Transcripción del DNA: Esto tiene que ver con la síntesis del RNA (en especial del RNA mensajero [mRNA 12%], habiendo también RNA de transferencia transferencia [tRNA], [tRNA], RNA ribosomal [rRNA], y RNA nuclear pequeño [snRNA]). Ya sabemos que existe el Dogma Central (flujo de información), que tiene el DNA DNA con con toda toda la info inform rmac ació ión n que que la célu célula la requ requie iere re (fun (funci cion ones es celu celula lare res, s, mantención de especie) almacenada. El DNA se transcribe a RNA, el cual se traduce en la formación de proteínas. Bases moleculares de la transcripción: El DNA sirve de molde para la transcripción. Las hebras se separan, quedando una hebra molde (a partir de la cual se crea el RNA) y una hebra codificante (con una secuencia equivalente a la del RNA formado por la hebra molde). La síntesis de RNA ocurre de 5’ a 3’, siendo catalizada por la RNA polimerasa. Ahora los nucleótidos son ribonucleótidos (no desoxirribonucleótidos, como en el DNA). La reacción está descrita a la derecha. Con la transformación de pirofosfato (PPi) a dos fosfatos inorgánicos (2P i) se produce energía para la formación formación del RNA. El RNA tiene en su extremo 5’ a los tres fosfatos, fosfatos, y en el extremo 3’ un grupo OH, al igual que el DNA. La hebra molde de DNA, para la síntesis de RNA, debe ir en la dirección dirección 3’ – 5’. La enzima RNA polimerasa polimerasa cataliza cataliza la síntesis de RNA. Esta enzima tiene un sitio catalítico para permitir la síntesis de RNA, un túnel (embudo) por donde entran los nucleótidos uno a uno (ribonucleótidos y desoxirribonucleótidos, la enzima reconoce los que necesita y los usa, descartando el resto). Un gen gen es una una unid unidad ad tran transcr scripc ipcio iona nal.l. Hay Hay un punto de inicio de la transcripción de un gen, al cual llamamos “+1”. Lo que está hacia el lado negativo se llama “río arriba” y hacia el lado positivo es “río abajo” (hacia donde se mueve la RNA polimerasa es río abajo). El lugar donde empieza la síntesis de RNA se llama promotor (5’), y el lugar donde termina es el terminador (3’). Transcripción en bacterias: La RNA polimerasa bacteriana tiene 5 subunidades: dos α, dos β (una (una β y una β’) y una σ. La subunid subunidad ad sigma sigma pued puede e est estar o no unid unida a a la enzi enzima ma.. Si est está se llam lama holoenzima, y si no está es simplemente la enzima core. La diferencia entre ambas, es que la enzima core no identifica el promotor, por lo que puede catalizar a partir de un lugar que no es el +1. La holoenzima holoenzima siempre parte en el promotor (sitio correcto en el DNA para sintetizar sintetizar el mRNA). Hay muchas subunidades σ (se adaptan a cambios ambientales) que responden a distintos estímulos para unirse a la RNA polimerasa. La transcripción del DNA se realiza en tres etapas:
Iniciación: Comienza con el promotor. Siempre una purina es el primer nucleótido de la secuencia (adenina [+] o guanina). Hay una secuencia de bases más o menos en el -10 (secuencia consenso TATAAT) y otra en el -35 (secuencia consenso TTGACA). La secuencia TATAAT se conoce como caja pribnow en bacterias y caja TATA en eucariontes. El promotor está río arriba del inicio de la transcripción. La subunidad σ tiene en su extremo carboxilo un reconocimiento de la secuencia -35, y en su extremo amino un reconocedor de la caja TATA. Según la distancia entre los dos sectores, la RNA polimerasa se unirá de manera afín o no afín al gen. Cuando la distancia es correcta, hay una gran afinidad por la unión, lo que hace que la eficiencia de transcripción sea óptima. Una vez que se ha constituido el complejo cerrado (unión de RNA polimerasa al DNA), se constituye el complejo abierto, donde se denatura el DNA por acción de la RNA polimerasa. Cuando se produce este fenómeno comienza a sintetizarse el RNA. Una vez que se han sintetizado entre 7 y 10 nucleótidos se libera la subunidad σ, terminando la iniciación de la transcripción. Elongación: Comienza con la disociación de la