Dinu, Veronica - Biochimie Medicala

VERONICA DINU Profesor dr. EUGEN TRUXIA Profesor dr. ELENA POPA-CRISTEA Profesor dr. AURORA POPESCU Profesor dr. doc. BIOCHIMIE MEDICALA mic tratat m EDITURA MEDICALA Bucure$ti, 199$ Coperta de: ADRIAN CONSTANTINESCU „Toate drepturile editoriale aparfin in exclusivtiate Editurii Medicate, Publicaiia este tnarca inregistraia a Editurii Medicate, fiind protejatd integral de - legislated interna §i international^ Orice valorificare a continutului tn afara limitelor acestor legi §i a permisiumi edUorilor este interzim §i pasibitd de pedeapstt. Acest lucrti este valabil pentru orice reproducere — integrala sau partiala, indiferent de mijloace (multiplicari, traduceri, micmfil- mariy tramcrieri pe dischete etc.)“ Tchnoretfactarc computcrizata; TOP GAL SRL ISBN 973-39-0299-3 ■ Prefafa tn domeniul piinfalor biologice progresele tehnologiei moderne au permis extinderea p aprofundarea studiilor referitoare la diverp constituent celulari sau subcelulari. Totodatd, utilizarea metodelor moderne de investigate §tiinpficd in domeniu au evidenpaf p noi roluri sau mecanisme de acpune ~ mai mult sau mat pupn complexe - ale unor asemenea constituent. Datoritd acestor fapte, insup obiectul de studiu al biochimiei - in general - p al biochimiei medicate - in particular - p-au largit sau §i-au aprofundat conpnutul propria. De asemenea, in ceea ce prive§te obiectul biochimiei medicate, investigapile moderne de cercetare au relevat noi §i multiple implicapi - din ce in ce mai strdnse ~ pe care le are aceastd disciplind cu diverse alte discipline medicate (genetica, fiziologia, fiziopatologia, farmacologia, medicina internd etc.). Se mfetege cd in asemenea condipi se impunea intocmirea unui nou tratat pentru studiul biochimiei medicate care sd cuprindd intr-un tot util atdt unele cuno§ti.n$e clasice cdt p nolle achizipi ale cercetdrilor modernet precum §i evidenperea relapilor existente intre procesele biochimice §i funcpile fiziologice - normale sau patologice studiate de alte discipline, considerate strict - medicate. In mod deosebit apdrea necesar sd fie relevate mecanismele moleculare care stau la baza declan§drii unor boli. In vederea realizdrii tuturor acestor deziderate s~a elaborat lucrarea de faid care cuprinde: studiul proteinelor, studiul enzimelor, transferal de infomape, hormonii p mecanismele de reglare metabolicd, energetica biochimicd, marile metabolisme, echilibrul acido-bazic, matrices extracelulard p nopuni de biochimia nutripei. Pe Idngd caracterul didactic care face ca lucrarea sd poatd fi utilizatd de studenp pentru insuprea inv&t&m&ntului de biochimie, adresabilitatea acestei biochimii medicate este mai largd, considerdnd-o folositoare atdt medicilor cdt p biologilor; in special, celor care-p desfd§oard activitatea

profesionald in laboratoare clinice. In dorinja realizdrii unui text u§or de urmdrit p repnut, lucrarea este insoptd de material ilustrativ bogat cuprinzdnd numeroase scheme, tabele p tablouri sinoptice. Referitor la bibliografia care a stat la baza elabordrii ei trebuie subliniat faptul cd dep ea a fast vastd, s~au menponat aid publicapile mai recente p mai importante, prezentdndu-se deci o bibliografie selectivd. Autorii Cuprins Cap. L Proteinele. Structure general#. (Prof. Dr. Elena Popa-Cristea) . .............................................................................. .......... 13 1.1.........................................................................Aminoacizii 14 1.2..........Peptidele................................................................. 29 I. 3. Proteinele ....... ........................................................... .30 1.3.1 Stmctura primara a proteinelor. . ............................ 32 1.3.2 Organizarea spapala a moleculelor proteice.... ........ 33 Stmctura secundara a proteinelor. i ...................................35 Struclura terpara a proteinelor. ..........................................40 Structure cuaternara.......................................................a proteinelor 45 f.3.3 Proprietap generate ale proteinelor......... ............. . 47 1.3.4 Clasificarea proteinelor...................................... 49 1.3.5 Proteinele plasmalice........................................... 51 Semmalbumina................................................................. 52 Inmnoglobulinele............................................................... 53 Faetori aicoagulant....................................(fibrinogenui) 57 1.3.6 Hemoproleinele...................................................... .62 1.3.7 Fibronectincle......................,....................................I . 65 Cap, II. Eitzimcle. (Prof. Dr. E. Impa).................................... . .67 II. 1.........................................................................Introduces 67 IL2 Scaderea de catre enzime a energiei dc activare a reacpilor. Capacitatea cauditica a enzimeior. . ,....................................................68 II.3 Specificitatea enzimeior ..... .......................................... 70 0.3.1 Specificitaie do reac|ie...... . ..................................... 70 0.3.2 Specificitaie de substrat. . .. . ....................................... . 71 11.3.3 vSpecificitate stereochimidl................................. 72 0.4 Stmctura enzimeior..................................................... 73 0.4.1 Aspect© generale................................................ 73 0.4,2 Enzime cu stmctura proteidi......................................74 0.4.3 .Enzime cu stmctura heleroproleicS . .........................75 11.5.............................. Sistenie (complex©) multienzimalice .77 11.6..........Izoenzime. ............................................................ 77 11.7 Central activ.......................................................§i mecanismul de ac|iune a enzimeior...................... 78 0.8 Cinetica enzimntica................................................... 83 11.8,1 Exprimarea vttezei teacpilor euzimalice. Activitatea enzimeior 83 0.8.2 Viteza inijiaUa reacjiilor enzimatice............................84 11.8.3 Influenja pH-ului §i icmpcraturii asupra activit5jii enzimeior 85 11.8.4 Influenpi concentrapei enzimei...............................86

11.8.5 Influenza concenirajiei substratului. Ecuajia Miclwelis-Menten 88 0.8.6 Delermmarea experimental# a K.M, Semnificajia aceslei constante. Constanta eataliUea, K
IV.3.1 Stmctura covalenta a ADN.......... IV.3.2 Conformajia molecule! de ADN; tipuri de cunfomia$ii. . . IV.3.3 Organszarea vnatevialului genetic la procariote §i eucariote. 1V.3.4 Arbitectura genomulul eucariot. IV.3.5 BiodiUeza ADN (replicarea). ....... Replicarea la procariote....................... Replicarea la eucariote, ...................... Sinteza de ADN pe matrila de ARN. ..... . IV.4 Acizii ribonucleic!......................... ... IV.4.I Tipuri de ARN. . ............................ ARN mesagcr (ARNJ.............................. ARN de transfer (ARNJ........................... ARN ribozonial (ARNJ. .......................... ARN nuclear de niici dimenshmi........... IV.4.2 Biosinteza ARN pe matron de A.DN (transcrierea) Transcriereu la procariote..................... Transcrierea la eucariote....................... Inhibitor! ai transeiierii.......................... 1V.4.3 Pre.lttcrari co- §i posllranscriere ale raoleculelor de ARN. Excizia imronilor din transcriplek- primare M.odificari posuranscriere adijionale..... IV,4.4 Biosinteza ARN pc matripi tie ARN. . 139 . 139 . 140 . 140 . 142 . 145 . 146 . 148 . 150 . 150 .• 152 . 153 , 154 . 154 . 158 . 160 . 162 . 165 . 172 . 174, . 175 . 175 . 1.77 . 178 . 180 . -181 . 181 . 182 . 187 . 188 . 188 . 190 . 197 . 201 6 Cap, V. Biosinteza proteinelor (traducerea mesajului genetic). (Prof. Dr. Veronica Dinu)....................................................................203 V.l Codul genetic........................................................*......203 V.2 Biosinteza proteinelor.................................................. 206 V.3 Preluerari posttraducere ale moleculelor proteice . ......216 V.4 Reglarea biosinlezei proteinelor ..................................... . 219 V.5 Leziuni ale moleculelor de ADN §i repararea acestora. Mutajii . 225 V.5,1 Repararea prin excizie-resinteza..............................227 V.5.2 Repararea prin reversarea leziunilor........................230 V.5.3 Mutapi........... ......... ................................‘...............230 V.6 Exprimarea fenotipica a mutajiilor. . ,...........................231 V. 7 Clonarea genelor........... ..................... .......................232 •V.7.1 Clonarea genelor in vivo (Tehnologia ADN recombinant) . 232 V.7.1.1. „Scenariul“ clonarii genelor; objinerea ADN recombinat 233 V.7.1.2. Exprimarea fenotipica a informajiei cuprinsa in ADN recombinant. . ...........................................................................................242 V.7.2 Clonarea genelor in vitro (Reacpa polimerazica in lan|) 246 V. 7.3 Aplicafii ale clonarii genelor................................ 248 (Determinarea secvenjei nucleotidelor in oligonucleotide) 248 Acizi nucleici antisens...................................................... 253 Tehnica de transfer Southern............................................253 Cap. VI. Energetics biochimica. (Prof. Dr: E.Tru|va)............ 259

VI. l A specie gene-rale...................................................259 VI.2 Sisteme termodinamice. Funcfii de stare. Principiile termodinamicii 260 VI.3 Sistemele vii sunt caracterizate cel mai bine prin energia liberS 262 VI.4 Variajia energiei li be re in reacjiile chimice §i biochimice 262 VI. 4.1 Vanajia energiei libere §i constants de echilibru. Energia libera de reacjie standard. ...... 263 VI.4.2 Variafia energiei libere in reacpile de oxido-reducere. Potenjialul redox §i legatura lui cu energia libera...............265 VI.5 Cuplarea reacjiilor endergonice cu cele exergonice. Intermediaml energetic comun................................................................266 VI.6 Legaturi macroergice. Sistemul ATP/ADP, principals intermedia!energetic comun (Compus macroergic).............................................268 VI.7 Alp compel macroergici. Potenjialul de transfer al gruparii fosfat 271 VI. 8 Cade de sintezS a ATP in vivo......................................, 273 VI.8.1 Fosforilarea la nivel de substrat...............................274 VI.8.2 Lanjul respirator §i fosforilarea oxidativS.................275 VI. 8.3 Teorii privind mecanismul cuplarii lanj respirator-fosforilare oxidativ#............................................................................284 Vl.8.4 Sisteme de transport a echivalenplor de reducere...286 VI.8.5 Afecjiuni datorate unor defecte eredit&re la nivelul enzimelor lanjului respirator §i fosforiiSrii oxidative................................................. 288 Vl.8.6 Controitil respirator............................................... 288 VI.8.7 Decuplanji ai fosforilarii oxidative de lanjul respirator 289 'VI.8.8 Alte lanjuri respiratorii............................................289 VI. 8.9 Specii incomplet redu.se ale oxigenului............. 290 Cap. VII. Metabolismul glucidelor. (Prof. Dr, Veronica Dinu). 294 VII. l Chimia glucidelor.................................................... 294 VII. 1.1 Monozaharidele............................................... 295 vStereoizomeria monozaharidelor.................................. 295 Structurile ciclice ale monozaharidelor.............................298 Aminozaharuri.............................................................. 303 Dezoxlzaharuri..................................................................304 Proprietaple fizice §i chimice ale monozaharidelor...........305 VII. 1.2 Oligozaharidele.................................................308 VII.l.3 Polizaharidele........................................................ 310 VII.2 Digestia $i absorbfia glucidelor..................................312 VII.2.1 Deficits enzimatice in digestia §i absorb|ia glucidelor ..................................................................- 315 VI1.3 Caile de nieiabolizare a glucozei. ............................. 316 VII.3.1 Glicpliza (Secvenja Embden-Meyerhof-Pamas).......318 Bilanjul energetic al glicolizei...................................... . .....* 328 VII.3.2 Decarboxilarea oxidativfi a piruvatului...................329 VII.3,3 Ciclul acizilor tricarboxilici (Ciclul Krebs)............ 333 Ciclul Krebs - cale amfibolica........................................... 339 Bilanjul energetic al arderii glucozei. . ................................ . 341 7 VI1.4 Alte cai de metabolizare a glucozei.............342

VII.4.1 Calea pentozo-fosfa|ilor (Suntul pentozo-fosfat)...... , ............................................................. 342 Deficient ale unor enzinie implicate in calea peiitozelor. . . 351 VU.4.2 Calea acidului glucuronic..................................... 351 VI1.5 Gluconeogeneza...................................................... 353 VU.5,1 Reglarea alosterica a gluconeogenezei................... 362 Vll.5.2 Reglarea homionala a gluconeogenezei.................. 363 VII.6 Metabolismul glicogenului............. ........................... 364 VII.6.1 Degradarea glicogenului (Glicogenoliza). .................... 366 Reglarea glicogenolizei.................................................. 368 V1I.6.2 Biosinteza glicogenului (Glicogenogeneza)...........371 Reglarea glicogenogenezei............................................... 373 VII.6.3 AlterSri enzimatice in metabolismul glicogenului...376 VII.7 Metabolismul galactozei............................................377 VII.8 Metabolismul fmctozei............................ ................. 379 VI1.9 Glicoproteinele. ........... .. ...... ................................. 382 VI1.9.1 Biosinteza glicoproteinelor. ........................................ 384 VII. 9.2 Semnifica|ia biologica a glicoproteinelor........... 387 VII. 10 Proteoglicanii......................................................... * • 388 Cap. VIII. Metabolismul lipidelor. (Prof. Dr. Elena Popa-Cristea) 394 VIII. l Chimia lipidelor.......................................................394 VIII. U Acizii gragi ........................................................ 394 VIil.1.2 Acilglicerolii (Gliceridele sau grasimile neutre).... . .397 VIII.l.3 Fosfoglicerideie {Glicerofosfolipidele, fosfatidele) 399 Acizii fosfatidici ............................................................... 399 Fosfatidilcolinele (lecitine)............................................... 400 Fosfatidiletanolamineie .......................................................... 402 Fosfatidilserinele (serin-cefaline)..................................... 402 Fosfatidilinozitolii (inozitol fosfatide, fosfoinozitlde) . . ......... . 402 Plasmaiogenele ............................................................ 404 Fosfatidilglicerolii .................................................................... 404 VIII.l.4 Sfingolipidele. ............................................................... 404 Sfingomielinele................................................................ 405 Glicosfingolipidele.............................................................405 VIII.l.5 Cerarile...................................................................407 VIII. 1.6 Lipide nesaponifiabiie.................................... 407 Terpenele. . . . ...................................................... ............. . 407 Carotenoizii.......................................... . ..................-.......409 Steroizii................................................. . .............. . .......... • * 410 V1II.2 Digestia §i absorbpa lipidelor. ........................ 415 VIII.3 Metabolismul acizilor gra§i...................................... 417 Vfll.3.1 Degradarea oxidativa a acizilor gra$i............. . 417 P - Oxidarea acizilor gra$i (Ciclul sail spiraia lui Lynen).....418 P - Oxidarea acizilor gra§i nesaturali. ..................................... 421 Oxidarea acizilor gra§i in peroxizomi............................. 422 VII1.3.2 Cetogeneza...................................................... 424 VII1.3.3 Biosinteza acizilor gragi..................................... 427 Biosinteza acidului palmitic............................................. 427 Elongarea acizilor graji............................................................ 432

Biosinteza acizilor gra§i nesaturali. ........................................ 433 VIII.4 Metabolismul glicerolului........ ................................... ■ 434 VII1.5 Metabolismul triacilglicerolilor. ....... .......... . .......... .......................................435 VIO.5.1 Hidroliza tmcilgliceroiilor................................... 436 VIO.5.2 Biosinteza triacilglicerolilor. ... ............................... . ■ 437 VIII.6 Metabolismul glicerol'osi'oliptdelor. ............................... 441 VIII.7 Metabolismul sfingolipidelor.................................... 445 "VIII.8 Metabolismul colesterolului................................. 448 VIII.8.1 Digestia §i absorbpa colestcrolului........................450 VU3.8.2 Biosinteza colesterolului. ................... ........ . ........ 450 VHI.8.3 Catabolismul colesterolului. ................... ............ 455 VIII.9 Lipidele plasmatice............................................... 457 VI11.9.3 Analiza lipidelor plasmatice............................... 458 VII1.9.2 ChiJomicixmii....................................................... 461 8 VIIL9.4 Lipoproteinele cu densitate midi (LDL, (3-lipoproteine) ■ 464 VIIL9.5 Lipoproteinele cu densitate mare (HDL, cx-lipoproteine) 466 VIII.9.6 Acizii gra§i liberi (AGL, acizi gra§i neesterificaji), . . 467, VIH.9.7 Dislipidemiiie. ............................ ........................467 VIII. IO Eicosanoizii. ....... .................................................. 471 VIIU0.1 Biosinleza eicosanoizilor.............................. ........473 VIII.10.2 Catabolismul prostaglandinelor........ ................... . . 476 VIII. 10.3 Actiunile bioiogice ale eicosanoizilor............... . . 476 Cap. IX. Metabolisms^ proteineior §1 aS anriuoadzilor. (Prof. Dr. E.Trupa) ............................................................................................. 479 IX. 1 introduces............................................................. 479 1X.2 Starea dinamicS a proteineior. Bilanjuri azotate ....... 479 IX.3 Digestia proteineior alimentare §i absorbpa aminoacizilor. Hidroliza proteineior endogene. .... 481 IX.4 Fondul de aminoacizi. Aminoacizi] esenpali...............485 1X.5 Catabolismul aminoacizilor: dezamtnarea oxidativa §i ciclul ureogenetic ............................................................................................ . . 486 IX. 5.1 Aspecte generale.................................. . ......486 1X.5.2 Dezaminarea oxidativa a aminoacizilor $i Iranspoitul amoniacului rezultat..............................................................................486 IX.5.3 Biosinteza ureei. ........ . ...................... .................... 490 IX.5.4 Relalii intre ciclul ureogenetic §i ciclul acizilor tricarboxilici 493 IX.5.5 Boli cauzate de defecie in metabolizarea amoniacului 493 1X.6 Catabolismul aminoacizilor; utilizarea schelelelor de carbon 494 IX.6.1 Aspecte generale.................................................... 494 1X.6.2 Alanina, treonina, glicina, serina, cisteina (§i cistina) se degradeaza la acid piruvic. ...... 495 IX.6.3 Arginina, prolina, histidina, glutamina §i acidul glutamic se degradeaza la acid ct-cetoglutaric. . .................................................... 497 IX.6.4 Aspargina $d acidul aspartic se degradeaza la oxaloacetat 499 IX.6.5 Izoleucina, valuta §i meliomna se degradeaza la succinil-CoA 499 IX.6.6 Leucina §i lizina se degradeaza la acid acetoacetie sau acetoacetil-CoA

...........................................................................................502 1X.6.7 Triplofanul se degradeaza la acctil-CoA alanina......503 IX.6.8 Fenilalanina $i lirozina se degradeaza la acid fumaric gi acid acetoacetie........................................................................503 IX.6.9 Boli cauzate de defecte in utilizarea .scheletului de carbon ai aminoacizilor......................................................................506 IX.7 Biosinteza aminoacizilor neesen|sali......................... 508 IX.7.1 Aspecte generale................................................... 508 IX.7.2 C5i particular de biosinteza.................................... 510 IX. 8 Formarea din aminoacizi a unor compugi cu func^ii specializate 513 IX.8.1 Compugii rezulta|i prin decarboxilarea aminoacizilor 513 1X.8.2 Biosinleza glutationului, . ............................................. 515 IX.8.3 Sinteza creatinei. Relajia creating - creatinfosfaL Creatinina 516 IX. 8.4 Conpugi de „conjugare“ a aminoacizilor........... 517 Cap. X. Metabolism!]! hemoproteinelor. (Prof.Dr. E.Tru|ia). ................................................................. 519 X. l Aspecte cliimice....................................................... 519 X.2 Biosinteza hemukii..................................................... 521 X. 2.1 Etapele biosintezei........................................... 521 X.2.2 Reglarea biosintezei hemului................ ................ . 525 X.2.3 Porfiriilc...................................................................... . . 526 X.3 Catabolismul hemukii.................................................. 529 X.3.1 Etapele initiate. ............................................. ...... 529 X.3.2 Bilirubina: fomtare, patmndere in ficat, caracLeristici, conjugare, excrepe biliara.................................................................... 530 X.3.3 Etapele finale. . .................................. . .............. . 533 X. 3.4 Hiperbilirubinemiile........................... ...................... . 534 Cap. XI. MetaboUsmul nudeotidelor purinice si piritmdinicc. (Prof. Dr. Elena Popa-Cristea).....................................................................538 XL1 Metabolismul nudeotidelor purinice........................... 538 XI. 1.1 Biosinteza de novo a nudeotidelor purinice......_ 540 Biosinteza IMP. . .......................... . ................ ........ 540 Biosinteza AMP gi GMP. .. . .................................................. 542 Biosinteza nudeotidelor cu legaturi fosfat ntacroergice...... . . 544 Biosinteza dezoxiribonucleotidelor....................................544 Reglarea biosintezei de novo a purinelor...........................544 XI. 1.2 Interconversiunile §i reutilizarca purinelor......... 546 XI.1.3 Catabolismul purinelor ...... .................................... 551 XI. 1.4 Palologia metabob'smului purinelor......................... 553 9 XI.2 Metabolismul nudeotidelor pirimidinice XI.2,1 Biosinteza de novo a nudeotidelor pirimidinice. . . . • XI.2.2 Reutilizarea, catabolismul nudeotidelor pirimidinice. XI.2.3 Patologia metabolismului pirimidinelor Cap. XII. HormotiU. (Prof. Dr. Elena Popa-Cristea).....562 . XII. 1 Introducers..............................................................362 XII.2 Receptorii hormonal! .......................................... 564 XII.3 Mecanismele de ac|iune a honnonilor, .. ................... 571 XII.3.1 Mecanismul de acjiune a honnonilor steroidici §1 tiroidieni

......................................................................... 571 XII.3.2 Mecanismul de acjiune a honnonilor peptidici $i a catecolaminelor ...................................................................................... . .. .572 Proteinele G......*......................... ................................. ...573 AMPC> adenilat cidaza §i AMPC fosfodiesteraza.....,............576 Protein kinaze §i fosfoproteinfosfataze............................... 577 AMPC mediator al expresiei genice .................................... 580 GMPC, guanilat ciclaza §i GMPC fosfodiesteraza ..................... 581 Fosfolipaza C §i mesagerii intracelulari. Diacilglicerol §i inozitoltrisfosfat 583 Ca2* mesager intracelular al semnalelor exteme..............585 Mecanismul de acjiune a unor honnoni care regleazS cre§terea §i proliferarea celulara. ...... 586 XII.4 Honnonii tiroidieni. ............................................... 592 X1I.5 Hormonii care rcgleaza calcemia (honnonii calciotropi). . . ............................................................................. . 593 XII.5.1 Homionul paratiroidian...........................................594 X1I.5.2 Calcitonina........................................................... 595 XII.5.3 1,25-Dihidroxicolecaldferol (Calcitriol)................. 598 XII.6 Honnonii pancreatici, .......................... -....................598 XII.6.1 Insulina....................................................................603 XII.6.2 Glucagonul........................................................ 604 XII.6.3 Somatostatina........................................................... , 606 XII.6.4 Polipeplidul pancreatic. ............................. ......... ..................................... 607 XII.7 Honnonii gastrointestinal! .......................................... 608 XII.8 Honnonii raeduiosuprarenalieni ............ . ................. 612 XII.9 Honnonii corticosuprarenalieni................................ 618 X11.10 Honnonii sexuali.................................................. 618 XII. 10.1 Androgenii.......................................................... 622 XII. 10.2 Honnonii ovarieni. . ............................................. 624 XII. 11 Hormonii hipofizari $i hipoUilamici.........................624 XILU.l Hormonii adenohipofizari....................................... 626 Peptide'derivate din pro-opiomelanocoitina (POMC)....... 628 Giupui honnonilor somatomainotropi......... ,..................... 629 Honnonii hipofizari glicoproteici. ............................................ 630 XU.I 1.2 Hormonii neurohiporizari.........,. . ........................ 631 XII. .12 Epifiza (glanda pinealS).................................... 633 XII.13 Endorfine..................................................................' 634 XII. 14 Factorii de cregtere. ..............................................., . 635 XII. 14.1 Familia EOF (Epidennal growth factor)............... .635 XII.14.2 Familia FGF (Fibroblast growth factor).....; . . ....... 636 XII. 14.3 Familia PDGF (Platelet derived growth factor)......636 XII.14.4 Familia TGF p (Transforming growth factor p)......... ..................................................................... . 637 XU.14.5 Factorii de cregtere insulin-like (IGF, somatomedine) ...................................................................... 638 XII, 14.6 NGF (Nerve growth factor)................................... . ........................................... . 638 XII,14.7 Familia CSF (Colony-stimulating factor).............. 639

XII.14.8 EritropoietinS ‘(Erythropoesis stimulating factor), . ............................................................640 XII.14.9 Interleukinele (IL). .... . . .................................... 641 XII.14.10 Interferonii (INF)................................................ 643 XII. 14.11 Oncogeneie gi controlul createrii celulare........ Cap. XIII. Apa. Proccsele hidroclcctrolitice §i cdiilibrul acido-bazic. (Prof. doc. Aurora Popescu)643 XIII. 1 Introducere.... ........... .................. ................... 643 XIII.2 Conjinutul §i reparlijia apei m organism. .................. 643 XI1I.3 EchiSibrul apei m organism.................. . ........647 X1IL3.1 Necesarul zilnic de apa. . . . .................................. 648 XIII. 3.2 Pierderile de apa..............................................649 XIII.3,3 Excesul de apa.......................................................649 XIII.4 ProprietSjile fizico-chimicc a)c apei....................... . . 649 XIII.4.1 Structura §i polaritatca moleculei de apa..............649 XI1I.4.2 Legatura de hidrogen §i asocierile mol.eculare .... 651 10 X1II.4.3 Calciura specifics §i cSldura de vaporizare........... 653 XI1I.4.4 Caldura de topire, punctul de topire §i punctul de Berbers654 XIII.4.5 Apa ea dizolvant. ................................................. 655 XIII.5 Procesele hidroelectrolitice............................ ..........658 X1II.5.1 lonizarea apei gi produsul ionic al apei. . ............. 658 XIII.5.2 Reacjia solujiilor si pH-ul. ................... ................. 659 XIII.5.3 Specii dc acizi §i baze; l&ria lor..............................661 XIII. 6 Echilibral acido-bazic................ .............................. 664 XIII.6.1 Sistemul tampon acid carbonie-bicarbonai............665 XIII.6.2 Sistemul tampon al fosfajilor. ................... ..................................................... 668 XIII. 6.3 Sistemul tampon al proteinelor ............ .......... 668 XIII .6.4 Sistemul tampon al hemoglobineL . . . ........... . 669 XIIL6.5 Cooperates plaraan-rioichi.................................. • • ; 669 Cap, XIV, Matr&cea extracelulari (Prof. dr. doc. Aurora Popescu) .......................................................................671 XIV. 1 Constituent chimici ai matricei extracelulare......... 671 XIV. 1.1 Proteinele.............................................................671 Colagenul............................................................................ . 672 Elastina...............*.............................................................680 XIV.1.2 Glicozaminoglicanii §i proteoglicanii............... 682 Glicozaminoglicanii............................................................682 Proteoglicanii......'.............................. . ........................... 687 Funcjiile biologice ale proteoglicanilor §i glicozaminoglicanilor * Biosinteza §i degradarea proteoglicanilor.......................... 695 XIV.2 Rolul matricei extracelulare Tn eursul morfogenezei 698 XIV. 3 Modificariie constituenjilor matricei extracelulare... .................................................. ♦ 699 XIV.3.1 ModificSri m funcfie de varsta................................. 699 XIV.3.2 Colagenozele.........................................*................ ■ 700

643 Dr.

-.•

694

XIV.3.3 Unele modificari calitative dobandite................. . . 700 XIV. 3.4 Mucopolizabaridozele. . ........................................ 701 Cap. XV. Nofiuni dc nutrifie (Prof. Dr. doc. Aurora Popescu) 703 XV. 1 Introducere. ................................... . ......... . 703 XV.2 Necesaml nutritiv...................................................... 703 XV. 2.1 Cheltuiala de energie.....................................704 Metabolismul bazal.....................................................-.....704 Efectele lemiogenetice.................................................. 705 Cheltuiala energetics determinant de activitatea fizica depusS 705 Necesaml energetic......................................................... 706 XV.2.2 Compozipa §i energia rafioi alimentare. .................... 707 XV.3. Principals nutritive, ........................................................ 709 XV .3.1 Glncidele.................................................... ........... ■ 709 XV,3.2 Lipidele.................................................................... . 710 XV.3.3 Proteinele..............,................................................711 XV.3.4 Vilaminele .......................................................... 713 XV.3.5 Mineralele. . ......................................................... 716 XV.3.6 Substanj.ele alimentare bioactive........................ 719 XV.3.7 Fibrele alimentare................................................ 720 XV,3.8 Apa. ........ ...................................... . ...................* 722 XV.4 Principalele produse alimentare. . . .............................. 723 XV,4.1 Produsele alimentare de origine animala............. 724 Camea.............................................................................. 726 Pe§tele............................................................................. 727 XV.4.2 Produsele alimentare de origine vegeiala............ . 728 Cerealele....................................................................... 728 Legumele..................................................................... 729 Fructele..............................................................................729 XV.4.3 Alte produse alimentare.................................. • -...732 Bauturile........................................................................ 733 Condimentele....................................................................• 733 XV.4.4 Aliments bogate in nminoucizi esen|iali. _................ . 733 XV.4.5 Repartizarea unor principii nutritive in cele mai importanle produse alimentare, ........ 734 XV.5 Contribupa nulrijiei la pastrarea sanatapi................736 11 Cap. I. PROTEINELE. STRUCTURA GENERALA Protcinele sunt constituent chimici ai organismelor vii cu cel mai malt grad de complexitate, de varietate molecular# §i care prezint# specificitate de specie, de organ. Denumirea lor deriv# de la euvantul grecesc „proteios“ care Inseamn# „de prim rang, cel dintai“, Proteinele^sunt substante macromoleeiilaE^^ La construct proteinelor participl 20 de aminoacizi fundamentals aceiasi la Joate vieftiitoarele. de la cea mai simple bacterie j3n# la^om. Prin legare In lanjuri polipeptidice variate ca lungime §i succesiune a uniBpto? se' poate objine un numdr nesfar§it de combinajii. Cu toalii multiplicitatea posibilitSjilor de combinare a aminoacizilor In lanjuri polipeptidice, la un anumit organism nu se reabzeazS dec^t, aniimite. secven|e> acelea care sunt specificate de materialul Proteinele sunt

macromolecule informajionale, cu sravenje specifice de aniino.acizi, sunt expresia epigenetic# a genomului celular, ' Proteinele Indeplinesc funcjii fundamental, specifice organismelor vii (Tabelul LI): Label LL Exemple de proteine §i funcjii fndepiinite de accstea Proteina Funclia Principala proteina a Jesuturilor Colagenul conjunctive Histona Proteina nucleara asociata cu ADN Proteina eritrocitar# cu rol in mentinerea Spectrina fonnei celuiare Amilaza Enzima, participa la digestia amidonului Pepsina EnzimS, participa la digestia proteinelor Glicogen sintaza Enzima, participa la sinteza glicogenului Lactat Enzima, catalizeaza oxidarea lactatului dehidrogenaza la piruvat Actina Proteina contractile din mu§chi Miozina Proteina contractila din mu§chi Insulina Hormon pancreatic hipoglicemiant Hormonul de cre§tere Mormon hipofizar Serumal Proteina plasmatica, transporta ioni, burnina vitamine, hormoni Transporta oxigenul in sistemul Hemoglobina circulator Transferina Transporta ioni de fier in plasma Feridna Forma de depozitare a Feral ui Citocromii Transporta electroni Imunoglobulinel Andcorpi care fixeaza §i imobilizeaza e agenjii bacterieni ProteinS. plasmadcS cu rol in coagularea Fibrinogenul sangeiui - Proteinele au un rol structural, major, ele constituie materialul din care sunt construite to ate structurile celuiare, membrane, organite celuiare ca §i materialul intercelular al {esuturilor §i organelor. Proteinele exist# Intr-o varietate molecular# -foarte mare §i ele asigur# diversitatea $i specificitatea de form# a tuturor fiin|elor jiL 1-3 - Protemele exergita.^ acjiuni catalitice. determinand varietatea nesfSr§ita de reacfii biochimice §i specified transformerilor chimice din organismele vii. - Proteinele contractile sunt instrumentele cu ajutorul c^rora organismele vii indeplinesc activitatea contractile §i locomotoare. e» ele pot aoc&gLiiaosin^ :,,£SMEa5LChimM ca ioni metalici, vitamine, oxigen, dioxid de carbon.

- Proteinele au sarcina de a apSra organismul xmpotriva unor corpi strSini, macromolecule, virusuri, bacterii. Reacjiile imunologice sunt mediate de o close de proteine specializate - imunoglobulinele. LI. AMINOACIZII Unitejile constituente ale proteinelor sunt aminoacizii, care prin legetura peptidicS intre gruparea aminicS a unei molecule si gruparea carboxil a altei molecule dau nagtere la macrorholeculele profeice, Exists 20 aminoacizi proteinogeni specificafi prm co3ul genetic, prezenji in toate organismele vii, de la cele mai simple pane la om (Tabelul 1:2). Aieturi de ace§ti 20 aminoacizi fundamental!, in proteine se mai intalnesc alji cSjiva, care rezuM, de fapt, prin modificeri chimice ale acestora dupe incorporare in lanjiirile polipeptidice (de ex. hidroxiprolina, hidroxilizina etc.). Totodate, se mai intalnesc §i unii aminoacizi cu alls funcjii, ca omitina, citrulina (Tabelul 13). Aminoacizii naturali au formula generaie: R — CH — COOH NH2 ei sunt a-aminoacizi. Face exeepjie unul din cei 20 de aminoacizi,gidina, care are o functie aminice secundare. Diversitatea aminoacizilor naturali este date de natura lui R care poate fi o catene hidrocarbonate alifatice sau aromatice, un heterociclu sau R poate se cuprinde o funcjie adifionaie. Aminoacizii alifatici (f&rS gruperi funcjionale in R). ■ COOH N-H2 CH3 — CH — CH —COOH Glicocolul sau CH2 gliicina; —

Alanina:

1 NHj CH3-

Valina:

CH3-

Leucina:

CH3-

Izoleucina: CH3CH, NH, CH —CH2 — CH —COOH CH, NH, ii CH, CH — COOH I

NH, 14 Tahelul 12 Siructurile si demimirile aminoacizilor proteinogeni Formula structurald Denumirea Denumirea rationale uzuala

3 Acid aminoacetic

NHa

2 glicocoi (glicina)

Prescu rtarea de irei litere ,4 Gly

CH3 — CH — COOH 1

alanina

Acid a-aminopropionic

Ala

j)A

valina

Acid a-aminoizovalerianic

Val

■. V

leucina

Acid a-aminoizocaproic

Lea

L

izoleucina

Acid a-amino-Pmetiivaleriaiiic

He

4U

Phe

F

1 CH2—COOH

1

Simb ol de o litera 5 (}

NH2

CH, — CH — CH — COOH 1 1 CH3 NH; CH3 — CH — C-H2 — CH — COOH ii CH3 NH2

CH3 — CH2 — CH — CH — COOH 1I CH3 NH2 . ^ CH2 — CH — COOH NH2

fenilaianin a

Tabelul 1.2 (continuare) 1 V H N C H

V/’

2 prolina

3 Acid pirolidin-a-carboxilic

4 Pro

5 \P 1 i \l i

Hisddina

Acid a-amino-pimidazoiilpropionic

His

.pH •tj

Triptofan

Acid a-aminopindoiilpropionic

Trp

p)w

Senna.

Acid a-amino-phidroxipropionic

Ser

f§) s

Treonina

Acid a-amino-phidroxibutiric

Thr

T

— COOH - — CH2 — CH — COOH I ' NH2 -CH2—CH —COOH V^ H

CH? CH — COOH 1 1 OH NH2 CH3 — CH — CH — COOH I1 OH NH2

Tirozina

p-hidroxifenilalanina

Tyr

CH? — CH — COOH II SH NH2 Tabelul 1.2 (continuare)

Cisteina

Acid a-amino-ptiopropionic

Cys

1 CH3 — S — CH2 — COOH

2 Metionina

3 Acid a-airrino-S-nietUtiobutiiic

4 Met

Acid aminosuccinic

Asp

NH2

Acid aspartic

H,NOC — CH, — CH — COOH i

Asparagin a

Acid a-amino-Pamidosuccinic

Asn

N

Acid glutamic

Acid a-aminoglutaric

GIu

N

Glutamina

Acid a-amino-yamidoglutaiic

Gin

1Q

Lizina

Acid a,e-diaminocaproic

Lys

K

Arginina

Acid a-amino- 5guadininovalerianic

Arg

,AR Sj

HO CH2 — CH — COOH NH2

CH2

— CH

.C -} 5■ ti) M

NH2

HOOC — CH, — CH — COOH 1

i/j

NH2

HOOC — CH2 — CH2 — CH — COOH 1 NH2

H2NOC — CH2 — CH2 — CH — COOH NH2

CH2 — CH2 — CH2 — CH2 — CH — COOH I 1 NH2 NH2 CH, — CH, — CH, — CH — COOH 1 1 NH NH, 1 C = NH I NH2

Tabelul 13 Amlnoaclzii neproteinogeni Formula structurald

Denumire uzuald Denumire §tiinlificd

H2N — CH2 — CH2 — COOH

P - Alanina

Acid Paminopropionic

Component al coenzimei A

H2N — CH2 — CH2 — CH2 — COOH

Acid yaminobutixic, GABA

—

Neuromodula tor

H2N — CH2 — CO — CH2 — CH2 — COOH

Acid 8aminolevulinie

H2N — CO — NH — (CH2)3 — CH(NH2) — COOH

Citnilina

Acid a-amino- 5amidinovalerianic

Funcpe

Intermedia! in biosinteza hemuiui Intermediar al ciclului ureogenetic

H2N — (CH2}3 — CH(NH2) — COOH

Ornitina

Acid a, 5-diamino valerianic

HS — CH2 — CH2 — CH{NH2) — COOH

Homocisteina

Acid a-armno-yticbu tiiic

HO — CH2 ~ CH2 — CH(NHJ — COOH

Homoserina

Acid a-amino-yhidroxibutixic

H2N — C6H4 — OH

Acid paminobenzoic

Intermediar al dclului ureogenetic Intermediar m metaholismtil aminoacizilor Intermediar in metabolismtil aminoacizilor Factor de cregtere persfni bacterii, compo-' ’ i*ent a! aciduiui folic *

Aminoacizii aromatici (£Sr& grap&ri funcjionale in R). Fenilalanina: /\ CHp — CH — COOH I NHp Aminoacizii heierociclici. Histidina cuprinde heterociclul pentagonal cu doi atom! de azot, irnidazol. N N r~ CH2 — CH — COOH NHo N H N H Irnidazol Histidina Triptofanul cuprinde nucleul heterociclic a! indoiului: Indol

Prolina cuprinde o grupare aminic5 secondary situate intr-un ciclu derivat din pirol: COOH '1ST H N H

pirol prolinS Aminoacizii cu grupdri hidroxilice. Serina §i treonina-curpind in R funcfii alcool: CH3 — CH — CH — COOH OH NH2 Serina Treonina Tirozina posedft o funcjie adifionalS fenol: CH2 — CH — COOH OH NH, HO —\ 7— CH2 — CH — COOH NH ' 19 Aminoacizii cu sulf (tioarninoacizii). Ci-steina cuprinde foncfia liol (R = —■ SH) §i metionina o funcfie doeter (R = — S — R); CH2 — CH — COOH CH3 ™ S — CH2 — CH2 — CH — COOH SH NH2 NH2

Cisteina Metionina Aminoacizi dicarboxilicL Acidul aspartic §i acidul glutamic sunt acizi monoaminodicar” boxilici, iar asparagina §i glutamina sunt amideie lor: HOOC — CH2 — CH — COOH HOOC — CH2 — CH2 — CH — COOH m2 NH2 Acidul aspartic Acidul glutamic H>NOC — CH2 — CH — COOH | NH, H2NQC — CH2 — CH2 — CH — COOH NH2 Glutamina Asparagina Aminoacizii diamlnici. Lizina are ca funcfie adiJionalS o grupare aminidl primary \ — CH2 — Ci NH2

NH H2N — CH2 — CH2 — CH* — CH, — CH — COOH Arginina cuprinde o grupare guanidil, — NH — C derivatft din guanidine, H2N — C — NH2 : NH m? H2N — C — NH — CH2 — CH2 — CH2 — NH CH—COOH NH2 Arginina Propriet&tile fizice ale aminoacizilor. Toji aminoacizii sunt substanje solide, cu pun'cte de topire ridicate, mai mari de 200° §i se descornpun inainte de a se topi. Aminoacizii se dizolv&, intr-o mSsuriS mai mare sau mai mica, in

ap&, dar sunt greu solubili in solvenfii nepolari ca: eter, cloroform, benzen. Sunt u§or solubili in soiufii diluate de acizi §i baze. Izomeria optica a aminoacizilor, Tofi aminoacizii, cu excepjia glicocolului, posedS un centru chiralic (un carton asimetric) care este Ca: R— CH — COOH NH2 20 Izoleucina §i treonina au on carbon asimetric adijional, atomul Cp. Formuleie de configurajie ale enantiomerilor unui aminoacid oareeare, reprezentate in sistemul D-L, m care substanja de referinjS este aldehida gliceric# dexlrogirS sunt: COOH COOK H — c — m2 H2N — C — H R R D — aminoacid L •— aminoacid In structura proteinelor nu se intalnesc decSt L-aminoacizi. Aminoacizii din seria D apar numai ocazional, in special la unele microorganisme §i totdeauna au roluri specifice. Proprieta$ile acidobazice ale aminoacizilor. Aminoacizii cuprind o grupare -— NH2 bazic# §i una — COOH acid# §i intre aceste dou# funcjii poate avea loc transferal de protoni: COOH R — CH ' R — OH COO“ NH2 NH3* ion bipolar (amfion) Datorit# interacfiunilor electronice posibile intre cele dou# funcfii invecinate, echilibrul reacfiei este deplasat aproape in totalitate spre dreapta, practic aminoacizii (monoaminomonocarboxilici), In cristale ca §i in solujie, exists numai sub form# de amfioni (ioni bipolari). Structura bipolar# a aminoacizilor este susjinut# de numeroase fapte. Prin m#sur#tori de distance interatomice s-a g#sit c# in gruparea carboxil, distanfele C-0 sunt egale (1,26 A), eie corespund ionului carboxilat, unde are loc conjugarea n-p: 1

De asemenea, moleculele aminoacizilor, neutre in ansamblu, au momente de dipoi foarte mari, cuprind sarcini electrice mari §i de semn contrar in regiuni diferite ale moleculei. Ionii bipolari ai aminoacizilor r#man in continuare amfoliji, ei au at&t caracter acid, cat $i caracter bazic. Funcpa acid# actual# a unui aminoacid (monoaminomonocarboxilic) este gruparea aminic# protonal#, — NH3\ acidul conjugal al grupdiii aminice, — NH2:

— H* — NH3* — NH2 4- H + acid baza •21 Funcjia bazic& a unui aminoacid este ionul carboxiiat — COO" , baza conjugate a grup&rii carboxil: + H+ COO'—- COON — H* baza acid Unii aminoacizi ca: lizina, acidul glutamic, acidul aspartic, cuprind In radicalul de la Ca grupSri acide sau bazice adijionaie, Pentru inceput In exam in area comport&rii aminoacizilor ca acizi §i baze se iau in considerate numai aminoacizii monoaminomono- carboxilici (aminoacizi neutri): , 000“ R — CHNH3* Pentru caracterizarea aciditdjii §i bazicitSfii aminoacizilor se folosesc exponenjii de aciditate, pK, (pKa = — log KJ. Funcfia carboxil este caracterizati prin pKa-coOH iar funcjia aminicft printr-un pKoe-NH3+, .La unii aminoacizi se adaugd o a fcreia mSrime pK, corespunz&toare funcjiei acide adijionale. In Tabelul L4 se dau valorile pK ale color 20 de aminoacizi naturali. Din examinarea datelor din Tabelul 1.4 se remarcil, in piimul rand, faptul c& fimcjia .— COOH este tin acid mai puternic (pK * 2) decat gruparea similar^ a acizilor carboxilici oarecari (pK pentru acidul acetic este 4,76). Aciditatea grup&rii — NH3+ este redusS (pK = 9-10), dar intrece totup bazicitatea — COO”. Din aceastd eauz&, in ap& purd, gruparea — NH3+ doneazS mai mulfi protoni decdt accepts ionul — COO”. Solujiile apoase ale aminoacizilor sunt slab acide. label L4 Valorile pK §i pi ale aminoacizilor Aminoacid pf
13. Metionina 2,28 ' '9,21 5,75 14. Asparagina 2,02 8,8 5,41 ‘ 15. Glutamina 2,37 9,13 . 5v65 16. Acid aspartic 2,09 9,82 3,86 2,97 17. Acid glutamic 2,19 9,67 4,25 3,22 18. Histidina 1,82 9,17 6,00 7,58 19. Lizina 2,18 8,95 10,53 9,74 20. Arginina 2,17 9,04 12,48 10,76 22 Un aminoac'id prin func[iile acid& §i bazicS pejsare le cuprincle, poaie reacfiona cu baze eedand protoni §i cu acizi, accept&nd protoni. IncSrcarea electrics a unui aminoacid depihde de pH~ul solujiei. DacS un aminoacid se alia intr-o solujie puternic acid# (pH ~ 0-1) grup&rile aceeptoare de protoni sunt protonate in totalitate. La titrarea acestuia cu o bazil tare (HG“) proton.il sunt eliberaji In ordinea descrescfitoare a aciditfijii funcjiilor acide. Au loc reacfiile:
Fig. 1.1. — Curba de titrare a alaninei. Din ecuajia Henderson-Hasselbalch: pH = pKa a log [BazS]

[Acid] 23 rezuita c3 La un pH egal cu pKa-cooH (2,35) exists egalitatea: H3N — CH(CH3) — COOH - H.N — CH(CH3) — COO” iar ia pH = pKa-NH3+ (9,69) egalitatea: H3N — CH(CH3) — COO” * H2N ~~ CH(CH3) — COO” La un pH egal cu semisuma valorilor pK, sarcina nets a aminoacidului este practjc nul&, In solujie existand numai ionii bipolari. Acst pH este denumit izoelectric (pi), in Tabelul 1.4, coloana 5, sunt date valorile pi ale aminoacizilor proteinogeni. Pentru aminoactzii neutri, punctele izoelectrice sunt, situate la valori de aproximativ 6, pH pujin inferior pH-ului fiziologic. La pH = pi solubilitatea aminoacizilor este minimi. Comportarea aminoacizilor cu grupdri acide §i bazice adifionale. Un num&r de 5 aminoacizi din cei 20 cuprind in radicalul R de la Ca grup&ri acide sau bazice: acidul aspartic, acidul glutamic, lizina, arginina p histidina. Funcfia fenol din tirozinU p cea tioalcool din cisteinft sunt acizi foarte slabi care la pH-ul fiziologic se ionizeazft intro m&suril neglijabilft. La acegti aminoacizi se adaugS o constants pK suplimentarS (Tabelul 1.4). Pentru acidul aspartic p glutamic aciditatea acestei funcjii este mai micS decat; a grupului carboxilic de ia Ca, are o tSrie comparabilii cu a acizilor monocarboxilici aiifatici (pK = 3,86 la acid aspartic p 4,25 la acid glutamic), nu se mai simte influenja grup&rii am inice vecine. Formele aciduiui aspartic, in raport cu pH-ul solujiei in care se aflft, pot fi deduse, ca p in cazul aminoacizilor neutri, prin protonare maximal^ p apoi adftugare treptat& de baz&; funcfiile acide vor ceda protoni in ordinea descresc&toare a tiiriei lor: (jXDOH t^OOH
NH NH/ II + H* II R — NH — C — NH2 R — NH — C — NH2 •• H+ ion guanidinium lonul guanidinium, datorita conjugSrii rc — p poate fi serfs: R — NH - C + 1 NH2 ^ NH + 1 *2 Histidina prezinta caracter bazic prin nucieul heterociciic al iniidazolului: © N HN ——i i || -rH* ' |t 11 w 11

Bazicitatea acestei grup8ri este mai redusd (pK = 6,00) §i pi este situat la valori apropiate de pH-ul fiziologic (7,58). Din cele expuse mai inainte rezuM c& ionizarea aminoacizilor, sarcina electric!! pe care o poartS fiecare dintre ei, depinde de pH-ul solujiei in care sunt cupringi. DacS jinem seama eft in organismele vii aminoacizii sunt cuprin§i in lanfurile poiipeptidice ale proteineior este important de examinat comportarea ca acizi sau baze a resturilor aminoacide -NH — CH(R) — CO sarcina electric^ pe care o poartft aceste resturi la pH-ul fiziologic. Resturile aspartil §i glutamil au in aceste condijii o sarcinft netft (-) pe cand resturile lizii, arginil §i histidil au sarcina (+): cjxxr cjxxr (fH*)* NH, —NH—CH—CO—; —NH—OH—CO—; -HN—CH—CO—; (CpU -HN— CH—CONH2 © NH2 Restul histidil este redat prin douft stmcluri tautomere: © HN

H CH2 — CH / NH — \ CO —

HN HH — CH2 — CH { \co — y

H 25 Clasificarea aminoacizilor dupd naiura radicaiului de la Ca. In proteine, aminoacizii sunt. angaja{i in legiltur^l peptidicfl prin gruparca aminic&-§i cea carboxil: R — NH — CH — CO — rest ammoacidic Ceea ce diferen|iazd resturile celor 20 de aminoacizi este natura radicaiului de la Ca. Natura interacjiuniJor ce se pot stabili intre resturile aminoacidice depinde de incftrcarca electrics. a acestor resluri, de caracterul lor polar sau hidrofob. Jinandu-se scama de aceste insu§iri ale resturilor R de la Ctt aminoacizii sunt imparjiji in patru grupe. a. aminoacizi cu R hidrofob, nepolar; alanina, vnlina, Ieucina, izoleucina, prolina, fenilalanina, triptofanul, metionina; b. aminoacizi cu. R polar, dar fdrM sarcina electric*!: serina, treonina, lirozina, cisteina, asparagina, glutainina $i glicocolul (R = H); c. aminoacizi cu R mc&rcat (-) (la pH-ul fiziologic): acidul aspartic, acidul glutamic; cl, aminoaocizi cu R mefircai (+) (la pH-ul fiziologic): lizina, arginina, histidina.' Reacf.iile chimice ale aminoacizilor, Aminoacizii prezinttl diverse reacjii chimice la care participii atat funcjiiie amino §1 carboxil comune tuluror aminoacizilor, cat. §i grupilriie prezente in radicalii de la Cw. ReacpJ ale grupdrii -COOH. Aminoacizii formeazS. derivaji normali ai acestei funcjii: esten, amide, anhidride, nitrilL Prin decarboxilare, aminoacizii formeaxfr amine, multe dintre ele substanje cu proprietaji fiziologice §i farmacologice remarcabile (amine biogene): R — CH — COOH ---------------> R — CH2 — NHa + C02 NH2 Unelc amine, produ§i.ai reacjiei de decarboxilare a aminoacizilor, sunt ar&taji mai jos: N CH2 — CH2 — NH2 HOOC — (CH2)3 — NH2 Nx hi,stamina H (din histidinft) ad d y-am inobuti ric (din acid glutamic) (jlH2 — CH2 — NH2 OH

H2N — (CH2)5 — NH2 Cj)H2 — CH^ — NH2 SH etanolamina (din serina) cadaverina (din lizina) cisteamina (din cisteina) Reacl'ii ale grupdrii ~NH2. Prin aceasta funcjie aminoacizii dau numeroase reacfii: - condensate cu compu§i carbonilici: R — CH — NHL ■f COOH (R')H A C=0 HoO R — CjH —* N = C COOH \ baza Schiff (aldimina, cetimina) H(R') 26 alchilare iota 111; agent metilant + R — CH — MH2 ---------------------R — CH — N(CH3)3 COOH COO" betaina acilare; agent aC) j R _ CH — NH„- -— -----------------R ■— CH -- NH — CO — R' I- ‘ I COOH COOH N-aci3-cierivat Cu acidul carbonic, aminoacizii formeazS derivaji carbaminoacizi: OH / o=c o OH R CH — NHo ■I COOH ► R — CH — NH — C — OH COOH - oxidare: R — CH — COOH R — CH — COOH + H2O R.r— C — COOH

-0

X z: 1

2H NHL NH2 NH Inloeuirea grupSrii — NH2 cu — OH: + HOH R — CH — COOH----------------O cx-cetoacid (a-oxoacid) NH, NH, R — CH — COOH I OH a-hidroxbacid Reacpi ale funcfiitor prezente in radicalul de la Ca. Penlru funcfia tioalcool din cisteind sunt caracteristice reacfiile: - oxidare bland! si reversibilS la disulfura: CH? — CH2 — S — S SH CH2 i - 2H I 1 CH NH2 CH — 1 + 2H I • I COOH COOH CO OH cistina 27 - formare de s&ruri cu metale grele, marcaptide: R — SH + AgN03 ---------------------R — SAg 4- HNOs - oxidare energies la acid cisteic: CH2S CH2 — S03H H 1 oxidare I CH — ------► CH — NH2 NHo 12 COOH COOH acid cisteic Serina, treonina §i tirozina prin func|ia hidroxi formeazS esteri, cu acidul fosforic, rezuMnd; CH2 O POSH2 0 — FOSH2 s2 1 CH — 0 — P0 H rS 3 £ CH — NH 1 P

COOH

CH — NH2 |

acid serinfosforic

COOH

2

V CH2 — CH — 2 l I NH2

acid ireomnfosforic acid tirozinfosforic Gruparea — NH2 de la Ce al lizinei confers acestui aminoacid sau restuiui

lizil, posibilit&fi multiple de a inferaefiona cu alfi compu§i. Condensarea cu funefii carbonil este una dintre proprietS{ile cele mai importante ale acestui rest aminoacidic. De asemenea, prin oxidarea grupSrii C£ ■— NH2 din lizinS se ohfine alizina: oxidare H2N — CH2 — (CH2)3 — CH — COOH 0 - HC — (CH2)3 — CH — COOH NH2 NHZ Hzina alizinS Gruparea carbonil ndu formats poate participa mai departe ia alte reaefii. 28 12 PEPTIDELE Peptidele sunt combinafii de tip amidic rezultate prin condensarea a doua sau rnai • multe molecule de aminoacizi: R R R R H2N —OH — COOH 4- H2N — CH — COOH —- H2N — H2O CH — CO — NH —CH — COOH dlpeptid Peptidele pot rezulta din doua, trei, n molecule de aminoacizi. Ceea ce rfcsane dinfcr-un aminoacid dupa angajarea sa in legStura peptidicd poartS denumirea de rest (reziduu) aminoacidic. Peptidele cuprinzand mai pujine resturi aminoacide sunt denumite oligopeptide, iar acelea cu un numSr mai mare de resturi aminoacidice sunt poiipeptide: HZH — CH — CO — NH — CH — CO - - - - NH — CH — COOH polipeptid Capetele moleculei unui peptid sunt diferite, unul are grupare aminicd libera, cap3t N- terminal, iar ceMalt are gruparea carboxil neangajata, este capatul C-terminal. Resturile de aminoacizi de la capetele moleculei sunt denumite rested N-terminale §i, respectiv, C~terminale. Inceputui unui peptid este capatul N-terminal. Denumirile peptidelor se construiesc socotindu-le derivaji acila{i ai restului aminoacidic C-terminal, Se citesc succesiv radicalii aminoacizilor Incepand cu capatul N- terminal panH la restul C-terminal. De exemplu, tetrapeptidul: CH(CH3)2 H2N — CH — CO — NH — CHg ■ CHoOH CH3 I I CO — NH — CH - CO — NH— CH — COOH Se cite§te valil-glicil-seril-alanin&. De asemenea, pentru redarea structurii unui peptid, mai mic sau mai mare, se folosesc prescurt&rile de trei litere sau de o singurS liters pentru aminoacizi. In acest sistem, tetrapeptidul de mai sus este redat:

Val-Gly-Ser-Ala sau VCSA. Cu ajutorul acestor prescurtM intr-un spa{iu restrans pot fi redate structurile unor poiipeptide foarte mari, Datorita posibilitajii de legare a acelora§i aminoacizi in secvenje diferite, peptidele pot prezenta fenomenul de izomerie de structura, de pozifie. Doi aminoacizi diferiji pot da na§tere la doua dipeptide izomere dupa cum unui sau altul ocupa pozifia N- sau C- terminaia. De exemplu, dipeptidele izomere leucil-metionina sau metionil-leucina. Posibilitajile de izomerie cresc foarte repede odata cu cregterea numarului de aminoacizi. Trei aminoacizi distlncji A, B, C pot da nagtere la 6 tripeptide izomere (peptidul cuprinde cate un rest din fiecare aminoacid), Din patru aminoacizi 24 tetrapeptide, din cinci 120. Un eicosapeptid (cu 20 resturi) In care fiecare din cei 20 de aminoacizi este cuprins o singura data poate exista sub forma a 2 x I018 izomeri. Posibilitatea legarii aminoacizilor In secvenje nesfar§it de numeroase sta la baza multiplicitajii §i varietajii moleculare a proteinelor. 29 In organismele vii se infalnese numeroase peptide (oligopeptide sau peptide mai marl) cu funcfii particulare. Unele din aceste peptide au legftturi peptidice atipice, cuprinzand. resturi aminoacidice modificate, au strueturi ciclice, cuprind D-aminoacizi (Tabelul 1.5), Oligopeptide cu funcjii biologsce Tabelul 1.5. Denu Structura Funcfia mirea Agent Glutati redox y—Giu — Cys — Giya on intracel ular Agent Bradiki Arg — Pro — Pro — Gly — Phe — Ser— hipoten nina Pro — Phe—Arg siv Agent hiperfensiv, Angiot regleaAsp — Arg — Va! — Tyr — lie — His — Pro ensina za — Phe 11 secrefi a de aldoste ron Mormo TSH — n Piro — Glu — His — Pro — amidab RH hipotat amic Oxltoci Cys — Tyr — lie — Gin — Asn — Cys — Mormo c na Pro — Leu — GSy — amida S : n ----------------S neurohi pofizar

Vasopr esina

Cys — Tyr—Phe — Gin — Asn — Cys — Mormo Pro — Leu(Arg} — Giy — amida n i1 neurohi S-----------------------S pofizar a) Restul Gly N-terminal este angajat in legatura pepttdica prin gruparea y-CQOH. b) Restu! Giy N-terminai formeaza amida interna; restul Pro C-terminal formeazS amida, c) Resturiie 1Cys §i 6Cys formeaza. punte disulfurica; restul Gly C-terminal formeaz& amida. 1.3 PROTEINELE Proteinele au o structura polipeptidicd. Granija dintre polipeptidele propriu-zise §i proteine este arbitrary. La un anumit grad de complexitate a ianfurilor polipeptidice apar nivele superioaxe de organizare §i caiitfifi noi neintilnite la polipeptidele mai mici. Proteinele, alitiuri de acizii nucleic!, sunt macromolecule ce exists fntr-o varietate foarte mare. Fiecare tip de celuHl, fiecare individ, fiecare specie posedd un set distinct de proteine. Se estimeazti dl num&rul de tipuri de proteine din intreaga iume vie este de 10K) —1012 §i potenfialul de diversi'tate nu este epuizat Chiar proteinele care indeplinesc funcfii similare la specii diferite sunt entitaji distincte, cu mase §i proprietfifi diferite. Chimia proteinelor este deosebit de complex^, ea presupune, mai intii, infelegerea principiilor generale de construcfie a moleculelor proteice, a modului in care dintr-un nurmlr limitat de unittifi structural se pot forma infinit de multe proteine gi a factorilor care inlervin in realizarea organizarii lor spafiale. In al doilea rind, studiul proteinelor 30 necesitS abordarea fiecSrui tip de proteins In parte, stabiiirea pentru fiecare specie molecularS a const! tufiei chiinice, a. arhitecturii gi a funcfiei (sau funcjiiior) pe care !e exerciti Structura poiipeplidicS este aptS sS asigure proteinelor cele douS caractere, diversitate molecularS, pe de o. parte, gi specif icitale de forms, pe de alts parte. Un polipeptidr R H O R i 1 .11 I CH N C CH \N/ \c/ \c/ \c/ ii H 0 R H O cuprinde o catenS principals cu o structurS monotonS in care se repetS grupul de atomi - — NH — CH —■ CO Varietatea lanfurilor este asiguralS de radicaiii R legafi la Ca. Cu ajutorul celor 20 radical! diferiji se pot objine combinafii multiple, deosebite prin -numSrul gi secvenfa resturilor aminoacide. Lanfurile polipeptidice, unidimensionale gi flexibile, se convertesc spontan m edificii cu trei dimensiuni, cu forme caracteristice pentru o anumitS secvenfS de aminoacizi. Organizarea spaJialS a lan|urilor polipeptidice are loc prin interacfiuni necovalente — iegSturi de hidrogen, atracfii polare §i ionice, interacfiuni c

hidrofobe — la care participS atit grupSrile C = O gi ^2^ NH din catena polipeptidicS, ctt gi diversele grupSri cuprinse In catenele laterale ale lanfului. Complexitatea proteinelor a fdcut necesarS. introducerea mai multor fcrepfce de organizare structural denumite ftstructurS primarS, secundarS, terfiarS.. gi structurS £uaternarS. /Structura primarSjprecizeazS tmmSruLgi secyenfa resturilor aminoacidice din molecplS. ea. reds totalitatea leiSturilor covalente din moIeculS gi mai este denumitS gi | Structura primarS corespunde formulelor slructurale uzuale ale unui compus organic. La moleculele simple astfel de formule definesc In acelagi timp gi relajitle spafiale dintre atomi. La proteine cu lanfuri lungi gi un numSr foarte mare de atomi sunt posibile numeroase conformafii (aranjamente spafiale rezultate prin rotafia iiberS a atomilor sau grupurilor de atomi in jurul legSturilor simple) gi este necesarS icrarhizarea nivelelor de organizare spaJialS. Structurile secundare rezultate din interacfiunile grupelor C = O gi' NH din grupSiile peptidice, sunt structuri ordonate, periodice, elemental structural care ie genereazS prezintS el Insugi regularitale. Structura terfiarS a unui tanf. polipeptidic InglobeazS nivelul de organizare secundar la care se adaugS rnodul de pliere, impachetare a lanfului polipeptidic determinat de interacfiunile posibile Intre radicaiii R de la Ca, interacfiuni ce depind atat de natura acestor radical! cSt gi de relafiile de vecinState dintre ei. Descrierea organizSrii spafiale a unui lanf polipeptidic prin structurS secundarS gi terfiarS este arbitrarS, cele douS niveie slructurale se intrepStrund, ImpreunS ele definesc conformafia specifics a lanfului. Proteinele alcStuite din mai multe lanfuri polipeptidice (proteine oligomere) cuprind un nive! cuaternar de organizare. Structura cuatemarS a unei proteine oligomere descrie modal In care lanfurile polipeptidice individuate, se asociazS, se asambleazS pentfu a realiza structura proteine! date, structura sa funcfionalS. 31 1.3.1 STRUCTURA PRIMARA A PROTEINELOR Prima protein^ a cSrei structure primarS a fost stability este insulins (Sanger, 1953), proteinS micS cu 51 resturi aminoacidice (Fig. 1.2). DupS aceasta a urmat ribonucleaza (Fig. 1.3) cu 124 aminoacizi. Numeral proteinelor a cSror structure primarS este cunoscutt. dep&gegte astSzi cateva zeci de mii. Cunoagterea structurilor primare are o important deosebitS pentru infelegerea rolurilor proteinelor, ea a deschis orizonturi noi in toate gtiinjele biologice: a. Prin studii de secvenjializare s-a stabilit definitv cS o^qmtaM.da!i...are o. structure unicS. nu este o colecjie de specii moleculare diferite (cum este cazul polimerilor de sintezH); b. proteinelor constituie baza intlegerii la nivel molecular a activit&ffi lor biologice; c. Prin compararea structurilor primare a proteinelor care indeplinesc funcjii omoloage la organisme diferite se poate stabili gradul de varietate structural^ compatibilS cup anumitS funcjie gi aceste comparand permit urmSrirea istoriei evolutive a proteinei. DouS sau mai multe proteine

omoloage pot varia la nivelul structurilor lor primare. Adesea aceste deosebiri rezultS prin inlocuirea unui aminoacid dintr-o grupS cu un altul aparjinand aceleiagi grupe (de ex. Val cu Leu sau Arg cu Lys). Astfel de substitufii sunt denumite conservative. Inlocuirea unui aminoacid dintr-o anume pozijie cu altul aparjinand altei grupe (substitute nonconservativS) poate altera intr-o mare m&sur& funcjia proteinei; d. Secvenfa aminoacizilor intr»o protein^ este veriga intre mesajul genetic inserts in ADN gi expresia acestui mesaj; e. Studiile de secvenjializare au dus la descoperirea unor specii de proteine anormale (proteine mutante) ca expresie a unor modific&ri la nivelul genomului; aceste proteine anormale se pot manifests sub forma unor boll (boll moleculare). f. Secvenfiaiizarea unui num&r din ce in ce mai mare de proteine a scos in evident fenomenul de polimorfism molecular. O protein^ cu o anumitS func{ie, la o aceiagi specie, poate exists sub forme moleculare diferite. Gly-Iie-Vat-Giu-GIn-Cys-Cys-Ala-Sef'Val-Cys-Ser-teu-Tyr-GIn-LeU'Glu-Asn-TyrCys-Asn 5 | 10 15 1 21 s s Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-GIU‘Ata'Leu-Tyr-Leu-Val-CysGly-G!u-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr'Pro-Lys-Aia 5 10 15 20 25 30 Fig. !.2 — Structura primary a insulinei 32

Fig. 1.3 — Structua primara a ribonucleazei L3.2. ORGANIZAREA SPATIALA A MOLECULELOR PROTEICE Fiecare protein! fiecare lan{ polipeptidic are o structure tridimensional^ specific^ care este reprodusft cu fidelitate de milioane §i milioane de ori in cursul viejii organismului §i de-a lungul generafiilor. Forma specific^ a unei molecule proteice este determinate de structura sa primar! unice pentru fiecare tip de protein! Aranjamentul spa|ial unic pe care un lanf polipeptidic il

adopts intr-o solujie este impus de constrangeri termodina- mice, este rezultanta tuturor interac{iunilor necovalente care se pot stabili in cuprinsul moleculei astfel ca nivelul s&u energetic s& fie minim. Aceste interacjiuni necovalente de encrgie joasS (1-7 kcal/mol sau 4-29 kJ/mol), au energii de activare mici, se stabilesc cu viteze foarte mari §i nu necesitit intervenjia unor catalizatori. Ele devin eficiente numai prin insumarea efectelor unui numSr foarte mare de leg^turi. Leg&urile necovalente care se manifesto in cadrul moleculelor proteice, ca §i la alte categorii de biomolecule, sunt legSturile de hidrogen, leg^turile polare §i interacjiunile hidrofobe. 33 Legatura de hidrogen se manifest# ca o valenf# auxiliary a hidrogenului cand acesta este legat covalent la un atom puternic electronegativ (0 sau N): 8— S+ 8 ~~~ X ------------------------------------ H ---------- Y-------------donor de hidrogen acceptor de hidrogen Atomul de hidrogen, polarizat pozitiv este atras de atomul electronegativ al altei molecule. Astfel, legdtura de hidrogen se manifest#, in principal, ca o forf# electrostatic#. Punfile de hidrogen se stabilesc dup# direc|ii privilegiate. Direcfia cea mai favorabil#, cea care duce la interacfiunea cea mai puternic#, corespunde coiinearit#Jii celor trei atomi: X, H §i Y. Totugi, earn! aceast# dispozifie no se poate realiza sunt posibile §i aranjamente nelineare ale atomilor. In afar# de ap#, unde fiecare molecul# este angajat# simultan in patru leg#turi de hidrogen, la dou# particip# ca donor §i la dou# ca acceptor de hidrogen, asociafiile intermoleculare prin punfi de hidrogen se intalnesc la mulfi alji compugi, in stare pur# sau in solufii apoase. Leg#turile. de hidrogen intra- sau intermoleculare intalnite la proteine §i alte biomolecule sunt:

Interacfiunile electrostatice, polare, se stabilesc intre grupSri cu sarcini elec trice opuse. Aceste interacfiuni pot fi: - asociafii intre perechi de ioni, leg#turi saline (de ex. intre un rest Arg §i unul Glu); - interacfiunea dintre o grupare cu sarcin# + sau cu o grupare polar# f#r# sarcin#; - interacfiuni intre grupfrri polare f#r# sai*cin#. Proteinele cuprind- un num#r mare de aminoacizi cu R polar, f#r# sarcin#, §i interacfiunile dintre acegtia sunt un factor important pentru stabiiizarea structuriior de ordin superior ale proteinelor. Totodat#, in interiorul moleculei proteice, unde accesul apei este interzis, se realizeaz# un mediu dielectric, care favorizeaz# interacfiunile polare. Interacfiunile hidrofobe sunt acele forfe care fac ca moleculele sau grupSrile nepolare s# se asocieze in agregarte gi s# reduc# la minimum contactul lor cu apa. Acest fenomen este datorat, in primul rand,, factorilor entropici; entropia apei scade cand o molecul# nepolar# vine in contact cu

apa gi, respectiv, entropia apei create dac# aceast# molecul# este excius# din ap#. 34 Interne jiimile hidrofobe sunt factorii cei mai important care determine conformafia unei molecule proteice prin insumarea unui foarte mare num&r de contacte nepolare. Dintre cei 20 aminoacizi proteinogeni, §apte posed# R cu caracter hidrofob. Punjile disulfurice — S — S — care se pot stabili intre dou# resturi Cys, de§i sunt leg#turi covalente, au un rol determinant pentru conformajia proteinei. Realizarea unei punfi — S — S — necesit# aducerea a douS resturi Cys in pozijii potrivite care se realizeaza prin forje necovalente. Fiecare specie proteic# este un unicat in ceea ce prive§te structura primary §i conformafia. Din studiul conformafiilor unui numir de proteine se pot formula principiile generate care guverneaz# organizarea spafial# a tuturor moleculelor proteice. Cele douS elemente structuraie ale unei proteine, axul catenei polipeptidice §i cele 20 de tipuri de radicaii legafi la Ca care se pot g&si intr-o multitudine de relafii reciproce contribuie la realizarea structurii secundare §i terfiare a proteinelor: R. R? R3 l l i — NH — CH — CO —NH — CH — CO — NH — CH — CO — Structura secundard a proteinelor Pauling §i colab. incepand din anui 1930 au intreprins studii sistematice, pin cristalografie cu raze X, de m&surare a distanfelor interatomice, a unghiurilor de ieg#tur& din aminoacizi, din peptide. S-a stabilit c#in gruparea peptidicS are ioc o conjugare n-p, legStura — NH — CO — capM un caracter partial de leg&tur# dubl#, rotafia liberal in juml acestei legSturi fiind astfel impiedicat#. Atomii Ca vor adopta pozifii rigide faf# de planul legHturii duble. In peptidele naturale se intalne§te numai configurafia trans, mai stabile decat aceea cis (Fig. 1.4).

Fig. 1.4 — Configurafia trans a unei legaturi peptidice 35 Lanjul peptidic i$i pesfreaze flexibilitatea prin rotajia liberU in jurul legftturilor: R'i O R2

— GH —~ NH — §i — C — CH — 0 alts inspire a grup3rii peptidice este capacitatea grupei NH de a forma o leg&turli d.e hidrogen cu un grup C = O aparjlnand altei grupftri peptidice: ^ N — H -- O * C Conjugarea n — pa gruparii peptidice accentueazd aceaste fnsu§ire. Un lanj polipeptidic, in solujie, ar putea adopta o infinitate de conformafii prin rotafii in jurul legiUurilor — CH(Rj) — NC^ §i — CH(R2) — CO— . Unele din aceste conform ajii vor fi mai stabile dace permit realizarea de punji de hidrogen intre grupSrile peptidice. Plecand de la principiul c& aranjamentul cel mai stabil este acela in care se realizeazS cel mai mare numSr de punji de hidrogen, Pauling §i Corey (1951) au postulat dou& structuri secundare pentru lanjurile polipeptidice a - elicea §i structura [3. O. structure elicoidalft, distinct^ de cea descris# de Pauling, este intSlnite la colagen, proteina major2 a matricei extracelulare, care are o compozijie aminoacidice particular^. Structura de elice alfa. Lanful polipeptidic se r£suce§te (la nivelul leg&turilor simple) pentru ca grupdrile O = C §i ^:NH s3 devinft adiacente stereochimic pentru a forma punfi de hidrogen. Se objine astfel o structure repetitive eiicoidala in care ioate unitSjile se aflii in raporturi spajiale identice cu unitS£ile vecine. O grupare NH formeaz# punte de hidrogen cu gruparea CO aparfin&nd celui de-al patrulea rest aminoacidic din secvenja linear&. In acest fel, toate grupele CO §i NH sunt unite prin punfi de hidrogen (Fig. 1.5). Stereochimia grupSrii peptidice, unghiurile de legSturi, distanjele interatomice, colinearitatea punfilor de hidrogen, apartenenja aminoacizilor la aceea§i serie optics (seria L) determine o anumite geometrie a a-eLicei; - cu fiecare rest aminoacidic se avanseaze pe verticaie, cu 1,47 A; ~ pasul elicei, distanfa intre done puncte echivalente pe verticaie este de 5,21 A §i cuprinde 3,6 resturi aminoacidice; - diametrul elicei, diametrul suprafejei cilindrice In care se afle atomii Ctt, este de 10,1 A; - sensul nlsucirii lanpdui polipeptidic este de la stanga la dreapta (elice dreaptd); 36

Fig. 1.5 —■ Structura seconders. de a-elice a unui lanf polipeptidic (dupa Linus Pauling) radicalii R ai tuturor aminoacizilor sunt orientafi spre exteriorul eiicei, configurafia atomilor Ca este aceea§i penlru tofi aminoacizii; toate grup&rile NH §i C = O formeazS punfi de hidrogen. Un lanf polipeptidic sub forma de a-elice are forma unui bastona§ cu diametrul de 10,1 A. Pentru 300 restun aminoacidice lungimea acestui bastona§ este de 450 A. 3? Struclura a-elicoidalS a lanjurilor polipeptidice postulate de Pauling §i Corey a fost gSsitS, in proporjie mai mare sau mai micS, la diverse proteine (Tabelul 1.6). Tabetui i. 6 Con{inutul in efice-alfa al unor proteine (evaluat prin metoda dispersiei activit&jii optics) Proteins % elice alfa Mioglobina 70 tnsulina 38 Ovalbumsna 31 Serumalbumma (bovina) 46 Pepsina 31 Ribonucleaza 16

Chimotripsina 15 Lungimea §i repart izarea segmentelor de a-elice in cuprinsul moleculei este diferitS de la o proteins la alia, in funcfie de distribujia factorilor stabilizator! §i destabilizatori ai elicei in structura primarS. Resturile prolil, prin geometria lor particulars, impiedicS rSsucirea elicoidalS a lanjmilor polipeptidice. La nivelul unui rest Pro, lanjul se indoaie cu un unghi de 130°. Resturile glicil, lipsite de catena laterals, confers lanjurilor polipeptidice flexibilitate §i adesea la nivelul resturilor Gly structura secundarS a este imreruptS, ianful schimbandu- §i u§or direejia. Resturile de valinS, izoleucinS, treoninS, prin radicaiii volumino§i de la Cp determinS o stanjenire stericS daca aceste R ajung adiacente in elice. Serina, prin capacitatea de a forma punji de hidrogen prin gruparea alcoolicS desiabilizeazfi elicea. Resturile de cisteinS cfmd formeazS punji disulfurice leagS covalent, rigid, porjiuni ale lanjului polipeptidic §i in vecinStatea acestor regiuni rSsucirea elicoidalS nu mai poate avea loc. Structura secundarS a se intalne§t:e in diverse proporjii atat la proteine fibrilare cat §i la proteine globulare. O proteins fibrilarS cu slructurS secundarS a in proporjie de aproape 100% este keratina, proteins abundentS in par, piele, unghii. Este alcStuitS din lanjuri polipeptidice lungi, cu slructurS de a-elice, asociate cate douS §i- superincolScite. Prin asocierea acestor dimeri se realizeazS fibrile §i fibre rezistente. In aceste fibrile, grupSrile R pot inieracjiona prin valenje secondare in cele mai bune condijiuni. In plus, structura superelicoidalS este stabilizatS §i prin punji disulfurice intercatenare, keratina avand un conjinut ridicat in cisteinS. Mioglobina §i hemoglobina au un procent mare (70’%) de slructurS secundarS a. In aceste cazuri, segmentele de a-elice sunt scurte, ele sunt intrerupte de porjiuni 38 neelicoidale. La nivelul acestora din urma, lanjul polipeptidic i§i schimbSL direcjia sub diverse unghiuri, permijand realizarea unei structuri compacle. Un ait motiv structural intalnit ia proteins cu un procent mare de structure secundard a const# in asocierea paralel# a unui numflx de segments de aelice. Acest motiv structural putandu~se repeta de mai multe ori in cuprinsul molecule! proteice. Stmctura p. O alt# structure secundar# a lanfurilor polipeptidice in care se realizeaz# potenfialul maxim de legare prin punji de hidrogen a grupdrilor ^:C = O §i ^:NH este structura (J sau structurain foaie plisat#. In acest caz punjiie de hidrogen sunt intercatenare, lanjurile polipeptidice se a§eaz# in foi. Cea mai stabil# interac{iune se obfine dac# lanfurile evolueaz# unul de la capdtui N-terminal spre cel C-terminal §i cel#lalt in sens in vers (structura (3 cu lanjuri antiparalele, Fig. 1.6).

39 DatoritS rigidit^ljii legdturii peptidice §i coplanarit&jii grupului i i — CH — NH — CO — CH — se realizeazS structuri asem&n&toare unei foi plisate. Radicalii R sunt oriental, alternativ, de o parte §i de alta. Structura secundarS p In foaie plisatS este intalnitS in propor{ie de aproape 100 % in proteina din m&tase, fibroina. Lanfurile polipeptidice antiparalele sunt intinse §i asociate prin leg&turi de hidrogen, d&nd nagtere unei foi plisate. Aceste foi se a§eaz& in straturi, intre straturi se stabilesc numeroase legSturi intre grup&rile R, care proemineazS de o parte §i de alta a fiec&rei foi. DatorM unei structuri primare speciale, cu multe resturi Gly §i Ala alternante, distanjele dintre foi sunt mici (3,5 A §i 5,7 A alternativ). AceastS structura confers fibroinei rezistenjS la intindere §i flexibilitate. Structurile p sunt motive structurale intalnite frecvent in proteine globulare. Cel mai simple element, de structure P const# dintr-un lan{ poiipeptidic indoit asupra iui insugicare realizeaz# douS segmente antiparalele, denumit p-turn:

II I o H II / N | o R H H De asemenea, mai multe catene polipeptidice, de regulS 6 dar §i mai multe, pot adopta structure p cu foi plisate. Domeniile structurale ale imunoglobulinelor §i ale proteinelor din aceeagi superfamilie cuprind un

motiv structural majoritar p. Structura terfiara a proteinelor Acest nivel de organizare inglobeazS structura secundarS §i definegte raporturile dintre segmentele de a-elice §i structura p, modul de impachetare a lanjului poiipeptidic. Factorii determinanti ai structurii tertlare ai unei proteine sunt interac|iunile necovalente intre. radicalii R de laCr„ fie cS acegtia se aflilin regiuni cu structure secundarS a sau ft. fie c# sunleupria$i4n.,segmenlej>eorganizate. La nivelul de organizare terjiar molecula proteicS dobandegte forma sa specifics. 40 .Intre divergii radical! ai aminoacizilor sc pot stabili urmtltoarele tipuri tie leg&turi necovalente: - punji de hidrogen intre radicalii cu (din resl-ur* seril, treonil), [fST6Tice](din resturi tirozil)jjynidiciJ.(din resturi glutaminil §i asparaginii): N NH H H j | | i i 1 -0— C CH — CH2 — CH2 — H 0—H-i i [ 1 C CO O i 1 1 s e 1 ri seril l - Jeg^turi ionicejsalinef intre radicalii cu sarcM negative (din resturi lizil, arginil, histidii) sair interactiuni polare intre radicalii polari, iMt sai;cini: NH NH CH — CH2 — cocr co I asparti! Ha*N - (CH2)4 - CH i CO I iizii - ipteracfiuni hidrofobe intre resturile aminoacizilor nepoiari ca valinft, leucina, izoleucinii, fenilalaninil, alanin& NH I CH — CH3

I CO I a!anil H,C CH — NH I CH I CO I valil Resturile cisteinil din multe proteine formeazd legftturi disulfurice care IeagS covalent regiuni mai depdrtate ale lanjurilor polipeptidice. Pozijiile acestor legSturi depind §i de totalitatea factorilor care asigurft conformafia nativii a proteinei. Ribonucleaza (104 resturi aminoacidice) cuprinde patru punji disulfurice intre resturile Cys2&~Cys84, Cys40-Cys95, Cys5B-Cysno §i Cys65-Cys72. Din multitudinea de combinajli posibile, intre cele 8 resturi cisteinil, in proteina native se realizeazit una singurii (Fig.1.3). 41 Un lan| polipeptidic adopt#, in m&sura in care ti permite structura sa primal'#, configurajii de a-elice §i de structur# P §i prin pliere, impachetarea lanjului caut# s# satisfac# §i afinitaple radicalilor R. Rezultanta tuturor acestor interacpuni determin# conformapa moleculei proteice. Aceast# conformape este de fapt un cornpromis — nu se pot realiza toate legSturile de hidrogen posibile, nu toate porpunile nepolare ajung s# fie inconjurate de un mediu pur hidrofob, nu orice grupare (—) ajunge ia vecin#tatea uneia (+)» dar este compromisui cel mai favorabil din punct de vedere energetic, cel mai stabil. Factorul ultim care detenu in# conformapa unei proteine este structura sa primarS. Informapa genetic# tradus# in secvenje de aminoacizi, prin jocul forjelor fizico-chimice, se transform# spontan in edificii tridimensionale specifice. Prima protein# a c#rei structui# tridimensional# a fost stabilit# in cele mai mici detalii, precizandu~se pozipa in spapu a tuturor atomilor componenp este mioglobina (Kendrew §i colab., 1957). fMioglobinaJeste o„protein# abundent#in mugchi, in special la mamiferele cufund#toare„ (balen#, cagalot) avand rolul de rezervor tisular de oxigen. Este o protein# cuprinz§nd aproximativ 150 aminoacizi (mioglobina din muyhiul de ca§alot 153) §i o grupare neproteic# denumit# hem. In Fig. 1,7. se arat# schematic conformapa moleculei de mioglobin#.

Fig. 1.7 — Structura ter|iar# a mioglobinei 42

Fig. 1.8 — Structura terfiara a lanjului p al hemoglobinei in mioglobinS 75% din lanjul polipeptidic formeazS a-elice. Cuprinde J_S£gmente eiicoidale (denumite A, B, ... H) cuprinzand intre 7 (segmentul D) 24 resturi arninoacidice (segmentnlJi). Regiunile eiicoidale sunt separate de segmente neelicoidale la nivelul cSrora lanjul polipeptidic i^i schimhS jireffiia. In patru puncte de terminare a elicelor se aflS Cprplmaf In celelalte regiuni intreruperea fSsucirii eiicoidale' este determinate de al{i factor!. Prin aceste schimbSri ale directieij.ant.ului polipeptidic, molecula devine extrem de compacts (45 x 35 x 25 A).flnterionil moleculmj cuprinde numai jaminoacizi cu R nepolaij cu excepjia a douS rejun^jstidil angaiate in legarea grupSrii hem..Resturile treonil §i tirozil au grupSrile hidroxilice orientate superficial, pe cand porjiunile nepolare ale acestor aminoacizi sunt ingropate in interior. Suprafaja externS a moleculei cuprinde toate resturile polare §i cu sarcinS electrics, presSrate printre radical! nepolari. Conformatia lanjurilor polipeptidice din hemoglobins este asemSnStoare cu cea a mioglobinei (Perutz, 1959) (Fig.1.8). 43 In prezent, sunt cunoscute structurile terfiare ale multor proteine.

Proteinele solubile, citoplasmatice sau aceiea prezente In plasma sau in lichidele interstifiale sunt proteine globulare care- au etalate pe suprafafd grupdrile polare §i pe aceiea care pooartd sarcini elec trice. Radical ii nepolari sunt orientaji in interiorul moleculei. Forma sfericd sau elipsoidald a moleculei depinde de raportul dintre numeral resturilor aminoacidice cu R incdrcat §i numdrul resturilor cu R hidrofob. O valoare mai mare a raportului (0,9-1,4) favorizeazd adoptarea unei forme mai alungite. O proteind cu un raport numdr R incdrcal/numdr R hidrofob mic (0,3-0,6) adopts o formd sferoidald, resturile nepolare, hiclrofobe se acomodeazd mai u§or in central unei structuri globulare decat al uneia cilindrice. La proteinele membranare tnglobate In stratul dublu lipidic, repartizarea resturilor aminoacidice polare §i nepolare este inversd. Partea exterioard a moleculei, in contact cu lipidele membranare, cuprinde radicalii hidrofobi. La unele proteine, in interiorul moleculei se delimiteazS canale cdptu§ite cu resturi aminoacidice polare §i incdrcate electric (canale ionice). Organizarea pe dom.enii a proteinelor. In anii din urmd a fost descris un alt nivel intermediar de organizare structural^ a proteinelor, organizare domeniald sau suprastruc- turd secundard. Acest nivel de organizare este inlalnit mai ales la proteinele mai mari. Un domeniu al unei proteine multidomeniale corespunde unei porjiuni continue in structura primary a lanjului polipeptidic care este impachetat intr-o entitate funejionald §i are o organizare proprie secundard §i terpard. Domeniile sunt separate intre ele prin porfiuni de ianj mai pu|in organizat, flexibil, eeea ce asigurd posibilitatea deplasdrii unui domeniu in raport cu altul (dinamica domeniilor). Relapile dintre domenii sunt deosebit de variate, zonele de contact, de interacpune pot fi mai reduse sau mai intinse. De asemenea, dimensiunile domeniilor structural variazd intre limite largi, de la cateva zeci de resturi aminoacidice, la sute (cel mult 400). Organizarea domeniald a proteinelor se intalne§te la multe proteine §i domeniile structurale s-au dovedit a fi unitdp fundamentale ale evolujiei §i diversificdrii proteinelor. Prin compararea unor proteine analoage (exercitd funcfii similars) sau/§i omoloage (derive dintr-un acela§i strdmo§) s-a gdsit cd aceste proteine euprind unul sau mai multe domenii structurale aproape identice. Acest fapt denote cd odatd ce prin procesul de evolujie s-a „inventat“ o proteind aptd sd indeplineascd optim o anumitd funcpe, patternul structural al acesteia a fost conservat §i repetat ori de cate ori a fost necesar. Diversificarea §i complexificarea proteinelor s-a fdcut prin combindri ale acestor motive structurale. In naturd exists numeroase enzime, diverse ca origine §i activitate cataliticd, care utilizeazd ca substrat un nucleotid (ca NAD, FAD, AMP). Toale aceste enzime euprind un domeniu structural de aproximativ 70 resturi aminoacidice cu o regiune specified de legare a nucleotidului. 44 Proteinele care regleazft transcrierea ADN §i exprimarea informajiei genetice au capacitatea de a se lega de ADN dubiu elicoidaJ. In structure acesior proteine a fost recunoscutd existenja calorva motive structural e (fermoar cu leucinS, deget cu zinc, motiv a|5a) care prin forma §i dimensiune- sunt complementare cu adancitnra mare din dubia dice de ADN (Hkflk).

Imunoglobulinele sunt aicatuile din mai multe domenii structurale (12) care prezintd o organizare spafiaM specifics (imunoglobulin fold). Acest domeniu structure este intalnit §i la receptorul celulelor T, la complexul major de histocompatibilitate (EMC) clasa I §i clasa II ' Un pas important m explicarea §i interpretarea organized domeniale a proteineior a fost fftcut odatd cu descoperirea discontinuitSjii genelor, a alc&tuirii lor din exoni (segmente de gene care se exprimfi ca proteine) §i introni (segmente de gene transcrip- iibile dar netraductibile, care nu se exprimd ca proteine). S-a constaiat cS, in multe cazuri, un domeniu structural proteic este codificat de un exon. Prezenja unui aceluiaji domeniu in proteine omoloagc indica descenden|a acestor proteine dintr-un stramog comum De asemenea, unele domenii sunt dispersate in diverse proteine ale aceleia§i specii. Trecerea unui domeniu de la o protein^ la alta este posibilS prin trecerea unui exon dintr-o gen& in alta, prin rearanjari cromosomiaie. Structura cmternara a proteineior Multe proteine sunt alc&tuite din mai multe lanjuri polipeptidice, de regulS un num&r mic §i pereche (proteine oligomere) (Tabelul 1.7). Lanjurile individuale sunt denumite protomeri sau subunitlifi. La aceste proteine pe langft structurile primarS, secundarS si terjianl ale fiecdrui protomer, apare un nivel superior de organizare —- structura cuaternarfi. Aceasta define§te nature, numfirul §i modul de asociere a protomerilor. Proteine oligomere Tabeiui 17 Masa Masa Nr.proto Pr©teina proteinei protomerilor meri Kdaltoni Kdaltoni Miozina 468 2 212 Creatin kinaza 80 2 40 Fosfataza 40 alcaltna 80 2 Hemoglobins 64,5 4 16 Lactat 150 4 35 dehidrogenaza Aldolaza 160 4 40 Glicogen fosforilaza 270 4 92,5 Piruvat kinaza 237 4 57,2 Ceruloplasmin 151 8 18 s Glutamin 592 48,5 12 sintetaza Funcjia specific^ a unei proteine oligomere se manifesto numai la nivelul structurii cuaternare, protomerii separaji sunt inactivi. 45 Asamblarea protomerilor, structura cuaternare, se realizeazS numai prin for|e slabe necovalente §i asocierea devine stabile, permanents, numai dacS suprafefeie de contact sunt complementare §i un num&r cat mai mare de atom] se apropie pane la nivelul razelor lor van der Waals (raze de contact). Complementarifatea suprafefelor de contact asigurS un grad foarte inalt de

precizie $i de specificitate a structurilor cuaternare. Protomerii unor proteine omoloage de la specii diferite nu se asociazS. Interacjiunile prin suprafeje complementare prezinte fenomenul de cooperate, primele interacjiuni favorizeazS formarea celorlalte. La inceput moleculele se juxtapun prin cateva puncte dupS care celelalle grupSri i§i gSsesc mai u§or partenerii. Capacitatea de interacjiune a moleculelor prin suprafeje complementare explicit nu numai form area proteinelor oligomere, a unor structuri supramoleculare, dar §i modui in care proteinele cu structure cuaternare T§i indeplinesc funcjiile caracteristice,’ de transport etc. Structurile cuaternare permit funcjionarea unor mecanisme fine de reglare a activitSjii proteinelor. O perturbajie care are loc la nivelul unui protomer (de exemplu combinarea sa cu un compos oareeare), poate fi transmisS in restul moieculei, fund resimjita la nivelul contactului dintve protomeri, structura cuaternare este alteratd §i totodatfi §i funcjia proteinei. Acest mecanism de reglare este denumit. regime alostericS, ce va fi dezvoltat in capitolul de enzime. Hemoglobina este o proteins oligomere. Hematiile normale cuprind mai multe speeii moleculare de hemoglobin#. Componenta principal# din sangele adultului este hemoglobina A, (Hb Aj) aieturi de care se afl# in cantitate mice Hb A2. La embrion exist# o Hb E iar la f#t §i nou-n&scut Hb F. Toate speciile de hemoglobin# cuprind patru lanjuri polipeptidice de cate dou# tipuri. Hemoglobina A, me structura a2 p2. Celelalte specii de hemoglobins cuprind in locul Ianjurilor P, lanjuri y. 6. e : Hb A, = a2 p2 Hb A2 = a2 52 Hb F" = a2 yl > Hb E = a2 e2 Fiecare protomer este legal de cate o grupare hem §i activitatea de transport a oxigenului se manifests numai la nivelul tetramerului. Lanjul a cuprinde 141 resturi aminoacidice, iar-cel p, 146 resturi. Structurile terjiare ale acestor lanjuri sunt similare cu ale mioglobinei, cu care are similitudini §i de compozijie aminoacidice. In Fig. 1.9 este arStat# structura cuaternare a hemoglobinei. Un lan| a este asocial de ceie dou# lanjuri p prin zone de contact diferite a} (Jj §i |i2. Contactele inlre protomeri idendci a §i a sunt foarte reduse, Contactul a1 p2 este cel mai intins in spajiu, sunt implicate 34 resturi aminoacidice §i aduce in contact 110 atomi, Forja principal# de legare sunt interacjiunile hidrofobe. A1 doilea contact, a; P3 mai restrims aduce- in vecimitate 80 atomi aparjinand la 19 resturi aminoacidice. Da tori t# acestui contact mai slab, hemoglobina se disociaz# in condijiuni favorabile, mai intai in dimeri §i apoi sunt eliberaji protomerii: a2 p2 ^ 2 ap ^ 2a + 2P 46

1.3.3. PROPRIETATI GENERALE ALE PRGTEINELOR Solubilitatea. Proteineie fibrilare sunt insolubile in ap&, pe c&nd cele globulare prezinttl grade diferite de soiubiiitate. AceastS. inspire este datoratd repartizMi pe suprafaja moleculelor de resturi aminoacidice cu sarcini electrice §i a acelora care cuprind grupSri polare. Solubilitatea in apS a proteinelor este puternic influenJatS. de pH-ul mediului prin modificarea inc&rcSrii electrice a proteinei. De asemenea, diverse s&ruri ale metalelor u§oare — NaCl, MgCl2, Na2S04, (NH4)2S04 influenjeaz& considerabil solubilitatea proteinelor. La concentrafii mici ele au un efect favorabil. De exemplu, proteineie din clasa globulinelor sunt greu soiubile in apd purS, ele se dizolv& u§or numai imsolujii saline diluate. La concentrafii foarte man, s&rurile amintite scad solubilitatea proteinelor panit laprecipitarea lor din solujii (salifiere). Albuminele §i globulinele se deosebesc dupd u§urinfa cu care sunt precipitate de cdtre sulfatul de amoniu. Globulinele precipitS cand soiufiile care le cuprind sunt aproximativ semi saturate in (NH4)2S04, pe cand albuminele precipita la concentrafii mai mari de 75% saturate. Precipitarea fracJionat& a proteinelor din solujie prin adSugarea treptatd de (NH4)2S04 este o metodd cu largi utilizSri pentru separarea proteinelor din medii biologice complexe. Proprietaiile electrochimice. Proteineie sunt amfoliji macromoleculari, cuprind un num&r mai mare sau mai mic de grupSri acide gi bazice. Contribufia cea mai important# o au resturile glutamil, aspartil, lizil, arginil §i histidil. Resturile aminoacidice C-terminal §i N-terminal au o contribute redus&, cu atat mai redus# cu cSt lanful polipeptidic este mai lung. La pH-ul fiziologic toate aceste funcjii acide sau bazice sunt ionizate complet (restul histidil este ionizat aproximativ 50%), proteina apare ca un poliamfolit. 47 ProprietStile electrochimice ale protdnelor sunt concretizate prin pH-ul izoelectric (pi), pH-ul solufiei in care proteina apare cu o sarcinS electric# nulS, numSrul grup&rilor (+) este egal cu acela al grupSrilor (—). Valoarea pi a unei proteine depinde de compozifia sa arninoacidicS, de predominenja res- turilor acide, a acelora bazice. 0 proteins cu pi > 7 cuprinde un exces de lizinS §i/sau argininS; o proteinS cu pi < 7 cuprinde o proporfie mare de aminoacizi dicarboxilici (Tabelul 1.8), La pH-ul izoelectric solubilitatea, mobilitatea proteinei in campuri elec trice este minimS. La pH-uri depSrtate de pi o proteins are o incSrcSturS nets

(+) sau (—):. P NH3+

+ H* ^------------ P COOH NH8* + HO" • ------------- P - H20 GOO" NH2 GOO" proteina la proteina la proteina la pH < pi pH = pi pH > pi Sub forms de anioni sau cationi, proteinele migreazS in campuri electrics, proprietate care stS la baza metodelor elect roforetice de separare a proteinelor din amestecuri. Tabelul 1.8. pH-urile izoelectrice (p!) ale unor proteine Proteina pi Sal mini 12,10 Histona 10,80 Serumafbumina 4,90 Miozina 5,20 Fibrinogen 5,50 Tireoglobulina 4,58 Lizozlm 11,00 MioglobinS 6,99 Hemoglobin^ 7,07 Citocrom c 9,80 Insulina 5,35 PepsinS - 1,00 Denaturarea proteinelor. Conformajiile native ale proteinelor globulare, rezultate prin impachetarea specifics a lanjurilor polipeptidice §i asocierea subunitSjilor in proteinele oligomere sunt extrem de fragile, ele sunt u§or perturbate sub ac{iunea unei multitudini de agenji care afecteazS interacjiunile necovalente din cuprinsul moleculei, Modificarea conformafiei native a unei proteine poartS denumirea de denaturare §i agenfii care o provoacS sunt agenji denaturanji. Slructurile de ordin superior ale unei proteine — secundarS, terJiarS, cuaternarS — sunt asigurate de legSturi necovalente de energie joasS §i agenjii denaturanji pun in joc forje de intensitate micS care nu afecteazS legSturile 48 covaiente. In cursul denaturSrii unei proteine nu sunt rupte iegdturile peptidice, nu se elibereaz! aminoacizi. Denaturarea proteinelor este provocate de agenji foarte diferiji: - temperatura de 50-60° denaiureaz! cele mai multe proteine globulare; pujine proteine, de ex, ribonucleaza, suport! pentru scurt limp temperaturi

de 100° f!r! a sc denatura; - radiajliie cu frecven{! mare, ultraviolets, X, y; ~ pH-urile extreme, acide sau bazice denaiureaz! majoritatea proteinelor; -ureea §i guanidina, In concentra{ii marl denaiureaz!, reversibil, majoritatea proteinelor solubile; - agenjii tensioactivi (surfactan(ii); - solvenjii organici. Acjiunea denaturant! a ureei §i guanidinei, compu§i cu o capacitate foarte mare de a conlracta legdturi de hidrogen, demonstreaz! rolul acestor interacjiuni la stabilizarea conformafiei unei proteine. Acjiunea acestor agenfi este u§or reversibil!; dup! indepdrtarea ureei sau a guanidinei, leg&turile de hidrogen se reconstituie in cuprinsul molecule!. proteice in acelagi num!r §i in aceleagi pozijii ca in proteins nativ!. Denaturarea proteinelor sub acjiunea agenjilor tensioactivi sau a solvenjilor organic! demonstreaz! rolul interacfiunilor hidrofobe in realizarea conformajiei native a unei proteine, Acizii §i bazele modifies inc!rcarea electrical a unor gup!ri, schimb! raporturile de vecindtate intre sarcinile + §i - de pe suprafaja moleculei. 1.3.4. CLASIFICAREA PROTEINELOR Sistematizarea proteinelor, compugi de o varietate molecular*! §i functional! extraordinar de mare, este deosebit de grea, orice incercare este arbitrar! bazfmdu-se pe uneie tr!saturi ale proteinelor gi ignorandu-le pe allele. O prim! imparjire foarte general! a proteinelor este aceea in proteine^obularc, ugor solubile §i in genere proteine intracelulare §i proteinef fibrilarej insolubile, de regul! proteine extracelulare, cu roiuri de sus|inere. Un alt criteriu de clasificare a proteinelor este prezenja sau absenja in molecul! a unei grupSri chimice distinct^, de lanjul polipeptidic, denp.mit! igrupare prostetic!: Pe aceast! baz!, proteinele sunt clasificate im proteine simple* alc!tuite numai din aminoacizi §i proteine conjugate (heteroproteine), alc!tuite dintr-o protein! (apoprotein!) §i o grupare prostetic!. Dup! natura grup!rii prostetice se deosebesc urm!toareIe clase de proteine: Fosfoprotemc* grugarea prostetic! este constiruit! din?restul fosforil (rEQ^H*). legat estenc la grup!ri hidroxilice aie resturilorlseril, treonil sau tirozili .//tuT Uneie proteine cuprind permanent resturi fosforil (de ex. cazeina), pe cand altele // oscileaz! intre forme fosforilate §i defosforilate (proteine interconvertibile). Schimbarea gradului de fosforilare a unei proteine, face parte dinlr-un mecanism general de re glare a func{iilor proteinelor (vezi capitolele enzime, hormoni). 49 '■■■ ■' * ^Ghcoproteinejptottmt ce cuprind unitdji^ mpiiozaharidice sau qjigozaharidice ata§ate de laniul polipeptidic.sProteinele din membrana plasmatic^ cele care cSptugesc diverse cavitriji sunt bogate in resturi giucidice. Un numSr redus de glucide este prezent insS in mai toate proteinele. Lipopi ofemek sunt asocjalii^intre proteine (apoiipoproteine) §i un a sau mai make grupe de lipide amfipatice. Asocierile predominant necovalente

sunt totu§i suficient de stabile §i specifics, lipoproteinele existand ca entity strucxuxate^de sine st&t&toare. In |fiasmS fexist.il mai multe grupe de lipoproteine (chilomicroni, a — §i P — lipoprotexne)r.QromoproteinelemuX proteine colorate din cauza grupSrii prostetice pe care o cuprind. Subclasa lhenioproteinei6i| proteine a cSror grupare prosteticS este rfjqra.pl,) cuprinde \ blkCC hemoglobina §i mioglobina, proteine transportoare de^oxigen, citocrqmii, proteine) iransportoare de electroni. 0 aitS subclass de cromoproteine suntlflavoproteinelet proteine^'Jl *',J‘\ colorate tn galben. Cuprind drept giupare prosteticS o structure derivatS de la. fvitomina^ EU) (nboGavina). Flavoprotemele funcfioneazS ca tnmsportori de^hidrogen. |i, . ______________ ,, ... bWeig]pproieinele\ proteine care cuprind ioni metalici sau combinapi. sjmpl^.al.ei metalejor asociate direct cu agoproteina, Feritina, proteina de depozitare a fierului este.' ^ alcStuitfidin apoferitinS §i ioni de tier; ceruloplasminaeste o proteina ce cuprinde ioni de cupru.;^X(b.?ix cS) Nucleoproteinele sunt alcStuite din aeizii nucleici §i proteine, in genere proteine bazice, asociate primleg&turi salines ' O aceeagi proteins poate cuprinde mai multe tipuri de grupSri prostetice, insumSnd caracterele mai multor clase de proteine conjugate, fosfo- gi glicoproteine, glico- §i metaloproteine etc. Un alt mod de a sistematiza studiul proteinelor este acela dopa funcfiile pe care le indeplinesc, proteine enzimatice, proteine contractile, proteine hormonale, proteine de transport etc., sau dupil origine in proteine plasmatice, proteine eritrocitare, proteine hepatice etc. In toate capitolele urmStoare ale acestei alrfi, proteinele apar ca figuri centrale prin varietatea lor structural^ §i multitudinea de funcjii pe care le indeplinesc, catalizatori, hormoni, anticorpi, proteine structural, contractile etc. Metabolismul proteinelor, sintezS §i degradare, este tratatin Cap. V unde se prezintft mecanismele moleculare de legate a aminoacizilor in succesiuni dictate de informajia 50 genetics cuprinsft in ADN §i in Cap. IX care cuprinde cSile de biosintezS §i de catabolizare a aminoacizilor. In subcapitolul urmator sunt prezentate cateva grupe de proteine, care evidenjiazli relafiile structur 300).

Metoda curentd pentru separarea proteinelor plasmatice (sau serice) utilizat# in laboratoarele de biochimie medicals este electroforeza. Se utilizeaza suporturi solide (hartie, gel de agarozd, gel de acetal de celulozd) §i pH-ul de lucru este 8,6. La acest pH toate component.de proteice sunt incarcate negativ §i migreaz3 spre anod. Pe electrofo- regramS, dupS colorare, proteinele apar ca benzi colorate. Prin mflsurarea densitd|ii optice a electroforegramei, fiecare bands d3 un maxim de absorbjie (Fig. 1.10). Prin electroforeza serului, in condijiile aminlite mai sus, se objin cinci fracfiuni: serumalbumina, ar, a2~, [3 - §i 7-globuline.

Fig, 1.10 — Electroforegrama seruiui uman (pH 8,6). Se separa cinci fracfunni; albumins, a,-, a2-, (}- §i f globulins

Serumalbumina are mobilitatea electroforeticS cea mai mare, Serumalbumina constituie o fracpune omogenS, pe cand fracfiunile globulinice, cuprinde fiecare mai multe componente individuate (Tabelul 1.9). Tabelui L3 Protein© piasmatice (label seSectiv) Proteina Conc.mg kD pi /dl PrealbuminS 20-40 54,4 4,7 12 h AlbuminS 350069 4-5,8 15-19 z . 4000 Fracjiunea ap arAntiproteaz a 78-200 55 4,8 4z (antitripsina) a^Glicoprotei na 50-150 40 2,7-4 5z (orosomucoid ) : Apolipoprotei na A 170-325 200 . arFetoprotein 0,003 69 a Fracjiunea a2: Haptoglobina 30-215 85 4,1 2z ocrMacrogiob 125-410 5,4 5z uiina 800

‘Ceruloplasmi 20-50 4,4 4,5 z 160 ns Fracjiunea p: Transferina 200-350 77 5,7 7z Apolipoprotei 60-155 3000 na B C4 10-40 206 7 Fibrinogen 200-400 340 5,5 . 2,5 z C3 70-150 180 . , p2Mtcroglobulin 0,1-0,2 11,8 a Fracjiunea y ; 525IgG 1650 160 6-7,3 24 z IgA 40-390 170 6z IgM 25-310 900 5z Proteina 0,8 120 6,2 reactiva C Serumalbumina. Este cea mai abundentS proteins plasmaticS (3,5 — 5,5 g/dl) reprezentand jumState din proteinemia totals. 0 cantitate aproximativ egalS cu cea din plasmS se aflS in spajiile extracelulare. Serumalbumina are masa molecularS de 69 kD §i este alcStuitS dintr-un lan{ polipeptidic cu 585 resturi aminoacidice. Este o proteins multidomenialS. Forma generals a moleculei este elipsoidalS. Are pi ~ 5, la pH = 7,4, poartS un numSr mare de sarcini negative. Este sintetizatS in ficat (12 g/zi) §i in plasmS, are un timp de injumStSjire de 15-19 zile. 52 Prin concentrajia sa moleculard mare, serumalbumina este componentul care r&spunde cle 75-80% din presiunea osmoticd a plasmei, avand rolul de a menfine apa in compartimentul intravascular. Serumalbumina are proprietatea de a lega, mai mult sau mai pufin specific, divergi component piasmatici, indepiinind funcjia de transporter al acestora. Serumalbumina leagd compugi hidrofobi, insoiubili in apd, ca bilirubina, acizi gragi liberi, vitamine liposolubile. Serumalbumina este transporter plasmatic pentru unii hormoni steroizi, pentru hormoni tiroidieni. Serumalbumina leagd cationi, Ca2+, Cu2+. De asemenea, serumalbumina este un vehicul pentru multe medicamente: aspirina, sulfonamide, peniciiind etc. Imunoglobulinele-. Imunoglobulinele (anticorpii) sunt proteine cu roiuri de apdrare impotriva microorganismelor — bacterii, virusuri, parazi|i — care invadeazd organisrpul. Sunt proteine solubile, se afld major! tar in plasm & gi reprezintd elementele de recunoag- tere ale sistemului imun umoral. Imunoglobulinele sunt sintetizate ca un rdspuns specific la pdtrunderea in organism a unui microorganism sau a unui compus macromolecular (protein^, polizaharid) strain (nonself). Agenjii strain! capabili sd dedangeze sinteza de anticorpi sunt denumifi antigene (imunogeni). Un anticorp se combind cu antigenul specific form and un complex antigen-anticorp (complex imun) care blocheazd antigenul gi totodatd ini{iazdprocese care distrug agentul patogen, fagocitoza, activarea complemen- tului (rdspuns imun).

