viande, os) d’animaux impropres à la consommation humaine. Le diagnostic d’ESB est réalisé par inoculation du tissu suspect à un animal sensible (souris) ou par analyse

microscopique ou immunohistochimique d’une biopsie de tissu cérébral (voir figure 29.10).

Contrôlez vos acquis Plus de deux cents agents infectieux différents sont responsables d’infections alimentaires. Les virus sont retrouvés dans la grande majorité de ces troubles. Des bactéries, des protozoaires, des prions sont également impliqués. •

Identifiez les virus le plus souvent à l’origine d’infections alimentaires.

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Comment la contamination des animaux de production par le prion peut-elle être évitée ?

USDA/A. Jenny/PHIL

952 Chapitre 29

FIGURE 29.10 Coupe de cerveau d’une vache atteinte d’encéphalite spongieuse bovine (ESB). Les vacuoles apparaissent comme des trous dans le cerveau, donnant l’apparence spongieuse caractéristique.

QUESTIONS 1. Indiquez et définissez les deux catégories majeures d’aliments en fonction de leur potentiel d’altération (voir section 29.1). 2. Indiquez les principales méthodes de conservation des aliments. Donnez un exemple d’aliment conservé pour chaque méthode citée (voir section 29.2). 3. Indiquez les principales catégories d’aliments fermentés (voir section 29.3). 4. Différenciez infection alimentaire et toxi-infection alimentaire (voir section 29.4). 5. Décrivez la pathogenèse d’une toxi-infection alimentaire staphylococcique. Suggérez des méthodes de prévention de cette maladie (voir section 29.5). 6. Identifiez deux types majeurs de toxi-infection alimentaire à Clostridium. Quel est le plus prévalent ? Quel est le plus dangereux ? Pourquoi (voir section 29.6) ?

7. Quelles sont les sources possibles de Salmonella spp., responsables d’infections alimentaires (voir section 29.7) ? 8. Quelles mesures sont utilisées par les industriels pour limiter la multiplication dans la viande hachée d’Escherichia coli O157:H7 ? par les consommateurs (voir section 29.8) ? 9. Campylobacter est une bactérie très fréquemment impliquée dans les infections alimentaires. Pourquoi (voir section 29.9) ? 10. Identifiez les aliments à l’origine d’infections par Listeria monocytogenes. Identifiez les sujets à haut risque de listériose (voir section 29.10). 11. Pourquoi les virus sont-ils très fréquemment associés aux maladies d’origine alimentaires (voir section 29.11) ?



Problèmes 953

PROBLÈMES 1. Indiquez les conditions optimales de stockage des aliments périssables et non périssables. Prenez en compte les facteurs économiques comme le coût du traitement et la valeur des produits. 2. Pour un aliment de votre choix, proposez un moyen de conservation par abaissement de l’activité de l’eau sans séchage. 3. La toxi-infection alimentaire à Clostridium perfringens implique l’ingestion de la bactérie suivie de la croissance et de la sporulation dans le tractus intestinal de l’hôte. La sporulation déclenche la production de toxine. Cette maladie est-elle une toxi-infection alimentaire ou une infection alimentaire ? 4. Des salades de pommes de terre mal préparées sont souvent à l’origine de toxi-infections alimentaires staphylococciques ou de salmonelloses. Expliquez de quelles manières cet aliment peut être contaminé par Staphylococcus aureus ou par Salmonella spp. 5. La production de toxine botulique par Clostridium botulinum demande un environnement anaérobie. Identifiez des méthodes de conservation des aliments créant un environnement anaérobie nécessaire à la multiplication de C. botulinum. À l’opposé, identifiez des méthodes de conservation des aliments créant un environnement aérobie inhibant la multiplication de C. botulinum. Quels autres facteurs influencent la multiplication de C. botulinum ?

6. Pourquoi les antibiotiques sont-ils en général inutiles dans le traitement des salmonelloses ? Justifiez votre réponse en tenant compte de l’habitat du micro-organisme et de la maîtrise de la résistance aux antibiotiques. 7. Indiquez les précautions nécessaires pour prévenir une infection par les Escherichia coli pathogènes. Détaillez le rôle de E. coli O157:H7 et les mesures d’hygiène associées. 8. Indiquez un plan pour éliminer une contamination par Campylobacter d’un élevage de volailles et de produits finis à base de volailles. Expliquez les avantages d’un élevage non contaminé par Campylobacter et indiquez les difficultés que votre plan pourrait rencontrer. 9. La listériose atteint les sujets présentant un déficit immunitaire cellulaire de type TH1. Pourquoi ? Imaginez un vaccin contre la listériose. Votre vaccin serait-il utilisable chez les sujets à haut risque de listériose ? 10. Indiquez les raisons potentielles expliquant l’incidence élevée des maladies alimentaires dues à des virus, particulièrement aux virus Norwalk. Imaginez un plan pour éliminer ce type de virus des aliments. 11. Indiquez les difficultés liées au dépistage d’agents infectieux latents comme le prion, responsable de l’encéphalite bovine spongiforme. Les maladies à prions peuvent-elles être éliminées ? Comment ?





CHAPITRE TRENTE

Microbiologie industrielle

I

Micro-organismes industriels et formation des produits

30.1

30.4

Micro-organismes d’intérêt industriel et leurs produits Métabolites primaires et secondaires Caractéristiques des fermentations à grande échelle Mise à l’échelle des fermenteurs

II

Produits pharmaceutiques

30.5 30.6

Isolement et caractérisation des antibiotiques Production industrielle de pénicillines et de tétracyclines Vitamines et acides aminés Procédés de biotransformation des stéroïdes Les enzymes en tant que produits industriels

962 966 968 969

Principaux produits industriels alimentaires et boissons

971

30.2 30.3

30.7 30.8 30.9

III

En microbiologie industrielle, une production rentable n’est possible qu’à grande échelle. Un produit compétitif ne peut être obtenu qu’avec un milieu de culture bon marché et un fermenteur de grande taille. On voit ici l’intérieur d’un tel fermenteur avec son serpentin de refroidissement et ses pales d’agitation.

30.10 30.11 30.12 30.13

Boissons alcoolisées et alcools Production du vinaigre Acide citrique et autres composés organiques La levure en tant que nourriture et supplément diététique 30.14 Champignons comestibles

956 956 957 959 960

961 961

971 976 978 978 980



956 Chapitre 30


GLOSSAIRE Antibiotique à large spectre (broad spectrum antibiotic) Molécule antimicrobienne efficace dans le traitement d’une grande variété de maladies d’origines bactériennes. Antibiotique β-lactame (β-lactam antibiotic) Membre du groupe d’antibiotiques incluant la pénicilline et contenant l’hétérocycle à quatre atomes β-lactame. Aspartame® Édulcorant non nutritif composé d’acide aspartique et du méthyle ester de la phénylalanine. Biocatalyse (biocatalysis) Utilisation de micro-organismes pour effectuer une synthèse chimique spécifique. Biotransformation (biotransformation) Utilisation de microorganismes pour effectuer une réaction chimique qui serait plus coûteuse par voie non biologique. Boisson distillée (distilled beverage) Boisson contenant de l’alcool concentré par distillation. Brassage (brewing) Production de boissons alcoolisées comme la bière par fermentation de grains maltés. Enzyme immobilisée (immobilized enzyme) Enzyme liée à un support solide sur lequel on fait passer le substrat afin de le convertir en produit. Exoenzyme (exoenzyme) Enzyme produite par un micro-organisme qui l’excrète dans son environnement. Extrémozyme (extremozyme) Enzyme capable de fonctionner dans des conditions physiques ou chimiques extrêmes, par exemple à de hautes températures ou avec un faible pH. Fermentation (dans un contexte industriel) [fermentation in an industrial context] Tout procédé microbiologique à grande échelle effectué en aérobiose ou en anaérobiose.

I

MICRO-ORGANISMES INDUSTRIELS ET FORMATION DES PRODUITS

La microbiologie industrielle utilise des micro-organismes, cultivés à grande échelle soit pour élaborer des produits à valeur ajoutée, soit pour effectuer des étapes chimiques difficiles par des procédés qui sont en fait des améliorations de réactions métaboliques déjà accomplies par des micro-organismes. Le but est dans la majorité des cas de surproduire le produit visé. À ce titre, la microbiologie industrielle diffère de la biotechnologie (microbienne) qui, souvent, procède à des manipulations génétiques pour faire engendrer un nouveau produit au micro-organisme (voir chapitre 31). La biocatalyse décrit les réactions effectuées par les microorganismes en microbiologie industrielle. Dans ce chapitre, nous décrirons plusieurs procédés de biocatalyse industrielle et les problèmes associés entre autres aux cultures microbiennes à grande échelle. Une revue des micro-organismes et des produits industriels sera suivie d’un aperçu des procédés de fermentation alcoolique conduisant à la fabrication de la bière ou du vin qui sont à l’origine de la microbiologie industrielle. Ensuite nous décrirons les procédés développés ultérieurement dans le domaine des produits pharmaceutiques (exemple des antibiotiques), puis dans ceux des additifs alimentaires (exemple des acides aminés), des enzymes et de produits chimiques tels que le butanol et l’acide citrique. Nous verrons comment ces procédés microbiologiques ont été rendus viables à une échelle industrielle.

Fermenteur (fermentor) Réacteur dans lequel la fermentation industrielle est effectuée. Métabolite primaire (primary metabolite) Métabolite excrété lors de la phase de croissance. Métabolite secondaire (secondary metabolite) Métabolite excrété à la fin de la phase exponentielle de croissance et lors de la phase stationnaire. Microbiologie industrielle (industrial microbiology) Utilisation à grande échelle de micro-organismes afin de produire des produits de valeur commerciale. Mise à l’échelle (scale up) Passage d’un procédé industriel de la taille du petit appareil de laboratoire à celle du grand fermenteur industriel. Pénicilline de biosynthèse (biosynthetic penicillin) Forme particulière de pénicilline obtenue en complétant le milieu de croissance du micro-organisme en chaînes spécifiques précurseurs de cet antibiotique. Pénicilline naturelle (natural penicillin) Structure parente de la pénicilline produite par des cultures de Penicillium non supplémentées en précurseurs de chaînes latérales. Pénicilline semi-synthétique (semisynthetic penicillin) Pénicilline produite en utilisant des composés dérivés de la fermentation microbienne et de synthèses chimiques. Protéase (protease) Enzyme capable de dégrader les protéines par hydrolyse. Tétracycline (tetracycline) Membre de la classe des antibiotiques contenant le cycle à quatre noyaux du naphtacène.

30.1 Micro-organismes d’intérêt m n industriel et leurs produits Les micro-organismes les plus utilisés en microbiologie industrielle sont les champignons (levures et moisissures – voir chapitre 14) et certains procaryotes, en particulier du genre Streptomyces (voir section 12.24). Ceux d’intérêt industriel ont des métabolismes spécialisés capables de synthétiser un ou plusieurs produits avec un rendement élevé. Pour obtenir ces métabolismes, on modifie souvent les génomes des souches par mutation ou recombinaison pour augmenter le rendement en un métabolite particulier. Les souches de micro-organismes réellement utilisées dans l’industrie sont généralement très éloignées de la souche sauvage initialement isolée de l’environnement. Une fois ces souches développées industriellement avec un rendement élevé en produit désiré, elles sont conservées soit dans les laboratoires de microbiologie des industriels, soit dans de grandes collections nationales de micro-organismes, telles que l’American Type Culture Collection (ATCC) aux États-Unis, ou le Centre de ressources biologiques de l’Institut Pasteur en France, ou encore le Centraalbureau voor Schimmelcultures (CBS) aux Pays-Bas. Ces collections fournissent des souches pour l’enseignement, la recherche et l’industrie. Toute souche ayant la capacité d’effectuer un nouveau procédé biocatalytique doit être déposée dans une de ces collections nationales. Cependant, pour des raisons de confidentialité, les souches déposées ne sont pas les véritables souches à fort



30.2 Métabolites primaires et secondaires 957

rendement, mais des souches effectuant le procédé avec un rendement plus faible.

Propriétés des micro-organismes d’intérêt industriel Un micro-organisme approprié à un procédé industriel doit posséder, outre la caractéristique de produire la substance d’intérêt, celle de croître et de sécréter cette substance dans des cultures à grande échelle. De plus, il est préférable qu’il produise des spores ou des cellules végétatives facilitant l’inoculation de grands fermenteurs. Il doit aussi croître rapidement et produire le métabolite désiré sur une échelle de temps courte. Une souche industrielle doit également pouvoir croître dans un milieu de culture relativement bon marché et disponible en grande quantité. Dans beaucoup de procédés, on utilise des déchets carbonés provenant d’autres industries comme ingrédients majeurs ou comme suppléments des milieux de culture à grande échelle. C’est le cas par exemple de la corn steep liquor (liqueur de trempage du maïs), sous-produit de la mouture humide du maïs, riche en azote et en facteurs de croissance, et du sérum de fromagerie (ou lactosérum), contenant du lactose et des minéraux. Un micro-organisme industriel ne doit pas être pathogène, en particulier à l’encontre des humains ou d’animaux et de plantes de grande importance économique. En effet, à cause des densités cellulaires très fortes présentes dans les fermenteurs industriels et de l’impossibilité virtuelle d’éviter la contamination de l’environnement par celles-ci, un tel micro-organisme pourrait présenter de sérieux problèmes de sécurité. Enfin, un micro-organisme doit pouvoir être manipulé génétiquement. L’augmentation des rendements a souvent été obtenue en jouant sur la génétique par mutation et sélection. Un micro-organisme génétiquement stable et facilement manipulable possède donc un avantage indéniable.

Exemples de produits industriels Les produits microbiens d’intérêt industriel (voir figure 30.1) comprennent les cellules microbiennes elles-mêmes, par exemple les levures alimentaires destinées à la boulangerie, à la brasserie ou à la nourriture (voir figure 30.24) et les substances produites par ces cellules. Parmi ces dernières, on trouve des enzymes comme la glucose isomérase, enzyme importante dans la production de sirops à haute teneur en fructose, des agents pharmaceutiques actifs comme les antibiotiques, les stéroïdes et

Cellules

Biotransformation

les alcaloïdes, des produits chimiques particuliers, des additifs alimentaires comme l’aspartame® (un édulcorant pour les boissons et la nourriture) et des produits chimiques bon marché produits en grande quantité comme l’éthanol, l’acide citrique et de nombreux autres.

Contrôlez vos acquis Un micro-organisme industriel doit engendrer le produit d’intérêt avec un rendement élevé, croître rapidement sur des milieux de culture bon marché disponibles en grande quantité, être susceptible de manipulations génétiques faciles et doit être si possible non pathogène. Les produits industriels de ces microorganismes sont variés et incluent à la fois les cellules elles-mêmes et les substances produites par ces cellules. •

Pourquoi les micro-organismes industriels doiventils être facilement manipulables génétiquement ?

•

Donnez trois exemples de produits issus de biocatalyse industrielle.

30.2 Métabolites primaires m n et secondaires À quel moment du cycle de croissance du micro-organisme le métabolite intéressant est-il produit ? Ce cycle comprend trois phases dites : de latence, exponentielle et stationnaire (voir section 6.1). Certains métabolites sont formés pendant la croissance exponentielle alors que d’autres le sont seulement une fois cette phase achevée. On distingue deux types principaux de métabolites microbiens : les primaires et les secondaires. Un métabolite primaire est formé durant la phase exponentielle de croissance alors qu’un métabolite secondaire l’est le plus souvent en fin de phase exponentielle ou lors de la phase stationnaire. L’alcool, métabolite primaire typique est un produit du métabolisme anaérobie de certaines levures et bactéries (voir section 5.10) et fait partie du métabolisme énergétique. Comme la croissance ne peut avoir lieu qu’avec une production d’énergie en parallèle, la formation d’éthanol s’accomplit pendant la croissance (voir figure 30.2a).

Produits issus des cellules

Cellules Substrat Suppléments (extraits de levure)

Cellules de levure

Produit (ex. : transformation des stéroïdes)

Antibiotiques Enzymes (ex. : glucose (ex. : pénicilline) isomérase)

Additifs alimentaires (ex. : acides aminés)

Alcool Produits (ex. : éthanol) chimiques (ex. : acide citrique)

FIGURE 30.1 Produits de la microbiologie et biocatalyse industrielles. Il peut s’agir des cellules elles-mêmes, ou des produits fabriqués à partir des cellules. Dans le cas des biotransformations, les cellules sont utilisées pour transformer chimiquement une substance en une autre.



958 Chapitre 30


Dans certaines biocatalyses, au contraire, le produit désiré n’est pas synthétisé pendant la phase active de croissance, mais lors de la phase stationnaire. Parmi ces métabolites secondaires figurent quelques-uns des métabolites d’intérêt industriel les plus importants et les plus communs (voir figure 30.2b). Tous partagent les mêmes caractéristiques : Les métabolites secondaires ne sont essentiels ni à la croissance ni à la reproduction. Leur formation est très dépendante des conditions de culture et de la composition du milieu afin d’éviter la répression de leur production. Ils font souvent partie d’un groupe de substances très proches. Par exemple, une souche de Streptomyces peut produire trente molécules proches d’antibiotique du type anthracycline. Il est souvent possible d’en obtenir une forte surproduction, ce qui n’est pas le cas des métabolites primaires (voir figure 30.2).

Voies de synthèse des métabolites primaires et secondaires La plupart des métabolites sont des molécules organiques complexes dont la synthèse nécessite un grand nombre

Alcool ou sucre ou nombre de cellules Pénicilline ou sucre ou nombre de cellules

Contrôlez vos acquis Les métabolites primaires et secondaires sont respectivement produits pendant la phase de croissance et juste avant ou pendant la phase stationnaire. Beaucoup de produits microbiens à valeur commerciale sont des métabolites secondaires. •

La pénicilline est-elle un métabolite primaire ou secondaire ? Pourquoi ?

•

Quel type de métabolite primaire ou secondaire peut être surproduit ? Pourquoi ?

Cellules

Alcool

Sucre

Temps

(a)

Glucose Erythrose-4-P

Phosphoénol pyruvate

Métabolite primaire Métabolite secondaire

3-Déoxy7-phospho-Darabinoheptulosonate

Ansamycine Rifamycine

Acide shikimique

Candicidine Nystanine

Acide chorismique

Acide anthranillique Tryptophane

Chloramphénicol Sucre Nocardicine

Cellules

Pénicilline (b)

d’étapes enzymatiques. Il y a 72 étapes enzymatiques dans la synthèse de l’antibiotique tétracycline (voir section 30.6) et plus de 25 dans celle de l’érythromycine. Aucune de ces réactions n’a lieu pendant le métabolisme primaire, bien que leurs voies métaboliques de production aient toutes pour origine des molécules produites pendant celui-ci. La figure 30.3 montre les relations entre la voie primaire principale de synthèse des acides aminés aromatiques et les voies secondaires de nombreux antibiotiques.

Temps

FIGURE 30.2 Comparaison entre production de métabolites primaires et secondaires. (a) Production d’alcool par une levure : métabolite primaire. (b) Production de pénicilline par le champignon Penicillium chrysogenum : métabolite secondaire. La pénicilline n’est produite qu’en fin de phase exponentielle (voir figure 6.8)

Acide préphénique

Actinomycine

Phénylalanine

Tyrosine

Polymyxine

Novobiocine

FIGURE 30.3 Antibiotiques à noyau aromatique. Comparaison entre la voie de synthèse primaire des acides aminés aromatiques et la formation d’antibiotiques contenant des noyaux aromatiques. Ces étapes n’existent pas chez tous les microorganismes.



30.3 Caractéristiques des fermentations à grande échelle 959

Matériel de fermentation aérobie

m n

30.3 Caractéristiques des fermentations à grande échelle

Les fermenteurs industriels, presque toujours construits en acier inoxydable, sont des cylindres fermés auxquels sont reliées de nombreuses tuyauteries et vannes (voir figure 30.4b). Comme la stérilisation du milieu de culture et l’élimination de l’excès de chaleur sont vitales, le fermenteur possède une double enveloppe de refroidissement dans laquelle on peut envoyer soit de l’eau froide soit de la vapeur. Ce système est insuffisant pour les grands fermenteurs, dans lesquels il est remplacé par un serpentin de circulation d’eau ou de vapeur intérieur (voir figure d’ouverture du chapitre). Le système d’aération est un autre facteur critique pour les fermenteurs de grande taille, car la solubilité de l’oxygène dans l’eau est faible, tandis que la demande par les microorganismes est très forte. Deux systèmes séparés sont nécessaires pour assurer une oxygénation efficace : un bulleur et une turbine d’agitation (voir figure 30.4b). Le bulleur est soit un anneau métallique percé de trous, soit un microdiffuseur à travers lequel de

En microbiologie industrielle, le terme de fermentation fait référence à tout procédé de culture à grande échelle d’un micro-organisme, que ce soit ou non une fermentation au sens biochimique. Le récipient dans lequel le procédé industriel a lieu est appelé un fermenteur d’une contenance allant de cinq à dix litres pour ceux de laboratoire (voir figure 30.4a) et jusqu’à 500 000 litres pour les industriels (voir tableau 30.1). Il y a deux grands types de fermenteur industriel : l’un dédié aux fermentations anaérobies et l’autre aux fermentations aérobies. Les fermenteurs anaérobies nécessitent peu d’équipements spécifiques, sauf l’élimination de la chaleur générée pendant la croissance. Par contre les fermenteurs aérobies nécessitent un équipement beaucoup plus élaboré assurant un mélange et une aération optimaux. La plupart des fermentations étant aérobies, nous nous focaliserons sur celles-ci.

Moteur pH

Vapeur Joint stérile

Hublot de surveillance

Régulation de pH Pompe et réservoirs acide et base

Filtre

Queue Systems, Inc.

Sortie d’air

(a)

Turbine Sortie d’eau de refroidissement Double enveloppe (refroidissement) Milieu de culture

Entrée d’eau de refroidissement Injecteur (d’air sous pression)

Entrée d’air stérile

Vapeur Novo Nordisk

Valve

(c)

(b)

Récolte

FIGURE 30.4 Fermenteurs. (a) Petit fermenteur de recherche de 5 L. (b) Schémas de principe d’un fermenteur. (c) Intérieur d’un fermenteur industriel montrant l’arbre d’agitation et les circuits de régulation de température. Aération et refroidissement sont des paramètres majeurs de régulation. Le pH et les apports nutritifs sont régulés automatiquement.



960 Chapitre 30

TABLEAU 30.1


TAILLES DES FERMENTEURS INDUSTRIELS

Taille des fermenteurs (L)

Produit

1-20 000

Enzymes de diagnostic, substances pour la biologie moléculaire

40-80 000

Certaines enzymes, antibiotiques

100-150 000

Pénicillines, antibiotiques aminoglycosylés, protéases, amylases, stéroïdes transformés, acides aminés, vin, bière

200 000-500 000

Acides aminés (glutamate), vin, bière

l’air (ou de l’air enrichi en oxygène) stérile est envoyé. Plus la taille des bulles est petite, mieux l’oxygène se dissout dans l’eau. Au bullage qui peut être suffisant dans les petits fermenteur, il est nécessaire d’ajouter une agitation dans les fermenteurs de grande taille (voir figure 30.4c). L’agitation favorise également l’obtention d’un mélange homogène permettant aux micro-organismes d’accéder aux nutriments de façon uniforme.

30.4 Mise à l’échelle des fermenteurs m n Le transfert du procédé d’un fermenteur de petite taille à un fermenteur de grande taille est un aspect important du procédé appelé mise à l’échelle ou scale up. En effet, les procédés biocatalytiques donnent rarement les mêmes résultats lorsqu’on passe du fermenteur de laboratoire (voir figure 30.6) au fermenteur industriel (voir figure 30.5). La mise à l’échelle d’un procédé industriel est du ressort de l’ingénieur en génie des procédés biologiques, qui est familier des transferts de gaz, de la mécanique des fluides, des mélanges et de la thermodynamique, de la microbiologie et du pilotage des fermenteurs. Les problèmes majeurs rencontrés sont ceux de l’aération et du mélange. Le transfert adéquat de l’oxygène est particulièrement difficile à obtenir : en effet, les milieux de culture utilisés sont riches, la croissance des microorganismes élevée, et par conséquent la demande en oxygène ne cesse de croître. Si jamais l’oxygénation est restreinte, même pendant peu de temps, la culture peut se trouver en conditions anoxiques temporaires avec des conséquences importantes sur son métabolisme et une réduction conséquente en rendement de produit.

Les grands fermenteurs doivent être pilotés avec soin pour des raisons de coût. Il est nécessaire de mesurer la croissance et la formation de produit, mais aussi de contrôler les paramètres importants du processus tels que la température, la concentration en oxygène, le pH et la concentration des nutriments clés, tout ceci en temps réel (voir figure 30.5b). Il peut être par exemple souhaitable de modifier certains paramètres en cours de fermentation comme l’arrivée de nutriments afin de l’ajuster au mieux à la croissance du micro-organisme. Un pilotage informatique permet d’ajouter la quantité de nutriment nécessaire au bon moment pour obtenir un rendement maximal en produit. Des modèles mathématiques de la fermentation informatisés permettent d’estimer l’effet de paramètres variés sur la croissance et le rendement en produit, et d’économiser temps et argent avant les expériences nécessaires en hall pilote et finalement à taille réelle de fermenteur.

Novo Nordisk

Contrôle et pilotage des fermentations

(a)


•

Quels genres de systèmes sont utilisés pour assurer une aération efficace des grands fermenteurs ?

•

Quels paramètres d’une fermentation industrielle doivent être contrôlés et quels ajustements doivent être réalisés par un contrôle informatique ?

Novo Nordisk

Les fermenteurs industriels à grande échelle présentent plusieurs difficultés de conception en génie des procédés, par exemple les procédés aérobies nécessitant des mécanismes d’aération et d’agitation. Les processus microbiologiques doivent être pilotés de façon continue afin d’obtenir des rendements satisfaisants en produit.

(b) FIGURE 30.5 Fermentations à l’échelle industrielle. (a) Unité de fermentation industrielle. Seul le sommet des fermenteurs, parfois hauts de plusieurs étages, est visible. (b) Salle de contrôle.



Elmer L. Gaden, Jr.

30.5 Isolement et caractérisation des antibiotiques 961

FIGURE 30.6 Fermenteurs de recherche et de production. (a) Série de petits fermenteurs utilisés en recherche et développement. En haut, fermenteurs en verre avec platine inox ; en bas, flacons en plastique de collecte des productions. (b) Série de fermenteurs industriels extérieurs de 240 m3 destinés à la production d’alcool au Japon. Un même type de fermentation ne donnera probablement pas les mêmes résultats dans des fermenteurs de tailles si différentes.

Processus de mise à l’échelle Le transfert du procédé du laboratoire au fermenteur industriel, se fait en plusieurs étapes. La première étape est réalisée en fiole de laboratoire appelée Erlenmeyer opération classique à petite échelle indiquant si le procédé a un quelconque intérêt commercial. De là, on passe à l’étape du fermenteur de laboratoire, fermenteur de verre, d’une contenance d’un à dix litres pour les premiers pas de mise à l’échelle. À ce stade, il est possible de tester des variations de composition du milieu, de température, de pH, etc. à faible coût. Quand les tests à ce stade sont prometteurs, on passe à l’étape de la fermentation en hall pilote avec des fermenteurs de 300 à 3 000 litres, déjà plus proches de la taille commerciale, mais d’un coût encore raisonnable. Finalement, on arrive au fermenteur industriel, d‘une contenance de 10 000 à 500 000 litres (voir figures 30.5a et 30.6b). Lors de toutes ces étapes, on suit de très près l’aération et la façon dont le volume joue sur l’évolution de la concentration en oxygène de la culture.

Contrôlez vos acquis La mise à l’échelle ou scale up est le procédé de conversion graduelle d’une fermentation industrielle de l’échelle du laboratoire à celle de l’industrie. L’aération et l’homogénéisation sont des points critiques à surveiller. •

Quelles sont les différences de taille entre un fermenteur typique de laboratoire, un fermenteur de hall pilote et un fermenteur industriel ?

II

Elmer L. Gaden, Jr.

(a)

(b)

PRODUITS PHARMACEUTIQUES

Les produits pharmaceutiques sont les produits commerciaux les plus importants issus des micro-organismes. La production des antibiotiques est une énorme industrie mondiale, l’une de celles où les principes les plus importants de cultures à grande échelle ont été développés.

30.5 Isolement et caractérisation m n des antibiotiques Les antibiotiques sont produits par les micro-organismes pour tuer ou inhiber la croissance d’autres micro-organismes (voir chapitre 20). Ce sont des métabolites secondaires typiques (voir section 30.2). Ils sont produits principalement par des champignons filamenteux et des bactéries du groupe des Actinomycètes (voir section 12.24). Le tableau 30.2 liste les plus importants des antibiotiques produits à grande échelle.

Recherche de nouveaux antibiotiques Bien que les sociétés pharmaceutiques découvrent aujourd’hui leurs nouveaux produits par modélisation informatique (voir section 20.13), les antibiotiques ont été découverts traditionnellement par criblage ou screening. Dans cette approche, un grand nombre de souches produisant potentiellement des antibiotiques de façon naturelle sont isolées en culture pure (voir figure 30.7a). Elles sont ensuite testées pour leur production de composés inhibiteurs de bactéries témoins choisies pour être représentatives ou très proches de bactéries pathogènes, par la méthode des stries croisées



962 Chapitre 30

TABLEAU 30.2 Antibiotique


ANTIBIOTIQUES PRODUITS a INDUSTRIELLEMENT

Micro-organisme producteur

Bacitracine

Bacillus licheniformis (BS)

Céphalosporine

Cephalosporium spp.

Chloramphénicol

Synthèse chimique (auparavant par Streptomyces venezuelae)

Cycloheximide

Streptomyces griseus

Cyclosérine

Streptomyces orchidaceus

Érythromycine

Streptomyces erythreus

Griséofulvine

Penicillium griseofulvium

Kanamycine

Streptomyces kanamyceticus

Lyncomycine

Streptomyces lincolnensis

Néomycine

Streptomyces fradiae

Nystatine

Streptomyces noursei

Pénicilline

Penicillium chrysogenum

Polymyxine B

Bacillus polymyxa (BS)

Streptomycine

Streptomyces griseus

Tétracycline

Streptomyces rimosus

a Voir chapitre 12 et figure 20.12 pour les structures de ces antibiotiques.

(voir figure 30.7b). Les isolats qui montrent une activité antibiotique sont ensuite testés afin de savoir si cet antibiotique est nouveau, ce qui réclame beaucoup de temps et de ressources, car la plupart des antibiotiques ainsi découverts sont déjà connus. S’il est nouveau, l’antibiotique est produit en quantité suffisante pour des études de structure, de toxicité et d’activité clinique sur des animaux infectés. Quelques-uns de ces nouveaux antibiotiques connaissent effectivement une activité in vivo sur l’animal et sont susceptibles d’une production commerciale. Cependant, la recherche continue car on estime par exemple à plus de cent mille le nombre d’antibiotiques différents produits par le seul genre Streptomyces.

Purification Pour produire un antibiotique commercial, il faut d’abord le développer à grande échelle (scale up, voir section 30.4) et ensuite le purifier de façon efficace. Comme l’antibiotique est présent à faible concentration dans le bouillon de fermentation, des méthodes d’extraction et de purification élaborées sont nécessaires (voir figure 30.8). Si l’antibiotique est soluble dans un solvant organique, il sera relativement simple à purifier dans un volume de solvant qui sera réduit par évaporation. S’il n’est pas soluble, il faudra faire appel à des techniques de chromatographie d’adsorption, d’échange d’ions ou de précipitation chimique. Dans tous les cas, le but est d’obtenir un produit cristallisé de haute pureté.

Augmentation du rendement Les rendements en antibiotique des souches naturelles sont souvent faibles et il faut donc sélectionner des souches à haut rendement. Pour obtenir de telles souches, il faut procéder à

une mutagénèse de la culture initiale, cultiver les mutants sur boîte de Petri et les tester pour leur activité antibiotique. Le génie génétique a permis de gagner beaucoup de temps sur ce processus très long. Par exemple, l’amplification des gènes rend possible l’insertion de copies additionnelles du gène intéressant dans la cellule au moyen d’un vecteur du type plasmide (voir chapitre 31). Les altérations des processus de régulation permettent aussi d’augmenter les rendements. Une des difficultés de l’utilisation du génie génétique pour la production d’antibiotiques réside dans la multiplicité des étapes de biosynthèse impliquant de nombreux gènes. Il n’est pas évident de savoir à l’avance si la modification ou l’amplification de gènes va augmenter le rendement. Il est donc important d’identifier au préalable en recherche fondamentale les étapes clés limitantes du rendement ou régulatrices de la voie biochimique donnée. Ce processus de recherche pouvant être très long, des études empiriques sont menées simultanément. Le rendement final (après purification) est une donnée commerciale critique de tous les produits pharmaceutiques. Même après démarrage de la production commerciale d’un antibiotique, la recherche continue souvent pour identifier ou produire des souches à haut rendement ou pour modifier le processus de façon à l’augmenter. Bien que les produits pharmaceutiques soient produits à petite échelle, en comparaison des produits chimiques de base et des produits agricoles, leur valeur économique pousse à obtenir les rendements les plus hauts dans les délais les plus courts. La durée de vie d’un antibiotique avant qu’il ne tombe dans le domaine public est de dix ans, au bout desquels la molécule pourra être produite par un concurrent ou par une filiale de la même société comme médicament générique.

Contrôlez vos acquis La production industrielle d’antibiotiques commence avec le criblage des souches productrices. Une fois ces nouvelles souches identifiées, la purification et l’analyse chimique du nouvel agent antimicrobien sont effectuées. Si le nouvel antibiotique est biologiquement actif in vivo, on peut modifier génétiquement la souche afin de porter le rendement à un niveau acceptable pour un développement commercial. •

Quel est l’habitat naturel de la plupart des microorganismes producteurs d’antibiotiques ?

•

Que veut dire le mot criblage dans le contexte de la découverte de nouveaux antibiotiques ?

30.6 Production industrielle m n de pénicillines et de tétracyclines Une fois que la structure d’un nouvel antibiotique a été caractérisée, que son efficacité et sa non-toxicité ont été prouvées en expérimentation animale, ce qui peut prendre plusieurs années, il reste à effectuer les essais cliniques humains. Si ces derniers sont concluants, l’antibiotique est prêt pour la production commerciale. Ces obstacles ont été levés depuis longtemps



30.6 Production industrielle de pénicillines et de tétracyclines 963

Étaler une dilution de terre sur un milieu sélectif

Inoculer par stries la souche productrice présumée sur le tiers inférieur de la boîte

Râteau de verre pour étaler Incuber pour permettre la croissance et la production d’antibiotiques

Incuber

L’antibiotique diffuse dans l’agar

Colonies de Streptomyces

Tapis de Streptomyces

Organismes non producteurs

Recouvrir avec une suspension d’un micro-organisme indicateur Incuber

Contre-strier avec les souches tests

Zones d’inhibition de croissance Organismes producteurs Incuber pour permettre aux souches tests de croître Zone de croissance

M. T. Madigan

Zones d’inhibition des souches tests

FIGURE 30.7 Isolement et criblage de souches productrices d’antibiotiques. (a) Isolement de souches utilisant un milieu sélectif pour Streptomyces et identification des souches productrices d’antibiotiques à l’aide d’un micro-organisme indicateur. La plupart des colonies sont de l’espèce Streptomyces, certaines produisant des antibiotiques, comme le montre la zone d’inhibition du microorganisme indicateur (Staphylococcus aureus) autour de ces colonies. (b) Test du spectre d’activité antibiotique d’un micro-organisme : le tiers de la boîte de Petri a été strié avec une culture d’un producteur (ici un Streptomyces) et la boîte a subi une incubation. Après croissance, cinq bactéries tests ont été inoculées perpendiculairement aux stries de Streptomyces et la boîte a été de nouveau incubée. Le défaut de croissance de certaines de ces souches près du Streptomyces démontre une activité antibiotique à l’encontre de plusieurs de ces souches tests. Souches testées (de gauche à droite) : Escherichia coli, Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Mycobacterium smegmatis.

T. D. Brock

(a)

(b)



964 Chapitre 30


Traitements préliminaires

Fermenteur

Solides

Filtration Liquide

Extraction

Extrait

Déchets solides

Colonne d’absorption ou précipitation chimique ou extraction par solvant

Solution d’antibiotique partiellement purifiée

Supplément en alimentation animale

Recristallisation Purification

Pfizer Research

Séchage

Antibiotique (b)

(a)

FIGURE 30.8 Purification d’un antibiotique. (a) Procédé d’extraction et de purification. (b) Installation d’extraction par un solvant d’un antibiotique du jus de fermentation. Les procédés de purification sont aussi importants que les facteurs microbiologiques pour obtenir un bon rendement en antibiotique.

pour les pénicillines et les tétracyclines, qui ont été produites par tonnes pour des usages médicaux et vétérinaires.

Antibiotiques à cycle β-lactame : pénicilline et dérivés Les pénicillines sont une classe d’antibiotiques caractérisés par leur cycle β-lactame (voir section 20.8) et sont produites par un grand nombre de moisissures (eucaryotes) des genres Penicillium et Aspergillus, ainsi que par certains procaryotes (voir figure 30.9). Les pénicillines utilisables en médecine sont de plusieurs types et beaucoup sont issues de réactions catalytiques avec modification chimique ultérieure. Ceci a permis la synthèse d’une série de pénicillines, chacune ayant ses propres propriétés cliniques (voir figure 30.9). La structure de base des pénicillines est l’acide 6-aminopénicillanique (6-APA), composé d’un anneau thiazolidine associé à un cycle β-lactame sur lequel est greffée une chaîne latérale variable en position 6 (voir figure 30.9). Les pénicillines naturelles sont produites sans addition de ces chaînes ; les pénicillines de biosynthèse le sont en ajoutant au milieu de culture le précurseur de la chaîne latérale variable (voir figure 30.9).

Pour produire les pénicillines les plus utiles, actives contre les bactéries Gram négatif, on utilise une approche combinée de fermentation et de chimie. Dans ce cas, une pénicilline naturelle issue de fermentation est coupée par voie enzymatique ou chimique pour donner du 6-APA ; ce dernier est ensuite modifié chimiquement par addition d’une chaîne latérale (voir figure 30.9). Ces pénicillines semi-synthétiques ont beaucoup d’avantages cliniques : elles ont typiquement un large spectre d’activité, peuvent être administrées de façon orale, et donc ne nécessitent pas d’injection ; l’ampicilline en est un bon exemple. La variation des chaînes latérales permet également de contrecarrer les phénomènes d’apparition de résistance à un antibiotique donné. C’est pourquoi les pénicillines semisynthétiques représentent la majorité des pénicillines produites.

Production d’antibiotiques à cycle β-lactame La pénicilline G est produite par Penicillium chrysogenum dans des fermenteurs de 40 000 à 200 000 litres. C’est un métabolite secondaire qui n’apparaît qu’une fois la source de carbone presque épuisée. En ajoutant du carbone et de l’azote au niveau adéquat, la production peut être poursuivie pendant plusieurs jours (voir figure 30.10).



30.6 Production industrielle de pénicillines et de tétracyclines 965

Pénicilline de biosynthèse 1

Ajout du Production de pénicilline précurseur 1 par fermentation

O

R C

Traitement Ajout chimique du précurseur ou enzymatique de la pénicilline G 3

Ajout du précurseur 2 Pénicilline de biosynthèse 2

H N H O

S 6 5

7

H 4 N

1

CH 3 2 3

H

CH 3 COOH

Acide 6-aminopénicillanique

Pénicilline de biosynthèse 3 Pénicillines naturelles (ex. : pénicilline G)

Addition chimique de chaînes latérales Pénicillines semi-synthétiques (ex. : ampicilline, amoxicilline, methicilline)

L’un des ingrédients majeurs des milieux de culture pour produire de la pénicilline est la liqueur de trempage de maïs, qui contient de l’azote et des facteurs de croissance. La source de carbone est le lactose, obtenu généralement à partir des sérums de fromagerie (voir figure 30.10). Hormis la question de coût, des concentrations élevées en glucose réprimeraient la production de pénicilline. Le glucose n’est donc ajouté que

FIGURE 30.9 Production industrielle de pénicillines . Le cycle β-lactame figure en marron foncé. La fermentation classique par des souches à haut rendement en pénicilline de Penicillium chrysogenum conduit aux pénicillines naturelles. Si on ajoute des précurseurs spécifiques pendant la fermentation, on peut obtenir diverses pénicillines biosynthétiques. Les pénicillines semi-synthétiques sont produites par addition d’une chaîne latérale au noyau de l’acide 6-aminopénicillanique (groupement R en violet). Ce sont celles qui ont la plus grande activité clinique, car elles sont typiquement actives contre des bactéries Gram négatif.

quand le lactose devient limitant et que la biomasse est devenue importante afin d’obtenir un rendement maximal en pénicilline. La pénicilline est excrétée dans le milieu ; après élimination des cellules par filtration, on abaisse le pH pour faciliter son extraction dans un solvant organique. Après concentration dans le solvant, l’antibiotique est réextrait dans une phase aqueuse basique, à nouveau concentré puis cristallisé.

Autres antibiotiques à cycle β-lactame

Apport de glucose

Biomasse (g/L), sucres, ammoniaque, pénicilline (g/L x 10)

100

Apport de composés azotés

90 80

Pénicilline

70

Production des tétracyclines

60 50 40

Cellules

30

Lactose

20 10 0

On trouve parmi ceux-ci les céphalosporines, qui contiennent un noyau dihydrothiazine au lieu d’un noyau thiazolidine (voir section 20.8 et figure 20.12). L’origine des céphalosporines est le champignon Cephalosporium acremonium, mais un certain nombre d’autres champignons ainsi que des procaryotes produisent des antibiotiques avec ce type de cycle. Un grand nombre de céphalosporines synthétiques sont produites de la même façon que les pénicillines semi-synthétiques (voir figure 30.9). Elles sont intéressantes d’un point de vue clinique car peu toxiques et pourvues d’un large spectre d’activité (voir section 20.8).

Ammoniac 20

40

60

80

100 120 140

Durée de la fermentation (h) FIGURE 30.10 Cinétique de production de pénicilline par Penicillium chrysogenum. Notez comment la production de pénicilline démarre quand les cellules entrent en phase stationnaire de croissance et lorsque carbone et azote sont épuisés. L’alimentation en nutriments permet de maintenir la production de pénicilline à un niveau élevé.

La voie de biosynthèse de la tétracycline comprend environ soixante-douze étapes enzymatiques (voir figure 30.11), dont une bonne partie non spécifique à cette synthèse. Les études génétiques sur Streptomyces aureofaciens, producteur de tétracycline, ont montré que plus de trois cents gènes étaient impliqués ! Avec un si grand nombre de gènes, la régulation de cette biosynthèse est très complexe. Toutefois, certains signaux de régulation et schémas de production sont très bien connus, par exemple la répression de la synthèse de la chlortétracycline par le glucose et le phosphate. La répression par le phosphate est très importante et le milieu de culture doit donc en contenir peu. Comme dans le cas de la production de pénicilline, on utilise la liqueur de trempage de maïs pour la production à grande échelle et le saccharose à la place du lactose comme source de carbone. Le glucose est ici aussi un répresseur catabolique de la production d’antibiotique (voir section 8.7).



966 Chapitre 30 Inoculum (spores cultivées sur tube de gélose ou sur sol stérile) Boîtes d’agar Inoculum de spores Agitation de la fiole 24 h

Petit fermenteur


Vitamines Milieu de croissance Extrait de viande (2 %), asparagine (0,05 %), glucose (1 %), K2HPO4 (0,5 %), agar (1,3 %) Liqueur de trempage de maïs (2 %), saccharose (3 %), CaCO3 (0,5 %) Idem milieu agitation de la fiole

19–24 h pH 5,2–6,2

Saccharose (1 %), Liqueur de trempage de maïs (1 %), (NH4)2HPO4 (0,2 %), CaCO3 (0,1 %), 60–65 h MgSO -7 H 0 (0,025 %), pH 5,8–6,0 ZnSO 4-7 H 20 (0,005 %), 4 2 CuSO4-5 H20 (0,00033 %), MnCl2-4 H2O (0,00033 %)

Grand fermenteur

Purification du bouillon de culture après élimination des cellules

H3C CH 3 Cl H3C OH H H N OH

OH

O

OH

OH

CO O

NH2

Chlorotétracycline FIGURE 30.11 Schémas de production de la chlorotétracycline par Streptomyces aureofaciens. En bas à droite, la structure de la chlorotétracycline. Température de croissance 28 °C.

Contrôlez vos acquis Les antibiotiques majeurs comprennent les antibiotiques à cycle -lactame comme les pénicillines, les céphalosporines et les tétracyclines. Tous ces antibiotiques sont du type métabolite secondaire. Leur production industrielle est bien maîtrisée en dépit de la compréhension incomplète des voies biochimiques et des séquences génétiques impliquées. •

Quelle est la structure chimique commune à la pénicilline et à la céphalosporine ?

•

Qu’entend-on par pénicilline semi-synthétique ? et par pénicilline biosynthétique ?

30.7 Vitamines et acides aminés m n Les vitamines et les acides aminés sont des facteurs de croissance très souvent utilisés en médecine ou comme additifs alimentaires. Plusieurs vitamines et acides aminés d’importance sont produits par des procédés biocatalytiques.

Les vitamines sont utilisées comme complément alimentaire (humain et animal) et la vente de vitamines est au deuxième rang derrière celle des antibiotiques. La plupart des vitamines sont synthétisées par voie chimique. Toutefois, certaines, de structure complexe, sont produites pour un coût beaucoup moins important par biocatalyse : c’est le cas de la vitamine B12 et de la riboflavine. La vitamine B12 (voir figure 30.12a) est exclusivement synthétisée par les micro-organismes dans la nature. C’est une coenzyme très importante en biochimie animale, qui intervient dans plusieurs réarrangements moléculaires dans lesquels un hydrogène placé sur un atome de carbone est échangé avec un substituant placé sur le carbone adjacent. Chez l’homme, une carence forte en vitamine B12 est un des facteurs pouvant conduire à l’anémie pernicieuse, caractérisée par une faible production de globules rouges et des désordres du système nerveux. Les besoins des animaux en vitamine B12 sont satisfaits par ingestion de nourriture ou par absorption de la vitamine produite dans l’intestin de l’animal par des micro-organismes intestinaux. Les plantes ne produisent pas et n’utilisent pas de vitamine B12. Pour la production industrielle de vitamine B12, on utilise des souches des genres bactériens Propionibacterium et Pseudomonas. Il y a un atome de cobalt au centre de la vitamine B12, et les rendements en vitamine sont amplifiés par addition d’une petite quantité de cobalt au milieu de culture (voir figure 30.12a). La riboflavine est apparentée aux coenzymes flaviniques FAD et FMN, qui jouent un rôle important dans les mécanismes d’oxydation-réduction de pratiquement tous les organismes (voir section 5.11). La riboflavine est synthétisée par de nombreuses bactéries, levures et moisissures. Le champignon Ashbya gossypii en produit naturellement de très grandes quantités (jusqu’à 7 g/L !) et est utilisé dans la plupart des procédés de production. Malgré ce bon rendement, la compétition est serrée entre procédé microbiologique et synthèse strictement chimique.

Acides aminés Les acides aminés sont très utilisés en industrie agroalimentaire en tant qu’additifs, en médecine et en industrie chimique comme molécules de base (voir tableau 30.3). L’acide aminé le plus produit est l’acide glutamique, utilisé en tant qu’exhausteur de goût (monoglutamate de sodium – MGS). Deux autres acides aminés importants, l’acide aspartique et la phénylalanine, sont à la base de l’édulcorant artificiel aspartame®, un agent sucrant non calorique des boissons sans sucre. L’aspartame est un dipeptide du glutamate et du méthyl ester de la phénylalanine. La lysine, acide aminé essentiel pour l’homme et certains animaux d’élevage, est utilisée en tant qu’additif alimentaire. Sa production à partir de la bactérie Brevibacterium flavum est un classique. Comme les acides aminés sont les « briques » servant à construire les protéines des organismes vivants (dont les enzymes), la régulation de leur production est très stricte (voir chapitre 8). Il faut donc court-circuiter ces mécanismes de régulation pour obtenir une souche surproduisant de façon rentable l’un de ces acides aminés.



