Université de Constantine III Faculté de Médecine PR Bensmail Département de Pharmacie Laboratoire de Chimie Analytique 6ème Année
DEMARCHE METHODOLOGIQUE EN ANALYSE PHARMACEUTIQUE Constantine les 5 et 7 Mars 2013 Dr B.ACHOUR-BOUAKKAZ
I)
INTRODUCTION
II) RAPPEL DES METHODES ANALYTIQUE 1) Méthodes d’analyses chimiques 2) Méthodes d’analyses instrumentales III) CHOIX D’UNE METHODE ANALYTIQUE III1) METHODES D’IDENTIFICATION a) Matière première b) Milieux biologiques III2) METHODES DE DOSAGE a) Matière première b) Formes pharmaceutiques (produit fini) c) Milieux biologiques 1
I-INTRODUCTION -La chimie analytique est une science fondamentale, elle regroupe les méthodes en analyse chimique qualitative et quantitative. quantitative. L’analyse chimique a fait preuve de beaucoup d’innovations, avec l’automatisation des méthodes analytiques utilisant des instruments très puissants et très performants en sensibilité et spécificité. Pour conseiller la meilleure méthode afin de résoudre le problème d’analyse, il existe une
science appelée chimiométrie. La chimiométrie regroupe l’ensemble des méthodes d’exploitation (statistiques) pour résoudre le problème posé en s’appuyant sur l’outil informatique.
Elle cherche a apporté une réponse correcte par exploitation des résultats afin de réduire le nombre d’es sais pour les analyses longues et couteuses. La chimie analytique englobe donc l’analyse chimique et la chimiométrie. En effet des méthodes d’analyses fiables sont requises pour assurer la conformité avec la réglementation nationale et internationale dans tous les domaines d’analyse et celui du
domaine pharmaceutique. pharmaceutique. Le laboratoire d’analyse doit prendre les dispositions appropriées pour s’assurer qu’il est en mesure de fournir les données de niveau de qualité requis par l’utilisation de méthodes
validées en respectant les critères de validation. - Répétabilité - Reproductibilité - Spécificité - Linéarité - Robustesse - Limite de détection et de quantification I)
Rappel des méthodes analytiques :
-
Méthodes chimiques d’analyse
-
Méthodes instrumentales d’analyse
1) Méthodes chimiques d’analyse : Elles sont caractérisé es par leur simplicité, leur rapidité de mise en œuvre et un faible coût du matériel. Elles sont décrites dans la pharmacopée et appliquées aussi bien pour les matières premières que pour les formes pharmaceutiques simples. simples. On distingue : 2
-
Méthodes protométriques
-
Méthodes d’oxydoréductions
-
Méthodes compléxométriques Méthodes par précipitations
-
Méthodes de dosage par paires d’ions
Ces techniques manquent de spécificité et sont difficilement applicables aux mélanges complexes sans extractions préalables des constituants à doser. Mais elles ont toujours leur place parmi les méthodes actuelles des différentes pharmacopées. a) Protométrie en milieu aqueux et non aqueux : - Il s’agit de réactions acide/base selon la définition de Bronsted protons d’où le nom de protométrie.
mettant en jeux des
La protométrie est une méthode bien adaptée aux matières premières, et adaptable dans certains cas au produit fini (forme pharmaceutique). Elle reste actuellement une méthode de base pour le contrôle de la matière première dans l’industrie pharmaceutique.
La méthode est décrite dans la pharmacopée française, dans la pharmacopée européenne et dans d’autres pharmacopées.
On distingue deux grands types de protométrie : - Protométrie en milieu aqueux = s’applique essentiellement aux acides et bases minéraux (généralement forts en milieux aqueux). Peu de molécules organiques d’intérêt pharmaceutique peuvent être dosées par ces méthodes (acide/base organiques faibles). Le point de fin de titrage est déterminé soit par les indicateurs colorés, soit par potentiométrie. - Protométrie en milieux non aqueux = met en jeux des réactions acide/base dans des solvants autres que l’eau. Elle sera mise en œuvre quand : le composé à doser est insoluble dans l’eau
la force de l’acide ou de la base est trop faible pour être dosé en milieu
aqueux. Mélange de polyacides ou polybases Elle nécessite un bon choix du solvant (solvants peu toxiques et peu chers) Exemple : le benzène permet le dosage des bases organiques mais il est peu employé à cause de sa toxicité b)
La compléxométrie = est une des méthodes volumétriques les plus utilisées, en
particulier pour le dosage des matières premières pharmaceutiques. Elle est 3
largement décrite dans la pharmacopée pour la détermination du titre des sels de métaux bivalents ou trivalents soit par méthode directe, soit par retour. -
En analyse qualitative elle est utilisée pour :
-
L’identification de ligands dans les essais limites des matières premières (recherche d’impuretés). Comme réactions d’identification d’une matière première
En analyse quantitative : la formation de complexes peut donner lieu à de très nombreuses exploitations quantitatives.