Antigenele, microorganisrne sau macromolecule, cuprind pe suprafafa lor un mozaic de grupdri chimice, fiecare dintre acestea putand declanga sinteza unui anticorp specific. O grupare chimicd sau un ansamblu de grupdri care poate declanga sinteza unui anticorp se numegte determinant antigenic. La o proteind, un determinant antigenic este realizat de cateva resturi aminoacidice. Mioglobina, o proteind cu aproximativ 150 resturi aininoacidice posedd cinci determinant antigenici. Numeral determinanj.ilor antigenici pe o celuld bacteriand este foarte mare. Organismul uman este capabil sd recunoascd orice fel de determinant antigenic gi sd sintetizeze anticorpi specific!. Se estimeazd cd un adult sintetizeazd in jur de un milion de specii moleculare de imunoglobuline. Imunoglobulinele sunt sintetizate de plasmocite, celule care provin prin diferenfiCrea gi proliferarea limfocitelor. Fiecare celuld gi dona celulard respectivd sintetizeazd un singur tip de imunoglobuline, capabile sd recunoascd un singur determinant antigenic. O celuld bacteriand sau o macromoleculd proteied cuprinzdnd numerogi determinant antigenici stimuleazd diverse celule limfoide B ceea.ce duce la sinteza unei popula{iL heterogene de imunoglobuline, •53 anticorpi policlonali. Prin tehnici de laborator se pot obfine clone celulare care sS product fiecare molecule identice de imunoglobuline (anticorpi monoclonal!). Exists mai multe clase de imunoglobuline (Ig) cu funcfii §i distribujii diferite: IgA, IgD, IgE, IgG, IgM. Clasa IgG cuprinde mai multe subtipuri: (lgG] ... IgG4). Imunoglobulinele M (IgM) se gSsesc in principal in plasmS, in concentrajii mici, sunt sintetizate ca rSspuns la primal contact al organismului cu antigenul. Sunt deosebit.de eficiente in activarea celulelor fagocitante §i in activarea complementului. Imunoglobulinele G (IgG) constituie fracfiunea majors a imunoglobulinelor plasmatice (70-80%). Se gSsesc, de asemenea, §i in lichidele interstijiale. Sunt sintetizate in cantitate mare la al doilea contact cu antigenul. ActiveazS. eomplementul §i celulele fagocitare. Pot traversa placenta. Imunoglobulinele A (IgA) se gSsesc in concentrajii mici in plasmS §i in secrejiile mucoase din intestin, plSman, lacrimi, salivS, colostra. IgA constituie prima linie de apSrare impotriva invaziilor cu agenji patogeni. Nu activeazS eomplementul. Imunoglobulinele E (IgE) sunt recunoscute ca fiind responsabile de unele manifestSri ale rSspunsurilor alergice. Se aflS fixate pe leucocite bazofile plasmatice §i pe mastocitele din perejii vaselor §i dupS interaejia cu antigenele celulare activate mediazS rSspuns urile alergice (secrejii de histaminS, uneori serotoninS). Imunoglobulinele D (IgD) sunt prezente in plasmS in cele mai mici concentra{ii; nu se cunoa§te exact ce funejie specifics au. Structura imunoglobulinelor. Diversitatea molecularS a Ig (aproximativ 106 specii moleculare) se realizeazS in cadrui unei scheme structurale unice (Fig. 1.11). Sunt tetrameri cu formula molecularS H2L2. Lan {urile H (de la heavy, greu) cuprind aproximativ 440 resturi aminoacidice (446 pentru ian{urile H din IgG) §i au mase de 53- 75 kD. Lanjurile L (de la light, u§or) cuprind

aproximativ 220 resturi aminoacidice (214 la IgG) §i au mase de 23 kD. Lanjurile H sunt diferite de la o clasS la alta, lanjuri y la IgG, p la IgM, a la IgA, e la IgE §i 8 la IgD. Lanjurile L, la toate clasele sunt fie lanfuri X, fie k. Unele imunoglobuline apar sub formS de oiigomeri ai structurii de bazS, dimeri (IgA) sau pentameri (IgM) (Fig.1.12). Structura generals a unei molecule de imunoglobulinS este arStatS schematic in Fig.I.ll. Molecula are forma literei Y. Lanfurile L §i H se asociazSincepand cu capetele lor N-terminale §i formeazS brajele literei Y. Cele douS jumStS|i C-terminale ale lanjurilor H alcStuiesc coada moleculei. Imunoglobulinele cuprind componente oligozaharidice legate N-glicozidic. Intre lan{uri §i interlanf exists numeroase punfi disuifurice. 54

Fig. 1.11 ■ Structura generals a unei imunoglobuiine (Ig) Fig. 1.12 - Structura pentameric& a imunogiobuiinelor M (IgM)

Funcfiile imunogiobuiinelor. Func|ia principal^ a unei imunoglobuiine sau anticorp (Ac) este aceea de a recunoa§te §i de a se combina cu antigenul sau determinantul antigenic (Ag), formand complexul Ag-Ac: Ag + Ac ** Ag * Ac 0 molecule tetramericS de Ig este bivalents, cuprinde douS. situsuri de legare, cu aceea§i specificitate, alc&tuite din capetele N-term inale ale lanjurilor H §i L. Interaejiunile dintre Ac §i Ag sunt necovalente, interacjiuni hidrofobe, polare, punfi de hidrogen §i se bazeaz& pe complementaritatea chimicS §i stench dintre determinantul antigenic §i situsul de legare al Ig. Acest gen de interacfiune are un grad foarte inalt de specificitate, afinititjile antigenelor pentru anticorpii specifici sunt foarte mari (kd pentru complexele Ag-Ac au valori de 10 -10'10 M) factorii determinanji ai acestor interacjiuni sunt vitezele de difuziune, fiecare intalnire dintre Ag §i Ac este eficace.

Fixarea Ag la Ac §i formarea complexelor Ag-Ac este urmatS de evenimente care vor duce la omorarea microorganismului invadator, la distrugerea antigenului. Aceste funcjii 55 • efectoare sunt comune pentru o clasd de imunoglobuline. Complexele Ag*Ac formate de cStre IgM. §i IgG sunt apte s& interacfioneze cu receptori de pe macrofage §i neutrcfile, inijiind chemotactism, fagocitozd, eliberare de mediator!, citotoxicitate. De asemenea, complexele Ag’Ac inifiaz^ evenimente care activeazd sistemul complementuiui, culminand cu formarea unui complex litic (sau MAC, membrane attack complex) care formeazS pori In membrana celuiei fintd §i determine liza celulei. Aceste funcfii efectoare sunt locaiizate in segmentele N-terminale ale lanfurilor H. Organizarea multidomeniald a imunoglobulinelor. Cercetarea imunoglobulinelor cu metode din ce in ce mai perfecfionate a dus la stabilirea de -analog!! structurale intre diversele porfiuni ale lanjurilor L §i H. Segmente cu lungimi de aproximativ 110 resturi aminoacidice, doud in lanpiri L §i 4 in lanfuri H, prezintd analog!! la nivelul structurilor primare §i al organized lor secundare §i terfiare, alc&tuind domenii structurale. Un astfel de domeniu este alciltuit din dou& foi plisate cu lanjuri antiparaiele cu structure p. Intre foi, radicalii nepolari determine interacjiuni hidrofobe putemice §i o punte disulfuricS, realizeazd o legytury covalentS interstrat. Impachetarea specific^ a unui astfel de domeniu bistrat cu foi antiparaiele, este intalnitd §i la alte proteine (immunoglobulin fold) receptorul celuielor T, complexele majore de histocompatibilitate (MHC clasa I §i clasa II), ceea ce pledeazd pentru originea lor genetic^ comund (Fig.L13). O molecule de Ig este alcStuitS din 12 astfel de domenii, Un domeniu dintr-un lanf este asociat cu un domeniu din alt lanf, astfel incat intreaga molecule apare ca fiind alcStuitS din §ase module globulare (Fig.1.14). Studiile de seevenfializare ale 1 an junior L §i H din poptilafii omogene, individuals de Ig au ardtat c& segmentele 1-108 pentru lanjurile L §i 1-125 pentru lanjurile H difer$ de la o molecule la alia, sunt domenii variabiie VL §i VH. Celelalte segmente au structuri primare aproape identice pentru fiecare ciasd de Ig, sunt regiuni constante CL §i CH. Regiunea constants, a lanfurilor L corespunde unui singur domeniu CL. Regiunea CH cuprinde trei domenii constante CH1, CH2, CH3 (la IgG). In structura Quaternary a unei Ig, domeniile VL §i VH formeazS situsurile de legare a antigenului, ceea ce permite, in raport cu structura primary a VL §i VH, realizarea de centre de legare cu specificity diferite. Variabilitatea acestor domenii nu este insy aceea§i pe toatS lungimea lanfului. Lanjurile L cuprind trei zone §i lanjurile H patru zone cu un grad de variabilitate mai mare, zone hipervariabile. Resturile aminoacidice coiespunzytoare acestor zone ct1ptu§esc ni§a nepoIarM unde este fixat determinantul antigenic. Regiunea CH cuprinde situsurile efectoare care mediazy funejiile comune intregii clase de imunoglobuline. Funcfia de activare a complementuiui este domeniul CH2, receptorii pentru macrofage §i neutrofile sunt localizaji pe CH3. Organizarea structuraiy a imunoglobulinelor aratd modul in care pe o schemd structuraiy comund sunt constitute milioane de molecule, diferite prin situsurile de legare a anti gender. 56

Fig. 1.13 — Protein© fnrudite structural §i genetic cu imunoglobinele: 1. Complex major de histocompatibilitate clasa i (MHC I) 2. Complex major de histocompatibilitate clasa ll (MHC II) 3. Receptorul ceiuielor T 4. Ig M (ancorata in membrana ceiulara)

Fig. 1.14 — Structura multidomeniaia a unei imunoglobuline Factori ai coaguldrii (fibrinogenul)% Coaguiarea sangelui reprezmt# un mecanism de ap&rare pentru a impiedica hemoragiile. Este o components a hemostazei care mai implied §i alte fenomene: vasoconstricpe, activarea §i aderarea trombocitelor la locul leziunii vasculare. Formarea chiaguiul (trombus) are loc prin transform area fibrinogenului, proteins plasmatic# solubilS, In fibrinS, insolubil#, care formeazS o rejea in care sunt inglobate trombocite §i hematii. Coaguiarea este un proces care se autoregleazS, menjinandu-se un echilibru foarte fin intre hemoragie gi trombozS. 5T La coagulare parlicipfl foarte muffi component plasmatici sau tisulari. Unii ciintre ace§t.i factori ai coaguklrii sunt desemnaji cu cifre romane, de la Ha XIII (factorul VI nu exista), Ace§fi factor! exists, intr-o forma activS §i una inactive (II §i IIJ. Unii factori (XII, XI, IX, VII, X, II) in forma lor inactive sunt zimogeni (proenzime) iar in cea activS sunt enzime proteolitice de inaltS specificitate. Ionii Ca2+ indispensabiii coaguISrii sunt factorul IV. Factori! V §i VIII nu sunt enzime, ei participS ca factori auxiliari (cofactori) in procesul de activare a unor component ai coaguklrii. Factorul I este fibrinogenul §i factorul la, fibrina. Factorul XlIIa este o enzimft cu aclivitate transamidazicS. Factorul III, trombomodulinS sau factorul tisular este prod us de endoteliul vascular (Tabelul 1.10). Tabelul 110

Factorii coagularii Facto Denumire r uzuala I Fibrinogen la Fibrina Protrombin ii a II. Trombina in

IV V Va VII VII. vm

Factorul tisular, trombomod ulina. Ca2* Proacceleri na Prooonverti na Factor antihemofili c

VIII. IX IX. X

Factor Christmas Factor

Xa XI XI.

XIII.

Proteins plasmatlca solubila. Formeaza agregate tibritare. Activate de un complex format din: Xa, Va, Ca2+. Transforma fibrinogenul in fibrina, activeaza: XIII, VII, VIII. Factor auxiliar la activarea factorilor X,V.

Activat de trombina. Cofactor la activareaa H de catre Xa. Activat de lla + Ca2+. Impreuna cu Hi activeaza X la Xa. Activat de lla. Cofactor af activarii X de catre IXa.

StuartPrower

XII XII. XIII

FUNCJIE

Factor Hageman Factor stabilizator al fibrinei

Activat de Xla §i Ca2+. Activeaza X la Xa (impreuna cu Vllla §i Ca2+). Activat pe suprafaja plachetelor de catre complexul Ca2* + Viila -v IXa (calea intrinseca) sau de catre VSIa asistat de factorul tisular (calea extrinseca). Activeaza protrombina. Activat de Xlla. Activeaza, impreuna cu Ca2+, IX la IXa. Activat de kaiikreina. Se leaga de peretele vasului lezat. Activat de trombina. Stabilizeaza fibrina prin iegaturi Tncruci§ate.

58 Protrombina, factorii VII, IX §i X sunt proteine care cuprind in segmentele ,N~ terminate resturi de acid Y-carboxiglutamic (Gla). Aceste resturi aminoacidice se formeaz£ intr-un proces post-traducjional la care participS ca intermediar, vitamina K:

COO“ “OOC COO“ CH2 ?CH2 co2 -----Vit. K CH i CH2 — HN — CH — CO — — HN — CH — CO — rest Glu rest Gla Proteinele cu resturi Gla au o mare capacitate de a lega ionii Ca2+. Inifierea procesului de coaguiare este urmat& de activarea in cascade a factorilor de coagulare, semnalul initial fiind puternic amplificat. Exists dou& c&i de inifiere a acestei cascade, calea intrinseca (aparent cu participare de factori exclusiv sanguini) §i calea extrinsec#, la care particip& §i factori de engine tisulara. Ambele c&i conduc la activarea protrombinei in trombinS, aceasta din urma transform^ fibrinogenul in fibrina. Agregatele de trombinS sub aejiunea factorului XIIIa (activat de trombinS) sunt legate incruci§at §i devin insolubile (Fig.1.15). Calea mtrmseca Calea extrinseca

Fibrinogen (solubifa) Xf Ha 2+ Ca T XIil a

Fibrins

(insolubila) Fig. 1.15 — Etapa finals a coagularii sangelui 59 in cele ce urrneazS sunt descrise unele aspecte biochimice, moleculare, ale coagulSrii, Fibrinogenul are un rol central in coagulare. Este o proteins plasmaticS cu rriasa molecularS de 340 kD. Concentrajia sa plasmaticS este de 200-400 mg/dl (2-3% din proteinemia totals). Este un hexamer alcStuit din trei tipuri de lan$uri: Aa (610 aminoacizi), Bp (461 aminoacizi) §i y (411 aminoacizi). Formula sa molecular! este (Aa BP y)2. Molecula este alungilS (460 A), prezentand trei zone globulare, douS periferice §i una centrals (Fig.1.16). Lanjnrile Bp §i y cuprind oligozaliaii.de legate N-glicozidic. Fibrinogenul cuprinde multe (17) pun{i disulfurice. Segmentele N-terminale A §i B din lanjurile Aa §i Bp, fibrinopeptide, cuprind multe resturi Glu §i Asp, segmentul B mai cuprinde §i resturi de tirozinS sulfatatS: I NH CH CO

Aceast! compozijie aminoacidicS confers fibrinopeptidelor sarcini (—). Trimerul Aa Bp y se formeazS prin asocierea paralelS a celor trei lanjuri §i doi trimeri se asociazS prin capetele lor N-terminale, fibrinopeptidele apSrSnd ca proeminenje ale nodului central. Nodulul central are o sarcinS nets negativS (-8) ca §i nodulii periferici. Repulsiile electrostatice intre moleculele de fibrinogen previn agregarea lor §i proteina este menJinutS in solufie. Inijierea coagulSrii determinS aclivarea in cascadS a factoriior coagulSrii care culmi- neazS cu activarea protrombinei la trombinS. Protrombina (factory] II) este sintetizatS in ficat. Cuprinde un lan{: polipeptidic cu 582 aminoacizi. In segmentul N-terminal cuprinde resturi Gla, formate intr-un proces dependent de prezenja vitaminei K. Fibrinogen Trombina Fibrinopepbc/e A si 3

230 A Ftbr/ncr Fig. 1.16 — Schema structural! a fibrinogenului §i a fibrinei. A §i. B: fibrinopeptidele A §i B; a §\ b: situsurile de interacjiune dintre moleculele de fibrin!60

Sub acfiunea factorului X3, o proteazS, sunt scindate c&teva legaturi peptidice §i protrombina este transformata in trombina. In aceasta transformare se pierde segmental N-terminal care cuprinde resturile Gia. Trombina este alc5tuit& din doua lanfuri polipepddice, A(49 aminoacizi) §i B(259 aminoacizi), reunite printr-o punte disulfuricl Trombina are activitate proteoliticd, sub acfiunea ei asupra fibrinogenului sunt indep&tafce fibrinopeptidele A §i B, fibrina rezultatS avand formula moieculara (a P y)2, Prin indepMarea fibrinopeptidelor, nodulul central capatS o sarcina +5. Totodata sunt demascate centre de legare pentru regiuni ale nodulilor periferici. Moleculele de fibrina se asociaza longitudinal §i lateral formand fibre cu o periodicitate de 230 A, jumittate din lungimea unei molecule de fibrind (Fig.1.16) Agregatele de fibrina formate numai prin interacfiuni necovalente sunt fragile (chiag moale), Asupra acestora acfioneazM factorul XIIIa, factor stabilizator al fibrinei, enzimS eu activitate transamidazica, leagS incruci§at resturi lizil glutaminil: CH — (CH2)4 — NH2 + H2NCO — (CH 2) 2 — CO NH I Xilla CH >■ I — NH3 CO NH NH i i CH — (CH2)4 — NH — CO — {CH2)2 — CH CO CO Aceste legaturi interlanfuri fac ca poiimerii de fibrinS s3 devinS insolubili §i rezistenfi. In rcjeaua de fibrina se incorpoieazd trombocite §i hematii dand na§tcre chiagului. Coagularea este un proces rapid care trebuie sit ram ami localizat la local leziunii vasculare §i chiagul urmeazl sa fie distrus, dizolvat cat mai rapid (fibrinolizl). Pe langl diluarea in torentul circulator a factorilor activi ai coagul&rii, captarea selective §i catabolizarea lor hepatic^, plasma cuprinde component care intervin prompt pentru a stopa procesul. Acfiunea trombinei este intreruptl prin intermediul unei proteine plasmatice (prezentfi in fracfiunea electroforetica a*), denumitS antitrombinl, care se combinft stoichiometric cu trombina §i ii anulcazS activitatea proteoliticl De asemenea, a2-macroglobulina are o acfiune similar^. Un alt mecanism de intrerupere a cascadei coagularii cuprinde proteina plasmatic!, Proteina C, care intervine prin inhibarea factorilor IX a §i Xa, Proteina C este activate de trombina in asociafie cu o glicoproteina din endoteliul vascular, trombomoduiina. 61 Fibrinoliza, Plasma cuprinde §i componenjii necesari dezagreg&rii §i dizolvSrii chiagului. Acedia r3man inacfivi pan& cand so impune intiai'ea lor in acfiune. Etapa finals a fibrinolizei este catalizatS de plasminS, enzimi proteoliticS, care transforms fibrina in fragmente solubile. Plasmina provine dintr-un precursor plasmatic inactiv, plasminogen, care este incorporat in rejeaua de fibrinS. El este activat de o proteazS eliberatS de endoteliul vascular, factorul tisular activator al plasminogenului.

1.3,6. HEMOPROTEINELE Acest grup de proleine conjugate cuprinde mioglobina §i hernoglobina, transportori de oxigen, citocromii, transportori de electroni, membri ai lanjului respirator mitocondrial §i ai aceluia situat in reticulul endoplasmic hepatic, diverse oxidaze §i peroxidaze. Gruparea prosteticd a acestor proleine este hemul. Yarietatea hemoproteinelor rezuM prin uncle diferenfe In structura hemului sau pentru aceia§i grupare hem pot rezulta enfMji distinct© in raport cu natura apoproteinei §i a modului de asociere cu hemul. Hernoglobina (Hb) §i mioglobina (Mb) cuprind aceea§i grupare hem, alcatuitii din protoporfirind §i Fe2*. Porfirinele sunt compu§i cu o structure macrociclicS, tetrapirolicd. In procesul de biosintezS a hemului apar ca intermediaii naturali uroporfirina, coproporfi- rina §i protoporfirina. Piecare din aceste porfirine derivd dintr-un precursor porfirinogenic. Nucleele fundamentale macrociclice ale porfirinogenilor §i ale porfirinelor sunt: porfinogenul §i porfina. N X N/ >N/ H H = \ /= Xz \= H „/Nv Z y H /Ns ./W\. Z X Porlinogen Poriina Porfirinogenii §i porfirinele poart& in pozijiile 1-8 urm&torii substituenfi: uroporfirinogenui §i uroporfirina: 1,3,5, 8 -grupari — CH2—COOH 2, 4, 6, 7 „ — CH2 — CH2 — COOH coproporfirinogenul §i coproporfirina: 1,3, 5, 8 -grupari —CH3 2, 4, 6, 7, „ — CH2 — CH2 — COOH 62 protoporfirinogenul §i protoporfirina: 1, 3r 5, 8 - grupari — CH3 (M) 2, 4 ,, — CH - CH2 (vinil, V) 8,7 „ CH2 — COOH (P) Formula protoporfirinei este:

Porfirinele cuprind o structure macrociclic<1 foarte stabdft cu caracter aromatic. Delocalizarea electronilor determine a§ezarea tuturor atomiior intrun singur plan. Atomii de hidrogen din macrociclu sunt eliberaji ca protoni, sarciniie — sunt delocalizate. Protoporfirina (spre deosebire de uroporfirina §i de coproporfirind) are proprietatea de a lega coordinativ un ion de Fe2+ formand hemul. Ionul de fer are capacitates de a coordina 6 ligand (are cifre de coordinajie 6). Asocierea Fe2+ la protoporfirina se face prin cei patru alomi de azot ai porfirinei §i alji doi liganzi externi, de regulS furnizaji de grupftri din protein;!: X N/ N' •

Mioglobina este o hemoproteinS care funcJioneazS ca transporter tisular de 02, prin legarea reversibild, a dioxigenului: Partea proteic#, globina, este alc#tuit# dintr-un singur lanf polipeptidic (cu 153 resturi aminoacidice) impachetat intr-o global# compacts. Cuprinde o grupare hem fixat# intr-un buzunar, c#ptu§it cu resturi aminoacidice hidrofobe. Legarea hemului la globing este diferit# dup# starea sa oxigenat# sau deoxigenat#. in forma deoxigena- t&, iigandul extern X este reprezentat de un rest His din lanful polipeptidic (His proximal) §i pozijia Y de coordinate a Fe2+ este vacant#. In forma oxigenat#, pozifia. Y este ocnipat# de dioxigen, care la randul lui contracteaz# o a doua leg#tur# coordinativ# slab# cu un alt: rest His (His distal): /i/'s//mm/

o=o

/Y/s d/sfd/

Acest gen de asociere dintre hem §i protein# face posibil# oxigenarea reversibil# a mioglobinei, f#r# modificarea valenfei ferului. Hemoglobins este o protein# tetrameric#, forma principal# din sangele adultului are formula molecular# 9^, Fiecare lanj a §i' p este asociat cu cate o grupare hem* Locurile de legare a hemului feunt situate la nivelul contactelor a / p. Asocierea dintre hem. §i fiecare lanf protomeric se face in mod similar cu asocierea hemului la mioglobin#. Resturile His proximal sunt 87 a §i 93 P iar restui'ile His distal sunt 58 a §i 63 p. Oxigenarea reversibil# a hemoglobinei este descris# printr-un §ir de reacjii: 0 2 Oz o2 o2 Hb ^ Hb02 ^ Hb(Og)2 ^ Hb(02)3 ^ Hb(02)4 Oxigenarea maximal# a hemoglobinei coiespunde fix#rii a patru molecule de dioxigen. Cinetica oxigen#rii hemoglobinei este diferit# de cea a mioglobinei, structura cuatemar# permite funcjionarea unor mecanisme foarte eficiente de reglare (vezi Cap.H). Totodat#, hemoglobina, pe iang# transportul de oxigen are §i funcjia de transporter de protoni §i de dioxid de carbon, Citocromii sunt hemoproteine care transport# electron!, prin schimbarea reversibil# a valenfei ferului: +e cit Fe3+ ^ cit Fe2* -e 64 H3C~ -ooc—CH?—CH,CH?—CH?—-S"-'CH CH3 ^M2HC~ -CH \1 / AT A

-CH, r! i\ i! n;a! -CH,—CH7—S—CH? COOFig. 1.17 — Hemui citocromului c Citocromii mitocoridriali (a, a3, b, c, Cj) acjioneazS secvenjial, electronii

tree de la un component la altul, in final fiind acceptaji de dioxigen: 4 cit Fe2* + 02 _______________.____4 cit Fe3+ + 202" 202“ + 4H+_________________________2H20 Citocromul c, cel mai bine studiat, cuprinde un lan{ polipeptidic cu 104 resturi arninoacidice §i o grupare hem. Asocierea dintre hem §i protein# este diferit# de cea intalnit# la hemoglobin# sau mioglobin#. Ligandul X este reprezentat de un rest His (18) §i pozifia Y este permanent ocupat# cu un rest Met (80). GrupSrile vinil sunt legate covalent la resturile Cys (Fig. 1.17). . 1.3.7. F1ERONECTINELE Fibronectinele alc&tuiesc o familie de proteine extracelulare adezive. Ele au roluri majore in interacjiunile dintre celule §i membrane bazale sau dintre divergi component ai matricei extracelulare §i celule. Aceste procese sunt cruciale pentru determinarea caracterului migrator sau stafionar al celulelor. Fibronectinele au roluri importante in embriogenez#, in menfinerea integritdpi |:esuturilor, in hemostaz#, determine migrarea celulelor canceroase. Fibronectinele sunt proteine dimerice, protomerii A §i B au mase de aproximaliv 250 kD §i prezint# o maM omologie structural#. In dimer capetele C-£erminale ale lanfurilor A §i B sunt reunite prin dou# pun|i disulfurice (Fig.1,18), Dimerul este o molecule alungit# (600 A/25 A), Protomerii A §i B sunt. organizafi in mai multe domenii structurale, fiecare domeniu fiind caracterizat prin capacitatea sa distinct# de a se lega la alji componenji. 65

Fig.L18 - Structure muttidomeniala a flbronectlnei plasmatic© Pentru fibroncctin! au fosl: descrise mai multe izoforme (12), specificate genetic, Una dinlre acestea este fibronectina din plasm!, Aceasta esle sintetizat! in ficat, f.esul: In care rat se mai exprimS nici o alt! genii a fibronectinei. Alte izoforme ale fibronec- linei sunt sinletizate de diverse aJle tipuri celulare. Cea produs! de fibroblast! este printre cea. mai mult sludiat! mai bine cunoscutft fibronectin!. Fibronectineie dup! sintez! intracelular! sunt secrciale in ■ matrices extrace] uiar! local! unde funcfionea- z!. Toate Jesuturile cuprind fibronectin!. Fibronectineie a.u capacitatea de a. stabiii' legaturi cu alte proteine, astfel se realizeaz! o retea de interaefixmi care conecteaz! proteine extracelulare (colagen., laminin;!, vitronectin!) §i mucopolizaharide (proteoglicani) cu receptor! membranari (integrine) §i cu proteine intracelulare care alc!tuiesc citoscheletul (acting, a-actinin!, vinculin!). O molecul! de fibronectin! posed! oral multe domenii structumle prin intermediul. c!rora interacjioneaz! cu componen{ii enumerafi mai sus. Au fost: identificate domeniile de legare ia colagen, heparin!, fibrin;!, acting ca gi domeniul de. interacjiune cu o celul!. interac|Iunea dinlre fibronectin! (fibronectina plasmatic!) §i celule are loc

prin intermediul unui domeniu de aproximativ 75 kD situat in jumStatea Cterrninal! a ianjurilor A §i B. Situsul de legare specific cuprinde secvenja Arg — Gly — Asp — Ser (RGDS). Peptide niici de sihlez! care cuprind acesl segment sunt aple s! adere pe suprafaja celulelor. Reeeptorul celular pentru fibronectina, care recunoagte secvenja RODS, a fost identificat in toate tipurile de celule. Acest receptor face parte dintr-o familie de receptor! care recunosc §i interac(ioneaz! cu diverse proteine adezive, familia integrinelor. Integrina specific! pentru fibronectin! este o glicoprotein!, un heterodimer a (1 Integrina din plachete (glicoproteina IIb — IIIa) este distinct! de cea a alter celule. Integrina plachetelor, pe king! fibronectin!, interaefioneaz! §i cu fibrinogen, fibrin!, cu factorul von Willebrand. Fibronectina plasmatic! are un rol deosebit In form area cheagului, prin legare de fibrin!, fibronectina este incorporat! in cheag, Prin multifuncfionalitatea sa fibronectina asigur! ancorarea cheagului ia celule §i pe mairicea structural! a perefilor vaselor. 66 ■ Cap. IL ENZIMELE ILL IMTRODUCERE Numftrul reacpilor cunosciite care au loc in organismele vii este de ordinul niiilor; cu rare exeeppi, acestc reacpi sunt catalizate. in anui 1877 .cgMizMoriJor recpilor din organismde vii ,U s-a atribuil numele de ^enzirne^4 (in drojdie); aceast! denumire, ahlturi de aceea de .,biocatalizatori“, se utilizeaza. §i in prezent. Denumirca mai veche a, fost aceea de JfermenlR (legate §i ea de procesele fermentative); pentru enzime individuate s-au utilizat denumiri specifice, ca de exemplo, „diastazav' (In prezent. a - amilaza), Locul de, acpune al eelor mai multe enzime este in imeriorul cehilelor; uncle acponeaza ins! §i in afara acestora (de exemplu, o serie de enzime din plasma sanguinfl intre care si ceie care asiguni coagularea)...Toate enzimeie specifice unui tip de celule sunt sintetizate chiar de acele celule; enzimeie care acponeaz! in afara ceiulelor sunt sint.cUz.ate dear de anumile tipuri de celule .(hepatice, rennie etc.)* Enzimeie au toate insujirile catalizatorilor utilizap In reaepile chi mice din. lumea nevie, Ele sunt ins! superioare acestor.catalizatori in mai multe privinje: a) Asiguril reacpilor chimice pe care le catalizeaz! viteze cu cateva ordine de m2 rime in plus; h) Reac|i.ile pe care le cafaiixeazfi au loc in condipi biande: iemperatur! sub 50°C, presiune atmosfericL pH in jurul lui 7; exist.;!, evident, §i unele exeeppi, Comparativ, eatalizatorii chimici acponeaz! la temperaturi ridicate, presiuni mari §i vaiori. extreme de pH; c) Au specificitave foaue mare ceea ce asigura ca in reaepile pe care le catalizcazS s! mi se formeze produ§i secundari. Multe enzime au insu§iri neintainite la.' catalizatori chimici. Foarie importanie sunt; a) Capaeitaiea de regime a producer!! lor in celule §i/sa.u de reglare a activitπ b) Fosibilitatea caializftrii unor reaepi endergonice prin cuplarea acestora

cu reaepi exergonice (vezi capitolul n,Energelica biochirniciL). Istoria enzimologiei se intinde pe douil sute de ani. Marile descoperiri realizate pan! la mijlocul secolului nostru au fost rodul gandirii §i experienfelor individuate ale unor chimi$li organicieni, fiziologi, microbiologi, captivap de acest domeniu: Gay-Lussac, Liebig, Berzelius, Kuhne, Emil Fischer, Pasteur §i alpi. Totu§i, ca §i in multe alte domenii ale biochimiei, abia in ultima jum!tate a secolului nostru, prin cercetftri efectupte de grupuri ultraspeciaiizate p cu mijloace tehnice din ce in ce mai perfeeponate, 67 s-a putut ajunge la o injelegere profunda a naturii §i funcfionSrii enzimelor. Cuno^tinjele de enzimologie sunt extrem de utile in prezent pentru interpretarea multor fenomene din biologia celular#, genetic# §i alte §tiinfe biologice.Ingineria genetic# se bazeaz# aproape exclusiv pe acjiunile specifice ale unor enzime. Din punct de vedere medical, enzimologia contribuie ast#zi in m#sur# hotdratoare la cunoagterea cauzelor a numeroase boli, diagnostical §i urmdrirea evolujiei acestora, elaborarea pe baze §tinjifice a medicamentelor §i multe allele. IL2. SCADEREA DE CATRE ENZIME A ENERGIEI DE ACTTVARE A REACJIILOR. CAPACITATEA CATALITICA A ENZIMELOR Toate reacjiile chimice sunt fnsojite de variajii ale energiei. In reacfiile care au loc In lumea nevie, variajiile de energie se urm#resc in mod curent prin variafia cSldurii (entalpiei); dup# cum ele elibereazS sau absorb c#ldura sunt „exoterme4< respectiv „endoterme“. Dac# reacjiile au loc in condifii de temperature §i presiune constant#, parametrul termodinamic urm#rit este altul, respectiv variafia energiei libere, notat# AG. In cazul reacjiilor care au loc in organismele vii superioare, la care cei doi parametri sunt constanfi, se urm#re§te, de asemenea, variafia energiei interne. Dac# AG in cursul reacjiei este negativ# (ceea ce corespunde eliber#rii de energie), reacjia este „exergoni- c#“; invers, reacjia este „endergonic#A In cazul reacjiilor exergonice, care constitute obiectui discufiei ce urmez#, energia medie a moleculelor reactanjilor este mai mare decat energia medie a produ§ilor de reacjie. Deoarece produ§ii de reacfie sunt mai stabili decat reactanfii, s-ar putea crede c# reacjiile in care se eiibereaz# energie sunt §i spontane. Totu§i, cu foarte rare excepjii, desf#§urarea acestor reacjii este condifionat# de fumizarea unei anumite cantit#Ji de energie; abia dup# ce au fost „amorsate“ ele devin eiiberatoare de energie. De exemplu, oxidarea glucozei cu 02 este o reacjie in care se eiibereaz# energie; tot.u§i glucoza rezist# contactului permanent cu acest element luni de zile, chiar §i ani, dac# reacjia nu este declan§at# prin fumizarea unei cantit#fi de energie. Energia fumizat# reacjiei are rolul de a ni#ri num#rul de ciocniri intre reactanji, inclusiv a celor efica.ce; este vorba de ciocniri din care rezult# „complexe de tranzifie44 st#ri prin intermediul c#rora au loc transform#rile substratelor in produ^i de reacjie. Aceast# energie este cunoscut# sub numele de „energie de activare44 §\ este definite ca „energia necesar# pentru ca toate moleculele dintr-un mol de reactant s# ating# starea de tranzijie44. Ea se exprim#, evident, in Kj/mol sau Kcal/mol §i este specific# fiec#rei reacjii.

68 In laborator sau industrie, energia de aciivare necesara reacflilor este furnizatd sub formd de cdldurd. Imposibilitatca ca reacjiile chimice din organismele vii sd fie influenfate de cdldurd este compensatd de cStre enzime, care, asemdnator tuturor catalizatorilor, scad energia de activare. Cu cat un catalizator scade mai mult energia de activare a reac^iei pe care o catalizeazd cu atat ei este mai eficace adicd asigurd o vitezd mai mare acelei reacfii. Enzimele scad foarte mult energia de activare in raport cu catalizatorii chimici. Reacfia de descompunere a apei oxigenate poate servi ca exemplu in acest sens: 2H2Q2 -----2H20 -f 02 in absenja catalizatorilor energia de activare are valoarea de 18 Kcal/moi; ea este de 11,7 Kcal/mol in prezenja catalizatoruiui de platind coloidald §i de numai 2 Kcal/mol in prezenja-catalazei, enzima cu specificitate absolute pentru aceastd reacjie (Fig. ILL). A§a se explicit capacilatea cataliticd deosebit de mare a catalazei: o singurd moleculd din aceastd enzimd descompune 5 x 106 molecule de apd oxigenatd intr-un minut, in condijii optime. Existd §i enzime care asigurd viteze de reacfie de ordinul 10 10 - 1012 in raport cu reacfiile corespunzdtoare necatalizate. Scdderea de cdtre cataiizatori a energiei de activare este consecinfa cursului diferit pe care acedia il imprimd reacfiei. Se §tie cd orice reacfie catalizatd decurge §i in absenja catalizatorului' dar cu vitezd foarte micd. In acest caz substratul (S) se transforms. direct in produs de reacfie (P).

Desfc?Si/r&red redcfre/' Fig. ILL Energia de activare pentru descompunerea apei oxigenate: a) fara catalizator; b) in prezenfa Pt coloidaie; c) in prezenja cataizei. 69 Cfmd este prezenl catalizatorul, In cazul reacjiiior din lumea vie enziina (E), nitre aceasta §i substrat se formeazd un complex ES din care apoi rezultd'P se reface E: E+S ES-----E + P In conformitale eu cele afirmate mai Inainte, energia tie activare pentru transform area lui S din ES in P este mult mai micd decal la transform area directs a lui S in P. In Fig. II. i. este reprezentat §i faptul cd intr-o reaejie exergonicd deelangata prim fumszarea energiei cle activare, se elibereazd o cantilate de energie case este suma energiei tie activare + variajia energiei iibere specifice (diferenja intre energia niedie a reacianjilor §i a producer),

Desigur cd In organismele vii, alafuri de reaejiile exergonice, au loc numeroase reaejii endergonice. Hie sunt posibile -prin faptul cd exists enzime specializate, care, pe langd sedderea energiei de activare, asigurft transfeml energiei Iibere necesare de la reaejii exergonice. DesBigurarea acestor reaejii este prezentatd. in capitolul „Energetica biochimic&A 11.3. SPECIFICITATEA ENZIMELOR Inalta specificitate este ima dintre caracteristicile fundamentaie ale enzimelor, Consecinje ale acestei specificitaji deosebite sunt a till evilarea formSrii de product secundari in reaejii, cat §i, pe un plan mai general, exist.en.ja insd§i a editor rnetabolice (in sensui cd succesiunea reaejiilor, de exemplu intr-un compartiment. celular, este impusd de enzimeie existente). ModalitdJ'ile de manifestare ale specilicitajii sunt diverse. Se pot considera. totugi trei variante de baza: specificitatea de reaejie, specificitatea de substrat §i specicificitatea stereochimicd. II.3.1 SPECIFICITATE DE REACJIE Specificitatea de reaejie constd in aceea cd fiecare enzimd catalizeazS. numai un singur tip particular cle reaejie (excepjiile sunt foarte rare). Tipul particular seincadreazd in unul din cele §ase tipuri fundamentaie de reaejii care au loc in lumen vie; oxidoreduce- re, hidrolizS. formare (scindare) de legdturi covalente, izomerizarc, form.are de leg&turi covalente utiiizXmd energia eliberafd prin scindarea unor legdturi macroergice. Se va vedea mai depnrte in acest capitoi cd in sistemul actual de clasificare sunt. §ase clase de enzime, corespunzdtor color §ase tipuri fundamentaie de reaejii. Ca exemplu de tipuri particulare de reaejii pot fi considerate: -hidroliza proteinelor in prezenja proteazelor; - fosforildri ale unor compuji diverji cu acid fosforic provenil din ATP, in prezenja kinazelor; 70 - schimburi de grup&ri amino contra grupSri carbon!! mire aminoacizi §i cetoacizi, catalizate de Iransaminaze. O consecin{& a specifid$p de substrat este aceea cd un anumit compus care poate ft traasformat in mai mul$ produ^i de- rescue, necesitft pentm fiecare feansforniam o enzim& specified se exemplifies prin. reacjiile pe care le suferS HI organism glncozob-fosfatul (G-6-P): glucozo-6-fosfat glucozo-6-fosfat gIucozo-6-fosfat giucozo-6-fosfat + H 2o giucozo-6-fosfatizomeraza =5=======^^ fructozo-6-fosfat fosfoglucomutaza glUGOZO~1 -fOSfat glucozo-6-fosfatdehidrogenaza -----—-—^acid-Bdosfo.gluconic glucozo-6-fosfataza —_--------------——► glucoza + acid fo$tone 113.2 SPECIFICITATE DE SUBSTRAT Aceasta. constS in aria mai restrSnsS sau mai largS de aejiune a Secarci enzime cu o anumM specificitate de reaepe. Ea poate fi: - absolute, dacS enzima catalizeazS un anumit tip de reaepe la un singur

substrat; - de grup, dacS enzima catalizeazS acela§i lip de reaefie la douS sau la un numSr restrains de substrate; - specificitate largS, dacS enzima catalizeazS acela§i tip de reaefie la un numSr foarte mare de substrate. DoaS dinire enzimele cu specificitate absolute sunt anhidraza carbonic^ §i ureaza: anhidraza carbonica CO, 4- H20 HaCOs y H2N - CO - NH2 + H20----------------2NH3 + co2 Alcooldehidrogeneza este un exemplu de enzima cu specificitate de grup; ea catalizeazS transform area prin dehidrogenare a aicoolilor monohidroxilici inferiori (§i chiar a unor alcooli dihidroxilici) in aldehidele corespunzStoare: alcoofdehidroq aneza R - CH2 - OH + NAD+ —— --------------^ R - OHO + NADH +■ H* Substratul preferat pentru alcool - DH este alcoolul etilic, acfiunea cataliticS fiind mult; mai redusS in cazul alcoolului metiJic, propilic, etilenglicolului etc. In reaefia de mai sus NAD* §i NADH + H+ sunt formele oxidata, respectiv redusd, ale coenzimei alcooldehidrogenezei (despre coenzime vezi in coniinuarea acestui capitol gi in capitolul „Vitamine §i coenzime“). 71 Spec if i c i ta tea largfi este intalnit! la mai multe enzime, dar cel mai frecvent la hidrolaze. Intre ncestea sunt si proteazele digestive; pepsina, tripsina. §i chimotripsina. Specificitatea largS a fiecSreia dintre ele const;! In capacitatea de a cataliza scindarea hidroliticS a oric^rei proteine din alimente. Dar acfiunea hidrolitic! a fiecireia In parte chiar ac(iunea simultan! a lor nu asigurS hidroliza totals (pdn5 la aminoacizii component!) a vreuneia dintre proteinele din alimente. FaptuI se explic! prin existenja unei „specificit&{.i de legatunT care const! in aceea c! fiecare dintre cele trei enzime asigur! hidroliza in oricare protein! numai a anumitor legdturi peptidice. Asti'el chimotripsina eatalizeaz! hidroliza legdturilor peptidice a cdror grupare CO provine de la aminoacizii Phe, Tyr, Trp, in timp ce tripsina asigurS hidroliza legdturilor peptidice a cdror grupare CO derivd de’ la aminoacizii bazici (lizina, arginina); la fel de specific acjioneaz! §i pepsina:

R | NH— CH"

CH2 — NH2 (CH2)3 i i

-CO — NH—CH— CO-j-NHHO H i i legatura scindata in prezenja tripsinei

R C H -

CH2

!

R |

i -CO—NH—CH— CO-l-NH- 1 HO H

-CH— CO

iegatura scindat& In prezenja chimotripsinei

Pepsina, tripsina §i chimotripsina sunt endopeptidaze (acfioneaz! pe legdturi peptidice din interiorul proteinelor). Exists categoria de enzime proteolitice numite exopeptidaze (aefioneaz! pe legaturi pepditice ale aminoacizilor N - terminali sau C - terminal!); §i in cazul aceslora exists limitari impuse de specificMjile menjionate. ri.3.3 SPECIFICITATE STEREOCHIM1CA Majoritatea substratelor, chiar dintre cele mai simple, au atomi de carbon asimetrici §i deci se pot prezenta, raportat la glicerinaldehidil, in configurafii absolute de tip D sau L (vezi proprietd}iie glucidelor sau aminoacizilor). Stereospecificilatea const! in aceea eft, dupil caz, enzima asigurd transformarea lie numai a substratului cu configurate D, fie numai a substratului cu configurate L. De exemplu, lactat dehidrogeneza (LDH) calalizeaz! numai oxidarea acidului L lactic la acid piruvic: COOH COOH HO — C — H + NAD* -ABtL c=0 + NADH + H+ I I CH3 CH3 acid L-!actic acid piruvic 72 Enzimele proleoiitice prezentate mai inainte, dar §i enzimele ce catalizeazS alte transform Sri ale proteineior, sunt stereospecifice in sensul cS acJioneazS strict pe compugii polipeptidici. ce confin L - amincacizi a§a cum sunt proteinele naturale. DimpotrivS, majoritatea enzimelor ce catalizeazS reacfii in cSile metabolice ale glucidelor i§i manifests acjiunea numai dacS acestea au configurate D. Stereospecificitate au §i enzimele care catalizeazS IransformSri in care substrata] sau produsul de reacfie prezintS izomeri geometric!. De exemplu, in reacjia de dehiclrogenare a aciduiui succinic (una dintre reacjiile ciclului Krebs), catalizatS de succinct dehidroge- nazS, se obfine strict acid fumaric (nici m&car urrne de acid maleic); COOH HOOC 1 \ CH 4- FAD CH 2 I ^ 11 -r FADH2 CH CH2 \ X COOH COOH acid succinic acid fumaric In aceastS reacjie FAD FADH2 sunt forma oxidatS, respectiv redusS a unei alte coenzime. StereospecificitSjile descrise, ca §i allele, sunt consecinje ale interacjiei substratelor cu enzimele corespunzStoare la nivelul centrelor active de acestora, a§a cum se va arSta in continuare. II,4 STRUCTURA ENZIMELOR ' 11,4.1. ASPECTE GENERALE Din studiul naturii chimice a eatorva mil de enzime cunoscute rezultS cS ele sunt, cu foarte rare exceppi, proteine sau heteroproteine. Excepjiile, descoperite in ultimii zece ani, sunt enzime cu struclurS. de acizi ribonucleici, iar ribonucleaza P este un complex proteinS-acid ribonucleic; activitatea

enzimaticS a acesteia din urmft este datoratS aciduiui ribonucleic §i nu proteinei. Una dintre teoriile formulate in legatura cu existenfa acestor enzime are in vedere urmStoarele; pe scara evolutivS, acizii nucleici au precedat proteinele §i alSturi de alte funcfii ei au indeplinit-o §i pe aceea de enzime; cand s-au sintetizat proteinele, acizii nucleici §i le-au ata§at pe acestea dobandind stabilitate §i unele activit&Ji crescute, Treptat insS, din motivele ce vor fi specificate, proteinele au preiuat funcfia ca.talit.icS, ARN-ul fiind abandonat. De aceea enzimele cu slructurS de ARN, sau complexe ARN - proteine, sunt considerate drept „fosile biochimiceA Structura proteicS §i heteroproteicS a enzimelor este avantajoasS din mai multe motive: resturile de aminoacizi din proteine dispun de o mare varietate de grupSri funcfionale care participS ia legarea substratului cat §i la desfS§urarea catalizei; nici-o altS clasS de compu§i din lumea p/ie nu are varietatea de monomeri §i de grupSri functional© pe care o au proteinele. in plus, enzimele sunt proteine globuiare, ele au deci structure secundarS, terjiarS §i deseori structure cuaternarS, Structurile secundarS §i mai ales cea terJiarS asigurS posibilitSji multiple de constituire a centrelor active, zonele 73 J'ierbinfr ale enzimelor, unde se desf$oar8 reacjiile. Deosebit de import aritft este existenja la aprox. 10-20% dintre enzime a structurii cuaternare, Activitatea aeestor enzime poate fi reglatd (erescutd, scdzuUi) prin dileriji compel din mediti care produc mid modificclri ale structurii cuaternare. IL4.2. ENZIME CU STRUCTURA PROTEICA Enximele cu structure strict profeic2 sunt relativ purine,'Dintre cede 6 clase man de enzime mai ales hidrolazele sunt proteine pure; exemple sunt ribonucleaza, chimotripsina §i lizozimul. In cazul acestor enzime atat legarea substratuiui cat §i cataliza !n sine se realizeazS de catre grupMic funcfionale ale resturilor de arninoacizi. Un exernplu 11 constituie acfiunea cataliticd a lizozimului, o enzimil ailatfi in mucusul nazal §i in laerimi. In prczcnja lizozimului are loc seindarea hidrolitic& a unor compugi heterozidici care alcdtuiesc perejii multor cellule bacteriene; odatd distru§i ace^ti perefL, celulele bacteriene inor. Fleming, care a descoperit acfiunea hidroliticli a Iizozozimului (in anul 1922), a avut un timp convingerea eel acesfa este un ,,antibiotic (compu§i de a cftror existen$ era sigur). Ceva mai tfirziu, in anul 1929, Fleming a descoperit un adevSrat antibiotic, penicilina. Heterozidcle din perejii celulelor bacteriene sunt aJcSLuite din resturi de acid-N-acetil muramic (.NAM) §i resturi de N-acedlglucozaminft (NAG); hidroliza lor, catalizatS de iizozim, este urmftloarea:

74 11.4.3. ENZIME CU STRUCTURA HETEROPROTEICA Cele mai muite enzime au structure heteroproteicd; ele sunt alc&luite din „apoenzi~ miC (component# proteicd) §i „cofactorfct (components neproteica). Fiind molecule organice, cationi §i anioni (mai rar) ai elementelor, stabilitatea cofactorilor la acfiunea lempleraturii este mai mare decat. a apoenzimelor. De regulS, o enzimd are un singur cofactor; exists lotugi §i enzime cu doi cofactori, clifeiiji structural §i funcJionaL In privinfa terminologiei cofactorilor s-au blent recent urmdloarele recomandSri (ele urmdresc s& elimine cpnfuziile, destul de freevente): - termenul cofactor se.va utiliza penlru total!tatea compu§i!or neproteici din structura heteroenzimelor; - termenul „coenzim3“ se va utiliza numai penlru componenteie neproteice de naturd organic^ care se leagd prin legdturi foarte slabe de apoenzime (legdturi de hidrogen, ionice, hidrofobe etc.); - termenul ,,grupare prosletlcd^'se va utiliza lot penlru cofactori de naturS organic# dai* care se leaga de apoenzime prin legdturi putemice, inclusiv covalente. Numarul cofactorilor cimoseufi este foarte mic in comparajie cu numSrul enzimelor cu structura heteroproleic#. "Faptul se explicit prin aceea c# un anumit cofactor este capabil s# se asocieze cu diferite. apoenzime rezul&nd astfel mai multe heteroenzime.- Mai ales o parte dimre eoenzime §i ioni au aceast# capacitate. Exist#, de exernplu, cateva sute de enzime cu rol de hidrogenaze-dehidrogenaze a edror coenzim# este nicotinandd-adenindinudeotidul, notat NAD* (in forma oxidat#). Ele pot acjiona simullan -inlr-un eompartiment celular dal care are o -canlitate limitat# de NADA ca urmare a faptului c# NAD+'trece cu ujurinj# de pe o apoenzim# pe alia in funefie de

necesitdjile de moment. De exernplu, alcool-dehidrogenaza §i laefatdehidrogenaza, ambele enzime cilosoliee (reaejiile calalizate au lost prezentatc mai inainte) uti.Iize.az3. NAD+ din fondul citosolic comun. Pe de alt# parte, in timp ce in cursul reaefiilor de dehidrogenare de lip ul celor catalizate de alcool dehidrogenaz#, NAD* trece in NADH 4- H+ (forma red us# a coenzimei), in comparlimentul celular dat (citosol.) au loc simullan reaefii de hidrogenare a unor substrate in prezenja unor enzime care utilizeaz# forum redusa. a coenzimei NADH 4- HA In condijiile unui echilibru intre reaejiile care genereazS §i ceie ce utilizeaz# NAD*, se amplified posibililatea de funejionare cu o canlilate limitat# a aceslei. eoenzime a unui num#r foarte mare de hidrogenaze- dehidrogenaze. Situajia este asem#n#toare penlru enzimele cu eoenzime NADP*, FMN §i FAD. Date ample privitoare la eoenzime, care sunt derivaji ai vitam in el or hidrosolubile, se afl# in capitolul „Vitamine §i eoenzime". Alte dale privind funepa lor se a lid in subcapitoiul „Cenl:rul activ §i mecanismul de aejiune al enzimelorA Dintre gruparile prosteice, hemul este intdlnit eel mai freevent in diverse enzime din organism ul uman. Date despre structura. §i funcfiiie acestora se afl# in capitolele ,,Hemoproleine" §i „Energetica biochimica" (lanful respirator). O reguld generalfi re-ie§it# din studiul unui mare numdr de heteroenzime cu cofactori organic! este ca specifidtalea lor este determinate in totalitate de apoenzime in timp ce coenzimele sunt grupSrile responsabile in cea mai mare parte de transformarea chimicd propriuzis#. Cum s-a mai' ardtat, cofactorii multor enzime sunt ioni metalici (metaloenzime). Legdturile dintre componenteie proteice §i ionii metalici sunt de tip electrostatic. Stabilitatea complexelor este in funefie de numdrul §i intensitalea acestor interaejiuni; din studiul acestor complexe a mai reiegit cd resturile aminoacizilor care elibereazd 75 protoni (de exemplu, Giu, Asp, Ser) sau care au atomi de azot cu electroni neparticipanfi (inciusiv atomi de azot, din leg&turi peptidice) constituie liganzii pentru ionii metaiici. DacS ionii metaiici sunt disociafi de apoenzimS, enzima t§i pierde complet sau tgi diminuS activitatea; de reguhl disocierile sunt reversibile in sensul c& ionul metalic poate fi reintegrat in components proteicd. In reacfiiie cataiizate de metaloenzime, ionii metaiici indepiinesc, de la caz la caz, roluri variate: -stabilizeazd structura enzimei; -paiticipS la legarea substratului; -indue unele modificSri in conformajia enzimei, cu elect asupra vitezei de reaefie; » participS nemijlocit la catalizJt.de exemplu in cazul multor reaefii de oxido-reducere. In legiiturS cu structura enzimelor in general, a metaloenzimelor in particular, este de remarcat gi existenfa enzimelor omoloage (care catalizeazQ aceeagi reaefie in fesuturi sau celule diferite, uneori chiar in compartimente diferite ale aceleiagi celule). Asemenea siluafii s-au remarcat la enzime cum sunt aldolaza, piruvatcarboxilaza gi allele. In cazul

metaloenzimelor diferenja intre enzimele omoloage poate fi la nivelul apoenzimei sau/gi a ionilor metaiici; de exemplu, enzima superoxiddismutazS extrasft din mitocondrii confine Mg2+ iar cea extras^ din citosol confine Cu2+ gi Zn2+. Sunt gi enzime care necesitd pentru activitatea lor simpla prezenfd in mediu a anumitor ioni, cationi sau anioni; exemple sunt prezenfa Ca2+ pentru activitatea lipazelor gi grezenfa Cl” pentru activitatea amilazei salivate. in tabelul II. 1 se dau gi alte enzime care au in structure, sau necesitS pentru activitate, diferiti ioni. Tabelul 1U En/Jme care confin sau necesita prezenja unor ioni Enzime Ionul Citocromi Fe2+ sau Fe3* Peroxidaze Calalaze Aleooldehidrogenaza Zn2+ Anhidraza carbonic^ Carhoxipep! idaza Fosfohidrolaza Mg2+ Fosfolransferaze Arginaza Mn2+' Tirozinaza Citocrom Cu2+ sau Cu+ oxidazTt Piruvaikinaza IC 5i Mgto AlP-aza menibranara Na+ Amilaza salivara cr 76 IL5. SISTEME (COMPLEXE) MULTIENZIMATICE E4 CercetSrile din ultimele decenii au evidential cS in cazul unor cSi metabolice toate enzimele care catalizeazS reacfii individuale (sau numai o parte din ele) sunt asociate in formS de „complexe multienzimatice". In aceste complexe enzimele sunt fixate prin legSturi slabe, intr-o ordine corespun- zStoare intrSrii lor in acfiune, pe o proteins, „centralS“ care poate fi chiar una dintre enzime (Fig. H.2.). Protein a centrals dispune de un „braf“ al cSrui rol este urmStorul: fixeazS substratul Ss §i il duce la enzima E{ care il transforms in P5; cum Pt este in acest caz S2, brajul i preia §i il duce la E2 care il transforms in P2. La mvelul fiecSrei enzime braful indepline§te rol similar asigurSnd formarea produsului unic al tuturor enzirnelor com- plexului. Avantajul este cS braful duce de fiecare datS S la E conespunzStoare potrivindu-I cu mare exact!tate pe centrul activ, ceea ce asigurS pe ansamblu o vitezS mai mare decSt cea corespunzStoare acfiunii enzirnelor neasociate. Complexe multienzimatice bine cu- noscute sunt „acid gras sintetaza" (vezi biosinteza acizilor gra§i) §i „complexul piruvat dehidrogenaza“ (vezi degradarea oxidativS a glucozei).

Fig. 11.2 - Reprezentare intuitiva a structurii §i modului de funcfionare a unui complex multien- zimatic cu §ase enzime IL6. IZOENZIME O parte dintre enzimele care au §i structurS cuaternarS se prezintS sub mai multe forme moieculai'e. Pentru o enzimS datS, formele moleculare sub care ea apare se numesc izoenzime. Toate izoenzimele unei enzime catalizeazS aceea§i reacfie; diferS doax viteza pe care fiecare o imprimS reacjiei unice. Structural, izoenzimele unei enzime diferS prin raportul in care sunt asociate ianfurile polipeptidice^ de bazS (subunitSfiie, monomerii), care, in acest caz sunt de cel pufin douS tipuri. In cazul lactatdehidrogenazei (LDH) cele douS lanfuri de bazS sunt H (de la heart=inimS) §i M (de la muscle==mu§chi). Cele cinci izoenzime ale LDH sunt tetrameri cu urmStoarele asocieri: H4 HSM H2M2 HM3 M4 (LDH5) (LDH£) (LDH3) (LDH4) (LDH5) 17 Imre lanjurile H §i M exist# foarte mid diferenje din punctul de vedere al structurii primare in limp ee structurile secundar# §i tcrjiar# sunt atat de apropiate incat asocieriJe in oricare din variamele de mai sus se fac cu aceiagi u^urin|ii (evident, aceste asocieri se daloreaz# formttrii de legfUun ionice, hidrofobe, de hidrogen etc.). •Cea mai mare parte a proprietiljilor fizico-chimice ale izoenzimelor unei enzirne date sunt foarte apropiate. Diferenje semnificative apar cand unul. din lanjurile de bazd dileril d.e celSIalt priMr-un aminoacid dicarboxilic suplimentar sau aminoacid diaminic suplimentar, Se exemplified tot prin LDH ale erirei izoenzime se diferenjiaz# prin sarcina electric# ca urmare a unei asemenea diferenje tic struciura primary a celor dou# lanjuri de bazfi. Aceasf# insugire a stat la baza separSrii electroforetice a izoenzimelor LDH; in prezent dozarea pe aceastd cale a izoenzimelor LDH series se practic# curent in scop diagnostic (se va vedea in continuarea acestui capitol). Lanjurile polipeptidice de tip H §i M ale izoenzimelor LDH, pe plan mai general lanjurile polipeptidice de bazS din izoenzime, sunt codificate de gene diferile; in condijiile asocierii lor cu egald ugurinj# in oricare din cele cinci forme izoenzimatice, intr-o specie celuiar# proporjia relafiva a izoenzimelor este determinate numai de intensitatea biosintezei celor doud lanjuri. La randul ei, intensitatea biosintezei lanjuriior H §i M este specified fieedrui tip de celule. Se reamintegtc in acest. sens efi izoenzimele LDH catalizeazd.

reaejia: • CH — C — COOH 4- MADH + H+ CH3 — CH — GOOH + NAD* II I O OH In sensul de la stanga la dreapta aceastS reaejie incheie glieollza in condifii anaerobe (vezi s,Glicoliza“ in capitolul „Metaholismui glucidelor‘% De aceea izoenzimele LDH cu capacitate ridicabl de Ira as form are a piruvatului in lactat sunt necesare, d.e exempli? in mugchi (care in eforl catabolizcaz# glucoza anaerob). Aceste izoenzime sunt M.4 §i MIL Mugchii si.n?.ctizeaza deci mai intens lanjurile M decaf: cele Hi Inima, Jesul cu catabolism aerob al glucozci, sintetizeaz# intens lanj.ul H, izoenzimele H4 §i H3M avand o capacitate foarte redus# de transformare a piruvatului in lactat. Creatinfosibkinaza sau creatinkinaza (notalft CPK sau CK) are trei izoenzime. Lanjurile de baxfi care se asocia/A in accst caz sunt M (tot de la muscle) §i B (de la bruin=creier); lieearc izoenzim# este un dimer, respectiv M.2, MB ji B2. §i aceste izoenzime se afl# in ser §i pot ft separate prin eiectroforez#. . In jesuturi, izoenzimele Tndeplincsc importance roiuri reglaiorii fiind sigur implicate gi in morfogenez# §i di.ferenji.erea eelular#. 117 CENTRUL ACTIV §1 MECANJSMUL DE ACpUNE AL ENZIMELOR S-a arista! la inceputul acestui capitol end in orice reaejie ealalizatd enzimatic form area intermediary a complexului enzimd-substrat este obligatorie: E+S ES-----v E H- P In prezent, exist# numeroase dovezi experi.nicnta.le, direefe sau indirecte, privitoare la fonnarea complexului ES. Infr-un num#r redus de cazuri enzima este legate de sabstrat prin legaturi putemice (covalente); aslfel de complexe ES stabile au fost izolate §i analizate prin difraejia razelor X §i alfe metixle. Complexele in care leg#turile dintre E §i S sunt slabe s~au studiat pe c#i indirecte: satunlnd enzima cu substratul s-au objinut modified in spectrul de absorhfie, solubililate, stahiiifate termic# etc, Mai non, formarea complexeior ES este studiat# 78 prin metoda marcajului chimic; ea consul in tratarea enzimelor izolafe cu coinpu§i chimici care reactionenzft in mod specific cu anumite grupftri (aparfinand unor resturi aminoacide) la care se aiageazft prin legftluri puienii.ee (care nu se scindeazft la hidroliza enzimei). Baal enzima marcatft nu mai fixeazft S inseamnft eft aminoacidul la care s-a a(a§at compusul chimic este implicat In formarea cornplexului ES. Acest aminoacid poate fi recunoscut dadl se hidrolizeazft enzima* in hidroiizai apMnd §i compexul aminoacid - compusul chimic, . O ohservajie important in legftturft cu form area cornplexului enzimft substrat este eft la anumite enzime indepftrtarea prin proteolizft a unor porfiuni din• macrornoleculele lor nu afecteazft (sau afecteazft in mieft mftsurft) acti vita tea. Aceste date experimental corelate cu aceea eft, de regulft, substratul este foarte mic in ra~ port cu enzima, au permis formularea concluziei eft numai o zonft resfransft din enzimft. par- ticipft la fixarea §i -transformarea chimicft a lui S; aceastft zona se nume§te „centrul aclhd al enzimei”. Tot din studii

experirnentale a rezultat ca o enzima dispune de on singur centra activ. In centrele active ale enzimelor s-au evidential grupftri chimice de tip carboxil, amino, hidroxil §i tio; acesfea aparfin unor resturi de aminoacizi cu caracter acid sau bazic (glutamic, aspartic, scrina, firozina, cisteiria etc.), dar §i hetrociclii, in special al histidine!, Gruparile sau resturile heterocicfice apxtrfin tie regulft unor aminoacizi indepftrtaji in seevenfa (structura priniarft) a proteinei - enzimft. De exemplu, in centru! activ al chimotripsi- nei s~att ideptifical gruparea OH a serine) in pozijia 195, gruparea carboxil a acidului'aspartic in pozijia 102 §i nucleul imidazolic al histidinei in pozijia 57. Grupftrile acestea sunt foarte apropiate in spajiu ca urrnare a conformajiei speciti.ce a chimotripsinei (Fig. IL3). Sunt ineft polemici in legftturft cu centru! activ al enzimelor rezultate dingenerali- zarea unor cazuri particulare; unii considers eft acesfa este alcfttuit dintr-un „centru de legareu §L separat, dintr-un „centru cataliticA Alj.ii susfin eft este mai cored: sft se eon.sid.ere eft in cent ml activ unele grupftri sunt implicate in legarea substratului, allele asigurit cataliza propriu-zisft, ele fiind intercalate. In cazul enzimelor heteroproteice, eofaetorii reprezentaji de grupftri prostetice fac parte din cenlrul activ: coenzimele §i ionii metalici au o pozijionare care le asigurft conlucrarca cu central activ.

Fig. 11.3. Structura terjiara a chimotripsinei; se evidenjiaza resturile Ser-195 §i His-57 care smpreuna cu. Asp-102 (dispus In apropiere) se alia In centru! activ. 79 • In iegSture cu organizarea spapalS a centrului activ al enzimelor (raportatfi la structura substratului) s-au elaborat douS modele: - Modelul clasic (Emil Fischer) consider^ c& potrivirea substratului cu centrul activ al enzimei este analoage cu potrivirea „lacj£t-cheie“. Acest model presupune o rigiditate a structurii enzimei in zona centrului activ (Fig, II.4). - Modelul Koshland, numit „centrul activ indusA presupune o flexibilitate a zonei in care aceasta se afll In enzima libera, central activ este „preformat“ ceea ce inseamn3 cS el are o configurape spapaie u§or diferite de cea necesM fix8rii substratului. Substratul induce o modificare conformaJionaM a zonei centrului activ realizandu-se configurapa optime fixMi, In Fig. II.5. se

re® una dinfre reprezentMe simplificate ale modelului Koshland. In cazul unor enzime, formarea complexului ES in varianta Koshland a lost demonstrate experimental. Pe de aM parte, din punct de vedere termodinamic a§ezarea cea mai potrivite a substratului in raport cu enzima reduce la minimum gradele de libertate in ceea ce privegte translapa §i rotapa substratului, element ce favorizeaze atingerea u§oar3 a sterii de tranzipe; aceasta este inteipretarea date scederii energiei de activare in reacpile catalizate de enzime. Specificitatea stereochimice §i mai ales inhibipa competitive a enzimelor pot fi explicate cu ugurinje pe baza modelului Koshland Desigur c& fiecare enzime prezinte o structure specifice a centrului activ (cu sterile „preforrnate“ §i „indusS.“). Aceasta nu exclude existenja unor analogii in structurile centrelor active, cel pupn pentru enzime cu funcpe apropiatS. Astfel o serie de enzime proteolitice au in centrul activ un rest de serine; mai mult, in vecinetatea restului de serine variapa resturilor aminoacide este foarte redusS (Fig. II.6). Fig. 11.4. Modelul lacat-cheie de interacjiune a enzimei cu substratul.

m .0 enzimS substrat enzimS - substrat Fig. 11.5. Modelul I(centru! activ Indus** de interact!e enzima-substrat

substrat enzima - substrat Tripsina Chimotripsina Trombina : - Gin -Asp - Gly -j Seri - G!y : - Met - Gfy - Asp -fSerl - Gly : - Gfu - Gly - Asp -1 Ser 1 - Gly Gly Gly Gly Pro - Pro - Pro Fig. 11.6. Secvenja aminoaciziior In zona centrului activ ai unor enzime proteolitice este apropiatd 80 1

Fig. II.7. Mecanismul propus pentru scindarea hldroiitica catallzata de chimotrpsina a legaturiior peptsdice (details ?n text). Existenja acestor omologii pledeaz& pentru faptul c3, cel pujin in linii mari, scindftrile proteolitice sunt asem&nStoare ca mecanism; situafia este de a$teptat sli se MalneaseS. §1 pentru alte tipuri de reacjii catalizate. O aim constatare rezultata din studiui centrulfii aetiv al multor enzime este c3 acesta se afM in „cavit&|i“ sau „§anjuri“ (crevase); polaritatea redusd sau chiar lipsa polaritSjii din aceste zone favorizeaz3 fixarea substratelor. Cunoagterea gruparilor funcjionale §i a altor detail! structural ale centrului^activ a! unor enzime a oferit §i posibilitatea formuLlrii unor mecanisme de reac{ie. In cazul chimotripsinei (Fig. II.7), se presupune cA In lipsa substratului imidazolul restului His-57 interacJioneazS prin leg^turi de H cu unul dintre atomii de oxigen ai grup&rii COOH 81 a Asp-102 §i cu H al grup&rii OH a Ser-193. Cand substratul este fixat In cavltatea in care se afiy central activ (§i a cdrai pozifionare este realizaty prin diverse interaejii) hidrogenul de la gruparea OH a serinei este transferal ca proton pe axotui restului itnidazol; el formeazS acum o leg8tur& de hidrogen cu azotul grupSrii peptidice a substratului in limp ce 0“ a restului de seriny atacS nucleofil atomul de C al gruptlrii peptidice a substratului. Prin aceste rearanjM se induce scindarea heteroliticd a legilturii peptidice; intr-o fazS

intermediary, gruparea carbonil a acestei legSturi (cu restul proteic de care este atagaty) se leagy covalent cu serina, in timp ce gruparea NH2 (de asemenea cu restul sdu proteic de care este ata§ata) formeazii legStura de hidrogen cu atomii de azot ai imidazolului. In final, restul proteic de la gruparea OH a serinei este deplasat de apy, restul proteic de la imidazol se desprinde §i el; chimiotripsina i§i reia structura inifiaiy. Un mecanism detaliat s-a formulat pentru reacjia catalizaty de lizozim. Central activ al lizozimului se prezintd sub forma unei „despicyturi“ (§an{) cuprinzand mai multe grupSri de legare §i catalitice (Fig. IL8). NumSrul resturilor de NAM §i NAG cuprinse in central activ este §ase. La legate participS. resturile de Trp-63, Trp-62, Asp-102, Ala- 107, Arg-114; gruparile carboxil din resturile Glu-35 §i Asp-52 participii la catalizy. Esenjial in mecanismul propus este faptui cM in timp ce restul Glu-35 este intr-o zonS. hidrofobS a lizozimului, el nefiind ionizat la pH-ul optim de aefiune (pH=5), restul Asp- 52 este intr-o zonS hidrofiiy §i deci este ionizat. Din cele cinci legSluri glicozidice (1-4) aflate in central activ singura care se scindeazS este cea cuprinsS intre resturile Glu-35 §i Asp-52. Gruparea COOH a Glu-35 cedeazS protonul oxigenului care formeazy legStura glicozidicy (1-4) simultan cu scindarea heteroliticS. a legyturii oxigen - C, a NAM. Restul NAG formeazy astfel gruparea OH la C4 in timp ce C{ a restului NAM devine carbocation (fiind stabilizat de interacjia cu gruparea COO” a restului Asp-52). Uimeazy atacul nucleofil a (OH)*'" din apy cu formarea grupyrii hidroxil la Ct a restului NAM; simultan ionul H+ din apS formeazy cu gruparea COO” a Glu-35 gruparea carboxil neionizaty (Fig. 1L9). Reac|iile catalizate de enzimele heteroproteice sunt gi mai complexe deoarece apoenzima §i cofactorul participy simultan la formarea complexului ES §i la catalizd.

Fig. ii.8. Reprezentarea intuitiva a centrului activ a! lizozimului (comentariu in text). 82

^C-Asp

1

(sF)

~o \JL OP' G/ u ^ 3 '"o' ae 5

■ A s p

«—- ->

G/ u35

' "'O -// M 0'K^ l/VAAf Fig. 11.9. Mecanismu! scindarii hidrolitice a legaturilor (1-4) glicozidice din heteropotizaharide, catalizata da lizozim. II.8. CINETICA ENZIMATICA Cinelica enzimaticS studiazd viteza reacjiilor catalizate de enzime in fimc{ie de variafia raportului concenirajiilor enzimei §i substratului ([E], [S]) §i a mfluenfeior unor factori fizico-chimici cum sunt: temperatura, pH-ul, inhibitorii etc. Concepfia unanim admisS in enzimologie cd formarea din substrat a produsului de reaepe implied obligatoriu existenfa complexului enzimSsubstrat (ES) redatd. prin ecuajia: E + S^=^ ES-------------------------------► E + P a fast statuata in primul rand in legdtunl cu cinelica reaejiilor catalizate de enzime; de aceea, in interpretarea fieedruia dinlre aspectele cuprinse in acest. subcapitol punctui de plecare il reprezintd chiar aceastd ecuafie, 11.8.1. EXPRIMAREA VITEZEI REACJIILOR ENZIMATICE. ACTIVITATEA ENZIMELOR Utilizarea curentdin cinetica enzimaticS a acestor termeni lace necesarS defmirea lor. Viteza de reaejie se exprimS prin cantitatea de substrat transformatS in produs de leacjtie (exprimatd in miligrame, mai mr in grame) intr-o imitate de limp (secundS, minut). 83 Pentru enzimele purificate, cSrora li se cunoa§te masa molecular^ se poate 'slabili num&rul de molecule de substrat transformate de c&tre o molecule de enzimS intr-o seconds, valoare ce reprezinta „activitatea molecular^44 a enzimei. Aceasta mSrime, sinonimS cu eficienfa cataliticft, este important^ pentru cd permite atat comparajii intre diversele enzime cat §i a enzimeior in raport cu catalizatorii chimici. Pe de alts parte, pentru enzimele a cftror activitate molecularS este stability pe baza mSsurarii canfitSfii de substrat transformat, de exemplu de c&tre un omogenat tisular,

se poate calcuia concentrajia enzimei (numSrui de molecule) din aeei omogenat. in practica biochimicft curentS, inclusiv in cadrul determinMlor enzimatice In scop de diagnostic (in special in ser), infiereseaza mai pupn activitatea absolute, fiind insS. importante variable de activitate; in acest caz este suficient sa existe o anumitS unitate arbitrarS de activitate care s3 serveascS drept referin$L Se utilizeaza urmS-toarele unitSji: - unitatea internafionald, UI; o imitate internafional& reprezintS cantitatea de enzimS care asigurd conversia unui prnol de substrat/min in condipi standardizate de p.H, temperature, prezenfa cofactorilor (care sunt stabiliji pentru fiecare enzima), - Katalul (Kat); un Kat reprezinta acea cantitate de enzima care asigura transfer- marea unui mol de substraf/sec (cu multiplu kilokat §i submullipli mkat §i pleat). Pentru unele enzime se ufilizeazl §i alte unitafi. Astfel pentru oxidoreductazele cu coenzime MAD" (NADH -f H+) sau (NADPH -f H*) activitatea se exprimS prin cregterea sau sc^derea extinefiei la 340 nm formele reduse ale enzimeior absorbind aceastl radiate, if. timp ce formele oxidate no o absorb; o unitate enzimatice pentru aceste hidrogenazedehidrogenaze reprezinta cre§terea sau scMerea cu 0,001 a exlincjjiei la 340 nm intr-un minut (cuva de 1 cm). Pentru fosfatazele din ser se utilizeaza unitatea. Bodansky care reprezinta cantitatea de enzima ce formeaz3, prin hidroliza esterilor fosforici, un mg de fosfat anorganic (in condifii standardizate de pH, temperature). II.8.2. VITEZA INIJiALA A REACpiLGR ENZIMATICE

Fig. II.10. Determinarea vitezei inijiale (v0) a unei reacfii enzimatice. Dacd unui substrat aflat in solujie i se adauga o cantitate de enzima care catalizeazS transformarea acelui substrat se constate c8 form area in timp a produsului P are loo dupd o curb# ca cea din Fig. ILK). Ea are o porjiune rectilinie (cu panta constants), apoi se incline §i in final se aplatizeazd. Este necesar ca in mSsitrStorile de cineticS sa se la valoarea notatd v0, numitd viteza inijiaia §i care reprezinta viteza. reaefiei pe porjiunea rectilinie. DatoritS concentra- Jiei mart a substratului corespunzStoare acestei porjiuni, ES se transforms numai in E + P (nu §i in E + S). in practice se determine viteza reaefiei in primele secun- de (sau minute pentru reaejii lente) §i aceasta se considers v0. 84 0.8.3. INFLUENTA PH-ULUI §1 TEMPERATURE ASUPRA ACTlVITA'p! ENZIMELOR Enzimelc produse de cclule pentru cataliza reacjiilor care au ioe in

inleriorul lor sau in afara-dcaxul enzirnelor piasmaticc, digestive) sunt adupiate condifiilor' dc pH, temperature alter factor! caracteristiei locului de aejiune. Daea in organismui uman temperatura la care se desfli^oanl loate reacjiile enzimatice este in mod curent constants (37°C), aland cand se fac sludii de cinelka in vitro, temperatura poaie 1.1 variola in limile destul de largi. Activitatea orciirel enzime variazJl .cu temperatura duplt o curb;! ea cea din Fig. 11,11. Credere a vitezei reacjici catalizate odatfi cu cregtcrca tempexaiurii este interpretaffi prin prisma „cnergiei de activarc‘7 a$a cum sa prezentat anterior. Pentru Occam enzinia se poate stahili (in condiljile menjineiii constante a celorlaiji paramefri) an „coefieient lerrnic al reaepei^ noiat Q10 a.uo reprezintsl cre^terea vitezei reaejiei' pentru o credere cu 10°C a te.mpera!:urii. Valoare.a cocfieientului formic pentru reacfiile enzimatice tone oupnasil obi§nuit intre .1 §i 2 Find rnarmicfi decar pentru reacjiile chimice necatalizate (Q10 intre 2 §i 4). Reiajia este vaiabila numai pfln3 la o anumM temperature nurnilS temperatura optima, pentru -care viteza atinge valoarea maxima, Paste lopt viteza reaejiei scade brusc daforifll denalurarii termice a apoenzimei (conslSnd mai ales in ruperea legaturilor de hidrogen), fiind afcctat §i cenirui activ. T t pentru enzimcle din organismui uman este intre 40-50°C. Existd enzime, in alle sisteme vii, a diror topE este mai. ridicatiS (la plante 50-60nC, chiar 80-100°C la enzime din microorganisme care fraiesc in ape termale). Cand sc detenmna aetivitSfile unor enzime in scop diagnostic (de exempio activitatea enzirnelor plasmatice), este obligatoriu oa aceasta s& se fact! la o temperature fix&, in cazul color mai multe dintre eie 37°C. Infiuenfa temperatuiii asupra activitajii enzirnelor esie foarte important^ in criobiologic; un caz II constitute conservarea la temperatuiri sdSzute a orga.nel.ar in vederea transplantului.

100 Fig. if.11. Variajia activitatii enzirnelor tn funeji© de temperatura. ~20 ’~40 SO t*C 85 ■

Fig. If.12. Varia]ia activit&jH urtor enzime In funcjie de pH. Viteza reacjiilor enziinatice este influen{at&, de asemenea, de pH. Pentru enzimele din organismul urnan pH-ul optim de acjiune este ehiar pH-ul normal al mediului in care ele i§i indeplinesc funcjia calaliticS (cazul pepsinei §i tripsinei din Fig. IT. 12.). Cum in majoritatea jesuturilor din organism pH-ul este in jur de 7 §i enzimele au acjiune optima in apropierea acestei valori. Diminuarea vitezei reacjiei enzimatice la valori de pH mai miei sau mai mari decat cel optim se realizeazdin mod specific pentru fiecare enzimft. In ire multiplele acjiuni ale ionilor H+ OH“ asupra enzimelor se menjioneaza in primul rand efectul ior denaturant; spre deosehire de efectul denaturant al temperalurii, in acest caz se rup mai ales legSturile de tip electrovalent. La enzimele in al eSror centru activ se afkl grup&ri ionizabile, acide sau bazice, acesla interacjioneaza direct cu ionii H+ §i OH~\ rezultalul fiind cre§terea sau sc&derea gradului lor de disociere; ionii §i OH“ acjioneazd in acest caz ca adevtiraji inhibitori (vezi mai depaite inhibijia activibljii enzimelor). Un exemplu de acjiune a pH-ului asupra enzimei il constituie inactivarea la nivelul stomacului (pH 1-2) a amilazei salivare (pH optim 6,6-6,8) care este antrenata cu aiimentele din cavitatea bucalS. IL8.4. INFLUENZA CONCENTRAJIEI ENZIMEI Eficienja cataliticS deosebitti a enzimelor este responsabil& de faptul c& in reacjiile enzimatice ce au loc in vivo, concentrajia substratului este mult superioarS concentrajiei enzimei; exists totu§i unele situajii cSnd regula nu se respects, concentrajia enzimei putand fi chiar mai mare decat cea a substratului. In vitro este foarte u§or s& se fac& un asemenea experiment, Iuand mai multe eprubete care confin aceea§i cantitate de substrat dar cantiklji din ce in ce mai marl de enzimS. DacS se determine vD pentru fiecare probfi §i apoi se reprezintd grafic vc in funcjie de fE] se objine o dreapttl ca cea din Fig. 11.13. 86 Fig. 11.13. Yarialia vitezei unei reacjii enzimatice In funcjie de concentrajia enzimei.

Matematic, aceastft linearitate se exprimS prin reiafia: v0 =■ K * fE] . ' unde K esle o constants caracteristicS pentru fiecare sistem enzimS-substrat. Cre§ierea lineanl a vitezei se explicS prin form area complexului ES in dependent dear de [E], m acesle condijii complexul transfonrsandu-se integral in produs de reaefie. in aceastS reprezentare, la o concentrajie a enzimei egnLl cu zero, vG = 0, sugerand cS reactia nu se desfS§oarS deloc in lipsa enzimei. Totu§i reprezentarea este corectd pentru c£ in praetiea enzimatica curentS v0 in lipsa E se scade din v„ in prezenja ei (se face on a§a numit „blanc“ reprezentSnd tocmai valoarea lui v0 in iipsa lui E care se scade din vaioarea v0 a fiecitrei probe). Proporjionalifatea inlre viteza vD §i [Ej are importante aplicajii practice; de exempt u, este posibil sS se esiimeze concentrajia relative a unei enzime in omogenate ceiulare fM a fi necesar sil se efectueze o purificare prealabilS a acesteia. Pe de o parte, vc = K . [E], iar pe de alia parte vD = [P]/t (unde [P] = concentrajia produsului reaejiei, t = limpid de desiilsurare al reaejiei); deci: K . [E] - [P]/t sau [EJ - [PJ/K * t Dacd timpul pentru studierea reaejiei este mereu acelagi (deci constant) §i produsul K *t *= constant (notat K,); in aceste condijii, concentrajia in enzimM este direct proporjio- nalft cu cantitatea de produs format [E] = [PJ/K,. Asemenea m&surittori de concentrajii relative a enzimelor se efectueazii sistematic in laboratoarele de analize medicate (mai ales asupra sftngelui) deoarece variajiile sunt corelate cu diferite sUlri patologice, (vezi subcapitolul „Enzimele in diagnosticul clinic") ■ 11.8.5. 1NFLL1ENJA CONCENTRATE! SUBSTRATULUL ECUATIA MICHAELiSMENTEN Concentrajia majoritniii enzirnelor cel ul are este constants! in limp; fac excepfie en/.imelc numise Jnduetibiie" (vczi „Regiarca aclfvinijii cnzirncior") precum si enzimde piasoraliee neftrnejionale a cftror concemrafie create sau seade in anumile st&ri palologice (vczi „Rcia[ia ertzime - patologie"), la schimb, concenirajia subsiratelor color mai rmiRe cnzime variazd clcstul cie mult dupa starea metabolic;! a jesul.iiJui §i numerous aJU fac tori. De acoca dependent vitexei do reacdo de concealrafia substratului consliiuie aspectui cel mai important al cinelicii enzimaiice. In accst caz, reprezentarea graded a lui vcI.n funefie de [S] ((EJ, temperalura $i pH-ul fiind constranlc) conduce la o

curbft cu aspect de hiperboN (Fig. IT 14), Exisfa p exceppi, enzime peniru care in Ioc de hiperbolil se obfine o curb*1 sigmoidall ACA „Enzime!e alosteriec")* Din analiza curbei rciese cM vD create proportional cu crcgterea [Sj numai peniru valori mici ale aceslda; apoi cregterea se face lol mai lent pentru ca dineolo de punctul IT orient de mult or creole [S], viteza reaejiei r&nane constant*!; valoarea constants a vitexei este §i valoarea maxima, notatft V1llax. Explicajia alurei curbei precum §i o ecuajie in care vc se expound In funejie de |S), VIIWX §i o constants! KM, se datoreazft lui Michaebs $i Men ten, In deduecrea ecuapei se plead! de ia; T K-3 EvS ES -. ..E + P (1) Ka In compietare la ceie menponate anterior in legating cu acc&sfS ecuajie geoerald se precixeaxA cS transformarea ES »» ErF este de reguld ireversibild din douil mo tive: pe de o parte, este etapa mai iemUl, pe de aim parte, P devine, in cadrui edii metaboiice speeifice,. substrat pem.ru reaefia unnatoarc p docs, se consume rapid (exists louigi reaejii erizimatice in care re form area lui ES din E p P nu poate fi neglijatS),

88 0 Fig, 11,14. Variajia vitezei reaejiei enzimatice in funcjle de concentrajia substratuiui. Deoareee viteza reacjJei caializaul cnzimatic se expand prin canritatea cle P formal inlr-u imitate de limp, iar [P] este proporjionald cu [ES], sc poate scric vo - K3 ’ [ES). (2) Cantilatea de ES disponibilil pentru transform are a in E $i P este insa dependent;!, pe de o parte, de viteza cu care sc £orrneax;1, iar, pe de alia parte, de viteza de disociere in E §i S; aceste viteze sunt redate prin: -■ - viteza de formare a lui ES = K, • [E]*[S] (3) node [El reprezintS concenlrajia enzimci libere (ciisponibila in momenn.il da.t pentm form area ES);

-.viteza de disociere a lui ES = k2 • [ES] (4) Dacf reaejia face parte dinir-o eale metabolic:! fES] r&mane practic constant;! ('"steady state'", stare staponara) §i variaz;! numai [S] §i [P]. Condifia matenialicfi pentru aceasta este e.a viteza de formare a iui ES stpfie ega!2 cu suma vifezelorde transformare in E §i P $i refaeere a lui E + S, deci: K,-[E]-[S] *= (K2 -f- Ks) ■ [ES] sau: K2 -r K3 .. [E] * [3] —~ “ *[E^" RaportuJ conslantelor este tot o constant.fr nolat& KM, deci: [E] • [S] K, [ES] (5) (S) (7) care poate fi serisa gi sub forma: [ES] [E]-[S] (8) Deci pentru calculul pe baza ecuafiei (7) a lui KM, care are o deosebild important in enzimologie, este necesarfi m&surarea directs, a lui [E] §i [ES], Aceste determimlri sunt de-seori dificiie; de aeeea se urmSregte objinerea unei ecuafii in care KM sa fie corelat. cu parametri mai u§or mSsurabili. in acest scop |E] se exprirrul prin: ra - [Et] - [ES] unde [ET] este concentrajia lotah! a. enzirnei in mediu. Substituind pe [E] din (9) in (8) se objine: [ES] ([Et] - [ES]) -[S] KM care- prin rezolvare conduce la; [ES] [ET3 • [S] __ (9) (10) (11) 89 Subslituind aceasta valoare a lui ES in (2), se ob|ine: (12) v 0 KM + [S] Cum s-a ardtat, cand eoncentrafia substralului este mare (caz frecvent in vivo), vileza reacfiei este Vimx ceea ce presupune participarea in totalitate a enzimei la reacfie, deci; vmax - K3 (Et] (13) Subslituind in (12), se obfine: Vm„ [S] Vn- .. (14) KM + [S] Aceasta este ecuafia Michaelis-Menten sau ecuafia de vitezS a reacfiilor

enzimatice cu un singur substrat. Ea redd deci variafia lui v0 in funcfie de variafia lui [S]; in ecuafie mai apar constanta KM §i VnM (care exprimS indirect eoncentrafia. enzimei). Coneordanfa ecuajiei cu alura corbel din Fig. 11.14 este excepfionald; pentru verificare se dau doud situafii: a. Cand S are eoncentrafia foarte midi (corespunzdtor porjiunii O - A pe curba), valoarea lui la numitor poate fi neglijald §i ecuafia (14) devine: V0 = 22L2LK • [S] (15) .KM adicd v0 este direct proporfionald cu [S]; b. Cand S are eoncentrafia foarte mare in raport cu KM (corespunzator punctului B pe corbel), valoarea acesteia din urmS poate fi neglijatd, deci; adicd vc atinge valoarea maxima. V,ax [S] [S] (16) 11.8,6, DETERMINAREA EXPERIMENTAL^ A KM; SEMNIFICAJIA ACESTEI CONSTANTE. CONSTANTA CATALITICA, Kcat Fiecare enzimd se caracterizeazd printr-o valoare particular^ a KM; aceasta valoare se determine in principiu astfel: se prepare o serie de 6-10 probe (iritr-o solufie tampon potrivitS) introducandu-se in toate aceea§i cantitate de enzimd dar realizandu-se un gradient crescdtor al substratului. Reacfia, declan§atd in momentul amesteedrii enzimei cu substratul, este idsatd sd se desfd§oare un anumit timp (secunde, minute, dupa caz) apoi este intreruptd prin adaosul unui inhibitor potrivit. Se masoara in fiecare proba cantitatea de produs format; cu aceste date se calculeazd valorile v0 care se reprezinta grafic in funcfie de [S] crescator. Se obfine curba hiperbolica caracteristicd (Fig. 1,1.14). Porfiunea dreapta paraleia cu abscisa (corespunzatoare saturdrii E cu S) se prelunge§te pand la interseefia cu ordonata; interseefia reprezinta V^. Se ia valoarea V^/2, se duce o dreapta paraleia cu abscisa pand la interseefia cu curba §i de aici se duce o dreaptd paraleld cu ordonata pdnd la interseefia cu abscisa, care este chiar KM. 90 Dac& in ecuafia Michaelis-Menten se substituie v0 cu Vmax/2 se objine succesiv: vmax fS] —«— 2[S] ~ Ku+ [S] KM - [S](17) 2 K„ + [S] Se trage concltizia: KM reprezintS acea concentrate a substratului pentru care viteza reacfiei este jumState din V£nax; in consecinjS valorile lui KM se dau in moli/litru. Semnificajia iui KM reiese dac£ se apeleazS la formula (6): KM = (K2 + K3)/K,; considerand K3« K, se objine KM = &A §i dec! „KM red£ capacitates de disociere- a lei ES in E + S"; in alfi termeni, ea red5 tSria leg&lurii intre E §i S in complexul ES. Valorile lui KM pentru diverse enzime sunt cuprinse intre 10'1 - 10*6 moli/litru. Se conchide: - valorile mici ale KM corespund unei leg&turi slabe intre E §i S;

- valorile mari ale KM corespund. unei legftturi putemice intre E §i S. In cinetica enzimatica se utilizeazS §i o altts constant#, notat# care se define§te prin raportul: Ea red# numeral de transformed substrat ~> produs pe care fiecare centra activ le catalizeaz# lntr-o unitate de limp (turnover). Cunoscand valorile §i semnificafiile lui KM §i Kcat se poate calcula Kcat/KM care red# eficienfa catalitic# a enzimei (Tabelul II.2). Tabelul 11.2 Valorile K*,, Kcat §i Kcat/K„ ale catorva enzime Tn raport cu substratele Enzima Substratul KU(M) Keatfs1) KJKM Acetilcolinester Acetilcolin 9,5x1 1,4x10“ 1,5x10® 5 aza a O’ Anhidraza 1,2x1 carbonica C02 O'2 1,0x106 8,3x107 Anhidraza 2,6x1 carbonica HCO“ O'2 4,0x105 1,5x107 2,5x1 Catalaza H2O2 O'2 1,0x1o7 4,0x10s Chimotripsina Esterul 4,4x10'’ 5,1x10'2 1,2x10'’ etilic ai Nacetilglicinei 5,0x1 Fumaraza Fumarat O'6 8,0x102 1,6x10® Ureaza Uree 2,5x1 1,0x10“ 4,0x10s 2 O' 91 118,7. ECUAJIA LINEWEAVER-BURK Maiemalic, ecuajia Michaelis-Mcnten poale fi transformatfi in moduli variate. O .variants, datorata Iui Lineweaver §i Burk, este forma reeiprocii: A= . (19) +J r V ” "v Tsi “ Variabilele fiind [S] §i v0, ecuajia este de forma general# y = a.x + h; reprezenland grafic 1/v0 in funcjie cic 1/{S] se obfine o dreapta (Fig. 11.15). Iniersecjia dreptei cu ordonata corespundc valorii 1/Vmax, iar pania dreptei este data de KM/Vmax„ Dac# se prclungegie dreapta pan# la iniersecjia cu* abscisa, se objine valoarea -1/KM. D i n punctul do vedere al determinant experimentalc a Iui KM §i VIIWJl reprezentarea Iui l/v0 in funcfie de i/[S] este avanlajoasfi, mimanil de probe necesare penlru objinerea dreptei (,>i d.ect a !ui Vmax JCM) fiind mult mai mic In comparajie cu numftrul de probe necesare objincrii hipcrboiei. Pe de alt# parte, ecuajia Iui Lineweaver §i Burk este extrem de utiId in studii de .inhibijle a aclivit&Jii enzimelor prin compu§i chimici. /A'


'"'Fanta z-; A: ’M max Fig. 11.15. Reprezentarea grafica a ecuatiei Ltneweaver-Burk. IL8,8. INHIBIJIA ACTTVITAJII ENZIMELOR Activilatea multor enzime este inhihat# de compugi chimici divergi; In sistemele vii asemenea compugi pot fi de origine endogen# (de exemplu diferiji metaboliji) sau de origine exogen# (cum sunt agenjii toxici sau unele medicamente). Inhibifia enzimelor poate fi reversibil# §i ireversibi.13, aceasta din urm# numindu~se §i inactivare. In ambele cazuri inhibitorul se leaga de enzirml, dar in timp ce in inhibijia ireversibil# leg&tura enzim#~inhibitor este putemicft (covalent#), in inhibijia reversibil# legStura este siabft. 92 Un exemplu de inhibijie ireversibite este oferit de acfiunea iodacetarnidei asupra enzimelor care au in central activ o grupare - 5H; are ioc reacjia: Enz — CH2 — SH+ CH2 -- COMH2 ——► Enz — CH2 — S — CH2 — CONHa + HI Complexul Enz — CH2 — S — GH2 — CONH2 este complet inactiv (nu poate fixa substratul). Tot grupSrile SH din centrele active pot fi blocate §i cu acidtii paraclormercuribenzoic in timp ce grupSrile hidroxil din centrele active (cum este cazul tripsinei) sunt blocate de inhibitorul di-izopropilfluorofosfat Se cunosc douS variance majore d:e inhibipe- reversibilil; a) Inhibifia competitive, prod usd de irihibitori care se leag& tot la nivelul centrului activ al enzimei, dar prin legdturi slabe. in cazul prezenfei simultane in medio (sau In celule) a substratului §i inhibitorului, intre acedia are loc o compefijie pentru fixarea pe enzirrte. La o capacitate egate de legate la nivelul centrului activ a substratului §i inhibitorului, enzima va fixa acegti competitors. in raport cu concentrapile lor. Inhibitorii competitivi 'sunt compugi cu structure apropiate de cea a substratului. Evenimentele care au loc pot fi reprezentate simplificat:

In acest tip de inhibipe, partea din enzima aflatd sub forma complexului El poate fi recuperate daat in mediu apare un execs de substrat (datorite reversibilit&fii E + I ** El). Precizarea cd un anumit compos este inhibitor competitiv pentru o enzim# data se face in mod simplu; se traseazS dreapta l/v0 in funefie de 1/ [S] pentru prezenjain mediu a lui E §i S §i apoi aceea§i dreapte pentru prezenja in. media a E, S §i I. In ultimul caz se remared o pante crescute a dreptei, interseejia cu ordonata nefiind modificate. Valorile interseejiei prelungirii dreptei cu abscisa. §i panta. dreptei sunt modificate cu coeficientul 1 + [Ij/Kj, unde are semnificafie asemdnhtoare lui KM dar pentru icacfia lui E cu I (Fig, 11.16). Fig, !L16. Reprezentarea grafic^ a ecuatiei Lineweaver-Burk Tn cazul inhibijiei competitive.

93 Printre numeroasele inhibijii competitive cunoscute sunt §i urmStoarele: Succinat dehidrogenaza, enzima ce catalizeaz# transformarea acidului succinic in ac-id fumaric, este inhibat# de acizii dicarboxilici malonic, malic §i chiar oxalic. COOH .1 CH2 1 CH2

COOH 1 CH2

1 COOH

COOH 1 CH — OH i

COOH 1 COOH

GH2

COOH

COOH

acid oxaiic Un num&r de medicamente larg utilizate i§i datoreaz# efectele faptului c# sunt inhibitor! competitive De exemplu, sulfaniiamida, cea mai simple sulfamidL este asem&n&toare structural cu acidul paraaminobenzoic pe care il poate inlocui in cursul sintezei acidului folic de cfttre bacterii (vezi vitamine §i coenzime); cum acidul folic este indispensabil bacteriilor, acestea mor (la om nu se intampl# acest lucru deoarece el ia din hran# acidul folic). acid succinic

acid malonic

H2N

COOH

H2N

acid mafic

SO2MH2

Aacid para-aminobenzoic Suifanilamida In chimioterapia cancerului se utilizeazl analogi structurali ai bazelor purinice §1 pirimidinice; ei Inhibit sinteza de acizi nucleici impiedicand diviziunea celular# care este mult mai rapid# la tumori. b) Inhibijia necompetitiv#; in acest caz inhibitorul, a c#rui structure poate $& difere destul de mult de structura substratului, se leag# prin legSturi slabein alt loc decat centrul activ a! enzimei. Afinitatea pentru substrat a enzimei pare a nu fi modificatL Exist# ins# posibilitatea ca o parte din ES cat §i EI s# formeze complex ESI; transformarea lui S din acest complex in P este sc&zut# in raport cu transformarea lui S din ES, deci atat v0 .cat §i sunt mai mici. Inhibifia necompetitiv# depinde numai de concentrafia inhibitorului (§i de afinitatea. enzimei pentru el) deoarece substratul in exces nu il poate deplasa pe acesta. t ES E ESI >- El + P (pujin) El Dac# se studiaz# cinetica unei asemenea reacjii, reprezentarea l/v 0 in funcfie de 1/[S] conduce le o dreaptS a cdrei prelungire intersecteaz^ abscisa in acelagi punct cu dreapta objinut# fM inhibitor (deci valoarea KM nu este modificat#); in schimb, sunt modificate intersecfia cu ordonata §\ panta (Fig. 11.17). 94 Fig. IL17. Ftorazentarea grafted a' ecuajiel Uneweaver- Burk Tn cazuJ inhibljiel necompatitive.

Exomple sunt unele enzime care confin grupM SH iibere in alte pozijii decat centrul activ, Aceste grupftri pot fixa prin leghturi slabe ioni ai unor metale grele cum sunt Ag+ §i Hg+ care dirninuft sau chiar anuleazh capacitatea enzimelor de a transforma substratele in produ§i. A§a se explicit efectul otrSvitor til multor metale grele. ■ 119 REGLAREA BIOSINTEZEI §1 ACTWITA11I ENZIMELOR II.9.L ASPECTS GENERALE insulin cum sunt capacitatea cataliticS deosebiti, specificiiatea, inhibarea prin diverji compu§i etc., se shidiazh in detaliu urm&rind comportarea

enzimelor cxtrase, puiificate §i dizolvate In mediu apos; in aceste condijii, atunci cand se studiazS acjiunea unui anumit factor, de exemplu a unui inhibitor, ceilalti parametrii cum sunt temperatura, pH-ul, concentrajia enzimei §i substratului, prezenjain limitele necesare a cofactorilor etc., se men Jin la valorile dorite (de regulh cele optime). §i pentru enzimele care i§i desfa^oarh activitatea in organismele vii, o parte dintre factorii mentionaji se menjin la valori constante sau variaziX in limite resttose. Apar totu§i relativ frecvenl 51 situajii deosebite; intre acestea variajiiie man in top ale concentrajiei substratului (de exemplu a glucidelor, lipidelor §i proteinelor in tractul digestiv) §i acumularea pesfce Limite a producer final! a c&lor metabolice sunt cele mai freevente. Se menjine in astfel de situajii in celule, organs sau organismul intreg o concentrate stajionarh §i o activitate constants a tuturor enzimelor? R&spunsul la aceasth intrebare a venit mai intai din studiul unor process metabolice la organismele simple (bacterii) la care s-au rcmarcat, funejie de condijiile create in mediu, crejteri §i scftderi in limite foarte marl ale cantitajii unor enzime, sau, in alte eazuri, variatii insemnate ale activit&jii enzimelor. Aceste variajii cantitative sau 95 caliiative. consliluie de fapi modaliftji de reglare care sunt alribulul biocatalizatorilor. Prin intermediul reacfiilor cataiizate de asifel de enzime (dar gi prin prezema sau absenfa cofact.oii.lor, .a inhibitorilor etc.) bacteriile igi menfin homeostazia in raport cu. medial extern. Pe baza cunogtinjelor actuate, se poate afirma ca gi In organismele superioare •toate procesele care au o bazfi molecular#. sunt reflate prin enzime; la acesfe organisme, datoritS specializilrii celulelor gi organelor, pe de o parte, gi a funcfiei integrate, pe de altil parte, regiajul cantitaliv sau calitativ al enzirnelor la on anuniit nivel poate avea ecou la nivelul organismului intreg, In afara condifiilor nienjionate (exces sau lips# de substrat, exces de produs,etc.) se menjioneaz# aid c# aefiunea hormonilor serealizeaz# final prin intermediul unor enzime de reglaj specializafe (vezi capitolul ^HormonD). In cele ee urmeazd sc prezintil reglarea cantiliSjii enzirnelor-(pe scurt) gi cele do oil variante rnajore de reglare a a.ctivit#Jii enzirnelor: reglarea alosteric# gi reglarea covalent#, 11.9.2 REGLAREA CANTITATH ENZIMELOR Cantitatea oricfirei proteine din organism, deci gi a enzirnelor, rexulla din dinamica proceselor de biosintez# §i degradare. Vitezade schimb (tunioverul proteinelor) exprimata prin timpul de injuiMLlfire, Tl/2, este foarte variat# (vezi „Metabolismul proteinelor gi ai aminoacizilor'*). Se gtie c# proteinele se sintetizeaza din aminoacizi; pe- de alia parte, produgii de degradare ai proteinelor sunt, de asemenea, aminoacizii. Se poate scric relajia: K. Aminoacizi Proteine (enzime) Kd unde K3 este 0 constant# general# a procesului de sinfezS, iar K.d este 0 constant# general;! a procesului de degradare. Dependent de vaioriie celor dou# constante generate se disting situajiile: Ks > K(l concentrate absent# a enzimei; ' Ka - K[t concentrate stajionanl a enzimei;

K;i < Kd concentrate sc#zut# a enzimei; M.ajoritatea enzirnelor au K,f = Kd; eie se numesc enzime constitutive, Enzimele la. care Ks> Kd se numesc inductibile, cele la care K.s < Kd se numesc represibile. Se face pre- cizarea c# inducjia sau represia sintezei enzirnelor nu au caracter permanent gi ca la o aceeagi enzim# inducjia simezci altemeaz# cu represia acesteia in funejie de necesit#Jile de moment. Inducjia sintezei se restrange de regul# 1a. 0 singura enzimil dintr-o cale metabolic;! (de ex. inducjia prin substrat a 5-aminolevulinatsintetazei, 8ALAS, 1n calea biosintezei hemului). Exists situajii de induejie simultan# a mai multor enzime; de exempiu, inducjia enzirnelor hepatice ilustrat# prin aceea c# la o diets bogaf# in proteine, in decurs de 1-2 zile stmt sintelizate cantit#{i man de enzime din c#ile metabolice de degradare ale aminoacizilor gi din gluconeogenez#. Schimband dieta in una bogat# in glucide, sinteza enzirnelor nienjionate este represai# gi este indus# sinteza enzirnelor din calea glicolitic# etc. 96 Represia sintezei enzimelor se face de reguIS. prin intermediul unor compugi cu molecule mic&, numiji corepresoii; ei acJioneazS sub forma de complexe cu proleine spccializate numite aporeprescri, Mecanismeie inducjiei §i represiei sintezei enzimelor, bine cunoscute In prezent, nu pot fi Infelese decal in contextul mai larg ai mecanismului biosintezei proteinelor coordonai de acizii nucleic! Aceste aspecte sunt tratate in capitolul „Bk>sinteza proteinelorA 11.9,3, REGLAREA ALOSTERICA A ACTIVITAJ11 ENZIMELOR In subcapitolul referitor la cinetica reacjillor catalizate de enzime s-a menjionat c5 pentru unde dintte acestea curba variajiei lui v0 in func|ie de [S] are un aspect, sigmoidal (Fig. 11.18). Viteza micS a reacfiei. la in-ceput urmatS de cre§lerea marcata la. concentrajii mai marl ale substratului, sunt rezultatul unor mecani-sme particulare de aefiune a enzimelor ce cafalizeazS aceste reacfii. Hot&ratoare pentru elucidarea acestor mecanisme au fost cercct&rile efectuate de J. Monod, J.P. Changeux §i F. Jacob, in a nil '60, asupra reghliii acfiviliifii unor enzime bacteriene. S-a constatal: de exemplu cA In biosinteza L-izoleucinei din L~treonin& (care constS din cinci reacjii catalizate de tot atitea enzime), L-izoleueina in exces inhite intreaga cale melabolica. Nu sunt Insd inhibate loale enzimele ci doar prima dintre ele, L-treonin-dehidi^ataza; ea catalizeazS transformarea L-treoninei in a-cetobutirat + amoniac (Fig. II19). 1. enzima alosterica cu elect homotrop; 2. enzima alosterica + modulator pozitiv; 3. enzima alosterica + modulator negativ. Fig. il.18. Reprezentarea grafica av0 = f([S]) pentru:

0 + [S] CHs CHs I L ■■ treonfn - a - cetobutirat CH2 HO-C-H I dehidrataza + NH3 H—C—CHs H-C-NHi I COOH L - treonina COOH L - izoleucina (-> Fig. 11.19. Inhibarea activitSfii L-txeonin-dehidratazei de cStre L-izoleucina aflatS in exces. 97 Pi F2 P"$ —+p c_££_^ £}__► t________________________ _ _ £-;______________j (a) /

-——►• P2

(b) E1 E2 A-5t-+B-==-+■ C---------------►——► -----► P 'A (c) (+) Fi F9 F-t FA A-RL^ e C-—> D-4- ► E-—-►-----■> P v ~ ~ W fV (d) Fig. il.20, Moduiarea activitajii enzimelor aiosterice: (a) inhibi|ie Tntr-o cafe metaboiica lineara; (b) inhibifii In cale metaboiica cu ramificajii; (c) activare prin substrat; (d) feed-forward stimuiare. Studiind §i alte c&i de biosintezfl, Monod §i colaboratorii au fost in m&sura sS generalizeze c& produsul final, acumulat peste necesit&jile de moment, devine inhibitor al enzimei care catalizeazd prima sau una din primele reacjii ale girului celor implicate in biosin teza sa (Fig. II.20.a). in cazul cfiiior metaboiice cu ramificajii, produgii finali sunt inhibitor! ai enzimelor care cataiizeazd reacjiile de la nivelul ramificajiilor; deseed, fiecare dinlre produgii finali inhibit gi activitatea primei enzime (Fig. II.20.b). Monod gi colaboratorii au denumit acest tip de inhibijie, inhibifie prin produs final, inhibijie feedback sau retroinhibijie; enzimeie inhibate s-au denumit enzime aiosterice iar inhibitorii, inhibitor! alosterici sau modulatori (efectori) negativi. Au fost idenlificate §i enzime aiosterice a c&ror activitate create in prezenja unor compugi care au fost numiji activatori alosterici sau modulatori pozitivi. Asemenea modulatori pot fi substratul (care acliveazd prima enzimS) (Fig. II.20.c), unul dintre intermediari care activeaz& o enzimit aflatS in continuarea c&ii metaboiice (feed-forward stimuiare) (Fig, II.20.d), diferiji alji compugi. Al&turi de denumirile deja enumerate se utilizeazd gi aceea de efectori alosterici in leg&tur& cu totalitatea compugilor cu rol activator sau inhibitor. 98 Pentru cele mai multe enzime alosterice exists atat modulator! pozitivi cat §i negativi. Modulatorii intensified sau scad activitatea enzimelor ca urmare a fixdrii lor pe acestea. Locurile de fixare sunt distincte pentru modulatorii pozitivi §i cei negativi §i altele decat centrul activ. De aid denumirile de enzime alosterice, inhibitor! alosterici (alio = alt loc). Existd in prezent mai multe argumente, bazate pe cercetdri experimentale, privind locurile distincte de fixare pe enzime a activatorilor §i inhibitorilor de acest tip. Astfel, s-au realizat „desensibilizdri“ ale unor enzime alosterice prin aepuni fizice sau chimice: pH-uri extreme, enzime proteolitice, ureea, temperaturi sedzute sau crescute, unele radiajii; s-au realizat astfel de models experimentale inc&t sd fie afectate numai locurile de legare ale modulatorilor nu §i centrul activ. In alte experience s-a putut proteja centra! activ de aejiunea unor agen|;i denaturaji prin intermediul modulatorilor. §i alte insugiri ale enzimelor alosterice, a reacjiilor catalizate de ele, precum §i a condifiilor in care se desfdgoard aceste reaejii au importance

pentru cunoagterea fie a mecanismului de aejiune, fie a rolului de reglatori a editor metabolice. Intie acestea se citeazd: -din punct de vedere structural, aproape toate enzimele alosterice sunt oligomeri, de reguld cu numdr par de monomeri: doi (mai rar), patru, §ase etc.; - reacfiile catalizate de aceste enzime au AG0’ negativ, sunt deci exergonice §i ireversibile; ele imprimd sensul unic a! editor metabolice din care fac parte; situ area chiar la inceputul edii metabolice a acestor reaejii asigurd nu numai un control ai intensitSjii edii, dar §i imposibilitatea parcurgerii ei in sens invers, ceea ce se traduce printr-o economicitate maximd; -compugii chimici cu rol reglator a enzimelor alosterice. (efectorii) sunt prezenji permanent (rareori doar intermitent) la locul de aejiune al acestor enzime; variazd doar concentra{ia lor. Mecanismele (modele) propose pentru expiicarea, cu respectarea datelor experimentale ardtate, a aejiunii enzimelor alosterice au fost numeroase. Dintre acestea s-au impus doud: modelul concertat (simetric) imaginat de Monod, Wyman §i Changeux (modelul MWC) §i modelul seevenfial propus de Koshland, Nemethy §i Filmer (modelul KNF). Cele doud modele au cateva elemente comune: a. fiecare monomer al oligomerului are centrul sdu activ; b. monomerii „coopereazd“ in fixarea substratului §i deci in desfdgurarea procesului catalitic. Prin cooperare se injelege cd la fixarea substratului monomerii se influenjeazd. De exemplu un monomer care a fixat substratul mdregte capacitatea de fixare a acestuia de cdtre ceilalfi monomeri (cooperare pozitivd); fixarea substratului de cdtre un monomer poate avea ca efect diminuarea capacitdfii de fixare a lui de cdtre ceilalfci monomeri (cooperare negativd). Cooperdrile acestea se fac numai prin intermediul centrelor active ale monomerilor (deci centre de acelagi tip); ele sunt de tip homotrop, Dacd avein insd in vedere cele ardtate anterior §i anume cd enzimele alosterice sunt conti'olate §i de modulatori (care se leagd in alte pozifii decat substratul) interaejia se face §i la nivelul locusuriior pe care se leagd modulatorii; astfel de interaejii se numesc de tip heterotrop; cele mai multe enzime alosterice sunt de tip mixt, homotrop-heterorop; c. interacfiunile intre monomeri in oligomer, atat in cazul efectului homotrop cat §i a celui heterotrop, nu implied modifiedri profunde (formare sau rupere de legdturi covalente) ci doar modifiedri conformajionale. De aceea reglarea alosteried se face cu consum minim de energie. 99

Starea R ~ substrat Fig, 11.21. Fixarea substratului §i tranzifia T -» R in cazul unei enzime alosterice formata din doi monomeri.