30.7 Vitamines et acides aminés 967

CO

NH2

CH 2 CH 2

CH 3 CH 2 CO NH2 C C NH2 CO CH 2 CH C C C CH CH 2 CH 2 CO NH2 CH 3 N C C N CH Co + CH 3 CH N N C CH 3 NH2 CO CH 2 CH C C C C CH CH 3 C CH 2 CH 2 CO NH2 CO CH 2 CH 2 CH 3 CH 3 NH H CH 3 C N CH 2 C C CH CH C C O– C N CH 3 O CH 3 O OH H P O CH HO

C H

CH 2

Méthionine Thréonine Isoleucine

H3C

C H

ATP ADP Aspartate

H3C

C

H3C

C

C

O

C

N

N

C

C C

N

HH

C

H

H

C

OH

H

C

OH

H

C

OH

N

H

C

O

CH 2OH

(b) Riboflavine FIGURE 30.12 Vitamines produites par des micro-organismes à l’échelle industrielle. (a) Structure de la cobalamine ou vitamine B12. Notez l’atome de cobalt central. La forme coenzyme de la vitamine B12 contient un groupe désoxyadénosyl lié au cobalt au-dessus du plan du noyau. (b) Riboflavine ou vitamine B2 (voir section 5.11 et figure 5.18).

Par exemple, la production de lysine par Brevibacterium flavum est contrôlée par l’aspartokinase ; un excès de lysine rétro inhibe (voir section 8.2) cette enzyme (voir figure 30.13a). On obtient une surproduction de lysine chez des mutants dont l’aspartokinase n’est plus sensible à cette rétro-inhibition. Ceci est réalisé en isolant des mutants résistants à un analogue de la lysine la S-aminoéthyl cystéine (AEC), qui se lie au site allostérique de l’aspartokinase et bloque son activité (voir figure 30.13b). On obtient facilement par sélection positive des mutants résistants à l’AEC produisant une aspartokinase dont le site allostérique est modifié et ne reconnaît plus ni l’AEC, ni la lysine. La rétro-inhibition par la lysine est ainsi fortement diminuée. De tels mutants peuvent produire plus de 60 g/L de lysine en fermenteur industriel, ce qui rend la production commerciale viable.

Diaminopimélate

(a)

(a) B12

C

Hémialdéhyde aspartique

Lysine

O

C

Aspartyl-P

Rétro-inhibition

CH

H

Aspartokinase

NH2

NH2

CH2

CH2

CH2

CH2

CH2

S

CH2

CH2

HCNH2

HCNH2

COOH

(b)

Lysine

COOH

S-amino-éthyl-cystéine (AEC)

FIGURE 30.13 Production industrielle de lysine par Brevibacterium flavum. (a) Voie biochimique menant de l’aspartate à la lysine. Notez l’inhibition possible de l’aspartokinase par excès de lysine (voir section 8.2), pouvant mener à l’arrêt de la synthèse de la lysine. Les structures de la lysine et de la S-amino-éthyl-cystéine (AEC), analogue de la lysine, sont identiques à l’exception d’un groupement. L’AEC est normalement un inhibiteur de croissance : les mutants de Brevibacterium flavum, résistants à l’AEC, possèdent une aspartokinase à site allostérique modifié et surproduisent la lysine, car l’inhibition rétroactive par cette dernière n’a plus lieu.

Contrôlez vos acquis Les vitamines comme la B12 et la riboflavine sont produites par voie microbiologique. Les acides aminés les plus importants produits de cette façon sont l’acide glutamique, l’acide aspartique, la phénylalanine et la lysine. Pour obtenir des rendements élevés d’un acide aminé, on modifie la régulation de sa synthèse de telle façon qu’il soit surproduit. •

Quel est l’acide aminé le plus produit ?

•

Comment peut-on court-circuiter une rétro-inhibition pour augmenter le rendement d’un acide aminé ?



968 Chapitre 30

TABLEAU 30.3


ACIDES AMINÉS UTILISÉS DANS L’AGROALIMENTAIREa

Acide aminéb

Production annuelle (t)

Application

Utilisation

L-glutamate

370 000

Divers aliments

Exhausteur de goût, attendrisseur de viande

L-aspartate

5 000

Jus de fruits

Rondeur du goût

Glycine

6 000

Produits sucrés

Améliorant de flaveur, base pour synthèse organique

L-cystéine

700

Pain

Améliorant

et alanine

Jus de fruits

Antioxydant

400

Divers aliments, lait en poudre

Antioxydant, antirancissement, additif nutritionnel

Aspartame (L-phénylalanine + acide L-aspartique)

7 000

Boissons sans alcool, chewinggum, produits sans sucre

Édulcorant peu calorique

L-lysine

70 000

Pain (Japon), additifs alimentaires

Additif nutritionnel

D, L-méthionine

70 000

Dérivés du soja, additifs alimentaires

Additif nutritionnel

L-tryptophane

a b

+ L-histidine

Glazer A.N. et Mikaido H.1995. Microbial Biotechnology, W.H. Freeeman, New York. Structure de ces acides aminés (voir figure 3.12).

m n

30.8 Procédés de biotransformation des stéroïdes

Les stérols ont un rôle important dans les membranes des eucaryotes (voir section 4.5). Les stéroïdes sont des dérivés des stérols et sont des hormones animales régulant de nombreux processus métaboliques. Certains stéroïdes sont utilisés comme médicaments en médecine humaine : c’est le cas du groupe des corticoïdes qui réduisent l’inflammation et sont efficaces pour contrôler les symptômes de l’arthrite et des allergies. Un autre groupe, composé des œstrogènes et des stéroïdes androgènes, est utilisé pour contrôler la fertilité humaine ou pour stimuler la construction musculaire. Les stéroïdes peuvent être obtenus par synthèse chimique complète, mais ceci est compliqué et coûteux. Certaines étapes clés peuvent être effectuées bien plus efficacement par des microorganismes ; la production de stéroïdes inclut typiquement une étape microbienne. La plupart des stéroïdes sont produits par

Étape de biotransformation O (Rhizopus nigricans) HO

CH 3

CH 3

C

C

O

O

Progestérone

biotransformation en ajoutant à la culture un précurseur du stérol au moment approprié. Ce dernier est obtenu à partir d’une source bon marché, en général le stigmastérol, un sous-produit de l’industrie du soja (voir figure 30.14).

Cortisone et hydrocortisone Ces corticoïdes servent à réduire les inflammations et les démangeaisons mineures de la peau et à lutter contre les allergies. Le champignon Rhizopus nigricans effectue une étape clé de biotransformation : l’hydroxylation stéréospécifique d’un précurseur de la cortisone (voir figure 30.14). On trouve dans la plupart des biotransformations des stéroïdes des hydroxylations stéréospécifiques de ce type en un site caractéristique. Un certain nombre de champignons sont utilisés à cet effet car ils effectuent cette réaction bien plus spécifiquement et plus économiquement qu’une étape de synthèse chimique ne le ferait. La production de stéroïdes est un très gros marché mondial, estimée à 800 t/an, et centrée sur quatre

CH 3

O Réaction

chimique

C HO

O

1α-OH-Progestérone

CH 3

O Réaction OH chimique

C O

O OH

O

Hydrocortisone

Cortisone

FIGURE 30.14 Exemple de biotransformation : la production de cortisone par le champignon Rhizopus nigricans. La première étape de la production de cortisone, la formation de la 11 α-hydroxylation de la progestérone est une biotransformation typique. Cette réaction très spécifique, et de plus stéréospécifique, est réalisée par le champignon et permet d’éviter une étape de synthèse chimique difficile. Les étapes suivantes sont réalisées par voie chimique classique.



30.9 Les enzymes en tant que produits industriels 969

stéroïdes : l’hydrocortisone, la cortisone, la prednisone et la prednisolone.

Contrôlez vos acquis La biotransformation microbienne utilise des microorganismes pour biocatalyser une ou des étapes spécifiques d’une synthèse chimique. •

Donnez un exemple de biotransformation microbienne. Pourquoi est-elle nécessaire ?

•

Donnez deux raisons pour lesquelles une biotransformation diffère d’une fermentation classique telle que la production d’antibiotiques ?

30.9 Les enzymes en tant que produits m n industriels Chaque organisme produit, généralement en petite quantité, un grand nombre d’enzymes impliquées dans des mécanismes cellulaires (voir section 5.5). Toutefois, quelques enzymes sont produites en beaucoup plus grande quantité par certains

TABLEAU 30.4

micro-organismes et sont excrétées au lieu d’être retenues à l’intérieur de la cellule. Ces enzymes extracellulaires, appelées exo-enzymes, peuvent digérer des polymères insolubles tels que de la cellulose, de l’amidon ou des protéines. Les produits de digestion sont ensuite transportés à l’intérieur de la cellule où ils sont utilisés comme nutriments. Les enzymes sont des biocatalyseurs très utiles car elles ont pour cible un seul groupement chimique fonctionnel et peuvent faire la différence entre plusieurs groupements fonctionnels de la même molécule. De plus, dans certains cas, comme avec les stérols (voir section 30.8), elles catalysent des réactions de manière stéréospécifique, conduisant à un seul des énantiomères possibles (voir section 3.6). De nombreuses enzymes sont utilisées dans les industries agroalimentaires (lessives, textiles par exemple) et pharmaceutiques (comme les suppléments diététiques) [voir tableau 30.4].

Protéases, amylases et sirops de fructose Les enzymes sont produites commercialement à partir de champignons et de bactéries. Celles produites en masse sont les protéases bactériennes utilisées dans les détergents pour lessives, qui contiennent également des amylases, des lipases, des réductases et d’autres encore. Beaucoup de ces enzymes

APPLICATION DES ENZYMES MICROBIENNES

Enzyme Amylase (digestion de l’amidon)

Protéase (digestion de l’amidon)

Source

Application

Industrie

Ch

Pain

Boulangerie

Bac

Couchage du papier

Papeterie

Ch

Sirop de glucose

Agroalimentaire

Bac

Amidon d’empesage à froid

Textile

Ch

Aide digestif

Pharmacie

Bac

Déglaçage

Textile

Bac

Détachage, détergents

Détergents

Ch

Pain

Boulangerie

Bac

Détachage

Nettoyage à sec

Bac

Attendrisseur

Viande

Bac

Nettoyage des blessures

Médecine

Bac

Déglaçage

Textile

Bac

Détergent ménager

Détergents

Invertase (digestion du saccharose)

Lev

Sucreries à cœur liquide

Confiserie

Glucose oxydase

Ch

Élimination glucose et O2 Kit diagnostique pour le diabète

Agroalimentaire Pharmacie

Glucose isomérase

Bac

Sirop de fructose

Boissons

Pectinase

Ch

Clarification

Vin, jus de fruits

Présure microbienne

Ch

Coagulation du lait

Fromagerie

Cellulase

Bac

Assouplissant, dépeluchant

Détergents

Lipase

Ch

Dissolution des graisses

Laiterie, détergents

Lactase

Ch

Séparation du lactose en glucose et galactose

Laiterie

ADN-polymérase

Bac Archaea

Réplication de l’ADN dans la technique de PCR (polymerase chain reaction – voir section 7.9)

Biologie moléculaire

Ch = Champignon ; Bac = Bactérie.



970 Chapitre 30


sont isolées de bactéries alcalinophiles (voir section 6.13), principalement des espèces du genre Bacillus, comme Bacillus licheniformis (voir tableau 30.4). Ces enzymes, qui ont des pH optimaux situés entre 9 et 10, restent actives au pH d’action alcalin des lessives ménagères. Les amylases et les glucoamylases sont d’autres enzymes importantes commercialement, car utilisées dans la production de glucose à partir d’amidon. Le glucose ainsi produit peut être converti par la glucose isomérase en fructose, qui a un pouvoir sucrant deux fois plus important que le glucose. Le sirop de fructose, obtenu à partir d’amidon de maïs, de blé ou de pomme de terre, a une importance majeure dans la production des boissons sucrées. On en produit dix millions de tonnes par an.

Enzymes immobilisées

(a)

100

Activité enzymatique résiduelle (%)

Certains procaryotes, appelés hyperthermophiles, croissent à des températures très élevées (voir chapitres 2 et 6). Ceci n’est possible que parce qu’ils produisent des macromolécules stables à ces températures (voir section 6.10 et 6.12), dont des enzymes (voir figure 30.15b). Le terme extrémozyme a été adapté aux enzymes fonctionnant dans des conditions extrêmes de température ou de pH acide (voir figure 30.15). Les micro-organismes qui les produisent sont appelés des extrémophiles (voir tableau 2.1). Comme beaucoup de processus chimiques fonctionnent mieux à température élevée, ces extrémozymes sont très utilisées en industrie et en recherche. C’est le cas des ADN polymérases Taq et Pfu, utilisées en PCR (polymerase chain reaction – voir section 7.9) et des protéases, amylases, cellulases, pullulanases et xylanases thermostables dans le domaine des lessives (voir figure 30.15b). D’autres extrémozymes actives à faible température (provenant de psychrophiles), à forte concentration en sels (issues d’halophiles) ou à pH faible ou élevé (issues d’acidophiles ou d’alcalinophiles) sont connues et, pour certaines, commercialisées (voir figure 30.15a).

Finnfeeds International

Extrémozymes : des enzymes de procaryotes des environnements extrêmes

10

Amidon

Pullulanase

oligosaccharides 90 °C 100 °C 110 °C 110 °C plus Ca2+

1

1

2

3

4

Temps (h) (b)

Les enzymes immobilisées sont des enzymes qu’on a liées à un support solide. L’immobilisation rend plus facile la conversion enzymatique d’un substrat à grande échelle et réduit la dénaturation possible de l’enzyme en stabilisant sa structure. Un bon exemple appliqué en est l’industrie de conversion en sirop de fructose de l’amidon de maïs par traitement séquentiel par une amylase et une glucose isomérase. La conversion du glucose en fructose est d’environ 50 % mais le rendement peut être amélioré en séparant le fructose et en recyclant le glucose restant. Il y a trois approches de base de l’immobilisation enzymatique :

FIGURE 30.15 Extrémozymes : enzymes fonctionnant dans des conditions extrêmes. (a) Enzymes tolérant l’acidité. Ce mélange enzymatique est un additif alimentaire pour la volaille, destiné à digérer les fibres de l’aliment, concourant ainsi à sa valeur nutritionnelle et permettant une croissance plus rapide de l’oiseau. (b) Enzymes thermostables : la pullulanase est extraite de Pyro-coccus woesei, un hyperthermophile dont la température optimale de croissance est de 100 ˚C (voir section 13.6). Le calcium améliore la stabilité à la chaleur de cette enzyme jusqu’à 110 °C (voir section 3.8).

1. Liaison de l’enzyme à un support. La liaison peut être réalisée par adsorption, par liaison ionique ou covalente. Parmi les supports utilisés on trouve des celluloses modifiées, du charbon actif, des argiles, des morceaux de brique ou de matériau poreux, de l’oxyde d’aluminium et des billes de verre (voir figure 30.16). 2. Coréticulation des molécules d’enzymes. La liaison des molécules d’enzymes avec une protéine neutre et entre elles est effectuée par réaction avec un agent chimique, par exemple le glutaraldéhyde qui va former des ponts

avec les groupements aminés des lysines des protéines. Les aldéhydes ont aussi une action dénaturante, mais si la réaction est effectuée correctement, une grande partie de l’activité enzymatique est conservée. Notons que le glutaraldéhyde a aussi une action antiseptique. 3. Inclusion enzymatique dans un gel ou une semi-membrane perméable. Les enzymes peuvent être incluses par exemple dans des gels d’alginate, des microcapsules, des membranes de polymère semi-perméables ou des polymères fibreux comme l’acétate de cellulose (voir figure 30.16).



30.10 Boissons alcoolisées et alcools 971 Coréticulation

Liaison à un support

30.10 Boissons alcoolisées et alcools m n Les boissons alcoolisées comprennent les vins issus de la fermentation de jus de fruits (raisin principalement), les bières issues de la fermentation de grains maltés et les boissons distillées produites par distillation de l’alcool provenant de ces fermentations (voir section 5.10). Dans le domaine des boissons alcoolisées, cohabitent des processus utilisant une flore endogène, d’autres, des souches de levures et bactéries sélectionnées à partir de la flore naturelle de fermentation des fruits et des graines, et, la plupart du temps, des processus mixtes. Cette utilisation de souches exogènes permet de mieux contrôler la production

Production des vins Inclusion dans des polymères ou des gels

Microencapsulation

FIGURE 30.16 Procédés d’immobilisation d’enzymes . Les molécules d’enzyme sont représentées en rouge. Le procédé utilisé varie selon l’enzyme, la réaction et l’échelle.

Chacune de ces méthodes a ses avantages et ses inconvénients : le procédé utilisé dépend de l’enzyme, du maintien de son activité après immobilisation, de l’application industrielle envisagée et de son échelle.

Contrôlez vos acquis Les enzymes peuvent être produites à grande échelle par des micro-organismes. Beaucoup d’enzymes thermo- et alcalino-stables sont utilisées comme détachants sur le marché très important des détergents. Les enzymes des extrémophiles sont des biocatalyseurs dans des conditions extrêmes de température et de pH. Quand on utilise une enzyme dans un procédé à grande échelle, il peut être intéressant de la lier à un support inerte pour stabiliser son activité. •

Pourquoi les enzymes sont-elles utilisées dans l’industrie des détergents ?

•

Quelle enzyme clé est nécessaire pour produire les sirops de fructose ?

•

Qu’est-ce qu’une extrémozyme ?

III

PRINCIPAUX PRODUITS INDUSTRIELS ALIMENTAIRES ET BOISSONS

La microbiologie à échelle industrielle a vu le jour avec les antibiotiques puis s’est élargie aux suppléments, et touche également de grandes productions alimentaires comme celles des boissons alcoolisées et des alcools.

On peut distinguer trois grandes catégories de vins issus de raisin : les vins rouges, les vins blancs et les vins effervescents : Les vins blancs secs sont des vins dans lesquels les sucres sont pratiquement tous fermentés, alors que dans les vins blancs doux il reste une partie du sucre ou du sucre a été ajouté ensuite (chaptalisation). Un vin de liqueur est un vin auquel on a ajouté un alcool (du cognac par exemple pour le pineau des Charentes, une eau-de-vie pour le porto) afin de stopper la fermentation lors d’une opération dite de mutage. Les vins effervescents comme le champagne contiennent une grande quantité de CO2 dissous, issu d’une deuxième fermentation sur levures (ajoutées) en bouteille fermée. On retrouve quatre étapes initiales communes de durée variable dans toutes les vinifications : – Le foulage a pour but de faire éclater les grains des grappes de raisin récoltées quand leur taux de sucre est jugé suffisant et de mettre en contact le jus exprimé avec la flore de surface de la pellicule des grains, en particulier les levures, et de commencer à dissoudre les matières colorantes rouges des pellicules. Les vins de méthode champenoise ne sont pas foulés. – L’éraflage permet d’éliminer les rafles du reste de la vendange et de réguler entre autres le taux de tanin et l’astringence du moût. – Le pressage, effectué plus ou moins tôt, permet de séparer le marc contenant les pellicules, les pépins (source également de tanins) et les rafles du jus appelé moût. – La cuvaison comprend la macération permettant l’extraction de composés vers le moût et la première fermentation (alcoolique) d’une durée de quatre jours à trois semaines. Les vins rouges à longue conservation subissent une macération prolongée permettant une extraction plus importante de composés comme les matières colorantes (anthocyanes) et les tanins avant pressage. Les vins blancs sont en général pressés avant macération pour éviter leur coloration, car ils sont réalisés à partir de raisins blancs ou rouges dont la pellicule (la peau) contenant la matière colorante rouge doit être éliminée (cas de la majorité des vins de Champagne issus de raisins rouges).

Maîtrise de la fermentation alcoolique Les levures impliquées sont de deux types : des levures sauvages présentes sur les grains, transférées aux moûts, et des levures



(a)

The Christian Brothers Winery

vinicoles cultivées du type Saccharomyces cerevisiae (ellipsoideus), ajoutées en début de fermentation. Les levures sauvages, moins tolérantes à l’alcool que les levures vinicoles commerciales peuvent produire des composés indésirables affectant la qualité finale du vin. Elles varient également en fonction des conditions climatiques de la vendange. Il est possible de les éliminer de façon progressive par addition préalable de sulfite ou SO2 et d’ajouter au moût une culture pure de souches vinicoles résistantes à ce taux de SO2 (maximum 100 mg/L) préalablement réalisée sur jus de raisin stérile. La fermentation alcoolique est poursuivie dans des récipients de volume variable, allant du tonneau de bois de chêne d’environ 200 L à la cuve en inox de 200 000 L (voir figure 30.17b). La fermentation étant exothermique, il faut en contrôler la température : en moyenne 28 à 30 °C pour les rouges et 18 à 20 °C pour les blancs. Dans le cas des vins rouges, on peut utiliser une pompe pour remonter en tête de cuve la vendange ou le moût en fermentation, afin de l’homogénéiser et d’apporter la quantité d’oxygène nécessaire à une croissance raisonnée des levures. Un faible niveau d’oxygène va favoriser une fermentation productrice d’arômes. Dans le cas des vins blancs qui s’oxydent très facilement (car dépourvus des composés colorés antioxydants comme les anthocyanes extraits des pellicules), on limite l’entrée de l’oxygène, les levures en croissance apportant toutefois un pouvoir réducteur protecteur contre l’oxydation. Le SO2 est ajouté en plus grandes quantités dans les vins blancs pour son un rôle antioxydant et pour son rôle de déviation de la fermentation du pyruvate vers le glycérol au lieu de l’éthanol. Le SO2 se fixe entre autres sur l’acétaldéhyde issu du glycéraldéhyde 3-phosphate précurseur de l’éthanol, bloquant cette voie et obligeant le métabolisme à utiliser la voie alterne de la dihydroxyacétone-phosphate pour régénérer le stock de NAD+ à partir du NADH tout en produisant du glycérol qui donnera du moelleux au vin et d’autres composés secondaires intervenant dans sa flaveur.



(b)


972 Chapitre 30

Maîtrise de la fermentation malolactique Après macération, le moût est décuvé et séparé du marc contenant pépins et lie (dont les levures ayant sédimenté) par écoulage naturel pour obtenir un vin dit « de goutte ». Le marc est également pressuré pour obtenir un vin dit « de presse », chargé en d’autres composés extraits du marc. Les deux vins seront séparés ou assemblés ensuite après des processus qui peuvent être différents. Les levures n’ayant consommé que 20 à 40 % de l’acide malique du raisin qui est un substrat fermentable, les techniques de vinification à cette étape visent soit à empêcher une fermentation ultérieure, soit à consommer ce substrat par une fermentation bactérienne contrôlée dite malolactique qui va le transformer en acide lactique à la saveur plus fade et moins astringente. En général la fermentation malolactique est peu souhaitée pour les vins blancs, sauf pour les vins blancs effervescents de méthode champenoise, car on désire leur conserver une note acide qui leur confère un goût « frais » et ne pas altérer leurs arômes par une seconde fermentation. Une nouvelle addition de SO2 a donc lieu à ce stade, inhibant la flore bactérienne. Pour les vins rouges, la fermentation malolactique est essentielle pour épuiser l’acide malique et les sucres résiduels afin de stabiliser le vin. Elle est effectuée en cuve par des bactéries

(c) FIGURE 30.17 Vinification commerciale en Californie (États-Unis). (a) Transport des grappes de raisin vers le pressage. (b) Cuves de fermentation. (c) Foudres de chêne où le vieillissement du vin a lieu. Le vieillissement en fûts peut durer plusieurs années dans le cas des grands vins rouges.

lactiques soit homofermentaires du genre Pediococcus (damnosus par exemple), soit hétérofermentaires facultatifs comme Lactobacillus (plantarum par exemple), ou stricts comme Leuconostoc. Leur croissance est optimale vers un pH de 3,7-3,8 et vers 20 à 23 °C.

Clarification des vins blancs Elle a lieu en général quand la fermentation malolactique est achevée et peut être accélérée par addition d’agents clarifiants tels que de la caséine, du blanc d’œuf, du tanin ou de la



30.10 Boissons alcoolisées et alcools 973

bentonite. Le vin peut être également filtré à l’aide de terres de diatomées (appelées kieselguhr) ou de membranes filtrantes avant mise en bouteilles.

Élevage en barriques des vins rouges La clarification des vins rouges est plus ou moins poussée avant et pendant le stockage (ou élevage) en barriques (souvent de chêne) à faible température, en cave, pour une à six années pendant lesquelles il vieillira, prendra ses arômes et son goût, et finira de décanter après des soutirages réguliers pour éliminer les lies résiduelles. À ce stade les fermentations sont achevées et adviennent surtout des phénomènes de précipitation et d’oxydation-réduction, ainsi que des échanges avec les bois des fûts, en particulier des apports de tanin par les bois de chêne, comme pour les grands crus du Bordelais.

Prise de mousse des vins effervescents Les vins effervescents, tels ceux fabriqués selon la méthode champenoise, subissent, après une fermentation malolactique plus ou moins complète, une stabilisation tartrique destinée à précipiter à froid l’acide tartrique du raisin (non consommé par les bactéries ou les levures) qui risque de cristalliser en bouteilles. Au-delà de l’aspect non esthétique pour un vin aussi limpide, les cristaux peuvent provoquer un phénomène de dégazage intempestif du CO2 à l’ouverture, appelé gerbage. On ajoute ensuite au vin une liqueur de tirage contenant du sucre, des levures vinicoles et des adjuvants comme du phosphate d’ammonium pour accélérer leur croissance dans un milieu appauvri en substrats. Cette deuxième fermentation a lieu en bouteilles muselées tenues horizontales et dure d’une à cinq années, ou plus. Elle permet de transformer pour moitié en alcool et pour moitié en CO2 le saccharose introduit, d’affiner le goût du vin et de favoriser une bonne prise de mousse par liaison du CO2 au vin. Le dépôt existant dans la bouteille est ensuite progressivement accumulé en trois semaines au niveau du col de la bouteille par remuage, puis expulsé après congélation du col à –25 °C. Une autre technique permettant de réduire ce temps de remuage est d’utiliser des levures encapsulées dans des billes d’alginate (voir section 30.8), qui décanteront presque instantanément. Le liquide expulsé est remplacé par une liqueur de dosage plus ou moins sucrée à base de vieux vin et de sucre avant rebouchage de la bouteille.

Brassage : réalisation du moût Le brassage est la fabrication de différents types de bières à partir de grains maltés (voir figure 30.19). Le malt est préparé à partir de grains d’orge germés dont le contenu en amylases est important, ce qui va permettre de transformer l’amidon en sucres de type maltose fermentescibles par des levures. Ceci est indispensable car les levures ne peuvent pas digérer directement l’amidon des grains de céréales. On prépare le liquide à partir duquel on élaborera une bière par un procédé appelé trempe. La maische, ou trempe ou salade, obtenue dans la cuve de trempe est composée uniquement de grains maltés concassés ou d’un mélange avec des grains crus de céréales concassés moins coûteux comme du blé, du riz ou du maïs déshuilé. On laisse tremper ce mélange en le chauffant par paliers entre 55 et 75 °C afin de réaliser

grâce aux enzymes du malt une digestion totale de l’amidon et une digestion partielle des protéines. Ce mélange, de pâteux, devient liquide, et l’éclatement final des granules d’amidon est obtenu lors d’un dernier palier à 100 °C. C’est le diagramme de brassage, qui est un des secrets de fabrication de chaque bière avec le choix des malts. Le maltose, sucre principal obtenu, sera fermenté par la levure ; les acides aminés et autres composés libérés participeront à sa croissance et à la tenue de la mousse. L’extrait aqueux sucré appelé moût est séparé par filtration sur le gâteau filtrant des écorces de la maische constituant les drêches. Dans la chaudière suivante dite de houblonnage (autrefois en cuivre, aujourd’hui en inox) [voir figure 30.19a et b], on ajoute du houblon qui va apporter une amertume et des arômes. Le houblon a également des propriétés antimicrobiennes qui aident à prévenir des contaminations ultérieures. Le moût est bouilli pendant plusieurs heures, temps nécessaire à l’extraction des composés désirés du houblon, à sa stérilisation et à la précipitation à chaud des troubles protéiques (casse). La casse est éliminée par création d’un tourbillon dans la cuve, et le moût est à nouveau filtré, refroidi, saturé en oxygène et ensemencé en levure avant passage en cuve de fermentation.

Brassage : procédé de fermentation Les levures de brasserie sont de deux types : celles de fermentation haute, de distribution uniforme dans le moût, et qui sont ramenées en surface par le CO2 qu’elles dégagent, et celles de fermentation basse, qui sédimenteront vers le fond. Les fermentations hautes ont lieu à de plus hautes températures (14 à 23 °C) que les fermentations basses (6 à 12 °C) et sont réalisées en un temps plus court : 5 à 8 jours contre 8 à14 jours. Les levures de fermentation haute du type Saccharomyces cerevisiae donnent des bières de type ale britannique (d’origine flamande) et comprennent les mild, bitter, porter, stout…, dont la Guinness est un représentant classique. Ces levures sont moins sensibles à l’alcool qu’elles produisent que celles de fermentation basse du type Saccharomyces carlsbergensis, qui donnent des bières de type lager. Ces dernières, originaires d’Europe centrale, nommées pils, incluent les bières blondes les plus répandues et les plus produites. À la fin d’une fermentation basse de type lager, la bière dite « verte » est pompée vers de grandes cuves « de garde », où elle est stockée à température très faible (quelques degrés Celsius) plusieurs semaines, période pendant laquelle son goût va s’affiner et la prise de mousse s’effectuer (voir figure 30.19c). La bière est de nouveau filtrée pour être placée en cuves de stockage, d’où elle sera soutirée pour la mise en bouteilles ou en fûts. La bière de type ale, en fermentation haute, est stockée pendant un temps plus court à une température supérieure (4 à 8 °C), ce qui lui donne une autre flaveur caractéristique (pour d’autres détails simplifiés sur le brassage, voir le focus « Comment faire de la bière chez soi »).

Boissons alcoolisées distillées Elles sont fabriquées par chauffage d’un liquide de fermentation, évaporation de l’alcool, condensation et collecte par le procédé de distillation. On peut ainsi obtenir un produit avec un taux d’alcool beaucoup plus élevé que celui obtenu par



974 Chapitre 30


Foulage Éraflage

Foulage Éraflage

Éraflage Levures

SO2

Levures

Pressage

Cuvaison avec macération 28-30°C 4 jours à 3 semaines

Pressage Marc

SO2

Débourbage

Moût

Lies

Pressage SO2

Bouillage + ou malolactique 2 à 12 semaines 18 °C en cuves

Marc

Débourbage Levures

Moût

SO2

Cuvaison vers 20 °C jusque 10 jours

Clarification stabilisation tartrique Élevage en barriques 14 à 18 °C 1 à 6 ans Soutirages réguliers

Lies Bitatrate de potassium

Levures

Prise de mousse en bouteilles 10 °C 1 à 5 ans

Lies

Agents clarifiants Agents clarifiants Filtration

Marc

SO2

Dégorgements

Filtration

Lies Mise en bouteilles

Barton Spear

Rafles

Dosage

Mise en bouteilles Liqueurs sucrée

Mise en bouteilles (a)

Vins blancs

(b) Vins

Rouges

(c)

Vins effervescents

FIGURE 30.18 Production du vin. (a) Vins blancs. Ces vins ne subissent en général pas de macération pour conserver leur couleur et ne subissent pas souvent de fermentation malolactique, qui nuirait à leur fraîcheur. La fermentation alcoolique a généralement lieu en cuves, mais peut se produire en barriques sur lie (cas du muscadet). (b) Vins rouges. Les procédés utilisés dans le Bordelais et en Bougogne sont très variables, mais comptent tous une macération plus ou moins importante, concomitante d’une fermentation alcoolique suivie d’une fermentation malolactique destinée à les stabiliser et d’un élevage en barriques, irremplaçables pour les grands crus tanniques. (c) Vins blancs effervescents. Dans la méthode champenoise présentée ici, la vendange ne subit ni foulage ni macération pour obtenir un moût blanc à partir de raisins rouges (cas de la plupart des champagnes). Après la fermentation alcoolique, une fermentation malolactique peut être choisie, et une dernière fermentation contrôlée sur levures a lieu en bouteilles. Elle donnera jusqu’à 6 bars de pression de CO 2 en bouteilles.

simple fermentation. La distillation d’un vin des Charentes donne le cognac, celle de brassins de malt, du whisky, celle de mélasses fermentées, du rhum, celle de grains ou de pommes de terre fermentées, de la vodka, et celle de grains mélangés à des baies de genièvre, du gin (voir figure 30.20). Le distillat contient, en plus de l’alcool éthylique, des produits volatils provenant soit de la fermentation de la levure, soit des ingrédients eux-mêmes. Pour éliminer ces derniers, le distillat est presque toujours vieilli dans des fûts de bois, souvent de chêne (voir figure 30.20), où, de transparent, il prend une couleur jaune à ambrée et des arômes issus de composés du bois

comme les tanins. Tous ces procédés traditionnels comprennent de nombreuses étapes qui en assurent la qualité.

Éthanol chimique La production d’éthanol à partir de substances variées en tant que produit chimique de base est un procédé biocatalytique très répandu : environ trente milliards de litre par an sont produits dans le monde. Aux États-Unis, la majorité de l’éthanol est produite par fermentation d’amidon de maïs au moyen de levures. L’amidon, transformé en glucose par des enzymes (voir section 30.9), devient fermentescible. L’éthanol est



(c)

Busch Creative Services, Anheuser Busch Company

(b)


(a)



30.10 Boissons alcoolisées et alcools 975

(d)

FIGURE 30.19 Brassage de la bière. (a) Chaudière en cuivre de brassage où s’effectue la liquéfaction du malt et des céréales. (b) Chaudière en cuivre de houblonnage où le houblon est ajouté. On procède par ébullition à l’épuration et à la stérilisation du brassin. De cette chaudière, le brassin passe, après dilution, dans de grandes cuves de fermentation où des levures de type Saccharomyces cervisiae fermentent le maltose, principalement en éthanol et en CO 2. (c) La bière de type lager est stockée pendant plusieurs semaines afin d’affiner son goût par fermentation secondaire. (d) Elle est finalement filtrée pour éliminer les levures restantes, puis stockée à froid sous CO 2, pour éviter son oxydation.

FIGURE 30.20 Couleurs d’alcools produits par distillation. Le gin ou la vodka, par exemple, sont incolores. Le vieillissement en fûts de chêne apporte à certains alcools une couleur ambrée ou jaune et un goût dû au transfert entre autres des tannins du bois. De gauche à droite ; vieux rhum, cognac, whisky.

L’éthanol est utilisé comme solvant industriel et comme additif jusqu’à 10 % à l’essence sans plomb. La combustion d’alcool produit de moindres quantités de monoxyde de carbone et d’oxydes nitriques, contribuant ainsi à la réduction de

Chris Standlee et DOE/NREL

Barton Spear

récupéré par distillation à partir du jus de fermentation (voir figure 30.21). Dans d’autres pays, comme au Brésil, on utilise à côté du maïs d’autres substances fermentescibles comme la canne à sucre, le sérum de fromagerie, les betteraves à sucre et même les déchets de bois et papiers recyclés. La cellulose du bois est traitée pour donner du glucose fermentescible. En Europe, la production d’éthanol comme biocarburant à partir de betteraves à sucre est lancée, le sucre européen étant frappé de plein fouet par la concurrence des sucres d’Amérique latine.

FIGURE 30.21 Usine de production d’éthanol au Nebraska (États-Unis). Le sirop de glucose, obtenu à partir d’amidon de maïs, est fermenté par Saccharomyces cerevisiae en éthanol et en CO2. L’éthanol est stocké dans la cuve au premier plan à gauche. À l’arrière-plan, les cuves et les tuyaux servant à la distillation de la liqueur fermentée.



976 Chapitre 30


la pollution et de l’effet de serre dus à ces composés. Plusieurs levures sont utilisées, parmi les espèces de Saccharomyces cerevisiae, Kluyveromyces et Candida, mais c’est Saccharomyces cerevisiae qui sert principalement aux États-Unis.

1/ 2

O2

H2O

Cytochrome o Force proton-motrice

Contrôlez vos acquis Les boissons alcoolisées sont produites par des levures qui fermentent des sucres en alcool éthylique et en CO2. Le vin est produit à partir de jus de raisin, la bière à partir de grains maltés, et les alcools distillés le sont à partir de liquides fermentés. L’alcool industriel est utilisé comme solvant et comme additif à l’essence. •

Pourquoi le degré alcoolique des vins est-il différent de celui de la bière ?

•

Quelles sont les différences majeures entre des bières de fermentation haute et basse ?

30.11 Production du vinaigre m n Le vinaigre résulte de la conversion de l’éthanol en acide acétique par des bactéries acétiques, dont les genres principaux sont les Acetobacter et les Gluconobacter. Il peut être produit à partir de n’importe quelle substance contenant de l’alcool, mais il l’est généralement à partir de vin, de bière ou de cidre. Quant au vinaigre d’alcool, il est produit à partir d’une solution d’alcool pur dans l’eau. Le vinaigre est utilisé comme un agent de flaveur dans les salades et comme acidifiant dans de nombreuses conserves en saumure. Son effet antibactérien permet aux viandes et aux légumes marinés du type pickles ou cornichons de se conserver très longtemps. Les bactéries acétiques (voir section 12.8) sont strictement aérobies mais ont la particularité, comme les Gluconobacter, de ne pas pouvoir oxyder complètement leur donneur organique d’électrons en CO2 et en eau (voir figure 30.22). Elles utilisent donc l’éthanol comme donneur d’électrons et l’oxydent au moyen des quinones uniquement en acide acétique, qu’elles excrètent dans le milieu ; elles sont par conséquent très tolérantes à l’acidité. Leur demande en oxygène pendant la croissance est très élevée et le problème majeur de la production du vinaigre est l’aération du milieu.

Procédés de production du vinaigre Il existe trois procédés de production du vinaigre. La méthode originelle à fût ouvert (dite « d’Orléans ») est encore utilisée en France : le vin est placé dans des récipients plats avec une grande surface d’exposition à l’air et sa surface se couvre d’un voile de bactéries acétiques. Ce procédé est peu efficace, car la surface de contact bactéries-substrat-O2 est limitée. La méthode par ruissellement (vinaigre rapide), permet d’obtenir un contact optimal entre bactérie, air et substrat en faisant ruisseler par le haut le substrat alcoolique sur un lit non tassé de brindilles de bouleau ou de copeaux de bois, à travers lequel de l’air est insufflé par le bas. C’est un type de réacteur

2H

UQ CH3CH2OH

Éthanol

2H

ATP

UQ

UQH2 CH3CHO

UQH2 CH3COOH Acide acétique

Alcool Aldéhyde Acétaldéhyde déhydrogénase désydrogénase

FIGURE 30.22 Voie biochimique de la production de vinaigre. L’oxydation de l’éthanol en acide acétique est l’étape clé de la production du vinaigre. UQ = Ubiquinone

à fermentation continue et à bactéries adsorbées sur un support poreux où le contact bactéries-substrat-O2 est maximal (voir figure 30.23). La durée de vie des copeaux de bois colonisés par ce type de bactéries varie de cinq à trente ans selon le type de substrat utilisé. La méthode à bullage, qui est une méthode de fermentation submergée comme pour la production d’antibiotique. Avec une oxygénation adéquate, le rendement de conversion de l’alcool en acide acétique atteint entre 90 et 98 %. Bien que la conversion de l’alcool en acide acétique par voie chimique soit simple, les procédés microbiens de production du vinaigre ont été conservés pour des raisons de flaveur, car d’autres molécules produites par les micro-organismes y contribuent.

Aération

Circuit de recirculation Pompe

Grille de bois Réservoir de collecte

Liquide alcoolique

Copeaux de bouleau Entrée de l’air oxydant Tubes de réfrigération Sortie du vinaigre

FIGURE 30.23 Schéma d’un générateur de vinaigre. Le liquide alcoolique est dispersé en douche sur les copeaux de bois, tandis que de l’air est insufflé d’en bas à contre-courant sur les copeaux. Les bactéries acétiques (Acetobacter) qui se développent sur les copeaux et transforment l’alcool en acide acétique sont en effet strictement aérobies. La solution d’acide acétique qui s’accumule dans le réservoir de collecte, pour avoir droit à l’appellation de vinaigre, est recyclée sur les copeaux jusqu’à ce que son taux en acide atteigne au moins 4 %.



30.11 Production du vinaigre 977

Faire de la bière chez soi

2 Conduite de la fermentation (voir figure 2). Ajoutez deux paquets de levure de bière fraîche au moût refroidi et fermez le fermenteur avec un couvercle connecté à un tuyau qui va plonger dans un autre récipient plein d’eau froide. Pendant les 2 ou 3 premiers jours de fermentation, de grandes quantités de CO2 seront émises par le tuyau, le piège à eau empêchant les levures sauvages ou les bactéries de pénétrer par le tuyau dans le fermenteur. Au bout du troisième jour, l’émission de CO2 est fortement ralentie et le tuyau est remplacé par un clapet antiretour qui empêche l’air d’entrer et permet au CO2 d’être évacué. Laissez la bière fermenter pendant 7 à 10 jours à 8 ou 15 °C, ou plus.

Figure 1

Bryon Burch

3 Mise en bouteille et vieillissement (voir figure 3). À ce moment, la plupart des levures auront sédimenté. Siphonnez soigneusement la bière au-dessus de la couche de levure pour la transférer dans les bouteilles. Les bouteilles à capsule de céramique et à joint caoutchouc sont les plus faciles à fermer et tiennent

Bryon Burch

1 Réalisation du moût (voir figure 1). Industriellement, le moût est réalisé en extrayant les sucres fermentables et les nutriments de la levure à partir du malt du sucre et du houblon. Une alternative est d’acheter de l’extrait de malt aromatisé au houblon prêt à l’emploi. Le type de bière dépend de la flaveur et de la couleur du malt choisi. Une recette de base pour ce type de moût utilise 2,25 à 2,75 kg d’extrait de malt aromatisé au houblon pour 20 L d’eau. On porte à

ébullition pendant quinze minutes l’extrait de malt dissous dans 5 à 6 L d’eau contenus dans un récipient émaillé ou en inox (pas en aluminium, ces ions étant inhibiteurs) [voir figure 1]. Le moût bouillant est alors versé dans les 14 ou 15 L d’eau froide déjà versés dans le fermenteur. La levure est ajoutée après refroidissement au-dessous de 30 °C.

Figure 2

Contrôlez vos acquis Le composé principal du vinaigre est l’acide acétique, produit par des bactéries acétiques oxydant un jus de fruit fermenté et alcoolisé. Le paramètre majeur dans la production du vinaigre est l’aération.

le mieux la pression. Il est possible d’ajouter une cuillère à soupe rase de sucre par litre, mais pas plus, au risque de voir les bouteilles exploser. Mélangez bien et laissez les bouteilles tête en haut fermenter à nouveau à température ambiante pendant 7 à 10 jours, puis stockez à la cave. Toutes les bières familiales sont meilleures si on les laisse vieillir quelques semaines, devenant plus douces et moins amères. Avec le même équipement, on peut faire différents types de bière : les bières sombres, qui sont souvent plus alcoolisées que les bières pâles, demandent plus de malt et leur brassage demande une combinaison de malts dont un malt foncé qui a été fortement grillé pour donner une saveur caramélisée et une couleur marron foncé. Les bières familiales, qu’elles soient blondes ou brunes, peuvent présenter des teneurs en alcool de 3 à 5° (voir figure 4). Ce type de fabrication simplifiée confirme la tendance aux bières de spécialité réalisées par des microbrasseries, qui entrent en compétition avec les bières au goût standard produites à très grand volume par les grands brasseurs.

a NdT : Bien que la pratique ne soit pas très commune, l’amateur américain, ou anglais, trouve dans le commerce les ingrédients à la préparation d’une bière « maison » selon le processus décrit ici. b Burch, B. 1992. Brewing Quality Beers-The Home Brewer’s Essential Guide Book, deuxième édition, Joby Books, Californie, États Unis.

Barton Spear

Le brasseur amateur peut réaliser différents types de bière, des ales anglaises amères à la pils germanique, en passant par l’imperial stout russe. Le brassage peut être divisé en trois étapes de base : 1) réalisation du moût ; 2) fermentation ; 3) mise en bouteille et vieillissement. Le caractère de la bière va dépendre de plusieurs facteurs : les proportions de malt, sucre, houblon et grains crus, le type de levure, la température, la durée de la fermentation et celle du vieillissement. Le fermenteur peut être un récipient en verre ou en inox de 20 L à fermeture hermétique. Tout ce qui va entrer en contact avec le moût doit être stérilisé, soit le fermenteur, les tuyaux, la cuillère pour agiter et des bouteilles résistantes à la pression, en les trempant par exemple dans une solution de 50 à 60 mL d’eau de Javel pour 20 L d’eau et en les rinçant avec de l’eau chaude ou bouillie. L’eau utilisée pour la fabrication du malt doit être de bonne qualité et sans goût chloré.

Bryon Burch

FOCUS

Figure 3

Figure 4

•

Pourquoi l’oxygène est-il nécessaire à la production du vinaigre ?

•

Pourquoi le vinaigre produit par la méthode de ruissellement a-t-il un goût plus prononcé que celui produit par la méthode à bullage ?



978 Chapitre 30


m n

CH2

30.12 Acide citrique et autres composés organiques

CH2

HO C COOH CH2

HO C

COO–

COO–

CH2

COOH

Acide citrique

Fe3+

COO–

Citrate

(a)

Concentration en métabolites ou en cellules

L’acide citrique est très utilisé comme additif en industrie agroalimentaire dans les domaines des boissons, des confiseries, de la pharmacie et en tant qu’agent levant du pain et remplaçant des phosphates dans les détergents. Plusieurs autres acides sont produits par des champignons, dont l’acide itaconique, employé dans la production des résines acryliques, et l’acide gluconique, servant à la production de gluconate de calcium dans le traitement des déficiences humaines en calcium et comme agent de lavage adoucissant. On compte, parmi d’autres produits chimiques importants produits par des bactéries, le sorbose, produit au moyen de l’oxydation du sorbitol par Acetobacter et utilisé dans la fabrication de l’acide ascorbique (vitamine C), et l’acide lactique, fabriqué par de nombreuses bactéries (voir section 12.19) et employé comme acidifiant alimentaire. Nous nous attarderons sur la production d’acide citrique par Aspergillus niger, qui est la fermentation industrielle aérobie en culture submergée pionnière, suivie plus tard des productions d’antibiotiques. Normalement la production d’acide citrique est liée au cycle de l’acide citrique (voir section 5.13). Toutefois, chez certains micro-organismes comme Aspergillus niger, on peut obtenir de grandes quantités d’acide citrique en faisant pousser le champignon en aérobiose sur un milieu carencé en fer. La déficience en fer oblige Aspergillus niger à surproduire de l’acide citrique pour séquestrer le fer dont elle a besoin dans le milieu par chélation avec l’acide citrique produit (voir figures 30.24a et 5.1). Le milieu de production est donc traité pour être déficient en fer ainsi que les fermenteurs inox, qui peuvent être recouverts d’une couche de verre interne pour éviter tout lessivage de fer des parois au pH acide généré par l’accumulation d’acide citrique durant la production.

COOH

Saccharose Glucose + fructose Masse cellulaire

Acide citrique 0

2

4

6

8

Temps (jours) (b) FIGURE 30.24 Synthèse de l’acide citrique par fermentation. (a) Structure de l’acide citrique. Notez que le citrate, forme ionisée de l’acide, possède trois groupements carboxyliques capables de chélater un ion ferrique Fe 3+. (b) Cinétiques de la fermentation. Le saccharose est coupé par la saccharase pour donner du glucose plus du fructose

et de sulfate de calcium qui cristallise (CaSO4). Après une seconde filtration destinée à éliminer ces cristaux, l’acide citrique est concentré par évaporation et cristallisé.

Production d’acide citrique : milieux de croissance, conditions de culture et purification


Les nutriments carbonés du milieu sont très variés et vont de l’amidon de pomme de terre aux mélasses de sucre de canne ou de betterave, en passant par les hydrolysats d’amidon, les sirops de glucose, l’amidon saccharifié, le saccharose (voir figure 30.24b) ou le sirop de sucre de canne. Les sucres sont catabolisés par le cycle glycolytique de Krebs (voir section 5.10) et entrent dans le cycle de l’acide citrique pour produire cet acide. De nos jours, l’acide citrique est élaboré principalement en culture submergée à grande échelle avec oxygénation importante, car Aspergillus niger est un aérobie strict. Dans ces conditions, l’acide citrique est produit comme un métabolite secondaire (voir figure 30.2). Pendant la phase de croissance, le saccharose est converti en glucose + fructose. Une grande partie de ces hexoses subsiste au moment de la phase stationnaire et est alors convertie en acide citrique pour contrer la carence en fer (voir figure 30.24). Après élimination de la biomasse, on purifie l’acide citrique en ajoutant de la chaux (CaO), qui le précipite sous forme de citrate de calcium. Après filtration, le précipité est traité avec de l’acide sulfurique pour donner une solution d’acide citrique

Un certain nombre de produits chimiques sont fabriqués industriellement par culture de micro-organismes. L’acide citrique produit par Aspergillus niger est le composé le plus important. •

Pourquoi l’acide citrique est-il considéré comme un métabolite secondaire (voir figure 30.2b) ?

