BAB I
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Salah satu hal yang terpenting dalam kegiatan yang bersinggungan dengan aktivitas mikrobiologi adalah proses sterilisasi. Tujuan utama dengan adanya sterilisasi adalah untuk meminimalisir atau meniadakan potensi kontaminasi dari mikroba yang tidak diinginkan. Kontaminasi yang timbul dari mikroba yang tidak diharapkan dikhawatirkan dapat menghambat aktivitas dari mikroba yang ditumbuhkan atau dapat membahayakan keselamatan dari pelaksana kegiatan tersebut.
Metoda sterilisasi yang dilakukan diupayakan berlangsung secara cepat dan dapat meminimalkan atau menghilangkan potensi kontaminasi mikroba seefektif mungkin. Dalam pelaksanaannya, sterilisasi harus dikerjakan secara aseptik. Proses sterilisasi yang tidak sempurna dapat menyebabkan munculnya kontaminasi mikroba baik yang berasal dari peralatan tersebut atau kontaminasi mikroba dari lingkungan.
Sterilisasi merupakan usaha untuk membebaskan alat dari segala bentuk kehidupan. Dalam melakukan suatu pekerjaan yang berkaitan dengan bidang mikrobiologi, keberhasilan percobaan sangat dipengaruhi oleh kebersihan suatu alat yang digunakan sehingga perlu dilakukan sterilisasi untuk mendapatkan hasil yang lebih optimal pada saat melakukan biakan murni yaitu hanya satu spesies mikroba yang berkembang.
Pada saat bekerja dengan mikrobiologi, persiapan umum yang dilakukan adalah menyiapkan medium dan larutan pengencer. Jenis medium ada banyak tergantung tujuan pembiakkan mikrobia itu sendiri. Untuk menstimulasi pertumbuhan mikrobia, medium yang digunakan harus mengandung komponen-komponen yang dibutuhkan oleh mikrobia tersebut. Oleh karena itu, dalam mempersiapkan medium perlu memperhatikan faktor-faktor yang dapat mempengaruhi pertumbuhan mikrobia yang diinginkan. Kaitannya dengan sterilisasi pada praktikum kali ini adalah memastikan bahwa peralatan yang telah disterilisasi sudah bebas dari kontaminasi mikrobia dengan melakukan swab test pada peralatan yang sudah disterilisasi kemudian dibiakkan dalam media tertentu untuk mengamati jumlah mikrobia yang mungkin masih dapat tumbuh.
Tujuan
Mahasiswa dapat menjelaskan prinsip kerja secara aseptik dan mempraktekan persiapan media dan larutan pengencer dengan indikator sebagai berikut :
Mampu bekerja secara aseptic
Membuat media dan larutan pengencer untuk uji mikrobiologi
Mempersiapkan peralatan untuk uji mikrobiologi
Melakukan dekontaminasi alat dan media pasca uji mikrobiologi
Landasan Teori
Dalam mempelajari mikroorganisme dalam kultur murni, para mikrobiolog memerlukan alat-alat yang menunjang dalam usaha mendapatkan kultur murni. Dalam mikrobiologi, peralatan laboratorium merupakan unsur penting yang harus ada. Peralatan yang ada dalam laboratorium pun haruslah steril agar dapat menunjang pekerjaan yang berhubungan dengan mikroorganisme dan hal tersebut merupakan syarat mutlak. Artinya, pada bahan atau peralatan yang akan digunakan harus bebeas dari mikroorganisme yang tidak diingikan yang dapat merusak media atau koloni suatu mikroorganisme yang diinginkan. Adapun peralatan yang umumnya digunakan di dalam laboratorium mikrobiologi antara lain : Media yaitu; cair, semi solid, solid (agak miring (siant), agak tegak (deep), agak cawan(plate)) dan peralatan yaitu; autoklaf, tabung kultur, cawan petri, jarum inokulasi, pipet, waterbath, inkubator, dan lemari pendingin (Suriawira, 2005)
Ada tiga cara yang umum digunakan dalam sterilisasi yaitu penggunaan panas, penggunaan bahan kimia dan penyaringan (Filtrasi). Bila panas digunakan bersama – sama dengan uap air maka disebut sterilisasi panas lembut atau sterilisasi basah, bila tanpa kelembapan maka disebut sterilisasi panas kering atau sterilisasi kering (Hadioetomo, 1993).
