Informe de laboratorio

INFORME DE LABORATORIO

PRÁCTICA NUMERO 3 CINÉTICA ENZIMÁTICA Integrantes: Johanna Yadira Giraldo Henao

CC: 32296721

Miguel Ángel Gil Saldarriaga

CC: 1035877537

Alejandra Murillo Suaza

CC: 1152705906

Alejandro Gonzalez Taborda

CC: 1037622372

UNIVERSIDAD DE ANTIOQUIA FACULTAD DE MEDICINA INSTRUMENTACIÓN QUIRÚRGICA 1 2017-2 MEDELLIN.

TABLA DE CONTENIDO. 1. INTRODUCCIÓN. INTRODUCCIÓN. ................... .................................... ................................. .................................. .................................. ................2 2. MARCO CONCEPTUAL. CONCEPTUAL. ........................ ........................Error! Bookmark not defined. 3. OBJETIVOS .................................. ................................................... .................................. .................................. ............................ ...........5 4. METODOLOGÍA METODOLOGÍA ................................ ................................................. .................................. .................................. ...................... ..... 6 4.1 MATERIALES MATERIALES ................................. .................................................. .................................. .................................. ..................... 6 4.2 PROCEDIMIENTO PROCEDIMIENTO................................... ................................................... .................................. .......................... ........10 4.2.1

Flujograma Flujograma protocolo protocolo 1 .................................. ................................................... ............................... ..............11

4.2.2


5. RESULTADOS. RESULTADOS.................................... ......................................... ......Error! Bookmark not defined. 5.1 RESULTADOS SUSTRATO CON INHIBIDOR.Error! Bookmark not defined. 5.2 RESULTADOS RESULTADOS SUSTRATO SUSTRATO SIN INHIBIDOR INHIBIDOR ................................ ................................15 5.3 COMPARACIÓN................................ ................................Error! Bookmark not defined. 6. ANÁLISIS. ................................. ................................................ ...............Error! Bookmark not defined. 7. CONCLUSIONES. CONCLUSIONES. ................................. .................................... ...Error! Bookmark not defined. 8. ANEXOS.................................................... Error! Bookmark not defined. 8.1 CÁLCULOS. ................................. ....................................... ......Error! Bookmark not defined. 8.1.1 CÁLCULOS GRUPO 3 CON INHIBIDOR.Error! Bookmark not defined. 8.1.2 CÁLCULOS GRUPO 2 SIN INHIBIDOR . Error! Bookmark not defined. 8.1.3

CONCENTRACIÒN DE SUSTRATOError! Bookmark not defined.

8.1.4 CONCENTRACIÓN CONCENTRACIÓN DEL PRODUCTO ... Error! Bookmark not defined. 8.2 FICHAS DE SEGURIDAD.................Error! Bookmark not defined. 8.3 BIBLIOGRAFÍA BIBLIOGRAFÍA ................................. .................................Error! Bookmark not defined. 1

TABLA DE CONTENIDO. 1. INTRODUCCIÓN. INTRODUCCIÓN. ................... .................................... ................................. .................................. .................................. ................2 2. MARCO CONCEPTUAL. CONCEPTUAL. ........................ ........................Error! Bookmark not defined. 3. OBJETIVOS .................................. ................................................... .................................. .................................. ............................ ...........5 4. METODOLOGÍA METODOLOGÍA ................................ ................................................. .................................. .................................. ...................... ..... 6 4.1 MATERIALES MATERIALES ................................. .................................................. .................................. .................................. ..................... 6 4.2 PROCEDIMIENTO PROCEDIMIENTO................................... ................................................... .................................. .......................... ........10 4.2.1


4.2.2


5. RESULTADOS. RESULTADOS.................................... ......................................... ......Error! Bookmark not defined. 5.1 RESULTADOS SUSTRATO CON INHIBIDOR.Error! Bookmark not defined. 5.2 RESULTADOS RESULTADOS SUSTRATO SUSTRATO SIN INHIBIDOR INHIBIDOR ................................ ................................15 5.3 COMPARACIÓN................................ ................................Error! Bookmark not defined. 6. ANÁLISIS. ................................. ................................................ ...............Error! Bookmark not defined. 7. CONCLUSIONES. CONCLUSIONES. ................................. .................................... ...Error! Bookmark not defined. 8. ANEXOS.................................................... Error! Bookmark not defined. 8.1 CÁLCULOS. ................................. ....................................... ......Error! Bookmark not defined. 8.1.1 CÁLCULOS GRUPO 3 CON INHIBIDOR.Error! Bookmark not defined. 8.1.2 CÁLCULOS GRUPO 2 SIN INHIBIDOR . Error! Bookmark not defined. 8.1.3

CONCENTRACIÒN DE SUSTRATOError! Bookmark not defined.

8.1.4 CONCENTRACIÓN CONCENTRACIÓN DEL PRODUCTO ... Error! Bookmark not defined. 8.2 FICHAS DE SEGURIDAD.................Error! Bookmark not defined. 8.3 BIBLIOGRAFÍA BIBLIOGRAFÍA ................................. .................................Error! Bookmark not defined. 1

1. INTRODUCCION Este trabajo se llevó a cabo con el fin de analizar las variaciones que presenta una enzima propia del hígado de vaca (FOSFATASA), (FOSFATASA), la cual será sometida a varios procesos en los cuales se observan observan los cambios cambios presentados presentados dependiendo de la concentración que tenga, la temperatura a la que esté sometida y los cambios de pH que se apliquen. Dependiendo de los cambios a los que se someta la solución calculamos el Km y la V Max que se presentan. Se usaron los conocimientos aprendidos en la práctica anterior de espectrofotometría, espectrofotometría, esto con el fin de analizar mediante el proceso de absorbancia cual es la concentración de cada solución ya que todas fueron sometidas a diferentes cantidades de reactivos pero a una misma temperatura Por medio de la actividad enzimática se dan diferentes procesos y funciones en el organismo, como lo es la digestión y la absorción de diversos componentes necesarios para el funcionamiento ideal de nuestro cuerpo; es así por lo que en este laboratorio se desea determinar la importancia de la fosfatasa y cómo puede cambiar el rendimiento y la velocidad de esta enzima según la temperatura, concentración, el pH, entre otros factores, representando todos estos datos en diversas gráficas, tablas y ecuaciones de (Michaelis-Menten (Michaelis-Menten y Lineweaver-burk) Lineweaver-burk) que veremos en las siguientes páginas de este trabajo.