Modelul simetric postuleazl suplimentan - Oligomeral trebuie s3 mdeplineascS permanent condifia de simetrie, respectiv centrele active ale monomerilor s& fie echivalente in interaefia cu ceilalji monomeri; de fapt, oligomerul poate exista numai in doui$ stari: conforma|:ia T (tensionat.&, constrSnsS.) in care enzima are afinitate micS. faf:S de substrat §i conformafia R (relaxatfi) cu afinitate mare pentru substrat. Starea T are centrul activ preformat., starea R il are definitivat. Cele douft st&ri se afl& in echilibru, constanta de echilibru fiind L (constants alostericS). Termenii T §i R se refers la flexibilitatea oligomerului, respectiv felul §i numSrul' interacfiunilor intre monomeri. In lipsa substratului starea predominant# este starea T. Dac# se consider!! numai interacfiunea de tip homotrop, fixarea substratului la starea T se face cu atlU mai greu cu cat concentrafia lui este mai mic# (Fig. IL18, porfiunea O- A pe curba 1). Intr-o enzim# alostericd formats numai din doi monomeri fixarea substratului la unul dintre ace§tia determine tranzifia T R; in virtutea postulatului simetriei, dar §i al principiului cooperMi, al doilea monomer dobandezpe automat conformafia R §i el va fixa mult mai u§or substratul (Fig. 11.21, porfiunea A-B, pe curba din Fig. 11.18), porjiunea B-C pe aceeagi curba, corespunde saturMi enzimei cu substrat. La o enzim# alosteric# formats din patru sau mai mulfi monomeri efectul cooperativ este mult: mai pronunjat deoarece fixarea substratului la un singur monomer determine tranzifia T R la intreg oligomerul. La enzimeie homotrop-heterotrope, efectul madulatorilor se suprapune peste eel all substratului. Cei pozitivi (activatorii) stabilizeaz# conformafia R, deci favorizeaz# deplasarea echilibrului T ** R spre dreapta; cei negativi (inhibitorii) stabilizeazS conformafia T (Fig. 11.22; curbele 2 §i 3 pe Fig. 11.18).

T S/area f Starea S Fig. 11.22. Stabiiizarea starii T a enzimeior alosterice de c&tre inhibitor! §i a starii R de catre activatori. 100 Diferenja esen{iala Inlre modelul secvenfial §i modelul simetric const! in aceea c5 primal abandoneaz! principiul simr.eriei. Legarea subslratului d.e c&tre on monomer reclaim! §i Tn acesl: eaz iranzijia T —> R dar nu este excJus! imeracpa sfiirii R a. acestuia. cu starile- T ale celorlaifi monomeri. Cooperativilatea se resirange de asl! data la influenja monomerilor T si R vecini. Legarea subslratului de cLSxe primal monomer se face §i in acest caz cu dificultate daiorit! stSrii T a iuturor monomerilor enziinei. Modific!ndu-§i conformajia prin legarea substratului, acesl monomer va induce modificarea corespunz&toare doar la monomerul vecin care va fixa substralul cu mai mult! u§urinfa, Chiar dacft numSrul enzimelor cu cooperativitate negative este foarte rnic (dintre acestea se citeaz! Urozil-ARNt-sintetaza), modelul

secvenfial s-a dovedit a ri mult mai potrivil d.ecat cel simetric in cazul acestora. Ulterior eiaborarii celor dou! modele, Eigen a demonstrat c! ele sunt cazuri particular ale unei scheme mult mai complexe; dependent de paidicularita|:i 1 e structurilor terfiara §i cuuiernaizL uncle enzime alosierice acfioneaz! dupa modelul simetric, allele dup! cel secvenfial, allele dupfi modelul generalize (cel propus de Eigen), Sub aspect cinetic, Kill a stabilil o ecuajie cu vaJabiliUUe atai pentru enzimele Michaeliene cat §i pentru cele alosierice; log ~~—------------------------- » nH * iogfS] - iogK V-v max o unde vG, §i S au semnificajiile cunoscute, K este constants specific! pentru interacjiunea enzimS-ligand; nH este coeficicntul Hill, o constants, empirical care reflect;! atat numarul locusurilor de fixare a iiganzilor cat §i intensitatea interacfiunii acestora. Reprezenland grafic log v0/Vnhlx - v0 in funcjie de log [S] (Fig. 11.23) se obfine dreapta 1 (pornind din origine) pentru enzime lipsite dc cooperativitate, dreapta 2 (intersecjie abscisa) pentru cele cu cooperativitate pozitiv! §i 3 (intersecjie ordonat!) pentru cele cu cooperativitate negaliva. Panta. dreplelor 2 §i 3 redd gradul de cooperativitate. Fig. 11.23. Drepteie objinute la reprezentarea graficS a ecuajiei Hill pentru enzime lipsite de cooperativitate (1), cu cooperativitate pozitiv! (2) §i cooperativitate negative (2).

101 In ultimii 15-20 ani s-au evidential la unele enzime alosterice structuri gi mecanism e de acfiune mult mai complexe. Un exemplu este aspartattranscarbamilaza, enzimM cu rol de reglare in calea de biosint.ez3 a nucleotidelor pirimidinice (vezi gi capitolul „MetaboIismul nucleotidelor purinice gi pirimidinice^)* Enzima are 12 subunit&ji dintre care gase sunt „catalitice“ gi gase sunt „reg!atorii“. !n starea T, subunitajile catalitice sunt grupate In doi trimeri iar subunitdjile reglatorii sunt grupate in trei dimeri, intreg ansamblul avand o anumit& simetrie gi o maxima compactizare. Tranzifia T —> R const& in trecerea spre un aranjament cu o aM simetrie, in care ansamblul subumtftjilor este mult mai deschis. Cele doufi substrate se leagd numai la unitdjile catalitice: legarea gi transform area se realizeaz# printr-un mecanism cooperativ sofisticat gi deosebit de eficient. Produsul final al eSii metabolice, acidul citidintrifosforic (CTP) se leagS numai la

subunitdfile reglatorii producand o inhibijie feed-back. 11,9.4. RECTLAREA ALOSTERICA A FUNCTIEI HEMOGLOBINEI Reglarea alosterictl nu se restrange numai la enzime. Funcjia hemoglobinei este reglatd tot printr-un asemenea mecanism. Hemoblobina (Hb) gi mioglobina (Mb) sunt hemoproteine care in organism indeplinesc funcjii vitale: prima transports. 02 de la pttimani la celelalfe Jesuturi gi C02 in sens in vers, cea de a doua depoziteazd gi disperseazd oxigenui in mugchi. Structurilc componentelor proteice ale Mb gi Hb sunt prezentate in alte capitole (“ProteineA „Metabolismul hemoproteineloF). Cunoagterea acestora este necesard pentru injelegerea reglSrii alosterice a funcjiei Hb. Din punct de veclere functional, comun pentru Mb §i Hb este fixarea 02 la nivelul hemului: mai precis, 02 se dispune intre Fe2+ (legandu-se coordinativ la acesta) gi histidina distalft (cu aceasta interacfioneazd electrostatic). Din faptul insS cd Mb nu are structure cuaternaril gi deci fixeazS o singurS moleculS de 02, in timp ce Hb are structure letrametric& gi fixeaza patru molecule de 02, rezuM diferenje importante intre ele. Acestea se reflects in aspectul hiperbolic al curbei de oxigenare a Mb faf& de cel sigmoidal in cazul oxigenfirii Hb in conditiile fiziologice (Fig. 11.24). Valorile presiunii de semisaturare calculate din curbele specifice sunt, de asemenea, net diferite: 1 mm Hg pentru Mb gi 26 mm Hg pentru Hb (presiunea de semisaturare, notat£ P50, reprezintS presiunea parjiaia a 02 la care Mb gi Hb se oxigeneaza in proporfie de 50%). Efectul cooperativ, responsabil de curba sigmoidal!! a Hb (gi de P50 ridicatS) este complex, de tip homotrop-heterotrop. Pentru simplificare, se prezintii mai intai aspectul homotrop al efectului. El poate fi studiat pe Hb izolald din eritrocite, adusS in solute apoasS din care 02 este apoi indepartat; Hb complet lipsitH de 02 se numegte deoxigenata. Dactl in aceastd solujie.se introduce 02 a cfSrui presiune cregte treptat de la 0 la 100 mm Hg gi se determine pe 102 20 40■ 60 80 100 120 ------------------------------------ —■— - ► Po2 (mm Hg) Fig, il.24. Curbele de oxigenare ale mioglobinei (Mb) §\ hemoglobinei (Hb). parcurs cat# Hb a fixat 02, se obfine o curbs sigmoidalS apropiatS de cea din Fig 11.19. (diferenja fapl de aceasta |ine de influenja in condifiile fiziologice a factorilor care determine caracterul homotrop-heterotrop al efectului). Interpretarea, bazatfi §i pe alte nrulsur&tori experimentale directe, este cfi Hb deoxigcnatS este in slarea T, cu afinitate foarie redusS pentru 02. Structural, aceastS stare se caracterizeazS printr-un numSr maxim de interne jiuni atat intracatenare cat §i intercatenare; intereseazS mai ales un numSr de opt legSturi ionice stahilite intre grupSri carboxil §i amino (Fig. 11.25).

Asp His COO + 146 94 NH; p. Fig. IL25. Legaturi ionice intre subunitafile Hb In starea T; acestea se scindeaza cand Hb se oxigeneaza. Important deosebM are §i faptul ca in starea T Fe2+ din fiecare subunitale este situai in afara planului protoporfirinei IX (la. o distant tie 0,6 A) ca urmare a leg&rii lui dc-r histidina proximalS (Fig.11.26.) NeinsemnatS la inceput, acceptarea 02 de c&tre Hb se face simjitd pe mSsurS ce se „for$eaz&“ prin cregterea presiunii. Fixarea 02 la o prim£ subunitate (sau, dupS Perutz, deodatS la cele douh subunMfi a), este corelatii cu modil'ictlri structural© relativ insernnate nu numai la nivelul acesteia (acesiora) ci, in concordanfd cu modelul simetric (considerat polrivit pentru Hb), la nivelul tuiuror subunitSjilor, Semnalul este dat de revenirea in planul protoporfirinei IX a Fe2* ca urmare a iegSturii ce se stabilegte intre acesta gi 02 care se plaseazft intre planul hemului §i histidina distalS. Cum leg&tura Fe2+ cu histidina proximaM nu se scindeazS in urma fix&rii 02 (Fe2+ trece doar din starea pentacoordinatS in starea hexacoordinatS), sunt, antrenate prin acest rest aminoa.dd.ic modificSri in structurile secundarS gi terJiarS ale fiecSrei subunit^Ji. Se scindeaz&totodatft gi ceie opt leg&turi ionice Find angajate modificSri semnificative in structura cuaternarl S-a stabilit de altfel, in urma unor analize prin difracfia razelor X, efi un dimer «|3 se rotegte in raport cu cei&Ialt, considerat fix, cu 15°. Aceste niodifidiri (influence §1 factorii de care se face deocamdatS abstacjie) constituie de fapt {ranzijia T —> R a Hb. Afinitatea mare pentru C)2 a stMi R se traduce prinir-o rapid# Fixare a acestuia de chtre subunit&file 2, 3 gi 4 (sau 3 gi 4). Doar in apropierea presiunii de 100 mrn Hg, capacilatea de fixare diminu# ca urmare a saturSrii. Planul hemului

+ o2

-o2

Fig. ii.26. Pozifia Fe2* faja de pianul hemului In Hb neoxigenata §\ oxigenati. 104

H—C—0—P—0 ~~ 2, 3 - bisfosfogliceratul (DPG) H-C-H 0~ I 0 ! o=p-o~ 1 o~ Fig. 11.27. Structure 2,3-DPG §i intercalarea acestuia in cavitatea centrala a Hb neoxigenate. O variate alat de mare a presiunii parjiale a 02 pentru ca acesta s£ se fixeze pe Hb ar constitui, in vivo, un dezavantaj. In pldmani ms;l presiunea parfiaLI a 02 nu variazft Intre 0 §i 100 mm Eg ca in condifiilc experimenlale descrise ci ea este constant la nivelul valorii maxime. Accasta inseamnS e& doar ultima porfiune a curbci din Fig. 11.24 este valabilS pentru condi(iile Fiziologice, ceea ce §i explicit oxigenarea extrem de u§oar& a Hb. Pe de altS parte, cedarea 02 la nivelul (esuturilor esle favorizatS §i chiar determinate de condifiile fixarii redate in Fig. 11.24. Evident, disocierea 02 de Hb se face dupd nceea§i curbs dar parcursS in sens in vers; presiunea parfialfi a 02, care este in fesuturi de cca 30 mm Hg, favorizeaza procesul cedarii sale de caire Hb dar il §i intrerupe in rnomentul cand Hb este indl oxigenat# in proporjie de 50-60%. Deci, Hb va prelua in pklmani doar restul de 40-50% 02 ceea ce favorizeazS suplimentar oxigenarea. Condi-tiile descrise ale oxigenSrii §i deoxigendrii Hb asigunl gi alte avantaje funcjionale:

a) in mujchi, 02 cedat de Hb este deosebit de u§or preluat de Mb (a se compara curbele de oxigenare din Fig. 11.24); h) tot cu ugurinpl este cedat 02 in iimpul sarcinii, de la Hb marnei (HbA2) la Hb embrionului (HbE = a2e2) $i Hb f&tului (HbF = a272) ale c&ror curbe de oxigenare sunt, de asemenea, sigmoidale, dar deplasate la stanga in raport eu cea a HbA2.

105

Efectiil homotrop avut in vedere pand acum pentru fixarea 02 pe Hb (dar §i pentru diso- ciere), este completat de acfiunile compugilor 2,3bisfosfoglicerat §i C02 precum §i ale ionilor H+; de aceea, pe ansamblu, efectul cooperativ este in acest caz de tip homotrop-heterotrop. 2,3-bisfosfogiiceratul (2,3-DPG), sintetizat in cursul glicolizei §i prezent in eritrocite Intr-o concentrate egal& cu aceea a Hb, intervine astfel: in starea T se intercaleazS in chiar cavitatea central!! a Hb ca urmare a atracjiilor eiectrostatice intre grup&rile sale ionizate negativ §i grupSri ionizate pozitiv (amino) ale lanjurilor de tip a §i, mai ales, de tip P (Fig. 11.27). Prin aceasta starea T a Hb este suplimentar consolidate, dificultatea fix3rii 02 crescand (carba sigmoidalS se deplaseaz£ la dreapta). Dupft ce ins£ Hb a fixat 02 la o subunitate (sail la dou3) modificarea conformational! a tuturor subunit!{ilor, responsabil! de tranzijia T —> R, face incompatibil! r!manerea 2,3-DPG in cavitatea centrals (care se mic§oreaz!). Curba de oxigenare a Hb lipsit! de 2,3-DPG este nu numai deplasat! spre stanga dar i§i pierde in bun! m!sur! aspectul sigmoidal tinzand spre cel hiperbolic. Prin aceasta, 2,3-DPG favorizeaz! cedarea 02 la fesuturi. Christian Bohr (tntSl celebrului fizician Niels Bohr) a f!cut, in anul 1904, observafia c! Hb cedeaz! mai u§or 02 dac! pH-ul este mai scSzut decat cel fiziologic §i presiunea partial! a C02 este mare; in literatura de specialitate aceste constatSri sunt cunoscute sub numele de „efect BohrA Expiicafia dat! efectului Bohr, despre care se §tie in prezent c! este mult mai complicat, se restrange aici la aspectele esenjiale. Astfel, in vivo, concentrajii man ale C02 §i ionilor de hidrogen sunt, la nivelul (esuturilor unde rezult! prin procesele catabolice; ionii de hidrogen mai rezult!: a.) la formarea intre Hb (dar §i alte proteine din plasm!) a carbamajilor sub forma, alrora cca. 15% din C02 este transportat la plamSni in vederea eliminSrii; gruparile amino care reaqioneaz! cu C02 sunt ale unor aminoacizi N-terminali din lanjurilc Hb §i celorlalte proteine: R - NH2 + C02 R - NH - 000“ + H+ ion carbamat b) la transformarea marei major* i!|i a C02 (cc. 85%) in ionul bicarbonat, compus solubil, care este transportat de asemenea la plSmani: anhidraza carbonic! co2 + H20 ' ~..... . .- —— H2CO3 + H2C03 H + HC03Valoarea mai mica decat 7,4 a pH-ului (cat este valoarea normals in sange) §i presiunea partial! mare a C02 favorizeaz! cedarea 02, curba de oxigenare fund deplasat! spre dreapta (Fig. 11.28). In pldmani echilibrele reacjiilor de la punctele a §i b sunt deplasate spre stanga datorit! elimin3rii C02 prin respiraiie. Concentrafia ionilor H+ descie§te, pH-ul depS§e§te u§or valoarea de 7,4; curba de oxigenare se depiaseaz! la stSnga bind favorizat! fixarea 02 pe hemoglobin;!. 106

Fig, 11.28. Deplasarea curbei de oxigenare a Hb tn func|ie de vaioarea pHului. IL9.5. REGLAREA COVATENTA A ACTlVlTkfn ENZIMELOR In prezent se cunosc multe enzime cu rol reglator a cSror conversie formS inactive A formS activa are loc prin modificSri chimice care implies formarea sau ruperea unor legSturi covalente. Cazul cel mai freevent este al enzimelor cam se activeazS prin fosforilare (sau defosforiiare), Fosforilarea se face de cStre ATP care transfers, de regulS, an singur rest de acid fosforic; acesta esterificS grupM hidrox.il ale unor resturi de serinS, mai rar tirozinS sau IreoninS, care nu fac A parte din central activ. Reacjiile de fosforilare sunt catalizate de kinaze specifice, care, la randul j. lop pot exists in forme fosforilate numite fosfokinaze §i defosforilate numite defosfokinaze. Fiind : putemic exergonice, reacjiile de fosforilare sunt ireversibile. Transformarea inversS, formS ; defosforilatS - formS fosforilatS, se lace hidrolitic in piezenja unor fosfalaze specifice; §i aceste | reaefii sunt ireversibile (Fig. 11.29). f Enzimele interconvertibile prin fosforilare-defosforilare apar numai in celulele organismelor superioare. Dupa caz, unele enzime interconvertibile pe aceastS cale sunt active in forma fosforilatS (glicogenfosforilaza) sau defosforilatS (glicogensintetaza). t Activarea unor enzime prin fosforilare (defosforiiare) este, de multe ori, etapa ultimS intr-o : cascadS de evenimente declangatS odatS cu fixarea de catre celule a unor hormoni sau alfi j compu§i chimici cu rol reglator. Aceste mecanisme sunt tratate in capilolul „Hormoni“. j 0 activare-inactivare 'printr-un mecanism covalent aparte este intalnitS la enzima A glutaminsintetazS care catalizeazS reac{ia: A COOH COOH | |

CH — NH2 (CH2)a + NH3 + ATP — COOH 107 ; ATP ADP

CH — NH, | - - -^ (CH2)2 CQNH2

Forma acdva a enzimei este iransformalS in form 15 inactive prin „adenililarev< (aia§area printr-o leg&turii covalentfi a unui rest de AMP). Ca §i fosforilarea, adenililarea se face cir ATP dar la un rest de tirozinft; reacjia este ireversibilS, Revenirea ia forma activft se face §i in acest. caz prin hidrolizft (Fig. 11.30), Glutaminsintctaza este o enzirml a carei activitate este reglata atat alosteric cat. §i covalent. Reglarea covalentd este cea anltall Reglarea alosterial prezintS douft aspects: este multiple in sensul c& exists noua compu§i cu rol de modulatori negativi (Tntre care histidina, triptofanul, carbamilfosfatul) §i cafiva modulatori pozitivi; pe de alta parte, este cumulative in sensul cd modulatori! pot acfiona simultan (in totalitate sau nurnai unii) §i atunci efectui lor se insumeazd. Tot activ&ri de rip covalent sunt; §i transformdrile proeazimelor de tipul pepsinogenului, iripsinogenului, chimotripsinogenului, procarboxidazei etc. in enzimele pepsinS, tripsinS, chimotripsinS, carlxmpeptidazfu Formele inactive (zimogenii) sunt cele prod use la locul ATP ■ PPf

Fig. 11.30. Reglarea activita|it glutamimsintetazei prin adeniniiaredeadeninilare. 108 de sintez! (mucoasa gastric! pentru pepsinogen, pancreasul pentru toate

celclalle); activSrile se produc la local de acjiune (stomac, intestinal subjire). Acesle activftri au loc atfit sub acjiunea unor factori local! cal §i autocatalitic, dup! schema general!: -7. Factor local {pH, enzima. autocatalitic) „ ,■ _ Zimogen —;____________________________tnzima activa Transform !rile acesiea sunt unidireejionale, nu exists posibiiitalea refacerii zimogenului din enzimeie active. Modalit!|ile particulare de activare a aeestor enzime se pot urmart in capitolul „MetaboIismuI proieinelor §i a! aminoaeizilorT ILK) LOCALIZAREA INTRACELULARA A ENZIMELOR Pe masura ce cuno$tintele privind structure celulclor speeiaiizate din fosuturile organismelor superioare s-au amplificat, imaginea distribujiei haotice a enzimelor in interiorul acestora (“celule sunt saci. cu enzime'*) datand din secolul trecuh a fost inlocuil! cu una diametral opus!. Separarea prin ultracentrifugare a orga.nit.elor celulare urmat! de identi.fi,carea prin tehnici histochimice §i biochimice a enzimelor in fiecare clintre aceste organke a constituit metodologia care a permis elaborarea unui adevfrat tablou al distributed intracelulare a enzimelor. Cftfeva elemente ale acestui tablou se prezint.fi in continuare. Este o regal! general c! orice celul! specializat! dispune numai de acele enzime care cataiizeaz! efectiv reacjii in ceiula dat!. Uriele enzime (sau seturi de enzime) se all! in loate tipurile de celule speeiaiizate. Este cazul enzimelor implicate in c!i metabolice fundamentale cum sunt: biosint;eza proieinelor §1 acizilor nucleici, glicoliza, ciclul acizilor tricarboxilici etc. F!r! funefionarea aeestor e!i, care asigur! multiplicarea si dezvoltarea, nici un tip de celule nu poate exista. Tot ca regula general;!, o acea§i enzimft apare in forme u§or diferite de la un tip de celule la ailul. Diferenjcle acesiea apar alat la nivelul strueturii prim axe §i conformajiei (enzime homoloage) cat. §i la nivelul strueturii cuaternare (izoenzimele); aclivitatea lor diferenjiat!, alaturi cle concenlrajia variabil! sunt in report direct cu necesithfile diferite ale tipurilor de celule. Pe de alt! parte, fiecare tip de ceiula specializat! dispune de seturi de enzime care cataiizeaz! reacjiile din c!ile metabolice particulare: enzimeie implicate in biosinteza hormonilor tiroidieni se afl! numai in.tiroid!, cele care particip! la biosinteza ureei se afl! numai in ficat, creatinkinaza se afl! aproape in lotaUtato Tn rnu§chi etc. Un alt aspect privegte locul in care se afl! diverse enzime intr-o celul! dat!; el coincide, evident, cu locul de desf!$urure a c!ii metabolice sau a unei seevenje a c!ii metabolice din care face parte reaefia pe care o cataiizeaz!. Astfel, glicoliza se desf!§oar! numai in citoplasm!, cleci toate enzimeie acestei c!i sunt in citoplasm!; biosinteza ureei (in hepatocite) se desf!§oar! partial in mitocondrii partial in citoplasm!, deci unele enzime ale acestei c!i sunt: citoplasmatice, allele sunt mitocondriale. Enzimeie implicate in biosinteza ARN-urilor sunt, localizate in nucleul celular care este sediul sintezei, §i enumerarea ar putea continua. 109 Unele enzime au localizare dubld: aspartat aminotransferaza (ASAT = GOT) cat gi izocitratdehidrogenaza (ICDH) se afi& atat in citopiasmS cat gi In mitocondri. ICDH citoplasmaticS are coenzima NADP+, cea din mitocondri are

NAD\ ICDH mitocondriald catalizeazS o reac[ie a ciclului acizilor tricarboxilici; ICDH citopIasmaticS, in relafie cu cea mitocondriaifi, asigur# transferal echivalenfilor de reducere prin membrana acestui organit. (vezi „Metabolismul energetic44). Multe enzime sunt legate de membrana celulaili sau sunt chiar inclose in aceastd membranS, cu localizare spre exterior sau spre citopiasmS. In cazul mitocondriilor, enzimele pot fi legale de membrana extern#, de membrana intern#, multe se ail# ia matrix (Tabelul IL3). Tabeluf 11,3 Localizarea unor enzime In mitocondriiie celulelor hepatice Monoaminooxidaza (MAO) Acii-CoA sintetaza Membrana externa Fosfoiipaza A2 Nucleoziddifosfatkinaza Spajiul Intre Adeniiat Kinaza membrane Membrana interna NADH dehidrogenaza Citocromi (b, c, c1f a, a3) Succinat dehidrogenaza Matrix Citrat sintetaza izocitratdehidrogenaza (ICDH) Fumaraza Giutamatdehidrogenaza Enzimele de oxidare ale aciziior gra§i II. 11. ENZIMELE §1 P.ATOLOGIA In plasm# se afl# un num#r foarte mare de enzime. Dependent de existenja sau inexistenfa la acest nivel a substratelor corespunz#toare (in alji termeni dup# cum enzimele catalizeaz# sau nu rea.c{ii in plasma.), ele se impart in: a) Enzime plasmatice funcjionale cum sunt: lipoproteinlipaza, pseudocolinesteraza, lecitin-colesterol aciltransferaza (LCAT), cele implicate in coagulare gi fibrinoliz# gi altele. In afecjiuni grave ale ficatului, acesta este incapabil s# sintetizeze normal proteine, inclusiv enzime, astfel activitSjiie lor scad in raport cu valorile normale. b) Enzime plasmatice nefuncponale: teoretic, oricare enzim# celular# trebuie s# fie prezentS gi in plasm#; numSrul celor identificate este intradev&r foarte mare. Prezenfa lor in plasm# se explic# prin destrucjia celular# normal# dar gi prin permeabilizarea membranelor in cursul efoiturilor fizice, scSderea resurselor pentru producerea de energie gi altele. La persoanele s&n&toase nivelul acestor enzime este aproape constant, el reprezentind o stare stafionar# intre rata elibenlrii din cel ale gi inactivare. La cele mai multe dintre enzime acest nivel constant este foarte sc#zut; ele au fost evidenfiate prin metode extrem de sensibile, posibile de efectuat cu aparatur# costisitoare. Cateva zeci de 110 enzinie pot fi insS dozate in plasxiiS cu suficientS precizie utilized metode relativ simple. Dintre acestea s-au seiecfionat un numar gi mai restrSns pentru dozare in scop de diagnostic; sunt enzime a airor concentrate

(activitate) create foarte mult in cursul destrucpilor masive ale celulelor producStoare gi proportional cu gravitatea leziunilor la nivelul {esuturilor din care aceste enzime fac parte: inimS, ficat, mugchi scheletici gi allele. Un element important pentru ca enzimeie plasmatice sii aib& valoare diagnostics, dar gi de urmSrire a eficacitSfii tratamentu- lui, este timpul in care activitatea lor devine semnificativ crescutS, respectiv scSzutS. Se exemplifies cu enzimeie serice care se dozeazS in legSturS cu infarctul de miocard gi afeejiunile hepatice. In primal caz se dozeazS creatinkinaza (CK), glumatic-oxaloacetic- transaminaza (GOT) gi lactatdehidrogenaza (LDH). La toate exists o cregfcere proporfio- nalS intre mSrimea zone! infarctate gi cregterea activitSjii serice. Dozarea creatinkinazei este totugi mai utilS pentru diagnostic deoarece chiar dupS 4-6 ore se remarcS o cregtere a activMfii ei iar maximul este atins dupS 18 ore (la GOT gi LDH peste 24 ore). Situajia este diametral opusS in ce privegte durata de revenire a activitSfii acestor enzime serice la valorile bazale (normale), de aceea evolufia bolii se urmSregte cel mai bine prin LDH. Pentru diagnostics afeejiuniior hepatice se practice alSturi de alte investigafii paradinice, dozarea uctiviktfii a peste zece enzime plasmatice nefuncfionale. Unele reflects integritatea celularS, allele sunt in legSturS cu diverse procese metaboiice, altele redau capacitatea de sintezS a proteinelor gi aeizilor nucleici gi in sfargit capacitatea de excrefie. Este recomandatS dozarea intr-o anumitS ordine (nivelele I, II, HI gi IV); in prima instan|S, nivelul I, se recomandS dozarea GPT (glumatic-piruvic-transaminaza), G1DH, (glutamatdehidrogenaza) gi 7GT (y-glutamiltranspeptidaza). Deosebit de util pentru diagnostic ar fi sS existe pentru fiecare fesut 0 enzimS extrem de specifics in ser. Un caz este fosfataza acidS a cSrei cregtere a activitdfii este in legSturS cu carcinomul de prostatS. Pentru investigarea hepaticS ar fi utilS dozarea activitSfii sorbitoldehidrogenazei (SDH) gi a ornitin-carbamil-lransferazei (OCT) care insS nil se practicS curent din cauza unor dificultSji tehnice. Dificultafi mari in investigarea paraclinicftprin intermediul activitSjii enzimelor serice apar, in primul rand, din faptul cS cele mai’ multe enzime plasmatice nefuncfionale a cSror activitate se poate determina, au provenienjS multipIS: LDH gi GOT provin din inimS, mugchi gi ficat, CK din inimS gi mugchii scheletici etc. O alts dificultate este legatS de inactivarea rapidS in ,ser a unora dintre enzime, Chiar gi in cazurile complicate, prin diverse strategii, medicul gi laboratorul de biochimie pot obfine totugi rezultate foarte bune. Se menJioneazS determinarea simultanS a mai multor enzime serice gi calculul unor raporturi (de exemplu, raportul De Rittis intre GOT/GPT, care scade sub 1,3 in afeejiuni hepatice), dozarea activitSjii enzimelor pe fesuturi (recoitate prin biopsie), mai rar practicatS. De mare valoare sunt determinSrile activit&filor izoenzimelor utilizand in acest scop procedee de separare (pe eoloanS, electroforetice) sau inhibarea cu anticorpi specifici a unora dintre izoenzimele unei enzime date. Astfel predominanfa in ser a formelor LDHj gi LD1L este un indiciu foarte bun pentru infarct de miocard, in timp ce predominant formei LDH5 indicS afeefiuni hepatice. In cazul CK, cregterea in ser nu numai a activitSfii totaie ci gi a activitSfii izoenzimei de tip MB este indiciu sigur de infarct de miocard (foima MB fiind de provenienfS aproape

strict miocardicS). Activitatea multor enzime plasmatice nefunefionale se determinS in relafie cu bolile de metabolism (glucidic, Iipidic gi proteic). Cele mai importante dintre acestea sunt prezentate in capitolele respective. Ill II12. CLA5IFICAREA SI DENUMIREA ENZIMELOR Primelor enzime descoperile li s-au atribuit diverse denumiri; in cele mai muile cazuri numele enzimei s-a formal din numele substralului prin adilugarea sufixului -azfc ureazii pentru enzirna ee catalizeazd hidroliza ureei la C02 §i NH3, arginazS pentru eazima care catalizeazS hidroliza argininei la orn.ii.iri3 uree etc. Alter enzime li s-au atribuit denumiri partieulare bird legaiuni cu reaejia caializala: pepsin! tripsinft, chimotripsinS. Cand irumarul enzimelor cunoscute a devenit foarte mare §i s-au acumulat date despre structure coenzime, mecanism de aojiime etc., s-a impus atat introducerea unei clasificari rationale cat §i a unor denumiri bazate pe crilerii chimice care s3 evite confuziilc. Acestea au fost elaborate, in arm! 1961, de o comisie de enzirn.oi.ogie a Uniunii Intemafionale de Bioehimie §i Biologie Molecular!! (IUBMB) Hind in vigoare §i in prezent. In sistemul de clasificare adoptat fiecare enzimfi este incadraUl intr-o subclass §i, eventual sub-subclas<1 care apartine unei clase, Clasele, subclasele, sub-subclaseie §\ cnzimele individuale se noteazS prin ci'fre despite de punct.e. Sunt §ase clase de enzime avand in ordine numerele §i cat.ali.zand reacfiile: 1. Oxidoreduciaze, catalizeaza reaej-ii de oxido-reducere; 2. Transferaze, catalizeazd transferuri de grupe ce conjin carbon, azot sau fosfor; 3. Hidrolaze, catalizeazd scindari d.e legaturi covalente cu participarea apei; 4. Liaze, cataiizeazd ruperi ale legfiturilor OC, C-S §i ON; 5. Izomeraze, catalizeazh toate tipurile de izomerizari, inclusiv racemizftri; 6. Ligaze, catalizeazd formarea de legaturi in be carbon §i O, S, N, cupiate cu hidroliza legdturilor macroerg ice. Subclasele §i sub-subclasele sunt stahilite dup3 tipul grupfuii sau leg&turii care se modified In cursul reaejiei, dup3 natura coenzimei §i alte particularity. Sistemul acesta de clasificare este deschis, orice enzimft nou descoperiia putand fi introdusd intr-o clasa, subclass §i sub-subclasfn Comisia a hotfufU c3 se pot utiliza doud modality de denumire pentru enzime: a) Numele „recomandal“: se p3streaz3 (sau se atribuie) denumiri cu sufixul -az& (glucozidaza, zaharaza, ureaza) sau se d& denumirea dupS aejiunea specified (lactatdehi- drogenazd, adenilateiclazd); pentru unele enzime se utilizeazd denumirile specifice (tripsina, pepsina). b) Numele „sislematie“: acesta este corelat cu numele ciasei, subclasei §i sub-subclasei; el cuprinde denumirea substratului (substratelor), tipul reaejiei catalizate, coenzima, eventual alte caracteristici. Astfel fiecare enzimd are on cod specific. Utilizarea numeiui sistematic este obligatorie doar in situafiile care reclama evilarea oriedrei ambiguity (lipdrituri, congrese etc.). Curent se utilizeazd denumirile recoman date.

112 Clasificarea §i denumirile sistematice ale enzimelor sunt redate in Tabelul II.4. i Tahelu! 11.4. Fragment© din tableau! vast al clasific&rii enzimelor §i a denumirii sistematice a acestora 1. Oxsdoreductaze 1.1. Care acjioneaza asupra gruparii CH — OH 1.1.1. Cu coenzirna NAD+ sau NADP+ 1.1.1.1. Alcooi: NAD+-oxidoreductaz§ 1.1.1,27. L-lactat: NAD-oxidoreduetaza 1.2. Care acjioneaza asupra gruparii C = O 1.2.1'. Cu coenzirna NADr §i NADP+ 1.2.1.12. D-gliceraidehid-3-fosfat: NAD-oxidoreductaza 1.2.3. Cu 02 ca acceptor 1.2.3.2. Xantina: oxigen-oxidoreductaza 1.3. Care acjioneaza asupra iegaturii CH — CH 1.3.2. Cu citocrom ca acceptor 1.4. Care acjioneaza asupra leg aturii CH — NH 2. Transferaz© 2.1. Care transfer^ fragment© de un carbon 2,1.1. MetH transferaze 2.1.1.10. S-adenoziimetionina; L-homocistein S-metiitransferaza 3. Hidrolaze 3.1. Care scindeaza iegaturi esterice 3.1.1. Carboxiesterhidroiaze 3.1.1.3. Giiceroi-ester hidrolaza 4. Uaze 4.1. Uaze C — C 5. Izomeraze 5.1. Racemaze §t epimeraze S. Ligaze 6.1. Care asigura formarea legaturllor C — O 113 Cap. Ill VI.TAMINE §1 COEMZIME. III. 1. GENERALITAJI Vitaminele sunt o categoric de substanfe strict necesare animalelor superioare §i care nu pot fi sintetizate in organismul lor, De aeeea, vitaminele trebuie s& fie procurate de rafia alimentary, in organismele superioare vitaminele nu reprezintS materiale structural, de felul principiilor mediate (proteine, glucide, lipide) §i nu au valoare energetic^ dar implinesc roluri func{ionale importante. Intr-adev3r, rnajoritatea vitarninelor - sau derivafi ai lor imediafl - sunt constituent coenzimatici, participand la multiple §i vaiiate reacjii metabolice. Pentru acest motiv, in capitolul de fafit se vor descrie §1 iiustra asemenea intervenjii. De§i pentru implinirea tuturor rolurilor funcjionale ale vitarninelor organism ul omului are nevoie de cantit&fi foarte raid ( cateva miligrame sau

chiar micrograme pe zi), rajia alimentary trebuie s£ le procure regulat. Altfel, ajung s£ se declan§eze anumite stdri patologice specifice, numite avitaminoze. • Este de remarcat cS exists §i vitamine distincte din punct de vedere chimic - dar * inrudite structural - care implinesc aceleaji funcfii §i a cMror carenfS determine aceeagi avitaminozS. Aces tea se numesc vitamer e. Spre exemplu, diverse vitamine E (tocoferoli) sunt caracterizate, una in raport cu alta, drept vitamere; astfel Incat in loc de vitaminele E se poate spune §\ vitamerele E. In studiul vitarninelor se intalnegte uneori §i terme/ml de antivitamind (sau anti vita- mine). Antivitaminele sunt substance cu acjiune antagonists vitarninelor §i care produc efectele avitaminozelor respective. In principiu, fiecare vitamina poate avea una sau mai iruilte antivitamine. HL2, CLASIFICAREA VITAMINELOR Vitaminele au structuri chimice foarte variate. Din aceasiy cauzl, ele nu sau clasificat conform structurii ci s-a fixat diept criteriu de clasificare o insu§ire fizic& §i anume, solubilitatea. Din punct de vedere al solubilitajii, vitaminele s-au grupat in doud categorii: vitamine hidrosolubile (cele cu molecule polare, solubile in ap3)'§i vitamine liposolubile (CQle cu molecule apolare, solubile in gr3simi). Prima categorie cuprinde vitaminele din complexul B (vitamina B1( vitamina B2, vitamina B6, vitamina PP, vitamina B12, acidul folic, biotina, acidul pantotenic) §i vitamina C. A doua categorie, cea a vitarninelor liposolubile, cuprinde: vitamina A, vitamina D, vitamina E §i vitamina K. 114 IIL3. VITAMINELE HIDROSOLUBILE §1 ROLURILE LOR COENZIMATICE III. 3.1. COMPLEXUL B „CompIexul B“ este un grup de cel pujin 8 vitamine hidrosolubile (menjionate la ctasificare) si care se gftsesc impreund in natunl, fiind Intr-o stransii inter-relajie funcfionalft. Toate vitaminele din complexul B sunt cofactori in diverse reacpi enzimatice; in special, ele joaeti rol de coenzime in cele mai importante reacjii metaboliee. Acest rol este ilustrat - penlxu fie care vitamin^ - In cele ce urmeazS. Vitamina Bj, sau tiamina, cuprinde in molecula sa cloufi nuclee heterociclice (pirimidinic §i tiazolic). Ambele nuclee stmt substitute in amimile pozifii §i sunt unite printr-o punte metilenied: In organism - la nivelul ficatului, rinichiului §i inimii — molecula vitaminei Bl este penlru a da nagtere la coenzime §i enzime active, participante la metaboiismul glucidelor. Inlr-adev&r, in celulele diverselor organe §i jesuturi tiamina se aM sub formd de ester pirofosforic, tiaminpirofosfat (TPP). El rezuM din reaefia tiaminei cu ATP: Aceaslii reaejie este catalizati de enzima tiarriin difosfotransferazS, aflatd - In special - In creer §i ficat. TiaminpirofosfatuI este coenzimd In reaejii enzimatice de transfer ale unei unitiifi de aldehidS activti. Asemenea transferuri au loc In reaejii de decarboxilare oxidativd a a- ceto-acizilor (piruvat, a-cetoglutarat) si In reaejii de transcetolare. Ambele tipuri de reaejii sunt intalnite in metaboiismul

glucidic. In aceste reaejii de transfer rolui propriuzis al coenzimei TPP este de a servi la eliberarea din anumite molecule a unMjilor Vitamina B* (tiamina) si coenzima tiaminpirofosfat.

Fig. 111.1. - Vitamina Bt (tiamina) combinata cu resturi de acid fosforic §i proteine specifice (in prezenja ionilor Mnz+) Tiamina + ATP TPP + AMP H3C

NH2

CHf"CHrQ~-P~Q~P-OH OH OH Fig. 111.2. - TiaminpirofosfatuI (TPP) 115 aklehidi.ce care urmeazfi s& fie transferate pe alte molecule. Se ilustreazS aid mtervenfia. tiaminpirofosfatului in decarboxilarea acidului piruvic §i formarea de acetaldehid&(' in vitro). DatoritS pozifiei sale in ciclul tiazolic din tiaminpirofosfat Cf este reactiv; in unna ionizMi H legal de el devine H+ iar C2 carbanion. Acest carbanion exercitd on atac nucieofil asupra C2 din molecula acidului piruvic. Ca urmare, rezuM un compos de aditie al acidului piruvic la tiaminpirofosfat §i care se decarboxileazS, formandu-se hidroxietil — tiaminpirofosfat. Ulterior, acesta elibereaz& molecula de acetaldehidS (rezultatS din hidroxietilul format prin decarboxilarea acidului piruvic) §i regenereazS tiaminpirofosfatul. +

CH-r C—COOH J 1! o * H3C HOOC-C OH

4*

OH CH—CH=O

Fig. Hi.3. - Mecanismul decarboxiiarii acidului piruvic (in vitro) In organism, aeeastS reacp-e - cheie de decarboxilare a acidului piruvic este catalizatS de un complex multienzimatic, al piruvat dehidrogenazei, In care - pe langS. tiaminpirofosfat - particip& incfi patru coenzime: acidul lipoic, acetil-CoA, NAD+ §i FAD. La studiul metabolismului glucidic se prezinta mecanismiil intregii reacfii complexe, ilustrandu-se in totalitate transferal acetaldehidei rezultate din decarboxilarea acidului piruvic. Decarboxilarea oxidativft a a-cetoglutaratului, precum §i a derivator a cetocarboxi- lici proveniji din aminoacizi cu catena ramificatft, se realizeazft printr-un mecanism absolut similar celui de decarboxilare a acidului piruvic; deci tot cu participarea tiaminpirofosfatului. Jinand seama de rolul coenzimei tiaminpirofosfat in metabolismul glucidic, se infelege dS in carenfa vitaminei B} este stanjenit - sau chiar intrempt acest proces alat de important din punct de vedere energetic. Acidul piruvic (piruvatul) ajunge astfel sS se acumuleze - ca a tare - in organism, ceea ce atrage o serie de manifest&ri patologice resimfite, in special, la nivelui sistemului nervos. Este' de remarcai; c& in deficienja de tiaminS, pe 12ng& acidul piruvic ajung s& se acumuleze in organism §i alte substanfe (a-cetoacizi sau pentoze) care in mod normal participS la reacfii de decarboxilare sau transcetolare prin intervenfia coenzimei tiaminpirofosfat. Concentrarea acestor substanfe in cantitfifi mai mari decat cele normale antreneazS - de asemenea - diverse tulbur&i metabolice. 116 Vitam ina B2 (riboflavina) §i coenzimele flavin Ice Vitamina B2 sc mai nume§te riboflavina, datoritft structurii sale cle Having (pigment galben) cu radical ribil.il, provenit din ribitol (polialcoolul corespunzStor ribozei). Acest radical este'subsliluil In pozijia 9 a heterociclului izoaloxazinic din molecula riboflavinei. In pozijiile 6 §1 7 ale aceluia§ heterociclu sunt substituiji radical! metil: OH OH OH I 1 i CM-CH- CH CH-CFL-OH i H3C

H3C I! o Fig. Hi,4. - Vitamina B2 (riboflavina) In organism riboflavina formeazii cu ATP-uI douft flavinnucleolide numite: ttavinmo- nonucleotid (FMN) §i flavinadenindinucieotid (FAD). Strucfurile lor chimice sunt umultoarele:

OH OH OH 1 i i C CH- CH- CH » CHr O - POJH2 l

Fig) Hi.5. - Fiavinmononucieotidul (FMN)

Fig. 111.6. - Fiavinadenindinucieotidul (FAD) 117 Ambele flavinnucleodde (FMN §i FAD) sent coenzime care fac parte din sisteme enzimatice implicate in diverse procese de oxidoreducere din organism. DatorifS stmcturii coenzimelor respective, aceste enzime se mai numesc flavoenzime sau flavoproteine. In structura lor se remarcd o legSturS strSnsa, dar necovalentil, iiitre coenzimS §i partea protdcte. De asemenea, majoritatea flavoproteinelor conjin metale (Mo, Fe) cu rol de cofactori adifionall De^aceea, enzimele corespunzSloare sunt cunoscute §1 sub numeie de metaloflavoproteine. In reacjiile de oxidoreducere catalizate de flavoproteinele active, participantele directe la procesele redox sunt tocmai coenzimele constituente, FMN sau FAD, Intr-adevSr, ciclul lor izoaloxazinic poate suferi reducer! reversibile prin fixarea temporary la atom!! de azot din pozijiile 1 §i 10 a doi atomi de hidrogen preluap. de la substratele (SH2) cu care intrS. in reacfie §i care se oxideazS (Sox). tLC SM2 *

R s H n O FMN sau FAD

Fig. ill.7. - Reducerea nucieului Izoaloxazinic in flavin-nucleotide In acest mod FMN' sau FAD tree din formele lor oxidate in fcrmele reduse, FMNH2 sau FABH2„ Ca in- orice reaefie de oxidoreduejie (dehidrogenare - hidrogenare) §i in reaefia anterioarii participS dou3 sisteme redox: SK2/Sox §i FMN/FMNH2. DupS.

cum se §tie, fiecare sistem redox se caracterizeazS printr-un potential electric standard. Valorile acestor potentate pentru sistemele FMN/FMNH2 §i FAD/FADH2 servesc la precizarea ioculoi lor de intervenpe in girul transportorilor de hidrogen §1 electron!. In studiul metabolismelor se vor intalni numeroase reaefii de oxidoreducere (dehidrogenare - hidrogenare) catalizate de enzime care admit drept coenzime FMN sau FAD, Printre aceste oxidoreductaze foarte eficiente sunt: a — aminoacid - oxidam participants la procesul de dezaminare a. aminoacizilor, aldehid dehidrogenaza care catalizeaz& degradarea aldehidelor, xantin oxidam implicate In degradarea purinelor, succinat dehidrogenaza din ciclul acidului citric, flavoproteina transportoare de electrons, participants la oxidarea acizilor gra§i, dihidrolipott dehidrogenaza implicate in decarboxilarea oxidativS a piruvatului §i a — cetoglutaratului. Se injelege, in aceste condijii, cat de important este in organism rolul metabolic a! coenzimelor flavinice §i implicit, al vitaminei B2 constituente, Vitamina PP (niacina) §i coenzimele nicotinamidice Vitamina PP este vitamina antipelagroas& (“pellagra preventiv factor“). Numeie de niacinSt corespunde constitujiei sale chimice. Intr-adev&r, din punct de vedere chimic, vitamina PP este niacina sau acidul nicotinic (vezi formula). Aceea§i acfiune vitaminicS antipelagroas& o are §i amida acidului nicotinic, nicotinamida sau niacinamda (Fig. III.8). Prin urmare, ambele substance (niacina §i nicotinamida) sunt vitamerele vitaminei PP. 118 Fig, HL8. - Nlacina §i niacinamlda

COOH

CONH2 ^AT

Acid nicotinic (niacina) '"■AT Nicotinamida (niacinamida) Principalul roi metabolic a.l vitaminei PP reiese din faptul cS ea in lift in siruclura a doua coenzime nicolinctmldice care pailicipFt la procese de .oxidoreducere. Aceste coenzime sunt: nicotinamidadenin dinucleotid (NAD) §i racotinamidadenin dinucleoridfosiat (NADP): Ca $i coenzimele Havinice, coenzimele nicotinamidice fac parte din constitujia onor enzime implicate in reaefii redox de hidrogenaredehidrogenare. Aceastft capacitate a nucleotidelor pridinice se datoreazS insft§i nucleului piridinic pe care-I conjin §i la nivelul caruia are loc fixarea hidrogenului de la substrat (Fig. III. 11). §i in cazul eoenzimelor nicotinamidice sistemele lor redox participante la reacjiile de hidrogenare - dehidrogenare, NAD7NADH+H* §1NADP+/NADPH+H+, se caracterizeazS prin potenjiale electrice standard, cu valori bine determinate, care servesc la precizarea locului ocupat de ele in lanpil respirator.

Spre deosebire de coenzimele flavinice, la conezimele nicotinamidice legSturile lor cu componentele proteice din enzimele respective sunt foarte slabe. De aceea, aceste

OH OH Fig. iil.9. - Nicotinamidadenin dinucleotid (NAD+)

NH2 OH OPQ3H2 Fig. iii.10. - Nicotinamidadenin dinucieotidfosfat (NADP+) 119

Fig. - Reducerea nucieului piridinic Tn coenzimele nicotinamidic© coenzime pot trece u§or pe mai multe proteine enzirnati.ee (apoenzime), Este de remarcat cS unele enzirne devin active numai eand funcponeazU cu coenzima NAD+, altele numai cu coenzima NADP\ iar altele admit drept coenzima atat NAD* cat §i NADP+. In ge-nere, dehidrogenazele care admit drept coenzima NAD+ calalizeazil reac|ii de oxidoreducere din cataboiismul oxidativ; spre exe-mplu, unele reactii din ciclul acidului citric. Pe de aM parte, dehidrogenazele §i reductazele pendente de NADP* participS. la reacfiile din calea pentozofosfaplor gi la cele care au loc in procesul de biosintezS a aciziior gragi, Prin tumare, ca §i coenzimele fia.vinice, coenzimele mcolinamidice - impreunS cu vitamina PP constituent# - sunt compugi cu rol metabolic important. Vitamina B6 (piridoxina) §i coenzimele derivate Numele de piridoxina corespunde constitufiei chimice a vitaminei B6 deoarece ea este un alcool cu nucleu piridinic. Acest nucleu este subslituit in patru pozi|ii astfel*. in 2 cu mctil, in 3 cu Mdroxil, iar in 4 §i 5 cu cate un grup hidroximetil (Fig. III.12.), Piridoxina - aflat# in prod use vegetale sau animate - este insojit# de dou5 vitamere inrudite structural; piridoxalul si piridoxamina, respectiv aldehida §i amina (in pozifia 4) corespunzand piridoxinei:

CHO

CHrOH

Fig. III.12. - Structuriie chimice ale celor trei conpu§i piridinici cu activitate de vitamina B6 In citoplasm# aceste trei vitamere devin substrate fa|# de enzima piridoxal kinaz# care catalizeazS reaefii de fosforilare cu ATP-uI pentru fiecare. Ca urmare, ele tree in esterii fosforici corespunz#tori (la grupul de alcool primar din pozijia 5). Dintre acegti esteri, piridoxalfosfatul §i piridoxaminfosfatul sunt coenzime participante la diverse reaejii metabolice; in special, la transaminarea, decafboxilaiea §i trans-sulfurarea a aminoacizilor. In procesul transaminftrii, piridoxalfosfatul §i piridoxaminfosfatul intervin pentru transformarea - dup# caz - a unui aminoacid in cetoacid §i invers: 120

R~CH~~COQH + Rs~C~~CQOM i Si Nf%~ a. Aminotransferaza (transaminaza) ► RO -OOH+ R-CH-COOH s NH2 Fig. 1IL14. - Reac|ia general a de transaminare Mecanismul (de ping-pong) reacfiei de transaminare poate fi urmSrit u§or dac& se iau in considerate notafiiie: E — CHO = aminotransferaza cu coenzimS piridoxalfosfat E — CH2NH2 = aminotransferaza cu coenzimS piridoxaminfosfat gi dacd. se {ine seam a de int:erven|ia succesivd a celor doud coenzime in reacfii reversibile: “ HoQ

R1~CH-NH2 * QHC-E Ri—CH—N = CH—E «$-=-=-* I f COOH COOH ' Baza SchiffI R/ —C—N.—CH2-E R-I-C-COOH + E~CH2~NH2 COOH O Baza Schifl R2-C-COOH + E~CH2~NH2 R2~e~cooH o N-CH2~E Baza SchiffHi + HoO ' R^CH-COQH^d** Rp-CH-COOH * E -CHO II N-CH—E NH2 Baza SchifV Fig. ill.15. - Mecanismul transaminarii i -H ;;=s. 121 In reacplle de decarboxilare a aminoacizilor, piridoxalfosfatul joac& rol de coenzimft tot prin formare de baze Schiff intermediare. Coenzima piridoxalfosfat paiticipg. gi ia procesul de trans-sulfurare; spre exemplu, la reacjia metioninei (sub found de S-adenozil melionind) cu serina din care rezultd ci stein a (vezi metabolismul acestor aminoacizi). In sfargit, piridoxalfosfatul participd la mecanismul de acjiune al fosforUazei implicate in scindarea glicogenului (vezi „g!icogenoliza“). Acidul pantotenic gi coenzima A Acidul pantotenic poartd acest nume (in grecegte, pan = tot, peste tot) pentru' cd este foarte mult r&spandit in fesuturile vegetale gi animale. Din punct de vedere structural, acidul pantotenic este produsul condensarii acidului 2,4 - dihidroxi - 3,35 - dimetil ~ buliric (numit gi acid pantoic) cu P - alanina: CHj HQ-CH3~C- CH - CO- NH- CHr CHr COON 2 \ \ .22 CH3 OH

Acid pantoic * ft - alanina Fig. ill.16. - Acidul pantotenic In majoritatea organelor acidul pantotenic este fosforilat pe seama ATPului, sub acpunea unei kinaze specifice. Produsul rezultat este anirenat ulterior intr-o serie de alte patru reacpi enzimatice, succesive, eonducand la formarea coenzimei A:

CH7 \ 3 CH2 i2 NH -CO Coenzima A participd la numeroase procese biochimice fundamentale, atat de biosintezd (spre exemplu, biosinteza acizilor gragi, a colesterolului), cat §i de degradare (in special la degradarea oxidativd a catenelor hidrocarbonate din divergi cataboliji). Posibilitatea coenzimei A de a participa la reacjii numeroase gi variate se datoreazd faptului cd gruparea — SH din molecula sapoate forma legdturi tiolesterice, macroergice. Spre exemplu, „activarea“ acizilor gragi (premergdtoare degraddrii oxidative sau biosintezei lor) are loc conform reacfiei: R — COOH + CoA — SH + ATP — ^ R — CO - SCoA + AMP +PP; 122 Se observe cH in reacfie s-a prescurtat slructura coenzimei A libere sub forma' CoA - - SH pentru a se pune in evident grupul reactiv, respectiv - SH. Acesta este modal obignuit de a se nota forma liberS a coenzimei A. De asemenea, din reacfie se observe leg&tura macroergM, C ~ S (aflatft in fiolesterul acidului gras) s-a format prin desfacerea and legSturi macroergice din ATP (scindat in AMP §i PPj). Un compus macroergic important in const!tujia caruia intr3 coenzima A este acetil — CoA, CH3 — CO ~ SCoA, intalnit mult in studiul metabolismelor; mai ales, In cadrul mefaboiismului glucidic gi lipidic. Biotina §i rolul ei coenzimatic Biotin a este vitamin!! pentru om §i animalele super ioare iar pentru drojdii, ciuperci §i bacterii este factor de cre'gtere. In constitujia moleculei de biotinS intr& cidul hidrogenat al imidazolului condensat cu ciclul hidrogenat al tiofenului. La acesta din urm&, in pozifia a fa{3 de atomul de suif, se aflS atagat (prin sobstituire) radicalul acidului valerianic: O 'CN HN NH HC■CH H2C CH- {CH2)4 - COOH Fig. Hi.18 - Biotina S In organism biotina unplinegte roluri importante, pariicipand in mod

constant la metabolismul lipidelor - formarea gi degradarea oxidative a acizilor gragi - precum gi la metabolismul glucidelor carboxikrea acidalui pimvic pentru formarea acidului oxalacetic (pnszent in ciclul acidului citric). De asemenea, biotina intwine gi m alte reacfii importante care necesit& fixarea dioxidului de carbon pe unii metabolifi. In toate aceste reacfii biotina funcfioneazSt cu rol de coen.zi.md. In calitatea sa de coenzima a carboxilazelor, biotina ia parte la reacfii de carboxilare care aparfin unor cSi metabolice bine precizate: Tabelul III. I Enzime care func$ioneaz3 cu coenzima biotina Enzima Rolul metabolic Piruvat carboxilaza Prima reacfie pe calea care conduce la transformarea precursorilor - rezultaji din unitaji cu 3 atomi de carbon - in glucoza (gluconeogeneza). Procura oxalacetat pentru ciclul acidului citric. Procura unitaji cu doi atomi. de Acetil. - CoA carbon - de acetat - in sinteza carboxilaza acizilor gragi pentru formare de malonil - CoA. Transforma propionatul in Propionil - CoA succinat care rntra apoi in ciclul carboxilaza acidului. citric P - Metil - crotonil - CoA Intervine in catabolismul leucinei - carboxilaza gi al unor compugi isoprenoidici 123Se ilustreazii aici rolul coenzimatic al biotinei In carboxilarea acidului piruvic. Reaefia general^ este: CH3 — CO •— COOH + CCX, - -HOOC — CH2 — CO — COOH acid piruvic acid oxalacetic Trebtiie subli.ni.al faptul eft la ieacfie dioxidul de carbon participft numai sub formft activatft, adicft unit cu biotina. In aceastii etapft a reacfiei iau parte: HC03\ ATP, Mg2+ §\ acetil - CoA. (cu ro! de efector alosteric). Ulterior, grupul carboxil activat. este transferal: la acidul piruvic. R i ? C OH [ NHx ° COOH CH _ CH _ yCH —CM — S| CO + CO ■> CO — +s CO ''CH, — N/, 1 ''CH, — CH — NH/ CH — 'coo- CH3 CH2 \ COOH Carboxibi otinAcid Acid Biotin

enzima

piruvic

R I XCH — CH —

oxalacet ic

enzima R I yCH — CH — m\

--s j CO *■ HCO3 +ATP — ► S | CO + AOP + Pj / '''CH. — CH — NH '''CH, — CH — N y cooCarboxibiotina Fig. Hi.19. - Mecanismul carboxiiarii acidului piruvic Vitamina Bu (cianocobaiamina) §i rolul ei coenzimatic* Vitamina Bi2 Implinegfe rol de vitamina anfipernleioasft. pentru om §i este factor de credere pentru mieroorganisme. Poarta indicele 12 fiind considerate al 12-lea produs izoiaf din complcxul B. Nurnele de „cianocobalaminft“ este datorat constitujiei sale chimice deoarcce confine in molecuift o grupare dan §i un ion de cobalt (Fig. Ilf.20). Exists §i alte substanfe cu acfiune de vitamins B12 (vi tarn ere) care a.u structuri asemnftnftfoare cianoeobalaminei. Ele se deosebesc de aeeasta prin faptul eft in locul grupftrii — CN cuprind. o uitit. grupare funcfionalft electronegative (nitro, hidroxil), radjcalul melil sau chiai' un rest de deoxiadenozinft. In float, la omul sftnfttos, se gftscse obi§nuit trei coinpu§i cobalarninici; metil-, hidroxi- deoxiadenozil - cobalamina. Ace§ti compu§i - sau vitamina Bn ca^atare - iau parte, cu rol de coenzime, in procese metabolice esenjiale din organism, in special, ele sunt coenzime pentru unele transmetilaze.§i anumite izomeraze (mutaze). 124

Fig. 111.20. “ Vitamina B12 (ciancobalamina) R variaza dand diverse vitamere ale vitaminei B12 ; R = CN Tn ciancobalamina, R = OH in hidroxicobalamina,

R = 5’ deoxiadenozil Tn 5’ — deoxiadenozilcobalamina §i R - CH3, Tn metilcobafamina. Se exemplified aici, Tn primal rand, participarea metflcobalaminei, in calitate de coenzimft a unei (ransferaze, la reaefia de transformare a homocisteinei Tn metionM. In al doilea rand, se pane in evident inecanismul de intervene al rnutazelor §i se ilusireazd participarea deoxiadenozilcobalaminei - cu rol de eoenzirrul - in neaejia de transfoimare a. L — melil — maloniJ — CoA Tn succinil — CoA:. SH CH3 1 s..1 CH2

CH2

CH2

CH2

HC NH2 COOH

HC “ NH2 COOH

Me - H4 fotat {-J —Homocistein metiitransferaz a Homoci steina Me t/loobalamina Fig. HI.21. - Rolui coenzimatic ■ \ a A

Met ion in a al metiicobalaminei

125 ;• ; '• ! . :j.| ifdU. Ai"Y 1 iv, wv' ii I ; -!■

' : i . V •ih -

■ii rL!:: CO CO \U\

1) Metilarea homocisteinei pentru transform area acesteia in metioninS are loc in cifoplasmd utilizandu-se N5 — metiltetrahidrofolatul (Me—H4—folat) ca donor de metil. Enzima catalizani# este homocistein — metiltransferaza care admite drept coenzimd specified metilcobalamina. In aceasld reacjie metilcobalamina igi insugegte temporar un grup metil de la donorul Me—I-I4—folat §i-l transfer# homocisteinei, gcnemndo-se astfel metionina. Semnificafia metabolic# a acestei reacfii este dubla: se economisegte metionina iar tetrahidrofolatul devine disponibil pentru a putea participa la sinteza de purine, pirimidine gi acizi ouclcici. 2) Izomeijzarea catalizatd de mutaze are loc conform reacfiei: A1 \f If if Fig. Ili.22. - Mecanismu! intervenjiei mutazeior XH HX In cazul L — metil — malonil — CoA izomerizarea la succinil CoA decurge conform reacfiei: CH3 H2G- COON HC-GOOH HCH 1 1 C-SCoA C-SCoA II II 0 Deoxiadeno- O zi/cobafamina ■ L~ Metiimalonii - - - -,-------------^ Succinil CoA - CoA Mutaza Fig. III.23. - Rolut coenzimatic a! deoxiadenozilcobaiaminei fiind catalizalil de enzima L — metilmalonil — CoA mutaza care funcfioneazd cu coenzima sa specified, deoxiadenozilcobalamina. Este de remarcat cd deficienfa de vitamin# Bu se poate resimfi pan# la nivelul acestor reacfii. Astfel, in primul caz, homocistcina rdmane nemetilatd

§i ajunge sd se elimine prin urind (homocistinurie) iar in al doilea'caz, pentru acelag motiv, acidul L — metil — malonic se elimind tot prin urind (acidurie metilmalonicd). Existd gi patru lulburdri metabolice ereditaie caracterizate prin incapacitatea organismuiui de a folosi vitamina B{2 cu rol de coenzimdin reacfii de felul celor ilustrate mai inainte. In dou# din aceste maladii ereditare este afectatd numai formarea (sinteza) deoxiadenozilcobaiaminei iar in celelalte dou# s-a pus in evidenfd incapacitatea de constituire fie a deoxiadenozilcobaiaminei, fie a metilcobalaminef Acidul folic §i coenzimele derivate Numele de acid folic este generic; el corespunde mai multor vitamere ale sale. Ca gi aite vitamine din complexul B, acidul folic este vitamin# pentru organismele superioare gi factor de cregtere pentru microorganisme. Denumirea „acid folic“ se datoreazd faptului ca prima substanj# descoperitd din acest grup de vitamine a fost izolatd din frunze (in latinegte „folia“) de spanac gi s-a dovedit cd are caracter acid. In structura -molecular# a acizilor folici se afid condensate trei sunstanfe: un derivat trisubstituit al heterociclului numitpteridina, acidul p — aminobenzoic gi acidul glutamic: 126 OH

2 - amino - 4 hidroxi, 6 - me til -pteridina acid p- amino - benzoic acid glutamic Fig. 111.24, - Acidul folic (pteroilmonoglutamat) Numele de »,pteroilmonoglutarna.t“ este in legSturd cu structura chirnicd a acidului folic, deoarece compusul rezultat din condensarea 2 ^— amino — 4 — hidroxi — 6 metil — pteridinei cu acidul p — anunobenzoic se nume§te acid pteroic §i acesta este condensat -la rSndul sdu - cu on singur rest de acid glutamic. Se cunosc ins& al{i doi acizi folici: pteroiipentaglutamatul (cu cinci resturi de acid glutamic) aflat in ficatul animalelor pteroilheptaglutamatul (su §apte resturi de acid glutamic) extras din plante. In acegli acizi folici resturile de acid glutamic sunt condensate Intre ele ifttrun'mod special (neobi§niiit). Intr-adevSr, la fiecare condensare ia parte grupaxea carboxil din pozifia y a unui rest §i gruparea amino a altui rest (erm&forii!) de acid glutamic. . Cel mai important rol pe cared implinegte in organism acidul folic este acela de transporter a! unor entitdji cuprinzand cate un atom de carbon §i care sunt folosite in multiple biosinfeze. InsS, pentru a putea indeplini aceastS. funepe, acidul folic este — In prealabil — hidrogenat in compusul H4 — Mat, sub aepunea. folat — reductazelor caie utilizeazft ca donor de

hidrogen NADPH-flT'. Reducerea are loc la nivelul dublelor legfiluii 5-6 §i 7-8 din nucieui pteridinic al acidului folic propriu-zis (ptoroilmonoglutamat):

9 10 CHrNHCOOH: / -CO-NH-CH (CH2)Z } COOH Fig. ill.25. - Acidul tetrahidrofolic (FH4 sau THFA) , In calitatea sa de coenzimil in procese enzimatice de transfer, acidul tetrahidrofolic participd la trecerea grup&rilor cu un carbon: metil (—CH 3), metilen ( >012), formil (-r-CHO), formimino (—CH = NIT), de la un metabolit la altui. Spre exemplu, transferul grupului cu un carbon de pe serind pe homocisteinii cu formate de rnetionind are loc conform reaepilor din fig. IIL26. 127 CHrOH CH--NH, + I C-OOH Senna N H CHrNH~~ CH-NHS COOH / CH, N ^rCHrNN H ) FH4 Glicina N5, N 1° ~ me Wen « FH4 NSs N 10 „ metlien - FH4 + NADH * H N $ - metil - FH 4 + NAD* N^, - metil - FH4 + homocisteina > FH 4 + metionina Fig.!!!.26. - Particlparea acidului tetrahidrofoISc, cu rol coenzimatic, la formarea metioninei Dupd cam s-a arStat la vitamina Bri, ultima reacfie din Fig. 1IL26 tire loc cu participarea coenzimatic^ a cobalaminei, pentru.lransferul grupului — CH3 (Fig, XII.21). N5, N10 — metilen H4F, participant la reacfie are rol coenzimatic §i in cedarea unui OTP metil deoxiuridilatului pentru a-1 transforma in deoxitimidilat HN

x o 2 '-Dezox iuridilat (dUMP) xiz1 H _____ WA^CHJ Stntaza * \X4 N5tN’10 -metilen-FH4 A OH H XX \ H Dih/drofolat 2'-Dezoxitimidilat (dTMP) Fig. III.27. ■■ Rolul coenzimatic al acidului tetrahidrofolic la formarea deoxltimldilatuluj Reacfia. aceasta prezintfl un interes deosebit cad deoxilimidilatul, astfel format, este precursor implicat in sinteza ADN-ului. Formiminoglutamalul, un catabolit al histidine!, transfer^, grupul sM imino la li4 — foiat §i rezulta N5 — formimino ■— H4 — folatuL III, 3.2. VITAMINA C (ACIDUL ASCORBIC) Vitamina C poart& §i numele de acid ascorbic (a - fMrd, scorbic = r&d&eina cuvantului scorbut) deoarece este 0 substanfii acida (acid organic) §i vindecS boala numild scorbut. Structural rnoleculei de acid ascorbic este inruditd cu cea a hexozelor. De fapt, el poate fi considerat drept y - iactona unui add hexuronic, numit acid L - gulonic. In molecule mai sunt cuprinse §i patru grupari - OH: doud alcoolice (la C5 §i C6) gi douS enolice (la C2 §i C3). Atomul de carbon C5 are configurate stSng8,' 128 Prin indepSrtarea atomilor'de hidrogen din cele douS grup&ri. enoiice se ob{ine acidul dehidroascorbic. Ambeie forme (acid ascorbic, acid dehidroascorbic) devin interconvertible prin bidrogenare - dehidrogenare §i sunt fiziologic active. Structurile ior chimice sunt prezentate In Fig. XH28. O O 1C--------1 I 2C-0H il o 3 OH 4 I HC--------J 5 i

HO-CH 6 I CH2~~OH - 2H *2H JS*. c c~o l c~a HC-----I HQ—CH O CH2-OH Acid L - ascorbic Add L - dehidroascorbic Fig. Hi.28. - Acidul L-ascorbic §i acidul L-dehidroascorbic Ca atare sau sub forms oxidatd, vitamina C participd la reacfii multiple pe'care le suferd In organism diverse eategorii de compugi important - din pu.nct de vedere biochimic: aminoacizi, nucleotide, hormoni, vitamine, coenzime, ioni metalici. Majoritatea reacjiilor care au loc cu participarea acidului ascorbic (forma redusd) sunt hidroxildri In care este implicat §i oxigen molecular: R — H + Ac. ascorbic + 02 - -^ R — OH + Ac. dehidroascorbic + HzO Se cunosc Insd §i hidroxildri care se fac pe seama acidului dehidroascorbic. In aceste cazuri, odatd cu hidroxilarea altei substanje are loc §i reducerea fonnei oxidate a acidului ascorbic. Alte oil, reacjiile la care participd acidul ascorbic (forma redusd) constau numai In reduced. In labelul 1112. se menjineazd cateva reac|ii metabolice in care intervine acidul ascorbic (forma redusd sau oxidatd), precizandu-se tototdatd §l tipul de reacfie corespunzdton Tabefui III.2 Unele reacjii metabolice la care partlcipi acidul ascorbic ________Reacfia metabolica Tipul de reacfie chimica z 1/2 Q2—>O * * Citocrom a(c) Fe3+ —> Citrocrom a(c) Fe2+ Methemoglobina —>Hemogiobina Acid folic —> acid tetrahidrofofic *Frolina —-> hidroxiprolina * Lizina —>hidroxiiizina Triptofan —>5 - hidroxitriptofan * Reacjii importante in biosinteza coiagenutui Reducere Reducere Reducere i Cu participarea acidului ascorbic (forma redusd) Reducere Hidroxiiare Oxidare cu participarea acidului dehidroascorbic 129 Pe langft reacfiile menjionate in tabelul precedent, acidul ascorbic intervine §i in diverse alte reacjii de oxidoreducere in care funcjioneaz#

cuplai cu glutationul sau coenzirnele nicotinamidice §i flavinice. Un rol important il are acidul ascorbic in degradarea oxidativ# a aminoaciduiui tirozin# precum §i in formarea (tot din tirozin#) a liormonului medulosuprarenalian, adrenalina. In ambele procese vitamina C intervine ca un cofactor activator al anumitor enzime (vezi catabolismul tirozinei §i biosinteza adrenalinei). De asemenea, acidul ascorbic este implicat in sinteza acizilor biliari precum §i In absorbjia ferului. In sfSrgit, funcfionand ca antioxidant hidrosolubil, acidul ascorbic poate inhiba dezvoltarea nitrozaminelor in cursul digestion III. 4. VITAMINELE LIPOSGLUBILE Spre deosebire de vitamineie hidrosolubile, ceie liposoiubile au molecule apolarc, hidrofobe^ Din panel de vedere structural, toate vitamineie liposoiubile sunt derivafi izoprenici. In organism, vitamineie liposoiubile, provenite din alimentele ingerate, se comport# la fel cu gnlsimile rajiei §i utilizarea lor depinde - in mare m#sur# - de meta- holismul lipidelor. Astfel, pentru a li absorbite din intestin vitamineie liposoiubile necesit# absorb}ia normaia a grasimilor din hraml Dupa absorbjie, vitamineie liposoiubile sunt transportateL- prin chilomicroni - la ficat gi apoi depozitate; in ficat; vitamineie ISX (B^K^iar in jesutui adipos Este de remarcat db spre deosebire de vitamineie hidrosolubile, ceie liposoiubile sunt vehiculate prin sange de cdtre anumite lipoproteine (unite cu ele). In organism vitamineie liposoiubile implinesc funejii importante foarte diferite. Astfel, vitamina A este necesar# - mai ales - in precesul vederii, vitamina D este direct implicate in metabolismul calciului §i fosforului, vitamina E joac#rol de antioxidant iar vitamina K-este strict necesar# in coagularea sangelui. Trebuie subliniat faptul c#, potrivit noilor concepfii biochimice, actualmente vitamina D (colecalciferolul) mi se mai considers vitamin# propriuzis# ci pro-hormon. III. 4.1. VITAMINA A ( RETINOLUL) Numele de vitamin;!-A este generic, valabil pentru mai multe vitamere ale sale, avand activitatea biologic# a primului prod us izolat c#ruia i se mai spune retinol. Acest nume se datoreaz# faptului c# este un alcool inrudit. imediat cu retinalul care intr# in constitufia bastonagelor din retin# (vezi, mai departs, rolul retinalului in menjinerea vederii). Actualmente exist# tendin{a de introduces a termenului de retinoi.de pentru cuprinderea intr-un singur grup atat a vitaminelor A naturale cSt gi a substanjelor sintetice, analoge retinolului. Din punct de vedere chimic, vitamina A este un derivat poliizoprenoidic care confine gi nucleul ciclohexenului: 130 Fig. Hi.29. - Vita min a A (retinolul) CH3 CH3 CM?

CH, OH CH, Vitamina A are mai multe provitamine. Aces tea sunt substanfe care se

transform^ - in organism - in vitamina. Provitaminele A sunt carotenii: a, (3 §i y. Ei sunt pigmenji tie euloare galbeny - roz, aflaji in anumite vegetal e care fac parte din hrana obi§nuitH a omului. Carotenii sunt $i ei compu§i poliizoprenoidici §i cu nucleu ciciohexenic.

P - carotenul posed;! o marcante activitate antioxidants fajS de radicaiii iiberi peroxidici. Deoarece activitatea sa antioxidants interfere adesea cu cea a vitaminei E, potenj&ndu-se reciproc, se presupune c3 ace§ti compugi liposolubili (provitamina A §i vitamina E) ar putea avea, impreunS, §ivo eficientS acfiune anticanceroasS. Activitatea biologies a vitaminei'A propmTz^^ in parte, §i de alte douS substance inrudite structural: retinalul §i acidul retinoic (Fig. III.31). Retinalul (aldehidS) este un component al pigmentului vizual rodopsina din bastonagele retinei. Intr-adevSr, rodopsina este constitute dintr-o proteins simply, opsina §i 11-cis- retinal (Fig. III.32.). Senzajia vizuaie, mediate de bastonage, ia na§tere in urma ahsorhfiei fotonilor.de luminS de cStre rodopsind. Insd absorhfia luminoasS determine descompunerea rodopsinei in opsinft §i retinal cu structure trans* All-trans retinalul, general, de rodopsinS, trece din nou in 11-cis-retinal prin izomerizare iar acesta din urm& reface rodopsina (Fig. III.32). Izomerizarea catalizatfi de o enzime specific^, retinal izomeraza, este ins# incomplete. Se injelege, in aceste condifii, c& pentru asigurarea desfyjurMi normale a procesului descris este absolut necesar un aport constant §i permanent in rafia alimentary de all-tras-retinal; respectiv, de vilamiml A (all-trans-retinol). Acidul retinoic participS la sinteza giicoproteinelor. De fapt, sub forme de retinil fosfat, acidul retinoic are rolul de a transporta, prin dublul strat lipidic celular, oligozaharidele care urmeazft s3 fie incorporate in glicoproteine. In acest proces acidul retinoic sufer! §i el izomerizare enzimatic5 cis-trans, analogy celei intalnite in ciclul rodopsinei. 131' •i •; i nW. f I: v CH<, CH* CM,

yOH CH3 CH3

Retinol (vitamins A) Acid retinoic Fig. ill.31. - Trecerea p-carotenului in retinol §i formarea derivator Tnrudiji i!: in: ' if.-.

Retinal izomeraza IT' ^

Opsins Rodopsina

Fig. IIL32 - Ciclui rodopsinei 132 Unele date relativ recente susjih eg. retinoidele ar afecta §i expresia genetidi. implical.il alat in proliferarea cat: §i in diferenjierea mai multor tipiiri de celuie normaie^Tmaligne. De altfel, s-a constatat c3 administrarea de retinoide scade totdeauna efectele unor compu§i caranogenici. III. 4.2, VITAMINA D. Ca §i vitamina A, vitamina D are mai multe vitamere §i mai multe provitamine D. Dintre ele, cele mai importante - din punct de vedere al acjiunii biologice §i ai rolurilor metabolice pe care le Implinesc - sunt vitaminele D2 §i I)v Ele corespund respectiv, provitaminelor ergosterol §i 7dehidrocolesteroL Tocmai pentru a se sublinia aceastS provenienja, vitaminei D2 i se mai spune ergocalciferol iar vitamina D3 se mai nume§te colecalciferol (Fig. HL33). Ambele vitamine au activitale antirahiticS (egalS). Deoarece aceastfl. acjiune biologic# este caracteristicd vitaminei D (name generic) ei i se mai spune vitamina antirahiticd. Totodate, asa cum s-a mai men|ionat, vitamina D este considerate astSzi ca un prohormon de tip sterolic. I'ntr*adev8r, prin hidroxilM suplimentare, ea de na§tere in organism hormonului calcitriol care joacft roi important in metabolismu! calciului §i fosforului (vezi capitolul ,JHormoni“). Din punct de vedere structural, provitaminele D sunt: steroli care diferS intra ei prin catena lateraie fixate in pozifia 21 iar vitaminele corespunz#toare pestreaze structura provitaminelor dar au nucleul B deschis.

Ergosterol (plante) Ergocalciferol (vitamina D2)

7 - dehldrocofesterol Colecalciferol {vitamina D3) (animaie) Fig. til.33. - Structurile ergosterolului, 7-dehidrocolesterolului §i ale vitaminelor D2 §i Da

rezultate prin fotoliza Vitamin a D din alimenteie ingerate este supus#, ca §1 gr#simile, acjiunii emuisifiante a bilei, apoi este absorb## prin regiunea proximal# a intestinului subfile, De la acest nivel, transportul prin sange al vitaminei D implicit unirea sa cu o polipeptid# (sintetizat# de ficat) §i care are mobilitate a - globulinic#. In acest fel, vitamina b2 (sau D3) ajunge in ficat. Tot la ficat ajunge prin sange §i vitamina D3 formats din 7 - dehidrocolesterol - in piele sub acfiunea radiafiilor ultraviolete din lumina solar#. In ficat vitamina D3 safer# hidroxilare la pozifia 25 sub acfiunea unei enzime specifice (vitamina D3-25-hidroxilaza). Produsul 25 - hidroxi colecalciferolul (25 - hidroxi - vitamina D3) reprezint# forma cea mai abundent# de compuji din aceast# categoric de vitamine D, aflat# in circulafia sangvin# §i in depozitul hepatic. 0 fracfiune apreciabil# din ea sufer# circuit enterohepatic ceea ce explica, deficienfa de. vitamin# D resimfit# in tulbur#rile acestui proces. Ulterior, 25 - hidroxi - colecalciferolul din sSnge safer# o noe# hidroxilare, la pozifia 1, sub acfiunea unei alte enzime specifice, 25 - hidroxi - vitamina D3 - la - hidroxilaza, aflat# in tubulii renali, oase §i placent#. Sub acfiunea unei alte enzime specifice aflat# in tubulii renali, cartilagii §i placent# 25 - hidroxicolecalciferolul poate fi hidroxilat §i in pozifia 24. Nivelul acestui 24, 25 - dihidroxicolecalciferol in ser se afl# in relafie reciproc# cu cel al 1,25 - dihidroxicolecalciferolului. Concentrafiile lor in sange sunt egale cand concentrafia calciului seric este normal#. De fapt, regiarea nivelului lor in sange se face direct de c#tre hoimonul paratiroidian §i indirect de concentrafia calciului seric. Este de remarcat c# nivelul 1,25 - dihidroxicolecalciferolului depinde - in mare m#sur# - §i de concentrafia fosforului plasmatic.

Fig. 111.34. - Coiecalciferolu! §i produ§ii lui d© hidroxilare formafi in organism 134 III.4.3. VITAM1NA E Vitamina E se mai nurnegte gi tocoferol. Acest nume este in legilturii cu principals ei funcjie bioiogicl de a favoriza fertilitatea (in grecegte tokos = nagtere gi pherein = a purta, a suporta). Vitamina E ai*c 4 vitamere (tocoferoli) care se gdsesc in nature, sunt semnificativi din panel de vedere dietar gi au constitujii chimice

asemnSnftoare (Fig, IIL35, Tabel.III.3.). Forma cea mai biologic - activ<1 este a •• tocoferolul. Tocoferolii au in moieculele lor, ca structure de bazfi, tocolul. La randul situ, acesta conjine un nacieu cromanic substituit in pozijia 6 cu un hidroxil iar in pozijia 2 cu un metil gi un radical saturat conjinand 16 atom! de carbon, Din toco! derive, prin median in diverse pozijii (5,7 sau 8) , cei palru tocoferoli naturali:

Fig, 111.35. - a-tocoferolu! Constitujia chmiica a tocoferolilor natural! Tabelul Ilf.3. Tocoferol a (alpha)

Pozijii substitute §i nume 5,7,8 - Lrimetiltocol

p (beta)

5,8 - dimetiltocol.

y (gamma) 7,8 - dimetiltocol A (delta) 8 - metil locol Deoarece vitamina E este cuprinsil in Ijoidclc aiMeMeto^dupd ingerarea acestora ea se ebbereaza gi se absorbe la nivelul intestinului sublire in cursul digestiei iipidelor. Ulterior, vitamina E este transportatS de sSnge la ficat gi alte organe. Se consider^ cl transportul vitaminei se face prin inglobare in chilomicroni iardupS eliberarea din ei este preluaU1.de iipoproteine. Date relativ recente tind s&arate eft fosfolipidele din mitocondrii, reticulul endoplasmatic gi membranele plasmatice posedft afinitftji deosebite (specifice) peniru a - tocoferol, ceea ce duce la concluzia cl vitamina E se concenlreazft in aceste formapuni. De asemenea, dupft cum s-a mai menjionat, depozilarea tocoferolilor se face in {esutul adipos.

135 in organismul urnan vitamina E joac& un rol important, funcfionanci ca antioxidant , In aceasta calitate, ea protejeazd hematiiie fa0 de divergi toxici oxidanji (radicali liberi- ai oxigenului), previne oxidarea unor hormoni hipofizari §1 suprarenalieni precum oxidarea altor substanje ce sunt, utile ca atare; spre exemplu, vitamina A §i acizii gm$i esenjiali Mecanismul interven{iei tocoferolilor in procesul antioxidativ se explied in fclul urm&tor: tocoferolii pot intrerupe §irul reac{iilor (inlSnJuite) ale radicalilor liberi datoritS capacitajii lor de a transfera un hidrogen fenolic propriu la un radical liber peroxi di.o.rr- un peroxid de acid gras polinesaturat: Toe OH + ROD' -----------------------^ Toe 0“ + ROOH Ulterior, radicalul liber fenoxi format din tocoferol reaefioneazd cu un alt peroxi! liber: Toe O’ 4- ROG' ■——ROOH + produs de oxidare fara radical liber Acest produs fM radical liber are struclura din Fig. III.36.

oc~o \ CHrCH3 Fig, HI.36. - Produsul de oxidare ai a-tocoferoiufui DupS conjugarea sa cu acidul glucuronic, produsul de oxidare a! tocoferolului este excreta! prin bil& - intestin. Acfiunea antioxidants a tocoferolilor este apreciabilS. §i eficientS la concentxatii ridicate ale oxigenului. DatoritS acestui fapt, tocoferolii au tendinfa sS se concentreze in acele structuri lipidice care - in genere - sunt expose h presiuni ridicate de oxigen; spre exemplu, in rnembrana eritrocitarS §i in mernbranele arborelui respirator. Up alt fapt demn de semnalat In legdturd cu acfiunea. antioxidants, a tocoferolului esie conlucrarea sa cu seleniul in acelag scop, intr-adevdr, in calitate de component: ai sistemului glutation peroxidazei - seleniu dependents, seleniul participS p el la prevenirea aejiunii distructive a peroxizilor, alftturi de vitamina E. Pe de aldi parte, a§a cum s»a specificat la vitamina A, tocoferolul poate fi intovM§it. in activitatea sa antioxidantd de p - caroten, cu acfitme sinergicS de acela§ tip. IH.4.4. VITAMINA K Vitamina K poartS acest: indicator deoarece este necesarfl coagulSrii (Koagulation’s Vitamin). Pentru acest motiv i se mai spune §i vitamina antihemoragicS. Intr~adevSr, earenfa vitaminei K determine predispozifii la hemoragii datorate prelungirii timpului de coagulare a sangelui. 136 o o

Menadione (vitamina K?) Menachinona (vitamina K2; n-6f 7, sau 9) /ON®

N FIlochinona (vitamina KJ ■ CWa, Menadio! ~ difosfatuf de sodiu 'Fig, Hf.37. - Struoturile vitaminefor K naturale §i de sinteza Ca §i celelalle viiamine liposolubiie, vitamina K am mai muite vifamere cu structuri chimice asemSnfltoare (Fig. 37). In primal r3nd, exists cioiul viiamine K naturale important©; vitamina K), izolatii din vegetale §i vitamina K2, izolatii din jesuturi animate §i baeterii iniestinale (care au capacitafea de

a o sintetiza), De ascmvnoaJitiocoIuL constituent at membranelor lipidice din bacilul Koch, are §i el activitale de vitamM K. Alfsturi de acestea, exisUl mai mulji produ§i de sintezS foiosiji in terapeuticil §i care au conslitufxi chimice asemftn&toare iar activity de vitamina K cel pujin egale cu cele ale produ§ilor nalurali. In aceasta categoric infrd menodiona §i unii derivaji funcfionali ai sfii (Fig.37). In constitujia lor molecular#, vitaminele K naturale cuprind nucleul p naftochinonei substituit in pozijia 2 cu un radical rneUf iar in pozijia 3 cu un radical poliizoprcnoidic. Produ§ii de sintezd nu conjin in moleculele lor radical! poliizoprenoidici. Vitamina K din aiimenleie ingerate este absorbitS la nivelul jejunului §i acest proces depinde de absorhjia norm alii a lipidelor. Intr-adev3r, cea mai frecvcnt& deficienfa de vitamin# K se daloreaziS malabsorbjiei grdsirmlor care - la randul ei - este asocial# cu disfunejia pancreatic#, obstruct!! biliare, atrofierea mucoasei iniestinale sau alter diverse cauzc de steatoree. Dup# absorbjie, sub acf'iunea bilei, vitaminele K naturale - Impreunil cu lipidele tree pemale limfaticS In sange care le duce la float* Vitaminele K de sintez# tree direct in torentul sangvin (fiind hidrosolubiJe). Ficatul este principalul organ de depozilare temporal# a vitaminelor K naturale. VitamineleK de sintezS nu-se acumuleazif in ficaf; excesul lor se elimin# prin urin#, sub form# de glucurono-conjugaji. Cea mai important# funejie a vitaminei K in organism este impiicarea ei in proeesul coagularii. Dup# cum se §tie, la form area fibrinei particip# protrombina iar la biosinteza protrombinei intervine vitamina K. CercetSri relativ recente au demonstrat cS aceast# vitamin# nu este implicate nurnai in biosinteza protrombinei (faciorul II) dar §i in cea a altor factori de coagulare (VII, IX, X). Top ace§ti factori ai coaguhlrii sunt biosin tetiza{i 137 alter factor! de coagulare (VII, IX, X). Toji ace§ti factor! ai coagulSrii sunt biosin tetizaji in ficat, sub forma unor precursori inactivi care devin biologic activi prin intervenes vitaminei K. De fapt, ulterior procesului de traducere a mesajului ARNm In seevenfa aminoacizilor din proteinele specifice - care constitute factorii de coagulare - intervine vitarnina K. Ea ajutS la modificarea resturilor de acid glutamic in resturi de acid j - carboxiglutamic, Modificarea constS intr-o carboxilare ce se face pe seam a dioxidului de carbon, in microsomii ficalului, sub aejiunea cataliticS a carboxilazei - in prezenja oxigenului - cu vitarnina K (forma hidrochinonicS) drept cofactor al enzimei.

Fig. IN. 38. - Carboxilarea resturilor de acid glutamic la resturi de acid ycarboxiglutamic, pentru constituirea factorilor de coagulare, prin intervenjia vitaminei K Resturile de acid y - carboxiglutamic (protrombina conjine 10 asemenea resturi) pot chela ionul calciu: Ca2+ O Om -Q O %/ cc

\/ CH ! CH2 —C—CH—NFig. ili.39. - Chelarea ionuiui de calciu de catre acidui f-carboxtgiutamic Acest proces de fixate a calciului este esee|ial pentni rolul biologic al factorilor de coagulare. S-a constatat cS pe langS factorii de coagulare exists §i alte proteine care conjin resturi de acid y - carboxiglutamic, formate tot prin intervenjia vitaminei K. Aceste proteine au fost identificate in diverse organe: piSmanL spliriS, rinichi, placentS, case (osteocalcina). 138 CapJV. ACIZH NUCLEICI IV. 1. INTRODUCERS Acizii nucleici sunt, din punct de vedere chimic, produji de policondensare a unor uni- tiifi denumite nucleotide. Se cunosc dou& clase de acizi nucleici; acizi dezoxiribonucleici (ADN) §i acizi ribonucieici (ARN), Atat ADN cat §i ARN sunt macromolecule informaponale care permit stocarea, transmitereai §i exprimarea informapei genetice. Molecula de ADN repezintd baza chimicd a eieditip, ea confinand informajia genetic^ cu privire la biosinteza proteinelor. Conpmitul informational al ADN, inserts in secvenja nucleotidelcr ce constituie macromolecula, permite specificarea structurii fiecSiei proteine, determine deci, prin definirea caracterelor morfofuncponale ale unui organism, individualitatea acestuia. Transmiterea informapei genetice de-a lungul generapilor, cu o fidelitate ireprogabiM, este rezultatul capacMpi de autoreplicare a moleculei ADN in virtutea cSreia molecula de ADN parental este copiatS astfel incat s& formeze doud molecule - fiice avand o secvenp nucleotidic^, deci un conpnut informational, identic^ cu ADN parental. Exprimarea informatiei genetice cuprinsd in molecula de ADN in secven{e specifice de aminoacizi, deci in proteine, se realizeaz& pe parcursul a doud procese: - transcrierea - constdnd in rescrierea unor pftrp din mesajul genetic sub forma unui ARN denumit mesager. Acesta. preia din nucleu mesajul genetic cu privire la biosinteza unei anumite proteine §1-1 aduce in citoplasmS, locul de biosinteza a proteinelor; - traducerea - in cursul c&reia mesajul genetic, care se afl& inseris intr-o succesiune de triplete (grup de trei nucleotide) din ARNm este exprimat in secvenjS de aminoacizi. Fiec&ruia dintre cei 20 de aminoacizi ii corespunde o succesiune de trei nucleotide, desemnat# drept codon. Amplasarea aminoacizilor intr-o secvenpi caracteristic^ unei proteine (codificatd de un anumit fragment ADN §i transcrisd intr-un anumit ARNm) este asiguratS de molecule de ARN „de transfer44, purlfttoare ale unor triplete complementare cu divergi codoni din structura ARNm denumi{i anticodoni. Acest ARN de transfer „adapteazS“ un anumit aminoacid, cel pe care-1 transports, in faja codonului de pe ARNm ce specified aminoacidul dat, gra{ie recunoagterii

codon-anticodon, in felul acesta, fiecare aminoacid !§i gSsegte locul „consacrat“ in polipeptidul in curs de sintezi. Fluxul de informape in lumea vie este exprimat prin „dogma central&“ a geneticii moleculare, care redS relapa celor trei procese fundamental (replicare, transcriere, traducere) grape cSrora se asigura continuitatea genetic^ a organismelor: Descoperiri relativ recente completeazS substantial imaginea oferitd de „dogma central^44, pnandu-se seama de capacitatea de autoreplicare a unor tipuri de ARN ca §i de cea de transcriere a informapei din ARN in ADN. Transcriere Traducere PROTEINE. 139 IV.2, STRUCTURA CHIMICA A ACIZILOR NUCLEIC! Kidroliza add# a acizilor nucleici d# na§tere la baze azotate, pentoze iji acid fosforic, Pentoza din structura acizilor ribonucleici s-a dovedit a fi Driboza, in limp ce aceea din structura ADN este D-dezoxiriboza. In structura acizilor nucleici pentozele se g#sesc sub form# cidici P-furanozic#. CHO CHO | | H — C — OH | H ■ C —' OH — | H

H—C—H| H _ c — OH 1

H — c — OH i 1 CH2OH CH2OH D-riboza D-2-dezoxiriboza IY.2.1. BAZELE AZOTATE DIN STRUCTURA ACIZILOR NUCLEICI. Razele azotate care intr# in structura acizilor nucleici deriv# din dou# structuri heterocidice: purina §i pirimidina. 6* — C — OH | 1

1

Piiimidlny Razele purinice din structura acizilor nucleici sunt adenina (6amino~purina) §i guanina (2-amino-6-hidroxipurina). Ca baze pirimidinice s-au identificat 3 baze majore: - uracilul (2,4-dihidimi-pirimidina); - timina (2,4-dihidr6xi-5-metil-pirimidina); - citozina (2-hidroxi-4-aminO“pirimidina). Razele purinice §i pirimidinice prezint# fenomenul de tautomerie. Se considers structuri tautomere doua structuri care difer# una cle cealalt# prin pozijia unui atom de hidrogen §i a unei dubie legSturi. Bazele azotate prezinta tautomeric lactim-lactam datorit# OH O grupei — C = N — care exist# in echilibm cu forma — C — NH »~ O OH — G — NH — —C=N— forma lactam forma lactim 140 In structura acizilor nucleici se g^sesc formele lactam, mai stabile. NH 2 0

- Adenma (6-aminopurina) lac fjft)

Guanina

Lactirn Lactam Uracil (2,^-dfhjdroW'p/rim/dina) OH PH3 CH, HO HN" v/ N Laclim H Lactam Timina (5'mel/i-u'adf)

tactim Lactam Citozina (2-hidfO»-4-arnino*fMfjmiaina) Derivajii aminaji care nu confin grup&ri -OH prezintS §i ei tautomeric iminoamino, dar echilibrul este net deplasat in favoarea formei amino; NH2

N

141 Ca atare, adenina se va prezenta sub forma amino. De menfionat cd uracilul este baza pirimidinicd specified AR.N, In limp ce trmina este baza pirimidinicd'specified ADN. Atat ADN cat §i ARN (in special ARNt) confin §i baze „minore“ ce reprezintd forme mediate, tiolate sau glicozilate ale bazelor majore. Ra|iunea prezenfei lor in acizii nucleici va fi discuta td ulterior. Bazele azotate sunt molecule plane, relativ insolubile in apd. Prezinfd on maxim de absorhfie in ultraviolet intre 252-271 nm, in funefie de natura bazei azotate §i de pH, ceea ce permite determinarea cantitdfii de acizi nucleici intr-o probd. IV.2.2, NUCLEQZIDE §1 NUCLEOTIDE DIN STRUCTURA ACIZILOR NUCLEICI Nucleozidele sunt compu§i ce rezultd prin stabilirea unei legdturi Nglicozidice intie hidroxilul semiacetalic (de la C ’) al pentozei §i atomul de azot din pozifia 9 a unei baze purinice sau din pozifia 1 a unei baze pirimidinice. Ribonucleozidele confin ca pentozd p-D-ribofuranoza, in limp ce dezoxiribonucleo- zidele confin P-2 -dezoxi-D-ribofuranoza, NH 2 O

O

OH 142 Citidinn DeioxiUmiclinn Dezoxiribonucleozidele se citesc adSugand prefixul dezoxi la numele ribonucleozidului corespunzStor. In unde nucleozide pirimidinice, denumite pseudonucleozide, leg&tura intre pentozS §i baza azotatS se realizeaz-S prin intermediul C5 §i N,. Nudeotidele sunt esteri fosforici ai nucleozidelor la gruparea alcool de la C5>, sau C3> al pentozei. In structura acizilor nucleid intrS nucleozid-5’fosfa{i.

Nudeotidele din structura ADN se citesc adSugand prefixul dezoxi la numele nucleotidului con{inSnd riboza (dezoxiadenozin-S’-monofosfat sau 5’- dezoxiadenilat); In limp ce ADN ti este propriu 5’- dezoxi timidilatul, in A.RN de transfer exists ca nucleotid „minor“ 5MimidiIatuI. o

Dezoxi guanozin- 5-monofosfai (dGMP) (S’-Dezoxiguanilal) O

Guanozin-S'-monofosfai (GMPj (S'-Guaniial) NH 2

Adenozin-5'-monofosfat (AMP) (S'-Adeo/la!) 143 NH

i!-M Ac ■V

;C^V

; ,‘i in\ i N

OezoxiciMin S'-monotostat (dCMP) 5'-de-joxidliciilai CiliUin-5‘-monofoafal (CMP) (S'-cHirislaV) O

Uridif^-5 -monofostat (UMP) Dezoxilimidin { b -undilat) t%-nwiobsiat (dTMP) (5-dezoxilimidilat} Dac& un nucleozid sau un dezoxinucleozid este di~ sau trifosforilat se objin nucleozid sau dezoxinucleozid di- gi trifosfaji. De exemplu, in cazul adenine! se objin adenozin- difosfatul (ADP) §i adenozin-trifosfatul (ATP),

144 De menjionat exisfcenfa a douS conforma|ii posibiie- pentru nucleozide gi nucleotide derivand din suprimarea/ofafiei libere in jure 1 legSturii J$-Nglicozidice: conformafiu anti gi conformafia syn. In conformerii anti, dezoxiriboza gi baza sunt situate de pSr{i opuse fatS de legStura glicozidicS, ceea ce reduce repulsia stericS intre acestea. UzuaJ, conformerii anti sunt prezenji in dubla helice Watson-Crick (ADN-forma B) in timp ce conformed! syn sunt prezenji in ADN-forma Z (vezi structura ADN)„-

IV.2.3. NUCLEOTIDE NATURALE LIBERE in afara nucleotidelor descrise ca fund elemente de construcjie a acizilor nucieici,. exists o serie de nucleotide care indeplinesc roluri dintre cele mai important© gi variate in Jesuturi. Adenozin~3 ’ ,5 ’-monofosfatul (AMP ciclic, AMPC) mediazS acjiunea a numerogi hormoni (mesageri primi) care nu traverseazS membrana celularS. Prin interacjiunea primului mesager (hormonal) cu enzima membranarS adenilat cielaza pe care o activeazS, ia nagtere din ATP NH 2

0" Struclura 3',5' AMP(AMPc) O

0" Slrucluf 3',5‘ GMP (GMPc) 145 adenozin monofosfatul ciciic (rnesagerul secund). AMPC este interprets acfiunii hormonilor respectivi in celulS, el realizand, prin intermediul unor kinaze, fosforilarca reversibiD a unor enzime, aciivarea sau inactivarea acestora (vezi hormoni). Suprimarea acfiunii hormonului se traduce prin hidroliza AMPC sub acfiunea fosfodiesterazei.

'Ca AMPC, §i GMPC se comports ca un important semnal intracelular al unor mesaje extracelulare. Activarea prealatiD a unor molecule, in vederea efectudrii unor reacjii de transfer, se realizeazS. adesea prin cuplarea acestora cu un nucleotid; metionina este activate ca S-adenozil-metionina, glucoza, ca uridindifosfatglucoza etc. (vezi metaboiisme), Alte nucleotide joacft un rol important in reglarea replic&rii §i transcrierii la tmele organisme. Astfel, guanoziri - 5 ’ - di fos fa t-3 ’ - difosfa lu 1 (guanozin tetrafosfatul) §i guanozin- 5’-trifosfat-3’-difosfatul sunt implicate in transcrierea unor gene bacteriene. Diadenozin tetrafosfatul este un dinucleotid important in activarea aminoacizilor §i replicarea ADN. Concentrafiile mici de diadenozin tetrafosfat (Ap4A) in fazele de go! sintetic (G{ §i G2) ale ciclului celular, cre-sc spectaculos in faza S a ciclului. Se considers cd Ap4A ar acjiona ca semnal pozitiv al cre§terii. 1Y.2,4; 'ANALOG! STRUCTURAL! Al BAZELOR AZOTATE §1 NUCLEOZIDELOR Analogii structurali ai bazelor purinice §i pirimidinice sau ai nucleozidelor se comportil ca antimetabolifi, ei putSnd sft acfioneze fie prin incorporare in acizii nucleici, fie prin inhibarea unor enzime implicate in biosinteza ADN. Printre compu§ii avand acjiune antivirals sau antimitoticS se numSrS. 5fluoroura- cilul, 4-aza-uracilul ca §i unele nucleozide confinand ca zaMr arabinoza (arabinozil citozina). §i derivajii purinici, cum ar fi 6-tioadenina, 6-tioguanina, 6mercaptopurina, 8~ azaguanina, se utilizeazS in afecjiuni tumorale, dar mai ales in leucemia acuta. Utilizarea lor in clinicile de oncologie se bazeazft pe tumoverul crescut ai nucleoti- delor in jesuturile canceroase. Allopurinolul, inhibitor al sintezei de novo a purinelor este utilizat in tratamentul hiperuricemiei §i a! gutei. Azatioprinul (imuranul) este utilizat in prevenirea respingerii irnunologice in cursul transplantelor de organe. • *. Azidotimidina (zidovudina), derival al timidinei, este un antiviral redutabil pe care il folosegte, ca nucleozid trifosfat, exclusiv ADN polimeraza virali (nu §i cea uman&). Alfituri de alfi analogi structurali, azidotimidina se utilizeazS in infecfiile cu HIV (virusul imunodeficienfei umane). 146 o o 0 If II I! 5 O™ P- O- P- 0~ P“ 0— H 2 C iff , 1f( o O" 0“ 0" A" 4 C.y 0OH

o A. 7) A„7 HO HO OH 6- Aza-uridina HOH2C kQ? A/, OW Zidovudina (AZT) SH

6 - Marcapt^punna

MM ^ H 6 - Tioadenina IV.5.2. STRUCTURA COVALENXA A ACIZILOR NUCLEICI Acizii nucleici sunt poiinucleotide realizate prin stabilirea de legatori covalente Intre nucleotidele ce se succed in ianp Gruparea 5’-hidroxi a unui nucleotid este legatd la gruparea S’-bidroxi a nucieotiduiui urmdtor prin legdturd fosfat diestericd (Figura IV. L) De remarcat cd orice catena polinucleotidicd are o direcjie (o polaritate) specified, in sensul cd, toate legaturile internucleotidice au aceeagi orientare de-a lungul lanfului. Fiecare catena polinucleotidicd va avea doud capete: capdtui 5\ ia care gruparea -OH de la C5’ este liberd, §i capdtui 3’, la care gruparea -OH de la C3’ nu este angajatd intr- o legdturd internucleotidicd. Prin convenjie, structura unei catene polinucleotidice este scrisd intotdeauna cu capdtui 5’ in stanga §i cel 3* in dreapta. De exemplu, succesiunea ACGAC semnified faptuj cd adenina are grupa 5’-OH neangajatd in legdtura cu alt nucleotid in limp ce citozina are liberd gruparea 3’-OH. Doud lan{uri polinucleotidice sunt antiparalele atunci ednd unul evolueazdin direejia 5’ —>3\ iar celdiait in direefia 3?~A5? (Figura IV.2). 148

Fig. IV.1 - Fragment din structura unui polinucieotid §i reprezentarea sa schematics

Fig. iV.2 - Catena polinucleotidice antiparaleie; reprezentare schematics 149 IY.2.6. CARACTER1STICI FIZIGO-CHIMICE ALE ACIZILOR NUCLEIC! Denaturarea §i renaturarea AON La variajii man dc pH sau de tempera tur# are ioc ruperea Ieg#turilor de hidrogen care solidarizeaz# calenele ADN dublu helicoidai acompaniat#, inevitabil, de suprimarea interacjiunilor van der Waals. Acest proces — denaturarea ADN — este insojit de o moclificare a absarbjiei la 260 nm, maxim de absorbjie caracteiisiic bazelor azotate libere §i a ceior din structum ADN (la pH = 7). Cantitatea de lurnin# absorbit# de ADN nativ, dublu helicoidai, este mai mic# decat cea absorbit# de bazele purinice §i pirimidinice izolate. Acest efect hipocrom se datoreaz# „masc#rii“ parfiale a bazelor „stivuite“ (stacked) care interacjioneaz# tore ele. Denaturarea are ca efect previzibil hipercromicitatea, respectiv cre§terea capaciMfii de absorbjie in ultraviolet la 260 nm, §i poate fi monitorizat#

urmMrind modificarea absorbfiei in cursul procesului. Repaezentand modificarea absorbfiei funcjie de temperatum la cam este supus# o prob# de ADN' se objine o „curb# de ioplrd cu Haiti sigmoidal#, denot#nd interacjiuni cooperative intie baze. Suprimarea progresiv# a acestor interacjiuni culmineaz# cu sepaxarea complet# a calendar. Se definegte „temperatora de topiie“ (melting temperature) a ADN ca temperatura la cate modificarea absoibanjei xepre- zint# 50% din cea total#, coies- punzStoare unei denatur#ri complete (Fig. IV,3). Este u§or de admis c# pro- centul de perechi G - C respectiv A = T dintr-o molecul# de ADN' influenjeaz# temperatura de topire in sensul cresterii sau descre§terii acesteia. Comparand ,,profilur de topire a dou# molecule de ADN' §i cunoscand pioparfia de baze G ■+- C/A -r T pentm una dintie ele se poate aproxima proporfia acestora din cealaM molecul#, cu com- pozijie necunoscut#. Denaturarea ADN este perfect reversibil#. Prin restabilirea valorilor de pH §i temperatura la valori fiziologice cateneie, fie §i complet separate, pot reforma dublul helix original* prin rena- turare (annealing). Renaturarea (termic#) se produce la temperaturi sub temperatura de topire (ideal, cu 20°C mai mici ca aceasta), prin r#cire progresiv#. Viteza cu care are ioc renaturarea este mult mai mic# in situajia in care cele dou# catene sunt separate complet in comparafie cu cea in^care cele dou# catene an rSmas legate printr-un num#r mic de leg#turi de hidrogen. in primul caz, cele dou# catene trebuie mai intai s# se reg#seasc# §i s# tatoneze, prin coliziuni intamp!#toare, alinierea cored# pe o porfiune mic# care apoi se va extinde. In cel de-al doilea caz exist# deja un reper care va permite o renaturare spontan# (Fig. IV.4).

timus de vljel 150 ADN dubiu helicoidal

Fig. IV.4 - Stadiile denaturarii reVersibile a ADN §i regenerarea sa In afara utiliz&rii procesului de denaturare-renaturare In vederea determinSrii proporjiilor de baze dintr-o molecuhl de ADN ca §i a hSrfilor de denaturare (localizarea regiunilor bogate in perechi A=T in condijiile unei denatur&ri „blandeu — temperaturd

151 §i concentrate de agenji' denaturanji relativ mici), exist! §i alte aplicafii ale acestui proces. Printre cele mai importante se numM hibridarea molecular^. Tehnica hibridSrii moleculare permits renaturarea prin combinare a unor monocatene de ADN sau a unor monocatene de ABN cu ARN, in condijiile unui grad relativ crescut de. complementaiitate a acestora, cu formarea unui heteroduplex. Detec tarea regiunilor hibride aie unui heteroduplex se poate face electrono-micrcscopic (contur mai ingro§at). Vizualizarea electronomicroscopicd a heteroduplexurilor ADN- ARNra, formate in solujie, permits determinarea pozifiei intronilor (vezi mai departe) in rnoleculele de ADN sau, in cazul heteroduplexurilor ADN, evidenjierea delefiilor cromozomiale. Detec tarea heteroduplexurilor ca §i determinarea gradului de hibridare se pot face §i prin marcarea uneia dihtre monocatene cu 32P, urmat& de

/ 0

0X 10 C L 1

0

autoradiografiere. Identificarea unui anumit fragment de ADN dintr-un amestec de fragments separate —■ de exemplu, prin electroforezB in gel de agarozSL, utilizeazS o sondS ADN sau ARN' radioactive. Tehnica Southern permite transferal fragmentelor de ADN de pe gelul fragil pe o membraml solid! de nitrocelulozS §i identificarea ulterioarS a fragmentului de interes. Hidroliza acizilor nucleici Hidroliza acizilor nucleici poate decurge atat chirnic eat §i enzimatic. Hidroliza chirnic! decurge in mediu bazic sau acid. Spre deosebire de ADN, care este rezistent la hidroliza bazicS, ARN este hidi'olizat la un amestec de 2’- §I 3'- nucleotide. Deprotonarea grupei T—OH in mediu bazic favorizeaz! atacul nucieofil al acesteia asupra leg&turii 3’, 5’- fosfat diesterice cu formarea intermediary a unui nucleotid ciclic 2\ 3’, hidrolizabil la nucleozid- T sau 3s- fosfat (Figura IV.5). L. . ............;. . A / // *——-r O ------:or 0 /^ /< / 0"

H20 3' 7~ T O-POg OH A ~|~ T HO 0~PQ' Fig, IV.5 — Hidroliza bazic& a ARN 152 Rezistenja la hidroliza bazicd a ADM este u§or de injeles §i poate fi interpretatd ca o necesitate servind funcjiei de depozifare a informajiei genefice. Atat ADN cat §i ARN pot id hidrolizafi enzimatic sub acjiunea unor enzime denumite nucleaze. Se cunosc doud tipuri de nucleaze: endonucleaze, care hidrolizeaz# legdturile fosfat diesterice din interiorul catenei polinucleotidice §i exonucleaze, care hidrolizeazd nucleotidele terminate de la capdtul 5’ sau 3’ ale until lanj polinucleotidic. Aceste enzime sunt distribuite ubicuitar. Nucieazele secretate de pancreas particip# la procesul de degradare a acizilor nucleici. Acjiunea nucleazicd, in special cea exonucleazicd, este proprie §i unor enzime implicate in biosinteza ADN, cum ar fi ADN polimeraza III. O elasd important de endonucleaze specifice, denumite enzime de restricjie sau restrictaze, a fost evidential# la bacterii. Rajiunea existenjei acestor enzime este aceea de a distruge once ADN strain care a patruns in.baclerie, prin calitatea de a recunoagte secvenje specifice de 4-6 nucleotide §i a cliva, intr-un loc specific, cate o iegdturd. fosfat diestericd de

pe fiecare calemt Numdrul de enzime de restricjie izolate §i purificate este impresionant. De remareat faptul cd bacteriile i§i „crujd“ propriul ADN, marcandud chimic, in general, prin metilarea specified a unora dintre reziduurile de adeninS §i citozind cuprinse in seevenjele recunoscute de enzimele de restricjie. Metilarea are loc sub acjiunea unor ,,metilaze de modificare“ fie la gruparea amino a. adeninei fie la C5 al citozinei. Cel mai adesea acjiunea endonucieazicd ca §i cea metilazicS aparjine aceleia§i proteine. Restrictaza Hind II, izoiatd din Haemophilus Influenzae, taie specific seevenja: 5' C-T-Pirimidina -------------------Purina A-C 3' 3J G-A-Purina —— Pirimidina-T-G 5’ din orice ADN, cu excepjia celui care este metilat la nucleotidele adeninei din aceste secvenje, adied a propriuiui ADN. In cursul sintezei de ADN fiecare dintre catenele parentale serve§te ca mairija a cate unei noi catene complementare; catenele non sintetizate sunt imperativ modificate prin metilare specified inaintea unui nou ciclu de repiicare (inodificare postreplicare). Acest sistem de restricjie-modificare, propriu bacteriilor, defensiv, ingenios si eficace pulverizeazd agresorul (fragmentele rezultate prin acjiunea enzimelor de restricjie sunt degradate apoi de exonucleazele haeferiene), in general un virus (bacteriofag). Enzimele de restricjie, adevdrate bisturie moleculare, permit, t&ierea selectiv# a unor fmgmente de ADN in scopul utilizdiii lor in tebnicile de clonare a ADN (vezi ingineria genetic#). Dintre diversele tipuri de enzime de restricjie, tipul II are iegdturd direct# cu tehnologia ADN recombinant, spre deosebire de cele de tip I §i III care sunt enzime bifunejionale manifestand atat activitate endonucieazicd cat §i activitate metilazicd. IV.3. ACIZII DEZOXIRIBONUCLEICI In 1868, Miescher a izolat, din celule spermatice de pegte, un compus conjindnd fosfor pe care l-a numit nucleina, fiind izolat din nucleii celulelor respective. Siructura covalent# a grupdrii prostetice, care a prim it numele de acid dezoxiribonucleic (ADN), a fost stability in jurul anilor J 940. Cu totul revolufionard a fost demonstrarea de catre Oswald Avery, Colin MacLeod §i Mciyn McCarty in 1943 a faptului ed ADN este molecula ereditdjii, cd ea este purtdtoarea informajiei genefice. ADN extrem de pur, extras dinlrun pneumococ 153 • virulent. provoacS transformarea geneticd a unci su§e neviruiente de pneumococ. Virulenfa ca§ligalfi de aceasta din urm& este transmisd ereditar, prin includerea ADN injectat in ADN al celulei gazdii. Informafia geneiicd este tnscrisd in secvenfa variabilS a nucleotidelor, elementele din care sunt constituifi acizii nucleici. ADN confine informafia genetic# complete pentru a specifies structura proteinelor unui organism. Definirea caracterelor morfologice §i funcfionale ale unei celule, al c&ror substrat este reprezentat de proteine, se realizeaz# dupd program ul inscris in ADN. IV.3.1. STRUCTURA COVALENTA A ADN Acizii dezoxiribonucleici sunt polidezoxiribomicleotide cu mass,

molecular# mare in care gruparea 3’-OH a unui dezoxiribonucleotid este legal# la gruparea 5’-OH a dezoxiribonucleotidului adiacent printr-o leg&tur# fos-fat diestericl (Figura IV.6).

