LAPORAN PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI UMUM ACARA III PERHITUNGAN MIKROBA
KELOMPOK 3 1. Agung Budi Prakoso
(H0915003)
2. Atiqa Ulfa
(H0915013)
3. Heni Widyastutik
(H0915032)
4. Jasmine Margrita J.
(H0915036)
5. Leonardo Kevin K.
(H0915044)
6. Naila Zulfa
(H0915055)
ILMU DAN TEKNOLOGI PANGAN FAKULTAS PERTANIAN UNIVERSITAS SEBELAS MARET SURAKARTA 2016
ACARA III PERHITUNGAN MIKROBA
A. Tujuan Praktikum
Tujuan dari praktikum acara III Perhitungan Mikrobia ini adalah : 1. Mahasiswa dapat mengetahui cara menghitung dan menghitung jumlah yeast secara secara langsung la ngsung menggunakan haemocitometer . 2. Mahasiswa dapat mengetahui cara menghitung dan menghitung jumlah bakteri secara tidak langsung (agar (agar plate method ). ).
B. Tinjauan Pustaka
Semua mikroorganisme memerlukan kondisi lingkungan tertentu untuk
pertumbuhan
dan
perkembangbiakannya.
Laju
perbanyakan
mikroorganisme seperti khamir bervariasi menurut spesies dan kondisi pertumbuhannya.Pertumbuhan mikroorganisme tidak berlangsung dengan laju tetap untuk setiap interval waktunya. Terdapat empat fase pertumbuhan mikroorganisme. Pada fase lag terjadi sedikit kenaikan ukuran sel, bukan untuk peningkatan jumlah sel. Selanjutnya sel memperbanyak diri secara cepat untuk beberapa jam atau bahkan beberapa hari, tergantung pada organisme dan kondisi lingkungannya, disebut fase log. Fase pertumbuhan stasioner, jumlah sel yang dihasilkan seimbang dengan jumlah sel yang mati. Akhirnya
laju
pertumbuhan
menurun,
biasanya
disebabkan
karena
kekurangan faktor pertumbuhan seperti vitamin dan unsur mineral.Koloni memasuki
fase
penurunan,
yang
juga
bersifat
logaritmik
(Gaman dan Sherrington, 1992). Yeast merupakan merupakan jamur eukariotik bersel tunggal. Yeast dalam dalam 3 jenis, yaitu Ascomycetes, Basidiomycetes, dan Deuteromycetes. Ascomycetes ada dua jenis, yaitu yeast budding (Saccharomyces ( Saccharomyces cereviseae) cereviseae) dan yeast fisi (Schizosaccharomyces pombe). pombe). Biasanya ditemukan di alam seperti di permukaan daun, jus buah, sirup palm, susu, tanah, ta nah, permukaan binatang, dan
jalur pencernaan hewan berdarah panas, dimana mereka hidup bersimbiosis dan parasit (Ghosh, 2011). Sel yeast Saccharomyces cereviseae biasanya digunakan dalam penelitian utnuk meningkatkan produksi bioetanol dari gula. Yaest tidak memerlukan cahaya matahari untuk untk hidup, tetapi menggunakan gula sebagi sumber energi (Slaa et al ., 2009). Perhitungan jumlah mikrobia pada sampel dapat diketahui dengan metode: mikroskopi atau counting plate (biasanya dengan metode pour plate dan spread plate), metode tidak langsung misalnya turbidimetri, teknik dasar DNA, flow cytometry, hibridisasi fluoresensi in situ dengan tujuan kecepatan, lebih mahal dan kultur bebas (Alatossava et al ., 2007). Metode yang dilakukan untuk menghitung bakteri ada 5, yaitu jumlah sel total ( total cell count ), perhitungan sel-sel hidup (agar plate method ) , penyaringan dengan membran (membrane filtration), teknik MPN (most probable number )dan teknik-teknik perhitungan selektif( selective counting techniques). 1. Jumlah Sel Total (total cell count ) Jumlah seluruh sel dalam larutan contoh dapat dihitung cepat dan langsung dengan menghitung jumlah sel yang terlihat di bawah mikroskop.Ada dua prosedur, yaitu prosedur yang paling sederhana ialah menghitung secara mikroskopis masing-masing sel di dalam suspensi contoh dengan volume yang sangat sedikit dan telah diukur dengan teliti. Perhitungan ini dilakukan dengan menggunakan kaca slide khusus yang dikenal sebagai kotak penghitung (chamber slide). Kaca slide ini terdiri dari kotak-kotak kecil dengan ukuran tertentu dan luas tertentu dan dibentuk sedemikian rupa sehingga suatu larutan tipis yang diketahui tebalnya dapat di1etakkan diantara kaca slide ini dengan gelas penutupnya. Dengan demikian voIume cairan yang berada di tiap-tiap kotak dapat diketahui secara pasti. Oleh karena volume ini diketahui dan jumlah sel dalam tiap-tiap kotak dapat terlihat dan dihitung, maka jumlah sel/ml larutan asal dapat diketahui; cara lain untuk menghitung jumlah sel total secara mikroskopis adalah dengan menggunakan lapisan suspensi contoh yang telah diwarnai. Kekurangan atau kejelekan dari perhitungan sel total
