alat sterilisasi Alat sterilisasi baik media maupun peralatan yang digunakan untuk proses isolasi dan penanaman eksplan yang sering digunakan adalah autoklaf. Tipe autoklaf yang dapat digunakan untuk sterilisasi ste rilisasi ada bermacam-macam, mulai dari yang sederhana sampai digital (terprogram). Autoklaf yang sederhana menggunakan sumber uap dari pemanasan air yang ditambahkan ke dalam autoklaf. Pemanasan air dapat menggunakan kompor atau api Bunsen. Dengan autoklaf sederhana ini, tekanan dan temperatur diatur dengan jumlah panas dari api. Kelemahan autoklaf ini adalah bahwa perlu penjagaan dan pengaturan panas secara manual, selama masa sterilisasi dilakukan. Tetapi autoklaf ini mempunyai keuntungan: sederhana, harga relatif murah, tidak tergantung dari aliran listrik yang sering merupakan problema untuk negara-negara yang sedang berkembang, serta lebih cepat dari autoklaf listrik yang seukuran dan setaraf. Autoklaf yang lebih komplit menggunakan sumber energi dari listrik. Alatnya dilengkapi dengan timer dan thermostat. Bila pengatur automatis ini berjalan dengan baik. Maka autoklaf dapat dijalankan sambil mengerjakan pekerjaan lain. Kelemahannya adalah bila salah satu pengatur tidak bekerja, maka pekerjaan persiapan media menjadi sia-sia dan kemungkinan menyebabkan kerusakkan total pada autoklaf. Sebagai sumber uap, juga j uga berasal dari air yang ditambahkan ke dalam autoklaf dan didihkan. Untuk laboratorium komersial, diperlukan autoklaf dengan kapasitas besar dan sumber uap biasanya dari boiler yang terpisah. Autoklaf Au toklaf ini sangat cepat dan dapat diprogam waktu sterilisasi, serta waktu pendinginan. Setelah sterilisasi bahan atau alat selesai, temperatur dan tekanan autoklaf diturunkan secara perlahan-lahan dalam waktu 15-20 menit. Pada autoklaf yang programmable,
panas ini diatur secara atomatis. Tetapi pada autoklaf yang sederhana hal ini harus diatur secara manual.
Autoklaf
Pada prinsipnya, sterilisasi autoclave menggunakan panas dan tekanan dari uap air. Temperature sterilasi biasanya 121o C, tekanan yang biasa digunakan antara 15-17,5 psi (pound per square inci) atau 1 atm. Lamanya sterilisasi tergantung dari volume dan jenis. Alat-alat dan air disterilkan selama 1 jam, tetapi media antara 20-40 menit tergantung dari volume bahan yang disterilkan. Sterilisasi media yang terlalu lama menyebabkan : 1. Penguraian gula. 2. Degradasi vitamin dan asam-asam amino. 3. Inaktifasi sitokinin zeatin riboside. 4. Perubahan pH yang berakibatkan depolimerisasi agar.
Autoklaf gas atau listrik portable pada umumnya mempergunakan sumber uap dari pemanasan air yang ditambahkan ke dalam autoklaf, sedangkan autoklaf besar pada laboratorium komersil pada umumnya menggunakan uap dari boiler sentral.
Bagian-bagian autoklaf : 1. Panci luar. 2. Panci dalam tempat meletakkan botol dengan alur tempat saluran uap. 3. Tutup beserta penunjuk tekanan dan saluran uap.
panas ini diatur secara atomatis. Tetapi pada autoklaf yang sederhana hal ini harus diatur secara manual.
Autoklaf
Pada prinsipnya, sterilisasi autoclave menggunakan panas dan tekanan dari uap air. Temperature sterilasi biasanya 121o C, tekanan yang biasa digunakan antara 15-17,5 psi (pound per square inci) atau 1 atm. Lamanya sterilisasi tergantung dari volume dan jenis. Alat-alat dan air disterilkan selama 1 jam, tetapi media antara 20-40 menit tergantung dari volume bahan yang disterilkan. Sterilisasi media yang terlalu lama menyebabkan : 1. Penguraian gula. 2. Degradasi vitamin dan asam-asam amino. 3. Inaktifasi sitokinin zeatin riboside. 4. Perubahan pH yang berakibatkan depolimerisasi agar.
Autoklaf gas atau listrik portable pada umumnya mempergunakan sumber uap dari pemanasan air yang ditambahkan ke dalam autoklaf, sedangkan autoklaf besar pada laboratorium komersil pada umumnya menggunakan uap dari boiler sentral.
Bagian-bagian autoklaf : 1. Panci luar. 2. Panci dalam tempat meletakkan botol dengan alur tempat saluran uap. 3. Tutup beserta penunjuk tekanan dan saluran uap.
4. Katup pengeluaran uap. 5. Pengunci atau klem.
Sterilisasi Media Mmenggunakan Autoklaf Portable (Pemanasan menggunakan api)
1. Isi panci luar dengan air, kalau dapat dengan de ngan aquadest untuk menghindarkan pengendapan Ca yang biasa terdapat pada air ledeng, sebanyak 1 liter untuk autoklaf kecil, dan 1.5 liter untuk autoklaf besar. 2. Botol-botol media yang akan disterilkan, dimasukkan ke dalam panel-dalam. Susun botol-botol tersebut hingga mencapai permukaan panel. 3. Atur posisi panci dengan memperhatikan alur tempat saluran uap yang terdapat pada tutup dan lingkaran permukaan panci-luar . 4. Tutup dengan erat. (kencangkan pengunci tanpa menggunakan alat) 5. Biarkan katup pengeluaran uap dalam keadaan terbuka. 6. Letakkan autoklaf di atas kompor gas atau pembakar Bunsen. 7. Panaskan sampai air dalam autoklaf mendidih dan uap mulai keluar dari katup pengeluaran uap. 8. Biarkan uap keluar selama 5 menit (minimum), untuk mengeluarkan udara mengeluarkan udara yang terperangkap dalam autoclave. 9. Tutup katup pengeluaran uap. 10. Amati kenaikan temperature dan tekanan. 11. Setelah tekanan mencapai 15 psi, api kompor dikecilkan. 12. Jaga keadaan tekanan 15 psi ini dengan mengatur besar kecilnya ke cilnya api kompor secara manual. Selama sterilisasi, jangan meninggalkan autoklaf dan mengerjakan
hal lain diruang lain, karena tekanan dapat meningkat sampai melewati batas. Keadaan ini berbahaya dan dapat menyebabkan kerusakan alat. 13. Setelah waktu sterilisasi tercapai, matikan api kompor. 14. Uap dikeluarkan sedikit-sedikit dengan mengatur katup pengeluaran uap (buka sedikit-sedikit). Jangan sekali-kali membuka katup dan membiarkan uap keluar sekaligus. Keadaan ini menyebabkan media atau air bubble up 15. Setelah tekanan turun sampai 0, buka pengunci dan keluarkan panci yang berisi media.
Sterilisasi Aquadest dan Media Menggunakan Autoklaf Listrik (Digital Atau Non Digital)
Dalam sterilisasi aquadest, lebih efektif bila digunakan wadah yang mempunyai volume antara 300 – 500 ml. Isi wadah tersebut sampai 80% volume, dan tutup dengan kertas, serta kencangkan dengan karet gelang. Media disterilkan dalam autoklaf. Untuk aquadest sebaiknya dimasukkan dalam wadah kecil misalnya erlemeyer 250 ml dengan isi maksimum 100 ml, agar sterilisasi lebih efektif. Waktu sterilisasi sama dengan waktu untuk sterilisasi alatalat waktu 30 menit pada tekanan 15 psi. atau 1 atm. Untuk media kultur yang tidak mengandung bahan-bahan yang Heat-labile, sterilisasi dilakukan dengan autoklaf pada temperatur 121oC, tekanan antara 15 psi atau 1 atm dengan waktu antara 20-25 menit tergantung dari volume wadah dan volume media. Untuk 15-50 ml media dalam tabung reaksi atau botol kecil berukuran 50-100 ml, sterilisasi dilakukan pada tekanan 15 psi dengan waktu 20
menit. Untuk 20 botol volume 1 liter membutuhkan waktu yang lebih lama yaitu 34 menit, 10 botol volume 2 liter memerlukan waktu 37 menit, 5 botol 4 liter waktu yang digunakan 52 menit. Dengan waktu yang lebih lama. Dalam sterilisasi aquadest dan media, setelah waktu sterilisasi yang diinginkan sudah tercapai, autoklaf tidak boleh diturunkan tekanannya secara mendadak. Bila tekanan diturunkan mendadak, cairan didalamnya mendidih dan meluap (bubbled up). Untuk bahan-bahan yang heat-labile dalam bentuk larutan, sterilisasi dilakukan dengan menyaring larutan melalui filter yang mempunyai ukuran pori 0.20-0.22 um. Diameter filter yang bermacam-macam tergantung dari volume larutan yang ingin disterilkan. Untuk volume larutan 10 ml, dipergunakan filter yang dipasang di ujung jarum suntik. Bahan yang heat labile antara lain : GA3, Thiamin-HCL, Capanthothenate, Antibiotik: carbenocilin.
Sterilisasi Peralatan Kultur
1. Botol bersih diberi beberapa tetes aquadest dan tutup dengan kertas atau aluminium foil (jangan terlalu kencang bila menggunakan al-foil). Untuk botolbotol yang mempunyai tutup yang autoclaveable, jangan tutup terlalu kencang, karena selama pemanasan terjadi pemuaian. 2. Alat-alat yang perlu disterilkan sebelum penanaman adalah: pinset, gunting, gagang skalpel, kertas saring, petri-dish, botol-botol kosong, jarum dan pipet. 3. Alat-alat dan kertas saring dibungkus rapi dengan kertas tebal atau ditaruh dalam baki stainless steel dan bakinya dibungkus dengan kain tebal sebelum dimasukkan dalam autoklaf. Alumunium foil tidak direkomendasikan sebagai pembungkus, karena uap tidak dapat masuk ke dalam bungkusan. Alat-alat sektio
seperti pinset, gunting, gagang skalpel, dan jarum, dibungkus dengan kertas kopi atau kertas merang. Hindarkan penggunaan Al-foil karena uap sukar masuk kedalam bungkusan sehingga sterilisasi kurang efektif. 4. Petri-dish akan disterilkan, juga dibungkus dengan kertas kopi atau kertas merang. 5. Temperatur yang digunakan untuk sterilisasi botol kultur kosong dan alat-alat yang akan digunakan untuk menanam eksplan, adalah 121o C pada tekanan 15 psi (pound per square inch) atau 1 atm selama 30-60 menit. Penghitungan waktu sterilisasi dimulai setelah tekanan dan temperatur yang diinginkan tercapai. . Alat-alat yang dipakai ketika penanaman, harus dalam keadaan steril. Alat-alat logam dan gelas dapat disterilkan dalam autoklaf. Alat tanam seperti: pinset dan gunting dapat juga disterilkan dengan pembakaran atau dengan pemanasan dalam bacticinerator. Khusus untuk skalpel, gagangnya dapat disterilkan dengan pemanasan, namun mata pisaunya (blade) dapat menjadi tumpul bila dipanaskan dalam temperature tinggi. Oleh karena itu untuk mata pisaunya dianjurkan cara sterilisasi dengan pencelupan dalam alkohol atau larutan kaporit.
Sterilisasi menggunakan Oven
Botol-botol/tabung reaksi/erlenmeyer yang dipergunakan sebagai wadah, biasanya disterilkan dalam oven. Botol-botol yang sudah dicuci bersih, dimasukkan ke dalam oven dan dipanaskan selama 4 jam pada temperatur 160o
C. Setelah disterilkan dapat langsung digunakan. Bila botol akan disimpan untuk beberapa lama, maka sewaktu sterilisasi, mulut botol harus ditutup dengan alumunium foil.
Sterilisasi Gas Sterilisasi gas digunakan dalam pemaparan gas atau uap untuk membunuh mikroorganisme dan sporanya. Meskipun gas dengan cepat berpenetrasi ke dalam pori dan serbuk padat, sterilisasi adalah fenomena permukaan dan mikroorganisme yang terkristal akan dibunuh. Sterilisasi yang digunakan dalam bidang farmasi untuk mensterilkan bahan-bahan dan menghilangkan dari bahan yang disterilkan pada akhir jalur sterilisasi, gas ini tidak inert, dan kereaktifannya terhadap bahan yang disterilkan harus dipertimbangkan misalnya thiamin, riboflavin, dan streptomisin kehilangan protein ketika disterilkan dengan etilen oksida. Etilen oksida bereaksi sebagai bakterisida dengan alkalis asam amino, hidroksi atau gugus sulfur dari enzim seluler atau protein. Beberapa lembab dibutuhkan untuk etilen oksida berpenetrasi dan menghancurkan sel. Kelembaban rendah misalnya minimal 20%, angka kematian tidak logaritmik (tidak nyata). Tetapi mikroorganisme muncul peningkatan resistensinya dengan penurunan kelembaban. Dalam prakteknya, kelembaban dalam chamber pensteril ditingkatkan dari 50-60% dan dipegang untuk suatu waktu pada permukaan dan kelembaban membran sel sebelum penggunaan etilen oksida. Etilen oksida bersifat eksplosif ketika dicampur dengan udara. Penghilangan sifat eksplosif dengan menggunakan campuran etilen oksida dan karbondioksida. Seperti Carboxide, Oxyfume 20, campuran etilen oksida dengan hidrokarbon
terflouronasi seperti Storoxide 12. Keduanya diluent inert yang mempunyai tekanan uap yang tinggi dan bereaksi sebagai pembakar etilen oksida keluar dari silinder masuk ke dalam chamber steril. Komponen terfloronasi mempunyai keuntungan over karbondioksida yang disimpan dalam wadah yang ringan dan campuran mengizinkan tekanan parsial tinggi dari etilen oksida pada chamber pensteril pada tekanan total yang sama. Sterilisasi gas berjalan lambat waktu sterilisasi tergantung pada keberadaan kontaminasi kelembaban, temperatur dan konsentrasi etilen oksida. Konsentrasi minimum etilen oksida dalam 450 mg/L, 271 Psi, konsentrasi ini 85°C dan 50% kelembaban relativ dibutuhkan 4-5 jam pemaparan. Di bawah kondisi sama 1000 mg/L membutuhkan sterilisasi 2-3 jam. Dalam partikel 6 jam pemaparan etilen oksida digunakan untuk menyiapkan tepi yang aman dan memperbolehkan waktu untuk penetrasi gas ke dalam bahan sterilisasi. Sisa gas dihilangkan dengan terminal vakum dilanjutkan oleh pembersihan udara yang difiltrasi. Cara ini digunakan untuk mensterilkan obat serbuk seperti penisilin, juga telah digunakan untuk sterilisasi benang, plastik tube. Penggunaan etilen oksida untuk sterilisasi akhir peralatan parenteral tertentu seperti kertas karf dan lapisan tipis polietilen. Semprot aerosol etilen oksida telah digunakan untuk mensterilkan daerah sempit dimana dilakukan teknik aseptis. Gas yang biasa digunakan adalah etilen oksida dalam bentuk murni atau campuran dengan gas inert lainnya. Gas ini sangat mudah menguap dan sangat mudah terbakar. Merupakan agen alkilasi yang menyebabkan dekstruksi mikroorganisme termasuk sel-sel spora dan vegetatif. Sterilisasi dilakukan dalam ruang/chamber sterilisasi. Sterilisasi menghasilkan bahan toksik seperti etilen klorohidrin yang menghasilkan
ion klorida dalam bahan-bahan. Digunakan untuk sterilisasi ala-alat medis dan baju-baju medis, bahan-bahan seperti pipet sekali pakai dan cawan petri yang digunakan dalam laboratorium mikrobiologi. Residu etilen oksida adalah bahan yang toksik yang harus dihilangkan dari bahan –bahan yang disterilkan setelah proses sterilisasi, yang dapat dilakukan dengan mengubah suhu lebih tinggi dari suhu kamar. Juga perlu dilakukan perlindungan terhadap personil dari efek berbahaya gas ini. Faktor-faktor yang mempengaruhi sterilisasi ini termasuk kelembaban, konsentrasi gas, suhu dan distribusi gas dalam chamber pengsterilan. Penghancuran bakteri tergantung pada adanya kelembaban, gas dan suhu dalam bahan pengemas, penetrasi melalui bahan pengemas, pada pengemas pertama atau kedua, harus dilakukan, persyaratan desain khusus pada bahan pengemas. Mekanisme aksi etilen oksida Etilen oksida dianggap menghasilkan efek letal terhadap mikroorganisme dengan mengalkilasi metabolit esensial yang terutama mempengaruhi proses reproduksi. Alkilasi ini barangkali terjadi dengan menghilangkan hidrogen aktif pada gugus sulfhidril, amina, karboksil atau hidroksil dengan suatu radikal hidroksi etil metabolit yang tidak diubah dengan tidak tersedia bagi mikroorganisme sehingga mikroorganisme ini mati tanpa reproduksi. B. STERILISASI SECARA MEKANIK
Filter Bakteri Cara kerja dari sterilisasi ini berbeda dari metode lainnya karena sterilisasi ini menghilangkan mikroorganisme melalui penyaringan dan tidak menghancurkan mikroorganisme tersebut. Penghilangan mikroorganisme secara fisik melalui
penyaring dengan matriks pori ukuran kecil yang tidak membiarkan mikroorganisme untuk dapat melaluinya. Cara sterilisasi ini untuk produk berupa cairan yang dapat disaring atau bahan yang tidak tahan terhadap panas dan tidak dapat disterilkan dengan cara sterilisasi lain. Teknologi tinggi membran filtrasi meningkatkan penggunaan sterilisasi filtrasi, khusunya jika digunakan berpasangan dengan sistem proses aseptik. Keefektifan sterilisasi filtrasi dapat merupakan fungsi magnitude dari beban mikroorganisme, selama tersumbat pada penyaring dapt terjadi pada konsentrasi yang tinggi dari mikroorganisme. Tekanan, laju aliran, dan karakteristik dari peenyaring adalah parameter yang harus dikontrol untuk mencapai sterilisasi pada produk yang dapat diprediksi dan reproduksibel. Ukuran nominal pori penyaring 0,2 ?m atau kurang dan penyaring dibuat dari berbagai jenis bahan seperti selulosa asetat, selulosa nitrat, florokarbonat, polimer akrilik, polikarbonat, poliester, polivinil klorida, vinil, nilon, politef, dan berbagai tipe bahan lain termasuk memban logam. Larutan dapat dibebaskan dari organisme vegetatif dan spora bakteri dengan melalui filter bakteri, filter bakteri tidak membebaskan larutan dari virus. Bagaimanapun alat ini tidak mengurangi jumlah dan adanya virus, secara prinsip oleh adsorbsi pada dinding filter dan penghilangan partikel besar dari bahan yang mengandung virus. Sterilisasi dengan filter bakteri digunakan untuk larutan farmasetik atau bahan biologi yang tidak diefektifkan oleh panas. Berbeda dengan metode filtrasi lain, filter bakteri ditujukan untuk filtrasi bebas bakteri. Metode sterilisasi ini membutuhkan penggunaan teknik aseptik yang benar. Sediaan obat yang
disterilkan dengan metode ini dibutuhkan yang mengandung bahan, bakteristatik, kecuali dinyatakan lain. Larutan yang ditujukan untuk injeksi intratekal atau merupakan larutan dosis tunggal intravena dengan volume lebih dari 15 ml, tidak boleh ditambahkan bahan bakterisida. Paraffin cair dan minyak lain, tidak disterilkan dengan metode ini karena dapat meningkatkan permeabilitas dari filter bakteri. Untuk membuat larutan bebas dari bakteri dan steril, filter dengan berbagai tipe digunakan. Tipe ini termasuk filter yang terbuat dari silikon murni (diatomaccus atau klesegurh), porcelin, asbes dan gelas fritled. Karena alat-alat ini mudah dibersihkan filter seitz yang menggunakan lapisan asbes dan filter-glass mungkin lebih berguna untuk farmasis. Filter dengan pori yang lebih kecil menghilangkan bakteri tetapi beberapa filtrasi sangat lambat untuk tujuan praktis. Dengan meningkatnya kekentalan dari lilin filter sangat menghasilkan filtrasi yang efektif, tetapi kekurangannya adalah banyak dari bahan aktif larutan dihilangkan oleh adsorbsi pada lilin. Bagaimanapun, dengan mengatur ukuran pori dan kekentalan dari filter sampai optimum. Filter dapat menjadi sangat efisien dan sangat cepat. Faktor lain dari filter bakteri yaitu keseimbangan permukaan antara bahan dari filter dengan bakteri dari larutan, tekanan yang digunakan, waktu filtrasi, muatan listrik dan filter, pH dari bahan yang disaring dan absorpsi dari protein dan bahan lain. Filter seitz
