Histokimia & Sitokimia Ari Pitoyo Memvisualisasikan bahan kimia dan enzim dalam jaringan. Enzim histochemistry berfungsi sebagai enghubung antara biokimia dan morfologi. !ni adalah teknik dinamis sensitif yang mencerminkan a"al ketidakseimbanganmetabolisme lesi atologis jaringan.
Histochemistry# $erdasarkan reaksi kimia antara komonen sel dan noda. Produk akhir reaksi ermanen% ber"arna resiitat yang daat dilihat di ba"ahmikrosko. Ada noda khusus untuk setia komonen sel% berdasarkan sifat dasar atau asame"arna. Prinsirinsi dasar Histochemistry Histochemistry menggabungkan metode Histologi dengan kimia atau biokimia% untukmengungkakan komosisi biokimia jaring an dan selsel luar distribusi asambasayang ditunjukkan oleh metode standar 'H( & E)% tana mengganggu distribusi normalba han kimia. Alikasi Mengidenti*kasi% mengukur% dan elokalan bahan kimia eksresi gen struktur biologis% Sell jenis sesi*k sesi*k sel Menjelaskan struktur sel dan jaringan dan morfologi. Memberikan demarkasi batasbatas fungsional. +eterbatasan metode saat ini ,idak daat daat digunakan digunakan untuk untuk real time di di vivo analisis analisis jaringan jaringan aaun 'memerlukan 'memerlukanengha enghausan usan dan membunuh membunuh jaringan). jaringan). -ntuk melihat erubahan dalam jaringan dari "aktu ke "aktu% masing masing titik"aktu memerlukan samel jaringan baru dari tanaman baru. aringan ersiaan ersiaan dan dan histokimia analisis analisis daat mengubah mengubah sesimen sesimen morfologi morfologi ataukimia tergantun tergantung g ada metode dan bahan yang digunakan. ,ujuan , ujuan dari Histochemist Histochemistry ry /resentasi dari 0istribusi 1ormal kimia# zat yang dianalisis harus tidak menyebardari temat aslinya. 2resentasi dari komosisi kimia 1ormal# rosedur harus tidak memblokir ataumengubah sifat Hotel kimia kelomok reaktif dianalisis sesuatu di eta benda% ataumengubah kelomok biasanya bebas reaktif dalam kelomokkelomok reaktif.
3kekhususan reaksi# metode harus sangat sesi*k untuk substansi atau kimiakelomok dianalisis% untuk menghindari hasil osit if alsu. 4detectability roduk reaksi# roduk reaksi harus ber"arna atau enyebaran elektron%sehingga daat divisualisasikan mudah d engan cahaya atau mikrosko elektron. 5insolubility roduk reaksi# roduk reaksi harus larut% sehingga teta dekat dengansubstansi itu tanda. Seorang enderal histologis noda gratis bagian tangan ,$6 ',oluidin oluidine e biru 6 noda) noda) ,$6 memiliki memiliki keuntungan keuntungan menjadi menjadi e"arna e"arna olychromatic olychromatic ini bereaksi dengan komonen kimia yang berbeda sel berbeda dan menghasilkansesimen multi"arna. 7arna"arna yang dihasilkan daat memberikan informasi tentang sifat sel dandinding.
,$6 adalah adalah e"arna e"arna kationik yang yang mengikat mengikat negatif diisi diisi kelomok. kelomok. Suatu larutan e"arna ini biru% tai "arna yang berbeda yang dihasilkan ketikae"arna mengikat dengan kelomok anionik ya ng berbeda dalam sel "arna ungu kemerahan akan muncul ketika e"arna bereaksi dengan olisakaridacarbo(ylated seerti asam ectic hijau% kehijauan terang atau biru biru dengan olifenol zat seerti sebagai lignin dantanin keunguan atau kehijauan biru dengan asam nukleat PhloroglucinolH8l tes untuk lignin
9ignin adalah konstituen umum di menengah dinding sel tanaman: Misalnya% dindingembuluh kayu elemen dan sclerenchyma jaringan. Akhir cinnamaldehyde ;ombongan lignin muncul untuk bereaksi dengan H8l hloroglucinol untuk memberikan "arna merah H8/ ,$6 vs PhloroglucinolH8l -ji yodiumkalium iodida '!+!) ?odiumkalium iodida '!+!) noda sesi*k untuk Pati. dasar reaksi adalah akumulasi yodium di usat molekul heliks Pati. Panjang molekul Pati menentukan "arna reaksi semakin endek molekul% lebih merah "arna semakin lama molekul% lebih biru "arna.