dengan mikroskop adalah sel-sel yang mati tidak dapat dibedakan dengan sel-sel hidup, 2) Sel-sel ukuran kecil sangat sulit untuk dilihat dan mungkin terlompati dalam menghitung sehingga memberi perhitungan di bawah jumlah yang sebenarnya, 3) Kurang peka karena suspensi contoh harus paling sedikit mengandung 10 6 sel/ml sebelum setiap sel dapat diihat dalam satu ruang pandang mikroskop yang berarti bahwa larutan yang berM kurang dari 10 6 sel/ml tidak dapat dihitung. 4) Ketepatan yang tinggi sukar diperoleh. 5) Pemeriksaan mikroskopis yang terus menerus menjemukan. 6) Suspensi contoh harus bebas dari zat-zat partikulat lain karena hal ini dapat menutupi sel pada saat dihitung. 2. Perhitungan Sel-Sel Hidup (agar plate method ) Secara sederhana suatu contoh suspensi sel atau bahan pangan homogenat diinokulasikan ke dalam atau ke atas media nutrien agar dan setelah diinkubasi, jumlah koloni yang terbentuk dihitung.Karena satu koloni menunjukkan satu koloni terbentuk dari satu sel maka jumlah koloni menunjukkan jumlah sel dalam larutan asalnya.Prosedur ini hanya menghitung sel-sel yang hidup dan sangat peka.Suspensi contoh yang mengandung sejumlah kecil sel hingga 20 sel/ml masih dapat dihitung. Keuntungan lain adalah kemungkinan untuk mengetahui berbagai jenis organisme yang berada dalam contoh dan perbedaan bentuk koloni yang tumbuh dan kemungkinan untuk tipe koloni yang paling dominan untuk identifikasi taksonomi. Beberapa kerugian dari perhitungan sel yang hidup adalah 1) Kemungkinan terjadinya suatu koloni lebih dari satu sel seperti pada organisme yang berbentuk pasangan rantai atau kelompok-kelompok sel. Hal tersebut dapat memperkecil perhitungan jumlah sel sebenarnya, 2) Kemungkinan adanya berbagai tipe sel dalam contoh yang tidak mau tumbuh dalam media agar yang digunakan atau yang berada dalam pH, tekanan, oksigen dari inkubasi yang dilakukan, 3) Koloni dari beberapa mikroorganisme terutama dari contoh bahan pangan kadang-kadang menyebar dipermukaan media agar, sehingga menutup pertumbuhan dan perhitungan jenis mikroorganisme lainnya, 4) Suspensi sel, termasuk
bahan pangan homogenat perlu pengenceran secara aseptik, sehingga jumlah koloni yang terbentuk dalam satu cawan petri adalah diantara 30 dan 300. Jumlah koloni kurang dari 30 menghasilkan hitungan yang kurang teliti secara statistik, sedang jumlah koloni lebih dari 300 akan memenuhi cawan, 5) Hasil yang diperoleh harus menunggu selesainya inkubasi yang biasanya membutuhkan waktu 24 jam atau lebih. 3. Penyaringan dengan membran (membrane filtration) Dibandingkan dengan cawan petri, penyaringan dengan membran (membrane filtration) merupakan teknik menghitung organisme yang paling baru. Dalam metode ini, larutan contoh yang akan diuji disaring dengan menggunakan membran steril atau filter yang mempunyai pori pori cukup kecil, sehingga mikroorganisme dalam suspense dapat tertinggal pada membran. Membran dengan ukuran lubang 0,45 seringkali digunakan untuk menghitung bakteri dan khamir. Setelah penyaringan, membran yang berisi sel-sel mikroorganisme yang tertinggal pada permukaan dipindahkan secara aseptis dan diletakkan ke dalam suatu cawan steril berisi kertas saring yang dijenuhkan dengan media nutrient cair dengan bagian yang ada selnya menghadap ke atas.Cawan beserta kertas penyaring kemudian diinkubasi dan diperiksa terhadap pertumbuhan koloni dipermukaan kertas saring. Cara lain, membran dapat pula dipindahkan pada permukaan media nutrien dalam cawan petri. Teknik ini sangat peka sekali dengan jumlah contoh 100 ml atau lebih dapat dipergunakan, walau hanya 5 sel dalam contoh dapat diketahui sebagai koloni pada membran. Oleh karena itu metode ini memungkinkan untuk mengetahui sel-sel yang walaupun hanya terdapat 5 sel hidup dalam 100 ml sampel, dimana hal ini tidak dimungkinkan pada prosedur penumbuhan pada agar. Pekerjaan dari teknik penyaringan dengan lapisan tipis ini tidak terlalu banyak dan cukup cepat.Walaupun demikian, suatu modal yang cukup besar dibutuhkan untuk membeli peralatan-peralatan yang cukup untuk pekerjaan rutin dan masing-masing harus disterilkan sebelum dipakai. Keterbatasan yang paling mengganggu dari teknik ini adalah
membran-membran ini mudah tersumbat oleh beberapa zat tertentu seperti homogenat bahan pangan, sehingga penggunaan teknik ini pun terbatas hanya pada contoh-contoh
berbentuk cairan yang jernih seperti air,