Bagian dari filter ini dibuat dari bahan asbestos yang dijepit pada dasar wadah besi. Keuntungan utama dari filter seitz adalah lapisan filter dapat dibuang setelah digunakan dan untuk masalah ini pembersihannya berkurang. Efisiensi dari filter ini tergantung pada pengembangan serat dan lapisan filter oleh air. Karena
larutan alkohol pekat tidak mengembang, filter ini tidak digunakan untuk mensterilkan larutan yang mengandung alcohol dengan jumlah besar. Filter ini mampu dengan kapasitas volume dari 30 ml hingga lebih 100 ml. Kerugian pertama dari filter ini cenderung memberikan komponen magnesium pada filtrat. Bahan alkalin ini dapat menyebabkan pengendapan dari alkaloid bebas dari garamnya dan dapat menginaktifkan bahwa yang sensitiv seperti insulin, ekstrak pituitary, epinefrin, dan apomorphin. Hal ini dapat diatasi dengan perawatan pertama dengan filter dengan dibasahkan dengan HCl dan kemudian dibilas dengan air. Kerugian kedua dari seitz adalah permukaan serat dari lapisan filtrat, membuat larutan tidak cocok untuk injeksi. Ini dapat diatasi dengan menempatkan ayakan dari nilon atau sutra, di bawah lapisan filter sebelum menempatkan lapisan di dalam filter atau sebuah fritted glass dapat ditempelkan pada saluran. Kedua untuk menghilangkan serat. Filter seitz juga cenderung menghilangkan substrat dari filtrate dengan absorpsi. Filter Swinny Sebuah adaptasi dari filter seitz, filter swinny mempunyai adaptor khusus yaitu terdiri dari lapisan asbes, bersama dengan layer dan pencuci. Keutamaan untuk digunakan filter swinny di bungkus dengan kertas dan autoklaf. Bagian yang dipotong dihubungkan pada spoit werlock dan cairan dimasukkan ke potongan asbes dengan menggunakan tekanan pada sal spoit. Filter Fritted-Glass Filter Sintered Fritted-Glass dapat dihancurkan oleh kandungan dalam serbuk, tombol bulat dari gelas digabungkan bersama dengan penggunaan panas untuk menempatkan ukuran dari bentuk potongan. Permeabilitas dari filter berbanding
lurus dengan berkembangnya ukuran. Setelah potongan dibentuk, potongan disegel dengan pemanasan didalam gelas pirex seperti corong Buchner. Filter Berkefeld dan Mandler Mandler terbuat dari tanah silika murni, asbestos dan kalsium sulfat. Berkefeld disusun juga dari tanah silika murni. Masing-masing filter bermuatan negatif. Tersedia dalam beberapa prioritas berdasarkan permeabilitasnya ke dalam air dalam Bekerfeld atau Mandler. Filter Selas Filter ini secara kimia, menjadi resistensi terhadap semua larutan yang tidak menyerang silika. Karena masing-masing partikel meliputi filter semata-mata bersama selama proses manufaktur, ada bahaya kecil partikel-partikel dari filter jauh dalam larutan. Filter Candles-Pasteur-Chamberland Ada pemanasan dengan Bekerfeld tetapi dibuat dari pori porselen tak berkaca dengan pori kecil yang menghasilkan filtrasi lambat. C. STERILISASI SECARA FISIKA 1. Pemanasan Kering a. Udara Panas Oven Bahan yang karena karakteristik fisikanya tidak dapat disterilisasi dengan uap destilasi dalam udara panas-oven. Yang termasuk dalam bahan ini adalah minyak lemak, paraffin, petrolatum cair, gliserin, propilen glikol. Serbuk steril seperti talk, kaolin dan ZnO, dan beberapa obat yang lain. Sebagai tambahan sterilisasi panas kering adalah metode yang paling efektif untuk alat-alat gelas dan banyak alatalat bedah. Ini harus ditekankan bahwa minyak lemak, petrolatum, serbuk kering dan bahan
yang sama tidak dapat disterilisasi dalam autoklaf. Salah satu elemen penting dalam sterilisasi dengan menggunakan uap autoklaf. Atau dengan adanya lembab dan penembusannya ke dalam bahan yang telah disterilkan. Sebagai contoh, organisme pembentuk spora dalam medium anhidrat tidak dibunuh oleh suhu sampai 121o C (suhu yang biasanya digunakan dalam autoklaf bahkan setelah pemanasan sampai 45 menit). Untik alasan ini, autoklaf merupakan metode yang tidak cocok untuk mensterilkan minyak, produk yang dibuat dengan basis minyak, atau bahan-bahan lain yang mempunyai sedikit lembab atau tidak sama sekali. Selama pemanasan kering, mikroorganisme dibunuh oleh proses oksidasi. Ini berlawanan dengan penyebab kematian oleh koagulasi protein pada sel bakteri yang terjadi dengan sterilisasi uap panas. Pada umumnya suhu yang lebih tinggi dan waktu pemaparan yang dibutuhkan saat proses dilakukan dengan uap di bawah tekanan. Saat sterilisasi di bawah uap panas dipaparkan pada suhu 121°C selama 12 menit adalah efektif. Sterilisasi panas kering membutuhkan pemaparan pada suhu 150°C sampai 170°C selama 1-4 jam. Suhu yang biasa digunakan pada sterilisasi panas kering 160°C paling cepat 1 jam, tapi lebih baik 2 jam. Suhu ini digunakan secara khusus untuk sterilisasi minyak lemak atau cairan anhidrat lainnya. Bagaimanapun juga range 150-170°C digunakan untuk streilisasi panas kering dan lain-lain, sebagai contoh : bahanbahan gelas, dapat disterilkan pada suhu 170oC. dimana beberapa serbuk seperti sulfonilamid harus disterilkan pada suhu rendah dan waktu yang lebih lama. Secara umum, panas kering digunakan untuk sterilisasi bahan – bahan melalui proses pengabuan dari mikroorganisme. Proses ini merupakan kelanjutan atau sekumpulan proses yang dilakukan dalam sebuah oven dengan temperatur
sekelilingnya 170°C untuk sterilisasi atau 250°C untuk depirogenisasi. Panas kering digunakan untuk sterilisasi/depirogenisasi alat-alat gelas yang akan digunakan untuk proses produksi secara aseptik. Suhu yang digunakan ini, terlalu tinggi untuk wadah-wadah plastik. Sama seperti sterilisasi uap air, prosesnya dapat diprediksi dan hasilnya dapat dikontrol. Sterilisasi panas kering biasa digunakan untuk depirogenisasi alat-alat gelas dan bahan-bahan lain yang memiliki kemampuan bertahan pada suhu yang digunakan. Secara umum, validasi untuk alur depirogenisasi untuk proses panas kering selalu termasuk proses sterilisasinya. Panas kering pada temperatur lebih 160oC efektif menghancurkan mikroorganisme hidup dengan sebuah proses kehilangan kelembaban secara inversible. Proses ini berjalan relatif lambat, mengisyaratkan sedikitnya 1 jam pada suhu 160oC tetapi lebih cepat pada temperatur yang tinggi. Panas kering ini sering merugikan beberapa produk. Penerapan panas dengan keberadaan lembab lebih fektif untuk pembunuhan mikroorganisme diisyaratkan 15 menit pada suhu 121oC. Beberapa bahan yang tidak dapat disterilkan dengan uap, paling baik disterilkan dengan panas kering,. Misalnya petrolatum jelly, minyak mineral, lilin, wax, serbuk talk. Karena panas kering kurang efisien dibanding panas lembab, pemaparan lama dan temperatur tinggi dibutuhkan. Range luas waktu inaktivasi dalam temperatur bervariasi telah diterapkan berdasarkan tipe indikator steril yang digunakan, kondisi kelembaban dan faktor lain. Jumlah air dalam sel mikroba diketahui mempengaruhi resistensinya terhadap destruksi panas kering. Umumnya, ini diterima bahwa sel mikroba dalam daerah yang betul-betul kering menunjukkan resistensi terhadap inaktivasi panas kering.
Ini jelas bahwa perhatian harus diberi untuk mendisain siklus sterilisasi panas kering untuk produk-produk rumah sakit dan validasi sistematis sterilisasi dengan metode sterilisasi standar. Oven digunakan untuk sterilisasi panas kering biasanya secara panas dikontrol dan mungkin gas atau elektrik gas. Beberapa waktu dan suhu yang umum digunakan pada oven : * 170°C (340 F) sampai 1 jam * 160°C (320 F) sampai 2 jam * 150°C (300 F) sampai 2,5 jam * 140°C (285 F) sampai 3 jam b. Minyak dan penangas lain
Bahan kimia yang stabil dalam ampul bersegel dapat disterilisasi dengan mencelupkannya, dalam penangas yang berisi minyak mineral pada suhu 1620C. larutan jenuh panas dari natrium atau ammonia klorida dapat juga digunakan sebagai pensterilisasi. Ini merupakan metode yang mensterilisasi alat-alat bedah. Minyak dikatakan bereaksi sebagai lubrikan, untuk menjaga alat tetap tajam, dan untuk memelihara cat penutup. c. Pemijaran langsung Pemijaran langsung digunakan untuk mensterilkan spatula logam, batang gelas, filter logam bekerfield dan filter bakteri lainnya. Mulut botol, vial, dan labu ukur, gunting, jarum logam dan kawat, dan alat-alat lain yang tidak hancur dengan pemijaran langsung. Papan salep, lumping dan alu dapat disterilisasi dengan metode ini. Dalam semua kasus bagian yang paling kuat 20 detik. Dalam keadaan darurat
ampul dapat disterilisasi dengan memposisikan bagian leher ampul kearah bawah lubang kawat keranjang dan dipijarkan langsung dengan api dengan hati-hati. Setelah pendinginan, ampul harus segera diisi dan disegel.
2. Panas lembab a) Uap bertekanan
Stelisisasi termal menggunakan tekanan uap jenuh dalam sebuah autoklaf. Ini merupakan metode sterilisasi yang biasa digunakan dalam industri farmasi, karena dapat diprediksi dan menghasilkan efek dekstruksi bakteri, dan parameterparameter sterilisasi seperti waktu dan suhu dapat dengan mudah dikontrol dan monitoring dilakukan sekali dalam satu siklus yang divalidasi. Secara umum, sterilisasi panas lembab dilakukan pada suhu 121°C dibawah tekanan 15 psig. Pada suhu ini konsep letal dilakukan dengan F0 yang juga dilakukan bila suhu sterilisasi berbeda dari 121°C. F0 dari proses ini tidak jauh pada 121°C dengan waktu yang dibutuhkan, dalam menit, untuk menghasilkan kematian yang setara dengan hasil pada 121°C pada waktu tertentu. Penggunanaan uap bertekanan atau metode sterilisasi yang paling umum memuaskan dan efektif yang ada. Ini adalah metode yang diinginkan untuk sterilisasi larutan yang ditujukan untuk infeksi pada tubuh, pembawa pada sediaan mata, bahan-bahan gelas. Untuk penggunaan darurat, pakaian dan alat kesehatan dan benda-benda karet. Kerugian yang paling prinsip dan penggunaan uap ini adalah ketidaksesuaiannya untuk penggunaan pada bahan sensitif terhadap panas dan kelembaban. Metode ini tidak dapat digunakan untuk sterilisasi misalnya, produk yang dibuat
dari basis minyak dan serbuk. Uap jenih pada 120°C mampu membunuh secara cepat semua bentuk vegetatif mikroorganisme hidup dalam waktu ½ menit. Uap jenuh ini dapat menghancurkan spora vegetatif yang tahan terhadap pemanasan tinggi. Keefektifan sterilisasi uap bertekanan tergantung pada 4 sifat dari uap jenuh kering yaitu : • Suhu • Panas tersembunyi yang berlimpah • Kemapuan untuk membentuk kondensasi air • Kontraksi volume yang timbul selama kon densasi
Waktu yang dibutuhkan untuk mensterilkan larutan saat suhu 121oC selama 12 menit, ditambah waktu tambahan untuk larutan dalam wadah untuk mencapai 121°C setelah termometer pensteril menunjukkan suhu ini. Secara umum larutan dalam botol 100-200 ml akan membutuhkan kurang 5 menit botol 500 ml antara 10-15 menit. Panas lembab merupakan bentuk uap jenuh di bawah tekanan yang merupakan cara sterilisasi yang paling banyak digunakan. Penyebab kematian dengan cara sterilisasi panas terhadap lembab berbeda dengan cara panas kering, kematian mikroorganisme oleh panas lembab adalah hasil koagulasi protein sel, berbeda dengan cara panas kering, kematian mikroorganisme yang paling penting adalah proses oksidasi. USP menentukan sterilisasi uap sebagai penerapan uap jenuh di bawah tekanan paling kurang 15 menit dengan temperatur minimal 121oC dalam jaringan tekanan. Bentuk yang paling sederhana dari autoklaf adalah “home pressure cooker”.
b). Uap panas pada 100oC
Uap panas pada suhu 100oC dapat digunakan dalam bentuk uap mengalir atau air mendidih. Metode ini mempunyai keterbatasan penggunaan uap mengalir dilakukan dengan proses sterilisasi bertingkat untuk mensterilkan media kultur. Metode ini jarang memuaskan untuk larutan yang mengandung bahan-bahan karena spora sering gagal tumbuh dibawah kondisi ini, bentuk vegetatif dari kebanyakan bakteri yang tidak membentuk spora. Temperatur suhu titik mati bervariasi, tetapi tidak ada bentuk non spora yang bertahan. Dalam prakteknya, 2 metode uap mengalir digunakan, suatu perpanjangan pemaparan uap selama 20-60 menit akan membunuh semua bentuk vegetatif bakteri tapi tidak akan menghancurkan spora. Untuk meyakinkan penghancuran spora, sterilisasi berjeda yang juga disebut sterilisasi tidak berlanjut. Penjedahan dan bertahap adalah tindalisasi digunakan. Dengan metode ini bahkan dipaparkan pada uap mengalir pada periode waktu bervariasi dari 20-60 menit setiap hari selama 3 menit. Antara pemaparan bahan terhadap uap yang disimpan pada suhu kamar atau pada inkubator pada 37oC. prinsip dari metode ini adalah pada saat waktu pertama kali pemaparan pada uap membunuh bakteri vegetatif tapi tidak sporanya. Tapi pada saat bahan disimpan pada inkubator atau pada suhu ruangan selam 24 jam, banyak spora akan tumbuh ke dalam bentuk vegetatif bentuk spora yang telah tumbuh ini akan dimatikan pada pemanasan hari ke dua. Kesuksesan dari proses ini tergantung pada spora yang berkembang ke bentuk vegetatif selama masa istirahat. c). Pemanasan dengan bakterisida Ini menghadirkan aplikasi khusus dari pada uap pans pada 100oC. adanya bakterisida sangat meningkatkan efektifitas metode ini. Metode ini digunakan
untuk larutan berair atau suspensi obat yang tidak stabil pada temperatur yang biasa diterapkan pada autoklaf. Larutan yang ditumbuhkan bakterisida ini dpanaskan dalam wadah bersegel pada suhu 100oC selama 20 menit dalam pensterilisasi uap atau penangas air. Bakterisida yang dapat digunakan termasuk 0,5%, fenol, 0,5% klorbutanol, 0,2% kresol atau 0.002% fenil merkuri nitrat saat larutan dosis tunggal lebih dari 15 ml larutan obat untuk injeksi intratekal atau gastro intestinal sehingga tidak dibuat dengan metode ini. d). Air mendidih Penangas air mendidih mempunyai kegunaan yang sangat banyak dalam sterilisasi jarum spoit, penutup karet, penutup dan alat-alat bedah. Bahan-bahan ini harus benar-benar tertutupi oleh air mendidih dan harus mendidih paling kurang 20 menit. Setelah sterilisasi bahan-bahan dipindahkan dan air dengan pinset yang telah disterilisasi menggunakan pemijaran. Untuk menigkatkan efisiensi pensterilan dari air, 5 % fenol, 1-2% Na-carbonat atau 2-3% larutan kresol tersaponifikasi yang menghambat kondisi bahan-bahan logam. 3. Cara Bukan Panas
Sinar ultraviolet Sinar ultraviolet umumnya digunakan untuk membantu mengurangi kontaminasi di udara dan pemusnahan selama proses di lingkungan. Sinar yang bersifat membunuh mikroorganisme (germisida) diproduksi oleh lampu kabut merkuri yang dipancarkan secara eksklusif pada 253,7 nm . Sinar UV menembus udara bersih dan air murni dengan baik, tetapi suatu penambahan garam atau bahan tersuspensi dalam air atau udara menyebabakan
penurunan derajat penetrasi dengan cepat. Untuk kebanyakan pemakaian lama penetrasi dihindarkan dan setiap tindakan membunuh mikroorganisme dibatasi pada permukaan yang dipaparkan. Aksi letal Ketika sinar UV melewati bahan, energi bebas ke elektron orbital dalam atomatom dan mengubah kereaktivannya. Absorpsi energi ini menyebabkan meningginya keadaan tertinggi atom-atom dan mengubah kereaktivannya. Ketika eksitasi dan perubahan aktivitas atom-atom utama terjadi dalam molekul-molekul mikroorganisme atau metabolit utamnya, organisme itu mati atau tidak dapat berproduksi. Pengaruh utamanya mungkin pada asam nukleat sel, yang diperhatikan untuk menunjukkan lapisan absorpsi kuat dalam rentang gelombang UV yang panjang. Radiasi pengion Radiasi pengion adalah energi tinggi yang terpancar dari radiasi isotop radioaktif seperti kobalt-60 (sinar gamma) atau yang dihasilkan oleh percepatan mekanis elektron sampai ke kecepatan den energi tinggi (sinar katode, sinar beta). Sinar gamma mempunyai keuntungan mutlak karena tidak menyebabkan kerusakan mekanik, namun demikian, kekurangan sinar ini adalah di hentikan dari, mekanik elektron akselerasi (yang dipercepat) keuntungan elektron yang dipercepat adalah kemampuannya memberikan output laju doisis yang lebih seragam. Aksi letal radiasi pengionan menghacurkan mikroorganisme dengan menghentikan rep-roduksi sebagai hasil mutasi letal. Mutasi ini disebabkan karena transformasi radiasi menjadi molekul penerima pada sinar x, menurut teori langsung. Mutasi ini dapat disebabkan oleh tindakan tidak langsung, dimana molekul-molekul air diubah menjadi kesatuan yang berenergi tinggi seperti
