Laporan Praktikum ke- 6 M.K. Mikrobiologi Akuakultur
Hari/Tanggal : Senin, 10 Nopember 2014 Asisten : Rahman S. Pi, M. Si : Tim Asisten Mikrobiologi
PENGHITUNGAN BAKTERI DENGAN METODE HITUNGAN CAWAN
Oleh: Kurniawan Wahyu Hidayat C151140311
ILMU AKUAKULTUR SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR 2015
I. PENDAHULUAN 1.1 Latar Belakang
Setelah kita mempelajari bagaimana menumbuhkan suatu koloni bakteri, tentu harus mengatahui kuantitas dan kualitas dari bakteri tersebut. Dalam hal ini yang akan dibahas adalah bagaimana mengetahui kuantitas dari suatu bakteri. Ada berbagai cara untuk menghitung jumlah sel bakteri, antara lain hitungan langsung dengan menggunakan mikroskop, dan hitungan tidak langsung dengan metode hitung cawan baik dengan metode cawan tuang maupun metode cawan sebar. Pengukuran kuntitatif populasi mikroba dari suatu sampel dilakukan untuk mengetahui kualitas bahan atau tujuan lain berdasarkan jumlah mikroba yang ada dalam sampel tersebut. Sehingga dengan kita dapat mengetahui apakah mikroba tersebut berbahaya atau bahkan baik bagi lingkungan maupun bagi organisme budidaya. Beberapa cara yang dapat digunakan untuk menghitung atau mengukur jumlah mikroorganisme di dalam suatu suspensi. Cara tersebut dibedakan atas beberapa kelompok yaitu, perhitungan jumlah sel, terdiri dari hitungan mikroskopik, hitungan cawan, dan MPN (most probable number); perhitungan massa sel secara langsung, terdiri dari volumetrik, gravimetrik, dan kekeruhan (turbidimetri); perhitungan massa sel secara tidak langsung, terdiri dari analisis komponen sel, analisis produk katabolisme, dan analisis konsumsi nutrien (Ferdiaz 1993). Sedangkan menurut Irianto (2007), ada beberapa cara penghitungan jumlah mikroba, yaitu cara penghitungan pada cawan petri, cara menghitung langsung (metode kaca objek), metode ukur kekeruhan, metode turbidimetri, nefelometri, serta dengan jumlah perkiraan terdekat (JPT). Cara penghitungan pada cawan petri disebut juga metode penghitungan bakteri hidup atau metode penghitungan koloni. Pada penghitungan koloni, dilakukan penyimpanan pada suhu yang sesuai. Oleh karena itu, suatu bakteri dapat tumbuh menjadi satu koloni yang terhitung mewakili jumlah bakteri hidup yang terdapat dalam tiap volume pengenceran yang digunakan Prinsip dari metode hitungan cawan adalah menumbuhkan sel mikroba yang masih hidup pada metode agar, sehingga sel mikroba tersebut akan
berkembang biak dan membentuk koloni yang dapat dilihat langsung dengan mata tanpa menggunakan mikroskop. Metode hitungan cawan dapat dibedakan atas dua cara, yaitu metode tuang (pour plate) dan metode permukaan atau sebar (surface atau spread plate) (Fardiaz 1993). Untuk memenuhi persyaratan statistik, cawan yang dipilih untuk dihitung harus memiliki 30-300 koloni. Oleh karena itu, dilakukan sederatan pengenceran dan pencawan. Jumlah mikroba dalam sampel ditentukan dengan mengalikan jumlah koloni dengan faktor pengenceran pada cawan yang bersangkutan. Satuan yang
digunakan untuk menyatakan jumlah
koloni bakteri adalah CFU/mL (CFU = colony forming units) (Waluyo 2008).
1.2 Tujuan
Mempelajari cara melakukan pengenceran serial dan menentukan jumlah bakteri dalam suatu sampel dengan metode hitungan cawan.
II. METODOLOGI
2.1
Waktu dan Tempat
Paraktikum ini dilaksanakan pada hari Senin, 29 September 2014 pukul 08.00-10.00 WIB, bertempat di Laboratorium Kesehatan Ikan, Depertemen Budidaya Perairan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Institut Pertanian Bogor.
2.2
Alat dan Bahan
Alat yang digunakan dalam praktikum ini adalah : 1. Tabung reaksi 2. Rak tabung 3. Mikropipet 4. Batang penyebar 5. Bunsen 6. Cawan petri steril 7. Plastic wrap 8. Korek api. Bahan yang digunakan dalam praktikum ini adalah : 1. Media SWC cair 2. Biakan bakteri MP5 3. Larutan fisiologis 4. Alkohol 95% 5. Alkohol 70%
2.3
Prosedur Kerja
1. pengenceran a. sterilisasi lat dan bahan. b. Tabung-tabung
berisi
sampel
didapakan FP 10 -5, 10-6, dan 10-7. 2. Metode cawan tuang
diencerken
secara
serial
hingga
a. disiapkan petri petri steril b. disiapkan dan media agar SWC yang masih dalam keadaan hangat. c. Suspensi bakteri pada masing-masing pengenceran dimasukkan satu persatu kedalam cawan petri dengan mikro pipet sebanyak 0,1 ml. d. Kemudian digoyangkan agar rata diseluruh bagian cawan petri dengan gerakan membentuk angka “8”. e. Bakteri kemudian diinkubasi pada suhu kamar selama 18-24 jam. f.