dosages compléxométriques ou compléxonométriques utilisant E.D.TA, Na 2 ou complexon III dans les méthodes volumétriques pour la détermination des sels de métaux bivalents ou trivalents, soit par méthodes direct ou par méthodes en retour. Dosages spectroscopiques : lorsqu’un complexe est fortement coloré, il peut être exploité dans un dosage colorimétrique Exemple dosage du Fer (Fe 2+) Les méthodes complexométriques sont aussi précises que la spectroscopie d’absorption atomique S.A.A, mais beaucoup moins spécifique et sensible. La compléxométrie est préférée parfois à la S.A.A pour des raisons de simplicité et du coût du matériel. c) Méthodes d’oxydoréduction = un grand nombre d’applications simples, précises et
dont la mise en œuvre est généralement peu couteuse. -
Les différentes techniques couramment utilisées sont : La manganimétrie utilisant le pouvoir oxydant du permanganate du potassium KMnO 4. Exemples d’applications : Dosage des sels ferreux et sels ferriques
Dosage de l’eau oxygénée
Dosage des sucres réducteurs (méthode de Bertrand) très utilisée en bromatologie
-
La chromimétrie = utilisant le pouvoir oxydant du bichromate de potassium K 2Cr2O7 c’est une technique connue pour le dosage de l’éthanol (Méthode de Cordebard)
-
L’halogénométrie : comprend l’ensemble des méthodes qui utilisent les propriétés
oxydoréductrices des principaux halogènes (chlore, iode, brome, ) chlorométrie, iodométrie, bromométrie 4
-
Periodimétrie. Comprend l’ensemble
des méthodes de dosage utilisant les propriétés oxydantes du système oxydoréducteur I +7/ I+5
Ces techniques sont peu spécifiques, ce qui limite leur emploi au contrôle des matières premières. En effet dans le cas d’un mélange de constituants (produit fini, milieu biologique), il est préférable d’utiliser une méthode d’analyse plus spécifique.
2)
Méthodes instrumentales d’analyse :
a)
Méthodes chromatographiques : ce sont des méthodes de séparation, d’identification, et de dosage . Principe général : il est basé sur la répartition des substances du mélange à analyser entre deux phases, l’une mobile et l’autre stationnaire
La phase mobile peut être : - liquide et on parle de chromatographie en phase liquide. - un gaz et on parle de chromatographie en phase gazeuse. - Un fluide supercritique et on parle de chromatographie en phase supercritique. Couplée à des systèmes de détection très puissants, la chromatographie est très utilisée en analyse pharmaceutique : - Matières premières - Produits finis - Surtout le dosage des médicaments dans les milieux biologique (sang et urine) Les différentes techniques de chromatographie : -
La chromatographie sur couche mince (C.C.M) ou
appelée aussi chromatographie planaire. Utilisant des plaques sur laquelle est déposée la phase stationnaire en une couche très mince. La révélation ou la détection des substances se fait sur la plaque, il s’agit d’une
chromatographie par développement. Chaque substance est caractérisée par son facteur de retardement ou facteur de rétention Rf mesuré directement sur la plaque L’identification d’u ne substance se fait en comparant son Rf avec le Rf d’une substance de référence (étalon). La C.C.M est très utilisée pour l’identification et la détermination de la pureté la matière première.( méthode pharmacopée) Utilisée aussi pour la détection des médicaments dans les milieux biologiques (toxicologie) 5
de
La chromatographie en phase gazeuse C.P.G : C’est une méthode de séparation sur colonne, utilisée pour les substances volatiles ou volatilisables véhiculées par un gaz inerte appelé gaz vecteur.