minuman berkarbon dan beralkohol. 4. Teknik MPN (most probable number ) Dalam bidang kesehatan masyarakat dan mikrobiologi pangan, prosedur ini dipergunakan secara luas untuk menghitung jumlah bakteri yang ada dalam bahan pangan.Metode ini berdasarkan pada pengenceran. Apabila
suatu
larutan
yang
mengandung
sel-sel
mikroorganìsme
diencerkan terus-menerus, akhirnya akan diperoleh suatu larutan dimana tidak dijumpai sel lagi yaitu dikatakan steril. Hubungan antara pengenceran dan kemungkinan pertumbuhan sel telah diuji secara statisti k. Asumsi dari teknik ini adalah : 1 ) Sel akan tersebar secara acak dalam contoh dan gaya pengelompokan, penarikan, dan gaya tolak-menolak diantara sel tidak terjadi, 2) Setiap bagian kecil (aliquot ) dari suatu larutan akan menunjukkan pertumbuhan apabila diinokulasikan dalam nutrient broth, bila aliquot tersebut berisi 1atau lebih sel-se1 hidup. 3) Terhindar dari pencemaran bahan dan alat-alat. Keuntungan dari metode ini adalah: 1) Dapat dibuat sangat peka dengan penggunaan volume inokulum contoh yang lebih besar dan 1,0 ml/tabung. 2) Bahan-bahan dapat dipersiapkan untuk tugas lapangan 3) Media pertumbuhan selektif dapat digunakan untuk menghitung jenis mikroorganisme yang diharapkan diantara jenis jenis lainnya yang ada dalam bahan pangan tersebut. Kerugiannya adalah dibutuhkan banyak ulangan untuk diperoleh hasil yang teliti dan sehubungan dengan hal tersebut banyak biaya dan waktu yang dibutuhkan untuk persiapannya.Perlu ditekankan disini bahwa metode ini banyak digunakan untuk menghitung bakteri patogenik dalam jumlah sedikit yang terdapat dalam bahan pangan. 5. Teknik-Teknik Perhitungan Selektif (selective counting techniques) Dalam kerusakan bahan pangan atau kesehatan masyarakat dari mikrobiologi pangan seringkali diperlukan untuk menghitung suatu jenis
mikroorganisme tertentu seperti jenis mikroorganisme pembusuk yang sudah dikenal atau jenis patogen tenentu seperti Salmonella. Dalam praktik, apabila akan menguji makanan olahan untuk organisme tertentu menggunakan media selektif, perlu dilakukan pemupukan pendahuluan untuk waktu singkat bagi contoh bahan pangan tersebut dengan menumbuhkannya ke dalam suatu nutrient broth yang tidak selektif dan diinkubasi sebentar. Selanjutnya contoh tersebut diinokulasikan ke dalam atau pada media selektif tertentu (Buckle, 1987). Menurut Hadioetomo (1990), pada metode hitungan mikroskpis langsung, sampel ditaruh di suatu ruang hitung (seperti hemasitometer) dan jumlah sel dapat ditentukan secara langsung dengan bantuan mikroskop. Keuntungan metode ini ialah pelaksanaannya cepat dan tidak memerlukan banyak peralatan. Namun kelemahannya ialah tidak membedakan sel – sel yang hidup dan yang mati, dengan perkataan lain hasil yang diperoleh ialah jumlah total sel yang ada di dalam populasi.dan kelemahan lain dari metode hitungan mikroskopis langsung adalah sulitnya menghitung sel yang berukuran sangat kecil seperti bakteri karena ketebalan hemasitometer tidak memungkinkan
digunakannya
lensa
obyektif
celup
minyak.
Pada
hemasitometer seluruhnya ada sembilan area, masing-masing berukuran 1 mm2. Kotak yang di tengah (kesemua sisinya dibatasi dengan garis ganda) juga berukuran 1 mm2 dan dibagi menjadi 25 kotak besar. Setiap kotak besar ini dibagi lagi menjadi 16 kotak kecil. Dengan demikian di dalam kotak tengah tersebut seluruhnya terdapat 400 kotak kecil (25 x 16). Metode penanaman mikroba dalam cawan petri dapat dilakukan dengan dua cara yaitu spread plate dan pour plate. Cara spread plate dilakukan dengan menuangkan secara aseptis ±12 ml medium NA ke dalam cawan petri steril dan didiamkan hingga medium memadat. Setelah memadat, secara aseptis sebanyak 1 ml starter inokulum ditambahkan pada medium NA yang telah memadat tersebut lalu disebarkan dengan menggunakan drilgasky hingga merata. Cawan Petri diinkubasi dalam inkubator pada suhu 37°C selama 24 jam dan kemudian diamati (Patangga, 2010). prinsip dari metode
kultur bakteri menggunakan nutrient agar adalah jika jasad renik yang masih hidup ditumbuhkan pada medium agar, maka sel tersebut akan berkembang biak dan membentuk koloni yang dapat dilihat langsung dan dapat dihitung dengan mata tanpa menggunakan mikroskop (Purwa, 2012).
C. Metodologi 1. Alat
a.
Mikroskop
b. Haemocytometer c.
Gelas penutup
d.
Pipet
e. Petridish f.
Tabung reaksi
g.
Pipet volume
h.
Erlenmeyer
i.
Bunsen
j.
Rak tabung reaksi
k.
Inkubator
l.