Sterilisasi dengan oven dilakukan dengan prinsip menggunakan aliran udara panas dan kering. Alat-alat gelas seperti Erlenmeyer, cawan petri, tabung reaksi atau pipet dapat disterilkan dengan oven. Bahan lain seperti kapas, kertas, kain saring, juga dapat disterilkan menggunakan oven dalam batasan suhu tertentu. Dalam menggunakan oven harap berhati-hati karena suhu yang terlalu tinggi dalam waktu lama dapat membakar bahan-bahan tersebut. Umumnya untuk sterilisasi kering oven diatur pada suhu 170 – 180oC selama paling sedikit 2 jam. Namun lama sterilisasi juga tergantung dari ketahanan alat terhadap panas (Sumarsih, 2015).
Sterilisasi dengan pemanasan basah dilakukan dengan alat bernama autoklaf, yang bekerja dengan tekanan uap. Jika tidak mempunyai autoklaf, panci presto atau pressure cooker dapat dipergunakan. Standar teknis untuk sterilisasi ini adalah tekanan uap 15 lb/in2 dengan temperature 121 oC selama 15-20 menit (Yuliarti, 2010).
Media yang umum digunakan untuk menumbuhkan berbagai mikrobia adalah nutrient agar (NA) untuk bakteri dan Potato Dextrose Agar (PDA) untuk yeast dan kapang. Media yang paling umum digunakan untuk menumbuhkan jamur/kapang/fungi adalah media PDA. Bahan baku utama media ini adalah ekstrak kentang dengan penambahan sumber karbon berupa dextrose (Setyaningrum dan Saparinto, 2014)
BAB II
BAHAN DAN METODE
Praktikum Pembuatan Medium
Alat
10 Tabung reaksi
6 cawan petri
Pemanas listrik dengan pengaduk magnit
Autoklaf
Penangas air (water bath) dengan suhu 100oC
Bahan
Nutrien Agar (NA)
Potato Dextrose Agar (PDA)
Alumunium foil
Plastik
Air Destilata
Kapas
Prosedur
Setiap kelompok harus membuat :
5 buah tutup tabung dari kapas
5 buah agar cawan (PCA/PDA, jumlahnya 100 ml)
5 tabung medium cair (NA, jumlahnya 50 ml)
Membuat media PDA (Potato Dextrose Agar). Penggunaan 39 gram bubuk PDA adalah untuk 1 L air destilata sehingga untuk pelarutan 500 ml media PDA digunakan sebanyak 19,5 g. Homogenkan larutan dan ditutup dengan alumunium foil. Masukkan dalam water bath dengan suhu 100 oC.
Membuat media NA (Nutrient Agar). Penggunaan 28 gram untuk dilarutkan pada 1 L air destilata sehingga untuk membuat 500 ml media NA dibutuhkan 14 gram. Homogenkan larutan dan ditutup dengan alumunium foil. Masukkan dalam water bath dengan suhu 100 oC.
Untuk membuat agar cawan, sterilisasi medium dilakukan didalam tabung Erlenmeyer, kemudian setelah didinginkan sampai suhu kira-kira 50 C, masukkan ke dalam cawan petri steril dengan jumlah kira-kira setebal 4 – 5 mm dan biarkan membeku. Medium yang telah siap dan tidak akan segera digunakan, sebaiknya disimpan di dalam lemari es dengan suhu 10 C untuk mencegah terjadinya kontaminasi.
