25/08/2015
Muestreo
Análisis microbiológico de alimentos c S M z e n í t r a M a l e c r a M
c S M z e n í t r a M a l e c r a M
Es la operación que consiste en separar un número determinado de muestras de un lote, lote, remesa, partida, etc. con el fin de obtener unos resultados analíticos fiables.
María Marcela Martínez Miranda M.Sc Micro Microbiolog biología ía Docente Dpto. Ingeniería
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Universidad de Caldas
Objetivos del muestreo
Condiciones de la muestra
Detectar la presencia de
Debe ser representativa del lote.
microorganismos microorganism os patógenos. Evaluar el cumplimiento de las
normas microbiológicas. Conocer la vida útil del
producto. Conocer el estado higiénico de
la industria, ambiente, equipos, manipuladores, etc. Investigar brotes alimenta alimentarios. rios.
c S M z e n í t r a M a l e c r a M
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Debería (siempre que sea posible) enviarse al laboratorio en su recipiente original, sin abrir.
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En autoclave a 121°C durante 15 minutos, especialment especialmente e para los materiales que no soporten el calor seco.
Si el producto es voluminoso, se transfiere en condiciones asépticas, una porción en un recipiente estéril estéril..
Utensilios para el muestreo: cucharas, sacabocados, espátulas, taladros, cuchillos, pipetas, siempre estériles y escogidos de acuerdo a la naturaleza naturaleza del alimento.
Debe protegerse de contaminaciones externas ocasionadas por el aire, el recipiente de muestreo, los equipos de toma de muestra o por una incorrecta manipulación.
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Esterilización de los elementos ele mentos para el muestreo
Condiciones para el muestreo
El recipiente no debería llenarse en más de ¾ de su capacidad para evitar posibles vertidos y favorece favorecerr el mezclado en el laboratorio.
No debe sufrir daño o transformación durante el transporte y almacenamiento.
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En estufa a 160-180°C durante 2 horas. Alternativamente se pueden utilizar los siguientes métodos, teniendo en cuenta que no eliminan todas las esporas: • Inmersión del utensilio en alcohol etílico al 95% y
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posterior flameado. 5
• Inmersión en una solución de hipoclorito de sodio de 50
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ppm de cloro libre durante al menos 30 segundos.
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Pasos para el muestreo
Definiciones importantes Lote
1. Selección de la muestra
2. Toma de la muestra
3. Conservación y transporte de muestra
4. Recepción de la muestra en el LMA
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c S M z e n í t r a M a l e c r a M
Muestra
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Unidad de muestreo
Plan de muestreo
Unidad analítica
Plan de muestreo de 2 clases
Extracción de muestra, análisis y toma de decisiones
P.M. Atributos
P.M. Variables
Dos clases
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c S M z e n í t r a M a l e c r a M
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Tres clases Análisis cualitativos
Plan de muestreo de 3 clases
Tamaño de la muestra
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Más de 10.000 unidades del lote.
MIL STD 105D
501- 10.000 unidades 1% del lote
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Representativa y aleatoria Análisis cuantitativos
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Tamaño muestra para alimentos pre-envasados
Resolución Mercosur 74/93
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Codex Alimentarius
Recolección de muestras
Lavado de manos Indumentaria adecuada
Alimentos envasados: empaque original, aleatoria, aséptica, toma de cantidad representativa
Productos envasados en grandes envases: abrirlos y extraer la muestra en condiciones asépticas
Recolección de muestras
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c S M z e n í t r a M a l e c r a M
Los alimentos expuestos al aire mismo y a otros contaminantes: no requieren precauciones estrictamente asépticas. 15
Recolección de muestras
Alimentos preparados sin envasar de consumo inmediato: la persona que elabora los alimentos introduce la muestra en los recipientes estériles con los utensilios que usa normalmente para servir los alimentos.