Keesokan harinya, koloni-koloni bakteri yang tumbuh dihitung pada setiap cewan petri pada masing-masing metode penghitungan.
3. Metode cawan sebar a. Disiapkan media SWC. b. Masukan suspensi bakteri yang telah diencerkan dan divortex. c. Suspensi diambil secara bergantian dengan mikro pipet sebanyak 0,1 ml pada tiap-tiap pengenceran d. Disebar pada tiap cawan petri dengan batang penyebar yang telah
disterilkan sebelumnya dengan alkohol 96%.
III. HASIL DAN PEMBAHASAN 3.1
Hasil
Pengamatan praktikum penghitungan bakteri dengan metode cawan adalah sebagai berikut : Kelompok
Isolat
Metode
(cfu/ml) Total Pl ate Count -
-
-
10 10 Tuang 33,6 x 10 18,4 x 10 1 1Ub Sebar 58,6 x 10 9 Tuang TBUD TBUD 2 NP5 8 Sebar 7,8 x 10 0 Tuang 3 Sta Sebar Tuang 16,2 x 10 4 1Ub Sebar 2,34 x Tuang 5 NP5 TBUD 1011 0 Sebar TBUD TBUD TBUD Tuang 6 Sta Sebar Tuang 25,8 x 10 43,2 x 10 7 1 Ub Sebar TBUD TBUD TBUD Tuang 0 0 8 NP5 8 Sebar 15 x 10 0 Tuang 9 NP5 Sebar Tuang TBUD TBUD TBUD 10 Sta Sebar TBUD TBUD TBUD Tabel 1 Hasil pengamatan Total Plate Count (TPC) bakteri dengan metode hitungan cawan tuang dan sebar 3.2
10 35,8 x 10 1,6 x 10 TBUD TBUD
Pembahasan
Sampling untuk mengetahui konsentrasi bakteri dalam lingkungan maupun inang sangat berguna bagi managemen pencegahan penyakit pada ikan. Kehadiran suatu mikroorganisme dianggap normal apabila jumlahnya atau konsentrasinya tidak lebih dari batas minimum, batas ini berbeda-beda pada setiap patogen. Patogen akan berbahaya apabila sudah memenuhi quorum sensing yaitu jumlah minimal
patogen
untuk
menyebabkan penyakit.
bisa
mengekspresikan
faktor
virulensinya
dan
Penghitungan bakteri menggunakan sistem koloni, hal ini disebabkan koloni merupakan bagian terkecil yang bisa dihitung secara kasat mata dari bakteri, selain itu koloni adalah representasi dari bakteri yang melakukan pembelahan dan berkumpul di suatu tempat. mendapatkan koloni mikroba dapat dilakukan dengan berbagai metode, salah satunya dengan menggunakan metode cawan tuang dan cawan sebar. Setelah didapatkan koloni yang tumbuh pada suatu media agar, kemudian kita juga dapat mengetahui jumlah koloni bakteri yang tumbuh setelah proses inkubasi selama 24 jam (Pelczar, 1986). Metode yang dilakukan pada praktikum kali ini yaitu metode cawan sebar dan cawan tuang. Metode ini dianggap lebih baik, dan akurat bila dibandingkan dengan menghitung jumlah bakteri secara langsung menggunakan mikroskop karena metode hitungan cawan hanya menghitung jumlah bakteri yang hidup dan yang membentuk koloni saja, sedangkan yang mati tidak ikut terhitung. Selain itu metode ini lebih mudah dan praktis. Kelemahannya yakni membutuhkan banyak bahan, media yang digunakan adalah media SWC (Sea Water Complete) yang digunakan untuk sampel bakteri dengan kode NP5. Metode cawan sebar (spread plate) sebar, 0.1 ml suspensi bakteri yang telah diencerkan disebar pada media penyubur steril yang telah disiapkan. Selanjutnya, suspensi dalam cawan diratakan dengan batang penyebari agar koloni tumbuh merata pada media dalam cawan tersebut, kemudian diletakkan dalam inkubator (370 C) selama 24 jam. Metode ini cukup sulit terutama saat meratakan suspensi dengan batang penyebar. Oleh karena itu, batang penyebar harus benar-benar steril, yaitu dengan mencelupkannya terlebih dahulu dalam alkohol kemudian dipanaskan dengan api bunsen. Batang penyebar yang masih panas akibat pemanasan dengan api bunsen, dapat merusak media agar, sehingga harus didinginkan terlebih dahulu dengan meletakkannya di sekitar api bunsen Dengan metode ini, satu sel bakteri akan tumbuh dan berkembang menjadi satu koloni bakteri. Satu koloni bakteri yang terpisah dengan koloni lainnya dapat diamati tipe pertumbuhan pada masing-masing media, diantaranya dilakukan terhadap konsistensi, bentuk koloni, warna koloni dan permukaan koloni (Riesama, 2010).
