DETERMINACIÓN DE NITRÓGENO MÉTODO DE KJELDAHL (PRONUNCIAR KIELDAL) Muchas muestras de importancia contienen nitrógeno en distintas formas. Interviene en la constitución de las proteínas, por lo cual su determinación es importante en el análisis de muestras de origen biológico, como son los alimentos de diversos tipos. También existen compuestos de nitrógeno en suelos, fertilizantes y una gama muy variada de productos de la industria. El método más común para determinar nitrógeno es el método de Kjeldahl. Es el método estándar para determinar el contenido de proteínas en granos, carnes, cereales y otros materiales biológicos; como la mayoría de las proteínas de un origen dado tienen aproximadamente el mismo porcentaje de nitrógeno (6.25% para carnes, 6.38% para leche y derivados, 5.7% para cereales), conociendo el % de nitrógeno es sencillo calcular el % de proteína en la muestra. En el método de Kjeldahl la muestra se descompone por calentamiento en ácido sulfúrico concentrado para convertir el nitrógeno orgánico en amonio; luego la solución resultante se enfría, se diluye y se alcaliniza por adición de solución de NaOH. El amoníaco liberado se destila, recogiendo los vapores en un exceso de una solución estandarizada de HCl. Finalmente se titula el exceso de HCl con una solución estandarizada de NaOH, y por diferencia se calcula cuanto amoníaco destiló. En otra variante se recoge el destilado en un exceso desconocido de ácido bórico y luego se titula con HCl. El paso crítico en el método es la mineralización con ácido sulfúrico concentrado. Suele adicionarse sulfato de potasio para elevar la temperatura de ebullición del sulfúrico acelerando la descomposición, y a veces se adiciona un catalizador, por ejemplo un compuesto de Hg(II) como HgO; en este último caso el Hg(II) debe precipitarse como HgS antes de la destilación para evitar la retención de amoníaco como complejos aminados del Hg, muy estables. Al calentar suelen formarse masas coloreadas que acaban transformándose en productos oscuros; antes de alcalinizar la solución debe ser límpida, coloreada o no dependiendo de la muestra; el proceso puede demorar horas, y por eso se emplean aparatos que permiten el análisis simultáneo de varias muestras. Durante la digestión ácida el C e H de la muestra se desprenden como CO2 y H2O y el N de + funciones amina y amida (proteínas) se transforma en NH4 . En cambio no se transforma en amonio el N de nitratos y nitritos (ver punto siguiente) ni el de las funciones orgánicas nitro ( - NO2) y azo ( -N=N- ). Algunos compuestos heterocíclicos aromáticos del N (como piridina y derivados) son muy resistentes.
La mineralización y destilación se llevan a cabo en un matraz de cuello largo (para evitar proyecciones) llamado matraz Kjeldahl.
En la figura se muestran dos aparatos de los tantos que han sido propuestos para este análisis.
EN EL APARATO (A) la solución se adiciona en un sistema cerrado para minimizar la pérdidas de NH3, y éste es arrastrado por una corriente de vapor de agua desde el matraz a la izquierda. EN EL APARATO (B) la solución de NaOH se adiciona con cuidado por las paredes del matraz, sin mezclar, de modo de formar una capa por encima de la solución que se originó en la mineralización; sólo se agita luego de haber conectado el matraz al condensador; la trampa tiene por objetivo evitar que gotitas de solución alcalina, que pueden ser proyectadas durante la destilación, lleguen al frasco colector. En cualquier caso para evitar pérdidas de amoníaco el extremo del refrigerante debe estar sumergido en la solución ácida. Antes de titular el extremo del condensador debe enjuagarse con chorro de pipeta arrastrando los líquidos acuosos al frasco colector. La reacción que ocurre al alcalinizar y calentar la solución obtenida en la mineralización es: +
NH4
+
OH
-
NH3 + H2O
y
el NH3 es recogido en la solución ácida.