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Identificación de la muestra La muestra debe ser identificada de manera clara y completa con la siguiente información mínima:
En caso de alimentos líquidos y semilíquidos: agitar o mezclar hasta conseguir homogenizar y después efectuar la toma de muestra en diferentes niveles.
Cuando la toma de muestra se realice en un conducto de salida o una compuerta de una partida a granel, antes de obtener la muestra se deben dejar pasar las primeras fracciones del producto para limpiar dicha salida con el flujo.
En productos a granel: tomar la muestra de varios puntos del contenedor para obtener una muestra representativa.
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Naturaleza del alimento.
No. de lote. Fecha de vencimiento.
Peso de la muestra.
Fecha, lugar y hora del muestreo.
Razones del muestreo.
T° del producto en el momento del muestreo.
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Transporte de la muestra Debe asegurar que se minimice la alteración en el número de microorganismos presentes. La muestra se envía al laboratorio con prontitud, manteniendo dentro de lo posible, las condiciones de almacenamiento originales. c S M z e n í t r a M a l e c r a M
Debe empaquetarse de forma que se eviten roturas o derrames. Las muestras que necesitan refrigeración o congelación deben transportarse en contenedores aislantes, con refrigerantes o hielo seco, a fin de mantener las temperaturas de transporte respectivas.
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Temperaturas de transporte recomendadas
No debe utilizase hielo suelto para evitar contaminaciones.
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Recepción de la muestra Si las condiciones no son satisfactorias o la muestra es insuficiente, el laboratorio debería rechazarla.
Productos estables: temperatura ambiente <40ºC
Productos inestables a temperatura ambiente: entre 1ºC y 8ºC
Documentar las muestras admitidas de tal manera que se garantice la trazabilidad en todas las fases:
Productos congelados y ultracongelados: entre - 15ºC y -18ºC
c S M z e n í t r a M a l e c r a M
- Identidad y codificación. - Fecha y hora de recibo. - Detalles del muestreo (fecha, hora y lugar). - Nombre y dirección del cliente.
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- Temperatura de recepción. Examinar las muestras tan pronto sea posible: 21
Referencia:
- Productos altamente perecederos: antes de 24 h.
NTC 4092:2009 Microbiología de los alimentos y productos para alimentación animal Requisitos generales y directrices para análisis microbiológico.
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- Productos perecederos: Máximo 36 h.
Preparación de la muestra DILUYENTE 9 x mg ó ml
DILUYENTES: • Peptona Bufferada
ALIMENTO mg ó ml
STOMACHER
• Buffer Fosfato • Peptona salina
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HOMOGENEIZADO DILUCIÓN 1:10 (10 -1) 23
Norma
Porción de ensayo
Diluyentes 1- Agua de peptona salina
ICMSF
Alimentos no homogéneos 50 g alimentos no menor a 10 g ó ml.
BAM-FDA
Entre 50 y no menos de 10 g ó ml de alimento.
Buffer Fosfato de Butterfield (KH2PO4)
ISO 68871:1999
Muestra representativa Peptona Bufferada m g ó V ml, no menor a Buffer Fosfato 10 g ó ml. Peptona salina
2- Agua de peptona
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Manteniendo condiciones asépticas
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Métodos de recuento y detección de microorganismos en la industria alimentaria
Preparación de diluciones Muestras sólidas Muestras líquidas
Solución madre: 1/10 de alimento en Diluyente
Solución madre: 1/10 de alimento en Diluyente
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10 ml
10 ml
10-1
10-2
10-3
10-4
10 -5
10-1
10-2
10-3
10-4
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10-5
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Métodos cualitativos
Métodos microbiológicos
Métodos rápidos
1. Métodos cualitativos •
Métodos convencionales
•
Métodos rápidos
2. Métodos cuantitativos • Métodos rápidos • Filtración por membrana • Numero Más Probable (NMP)
Están diseñados c S M z e n í t r a M a l e c r a M
• Recuento en placa
para determinar si una muestra de alimentos contiene o no una especie microbiana específica.