Jumlah sel bakteri yang terdapat dalam sampel dapat ditentukan dengan rumus sebagai berikut. ∑sel
=
∑koloni x
x
Satuan untuk ∑sel adalah CFU/mL yang mana CFU merupakan colony forming units per mL. Semakin besar pengenceran, maka jumlah koloni semakin kecil sehingga jumlah mikroorganisme dapat dihitung. Fp merupakan faktor pengenceran sedangkan ∑inokulan merupakan larutan pengencer yang diambil untuk diinokulasikan. Pada percobaan volume inokulan yang digunakan sebesar 0,1 mL. Jumlah bakteri pada percobaan baik cawan sebar maupun cawan tuang tidak dapat dihitung, karena tidak memenuhi persyaratan statistik Kelemahan utama metode hitungan cawan adalah keselektifannya. Kondisi pertumbuhan bakteri, termasuk komposisi media yang digunakan, waktu inkubasi, suhu, dan pH sangat menentukan jenis bakteri yang dapat tumbuh dari seluruh populasi yang ada. Tidak ada satu kondisi yang universal untuk membuat seluruh mikroorganisme dapat tumbuh dengan baik. Kekurangan tersebut dapat menjadi suatu keunggulan jika ingin menghitung populasi mikroorganisme spesifik. (Harmita 2006). Penggunaan metode hitungan cawan pada dunia akuakultur antara lain sebagai kontrol dalam evaluasi bakteri patogen dan bakteri probiotik pada lingkungan budidaya (tambak udang) dengan mengetahui jumlah bakteri patogen dan bakteri probiotik sebagai pesaing alami untuk bakteri patogen, selaku managemen budidaya mampu membuat keputusan untuk kelangsungan organisme inang. Hal tersebut seperti disebutkan oleh Widanarni et al (2008), bahwa Isolat probiotik 1Ub, SKT-b, dan Ua efektif menghambat pertumbuhan V. Harveyi serta secara signifikan dapat meningkatkan kelangsungan hidup larva udang windu. Peningkatan
kelangsungan
larva
udang
tersebut
terjadi
karena
adanya
penghambatan pertumbuhan V. harveyi oleh bakteri probiotik yang kemungkinan melalui kompetisi tempat pelekatan atau sumber nutrisi. Hasil pengamatan jumlah koloni bakteri yang ditunjukkan pada tabel diatas untuk kelompok IX media semua terkontaminasi sehingga tidak dapat dihitung
dan diestimasikan kepadatan bakterinya. Suatu biakan dikatakan kontaminasi apabila terdapat bakteri lain, selain isolat atau biakan murni yang telah diidentifikasi. Kontaminasi dapat terjadi karena adanya prosedur yang tidak aseptis, sehingga masuknya bakteri kontaminan kedalam media.
IV. KESIMPULAN DAN SARAN 4.1 Kesimpulan
Penghitungan bakteri yang dilakukan pada praktikum ini adalah metode hitungan cawan. Kelebihan dari metode ini adalah mudah dan praktis. Dengan praktikum ini praktikan mampu mengetahui garis besar penghitungan bakteri dengan metode cawan.
4.2 Saran
Mohon untuk dibiasakan tidak menggunakan kode bakteri. Lebih baik langsung menggunakan nama bakteri tersebut.
DAFTAR PUSTAKA Fardiaz S. 1993. Analisis Mikrobiologi Pangan. Jakarta: PT. Raja Grafindo Persada. Harmita. 2006. Buku Ajar Analisis Hayati. Jakarta: Kedokteran EGC. Ed. ke-3. Irianto K. 2007. Mikrobiologi. Bandung: Yrama Widya. Waluyo Lud. 2008. Teknik dan Metode Dasar dalam Mikrobiologi. Malang: UMM Press. _________ 2007. Mikrobiologi Umum. Malang: UMM Press. Widanarni, Ayuzar. E. dan Sukenda. 2008. Mekanisme Penghambatan Bakteri Probiotik terhadap Pertumbuhan Vibrio harveyi pada larva udang Windu ( Penaeus monodon). Jurnal Akuakultur Indonesia, 7(2): 179 – 188 (2008).