Propipet
2. Bahan a. Aquades b. Es teh c. Jus buah naga d. Larutan pengencer steril e. Medium nutrient agar f.
Suspensi Saccharomyces cereviseae
3. Cara Kerja a. Perhitungan Jumlah Bakteri Secara Langsung Yeast
Pengenceran hingga pengenceran 10 -2 Pengambilan dengan pipet Pemasukan pada haemacitometer yang sudah dibersihkan dengan alkohol Pemasukan suspensi pada tepi kaca tutup haemacytometer tepat pada petak-petaknya Penutupan dengan kaca penutup yang telah dibersihkan dengan alkohol
Peletakan haemacytometer pada meja mikroskop
Pengmatan dengan perbesaran lemah untuk menemukan petak - petaknya Pengamatan diawali dengan bagian kiri atas Penghitungan jumlah sel dalam setiap petak kecil, jika berada pada batas atas atau kiri dihitung namun batas bawah dan kanan tidak dihitung Perhitungan pada petak kanan atas, kanan bawah, kiri atas, kiri bawah, tengah dan dirata-rata Penghitungan jumlah sel yeast tiap ml bahan
Gambar 3.1 Diagram Alir Metode Perhitungan Mikrobia Secara Langsung
b. Perhitungan Jumlah Bakteri secara Tidak Langsung Es teh, Jus Buah Na a
Pemberian tanda pada bagian belakang masingmasing petridish sesuai dengan tingkat pengenceran 10-4 , 10-5
Pemipetan 1 ml untuk masing-masing sampel dengan pengenceran 10 -1, dimasukkan kedalam 9 ml aquades steril (pengenceran 10-2) dan digojok hingga homogen Penginokulasian secara aseptik 1 ml pengenceran 10 2 dalam 9 ml aquades steril (Pengenceran 10 -3) dan digojok hingga homogen Penginokulasian secara aseptik 1 ml pengenceran 10 3 dalam 9 ml aquades steril (pengenceran 10 -4) dan digojok hingga homogen.
Pengulangan hal yang sama sampai pengenceran 10 -5 didalam tabung reaksi
Pengambilan 1 ml pada masing – masing pengenceran (10-4 , 10-5). Dan dimasukkan ke dalam petridish, kemudian diberi media agar pada pengenceran 10 -4 , 10-5
Penginkubasian selama 24 jam dan kemudian dihitung jumlah mikrobanya
Gambar 3.2 Diagram Alir Metode Perhitungan Mikrobia Secara Tidak Langsung
D. Pembahasan Tabel 3.1 Perhitungan Jumlah Yeast Secara Langsung No. Kelompok Jumlah sel/ml 1 1 4,75 x 104 2 2 4,90 x 104 3 3 5,30 x 104 4 4 4,65 x 104 5 5 5,55 x 104 6 6 5,20 x 104 7 7 4,40 x 104 8 8 4,50 x 104 9 9 5,35 x 104 Sumber: Laporan Sementara
Tabel 3.2 Hasil Pengamatan dan Perhitungan Mikrobia Beberapa Sampel Pengenceran 10-4 10-5
No
Kelompok
Sampel Uji
1
1 dan 5 2
Teh
4
2
3 4
Jus buah naga
62
3
6 7
Teh
1
4
8 9
Jus buah naga
186
5
10 dan 14 11
Teh
4
6
12 13
Jus buah naga
TNTC
7
15 16
Teh
10
17 Jus buah naga 18 Sumber : Laporan Sementara 8
193
84 54
Jumlah mikroba 8,4 x 106 6,2 x 105
264
2,64 x 107
83
1,86 x 106
21 48 8 TNTC
4 x 104 4,8 x 106 1 x 105 1,93 x 106
Keterangan Diambil 30300 >2 (pengenceran treendah) Diambil 30300 >2 (pengenceran treendah) <30 (pengenceran terendah) Diambil 30300 <30 (pengenceran terendah) Diambil 30300
Terdapat berbagai metode dalam mengukur pertumbuhan sel bakteri. Perhitungan sel bakteri terdiri atas 2 cara, yaitu perhitungan langsung dan tidak langsung. Perhitungan langsung terdiri dari metode turbidimetri, metode toal count, dan metode kering. Prinsip dasar metode turbidimetri adalah jika cahaya mengenai sel, maka sebagian cahaya diserap proporsional
(berbanding lurus) dengan jumlah sel bakteri. Atau jumlah cahaya yang diteruskan berbanding terbalik dengan jumlah jumlah sel bakteri. Semakin banyak jumlah sel, semakin sedikit cahaya yang diteruskan. Metode tersebut mempunyai kelemahan yaitu tidak dapat membedakan antara sel mati dan sel hidup. Metode Total Count memerlukan mikroskop dan wadah yang diketahui volumenya. Jika setetes kultur dimasukkan ke dalanm wadah (misalnya hemasitometer) yang telah diketahui volumenya, maka jumlah sel dapat dihitung. Akan tetapi cara ersebut memiliki keterbatasan, yaitu tidak dapat membedakan sel hidup dan mati dan tidak dapat digunakan pada jumlah sel yang sangat sedikit (kurang dari 106 sel/ml). Metode berta kering merupakan cara yang paling cepat mengukur jumlah sel karena metode tersebut relatif mudah dilakukan, yaitu kultur disaring atau disentrifugasi dikeringkan. Pada metode itu juga tidak dapat membedakan sel yang hidup dan mati. Sedangkan perhitungan tidak langsung mengunakan metode viable count. Metode viable count sering disebut dengan metode total plate count . Kultur diencerkan sampai batas yang diinginkan. Kultur encer ditumbuhkan kembali pada media , sehingga diharapkan setiap sel tumbuh menjadi 1 koloni beberapa saat berikutnya, biasanya 4-12 jam. Akan tetapi, cara ini memiliki keterbatasan yaitu jumlah sel terhitung biasanya lebih kecil dari sebenarnya (kemungkian besar 1 koloni dapat berasal lebih dari 2 sel) dan tidak dapat diaplikasikan pada bakteri yang tumbuh lambat (Purwoko, 2007). Metode yang dapat digunakan untuk menghitung jumlah mikroba di dalam bahan pangan terdiri dari metode langsung, tidak langsung, dan metode turbidimetri. Metode langsung dilakukan dengan menghitung jumlah yang terlihat di bawah mikroskop. Ada dua prosedur yaitu pertama, menghitung secara mikroskopis masing-masing sel di dalam suspensi contoh dengan volume yang sangat sedikit dan telah diukur dengan teliti. Perhitungan ini dilakukan dengan menggunakan kaca slide khusus yang dikenal sebagai kotak penghitung (counting chamber ). Kedua, menggunakan lapisan suspensi contoh yang telah diwarnai. Metode tidak langsung dilakukan dengan menggunakan prosedur perhitunagn dengan penumbuhan
dalam agar. Secara sederhana suatu contoh suspensi sel atau bahan pangan homogenat diinokulasi ke dalam atau ke atas media nutrien agar dan setelah diinkubasi , jumlah koloni ynag terbentuk dihitung. Karena satu koloni menunjukkan jumlah sel dalam larutan asalnya. Perhitungan secara penumbuhan dalam cawan petri dapat dilakukan dengan menggunakan tiga metoda, yaitu metode penuangan, penyebaran, dan penetesan dalam cawan (Buckle, 1985). Dalam penghitungan mikroba juga dapat menggunakan metode lain, misalnya dengan prosedur penyaringan dengan membran (membrane filtration).