Melakukan uji komparasi sterilisasi, siapkan 2 buah kapas dan masukkan ke dalam plastik. Lakukan swab pada cawan basah dan cawan kering. Tambahkan air sebanyak 1 ml pada kapas menggunakan mikropipet. Melakukan plating pada cawan petri yang berisi media NA dan PDA.
Praktikum Pembuatan Larutan Pengencer
Alat
Labu Erlenmeyer 150 ml
Autoklaf
Bahan
NaCl
Alumunium foil
Air destilata
Prosedur
Membuat 10 buah tutup tabung dari kapas dan 5 buah tutup Erlenmeyer
Timbang 2,125 g NaCl dalam 250 ml air destilata sehingga diperoleh larutan NaCl dengan konsentrasi 0,85%.
Tutup erlenmeyer dengan alumunium foil
Selanjutnya lakukan sterilisasi seperti pada autoklaf suhu 121oC tekanan 1 atm selama 15 menit.
BAB III
HASIL
Pengenalan alat laboratorium
No
Nama Alat
Keterangan
1
Autoklaf
Autoklaf disini digunakan untuk mensterilkan alat-alat laboratorium yang ingin kita gunakan dengan mengunakan tekanan uap dengan suhu 1210C selama 15 menit.
2
Bunsen
Bunsen disini gunakan sebagai alat pemanas sementara untuk membunuh mikroorganisme yang ada disekelilingnya pada saat pengambilan sampel ataupun penanaman sampel pada media tanam.
3
Cawan petri
Cawan petri digunakan sebagai media tanam mikrobia dengan tambahan bahan didalam cawan yaitu agar-agar.
4
Erlenmeyer
Erlenmeyer disini berfungsi menampung sementara aquadrest yang sudah di sterilisasikan.
5
Mikropipet
Pipet mikro disini digunakan untuk mengambil sampel dengan skala kecil.
6
Tabung reaksi
Tabung reaksi digunakan sebagai tempat pencampuran aquadrest dengan sampel yang telah diambil dengan pipet mikro.
7
Kapas
Kapas digunakan sebagai penutup mulut erlenmeyer pada saat disterilisasikan agar uap tidak keluar, juga digunakan untuk menutup mulut tabung reaksi.
8
Kertas
Kertas untuk membungkus alat-alat leb yang akan disterilisasikan agar tidak pecah lalu dibungkus pelastik.
9
Plastik HDPE
Plastik HDPE ini digunakan untuk membungkus alat-alat kimia yang ingin disterilkan.
10
Incubator
Tempat untuk menyimpan bakteri dengan perlakuan suhu
11
Water bath
Untuk mencairkan media padat setelah penyimpanan di kulkas
12
Neraca analitik
Untuk menimbang media atau bahan-bahan yang digunakan secara akurat
Pengamatan mikrobia
No
Pengamatan
Gambar
Jumlah bakteri
1
Sterilisasi kering Media NA
TBUD
2
Sterilisasi kering Media PDA
0 (nol)
3
Sterilisasi basah Media NA
TBUD
4
Sterilisasi basah Media PDA
6 (enam)
BAB IV
PEMBAHASAN
Salah satu hal yang menunjang dalam pembelajaran mikrobiologi adalah laboratorium. Laboratorium digunakan untuk melakukan percobaan-percobaan yang dilakukan untuk memahami lebih dalam tentang hal-hal yang berkaitan dengan jasad renik. Bekerja di laboratorium selali memungkinkan terjadinya suatu kecelakaan. Satu-satunya jalan untuk menghindari kecelakaan tersebut adalah dengan bekerja secara cermat dan hati-hati. Peralatan merupakan suatu bagian yang mendasari dalam pembentukan laboratorium, baik itu laboratorium yang sederhana (praktikum) maupun untuk tujuan penelitian (laboratorium penelitian). Pengenalan alat-alat laboratorium merupakan hal yang sangat penting sebelum melakukan percobaan karena dapat memperlancar kegiatan praktikum serta menghindari penyalahgunaan fungsi setiap alat akibat ketidaktahuan seorang praktikan.