Fig. IV.6 - Structura covalenta a ADN ADN confine patru baze azotate §i aniime: adenina, guanina, timina §i citozina. In secvenfa nucleotidelor corespunzStoare din macromoleculele de ADN este inscris# informafia genetic# pe care acestea o cuprind. IV.3.2. CONFORMAT1A MOLECULE! DE ADN; TIFURI DE CONFORMATTII In stabilirea structurii secondare a ADN decisive au fost cercetdrile intreprinse de Chargaff, Rosalind Franklin §1 Wilkins, ale cSror concluzii le vom sumariza in celece urmeaz#: 154 - analiza cromatograficS, efectuatS de cfttre Chargaff pe molecule deADN izolate din diverse specii, stabile§te o anumitS. relatie cantitativS intre cede 4 haze azotafe, In toate tipurile de ADN studiate numeral de reziduuri de adenind este egal cu cel al reziduurilor de timing, iar cel al reziduurilor de guanine cu cel de citozina; rmmdrul de baze purinice este egal cu cel de baze pirimidinice (A+G=T+C); - difracjia razelor X, efectuatS pe cristale de ADN de c&tre Rosalind Franklin §i Maurice Wilkins, a demonstrat existenfa a doufi perioade de identitate de-a lungul axei lungi a moleculei: una mare, de 3,4 nm §i una mic&, de 0,34 nm. Pornind de la aceste date, cat §i de la necesitatea tie a oferi o interpretare molecular^ capacity!! de reproducere a informajiei genetice conjinuta in rnoiecula ADN, ca taMturli caracteristicS a acesteia, Watson, §i Crick an elaborat un model tridimensional al macromoleculei de ADN cu urmStoarele caracteristici; - tlouil lanfuri polidezoxiribonucleotidice antiparalele se riisucesc helicoidal §i in acela§i sens in jurul unui ax comun, formand o dubia helice cu orientare dreapta. Ineleie glucidice, legate prin resturi fosfat, constitute scheletul extern al dublului helix, in limp ce bazele azotate, hidrofobe, sunt

orientate spre interior §i perpendicular pe axa helixului. Toate grup&rile fosfat la pH = 7 sunt ionizate §i inc&rcate negativ; - cilindrul ce incadreazft dublul helix are diametrul de 2 nm; - distanja dintre planurile a dou3 baze adiacente este de 0,34 nm; perioada de identitate este de 3,4 nm, deci structura se repetS dupil 10 perechi de baze azotate; - stabilitatea dublului helix este asiguratfi atfit. de interacjiunile hidrofobe dintre bazele azotate cat §i de leg&turile de hidrogen ce se srahilesc intre bazele azotate de pe o catena §i cele complementare de pe cealaltit catena.; multitudinea de legattiri van der Waals, stabilite intre bazele azotate suprapuse, „slivuite“ (stacked), prin. suprafejele lor de contact, contribute major la stabilitatea moleculei. Leg&turile de hidrogen se stahiiesc, invariabil, intre o baxS azotatS purinicS de pe o catena §i una pirimidinica de pe cealaltli calenti. imperecherea a doua baze purinice

Timidin a

Dezoxiadenozina

Fig. 1V.7 - Baze complementare unite prin iegaturi de hidrogen 155 este excIusS intrucai s-ar depa§i spajiui oferit de dublul helix (diametrul constant,-- de 2 nm, de-a lungul axului), iar fmperecherea a dou& haze pirimidinice ar face imposibiia stabilirea leg&turilor de hidrogen, bazele azotate fund situate prea departe una de alta. Bazele pereehe sunt adenina-timina §i guanina-citozina, intrucat numai acestea pot stabiii num3rul. maxim de leg&turi de hidrogen, asigurand astfel conformafia cu energia iibeift cea mai mic&, de-ci cea mat stabilS, moleculei de ADR Adenina se leagS de timing prin dou& legiituri de hidrogen, iar guanina de citoziM prin trei leg&turi (Fig. IV.7). Cele dou8 catene poiinucleotidice nu sunt identice ci complementare, in sensul c&, adeninei dintr-o catena ii va corespunde intotdeauna timina de pe cealaM catena, iar guaninei - citozina. Succesiunea bazelor azotate dintr-o catena dicteazS succesiimea bazelor azotate din cea de-a doua catena.: o catena este replica celeilalte. Ins&gi dispozijia siruclurilor hidrofobe, respectiv hidrofile, in medial convenabil lor, confera stmcturii ADR maximum de stabilitate necesarS; tifcria leg&turilor care asigurd conformajia moieculelor de ADN trebuie sa fie

suficient de mare pentru a-i menfine integritatea pennifUnd totodata flexibilitatea conforma|ionaia a acesteia. Modelul Watson-Crick este reprezentat in Figura IV.8.

Fig. 1V.8 - Structura dublu heiicoidaia a ADN CAlZNit PAW;NTAtC

Fig. IV.9 - Autorepiicarea ADN 156 . Ir.formafia genetic# cu privire 1a biosinteza de proteine rezid# in ins#§i

secvenfa bazelor azotate din catenele de ADN. Multipiele posibiiifAji de variable a acesteia explicit multitudinea de proteine ce pot fi sinteiizate conform ,,instruc|iunilotu cuprinse in ADN. Modelul Watson-Criek ofer# elementele pentru explicarea capacity ADN fie a stoca §i transmite informa|ia inserts# in secvenja bazelor azotate. Fiecare dintre aceste catene va servi ca matrix (template) pentru sinteza unei catene noi, complementary cu catena parental9, rezultSnd astfel dou# molecule fiice identice cu ADN parental (Figura. IV.9). Conforrnajia dublu heiicoidal# descris# de Watson-Crick corespun.de formei predominante de ADN in celulii - forma B. Exist# dovada c#, departe de a fi o molecul# static#, molecula de ADN adopt# §i alte conformajii. Conformafia de tip A corespunde tot unei duble helice drepte d.ar este mult inai compact#; pasul helicei este de 2,8 nm iar numdrul de baze per tur este de 11. Ca. §i in cazul ADN-B §i in ADN-A predomin# conformerii anti. Conformajia de tip Z (Z de la zig zag) corespunde la o helice sting# avand 12 perechi de baze per tur, pasul helicei Bind de 4,56 nm. Ea intrerupe „monotonia“ helicei drepte atiinci cand intilnegte structuri speciale (anumite succesiuni de secven{e alternative de purine §i pirimidine) fiind prezent# a tit in condifii fiziologice cit §i in condijii speciale (la concentrajii marl de cation!). Intro succesiune GC dezoxinucleotidul guaninei adopt#

Fig. IV.10 - Confer- ma|ia 2 a ADN

Superrasuciri pozltlve 157jib A A:j

f:: : \ •' V;

conformafia syn iar cel a 1 citozinei pe cea anti, ceea ce face ca lanjul sft evoiueze in zigzag intne cele douM conformafii (Fig. IV. 10). MinoritarS fa|ii cle dubla helice Watson-Crick §i avand o stabilitate mai mic£ decat ea, prezenja acestei con.forma{ii are, probabil, o semnificafie biological; se sugereazS cS ar reprezenta un semna.1 de recunoagtere sau ar

juca un rol important in variabilitatea geneti- c<1 a organismelor (aceste regiuni sunt, in general, predispose la mutajii). Se admits c& in timpul proceseior de replicare sau transcriere a ADN, procese implicand , natural instabile. Dacft este a§a, rezuM c& in cursul acestor procese au loc remanieri ale conformajiei ADN, variable in cursul existenjei celuJei. De§i prezenfa acestei conformajii in vivo nu este ferm dovedita, exists argumente (in vitro) ca structura Z modifica interacjiunile ADN-proteine, prin excelenjS importante in replicare, transcriere, repararea leziunilor ADN. Se speculeazS ideea de limbaj conformational receptat ca rnesaj. IV.3.3. ORGANIZAREA MATERIALULUI GENETIC LA FROCARIOTE §1 EIJCARIOTE La procariote, o moleculii unicii de ADN, de mars dirnensiuni (confin&nd. 4.000.000 perechi de baze) §i in general circulars (formats prin legarea covalent# a capetelor 5’, 3'), alc#tuie§te un cromozom. Lungimea conturului de ADN cromozomial este de -1,4 mm, deci cu mult mai mare decat dimensiunile unei celule de Escherichia coli. Evident, molecuia ADN va trebui s& adopte in celuLI o form# cat mai compacts, care s-o fac# compatibil# cu spajiul oferit de ciitre aceasta. ADN circular formeaz# infr-adevdr superhelixuri prin suprarfisuciri, superspiralizftri (supertwisting, supercoiling). Suprar3sucirile spre dreapta (sensul dublei helice), determinate de scMerea num&rului de perechi de baze per tur helice (faf# d.e 10,5 in ADNR), sunt considerate'pozitive (positive supercoling ). SuprarSsucirile spre stanga, determinate de cregterea num&rului de perechi de baze per tur helice, sunt considerate negative (negative supercoiling) tot prin convenjie. Structure superhelicoidald negative este proprie celulelor vii, ea relaxand dubla helice. Suprarilsucirea este o proprietate universal fi a ADN dublu helicoidal; suprar&suciri apar nu numai atunci cand un ADN circular se r$suce§te in jurul propriei axe dar §i in cazul ADN Liiuar-deci fi la eucarioie. Formele superhelicoidale sunt In report cu forma helicoidala, ca §i una faja de cealaM, topoizomeri. Enzime specifics, denumite topoizomeraze, catalizeaz# aceste modificdri topologice, interconvertind izomerii topologici (tapoIogia-ramurS a matematicii, studiaz# deform&rile geometriei unor structuri). O topoizomeraz#, prezent# in procariote, este ADN giraza care are abilitatea de a produce sau desfiinja suprar3suciri negative. Dou& dintre subunitajile acestei enzime- tetramer (doiul perechi de subunit# {i A §1 B), acelea care introduc superhelixuri negative, au fi activitafe ATP-azic#, spre deosebire de subunitilfile specializate in desfiinjarea acestora. 158 Pe langd ADN reprezenlSnd materialal cromozomial, ce cuprinde setul complet de gene penlru specificarea tuturor caracterel'or celulei, bacleriile confin §i mici cantitdfi de ADN circular, ex(racroinozoniial, care se gdse§te in citoplasmd. Aceste molecule de A.DN se numesc plasmide §i confin o cantitate redusd de informalie geneUea. Pe langd alte gene, ele confin §i gene care specifiers anumite proteine ce le confera rezisfenfa la antibiotice. Plasmidele pot migra de la o celuld cu rezistenjd la un antibiotic la alia

.celuld, cu sensibilitate la antibiolicul respectiv, fdcand-o §i pe aceasta rezistentd, Rezistenfa la antibiotice, transferable nu nurnai in cadrul aceleia§i specii bacteriene ci §i de la o specie la alia,.pone probleme serioase antibioterapiei. Plasmidele s-au dovedit. a fi instrumente ideale de manipulare a genelor. Manifest&nd adesea autonomic fatd de ADN cromozomial, plasmidele se autoreplicM extrem de rapid. Posibilitatea incorporarii unui fragment de ADN strain intr-un plasmid, prin tehnicile ingineriei genetice, $i reintroducerea plasmidului modificat intr-un organism gazdd permite ohfinerea. unor mari cantildfi din gena str&ind sau din proteina specificate de aceasta. In cazul eucariotelor, cea mai mare cantitate de ADN se gase§te in nucieu care, spre deosebire dc procariote, este delimitat de citoplasma printr-o mernbrana. In perioadele de repaos ale celulei, deei in afara perioadelor de diviziune, materialul genetic se gase§te sub formd de cromatind, un material amorf, dispersal in nucieu, care confine ADN, proteine bazice denumite histone §i proteine nehistonice denumite -hertone. In timpul mitozei §i pufin inaintc de aceasta, cromatina se eondeiiseazd §i se subdivide in. cromozom i care sunt complexe ADN-proteine. Num&rul acestora depindc de specie; astfel, celulele somatice umane confin 46 de cromozomi grupafi in 23 de perechi, vulpea 34, puiul de gdind 78 etc. Fieeare cromozom confine o singuril moleculd de ADN linear lungimea sa variind de la un cromozom la altul. Porjiunile ADN care confin informajia genetied cu privire la sinteza unei proteine au fost denumite, inifial, gene. S-a mai tat: ulterior cfi proteinele fonnate din mai multe subunitdfi polipeptidice sunt codificate de un grup de gene, fiecttrei gene corespunzandu- i un lanf polipeptidic. Relafia dintre materialul genetic (ADN) §i expresia sa finald (proteinele) este cored exprimala prin conceptul o gend - un lanf polipeptidic; tot gene sunt §i fragmentele de ADN care nu se oxprimd final in proteine, ci in acizi ribonucleic! de transfer §i . ribozomiali. Gena reprezintd deci fragment'd cromozomial care confine informafia cu privire la sinteza unui singur lanf polipeptidic sau a unei molecule de ARN. Fieeare cromozom confine un set unic de gene. Totalitatea genelor cuprinse in cromozomii unei celule constituie genomul acesteia. (Genomul haploid uman constd din 3,5 x 109 perechi de baze). In general, genele eucariotelor se intalnesc o singura datd in genom. Unde gene sunt prezente, insd, in copii multiple, de exemplu genele care corespund tuturor lipurilor dc ARN,„ genele care codified histonele, genele care codified cheratina la pdsdri §i cornute etc. Moleculele de ADN eucariot prezintd, spre deosebire de ADN procariot, §i anumite segmente, relativ mici, noninformafionale, care se pot repeta de milioane sau nurnai de mii de ori (ADN satelil). Aeeste seevenfe repetitive, cuprinzand zeci sau sute de perechi de baze, sunt suspectate a indeplini roluri in reglare, in arhitectura moleculei de ADN, d:u* dovezile in acest sens sunt ined neeonvingdtoare. 159

■I M -.1 :: z-

Surpriza cea mare privind organizarea genomului eucariot a oferit-o descoperirea discontinui- t^Jii genelor, 0 genS conjin&nd inform afia privind structura unui lanf polipeptidic- este intreruptS de secvenfe care nu sunt fraduse via ARNm, care nu se vor exprima in structura poiipeptidului dat.

Secvenjele de ADN traductibile, dinlr-o anumitii gerul structural^, s-au denurnit exoni (expressed regions), iarcelelaite introni (intervening sequences). Cercetflrile din ultimii ani au dus la concluzia c& discontinuitalea. genelor, departe de a fi o excepfie, reprezanUl o IrSsSturS comiind a genomului organismelor superioare (excepfie ar face genele care codifidi histonele §i interferonul). Afirmafia unor geneticieni dup8. care genomul eucariot est.e organixat pe linia relaxSrii §i extravaganfei nu pare, deocamdaU, extravagant#. Celulele eucariote eonfin, pe laugh ADN nuclear, §i ADN- localize! in mitocondrii, diferit atat prin structura, cat §i prin unele proprietyfi, de cel nuclear. ADN mitocondrial se prezintii ca un duplex circular, cu raasa molecular# relativ midi §i o capacitate de renaturare surprinzStoare. Prezenfa ADN mitocondrial confers acesteia o oarecare autonomie genetic#, o parte dintre proteineie mitocondriale, mai ales cele implicate in biogeneza sa, sintetizSndu-se pe tipar de ADN propria. Printre aceste proteine semnalfim: NADH-ubichinono oxidoreductaza (inhibat# de rotenon#), apocitocromul b, subunitSfi ale citocrom oxidazei, diferite proteine structurale. Majoritatea proteinelor mitocondriale sunt ins# specificate de gene nucieare, sintetizate in citoplasm# apoi importate, grafie recunoa^terii lor de c&tre receptorii specializafi de pe suprafaja rhitocondriei. Este surprinzhtor faptul c# setul de gene ale ADN mitocondrial (care specifics proteine mitocondriale) nu este identic la. diferite ovganisme, proteine omoloage fiind codificate la unele de e#tre ADN mitocondrial, iar la altele de c#tre ADN nuclear. Ideea unui transfer de gene intre nucieu §i mitocondrie pare plauzibila finand seama de faptul oil ADN nuclear poate incoipora AON exogen phtruns in celuLl Se pune firesc intreharea: de ce alte organite celulare las# pe seama ADN nuclear intreaga responsabilitate a biogenezei lor iar mitocondria cointereseaz# atat ADN nuclear cat'$i ADN propria? Indiscutabil, prezenfa ADN mitocondrial nu poate fi un capriciu sau un accident al evolution menfinerea unui sisfem genetic separat constituind o substantial^ investifie, impusa probabil de o necesitate inc# neinfeleas#. IV.3A ARHITECTURA GENOMULUI EUCARIOT Cantitatea de ADN In celulele eucarioteloi* este semnificativ mai mare decat la procariote. Lungimea conturului de ADN dintr-o singur# celul# urnan# este de ~2 m. Pentru ca o rnolecul# de ADN s# „incap#“ in spafiul nuclear, stramt, materialul genetic se organizeaz# corespunziitor, un rol important revenind histonelor, proteine bazice, cu mas# molecular# micfi, asociate ADN. Se eunosc 5 clase de histone §i atiume H}, H^, H^, H3, H4. Histonele §i H2K au un confinut foarte begat in lizinh, in limp ce H3 §i H4 sunt foarte bogate in arginin#. Intrucat la pH fiziologic radicalii color doi aminoacizi sunt protonafi, histonele stabilesc legftturi saline .cu anionii fosfat din molecula ADN, ceea ce permile formarea de complexe ADN-histone. 160 Cantitatea mare de histone, • existenja strict# a 5 tipuri de histone In toate celuiele eucariote ca §i constanja structurii lor pe scara evolupei au reactualizat problema importan|ei acestora In organizarea cromozomiior:

unde se afM aceste proteine in cromozom, cum sunt dispose §i ce rol au de indeplinit? Este asocierea histonelor cu ADN r#spunz#toare de condensarea materialului genetic, f&cand posibil# incadrarea in spajiul nuclear cu diametral de 1/10 n.m a unor molecule care, extinse, ar mSsura 2 m? CercetSrile ultimelor decade, utiliz&nd un intreg arsenal de tehnici de performanj# (microscopie electronic#, difracjia neotrosiicS etc.), au dus la concluzii ce par s& dezlege „misterur histonelor. Studiile de difracfie a razelor X (efectuate de Wilkins §i Buzzati) au dus la constatarea surprinz^toare c#, cromatina (cromozomii interfazici) prezint# structuri repetahile la intervale de -10 nm.

Nucleozom „miezw

Fig. IV,12 161 in sfudiile de microscopie electronic! cromatina are aspectul unor m!rgele peaf!. „M!rgelele“ reprezint! o suit! de particule sferice cu diametru de -10 nm, iar „afaA porjiuni de ADN liber. Unitatea repetitive de 10 nm, evidential!

prin. studiile de microscopie electronic!, a fost denumit! nucleozom (Fig. IV. 12a). Fiecare unitate repetitiv!-nucleozom-cuprinde un octamer histonic constituit din 2R7A, 2H^, 2H3, 2H4, ce formeaz! un fel de cilindru turtit cu dimensiuniie 11 x 11 x 5,5 nm. Dubla helice a ADN infa§oar! de aproximativ dou! ori fiecare miez histonic al nucleozomului. ADN asociat octamerului este constituit din -140 perechi de baze: (nucleozom „miez“). intre doi nucleozomi „miez“ adiacenji se g!se§te ADN liber, 20-60 perechi de baze, la erne este legal! histona Hj (Figura IV.12.b). Studiile de difraejie neutronic! au demonstrat c! ADN impacheleaza octamerul histonic §i no invers, cum se credea, astfel incat polinucleozomii pot fi mai degrab! asimiiaji cu o ajii inf!§urat! pe m&rgele. in cromatina eucariotelor polinucleozomii formeaz! un superhelix, dispunandu-se dup! un solenoid cu un pas de 10 nm, cu diametral de 30 nm §i o distanj! intre spire de 10 nm (Figura IV.13). Fiecare tur de spir! are 6-10 nucleozomi. Solenoizii ar fi, ei in§i§i, organizaji in fibre cu configurafu heiicoidale de ordin superior. Se pare c! ins!§i cromatina „activ!“, subiect al replic&rii §i transcrierii, este asociat! cu histonele. Cromatina activ! ar con|ine, pe iang! histone, §i proteins nehistonice care modified, intr-o oarecare m!sur!, sti'uctura nucleozomului ce „se deschide‘\ permijand citirea mesajului genetic. Structura condensat! trece intr-o stare mai destinsa, care permite replicaiea §i transcrierea. Indiscutabil, imaginea pe care o avem despre cromatina, §i mai ales despre modifi- c!riie pe care aceasta le poate suferi, este incomplete §i perfectibil!. IV.3.5. BIOSXNTEZA ADN (REPLICAREA) Biosinteza ADN trebuie s! decurg! astfel incat. s! permits conservarea §i transmiterea informajiei genetice de la o generate la alta. In cursul diviziunii celulare, fiecare celulfi genereaz! dou! celule fiice cu acela§i patrimoniu genetic, conpnand, deci, aceea§i cantitate §i calitate de ADN. Modalitatea specific! de biosinteza a ADN este repiicarea, respectiv desfacerea duplexului de ADN parental §i construirea pe fiecare dintre cele dou! catene a cate unei catene complementare - replica celor dintai. Ca urmare a replicMi apar dou! molecule ADN fiice identice cu parentala, in fiecare dintre moleculele nou formate conservandu-se o catena veche, parental!. Sinteza ADN poarta, din acest motiv, numeie de replicare semiconservativa (Fig. IV.9). Intuit! de catre Watson.§i Crick, repiicarea semiconservativa a fost confirmat! de Meselson §i Stahl. Cultivand o bacterie (Escherichia coli) tntrun media confinand ca unich sursa de azot NH4C1 marcat! cu i5N, se ob{ine ADN bacterian integral marcat. Bacteriile sunt transferate apoi pe un mediu conjinand. NH4C1 nemarcata. ADN extras dup! prima diviziune are o densitate intermedia!*! intre aceea a ADN marcat cu i5N 162

Fig. IV.13 - Polinucleozomi - Fig. IV.14 - Replicarea semiconservativa; cbnstituind un solenoid experienja Meselson - Stahl (greu) §i aceea a ADN nemarcat (u§or). DupS cea de a doua diviziune, pe lang& ADN cu densitate intermediary (50% din ADN total), apare, in aceea§i proporjie, ADN u§or (Fig. IV. 14). Desigur, in urmatoarele generajii bacteriene procentul de ADN u§or va create. Experienja, devenM clasicS, a lui Meselson §i Stahl a reprezentat dovada de necontestat a mecanismului de replicare a ADN. Considerat mecanism general de siniez& (in vivo) a ADN £ I

163 atat la procariote cat §i la eucariote, sinteza semiconservativd asigurd transferal de informajie geneticd de la ADN parental la ADN fiu §i deci menjinerea stabilitiijii genetice a fiecdrui organism §i a speciei. Procesul de biosintezd a ADN este un proces de mare compiexitate care necesitd, atat la procariote cat §i la eucariote: - prezenja ADN matrix (template); - prezenja celor patru dezoxiribonucleozid-trifosfaji (dATP, dGTP, dCTP, dTTP); - prezenja ribonucleozid-trifosfajilor (ATP, GTP, UTP, CTP), sugerand necesitatea sintezei de ARN in cursul sintezei ADN; - prezenja ionilor de magneziu; - un sistem enzimatic complex avand ca enzime constitutive: . a) helicaza - enzimd care realizeazd desfacerea duplexului parental

(denaturarea) cu etalai'ea celor doud catene complementare, permijdnd citirea secvenjei nucleotidelor de cdtre enzimele replicdrii. Desfacerea duplexului parental se realizeazd treptat, pe porfiuni mici de ADN, pe mdsurd ce replicarea avanseazd. Cele doud catene rdman separate ca urmare a intervenjiei proteinelor de stabilizare a ADN monocatenar, care se leagd ferm la acesta. b) topoizomerazele, care rezolvd problemele topologice apdrute in cursul desfacerii duplexului parental. c) ADN primaza, enzimd care sintetizeazd mici fragmente de ARN (ARN inijiator, primer), necesare inijierii sintezei de ADN. d) ADN polimeraze ADN-dependente. La procariote s-au descris mai multe ADN polimeraze (I, II, III) avand funcjii specifice. Rolul central in procesul de replicare in vivo revine ADN polimerazei III, enzimd cu masS moleculard mare (aprox. 500000) constituitd din mai multe subunitdji, fiecare avand un rol precis in legarea substratelor (ADN matrijd, ARN primer, dNTP), acjiunea polimerazicd §i cea exonucleazicd. li sunt proprii urmdtoarele atribute; - edified lanfuri polidezoxiribonucleotidice, preluand instruejiuni de la ADN-matrijd care dicteazd seevenja nucleotidelor din catena nou sintetizatd; - nudnijiazd catene ADN, necesitSnd un primer cu o grupare 3”OH IiberS; - sintetizeazd exclusiv catene cu direejia 5’~3’; - prezintd activitate exonucleazicd (3*-5’) excizand nucleotide de la capital 3J al catene! in cre§tere. Atributele enumerate permit ADN polimerazei III sit exercite, pe langd activitate polimerazicd, §i o important# activitate de control al replicdrii, asigurand procesului o inaltd fidelitate. ■ Funcjia ADN polimerazei II este ined obscurd. ADN polimerazei I ii revin sarcini speciale in evenimentele replicdrii §i repardrii leziunilor ADN, derivate dintr-un atribut pe care nu-1 impdrtd§e§te cu celelalte ADN polimeraze §i anume activitatea 5’-3’ exonucleazicd. In cazul eucariotelor existd o multitudine de ADN polimeraze avand atribute specifice. e) ADN ligaza — enzim'd ce reunegte fragmentele ADN rezultate in cursul repliedrii. ADN-ligaza catalizeazd formarea unei legSturi fosfat diesterice intre extremitatea 3’-OH a unui fragment de ADN §i extremitatea 5’ monofosfat a altuia. Enzima necesitd prezenja unui donor al unui rest de acid adenilic (ATP la eucariote, NAD la procariote) 164 care se fixeazS la capital 5’ monofosfat al unui fragment, generand o structure de tipul -O-P-P-RibozS-AdeninS. Capital 3’-OH terminal al celaila.lt fragment atacS iegStura -P-P §i, eliberand AMP, stabilegte o !eg3turS fosfatdiestericS care reune§te cede douS fragmente de ADN (Fig. IV. 15). Complexul de factori care participS la replicarea ADN poartS numele de replizom sau sistemul ADN replicazS. 5' 3* 5' ( >B5f • AMP / OH 3' o—[PC! P

\

^OH

(X' .....N ....."* EE IP-R-AI P AMP R s — rA Fig. IV.15 - Mecanismul de ac|iune a ADN ligazei Replicarea ADN la procariote DesfS§urarea procesului de biosintezS a ADN la procariote implicit urm&txwea. succesiune de evenimente: inifiere, elongare, terminare a replicarii. 1. Inijierea replicarii se produce in puncte bine determinate, avand caracteristici distinctive u^or de recunoscut de cStre enzimele mifierii (helicaze, topoizomeraze, ADN primaze), denumite „regiuni-origine“ (ori). La Escherichia coli ar exista o singurS „regiune ori“. Aceste regiuni conjin secvenje ,,consens“ foarte bine conservate de-a lungul evolufiei, bogate in perechi A=T, rccunoscute de proteina dna A responsabilS de corectitudinea ini|iem. Duplexul de ADN circular se replies simultan in ambele direejii; cromozomul bacterian arc in timpul rcplicSrii forma literci theta. (Fig. IV. 16). Regiunea activS in replicare la un moment dal care se deplaseazS de-a lungul duplexului parental este desemnatS drept „bifurca{ie de replicare*4. Pe cromozomul bacterian evolueaza douS bifureajil de replicare, una in sens orar, cealalta in sens antiorar, Replicarea bidirectional# s-a dovedit a fi uzualS atat la bacterii cat §i la virusuri, Iniperea replicSrii parcurge douS etape: a) desfacerea duplexului parental pe anumite porfiuni — replicatori — sub acfiunea helicazelor (proteine dna B); procesul, presupunand ruperea legSturilor de hidrogen dintre bazele complementarc, se produce cu un substantial consum de energie (ATP). Desfacerea duplexului parental (denaturarea acestuia), realizatS initial pe o por{iune micS de ADN (in „regiunea oriu), continu# de-a lungul moieculei pe mSsura inaintSrii 165 0

Fig. JV.16 - Replicarea bidirecjionaia a unui cromozom circular bifurcafiilor de replicare, precedate de helicaze. Reunirea catenelor de ADN

formate (renaturarea) este prevenitd de cdtre proteinele de stabilizare a ADN monocatenar care se leagd cooperativ la acesta. Desfacerea duplexului ADN permite accesul replizomuiui la fiecare dintre catenele ADN parental, ce vor constitui matrije pentru sinteza a cate unei catene fiice; ilustrarea procesului se va raporta la una dintre bifurcajiile de replicare. Intrucat duplexul circular se desface (se desrdsuce§te) in regiunea bifurcajiei de replicare cu o vitezd de aproximativ 100 de revolujii/secundd, apar, inevitabil, supertorsiuni, regiuni superhelicoidale, dincolo de limita bifurcajiei de replicare. Intr-o moleculd circular^, avansarea bifurcajiei de replicare genereazd supertorsiuni pozitive, care pot bloca replicarea. Am vdzut cd ADN-giraza (topoizomeraza II) introduce in molecula ADN supertorsiuni negative, astfel incat constrangerile impose de avansarea bifurcajiei de replicare sunt in mare mdsurd contracarate '§i replicarea nu este sfanjenitd. Altfel spus, ADN-giraza, introducand torsiuni negative ale dublei helice, in sens contrar celor create de inaintarea bifurcajiei de replicare, compenseazd, in avans, constrangerile impuse de derularea catenelor ADN. Interesant de notat cd acidul nalidixic (Negram) §i derivajii sdi fluomraji (norfloxacin), superior! prin toxicitatea redusd §i prin faptul cd nu dezvolta rezistenjd plasmidicd transferabild, suprimd cregterea §i multiplicarea bacteriand prin inhibarea ADN-giruzei. Torsiunile pozitive pot fi eliminate §i prin acjiunea topoizomerazei de tip I. ADN- topoizomeraza I acfioneazd ca o endonucleazd reversibild. Ea incizeazd o legdturd fosfat diestericd de pe una dintre catenele ADN, permij&nd astfel celor doud capete ale ADN sd se released unul fafd de celSlalt; starea superhelicoidald este desfiinjatd. Acjiunea de „suveic&“ a topoizomerazei I duce la relaxarea termodinamic avantajoasd a ADN. Este necesard, desigur, refacerea legdturii fosfat diesterice incizate. Intrucdt energia legdturii fosfat diesterice originale a fost eonservatd intr-o legdturd fosfat esteried, implicand tirozina din centrul activ al enzimei, reaejia este reversibild §i nu necesitd apart energetic (Fig. IV. 17). Conlucrarea ambelor categorii de topoizomeraze reu§e§te sd scadd stress-ul topologic produs de helicazd. 166 b) Construirea unei molecule de ARN inijiator (primer) al polimerizSrii dezoxiribonu- cleozid trifosfajilor in „regiunea oriT Primerul este reprezentat de un ARN de mici dimensiuni (5-10 ribonucleotide) §i este realizat prin acjiunea ADN-primazei, asistatd de alte protein-enzime (complexul primozom). De menjionat cd etapa de inijiere a replicdrii controleazd intregul proces, prin mecanisme incd neelucidate. 2. Elongarea (alungirea) ARN initiator constd in addugarea succesivd de dezoxiri- bonucleozid fosfaji la capdtul 3’ al acestuia. Reacjia decurge prin atacul nucleofil al grupei OH de la capdtul 3’ al moleculei primer asupra unui dezoxiribonucleozid trifosfat aliniat in ordinea dictatd de matrifd (ADN monocatenar), cu care formeazd legdturi de hidrogen. Reacjia are loc sub acjiunea ADN polimerazei III §i duce la formarea unei legdturi fosfat diesterice ce inifiazd propriu-zis catena ADN fiicd (Fig. IV.18). Clivarea restului pirofosfat sub acjiunea pirofosfatazei, enzimd prezentd in toate Jesuturile, asigurd ireversibilitatea reacjiei de polimerizare, devenitd termodinamic avantajoasd. Nu trebuie ignorat faptul cd energia eliberatd in cursul interacjiunilor slabe, dar numeroase, pe care le stabile§te nucleotidul

introdus (legdturi de hidrogen, forje de stivuire), favorizeazd, de asemenea, procesul. Reacjia se repetd pand la parcurgerea integrald a matrijei ADN dintr-o anumitd unitate replicatoare. Bifurcajia de replicare avanseazd prin desfacerea unei noi porjiuni din duplexul parental realizatd de helicazd, asistatd de ADN girazd §i de proteinele de stabilizare a monocatenelor. Jinand searna de capacitatea ADN polimerazelor, din orice sursd, de a cataliza numai sinteza unui lanj polinucleotidic cu direcjia 5*—ar rezultd cd numai catena cu direcjia 3’—>5 dintr-o bifurcajie de replicare poate fi copiatd. Totu§i, sinteza catenei avand ca matrijd catena cu direcjia 5’—>3’ se face tot in direcjia 5’—>3’, ea evoluand, formal, in direcjie opusd deplasdrii bifurcajiei de replicare. Replicarea catenei 5’—>3' §i construirea unei replici cu direcjia 5’-»3’ este, evident, discontinud. Odatd cu avansarea bifurcajiei de replicare (dilatarea replicatorului), noi molecule de ARN primer vor fi sintetizate la capdtul 3’ al catenei parentale, molecule pe care se vor construi fragmente mici de ADN, denumite fragmente Okazaki. Acestea au dimensiuni de 10002000 nucleotide la procariote §i de numai 150-200 la eucariote. Excluderea ARN primed din catenele nou-formate, nucleotid dupd nucleotid, prin acjiunea exonucleazicd a ADN polimerazei I, presupune obligativitatea de a „umple“ golurile rdmase cu dezoxiribonucIeoti.de. Operajia este efectuatd tot de ADN polimeraza I, in conformitate cu rolul sdu poiimerazic. Fragmentele ADN rezultate vor fi sudate prin acjiunea ADN ligazei, cu consum de ATP. In Figura IV. 19 sunt redate etapele replicdrii pe una dintre bifurcajiile de replicare. Evident, in timp ce sinteza uneia dintre eatene este continud, sinteza celeilalte este discontinue; ele au fost desemnate drept catend „in avans“ (leading strand) respectiv catend „ln intarziere“ (lagging strand). Replicarea moleculei de ADN este semidiscontinud. Cum replicarea este bidirecjionald, pe cealaltd bifurcajie de replicare evenimentele decurg identic. 3. Terminarea replicdrii are loc atunci can cl cele doud bifurcajii de replicare se mtalnesc intr-o regiune opusd regiunii „ori“. Proteine specifice semnalizeazd oprirea replicdrii prevenind acjiunea helicazelor. Uti■ m :

-v

■old U-. 2 :; :n I s i /:\ 167 HO-TiROZiNA ENZIMA i

5' ®- T-0-A~ T -CP)- A-(R M i! n ui II H it HI H M il Hi -5! 5' T-®~A-0- T-0- C-®-G) -G-0- A-0-3’ Fig. 1V.17 - Reactia catalizata de ADN topoizomeraza ! 5’ .. p .. / T ■ i - /■ ?' OH / r A_____/ "■'P J s / 7/ / / u, P-P-P

/ /

'VDH &

/ / p7 /

O

___ c -

A

P7 ... I j _ /

p/ / / 3’ 5' P / R7 / / P7 / P7 / P

P7 _ .—Z -7

. -^ OH

,

E C L

py

Z c c <

z / p

£

j -pp ? T C OH T P7 A

- - - -U •-

7

„. Z .. P/

v:: c / / " g:/. P

J w C D

____ G —V

/ A

--- - y

____ z__^

s _ < L > £ a . 2 C C <

p7 p/ /_____ — -■ ^ -c — vG 3’ OH p l Fig. IV. 18 - Eiongarea primerului ia capaiui 3’OH cn, .00 GiRAZA

SINTEZA UNUi NOU ARN PRIMER ( PRIMAZA)

EXCLUDEREA ARN PRIMER! Si COMPLETAREA QOLURILOR (ADN POLIMERAZA I ) t

Fig. IV.19 - Etapeie biosintezei ADN 169

Despre mecanismul separftrii ceior douft molecule de ADN circular,

rezultate prin replicare, au se §tie aproape nimic. Relativ recent , s-a postulat un model de replicare a ADN care fine seama de faptui eft aceasta se desfa§oarft in vivo cu viteze egale pent.ru ambele catene (Fig. IV.20), care admite eft: L replizomul este ancorat la membrana nuclearft, deci relativ fix, iar molecula de ADN il „tranziteazftu; 2. formarea unei bucle (loop) de cfttre catena matritft cu direcfia 5’->3’ permite catenei Jagging”1 sa fie sintetizatft simullan §i in aceea§i direcfie cu catena JeadingA cea a bifurcafiei de replicare. 3. sinteza ceior douft catene este concomitentft, fiecare dintre ele devenind subslrat pentru subunitftfi diferite ale ADN polimerazei III care este un dimer asimetric. Subunitftfile cu aclivita|i polimerazice ale holoenzimei ar diferi prin aceea eft subunitatea responsabilft de sinteza catenei pleading11 se asociazft ferm cu o subunitate p, care-i create procesivitatea (abiliialea de a adftuga nucleotide continuu, fftrft sft se disocieze de catena in credere - vezi mai deparie). Pentru catena Jagging11 esenfialft este viteza reaefiei de polimerizare §i no procesivitatea. Modelul propus, a eftrei esenfft este replicarea simultanft a ceior douft catene in §i pe direcfia bifurcafiei de replicare pare un model valid. De remarcat un avantaj important al acestei modalitafi de replicare: proximilatea situsurilor de terminare §i incepere a douft fragmente Okazaki ce se succed permite Iransferul concertat §i rapid al dispozitivului de replicare de la un primer la altul. Fidelitatea procesului de replicare la procariote, Replicarea ADN, utilizand un aparat enzimatic extxem de elaborate reu§e§te sa asigure, prin inalta sa fidelitate, menfinerea capitalului genetic al speciei. 170 Crearea unei catene noi, perfect complementary cu catena matrijy, se realizeazS atat prin respectarea principiuiui complementaritSjii bazeior cat gi prin activitatea de autocontrol a ADN polimerazei III. Aceasta, pe langd activitate polimerazicSt, prezinE gi o important activitate de corectare a unor erori, rezultat al atributelor enumerate anterior. De subliniat c& ADNpolimeraza III stabilegte o legSturS fosfat diesteriCcf intre capStul 3’-OH al catenei in cregtere gi nucleotidul unrEtor, numai dacd la capStul 3’-OH se giisegte un nucieotid corect imperecheat cu catena matnp. Enzima are calitatea de a descoperi o eventual^ eroare de imperechere matrifSdezoxiribonucleotidul impropriu (incorporat la cap&tul 3’-OH al catenei in cregtere) gi de a selecta pe cel adecvat. O asemenea situajie poate sS decurgS. din aparifia tranzitorie a unor forme tautomere rare ale bazeior azotate (frecvenfa este de 104 - 10‘5). Astfel, citozina in fornE imino, gi nu amino, se imperecheazM cu adenina gi nu, firesc, cu guanina. Aceastd imperechere gregiE este numai temporary citozina revine la forma amino, uzuaE, care nu se poate imperechea cu adenina; situa|ia este sesizaE de ADN polimerazll, care nu mai continue elongarea catenei av&nd la capHtul 3’-OH un nucieotid neimperecheat. Prin activitate exonucleazicS 3’—x5\ enzima exclude citozina, reludnd elongarea catenei. In ipoteza unor erori repetate, ea igi continua activitatea exonucleazicS pand cand g&segte eap&tul 3’-OH adecvat (imperecheat cu matrija). Aceasta activitate de

supercontrol a ADN polimerazei III eliminS erori ce s-ar fi comis dacS singurul mecanism de control ar fi fost respectarea principiuiui complernentariEjii bazeior. Intr-adevir, dacii ADN polimeraza III n-ar fi fost inzestraE cu activitate de corector, perechea adenind-citozirE s-ar fi menjinut in ADN non sintetizat, generand o mutafie. Incapacitatea ADN polimerazei III de a ini Jia catene polinucleotidice, respectiv necesitatea unui primer, nu este un handicap al enzimei ci o necesitate impusd de exigenjele procesului de replicare; ADN polimeraza III poate s& exclude un nucieotid impostor numai dacfi acesta se aM la capStul 3’ al unui lanj polinucleotidic in cregtere, ceea ce ar permite o inijiere defectuoasl Solujia pare a fi intr-adevar o inijiere mai aproximativS, prin sinteza unui ARN primer, sub acjiunea unei ARN poiimeraze lipsitS. de activitate de corector, gi excluderea ulterioaE a acestuia, care va fi inlocuit. cu fragmentul de ADN corespunz&tor. InsSgi alegerea unui sens unic al replicSrii, §i anume cel cu direcjia 5"— >3% contribuie la asigurarea acuratejii procesului, permijand ADN polimerazei sil-gi exercite acfiunea de autocontrol si corectare a erori!or. Dacd lan{ul sintetizat ar avea direcfia gi la cap&tul S’ ar apare o gregeaE de imperechere, excluderea dezoxiribonucletidului impropriu ar face imposibiM continuarea replicSrii in condifiile date, de unde necesitatea pSstrSrii lui, chiar cu preful compromiterii fidelitStii, aproape absolute, a procesului. Ca rezultat al funcpei de corector a ADN polimerazei gi al imperativului complemen- taritS|ii bazeior, frecvenja erorilor in procesul de replicare a ADN este de una la 106 - 107 pexechi de nucleotide. Totugi, frecvenja erorilor in ADN al Escherichiei coii este de numai una la 109 perechi de nucleotide, grape unui sistem enzimatic ce acfioneazS post-replicativ (vezi mai departe). Pe langii activitatea de corector, ADN polimeraza III este o enzimS cu o capacitate cataliticS excepJionaE; ea reugegte sS adauge in cursul elong&rii aproximativ 60 000 de nucleotide pe minut. Viteza extrem de mare de polimerizare o face demiE de rolul pe care gi-1 asumS in sinteza ADN. 171

". v;i j

Un numSr mic de molecule de ADN polimerazS Ill prezente lntr-o celulS bacterianS (aproximativ 1.0 molecule) reu§e§te s& asigure o vitezS adecvatS sintezei discontinue a catenei Jagging44, ceea ce presupune §i „reciclarea44 lor rapids intre capStul unui fragment Okazaki §i capStul 3’ al primerului anterior. O a treia calitate a ADN polimerazei III, care o distinge, este procesivitatea, respectiv abilitatea de a adSuga nucleotide la catena in curs de sintezS fM sS „coboare“ de pe matrijS. ADN polimeraza III catalizeazS formarea a mii de legSturi fosfat diesterice fSrS sS se disocieze de matrijS, ceea ce o consacrS ca enzimS cu procesivitate remarcabilS, calitate extern de important^ pentru sinteza catenei leading. Viteza foarte mare a reacjiei catalizate dec urge, in speJS, din atributul de procesivitate al enzimei. Acuratejea, procesivitatea §i eficienja cataliticS proprii ADN polimerazei III sunt calitSji pe care le reclame rolul s&u in replicare.

In contrast, ADN polimeraza I are procesivitate redusS §i capacitate cataliticS micS, in acord cu atribujiile sale in replicare; excluderea primenlor §i umplerea golurilor rSmase. Repiicarea la eucariote In linii mari, repiicarea la eucariote se desfS§oarS dupS modelul descris, cu particularitSji derivand din organizai*ea genomului eucariot. Ca §i la procariote, s-au identificat mai multe tipuri de ADN polimeraze §i anume; a, p, y, 8. ADN polimeraza a este implicate in repiicarea ADN nuclear. Ea este formats din patru subuni tSji, av&nd proprietSji §i structuri similare in toate celulele eucariote. Cum procesivitatea acestei enzime este relativ micS §i una dintre subunitSJi manifests acjiune primazicS, se suspecteazS cS ea este responsabilS de sinteza catenei flagging44. ADN polimeraza 5 este un dimer asocial cu o proteins - antigenul nuclear din celulele proliferate; aceastS proteinS, prezentS in cantitSji mari in nucleul acestor celule, stimuleazS ADN polimeraza 8, crescandu-i procesivitatea. Se considers cS ADN polimeraza 8 rSspunde de sinteza catenei Jeading44. Ea manifests acjiune 3’->5’ exonucleazicS. ADN polimeraza P este implicatS numai in repararea ADN, nu §i in repiicarea acestuia; manifests acjiune 5’-»3’ exonucleazicS. ADN polimeraza y este implicatS in repiicarea ADN mitocondrial. Polimerazele nu manifests, in general, acjiune 3’-»5’ exonucleazicS, ceea ce sugereazS existenja unor mecanisme de asigurare a fidelitSjii diferite fa{S de cele ale procariotelor; se admite existenja unor exonucleaze ca entitSJi in sine. Existenja ADN ligazelor §i izolarea fragmentelor Okazaki pledeazS pentru discontinui- tatea replicSrii (ca §i in cazul procariotelor). DatoritS mSrimii moleculei ADN eucariot, cat §i depiasSrii relativ lente a bifurcajiei de replicare (aproximativ 3000 baze/minut, fatS de 16 000 la procariote), rezultat al organizSrii superioare a genomului, pe o moleculS de ADN exists mai multe origini de replicare, separate prin 3.104 - 3.105 perechi de baze. In aceste origini multiple de replicare se organizeazS bifurcajii.de replicare (aproximativ 100 pe fiecare cromozom) ce se deplaseazS bidirecjional pe cromozomul eucariot in curs de replicare. n; c • IV ilia 172 Fig, IV.21 - Fazele cidului ceiular

Mitoza

Fidelitatea lepiicSrii este la eucariote de ordinal 1CT9, rezultat, probabil, al insd§i naturii cromozomului eucariot §i al acjiunii unor exonucleaze 3 ’-^5 ’ care secondeazit ADN poHmeraza. Biosinteza 'ADN are loc la mamifere in faza S, de sinfezd, a ciclului ceiular, fazd separata de faza mitoticS prin perioadele de gol sintetic, G, §i G2 (Fig. IY.21). In cursul acestei faze, ADN nuclear este replicat in intregime §i o singurd data per ciclu ceiular. Respectarea acestui imperativ este posibilS. grafie unor procese de metilare care marcheazS covalent molecula ce a trecut prin experienfa replic&rii. Marcarea constS intr-o metilare, in general a citozinei, la 5-metil-citozM, efectuatd de ADN metilaze care folosesc ca donator de grupare metil SAM (S -adenozil metionina). Gradul de metilare a citozinei este extern de variabil, de la 3-5% pentru regnul animal, la 33 % pentru cel vegetal (virusurile animate se sustrag, in general, metii&rii). La eucariote secvenfa recunoscuhl de c&tre metilaze este: 5* - GG - 3* 3* - GC - 5' metilarea decurgand pe ambele catene. In eucariotele superioare un num&r restrains de celule se divid activ; cele mai multe sunt refinute, dupft mitozd, in faza G0, de nondiviziune (resting phase). Decizia intr&rii din faza Gc in faza Gj §i apoi in faza S, urmatS de mitozft, este luatil de proteine cu activitate kinazic& (variabile cu specia) activate prin interacfiunea cu diverse cicline - proteine a c8ror concentrate create sau scade dramatic In cursul ciclului ceiular. Celuiele tumorale §tiu s& evite faza G0 a ciclului ceiular. Ritmul sintezei de histone este cel al sintezei ADN, grafie copiilor multiple ale genelor ce specific^ histoneie (40 de seturi, fiecare confin&nd genele corespunz&toare celor 5 tipuri de histone). In faza S cantitatea de ADN §i histone se dubleazH. Durata fazei S variaz& cu specia; la mamifere este de aproximativ 8 ore. Dac& ar exista o singurM bifurcafie de replicare care se deplaseaza cu o vitezd de 50 nucleotide/secundd pe un cromozom confin&nd aproximativ 150 milioane de nucleotide, ar fi necesare aproximativ 800 de ore - de unde necesitatea funcjionftrii sincrone a peste 100 de bifurcajii de replicare per cromozom. Diferite regiuni ale fiecdrui cromozom sunt replicate in momente diferite ale fazei S, dar invariabil in aceea§i secvenfd. Controlul replicMi §i diviziunii celulare ridicSt probleme numeroase, la care sa rdspuns, cel mult, parfial. Sinteza de ADN pe matrifa de ARN Fluxul de informafie genetic# in lumea vie are, in general, seasul ADN —> ARN —» Proteine. In ultimii ani, s-a identificat in virusurile oncogene conjinand ca material genetic ARN o enzim# a c&rei existenfS era greu de pievSzut care a completat conceptul expiimat prin „dogma central#" a genelieii moleculare. Aceast# enzimd, revers transcripfaza, este o ADN polimerazS ARN - dependents. Ea are'abilitatea ca, o dat# pdtruns# in celula

gazdd, sS sintetizeze un hibrid ADN-ARN, mai exact sS construiascS o eaten# de ADN pe matrifS de ARN. ARN viral este degradat enzimatic iar catena ADM rSmasd se autoreplic# dand na§tere la un duplex ADN ce confine informafia prezent# in ARN viral (Fig. IV.22),

ADN duhlu catenar Inserfia ADN Fig. IV.22 - Repibarea ADN pe ma- trifa de ARN sub acpunea ADN polimerazei - ARN dependent# (revers transcriptaza) Ambele procese sunt catalizate de c&tre revers transcriptaza in virtutea a douS activity enzimatice adifionaie de care dispune: 1) activitate ribonucleazicS, ce-i permite s# hidrolizeze ARN din hibridui ARN/ADN (de unde §i desemnarea sa ca ribonucleaz# II); 174 2) activitate ADN polimerazidt ADN - dependents. Primerul foiosit de revers IranscriplazS in activitaiea sa. polimerazicS este, surpiinzS- tor, un ARNt inglobat in particula viralS (preluat in cursul unei infecfii anterioare). ADN rezultat prin revers transcriere se insert in genomul gazdS putanduse exprima in proteine, intr-o anumitS conjuncture. Cum numeroase virusuri ARN sunt oncogene §i genomul viral este mo§tenit, se considers eft fiecare subiect uman este purt&torul unei oncogene neexprimate, ca rezultat ai pfttrunderii in organism a unor astfel de virusuri ARN (retrovirusuri), intr-un moment al evolufiei. Dacft apare o condifie care sft le favorizeze exprimarea, deci dacft vor fi transcrise §i traduse, celula se malignizeazft prin acfiunea unor proteine ce realizeazft transformarea neoplazicS (adesea kinaze). Revers transcriptaza comite gregeli, neavand activitate 3’->59 exonucleazicft; acest fapt ar constitui una dintre explicable varietftfii mari de tulpini virale producfttoare de boalft. Un retrovirus, prin excelenfft versatil,virusul imunodeficienjei umane (HIV) este rftspunzator de sindromul imunodeficienjei dobftndite (SIDA).

Acest virus are un design comparabil cu al celorlalte retrovirusuri, confinand , obligatoriu genele pol, env §i gag. Acestea specifics revers transcriptaza §i o enzixhft.de integrare in genomul gazda (pol) cftt §i proteine necesare asamblftrii particulei virale (gag, env) in cursul multiplicftrii: Integrarea in genomul gazda presupune, pe langft o integrazft, secvenfe nucleotidice specifice la ambele capete (Long Terminal Repeats), Virusul imunodeficienfei dobandite dispone de multe alte gene care, prin „splicing“ altemativ, produc un numftr impresionant de proteine benefice lui. Versatilitatea acestui virus derive, in spefft, din lipsa de acuratefe a revers transcrip- tazei, avand ca rezultat un. numftr mare de mutafii, deci de variante HIV, §i o eficienfft redusft a tratamentelor. Descoperirea revers transcriptazei, pe langii semnificafia ei teoreticft, are §i o important^ laturft practice rezultatft din faptpl eft, deji prefers propriul ARN (viral), erizima poate utiliza ca matrifft orice ARN pe care construie§te un ADN complementar (ADNC). Apare astfel posibilitatea obfinerii unor gene sintetice (ADNC), prin utilizarea unof ARN mesageri, relativ u§or de izolat, gene care, prin tehnicile ingineriei genetice, pot produce mari cantitftfi din proteina codificatft. IV.4, ACIZII RIBONUCLEICI IV, 4.1. TIPURI DE ARN Sunt produgi macromoleculari care iau na^tere prin condensarea. rihnniidmtldelnr. Ribonucleotidele ce alcfttuiesc molecuia de ARN stabilesc legftturi fosfat diesterice intre guparea OH din uozitia T a unui nucleotid §i gruparea OH din pozajiaA’ a nucleotidiilui succesiv (Fig. IV.23). Din punct de vedere al compozifiei in baze, ARN confine, ca §i ADN, guanina, citozina §i adenina. dar, spre deosebire de acesta, cea de-a patra bazft nu este timina, ci uracil ul. Pe langft aceste baze, ARN confine §i baze a§a-zise „mmore‘\ rezultate prin metilftri, tiolftri ale bazelor „majore“. Componenta glucidicft din structura ARN este riboza §i nu dezoxiriboza. i. i

175

if ;• yii-i;

il f >

Fig. IV.23 - Structura covalenta a ARN 5* ________________________________________________ UGGCGUUCGUACUUAAAUAUGGAAU \ Fi9- !V-24 ' Structura ARN mo|g|||||j| j|| | | j| | | 3>j nocatenar conjinand porpuni cu GCCUCAAGCAUCGCUUUCAACCUUA j, ') Jiuni cu baze necomplementare 3s Confinutul In adenind este diferit de cel in uracil §i nici cel de guaninM nu este egal cu cel de citozinfi. Q_ structura dublu. catenary complementary este exclusS pentru. ARN. Moleculele de ARN sunt monocatene, dar, pe anumite porjiuni, acolo unde o perrmte complementaritatea bazeior se organizeaz& in structuri dublu helicoidale. Portiunile de baze necomplementare sunt expulzate ca bucle in afara zonelor de dublu helix dand moleculei aspectu! de (Fig. IV.24). Cantitatea de ARN, spre deosebiS
ARN nuclear scurt Ide jrnjcjidimensiune) 176 ARN mesager (ARNm) Jinand seama d.e faptul ca molecula de ADN se g£tse§te In nucleu, in timp ce biosinteza proteinelor se desf&§oar& in citoplasmS, Jacob §i Monod au postulat existenfa urrni intermediar care „aduce“ mesajul genetic .din nucleu in citoplasmjL Acest intermediar s-a dovedit a fi o molecula de ARN, denumitS ulterior ARN mesager, Moleculele de ARNm sunt molecule monocatenare liniare. de, lungime variabilft. ARN^ este sintetizat in.nucleu ^D^niatrigei^ ADN. O genS structural^ este transcnsa* in sensul complementarit&tii bazelor (A corespunde la U, iar G la C), objinandu-se o rnoleculd de ARNra a cftrei cornpozifie in baze reflects compozifia in haze a genei transcrise. ARNn nuclear iese in citoplasmS (la eucariote dupS .,preluerarea“ sa §i formarea unui A.RNni matur), unde va servi ca matrifft (template) pentru sinteza unui pohpeptid cu sec vents specifics de aminoacizi. Fiecare aminoacid este codihcat de cStre o secvenfft de trei nucleotide, denumitS codon, CapStul 5’ al ARN m confine o secvenfa care no este tradusS in proteine, denumitS secvenfa ,deader" (la procariote, include secvenfa Shine Dalgamo“); capStul 3' confine $i el o iegiune netradusS, cunoscutS ca secvenfa ,,trailer A La procariote, o moleculS de ARNm poate sS confinS informafia pentru sinteza unui singur polipeptid (ARNT monogenic sau monocistronic) sau a mai multor polipeptide implicate in aceea§i cale metabolicS (ARN^ poligenic. sau policistronic). Cistronii sunt separafi prin „regiuni intercistronice“ sau ,,spafiatoriA La procariote, intre gena transcrisS, ARNm §i proteina specificate de genS exists o relafie de colinearitate, succesiunea tripletelor nucleotidice intr~o genS. corespunzand exact celei a aminoacizilor in proteina codificatS. La eucariote, ARNin rezultat al transcrierii este monogenic §i, cel mai adesea, cu mult mai lung decat ARNm citoplasmatic. §i la eucariote, ca §i la procariote, la capetele 5’ §i 3’ se gSsesc regiuni netraductibile. Genele care codificS proteine, sunt, in general, intrerupte de sccvenfe de ADN necpdifipatoare,. iolronj (intervening sequences). Secvenfele codificatoare, separate prin introni, poartS numele de exoni (expressed regions). Dogma coiinearitSfii genS-proteinS, valabilS la procariote, este incSlcatS la eucariote, la care continuitatea infonnafiei genetice este desfiinfatS. Gena nu mai este corespondentul structural al ARNm, subject al traducerii, fiind cu mult mai lungS decal ar fi necesar pentru codificarea unui anumit polipeplid. ARNm rezultafi prin transcriere, respeciiv ARN,n iranscripte grimaie sau ARNrn precursor!, sunt supu§i unor prelucrari diverse avand ca rezultat obfinerea unor ARNm de dimensiuni diferite, funefie de stadiul de prelucrare la care se g&se§te fiecare exemplar, reunifi sub numele de ARN nuclear heterogen; un ARNm produs final al procesului de prelucrare este un ARNm matur. Prelucrarea ARN... nuclear genereazft unui sau, uneori, mai mulfi ARN„,

maturi, care vor servi ca matrite pentru sjnteza -unuia sau a mai mul1or.-..nolipeptideJgcygnte specif ice, de aminoadzL^ Timpul de supraviejuire a ARNm in celuia este variabil. ARNm bacterian are o..........................................................................................viajh foarte scurth (2-3 minute); dupd ce serve§te la sinteza catorva zeci...de .exemplare din proteina pe care ^itccifica' egej^rMaLdb^micIeaze. La eucariote, ARN„, are o viafh de ordinal orelor; aceasta diferenfd este u§or de infeles finand seama de fluctuafiile mari de mediu la care o bacterie se obstineazir sh se adapteze continuu. 177 AKN tie transfer (ARNt) Moleculde de ARN, sunt molecule mici (70-90 nucleotide), monocatenarg, In care procentul de baze complementare este deosebit de mare fajd. de celeialte specii de ARM* 'Raportul A+G/U+C din ARNt este apropiat de 1. ARNt nuclear, nu gi cel mitocondrial, prezintS o conformajie in .dome de trifoiA avand 4 zone deperechi complementare gi 3 necomplementare. expulzatecu bucle (Fig. IV.25). 5* -
/ o DHU Vt -o~o. 95& 1 o9i 3' 9 c 9 Brat aminoacid 9t O \ O-O-O-O-O .o-q Bra( 9 rwcP O-O-O-O-fXj^P b'°°O~0h

u'Q9 0 1 p p '0-0 Braf adlponal ~o-oy° O-c ! I 1 Bra} anticodon Fig. IV.25 - Structura tridimensionala a ARNt La capStul 5’ terminal, cei mai mulji ARNt au restul acid guanilic, iar la cap&tul 3\ top. au secvenfa nudeotidicS CCA. La cap&tui buclei inferioare se g&segte aga-numita portiune anticodon, care variazS cu natura ARN t. §i alte secvenje nucieotidice sunt important© in procesele de recunoagtere; de exemplu, in bra£u]JDHU exists o secventS. nucleotidicS care recunoaste. gi se leagS la aminoacil-ARNr"Sintetaza, enzimS care... JncarcSRAELLxn un aminoacid specific, activat. In braful PRC, o anumitS secvenja nucleotidicS asjgurS legarea la ribozom a complexului. aipinoacil - ARN„ 178 o Toate tipurile de ARNf au on procent neobisnuit de mare de baze rninore; A. HN NH

OH OH Pseudouridina (^V)

OH OH 4-Tiouridina O

OH OH Dihidrouridina (DHU)

CH3 HOH, k f3C \ O'

OH OH Ribotimfdina (T)

OH OH 3 - MetifcitidinS

N J HOHfC | C? OH OH Inozina In procesul de biosintezS a onitemeier, ARNt are de Indeplinit dooa func(ii: 1. Transports aminoacizilor activati in faza solubilS, la ribozomi, sub formS de complcxe aminoacii - ARM£. FiecSraia dintre cei 20 deaminoacizi care intrS in stnictura profeliefof il corespunde cel pujin un ARNt specific. Exists, cel pujin 20 de lipuri de ARNt. In general, exists mai mul{i ARNt specific! pentru un aminoacid - ARNt izoacceptori - fapt explicabil prin caracterul degenerat al codului genetic (un aminoacid poate fi specificat de mai mulfi codoni). Legarea aminoaeidului se face la reziduul adenilic din secvenja CCA §i constS in stabilirea unei legaturi macroergice intre -OH din 35 al adeninei §i restul acil al aminoaeidului (vezi sinteza profceineior). 2. Adaptarea gninoaciduiui transportat In dreptul codpnului de pe ARNL.care-1 specifics. AceastS racordare a. aminoaci3uiui este posibilS prln recunoagterea codon-anticodon. Porjiunea anticodon din ARNt este complementers. succesiunii de nucleotide din ARNm ce codified aminoacidul transportat de ARNt respectiv gi ca atare cele douS regiuni pot stabili legSturi de hidrogen (Fig. IV.26). ARN, este relativ slabil la.procariote gi mai putin stabil ia eucariote. Fig. IV.26 - Recunoag- terea codon - anticodon 3' A ~ aaf C C A ~ BB2 C C

iM m m. m m m ■ 'Id ■t in ■M :: i

179 ARN ribozomal (ARNr) Moleculele de ARN, sunt rnacrornolecule flexibife. si deformafaiM, care contin. zone dubiu catenare Mrerupte de zone monocatenare, Extrem de heterogen ca forrnS §i inMrime, ARNt se fmparte, in funcjie de constanta de sedimentare (S), care depinde de mSrimea §i forma particulei, in; ARNr 23 S, 16 S §i 5Ji la procariote §i ARNr 28 S, IB S, 5,8 S §i 5 S la eucariote. ARNr reprezinta tipul de ARN cel mai abundent (aproximaliv 75% din totalpl .de ARN.. celular) §i cel mai stabil metabolic.. ARNr se agregd cu prot:eine,"3Iverseiaii lipide, constituind particule ribonucleoproteice denumite rihozomi (desccperiji de George Palade). Dupd valoarea constantei de sedimentare, ace§tia pot fi 70 S la bacterii §i 80 S la eucariote. Ribozomii pot disocia reversibil in dou& subunit5|i; 50 S si 3Q..JLpentru

procariote §1 60 S, Te^ectiyjjli^ La procariote, subunitalea mare. 50 S, contine ARM 23 S. ARN, 5 S si 34 tipuri de 3^ (dup& apartenenja la subunitatea mic& - small) (Fig. IV.27). Proteinele ribozomale au roluri bine stabilite, nu in intregime descifrate, decurgand fie din capacitatea cataliticS (peptidil transferaze, GTP-aze), fie din abi-litatea de a „construi“ arhitecturi stereospe- cifice, esentiale in recunoasterea si lesarea diverselor tipuri de ARN implicate, in biosinteza proteinelor (ARN m, aminoacil-ARN,). 70S 80S

50 S SOS ii 60S 40 S ARNr 5 S ARNr 16 S ARNr 5 S ARNr 18 S ARNr 23 S 21 poiipeptide ARNrS,8 S + + ~ 33 poiipeptide 34 poiipeptide ARNr 28 S + ~ 46 poiipeptide Fig. IV.27 - Ribozomii ia procariote §i eucariote 180 Ribozomii. constituie sediul hiogntezei ^roteirjel^L^Aceste unit&fi mecano-chimice permit conlucrarea ARNm, ARNt §i ARJ^lnTetLrea desfdgurdrii procesului de sintezd a proteinelor. Pe suprafaja fiecdrui ribozom exists doud situsuri §i anume: situsul aminoacid, care leagd ARN. portS.tor ai unui ...aminoacid, si situsul peptid, care ieagd ARN, purtStor al unui jant polipeptidic. „ Subunitatea micd a ribozomului (30 S sau 40 S) ieagd ARNL.intr-un loc specific^ astfel incat ribozomul sd se afle cu locusul peptid in fafa codonului care specifics aminoacidul initiator §i cu locusul aminoacid in fata codonului

ce specified, aminoacidul 2. Legarea subunitdfii man de complexul ARNm - subunitate micd determine formarea ribozomului functional. ARNm §i ribozomii se pot deplasa unui in raport cu celSlalt, ribozomul giisand pe ARNm. Aceastd deplasare reciprocd permite trecerea tripletelor de pe ARNm, care specified aminoacizi suceesivi in lanful polipeptidic, prin fafa locusului aminoacid, indicand acestuiacomplexul aminoacil-ARNt ce trebuie legal. Aminoacizii vor fi incorporafi in molecula proteied In curs de edificare. Dupd sinteza unei molecule proteice, ribozomii disoeiazd, permifdnd reluarea sintezei unei noi molecule proteice. Cercetari recente sugereazd participarea cataliticd a ARN. in sinteza legdturii peptidice. , ~ ~ ARN nuclear de mkl diinensiuni O a patra categoric de ARN intalnitd la eucariote, despre care no se §tiu ined multe lucruri certe, este reprezentatd de ARN de mici dimensiuni - scurt (small nuclear RNA). Acest tip de ARN este constituit din aproximativ 100 de nucleotide §i confine un procent mare de uridind. Existd sub forma mai multor specii moleculare notate U1? U2 etc. Se gdse§te cu preeddere in nucleu, asocial cu proteine, generand ribonucleoproteine desemnate dupd tipul de ARN „scurt“: snRNPUj, snRNPU 2 etc. (small nuclear ribonucleo- proteins = snurps). snRNP(U!, U2, U4, U5 §i U6) intervin in' excizia infronilor din ARNm transcript primal*, snRNPU3 sunt implicate in prelucrarea ARNt transcript primar iar snRNPU7 pare responsabild de formarea capdtului 5’ al ARNm precursor pentru histone. TV.4.2. BIOSINTEZA ARN PE MATRIJA DE ADN Transcrierea Modalitatea majord, specified, de sintezd a tuturor specifier de ARN, atfit la procariote cat §i la eucaiiote, este transcrierea, respectiv sinteza ARN pe matrijd de ADN. In vivo, transcrierea este asimetried in sensul cd, intr-o anumitd regiune a genomului, se copiazd o singurd catend a ADN desemnatd drept catend matritd (template) sau necodificatoare, cealaltd catend a ADN, purtdtoare a informatiei cu privire la sinteza unui lan{ polipeptidic, in spejd, este catena codificatoare. Succesiunea bazelor in ARN nou sintetizat (ARN transcript primar) este aceea§i cu succesiunea bazelor azotate din catena codificatoare (cu excepfia inlocuirii timinei cu uracilul). Reia|ia catend template - catend codificatoare se schimbd funejie de gena transcrisd, sensul sintezei ARN rdmdnand obligatoriu 5’->3’ (Fig. IV.28). 181 Gena A Gena B Gena C Gena B

*__________-.... ^. ....................t Catena matrifa (template) Fig. IV.28. Transcrierea asimetrica a ADN Biosinteza ARN, spre deosebire de replicaxe, proces care angajeazd sirnuitan Intregul cromozom, vizeazd numai anumite porfiuni de ADN, acelea

care codified proteineie de care celula are nevoie la un moment dat §i implicit ARNt §i ARNr necesari. Biosin teza ARN, moment crucial In transferal de informajie de la ADN la proteine, presupune, in esenfd, prezenja ADN dublu helicoidal, a celor patru ribonucleozid- Irifosfaji (ATP, GTP, CTP, UTP) §i a ARN polimerazei ADNdependentd. Enzima construie§te o catend de ARN, complementary co catena ADN malrijd pentru o anumitd gena, avand polaritate Ca. §i ADN polimeraza, ARN polimeraza confine zinc §i necesitd prezenja in media a ionilor de magneziu sau mangan (Mn2*). Transcrierea la procariote Spre deosebire de eucariote, care folosesc ARN polimeraze diferite in funefie de tipul de ARN sintelizat, la procariote existd o singurd ARN polimerazd pentru toate tipurile de ARN. Ea este constituitd din patru subunildfi: doud de tip a, ana de tip (i §i una de tip |P (a2P[i’)‘ ba aceastd „enzimd-miez‘\ importaritd In procesul de elongare, se asociazd, tranziloriu, subunitatea sigma A-a, important in inifierea transcrierii. Pentamenil a2|i(Pa constituie holoenzima. In absenfa subunitdfii a ARN polimeraza se leagd nespecifie la ADN. Din punct de vedere ehimic, reaefia globald catalizatd de ARN polimerazd poaie fi reprezentatd: (ARN)n + NIP —^ (ARN)n+l + PP Ca §i in cazui acfiunii ADN polimerazei, reaefia de formate a legdturii fosfat. diesterice constd In afacui nucleofil al grupdrii 3’ hidroxi libere din poliribonucleolidul in cre§tere asupra grupdrii a-fosfat din ribonucleozid trifosfatul urmdtor impus de matripl. Reaefia devine termodinamic favorabi.ld prin acfiunea pirofosfatazei (PP— >2Pa). Spre deosebire de ADN polimeraza III, ARN polimerazele sunt apte sd inificze sinteza catenelor poliribonucleolidice, fapt corelat, eu lipsa calitdfii de corector, tolerat'd, de insd§i funefia ARN. Sinteza ARN, atat la procariote cat §i la eucariote, decurge dupd un model similar implicand ca etape: L inifierea transcrierii, II. elongarea catenei poliribonucleolidice III. terminarea transcrierii. ; In procesul transcrierii esenfiald este recunoa§terea pe molecula de ADN a unor semnale de inifiere §i de terminare a transcrierii care sd indice inceputul §i sfar§itul fragmentelor de ADN ce vor fi transcrise (unitdfi de transcriere). Aceastd sarcind, de extremd importanfd, §i-o asumd ARN polimerazele. I, Ini{ierea transerieni Situsul de inijiere a transcrierii este semnalat de catre o secvenja specified de nucleotide din molecula ADN, responsabild de acuratejea procesului, care poarta numeie de promoter (P) §i care este recunoscut de ARN polimerazS — holoenzima (a2p(5’a). Subunitaji a diferile orienteazd holoenzima cdtre promotori diferiji asigurand specificitatea. Secvenja nucleotidelor in regiunea promotor, conservatd in evolume, a fost stability pentru un numdr mare de gene bacteriene, fapt care a permis desemnarea unor seevenje consens, ca medie a sfructurii diferifilor promotori, Fajd de punctul de start al transcrierii, notat cu +1, care va dicta capdtul

5’ al Iranscriptului primar ARN, promotorii sunt situaji in „amonte“ §i notaji cu 'minus (seevenjele in aval faj& de +1 sunt notate cu plus, tot prin convenjie). Toji promotorii bacterieni au dou£ seevenje consens situate pe catena codificatoare ; caseta - 10 (Pribnow): 5 TATA AT 3* §i caseta » 35: 5TTG ACA 3a ' Se admits cfl variabilitatea seevenjelor promotor este eoreiahl cu eficienja cu care ARN polimeraza se leagd la ace'stea, respectiv cu amploarea exprim drii genei. Momentele imperii pot fi sumarizate astfel: 1. subunitalea 0 a holoenzimei recunoa§te promotoml specific, in regiunea - 35, §i se leagd la acesfa'prinir-o legdturd laxd; are loc foimarea a§a-zisului ^complex inchis“ de inijiere; 2, Holoenzima „alunecd“ de-a lungdl ADN §i, in jurul pozijiei - 10, bogatd in acid iimidilic §i adenilic, deschide (“tope§te“) dublul helix pe o porjiune de aproximativ 10 perechi de haze in virtutea activitdjii sale de helieazd; are loc foimarea „complexului deschiT de inijiere;

po/memze/ Fig. IV.29 - ARN polimeraza se afla cu situsul catalitic in dreptul semnalului de inijiere a transcrierii 3. ARN polimeraza, prezentd cu situsul activ in dreptul semnalului de inijiere a transcrierii (Fig. IV.29), catalizeazd formarea primei legdturi fosfat diesterice in Ire nucleotidul +1, aproape invariabil until purinic, §i nucieotidul +2. Enzima, care conjine pe subunitalea P un situs de legare a nucleotidului nou introd'us §i altul de legate a moieculei de ARN in curs de edificare, se deplaseazdfn pozijia +3 pe template -§i continud sinteza, Subunitalea a, care se disociazd din complexul ARN polimeraza -ADN- ARN dupd fonnaiea primelor legdturi fosfat diesterice, se asqciazd unei alte molecule de ARN polimeraza — miez — §i incepe o noua runda de transcriere (Fig. IV.30). 0 ; Id: ,::.V ■V ;■ is-

183 t:\ ■

m'.uh sir. u; :■ f■

ARN polimeraza^se ieaga la ARM Polimeraza

ADN si migreaza spre promotor

Fig. IV.30 - Momente In inijierea transcrierii :a If )r\\ 184 D 3 Situs x promoter

■■f-e-c-c' urp CTP ARN-po/meraza avansaazA (disoc/erea facforv/uiG) M-U-C-G-G-C

$* t. ARN-oo/imeraza (OJ Catena, rSUDiimtoteeCr t&J template

AUCGG-C-U hr/ATP era erp ^S/Ws AsocterpaARR% fer/n/Cart

+ A UCtrGCUUA CG +•€> + □ Fig. IV.31 - llustrarea procesului de transcriere cu sublinierea rolului ARN polimerazei §i a factorilor o § ip IL Elongarea lantului polinucleotidic La^ capStul 3’ terminal al ARN in cre§tere se adaugS ribonucleotidele dictate de matri^S. Toate evenimentele transcrierii decurg in bucla de transcriere care cuprinde 1247 perechi de baze ADN-ARN. Pe mSsurS ce molecula de ARN transcript primar se sintetizeazS, are loc disocierea sa din duplexul hibrid cu catena template, permijandu-se refacerea ADN duplex, asistatS, ca §i desrSsucirea, de topoizomeraze, parte integrants a complexului de transcriere. Viteza de elongare nu este constants, ea depinzand de secvenfele de ADN „citite“ de ARN polimerazS. ■ III. Terminarea transcrierii Exists cel pujin douS modalitSfi de terminate a transcrierii: rho (p) dependents §i rho independents, rho fiind un factor proteic reglator (Fig. IV.31). 185 Terminarea p independents este impost de faptul eft transcrierea unor secvenje de ADN specifice devine neconvenabilft, din punct de vedere terniodinamic, complexuiui de elongate. De exemplu: o secvenjft bogatft in

perechi guaninft-cilozmft este parciirsft dificil intrucSt bucla de transeriere se formeazft greu gi duplexul hibrid ADN-ARN se denatureazft greu. DificuMji maxime creeazft secvenjele palindromice bogafedn acid guanilic §i citidilic care preced o serie de „A“ consecutive §i care dau prin transeriere 'structuri in ,,ac de pftrc< terminate cu numeroase nucleotide uridilice (Fig. IV.32). Stabilitatea „acului de pftru terminator bogat In GC §i imperecherea mai samara a cozii sale poli-U cu catena ADN mauija sunt favorabiJe UmimMi Uanserierii. Terminarea p dependents este impusft de recunoa§terea de efttre acesta a unor secvenje de pe ADN template ce semnalizeazft sfar§itul procesului de transeriere. Rho depisfeazft, astfel, ARN polimeraza opritft temporar la situsul terminator (relativ greu de parcurs) §i, folosindu-se de activit&jile sale catalitice .de helicazft ARN-ADN (desfa.ee duplexul hibrid) §i ATP-azft, ca §i de afinitatea mare pentru ARN monocatenar, elsberaazft tnmscriptul prinruir ARN. Mecanismcle intime ale procesului de transeriere nu sunt cunoscute ci, cel mult aproximate. Transcriptele ARN, rezultate dupft prelucrarea posttranscriere a transcriptelor primare, sunt fie produ§i finals ai expresiei unor gene (ARNr, ARNt), fie molecule purtftioare a informajiei privind sinteza unor proteine (ARNni), catena codificatoarer catena rnainfa uuuuu C 0 transcript ARM CGCG G■C Fig. IV.02 - Structural in "ac de par" favorabila termin&rii transcrlerli

direepa de transeriere AGCCCGC\ TCGGGCGL GCGGGCT CGCCCGA TTTTTTTT- AAAAAAA ADM AAAAAAA ADN1 De remarcat eh. transcriptul primar ARNm procariot este mai lung decat insft§i gena de transcris. ARN polimeraza transcrie nu numai gena

corespunzfttoare unui anumit AR.Nm ci §\ douft secvenje suplimentare care o flaneheazft. ARNin transcript primar va. a.vea, ca urrnare, la cap&tul 5’ o secvenjft denumitft- „ieader“ iar la capfttul 3" o secvenjft „trailer“ care nu se exprimft in proteinft: +1 gena ADN .. ....................... -i---1------ - - --- - - -""-1- - i--- ------- i iii l ___________________i _____i ) S' fe A seevenfa leader seeven^a trailer h——“— ---------------------------—------- ----H transcript primar ARNm 186 Transcrierea la eucariote In cazul eucariotelcr, procesul decurge similar transcrierii la procariote, comportand insil un grad de complexitate net superior. Spre deosebire de procariote, eucariotele folosesc ARN polimeraze diferite, in funcpe de tipul de ARN sintetizat. - ARN polimeraza I, localizaUl in nucleoli, sintetizeazd. A.RNr 45S; - ARN polimeraza II, loealizata in nucieoplasmft, sintetizeaz&, cu precMere, ARNm; - ARN polimeraza III, cu aceea§i locaiizare ca §i ARN poLimeraza II, sintetizeazS ARN{ §-i ARNr 5S, At&t ARN polimeraza II cat §i ARN polimeraza III sintetizcaz£ §i ARN nuclear de mici dimension!. O ARN polimemz.il mitocondrialS, localizata In matrixul mitocondrial, sintetizeazS toate tipurile de ARN mitocondrial, Fiecare dintre cde patru tipuri de ARN polimeraze utilizeazS promotori dil'erifi intre ei. In timp ce ARN polimeraza I utilizeaza promotori identic!, ARN polimeraza II utilizeaza o diversitate de promotori, avSndxa seevenfe-consensi - caseta'TATA, asemSn&toare secvenjei Pribnow, central# in jurul pozifiei -32, in amonte de punctui de start al transcrierii; este considerate responsabil# de acurafcejea .inifierii transcrierii, reprezenland „semnalul .unde“ (tncepe transcrierea), recunoscut de polimeraza; -casetele CAAT §i GC, situate de asemenea in amonte fata de 4-1, sent considerate responsabile de frecvenja transcrierii, reprezenland „semnalul c&nd“ (incepe transcrierea). Ca §i in cazul secvenfei TATA, interacfiunea cu proteine specific© (factor! de inifiere a transcrierii) este necesar# in realizarea acestei funcfii. Pozijia §i orientarea celor douS casete TATA §i CAAT sunt attribute important©, distanfa fix# fafil de punctui start: §i orientarea 5’—>3* Iliad obligatorie. Fiind situate pe acela§i cromozom ca' §i gena de reglat, aceste secvenfe se considers, elemente acJionSnd in „cis“, spre deosebire de proteinele cu care interacfioneaz#, considerate a acjiona in „trans“. O a treia cias# de secvenfe de 10-20 perechi de baze cresc sau scad viteza de inifiere a transcrierii (etapa limitantS tie vitez&); motiv pentru care

au fost desemnate „enhancer‘\ respectiv „silenceri\ Spre deosebire de sexvenfele descrise mai sus, care rftspund de expresia bazald a unor gene, aceste secvenfe indeplinesc rolul de reglatori ai expresiei genelor (expresia reglabil#). Ele sunt funcfionale fie in amonte, fie in aval fafii de punctui de start. $i la distance uneori chiar foarte marl faf# de promotori (obiigatoriu ins# in' cis). Orientarea relative faf# de gena a. cftrei transcriere o controleaz# poate fi adit 5’ —>3’ cat §i 3*->5* (Fig. IV.33). Express's reglabila Expresie bazala Elemente de rasp arts (la semnale)

i.Hh

7A caveta TATA +1

gena structural^ Fig. IV.33 - Elemente implicate in transcriere la eucariote

.MA 187 Funcjia aces tor elemente de control se realizeazd ca urmare a interacfiiinii cu factor! proteici, respecliv factori de transcriere, avand ca efect modificdri conforrnajionale in molecula de ADN, modificdri ce pot fi favorabile sau defavorabile transcrierii. Secvenjele enhancer sunt asociate cu gene care se exprimS selectiv in diverse Jesuturi, deci relajia lor cu diferenjierea celularS este de admis. Tot din clasa secvenjelor interesate in expresia genelor fac parte §i anumite elemente care mediazd rdspunsul la diferite semnale - motiv pentru care sunt numite „elemente de r&spuns*' (responsive elements) foarte asemdndtoare cu enhancerii. Sunt identificate „eleme-nte de rdspuns44 la hormonii glucocorticoizi,

tiroidieni §i alji compuji cu caracter polemic hidrofob, care pot traversa cu u§urin$ membrana celulard, legandu-se, ulterior, la receptori specific! intracelulari. Complexul hormon-receptor traverseazd membrana nucleard §i schimhd proteina receptor cu on factor de transcriere avand un domeniu de recurioa§tere a elementuiui de rdspuns hormonal specific. Toate genele care dispun de un element de rdspuns hormonal, in spejd, i§i vor activa transcrierea (vezi stiirmlarea transcrierii genelor ce specified enzimele-cheie ale gluconeogenezei prin glucocorticoizi - hormoni hiperglicemianji). Factori de (ranscriere specific!, interacponand cu „elemente de rdspuns“ la stresuri termice, chimice etc. activeazd transcrierea unui grup de gene avand ca produgi proteine ce atenueazd stresul: proteine de §oc termic, proteine care cheleazd metalele grele (ca de exemplu metalotioneina, proteind cu conjinut mare in grupdri tiol), proteine care se opun stres-ului oxidativ at speciilor reactive de oxigen (superoxid dismutaza) etc. O subliniere necesard la sfdrgitul „odiseei“ transcrierii; toate elementele bazale sau reglatorii au o caracteristicd comund: interacjiunea cu proteine specifice. Aejiunea ARN poiimerazelor I §i III prezintd similitudini dar §i diferenfe majore fatd de acjiunea ARN polimerazei II, diferenje doar consemnate, fard pdtrunderea rajiunii lor. Inhibitor! ai transcrierii Transcrierea ADN este suprimatd de cdtre unii compu§i exogeni, fie prin modificarea structurii ADN astfel incat acesta sd nu mai poatd servi ca matrifd in sinteza ARM, fie prin inhibarea ARN poiimerazelor procariote sau eucariote. Antibioticui actinomicina D, ca §i colorantul acridind, prin porjiunea lor pland, se insinueazd intre perechile de baze GsC; aceastd intercalare are ca rezultat distorsiunea moleculei de ADN, care nu mai poate servi ca malrifd pentru ARN polimeraze. Dependenja unui proces celular de sinteza ARN se „diagnosticheaz&“ in vitro prin inhibijia acestuia de cdtre actinomicina. Rifampicina, un antibiotic extern de activ in tratarea tuberculozei, se leagd la subunitatea (J a ARN polimerazei-holoenzimd din procariote, prevenind inijierea lranscrierii. Ea nu inhibit ARN polimerazele eucariotelor. Un inhibitor de temut ai ARN poiimerazelor din celulele animate este produsul one! frumoase ciuperci, Amanita phalloides. Acest produs, amanitina, inhibit, cu precMere, la concentrajii mici, ARN polimeraza II. IV.4.3. PRELUCRARJ CO- §1 POSTTRANSCR1ERE ALE MOLECULELOR DE ARN Procesui se referd la modificdrile pe care le suferd diferitele tipuri de ARN inainte de implicarea lor In biosinteza proteinelor. Aceste modific&ri decurg atat in nucleo cat §i in citoplasmfi $i presupun: - eliminarea din moleculd a unor fragmente polinucleotidice; - addugarea unor fragmente polinucleotidice; - modificdri covalente ale bazelor azotate. 188 Modificarea majors pe care o sufer# transcriptele primare la eucariote const# in scurtarea acestora. CercetSrile ultimilor ani au ar#tat c# moleculele de ARN (ARNm, ARNt, ARNr, ARN nuclear „scurt“), rezultate prin transcrierea unor gene structural^,

pot s# ajung# la locul de sintez# a proteinelor cu mult mai scurte decat porfiunea din genom ce corespunde proteinei respective sau ARN t, ARNr. Constatarea a avut ca punct de plecare observafia c# fragmentul de ADN corespunzStor ARNm ce confine informafia privitoare la sinteza ovalbuminei este intrerupt de secvenfe de ADN ce nu se reg&sesc in ARNm citoplasmatic. Rezult# ca secvenfele de baze care codific# ovalbumina sunt plasate discontinuu in genom. Secvenfele nucleotidice din cuprinsul genei corespunz#toare ovalbuminei care nu se regSsesc in molecula de ARNffi citoplasmatic s~au denumit „introni“, iar secvenfele nucleotidice transcriptibile §i traductibile, delimitate de introni, s-au denumit „exoni“. Lungimea total# a genei de ovalbumin# corespunde la 7700 perechi de baze, in timp ce aceea a ARNm citoplasmatic, la numai 1872. Dintre acestea 1158 perechi de baze codific# cei 386 aminoacizi ai proteinei, iar 64 de nucleotide de la capStul 5’ §i 650 de la cap#tul 3' al ARNm nu sunt traduse. Gena ovalbuminei 7700 perechi baze — 1 2 3 4 5 6 7 M Intron \ xon Transcriere L12 3 4 5 6 Transcriptul *» I A primar I i ARN matur pentru ovalbumina

7

/1872 nucleotide \ 3' Fig. IV.34 - Transcrierea genei de ovalbumina, cu obfinerea transcriptuiui primar, urmat# de excizia introniior; ARNm matur rezultat va servi ca matrifa pentru sinteza ovalbuminei Constatarea c# ARNm nuclear este mai lung decat a.cela§i ARNm ajuns in citoplasm# a dus la concluzia c# ARN polimeraza realizeaz# o copie primar# identic# cu intreaga gen#, apoi intronii sunt excizafi §i exonii se leag# formSnd ARNm matur, traduclibil (Fig. IV.34). Departe de a fi un fenomen izolat, discontinuitatea genelor s-a dovedit a fi un fenomen cvasi-general. Cel mai adesea, secvenfele intron au dimensiuni cu mult mai mari dec#t ce-le exon (de peste 100 de ori), ceea ce ar constiui o explicafie parfial# a faptului c# numai 5-10% dm genomul eucariot repiezint# secvenfe codificatoare pentru proteine §i ARN. Dac# secvenfele de nucleotide dintr-un ADN codificand o protein# nu sunt adiacente, ci secvenfele codificatoare sunt intrerupte de secvenfe necodificatoare, este evident c# la eucariote nu se mai poate vorbi de colinearitatea gen#~protein#, ci numai de o colinearitate exon-fragment din

proteina specificat# (corespunzand, probabil, unui domeniu funcfional al proteinei).

189 Excizia intronilor din transcriptele primare Excizia intronilor din ARN precursor, biologic inactiv, se realizeazd pentru toate tipurile de ARN' in nucleu, sub acpunea unor enzime specializate, care trebuie sS recunoasci' secvenjele de baze la jonc|iunea intron-exon, sS asigure juxtapunerea corectif a substratelor §i sit efectueze actul catalitic. In general, intronii au la cap&tul 5’ secvenfa GU iar la cel 3' secvenja AG incadrate adesea in secvente consens mai lungi. Exists o categoric de introni in care, in amonte fap. de capStul 3’ a! intronului (50 nucleotide), este prezentS o secven{S consens, parte a unui situs de ramificare, confinand invariabil adenozina; in drojdxi, secvenja consens, diferitS de cea a vertebratelor, este: 5’-TACTAAC-3\ Mutajii in vecinStatea unei jonc{iuni intron-exon, cu precSdere in

dinucleotidul de la capetele intronului, interfere excizia intronilor putand genera un ARN inactiv, conjinand un intron rezidual. In uncle {kihalasemii sinteza sc&zutd a ianfurilor fl-glohinS s-at datora unui defect de excludere a intronilor, avand (kept consecin|S incapacitatea ARN nuclear de a „ie§i“ in citoplasmS pentru a fi citit. Cech §i Zaug au evidential o modalitate cu totul surprinzStoare de excizie a intronilor dintr-un ARN ribozomal al unui protozoar cilia! — Tetrahymena termophila. Incubarea in vitro a ARNr precursor (transcript primar) cu nucleozid trifosfaji §i extract nuclear, ca sursS de enzimd catlizand procesul de excizie, a dus la conciuzia c& adaosul de extract nuclear era inutil. Se contura ideea intervenjiei autocatalitice a ARNr in procesul de exciziecoasere* idee greu de acceptat, care extindea la acizii ribonucleici un atribut aparjina nd exclusiv proteineior. Excizia intronilor din ARNr. 1. ARN precursor 2 Exon stang 5* AGGC V. CUi

3*

intron Adaos guanozina 2. 4 5*----

intron liniar ~ cucucuuExoni reunip

Fig. IV.35.a - Excizia autocatalitica a intronilor din ARNr la Tetrahymena termophila 190

tntron excizat Exons reunifi Fig. 35.b - Mecanismul transesterificarii Tn reacjia de excizie Lucrandu-se in medii in care contaminarea cu protein^ era excius& (ARNr obfinut prin tehniciie ingineriei genetice §i mi prin extraejie din nucleu), concluzia indubitabilS a fost aceea c& ARM' catalizeazii excizia intronilor §i coaserea propriilor exoni (Fig. IV.35a §i b). Acestui tip de ARNr, izolat din Tefcrahymena termophila, i s-a dat numele de ribozim pentru a cpnsfinji activitatea sa cataliticl Spre deosebire de enzimele clasice, aceast& enzimft avand activitate autocataliticS nu se reg£se§te neschirnbatii dugii actul catalitic. In l&murirea mecanismului de acfiune a ribozimului decisive a fost constatarea ca la unul dintre capeteie intronului excizat se gSse§te on rest de guanozinS care nu exista in ADN. GIF sau guanozina nu erau folosile in scopuri energetice, ci ca agent nucleofil apt sS desfacSt leg&tura fosfat diestericft de la unul dintre capeteie intronului. Legarea guanozinei la un loc specific din porjiunea intron o orienteazS. astfel incat o gnipare -OH a acesteia s& poafi ataca legHtura fosfat diestericfi de la joncjiunea exon- cap&tul 5’ al intronului. La capital 5s a! exonului exists o secvenp. de 6 nucleotide pirimidinice CUCUCU care se imperecheazS cu o porjiune din intron GGGAGG. Agezatft convenabil steric, guanozina atacft joncfiunea exon-intron la capital 5\ Aceasfl reacpe de transesterificare are ca rezultat legarea guanozinei (G) la adenM (A) §i eliberarea capital ui 3’ al exonului I. Uracilui (U), devenit capital 3-OH liber al exonului I, efectueazii o a doua transesterificare cu uracilui de la capital 5' al exonului II, realizandu-se, oda$ cu excluderea intronului, coaserea celor doi exoni (pieces de „splicing“) (Fig. IV35). De remarcat C& activitatea catalitic^ a ARNf este conditional# de integritatea conformajiei sale, intrucat, intocmai ca o enzimii, el trebuie sa asigure juxtapunerea corecta a substratelor. Excizia intronilor §i coaserea exonilor sunt accelerate, grape efectului autocatalitic al ribozimului, printr-un factor de ordinul a zece

bxlioane. .Un argument in plus pentru calitatea de catalizator a. ARNr este saturabilitatea reacfiei ARNr (intron) cu GTP sau guanozina (KM « 30 M) §i inhibifia acesteia piin 3 ’-dezoxi-guanozina. Intronii din categoria descrisd, avand capacitate autocatalitic^ (seif-splicing) §i utilizand GTP (sau guanozina) adijional, ca agent nucleofil, aparfin grupului 1 de introni.

192 Excizia intronilor die ARNn Excizia intronilor din ARNm eucariot se desf#§oar# similar exciziei intronilor din ARHr, presupunand, de asemenea, succesiunea a dou# reacjii de transesterificare (Fig, IV36). Deosebiriie fa{# de excizia intronilor din AKNr constau in faptul c# agentul nucleofil care opereaz# prima reacjie de transesterificare nu mai este GTP (sau guanozina) liber, ci un nucleolid in cadrul infronului, iar excizia intronilor nu este autocatalitic# (gnipul 03 de intjnoni). Intr-o prima etap#, gruparea 2’-hidroxi a unei unitSji de adenozin# atac# nucleofil iegdtura fosfat diesteric# ce unegte exonul I (5’) cu intronul, eliberand exonuL LegStura noufi 2\5’-fosfatdiesteric# stability da structurii

rezultate forma unui lasou. In cea de-a doua etap#, gruparea 3’-hidroxi terminal# a exonului I atac# nucleofil legfttura fosfaldiesteric# dintre intron §i exonul II (3’)- Intronul este eliminat, urm&nd a se degrada, iar eei doi exoni se. reunesc. Indep#rtarea intronilor este calalizat#, in cazul intronilor din grupul III, de un complex ribonucleoproteic constituit din ARN nuclear scurt (small nuclear RNA = sn RNA), proteine §i ARNm, subiect til prelucrfirii, care poart# nurnele de „splicozonT (spliceosome), prin analogic cu ribozomul. Se consider# c# dimensiunea mare a splicozom-ului impiedic# ARNU1 precursor s# p#r#seasc# nucleul inainte de prelucrarea sa complete la ARNSI1 matur. ARN scurt, nuclear (60-300 nucleotide), bogat in uracil, particip# sub forma a cinci specii diferite: Uj, U2, U4, Uj/U* desemnand §i tipul de ribonucleoproteine rezultate prin asociere cu proteine: snRNPU,, snRNPU2,.... (small nuclear ribonucleoprotein - colocvial citite snurp). Recunoa§terea joncliunii intron-exon ca §i a situsului de ramificare este asigurat# de e#tre snRNPU. Se admite c# snRNPU, recunoa§te din ansamblul de transcript© ARN prezente in nucleu numai pe cele con{in#nd introni. snRNPU5 se imperecheaz# cu cei doi exoni ce flancheaz# intronul, ceea ce permit© discriminarea intre secvenjele GU §i AG la limita intron-exon §i alte secvenfe de acest fel. RNPU2 se ieag# la secvenfa consens din intron fiind implicate in selecjia punctelor de ramificare (Fig. IV.37). Interacfia intre ARNnt precursor (premesager) §i celelalte tipuri de snRNPU nu este clarificat#. Asocierea ARNm transcript primar cu snRNPU, presupunand o multitudine de interacfiuni (proteinfi-proteind, ARN-protein#, ARM-ARN) §i o riguroas# intrare in seen# a componenjtilor, asigur# inalta fidelitate a procesului de excizie-coasere a intronilor, realizat catalitic de components ARN a snRNPU. . Trecerea prin „furcile caudine“ ale splicozomului face din ARN pre-mesager urt ARNm pe deplin matur, apt s# ajung# in citosol pentru a fi citit §i tradus. 193 ifi •j fi

Fig. IV. 37 - Rolui SNURP in eliminarea introniior 194 Excizia intronilor din ARNt Unele molecule de ARN£ eucariot confin in vecinStatea regiunii anticodon succesiuni de nucleotide (20-40) ce corespund unor introni. Spre deosebire de intronii din grupul I §i HI, ace§ti introni se exclud prin paiticiparea unor protein-enzime organizate intr-un sistem multienzimatic avand printi*e multiplele sale activitSJi §i pe cele de endonucleazS §i ligazS (Fig. IV.38). Din demonstrarea capacitSjii catalitice a ARM rezuM o idee fundamentals din punct de vedere teoretic: dualitateafuncJionalS a moleculei de ARM care, pe langS calitatea de a fi o moleculS informaJionalS, o are §i pe aceea de a funcjiona drept catalizator. DupS aprecierea. lui Cech, diviziunea muncii in celulS nu pare sS fie chiar atat de strictS. Problems discontinuitSjii genelor la eueafiote este o temS fascinantS de biologie, care pane o serie de intrebSri al cSror rSspuns, cel pufin deocamdatS, este departe de a fi satisfScStor. In ce moment al evoiujiei, cum §i in ce scop au ap&rut intronii? Procariotele actuale sunt identice ca genom cu cele din care au provenit eucarioteie? DacS nu, este posibil ca §i

procariotele sS fi dispus de gene discontinue §i ca variajia posibilitSjilor de excizie a intronilor sS fi servit evoiujiei, imbogSjind „repertoriur* de proteine al acestora. Cu timpul, este probabil ca procariotele sS fi „renunjat“ la ADN necodificator, astfel incat sS-§i mSreascS viteza de cregtere prin scSderea cantitSJii de ADN ce trebuia replicatS in fiecare generate. Este prezenja intronilor avantajoasS eucariotelor sau pur §i simplu s~au pastrat prin lipsa unui aparat de excludere a intronilor? S-ar pSrea cS prezenja lor este avantajoasS. Se conlureazS ipoteza intervenjiei intronilor in procesul de diferenjiere celularS. Mai mult, transportul ARM din nucleu in citopiasmS pare s& depindS de prezenja intronilor. Intr-adevSr, unii ARM objinuji prin transcrierea ADN complementari unor ARN m atari (sub acjiunea revers transcripfazei) nu pSrSsesc nucleul; probabil, unii introni codifies porjiuni dintr-o enzimS, maturaza, implicatS in insu§i transportul ARN. CercetSri recente au demonstrat o mare flexibiiitate a „aparatului de excizie-sudurS“ a diverselor regiuni din ARNns ia eucariote intrucat, dintr-un singur transcript primar pot rezulta numerogi ARNm maturi §i deci proteine diferite (splicing alternativ). Chiar dacS dintr-un singur transcript primar se objin proteine diferite, caraeterul monocistronic al ARNra eucariot se pSstreazS, intrucat un singur tip de ARNm matur §i un singur polipeptid rezultS intr-un anumit tip de celulS, la un moment dat, prin procesSri diferite. Un exemplu de splicing alternativ il oferS transcriptul primar pentru tropomiozinS — proteins a aparatului contractil ce prezintS diferenje structurale in diverse Jesuturi. O genS unicS genereazS un transcript primar unic in toate Jesuturile caxe conjin tropomiozinS. Prin tfatarea diferenjiatS a exonilor — in unele Jesuturi acedia sunt trataji ca introni — se objin tipuri diferite de ARNm matur §i deci tropomiozine diferite funcjie de Jesut (Fig. IV.39). . Exonii exprimaji in toate Jesuturile sunt desemnaji ca fiind constitutivi. ■V C "N

m m i AH

1 M: : i;: 195 Intron

ADN Transcript pwlmmr ARNt

/

4 Excizia intrciiy§Mi H 0

Fig. IV.38 - Prelucrari posttranscriere aie ARNt 196 JM = introni STR aa (N) STR 165IBS- 214- 235258- STR 2585' UT1-38 39-80 39-8081-125 126-164 188 213 234 257 284 3' UT 284' 3’ UT 3 U11-38 3W-80 3S-8U 81-1 25 126-184 1 88 213 234 257 284 3 U I |:

ARNm transcris Mu$chi striatl (STR) '

(N) Muschi striatl ’ '(STR)' Creier Fig. IV.39 - Organizarea ganei a-tropomiozinei ia §obo!an; alternativeie de transcriere Pe lang# excluderea intronilor prezenfi in ARN eucariot (§i in foarte pufine procariote —- mai ales din dasa bacteriilor arhaice), numeroase prelucrSri adifionale, diferind cu tipul de ARN, des#var§;esc trecerea de la ARN transcript primar ia ARN matur, functional, succesiunea ior temporal^ fiind stability cu aproximafie. Spre deosebire de ARNm procariot care este tradus in timp ce este sintetizat, deci se na§te matur, la eucariote ARNm devine functional numai dupft modificarea capetelor 5' §i 3\ Cap&tul 5' al ARNm este modificat covalent intr-un proces considerat a fi cotran- scripjional, intrucat se realizeazS chiar inainte ca deplasarea ARN polimerazei II din situsul de inifiere a transcrierii s# fi avut loc. Modificarea const# in adSugarea unui rest de 7-mefiI guanozind legal prin leg&turd 5’-5’ tdfosfat de transcriptul primar (Fig. IV.40). La unele specii modificarea la capdtul 5’ include §i metilarea grupMrii T hidroxi din nucleotidul ultim, uneori §i penultim, din fostul transcript primar. „Marcarea“ cap&tului 5’ al ARNm este necesardintrucat; - protejeaz# molecula de acjiunea 5’-3* exonucleazelor; determine specificitatea celulara Modificari posttranscriere adifionale Modificari adifionale ale ARN raesager eucariot 197

0 1 -O-P = O I 0 1 -o-p = o I 0 1 CH. Baza

Q~~CH? ~o—p=o I 0 1 CH2

Baza O —CH? ~Q—P = Q Fig. IV.40 - Marcarea oapatului 5’ ai ARNm - favorizeazh ina^erea, fiind recunoscutd de cStre ribozom ca semnal de inijiere a sintezei proteinelor; - reprezintd un semnal de recunoa§tere pentxu enzirnele care-l vor folosi ca substrat in cursul prelucrMlor ulterioare. Capital 3’ al ARNm este adesea modificat covalent prin poiiadenilare — formarea „cozii“ poli A (200-300 nucleotide). Poliadenilarea se produce in aval fapl de o „secvenf& de semnalizare" a clivdrii §i poliadenildrii §i este rezultatul acjiunii concertate a douS enzime: o endonucleazft care taie molecula de ARNm in vecinStatea „secVenJei de semnalizare: §i o poli-A-polimerazS care, fM $& necesite un template, cataiizeazS polimerizarea resturilor adenilat. Semnificafia poliadeniklrii la capStul 3’ al ARNm este obscurS; jinand seama c& in cursul existenjei sale in citoplasmS coada poli A a ARN m sufeifi o scurtare progresi- v5, ca urmare a acjiunii unor 3,~~>5’ exonucleaze, se poate admite c& scopul cozii este acela de protecjie a regiunilor codificatoare. §i totu§i, ARNm pentru histone §i interferon, cel pujin, nu sunt poiiadenilaji. In vitro, prezenfa cozii poli A s-a dovedit extrem de utild. Ea servegte ca, djiator in sinteza ADN pe matrifh de ARN, dec! la objinerea \DNC (“C“ pentru complementar), utilizat in tehnicile de clonare ca §i la izolarea §i purificarea ARNm din totalul de ARN celular din care el reprezint£ o mich parte. Prelucrarea ARNm eucariot se incheie cu excizia intronilor (vezi anterior). Modificari adijionale ale ARN de transfer La procariote, ca §i la eucariote, transcriptul primar confine mai mulfi ARNt precursor! (multimeric). ARNt precursor! monomerici, avand extensii 5’§i 3' relativ scurte, se obfin prin acfiunea unui mare num&r de ribonucleaze (Fig. IV.38) In ob|inerea capdtului 3’ al ARNt matur este implicate o ribonucleazd cu activitate endonucleazictt §i anume Ribonucleaza P (RNA-aza P), constituM dintr-o subunitate ARN de c&teva sute de nucleotide §i o protein^ cu caracter bazic, cu masft molecular# de aproximativ 14 kD. 198 In vitro, in prezenja unor concenlrajii maxi de s3ruri, proteina s-a dovedit a nu fi necesara actului catalitic, Activitatea enzimei in vivo impune prezenfa ambelor subunit&Ji, actul catalitic fiind instl realizat, aga cum a demonstrat S. Altman, de c8lre subunitatea ARM, erne poate fi considerate un ribozim. Prezenja proteinei bazice reduce, ia concentrajii fizioiogice de siiruri, repulsia

dintre dou& molecule ineftreate negativ: dintre ribozim ™ un ARN polianionic - gi substratul sflu - ARNt. Acjiunea RNA-azei P se soldeaza cu formarea unor ARN, precursori cu capete. 5’ mature, De remarcat obiigativitatea prezenjei Mg2* sau Mn2+ pentru activitatea enzimei. La eucariote s-a demonstrat activitate de tip ribonucieazfi P in nucleu gi mitocondrii. Spre deosebire de alte enzime ARN, RNA-aza P este o enzimft ce se conformeaz8 accepjiei ciasice a enzimei, sub aspectul recuper&rii sale in unna actului catalitic. Descoperirea ribozimilor - enzime in care componenta ARN dejine activitatea catalitic;! - a propulsat aceastft moleculd, dintotdeauna informajionalS, pe un teren pand nu demult rezervat proteinelor, a desfixhjat dihotomia genotip-fenotip gi a consolidat punctul de vedereal lui L. Johnson privind soarta adevftrurilor: „orice adevftr incepe ca erezie gi se terming ca dogmSA Se speculeazS c8 ARN ar fi' molecula primordial^, urmat2 de ADN gi proteine, catalizatorul originar, gi c& ingigi rihozomli,constituifi dintr-un procent foarte mare de ARNr (aproximativ 50%), ar juca in celulS gi un rol catalitic, Argumentul pare a fi „servit“ de dUre Noller gi eoiaboralorii care au demonstrat ca ARNr necontaminat de proteine, este apt sa catalizeze sinteza legftturii peptidice. Objinerea cnp&tului 3’ matur al ARNt, din transcriptele primare multimerice, presupune o activitate exonucleazici soldat&v in cazul procariotelor, cu revelarea capStului CCA (toate genele pentru ARNt codificS seevenja CCA terminus). In cazul eucariotelor, seevenfa CCA este aditugatii ulterior de cStre o nucleotidil-lransferazS avfmd ca substrate ATP gi CTP. O modificare covalentS pe care o sufer! atat ARNt procariot cat gi cel eucariot const# in modificarca unor baze sau a ozei. Aceste modific&ri enzimatic-catalizate constau in alchiifui, tioklri, hidrogenSri, gi decurg, in spejfi, in regiuni de ARN, in care nu exists baze eomplementare (vezi IV 4.L). IVfodificari adi$Ionale ale ARN ribozomal Prelucrarea ARNr ciecurge similar la procariote gi eucariote gi presupune clivai*ea unor transcripte prim are de mari dimensiuni la transcripte de dimensiuni mai mici: 30S pentru eucariote gi 45S pentru procariote. Aeestea vor genera molecule de ARNr, matur: 23S, 16S, 5S ARN,. pentru procariote gi 28S, I8S gi 5,8S ARNr pentru eucariote, dup# indepftitarea fragmentelor spajiatoare gi, in cazul procariotelor, a ARN, objinut prin transcrierea unor gene ARNt intruse (Fig. IV.41). De menjionat c! ARNr 45S rezuM prin transcrierea, operate in nucleol, de ditre ARN polimeraza I, a sule de gene ARNr separate. ARNr 5S rezultd dintr-o molecul# precursoare diferitd obfinukl prin transcrierea unei gene, 5S, de cfltre ARN polimeraza III. Objinerea ARNr matur implicit, atat la procariote cat gi la eucariote, modificarca prin metilare a unor baze. 199 16 S 1TS

ARN r 16 S precursor 30 S 23 S ARNt (4S) metiSare + hidroliza enzimatica 25 S ARNt ARNt ARN r 23 $ SS hidroliza enzimatica 5S ARN r Fig. IV.41 - Modificari post transcriere ale moiecuielor de ARN, precursor 45 S 18 S 5,8 S 28 S median hidroliza enzimatica H .. grupari metrl ARN r ARN r ARN r 18 S 5,8 S 28 S Modificari adiflon&le ale ARN miciear de imict dimensitmi Sintetizat de c3tre ARN polimeraza II, acest tip de ARN transcript primar va primi la cap&tul s3.u 5’ un rest de 7-metil-guanozin& (ca §i ARN,*) in cursul unui proces contranscripfional. Dup3 ce ARN „scurt“ ajunge in citosol, o metilaz& locals il hipermetileazS dand un capSt 5’ ce confine 2,2,7 trimetil guanozinS (m3G); metilarea se realizeazd numai dupS asocierea ARN nuclear „scurt“ cu proteine specifice sintetizate in citosol. Ribonucleoproteinele rezultate sunt importate de nucleu, de§i proteina nu are semnalele caracteristice proteinelor de import. S-a demonstrat c3 introducerea m3G este necesarS transportului in nucleu, mediat receptorial, ca §i legarea prealabilft la proteine. 200 Din necesitatea ca particuia s# aM ambele semnaie pentru a fi importat# s~ar putea deduce c# numai particuiele corect asamblate au acces in nucleu, unde au de indepiinit funcfii specifice. IV.4.4. BIOSINTEZA ARN PE MATRIjA DE ARN Unele virusuri con fin ca material cromozomial ARN, Replicarea acestui ARN in celula gazd# are Ioc sub acfiunea unei replicaze, o ARN polimeraz# ARN-dependent#, analoag#, ca mecanism dt acfiune, ARN polimerazei ADNdependenll.