hidrogen dan ion hidroksil. Semua ini pada akhirnya, menyebabkan perubahan energi pada asam nukleat dan molekul lain sehingga hilangnya keberadaannya bagi metabolisme molekul sel bakteri. Dekstruksi bakteri untuk menghasilkan kondisi steril dapat dilakukan dengan menggunakan radiasi pengion, dengan efek pada asam nukleat dari mikroorganisme yang nonreversibel. Pembentukan radikal bebas dan peroksida yang merupakan senyawa reaktif juga memberikan kontribusi pada letalitas dari proses sterilisasi ini. Dua tipe radiasi pengion yang dapat digunakan yaitu radiasi sinar gamma dan radiasi electron. Sterilisasi dengan radiasi digunakan untuk alat-alat medis yang sensitive terhadap panas dan jika residu etilen oksida tidak diharapkan. Pengukuran presisi dari dosis radiasi, yang tidak berhubungan dengan suhu, adalah merupakan faktor kontrol dalam sterilisasi radiasi selama dengan waktu iradiasi. Monitoring dan kotrol proses sangat sederhana, tetapi kehati-hatian akan keamanan harus dilakukan oleh operator sterilisasi. Radiasi pengion juga digunakan untuk sterilisasi bahan-bahan obat dan bahanbahan formulasi. Kompabilitas dari bahan yang disterilkan dengan radiasi adalah factor yang harus diperhatikan sejak bahan-bahan dan alat-alat dipengaruhi oleh radiasi, mungkin tidak dengan segera dilakukan penanganan tetapi setelah stabilitas produk dapat dipengaruhi. Untuk bahan-bahan medis dan plastik, perubahan dari sterilisasi etilen oksida ke sterilisasi radiasi membutuhkan penentuan efek radiasi jangka pendek dan jangka panjang, dan kadang membutuhkan modifikasi produksi bahan plastik dan karet untuk membuatnya sesuai dengan sterilisasi radiasi. Penerapan untuk sterilisasi ini
Elektron dipercepat atau sinar gamma dapat digunakan untuk mensterilkan produk-produk pilahan dengan suatu proses berkesinambungan. Kebanyakan prosedur sterilisasi produk lain harus diselenggarakan dalam batch setrilisasi dengan proses berkesinambungan memerlukan pengendalian yang tepat, sehingga tidak ada bagian yang lepas dari keefektifan sterilisasi. Radiasi ionisasi digunakan untuk sterilisasi industri untuk alat-alat rumah sakit, vitamin, antibiotik, steroid hormon dan transplantasi tulang dan jaringan dan alat pengobatan seperti alat untuk suntik plastik, jarum, alat beda, tube palstik, katter, benang bedah dan cawan Petri. Radiasi ioniasasi dapat menghasilkan perubahan dalam molekul organik yang dapat mempengaruhi kemujaraban sediaan atau dapat menginduksi toksisitas. Radiasi produk juga dapat menghasilakn perubahan warna dan kerapuhan beberapa wadah gelas dan bahan plastik. Sterilisasi radiasi dapat dilakukan baik dengan radiasi elektromagnetik dan radiasi partikel. Radiasi elektromagnetik dan energi foton, termasuk ultra dari bahan radioaktif seperti kobalt 60 atau sesium 137 adalah yang paling sering digunakan sebagai sumber energi sterilisasi adhesi elektromagnetik. Radiasi partikel atau molekul termasuk daftar partikel yang steril. Satu-satunya sekarang yang digunakan untuk sterilisasi radiasi pada obat-obat rumah sakit dan laboratorium. Bagaimanapun banyak prosedur sterilisasi industri manggunakan radiasi, termasuk penjelasan singkatnya. Beberapa informasi mengenai efek sterilisasi ultraviolet juga dihadirkan. Prinsip bermuatan negatif sepeti elektron yang berinteraksi langsung dengan bahan menyebabkan ionisasi seperti elektron elektromagnetik menyebabkan ionisasi pada mekanisme yang bervariasi yang menghasilkan perpindahan suatu orbital elektron dengan mekanisme jumlah tertentu dari energi yang ditransfer
dalam insiden sinar gamma. Perpindahan elektron ini kemudian bentindak sebagai partikel beta dalam reduksi. Oleh sebab itu baik partikel maupun elektromagnetik, dipertimbangkan sebagai radiasi ionisasi yang berbeda dengan radiasi sinar ultraviolet. Kerugian penggunaan germisida radiasi sinar UV adalah penetrasinya terbatas, pada panjang gelombang 253,7 nm, diserap oleh banyak bahan dan membuat penggumpalan organisme dan hal tersebut dilindungi oleh debu dan puing-puing. Untuk menghindari aksi letal panggunaan radiasi sinar UV sebagai cara sterilisasi tidak direkomendasikan lemak jika bahan-bahan yang diradiasi sangat bersih dan bebas yang dapat melindungi mikroorganisme. KESIMPULAN : Metode sterilisasi yaitu : 1. Metode Kimia a. Menggunakan bahan kimia Dalam pensterilan digunakan bahan kimia seperti alkohol 70%, fenol 5%. b. Sterilisasi gas Dalam pensterilan digunakan bahan kimia dalam bentuk gas atau uap, seperti etilen oksida, formaldehid, propilen oksida, klorin oksida, beta propiolakton, metilbromida, kloropikrin. Digunakan untuk sterilisasi bahan yang termolabil seperti bahan biologi, makanan, plastik, antibiotik. Aksi antimikrobialnya adalah gas etilen oksida mengadisi gugus –SH, -OH, -COOH,-NH2 dari protein dan membentuk ikatan alkilasi sehingga protein mengalami kerusakan dan mikroba mati. 2. Metode mekanik Filtrasi
Digunakan untuk sterilisasi larutan yang termolabil. Penyaringan ini menggunakan filter bakteri. Metode ini tidak dapat membunuh mikroba, mikroba hanya akan tertahan oleh pori-pori filter dan terpisah dari filtratnya. Dibutuhkan penguasaan teknik aseptik yang baik dalam melakukan metode ini. Filter biasanya terbuat dari asbes, porselen. Filtrat bebas dari bakteri tetapi tidak bebas dari virus. 3. Metode Fisika a. Pemanasan kering Prinsipnya adalah protein mikroba pertama-tama akan mengalami dehidrasi sampai kering. Selanjutnya teroksidasi oleh oksigen dari udara sehingga menyebabkan mikrobanya mati. - Udara panas oven Digunakan untuk sterilisasi alat gelas yang tidak berskala, alat bedah, minyak lemak, parafin, petrolatum, serbuk stabil seperti talk, kaolin, ZnO. Suhu sterilisasi yang digunakan adalah 170¬¬¬¬¬¬¬oC selama 1 jam, 160¬¬¬¬¬¬¬oC selama 2 jam, 150¬¬¬¬¬¬¬oC selam 3 jam. - Pemijaran langsung Digunakan untuk sterilisasi alat logam, bahan yang terbuat dari porselen, tidak cocok untuk alat yang berlekuk karena pemanasannya tidak rata. Suhu yang digunakan 500-600oC dalam waktu beberapa detik, untuk alat logam sampai berpijar. - Minyak dan penangas lain Digunakan untuk sterilisasi alat bedah seperti gunting bedah sebagai lubrikan menjaga ketajaman alat, bahan kimia stabil dalam ampul. Bahan atau alat dicelupkan dalam penangas dicelupkan dalam penangas yang berisi minyak mineral pada suhu 160¬¬¬¬¬¬¬oC. Larutan natrium atau amonium klorida jenuh
dapat digunakan pula sebagai pengganti minyak mineral. b. Pemanasan basah Prinsipnya adalah dengan cara mengkoagulasi atau denaturasi protein penyusun tubuh mikroba sehingga dapat membunuh mikroba. - Uap bertekanan (autoklaf) Digunakan untuk sterilisasi alat gelas, larutan yang dimaksudkan untuk diinjeksikan ke dalam tubuh, alat berskala, bahan karet. Waktu yang dibutuhkan untuk sterilisasi larutan suhu 121oC adalah 12 menit. Uap jenuh pada suhu 121oC mampu membunuh secara cepat semua bentuk vegetatif mikroorganisme dalam 1 atau 2 menit. Uap jenuh ini dapat menghancurkan spora bakteri yang tahan pemanasan. - Pemanasan dengan bakterisida Digunakan untuk sterilisasi larutan berair atau suspensi obat yang tidak stabil dalam autoklaf. Tidak digunakan untuk larutan obat injeksi intravena dosis tunggal lebih dari 15 ml, injeksi intratekal, atau intrasisternal. Larutan yang ditambahkan bakterisida dipanaskan dalam wadah bersegel pada suhu 100 oC selama 10 menit di dalam pensteril uap atau penangas air. Bakterisida yang digunakan 0,5% fenol; 0,5% klorobutanol; 0,002 % fenil merkuri nitrat; 0,2% klorokresol. - Air mendidih Digunakan untuk sterilisasi alat bedah seperti jarum spoit. Hanya dilakukan dalam keadaan darurat. Dapat membunuh bentuk vegetatif mikroorganisme tetapi tidak sporanya. c. Cara bukan panas Sterilisasi dengan radiasi
Prinsipnya adalah radiasi menembus dinding sel dengan langsung mengenai DNA dari inti sel sehingga mikroba mengalami mutasi. Digunakan untuk sterilisasi bahan atau produk yang peka terhadap panas (termolabil). Ada dua macam radiasi yang digunakan yakni gelombang elektromagnetik (sinar x, sinar ?) dan arus partikel kecil (sinar ? dan ?).
HANYA Rp.80rb,MESIN UANG anda jalan OTOMATIS Cara Praktis Pemula Bikin Web MESIN UANG dgn 70 Rb
UANG MENCARI ANDA CARA CERDIK BISNIS LEWAT INTERNET
Miliki aset di Internet PANDUAN BERBISNIS DI INTERNET (RECOMMENDED)
Cara Praktis Menghasilkan Uang Anda Mau Jadi Jutawan Baru?
Ladang Uang Online PELUANG DAHSYAT PASIVE INCOME
HIDUP INI INDAH HEBOH Tinggal Klik UANG NGALIR
KumpulBlogger.com
Pustaka : * Scoville’s : The Art of Compounding, Glenn L. Jenkins et.all., 1957, New York :
MC-Graw Hill Book Companies. * Pharmaceutical Technology, Eugene L. Parrott, 1974, Minneapolis : Burgess Publishing Company. * Teori dan Praktek Farmasi Industri (terjemahan), Leon Lachmann et.all., 1998, jakarta : UI-Press. * Remington’s Pharmaceutical Sciences 18 th Edition, A.R. Gennaro, 1990, Pennsylvania : Mack Publishing Company. * Parenteral Manual Technology, Michael J. groves, 1988, USA : Interpharm Press Inc. * Validation of Pharmaceutical Processes (electronic version), diposkan oleh hari mulyakno santoso di 20.59 label: sterilisasi
Kultur jaringan atau biakan jaringan merupakan teknik pemeliharaan jaringan atau bagian dari individu secara buatan (artifisial). Yang dimaksud secara buatan adalah dilakukan di luar individu yang bersangkutan. Karena itu teknik ini sering kali disebut kultur in vitro, sebagai lawan dari in vivo. Dikatakan in vitro (bahasa Latin, berarti “di dalam kaca”) karena jaringan dibiakkan di dalam tabung inkubasi atau cawan Petri dari kaca atau material tembus pandang lainnya. Kultur jaringan secara teoretis dapat dilakukan untuk semua
jaringan, baik dari tumbuhan maupun hewan (termasuk manusia) namun masing-masing jaringan memerlukan komposisi media tertentu. Metode kultur jaringan dikembangkan untuk membantu memperbanyak tanaman, khususnya untuk tanaman yang sulit dikembangbiakkan secara generatif. Bibit yang dihasilkan dari kultur jaringan mempunyai beberapa keunggulan, antara lain: mempunyai sifat yang identik dengan induknya, dapat diperbanyak dalam jumlah yang besar sehingga tidak terlalu membutuhkan tempat yang luas, mampu menghasilkan bibit dengan jumlah besar dalam waktu yang singkat, kesehatan dan mutu bibit lebih terjamin, kecepatan tumbuh bibit lebih cepat dibandingkan dengan perbanyakan konvensional. Tahapan yang dilakukan dalam perbanyakan tanaman dengan teknik kultur jaringan adalah: 1)
Pembuatan media
2)
Inisiasi
3)
Sterilisasi
4)
Multiplikasi
5)
Pengakaran
6)
Aklimatisasi
Media merupakan faktor penentu dalam perbanyakan dengan kultur jaringan. Komposisi media yang digunakan tergantung dengan jenis tanaman yang akan diperbanyak. Media yang digunakan biasanya terdiri dari garam mineral, vitamin, dan hormon. Selain itu, diperlukan juga bahan tambahan seperti agar, gula, dan lain-lain. Zat pengatur tumbuh (hormon) yang ditambahkan juga bervariasi, baik jenisnya maupun jumlahnya,
tergantung dengan tujuan dari kultur jaringan yang dilakukan. Media yang sudah jadi ditempatkan pada tabung reaksi atau botol-botol kaca. Media yang digunakan juga harus disterilkan dengan cara memanaskannya dengan autoklaf. Inisiasi adalah pengambilan eksplan dari bagian tanaman yang akan dikulturkan. Bagian tanaman yang sering digunakan untuk kegiatan kultur jaringan adalah tunas. Sterilisasi adalah bahwa segala kegiatan dalam kultur jaringan harus dilakukan di tempat yang steril, yaitu di laminar flow dan menggunakan alat-alat yang juga steril. Sterilisasi juga dilakukan terhadap peralatan, yaitu menggunakan etanol yang disemprotkan secara merata pada peralatan yang digunakan. Teknisi yang melakukan kultur jaringan juga harus steril. Multiplikasi adalah kegiatan memperbanyak calon tanaman dengan menanam eksplan pada media. Kegiatan ini dilakukan di laminar flow untuk menghindari adanya kontaminasi yang menyebabkan gagalnya pertumbuhan eksplan. Tabung reaksi yang telah ditanami ekplan diletakkan pada rak-rak dan ditempatkan di tempat yang steril dengan suhu kamar. Pengakaran adalah fase dimana eksplan akan menunjukkan adanya pertumbuhan akar yang menandai bahwa proses kultur jaringan yang dilakukan mulai berjalan dengan baik. Pengamatan dilakukan setiap hari untuk melihat pertumbuhan dan perkembangan akar serta untuk melihat adanya kontaminasi oleh bakteri ataupun jamur. Eksplan yang terkontaminasi akan menunjukkan gejala seperti berwarna putih atau biru (disebabkan jamur) atau busuk (disebabkan bakteri).
Aklimatisasi adalah kegiatan memindahkan eksplan keluar dari ruangan aseptic ke bedeng. Pemindahan dilakukan secara hati-hati dan bertahap, yaitu dengan memberikan sungkup. Sungkup digunakan untuk melindungi bibit dari udara luar dan serangan hama penyakit karena bibit hasil kultur jaringan sangat rentan terhadap serangan hama penyakit dan udara luar. Setelah bibit mampu beradaptasi dengan lingkungan barunya maka secara bertahap sungkup dilepaskan dan pemeliharaan bibit dilakukan dengan cara yang sama dengan pemeliharaan bibit generatif. Keunggulan inilah yang menarik bagi produsen bibit untuk mulai mengembangkan usaha kultur jaringan ini. Saat ini sudah terdapat beberapa tanaman kehutanan yang dikembangbiakkan dengan teknik kultur jaringan, antara lain adalah: jati, sengon, akasia, dll. Bibit hasil kultur jaringan yang ditanam di beberapa areal menunjukkan pertumbuhan yang baik, bahkan jati hasil kultur jaringan yang sering disebut dengan jati emas dapat dipanen dalam jangka waktu yang relatif lebih pendek dibandingkan dengan tanaman jati yang berasal dari benih generatif, terlepas dari kualitas kayunya yang belum teruji di Indonesia. Hal ini sangat menguntungkan pengusaha karena akan memperoleh hasil yang lebih cepat. Selain itu, dengan adanya pertumbuhan tanaman yang lebih cepat .
Tidak Sulit Belajar Kultur Jaringan
Anggapan orang selama ini bahwa teknik kultur jaringan sangat sulit dilakukan oleh orang awam dan biayanya sangat mahal tidak betul.
Teknologi ini pada awalnya memang hanya dilakukan di kalangan perguruan tinggi dengan menggunakan peralatan yang canggih dan mahal. Tujuan kultur jaringan banyak sekali, diantaranya adalah untuk mendapatkan tanaman bebas penyakit/virus, mendapatkan tanaman yang tahan terhadap stres tertentu (stres kekeringan, stres salinitas, dll). Selain itu juga untuk menyelamatkan tanaman langka agar tidak punah dan juga untuk memperbanyak tanaman dalam jumlah banyak. Tujuan terakhir inilah yang rupanya saat ini menarik perhatian banyak orang.
Di negara-negara tetangga kita, kultur jaringan sudah bukan hal yang asing lagi. Teknologi ini sudah dikenalkan pada para petani sejak lama, sehingga mereka sangat leluasa untuk menghasilkan produk2 tanaman yang berkualitas bagus. Sekarang ini banyak bibit-bibit tanaman hias hasil kultur jaringan yang masuk keIndonesia, sebut saja : Aglaonema, anthurium, calladium, anggrek, dll.
Tidak Sulit Betul sekali apabila dikatakan kultur jaringan tidak sulit. Pada intinya kita hanya melakukan isolasi tanaman, bisa bagian protoplasma, sel, aringan ataupun organ tanaman yang selanjutnya ditanam dalam kondisi steril di dalam botol menggunakan media buatan. Tanaman
dalam botol itulah yang kita pelihara hingga saatnya dikeluarkan dan ditanam di luar. Kultur jaringan hanya butuh ketelatenan dari yang mengerjakannya, dengan jam terbang yang semakin tinggi maka akan semakin dirasakan bahwa teknik kultur jaringan sama sekali tidak sulit. Tidak Mahal Peralatan kultur jaringan seringkali menjadi momok bagi orang awam yang ingin terjun di bidang ini. Menurut mereka, semua alatalat yang digunakan dalam proses kultur jaringan membutuhkan biaya yang sangat mahal. Anggapan tersebut tidak 100% betul, karena beberapa alat bisa dimodifikasi sehingga dapat diberdayagunakan seperti alat-alat yang canggih dan mahal tsb. Saat ini sudah banyak tersedia di pasaran alat-alat kultur jaringan dengan harga terjangkau, misalnya : dengan uang 1 juta sudah bisa mendapatkan entkas (alat untuk menanam dalam kondisi steril) Bahan-bahan kimia untuk membuat media kultur juga sering dituding menjadi mahalnya teknologi ini. Sebetulnya untuk media tumbuh bisa disiasati dengan misalnya : membeli media kultur
aringan jadi di pasaran atau membeli nempil (eceran) di laboratorium-laboratorium kuljar atau bahkan bisa mencari media alternatif dari bahan-bahan alami. Nah, sekarang menjadi tidak mahal lagi bukan? Tahapan Kultur Jaringan Tahapan dalam kultur jaringan diawali dengan pemilihan pohon induk yang bagus, sehat dan berkarakter khusus. Pohon induk tsb nantinya akan dijadikan sebagai sumber eksplan. Selanjutnya eksplan disterilkan menggunakan zat tertentu, demikian juga semua peralatan yang akan digunakan perlu disterilkan dalam autoklaf. Tahap berikutnya adalah mengiris eksplan dalam ruang steril. Tahap inilah yang perlu teknik-teknik khusus, beberapa tanaman yang mengeluarkan getah akan lebih bagus bila diiris dalam larutan pencegah browning. Selanjutnya tanaman ditanam dalam botol dan dipelihara hingga siap untuk diaklimatisasi (dipindahkan dari botol ke pot). Pemilihan eksplan perlu mendapat perhatian karena itulah yang nanti akan menentukan kualitas bibit yang akan dihasilkan. Paling bagus
apabila eksplan berasal dari jaringan yang masih muda karena selselnya masih aktif membelah (meristematis). Semua bagian tumbuhan dapat dijadikan eksplan, mulai dari bunga, biji, akar, batang hingga daun. Harapan Untuk Petani & Pengusaha Tanaman Untuk lebih menggairahkan pertanian di Indonesia dan agar tidak luar negeri minded artinya agar kita tidak berfikir bahwa tanaman-tanaman dari luar negeri pasti bagus maka kita harus berani berubah. Sudah saatnya para petani dan pengusaha tanaman mengetahui bermacam-macam teknologi yang bisa digunakan untuk meningkatkan hasil tanamannya, baik kuantitas dan kualitasnya.
Laboratorium kultur jaringan fakultas pertanian UPN Jogjakarta yang berada di ring road utara condongcatur telp 0274-486693 siap untuk mentranfer ilmu tentang teknologi kultur jaringan pada masyarakat umum dengan metode praktis dan mudah diikuti. Tidak perlu background pertanian untuk mendalaminya, bahkan para pensiunanpun akan mudah mengikuti praktek mandirinya.