Métodos convencionales
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a. Por profundidad b. Por superficie
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Microorganismos a detectar
Método convencional
• Salmonella spp.
1. Enriquecimiento previo NO selectivo
• Listeria monocytogenes • E. coli O157:H7 • Vibro cholerae
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• Clostridium botulinum 29
Reparar células lesionadas o estresadas y proliferen hasta una cantidad medible.
2. Enriquecimiento selectivo
Proliferación del patógeno específico y multiplicación abundante.
3. D iferenciación
Desarrollo de colonias características del patógeno en medios selectivosdiferenciales
Identificación
Realización de pruebas bioquímicas y serológicas.
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5
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Métodos rápidos • Detectar patógenos. • Cargas bacterianas. c S M z e n í t r a M a l e c r a M
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2
1
3
• Toxinas. • Verificar los controles del proceso de manufactura. • Vigilar las prácticas de limpieza y desinfección utilizadas en cada planta.
• Son rápidos. • Sensibles. • Específicos. • Entrega oportuna de desviaciones de proceso.
5
1. Rehidratar el medio con agua estéril. 4. 2. Añadir 25 g de la muestra e incubar por 5. 8-20 h. 3. Transferir 2 mL de la muestra a un tubo 6. de ensayo.
Filtración por membrana
Calentar por 10 minutos. Enfriar la muestra y agregar 5 gotas a la paleta. Leer el resultado.
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Ventajas
• Requieren menos trabajo.
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6 33
Métodos cuantitativos
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Filtración por membrana
Numero más probable
Recuento en placa
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c S M z e n í t r a M a l e c r a M
1. Filtrar un volumen determinado de la muestra de agua a analizar a través de una membrana de 0,45m 2. Incubar en placas con medios de cultivo selectivos.
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3. Realizar el recuento.
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Método Filtración por Membrana
Método Filtración por Membrana
Paso 1:
Paso 2:
En condiciones asépticas, se utiliza un filtro de membrana de 0,45 µm de tamaño de poro que se coloca en el portafiltros de la rampa de filtración de vacío.
Se coloca el embudo del filtro previamente esterilizado.
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c S M z e n í t r a M a l e c r a M
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Método Filtración por Membrana
Método Filtración por Membrana
Paso 3:
Paso 4: Una vez finalizado, se recoge el filtro con unas pinzas estériles y se coloca en medios de cultivo selectivos.
Se inicia la filtración de los 100 mL de agua.
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c S M z e n í t r a M a l e c r a M
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Método Filtración por Membrana
Número más probable (NMP)
Paso 5:
Se incuban a la temperatura y tiempo indicados según el microorganismo y se hace el recuento.
• Determina la presencia/ausencia de un atributo específico del m.o. en réplicas obtenidas por diluciones consecutivas .
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• Una sola célula viva puede desarrollarse y producir un cultivo turbio. • Al aumentar el factor de dilución, algunos tubos contendrán tan sólo un microorganismo y otros tubos no contendrán ninguno. • Al calcular la probabilidad de que los tubos n o hayan recibido ninguna célula, se puede estimar el NMP de m.o. presentes en la muestra original, a partir de una tabla estadística.
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42
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Procedimiento
NMP de coliformes
Sembrar cada dilución por quintuplicado 1
2
3
4
5
10-1
Crecimiento y formación de gas
No crecimiento ni formación de gas
10-1
1 ml
1 ml
1
2
3
4
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5
10-2
10-2 1 ml 1
Muestra
2
3
4
5
10-3
44
10-3
Realizar diluciones hasta 10-3
Tabla de NMP
Recuento en placa
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• Es un método de recuento de células viables (aquella capaz de dividirse y originar descendencia).
c S M z e n í t r a M a l e c r a M
• En la mayoría de los casos se hacen diluciones de la muestra antes de la siembra. 45
• Se cuentan las células capaces de formar colonias cuando se inoculan en un medio de cultivo sólido luego de un periodo de incubación.
