Universidad de Chile Facultad de Ciencias Departamento de Química
Informe de Laboratorio Nº2 Efecto de la fuerza iónica. Precipitación por salazón y cuantificación de las proteínas del suero sanguíneo. Efecto solubilizante del NaCl sobre las proteínas del suero sanguíneo.
OBJETIVOS
Los principales objetivos de esta experiencia son: -
-
-
Realizar una curva de calibración para una muestra patrón (absorbancia versus concentración) de suero sanguíneo, con el fin de obtener una recta para calcular la concentración de una muestra problema. Determinar la concentración, y composición de una muestra problema de suero sanguíneo, calcular la cantidad de seroglobulina y seroalbúmina presentes en el suero. Observar y comprender el efecto de las sales (NaCl y (NH 4)2SO4) en la solubilidad de las proteínas, ya sea precipitación o aumento de solubilidad.
ANÁLISIS DE RESULTADOS
A partir de la primera actividad, la cual consistía en preparar soluciones a distintas concentraciones de suero sanguíneo patrón de concentración 10 mg/mL y luego medir su absorbancia, por medio de la coloración que tomaban al adicionar reactivo de Biuret, se obtuvo la siguiente tabla: Tabla N°1: Absorbancia de las soluciones según su concentración. Suero sanguíneo [mL]
0,1 0,2 0,3 0,4 0,5
[Suero sanguíneo] [mg/mL]
1 2 3 4 5
Absorbancia [nm]
0,118 0,216 0,320 0,418 0,486
El test de Biuret permite reconocer proteínas, esto es posible por medio de la formación de un complejo de Cu +2 el cual reconoce los enlaces peptídicos en los residuos de aminoácidos. El complejo que se forma presenta un color violeta, por ello, a mayor concentración mayor es la cantidad de enlaces peptídicos presentes en la solución por lo que mayor es la coloración en la solución, gracias a esto es posible medir la absorbancia en las soluciones. A continuación se presenta la reacción de formación del complejo de Cu+2.
Figura N°1: Reacción de la formación de complejo para el test de Biuret. Con estos datos es posible generar una curva de calibración, de concentración versus absorbancia, de la cual se desprenderá una ecuación de la recta que permite obtener el valor de la concentración de la muestra problema.
Figura N°2: Curva de calibración suero patron. Durante la segunda experiencia, se buscó separar por medio salazón las proteínas del suero sanguíneo, de manera que al adicionar sulfato de sodio, el cual se caracteriza por generar un efecto diferente en las proteínas del suero.
Luego de esto fue necesario centrifugar para lograr separar el precipitado (Globulina) del sobrenadante (Albumina), donde a partir de este se generó una nueva solución a la cual se le midió su absorvancia, obteniendose así la concentración de una de la Albumina. Tabla N°2: Absorvancia muestra problema y filtrado. Solución
Absorbancia [nm]
Muestra problema (0,1 mL) Filtrado Albumina (0,2 mL)
0,362 0,121
Con estos datos es posible calcular la cantidad de proteínas presentes en la solucion de suero sanguíneo, utilizando la ecuacion de la recta obtenida en el grafico de la figura N°2. De esta manera es posible completar la siguiente tabla de balance: Tabla N°3: Composición de suero sanguíneo.
Fracción
Suero total Sobrenadante (Albumina)
mg/6mL de Proteinas
mg de Proteinas 100 mL
3,537
58,95
0,968
16,13
A partir de los datos obtenidos de la tabla N°3 es posible determinar los porcentajes de albumina 27,36% y de globulina 72,64%. Esta ultima se obtuvo por diferencia, ya que al no ser soluble preciita, obteniendose 42,82 mg/100 mL de Globulina. Los resultados no estan dentro de lo esperado, ya que, se considera que el rango de proteínas totales en la sangre es de 60 - 83 mg/mL lo que no concuerda con los resultados obtenidos en el practico. Tambien se tiene que la albumina se encuentra en menor concentracion que la globulina, lo que no coincide con la teoria. Finalmente, se observó el efecto que tiene una sal como el NaCl en la solubilidad de las proteínas presentes en el suero sanguíneo de la muestra problema, de manera que se prepararon soluciones de 0,5 mL de suero aforadas a 50 mL. Luego de esto se les adicionó gota a gota ácido acético hasta alcanzar una solución turbia, de manera de pasar el punto isoeléctrico de la proteína se agrega un poco más de ácido, luego para regresar al punto isoeléctrico se adiciona NaOH, así se tiene que las proteínas en la solución esten completamente insolubles.
Al agregar NaCl 2M gota a gota se observa que la solución deja de ser turbia, debido a que esta sal estabiliza las cargas presentes en la proteína, lo cual beneficia su solubilidad. Los volumenes utilizados de ácido acético para alcanzar el punto isoeléctrico y de NaCl para solubilizar la proteína son: TablaN°4: Volumenes de ácido acético y NaCl según su efecto en la solubilidad.
Solución
Volumen [mL]
Ácido acético [0,1M] NaCl [2 M]
1 1,7
CONCLUSIÓN
1- Es posible determinar la concentración de una solución de proteínas como el suero sanguíneo, por medio de la absorbancia. Utilizando un suero patrón para crear una curva de calibración. 2- El reactivo de Biuret permite reconocer proteínas en una solución a partir de un cambio de color (azul a violeta) debido a la formación de un complejo, así como también permite estimar la concentración de estas por medio de mediciones de absorbancia, donde a mayor concentración más coloreada será la solución
3- Las sales generan un efecto en la solubilidad de las proteínas, a determinadas cantidades son capaces de aumentar la solubilidad de las proteínas en la solución ya que estabilizan los grupos cargados en ella, pero a concentraciones más altas disminuyen drásticamente la solubilidad de las proteínas ya que comienzan a competir con ellas por la solvatación del agua, por tanto priman las interacciones de la sal con el agua por sobre las de proteínas agua, teniéndose así la precipitación de la proteína.