BAB II
MANFAAT KULTUR JARINGAN Perbanyakan bibit dengan teknik kultur jaringan, kultur organ, dan embiogenesis somatik dapat pula diterapkan pada jaringan hewan dan manusia. Tidak seperti pada tumbuhan, kultur pada hewan dan manusia tidak dapat dikembangkan menjadi individu baru. ¨ Pengadaan bibit tidak tergantung musim ¨ Bibit dapat diproduksi dalam jumlah banyak dengan waktu yang relatif lebih cepat (dari satu mata tunas yang sudah respon dalam 1 tahun dapat dihasilkan minimal 10.000 planlet/bibit) ¨ Bibit yang dihasilkan seragam ¨ Bibit yang dihasilkan bebas penyakit (menggunakan organ tertentu) ¨ Biaya pengangkutan bibit relatif lebih murah dan mudah ¨ Dalam proses pembibitan bebas dari gangguan hama, penyakit, dan deraan lingkunganlainnya KULTUR jaringan adalah serangkaian kegiatan yang dilakukan untuk membuat bagian tanaman (akar, tunas, jaringan tumbuh tanaman) tumbuh menjadi tanaman utuh (sempurna) dikondisi invitro (didalam gelas). Keuntungan dari kultur jaringan lebih hemat tempat, hemat waktu, dan tanaman yang diperbanyak dengan kultur jaringan mempunyai sifat sama atau seragam dengan induknya. Contoh tanaman yang sudah lazim diperbanyak secara kultur jaringan adalah tanaman anggrek.
Alat-alat yang dipakai dalam penanaman dalam kultur jaringan harus dalam keadaan steril. Alat-alat logam dan gelas dapat disterilkan dalam autoklaf . Alat tanam seperti: pinset dan gunting dapat juga disterilkan dengan pembakaran atau dengan pemanasan dalam bacticinerator khusus untuk scapel, gagangnya dapat disterilkan dengan pemanasan namun pisaunya dapat menjadi tumpul bila dipanaskan dalam temperatur tinggi. Oleh karena itu untuk bladenya dianjurkan cara sterilisasi dengan pencelupan dalam alkohol atau larutan kaporit.
Alat-alat kultur jaringan yang perlu disterilisasi sebelum penanaman adalah; Pinset, Gunting, - Gagang scapel, Kertas saring, Petridish, Botolbotol kosong, Jarum, Pipet
Autoklaf yang dapat digunakan ada bermacam-macam mulai dari yang sederhana sampai yang Programable. Autoklaf yang sederhana menggunakan sumber uap dari pemanasan air yang ditambahkan kedalam autoklaf. Pemanasan air dapat menggunakan kompor atau api bunsen. Dengan autoklaf sederhana ini tekanan dan temperatur diatur dengan jumlah panas dari api. Kelemahan autoklaf ini adalah bahwa perlu penjagaan dan pengaturan panas selama masa sterilisasi dilakukan secara manual. Tetapi autoklaf ini mempunyai keuntungan: sederhana, harga relatif murah, tidak tergantung dari aliran listrik yang sering merupakan problema untuk negara-negara yang sedang berkembang, serta lebih cepat dari autoklaf listrik yang seukuran dan setaraf.
Media dan Aquades Media dan aquadest yang akan digunakan dalam kultur jaringan (kuljar) juga disterilisasikan dalam autoklaf. Untuk aquadest sebaiknya dimasukkan dalam wadah kecil misalnya Erlenmeyer 250 ml dengan isi maksimum 100 ml, agar sterilisasi lebih efektif. Waktu sterilisasi sama dengan waktu untuk sterilisasi alat-alat yaitu 1 jam pada tekanan 17,5 psi.
Untuk media kultur jaringan (kuljar) yang tidak mengandung bahan-bahan yang Heat-labile, sterilisasi dilakukan dengan autoklaf pada temperatur 121 C, tekanan antara 15-17.5 psi dengan waktu antara 20-25 menit
tergantung dari volume wadah dan volume media. Untuk 15 ml media dalam tabung reaksi atau botol kecil berukuran 75ml, sterilisasi dilakukan tekanan 15 psi dengan waktu 20 menit. Volume yang lebih besar membutuhkan tekanan yang lebih tinggi dengan waktu yang lebih lama. Dalam sterilisasi aquadest dan media, setelah waktu sterilisasi yang diinginkan sudah tercapai, autoklaf tidak boleh diturunkan tekanannya secara mendadak. Bila tekanan diturunkan mendadak, cairan didalamnya mendidih dan meluap (Bubbled up).
Untuk bahan-bahan kultur jaringan (kuljar) yang heat-labile, dalam bentuk larutan, sterilisasi dilakukan dengan menyaring larutan melalui filter yang mempunyai ukuran pori 0.20-0.22 dm. Diameter filter bermacammacam tergantung dari volume larutan yang ingin disterilkan. Untuk volume larutan 10 ml, dipergunakan filter yang dipasang di ujung jarum suntik. Bahan yang heat labile seperti: GA3, Thiamin-HCI, Capanthothenate dan antibiotik: carbenocillin.
Botol-botol/tabung reaksi/erlenmeyer yang dipergunakan sebagai wadah kultur jaringan biasanya disterilisasi dalam oven. Botol-botol yang sudah dicuci bersih dimasukkan dalam oven dan dipanaskan selama 4 jam pada temperatur 160 C. Setelah disterilisasi dapat langsung digunakan.
Bila botol akan disimpan untuk beberapa lama maka sewaktu sterilisasi, mulut botol harus ditutup dengan aluminium foil.
Enkas Sebelum digunakan enkas kultur jaringan harus disterilisasi dengan menggunakan hand sprayer berisi spirtus atau campuran formalin 10% dan alkohol 70% dengan perbandingan 1:1. Setelah enkas tersebut disemprot kemudian dibiarkan terlebih dahulu kurang lebih lebih 10 menit, baru kemudian boleh digunakan. Sebab, bila enkas yang baru disemprot tersebut langsung digunakan. Maka formalin yang belum kering bila terkena api spirtus dapat meledak sehingga memecahkan enkas.
Laminar Penggunaaan formalin dalam laminar air flow dalam kultur jaringan,
"penggunaan formalin tidak dibenarkan sama sekali, karena uap formalin dapat terhembus kearah dada sipenabur sehingga berbahaya bagi kesehatannya. Strerilisasi pada laminar air flow yang dibenarkan adalah dengan spirtus atau alkohol 70%. "
Sebelum mulai bekerja, permukaan tempat kerja dari laminar air flow cabinet dilap dengan kapas yang telah dicelup dalam 70% alkohol atau
dalam larutan kaporit. Ada juga tipe laminar air flow cabinet yang dilengkapi dengan lampu ultra violet. Sebelum kerja, lampu ultra violet dinyalakan selama beberapa waktu antara 1-2 jam untuk mematikan kontaminan dipermukaan tempat kerja. Laminar air flow cabinet harus dijaga sebersih mungkin. Setelah bekerja, permukaan tempat kerja dibersihkan dengan alkohol 70% atau dengan lampu ultra violet selama 1-2 jam. AUTOCLAVE ALAT UNTUK STERILISASI ALAT DAN MEDIUM DALAM KULTUR JARINGAN TUMBUHAN
AUTOCLAVE ALAT UNTUK STERILISASI ALAT DAN MEDIUM DALAM KULTUR JARINGAN TUMBUHAN
Sterilisasi adalah setiap proses baik fisika, kimia dan mekanik yang membunuh semua bentuk kehidupan terutama mikroorganisme atau usaha untuk membebaskan alat dan bahan dari seala bentuk kehidupan terutama mikrobia. Suatu alat atau bahan dikatakan steril apabila alat atau bahan tersebut bebas dari mikrobia, baik dalam bentuk veetatif ataupun spora. Suatu benda atau substansi hanya dapat dikatakan steril atau tidak steril, tidak akan pernah munkin ada setengah steril atau hamper steril. Untuk sterilisasi alat dan medium diunakan sterilisasi dengan mengunakan alat yang disebut autoclave. Autoclaf adalah alat untuk mensterilkan berbagai macam alat dan medium kultur jaringan tumbuhan denan mengunakan tekanan 15 psi (1,02 atm) dan suhu 121°C . Suhu dan tekanan tinggi yang diberikan kepada alat dan media kultur jarinan tumbuhan yang disterilkan memberikan kekuatan yang lebih besar untuk
membunuh sel dibandingkan dengan udara panas. Biasanya untuk mensterilkan media diunakan suhu 121°C dan tekanan 15 lb/in² (SI = 103,4 Kpa) selama 15 menit. Alasan digunakan 121°C atau 249,8°F adalah karena air mendidih pada suhu tersebut jika digunakan tekanan 15 psi. Untuk tekanan 0 psi pada ketinggian di permukaan laut (sea level) air mendidih pada suhu 100°C, sedangkan untuk autoclave yan diletakkan pada ketingian yang sama, mengunakan tekanan 15 psi maka air akan mendidih pada suhu 121°C. Kejadian ini hanya berlaku untuk sea level, jika dilaboratorium yang terletak pada ketinggian tertentu, maka pengaturan tekanan perlu diseting ulang. Misalnya autoclave diletakkan pada ketinggian 2700 kaki dpl, maka tekanan dinaikkan menjadi 20 psi supaya tercapai suhu 121°C untuk mendidihkan air. Semua bentuk kehidupan akan mati jika dididihkan pada suhu 121°C dan tekanan 15 psi selama 15 menit.
Autoclave dengan sumber panas menggunakan kompor
Autoclave dengan sumber panas menggunakan listrik
Autoclave dengan sumber panas menggunakan kompor gas dan listrik
Cara menggunakan autoclave Autoclave merupakan alat yang terdiri dari bejana tahan tekanan tinggi yang dilengkapi dengan manometer, thermometer, dan klep bahaya.
Langkah-langkah penggunaan autoclave adalah sebagai berikut : Pertama kali masukkan aquadest ke dalam bejana autoclave sampai batas yang ditentukan (tanda batas terdapat di dalam bejana autoclave) setelah memasukkan aquadest masukkan ansang ke dalam autoclave.
Setelah itu alat-alat dan media kultur jaringan tumbuhan yang akan disterilkan dimasukkan ke dalam bejana autoclave (alat seperti scalpel, pinset, petridisk dibungkus terlebih dahulu dengan menggunakan kertas payung atau untuk botol kultur, erlenmeyer bagian mulutnya ditutup dengan menggunakan aluminium foil).
Kemudian autoclave dihubungkan dengan sumber listrik apabila autoclavenya mengunakan sumber panas dari listrik atau letakkan autoclave di atas kompor gas untuk autoclave yang menggunakan api dari kompor gas sebagai sumber panasnya. Pada saat sumber panas dinyalakan air dalam autoclave lama-kelamaan akan mendidih dan uap air yan terbentuk mendesak udara yan mengisi autoclave. Setelah semua udara dalam autoclave diganti dengan uap air, katup uap atau udara ditutup sehingga tekanan udara dalam autoclave naik. Pada saat tercapai tekanan dan suhu yang sesuai, maka proses sterilisasi dimulai dan timer mulai menghitung waktu mundur. Setelah proses sterilisasi selesai, sumber panas dimatikan dan tekanan dibiarkan turun perlahan hingga mencapai 0 psi. Autoclave tidak boleh dibuka sebelum tekanan mencapai 0 psi. Setelah autoclave tekanannya 0 psi dan sudah dingin maka autoclave baru boleh dibuka. Dan alat ataupun media
kultur jaringan tumbuhan yang disterilisasi dengan mengunakan autoclave yang sudah steril dipindahkan ke tempat yang steril.
Alat-alat dan media yang yang bisa disterilisasi disterilisasi menggunakan menggunakan autoclave autoclave
Adapun alat yang dapat disterilisasi disterilisasi dengan dengan menggunakan menggunakan autoclave autoclave antara lain petridisk, botol jam, pinset, scalpel. Setelah dilakukan sterilisasi sterilisasi maka alat-alat tersebut menjadi steril. Untuk tetap menjaga sterilitas alatalat tersebut, setelah diangkat dari dalam autoclave kemudian dimasukkan ke dalam oven untuk penyimpanannya. I. PENDAHULUAN
A.
Latar Belakang
Kultur jaringan merupakan suatu teknik budidaya yang dilakukan secara invitro, tanaman dikembangkan dengan cara dicukupi kebutuhannya secara lengkap dan diperhitungkan secara tepat kadar kebutuhannya. Dasar dari teknik budidaya kultur jaringan jaringan adalah teori teori totipotensi sel, suatu teori teori yang mengungkapkan bahwa suatu sel mampu berkembang biak menjadi tanaman yang sempurna apabila diletakkan pada media dan kondisi lingkungan yang sesuai. Berdasarkan teori tersebut maka dalam kultur jaringan harus menggunakan media yang sesuai untuk tanaman yang dikulturkan dan kondisi lingkungan juga harus sesuai. Kondisi lingkungan yang sesuai meliputi suhu, kelembaban,
pencahayaan dan hal yang paling utama utama yaitu kondisi harus harus aseptis. aseptis. Keadaan yang aseptis merupakan syarat mutlak dalam kultur jaringan. Kondisi aseptis tidak hanya sebatas pada kondisi lingkungan, semua bahan dan sesutu yang berhubungan dengan kegiatan tersebut haruslah dalam kondisi aseptis. Pelaksanaan teknik kultur jaringan tanaman dilakukan berdasarkan teori totipotensi sel yaitu kemampuan setiap sel untuk tumbuh menjadi tanaman sempurna apabila diletakkan pada lingkungan yang cocok dalam keadaan aseptik. Teknik kultur jaringan akan berhasil dengan baik apabila semua persyaratan dipenuhi yaitu: media yang cocok, kondisi atmosfer yang sesuai dan kondisi aseptik. Kondisi aseptik berlaku untuk eksplan (bahan tanam), ruangan dan peralatan yang digunakan. digunakan. Apabila kondisi aseptik tidak dipenuhi, maka kultur kultur akan gagal karena kontaminasi. Untuk itu perlu dilakukan sterilisasi peralatan yang akan digunakan. Sterilisasi dilakukan dengan menggunakan autoclave (pakai kompor atau listrik), dengan suhu dan tekanan tertentu.
B.
Tujuan Praktikum
Praktikum ini bertujuan untuk meningkatkan keterampilan mahasiswa dalam melakukan sterilisasi peralatan dengan autoclave.
II. METODE PELAKSANAAN A. Waktu
Praktikum dilakukan pada tanggal 26 November 2012 B. Tempat pelaksanaan
Praktikum dilakukan di Laboratorium Agronomi Agronomi Fakultas Pertanian C. Alat dan Bahan
-
Autoclave.
-
Kompor.
-
Glass ware (botol ware (botol kultur, erlenmeyer erlenmeyer,, petridish).
-
Dissecting kit (pinset dan skalpel).
-
Kertas payung
-
Alumunium foil
-
Karet gelang
-
Pipet
-
Pengaduk
-
Sabun
-
Air.
D. Prosedur Kerja
-
Glass ware (botol kultur, erlenmeyer, petridish) dan dissecting kit (pinset dan skalpel) dicuci bersih dengan sabun, dibilas dengan air lalu dikeringkan. Setelah kering mulut botol ditutup dengan aluminium foil dan kertas payung dan diikat dengan karet gelang. Pinset dan skalpel dibungkus dengan kertas atau aluminium foil.
-
0 Glass ware dan dissecting kit disterilisasi dengan autoclave pada suhu 120 C
pada tekanan 15 psi selama 15-30 menit. -
Selama sterilisasi autoclave ditutup rapat sehingga tekanan didalam autoclave naik.
-
Tekanan tinggi itu dipertahankan selama 30 menit dengan mengecilkan api.
-
Kompor dimatikan setelah proses sterilisasi selesai dan katup dibuka untuk membuang uap air hingga tekanan 0 psi.
-
Autoclave dibuka dan diambil peralatan yang sudah ada di dalamnya diambil.
-
Peralatan yang sudah disterilisasi disimpan ditempat yang bersih.
III. HASIL DAN PEMBAHASAN A. Hasil No Nama Alat
1
Autoclave
Gambar
Fungsi
Untuk mensterilisasi peralatan dan media
2
Magnetic
Untuk mengaduk
Stirer
dan mencampur larutan
3
pH meter
Untuk mengukur pH
4
Timbangan
Untuk menimbang
analitik
bahan-bahan kimia
No Nama Alat
5
Gambar
Fungsi
Laminar Air
Untuk melakukan
Flow
penanaman eksplan dalam kultur jaringan
6
Erlenmeyer
Untuk menampung larutan
7
Beaker glass
Untuk menampung dan membuat media
8
Botol kultur
Untuk tempat kultur (eksplan)
9
Gelas ukur
Untuk mengukur larutan
No Nama Alat
10
Pinset
Gambar
Fungsi
Untuk mengambil eksplan
11
Scalpel
Untuk memotong eksplan
12
Pipet
Untuk mengambil dan memindah larutan
13
Suntikan
Untuk mengambil larutan dalam jumlah kecil
14
Hand sprayer
Untuk sterilisasi dengan alcohol
15
Petridish
Untuk meletakkan eksplan
16
Pembakar
Untuk memflamir
Bunsen
eksplan, pinset, scalpel dan mulut botol
17
18
Alumunium
Untuk menutup
foil
mulut botol
Rak kultur
Untuk meletakkan botol kultur yang sudah ditanami eksplan
19
Tisu
Untuk mengeringkan alat
20
Kertas payung
Untuk membungkus petridis dan alat-alat dari logam untuk disterilisasi
21
Pengaduk
Untuk mengaduk
kaca
larutan
B. Pembahasan
Ruang dan alat yang digunakan dalam kutur jaringan harus dalam kondisi steril. Sterilisasi ruang dapat dilakukan dengan menggunakan lampu UV dan alcohol 90%. Tujuan dari sterilisasi ruang adalah untuk menghindari kontaminasi yang disebabkan mikroorganisme yang ada di alat maupun beterbangan di udara sekitar ruangan. Srerilisasi ruang seperti tersebut mutlak dilakukan pada ruang penabur atau tempat yang untuk jaringan. Ruang-ruang yang tidak lebih harus 100% steril karena tidak berhubungan langsung dengan media maupun jaringan yang akan ditanam. Peralatan yang akan digunakan juga harus dalam keadaan steril juga dapat biasanya menggunakan autoclave untuk sterilisasinya. Tujuan dari sterilisasi alat ini untuk menghindari terjadinya kontaminasi oleh mikro organisme seperti jamur dan bakteri, yang menempel pada alat sehingga dapat mengggagalkan kultur jaringan (Soebardini M dan Slamet Rachadi, 2011). Ada beberapa persyaratan yang harus dipenuhi jika kita akan menggunakan teknik kultur jaringan untuk menumbuhkan suatu tanaman. Persyaratan tersebut adalah adanya peralatan yang mendukung teknik kultur jaringan dan pengetahuan dasar mengenai teknik kultur jaringan misalnya teknik aseptik dalam kultur jaringan. Peralatan minimum yang harus dimiliki oleh suatu laboratorium seperti alat sterilisasi, laminar atau kotak steril, peralatan untuk membuat media, bahan-
bahan kimia, alat-alat kaca, dan ruang penyimpanan kultur. Teknik aseptik dalam kultur jaringan berhubungan dengan cara-cara melakukan sterilisasi. Ada beberapa cara sterilisasi yang digunakan dalam teknik kultur jaringan adalah sebagai berikut: Sterilisasi Kering, Sterilisasi ini digunakan untuk peralatan yang terbuat dari logam, kaca, atau kertas, contohnya pinset, gagang pisau, batang pengaduk, c awan petri, dan kertas saring. Dalam sterilisasi ini, alat yang akan disteril harus dibungkus terlebih dahulu dengan menggunakan aluminium foil atau kertas. Kemudian peralatan tersebut dmasukkan dalam oven bersuhu 120 0 C, dan waktu yang dibutuhkan minimal 1 jam. Setelah steril, peralatan disimpan di tempat yang kering dan bersih. Sterilisasi Basah, Sterilisasi basah sering digunakan untuk peralatan dan bahan-bahan, seperti media, akuades. Umumnya peralatan yang disterilkan menggunakan cara ini adalah peralatan logam, kaca, atau peralatan apapun yang tahan terhadap suhu dan tekanan yang tinggi. Hal ini karena teknik sterilisasi ini menggunakan Autoclave dengan tekanan 1,5 atm dan suhu 121 0 C dengan waktu yang dibutuhkan 1-20 menit. Setelah sterilisasi selesai, bahan atau peralatan disimpan di tempat yang kering dan bersih. Sterilisasi dengan Sinar Ultraviolet (UV), Sterilisasi ini dilakukan pada laminar air flow atau kotak alir udara, dengan tujuan agar kotak menjadi steril sehingga bisa digunakan untuk penanaman. Kotak alir udara dilengkapi dengan lampu UV. Sebelum lampu UV dinyalakan, permukaan dalam kotak dibersihkan dengan menggunakan alkohol 70%. Lampu UV dinyalakan minimal 1 jam sebelum pemakaian, dan pada saat pemakaian jangan lupa untuk mematikan lampu UV-nya. Sterilisasi dengan Bahan Kimia, Bahan-bahan yang biasanya digunakan untuk sterilisasi ini antara lain alkohol, natrium hipoklorit (NaOCl), kalsium hipoklorit atau kaporit (CaOCl), sublimat (HgCl2 ), dan hidrogen peroksida (H2O2).