-
Les applications de la C.P.G sont nombreuses. Dans le domaine pharmaceutique elle est utilisée en analyse qualitative et quantitative
En analyse qualitative : les grandeurs de rétention volume ou temps de rétention sont caractéristiques d’une substance ; elles peuvent être utilisées dans un but d’identification. - pour vérifier la pureté de certaines matières premières. -Séparation des médicaments d’une même famille en toxicologie. En analyse quantitative : l’analyse quantitative est basée sur la mesure de la surface du pic enregistré puisqu’elle est proportionnelle à la quantité de
substance éluée. Du fait de sa sensibilité, la C.P.G a permet le développement des dosages des médicaments surtout dans les milieux biologiques Plusieurs types de détecteurs peuvent être utilisés, de sensibilité et spécificité variables. On peut citer comme détecteurs : L’ionisation de flamme (FID : flamme ionisation detector) le plus utilisé Le catharomètre
Capture d’électrons
Détecteur thermoïonique
Avec l’utilisation des colonnes capillaires très performantes, et le couplage avec d’autres méthodes d’analyse comme :
La spectrométrie de masse C.PG/Masse La spectrométrie Infrarouge C.P.G/IR A permet les identifications complexes. La chromatographie en phase liquide = c’est la plus ancienne des méthodes
-
chromatographiques. ( expérience de Mickael Tswest = séparation des pigments colorés par l’éther de pétrole utilisé comme phase mobile sur une colonne remplie de carbonate de calcium qui constitue la phase stationnaire) d’où le nom de
chromatographie : chroma du grec signifie couleur. Avec l’utilisation de phases stationnaires de fine granulométrie diamètre des
grains environ 3um, et les pompes puissantes. La chromatographie liquide a changé de nom est devenu : Chromatographie liquide haute pression ou haute performance C.L.H.P
6
(en Français), High performance liquid chromatography H.P.L.C (en Anglais) Les systèmes de séparation les plus courants qui sont mis en œuvre sont : Adsorption : la phase stationnaire est solide Partage classique ou mode normale : utilisant une phase stationnaire liquide polaire et une phase mobile apolaire. Polarité de phase inversée ou reversed phase (R.P) : dans ce cas la phase stationnaire liquide est apolaire et la phase mobile est polaire. 75% des séparations sont réalisées en mode inverse utilisant des colonnes R.P contenant des phases stationnaires greffées formées de longues chaines de carbone. EX : colonne R.P C8 et R.P C18 Les détecteurs utilisés en chromatographie liquide :
Spectrophotomètre UV/Visible = après les détecteurs à longueur d’onde fixe (254 ou 280 nm), l’apparition sur le marché de spectrophotomètres à longueur d’onde variable (de 190 à 700 nm) a considérablement étendu leur domaine d’application ; ils
restent cependant des détecteurs spécifiques dont la réponse dépend essentiellement de l’absorptivité du soluté (application de la loi de Beer -Lambert)
Spectrofluorimètre = destiné au départ aux composés fluorescents, le champ d’application de ce détecteur s’est développé grâce aux réactions chimiques de dérivation pré ou post colonne à l’aide de marqueurs fluorescents.
Détecteur électrochimique = ce type de détection, qui ne s’applique qu’aux substances oxydables ou réductibl es s’est extrêmement popularisé ces dernières années. On peut citer le dosage des catécholamines. -La
chromatographie en phase supercritique CPS : Complémentaire des
chromatographies en phase liquide et gazeuse:
La CPG exige la volatilité et la stabilité thermique des solutés;
L’HPLC l’absence de détecteur aussi universel et sensible que le détecteur à
ionisation de flamme Phase mobile(CO2):peu couteux, atoxique, ininflammable, bon pouvoir solvant, sans odeur
-La
chromatographie ionique : est l’évolution moderne de la chromatographie par échange d’ions. Son principe est fondé sur les propriétés des résines échangeuses d’ions qui
permettent une fixation sélective des anions ou des cations présents dans une solution. La 7
chromatographie ionique est considérée comme la méthode de référence en matière de dosage des espèces ionique. Cette méthode s’applique aussi bien aux anions qu’aux cations conjugués à des protolytes forts mais elle est cependant, actuellement surtout utilisée pour doser les anions minéraux difficiles à déterminer par les autres procédés chromatographiques : Chlorures, nitrates, phosphates et sulfates en hydrologie par exemple. b) Méthodes électrochimiques : Les méthodes électrochimiques mettent en jeu des réactions électrochimiques, c'està-dire des réactions où il existe un échange d’électrons entre un conducteur ionique (la solution) et un conducteur électronique (une électrode). Les méthodes électrochimiques sont utilisées pour le contrôle de la matière première (protométrie en milieu aqueux et non aqueux) et dans les mesures précises de pH. La mesure du pH : paramètre très important qui caractérise la pureté d’une substance, une valeur anormale du pH est l’indice de la présence d’une impureté. On distingue : les méthodes indicatrices = - Polarographie - Ampérométrie - Potentiométrie - Coulométrie Les électrodes sélectives = elles permettent la mesure d’une espèce dans un mélange sans préparation. La détection peut être ampérométrique ou potentiométrique c) Méthodes instrumentales spectrales : de nombreuses méthodes analytiques sont fondées sur les interactions entre la matière et une radiation électromagnétique. Le phénomène exploité en analyse d’atomes ou de molécules, est l’absorption de la radiation ou la restitution sous forme de lumière de l’ énergie absorbée. Les mesures sont réalisées aussi bien sur un liquide que sur un solide (spectrométrie d’absorption ou d’émission moléculaire) ou sur une vapeur atomique produite dans une flamme ou dans un four (spectrométrie d’absorption ou d’émission atomique).