Praktikum ini membahas tentang pembuatan media pertumbuhan mikroorganisme. Media yang dibuat pada praktikum ini adalah Potato Dextrose Agar (PDA) dan Nutrien Agar (NA). Media Potato Dextrose Agar (PDA) menurut konsistensinya termasuk medium padat, berdasarkan susunan kimianya termasuk non-sintetik atau semi alamiah. Media Nutrien Agar (NA) menurut konsistensinya termasuk medium padat, berdasarkan susunan kimiawinya termasuk non-sintetik atau semi alamiah karena terdiri dari pepton, ekstrak daging dan agar.
Media Potato Dextrose agar (PDA) mempunyai komposisi yaitu kentang, dextrose, agar dan aquades. Oleh karena itu Potato Dextrose Agar (PDA) termasuk dalam medium semi alamiah. Kentang sebagai sumber karbohidrat bagi mikroorganisme, dextrose yang berfungsi sebagai sumber karbon, agar berfungsi memadatkan medium dan aquades berfungsi sebagai pelarut dan sumber oksigen. Medium Potato Dextrose Agar digunakan untuk menumbuhkan dan mengidentifikasi jamur dan khamir. Contohnya adalah Aspergillus oryzae dan Ascomycetes. Media Nutrien Agar teridiri dari ekstrak daging, pepton, agar dan aquades. NA merupakan medium yang berbentuk padat yang merupakan campuran dari bahan alamiah dan senyawa-senyawa kimia. Ekstrak daging dan pepton digunakan sebagai bahan dasar karena merupakan sumber protein, nitrogen, vitamin serta karbohidrat yang dibutuhkan oleh mikroorganisme untuk tumbuh dan berkembang. Agar sebagai pemadat dan aquades sebagai pelarut. NA digunakan untuk menumbuhkan beberapa jenis bakteri contohnya Salmonella dan Eschericia coli.
Nutrient Agar (NA) merupakan suatu medium yang berbentuk padat, yang merupakan perpaduan antara bahan alamiah dan senyawa-senyawa kimia. NA dibuat dari campuran ekstrak daging dan peptone dengan menggunakan agar sebagai pemadat. Dalam hal ini agar digunakan sebagai pemadat, karena sifatnya yang mudah membeku dan mengandung karbohidrat yang berupa galaktam sehingga tidak mudah diuraikan oleh mikroorganisme. Dalam hal ini ekstrak beef dan pepton digunakan sebagai bahan dasar karena merupakan sumber protein, nitrogen, vitamin serta karbohidrat yang sangat dibutuhkan oleh mikroorganisme untuk tumbuh dan berkembang. Medium NutrientAgar (NA) merupakan medium yang berwarna coklat muda yang memiliki konsistensi yang padat dimana medium ini berasal dari sintetik dan memiliki kegunaan sebagai medium untuk menumbuhkan bakteri
Larutan pengencer/ larutan fisiologis adalah larutan yang digunakan untuk mengencerkan contoh pada analisis mikrobiologi. Pengenceran dilakukan untuk memperoleh contoh dengan jumlah mikroba terbaik untuk dapat dihitung yaitu antara 30 sampai 300 sel mikroba per ml. Pengenceran biasanya dilakukan 1:10, 1:100, 1:1000, dan seterusnya. Pengenceran adalah melarutkan atau melepasan mikroba dari substratnya ke dalam air sehingga lebih mudah penanganannya. Tujuan pengenceran yaitu untuk mengurangi kepadatan kepadatan bakteri yang ditanam. Pengenceran merupakan proses yang dilakukan untuk menurunkan atau memperkecil konsentrasi larutan dengan menambah zat pelarut ke dalam larutan sehingga volume larutan menjadi berubah.