Penyaringan
membran
merupakan
teknik
menghitung
mikrrorganisme yang paling baru. Dalam metode ini larutan contoh yang kana diuji disaring dengan menggunakan membran steril atau filter yang mempunyai pori-pori berukuran cukup kecil, sehingga mikroorganisme dalam suspensi dapat tertinggal pada membran. Membran dengan ukuran lubang 0,45 µ akan lewat melalui membran. Setelah penyaringan, membran yang berisi sel-sel mikroorganisme yang tertinggal pada permukaan, dipindahkan secara aseptis dan diletakkan ke dalam suatu cawan steril berisi kertas sarig yang dijenuhkan dengan media nutrien cair dengan bagian yang ada selnya menghadap ke atas. Cawan beserta kertas penyaring kemudian diinkubasi dan diperiksa terhadap pertumbuhan koloni di permukaan kertas saring. Selain dengan metode penyaringan, juga dapat menggunakan teknik MPN (most propable number ). Metode ini berdasarkan pada pengenceran. Apabila suatu larutan yang mengandung sel-sel mikroorganisme diencerkan terus-menerus, akhirnya akan diperoleh suatu larutan dimana tidak dijumpai sel lagi yang dikatakan steril (Buckle, 1985). Analisis mikrobiologis dilakukan dengan cara menghitung koloni bakteri yang tumbuh pada media kultur, yang bertujuan untuk mengetahui jumlah mikroba selama penyimpanan. Perhitungan jumlah bakteri dilakukan dengan metode Total Plate Count (metode hitung cawan) secara duplo. Prinsip dari metode ini adalah jika jasad renik yang masih hidup ditumbuhkan pada medium agar, maka sel tersebut akan berkembang baik
dan membentuk koloni yang dapat diluhat langsung dan dihitung dengan mata tanpa menggunakan mikroskop. Untuk mengkultur bakteri digunakan nutrien agar (NA). Jumlah koloni dapat dihitung dengan rumus sebagai berikut: Koloni per ml/gram = jumlah koloni per cawan x 1 Faktor Pengenceran (Purwa dkk, 2012). Pada percobaan perhitungan mikroba, hemasitometer adalah alat yang digunakan untuk menghitung mikroba secara langsung dengan bantuan mikroskop cahaya. Mikroskop cahaya digunakan untuk membantu melihat yeast yang ada pada kotak perhitungan. Terdapat lima kotak perhitungan yang ada pada hemasitometer yaitu pada sisi kanan atas, kiri atas, kanan bawah, kiri bawah dan tengah. Kaca slide (hemasitometer) yang terdiri dari kotak-kotak kecil dengan ukuran tertentu dan luas tertentu dan dibentuk sedemikian rupa sehingga suatu larutan tipis yang diketahui tebalnya dapat diletakkan di antara kaca slide ini dengan gelas penutupnya. Dengan demikian volume cairan yang berada di tiap-tiap kotak dapat diketahui secara pasti. Oleh karena volume ini diketahui dan jumlah sel dalam tiap-tiap kotak dapat terlihat dan dihitung, maka jumlah sel/ml larutan asal dapat diketahui (Buckle et al., 1987). Keuntungan metode ini ialah pelaksanaannya cepat dan tidak memerlukan banyak peralatan. Namun kelemahannya ialah tidak membedakan sel – sel yang hidup dan yang mati, dengan perkataan lain hasil yang diperoleh ialah jumlah total sel yang ada di dalam polulasi (Hadioetomo, 1990). Menggunakan hemasitometer terdapat kelemahan dan kelebihannya. Menurut Hadioetomo (1990), pada metode hitungan mikroskpis langsung, sampel ditaruh di suatu ruang hitung (seperti hemasitometer) dan jumlah sel dapat ditentukan secara langsung dengan bantuan mikroskop. Keuntungan metode ini ialah pelaksanaannya cepat dan tidak memerlukan banyak peralatan. Namun kelemahannya ialah tidak membedakan sel – sel yang hidup dan yang mati, dengan perkataan lain hasil yang diperoleh ialah jumlah total sel yang ada di dalam polulasi.