Replicazele se sintetizeaz# in organismul gazd# ca rfispuns la infecfia viral#. Ele manifest# o specificitate surprinz#toare, folosind ca matrif# exclusiv ARN omolog (al virusului cu care a fost infectat# celula). In felui acesta, in celula gazd# are loc replicarea ARN viral, nu §i a ARN al celulei gazd#. ARN sintetizat pe matrif# de ARN omolog nu este complementary ci identic cu acesta, Dupa infecfie se sintetizeaz# pe matrifa ARN (+) o replica complementary (-), luand na§tere o dubl# elice constituit# dintr-o eaten# ARN (+) §i una ARN (-). Catena ARN (-) va servi apoi ca matrifa pentru sinteza a numeroase catene complementare (+) (Fig. IV.42). + (+) M * + + + *

omoloage ARN viral Fig. IV.42 - Sinteza de ARN pe matrifa de ARN Fig. IV.43 - Completarea dogmei centrale a geneticil moleculare prin prisma descoperirii ADN polimerazei ARN-dependenta §i ARN polimerazei ARNdependenta.

201

ARN viral va funcjiona ca ARNm perifru sinteza proteinelor virale (spre deosebire de ARN al retrovirusurilor).

Tinand seama atat de existen{a ADN polimerazei - ARN-dependentS (revers trams- criptaza), cat §i de a ARN replicazelor, dogma centrals a geneticii moleculare treb.uie reconsiderata in sensul indicat in Fig, IV,43, t? Cap. V, BIGSINTEZA PROTEINELOR (Traducerea mesajului genetic) V.l. CODUL GENETIC A§a cum s~a arStat anterior, informafia genetics - mesajul genetic - cu privire la biosinteza proteinelor este confinut in secvenfa de nucleotide din ADN. Acest mesaj este transmis codificat in citoplasmS, local de biosintezS a proteinelor, prin sintezS de ARNm* Secvenja de nucleotide dinir-un anumit ARNm trebuie tradusS intr-o succesiune specific^ de aminoacizi, corespunzand unui lan{ polipeptidic. In citoplasmS trebuie sS aibS loc decodificarea ARNm, respectiv traducerea limbajului nucleotidie in care este scris acesta, in iimbaj aminpacidic. Este de presupus cS unui anumit aminoacid ii corespunde on cuvant cod format dintr-o anumitS succesiune de nucleotide. Identificarea cuvantuiui cod pentru fxecare dintre cei 20 de aminoacizi ce intrS in structura proteinelor a constituit un eveniment remarcabil §i se datoreazS lucrSrilor lui Nierenberg, Ochoa, Khorana §i Matthaei. Descifrarea codului genetic, a relafiei dintre secvenja de nucleotide din acizii nucleici (materialul informafional genetic) §i secvenja de aminoacizi dintr-un lanj polipeptidic, care reprezintS forma de exprimare a acestui mesaj, a ridicat numeroase probleme; - aprecierea mSrimii unitSjii codificatoare, respectiv a numSrului de nucleotide ce codificS un aminoacid; - stabilirea naturii unitSjii codificatoare, a nucleotidelor ce formeazS unitatea; - determinarea seevenjei nucleotidelor in unitatea codificatoare. Evident, intruc.it exists 20 de aminoacizi §i numai 4 nucleotide, este exclus ca un aminoacid sS fie specificat de un singur nucleotid. Specificarea unui aminoacid prin douS nucleotide este, de asemenea, insuficientSintrucat se pot obfine numai 16 cuvinte cod. In schimb, construirea unui cuvant cod dintr-o succesiune de 3 nucleotide oferS 64 de posibilitSji, respectiv 64 de cuvinte cod pentru cei 20 de aminoacizi. Faptul cS toate cuvinteie cod sunt triplete, denumite codoni, a fost verificat prin experience simple §i expresive cum ar fi; - un ARNni viral monogenic constituit din 1200 de nucleotide codified o proteinS continand 400 de aminoacizi; - delelia (excluderea) sau inserjia unui triplet intr-un anumit ARNm determinS sinteza unei proteine cu un aminoacid mai pufin, respectiv cu unui in plus. In ceea ce prive§te stabilirea naturii nucleotidelor ce constituie tripletul §i a sucxesiunii lor in acesta, decisive an fost experienjele efectuate pe polinucleotide de sintezS, constituite din acela§i nucleotid sau din nucleotide diferite, care au servit ca ARNm pentru 203

sinteza unor proteine in sisteme acelulare. De pildft, dac5 se utilizeazU ca ARNm un polinucleotid adenilic se ob|ine o proteinS consfituM exclusiv din lizinSL RezuM c& lizinei ii corespunde triple!ui AAA. Analog, un polinucleotid uridilic d& na§tere unui lan| polifenilalaninic, unul policitidilic edified o poliprolind; rezultd cuvintele cod peritru feniialanind (UIJU) §t pentru prolind (CCC). JSensur ceiorlalfi codoni s-a stabilit prin utilizarea unox heteropolinucleotide cu seevenjd cunoscutd, Jinandu-se seama de faptul ca direejia de traducere a moleculei de ARNm este 5’~3\ Secvenfa bazeior intr-un codon s-a precizat ca urmare a unei experience ingenioase imaginate de Nirenberg care a pus in contact un triplet nucleotidic sintetizat in laborator (avand o succesiune de baze cunoscuta) cu ribozomi §1 20 de complexe aminoa- cil~ARNt, dintre care unul singur era marcat 14C aminoacil-ARNO §i apoi a filtrat amestecul pe nitroceluioziL Pe filtrul de ceiulozft este refinut numai aeel UC amiiioa- cil~ARNt care s-a Tinperec!icat prin porjiunea anticodon cu tripletul utilizat, legat specific la ribozomi. S-a demonstrat astfel, de exemplu, cS tripletul UGU codified cisteina, UUG, leucina, iar GUU, vaiina. In tabelul V.l. este redat codul genetic.

Tabelul V. 1. Codul genetic // / U C UUU UCU Phe u UUC UCC Ser UUA UCA

G

Leu UUG CUU

UCG

cue Leu CUA

CCC Pro CCA

CUG

CCG

GCU

A UAU Tyr UAC UAA Codon terminator UAG CAU His CAC CAA Gin CAG

G UGU Cvs UGC Codon UGA terminator

/// U C A G

UGG Trp CGU

U

CGC Arg CGA

C

CGG

G

A

AUU A

G

AUC He AUA

ACU

AAU Asn

AGU Ser

U

ACC Thr ACA ACG

AAC

AGC

C A

AAA Lys AAG

AGA Arg AGG

G

GAU Asp GAC

GGU

U

GGC Gly GGA

C

GGG

G

AUG Met GUU

GCU

GUC Val GUA

GCC Ala GCA

GUG

GCG

GAA Glu GAG

A

204 Caractehsticile codului genetic standard ~ intrucat nu exists semnale care sd indice inceputul §i sfar§itul fiecdrui codon, citirea mesajului genetic se face neintrerupt, de la un codon start pand la an codon terminator. Punctul de start in citire este reprezentat de un semnal de inijiere incluzand, invariabil, codonul de inijiere AUG. Codul genetic nu are deci, virgule, semne de punctuajie. - Codul genetic este degenerat, mai exact, redundant. Dintre cele 64 de triplete 61 codified aminoacizi particular! Cum nu exist'd. decat 20 de aminoacizi ce trebuie specificaji, rezultd cd unui singur aminoacid ii pot corespunde mai multe cuvinte cod, Intr-adevdr, a§a cum se vede din tabelul V.l. numai triptofanul §i metionina sunt specificaji de cfUre un singur codon, in timp ce ulji aminoacizi, cum ar fi de exemplu serina §i leucina, sunt codificafi de catre 6 codoni fiecare (codoni sinonimi). Degenerarea codului, respectiv existenja mai multor cuvinte cod pentru acelagi aminoacid, se manifesto in special la nivelul nucleotidului 3 din codon. Intr-adevdr, este u§or de observat cd, in general, primele doud baze ale codonilor sinonimi sunt constante. Crick a conchis cd asocierea nucleotidelor 1 §i 2 din codon cu nucleotidele 3 §i 2 din anticodon este fermd, respectand principiul complementaritdjii A, U §i C, G, in timp ce imperecherea nucleotidului 3 din codon cu 1 din anticodon este, in general, laxd, Aceasta s-ar datora particularildjii nucleotidului 1 (capdtul 5’) din anticodon de a se imperechea §i cu alte nucleotide, tncdlcand regulile Watson-Crick (A, U; C, G). De exemplu, in pozijia 1 a anticodonului, uracilul se poate lega cu A dar §i cu G (slab), iar guanina se poate lega cu C, dar §i cu U (slab), din pozijia 3 a codonului. Frecvent prezentd ca nucleotidul 1 in anticodon, inozina se poate lega de citozind, ca §i de uracil sau adenind, dar legdturile sunt slabe. Cand insd in pozijia 1 a anticodonului se gdse§te C sau A, acestea se pot lega numai dupd regula Watson-Crick cu G, respectiv U din pozijia 3 a codonului, stabilind legdturi ferme. In pozijia 1 a anticodonului existd deci, in mulji ARNt, o baza „§ovdielnicd", „nedccisd‘\ „oscilantd'\ dispusd sd incalce regulile de complementaritate

Watson-Crick (efectul wobble). Un ARNt conjinand un astfei de anticodon poate recunoagte §i se poate lega la mai mulji codoni care specified acela§i aminoacid (s-au identificat 51 de tipuri de ARNt); cel mai adesea legdturile sunt slabe. Rafiunea biologicd a complexiidjii interacjiunilor codon-anticodon ar decurge din necesitatea de a asigura atat acuratcjea imperecherii cat §i promptitudinea disocierii complexului ARNt-ARNn), care nu trebuie sa devina un factor limitant al vitezei procesului de biosintezd a proteinelor. Departe de a fi un semn de imperfeejiune, degenerarea codului minimalizeazd efectele mutajiilor, prin redundanja ibformajiei. De remarcat cd trei codoni din cei 64 (UAA, UGA, UAG) nu specified nici un aminoacid. Ace§ti codoni, denumiji „non sens", reprezintd de fapt semnale de intrerupere a traducerii ARNnl. Un lanj polipeptidic, sintetizat pe un anumit ARNm, iji inceteazd cre§terea atunci cand citirea ARNn) a ajuns la un codon non sens.

205 - Codul genetic nu este ambigou, niciodatS acela§i triplet no semnific& doi aminoacizi diferiji. - Codul genetic este universal-toate viepiitoarele utilizeazS acela§i cod genetic pentru a traduce genele lor specifice in proteine specifice, O abatere surprinzStoare de la universalitate ne releva codul genetic al mitocondriei. Astfel, codonul AUA corespunde metioninei, §i nu izoleucinei, codonul UGA corespunde triptofanului, nefiind nn codon non sens, codonii AUA §i AUU sunt codoni de iniJiere §i nu codonii ce specific^ izoleucina §.a.m.d.. V.2. BIOSINTEZA PROTEINELOR Edificarea unei macromolecule proteice este, probabil, cel mai complex

proces biosintetic ce decurge in lumea vie, implicand conlucrarea a peste 300 de macromolecule reprezentate de protein * cnzime, cu funcfii distincte in acest proces, §i de diverse tipuri de acizi ribonucleici. Procesul de biosintez& a proteinelor presupune traducerea limbajului de patra litere al acizilor nucleici (4 nucleotide) in limbajul de 20 de litere (20 de aminoacizi) al proteinelor. In cadrul transferului de informafie, in organismele pro- §i eucariote, etapa de biosinteza a proteinelor este desemnata drept etapa de traducere a mesajului genetic inscris in ADN §i transcris in ARNm. Aceastil etap& decurge la nivelul ribozomilor §i se deruleazS, in principiu, prin ad&ugarea succesivif a cate unui reziduu aminoacidic la cap&tul carboxi terminal in cre§tere. Atat in cazul procariotelor c3t §i in cel al eucariotelor, biosinteza proteinelor implicit 5 etape: - activarea aminoacizilor - inifierea lanfului polipeptidic - elongarea lanfului polipeptidic - terminarea edific&rii proteinei §i eiiberarea sa - prelucr&ri posttraducere ale proteinei sintetizate. I. Activarea aminoacizilor Participarea aminoacizilor la biosinteza legaturii peptidice, care este un proces endergonic, impune activarea prealabil& a acestora, Activarea are loo in urma reaefiei aminoacidului cu ATP. Se formeaz& complexul aminoacil~AMP, care con|ine o legatura macroergicti de tip anhidridS mixt& §i pirofosfat. Hidroliza ulterioarS a 206 pirofosfatului, sub acfiunea pirofosfatazei, depiaseazS echilibrul spre dreapta, f&cand reacfia ireversibiLl

Complexul aminoacil-adenilat cedeaz& restul aminoacid activat unei molecule de. ARNt specified aminoacidului dat (al edrui anticodon corespunde codonului ce specified aminoacidul respectiv), permijandud ARN r s&-§i exercite funefia de transport §i adaptors a aminoacizilor. ARNt leagS aminoacidul la capStul CCA §i anume la gruparea -OH din pozifia. T sau 3’ a nucleotidului adenilic, cu formarea unei legSturi esterice, in mod exceptional, macioergicS. ROO ARN{ ARNt

I 1! II

I

I

NH2 Aminoacil-ARNt Reacfia global*! de activare a aminoacidului poate fi scrisd: aminoacid + ARN, + ATP ——■>- aminoacil ™ ARNt + AMP + 2P Pentru activarea fiecarui aminoacid se consumd doud legaturi macroergice. Atat reacfia 1 cat §i reacfia 2 sunt catalizate de ligaze-aminoacil ARNt sintetaze, care manifesto o extremd specificitate atat pentru aminoacid cat §i pentru ARNt, evitandu-se astfel eroarea legSrii la un anumit ARNt a altui aminoacid decat cel al cfirui codon este complementar cu porfiunea anticodon a ARNt dat. Pe langd local de legare a ARNt §i a ATP, enzima este inzestratd cu incd doud locusuri, unul pentru legarea aminoacidului, avand o dimensiune adecvatd acestuia §i altui, hidrolitic. Dacd un aminoacid ce diferd minimal de aminoacidul consacrat se leagd la locusul de legare a aminoacidului activat, enzima recunoa§te aminoacidul „impostor“ §i-I exclude prin hidrolizd. De exemplu, dacd in loc de izoleucind se leagd valina, care diferd doar printr-o grupare metilenicd de prima, enzima corecteazd imediat aceastd eroare, expulzand valina din locusul hidrolitic, care are dimensiuni potrivite pentru complexul AMP~valind, nu insd §i pentru AMP~izoleucind. Prin hidroliza complexului valil-AMP, valina este eliminatd §i enzima leagd corect izoleucina. Fidelitatea procesului de traducere-respectiv adaptarea corectd a aminoacidului pe matrices de ARNm §i stabilirea secven|;ei de aminoacizi caracteristicd proteinei de sintetizat este, in mare mdsurd, asiguratd de capacitates de autocontrol a ARNt sintetazelor. IL Iniiierea laniului polipeptidic Citirea de cdtre ribozom a ARNm se face in direcfia 5’-3’ a acestuia, proteina edificandu-se de la capdtul amino-terminal spre cel carboxiterminal. Inifierea presupune ca primd etapd legarea subunitdfii 30 S a ribozomului la ARNm. Legarea este mediatd de unul dintre cei trei factori de inijiere §i anume de factorul de inifiere 3 (FIS), care are §i rolul de a preveni reasocierea prematurd a celor doud subunitdfi ribozomale. Etapa necesitd prezenfa GTP. Legarea corectd a ribozomului in dreptul codonului de inifiere, ce specified aminoacidul N-terminal, este esenjiald pentru citirea corectd a mesajului genetic. La procariote, aminoacidul N-terminal este, invariaUl, Nformil-metionina. Acestui aminoacid ii corespunde pe molecula de ARNm codonul AUG (uneori §i GUG), cel care specified §i metionina nefonnilatd din

cuprinsul lanfului polipeptidic. Subunitatea ribozom aid 30 S va trebui sd discearnd intre AUG corespun- zand N-formil-metioninei, deci aminoacidului initiator, §i AUG corespunzand celorlalte reziduuri de metionind. Ghidarea corectd a ribozomului la capdtul 5’ al ARNm, in 208 dreptul codonului cle inijiere, este posibilS datorita prezenjei la capS- tul 5’ ai ARNm a unei secvenfe. poHnucieotidice (secvenja Shine Daigarno), adiacentd codonului de inijiere, perfect complementary cu o succesiune de nucleotide de la capStuI 3’-OH al ARNr 16 S, conjinut in subu- nitatea 30 S. Semnalul de inijiere a traducerii la procariote este, deci, re- prezentat de codonul AUG precedat de secvenja nucleotidica descrisS. Afinitatea ribozomului pentru semnalul de inijiere ar modula viteza traducerii, a§a cum afinitatea ARN polimerazei pentru promoter modu- leazfi viteza transcrierii. A§a cum s-a menjionat anterior, la procariote, mulji ARNm sunt poiicistronici, codificfind douS sau mai multe polipeptide. Pe un astfel de ARNra exists multiple semnale de inijiere egale numeric cu .numS- rul de lanfuri polipeptidice codifi- cate, Ribozomul, alunecand peste semnalul de terminare a sintezei pri- mului polipeptid (codonul non sens), iniJiazS, informal fiind de un nou semnal de inijiere, sinteza urmS- torului lanj polipeptidic. A doua etapS a procesului de inijiere constd in legitrea ia com- plexul ARNm — subunitate 30 S a N-formil-metioniJ~ARN,fmet §i a GTP. La aceastS legare colaboreazS factorii de inijiere 1 §i 2 (FIl + FT2). N-formiI-metionilARN,fnwt rezultS prin formilarea metionil~ARN£fmc{,

Fig. V.1 - Cele trei trepte in formarea complexului de inijiere.

209 format din ARNt11,Kt §i metionind, sub acjiunea unei transformiiaze avand ca donator de grupare formil N10-formi!tetrahidrofoiatul (N10-CHO-FH4): metionina + ARNtfm9t + ATP —*■ rnetionil~ARNthnet + AMP + PR metioni! — ARN/met + N10 - CHO ~ FH4 —- formlbmetionil - ARN/™' + FH4 De suhliniat faptul ca existd doufi specii diferite de ARNt purtdtoare ale metioninei: ARN(niel §i ARNtfme\ fiecare aptd sd lege metionina generand

metionil~ARNtnie\ respeetiv metionil~ARNtfnwt. Dintre aeestea numai metionilARN/™1 este susceptibild la formiiare generand aminoacidul initiator care se va lega la codonul de inijiere, §i nu la oricare codon AUG de pe ARNm, in dreptul locusului peptid de pe ribozom care-1 accepts (Fig. V.l). In cea de-a treia etapd a inijierii, subunitatea ribozomald mare, 50 S, se leagd la complexul anterior format, cu eliberarea simultand a factorilor de inifiere §i hidroliza GTP. Se formeazd, astfel, ribozomul functional desemnat drept complex de inifiere. Formil-metionil~ARN,fmct, legal pe principiul complementaritdfii bazelor la codonul de inifiere, ocupd locusul peptid de pe ribozom (ocupat altfel numai de lanful polipeptidic in cre§tere), Locusul aminoacid al ribozomului este deocamdatd liber (Fig. V.l). III. Ehmgarea ian^ului polipeptidic Procesul const! in addugarea succesivd de aminoacizi pand la formarea proteinei de sintetizat. Addugarea fiecdrui aminoacid parcurge mai multe etape, ce se vor exemplifica pentxu aminoacidul 2 din catena polipeptidicd. a. Recunoa§terea de cdtre ARNf purtdtor al aminoacidului doi a celui de-al doilea codon de pe ARNni. Fixarea corecld a aminoacil~ARNt pe locusul aminoacid de pe ribozom este asiguratd atat de interacjiunea codonanticodon cat §i de interacfiunile ce se stabilesc intre o anumitd porfiune a ARNt §i locusul aminoacid (A). Aceastd etapd a eiongarii necesitd prezenfa unui factor de elongate (Tu) legal la GTP, ca elector alosteric (Fig. V.2). b. Formarea legdturii peptidice prin transferul restului formii-medonil pe gruparea amino a aminoaciI~ARNt din locusu’ aminoacid. Reacfia este de fapt o reacjie de acilare a grupei. amino din aminoacidul doi, catalizatd de o peptid.il transferazd, factonii de elongate G, inclusd in subunitatea 50 S. Locusul peptid este, in acest moment, ocupat de ARNtfnicL, iar locusul aminoacid este ocupat, nefiresc, de un ARNt purtdtor al dipeptidului format (Fig. V.2.) Energia necesard fonnarii legdturii peptidice este furnizatd de energia eliberatd la desfacerea legdturii aminoacid inifiator-ARN, corespunzdtor. c. Glisarea ribozomului de-a lungul ARNm pe o distanjd de un codon spre capatul 3’ al ARNm. Simultan sire loc hidroliza ARNrfmet (fost purtdtor al aminoacidului 1) cu eliberarea sa in citosol. In acest moment, locusul peptid, ajuns in dreptul codonului 2, este ocupat de ARK, purtdtor al dipeptidului, iar locusul aminoacid, ajuns in fafa codonului 3, este gala sa accepts ARNt purtdtor al aminoacidului 3 (Fig. V.2). Aceastd 210

alunecare a ribozomului pe ARNm, cu toate evenimentele ce o inso{esc, poartS numele de transiocare. Etapa de translocate este catalizat# de o translocazS §i presupune hidroliza unei molecule de GTP. Ca §i in etapa anterioard procesui este conditional de existenja unor factor! de elongare. Procesui de elongare este un proces repetitiv, care se deruleaz& absolut analog la formarea urmdtoarelor legdturi peptidice. 211

Pozitia P

Pozitia A

Pozitia P

Pozitia A

Fig. V. 2a - Etapa 2 a elong3rii. 212 PozitiaP ' Pozitia A hi I C=0 k'1-'

Fig. V.2b - Etapa 3 a elongMi. IV. Terminarea sintezei lanftilui polipeptidic Procesul de elongare se opre§te cdnd ribozomul intalneste unul dintre codonii non sens care semnalizeaza terminarea lanfului polipeptidic. Pe unii ARNm existd doi codoni non sens succesivi sau separap prin 5 codoni, probabil pentru a reduce riscul citirii in continuare a mesajului genetic in cazul unei mutafii care schimbd un codon non sens cu unul sens. La ace§ti codopi, ajun§i in faja locusului aminoacid, nu se mai poate lega.nici un ARNt, intrucat nici o secvenjd anticodon nu corespunde acestora. In acest moment intervin divert factori de eliberare care efectueazd urmdtoarele operafii: -desfacerea hidroliticd a legdturii polipeptid-ARNt, cu elibexarea polipeptidul ui, sub acfiunea peptidil trans ferazei ,,transformatdu de factorii de eliberare (FE) in hidrolazd; - eliberarea ARNt, purtdtor al ulti- mului aminoacid, din locusul peptid; -disocierea ribozoinului in subunitdjile respective, apte sd inceapd sinteza

unui nou lanj polipeptidic; -degradarea ARNm care a servit ca matrix pentru bio- sinteza unei proteine, atunci cdnd sinteza acesteia nu mai este necesard (Fig. V.3.) Biosinteza proteinelor este, a§a cum s-a ardiat, un proces de mare complexitate cai'e presu- pune §i uiiA con sum energetic substantial Intradevdr, la for- mai'ea unei legdturi peptidice se consumd patru legdturi macro- ergice, doud in etapa de activare a aminoacizilor (ca ATP) §i doud in etapa de elongare (ca GTP). Cele 29 kcal investite in fonnarea unei legdturi peptidice care elibereazd la hidroliza numai 5 kcal, asigutd ireversibililatea procesului §i, desigur, fidelitatea sa. Fig. V.3 - Terminarea lanjului proteic.

214 Biosinteza proteinelor decurge cu o vitezd impresionantd (un lanj polipepiidic de 100 de aminoacizi este edificat de cdtre un ribozom de Escherichia coll in numai 5 secunde). Pentru a~§i adecva fondul de proteine necesit&Jilor extrem de variable, impose de fluctuafiile de media, procariotele cupleazd procesu! de transcriere cu cel de traducere; pe m&surd

ce ARN polimeraza ADN-dependentd sintetizeazd ARNm ribozomii efectueazd traducerea acestuia. Biosinteza proteinelor la eucariote decurge printr-un mecanism similar cu cel propriu procariotelor; aparatul de sintezd a proteinelor din Escherichia coli poate sd utilizeze ARNia objinut de la organismele superioare §i sd sintetizeze proteine perfect funcjionale. Exisfa §i uneie particularity in desfd§urarea biosintezei proteinelor la eucariote, cum ar fi: -aminoacidul initiator nu este N-formil metionina, ci metionina; - pe molecula de ARNm- existd un singur semnal de inijiere a traducerii, reprezentat, a§a cum s-a mai ardtat, de 7-metil guanozind legatd printr-o legdturd trifosfat de o succesiune de nucleotide mediate, urinate de ccxlonul AUG (Fig. IV.40). Sinteza proteinelor la eucariote incepe cu citirea codonului AUG situat in proximitatea capdtului 5’ terminal, marcat. Nici unul dintre ceilalji codoni AUG din ARNm nu vor servi drept codoni de inijiere, datoritd exigenjelor de legare ale ribozomului. Ribozomul eucariot mai are un atribut: el nu „sareV pesle codonii terminatori (ca cel procariot). Ca urmare, pe un ARNm eucario|v nu se poate sinleliza, intr-o circumstanfa datd, decat un singur ianf polipepiidic, chiar cand transcriptul primar confine infonnajia cu privire la sinteza mai multor lanfuri polipeptidice. - viteza procesului de traducere este mai mare, in cazul eucariotelor. Citirea ARNm de cdtre ribozom cu o vitezd de 40 codoni/sec ar fi total insuficientd pentru eucariote care trebuie sd sintetizeze un intreg arsenal de proteine, dintre care uneie cu masa moleculard foarte mare. Pentru cregterea eficienfei traducerii, mai mulji ribozomi se angajeazd simultan in citirea ARNU1, fiecare dintre ei incepand citirea de la capdtul 5’ tenninal. Evident, intr-un anumit moment, un ribozom va fi purtdtoml unui lanj; polipeptidic mai lung sau mai scurt, funcjie de momentui in care a inceput citirea. Ribozomii cei mai apropiafi de capdtul 5' al ARNm, spre deosebire de cei care au ajuns aproape de capdtul 3' terminal, vor purta un lanf polipeptidic mult mai scurt, avand incd de „descifrat“ o mare porjiune de ARNm. Asocierea mai multor ribozomi, ce Iraduc sincron aceeagi moleculd de ARNm, constituie un poliribozom sau polizom (Fig. V.4.) Se pare cd §i procariotele recurg la formarea polizomilor. tots

Fig. V.4 - liustrarea schematics a unui poliribozom. 215 V.3. PRELUCRARI POSTTRADUCERE ALE MOLECULELOR PROTEICE Objinerea unei proteins native, funcfionale, presupune, cel mai adesea, modificarea lanjxslui polipeptidic rezuitat prin traducere. Prelucr!riie posttraducere constau in:

-indepftrtarea enzimatic! de ia cap&tul N-terminal a restului formil din formil- metionin! (la procariote) sau a metioninei (la eucariote), ceea ce explicit faptul c! nu toate proteinele incep cu ace§ti aminoacizi; -modificarea unor aminoacizi in scopul obfinerii celor care nu dispun de cuvinte cod. Hidroxiprolina, hidroxilizina din colagen se ob|in prin hidroxiiarea enzimatic! a prolinei, respecliv lizinei. Cistina se formeaz! prin oxidarea reziduurilor de cistern! y-carboxilarea reziduurilor de acid glutamic din unele proteine, indeosebi a celor implicate in coagulate, genereaz! 7-carboxiglutamat, excelent chelator al calciului. Reacjia este dependent! de vifamina K. - iodurarea reziduurilor de tirozin! ale tireoglobulinei; -atagarea la lanjul polipeptidic a unor grup&ri funcfionale, de exemplu fosfat, pentru formarea fosfoproteineior (fosforilarea reziduurilor de serin! a unor enzime reglatoare. sau a reziduurilor de serin!, treonin!, tirozin! din cazein!), glicozil, pentru formarea glicoproteinelor, biotin!, pentru acetil-CoA carboxiligaza etc, -clivarea unor oligopeptide in cazul unor proteine sintetizate ca precursor! De exemplu, insulina sintetizat! ca preprohormon este convertit! la hormon numai dup! indep!rtarea succesiv! a unor fragmente polipeptidice (vezi insulina). -ADP-ribozilarea (mono- sau poli- ADP-ribozilarea) proteinelor, intalnit! la eucariotele superioai*e, joac! on rol central in procesele de reparare, diferenfiere celulanl, carcinogenez!. Mono ADP-ribozilarea reprezint! 0 modaiitate de acjiune a unor toxine bacteriene printre care toxina difteric! a holerei etc. care igi aleg, inspirat, Jinta printre proteinele implicate in transducjia unor semnale celulare. Sursa de ADP riboz! este NAD+ - S-farnezilarea. O prelucrare posttraducere, recent relevat!, este S-farnezilarea proteinelor. Proeesul se adreseaz!, in special, polipeptidelor sau proteinelor avand la cap!tul carboxi-terminal secvenfa: cistein!-(aminoacid alifa.tic) 2aminoacid C-terminal §i const! in S-farnezilarea restului cisteinil catalizat! de 0 S-farnezil transferaz! (fig. V.5). Proteina-aa (N terminal) 1 Cys-aa-aa-aa ( C terminal) I alifatici SH S - fameziltransferaza * Farnezil PP ► Proteina - aa ( N terminal) 7 1 + PP Cys -aa-aa-aa ( C terminal) I atifatici S - farnezil Fig. V.5 - S - farnezilarea proteinelor 216 Glucoza Giicoiiza T acetiJ CoA

i i. -4-^— mevinoiin V mevalonat . i ! CH3 t I izoperttenil pirofosfat (Cs) ( CHS = C-CH2 ™ CH2 ~0(P)0 (P)) i i geranil pirofosfat ( CiB) i i o0d® farnezil pirofosfat ( C15 ) YN/YN/Y^ / / / / / & \ \ \ \ \ \ X coiesterol farnezilarea proteineior Fig. V.6 - Provenienja metabolica a farnezil pirofosfatului §i utilizarea sa. Donatorul radicalului farnezil este farnezil pirofosfatul, intermediar in biosinteza colesterolului (Fig. V.6). Frecvent, farnezilarea este acompaniat& de metil esterificarea grapSrii carboxi-terminale. Sunt susceptibile la S-famezilare polipeptide §i proteine din clasa proteineior G, GMPC fosfodiesterazele diverselor fesuturi (vezi hormoni) §i alte numeroase proteine corelate cu proceseie de transducjie a unor semnale extracelulare sau implicate in diviziunea celularH Hidrofobia radicalului farnezil ii justified prezenja in proteinele ancorate la membrane iar depistarea lor in citosol sugereaz& c5 proteinele famezilate servesc ca mesageri secunzi ai unor semnale extracelulare, mediate de proteinele G. 217 O intreagS clasS. cie proteine farneziiate este reprezentatft de oncoproleine; inhibitori ai farnezii transferazeJor sunl consiiierafi ca fiind promij&tori in prevenirea maligniz&rii celulare.

S-a demOnstrat cd mevalonatul, intermediar in sinteza farnezii pirofosfatului, este necesar replicSrii ADN in celulele animate. Inhibitori ai sintezei de mevalonat, cum ar fi mevinolinul (utilizat §i in tralamentul hipercoiesterolemiei), inhiba cregterea blocand celulele in faza Gjt Reversarea procesului prin adaos de mevalonat, §i nu de colesterol, demonslreaza cd intermediarul faniezil pirofosfiat, §i nu colesterolul, este responsabil cle cregterea celularSL Conslatarea nu este incompatibilft cu cregterea sintezei de colesterol in celula canceroasS. - acilarea proteinelor cu radical! acil ai acizilor gragi (miristQilare, palmitoilare) este, de asemenea, o modificare posttraducere cu profunde implicajii fiziologice. Orice protein;!, cu o secvenpl anume de aminoacizi, isi dobandegte, ulterior, conformajia nativa, cme ii asigura reaiizarea fuiicjionakl. Inhibitori ai sintezei proteinelor Numeroase antibiotice §i toxine bacteriene se comports ca inhibitori ai procesului de biosintezfl a proteinelor, Inhibarea sintezei proteinelor se poate realiza in orice moment al transferului de informafie ADN-ARNm-proteina (Tabel V.2). Tabetul V.2. inhibitori ai sintezei proteinelor Compusul I Mecanism de acpune Proce su! Mitomicina ! tmpiedica fizic separarea Replic cateneior compiementare de are ADN, Repiic Acidul nalidixic are Inhiba ADN giraza Rifampicina Transc Leaga ARN poiimeraza. riere Actipomicina D Transc Se leaga term la ADN. riere Streptomicina Tradu Interfera cu iegarea formilcere metionii-ARN,*™*1 la locui de inhere. Cloramfenicolu Tradu inhiba peptidil-transferaza l cere Tradu Inhiba iegarea amtnoacil-ARN, la Tetraciclina cere ribozomi. Tradu Inhiba transiocarea prin Segare la Eritromicina cere subunitatea 50 S. Puromicina Tradu Blocheaza elongarea, cere substituindu-se unui amino- acilARNt in situsui A (este analog structural al extre- mitajii 3’ ai tirozil-ARN,) Neomicina, Tradu Erori Tn citirea coduiui genetic Kanamicina cere Toxina difterica Tradu Inhiba translocaza

cere Degi acjiuriea compugilor men|iona|i se manifests, cu precMere, in organismele procariote, unele sunt la fel de active §i in cele eucariote (puromicina, actinomicina D, a-amanitina). 218 VA REGLAREA BIOSINTEZEI PROTEINELOR Mecanismele care regleazd viteza sintezei de proteine.au fost studiate in special in cazul procariotelor. Activitatea acestora depinde foarte mult de mediul in care trdiesc, de fluctuafiile in concentrafia substanfelor nutritive pe care le utilizeazd. Procariotele au abilitatea de a-gi adecva echipamentul enzimatic la natura surselor de azot sau carbon ce li se ofera; ele dispun de doud tipuri de enzime: a. enzime inductibile; b. enzime represibile. a Enzimele inductibile sunt acelea a cdror concentrate depinde de prezenfa sau absenfa din mediu a unui compus denumit inductor. In general, enzimele inductibile sunt implicate in cdi catabolice. In mod normal, cantitatea de enzime inductibile in celule este foarte micd dar ea poate create spectaculos atunci cand apare necesitatea utilizMi substratului enzimei respective, substrat care se comportd ca inductor. Un astfel de exemplu este JLgalaetozidaza, enzimd care catalizeazd hidroliza lactozei gi care este prezenfcd iritr-un numdr minim de exemplare in condijiile in care bacteria are la dispozifie altfe surse de carbon, de preferinfd glucoza, dar care, in condi fiile in care lactoza devine sursa exclusive de carbon, deci de energie, este sintetizatd in rnii de exemplare. Organizatd pe principiul maximei economii, bacteria investegte aminoacizi gi energie pentru sinteza enzimei numai atunci cand aceasta devine imperios necesanl Transferarea bacteriei pe un mediu confinand glucozd determine sistarea sintezei P-galactozidazei. Lactoza se comportd ca inductor al sintezei enzimei ce o catabolizeazd. Utilizarea lactozei presupune participarea a incd doud enzime §i anume: o permeazd, care faciliteazd ti'ansportul (J-galactozidul'ui in interiorul celulei gi o transacetilazd, a cdrei funcfie nu a fost incd precizatd. Lactoza induce sinteza nu numai a galactozidazei ci gi a celorlalte doud enzime. Inducfia prin lactozd este deci coordonatd, referindu-se la toate enzimele implicate in utilizarea sa. b. Enzimele represibile sunt acelea a cdror concentrafie depinde de prezenfa sau absenfa din mediu a unui compus denumit corepresor. In general, enzimele represibile sunt implicate in cdi anabolice. O bacterie care cregte pe un mediu confinand surse de azot gi carbon este aptd sd realizeze sinteza tuturor eeior 20 de aminoacizi. Dacd in mediu se adaugd unui - oricare - dintre acegti aminoacizi, bacteria inceteazd sd producd enzimele implicate in biosinteza aminoacidului respectiv. Aminoacidul addugat produce represia sintezei tuturor enzimelor implicate in biosinteza sa. Represia prin produsui final al unei cdi anabolice este deci o represie coordonatd. Explicarea in termeni molecular! a proceselor de inducfie gi represie enzimaticd se datoreazd lucrdrilor lui Jacob gi Monod. In 1961, acegtia elaboreazd modelul privind reglarea biosintezei proteineior la procariote, reglare ce se efectueazd la nivelul trans- crierii, deci a sintezei ARNm.

Modelul Jacob-Monod de reglare a biosintezei proteineior poartd numele de teoria operonului gi s-a bazat, in principiu, pe studiul regldrii metabolismului lactozei in Escherichia coli. Ei au postulat cd genele structural ce confin informafia cu privire la biosinteza ($-galactozidazei, permeazei gi transacetilazei (desemnate z,y,x) sunt adiacente in genom gi cd viteza sintezei celor trei enzime este guvernatd de un fragment de ADN 219 denumit gen# reglatoare. Pe aceast# gen# reglatoare se edific# un ARNm ce conjine informajia pentru sinteza unei proteine denumit# represor. Acest represor, o protein# alosteric#, se leag# la un fragment de ADN, desemnat drept operator, care este adiacent la genele structurale a c#ror transcriere o controleaz# §i impreun# cu care formeaz# un dperon (operonul lac). Genele structurale ale operonului pot fi transcrise atata tisnp cat operatorul este liber. Legarea represorului la operator blocheaz# accesul ARN polimerazei la locusul promotor avand ca rezultat suprimarea transcrierii genelor structurale interesate in metabolizarea lactozei. Ce se intampl# Tn prezenja lactozei care, a§a cum am v#zut, se comports ca inductor, declan§and sinteza celor trei enzime ce o catabolizeaz#? Jacob §i Monod admit c# inductorul se leag# specific la represorul atagat la operator §i, inducand o Ixanzijie alosteric#, il converted la o conformajie cu afinitate redus# pentru operator; ca urmare, are loc desprinderea acestuia de pe operator. In aceast# situajie, ARN polimeraza se leag# nestanjenit# la locusul promotor, inijiind transcrierea genelor structurale, respectiv sinteza unui ARNm policistronic pe care se vor edifica cele trei enzime ce catabolizeaz# lactoza (Fig. Y.7). Inductorul realizeaz# derepresia operonului §i permite declan §area proceselor de transcriere §i traducere subsecvente. Moleculele de represor liberepot lega §i ele molecule de inductor, ceea ce le converted la forme inapte s# se lege la operator. Abilitatea represorului de-a se lega reversibil §i exclusiv la operator sau inductor este responsahil# atat de represia sis tern ului p-galactozidaz# cat §i de derepresia (inducjia) sa. O Tntrebare pare ineviiabil#: ce se intampl# dac# bacteria (E.coli) dispune simultan de glucozft §>i lactoz#? Se va comporta lactoza ca inductor, impiedicand acjiunea represorului §i deci permijand transcrierea genelor lac §i ulterioara lor traducere? Strategia bacteriei este alta; ea create pe seama glucozei §i numai alunci cand concentrajia acesteia atinge valori minime incepe s# utilizeze lactoza. Metabolizarea simultan# a glucozei, combustibil preferat al E.coli, §x a lactozei sunt excluse; bacteria nu consum# energie pentru sinteza enzimelor operonului lac atata timp cftt dispune de glucoz# (represie prin catabolit). Cum „simte“ bacteria prezenja glucozei in mediu §i cum se comut# activitatea ei pe utilizarea lactozei cand concentrajia glucozei scade? R#spunsul s-a conturat ca urmare a urm#toarelor constatSri: - adenozin monofosfatul ciclic (AMPC), format din ATP sub acjiunea adenilatciclazei §i hidrolizat de fosfodiesteraz#, reprezint# semnalul de foame al bacteriei (“hunger signal"), de lips# a glucozei. AMPC se leag# la o protein# receptoare specific# (proteina receptoare a AMPC = P.R.AMPJ, formand complexul AMPC-PRAMPC, apt s# se lege pe un locus specific din regiunea promotor. Prezenja complexului in acest locus favorizeaz# accesul

§i legarea ARN polimerazei la promotor (locusul promoter se suprapune partial peste locusul operator). - in lipsa glucozei sau la concentrajii mici ale acesteia, concentrajia AMPc este mare; formarea complexelor cu proteina receptoare §i legarea acesteia la promotor permite intrarea ARN-polimerazei la locusul promotor. Dac# lactoza este prezent# in mediu, operatorul este liber §i ARN polimeraza efectueaz# transcrierea genelor lac. (p- galactozidaza, permeaza, transacetilaza) §i deci utilizarea lactozei (Fig. V. 8). Alunci cand concentrajia glucozei este mare, concentrajia AMPc este redus# §i, prin absenja complexului AMPC-P.R.AMPC, ARN polimeraza nu se leag# la promotor §i genele lac nu sunt transcrise fie c# exist# lactoz#, fie c# nu, deci indiferent dac# operatorul este ocupat de represor. 220 GemragZahtare Gene structureie 1 URN J , | ARNm}entrjj { .J AON GKK/\/ KA/MVVA^/W^ Afittm poiigenic Pibozmt j /ftibozomi Proteina represorfc (active) +inductor J3-GdioctozidazS Pmna&zi ProteinSA Prote/ne cnd/ficate Comp/ex /nductorrepresor (inac/ix) Fig. V.7 - ilustrarea mecanismului de reglare a biosintezei proteinelor prin inducjie. 9MZ*ro Promoter Opere/or (te/tfiere 3 •ff/a/Oof c______ A_ A regie, y Prote/nS(~\ recepteare v_y Repreaor A RNpo/imeraza b / ProteinS recepteare X y ARN AMPC po/imeraza Comp/ex , , , represor-inoucror Fig. V.8 - Reglarea operonuiui lac la E.Coli intr-un medlu confinand giucoza (a) sau lactoza (b).


In cazul enzimeior inductibiie, tepresorul este activ in mod normal §i genele structurale sunt represate. Cand in media apai'e inductorul, represorul este inaclivat de c&tre acesta, ceea ce duce la derepresia genelor, deci la sinteza enzimei respective. In cazul enzimeior represibile, represorul este inactiv in mod normal §i genele structurale se exprimil ducand la sinteza unui anumit component celular. Cand in media se acumuleaz# produsul final al cSii anabolice respective, care se comports drept corepresor, represorul este activat prin formarea complexului represor-corepresor, producandu-se represia genelor structurale §i sistarea sintezei enzimeior implicate in sinteza metaboiitului celular terminal. Ipoteza Jacob-Monod §i-a dovedit validitatea in cazul a nenum&rate sisteme enzimatice. Ea a perm is interpretarea acfiunii unor compu§i endosau exogeni (medicamente, hormoni) prin mecanisme de inducjie §i represie enzimaticS, contribuind totodatii la descifrarea unor mecanisme patogene. Pe langd tipul de reglare deserts, bacteriile dispun §i de alte mecanisme de control al biosintezei proteinelor, care ie asigurS supraviefiiirea. La eucariote, reglarea sintezei proteinelor se realizeaza atat la nivelul transcrierii cat §i la nivelul traducerii. Mecanismele reglSrii la eucariote sunt pujin cunoseute. Reglarea la nivelul transcrierii se realizeazS prin aejiunea unor hormoni. Se §tie, de exemplu, c& sinteza unor enzime implicate in gluconeogeneza, cum ar fi: piruvat carboxiligaza, fosfoenolpiruvat carboxikinaza, fructozo-l,6bisfosfataza, este indus& de cortizol. Estrogenii, androgenii, vitamina D i§i exercitS acfiunea asupra fesuturilor fintii declan§and sinteza unor proteine specifice. Prin ce mecanism realizeazd hormonii steroizi induefia? Se considers cS acedia au intrare liberS in celulS unde se leagfi la receptori specific!, citoplasmatici, formand complexe hormon-receptor. Aceste complexe sunt transferate in nucleu unde interaejio- neazS cu cromatina, declan§and sinteza anumitor tipuri ARNm care, prin traducere, genereazS proteine specifice (vezi hormonii). Anumite evenimente care au loc la nivelul genomului pot sa modifice numftrul de exemplare dintr-o proteins datit sau chiar dinlr-un ARN de care celula are nevoie express la un moment dat. Astfel, unele celule cresc numarul de copii, per genom, a unei clase de gene, probabil printr-un proces de inijiere repetatft decurgand in cursul sintezei ADN (ampiificare genicS). Pe de altS parte, gradul de metilare a ADN 1-ar face mai susceptibil sau trial pujin susceptibil la a fi transcris. in general, o genS mai pufin mediate are §anse mult mm man de a se exprima decat una mai mediate. De§i potenfialul genetic este comun pentru diverse Jesuturi, compozifia in proteine a acestora diferri atat cantiiativ cat §i calitativ. in fiecare fesut numai o fraejiune din informajia genetic £ este tradusft sub fortn£ de proteine. Jinand seama de mSrimea genomului eucariot §i de faptul c& nu mai mult decat 10% din acesta este vreodatS 223 transcri's §i apoi exprimat in proteine, se considers cS reglarea transcrierii la eucariote s-ar face mai degrabS prin proteine activatoare ale genelor §i nu prin

proteine represoare. Reglarea la nivelul traducerii poate fi exemplificatS in caznl biosintezei hemoglobinei trpextracte de reticulocite. Adaosul de hem la acestea declanjeazS biosinteza glob'inei; suprimarea aportului de hem sisteazS sinteza. Controlul s-ar exercita asupra unuia dintre factorii de inifiere §i anume factorul de ini{iere-2 (FI-2). Acesta poate trece reversibil dintr-o formS defosfo, activS, intr-o formS fosfo, inactive, AceastS modificare covalentS a FI-2 este realizatS de o proteinkinazS AMPC dependents, enzimS constituitS din dou& subunitSfi reglatoare §i douS subunitSfi catalitice cu activitate kinazicS (C2R2). Sub acjiunea AMPC, proteinkinaza (C2R2) se disociazS cu eliberarea subunitSJilor catalitice active, care fosforileazS FI-2 trecandu-1 in forma fosfo- inactivS. Deosebit de important este faptul cS protein kinaza AMPC dependents este inhibatS de hem. DacS hemul este prezent in probS, proteinkinaza este inactivS §i FI-2 rSrnane in forma defosfoactivS, permifand ini{ierea sintezei globinei. In absenfa hemului, inhibijia proteinkinazei se suprimS §1 ca atare ea va fosforila FI-2 inactivandu-1 deci oprind sinteza globinei. Conversia formelor fosfo- la defosfo- este realizatS de cStre o fosfatazS (Fig. V. 10.) Reglarea biosintezei proteinelor la eucariote presupune §i alte mecanisme, a cSror bazS molecularS este incS neclarificatS. Hem © A MPc + Cg R2 2C + 2 R-AM Pc

ATP AFP FI-2 -defosfo- (acff ) -fosfo- (indch'y) RI-2 FosfdtdTS Fig. V.10 - Reglarea biosintezei globinei prin fosforilare reversibila a Fl2. 224 V.5. LEZIUNI ALE MOLECULELGR DE ADN §X REPARAREA ACESTGRA, MUTAJII Stabilitatea informa{iei genetice inscrisS in molecuia de ADN este .esenfialS pentru organisme in sine §i pentru continuitatea lor in limp. Cum medial in care trSiesc acestea poate fi advers, exists .riscul ca integritatea informajiei genetice s3 fie ameninfatl Vulnerabilitatea moleculei de ADN la factori chimici (agenji aJchilanfi, agenp de intercalare, agenfi de nitrozare, analogi structural!, acizi, cum ar fi acidul azotos, compu§i care prin metabolizare genereazS radical! liberi) §i fizici (radiajii ultraviolete, X) creeazft premiza aparifiei „leziunilor“ ADN. Leziuni ale ADN pot fi introduse §i in cursul replicSrii, dacS acestea au scSpat acjiunii de corector (proof reading) a ADN polimerazei III (mismatch

errors). Leziunile pe care le suferS materialul genetic constau, in principal, din: - schimbarea stMlor tautomere, cu posibilitatea fmperecherii eronate a bazelor, fie in cursul replicSrii, fie prin substituirea unei baze proprii ADN cu un analog structural; astfel, 5 brom-uracilul, analog al timinei, prefers forma enolicS §i nu pe cea cetonicS, pe cam o adopts timina; din acesf motiv 5 brom-uracilul se imperecheazS cu G §1 nu cu Ac Br o — H - ---------- 0

H Forma enolica a 5~Br - uracilului Guanina Consecinfa este inlocuirea perechii A = T cu G s C (tranzijie), - depurinSri; aproximativ 5000 de baze purinice se pierd pe zi prin hidroliza spontanS a legSturii glicozidice; ruperea legaturilor fosfat diesterice; cross-linking al bazelor de pe catene opuse; - dezaminarea spontanS sau sub ac{iunea acidului azolos/cu formarea unor compu§i care fie nu se imperecheazS cu bazele azotate, fie sunt susceptibili la imperecheri eronate.

r

Pan dezaminare citozina conduce ia uracil, guanina la xantiml si adenina la hipoxantina (Fig. V. 11); fiecare dintre ele, nefiind baze proprii ADN, vor fi cu u§urin{& recunoscute §i exclusc de callre enzirnele de reparare (se admitc c3 existenja timirid in loC de uracil In rnolecula ADN §i-ar gdsi astfel justificarea); - dimerizarea timinei, cu formarea unor stmcfuri ciclobutanice in cadrul aceleiaji calene (Fig. V.12); - inserjia uneia sau a mai multor baze suplimentare; se produc inserjii la tratarea unor culturi celulare cu acridinS, molecuid plan# care se poate intercala intre douS baze din tr- un Ian]., fifnl sil se lege covalent. In timpul replicMi, pe catena complementary se insert, corespunzdtor acridinei, o bazS suplimentarS care se leaga covalent. La o replicare ulterioaiti va exista o pereche de baze suplimentara; - delejia uneia sau a mai multor baze; se produc delefii prin hidroiiza unei baze din lang posibild la variajii de pH §i temperature, sau prin acjiunea unor agenji care modified o baza de a§a nalura incat aceasta nu mai este complementary cu nici o altil bazd, Prin replicare, „golur apare pe ambele catene. Aceste leziuni pot fi corectate de mecanismele de reparare pe care le-a imaginat nalura. Gama cxtrem de variatd a leziunilor, rezultand din gre§eii apdrute in cursul replicftrii, ca §i din agresiuni externe a supra moleculei,

implied o mare diversitate a mecanismelor de reparare. H A4/ nw CVZoz/nd | N // i ^ Dezdm/nare O Dezam/fjjre •---------" l A Urati/ O //// /Y Jde/r/rra 0 Nib

VZ

Deza/rw&re /V /V GuavZnZr J/ HZpoxmZini 0 11 l H Xanana Fig. V.11 - Dezaminarea due© ia baze "strain©" ADN 226 Fig. V.12 - Dimeri de timlna. H3C. MC

H ff/boza '‘dft/AQZtf \ V.5.I. REPARAREA PRIN EXCIZIE-RESINTEZA Moiecula de ADN este singura rnacrornolecida care poate' fi reparanl (cu maxim<1 acurate|.e), atrihut. decurgand din redundanfa informajien inlrinsecd slructurii dubiu heiicoidale; ori de cate ori o catenS este lezatS cealaM va servi nu nu'mai la pdstraxea informajiei genelicc, dar §i la repararea catenei lezate. Esenfiale in procesu.1 de reparare sunt detectarea leziunii gi corectarea acesteia. Numerous© enzime (pcste 50) conlucreazS in acestc procese de recunoagtere specified §i reparare, „supraveghind“

continuu moleculeie de ADN. Acpunea sistemului reparator constitute presupune, in esenjfi, urmStoarele etape: - excizia seevenjei alterate; - sinteza unui fragment de ADN corespunzator porfiunii exeizate; - sudarea fragmentelor rezultate. Sislemul de extizie-refacere aejioneazft atat in mutageneza spotanS, cat §i in cea indusft de radiafii sau de agenfi chimici, Vom ilustra aejiunea sistemului de reparare in situafia dezaminSrii uneia dintre hazel© azotate (Fig. V.13). Elim inarea bazelor rezultate se realizeazS sub acfiunea unor glicozidaze specific© care recunosc legtttura glicozidicft purditoare a unei baze alterate. Endonudeaze speciiice recunosc riboza neangajatS in iegStunl glicozidicd §i cliveaz& leg&turiie fosfat diesterice dintr-un fragment de ADN ce delimiteazii „go!ul“ l&sat prin elim inarea bazei. ADN poiimeraza 1 efectueazd, folosind ca matrix catena de ADN „bun£“, o copie a fragmentului de ADN excizat. ADN ligaza ligatureazS fragmented de ADN in prezenja ATP. 227 AJ CG G C T' cjAjr C C G AJ .i I II :ni ■ fAGC C GAG A G G C GA Ci/durd T AT r CCGA r CGGCrC N ____ L rA GCCGAG r/ V AT C G G C TO » T AGCC GAGr A ~~c _ 7” A r c ffff c r * } rAGCCG AGr

fGGcrA Adeni/ AON g/zcozidaze r c c GA r i A GGCTA Nac/eazS CCGA r .. AGGCTA | ADN'flo/merez# / AON-//g#zd

u

A rCG G c r cA

rccGAr

rA G C C ff A G rA GGCrA Fig. V.13 - Repararea unei catena ADN in care a avut ioc dezaminarea

adeninei la hipoxantina Un alt exemplu de acjiune a sistemului constitutiv reparator il reprezintS. excizia dimerilor de timing formaji prin acjiunea radiajiilor UV (Fig. V.14). Defecte in activitatea enzimelor de reparare se traduc printr-o mare sensibilitate la acjiunea radiafiilor UV §i o frecvenjd. crescuta a cancerelor de pieie. imperecherea gre§ita a bazelor in cursul replicSrii (mismatches), scftpata vigilen|ei ADN polimerazei III, este rezolvatS de un sistem de reparare specializat care sesizeaza distorsiunile introduse in dublul helix, discriminand totodata intre catena nou sintetizata (inc& nemetilata specific) §i catena parental! Pe langS sistemul constitutiv de reparare, organismele dispun de un sistem inductibil de reparare, reprezentat de o serie de factori de naturd proteica, a c£ror fidelitate in replicare este numai aproximativa care, din acest motiv, a fost dermmit „sistemul reparator predispus la erori“. Cum el condijioneaza supraviepiirea, f&c&nd posibiia replicarea ADN, chiar dac& prin repar&ri oarecum aproximative, a fost denumit §i sistem SOS. 228 Repararea este realizatft de sisteme enzimatice care pot preceda procesul de replicare sau, dimpotriv8, acfioneazd poslreplicativ. Enzimele reparatorii ce preced replicarea sunt in general enzime constitutive §i pot fi surprinse de replicare in urmdtoarele situajii: ieziunea este complet remediate §i bifurcajia de replicare trece normal; Ieziunea permite trecerea aparatului replicator dar catena in formare rSmane incomplete Ieziunea nereparatit, inc3, nu permite desfSjurarea replic&rii. De menjionat c& sistemul inductibil de reparare este tranzitoriu, incetandu-§i activitatea cand acpunea inductorilor sSi a luat sfSr§it. JSrr"TTi -s' -3f 0 erdom/c/eazaspec/A/ca (^d~aqdoqucfecda)c//^dzd a /agarere resfafd/esfer/cd

3

Dfmera/ de dm/na,, s/ /yac/eoddefe ad/acerre 3swf-exc/zefe c/e o e/?do - $ m/cfeeza s

3'

s'3' AON f/qaza re face /eqa/dra fosfaf if/esfence

,_

s J__L Fig. V.14 - Excizia dimerilor de timina (structuri cidobutanice). 229 V.5.2. REPARAREA PRIN REVERSAREA LEZIUNTLOR Pc langd mecanismele de reparare prin excizie-resinlezd existfi §i posibilitatea d.e reve.rsare a lezkmilor ADN. Astfeh dimerii de timind pot sd reformeze ^nonomerC sub acjiunea luminii. Revcrsarea acestui tip de lezitme se datoreazd aetivMi, sub acjiunea luminii (300-600 nm), a unci fotoliaze (enzima fotomerizantd) care recunoa§le regiunea ADN disiorsionatd de dimer, pe care il cliveazd. Reversarea dircctd este demonstrate gi pent.ru 06-alchiI-guanine forma enolied, rezultate prin acjiunea unor agenji alchilanji asupra guaninei. Procesul este enzimalie §i acceptorul final este lnsd§i enzima-Ofi-alchilguanin-alchil transferaza care se autometiieazd la an reziduu cisteind. Surprinzdtor, enzima, devenitd inactive, nu se regenereazd. Exists dovada efi o activitate 06-aichii transferazied scdzutd este o caracteristicd a ficatului cirolic. Menjinerea OMnetiNguaninei ar fi responsabild de transformarea malignd a celulelor hepatice prin mu tape de tip tranzipe (G-A) §i activarea oncogene! celulare liras (mecanism admis de activare a oncogendor). Cum ciroza hepatied este o elapd In procesul de hepatocarcinogenezd, teoria privind reiajia mutape-cancer are un argument in plus, Leziunile care scapd sistemelor de reparare devin rnutapi (schimbarea permanent^, a seevenjei nucleotidelor intr-o gend reprezintd o mutafie). Mutajiile pot interesa o singurd pereche de baze (mutapi punctiforme) sau un grup de baze, de pe una sau arnbele catene ale unei molecule de ADN, Mutajiile punctiforme surd, rezultatui: 1, substitupei care poate dec urge prin: a) tnmzijie - o pereche de baze este inlocuitd cu alia; o bazd purinied dintr-o eatend este inlocuitd lot cu una purinied, sau o bazd pirimidinied este inlocuitd tot cu una. primidinied. Acidul azotes dezamineazd adenina, a edrei pereche este timina, la hipoxantind care se imperecheazd de preferinjd cu citozina:

V.5.3. MUTAJIT

N citozina hipoxantina 230 b) transversie - o perechede baze este inlocuitd cu alia; o baz& primidinicd dintr-o catena este Inlocuitd eu una porinica, sail una purinicd eu una pmmidinicd. In Fig. V.15 sunt reprezentate diferile mutajii ce pot avea loc prin tranzijie §1 transversie in gena structural#. corespimzand ianjului P al hemoglobinei, avand ea rezultat substituirea aminoacidului valind din pozijia 67 cu alji arninoacizi §i dec! aparifia unor hemoglo- bine anormale. 2.inserfiei. 3.delejiei. Hemogiobina Milwaukee Glutamat Hemogiobina . Bristol Aspartai Hemogiobina A ( Normaia ) Valina Hemogiobina Sydney Aianina GAU «-------------------------------------GUU------------&GCU GAC<--------------------------------------GUC-------r---GAA 4----------------:--------- -----------QUA----------------------► GC4 GAG<------------------------------ ---:— GUG -------------------+ GCG Fig, V.15 - Hemoglobin© anormale rezuitate prin substitute V.6. EXPRIMAREA FENOTIPICA A MUTAjllLOR Modificarea inform ajiei genetice din ADN prin mutajie se exprirnd, datoritd fluxului informational ADN-ARN-proteind, in lnsd§i secvenja aminoacizilor din proteine. Aceste proteine sunt proteine mutante. Mutafiile punctiforme care schimba o singurd bazft dintr- tin triplet prin transversie sau tranzijie pot produce efecte diverse cand se traduc In proteine, La nivelul ARNm mutafia se traduce prin substitujia unui codon cu altul. Acegtia pot fi: a. Cu acela§i sens - dacfi mutafia a inlocuit un codon cu un codon sinonim (degenerarea codului). Proteina rezultatd nu se deosebegte de cea de engine, mutajia produsd este o mutajie mutii (silent mutation). b. Cu ait sens - In cazul in care codonui nou format specified alt aminoacid, O astfel de mutajie punctiforma poate avea un ecou mai mare sau mai inic asupra expresiei fenotipice, funejie de numerogi factor!, cum ar fi:

- calitatea intrinsecd a aminoacizilor „schimbaji“ - diferenja de polaritate intre aminoacidul original* §i cel din proteina mutants, ceea ce duce la modificarea stabilitdjii, respectiv solubilitdfii proteinei; -diferenfa de sarcind electried modified migrarea In efunpul electric §i solubilitatea proteinei respective. Exemplul cel mai eloevent este acela al substitu{iei acidului glutamic din pozijia 6 a ianjului P din hemogiobina A cu valina. Solubilitatea proteinei „mutante“ este mai mied (2%) In stare neoxigenatd, fajd de hemogiobina normaid. Schimbarea sarcinii de suprafatd a proteinei schimbd interaejiunea dintre subunitdji §i face ca ea sd

231 precipite, formand cristale in forma de secer# (sickle), ceea ce confer# acestei proteine anormale denumirea de hemoglobin# S. Hemoliza avansat# care se produce determine ischemic tisularil mai mult sau mai pufin severe. Proteina safer# modific#ri mai mici sau mai mari in funcfie de situarea aminoacidului substituit intr-un loc mai mult sau mai pufin vital pentru structura, respectiv func{ia proteinei. De exemplu, dac# aminoacidul schimbat este integral unei porfiuni de lanf proteic angajat in legarea substratului, este probabil ca repercusiunile s# fie severe, mergand pan# la

abolirea capacit#fii catalitice a proteinei. Un exemplu este cel al hemoglobinei M, in care histidina din pozijia 58 a lanfului alfa sau din pozijia 63 a lanfului beta este mlocuit# cu tirozina. Histidina din pozijiile respective este implicate, a§a cum se gtie, in insugi procesul de legate a 02 (substratul). Ca urmare a substitute!, hemoglobina mutants va lega mai slab 02; mai mult, in aceast# hemoglobin#, Fe2+ este vulnerabil oxid#rii la Fe3+. Methemoglobina format# in timp agraveaz# lipsa oxigenului. ModificSri severe pot suferi proteinele reglatoare prin schimbarea unor aminoacizi din locusul aiosteric sau din regiuni interesate in relafiile interprotomerice ce mediaz# tranzifia aiosteric#. Schimbarea unui aminoacid cu altul intr-o protein# poate s# afecteze legarea acesteia la receptorul s#u specific. In hiperlipoproteinemia familial# tip III (dis-(3-lipoproteinemie — vezi lipide) incapacitatea de legare a apoproteinei E la receptorul ei hepatic este rezultatul substitufiei, in regiunea de legare, a argininei cu cisteina. Cum apoproteina E este esenfial# in introducerea in hepatocit a chilomicronilor §i p-lipoproteinelor remanente, se constat# acumularea acestora in sange, cu aparifia aterosclerozei. Se poate intSmpla'ca un codon sens, ce codific# un aminoacid, s# fie inlocuit cu un codon non sens, terminator. In acest caz, intrucat transcrierea se termin# prematur, se obfin lanfuri proteice incomplete, nefuncjionale, care sunt degradate. Inserf iile §i delefiile conduc la mutajii „in coloaniT (frame shift mutation) atunci cand num#rul de perechi de baze ad&ugate sau scoase dintr-o secvenf# nucleotidic# nu este multiplu de 3. Citirea ARNm corespunz#tor unei gene in care s-au produs astfel de mutafii genereaz# proteine nefuncjionale. Dac# inserfia sau delejia se refer# la un multiplu de trei perechi de baze, proteinei rezuitate ii vor lipsi sau prisosi mai mulfi aminoacizi, ceea ce poate fi grav, mai pufin grav sau foarte grav. V/7. CLONAREA GENELOR ■ V.7.1. CLON/7REA GENELOR IN VIVO (Tehnologia ADN recombinant) Recombinarea genetic# reprezint# un schimb de informafie genetic# intre dou# genoame avand ca rezultat crearea de molecule de ADN recombinat, Schimburile genetice sunt posibile, natural, numai in cadrul acelea§i specii, posibililatea de recombinare constituind insu§i criteriul de definire a unei specii. Recombinarea genetic# Intre specii a ap#rut intotdeauna ca tentant# §i s-a anticipat ca avantajoas#. 232 Experience de inginerie genetic?! (tehnologia ADN recombinant) vizeazft inserfia unor gene de provenienfii animals sau vegetal?! (ADN recombinant) intr-un vector potrivit (o molecula de ADN) §i introducerea intr-un media celular care s2 ii permits replicarea autonomy §i chiar exprimarea fenotipicS. Tehnologia ADN recombinant face apel la letmicile de clonare (a ciona = a face copii identice dintr-o singurS ceiula sau molecula parental?!; se obfine o clonS celularS sau molecular?!). Clonarea ADN presupune objinerea unui mare numilr de copii ale unui anumil fragment de ADN (ideal o genS), prin introducerea acestuia In

complementul genetic al unui organism §i replicare ulterioarli.Obfinerea unor cantMji rnari din fragmentul de ADN izolat §i purificat permite atingerea scopurilor denarii ADN §i anume: 1) studii fundamentale de genetic?! (seevenjializarea §i locaiizarea genei in genom, objinerea de „sonde" pentru depistarea dintr-un amestec a unei anumite seevenje micleotidice, terapie genic?! etc.) 2) studio! expresiei unei gene; proteina codificatS de gen5 nefdcand parte, in general, din reportoriul de proteine al celulei gazdil este posibild alterarea void a proprietdfilor organismului acceptor ca §i objinerea unor microorganisme apte s& sintetizeze gi' sS secrete proteine de uz practic. Introducerea unei molecule de ADN „ca atare“ xntr-o ceiula gazdh comports riscul ineficienjei preluSrii sau degradSrii acesteia. Pentru evitarea acestei eventuality^ se apeleazS la un vector de donate — o molecula ADN, in general, extracromozomial, care indeplinegte dou& proprietSji fundamentale: este invulnerabil la aejiuni distructive §i posed# o origine a replicSrii. V.7.1.1. „Scenariul“ clonarii genelor; objinerea ADN recombinat „Scenariul“ pe care il presupune clonarea parcurge etapele: I. includerea fragmentului de ADN conjinand gena de clonal (ADN recombinant) intr- un vector de clonare, cu formarea unei molecule hibride desemnat# ca moleculS de ADN recombinat; II.introducerea moleculei de ADN recombinat. in ceiula gazdS, in care i se permite s# se replice, urmatS de selectarea celulelor transformate. Gazda cea mai utilizatS este E. coli. Parcurgerea unui mare numSr de cicluri celulare genereaz# o populate de celule conjinand copii multiple ale moleculei de ADN recombinat (o cion#); III.recuperarea ADN recombinat din extractele celulare §i objinerea genei donate. I a) Clonarea unui anumit fragment de ADN presupune identificarea §i objinerea sa in stare purfi din genomui unei celule. AceastS operajie este practicabil# numai pentru genoamele de mici dimensiuni. ADN donor al genei de interes, ca §i ADN vector, sunt clivaji astfel incat: s# se poatS forma exiremitaji monocatenare omoloage, avand posibilitatea de a realiza o sinapsii molecular#. Decisive In implinirea acestei necesit#Ji a fost descoperirea enzimelor de restriejie. Aceste endonudeaze recunosc In molecula de ADN o seevenfa anumit# de baze §i cliveaz# cate o legatur# fosfat diesteric# de pe ambele catene, intr-un loc particular ai seevenjei recunoscute. Situsurile de recunoagtere pentru cele mai multe enzime de restriejie sunt palindroame care prezint# dubl# simetrie rotational#. Un palidrom este definit ca o porjiune de ADN in care seevenfa nudeotididl, cititH pe ambele catene in direejia 5’ 3’, este identic#. 233 Dinire diverse!e tipuri de enzime de resiricfie, tipul II are legitlur& directs cu tehnica ADN recombinant. A fost caracterizat on numSr ibarte mare de enzime de restrief e tip II, avSnd specificitil{i diferite §i provenind dintr-o varietate de bacterii. O selecjie a ceior mai uzuale esle data in tabelul V.3. Uneie enzime de resiricjie „taie“ moieculele de ADN bicalenar decaiat, producand

segmente purtStoare de extremity monocatenare coezive (con{inand nucleotide complementare) ce permit sinapsa fragmentelor aid'd neomoloage. Aslfel, restiictaza Eco R-I, izolata din Escherichia coin recimoasrc secvenja palidromicfi 5' GAATTC 3’ §i taie intre G §i A. Secvenfa de pe cealaltS catena 3’ CTTAAG 5’ va fi taiatd tot intre G §i A. Evident, rezultS. fragmente de ADN cu capete monocatenare eomplementare; Situsurilede recunoa§tere §i clivare ale unor enzime de restricfie Tabelul V.3. Secvenfa Enzima de recunoscuta G Provenienja restricpe indica situsul de metiiare) Eco R i S' GKA'TTCS' Escherichia coil Ry13 Eco R il

^CC'^GG

Mae III Hind II!

GGV‘ C

Hpa II

cV'GG

Pst 1

CTGCA^G .

Taq i Bam H 1

T*CGA' G'kaATCC

A^AGCTT

Escherichia coll Ry245 Haemophilus aegyptius Haemophilus influenzae Rd Haemophilus parainfluenzas Providencia stuartii 164 Thermus aquatieus , Bacillus amyloiiquefadens H

4 5’ — G — A — A— T — T — C — 3’ 5-_C —T—T —A —A—G —5' IT j Eco Rl 1 — G A— A — T — J —C — — C—T — T — A — A G— Alte endonucleaze de restricjie taie ADN bicalenar, formand capete boante (blunt ends), drepte, necoezive. Hpa I, obJinutS din bacteria Haemophilus parainfluenzae, taie aslfel: 5 G -T - — 3 ' — AA C ’ — T— 3 C -A - — ’ — — T G 5 — AT~ - — ’ i Hpa i 5 G -T A A— C ’ — — —3’ ™ T-

T

T

0I

3 C -A 234 P/dSfi7f(f

(§□) AU) Fig. V.16, - Etapeie c\onaru unui fragment de ADN intr-un plasmid. Dactl pe o molecule de ADN exists mai multe situsuri de.recunoa§tere pentru o restrictazd, aceasta va genera mai multe fragmente de ADN. Cu cat secvenfa recunoscut& de enzima de reslricjie este mai lungft cu atat fragmentele de ADN obfinute sunt mai lungi. De exemplu, Eco R I, care recunoa§te o secvenjfl de 6 nucleotide, taie fragmente de 10-20000 nucleotide, care pot sft corespundft la una sau mai multe gene, Fragmentele objinufe prin acfiunea mai muhor enzime de restricfie, adesea unigenice, pot fi separate prin diferite metode. Dac<1 atat ADN donor al unei gene, cat §i plasrnidul vector sunt clivafi de aceea§i restrictazS, de exemplu Eco R I, este posibiD inserpa genei in plasmid prin imperecherea nucleotidelor de la nivelul capetelor coezive (Fig. V.16). O ligazj stabilejte legifturi fosfat diesterice sudand plasrnidul devenit recombinat. 235

fi :;i

Dacd doud molecule de ADN, ce provin de la specii diferite, nu conjin capele coezive, se recurge la adflugarea de secvenje monocatenare complementare la capetele celor doua molecule. Enxima dezoxinucleotidil transferaza, denumitd §i terminal transferaza., are abilitatea de a adduga la capetele 3’-OH ale celor dou& molecule ce trebuie sudate cozi homopolimerice complementare, de exemplu polidezoxicitidina pe o molecule §i polidezoxiguanozina pe cealaldi: 5s 5’

5l 3' 5s 3* terminal transferaza. GGGG CCCG»3s 5f 3! ADN iigaza GGGG-JJYTT' cccc~~±±±±±± 3( De remarcat cd, terminal transferaza nu reclamd o catend ADN matrifd. Alternativ la modalitatea prezentatd, se pot insera direct Tntr-un vector adecval fie ADNC objinut prin revers transcriere, fie o gend sintetizatd chimic. L b) Vectori de clonare. Ca vectori de cionare se utilizeazd: plasmidele, i'agii, cosmidele. Plasmidele sunt., a§a cum s-a ardtat anterior, molecule circulare de ADN dublu catenar, extracromozomial, care se replied independent de cromozom. Ele sunt instrument© ideale ale tehnologiei ADN recombinant, intrucat insumeazd calitdji importante, cum ar fi: - se izoieazd u§or §i rezistd la manipuldri; - sunt'molecule rnici care tree u§or prin membrana celulei gazdd; - se replied autonom §i rapid, independent de cromozom, ceea ce permite amplificarea genei (fragrnentului ADN inclus); - prezinta gene marker care, exprimate fenotipic, le conferd caracteristici ce permit selecfionarea celulelor transformate (cel mai adesea gene de rezistenjd la antibiotice). Plasmidele uzual utilizate pentru cionare au fost modificate in laborator §i conjin in genele de rezistenjd la antibiotice situsuri recunoscute de uncle enzime de restriejie, Un plasmid foarte popular, confecfionat in laborator, pBR322, de aproximativ 4 kb, are doua gene care-i conferd rezistenjd la antibiotice (la ampicilind §i tetraciclind), ambele inciuzand situsuri recunoscute de anumite enzime de restiicjie (Fig. V.17 a), Dacd atat fragmental de clonal, cat §i plasmidul s-au tdiat cu aceea§i enzimd de restriejie, de exemplu Pst I care tale seevenfa CTGCA4G (prezentd in gena care-i conferd rezistenfa la ampicilind), capetele lor complementare se vor lega, constituind plasmidul recombinat - o moleculd himerd (Fig. V7!7.b). Introducerea plasmidelor recombinate in celule bacteriene-gazdd. se face prin procesul numit „transformare‘\ cu objinerea unor celule „transformate" genetic. 236 plasmid p8R322 o,r6-«° endonudeazS de restrictie (pst!) strain O

Fig. V.17 - Clonarea ADN in p.BR3. i

■■■

237

Fagii se ulilizeaza ca vector! alternative intrucat ut.iliza.rea piasnricielor este limitatd la secvenje ADN de lungimi moderate (~ 15 kb), eficienja procesului de transformare scdzand cu cvegterea lungimii fragmentului ADN. Bacteriofagii, virusuri bacteriene, pot clona fragmente de ADN de dimensiuni mult, rnai mad decat plasmidele, generand un imens numdr de copii per celukl Fagul A, cel mai utilizat, are o calitate cared distinge,

aproximativ o freime din genomul sdu nu este esenjiald pentru existenja sa §i, ca aiare, accepts cu ugurinjd ADN strain, de dimensiuni comparabiie, in local fragmentului neesenjiak De menjionat eft fagul A, utilizat ca vector de clonare (fagul „Charon“), es(e prelucrat astfei incat singurul situs recunoscut de Eco R 1, cu care este, in general, tdiat sd se afle in regiunea neesenfiala. Molecuiele de ADN recombinat objinute sunt introduse in cclule bacteriene (E.coli} prin procesul numit „transfeeJie/‘ (infeejie fagied). Cosmidele sunt construcjii artificiale rezullate din asamblarea unor piasmide de dimensiuni mari cu unele secvenje de ADN din bacteriofagul A. Ele accepts fragmente de ADN foarte mari (>45 kb) §i pot fi introduse in E. coli drept cosmide recombinate. Reamintim cd, in toate cazurile, ohjinerea ADN recombinat implied sudarea. ceior douft specii de ADN (ADN de clonal: §i ADN vector) sub aejiunea unor ADN ligaze. Eficienja enzimei este maxima in situajia in care fragmented objinute sub aejiunea unor enzime de restriejie au capete coezive (tentajie naturald de a se uni). II. Odatd create premized clonMi, confecjionarea modcudlor de ADN recombinat, urmeazd introducerea acestora in celule gazdd care devin astfei celule transformate genetic. Aceastd operajie se realizeazft prin permeabilizarea membranelor celulare cu Ci2Ca. Numdrul de celule bacteriene (in general E.coli) care preiau molecule himerft este rnic, ceea ce obligfi la detectarea §i sedetarea exclusiv a acestora. In cazul utilizdrii pBR322 tdiat cu Pst I, existd posibilitatea ca, pe iangd celulele bacteriene care au preluat modcula recombinatd (A), sd existe celule care fie au preluat piasmidul recircularizat inainte de a insera fragmentul ADN de cionat (B), fie n-au preluat nici unul dintre cele doud tipuri de piasmide (C). Se poate discrimina intre cele trei tipuri de celule §i selecta exclusiv cele care au incorporat piasmidul recombinat, Jinand seama de faptul cd acestea §i-au pierdut rezistenfa la arnpicilinri, prin inserarea ADN de cionat in insdgi gena care i-o conferea, pdstrand-o pe cea la tetraciclinSL Dacd celulele sunt crescute pe pldci de agar conjinand tetraeiclind, vor create atat cele din categoria A, cat §i cele din categoria B, care au preluat un plasmid nemodificat (evident, cele din categoria C mor). Preluate ca replica (replica plating), pe agar conjinand atat ampicilind cat §i tetraeiclind vor create numai cele din categoria B (Fig. V.17 b). Compararea ceior doud geluri: agar+tetraciclind §i agar+ampicilind+tetraciclind, precizeazd pozijia coloniilor recombinate, patternul de distribute a coloniilor fiind identic. Bacteriofagii recombinaji se recunosc prin capacitatea lor de a crea „plaje“ de lizd. intr-o culture bacteriand cultivat'd pe pldci de agar. Plajele de lizd conjinand ADN recombinat de interes se identified printr-o tehnied de hibridare in situ (“in situ hibridization“), ce va fi prezenlatd ulterior. III. ADN heterolog se „scoate“ din piasmidul recombinat prin tdierea acestuia cu aceeagi enzimd de restriejie care 1-a general. 238 Bibiioteci genomice Clonarea unui anumit fragment de ADN obfinut in stare purd este prin excelenfd dificild pentru genoamele de mari dimensiuni, cum ar fi cel uman.

Hidroliza, fie §i limitatd, a unui astfel de genom, sub acfiunea enzimelor de restricfie, duce la un numdr imens de fragmente. Modaiitatea cea mai practice de separare a unei gene, in aceastd situafie, este hidroliza intregului genom cu o enzimd de restricfie care recunoa§te §i cliveazS o secvenfd reiativ rard in ADN, urmatd de clonarea tuturor fragmenteior obfinute. Aceastd tehnicd este cunoscutd ca Ushnica pu§ti.i de vdn£toare“ (“shot gun technique"). Colecfia de clone recombinate, confin&nd intreaga informafie geneticd a unui organism constitute o bibliotecS genomicd. Crescute in medii de cuitord adecvate, celuiele confindnd biblioteca clonatd se pot replica §i, adesea, exprima in celula gazda producand proteine. Selectarea (screeningui) unei clone confindnd o gend anume din multitudinea de clone ce constituie biblioteca genomicd se realizeazd printrun proces ce poartd numele de „hibridare in sitii“. Coloniile bacteriene, fiecare confinand un ADN recombinat diferit, sunt transferals din culture originald pe un filtru de nitroceiulozd (sau nylon), care are afinitate mare pentru ADN monoeatenar, Un numdr de celule din fiecare colonie aderd la filtru, obfinandu-se o replied a culturii originale de pe geiul de agar. Filtru! (sau nylonul) se trateazd cu NaOH, care lizeazd celuiele bacteriene. denatured totodatd ADN confinut in acestea. ADN monoeatenar se ieagd form la filtrul de nitroceiulozd (prin scheletul glucidofosforic, sub acfiunea racliajiilor ultraviolets sau a temperaturii) in pozifia clonei din care provine. Filtrul este „tratat“ cu o sondd radioactivd monocatenard pentru gena de interes, spdiat, pentru indepdrtarea sondei in exces, uscat §i autoradiografiat (Fig. V.18). Sonda, hibridizand exclusiv cu gena complementary, permite vizualizarea coloniilor ce o confin. Localizarea pe filtru a sondei legate corespunde localizdrii celulelor conjinand clona de interes din cuitura originals, ceea ce permite recuperarea §i amplificarea acesteia. Ca alternative la sonda radioactive se poate utiliza o sonde asociate unei activit&fi enzimatice,' cu condi fia ca actul catalitic sd se soldeze cu un eveniment perceptibil. Avantajul net al unei biblioteci genomice conste in faptul cd, odatd constituitd, informajia inmagazinatd se pdstreazd, accesul la ea depinzand exclusiv de disponibilitatea unei sonde specifics. Natura unei sonde depinde de informajia pe care o avem despre gena de interes. In situafia in care produsul de traducere a genei de interes nu este caracterizat, se pot folosi ca sonde; ADNC anterior clonat, o gend omoloagd clonatd provenitd din altd specie (pentru genele avand seevenje perfect conservate in cursul evolufiei hibridizarea este mai mult deedt parfiald), ARNm in situajia in care este abundent si u§or de purificat dintr-o celuld. Dacd insd gena cdutatd codified o proteind a carei seevenjd de aminoacizi este cunoscutd, cel pufin partial, existd posibilitatea de a utiliza, ca sonde, oligonucleotide de sintezd obfinute in conformilate cu codui genetic. Jinand seama de o caracteristicd a acestuia — codui genetic este degenerat — devine evident faptul cd ideale sunt proteinele foarte bogate in aminoacizi specificafi de unui (metionind, triptofan) sau cat mai pufini codoni, pentru a reduce ambiguitatea. Din setul.de oligonucleotide sintetizate, folosite casondd mixtd,

239 unul va hibrida perfect cu gena cie interes. Posibilitatea ca un oligonucleotid s& hibrideze, prin hazard, cu secvenfe din alte gene oblige la verificaiea cu un nou set de oligonucleotide sintetizaf conform unei alte secvenje aminoacidice din proteina de interes (Fig, V.19). Biblioteci genomice provenind de la specii animate diferite, donate de preferinfH in bacteriofagi, stau la dispozijia laboratoarelor de genetic*!.

Agar cu colonii bacteriene transformate ■

Replica coloniilor pe niirocelulozci I NaOH + uscare ▼

ADN transferal pe hartie nitroceiulozlca Y' W Asc 'w' radi Asocierea cu proba radioactiva •+■ uscare

Colonii detecta te Film au-to- radiografic Fig, V.18 - Identificarea unei clone conlinand segmentul de ADN dorit. 240 Secvenfe + cunoscute de aminoacizl - Gly Codonipasibiti ($') GGA GGC GGU GGG Leu ~ Pro - 7rp - GIu - 4sp ~ Met - 7?p - P/je U CCA G G AUG U UGG A A UGG

A A C UUC U ccc G G UUU U A A G G U G ecu U A c u e CCG c u u G U G Regfune de degenerare minima Val - Arg - COO ~ Gf/U 4G4 p'J Gu'c 4GG GUlU CGA GI/G CGC 1 GGU ? CGG \ ! Probe sintetice UGG GA* GAfi AUG UGG Uufi GU Fig. V.19 - Detectarea genei unei proteine cu secvenja de aminoacizi cunoscuta. Biblioteci ADNC Pentru genoamele de mari dimensiuni, utilizarea unei biblioteci genomice comports probleme, identificarea unei gene anume fiind o operajiune dificilS. Este motivul pentru care, cel pufin in situafia in care scopul cion&rii este acela de a objine o anume proteins eucariotS, se recurge la o bibliotedl ADNC. Pentru constituirea ei, ARNm matur se separS de celelalte tipuri de ARM celular, mult mai abundente, prin cromatografie de afinitate pe oligodT imobilizat pe coloanS. HibrideazS cu oligodT exclusiv ARNm care sunt purtStorii unei cozi poliA; modiiicarea temperaturii §1 concentra}iei saline per mite eluarea ARNm. Toate moleculele de ARNm dintr-o celula vor servi ca template pentru sinteza unor ADNC monocatenari, sub acjiunea unor revers transcriptaze virale (Pig. V.20). ADNC dublu catenari, formafi pe monocatenele ADN sub acjiunea unei ADN polimeraze modificate, se insert! in vectors de donate care-i vor introduce in celulele gazdd, constituindu-se o biblioteci ADNC. De remarcat cS, pentru un organism dat bibliotecile genomice au acela^i conjinut, indiferent de Jesutu! utilizat ca sursS de ADN, in timp ee confinutul unei biblioteci ADNC exprimS funcjiile specializate ale fiecdrui tip de celulS, refleciate in expresia diferilS a unor gene particulare in diferite |esuturi. Reprezentand toate genele exprimate la un moment dat intr-un |esut dat, numftrul de clone cuprinse intr-o biblioteci ADNC complete este relativ mic in comparajie cu numftrul de clone dintr-o biblioteci genomic# §i deci depistarea unei clone particulare va fi uguratS. O bibliotec# ADNC, reprezentand molecule de ARNm foarte abundente sau mai pujin abundente, este deci mai „tentantS“ decat o biblioteci genomic#. Ea prezintS §i

avantajul posibilitifii unei gene eucariote de a se exprima in gazde procariote intrucat lipsa intronilor nu pune gazdei probiema existence! unui aparat de excizie, ADNC pot, la randul lor, sS serveasc# ca sonde pentru a „pescui“ intro banc# genomic# anumite gene. 241 ARNm 'i \\i y

y; \ ’ ARNm + oligonucleotid sintetic foiosit ca primer

Csnstruirea eatenei complementare de'ADNjpu ajutorufrevers transcriptazei ARNm-ADN hibrid 3' ARNm este degradai Tn mediu alcalin i 3’ TTTTTTTT

Fig. V.20 - Construirea unei biblioteci ADNC folose§te ARNm sintetizat prin revers transcriere. V .7.1.2. Exprimarea fenotipicS a informa$iei ceprtnsa in ADN recombinat Plasmidele hibride, ca §i bacteriofagii hibrizi, reprezint& nu numai o sursS abundent& de ADN heterolog, dar §i o modalitate de a obfine in celula gazd& mari cantit&Ji de proteine specificate de genele inserate. Clonarea operonului triptofan din E. coli, de exemplu, a perm is sinteza celor cinci enzime ce-i corespund, reprezent&nd 40% din proteinele celulare. 242 Utilizarea. unei gazde procariote pentru clonarea unei gene eucariote, avand ca scop final objinerea proteinei corespunz&toare, poate fi ins3 un egec dac£ nu se |ine seama de diferenfele notabile intre transcrierea, traducerea gi controlul celor douS procese la eucariote fa(3 de procariote. Vectorii care permit; transcrierea fragmentelor ADN inserate in bacterii

poartii numele de vector! de expresie gi sunt confecjionaji in vederea acestui scop. Prin tehnicile ingineriei genetice s-au objinut mari cantitSji de insulin^ uman& (humulina), somatostatin;!, hormoni de credere, la un grad de puritate pe care tehnicile de izolare nu-I puteau atinge. Tot prin sintezS bacterianS. s-au objinut, fapt remarcabil, interferoni gi vaccinuri fgrS incovenientele celor clasice. Obfirserea activatorului piasminogenului, utilizat in tratamentul infarctului de miocard, §i a antitripsinei (inhibitor al elastazei), utilizatS in tratarea enfizemului pulmonar, se num&rS printre succesele tehnologiei ADN recombinant. Tehnica clonSrii genelor a rezolvat probleme de terapie medicals, stringent© (tratamentul diabetului insulino-dependent, a nanismuiui hipofizar etc.), a p&rmis modificarea geneticS a unor piante superioare (transfer de gene avand ca rezultat cregterea eficienfei fotosintezei gi a rezistenfei la diferite condijii de media), a produs bacterii specializate in degradarea unor poluanji etc. Amplificarea genelor, prin clonare in bacterii, a permis succese remarcabile in genetics (secvenjializarea genelor, determinarea structurii cromozomilor la eucariote, mecanisme de control in exprimarea genelor). Se anticipeazS utilizarea rezultatelor clonSrii genelor in corectarea unor defecte metabolice innSscute, prin transformarea genetic!! a unor celule somatice. Este de sperat cS manipularea genetic# a microorganismelor va fi practical# exclusiv in serviciul exislenfei, in spiritul celei mai inalte gi inalterabile bioetici. Incapacitatea bacteriei gazdS de a recunoagte elementele de control al sintezei de ARM gi proteine, adSugatS la inexistenja aparatului de exciziecoasere a intronilor, ca gi a celui de prelucrare posttranscriere, proprii eucariotelor, poate fi depSgitS prin utilizarea unor vectori de clonare apji s# foloseasc# gazde eucariote (drojdii, celule animate in culturfi sau in vivo). Printre vectorii de acest tip, cei mai utilizafi sunt vectorii retroviral! modificafi. Simplificand, procesul de clonare a unor vectori retrovirali in celulele animate parcurge etapele: 1) sub acfiunea revers transcriptazei, ARN retroviral genereaz# un ADN dublu catenar, conjinand informajia ARN; 2) o gen^l strain#, cea doriti, se insera in ADN, ob{inandu-se o molecul# de ADN recombinat. Acesta este incapabil s# se replice gi s3 se transcrie, intruc&t introducerea genei pasagere presupune ablajia anterioar# a genelor responsabile de aceste procese (pentru a-i „face loc“ genei str&ine); 3) ADN recombinat este introdus in celule in cultural, in prezen{a, obligatorie, a unui „ virus helper4' ce permile transcrierea sa; ARN viral recombinat rezultat se asambleaz# in particule virale; ■H ■H A" i/i

TA - - : V! :A ^!: i ■. 243 Genom retroviral L e T * n R flag pa! v LTR I ADN LTR » ga< ADN retroviral deveni l recornbinat iRevers transcriplaza transforma genomul ARN 1h ADN dublu helicoidal pol i... ism f Genele virale s&njlhiocuite I' cu o gena straina ADN recornbinat este introdus in celuie Copii ARN viral recornbinat. produse in prezenta unui virus “helper"

Revers Iranscriptaza' si integraza Genom ARN / retroviral cu gene straine Genomul retroviral cu gena straina este integral ?n cromozornul celulei tinta r Particuiele virusuiui recombine! infecieaz^ o celuia tin la

Fig. V.21 - Cionarea in celule animaie a unor vectors retroviraii 4) genomul retroviral, purtStor ail genei supine, este introdus in celuie fintd, unde este reconvertit la ADN recombinat care se -integreazd in genomul gazdd, unde se poate exprima (Fig. V.21). Eficacitatea transferuiui genei trebuie sd fie vcrificata atat la nivelul sintezei ARNra cat §i la cel al sintezei proteinei normals Terapia genicci Terapia genicd — un deziderat care prinde contur — uimdre§te Inlocuirea unei gene defectuoase, exprimate intr-un produs final defectuos, cu o genii normals (terapie de substitute). Un numSr important de lucrSri §tiinJifice recente se refers la utilizarea adenovirusurilor recombinate in tratamentul fibrozei chistice (mucoviscidoza). Tentativa a devenit posibilS prin separarea §i secvenjializarea genei responsabile de producerea acestei maladii, autosomal recesivd, afectand 1/2500 caucazieni, §i care se adreseazS, in principal, sistemului digestiv (in spe(S pancreasului exocrin) §i respirator (secrepe brongicd excesivS cu consecinfa infecfiilor repetate). Este stabilif cS anomalia biologies fundamentals care stS la originea mucoviscidozei este disfuncfia unui canal ionic pentru cloruri, prezent in membrana celulelor epiteiiale, disfuncjie datorate, in majoritatea cazurilor, delefiei unor reziduuri de fenilalanind. Introducerea in epiteliul respirator a genei normale, folosind ca vector un adenovims recombinat caracterizat printr-un tropism particular pentru epiteliul editor respiratorii, a eondus la rezultate incurajaloare. Pe langd vectorii virali, s-a incercaf utilizarea lipozomilor, ca §i a unor compu§i fiziologici avand afinitate crescutd pentru membrana unor celuie | intd (imunoglobuline, transferina etc.) Tehnici recente de terapie genicS ocolesc incovenientele introduse de vectorii retrovirali, recurgand la microinjecjia de ADN (gena) in nucleul unei celuie. Microinjecjia de ADN intr-un ovul de joarece fecundat, care se introduce intr-o fetneld, permite exprimarea genei straine in §oriceii nou ndscuji (animale transgenice). Prin aceastd tehnied, s-a reu§it introducerea genei specificand hormonul de cregtere urn an in ADN cromozomial at §oarecelui, sub controlul unui promotor inductibil. §oarecii proveni{i din embrionii injectaji capdtS dimensiuni fabuloase dacfi in hrana acestora se include inductorul genei pentru hormonul de cre§tere. Animalele transgenice permit evaluarea funcfici celulare a genelor §i a produ§ilor specificafi de de in cursul diferenfierii, in diverse fesuturi. Se sperd, in limitele unui optimism moderat, in tratarea bolilor genetice umane, in mdsura in care defectul genetic este limitat la o singurd genii, mecanismele biologice ce produc boala sunt injelese §i gena normals este

donate. S-a experimentat terapia genied exclusiv pe boli genetice de mare gravitate, cum ar fi o form! de imunodeficienfd severd determinate de deficitul genei specificand adenozindezaminaza. Introducerea genei in celulele maduvei osoase pare se aibe rezultatul scontat. 245

Intr-un viitor, nu tocmai apropiat, pare posibild gi abordarea terapiei cancerului, scontandu~se, inclusiv, pe cionarea genei ee specified factorul de necrozd tumorald (INF). De subliniat cd, in timp ce terapia genicd somaticd (introdueerea materialului genetic in celuiele dipioide ale organelor bolnave) este permisd, terapia genicd germinal d este interzisd prin lege sau prin consensul comunitdjii gtiinjifice internajionale. V.7.2. CLONAREA GENELOR IN VITRO (Reacjia polimerazied in lanj) O aM modalitate de amplificare a unui fragment specific de ADN, de data aceasta o amplificare in vitro, utilizeazd o reacjie enzimaticd. — aceea de polimerizare in lanj a dezoxiribonucleotidelor (polymerase chain reaction = PCR). Tehnica PCR, datoratd lui Kary Mullis (1984), necesitd: 1) molecule sau fragmente de ADN (provenind esenjial din lizate celulare); 2) oligonucleotide primeri (amorse), formate din 20-30 de dezoxiribonucleotide care hibrideazd perfect cu extremitdjile 3’ ale fragmentului de amplificat (in situajia in care secvenfa acestuia se cunoagte) sau cu secvenje ce-1 flancheazd; acestea se pot objine fie prin adaugarea unor fragmente sintetice la capetele fragmentului de analizat, fie prin inserfia fragmentului de amplificat, de secvenjS necunoseutd, intr-un vector de clonare de secvenfd cunoscutd; 3) o ADN polimerazd cataiizand elongarea celor doi primeri. Utilizarea unei enzime termostabile Taq polimeraza - izolatd din Thermos aquaticus organism apt s& tr&iascd. activ la 75~85°C, simplified metoda ce presupune variajii de temperaturd. Enzima s-a dovedit a avea o foarte bund procesivitate - calitate remarcabild pentru o enzimd care edified un polinocleotid; 4) cei patru dezoxiribonucleozid trifosfajL Tehnica in sine reprezinld un ciclu repetabil, constand in: -separarca celor doud catene de ADN prin denaturare termied; - cuplarea primerilor, addugaji in exces, cu seevenjele complementare (annealing); - polimerizarea, respectiv elongarea primerilor in direejia 5’-3\ Operajiile se repetd pand la obfinerea unei cantitdji suficiente de produs. In general, ciclul se reia de 25-30 de ori, seevenja de interes fiind dublatd la fiecare ciclu, derulat pe parcursul catorva minute (Fig. V.22). Dupd cateva ciciuri, produsul major este un fragment de ADN cu o iungime egald cu soma lungimilor celor doi primeri plus segmentul ADN de interes. Atributele evidente ale acestei tehnici sunt: selectivitatea, sensibilitatea, rapiditatea. Fragmente de ADN virtual pure, din genoame complexe, pot fi obfinute pe parcursul catorva ore, in contrast cu sdptdmanile „pretinse“ de cionarea tradijionald.1 Supremajia metodei rezultd §i din cantitatea de material necesar — o singurd moleculd de ADN §i nu milioane, necesare clondrii „standard“; mai mult, tehnica nu presupune un ADN purificat. In plus, pentru amplificarea unui fragment specific de ADN nu este obligatoriu sd se cunoascd seevenja nucleotidicd a segmentului „Jintd“ de ADN.

246 fragment de clonat 5 s3 ' 3* * 5* 5p P1

CATAGGACAGGO

3 s-----------GGACGTATCCTGTCCGATTGCCA 5' 3' 5’ S* - * ciciui 1 3e 3’ * - S’ 5' - * J' * dcfuf 2 * * 3' * S’ Fig. V.22 - Clonarea geneior prin tehnica PCR (P(fP2 = primeri) Specificitatea se asigurd, in spejd, prin alegerea unor primeri (care flancheazd fragmentul de ADN „jintd“) suficient de lungi, astfel incat secvenfa lor s& fie, virtual, unicd in genom. Intrucal interacfiunea prin leg&turi de hidrogen a primerilor cu fragmentul |int& este dependents de temperaturd §i concentrafia salind, amplificafea specified este condijionatd de stabilirea riguroasd a condifiilor de lucru. 247 j", Utilizarea unei polimeraze termostabile permite alegerea unor temperaturi de cuplare !; primer-ADN suficient de mari (92-96°C) pentru.a exclude interacfiuni primer-template i. de joas& specificitate. j Recent, s-a imaginat o strategic de lucru care Iimiteaz3

amplificarea strict la :j fragmental Alaturi de primerii „consaeraff\ se utilizeazi an primer intern. Dup& I' piima rund£ de amplificare, desf3§urat3 in prezenfa ceior trei primeri, se ajusteaz& i temperatura astfel incat sS fie favorizatS cuplarea primer intern — secvenfS finis : (select!vitate infailibild). Tehnica PCR se practice in aparate automate, cu controlul strict al timpului §i temperaturii, permifand amplificarea unui ADN, care nu trebuie s2 fie nici purificat nici „proaspSt“, provenind chiar dintr-o singurS. pic&turS de sange, spermti, saliva sau un singur fir de par. Aplicajiile practice ale tehnicti de clonare in vitro sunt numeroase §i u§or de imaginat; stabilirea diagnosticului prenatal intr-o largd arie de boli genetice, detectarea polimorfis- mului alelic, detectarea infecfiilor virale inainte de aparifia simptomelor sau a unui r&spuns imun manifest, tiierea suspecjilor §i identificarea celui vinovat in medicina legaM. V.7.3. APLICAJII ALE CLONARE GENELOR (Determinarea secvenfei nucleotidelor in oligonucleotide) Clonarea genelor prin metodele descrise anterior-Tehnologia ADN recombinant §i Tehnica PCR — permite objinerea, in cantitSfi suficiente, a unor polinucleotide a cSror secvenfS trebuie determinate Metoda chimica Stability de Maxarn §i Gilbert, metoda, simple §i riguroasii, are ca principiu fragmentarea ADN §i separarea electroforeticS a fragmentelor rezultate, funcfie de m&rimea lor §i independent de natura bazelor, urmata de identificarea acestora. Simplificand, etapele s-ar succeda astfel: 1) se marcheaz& unui dintre capetele ADN clonat cu 32P. 2) se separd -cele doud catene §i se izoleazS populafia omogend, constituit& din aceeagi monocaten&; 3) se utilizeazif patru probe de ADN monocatenar marcat la capital 5’ (de exemplu) gi fiecare se supune unui agent chimic care distruge select!v una dintre cele patru baze. S3 admitem c3 oiigonucleotidul marcat lacap&tul 5’ este: -G*CTCGTCAA~§i c3in proba 1 este degradat3 timina, in a 2-a citozina, in a 3-a guanina gi in ultima adenina Prin distrugerea in proba 1 a timinei, oiigonucleotidul este scindat in fragmente de diferite dimensiuni, care vor avea sau nu capital 5’ marcat. Prin indep&rtarea, tot la intamplare, a citozinei, guaninei, adeninei din probele 2,3,4, se objin seturi de fragmente de dimensiuni diferite (mono, di, tri, tetra-nucleotide). 4) se separ3 electroforetic fragmentele obfinute in fiecare dintre cele patru probe, pe gel de poliacrilamidil Este necesar ca puterea de rezolufie a gelurilor s3 permits separarea, neambigu3, a unor fragmente diferind printr-un singur nucleotid. Impunerea acestui unic criteriu, al

248 lungimii fragmentelor, se realizeazS prin alegerea condifiilor de separare: gelul confine uree (~8M), iar electroforeza se realizeazft ia ~55°C, pentru a elimina orice asociere prin leg&turi de hidrogen a bazelor. 5) se identifies autoradiografic, exclusiv, fragmentele dinspre capStul 5’, care a fost marcat §i se indicS numSrui de nucleotide corespunzStor fiec&uia pin comparaie cu an etalon. Admifand (Fig. V.23) cS in proba 1, In care s-a excizat timina, s-au objinut di- §i pentanucleotide marcate (G*C §i G*CTCG), este evident cS timina reprezintS nucleotidul 3, respectiv 6 din oligonudeotidul analizat Similar, dacS in proba 2, din cane s-a exclus citozina, se objin mono, tri, hexanucleoiide marcate (G*- capStul 5\.G*CT, G*CTCGT) rezuM cS nucleotidele 2, 4 §i 7 din oligonudeotidul de analizat sunt reprezentate de citozinS. RajionSnd similar pentru pattemul objinut in cazul probelor 2 §i 4, rezultS c& oligonu- cleotidul analizat este mononucleotidul GCTCGTCAA. Se poate conchide cd seevenja nucleotidelor din orice ADN poate fi stability direct pe gelul autoradiografiat, citindu-1 de jos in sus. OPdonuc/eotid de ane/iratBaza exc/zeta: G*CTCG TCAA T [A1, G A GC <3C, ACT G*crc GlCTCGTC ■*CTC6T ■ G CTCGTCA

Start

Start

Start

Start

Start nendocr /eof/d. GtrCuJ ocbiJ7W 'CA c/eof/d\ GVrcG te0rc/Se rc odo1 GlAPPI texemc/ L eot/d G*CTC penfaMc G /eobb G*crc tetrenuc /eotid G*cr_ Mrwcfeo t/d od/ecpo G*C /id . .G*_ mormuc /ec/i{j\ 1 Proba / ~Proba2 Probe J Probe 4 Probe de eta/orare Fig. V.23 - Determinarea seevenjei nucleotidelor dupa tehnica Maxam §i Gilbert 249 De menfionat c&> tn fapt, degradarea chimica afecteaz2 ambele baze purinice (atat A, cat §i G) ca §i ambele baze pirimidinice (atat C, cat §i T) in m&surS diferM, funcfie de condifii. Problema se rezolva cu acurateje, folosind probe cuplate; G §i G+A, C §i C+T. Modificand condijiile de lucru, de exempli] in cadrul cupluiui G/G+A, Intr-o probS se distruge, prin excelenje, G, in timp ce in cea de-a doua se distrug §i se elibereazS. (prin ruperea legdturilor fosfat diesterice), la viteze comparabile, atat G, cat §i A. Reziduurile A se pot identifica comparand pe electroforez& pozifiile G cu cele G+A; similar penirn cuplul G/C+T (Fig. V.24). Intrucat nucleolidul 5' terminal nu poate fi identificat (se distruge) §i o verificare a secvenjei catenei ADN in studiu este necesarft, se recurge la secvenjializarea paralel&a catenei complementare, dupS marcarea acesteia cu 32P. Metoda enzimadcd O modalitate alternative de determinare a secvenjei ADN clonat este metoda Sanger. Spre deosebire de metoda Maxam §i Gilbert, care este o metoda ehimicS, aceaste tehnicft este o metoda enzimaticS; ea igi propune s2 determine secvenja catenei complementare cu cea de analizat, avand ca principiu intreruperea controlata a sintezei acesteia prin incoiporarea unor analog! structural ai dezoxiribonucleozid trifosfajilor proprii structuiii ADN, Sinteza in vitro a catenei ADN complementare presupune prezenja: 1) monocatenei ADN de secvenjializat, utilizate ca matrije (template) §i care provine, in general, dintr-un fragment de restricfie. 2) unui primer complement^' cu o mica por- Jiune de la capital 3’ a!

catenei de replicat, care se marcheaza cu 32P« Acesta se ohjine cu u§urinje finand seam a de faptul ca fragmentele de restricjie sunt flancate de secvenje cunoscute. 3) ADN polimerazei 1 din care s-a exclus regiunea cu activitate 5’-3’ exonucleazic#, rezul- tand „fragmentul KlenowA 4) celor palm T dezoxinucleozid trifosfaji: dATP, dCTP, dGTP, dTTP, dintre care cel pujin unul este marcat (ca alternative la marcarea primerului). 5) mici cantiteji din cei patru T-V didezoxinu- cleozid trifosfaji: ddATP, ddCTP, ddGTP, ddTTP, ca analog! structural] ai T dezoxinucleozid trifosfajilor. Este u§or de imaginat cd absenja grupei -OH din ddNTP face imposibilS continuarea sintezei ADN in momenta] in care unul dintre ace§tia ca§tige in competijia cu dNTP dictat de matrije. Sinteza ADN poate fi deci intrerupte, prematur §i intampldtor, la oriaire dintre reziduurile nucleotidice. A+GG C4

smi ................SBB3C G§ • ..... p t^aSSBSS TT ****** T - AG .1 ■• ■ i ***'*&*&: t r ?>• c '• A A 'X'fpfy l T : cA AA

Fig. V.24 - Autoradiografie de control 250 Experiments se realizeazS in'patru probe distinct© care diferd intre ele, exclusiv, prin natura ddNTP utiiizat. Fiecare proM va confine fragmente de ADN de dimensiuni diferite avand la cap&tul 3’ acel ddNTP, ap&rut prin hazard, ori de cate ori ADN polimeraza 11-a incorporat in locul unui dNTP. Cele patru seturi de fragmente objinute in fiecare 'dintre cele patru probe se supun, dupd separarea fragmentelor nou sintetizate de catenele template, electroforezei in gel de poliacrilamidd sau agarozd §i se identified prin autoradiografiere (Fig. V.25). Secvenfa se cite§te, ca §i in tehnica Maxam Gilbert, pe imaginea autoradiografied a gelului, de jos in sus, pe direefia 5’3’. Pentru a evita iradierea §1 a simplifica stocarea, marcarea cu 32P, care permite vizualizarea fragmentelor ADN de diferite m&rimi, a fost inlocuM fie

cu legarea covaientd ia primerul nucleotidic a unui compus fluorescent, diferit pentru fiecare dintre cele patru probe, fie cu ata§area la un anumit ddNTP a unei molecule care prezintd fluorescent la o anumihi lungime de unda. In cel de-al doilea caz, reunirea celor patru probe, dopd efectuarea replicilrii, urmatd de electroforeza amestecului, duce la aparijia Matrifa', 3' Primer: 5 - CCGGTAGCAACT - GG 3‘

GGCCA GGCCATCGTTGA GGC GGCC GGCCATC GGCCATCG GGCCATCGTTG dATP dCTP dGTP dTTP + ddTTP GGCCAT GGCCATCGT GGCCATCGTT

3‘ N SecventS complementary > modelului ADN Fig. V.25 - Secvenfializarea ADN prin metoda Sanger (seevenja nucieotidelor se cite§te direct pe electroforegrama).

251 a numeroase benzi electroforetice, fiecare cu un spectru de fluorescent caracteristic cap&tului s&u 3’ terminal, a c£ror succesiune indicii succesiunea nucleotidelor In catena ADN (Fig. V.26). Sistemui de detecjie a fluorescenjei este automatizat §i permite secvenjializarea unor fragmente de ADN (de peste 500 de perechi de baze), intr-un ritm de -10000 perechi de baze/zh Secvenfa complete a peste 1000 gene, printre care cele codific&nd insulin^, interferoni, citocromi, hemoglobin^, interleukine, a fost stability. Secvenfializarea complete a genomului E.coli este iminentS, iar cea a

genomului uman pare sa aparjM unui viilor apropiat, prin aportul decisiv al lui Fred Sanger, dublu laureat Nobel (pentru secvenjializarea proteinelor in 1958 §i pentru secvenjializarea acizilor nucleic! in 1980). Utilizarea tehnicilor de amplificare a ADN permite stabilirea hazel moleculare a boiilor genetice (peste 3000), objinerea de sonde necesare diverselor tipuri de hibridizare, evaluarea producer unei gene (ARNm, proteine). Secvenjializarea ARN se face, cel mai adesea, dupS sinteza ADNC, catalizatS de revers transcriptazd §i recurge la ambele tehni.ci descrise pentru ADN.