8A996SE Aniline $lue metode ,emat tisu segar dalam larutan @.@@5> aniline biru di 5@> alkohol selama 424 jam.$ilas bagian dalam air dan gunung. 8allos e harus noda biru. ;esorcin biru 'lacmoid)%atau katun biru daat digunakan di temat aniline biru. SE9-96SA !+! H2S64 metode ,ematkan bagian segar dalam !+! solusi '9ihat / di atas) selama /5 menit atau lebih.Bunung bagian di !+! di ba"ah enutu sli% tambahkan setetes C5> H2S64 di sisicover sli% dan memungkinkan untuk menyebar di ba"ah enutu sli. 0inding yang mengandung selulosa akan berubah biru gela: lignin akan noda jerukkuning. Seerti H2S64 bereaksi ada dinding% dinding akan s"el
,anaman kromosom enanganan Ari Pitoyo Sitogenetik Studi nomor kromosom% struktur% fungsi dan erilaku berkaitan dengan "arisan gen%organisasi dan eksresi +romosom enanganan Prinsirinsi dasar untuk menangani kromosom mitosis dan meiotic dari semuajenis tumbuhan sama dan te rdiri dari koleksi sesimen% *ksasi% dan noda. 1amun% sitologikal rosedur yang dimodi*kasi tergantung ada jenis tanaman% tujuanercobaan% dan% di atas semua% referensi ribadi cytologists '0arlington dan 9a 8our%/DCD: Sharma dan Sharma% /DC5). +romosom enanganan +oleksi Siklus sel 8ell8ycles 8ell8ycles 8eat mulai +oleksi akar -mumnya% akar yang dikumulkan di laboratorium setelah germinating bibit dalamca"an Petri. Mengumulkan akar tis yang / samai 2 cm anjang. ,ransfer akar ke ca"an berisi air dingin setelah mencuci tanah dari akar. Pretreatment akar Pretreatment akar adalah langkah enting untuk studi somatik kromosom. !tumelakukan beberaa tujuan# berhenti embentukan gelondongan% meningkatkan jumlah selsel metahase dengan menangka kromosom metahaseiring%
kontrak anjang kromosom dengan konstriksi berbeda% dan meningkatkan viskositassitolasma. Pretreatment agen Air dingin =Hydro(yuinoline 8olchicine F$romonahthalene Paradichlorobenzene ) 8arnoys solusi 2 asam asetat glacial $agian / 3 bagian kloroform C bagian etanol 'D5/@@>) Asam roionat alkohol solusi asam roionat / $agian 3 bagian etanol 'D5/@@>) / gI/@@ m9 *ksatif 'untuk bahan meiotic) atau feri klorida Pe"arnaan kromosom +ualitas yang baik e"arnaan agen noda khusus kromosom% membedakaneuchromatin dan heterochromatin% dan memberikan jelas sitolasma dengan bernodanucleoli 'tetai tidak dengan noda # / g carmine bubuk 'menggunakan banyak carmine diserti*kasi oleh +omisi nodabiologis asam asetat glacial 45 m9 55 m9 ddH26 air Pe"arnaan kromosom Persiaan noda Panas mendidih /@@ m9 asam asetat 45> di ba"ah ka asa. ,ambahkan bubuk carmine menjadi asam asetat 45> mendidih. 0idihkan selama 5/@ menit% dengan aduk sesekali% samai "arna menjadi merahgela. +eren dan *lter ke dalam botol ber"arna% dan toko di kulkas. Pe"arnaan kromosom Pe"arnaan akar Acetocarmine noda telah efektif untuk somatik kromosom jelai. Akar ditransferlangsung ke noda setelah ret reatment. 9ain e"arnaan Pe"arnaan ) 9actoroionat6rcein orcein 2 g 5@ m9 asam laktat