2. MARCO CONCEPTUAL 2

Para llevar a cabo este informe de laboratorio de manera satisfactoria debemos tener muy claros algunos conceptos que son claves para el desarrollo del tema y que se presentaran a continuación. Las enzimas son proteínas que catalizan reacciones químicas en los seres vivos. Las enzimas son catalizadores, esto quiere decir que, son sustancias que sin consumirse en una reacción, aumentan notablemente su velocidad. No hacen factibles las reacciones imposibles, sino que aceleran las reacciones que espontáneamente podrían producirse. Lo dicho anteriormente hace posible que en condiciones fisiológicas tengan lugar reacciones que sin catalizador requerirían requerirían condiciones extremas de presión, temperatura o pH. Prácticamente todas las reacciones químicas que tienen lugar en los seres vivos están catalizadas por enzimas. Las enzimas son catalizadores específicos, es decir, cada enzima cataliza un solo tipo de reacción, y casi siempre actúa sobre un único sustrato o sobre un grupo muy reducido de ellos. En una reacción catalizada cata lizada por una enzima: • La sustancia sobre la que actúa la enzima se llama sustrato. • El sustrato se una a una región concreta de la enzima, llamada centro activo. El

centro activo comprende un sitio de unión formado por los aminoácidos que están en contacto directo con el sustrato y un sitio catalítico, formado por los aminoácidos directamente implicados en el mecanismo de la reacción. • Una vez formados los productos la enzima puede comenzar un nuevo ciclo de

reacción. La descomposición de alimentos en el cuerpo y la coagulación de la sangre son ejemplos del trabajo de las enzimas, que además son necesarias para todas las funciones corporales. Por otro lado, las coenzimas son necesarias para la actividad de muchas enzimas. El ATP, el GTP, el NAD, la coenzima A o la coenzima Q son algunos ejemplos ejemplos de coenzimas. Muchas coenzimas son vitaminas o derivados de ellas, especialmente de la vitamina B.

3

Un sustrato es una especie química que se considera, de forma explícita, objeto de la acción de otros reactivos. Por ejemplo, un compuesto cuya transformación es intervenida por un catalizador. La cinética enzimática es el análisis cuantitativo del efecto de cada uno de los factores que intervienen en la actividad enzimática y se avalúan a través de la velocidad de la reacción catalizada por la enzima. Las variables más importantes para realizar estos estudios son: concentración de enzima, sustratos y productos, pH y temperatura. La actividad de la enzima puede verse obstaculizada por un componente que es llamado inhibidor. Los inhibidores son sustancias que disminuyen la actividad enzimática a través de interacciones con el centro activo de la enzima o con otros centros específicos. Los inhibidores son: • Isotéricos: ejercen su acción sobre el centro activo de o

o

la enzima y pueden ser:

Reversibles: se da cuando se establece un equilibrio con la enzima libre, con el complejo enzima-sustrato o con ambos. Irreversible: se da cuando el inhibidor modifica químicamente la enzima.

• Alostéricos: ejercen su función en un lugar diferente al centro activo de la

enzima, pueden causar un cambio conformacional de la enzima. Leonor Michaelis y Maud Menten desarrollaron la teoría del complejo enzimasustrato como intermediario del proceso de catálisis enzimática y propusieron una ecuación de velocidad que explica el comportamiento cinético de las enzimas. La ecuación de Michaelis-Menten es:

=[]/+[]

4

3. OBJETIVOS General: Conocer la actividad enzimática de la fosfatasa alcalina de hígado de vaca alterando sus condiciones óptimas para reaccionar. Específicos: • Analizar la variación de la reacción enzimática de la fosfatasa alcalina de hígado

de vaca induciendo cambios en el pH, la temperatura y la concentración. • Calcular la velocidad máxima y el valor del Km. • Representar gráficamente los datos obtenidos a partir de la medición de la

actividad enzimática en diferentes condiciones de su entorno.

5

4. METODOLOGIA 4.1 MATERIALES Y EQUIPOS • Espectrofotómetro: instrumento usado en el análisis químico que sirve para

medir, en función de la longitud de onda, la relación entre valores de una misma magnitud fotométrica relativos a dos haces de radiaciones y la concentración o reacciones químicas que se miden en una muestra.

Figura 1 Imagen tomada: http://www.aguascolombia.com/equipos-analisis-de-agua/espectrofotometros/

• Cubetas de polietileno: son utilizadas para leer las

espectrofotómetro.

Figura 2 6

sustancias en el

Imagen tomada de: http://www.ictsl.net/productos/01d63694a80f7ae0a/0000009c970a95812.html

• Baño María: es un método

empleado en las industrias, en los laboratorios de química y en la cocina para conferir temperatura uniforme a una sustancia líquida o sólida o para calentarla lentamente, sumergiendo el recipiente que la contiene en otro mayor con agua u otro líquido que se lleva a o está en ebullición.

Figura 3 Imagen tomada de: https://www.e-allscience.com/collections/ba-os-mar-a

• Tubos de ensayo: un tubo de ensayo es un pequeño tubo cilíndrico de vidrio con

un extremo abierto (que puede poseer tapa) y el otro cerrado y redondeado, que se utiliza en los laboratorios para contener pequeñas muestras líquidas o sólidas, aunque pueden tener otras fases, como realizar reacciones químicas en pequeña escala.