Lungimea oligonucleotidului Fig. V.26. - Detecpa prin fluorescent a tragmenteior oiigonucleotidice objinute prin metoda didezoxi 252 Acizi nucSeici antisens Tehnicile de eionare permit, in cazul folosirii unor vector! de expresie, sinteza unor ARN antisens, respectiv a ARN avand succesiunea nucleo tidic& (T=U) a catenei necodificatoare. Acest ARN este, desigur, complementar cu ARNm, a c&rei succesiune nucIeotidicS corespunde catenei codificatoare. Un ARN antisens poate fi rezultatul clonarii unei gene care este introdusd in vectorul de expresie in aval fata de promotor, intr-o orientare invetsS, care-i schimte polaritatea. Transfecfia vectorului de expresie recombinat in celula parental^ permite sinteza unui ARN antisens, celula dispunand astfel de ambele categorii de ARN (antisens §i mesager). Hibridand perfect cu ARNin, un ARN antisens va bloca traducerea ceiui dintai, intrucat form area hibridului nu numai c& mascheazd situsul de legare la ribozomi, f&cand mesajul inoperant, dar create §i susceptibilitatea la hidroliz# a ARNm. Utilitatea producerii acizilor nucleici antisens este, in primul rand, terapeuticd; posibiiitatea de biocare a sintezei unei proteine virale cu eventual potential oncogen este dintre cele mai tentante,

in cele din urmft, tehnoiogia ARN antisens poate aduce contribufii teoretice importante privind funcfia unei proteine specifice unei celule, care a fost represatS selectiv in celula data. Sinteza, in vitro, a ARN antisens a fost: inspirat& de descoperirea sintezei in vivo a acestui tip de ARN, la procariote. Rolul acestuia in controlul expresiei genelor este stabilit atat in ce prive§te transcrierea, cat §i traducerea sau modificSrile posttraducere. S-au detectat ARN antisens care se adreseazfi ARNm specificand dihidrofolat reductaz- timidilat sintaza, secvenje ARN complementar ARNm pentru proteina P53, ca §i ARN antisens pentru proteinele bazice din mielind. Tehnica de transfer Southern Identificarea unui fragment de ADN cu o anumM secvenjd se poate face prin tehnica de transfer pus& la panel de c&lre Ed. Southern. Etapele parcurse sunt: 1) separarea fragmentelor de dimensiuni variabile, rezultate prin aejiunea enzimelor de restriefie asupra ADN genomic, prin electroforezft in gel de agarozS (pentru fragmente de lungimi relativ mail ~20 Kb); 2) gelul, confinand fragmentele de ADN separate, este imersat intr-o solufie de NaOH 0,5N, care produce denaturarea acestuia, §i apoi neutralizat; 3) ADN monocatenar rezultat este transferal de pe gelul fragil pe un filtru de nitrocelulozd sau nylon, care are calitatea de a fixa ferm monocatenele ADN. Acest 253 transfer (the blot transfer technique sau Southern blot), se renlizeazd prin eapila- ritate la forjd ionicft mare; gelul acoperit cu filtrul de nitrocelulozd, peste care se adaugd un „teancu de hartii absorbante, este plasat pe o hfutie, de asemenea absorbante, imer- satd intr-o solujie salind concentrate. Bar- tiile absorbante „trag“ solujia din gel odatd cu ADN; pentru rapiditate, se lucreazd sub vacuum. ADN eluat din gel se fixeazd pe nitrocelulozd, ca replied exacts, a acestuia. Monocatenele ADN, legate la nitrocelulozd exact in pozijia in care se aflau pe gel, sunt fixate prin iradiere in ultraviolet sau prin cregterea temperaturii (~80°C); 4) se incubeazd replica nitrocelulozicd cu o sondd 32 radioactivd ( P), de asemenea, monocatenard, in condijii care favorizeazd hibridizarea; 5) se indepdrteazd, prin spdlare, excesul de sondd radioactivd gi se realizeazd prin autoradiografiere, pozijia heteroduplexurilor. Revelarea unui fragment de interes se poate face gi utilizand o' enzimd a edrei aejiune se soldeazd cu o modificare vizi- bild; 6) se compard pattern ul de hibridizare cu gelul original gi se definesc secvenfele ADN de interes (Fig. V.27). . Aceastd tehnied ingenious^, permijand detectarea unui fragment de ADN cu o anume seevenja, poate pune in evidenja numdrul de copii in care se gdsegte o gend in ADN genomic al unui fesut, posibilele altenlri ale materialului genetic, exprimate in polimorfismul lungimii fragmentelor de restriejie. Hibridizarea acizilor nucleici, imobilizaji pe membrane solide, se praetied §i in cazul 254

rrty> cJip** • v

^ Q£

Fig. V.27 - Tehnica de transfer Southern. deteciarii moleculelor de ADN recombinat. in coloniile bacteriene (sau plajele de liza produse de bacteriofagi), duph transferul lor din mediul de culturil Metoda de transfer a ADN de pe geluri pe membrane nitrocelulozice a fost extinsh §i la ARN, fiind denumitS, colocvial, drept tehnica de transfer Northern, facandu-se astfel sugestia analogiei conceptuaJe cu tehnica Southern. Practic, analogia nu este perfects intrucat ARN nu se leagS la filtrul de nifroceluloza in condifiile in care o face ADN §i, in plus, este susceptibil la hidrolizS alcalina; imobilizarea pe filtru nitrocelulozic este posibilS numai dacS electroforeza in gel de agarozS se efectueazft in condijii de denaturare (incluzand in gelul de agarozh formaldehida, de exemplu) c*ire previne adoptarea unor struciuri secundare. Transferul unor proteine, separate electroforetic, de pe geluri de poIiacrilamid& pe nitrocelulozfi, i§i propune identificarea imunochimicS a uneia dintre ele, in spe{S, prin utilizarea unor anticorpi specific!. Tehnica de transfer a proteinelor a fost. denumitS, cu umor, tehnica Western. Utilizarea tehnicii de transfer Southern in depistarea polimorfismului

fragmentelor de restrictie Cromozomii umani homoiogi, ca §i segmente ADN homoloage de ia indivizi diferiji, prezinth diferenfe (mo§tenite) in secvenja nucleotidelor. Acestea apar cu o frecvenjh de unu la cateva sute de perechi de baze (~ de 107 ori/genom) §i constau in delefii, inserfii ample sau numai in mutaiii punctiforme; modificfrile nu se traduc prin boaM in situajia in care sunt prezente in regiuni necodificatoare sau se produc in regiuni ale unor gene neesenjiale funcjiei acestora (variafii genetice). O mutaiie in secvenjele nucleotidice cuprinzand situsuri specifice pentru acjiunea unei anumite enzime de reslricfie poate* avea ca rezultat abolirea unora dintre ele, fapt ce se reflects in dimensiunile diferite ale fragmentelor de ADN rezuitate prin hidroiiza, Este u§or de imaginat reciproca — o mutajie intr-o secvenja nucleotidica poate crea un situs suplimentar de recunoa$tere pentru o anume enzinia de restricjie. O diferenfa mo§tenita in patternul de restriefie este desemnatS drept „polimorfismu3 fragmentelor de restricjie" (RFLP=restriction fragment length polimorfism); ea s~a dovedit extrem de utilS diagnosticului, cand polimorfismul este intragenic §i deficitul functional intr-o boahl creditors nu este cunoscut. Separarea prin electroforeza, pe criteriul lungimii fragmentelor de restricjie, urmatd de aplicarea tehnicii de transfer Southern, pennite evidenfierea polimorfismului prin utilizarea unei sonde anume. Detectand RFLP, tehnica Southern este deja o tehnica de rutind in depistarea §i screeningul bolilor genetice umane, utilizandu-se §i in diagnostical prenatal al acestora, alftiuri de alte tehnici, cum ar fi: hibridizarea imperfecta, secvenfializarea genomica etc. 255 1,15Kb t Ii B. 5' 1,35 Kb

heterozigot normal heterozigot Fig. V.28 - Utilizarea polimorfismului fragmentelor de restric|ie in depistarea prenatala a anemiei falciforme 256 Vom ilustra utilitatea acestei tehnici in cazul anemiei falciforme, datorat&, a§a com se §tie, unei mutajii punctiforme (A substitute T in catena matrij£) in codonul specificand cel de-al gaselea aminoacid.de la capfttul aminoterminal al globinei, soldafii co inlocuirea glutamatului cu valina. Enzima de reslricfie Mst II, care recunoagte §i taie secvenja CCTGAGG din catena codificatoare normals, nu mai recunoa§te secvenfa modificatS. CCTGTGG, abolindu-se astfel un situs de restricjie —CCTGTGG mutafie — — ~~ —CCVGAGG — -----------J* GGACACC —GGACTjCC — — in gena normals pentru [I globind (A), digestia cu Mst II produce fragmente de 1150, respectiv 200 de perechi de baze, in timp ce in gena anormalft (B) rezuM un singur fragment de 1350 perechi de baze. T&ierea cu Mst II §i utilizarea unei sonde corespunzand genei pentru p globing permite sS se distingii intre indivizii normali, homo §i heterozigoji Pentru stabilirea diagnosticului prenatal la un copil provenit din p2rin{i heterozigoji, probe de ADN fetal (din lichidul amniotic) §i parental, taiate cu Mst H, sunt analizate prin tehnica de transfer Southern. Admijand c3 fetiisul prezintd un pattern de restricjie din care lipsegte fragmentul de 1350 baze, existent la arnbii pSrinJi, se poate conchide c& acesta nu a mojtenit boala de la p3rinjii s3i heterozigoji §i niei nu este purtittor al acesteia (Fig. V.28). De remarcat c&, din numfunl mare de gene sau fragmente ADN extragenic donate, un procent semnificativ (peste 40%) prezintS, cel pujin, unul sau mai multe RFLP. Este stabilit c3 num3rul de secvenje repetitive, in tandem, intre dou& situsuri de recunoa§tere pentru o enzimh de restricjie, variaz& de la cromozom la cromozom, de la individ la individ (cu o transmitere strict mendelianS). Acest tip de polimorfism face ca cei mai mulp indivizi sft genereze un numiSr diferit de fragmente, de mftrimi diferite, pentru fiecare membru al unei perechi de cromozomi. Utilizarea unei sonde (sau §i mai bine a mai multora) care recunoagte

unele secvenje de ADN necodificatoare, intragenice, relevit pattemul diferit al benzilor electroforetice. Medicina legalS se serve^te de acest poliforfism in selectarea vinovatului din totalul de suspecfi. Folosind ca enzim& de restricjie Hinf I pentru digestia unui ADN provenit dintr-o pat& de sange gSsitii la locul crimei, c&t §i a ADN provenit, s& zicem, de la trei suspecji, se objin prin tehnica de transfer Southern „amprentele ADN“ diferite pentru fiecare dintre cei trei indivizi. Dacd unul dinlre patternurile corespunzand suspecjilor se suprapune pe pattemul de restricjie al ADN din pata de sange, identitatea vinovatului prinde contur (Fig. V.29 a). Poliforfismul fragmentelor de restricjie intergenice tran§eaz&, chiar, §i in disputele de paternitate (Fig. V.29 b). 257 N> LA 00

CAP. VI. ENERGETICA BIQCHIMICA VI. 1. ASPECTE GENERALE

Existenja organismelor vii este condi jionatS de on consum insemnat §i continuu de energie. Celula, unisatea de bazS a acestor organisme, este, din punct de vedere termodinamic, un sistem foarte pufin stabil; numai un consum permanent de energie ii permite sS-§i menfinS ordinea complexS a structur'd side fragile §i sS-§i indeplineascS funcjiile specializate. Studiul aprofundat al desiS§urSriI proceselor energetice in lumea vie, cu contrubu|ia esenfialS a biochimiei, a condos la douS concluzii majore: a) conceptele $i principiile termodinamicii clasice isi pSstreazS...ya].abi]i| atea^icaz; b) toat£ameeMe_.ac.estDr Diocese au o baza moleciilaril.^ Radiajia solarS constituie sursa primarS de energie pentru toate organismele vii; dupS modal in care o recepjioneazS dar §i in funcjie de forma sub care preiau carbonul, principalul element din constitufia lor, se disting: -grjanisme^aiitofro^ cuprinzSnd lumea vegetala §i o serie de microorganisme; ele utilizeazS drept sursS de carbon CQ?,„ din care, sub acjiunea radia|iei solare, prin procesul num.it fotosintezS, Igi construiesc moleculele organice complexc prin intermedin! glucozei. Procesul este redat prin ecuafia general^1: hv 6C02 + 6H20 ——C6Hl206 P 602 In afarS de autotrofele fotosintetizatoare exists §i .autotrofe ce utilizeazS energia rezultatS din joxidarea anaerobS a unor subsfraturi anorganice (H2S, NH3 etc.) pentru sintezS de compu§i organic!; ~~~ -organismele h^rofrofe, cuprinzand lumea animals, i§i procurS prin hranS compusji cqrnpl^gi (reprezentaji de glucide, lipide §i proteine) sintetizafi de autotrofe sau de alte heterotrofe. Degradarea acestor compu^i pieluafi din exterior, dar §i a celor proprii, constituifi ca rezerve, la compu§i simpli este insoptS de elibemre masivS de energie. Aceste degradSarL reprezintS catabolismul compusilor respective Majoritatea cSilor catabolice implies particioarea oxigenului molecular iar produgii final! ai for sunt-C^igi Hgb^iEnergia eliberatS in procesele catabolice este utilizatS. pentru sinteza de compQ§i organici diver§i, ceea ce reprezintS anabqbsmuL dar §i pentm sus{inerea a numeroase alte process consumatoare de energie cum sunt ceje mgcanice (contracfia muscularS), electrice (potentate membranare) §i altele. Intrucat organismele autotrofe utilizeazS in procesul de fotosintezS C02 §i H20, adicS exact compugii pe care heterotrofele ii elibereazS in cursul degradSrii aerobe (oxigenul necesar acestor degradSri fiind objinut tot in procesul folosintezei), cele douS tipuri de i Intrucat fotosinteza este proprie iumii vegetale gi unor microorganisme, studiul acestui proces depS§e§te cadrul unei car£i de biochimie medicals. Procesul este tratat m orice carte de biochimie general! 259

Fig. VL1 - Dependent organismelor vii de radiajia solara §i interdependent© organism© autotrofe-organisme heterotrof© organisme se..inten^diftqiieaz{i (sintrofia), in Fig. VI. I se reckl schematizal acest aspect ca §i dependent© tuturor organismelor vii de radiafia solarS. FSrd cunoagterea aspectelor esen{iale ale energeticii chimice 2 care sunt prezentate in continuare, injelegerea aprofundatH a metabolismelor glucidic, lipidic §i proteic no este posibil& VI,2. SISTEME TERMODINAMICE. FUNCJH DE STARE. PRINCIPIILE TERMODINAMICIL Termodinamica, in oricare domeniu se aplicS, studiazft procesele energetice caracteris- tice.ale sistemelor: ea are in vedere numai sterile energetice initial^ si final ft, decTnu ia in considerare niei drumul parcurs nici timpul scurs la trecerea de la o stare la alta. Sistemul este definit ca o parte a universului, separata real sau imaginar de mediul inconjur&tor; acesta din urmft reprezintS restul universului. Sistemul e-sfeiiicfaisdacaintre ei si mediul inconiunitor nu se schimbfl materie (dar poate avea loc schimh de energie). Dac&sistej^ mediuljiici materie nici energie, el se numeqte izoiat,. 2 Deseori, tn locul denumirii "energetics chimicS" se utilizeaza termenul "bioenergeticS". 260 / In lurnea vie sistemul poatej^reprezentat de un organism intreg, un jesut^o culture de celuie, o^eiuM, o secventa de reacjii dintr-o cale metabolied. etc. Sistemele ^oiogice sunt sisteme cfeschise. ele fund traversate de flipcuo -de materif ..jr^nergre, Ca oricare ait sistem, un sistem via se poate afia in mat multe stdri. O anuniitd^stare a sisteryiu^i este caracterizatd prin y^^bine definite ale unor rQ|rim^^i^iJgcuni sunt pmsiunea, iium^fl de mpli etc., cai*e se numesc fiipfijiide^tare^ Cand sistemul trece de ia o stare la alta, o parte sau toate funcfiile de stare care il caracterizeazd i§i schimbd. valoarea; cum a mai fost menfionat, drumul parcurs de sistem .intre cele douS stUri poate fi oricare, ceea ce conteazd este ca funcfiile de stare sd ajungd ia nolle valori. Acest espect este deosebit de important pentru energetica biochimicd §i este ilustrat in continuare printr-un exemplu: giucoza poate fi ti'ansformatd in CO^gi H^O, in doud moduli:

prin oxidare energicd in bomba, calorimetricft C6H5A + 602 ■ 6C02 + 6H20 ^ in vivo, prin intermediul unei lungi seccesiuni de reacjii dintre care unde de oxidare: 6CO? + 6H?0 unde I{, I3, I3 sunt intermediari. Sjarea finalda sistemuiui este aceeagi indiferent cd^O^Jgi^Oobjinut prin prima sau a doua transformare (dacd condi fiile in care se afld cei doi produji sunt identice). In timp ce prima transformare nu are nici-o importanfd pentru orgamsmele vii, cea de a doua este esenjiald a§a cum va reie§i in continuai'e din acest. capitol §i din capitolul de metabolism glucidic. Faptulinsd c;iin ^trej^azuri sepbtine.ac,eiasi..cao.tiMed.eenergies Legile termodinamicii sunt relajiile, formulate adeseori matematic, intre funcfiile de stare. La baza tuturor acestor legi stau doud principii, adevdruri incontestable reie§ite din nenumdrate obsrvafii ale fenomenelor naturale, precum §i din experienje. Principiul I este principiul conservdrii £nerdei: formulat ia modal foarte general el precizeazS ca El prevede posibililatea transformarii unei forme de energie in altele, fiind formulat §i astfel: ■ Principiul II, numit §i principiul evolufiei, stabilfeste sensul in care au loc transfor- m&ile tnsotite de schimbfri de enereiZHtatueaza cd sau, in alfi termeni c2 „orice PmsfonniasJfe^^^^^ toare crejgtaikia^^^ hi id-5' ra W U 111 ill ' O;; in'1 Ub 261 VI.3 SISTEMELE VII SUNT CARACTERIZATE CEL MAI BINE PRIN ENERGIA LIBERA Faptul ca principiile §i conceptele termodinamicii ciasice au valabiiitate §i pentru procesele energetice din sistemele vii nu inseamnd §i cd mdrimile (parametri de stare) care au mare valoare pentru caracterizarea unor sisteme din domeniul tehnic de exemplu (termodinamica dasicd s-a dezvoltat in legdtura cu funcjionarea motoarelor termice), i§i pdstreaza aceia§i valoare §i pentru caracterizarea energeticd a diferitelor sldri ale sistemelor vii. Astfei, in (imp ce trecerea intre doud stSri energetice care se realizeazd. in cursul functionary unei masini termice este caracterizatd prin variatia entropiei (AS) si ent^lp|gf.IAHjr la trecerea .de la o stare la...alJiLiLjjnui ststem vm variatia lor (care, evment, are loc) este dificil sau chiarjrnposibil de determinate? T7S3TS Vi\ in schimb, varia|ia energiei libjere/notatH AG) care matematic

reprezinfd diferenja intre variatia entalpieT§i produsui variapa eTiTfopiei x T (temperatura absolute) (AG-AH —T-AS) s-a dpvediUniirim.ea ideald deoarece: a) reprez^p. conform definijiei termodinamice, »acea On, menjinerea ddnstantd a acestor parametrii caracterizeazd sistemele vii, in special organismele superioare; b) in cmsu^evolupei reacjiilor^chjimcc(pot Ipobimutc e^mai pujind ^ihcultate deoarece sunt cordate eu,mdnmij;nuH mapujor dc determmat. Se face menfmnea cd, pentru sistemele vii, in ecuafia prezentatii mai fnainte AH este deseog inlocurf cujndumea AE deoaiece, dm motive caie {in de specificul Iransfornvdrilor in aceste sisteme, AH ® AE; deer. Din aceastd ultimft ecuajie rezultd cd ter

ef p-ct ■ l transformdri care are loc la pe langd componenta capabila sa efectueze travaku ° ■ • —.............................................. (deci o mi§care ordonata), exista obligatoriu . o component#;(T. AS) care reprezintd o formlTde inferioard. In opozipe cip energia liberd, acestei pdr{i din energia total'll i se spune „energie jegatdA VI.4 VARIATIA ENERGIEI LIBERE . iN REACTIILE CHIMICE §1 BIOCHIMICE Aproape toate transformarile care au loc in organismele vii sunt, sau au la hazd, reaejii chimice; de aceea in bioenergetied intereseazd in mod deosebit AG a*acestor reaejii. Respectdnd conventia de semne di.n termodinamidL reacjiile chimice pot fi impdrfite dupftjvatoai&^^ Variapa de entropie se masoarS cu suficienta precizie doar m cazul sistemelor reprezentate de elemente chimice §i molecule mici. 262 gyjjj ««*# ^ASi4fereacfie m

*^^5SsEtia»iaSEifioM“; dQsWguiarca dc la stiiiga.la dicapt^i, cncrgic __ A .. c) reacjia ejrieJas^Mfem. ea no evolueazS spontan in mci un sens. Majoritatea reacfiilor chimice care au loc in organismele vii fac parte din ,,g§;| ^ BfilitaMee*' care constau din secvenfe de reacfii; evident, fiecSreia dintre acestea ii corespunde o variafie a energies Iibere: AG, ->• B AG9

G AG« DAG, E Fiind o ener|k U^gr|jge AGtota, = AG, 4- AG2 4- AG3 4- AG4 .... Dacfi AGtPtal < 6' calea melaboljcS e§lc exergonic# intr-o astfel de'cale obUgatqritf ca fiec&re. reacpe individuals s$ ajbS AG<0? pentru unele reacjii aceasta putted fi pozitivS. Condijia esle ca sum AG ppgative *4 fi$ mi decat surra AG po/itive. CSil^exergompQ sppt ccle dtgmdatiYP (catabqlice)^ c3i endefgonice; evident, in cazul acestqra^suma AG Poziiivqreste1. maiJojacejuLSSme absolute decat £pma AJ3 negative. In sintezS, modui in care organismele vii he.terotr.ofe i§i asigurft energia. este: moleculelg organise cqmplf xq (glupidq, Ijiplde1, ptptqne) preluate din hranS sunt d(egpadate pe chi carc^ai|.AGtotai pegaijve; energy libuS este utiljuatS pentru proqesde anabolice §i pen tip npmqrgasepTtp jiioccse. Pnn mtennediul moleculelor complexe din hranS (dar §i a unor molecule simple) organismele heterotrofe i§i asigurd totodatd elementele §i compu§ii chimici pe care le vor utiliza pentru sinteza de compu§i specifici. Numai 0 parte din energia totals a moleculelor organice complexe este utilizatS a§a cum numai 0 parte din de sunt folosite pentru sinteze proprii, restul fiind retumat mediului; in aceasta constS caracterul deschis ai acestor sisteme. Transferal energiei iibere care se produce in cursul degradSrilor c&tre procesele consumatoare se face in organismele vii intr-un mod cu total aparte. VI.4.1. YAR1AJIA ENERGIEI LIBERE §1 CONSTANTA DE ECHILIBRU; ENERGIA LIBERA DE REACJIE STANDARD Cunoa§terea variapei energiei iibere in reacpile chimice este posibiia prin faptul c3 aceasta estelegaffdeln^i'iml relativ usor misurabilefconstanta de echilibru §i - in cazul reacjiilor de pxido-reducere - potenpalul icdpx. Dac& energia liberd exprim& tendinja reacpei de a atinge echilibrul (AG ~ 0), se injelege ciS AG va fi cu atat mai mare cu cat, in starea inipald, reacfia este mai departe 4 A se face distincjia intre reacjii ,,exergon^ce-endergonice,, 51 reacjii "exoterme-endoterme". Reac|iile sunt exergonice sau endergonice dupa valoarea lui AG §i exotenne sau endoterme dupa valoarea lui AH (variapa caldurii). 263 de echilibrul ei; dec! trebuie sS existe o relafie a AG cu concentrafia reactanjilor §i a producer de reaefie. Pentru reaefia generals A + B ^ C + D aceastd relafie este:

undej^^te cppstaina^g^aexal^a gazelor _(l,98^ca|rmo|;!K^), T,~,temperalui;a absolute la care se desf3goar& reactia, [A]%

§L4J^^ccygj^.u4ra|iile^^reactantilar §i ale produgilor iar AG o constants niuiuta Menergi£jib,ef$ dp reaefie standard'4. Pentru a defini pe AG° se consider^ [A] - [B] - [C] = [D] - lM;-atunci [C] [D]/[A] [B] = 0 §i AG = AG°. Deci Jinand seama c3 la echilibru AG = 0 §i inlocuind pe [C] [D]/[A] [B] cu K^, se obfine: 0 ™ AG° + RT in Kech AG° = - RT in Kech Deci se poate calcula vaioarea lui AG° dacS se determine valoarea Kech. In practice, plecand de la concentrafiile de 1 M a fiecSrui reactant §i produs de reaefie se las3 reaefia s3 se desf3§oare panS la atingerea echilibrului (stare stafionarS); atunci se determine nolle concentrafii ale lui A, B, C §i D. Valorile lui AG° sunt: 0f

ML Pentru a respecta in intregime condifiile in care se desf3§oarft reaefiile in organismele vii, in locul valorii AG° care corespunde pH-ului imprimat de reactivi §i produ^i se utilizeazS valoarea corectat#5 pentru pH ~ 7 notatS AG°\ Pentru un numSr foarte mare de reaefii care au loc in lumea vie aceste corecfii sunt cunoscute (se dau in tabele). Valorile AG°’ pentru diverse tipuri de reaefii sunt date in Tabelul VI. I. Se impune injelegerea corectii a semnificafiilor iui AG0’ §i AG; AG0’ |indicS sppsuJLdgL, djesf3surare a reactiei in cpndi|.ii standard fingfogiv pH-ul = 7) §i este o constants, in limp ce AG^esTte '“variatia energiei1mweTn’ condifiile speo^^ in cardan loc reaefiile in organismul viu (concentrafii diferite de 1 M a reactanfilor §i produgilor de reaefie, pH diferit de 7, eventual T diferit de 298°K). Ideal ar fi ca pentru fiecare reaefie s& se poatfi calcula AG care red3 starea energetics reals in sistemul biologic; acest Iucru este posibil in ultima vreme pentru reaefii care au loc in a§a numitele >.sisteme aceiulare44. Pentru celelalte este utilize tS valoarea AG°\ care, in majoritatea cazurilor, red& suficient de corect tendinfa de evolufie a sistemului. . 5 Cu rare excepjii, pH-ul m |esuturi p'recum §i al umorilor din organismul uman este in jurul valorii de 7. 264 VL4.2. YARIAJIA ENERGIEI LIBERE IN REACJIILE DE OXIDG-REDUCERE. POTENTIALUL REDOX §I LEGATURA LUI CU ENERGIA LIBERA Datele din Tabeiul VI. 1 evidenfiazft c& AG0' in reacfiile de oxidate a gJucozei §i a acizilor gra§i la C02 §i H20 au valori negative foarte man. Aceste valori au fost objinute pe glucozS §i acid palmitic care s-au oxidat in bomba calorimetric! Dar, a§a cum s-a ar&tat mai inainte, acelea§i valori ale AG°’ totale se obfin §i prin oxidarea treptatft la C02 §1 H20 a celor doi compu§i in vivo. In faptul cd aceste valori negative ale AG0’ sunt foarte ridicate rezidS explicafia c£ oxidarea glucidelor §i a lipidelor in organismele vii este resDonsabM de producerea celei mai mari p&rfi a energiei. Tabeiul VI.l Valoriie AG0’ pentru c&teva reacjii care au Soc fn organismele vis AG01 Tipul reacfiei Reacfia kealimol Oxidare Acid palmitic 4-2302 -> 16 C02 - 2 338,0

-f 16 H20 Oxidare Glucoza -f 602 6C02 + 6H2G - 686,0 Hidroliza Zaharoza 4- H20 -> Glucoza + - 5,5 ■ Fructoza Hidroliza ATP -f H20 ADP + P, . - 7,3 Glucozo-6-P 4- H20 Glucoza + Hidroliza P* - 3,3 Izomerizare Glucozo-l-P -4 Glucoza-6-P - 1,7 Eliminare Acid malic Acid fumarie + H20 - 0,88 Condensare Acid glutamic + NH3 ' ' ' -t-3,4 ' Condensare Glutamina + H20 Glicina + - -i- 2,2 Glicina —» Glicilglicina 4- H20 In cazul reacjiilor de oxido-reducere AG°’ se poate calcula din relajia care Ieag& aceast! m&rime de variajia potenpalului redox standard coiectat pentru pH = 7, notatft AE* unde n este nuir |r AG0' = - n * F » AE; ^ it_cMaiLsm*acf in reactie i ecliiyaffifful SSMW’W—... . . . - --- t Valoarea lui se obfine mftsurand pe Ec (Fig. VI.2) care este potenpalul redox standard al sistemului de oxido-reducere la pH = 0 §i adaug&nd -0,421 vol{i cat reprezintA potenjialul redox al unui eiectrod de hidrogen in care [H+] = I O'7 ioni/iitru fa$ de electrodul normal de hidrogen. Fig, VL2 - Determinarea potentiaiului redox standard (E0) ai unui sistem de oxido- reducere. Electrodul normal de hidrogen consta dintr-o placa de platina platinata cufundata mtr-o soluble de acid tare de concentrajie 1M in care se sufla un- curent de H2 la presiune de 1atm. Reacts. de oxidoreducere care are loc este H2 ** 2H+ •+■ 2e\ Potenjialui redox ai acestui eiectrod este, prin canven|ie, zero. In celula de masurare concentrate formei oxidate §i a celei reduse sunt de tM.

Tub cu so buffi s&bi/robjo'e KCl Ce/ubs cfe /ndsi/rsre

H2

cbecbrodub flocwsb cbebrbdruffe/7 265 Valorile pent.ru o serie de reacjii redox impoitante In biochimie se dau in Tabelul VL2, Tabelul VI.2 Valorise Ef0 ale unor slsteme redox (determinate la temperature fntre 25 30°C Reacfia de electrod Ef0 voi-l'i - 0,421

2H+ + 2e‘ **H2 a -cetoglutarat + C02 + 2H+ + 2e' ** 2 Izocitrat - 0,380 NAD+ + 2H+ + 2e' ** NADH + FP ■ - 0,320 + + NADP* + 2H + 2e ** NA.DPH + H - 0,324 Piravat + 2H+ + 2e' ** Lactat - 0,185 + Oxaloacetat + 2H + 2e* ** malat - 0,166 Fumarat + 2H+ + 2e* * snccinat - 0,031 2 cit. c(ox) 2e* 2 cit. c(red) + 0,254 2 cit. a3(ox) 2e' - 2 cit. a3(red) + 0,385 + 1/2 03 + 2H + 2e- ** H,C> + 0,816 In afara posibilitdfilor ce le oferil pentru calcuiul lui AG°\ valorile potenfialelor redox standard sunt utile §i in stabilirea sensului de curgere a electronilor in sisteme conjinand mai multe cupluri de oxidoreducere (vezi „Lanjul respirator**); ca §i in cazul lui AG°\ valoarea informational^ a lui E’ este limitata la condipile standard. Potenjialul redox al unui sistem care nu se ail! in condijii standard se calculeazS cu ajutorul relajiei: E R-T in [Ox] TT TRidJ unde R, T n §i F sunt constantele intalnite §\ anterior, [Ox] §i (Reel) reprezentand concentrajiile formei oxidate, respectiv reduse. VI.5. CUPLAREA REACJIILOR ENDERGGNICE CU CELE EXERGONICE; INTERMEDIARY ENERGETIC. COMUN Organismele vii utilizeazS in permanents mari cantitati de energie atat pentru sintea ^ eat §i pentru sustinerea unor nrocese_cum sunt contractia muscular:! excitatia, transportul activ si altele. Toate aceste procese sunt sustinute defreactiile exergoniceaEliberarea de energie prin aceste reaejii se face chiar la locul desfdsurSrii processor consumatoare

§i numai in limitele necesaruiui. Este evident c& transferul energiei libere rezultatS din reaejiile exrgonice c&tre aceste procese, toate avand o bazS molecular:!, trebuie sd se realizeze cu 266 mare eficienp. La ogcMHgmglejm^^ ca acest transfer s 3J&£22kl£S daa4MM0«Slflillfiatoa eper^ MwA a uueia, cai^e^ggtM’#. este^^g«». Sunt cunoscute douS variante de cuplaj: ^atolgoaisi- Acest cuplaj nu este strict" specific lumii vii, el fiind fntalnit §1 in chimia organic^ sau cea anorganic^. Un exemplu .din aceste domenii este cuplareareacpei |de.p hidrolizd a anhidridei acetice cu sinteza acetatului de et.il din^acicLacetic si alcool etilicr CH3— c = o \ o + H2O CH3 — c = o ->* 2CH3 — COOH; AG01 = -21,8 Kca^md CH3 — COOH + C2H5 — OH ^ CH3 — COOC2H5; 3 AG0 = + 4,7 Kcaf/rrd CH3 — C = O \ O + C2H5 — OH ----------CH3 — COOC2H5 + CHa — COOH; ■ AG01 - -17,1 KcaVmd CH,-~ C = 0 In acest caz, scMfpimljle energie lihedL se re'alizeazft prin iiip^riped^ a carui asi ura Isfaff’ § MMEusl&yuu^’ In organismele vii opereazd numeroase reacpi cuplate in acest mod. Ele sunt, de reguia, exemplu xl oferS douS JjLmusduL reactii succesive care fac parte din calea ilicim glucozo-1-fosfat ---------------------------------------- ► glucozo-6-fosiat §i glucozo6-fosfat ----->*■ fructozo-6-fosfat: glucozo-1-fosfat Fosfoglucomutaza d AG0’ = -1,74 kcal/mol glucozo-6-fosfat Glucozofosfatizomeraza J, AQo, = +0i40 kcal/mol fructozo-6-fosfat Pe ansambiu: AG01 = -1,74 + 0,40 = -1,34 kcal/mol (izomerizarea glucozo-6-fosfat ** fructozo-64osfat). 267 b) cupiarea...r^ti^j endergon^^ prin jQggggjjg'comun“ (Fig. VL3); inteimodiaxul mf.np este reprezentat de fapt de doi comniisi dinfre care unul este neenemeiizat (D §i al doilea enerrizat Ix). Cci doi ccmpu§i sunt Iglgrgpnvextibili pnsi(jfbsoib[ie-ced^'a de.e,nergie libera, MecamsmuLacestui cuplaj, care ;gjgij|hcre dc *a reacjiile exergonice ale cdilor degradative ale proteinelor cStre cele mai diverse reacpi consumatoare de energie, este

prezentat in continuare. VI.6. LEGATURILE MACROERGICE. SISTEMUL ATP/ADP, PRINCIPALLY INTERMEDIAR ENERGETIC COMUN (COMPUS MACROERGIC) Starile F §i I ale intermediarului energetic comun nu au nici o legiUurS cu stdrile excitatS, - neexcitatd ale atomiior §i moleculelor, st8ri convertibile prin absorbjie-emisie de cuante de energie. F reprezintd un compus care are „leg3turi macroergice66 in timp ce I este produsul reactiei de hidrolizfl a lui P; dupfl caz, cl nu arc snu mai arc Tnc£ o leg&turd macroergicS. Deoarece sistemul format din. ATP.(acidul adenozintrifosfpric), corespunz&tor lui §i APEwtoai degrabd ADP.+. P,), corespunzStor lul l, constituie intennediarul energetic comun al majori&Jii cuplajelor, se prezintd mecanismul funcjiondrii acestuia. ATP-ul ca §i alfi compugi care au legaturi maciocrgice sunt dcnumiji curent „compu§i macrocrgieii? de§i cored este sS fie denumiji „comp,u§L(cu IcgSturi macrocrgiqe". In catena ATP, care cuprinde trci resluri de acid fosforic* sunt doui legSturi macroergice, notate NH.

OH OH Cele doua legaturi macroergice din ATP 268 Fig. VI.3 “ Cuplarea reaci;ii!or endergorvice cu cele exergonice prin intermediar cornun

Scindarea hidroIiUcA a ATP~(redat in forma ionizatA a§a cum se aflA el in solufie sau in mediul biologic), poate avea loc in douAmoduli: la ADP^P^respecliv la AMP + PPi% 0 "t>-~ P - O- P~ 0- P- 0™ Adenozina* H20 0” O" I

0“ o o OH l O- P~ 0~ P~ O- Adenozina + o= P—0” O'” 0” O" AG°‘« -7,3 Koal/moi O o "0— P- 0- Adenozina* 0- P ~0— P—0 i I I 0~ 0~ 0“ AG0' = -7,3 Kcal/moi In fiecare dintre cejp douA. seindari se rape o legAturA,, macroergicfl iar AG 0> este de -13 kcal/moi: aceastfi valoare s-a luat in bioenergeticS drept referintA in sensul-cS legAtun macrocvgicc sunt considerate acelea care prin scindare hidroliticA dibeareazA cel pujin a tala energie. ■ ^ v ; , „ Teoretic, legAtura macroergicA rAmasAtn ADP s-ar puteasclmia hidroUiic ^iar,.elibera tot -7,3 kal/moL |R vavo, o ARCmenca jecpe nu r^rc loc dm bpsa enzirpei corespuozAtoarc. In schimb, legAturn macroergicA dm acidol piroiosfonc este scindatA hidrolilic extrern de..rapid, In celuie existSnd energia care se ellbereazA este chiar ceva mai mare decat -13 kcal/moi. O 0 HO — P — O — P — OH + H20 - -2H3P04 ; AG01 - - 8 kcai/moi ii. OH OH 269 % % pioo*Q$*ttr Cea de a Pe de altd parte, in celule ^ nici nu existd enxinie care sd asigure aceastd scindMeuAG0’ pentru aceastd scindare a fost totu§i mdsuratd. ..e£e.ctuindu-se in vitro hidroliza:tAMP* AMP + H20 —---------->* Adenozina + H3P04 ; AG0’ ~ -3,4 kca!/mol Existd mai multe explicajii in legdtnrd cu valoarea negative ridicatd a AQ C' in corsul hidrolizei legdtuniar,. P~0 din ATP ,§i dm pirofostat;., - in pnmul mnd, Of9tmW£& ATP, la^H-^are^miu^arcjninog^.tsitt aciduj^ fosforjp; - in al doilea rand, atat in ATP cat §1 in pirofoslat legdturile cu caracter macroergjp sunt de ,tip,-anhidnda (unesc doud res tun acide). S^ihtatea acizilor care rezultd prin hidrohza este mult, supenoard celei a anhidndelor, acizu exTstand mezojnere^ un al treilea aspect este legat de rolul ionilor defMg^;un celule, atat ATP cat §i ADP^ §i P| sunt complexafi cu ace§ti ioni: sejie&ping mai puternic decat cele trei dm AJDP, respectiv cele cloud dm ^mdndloare lippjfWa® 000

0o -0—P-0--P-O—P — O — Adenozina “0 — P-0 — P — P — Adenozin a 0“ O" O’ 0~ 0~ Mg2+ MgATP2" Mg2+ 0 II MgADP" HO — P — 0“ 1 | 0“--- Mg2* MgHP04 a Deoarece £&-8fl JW0i wa&J&SU&Q*_ = 2 4IJV 3.B.10 ), reagiaJ^jTu^droliza In cele mai multe dintre cazurile cfmd ATPTumizeazd energie, el se scindeazd la ADP §i Pr Scindarea ATP_ la 4MP + PP^ urmatd de scmdarea rapldd a acestuia din urmd la 2P; este intalmtd mai rar, ea este insd avantajoasd dm punct de vedere energetic (AG0,lora] = -15,3 kcal/moi); aceastd scindare a ATP se realizeazd cand reacfia endergonicd cuplatd necesitd mai mult de 7,3 kcal/ipol. Cele doud variante se exemplified prin feacjiile: 270 I. Activarea glucozei co'nstSnd in fosforilarea ei la glucozQ-6-fogfat6; intruc&t reacfia necesi^maT^^n^S^Ts kcal/mol, este CH2 — OH CH2 — O — P03H2

2. Activarea acizilor gi;agj, constfmd in trecerea. lor in derived acil-CoA, necesitd mai mult cle 7,3 kcal/mol (pentru formarea ieg^turii macroergice C~S); ATP se scindeazd in acest caz la AMP -f PPj? pirofosfatul scindandu-se rapid ia 2P,: O tiokinaza # B — COOB 4- ATP + CoA - 3H------>*■ R - C ~ SCoA + AMP + PPf pirofcsfataza pp, + H20 - - -->*■ 2 Ps Consumul de ATP in organism este permanent; daei$ acesta este Inegal in limp pen tip anumite procese ula^>, pentru allele este practic constant, (qctivitatea sistem^lpp de aceea el trebuie s2t se resintetizeze tot timpul, aspect ce va fi prezentat in continuare. Se tac acum dear precizarile: in timp ce ADP..+ P, reformeazA ATP (in cotulipile care vor fi precizate), din AMP §i PPJ nu este posibilft o resintezd directs in muschi se poate realiza • o sintezft indirect# datoritd nrezenjej aici a enzimei adenilatkinaza: adenitatkinaza AMP + ATP •T:=r——2ADP Din 4e£U^aISfe®

YI.7. ALJI COMPU§I MACROERGICI. POTENJIALUL DE TRANSFER A GRUPARII FOSFAT Celelaite nucleotide trifosforilate, cu ribozfl sau dezoxiribozd, servesc in anumite siluajii drept compu§i macroergiciAstfebm^ este utilizat, in met^bqlismulii^ glucidic. la sinteza UDP-glucozei care particip# la biosinteza 6 Reacfia aceasta, ca multc al(e fosforitSri, are loc in doi timpi: hidroliza ATP la ADP +• P{ §i reacfia P; cu glucoza.

:■ . r * ;; ■ A '! 271 ■;V ••

CTP activeaz a SUSMMisi A unii compel lipidici in timp ce la sinteza proteinelor parti cipS atat ATP. c&t §i CUffi. In procesele de biosin teziS ale acizilor nucleici nucletidele trifosforilate (ATP, GTP, UTP §i CTP pentru ARN §i ATP, GTP, UTP, CTP, dATP, dGTP, dCTP, dTTP pentru ADN) sunt, simultan, unitlijii monomerice §i furnizori de energie, Dac& la scindarea hidroliticS a leg&turiior macroergice din celelalte nucleotide trifosforilate se elihereazft aceea§i energie ca la scindarea ATP, exists in organismele vii alji compu§i cu legSturi macroergice a c&ror AG°’ in reacfiile de hidrolizS. este mai mare decat -7,3 kcal/mol; majoritatea acestora sunt tot compu§i fosforilafi (Tabelul VL3): Tabelul VIJ AG05 in reactiile de hidroUziS ale imor compusi macroergici (fosforilaji sau de aSta natura) si ale imor conipu§i fosforilap care nu sunt macroergici Compustd AG0’ kcallmol kJimol Acidul fosfoenolpiruvic - 14,8 -61,9 Carbamilfosfatul - 12,3 - 51,4 Acidul 1,3-bisfosfoglicerie - 11,8 - 49,3 Creatinfosfatul - 10,3 - 43,1

Acil - CoA - 7,5 - 31,4 ATP ADP +P( n^ - 30,5 Glucozo-1 -fosfatul - 5,0 - 20,9 Fru ctozo-6 - fos fa t ill - 3,8 - 15,9 G1 u cozo- 6-fosfatul - 3,3 - 13,8 Glicerol-3-fosfatul -9,2 - 2,2 Din dispunerea pe baza AG°’ a ATP intr-o pozijie de mijloc in raport cu ceilalfi compugi fosforila|i reiese $i mai bine rolul siiu de intermediar energetic („moned& de schimb^). Orice compus macroergic fosforilat (dar §i nefosforilat) cu AG0' negativ mai mare de 7,3 kcal/mol poate transfera teoretic restul de acid fosforic ADP-ului pentru a se forma ATP; acesta din urmS este, la randul sftu, capabil sii Iransfere restul de acid fosforic pe compugi cu AG0’ negativ mai mic decat 7,3 kcal/mol. Se realizeazft astfel o scanl de transfer a restul ui de acid fosforic numitS „potenlial de transfer a grup&rii fosfaf4 (sau potential de fosforilare) care are o mare important in bionergeticS. Pentru ca aceste transferuri sfi se product in realitaie, este obligatorie existenfa enzimelor specifice. Lipsa enzimelor specifice face imposibile transferurile fosfatului intre compugii situaji deasupra ATP in Tabelul VL3, sau intre acil-CoA §i ATP; din acelagi motiv nu este posibilti nici transfenirea fosfatului de la compusii de deasupra ATP c&tre cei dedesubtul acestuia. Fosforilai*ea ADP cu Pt furnizal de compugii macroergici ca fosfoenolpiruvatul §i aci- dul 1,3 bisfosfogliceric reprezinUl, a§a cum va reiegi in continuare, una din modalitSjile de sinteza a ATP in sistemele vii. Deosebit de important^ este relatia dintre ATP si cieatinfosfat. Acesta din urm3 se poate acnmula in anumite limite in muschi constituindu-se ca o „rezerviT de 272 ^ ts 1 ,tf ,z

*1J0 'K. f\~p H Oj 'b 8 S 4 2 O fosfoe/rofft/nj^fPSf^f u ytorft/ ' , ~A Creafy'/jfosfyf/ Gfucazo

' 8-far/*/ k G/t'cero/ 3-fosfyfFig. VI.4 - Transferal grup&rii fosfat de la compu§i macroergici cu AG01 negativ mai mare decat -7,3 kca!/moS ia ATP §i de la acesta la alji compu§i ■ Depozitarea se face in starea de repaos §i in condifiile excesului de ATP. Creatinfo- sfatul serve§te pentru furnizarea rapids de ATP in momentul contracjiei, sinteza obi§nuit# de ATP necesitand un timp mai indelungat. Sinteza §i utilizarea creatinfosfatului In mu§chi se fac prin intermediul re&cfiei reversibiie cataiizat# de cseatinksnaz#, numita §i creatMosfoMnaz# (CK, CPK): HN = C' NH, CPK + ATP HN = C' NH ~ P03H2 + ADP N — CK—COOH N — CHg™ COOH CH3 CH3

creating creatinfosfat Potenfialul de transfer a grup&rii fosfat §i relafia ATP-creatinfosfat sunt reprezentate in Fig. VIA. Se face preeizarea dx acidul fosfoenolpiruvic, creatinfosfatui §i acetil~CoA (in genera! acil~CoA) au ieg&turi macroergice de§i nu sunt anhidride. AG°’ negativ ridicat in leacjiile de hidroliz# a lor i§i are explicajia in stabilizarea prin rezonanf# a produgilor rezultafi. VI.8 CAILE DE SINTEZA ALE ATP IN VIVO S-a mai menjionat eft, din punct de vedere energetic, fiecare Jesut, chiat fiecare celulS, acjioneaz# pe cont propriu, In alji termeni, nu exist# posibilitatea transferului de energie liber# §i nici de compu§i cu legHturi macroergice de la o eelul# la alta. 273 Pentru producerea de ATP, celulele utilizeazd energia eliberatH in reacjiile exergonice din caile de degradare a giucidelor, iipidelor §i proieinelor. Cu excepjia eritrocilelor §i a altor cateva tipuri de celuie, toate ceielalte degradeazd aerob compu§ii menfionafi ceea ce asigurS producerea unei cantMfi insemnate de ATP raporat la un mol de compus degradat. In eforturi intense, celulele musculare degradeaz£ giucoza §i in condijii anaerobe. Eritrocitele sunt celuie strict anaerobe in limp ce celulele musculare sunt „facultative“. Deoarece cuprind numai o parte din etapele c&ilor degradative aerobe, cftile anaerobe produc pufina energie §i dec! pufin ATP: fajS de 38 moli ATP/mol de glucozft degradatS aerob, in etapa anaerobe se produc doar doi moli ATP/mol de glucozd. Sinteza de ATP corelatd cu degradarea anaerobe se

realizeazft in intregime prin procesul numit „fosforilare la nivel de substraf 1 in timp ce sinteza de ATP corelatS cu degradarea aeroM se realizeazS numai in micB mSsurS prin acest proees, in cea mai mare parte ea are loc prin cuplarea proceselor numite ,,lanf respirator14 §i „fosfori!are oxidafiviT. VI.8.1. FO S FOR IL ARE A LA NIVEL DE SUBSTRAT Energia eliberatd Intr-o reacfie exergonicd poate fi utilizatS direct pentru sinteza d e A T P d i n A D P § i Pf, se spune, in acest caz, c& ATP s-a objinut prin „fosforilare la nivel de substrat". Numai reacfiile exergonice care elibereazfl energie in valoare cel pufin egald cu cea eliberatft la hidroliza ATP pot asigura sinteza acestuia prin fosforilare la nivel de substrat. Cuplarea ADP cu P; in urma c&reia se formeazS leg&tura macroergicfc este catalizatS de kinaze, enzime cu specificitate absolute in raport cu substratul. In organismul uman acfioneazli numai trei asemenea kinaze, corespunzand la tot atatea variante de sinteza a ATP la nivel de substrat. Doua dintre variante sunt in Iegfttur& directa cu degradarea glucozei la acid piruvic fiind operafionale atat in condijii anaerobe cat §i aerobe; cea de a treia este corelatd cu catabolizarea acetil-CoA in ciclul aeizilor iricarbcxilici: 1. Sinteza de ATP cuplat# cu transformarca. acidului 1,3-bisfosfogliceric in acid 3-fosfogliceric; este una dintre reacjiile glicolizei fiind catalizatS de fosfogliceratkinazil: O C# j XO~PO3H2 HC-~ OH Fosfogliceratkinaza + ADP

1O

| N OH HC — OH + ATP H2C — O — P03H2 H2C — 0 — PO3H2 274 Din cele 11,8 kcai/mol ale legftturii macroergice din acidi.il 1,3bisfosfogIiceric doar 73 se conserve in legftturft macroergice din ATP, restul de 4,5 se disipeazd in media. 2. Sinteza de ATP cupiafil cu tmnsformarea aciduiui fosfoenopiruvic in acid piruvic este o alld reacjie glicoliticll; ea este catalizate dc pinivatkinnze: 0 < c# C# Piruvat \\r j OH kinaza V C — 0 —■ P03H2 . ii 1 CH2

O OH

CH3

+ ATP Ceie 14,8 kcal/moi cat se eiibereazd la hidroliza aciduiui fosfoenolpiruvic ar fi suficiente pentru sinteza a doi moii de ATP; in realitate se formeaze numai unul, 7,5 kcal/mol disipandu-se in mediu. 3. Sinteza de ATP cuplate cu transformarea succinil-CoA in acid succinic; este ana dintre reacfiile ciclului acizilor tricarboxilici fiind catalizate de succinii-CoA-tiokinazd: CO COOH OH j j 1 Succinii- l CH2 CoA CH2 1 tiokinazi 1 GHp -f GDP 4- P; - - ------CH2 1 ^0 1 C ~ SCoA CO OH LegiStura macroergice din succinil-CoA eiibereazd prin hidrolize ~8 kcal/mol din care 7,3 se utilizeazS pentru form area legSturii macroergice din GTP. Este singura reacjie in care se formeazfi un alt nucleotid decat ATP-ul; GTP este utilizat ca atare sau este transformat prin reacfie de schimb in ATP; GTP -f ADR GDP + ATP VI.8.2. LANJUL RESPIRATOR §1 FOSFORILAREA OXIDATIVA Rolul catabolic al ciclului acizilor tricarboxilici este de a degrada restul acetii din acetil-CoA care se objine prin degraderi specifice ale glucidelor, lipidelor §i unora dintre aminoacizi. In cursul acestei degraded, carbonii din restul acetii sunt oxidafi la C02 iar hidrogenii sunt preluaji de coenzimele NAD+ §i FAD care se reduc la NADH + H\ 4i k: A, ;i 'A : A ■j;i A 275

FADH2

Fig. VI.5 - Schema de ansamblu a degradSrii aerobe a giucidelor, lipidelor §i proteinelor respectiv FADH2 (vezi „CicIul acizilor iricarboxilici“) (Fig. VI.5). Coenzimele reduse NADH + H+ §i FADH2 se formeazS §i in cursul degradarilor specifice ale giucidelor (de exemplu in glicolizS), lipidelor (P-oxidarea acizilor gra§i) §i unor aminoacizi. Lanful respirator, etapa ultima a degradarii aerobe, are drept scop reoxidarea coenzimelor NADH + H+ §i FADH2 prin trecerea hidrogenului pe oxigen cu formarea apei. 276 Prin reoxidarea coenzimelor se asigurifc a) posibilitatea continu&rii dehidrogenSrilor in entile degradative specifice §i in ciciul acizilor tricarboxilici; b) eliberarea unei cantitdfi de energie care serve§te la sinteza celei mai marl p&rfi din ATP-ul necesar organismului; Sinteza propriu zisS de ATP se realizeazS prin procesui numit' Jfosforilare oxidativiT, proces cupiat cu lanful respirator; ATP se objine din ADP §i Fi a c&ror condensare este posibiia numai pe seama energiei eliberatd in lanful respirator. Transferal „echivalenfilor de reducere“7 de pe coenzimele reduse pe oxigen poate fi redat prin ecuafiile globale aie lanfului respirator: NADH + H+ + 1/2 02 -------------------NAD" 4- H2G FADH, 4-1/2 0, ----------------------► FAD + H20 Acest transfer se face ins& printr-un num3r mare de reaefii intermediare (lanf) catalizate de enzime specifice care aefioneazd individual sau in complexe; corespun- zdtor, energia totals a fieedreia din cele dou& reaefii se elibereazd in trepte sau „pachete“ cu valori ale AG0’ sub sau u§or peste -7,3 keal/mol, ultimele utilizabile pentru sinteza ATP din ADP §i.Pj. . . Lanful respirator §i fosforiiarea oxidativd, se des'fS§oar5 in membrana internd a mitocondriilor, toate enzimele care catalizeazd cele uoud procese fiind integrate in structura acestei membrane. Multe enzime (componente) ale lanfului respirator au fost izolate §i

structura lor a fost elucidate; altele au fost studiate numai pe edi indirecte. Citocromii sunt compu§i heteroproteici ale edror grupdri prostetice sunt hemuri, foarte u§or diferite de hemul din hemoglobin^ §i mioglobind (vezi „Metabolismul hemoproteineior“). Cel mai bine studiat este citocromul c (Cit. c) care este deosebit de stabil deoarece legdtura intre hem §i componenta proteied este covalentd (Fig, VI.6). O proprietate deosebit de important# a citocromilor este absorfia selective a unor radiafii din domeniul vizibil al spectruiui radiafiilor eleetromagnetice; clasificarea citocromilor in a, b, c etc. (fiecare cu mai multe variante, notate prin indici 1, 2, 3 ...) s-a realizat dupd acest criteria. Mecanismui prin care fiecare dintre citocromi aefioneazd in lanful respirator constii in acceptarea electronilor de la un partener cu potenfxal redox standard mai negativ (sau pozitiv mai mic) decat al sdu §1 cedarea apoi a acestor electroni cdtre un partener cu potenfial eiectronegativ mai mic (sau electropozitiv mai mare) (Fig. VL7). In cursul funefiei lor, citocromii i§i schimbd deci alternativ valenfa fierului intre Fe3+ §i Fe2+. Aceastd inspire este total diferitd de a miogiobinei §i hemoglobinei la care valenfa fierului nu se modified odatd cu fixarea 02; aa se explicit nu numai prin diferenfa structurii hemului din citocromi ci §i prin componentele proteice diferite. 7 Dupa cum se va vedea in continuare, in un.ele- reaefii ale lanfului respirator se transfers hidrogeni, m altele electroni. Termenul "echivalenfi de reducere" este comun pentru cele doua transferuri. 277 CH3 CHS. H,C HOOC' v_ /r V I /VSe^-H yCHs HOOC HeC S' \ Ctf, -CH—SI CHj / $ V Fig. VI.6 - Structure citocromului p (componenta neproteica). Legatura cu proteina specified se face prin intermediul gruparilor -SH ale unor resturi de cisteina

(Fe**) Fig. VI.7 - Modul de funcjionare a citocromllor in lanjul respirator (detalii In text) Citocromii a §i a3> unit&ji distincte dup& spectrele de absorbfie inregistrate pe fragmente de memhranft intern^ mitocondrial^, no an putut fi tot-u§i separafi imul de altul, Impreunft ei alcdtuiesc citocrom-c-oxidaza, singurul dintxe componentele lanjului respirator care este capabil s8 reduce oxigenul. Coenzirrm Q (CoQ), numit& §i ubichinonS, seamSnS structural §i functional cu vitaminele K. Sunt cunoscute variante ale CoQ care difera prin lungimea catenei izoprenoide; fiecare dintre acestea exists in forms redusli §i in forms oxidala; funcfia lor in lanful respirator se' bazeaz# tocmai pe alternanja continue intre cele douil forme: O OH ‘CH, H C / 3 ° ^Y'/AS (CH2--CH = C- 0 CoQ, forma oxidata

CH, (CH2~-CH = C — CHZ~^H CoQ, forma redusa Flavoproteinele (FP) sunt componente ale lanfului respirator prin intermediul cMrora se preiau hidrogenii de la coenzimele dehidrogenazelor NADH + H+ §1 FADH2. Structurile diverselor flavoproteine au fost prezentate in capitolul „Vitamine §i coenzimeA In Ian{ul respirator se intSInesc in variantele; -flavoproteina N, cu coenzimft FMN, notata FPN; are rolul de a prelua hidrogenii de la coenzima NADH + H+;. ~ flavoproteina S, cu coenzima FAD, notatS FPS; preia direct, hidrogenul de pe acidul succinic in ciclul acizilor tricarboxilici; alte flavoproteine cu coenzima FAD, care preiau hidrogenul de la diverse substrate; Proteine cu fier §i sulf: atomii aces tor elemente sunt grupafi in „centre“ care se ieag& de componentele proleice prin intermediul unor resturi de cisteind (Fig. VLB).

. .Aceste componente sunt dispose secvenjial in membrana interna mitocondriand, in ordi- nea descre^terii potenjialului redox negativ §i crejterii celui pozitiv; cu excepfia CoQ §i Cite, CyS-S, \. Fe~ Fe > s

S-CyS \ Fig. VLB - Structura unei proteine cu Fe §i S MATRIX mm am

mfrnra

mm JfiHM

MM

SPAJ'fU SNTERMBMBRANAR Rg. VI.9 - Locaiizarea m membrana interna mitocondriala a cotnplexeior 1...1V] ale !an|uiui respirator §i ATP sintaza care funcjioneazit individual, celelalte componente se gsrupeaz& in complexe notate I, 13, m §i IV (Fig. V1.9) fiecare complex catalizSnd o anumitS reacjie de oxido-reducere. Tot in membrana intemd mitocondriaLI, dupft complexul IV, este inclus (partial) complexul responsabil de fosforilarea oxidativS numit ATP~sintaz& dar §i ATP-azS, deoarece, dac& este extras din membrane, el catalizeazU

hidroliza ATP; denumiri sinonime mai sunt H+ - ATP-azS §i FoFrATP-az38. Complexul are o subunifate, notatS F0, care strSbate In totalitate membrana intern*!; ea const# din patru tipuri de proteine care formeaz# un sistem de pori transmembranari prin care tree cu mare u§urin$ protonii („canai protonic4')- Subunitatea notate este aic&tuit# din cinci tipuri de proteine care se afl& in raportul stoechiometric a3p378e; ea este cuplatft la subunitatea F0 §i se afl# in intregime In matrixul mitocondrial sub forma unei mid sfere (Fig. VI.10). La niveiul acestei subunitS{i are loc. reaejia de condensare a ADP cu Pj, de aceea este denumit# §i ^factor de cuplare I“. Funcjionarea celor patru complexe, a CoQ §i Cit.c ale lanfului respirator, cuplate cu funejionarea ATP-sintazei pot fi urmiSrite in Fig. VI.ll. Complexul I, numit chimic NADH - CoQ reductaz#, transfer# ionii de H+ §i electronii de pe NADH -f H+ din matrix pe coenzima Q. CMerii de potential de 0,42 V, care reprezint# difeienfa Intre Ec' a NADH §i E0' a CoQ, ii corespunde o AG°’ = -19,4 keal/mol, suficient# pentru sinteza a doi moll de ATP, in procesul fosforii&ii oxidative se sintetizeaz# ins# un singur mol, restul de energie se disipeaz# in mediu. Reacfia catalizat# de complexul I, cuplat# cu fosforilarea oxidativ# se sumarizeaz# astfel: NADH + HN CoQ NADH-CoQ reductaz# •> NAD* + CoQHz ADP + Pi ATP *Uneori, ATP-sintaza este denamita $i complexul V. 280 MATRIX MMMM

mm Fig. VI.10 - Un model ai structurii ATP sintazei ATP ATP ATP

Fig. VL11 - Funcjlonarea cuplat& a complexelor lanjului respirator §f fosforilarii oxidative Subuni dtyiie complexului I sunt FPN (numit& §i NADH dehidrogenaza) §i cateva proteine cu fier §i sulf notate FeSl5 FeS2, FeS3 §i FeS4, aceastS. ordine corespunzand deseregtcrii valorii negative a !ui E0’; corespunz&or, curgerea echivaienfilor de reducere m interiorul acestui complex este: NADH + H NAD+ FPN(FMN) 2 e‘ 2 e“ 2 e" 2 e" 2 e“ FeS, FeS? FeS, -FeS4 FPN(FMNH2) 2H+ 2H+ CoQ COQH2 281 Se observe eft hidrogenul este disproporfionat la prelurea sa de cfttre complex, in continuare fiind transferaji dectronii; transferul se asigurft prin oxidftri-reduceri ale ionilor de fier §i de sulf ai subunitftfilor. In final, protonii §i dectronii refac atomii de hidrogen §i acejtia reduc coenzima Q. Complexul I este inhibat de rotenonft (un insecticid de origine vegetalft), amital (compus din clasa barbituricelor) §i pericidinft (an antibiotic), substance care hlocheazft transferal de electroni la acest nivel. Complexul II, numit §i succinat-CoQ reducteazft, realizeazft transferal echivalenjilor de reducere de la succinat la CoQ conform schemed Succinat FPS (FAD) N . COQH2 Fumarat FPS (FADH2) / ^ CoQ ■Subunitatea principal;! a complexului II este succinatdehidrogenaza cu coenzima FAD, care, fiind dispusft la marginea dinspre matrix a membrane! interne mitocondriale, catalizeazft dehidrogenarea succinatului la fumarat in

ciclul acizilor tricarboxilici §i, in acela§i timp, introduce hidrogehii in ianful respirator. Aiftturi de aceastft subunitate, in complex se mai aflft cel pufin trei proteine cu fier §i sulf; evident, exist# §i in interiorul complexului II un transfer din aproape in aproape a electronilor. Variafia de potential la transferul electronilor de la succinat la CoQ este de 0,07 V corespunzand unei valori a AG°’ = -3,2 kcal/mol; deci la nivelul acestui complex no se elibereazft suficientft energie pentru ca prin cuplare cu fosforilarea oxidativft sft se sintetizeze ATP. Complexul II al lanfului respirator are §i flavoproteine specializate pentru introducerea hidrogenilor de pe alte substraturi: acil-CoA, glicerol-3-fosfat, colinft, sarcozinft. In cazul acil-CoA, aceastft flavoproieinft a fost identificatft; ea a fost numit# „electron transporting flavoprotein“ (ETF). Complexul III, numit CoQ-citocrom c reductazft, asigurft transferul echivalenfilor.de reducere, tot sub forma de electroni, de la CoQ la citocromul c: CoQ-citocrom c redact aza COQH2 + 2Cit.c (Fe3*) ------■—CoQ -!- 2Citc (Fe2*) + 2H+ Variafia de potential la acest transfer este de 0,18 V, cftreiaii corespunde AG05 = -7,75 kcal/mol, ceea ce asigurft ca prin cuplarea cu fosforilarea oxidativft sft se sintetizeze un mol de ATP. Citocromii care participft la structura acestui complex sunt notafi bK, bx §i q; este prezentft §i cel pufin o proteinft cu Fe §i sulf. Complexul III este inhibat specific de antibioticul antimicim! A. 282 Coinplexul IV, numit eitocromoxidaz!, calalizeaz! adijia a patru electron! fumizaji de Cit.c (Fe2+), la oxigenul molecular cu formarea a 202"; acesta, combinandu-se cu protonii, formeaz! ap!: Citocromoxidaza 02 + 4e* + 4H* ADR + P} ATP Structural mecanismul de acjiurid al acestui complex nu sunt inc! pe deplin cunoscute, Au fosl identificate cel pujin §apt.e subunit!j.i proteice a c&ror compozijie in aminoacizi este diferil!. Unele dinfcre acestea conjin §i ioni de cupru, Pe baza unor determinSri indirecte, se admite al in complexe elecironii receptionap de la Cit.c de c!tre Cit.a, tree de la acesta pe proteina cu cupru §i de aici pe Cita3 care u transfer! apoi pe oxigen. C!derea de potential la trecerea electronilor medial! de compiexul IV este de 0,54 V c!reia ii corespunde o valoare AG0> = -24,8 keal/mol, deci energie suficient! pentru sinteza a trei moli de ATP; nu se sintetizeazfi ins! decat un singur mol. Citocromoxidaza este puternic inhibat! de ionul CN~, de oxidul de carbon §i compu§ii denumiji azide ceea ce explic! toxicitatea mare a acestora. Cu datele prezentate se poate face un bilanj; complect al energiei eliberate la „ reoxidarea NADH + H+ §i FADH2 in lanjul respirator §i a utiliz!rii acesteia pentru producerea de ATP prin procesul de fosforilare exidativ!. Ecuajiile globale corespunz!toare sunt: ■NADH + H* + 1/2 02 + 3 ADR + 3 P; NAD* 4- 3 ATP + 4 H2G FADH2 + 1/2 02 + 2 ADR + 2 P, - - ->■ FAD 4- 2 ATP + 3 H20 Variafia polenjialului redox standard pe tot lanjul respirator este AE’0 =.

1,14 V pentru reoxidarea NADH + HL valoare rezultat! din insumarea c! derilor de potenjial la nivelul celor trei complexe. ApiicSnd formula AG0’ = mF*AE0? se ob{ine AG0' = - 52,6 kcai/mol. Intrucat se sintetizeazfi trei moli de ATP pentru care se consum! 3x7,3 = 21,9 keal/mol, randamentul utiliz!rii energiei libere pentru sinteza de ATP este: 21,9x 100/52,6 - 42%. Intrarea echivalenfilor de reducere in lanjul respirator prin compiexul I este numit! „ramura lung!u a acestuia; ea asigur! deci formarea a trei moli de ATP/atom gram de oxigen redus. La intrarea echivalenjilor de reducere prin compiexul II se asigur! formarea a numai doi moli de ATP/atom gram de oxigen redus. Este „ramura scurt!“ a lanjului respirator. Raportul intre numfirul de moli de ATP produgi §1 oxigenul (in atomi gram) consumat este numit „cat de fosforilare44. El se simbolizeaz! P/O §i este deci 3/1 pentru ramura lung! §i 2/1 pentru ramura scuit!. 283 VI.8.3. TEORII PRIVIND MECANISMUL CUPLARII LANJ RESPIRATOR FOSFORILARE OXIDAHVA Una dintre problemele fundamentale ale bioenergeticii o constituie mecanismul prin care energia eliberatd in lanful respirator este cuplatd cu formarea de ATP prin fosforilarea oxidativd. Cele trei teorii formulate in timp au ca element comun existenja intermediary a unei „stdri energetizateA Aspecteie esenfiale ale eelor trei teorii sunt prezentate. in continuare. a) Teona chimicd, numitd §i a intermediarilor comuni (Slater, 1953): prin analogic cu fosforilarea oxidativd la nivel de substrat, se admite cy variafia energiei libere in cursul Irecerii electronilor de la un intermediar redus (AH2) al lanpilui respirator la urmytorul oxidat (B) serve§te la cuplarea lui A cu un compus C pentru a forma legytura macroergicy A~C. in reacjii de schimb secvenfiale, legytura macroergicy este trecutyin compusul C~P; de aici in ATP. in timpul acestor reacjii AH2 este oxidat la A, B este redus la BH2 §i C este refycut putandu-se inijia o nouy secvenld: AH2 + B 4- C ^ A - C+ BH2 A — C + P| c—P+A C — P + ADP ATP + C Celor trei cuplaje ale lanjului respirator cu fosforilarea oxidativy ar trebui sd le * corespundy trei intermediari A~C; nici un asemenea compus no a fost identificat. Abandonaty din acest motiv, teoria cuplajului chimic a fost reluatd (Griffith, 1977) considerdndu-se cd acidul lipoic, care s-a constatat cd este implicat in complexul ATP- azic, ar putea indeplini roiul lui C dar nu s-a objinut nici un fel de date experimentaie care sd sprijine aceastd supozijie. b) Teoria conformafionald: in forma initiate (Boyer, 1964), considerd cd energia eliberatd in cursul transportului electronilor este conservatd prin modificarea conformajionald la o stare energizatd a unuia sau mai multor transported de electroni. Ulterior, s-a postulat modificarea conformafionald a complexelor enzimatice la care se reaiizeazd cuplajul. in sprijinul acestei teorii se aduc rezultate objinute prin microscopia electronicd care evidenfiazd cd la trecerea mitocondriilor din starea de repaos metabolic la starea activd (consum de 02 §i sintezd de ATP), membrana intemd se pliazd, volumul matriceal reducandu-se foarte mult. Viteza redusd a modificdrilor

conformafionale in raport cu rapiditatea cuplajului transport de electronisintezd de ATP este un serios impediment de impunerea acestei teorii. c) Teoria chemiosmoticd (Mitchell, 1961) postuleazd cd starea intennediard energetizatd care determind sinteza de ATP din ADP §i P; este reprezentatd de gradientul de protoni care se stabilegte intre fafa interioard §i cea exterioard a membrane! interne mitocondriale in timpul transportului de electroni. in alji termeni, transportul direefionat al electronilor in lungul membranei determind un transport direefionat (vectorial) al protonilor din interioml mitocondriilor spre exterior (Fig. VI. 12). Gradientul protonilor ejectafi in spajiul intermembranar are doud componente: una de pH, (ApH) 284 ADP * Pi ATP

Fig. VI.12 - 0 iiustrare schematizata a teoriei chemiosmotice una electric^ sau potential de membrane (A*F). Surma lor este numitft for|& proton motrice, notatft Ap: A p = A - 2,303 A pH Numeroasc date experimentale vin in sprijinul acestei teorii. Astfel existenja unui potential transmembranar, care constitute cheia ipotezei chemiosmotice, are justificare prin faptul cil spajiul intermembranar al mitocondriilor este mult mai acid in cursul funcjion&rii celor douh procese. Prin studii de microscopic electronic^ §i alte tehnici, s-a confirmat §i faptul, de asemenea obligatoriu pentru valabilitatea teoriei, cS membrana interns mitocondrialfr este strSbStutS de la o fajd ia cealaltS de complexele I, III §i IV ale lanfului respirator (Fig. VI.9). Teoria prevede in continuare cS protonii din spajiul intermembranar revin in mitocondrie strict prin partea Fu a ATP sintetazei care este un „conductor“ pentru protoni (restul membranei fiind impermeabilS pentru ace§tia). Acest flux de protoni este cel care determine, la nivelul subunit&jii Fj, sinteza de ATP din ADP §i P;. in experienfe model s-a putut demonstra eft un flux artificial de protoni, in absenja lanjului respirator, poate determina cuplarrea ADP cu P,;, ceea ce constituie incft un argument series in favoarea teoriei chemiosmotice. Unui dintre postulated teoriei chemiosmotice prevede eft apa rezultatft in reaefia de form are a ATP din ADP §i P- se ionizeazft spontan, ionii H+ fiind dirijafi spre interiorul mitocondriei (ei urmfmd sft creeze gradientul protonic) in limp ce ionii OH” sunt dirijaji spre spajiul intermembranar; ADP 4- Pj ' ATP 4- H+jnterior 4- OH exterior . Obligatoriu dupft Mitchell, acest postulat a constiluit obiectul principal al

unor inver§unate critici la adresa teoriei chemiosmotice; totu§i, prin argumentele experimentale deja menjionate ca $i prin allele aduse relativ recent, aceastft teorie s-a impus net in raport cu teoria ehimieft §i cu cea conformajionalft. 285 VI.8.4. SISTEME DE TRANSPORT A ECHIVALENXILOR DE REDUCERE Reacjii de dehidrogenare catalizate de enzime cu coenzima NAD+ au loc atat in citoplasma cdt §i in mitocondriile celulelor. NADH 4 H+ care se produce in astfel de reacjii la nivelul mitocondriilor se reoxideazd prin preluarea direct# a echivalenjilor de reducere de cdtre lanjul respirator (mecanismul descris). Mai complicate! este reoxidarea NADH + H+ care se produce in citoplasmd. Exceptand anumite cazuri, de exemplu reoxidarea NADH 4 H+ produs in cursul oxiddrii gliceraldehid-3-fosfat ---4 acid-3fosfogliceric in reacjia acid piruvic > acid laclic (vezi „Glicoliza“ in condi|ii anaerobe) §i NADH 4 H+ produs in citoplasm^i se reoxideazd prin introducerea echivalenjilor de reducere in lanjul respirator. Cum insa membrana mitocondriald nu este permeabild pentru coenzimele nicotinamidice, procesul are loc pe cdi indirecte numite navete (shuttle). Naveta „glicerolfosfat“ (Fig. VL13.A) opereaza astfel: NADH + H+ format in diverse reacjii de reducere din citoplasmd se asociazd cu apoenzima specified formand glicerol-fosfatdehidrogenaza, enziind ce catalizeazS reacjia de hidrogenare a dihidroxi- acetofosfatului (DHAP, intermediar glicolitic.) la glicerolfosfat; intrucat membrana extern^ mitocondriald este permeabild pentru glicerolfosfat, acesta pdtrunde cu u§urinjd in spafiul intermembranar. Pe suprafaja externd a membranei interne mitocondriale este localizatd glicerolfosfatdehidrogenaza mitocondriald care reoxideazd glicerol-fosfatul la dihidroxiacetonfosfat, cei doi atomi de hidrogen fiind prelua|i de coenzima acestei enzime, care este de tip FP (FAD); de aici echivalenjii de reducere tree in lanjul respirator. Dihidroxiacetonfosfatul revine in ■citoplasmd §i suita de reacjii se reia. Acjiunea navetei glicerol-fosfat este restransd la introducerea echivalenjilor de reducere de pe NADH 4- H* citoplasmatic in lanful respirator. Ea este deci unidireejio- nald §i are ca scopuri menjinerea concentrajiei necesare de NAD+ in citoplasma §i furnizarea de echivalenji de reducere lanjului respirator. Prinlr-un mecanism mai compiieat opereazfi naveta „malat-aspartat“ (Fig. VI.13.B); la transferul in sensul citoplasmd —> mitocondrie sau mitocondrie » citoplasmd (naveta este deci hidirecjionald) a echivalenjilor de reducere concur# malatdehidroge- nazele (MDH) §i glumaiic-oxalocetic-transminazele (GOT) citoplasmalice §i mitocondriale precum §i transported specializaji pentru transferul prin membrana intern# mitocondriald a malatului, glutamatului, aspartatului §i a-cetoglutaratului (notaji pe figurd, in ordine 1, 2, 3 §i 4). Prin acjiunea acestei navete se asigurd atat. reoxidarea NADH + H+ citoplasmatic, cat gi, pe plan mai general, reglarea cuplurilor NADH - NAD+ extra §i intramitocondriale.

Alte navete sunt capabile sd realizeze schimb de echivalenji de reducere cu participarea §i a coenzimelor de tip NADP. Una dintre ele este responsabild de form area in citoplasmd a unor man cantitdji de NADPH 4 H* necesar pentru biosinteze, in special de lipide. 286 NAO N H ^ NAD ~h \ O/Zcero/N-Omf v c/ksoZZct, y OMAN "v. GZ/ceroZ-0 GZ/cemZ~3rfnzZs s^/ZocoxcZroM/ €%N (zmi/OrUh cZZbM/tacofuZrZe A CZrOPLASZAA D/sZdZp________________ AfA0+*r^/'ZZAZZZZ^P MM ZZ/d/OAceZdZ WD^DZo <- 'G0r\ , * Asp ■■*■o(- ce%pZxZdrd/- ■*#1 M/rOCONDN/E 0' vV Afd/dZ MON

NADt *• NAOH OXdZOACeZdZ ■ G/cX7®1 x ----- -

Asp *- °A~ceN?p/xZdXdZ B Fig. VI.13 - A. Naveta unidirectional^ ..glicerol-fosfaf; B. Transferul bidirectional „malat-aspartat“ 287 I \4: V:

VI.8.5. AFECJIUNI DATORATE UNOR DEFECTE EREDITARE LA NIVELUL ENZIMELOR LANJULUI RESPIRATOR §1 FOSFOKILAKII OXIDATIVE In complexele lanjului respirator §i fosforiidrii oxidative au fost identificate cateva zeci de proteine. Cele rnai multe dintre ele sunt sintetizate in citosol §i transportate in mitocondrii; pentru un numdr dintre aceste proteine s-a stabiiit cd sunt codificate de ADN mitocondrial. Se gtie cd ADN mitocondrial are o ratd a mutafiilor de aproximativ zece ori mai mare decat aceea a ADN nuclear. De aceea, mai ales in Jesuturile care consume cantitdji mari de ATP, cum sunt ficatul, rinichii, mugchii scheletici, mugchiul cardiac, s-au semnalat „miopatii mitocondriale44 de care sunt responsabile proteinele cu defecte a cdror sintezd a fost controlatd de ADN mitocondrial. Se cunoagte §i o neuropatie opticd ereditard caracterizatd prin pierderea bilaterald a vederii cenlrale ca rezultat al degraddrii retinei. VI.8,6. CONTROLUL RESPIRATOR S-a afirmat chiar la inceputul acestui capitol cd organismeie vii produc

energie §i deci sintetizeazd ATP in raport cu necesitdfiie de consum din fiecare moment. Pentru a rdspunde prompt la aceste necesit&fi, fosforilarea oxidative cuplatd cu lanjul respirator, principalele procese prin care se produce ATP, sunt riguros controlate. Cum insd cele doud procese constituie etapa finaid a degraddrii glucidelor, lipidelor §i proteinelor (Fig. VI.5), teoretic „controlul respirator44 se poate exercita atat prin compugi §i factor! implicaji direct in lanful respirator §i fosforilarea oxidativd (coenzime reduse, 02, ATP, ADP, Pj, complexe enzimatice etc.), cat §i prin intermediari ai degraddrilor celor trei clase de compugi. S-a constatat cd, dintre aeegtia, rolul principal it are ADP-ul; astfel, un omogenat tisular consumd cantitatea cea mai marcde oxigen cand se adaugd ADP. Deoarece ADP-ul se cupleazd cu P; pentru a forma ATP, controlul respirator se mai numegte §i ^control prin acceptor de fosfat44. Raportul intre intensitatea respirafiei celulare in prezenja ADP fa{d de lipsa acestuia se numegte „rata“ controlului prin acceptor de fosfat; din studii efectuate pe mitocondrii izolate a rezultat al aceasta poate varia in limitele unui ordin de mdrime gi chiar mai mult. Sunt mai multe fapte care justified rolul principal al ADP in controlul respirator: a) Factorul de cuplare 1 din ATP sintazd, prezent in cantit^tji limitate in membrana intemd mitocondrinld, rdmane Jblocaf4 in forma energizatd in lipsa ADP; b) Intensitatea fluxului protonic prin componenta F0 a ATP sintazei este, de asemenea, determinate de nivelul ADP; c) ADP este modulator alosteric pentru mai multe enzime cu rol reglator care catali- zeazd diversele etape ale degraddrii glucidelor, lipidelor gi proteinelor. 288 VI.8.7. DECUPLANJI AI FOSFORILARII OXIDATIVE DE LANJUL RESPIRATOR Se numesc decuplanji compugii chimici care blocheaz# utilizarea pen Ini fosforiiarea ADP a energiei eliberaie in lanjul respirator. Primul decuplant cunoscuf a fost 2,4-dinitrofenolul. Prezent intr-o concentrate cie numai 10 uM, el determine! o diminuare a raportului P/G cu 50%; la concentrajii mai mari raportui devine zero. Alte substance decuplatnte sunt unele hidrazone, izotiocianaji:

F CN 2,4-dinitrofenol carboniicianida-p-trifiuorometoxifenilhidrazona (FCCP) In celule exist# far# indoial# decuplanji natural! ai fosforilSrii oxidative de lanjul respirator. Ei asigur#, intre altele, stabilirea unui report optim intre procesele consumatoare de ATP gi producerea de c#ldur# necesar# menjinerii constants a temperaturii. De exemplu hormonal T4 (tiroxina), in concentrajii peste limitele norm ale, are un elect decuplant. Energia care nu se utilizeaz# in alte scopuri se disipeaz# sub form# de c#ldur#. Se admite gi existenja unei proteine, termogenina (sau leptina), cu rol asem#n#tor. In Jesuturile adipoase brune, a c#ror euloare este datorat# unui confinut ridicat de mitocondrii (deci de citocromi), lanjul respirator funcjioneaz#

decuplat de fosforiiarea oxidativ#.' Asemenea Jesuturi au animalele care hibemeaz#; de asemenea, la flit gi la nou n#scut se afl# un jesut brun r#spandit in. jurul vaselor mari gi in regiunea omoplajilor. Teoria chemiosmotic# ofer# o explicajie pentru acfiunea decuplanjilor. Astfel 2,4- dinitrofenolul este un acid slab, care este solubil in mem bran# in stare protonat# gi solubil in ap# sub form# de anion (2,4-dinitrofenoiat). El este deci un transporter de protoni prin membran#, determinand prin aceasta abolirea gradientului protonic gi provocand decuplafea (Fig. VI12). VI.8.8. ALTE LANJURI RESPIRATORII In celule exist# gi idle varianle de lanfuri respiratorii, care nu sunt ins# cuplate cu fosforiiarea oxidativ#. Rolul lor este restrains' la reducerea 02 in vederea incorpor#rii in anumiji compugi chimici. Cele mai freevente cazuri le reprezint# procesele de hidroxilare. Astfel, reacfiile de hidroxilare catalizate de monooxigenaze decurg dup# schema general#: R-H. + 02 + XH2 ------------------ - -+» R-OH + H20 + X unde R-H este subs!ratul care se hidroxileaz# iar XH2 coenzima redus# donatoare de hidrogen, de cele mai multe ori NADPH. 289 in sistemul de hidroxilare iocalizat in reticulul endoplasmic al celulelor hepatice §i suprarenale, rol esenfial are Cit P45Q ale cdrui Tnsujiri sunt asemdndtoare cu ale citocromoxidazei din mitocondrii. El cuprinde §i o flavoproteind (FAD) la nivelul cdreia hidrogenul este disproporjionat in H+ §i e“. Simplificat, acfiunea acestui sistem de hidroxilare este redata in Fig. VI. 14. in ficat, acest sistem asigurd hidroxilarea unor compuji de origine exogend (de exemplu medicamente) dar §i a unor compuji endogeni (unii hormoni), care, devenind solubili, se elimind u§or din organism. In medulara suprarenalei, acela§i sistem participS la sinteza noradrenalinei §i adrenalinei, in limp ce in corticosuprarenald se introduc grupdri hidroxil pe nutieul de perhidrociclopentanofenantren In cursul sintezei din colesterol a hormonilor glucp §i mineraicorticoizi. 2//f

Fig. VI.14 - Lanju! respirator cu rol de hidroxizare din reticulul endoplasmic ai ceiuieior hepatice §i renale VI.8.9. SPECIIINCOMPLET REDUSE ALE OXIGENULUI In lanpil respirator nefosforilant din reticulul endoplasmic prezentat: in Fig. VI. 14, aldfuri de oxigenul compiel redus (Oa“) care intrd in R-OH H20 apare si o specie de oxigen partial redus, 07, care se mimejte ion superoxid. Mici cantitd[i de 07 se formeazd in cursul oxiddrii ferohemului din Hb la 'ferihem. Sisteme generaloare de radicali superoxid se afid §i in membrana plasmaticS,

in peroxizomi cat §i in citosol. O reacjie care face parte din catabolismul purinelor, oxidarea xantinei la acid uric, genereazd permanent, insemnate cantitdji din acest ion: Xantin Xantind + 202 + H20 --------------^ Acid uric + 202“ + 2H+ oxidaza Lanjul respirator mitocondrial este considerat de unii, in virtu tea faptului cd reducerea 02 la 202” se face in trepte, o important^ sursd de 07 ; s-a ardtat, insd, recent, cd 290 citocromoxidaza realizeazft nu numai reducerea dar §i fixarea fermft a 02 §i tuturor formelor reduse ale acestuia, ea elibemnd doar produsui cuplarii O2' cu ionii de H+, adicft apa. Specii reactive ale oxigenului se genereazftin cursul iradierilor masive cu raze X §i y. Aniomil superoxid, cu caracter de radical, are o foarte mare reactivate, putand interacfiona. cu proteinele, acizii nucleici, lipidele etc. Pe de altS parte, anionul superoxid genereaza alji radicali liberi §i molecule care au, de asemenea, o mare reaclivitate. Imporatanjft au mai ales radicalul hidroxil §1 apa oxigenatft: 0“ + 0- + 2H+ -----MHA + 02 2+ Fe O2 + H202 ----->- 02 + HO" + HOReactivitatea lor este, in anumite situajii, beneficft pentru organism. Un caz este cel al fagocitftrii microorganismelor, particulelor slrftine §i fragmentelor de membranft de cade neutrofile §i macrofage. Pentru omorarea bacteriilor, aceste celule acjioneazft printr-un mecanism oxigenodependent §i prin unul oxigeno-independent. Mecanismul oxigeno-dependent include sistemul mieloperoxidazft §i un altul care genereazft radicali ai oxigenului. In iinii marl, acest mecanism opereaza astfel: dupft ce s-a produs fagocitoza, NADPH oxidaza, localizafft in membrana leucocitelor, transforms 02 din vecinfttftji in Op; procesul este atat de rapid incat i s-a atribuit denumirea de „explozie respiratorie" (respiratory burst). Mai departe, 02 este transformat in H202 prin reacjia de mai sus, care, in condijiile catalizftrii de cfttre superoxiddismutazft, este foarte rapid#. in prezenja mieloperoxidazeL o enzimft lizozomalft, H202 §i CP genereaza acid hipocloros (HOC1) care omoarft bacteriile. Mecanismul oxigeno-independent de distrugere a bacteriilor funcjioneazft pe principiul hidrolizei prin enzimele lizozomale cuplat cu variajii irisemnate de pH. In cantitftfile produse in mod curent, efectele distruct!ve ale spcciilor reactive ale oxigenului sunt nesemnificative deoarece organismul dispune de sisteme de apSrare deosebit de eficace. Daca, ins#, limitele producer!! normale a lor sunt. depft§ite, interacfia cu acizii nucleici, proteinele, lipidele §i alji compu§i se produce, efectele fiind multiple: mufafii, inactivitatea multor enzime, modificarea ciclului celular §i al tele, Nu este surprinzfttor, de aceea, eft un rol major in producerea snu in complicajiile unor procese cum sunt imbfttrSnirea, inflama|iile, ischemiile, diabetul, malignizarea, il au speciile reactive ale 02. Douft dintre interacjiunile acestor specii cu divert

compup se dau in continuare: 1) Reacjia HO* cu bazele azotatedin acizii nucleici: 00

R

R 291 iiii i Catala za

\

V Superoxiddisrnutaza ZZZTXZZ: Hfi2 L r 2G -SH OH, Glutation ~ peroxidaza —IHpG i G~ S~S - G Fig. Vi.15 - Sistemui enzimatic de aparare impotriva speciiior reactive ale oxigenului Raclicalul format suferd, la randul lui, o serie de reacjii cu desf&§urare imprevizibilfl. Severitatea afectMi ADN este mare dacft se produc asemenea lezruni pe ambele lanjuri ale moieculei deoarece sistemele reparatorii nu mai pci reconstitui macromolecula iniJialS. 2) Peroxidarea lipidelor la nivelul acizilor gra§i polinesaturafi; este iivijiatd de mai multi radical! intre care §rQ; sau HO. Se produc in serie: - atacu! radicaiic cu extragerea H : - rearanjarea moleculara: - incorporarea oxigenului: HO-; O’. + 05 - combinarea radicalului p-eroxi cu H:

O-OH Sistemele de aparare ale organismului impotriva acestor efecte sunt de douft tipuri: a) enzimatic, prin care compu§ii agresivi sunt transformaji in compu§i inactivi; enzimele superoxiddismutazS, catalazft §i glutationperoxidazd, care catalizeazd reac{ii!e de mai jos, sunt, la un loc, sistemui cel mai important de aparare (Fig, YL15): Superoxid 20; a 2H+--------------------------------->- H202 a 0o dismutaza catalaza 2H202 ——3*- 2H20 + 02 Glutation H202 + 2G-SH ----------------------- --->- 2H20 + G-S-S-G peroxidaza 292 Acjiunea glutationperoxidazei este cupiata cu aceea a glutationreductazei, cu coenzimd NADPH 4- H+, care reface glutationul redos: Giutation G — S — S G -h NADPH + H+ -——>* 2G—SH + NADP* reductaza b) neenzimatic, prin care sunt impiedicate proceseie oxidative; o serie de vitamine, respectiv, C, E §i A, prin caracterul ior reducdtor, detoxified celulele de intermediary reactivi ai oxigenului. Aceasta ar putea fi o explicate ia constatdrile fdcute in timp cd. prezenja vitaminelor respective in cantitdfi rnari in brand este corelatd cu on rise mai redos de producere a unor tipuri de cancer §i cu o freevenfd mai scdzutd a alter afecjiuriL

h if I i il Cap. VII METABOLISMUL GLUCIDELOR VII. 1. CHIMIA GLUCIDELOR Glucidele sau zaharurile sunt compu§i polihidroxicarbonilici §i derivajx ai acestora. Numele de hidraji de carbon, care se mai folose§t:e incd, sugereazd di formuiele empirice. ale acestora con Jin C, H, O in raport.de 1/2/1. Degi’multe zaharuri se conformeazS formulei empirice (CH20)n, denumirea s-a dovedit improprie pentru un numdr mare de compu§i din aceastft dasa care conjin ait raport al atomilor de C, H, O sau conjin in plus azot, sulf, fosfor. Glucidele se impart in oze §i ozide, dup5 comportarea la hidrolizih Ozele, sau monozaharidele. sau zaharurile simple, conjin o singurS unitate polilriita&CT (sunt decx nehidrolizabiieh Dupd natura grupflrii carbonil din ijiaiediltL se impart in alcjojffi §i cetozg, iar dupii numSrul atomilor de carbon se impart in trioze, tetrqze, pentqze, hexpze, hegtoze, octoze:' (n = 1 - 6) CH2OH I G = O (n = 0 - 5) I (CHOH)n

CHO I (CHOH)n I CH2OH

CH2OH Cele mai import-ante §i abundente sunt hexozele (gjucqzd, fnuctozS, galactozji) §i pentozele (ribozd). Ozidele se impart, dupd numarul de unitaji monozaharidice la care dau na§tere prin hidrolizd, in oligozide si poliozide. Oligozidele sau oligozaharideie sunt constituite dintr-un numSr relativ mic de unitaji monozaharidice (intre douft §i zece) legate covalent. Dintre oligozaharideie care se gSsesc in Jesuturile animale §i vegetale, ca atare, cele mai frecvente sunt: zaharoza, lactpza, maltoza. Oligozaharideie constituite din mai muite subunihlji monozaharidice nu se gftsesc libere; ele formeazS lanjurile laterale ale unor catene polipeptidice din •structura glicoproteinelor. Polizaharidele conjin un num&r mare de unitaji monozaharidice (de ordinul sutelor sau miilor), pe care le pot elibera prin hidrolizS. Polizaharidele cele mai rhspandite in regnul vegetal sunt amidonul §i celuloza, iar in regnul animal, glicpgenul. 294 VTL1.1. MONOZAHARIDELE Stereoizomeria monozaharidelor Compu§ii care au aceea§i formula structural# dar clifera prin configurajia spajial# sunt stereoizomeri. Stereoizomerii aparuji' ca urmare a prezenjei in molecul# a.-unui atom de carbon asimetric (C* - carbon ale card covalence sunt satisf&cute cu patru substituenji diferiji) sunt stereoizomeri optic activi. Num&rul de stereoizomeri posibiii ai umii compus conjinand n carboni asimetrici este egal cu T; Toate monohazaridde (cu excepfia cetotriozei, respectjv..dihidroxiacetona) confin in rnolecul# atomi de carbon asimetrici, fiind optic active. Prezenja unui C* tntr-o molecule face ca aceasta s# poatii exista in don# configurafii diferite, nesuperpozabile, comport&ndu-se una fajd de alta ca obiectul §i imaginea sa in oglind#, ca mana dreapte faj# de cea slang#, Moleculele ozelor sunt deci molecule chirale (chiros - man#) avand ca centra chiralic, de asimetrie, unul sau mai mulfi atomi dFclirbon asimetrici. Cea mai simple aldozil, aldotrioza (gliceraidehida), avand un singur carbon asimetric, se prezint# sub forma a doi stereoizomeri optic activi care se deosebesc intre ei exclusiv prin sensul in care rotesc planul luminii polarizate (au acelea§i propriety fizice §i chimice). Ace§ti doi stereoizomeri optic activi poartft numele de enantiomeri §i se gfisesc unul faj# de celSlalt ca obiectul fa{a de imaginea sa in oglinde, Prin convenfie, cei doi stereoizomeri ai gliceraldehidei au fost desemnaji D §i L. Configurafia absolute a celor patru subsdtuienji ai carbonului asimetric, stability prin studii de difracjre a razelor X, este redat# prin foimulele de perspective §i plane:

D - giiceraldehida L - gliceraldehida 295

2> i confinfmd doud centre de chiralitate. (doi atomi de carbon asimetrici)* se prezint# sub forma a 22 (patru) stereoizomeri optic activi care formeazd (loud perechi . de enantiomeri (I §i II): CHO CHO CHO CHO r I i | I i H C— HO C— HO H— — OH -C—H OH — C— I l l H| H C— -C—H C— C— HOHO — H— — OH I | H| OH | i CH2O CH2 CH2OH CH2OH H OH Aldopentozele confin trei. atomi de carbon asimetrici ,_gi deci se prezint# sub forma a 23 (opt) stereoizomeri optic activi grupaji in patru perechi de enantiomeri. Similar, exist# 16 aldohexoze siereoizomere grupate in opt perechi de enantiomeri. A§a cum s-a mai ardtat, stereoizomerii care difer# tntre ei prin configuratia tuturor atomilor de carboiL^asimetdci... sunt.^nandon^ri. in timp ce aceia care difer# prin configurafia a unu, maximum ;n T^af¥onf“'Tsimetnci (din totalul de n C*), sunt diastereoizomgn. Diastereoizomerii care diferd prin configurafia unui singur atom de caiton asSrietric se numesc egim^g. Schimbarea configurafiei unui C* se numejte epimerizare. Enantiomerii se deosebesc inire ei exclusiv prin sensul de rotafie a planulu; lumuiii polarizate, unghiul de rotafie fiind acela§i. Amestecul echimolecular al celor doi CHO HCOH CH2OH

D - Gliceraidehida

CHO HO-C-H HQpH CH2OH

D - Treoza CfHO HCOH HQOH H(fOH CH2OH D - Riboza

Aloza CHO HOCH HCOH HCOH HCOH CH2OH D -AltrozS CHO CHO CHO

HQ~C~H HQOH HCpH

HCOH HOCH HCOH

HOCH HOC{H HCOH

CH2OH

CH2OH

CH2OH

DArabinoza

D-XHoza

D-L ixoza

/\

/\

/\

CHO HCOH HCOH HOCH HCOH CH2OH D - Guloza CHO HOCH HCOH HOCH HCOH CH2OH D- Idoza

CH2OH D - Gatactoza CH2OH D - TaJoza Fig. Vil. 1 - Seria D a aldozeior 296 -4 CH2OH c=o CH2OH

Dihidroxiacetoni CH2OH

c*o HCOH CH2OH D- Eritruloza


c-o HCOH HCfOH HCOH CH2OH D‘ Psicoza

CH2OH C"o HOCH H§OH HCOH CH2OH D~ Fructoza

CH2OH

CH2OH

c=o . HCOH H0(fH HCOH

C s? O HOCH HOCH HCOH

CH2OH

CH2OH

CH2OH

DDSorboza Tagatoza Fig.. VII. 2 - Seria D a cetozelor enantiomeri, dextrogir §t levogir, constituie un racemic. Sinteza organic^ dS na§tere ia racemici, optic inactivi, in (imp ce natura sintetizeazd nurnai unul sau altui dintre enantiomeri, grajie stereospecificitilfii enzimelor implicate in sinteza, Diastereoizomerii se deosebesc intre ei prin propriet&file chimice §i fizice, precum §i prin valoarea unghiului sau sensul de rota{ie a planului luminii polarizate. Din motive de sistematizare, compu§ii optic activi s-au imp^rjit in doud serii sterice, D §i L, dupd inrudirea configurajionali cu un compus de referinpl. care este gliceraldehida (vezi §i aminoacizii). Se consider^ c& monozaharidele avand configuratia atpm.ylni..de^aito dej^moam^ aparfin seriei_ sterice D, iar cele avand configurafia aceluia§i atom de caftonTlenHcd cu cea a carbonuiui din L-gliceraldehidS aparfin seriei sterice L. In Fig, VII. 1 §i Fig. VII.2 sunt redate structurile stereoizomeriior aldozelor §i cetozelor aparfinand seriilor D. 297 5~ Nu toji stereoizomerii posibili se gasesc In nature. Cele mai rftspandite §i importante din punct de vedere biologic sunt aldozele D-ribozff, D-glucozS. D-galactozU §i I> manozll §i cetozele D;:rihu]pzfi §i D-fructozd (numele cetozelor se formeazS in general inserand sufixul „uiu in numele aldozei corespunzatoare). In natura se gasesc §i zaharuri aparfinand seriei L, cele mai importante §i rdspandite fiind L-fucoza §i L-sorboza, De subliniat cd apartenenfa la seria D sau L nu exprimS sensul de rotate a planului luminii polarizate de c&tre zah&rui respectiv, ci se refers la configurafia absolute a atomului de C* cel mai depdrtat de gruparea carbonil Din acest motiv este necesar ca, pe langii convenfia de simbolizare D sau L, s3 se noteze §i sensul de rotafie prin + sau Un compus aparjinSnd seriei D poate fi levogir D (~) sau dextrogir D (+). Evident, fiecare ozd aparfinand seriei D t§i aflii

enantiomerul in seria L, Ozele confinand acela§i numar de atomi de carbon §i aparfinand aceleia§i serii sterice (D sau L) se g&sesc intre ele In relafie de diastereoizomerie.

In moleeulele nionozaharidelor exist# grupari funcjionale care, In pozijii sterice convenabile, pot s# interacfioneze. Astfel, gruparea carbonil poate fi aJacat#_ nuclepfil de c&tre gruparile ~QEL(prin eleclronii nepaiticipanfi ai oxigemihii) din pozitiile 4,5. sau 6cu formarea unui compus de._adi.fie intramolecular# denumit semiacetal sau seniicefol intern; reamintim c# produsul de adifie a unui alcool la un compus carbonilic se numegte semiacetal in cazul aldehidelor §i semicetal In cazul cetonelor: o ii R — CH(R) + R'OH Gruparea hidroxil, aparutd la fostul carbon carbonilic, poart# numele de hidroxil semiacelalic sau glicozidic §i se deosebejle ca reactivate de celelalle, Reacfiile de formare a semiacetalilor pentru aldoze §i cetoze pot fi schematizate; OR’ i CH(R) OH HO CH,OH i CH2OH r/° \ i“ i. HC . —| C=0 c— I XH I I 1 (CHOH 5=*= (CHOH)„ 0 ; -—~ )„ : ij (CHOH)n (CHOH), I 1 CHOH HC -------1 CHOH 1 I 1 HC CH2OH 1 1 CH2OH ■ CH^OH CH?OH 298 .Semiac^laliL^alfimi se iormeazh' cu participarea unei gmpflri -OH situate intr-o pozi|ic relativE,fatS...dc carbonileare..SilDemilt|^|m.......samjase atomi (§i nu mai mic sau mai mare), intrucat aces tea sunt favorizate din punct de^ed&m engrfetic prin In cazul ciclurilor de cinci atomi unghiurile pentagonului sunt foarte apropiate de cele pe care le fac carbonul §1 oxigenuJ hibridizaji sp3 (108° fa$ de 109°2jQ. In. cazul ciclurilor de §ase, atomii nu sunt coplanari, generand conformed, jpaijg sau scayri, in care unghiurile sunt de(l09^) Structurile ciclice se formeazh in cazul aldohexozelor prin participarea carbonilor 1 §i 4 sau 1 §i 5, iar in cazul cetohexozelor cu participarea carbonilor 2 §\ 5 sau 2 §i 6. Structurile mongzahatildox continand numesc

furanozice (prin analogic, cu heterociclul furan) in tiinp ce acelea conjinand ciclpri de sase atomi se numesc piranorice^(prin analogic cu heterociclul piran). r GHO CHOH CH0OH CH2OH !"■ ' | I 1 I 1 CHOH CHOH C-0 COH I 10 1 i CHOH CHOH CHOH CHOH i i 1o -CHOH CH™---CHOH CHOH 11 1 | a Ho 1 l 1 1 / CHOH . CHOH CHOH CH-------} I 1 1 i 1 CH2OH CH2OH CH2OH CH2OH fur str. cetohexo str. an aidohaxozS furanozica za furanozica piran CHOH I• CHOH I. CHOH O I CHOH i '■ CH-----------------------1 I CH2OH str. piranozica CH2OH 1/—■—i COH I CHOH I CHOH 0 I ■ ' '■ CHOH CH2- - - -:—1 str. piranozica 299 Structurile piranozice sunt mai stabile. In. solute decat cele ftrangzjce, care se intalnesc, mai ales, in combinajii ale ozelor, Ca urmare a reaqiei de ciclizare piin seniiaceXalizare, fostul carbon carbonilic devine carbon asimelric putand sfi adopte douft configurajii sterice diferite. Apar doi stereoizo- meri supranumerari numijiCgnorne^, in care

1X

i -o I o

atomul de carbon care leagS gruparea -OH semiacetallcF^oaTe avea dou& configurajii diferite* (anomer a §i (3). Anomerii a se figureaza in formulele ciclice de proiecfie cu gruparea -.OH... seJ&SQ.e|.alic& de aceiasi garte a catenei de carbon ca §i oxigenul din ciclu, spre deosebire de anomerii (3. Cele doiul forme anomere pot trece una in cealaltd prin intermediul formei aciclice care, in solujie apoasd, este prezentS in cantMfi minime. Fonnele piranozice §i furanozice (a §i (3) ale glucozei (a) §i fructozei (b) sunt reprezentate in Fig. VII 3. De menjionat c<1 cei doi anomeri diferS intre ei prin propriet&Jile chimice §i fizice ca §1 prin valoarea unghiului de rotajie. Toate considerable de mai sus.cu privire la structura ozelor indreptftjesc definirea lor mai degrabB ca poliliidroxisemiacetali, respectiv polihidroxisemicetali, §i nu ca polihidroxialdehide sau polihidroxicetone. Formulele ciclice de proiecfie utilizate, cu tot avantajul claritBfii §i simplitftjii, nu Jin seama de relajiile sterice dintre atomii sau grupele de atomi din moleculB, Hgwgrth) utilizeazS structuri ciclice care Jin seama de distanjele interatomice objinute pe diagramele de diiracjie a razelor X. in reprezentarea Haworth, ciclurile furanozice §i piranozice sunt imaginate ca poiigoane regulate perpendiculare pe planul hartiei Laturile poligonului apropiate de privitor se reprezintB adesea prin linii ingrogate. In general, formulele Haworth se scriu astfel incat oxigenul s& fie situat in spatele planului hartiei. Substituenjii care se gSsesc in formulele de proiecjie in dreapta se figureazft in formulele Haworth sub planul ciclului, iar cele din stanga deasupra planului. Pentru a deduce formula Haworth a unei oze - de exemplu a Dglucozei din formula sa de proiecjie se opereazB trei modificari ale locurilor pe care le dejin in molecuLl cei trei substituenii de la carbonui 5. Se inchide ciclul semiaceMie intre guparea OILdeJaX^ si gruparea aldehidica de la C, obfinandu-se formula III care se scrie apoi conform convenjiei Haworth: H o r \# _ C H— c - OH | 1 •H— OH H— c - OH C— c H HO — - -H —— 1 —-— 1 OH H— c - OH 1 Hj C 7 OH HOH2C c - OH fl) — ^ CH2OH O 300 HO H

v C— H-C-OH HO-C-H C ! H~C------s H-C-OH ! CH2OH

P” glucofuranozS HO H v C----------H-C-OH i HO-C-H O I H-C-OH 1 H- C-----CH2OH p - glucopiranoza

CHO i H-C-OH \ HO-C-H i H-C-OH l H-C-OH 1 CH2OH

glucoza a) AT' H-COH H-C-OH I HO-C-H 1 H~C----l

H-C- OH \ CH,OH (X- giucofuranoza

CHgOH (X - glucopiranoza CH2OH HOK 1 N0—_ i HO-C-H 1 O H-C- OH j H-CCH2OH

p- fructofuranoza HO HO' HHCH2OH 0— 1 C-H C~ I CH OH OH p- fructopiranoza

CH2OH

I c**o I HO-C-H I H-C-OH i H-C-OH ! CH2OH fructoza

CH2OH I .0# CHO-C-H \ H-C~OH i -----------CH?OH CC■ fructofuranoza CH2OH I .Ort c-- - HO-C-H I H-C-OH 1 H-C-OH I CH,------£X- fructopiranoza Fig. VIL-3 - Structuriie ciciice ale giucozei (a) §i fructozei (b) 301

Structurile Haworth pentru anomerii a §i p ai glucopiranozei, galactopiranozei §i fructofuranozei se reprezinta astfel: CH2OH

CH2OH

CH2OH

a-D-fructofuranoza

Fig. VII. 4 - Conformafis scaun a unel piranoze CH2OH

(3-D-fructofuranoza Fqrmulele Haworth au a van lajul*. iajiiikxefe de?"ptbieeJIeV dc? 'pdsfra indmduahtatea atunci cand sunt unghi. De remarcat cS formulele Haworth prezlnta cicluriie ca fiind plane. Aceasta este relativ cored pentru. ciclul furanozic degi studiile de difrac|ie a razelor X efectuate pe fructofuranozS au demonstrat c3 patru din cei cinci atomi ai ciclului sunt in acelasi plan, in timp ce al cincilea iese din plan cu 0,05 nm. Cicluriie piranozice pot adopta, ca gi ciclo- hexanul, conformajii f&rS tensiune corespun- zand conformerilor' baie sau scaun. Studiile cu raze X au demonstrat ca cicluriie de §ase, conjinand un atom de oxigen, se gilsesc exclusiv in conformajie scaun (Fig. VIL4). 302 -JO

Aminozaharuri Inlocuirea in molecula unejLozfi-a unei .gmp2i:U)idj:Qxi],cu o gmpm^miEaJa nagtere la arninozaharuri. Cele mai importante aminozaharuri sunt jlucozamina, galactozarmna, §i manozamina. compusi care se gSsesc in structura gligppro^n^r/f^ofcoghcanilor si' mai departe). In proteogiicani se gasesc cu precMere sub forma N-acetilatft sau Nsulfatatfi: CH2OH CH2OH ■

CH2OH

CH2OH

NH — S03H cc-N-acetil-galactozamina N-sutfatul-galaetozaminei Prin condensarea unei molecule de manozamiml cu 0 molecula de acid piruvic rezultft acidul neuraminic: H COO — C=0 H t I H2 1 N C— G-0 — H| | HO C — CH2 — H + | CH? — CO — COOH 1 H C— 1 H— C— — OH H OH I

H —

j C— OH | CH2O H

H2N — HO — H— H—

C— Hj C— H i C— OH C— OH | CH2O H

303 -II-

; !r

\u :'S>. H: i- ■ *: i'jil CC i: j

Acilarea acidului neuraminic d<1 na§tere ia N-acilderivaJi denumiji acizi siaiici. Daca resiul acil este un rest acetil rezuM acidui N-acetil neuraminic (NANA), constituent. ■ principal al glicoproteinelor: COOH I l---------------- C — OH

I CH2 ■ 0 I . u H — C — GH I H,N — C — H i 1 -------- C — H ! H — C — OH I H — C — OH I CH2OH

acid neuraminic Dezoxizaharuri Inlocuirea unei grupari hidrox.il din molecuia unei oze cu un atom dejridrogen da na§tere la dezoxizaharuri. Un dezoxizahar important este 2dezoxiriboza, components glucidicft din structura acizilor dezoxiribonucleici (vezi acizii nucleici). Un alt dezoxizahar important, provenitdin galaciozl §i anume 6-dezoxi-(5L-galactozi1 sau (i-L-fucoza, este prezent, aiaturi de acidui sialic, in structura glicoproteinelor: CHO I HO — C — H H — C — OH I H — C OH I HO — C — H I CH3 L-fucoza p-L-fucoza

acid N-acetil-neuraminic (NANA) 304 - M~

PROPRIETAjlLE FIZICE §1 CHIMICE ALE MONOZAHARIDELOR Monozaharidele sunt sufestanfe solide, cristaiizate, solubile in solventi polar! grade num^iruIuFmai'e'ae grup«1ri . . . • Ptezen{a ~gnip^ > C = 6 §i - OH in moleeula ozelor le confer^ o reactivitate chimicd deosebitft, exprimatft in multitudinea de reacfii pc care le prezinta. in solute, diversele forme ciclice,...:e.oexisl:ft cu forma, aciclicfl. chiar dac& aceasta din urmfi nu dep<1§e§te 0,02%, fn prezenfa unui reactant specific grupSrii > C = O echilibrul s^fo QfcJtceasta se; cotisumain reacfie asffellndH iolreaga cantibUedcoztl va reactions ca un campus-carbonilic. In prezcnta unor reactanti glieozidic oza va reactiona suL formS ciclici Propriedjile chimice ale ozelor, avand interes pentru debrmmareaTor cantitativd. §i calitativli in diverse niedii biologice, nu vor fi prezentate. Vom menfiona aici exclusiv pe acelea semnificative pentru transformSrile lor metabolice. Se vor alege formele ciclice sau aciclice, funcjie de participarea efectivfl la reacjie a uneia sau altcia dintre de. 1. Red.ucerea_monozahmdelor d5 na§tere la polialcooiii corespunzStori. In organism, reacjia este catalizatfl de enzime NADH sau NADPH dependente. D-glucoza se reduce la D-glucitol (D^orbltoTJTTar' fructoza d3 na§tefela do! polioii diastereoizomeri: D- sorbitol §i D-manilol: CHO CH2OH CH2OH CH2OH | I H Lo C — OH H — G —OH HO — C-H — H O H H — C—H O - Q-H O -Q-H HO — C-H 1 -A | <— 1 “A 1 H C — OH H — C — OH H — C — H — C — OH — OH —C— H C — OH H — C — OH H OH H — — 1 1 C — OH | CH2OH CH2OH CH2OH CH2OH Dfructoz D- giucoza D-sorbitol a D-mariitol In diabetul zaharat se formeazS mail cantitdji de sorbitol, prin excelenpt in retiml, ceea ce contribute la instalarea refinopatid diabetice. 2. Oxidarea ozelor poale decurge fie la gruparea carbonii, cand se obfin acizi aldonici, fie la gruparea alcool primar, cftnd se obfin acizi uronici. Oxidarca glucozei, sub forms de ester glucozo-6-fosforic la add 6-fosfoglueonic este o reacjie catalizatft enzimatic cu care debuleazii o cale de metabolizare a glucozei avand ca scop objinerea de pentoze (vezi $untul pentozelor). Ca acceptor de

hidrogen funcfioneazd. NADPL CHO | H —C — OH

CH2

305 -13f 3.. ■" ; 3

OPO3H2

H2OS NADP4 . —(NADPH -r H+*

X i 0™ 1 o X

HO — C — H 1 H __ C — OH 1 H — C — OH j

COOH :! | H — C — OH i H — C — OH 1 H — C — OH ! '1 ;; acid-6-fosfo-giuconic CH2OPO3H2

Oxidarea energies a grupSrii alcooi primar duce la acid glucuronic §i reprezinUS o reaefie important^ utilizatS in procesele de detoxifiere sau in sinteza unor proteoglieani. ce con fin in structura lor acid glucuronic (vezi calea acizilor uronici). 3. Condensarea cu compu§i c-ontinSrid grupftri amino dS na§tere la compugi de tip baza Schiff, Interacfiunea glucozei cu grupSrile amino ale unor proteine este responsabilS de form area in organism a proteinelor glicozilate. Gradul de giicozilare a unor proteine, cum ar fi hemoglobina, constituie un test de apreciere a cantitSfii de glucozS din sange. Se considers cS in hemoglobins grupSrile amino ale valinei terminale de pe lanfurile (3 sunt glicozilate conform reaefiilor: H3C CH3

CH H3C

CH© I

x

+ H2N — valina N

— — termin als

H —

' HO — ^H—

C H 1 1 C H

CH,

CH = N— 1 i ■c — OH 1 1 C~~ HI 1 C— OH X O 1

H3C

— NH — 1

Amadori

HO —

H —

CH2

transpozi jie

H —

CH l i O 0 1

H—C— | i H© — C —H1 1 H—C— ©H i 1 H—C— ©H | i CH2mH

CH3

CHgO H

— CO —

C-01 1 C—H i C— OH 1 X 0 1 o

H— CH2OH Alterarea, prin giicozilare, a unor proteine in diabetul zaharat este incriminatS in nefropatia, neuropatia, retinopatia diabetics. 4. Esterificarea ozelor cu acid fosforic reprezintS o etapS importantS in insS§i menjinerea ozelor in celulS ca §i in metabolizarea lor ulterioarS. Printre esterii fosforici ai ozelor menjion&m glucozo-6-fosfat.ul fruidozo-^ fnicto (se utilizeazS prefixul „bis‘\ pentru desemnarea diesterilor fosforici). 306 CH2QPO3H2

a-gtucozo-6-fosfat a-fructozo-6-fosfat

a-fructozo-1,6-bisfosfat 5. Formarea gUcozkldor. Gruparea -OH seiniacetaiic& poate forma oxigeneteri cu alji compugi care confin o gmpare„-QH (de ex. cu alcooli). Compugii formaji se numesc glicozide: giicozidele glucozei sunt glucozide, ale galactozei-galactozide etc. Glicozidele se pot prezenta fie sub forma anomerului a, fie a ceiui {3. Cele dou& forme anomere ale metil -glucopiranozidului sunt: CH2OH

CH2OH

Dadi eterificarea se face cu gruparea -OH a altei oze se objin oligo- §i polizaharidele (vezi mai departe), Legarea unei componente neglucidice, desemnat&cii termenul general de aglicon, duce la oxigen-, azot-, sulf-, glicozide. De exemplu, nucleozidele sunt, a$a cum s-a arfttat, N- giicozide in care componenta monozaharidica este D-ribo- sau D-dezoxiribofuranoza iar aglicouul este o baz& azotatSL 307 /S' Importante din punct de vedere medical sunt glicozideie cardiotonice care m ca agUcon compngi steroicjici. Administrate in in.suficienta cardiacs, glicozidele cardiotonice • scad frecvenja gi cresc intensitatea bMilor inimii. Agliconii liberi (genine) nu numai cd nu suntjrizestr^cu vaioare terageutic& dar reprezintS chiar otrdvuij. ■ VII. 1.2. OIJGOZAHARIDELE

Oligozaharidele sunt compusi glucidici rezultati prin condens&rea a dou3 sau mai multor monozaharide (maximum IQV Legilturastability intre monozaharide este denature glicozMicA, Cele mai importante si abundente oligozaharide sunt, dizaharidgje.' Dizaharidele rezuM, formal, prin condensarea a douft molecule de monozaharid, care se poatejace: cu participareafambilor hidroxili semkcetalid) rezuJtandidizahaiide dicru;borHliceg (nereducStoare): . ........ . _ ✓-----—«■— - cu paidicjparealddrQxihilui semiacetalic al mzilyzfrfii a unui^idroxil alcoolifijiT) (cdellalt.e 6zB) rezu.lta.nd flizalKinde iTOnocai^^illce5^TredticArddre). f—------------------- -- -----O --------------- -1 HC H— C CHOH I CHOH O 1 CHOH I H c---------I CH2GH

CHOH I CHOH O I CHOH H c---------I CH2OH dizaharid dicarboniiic H C ~—■— CHOH I CHOH 0 CHOH I H C---------I CH2OH 0 . OH H C —----1 CHOH I CHOH O - CH I

H C --------I CH2OH dizaharid monocarbonilic 308 ff1' \l Dintre dizaharidele diearboniiiee cel mai important este zaharoza (sucroza), glucid foarte r&spandit In regnul vegetal §i anume in trestia de zah£r si xn^ sfecllt, avand o valoare nutritive deosebiUL .Zaharoza este constituitSi dintr-o molecule de a-giuc6pkanQz£..$i una de $-fTuctofuranozii legate 1 - 2, fiind un a-gIucopinifK)zido-|3~fructofuranozid (leg&tuni diglicozidicil); CH/OH Ov OH HO OH O zaharoza HCH2C

OH zaharazeil denumirtl §i [invertaziU zaharoza, Prin hidrolizS enzimatidt sub acjiunea. zah&r dextrogir ([a] ^ ~ + 66,5°), formeazS un amestec echimolecular de fructozft levogird# ([a] D = - 92°) sffiglucozji dextrogirgi ([a] jj? = + 52,5°), care va roti planul luminii polarizate spre stSnga. Acest proces de hidrolizS a zaharozei poarth, din acest moliv, §i ntimele de invertire a jfMnjliLi. Zaharoza nu prezintS proprietdfile ozelor conferite de gruparea semiacelalich, virtual ear bon il (caracter reduchtor, formare de osazone, anomerie), intruc&t ambele gruphri sunt angajate in formarea leghturii glieozidice. Dintre dizahaiid.de monocarbonilice cele mai impoilante sunt maltoza, celobiozji §i lactoza. Maliaza^rezulth formal prin eiiminarea apei infre hidroxitul ■semiaeetalie al unei mola:ule^^a-D:glucQX>Eanx)z^i hidroxi 1 ui rliii D0zitia5.....a alte-i molecule a-D^ glucopiranozd, fiind o a-glucopiranozido-4-glucopiranozh (legSturS moooglicozidich): CH2OH CH2OH

IVlaitoza 309 if Maltoza ia nagftere prin hidroliza enzimaticfl a amidonului si glicogenului. Celobioza este dizaharidul format din douft molecule de B-glucopiranoza legat.e 1,4 • fiincl o g-glucopii’anozido-4-glucopiranozfl:

Ceiobioza Celobioza ia na§tere prin hidroliza celulozei. Lactoza rezultft formal prin diminarea, unei molecule de a£ftjintre hidroxilul semiacetalic al ft-D-galactopiranozei hidroxilul din pozi(:ia 4 aiumeLmolecule de j3- glucopiranozS, fiind o (3-galacto-piranozido-4gIucopiranoz& CH20H CH2OH

Lactoza Lactoza se g&se§te !n iaptele manriferelor care o sintetizeaza din glucoza. Sub ac|iunea unei|p2gt^tozidaze}esie hidroiizatft la zaharurile componente. Dizaharidele de tip monocarbonilic prezinfd, desigur, proprietajile ozeior date de gruparea carbonil (caracter reducfttor, formare de osazone). Intrucat dispun de un hidroxil semiacetalic liber, virtual carbonil, prexinta, de asemenea, §i fettomenul de anomerie.