Si en el frasco colector se ha colocado Va mL de HCl de molaridad Ma, luego de la destilación tendremos una mezcla de HCl (exceso) y NH4Cl, con pH de ácido fuerte. Titulamos el exceso de HCl con NaOH de molaridad Mb, gastando Vb mL. En el pe tendremos una mezcla de NH4Cl y NaCl, cuyo pH será alrededor de 5.3; podemos usar Rojo de Metilo (rojo 4.2 - 6.2 amarillo) como indicador. Se ha destilado (VaMa - Vb Mb) mmoles de NH3.
Si en el frasco colector se ha colocado un volumen cualquiera de H3BO3 de concentración desconocida la reacción al recibir los vapores de NH3 será H3BO3 + NH3
.
NH4
+
y al titular con HCl de molaridad Ma
+ H2BO3 H2BO3
-
-
+
H
+
H3BO3
En el Erlenmeyer tendremos una solución de ácido bórico e iones amonio, de pH cercano a 5: usar Rojo de metilo. Se ha destilado VaMa mmoles de NH3. Ejemplo: se mineralizan 4.1053 g de un producto fabricado a partir de harina de trigo. Se mide con pipeta de doble aforo 25.00 mL de HCl 0.1987 M. Se destila y al titular con NaOH 0.1034 M se gastan 15.36 mL para producir el viraje del Rojo de Metilo. Calcular el % p/p de proteína en la muestra. (25.00 x 0.1987) - (15.36 x 0.1034) = 3.3793 mmol de NH3 1 mmol de NH3 ------------------ 0.01401 g de N 3.3793 mmol de NH3------------x = 0.0473 g de N 5.7 g de N ---------------100 g de proteína de cereal 0.0473 g de N ----------x = 0.8306 g de proteína (0.8306 g proteína / 4.1053 g muestra)100 = 20.23% p/p de proteína en la muestra.
Si el NH3 hubiera sido recogido en una solución de ácido bórico, al titular con HCl 0.1987 M hubiéramos gastado: --
3.3793 mmol NH3 = 3.3793 mmol de H2BO3 = Va (0.1987) Va = 17.01 mL de HCl. La ventaja de usar ácido bórico reside en que se necesita sólo una solución estandarizada; a la vez que demanda menos trabajo de titulación, se disminuyen los errores de titulación y en la medición del ácido que se coloca en el colector.
DETERMINACIÓN DE PROTEÍNAS El contenido promedio de proteínas totales en la leche es de 3,4%. En esta fracción se incluyen las caseínas, las cuales por si solas representan un 80% del contenido proteico total (2,7 %), el resto está integrado por las proteínas séricas, que incluyen la b-lactoglobulina (0,3%), la a-lactoalbúmina (0,15%), una albúmina similar a la seralbúmina de la sangre, inmunoglobulinas y una fracción de proteínas menores, entre las cuales se incluyen la lactotransferrina, la lactolina y la proteína de la membrana del glóbulo graso. Algunas de estas fracciones proteicas son heterogéneas, estando constituidas por varias proteínas muy relacionadas entre sí, pero que son separables mediante el uso de técnicas físicas como la ultracentrifugación ó químicas como el fraccionamiento con solventes y mas recientemente con técnicas mas específicas como la electroforesis, mediante la cual ha sido posible identificar muchas fracciones dentro del grupo de las caseínas, como lo son la as1 –caseína, la b-caseína y la k-caseína (Alaís, 1984). Para la determinación cuantitativa de proteínas pueden emplearse diversos métodos, los mismos pueden clasificarse en los siguientes grupos; § Métodos Químicos: fundamentados en las técnicas químicas convencionales, entre las cuales se incluyen la determinación del nitrógeno total y los métodos gravimétricos y volumétricos tradicionales. § Métodos Fotométricos: están fundamentados en la medición del color de soluciones, o de la absorbancia en determinadas regiones del espectro de absorción, aquí se incluyen las técnicas colorimétricas, las de medición en el ultravioleta o en el infrarrojo, las de fijación de colorantes y algunas técnicas turbidimétricas. § Métodos Refractométricos: están basadas en el incremento en el índice de refracción de aproximadamente 0,001 por cada gramo de proteína en 100 mL de leche, de este modo utilizando un refractómetro de inmersión o uno tipo Abbe, es posible determinar la concentración proteica. § Electroforesis: las proteínas pueden separarse por sus diferentes velocidades de migración bajo la influencia de un campo eléctrico, esto se debe al hecho de que las proteínas presentan