5@ m9 asam roionat elai kromosom
$A10!1B +;6M6S6M B banding J banding 8 banding ; banding , banding A,A- $anding ;esolusi tinggi $anding Pembatasan endonuklease $anding Jbanding Mengeringkan slide oleh mencelukan dalam alkohol dengan enurunan konsentrasiD@>% K@> dan 5@> satu menit masingmasing. $ilas dengan air suling. 8uci slide dalam buLer fosfat ada H C.=. 1oda slide dalam uinacrine mustard '5 mg dalam /@@ mil) atau di uinacrinedihydrochloride 5> untuk 2@ m enit. $ilas di buLer fosfat dan mount di buLer sama. Periksa di ba"ah mikrosko neon. 8banding /. memerlakukan slide dalam @.2 1 H8! untuk satu jam ada suhu kamar. 2. bilas dengan air. 3. membenamkan dalam /> barium hidroksida ada 5@ 8 selama 5/5 menit. 4. bilas dengan air terionisasi.. 5. diinkubasi di C@ 8 di 2NSS8 buLer selama satu jam. C. bilas dengan air dan noda di 4> Biemsa noda untuk D@ min. K. bilas dengan air% kering dan memeriksa di ba"ah minyak enceluan. ;banding /. usia slide untuk K/@ hari. 2. ,ematkan slide dalam 8olinjar yang mengandung ofH buLer fosfat C%5 di =5 8dan diinkubasi selama 2@25 menit. 3. noda slide di @%@/> acridine oranye fosfat enyangga H C%5 untuk 4C menit bilasdi buLer fosfat dan gun ung di buLer sama. 4. Periksa di ba"ah mikrosko neon. ,banding /. usia slide selama K hari. 2. Place.the slide di P$S H 5.@ 2@C@ menit di =K 8. 3. bilas di P$S. 4. noda dalam 3> Biemsa H buLer fosfat C.= ada =K 8% berangkat 53@ menit danbilas. 5. slide yang di"arnai di Hoechst 3325= noda untuk /@ min 'Hoechst noda @%5 gIm/buLer fosfat). $ilas di bu Ler fosfat dan memeriksa di neon mikrosko. C. Selain itu% slide bernoda ditutui dengan enutu sli dan ditematkan di dalamsebuah bilik basah di ba"ah lamu -O untuk 2 samai 3 jam atau di ba"ah sinarmatahari untuk 2 jam. K. Haus cover sli dan noda di Biemsa noda untuk /@ menit. =. bilas di buLer% kering dan mount di 0PN. B banding -ntuk noda metahase kromosom dengan Biemsa untuk menimbulkan olamenyatukan seluruh lengan krom osom% ditunjuk Bband. ,eknik B $anding inimembutuhkan langkah retreatment kromosom trisin untuk menginduksikromosom band.
Bbanding adalah teknik yang digunakan dalam Sitogenetik untuk memroduksikariotie terlihat oleh e"arn aan kental kromosom. Metahase kromosomdierlakukan dengan trisin 'untuk sebagian mencerna rotein) dan di"arnai denganBiemsa. $and gela yang mengambil noda yang kuat% , yang kaya.