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• El resultado se expresa como UFC/ml.
Métodos de siembra Superficie
Profundidad
c S M z e n í t r a M a l e c r a M
Se inocula 0,1 ml de la muestra sobre la placa de agar y se extiende con una asa.
Se mezcla 1 ml de la muestra con el medio de cultivo fundido y se deja solidificar.
47
48
8
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Ensayo cuantitativo
Guía general para el recuento de microorganismos
Recuento en medio sólido: Cuántas placas se deben sembrar? -1 placa por dilución para un mínimo de dos diluciones consecutivas si el laboratorio trabaja bajo un sistema de garantía de calidad (ISO 17025)
8 1 2 7 O S I
10-1 10-2 - Si se realiza una sola dilución o el laboratorio no trabaja bajo un sistema de garantía de calidad, deben sembrarse 2 placas 50
10-1
Generalidades:
10-2
Método de cálculo: caso general
― Inoculación de una placa de Petri de 90 mm Ø por
cada dilución.
N =
― Recuento máximo de colonias totales presentes:
300 por placa.
ΣC V (n1 + 0,1n2)d
Donde:
― Recuento máximo de colonias típicas o
ΣC es la suma de la s colonias conta da s en todas la s placas escogidas de dos diluciones sucesivas, en las que al menos una contiene 15 colonias.
sospechosas: 150 por placa. ― Número de colonias sospechosas inoculadas para su
V es el volumen del inóculo aplicado a cada placa, en mililitros;
identificación de cada placa escogida: 5
n1 es el númerode placasescogidasen la primera dilución;
Estas cifras se definen en las normas específicas
51
n2 es el númerode placas escogidasen la segunda dilución;
52
d es la dilución correspondiente a la primera dilución escogida.
Ejemplo: Esquema de siembra para muestra líquida Siembra directa 100 10-1
10-2
10-3
El conteo delproducto líquido da los siguientes resultado: En la primera dilución escogida (10-2): 232 y 244 colonias
10-4
En la segunda dilución escogida (10-3): 33y 28colonias
Aplicandola fórmula: N =
1 mL
ΣC
=
V (n1 + 0,1n2)d Incontables 1800, 1722
232, 244
33, 28
232+244+33+28 –2
1 (2+0,1x2) x 10
=
537 = 24.409
0,022
1, 3
Se deben escoger para el recuento las placas ≤ 300 y ≥ 10 colonias
53
54
9
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Método de cálculo: después de la identificación Los resultados se redondean a dos cifras significativas.
Cuando el método requiere identificación, se identifican un número A de colonias sospechosas de cada placa escogida para el recuento. Tras la identificación, se calcula el nº de colonias de cada placa, a, que cumple con los criterios de identificación con la siguiente fórmula: a= bxC A
Si la tercera cifra es inferior a 5, no se modifica la cifra anterior; si es 5 o más, la cifra anterior se incrementa en una unidad. 24.409
24.000
Se toma como resultado el número de microorganismos por mililitro (productos líquidos) o por gramos (productos sólidos), expresados como un número entre 1,0 y 9,9 multiplicado por la potencia de 10 adecuada o un número entero con dos cifras significativas.
2,4 x 104 ó 24.000 UFC/mL
b es el nº de colonias que cumplen con los criterios de identificación dentro de las colonias identificadas A. C es el nº total de colonias sospechosas contadas en cada placa.
55
El número de microorganismos identificados se calcula reemplazando ΣC por Σa en la fórmula.