cargas eléctricas diferentes dependiendo de la composición aminoacídica de las mismas. A nivel de plantas receptoras de leche se utilizan comúnmente las técnicas para determinación de proteínas basados en los métodos de fijación de colorantes, como lo es el equipo Pro-Milk MK II, (Foss Electric), e incluso en laboratorios grandes puede encontrarse equipos como el Milko Scan, el cual está basado en la espectrofotometría con rayos infrarrojos, el cual es capaz de captar la absorbancia del enlace peptídico de las proteínas, sin embargo, estos métodos rápidos, requieren de una cuantiosa inversión inicial y además deben ser sujetos a un proceso de calibración que requiere de los métodos químicos convencionales, por lo cual son dependientes de estos. Tomando en cuenta que los métodos químicos son los mas precisos que se conocen y que los mismos son requeridos en cualquier laboratorio lácteo, independientemente del equipamiento que este posea, la determinación de proteínas en la leche se efectuará utilizando un método químico basado en la medición del nitrógeno total, en este caso se aplicara la versión micro de la prueba de Kjeldahl, dado que la misma requiere menor cantidad de reactivos, de la misma forma se utilizará otro método químico basado en la titulación de Sorensen para la estimación directa de la concentración de caseínas en leche, la cual consigue especial utilidad para prever el rendimiento quesero a nivel de fincas o plantas procesadoras.
DETERMINACIÓN DE PROTEÍNAS EN LECHE. MÉTODO DE KJELDAHL. En ambas versiones de este método, la materia orgánica es digerida con ácido sulfúrico y el nitrógeno obtenido en forma de una sal estable (sulfato de amonio) es valorada, previa destilación en medio alcalino para descomponer la sal y convertirla en amoníaco, contra una solución ácida valorada (HCl). Determinación de nitrógeno total: Existen varios métodos fundamentados en el hecho de que las proteínas contienen, aproximadamente un 16% de nitrógeno, por lo tanto, si se determina el porcentaje total del mismo, puede establecerse según un factor de conversión apropiado (100/16 = 6,25), el porcentaje de proteínas totales presentes en la muestra, en el caso específico de la leche, este factor de conversión es de 6,38, debido a que las proteínas de la leche presentan una menor relación entre proteínas y nitrógeno total (100/15,65). Es importante resaltar el hecho de que los resultados obtenidos por estos métodos son ligeramente elevados, ya que, no todo el nitrógeno contenido en las muestras forman parte de moléculas proteicas, existiendo entonces otras no proteicas cuyo nitrógeno afecta los resultados (úrea, creatina, creatinina, adenina, guanina, ácido úrico, etc.), no obstante, la determinación química de nitrógeno constituye el fundamento mas empleado, por su precisión, para la determinación de proteínas, entre ellos encontramos los métodos de Kjeldahl (macro y micro), Nessler y el método gasométrico de Dumas.
MÉTODO KJELDAHL La materia orgánica es digerida por la acción del H2SO4 concentrado, convirtiéndose en CO2 y H2O; además reduce el nitrógeno a amonio, el cual pasa a ser fijado por el ácido como sulfato de amonio, una sal de gran estabilidad. La reducción del material nitrogenado hasta amonio, se debe a que parte del H2SO4 es simultáneamente reducido a SO2, que se comporta como un fuerte reductor. La digestión de la muestra es la parte mas difícil de la determinación, esta se acelera mediante la adición de catalizadores como el mercurio metálico, el óxido rojo de mercurio (HgO), el sulfato cúprico (CuSO4), el selenio, el permanganato de potasio (KMnO4) o una mezcla de estos. El sulfato de sodio o de potasio se adicionan a la mezcla con la finalidad de aumentar el punto de ebullición y disminuir entonces el tiempo de digestión. Cuando la totalidad de la materia orgánica ha sido digerida, se libera el amoníaco por descomposición del sulfato de amonio con un álcali fuerte (NaOH) y luego se separa por destilación y recolección en un volumen de ácido bórico, como borato de amonio.