subunidad σ de la RNA polimerasa. A medida que transcurre la transcripción, la cadena de RNA formada por la RNA polimerasa “choca” con una “muralla” en la enzima, y se separa de la hebra molde de DNA para salir por el sitio de salida de RNA de la RNA polimerasa. El DNA es lo que se mueve cuando entra a la RNA polimerasa, pues esta enzima está anclada al citoesqueleto nuclear. Si el RNA queda mal transcrito, NO se puede reparar. Con esto se sintetizan proteínas erróneas. Terminación: Depende en algunos casos de la proteína Rho. Es un hexámero con seis subunidades idénticas. Existe también un mecanismo que es Rho independiente. El RNA es una monohebra que se puede plegar. Esto es el plegamiento intracatenario, y antiparalelo. Para ello se unen los “repetidos invertidos”. Las estructuras que se generan son las llamadas “horquillas”. De este modo la hebra de RNA no es una estructura lineal, sino que se pliega para formar las horquillas. Luego de la formación de una horquilla podría haber un sector con muchas adeninas, desde donde se transcribirán uracilos. Esta unión es más débil que la unión de guaninas con citocinas, lo cual determina que la cadena de RNA se separe de la hebra de DNA. Así ocurre la terminación Rho independiente. Las horquillas formadas son los terminadores de la transcripción.
El mecanismo Rho dependiente se produce por el enrollamiento de la cadena de RNA a la proteína Rho. Esto permite que Rho hidrolice ATP en ADP. Con esta energía, la proteína Rho es capaz de separar la cadena de RNA formada de la hebra molde de DNA.
Regulación de la expresión génica: Significa determinar la cantidad de RNA que se sintetiza. Esto se determina según algunos mecanismos. La expresión constitutiva (genes housekeeping) depende de la arquitectura del promotor (débil o fuerte), según sea como el consenso o diferente del consenso. El tiempo de vida media de una célula es el tiempo que se demora en cambiar la mitad de un componente (por ejemplo, proteínas). La célula invierte energía para sintetizar moléculas. Las moléculas pequeñas en general tienen una vida media corta (rápida renovación, promotor cercano al consenso fuerte), mientras que las grandes tienen una vida media larga (renovación lenta, promotor lejos del consenso débil). La expresión regulada, con productos génicos con niveles que varían en respuesta a una señal, son de represión e inducción. Esto es mediado por interacciones proteína-DNA específicas. Un factor transcripcional es una molécula que interactúa con el DNA para inducir activación o represión. Un activador puede unirse a la RNA polimerasa de manera directa o indirecta (a través de otras proteínas [subunidad α por ejemplo]). Un represor puede bloquear la unión de la RNA polimerasa al DNA, haciendo una especie de efecto pantalla en el promotor. Un represor también puede anular el efecto de un activador (indirecto sobre la enzima), anulando la función del activador por cambiar la afinidad que las proteínas tienen para los sitios de reconocimiento. La selección de genes a ser transcritos y la eficiencia del proceso de transcripción son afectadas por la regulación de la expresión génica. Un ejemplo de la represión está representado por el operón lac. Este se compone de tres genes: lacZ, lacY y lacA. Éstos transcriben para la producción de beta galactosidasa, permeasa y transacetilasa. Se transcribe un solo RNA mensajero para los tres productos, determinando un RNA policistrónico (codifica para más de un gen). En ausencia de lactosa, el lacI sintetiza un represor que impide que se expresen los genes del operón lac, uniéndose a una región del promotor para que no se pueda unir la RNA polimerasa. Esto ocurre porque si no hay lactosa no hay necesidad de sintetizar beta galactosidasa. Cuando hay lactosa, ésta inhibe el represor que genera el lacI, por lo que este represor no se puede unir al DNA para bloquear la zona de unión de la RNA polimerasa, permitiendo la expresión de beta galactosidasa, permeasa y transacetilasa. La lactosa induce los genes del operón lac.