•

Quelle est la relation entre le fer et la production d’acide citrique par Aspergillus niger ?

30.13 La levure en tant que nourriture m n et supplément diététique Les levures font partie des micro-organismes les plus utilisés dans l’industrie. Au-delà de leur importance en panification et en brasserie, elles sont utilisées pour leurs cellules ellesmêmes ou pour les composés extraits de ces cellules (voir tableau 30.5). À l’opposé des industries de panification et du brassage, pour lesquelles la fermentation en anaérobiose est



30.13 La levure en tant que nourriture et supplément diététique 979

TABLEAU 30.5

favorisée (voir Focus, chapitre 5 et section 30.10), la production de cellules de levures nécessite une respiration pour une production maximale. C’est Saccharomyces cerevisiae qui est utilisée couramment.

UTILISATION DES LEVURES a ET DE LEURS PRODUITS

Production de levure Levure de boulanger (fabrication du pain) Levure sèche (supplément nutritionnel humain et animal) Produits des levures Extrait de levure (milieux de culture de micro-organismes) Vitamines B et D Enzymes : invertase, galactosidase (industrie agroalimentaire) Produits chimiques pour la recherche : ATP, NAD+, ARN Produits de fermentation de la levure Éthanol (chimique, industriel, carburant) Glycérol Boissons alcooliques Bière, vin Boissons distillées Cognac, whisky, vodka, rhum a Voir focus « Les produits de la fermentation de la levure », au chapitre 5, ainsi que les sections 5.10 et 5.13.

Production de cellules de levure Les levures destinées à la production de cellules sont cultivées dans de grands fermenteurs aérés sur des milieux à base de mélasses qui contiennent une grande quantité de sucres comme source de carbone et d’énergie, ainsi que des minéraux, des vitamines et des acides aminés nécessaires à leur croissance. Pour compléter le milieu, on ajoute une source de phosphore (l’acide phosphorique) et une source d’azote et de soufre (le sulfate d’ammonium). Pour atteindre des volumes de fermenteurs allant de 40 000 à 200 000 litres, plusieurs étapes intermédiaires de mise à l’échelle sont nécessaires (voir figure 30.25). Ajouter toute la mélasse en une seule fois dans le fermenteur aboutirait à un excès de sucre qui serait fermenté en alcool et en CO2 plutôt qu’en cellules ; aussi la mélasse est-elle ajoutée de façon contrôlée. En fin de croissance, le milieu de culture est éliminé par fermentation et les cellules de levure sont lavées à l’eau et recentrifugées, jusqu’à ce qu’elles soient de couleur claire. La levure de boulanger est vendue sous deux formes : en cubes de levure humide compressée ou sous forme de paillettes. On fabrique les cubes de levure humide compressée en ajoutant à

FIGURE 30.25 Production industrielle de levures. Étapes de production. Des agents antimousse sont ajoutés au fermenteur pour éviter la création d’une mousse excessive en surface due à l’aération et à l’agitation.

Mise à l’échelle (scale up)

Culture initiale de la souche à produire

Culture en flacon

Petit fermenteur Fermenteur intermédiaire

Milieu stérile Antimousse Contrôle de pH

Agitateur

Concentration, lavage Aération Fermenteur de production (1)

Essorage

Compression

(2)

Essorage

Extrusion

Pasteurisation

Séchage sur tambour chauffant

(3)

Stockage au froid

Emballage

Stockage au froid

Séchage doux

Emballage

Stockage au froid

Mouture

Emballage

Stockage au sec



980 Chapitre 30


la levure des agents émulsifiants, de l’amidon et d’autres additifs pour lui donner la consistance et la durée de vie souhaitées. Un cube de levure compressée contient environ 70 % d’humidité et doit donc être conservé au réfrigérateur pour préserver son activité. La levure vendue à l’état sec l’est souvent sous la dénomination de levure sèche active. Après mélange avec des additifs, les cellules lavées de levure sont séchées sous vide jusqu’à 8 % d’humidité, puis emballées à l’abri de l’air souvent en sachets et parfois sous atmosphère d’azote pour prolonger leur DLUO. La levure sèche active n’a pas un aussi bon pouvoir levant en boulangerie que la levure fraîche, mais elle a une durée de vie nettement plus longue. La levure diététique, vendue comme complément alimentaire sous forme de paillettes, est stérilisée et en général séchée à l’air. Elle est riche en vitamine B et en protéines, mais est carencée en acides aminés soufrés. Elle peut être par exemple ajoutée à la farine de blé ou de maïs pour en augmenter la valeur nutritionnelle.

Contrôlez vos acquis Les cellules de levure de boulanger utilisées en panification et en nutrition sont produites dans des fermenteurs aérés à grande échelle sur des mélasses, sources de carbone et d’énergie. •

Pourquoi est-il important, quand on cultive des levures pour obtenir des cellules, de maintenir des conditions aérobies ?

•

Sous quelles formes commercialise-t-on la levure de boulanger ?

30.14 Champignons comestibles m n

Production commerciale des champignons Le champignon le plus cultivé au monde est le champignon de Paris Agaricus bisporus, un mutant naturel au chromosome double de son cousin sauvage, mis en culture pour la première fois pour Louis XIV au château de Versailles. Il est cultivé sur des couches à l’abri de la lumière, dans des caves naturelles ou artificielles dont la température, l’humidité et la proportion d’O2-CO2 sont soigneusement contrôlées (voir figure 30.26a). Les couches sont réalisées avec un mélange de terre et de matière organique riche de type fumier de cheval, avant lardage (inoculation) par des morceaux de blanc de champignon composé de mycélium dense précultivé sur un milieu organique riche liquide. Dans la couche, on laisse le mycélium croître et envahir tout le substrat organique. Après plusieurs semaines, il est prêt pour l’étape suivante d’induction de la fructification et de formation des champignons. Pour cela, on ajoute en surface de la couche un lit de gobetage constitué de calcaire additionné de tourbe, qui maintient entre autres l’humidité de celle-ci. On appelle volée l’apparition des champignons en surface en plusieurs récoltes décroissantes (jusqu’à six), qui commence un à un mois et demi après inoculation ; ceux-ci doivent être immédiatement cueillis et stockés au frais pour garder leur fraîcheur et leur couleur. Le shiitake, ou Lentinus edodes, ou lentin de chêne, est un autre champignon très cultivé, dit « champignon de bois » car, au contraire du précédent, il peut digérer la cellulose et pousse sur de petites bûches de bois dur ou sur des sacs contenant un mélange stérilisé à base de copeaux de bois (voir figure 30.26b). Traditionnellement, les bûches sont trempées dans l’eau pour les hydrater, puis l’inoculum est injecté dans la bûche par plusieurs trous forés. Après croissance du mycélium dans la bûche (ce qui peut prendre une année), on obtient une volée de champignons. Le délai de production de ce champignon, très apprécié en Asie, a été fortement amélioré

(a)

Bob Harris

American Mushroom Institute

Plusieurs espèces de moisissures sont consommables par l’homme, dont principalement les champignons comestibles, qui sont un groupe de champignons filamenteux formant de grandes structures appelées fructifications (voir figure 30.26).

On appelle commercialement champignon cette fructification qui est formée de l’association d’un grand nombre d’hyphes pour constituer ce type de mycélium (voir section 14.12). La production mondiale de champignons était estimée entre 6 et 8 millions de tonnes en 2004, l’incertitude portant sur la production chinoise de pleurotes et de shiitake.

(b)

FIGURE 30.26 Production commerciale de champignons. (a) Volée de champignons de Paris (Agaricus bisporus). (b) Volée de champignons de bois shiitake (Lentinus edulus).



Questions 981

par la culture en sacs, ce qui a permis de faire baisser son prix de vente. Il a un concurrent redoutable, le Trichoderma, qui peut contaminer une bonne partie de la culture en utilisant le substrat à son profit et faire tomber le rendement en shiitake. D’autres champignons sont produits commercialement, comme les pleurotes (en général Pleurotus ostreatus, cornucopiae et eryngii), le champignon noir chinois ou « oreille de Judas » (Auricularia sp.), la volvaire cultivée dans les rizières (Volvariella volvacea), le pied-bleu ou tricholome (Lepista nuda). La truffe, dont la plus célèbre, la plus goûtée et odorante est la truffe noire du Périgord (Tuber melanosporum), et dont le mycélium ne peut pousser qu’en symbiose avec certains

arbres dans certains sols, a résisté à toute production sur substrat artificiel.

Contrôlez vos acquis L’aliment le plus produit à partir d’un micro-organisme est le champignon, qui est une fructification de certaines moisissures. •

Pourquoi les champignons sont-ils considérés comme des micro-organismes ?

•

Qu’est ce qu’une volée de champignons ?

QUESTIONS 1. Quelles sont les similitudes et les différences entre micro-organismes industriels et classiques (voir section 30.1) ? 2. Donnez trois types importants de produits industriels obtenus à partir de micro-organismes, avec deux exemples de chaque (voir section 30.1). 3. Comparez en donnant un exemple de chaque la production de métabolites primaires et secondaires. Expliquez pourquoi certains métabolites sont secondaires plutôt que primaires en donnant au moins deux explications moléculaires (voir section 30.2). 4. En quoi un fermenteur industriel et une fiole de culture sont-ils différents ? Quelles contraintes une fermentation aérobie impose-telle par rapport à une fermentation anaérobie (voir section 30.3) ? 5. Quels sont les problèmes de mise à l’échelle rencontrés au niveau de l’aération, de la stérilisation et du contrôle des procédés ? Pourquoi assurer la stérilité est-il aussi important dans la conduite d’un fermenteur industriel (voir section 30.4) ? 6. Donnez trois exemples d’antibiotiques produits industriellement. Pour chacun de ces antibiotiques, donnez les micro-organismes producteurs, la structure chimique générale et le mode d’action (voir section 30.5) ? 7. Comparez les productions d’antibiotiques à cycle β-lactame naturels, biosynthétiques et semi-synthétiques (voir section 30.6). 8. Quel métal ajouté au milieu de fermentation peut améliorer de façon importante la production de vitamine B12 (voir section 30.7) ? 9. Quelle caractéristique peu commune doit posséder un microorganisme pour excréter un acide aminé tel que la lysine (voir section 30.7) ?

10. Définissez le terme de biotransformation microbienne et donnez un exemple. Expliquez pourquoi on effectue des réactions chimiques impliquées dans des biotransformations par voix microbienne plutôt que par voie chimique (voir section 30.8) ? 11. Donnez trois différents types d’enzymes produites commercialement. Pour chaque enzyme, détaillez le micro-organisme utilisé pour sa production, son activité enzymatique et son utilisation commerciale (voir section 30.9). 12. Qu’est-ce que le sirop de fructose, comment est-il produit et quel est son usage commercial (voir section 30.9) ? 13. Qu’est-ce qu’une extrémozyme et quel est son usage industriel (voir section 30.9) ? 14. Quelles sont les ressemblances et dissemblances entre les procédés de production de la bière et du vin ? En quoi sont-ils différents de la production de boissons alcoolisées distillées (voir section 30.10) ? 15. Quel est le composant actif du vinaigre ? En quoi Gluconobacter est-il plus adapté qu’Escherichia Coli à cette production (voir section 30.11) ? 16. Donnez deux raisons pour lesquelles on utilise des fermenteurs en acier inox spéciaux pour la production industrielle d’acide citrique (voir section 30.12). 17. Pourquoi les levures sont-elles d’une telle importance industrielle (voir section 30.13) ? 18. Quelle partie d’un champignon est consommée ? Que contient cette structure (voir sections 30.14 et 14.12) ?

PROBLÈMES 1. Vous êtes chercheur dans une compagnie pharmaceutique et on vous demande de mettre au point un antibiotique efficace contre une nouvelle bactérie pathogène. Donnez un schéma du processus en partant de l’isolation d’une souche à faible rendement jusqu’à la production industrielle à haut rendement de ce nouvel antibiotique. 2. Une bouteille de vin rouge dit « biologique » (sans additifs) est entamée puis rebouchée et oubliée au réfrigérateur pendant deux mois. En goûtant le vin à nouveau, vous notez un goût aigre très net qui rend ce vin imbuvable. En utilisant les informations de ce chapitre et de la section 12.8, décrivez : a) le processus microbiologique qui a affecté ce vin et b) comment auriez-vous pu l’empêcher de se produire facilement ?

3. Vous avez besoin de produire de la phénylalanine avec un rendement élevé pour synthétiser un édulcorant : l’aspartame®. Le micro-organisme surproducteur que vous désirez utiliser n’est pas sujet à la rétro-inhibition par la phénylalanine, mais il est sujet à la répression typique de la synthèse des enzymes intervenant dans la biosynthèse de la phénylalanine par un excès de cette dernière. En appliquant les principes de la régulation enzymatique (voir chapitre 8) et de la génétique microbienne (voir chapitre 10), décrivez deux classes de mutants que vous pourriez isoler pour surmonter ce problème en donnant les détails des mutations génétiques nécessaires.





I

Techniques du génie génétique

984

31.1 31.2 31.3 31.4 31.5

Principes découlant du génie génétique Hôtes et vecteurs de clonage Identifier le bon clone Vecteurs spécifiques Expression de gènes de mammifères chez des bactéries

984 986 987 989 992

Applications pratiques du génie génétique

994

II

CHAPITRE TRENTE-ET-UN

Génie génétique et biotechnologie

31.6

Production d’insuline : les débuts de la biotechnologie commerciale 994 31.7 Autres produits et protéines de mammifères 995 31.8 Vaccins issus du génie génétique 996 31.9 Génie génétique appliqué à la génétique animale et humaine 999 31.10 Génie génétique en production végétale : les plantes transgéniques 1000

D’un point de vue scientifique, la capacité à manipuler de l’ADN et à l’insérer dans un organisme qui l’exprimera représente une technique extrêmement utile. Par génie génétique, les plants de soja de la photographie sont devenus résistants à un herbicide largement utilisé, le glyphosate.



984 Chapitre 31


GLOSSAIRE ADN-T (T-DNA) Fragment du plasmide Ti d’Agrobacterium transmis aux cellules de plantes. Biotechnologie (biotechnology) Utilisation d’organismes génétiquement modifiés (OGM) pour mettre au point des procédés d’intérêt industriel. Clonage moléculaire (molecular cloning) Isolement et incorporation d’un fragment d’ADN dans un vecteur pouvant le répliquer. Empreinte ADN (DNA fingerprinting) Méthode issue du génie génétique pour déterminer l’origine de l’ADN d’un échantillon de tissus. Génie génétique (genetic engineering) Utilisation de techniques in vitro pour l’isolement, la manipulation, la recombinaison et l’expression d’ADN ainsi que le développement d’OGM. Gène indicateur (reporter gene) Gène introduit dans un vecteur car codant un produit facilement détectable. Organisme génétiquement modifié, OGM (genetically modified organism, GMO) Organisme au génome modifié par le génie génétique. Organisme transgénique (transgenic organism) Plante ou animal possédant de l’ADN étranger introduit dans ses cellules et les transmettant à sa descendance.

L

a biotechnologie consiste en l’utilisation d’organismes vivants pour réaliser des procédés chimiques d’intérêts industriel ou commercial (voir chapitre 30). Cependant, le mot biotechnologie implique la production d’organismes modifiés in vitro par l’intermédiaire de techniques génétiques. Ces techniques permettent l’isolement et la manipulation d’ADN ainsi que le contrôle de son expression (voir chapitre 10). L’utilisation de techniques in vitro, et particulièrement le clonage moléculaire (voir section 10.15), impliquant des organismes génétiquement modifiés est appelée génie génétique. Le génie génétique s’efforce de se diriger de la théorie (voir chapitres 10 et 15) vers des applications pratiques. Dans ce chapitre, une attention particulière sera portée sur les techniques de clonage de gènes et leur expression dans des applications biotechnologiques. Ensuite, nous verrons comment les organismes génétiquement modifiés peuvent synthétiser des molécules d’intérêt comme l’insuline humaine, des hormones de croissance, des interférons, des vaccins et des enzymes industrielles.

I

TECHNIQUES DU GÉNIE GÉNÉTIQUE

Les techniques de base du génie génétique sont aussi celles de la génétique microbienne (voir chapitres 7 à 10). Génomique et bio-informatique (voir chapitre 15) commencent également à jouer un rôle majeur. L’ensemble des techniques ne peut être intégralement décrit. Celles directement appliquées à la biotechnologie et les principes qui les soustendent sont présentés ici.

Plasmide Ti (Ti plasmid) Plasmide provenant d’espèces d’Agrobacterium capable de transmettre des gènes d’une cellule bactérienne à une cellule de plante. Sonde nucléique (nucleic acid probe) Fragment d’acide nucléique pouvant être utilisé pour hybrider une molécule complémentaire à partir d’un mélange d’acides nucléiques. Thérapie génique (gene therapy) Traitement de maladies causées par un gène déficient par l’introduction de copies fonctionnelles de ce gène. Traduction inverse (reverse translation) Processus d’utilisation du code génétique pour obtenir une séquence potentielle à partir d’un ARNm ou d’un gène codant une protéine. Vaccin (DNA vaccine) Utilisation du matériel génétique d’un pathogène pour éliciter une réponse immunitaire. Vecteur d’expression (expression vector) Vecteur de clonage contenant les séquences de régulation nécessaires à la transcription et la traduction des gènes clonés. Vecteur de clonage (cloning vector) Voir chapitre 10. Vecteur d’intégration (integrating vector) Vecteur de clonage qui s’intègre au chromosome d’un hôte. Vecteur navette (shuttle vector) Vecteur de clonage pouvant se répliquer dans deux ou plus de deux hôtes différents.

31.1 Principes découlant du génie m n génétique Le génie génétique est principalement basé sur le clonage moléculaire (voir section 10.15) qui permet la recombinaison d’un fragment double brin d’ADN avec un vecteur (généralement des vecteurs de clonage incluant les plasmides et les bactériophages) et son introduction dans un hôte approprié (voir sections 10.16 et 10.17). Les applications biotechnologiques qui en résultent ne dépendent pas seulement de la capacité à identifier et à cloner un gène mais également à contrôler son expression afin de produire, identifier et purifier les protéines produites (voir figure 31.1). 1. Chimie de l’ADN : isolement, séquençage et synthèse d’ADN (voir section 7.8). 2. Enzymologie de l’ADN : endonucléases de restriction, ADN ligases et ADN polymérases (voir sections 7.5 et 7.7). 3. Réplication de l’ADN : réplication de l’ADN, éléments génétiques, vecteurs de clonage capables de réplication indépendante et réaction de polymérisation en chaîne (PCR) [voir sections 7.4 à 7.9]. 4. Plasmides et conjugaison : plasmides, réplication plasmidique et conjugaison (voir sections 10.9 et 10.10). 5. Bactériophage tempéré : réplication de phage et intégration, bactériophages tempérés, lysogénie et phages de transduction (voir sections 9.10, 10.8 et 10.17). 6. Transformation : méthodes d’introduction d’ADN libre dans des cellules (voir section 10.7).



31.1 Principes découlant du génie génétique 985

A T G C C A ...

Séquençage de l’ADN ADN synthétique (amorces ou gènes A G C complets) C T T A

Gènes de synthèse

C

G

Plasmide

Enzymes de restriction

Conjugaison

PCR

Clonage (vecteurs classiques, YAC, BAC)

Chromosome Réplication

Transduction

Transformation

Lysogénie

Régulation Transcription Maturation de l’ARN (eucaryotes)

Codons

ARN G C A C G A U G C U U A

Ré

pli

ca

tio n

Transcription inverse

C G T G C T A C G A A T ADNc

Traduction Protéine active

Modification post-traductionnelle

Ala

Arg Cys

Protéine

Leu

Chimie des protéines, traduction inverse

FIGURE 31.1 Processus fondamentaux à la base du génie génétique. Les techniques et les processus apparaissent en gras.

7. Chimie des ARN et enzymologie : ARN messager, ARN polymérase, différences entre ARNm procaryotes et eucaryotes et traitement des ARN (voir sections 14.7 et 14.8). 8. Transcription inverse : activité de la transcriptase inverse afin de transcrire l’information d’ARNm en ADN (voir sections 9.13 et 16.15).

et autres modifications post-transcriptionnelles des protéines. 13. Code génétique : le code génétique quasi universel et les différences d’utilisation des codons (voir section 7.14).


10. Traduction : processus traductionnel, importance des sites de fixation des ribosomes sur l’ARNm, rôle du codon d’initiation et importance du cadre de lecture (voir sections 7.14 à 7.16).

Les techniques du génie génétique sont basées sur des concepts fondamentaux de génétique moléculaire et de biochimie. La réussite du génie génétique ne dépend pas seulement de la capacité à effectuer un clonage moléculaire mais également de connaissances sur la réplication, la transcription et la traduction ainsi que sur les mécanismes de régulation contrôlant l’ensemble de ces processus.

11. Chimie des protéines : isolement, purification, dosage et séquençage des protéines.

•

Qu’est-ce qu’un vecteur de clonage ?

•

Comment le séquençage d’ADN peut-il fournir des informations sur la structure des protéines ?

9. Régulation : régulation de la transcription, incluant promoteurs et contrôle des opérons (voir sections 7.10 à 7.13 et chapitre 8).

12. Excrétion des protéines et modifications posttraductionnelles : séquences signal (voir section 7.17)



986 Chapitre 31


m n

31.2 Hôtes et vecteurs de clonage

En biotechnologie, le génie génétique est utilisé à des fins commerciales comme pour la production de grandes quantités de protéines valorisables, la production de nouveaux vaccins ou l’introduction de gènes spécifiques dans un organisme animal ou végétal. Dans chaque cas, le choix de l’hôte est essentiel puisqu’il nous orientera vers un type de vecteur adapté. Pour obtenir de grandes quantités d’ADN cloné, l’hôte idéal doit se développer rapidement dans un milieu de culture peu onéreux, être non pathogène, être capable d’incorporer l’ADN, être stable en culture et posséder des enzymes appropriées pour la réplication du vecteur. Les hôtes répondant à ces critères sont des micro-organismes eucaryotes ou procaryotes (voir figure 31.2) dont les génomes sont bien connus car entièrement séquencés (voir chapitre 15), génétiquement manipulables.

Les hôtes procaryotes La plupart des clonages moléculaires sont effectués dans Escherichia coli, hôte naturel de l’intestin humain, et ce, malgré plusieurs inconvénients (voir figure 31.2) comme le potentiel pathogène de souches sauvages et la synthèse d’endotoxines (voir sections 4.9 et 21.12) susceptibles de contaminer les produits finis. Cela constitue un problème potentiel notamment pour les produits pharmaceutiques administrés par voie intraveineuse. De plus, E. coli retient des protéines extracellulaires dans son espace périplasmique, ce qui peut rendre l’isolement et la purification de protéines recombinantes difficiles. Cependant, des souches d’E. coli modifiées ont été développées pour éliminer ces problèmes. Ainsi, grâce à sa génétique et sa biochimie

Hôtes Procaryotes Escherichia coli Bacillus subtilis

Eucaryote Saccharomyces cerevisiae

Génétique très bien connue Nombreuses souches disponibles Procaryote le plus connu

Facilement Génétique très transformable bien connue Non pathogène Non pathogène Protéines sécrétées Assure la maturation naturellement des ARNm et Formation des protéines d’endospores Facile à cultiver facilitant les cultures

Potentiellement pathogène Périplasme piégeant les protéines

Génétiquement instable Génétique moins connue que pour E.coli

Avantages

Plasmides instables Pas de réplication pour la plupart des plasmides procaryotes

Inconvénients

FIGURE 31.2 Hôtes de clonage moléculaire. Avantages et inconvénients des hôtes les plus utilisés pour le clonage.

très bien connues (voir section 10.19), E. coli reste l’organisme de choix pour la plupart des études de clonage. Bacillus subtilis, bactérie Gram positif, est également utilisée comme hôte de clonage (voir figure 31.2). Ce micro-organisme n’est pas pathogène, ne produit pas d’endotoxines, produit des spores (ce qui constitue un avantage dans les procédés microbiologiques industriels) [voir section 30.1], n’a pas de périplasme et sécrète naturellement des protéines dans le milieu. La technologie de clonage n’est pas aussi bien développée que pour E. coli mais plusieurs plasmides et phages ont été développés et la transformation (voir section 10.17) est un procédé désormais fonctionnel. L’inconvénient majeur reste l’instabilité des plasmides (difficulté de maintenir la réplication plasmidique dans les sous-cultures), ce qui engendre souvent la perte de l’ADN cloné. Souvent les organismes utilisés comme hôtes pour le clonage doivent avoir des génotypes spécifiques. Par exemple, si le vecteur contient le gène de la β-galactosidase comme marqueur de sélection, ce gène doit être muté et l’enzyme fonctionnelle chez l’hôte. Parce que le bactériophage M13 n’infecte que les bactéries à pili F, les hôtes utilisés avec les vecteurs dérivés de M13 doivent répondre à cette exigence (voir sections 10.8 et 16.3). La capacité à sélectionner les organismes transformés est un autre critère important pour le choix d’un hôte.

Les hôtes eucaryotes Le clonage dans les micro-organismes eucaryotes a des applications importantes dont la compréhension des mécanismes de régulation génétique des systèmes eucaryotes. La levure Saccharomyces cerevisiae a été bien étudiée et est largement utilisée comme hôte de clonage (voir figure 31.2). Des vecteurs plasmidiques et des chromosomes artificiels de levures (yeast artificial chromosomes, YAC) ont été développés pour ce type d’organisme (voir section 15.1). À la différence des procaryotes, un avantage important des hôtes eucaryotes est qu’ils possèdent les ARN et les systèmes post-traductionnels complexes nécessaires à la synthèse de produits de gènes d’organismes supérieurs. Les processus post-traductionnels peuvent être à l’origine de problèmes de clonage (voir section 31.5). Les cultures de cellules de mammifères peuvent être traitées comme des cultures microbiennes et trouvent ainsi de larges applications dans les domaines de la génétique humaine, de la physiologie du cancer et des maladies infectieuses. Les inconvénients majeurs sont le coût élevé et les difficultés de production à grande échelle. De plus, le niveau d’expression des gènes clonés est souvent faible. Les cellules d’insectes sont plus faciles à cultiver et des vecteurs ont été développés à partir d’un virus à ADN d’insectes, le baculovirus (voir section 31.4). Pour certaines applications, il est important que l’hôte eucaryote soit une culture cellulaire de plante ou même une plante entière. En effet, le génie génétique trouve de nombreuses applications en production végétale (voir section 31.10).

La transfection de cellules eucaryotes Les micro-organismes eucaryotes, les cellules animales et végétales peuvent intégrer de l’ADN par un procédé qui ressemble à la transformation de bactéries (voir section 10.7). Cependant, la transformation de cellules de



31.3 Identifier le bon clone 987

mammifères désigne habituellement la conversion en cellules malignes (tumorales, cancéreuses) [voir section 9.12]. Par conséquent, le mot transfection est utilisé pour les eucaryotes. La transfection de cellules animales en culture était initialement effectuée par précipitation de l’ADN afin que les cellules puissent l’intégrer par phagocytose (voir sections 14.10 et 22.2) puisqu’elles sont dépourvues de paroi. Pour les levures, différentes méthodes sont utilisées mais leur efficacité est faible. L’électroporation est largement appliquée pour les cellules eucaryotes car elle est utilisable aussi bien en absence qu’en présence de paroi. Cette technique implique l’exposition de l’hôte à des décharges électriques afin d’ouvrir les pores dans la membrane par lesquels, l’ADN cloné, ajouté dans le milieu, peut pénétrer sans lyse des cellules. Un canon à particules est également utilisé pour l’incorporation d’ADN dans les cellules et sa recombinaison dans l’hôte. Un petit cylindre d’acier contenant une charge est utilisé pour introduire des particules, recouvertes d’acides nucléiques, dans des cellules cibles (voir figure 31.3) en perçant parois et membranes plasmiques sans provoquer de lyse cellulaire. Cette technique a été utilisée sur des levures, des algues, des cellules de plantes et même des mitochondries et des chloroplastes. De plus, contrairement à l’électroporation, cette technique peut être utilisée pour introduire de l’ADN dans des tissus intacts comme des graines de plantes. Enfin, dans les cellules animales, l’ADN peut être injecté directement dans le noyau par micro-injection.

Contrôlez vos acquis Le choix d’un hôte de clonage, qu’il soit procaryote ou eucaryote, dépend de l’application finale. Tous les hôtes doivent être capables d’incorporer de l’ADN. Pour cela, de nombreuses techniques peuvent être utilisées, qu’elles soient naturelles ou artificielles. •

Pourquoi le clonage moléculaire requiert-il un hôte ?

•

Décrivez trois mécanismes par lesquels les cellules peuvent incorporer de l’ADN.

Percuteur

Charge à blanc

Microprojectiles recouverts d’ADN ou d’ARN Conduit

Macroprojectile en nylon

Plaque arrêtant le macroprojectile Cellules ou tissus cibles

FIGURE 31.3 Canon à acide nucléique pour la transfection d’eucaryotes. Transfection par projection de billes métalliques, recouvertes d’acides nucléiques, sur des cellules cibles.

31.3 Identifier le bon clone m n Le génie génétique commence par l’isolement d’un clone contenant un gène d’intérêt qui peut être suivi d’une multitude de manipulations en fonction des applications désirées. Mais, en premier lieu, il convient de sélectionner l’hôte qui contient le bon clone. Les méthodes de clonage de l’ADN impliquent la création d’une banque de gènes à partir d’ADN génomique total (voir section 10.15) ou le clonage d’un fragment d’ADN obtenu par PCR (voir section 7.9). Lorsque le gène d’intérêt est déjà identifié et que le but est d’obtenir un seul clone, le clonage s’effectue à partir de produits PCR. Cependant, dans une banque de gènes, il existe plusieurs milliers voire dizaine de milliers de clones et classiquement un seul ou au plus quelquesuns sont les gènes d’intérêt. Il est possible de sélectionner les hôtes contenant un marqueur de sélection, comme la résistance à un antibiotique, de sorte que seules les cellules qui ont incorporé un vecteur plasmidique forment des colonies (voir section 10.15). Dans le cas des vecteurs viraux, on recherche les plages de lyse (voir section 10.16). Il est également possible de cribler les colonies en recherchant des pertes d’activités spécifiques occasionnées par l’insertion d’un ADN étranger dans un gène du vecteur (voir sections 10.37 et 15.1). Pour le clonage de fragments d’ADN simple brin issus de PCR ou purifiés, ces méthodes sont largement suffisantes. Cependant, pour une collection hétérogène de fragments d’ADN, comme une banque de gènes, l’identification des cellules possédant de l’ADN cloné ne représente que la première étape. Trouver le clone qui possède le gène d’intérêt reste l’objectif principal. Parfois le gène cloné peut être exprimé (la protéine est synthétisée), mais le plus souvent il ne l’est pas et la seule possibilité est alors de le chercher au niveau de l’ADN.

Les gènes étrangers exprimés dans l’hôte de clonage Si le gène étranger est exprimé, la recherche de protéines s’effectue au niveau des colonies de l’organisme hôte. L’organisme hôte ne devant évidemment pas lui-même produire cette protéine. Si c’est le cas, l’hôte sélectionné doit être déficient, c’est-à-dire porter une mutation du gène d’intérêt. Lorsque le gène étranger est inséré dans l’hôte, son expression peut être contrôlée par complémentation (voir section 10.13). Ainsi, la sélection de cellules contenant les gènes clonés est particulièrement aisée. Un exemple frappant est le clonage des gènes de la luciférase dans d’autres organismes qui deviennent luminescents dans l’obscurité (voir figure 8.22).

La détection de protéines par des anticorps Un anticorps est une protéine sérique qui a été produite par un animal et qui forme un complexe hautement spécifique avec une autre protéine, un antigène (voir section 22.4). Dans le cas présent, la protéine produite par le gène cloné est l’antigène (qui a été utilisé pour produire des anticorps dans le corps d’un animal de laboratoire). Lorsque l’antigène est présent dans une ou plusieurs colonies, ces dernières sont visualisées par la formation de complexes avec les anticorps.



988 Chapitre 31


La réaction doit être très sensible puisque seule une faible quantité de protéines (antigènes) est produite dans les colonies et donc seule une faible quantité d’anticorps y est associée. En pratique, la détection repose sur l’utilisation de radio-isotopes, de composés chimioluminescents ou d’enzymes (voir sections 24.7-24.12). Cette méthode de détection impose un criblage de milliers de clones qui sont soit des colonies (contenant des plasmides), soit des plages (contenant des virus). La détection par autoradiographie est décrite en figure 31.4a. Une réplication (voir figure 10.2) de la boîte est réalisée sur une membrane filtrante. Les colonies répliquées sont lysées pour libérer la protéine d’intérêt (le criblage de vecteurs phagiques ne nécessite pas cette étape car les bactéries sont déjà lysées). L’ajout d’anticorps provoque la formation d’un complexe « antigène-anticorps ». Les anticorps non hybridés sont éliminés par lavage, puis un agent radioactif spécifique de l’anticorps est ajouté. Un film radiographique sensible aux rayons X est placé en exposition sous la membrane. Après développement, la présence d’une colonie radioactive est révélée par la présence d’un spot sur le film (voir figure 31.4a). L’emplacement de ce spot correspond à celui de la colonie, qui peut alors être repiquée. Une difficulté est de disposer d’un anticorps spécifique de la protéine d’intérêt. La protéine injectée lors de la production d’anticorps doit être pure au risque de former plusieurs anticorps qui pourront entraîner la présence de faux-positifs.

Croissance de colonies transformées sur de l’agar

Réplication des colonies sur une membrane

Cellules partiellement lysées ; ajout d’anticorps spécifiques ; ajout d’agents radioactifs spécifiques de l’anticorps

Lyse bactérienne et dénaturation de l’ADN ; ajout de sonde nucléique radioactive (ADN ou ARN) ; élution des sondes non hybridées

Les sondes nucléiques : recherche du gène d’intérêt dans l’hôte Comment détecter la présence d’un gène dans un hôte lorsque ce dernier ne l’exprime pas ou qu’il n’existe aucune méthode de détection du produit ? La solution consiste à utiliser une sonde nucléique (ADN ou ARN) possédant une séquence complémentaire de celle du gène cloné afin de l’hybrider (voir section 7.7). Le protocole le plus commun consiste à marquer la sonde avec un groupement phosphate radioactif (32PO42–), mais d’autres techniques non isotopiques sont de plus en plus utilisées. En appliquant des conditions d’hybridation appropriées, il est possible d’ajuster la stringence de sorte que la complémentarité entre les deux séquences simple brin (sonde et gène) soit la plus exacte possible et d’éviter ainsi les faux-positifs. Une sonde nucléique peut être utilisée pour cribler des colonies de recombinants (voir figure 31.4b). Ce protocole passe également par la réplication sur membrane des colonies (ou des plages pour les virus). Les cellules sont ensuite lysées afin de libérer leurs acides nucléiques qui sont alors dénaturés en simple brin et fixés à la membrane. Après l’ajout d’une sonde spécifique marquée, un lavage est effectué afin d’éliminer les sondes non hybridées puis le filtre est recouvert d’un film sensible aux rayons X. Après développement, les emplacements des spots formés correspondent à ceux des colonies transformées qui sont alors repiquées pour des travaux ultérieurs.

Contrôlez vos acquis Des procédures spécifiques sont nécessaires pour la détection de gènes étrangers dans un hôte de clonage. Si le gène est exprimé, la présence de la protéine synthétisée

autoradiographie Film radiographique

Film radiographique

Clones positifs (a)

(b)

FIGURE 31.4 Techniques de sélection des clones. (a) Utilisation d’anticorps spécifiques pour détecter la synthèse d’une protéine. (b) Détection de clones recombinants par hybridation avec une sonde nucléique radioactive qui permet la visualisation d’un spot sur la membrane. Plusieurs autres types de détection non radioactive sont utilisés, comme les composés chimioluminescents (utilisant également des films radiographiques) et les enzymes, qui libèrent un produit coloré.

peut être détectée par son activité ou par réaction avec des anticorps spécifiques. Si le gène n’est pas exprimé, sa présence peut être détectée par l’utilisation d’une sonde nucléique. •

L’utilisation d’une sonde nucléique dépend-elle de l’expression du gène cloné ? Expliquez.

•

Pourquoi est-il nécessaire de lyser les cellules contenant des plasmides afin de détecter le produit du gène cloné ?



31.4 Vecteurs spécifiques 989

m n

31.4 Vecteurs spécifiques

Si le but du clonage est d’obtenir un niveau d’expression élevé d’un gène dans un hôte approprié, le fait de localiser une copie du gène cloné est insuffisant. Tout comme les chromosomes artificiels de bactéries et de levures (bacterial and yeast artificial chromosomes, voir section 15.1), vecteurs spécifiques développés afin de permettre de travailler avec de longs fragments d’ADN, d’autres vecteurs spécialisés ont été produits pour répondre aux besoins de la biotechnologie. Deux types sont présentés ici : les vecteurs navettes et les vecteurs d’expression.

Les vecteurs navettes et les vecteurs d’expression Les vecteurs navettes peuvent transporter un ADN cloné entre deux organismes différents et se répliquer de manière stable dans chacun d’eux. Certains vecteurs sont capables de se répliquer à la fois dans Escherichia coli et dans Bacillus subtilis, dans E. coli et dans une levure, ou encore dans E. coli et dans des cellules de mammifères, ainsi que dans une multitude d’autres couples d’organismes. L’avantage majeur est la réplication de l’ADN cloné d’un organisme dans un hôte secondaire sans modification du vecteur. Les organismes possèdent des systèmes de régulation complexes qui sont des obstacles à l’expression des gènes étrangers (voir chapitre 8). Par conséquent, certains vecteurs capables de faciliter l’expression de l’ADN cloné ont été élaborés. Un vecteur d’expression permet de cloner un gène mais contient aussi les séquences de régulation nécessaires à son expression.

La régulation de la transcription des vecteurs d’expression L’élément clé du vecteur d’expression est le mécanisme de contrôle transcriptionnel. Une forte expression suppose la production de grandes quantités d’ARNm. Le promoteur est le site de fixation de l’ARN polymérase (voir section 7.10). Pour les bactéries, la région de l’ADN située environ 10 à 35 nucléotides avant le point de démarrage de la transcription (voir figure 7.30) est une zone particulièrement importante du promoteur. Le promoteur normalement associé au gène cloné risque d’être faiblement efficace dans un nouvel hôte. Par exemple, les promoteurs d’eucaryotes ou même d’autres procaryotes fonctionnent peu ou pas du tout chez E. coli. Même certains promoteurs d’E. coli fonctionnent très faiblement chez E. coli en raison d’un manque de similitude par rapport aux séquences de promoteurs dits « forts » (voir section 7.10). Ainsi, un vecteur d’expression doit contenir un promoteur fonctionnel dans l’hôte et correctement situé afin de permettre la transcription des gènes clonés. Des promoteurs d’E. coli ont été utilisés pour la construction de vecteurs d’expression dont les promoteurs des opérons lac, trp, tac et trc (hybrides synthétiques des promoteurs lac et trp) et PL lambda (voir section 9.11). Ce sont des promoteurs « forts » qui peuvent être spécifiquement régulés (voir sections 8.4-8.9 et 9.11).

Usuellement, il est nécessaire de pouvoir réguler l’expression d’un gène cloné. Bien que l’on veuille obtenir de grandes quantités d’ARNm (et de protéines), il n’est généralement pas souhaitable d’avoir en permanence ce niveau d’expression élevé. Certaines protéines d’intérêt commercial sont toxiques pour l’hôte. Dans un tel cas, il n’est pas souhaitable que le gène soit transcrit en début de croissance des cultures. Idéalement, la culture contenant le vecteur d’expression doit se développer jusqu’à atteindre une forte concentration cellulaire. Ensuite, il faut pouvoir déclencher simultanément l’expression des gènes dans toutes les copies en activant un mécanisme de régulation. Nous avons vu l’importance du système répresseur – opérateur dans la régulation de la transcription (voir section 8.5). Un répresseur « fort » peut complètement bloquer la synthèse des protéines sous son contrôle en se liant à la région opératrice. Cependant, la fonction du répresseur peut être arrêtée par l’ajout d’un inducteur, ce qui permet la transcription de gènes contrôlés par l’opérateur. Afin de pouvoir assurer la régulation, le vecteur d’expression est élaboré de telle sorte que le gène cloné soit associé aux régions promoteur et opérateur, ce qui permet une transcription et une traduction efficaces. Dans la plupart des cas, on associe le promoteur et l’opérateur d’un même opéron (opérateur lac utilisé avec promoteur lac), mais ce n’est pas toujours le cas. Par exemple, un vecteur peut être élaboré avec un promoteur trp sous contrôle d’un opérateur lac. La figure 31.5 montre un vecteur d’expression utilisant le promoteur hybride synthétique trc sous contrôle de l’opérateur lac (lacO). Ce plasmide contient également une copie du gène lacI qui code le répresseur lac. La quantité de répresseurs dans une cellule contenant ce plasmide est suffisante pour bloquer la transcription à partir du promoteur trc avant l’ajout d’un inducteur. L’addition de lactose ou d’un autre inducteur du gène lac permet la transcription de l’ADN cloné (voir figure 31.5). Les vecteurs d’expression contiennent également un terminateur de transcription fonctionnel, en aval du gène d’intérêt dans le cas du vecteur de la figure 31.5 (voir section 7.12), permettant d’empêcher sa transcription intégrale, car elle pourrait interférer avec la stabilité du vecteur.

Le contrôle de vecteur par des éléments du bactériophage T7 Le système de contrôle transcriptionnel peut ne pas être celui de l’hôte comme lors de l’utilisation du promoteur du bactériophage T7 et de l’ARN polymérase en tant que système de régulation dans un vecteur d’expression. Lorsque T7 infecte Escherichia coli, il code sa propre ARN polymérase qui reconnaît uniquement les promoteurs de T7 et inhibe la transcription de l’hôte (voir section 16.4). Dans un vecteur d’expression, il est possible de placer les gènes clonés sous contrôle d’un promoteur T7, ce qui limite alors la transcription uniquement aux gènes clonés. Cela n’est possible qu’en introduisant dans le plasmide un gène codant l’ARN polymérase T7 placé sous contrôle d’un système de régulation simple comme le système lac. L’expression des gènes clonés s’effectue alors peu de temps après que la transcription de l’ARN polymérase T7 ait été initiée par un inducteur du gène lac. Cependant, parce que seuls les promoteurs de T7 sont



990 Chapitre 31

Génie génétique et biotechnologie Promoteur trc lacO S/D Site de clonage multiple (polylinker)

lacI

T1 T2

L’insertion des codons adéquats n’est guère envisageable car il faudrait le faire pour tous les codons concernés du gène. Toutefois, si nécessaire, l’ADN synthétique et la mutagénèse dirigée (voir sections 7.8 et 10.18) peuvent être utilisées pour changer des codons sélectionnés dans le gène, pour le rendre plus proche du mode d’usage des codons de l’hôte. Si le gène cloné contient des introns, comme c’est souvent le cas chez les eucaryotes (voir sections 14.7 et 14.8), la protéine adéquate ne sera pas synthétisée si l’hôte est un procaryote. Ce problème peut être contourné par l’utilisation d’ADN synthétique ou par mutagénèse dirigée ou par d’autres méthodes de création de gène sans introns (voir section 31.5).

Les vecteurs eucaryotes Origine de réplication


FIGURE 31.5 Carte génétique partielle du vecteur d’expression pSE420. Ce vecteur est distribué par Invitrogen, société spécialisée en biotechnologie. Un site de clonage multiple (polylinker) contient plusieurs séquences reconnues par des enzymes de restriction pour faciliter le clonage (voir section 10.15). Cette région (ainsi que les gènes clonés) sera transcrite par le promoteur trc, en amont de l’opéron lactose (lacO). En amont du polylinker, se trouve une séquence Shine Dalgarno (S/D) [voir section 7.16]. En aval du polylinker, se situent deux terminateurs de transcription (T1 et T2). Ce plasmide contient également un gène régulateur lacI, ainsi qu’un gène de résistance à l’ampicilline, ces deux gènes étant sous contrôle de leurs propres promoteurs, non représentés.

Plusieurs vecteurs eucaryotes sont disponibles dont les caractéristiques principales comprennent : des origines de réplication pour eucaryotes et procaryotes (requises pour les vecteurs navettes), des marqueurs de sélection pour chaque hôte et un site de clonage multiple (voir figure 31.6). Outre l’utilisation de chromosomes artificiels de levure comme vecteurs de clonage dans Saccharomyces cerevisiae (voir section 15.1), de nombreux vecteurs existent pour le clonage dans la levure. La levure est l’un des rares eucaryotes à posséder un plasmide, appelé le cercle de 2 microns, à l’origine de l’élaboration de nombreux vecteurs. Bien que la levure soit un organisme extrêmement utile pour la génétique et les applications commerciales, il est souvent important

ori EC

reconnus, l’ARN polymérase T7 transcrit uniquement les gènes clonés ; tous les autres gènes de l’hôte restent silencieux (non transcrits) et les cellules cessent leur croissance. De grandes quantités de protéines d’intérêt peuvent être obtenues avec un tel système de contrôle.


t/pa MSE

La traduction du gène cloné Les vecteurs d’expression doivent également être construits pour s’assurer que les ARNm produits soient efficacement traduits. Pour traduire un ARNm, il est essentiel que les ribosomes se lient au bon site et effectuent la lecture avec le bon cadre. À cet effet, les procaryotes possèdent un site de liaison aux ribosomes (séquence de Shine / Dalgarno) [voir section 7.16] et à côté, un codon de départ sur l’ARNm. Les gènes eucaryotes n’ont pas ce site de liaison, qui doit alors être introduit dans un vecteur si un haut niveau d’expression est attendu. Le vecteur de la figure 31.5 possède un tel site. Des ajustements sont souvent réalisés pour assurer un haut niveau de traduction après que le gène a été cloné. Par exemple, l’usage des codons peut être un obstacle. Plus d’un codon existe pour la plupart des 20 acides aminés (voir tableau 7.3) et certains sont plus utilisés que d’autres. L’usage des codons diffère entre les organismes, en partie en fonction des concentrations d’ARNt dans la cellule. Ainsi, si un gène cloné correspond à un mode d’utilisation de codons très différent de celui de l’hôte, la traduction dans l’hôte peut être peu efficace.

p

ori y

t/pa p

Site de clonage multiple (polylinker)

FIGURE 31.6 Caractéristiques d’un vecteur « navette » d’expression procaryote/eucaryote. Le vecteur contient des éléments permettant sa compatibilité avec Escherichia coli et la levure et peut être sélectionné pour chacun de ces organismes : oriEC et oriy, origines de réplication dans E.coli et dans la levure ; Ampr, résistance à l’ampicilline; MSE, marqueur de sélection eucaryote. Autres caractéristiques : p, promoteur ; t/pa, signaux de terminaison de transcription/polyadénylation (voir section 14.8). Les flèches indiquent le sens de transcription.



31.4 Vecteurs spécifiques 991

Le gène rapporteur

Jason A. Kahana et Pamela A. Silver

(a)

Contrôlez vos acquis De nombreux gènes clonés ne sont pas exprimés efficacement dans un nouvel hôte. Les vecteurs d’expression pour hôtes eucaryotes et procaryotes contiennent des gènes augmentant le niveau de transcription du gène cloné et permettant la régulation spécifique de la transcription. Des signaux améliorant l’efficacité de la traduction peuvent également être présents dans un vecteur d’expression. •

Décrivez les éléments d’un vecteur d’expression permettant d’améliorer la transcription d’un gène cloné.

•

Qu’est-ce qu’un gène rapporteur ?


Tout comme des vecteurs spécialisés sont utilisés pour certaines applications, des gènes spécialisés sont utiles au génie génétique. Précédemment, nous avons discuté de l’utilisation de promoteurs et d’opérateurs dans la construction de vecteurs d’expression (voir figures 31.5 et 31.6) et de l’utilité d’un site de clonage dans un gène dont l’activité est facilement détectable. Un système utilisant le gène codant la β-galactosidase est décrit dans un chapitre précédent (voir figure 15.1). L’activité de cette enzyme est facilement détectable. Ainsi, le gène lacZ codant la β-galactosidase est utilisé comme gène rapporteur.