Figura 4 7

Imagen tomada de: https://es.dreamstime.com/imagenes-de-archivo-soluci%C3%B3n-transparente-coloreada-en-tubos-deensayo-image39781814 

Pipeta repetidora: Herramienta que permite el paso de un volumen exacto de una determinada disolución que será agregada al tubo por medio de alícuotas.

Figura 5 Imagen tomada de: http://www.hellotrade.com/mandel-scientific-company-canada/distriman-pipette.html

• Servilletas y pañuelos de papel : es un producto de un sólo uso elaborado con

hojas de papel absorbente.

Figura 6 Imagen tomada de: http://www.ehowenespanol.com/doblar-servilletas-papel-formar-rosas-como_2979/

8

Reactivos       

Extracto enzimático de hígado de res (fosfatasa) TRIS (Hidroximetil-aminometano) 20 Mm, pH óptimo. P-nitrofenil fosfato (PNFP) 2mM Estándar de p-nitrofenol (PNF) 0,5mM Solución acuosa de fosfato (2 4 ) 0,1M Hidróxido de sodio (NaOH) 2N Agua destilada

Tabla que se tiene en cuenta para la mezcla de reactivos ( Protocolo 1)

Tubo Reactivo Agua destilada Tampón TRIS 20 mM pH optimo: 4.0 Sustrato PNFP *2mM Producto PNF **0.5mM Extracto enzimático Solución de parada NaOH 2N

Volumen de Reactivos Blanc Estándar 1 2 o 2,6 1,0

2,7 1,0

3

4

5

6

7

8

2,6 2,4 2,2 2,0 1,8 1,6 1,2 --1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 ---

0,2

0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,6 ---

---

0,3

--- --- --- --- --- --- --- ---

--1,0

--1,0

0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 --1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 ---

4.2 PROCEDIMIENTO: Con base a la tabla anterior se realizó la mezcla de los reactivos en los respectivos tubos de ensayo, en el siguiente orden: 1. Agua destilada 9

2. Sustrato (PNFP 2Mm) 3. Tampón (TRIS, 20Mm) PH óptimo 4.0 4. Producto (PNF, 0.5Mm) • Luego de la preparación de cada uno

de los tubos de ensayo, se sumergieron los numerados al baño maría a una temperatura de incubación de 37ºC durante 1 minuto. • Después de transcurrido el tiempo, se agregó la enzima con un intervalo de

tiempo de 10 segundos entre tubo y tubo • Al adicionar la enzima se empezaron a contabilizar 15 minutos (de reacción).

Después de pasados los 15 minutos, en el mismo orden se fue agregando 1 ml de NaOH (2N). El NaOH también se le adicionó a los tubos blanco y estándar. • Se retiraron los tubos del baño

maría para finalmente determinar la absorbancia de cada sustancia (incluyendo blanco y estándar) a una longitud de onda de 405 nm mientras se calibraba con el blanco.

10

4.2.1 Flujo grama Protocolo 1

11

4.2.2 Flujo grama Protocolo 2

12

5. Resultados

5.1 DE SUSTRATO SIN INHIBIDOR. Se hace una descripción de los resultados obtenidos durante la práctica de laboratorio Cinético enzimático utilizando las tablas y gráficas. Se utiliza algunos métodos aprendidos en clase: Michaelis-Menten (que relaciona Velocidad vs Sustrato) y Lineweber-Burk (que relaciona valores inversos, o sea, 1/Velocidad vs 1/Sustrato). A continuación, se muestra los resultados obtenidos en la práctica de laboratorio nº3 cinética enzimática, donde se pueden ver los efectos de pH, la temperatura, la concentración del sustrato sin inhibidor fosfato sobre la velocidad de reacción de una enzima

Muestra Reactante Tampón TRIS 20 mM (pH óptimo) Sustrato(PNFP 2m M) Producto(PNF 0.5m M) Agua destilada

Blanco 1

Extracto enzimático

2

3

4

5

6

7

1,0

1,0 1,0

1,0

1,0 1,0

1,0

1,0

0.2

0,2 0,4

0,6

0,8 1,0

1,2

1,6

0.0

----- ----- ----- ----- ----- ----

-----

2,6

2,6 2,4

2,2

2,0 1,8

1,6

1,2

0.2

0,2 0,2

0,2

0,2 0,2

0,2

0,2

Tabla 1. D istribución de volúmenes para la medición de la velocidad de reacción enzimática

La absorbancia fueron medidas por la espectrofotometría de muestras con diferente concentración de sustrato (PNFP), teniendo en cuenta que se inició con el mismo pH y mista temperatura (37ºC).

13

N. Tubo Estándar 1 2 3 4 5 6 7

D.O 1.805 0.241 0.471 0.615 0.780 0.876 1.043 1.173

Tabla 2. Absorbancia, concentración de producto del PNF a diferentes concentraciones en presencia de la enzima fosfatasa alcalina.

Con las formulas aprendidas en clase de Michaelis-Menten: Velocidad (µmoles/min) vs Sustrato (µmoles) pudimos obtener la velocidad y sustrato de cada tubo

Tubo 1 2 3 4 5 6 7

Sustrato

Velocidad

0.0040 mM 0.0078mM

0.00026 mM/min 0.00052 mM/min

0.010 mM

0.0006 mM/min

0.012 mM

0.0008 mM

0.014 mM

0.00093 mM/min

0.017 mM

0.0011 mM /min

0.019 mM

0.0012 mM /min

Gráfico 1. Michaelis - Menten (Velocidad de reacción vs [PNF P]) sin inhibidor

El tiempo de reacción para todas las muestras fue de 15 minutos, los valores de Sustrato y velocidad se presentan en los cálculos, medido a 37ºC.