VII. 1.3. POLIZAHARIDELE Polizaharidele sau glicanii sunt compu§i glucidici care prin hidroliza chimicd sau &QZmMk& fonneazd monozaharide sau derivaji ai acestora (glucozamina, galacdozaminA acizi uronici, acid N-acetil - neuraminic). 310 ~/<3 Se disting:. ’ “ homoglicani - produgi de policondensare a unui singur tip de unitate_structuraia; - heteroglicani ” produgi de policondensare a mai multor tipuri de unitap structurale. Dintre homoglicani, polimerii de glucoza (glicani) sunt cei mai r&spandifi, fiind reprexentaji de celjilozd, gljcogen, amidon! Se cunosc gi polimeri ai manozei (manani), arabinozei (arabinani), galacjpzei (galactozani) etc. Dintre heteroglicani, rmiconol i zahar idele, componente ale proteoslicanilor (constituite, in general, din molecule de acid hexuronic gi hexozanime,) gi poliozidele bacteriene sunt cele mai nlspandite. Glicanii -indeplinesc roluri structurale (celuioza,. poHozidele grezente in peretele ectoplasmic al bacteriilor gi in eapMmJBlL^^ sau de depozitare a rezervelor energelice (amidonul, gljcogenul). In acest capitol se vor face referiri la structura amidonului gi a glicogenuiui. Mucopolizaharidele vor fi descrise in capitolul „Proteoglicani“. Amidonul este homoglicanul cel mai r&spandit in lumea vegetal!! unde reprezinta r^empglucidicli.princlp este eonstituit din douft componente: - amiloza, in care resturile glucozil se leagS prin legAuri a- (L41 -glueozidiee: CH2OH CHpH CH2OH CH2OH

OH OH OH OH - aniilopectina, in care resturile glucozil se leagS nu numai prin legaturi ot(M)glucozidice, ci gi prin legaturi q-( 1 AVglucozidice conferind moleculei o structura ramificata:

Masa molecular:! a amilpzei variaza de la cateva mil la jumatate de roil ion. Nu este golubilLin apa, formftnd micelii hidratate care dau cu iodul o coloratie albastra. 311 Amiloza formeazS structuri helicoidale, pasul helicei cuprinzSnd.4 - 5

rcsturi glucozil (Fig. viirs). este soiubil|ji ap3, fonpand solufo coloidale sau micelare care dau cu iodul o colomtie rosie, Prezenfa ramificajiilor in amilopectinS duce la o molecuia de. tip, globular, foarte condensajtL.(Fig. VII.6.) Glicogenul este echivalentul animal al amidonului vegetal, reprezent&id forma de depcjzitare a excesului de hidrati de carbon. Rezerve semnificative de glicogen se giisesc in muschi §i in ficat. CantitSti mici de glicogen se gftsesc in (oate- fesuturile, inciusiv in creier. Din punct de vedere al structurii, glicogenul este asem3n&tor amilopectinei, cu deosebirea c& glicogenul,. avand on numjfrm^ leglluri 1.6 y glucozidkc. este mai ramifieat. Catenele laterale sunt formate in medie din 10-15 Linitafi de glucozS, in centrul moleculei int&lnindu-se o ramificafie la 3 - 5 uni^fi de glacozS. Acest tip de organizare face ca glicogenul sd prezinte o sjructurfl arborescent^ (Fig. VII.7). Glicogenul are,, o gnasd moleculard je ordinul milioanelor. formeazil solu|ii cploidale care cu iodul dau o coloratie brun-ragcattLce nu dispttre la cald. VIL2. DIGESTIA §1 ABSORBJIA GLUCIDELOR Glucidele ne parvin din alimentajie sub forms de polizaharide (amiuon, glicogen, penlozani, celujozg), dizahmde (zaharozd, maltozit, lactoz&) §i monozaliaride (glueozS, fruclozi, galactozii, pentoze) intr-un raport procentual ce variazd cu varsta. Intrucat singura formS absorbabilil este cea de monozaharid. este necesar ca polizaharidele §i dizaharidele si fie mai intai hidrolizate la monozaharidele componente in cursul procesului de digeslie. Digestia amidonului, zaKSrul cel mai bogat: in diets, incepe prin acjiunea tffmilazei) i$airvarS)§i continue in intestinul^subjire sub acfiunea Ijmilazei pancreatic^. Ambele tipuri de amilaz£.isi incep acjiunea de la periferia moleculei spre cent.ru, desfftcand exclusiv

Fig. Vii. 5 - Structura helicoidata a amilozei 312 $ $ * : *• • a #

»** V * V .•* ***•*« « S* # ■ffif •P* #* ®* a#* *® *•* *■**„ \~-x * <& *■ is,®'® Fig. VII. 6 - Structura amiiopectinei

.* .• #« •« •.: i// ©•• ««* >•** X © «r «© /© 1 /© «© ■? '©© 1@ 1 L® #< •2 * *• »\ ••/ ® « V --V .•*: •*s •0

®a4.'

•* % // *u ® *!»/•«% 5 *-* «*• • —F « * * # •* 1 5 ©••© © © # © « •t ©* © $• © $« •• Fig. Vli. 7 - Structura glicogenului 313 legdturi 1,4 - glucozidice. Cum legdturile 1,6 ca §i cele 1,4 din vecin&tatea ramificajiiior nu pot fi desfdcute de' cdtre amilazd, produsii de digcstie a amidonului sub acjiunea' familazellvor fi maltoza §i fragmente oligozaharidice de dimensiuni variabile - dextrine Hnutd. Dextrinele limits sunt hidrolizate ulterior, sub acjiunea unei hidroiaze, amilo~l, 6-gIucozidaza, la maltozd. Ceiuloza nu poate fi digerata in tractul digestiv al omului, astfel incut ea este lipsitd de orice valoare nuti'itivli. Digestia dizaharidelor, provenite direct din alimentafie sau prin hidroliza enzimaticd a amidonului, se realizeazd in intestinul subfire sub acjiunea dizaharidazelor, enzime ce manifests specificitate pentru natura dizaharidului §i a legdturii. glucozidice. Astfel, maltoza este hidrolizatd de maltazft (ooglucoB^iz^), lactoza de lactazd (p-galactbzidazaA zaharoza de zaharazd (iFpiooz^^ . Toate aceste enzime sunt concentrate la nivelul jejunufui §i sunt sintetizate de c<1tre enterocite. Eie acfioneaza la nivelul marginii in perie a enterocitului (§i nu in lumenul intestinal), in vecindtatea sistemului de transport al monozaharidelor rezultate. De remarcat cd membrana plasmaticd a celuielor epiteliale intestinale (suprafaja apicald) are o structurd microvilard, ceea ce mdregte substantial suprafaja aclivd in procesul de digestie §i absorbjie a zaharurilor. Absorbjia monozaharidelor, respectiv a glucozei, fructozei, galactozei, inanozei ca §i a unor pentoze, se realizeazd prin sistemul port hepatic §i implied doiid mecanisme posibile: transports actitt (energodependenO, contra gradientuiui de concentrajie, $i difuzia facilitate. Transportul activ este propriu ozelor cu structurd piranozied avand la;C? aceea£ configurajieca a glucozei._s.UaX&' un^grupjp^etiL.Ml^ respectiv glucozep§i gaiadozei Se presupune cd transportul glucozei in celula intestinald se face cu

participarea unui transporter gi ar fi dependent de prezenja Na* (sistemul simpprt glucozd-sodiu). Transportoml leagd la locuii separate atat glucoza cat §i Nab Legarea Na+ create afinitatea transportorului pentru monozaharid. Odatd pdtrus in celula epiteliale intestinald prin membrana apicald (absorbtivd), la concenlrajii mici de sodiu, acesta este eliberat §i odatd cu el §i glucoza. Glucoza iese din celuld prin difuzie facilitate, mediatd de un transporter prezent in membrana bazald, iar Na+ este expulzat contra gradientuiui de concentrate prin intervenjia ATP-azei Na+, K+ dependente (Fig. VII.8). Activitatea acestei enzime, situatd In membrana bazald, permite menjinerea gradientuiui de concentrajie a Na+ §i deci reinedrearea transportorului cu glucoza. Pentru acest mecanism de transport al glucozei pledeazd faptul cd transportul acesteia.,este inhibat prin(61iabain2p cunoscut inhibitor al pompei de sodiu. Considerate anterior a fi transportatd prin difuzie facilitate, s-ar pdrea cd §i fructoza recurge la un carrier, diferit insd de cel al glucozei. Uncle constatdri experimentale contrazic mecanismele de absorbjie propose care nu par, in forma actuald, incontesiabile. 314 Lumen intestinal - Epiteliu intestinal Capiiare

ATP- aza Fig. Vii. 8 - Transports glucozei prin mucoasa intestinal# VII,2.1. DEFICITE ENZIMATICE IN DIGESTIA §1 ABSORB JIA GLUCIDELOR Exist# anumite anomalii in digeslia dizahatidelpr, determinate de deficitul enzimatic fal dizaharidazeiorjcare due la intolerant# la dizahjtride. Deficitul de lactazd duce la intoleranjd la lactoz#, cel de zaharazd la intolerant# la zaharozd. Semnele clinice ale intolerance! la dizaharide sunt eomune §i se exprim# prin/ybureri _abdominale^^iaree gmicd^jflaUile^i, -Acumuiarea in intestin a dizaharidelor, compusi osmotic activL create presiunea osmotic# §i favorizeaza intrarea apei din spafiile interslijiale in lumenul intestinal ducand la pierderi digestive de apd. Procesele fermentative declansate.deJlQm microbian# genereaz# produgi care iritd mucoasaJnjjas.tmal4. (de ex. acid lactic); in extremis, aceasta devine permeabild la dizaharide, care se vor elimina prin urind.

De menjionat c# deficienja de lactazd poate fi mogtenitd, situajie in carTse manifest# imediat dupa na§tere, sau se poate datora scaderii in limp a activitajii enzimatice. Deficitul de dizaharidaze poate fi secundar unor boll ca^enteriteJicolite^prue. Se cunoaste si un deficit de trehalaz#, evidential strict dupa ineestia de ciuperci tinere (unica sursd. de jrehalozdi. 315 VII. 3. CAILE DE METABOLIZARE A GLUCOZEI Glucoza indepline§te in organism roluri metabolice multiple care o fac indispensabila. Pe langft faptul cd reprezintS un combustibUj&xcelent peiitojesutm (quasi-exclusiv pentru jesuturile glucodependente), glucoza mai este n^cesj^ important) cum nr fi: fi Y acizi uronici - pentru sinteza de protgoglipaoi §i dBAijMSVMliJI «3mBm£lldei£0L sau exogenip glicerol si acetil-CoA utilizate in procesul de neolipagsiiez^; ' - NADPH - necesar biosintezelor reducbve; Utilizarea glucozei drept sursd de energie necesibl parcurgerea glicolizei (dejp;adarea,., incomplete, panii la lactat sau piruvat^ji a ciclului Krebs (degradarea compjetfl, pan& la CO?), Prin parcurgerea glicolizei se objin, de asemenea, elementul.de conslructie a acizilor gra§i (a^etilrCoA) §i gLiceroluL Pentoze §i NADPH se obfin in cursul desf3§ur$rii cgii 6“fosfo~gluconat, iar acizi uronici in a§a-zisa cale a^giucoronatului. hidrocarbonat al acestora (a-cetoacizii rezultaji in ciclul Krebs). Angajarea glucozei in una sau alta. dintre cSile metabolice posibile va fi decisd de starea metabolic!! a Jesutului respectiv. In faza anabolidi, caracterizatil prin abundenjft de substrate energogene, rezultat al absorbjiei postprandiale, glucoza va fi transformant in piruvat §i apoi oxidate terminal in ciclul Krebs, in vederea asigunlrii resurselor energetice ale organismului. Utilizarea glucozei drept combustibil energogen este „permisft“ in faza anabolic^ oricdrui Jesut, ala! celor glucodependente, cat §i celor glucoindependente (insulinodependente). Cu precMere in ficat, dar §i in alte jesuturi, variind cu specia, glicoliza se poate desfa^ura exclusiv in vederea objinerii elernentelor de construcjie a triglicerideior care vor fi depozitate in Jesutul adipos. Transfomiarea glucozei in triacilgliceroli, fosfolipide, §i colesterol are loc atunci cand posibilitfijile ficatului de a stoca glucoza sub formal de glicogen au fost depute (2-3 ore postprandial). In faza catabolict - in perioade interprandiale sau in cursul unei hiperactivitciji fizice sau intelectuale - glucoza nu mai reprezintS. combastibilul principal decat. pentru jesuturile glucodependente, care o objin prin glicogenolizd §i gluconeogenezd hepatica. SursS de energie pentru celelalte jesuturi devin rezervele de lipide constituite in fazfl anabolics §i, in extremis, proteinele. Metabolizarea glucozei prin oricare dinlre caile enumerate este precedata, cu obligativitate, de^fosforilare, condijie necesarft ramanerii ei in celuld. intradevSr, i) - pentoze - utilizate In sinteza nucleotidelor §i a acizilor nucleici; Sinteza de aminoacizi se realizeazft prin

316 graparea fosfat, putemic ionizatii la pH~fizioiogic, conferd molecule! de glucozo-6-fosfat o incdrcare net&jiegativli §i §anse minime de a strSbate membrana celuiara, Basforilarea glucozei, in prezen|a(^E^xaJaaator.de.-gnipai^^slatfl este o reaejie ireyersibild catalizatS de;'bexpkiMz§;'i C H CHO O j 1 i 1 H C —OH H■ C OH — — — l 1 H C —H HO c O H 1■ — — — Mg2* i H C — OH -f ATP H— c OH — 1 + Jill i hexokinaze H H— c OH — C — OH 1 — 1 CH2OPO3 CH2OH

H2

jfitexokinazei^ diverseior fesufuri sunt enzime alosterice ce se prezintd sub forma mai multor specii moieculare, majoritatea avand rmc'^peniru glucozd (prin excelenjd, izoenzima din order). Ele sunt inhibate alosteric, temporal* §i reversibil, ia coneentrajil man ale glucozp-WosfetuIui, produsul acfiunii lor. Dacd necesitajile celuiei ia un moment dat impun inhibarea uneia dintre cdile de metabolizare a glucozei, acumularea temporary de giucozo-6fosfat in eeluid va opri fosforilarea glucozei pana ce aceasta va fi consumaia, evifandu-se sechestrarea inutild a fosfatului in celula. Jiexokinazele sunt inhibate §\ de acizii graph Scdderea captarii glucozei in condifiile unei concentrajii intracelulare mari de acizi gra§i poate fi explicat'd prin prisma acestei constatdri. In float, are ioc, de asemenea, fosforilarea glucozei sub acfiunea unei hexokinaze, desemnatd drept ^xoBnaS'^|J)sau ,(|lu'coBn5z|k izoenzima majord din ■ ficat^ Spre deosebire de alte hexokinaze, care pot utiliza drept suBsCuTii al^fextizA^ucokinaza utilizeazS. exclusiv glucoza. Deosebirea fundamental^ fajd de acestea o constituie insd diferenja valorilor pentru glucozd. In limp ce hexokinazele altor fesuturi au un KM mic (-0,1 inM) deci afinitate mare penlru glucozd, glucokinaza are un KM mare (-10 mM). Valorile mici ale KM permit hexokinazelor sit lucreze la Vlmx §i sil asigure necesarul de glucozd pentru jesuturi chiar la concentrajii mici ale acesteia in sange, ceea ce este esenjial pentru Jesuturiie glucodependente. Glucokinaza hepaticd este activd numai in condijiile unui aport rnasiv de glucozd (valori peste 5 mM ale glicemiei) care, depd§ind nevoile de moment ale organismului, fi

depusd, dupd conversia la glucozo-6-fosfat, ca glicogen. La concentrajii mari de glucoza (de ex. postprandial) o hexokinazd hepaticd oarecare ar fi incapahild sd asigure fosforilarea glucozei in ritmul impus de necesitajile restabilirii glicemiei, intrucat ea este saturatd chiar la concentrajii-fiziologice de glucozd. Cum viteza de fosforilare a glucozei sub acjiunea glucokinazei create pe masura ce concentrajia intracelulard a acesteia create, glucokinaza poate fi considerate o enzima potrivitd la locul potrivit. Prezenja glucokinazei in ficat asigurd acestuia un rol central in reglarca captdrii glucozei §i menjinerea glicemiei. Fiintl o enzimd inductibild, transcrierea genei sale este 317 'io activatd de insulind, unui aporl glucidic substantial ii corespund, evident, cantitdji maxi de enzimd in ficat §i posihilitatea. restabilirii prompte a giicemiei. De^ijpreluarea glucozei de cdtr^Cjelulele^piirenchiinuJui hepatic nu este lQsulmo-dependentd, scMerea activitdtii glucokinazei in diahetjustified, aldturi de perturbarea depuneru $x ufxlxzdrix glucozei (vezi reglarea glicogenosxntezei §1 glicohzei), ingaji^ De menjionat cd glucokinaza, spre deosebire de alte hexokinaze. nu este inhibatd de glucoz£^64Qsfat; activitatea ei este controlata insd de esjerii fostolci ai Jructozei: fmctozo-6-ibsfatul §i fnictozo-1 -fosfatul cel_ diiitai comporting iar cel de_al_doilea ca activator al sdm. Acftunea acestor efectori alosterici este mediate de o proteind „3ispusd“ sd se lege la glucokinazd §i sd o inhibe; la concenlrajii rnari de fmctozo-6-fosfat acesta se leagd la proteind inducand o modificare conformajionald favorabild legdrii sale la glucokinazd in timp ce legarea fructozo-1 -fosfatului are efect invers, enzima rdmanand activd. Stimularea glucokinazei prin fructozo-l-fosfat, provenit din aportul de zaharozd, sugcreaza..dependen|a actly.itd.iii enzimei de starea nutritionald §i oferd o explicate rolului aterogen al excesului L VII.3.L GLICOLIZA (SECVENJA EMBDEN - MEYERHOF - PARNAS) Funcjia major# a glucozei in organism este aceea de a servi drept sursd de energie metabolicd. Eli'berarea energiei incorporate in molecula de glucozd se reaiizeazd fie parfial, prin degradarea sa la piruvat, fie total, prin oxidare la fco2. Oxidarea glucozei pana la piruvat presupune parcurgerea glicolizei - caie metabolicd elucidatd de cdu*e Embden, Meyerhof §i Parnas. Pinxvatul rezultat in glicolizd este oxidat in continuare paxid la C02 prin antrenarea sa in ciclul Krebs, in condijiile in cai*e {esuturile dispun de oxigen sau este redus la lactat, in condi Jiile in care aportul de oxigen este sedzut. Desfd§urarea glicolizei, proces putemic exergonic. (AG0’ =-47 kcal/mol) se rpalizeazd in.-jscopul procurdrii ATP. In condijiile unei disponibilitdti crescute de glucozd (postprandial) toate Jesuturile, inclusiv cele insulino-dependenfe (fesutul .........................................................................................adipos, xnu§chiul), vox; utiliza glucoza in vederea obtinerii resurselor enersetice. In ficat §i alte tesuturi, glicoliza reprezintd gi modaiitalea metabolicd de transform are a glucozei, oferitd in cantitdji rnari postprandial, in lipide de

rezervjL respectiv iriglfoeride, formd ideaid de depozitare a energiei la care se va face ape! in condijiile in care concentrajia glucozei in sange este redusd. Glicoliza furnizeaz# a tat components glicerol a trigiiceridelor cat §i • elementul de construcjie a acjyz^ acetifoCoA)(vezi melabolismul lipidelor). De menjionat; cd ficaiu j_utilizeazd components ghcerol (ca.. glicerolfosfot) §i in vederea ob|inerii fosfolipidelor, iar componenta acetil-CoA §i in scopul sintezei colesterolului. Ace§ti compu§i de naturd lipidied -vor fi exportaji Jesuturilor extrahepatice, cu preeddere Jesutului adipos, sub formd de lipoproteine. Secventa glicoliticd se desfd§oard in^Gitosal §i presupune urmdtoarele transformdri enzimatic catalizate: 318 n /' (K Ko \ 1 .A^onversia giucozo-6-fosfatului la fructozo*6-fosfat. Izomerizarea aglucopirajiozo-6- Tosfatului la p-fructofuranozO“6~fos*faF s~7ealizeazi sub acfiunea g;fucQzo~6~ro$Pn"\ cTzomeraze#. Enzima realizeazft izomerizarea odor dornl oze intr-o reacjie reversIBilFce necesita prezenfo ionilor de Mg2* sau Mn2+; H2O3POCH2

0H

OH 2, Fosforilarea frugtozo-6-fosfatului (P-6-P) Fosforilarea gjructofuranozQrl.,6 -bisfosf^|. (F-l, 6-P,)^ se realizeaz# tntr-o reac^kevgrsibilg' (AG°’ = - 3,4 kcal) jsatalizatii de[6fosfofructo-1 -) kin^a>(6-FF4K).^^’^ ~

OH ' OH Diiitre toate enzimele implicate in giicoliza, 16-fosfofructo-1 -kinaza^ste, atat in ficat cat in rinichi §i mu^chi, enzima cu activitatea ceTmmlegiisy"Xmpioarea degradarii hexozomonofcsfafilor depinde, in aceste tesuturi, de.viteza conversiei(|mctozo-6~fosfat -» fructozo-jU^bisfosfat, care este dec? etapa limitantft de-j/itezilin giicoliza. 6-Fosfofructo-i-kinaza este o enzim&~aiosteric2 a carei activitate este controlata de numerogi efectori metabolici, pozitivi sau negativi. Astfel, 6-fosfofructo-J.ddnaza este sgns^bi^ .energe.ti.ee a celulei, ATP comportandu-se ca inhibitor alosteria Concentrajiile mari de ATP intraeelular inhiM activitatea enzimei prin legarea la un situs alosteric, difent de locuf^Sv^cel^^AlP^ ca substrat, sub forma complexului iMg 2+-ATP. / 1 Forma anomerica preferata de enzimele glicolizei. (ca gi de cele ale ^untului pentozelor) este forma (k aga cum atesta studii recente de cinelica

enzimalica gi RMN. 319 De menjionat ca AMP (ca §i ADP) se comportd ca efector poziiiv, suprimand inhibijia pria ATP. Constat area eft in mu^chi fluxul glicolitic poale varia de peste 100 de ori in tisnp ce coneentraj'ia ATP variazd cu mai pujin de 10% in irecerea de la stanea de repaos la activitate intense poate ft explicate prin consideraiea activitdjii adenilat kinazei (miokinaza). Aceastd enzimd, preeminent^ In mu§chi (dar §i in float §i alte Jesuturi), converted ADP rezultatin cursul contracjiei musculare in ATf §i AMP: 2ADP ^ ATP + AMP, IntrucSt concentrajia ATP este de aproximativ 10 ori mai mate decat cea a ADP §i de aproximativ 50 de ori mai mare decat a. AMP este u§or de injeles cd semnalul metabolic reprezentat: de variajii minore in concentrajia ATP este amplifleat, fiind perceput ia nivelul activitdjii miokinazei in concentrajia ADP, dar mai ales in concentrajia AMP care se modified major : ([AMP] = [ADP]2 • Kccb/[ATP]); astfel, o crejtere procentual minord in concentrajia ATP, incapabild sd inhibe substantial activitatea 6-fruct.ozo-l -kinazei, antreneazd o seddere procentual majord a concentrajiei AMP, suficienld pentru a deprima semnificativ activitatea enzimei, cf>Fosfofructo-l:kinaza| este inhibatd. de asemenea, de fnafoenolgmivat §i 1,3._ llisfosfoglicerat, intermediari macroergi,ei.mi,.gMcoIizei. Dependenta activitdjii 6-fosfofructo-1 -kinazei de modiflcdri minore in statpsul energetic^ celulaijpeimite un control riguros al cantildju de glucozd antrenatd in glicoliza. A5 Un inhibitor pateniic nl enzimei s-a dovedit a iiMcMtik care acceiitu.eazd inhibijia prin ,v#' \ ATP, Citratul, internediar a! ciclului Krebs, format din acetiTCpA provenit in faza ,n j anabolied din piruvat, recle din glucozd, se acumuleazd la concentrajii man de ATP (vezi 1 reglarea ciclului Krebs) §i iese in citosol unde inhibd. enzima cheie a giicolizei. Hfecti.il \ Pasteur - respectiv inhibijia giicolizei prin respirajie - ar putea avea aceastd explicajie. In Jesuturile ettre fac sintezd de acizi gra§i din glucozd, citratul ie§it in citosol serve§te ca donator de grupdri acelil §i totodatd ca activator alosteric al enzimei cheie a procesului- de neolipogenezd. Acumularea de citrat in citosol reprezintd semnalul celular al satisfacerii nevoilor energetice ale fesuturilor ca §i al necesarului de int:ermed.iari biosintetici al acestora. Inhibijia prin citrat a 6-fosfofnicto-l-kinazei are §i o alia rajiune in jesuturile care utilizeazd de preferinjd acizii gm§i ca sursd energetied (mu§chiul scheletic §i cardiac) ca §i in jesuturile glucoindependente in perioadele catabolice. in fazd catabolicd raportul glucagon insulind mare, care-i este propriu, activeazd lipoliza in Jesutul adipos avand ca rezultat aflux de acizi gra§i spre Jesuturi. Degradarea acestora prin (Toxidare dace la acetil-CoA mitosolic care este introdus in ciclul Krebs, via oxaloacctat, sub foimd de citrat. Cfrnd concentrajia de citrat depd§e§ie posibilitdjile de utilizare In ciclul Krebs, citratul acumulat iese in citosol §i, desigur, inhibd 6- FF-i-K, ceea ce se soldeazd cu acumulare de glucozo-6-fosfat, inhibitor alosteric al hcxokinazelor extrahepatice. Reducerea capacitdjii de preluare a glucozei din circulajie, subseeventd utilizdrii acizilor gra§i, reprezintd una dintre modalitdjile prin care jesuturile glucoindependente cmjd glucoza sangvind

care, in condijii de austeritate glucidicd, trebuie sd satis feed, exclusiv, necesitdjile jesutuiilor glucodependente. 320 cA.0 4 O particularitafe important^ a, 6-fosfotructo-l-kmazei)o reprezintS activarea prin produsLii ac^uiw^sale, dructozo -1, 6-bisfosfa tuk ~~ AceastS stimulare prin produs final (feed-back stimulare, proces rarintalnit, opus feed- back inhibijiei) prezintS-un interes-major in truest Sxuctozo-1 .■■6-bisfosfataj)este in acelagi timp un inhibitor al fructozo-l, 6bisiostatazeu enzimS ce catalizeazS reaefia inverse, de form are a imcto^-6fosfatuluhdin tfructozo-l»^6^^os|ay Cum aceste douS enzime reprezintS puncte cheie in controlul /glicolizeijgi giuconeoggnezei (GNG), cSi antagoniste ce nu trebuie sS se desfS§oare simultan la viteze comparabile, se poate imagina important reglatoare a fenomenului descris (vezi reglarea gluconeogenezei). Efectorui alosteric poxitiv cel. mai eficient al fS-fosfofructO“ 1 -kinazei]hepalice s-a dovedit a fi((Snct^-2^bis^S^(F-2, 6-P2) care actioneazS sinergic cu AMP (Fig, V1I.9); el cre§te afinitatea enzimei pentru substratui sSu scSzand-o insa pe cea pentru efectorii alosterici negativi ai acesteia: citratul §i ATP, MolecuiScu rol de semnal, de integrator metabolic, F-2, 6~P2 este sintetizat §i degradat de cStre 0 enzimS bifuncJionalS: fosfofructo-2kinaza/fructozo-2, 6-bisfosfataza (FF-2- K/F-2, 6-P2-aza), Enzima, izolatS §i secvenJializatS, cuprinde 470 de aminoacizi care pot fi divizaji in douS domenii: domeniul 'kinazic, aminoterminal (reziduurile 1-249) §i domeniul fosfatazic:carboxito 250-470). Enzima este reglatS covalent, prin interconversie fosfo -defosfo, Prin fosforilare, sub aejiunea proteinkinazei A, AMPC dependents, activitatea kinazicS scade in timp ce activitatea fosfatazicS create. Concentrafia hepaticS de fructozo-2,6-bisfosfat este controlatS de doi factor! §i anume: fructgzo-b-fosfatul §i AMP^.C55e^ mesager secund al imor hormoni (vezi Hormoni). Fructozo-6-fosfatul create concentrafia de fructozo-2, 6-bisfosfat prin activarea alostericS a fosfofructo-2-kinazei §i inhibitia fructozo-2,6bisfosfatazei; AMPC scade concentrafia de fructozo-2,6-bisfosfat, inactivand, via proteinkinaza-AMPc dependents, fosfofructo-2-kinaza (inactivS in forms fosfo) §i activand simultan fructozo- 2,6-bisfosfataza (activS in formS fosfo) (Fig. VII. 10). Dependent concentrafiei de fructozo-2,6-bisfosfat de AMPc lace 6fosfofructo-l- kinaza susceptibilS la control hormonal §i explicit cel pujin parjial, efectul glucagonului §i insulinei asupra glicolizei, gluconeogenezei §i lipogenezei. ScSzSnd concentra]ia lrmctozo-256bisfosESuIuTr^Tiva7oFal^TdsTolfucb-i-kinazei §1 inhibitor al fructozo-1,6bisfosfatazei, glucagonul inhibS glicoliza §i lipogeneza §i activeazS gluconeogeneza. Dependenta conceniratiei de fructQzo-2T6-blsfosfat de-factori nutritipnali

(concentrajia de fructozo-6-fosfat, respectiv de glucozo-6-fosfat) gH^monali. (prezenja sau absen{a glucagonului) face_ca fructozo-2,6-bisfosfatul sS fie considerat serpnal • de abundenjS glucidicS, in contrastcu AMPc, considerat semnal. de absents a glucozei (hunger signal). Fructozo-2,6-bisfosfat5 va decide fluxul de substrate fie . ..glicolizS fie spre glucpneogenezS. Concentratiile fructozo-2,6-bisfosfatului sunt redass injinanifie §i diabet. Se considers cS aejiunea unor factori|pitQgeniJancogeni sifeomotori tumoralLasupra glicolizei s-ar rcaliza prin controlul activitSlii FF-2-K/F-2,6P 2aza. 321 : ■i ;. i

: •; '23 ■ I

i: ii-

Fig. VIL 9 - Activarea atosterica a 6-fosfofructo-1 -kinazei prin AMP §i fructozo-2,6 bisfosfat a - cinetica sigmoidala devine hiperbolica b - efectui sinergic al AMP §i F-2,6P2 v Fructozo 6-fosfat 6-EE -2-K/ F2,&-P2"

6~EE -2~K/F2f6-P2~ aza

322 - 3D 3. Scindarea. fructozo- 1^6-bisfp^fatului Fructozo-1,6-bisfosfatul este scindat la doud trioze: glicgraldehid-3-fosfat §i dihidroxiaccton-fosfat, intr-o reacfie reversibild catalizatd de o liazd. fructozo-1,6^ - bisfosfat iiaza sau aldolaza:

CH2O®

I C=0

CHO

I + CHOH CH2OH CH2O0 Intre esteriifosforici ai triozelor objinute se stabilegte un echilibru, conversia unuia.in celdlalt fund catalizatd de o triozofosfat izomerazd: CH2OH CHO 1 I 1 C-0 —CHOH j | CH2O0 CH20® Cum forma aldehidicd este foarte reactlvd, toate transformdrile ulterioare vor avea ca punct de plecare gBceFaIdehid-3-fosfatul fapt ce implied deplasarea echilibrului de mai susjn geji^urautilkgrii jale. 4, Oxidarea fosforilanta a gliceraldehid-3-fosfatului ___ Qxidarea gliceraldehid-3-fosfatului la 3-fosfoglicerat este catalizatd defidceraldehid-i) iosfat dchidrog§iBzLsi implied participarea obligatorie in procesul catalitic a unor grupdri sulfhidril ce coopereazd cu iNADj legat ferm de enzimd (spre deosebire de aite dehidrogenaze NAD dependente), Enzima este mhibatd de iodpacetat §i alfi reactivi liplici. Procesul de oxidare presupune urnidtoarele etape: a. adi{;ia^unepgrupdr^-SH din central activ al enzimei la gliceraldehid-3fosfat, cu form area unui semitiaacetal (analog semiacetalilor) §i oxidarea

serpitioacetaluliiipp seaipfl NAD legat, cu form area unui tioester: HH

b. fosforoliza tioesterului cu formarea 13-bisfp?fogliceratu 1 ui si eliberarea grupdrii -SH 323 a enzimei: HH

PO,H3

c. depIasare:a^_NADH .legal

decApe^N^

CONH2

NAD+ NADH + H+ SH

oo

De remarcat c&, 1.3-bisfosfogliceratul confine o legftturft aciifosfat macroemc# (prin hidroliz# elibereaz# 12 kcal/mol). Cum leg&tura fosfat-terminald a ATP este de ordinal a 8 kcal/mol, rezultS posibilitatea formdrii unei molecule de ATP prin transferul restului fosforil de pe 1,3-bisfosfoglicerat pe ADP (fosforilare la nivelul substxatului). Reacjia este catalizat# de Jfosfoglicerat leinaz#3 COOH' 1 1 X OPO...K -i- ADP MgCHOH CHOH i CH2O0 CH2O0+ ATP Desf3§urarea etapei; gliceraldehid-3-fosfat + Ps + ADP + NAD+ -> 3fosfoglicerat + ATP + NADH- + H+ implied necesitatea reoxidarii permanente a NADH rezuilat in cursul glicolizei ce se desfd§oar& in citosol O deviere a 1,3-bisfosfogliceratului (1,3 BPG) din calea glieolitica, paradoxal# la prima vedere intruc&t. se soldeaz# cu risipd de energie (ATP),

decurge in eritrocif. 1,3-Bisfosfoglice- ratui este convertit sub aejiunea unei mutaze specifice la 2,3-bisfosfoglicerat apoi la 3fosfoglicerat sub aejiunea aceleia§i enzime care manifest# §i activitate fosfalazic# (Fig. VII-11). Glucoza G/iceraldehid -3 - P Pa-w -NAD + T" K NADH + H + 1, 3 - Bisfosfoglicerat mutaza 1, 3- Bisfosfoglicerat ADR \ y 3-fosfoglicerat kinaza 2,3- Bisfosfoglicerat ATP Pa 3-Fosfoglicerat 2,3Bisfosfoglicerat fosfataza 2-Fosfoglicerat . Lactat >Fig. Vli, 11 - §untul 2,3-bisfosfogiicerat krnazei in eritrocit (by pass~ul 3fosfoglicerat kinazei) 2,3-Bisfosfogliceraj-ul este un ester bisfosforic esenjiai in exercitarea ......................................................................................fuacXtel.. de transpwtor^oxigen a^h^iaglobiB^L Acest; ligand (efector alosteric), prezent in eritrocit la concentratii ecliimoleculare cu hemoglobina, scade marcat afinitatea acesteia pentru oxigen, favorizand disocierea complexului Hb.40x§i deci oxigenarea jesuturilor. Din cantitatea de glucozft angajatd in glicolizd aproximativ 25 la sut& urmeazft in eritrocit §untul 2,3-bisfosfoglicerat. Viteza de desfe§lSmFe'Ti^picolizei modified, desigur, afinitatea pentru oxigen a hemoglobinei; deficite enzimatice in glicolizd pot dace fie la cre§terea, fie la sedderea eoncentrajiei de 2,3-bisfosfoglicerat, funefie de situarea deficitului - inainte de sinteza 1,3-bisfosfogliceratului (seddere) sau dupd (cregtere, prin acumularea produgilor netransformaji). Astfel, in deficitul genetic al hexokinazei eri'trocitare afinitatea hemoglobinei pentru oxigen este crescuta iar oferta de oxigen cdtre fesuturi sedzutd. Eritrocitul insu§i este victima acestui deficit enzimatic intrucat blocarea glicolizei in chiar etapa de debut ii scade dramatic §ansa de a obfine ATP necesar funefiondrii pompelor ionice, rezulfatul fiind swellingul eritrocitului §i liza ulferioaid.

10

Diminuarea producerii de ATP in eritrocit, ca rezultat al parcurgerii seevenfei 1,3- bisfosfoglicerat —» 2,3-bisfosfoglicerat 3-fosfoglicerat, face posibild desfd§urarea glicolizei §i implicit menfinerea unei concentratii optime de 2, 3-bisfosfoglicerat chiar in condifiile in care necesitdjile de ATP ale eritrocitului sunt reduse. 325 5. Transformarea 3-fosfogliceratului in 2Tfosfoglicerat sub acfiunea unei mutazespecifice - fosfoglicerat mutaza - in prezenja obligatorie a Mg2+: COOH COOH CHOH CHO® 1 ^ 1 CH2C(P) CH2OH 6. Tranrfom Intr-o prima etapa, reacfia implicafconversia 2-fosfogliceratului la 2fosfoejiolpiruyat v sub acjiunea unei lenblazej enzimS care necesita prezenfa Mg2+ §i este, ca atare, susceptibiia la mhibifta prin _ fluoruri: COOH COOH CHO -**---® 1 - H20 II CH2OH CH2 Recoltarea sangelui in vederea determinarii glucozei se face pe o fluorurd, tocmai pentru a inhiba utilizarea glucozei de cfttre eritrocite. 2-Fosfoenolpinivatul este un compus macroergic; leg&tura enolfosfat elibereaza prin hi^oRzil„^-I4..kcal/mol, in prezenfa Spiruvat. kinazeugrupareajosforil este transferatape ADP cu formarea unei molecule de ATP. in aceastS etapa a glicolizei se formeaztt ojioua,molecdd de ATP prin fosforilare... la nivelul substratului: COOH i 1 C —0-0 + ADP II

COOH i K* ■ ------■*»“— Mg2*(M n2t)

1 C - 0 + ATP i

CH3 • Piruvat kinaza se prezinta sub forma a jfouft flzoenzimS de tipJL, proprie ficatului, §1 de tip M, proprie mu$chiului, izoenzimele de tip L sunt enzime alosterice, tetrameri, suscgptibile la acfiunea a numero^.i efectori metaboJigi: etapa catalizata de piruvat kinaza reprezinta, din acest motiv, un punct de control important al caii glicolitice. Printre efectorii .enzimei hepatice se numara fructozo-1, 6-bisfosfatul care funcjioneaza ca activatoijffiActivarea unei etape dintr-o secventadereactii printr-un metabolit, .........................................................................................substrat al unei etape anterioare poarta numele de feed-forward stimulare. Exptimand. activitatea enzimei limitanta de vitezd, fructozo-1, 64)isfosMul 3reviiiea enzima, situata. in aval, asupra cantitatii de fosfoenolpiruvat caieia CH2

va trebui sa-i facd faff. ajuslflndu-i corespunzto^ Aiaturi de feed-back inhibifie §i feed-back stimulare. feed forward stimularea reprezinta o modalitate de realizais a unor inJ®c|im.„metabolice .complexe avand ca scop desf3§urarea armonioasa a proceselor vitale (vezi reglarea gluconeogenezei). 326 Piruvat kinaza (ca. §i fosfofructo-1 -kinaza) este inhibatd. alosteric de cStre ATP, Alanina - aminoacid glucoformator - este gi ea un inhibitor putemi.c.af.fenzimei hepatice, ca §i acd CoA §i acetilCoA. Piruvat kinaza hepaticS este o enzijnS interconvertibilS jnaciivS in form#.,, foslo, promovatS de glucagon §i catecolamine via protein kinaza A, AMP C dependents, gi activS in formS defosfo, promovatS de* msulinS. De remarcat cS msulina funcJioneazS gi ca inductor al enzimei,. activ&nd' transcrierea genei ................................................................ce:i.^.coresp,undie, in limp ce glucagonul acfioneazS ca represor. Piruvatul rezultat pnrTparcurgerea cSii Embden-Meyerhof poate fi redus 3a lactat in conditii de relative anaerobiozS (in mugchiul in contracjie, ficat, rinichi) sau in..J^uJ_ujri care nu dispun de echi£^entul enzimatic ,necesari metabolizSrii aQrob^ a piruvatului (retina, jcsuturile embrionare sau neoglazice, hematiile, fibrele _ musculare jtlfoe)- Reducerea se face pe seama NADH rezultat in etapa de oxidare a gliceraldehid-3- fosfatului, fapt care asigurS reoxidarea NADH gi dec! posibilitatea desfS^urSrii glicolizei, respectiv furnizarea de ATP, in absenfa 02; COOH LDH ! + + NADH + H _____» CHOH + NAD* I CH3 Lactatul este ..trimis“ pe calc smmm& ficatului, miocardului gi rinichiuluj unde se reox.ide.azS, in prezenta LDH, la piruvat• care va servi ca substrat pentru gluconeogenezS. G.lucoza rezultatS din lactatul muscular poate fi furnizatS mugchiului, care o va utiliza, formand din nou lactat (vezi ciclul C.ori). Abiiitatea glicolizei de a funcjiona in conditii de anaerobiozS o consacrS drept cale unicS de supraviejuire (sintezS de ATP) pentru unde Jesuturi intr-o astfel de conjuncturS. Mai mult, prezenja enzimelor glicolizei in concentrajii man ii permite acestei cSi sS producS ATP mult mai rapid decat o face degradarea aerobS, chiar -dacS producerea de ATP este mai eficientS in prezenja oxigenului. De menjionat cS functionarea glicolizei este limhatS^ care-gi deprimS activitatea la pH mai mic de 7,. In condijii de aerobiozS, piruvatul este convertit la acetil ~CoA care va servi ca subslrai^alciclului Krebs, asigurandu-se astfel NADHLrezultat in glicplizS este reoxidat in lanjul respirator (vezi metabolism energetic). In ficat, acetil -CoA rezultatS din jduQOzA, in cadrul procesului de neolipoaenezS. In Fig, VII, 12 este redatS schema generals a glicolizei. COOH

I c-oI CH3

327 -bfr Glucoza ATP — ADP hexokinaza giucokinaza "O . Glucozo 1 -P Glicogen Glucozo 6-P t Fructozo 6-P ATP ADP •* 6FF-1-K Qi-----ATP, citrat (+)'-------------------AMP, fructozo-2,6-bisfosfat Fructozo 1,6-bisfosfat- -Citoplasma 2xGliceraidehid~3-P - 2xNAD+ -2xNADH + H+ 2x1,3-bisfosfoglicerat 2ADP — I 2ATP 2x3-Fosfoglicerat 2x2-Fosfoglicerat 2x2-Fosfoenoipiruvat 2ADP2 ATP l . Piruvatkinaza 0 2 x Plruvat —ATP, alanina

NAD 2 xLactat NAD + Citrat Oxaloacetat Acetil-CoA

I Acizi grasi I Liplde Fig. VII. 12 - Glicoliza (reacjii §i reglarea procesului) BILANJU'L ENERGETIC AL GLICOLIZEI Degradarea glucozei pane ia lactat reprezintS un proces exergonic ce eiibereaz& o cantitate redusft din conjinutul energetic ai glucozei. Energia eliberate_ este partial incorporate sub forma de ATP. De remarcat c8. in procesul de glicoliza anaerobe energia nu se,_elibereaze prin oxidarea -NADH la niveiul. lanjului respirator, urmate de cuplarea cu fosforilarea, ci exciusiv ..substratulni. In aceste 328 —condifii glicoliza isi asigurd „pe cent propriu" reoxidarea echivalenfilor reduedtori, MAOH^rezultat in^et^a glicgraldehidfosfat dehidrogenazieg. fiind reoxidat la NAD, in cursul readier de tregere a miniva^^ Etapele de fosforilare la nivelul substratului, in care energia incorporate infoun substrat macroergi'c este transferatd ADP, cu form area ATP, sunt: - conversia 1,3-bisfosfoghceratului la 3-fosfoglicerat;' - cqny^rsia.fosfp^ la piruvat. Cum dintr-o molecule de glucozd rezultd dou3 molecule de.trioze, cantitatea de ATP formate este de 4 ^ .glucozd fransformatd in lactat. Cagtigul energetic net este insd de numai moli ATP dacd^degradarea pornegte de la glucozdj intrucat reacfiile catalizate de kina/e ?i aiiurne: ATP glucoza------------------------------^ glucdzo-6-fosfat *■ ATP fructozo~6-fosfat ----------------fructozo-1, 6-bisfosfat . s gmsurngf^ moli ATP) Daed degradarea pome§te de la glicogen cajtigul net este de .Mali AJP intrucat gkicozo-6Tosfatul se obtine prin fosforoliza glicogenului, neconsuma- toare de ATP. Considered cd energia eiiberatd ia hidroliza iegdturii fosfat terminate din ATP este de 73 keal/mol, cantitatea de energie eiiberatd in cursul glicolizei este de 73x2=14,6 keal/mol glucozd, respectiv 73x3=21,9 keal/mol glucozS. Caotdatea. de energie eiiberatd este. relatiy mied, astfel incat glicoliza anaerobd pare neayantajoasd. din punct dej/edere energetic, Viteza foaite mare a fluxului. glicqUtic. permite insd funxizarea unei cantitlgi de energie care sit satisfacd, cel pu{in pentru perioade relativ scurte, necesitdjile energetice ale fesuturilor in absenfa oxigenului. Consumul crescut de glucozd face totu§i din glicolizd o cale neecqnomicd. Dacd anaerobioza este de scurtd duratd §i in sistem apare oxigen, lactatul este oxidat la piruvat. In condijii de aerobiozd piruvatul, format prin parcurgerea edii Embden- Meyerhof de cdtre glucozil, este oxidat pand la C02 §i H20 in scopul eliberdrii integrate a energiei incorporate in molecula glucozei. Oxidarea finald a oriedrui metabolit presupune antrenarea acestuia

in ciclul Krebs, Admisia piruvatului in ciclul Krebs implied conversia la acetil ~CoA §i se realizeazd prin decarboxilarea sa oxidativd in matrixul mitosolic. Transpoitul piruvatului in mitosol este efectuat de un transporter specialize §\ presupune cotranspoitul unui proton (mecanism simport). VII.3.2. DECARBOXILAREA OXIDATIVA A PIRUVATULUI Este un proces mitosolic complex ce presupune colaborarea urmdtoarelor enzime: (Eju §i cofactori: - - piruvat dehidroggnaza (decarboxilantd), constituitd din doud subunitdlii: E.l0C §i EjP avand ca grupare prostetied tiamin pirofosfatul (TPP): 329 - E2 - lipoil reductaz transacetilaza, avand ca.. grupare prostetica acidul lipoic. De menjionat cS acidjiHipok se leagS la enzimS prin gruparea £ - amino a unei molecule ■ de lizi.nl; s---s (CH2)4 — CO — NH ~ CH2 — CH2 — CH2 — CH2 — CH — CO NH — - Ea^~ lipoiLdehidxQgenaza, avand ca grupare prpstetic^ F^. - kinaza AMEe independent: fosfataza specific^, dependent de Ca2* §i Mg2*, asociatii, tranzitoriu, complexului. Aceste enzime aicrituiesc un sistem multienzimatic, cu un aranjament spajial rigid, care poartii numele de comglexu]Structural §i functional diferite, fM sft fie legate covalent, enzimele componente catalizeazft etapele succesiye ce due la objinerpa acetil_~CgA din piruvat, Complexul are p masa molecular# de aproxixnativ 5 x ID3 k.D §i conjine un foarte mare num&r de copii din fiecare enzimtl Decarboxilarea piruvatului necesitd aditia TPP la piruvat - adifie efectuata ca urmare a unui atac nucleofil realizat de.ionul iljdL forma ionizatft a nucleului tiazolic ai TPP, asupra cmitojiuluLfiM .: C + CH3 — C — COOH II O H+ i CH, HOOC — C ' "S i OH Compusul de adifie se decarboxileaz3 cu-formarea acetaldehidei- active: + S NCH, C07 HOOC — C x S

I OH pi o< V CH I H—C I OH Reacfia este catalizakl de subunitatea a a E,, UrmeazS etapa de oxidate proptiu-zisfi. constand in pierderea_„hi.drogenului’ §i tonsformarea acetaldehidei in radical aeet.il Reacjia este catalizatft de subunitatea [3 a pjruvat dehidrogenazei (E,). Cum reaejia se desOi§oarii in prezenja acidului lipoic, se 330 '03 formeaz# agid...j^cetiLdipoic. De remarcat faptui c# energia eliberat# prin oxidare se reg&se§te in tioesterii care se formeaz# (acetil ~ lipoic §i apoi acetil -CoA).

OH Radicalul acetil, temporar legat la acidul lipoic, este transferal coenzimei A cu form area acetil-CoA-tioester macroergic: SH S ~ COCK SH SH 4- CoASH + CH* — C o SCoA Acidul lipoic astfei redus se reoxideaz# in prezenja lipoat dehidrogenazei, flavin enzim# ce transfer# hidrogenul acidului lipoic pe FAD, SH SH S ----------------------------.s + FAD + ■ FADH2 Atomii de hidrogen din FADH2 sunt apoi transferafi pe NAD. Reacfia global# a decarboxildrii oxidative a piruvatului: CH3COCOOH + NAD* + CoASH ^ CH3CO - SCoA + NADH + H+ + C02 este o reacfie ireversibil# avand un AG°* foarte negativ (-8 kcal). Ireversibilitatea acestei reacjii constituie motivul pentru care acizii gra§i cu numSr par de atomi de carbon sau divert aminoacizi ce formeaz# prin degradare acetil -CoA nu sunt glucoformatori (vezi gluconeogeneza).

331 De menjionat cS in avitaminoza B, decarbo?$ais^ realiza prin lipsa TPP, ceea ce are grave repereusiuni asupra in sitiiajiaj^^nu jutea^M Defi ci tul,, si stem u! ui vat dehidrog este responsabil de fenomeneje nervoase ce caracterizeazS boaia beriberi (in dialect indonezian = nu pot! — exprimand deficitul jieuro-muspplar) dar §i pejnarii amafori de aicooL Enzimeie implicate in decarboxilarea oxidativS a piruvatului, §i anume: piruvat dehidrogenaza, lipoil reductaz transacetilaza §i lipoatdehidrqgenaza, alc&tuiesc, a§a cum s-a ar&fat, un sistern^multienzimatic cu o determinaae Pe .jniezuT sistemului, reprezentat de lipoil reductaz transacetilazS, sunt ancorate celelalte douS enzime. Transfonnarea substratelor presupune ca acestea sS fie purtate succesiv la enzimeie sistemului, Intr-adevSr, operajiunea este realizatS de eSire acidul lipoic legal la radical ul lizil din molecula lipoil reductaz transacetilazei care realizeazS astfel un „braj“ flexibil de aproximativ 1,4 nm: S "--- S

CH2—CH2~~CH2—CO — NH—CH2—CH2—CH2—CH2—OH — CO — NH — Acest „hraf£ incSrcat efectueazS o migcare de „du-te vino“ intre grupSrile prostetice ale sistemului multienzimatic in cursul cSreia fiecare enzimS i§i realizeazS acjiunea, produsul unei reac^ii enzimatic cataiizate devenind substrat pentru urmStoarea enzimS, fSrfi sS difuzeze din complex (Fig. VII. 13). Grganizarea color trei enzime intr-un sistem multienzimatic confers o eficienfS deosebitS procesului catalitic, excluzand hazardul coiiziunii substratelor cu enzimeie respective, pe care bar presupune existenja acestora in stare liberS. CercetSri recente au evidential faptul cS la mamifere sistemul piruvat dehidrogenazS este sediul unui control metabolic riguros realizat atat prin efectori alosterici cat §i prin modificare covalenlS, respectiv prin trecerea reversibilS a formei fosfo in defosfo. Conversia defosfo-piruvat dehidrogenazei la fosfo-piruvat dehidrogenazS se realizeazS in prezenja unei kinaze, AMPC independents, parte integrants a complexului multienzimatic, §i coincide cu innctivarea enzimei, in limp ce conversia fosfo-piruvat dehidrogenazei la defosfo -enzimS este catalizatS de o fosfatazS specifics §i duce la activarea enzimei. Forma activS, defosfo, a complexului piruvat dehidrogenazS este inhibatS alosteric de produ§ii acjiunii sale, acetil ~CoA §i NADH care sunt in acela§i timp §i activatori 332 alosterici, ca §i ATP, ai piruvat dehidrogenaz-kinazei, enzixM ce fosforileazft subunitatea Ela a piruvat dehidrogenazei, inhiband-o. Spre deosebire de acetil CoA §i. NApfl. piruvatuL ca §i CoA-§i NAD, substrate ale complexului multienzimatic, ina.ctiveazfi, la ^oaenlxalMjIiari,

piruvat dehidrogenaz- kinaza. Simultan, are loc reactivarea complexului pimvat dehidrogenazS. prin legarea §i activarea piruvat dchidrogenaz fosfatazei promovatH de Ca2+ crescut, ca expresie a scftderii concentrajiei ATP (Fig. VII. 14). Aprecierea dependent activit&jii complexului piruvat dehidrogenazii de rapoxturile moiare acetil CoA/CoA, NADH/NAD duce la concluzia al metabolizarea piruvatului la acetil-CoA este deprimaUl in condijii de austeritate glucidicd, situate in care Jesuturile glucoindependente recurg la. acizii gra§i ca surs5 energetical; acetil-CoA §i NADH, rezultate prin (i oxidarea acizilor gra§i, inactiveazS complexul piruvat dehidrogenazS f3c3nd imposibilft utilizarea energetics a piruvatului (proven.it, in spe$, din lactat §i alaninS) care se va orienta spre gluconeogenezS. In faza anabolics, activitatea complexului piruvat dehidrogenazS este crescuta cand necesitS{ile energetice crescute impun antrenarea unor cantit&Ji mai mari de acetil-CoA, de sorginte glucidicS, in ciclul Krebs. VIL3.3. CICLUL ACIZILOR TRICARBOXILICI (CICLUL KREBS) Ciclul acizilor tricarboxilici (ciclul acidului citric! reprezintS o succesiune de reaclii prin parcurgerea cSrei'a fragmentul acetil - CoA este oxidat pans la CP2, Etapele ciclului au fost postulate §i demonstrate ulterior de ciitre Hans Krebs care, cu capva ani inainte, elucidase etapele procesului de ureogenezl Introducerea fragmentului acetil-CoA !n ciclul Krebs se realizeaza prin condsnsarea sa cu oxaloacetatul. Parcurgerea acestui ciclu, unnatg de oxidarea hidrogenului in iasatul respirator, se sojdeazg cu oxidarea totalS-a.aQ^t,jl-CQA. (in cursul cdreia se formeazi 12 moli ATP/moLacetil-CoA) §i regenerarea oxaloaceUatnluiAmorsarea secvenfei de reac|ii presupune condensarea acetil" CoA cu oxaloacetatul in urma ciireia se formeazS citrat. Reacjia este catajizatft de ffitrat sintazS)§i reprezinta, In fapt, o condensare aldolicS intro oxaloacetat (componenta carbonilicS) §i acetil-CoA (componenta metilenicd). Absenja fenomenului de mezomerie in tioesteri este responsabikl de efectul atrftgdtor de electroni al grupei >00 din gruparea — c£ 0 avand ca SCoA rezultat labilizarea hidrogenului din pozijia a. H — CH2 — CO SCoA ?H2 ~ COOH 2 + HOH I ---------HO — C — COOH Q HOOC - C ( — CoASH I CH2COOH CH2 — COOH 0 AG ’ = ~9kca!/moi

Fig. Vii. 13 - Organizarea compiexului piruvat dehidrogenaza acetil CoA / CoA-SH NADHI HAD + ATP / ADP ©

Fig. Vii.14 - Controlui modificarif covaiente §i aiosterice a activitajii compiexului piruvat dehidrogenaza

X—o

334 fCitrat sintazafeste o enzima alostgric^ inhibata de ATP, NADH, citrat, acted gva$i cu lant-lung, ca §i de succinil-CoA.. intermediar al ciciului Krebs. S.e4der^j^inMjiiMciti:3t ,sintazei penfru acetil~CoA ia concentratii marl de ATP permite ciclnlui Krebs s&-si adaoteze ritmul la necesitatile energetice ale tesuturiloL De remarcat oil in ficaf si alte. tesirturi.care fae neolipogeneza, formarea citralului reprezintil o r&sp&ntle metabolic^ extrem de important# in care se hot&r>e soarta acetatuiui activ. Acesta se poate angaja nu numai in etapele ulterioare ale ciciului Krebs ci §i in biosinteza de novo a acjgjtoi jgrasL care are loc In citosol. Intruc&t acetibCpA nu .poate IravgmiBmbraaa mitosoUca, strategia adogtatf. de celuia consta in eaaaiMjau SUb-JonaLik....dlat, prin mtermediul unui transportor specializat, urmatft de clivarea la acetil-CoA si.oxaloacetaf; citrat iiaza citrat acetil~CoA * oxaloacetat ATP ADP + P\ Iesirea ctotului din mitosol, In vederea angajdrii sale in neolipogeneza, are loc exclusiv in condijiile in care evolufia sa in ciclul Krebs este blocaUl prin cantitatile man de ATP si NADH, rezuitate prin metabolizarea glucozgi, care sunt mhibitori ai enzimei limitante de yiteza (vezi mai jos), 2. lntr-o etapa ulterioara, citratul este izomerizat la izocitrat prin intermediui aciduiui, cis-aconitic sub actiunea j^onilazeD CH2— COOH CH — HOCOOH C COO H H — II + H20 H20 C— _____ COOH 1 1 3Bw C HO — C — —"■ H COO COOH ■S---H I 41 —‘ H2O — CH2— COOH H20 CH2 — COO COOH H Echilibrul care se stabile§te intre cele trei forme depinde de viteza de oxidare a 'aciduiui izocitric sub acfiunea izocijrat ^deh^^ Trecerea aciduiui citric in acid,. 3. Sub acjiunea Jkomtnk dehidrogenazeij izocitratul. sufer# o oxidare insojit# de decarboxilare, fonn5nd^-cetogiutarat HO — CH — COOH I CH — COOH' I CH2 — COOH

NAD* NADH + H+ O ii C —COOH + CQ2 OH2 CH2 — COOH A fost demonstrata exislenja a doua izoenzime ale izocitrat dehidro^eitazei; una NAD dependenta, prezenta exclusiv intramitosolic, si cealaltS KADP dependenta, avand o dubl& localizare: intrarnitosplica gi citosolic&.{Enzima NADJdependenta estep enzima alosterica av^nd ca efector pozitiv APR, ceea ce sugereazS ca ea este forma implicata in desi:a§urarea ciciului Krebs, calc catabolici avand ca scop sinteza de ATP. Activarea 335 4V enzimei prin ADP antreneazft faptul c3, ori.de cSte ori concentratia ADP este mare,' enzima isi mSrggte semmficativ activitatea. Simultan, activitatea intregului ciclu create, etapa..calaikatS de izocitrat dehidrogenazariind_etaga iimitania de vitezli, Enzima:...este inhibata alosteric si Uzocitrat dehidrogenaza NADP dependents! este, dimpotriva, inhibata de ADP §i stimulate de ATP. Cum enzima este active tn condifii ce favorizeaza sintezele (ATP crescut), s-a conchis ca enzima este impiicata, aiaturi defenzim^mabcljgi zeTeHsunf^ in fumizarea NADPH necesar sintezelor reductive ce se desf3§oarS esenjial in citosol. 4. Decarboxilarea oxidativa a a-cetoglutaratului la succinat are loc similar cu decarboxilarea piruvatului. Ea necesita prezenja sistemului multienzimatic^cetopItaF^ dehidrogenaza |care utilizeazS drept cofactori TPP, acid lipoic, CoASH, NAD, FAD. Energia eliberata la oxidate este Incorporate sub forma unci legSturi tiol esterice In succinil~CoA: COOH COOH 1 | 1 1 CH2 C-01 1 1 - co2 1 CH2 + NAD" + CoASH CH2 + NADH + CH2

CO - SCoA 1 1 COOH Succinil~CoA. in prezenja GDP si fosfatuiui anorganic, formeazS jjTP §i succinat. Se formeazd o legdturd fosfat macroergicd realizatd prin fosforilare la nivelul substratului, ..... Reacjia este catalizate detsuccinil tiokinaza tsuccinil CoA sintetaza). CH2 — Ct)OH CH2 — COOH

I + GDP + P04H3 | + CoASH + GTP CH2 — CO ~ SCoA CH2 — COOH Sistemul a-cetogiutarat dehidrogenazic este inactivat de succniil-CoA gi NADH §i activat de Ca_2+. TTalta modalitate de transformare ajuccmihCoA reprezentata, exclusiv In Jesuturile extrahepalice. de triinsferul CoAjjejiceto COOH — CH2 — CH2 — CO - SCoA 4- CH3 — CO — CH2 — COOH s- . COOH — CH2 — CH2 — COOH -f CH3 — CO — CH2 — CO- SCoA Reacjia permite metabolizarea ulterioarft a acetoacetatului sub forme de acetoacetil— CoA. Reacjia este catalizate de succinil CoA - acetoacetat tioforaza (vezi cetogeneza). 336 ... ~J 7 la-Cetoglutarat dehidrogenazai este, ca §i ipiru vat dehidrogenaza^ inhibatfl de produsii reacj.iei enzimatice; succinil-CoA §i MADE, De asemenea, enzima este sensibil^ la incflrcarea energetic^ aceluiei, fond inhibatS de.ATP si activ^ta...
COOH COOH I CH — OH I CH2

COOH FAD FADH, HOOC — CH II HC —• COOH

COOH

Derularea ciclului Krebs duce deci ia oxidarea,acetil ~JCoA §i regenerarea oxaloaceta- tului (Fig. VII. 15), Sin oxidarea.acetil~CoA .se fonneazltIou& molecule de CO?sgi patru perechi de echivaienju (3_NADH + 3H^.+^FADH^ csL^fir fi oxidafi in iaotul jesoirotor. Necesitatea reoxidlni permanente a acestora la nivelul lanjului respirator permit© ciclului Krebs s£ se desfd§oare exclusiv in cpndifii de aerpbioz& .(spre deosebire de glicolizi). Ox^acetatul regenerat poate accepta o nou8 moleculS de acetil-CoA pe care o introduce in ciclu. Reacfia global?* cle desfiigurare a ciclului Krebs se poate formula; CH3CO~SCoA + 3 NAD+ + FAD + GDP + 2H2Q + P] —> 2C02 + 3NADH + FADH2 + GTP + 2H+ + CoASH Ciclul Krebs constituie o cale finaia de degradare, cornunS glucidelor, lipidelor, projemelpc 337 L fb" •H2° ivlata'i dehidrogenaza BO-CH-COO" I CH2- COO" L-Maiat Fumaraza / A* H - C - COO" il “OQC-C-H Fumarat
r o dehldrogen aza

NAD NADH+H NAD" 0 ii C- COO 1 CH2 * coo CH3-C0-S-C0A Ace til CoA Cftrat dt?taZCX-*sH*,^“ CoA-SH CH2- COO" -COO" — r CL > 16 2: X 6' o > HO-C- I CH2~ coo" Citrat \ \ AcoWita&Si A H2O^ \ CH2- COO" C - COO" CH - COO" Cis-aconiiat H2O Aconitaza N Fe 2+ NAD CH2-COO" CH - COO" I HO ■■ CH - COO + Izodtrat NADH+H**

CoA-SH CO 2 CH2-COO“ t ifr 2+ Mn CH2 * c- coo" ot- Cetogiutarat

CH2-COO CH - COO" O « C - COO"

Oxalosucdnat £L ADP,Ca2+ ATP,NADH izodtrat dehidrogenaza © Fig. VII. 15 - Cidul acizilor tricarboxilici (ciclul Krebs) Acizii grasi inlrS in ciclul Krebs prin components acetii-CoA, prcxlus al ftoxidgriL Aminoacizii glucoformatori (giutamal, aspartat, arginin&, proiing, histidine, valinS,- inedonina, scrim! giicoco! treoning, cisteinfl, tirozinS, fenilatojnS) se catabolizeazg pe d& proprii dand na§tere la intermediari ai ciclului Krebs. Aminoacizii cetoformatori (leucii|4 fenManinS) genereazS aeetil~CoA jvezi metabolismul aminoacizilor). De remarcat c3 acizILg^i ca §i aminoacizii cetoformatpri, pot furniza , exclusiv componentaJ^etil-CoA.l Spre deosebire de ace§tia, unii aminoacizi, dar mai ales jlucidele, pot forma nu numai componenta acetil-CoA (prin piruvat) care se consume, ci §i componenta oxaloacetat care permite ainorsarea ciclului Krebs_. Reacjia de formare a oxaloacetatului condilioneazS, evident, utilizarea gnisimilor. Form area oxaloacetatului are loc esential prin carboxilareapiruvatului^ub actiunea IpiimvafcCT ft localizatS iiUramitosolic care necesM biolina drept grupare prostetic& CH3COCOOH + C02 4- ATP —> COOH — CH2 — CO — COOH + ADR 4- Pi 338 1 Piruvat carboxiligazajeste o enzimft ajosterigft a cSrei activitate depinde de prezenla acetll-CoA- efector pozitiv al enzimei; in absenta acestuia enzima este compiet inactive Cregterea concentratiei acelil-CoA va induce cregterea activit^tii piruvat carboxiligazeL favorizand asffel inixarea restului acetil in jdclui de oxidare, prin cupiare cu oxaloacetatul. Diminuarea concentrajiei de acetil~CoA favorizeazS activitatea piruvat dehidrogenazei, enzimS ce catalizeazi form area acetil~CoA. este, aga cum. se va anlta, prima enzima a gluconepj^enezei. Orientarea piruvatului spre gluconeogenezil sau spre ciclul Krebs va fi decisft, .in ultima instant, de disponibilit&Jile energetice ale fesuturilor. CICLUL KREBS - CALE AMFIBOLICA Pe langd faptul cfi reprezintd o cale de degradare comund pentru glucide, iipide gi proteine, ciclul-Krebs poate fumiza intermediary s&i diverselor procese metabolice. Astfel, oxaloacetatul gi a - cetoglntamluL cei doi cetoacizi ai ciclului, pot forma, prin transaminare sau aminare reductive!. aminoacizii corespunzfltori - aspartic gi glutamic, dac& celula ii reclame. ~~ *"* COOH — CH2— CO — COOH + CH*—CH —-COOH COOH —CK-CH —COOH + CHs-C —COOH I I II NH2 NH2 0 COOH-CH2~CH2-CO-COOH+CH3-~CH~COOH ^ COOH~-CH?-CH2-CH~COOH + CH3-C--COOH ■I I II

NH2

COOH-CH2-CH2-CO-COOH + NH; + NAD(P)H + NADP* + H2O

0 COOH~~CH2-OH2™CH-CDOH

NH2

NH2

Acidul aspartic constituie un punct de plecare in biosinteza nucleotidelor WimidiniceJ in limp ce glutamina provenita din, inijiazS biosinteza imcleotidelorf^imce;} SuccinatuL alt intermediar al ciclului Krebs, este •antrenat in biosiiiteza hemuliii priiL CitratnL reprezintft forma de.transport a accliJ - CoA. din mitosol in citosol; acetil— CoA citosolic este antrenat in CH2 — COOH HO — C — COOH I CH2 — COOH + CoASH citrat iiaza ATP ADP-fPj CH2—COOH CO—COOH + CH3CO~SCoA OxafoacetatuLtransportat din mitosol in citosol ca malat, este convertit la fosfoenoipi- ruvat care se angajeazS in gluconeogeneziL. AspartatuL glutamatul, porfirinele, glucoza, pirimidinele, acizii gragi igi construiesc scheletul hidrocarbonal pe seama intermediarilor ciclului Krebs. 339 4*r'ii i :U r.r;

fj hi

■q i

Funcfionarea ciclului Krebs, pe cle o parte drept calc catabolicii iar pe de altii parte'- drept cale de initiere anabolic^ il consacri drept cakM amfibolicft (anabolic^ §i catabolic#). Relafiile intermetabolice ale ciclului Krebs sunt

redate In Fig. VII. 16, UliJizarea in diferite procese biosintelice a intennediarilor ciclului Krebs necesitii, evident, mecanisfne complementare ce permit refacerea acestora rilor ciclului Krebs poart£ numele de reactii anaplerotice, (ana = din nou; pliro = a ample, a cornpleta). Necesitatea „reumplerii't cu substrate decurge din caracterul endergonic al reactiilor biosintetice a c<1ror desf3§urare se asigurd prin funcfia catabolicii a ciclului Krebs. Reaclia anapler.‘Oticij cea mai important^ este cea de carboxilare a piruvatului la maEa^tkivezi mai sus). ’ Krebs se traduce prin acumulare de acetil-CoA, „percepufiT de c&tre piruvat carboxiligazfl care, activandu-jc, produce oxaloacetat. Acesta va fi utilizat in reacjiile de sinteza sau va create viteza de desfaprare a ciclului Krebs (dac5 nu este suprasaturat). in faza catabolica, enzjmele cheie ale ciclului Krebs sunt inhibate la conceiitrajli^nwi^ dej^ADH, provenit prin 6 oxidarea acizilor grasi. fn aceasta situate, oxaloacetatul se reduce la malat si iese in citosol unde- va fi utilizat in gluconeQgeneza^"~^ “ ‘ Reacjii anaplerotice s-unt considerate §i calfe 7ie"degradai‘e.;.a. acizilor^grasi.................................................................cu numSr impar.de atoms de carbon §i a unor aminoacizi (izoleucnia, valinft, metioniiia),. soldate cu formarea succinil-CoA. Oxidarea glutamatului la a-cetogluteit este, de asemenea, o reacfie anapleroticL OxaioaceiaO - Fosfoeno! piruvat Glucoza l - Piruvat acetoacelil-CoA f Triptofan < Leucina Feniiaianina ^Tiroana Aspartat i aminoaazi ■ Oxaloacetat 1 Pirimidinel Maiatc -Malat Tirozina Feniiaianina Porfirine - Fumarat \ --- Sucanat : Aceiii-CoA • - Cisteina Alanina Serina Glicina Treonina -Acizi grasi I Leucina L Izoleudna f Triptofan I .... ' compusi steroidia acid grasi

acetil-CoA Izodtrat -oc-Cetoglutarat Valina Metionina ?;ATP BILANJUL ENERGETIC AL ARDERII GLUCOZEI

In succesiunea de reacfii ce reprezintd ciclul Krebs, semnificative din punct de vedere energetic sunt reacfiiie de oxidare. In ciclul Krebs, reactiile de oxidare se soldeazd cu formarea de echiyplent'i feducdlori: NADH. FADH?, Oxidarea coenzimelor reduse are loc la nivelul lanfului respirator, proces in cursul cdruia, prin cupiarea oxidarii cu fosforilarea, este VoaMLJiQfleXa. Cml&g? maclulpr cMuiui Krebs cu lanful respkato£j£Si^QSibiI3 grape localiz&rii ijUramitpsplipe ji vecindtdfii spafiale p sistemelor enzipigtice indicate in cele cloud.grocese. Oxidarea N ADH'duce, a$a cum s-a ardtat. la. formarea al3 molfTlP^ dd nastere la 2 moli de ATP. Pentru stabilirea bilanfului energetic al oxidarii piruvatului, vom urmdri etapele oxidative §i bilanjul lor energetic. Etapele cataUzatejfc dehidrogenaze NAD dependents, care se soldeazd cu formarea NADH, deci a cate\3 moli ATP) sunt: ■ - decaboxiiiirea oxIdiuiWapi-uvatului in prezenta piruvat dehidrogenazei —> NADH ~ 3 ATP; - dehidrogmarea izocitraFuiui.in prezenfg izocitrat dehidrogenazei NADjlependente -»» NADH = 3 ATP; “ ~~~ - decarboxilama..pftidativd a a-cetogl£tya£uhii in prezenta q-cetoglutarat dehidrpge-- nazei^--» NADH = 3 ATP; - dehidrogenarea uiaLat:nIuiJ.n.mrez&nta malat dehidrogenazei -o NADH = 3 ATP. Etapa de oxidare a succinatului la fumarat se face in pi^enpiFAD §i duce la 2 moli ATP. In afara etapelor oxidative, care reclamd cupiarea acestora cu catena de oxidafie celulard in vederea form drii ATP, existd in ciclul Krebs o etapd care sintetizeazd ATP la nivelul substratului §i anume etapa conversiei succinilCoA (obfinut prin decarboxi- larea oxidativd a a-cetoglutaratului) la succinat.

Insumand numdrul de moli de ATP rezultafi prin oxidarea unui mol de . piruvat In ciclul Krebs, cuplat cu catena de oxidafie celulard, se obfine un total de 15 moli ATP. OxidaresTunui mol de.acetil-CoA fumizeazd 12 moli ATP. Jinand seama cd trei sferturi pand la noud zecimi din glucozd parcurge, in vederea oxidarii, calea Embden-Meyerhof §i apoi ciclul Krebs cuplat cu lanful respirator, bilanjul energetic ai oxiddrii totale a unei molecule de glucozd trebuie sd ia In considerajie §i etapele pand la form.area piruvatului. In condifii de aerobiozd, NAD1J, rezultat in etapa catalizatdde^lceraidehid:3fosEFEe^TO^^^seoxHeazHla nivelul lanfuluirespirator generand fie 3 moll, fieJ2 moli ATP pentru fiecare mol de gliceraldeiudd. furicjie de sistemul nave® utillzal Cum naveta malat i§i revendicd universalitatea, se poate aprecia cd pentru fiecare mol de glucozd oxidatd total se formeazd in aceastd etap8&:moii ATP) In calea Embden-Meyerhof existd doud etape in cai'e ATP se obfine prin fosforilare la nivelul substratului; etapa conversiei 1,3-bisfosfogliceratului la 3-fosfoglicerat §i cea a conversiei fosfoenolpiruvatului la pimvat Prin fosforilare la nivelul substratului rezultdln total 4 moli ATP. Numdrul total de moli ATP formaji prin oxidarea glucozei la piruvat este deci 10. Cum insd 2 moli se consumd In reacfiiie catalizate de kinaze, glucoza fructozo-6-P ATP glucozc-6-fosfat ATP fructozo-1,6-bisfosfat ca§tigul net este de 8 moli ATP. 341 h$Oxidarea celor 2 mob iBQii.AIE^deci JejlucozS^ de 38 moli ATP. Consider&nd c3 AG0’ de hidrolizft a legilturii fosfat term inale din rnolecula ATP este de - 7,3 kcal/mol, prin oxidarea giucozei in condi|ii de aerobiozd se elibereaza 38 x 7,3 = 277 kcal/mol glucozT Jinand seama c& oxidarea giucozei in condijii standard (C6H{206 4- 602 —» 6C02 4- 6H20) geneieazS 686 kcal/mol se poate conchide ca randamentul de utilizare a energiei libere mobilizatd in acest proces este de 40% (276/686 x 100), Eficienja energetic^ a degradMi oxidative complete a giucozei este superioarS glicolizei, a§a cum rezulD din compararea ecuajiiior globale a celor douS procese: Pentru obfinerea a 38 molt ATP este necesar ca 19 moli de glucozd s& se angajeze, in condijii de anaerobiozd, in degradarea pana la iactat. Trecerea de la anaerobiozd la aerobiozft create cantitatea de ATP, pe seama ADP, ceea ce antreneazft scdderea vitezei lanjului respirator (ve-zi controlul prin acceptor de fosfat.) §i deci a raportului NAD/NADH. Enzimele cheie ale ciclului Krebs, ca §i cele ale glicolizei (FF-1K este inhibata de ATP §\ citrat) i§i reduc activitatea, viteza glicolizei scSzand dramatic in cursul comutMi anaerobiozft - aerohioz&. In celuiele canceroase viteza glicolizei dep&§e§te posibilitdjile de utilizare a piruvatului in ciclul Krebs, motiv pentru care, chiar in condijii de aerobiozS

piruvatul trece in Iactat. Pierderea relajiei reglatorii a celor douft c&i, caracteristicft §i altor procese interdepen- dente, in cancer, alaturi de consumul foarte mare de ATP, propiiu proceselor tumorale (antrenand activarea FF-1 ~K), sunt considerate explicajii posibile pentru viteza fulminant*! a glicolizei in aceasfS situajie. O important! posibilitate de evolufie^metabohM a glueozo-6'^sfottjta o reprezinta trtii^Ht*’i/o-fosfuiiin! r ea biologic! a acestei cSi, in care etapele oxidative sunt catalizate i ck^'idiuiun ' % t''
SOD Fe2+ 20; + 2H+ ------ - -^ H202 + 02 H202 + o; - - -OH + “OH + 02 Aceste specii reactive de oxigen produc oxidarea tmor componente esenjiale pentru structura §i funcjia bacteriei, ca de exemplu acizii grasi din structura membranelor; peroxizii lipidici formati (ROOH) se descpmpun formand compusi cit.oto_x.id, in spepl aldehide, cum ar fi 4Jiidroxi nonenaluL§i malondialdehida, care contribuie la actiunea bacterioliticii §i bactericidal a fagocitului. Protecffa gramilocitnlni fnsiigi impotriva aces tor specii distructive este necesard §i posibiia, intrucat acesta este ii;iy^SiriiLEU.Q}ccanisme de detoxifiere a radicalilor liberi, Pentru regeneiiimafGSEfcorvsumat- in reacjia glulation peioxidazic£ (GSHPx), de descompunere gJufalion _ a apei oxigenate (2 GSH + H202 - GSSG + 2H20), se face apei la guiitul pentozelor peroxidaza care furnizeazft NADPH necesar reacjiei glutation reductazice (GSSG-R) (Fig, VII. 17). Implicarea §unt.ului pentozelor atilt in cat §i in limitarea proceselor distructiveJa. caie se expune_ fagocitul subliniazS impprtanfa ac.es.lei cfti metabolicein reacliile de apflrarea organismuiui. Se consider^ c2 produs In reactia NADP'B oxidazicg. particip3 §i la actiunile antivirale §i antitumorale ale unor celule specializate. Pe langa producerea NADPH, importanfa cfui pentozelor consta §i in furnizarea de pentoze necesare biosintezei nucleotidelor §i ocizilor nucleici. 2 citocrom b(Fe3 2 citocrom b(Fe2+) 20, 20; 343 61

6 - PGDN R- 5P NADPH Fig, Vtt. 17 - §untu! pentozeior furnizeaza NADPH pentru reducerea glutationului oxidat DesfSgurarea c8ii pentozeior implied clouS etape majore, §i anurne: 1.con vers ia hexozelor la pentoze (etapa Qxidativft); 2. conyersia pentozeior la hexoze. 1. Conversia hexozelor la pentoze este inifiafS de oxidarea NAPP dependents a giucozo-6-fosfatului .la 6-fosfogluconat in prezenta fgiucazo-6fQsfat (iehidroaenazeS intermediar se formeazS 6-fosfogluconolactona care,

sub acfiunea fSdactoriazelj este hidrolizata la acidul corespunzBtor. De menjionat specificitatea glucozo-6-fosfat dehidrogenazei pentni anomerul p; \ CH I H — C— OH IO HO - C - H . H - C~~ OH I H C ------------1 I CH2O© giucozo-6-fosfat c COO H I i i H C — OH »C — O HH 0 H2° 1 NADP* NADPH + H+ H0 „ \ HO - C— _ H c H 1 -C— ““ H - C - OH HO H 1 ~C — 1 HO HC H 1 t i CH2O® CH2O @ acid-66'fosfogiuconoiactona fosfogluconic (6-P-g) Intr-o etapS ulterioarS are loc oxjda^afia tofoglnconaljgiuiJHa acid 3 “Ceto-6fosfogluconic, care este decarboxilat simultan la ribulQzo-SzfQsfat, Enzima care catalizeazS aceastS etapS, 344 v-W.-'" {6-fosfogIuconat dehidrogenaza NADP dependentslrealizeazfl deci oxidarea decarboxilantii TsufSt^^............... COOH COOH CHz 1 | OH

j HC— OH j HO —■ C—H 1 HC— OH i 1 HC— OH | CH8O®

H—

C— OH |

NADP* NADPH + H* AA ■ ’ H —

C-0

H—

H— — co2 .

1 C— OH } l C— OH j CH2O®

H—

C-0 1 C— OH I C— OH | CH2O ( P)

ribu)ozo-5acid-6-fosfogiuconic fosfat AcJivitateA&dEosl^ est& inhibat2.de c&tre fructozo-1, 6bisfosfat, substrat al glicolizei. Cregterea concentrajiei acesluia va produce o relative biocare a guntului in aceastS etap&, astfel inc&t conversia ulterioar& a pentozelor la hexoze, eventuate, substrate ale glicolizei, nu se mai produce. Mai mult, mtrucat 6-fosfogluconatul este un inhibitor, atfb’fosfoglucoizomerazeil enzimS ce introduce glucozo-6-fosfatul in glicoiiztl, acumularea acestuia ca rifepuiis" la cregterea substratelor glicolizei (fructozo-1, .6- bisfosfatul), va determina inhibi|ia etui glicoiitice. Aceastd corelafie reglatoare reciprocfi a celor douii cdi este evident avantajoasft penlru celubl Ribulozo-5-fosfatul este convertit la epimerul stlu, xilulozo-5-fcsfatul (sub acjiunea ribulozo-5-fosfat epimerazei), ca §i la aldoizomerul s&u, ribozo-5fosfatul (sub acjiunea ribozo-5-fosfat cetoizomerazei). CH2O H

1 i c= o 1 C— H1 X 0

H O — H —

H — C — OH CH2O© ribozo-5-fosfat 345 - 5b■ J •; '.V

i •f J :J

Pentozele rezultate sunt: utiiizate in sinteza acizilor nucleici. a coenzimelor, a compugiiof macroergici sau sunt metabolizate in continuare. In {esuturile in care nevoia cie NADPH §i de pentoze este echilibratd, calea pentozo- losfafilor parcurge exclusiv etapa tansformdrii hexozelor to pentoze. Dacdinsd nevoia de NADPH a {esuturilor este mai mare decat cea de pentoze (ca in {esuturile cu iipogeneza intensd), pentozele obfinutein exces fa(d de necesitafi vor fi reconvertite la hexoze, care vor fi reintroduse in etapele oxidative describe, furnizand NADPH necesar. 2. Conversia pentozelor ia hexoze parcurge unndtoarele etape:

+ X 1 - o-

Xiluiozo-5-fosfatul cedeazd, sub acjiunea transcetolazei, fxagmentui glicolaldehidd pe ribozo-5-fosfat cu formarea sedoheptuIozo-7-fosfatului §i gIiceraklehid-3-fosfatului. Ca §i piruvat dehidrogenaza, transcelolaza are drept coenxirnd tiaminpirofosfatul. CH20H CHpOH i 1 OHO J CHO C=01 ! 0=01 | i H i ! H—C— HO — C— C — H + OH OH | j | 1 H C— C —OH H— CH2O© — OH C — OH l i | 1 1 H CH2O@. C— H— C — OH — OH j CH2O 1 H— © C — OH | CH2O© &edoheptulozc-7-fosfat un punct de intMiiKat^a^limlizei cu guntul pentozelor^ Sedoheptulozo-6-fosfatul, rezultat in reacjia de transcetolizare, suferd o reacjie de transaldolizare (transfer al restuiui dihidroxiacetond) pe gliceraldehid-3-fosfat in urma cdrela iau nagtere eritrozo-4-fosfatul gi fructozg-6-fosfatub intermediar comun al glicolizei §i cdii pentozelor. CH2OH CH?OH . j i l C = 0 i - CHO 1 CHO • C=0j 1 H iH—C— ^ HO — 1 O C — H + OH ■C—H — | | + i l 1 H H—C— C — OH CH2O© H~ - C —OH — OH I l .! .| H 1 C— HCH2O® — - C — OH OH \ i | H C — OH CH2O@ — | CH2O© X 0 1 - o- 1 X

fructozo-6-fosfat eritrozo-4-fosfat 346 j Eritrozo-4~fosfatu! poate accepta un rest glicolaldehidS, provenit de la o aM moleculd de xiIulozo-5-fosfat, formandu~se gliceraldehid-3fructozo-6-fosfat §i fosfat, ambele substrate tile glicolizei. CH2OH i 2 CHO CHO CH2OH | c-01 | H—c— HO H — C — OH + c - O ----^ C— H 4OH ■ — 1 | | H C — OH H — C — OH — C —OH 1 H— 1 CH2O@ 1 H i 1 H— CH2O© — C —OH C — OH j | CH20@ CH2O© Cum toate reacjiile c3ii neoxidative a §untului pentozelor sunt reversibile este evident eft §i hexozofosfa|ii pot 0 convert,^! la pentozofosfafi Desfft§urarea reaejillor oxidative §i neoxidative ale §untului poate fi sumarizatd: 6 glucozo-6-fosfat 4- 12 NADP+ + 6H20 —>*• 6 ribulozo-5-fosfat + 12 + (NADPH + H ) + 6 C02. 6 ribulozo-5-fosfat —J*- 4-xilulozo-5-fosfat + 2 ribozo-5~fosfat 2 ribozo-5~fosfat + 2 xflulozo-5-fosfat —■ ^ 2 sedoheptulozo-7-fosfat + 2-g(iceraldehid-3-fosfat 2 sedoheptulozo-7-tosfat + 2 gliceraldehid-34osfat ■—>■ 2 fructozo-6fosfat -f 2 eritrozo-4-fosfat 2 eritrozo-4-fosfat + 2 xilulozo-5-fosfat 2 fructozo-6-fosfat + 2 gliceraidehid-3-fosfat Bilanful: 6 gtucozo-6-fosfat 4- 12 NADP+ + 6 H20 6 C02 + 12 (NADPH + H+) + 4 fructozo»6-fosfat + 2 gliceraidehid-3-fosfat GIiceraldehid-3-fosfatul se poate izomeriza la dihidroxiaceton-fosfat, formand impreunft fructozo-l, 6-bisfosfalui. Cum acestadin urmft suferft acjiunea fructozo-1,6-bisfosfatazei, rezuM cii din 6 molecule de giucozo-6fosfat se obfin 5 molecule de fnjctozo-6-fosfat care prin parcurgeiea etapelor gluconeogenezei formeazft 5 molecule de glucozo-6-fosfat. Bilantui net al cftii pentozelor este oxidarea unei molecule de glucozft, conform ecuajiei: glucozo'6-fosfat 4- 12 NADP+ 4- 7 H20 6 C02 + 12(NADPH + H+) + PQ4H3 In uneie tesutun, cum ar fi mu§chiul, enzimele etapelor oxidative ale suntnlui pentozelor au activitdti exlrem de reduse, necesfrur3e"TTAI7PHTImHTiiinina Nevoia de penloze posibilitat&Tcorv^^ pentoze. Aceasta se realizeazft prin parcurgerea in sens inVers areacjiilor catalizate de

transaldolazft §i transcetolazft (ambele sunt reacjii reversibile) de cfttre fructozo-6-fosfatul §i gliceral- dehid-3-fosfatul obfinute in glicolizft: fructozo-6-fosfat 4- gliceraldehid-3-fosfat >- xilulozo-5-fosfat 4- eritrozo-4fosfat eritrozo-4-fosfat + fructozo-6-fosfat sedoheptulozo-7-fosfat + gliceraidehid-3-fosfat sedoheptulozo-7-fosfat + gliceraldehid-3-fosfat xilulozo-5-fosfat 4- ribozo-5fosfat Bilanful etui inverse a etapei hexoze - pentoze va fi: 2 fructozo-6-fosfat 4- gliceraldehid-3-fosfat K 2 xiiuIozo-5-fosfat 4ribozo-5-fosfat. 347 0Din doua moiecuie cie fractozo-6-fosfot si uD&de gliceraldehid-3-fosfal se formeazft deci 3 molecule de ribozo-5-fosfaL In Fig. VII. 18 este ieprezeritalil secven{a de reacjii a1 alii pentozo- ibsfajilor. Marea flexibilitate metabolic*! a c3ii pentozelor, interdependenta sa functionals cu glicoliza §i gluconeogensza permit acesteia adaptarea prompts la necesitSjile diverselor jesuturi in diferite momente metaboiice. Amploarea desfSprarii eSii pentozelor depinde de starea fizioIogicS a celulei. Gum sensul desf&§urSrii sale este,producerea NADPH, neeesar biosintezelor reductive, ca §i producerea de pentoze necesare sinlezei nucleotidelor §i acizilor nucleici, este de ajteptat ca amploarea sa sft fie paralelS cu cea a proceselor consumatoare de NADPH $i pentoze. Exists intradevSr dovada'cS intensitatea §untului este modificafS in acela§i sens cu intensitatea biosintezei acizilor gra§i de c&tre anumiji factori. Interdependent activit3{ii eaii pentozelor §i cSii de biosintezfi a acizilor gra§i se realizeazS in primul rSnd prin faptul o ii

Fig. VII. 18 - Calea pentozo-fosfa|ilor in |esutul adipos 348 c! yjfeza guntului esle controlatSde NADPH, suhstrat ai lipngenezeLPe Jang! faptul. ca este cofactor al glucozo-b-fosfat dehidrogenazei, NADPH estejd inhibitor alosteric al acestei enzime. Este clar al rcoxkkirea NADPH va produce accelerarea guntului, Cun) calea majors de oxidate a NADPH este biosinteza aciziior gragi, intensitatea acesteia va decide activitatea glucozo6-fosfat dehidrogenazei, deci a suntului. Cregterea raportului NADP/NADEH^reprezintS uu semn'al ce^Jnduce oxidarea giucozgi^pe caiea guntului pentozelor, a$a cum cregterea raix)!iBM....N.AD/NADH induce glicoiiza. , •; Coreiajia dintre calea pentozo-fosfat gi biosinteza aciziior gragi este atestat! gi de constatarea c! glucozo-6-fosfat dehidrogenaza este inhibat! de acizii gragi activaji (acil- CoA). Inhibarea biosintezeLacmlor gragi prin produsul final I scfiderea intensitSfii guntului, IntrucSt^rincigalul consumator de. NADPH (biosinteza aciziior gragi) inceteazS s! mai solicits' i: Activitatea guntului pentozelor este controlat! in unele fesuturi, in special in hematic 2 gi de cStre raportul giutationoxidat ^iutanon-mdus^ (GSSG/GSH), intrucat reducerea ij GSSG la GSH eonsum! cantiiafi semnificative de NADPH. ;;j Viteza guntului cregte de asemenea in perioade de crestere rapid!, care 'solicit! d ! biosintez! de proteins gi acizi nucleici. ;i (

De remarcat c! activitatea guntului poate fi reglat! nu numai la nivelul activit&fii jjl enzimelor ci gi la cel al biosintezei acestora Astfel, glucozo-6-fosfat dehidrogenaza §i 6 k{ fosfogluconat-dehidrogenaza sunt enzime adaptative a c!ror vitez! de sintez! variaz! cu d necesitSfile de desfSsurare a guntului. Sinteza gehidrogenazelor cregte, de .exemplm jti d; glanda niamar! in p&rioada,„deJactafie^sau scadejn ficat gi fesutu! adipos in diabet gi jjj inanifie (insulina se comport! ca inductor al dehidrojeaiazeToflT ^ CcrcetSrile ultimilor ani au dovedti c! in ficat gunf ul pentozelor se desfSgoar! pe o cale diferit! de cea descrisS, caracteristic! penlru fesutul adipos. Diferenjele rezultS din C posibilitatea ribozo-5-fosfatului de a se epimeriza, sub acfiunea unei pentozo-5-fosfat-2’~ g! izomeraze proprii ficatului, la arabinozo-5-fosfat. \\ Ca gi in calea descris!, o molecul! de ribozo-5-fosfat accept!, intro reacfie de gi CH^OH transcetolizare, gruparea I (glicolaldehid!) de la xdidozo-5-fosfat, generSnd sedo[ V° '■ j heptulozo-7-fosfat gi dihidroxiaceton-fosfat. Dihidroxiaceton-foslatul reacfioneaz! cu arabinozo-5-fosfatul generand, sub acjiunea unei aldolaze, DgIicero-D-ido-octulozo-1,8;\ bisfosfatul. Acesta cedeaz!, sub acfiunea unei fosfotransferaze, o grupare fosfat o sedoheptulozo-7-fosfatuiui: dihidroxiaceton-fosfat + arabinozo-5-fosfat >■ D-glicero-D-ido-octutozo1,8-bisfosfat D-glicero-D-ido-octu!ozo-l ,8-bisfosfat + sedoheptulozo-7-fosfat D-giicero-Didooctuiozo-8-fosfat + sedoheptulozo-1,7-bisfosfat. Sedoheptulozo-l,7-bisfosfiUul, sub acfiunea unei aldolaze, se scindeaz! la diliidroxiaceton| jj fosfat gi eritrozo-4-fosfat; acesta din unn!, intro reacfie de transcetolizare, accept! restul CH,OH !£ . de pe D-gliceroD-ido-octulozo-8-fosfat generandu-se hexozele glucozo-6; fosfat j; C=O 349 hi §i fructozo-6-fosfat: sedoheptulozo-1,7~bisfosfat----------->*■ dihidroxiaceton-fosfat+eritrozo-4fosfat ■ eritrozo-4-fosfat + D-glicero-D-ido-octutozo-8-fosfat glucozo-6-fosfat +

fructozo-6-fosfat. Secvenfa de reacjii proprii c&ii pentozelor in ficat este reprezenlatfi in Fig. VII. 19. •o 'i

350 - {>«■DEFICiENTE ALE' UNOR ENZIME IMPLICATE IN CALEA PENTOZELOR Deficienja ereditarS a unor enzime ale cHii pentozelor poate constitui cauza unor dezordini foarte grave, mai ales in condijii de mediu favorizante. Dintre acestea, dgficienta .genetics a transcetolazek exprimatS in afinitatea extrem de redusS a acesteia pentru TPP. duce ia tulburSri neurologice §i comportamentale importante, agravate de aportol scazuj: de tiaininajn diets (sindromul Wernicke-Korsakoff), Alta deficienja - aceea de glucozo-6-fosfatdehidrogenazft - se manifests in special in eritrocit, unde calea pentozelor este unica sursS de NADPH (iipsesc^malic enzima gi izocitrat dehidrogenaza), Deficienja enzimaticS se

exprimS in susceptibilitatea crescutS ia hemolizS a eritrocitului, rezultat al faptului cS reacfia de reducere a GSSG este inoperantiL grinjipsa NADPH. Acumularea de GSSG nu permite descompunerea divergilor peroxizi pe seama GSH, ceea ce expune membrana eritrocitarS la stressul oxidativ realizat esenjial prin H202. Modificarea arhitecturii bistratului lipido-proteic menibranar face erilrocitul susceptibil la hemolizS. Ca §i in primul caz, deficienja este accentual# de administrarea unor medicamente cu earaeter oxidant (aspirin#, antimalarice), Frecvenja foarte mare a deficienjei de gIucozo-6-fosfat dehidrogenazS la indivizii care trSiesc in regiuni infestate de malaiie reprezintS o incercare de adaptare la mediu, intruc&t parazitul malariei este dependent de concentrajii optime de GSH, implicit de buna funcjionare a cSii pentozelor. VII.4.2. CALEA ACIDULUI GLUCURONIC O altS cale metabolic# a glucozei este cea de formare a acidului glucuronic, Procesul implied aciivarea glucozo- 1-fosfatului sub forma de uridin-difosfat-glucozS (UDP-glucoza) §i necesitS UTP §i enzima UDP-glucozopirofosforilaza: UTP + glucozo-1-fosfat___________>. UDP-glucoza + PPUDP-glucoza poate servi ca donator de glucozS in sinteza dipolizaharidelor sau poate fi oxidatS la UDP-giucuronat in prezenja unei dehidrogenaze NAD-dependente: 351 o

\ ■- I ii'

:

j

COO"

oo OH NH A, N' O UDP-giucuronat

+ 2NADH + 3H+ UDP«glucuronatul reprezintd forma active a glucuronatului. El poate servi ca donator de rest glucuronozit in reacjia de sintezd a unor polizaharide acide (vezi proteoglicani) ca §i in reacfia de conjugare cu divert compuji endo- sau exogeni din clasa aminelor, fenolilor, acizilor carboxilici. Conjugarea cu giucuronatul, catalizatft de glucuronozil transferaze, enzirne prezente in special in ficat, conduce la giucuronozide (compu§i de naturd glicozidicd avand configurafia p): COO“

Conjugarea cu giucuronatul (glucuronidarea) reprezintd o etapd important^ in detoxifierea compu§ilor strdini (xenobiotice) sau proprii organismuiui, form area glucuronozidelor, compu§i cu polaritate crescutd, facilitand transportul §i excrejia acestora. De menjionat cd glucuronoziltransferazele sunt enzime inductibile cai*e au activity i

352 specifice reduse la na§tere, malurizdn&u-se insd din primele zile de viajd. Imaturitatea sau deficienfele genetice ale glucuronozii-transferazelor due la perturbarea proceselor de detoxifiere (vez'i §i catabolismul hemoglobinei). Acidul glucuronic poate urma, atunci cand necesitajile organismului in acest compus sunt satisfdcute, o cale de metabolizare ce conduce ia xilulozd, substrat al edii pentozelor. Metabolizarea''acidului glucuronic debuteazd cu reducerea NADPH dependents ia acid gulonic care, intr-o reaejie NAD dependents, este oxidat la acid 3-ceto-gulonic; acesta, prin decarboxiiare, formeazd L-xiluloza. Conversia L-xilulozei la izomerul natural implied transform area NAD? dependents la xilitol care, prin oxidare in prezenja NAD, trece in D-xilulozd (Fig. VIL20). Iinposibilitatea conversiei L-xilulozei la D-xilulozd duce la eliminarea in urind a L- xilulozei §i reprezintd o enzimopatie datoratd lipsei L-xilitoldehidrogenazei NADP dependente. Aceastd maladie ereditard este cunoscutd sub numele de pentozurie esenjiald. La animalele capabile sd sintetizeze acid asorbic (toate mamiferele, cu excepfia maimufelor antropoide, omului, cobaiului), acidul L-gulonic poate fi convertit la acest compus. Keacfia implied formarea intermediary a gulonolactonei care, sub aejiunea gulonolacton-oxidazei, este oxidat'd la 2ceto-L-guIonolactond, aceasta izomerizandu-se la acid ascorbic (Fig. VIL20). Incapacitatea unor mamifere de a sintetiza ascorbat se datoreazd lipsei genetice a gulonolacton-oxidazei §i le face tributare aportului exogen de vitamind C. VIL5. GLUCONEOGENEZA Existd posibililatea ca nevoia de glucozd a (esuturilor glucodependente, a edror existenfd depinde de aportul permanent al accstui zahdr (si stem ul nervos central, mu§chiul alb in contracjie, hematia), sd nu fie satisfacutd. O astfel de situate poate sd apard in inanijie, in cazuljinui regirp alimentar^bogaLai proteine dar sdrac in glucide, in efortul prelungit. In aceste condijii are ioc sinteza JJiT'nbvo" a giucozei din compugi neglucidici (sau nonhexozd): piruvat, aminoacizi, glicerol §i lac tat, respectiv procesul de gluconeogenezd (GNG). Satisfacerea nevoilor de glucozd a (esuturilor glucodependente exclusiv pe searna gluconeogenezei are loc in condijiile epuizdrii rezervelor de glicogen hepatic. Par|Ial, gluconeogeneza este solicitatd §i in perioade interprandiale ce dep&gesc- 7-8 ore. Gluconeogeneza poate avea loc §i in condijiile unui a port nonnal de glucozd, dar intensitatea procesului este extrem de redusd. Procesul dec-urge in acest caz numai din necesitatea reutilizdrii lactatului fonnat in nmgchi §i eritrocit sau a glicerolului rezultat din degradarea triglicerideior din Jesutul adipos. Viteza gluconeogenezei va create proportional cu activitatea musculard §i activitatea sistemului simpatic, de care depinde amploarea lipolizei in (esutul adipos. Gluconeogeneza este asiguratd la mamifere esenpul de cdtre ficat §i cortexul renal. Intensitatea procesului in cele doud Jesuturi este aproximativ egald. Cu toate aeestea, datoritd diferenjei ponderate a celor doud organe, rinichiul asigurd numai 20% din totalul tie glucozd produsd. Creierul §i

mu§chiul au §i ele, intr-o oarecare mdsurd, 353 U D P -g! u cu r on a t OHO HCOH H OH UDP HOCH HC-OH HCOH COOH Add D-glucuronic COOH HOCH i C—O -------HCOH NADH.H^ HOC H CH2OH

Add 3-ceto-L-guionic Vx>2 CH2OH c~o i HCOH I HOCH CH2OH

L-xiluioza s pentozurie + esentiala HAD '

NADH+H L-'NADPH-H PNADP ' COOH HOCH i - HOCH hi COM 1 HOCH CH^OH Acid L-gulontc C HOCH

1 HOCH HOH HC HOCH ■ CH2OH L-gulonoiactoria , am.niBimuta oohai ,P C—i o=c 1 HO-CH I O HC—J I HO-C-H i CHoOH 2-ceto 1-guionoOclona . >° C~ 1 HO-C H °-c 0 HC----1 } HO-C-H CH2OH Acid L-ascorbic ( vitamina C 5 CH2OH

HO-CH Af I\ HCOH ._0 I CH2OH D-xiluloza ADR JL__ D-xiluloza-5 Calea pentozofosfetilor Fig. VII. 20 - Calea actdului glucuronic 354 abilitaiea de a efect.ua gluconeogenez&, exclusiv pentru nevoile proprii tnlrucat sunt lipsite de glucazo-6-fosfataziL Materia primS. pentru procesul de ghiconeogenezS. este reprezentatS de aminoacizii glucoformatori, lacial gi glicerol. Date recente indict §i acetona drept substrat al GNG. Procesul de gluconeogenezd const#, central, in conversia piruvatului la glucozS §i decurge, Tn priiicipiu, prin parcurgerea in sens inverse a etapeior giicolizei (glueoz# piruvat), eu menjiunea c# trei dintre aeestea sunt cataiizate de enzime unidirecfionale, proprii gluconeogenezei. Aceste elape reprezinl# reacjiile cataiizate in sensul giicolizei de c#tre kmaze: piruvat

kinaza, 6,-fosfofructo-1 -kinaza, hexokinaza sau glucokinaza, Simpla reversiune a. acestor reucfii este dezavantajoas# din punct de vedere energetic, iritrucfit reaefiiie in sens invers ce le corespund au AG0’ foarte pozitiv. Gluconeogeneza dispone de cSi proprii ce evitd acest impas energetic,. Prima etapfi in gluconeogeneza este reprezentat# de conversia piruvatului la. fosfoen.olpin.ivat (ea corespunde etapei glicolilice de transformare a ibsfoenolpiruvatului la piruvat sub acfiunea pinivat kinazei) §1 implied cooperarea a douS sisteme enzimatice ce eatalizeaza; a. carboxilarea piruvatului la oxaloacetat (OAA) CH3CO — COOH + C02 4- ATP + H20 -—> HOOD — CH2 — CO ■— 'COON + ADR + Pl b, conversia OAA la fosfoenolpiruvat (PEP) COOH I HOOC — CH2 — CO — COOH + GIF C — O - P03H2 + GDP 4- C02 CH2