Les gènes rapporteurs sont insérés dans des vecteurs car ils codent des protéines facilement détectables. Il est ainsi possible de mettre en évidence la présence, l’absence et même la localisation précise d’un élément génétique particulier. L’étude de l’expression génétique peut être effectuée en fusionnant un gène rapporteur à d’autres gènes ou à leurs promoteurs. Il existe une pluralité de choix de gènes indicateurs, autres que lacZ. L’enzyme luciférase permet aux cellules l’exprimant de devenir luminescentes (voir figures 1.1d et 8.22). La détection de colonies possédant ce système s’effectue alors simplement sur boîte de Petri. Mais la production et la détection de la luciférase impliquent plus d’un gène et des facteurs annexes. Un autre gène codant une protéine fluorescente, la Green Fluorescent Protein (GFP), a été cloné à partir de la méduse Aequorea victoria. La GFP ne nécessite aucun facteur annexe et a ainsi été utilisée comme indicateur ou cible dans une grande variété d’organismes (voir figure 31.7). Si l’expression du gène d’intérêt cloné est liée à celle de la GFP, l’expression de cette dernière signale par fluorescence que celle du gène cloné s’est effectuée (voir figure 31.7).

(b)


d’utiliser d’autres eucaryotes comme hôtes pour le clonage d’ADN. Ainsi, de nombreux vecteurs de clonage ont été développés pour différents eucaryotes, incluant les plantes (voir section 31.10). Les vecteurs viraux sont couramment utilisés chez les eucaryotes supérieurs comme le virus à ADN SV40 (voir section 16.11), responsable de tumeurs chez les primates mais utilisé comme vecteur de clonage pour les lignées cellulaires humaines. Des dérivés de SV40 n’induisant pas de tumeurs ont été développés pour le clonage et l’expression de gènes de mammifères. L’adénovirus (voir section 16.14) ou le virus de la vaccine (voir section 16.13) sont utilisés comme vecteurs pour le développement de vaccins recombinants (voir section 31.8) pour mammifères. Des vecteurs dérivés du baculovirus, un virus à ADN se répliquant dans les cellules d’insectes, peuvent être utilisés pour obtenir de grandes quantités de produits de gènes clonés. Des vecteurs intégrants, destinés à être maintenus en faible nombre de copies (typiquement une copie par génome), ont été développés pour les eucaryotes, des levures aux cellules de mammifères, ainsi que pour certains procaryotes. Les rétrovirus, dont la rétrotranscription produit un ADN bicaténaire qui s’intègre au chromosome de la cellule hôte, peuvent aussi être utilisés pour l’introduction de gènes dans des cellules de mammifères (voir sections 9.13 et 16.15).

(c)

FIGURE 31.7 La Protéine fluorescente verte (GFP). La GFP peut être utilisée comme détecteur de protéines in vivo. Ci-dessus, le gène codant pour Pho2, une protéine se fixant à l’ADN issue de Saccharomyces cerevisiae, est associé au gène codant pour la GFP. Dans les cellules de levures en division, le gène recombinant est visualisé au niveau du noyau. (a) Cellules exprimant Pho2-GFP en microscopie par contraste d’interférence différentielle et (b) par épifluorescence (voir sections 4.1 et 4.2). (c) Superposition des deux images précédentes.



992 Chapitre 31


m n

31.5 Expression de gènes de mammifères chez des bactéries

Pour pouvoir cloner et exprimer des gènes de mammifères, un des grands défis du génie génétique fut de réussir à détecter le bon clone (voir section 31.3). Mais ensuite, d’autres obstacles existent dont un des plus importants est la présence d’introns (voir section 14.8), spécifiques aux eucaryotes. Ces gènes ne sont pas fonctionnels dans un hôte procaryote à moins d’éliminer les introns. Deux méthodes sont présentées dans ce chapitre dans lesquelles les introns ne sont pas éliminés des gènes clonés mais retirés avant le clonage.

Queue poly-A

L'obtention du gène à partir de la protéine La connaissance de la séquence d’un gène facilite sa détection dans une banque de gènes ou son clonage par PCR grâce à la synthèse d’une molécule d’ADN complémentaire utilisée

3′ A A A A A An

Ajout d’une amorce A A A A A An

5′

ADNc

T T T T

Transcription inverse Amorce poly-T

A A A A A An

5′

T T T T 5′

Boucle en épingle à cheveux

L'utilisation d’ARN messager (ARNm) pour cloner un gène Pour isoler un gène eucaryote fonctionnel, une approche consiste à le cloner via l’ARNm mature qui a l’avantage de ne plus posséder d’introns. Une transcription inverse permet d’obtenir un ADN complémentaire (ADNc) [voir sections 9.13 et 16.15]. Le plus souvent, le tissu exprimant le gène d’intérêt contient de grandes quantités de l’ARNm désiré. Cependant, dans certaines situations, un seul type d’ARNm domine dans un tissu et l’extraction de l’ensemble des ARNm est le point de départ pour le clonage. Dans une cellule de mammifère, 80 à 85 % des ARN sont des ARN ribosomiques (ARNr), 10 à 15 % des ARN de transfert (ARNt) et 1 à 5 % des ARNm. Bien que faiblement abondants, les ARNm sont facilement identifiables par leur queue poly-A à l’extrémité 3’ (voir section 14.8). La séparation des ARNm des ARNr et ARNt à partir d’un extrait cellulaire peut s’effectuer par appariement spécifique sur colonne de chromatographie contenant des fragments poly-T liés à un support cellulosique. Après isolement des ARNm, l’information est convertie en ADN en utilisant la transcriptase inverse, enzyme de la réplication rétrovirale (voir sections 9.13 et 16.15 et figures 31.1 et 31.8). Cette enzyme nécessite une amorce oligo-dT pour débuter la transcription inverse (chez les rétrovirus, l’amorce est un ARNt). Une fois l’amorce hybridée avec l’ARNm, la transcriptase inverse est ajoutée. Comme le montre la figure 31.8, l’ADNc synthétisé possède une boucle en épingle à cheveux à une extrémité qui forme une amorce pour la synthèse d’un brin complémentaire d’ADN. Un clivage de l’ADN double brin résultant est alors effectué par une nucléase spécifique de l’ADN simple brin pour produire l’ADN double brin désiré dont l’un des brins est complémentaire de l’ARNm. Cet ADN double brin code un gène d’intérêt et peut être inséré dans un plasmide ou un autre vecteur en vue d’un clonage. De cette manière, l’ADNc obtenu code la protéine d’intérêt et ne contient pas d’introns. Bien qu’il y ait un codon d’initiation, il n’y a pas de promoteurs car ces derniers ne sont pas transcrits et donc leurs séquences ne sont pas présentes dans l’ARNm (voir section 7.8).

ARNm

5′

3′

Dégradation alcaline de l’ARN T T T T 5′ 3′

ADN polymérase I Nucléase T T T T 5′ 3′

Nucléase spécifique d’ADN simple brin

3′

5′

5′

3′

ADN double brin

Clone FIGURE 31.8 ADN complémentaire (ADNc). Synthèse d’ADNc à partir d’un ARNm, en utilisant une transcriptase inverse de rétrovirus. La queue poly-A est typique des ARN messagers d’eucaryotes (voir section 14.8).

comme sonde (voir section 7.8). Les connaissances sur les séquences en acides aminés d’une protéine peuvent être également utiles pour construire un gène de novo. La traduction inverse permet d’utiliser une séquence d’acides aminés pour synthétiser une sonde nucléique (voir figure 31.9). Cependant, la dégénérescence du code génétique (voir section 7.14) complique ce procédé. La plupart des acides aminés sont codés par plus d’un codon (voir tableau 7.5) et l’usage des codons varie d’un organisme à un autre. Ainsi, pour synthétiser une sonde avec une forte probabilité d’être exactement ou presque exactement complémentaire de l’ARNm ou du gène d’intérêt, le meilleur moyen est de choisir une région codant une protéine riche en acides aminés spécifiques d’un seul codon (par exemple, méthionine, AUG ;



31.5 Expression de gènes de mammifères chez des bactéries 993

tryptophane, UGG) ou au plus deux codons (phénylalanine, UUU, UUC ; tyrosine, UAU, UAC ; histidine, CAU, CAC). Lorsque la séquence complète en acides aminés de la protéine est inconnue, on utilise généralement la séquence terminale, là où le séquençage de la protéine débute. De nombreuses protéines de mammifères (incluant les hormones peptidiques à usage thérapeutique) sont les produits de processus post-traductionnels (voir sections 8.3) et peuvent ainsi être relativement petites. Ainsi, pour synthétiser une hormone peptidique, il est plus pertinent de synthétiser un gène codant uniquement l’hormone finale plutôt que pour la protéine précurseur de plus grande taille dont elle est dérivée. De plus, la synthèse chimique permet la synthèse de gènes modifiés utiles pour produire de nouvelles protéines. Les techniques de synthèse d’ADN permettent de nos jours d’obtenir des gènes codant des protéines de plus de 200 acides aminés (600 nucléotides). La synthèse de gènes dénuée d’introns ne nécessite pas le traitement des ARNm résultant. De plus, des promoteurs et des systèmes de régulation peuvent être ajoutés en amont des séquences codantes et du biais d’usage des codons qu’elles présentent (voir section 7.14). Grâce à ces techniques, un grand nombre de protéines humaines et virales ont été exprimées à haut rendement sous contrôle de systèmes de régulation bactériens. C’est le cas de l’insuline, d’antigènes viraux, de l’interféron et de la somatostatine (voir sections 31.6 et 31.7).

issues d’eucaryotes sont toxiques chez un hôte procaryote engendrant ainsi la mort de l’hôte avant la synthèse de quantités suffisantes du produit. Parfois, lorsque les protéines d’intérêt sont massivement surproduites, elles forment des corps d’inclusion dans l’hôte, facilement purifiables du fait de leur taille mais très difficiles à solubiliser. Dans la plupart des cas, ces corps d’inclusion se forment en raison d’un repliement incorrect des protéines. Une solution à ce problème est d’utiliser un hôte qui surproduit des molécules chaperones qui aident au repliement (voir section 7.17). Cependant, ces problèmes de repliement ne peuvent le plus souvent se résoudre que si la protéine du gène cloné est une protéine de fusion associée à une protéine codée par le vecteur. Cela implique la fusion de deux gènes suivie d’une transcription et d’une traduction en une seule protéine clivable. Les protéines de fusion simplifient la purification de la protéine d’intérêt dès lors que l’on dispose de techniques de purification rapides et de faible coût pour la seconde partie de la protéine de fusion. Plusieurs vecteurs de fusion codant ces protéines sont maintenant disponibles. La « protéine clonée » est libérée de la protéine de fusion après purification par des protéases spéciales ou par traitements chimiques. La figure 31.10 montre un exemple

Ptac Shine/Dalgarno

Repliement et stabilisation des protéines La synthèse d’une protéine dans un hôte peut s’accompagner de problèmes comme une dégradation par des protéases intracellulaires avant de pouvoir l’isoler. De plus, certaines protéines

lacI malE Séquence codant pour le site de clivage par une protéase

Protéine H2N

Met

Trp

Tyr

Glu

His

Lys

Glu

COOH

Codons ARNm potentiels 5′

AUG UGGUAU GAG CAU AAG GAG C A C A A

origine pBR322

3′

Site de clonage multiple (polylinker) lac Z'

Oligonucléotides (sondes ADN potentielles) T A C A C C A T A C T C G T A T T C C T C 5′ T A C A C C A T G C T C G T A T T C C T C 5′ T A C A C C A T A C T T G T A T T C C T C 5′ T A C A C C A T A C T C G T G T T C C T C 5′ Et ainsi de suite Séquence ADN préférée (fondée sur le biais d’usage des codons) T A C A C C A T G C T C G T A T T C C T C 5′ FIGURE 31.9 Déduction de la meilleure séquence d’une sonde oligonucléotidique à partir de la séquence d’acides aminés d’une protéine : traduction inverse. La dégénérescence du code génétique (voir section 7.14) conduit à la synthèse de plusieurs sondes. Si l’usage des codons pour un organisme est connu, il est possible de sélectionner une séquence synonyme préférée. Une exactitude parfaite n’est pas obligatoire, car un faible taux d’erreur est toléré, particulièrement pour les sondes de grande taille.

origine M13


FIGURE 31.10 Vecteurs pour l’expression de gènes de fusion. Ce vecteur, développé par la société New England Biolabs, permet d’insérer un gène au niveau d’un site de clonage multiple (polylinker, voir figure 15.1), associé au gène malE codant une protéine de liaison au maltose. Cette insertion inactive le gène lacZ’ (voir figure 15.1). Le gène de fusion est contrôlé par le promoteur hybride tac (Ptac). Le plasmide contient également le gène lacI codant le répresseur lac. Ainsi, un inducteur doit être ajouté aux cellules pour activer le promoteur tac. La protéine de fusion est aisément purifiée par des méthodes utilisant son affinité pour le maltose. Les deux parties de la protéine de fusion peuvent alors être séparées par une protéase très spécifique (facteur Xa). Le plasmide confère à l’hôte une résistance à l’ampicilline. En plus d’une origine de réplication plasmidique, une origine de M13 est présente. Ce vecteur est donc un « phagemide », pouvant ainsi se propager en tant que plasmide ou bactériophage.



994 Chapitre 31


de vecteur de fusion qui sert également de vecteur d’expression. Les systèmes de fusion peuvent également être utilisés dans un but autre que d’augmenter la stabilité des protéines. En associant des séquences bactériennes codant un peptide signal, la protéine est transportée à travers la membrane cytoplasmique (voir section 7.17). La synthèse ainsi que l’excrétion d’une protéine de mammifère par un système bactérien est alors possible. En utilisant des souches et des vecteurs adéquats, la protéine désirée peut atteindre 200 000 molécules et 40 % des protéines totales dans une cellule.

Contrôlez vos acquis Il est possible d’obtenir un niveau d’expression très élevé de gènes de mammifères dans des hôtes procaryotes. Cependant, les gènes exprimés ne doivent pas contenir d’introns. Ceci peut être obtenu avec une transcriptase inverse qui synthétise de l’ADNc à partir d’un ARNm mature codant la protéine d’intérêt. Cela peut également être obtenu en synthétisant un gène entier à partir de la séquence en acides aminés de la protéine d’intérêt. Les protéines de fusion sont souvent utilisées pour stabiliser ou solubiliser la protéine clonée. •

Quel avantage majeur possède le clonage de gènes de mammifères à partir d’ARNm ou de gènes synthétiques sur l’amplification par PCR et le clonage d’un gène natif ?

•

Comment est fabriquée une protéine de fusion ?

II

APPLICATIONS PRATIQUES DU GÉNIE GÉNÉTIQUE

Seules quelques applications du génie génétique en biotechnologie sont ici présentées, notamment celles d’importance en agriculture et médecine. D’autres applications émergent ou sont en cours de développement comme l’amélioration des fermentations industrielles (voir chapitre 30) et l’utilisation de procaryotes modifiés génétiquement en bioremédiation (voir section 19.18).

31.6 Production d’insuline : les débuts m n de la biotechnologie commerciale La production de protéines humaines est le secteur des biotechnologies le plus rentable. Les protéines de cellules de mammifères ont une très grande valeur pharmaceutique mais elles sont présentes en très faible quantité dans les tissus normaux ce qui rend leur purification extrêmement onéreuse. De plus, même si ces protéines peuvent être produites par des cultures cellulaires (voir section 9.3), c’est une voie beaucoup plus coûteuse et difficile que la production par une culture microbienne à fort rendement. En conséquence, l’industrie de la biotechnologie a mis au point des micro-organismes génétiquement modifiés pour produire ces protéines.

La biologie de l’insuline Les hormones sont de petites protéines indispensables au contrôle métabolique chez les mammifères. Ces molécules sont d’une grande importance thérapeutique, notamment l’insuline, protéine produite dans le pancréas et vitale dans la régulation du métabolisme glucidique. Le diabète juvénile, maladie due à une déficience en insuline, affecte des millions de personnes (voir section 22.15) traitées par des injections ou des administrations orales d’insuline. La structure de l’insuline étant similaire chez la plupart des mammifères, des traitements ont pu être réalisés dans le passé avec de l’insuline isolée de pancréas de bœuf ou de porc. Cependant, ce type d’insuline n’est pas aussi efficace que l’insuline humaine et le procédé de purification est complexe et coûteux. Le clonage du gène de l’insuline humaine dans des bactéries a permis de résoudre ce problème. Le clonage et la production furent d’abord réalisés avec Escherichia coli puis, de nos jours, avec la levure. L’insuline produite est désormais totalement identique à l’insuline purifiée du pancréas humain. La production d’insuline a représenté un véritable challenge pour l’industrie de la biotechnologie. Dans sa forme active, elle est composée de deux polypeptides (A et B) reliés par des ponts disulfures (voir figure 31.11a). Ces deux polypeptides sont codés par des parties séparées du gène de l’insuline. Ce dernier code la préproinsuline, un polypeptide contenant une séquence signal (impliquée dans l’excrétion de la protéine) [voir section 7.17], les polypeptides A et B de l’insuline active et un polypeptide de connexion absent dans l’insuline active. La proinsuline est formée par transformation de la préproinsuline. La conversion finale en insuline implique un clivage enzymatique du polypeptide de connexion.

L'insuline génétiquement modifiée L’insuline étant une protéine relativement petite, le gène entier a pu être synthétisé. Seules 63 bases (soit 21 acides aminés) et 90 bases (soit 30 acides aminés) codent respectivement les chaînes A et B. La proinsuline compte 105 bases additionnelles pour le peptide de connexion (voir figure 31.11b). Une fois les polynucléotides synthétisés et des sites de restriction appropriés ajoutés à chaque extrémité, les polynucléotides ont pu être insérés dans un plasmide. Les gènes d’insuline synthétisés ont été insérés en aval d’un promoteur d’Escherichia coli de telle sorte que le fragment d’insuline soit synthétisé comme partie d’une protéine de fusion (voir section 31.5). L’avantage étant que le produit de cette protéine de fusion est beaucoup plus stable dans E. coli que l’insuline seule. Le bromure de cyanogène entraîne spécifiquement le clivage des chaînes polypeptidiques au niveau des résidus méthionine. En conséquence, un codon spécifique de la méthionine a été ajouté au niveau de la jonction entre le gène de l’insuline et la partie amont du gène de fusion (voir figure 31.11b). Cela permet de séparer l’insuline de la protéine de fusion sans dommage puisque l’insuline ne contient pas de méthionine. Après traitement au bromure de cyanogène, la proinsuline est convertie en insuline par la formation de ponts disulfures, suivie de l’élimination enzymatique du peptide de connexion. Le passage par la proinsuline est nécessaire car elle se replie



31.7 Autres produits et protéines de mammifères 995 FIGURE 31.11 Utilisation du génie génétique pour la production d’insuline humaine par une bactérie. (a) Structure de la proinsuline humaine. Une lettre représente chaque acide aminé de cette protéine (voir figure 3.12). Le peptide apparaissant en jaune doit être éliminé des chaînes A et B pour produire de l’insuline. (b) La synthèse chimique du gène de l’insuline et des séquences de liaison appropriées permet le clonage et l’expression. Les fragments synthétisés ont été liés à un vecteur plasmatique par les sites de restriction EcoR1 et BamH1, afin que les chaînes d’insuline soient formées comme une protéine de fusion (voir section 31.5), avec une portion d’un gène du vecteur (N.B. : le site EcoRI fait partie de la région codante). La séquence codante pour la méthionine a été insérée afin de permettre le clivage chimique des chaînes A et B à partir de la protéine de fusion. En effet, le cyanate de bromure clive spécifiquement au niveau des résidus méthionine, et l’insuline n’en contient pas. L’insertion de deux codons stop en fin de séquence codante détermine la fin de la traduction.

4 6 7 8 9 10

5 L

H

3 Q

S

H 11 L 12 V 13 E 14 A 15 L

75 I

16 Y

76 C

17 L

77 S

21 E 22 R

S

Quelle est l’importance du bromure cyanogène dans la production d’insuline biosynthétique ?

L 56 P 55

82 E S

25 F 26 Y 27 T

Q 54

83

L 53 S 52 G 51 A 50 G 49

N

84

Y

C 85 N 86 COOH

P 48

G

47 G 46 G L 45

P

28 29 K 30

L’insuline humaine a été la première protéine humaine produite commercialement par des bactéries modifiées génétiquement. De nombreuses autres hormones et protéines humaines sont maintenant produites ainsi que de nombreux vaccins recombinants.

•

A 57

80 Q 81 L

23 G 24 F


Pourquoi dans la synthèse d’insuline, le génie génétique peut-il se passer de l’étape de la préproinsuline, mais requiert-il la formation de proinsuline ?

L 58

S

79 T

20 G

•

Protéine de fusion

78 L

19 C

naturellement en amenant face à face les résidus cystéiniques impliqués dans la formation des ponts disulfures (voir figure 31.11a). Un traitement chimique permet de catalyser la formation des ponts disulfures. Le peptide de connexion est alors éliminé par la trypsine et la carboxypeptidase B, deux enzymes protéolytiques n’ayant aucun effet sur le produit final, l’insuline, qui peut être utilisé.

N

67 66 68 65 I G R 69 V 64 E K 70 63 Q Chaîne A Q S 71 C F 62 72 C S 61 73 T G 60 S 74 S E 59

G

18 V

F NH2

V

Chaîne B

C

S

1

2

T

E 44 R V 43 31 R Q 42 32 E G 41 33 A E D L Q V 40 34 39 35 36 37 38

(a) Site EcoR1 . . . Phe

Met

AATTC ATG GTAC Gène de la protéine de fusion

Méthionine clivable Région codant l’insuline

Stop

Stop

TAA TAG ATT AT CCTAG

Site BamH1

m n

(b)

Le génie génétique permet de synthétiser de nombreux produits (voir tableau 31.1), en particulier des hormones et protéines impliquées dans la coagulation sanguine. Par exemple, la TPA (tissue plasminogen activator) est une protéine sanguine capable de dissoudre des caillots sanguins. Son action est importante pour les malades cardiaques et pour les personnes souffrant de troubles circulatoires à cause d’une coagulation excessive. La TPA est ainsi administrée à la suite d’attaques cardiaques, de pontage, de transplantation ou d’interventions chirurgicales pour prévenir le risque d’embolies pulmonaires

dont les conséquences sont très graves. Les maladies cardiaques sont une cause importante de mortalité dans les pays développés, par conséquent la demande de TPA recombinante est très importante. Les facteurs de coagulation VII, VIII, IX sont des protéines importantes dans la formation de caillots sanguins notamment pour les hémophiles qui soufrent d’une déficience pour un ou plus d’un de ces facteurs. De nos jours, des facteurs de coagulation recombinants existent et ont pris une importance considérable sachant que, dans le passé, les hémophiles étaient

31.7 Autres produits et protéines de mammifères



996 Chapitre 31

TABLEAU 31.1


PRODUITS THÉRAPEUTIQUES ISSUS

en réponse à une infection virale (voir section 23.10) ou une activation immunitaire.

DE LA GÉNÉTIQUE

Produit

Fonction

Protéines sanguines Érythropoïétine

Traitement de certains types d’anémies

Facteurs VII, VIII, IX

Agent de coagulation

Activateur tissulaire du plasminogène (TPA)

Dissolution des caillots sanguins

Urokinase

Coagulation sanguine

Hormones humaines Facteur de croissance épidermique

Cicatrisation

Hormone folliculostimulante

Traitement des problèmes de la reproduction

Insuline

Traitement des diabètes

Facteur de croissance du nerf

Traitement possible des troubles dégénératifs neurologiques

Relaxine

Facilitation de l’accouchement

Somatotropine (hormone de croissance)

Traitement de certains types de défauts de croissance et de stature.

Modulateurs de réponse immunitaire Interféron α

Agent antiviral et antitumoral

Interféron β

Traitement des scléroses en plaques

Facteur de stimulation des colonies

Traitement d’infections et de cancers

Interleukine 2

Traitement de certains cancers

Lysozyme

Anti-inflammatoire

Facteur nécrosant de tumeurs

Agent antitumoral, traitement potentiel de l’arthrite

Enzymes de remplacement β-glucocérébrosidase

Traitement de la maladie de Gaucher, maladie neurologique génétique

Enzymes thérapeutiques Désoxyribonucléase humaine I

Traitement de la mucoviscidose

Alginate lyase

Traitement de la mucoviscidose

traités avec du sang humain dont une partie était contaminée par le virus du SIDA. Les facteurs de coagulation recombinants ont éliminé ce risque sanitaire. Nombre de protéines ont des rôles d’agents anticancéreux ou de modulateurs de réponse immunitaire. Parmi celles-ci, les interférons sont des protéines produites par des cellules animales

Les protéines non sanguines Certaines protéines produites par génie génétique sont des enzymes (voir tableau 31.1). La désoxyribonucléase humaine I (human Dnase I) est utilisée dans le traitement de la mucoviscidose, qui entraîne la formation, dans les poumons, de mucus induisant de graves infections dues à Pseudomonas aeruginosa. Les cellules bactériennes forment des biofilms (voir section 19.3) dans les poumons rendant le traitement difficile. La Dnase permet de digérer l’ADN libéré lors de la lyse des cellules bactériennes. L’alginate lyase recombinante est également utilisée chez les patients atteints de cette maladie pour traiter les polysaccharides produits par P. aeruginosa. Comme l’ADN des cellules lysées, ces polymères contribuent à la formation du mucus pulmonaire et leur hydrolyse réduit les symptômes respiratoires. La synthèse d’enzymes et d’hormones non humaines par le génie génétique présente un intérêt commercial par-delà les aspects thérapeutiques (voir section 30.9). Par exemple, la somatotropine bovine recombinante est utilisée aux États-Unis pour augmenter la production laitière (voir section 31.9). La rénine utilisée dans la fabrication de fromage est un produit animal et n’est donc pas consommée par les stricts végétariens, les végétaliens. Mais la rénine recombinante produite en GrandeBretagne pour la production de « fromage végétarien » a été un succès commercial. La mutagénèse dirigée (voir section 10.18) appliquée à des gènes clonés permet l’obtention de nouveaux produits aux propriétés nouvelles. Des molécules telles que les antibiotiques sont synthétisées dans les cellules par des voies biochimiques utilisant une série d’enzymes (voir chapitre 30) qui peuvent être modifiées par génie génétique pour produire une variété d’antibiotiques non naturels, cliniquement efficaces.

Contrôlez vos acquis De nombreuses protéines humaines, autrefois très onéreuses à produire en raison de leurs faibles quantités dans les tissus, sont désormais largement synthétisées à partir d’un gène cloné dans un système d’expression adapté. •

Comparez l’activité de la TPA et des facteurs de coagulation VII, VIII, IX.

•

Expliquez comment une enzyme dégradant l’ADN peut être efficace dans le traitement d’une maladie comme la mucoviscidose.

31.8 Vaccins issus du génie génétique m n Les vaccins sont des suspensions de micro-organismes pathogènes tués ou modifiés qui, lorsqu’elles sont injectées à un animal, induisent l’immunité vis-à-vis de la maladie provoquée (voir sections 22.13 et 22.14). La substance qui provoque la réponse immunitaire étant le plus souvent une protéine, le génie génétique peut être utilisé pour la production de vaccins (voir tableau 31.2).



31.8 Vaccins issus du génie génétique 997

TABLEAU 31.2

QUELQUES VACCINS GÉNÉTIQUES

Maladie

Organisme responsable

Fonction du vaccin

Maladies virales Hépatite A

Virus de l’hépatite A

Prévention d’hépatites infectieuses (voir section 26.11)

Hépatite B

Virus de l’hépatite B

Prévention d’hépatites sériques (voir sections 16.15 et 26.11)

Rougeole

Virus de la rougeole

Prévention des rougeoles (voir section 26.7)

Rage

Virus de la rage

Prévention de la rage (voir section 27.1)

Grippe

Virus de la grippe

Prévention de la grippe (voir section 26.8)

Poliomyélite

Virus de la poliomyélite

Prévention de la poliomyélite (voir sections 16.8, 25.9 et 28.8)

Tétanos

Clostridium tetani

Prévention du tétanos (voir section 27.9)

Diphtérie


Prévention de la diphtérie (voir section 26.3)

Syndromes chlamydiens


Prévention de la maladie pelvienne inflammatoire (voir section 26.13)

Plasmodium vivax

Prévention de la malaria (voir section 27.5)

Maladies bactériennes

Maladies à protozoaires Malaria

Les vaccins recombinants Les techniques actuelles permettent, dans certains cas, de supprimer les gènes de virulence en laissant ceux qui provoquent une réponse immunitaire. Cela permet d’obtenir un vaccin recombinant vivant atténué. Il est également possible d’ajouter des gènes à un virus, ce qui engendrera une immunité spécifique à une maladie virale. Par exemple, un virus recombinant est utilisé en élevage de volailles à la fois contre la variole aviaire (fowlpox, voir section 16.13) [une maladie qui réduit à la fois le gain de poids et la production d’œufs] et à l’encontre de la maladie de Newcastle (maladie virale souvent fatale). Pour ce faire, les gènes de virulence ont été enlevés au virus fowlpox (mais pas ceux qui provoquent la réponse immunitaire), puis des gènes induisant l’immunité vis-à-vis de la maladie de Newcastle lui ont été ajoutés. Il en résulte un vaccin polyvalent sous la forme d’un virus qui confère l’immunité à deux maladies. Le virus de la vaccine, généralement non pathogène pour l’homme (voir sections 16.12 et 16.13), est largement utilisé pour préparer des virus recombinants. Ce type de virus est également appelé vaccin à vecteur. Le clonage dans le virus de la vaccine s’effectue en utilisant un plasmide d’Escherichia coli qui contient un fragment du gène de la thymidine kinase du virus de la vaccine (voir figure 31.12a). Un ADN étranger approprié est inséré dans le plasmide, par exemple un gène de protéine d’enveloppe d’un virus pathogène. Le plasmide recombinant est alors transformé dans une cellule hôte dont le gène de la thymidine kinase est inactivé mais qui a été préalablement infecté par une souche sauvage du virus de la vaccine (voir figure 31.12b). En cas de recombinaison homologue entre l’ADN plasmidique et l’ADN génomique du virus de la vaccine (voir figure 31.12c), des virions recombinants sont obtenus et contiennent le gène de la thymidine kinase inactivé. Sans recombinaison, la thymidine kinase est active et la croissance est inhibée par le 5-bromodeoxyuridine. Cette technique permet de sélectionner les

virions recombinants du fait de leur réplication en présence de cet inhibiteur (voir figure 31.12d). Bien que des virus recombinants n’expriment plus la thymidine kinase, ils peuvent encore infecter les cellules humaines et exprimer les gènes étrangers clonés. Les virus de la vaccine recombinants peuvent porter plusieurs gènes issus de plusieurs virus et constituer ainsi des vaccins polyvalents. Actuellement, les applications sont principalement vétérinaires avec, par exemple, un vaccin contre la rage. Plusieurs vaccins sousunitaires pour l’homme sont actuellement en essai clinique. Les vaccins recombinants semblent à la fois suffisamment bénins et hautement immunogènes pour les êtres humains pour conclure que leur utilisation devrait se généraliser dans les prochaines années.

Les vaccins sous-unitaires Les vaccins recombinants n’ont pas à intégrer l’organisme pathogène en entier. Un vaccin sous-unitaire peut contenir uniquement une protéine spécifique d’un organisme pathogène. Pour les virus, cette protéine est souvent une protéine d’enveloppe, hautement immunogène (voir section 22.13), qui est purifiée et utilisée pour provoquer une réponse immunitaire rapide et élevée. Ce type de vaccin est actuellement très répandu car les technologies de l’ADN recombinant permettent de produire de grandes quantités de protéines immunogènes sans risque de présence de l’organisme pathogène. La production d’un vaccin sous-unitaire comprend les étapes suivantes : fragmentation de l’ADN viral par des enzymes de restriction, clonage de gènes de protéines de l’enveloppe virale dans un vecteur approprié, ajout de promoteurs, cadre de lecture et sites de fixation du ribosome qui conviennent, puis réinsertion et expression des gènes viraux dans un microorganisme. Parfois, seuls certains domaines de la protéine sont exprimés puisque les cellules immunitaires et les anticorps ne réagissent qu’avec de petites parties des protéines (voir section 22.5).



998 Chapitre 31

Génie génétique et biotechnologie Fragment du gène de la thymidine kinase du virus de la vaccine

Plasmide recombinant

Plasmide

(a)

ADN étranger

(b)

Gène sauvage de la thymidine kinase

ADN d’une souche sauvage du virus de la vaccine

Le futur des vaccins recombinants Infection

Transfection

Cellules sans thymidine kinase Pas de recombinaison


ADN recombinant de la vaccine (c)

ADN de souche sauvage de la vaccine

Croissance des cellules en présence de 5-bromodésoxyuridine Virions recombinants

sous-unitaire recombinant autorisé pour l’homme : le gène codant une protéine de surface du virus de l’hépatite B a été cloné et exprimé dans la levure. Les cellules d’insectes et de mammifères sont souvent utilisées comme hôtes pour préparer ces vaccins recombinants. Pour obtenir un mode de glycosylation correct ou d’autres modifications des protéines, il est souvent souhaitable d’utiliser un hôte proche de l’homme. Cependant, ces vaccins peuvent aussi être produits dans les plantes (voir section 31.10), qui, étant des eucaryotes, réalisent usuellement une glycosylation convenable.

Pas de croissance Infection humaine, l’expression de protéines étrangères et provoque la réponse immunitaire

(d) FIGURE 31.12 Production de virus recombinant de la vaccine et utilisation comme vaccin recombinant. (a) Un ADN étranger est inséré dans un plasmide contenant un fragment du gène viral de la thymidine kinase. (b) Formation d’un plasmide recombinant. (c) Le plasmide recombinant est utilisé pour transfecter des cellules hôtes préalablement infectées avec la souche sauvage de la vaccine. En cas de recombinaison, l’ADN viral recombinant peut être produit. (d) Les cellules sont mises en présence de 5-bromodésoxyuridine, toxique pour les cellules possédant une thymidine kinase active. Seuls les virions recombinants se développent dans ces conditions. Si les virions recombinants contiennent des gènes pour d’autres protéines virales d’envellope, ces derniers peuvent êtres exprimés.

L’utilisation d’Escherichia coli comme hôte de clonage entraîne souvent une faible immunité et donc une protection insuffisante. En effet, lors de la réplication du virus dans une cellule animale, beaucoup de protéines d’enveloppe subissent des modifications post-traductionnelles, habituellement une glycosylation (réaction d’addition d’un glucide), nécessaires pour que ces protéines soient immunologiquement actives. Or, les protéines recombinantes produites par des bactéries ne sont pas glycosylées. Pour résoudre cette difficulté, des hôtes eucaryotes sont utilisés. Ce fut le cas pour le premier vaccin

Les vaccins recombinants issus du génie génétique devraient probablement se développer dans les prochaines années. Premièrement parce que les vaccins recombinants sont plus sûrs que les vaccins normaux constitués de virus atténués ou tués. La maladie ne risque pas d’être transmise lors de la vaccination. Deuxièmement parce qu’ils sont plus reproductibles car leur composition génétique peut être précisément contrôlée. Troisièmement parce qu’ils peuvent être administrés à des doses élevées sans danger ni effets secondaires. De plus, dans des cas comme la grippe, le temps d’action est primordial. Les vaccins recombinants qui utilisent les gènes de l’hémagglutinine du virus de la grippe (voir section 16.9) peuvent être préparés en 2 à 3 mois comparés aux 6 à 9 mois de préparation des vaccins normaux. La vitesse de préparation d’un vaccin participe à la lutte contre les épidémies provoquées par de nouvelles souches virales, ce qui est fréquent pour la grippe (voir section 26.8). Enfin, les vaccins recombinants sont usuellement beaucoup moins onéreux que ceux préparés par les méthodes traditionnelles, ce qui constitue aussi un avantage en matière de santé publique.

Les vaccins à ADN Bien que les vaccins traditionnels et recombinants aient été extrêmement efficaces pour lutter contre diverses maladies infectieuses, ces vaccins sont parfois difficiles à produire – comme dans le cas du paludisme (voir section 27.5) et du SIDA (voir section 26.14). Dans l’attente de progrès avec les techniques « standard » du génie génétique, une nouvelle voie passionnante est apparue, celle des vaccins à ADN aussi nommés vaccins génétiques. Les vaccins à ADN utilisent le matériel génétique du pathogène (fragments définis du génome ou gènes codant des protéines immunogènes) pour immuniser un individu. Les gènes clés sont clonés dans un plasmide ou dans un vecteur viral et administrés par injection. Quand l’ADN est intégré dans les cellules animales, il est soit éliminé, soit transcrit, puis traduit. Dans ce dernier cas, si la protéine est immunogène, l’animal sera immunisé contre le pathogène. Ainsi, un vaccin ADN provoque une réponse immunitaire contre les protéines codées. L’ADN lui-même n’est pas immunogène. De nombreux vaccins à ADN sont en cours d’essais cliniques tandis que d’autres sont en phase de développement. Ces vaccins possèdent l’avantage d’être à la fois sans risque et bon marché. À la différence des vaccins viraux, un vaccin à ADN échappe à la surveillance du système immunitaire de l’hôte car



31.9 Génie génétique appliqué à la génétique animale et humaine 999

les ADN sont faiblement immunogènes, ceci permet d’éviter des effets auto-immunitaires (voir section 22.15).

Contrôlez vos acquis De nombreux vaccins recombinants ont été produits : ils comprennent les vaccins recombinants vivants, à vecteur, sous-unitaires et à ADN. •

Expliquez pourquoi les vaccins recombinants présentent moins de risques que les vaccins traditionnels.

•

Présentez les différences entre un vaccin recombinant vivant atténué, un vaccin à vecteur, un vaccin sous-unitaire et un vaccin à ADN.

31.9 Génie génétique appliqué m n à la génétique animale et humaine Cette partie présente quelques applications du génie génétique pour les animaux et les humains. Certaines de ces applications concernent des produits mais la plupart ont pour objet la compréhension des fonctions des gènes chez les mammifères et le traitement des maladies génétiques.

Les animaux transgéniques La présence permanente de gènes étrangers dans des organismes animaux grâce à la technologie de l’ADN recombinant désigne les animaux transgéniques. Ces organismes ont pris une grande importance en recherche biomédicale pour l’étude de la régulation génétique et de la biologie du développement. Une application consiste à accroître la productivité ou la résistance à une maladie chez l’animal – comme dans le cas des plantes transgéniques utilisées en agriculture. Les animaux transgéniques peuvent également être utilisés pour produire des protéines d’intérêt pharmaceutique par un procédé appelé pharming. C’est notamment le cas pour la production de protéines humaines nécessitant des modifications post-traductionnelles comme certaines enzymes de la coagulation sanguine (voir section 31.7). Le génie génétique a permis d’obtenir de grandes quantités de protéines dans le lait en les faisant sécréter en grandes quantités par les glandes mammaires. Les protéines obtenues de cette manière comprennent l’antitrypsine alpha 1 (utilisée dans le traitement de maladies pulmonaires) produite par des moutons et la TPA (tissue plasminogen activator, utilisée pour dissoudre les caillots sanguins, voir section 31.7) produite par des chèvres.

La génétique humaine La génétique conventionnelle qui repose sur les croisements et la mutagénèse n’était évidemment pas applicable à l’homme. Par conséquent, avant l’ère du génie génétique, nos connaissances sur la génétique humaine étaient en retard sur les connaissances de la génétique de nombreux autres organismes. Cependant, la technologie de l’ADN recombinant a permis le développement d’applications en génétique

humaine, notamment pour les techniques d’identification et en médecine. Une première ébauche de la séquence du génome humain est parue en 2000 (voir chapitre 15). Dès lors, les techniques du génie génétique ont été largement utilisées pour identifier les individus par un procédé appelé empreinte ADN (voir Focus, Empreinte ADN). Cependant, un objectif majeur du séquençage du génome humain était de comprendre davantage les maladies génétiques humaines pour mieux les traiter et les soigner. La technologie de l’ADN recombinant, couplée à des études génétiques conventionnelles, permet de localiser des imperfections au niveau d’un ou d’une partie d’un chromosome. Il est alors possible de cloner la région contenant un défaut génétique et de comparer sa séquence à celle d’un gène normal. De nombreux gènes, dont ceux sont impliqués dans la maladie d’Huntington, les hémophilies de type A et B, la mucoviscidose, la dystrophie musculaire de Duchenne, la sclérose en plaques et le cancer du sein, ont pu être localisés par ces techniques et les mutations identifiées. Comment le génie génétique peut-il être utilisé pour traiter ou même guérir ces maladies ?

La thérapie génique En thérapie génique, un gène non fonctionnel ou qui fonctionne mal chez un individu est remplacé par un gène fonctionnel. De nombreux obstacles existent, notamment pour atteindre les cellules concernées et pour réussir la transfection. La première maladie génétique pour laquelle une technique de thérapie génique a été autorisée est une forme du déficit immunitaire combiné sévère (DICS) due à l’absence d’adénosine déaminase (ADA). C’est une enzyme impliquée dans le métabolisme des purines, dans les cellules de moelle osseuse dont l’absence empêche le développement du système immunitaire. Le procédé consiste à utiliser un rétrovirus comme vecteur pour insérer une copie non mutée du gène de l’ADA dans les lymphocytes T (voir section 22.1) prélevés sur le patient et à réintroduire ces cellules « corrigées » dans son organisme. (Le rétrovirus compte un gène marqueur de résistance à la néomycine, ce qui permet de sélectionner et d’identifier les cellules porteuses du rétrovirus inséré.) Cependant, les lymphocytes ayant une faible durée de vie, cette thérapie doit être répétée tous les 1 à 2 mois. Des essais ont été effectués pour insérer le gène au niveau des cellules souches de la moelle osseuse (voir section 22.1) afin de guérir véritablement cette maladie. Un succès a pu être obtenu dans au moins un cas de DICS. Plusieurs autres traitements, certains utilisant d’autres vecteurs viraux, sont actuellement évalués avec des niveaux de réussite variables. Depuis la première tentative de thérapie génique en 1990 avec l’ADA, il n’y a pas eu de progrès notable au plan pratique jusqu’en 2000. Pour une autre forme du DCIS, impliquant un gène différent, la thérapie génique a été un succès pour trois patients, ce qui ouvre une perspective de traitement pour cette forme rare de la maladie. Bien que la thérapie génique ait un potentiel d’applications pratiques énorme, les applications effectives restent éloignées. Certaines des difficultés actuelles concernent les vecteurs. Bien que la transduction avec des vecteurs rétroviraux permette une intégration stable du gène, le site d’insertion est



1000 Chapitre 31


imprévisible, la quantité d’ADN cloné est limitée et l’expression du gène cloné souvent temporaire. De plus, les vecteurs ont un pouvoir infectieux limité et sont rapidement inactivés dans l’hôte. Beaucoup de vecteurs non rétroviraux comme les adénovirus (voir section 16.14) rencontrent les mêmes problèmes. Cependant, de nouveaux vecteurs, comme les chromosomes artificiels humains et des versions modifiées du virus du VIH (voir sections 9.13 et 16.15), semblent prometteurs. En thérapie génique, le gène défectueux n’est pas remplacé mais la bonne copie du gène est simplement intégrée dans le génome humain. Actuellement, le remplacement de gènes au niveau de cellules germinales peut être effectué sur des animaux de laboratoire. Outre les difficultés expérimentales d’une transposition à l’homme, des essais sur des cellules germinales humaines soulèveraient de sérieuses questions éthiques.

Contrôlez vos acquis Le génie génétique est utilisé pour créer des animaux transgéniques capables de produire des protéines d’intérêt pharmaceutique. Les techniques du génie génétique sont également utilisées pour identifier des individus par empreinte ADN. Un des grands espoirs du génie génétique est la thérapie génique dont le but est de fournir des copies fonctionnelles d’un gène à un individu pour traiter sa maladie génétique. •

Qu’est-ce que le pharming ?

•

Qu’est-ce qu’une VNTR (répétition en tandem en nombre variable) ?

•

Une personne traitée avec succès par thérapie génique possédera toujours une copie défectueuse du gène. Expliquez.

31.10 Génie génétique en production m n végétale : les plantes transgéniques Le génie génétique permet de modifier l’ADN de plantes et ensuite de transformer des cellules de plantes avec l’ADN par des méthodes telles que l’électroporation ou le canon à particules (voir section 31.2). Une alternative consiste à utiliser des vecteurs d’Agrobacterium tumefaciens qui peuvent transférer de l’ADN directement dans certaines plantes (voir section 19.21). Il est possible d’utiliser des techniques de culture de tissus végétaux pour sélectionner des clones de cellules végétales génétiquement modifiées par des techniques in vitro puis de produire des plantes entières à partir de ces cultures cellulaires grâce à des traitements appropriés. Ces plantes transgéniques sont connues du public comme des organismes génétiquement modifiés (OGM). Bien que les techniques de production de plantes ou d’animaux transgéniques (voir section 31.9) soient identiques à celles qui sont utilisées pour obtenir des micro-organismes exprimant un gène étranger, le terme « transgénique » est réservé aux organismes pluricellulaires.

Le plasmide Ti et les plantes transgéniques Agrobacterium tumefaciens est une bactérie Gram négatif pathogène de plantes qui contient le plasmide Ti responsable de sa virulence. Le plasmide contient des gènes qui mobilisent l’ADN à transférer à la plante (voir section 19.21). Le fragment de ce plasmide transféré à la plante est nommé ADN-T, les extrémités de sa séquence sont essentielles au transfert. Un système de transfert de gènes aux plantes à deux plasmides, appelé vecteur binaire, contient les séquences de chaque extrémité de l’ADN-T qui entourent le site de clonage ainsi qu’un marqueur de résistance à un antibiotique utilisable dans les plantes. Ce type de vecteur contient également une origine de réplication qui lui permet de se répliquer dans Escherichia coli et A. tumefaciens ainsi qu’un autre marqueur de résistance à un antibiotique exprimé dans les bactéries (voir figure 31.13). L’ADN cloné est inséré dans le vecteur qui est ensuite utilisé pour transformer E. coli, puis transféré à A. tumefaciens par conjugaison. Ce vecteur de clonage ne possède pas les gènes nécessaires pour le transfert de l’ADN-T à la plante. Par conséquent, la bactérie Agrobacterium, qui sert au transfert, doit contenir la seconde partie du vecteur binaire mais ne possède pas les gènes responsables de la maladie. Cet autre plasmide contient les gènes de virulence (vir) d’un plasmide. Le transfert d’ADN à la plante est dirigé, mais la maladie n’est pas provoquée. Ce plasmide désarmé, appelé D-Ti, fournit tous les gènes nécessaires au transfert de l’ADN-T du vecteur de clonage. L’ADN cloné et le marqueur de résistance à la kanamycine du vecteur peuvent être mobilisés par D-Ti et transférés dans une cellule végétale (voir figure 31.13). Après recombinaison avec un chromosome de l’hôte, l’ADN étranger peut être exprimé et conférer de nouvelles propriétés à la plante. L’utilisation d’A. tumefaciens a permis la culture de nombreuses plantes transgéniques (dicotylédones) comme la tomate, la pomme de terre, le soja, la luzerne et le coton mais également d’arbres transgéniques comme le noyer et le pommier. Concernant les monocotylédones, cette technique est apparue plus difficile et a laissé la place à d’autres plus efficaces comme le canon à ADN (voir section 31.2).