Pada tabel 3.1 merupakan tabel perhitungan jumlah yeast secara langsung. Dengan hasil berturut-turut dari kelompok 1 sampai 9 berturutturut sebagai berikut 4,75 x 104; 4,90 x 104; 5,30 x 104; 4,65 x 104; 5,55 x 104; 5,20 x 104; 4,40 x 104; 4,50 x 104; dan 5,35 x 104. Jumlah sel paling banyak yaitu 5,55 x 104 sel/ml dan jumlah sel paling sedikit yaitu 4,40 x 104 sel/ml. Pada tabel
3.2 merupakan tabel hasil pengamatan dan perhitungan mikrobia beberapa sampel. Sampel yang digunakan dalam uji ini yaitu teh dan jus buah naga. Jumlah mikroba pada sampel teh yaitu 8,4 x 10 6; 2,64 x 10 7; 4 x 10 4; dan 1 x 105. Sedangkan pada sampel jus buah naga jumlah mikroba sebanyak 6,2 x 105; 1,86 x 10 6; 4,8 x 106; dan 1,93 x 10 6. Yeast merupakan salah satu fungi bersel tunggal (uniseluler), dengan bentuk spheroid sampai ovoid dan kadang membentuk miselium semu ( pseudomicellium). Sebagian besar yeast melakukan reproduksi secara aseksual melalui pembentukkan tunas (budding ). Sebagai sel tunggal yeast dapat tumbuh lebih cepat dibandingkan dengan kapang ( mould ) yang tumbuh dengan pembentukan filamen. Disamping itu yeast lebih efektif dalam memecah komponen bahan kimia dengan volume hasil yang lebih banyak (Satife et al ., 2009). Menurut Buckle (1987) khamir (ragi) adalah mikroorganisme bersel tunggal dengan ukuran antara 5 dan 20 mikron. Biasnya berukuran 5 sampai 10 kali lebih besar dari bakteri. Kapang berlawanan dengan bakteri dan khamir, seringkali dapat dilihat dengan mata. Berbeda dengan bakteri dan khamir, kapang adalah multiseluler, terdiri dari banyak sel yang bergabung menjadi satu. Kapang tumbuh dengan cara memperpanjang hifa pada ujungnya, dikenal sebagai pertumbuhan apikal. Berbeda dengan kapang, khamir ( yeast ) mengalami bertumbuhan dengan cara bertunas (budding ). Pembelahan sel khamir terjadi secara aseksual dengan pembentukan tunas (budding ) suatu proses yang merupakan sifat khas dari khamir. Mulamula timbul suatu gelembung kecil dari permukaan sel induk. Gelembung ini secara bertahap membesar dan setelah mencapai ukuran yang sama dengan induknya terjadi pengerutan yang melepaskan tunas dari induknya. Sel yang
baru terbentuk selanjutnya akan memasuki tahap pertunasan kembali. Bagi kebanyakan
khamir
seperti
Saccharomyces
cerivisae,
tunas
dapat
berkembang dari setiap bagian permukaan sel induk (pertunasan multipolar), tetapi bagi beberapa spesies hanya pada bagian tertentu saja (Buckle, 1987). Menurut
Widiastuti
(1984)
Untuk
pertumbuhannya,
yeast
memerlukan energi dari karbon. Gula adalah substrat yang lebih “disukai”, oleh karenanya konsentrasi gula sangat mempengaruhi kualitas alkohol yang dihasilkan. Untuk yeast , pH optimal untuk pertumbuhannya ialah berkisar antara 4-4,5. Pada pH 3 atau lebih rendah lagi, maka fermentasi alkohol akan berjalan dengan lambat. Kandungan gas karbondioksida sebesar 15 gram/l (kira-kira 7,2 atm) akan menyebabkan terhentinya pertumbuhan yeast . Dengan mengetahui jumlah mikroba dalam bahan pangan akan dapat diketahui keamanan produk tersebut yang ada kaitanya dengan jumlah mikroba maksimal yang ada pada suatu produk juga berguna untuk menentukan banyaknya mikroba probiotik yang mana memiliki pengaruh menguntungkan bagi kesehatan dan kehidupan inang (Feliatra, 2004). Juga dapat digunakan untuk uji koeksistensi. Metode perhitungan populasi sel dilakukan dengan asumsi bahwa penurunan populasi salah satu isolat bakteri merupakan indikasi adanya penghambatan pertumbuhan akibat aktivitas isolat bakteri lainnya berupa eksekresi zat antimikroba (Patangga dkk, 2010). Bahan pangan yang diperkirakan mengandung lebih dari 300 sel mikroba per ml, per g, atau per cm permukaan, memerlukan perlakuan pengenceran sebelum ditumbuhkan pada medium agar di dalam cawan petri, sehingga setelah inkubasi akan terbentuk koloni pada cawan tersebut dalam jumlah yang dapat dihitung, dimana jumlah yang terbaik adalah di antara 30 dan 300. Pengenceran biasanya dilakukan secara desimal yaitu 1:10, 1:100, 1:1000 dan setreusnya, atau 1:100, 1:10000, 1:1000000 dan seterusnya. Pemgambilan contoh dilakukan secara aseptik dan pada setiap pengenceran dilakukan pengocokan kira-kira sebanyak 25 kali untui memusahkan sel-sel mikroba yang bergabung menjadi satu. Pengenceran secara desimal memudahkan dalam perhitungan jumlah koloni, sedangkan pengenceran yang