El amonio se determina por titulación con solución valorada de HCl 0,02 N en presencia de un indicador mixto compuesto por una mezcla de rojo de metilo y azul de metileno, el cual en medio ácido se presenta de color morado y en medio alcalino de color verde.
Resumen de las reacciones químicas en el método Kjeldahl
Digestión: Materia Orgánica + H2SO4 → CO2 + H2O + SO2 + (NH4)2SO4 Destilación: (NH4) 2SO4 + NaOH → Na2SO4 + 2NH3 + 2 H2O Recolección : NH3 + H3BO3
→
NH4H2BO3
Titulación: NH4H2BO3 + HCl
→
NH4Cl + H3BO3
Se acostumbra a hacer determinaciones en blanco para corregir cualquier impureza en los reactivos. El contenido proteico de la muestra se calcula aplicando la siguiente fórmula: Luego de calculado el porcentaje de nitrógeno, es necesario calcular el porcentaje de proteínas basándose en este valor y utilizando entonces la siguiente ecuación; %N=
V * N * Pe 10 * A
%P = %N * 6.38
Donde: V = mL de HCl gastados en la titulación. N = normalidad de la solución de HCl (0,02 N). E = equivalente del nitrógeno (14). a = gramos de muestra. P = proteína total. Materiales y Aparatos Balones Micro Kjeldahl de 30 mL; Digestor eléctrico micro; Microdestilador al vapor por calentamiento eléctrico con reóstato; Microbureta automática; Perlas de vidrio; Vaselina; Balanza analítica; Equipo individual. Reactivos H2SO4 libre de nitrógeno HgO libre de nitrógeno Na2SO4 pulverizado Solución de NaOH-Na2S2O3 (60 g NaOH + 5 g Na2S2O3 * 5H O /100ml) Solución dev ácido bórico al 4%. Solución indicadora (2 partes de rojo de metilo al 0,2% + 1 parte de azul de metileno al 0,2%, ambas en solución alcohólica). HCl 0,02 N. Procedimiento 1. Medir con pipeta 0,5 mL de la muestra bien homogeneizada, Transferir a un balón de Kjeldahl para microanálisis (30 mL). Agregar 1,9 g de K 2SO4, 40 mg de HgO y 2,5 mL de H2SO4. La técnica de la A.O.A.C. recomienda no pesar mas de 100 mg de materia orgánica seca y el empleo de 2 mL de H2SO4 para 15 mg de muestra.
2. Si la misma pesa mas de 15 mg, se debe agregar 0,1 mL de H 2SO4 por cada exceso de 10 mg de muestra. Adicionar además, algunas perlas de vidrio. 3. Calentar la mezcla en el agitador hasta que el digerido adquiera un aspecto claro y limpio. Enfriar a temperatura ambiente. 4. Disolver el contenido del balón en una pequeña cantidad de agua destilada. Colocar una fina película de vaselina alrededor del borde del balón. 5. Para efectuar la destilación, colocar un vaso de precipitado o erlenmeyer de 100 mL de capacidad, conteniendo 5 mL de solución de ácido bórico al 4% y 2-4 gotas del indicador en el aparato, debajo del refrigerante de modo que la punta de este quede sumergida en el líquido. Seguidamente, transferir el digerido, ya diluido, con agua destilada, a la cámara interna de destilación, haciendo 5 o 6 lavados sucesivos con porciones de 1-2 mL de agua destilada. A continuación adicionar 8-10 mL de la solución de NaOH-Na2S2O3, lavar ligeramente el embudo con agua destilada y cerrar las llaves de vidrio del aparato. Finalmente, encender el generador de vapor y destilar hasta recoger unos 15 mL. 6. Retirar el destilado y diluirlo con agua destilada hasta 50 mL. Titular directamente con HCl 0,02 N, colocado en una microbureta automática. 7. Calcular el porcentaje de nitrógeno y de proteínas totales en la muestra de leche aplicando la fórmula correspondiente y empleando el factor 6,38.