-Spectrophotométrie UV/VISIBLE : -Son domaine spectral est compris entre 50 à 800nm Zone comprise entre 50 à 200nm (UV lointain) ce domaine n’est pas utilisé en pratique car l’énergie est trop importante. Zone comprise entre 200 à 400nm (UV proche). L’énergie reste élevée, on observe soit des transitions électroniques, soit des réactions photochimiques. Zone comprise entre 400 à 800nm (visible). 8
La Spectrophotométrie UV/VISIBLE est utilisée en analyse qualitative et quantitative Application qualitative : identification d’une matière première par la détermination de l’absorbance spécifique d’une substance. Elle n’est pas parfaite comme méthode d’identification
Application quantitative = dosage basé sur la loi de Beer- Lambert qui relie l’absorbance à la concentration de la substance à doser à une longueur d’onde donné
Utilisation de la technique UV/VISIBLE comme détecteur après séparation par chromatographie liquide H.P.L.C H.P.L.C/UV/Visible classique H.P.L.C/UV/Visible à barrettes de diodes H.P.L.C/D.AD qui est la plus utilisée actuellement en raison de sa puissance de détection. Toutes les longueurs d’o ndes de 200 à 800 nm peuvent être analysées simultanément en quelques secondes. Nouvelles applications de la spectroscopie UV/VISIBLE - Analyse multi composants Spectrométrie dérivée
-Spectrophotométrie Infrarouge : On distingue habituellement trois régions: L’infrarouge lointain, allant approximativement de 420 à 20 cm-1 L’infrarouge moyen, allant approximativement de 4300 à 420 cm -1
Le proche infrarouge plus énergétique allant approximativement de 12800 La Spectrophotométrie infrarouge est inscrite à la pharmacopée,
à 4300 cm -1
Les applications de l’infrarouge sont quotidiennes dans les laboratoires de recherche qui doivent identifier des substances organiques de synthèse. C’est une méthode intéressante qui s’ajoute à l’UV, la R.M.N et la spectrométrie de masse. En analyse qualitative elle permet l’identification des matières premières ou d’un toxique
Elle est basée sur la comparaison du spectre de la substance avec celui décrit dans les tables de spectre. Les appareils récents comportent en mémoires une bibliothèque de spectre de produits les plus courants et la comparaison entre la substance et le produit étalon est réalisée sur écran cathodique. De nouveaux développements de la technologie dans le domaine de l’industrie pharmaceutique permettent d’augmenter considérablement le rôle de l’infrarouge pour l’identification des m atières premières. 9
- Spectrophotométrie d’émission atomique S.E.A
= photométrie de flamme
S.A.A flamme - Spectrophotométrie d’absorption atomique
S.A.A
S.A.A four Ces méthodes sont basées sur l’exploitation des s pectres de raies émis par les atomes ayant subi une excitation suffisamment énergétique pour obtenir une variation de l’énergie
des électrons et essentiellement de ceux qui se trouvent sur les couches les plus extérieures (électrons de valence). La S.E.A, qui s’intéresse aux atomes à l’état E1 sera utilisée pour doser les alcalins dans une flamme qui n’a pas besoin d’être très énergique. La S.A.A, qui concerne les atomes à l’état E 0, sera de portée plus générale. Elle permet de doser tous les éléments dont la radiation de résonance λ > 180 nm Ces méthodes intéressent de nombreux domaines : l’industrie chimique pharmaceutique et l’agro-alimentaire ainsi que la biologie. Les dosages sont donc réalisés dans différentes
matrices, ce qui nécessite une mise au point adaptée à chaque cas. -La Spectrophotométrie d’émission plasma Les plasmas sont des gaz plus ou moins ionisé : G
G+ + e-
Ils sont créés et entretenus par apport d’énergie à un gaz dit plasmagène au moyen d’un générateur. Ce gaz est en général de l’argon. Les échantillons à analyser sont introduits dans le plasma par l’intermédiaire d’une torche (torche plasma) I.C.P (inductively coupled
plasma) et sont transformés en vapeur atomique ou éventuellement ionique et excités par les constituants du plasma : G, G +, eLes températures atteintes dans le plasma sont élevées : de l’ordre de 4500K° à 8000K° II) Choix d’une méthode analytique : Le dosage et l’identification de toute molécule médicamenteuse font appel à des procédés analytiques très divers dont le choix n’est pas toujours facile. Il ya donc lieu avant de mettre au point ou d’adapter une technique ana lytique plus ou moins complexe et onéreuse en temps et en matériel, de bien positionner le problème à résoudre. S’agit-il d’un contrôle pharmaceutique ? - Matière première ou produit fini - D’un dosage de médicament dans un milieu biologique (sang, urine etc…) En effet la méthode sera fonction de : 10
1) De la composition du milieu (matrice) Dans une matière première le principe actif est le constituant essentiel Dans une forme pharmaceutique ou produit fini (comprimé, suppositoire, ou autres). Le ou les principes actifs coexistent avec des excipients et des conservateurs. Dans les milieux biologiques la matrice est plus complexe, dans ce cas le principe actif doit être séparé d’abord des protéines est des autres composés endogène, d’où la nécessité d’un prétraitement de l’échantillon
2) Des caractéristiques des méthodes analytiques : Certaines méthodes sont plus ou moins sensibles ou spécifiques Ainsi les méthodes titrimétriques ou spectrophotométriques seront utilisables
sur des milieux limpides en l’absence d’interférences importantes. A l’inverse, les méthodes chromatographiques (méthodes séparatives) seront utilisables lorsqu’il ya lieu de séparer le principe actif P.A des substances endogènes ou d’autres molécules à propriétés voisines.