Sterilisasi dengan Menggunakan Filter, Teknik sterilisasi ini adalah dengan menggunakan sterilisasi filter untuk bahan-bahan yang tidak tahan terhadap panas seperti antibiotika dan hormon. Sterilisasi biasanya dilakukan dengan filter ukuran 0,2 µm. Ada beberapa peralatan yang digunakan dan fungsinya dalam teknik kultur jaringan, antara lain : 1.
Aluminium foil : alat ini digunakan untuk meletakkan bahan – bahan kimia pada saat ditimbang dan juga digunakan untuk menutup serta membungkus botol erlemeyer agar larutan stok tidak rusak.
2.
Plastik dan karet : alat ini digunakan untuk menutup botol kultur agar mikroba penyebab kontaminasi tidak dapat masuk ke dalam.
3.
Petridish : digunakan sebagai tempat untuk meletakkan eksplan pada saat penanaman.
4.
Erlenmeyer : digunakan sebagai tempat untuk menuangkan air suling, sebagai tempat menampung media maupun stok media. Erlenmeyer juga bisa digunakan sebagai tempat pananaman karena mempunyai dasar yang lebar dan mulut yang sempit. Sebab mulut yang lebar memperbesar peluang kontaminasi.
5.
Keras buram : alat ini digunakan untuk membungkus alat – alat kultur dan petridish sebelum disterillisasikan.
6.
Stirrer : digunakan sebagai pengaduk media hingga media menjadi menjadi homogen secara otomatis.
7.
Gelas ukur : untuk mengukur larutan bahan kimia atau larutan stok yang akan digunakan untuk pembuatan media.
8.
Gelas piala :digunakan sebagai tempat untuk pembuatan media Ms.
9.
Pinset : untuk mengambil eksplan pada saat eksplan akan ditanam.
10. Kertas label : untuk memberi keterangan pada botol kultur yang digunakan.
11. Panci dan pengaduk : alat ini digunakan untuk memasak media yang akan digunakan serta untuk mengaduk media. 12. Magnetic stirrer : Alat ini berfungsi untuk menggojog dan pemanas. Alat ini digunakan dalam pembuatan stok media. Batang pengaduk magnetik dimasukkan ke dalam erlenmeyer, sehingga pada saat dinyalakan pengaduk akan bergerak memutar. Sehingga bahan kimia di dalamnya dapat larut dengan cepat dan baik. 13. Bunsen : digunakan untuk membakar dissecting kit, blade dan pinset pada saat penanaman eksplan. 14. Tissue : untuk membersihkan alat – alat kultur dan LAF. 15. Sprayer : digunakan sebagai alat penyemprot yang berisi alkohol 70% dan 90% untuk mensterilkan alat dan ruang penanaman. 16. Corong : untuk menuangkan media ke dalam botol kultur. 17. Pipet tetes : untuk mengambil larutan yang akan digunakan atau protoplas. 18. Scalpel :digunakan sebagai tempat untuk meletakkan blade. 19. Blade : untuk memotong eksplan pada saat penanaman. 20. Botol kutur : sebagai tempat yang berisi media yang bernutrisi dan juga sebagai tempat pertumbuhan serta perkembangan eksplan. 21. pH meter : digunakan untuk mengukur pH larutan stok. 22. Timbangan analitik : untuk menimbang larutan stok yang akan digunakan. 23. LAF : berfungsi sebagai tempat untuk penanaman eksplan. LAF harus selalu dalam kondisi steril. Sterilisasi LAF dapat dilakukan dengan menyemprot dan mengelapnya menggunakan alkohol 96 % atau formalin 5 % dan disinari dengan sinar UV. 24. Rak kultur : untuk meletakkan botol – botol kultur. 25. Kompor gas : untuk memanaskan autoclave dan untuk memasak media. 26. Autoclave : Autoclave digunakan untuk sterilisasi peralatan dan media. Pemanasan autoclave biasanya digunakan kompor gas. Pengaturan tekanan dapat
dilakukan dengan mengatur katup pada tutup autoclave. Bila tekanan dalam autoclave naik maka secara otomatis katupnya akan terbuka untuk mengurangi tekanan. Dengan demikian tekanan akan dapat dipertahankan disebabkan sebagaian uap keluar (Daisy dan Ari, 2002). Pada praktikum kali ini . untuk sterilisasi alat dibutuhkan waktu sekitar 30 menit. Suhu dalam autoclave 0
dipertahankan antara 120 C dan tekanan17,5 Psi dengan cara membesar atau mengecilkan nyala api kompor.
Cara kerja menggunakan Autocalve, LAF, pH meter, dan Hot Plate Magnetic Stirer. 1.
-
Autoclave:
Botol bersih diberi beberapa tetes aquadest dan tutup dengan kertas atau aluminium foil (jangan terlalu kencang bila menggunakan aluminium foil).Untuk botol-botol yang mempunyai tutup yang autoclaveable, jangan tutup terlalu kencang, karena selama pemanasan terjadi pemuaian.
-
Alat-alat yang perlu disterilkan sebelum penanaman adalah: pinset, gunting, gagang skalpel, kertas saring, petridish, botol kultur, jarum dan pipet.
-
Alat-alat dan kertas saring dibungkus rapi dengan kertas tebal atau ditaruh dalam baki stainless steel dan bakinya dibungkus dengan kain tebal sebelum dimasukkan dalam autoklaf. Alumunium foil tidak direkomendasikan sebagai pembungkus, karena uap tidak dapat masuk ke dalam bungkusan. Alat-alat sektio seperti pinset, gunting, gagang skalpel, dan jarum, dibungkus dengan kertas kopi atau kertas merang. Hindarkan
penggunaan Al-foil karena uap sukar masuk kedalam bungkusan sehingga sterilisasi kurang efektif. -
Petridish akan disterilkan, juga dibungkus dengan kertas kopi atau kertas merang.
-
Temperatur yang digunakan untuk sterilisasi botol kultur kosong dan alat-alat yang akan digunakan untuk menanam eksplan, adalah 121°C pada tekanan 15 psi (pound per square inch) atau 1 atm selama 30-60 menit. Penghitungan waktu sterilisasi dimulai setelah tekanan dan temperatur yang diinginkan tercapai.
2. -
LAF: Nyalakan lampu U.V., minimum selama 30 menit, sebelum laminar air flow digunakan. Hindarkan sinarnya dari badan dan mata.
-
Siapkan semua alat-alat steril yang akan dipergunakan. Alat-alat yang dimasukkan ke dalam Laminar Air Flow Cabinet, disemprot terlebih dahulu dengan alcohol 70% atau spiritus.
-
Meja dan dinding dalam LAF disemprot dengan alkohol 70% atau spiritus untuk mensterilkan LAF.
-
Blower pada LAF dihidupkan untuk menjalankan air flow.
-
Nyalakan lampu dalam LAF.
-
LAF sudah siap untuk digunakan.
3. -
pH meter: Meletakkan pH-meter pada keadaan standby on jika tidak dipakai; jangan ditekan off.
-
Menyiram electrode dengan aquades perlahan sebelum digunakan. Lalu masukkan ujung pH meter ke dalam larutan. Menyiram electrode dengan aquades kembali sesudah digunakan dan letakan pada silinder kembali.
-
Jangan dibiarkan elektrode diluar larutan pada waktu yang lama.
4.
Hot Plate Magnetik Stirer:
-
Nyalakan Heater, lalu letakkan bekker glass di atas heater.
-
Letakkan stirrer di dalam becker glass.
-
Masukkan larutan satu per satu ke dalam bekker glass.
-
Tunggu beberapa saat sampai larutan menjadi homogen. IV.
PENUTUP
A. Kesimpulan
Berdasarkan praktikum yang sudah dilakaukan dapat diketahui, bahwaSterilisasi adalah salah satu prosedur yang digunakan untuk menghilangkan mikroorganisme. Semua alat – alat dan media yang akan digunakan dalam kultur jaringan harus disterillisasi dahulu menggunakan autoclave agar mikroba penyebab kontaminasi hilang dan mati, dan dalam kegiatan kultur jaringan, semua ruangan dan peralatan kultur harus selalu dalam keadaan steril.
DAFTAR PUSTAKA
Chatimatun Nisa dan Rodinah, 2005. Kultur Jaringan Beberapa Kultivar Buah Pisang ( Musa paradisiaca L.) Dengan Pemberian Campuran Naa Dan Kinetin. Volume 2, Nomor 2, Juli 2005, Halaman 23-36. Rahardja, P. C. 1995. Kultur Jaringan : Teknik Perbanyakan Tanaman Secara Modern. Penerbit Swadaya, Jakarta. M, Soebardini dan Slamet Rochdi. 2011. “ Handout Kultur Jaringan Tanaman Hortikultura”. Fakultas
Pertanian Universitas Jenderal Soedirman, Purwokerto.
Murashige, T. 1974. Plant propogation through tissue culture. Ann. Rev. Plant Physiology.Pierik, R. L. M. 1975. Callus multiplication of Aunthurium andraenum L. in liquid media. Neth. J. Agric. Sci.: 229. Sriyanti, Daisy P. dan Ari Wijayani. 2002. Teknik Kultur Jaringan : Pengenalan dan Petunjuk Perbanyakan Tanaman Secara Vegetatif-Modern. Kanisius, Yogyakarta. Suryowinoto, Moeso. 2000. Pemuliaan Tanaman Secara In-Vitro. Kanisius, Yogyakarta.
Widarto, L. 2000. Perbanyakan Tanaman dengan Biji, Stek, Cangkok, Sambung, Okulasi dan Kultur Jaringan. Kanisius, Yogyakarta. Dasar Teori.
Kultur jaringan merupakan salah satu cara perbanyakan tanaman secara vegetatif. Kultur jaringan merupakan teknik perbanyakan tanaman dengan cara mengisolasi bagian tanaman seperti daun, mata tunas, protoplasma, sel, sekelompok sel, jaringan maupun organ , serta menumbuhkannya dalam keadaan aseptik serta menumbuhkan bagian-bagian tersebut dalam media buatan secara aseptik yang kaya nutrisi dan zat pengatur tumbuh dalam wadah tertutup yang tembus cahaya sehingga bagian tanaman dapat memperbanyak diri dan bergenerasi menjadi tanaman lengkap (Sany 2007: 1). Adapun prinsip-prinsip dalam kultur jaringan sendiri kita ketahui antara lain (1). Totipotensi Sel: Setiap sel dari manapun asalnya, akan mampu tumbuh menjadi tanaman sempurna kalau diletakkan pada lingkungan yang sesuai (Scheleiden & Sachwan, 1901), (2). Regenerasi Tanaman: Proses menuju diferensiasi ke arah pembentukan organ baru, (3). Bebas Kontaminasi Mikroorganisme, dan (4). Lingkungan (media) yang sesuai dengan pertumbuhan jaringan. Dapat dilihat salah satu prinsip adalah terbebas dari kontaminasi mikroorganisme. Ini artinya kultur jaringan merupakan perbanyakan tanaman dengan menggunakan bagian vegetatif tanaman, menggunakan media buatan yang dilakukan di tempat steril. Lingkungan yang sesuai dapat dipenuhi dengan menentukan media tumbuh yang sesuai dan penempatan pada kondisi yang terkendali berkaitan dengan intensitas dan periodisitas, cahaya, temperatur, dan kelembaban serta keharusan sterilisasi (Hendaryono & Wijayani 1994: 2).
Sterilisasi merupakan hal yang erat dengan pembuatan medium isolasi dan pembiakan mikroorganisme secara murni. Pengertian umum sterilisisasi adalah suatu proses yang berusaha membebaskan bahan atau alat dari mikroorganisme. Namun perlu diketahui bahwa bahan atau alat yang telah melalui proses sterilisasi tidak akan benar-benar bebas dari mikroorganisme. Tujuan utama sterilisasi adalah untuk meminimalkan gangguan oleh mikroorganisme yang tidak dikehendaki (kontaminan), sekaligus meminimalkan gangguan akibat proses sterilisasi itu sendiri sekecil mungkin (Sany 2007: 1). Sterilisasi dalam segala kegiatan kultur jaringan harus dilakukan di tempat yang steril, yaitu di laminar flow dan menggunakan alat-alat yang juga steril. Sterilisasi juga dilakukan terhadap peralatan, yaitu menggunakan etanol yang disemprotkan secara merata pada peralatan yang digunakan. Teknisi yang melakukan kultur jaringan pun juga harus dalam keadaan steril. Tidak hanya terbatas pada peralatan, namun ruangan yang akan digunakan pun harus dalam kondisi aseptik. Tujuan utama dari sterilisasi ruangan maupun peralatan kultur pada dasarnya untuk menghindari kontaminasi oleh mikro organisme yang ada di peralatan maupun di udara bebas sekitar ruangan. Perlakuan tersebut mutlak dilakukan terutama pada ruang penabur atau tempat yang digunakan untuk penanaman eksplan (Fardiaz 1992: 2).
Faktor-faktor yang perlu diperhatikan untuk keberhasilan kultur jaringan yaitu bahan sterilisasinya, kandungan unsur kimia dalam media, hormon yang digunakan, substansi organik yang ditambahkan dan terang atau gelapnya saat inkubasi. Dari sekian banyak permasalahan yang harus diteliti dan diperhatikan adalah komposisi media tumbuh pada kultur jaringan karena sangat besar pengaruhnya terhadap pertumbuhan dan
perkembangan eksplan serta bibit yang dihasilkannya. Teknik aseptik merupakan salah satu kunci keberhasilan dalam kutur jaringan. Keaseptikan harus dijaga dalam proses pengkulturan, selain itu juga termasuk sterilisasi bahan tanaman (eksplan). Pada tahap ini dilakukan berbagai perlakuan untuk membersihkan kotoran yang ada di permukaan bahan tanaman (disinfestasi). Selain itu, zat pengatur tumbuh adalah senyawa organik bukan hara yang dalam jumlah sedikit dapat mendukung, menghambat dan dapat merubah proses fisiologi tanaman (Daisy 1994: 4). 1.2. Tujuan
Praktikum ini bertujuan untuk mempelajari cara serta prinsip-prinsip sterilisasi alat dan bahan dalam teknik kultur jaringan tumbuhan. BAB II TINJAUAN PUSTAKA
Sterilisasi merupakan suatu proses untuk mematikan semua organisme yang terdapat pada atau di dalam suatu benda. Sterilisasi basah dapat digunakan untuk mensterilkan bahan apa saja yang dapat tembus uap air dan tidak rusak bila dipanaskan dengan suhu yang berkisar antara 110-121 . Sterilisasi dalam setiap proses baik fisika, kimia dan mekanik yang membunuh semua bentuk kehidupan terutama mikroorganisme atau usaha untuk membebaskan alat dan bahan dari segala bentuk kehidupan terutama mikrobia (Fardiaz 1992: 4). Menurut Hamdan (2012: 11), bahwa sterilisasi dalam setiap proses yang umum dilakukan dapat berupa: (a). Sterilisasi secara fisik (pemanasan, penggunaan sinar gelombang pendek yang dapat dilakukan selama senyawa
kimia yang akan disterilkan tidak akan berubah atau terurai akibat temperatur atau tekanan tinggi). Dengan udara panas, dipergunakan alat “b ejana/ruang panas” (oven dengan temperatur 170–180 dan waktu yang digunakan 2 jam yang
umumnya untuk peralatan gelas), (b). Sterilisasi secara kimia (misalnya dengan penggunaan disinfektan, larutan alkohol, larutan formalin), (c). Sterilisasi secara mekanik, digunakan untuk beberapa bahan yang akibat pemanasan tinggi atau tekanan tinggi akan mengalami perubahan, misalnya adalah dengan saringan/filter. Sistem kerja filter, seperti pada saringan lain adalah melakukan seleksi terhadap partikel-partikel yang lewat (dalam hal ini adalah mikroba). Autoclaf adalah alat untuk mensterilkan berbagai macam alat dan medium kultur jaringan tumbuhan denan mengunakan tekanan 15 psi (1,02 atm) dan suhu 121°C . Sterilisasi dengan autoklaf adalah salah satu metode sterilisasi dengan uap air di bawah tekanan. Suhu dan tekanan tinggi yang diberikan kepada alat dan media kultur jarinan tumbuhan yang disterilkan memberikan kekuatan yang lebih besar untuk membunuh sel dibandingkan dengan udara panas. Biasanya untuk mensterilkan media diunakan suhu 121°C dan tekanan 15 lb/in² (SI = 103,4 Kpa) selama 15 menit (Torres 1989: 1). Menurut Yuan (2012: 2), bahwa dalam metode kultur jaringan diperlukan lingkungan yang steril. Ada beberapa metode sterilisasi alat dan bahan tanaman. Sterilisasi dapat dilakukan dengan beberapa cara yaitu dengan pembakaran, pemanasan kering, pemanasan basah, penyaringan atau secara kimiawi. Sterilisasi dengan pembakaran yaitu alat-alat yang terbuat dari logam dapat disterilkan dengan cara memanaskan atau membakar di atas lampu spirtus. Sterilisasi dengan udara panas/kering pada alat-alat dari gelas seperti cawan petri,
erlenmeyer, tabung piala, botol eksplan, tabung reaksi dan sebagainya dapat o
disterilkan dengan udara panas (oven) pada suhu 130 – 160 C selama 1 – 2 jam. Alat-alat ditata tidak terlalu rapat agar sirkulasi udara antar tumpukan alat dapat berjalan lancar, sehingga semua alat dapat disterilkan dan dapat dengan mudah dijaga kesterilannya saat dikeluarkan dari alat sterilisasi. Sterilisasi dengan uap panas (basah) pada bahan atau alat dapat disterilkan dengan uap panas atau secara basah pada uap panas biasa atau uap panas dengan tekanan tinggi, secara terus menerus (kontinyu) atau secara terputus putus (diskontinyu), khususnya medium pada suhu atau tekanan yang rendah. Untuk sterilisasi dengan cara ini sering kali menggunakan otoklaf. Sterilisasi o
medium biasanya dilakukan pada suhu 121 C dengan tekanan 1 atm selama 15-30 menit, namun untuk medium yang tidak mudah rusak dapat dilakukan pada suhu atau tekanan yang sedikit lebih tinggi. Sterilisasi dengan bahan kimia yaitu bahan kimia tertentu sering digunakan untuk sterilisasi alat maupun bahan. Etanol 70% sering digunakan untuk sterilisasi permukaan pada alat yang sering dikombinasi dengan pembakaran pada api. NOCl (natrium hipoklorit) dan formalin juga sering digunakan untuk sterilisasi permukaan atau disinfestasi permukaan atau disinfeksi permukaan (Torres 1989: 1). Suatu alat atau bahan dikatakan steril apabila alat atau bahan tersebut bebas dari mikrobia, baik dalam bentuk vegetative ataupun spora. Suatu benda atau substansi hanya dapat dikatakan steril atau tidak steril, tidak akan pernah mungkin ada setengah steril atau hampir steril. Untuk sterilisasi alat dan medium digunakan sterilisasi dengan mengunakan alat yang disebut autoclave. Sterilisasi dilakukan untuk membunuh bakteri dan cendawan yang melekat pada eksplan
maupun pada alat serta bahan yang digunakan dalam penanaman eksplan (Fardiaz 1992: 4). Menurut Pramono (2007: 1), bahwa metode sterilisasi alat dan bahan tanaman juga dilakukan sterilisasi dalam kegiatan kultur jaringan harus dilakukan di tempat yang steril, yaitu di laminar flow dan menggunakan alat-alat yang juga steril. Sterilisasi lingkungan kerja yaitu sterilisasi yang dilakukan dalam penanaman eksplan agar mendapat tempat atau ruang yang steril dan bebas dari mikroorganisme. Tempat untuk menanam dan memindahkan eksplan yaitu disebut Laminar Air Flow. Dengan dihembuskannya aliran udara halus dari blower melalui suatu filter HEPA (High Efficiency Particulate Air) dengan pori-pori kurang dari 0,3 µm. Fungsi aliran udara ini yaitu dapat mencegah kontaminan yang air borne selama penanaman. Sebelum bekerja, bagian dalam laminar disterilkan dengan alcohol 70% dan diratakan dengan tissue, kemudian dilanjutkan dengan menyalakan lampu UV selama 0,5-1 jam untuk mematikan kontaminan di permukaan tempat kerja. Sterilisasi alat dan media dilakukan pada alat-alat seperti botol, erlenmeyer, beaker glass, petridish, pinset, scalpel, gunting, jarum ose, dll sebaiknya sebelum disterilisasi peralatan dicuci denga detergen kemudian dibilas dengan aquades dan dikeringkan. Kemudian dibungkus dengan kertas merang. Temperatur yang digunakan untuk sterilasasi alat-alat dengan autoclave 121°C pada tekanan 17,5 psi selama 20-30 menit. Sterlisasi bahan tanam yaitu bahan tanam yang ada dilapangan banyak mengandung debu, kotoran-kotoran dan berbagai kontaminan hidup pada permukaan. Apabila kontaminan ini tidak dihilangkan maka media yang mengandung gula, vitamin, dan mineral merupakan
sumber energy bagi kontaminan yang ada. Prinsip sterilasasi eksplan adalah dapat mematikan kontminan tanpa membunuh eksplan, karena baik kontaminan maupun eksplan merupakan benda hidup. Berhasilnya teknik sterilsasi merupakan langkah awal keberhasilan dalam kerja kultur in vitro (Hadioetomo 1993: 1). BAB III METODOLOGI PRAKTIKUM 3.1. Waktu dan Tempat
Praktikum ini dilaksanakan pada hari Selasa, tanggal 06 November 2012 pada pukul 09.00 s/d selesai. Bertempat di Laboratorium Botani Jurusan Biologi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam di Universitas Sriwijaya Indralaya. 3.2. Alat dan Bahan
Alat yang digunakan pada praktikum ini adalah aluminium foil, autoklaf, botol kultur, erlenmeyer, gunting kultur, kertas pembungkus, lampu bunsen, petridish, pinset dan scapel, sedangkan bahan yang dibutuhkan adalah aquades dan medium. 3.3. Cara Kerja
Disiapkan alat-alat yang berupa aluminium foil, Erlenmeyer, gunting, petridish, pinset tetes, scapel kemudian dibungkus dengan kertas pembungkus. Botol kultur ditutup dengan aluminium foil. Sedangkan bahan-bahan berupa aquades dan medium disterilisasikan dengan cara dimasukkan dalam botol lalu
ditutup dengan aluminium foil. Disterilisasi alat dan bahan dengan autoklaf pada suhu 121°C dengan tekanan 15 psi selama 20-30 menit.