14

A continuación la gráfica mostrara el comportamiento de la reacción del sustrato facilitada por catálisis enzimática. Tubo

1/Concentración de sustrato [µM]

1/Velocidad de reacción [µmoles/min]

1 2 3 4 5 6 7

250.0 128.2 100.0 83.333 71.428 58.82 52.63

3.846 1.923 1.666 1.250 1.075 909.0 833.33

Tabla 4. I nversos de la concentración de sustrato y velocidad de reacción. E cuación de Lineweaver _ Burk (1 / V y 1 / [PNF P] sin inhibidor

Resultado de los inversos de la concentración de sustrato y velocidad de reacción del para-nitrofenil fosfato en presencia la enzima fosfatasa alcalina. 5.2. RESULTADOS SUSTRATO CON INHIBIDOR Como en las muestras anteriores se mostrara , los resultados obtenidos en la practica ,Donde en igual manera veremos los efectos de pH, temperatura , La concentración del sustrato y el inhibidor sobre su velocidad de reacción. Muestra Reactante Tampón TRIS 20 mM (pH óptimo 4.0) Sustrato(PNFP 2m M) Producto(PNF 1m M) Inhibidor fosfato Agua destilada Extracto enzimático

Estándar 1

Volumen de reactantes(ml) 2 3 4 5 6

7

8

1.0

1.0 1.0

1.0 1.0 1.0

1.0

1.0

1.0

-----

0.2 0.4

0.6

1.2

1.6

2.0

0.3

----- ----- ----- ----- ----- ----

----- ------

----2.7 ------

0.2 0.2 2,6 2,4 0.1 0.1

0.2 1,2 0.1

0.8 1.0

0.2 0.2 0.2 2,2 2,0 1,8 0.1 0.1 0.1 15

0.2 1,6 0.1

0.2 2,6 0.1

Tabla 5. Distribución de volúmenes para la medición de la velocidad de reacción enzimática En la tabla se muestran la distribución de los volúmenes de solución tampón, sustrato, producto, inhibidor fosfato, agua destilada y extracto enzimático que se usaron para analizar los efectos de la presencia de un inhibidor en la respuesta enzimática. Las absorbancias fueron medidas por la espectrofotometría de muestras con diferente concentración de sustrato (PNFP), teniendo en cuenta que se inició con el mismo pH y misma temperatura (37ºC).

N. Tubo Estándar 1 2 3 4 5 6 7 8

D.O 2.041 0.115 0.165 0.227 0.270 0.403 0.405 0.436 0.724

Tabla 6. Absorbancia, concentración de producto del PNF a diferentes concentraciones en presencia de la enzima fosfatasa alcalina.

Con las formulas aprendidas de Michaelis-Menten: Velocidad (µmoles/min) vs Sustrato (µmoles) Se dispone a sacar la velocidad y sustrato de cada tubo.

Tubo 1 2 3 4 5

Sustrato

Velocidad

0.0016mM 0.002 mM

0.00010 mM /min 0.00013 mM /min

0.003 Mm

0.0002 mM/min

0.0039 mM

0.00026 mM /min

0.00592 mM

0.000394 mM /min 16

6 7 8

0.00595 mM

0.000396 mM / min

0.0064 mM 0.0106 mM

0.00042 mM /min 0.00070 mM /min

Gráfico 7. Michaelis - Menten (Velocidad de reacción vs [PNF P]) con inhibidor

El tiempo de reacción para todas las muestras fue de 15 minutos, los valores de Sustrato y velocidad se presentan en los cálculos, medido a 37ºC. A continuación la gráfica mostrara el comportamiento de la reacción del sustrato facilitada por catálisis enzimática. . Tubo

1/Concentración de sustrato

1/Velocidad de reacción

[µM]

[µmoles/min]

1

625.0

10.000

2

500.0

7.692

3

333.333

5.000

4

256.41

3.846

5

168.91

2.538

6

168.06

2.525

7

156.25

2.380

8

94.339

1.428

Tabla 8. I nversos de la concentración de sustrato y velocidad de reacción. E cuación de Lineweaver _ Burk (1 / V y 1 / [PNF P] con inhibidor

17

Resultados de los inversos de concentración del sustrato y velocidad de reacción del para-nitrofenil fosfato en presencia de la enzima alcalina.

5.3 Graficas Velocidad de la reacción y concentración de sustrato sin inhibición. Sustrato 0.7 0.64 0.6

0.5

0.48

0.4

0.4 Sustrato 0.32

0.3

Poly. (Sustrato)

0.24 0.2 0.16 0.1

0.08

0 0

0.0001

0.0002

0.0003

0.0004

18

0.0005

Velocidad de la reacción y concentración de sustrato Con inhibición Sustrato 0.9 0.8

0.8

0.7 0.64 0.6 0.5

0.48 Sustrato

0.4

0.4

Poly. (Sustrato)

0.32

0.3 0.24 0.2 0.16 0.1

0.08

0

.

0

0.0001

0.0002

0.0003

0.0004

0.0005

0.0006

0.0007

0.0008

Se observa en la gráfica con la sustancia sin inhibidor alcanza menos velocidad de reacción que la que contiene el inhibidor.

19

12000.000

10000.000

8000.000

6000.000

4000.000

2000.000

0.000 0.000

2.000

4.000

6.000

8.000

10.000

12.000

14.000

No competitivo Se puede identificar en la gráfica N, el comportamiento entre la reacción con inhibidor y sin inhibidor, al ser este un inhibidor no competitivo provoca una disminución de lavelocidad máxima sin modificar la constante de Km. Un inhibidor no competitivo puede unirse tanto a la enzima libre como a la enzima ligada al sustrato, en ambos casos con la misma afinidad, sin embargo, inhibidor y sustrato no entran en competencia por unirse sobre un mismo sitio, el sustrato se liga al sitio activo y el inhibidor a otro sitio. El inhibidor modifica la conformación del sitio activo obstaculizando la transformación del sustrato en producto, pero no afecta el reconocimiento entre enzima y sustrato (aquí hay alostería).