3) Des caractéristiques de la molécule
Les caractères organoleptiques (aspect, couleur, odeur) de la molécule permettront dans certains cas simples son identification. Les caractères physicochimiques tels que le point de fusion, le pouvoir rotatoire, les longueurs d’onde d’absorption UV ou IR peuvent aider à l’identification d’une substance.
Le caractère acide /base, la volatilité, la solubilité, la stabilité, la polarité permettent de mettre au point l’extraction et le dosage de la molécule
Connaître les caractéristiques pharmacocinétiques de la molécule va nous permettre de mettre au point son dosage dans liquides biologiques. En effet selon les médicaments, les concentrations dans le plasma, les urines, les tissus sont très variables.
III1) les méthodes d’identification
a) -
Matière première : la première série d’opérations de contrôle consiste à vérifier L’identité de la matière première réceptionnée L’examen des caractères organoleptiques qui sont définis par la pharmacopée 11
-
Ensuite en fonction de la matière première il faudra choisir une ou plusieurs des techniques suivantes basées sur la détermination d’une constante physique ou d’une propriété chimique tel que : Le point de fusion = la température de fusion d’une espèce chimique est une constante caractéristique de chaque composé dont la détermination permet de vérifier l’absence d’impuretés
Le pouvoir rotatoire : c’est la propriété que représente certaines substances de dévier le plan de polarisation de la lumière polarisée en utilisant un polarimètre la pharmacopée définit l’angle de rotation optique, le pouvoir rotatoire spécifique d’un liquide, d’une substance ou d’une solution . Le pouvoir rotatoire est particulièrement intéressant pour l’identification des acides
aminés, des sucres, des composés à carbone asymétrique
-
L’indice de réfraction : mesuré à l’aide d’un réfractomètre, il permet l’identification des huiles et de nombreux liquides purs.
La densité relative : mesurée grâce à un pycnomètre à solide ou à liquide.
Les indices chimiques : comme l’indice d’acide, de peroxyde.
Enfin, deux groupes de méthodes sont facilement réalisables pour l’identification d’une matière première mais nécessitent un échantillon pur comme étalon Méthodes spectrales : En UV/Visible = détermination du maximum d’absorption qui doit correspondre à la longueur d’onde indiqué dans la monographie de la pharmacopée. En IR on doit vérifier la superposition des bandes du spectre de la substance à analyser et d’une substance de référence L’IR ne peut pas servir de critère de pureté mais c’est d’identification rapide et fiable
une méthode
Méthodes chromatographiques : La C.C.M est une méthode spécifique et trés sensible largement utilisée pour l’identification des molécules (comparaison des Rf substance et étalon)
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-A côté de ces techniques physiques d’identification des matières premières, la pharmacopée décrit des réactions d’identité des ions et des groupements fonctionnels. Le
principal inconvénient réside en la préparation des nombreux réactifs nécessaires et en la complexité de certaines réactions. Il existe différents documents couramment utilisés pour connaître les caractères Physico-chimiques d’une matière première, on peut citer : - Les pharmacopées françaises et européennes -
L’index Merck
-
Les fiches SFSTP (société Française des sciences et techniques pharmaceutiques) Les fiches techniques et les dossiers techniques fournis par les laboratoires fabricants.
-
Critères de pureté d’une matière première Après l’identification de la matière première, il est nécessaire de s’assurer que celle-ci n’est pas contaminée (résidus de synthèse en cas de purification
insuffisante, produit de dégradation en cas de mauvaise conservation). Des méthodes plus ou moins spécifiques sont utilisables :
C.CM : un corps pur ne donne qu’une seule tâche après révélation . Cette méthode très facile à mettre en œuvre, permet la mise en évidence d’impuretés ou de produits de dégradation.
Spectrophotométrie UV le coefficient d’absorbance spécifique est caractéristique de la substance dans un solvant déterminé. On se place à la longueur d’onde maximale d’absorption. L’absorption mesurée doit être comprise entre deux limites définies par la monographie ou la fiche technique de la matière première.