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN 4.1. Hasil
Berdasarkan praktikum didapatkan hasil sebagai berikut : N
Nama
Gamb Keterangan
o.
Alat
ar
1.
Autoklaf
Autoklaf adalah alat sterilisasi untuk alat dan o
medium kultur jaringan. Suhunya 121 C, tekanan uap 15 selama 15 menit 2.
Magnetic
Magnetic stirer memiliki fungsi untuk
Stirer
menggojok denganpemanas.Dengan menggunakan listrik, alat ini berfungsi sebagai komporselain digunakan sebagai penggojok.
3.
Elenmey er
Alat ini digunakan dalam kultur jaringan tanaman sebagai sarana menuangkan air suling maupun untuk tempat media dan penanaman eksplan. 4.
5.
Gelas
Gelas ukur digunakan untuk menakar air suling
ukur
dan bahan kimia yang akan digunakan.
Pipet
Pipet tetes digunakan untuk mengambil supernatan
tetes
(larutan) protoplas atau untuk menambahkan KOH, HCL, menetralkan pH.
6.
Botol
Botol ini digunakan untuk tempat menanam eksplan
kultur 7.
Gelas piala Alat ini digunakan untuk menuangkan atau mempersiapkan bahan kimia dan air suling dalam pembuatan medium
8.
Gunting kultur Alat ini digunakan untuk mengiris bagian tanaman atau eksplan.
9.
Aluminiu
Aluminium foil berfungsi untuk menutup botol
m foil
kultur.
10 Pinset
Pinset digunakan untuk memegang atau
.
mengambil irisan eksplan atau untuk menanam eksplan
11 Cawan .
petri
12 Scalpel
Alat ini digunakan untuk tempat eksplan
. Alat ini digunakan untuk mengiris bahan isolasi protoplas 13 Kertas
Kertas digunakanuntuk membungkus alat-alat yang
.
akan di sterilisasi
Pembung kus
4.2. Pembahasan
Berdasarkan hasil praktikum yang dilakukan diketahui beberapa alat-alat seperti erlenmeyer, pipet tetes, pinset, disseting set, gunting, magnetic stirer, scaple, botol kultur dan lain-lain. Dari alat-alat yang mempunyai fungsi dan cara pemakaian yang berbeda, namun disterilisasikan bersama menggunakan autoklaf. Sterilisasi adalah segala kegiatan dalam kultur jaringan yang sangat penting dan harus dilakukan ditempat yang steril, yaitu di laminar flow. Seperti yang diungkapkan Wetherell (1976: 1), bahwa lingkungan aseptic sebagai salah satu syarat utama suksesnya kegiatan kultur jaringan perlu diterapkan dengan sungguh-sungguh. Untuk itu perlu adanya usaha sterilisasi peralatan dan media yang akan digunakan dalam proses kultur agar bebas dari mikroba. Sterilisasi secara umum terdiri dari sterilisasi fisika, sterilisasi kimia dan sterilisasi modifide yaitu gabungan antara sterilisasi fisika dan kimia. Menurut Yuan (2012: 2), bahwa ada beberapa metode sterilisasi alat dan bahan tanaman yang dilakukan dengan beberapa cara yaitu dengan pembakaran, pemanasan kering, pemanasan basah, penyaringan atau secara kimiawi. Sterilisasi alat dan bahan tanaman juga dilakukan sterilisasi dalam kegiatan kultur jaringan harus
dilakukan di tempat yang steril, dan menggunakan alat-alat yang juga steril yaitu sterilisasi lingkungan kerja, sterilisasi alat dan media dan sterlisasi bahan tanam. Jenis sterilisasi yang baik digunakan adalah sterilisasi menggunakan autoklaf.
Autoklaf yaitu alat yang berfungsi untuk sterilisasi dengan uap
panas bertekanan. Autoklaf dipakai untuk sterilisasi medium atau larutan atau alat-alat yang tidak tahan suhu tinggi. Prinsip kerjanya yaitu mensterilkan dengan bantuan uap. Menurut Wetherell (1976: 1), dalam waktu 10-15 menit hampir semua sel-sel mikroba dapat terbunuh oleh uap air yang sangat panas. Untuk mensterilisasi alat-alat dibutuhkan suhu uap air 250 oF (121°C) dalam waktu 15 menit. Untuk menaikkan suhu yang lebih tinggi dari titik didih tersebut yaitu dengan menaikkan tekanan uap air. Sedangkan menurut Estuningsih (2012: 1 ), jika panas digunakan bersama-sama dengan uap air disebut sterilisasi basah mengggunakan autoklaf, sedangkan jika tanpa uap air disebut sterilisasi kering menggunakan oven. Pada praktikum yang dilakukan hanya menggunakan sterilisasi basah yaitu menggunakan autoklaf. Percobaan sterilisasi kultur jaringan dilakukan dengan baik, kita bisa membuat kisaran konsentrasi dan waktu yang diperlukan untuk sterilisasi dengan rentang yang cukup lebar. Jika dengan konsentrasi tertentu tidak terkontaminasi tetapi eksplannya mati, berarti konsentrasinya harus diturunkan. Begitu juga sebaliknya, jika masih banyak kontaminannya, konsentrasi bahan harus dinaikkan supaya tidak terkontaminasi lagi. Sama juga halnya dengan waktu yang diperlukan untuk sterilisasi. Jika masih banyak kontaminasi, berarti proses sterilisasi harus lebih lama. Jika kita telah berhasil mendapatkan satu kultur jaringan saja yang bebas kontaminan, maka kita dapat memperbanyaknya dalam jumlah banyak.
Fungsi alat yang disterilisasikan adalah untuk menghindari adanya mikroorganisme yang masih terbawa oleh alat-alat yang akan digunakan, karena adanya mikroorganisme menyebabkan kontaminasi bahkan dapat menumbuh kembangkan bakteri yang belum benar-benar steril. Suatu alat atau bahan dikatakan steril apabila alat atau bahan tersebut bebas dari mikrobia, baik dalam bentuk vegetative ataupun spora. Suatu benda atau substansi hanya dapat dikatakan steril atau tidak steril, tidak akan pernah mungkin ada setengah steril atau hampir steril. Untuk sterilisasi alat dan medium juga digunakan sterilisasi dengan mengunakan alat yang disebut autoclave. Sterilisasi dilakukan untuk membunuh bakteri dan cendawan yang melekat pada eksplan maupun pada alat serta bahan yang digunakan dalam penanaman eksplan (Fardiaz 1992: 4). Labu erlenmeyer berfungsi sebagai tempat penyimpanan medium, memanaskan larutan, dan menampung hasil dari penyaringan. Di dalam kultur jaringan aluminium foil berfungsi untuk menutup botol kultur. Pipet tetes fungsinya sama dengan pipet ukur yaitu digunakan untuk memindahkan suatu cairan atau larutan, namun volume yang dipindahkan tidak diketahui. Lampu bunsen salah satu alat yang berfungsi untuk menciptakan kondisi yang steril adalah pembakar spiritus. Alat-alat ini dapat disterilisasikan dengan dibungkus aluminium foil, lalu disterilisasi dengan menggunakan autoklaf. BAB V KESIMPULAN
Dari hasil praktikum yang dilakukan dapat disimpulkan bahwa :
1.
Sterilisasi alat dilakukan pada alat-alat seperti botol, erlenmeyer, beaker glass, petridish, pinset, scalpel, gunting, jarum ose, dll sebaiknya sebelum disterilisasi peralatan dicuci denga detergen kemudian dibilas dengan aquades dan dikeringkan. Kemudian dibungkus dengan kertas merang dan dimsukkan ke dalam autoklaf.
2.
Temperatur yang digunakan untuk sterilasasi alat-alat dengan autoclave 121°C pada tekanan 15 psi selama 20-30 menit.
3.
Fungsi sterilisasikan adalah untuk menghindari adanya mikroorganisme yang masih terbawa oleh alat-alat yang akan digunakan, karena adanya mikroorganisme menyebabkan kontaminasi bahkan dapat menumbuh kembangkan bakteri yang belum benar-benar steril.
4.
Segala peralatan yang digunakan dalam kultur jaringan harus dalam keadaan steril melalui proses sterilisasi.
5.
Sterilisasi adalah membebaskan bahan dari semua mikroba. Cara sterilisasi terdapat kesamaan seperti pada oven dan autoclave. Hanya saja yang menjadi perbedaan yaitu metode penggunaannya.
DAFTAR PUSTAKA
Daisy. 1994. Laporan Kultur Jaringan. http://blogspot.com/2012/02/laporan-kultur jaringan-pembuatan-media_822.html. 1 ± 2 diakses pada tanggal 8 November 2012.
Fardiaz. 1992. Cara Steilisasi Alat-alat dan Media Kultur Jarngan. http://eshaflora.blogspot.com/2010/02/cara-sterilisasi-alat-alat-dan-
media.html. 1 ± 2 diakses pada tanggal 8 November 2012. Hadioetomo, R.S. 1985. Mikrobiologi Dasar dalam Praktek . PT.Gramedia: Jakarta. 237 hal. Hamdan. 2012. Laporan Kultur Jaringan Sterilisasi Alat. http://hamdanmaruli.blogspot.com/2012/02/lap-kultur-jaringan-sterilisasi-alat.html. 1 ± 2 diakses pada tanggal 8 November 2012. Hendaryono & wijayani. 2002. Media Kultur Jaringan. http://kultur-jaringan. blogspot.com/2009/08/media-kultur-jaringan.html. 1 ± 2 diakses pada tanggal 8 November 2012. Sany. 2007. Pembiakan Tanaman Melalui Kultur Jaringan . Jakarta: Gramedia. 213 hal. Pramono. 2007. Sterilisasi dalam Kultur Jaringan. http://sterilisasi-dalam-kultur jaringan.blogspost.com/2012/09/kultur-jaringan.html. 1 ± 2 diakses pada tanggal 8 November 2012. Yuan. 2012. Kultur Jaringan Sterilisasi. http://yuangaknekoneko.blogspot.com/2012/03/kultur-jaringan-
sterilisasi.html. 1 ± 2 diakses pada tanggal 8 November 2012.
Wetherell, dkk. 1976. Biologi . Jakarta: Erlangga. 211 hal.
Bioteknologi di bidang pertanian telah berkembang pesat, salah satu contohnya adalah kultur jaringan. Kultur jaringan tanaman merupakan teknik menumbuh kembangkan bagian tanaman, baik berupa sel, jaringan atau organ tanaman dalam kondisi aseptis secara in vitro. Ciri teknik ini adalah kondisi kultur yang aseptis, penggunaan media kultur buatan dengan kandungan nutrisi lengkap, dan kondisi lingkungan kultur yang sesuai. Lingkungan yang sesuai dapat dipenuhi dengan menentukan media tumbuh yang sesuai dan penempatan pada kondisi yang terkendali berkaitan dengan intensitas dan periodisitas, cahaya, temperatur, dan kelembaban serta keharusan sterilisasi. Kultur jaringan merupakan suatu metode untuk mengisolasi bagian dari tanaman seperti protoplasma, sel, sekelompok sel, jaringan maupun organ , serta menumbuhkannya dalam keadaan aseptik, sehingga bagian-bagian tersebut dapat memperbanyak diri dan beregenerasi menjadi tanaman utuh kembali (Sany, 2007). Konsep awal dari kultur jarngan adalah diketahuinya kemempuan totipotensi dari sel tumbuhan. Totipotensi sel (Total Genetic Potential), artinya setiap sel memiliki potensi genetik seperti zigot yaitu mampu memperbanyak diri dan berediferensiasi menjadi tanaman lengkap. Sterilisasi adalah bahwa segala kegiatan dalam kultur jaringan harus dilakukan ditempat yang steril, yaitu di laminar flow dan menggunakan alat-alat yang juga steril. Se per ti dise but kan se bel umn ya bah wa kondisi yang aseptic merupakan syarat yang mutlak dalam taha pan per ban yaka n ta na man sec ara kul tur jar ing an. Lingkungan aseptic sebagai salah satu syarat utama suksesnya kegiatan kultur jaringan perlu
diterapkan dengan sungguh-sungguh. Untuk itu perlu adanya usaha sterilisasi peralatan yang akan digunakan dalam proses kultur. Tidak hanya terbatas pada peralatan, namun ruangan yang akan digunakan pun harus dalam kondisi aseptic. Tujuan utama dari sterilisasi ruangan maupun peralatan kultur pada dasarnya untuk menghindari kontaminasi oleh mikro organisme yang ada di peralatan maupun di udara bebas sekitar ruangan. Perlakuan tersebut mutlak dilakukan terutama pada ruang penabur atau tempat yang digunakan untuk penanaman eksplan.
Tujuan dari acara ini adalah untuk meningkatkan ketrampilan mahasiswa dalam melakukan sterilisasi peralatan dengan menggunakan autoklaf.
Sterilisasi merupakan suatu proses untuk mematikan semua organisme yang terdapat pada atau di dalam suatu benda. Sterilisasi basah dapat digunakan untuk mensterilkan bahan apa saja yang dapat tembus uap air dan tidak rusak bila dipanaskan dengan suhu yang berkisar antara 110-121. Sterilisasi yang umum dilakukan dapat berupa: a. Sterilisasi secara fisik (pemanasan, penggunaan sinar gelombang pendek yang dapat dilakukan selama senyawa kimia yang akan disterilkan tidak akan berubah atau terurai akibat temperatur atau tekanan tinggi). Dengan udara panas,
dipergunakan alat “bejana/ruang panas” (oven dengan temperatur 170– 180 dan
waktu yang digunakan adalah 2 jam yang umumnya untuk peralatan gelas). b. Sterilisasi secara kimia (misalnya dengan penggunaan disinfektan, larutan alkohol,larutan formalin). c. Sterilisasi secara mekanik, digunakan untuk beberapa bahan yang akibat pemanasan tinggi atau tekanan tinggi akan mengalami perubahan, misalnya adalah dengan saringan/filter. Sistem kerja filter, seperti pada saringan lain adalah melakukan seleksi terhadap partikel-partikel yang lewat (dalam hal ini adalah mikroba). (http://elearning.unram.ac.id/KulJar/BAB%20IV%20STERILISASI/IV2%20Sterilisasi %20Alat.ht) Sterilisasi dengan autoklaf adalah salah satu metode sterilisasi dengan uap air di bawah tekanan. Kapas penyumbat, kasa, perlatan laboratorium, plastik penutup, peralatan gelas, penyaring, air, dan media nutrisi dapat disterilisasi dengan autoklaf. Hampir semua mikroba mati bila terkena uap yang sangat panas dari autoklaf selama 10-15 menit/ semua obyek hendaknya disterilisasi pada suhu 121ºC dan tekanan 15 Psiselama 15-20 menit. (Torres, 1989). Sebagai syarat mutlak suksesnya kultur jaringan tanaman, biasanya sterilisasi dilakukan dengan menggunakan autoklaf. Bahkan autoklaf juga dapat digunakan untuk sterilisasi media tumbuh kultur jaringan. Tipe autoklaf yang dapat digunakan untuk sterilisasi sangatlah beragam macamnya, mulai dari yang sederhana sampai digital (terprogram) (Gunawan, 1988).
Autoklaf yang sederhana menggunakan sumber uap dari pemanasan air yang ditambahkan ke dalam autoklaf. Pemanasan air dapat menggunakan kompor atau api Bunsen. Dengan autoklaf sederhana ini, tekanan dan temperatur diatur dengan jumlah panas dari api. Kelemahan dari autoklaf ini adalah bahwa perlu adanya penjagaan dan pengaturan panas secara manual dan terkontrol, selama masa sterilisasi dilakukan. Tetapi autoklaf ini mempunyai keuntungan, yaitu: lebih sederhana sederhana, harga relatif murah, tidak tergantung dari aliran listrik yang sering merupakan problema untuk negara-negara yang sedang berkembang, serta lebih cepat dari autoklaf listrik yang seukuran dan setaraf. Autoklaf yang lebih komplit menggunakan sumber energi dari listrik. Alatnya dilengkapi dengan timer dan thermostat. Bila pengatur automatis ini berjalan dengan baik. Maka autoklaf dapat dijalankan sambil mengerjakan pekerjaan lain. Kelemahannya adalah bila salah satu pengatur tidak bekerja, maka pekerjaan persiapan media menjadi sia-sia dan kemungkinan menyebabkan kerusakkan total pada autoklaf. Sebagai sumber uap, juga berasal dari air yang ditambahkan ke dalam autoklaf dan didihkan. Biasanya untuk laboratorium komersial, menurut Gunawan (1988), diperlukan autoklaf dengan kapasitas besar dan sumber uap biasanya dari boiler yang terpisah. Autoklaf ini sangat cepat dan dapat diprogam waktu sterilisasi serta waktu pendinginan. Setelah sterilisasi bahan atau alat selesai, temperatur dan tekanan autoklaf diturunkan secara perlahan-lahan dalam waktu 15-20 menit. Pada autoklaf yang programmable (memiliki program yang dapat diatur), panas ini diatur secara atomatis. Tetapi pada autoklaf yang sederhana hal ini harus diatur secara manual.