La résistance aux herbicides et insectes Plus d’un millier d’essais au champ sur plus de trente espèces de plantes différentes ont été menés ces dernières années. Le premier champ génétiquement modifié fut une culture de tabac en Chine en 1992. En 2000, plus de 44 millions d’hectares de champs ont été plantés. Parmi eux, 58 % de soja, 23 % de maïs, 12 % de coton et 6 % de colza. La quasi-totalité des plants de soja et de colza génétiquement modifiés sont résistants aux herbicides tandis que les plants de coton et de maïs sont résistants aux herbicides et/ou aux insectes. Le génie génétique produit des plantes résistantes à un herbicide de sorte qu’elles ne soient pas tuées lors de l’application du produit phytosanitaire. De nombreux herbicides inhibent l’activité d’une enzyme ou d’une protéine nécessaire à la croissance – comme le glyphosate qui inhibe l’activité d’une enzyme nécessaire à la formation d’acides aminés aromatiques. Un tel herbicide élimine les adventices et les plantes cultivées et doit donc être utilisé comme « herbicide de préémergence »



31.10 Génie génétique en production végétale : les plantes transgéniques 1001

FOCUS

Empreinte ADN

Les techniques de génétique moléculaire et génie génétique peuvent être utilisées pour différencier des organismes très proches, y compris au sein de l’espèce humaine, par un procédé dit d’empreinte ADN. Les organismes eucaryotes supérieurs possèdent des séquences d’ADN répétées en très grand nombre, dispersées dans le génome et classées en familles. Après clonage et séquençage, un type de ces séquences est apparu comme variant en fonction du nombre de répétitions : les séquences répétées en tandem ou VNTR (variable number of tandem repeats). La figure 1.a montre que l’utilisation des VNTR permet de distinguer deux allèles d’un chromosome eucaryote qui ne diffèrent que par le nombre de copies des séquences répétées présentes. Depuis que les VNTR ont été séquencées, on connaît les sites de restriction qui ne sont pas présents dans un VNTR particulier. La digestion par

EcoRI

Allèle 1

Allèle 2

une telle enzyme libère le VNTR complet et intact. Lorsque l’ADN de deux chromosomes qui diffèrent par le nombre de séquences répétées au niveau d’un site particulier est digéré par une enzyme de restriction, les fragments obtenus présentent des différences de taille. Ce polymorphisme de longueur des fragments de restriction ou RFLP (restriction fragment lenght polymorphism) peut être mis en évidence par Southern blot, après séparation sur gel d’électrophorèse (voir section 7.7) avec une sonde spécifique (réalisée à partir des séquences VNTR clonées). Afin d’augmenter la spécificité de la détection, il est possible de mettre en évidence l’ADN digéré pour plusieurs VNTR différents. Ainsi, la probabilité d’identification d’un individu particulier à partir de deux échantillons d’ADN différents est particulièrement élevée. Lorsque la quantité d’ADN d’un échantillon est extrêmement faible, la PCR

VNTR

EcoRI

– Digestion de l’ADN, électrophorèse,

EcoRI

EcoRI

VNTR Allèle 1

Allèle 2

(b)

Gel

puis hybridation avec une sonde Fragments de petite taille

(a)

Amorce

devient un outil essentiel. De plus, cette technique offre une autre méthode d’empreinte ADN sans emploi d’enzymes de restriction (voir figure 1.b). Cela implique de connaître les séquences entourant un site VNTR afin de synthétiser des amorces spécifiques. Les bandes obtenues sont alors séparées sur gel d’électrophorèse en fonction de leur taille (nombre de répétitions). En analysant plusieurs VNTR différents, un profil unique peut être obtenu pour chaque individu. Les VNTR ne se restreignent pas aux organismes supérieurs. Bacillus anthracis, une espèce bactérienne responsable de la maladie du charbon et utilisée comme arme biologique (voir sections 25.11 et 25.13), contient plusieurs VNTR différents, ce qui permet l’identification de souches spécifiques et leur traçabilité. Cela permet de disposer des preuves et de rechercher l’origine des souches utilisées lors d’actes bioterroristes.

PCR,

+ –

Amorce et identification sur gel +

Figure 1 Empreinte ADN (a) Deux allèles différents issus d’une région d’un chromosome ; ils ne diffèrent que par le nombre de répétitions VNTR. L’ADN des cellules contenant ces chromosomes est coupé par l’enzyme de restriction EcoR1 (qui ne coupe pas les VNTR), puis les fragments sont séparés sur gel d’agarose (les fragments courts se déplacent plus loin que les longs). Les fragments contenant les VNTR sont ensuite identifiés après hybridation par Southern Blot, avec une sonde spécifique des VNTR. La figure représente le cas où les deux individus possèdent des allèles différents. Dans le cas inverse, une seule bande aurait été observée. (b) Les mêmes allèles, en utilisant des amorces spécifiques pour amplifier les VNTR par PCR. Les produits de PCR peuvent alors être directement introduits dans un gel sans utilisation d’enzymes de restriction.

c’est-à-dire avant que la plante cultivée n’émerge du sol. Un gène codant une enzyme de résistance, issu d’Agrobacterium, a été cloné, modifié pour s’exprimer dans des plantes cultivées et transféré dans des plantes de grandes cultures – telles que le soja – qui deviennent alors résistantes à l’herbicide (voir

figure 31.14). Le soja manipulé génétiquement est maintenant largement cultivé aux États-Unis. Le génie génétique permet également de protéger les plantes d’une infection virale. Par exemple, lorsque des plantes transgéniques expriment un gène de synthèse de protéine de surface



1002 Chapitre 31


Plasmide Ti non virulent

Région mobile Résistance à la kanamycine

Résistance à la streptomycine (a)

ADN étranger

Chromosomes

D-Ti

Transfert par conjugaison

Origine de réplication d’A. tumefaciens Origine de réplication d’E. coli

Transfert aux cellules de plantes

E. coli

Régénération de plantes transgéniques à partir de cellules

Noyau A. tumefaciens

(b)

(c)

(d)

Cellule de plante

(e)

FIGURE 31.13 Production de plantes transgéniques en utilisant un vecteur binaire Agrobacterium tumefaciens. (a) Le vecteur de clonage de plante contient l’ADN étranger (en jaune) et deux extrémités de l’ADN-T (en rouge), les origines de réplication d’ E. coli et d’A. tumefaciens (en mauve), et des gènes de résistance à la streptomycine et à la kanamycine (sélectionnés pour les plantes). (b) Le vecteur est introduit dans E. coli pour le clonage, puis transféré dans A. tumefaciens par conjugaison. (c) La plasmide Ti dont certains gènes de virulence ont été éliminés est utilisé pour transférer le vecteur à la plante. (d) Cependant, pTi peut toujours mobiliser la région contenant l’ADN-T et ainsi permettre le transfert dans les cellules végétales en culture. Des plantes transgéniques peuvent être obtenues à partir des cellules recombinantes. Les détails du transfert de l’ADN d’A. tumefaciens aux plantes sont visibles à la section 13.21 et aux figures 13.55 à 19-57.

d’un virus, alors elles deviennent résistantes à une infection par ce virus.

La résistance aux insectes : toxine Bt

Stephen R. Padgette, Monsanto Company

Concernant la résistance aux insectes, un exemple largement répandu est l’utilisation de gènes de la bactérie Bacillus thuringiensis codant une protéine, toxique pour les mites et les larves de papillons, appelée toxine Bt (voir section 12.20). Certaines souches de cette bactérie produisent d’autres protéines toxiques pour les larves de mouches et les moustiques. Pour favoriser l’utilisation de la toxine Bt en agriculture pour le contrôle des insectes nuisibles, une approche consiste à développer une seule et même toxine efficace contre de

FIGURE 31.14 Plantes transgéniques et résistance aux herbicides. La photographie montre une portion de champ de soja traitée au Roundup, un herbicide à base de glyphosate produit par la société Monsanto. À droite, des plants de soja normaux et à gauche des plants génétiquement modifiés pour exprimer une résistance au glyphosate.

nombreux types d’insectes. C’est envisageable car la toxine possède des domaines de toxicité et de spécificité différents. Le domaine de toxicité est très conservé chez toutes les toxines Bt. Les biologistes moléculaires peuvent alors produire un gène qui code le domaine de toxicité et pour un domaine de spécificité parmi ceux qui existent de façon à disposer d’une série de toxines, chacune adaptée à une plante et un type de parasite précis. Le transfert de gène dans le génome de la plante assure expression et stabilité. Ainsi, le gène de la toxine Bt cloné dans un vecteur plasmidique sous contrôle d’un promoteur ARNr chloroplastique, puis transféré dans les chloroplastes d’une plante de tabac par bombardement de particules (voir section 31.2), exprime la protéine à des niveaux extrêmement toxiques pour les larves d’un grand nombre d’espèces (voir figure 31.15). Bien que cette stratégie se soit avérée efficace, des cas de résistance d’insectes ont été rapportés. La résistance aux insecticides et aux herbicides est un problème usuel en agriculture dont les produits du génie génétique ne sont pas épargnés. Il en résulte que de nombreuses approches doivent être mises en œuvre dans la lutte contre les ravageurs des cultures et que la toxine Bt ne représente qu’un outil parmi d’autres. Cependant, les plantes résistantes à la toxine Bt sont toujours largement cultivées aux États-Unis.

Les autres applications de la biotechnologie végétale Outre le développement de plantes résistantes, le génie génétique peut être utilisé pour mettre au point des plantes transgéniques répondant aux exigences des consommateurs. Par exemple, aux États-Unis, le premier aliment génétiquement modifié mis sur le marché fut une tomate à détérioration retardée. Les plantes transgéniques peuvent aussi être utilisées pour synthétiser des produits pharmaceutiques ou commerciaux à l’instar des micro-organismes (voir section 31.6) et



Questions 1003

Kevin McBride, Calgene, Inc.

(a)

(b) FIGURE 31.15 Plantes transgéniques et résistance aux insectes. (a) Résultats de deux essais afin de déterminer l’effet de larves de vers sur des feuilles de plantes de tabac. (b) Résultats d’essais similaires, mais sur des feuilles de plantes de tabac transgéniques exprimant une toxine Bt dans leurs chloroplastes.

des animaux (voir section 31.9). Par exemple, des plantes cultivables, comme la tomate et le tabac, ont été modifiées pour produire différentes molécules et par exemple l’interféron humain. Les cultures transgéniques peuvent aussi être utilisées pour la synthèse d’anticorps humains à bon marché. Ces anticorps potentiellement utiles comme médicaments anticancéreux ou antiviraux sont appelés « planticorps ». Les plantes peuvent également être utilisées dans la synthèse de vaccins. Par exemple, un virus recombinant de la mosaïque du tabac (voir section 16.7) a été modifié pour que les protéines de surface contiennent des antigènes de Plasmodium vivax, un organisme responsable du paludisme (voir section 27.5). Ce

virus recombinant pourrait être utilisé pour produire un vaccin contre le paludisme en grande quantité et à faible coût. Une autre application concerne les vaccins comestibles, actuellement en cours de développement ; de tels vaccins pourraient immuniser des individus contre les maladies provoquées par des bactéries entériques responsables de maladies comme le choléra et la diarrhée (voir section 28.5). Bien que les consommateurs aux États-Unis aient bien accepté l’apparition de champs d’organismes génétiquement modifiés, des difficultés se sont présentées dans certains pays européens qui ont interdit toute culture et toute importation. Ces cas prouvent que la connaissance scientifique et le succès commercial potentiel ne garantissent pas forcément l’acceptation du public vis-à-vis d’un produit agricole transformé. Une prise de conscience croissante des consommateurs a stabilisé les surfaces de cultures OGM aux États-Unis ces dernières années. Des interrogations s’expriment sur les effets secondaires des gènes étrangers sur les humains ou les animaux domestiques ou même sur le transfert éventuel de gènes de plantes transgéniques aux plantes naturelles. Bien que les évidences de difficultés soient maigres en l’état actuel, l’opinion publique a réussi à réduire la vitesse d’entrée des plants transgéniques sur le marché.

Contrôlez vos acquis Le génie génétique appliqué au végétal est utilisé pour le développement de plantes résistantes à des maladies, pour augmenter la qualité des denrées végétales et comme source de protéines recombinantes et de vaccins. Le plasmide Ti d’Agrobacterium tumefaciens est le vecteur de clonage le plus utilisé car capable de transférer l’ADN directement dans les cellules de plantes. Les plantes commerciales dont les génomes ont été modifiés par des techniques de génétique in vitro sont appelées OGM. •

À quelle forme de transfert de gène bactérien le transfert d’ADN aux plantes via le plasmide Ti ressemble-t-il (voir chapitre 10) ?

•

Qu’est-ce qu’une plante transgénique ?

QUESTIONS 1. Le génie génétique découle de nombreuses techniques de génétique in vitro. Décrivez les techniques de clonage moléculaire utilisées en incluant les termes vecteur de clonage, endonucléase et transformation (voir section 31.1). 2. Décrivez deux hôtes de clonage procaryotes ainsi que les avantages et inconvénients de chacun (voir section 31.2). 3. Comment pouvez-vous identifier une colonie contenant un gène cloné si sa séquence est connue ? Comment faire si la séquence n’est pas connue mais que vous possédez la protéine purifiée codée par ce gène (voir section 31.3) ?

4. Décrivez les points communs et les différences entre les vecteurs d’expression, navettes et d’intégration (voir section 31.4). 5. Comment est utilisé le bactériophage T7 dans l’expression de gènes d’Escherichia coli et quelles fonctions doit posséder ce système de régulation (voir section 31.4) ? 6. Expliquez pourquoi le fait de commuter la régulation est souhaitable pour la production à grande échelle d’une protéine (voir section 31.5). 7. Quel produit issu de la biotechnologie fut le premier « succès commercial » ? Quel est le gène qui le synthétise (voir section 31.6) ?



1004 Chapitre 31


8. Qu’est-ce qu’un vaccin sous-unitaire et pourquoi est-il considéré comme plus sain qu’un vaccin viraal atténué (voir section 31.7) ? 9. Comment le génie génétique a-t-il profité du traitement de la mucoviscidose (voir section 31.8) ?

10. Quelles sont les différences entre les plantes et animaux transgéniques et les plantes et animaux modifiés par des techniques de culture conventionnelles (voir section 31.9) ? 11. Qu’est-ce que le plasmide Ti et comment est-il utilisé par le génie génétique (voir section 31.10) ?

PROBLÈMES 1. Vous devez élaborer un vecteur d’expression plasmidique approprié pour le clonage moléculaire dans un organisme d’intérêt industriel. Quelles caractéristiques doit posséder ce plasmide ? Listez les étapes à effectuer pour le développer. 2. Vous venez de déterminer la séquence d’un promoteur fort sur Escherichia coli et vous souhaiteriez l’incorporer dans un vecteur d’expression. Par quelles étapes allez-vous passer ? Quelles précautions faut-il prendre pour s’assurer que ce promoteur fonctionnera ?

3. Vous venez de découvrir une protéine de souris pouvant avoir des effets anticancéreux, mais elle est produite en très faible quantité. Quel protocole allez-vous utiliser pour produire cette protéine ? Quel hôte de clonage souhaitez-vous choisir et pourquoi ? Quel hôte souhaitez-vous choisir pour exprimer la protéine et pourquoi ? 4. La thérapie génique est utilisée pour le traitement de maladies génétiques. Cependant, ces personnes seront tout de même susceptibles de transmettre ces maladies à leur descendance. Expliquez.



Annexe 1 Bioénergétique microbienne : les calculs L’annexe 1 est une aide pour le calcul des variations d’énergie libre qui accompagnent les réactions chimiques effectuées par les micro-organismes. Elle définit les conditions nécessaires à la réalisation de tels calculs. La connaissance de l’état redox, de l’état atomique, de l’équilibre des charges et d’autres facteurs est nécessaire pour le calcul de l’énergie libre.

I.

Définitions 1. ∆G0 = variation d’énergie libre standard d’une réaction à la pression de 1 atm et à la concentration de 1 M ; ∆G = variation d’énergie libre dans des conditions données ; ∆G0’ = variation d’énergie libre dans des conditions standard à pH 7. 2. Calcul du ∆G0 d’une réaction chimique à partir de l’énergie libre de formation, Gf0, des produits et des réactifs : ∆G0 = Σ∆Gf0 (produits) – Σ∆Gf0 (réactifs) Il faut additionner les ∆Gf0 des produits, les ∆Gf0 des réactifs, et soustraire le deuxième résultat du premier. 3. Pour les réactions produisant de l’énergie et impliquant H +, il faut utiliser les conditions cellulaires (pH 7) à la place des conditions standard (pH 0) : ∆G0’ = ∆G0 + m∆Gf0 (H+) où m est le nombre net de protons de la réaction (m est négatif quand il y a plus de protons consommés que de protons formés) et ∆Gf0 (H+) est l’énergie libre de formation d’un proton à pH 7 (–39,83 kJ) et à 25 ˚C. 4. Effet des concentrations sur ∆G : avec des substrats solubles, le rapport de la concentration des produits formés sur la concentration des substrats exogènes utilisés est généralement égal ou supérieur à 10–2 au début de la période de croissance et, égal ou inférieur à 10–2 à la fin de la période de croissance. À partir de la relation entre ∆G et la constante d’équilibre (voir paragraphe 8), on peut vérifier que la valeur de ∆G dans des situations réelles diffère de la valeur de ∆G en conditions standard d’au moins 11,7 kJ ; ainsi, en première approximation, les valeurs de l’énergie libre standard peuvent être utilisées dans la plupart des cas. Cependant, quand H2 est produit, les bactéries consommant le H2 peuvent maintenir sa concentration tellement basse que la valeur de l’énergie libre est modifiée de façon significative. Ainsi, dans la fermentation de l’éthanol en acétate et H2 par les bactéries syntrophiques,

(C2H5OH + H2O → C2H3O2– + 2H2 + H+), le ∆G0’ est de + 9,68 kJ quand la pression de H2 est égale à 1 atm, alors qu’il est de –36,03 kJ quand la pression de H2 est de 10–4 atm. Ainsi, en présence de bactéries consommant du H2, la fermentation de l’éthanol devient exergonique (voir également le paragraphe 9). 5. Potentiels de réduction : par convention, les équations redox sont écrites dans la direction oxydant + ne– → réducteur, (il s’agit d’une réduction), où n est le nombre d’électrons transférés. Le potentiel standard (E0) de l’électrode à hydrogène, 2H+ + 2e– → H2 est, par définition, égal à 0,0 V, pour une pression de H2 gazeux de 1 atm et une concentration en H+ de 1,0 M, à 25 ˚C. E0’ est le potentiel de réduction standard à pH 7 (voir tableau A1.2). 6. Relation entre l’énergie libre et le potentiel de réduction : ∆G0’ = – nF∆E0’ où n est le nombre d’électrons transférés, F la constante de Faraday (96,48 kJ/V), et ∆E0’ la différence entre la valeur de E0’ du couple accepteur d’électrons et celle du couple donneur d’électrons. 7. Constante d’équilibre, K. Pour la réaction générale aA + bB ↔ cC + dD, [C]c [D]d K = ⎯⎯⎯⎯ [A]a [B]b où A et B représentent les réactifs et C et D, les produits ; a, b, c, et d représentent le nombre de molécules pour chacun d’eux ; les lettres entre parenthèses représentent les concentrations. Cette relation n’est vérifiée que lorsque le système chimique est à l’équilibre. 8. Relation entre la constante d’équilibre K et la variation d’énergie libre. À température, pression et pH constants, ∆G = ∆G0’ + RT ln K où R est une constante (8,29 J/mol/˚K) et T la température absolue (en ˚K). 9. Deux substances dont les potentiels standard sont défavorables peuvent réagir dans une réaction redox, à condition que leurs concentrations soient appropriées. On suppose que, normalement, la forme réduite de A donne des électrons à la forme oxydée de B. Cependant, si la concentration de la forme réduite A est basse et que la concentration



1006

Annexe 1

de la forme réduite B est élevée, cette dernière peut donner des électrons à la forme oxydée A. La réaction procède alors dans la direction opposée à celle prévue à partir des potentiels standard. L’utilisation de H+ comme accepteur d’électrons pour produire H2 en est un exemple. Normalement, la production de H2 par les bactéries fermentaires est faible parce que H+ est un accepteur d’électron peu performant ; le E0’ du couple 2 H+/H2 est de – 0,41 V. Cependant, si la concentration de H2 est maintenue basse (un processus effectué par les procaryotes méthanogènes, qui utilisent H2 + CO2 pour produire du méthane, CH4, ou par beaucoup d’autres micro-organismes anaérobies capables de consommer H2 en conditions anaérobies), le potentiel sera plus positif et alors H+ deviendra un accepteur d’électrons acceptable.

II. État d’oxydation ou nombre d’oxydation 1. L’état d’oxydation d’un élément d’une substance élémentaire (par exemple, H2, O2) est égal à zéro. 2. L’état d’oxydation de l’ion d’un élément est égal à sa charge (par exemple, Na+ = + 1, Fe3+ = + 3, O2– = – 2). 3. La somme des nombres d’oxydation de tous les atomes d’une molécule neutre est égale à zéro. Ainsi, H2O est neutre parce qu’elle a deux H à + 1 chacun et un O à – 2. 4. Dans un ion, la somme des nombres d’oxydation de tous les atomes est égale à la charge de cet ion. Ainsi, dans l’ion OH–, O (– 2) + H (+ 1) = –1. 5. Dans les composés, l’état d’oxydation de O est pratiquement toujours égal à – 2 et celui de H est égal à + 1. 6. Dans les composés carbonés simples, l’état d’oxydation de C peut être calculé en dénombrant les atomes H et O présents et en utilisant les états d’oxydation de ces éléments donnés dans le paragraphe 5, parce que, dans un composé neutre, la somme de tous les nombres d’oxydation doit être égale à zéro. Ainsi, l’état d’oxydation du carbone dans le méthane, CH4, est de – 4 (4 H à +1 chacun = + 4) ; dans le dioxyde de carbone, CO2, l’état d’oxydation du carbone est de + 4 (2 O à – 2 chacun = – 4). 7. Dans les composés organiques à plus d’un atome de C, il n’est pas possible d’assigner un nombre d’oxydation à chaque atome de C, mais il est toutefois possible de calculer l’état d’oxydation du composé dans son ensemble. Les mêmes conventions sont utilisées. Ainsi, l’état d’oxydation du carbone dans le glucose C6H12O6, est de zéro (12 H à + 1 = 12 ; 6 O à – 2 = – 12) et l’état d’oxydation du carbone dans l’éthanol, C2H6O, est de – 2 pour chaque carbone (6 H à + 1 = + 6 ; un O à – 2). 8. Dans toutes les réactions d’oxydo-réduction, il y a un équilibre entre les produits qui sont oxydés et ceux qui sont réduits. Pour calculer la balance redox, on multiplie le nombre de molécules de chaque produit par son état d’oxydation. Par exemple, dans le calcul de l’équilibre redox de la fermentation alcoolique, il y a deux molécules d’éthanol à – 4 = – 8 et deux molécules de CO2 à + 4 = + 8, de sorte que l’équilibre net est de zéro. Quand

on écrit les réactions, il faut d’abord calculer l’équilibre redox pour s’assurer que la réaction est possible.

III. Le calcul des valeurs d’énergie libre dans le cas de réactions hypothétiques Les rendements énergétiques peuvent être calculés à partir de la valeur des énergies libres de formation des réactifs et des produits, ou à partir de la différence des potentiels de réduction du donneur et de l’accepteur d’électrons pour les réactions partielles.

Le calcul des énergies libres Les énergies libres de formation sont données dans le tableau A1.1. La méthode utilisée pour calculer le rendement énergétique d’une réaction est la suivante : 1. Équilibre des réactions. Dans tous les cas, il est essentiel de s’assurer que la réaction d’oxydo-réduction couplée est équilibrée. Ceci implique trois conditions : a) le nombre total de chaque classe d’atome doit être identique des deux côtés de l’équation ; b) l’équilibre ionique doit être respecté de sorte que, quand des ions positifs et négatifs sont ajoutés du côté droit de l’équation, la charge ionique totale (qu’elle soit positive, négative, ou neutre) équilibre exactement la charge ionique du côté gauche de l’équation ; et c) l’équilibre d’oxydo-réduction doit être respecté, de sorte que tous les électrons perdus par une substance sont transférés à une autre substance. En général, quand on construit des réactions équilibrées, on utilise les trois étapes énumérées ci-dessus dans l’ordre inverse. Généralement, si les étapes (c) et (b) ont été correctement écrites, l’étape (a) est forcément correcte. 2. Exemples : a) Quelle est la réaction équilibrée pour l’oxydation de H2S en SO42– par O2 ? D’abord, il faut déterminer le nombre d’électrons impliqués dans l’oxydation de H2S en SO42–. Ceci peut être facilement calculé à partir des états d’oxydation des composés, en utilisant les règles énoncées précédemment. Puisque H a un état d’oxydation de + 1, l’état d’oxydation de S dans H2S est de – 2. Parce que O a un état d’oxydation de – 2, l’état d’oxydation de S dans SO42– est de + 6 (parce que c’est un ion, on utilise les règles données dans les paragraphes 4 et 5 de la section précédente). Ainsi, l’oxydation de H2S en SO42– implique le transfert de huit électrons (de – 2 à + 6). Puisque chaque atome de O peut accepter deux électrons (l’état d’oxydation de O dans O2 est de zéro, mais dans H2O est de – 2), cela signifie que deux molécules d’oxygène moléculaire O2 sont nécessaires pour fournir une capacité d’accepteur d’électrons suffisante. Or, nous savons que la réaction nécessite 1 H2S et 2 O2 du côté gauche de l’équation et 1 SO42– du côté droit. Pour réaliser l’équilibre ionique, deux charges positives du côté droit de l’équation doivent équilibrer les deux charges négatives de SO42–. Ainsi, 2 H+ doivent être ajoutés du côté droit de l’équation, selon la réaction globale : H2S + 2O2 → SO42– + 2H+



Annexe 1 1007

On peut voir que cette équation est également équilibrée en termes de nombre total d’atomes de chaque catégorie des deux côtés de l’équation. b) Quelle est la réaction équilibrée pour l’oxydation de H2S en SO42– avec Fe3+ comme accepteur d’électrons ? Nous venons de vérifier que l’oxydation de H2S en SO42– nécessite un transfert de huit électrons. Parce que la réduction de Fe3+ en Fe2+ transfère seulement un électron, 8 Fe3+ seront nécessaires. À ce point, la réaction est la suivante : H2S + 8Fe3+ → 8Fe2+ + SO42– (réaction non équilibrée) Nous notons que l’équilibre ionique n’est pas correct. Nous avons 24 charges positives du côté gauche et 14 charges positives du côté droit (16 + du Fe, 2 – du sulfate). Pour égaliser les charges, nous ajoutons 10 H + à droite. Maintenant notre équation est la suivante : H2S + 8Fe3+ → 8Fe2+ + 10H+ + SO42– (réaction non équilibrée) Pour fournir les atomes d’hydrogène pour les H+ et les atomes d’oxygène pour le sulfate, nous ajoutons 4 H2O à gauche et constatons que l’équation est maintenant équilibrée : H2S + 4H2O + 8Fe3+ → 8Fe2+ + 10H+ + SO42– (réaction équilibrée) En général, dans des réactions impliquant des microbes, l’équilibre ionique peut être réalisé en ajoutant H+ ou OH– du côté gauche ou du côté droit de l'équation ; parce que toutes les réactions se déroulent en milieu aqueux, des molécules d’eau peuvent être ajoutées ou enlevées si nécessaire. L’addition de H+ ou de OH– dépend généralement des conditions de la réaction (si la réaction se déroule en milieu acide ou alcalin). 3. Calcul du rendement énergétique pour des équations équilibrées, à partir des énergies libres de formation. Une fois qu’une équation est équilibrée, le rendement en énergie libre peut être calculé en utilisant, d’une part, les valeurs d’énergie libre de formation de chaque réactif et de chaque produit indiquées dans le tableau A1.1 et, d’autre part, la formule du paragraphe 2 de la première section de cette annexe. Par exemple, pour l’équation : H2S + 2O2 → SO42– + 2H+ Valeurs de Gf0 → –(– 27,87) + (– 744,6) + 2(– 39,83) (à pH 7)

∆G0’ = – 796,39 kJ Les valeurs de Gf0 pour les produits (du côté droit de l’équation) sont additionnées, puis soustraites des valeurs de Gf0 pour les réactifs (du côté gauche de l’équation), en s’assurant que les signes arithmétiques sont corrects. Une grande variété de rendements d’énergie libre peut être calculée à partir des données du tableau A1.1, pour des réactions rencontrées en microbiologie.

Calcul du rendement en énergie libre à partir des potentiels de réduction Le tableau A1.2 donne les potentiels de réduction de quelques couples redox importants. La quantité d’énergie libérée pour les deux demi-réactions peut être calculée à partir des différences de potentiel de réduction des deux réactions et à partir du nombre d’électrons transférés. Plus la différence de potentiel entre deux demi-réactions est élevée, plus le nombre d’électrons transférés est grand, et plus la quantité d’énergie libérée est importante. La formule ∆G0’ = – nF∆E0’, où n est le nombre d’électrons, F la constante de Faraday (96,48 kJ/V) et ∆E0’ la différence de potentiel, permet de convertir la différence de potentiel en énergie libre. Ainsi, si le couple 2H+/H2 a un potentiel de – 0,41 V et le couple 1/2O2/H2O un potentiel de + 0,82 V, la différence de potentiel est de 1,23 V, ce qui équivaut (parce que deux électrons sont impliqués) à un rendement en énergie libre (∆G0’) de – 237,34 kJ. D’autre part, la différence de potentiel entre les réactions des couples 2H+/H2 et NO3–/NO2– est plus faible, 0,84 V, ce qui équivaut à un rendement en énergie libre de – 162,08 kJ. Parce que beaucoup de réactions biochimiques sont des réactions qui transfèrent deux électrons, on donne souvent les rendements énergétiques pour des réactions de transfert de deux électrons, même si plus d’électrons sont impliqués. Ainsi, le couple redox SO42–/H2 met en jeu huit électrons, et la réduction complète de SO42– par H2 requiert 4H+ (équivalents à huit électrons). À partir de la différence de potentiel de réduction entre 2H+/H2 et SO42–/H2S (0,19 V), on calcule un rendement d’énergie libre de – 36,66 kJ par paire d’électrons. Par convention, on donne les potentiels de réduction dans les conditions pour lesquelles les concentrations des formes oxydées et réduites sont égales. Dans la pratique, les concentrations de ces deux formes peuvent être tout à fait différentes. Il est possible (voir paragraphe 9, section I) de coupler des demi-réactions, même si la différence de potentiel est défavorable, à condition que les concentrations des espèces qui participent à la réaction soient appropriées.



1008

Annexe 1

TABLEAU A1.1

ÉNERGIES LIBRES DE FORMATION (Gf0) POUR QUELQUES SUBSTANCES (KJ/MOL)a

Composé carboné CO, – 137,34

Composé carboné Glutamine, – 529,7

Métal H2, 0

2+

+

Cu , + 50,28

CO2, – 394,4

Glycéraldéhyde, – 437,65

Cu , + 64,94

CH4, – 50,75

Glycérate, – 658,1

CuS, – 49,02 2+

H2CO3, – 623,16

Glycérol, – 488,52

Fe , – 78,87

HCO3, – 586,85

Glycine, – 314,96

Fe3+, – 4,6

CO3–,

– 527,90

Non métal

+

N2, 0

H , 0 à pH 0 ; – 39,83 à pH 7 (– 5,69 par unité pH)

NO, + 86,57

O2, 0

NO3–, – 111,34

–

Glycolate, – 530,95

FeCO3, – 673,23

Acétaldéhyde, – 139,9

Glyoxalate, – 468,6

FeS2, – 150,84

Acétate, – 369,41

Guanine, + 46,99

FeSO4, – 829,62

Acétone, – 161,17

α-cétoglutarate, – 797,55

Pbs, – 92,59

H2O, – 237,17

Alanine, – 371,54

Lactate, – 517,81

Mn2+, – 227,93

H2O2, – 134,1

OH , –157,3 à pH 14 ; – 198,76 à pH 7 – 237,57 à PH 0

Arginine, – 240,2

Lactose, – 1 515,24

Mn , – 82,12

PO43–, – 1 026,55

Aspartate, – 700,4

Malate, – 845,08

MnO4–, – 506,57

Se0, 0

Benzène, + 124,5

Mannitol, – 942,61

MnO2, – 456,71

H2Se, – 77,09

Acide benzoïque , – 245,6

Méthanol, – 175,39

MnSO4, – 955,32

SeO42–, – 439,95

n-Butanol, – 171,84

Méthionine, – 502,92

HgS, – 49,02

S0, 0

Butyrate, – 352,63

Méthylamine, – 40,0

MoS2, – 225,42

SO32–, – 486,6

Caproate, – 335,96

Oxalate, – 674,04

ZnS, – 198,60

SO42–, – 744,6

Citrate, – 1 168,34

Phénol, – 47,6

S2O32–, – 513,4

o-Crésol, – 37,1

n-Propanol, – 175,81

H2S, – 27,87

Crotonate, – 277,4

Propionate, – 361,08

HS–, + 12,05

Cystéine, – 339,8

Pyruvate, – 474,63

S2–, + 85,8

Diméthylamine, – 3,3

Ribose, – 757,3

Éthanol, – 181,75

Succinate, – 690,23

Formaldéhyde, – 130,54

Sucrose, – 370,90

Formiate, – 351,04

Toluène, + 114,22

Fructose, – 915,38

Triméthylamine, – 37,2

Fumarate, – 604,21

Tryptophane, – 112,6

Gluconate, – 1 128,3

Urée, – 203,76

Glucose, – 917,22

Valérate, – 344,34

3+

Composé azoté

NO2, + 51,95 NO2–, – 37,2 NH3, – 26,57 NH4+, – 79,37 N2O, + 104,18

Glutamate, – 699,6 On peut trouver les valeurs des énergies libres de formation de composés variés dans Dean, J. A. 1973. Lange’s Handbook of Chemistry, 11e édition. McGraw-Hill, New York ; Garrels, R. M., et C. L. Christ. 1965. Solutions, Minerals, and Equilibria. Harper and Row, New York ; Burton, K. 1957. Dans Krebs, H. A., et H. L. Komberg. Energy transformations in living matter, Ergebnisse der Physiologie (appendix): Springer-Verlag, Berlin; et Thauer, R. K., K. Jungermann, et H. Decker. 1977. Energy conservation in anaerobic chemotrophic bacteria. Bacteriol Rev 41:100–180. a



Annexe 1 1009

TABLEAU A1.2

POTENTIELS DE RÉDUCTION a IMPORTANTS EN MICROBIOLOGIE Couple redox

E0’ (V)

SO42–/HSO3–

– 0,52

CO2/formiate

– 0,43

2 H+/H2

– 0,41

S2O32–/HS– + HSO3–

– 0,40

Ferrédoxine ox/red

– 0,39

Flavodoxine ox/redb

– 0,37

NAD+/NADH

– 0,32

Cytochrome c3 ox/red

– 0,29

CO2/acétate–

– 0,29

S0/HS–

– 0,27

CO2/CH4

– 0,24

FAD/FADH

– 0,22

SO42–/HS–

– 0,217

Acétaldéhyde/éthanol

– 0,197

Pyruvate–/lactate–

– 0,19

FMN/FMNH

– 0,19

Dihydroxyacétone phosphate/glycérolphosphate

– 0,19

HSO3–/S3O62–

– 0,17

Flavodoxine ox/redb

– 0,12

HSO3–/HS–

– 0,116

Ménaquinone ox/red

– 0,075

APS/AMP + HSO3–

– 0,060

Rubrédoxine ox/red

– 0,057

Acrylyl–CoA/propionyl–CoA

– 0,015

Glycine/acétate– + NH4+

– 0,010

S4O62–/S2O32– 2–

+ 0,024

Fumarate /succinate2–

+ 0,033

Cytochrome b ox/red

+ 0,035

Ubiquinone ox/red

+ 0,113

AsO43–/AsO33–

+ 0,139

Diméthyl sulfoxide (DMSO)/diméthylsulfide (DMS)

+ 0,16

Fe(OH)3 + HCO3–/FeCO3 S3O62–/S2O32– + HSO3–

+ 0,20

Cytochrome c1 ox/red

+ 0,23

2–

+ 0,225

NO /NO

+ 0,36

Cytochrome a3 ox/red

+ 0,385

Chlorobenzoate–/benzoate– + HCl

+ 0,297

NO3–/NO2– SeO42–/SeO32– 3+ 2+

+ 0,43

Fe /Fe 4+

2+

+ 0,475 + 0,77

Mn /Mn

+ 0,798

O2/H2O

+ 0,82

ClO3–/Cl–

+ 1,03

NO/N2O

+ 1,18

N2O/N2

+ 1,36

a

Données de Thauer, R. K., K. Jungermann, et K. Decker, 1977. Energy conservation in anaerobic chemotrophic bacteria. Bacteriol. Rev. 41:100–180. b Des potentiels séparés sont donnés pour chaque transfert d’électrons dans ce transfert à deux électrons.





Annexe 2 Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology, deuxième édition LISTE DES GENRES ET TAXONS D’ORDRE SUPÉRIEUR a Domaine Archaea Phylum AI. Crenarchaeota Classe I. Thermoprotei Ordre I. Thermoproteales Famille I. Thermoproteaceae Genre I. Thermoproteus Genre II. Caldivirga Genre III. Pyrobaculum Genre IV. Thermocladium Genre V. Vulcanisaeta Famille II. Thermofilaceae Genre I. Thermofilum Ordre II. Caldisphaerales Famille I. Caldisphaeraceae Genre I. Caldisphaera Ordre III. Desulfurococcales Famille I. Desulfurococcaceae Genre I. Desulfurococcus Genre II. Acidilobus Genre III. Aeropyrum Genre IV. Ignicoccus Genre V. Staphylothermus Genre VI. Stetteria Genre VII. Sulfophobococcus Genre VIII. Thermodiscus Genre IX. Thermosphaera Famille II. Pyrodictiaceae Genre I. Pyrodictium Genre II. Hyperthermus Genre III. Pyrolobus Ordre IV. Sulfolobales Famille I. Sulfolobaceae Genre I. Sulfolobus Genre II. Acidianus Genre III. Metallosphaera Genre IV. Stygiolobus Genre V. Sulfurisphaera Genre VI. Sulfurococcus Phylum AII. Euryarchaeota Classe I. Methanobacteria Ordre I. Methanobacteriales Famille I. Methanobacteriaceae Genre I. Methanobacterium Genre II. Methanobrevibacter Genre III. Methanosphaera Genre IV. Methanothermobacter Famille II. Methanothermaceae Genre I. Methanothermus Classe II. Methanococci Ordre I. Methanococcales

Famille I. Methanococcaceae Genre I. Methanococcus Genre II. Methanothermococcus Famille II. Methanocaldococcaceae Genre I. Methanocaldococcus Genre II. Methanotorris Classe III. Methanomicrobia Ordre I. Methanomicrobiales Famille I. Methanomicrobiaceae Genre I. Methanomicrobium Genre II. Methanoculleus Genre III. Methanofollis Genre IV. Methanogenium Genre V. Methanolacinia Genre VI. Methanoplanus Famille II. Methanocorpusculaceae Genre I. Methanocorpusculum Famille III. Methanospirillaceae Genre I. Methanospirillum Genres incertae sedis (affiliation incertaine) Genre I. Methanocalculus Ordre II. Methanosarcinales Famille I. Methanosarcinaceae Genre I. Methanosarcina Genre II. Methanococcoides Genre III. Methanohalobium Genre IV. Methanohalophilus Genre V. Methanolobus Genre VI. Methanomethylovorans Genre VII. Methanimicrococcus Genre VIII. Methanosalsum Famille II. Methanosaetaceae Genre I. Methanosaeta Classe IV. Halobacteria Ordre I. Halobacteriales Famille I. Halobacteriaceae Genre I. Halobacterium Genre II. Haloarcula Genre III. Halobaculum Genre IV. Halobiforma Genre V. Halococcus Genre VI. Haloferax Genre VII. Halogeometricum Genre VIII. Halomicrobium Genre IX. Halorhabdus Genre X. Halorubrum Genre XI. Halosimplex Genre XII. Haloterrigena Genre XIII. Natrialba Genre XIV. Natrinema Genre XV. Natronobacterium

a. Les genres et taxons d’ordre supérieur de cette annexe sont ceux reconnus en 2005. Les genres ou taxons d’ordre supérieur entre guillemets sont des taxons reconnus dont les noms n’ont pas encore été validés. La taxinomie bactérienne étant en cours de modification, les mises à jour de cette liste sous forme de nouveaux genres et de nouvelles espèces sont décrites en fonction des nouvelles données taxinomiques disponibles. Voir les sections 11.10 et 11.13 pour plus de détails sur la taxinomie bactérienne.



1012

Annexe 2

Genre XVI. Natronococcus Genre XVII. Natronomonas Genre XVIII. Natronorubrum Classe V. Thermoplasmata Ordre I. Thermoplasmatales Famille I. Thermoplasmataceae Genre I. Thermoplasma Famille II. Picrophilaceae Genre I. Picrophilus Famille III. Ferroplasmaceae Genre I. Ferroplasma Classe VI. Thermococci Ordre I. Thermococcales Famille I. Thermococcaceae Genre I. Thermococcus Genre II. Palaeococcus Genre III. Pyrococcus Classe VII. Archaeoglobi Ordre I. Archaeoglobales Famille I. Archaeoglobaceae Genre I. Archaeoglobus Genre II. Ferroglobus Genre III. Geoglobus Classe VIII. Methanopyri Ordre I. Methanopyrales Famille I. Methanopyraceae Genre I. Methanopyrus Domaine Bacteria Phylum BI. Aquificae Classe I. Aquificae Ordre I. Aquificales Famille I. Aquificaceae Genre I. Aquifex Genre II. Calderobacterium Genre III. Hydrogenobaculum Genre IV. Hydrogenobacter Genre V. Hydrogenothermus Genre VI. Persephonella Genre VII. Sulfurihydrogenibium Genre VIII. Thermocrinis Genres incertae sedis (affiliation incertaine) Genre I. Balnearium Genre II. Desulfurobacterium Genre III. Thermovibrio Phylum BII. Thermotogae Classe I. Thermotogae Ordre I. Thermotogales Famille I. Thermotogaceae Genre I. Thermotoga Genre II. Fervidobacterium Genre III. Geotoga Genre IV. Marinitoga Genre V. Petrotoga Genre VI. Thermosipho Phylum BIII. Thermodesulfobacteria Classe I. Thermodesulfobacteria Ordre I. Thermodesulfobacteriales Famille I. Thermodesulfobacteriaceae Genre I. Thermodesulfobacterium Genre II. Thermodesulfatator Phylum BIV. Deinococcus-Thermus Classe I. Deinococci Ordre I. Deinococcales Famille I. Deinococcaceae Genre I. Deinococcus Ordre II. Thermales Famille I. Thermaceae Genre I. Thermus Genre II. Marinithermus

Genre III. Meiothermus Genre IV. Oceanithermus Genre V. Vulcanithermus Phylum BV. Chrysiogenetes Classe I. Chrysiogenetes Ordre I. Chrysiogenales Famille I. Chrysiogenaceae Genre I. Chrysiogenes Phylum BVI. Chloroflexi Classe I. Chloroflexi Ordre I. Chloroflexales Famille I. Chloroflexaceae Genre I. Chloroflexus Genre II. Chloronema Genre III. Heliothrix Genre IV. Roseiflexus Famille II. Oscillochloridaceae Genre I. Oscillochloris Ordre II. Herpetosiphonales Famille I. Herpetosiphonaceae Genre I. Herpetosiphon Classe II. Anaerolieae Ordre I. Anaerolinaeles Famille I. Anaerolinaceae Genre I. Anaerolinea Genre II. Caldilinea Phylum BVII. Thermomicrobia Classe I. Thermomicrobia Ordre I. Thermomicrobiales Famille I. Thermomicrobiaceae Genre I. Thermomicrobium Phylum BVIII. Nitrospirae Classe I. Nitrospira Ordre I. Nitrospirales Famille I. Nitrospiraceae Genre I. Nitrospira Genre II. Leptospirillum Genre III. Magnetobacterium Genre IV. Thermodesulfovibrio Phylum BIX. Deferribacteres Classe I. Deferribacteres Ordre I. Deferribacterales Famille I. Deferribacteraceae Genre I. Deferribacter Genre II. Denitrovibrio Genre III. Flexistipes Genre IV. Geovibrio Genres incertae sedis (affiliation incertaine) Genre I. Synergistes Genre II. Caldithrix Phylum BX. Cyanobacteria Classe I. Cyanobacteria Sous-section I. Sous-section 1 Famille I. Famille 1.1 Morphotype I. Chamaesiphon b Morphotype II. Chroococcus Morphotype III. Cyanobacterium Morphotype IV. Cyanobium Morphotype V. Cyanothece Morphotype VI. Dactylococcopsis Morphotype VII. Gloeobacter Morphotype VIII. Gloeocapsa Morphotype IX. Gloeothece Morphotype X. Microcystis Morphotype XI. Prochlorococcus Morphotype XII. Prochloron Morphotype XIII. Synechococcus Morphotype XIV. Synechocystis

b. La position taxinomique des cyanobacteria dans le Bergey’s Manual est ouverte. Le terme « Morphotype » concerne un groupe de cyanobacteria mondialement répandu et de morphologie très caractéristique. Cependant, tous les isolats de ce type ne se retrouvent pas dans un même genre. Dans quelques cas, les cultures pures de « morphotypes » ne sont pas disponibles.



Annexe 2 1013 Sous-section II. Sous-section 2 Famille I. Famille 2.1 Morphotype I. Cyanocystis Morphotype II. Dermocarpella Morphotype III. Stanieria Morphotype IV. Xenococcus Famille II. Famille 2.2 Morphotype I. Chroococcidiopsis Morphotype II. Myxosarcina Morphotype III. Pleurocapsa Sous-section III. Sous-section 3 Famille I. Famille 3.1 Morphotype I. Arthrospira Morphotype II. Borzia Morphotype III. Crinalium Morphotype IV. Geitlerinema Genre V. Halospirulina Morphotype VI. Leptolyngbya Morphotype VII. Limnothrix Morphotype VIII. Lyngbya Morphotype IX. Microcoleus Morphotype X. Oscillatoria Morphotype XI. Planktothrix Morphotype XII. Prochlorothrix Morphotype XIII. Pseudanabaena Morphotype XIV. Spirulina Morphotype XV. Starria Morphotype XVI. Symploca Genre XVII. Trichodesmium Morphotype XVIII. Tychonema Sous-section IV. Sous-section 4 Famille I. Famille 4.1 Morphotype I. Anabaena Morphotype II. Anabaenopsis Morphotype III. Aphanizomenon Morphotype IV. Cyanospira Morphotype V. Cylindrospermopsis Morphotype VI. Cylindrospermum Morphotype VII. Nodularia Morphotype VIII. Nostoc Morphotype IX. Scytonema Famille II. Famille 4.2 Morphotype I. Calothrix Morphotype II. Rivularia Morphotype III. Tolypothrix Sous-section V. Sous-section 5 Famille I. Sous-section 5.1 Morphotype I. Chlorogloeopsis Morphotype II. Fischerella Morphotype III. Geitleria Morphotype IV. Iyengariella Morphotype V. Nostochopsis Morphotype VI. Stigonema Phylum BXI. Chlorobi Classe I. Chlorobia Ordre I. Chlorobiales Famille I. Chlorobiaceae Genre I. Chlorobium Genre II. Ancalochloris Genre III. Chlorobaculum Genre IV. Chloroherpeton Genre V. Pelodictyon Genre VI. Prosthecochloris Phylum BXII. Proteobacteria Classe I. Alphaproteobacteria Ordre I. Rhodospirillales Famille I. Rhodospirillaceae Genre I. Rhodospirillum Genre II. Azospirillum Genre III. Inquilinus Genre IV. Magnetospirillum Genre V. Phaeospirillum Genre VI. Rhodocista Genre VII. Rhodospira

Genre VIII. Rhodovibrio Genre IX. Roseospira Genre X. Skermanella Genre XI. Thalassospira Genre XII. Tistrella Famille II. Acetobacteraceae Genre I. Acetobacter Genre II. Acidiphilium Genre III. Acidisphaera Genre IV. Acidocella Genre V. Acidomonas Genre VI. Asaia Genre VII. Craurococcus Genre VIII. Gluconacetobacter Genre IX. Gluconobacter Genre X. Kozakia Genre XI. Muricoccus Genre XII. Paracraurococcus Genre XIII. Rhodopila Genre XIV. Roseococcus Genre XV. Rubritepids Genre XVI. Stella Genre XVII. Teichococcus Genre XVIII. Zavarzinia Ordre II. Rickettsiales Famille I. Rickettsiaceae Genre I. Rickettsia Genre II. Orientia Famille II. Anaplasmataceae Genre I. Anaplasma Genre II. Aegyptianella Genre III. Cowdria Genre IV. Ehrlichia Genre V. Neorickettsia Genre VI. Wolbachia Genre VII. Xenohaliotis Famille III. Holosporaceae Genre I. Holospora Genres incertae sedis (affiliation incertaine) Genre I. Caedibacter Genre II. Lyticum Genre III. Odyssella Genre IV. Pseudocaedibacter Genre V. Symbiotes Genre VI. Tectibacter Ordre III. Rhodobacterales Famille I. Rhodobacteraceae Genre I. Rhodobacter Genre II. Ahrensia Genre III. Albidovulum Genre IV. Amaricoccus Genre V. Antarctobacter Genre VI. Gemmobacter Genre VII. Hirschia Genre VIII. Hyphomonas Genre IX. Jannaschia Genre X. Ketogulonicigenium Genre XI. Leisingera Genre XII. Maricaulis Genre XIII. Methylarcula Genre XIV. Oceanicaulis Genre XV. Octadecabacter Genre XVI. Pannonibacter Genre XVII. Paracoccus Genre XVIII. Pseudorhodobacter Genre XIX. Rhodobaca Genre XX. Rhodothalassium Genre XXI. Rhodovulum Genre XXII. Roseibium Genre XXIII. Roseinatronobacter Genre XXIV. Roseivivax Genre XXV. Roseobacter Genre XXVI. Roseovarius Genre XXVII. Rubrimonas



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Annexe 2 Genre XXVIII. Ruegeria Genre XXIX. Sagittula Genre XXX. Silicibacter Genre XXXI. Staleya Genre XXXII. Stappia Genre XXXIII. Sulfitobacter Ordre IV. Sphingomonadales Famille I. Sphingomonadaceae Genre I. Sphingomonas Genre II. Blastomonas Genre III. Erythrobacter Genre IV. Erythromicrobium Genre V. Erythromonas Genre VI. Novosphingobium Genre VII. Porphyrobacter Genre VIII. Rhizomonas Genre IX. Sandaracinobacter Genre X. Sphingobium Genre XI. Sphingopyxis Genre XII. Zymomonas Ordre V. Caulobacterales Famille I. Caulobacteraceae Genre I. Caulobacter Genre II. Asticcacaulis Genre III. Brevundimonas Genre IV. Phenylobacterium Ordre VI. Rhizobiales Famille I. Rhizobiaceae Genre I. Rhizobium Genre II. Agrobacterium Genre III. Allorhizobium Genre IV. Carbophilus Genre V. Chelatobacter Genre VI. Ensifer Genre VII. Sinorhizobium Famille II. Aurantimonadaceae Genre I. Aurantimonas Genre II. Fulvimarina Famille III. Bartonellaceae Genre I. Bartonella Famille IV. Brucellaceae Genre I. Brucella Genre II. Mycoplana Genre III. Ochrobactrum Famille V. Phyllobacteriaceae Genre I. Phyllobacterium Genre II. Aminobacter Genre III. Aquamicrobium Genre IV. Fluvibacter Genre V. Candidatus Liberibacter c Genre VI. Mesorhizobium Genre VII. Nitratireductor Genre VIII. Pseudaminobacter Famille VI. Methylocystaceae Genre I. Methylocystis Genre II. Albibacter Genre III. Methylopila Genre IV. Methylosinus Genre V. Terasakiella Famille VII. Beijerinckiaceae Genre I. Beijerinckia Genre II. Chelatococcus Genre III. Methylocapsa Genre IV. Methylocella Famille VIII. Bradyrhizobiaceae Genre I. Bradyrhizobium Genre II. Afipia Genre III. Agromonas Genre IV. Blastobacter

Genre V. Bosea Genre VI. Nitrobacter Genre VII. Oligotropha Genre VIII. Rhodoblastus Genre IX. Rhodopseudomonas Famille IX. Hyphomicrobiaceae Genre I. Hyphomicrobium Genre II. Ancalomicrobium Genre III. Ancylobacter Genre IV. Angulomicrobium Genre V. Aquabacter Genre VI. Azorhizobium Genre VII. Blastochloris Genre VIII. Devosia Genre IX. Dichotomicrobium Genre X. Filomicrobium Genre XI. Gemmiger Genre XII. Labrys Genre XIII. Methylorhabdus Genre XIV. Pedomicrobium Genre XV. Prosthecomicrobium Genre XVI. Rhodomicrobium Genre XVII. Rhodoplanes Genre XVIII. Seliberia Genre XIX. Starkeya Genre XX. Xanthobacter Famille X. Methylobacteriaceae Genre I. Methylobacterium Genre II. Microvirga Genre III. Protomonas Genre IV. Roseomonas Famille XI. Rhodobiaceae Genre I. Rhodobium Genre II. Roseospirillum Ordre VII. Parvularculales Famille I. Parvularculaceae Genre I. Parvularcula Classe II. Betaproteobacteria Ordre I. Burkholderiales Famille I. Burkholderiaceae Genre I. Burkholderia Genre II. Cupriavidus Genre III. Lautropia Genre IV. Limnobacter Genre V. Pandoraea Genre VI. Paucimonas Genre VII. Polynucleobacter Genre VIII. Ralstonia Genre IX. Thermothrix Genre X. Wautersia Famille II. Oxalobacteraceae Genre I. Oxalobacter Genre II. Duganella Genre III. Herbaspirillum Genre IV. Janthinobacterium Genre V. Massilia Genre VI. Oxalicibacterium Genre VII. Telluria Famille III. Alcaligenaceae Genre I. Alcaligenes Genre II. Achromobacter Genre III. Bordetella Genre IV. Brackiella Genre V. Derxia Genre VI. Kerstersia Genre VII. Oligella Genre VIII. Pelistega Genre IX. Pigmentiphaga Genre X. Sutterella Genre XI. Taylorella

c. En taxinomie bactérienne, le statut de « candidatus » ou « candidat » concerne les organismes connus par leurs séquences d’ARNr 16S et d’autres propriétés essentielles, mais dont on ne dispose pas encore en culture pure.