Perte de masse par dessiccation : cet essai permet de connaitre le degré d’hydratation. C’est un critère important à connaitre puisque la présence d’eau abaisse le titre de la matière première. Elle peut être déter minée par différentes méthodes selon les indications de chaque monographie.
Essai limites des métaux lourds : recherche des métaux lourds en fonction de chaque matière première. Chaque monographie indiquera le procédé à utiliser.
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Recherche d’impuretés particulières : certaines impuretés particulières à
chaque matière première peuvent être recherchées. Une impureté de fabrication, de dégradation. b) Médicaments dans les liquides biologiques : dépistage toxicologique L’identification des médicaments dans les liquides biologiques après intoxication aigué est souvent complexe en effet la gamme des médicaments à identifier est vaste. Les réactions d’identification doivent être spécifiques des médicaments et non des
substances endogènes. Les concentrations peuvent être inférieures au seuil de détection. Dans la pratique le médicament est recherché dans le liquide de lavage gastrique, le plasma et les urines. Mais c’est dans le liquide de lavage qu’il sera plus facile d’identifier un médicament et ce d’autant q ue le médicament subit des biotransformations importantes.
Les méthodes utilisées sont :
Identification par réactions colorés: ces réactions sont spécifiques d’un groupement chimique, elles s’effectuent directement sur le liquide de lavage gastrique ou l’urine.
Identification après séparation : c’est la méthode la plus employée Elle consiste à identifier les médicaments après séparation par chromatographie sur couche mince C.C.M
Identification par les méthodes immunologiques : ces méthodes développées pour le dosage des médicaments ont été appliquées aux recherches toxicologiques
Dans certains cas difficiles, on fait appel à d’autres méthodes comme la spectrométrie de masse couplée à la C.P.G ou à L’ H.P.L.C
III2 Les méthodes de dosage
On définit les critères analytiques fondamentaux des techniques de dosage dans les trois milieux : matière première, produit fini, milieux biologiques Pour les matières premières : le point fondamental est la précision : une pureté doit pouvoir être déterminée à 0,1% prés.
Pour les formes pharmaceutiques : le titre du P.A doit pouvoir être assuré à ± 5%
selon la législation européenne en vigueur, sinon il conviendra de justifier un dépassement de ces normes Le point le plus important est la spécificité (interférences des excipients) ainsi que la sensibilité dans certains cas. 14
Pour les milieux biologiques : les
deux critères essentiels sont la sensibilité et la spécificité, la précision de la méthode étant acceptable jusqu’à 10% environ
a) Matière première 1) Dosage des éléments minéraux
1,1) Cations
Les alcalins : Na, K, Li, Ce, Fr, Rb Ce sont des métaux qui, combinés à l’oxygène, forment des alcalis. Leur potentiel d’ionisation relativement bas, permet de les doser facilement par spectrophotométrie d’émission atomique (S.A.E) encore appelée photométrie de
flamme
C’est la méthode la plus simple et la plus spécifique (utilisation de la raie de résonance de l’élément à doser). Les alcalino-terreux : Ba, Mg, Ca, Sr, Rd Leur potentiel d’ionisation plus élevé que les alcalins ne permet pratiquement pas d’utiliser la S.A.E, c’est pourquoi on utilise la spectrophotométrie d’absorption
atomique (S.A.A) en raison de sa précision et de sa spécificité. On utilise aussi les méthodes compléxométriques qui sont aussi précises que la S.A.A, mais beaucoup moins spécifiques et sensibles. La compléxométrie nécessite une bonne maîtrise de l’appréciation du virage et le contrôle du PH en utilisant des solutions tampons. Le dosage peut être direct ou en retour.
Les métaux de transition et certains non métaux
Ils correspondent dans le domaine médical aux oligoéléments et certains minéraux (métaux lourds) Cr, Mn, Fe, Co, Ni, Cu, Zn, Ag, Cd, Sn, Bi, Pb, leur détermination se fait sélectivement par absorption atomique (S.A.A) Il ne faut pas oublier que la S.A.A dose l’élément et non pas l’état d’ionisation possible de l’élément (Fe 2+ et Fe3+ ne peuvent être distingués). Il faudra utiliser d’autres méthodes comme (polarographie, électrode spécifique) pour obtenir une information plus précise sur l’état de valence.
Une autre alternative pour les éléments de transition est la titrimétrie soit par formation de chélate (compléxométrie), soit par oxydoréduction chimique ou électrochimique. 1,2) Anions : Dans les pharmacopées le dosage d’un sel minéral est soit le dosage du cation, soit le dosage de l’anion. 15
les halogénures (F-, Cl-, Br-, I-)
Pour le dosage de ces anions, on utilise comme techniques :
l’argentimétrie
-Argentimétrie directe : Cl- , Br- , I- ont des produits de solubilité suffisamment faible sous forme de sels d’argent pour être dosés par argentimétrie directe en utilisant le nitrate d’argent 0,1N comme réactif titrant et en utilisant une détection potentiométrique en utilisant une électrode d’argent.