!+A1 metodologi 1omor 7"".nhgri.nih.gov.I0!;IO!P 'artis 0arryl 9eja) Sistem internasional untuk 8ytogenetic tatanama% '!S81% /DD5) 9engan endek kromosom Panjang lengan kromosom $and diberi nomor secara indeenden ada lengan endek dan anjang 8entromeres /@% /@ $and nomor meningkatkan sebagai indah dari centromere ke telomer
+aryotying +ariotie ,amilan bergambar metahase kromosom dari sel mitosis +romosomasangan homolog +ariotie +aryotying adalah analisis kromosom Sitogenetik adalah studi tentang kromosom dan "arisan Sitogenetik didasarkan ada studi tentang manusia serta 0rosohila dan organismelainnya
MENGENAL IMUNOHISTOKIMIA
!munohistokimia meruakan suatu cara emeriksaan untuk mengukur derajat imunitas atau kadar antibodi atau antigen dalam sediaan jaringan. 1ama imunohistokimia diambil dari nama immuneyang menunjukkan bah"a rinsi dasar dalam roses ini ialah enggunaan antibodi dan histomenunjukkan jaringan secara mikroskois. 0engan kata lain% imunohistokimia adalah metode untuk mendeteksi keberadaan antigen sesi*k di dalam sel suatu jaringan dengan menggunakan rinsi engikatan antara antibodi 'Ab) dan antigen 'Ag) ada jaringan hidu. Pemeriksaan ini membutuhkan jaringan dengan jumlah dan ketebalan yang bervariasi tergantung dari tujuan emeriksaan. ,eknik imunohistokimia bermanfaat untuk identi*kasi% lokalisasi% dan karakterisasi suatu antigen tertentu% serta menentukan diagnosis% therai% dan rognosis kanker. ,eknik ini dia"ali dengan embuatan irisan jaringan 'histologi) untuk diamati diba"ah mikrosko. !nteraksi antara antigenantibodi adalah reaksi yang tidak kasa mata. ,emat engikatan antara antibodi dengan rotein sesi*k diidenti*kasi dengan marker yang biasanya dilekatkan ada antibodi dan bisa divisualisasi secara langsung atau dengan reaksi untuk mengidenti*kasi marker. Marker daat berua senya"a ber"arna # 9uminescence% zat berQuoresensi # fluorescein% umbelliferon% tetrametil rodhamin% logam berat # colloidal% microshere% gold% silver% label radioaktif% dan enzim # Horse ;adish Pero(idase 'H;P) dan alkaline hoshatase. Enzim 'yang diakai untuk melabel) selanjutnya direaksikan dengan substrat kromogen 'yaitu substrat yang menghasilkan roduk akhir ber"arna dan tidak larut) yang daat diamati dengan mikrosko bright feld 'mikrosko bidang terang). Akan tetai seiring berkembangnya ilmu engetahuan khususnya dunia biologi% teknik imunohistokimia daat langsung diamati 'tana direaksikan lagi dengan kromogen yang menghasilkan "arna) diba"ah mikroskouorescense. 9angkahlangkah dalam melakukan imunohistokimia dibagi menjadi 2% yaitu rearasi samel dan labeling. Prearasi samel adalah ersiaan untuk membentuk rearat jaringan dari jaringan yang masih segar. Prearasi samle terdiri dari engambilan jaringan yang masih segar% *ksasi jaringan biasanya menggunakan formaldehid% embedding jaringan dengan ara*n atau dibekukan ada nitrogen cair% emotongan jaringan dengan menggunakan mikrotom% deara*nisasi dan antigen retrieval untuk membebaskan eito jaringan% dan bloking dari rotein tidak sesi*k lain. Samel labeling adalah emberian bahanbahan untuk daat me"arnai rearat. Samel labeling terdiri dari imunodeteksi menggunakan antibodi rimer dan sekunder% emberian substrat% dan counterstaining untuk me"arnai jaringan lain di sekitarnya. Antibodi adalah suatu imunoglobulin yang dihasilkan oleh sistem imun dalam
mereson kehadiran suatu antigen tertentu. Antibodi dibentuk berdasarkan antigen yang menginduksinya. $eberaa antibodi yang telah teridenti*kasi adalah !gA% !g0% !gE% !gB% dan !gM.Antigen adalah suatu zat atau substansi yang daat merangsang sistem imun dan daat bereaksi secara sesi*k dengan antibodi membentuk komleks terkonjugasi. !katan antibodi antigen divisualisasikan menggunakan senya"a labelImarker. ,erdaat dua metode dasar identi*kasi antigen dalam jaringan dengan imunohistokimia% yaitu metode langsung 'direct method) dan tidak langsung 'indirect method). Metode langsung 'direct method) meruakan metode engecatan satu langkah karena hanya melibatkan satu jenis antibodi% yaitu antibodi yang terlabel% contohnya antiserum terkonjugasi uorescein isothiocyanate '
• • • • •
• •