bukan secara desimal, misalnya 1:5, 1:25,dan seterusnya. Jarang dilakukan karen atidak praktis dalam perhitungannya. Untuk mengetahui jumlah mikroba pada permukaan luar bahan pangan, misalnya daging sapi, ayam, atau ikan, pengambilan contoh dapat dilakukan menggunakan metode usap (swab) (Fradiaz, 1993). Metode pengenceran digunakanuntuk menentukan jumlah mikroba yang hidup saja (Muchtadi dan Laksmi, 1980). Untuk melaporkan suatu hasil analisis mikrobiologi digunakan suatu standar yang disebut Standard Plate Count (SPC) yang menjelaskan mengenai cara menghtung koloni pada cawan serta acra memilih data yang daa untuk emnghitng jumlah koloni di dalam suatu contoh. Cara menghitung koloni pada cawan adalah cawan yang dipilih dan dihitung adalahyang mengandung jumlah kolni antara 30-300, beberapa koloni yang bergabung menjadi satu merupakan suatu kumpulan koloni yang besar dimana jumlah koloninya diragukan, dapat dihitung sebagai satu koloni, suatu deretan (rantai) koloni yang trerlihat sebagai suatu garis tebal dihitung sebgai satu koloni (Fardiaz, 1993). Prinsip metode hitungan cawan yaitu jika sel mikroba yang masih hidup ditumbuhkan pada medium agar, maka sel mikroba tersebut akan berkembang biak dan membentuk koloni yang dapat dilihat langsung degan mata tanpa menggnakan mikroskop. Keuntungan menggunakan perhitungan cawan petri yaitu hanya sel yang mash hidup yang dihitung, beberapa junis mikroba dapat dihitung sekalihus, dan dapat digunakan untuk isolasi dan identifikasi mikroba karena koloni yang terbentuk mngkin bersal dari satu sel mikroba dengan penmapakan pertumbuhan spesifik. Selain kentungankeuntukangan tersebut, metode hitungan cawan juga mempunyai keemahankelemahan yaitu hasil perhitungan tidak menunjukkan jumlah sel mikroba yang sebenarnya karena beberapa sel yang berdekatan mungkin membentuk satu koloni; medium dan kondisi yang berbeda mungkin mengasilkan nilai yang berbeda; mikroba yang ditumbuhkan harus dapat tumbuh pada medium padat dan membentuk koloni yang kompak dan jelas, tidak menyebar; dan
memerlukan persiapan dan waktu inkubasi beberapa hari sehingga pertumbuhan koloni dapat dihitung (Fardiaz, 1993). Agar adalah polisakarida dengan susunan kompleks dan terjaut kuat berasal dari ganggang laut. Agar ditambahkan pada larutan air dengan kadar 15-20 g/l. Agar baru mencairpada 100 0C, masih tetap cair jika didinginkan sampai450C. Agar hanya dipengaruhi oleh sejumlah kecil kecil bakteri. Bila diperlukan media baik padat tanpa komponen-komponen organik, maka dipakai silika gel sebagai bahan pemadat (Schlegel, 1976). Metode penanaman mikroba dalam cawan petri dapat dilakukan dengan dua cara yaitu spread plate dan pour plate. Cara spread plate dilakukan dengan menuangkan secara aseptis ±12 ml medium NA ke dalam cawan petri steril dan didiamkan hingga medium memadat. Setelah memadat, secara aseptis sebanyak 1 ml starter inokulum ditambahkan pada medium NA yang telah memadat tersebut lalu disebarkan dengan menggunakan drilgasky hingga merata. Cawan Petri diinkubasi dalam inkubator pada suhu 37°C selama 24 jam dan kemudian diamati (Patangga, 2010). prinsip dari metode kultur bakteri menggunakan nutrient agar adalah jika jasad renik yang masih hidup ditumbuhkan pada medium agar, maka sel tersebut akan berkembang biak dan membentuk koloni yang dapat dilihat langsung dan dapat dihitung dengan mata tanpa menggunakan mikroskop (Purwa, 2012). Faktor – faktor yang mempengaruhi pertumbuhan mikroorganisme yaitu air, karbon, energi, mineral, dan faktor tumbuh. Bagi organisme bersel tunggal, air amat pentig artinya karena antara lain merupakan komponen utam aprotoplasma (70-85% protoplasma terdiri dari air) serta wahana bagi nutrien ke dalam sel dan keluarnya sekresi ataupun ekskresi dari dalam sel. Di samping itu air juga diperlukan untuk berlangsungnya reaksi-reaksi enzimatik di dalam sel. Berdasarkan pada sumber karbon yang digunakannya, organisme dibagi menjadi autotrof dan heterotrof. Organisme yang dapat mensintesis semua komponen selnya dari karbondioksida disebut aututrof. Sedangkan organisme yang memerlukan satu atau lebih senyawa organik sebagai sumber karbnnya disebut heterotrof. Autotrof dan heterotrof
dikelompokkan lebih jauh berdasarkan pada sumber energinya. Autotrof yang dapat memanfaatkan energi cahaya matahari dengan bantuan pigmen fotosintetiknya disebut fotoautotrof, sedangkan yang memperoleh energi dan oksidasi senyawa-senyawa anorganik sederhana
disebut kemoautotrof.