Bahan dan peralatan yang digunakan pada acara praktikum ini antara lain autoklaf, kompor serta gas, peralatan kaca/ Glass ware (seperti botol kultur, Erlenmeyer, petridish, gelas piala), peralatan penanaman /Dissecting kit (seperti pinset, scalpel), aluminium foil, kertas paying, karet gelang, kertas merang, kertas pembungkus, plastic seal .
B. 1.
Glass ware dan dissesting kit dicuci bersih dengan sabun, dibilas dengan air lalu
dikeringkan. Setel;ah kering mulut botol ditutup dengan aluminium foil dan dieratkan dengan plastic seal (segel plastik). Pinset dan scalpel dibungkus dengan kertas aluminium foil. 2.
o
Glass ware dan dissesting kit disterilisasi dengan autoklaf pada suhu 120 C pada
tekanan 17,5 psi selama 30 menit. 3.
Selama proses sterilisasi berlangsung, autoklaf ditutup rapat sehingga tekanan didalam autoklaf naik. Tekanan tinggi tersebut dipertahankan selama 30 menit dengan mengecilkan api, dilakukan selama tiga kali.
4.
Kompor dimatikan setelah proses sterilisasi selesai katup dibuka untuk membuang uap air hingga tekanan 0 psi.
5.
Autoklaf dibuka dan peralatan yang disterilisasi diambil.
6.
Peralatan disimpan di tempat yang bersih.
No. Nama Alat
1
Autoclave
Gambar
Keterangan
Alat sterilisasi peralatan dan media kultur jaringan
2
Timbangan
Untuk menimbang
Analitik
bahan dalam pembuatan media kultur jaringan
3
pH Meter
Untuk mengukur pH media kultur jaringan
4
Magnetik Stirer
Untuk mengaduk larutan dan memanaskan larutan
5
Botol Kultur
Untuk tempat menanam eksplan
6
LAF
Untuk tempat penanaman eksplan
7
Gelas ukur
Untuk mengukur suatu larutan
8
Erlenmeyer
Untuk menampung larutan
9
Seal
Untuk merekatkan alumunium foil pada botol kultur
10
Pipet
Untuk memindahkan larutan
11
Suntikan
Untuk memindahkan larutan dengan skala yang kecil dan terukur
12
13
Pembakar
Untuk sterilisasi
Bunsen
eksplan dan alat
Petridish
Untuk meletakan eksplan yang akar di kultur
14
Pinset
Untuk mengambil eksplan
15
Pengaduk Kaca
Untuk mengaduk larutan dalam pembuatan media kultur
16
Sarung Tangan (Gloves)
17
Karet Gelang
Untuk melindungi tangan dari panas
Unttuk mengikat alat-alat yang akan disterilkan
18
Aluminium foil
Untuk menutup botol kultur
19
Beker Glass
Untuk tempat membuat media/tempat
melarutkan larutan 20
Kertas Payung
Untuk membungkus alatalat yang akan di sterilisasi
Sterilisasi adalah bahwa segala kegiatan dalam kultur jaringan harus dilakukan ditempat yang steril, yaitu di laminar flow dan menggunakan alat-alat yang juga steril. Se per ti dise but kan se bel umn ya bah wa kondisi yang aseptic merupakan syarat yang mutlak dalam taha pan per ban yaka n ta na man sec ara kul tur jar ing an. Lingkungan aseptic sebagai salah satu syarat utama suksesnya kegiatan kultur jaringan perlu diterapkan dengan sungguh-sungguh. Untuk itu perlu adanya usaha sterilisasi peralatan yang akan digunakan dalam proses kultur. Autoclave adalah alat yang digunakan untuk sterilisasi media mikrobiologi, peralatan gelas laboratorium dan dekontaminasi atau membunuh bakteri. Pada prinsipnya, sterilisasi autoclave menggunakan panas dan tekanan dari uap air. 0
Temperature sterilasi biasanya 121 C, tekanan yang biasa digunakan antara 1517,5 psi (pound per square inci) atau 1 atm. Lamanya sterilisasi tergantung dari volume dan jenis. Alat-alat dan air disterilkan selama 1 jam, tetapi media antara 20-40 menit tergantung dari volume bahan yang disterilkan.
Prinsip kerja autocalve: Proses Sterilisasi pada Autoclave adalah memanfaatkan panas dan tekanan uap
o
dalam chamber. Panas dan tekanan tersebut dihasilkan oleh pemanasan elemen di dalam
o
chamber yang dikondisikan menjadi hampa udara. semakin besar setting waktu dan suhu yang digunakan maka semakin besar
o
tekanan yang dihasilkan dalam chamber sehingga proses sterilisasi akan lebih cepat selesai. Tetapi dalam proses sterilisasi sudah ditentukan besarnya suhu dan lamanya
o
waktu sterilisasi, tergantung pada hasil kualifikasi nya dan dari setiap bahan / alat yang akan disterilkan. Adapun cara kerja yang baik dalam menggunakan autocalve antara lain, sebagai berikut : Sebelum melakukan sterilisasi cek dahulu banyaknya air dalam autoklaf. Jika air
o
kurang dari batas yang ditentukan, maka dapat ditambah air sampai batas tersebut. Gunakan air hasil destilasi, untuk menghindari terbentuknya kerak dan karat. Masukkan peralatan dan bahan. Jika mensterilisasi botol bertutup ulir, maka
o
tutup harus dikendorkan. Tutup autoklaf dengan rapat lalu kencangkan baut pengaman agar tidak ada uap
o
yang keluar dari bibir autoklaf. Klep pengaman jangan dikencangkan terlebih dahulu.
o
Nyalakan autoklaf, diatur timer dengan waktu minimal 15 menit pada suhu 121oC.
Tunggu sampai air mendidih sehingga uapnya memenuhi kompartemen autoklaf
o
dan terdesak keluar dari klep pengaman. Kemudian klep pengaman ditutup (dikencangkan) dan tunggu sampai selesai. Penghitungan waktu 15’dimulai sejak
tekanan mencapai 2 atm. Jika alarm tanda selesai berbunyi, maka tunggu tekanan dalam kompartemen
o
turun hingga sama dengan tekanan udara di lingkungan (jarum pada preisure gauge menunjuk ke angka nol). Kemudian klep-klep pengaman dibuka dan keluarkan isi autoklaf dengan hati-hati. Bagian-bagian autoklaf : 1. Panci luar. 2. Panci dalam tempat meletakkan botol dengan alur tempat saluran uap. 3. Tutup beserta penunjuk tekanan dan saluran uap. 4. Katup pengeluaran uap. 5. Pengunci atau klem. Komponen-komponen utama autoclave : 1. Pressure Gauge (Pengukur Tekanan Gas/Uap) ; tekanan yang disarankan 1,051,2 kg/cm
2
o
o
2. Thermometer (Pengukur Suhu) ; suhu yang disarankan 121 -125 C 3. Exhaust Valve
a.
Saat sterilisasi dimulai, valve dinuka sampai ada uap air yang keluar dan menetes kemudian valve ditutup, tujuannya untuk kesempurnaan sterilisasi (pada saat velve dibuka gas/udara yang tidak steril keluar)
b.
Setelah sterilisasi selesai (tekanan menunjukan angka 0), valve dibuka kembali untuk mengeluarkan gas/uap yang tersisa
4. Automatic Pressure Regulating Valve (Sefety Valve) ; menjaga tekanan uap/gas tetap pada tekanan yang disarankan Alat-alat logam dan gelas yang digunakan pada saat penanaman dapat disterilkan dalam autoklaf. Alat tanam seperti: pinset dan gunting dapat juga disterilkan dengan pembakaran atau dengan pemanasan dalam bacticinerator ataupun pembakar bunsen. Menurut Anonim (2009), khusus untuk skalpel, gagangnya dapat disterilkan dengan pemanasan, namun mata pisaunya (blade) dapat menjadi tumpul bila dipanaskan dalam temperature tinggi. Oleh karena itu untuk mata pisaunya dianjurkan cara sterilisasi dengan pencelupan dalam alkohol atau larutan kaporit. Sebelum dimasukkan petridish, pisau scalpel , pinset, dan alat-alat yang lain (alatalat logam dan gelas) terlebih dahulu dibungkus dengan kertas agar tidak kontak langsung dengan uap air autocalve. Petridish akan mudah rusak (pecah) jika mengalami kontak langsung dengan uap air yang panas. Sedangkan alat-alat seperti pisau scalpel dan pinset akan mudah berkarat jika berkontak langsung dengan uap air. Bagian yang ada tulisan dari kertas pembungkus harus diletakkan di bagian luar agar tinta yang larut nanti tidak mengotori alat yang ada di dalamnya.
Peralatan Kultur Jaringan o
Cawan petri: Cawan petri berfungsi untuk membiakkan (kultivasi)
mikroorganisme. Medium dapat dituang ke cawan bagian bawah dan cawan bagian atas sebagai penutup. Cawan petri tersedia dalam berbagai macam ukuran, diameter cawanyang biasa berdiameter 15 cm dapat menampung media sebanyak 15-20 ml,sedangkan cawan berdiameter 9 cm kira-kira cukup diisi media sebanyak 10 ml. o
Botol kultur: Umumnya botol-botol kultur terbuat dari bahan yang tahan panas.
Syarat botol kultur adalah dasarnya lebar dan mulutnya kecil, karena mulut botol yang lebar memungkinkan kontaminasi yang lebih besar. Sama seperti glassware yang lain sterilisasi botol kultur dengan autoclave tetapi sebelumnya dicuci bersih dengan deterjen dan dikeringkan. Ketika dimasukkan ke dalam autoclave mulut botol kultur ditutup dengan plastik dan diikat dengan karet gelang. o
Alumunium foil: adalah Alumunium foil lembaran aluminium tipis yang dapat
dipakai untuk berbagai macam aplikasi memasak ataupun lainnya. Salah satu keuntungan dari menggunakan aluminium foil adalah karena sifatnya yang dapat digunakan kembali hingga beberapa kali. Di dalam kultur jaringan aluminium foil berfungsi untuk menutup botol kultur. o
Seal : Seal digunakan untuk menutup botol kultur atau botol ukur. Tujuannya
adalah untuk meminimalisir masuknya kontaminan ke dalam botol kultur atau bisa juga untuk mencegah bahan-bahan atau larutan dalam botol tumpah.
o
Kertas payung: Kertas ini digunakan untuk membungkus alat – alat kultur dan
petridish sebelum disterillisasikan. o
Karet gelang: Karet gelang digunakan sebagai pengikat penutup botol yakni
plastik atau juga untuk mengikat kertas pembungkus petridish dan dissecting kit selama proses sterilisasi dengan autoclave. o
Suntikan: Jarum injeksi digunakan untuk mengambil larutan stok dalam
pembuatan media atau untuk memasukkan larutan (enzim) dalam pekerjaan isolasi protoplas ataupun untuk keperluan lain. Jarum injeksi ada dua macam yaitu yang terbuat dari plastik dan yang terbuat dari kaca. Jarum injeksi ada yang dapat disterilisasi dengan autoclave ada juga yang dengan mengganti jarum suntiknya. o
Scalpel: scalpel atau pisau dalam kultur jaringan digunakan untuk mengiris atau
memotong eksplan. Scalpel ada dua macam yaitu scalpel biasa yang dapat dipakai seterusnya (selalu disterilkan dengan autoclave) dan scalpel blits. Scalpel jenis blits mata pisaunya dapat dipasang menurut ukuran yang dikehendaki. Tangkainya dapat disterilkan dengan autoclave sedangkan mata pisaunya hanya sekali dipakai. Scalpel blits digunakan untuk mengiris bahan isolasi protoplas karena membutuhkan irisan yang sangat tipis (Daisy dan Ari, 2002). o
pH meter: pH meter yang dipakai pada praktikum kali ini menggunakan pH meter
otomatis. Pengukuran pH media, ujung sensor dimasukkan ke dalam larutan media, pada monitor akan muncul nilai pH media. Tinggal kita tambahkan NaOH jika terlalu asam dan HCl jika terlalu basa.
o
Gelas ukur: Berguna untuk mengukur volume suatu cairan, seperti labu
erlenmeyer, gelas ukur memiliki beberapa pilihan berdasarkan skala volumenya. Pada saat mengukur volume larutan, sebaiknya volume tersebut ditentukan berdasarkan meniskus cekung larutan. o
Erlenmeyer : Alat ini digunakan dalam kultur jaringan tanaman sebagai sarana
menuangkan air suling maupun untuk tempat media dan penanaman eksplan. o
Laminar Air Flow Cabinet (LAFC): Alat ini letaknya di ruang penabur, yaitu ruang
yang selalu harus dalam keadaan steril. Alat ini digunakan sebagai tahap perlakuan penanaman. o
Shaker (penggojok) : Merupakan alat penggojok yang putarannya dapat diatur
menurut kemauan kita. o
Sarung tangan: Sarung tangan adalah sejenis pakaian yang menutupi tangan, baik
secara sebagian ataupun secara keseluruhan. Fungsi sarung tangan ialah untuk melindungi sang pemakai dari pengaruh lingkungan sekitarnya atau melindungi lingkungan sekitar dari tangan sang pemakai. o
Timbangan Analitik : jenis alat ini bermacam-macam, tetapi yang penting adalah
timbangan yang dapat dipergunakan untuk menimbang sampai satuan yang sangat keil. Alat ini berfungsi sebagai alat untuk menimbang bahan-bahan kimia yang digunakan untuk kultur jaringan. o
Stirer : Alat ini berfungsi untuk menggojok dengan pemanas. Dengan
menggunakan listrik, alat ini berfungsi sebagai kompor di samping sebagai penggojok.
o
Pembakar spiritus: Salah satu alat yang berfungsi untuk menciptakan kondisi yang
steril adalah pembakar spiritus. Api yang menyala dapat membuat aliran udara karena oksigen dikonsumsi dari bawah dan diharapkan kontaminan ikut terbakar dalam pola aliran udara tersebut. Untuk sterilisasi jarum ose atau yang lain, bagian api yang paling cocok untuk memijarkannya adalah bagian api yang berwarna biru (paling panas). Perubahan bunsen dapat menggunakan bahan bakar gas atau metanol. o
Tabung Reaksi: Di dalam mikrobiologi, tabung reaksi digunakan untuk uji-uji
biokimiawi dan menumbuhkan mikroba. Tabung reaksi dapat diisi media padat maupun cair. Tutup tabung reaksi dapat berupa kapas, tutup metal, tutup plastik atau aluminium foil. Media padat yang dimasukkan ke tabung reaksi dapat diatur menjadi 2 bentuk menurut fungsinya, yaitu media agar tegak ( deep tube agar ) dan agar miring(slants agar ). Untuk membuat agar miring, perlu diperhatikan tentang kemiringan media yaitu luas permukaan yang kontak dengan udara tidak terlalu sempit atau tidak terlalu lebar dan hindari jarak media yang terlalu dekat dengan mulut tabung karena memperbesar resiko kontaminasi. Untuk alas an efisiensi, media yang ditambahkan berkisar 10-12 ml tiap tabung. o
Pipet Tetes: Fungsinya sama dengan pipet ukur yaitu digunakan untuk
memindahkan suatu cairan atau larutan, namun volume yang dipindahkan tidak diketahui. Salah satu penerapannya adalah dalam menambahkan HCl / NaOH saat mengatur pH media, penambahan reagen ada uji biokimia, dll. o
Autoclave: Autoclave adalah alat untuk mensterilkan berbagai macam alat dan
bahan yang digunakan dalam mikrobiologi menggunakan uap air panas bertekanan. Tekanan yang digunakan pada umumnya 15 psi atau sekitar 2
atm dandengan suhu 121oC (250oF). Jadi tekanan yang bekerja ke seluruh permukaan benda adalah 15 pon tiap inchi 2(15 psi = 15 pounds per square inch). Lama sterilisasi yang dilakukan biasanya 15 menit untuk 121oC. 1. Botol bersih diberi beberapa tetes aquadest dan tutup dengan kertas atau aluminium foil (jangan terlalu kencang bila menggunakan aluminium foil). Untuk botol-botol yang mempunyai tutup yang autoclave, jangan tutup terlalu kencang, karena selama pemanasan terjadi pemuaian. 2. Alat-alat yang perlu disterilkan sebelum penanaman adalah: pinset, gunting, gagang skalpel, kertas saring, petri-dish, botol-botol kosong, jarum dan pipet. 3. Alat-alat dan kertas saring dibungkus rapi dengan kertas tebal atau ditaruh dalam baki stainless steel dan bakinya dibungkus dengan kain tebal sebelum dimasukkan dalam autoklaf. Alumunium foil tidak direkomendasikan sebagai pembungkus, karena uap tidak dapat masuk ke dalam bungkusan. Alat-alat sektio seperti pinset, gunting, gagang skalpel, dan jarum, dibungkus dengan kertas kopi atau kertas merang. Hindarkan penggunaan Al-foil karena uap sukar masuk kedalam bungkusan sehingga sterilisasi kurang efektif. 4. Petri-dish akan disterilkan, juga dibungkus dengan kertas kopi atau kertas merang. 5. Temperatur yang digunakan untuk sterilisasi botol kultur kosong dan alat-alat yang akan digunakan untuk menanam eksplan, adalah 121 pada tekanan 15 psi (pound per square inch) atau 1 atm selama 30-60 menit. Penghitungan waktu sterilisasi dimulai setelah tekanan dan temperatur yang diinginkan tercapai.
Pada prinsipnya, sterilisasi autoclave menggunakan panas dan tekanan dari uap air. Temperature sterilasi biasanya 121 , tekanan yang biasa digunakan antara 1517,5 psi( pound per square inci) atau 1 atm. Lamanya sterilisasi tergantung dari volume dan jenis. Alat-alat dan air disterilkan selama 1 jam, tetapi media antara 20-40 menit tergantung dari volume bahan yang disterilkan. Sterilisasi media yang terlalu lama menyebabkan : 1. Penguraian gula. 2. Degradasi vitamin dan asam-asam amino. 3. Inaktifasi sitokinin zeatin riboside. 4. Perubahan pH yang berakibatkan depolimerisasi agar. ( Lydiane Kyte & John Kleyn. 1996 : 169).
Suhu sterilisasi yang disarankan adalah 121°C, hal ini dikarenakan suhu tersebut merupakan suhu kritis, dimana seluruh bentuk kontaminan tidak dapat bertahan hidup/mati. Sedangkan khusus untuk lama sterilisasi sifatnya disesuaikan dengan volume media yang disterilisasi dan besarnya suhu yang diinginkan, Semakin banyak volume media maka semakin lama masa sterilisasinya. Biasanya untuk lama sterilisasi 20 menit, volume media yang digunakan berkisar 20-30 ml/botol atau 70-100ml/cup plastik atau 1 liter botol Schoolt atau 4 liter botol Erlenmeyer.
Berdasarkan data hasil pengamatan, maka dapat ditarik kesimpulan bahwa sterilisasi peralatan kultur dilakukan sebagai salah satu syarat utama suksesnya kegiatan kultur jaringan yang perlu diterapkan dengan sungguh-sungguh, salah 0
satunya dengan menggunakan autoclave pada suhu 121 C pada tekanan 15-17,5 psi. selama 30 menit. Beberapa peralatan yang di sterilisasi menggunakan autoklaf antara lain botol kultur, petridish, Erlenmeyer, aluminium foil, scalpel, dan pinset.
Bagian-bagian autoklaf : 1. Panci luar. 2. Panci dalam tempat meletakkan botol dengan alur tempat saluran uap. 3. Tutup beserta penunjuk tekanan dan saluran uap. 4. Katup pengeluaran uap. 5. Pengunci atau klem.