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6. Análisis Mediante las observaciones y experimentos realizados en el laboratorio se pudo analizar la influencia que tiene el pH, la temperatura, concentración de sustrato y la presencia de un inhibidor en el comportamiento de una enzima como lo es la fosfatasa alcalina de hígado de res. El pH es un factor importante en el momento de realizarse la actividad enzimática, es por esto que debe ser ideal para evitar la desnaturalización de la enzima, ya que por su conformación sus grupos ionizables pueden protonarse o desprotonarse según el pH al que sean sometidos. La velocidad de la enzima se hace máxima, cuando hay una mayor afinidad entre la enzima y el sustrato y para ello es necesario el pH ideal u óptimo. Este análisis se hace evidente en la tabla (Ver tabla #7 en los anexos), en esta observamos que a medida que el pH va aumentando la absorbancia del producto va disminuyendo. La temperatura puede afectar la reacción enzimática de la misma manera que lo hace el pH, así mismo esta debe de ser óptima para que la enzima conserve su estructura funcional y alcance su velocidad máxima, es por ello que durante todo el experimento la incubación de los tubos fue a 37°C, ya que a esta temperatura la absorbancia de del producto (PNFP), es menor cuando es sometido a dicha temperatura, ver tabla (Ver tabla #10 en los anexos). Cuando las enzimas se someten a bajas temperaturas no poseen la energía suficiente para realizar su función enzimática o si por el contrario son sometidas a altas temperaturas puede causar su desnaturalización. La efectividad de la enzima también puede verse afectada o favorecida por la concentración de sustrato, ya que este determina la cantidad de sitios activos que serán ocupados y así determina la velocidad de la enzima. La influencia que tiene este factor en la velocidad de la enzima; donde es posible apreciar que a medida que el sustrato aumenta, la velocidad de la reacción también, y

21

cuando la reacción presenta más baja concentración de sustrato (PNFP), la velocidad de reacción es mínima. Sin embargo, esta velocidad se ve afectada por la presencia del inhibidor en la reacción, ya que este provoca una menor afinidad de la enzima con el sustrato (PNFP). En el Gráfico Michaelis - Menten (Velocidad de reacción vs [PNFP]) sin inhibidor ; se muestra el comportamiento de la reacción del sustrato facilitada por catálisis enzimática. En este se puede evidenciar que la reacción es mucho más eficiente ya que no existe algún factor que interrumpa la afinidad existente entre el sustrato y la enzima.

22

7. Conclusiones CONCLUSIONES

Al terminar el análisis correspondiente sobre la cinética enzimática y los resultados adquiridos, podemos concluir que:

-Al aumentar la concentración de sustrato la enzima se satura, por lo que la velocidad de la reacción se vuelve constante y por más sustrato que se le agregue esta no varía, ya que los centros activos de la enzima se encuentran ocupados.

- Si a una reacción enzimática se le proporciona calor (energía) a temperaturas muy altas, la enzima se desnaturaliza ya que su estructura es proteínica; y la actividad enzimática finaliza al agregar NaOH.

- Podemos evidenciar cuando hay inhibición en una reacción enzimática, al observar la disminución de la eficiencia de la enzima, es decir, la disminución de la actividad enzimática.

- Durante la práctica de laboratorio se pudo determinar que la velocidad de una reacción enzimática varía cuando se realizan alteraciones en diferentes condiciones físicas, como lo son exactamente el pH, la temperatura y la concentración.

23

7.1 Anexos Ph

Abs 37°C

3

2.202

4

1.984

5

1.723

6

1.648

7

1.527

8

1.363

9

0.786

10

0,780

12

1.577

STD

1.845

Tabla 10. Datos de pH y temperatura

7.2 Cálculos Cálculos Grupo sin inhibidor Concentración del producto y la velocidad

Estándar V1xc1=v2xc2 V1= 0.3 ml C1= 0.5 mM V2= 5 ml

c2=?

C2= V1XC1/V2= 0.3 ml x 0.5 mM / 5 ml = 0.03mM

Tubo 1 Ae/ Ce = Ap/Cp No se conoce el valor de Cp así que se despeja: Cp= Ce x Ap/Ae

Cp= 0.03 mM x 0.241/ 1.805= 0.0040 mM 24

Velocidad = [] /  Velocidad = 0.0040 mM / 15 min = 0.00026 mM/min Tubo 2 Cp= Ce x Ap/Ae Cp= 0.03 mM x 0.471/1.805= 0.0078mM Velocidad= [] /  Velocidad= 0.0078 mM/ 15 min = 0.00052 mM/min Tubo 3 Cp= Ce x Ap/Ae Cp= 0.03 mM x 0.615/1.805= 0.010 mM Velocidad= [] /  Velocidad= 0.010 mM / 15 min= 0.0006 mM/min Tubo 4 Cp= Ce x Ap/Ae Cp= 0.03 mM x 0.780 / 1.805 = 0.012 mM Velocidad= [] /  Velocidad= 0.012 mM/ 15 min = 0.0008 mM

Tubo 5 Cp= Ce x Ap/Ae Cp= 0.03 mM x 0.876 / 1.805 = 0.014 mM Velocidad= [] /  Velocidad= 0.014 mM/15 min= 0.00093 mM/min

Tubo 6 Cp= Ce x Ap/Ae Cp= 0.03 mM x 1.043/ 1.805 = 0.017 Mm Velocidad= [] /  Velocidad= 0.017 mM/ 15 min = 0.0011 mM /min

Tubo 7 Cp= Ce x Ap/Ae 25

Cp= 0.03 mM x 1.173 / 1.805 = 0.019 mM Velocidad= [] /  Velocidad= 0.019 mM / 15 min = 0.0012 mM /min

Grupo con inhibidor

Estándar V1xc1=v2xc2 V1= 0.3 ml C1= 0.5 mM V2= 5 ml

c2=?