Annexe 2 1015 Famille IV. Comamonadaceae Genre I. Comamonas Genre II. Acidovorax Genre III. Alicycliphilus Genre IV. Brachymonas Genre V. Caldimonas Genre VI. Delftia Genre VII. Diaphorobacter Genre VIII. Hydrogenophaga Genre IX. Hylemonella Genre X. Lampropedia Genre XI. Macromonas Genre XII. Ottowia Genre XIII. Polaromonas Genre XIV. Ramlibacter Genre XV. Rhodoferax Genre XVI. Variovorax Genre XVII. Xenophilus Genres incertae sedis (affiliation incertaine) Genre I. Aquabacterium Genre II. Ideonella Genre III. Leptothrix Genre IV. Roseateles Genre V. Rubrivivax Genre VI. Schlegelella Genre VII. Sphaerotilus Genre VIII. Tepidimonas Genre IX. Thiomonas Genre X. Xylophilus Ordre II. Hydrogenophilales Famille I. “Hydrogenophilaceae” Genre I. Hydrogenophilus Genre II. Thiobacillus Ordre III. Methylophilales Famille I. Methylophilaceae Genre I. Methylophilus Genre II. Methylobacillus Genre III. Methylovorus Ordre IV. Neisseriales Famille I. Neisseriaceae Genre I. Neisseria Genre II. Alysiella Genre III. Aquaspirillum Genre IV. Chromobacterium Genre V. Eikenella Genre VI. Formivibrio Genre VII. Iodobacter Genre VIII. Kingella Genre IX. Laribacter Genre X. Microvirgula Genre XI. Morococcus Genre XII. Prolinoborus Genre XIII. Simonsiella Genre XIV. Vitreoscilla Genre XV. Vogesella Ordre V. Nitrosomonadales Famille I. Nitrosomonadaceae Genre I. Nitrosomonas Genre II. Nitrosolobus Genre III. Nitrosospira Famille II. Spirillaceae Genre I. Spirillum Famille III. Gallionellaceae Genre I. Gallionella Ordre VI. Rhodocyclales Famille I. Rhodocyclaceae Genre I. Rhodocyclus Genre II. Azoarcus Genre III. Azonexus Genre IV. Azospira Genre V. Azovibrio Genre VI. Dechloromonas Genre VII. Dechlorosoma Genre VIII. Ferribacterium

Genre IX. Propionibacter Genre X. Propionivibrio Genre XI. Quadricoccus Genre XII. Sterolibacterium Genre XIII. Thauera Genre XIV. Zoogloea Ordre VII. Procabacteriales Famille I. Procabacteriaceae Genre I. Procabacter Classe III. Gammaproteobacteria Ordre I. Chromatiales Famille I. Chromatiaceae Genre I. Chromatium Genre II. Allochromatium Genre III. Amoebobacter Genre IV. Halochromatium Genre V. Isochromatium Genre VI. Lamprobacter Genre VII. Lamprocystis Genre VIII. Marichromatium Genre IX. Nitrosococcus Genre X. Pfennigia Genre XI. Rhabdochromatium Genre XII. Rheinheimera Genre XIII. Thermochromatium Genre XIV. Thioalkalicoccus Genre XV. Thiobaca Genre XVI. Thiocapsa Genre XVII. Thiococcus Genre XVIII. Thiocystis Genre XIX. Thiodictyon Genre XX. Thioflavicoccus Genre XXI. Thiohalocapsa Genre XXII. Thiolamprovum Genre XXIII. Thiopedia Genre XXIV. Thiorhodococcus Genre XXV. Thiorhodovibrio Genre XXVI. Thiospirillum Famille II. Ectothiorhodospiraceae Genre I. Ectothiorhodospira Genre II. Alcalilimnicola Genre III. Alkalispirillum Genre IV. Arhodomonas Genre V. Halorhodospira Genre VI. Nitrococcus Genre VII. Thioalkalispira Genre VIII. Thialkalivibrio Genre IX. Thiorhodospira Famille III. Halothiobacillaceae Genre I. Halothiobacillus Ordre II. Acidithiobacillales Famille I. Acidithiobacillaceae Genre I. Acidithiobacillus Famille II. Thermithiobacillaceae Genre I. Thermithiobacillus Ordre III. Xanthomonadales Famille I. Xanthomonadaceae Genre I. Xanthomonas Genre II. Frateuria Genre III. Fulvimonas Genre IV. Luteimonas Genre V. Lysobacter Genre VI. Nevskia Genre VII. Pseudoxanthomonas Genre VIII. Rhodanobacter Genre IX. Schineria Genre X. Stenotrophomonas Genre XI. Thermomonas Genre XII. Xylella Ordre IV. Cardiobacteriales Famille I. Cardiobacteriaceae Genre I. Cardiobacterium Genre II. Dichelobacter Genre III. Suttonella



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Annexe 2 Ordre V. Thiotrichales Famille I. Thiotrichaceae Genre I. Thiothrix Genre II. Achromatium Genre III. Beggiatoa Genre IV. Leucothrix Genre V. Thiobacterium Genre VI. Thiomargarita Genre VII. Thioploca Genre VIII. Thiospira Famille II. Francisellaceae Genre I. Francisella Famille III. Piscirickettsiaceae Genre I. Piscirickettsia Genre II. Cycloclasticus Genre III. Hydrogenovibrio Genre IV. Methylophaga Genre V. Thioalkalimicrobium Genre VI. Thiomicrospira Ordre VI. Legionellales Famille I. Legionellaceae Genre I. Legionella Famille II. Coxiellaceae Genre I. Coxiella Genre II. Aquicella Genre III. Rickettsiella Ordre VII. Methylococcales Famille I. Methylococcaceae Genre I. Methylococcus Genre II. Methylobacter Genre III. Methylocaldum Genre IV. Methylomicrobium Genre V. Methylomonas Genre VI. Methylosarcina Genre VII. Methylosphaera Ordre VIII. Oceanospirillales Famille I. Oceanospirillaceae Genre I. Oceanospirillum Genre II. Balneatrix Genre III. Marinomonas Genre IV. Marinospirillum Genre V. Neptunomonas Genre VI. Oceanobacter Genre VII. Oleispira Genre VIII. Pseudospirillum Genre IX. Thalassolituus Famille II. Alcanivoraceae Genre I. Alcanivorax Genre II. Fundibacter Famille III. Hahellaceae Genre I. Hahella Genre II. Zooshikella Famille IV. Halomonadaceae Genre I. Halomonas Genre II. Carnimonas Genre III. Chromohalobacter Genre IV. Cobetia Genre V. Deleya Genre VI. Zymobacter Famille V. Oleiphilaceae Genre I. Oleiphilus Famille VI. Saccharospirillaceae Genre I. Saccharospirillum Ordre IX. Pseudomonadales Famille I. Pseudomonadaceae Genre I. Pseudomonas Genre II. Azomonas Genre III. Azotobacter Genre IV. Cellvibrio Genre V. Chryseomonas Genre VI. Flavimonas Genre VII. Mesophilobacter Genre VIII. Rhizobacter Genre IX. Rugamonas

Genre X. Serpens Famille II. Moraxellaceae Genre I. Moraxella Genre II. Acinetobacter Genre III. Psychrobacter Famille III. Incertae sedis (affiliation incertaine) Genre I. Enhydrobacter Ordre X. Alteromonadales Famille I. Alteromonadaceae Genre I. Alteromonas Genre II. Aestuariibacter Genre III. Alishewanella Genre IV. Colwellia Genre V. Ferrimonas Genre VI. Glaciecola Genre VII. Idiomarina Genre VIII. Marinobacter Genre IX. Marinobacterium Genre X. Microbulbifer Genre XI. Moritella Genre XII. Pseudoalteromonas Genre XIII. Psychromonas Genre XIV. Shewanella Genre XV. Thalassomonas Famille II. Incertae sedis (affiliation incertaine) Genre I. Teredinibacter Ordre XI. Vibrionales Famille I. Vibrionaceae Genre I. Vibrio Genre II. Allomonas Genre III. Catenococcus Genre IV. Enterovibrio Genre V. Grimontia Genre VI. Listonella Genre VII. Photobacterium Genre VIII. Salinivibrio Ordre XII. Aeromonadales Famille I. Aeromonadaceae Genre I. Aeromonas Genre II. Oceanimonas Genre III. Oceanisphaera Genre IV. Tolumonas Famille II. Incertae sedis (affiliation incertaine) : Succinivibrionaceae Genre I. Succinivibrio Genre II. Anaerobiospirillum Genre III. Ruminobacter Genre IV. Succinimonas Ordre XIII. Enterobacteriales Famille I. Enterobacteriaceae Genre I. Escherichia Genre II. Alterococcus Genre III. Arsenophonus Genre IV. Brenneria Genre V. Buchnera Genre VI. Budvicia Genre VII. Buttiauxella Genre VIII. Calymmatobacterium Genre IX. Cedecea Genre X. Citrobacter Genre XI. Edwardsiella Genre XII. Enterobacter Genre XIII. Erwinia Genre XIV. Ewingella Genre XV. Hafnia Genre XVI. Klebsiella Genre XVII. Kluyvera Genre XVIII. Leclercia Genre XIX. Leminorella Genre XX. Moellerella Genre XXI. Morganella Genre XXII. Obesumbacterium Genre XXIII. Pantoea Genre XXIV. Pectobacterium



Annexe 2 1017 Genre XXV. Phlomobacter Genre XXVI. Photorhabdus Genre XXVII. Plesiomonas Genre XXVIII. Pragia Genre XXIX. Proteus Genre XXX. Providencia Genre XXXI. Rahnella Genre XXXII. Raoultella Genre XXXIII. Saccharobacter Genre XXXIV. Salmonella Genre XXXV. Samsonia Genre XXXVI. Serratia Genre XXXVII. Shigella Genre XXXVIII. Sodalis Genre XXXIX. Tatumella Genre XL. Trabulsiella Genre XLI. Wigglesworthia Genre XLII. Xenorhabdus Genre XLIII. Yersinia Genre XLIV. Yokenella Ordre XIV. Pasteurellales Famille I. Pasteurellaceae Genre I. Pasteurella Genre II. Actinobacillus Genre III. Gallibacterium Genre IV. Haemophilus Genre V. Lonepinella Genre VI. Mannheimia Genre VII. Phocoenobacter Classe IV. Deltaproteobacteria Ordre I. Desulfurellales Famille I. Desulfurellaceae Genre I. Desulfurella Genre II. Hippea Ordre II. Desulfovibrionales Famille I. Desulfovibrionaceae Genre I. Desulfovibrio Genre II. Bilophila Genre III. Lawsonia Famille II. Desulfomicrobiaceae Genre I. Desulfomicrobium Famille III. Desulfohalobiaceae Genre I. Desulfohalobium Genre II. Desulfomonas Genre III. Desulfonatronovibrio Genre IV. Desulfothermus Famille IV. Desulfonatronumaceae Genre I. Desulfonatronum Ordre III. Desulfobacterales Famille I. Desulfobacteraceae Genre I. Desulfobacter Genre II. Desulfatibacillum Genre III. Desulfobacterium Genre IV. Desulfobacula Genre V. Desulfobotulus Genre VI. Desulfocella Genre VII. Desulfococcus Genre VIII. Desulfofaba Genre IX. Desulfofrigus Genre X. Desulfomusa Genre XI. Desulfonema Genre XII. Desulforegula Genre XIII. Desulfosarcina Genre XIV. Desulfospira Genre XV. Desulfotignum Famille II. Desulfobulbaceae Genre I. Desulfobulbus Genre II. Desulfocapsa Genre III. Desulfofustis Genre IV. Desulforhopalus Genre V. Desulfotalea Famille III. Nitrospinaceae Genre I. Nitrospina Ordre IV. Desulfarcales

Famille I. Desulfarculaceae Genre I. Desulfarculus Ordre V. Desulfuromonales Famille I. Desulfuromonaceae Genre I. Desulfuromonas Genre II. Desulfuromusa Genre III. Malonomonas Genre IV. Pelobacter Famille II. Geobacteraceae Genre I. Geobacter Genre II. Trichlorobacter Ordre VI. Syntrophobacterales Famille I. Syntrophobacteraceae Genre I. Syntrophobacter Genre II. Desulfacinum Genre III. Desulforhabdus Genre IV. Desulfovirga Genre V. Thermodesulforhabdus Famille II. Syntrophaceae Genre I. Syntrophus Genre II. Desulfobacca Genre III. Desulfomonile Genre IV. Smithella Ordre VII. Bdellovibrionales Famille I. Bdellovibrionaceae Genre I. Bdellovibrio Genre II. Bacteriovorax Genre III. Micavibrio Genre IV. Vampirovibrio Ordre VIII. Myxococcales Sous-ordre I. Cystobacterineae Famille I. Cystobacteraceae Genre I. Cystobacter Genre II. Anaeromyxobacter Genre III. Archangium Genre IV. Hyalangium Genre V. Melittangium Genre VI. Stigmatella Famille II. Myxococcaceae Genre I. Myxococcus Genre II. Corallococcus Genre III. Pyxicoccus Sous-ordre II. Sorangineae Famille I. Polyangiaceae Genre I. Polyangium Genre II. Byssophaga Genre III. Chondromyces Genre IV. Haploangium Genre V. Jahnia Genre VI. Sorangium Sous-ordre III. Nannocystineae Famille I. Nannocystaceae Genre I. Nannocystis Genre II. Plesiocystis Famille II. Haliangiaceae Genre I. Haliangium Famille III. Kocueriaceae Genre I. Kocueria Classe V. Epsilonproteobacteria Ordre I. Campylobacterales Famille I. Campylobacteraceae Genre I. Campylobacter Genre II. Arcobacter Genre III. Dehalospirillum Genre IV. Sulfurospirillum Famille II. Helicobacteraceae Genre I. Helicobacter Genre II. Sulfurimonas Genre III. Thiovulum Genre IV. Wolinella Famille III. Nautiliaceae Genre I. Nautilia Genre II. Caminibacter Famille IV. Hydrogenimonaceae Genre I. Hydrogenimonas



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Annexe 2

Phylum BXIII. Firmicutes Classe I. Clostridia Ordre I. Clostridiales Famille I. Clostridiaceae Genre I. Clostridium Genre II. Acetivibrio Genre III. Acidaminobacter Genre IV. Alkaliphilus Genre V. Anaerobacter Genre VI. Anaerotruncus Genre VII. Bryantella Genre VIII. Caminicella Genre IX. Caloramator Genre X. Caloranaerobacter Genre XI. Coprobacillus Genre XII. Dorea Genre XIII. Faecalibacterium Genre XIV. Hespellia Genre XV. Natronincola Genre XVI. Oxobacter Genre XVII. Parasporobacterium Genre XVIII. Sarcina Genre XIX. Soehngenia Genre XX. Tepidibacter Genre XXI. Thermobrachium Genre XXII. Thermohalobacter Genre XXIII. Tindallia Famille II. Lachnospiraceae Genre I. Lachnospira Genre II. Acetitomaculum Genre III. Anaerofilum Genre IV. Anaerostipes Genre V. Butyrivibrio Genre VI. Catenibacterium Genre VII. Catonella Genre VIII. Coprococcus Genre IX. Johnsonella Genre X. Lachnobacterium Genre XI. Pseudobutyrivibrio Genre XII. Roseburia Genre XIII. Ruminococcus Genre XIV. Shuttleworthia Genre XV. Sporobacterium Famille III. Peptostreptococcaceae Genre I. Peptostreptococcus Genre II. Anaerococcus Genre III. Filifactor Genre IV. Finegoldia Genre V. Fusibacter Genre VI. Gallicola Genre VII. Helcococcus Genre VIII. Micromonas Genre IX. Peptoniphilus Genre X. Sedimentibacter Genre XI. Sporanaerobacter Genre XII. Tissierella Famille IV. Eubacteriaceae Genre I. Eubacterium Genre II. Acetobacterium Genre III. Anaerovorax Genre IV. Mogibacterium Genre V. Pseudoramibacter Famille V. Peptococcaceae Genre I. Peptococcus Genre II. Carboxydothermus Genre III. Dehalobacter Genre IV. Desulfotobacterium Genre V. Desulfonispora Genre VI. Desulfosporosinus Genre VII. Desulfotomaculum Genre VIII. Pelotomaculum Genre IX. Syntrophobotulus Genre X. Thermoterrabacterium Famille VI. Heliobacteriaceae

Genre I. Heliobacterium Genre II. Heliobacillus Genre III. Heliophilum Genre IV. Heliorestis Famille VII. Acidaminococcaceae Genre I. Acidaminococcus Genre II. Acetonema Genre III. Allisonella Genre IV. Anaeroarcus Genre V. Anaeroglobus Genre VI. Anaeromusa Genre VII. Anaerosinus Genre VIII. Anaerovibrio Genre IX. Centipeda Genre X. Dendrosporobacter Genre XI. Dialister Genre XII. Megasphaera Genre XIII. Mitsuokella Genre XIV. Papillibacter Genre XV. Pectinatus Genre XVI. Phascolarctobacterium Genre XVII. Propionispira Genre XVIII. Propionispora Genre XIX. Quinella Genre XX. Schwartzia Genre XXI. Selenomonas Genre XXII. Sporomusa Genre XXIII. Succiniclasticum Genre XXIV. Succinispira Genre XXV. Veillonella Genre XXVI. Zymophilus Famille VIII. Syntrophomonadaceae Genre I. Syntrophomonas Genre II. Acetogenium Genre III. Aminobacterium Genre IV. Aminomonas Genre V. Anaerobaculum Genre VI. Anaerobranca Genre VII. Caldicellulosiruptor Genre VIII. Carboxydocella Genre IX. Dethiosulfovibrio Genre X. Pelospora Genre XI. Syntrophospora Genre XII. Syntrophothermus Genre XIII. Thermaerobacter Genre XIV. Thermanaerovibrio Genre XV. Thermohydrogenium Genre XVI. Thermosyntropha Ordre II. Thermoanaerobacteriales Famille I. Thermoanaerobacteriaceae Genre I. Themoanaerobacterium Genre II. Ammonifex Genre III. Caldanaerobacter Genre IV. Carboxydibrachium Genre V. Coprothermobacter Genre VI. Gelria Genre VII. Moorella Genre VIII. Sporotomaculum Genre IX. Thermacetogenium Genre X. Thermanaeromonas Genre XI. Thermoanaerobacter Genre XII. Thermoanaerobium Genre XIII. Thermovenabulum Famille II. Thermodesulfobiaceae Genre I. Thermodesulfobium Ordre III. Halanaerobiales Famille I. Halanaerobiaceae Genre I. Halanaerobium Genre II. Halocella Genre III. Halothermothrix Famille II. Halobacteroidaceae Genre I. Halobacteroides Genre II. Acetohalobium Genre III. Halanaerobacter



Annexe 2 1019 Genre IV. Halonatronum Genre V. Natroniella Genre VI. Orenia Genre VII. Selenihalanaerobacter Genre VIII. Sporohalobacter Classe II. Mollicutes Ordre I. Mycoplasmatales Famille I. Mycoplasmataceae Genre I. Mycoplasma Genre II. Eperythrozoon Genre III. Haemobartonella Genre IV. Ureaplasma Ordre II. Entomoplasmatales Famille I. Entomoplasmataceae Genre I. Entomoplasma Genre II. Mesoplasma Famille II. Spiroplasmataceae Genre I. Spiroplasma Ordre III. Acholeplasmatales Famille I. Acholeplasmataceae Genre I. Acholeplasma Genre II. Phytoplasma Ordre IV. Anaeroplasmatales Famille I. Anaeroplasmataceae Genre I. Anaeroplasma Genre II. Asteroleplasma Ordre V. Incertae sedis (affiliation incertaine) Famille I. Erysipelotrichaceae Genre I. Erysipelothrix Genre II. Bulleidia Genre III. Holdemania Genre IV. Solobacterium Classe III. Bacilli Ordre I. Bacillales Famille I. Bacillaceae Genre I. Bacillus Genre II. Amphibacillus Genre III. Anoxybacillus Genre IV. Exiguobacterium Genre V. Filobacillus Genre VI. Geobacillus Genre VII. Gracilibacillus Genre VIII. Halobacillus Genre IX. Jeotgalibacillus Genre X. Lentibacillus Genre XI. Marinibacillus Genre XII. Oceanobacillus Genre XIII. Paraliobacillus Genre XIV. Saccharococcus Genre XV. Salibacillus Genre XVI. Ureibacillus Genre XVII. Virgibacillus Famille II. Alicyclobacillaceae Genre I. Alicyclobacillus Genre II. Pasteuria Genre III. Sulfobacillus Famille III. Caryophanaceae Genre I. Caryophanon Famille IV. Listeriaceae Genre I. Listeria Genre II. Brochothrix Famille V. Paenibacillaceae Genre I. Paenibacillus Genre II. Ammoniphilus Genre III. Aneurinibacillus Genre IV. Brevibacillus Genre V. Oxalophagus Genre VI. Thermicanus Genre VII. Thermobacillus Famille VI. Planococcaceae Genre I. Planococcus Genre II. Filibacter Genre III. Kurthia Genre IV. Planomicrobium

Genre V. Sporosarcina Famille VII. Sporolactobacillaceae Genre I. Sporolactobacillus Genre II. Marinococcus Famille VIII. Staphylococcaceae Genre I. Staphylococcus Genre II. Gemella Genre III. Jeotgalicoccus Genre IV. Macrococcus Genre V. Salinicoccus Famille IX. Thermoactinomycetaceae Genre I. Thermoactinomyces Famille X. Turicibacteraceae Genre I. Turicibacter Ordre II. Lactobacillales Famille I. Lactobacillaceae Genre I. Lactobacillus Genre II. Paralactobacillus Genre III. Pediococcus Famille II. Aerococcaceae Genre I. Aerococcus Genre II. Abiotrophia Genre III. Dolosicoccus Genre IV. Eremococcus Genre V. Facklamia Genre VI. Globicatella Genre VII. Ignavigranum Famille III. Carnobacteriaceae Genre I. Carnobacterium Genre II. Agitococcus Genre III. Alkalibacterium Genre IV. Allofustis Genre V. Alloiococcus Genre VI. Desemzia Genre VII. Dolosigranulum Genre VIII. Granulicatella Genre IX. Isobaculum Genre X. Lactosphaera Genre XI. Marinilactibacillus Genre XII. Trichococcus Famille IV. Enterococcaceae Genre I. Enterococcus Genre II. Atopobacter Genre III. Melissococcus Genre IV. Tetragenococcus Genre V. Vagococcus Famille V. Leuconostocaceae Genre I. Leuconostoc Genre II. Oenococcus Genre III. Weissella Famille VI. Streptococcaceae Genre I. Streptococcus Genre II. Lactococcus Famille VII. Incertae sedis (affiliation incertaine) Genre I. Acetoanaerobium Genre II. Oscillospira Genre III. Syntrophococcus Phylum BXIV. Actinobacteria Classe I. Actinobacteria Sous-classe I. Acidimicrobidae Ordre I. Acidimicrobiales Sous-ordre IV. Acidimicrobineae Famille I. Acidimicrobiaceae Genre I. Acidimicrobium Sous-classe II. Rubrobacteridae Ordre I. Rubrobacterales Sous-ordre V. Rubrobacterineae Famille I. Rubrobacteraceae Genre I. Rubrobacter Genre II. Conexibacter Genre III. Solirubrobacter Genre IV. Thermoleophilum Sous-classe III. Coriobacteridae Ordre I. Coriobacteriales Sous-ordre VI. Coriobacterineae



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Annexe 2 Famille I. Coriobacteriaceae Genre I. Coriobacterium Genre II. Atopobium Genre III. Collinsella Genre IV. Cryptobacterium Genre V. Denitrobacterium Genre VI. Eggerthella Genre VII. Olsenella Genre VIII. Slackia Sous-classe IV. Sphaerobacteridae Ordre I. Sphaerobacterales Sous-ordre VII. Sphaerobacterineae Famille I. Sphaerobacteraceae Genre I. Sphaerobacter Sous-classe V. Actinobacteridae Ordre I. Actinomycetales Sous-ordre VIII. Actinomycineae Famille I. Actinomycetaceae Genre I. Actinomyces Genre II. Actinobaculum Genre III. Arcanobacterium Genre IV. Mobiluncus Genre V. Varibaculum Sous-ordre IX. Micrococcineae Famille I. Micrococcaceae Genre I. Micrococcus Genre II. Arthrobacter Genre III. Citricoccus Genre IV. Kocuria Genre V. Nesterenkonia Genre VI. Renibacterium Genre VII. Rothia Genre VIII. Stomatococcus Genre IX. Yania Famille II. Bogoriellaceae Genre I. Bogoriella Famille III. Rarobacteraceae Genre I. Rarobacter Famille IV. Sanguibacteraceae Genre I. Sanguibacter Famille V. Brevibacteriaceae Genre I. Brevibacterium Famille VI. Cellulomonadaceae Genre I. Cellulomonas Genre II.Oerskovia Genre III. Tropheryma Famille VII. Dermabacteraceae Genre I. Dermabacter Genre II. Brachybacterium Famille VIII. Dermatophilaceae Genre I. Dermatophilus Genre II. Kineosphaera Famille IX. Dermacoccaceae Genre I. Dermacoccus Genre II. Demetria Genre III. Kytococcus Famille X. Intrasporangiaceae Genre I. Intrasporangium Genre II. Arsenicicoccus Genre III. Janibacter Genre IV. Knoellia Genre V. Ornithinicoccus Genre VI. Ornithinimicrobium Genre VII. Nostocoidia Genre VIII. Terrabacter Genre IX. Terracoccus Genre X. Tetrasphaera Famille XI. Jonesiaceae Genre I. Jonesia Famille XII. Microbacteriaceae Genre I. Microbacterium Genre II. Agreia Genre III. Agrococcus Genre IV. Agromyces Genre V. Aureobacterium

Genre VI. Clavibacter Genre VII. Cryobacterium Genre VIII. Curtobacterium Genre IX. Frigoribacterium Genre X. Leifsonia Genre XI. Leucobacter Genre XII. Mycetocola Genre XIII. Okibacterium Genre XIV. Plantibacter Genre XV. Rathayibacter Genre XVI. Rhodoglobus Genre XVII. Salinibacterium Genre XVIII. Subtercola Famille XIII. Beutenbergiaceae Genre I. Beutenbergia Genre II. Georgenia Genre III. Salana Famille XIV. Promicromonosporaceae Genre I. Promicromonospora Genre II. Cellulosimicrobium Genre III. Xylanibacterium Genre IV. Xylanimonas Sous-ordre X. Corynebacterineae Famille I. Corynebacteriaceae Genre I. Corynebacterium Famille II. Dietziaceae Genre I. Dietzia Famille III. Gordoniaceae Genre I. Gordonia Genre II. Skermania Famille IV. Mycobacteriaceae Genre I. Mycobacterium Famille V. Nocardiaceae Genre I. Nocardia Genre II. Rhodococcus Famille VI. Tsukamurellaceae Genre I. Tsukamurella Famille VII. Williamsiaceae Genre I. Williamsia Sous-ordre XI. Micromonosporineae Famille I. Micromonosporaceae Genre I. Micromonospora Genre II. Actinoplanes Genre III. Asanoa Genre IV. Catellatospora Genre V. Catenuloplanes Genre VI. Couchioplanes Genre VII. Dactylosporangium Genre VIII. Pilimelia Genre IX. Spirilliplanes Genre X. Verrucosispora Genre XI. Virgisporangium Sous-ordre XII. Propionibacterineae Famille I. Propionibacteriaceae Genre I. Propionibacterium Genre II. Luteococcus Genre III. Microlunatus Genre IV. Propioniferax Genre V. Propionimicrobium Genre VI. Tessaracoccus Famille II. Nocardioidaceae Genre I. Nocardioides Genre II. Aeromicrobium Genre III. Actinopolymorpha Genre IV. Friedmanniella Genre V. Hongia Genre VI. Kribbella Genre VII. Micropruina Genre VIII. Marmoricola Genre IX. Propionicimonas Sous-ordre XIII. Pseudonocardineae Famille I. Pseudonocardiaceae Genre I. Pseudonocardia Genre II. Actinoalloteichus Genre III. Actinopolyspora



Annexe 2 1021 Genre IV. Amycolatopsis Genre V. Crossiella Genre VI. Kibdelosporangium Genre VII. Kutzneria Genre VIII. Prauserella Genre IX. Saccharomonospora Genre X. Saccharopolyspora Genre XI. Streptoalloteichus Genre XII. Thermobispora Genre XIII. Thermocrispum Famille II. Actinosynnemataceae Genre I. Actinosynnema Genre II. Actinokineospora Genre III. Lechevalieria Genre IV. Lentzea Genre V. Saccharothrix Sous-ordre XIV. Streptomycineae Famille I. Streptomycetaceae Genre I. Streptomyces Genre II. Kitasatospora Genre III. Streptoverticillium Sous-ordre XV. Streptosporangineae Famille I. Streptosporangiaceae Genre I. Streptosporangium Genre II. Acrocarpospora Genre III. Herbidospora Genre IV. Microbispora Genre V. Microtetraspora Genre VI. Nonomuraea Genre VII. Planobispora Genre VIII. Planomonospora Genre IX. Planopolyspora Genre X. Planotetraspora Famille II. Nocardiopsaceae Genre I. Nocardiopsis Genre II. Streptomonospora Genre III. Thermobifida Famille III. Thermomonosporaceae Genre I. Thermomonospora Genre II. Actinomadura Genre III. Spirillospora Sous-ordre XVI. Frankineae Famille I. Frankiaceae Genre I. Frankia Famille II. Geodermatophilaceae Genre I. Geodermatophilus Genre II. Blastococcus Genre III. Modestobacter Famille III. Microsphaeraceae Genre I. Microsphaera Famille IV. Sporichthyaceae Genre I. Sporichthya Famille V. Acidothermaceae Genre I. Acidothermus Famille VI. Kineosporiaceae Genre I. Kineosporia Genre II. Cryptosporangium Genre III. Kineococcus Sous-ordre XVII. Glycomycineae Famille I. Glycomycetaceae Genre I. Glycomyces Ordre II. Bifidobacteriales Famille I. Bifidobacteriaceae Genre I. Bifidobacterium Genre II. Aeriscardovia Genre III. Falcivibrio Genre IV. Gardnerella Genre V. Parascardovia Genre VI. Scardovia Famille II. Incertae sedis (affiliation incertaine) Genre I. Actinobispora Genre II. Actinocorallia Genre III. Excellospora Genre IV. Pelczaria Genre V. Turicella

Phylum BXV. Planctomycetes Classe I. Planctomycetacia Ordre I. Planctomycetales Famille I. Planctomycetaceae Genre I. Planctomyces Genre II. Gemmata Genre III. Isosphaera Genre IV. Pirellula Phylum BXVI. Chlamydiae Classe I. Chlamydiae Ordre I. Chlamydiales Famille I. Chlamydiaceae Genre I. Chlamydia Genre II. Chlamydophila Famille II. Parachlamydiaceae Genre I. Parachlamydia Genre II. Neochlamydia Famille III. Simkaniaceae Genre I. Simkania Genre II. Rhabdochlamydia Famille IV. Waddliaceae Genre I. Waddlia Phylum BXVII. Spirochaetes Classe I. Spirochaetes Ordre I. Spirochaetales Famille I. Spirochaetaceae Genre I. Spirochaeta Genre II. Borrelia Genre III. Brevinema Genre IV. Clevelandina Genre V. Cristispira Genre VI. Diplocalyx Genre VII. Hollandina Genre VIII. Pillotina Genre IX. Treponema Famille II. Serpulinaceae Genre I. Serpulina Genre II. Brachyspira Famille III. Leptospiraceae Genre I. Leptospira Genre II. Leptonema Phylum BXVIII. Fibrobacteres Classe I. Fibrobacteres Ordre I. Fibrobacterales Famille I. Fibrobacteraceae Genre I. Fibrobacter Phylum BXIX. Acidobacteria Classe I. Acidobacteria Ordre I. Acidobacteriales Famille I. Acidobacteriaceae Genre I. Acidobacterium Genre II. Geothrix Genre III. Holophaga Phylum BXX. Bacteroidetes Classe I. Bacteroidetes Ordre I. Bacteroidales Famille I. Bacteroidaceae Genre I. Bacteroides Genre II. Acetofilamentum Genre III. Acetomicrobium Genre IV. Acetothermus Genre V. Anaerophaga Genre VI. Anaerorhabdus Genre VII. Megamonas Famille II. Rikenellaceae Genre I. Rikenella Genre II. Alistipes Genre III. Marinilabilia Famille III. Porphyromonadaceae Genre I. Porphyromonas Genre II. Dysgonomonas Genre III. Tannerella Famille IV. Prevotellaceae Genre I. Prevotella



1022

Annexe 2

Classe II. Flavobacteria Ordre I. Flavobacteriales Famille I. Flavobacteriaceae Genre I. Flavobacterium Genre II. Aequorivita Genre III. Arenibacter Genre IV. Bergeyella Genre V. Capnocytophaga Genre VI. Cellulophaga Genre VII. Chryseobacterium

Genre VIII. Coenonia Genre IX. Croceibacter Genre X. Empedobacter Genre XI. Gelidibacter Genre XII. Gillisia Genre XIII. Mesonia Genre XIV. Muricauda Genre XV. Myroides Genre XVI. Ornithobacterium Genre XVII. Polaribacter



Index A Abysses 641 Acaricide 902 Acariens 902 Acaryochloris 404 Accepteur d’électrons 102, 112 Acétate 574 kinase 586 produit de fermentation 585 Acetobacter 351, 976, 978 Acetobacterium woodii 576 Acétogène 636 Acétogénèse 575, 650 α-cétoglutarate 130 cycle de l’acide citrique 126 α-cétoglutarate deshydrogènase 345 Acétotrophe 426 réaction 436 Acétyl-CoA 116, 577, 589, 591, 598 cycle de l’acide citrique 126 produit de fermentation 585 synthèse 593 Acétylène réduction de l' 602 Acétyl-phosphate 585 Achromatium 340 Aciclovir 884 Acide 864 acétique 652, 976 aminé 966 ascorbique 978 aspartique structure 49 butyrique 652 carboxylique 41 citrique 978 cycle inverse 559 diaminopimélique 77 dipicolinique 87, 688 folique 700 gluconique 978 glutamique 966 structure 49 gras 740 oxydation 598 syntrophie 590 gras volatil 652 hydroxamique 104 inosinique 130 itaconique 978

lactique 972 lipoïque 103 lipoteichoïque 77 malique 972 mycolique 701, 866 N-acétylmuramique 77, 129 nalidixique 701 nicotinique niacine Voir Niacine nucléique 512, 701 hybridation 822, 826 organique métabolisme 597 p-aminobenzoïque 700 péroxyacétique 696 poly-β-hydroxybutyrique 84 poly-D-glutamique 853 propionique 652 sialique 708 tartrique 50, 973 teichoïque 77 Acide aminé 43 aromatique biosynthèse 208 groupe aminé 130 groupement amine 49 non conventionnel 196, 636 Acide citrique 126 cycle 126 Acide gras 67 ester méthylé 325 structure 46 synthèse 131 Acide nucléique 3, 40, 43 Acidianus 444–445 Acidithiobacillus 658 ferrooxidans 340, 438, 565, 659, 661 Acido-alcoolo-résistance 332 Acidophile 136, 158, 340, 436 Acinetobacter 354 Acné 875 ACP protéine transporteur de groupement acyle 131 Acte invasif 739 Actine 462 Actinomycète 594 Actinomycine 703 Activité de l’eau 936

eau 159 microbienne 3, 608, 621 superantigénique 944 Acyl-homosérine lactone spécifique (AHL) 221 Adamantane 708 Adaptation 226 Adéfovir 879 Adénine 47, 170, 586 synthèse 131 Adénosine phosphosulfate 563, 573 Adénosine diphosphoglucose ADPG Voir ADPG Adénosine monophosphate cyclique (AMP cyclique) 217 Adénosine triphosphate ATP Voir ATP Adenoviridae protéine terminale 536 Adenoviridae Voir Virus Adényl cyclase 735 Adényl cyclase-hémolysine 864 Adénylate cyclase 217 Adénylation 209 Adhésion 728 ADN 2, 4, 43 amplification 187 antiparallèle 168, 170 de synthèse 186 dénaturation 172 double hélice 170 grand sillon 170, 211 gyrase 168, 173, 181, 701 gyrase reverse 451 hybridation 323, 326 kilobase (kb) 171 kilopaires de bases (kpb) 171 ligase 179 linéaire 463 mégapaires de bases (Mpb) 171 petit sillon 170 polymérase 168, 178, 185, 187, 505, 970 I 179, 181 III 178–179, 181 relâché 173 réplication 177 stabilité thermique 450–451 structure super-enroulée 173



1024 Index

ADN-T 674 ADP 584 ADPG adénosine diphosphoglucose 129 Aérobactine 730 Aérobie 28, 136, 161 facultative 630 obligatoire 630 respiration 120 Aérosol 858, 899 Aérotactisme 99 Aflatoxine 911 Agar 12 Agaricus bisporus Voir Champignon de Paris Agent antimicrobien 686 bactéricide 686 biologique 851 chimiothérapeutique 706, 708, 715 antiviral 706 fongicide 686 stérilisant 686 Agent découplant 125 Agglutination de microbilles de latex 902 directe 813 facteur rhumatoïde 813 groupes sanguins 813 passive 813 virus 827 Agglutination 792 Agrégotope 776, 783 Agrobacterium 673 rhizogenes 673 tumefaciens 673 Agrobacterium tumefaciens 1000 ADN-T 1000 plasmide Ti 1000 Akinète 402 Alanine aminotransférase 879 Alarmones 218 ALAT Voir Alanine aminotransférase Alcalinophile 430 Alcaliphile 136, 158 Alcalophile 34 Aldolase 118 Algue 23, 456, 481 calcaire 484 Chlorella Voir Chlorella virus corraligène 484 diatomée 484 écologie 485 endolithe 486 motilité 485 verte 482 Aliment non périssable 936 périssable 936

Allèle 302 Allolactose 213 Allophycocyanine 550 Allostérie 207 Altération alimentaire 936 Amantadine 706, 874 Ames test 268 Amiante 692 Amibe 473, 931 Amibiase 474, 845, 931 intestinale aiguë 932 Amidon 45, 117, 484, 594 Amikacine 704 Aminoacyl-AMP 197 Aminoacyl-ARNt synthétase 168, 195, 197 Aminoglycoside 686, 704–705 Aminoside 704 Aminotransférase 130 Ammoniac 567 source d’azote 103, 130 Ammonification 655 Ammonium mono-oxygénase 347, 567, 621 Amoeba 473 Amoebicide de contact 932 tissulaire 932 Amorce 168, 178, 186 ARN 178–179, 181 Amoxicilline 905 AMPc 476 Amphipathique 46 Amphotericine B 913 Ampicilline 703 Amylase 595, 969 Amylphénol 696 Anabaena 401, 403 azollae 681 Anabolisme 102, 129 Anaérobie 28, 136 aérotolérant 136, 161 chambre 163 eucaryote 458 facultatif 161 jarre 162 organisme 630 respiration 126 sporulé 945 strict 161 Anaérobiose 792 Analogue de facteur de croissance 686, 698 Analogue de base Voir Mutation Analogue didésoxy 185 Analyse phylogénétique 620

Anammox (anoxic ammonium oxydation) 339, 544, 567, 656 Anammoxosome 568 Anatoxine 744, 767–768, 914 diphtérique 863 Ancêtre commun 5 Ancêtre universel 316 Ancyclobacter 366 Androgène Voir Stéroïde Anémie à hématie falciforme 896, 907 pernicieuse 966 Anergie 776, 785 Angine streptococcique 860 Animal sauvage 896 Anneau L 92 MS et C 93 P 92 Annelage 172 Annotation 488 Anoxique 544, 630, 637 Anoxygénique photosynthèse 128 Antenne 544 photosynthétique 548 Anthranilate synthétase 222 Anthrax 12, 851, 853 pulmonaire 853 Antibiogramme 792 Antibiotique 686, 695, 698, 702–703, 800–803 à cycle β-lactame 686, 964 à large spectre 686, 702, 956 acide 6-aminopénicillanique 964 amplification des gènes 962 β-lactame 956 céphalosporine 965 détermination de la sensibilité 800 dilutions 800 effet sur les eucaryotes 460 inhibition de la synthèse protéique 201 pénicilline G 964 Penicillium chrysogenum 964 purification 962 rendement 962 screening 961 spectre d’activité 965 tétracycline 965 Anticodon 168, 193, 195–196 Anticorps détection de clone 987 fluorescent 615 planticorps 1003 Anticorps (Ac) 744–745, 749, 752–754, 757–764, 766–768, 771, 781–782 fluorescence 815 fluorescent 792



Index 1025

Anticorps (Ac) (suite) monoclonal 792 monoclonaux 808 polyclonal 792 polyclonaux 808 réponse immune 806 titre 807 Anti-facteur sigma 219 Antigène capsulaire Vi 731 flagellaire H 731 O 731 Antigène (Ag) 744–745, 748, 751–764, 766–772, 777–778, 780–783, 785– 786, 788–789 soluble urinaire 931 tumoraux 810 Anti-inflammatoire 739 Antiparallèle ADN 168 Antiport 72 Antiport Na+/H+ 432 Antirétroviraux enfuvirtide 890 inhibiteurs de la protéase 890 INNTI 889 INTI 889 résistance 890 traitement 889 Antiseptique 686, 696 Antitoxine 914 Apicomplexé 475 Apicoplaste 475 Apolaire 40–41 Apoptose 757, 776, 785 Appareil de Golgi 461 Appareil photosynthétique 547 bactéries pourpres 551 phototrophes oxygéniques 555 Aquachéline 105 Aquaporine 70 Aquaspirillum 364 Aquifex 32, 307, 317, 421, 452 aeolicus génome 494 Arabidopsis thaliana génome 500 Arbovirus 846 Arbre phylogénétique 19, 469 universel 302 Arbuscular mycorhizae 672 Archaea 22–23, 26, 68, 78, 302, 316, 318, 426, 577, 640 arbre phylogénétique 426 distribution des gènes 498 hyperthermophiles 307 virus 521 Archaeoglobale 439

Archaeoglobus 439–440 Arginine régulon 216 synthèse 208 Arginine dihydrolase 402 Arme biologique 851–852 ARN 2, 5, 22, 43, 305 16S 311 23S 311 5S 311 antisens 228 catalytique 305–306, 468 de transfert 43, 188 messager 43 monde 468 petit 228 polymérase 319, 512 régulation 222 ribosomal 48, 168–169, 188 16S 618 traduction 200 unité de transcription 192 ribosomique 26, 311 16S 302 ribozyme 468 viral négatif 243 positif 243 ARN de transfert (ARNt) 168–169, 195, 319 activation 197 base modifiée 195 boucle D 195 boucle de l’anticodon 196 boucle TψC 195 chargement 197 extrémité acceptrice 196 non chargé 218 reconnaissance 196 structure 195 en feuille de trèfle 195 ARN messager (ARNm) 168–169, 192, 319 ARNm polycistronique 192, 199, 214 coiffe 467 dégradation 467 épissage 467 hybridation 507 intron 466 maturation 466 puce à ADN 507 queue poly-A 467 site de fixation ribosomique 199 structure en lasso 467 structure tige-boucle 223 traduction 200 transcription 188 transcriptome 507 ARN polymérase 168, 189

ARN dépendante 242 core enzyme 189 facteur sigma Voir Facteur sigma I 191 II 191 III 191 ARN ribosomal 16S 310, 326 18S 311 ARNr phylogénie 469 ARNt 702 Voir ARN de transfert Arsenate 582 Arsenic 582 Arsenite 582 Artémisine 906 Arthropode 836, 900 hématophage 900 Ascidie symbiote 403 Ascomycète 480 Ascospore 466, 479 Asepsie 102 culture 108 Aseptisant 696 Ashbya gossypii 966 Aspartame 956, 966 Aspartate 130 Aspartokinase Voir Lysine Aspergillus flavus 911 niger 978 sp. 911 Asque 466, 479 Atovaquone 905 ATP 47, 70–71, 112, 561 activation d’un acide aminé 197 adénosine triphosphate 116 fermentation 584 repliement protéique 201 sulfurylase 573 ATP Synthase 102 ATPase Voir ATPase ATP Voir Adénosine triphosphate ATPase 307 ATP synthase 124 Att région 276 Attaque bioterroriste 911 Atténuateur 222 Atténuation 206, 222, 720, 730 Auto-anticorps 744, 771 Autoclave 686, 688 Auto-épissage 210 Autolyse 136 Autolysine 139–140 Autophosphorylation 224 Autotrophe 16, 29, 102–103, 128