Transcripción en eucariontes: El RNA se transcribe a partir del DNA y luego se procesa para producir RNA maduro. El mRNA maduro sale al citosol a través de poros nucleares, y es usado como sustrato para la síntesis de las proteínas. Todo lo que tiene que ver con la síntesis del mRNA ocurre dentro del núcleo. Todos los genes eucariontes son individuales, teniendo una organización monocistrónica. Esto hace que no haya operones.
Hay tres RNA polimerasas con especificidades distintas. La RNA polimerasa I se encuentra en el nucléolo, y tiene como función sintetizar exclusivamente el rRNA. La RNA polimerasa II está en el nucleoplasma y tiene por función sintetizar exclusivamente mRNA. La RNA polimerasa III está en el nucleoplasma y tiene por función la síntesis exclusiva de tRNA, rRNA 5s y snRNA. Nos centraremos en la RNA polimerasa II pues es la que sintetiza mRNA. La RNA polimerasa II tiene 10 a 12 subunidades, siendo un heptapéptido (siete aminoácidos que se repiten varias veces, especie-específico; 36 en el humano, 42 en la levadura, etc.) en CTD (dominio carboxilo terminal, subunidad de 200 Kd), y que es fosforilable. Las dos subunidades grandes que tiene, se asemejan a las subunidades β de la RNA polimerasa bacterial. Esta enzima por si sola no puede transcribir. A diferencia de las bacterias, en las que existía un promotor conservado para cada subunidad sigma, en las células eucariontes hay promotores diversos, que varían en número, naturaleza y localización. En cada elemento de promotor se une una proteína llamada factor de transcripción. La caja TATA está ubicada aproximadamente en el -30, estando el promotor proximal en el -200 (lugares donde se empiezan a unir factores de transcripción).
Hay muchos tipos de factores de transcripción. Los basales o generales son los encargados de identificar la región del promotor. Los transactivadores proximales o distales permiten que se facilite la entrada de otras moléculas, uniéndose al DNA en elementos del promotor. Los coactivadores comunican al transactivador con la RNA polimerasa II, sin unirse al DNA. El DNA está estructurado en nucleosomas, por lo que para poder diponer del DNA hay actividades que permiten que las hebras se suelten o aflojen del nucleosoma para la transcripción. Un mecanismo es la acetilación de histonas ricas en lisina, para una menor unión del DNA a la proteína nucleosomal. Modificaciones post-transcripcionales: procesamiento transcrito primario: Son de tres tipos: capping, poliadenilación y splicing. Capping: Proceso en el cual se introduce una molécula (Cap) en forma inversa al extremo 5’, para que la molécula de RNA quede 3’ – 3’.
Poliadenilación: Es la señal de término que indica a la RNA polimerasa que active un factor basal para que se produzca una actividad endonucleolítica, que rompa el RNA que se está sintetizando. Se agrega una cola de polinucleótidos (poli a) (adeninas) que determina una señal de término. Splicing: El DNA tiene exones (que codifican) e intrones (que no codifican). Cuando se transcribe el RNA, el transcrito primario contiene la información de los exones y los intrones. Para deshacerse de la información de los intrones ocurre el splicing. El mecanismo de splicing reconoce el inicio (adenina 3’) y el término (guanina 5’) de los intrones, aproximando lo exones para que se unan una adenina con un guanina por un lazo, interaccionando, empalmándose los dos exones y eliminando el intrón. Los spliceosomas son complejos especializados de RNA-proteína: los snRNP. Cada uno tiene un tipo de snRNA.
Procesamiento alternativo: Hay varias señales de poliadenilación y varias señales de splicing. Un gen crea más de una proteína diferente. Esto explica que 150.000 proteínas sean codificadas por sólo 30.000 genes en el ser humano. Una manera de splicing alternativo es la eliminación de algún o algunos exones junto con los intrones del transcrito primario (RNA). Un mismo gen produce la calcitonina (tiroides) y un neurotransmisor (cerebro), dependiendo de los exones que son sacados luego del splicing de un mRNA.