C2= V1XC1/V2= 0.3 ml x 0.5 mM / 5 ml = 0.03mM

Tubo 1 Ae/ Ce = Ap/Cp No se conoce el valor de Cp así que se despeja: Cp= Ce x Ap/Ae

Cp= 0.03 mM x 0.115/ 2.041= 0.0016 mM Velocidad = [] /  Velocidad = 0.0016 mM / 15 min= 0.00010 mM /min Tubo 2 Cp= Ce x Ap/Ae Cp= 0.03 mM x 0.165 / 2.041= 0.002 mM

Velocidad = [] /  Velocidad= 0.002 mM / 15 min= 0.00013 mM /min

Tubo 3 Cp= Ce x Ap/Ae Cp = 0.03 mM x 0.227 / 2.041= 0.003 mM

Velocidad = [] /  Velocidad= 0.003 mM / 15 min = 0.0002 mM/min

26

Tubo 4 Cp= Ce x Ap/Ae Cp= 0.03 mM x 0.270 / 2.041 = 0.0039 mM

Velocidad = [] /  Velocidad= 0.0039 mM / 15 min = 0.00026 mM /min

Tubo 5 Cp= Ce x Ap/Ae Cp= 0.003 mM x 0.403 / 2.041 = 0.00592 mM

Velocidad = [] /  Velocidad= 0.00592 mM / 15 min = 0.000394 mM /min

Tubo 6 Cp= Ce x Ap/Ae Cp= 0.03 mM x 0.405 / 2.041= 0.00595 mM Velocidad = [] /  Velocidad= 0.00595 mM / 15 min = 0.000396 mM / min Tubo 7 Cp= Ce x Ap/Ae Cp= 0.03 mM x 0.436 / 2.041 = 0.0064 mM Velocidad = [] /  Velocidad= 0.0064 mM / 15 min = 0.00042 mM /min Tubo 8 Cp= Ce x Ap/Ae Cp= 0.03 mM x 0.724 / 2.041 = 0.0106 mM Velocidad = [] /  Velocidad= 0.0106 mM / 15 min = 0.00070 mM /min

27

Grupo sin inhibidor Concentración sustrato Se aplica la formula V1.C1=V2.C2 conociendo los valores de V1, C1 Y V2 se despeja la fórmula para encontrar la otra concentración así: C2= V1.C1/V2

Tubo 1 C2= 0.2 ml x 2 mM / 5 ml C2= 0.08 mM

Tubo 2 C2 = 0.4 ml x 2 mM / 5ml C2= 0.16 mM

Tubo 3 C2= 0.6 ml x 2 mM / 5ml C2= 0.24 mM


Tubo 5 C2= 1 ml x 2 mM / 5 ml C2= 0.4 mM



28

Grupo con inhibidor


Tubo 2 C2 = 0.4 ml x 2 mM / 5ml C2= 0.16 mM







29

7.3 FICHAS DE SEGURIDAD

TA R J E TA D E E ME R G E N C IA

NOMBRE DE L PR ODUCTO E xtracto enzimático de hígado de res. Sinónimos: Peptona de hígado- Hidrolizado enzimático de hígado de bovino. Laboratorio de Cinética de enzimas

I nformación fabri cante: ME RCK S.A Bogotá Calle 10 N° 65-28 AA: 98-96 Tel: +57 1 4254770 Teléfono de emergencia  

Cem: 123 UdeA: 2198412- 2630370

Pictogramas de riesgo ESTABI LIDAD Y RE ACTIVI DAD Estable bajo condiciones normales de temperatura y presión. Evitar contacto con agentes oxidantes fuertes.

PELI GRO / RI E SGO Producto higroscópico, sus partículas a pesar de ser inertes pueden afectar el tracto respiratorio si son inhaladas. Se debe mantener protegido de la humedad, cerrado y a una temperatura de 15°C y 35°C. Puede formar gases y vapores.

PROTE CCI ÓN PE RSONAL Protección general: Ropa adecuada que sirva como barrera. Protección manos: Guantes de nitrilo. Protección ocular: Gafas de seguridad contra químicos. Protección respiratoria: Solo necesario tapabocas o máscara de seguridad en presencia de polvo.

Ficha de seguridad

30

PRI ME ROS AUXI LI OS Contacto piel: Quitar ropa contaminada. Lavar con abundante agua. Contacto ojos: Aclarar con abundante agua. I ngestión: Beber abundante agua. En caso de malestar, consultar al médico. I nhalación: Trasladar al aire fresco. ME DI DA S PARA VE RTI DO ACCI DE NTAL Evitar el contacto con la sustancia, evitar la formación de polvo, no inhalar, recoger en seco y proceder a la eliminación de residuos.

EXTINCI ÓN DE I NCENDIOS No permanecer en la zona de peligro sin sistemas de respiración artificiales independientes del ambiente, adoptar a los materiales en el contorno.

DI SPOSICI ÓN DE RE SIDUOS Los productos químicos deben ser eliminados de acuerdo a normativas nacionales vigentes. Los residuos deben considerarse como especiales, los envases no contaminados deben ser tratados como reciclables y los envases contaminados deben ser tratados como el mismo producto.