1026 Index

Autotrophie 545, 562, 574, 579 Archaea 428 Auxotrophe 258, 260 Avery, Oswald T. 272 aw Voir Activité de l'eau Azidothymidine 706 Azithromycine 705 Azobacter 30 Azolla 681 cyanobactérie endosymbiote 403 Azomonas 352 Azorhizobium 676 caulinodans 681 Azospirillum lipoferum 364 Azote 103 assimilation 225 cycle de l’ 655 fixation de l' 352, 599, 604, 655 nitrogénase 353 Azotobacter 352, 601, 610, 681 AZT 706

B BAC (Bacterial Artificial Chromosomes) 489 Bacille 64, 864 acido-alcoolo-résistant 864 Calmette-Guérin 866 Bacillus 10, 30 anthracis 851, 853 atténuation 224 cereus 951 licheniformis 970 sporulation 225 Bacillus anthracis 12, 701 Bacillus subtilis 219, 224 compétence 272 génome 494 Voir aussi Hôte de clonage Bacillus thuringiensis toxine Bt 1002 Bacteria 22–23, 26, 30, 77, 302, 316, 318, 640 distribution des gènes 498 hyperthermophiles 307 Bactéricide 686, 694 Bactérie 722, 792 acétique 351, 976 acidophile 661 amonium-oxydante 338 anaérobie stricte 792, 797 appendiculée 64 bourgeonnante 368 cellulolytique 648 corynéforme 794 entérique 332 filamenteuse 64 Gram négatif 58, 80 Gram positif 58, 80, 722

lactique 105, 972 hétérofermentaire 972 homofermentaire 972 nitratante 631 nitrifiante 332, 656 nitrite-oxydante 338 nitrosante 631 pourpre 332, 334 sulfato-réductrice 332, 573, 649, 651, 657 sulfo-oxydante 562, 657 syntrophe 647 verte 332 Bactériémie 720, 730, 793 Bactériochlorophylle 544 a 546, 681 Bactériocine 280 Bactériologie 10 Bactériophage 232–233, 512, 716, 850, 860 contrôle transcriptionnel 989 φX174 Voir Virus G 233 lambda 247, 275, 489 M13 487 Voir Virus MS2 513 Voir Virus Mu 520 Voir Virus T4 235 T7 517 Bactériophage Voir Virus Bactériophéophytine 551 Bactériorhodopsine 426, 432, 640 Bactériorubérine 431 Bactériostatique 686, 694 Bactériurie 794 Bactéroïde 677, 725, 796 Bactoprénol 139 Balantidium coli 475 Baltimore, classification 241 Baltimore, David 241 Banque de gènes 987 génomique 291, 489 Barème de stérilisation 688 Barophile 641 extrême 641 Barotolérant 641 Barrière 740 Base azotée 47 purique 168, 170 pyrimidique 168, 170 Baside 479 Basidiomycète 479 Basidiospore 479–480 Bassin de coagulation 918

Bayou, virus 899 β-carotène 549 Bdelloplast 365 Bdellovibrio 363, 365–366 Beggiatoa 10, 341, 564, 644 Beijerinck, Martinus 15, 523, 608 Benzathine-pénicilline G 883 Benzène 591 Benzoate 591 Benzoyl-CoA 592 Bêta-galactosidase 213, 216 Bêta-oxydation 591, 598 Biais d’usage des codons 492 de codon 504 Bicouche phospholipidique 67 Bière 973 ale 973 brassage 973 diagramme de brassage 973 drêches 973 fermentation basse 973 haute 973 houblon 973 lager 973 maische 973 malt 973 moût 973 Saccharomyces cerevisiae 973 Biocarburant 8 Voir Éthanol Biocatalyse 956 Biodiversité 608 Biofilm 61, 65, 221, 631, 698, 723, 728 Biogéochimie 629 Bioinformatique 488 Biolixiviation 659, 661 de l’or 663 de l’uranium 663 Biologie moléculaire M13 Voir Virus Bioluminescence 359 régulation 221 Biomasse 6, 8 Bioremédiation 661, 665 Biosynthèse 129 Biotechnologie 19, 956, 984 microbienne 956 Voir Génie génétique Bioterrorisme 852–853 Biotine 103, 105 Biotransformation 956 β-lactamase 704, 710, 713 β-lactamine 703–704, 862 Blanc de champignon Voir Champignon Bleu de méthylène 58 Boisson distillée 956



Index 1027

Boîte de Petri 107 Boîte de Pribnow promoteur 191 Boîte TATA promoteur 191 Bordetella pertussis 863 Borrelia afzelli 903 burgdorferi 105, 902 garinii 903 Botryococcus braunii 667 Botulisme 734, 936 alimentaire 946 Voir aussi Clostridium botulinum 945 Boucle de l’anticodon 196 Boues activées 922 Bradyrhizobium 676 japonicum génome 494 Branhamella 354 Brassage 956 Voir Bière Brevibacterium flavum Voir Lysine Brin avancé réplication 179 retardé réplication 179 Brocadia 569 anammoxidans 568 Bromo-uracile 701 Bronchiolite 836 Broyeur 943 Brucella abortus 730, 851 Brucellose 688, 851 Bubon 909 Bulking 342 Bunyaviridae 899 Bunyavirus 836 Burkholderia 349 cepacia 739 Burkitt, lymphome 886 Butyrate 590

C C. acidiurici 586 C. botulinum 914 C. perfringens 914 C. purinolyticum 586 Cadre de lecture synthèse protéique 194 Cadre ouvert de lecture 488, 492, 495 gène 195 Caenorhabditis elegans génome 500 Calcium 103 dipicolinate 90

Calvin, Melvin 557 Campagnol 899 Campylobacter 363, 366, 688, 795 coli 949 fetus 949 jejuni 714, 949 spp. 949 Candida 710 albicans 480 génome 499 Candida albicans 841 Canon à ADN 987 Capside 233 Voir Virus Capsomère 234 Capsule 56, 83, 728, 731, 853, 862 Carbénicilline 704 Carbonate 428 Carbone cycle du 646 monoxide déshydrogénase 343 Carboxydotrophes bactéries 343 Carboxylation 591 Carboxysome 332, 341, 544, 558 Carcinome hépatocellulaire Voir CHC Carie dentaire 720, 723 Caroténoïde 431, 544, 549 Carpophore 479 Carrier state Voir Virus Carte de restriction 184 génétique 258, 297 Cartographie optique 184 Cassette mutagenèse Voir Mutagenèse Cassure antigénique 872–873 cat 489 Catabolisme 102 Catalase 163, 875 Catalyse enzyme 111 Catalyseur 102, 111 Catéchol 104, 591 Caulobacter 368, 371 crescentus génome 494 CCR5 740 corécepteur 886 CD4 740 protéine 885–886 Ceftriaxone 905 Cellobiose 596 Cellule 2–3, 860 à ADN 306 B 806 hybridomes 808 comptage 144–145

dendritique 744, 746, 748, 752, 755, 769 densité 147 eucaryote 309 fille 138 lignées 826 lyse 144 natural killer (NK) 757 présentatrice d’Ag 744 présentatrice d’Ag (CPA) 747–748, 752, 755, 757–758, 777–778, 786 primaire 826 T 860 CD4 806, 815, 885–887 CD8 807, 815 cytotoxiques 807 helper 806 SIDA 815 végétative 90 viable 143, 145 Cellules de mammifères culture 986 hôte de clonage 992 Cellulose 45, 484, 594 Centre réactionnel 544, 548 bactéries pourpres 551 Centre de contrôle et de prévention des maladies infectieuses 830 Centromère 175, 490 Céphalosporinase 704 Céphalosporine 703–704, 862 Cephalosporium sp 704 Céphamycine 703 Cercle roulant Voir réplication CFA 729 CFTR 739 Champagne 971 Champignon 23, 456, 478, 708 blanc de 980 comestible 980 de Paris 980 fructification 980 gobetage 980 lardage 980 macroscopique 479 microscopique 911 levure 911 moisissure 911 noir 981 volée 980 Chancre 883 syphilitique 882 Chant du coq 864 Chaperon 450 moléculaire 168, 201, 220 Chaptalisation Voir Vin Charge virale VIH 889–890



1028 Index

Chauve-souris 896 CHC 878 Cheminée hydrothermale 452 Chémokine 764, 776 Chémostat 136, 149 Cheval 909 Chevelu racinaire 673 Chien 897 Chimio-autotrophes 16 Chimiolithotrophe 22, 28, 128, 307, 332, 561 Chimiolithotrophie 15, 126, 337, 342, 561 Archaea 427 Chimio-organotrophe 22, 28, 307, 478, 647 Chimio-organotrophie Archaea 427 Chimio-osmose 102, 122 Chimiorécepteur 97 Chimiosynthèse 647 Chimiotactisme 96, 226, 476 Chimiotaxie 56 Chimiotaxinomie 322 Chimiothérapeutique 698 Chimiotrophe 28 Chitine 456, 478, 709 Chlamydia 32, 795, 843 trachomatis 795, 883 transfert horizontal de gènes 504 Chlamydiose 883 Chlamydomonas nivalis 153 Chloramine 918, 924 Chloramphénicol 702, 900–901, 910 Chlorate 581 de sodium 696 Chlore 918–919 Chlorella virus PBCV-1 525 Chlorella vulgaris 501 Chlorobium 559, 567 Chloroflexus 31, 303, 548, 559 Chlorophylle 544, 546 a spectre d’absorption 546 b 546 types 484 Chlorophyta 482 Chloroplaste 23, 26, 177, 309, 456, 459 ADN 460 ARNr 500 ARNt 500 endosymbiote 500 génome 500 origine 404, 460 Chloroquine 905 Chlorosome 332, 544, 548 Chlortétracycline 705

Chlostridium 30 Choc froid 220 septique 793 thermique 219 toxique staphylococcique 875 Choléra 735, 836, 843, 850, 926 Chromatine 173 Chromobacterium 354 Chromosome 22, 25, 168, 173, 175, 177, 456 artificiel 488 bactérien 489 domaine super-enroulé 174 Chronomètre de l’évolution 302 moléculaire 311 cI gène 249 cII gène 247 cIII gène 247 Cil 462 Cilié 456, 474 Ciliophora 474 Ciprofloxacine 701, 854, 910 Cirrhose 877 Citrate lyase 559 métabolisme 597 synthétase 559 Clarithromycine 705 Classe 326 Classification Baltimore 241 Clofazimine 867 Clonage 290 détection de gène via sonde nucléique 988 détection de protéines via anticorps 987 en aveugle 258 gène étranger exprimé dans l’hôte 987 moléculaire 258, 984 sélection du bon clone 987 Clostridium 586, 594, 725, 796–797, 837 aceticum 576 botulinum 690, 734, 738, 945 pasteurianum 601 perfringens 733, 797, 945 tetani 731, 734, 740, 797, 914 Clostridium pasteurianum 16 CMI 686, 694–695 CO2 cycle de l’acide citrique 126 Coagulase 733, 875 Coagulation 918

facteurs de coagulation VII, VIII, IX 995 Cobalamine vit B12 105 Cocci 64 Coccidie 929 Coccidioïdomycose coccidioides immitis 912 Coccidiose 475 Coccus Voir Cocci Code génétique 193 dégénéré 193 dégénérescence 992 universel 195 Codon 168–169, 193, 195, 990 d’initiation 193, 199, 492 non-sens Voir Codon stop start 319 stop 193, 492 Coenocytique hyphe 479 Coenzyme 102, 105, 112, 115 A 103, 116 B 577 F420 577 F430 577 M 577 Q 123 Cognac 971, 974 Cohn, Ferdinand 10, 30 Cointégrat 288 Coliforme 918 Collagénase 733 Collection 956 Colonie 107, 145 Colonisation 720, 730, 837 Colonization factor antigen 729 Colonne de Winogradsky 608 Coloration 57 différentielle 58 du chromosome 617 génétique 617 Gram 58, 74, 80, 794 simple 58 viable 615 Communauté microbienne 6, 315, 608, 628 Compétence 272 Complément 744 Complément (C) 752, 764, 771, 776– 777, 781 Complémentaire 168, 170 Complementary-determining region (CDR) 776, 781–783 Complexe méthyl-réductase 578 milieu de culture 105



Index 1029

Complexe majeur d’histocompatibilité (CMH) 744, 754–757, 762, 777– 779, 781, 783, 787, 790 Complexe succinate déshydrogénase 123 Composé aromatique 586 chloré 668 inorganique 582 osmocompatible 160 osmorégulateur 136 riche en énergie 116 Concatémère 244, 512, 518 Concentration minimale inhibitrice (CMI) 694, 800 Conidie 456 Conjugaison 258, 281 levure 466 Conservation de l’énergie 117 Conserve au vinaigre 936 en boîte 936 Consortium 332 Contaminant 11, 107 Contamination aliment 836 eau 836 fomites 836 prévention 843 Contracture 914 Contrôle bactériologique des aliments 942 global 216 réponse stringente 218 négatif 206, 213 positif 206, 214–215 traductionnel 227 Coqueluche 843, 851, 863 Coralligène Voir Algue Cordon d’infection 677 Corécepteur CCR5 886 CXCR4 887 Corépresseur 213 Co-réticulation Voir Immobilisation Corn steep liquor 957 Coronavirus 841, 871 Voir Virus Corps basal 93 Corps d’inclusion 993 Corps de Negri 897 Corps parabasal 473 Cortex 90 Corticoïde 968 Cortisone 738 hydroxylation 968 Rhizopus nigricans 968 Voir aussi Stéroïde 969 Corynebacterium diphteriae 734, 862 Cosmide 294

Couche muqueuse 720 S 56, 78, 82 Couche S 433, 438, 448 Couple redox 307 Couple fumarate/succinate 113 Course 97 Coxiella burnetii 361, 902 Coxsackie virus 871 Coyote 896 Crenarchaeota 317, 426, 441 Voir Archaea Crête 456, 458 Creutzfeld-Jacob maladie 952 Criblage 258, 260 cro gène 247 Crochet 92 Croissance 5, 136 cryptique 144 diauxique 216 exponentielle 136, 141–142 phase 143 Crotonate 589 Crown gall 673 Cryptosporidiose 886, 929 Cryptosporidium 850, 925 parvum 929 CTS Voir Choc toxique staphylococcique Ctx 735 Culbute 97 Culture asepsie 108 cellulaire 236, 692, 826 d’enrichissement 2, 15, 608, 610, 792 milieu clos 136, 144 milieu ouvert 149 pure 2, 12, 102, 107, 612 CXCR4 740 CXCR4, corécepteur 887 Cyanidium 486 Cyanobactérie 30, 304, 307, 332, 400, 681 ADN génomique 403 écologie 402 morphologie 400 motilité 402 nutrition 402 paroi 400 toxicité 402 Cyanophycine 402 Cycle 8 azote 8 biogéochimique 629 β-lactame 703, 705, 710, 713, 715 carbone 8 de Calvin 459, 544, 557, 576, 644

de Calvin (stoechiométrie) 558 de l’acide citrique 102 de l’acide citrique inverse 559 de l’azote 655 de l’hydroxypropionate 560 de l’oxygène 646 dihydrothiazine 704 du carbone 646 du fer 658 du glyoxylate 597 du mercure 664 du soufre 657 inverse de l’acide citrique 576 lytique 232 naphthacène 705 Q 124 soufre 8 thiazolidine 704 Cycloheximide 702 Cyclosporose 951 Cystéine structure 49 Cytochrome 120 a 120 b 120 bc1 121, 553 c 120 c2 553 Cytokine 708, 744–745, 751–752, 757– 758, 762, 764, 769–770, 772, 785, 787–789 Cytomégalovirus 843 Voir aussi Herpesviridae Voir aussi Pneumopathie Cytomètre de flux 815 Cytophaga 594 Cytoplasme 2, 4, 22, 457 Cytosine 47, 170 synthèse 131 Cytosquelette 456, 462 Cytostome 472, 474

D DAHP synthétase 208 Daim 903 DAP Voir Acide diaminopimélique DAPI 608, 614 Dapsone 867 Daptomycine 705 DBO (demande biologique en oxygène) 628, 638, 920-923 DDT (dichlorophényltrichloréthane) 843 Décapsidation 240 Décès 845, 853 Déchloration aérobie 669 réductrice 583, 668



1030 Index

Déchlorination réductrice 544 Décomposition 479 Décontamination 686–687 DEET (diéthyl-m-toluamide) 909 Deferribacter 422 Déficience 739 Défini, milieu de culture 105 Déhalorespiration 583 Deinococcus radiodurans 32, 267 Délétion clonale 776, 785 Demande biologique en oxygène Voir DBO Demi-réaction 113 Dénaturation 40, 52 ADN 172 Dengue 845–846 Dénitrification 544, 571, 655 Dénombrement 144–145 Dépurination 451 Dépyrimidination 451 Dérive antigénique Voir Glissement antigénique Désinfectant 686, 696 Désinfection 686–687, 739, 843 Désinsectisation 691 Désoxyribose 47, 129, 170, 188 Destruction thermique 688 Desulfomonile 668 Desulfovibrio 573 sulfodismutans 575 Desulfurococcale 446 Desulfurococcus 447 Détection de quorum 5, 206, 221 Détérioration 8 Déterminant antigénique (épitope) 754, 759–760, 783 Dextrane 596, 723 sucrase 596 Dextransucrase 723 DGGE (denaturing gradient gel electrophoresis) 608, 619 Diagnostic virologique culture cellulaire 826 immunoanalyses 826 microscopie électronique 826 Diarrhée 735 du voyageur 948 Diatomée 484 forme pennée 485 forme radiale 485 Dichlorophényltrichloréthane (DDT) 843, 906 Dictyostelium discoideum 476 Dicumarol 125 Didinium 474 Diéthyl-m-toluamide (DEET) 902, 905 Différenciation 4

Différentiel, milieu de culture 107 Diffusion 730 en milieu gélosé 695 Digesteur 921 Dihydrothiazine 704 Dihydroxyacétone phosphate 118 Dilution 146 Diméthylase 227 Diméthyl-mercure 664 Diméthyl-sulfoxyde 583 Diméthylsulfure 658 Dinitrogénase 600–601 réductase 600–601 Dinitrophénol 125 Dinoflagellé 482 Dioxygénase 590 Dipeptide 51 Diphtérie 838, 843, 851, 862 Dipicolinate, calcium 90 Diploïde 25, 465 Diplomonadine 35, 318, 469 Dirithromycine 705 Disaccharide 45, 596 Dismutation 544 du soufre 575 Dispositif de codage 5 Disruption génique 258 Distance évolutive 302, 313 Distillation 973 Diversité des fermentations 586 Divinyl chlorophylle a 404 Division cellulaire 137 eucaryote 465 Divisome 136–137, 139 DL50 238, 730, 737 DMSO 658 Dogme de la biologie cellulaire 169 Doigt de zinc 211 Domag, Gerhard 700 Domaine 22, 26, 302, 326, 744, 755, 760, 762, 769, 772, 777–778, 781– 783 protéine 51 Donneur d’électrons 102, 112, 115 Dose létale 50 730 Doxycycline 902, 905, 910 Dracunculose 844 Dracunculus medinensis 845 Drépanocytose homozygote 907 Drosophila melanogaster, génome 500 Dunaliella 429 Dynéine 463 Dysenterie amibienne 932

E Eau brute 918 potable 924, 926 récréative 926

usée 918 Ebola 899 Échinocandine 709 Éclipse 239 Écogénomique 620 Écologie 2 algues 485 microbienne 6, 34, 608, 628 Écosystème 2, 6, 628 Écotype 302 Ectomycorhize 672 Ectothiorhodospira 429 Édition des ARN 488, 503 Effecteur 207, 213 Effet glucose 216 Efflorescence 85 dinoflagellés 482 Effluent 918 EGH 901 Ehrenberg 364 Ehrlich, Paul 698 Ehrlichia 362, 901 chaffeensis 900–901 equi 901 Ehrlichiose 362, 896, 900, 902 monocytaire humaine 901 EIEC Voir Escherichia coli entéro-invasif Eimeria 475 Électron accepteur terminal 115 donneur primaire 115 transporteur 115 Électronégatif 41 Électrophorèse 183 immunoblot 821 sur gel en gradient dénaturant 619 Éléctroporation 987 Élément transposable 177, 258 transposase Voir Mu Éléments génétiques mobiles 850 ELISA 899, 902, 904, 909 direct 817, 826 immunoblot 821 indirect 817, 827 SIDA 817 tests rapides 817 VIH 817, 889 Émergence 840, 846, 850 EMH (ehrlichiose monocytaire humaine) 901 Empreinte ADN 984, 1001 Énantiomères 40 Encéphalite 845, 851, 909 de Californie 836 de Saint-Louis 851 japonaise 851 Encephalitozoon 469, 471



Index 1031

Encephalitozoon cuniculi génome 500 Encéphalopathie bovine spongiforme 952 Encéphalopathie spongiforme transmissible Voir Prion Endémie 830, 844, 850 Endergonique 102 réaction 110 Endogénote 269 Endolithe Voir Algue Endomycorhize 672 Endospore 30, 56, 87, 688, 698, 853 Endosymbiose 22, 26, 35, 302, 309, 456 théorie 460 Endotoxine 80, 720, 736, 910 Énergie 8, 109 d’activation 102, 110 de formation 110 libre 102, 109, 561 Enfuvirtide 706, 890 Enrichi, milieu de culture 107 Enrichissement 608 Ensemencement 145 Entamoeba 471 Entamoeba histolytica 474, 931 génome 499 Entécavir 879 Entériques 359 Enterobacter 358, 794 Entérobactérie 794 Entérobactine 104 Enterococcus faecalis 725, 794 Enterococcus faecium 714 Entérotoxine 720, 729, 735, 852, 948 cholérique 927 staphylococcique 875, 944 Entérovirus 843, 931 env gène 252 Envahissement 729, 731 Enveloppe 235 Enveloppé 512 Enzyme 2, 5, 51, 102, 111 adénosine déaminase 999 alginate lyase 996 allostérique 206–207 constitutive 206 de restriction 19, 168, 182 analyse de l'ADN 183 séquence de reconnaissance 182 désoxyribonucléase humaine I 996 exo- 969 extrémozyme 970 immobilisée 956, 970 inhibition non covalente 207 iso-enzyme 208 modification covalente 208

Enzyme-linked immunosorbent assay Voir ELISA EPEC Voir Escherichia coli entéropathogène Éperon 812 Épidémie 830 de Milwaukee 929 grippe 873 H5N1 874 interhumaine 837 source commune 836, 846 Épidémiologie 830 Épidémiologiste 831 Épididymite 883 Épilimnion 637 Épisome 277 Épissage 467, 503 protéique 210 Épitope 744, 776 Epulopiscium 64 Equilibre hydrique 431 Ergostérol 709 Erythema migrans (EM) 903 Erythrobacter 640 Érythromycine 705, 862 ESB Voir Encéphalopathie bovine spongiforme Escherichia 356 Escherichia coli 25, 30, 64, 72, 104, 107, 297, 572, 631, 722, 725, 727– 728, 730, 793, 795, 837, 841, 919 ADN polymérase III 505 atténuation 224 beta-galactosidase 489 catabolisme du maltose 214 entéro-hémorragique 948 entéro-invasif 949 entéropathogène 949 entérotoxinogène 948 facteur sigma 220 génome 494 O157 H7 688, 846, 851, 948 opéron tryptophane 222 pathogène 948 plasmide F 489 Voir Hôte de clonage Espèce 302, 326 ETEC Voir Escherichia coli entérotoxinogène Etest 801 Éthanol 974 biocarburant 975 produit de fermentation 119, 585 Éther, liaison 132 Eucaryote 22–23 génomes 499 Euglena 473 Euglena gracilis 501

Euglène 473, 482 Eukarya 22, 26, 35, 316, 318, 708 phylogénie 469 Euryarchaeota 317, 426, 428 Euryarchaeota Archaea 33 Évolution 5, 22, 26 microbienne 316, 452 Excisionase, gène xis 250 Exergonique 102 réaction 110 Exoenzyme 956 Exogénote 269 Exon 168–169 Exosporium 87 Exotoxine 720, 733, 860, 914 A 734 botulique 945 pyrogène 860 streptococcique A 860 streptococcique B 861 streptococcique C 861 Expérience de Volta 433 Expression génétique 206, 488 puce à ADN 508 Extéines 210 Extrémité acceptrice 200 Extrémophile 22, 29, 136 Extrémozyme 956, 970

F Facteur de croissance 105 de virulence 900, 903, 910 limitant 149 rhumatoïde agglutination 813 Facteur nod 677–678 Facteur sigma 190 32 220 70 219 alternatif 219 Facteurs de l’hôte 737 Facultatif, organisme 136 FAD, flavine-adénine dinucléotide 120, 598 FADH2 126 FAME (Fatty acid methyl ester) 302 Famille 302, 326 de gènes 488, 503 Fasciite nécrosante 861 Fausse membrane Diphtérie Fèces Voir Selle Fer 103, 978 cycle du 658 en rubans 307 ferreux 565, 658 ferrique 565, 581, 658 oxydation 565 réduction du 658



1032 Index

Fermentation 102, 544, 584, 647, 798, 956, 959 aérobie 959 alcoolique 956, 972 anaérobie 959 bactérienne 725 basse Voir Bière conservation de l’énergie 117 équilibre redox 585 haute Voir Bière homoacétique 576 hydrogénosome 458 liqueur de trempage de mais 965 malo-lactique 972 Fermenteur 956, 959 aération 960, 976 agitation 959 bullage 960 contrôle 960 de laboratoire 961 double enveloppe de refroidissement 959 hall pilote 961 mise à l’échelle 960–961 pH 960 scale up 960 serpentin de circulation d’eau 959 Fermeture à leucine 211 Ferrédoxine 121, 585 Ferrobactérie 565 Ferroglobus 439–440 Ferro-oxydantes 339 Ferroplasma 436–438, 565, 661 Feuillet bêta 51 FHSR (fièvre hémorragique avec syndrome rénal) 899 Fibres de borosilicate 692 Fibrobacter 594 Fibrobacter succinogenes 652 Fièvre à virus West Nile (VWN) 896 de la vallée du Rift 850 équine du Potomac 362 hémorragique 843, 845–846, 850– 851, 899 avec syndrome rénal 899 jaune 843 pourprée des Montagnes Rocheuses 361, 896, 900, 902 Q 361, 688, 902 typhoïde 361, 688, 833, 843, 931, 947 West Nile 842 Filovirus 850 Filtration 918 Filtration en épaisseur 692 Filtration stérilisante 692 Filtre épais 692 HEPA 686, 692

membranaire 692 Nucléopore 693 Fimbriae 82, 728, 731 Fiole Pasteur 11 FISH MAR 622 FISH (fluorescent in situ hybridization) 302, 314, 608, 617 Fission binaire 136–137 Fixation de l’azote 401, 544, 604, 655 Fixation de l’azote atmosphérique 676 Flacon à col de cygne 11 Flagelle 56, 92 algues 485 contrôle 226 eucaryote 462 Flagellé 456, 472 Flagelline 92 Flash pasteurisation 689 Flavine mononucléotide FMN Voir FMN Flavine-adénine dinucléotide Voir FAD Flavivirus 908 Flavoprotéine 120 Fleming, Alexander 703 Flocculation 918 Flore 722, 725 bactérienne normale 720 buccale 722 cutanée 722 intestinale 725 Florey, Howard 703 Fluide hydrothermal 452 Fluorescence 905 anticorps 815 immunoanalyse 815 Fluoroquinolone 701, 862 Fluoro-uracile 701 Flux d’électrons bactéries pourpres 554 bactéries vertes 554 héliobactéries 554 inverse 554 photosynthèse oxygénique 556 FMN flavine mononucléotide 120 Fomite 830, 841 Fongicide 694 Fongistatique 694 FoodExpert-ID 508 Foraminifère 473 Force de van der Waals 41 proton-motrice 70–72, 102, 122, 128 Force proton-motrice 587, 590 Formaldéhyde 592, 696 Formation ferrifère rubannée 440 Forme réplicative 512 Formiate, produit de fermentation 586

Fourche de réplication 178 Fractionnement isotopique 624 Frameshift Voir Traduction Francisella tularensis 851 Frankia 681 Frederick Sanger Voir φX174 Frottis sanguin 905 Fructification 35 Fructose 1,6-diphosphate 118 diphosphate aldolase 112 Frustule 484 FtsZ 136 Fumarate 582 métabolisme 597 Fumeur noir 439, 446, 452, 643, 645 Furoncle 836, 875 Fuschine 864 phéniquée 864 Fusion inhibiteurs 890 φX174 Voir Virus

G gag gène 252 Galle du collet 673 Gallionella 371–372, 659 Gallionella ferruginea 566 Gamétange 479 Ganglioside GM1 735 Gastrite Voir Helicobacter pylori Gel de polyacrylamide électrophorèse bidimensionnelle 505 Gélatine 12 Gélose 107 Gène 168 bch 554 cadre ouvert de lecture 195 chevauchant 512 copie silencieuse 466 crt 554 de ménage 25, 177 de régulation 466 dnaE 505 entA Voir Entérotoxine staphylococcique flux d’informations 168 indicateur 984 lacZ 489 modifié 993 nod 678 orthologue 503 paralogue 503 photosynthèse 554 puf 554 puh 554 rapporteur 991



Index 1033

Gène (suite) structure 169 thymidine kinase 997 Gène chevauchant MS2 Voir Virus et φX174 Génération 137, 141 spontanée 2, 10–11 Génétique 19 bactérienne 19 Génie génétique 984 appliqué aux animaux 999 appliqué aux humains 999 appliqué aux plantes 1000 techniques 984 Voir Clonage Génome 22–23, 168, 175, 488 annotation 492 assemblage 492 exploitation 505 sequençage 491 taille 497 Génomique 19, 34, 487–488 comparée 503 environnementale 509, 608, 620 fonctionnelle 505 structurale 506 Génotype 258–259 Genre 302, 326 Gentamicine 704 Geobacter metallireducens 582 Géosmine 402 Germicide 696 Germination 90 GFP (green fluorescent protein) 608, 615 Giardia 35, 317, 469, 925 intestinalis 928 Giardia lamblia génome 499 Giardiase 928 Gin 974 Glissement 92, 94 antigénique 873 virus influenza 531 Glomérulonéphrite aiguë 860–861 Gluconéogenèse 129, 596 Gluconobacter 351, 976 Glucose 44 1-phosphate 596 6-phosphate 116, 596 6-phosphate deshydrogénase (G6PD) 907 isomérase 957, 970 Glutamate de sodium 966 déshydrogénase 130 synthèse 130 Glutamine synthèse 130

synthétase 130 Glutaraldéhyde 970 Glycéraldéhyde 3-phosphate 118, 972 déshydrogénase 118 Glycérol 46, 67 diéther 69 tétraéther 69 Glycine, structure 49 Glycocalyx 728 Glycogène 44, 117 Glycolipide 45 Glycolyse 73, 102 voie de Embden-Meyerhof 118 Glycoprotéine 45 Glycosylation 241 Glyoxylate 597 Gobetage Voir Champignon Golgi Voir Appareil de Golgi Gonococcie 880 Gonocoque Voir Neisseria gonorrhoeae Gonyaulax 482 Gram 30, 56 négatif 56 positif 30, 56 Grana 459, 547 Grand Lac Salé 428 Granules 83 grays 690 Greigite 364 Griffith, Frederick 271 Grippe 706, 836, 838, 850 asiatique 873 aviaire 843 cassure antigénique 873 espagnole 846 glissement antigénique 873 vaccin 874 virus influenza 871 Griséofulvine 710, 912 Grossissement 57 Groupe d’inoculation croisée 677 Groupe fonctionnel 42 Groupe sanguin 813 Groupement prosthétique 112, 115 Guanine 47, 170 synthèse 131 Guanosine pentaphosphate (pppGpp) 218 tétraphosphate (ppGpp) 218 Guérison 833 Guerre biologique 830, 851, 902 Guilde 628 GvpA 86 GvpC 86

H H2O2, production 462 H5N1 874

Habitat 2, 6 sol 498 Haemophilus influenzae 488, 739, 868 Hairy root 673 Haloanaerobium 429 Halobacterium 33, 428, 430–431, 451, 640 Halobacteroides 429 Halococcus 78, 430 Haloferax 428 Halophile 136, 159 extrême 426, 428 Halorhodopsine 426, 432 Halorhodospira 429 Halotolérant 136, 159 Hantavirus 851, 898 Haploïde 25, 465 Haptène 744, 753 HAT, milieu 808 Hélicase 178, 181 Hélice de reconnaissance 211 de stabilisation 211 Hélice alpha 51 Helicobacter 366 pylori 725, 876 Héliobactérie 332 Hémagglutinine 872 filamenteuse 863 Voir Virus influenza Hématie falciforme 907 Hème 120 Hémoculture 793 Hémoglobine S 907 Hémolysine 720, 733, 860 staphylococcique 875 Hepadnaviridae, virus de l’hépatite B 540–541 Voir Virus Hepadnavirus 512, 878 Hépatite 843 A vaccin 879 virus 877 B 833, 843 inhibiteurs de polymérase 879 vaccin 879 virus 878 C 846, 850, 878 CHC 878 D 878 E 878 G 878 virale 877 Herbicide, résistance 1000 Herpès simplex type 1 883 type 2 883



1034 Index

Herpesviridae core 534 cytomégalovirus 535 virus de la varicelle et du zona Voir Virus virus herpes simplex 534 Voir Virus Hétérocyste 332, 400–401 Hétérodimère 52 Hétérodisulfure réductase 580 Hétérofermentatif 332 Hétérotrophe 29 Hexose 44, 594 Hexulose phosphate synthase 594 Hexulose-6-P isomérase 594 Hfr souche 282 Histone 173, 211 archaéenne 451 Histoplasmose histoplasma capsulatum 912 HLA (Human leukocyte antigen) 776 Homo sapiens, génome 500 Homoacétogène 575 Homoacétogénèse 544 Homodimère 52, 211 Homofermentatif 332 Homologue 488 Hooke, Robert 9 Hopanoïde 68 Hormogonie 402 Hormone rénine 996 somatotropine bovine 996 Hôte 232, 720–721 Hôte de clonage 986 eucaryote 986 procaryote 986 Hotte à flux laminaire 690 Houblon Voir Bière Human leukocyte antigens (HLA) 755, 757–758, 762, 777–778, 780, 783– 786 Hyaluronidase 733 Hybridation 168, 172, 184 acides nucléiques 822, 826 ADN-ADN 323, 326 fluorescente in situ 617 génomique 302 moléculaire 905 sondes 823 Voir Sonde nucléique Hybridome 808 Hydrate de carbone, sucre 44 Hydrocarbure 666 aliphatique 591 aromatique 591 Hydrocortisone Voir Stéroïde

Hydrogénase 342–343, 544, 585 Hydrogène oxydation 561 produit de fermentation 585 Hydrogénobactérie 342–343, 562 Hydrogénosome 456, 458 origine 461 Hydrophobie 897 Hydroxyde ferrique 658 Hydroxylamine 338 oxydo-réductase 567 Hydroxypropionate 576 cycle 560 Hygiène 739, 842, 845 Hypermutation somatique 776, 782, 784 Hypersalé, environnement 428 Hypersensibilité 744, 762, 769–770 retardée 808, 865–866 Hyperthermophile 136, 155, 332, 426, 438, 494, 970 Hyperthermophilie 32 Hyphe 368, 479, 911 Hyphomicrobium 368, 370 Hypolimnion 637 Hypothalamus 897 Hyrogéno-oxydantes, bactéries 342

I ICAM1 (Intercellular Adhesion Molecule-1) 872 Ig Voir Immunoglobulines Ignicoccus 317, 446–448 Îlot de pathogénicité cag 877 Immersion huile 57 objectif 57 Immobilisation co-réticulation 970 liaison 970 Immunité 744, 837 à médiation cellulaire 745, 752, 758, 766–767, 769 adaptative 745, 751, 766 de population 830 innée 745, 751, 766, 776, 806 phagocytose 806 médiation cellulaire 807 Immunoanalyse agglutination 812 diagnostic virologique 826 ELISA 817–818 fluorescence 814 immunoblot 821 neutralisation 811 précipitation 812 RIA 819 Immunoblot 792, 821 applications 822

électrophorèse 821 ELISA 821 protéine A 821 VIH 817, 822 Immunodépression SIDA 889 VIH 885, 889 Immunofluorescence 897, 904 indirecte (IFI) 901–902 Immunogène 744, 753–754, 765, 767– 768 Immunoglobuline 744, 776 Immunoglobuline (Ig) 752, 759–760, 762–764, 766, 768–769, 777, 781– 782 antirabique 897 Immunologie 18 Immunoperoxydase 897 Immunosuppresseur 739 Impétigo 860, 875 In silico 493 Incidence 830, 832, 845 Inclusion 901, 970 cellulaire 83 Incompatibilité Voir Plasmide Incubation 832 Inducteur 213, 989 Induction 206 enzymatique 213 Industrie alimentaire puce à ADN 508 Infection 720–721, 792, 794–796, 798, 803, 830, 832, 861 aiguë 830–831, 833 alimentaire 942, 947 protozoaire 951 virale 951 Candida 480 chronique 830–831, 833 communautaire 803 cycle 838 émergente 830, 841, 843–844, 846, 851 endémique 831 épidémique 831 histoire naturelle 831 inapparente 902 invasive 861 nosocomiale 720, 739, 803, 830, 840, 844, 846, 876 opportuniste 885 pandémique 831 parasitaire 792 pulmonaire 862, 865 pyogène 875 réémergente 830, 846 respiratoire 836, 841, 858 sexuellement transmissible 796, 836, 879, 892



Index 1035

Infection (suite) sporadique 831 transmission 836 tuberculeuse 865 urinaire 794 virale 24, 792, 826 voyages 845 Inflammation 744, 748, 751–752, 757– 758, 771–772, 777, 789 Influenzavirus Voir Virus inflenza Ingénierie génétique 9 Inhibiteur 125, 207 de fusion 686 non nucléosidique de la transcriptase inverse 889 nucléosidique de la transcriptase inverse 889 Inhibiteur antiviral 708 Inhibition 686 INNTI Voir Inhibiteurs nucléosidiques de la transcriptase inverse Inoculum 108 Insecte, résistance 1000 Insuline biologie 994 génétiquement modifiée 994 Intégrase 253, 289 gène int 249 Intégron 289 Intéine 210, 505 Interaction hydrophobe 41 Interféron 686, 708, 996 génétiquement modifié 1003 Interféron-α 872 Interleukine (IL) 744, 751–752, 758, 788–789 INTI Voir Inhibiteurs nucléosidiques de la transcriptase inverse Intoxication alimentaire 936 Intradermoréaction 865 Intron 168–169, 175, 210, 466 auto-épissant 468 groupe I 468 Inv 731 Invasion 720, 731 Invertase 596 Irradiation 936 Isocitrate 597 cycle de l’acide citrique 126 Isocitrate lyase 597 Isomère 40, 50 Isoniazide 701, 714, 866 Isoprène 68 Isopropylthiogalactoside (IPTG) 213 Isotope léger 303, 624 lourd 624 radioactif 819 stable 621, 624, 636

IST (infection sexuellement transmissible) 884, 892 Ivanovsky, Dmitri 523 Ixodes 903 pacificus 903 persulcatus 903 ricinus 903 scapularis 903

J Jarosite 659 Jaunisse 879

K Kanamycine 704, 711 Kaposi, sarcome 886 Kétoconazole 912 Kinase 206 de détection 224, 226 Kingella 354 Klebsiella 225, 358, 793–794 pneumoniae 603, 793, 841, 919 Knallgas, réaction de 342 Knockout 296 Koch, Robert 359 Korarchaeota 317, 426–427 Kyste 474, 918

L Laboratoire 792 Lac alcalin 428 Lachnospira multiparus 653 Lactate déshydrogénase 120, 503 produit de fermentation 119 Lactique Voir Acide Lactobacillus 30, 105 Lactobacillus acidophilus 727 Lactobacillus plantarum 105, 972 Lactobacillus sp 15 Lactoperoxydase 722 Lactose 72, 596, 798, 965 Lame 480 Lamivudine 879 Lardage Voir Champignon Lassa 899 Leaky scanning 516 Voir Traduction Lécithinase 733 Leghémoglobine 676 Legionella pneumophila 846, 930 Légionellose 705, 846, 930 Légumineuse 676 Leishmania major, génome 499 Lemming 899 Lentinus edodes 980 Lèpre 844, 866 lépromateuse 866

tuberculoïde 867 Leptospirillum ferrooxidans 438, 565, 659 Leptothrix 366–367, 659 Leucocidine 734, 875 Leucocyte 744–747, 787, 789 Leucoencéphalopathie multifocale progressive 886 Leuconostoc 105, 972 Leuconostoc mesenteroides 107, 596 Levure 456, 480, 978 chromosomes artificiels 490 conjugaison 466 de boulanger 980 génome 499 humide compressée 979 locus MAT 466 Saccharomyces cerevisiae Voir Saccharomyces cerevisiae sèche active 980 type sexuel 466 LGV Voir Lymphogranulomatose vénérienne Liaison 40, 77 anhydride 116 β-1,4 osidique 77 covalente 40 ester 116, 319 éther 439 glycosidique 40, 45 hydrogène 40 ionique 41 peptidique 40, 49 phosphate 47, 116 phosphoanhydride 116 phosphodiester 40, 47 phosphoester 116 thioester 116 Lichen 35, 671 Ligation 489 Lignine, dégradation 479 Limace 476 Limulus polyphemus 737 Lipase 598, 733, 969 Lipide 3, 40, 43 A 79, 736 hydrolyse 598 stabilité thermique 451 synthèse 131 Lipoglycane 437 Lipopolysaccharide 56, 79, 736 Liqueur de dosage Voir Vin de tirage Voir Vin de trempage de mais 965 Lister, Joseph 11 Listeria, monocytogenes 950 Listériose 936, 950 Lixiviation 445



1036 Index

Loeffler, milieu 863 Long Terminal Repeats 539 Longue répétition terminale Voir Rétrotranscription Longueur d’onde 92 Lophotriche 92 LPS 736 Voir Lipopolysaccharide Luciférase 221, 360 Lyme, syndrome 105 Lymphe 744–746, 752 Lymphocyte 744–748, 785 à mémoire 744 B 744, 752–753, 755, 758, 777, 782, 785 T 744, 751–758, 763, 769, 771–772, 777, 782–783, 785–786, 788–789 Lymphogranulomatose vénérienne 883 Lymphome de Burkitt Voir Virus d’Epstein-Barr Lyophilisation 936 Lyse 686 Lysine 740, 966 aspartokinase 967 Lysogène 232, 246 Lysogénie 232, 246 Lysosome 461 Lysozyme 77, 112, 235, 722, 740

M M13 Voir Bactériophage Macrocyste 476 Macrolide 705 Macromolécule 3, 40 Macronoyau 474 Macronutriment 102 Macrophage 744, 746–748, 751–752, 755, 758, 766, 770, 776, 788–789, 865, 867 Magnésium 103 Magnétite 364 Magnétosome 56, 84, 364 Magnetospirillum magnetotacticum 364 Magnétotactisme 84 Maische Voir Bière Maladie 720–721 à déclaration obligatoire 901 amibiase 474 coccidiose 475 Creutzfeld-Jacob 952 de la vache folle Voir Encéphalopathie bovine spongiforme de Lyme 31, 846, 850–851, 896, 902 déficit immunitaire combiné sévère 999 des Légionnaires 930 diabètes juvéniles 994 du charbon 739, 851, 853

du sommeil 473 fibrose kystique 996 infectieuse 10, 830, 845 contrôle 830 inflammatoire pelvienne 881 malaria 475 SRAS 526 Voir Virus toxoplasmose 475 Malaria 475, 905 Malarone 905 Malate métabolisme 597 synthase 597 Malique Voir Acide Malnutrition 738 Malolactique Voir Fermentation Malonate 131 Malonyl-ACP 131 Malt Voir Bière Maltose, régulon 216 Manganèse 581 réduction 582 MAR (microautoradiographie) 622 Marais salant 429 Marée rouge Voir Efflorescence Mastigophora 472 Matière en suspension 918 Maturation ARNm eucaryote 466 de l’ARN 456 Mécanisme de cassette 466 Méfloquine 905 Megasphaera 653 Méiose 25, 456, 465 Mélasse 979 Membrane 66 chloroplaste 459 cytoplasmique 3, 22, 56, 66 externe 56, 79 mitochondrie 457 noyau 457 photosynthétique 547 réticulum endoplasmique 461 Mémoire immunologique 744–745, 752, 763, 767 Méningite 843, 867, 909 Méningococcémie 867 Méningo-encéphalite 918 amibienne primitive Voir Naegleria fowleri Mer Morte 428 Mercure 664 cycle du 664 Mérozoïte 905 Mésophile 136, 151 Mesorhizobium 676 Mesostigma viride 500–501 Métabolisme 2, 4, 102

assimilatif 570 dissimilatif 570 Métabolite primaire 956–957 secondaire 956–957, 978 synthèse 958 Métagénome 509, 608, 620 Métagénomique 620 Métazoaires 302 Méthane 8, 344, 346, 592, 647 biogénique 433 mono-oxygénase 345, 347, 593 Methanoarchaea 433 Methanobacterium 34, 433 Methanocaldococcus 433 Methanocaldococcus jannaschii 436 génome 494 Méthanochondroïtine 433 Méthanofurane 577–578 Méthanogène 8, 34, 426, 433, 575, 577, 636, 647, 649, 725, 921 Méthanogenèse 433, 544, 577, 648, 651 substrat 433 Méthanol 345 Méthano-oxydantes 346 Methanoplanus 433 Méthanoptérine 577–578 Methanopyrus 33, 317, 438–439, 645 Methanosarcina 78, 433 Methanospirillum 433 Methanothermus fervidus 451 Méthanotrophe 332, 344, 346, 544, 592, 649, 666 Méthicilline 704, 712 Méthode de Kirby-Bauer 800, 803 de Sanger 185–186 des stries croisées 961 du coefficient de phénol 695 Méthylation 241 Méthyle CoM réductase 440 Méthyle, réductase 580 Méthylmalonyl-CoA 586 Méthyl-mercure 664 Methylobacter 344 Methylomonas 344 Methylosinus 593 Méthylotrophe 332, 344, 544, 592 Méthylotrophique 370 Métronidazole 885 Microaérophile 136, 161, 630 Microautoradiographie 608, 622 Microbiologie 2 industrielle 956 acides aminés 208 médicale 18 Microélectrode 608, 621–622 Microenvironnement 629 Microfilament 456, 462, 476



Index 1037

Micro-injection 987 Micronoyau 474 Micronutriment 102 oligo-élément 105 Micro-organisme 2 Micro-organismes telluriques 911 Microscopie 57 confocale à balayage laser 61 contraste d’interférence différentielle 60 contraste de phase 58 électronique 62 balayage 63, 693 diagnostic virologique 826 transmission 62 fluorescence 59 fond clair 57 fond noir 59 force atomique 61 Microsporidie 318, 469, 471 Microtubule 462 Milieu 793, 795, 798 complexe 102 d’enrichissement 793 de culture 102, 105 défini 102 différentiel 792–793, 798 EMB 795, 798 enrichi 792 Mac Conkey 795 modifié de Thayer et Martin 797 non sélectif 792–793 sélectif 792–793, 798 Mise à l’échelle 956 Mitchell, Peter 123 Mitochondrie 23, 26, 177, 309, 456– 457 ADN 460 ARNr 501 ARNt 501 origine 460 phosphorylation oxydative 501 Mitose 25, 456, 465 Mitosome 471 Mixotrophe 332, 342, 544, 561 Mixotrophie 341 Mobilité 91 glissement 96 par contraction 354 par essaimage 358 rapide 82 Modification covalente adénosine diphosphate (ADP) 208 adénosine monophosphate (AMP) 208 méthyle (CH3) 208 phosphate inorganique PO43- 208 covalente des enzymes 208

restriction 241 Modulon 219 Moisissure 456, 478 Moisissure glaireuse 476 acellulaire 476 cellulaire 476 Molécule 40 antifongique 708 biologique stabilité thermique 450 HLA de classe I 744, 755–757, 769, 777– 778, 780–781 de classe II 744, 755–758, 769, 772, 777–778, 780–781 Monde à ARN 228 Monomère 40 stabilité thermique 451 Mono-oxygénase 544, 590 Monoxyde de carbone 125, 343 déshydrogénase 576 Montmorillonite 304 Moraxella 354 Morbidité 830, 832 Moritella 641 Morphologie 22, 56 Mortalité 830, 832 Moteur flagellaire 92, 226 Motif 752, 776, 780 hélice-tour-hélice 211 Motilité algues 485 eucaryote 462 Mouche tsé-tsé 473 Mouffette 896 Moustique 842, 846, 850, 908 Anopheles 905–906 Mouvement 5 Mu région G inversible 520 Voir Bactériophage Mucoviscidose 739 Voir Maladie, fibrose kystique Mucus 720–721 Muqueuse 720–721, 740 Mus musculus, génome 500 Mutage Voir Vin Mutagène 258 Mutagenèse cassette 296 dirigée 258, 295, 990 transposon Voir Transposon Mutant 258–259 Mutation 258 décalage du cadre de lecture 262 faux-sens 262 inactivation des gènes 499 non-sens 262 ponctuelle 258, 261

silencieuse 262 spontanée 261 transition 262 transversion 262 Mycélium 479 Mycète 35 Mycobactérie 866 Mycobacterium 795, 864 avium 867 bovis 866–867 chelonae 867 kansasii 867 leprae 210, 844, 866 scrofulaceum 867 tests cutanés 808 tuberculosis 13, 32, 698, 701, 712, 714, 795, 833, 864, 907 génome 493 Mycobionte 671 Mycoplasma 30, 318 genitalium génome 494 pneumoniae génome 494 Mycoplasme 78 Mycorhize 672 Mycose 896, 912 à candida 709 sous-cutanée 912 superficielle 912 systémique 912 Mycotoxine 911 Myorelaxant 914 Myxococcus xanthus, génome 494