El recuento da los siguientes resultado:
Método de cálculo: recuento bajo
- en la primera dilución escogida(10-3): 66 colonias;
Si la placa contiene < 10 colonias, pero como mínimo 4, el resultado se calcula siguiendo el caso general y se expresa como:
- en la segunda dilución escogida (10-4): 4 colonias. Realizamos la identificación de las colonias: - De las 66 colonias, se identificaron 8 (A) de las cuales 6 (b) cumplieron con los criterios a= bxC
6 x 66
A
Número estimado de microorganismos / g ó mL Si el recuento oscila entre 1 y 3, la precisión del análisis es demasiado baja y el resultado debe expresarse como:
a = 50
8
- De las 4 colonias, las 4 cumplieron con los criterios, a = 4
Hay microorganismos presentes, pero a un nivel inferior a 4 x 1/ d (dilución) / g ó mL
Aplicando la fórmula: N =
Σa
V x 1 , 1 x d
=
50 + 4 1x1,1x10
= 54 –3
56
= 49.0 90
0,011
57
El resultado se informa 4,9 x 10 4 ó 49.000 UFC/ g ó mL
Si la dilución inoculada es 10 -1: Hay microorganismos presentes, pero a un nivel inferior 40 UFC/g ó mL
Ejemplo 1 :
Caso en que la placa no contiene colonias
Líquidos
Sólidos
100
Si la placa de siembra directa para productos líquidos o la suspensión inicial para productos sólidos, o la primera dilución inoculada no contiene colonias, el resultado se expresa:
58
10-1
10-2
10-3
Siembra directa
Menor de 1/d / g ó mL
Sin Desarrollo
Donde d es la dilución de la suspensión inicial o la primera dilución inoculada.
Sin Desarrollo
Sin Desarrollo
Sin Desarrollo
Menos de 1 por mililitro (productos líquidos) <
1 UFC/mL
Menos de 1/d por gramo (productos sólidos) 59
En donde d es la dilución de la suspensión inicial.
60
Si la dilución inicial es 10-1 : < 10 UFC/g
10
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Ejemplo 2 10-2
10-3
10-4
10-5 Ejemplo 3: Recuentos superior a 300 colonias Si el recuento de las colonias en todas las placas de todas las diluciones es mayor de 300 el resultado se expresa: Más de
300 / microorganismos d
/ g ó mL
Donde d esla dilucióncorrespondientea laúltima diluciónescogida
Sin Desarrollo
Sin Desarrollo
Sin Desarrollo
Sin Desarrollo
Ejemplo: Si la última dilución (más diluida) sembrada fue 10-3 el resultado se expresa como:
Menos de 1/d . En donde d es la primera dilucióninoculada.
Más de 300.000 microorganismos/ mL o g
En este ejemplo donde la primera dilucióninoculada es 10 -2 El resultado es <
100 UFC/g sies unproducto sólido < 100 UFC/mL si es unproducto líquido.
o
61
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Ensayos cualitativos
Nunca informar !!!
•Cero (0)
Un método de detección es el que determina la presencia o ausencia de microorganismos en una cantidad dada de producto
•Sin Desarrollo •No se observa desarrollo 63
Si el microorganismo buscado ha sido detectado, se informa el resultado de la siguiente manera:
Informe de resultados
“Presencia en X ml analizados (productos líquidos) o X g ( productos sólidos)”
Los resultados deben ser informados en forma exacta, clara, no ambigua y objetiva
Si el microorganismo buscado no ha sido detectado, se informa el resultado de la siguiente manera: “Ausencia en X ml analizados (productos líquidos) o X g (productos sólidos)”
Bajo ninguna circunstancia se generaliza a cantidades mayores de producto
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66
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Debe incluir: - Título: “Informe de Ensayo”. - Nombre y Dirección del Laboratorio. - Identificación única del Informe y Paginado. - Nombre y Dirección del cliente. - Identificación del Método utilizado. - Descripción, condición e identificación exacta de la muestra. - Fecha de recepción y fecha de ejecución del ensayo. - Referencia al plan y procedimiento de muestreo (si corresponde).
- Los resultados con sus unidades de medida. - Nombre, función y firma de los responsables. - Declaración que los resultados sólo están relacionados con la
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“Solo una cosa vuelve a un sueño imposible: el miedo a fracasar”
68
Paulo Coelho
muestra ensayada.
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