Universidad Nacional del Santa Facultad de Ingeniería E. A. P. de Biotecnologia Tema: BIOCATALISIS ENZIMATICA
Curso: LABORATORIO DE BIOPROCESOS II
Docente: Grupo:
Integrantes:
Nvo.Chimbote – Perú
BIOCATÁLISIS ENZIMÁTICA 1. OBJETIVOS OBJETIVO GENERAL Diseñar y realizar diferentes experiencias de estudios cinéticos de un preparado enzimático en bruto de invertasa en sus formas solubles e inmovilizadas.
OBJETIVOS ESPECÍFICO o
Obtener el preparado enzimático en bruto de invertasa de levadura.
o
Determinar el rango de linealidad y actividad enzimática (actividades volumétrica y específica) del preparado soluble.
o
Inmovilizar invertasa en geles.
o
Diseñar y montar el sistema mini-reactor con invertasa inmovilizada, para determinar parámetros cinéticos de la enzima.
o
Determinar los parámetros cinéticos de la invertasa soluble.
CONSIDERACIONES Para el diseño se debe considerar:
o
Usar soluciones concentradas de sacarosa: 0.2M – 0.6M.
o
Utilizar como soporte alginato de sodio al 1.5% - 2.5% (p/v).
o
Usar un sistema mini-reactor enzimático en reciclo.
o
Definición: una unidad internacional de invertasa es aquella cantidad de enzima necesaria que hidroliza un micromol de sacarosa por minuto a 40ºC y pH 4.7.
2. METODOLOGÍA EXPERIMENTAL a. Determinación de proteínas mediante el método de Bradford.-
Reactivo: Disolver 0.1g de azul de coomassieg G-250 en 250 ml de etanol al 98%, mas 100ml de acido fosforico al 85% y con agua destilada aforar a un litro.
Se agrega a un tubo de ensayo 500
l
de muestra convenientemente
diluida.
Luego se añade 5ml de reactivo de Bradford (a cada muestra) y deja reaccionar durante 5 minutos.
Se leerá la absorbancia a una longitud de onda de 595nm, contrastándola con un blanco de agua destilada de 500 l.
Posteriormente se obtendrá la concentración interceptando la medida de la absorbancia en la curva de calibrado.
La curva de calibrado se obtendrá a partir de muestras de concentración conocida de una solución estándar de albúmina de suero de bovino y analizadas según el procedimiento descrito anteriormente.
b. Determinación de azúcares reductores mediante el método del DNS.Para la preparación de este reactivo, se disuelve el tartrato en aproximadamente 20 ml de agua, paralelamente se disuelve el DNS en pequeñas cantidades con ayuda de un agitador magnético y calentando. Ambas soluciones se mezclan en un matraz aforado de 50 mL y se agita hasta la completa disolución de todos los componentes, para posteriormente aforar hasta 50 mL.
Se precisa realizar los siguientes pasos para el análisis de la muestra: o
Se añade 1 mL de reactivo DNS a un 1 mL de muestra a análizar.
o
Se mantiene la mezcla en baño de agua a ebullición durante 5 minutos para luego enfriar con agua helada.
o
Se añaden 10 ml de agua destilada, y se deja reposar por 15 minutos, luego agitar.
o
Se lee la absorbancia a 540 nm, utilizando agua como blanco.
o
La concentración se obtiene interceptando la medida de absorbancia en la curva de calibrado.
La curva de calibrado para el azúcar se obtiene a partir de muestra de concentración conocida y analizadas según este procedimiento.
c. Obtención del preparado de enzimático en bruto de inverstasa de levadura.-
Se mezclara 10g de levadura desecada con 50 ml , de agua destilada en una fiola de un litro hasta que la solución ablande todos los acumulo.
Se tapara el frasco con una torunda de algodón y se colocara en un baño de agua manteniendo la temperatura entre 40º a 45ºC,y se dejara Autolisar la preparación por 24 horas.
Se centrifugara la mezcla después de al autolisis a 150 r.p.m. durante 15 minutos a temperatura ambiente.
Se decantara el liquido sobrenadante claro y de color ambar en una probeta; se anotara el volumen y se vertira la solucion en un vaso manteniendo entre 0º y 2º C en baño de hielo.