B I B L I OG RA F A Microquin SRL- PEPTONA DE HÍGADO[internet]. microquin.com.ar [cited 20 th March 2017]. Available from: https://microquin.com.ar/peptonadehigado.html

31

TARJETA DE EME RGENCIA NOMBRE DE L PR ODUCTO TR I S (H idroximetil-aminometano). Sinónimos: Trometamol-Trometano-Trometamina. (C 4H 11NO 3 ) I nformación fabri cante: ME RCK S.A Laboratorio de Cinética de enzimas

Bogotá Calle 10 N° 65-28 AA: 98-96 Tel: +57 1 4254770

Pictogramas de riesgo

Teléfono de emergencia

 

Cem: 123 UdeA: 2198412- 2630370

ESTABI LI DAD Y REACTIVI DAD Estable bajo condiciones normales de temperatura y presión. Evitar contacto con agentes oxidantes fuertes, bases, nitrilos y nitratos. Evitar calentamiento.

PELI GRO / RI E SGO No es una sustancia peligrosa de acuerdo al reglamento. Puede provocar: vómitos, náuseas, convulsiones, diarrea

PROTE CCI ÓN PE RSONAL Protección general: Ropa adecuada que sirva como barrera. Protección manos: Guantes de nitrilo. Protección ocular: Gafas de seguridad contra químicos. Protección respiratoria: Solo necesario tapabocas o máscara de seguridad en presencia de polvo. PRI ME ROS AUXI LI OS Contacto piel: Quitar ropa contaminada. Lavar con abundante agua. Contacto ojos: Aclarar con abundante agua. I ngestión: Beber abundante agua. En caso de malestar, consultar al médico. I nhalación: Trasladar al aire fresco. ME DI DAS PAR A VE RTI DO ACCI DE NTAL Evitar el contacto con la sustancia, evitar la formación de polvo, no inhalar, recoger en seco y proceder 32

a la eliminación de residuos. No arrojar los residuos por el desagüe y cubrir alcantarillado.

EXTINCI ÓN DE I NCENDIOS No permanecer en la zona de peligro sin sistemas de respiración artificiales independientes del ambiente, adoptar a los materiales en el contorno. Extinguir con agua, dióxido de carbono, espuma o polvo seco.


B I B L I OG RA F A MERCK. Ficha de datos seguridad Tris (hidroximetil) [internet]. www.merck-performancematerials.com [cited 19th March 2017]. Available from: www.merck-performance-materials.com/merck ppd/tris-hidroximetil-aminometano

TARJE TA DE E MERGENCIA NOMB RE DE L PRODUCTO P-nitrofenil fosfato (PNF P). Sinónimos: 4-Ni trofenil F osfato-Sal sódica. Laboratorio de Cinética de enzimas

I nformación fabricante: ME RCK S.A Bogotá Calle 10 N° 65-28 AA: 98-96 Tel: +57 1 4254770



 

33

Cem: 123 UdeA: 2198412- 2630370

ESTABI LI DAD Y REACTIVI DAD Estable bajo condiciones normales de temperatura y presión.

PELI GRO / RI E SGO No es una sustancia peligrosa de acuerdo al reglamento.

PROTE CCI ÓN PE RSONAL Protección general: Ropa adecuada que sirva como barrera. Protección manos: Guantes de nitrilo. Protección ocular: Gafas de seguridad contra químicos. Protección respiratoria: Solo necesario tapabocas o máscara de seguridad en presencia de polvo. PRI ME ROS AUXI LI OS Contacto piel: Quitar ropa contaminada. Lavar con abundante agua. Contacto ojos: Aclarar con abundante agua. I ngestión: Beber abundante agua. En caso de malestar, consultar al médico. I nhalación: Trasladar al aire fresco. ME DI DAS PAR A VE RTI DO ACCI DE NTAL Evitar el contacto con la sustancia, evitar la formación de polvo, no inhalar, recoger en seco y proceder a la eliminación de residuos. No arrojar los residuos por el desagüe y cubrir alcantarillado.



B I B L I OG RA F A Pan Reck. Ficha de seguridad [internet]2006. [cited 219th March 2017]. Available from: https://www.applichem.com/fileadmin/detenblaetter/41442_es_Esi.pdf

34

TARJE TA DE E MERGENCIA NOMBRE DE L PR ODUCTO Solución acuosa de F osfato (K 2HPO4 ). Sinónimos: Fosfato de potasio bibásico Anhídri do. Laboratorio de Cinética de enzimas

I nformación fabri cante: ME RCK S.A Bogotá Calle 10 N° 65-28 AA: 98-96 Tel: +57 1 4254770



 

Cem: 123 UdeA: 2198412- 2630370

ESTABI LIDAD Y RE ACTIVI DAD Debido a la presencia de fósforo puede favorecer la eutrofia en las zonas de vertido. Producto incombustible.

PELI GRO / RI E SGO Producto de baja toxicidad. Puede provocar: vómitos, náuseas, convulsiones, dolor de estómago, irritación de ojos, diarrea.

PROTE CCI ÓN PE RSONAL Protección general: Ropa adecuada que sirva como barrera. Protección manos: Guantes de nitrilo. Protección ocular: Gafas de seguridad contra químicos. Protección respiratoria: Solo necesario tapabocas o máscara de seguridad en presencia de polvo. PRI ME ROS AUXI LI OS Contacto piel: Quitar ropa contaminada. Lavar con abundante agua. Contacto ojos: Aclarar con abundante agua. I ngestión: Beber abundante agua. No inducir vómito. En caso de malestar, consultar al médico. I nhalación: Trasladar al aire fresco. ME DI DA S PARA VE RTI DO ACCI DE NTAL Evitar el contacto con la sustancia, evitar la formación de polvo, no inhalar, recoger en seco y proceder a la eliminación de residuos. No arrojar los residuos por el desagüe y cubrir alcantarillado. 35



BIBLIOGRAFÌA. Ficha de seguridad Solución acuosa de fosfato [internet] Nuevo León-México CTR; [cited 19th March 2017]. Available from: https://www.ctr.com.mx/pdfcent/fosfato%20de%20potasio%20dibasico%20anhidro.pdf

36

TARJE TA DE E MERGENCIA NOMBRE DE L PRODUCTO Hidróxido de Sodio (NaOH). Sinónimos: Soda cáustica-Hidrato de sodio-Cáustico blanco. Laboratorio de Cinética de enzimas




 

Cem: 123 UdeA: 2198412- 2630370

ESTABI LIDAD Y RE ACTIVI DAD Es corrosivo en ambientes húmedos y para algunos metales. Puede formarse hidrógeno.