-Technique de Mohr en milieu neutre pour les chlorures Cl-Technique de Charpentier-Vohlard en milieu acide Les méthodes de Charpentier- Vohlard et Mohr permettent de doser en principe n’importe quel anion chlorure dans n’impor te quel matière première. La simplicité de la méthode de Mohr en fait la méthode de choix alors qu’elle n’est pas toujours utilisable
pour les formes pharmaceutiques (pH acide). Dans ce cas il faudra avoir recours à la technique de charpentier Volhard.
Dosage par électrode spécifique : dans le cas des halogénures on utilise tout particulièrement l’électrode spécifique à fluorure pour les préparations
pharmaceutiques et les milieux biologiques.
Méthodes compléxométriques : avec le
nitrate de thorium pour le dosage des
fluorures FC’est la méthode de choix pour le dosage des sels fluorés : simple, rapide, spécifique
Méthodes d’oxydoréduction = simple et précise, mais comme toutes les techniques d’oxydoréduction, sa spécificité est très mauvaise (interférences des autres couples
dans le dosage). 1,3) Les anions complexes : On définira les anions complexes par la combinaison de deux éléments chargés négativement : SO42-, NO2-, NO3-, CN-, PO43Il est rare, en fait que ces anions soient dosés lors du contrôle d’une matière première. On préfère déterminer le cation correspondant (sodium, potassium) dont le dosage est souvent plus simple et plus précis 2) Dosage des molécules organiques : Les substances organiques peuvent être définies comme des combinaisons moléculaires formées des atomes de C, H, N, S, O et éventuellement d’autres éléments. Il peut s’agir d’acides, de bases, de molécules sans pK, de sels.
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Pour doser une molécule organique en tant que matière première, l’analyste doit sélectionner dans la molécule considérée un groupement fonctionnel susceptible d’être mis en jeu dans une méthode de dosage rapide, simple, très précise. 2,1) Acides
L’acidimétrie en milieux aqueux : les
acides organiques suffisamment forts pour être dosés directement ou en retour en milieu aqueux sont relativement peu nombreux en pharmacie. l’acidimétrie en milieu non aqueux : l’utilisation d’un solvant non aqueux permettant une meilleure dissolution du principe actif, Exemple Acétone, éthanol préalablement neutralisés. Dans ce cas le réactif titrant est une solution alcoolique ex : KOH alcoolique 0,5N 2,2) Bases
Dosage en milieu aqueux : réservé aux bases fortes
Dosage en milieu non aqueux : réservé aux bases faibles on peut citer comme exemple la méthode classique de Pifer et Wollish développée dans les années 1950 ; sa simplicité, sa rapidité, sa très grande précision l’on fait adopter de façon universelle et elle figure dans de très nombreuses pharmacopées. Le principe de la méthode est le suivant : la basicité de la molécule à doser est exaltée par dissolution dans l’acide acétique ; ce dernier par solvatation va libérer un ion acétate qui va pouvoir être dosé par un acide fort comme HClO4 0,1N. Il s’agit
d’un dosage indirect.
2,3) Les molécules carbonylées : Aldéhydes et cétones peuvent réagir de façon quantitative avec l’hydroxylamine R – C = O + H2NOH
R – C = N - OH + H2O
C’est une technique volumétrique simple applicable à de nombreux composés carbonylés ne possédant pas d’autres fonctions organiques caractéristiques.
2,4) Les polyols simples : sucres, dérivés du glycérol etc……….. périodimétrie : elle est précise, simple, reproductible, elle figure dans de très nombreuses monographies de la pharmacopée. La méthode de choix c’est la
-
Lorsque la périodimétrie n’est pas utilisable, il reste deux solutions : Soit exploiter le pouvoir réducteur d’un aldose ou d’un cétose (réduction de la liqueur
de Fehling) Soit déterminer le titre par polarimétrie pour les sucres possédant un pouvoir rotatoire spécifique. 17
2,5) Les molécules oxydoréductibles : Manque de spécificité des techniques d’oxydoréduction. Ce type de dosage est pratiqué que s’il n’ya pas d’autres méthodes disponibles.