N N-3-oxohexanoyl homosérine lactone 221 N-acétylglucosamine 45, 77, 129 NAD+ 598 NAD+/NADH nicotinamide adénine dinucléotide 116 NADH déshydrogénase 120 NADH quinone oxydoréductase 123 NADPH voie des pentoses phosphates 596 Naegleria fowleri 932 Nanoarchaeota 317, 426–427, 448 Nanoarchaeum 317, 447–449 Nanoarchaeum equitans génome 494 intéine 505 Nanobactérie 65 Natronobacterium 34, 428, 430 Natronococcus occultus 222 Natronomonas 430 Nébuliseur. 491



1038 Index

Neisseria 30, 354, 793, 796 gonorrhoeae 107, 704, 713, 728, 793– 794, 796, 836, 880 immunité 808 meningitidis 797, 867 Néomycine 704, 711 Néphrotoxicité 704 Netilmycine 704 Neuraminidase 708, 872 inhibiteurs 874 Voir Virus influenza Neurotoxicité 704 Neurotoxine 482 Voir Clostridium botulinum Neutralisation 792 Neutrophile 158 Névirapine 706 Niacine, acide nicotinique 112 Nicotinamide 701 Nicotinamide adénine dinucléotide NAD+/NADH Voir NAD+/NADH Nitrate 103, 567, 571 réductase 571 réduction 571 Nitrate de niconazole 912 Nitrifiantes 337 Nitrification 544, 567, 656 Nitrite 567, 571 oxydoréductase 568 réductase 571 Nitrobacter 567 Nitrogénase 343, 544, 599, 602, 676, 679 Nitrosantes 337, 347 Nitrosomonas 567 Nitrospira 422 Niveau de confinement 804 NSB1 804 NSB2 804 NSB3 804 NSB4 805 NNRTI (non-nucleoside reverse transcriptase inhibitor) 686, 706 Nodosité 676 caulinaire 680 Nodulation 678 Nodule 7 Nombre le plus probable 608, 612 Nomenclature binomiale 302 Non cultivée, espèce 34 Non nucleoside reverse transcriptase inhibitors 706 Northern Blot, hybridation 184 Norwalk-like, virus 951 Nosocomial 803 Nostoc 400, 403 Noyau 4, 22, 309, 456 macronoyau 474 micronoyau 474

pore 457 NPP (nombre le plus probable) 612, 919 NRTI (nucleoside reverse transcriptase inhibitor) 686, 706 Nucléase 733 Nucléocapside 232, 234, 512 Nucléoïde 4, 22, 25 Nucléole 457 Nucléoplasme 457 Nucléoside 40, 47 Nucleoside reverse transcriptase inhibitors 706 Nucléosome 173, 437, 456 Nucléotide 40, 43 Nutriment 102 Nutrition 102 nvMCJ Voir Maladie de Creutzfeld-Jacob Nyctotherus ovalis 461

O Océan profond 640 Oceanospirillum 364 Œstrogène 968 Oiseau 908 Oligo-élément micronutriment Voir Micronutriment Oligosaccharide 45 Oligotrophe 637 OmpC 225 OmpF 225 Oncogène 232 Opa (opacity associated proteins) 728 Opéron 168, 193, 206, 214 his 224 lac 217 lux 221 pyr 224 régulon 216 tryptophane 222 Opine 674 Opportuniste, infection 885 Or, biolixivation 663 Ordre 326 Oreillons 843 ORF (Open Reading Frame) 488 non identifiés 496 Organelle 22, 23, 302, 309 eucaryotes 457 génome 500 Organisme génétiquement modifié 984 transgénique 984 Organite Voir Organelle Orientia tsutsugamushi 902 Origine de réplication 490 oriS 489 Orthologue 488, 503 Orthomyxoviridae Voir Virus

Orthomyxovirus 871 Oryza sativa 501 Oscillatoria 400 limnetica 557 princeps 400 Oseltamivir 708, 874 Osmolarité 225 Osmorégulateur 160 Osmose 159 Osmotactisme 99 Ouverture numérique 57 Oxacilline 704, 712 Oxalate 586 Oxaloacétate 597 cycle de l’acide citrique 126 Oxalobacter formigenes 586 Oxy 733 Oxydase terminale 124 Oxydation anaérobie du méthane 649 de H2 453 de l’hydrogène 561 des composés soufrés réduits 562 du fer 565 du soufre 563 oxydoréduction 113, 120 Oxyde d’éthylène 696 Oxyde nitreux 110 Oxydoréduction oxydation 113, 120 redox 112 réduction 113, 120 Oxygénase 590 Oxygène cycle de l’ 646 moléculaire réactif 591 singulet 163 toxicité 163 Oxygénée, particule 630 Oxygénique, photosynthèse 128 Oxytétracycline 705 Ozone 308

P P680 555 P700 555 P870 551 Pace, Norman 34 Paire spéciale (bactériochlorophylles) 551 Palindrome 182 Palmitate 46 Paludisme 833, 836, 842, 845, 896, 905 Panaris 836 Pandémie 830, 927 grippe 873 Parabasalien 469, 473



Index 1039

Paracoccus 342 denitrificans 572 Paralogue 488, 503 Paramecium 35, 474 Paramètre zT 687 Paramyxovirus 869 Parasite 720 homme 473 intracellulaire 930 pARN 228 Paroi 77 algues 484 cellulaire 22 Particule signal de reconnaissance (SRP) sécrétion de protéines 202 Particule transductrice 274 Partie centrale 87 Pasteur, Louis 11, 50, 107, 688 Pasteurisation 11, 686, 688, 691 Pathogen-associated molecular pattern (PAMP) 776 Pathogène 2, 7, 720, 831, 837, 840, 846 éradication 844 opportuniste 720, 913 respiratoire 860 Pathogénicité 720 Pattern recognition molecule (PRM) 744, 776 Pays en voie de développement 896 PBP 704 PCR 618, 897, 901–902, 904–905, 970 diagnostic 824 RT-PCR 824 temps réel 824 Peau 722, 740 Pediococcus damnosus 972 Pelobacter acidigallici 586 Penicillin binding protein 704 Pénicillinase 704, 713 Pénicilline 138, 140, 686, 703, 903, 905, 914 de biosynthèse 956, 964 G 703, 710 naturelle 956 semi synthétique 964 semi-synthétique 686, 956 Pénicilline G 703 Penicillium chrysogenum 703, 964 Penné Voir Diatomée Pentose 44, 129, 596 Pentose phosphate voie des pentoses phosphates 596 Peptidoglycane 45, 56, 76 Péril fécal 926, 947 Période de latence 239 Périplasme 56, 80 Péristome 474 Péritriche 56, 92, 359

Perméabilité 70 Perméase 72 Lac 72 Permutation circulaire 244 Peromyscus maniculatus 898 Peroxydase 164 d’hydrogène 696 Peroxysome 462 Peste 833, 843, 846, 851, 896 bubonique 909 noire 909 pulmonaire 910 septicémique 910 sylvatique 909 yersina pestis 909 Pesticide 667 Petite sous-unité d’ARN 302 Petri, Julius 14 Pétrole, biodégradation 665 Pfiesteria 482 Pfu polymérase 188 pH 136 gradient 122 PHA Voir Poly-β-hydroxyalkanoate Phage 717 Charon 489 pBR322 489 Phage auxiliaire 275 Phagocyte 744–746, 748–749, 751– 753, 755, 758, 764, 766, 772, 776, 789 Phagocytes 805 Phagocytose 456, 472, 731, 862 Pharming 999 Pharyngite streptococcique 860 Phase de latence 136, 957 exponentielle 957 stationnaire 136, 957 PHB Voir Acide poly-β-hydroxybutyrique Phénotype 258–259 Phénylalanine, structure 49 Phloroglucinol 586 Pho 733 Phosphoadénosine phosphosulfate 573 Phosphoénolpyruvate 116, 119, 129 Phosphoénolpyruvate carboxylase 598 Phospholipase 598, 733 Phospholipide 46, 66 Phosphore 103 Phosphorolyse 595 Phosphorylation 226 au niveau du substrat 102, 118, 584, 589 oxydative 102, 118, 589 Photoautotrophe 128 Photoautotrophie 545 Photobacterium 359

Photohétérotrophe 128 Photophosphorylation 102, 118, 128 cyclique 553 Photoprotection 549 Photorhizobium 676, 681 Photosynthèse 544–545, 647 algues 484 anoxygénique 29, 128, 545, 550, 639, 681 gènes 554 génétique 553 oxygénique 29, 128, 307, 544–545 Photosystème I 555 Photosystème II 555 Phototactisme 96, 98–99 Phototaxie 56, 432 Phototrophe 16, 22, 28, 366, 544 anoxygénique 304, 307, 566 anoxygénique aérobie 640 oxygénique 647 Phototrophie 126, 128, 545 Phycobiline 400 Phycobiliprotéine 400, 482, 544, 550 Phycobilisome 550 Phycobionte 671 Phycocyanine 401, 550 Phycoérythrine 550 Phyllosphère 670 Phylogénie 22, 26, 302, 320 Eukarya 469 Phylotype 620 Phylum 302 Physarum 476 Phytane 46 Phytanyle 319, 426, 439 Phytopathogène 349 Phytoplancton 637 PI (protease inhibitor) 686, 706 Picornavirus Voir Virus Picrophilus 34, 436, 438 oshimae 158 Pied d’athlète, trichophyton 912 Pigment prodigiosines 358 violacéine 354 PII 209 Pili 82, 728, 736 Pilus sexuel 281 Pince optique 608, 613 Pinus thunbergii 501 Pityrosporum ovalis 722 Plage 232, 237 Planctomyces 30, 318 Plaque dentaire 720, 723 Plasma 744–745 Plasmide 22, 25, 176, 258, 276, 850 ColV 730 conjugatif 281 de résistance 710



1040 Index

Plasmide (suite) F 277 F’ 284 pBR322 291 pSym 678 pUC19 293 R 279, 711, 713 Ri 675 Ti 673, 984 Plasmocyte 744, 746, 763, 788 Plasmode 476 Plasmodium 475, 836–837 falciparum 907 Plastocyanine 556 Pleurote 981 Pneumocoque résistant à la vancomycine 846, 850 Pneumocystis carinii génome 499 Pneumocystis jiroveci 886 Pneumonie 862 Pneumopathie Voir cytomégalovirus pol gène 252 Pol I Voir ADN polymérase I Pol III Voir ADN polymérase III Polaire 40–41, 56, 92 Poliomyélite 843–844 Poliovirus 233, 838, 931 Voir Virus Poly-β-hydroxyalkanoate 84 Poly-β-hydroxybutyrate 56, 117 Polymérase, ARN 319 Polymère 40, 918 Polymère de réserve algues 484 Polymérisation en chaîne 618 Polymorphisme 755, 776, 779 de longueur des fragments de restriction 1001 Polynucléaire neutrophile 744, 746, 748, 751, 776 Polynucléotide 40, 47 Polyomavirus pouvoir transformant 533 SV40 Voir Voir Virus Polyoxine 710 Polypeptide 40, 51 Polyphosphate 84 Polyprotéine 210, 512 Polysaccharide 3, 40, 44 métabolisme 595 Polysome 200 Pont disulfure 49 glycosidique 76 interpeptidique 76–77

Population 6, 628 Porine 80, 225 Porphyrine 120 Porte d’entrée 728 Porteur 830 Porto 971 Postulat de Koch 2, 11 Potable, eau 918 Potassium 103 Potentiel de réduction 102, 113, 115, 561 électrochimique 122 Pourcentage de GC 302 Pourriture blanche 479 brune 479 Poux 900 Poxviridae virus de la vaccine Voir Virus virus de la variole Voir Virus Voir Virus Précellulaire 5 Précipitation 792 éperon 812 immunodiffusion 812 Prednisolone Voir Stéroïde Prednisone Voir Stéroïde Préfiltre 692 Pression osmotique 225 Prévalence 830, 832 Primaquine 905 Primase 178–179, 181 Primosome 181 Prion 232, 254, 951 Probénécide 905 Procaryote 6, 22 Prochlorococcus 404, 639 Prochloron 403 Prochlorophyte 332, 403, 639 Prochlorothrix 404 Producteur primaire 637 Voir Autotrophe Production 5 Produit 111 de fermentation 118–119, 584 Proguanyl 906 Proline, synthèse 208 Promoteur 168, 190 fort 989 Prophage 232, 246 Propionate 586 Propionibacterium 794, 966 acnes 722, 794 Propionigenium 577 modestum 586 Prostatite 883 Prosthèque 332, 368, 371 Protéase 220, 733, 956 inhibiteurs 879, 890

VHC 879 VIH 890 Protéine 3, 5, 40, 43, 67 acido-soluble 89 activatrice 206, 215 activatrice du catabolisme (CAP) 217 auto-épissage 505 coiffe 93 corrinoïde 579 d’atténuation de trp 224 d’intérêt toxique pour l’hôte 989 d’opacité 881 de choc thermique 201, 206, 220 phylogénie 471 de fusion 993–994 de liaison à l’ADN 437, 451 de liaison simple brin réplication de l’ADN 178 de régulation 210 du chimiotactisme acceptrice de méthyle (MCP) 226 extramembranaire 67 fer-soufre 120 Fli 93 Fts 137 green fluorescent protein 991 hypothétique 497 intramembranaire 67, 71 kinase de détection 206 M 861 membranaire 67 Mot 93 MreB 139 Opa Voir Protéine d'opacité périphérique 67 périplasmique 73 point isoélectrique 506 précoce 232 régulatrice de réponse 206 repliage 993 répresseur 206, 214 Sac7d 451 se liant à l’ADN 210–211 sensorielle 97 stabilisation 993 synthèse protéique 22 taille 506 terminale Voir Adenoviridae transmembranaire 67 transporteur de groupement acyle ACP Voir ACP Proteobacteria 339, 361 Protéobactérie 22, 30, 302, 317, 332, 338 gainées 366 Protéome 488, 505 Protéomique 19, 488 Protéorhodopsine 621, 640



Index 1041

Proteus 358, 794 mirabilis 727 Protiste 35 Protocatéchuate 591 Protoplasme 688 Protoplaste 56, 78, 87 Prototrophe 258, 260 Protozoaire 23, 456, 472 Provirus 232, 253 Voir Retroviridae Pseudomonades 348 Pseudomonas 30, 342, 348, 359, 591, 793–794, 966 Pseudomonas aeruginosa 221, 632, 665, 710, 734, 739, 793, 796, 841 détection de quorum 221 génome 494 Pseudomonas stutzeri 572 Pseudopeptidoglycane 78, 433 Pseudoplasmode 476 Psychroflexus 154 Psychrophile 136, 153, 426, 441, 641 Psychrotolérant 136, 153 Psychrotrophe 950 Puce 900, 909 à ADN 507 identification 508 industrie alimentaire 508 du rat xenopsylla cheopis 909 Purine 47 synthèse 130 Puromycine 702 Purpura fulminans 868 Pyridoxine vit B6 105 Pyrimidine 47 synthèse 130, 224 Pyrite 340, 437–438, 659 Pyrobaculum 444, 446 Pyrococcus 438 furiosus 164 PAV1 Voir Virus Pyrodictium 446, 452–453, 645 Pyrolobus 33, 446, 453, 645 Pyruvate 119, 586, 591 carboxylase 598 cycle de l’acide citrique 126 métabolisme 598 oxydation 458

Q Quarantaine 830, 843 Quinolone 686, 701 Quinone 120–121, 551 Quorum sensing 5, 360, 632

R Racémase 50 Rad 690 Radiale Voir Diatomée Radiation ionisante 265, 690 non ionisante 265 Radicaux d’hydroxyle 690 Radicaux libres 690 RadioImmunoAssay Voir RIA Radio-isotope 622 Rage 842, 844, 896 Ralstonia 342, 349 eutropha 562 Rat 899 Raton laveur 896 Rayon γ 690–691 Rayon X 690–691 Rayonnement UV 690 RDP (Ribosomal Database Project) 302 Réaction de polymérisation en chaîne (PCR) 168, 187 de Stickland 332 Réassortiment 872–873 RecA, protéine 269 Recombinaison 258 homologue 269 Rectite aiguë 883 Redox, oxydoréduction 112 Réductase 969 mercurique 665 Réducteur 162 Réduction de l’acétylène 602 de sulfate 573, 657 des nitrates 571 du CO2 567 du fer 658 du fer ferrique 581 du manganèse 582 oxydo-réduction 113, 120 Réduction-neutralisation des plages 899 Réémergence 851 Région G inversible Voir Mu hypervariable 776, 781 opératrice 214 Règne 469 Régulateur de réponse 224 Régulation 5 des porines 225 expression génétique 205 génétique commutation de la régulation 989 métabolisme 206 négative 211 positive 211

post-traductionnelle 207 transcription 210 Régulon 216 Pho 225 RelA 218 Renard 896 Rendement 956 Reoviridae, rotavirus 531 Voir Virus repE, 489 Répétition inversée 211 Réplication 5 ADN 168–169, 177 eucaryote 463 asymétrique 537 bidirectionnelle 180 brin avancé 179 brin retardé 179 cercle roulant 248, 281 Voir Virus concatémère Voir Virus correction des erreurs d’élongation 181 forme réplicative 515 origine de réplication 178 par cercle roulant 512 réplicase 530 Voir Virus réplicase Voir Virus rétrotranscription Voir Retroviridae semi-conservative 168, 177 structure thêta 180 terminaison 182 Réplisome 181 Réponse au choc thermique 220 immune anticorps 806 primaire en Ac 744, 763, 782 secondaire en Ac 744, 763, 766–768, 782 SOS 219 stringente 206, 218 Répresseur arginine 214 du phage lambda 211 lac 211 lactose 217 système répresseur – opérateur 989 Répression 206 catabolique 216, 219 enzymatique 213 Répulsif 909 Réservoir 830–831, 833, 841–842, 846, 850 Résistance 800, 840, 850 à l’arsenic 665 antimicrobienne 710 antirétroviraux 890



1042 Index

Résistance (suite) au mercure 665 aux molécules antimicrobiennes 686 naturelle 739 pénicilline 862 spore 479 VIH 890 Résistant, sujet 837 Résolution 56–57, 59, 62–63, 100 Respiration 102 aérobie 120, 570, 647 anaérobie 126, 219, 442, 544, 589, 647 des composés chlorés 668 artificielle 914 conservation de l’énergie 117 mitochondrie 457 Restriction, modification 241 Voir Chlorella virus Réticulum endoplasmique 461 granuleux 461 lisse 461 Rétinal 432 Rétroaction 224 Rétro-inhibition 206–207, 967 Rétrotranscription 897 Hepadnaviridae 537 transcriptase inverse Voir Reoviridae Retroviridae provirus 539 VIH-1 Voir Virus virus de l’immunodéficience humaine Voir Virus Rétrovirus 232, 243, 252, 512, 533, 706 Réverse gyrase 174 Reverse-Transcriptase PCR Voir RTPCR Réversion Voir Mutation RFLP Voir Polymorphisme de longueur des fragments de restriction Rhabdoviridae 896 Voir Rhabdovirus Voir Virus Rhabdovirus Voir Rhabdoviridae Rhicadhésine 677 Rhinovirus 871 Rhizobium 225, 676 Rhizobium leguminosarum 678 Rhizoplan 670 Rhizopus 479 Rhizopus nigricans Voir cortisone Rhizosphère 634, 670 Rhodobacter 553 capsulatus 553 sphaeroides 553 Rhodocyclus purpureus 366 Rhodomicrobium 370 Rhodophyta 482

Rhodopsine 432 Rhodopsine sensorielle 432 Rhum 974 Rhumatisme articulaire aigu 860–861 Rhume 836, 871 RIA (radioimmunoassay) 792 sensibilité 820 Riboflavine 120, 966 Ribonucléotide réductase 129 Ribose 47, 129 Ribosome 4, 22, 43, 168–169, 197, 310, 460, 702 site-A 200 site-E 200 site-P 200 Riboswitch 206, 228 Ribotypage 302, 323 sonde 824 Ribozyme 456, 468 Ribulose 1,5-diphosphate 594 Ribulose bisphosphate carboxylase 557 Ribulose monophosphate voie du ribulose monophosphate 593 Ribulose-5-phosphate 594, 596 Rickettsia 30, 32, 361, 896 prowazekii 900 rickettsii 900 transfert horizontal de gènes 504 typhi 900 Rickettsiales 361 Rickettsie 361, 850, 900 Rieske (protéine) 123 Rifampicine 866–867 Rifampine 702 Rimantadine 706, 874 Rizosphère 342 Rochalimaea 362 Rochalimaea quintana 362 Rongeur 899, 901–902 rat 909 Röntgen 690 ROR, vaccin 869 Roseobacter 640 Rotation anti-horaire 97 horaire 97 Rotavirus 843 Voir Reoviridae Rotor 93 Rougeole 838, 843–844, 869 vaccin 869 RT-PCR 824, 842 VIH 824 Rubéole 843–844, 869 congénitale 843 vaccin 869 RubisCO 459, 544 Voir Ribulose bisphosphate carboxylase

Rumen 8, 594, 650–651 Ruminicocus albus 652 Ruminobacter amylophilus 653 Ruminococcus 594

S S. aureus méticilline résistants 841 Saccharomyces carlsbergensis 973 cerevisiae 25, 226, 465, 490, 972–973, 976, 979 expression génétique 507 génome 500 génome mitochondrial 501 levure 133 puce à ADN 507 Voir Bière Voir Hôte de clonage Saccharose 723 S-adénosylméthionine 227 Salive 722, 897 Salmonella 30, 80, 357, 688, 731, 795, 851 enterica 947 spp. 947 typhi 833, 919, 931, 947 typhimurium 104, 690, 730, 852 Salmonellose 843, 936, 947 Salpingite 883 Salvarsan 698 Sang 793 Sanger, Frederick 488 Voir Méthode de Sanger Santé publique 830 Saprophyte 831, 833 Saquinavir 716 Sarcodina 473 Sarcodine 473 SARM (S. aureus méticilline résistants) 841 SASP Voir Protéine acido-soluble Saut antigénique, virus influenza 530 Scarlatine 860 Schéma en Z 556 Schizonte 905 Science biologique fondamentale 3 Scotophobotactisme 98 Scrub typhus 902 Sédiment 918 Sélectif, milieu de culture 107 Sélection 258 clonale 776, 785 négative 776, 785 positive 776, 785 Sélénium 49, 582 Selenomonas 653 Selle 795 Semmelweis, Ignaz 11



Index 1043

Sensibilité 792, 811 ELISA 817 RIA 820 Sepsis 792–793 Septum 137–138 Séquençage 19, 185 aléatoire global 488, 491 multigénique 324 Séquence consensus 191 d’insertion Voir Élément transposable de Shine-Dalgarno 194, 199–200, 492 intergénique 489 inversée répétée ADN 171 leader 222 répétée directe Voir T7 répétée en tandem 1001 signal sécrétion de protéines 202 signature 302, 314 Sérine structure 46 transhydroxyméthylase 593 voie de la 345, 593 Sérogroupe O1 Voir Vibrio cholerae O139 Voir Vibrio cholerae Sérologie 744–745, 792, 810 Sérotype 862 Serratia 358 Sérum 744–745, 759, 761–764, 768, 777, 781 de fromagerie 957 Sesbania 681 Shewanella putrefaciens 582 Shigella 357, 795 dysenteriae 948 Shiitake 980 Shine-Dalgarno, site 228 SHU Voir Syndrome hémolytique et urémique SIDA 480, 706, 739, 839, 843, 845– 846, 850–851, 865–867, 885, 913 cellules T 815 ELISA 817 immunodépression 887 Sidérophore 102, 104, 730, 733 Signal peptide 994 Silice 484 Sin Nombre 899 Sinorhizobium 676 Sirop de fructose 970 Site accepteur (site-A) 200 actif 111, 207 allostérique 207 cos 247 de fixation de l’activateur 215

de pause de la transcription 223 de restriction 491 multiple de clonage 489 S-layer 438 Slime 83, 728 Smallpox 233 Smith, Hamilton O. 488 SO2 972 Sodium 103 Sol 633 Solfatare 426, 441 Soluté 450 compatible 136, 426, 431 Solution tampon 158 Sonde 822 dipstick 823 hybridation 823 nucléique 184, 186, 608, 617, 984, 992 phylogénétique 302, 314 ribotypage 824 sopA 489 sopB 489 Sorangium cellulosum, génome 494 Sorbose 978 SOS, réponse 266 Souche 866 à haut rendement 962 multirésistante 866 sauvage 258 Soufre 103 cycle du 657 dismutation 575 élémentaire 84, 307 globules 555 oxydation 563 Source d’azote 130 d’énergie 114 de carbone 128 hydrothermale 426, 439, 441, 446, 452, 643 thermale 446 Souris 899 champêtre 903 Southern Blot hybridation 184 Spéciation bactérienne 326 Spécificité 744, 752, 754, 792, 810 Spectinomycine 704, 713 Spectre d’absorption 546 Sphaerotilus 366–367, 372 Sphaerotilus natans 566 Sphéroplaste 78 Spirille 64, 363 Spirillum 363 lipoferum 364 volutans 364 Spirochète 64, 332

Splicéosome 456, 466 Spo 90 Sporange 476 Spore ascospore 479 basidiospore 479–480 moisissure 479 Sporicide 696 Sporocytophaga 594 Sporotrichose, sporothrix schenckii 912 Sporozoaire 456, 475 Sporozoïte 475, 905 Sporulation 89 Spyrochète 31 SRAS (syndrome respiratoire aigu sévère) 841, 843, 846 SRAS-CoV 841 Sreptomycine 910 Ssp 90 Stabilité thermique, molécule biologique 450 Staphylococcus 793–794, 796, 860 aureus 712, 714, 726, 733, 739, 793, 796, 840, 860, 874, 944 détection de quorum 222 epidermidis 794, 874 saprophyticus 794 Staphylocoque résistant à la vancomycine 844 Staphylothermus 446–447 Stator 93 Stéréoisomère 45 énantiomère 50 isomère optique 50 Stéréospécificité 969 Stérile 2, 11 Stérilisant 696 Stérilisateur 696 Stérilisation 10–11, 686–688, 691–692 froide 696 par rayonnement 690 thermique 687 Stérilité 881, 883 Stéroïde 968 cortisone 969 hydrocortisone 969 prednisolone 969 prednisone 969 Stérol 56, 68, 345 synthèse 590 Stigmastérol 968 Stimulon 219 Stomacher 943 Streptococcus 30, 105, 793, 860 faecium 712 mitis 723 mutans 723, 738 pneumoniae 271, 710, 726, 730–731, 860



1044 Index

pyogenes 107, 712, 714, 733, 793, 860–861 sanguis 723 sobrinus 723, 738 Streptocoque 700 β-hémolytiques agglutination 813 Streptokinase 733 Streptolysine O 734 Streptomyces 30, 956 coelicolor génome 494 erythreus 705 griseus 704 thermoautotrophicus 602 Streptomycine 702, 704, 711, 713 effet sur les eucaryotes 460 Streptovaricine 703 Stress 220, 738–739 oxydatif 219 Stroma 459 Stromatolite 302–303 Structure 211 en lasso 467 primaire 40, 47 quaternaire 40, 52 secondaire 40, 48 tertiaire 40, 52 tige-boucle ADN 171 ARN 191 ARNm 223 Substance attractive 92 élicitrice 674 répulsive 92 Substrat 111 Subsurface 6, 635–636 Succimonas amylolytica 653 Succinate 582, 586, 591 métabolisme 597 Succinyl-CoA 126 Sucre, hydrate de carbone 44 Sucrose 596 Sujet porteur 831, 833 Sulfaméthaxazole 700 Sulfamide 700, 703 Sulfanilamide 700, 712 Sulfate 103, 573 réduction 573, 657 Sulfato-réducteur 439, 636 Sulfite 563 Voir SO2 Sulfolobale 444–445 Sulfolobus 444–445, 663 SIFV Voir Virus TTV Voir Virus virus SSV 521 Sulfonamide 710

Sulfo-oxydantes 339 bactéries 339 Super-Ag 744 Superantigène 769, 772, 860 Voir Super-Ag Super-enroulement négatif ADN 173 positif ADN 174 Superfamille génique des immunoglobulines 776–777 Superoxyde dismutase 164 réductase 164 Surface cutanée 722 Surveillance 830, 843, 851–852 Symbiose 458, 482, 670 Symbiosome 678 Symétrie hélicoïdale 234 icosaédrique 234 Symport 71 acides aminés/Na+ 432 Syndrome 860 choc toxique streptococcique 860 d’immunodéficience acquise Voir SIDA hémolytique et urémique 948 Lyme Voir Lyme post-streptococcique 860 pulmonaire à hantavirus (SPH) 898 respiratoire à hantavirus (SRH) 896 respiratoire aigu 898 Syndrome d’immunodéficience acquise 739 Synechococcus 400 Synechocystis ADN polymérase 505 gène dnaE 505 Synthèse ATP 556 biogénique de méthane 439 Syntrophie 588, 648 énergétique 589 Syntrophomonas 588–589 Syntrophomonas wolfei 649 Syphilis 836, 844, 846, 882 congénitale 882 primaire 882 secondaire 882 tertiaire 882 Système Arc 225 de distribution de l’eau 918 de régulation à deux composants 206, 224 de régulation Nar 225 de régulation Ntr 225

Système immunitaire complexe majeur d'histocompatibilité 907 Système phosphotransférase 73

T T7 Voir Bactériophage Tactisme 92 Tanin 971, 973–974 Tapis bactérien 622 Taq polymérase 188 Taux croissance 142, 149 dilution 149 division 142 Taxinomie 302, 320 Taxol 710 TC Voir Cellules T cytotoxiques T-cell receptor (TCR) 744, 753–757, 762, 772, 776–778, 781, 783–786 Technique sérologique 899 Teigne 836 Télomérase 456, 464 Télomère 175, 464, 490 Température 151 cardinale 136, 151 Temps de génération 136, 141 de réduction décimal 687–688 doublement 141 Ténofovir 706 Terminaison 223 Terminateur de transcription 989 Termoplasmatale 436 Terril 437 Test 474, 865 Ames 268 cutané tuberculine 808 de complémentation 285 de diagnostic rapide 861 ELISA 792 rapide ELISA 817 latex 813, 827 respiratoire à l’urée 877 sérologique 897 897 tuberculinique 865 Tétanos 734, 843, 896, 914 Tétracycline 686, 702, 704–705, 713, 715, 900–903, 956 Tétraéther 439 de dibiphytanyle 451 Tetrahydrofolate 576 Tetrahymena 468 TH Voir Cellules T helper Thalamus 897 Thalassémie 896, 907



Index 1045

Thayer-Martin, milieu 868 Théorie des germes 11 Thérapie génique 984, 999 cellules souches 999 Thermoacidophile 34 Thermococcale 438 Thermococcus 438 Thermocrinis 421 ruber 421 Thermodesulfobacterium 420 Thermophile 136, 155 Thermophilum 445 Thermoplasma 34, 436–437 Thermoprotéale 444–445 Thermoproteus 444–445 Thermorésistance 688 Thermosome 426, 450 Thermostabilité 450 Thermotoga 32, 420, 452 Thermotoga maritima systèmes de transport 496 transfert horizontal de gènes 504 voies métaboliques 496 Thermus aquaticus 157 Thiamine 105 vit B1 103 Thiobacillus 340, 644, 658 Thiobacillus denitrificans 563 Thiomargarita 64 Thiomicrospira 644 Thioploca 342 Thiospirillum 364 Thiothrix 342, 564, 644 Thylacoïde 456, 459, 547 Thymidine 706 Thymine 47, 170, 701 synthèse 131 Tique 900–902 Tissue plasminogen activator 995 Titration 238 Titre 792 Tobramycine 704 Togavirus 869 Tolérance 744–745, 752, 754, 776, 785 Toll-Like Receptor (TLR) 744, 749, 752, 764, 776–777 Toluène 591 Topoisomérase 451 Tour des électrons 113 Tox 734, 736 Toxicité 720, 731 Toxi-infection alimentaire 936, 942 à Clostridium perfringens 945 staphylococcique 944 Toxine 903, 910 A-B 733, 853 botulinique 735, 851–852

cyanobactéries 402 cytolytique 733 diphtérique 734 Voir Diphtérie murine 910 Shiga 948 superantigénique 733 tétanique 731, 735, 740, 914 Toxoplasma 475 gondii 951 Toxoplasmose 475, 951 tra région 278 Trachome 883 Tractus 725 gastro-intestinal 725 Traduction 5, 168–169, 197 frameshift Voir Virus inverse 984, 992 leaky scanning Voir Virus polyprotéine Voir Virus Trait drépanocytaire 907 Traitement antituberculeux 866 immunosuppresseur 913 primaire 918, 921 secondaire aérobie 918, 922 secondaire anaérobie 918, 921 tertiaire 918, 922 thermique 687–688 Transaminase hépatique 901 Transamination 130 Transcriptase inverse 186, 885 Voir rétrotranscription Transcription 5, 168–169, 189, 702 interruption 222 inverse 232, 512, 617 transcriptase inverse 243, 252 terminaison 191 unité de transcription 192 vecteurs d’expression 989 Transcriptome 488, 507 Transcrit primaire 168–169 Transducteur Tar 226 Transduction 258 du signal 224 généralisée 274 spécialisée 275 Transfection 273, 987 Transfert de gène latéral 302 horizontal 299, 316 de gènes 488, 504 latéral 316, 327 Transformation 232, 258, 271 par un virus 251 Transfusion 839 sanguine 846 Transgénique

animal 999 plante 1000 Translocase 74 Translocation 263 de groupe 56, 72 Transmission 833 aérienne 854 interanimale 833 interhumaine 833, 836, 839–841, 844, 846 voyage 842 Transpeptidase 704 Transpeptidation 136, 140 Transport d’électrons 120 inverse 544 nucléaire 457 simple 71 système 71 Transporteur 71 ABC 56 de C1 577 Transposase 287, 512 Voir Mu Transposition 286 conservative 288 réplicative 288 Transposition Voir Élément transposable Transposon 258, 287, 850 Voir Élément transposable Treponema pallidum 836, 846, 882, 903 Trichocyste 474 Trichoderma 981 Trichodesmium 639 Trichomonas 458, 469, 473 Trichomonas vaginalis 884 Trichrome Voir Hormogonie Triglycéride 46 Triméthoprime 700 Tripeptide 51 Trisaccharide 45 Trismus maxillaire 914 Trypanosoma 473 Trypanosoma cruzi 844 Trypanosome 473 TSST1 Choc toxique staphylococcique Tsutsugamushi 902 Tubercule 865 Tuberculose 13, 688, 698, 701, 833, 864 bovine 833, 843 granulome 865 maladie 865 primo-infection 865 Tubuline 462–463 Tularémie 851 Tunique sporale 87



1046 Index

Turbidité 147, 918 Turbine à protons 93 Tyndall, John 10 Typage de séquences multigéniques 302 Type sexuel, levure 466 Typhoïde 833 Typhus 845, 896 épidémique 900 murin 900

U UDPG, uridine diphosphoglucose 129 UFC 146 Ulcère gastrique Voir Helicobacter pylori Ultraviolet 690 UNG Voir Urétrite non gonococcique Uniport 71 Unité formant une plage 237 Svedberg 197 Uracile 47, 701 synthèse 131 Uranium, biolixivation 663 Urétrite 796 gonococcique 796, 836 non gonococcique 883 Uridine diphosphoglucose UDPG Voir UDPG Uridylate 131 Urine 794

V vacA Voir Helicobacter pylori Vaccin 744, 763, 767–768, 862, 907, 909, 914, 984 à ADN 998 à vecteur 997 anticholérique 927 antirabique inactivé 898 comestible 1003 coquelucheux 864 diphtérique 863 méningococcique 868 multivalent 862 pentavalent 863 polyvalent 997 recombinant 997 sous-unité 997 vecteur viral 536 Vaccination 744, 752, 766–767, 769, 838, 843–845, 851, 854 génétique 996 Vaccine 851 Vacuole gazeuse 85, 401 Vampirococcus 365 Van Leeuwenhoek, Antoni 10, 364

Vancomycine 702, 704, 712, 714, 862 Variation antigénique 881 Varicelle 838, 870 vaccin 870 Variole 843–844, 851–852 Vecteur 258, 830, 836 d’expression 984 d’intégration 984 rétrovirus 991 de clonage 258, 291, 489, 984 binaire 1000 chromosome artificiel de levures 986 chromosomes artificiels humains 1000 M13 517 vecteur d’expression 989 vecteur navette 989 vecteur plasmidique 986 navette 984 viral adénovirus 991 bacilovirus 991 vaccin 536 virus de la vaccine 991 virus SV40 991 Véhicule 830 Venter, Craig J. 488 Vérotoxine 948 Vésicule de gaz 56, 85 VHA Voir Hépatite A, virus VHB Voir Hépatite B, virus VHC Voir Hépatite C, virus VHD Voir Hépatite D, virus VHE Voir Hépatite E, virus VHG Voir Hépatite G, virus Viable 136 Vibrio 359 cholerae 359, 735, 738, 836, 927 fischeri 221, 360 parahaemolyticus 359 spp. 951 Vibrion cholérique Voir Vibrio cholerae Vibrionales 359 Vie à ARN 302, 305 VIH 706, 739–740, 839, 843, 885 charge virale 889 ELISA 817 immunoblot 817 immunodépression 887, 889 protéase 890 résistance 890 résistant à l’AZT 850 RT-PCR 824 vaccins 891 VIH-2 885 virus de l’immunodéficience humaine 252 VIH-1 Voir Virus

Vin blanc 971 chaptalisation 971 clarification 972 cuvaison 971 effervescent 971, 973 élevage 973 éraflage 971 fermentation alcoolique 972 malolactique 972 foulage 971 gerbage 973 glycéraldéhyde 3-phosphate 972 lie 973 macération 971 marc 972 mutage 971 oxydation 972 pressage 971 rouge 971 SO2 972 souches vinicoles 972 tanin 971, 973 Vinaigre 976 Acetobacter 976 Vinblastine 710 Vincristine 710 Virion 232 recombinant 997 Viroïde 232, 254 Virostatique 686 Virucide 686, 694 Virulence 720, 730, 733, 837, 842–843 Virus 24, 176, 232, 706, 708 à ARN simple brin négatif 232 à brin positif 232 Adenoviridae 536 Archaea 521 carrier state 516 Chlorella virus Voir Chlorella coronavirus 526 de l’immunodéficience humaine Voir VIH de l’immunodéficience humaine Voir aussi VIH de la maladie hémorragique du lapin 837 de la mosaïque du tabac 523 VMT 234 de la myxomatose 837 de la vaccine Voir Vaccin, recombinant de la varicelle et du zona 870 de Marburg 850–851 Ebola 850–851 enveloppé 514 Hepadnaviridae 540 Voir Rétrotranscription



Index 1047

Virus (suite) herpès 883 herpesviridae 534 influenza 529, 846 MS2 488 Norwalk-like 951 orthomyxoviridae 529 PAV1 Voir Pyrococcus poliovirus 525 polyomavirus 532 polyprotéine 525 poxviridae 535 procaryote Voir bactériophage Reoviridae 531 respiratoire syncytial 871 Retroviridae 531, 537 Rhabdoviridae Voir maladie de la rage segmenté 531 Voir Virus influenza SIFV Voir Sulfolobus SRAS 526 SSV Voir Sulfolobus SV40 532 Voir polyomavirus tempéré 232, 244 TTV Voir Sulfolobus vaccin recombinant 536 variant 850 végétaux 523 virulent 232, 244 virus de la vaccine Voir Poxviridae virus de la variole Voir Poxviridae VPg 525 West Nile (VWN) 846 908 Virus d’Epstein-Barr Voir Herpesviridae Voir lymphome de Burkitt Virus de l’hépatite B 541 Voir Hepadnaviridae Virus de l’immunodéficience humaine 706, 739 Voir Retroviridae Virus de la grippe Voir Virus influenza Virus de la mosaïque du tabac

protéine de mouvement 524 Virus de la rage 739 Virus de la vaccine corps d’inclusion 536 Voir Vaccin Virus de la varicelle et du zona Voir Herpesviridae Virus herpes simplex Voir Herpesviridae Virus influenza glissement antigénique 531 hémagglutinine Voir Virus neuraminidase Voir Virus saut antigénique 530 virus de la grippe 529 Virus SIFV 521 Virustatique 694 Vitamine 103, 966 B12 966 Vitamine B1 thiamine Voir Thiamine Vitamine B12 725 cobalamine Voir Cobalamine Vitamine B6 pyridoxine Voir Pyridoxine Vitamine K 121, 725 VMT Voir Virus de la mosaïque du tabac VNTR (variable number of tandem repeats) Voir Séquence répétée en tandem Vodka 974 Voie 726 de l’acétyl-CoA 426, 574, 576–577, 579 de l’hydroxyproprianate 544 génitale 727 respiratoire 720, 726 urinaire 727 Voie de Embden-Meyerhof glycolyse Voir Glycolyse Voie lytique 246 Voie métabolique Entner-Doudoroff 349 fermentation acides mixtes 355

fermentation butanediolique 355 Volée Voir Champignon Volta 433 Volvaire 981 Vue d’ensemble 333 Vulcano 441 VZV Voir Virus de la varicelle et du zona

W Western blot 904 Whisky 974 WIN 52084 872 Winogradsky, Sergei 15, 338, 342, 563, 611 Woese, Carl 26 Wolbachia 361–363 pipientis 362

X Xanthine 586 Xanthomonas 348 Xénobiotique 667 Xérophile 136

Y YAC (Yeast Artificial Chromosomes) 490 Yellowstone Parc 441 Yersinia enterocolitica 951 pestis 846, 851, 907

Z Zanamivir 708, 874 Zea mays 501 Zidovudine 706 Zona 871 Zoogloea 348 ramigera 922 Zoonose 830, 833, 841, 896 Zygomycète 479 Zygospore 479 Zymomonas 349




7209_00_Cartonne Page C Jeudi, 2. août 2007 6:08 06

PHYLOGÉNIE DU MONDE VIVANT – ARCHAEA

Euryarchaeota marins

Archaeoglobus

Halococcus Halophiles extrêmes

Crenarchaeota marins

Euryarchaeota

Halobacterium

Natronococcus Methanobacterium

Methanocaldococcus

Crenarchaeota


Methanothermus Sulfolobus

Methanosarcina

Thermococcus/ Pyrococcus

Methanospirillum

Pyrodictium

Thermoproteus

Thermoplasma

Hyperthermophiles

Methanopyrus Picrophilus

Desulfurococcus

Ferroplasma Acidophiles extrêmes


Arbre phylogénétique des Archaea. Cet arbre a été obtenu par comparaison des séquences d’ARN ribosomique 16 S. Quatre phyla majeurs d’Archaea peuvent être définis : les Crenarchaeota, comportant à la fois des hyperthermophiles et des psychrophiles ; les Euryarchaeota, comportant les méthanogènes et les halophiles extrêmes ; les Korarchaeota, hyperthermophiles selon les données actuelles ; et les Nanoarchaeota, parasites de petite taille d’hyperthermophiles. Voir les sections 11.5 et 11.9 pour plus d’informations sur les phylogénies basées sur les ARN ribosomiques. Les données concernant cet arbre ont été obtenues du Ribosomal Database project http://rdp.cme.msu.edu.


7209_00_Cartonne Page D Jeudi, 2. août 2007 6:08 06

PHYLOGÉNIE DU MONDE VIVANT – EUKARYA

Microsporidies (Encephalitozoon) Dépourvus de mitochondries mais avec des hydrogénosomes ou des mitoses

ho

n

ie dr

M

ito

c

Diplomonadines (Giardia)

Bacteria

Parabasaliens (Trichomonas)

s e

sym

Chlo

ropla

Entamoeba

Amoeba

s bio

do

En

Euglenobiontes (Euglena) Trypanosomes (Trypanosoma)

stes

Archaea

Moisissures glaireuses

Ciliés

Apicomplexés (Plasmodium) Dinoflagellés

Animaux

« Couronne » des Plantes Algues vertes pluricellulaires Algues rouges Champignons

Oomycètes Diatomées Algues brunes

Arbre phylogénétique des Eukarya, les eucaryotes. Cet arbre a été obtenu par comparaison des séquences d’ARN ribosomique 18S provenant de la petite sous-unité des ribosomes cytoplasmiques. Notez la proximité phylogénétique entre les animaux et les plantes, mais la distance importante entre ces groupes et des organismes comme Giardia. Voir les sections 11.5 et 11.9 pour plus d’informations sur les phylogénies basées sur les ARN ribosomiques. Les données concernant cet arbre ont été obtenues du Ribosomal Database project http://rdp.cme.msu.edu.



M. Madigan J. Martinko

Bactéries, micro-algues, champignons, virus… Qu’ils menacent notre santé ou la protègent, qu’ils constituent des acteurs majeurs de la biosphère en assurant le recyclage de la matière organique ou soient devenus des outils précieux dans les domaines des biotechnologies et de l’agroalimentaire, les micro-organismes sont au cœur des défis scientifiques du XXIe siècle.

Thomas Brock est le fondateur de cet ouvrage. C’est aussi à lui que nous devons la découverte de la bactérie thermophile dont est issue la polymérase Taq, pierre angulaire de la réaction de polymérisation en chaine (PCR).

Ouvrage de référence pour tous les microbiologistes, le « Brock » (du nom de son fondateur), aujourd’hui dans sa onzième édition, voit enfin le jour en français, traduit par une équipe de spécialistes du domaine.

Michael T. Madigan est professeur de microbiologie à l’université Carbondale de l’Illinois du Sud (États-Unis). Auteur de plus de 100 articles scientifiques, il a reçu de nombreuses distinctions pour ses travaux de recherche ainsi que pour ses activités d’enseignant.

Ses principaux atouts : • il livre dans ses premiers chapitres toutes les notions scientifiques qu’il est indispensable de posséder pour appréhender le monde des microorganismes : éléments de biochimie, de biologie moléculaire, de biologie cellulaire, de génétique, de métabolisme, etc. ; • tous les aspects de la microbiologie moderne sont abordés de manière équilibrée ; • les micro-organismes sont présentés selon différents ordres logiques, par grandes familles évolutives mais aussi par grandes caractéristiques communes (maladies microbiennes transmises d’homme à homme, par les animaux, par l’eau, etc.) ; • l’écologie microbienne et les applications de la microbiologie sont traitées à part entière ; • le texte est soutenu par de très nombreux tableaux, schémas et clichés, dont la clarté et la qualité en font des outils inestimables. Brock, Biologie des micro-organismes constitue un manuel de cours d’initiation et d’approfondissement parfaitement adapté pour accompagner l’étudiant tout au long de son cursus. Il représente aussi une référence pour les enseignants de la discipline et les chercheurs des domaines apparentés.

John M. Martinko est professeur associé à l’université Carbondale de l’Illinois du Sud (États-Unis) et dirige le Département de microbiologie. Il a été récompensé à plusieurs reprises pour ses travaux de recherche et la qualité de son enseignement.


11e édition

Michael Madigan et John Martinko

11e édition

Public : étudiants en sciences de la vie, environnement, écologie, médecine et pharmacie. Cours : microbiologie, biologie des micro-organismes, virologie, bactériologie, biologie microbienne, écologie microbienne, maladies microbiennes, immunologie, biologie moléculaire des procaryotes, génétique microbienne, diversité microbienne et évolution, microbiologie industrielle, traitement de l’eau, biotechnologie Niveau : licence, master, doctorat, BCPST

11e édition Traduction française coordonnée par Daniel Prieur

www.pearson.fr

7209-bioorganismes.indd 1


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Madigan Brock Biologie Des Micro Organismes

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