Bakteri memerlukan sejumlah unsur logam seperti natrium, kalium, kalsium, magnesium, mangan, besi, seng, tembaga, fosfor, dan kobalt dalam jumlah yang sedikit. Faktor tumbuh yaitu komponen seluler esensial yang tidak dapat disintesis sendiri oleh suatu organisme dari sumber dasar karbon dan nitrogennya. Keasaman (pH) medium juga amat penting bagi pertumbuhan organisme, terutama kerja enzim amat dipengaruhi oleh pH. Sebagian besar bakteri tumbuh paling baik pada sekitar pH 7 (Hadioetomo, 1985). Faktor yang mempengaruhi pertumbuhan mikroorganisme yaitu waktu, makanan, kelembaban, suhu, oksigen, dan pH (Gaman, 1981).
E.
Kesimpulan
Kesimpulan yang dapat diambil dari praktikum acara III Perhitungan Mikroba ini adalah: 1. Perhitungan
jumlah
mikroba
secara
langsung
menggunakan
haemocitometer. Rata-rata jumlah mikroba dengan metode secara langsung yaitu 4,955 sel/ml. 2. Perhitungan jumlah mikroba secara tidak langsung menggunakan metode agar plate. Rata-rata jumlah mikroba dengan metode secara tidak langsung yaitu 1,3 x 10 6.
DAFTAR PUSTAKA
Alatossava, Munsch P. 2007. A Faster And More Economical Alternatif To The Standart Plate Count (SPC) Method For Microbiological Analyses Of Raw Milks. Interntional Journal of Communicating Research and Educational Topics and Trends in Applied Microbiology. Buckle, K.A., R.A. Edward, G. H. Fleet, dan M. Wooton. 1987. Ilmu Pangan. UI Press. Jakarta. Fardiaz, Srikandi. 1993. Analisis Mikrobiologi Pangan. PT RajaGrafindo Persada. Jakarta. Feliatra, Irwan Efendi, dan Edwar Suryadi. 2004. Isolasi dan Identifikasi Bakteri Probiotik dari Ikan Kerapu Macan (Ephinepheleus fuscogatus) dalam Upaya Efisiensi Pakan Ikan. Jurnal Natur Indonesia 6(2): 75-80. Gaman, P.M. dan K.B. Sherrington. 1981. Ilmu Pangan Pengantar Ilmu Pangan, Nutrisi, dan Mikrobiologi Edisi Kedua. Gadjah Mada University Press. Yogyakarta. Ghosh, Swapan kr. 2011. Study of Yeast Flora from Fruit of Syzygium cumini (linn) Skeel. Agriculture and Biology Journal of North America 2(8): 1166-1170. Hadioetomo, Ratna Siri. 1985. Mikrobiologi Dasar dalam Praktek Teknik dan Prosedur Dasar Laboratorium. PT. Gramedia. Jakarta. Muchtadi, Deddy dan Berty Laksmi. 1980. Petunjuk Praktek Mikrobiologi Hasil Pertanian 2. Departemen Pendiidikan dan Kebudayaan Direktorat Pendidikan Menengah Kejuruan. Jakarta. Patangga, P. Yoanna, Maya Shovitri dan Aunurohim. 2010. Uji Koeksistensi Dua Isolat Bakteri Resisten Merkuri dari Kali Mas Surabaya.Program Studi Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Institut Teknologi Sepuluh Nopember Surabaya. Purwa, Nunik., Junianto., dan Titin Herawati. 2012. Karakteristik Bakteri Caviar Nilem dalam Perendaman Campuran Larutan Asam Asetat dengan Larutan Garam pada Penyimpanan Larutan Garam pada Peyimpanan pada Suhu Rendah. Jurnal Perikanan dan Kelautan 3(4): 171-175. Purwoko,Tjahjadi. 2007. Fisiologi Mikroba. Bumi Aksara. Jakarta. Schlegel, Hans G. 1976. Mikrobiologi Umum Edisi Keenam. Gadjah Mada University Press. Yogyakarta. Slaa, J., Gonde M., dan Else H. 2009. Yeast and Fementation: The Optimal Temperati ure. Journal of Organo Chemistry 134.
Widiastuti, Dian dan Eska Pramesti. 1984. Proses pembuatan Anggur dari Buah Rambutan. Jurusan Tekik Kimia Fakultas Teknik Universitas Diponegoro. Semarang.
LAMPIRAN PERHITUNGAN
a) Perhitungan secara langsung
Jumlah sel/ml =
Jumlah sel/ml =
=
=
,
−
x fp
× 10− x 10− x 10−
= 5,30 x sel/ml. b) Perhitungan secara tidak langsung
Pengenceran
10−
10−
62
54
Karena kedua data berada dalam kisaran 30-300, jadi cara perhitungan mikrobanya :
ℎ
=
54 10 6,2 10
= 8,7097 > 2
Apabila perbandingan pengenceran tertinggi dengan pengenceran terendah >2, maka jumlah mikroba adalah pengenceran terendah, maka jumlah mikroba adalah : Jumlah mikroba = 62 x
= 62 x 10 = 6,2 x koloni/ml.
DOKUMENTASI ACARA III
Gambar 3.3 Pengambilan Sampel Jus Buah Naga
Gambar 3.4 Pengambilan Sampel Teh
Gambar 3.5 Sampel Jus Buah Naga yang telah diencerkan
Gambar 3.6 Pemipetan sampel ke cawan petri
Gambar 3.7 Penuangan media agar ke cawan petri
Gambar 3.8 Sampel yang akan diisolasikan (diinkubasi selama 1x24 jam)
Gambar 3.9 Sampel jus buah naga yang telah diinkubasi
Gambar 3.10 Sampel teh yang telah diinkubasi