Alat-alat logam dan gelas yang digunakan pada saat penanaman dapat disterilkan dalam autoklaf. Alat tanam seperti: pinset dan gunting dapat juga disterilkan dengan pembakaran atau dengan pemanasan dalam bacticinerator ataupun pembakar bunsen. Khusus untuk skalpel, gagangnya dapat disterilkan dengan pemanasan, namun mata pisaunya (blade) dapat menjadi tumpul bila dipanaskan dalam temperature tinggi. Oleh karena itu untuk mata pisaunya dianjurkan cara sterilisasi dengan pencelupan dalam alkohol atau larutan kaporit.
Sterilisasi alat harus dilakukan sesuai prosedur dan teliti agar tidak terjadi kontaminasi
LAPORAN KULTUR JARINGAN STERILISASI RUANG, ALAT, DAN MEDIA KULTUR IN VITRO
L APORAN PRAKTI KUM TEKNI K KULTUR JARI NGAN “STERILISASI RUANG, ALAT, DAN MEDIA KUL TUR IN VITRO”
OL E H : NAM A NPM CO.ASS
: PETRUS SI M ATUPANG : E1J009094 : RUTH SI REGAR
PRODI AGROEKOTEK NOL OGI FAKUL TAS PERTANI AN UNI VERSI TAS BENGKUL U 2012
BAB I
PENDAHULUAN
A.
Dasar Das ar Te Teori ori
Umumnya penggunaan operasional di lab perbanyakan tanaman dengan kultur jaringan dapat dipelajari dengan mudah. Hal yang paling perlu diperhatikan adalah akurasi, kebersihan dan keamanan saat bekerja dengan teknik kultur jaringan. Penimbangan Pada saat pembuatan media, semua bahan yang ditimbang harus dilakukan dengan hati-hati meskipun untuk pembuatan media dalam skala komersial. Setiap penggunaan timbangan atau alat-alat lain harus memperhatikan instruksi dari pabrikannya.
Jenis timbangan timbangan yang sering digunakan digunakan di lab antara antara lain top-loading top-loading balance dan analytical balance yang memungkinkan akurasi penimbangan hingga skala milligram. milligram. Beberapa persyaratan persyaratan yang yang harus diperhatikan diperhatikan agar diperoleh penimbangan yang yang akurat adalah (i) (i) timbangan harus ditempatkan ditempatkan pada tempat yang keras, stabil, stabil, permukaannya permukaannya rata yang bebas bebas getaran dan kebocoran, (ii) daerah sekitar penimbangan harus terjaga kebersihannya, (iii) yang terpenting lagi, penimbangan jangan sampai pernah overload, (iv) penimbangan disarankan menggunakan wadah atau alas yang ringan atau kertas daripada menempatkan bahan yang ditimbang secara langsung di atas piring timbangan.
Pengukuran cairan/larutan cairan/larutan Peralatan Peralatan gelas yang yang mempunyai ukuran ukuran seperti gelas piala, erlenmeyer erlenmeyer dan pipet pipet diperlukan untuk pembuatan media. Gelas Gelas ukur kapasitas 10, 25, 100 dan 1000 ml banyak digunakan untuk mengukur volume, tetapi pengukuran yang lebih akurat diperlukan labu ukur dan pipet. Pengukuran larutan dengan menggunakan pipet dan labu ukur hanya akan akurat apabila bagian dasar dari cekungan antara air dan udara berada tepat pada tanda
pengukuran. Penggunaan Penggunaan pipet harus dibantu dibantu dengan alat penghisap penghisap larutan larutan (pipetor). Jangan pernah menggunakan mulut untuk memipet. Jenis -jenis pipetor yang umum digunakan digunakan antara lain lain (i) tipe bola penghisap penghisap yang dilengkapi dilengkapi dengan beberapa katup pengontrol, (ii) pipet penghisap yang dioperasikan menggunakan roda kecil pada bagian atas alat penghisap, (iii) alat penghisap dengan bantuan pompa udara secara secara elektrik. Cairan dihisap dihisap kedalam pipet pipet dengan menekan tombol bagian atas dan melepaskan cairan dengan menekan tombol bagian bawah, (iv) pipet mikro, biasanya untuk pengambilan larutan dengan volume yang sangat kecil (mikro (mikro liter).
Membersihkan Membersihk an peralatan gelas gelas Metoda konvensional konvensional pencucian pencucian peralatan gelas dilakukan dengan merendam gelas dalam larutan larutan asam kromat yang diikuti diikuti pembilasan dengan dengan air kran dan air destilasi. destilasi. Karena asam kromat dapat dapat menyebabkan korosif, maka cara ini banyak ditinggalkan kecuali untuk peralatan gelas yang terkontaminasi terkontaminasi tinggi. Pencucian yang lebih lebih aman adalah adalah dengan air panas (>70oC) (>70oC) + sabun, diikuti diikuti dengan pembilasan pembilasan dengan dengan air panas dan air destilasi. Peralatan gelas yang telah dicuci, dikeringkan dalam oven pada suhu 150oC dibungkus dengan aluminium foil, kemudian disimpan dalam lemari tertutup.
B.
Tujuan
Memberikan pengetahuan pengetahuan dan ketrampilan ketrampilan pada mahasiswa agar mahasiswa mahasiswa terampil melakukan sterilisasi ruang, peralatan dan media yang digunakan dalam kultur jaringan. BAB II TI NJAUAN PUSTAKA PUSTAKA
Sterilisasi Bagian Bagian yang sangat penting dalam teknik in vitro adalah sterilisasi bahan tanaman dan media dan menjaga menjaga kondisi aseptik aseptik yang telah telah dicapai. Bakteri dan jamur adalah dua kontamina kontaminan n yang paling banyak dijumpai dalam kultur. Spora jamur sangat ringan dan ada disekeliling lingkungan. Apabila spora jamur kontak kontak dengan media media kultur dan kondisinya kondisinya optimal optimal untuk perkecambahan jamur, jamur, maka akan terjadi terjadi kontaminasi. kontaminasi.
a.
Ste terr il isa isas si Ruan g Kul tur dan Tr ans ansfer fer
Sterilisasi ruang kultur yang paling baik adalah dilakukan dengan penggunaan sinar sinar ultraviolet ultraviolet (UV). Waktu Waktu sterilisasi sterilisasi bervariasi tergantung dari dari ukuran ruang transfer itu sendiri dan harus dilakukan apabila tidak ada kegiatan dalam ruang tersebut. Radiasi UV sangat berbahaya bagi mata dan kulit. Ruang transfer dapat juga disterilisasi dengan mencuci/mengepel 1-2 kali setiap bulan dengan bahan anti jamur (fungisida) komersial. Ruang kerja dalam laminar flow biasanya sudah dilengkapi dengan lampu UV, sehingga sterilisas sterilisasinya inya dilakukan dengan UV dan diikuti dengan membasuh/melap permukaan tempat bekerja dalam laminar dengan alkohol 95% sebelum mulai bekerja. Ruang kultur harus dibersihkan dengan sabun kemudian dilap dengan Na-hypoklori Na -hypokloritt 2% (merek komersial seperti Sunclin, Bayclin atau pembersih lantai lain yang mengandung disinfektan) atau alkohol 95%. Lantai ruangan dan dinding harus dibesihkan seminggu sekali dengan bahan yang yang sama.
b.
Ste terr il isa isas si Pe Perr alatan Gelas dan Per Per alatan L ain .
Peralatan yang yang terbuat dari dari metal, gelas, aluminium aluminium foil, dll., dll., dapat disterilsasi dengan cara pengeringan dalam oven pada suhu 130o-170oC selama
2-4 jam. Semua peralatan tersebut harus dibungkus sebelum di oven, tetapi jangan menggunakan kertas karena akan akan terdekomposisi pada suhu 170oC. Sterilisasi dengan menggunakan autoclave tidak dsarankan untuk bahan yang erbuat dari metal karena akan menyebabkan karat. Untuk peralatan diseksi yang akan digunakan pada ruang transfer atau laminar, setelah disterilisasi dalam oven harus direndam dahulu dalam alkohol 96% kemudian dibakar di atas lampu bunsen. Teknik ini disebut sterilisasi pembakaran (flame sterilization). Teknik ini harus dilakukan dengan ekstra hati-hati karena alkohol sangat mudah terbakar. Autoclave adalah metoda sterilisasi dengan menggunakan tekanan uap air. Bahan-bahan atau alat yang dapat disterilisasi dengan cara autoclave ini antara lain kapas penutup tabung, saringan dari nylon, pakaian lab, tutup plastik, peralatan gelas, pipet, air, dan media kultur. Hampir semua mikroba dapat mati bila diautoclave pada suhu 121oC dengan tekanan 15 psi selama 15-20 menit.
c.
Ster il isasi M edia
Ada dua metoda untuk sterilisasi media yang umum digunakan, yaitu dengan autoclave dan filter membran. Media kultur, air destilasi dan campuran yang stabil dapat disterilisasi dalam autoclave dengan menggunakan wadah yang ditutup dengan kapas, aluminium foil atau plastik. Akan tetapi, larutan dari bahan-bahan yang bersifat tidak stabil (heat-labile) harus menggunakan filter. Umumnya media diautoclave pada tekanan 15 psi dengan suhu 121oC. Untuk volume larutan per wadah yang sedikit (< 100 ml), waktu yang dibutuhkan adalah 15-20 menit, tetapi untuk jumlah yang besar (2-4 liter) selama 30-40 menit. Tekanan jangan melebhi dari 20 psi karena dapat mengakibatkan dekomposisi karbohidrat dan bahan lain dalam media yang bersifat thermolabile.
Beberapa senyawa yang tergolong dalam kelompok protein, vitamin, asam amino, ekstrak tanama, hormon dan karbohidrat ada yang bersifat thermolabile yang mungkin akan mengakibatkan dekomposisi bila disterilisasi dengan autoclave, sehingga harus disterilisasi dengan filter. Filter Millipore yang mempunyai porositas ± 0.2 mikron (µm) merupakan salah satu filter yang banyak digunakan untuk sterilisasi bahan yang bersifat thermolabile. Peralatan gelas yang akan menampung media yang disterilisasi dengan filter harus sudah disterilisasi dahulu dengan autoclave.
Media yang sebagian mengandung komponen thermolabile, dapat dibuat dengan cara: (i) larutan yang mengandung komponen heat-stable disterilisasi dengan autoclave, kemudian didinginkan sampai suhu 50o-60oC pada kondisi steril (biasanya dalam laminar), (ii) pada bagian lain dalam kondisi yang steril, larutan yang mengandung komponen besifat thermolabile disterilisasi dengan filter, (iii) kedua larutan yang sudah disterilisasi dengan metoda yang berbeda tersebut digabungkan dalam kondisi aseptik. d d.
Ster il isasi Bahan Tanaman
Mendapatkan bahan tanaman yang steril merupakan hal yang sulit. Meskipun bermacam tindakan pencegahan sudah dilakukan, 95% kultur akan mengalami kontaminasi apabila eksplan tidak didisinfeksi. Organ atau jaringan tanaman harus disterilisasi dengan larutan disinfektan, karena sebagai bahan biologis tidak dapat dilakukan dengan cara pemanasan yang ekstrim. Tidak ada metoda yang baku untuk sterilisasi eksplan, sehingga waktu perendaman dalam larutan disinfektan merupakan kisaran karena tergantung pada jenis bahan dan tanaman yang akan disterilisasi. Larutan yang digunakan harus yang aman bagi jaringan/eksplan tetapi bersifat dapat membunuh kontaminan baik bakteri maupun jamur. Untuk tanaman berkayu, umbi dll.
biasanya sebelum disterilisasi dengan larutan disinfektan harus dibersihkan dahulu dengan sabun dan dibilas dengan air mengalir, tetapi tidak untuk tanaman jenis herbaceous. Semua permukaan eksplan yang disteriliasi harus terendam dalam sterilan, dan setelahnya harus dibilas dengan akuades steril sekurangkurangnya tiga kali.
B AB I I I M ETODE PELAKSANAAN A. Bahan dan Alat
-
Autoclave
-
Peralatan gelas kaca/Glass were (botol kultur, petridish, Erlenmeyer)
-
Peralatan penanaman/ Dissecting kit (pinset, gunting, scalpel)
-
Plastik, karet gelang, kertas pembngkus, alumunium foil, plastic seal
-
Bahan kimia formalin
-
Alkohol
B.
Cara Kerj a
Sterilisasi Lingkungan Kerja Kebersihan lingkngan kerja secara keseluruhan dilakukan dengan cara membersihkan semua debu dan kotoran yang ada, selanjutnya dilakukan kegiatan fumigasi dengan menggunakan disinfektan ataupun senyawa formalin yang dilakukan secara periodic. Disamping itu, lingkungan kerja terutama pada ruang transfer harus selalu dalam kondisi yang steril dari kontaminan. Pada ruang transfer biasanya dilengkapi dengan laminar air flow (LAC). Proses transfer atau penanaman eksplan dilakukan secara aseptic didalam LAC, karena dilengkapi dengan:
1.
Filter HEPA (High Emergency Particulate Air)
2.
Ultraviolet lamp (UV Lamp)
3.
Blower
Sterilisasi Air Dan Media Tanam
1.
Botol yang telah diisi dengan air dan botol kultur yang telah berisi media kultur ditutup rapat dengan menggunakan allumunium disterilisasi dengan menggunakan o
autoclave pada suhu 121 C selama 15 menit pada tekanan 15 psi (pound per square inch) 2.
Selama proses sterilisasi berlangsung, autoclave ditutup rapat sehingga tekanan didalam autoclave naik.
3.
Setelah proses sterilisasi selesai, suhu dan tekanan autoclave kembali ke posisi 0, keluarkan botol kultur dari dalam autoclave
4.
Inkubasi di dalam ruang kultur selama ± 1 minggu Sterilisasi botol kultur yang terkontaminasi:
1.
Botol kultur yang terkontaminasi dikelurkan dari ruang kultur
2.
Sterilisasi langsung dengan menggunakan autoclave pada suhu 121 C selama
o
30 menit pada tekanan 15 psi 3.
Selama proses sterilisasi berlangsung, autoclave ditutup rapat sehingga tekanan didalam autoclave naik.
4.
Setelah proses sterilisasi selesai, suhu dan tekanan autoclave kembali ke posisi 0, keluarkan botol kultur dari dalam autoclave
5.
Buang semua sisa media yang terkontaminasi pada tempat yang sudah disiapkan
6.
Rendam dalam larutan sodium hypochlorite (dapat menggnakan byclin) dengan konsentrasi 50% selama minimal 1 jam.
7.
Cuci dengan detergen
8.
Bilas dengan air yang mengalir
9.
Tempatkan di dalam oven pada suhu 70-80 C. Atau simpan kembali di tempat
o
yang bersih.
1.
Sterilisasi Glass Were Dan Dissecting Kit Cuci bersih glass ware dan dissecting kit yang akan disterillkan.
2.
Bungkus dengan menggunakan allumunium foil atau kertas yang bersih
3.
Autoclave pada suhu 121 C pada tekanan 15 psi selama 30 menit
4.
Suhu autoclave kembali ke posisi 0, keluarkan alat-alat dari autoclave
5.
Simpan dalam oven atau dalam LAC dengan lampu UV tetap menyala.
BAB IV H ASI L DAN PEMBAH ASAN
Dalam praktikum ini membahas tentang bagaimana melakukan sterilisasi ruang alat dan media kultur, adapun jenis jenis sterilisasi yang digunakan adalah: -
Sterilisasi lingkungan kerja
-
Sterilisasi air dan media tanam
-
Sterilisasi boltor kultur yang terkontaminan
-
Sterilisasi glass ware dan dissecting kit Pada prosedur pelaksanaan sterilisasi ruang dapat melakukan beberapa cara sebagai berikut;
-
Dapat menhidupkan UV Lamp selama 1 jam
-
Melakukan pembersihan terhadap semua kotoran dan debu
-
Dan dapat juga melakukan kegiata fumigasi dengan larutan disinfectant dan formalin Adapun bahan kimia yang digunakan untuk sterilisasi ruang adalah formalin, alcohol dan disinfectant. Selain membahas tentang sterilisasi ruang disini juga akan membahas tentang prosedur sterilisasi alat. Pada peralatan yang terbuat dari metal, gelas, aluminium foil, dll., dapat disterilsasi dengan cara pengeringan dalam oven pada o
o
suhu 130 -170 C selama 2-4 jam. Semua peralatan tersebut harus dibungkus sebelum di oven, tetapi jangan menggunakan kertas karena akan akan terdekomposisi pada suhu 170oC. Sterilisasi dengan menggunakan autoclave tidak dsarankan untuk bahan yang erbuat dari metal karena akan menyebabkan karat. Untuk peralatan diseksi yang akan digunakan pada ruang transfer atau laminar, setelah disterilisasi dalam oven harus direndam dahulu dalam alkohol 96% kemudian dibakar di atas lampu bunsen. Teknik ini disebut sterilisasi pembakaran (flame sterilization). Teknik ini harus dilakukan dengan ekstra hati-hati karena
alkohol sangat mudah terbakar. Autoclave adalah metoda sterilisasi dengan menggunakan tekanan uap air. Bahan-bahan atau alat yang dapat disterilisasi dengan cara autoclave ini antara lain kapas penutup tabung, saringan dari nylon, pakaian lab, tutup plastik, peralatan gelas, pipet, air, dan media kultur. Hampir semua mikroba dapat mati bila diautoclave pada suhu 121oC dengan tekanan 15 psi selama 15-20 menit. Setelah selesai, selanjutnya alat tersebut di masukan ke dalam LAC atau oven. Pada sterilisasi media dan air dapat menggunakan dua metoda untuk sterilisasi media yang umum digunakan, yaitu dengan autoclave dan filter membran. Media kultur, air destilasi dan campuran yang stabil dapat disterilisasi dalam autoclave dengan menggunakan wadah yang ditutup dengan kapas, aluminium foil atau plastik. Akan tetapi, larutan dari bahan-bahan yang bersifat tidak stabil (heat-labile) harus menggunakan filter. Umumnya media diautoclave pada tekanan 15 psi dengan suhu 121oC. Untuk volume larutan per wadah yang sedikit (< 100 ml), waktu yang dibutuhkan adalah 15-20 menit, tetapi untuk jumlah yang besar (2-4 liter) selama 30-40 menit. Tekanan jangan melebhi dari 20 psi karena dapat mengakibatkan dekomposisi karbohidrat dan bahan lain dalam media yang bersifat thermolabile. Beberapa senyawa yang tergolong dalam kelompok protein, vitamin, asam amino, ekstrak tanama, hormon dan karbohidrat ada yang bersifat thermolabile yang mungkin akan mengakibatkan dekomposisi bila disterilisasi dengan autoclave, sehingga harus disterilisasi dengan filter. Filter Millipore yang mempunyai porositas ± 0.2 mikron (µm) merupakan salah satu filter yang banyak digunakan untuk sterilisasi bahan yang bersifat thermolabile. Peralatan gelas yang akan menampung media yang disterilisasi dengan filter harus sudah disterilisasi dahulu dengan autoclave.
Media yang sebagian mengandung komponen thermolabile, dapat dibuat dengan cara: (i) larutan yang mengandung komponen heat-stable disterilisasi dengan autoclave, kemudian didinginkan sampai suhu 50o-60oC pada kondisi steril (biasanya dalam laminar), (ii) pada bagian lain dalam kondisi yang steril, larutan yang mengandung komponen besifat thermolabile disterilisasi dengan filter, (iii) kedua larutan yang sudah disterilisasi dengan metoda yang berbeda tersebut digabungkan dalam kondisi aseptik.
BAB V PENUTUP
Kesimpulan:
Sterilisasi perlu dilakukan karena itu adalah hal terpenting untuk keberhasilan dalam kultur jaringan.
adapun jenis jenis sterilisasi yang digunakan adalah:
o
Sterilisasi lingkungan kerja
o
Sterilisasi air dan media tanam
o
Sterilisasi boltor kultur yang terkontaminan
o
Sterilisasi glass ware dan dissecting kit
Dengan
o
menggunakan autoclave, sterilisasi digunskan pada suhu 121 C selama
15 menit pada tekanan 15 psi (pound per square inch)