2,6) Molécules comportant des groupements fonctionnels basiques et acides. Le meilleur exemple est l’acide aminé Dosage de la fonction acide : c’est la méthode de Sorensen par formol
titration Dosage de la fonction basique : dosage en milieu non aqueux
2,7) Dosage des sels de molécules organiques : Beaucoup de médicaments organiques sont salifiés pour faciliter la dissolution du principe actif en milieu aqueux
Dosage des sels de bases organiques : les principaux sels de bases utilisées en pharmacie sont : Les chlorhydrates, les bromhydrates, les sulfates, les mésylates Le dosage se fait par protométrie en milieu non aqueux
Dosage des sels d’acides organiques : ex acétate de Zinc, gluconate de sodium dosage du cation correspondant par compléxométrie ou par absorption atomique S.A.A pour cation ( bi ou trivalent), quand le cation est monovalent il peut être dosé par photométrie de flamme. On peut aussi doser l’anion par protométrie en milieu acétique par l’acide
perchlorique 0,1N 3)
Les formes pharmaceutiques : Dosage des minéraux dans les médicaments 1)
Cations : les méthodes évoquées pour les matières premières (photométrie de flamme, absorption atomique, colorimétrie, oxydoréductimétrie…) sont
globalement applicables aux formes pharmaceutiques 1,1) Association minérales strictes, ex oligoéléments et certains solutés massifs Le dosage se fait par :
Compléxonométrie : lorsque les circonstances le permettent (forte concentrations, un seul cation à doser) les techniques titrimétriques deviennent intéressantes en raison de leur simplicité et de leur faible coût. 18
Dosage spectrophotométrique : Formation de complexes colorés Émission ou absorption atomique : lorsque l’analyste doit résoudre le problème de dosage multiéléments dans une préparation pharmaceutique, il se tournera vers une méthode physique d’émission (photométrie de flamme) pour les alcalins et d’absorption atomique (S.A.A) pour les autres éléments. L’émission atomique par plasma induit ICP = (inductive coupled plasma)
1,2) Association avec des molécules organiques = ces associations posent moins de problèmes qu’un mélange complexe strictement poly ionique. 2) Anions Les méthodes volumétriques sont très pratiquées à partir du moment où une seule espèce anionique est en cause.
Les électrodes spécifiques : peuvent être utiles (F -, CN-, SCN-, NO2-, NO3-) mais nécessite un entretien très rigoureux Les méthodes d’oxydoréduction sont d’un emploi limité du fait de leur manque de spécificité. Sont utilisées dans les dosages classiques des solutés d’hypochlorite (Dakin, l’eau de javel)
La chromatographique ionique : tous les anions ainsi que les anions complexes peuvent dans certaines conditions être dosés simultanément par cette méthode La colonne utilisée est une résine échangeuse d’anions
3) Dosage des molécules organiques C’est le problème le plus couramment rencontré lors du contrôle du
produit fini, la grande
majorité des médicaments relevant de la chimie organique. L’analyste est appelé à développer une méthode parfaitement spécifique du produit à doser toutes les interférences avec d’autres principe actifs associés, excipients doivent être évitées, ceci n’est pas toujours réalisable et seules les méthodes chromatographiques permettent d’atteindre ce but.
3,1) Les médicaments acides = les techniques qui sont utilisées sont :
La protométrie ne peut être utilisée qu’en milieu neutre ou quand le PH n’est
pas ajusté pour une raison de stabilité des principes actifs. Absorptiométrie dans l’ UV. La chromatographie en phase gazeuse (C.P.G) La chromatographie en phase liquide (H.P.L.C) 19
3,2) Les médicaments basiques = Ce groupe constitue la majorité des médicaments (sous forme de base et de sel de base). Les médicaments basiques (et leur sels) peuvent être titrés plus commodément par trois groupes de méthodes : Volumétrie en phase hétérogène avec appariement de paire d’ions
Absorptiométrie directe dans l’UV
Méthode chromatographique : C.P.G ou plus souvent H.P.L.C
3,3) Les polyols (sucre) Ils peuvent être dosés : Par voies enzymatiques (glucose) Par périodimétrie Par H.P.L.C- réfractométrie et polarimétrie 4)
Liquide biologique Le dosage des médicaments dans les milieux biologiques est le plus complexe, puisqu’il faut séparer le médicament à doser des substances endogènes susceptibles d’interférer et
éventuellement de métabolites. Les principaux facteurs à prendre en compte sont bien sûr la spécificité et la sensibilité de la méthode. Les méthodes utilisées à l’heure actuelle pour le dosage des médicaments sont de deux types :
Méthodes immunologiques : immunoenzymologie et immunofluorescence
Méthodes chromatographiques : La C.C.M se prête difficilement à des réactions de quantification, mais possible par HPTLC (CCM à haute performance) . La C.P.G et l’H.P.L.C s’appliquent au dosage de très nombreux médicaments ainsi qu’à
leurs métabolites. La sélection entre C.P.G et H.P.L.C se fera en premier lieu en fonction des caractéristiques physicochimique de la molécule à doser.
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BIBILIOGRAPHIE
1)
Analyse pratique du médicament
D. Pradeau
2)
Chimie analytique et équilibres ionique
Jean-Louis Burgot
3)
Méthodes de séparation (tome 2)
M. Hamon
4)
Chimie des solutions
M.Hamon
5)
Pharmacopée Européenne
(tome 1)
6ème Edition
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