Seperti halnya media, larutan yang digunakan untuk mengencerkan contoh biasanya mangandung buffer untuk menjaga keseimbangan ion dari mikroba. Buffer yang digunakan untuk pembuatan media dan larutan pengencer adalah fosfat. Pengunaan fosfat dikarenakan satu-satunya komponen anorganik yang mengandung sifat buffer pada kisaran pH normal, yaitu merupakan pH yang dapat mempertahankan keseimbangan fisiologi dari mikroba. Selain dari itu fosfat tidak mempunyai unsur racun bagi mikroba. Garam fosfat yang sering digunakan sebagai buffer adalah kalium monohidrogen fosfat atau kalium hidrogen fosfat. Sebagai larutan pengencer, selain larutan yang mengandung buffer fosfat, dapat juga digunakan larutan garam fisiologi (0,85%) atau larutan reagen. Larutan pengencer ditempatkan dalam tabung reaksi adalah 9 ml setiap tabung nya.
Sterilisasi dilakukan pada percobaan sebelum digunakan untuk menumbuhkan mikroba. Medium di sterilisasi dalam autoclave pada suhu 1210C dan tekanan 1 atmosfer dengan tujuan agar medium dan peralatan lab yang digunakan dalam keadaan steril bebas dari pengaruh mikroba yang tidak diharapkan.
Inkubasi dilakukan selama 48 jam untuk mengamati bakteri yang tumbuh pada media. Pada hasil percobaan, pengamatan hasil sterilisasi kering menunjukkan jumlah yang TBUD (Terlalu banyak untuk dihitung) pada cawan petri yang berisi media NA, dan tidak ada bakteri yang tumbuh pada media PDA. Hal tersebut dapat disebabkan oleh perbedaan nutrisi yang dibutuhkan mikrobia untuk tumbuh. Nutrisi yang dikandung media NA sangat disukai bakteri sehingga banyak bakteri tumbuh yang terukur pada media NA. sedangkan media PDA akan lebih efektif jika dipakai untuk menumbuhkan jamur atau spora.
Pada pengamatan sterilisasi basah menunjukkan jumlah yang TBUD (Terlalu banyak untuk dihitung) pula pada cawan petri yang berisi media NA, dan hanya ada 6 bakteri yang tumbuh pada media PDA. Hal tersebut dapat disebabkan oleh perbedaan nutrisi yang dibutuhkan mikrobia untuk tumbuh. Nutrisi yang dikandung media NA sangat disukai bakteri sehingga banyak bakteri tumbuh yang terukur pada media NA. sedangkan media PDA akan lebih efektif jika dipakai untuk menumbuhkan jamur atau spora.
BAB V
KESIMPULAN
Kesimpulan
Pengenalan alat-alat laboratorium dan kerja aseptik merupakan hal yang sangat penting sebelum melakukan percobaan.
Jumlah bakteri yang tumbuh pada cawan petri sterilisasi kering adalah TBUD dengan memakai medium NA dan 0 (nol) pada media PDA
Jumlah bakteri yang tumbuh pada cawan petri sterilisasi basah adalah TBUD dengan memakai medium NA dan 6 (enam) pada media PDA.
Saran
Sebaiknya praktikan lebih memperhatikan prinsip kerja aseptis agar mengurangi terjadinya kontaminasi
Sebaiknya penggunaan alat tiap kelompok disesuaikan sehingga tidak saling pinjam peralatan antar kelompok.
DAFTAR PUSTAKA
Hadieotomo, R, S. 1993. Mikrobiologi Dasar Dalam Praktek. Gramedia. Jakarta
Setyaningrum, H.D dan Saparinto, Cahyo. 2014. Panduan Lengkap Gaharu. Penebar Swadaya . Jakarta
Sumarsih, S. 2015. Bisnis Bibit Jamur Tiram. Penebar Swadaya. Jakarta
Suriawira. 2005. Pengantar Mikrobiologi Umum . Angkasa. Bandung.
Yuliarti, N. 2010. Kultur Jaringan Tanaman Skala Rumah Tangga. Lily Publisher.Yogyakarta