PELI GRO / RI E SGO Sustancia muy tóxica. Puede provocar: vómitos, náuseas, convulsiones, dolor de estómago, perforación de esófago, diarrea, quemadura de boca y garganta, quemadura de las mucosas, tos, insuficiencia respiratoria.

PROTE CCI ÓN PE RSONAL Protección general: Ropa adecuada que sirva como barrera. Protección manos: Guantes de nitrilo. Protección ocular: Gafas de seguridad contra químicos. Protección respiratoria: Solo necesario tapabocas o máscara de seguridad en presencia de polvo. PRI ME ROS AUXI LI OS Contacto piel: Quitar ropa contaminada. Lavar con abundante agua. Contacto ojos: Aclarar con abundante agua. I ngestión: Beber abundante agua. Inducir vómito. En caso de malestar, consultar al médico. I nhalación: Trasladar al aire fresco. ME DI DA S PARA VE RTI DO ACCI DE NTAL Evitar el contacto con la sustancia, evitar la formación de polvo, no inhalar, recoger en seco y proceder a la eliminación de residuos. No arrojar los residuos por el desagüe y cubrir alcantarillado. 37



BIBLIOGRAFÌA MERCK. Ficha de datos seguridad Hidróxido de sodio [internet]. www.merck-performancematerials.com [cited 19th March 2017]. Available from: www.merck-performance-materials.com/merck ppd/hidroxido-de-sodio

38

TARJE TA DE E MERGENCIA NOMBRE DE L PRODUCTO Hidróxido de Sodio (NaOH). Sinónimos: Soda cáustica-Hidrato de sodio-Cáustico blanco. Laboratorio de Cinética de enzimas




 

Cem: 123 UdeA: 2198412- 2630370

ESTABI LIDAD Y RE ACTIVI DAD Es corrosivo en ambientes húmedos y para algunos metales. Puede formarse hidrógeno.

PELI GRO / RI E SGO Sustancia muy tóxica. Puede provocar: vómitos, náuseas, convulsiones, dolor de estómago, perforación de esófago, diarrea, quemadura de boca y garganta, quemadura de las mucosas, tos, insuficiencia respiratoria.

PROTE CCI ÓN PE RSONAL Protección general: Ropa adecuada que sirva como barrera. Protección manos: Guantes de nitrilo. Protección ocular: Gafas de seguridad contra químicos. Protección respiratoria: Solo necesario tapabocas o máscara de seguridad en presencia de polvo. PRI ME ROS AUXI LI OS Contacto piel: Quitar ropa contaminada. Lavar con abundante agua. Contacto ojos: Aclarar con abundante agua. I ngestión: Beber abundante agua. Inducir vómito. En caso de malestar, consultar al médico. I nhalación: Trasladar al aire fresco. ME DI DA S PARA VE RTI DO ACCI DE NTAL Evitar el contacto con la sustancia, evitar la formación de polvo, no inhalar, recoger en seco y proceder a la eliminación de residuos. No arrojar los residuos por el desagüe y cubrir alcantarillado. 39



BIBLIOGRAFÌA MERCK. Ficha de datos seguridad Hidróxido de sodio [internet]. www.merck-performancematerials.com [cited 19th March 2017]. Available from: www.merck-performance-materials.com/merck ppd/hidroxido-de-sodio

8 bibliografia MedlinePlus. Enzima. [En línea]. Disponible en: http://www.nlm.nih.gov/medlineplus/spanish/ency/article/002353.htm .[Citado el 16 de Septiembre de 2014].

• Universidad de Córdoba. Caracterización cinética de la fosfatasa

alcalina. [En línea]. Disponible en: http://www.uco.es/dptos/bioquimicabiolmol/pdfs/30%20FOSFATASA%20ALCALINA.pdf . [Citado El 16 de Septiembre de 2014].

40

• Coenzima.com. Las coenzimas. [En línea]. Disponible en: http://www.coenzima.com/ . [Citado

el 16 de Septiembre de 2014].

• Universidad del País Vasco. Enzimas. [En línea]. Disponible en:

http://www.ehu.es/biomoleculas/enzimas/enz1.htm [Citado el 16 de Septiembre de 2014].

• Universidad del País Vasco. Cinética enzimática. [En línea]. Disponible en:

http://www.ehu.es/biomoleculas/enzimas/enz3.htm. [Citado el 16 de Septiembre de 2014].

• Isidro Sobrino. Baño maría especial de 50 litros. [En línea]. Disponible en:

http://www.isidrosobrino.com/productos/producto.asp?cat=52. [Citado el 16 de Septiembre de 2014].

• Icoformas. Nevera pequeña. [En línea]. Disponible en: http://www.icoformas.com/npeque.html

. [Citado el 16 de Septiembre de 2014].

• Química. Hoja de seguridad II Hidróxido de sodio. [En línea]. Disponible en:

http://www.quimica.unam.mx/IMG/pdf/2hsnaoh.pdf . [Citado el 16 de Septiembre de 2014].

• Fichas internacionales de seguridad química. Nitrofenol. [En línea].

Disponible en: http://www.insht.es/InshtWeb/Contenidos/Documentacion/FichasTec nicas/FISQ/Ficheros/0a100/nspn0066.pdf . [Citado el 16 de Septiembre de 2014]. 41

Informe de laboratorio

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