Esta solución obtenida constituye la enzima original bruto, fracción I , es necesario determinar la actividad especifica y total de esta preparación mediante el análisis de determinados diluciones del enzima, la concentración de proteínas y el volumen total(guarde para esto un volumen de 5 ml de la fracción I a 0º C)
d. Rango de linealidad de la enzima Se realizará a diferentes concentraciones de enzimas, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, y 1, se graficará tiempo vs. Sustrato o Tiempo vs. Producto. Se obtendría una gráfica parecida a la siguiente 0.8 S P 0.6 0.2
T
e. Medida De La Actividad Especifica De La Enzima La actividad enzimatica de la invertasa además de indicarnos su recuperación puede servir como un índice de la calidad y rendimiento de nuestro trabajo durante el proceso de purificación.
Utilizaremos el método del DNS para determinar la actividad enzimática.
La conversión de la sacarosa en glucosa y fructosa.
f. Inmovilizar invertasa en geles El método de inmovilización es por unión química. Se debe procurar que la inmovilización incremente la afinidad por el sustrato, disminuya la inhibición, amplie el intervalo de pH óptimo y reduzca las posibles contaminaciones microbianas. El alginato es un polímero natural (polisacárido) y es un soporte inorgánico y el método de inmovilización es el siguiente o
Preparar una disolución de alginato de sodio al 2% y calentar a 80ºC por 15 minutos y luego enfriar a 45ºC.
o
De la disolución anterior tomar 5 mL, mezclar con 1 mL del preparado invertasa y cargar toda una jeringa provista de aguja.
o
Con la jeringa gotear la mezcla dentro de 30 mL de solución agitada de CaCl2 0.1 M.
o
Los “beads” esféricos de enzima inmovilizada, dejarlos reposar en refrigeración por 3 a 4 horas y luego lavarlos con una solución de CaCl2 0.05 M.
o
Empacar los “beads” dentro del mini-reactor.
g. Diseñar y montar el sistema mini-reactor con invertasa inmovilizada, para determinar los parámetros cinéticos de la enzima. La forma usual de usual de determinar los parámetros cinéticos es a través de mediciones de velocidad inicial de reacción a diferentes concentraciones de aquellas sustancias que la afectan. La manera más adecuada de obtenerlos es por linealización de las ecuaciones cinéticas. Los métodos más empleados aparecen en la tabla siguiente, para un modelo cinético simple
E
+
S
E S
V
E
+
P
K s
K
s
Métodos de linealización para determinar parámetros cinéticos
Intercepto
Intercepto
Eje Y
Eje X
1/s
1/v
-1/k
k/V
s/v
S
k/V
-k
1/v
V
v/s
V
v/k
-k
Método
Eje Y
Eje X
Lineweaver – Burke
1/v
Hames Eadie – Hofstee
Pendiente
1/v
K/V
1/V
-1/K
1/s
Figura Nº 2: Determinación de parámetros cinéticos mediante método de inversos de Lineweaver – Burke
3. MATERIALES, INSTRUMENTOS Y REACTIVOS Levadura desecada CO3HNa 0.1 M Baño termostático de agua Centrifuga Alginato de sodio (1.5% - 2.5%) DNS (para azúcares reductores) Sacarosa (0.2 M – 0.6 M) Sal común Reactivos de Bradford (para proteínas) Mini-reactor enzimático en reciclo.
4. CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES
Determinación de proteínas mediante el método de Bradford. Y determinación de azucares reductores mediante DNS Día: martes 21 Hora : 8: 00 a.m. a 12:00 M
Obtención del preparado de enzimático en bruto de inverstasa de levadura.Día: jueves 25 y viernes 26 Hora : 3: 00 p.m. a 7:00 PM
Rango de linealidad de la enzima Día: viernes 2 de agosto Hora : 3: 00 p.m. a 7:00P M
Medida De La Actividad Especifica De La Enzima Día: viernes 2 de agosto Hora : 3: 00 p.m. a 8:00 PM
Inmovilizar invertasa en geles Día: viernes Hora : 3: 00 p.m. a 7:00 PM
Diseñar y montar el sistema mini-reactor con invertasa inmovilizada, para determinar los parámetros cinéticos de la enzima. Día: viernes 3 agosto Hora : 3: 00 p.m. a 7:00 pM
5. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
o
Cinética enzimática. Profesor Andrés Illanes Frontaura. Escuela de Ingeniería Bioquímica. Universidad Católica de Valparaíso.
o
Reactores Enzimáticos. Profesor Agustín López Munguia. Departamento de Biotecnología. Universidad Nacional Autónoma de México.