Intracelular reaejia este reversibilft. Investifia mare de energie pe care-o presupune aceast# etapa face din gluconeoge- nezft un mare consumator de ATP (GDP + ATP -» GTP + ADP) De semnalat cli C02 eliberat in reaejia b este, in fapt, cel utilizat. in reaejia. a; carboxilarea unui compus in scopul favoriz&rii transform#™ sale ulterioare in alt campus insoJitS de decarboxilare, este o strategic termodinamic# utilizatS. de Jesuturi (vezi sinteza acizilor gra§i). Conversia piruvatului la oxaloacetat decurge intramitosolic §i este catalizat# de piruvat carboxiligaz# (PQL), enzim# biotin dependent#, avand ca efector alosteric pozitiv acetii~CoA. Piruvatul (provenit esenfialTEST allnlnS) ajuns in mitosol, este oriental spre formarea, prin carboxilare, a oxaloacetatului §i nu spre decarboxilare oxidativJt, intrucat acet;il~CoA, formats prin degradarea excesivS a acizilor gragi in condijii de gluconeogenez# (in lipsa glucozei, nevoile energetice aie fesuturilor glucoindependente se satisfac exclusiv pe seatna trigliceridelor), este un efector pozitiv al piruvat-caxboxiligazei §i un inhibitor al piruvat dehidrogenazei. Conversia oxaloacetatului la fosfoenolpiruvat decurge, in cazul gluconeogenezei din piruvat, extramitosoiic §i este catalizat# de fosfoenolpiruvat emboxikinaz# (PEPCK). Cum membrana mitosolic# este impermeabil# pentru oxaloacetat, acesta va fi translocat in citosoi dupS conversia ia compugi permeabili ce pot fi reconvert^ apoi la oxaloacetat. 355 Intr-adev&r, oxaloacetatul d& na§tere la malat sob acjiunea malat dehidrogenazeb in prezenja NADH provenil din degradarea acizilor gra§i. Malatui, permeabil prin membrani, ajunge in citosol aside va fi reconvertit la oxaloacetat sub acjiunea malat- dehidrogenazei citosolice. Reducerea oxaloacetatului la malat in interiorul mitosolului §i reoxidarea sa extramitosolicd este favorizaia de raporiul NA'DH/NAD, mult mai crescut in mitosol decat in citosol (Fig, VIL21). Pa Glucoza

V ATP giicogen ADR Glucozo-6-fosfat glucozo-1 -fosfat . Fructozo-6-fosfat . Pa,/ V ^Tructozo-1,6-bisfosfat'^ Gliceraldehida-3-fosfat + Dihidroxiaceton fosfal 1________________________________________* - glicerol fosfat NAD x NADH' N AD -MNADH + H 1,3-Bisfosfoglicerat ATP \fi*ATP ADP^ADP 3-Fosfoglicerat ti 2-Fosfogiicerat Fosfoenolpiruvat CO2 A GDP - < K GTp Fosfoenoipiruval PEPCK O. A. A. •NADH +H‘ 'NAD Malat MITOCONDRIE Malat / NAD ^NADH + OAA. Piruvat 4 carboxiligaza Fosfoenolpiruvat f PEPCK ( mitocondriala O.AA Piruvat carboxiiigaza Alanina---Piaivat -CO2 Piruvat NADH + H' Alanina Piru vat Piruvat ' NAD

-A----Lactat L.D H. Fig. Vli. 21 - Gluconeogeneza hepatica 356 Conversia oxaloacetatului la malat, urmatft de reconversia sa la oxaloacetat in citosol, reprezintft o modalitate de export, a NADH mitosolic fftrft de care gluconeogeneza n~ar fi posibilS. Sub acfiunea fosfoenolpiruvat carboxikinazei, oxaloacetatul ajuns In citosol formeaza fosfoenolpiruvat. De remarcat eft donatorul de fosfat specific In aceastft reaefie este GTP. Reacfia global ft de formare a fosfoenolpiruvatului din piruvat se poate scrie: CH3 COOH 1 I i 1 C — 0~P0,H2 + ADR w CO + GTP + GDP + P + ATP 1 ii .3 1 11 COOH CH2 0 Cum AG ’ al reaefiei este de numai +0,2 kcal rezultft eft 'reacfia este reversibilft. Cregterea rapoitului ATP/ADP favorizeazft reacfia de formare a fosfoenolpiruvatului, reprezentand o condifie a desfftgurSrii giuconeogenezei, alftturi de necesitatea unor concentrafii mari de piruvat. Urmfttoarele etape ale giuconeogenezei presupun convertirea fosfoenolpiruvatului la fmctozo-l ,6-bisfosfat. Aceasta se realizeazft prin parcurgerea in sens invers a reaefiilor giicolizei, reaejii catalizate de enzime bidirecjionale ~ comune giuconeogenezei §i glicolizei; enolaza • ■ fosfoenolpiruvat 2-fosfogiicerat —_=2!^ 3-fosfogliceraf ATP NADH + W+ w t ,3-bisfosfoglicerat qliceraldehid-3-fosfat ■--w ADP NAD* J^ ...............w fructozo 1,6-bisfosfat dihidroxiaceton fosfat De remarcat eft NADH necesar reducerii 3-fosfogliceratului la gliceraldehid-3-fosfat provine tot din p-oxidarea acizilor gragi. Transformarea fructozo-i,6-bisfosfatului In fructozo-6-fosfal nu se face prin simpia reversiune a reaefiei catalizate de 6-fosfofructokinaza-1 (AG 0’ = +3,4 kcal) ci necesitft, din motive deja expuse, intervenfia unei enzime proprii, fructozo-1,6-bisfosfataza: fructozo-1,6-bisfosfat + H20 -------fructozo-6-fosfat + Pt Fructozo- 1,6-bisfosfataza este o enzimft alosterieft sensibilft ia statusul energetic celular, al eftrui indicator fidel este, a§a cum am vftzut, concentrafia AMP. Enzima este inhibatft de AMP gi stimulate de ATP. Fructozo1,6-bisfosfatul, substratul sftu, cat §i fructozo-2,6~blsfosfatul sunt inhibitori ai enzimei, Ffuctozo-6-fosfatul formeazft sub acfiunea hexozoizomerazei, enzimft bidirecfionalft, glucozo-6-fosfatul care, sub acfiunea glucozo-6-fosfatazei, enzimft unidirecfionalft ancoratft pe membrana reticulului endoplasmic este hidrolizat la glucozft. Localizarea enzimei In ficat asigurft acestuia rolul de

fumizor al glucozei pentru satisfacerea nevoilor energetice §i de sintezft ale Jesuturilor extrahepatice. Este posibil ca glucozo-6-fosfatul, 357 rezultat al gluconeogenezei, s5 fie utilizat, dup# conversia la glucozo-l-fosfal, in sinfeza glicogenului. Orientarea glucozo-6-fosfatului spre formarea de glucozft sau spre sinteza de glicogen va fi decistt, in cele din urmib de raportul de concentrate dintre glicogenul hepatic §i glucoza sanguinSL Ecuafia global# a gluconeogenezei: 2 piruvat 4 6 ATP 4 2 NADH 4 2H* 4 4 HsOglucozS + 6 ADP + 6 Pf 2 NAD*, este elocvent# pentru aprecierea acestui proces ca proces reductiv §i mare consurnator de cnergie. Aga cum s-a menjional anterior, materia prim# pentru procesul de gluconeogenez# este reprezentat& de proteine, glicerol §i lactal. Vom urmiri modalit#|.ile de transfonnare a aeesi'ora in substrate direct utilizabiie in gluconeogeneza, Accesu! proteinelor la gluconeogenez#, respecliv al aminoacizilor giucoformatori (tofu cu excepjia leucine! §i lisinei), se realizeaza prin transfbnnarea lor in substrate' ale ciciului Krebs, direct convertibile la oxaloacetat sau piruvat. Astfel, glutamatul, glutamina, hisiidina, arginina, prolina participti la gluconeogenez# prin formare de a~eetoglutarat care, prin parcurgeiea ciciului Krebs, formeaz# oxaloacetat, Asparfalul genereazft direct oxaloacetat. prin transaminare/ Metionina §t izoleucina se metabolizeaz# la propionil-CoA, care se converte?tc la succinii-CoA §i apoi la oxaloacetat: CH3 — CH2 — CO SCoA 4- CO, + ATP propionil ~ CoA carbcxiligaza COOH — CH— CO - SCoA i CH3

rnetilmaloniKCoA izomeraza COOH — CH2 — CH2 — CO - SCoA Bi2 dependents succinih-CoA Propionil-CoA rezull# ?! prin oxidarea acizilor gra§i cu numSr impar de atom! de carbon - deci im tuturor acizilor gra§i li se aplic# stigmatul de neglucoformatori. Tirozina §i fenilalanina sunt convertibile la oxaloacetat prin fumarat, produsul de catabolism al color doi ami.noa.cizi (Fig,. VII. 1.6). De§i tofi aminoacizii enumeraji sunt potential gluconeogeni, alanina, senna. §i glicina sunt, cei care formeaz# cantitap semnificative de glucoz# in vivo. Ei se transforms prin transaminare in piruvat, care formeaz# apoi oxaloacetatul. Ca precursor glucidic de natur# proteic#, alanina oeup# un loc cu totul deosebit. Este demonstrat faptul c3 viteza producerii gtucozei din alani-n# este mai mare decat a oric#rui alt aminoacid.. Sursa major#, de alanin# pentru gluconeogeneza hepatic# §i renal# este mugchiul, unde ea rezult# nu atat prin catabolismul proteinelor, cat mai ales prin sintez# din piruvat, Piruvatul muscular deriv# din glucoz#, prin glicoliz#, §i din aminoacizi ce se pot convert! ia piruvat. Inal me de a p#r#si mugchiul, piruvatul se

358 transamineaz«S la alaniml, in special pe seama aminoacizilor ramificaji care se dczamineazg preferential in mu§chi §i nu In float Alanina formats in mugchi ajunge in float unde se transamincazS pe acetogluiarat formand piruvaf glutamat. Piruvatul furnizeazS scheletul hidrocarbonat pentru sinteza ,,de novo“ a glucozei. Transport*!! piruvatului din mugchi in ficat, in vederea.intrdrii sale in gluconeogeneza hepaticS, este o strategic remarcabilS a organism ului care „paseaz3“ ficatului o sarcinS energofagS numai pentru a pastra disponibilul de ATP muscular pentru contracfie. Giutamatol, inlrat in mitosol, elibereazS, sub aejiunea glutamat dehidrogenazei, amoniac care intrS in ureogenezS. Transportui piruvatului ca alaninS-permits, evident, §i expedierea azofului proteic, de provenienfS muscular#, spre float, sediul ureogenczel. Secvenfa de reaefii descrisS este considerate, de c&tre Felig §i Malefic, un cioiu alamo# - glucozS, analog ciclului lactat - glucozS (Fig, VIL22). De remarcat cS alanina, pe IfmgS faptul c& furnizeazS substrate gluconeogenezei, intervine §i in regiarea procesului in jesutul hepatic, inhihand piruvaf. kinaza. Blocand conversia fosfoenolpiruvatului la piruvat, alanina favorizeazS utilizarea precursoriior glucozei In gluconeogeneza. Gluconeogeneza din lactat presupune conversia sa in hepatocit la piruvat. Lactatul, provenit esen|ial din mu§chi, in condijii de . relative anaerobiozS (din necesifaiea reoxidSrii NADH care sS permits desf3§urarea glicoiizei), ca §i din eritrocit, tributar din punct de vedere energetic glicoiizei, suferS in ficat acfiunea lactat dehidrogenaze'i, formSnd piruvat care este conveitif. la OAA §i apoi l.a fosfoenolpiruvat, in mitosol, sub aejiunea unei PEPCK mitosolice (Fig, VI1.21). De remarcat dl oxaloacelaluf mi se mai export# ca malat, ca in cazui gluconeogenezei din piruvaf, intnicat sursa de NADH necesar gluconeogenezei este, in acest caz, insu§i lactatul. Acesta formeazS, a§a cum s-a anliat glucozS, care poate fi trimisS mu§chiului in contracfie sau eritrocituiui (Fig. YTL23F Gluconeogeneza din lipide. Acizii gm§i cu. numSr par de atom! de carbon sunt degradafi prin (Loxidare pan# la acetil-CoA, care nu este glucogen. Participarea semnificativS a lipidelor la gluconeogeneza se realizeazS prin componenta glicerol. Rezultat al lipolizei din fesulul adipos, glicerolul este convert it in ficat, sub acfiunea glicerol kinazei, la ot-glicerol-fosfat care, sub acfiunea unei dehidrogenaze specifice, formeazS dihidroxiaceton fosfat, intermediar al glicoiizei: ChLO ATP ADR CH?OH NAD" NADH + CH2OH H H* 1 1 VJ V J. CHOH CHOH 1 j. I C=0j I ! CH2OPO3 CH2OH

CH2OPO3H2

H2

ImpreunS cu 3-fosfo-gliceraldehida, cSreia ii poate da na§tere, formeazS fructQzo-1,6bisfosfat. Gluconeogeneza din glicerol reprezintS aproximativ 10% din capacitatea total# de gluconeogenezS a ficatului,

De remarcat cS gluconeogeneza hepatic# sau renal# din lactat (eritrocit, mu§chi scheletic in contracfie), alaninS (mu$chi in condijii catabolice) §i glicerol (jesutul adipos) reprezintS o modalitate de resintezS a glucozei din compu.si rezuifafi prin metabolizarea 359 MU§CHi SANGE FfCAT Glucoza gllco/iza Piruvat Alanina prote/ne musculare aminoacizi | m4* Glutamat ~ ceiogiutarat Glucoza r Alanina Glucoza Alanina gluconeogeneza . a - cetoglutarat -«— j I alanin amino transferaza Piruvat * ^ Glutamat \ glutamat dehidro- genaza mitocondriala NH 4+- ► uree Fig. Vii. 22 - Ciciu! alanina-giucoza (ciclul Feiig-Mafette) FICAT -Glicogen' +*Gtc6-P I,t Piruvat Lactat ~Glc~ SANGE Glucoza • Lactat MU?CHI SCHELETIC

- Lactat Fig. VII. 23 - Ciclul lactat- glucoza (ciciu! Cori) sa parfial& in Jesuturile extrahepatice §i extrarenale, care devin beneficiarele procesuiui de gluconeogeneza. Acegti compu§i nu ar avea nici o posibilitate de evolufie ulterioara in {esutuiile in care se formeazd astfel incat

participarea lor la GNG este salutar! Evident, ciclul Cori ca §i ciclul Felig nu constituie surse pentru sinteza nets de glucozft prin giuconeogenezS; sursS pentru sinteza nets de glucozS sunt aminoacizii glucoformatori rezultafi, prin excelenjS, in cursul proteolizei musculare. Dinlre ace§tia, alanina, glutamina §i glicina ocupS o pozijie special! 360 Alanina s-a doveclit a fi cel mai important aminoacid gluconcogen din punct de vedere canlitativ. Ficalul esfe apt s3 converteasc3 alanina la giucozS chiar §i la concentrajii de 20-30 de ori mai mari decat cele fiziologice. Glutamina, eliberatS de mu§chi, ajunge in mucoasa intestinal^ care o folosegte ca sursS de energie metabolic! Dintre cei cinci atomi de carbon din glutamin& doi vor fi oxidaji la C02 iar alanina rezullatft va fi utilizatS in gluconeogeneza hepatic:! glutamina glutamat

a-cetogiutarat A alanina -- - -> Piruvat oxaioacetat Float C02 Glicina este tnmsformatft in serinft §i utilizatii in gluconeogenez! O ultimS remarcS legate de gluconeogeneza din aminoacizi: intrucat acest proces utilizeazS strict scheletul hidrocarbonat al aminoacizilor rezultat din indep^rtarea grupSrii amino (prin transdezaminare), gluconeogeneza din aminoacizi este inevitabil cuplatS cu sinteza ureei. Fig. VII.24 reda cele dou& cSi de acces ale alaninei in gluconeogeneza! §i ulillzarea amoniacului in ureogenez! if {2) Glicer.nld«hid ii-fosta! 4 p t——------------(2) NAD 1 ^--------(2) N AOH (2) 1.3-Bisfostoglicerat If (2) OAA t- -f2) NADH (2) Malat . Id Asp Ajfinina Piruvat —O . ....- a-KG

’"Glut -(2)NAD+ j'NWD'ACf .a-KG -qj— Mala! - Orn • Citrulina • Piruvat rc°2 OAA 2NADH , Glut . Orn Citrulina • -Asp ►Glut Alanina Citoso! Mitosoi \ - a-KG b-c lut OAA f-co2 \ Piruvat V L. r J Piruval -a-KG Fig. V!L 24 - Gluconeogeneza din alanina §i raiajiile ei cu biosinteza ureei (dupa Devlin) 361 VII.5.1. REGLARBA ALOSTERICA A GLUCONEOGENEZEI Reglarea gluconeogenezei se realizeaz# esenfial prin modularea activMjii enzimelor cheie: piruvat carboxiligaza, fosfoenolpiruvat carboxikinaza,.fructozo-1,6-hisfosfataza, giucozo-6~fosfataza - care sunt enzime alosterice - de c3tre anumiji efectori metaboliei. Este de remarcat c3 intensita&a procesului de giuconeogenczil trebuie sh fie invers proportionals cu intensitatea glieolizei, imrueat funcjionarea sincron# §i on viteze egale a celor douS cM ar dace la irosirea substratelor acestora. De exemplu, dacS fructozo-1,6- bisfosfataza ar acjiona simultan §i cu eficacitute egalS cu 6fosfbfrueto-1-kinaza (6-FF-l-K), enzimd glicoliticfi, fructozo- 1,6-bisfosfatul format prin acjiunea 6-fosibfructo-l-kinazei ar fi hidrolizat de prima enzimS, astfel ineai celuia ar lucra Jn goV\ nedispun&nd nici de substi*atele glieolizei, nici de cele ale gluconeogenezei, Scurtcircuitarea activiiSjii celelare se evitS prin faplul ca efectorii pozitivi ai enzimelor cheie din glicolizS sunt efectori negativi ai enzimelor cheie din gluconeogcnezS. Considerdm eUspa: 6-FF-1 -K

fructozo-6-fostat + ATP fructozo-1 ,6-bisfosfat 4- ADP fruclozo-1,6-bisfosfatazS Se §tie c# 6-fosfofructo-1-kinaza este stimulate de ADP §i AMP §i inhibalS de ATP, in limp ce fructozo-1,6-bisfosfaiaza este stimulate de ATP gi inhibatS de AMP. Este evident c# acele condijii intracelulare care - favorizcazft activitatea unei enzime sunt absolut defuvorabile activitSjii enzimei din calea invers#. Stimularea 6-FF-l-K prin produsul sdu de reacjie - fructozo-1,6-bisfosfatul consoiideazS capacitatea sa tie funefionare nesincron# cu fructozo-1,6bisfosfataza. In condijiile in care concentrajia de ATP intracelular este redus#, 6-fosfofructo-1 -kinaza este stimulate de ADP. Pe mSsura formSrii fructozo-l ,6-bisfosfat.ului activitatea 6-fosfofriicto-l -kinazei cregle §i deci $i viteza cSii glicolitice generatoare de ATP. Crejterea concentrajiei tie ATP va induce scMerea activitSpi '6-fosfofructo-1 -kinazd, accentuate de scMerea concentrajiei fructozo-1,6- bisfosfatului. Simultan cu inactivarea glicolizei se va produce activarea gluconeogenezei, intrucat fructozo-1,6-bisfosfataza este activate de ATP §i inhibatS de substratul s&u, fructozo-1,6-bisfosfatul, care scadc. Faralei, scMerea concentrajiei acestui subslrai induce o inhibijie a piruvatkinazei (fructozo-1,6-bisfosfatul se comport# ca activator a! enzimei), fapt ce constrange fosfoenolpiruvatul s3 se orienleze spre gluconeogenez3, care se acceiereaz#. De menjionat c# fosfoenolpiruvatul se comport# ca efector aiosteric negativ al FF-2-K §i efector aiosteric pozitiv penlru F-2,6-P2aza. Cresperea concentrajiei acestuia in condijii de gluconcogenezS va. duce la sc&derea. concentrajiei fructozo-2,6-bisfosfatului, activator al 6fosfofructo-l-kinazei §i inhibitor al fructozo- 1,6-hisfosfatazei, deprimSnd glicoliza §i favorizand gluconeogeneza. Un alt punct dc control in gluconeogenezS este reaejia de formare a fosfoenolpiruva- tului sub acjiunea piruvat carboxiligazei §i fosfoenolpiruvat carboxikinazei. Piruvat carboxiligaza, enzima ce catalizeaz# conversia la oxaioacetat a piruvatului, se afl& in competijie pentru acelagi substrat cu enzima ce catalizeaz# decarboxilarea oxidativ# a piruvatului (piruvat dehidrogenaza). 362 In condifii de giuconeogenezd nevoile encrgelicc ale fesuturilor sunt satisf&cute, din plin, pe seama excesuiui lipidie. Ca urmare, fosforilarea oxidative este incetinitS, priii lipsa aecepiorului de fosfat (ADP), aeumulanduse NADH, inhibitor al enzimelor eheie ale ciclului Krebs, Concentrafiile man de acetil-CoA acumulate produc stimularea piruvat carboxiligazei §i inhibifia piruvat dehidrogenazei, orientSnd astfel piruvatul spre oxaloacetat. Acesta se poate cupla eu acetil-CoA pentru a forma citrat, substrat al ciclului Krebs, sau poate forma fosfoenolpimvat, substrat al gluconeogenezei. Cum citrat sintaza este inhlbabl prin ATP, in limp ce fosfoenolpimvat carboxikinaza este stimulate de nucleozid trifosfaji, in condifii de gluconeogeneza-(ATP crescut prin arderea acizilor gra§i) oxaloacetatul va lua calea fosfoenoipiruvalului. §i in etapa formSrii fosfoenolpiruvatului exists pericolul i.roslrii acestui substrat comun al gluconeogenezei gi glicoiizei, prin acfiunea simultand a piruvat kinazei §i fosfbenolpiruval carboxiidnazei. AceastS posibilitaie este evitatS in condijii ce favorizeazd gluconeogeneza, infcruc&t piruvat kinaza este inhibatft de nucleozid trifosfafi (ATP), acizi gragi cu lanf lung, acetil-CoA, alaniml In

aceiagi tirnp piruvat kinaza este stimulat'd de fructozo-1,6-bisfosfat. Scdderea concenlrafiei fruclozo-1,6- bisfosfatului va contribuila inhibifia piruvat kinazei, excluzSndu-se astfel simuitaneitatea d.e acfiune a piruvat kinazei §i fosfoenoipinivat carboxikinazei. Evitarea funcjion&rii simultane, deci a parcurgeri-i -utfui-ciclu inutil, este neeesaril. §i in cazul conversiei glucozo-6-fosfat —> glucozS. Funcfionarea concomitentS a glucozo-6- fosfatazei §i glucokinazei ar dace la on consum inutil de ATP, Spre deosebire de cazurile anterior descrise, cuplul glucokinaz&*glucozo-6-fosfatazft nu este supus acfiunii unor efectori metabolic! cu acfiune antagonists. Evitarea funcfiomlrii simultane a celor douft enzime se reaiizeaza In special prin concentrafia de glucozd sanguine §i prin acfiunea unor factor! hormonali. In mod. normal, cand concentrafia de glueozft sanguinS, create, activitatea glucokinazei (indusd de insulind) create paralel cu activitatea glicogen sintazei, care este activate de glucozo-6fosfat, ceea ce (luce la depunere de glicogen. Cand concentrafia glucozei scade, activit&Jile celor doud enzime scad, ceea ce duce la predominenfa activildfii glucozo-6-fosfatazei §1 glicogen fosforilazei cu eliberare de glucozd. V1L5.2. REGLAREA HORMONALA A GLUCONEOGENEZEI Gluconeogeneza se desfagoanl, aga cum am vfizut, In condifiile in care aprovizionarea f.esuturilor glucodependente cu glucozd este deficitarft. In aceste condifii sursa majors de energie pentru toate ceielalte fesuturi devin trigliceridele depozitate in fesutul adipos In cursul fazei anaboiiee. Ca urmare a lipolizei, activate de glucagon, catecolamine §i glucocorticoizi, trigliceridele din fesutul adipos dau nagtere la giieerol, substrat al gluconeogenezei, gi acizi gragi. Degradarea oxidativd a acizilor gra§i duce la cantit&fi rami de acetil-CoA care, prin oxidate in ciclul Krebs cuplat cu lanfu! respirator, elihereazd marl cantiulf.i de energie. Gluconeogeneza este tributary Poxid&rii care !i furnizeazd, pe langS ATP necesar in reacfiile de formare a fosfoenolpiruvatului gi 1,3- bisfosfogliceratului, gi echivalenfi reduc&tori (sub formft de NADH), necesari reducerii 3-fosfogiiceratuiui la 3fosfoglieeraIdehidd. NADH, formalin cursul cxiddrii acizilor gragi in mitosol, ajunge in citosol, sediul gluconeogenezei, ca malat. Mai mult, acetil-CoA, rezultat. prin fkoxidare, activeazd piruvat carboxiligaza §i inhibd piruvat dehidrogenaza, decizand intrarea piruvalului in gleeoneogenezd. Stimularea lipolizei prin glucagon §i glucocorticoizi favorizeazS deci giuconeogeneza. Glucocorlicoizii favorizeazd giuconeogeneza prin stimularea proteolizei extrahe- patice, prin excelenfd muscularS. Efectul glucagonului, glucocorticoizilor cat §i al catecolaminelor nu se limiteazS insd la fumizarea de substrate pentru gluconeogenezei; ace§ti hormoni stimuleazS direct giuconeogeneza prin inducjia enzimelor cheie ale acesteia cat §i a unor aminotransferaze. Un raport glucagon/insulind mare va produce, de asemenea, represia glucokinazei §i piruvatkinazei. Acjiunea glucagonului se reaiizeazd §i la nivelul activitHjii acestor enzime, via AMPC. Fosforilarea fosfoenolpiruvat carboxikinazei, fructozo-1,6bisfosfatazei, sub ac|iunea protein kinazei AMPC dependente, coincide cu activarea acestor enzime, Reaminlim cd piruvat. kinaza hepaticS este o enzirnd interconvertibila a glicolizei, activd in formd defosfo.

Stimularea prin' glucagon a gluconeogenezei hepatice se reaiizeazd §i prin controlul concentrafiei de fructozo-2,6-bisfosfat (vezi glicoliza). Fructozo-2,6bisfosfatul reprezintd cel mai eficient efector aiosteric pozitiv al 6-fosfofructol-kinazei; (create afinitatea pentru substrat §i scade afinitatea pentru efectorii alosterici negativi: ATP §i citrat), fiind in acela$i timp efector aiosteric negativ al fructozo-l ,6-bisfosfatazei. Prin activarea protein kinazei AMPC dependents glucagonul fosforileazd enzima bifuncjionald 6fosfofxucto-2-kinaza/fructozo-2,6-bisfosfataza, ceea ce va duce la inhibarea activitrijii fosfo-ffucto-2-kinazei §i cre§terea activitSjii fructozo2,6~bisfosfatazei • (Fig. VIL25b). ScSderea concentrafiei fructozo-2,6bisfosfatului, activator al 6-fosfofructo-l-kinazei §i inhibitor al fructozo-1,6bisfosfatazei, ca urmare a acfiunii glucagonului, va avea ca efect net accelerarea gluconeogenezei in defavoarea glicolizei. Hormonul fazei anabolice - insulina - inhibd giuconeogeneza, reprimand sinteza enzimelor cheie ale acesteia. Mai mult, in condijiile secrejiei de insulins, lipoliza este inhibatS iar glicoliza stimulate, condi{ie defavorabilS desfSgurSrii gluconeogenezei; In Fig. VIL25a se reprezintd modalitafile de reglare a glicolizei §i gluconeogenezei. VII. 6 . METABOLISMUL GLICOGENULUI A§a cum s-a arStat, glicogenul reprezintd forma de depozitare a excesului de glucide in organismele animale, la care se face apei in faza cataboiicd a metabolismului. Cantitdfi semnificative de glicogen se gSsesc In mu§chi (1% din greutate) §i in ficat (6% din greutate). Depozitele de glicogen sunt utilizate de cStre cele doud jesuturi in scopuri diferite; ficatul le utilizeazS in scopul menjinerii glicemiei, in timp ce mu§chiul i§i satisface strict necesitdjile proprii de glucozd. Rezervele de glicogen scad dramatic in ficat in cursul a 12-20 ore de inanijie, iar in mu§chi in cursul unei activitSfi musculare intense, ca urmare a glicogenolizei; ele se refac in faza anabolics a metabolismului, caracterizatd prin abundenfa de substrate energogene (glucidice). Grafie rezervelor de glicogen mancSm intermitent §i nu continuu. Glicogenoliza §i glicogenosinteza decurg, ca §i alte cdi metaboiice paralele, p@ cdi distincte ce se conformeazd principiului general al dualitdjii regldrii, care asigurS funcfionarea lor nesincronS. 364

Fig, VIL 25, a - Regiarea aiosterlca §i covaienta a giuconeogenezel (dupa Harper's Biochemistry, 1993) metaboii|i provenind din aminoacizi gtucogenici 365

(+) •^AMP >r-dtrat B ATP Fig. ViL 25. b - Rolui F-2,6-P2 In reglarea call glicolitice §i giuconeogenetice in ficat VIL6.L DEGRAD AREA GLICOGENTJLUI (GLICOGENOLIZA) Degradarea glicogenului - giicogenoliza - presupune desfacerea, enzimatic calalizatfi, atat a leg&turilor 1,4-glicozidice din structure. glicogenului, cat §i a c-elor 1,6. Desfacerea leg&turilor 1,4-glicozidice se realizeazft printr-un proces de fosforoliz£ implicfmd transferul unui rest glucozil pe molecula de acid fosforic. Reacfia este catalizatS de 1,4- giucan-fosfat-glucoziltransferaza, cunoscutd §i sub numele de glicogen-fosforilazd, dand na§tere la giucozo-l-fosfat. Clivarea incepe de la capStul nereducfttor al faiiftilui poiiglicozidic (Fig. VIL26). •f HO

Fig. Vli. 26 - Acjiunea giicogenfosforiiazei asupra moieculei de glicogen 366 Fosforilaza nu poate sa desfac;! leg&turile 1,6-glicozidice din rnoiecula glicogenului, aejiunea sa incef2nd la o distant de patru resturi glucozil fa|& de o ramificajie 1,6. O aliS. enzima, enzima de deramifieare avand activitate amilo-1,4-1,6-glucan transferazicS, catalizeazS transferal unei un.itd.Ji trizaharidiee-de pe un lanj pe on altul. In regiunea de ram.ificajie rainane un singur rest glucozil care va fi hidrolizaf ulterior de aceea^i enzimS de deramifieare (enzirnit bifuncjionaia) care' manifests §1 activitate 1,6-

glucozidazicS (Fig. VII.27). Dupft degradarea lanjului lateral,.fosforilaza i§i continue nestingheritil aejiunea panfi in apropierea unui nou punct de ramificajie. Ca urmare a glicogenolizei rezulta glucozo-l-fosfat §i miei cantitdji de glucozS (prin j aejiunea 1,6-glucozidazei). Glucozol-fosfatul este convertit la glucozo-6-fosfat sub jj 2 aejiunea glucomutazei, enzima necesitSnd drepl cofactor ionul de Mg "'. Evolujia giucozo-6-fosfatului este di.feri.td in cele douS Jesuturi ce conjin cantitBfi -.11 importante de glicogen: ficatul §i mugchiul. In ficat, gIucozo-6-fosfatul este hidrolizat, sub aejiunea glucozo-6-fosfatazei, la !■ S glucozS, care va fi trimisS. in circulate in scopul satisfacerii nevoilor energetice ale jesuturilor glucodependente; intrarea glucozo-6-fosfatului in glicolizd este exdusft in faza catabolicS a ; metabolismului, snfeucat in aceastS situajie glucagonul (hormonal fazei catabolice) inhM glicoliza prin sdidensa concentrajiei de fructozo~2,6~bisfosfat, activator al 6-fosfo-fmcto-l- kinazei, §i inaclivaxea piruvat-kinazei, pe care o converted ia forma fosfo-inactiv2L In mu§chi, jesut lipsit de giucozo-6-fosfataz,S, glucozo-6-fosfatul va urma calea i Embden-Meyerhof, servind ca sursd de energie pentru mugchiul insu§i. In acest Jesut, ;•;! glicoliza, urmfind glicogenolizei declangatd de efortul muscular, este un imperativ. ;•

v 367 Spre cleosebire de glicoliza hepatica, glicoliza musculard este active in

fazS catabolicS, intruc&t piruvat kinaza muscular^ este o enzimS interconvertibilft, activS in forma fosfo, promovatS de protein kinaza A, AMPC dependents (receptori (3-adrenergici), iar acti vita tea 6-FF-1K nu este controiatS prin fructozo-2,6-bisfosfat. De remarcat soarta, din nou diferitS a glucozei rezultatS prin giicogenolizS Tn cele douS jesuturi. In ficat, glucokinaza, datoritS valorilor KM foarte man, nu reconverted glucoza la G-6-P, ceea ce permite acesteia s3 iasS in sange, in timp ce in mu§chi, hexokinaza (KM mic) opereaza aceastS transformare §i G-6-P rezuliat se angajeazS in glicoliza, REGLAREA GLICOGENOLIZEI Etapa limitantS de vitezS in degradarea glicogenului este etapa fosforoliticS. Enzima ce catalizeazS. reacjia de fosforoiizS - giicogen fosforilaza - este subordonaal unui control metabolic varial §i complex, realizat alftt prin reglare covalentS. cat §i alostericSL Ca. activator aJosteric al enzimei se comports AMP in timp ce glucozo-6-fosfatul §i ATP (concentra{ii marl) sunt inhibitori alosterici ai acesteia. Activarea prin AMP se manifests prin excelenjS in jesutul muscular, unde concentrajia sa cre§te marcat in eforturi intense §i exprimS, ca §i in cazui 6-FF-l-K, dependenja procesului de statusul energetic celular. Experien|ele lui Cori au ar&lat cS giicogen fosforilaza, un dimer, se gSse§te in jesiituri in douS forme interconvertibile prin fosforilaredefosforiiare desemnate drept. „ak\ respectiv „h“. Interconversia celor douS forme ale glicogen-fosforilazei se realizeazS grajie aejiunii antagoniste a douS enzime: giicogen fosforilaz-kinaza §i giicogen fosforilaz-fosfataza, §i poate fi reprezentatS: giicogen fosforilaz kinaza giicogen fosforilaza „a“ (fosfo) activa giicogen fosforilaz fosfafaza Giicogen fosforilaz kinaza este o enzima conslituitft din patru tipuri de subunitafi fiecare prezentS in patru copii (a, (3, 5, Y)4. Subunitatea 8 iiincfioneazS ca subunitate cataliticS, in timp ce subunitSjile a, (3, y indeplinesc roluri reglatorii. Subunitatea 8 este reprezentatS de calmodulins, proteinS care t'ixeazS caiciu §i care, funcjie de concentrajia citosolicS a acestuia, i§i modifies conformafia. Fosforilaz kinaza este ea tnsSgi prezentS in douS forme interconvertibile, Conversia formei inactive (b) la forma activS (a) se realizeazS tot prin fosforilare la subunil&jile a §i (3 in prezenja ATP §i a unei kinaze, protein kinaza AMPC dependents. Forma fosfo- activS a fosforilaz kinazei este reconvertitS la forma defosfo inactivS, sub acfiunea unei fosfataze (fosfoprotein-fosfataza), identicS cu giicogen fosforilaz fosfataza. AMPC, mesagerul secund format ca rSspuns la aejiunea adrenaline! in ficat §i mu§chi (acfiune mediatS prin {3 receptori) §i a glucagonului in ficat, stimuleazS activitatea protein kinazei AMPC dependents, care va efectua fosforilarea fosforilaz kinazei. Fosforilaz kinaza astfel giicogen fosforilaza ,,5“ (defosfo) inactiva

368 activate va cataliza fosforilarea glicogen fosforilazei care, activandu-se, va

sdinda fosforolitic glicqgenul. Viteza de desfllgurare a glicogenolizei va create deed ca urmare a aejiunii adrenaline! §i (sau) glucagonului, ale edror efecte intracelulare au fost realizate prin AMPC. De rem areal' dt activarea „in cascade4 a glicogenolizei realizeazS o ampiificare a rftspunsuiui celulei la s'timulul. inifial. Intr-adevSr, eliberarea urior concenlrajii mici de adrenalin!. (de ordinul lO'9 M) sau glucagon determine, printr-o ampiiiicare succesivd tn etapele calaiizale enzimatic, o ampiificare a glicogenolizei de 15 ortline de marlrne (Fig, VII.28), Resfabilirea valorllor glicemiei deprimd secrejia de glucagon. Ca urmare aacesiui fapt pnoteina G devine maedvd, ceea ce aMreneazd inaedvarea adrenilaf ciclazei, a protein kinazei AMPC dependente, a fosforilaz kinazei §i glicogen fosforilazei. De men|ionat cd glicogenoliza hepatic! este controiatd de adrenalin:! nu nurnai prin cregterea eoncentrafiei AMPC, mesager secund format ca rSspuns la interaejiunea hormonului cu jl-receptori membnmari, ci §i prin mesageri secunzi rezultap In urma interaejiunii adrenalinei cu receptor! adrenergic! de tip a}. Aceasta interacjiiune se soldeazd cu formareaa doi mesageri secunzi: inozitol trisfosfatul (IP3) §i diacilglicerolul ATP

fosforiiaz kinaza b y fosfoprotein fosfataza . AMPC----►© protein kinaza AMPC - dependental □ 0 t ©, fosforilaz kinaza a

Fosforilaza i?04 r

AMP Fosforilaza a fosfoprotein fosfataza e A

Inhibitor -1 a

AMPC----►© protein kinaza AMPC - dependents Q-p Fosfoprotein fosfataza ATP inhibitor -1 b □ Fig. Vil. 28 - Reglarea glicogen fosforilazei prin modificare covaienta 369

Fig. VII. 29 - Efecteie glucagonului §i adrenaline) asupra glicogenolizei §i glicogenosintezei hepatlce (DAG) (vezi „Hormoni“). IP, scoate calciu din reticulul endoplasmic crescind

astfei concentrajia sa citosolicft. Unitatea 8 a glicogen fosforilaz kinazei, reprezentatft de calmodulins, ieagS cu afinitate mare calciu, ceea ce induce in molecuia enzimei o tranzijie conformafionalS avSnd ca rezuilat superaetivarea acesteia, Activarea la maximum a glicogenolizei hepatice in condifii de stress permite restabilirea rapidS a glicemiei. In Fig. VII.29 sunt sumarizate efecteie'glucagonului §i adrenalinei asupra glicogenolizei §i implicit glicogenosintezei hepatice. Glicogenoiiza muscular^ este declan§atS, a§a cum s-a menjionat, de acjiunea adrenalinei mediate de receptori ji adrenergic!. Ca §i glicogenoiiza hepafica, glicogenoiiza muscularS este declan^atS §i de cre§terea calciului citosolic, cre§tere determinate In mu§chi de acetilcolinl Acetilcolina, care mediazHtransferul impulsului nervos, determine depolarizarea membranei §i cre§terea concentrajiei Ca2" in sarcoplasma celulei musculare, rezuilat al eliberftrii Ca2+ din reticulul sarcoplasmic. Calciu necesar contracjiei musculare, de necesitatea c&ruia mugchiul este informal prin acetilcolina, determinS. superaetivarea glicogen-fosforilaz-kinazei prin legarea la subunitatea 8, dect superaetivarea glicogeno- lizei. Declan§area prin acela§i siimul (Ca2") atat a contracjiei cat §i a glicogenolizei asigurS sincronizarca, absolut necesarit, a celor douli procese. Cre§terea concentrajiei Ca~ + citosolic create activitatea muscularft §i fumizeaz#, In acela$i limp, prin superaetivarea glicogenolizei, eanliUIJi mari de glucozo-6-fosfat care, prin parcurgerea. glicolizei, va genera ATP necesar contracjiei. 370 VIi.6.2 BIOSINTEZA GLICOGENULUI (GLICOGENOGENEZA) Riosinteza glicogenului din glucozo4-fosfat implied acfiuinea conjugal a unor enzime apte s& realizeze legftturi 1,4 §i 1,6 glucozidicePormarea unei Segfituri glicozidice este un proces endergonic ce consume aproximativ 4,2 kcal. Din acest motiv este necesar ca glucozo 1-fosfatul s& fie mai intii activat Activaiea se realizeaza, a§a cum s-a ar3fcat (vezi calea aeizilar uronici), prin conversia sa la uridin difosfat glucozS, in prezenja UDP-glucozopirofosfoiilazei: Uridin difosfat glucoza cedeazS un rest glucozil pe un glicogen „mic“ rezultat din glicogenoliza §i care serves le ca- initiator (primer) al procesului de policondensare. Transferal unit3{ii giucozil de pe uridin difosfat glucozS pe primerul glicogenic se efectueazfi la capfttul nereducfttor al oligozaharidului §i este catalizat de glicogen sintazS. (Fig. V1I.30), Energia cliberatA la sinteza unei legSturi 1,4 glicozidice, prin transferul ,glucozei de pe uridin difosfat glucozS, este de aproximativ 3 kcal, deci reacfia este fermodinamic avantajoasS sintczei (la hidroliza pirofosfatului AG 0' = -7 kcal). Glicogen sintaza realizeazS, excl-usiv leg&turile 1,4 din molecula glicogenului. Ramificarea glicogenului se realizeazS sub acpunea amilo-1,4-1.6transglicozidazei (enzima de ramificare) §i implica transferul de resturi glucozil (cel pujin $ase) la C6 al. unui rest de glucoza (Fig. VII.31). Cercetari relativ recente au arfttat c&, In situa|ia in care nu exists un primer glicogenic (condit-ii care au impus deplejia glicogenului), se recurge la un primer de natura proteicS. - glicogenina. AceasLl proteins cu masa moleculara mica manifests §i activitate catalitidS, permi$nd inifierea procesului de sinteza ca §i adaugarea succesiv# a c&torva resturi glucozil.

Inifierea procesului presupune transferul unui rest glucozil din UDPgiueozS pe gruparea hidroxil a lirozinei din pozijia 194 din molecula glicogeninei §i face uz de activitatea protein-tirozil-glucozil transferazicft a primerului. Asocierea glicogeninei cu glicogen sintaza precede adaosul secvenjial a §apte resturi glucozil cedate de UDP-glucozS; cataliza procesului revine, de asemenea, glicogeninei (autocatalizS) care func|ioneaza ca glucozil transferazi. Extinderea fragmentului pollzaharidic este operate de glicogen sintaza care, pentru a avea Jibertate de mi§care“, iese din legdtura sa temporary cu glicogenina, care ramane legatS covalent la molecula de glicogen (Fig. VII.32). Acfiunea enzimei de nimificare „lncheie“ sinteza glicogenului (Fig. VII.31). glucozo-1-fosfat +. UTP UDP ~~ glucoza + PP pp -------------------- - -^ 2P;

O— Giicogen sintaza UDP OH UDP-glucoza Glicogen initiator

CH2OH CH2OH CH2OH 0— Fig. VII. 30 - Sinteza legaturilor 1,4 glicozidice din molecula glicogenului enzima de ramifiere

Fig. VIL 31 - Ramificarea giicogenului Tyr-OH y Gficogenina UDP-glucoza U DP Giicogenina Tyr-O-M----

J ^ 7 UDP-giucoza 7UDP Tyr-G gftcogen ftintaza nUDP-glucoza nUDP HDOOOOCKDOOOenzima de ramificare _

372 REGLARE A GLICOGENOGENEZEI Enzima limltanlS de vifeza a glicogenosintezci, la nivelul cSreia se exercitS un control metabolic riguros, esie glicogen sintaza. Ca §i glicogen fosforilaza, glicogen sintaza se prezintS sub doml forme interconve-rtihile prin fosforilare - defosforilare. Forma fosforilaLL JA este inactive in limp ce cea defosibrilala ,,a“ este activS. Interconversia eelot dotia forme ale glicogen -sintazei se reaiizeazS, esenjial, grajie acjiunii antagonize a douS enzime: glicogen-sintaz-kinaza §i glicogen-sintazdbsfataza: glicogen sintaz-kinaza glicogen sintaza „a“ (defosfo) activa glicogen sintaz-fosfataza • Glicogen sintaz-kinaza AMPC dependents este identic^ cu protein kinaza AMPc dependents care activeazS, prin fosforilare, glicogen fosforilaz kinaza. Glicogen sintaz- fosfataza este identicS cu glicogen fosforilaz kinaz fosfataza §i cu glicogen fosforilaz fosfataza. AceastS fosfo-protein-fosfatazSreaiizeazS prin defosforilare activarea glicogen- sintazei §i inactivarea simultanS a glicogen fosforilaz kinazei §i glicogen fosforilazei. O mSsunl adifionaia pe care o la cekila pentru a evita desf3§ururea sinmlianS a defosforilSrii cu fosforilarea const'S in inactivarea fosfo-proteinfosfatazei de cStre o proteins ~ inhibitory! de fosfatazS-l - care devine activ prin. fosforilare AMPC dependents (ca §i glicogen fosforilaz kinaza §i glicogen fosforilaza), fosforilare realizatS. insS la un reziduu de treonina $i nu de serinS, ca in. celelalte caznri, Prin legarea inhibitorului de fosi'alaza la fosfoprotein fosfalazS este suprimatS numai activitatea hidroliticS a acesteia asupra reziduurilof do fosfoserinS nu §i asupra celor de fosfotreonipS astfei incat fosfoprotein fosfataza ix>ate defosforila inhibitorul de fosfafcizS-l cam devine inactiv (Fig, VII.33). Regiarca covalent:! a glicogenoiizei §1 glicogenosintezei se reaiizeazS astfei incal sS nu permits celor douS procese antagoniste sS se desfS§oare simultan la aceea§i intensitate. Crejterea. conceniraliei de AMPc, proidusS prin activarea adenilat-ciclazei de cStre glucagon §i adrenalins (secretaji ca rSspuns la o stare hipoglicemicS sau de stress), activeazS protein kinaza AMPC dependents (via proteina G; vezi „Hormoni“). Ea va efectua fosforilarea simultanS a glicogen fosforilaz kinazei, glicogen fosforilazei, glicogen sintazei §i a inhibitorului de fosfatazS-1. Activarea inhibitorului fosfoprotein fosfatazei prin fosforilare AMPC dependents inactiveazS fosfoprotein fosfataza, excluzand funcjionarea simultanS a celor douS enzime antagoniste; protein

kinaza §i fosfoprotein

glicogen sintaza „bM(fosfo) Inactiva 373 Caw

© 4 I I AMP,--->

F/(7. VII - 33 Reglarea glicogen sintazeiprin modificare covalentd( Dupa Devlin ) 374 fosfataza. Glicogen fosforilaz kinaza’ §i glicogen fosforilaza in forma fosfo vor

decianga proc'esul de glicogenolizi ca rSspuns la stimulul hormonal. In acelagi timp, sinteza glicogenului este suprimatS, mtrucat glicogen sintaza se inactiveazS prin fosforilare (Fig. VII.34). De men|ionat c3 glicogen sintaza este inhibatd prin fosforilare no numai de catre protein kinaza A, AMPC dependents, ci §i de cStre alte kinaze, activate de alji mesageri secunzi, cum ar fi de exemplu protein kinaza C activate sinergic de Ca2+ §i DAG. Evident, inactivarea glicogen sintazei de catre protein kinaza C este complementary acfiunii de stimulare a glicogen fosforilaz kinazei prin Ca2+ (via IP3). Suprimarea sintezei de glicogen in perioadele de glicogenolizS activS se asigurft §i prin fosforilarea glicogen sintazei de cStre glicogen fosforilaz kinaza superactivS, care a legat Ca 2\ Efectul net ai acjiunii hormonilor ce cresc concentrafia de AMP C asupra ficatului va fi acela de formare a glucozei din glicogen §i cregtere a glicemiei. Mugchiul va rSspunde la acjiunea adrenalinei prin amplificarea glicogenolizei §i glicolizei §i eliberare de lactat. ScMerea concentrajiei AMPC (prin scMerea concentrafiei de adrenalins §i glucagon, respectiv cregterea concentrafiei de insulina, care activeazS fosfodiesteraza prin intermedia! unui mesager secund, presupus a fi un inozitol glicozaminoglican) inactiveazS protein kinaza AMPC dependents §i deci sisteazS fosforilarea glicogen fosforilaz - kinazei, glicogen fosforilazei, glicogen sintazei §i inhibitorului fosfoprotein fosfatazei-1. Inhibitorul de fosfataza 1, devenit inactiv, permite acjiunea fosfoprotein fosfatazei care defosforileazS cele trei enzime implicate in metabolismul glicogenului. Ca urmare, glicogen sintaza se activeazS, in timp ce glicogen fosforilaz kinaza §i glicogen fosforilaza se inactiveazy, ceea ce se traduce prin cregterea vitezei de sintezy a glicogenului gi deprim area glicogenolizei. Efectul net al hormonilor care scad concentrajia de AMPC asupra ficatului va fi acela de stimulare a glicogenosintezei gi deci de scydere a glicemiei. AiijPc ProteinkinazaAt ^ProteinkinazaA fis inhibitorul l , Inhibitorul inactivS ^ / activa.... fosfoprotein-fosfalazei► , fosfoprotein-fosfatazei /v inactiv (~P) K ^ _ s activ (+P) 1© r\. (+) Fosfoprotein t 7 Fosfoprotein Glicogen * f Glicogen x. fosfataza activa & ! fosfataza inactiva fosforilazkinaza* / fosforifazkinaza \ \ ^ inactiva (~P)_^ ^ ' activa (+P)

Fosfoprotein- fosfataza 3 Glicogenfosforilazaf ^^Glicogenfosforilaza Giicogensintaza, inactivS (-P) ^ J active (+P) actvi (+P) \ GUcogensintaza J inactiva (+P) Fosfoprotein- fosfataza Glicogen (n)-^glicogen (n-1) Fosfoprotein- fosfataza Glicogen (n)—-glicogen (n+1) Fig. VII. 34 - Activarea giscogenolizei coincide cu inactivarea

giicogenosintezei 375 Cercet&ri recenle due la concluzia efi, ficatul are abilitatea de a r&spunde direct la concentrajii man de giucozli in sange (postprandial) prin inactivarea giicogen fosforilazei si activarea giicogen sintazei, in afara unei medieri hormonale. Glucoza hepatica sc comporta ca inhibitor alosteric a.! giicogen fosforilazei inducfmd in aceasta o modificare conformafionald soldatd cu expunerea reziduurilor de fosfoserind. la aejiunea fosfoprotein fosfatazei care o defosforileazd, inactivllnd-o, Defosforilarea giicogen fosforilazei „a4\ acompaniahl de ccnversia la giicogen fosforilaza „b“, permire eliberarea fosfoprotein fosfatazei din complexul pe care nceasta T1 formeazd exclusiv cu giicogen fosforilaza ,,aA Ca urmare, giicogen sintaza devine pinta aejiunii fosfoprotein fosfalazei care o ciefosforileazfu activand-o. Inhibipia glicogenolizei prin concenlrajia de giucozfi sanguinS, respeefiv de glucoza hepatic^ libera, §i activarea simultanil. a glicogenosintezei, prin mecanismu! desciis, desemneuzd giicogen fosforilaza ca. senzor de giucozfi, De remarcat cd insSt§i natura efeclorului alosteric pentru cele doufi giicogen iosfbriiaze - glucoza - efecior negativ pentru giicogen fosforilaza hepatied §i AMP - cfector poziliv redutabil pentru giicogen fosforilaza muscular^ - este expresia scopului diferit til glicogenolizei hepatite (restabilirea. glicemiei) fapl de cea muscular^ (asigurarea ATP necesar confracjiei), VII.6.3. ALTERARI ENZIMATICE IN METABOLISMUL GLICOGENULUI Se eunosc mimeroase situajii pat.ologi.ee caracterizate prin deficienja eredilaril a si.stemel.or enzimatice implicate HI metabolismu]' glicogenului. Acestc defidertfe antreneazii depunerea unor cantitdji masive de giicogen, inotiv pentru care au fost reunite sub numeic de boli de depozitare a glicogenului sau giicogenoze. Au Cost descrise pane acum nourl iipuri de giicogenoze; 1. Glicogenoza hepalo-renald sau boaia von Gierke reprezintd cel mai freevent tip de glicogenoza. Boaia se earaeterizcaza printr-o aefivitate redusd sau prin absenjn glucozo-6- fosfatazei in float inteslin, rinichi (singurele jesuturi care con (in enzima), ceea ce are ca rezultat imobilizarea glucozei. Hipoglicemia rnarcatd care sc instaleazfi nu poale fi corectald prin administrare de glucagon sau adrenalins; stigmateie biochimice sunt cele ce insofesc In general hipoglicemia, Alarmarea sislemelor hiperglicemiante antreneazd mebilizarea excesivd adipidelor §i proteinelor din fesuturile exlrahepatice §i -cre^ferea gluconeogCnezei. Cetogeneza excesivfi §i laclaeidemia completeazd tabloul biochimic al bold. Manifest&riJe clinice ale bold sunt tulburiiri digestive, convulsii, hepatomegalie (prin depozitarea glicogenului §i inedreare lipidicil), manifestfui neuroiogice. Boaia apare inca din primele luni de viafd §i are, adesea, o evolujie fatald. Dep3§irea prime! etape §i coreclarea hipercorticismului dace la o'evolujie relativ norma 15 in cadml h ipog lice m i ei per si s ten t e. 2. Glicogenoza generalizatd sau sindromul Pompe se daioreazd deficilului de (1,4 - 1,6) glucozidazd, enzirnd lizozomald avand rolul de a degrada

glicogenul. Se constata o depunere masivfi de giicogen, in special in lizozomii din mu§chiul cardiac §i scheletic, SNC. Acumularea glicogenului duce la o evolujie nefavorabild a bolii, in afara unui sindrom hipoglicemia 3. Glicogenoza Forbes se caracterizeazd biochimic prin lipsa enzimei de deramifiere, fapt. ce determine depunerea unui giicogen anorrnal (de tipul dextrineior limitd), in special in ficat §i mu§chiul striat. Clinic, boaia se manifesto analog maladiei von Gierke, dar mai alenuatd. 4. Glicogenoza Anderson este determinate de deficienja enzimei de ramifiere - amilo - (1,4 - l,6)-transg!ucozidaza. In ficat, splind, intestin se depune un giicogen cu lanjuri extrem de scurte. Boala se manifest'! clinic prin cirozfl §i evolupa este falala in juris] vftrstei de 10 anri de§i glicemia se menjinc in limite normaie. 5. Glicogenoza Me Ardie se datoreaz! deficienfei fosforilazei imiseulare §i duce la depuneri masive de glicogen normal. Cum mugchiul In repaos folose§te drept combustibil acizii gra§i §i corpii cetonici, preferential faf! de glucoza sanguin!, boala se manifest numai in cursul efortului muscular, Crampele, durerile, oboseala muscular*! sunt, rezultatul inenpacitilJii mu$chiului de a folosi glicogenui propriu, principal surs! de giucoz! In condifii de efort. Ciciul Cori este profund perturbat, ca urmare a fenomenului descris. 6. Glicogenoza Hers se caracterizeaz! prin diminuarea act.ivit3f.ii fosforilazei hepatice, ceea ce antreneaz! depuneri masive de glicogen normal in ficat Hipoglicemia nu este foarte sever!. Maladia Hers se manifesto, de asemenea, ca o forma alenuata a maladies von Gierke, Unii auiori consider*! drept cauz! prirnar! a acestui tip de glicogenoz! o anomalie in activimtea adeniiat ciclazei, incapabil! sa asigure o eoncemrape adeevat! de AMPC. 7. Glicogenoza de tip 7 reprezint! forma maladiei Hers in care, concomitent cu depozitarea excesiva de glicogen in ficat, se consult! o inc! rcare muscular!. 8. A last descris! o glicogenoz! de tip 8, avfrncf drept cauz! ahsenfa. glucagonului, activator al fosforilazei, 9. Hug a pus in evidenf! glicogenoze datorate deiiciCuIui unorsistemc enzimalice responsabile de activarea fosforilazei,, cum ar fi fosforilaz-kinaza (glicogenoza de tip .9), Exist! posibilitatea ca unde tipuri-de glicogenoze s! apar! asociate, ceea ce compile! diagnosticarca §i tratarnentul acestora. VII.7. METABOLISMUL GALACTOZEI Galacfoza este o component! major! a glkolipidelor. glicoproteinelor, proteoglieanilor. Metabolismul: s!u pair urge c!ile de' edificare a' accstor componente. Pe de alt! parte, galacfoza este convert!!! la giucoz!, cu prec! dere in rinichi §i ficat, astfel incat c!ile sale de metabolism sunt comune cu ale acesteia. Convcrsia galactozei la giucoz! parcurge etapele: 1. fasfbrilarea galactozei sub acftunea gaiactokinazei cu formarea gdactozo-l -fosfatului; . OH ,________. H — Q----------1 I H — C — OH

! HO — C — H O I HO — C — H i H C--------------1 ■ I CH2QH + ATP H — C — 0P03H2 I H — C — OH • I HO— C — H i HQ c H I H C -----------I CH2OH 4- ADP 377

2. Transferul reslulu? galactozil pe uridin difosfat-glucozft (UDP-glucoz2) sub ac|iunea UDP-glucozo-galactozo-l-fosfat-uridil transferazei: CH2OH CH2OH

UDP-galactoza se formeazft partial §i prin reac|ia: UTP + gal-1 dosfat-------------------UDP-gal + PP; Activitatea UDP-gaIactozo-piix)fosforila^i, enzima ce catalizeazS reacjia de mai sus, scade cu vftrsta, astfel incSt ea mi se poate substitui UDPglucozo-galactozo-l-fosfat uridil Iransferazei. 3. Interconversia celor douft oze se produce la nivelul nucleoziddifoslafilor §i presupune inversia grupei - OH de la C4 (epimerizare la C4). Reacjia este catalizatS. de o epimerazd (UDP-gIucozo-4-epirnenM). 0

378 Echilibrul UDP-Gal ** UDP-GIuc este dorninaf de nevoile organismului la un moment dat. in perioadele de lactafie, cam! glanda mamard sintetizeazd mari cantitdji de lactozd, in perioadele de form are a structurilor glicolipidice (mielind), echilibrul este favorabil formdrii gaiactozei. Interconversia UDP-Gal ** UDP-GIuc face ca prezenja galactozei sd nu fie obligatorie in diet'd. UDP-glucoza poate constitui precursorul imediat al sintezei de glicogen sau poate fi scindatd la giucozo- 1-fosfat (UDP-Gluc + PP UTP + Glue- 1fosfat), sub acfiunea UDP-

glucozo-pirofosforilazeL Metaboiismul galactozei poate fi biocat In anomalia genetied a enzimelor implicate In conversia sa la glucozd. Deficienfa galactokinazei duce la galactpzemie §i galactozurie §i se manifesto clinic prin aparifia cataractei. In instalarea cataractei un ro! important revine redticerii galactozei, acumulatd In cristalin, la poliolul corespunzdtor, sub aejiunea aidoz-reductazei (prin efeclul osmotic al acestui poliol). CH2 OH CHO 1 i 0— H C —OH OH — j NADH + H* NAD" H — 1 H i i O C—H C— — HO — H aidoz—reductaza 1 H C-4O HO — 1 H — C —H | | 1 j H C —OH H— C— — I OH j 1 1 CH2OH

CH2O H

Gaiactoza Galactitol Mult mai seven! este deficient UDP-glucozo-galactozo-l-fosfat-uridil transferazei, intrucSl acumularea de gaiactozo-1-fosfat in ficat duce la sechestrarea fosfatului sub forma acestui ester. Stigmatele clinice ale bolii sunt: altered hepatice, cataractd, tulburdri neuropsihice. Modificari analoage pot aparea in insuficienfa hepatied gravd, cSnd ficatul este incapabil sd metabolizeze gaiactoza (toleran|a la galactozd exprimd starea hepatocituiui). Din acest motiv, diagnosticul diferenfial implied, cu necesitate, evaluarea activit&fii UDP-glucozo-galactozo-1 -fosfat-uridil transferazei. Eliminarea din dietd a galactozei se impune in ambele situafii. VII.8. MBTABOLISMUL FRUCTOZEI Fructoza parvine organismului sub formd de zaharozd care, prin hidrolizd intestinald, formeazd glucozd §i fructozd. Prima etapd in metabolizarea fructozei constd in fosforilarea sa. In ficat fosforilarea tire loc sub aejiunea fructokinazei, enzimd cu afinitate mare pentru fructozd, necontrolatd de insul'ind. 379 I. 1 ■ : :.■. :

::

+ O !i O—

Fructozo-1-fosfatul rezultat esle scindai sub acfiunea aiciolazei B, enzima prezenbL- exclusiv in ficat, la doua triozc: glieeraidehida §i flihidroxsa.celonrosfa.iul. C.H9 CH2OPO3 OH H2 | | ! ■ ATP 1 CH c - 0 ADR c-0 CH2OPO3H2 O VJ ! J i 1 i H C— HO n _ u GH O H OH fructoki — 1. . 1 naza 1 aldolaza B 2t H C — Mg H C — OH CHgOH ' CH2 — OH 1 — OM H l H C — OH — C— —

■ OH CH2OH CH,OH Gliceraldehida formats intrS in glieolizd pc urmfltoarele cSi: a' prin fosforilare la gliceraldehid-3-fosfat, sub ac{iunea unci Inoxokinaxe; b. ca dihidroxiaceton-fosfat, obfinui prin urmaloarea succesiunc de reacfii; CH NADH + CH? ATP CH.QH NAD* - H* O H* NAD* OH ADR NADH -i CH2OH 1 t V......J i VJ v y. 1 CH CHO CHOH c-01 gSicer OH H oli aloool 1 CH2 dehidroge OH naza CHpH kinaza CH2OPO3H2 CH2OPO3H. c. ca 2;ft>sfogiiceral, obfinui prin acfiunea aldehid dehidrogenazei urmat# de acfiunea glicerat kinazei; CHO NAD* NADH + COOH ATP ADP COOH H* I vJ 1 VJ i CHO CHOPO H CHOH glicerat 3H, | aldehid i kinaza 1 CH2 dehidrogenaz CH2OH . CH2OH OH a Oricare dintre ace§ti compu§i poale parcurge calea glicoiitidi spre piruvai sau, in funcfie de necesilSfile ceiulei, poale genera glucozS. De remarcat cS fructoza se sustrage controlului exercitat de c&tre enzima limitantS de vitezS a glicolizei, 6-FF-1K, ceea ce-i permiie sS alimenteze necontrolat neolipogeneza cu substrate §i sS aibS, in consecinfS, acfiune aterogenS. 380 In veziculele scminale ca §i in 'cristalin fruetoza se objine din. glucozd pe calea polioiica, carepresupune acjiunea conjugate a doml enzlme: aldoz reductaza NADPH dependent# §i sorbitol dehidrogenaza NAD dependent#: CHO CH2OH CHo0H j I I 1 i HC— 1 C-O OH H G ~ OH sorbitol i■ aldoz reductaza i dehidrogen 1 ■ aza ■ HO — C — CH HO — C — H —H I yy i 1 NADPH NADP* 1 NAD* NADH 1 ■ HC— OH H C — OH | H C“ OH I HC— s s OH H C — OH i HC - OH 1 j 1 j i

CH2QH

CH2OH

CH2OH

In iichidul seminal, fruetoza se angajeazd" in giieolizd §i cielul Krebs, ea fiind combustibiiul preferat pentru spermaiozoid. In cristalin, conversia glucoza H> fructoz# este semnificativS la concenlrajii man de glucoz#. In diabetul zaharat activitatea aldoz reductazei este foarte ereseutd ducand la acumulare de sorbitol dar §i la deplejia NADPH, cofactor al glutation reductazei, enzlmfi implicate in apararea antioxidant#. Incapabil s# traverseze membrana cristalinului, sorbitolul contribuie la instalarea retinopatiei §i cataractei diabetiee prin modificiirile osmotice §i, probabil, prin depriniarea statusului antioxidant celular. Considerat o „toxin# tisuIanYb sorbitolul, produs al cdii poliolice, contribuie §i la patogeneza neuropatiei §i nefropatiei diabetiee, aiatini de perturbarea metabolismului fosfatidil - inozitolilor §i activiuljii Na+, K+, ATPazei. Inhibarea edii poliolice previne a tut instalaiea cataractei retinopatiei cat §i dezechiljbrele menjionate mai sus (In diabetul experimental), Evolujiile metabolice posibile pentru fructozd sunt reprezentate in Fig. VII. 35. Deficienja ereditar# a aldolazei B duce la intolerant ereditar# la fructoz#. Acumularea de fructozo-l-fosfat inhibd glucozo-6-fosfataza §i glicogen fosforilaza §i deci glucoza este sechestrata in float ca ester fosforic, ceea ce expliefi crizeie hipoglicemice. In mu§chi §i rinichi fruetoza este converfit# la fructozo-6-fosfat prin acjiunea hexokinazei. Deficienja ereditara a enzimei duce la acumularea de fructozfi in sange, urmatS de eiiminare (fructozurie esenjiala). 381 Glucozo-6-P ADP hexokinaza ATP \ glucokinaza Giucoza aldoz reductaza Sorbitoi giucozo-6Tosfataza Fructbzo-6-P , ATP F-1,8-bis P-aza f 6FF-1 -K V 1 ADP Fructozo-1,6-bisfosfat Aidolaza A NADPH+H+ NADP+ hexokinaza ------------ADP ATP Y sorbitoi dehidrogenaza V NAD +

NAD H+H'f Fructoza ATP. ADP Fructokinaza Fructozurie esentiala triozo-kinaza ---ADP ATP ——1—■— Dihidroxiaceton(£) $ -----------glieeratdehid -3-P iii? pirn vat Fig. VIL 35 - Evolu|ii metabolice posibile pentru fructoza VII.9. GLICOPROTEINELE Fructozo-1 -P Aidolaza B gliceraldehida Giicopruleinele reprezinta o class de proteine rezullate prin legarea covalentS la lanjurile polipeptidice a unor fragmente oligozaharidice liniane sau nunificate, de dimensiuni variabiie. Conjinutul glucidic al glicoproteineior variazS intre 1 §i 80% din masa moleculei. Monozaharidele care intrS in structura glicoproteineior sunt: galactoza, manoza, fucoza, acidul sialic, galactozamina, glucozamina, arabinoza §i xiloza. NumSrul de unMji monozaharidice in fragmenlele oligozaharidice variazil intre minimum 3 §i maximum 15. Legaturile dinrre fragmenlele oligozaharidice §i proteine sunt legSturi de tip N- sau O- • glicozidic se stabilesc fie prin azotul amidic al asparaginei, fic prin grupSrile hidroxil ale serinei, treoninei, hidroxilisinei, hidroxiprolinei. La fomuuea legftturii N- sau O-glicozidice participfi cu precSdere N-acetilglucozam ina §i N-acetil-gaiactozamina, CealaM extremitate a lanfului oligozahjuidic este reprezentata in special de acidul sialic. LegStura N-glicozidicfl este cea mai frecventa $i utilizeaza ca monozaharid de legatura N-acetil-glucozamina (N Ac Glc). Exista doua tipuri principale de oligozaharide N-glicozidice: - simple - confinand exclusiv N-acetil-glucozam in3 (N Ac Glc) §1 un numar relativ mare de uniiaji manozil; - complexe - care, pe langa N-acetiLgiucozamina §i manozfl, conjin acid sialic, galactoza, N-acetiLgaiactozamina (N Ac Gal). 382 Ambele categorii conjin o regiune corrminl ,,un reprezenfaf de succesiunea a trei resturi de manozS §i douS de N Ac-GIc legale la asparaginft: Man Man a 1,3 \ / a 1,6 Man 1 P 1,4

NAc — Glc J fi1’4 NAc — Glc lP Asparagina In limp ce in oligozaharidele simple, bogate In manozft, ramificapile sunt conslituite dintr-un num&r variabil de unit&jl manozil, in cele complexe ramificajiile externe constau, cel mai adesea, din unitatea trizaharidicS siaiicgaiactoz# - N-aced!-glucozamin£. Un rest fucozil se leag& uneori la restul Nacetil-glucozamiM din „miezuT oiigozaharidic. In Fig. VIL36 este repiezentatft structura uiiui oligozaharid sintplu, bogat. in manozft (a) (izolat. din tireogiobulina bovinft) §i a unui oligozaharid complex (b). Sial Sia! ot 2,3 I a 2,3 sau 6 sau 6 j T Gal Gal 4 P 1. J JP 1,4 GIcNAc GicNAc P 1.2 J , |P'!'2 Man Man a 1,6\ v 1,3 tGieNAep 1.4—► Man Jp M GIcNAc |p1’4 ±Fuc oc 1,6—GIcNAc ip Asn Man Man Man a 1,2 I a 1,2 a | 1 7 7 a Man Man Mf n
oligozaharid complex (b) 383 VII. 9.1. BI0S1NTEZA GLICOPROT.EINELOR Biosinteza glicoproieinclor presupune urmdtoarele etape: L formarea unui ollgozaharid precursor; 2. transferul oligozaharidului pe proteina acceptoare; 3. prelucrarea oligozaharidului precursor din molecula glicoproteinelor, cu formarea glicoproteinelor ,,mature‘\ conjinfmd un fragment oligozaharidic specific. Primele doud etape ale hiosintezei- se desfd§oard la nivelul reticulului endoplasmic. In limp ce ultima are loc in complexul Golgi. 1. Formarea oligozaharidului precursor. Monozaharideie iau parte la biosinteza oligozaharidelor, atat a celor precursor, cal §i a celor „mature“, in stare activate. Ca. §i in cazul hiosintezei glicogenului, forma active este reprezentatft de nucleozid-difosfatmonozaharid. Monozaharideie arald oarecare spec-ificitale fafd de nucleozidtrifosfatul cu care reacjioneazft. Astfel, a glueoza §i a- galactoza, ca §i Nacetil«ozaminele corespunzdtoare se leagd de CMP. Oligozaharidul precursor este un oligozaharid simplu (conpnand exclusiv Nmeetil-glucozamina §1 manozfi) ce rezulta prin transferal succesiv al ozelor activate pe un alcool gras care poaild numele de dolicol. Molecula de dolicol, care este un poliizoprenoL este putemic hidrofoM §i are o lungirne de aproximativ 10 -urn, ceea ce ii permite sfi slnlbaUl de mai multe ori dublul strat lipidic al membrane!, leticulului endoplasmic (fafa luminal#) in care este ancorat: CH3 CH, (CHa - C — CH = CH-fcp- CH2 — CH — CH, — CH2 ~ OH In general n = 16 - 20 unitafi izopren; unitatea. izopren finals este salurat#. Dolicolul este fosforilat in prezenfa ATP formand dolicol fosfat care devine acceptorul resturilor glieozidice ce eonstituie ^niiezuT precursor. La „miezuT comun se adaugil un numflr variahil de uml#|i manozil cedate tie de GDPmanoza, fie de dolicol-ibsfat-mtaiozU Se edified astfel oligozaharidul precursor, avand structure oligozaharidelor simple, bogate in manozft (Fig. VIL37). ♦ ~ Giucoza ▼ - Manoza - N-acetHglucozamina (NAG) do! - Dolicol Lanf poispep- X lidic

3UDP - * ^ - doi YlO Y 'T-Tx. .A, 3UDP • -3+rP-dol P^4 GDP 9 4P - do!• Y of-^^4 GDP- T Fig. VII. 37 - Sinteza oligozaharidului precursor 384 De remarcat c# oligozaharidul se'leag# de doiicol printr-o Iegfttur# pirofosfat care il activeazft, facililand transferal s#u ulterior pe protein#. Proteinele ce urmeazfi a fi glicozilate pentru a da na§tere glicoproteinelor sunt sinletiznte, ca toate proteinele secretorii, pe ribozomii ancoraji pe reticulul endoplasmic (RE). Ancorarea unui ribozom, iniplicat in sinteza unei proteine secretorii* pe reticulul endoplasmic este decisd de prezenta la capatul aminoterminal al acesteia a unei secvenje semnal, complementary unui domeniu din molecula riboforinelor, proteine transmembranare ale reticulului endoplasmic. Proteinele sintetizate pe polizomii ata§a{.i strdbat tunelul subunMfii man a rtbozomului, tunel ce se extinde in membrana reticulului endoplasmic. Lanjul polipeptidic i§i continue cre^terea in reticulul endoplasmic dup# excizia secven{ei semnal sub acjiunea unei peptidaze specifice. 2. Transferal oligozaharidului precursor pe rested asparagin# al proteinei esle catalizat de o oiigoztdiarid-tnmsferaz#, enzimd membrananl avand cenlruf activ orientat spre fa{a luminal# a membranei reticulului endoplasmic, acolo unde iue loc glicozilarea (Fig. VII. 38). Aceast# orientate spajial# a enzimei tie transfer face ca glicozilarea s# fie atributul exclusiv al proteinelor ce intr# in lumenul reticulului endoplasmic, respectiv al proteinelor de export '$i al celor destinate a fi proteine ale membranelor inlracelulare (lizozomale, nucleare, ale reticulului endoplasmic) §i plasmafice, Glicozilarea se efectueaz# numai pe reziduuri de asparagin# integrate secvenjelor Asn-Aa-Ser sau Asn-Aa-Thr, secvenje rar infinite in glicoproteine,

tocmai pentru a se evita glicozil&ri multiple care ar crea dificuMfi In organizarea spatial# a proteinelor. 3. Prelucrarea glicoproteinelor purt#toare ale unui oligozaharid precursor const# in remodelarea acestuia cu formarea oligozahaiidelor complexe. Acest proces decurge in complexul Golgi unde giicoproteinele „imature‘l sunt aduse de c#tre inicroveziculele ce se detageaz# din capetele reticulului endoplasmic. Prelucrarea oligozaharidului presupune inlhturarea unor resturi giicozil §i adaugarea altora, operajie efectuata de glicozidaze (esenjial mangzidaze) §i glicozil transferaze (galactozil-transferaze, 'fucoziltransferaze, sialil-transferaze). Glicozil transferazele alcatuiesc un sistem multienzimatic cu determinare spajial# rigid#. Adtlugarea intr-o succesiune foarte strict# a unitiljilor glicozil este rezultatul specificityjii de substrat a glicozil transferazelor; produsul de glicozilare al fiecarei etape constituie substratul exclusiv al unMtoarei enzime din sistem. Principiui sintezei oligozaliaridelor „mature“ corespunde decs aserjiunii o legatunl - o glicozil transferaz#. In Fig. VII.39 este reprezentat# prelucrarea unui oligozaharid precursor cu forma- rea unei glicoproteine „matureA Variabilitatea fragmentului oligozaharidic in diferite

Bistrat Iipidic af R.E. Fig. VII. 38 - Glicozilarea unei proteine nascande in lumenul reticulului endoplasmic 385 NH CH-CH2-CO-NH“NAcGlc-NAcGlc-Man^ CO ii !i Man : , Man-Man v Man-Man 'Man-Man-Man-GIc-GIc-Gic -3 Glc NH i C H -C H 2 -C O -N H ~N AcGi c-N AcG I c-M a n CO ii NH I

Man-Man Man ^ /s Man-Man x Man-Man-Man -4 Man , Man; ,Man v CH-CH2-CO-NH-N ACGIC-N AcGlc~Man( Man CO i i ii NH i Man UDP NAcGIc Man .Man; CH-CH2-CO-NH-NAcGlc-N!A.cGlc-Man( xMan Man-NAcGIc i ! NH -2 Man CH-CH2-CO-NH-NAcGlc-NAcGlc-Man; I CO I } NH Man 'Man-NAcGIc +UDP NAcGIc CH-CH2-CO-NH~NAcGlc-NAcGlc~Man( CO NH i Man-NAcGIc Man -NAcGIc 2UDP Gal CH-CH2-C0-NH-NAcGlc-NAcGlc-Man( i CO i i i NH i 2 CMP Sial CH~CH2-CO-NH~NAcGlc~NAcGlc-Man( CO

Man-NAcGIc-Gai Man -NAcGic-Gal Man -NAcGIc-Gal -Sial Man -NAcGlc~Gal-Sial Fig, VII. 39 - Prelucrarea oligozahariduiui precursor §i objinerea glicoproteinei mature 386 glicoproteine „mature“ sugereaza cd celula adopts un program diferit de prelucrare a oligozaharidului precursor, in general acela§i, funcfie de lanful polipeptidic de care- este legal. Glicoproteinele „maturate“ in. complexul Golgi sunt transportate pe fafa concavd a acestuia spre membranele piasmatice, lizozomaie, nucleare, de cdtre veziculele secretorii golgiene (coated vesicles). Orientarea glicoproteinelor spre membranele intracelulare sau spre cea plasmaticd este, probabil, decisa de o unitate monozaharidicd variabild. Fuzionarea veziculelor golgiene cu membrana plasmaticd are ca rezultat ancorarea glicoproteinelor pe fa|a externd a acesteia. Clalrina din veziculele secretorii, proteind origanizatd structural ca un poliedru, are abilitatea de a integra §i transporta componente ale membrane! piasmatice spre interiorul celulei, unde vor fi reutilizate la niveiul complexului Golgi, asigurandu-se astfel iluxul de membrane intre citosol §i membrana plasmaticd. VII. 9.2. SEMNIFICAjlA BIOLOGICA A GLICOPROTEINELOR Prezenfa ubicuitard a glicoproteinelor pledeazd pentru o funcfie vitald a acestora. In organismele animale, glicoproteinele joaca un rol preeminent in procesele de apdrare, cregtere celulard, medierea unei varietdfi de interaefiuni intercelulare, transport a! unor compu§i endo- §i exogeni, edificarea unor structuri intra- sau extracelulai'e. in general, activitatea biologicd a glicoproteinelor este realizatd de paitea proteied, pdrfii glucidice revenindu-i aspectul informational cai*e ii permite modularea funefiei acestor entitdfi ca §i decizia asupra destinajiei §i duratei lor de existenfd. A§a cum s-a ardtat, colagenul §i elastina sunt glicoproteine care indeplinesc un rol structural important in constituirea matrixului celuiar. Anumifi hormoni (hormonal foliculo-stimulant, hormonul luteinizant, tireotropina) sunt hormoni glicoproteici. Numeroase proteine ce intrd in structura membranelor sunt glicoproteine. Printre cele mai cunoscute se numdrd glicoforinele §\ glicoproteina din banda III. Glicoforinele reprezintd un grup de proteine integrale prezente in glicocalixul eritrocitar §i care reprezintd aproximativ 10% din totalul proteinelor membranare. Moleculele de glicoforind confin trei zone; doud, corespunzand capetelor N- §i C- terminale, reprezintd zonele hidrofile ale moleculei, iar cea de a treia, cuprinsd intre zonele hidrofile, reprezintd zona hidrofobd. Zona hidrofild dinspre capdtul N-terminal este situatd in afara membranei §i reprezintd 60% din masa moleculei, confine peste 100 de resturi glucidice repartizate in 16 fragmente oligozaharidice avand, aproape invariabil, acid sialic la capete. Prezenfa acidului sialic confefd suprafefei eritrocitului o incarcare negativa puternied, cu rol in controlul schimbului ionic transmembranar. Cealaltd zond hidrofild a moleculei este orientatd spre citosol §i confine o mare cantitate de acid glutamic §i aspartic ionizafi negativ ia pH fiziologic. Zona hidrofobd a moleculei strdbate bistratul lipidic. Funcfiile

glicoforinelor nu se cunosc cu certitudine. Se considers cd paitea bogatd in glucide a glicoforinelor confine antigenele de grup sanguin (A, B, 0). Glicoproteina din banda III (denumitd astfel pe criteriul de migrare electroforeticd) este o proteind integraid a membranei eritrocitare, avand doud zone polare: una situatd spre capdtul C-terminal expus in spafiul extracelular §i confindnd un mic procent de glucide, cealaltd situatd spre capdtul N-terminal oriental spre citosol. Intre cele doud zone hidrofile 387 se afld zona hidrofobd care, traverseazd de cateva ori bivStratuI lipidic. Se pare cd aceastd distribute a zonei hidrofobe permite giicoproteinei din banda III sd constituie un canal hidrofil pentru ionii de clorurd §i bicarbonat, consacrand-o ca pe o protein# eritrocitard cu rol major in transportui oxigenuiui §i dioxidului de carbon. Deosebit de important# este participarea glicoproteinelor in procesele de apdrare §i recunoa§tere. Imunoglobulinele, factorii sistemului complement, interferonul, receptorii hormonal!, unele proteine ale coaguldrii (trombina, fibrinogenul) sunt, de asemenea, giicoproteine. Recunoa§terea celuld-celuld, bacterie-celuld, virus-celuld este mediat'd de giicoproteine. Una dintre aceste giicoproteine, care a suscitat un interes deosebit este fibronecdna, considerate a juca un rol important in procesul de adeziune ceiulard §i avand implicajii in transformarea neoplazicd a jesuturilor. Unele giicoproteine servesc transportului unor compugi endo sau exogeni (feritina, ceruloplasmina, haptoglobina, lacfcorul intrinsec, proteinele de transport al unor honnoni etc.). Protejarea suprafejelor intra- §i extracelulare impotriva unor factori mecanici sau chimici ca §i a unor agresiuni bacteriene sau virale se realizeazd cu participarea glicoproteinelor. VII. 10. PROTEOGLICANII Proteoglicanii (PG) sunt biomolecule conjinand fragmente heteropoiizaharidice neramificate, legate covalent la pailea proteicd a moleculei. Conjinutul glucidic al proteoglicanilor variazd intre 85-90% din masa molecular#. Proteoglicanii se gdsesc in substanfa fundamental# care umple spajiul dintre celule, in cartilagii, tendoane, piele, lichid sinovial. Interacfiunile intre proteoglicani §i moleculele de colagen, elastind, fibronectind sunt decisive in organizarea matricei extracelulare (vezi mai departe). In proteoglicani, polizaharidele sunt constituite din unitdfi dizaharidice repetabile care confin invariabil o ozamind (glucozamina sau galactozamina); din acest. motiv fragmented glucidice ale proteoglicanilor sunt denumite §i glicozaminoglicani (GAG). Cealaltd componentd a unitdjii dizaharidice este reprezentatd (cu o excepjie) de acidul glucuronic sau epimerul sdu la C5 acidul iduronie. Toate unitdfile dizaharidice (cu o excepfie) confin grupdri sulfat legate covalent la oxigen sau azot. Diferenfele structurale intre glicozaminoglicani sunt determinate de; - natura monozaharidelor ce constituie unitatea dizaharidicd; - configurafia anomericd §i pozipa legdturii glicozidice ce se stabile§te in §i intre unitdfile dizaharidice;

- numdrul §i localizarea grupdrilor sulfat. Se cunosc §apte lipuri de glicozaminoglicani, a cdror structurd este reprezentatd in Tabelul VII. I. „De remarcat cd glicozaminoglicanii 'sunt polianioni, rezultat al iiumdrului mare de anioni carboxilat §i sulfat prezenp in molecule, caracteristicd structural# esenfiald care le determind impiicarea functional#. 388 Tabelu! Vtt. 1 Glicozaminoglicanii Dizaharidulrepetiti Gru v (A- B )n pari Greuiat Legat Alte sufaiAi Distribu Glicozamino- ea la compone nitate tia giicanuf molecul Monoza Monoza prote nts de tisulara ara ina glucidice harid harid dizaha rid Acid 4 000Acid DN-aceti! 0 0 corp 6 hialuronic 8x10 glucuD-gluvitros, ronic cozamin cartilajji a chid dnoval Condroitin 4- 5 000Acid DN-acetil 0,2+ Dcartilai sulfat 50 000 glucuD-ga1,0 galactoza oase ronic lactoza artere.c mina ornee piele Condroitin 6- 5.000Acid DN-acetil 0,2-f ” cornee. suifat 50 000 glucuD-ga2,0 oase ronic lactoza artere, mina piele Dermatan 15 000- Acid D1? 1,0■+ piele.sf sulfat 40 000 glucu2,0 nge ronic inima, sau Add valve Liduronic Heparan 5 000-1 ? 5 N-acetil 0,2+ ** artere, suifat 2 000 D-glu3,0 plamtni cozamin suprafa a ta celulelo r Heparina 6 0002,0i> ficat 25 000 3,0 piele plamtni Keratan 4 000-1 D0,9-jDcartifaj, sulfat 9 000 galactoz 1,8 galactoza cornee a mi- na,Dmonoza,

Ltucoza,ac id sialic . I;

:

n; ' i •• ■ F; r. Cu excepfia acidului hialuronic, care formeazS ianfuri heteropolizaharidice soli (are, ceiialfi glicozaminogiicani se asociazS covalent cu proteine, fonnanci proteoglicani. In majoritatea cazurilor legStura intre glicozaminogiicani §i proteine este o legfUmdi oxigen-giicozidicft stability mtre serina xiloza apar{inand unei unit^ji frizaharidice de legfitunl (serin&xi]oz&-galactoz&- galactoz&~ [Monozaharid I - Monozaharid II] n (Fig, VIL40). Uneori legatura cu proteina se stabilegie intre N-acetil-galactozaminti §i serinft, treoninS sau asparagin&. Caracterul hiclrofil puternic §i densitatea mare de sarcinft negative, care le permite sS lege calioni osmotic activi, fac ca proteoglicanii sa lege man cantitSji de ap&. Acest fapt, ca §i rigiditatea lanjurilor polizaharidice, exclude posibilitatea formSrii unor structuri globulare compacte. Proteoglicanii ocupS, ca atare, volume disproporponat de mari fa.0 de procentul de greutate pe care-I reprezintfi din masa proteinelor mediului extraceiular. Organ izarea aceasta difuz£ §i hidratarea avansatS a moleculelor, care formeaziA geluri chiar la concentrafii mici, ugureazil migrarea moleculelor acvosolubile, in medial extraceiular. Cre§terea concentrate! de acid hialuronic in timpul morfogenezei §i repar&rii tisulare subliniazS importanja acestor a tribute. Acidul hialuronic, singurul GAG nesulfatat, este un polimer liniar cu mas3 molecular*! foarte mare (de ordinul milioanelor) constituit din acid glucuronic §i N-acetil-glucoza- mind, legate altemativ prin legation [3-(l,3)-glucuronidice gi (3~(1,4>glucozamiiiidice (Fig. VI1.41).

Acid glucuronic ' Galactoza Gaiactoza Xiloza , Fig. VII. 40 - Legatura dintre gltcozaminoglican §i proteina NH O— CH2~"CH CO

Legatura glucozaminidica COO"

OH NH-Ac Glucuronil Legatura glucuronidica N-acetilglucozaminil OH NH-Ac Fig, VH. 41 - Acidui hialuronic 390 Se pare c#, spre deosebire de ceilalji glicozaminoglicani, acidui hialuronic nu este legal covalent de o moleculfi proteicS. El poate forma ins# axhitecturi moleculare „gigant“ prin asamblare cu proleoglicani conjinand cu precMere condroitin sulfaji. Calityile structurale descrise, comportarea vasco-elastic# a solujiilor sale, fl fac un bun lubrefiant §i „absorbant al §ocuriior“ iar prezenja sain cartilagii, umoarea vitroas#, lichidul sinovial, cordonul ombilical, esie justificalll. Leg#turile giicozidice ale acidului hialuronic pot fi hidrolizate de cStre hialuronidaza baeterian#, ceea ce duce la alterarea capacit#fii de filtru selectiv a substanjei fundamen- taJe §i la expunerea jesuturilo'r la invazia

bacterianfi. Hialuronidaza este prezent# §i in {esuturiie animale ca §i in toxinele unor gerpi §i insecte. Condroitin sulfajii sunt glicozaminoglicanii majori din proteoglicanii cartilagiilor, arterelor, corneei, constituiji din unit#ti de acid glucuronic §i Nacetibgalactozamin# legate p-(l,3)-glucuronidic §i (i-(l ,4)-galactozaminidic (Fig. VII.42). Reziduurile de N- acetii galactozamin# sunt sulfatate in pozifiile 4 sau 6 (condroitin -4, respectiv 6-sulfa{j). Ca donor de grup#ri suifat active funcjioneaz# 3-fosfo-adenozil~5-fosfosulfatul (Fig. VIL43). Numitrul mare de sarcini negative din molecula condroilin sulfajilor ii consacr# ca r#§ini schimb#toare de cationi, cu rol important in reglarea homeostaziei matricei cartilajului §i in mineralizarea matricei osoase. Proteoglicanii eonpnand condroitin sulfaji se asociaz#, prin intermedia! unor proteine de legare, cu acidui hialuronic, formand agregate supramoleculare de dimensiuni foarte mari (circa 100 de molecule de proteoglicani/molecul# de acid hialuronic), cu mas# molecular ft de ordinul sutelor de milioane (Fig. VII.44). Dermatan sulfatul este un constituent principal al Jesuiului conjunctiv dermic; mai este prezent in tendoane, valvele cardiace, peretele vascular. Din punct de vedere structural, difer# de condroitin sulfaji prin acidui uronic, care in acest caz este reprezental de acidui idiironic, epimerul la C 5 al acidului glucuronic (Fig. V1L45). Heparina este un glicozaminoglican avand o serie de particularity! structurale din care decurg §i unele particularity! funejionale. Unity lie dizaharidice manifesto o mare heterogenitate in privinja componentei acid uronic, care poate fi acid glucuronic sau acid id uronic sulfatai, cat §i a glicozaminei care poate fi N-suIfatat# sau N-acetilat#. Principala particularitate structural# a heparinei o constitute cantitatea important# de grupSri suifat legate la azotul aminic (grup#ri N-sulfat). Sulfatarea glucozaminei este numai partial#, 50 la suta din resturile de glucozanvin# fiind, totu§i, acetilate. GrupSrile O-sulfat sunt iocalizate in general la C6 al glucozaminei §i C2 al acidului iduronic. O structure posibil# a heparinei, cu o distribute arbitral* aleas# a resturilor suifat §i a tipului de acid uronic, este redat# in Fig. V1L46. Spre deosebire de ceilalji GAG, heparina nu este un component intracelular, ea este sintetizat# in mastoeitele care bordeaz# peretele arterial in ficat, pieie §i pl#man. Acfiunea anticoagulant# a heparinei s-ar explica prin abiiitatea acesteia de a accent.ua acfiunea de inhibare a trombinei, manifestat# de antitrombina III. Legarea heparinei la antitrombina III induce in molecula acesteia o tranzijie alosteric# ce favorizeaz# legarea sa la trombina. Heparina joae# un rol important §i in procesul de clarifiere a plasmei prin acfiunea de eliberare in circulajie a lipoprotein lipazei din perejii capilarelor (enzima are drept substrat chilomicronii §i iipoproteinele de densitate foarte joas#) (vezi iipidele). Degradarea proleoglicanilor, ca §i cea a glicoproteineior, const# in acjiunea secvenjial# a unor enzime hidrolitice: glucozidaze, proteaze, sulfataze, dcacetilaze. Acumularea in Jesuturi §i excrejia in urina a unor produgi de degradare incomplet# a proteoglicanilor caracterizeaz# un grup de maladii genetice,

reunite sub numele de mucopolizaharidoze, datorate unor deficite ale enzimelor hidrolitice (lizozomale). 391 COO'

COO'

OH NH-Ac CH2OSO 3 J—O

OH

NH-Ac Glucuronil N-acedi6-sulfatgalactozaminil Fig. VIL 42 - Condroitin 6-sulfatu

Acid hialuronic Condroitin suifat VII. 43 - 3'-fosfo-adenozil-5'-fosfosulfatul Fig. VIL 44 - Structura unui proteoglican

Fig. VII. 45 - Dermatan sulfatul 392 a-EOSCA CH2OSO3

CHzOSCE

CH2OSO3"

Fig. Vli. 46 - Heparina Tabelul VII.2 ilustrea-zS modificSrile biochimice coreiale cu deficitul enzimatic §i manifestarea clinica a catorva tipuri cle mucopolizaharidoze. Posibilitatea depislihii prenatale a acestor maladii, prin analiza lichidului amniotic, va deschide, probabil, perspective terapeutice sau de ameliorare a consecinjeior acestora. Tabel VtL 2, Tipuri de mucoptriizaharidoze SINDR TIP PRODUSI OMUL UL TRASATURf ACUMULA DEFICIT CUNICE TI ENZIMATIC Hurler I -fntirziiere DC- L mintala Dermatan iduronidaza -deformari suifat si schelet heparan -opacitate suifat in a corneei urina si -modificari iesuturi somatice -Dermata n suifat in fibroblasti 1 Hunter II -ca in I + -ca mai OC- Lsurditate sus iduronidaza +• iduronat sulfataza Sanfiiip -Heparan -Heparan po -mtirziiere suifat A sulfamidaza -Nmintala in 10 OC-D-gl ucozami -modificari urina B nidaza - N-ace ti lale si D IV gl ucozami n-6-s schcletului tesutu ul fa taza ri Marole VI N-acetil-D-deformari auxDerma galactozamin ale Lamy tan sulfataze scheletului suifat -opacitate in a corneei urina

393 Cap. VIII METABOLISMUL LIPIDELOR Hv; ■i ' 'J:: i,

VIII. 1. CHIMIA LIPIDELOR Lipidele sunt constituent ai organismelor vii, plante sau animate, care se aseamanh prin caractere comune de solubilitate, sunt greu solubile in ap& dru* se dizoivh ugor.tn solvent nepolari (eter, benzen, cloroform etc.). Aceastft Insugire este'datoratS prezenjei in moieculele lipidelor a unor intinse regiuni hidrocarbonate, hidrofobe. Sunt compugi foarte r&spandiji in lumea vie gi indeplinesc funcjii important#: - sunt principal a forma de depozitare gi de transport a rezervelor energetice ale organismelor; -au rolul de izolatori electrici, tennici gi mecanici;

-sunt constituent structural ai membranelor celulare gi intracelulare; - unele lipide au roluri importante in procesele de comunicare gi recunoagtere intercelularS; - sunt vitamine, hormoni etc. Natura chimicS a lipidelor este foarte variatd. Unele cuprind acizi gragi, legaji esteric sau amidic gi prin hidroiizii sunt descompuse in substanjele component#. Acestea sunt lipidele saponifiabile. 0 a doua elasa, lipidele nesaponifiabile, reunegte diverse categorii de compugi, hidrocarburi superioare gi derivaji oxigenaji ai acestora, care nu sunt scindate hidrolitic in compugi simpli. Caracterul lipidic sau gras al unor compugi atat de divergi din punct de vedere chimic le este conferit de prezenfa in moieculele lor a unor intinse regiuni hidrofobe. In cazul lipidelor saponifiabile, proprietitfile hidrofobe aparjin de reguld resturilor de acizi gragi. Unele lipide sunt asociate cu proteine gi alc&tuiesc lipoproteinele, altele cu glucide gi dau nagtere la glicolipide. Pfincipalele grape de lipide saponifiabile sunt: - aeilgliceroLii sau gliceridele; - fosfogliceridele sau fosfatidele; - sfingolipidele; - cerurile (ceride). Lipidele nesaponifiabile sunt in genere hidrocarburi, alcooli, aldehide, acizi care cuprind schelete alifatice sau ciclice cu structurepolilzopienicfi: terpene, carotenoizi, steroizi. VIII. 1.1. ACIZI! GRA§I Acizii gragi sunt component ai majorihlti lipidelor saponifiabile. In lipidele izolate de la diverse specii de plante gi animale au fost identifica{i peste 100 acizi diferi|i Totugi acizii gragi tipici cei irtai rSspandiJi gi cei mai abundenji sunt acizii monocarboxilici alifatici cu catena normal^ saturate sau nesaturatd gi cuprind un numSr pereche de atomi de carbon (de la 4 la 26). Acizi gragi ciclici, cu catena ramificatd, cu numar 394 impar de atomi de carbon sau cuprinzand p alte grup&ri funcponale sent intainip in nature doar ocazional. Acizii gra§i saturap, CH3 - (CH2)n - COOH, cei mai r&sp&ndip in lipidele izolate din fesuturile mamifereior sunt acidul palmitic (C16) p acidul stearic (Cl8). Acidui iignoceric (C24) se aM in cantpap apreciabile in uneie lipide din substanja nervoas&. Acizii inferiori (C4 - C10) sunt mai abundenp in grdsimile din laptele rumegdtoareior. Grflsimile din laptele uman cuprind dear urine din acepi acizi (TabeJul VIII.l). Tabehd VUU. Acizii grasi satura^i p nesaturati Denumire Denumire Formula uzuala gtiinjifica Acid butiric Acid butanoic CH, - (CH2)2 - COOH Acid caproic Acid hexanoic CH3 - (CH2), - COOH Acid Acid octanoic CM, - (CH2){i - COOH caprilic

Acid capric Acid lauric Acid miristic Acid palmitic Acid stearic Acid arahic Acid behenic Acid Iignoceric Acid palmitolei c

Acid decanoic

CH3 - (CH2)g - COOH

Acid dodecanoic

CH, - (CH2)!P - COOH

Acid tetradecanoic Acid hexadecanoic Acid octadecanoic Acid eicosanoic-

CH, - (CH2)J2- COOH

Acid docosanoic

CH, - (CH2)20 - COOH

Acid tetracosanoic

CH, - (CH2)22 - COOH

Acid A9 hexadecenoic Acid A9 octadecenoic Acid A9'12 octadecadienoie Acid A9’l2’!5ocladecaUienoic Acid A5,8,11'14eicosatetraenoic

CH, - (CH2)5-CH=CH-(CH2)7COOH CI-1, - (CH2)7-CH=CH(CH2)7-COOH CH, - (CH2)4-(CH~CH-CH2)2(CH2)f3-COOH CH3-CH2-(CH=CH-CH2)1(CH2)t,-COOH CH1-(CH2)4-(CH=CHCH2)4'(CH2)2'COOH

CH, - (OrU)l4 - COOH CH, - (CH 2)lb - COOH CH3 - (CH2)I8 - COOH

Acid oleic Acid linoleic Acid linolenic Acid arahidoni c Acid Acid A15CH3-(CH2)7-CI-I=CH-(CH2)(3nervonic tetracosenoic CO6H Acid Acid aCH3-(CH2)21-CHOH-COOH cerebroni hidroxilignoceric c Acid Acid aCH3-(CH2)rCH=CH-(CH2)l2hidroxiner hidroxitetracosen CMOH-COOH - vonic oic. Acizii gra§i netasurap cuprind una sau mai multe legftturi duble etilenice. Acepi acizi sunt caracterizap prin lungimea catenei hidrocarbonate p prin pozipa dublei (sau a dublelor) legdturi; Cn: A111, Cei mai important acizi grap nesaturap sunt acidul palmitoleic (C16: A9), acidul oleic (C18: A9), acidul linoleic (CI8; A9,12), acidul linolenic (CI8; A9’12,15), acidui 7 -linolenic (C18: A6,9,12), acidul arahidonic (C20: A5,8,11,14). Propriet&lile acizilor gra§i. Acizii grap saturap pand la C8 sunt lichizi, ceilalti sunt solizi. Acizii nesaturafi sunt lichizi. In cristate, catenele hidrocarbonate saturate au o configurate in zig-zag (cu .unghiuri de valenfd de 109°28’) p sunt agezate paralel. Acizii grap etilenici prezintd izomerie cis-trans. Formele naturale ale acestor acizi sunt izomerii cis. Configurapa cis a uhei duble legdturi determind 0 indoire cu 30° a catenei hidrocarbonate. Prin aceasta este

perturbatd a§ezarea ordonatd paraleld a catenelor lungi ale acizilor grap, Nesaturarea acizilor grap este un element de reglare a 395 a:

i

fluidit&fii lipidelor care ii cuprind §i, respective a membranelor biologice. Acidul oleic are o legMurd dubl<1 cu configurate cis. Izomerul s&u trans este acidul elaidic. Configurajiile lor sunt:

In cazul acidului iirahidonic, cele patru legSturi cis confers catenei forma literei U: COOH Acizii gra§i sunt pujin solubili in apS, solubilitatea scazand odatS cu lungimea catenei hidrocarbonate. Din punct: de vedere chimic acizii gra§i prezintS reacjiile grupSrii carboxil: formeazS sSruri, sapunuri, cu propriet&fi tensioactive; - formeazS. esteri; in numeroase clase de lipide acizii gra§i se aflS legafi esteric (gliceride, fosfogliceride); formeazS amide (in sfingolipide acizii gra§i sunt legafi amidic la sfingozinS); Catenele hidrocarbonate cu iegSturi duble: adifioneazS hidrogen, halogeni; suferS procesui de peroxidare. 396 VIII 1.2. ACILGLICEROLII (GLICERIDELE SAU GRASIMILE NEUTRE) Sunt lipidele cele mai abundente din nature. Sunt componentele principale ale grasimilor de rezervi din Jesuturi §i ale gnlsimilor din lapte. In proporSii variabile se g&sesc §i in iipoproteinele plasmatice. Sunt esteri ai giicerolului (propantriol) cu acizi gra§i, acilgliceroii. Dupft num&rul grup&rilor alcoolice din glicerol esterificate se impart in monoacilgliceroli (monoglice- ride), diacilgliceroli (digliceride) §i triacilgliceroli (trigliceride): 1,2 CH2OCOR

CH2OH

1

I I

1 . CHOH |

CHOCOR2

I

CH2OH a - sau 1 -acilgli ceroi (monoglic erid) CH2OCOR I CHOCOR2

CH2OH

i CH2OH

P - sau 2-aciiglicerol (monogliceri d) CHgOCOR, I CHOH

CH2OCOR2

CBpCOR, I CHOCOR2

CH2OCOR 3

aft - sau

a,a' - sau

triacilgiic eroi

diacilglicer 1,3(trigiiceri ol diaciigiicerol d) (digiicerid) (digiicerid) Grasimile de rezervfi sunt alciftuite aproape exclusiv din trigliceride. Mono §i digliceridele sunt intermediari in.cursul sintezei degrad&rii triglieeridelor §i se gasesc in fesuturi in cantitdp mici. Trigliceridele naturale exist# intr-o varietate foarte mare diferen|iindu-se atat prin natura acizilor gra§i constituent cat §1 prin aranjarea lor in interiorul moleculei. Cele mai rdspandite sunt trigliceridele mixte, acizii gra§i ce intr# in compozifia unei grftsimi se r#spandesc cat mai uniform in toate moleculele de trigliceride. Trigliceridele din jesutul adipos uman cuprind urmdtorii acizi gragi (in procente din greutate): acid oleic (43%), acid palmitic (2%), acid linoleic (8%), acid palmitoleic (7%), acid stearic (7%), alji acizi (8%). Proprietdtfle triacilgli.cerolilor. Staiea de agregare a triacilglicerolilor depinde de compozijia in acizi gra§i: cele bogate in acizi saturaji inferiori sau acizi nesaturafi sunt lichide; cele cu un conjinut ridicat in acizi satura|i superiori sunt solide. Tributirina §i trioleina sunt lichide, Uistearina este solid! Gbisimile naturale sunt amesteeuri de diver§i triacilgliceroli, ele nu au un punct de fierbere sau de topire net. Cele solide prin incSlzire se inmoaie treptaL 1

'■ : Triaciiglicerolii an densitafi mai mici decat apa (0,96 g/cm02 3). Avand caracter hidrofob foarte pronunjat nu se dizolvS in apS. Monoacilglicerolii gi diacilglicerolii au un slab caracter amfipatic. Triaciiglicerolii sunt hidrolizaji in glicerol gi acizi gragi: . CHaOCOR CHgOH 1 1 CHOCOR + 3 CHOH + 3 R ---H20 1 COOH i I CH2OCOR CHJJOH In laborator aceastS reacfie necesitS condifii energice, temperaturi ridicate §i/sau catalizatori. In organism hidroliza triacilgiicerolilor este catalizatS de enzime denumite lipaze. Catenele hidrocarbonate nesaturate ale resturilor acil prezinta proprietSfile specifice nesatunlrii. GrSsimile nesaturate adiJioneazS hidrogen. De exemplu, trioleina prin hidrogenare totals se transforms in tristearina. Hidrogenarea este asociatS cu cregterea punctului de lopire a grSsimii. Uleiurile vegetale solidificate prin hidrogenare sunt utilizate la prepararea margarinei. GrSsimile nesaturate adifioneaza halogeni, brom sau iod. Cantitatea de halogen fixatS de o grSsime (g iod/100 g grSsime) este o mSsurS a gradului de nesaturare .a grSsimii (indice sau cifra de iod), GrSsimile nesaturate, tndeosebi acelea care cuprind acizi polietilenici, prin expunere la luminS, la aer gi in prezenja unor factori care genereazS radicali liberi, suferS un proces de peroxidare (autooxidare) care le altereazS gustul gi mirosul (rancezire). Acest proces este inijiat de un radical liber ce se formeazS in sistem gi se propagS in lanp Pozifia cea mai vulnerabilS la un atac radicalic este pozijia invecinatS unei duble legSturi, pozijia aliiicS: — CH - CH — CH2 — CH = CH — + R^ — CH = CH — 6H — CH - CH —

— RH 02 + RH — CH = CH — CH = CH — CH —-► — CH - CH — CH = CH — CH I —Rradical peroxid Q—O -----^ — CH ^ CH — CH = CH — CH2 — hidroperoxid O—O—H Radical ul peroxidic poate reacjiona cu o nouS moleculS de grSsime generand un nou radical liber gi un hidroperoxid, R-OOH, procesul desf£§urandu-se in lanj. Hidroperoxidul la randul lui genereazS alji radicali liberi gi divergi produgi de oxidase, de polimerizare, de sciziune a lanfurilor hidrocarbonate. In organism peroxidarea grSsimilor gi a altor lipide nesaturate este intarziatS prin acjiunea unor factori antioxidanfi, captatori de radicali liberi. TotodatS, organism ul dispune de multiple mecanisme de apSrare impotriva efectelor nocive ale peroxizilor. 398 VIIL1.3. FOSFOGLICERIDELE ‘(GUCEROFOSFOLIPIDELE, FOSFATIDELE) Aceasf# categorie de lipide cuprinde cele mai importante iipide structural. In asociere cu proteine §i alte lipide alc&tuiesc membranele tuturor celulelor animate §i vegetale. Substanja de bazft a acestor iipide este glicerol-fosfatul (sn-3-glicerol-fosfat, sn de la stereochemical numbering): 1 CbLGH I 2 CHOH 3 CH20P03H2 Configurajia acestui compus este; HO N /CH.OH s / C’ CH2OH s HO — 0 — sau H s 'c i H ^ CHz0p GH2OP Acszii fosfatidicl Adzii fosfaiidici cuprind douS resturi aci-1 (de reguld diferiji) legate de glicerol fosfat: CH2 — O — CO — R, R2 ■— OC — O -— CH

Reprezentarea confjgurajionald a unui acid fosfatidic (palmitil-oleii-glicerolfosfat) este: O

'"0 / No399

Acizii fosfatidici se g&sesc in cantitafi mici, sunt intermediari in metabolismui fosfatidelor. De la acizii fosfatidici, prin legarea grupei fosforil ia diver§i alcooii rezuM fosfatidele: fosfatidilcoline, fosfatidiletanolamine, fosfatidilserine, fosfatidilinozitoli, fosfatidiigliceroli. ■ Fosfaiidilcolinele (lecitine) Sunt cele mai abundente fosfoiipide, se gasesc in proporfia cea mai mare in sfracturile lipoproteice membranare (Tabelui VIII.2). Cuprind restul fosfatid.il legal la colinfr. HOCH2— OH,,— N+(CH3)3. Formula general^ a unei lecitine este:

CH2—O —CO —R. I R CO — O — CH I CH2O

X

/ 0~

N(CH3)3 O — CH2 — CH2

Restul acii din pozifia 1 este de regulft saturat iar R2 nesaturat, adesea provine din acid linoleic, acid anihidonic. Prezenfa acestor resturi nesaturate face ca lecitinele sS fie foaite sensibile la procesul de peroxidare. Lecitinele au structure de amfiioni (bipolar^) prin sarcina negative a reslului fosforil §i sarcina pozitivft a grupSrii cuaternare de amoniu. Tabelui VIU.2. Compozitia (ipiclica a unor membrane Memb rana Memb Membra Reticul Membr plasm rana Miel na Lipide endopl ana. E. aiicd eriiro ind mitocon asmic call hepal cit driala ocit Colester 17 23 3 ol 2 6 0 Fosfatidil 24 17 10 39 40 0 -coline Fosfatidil -etano7 18 15 35 ' 17 70 lamine Fosfatidil 4 7 9 2 5 urine -serine Sfingomi 19 18 8 0■ 5 0 eline Glicolipi 7 3 28 urme urme 0 de Altele 13 27 30 22 8 21 400 Ptezenfa resturilor acil hidrofobe’§i a sarcinilor electrice pozitivS §i negative confers lecitinelor caracter amfipatic §i proprietSfi tensioactive puternice. In apS fosfalidilcolinele se dizolvS form and agregate, miceiii, alcStuife din dou& straturi lipidice (Fig. VIII. 1.) f
'fazi'jposs# ffep/wedd'rofohd ^ ffri/pjre y y fj/drufi/J Mff/eviz/z j/iifi/zf/m Fig. Vfti. 1 - Asocierea tntr-un strat dubiu a moleculelor lipidice amfipatice Acest strat dubiu lipidic este stabilizat prin forfele van der Waals dintre catenele hidrocarbonate ale resturilor acil aranjate paralel §i, pe de altil parte, prin interacjiunile electrostatice dintre grupSrile polare. TotodatS, eliberarea apei sechestratft intre resturile acil hidrofobe mSre§te stabiiitatea bistratului lipidic. Asocierea spontanft a lipidelor amfipatice sub form& de bistraturi stS la baza formSrii membranelor biologice cu o structure dubiu lipidicil Derivajii lecitinelor (§i a alter fosfatide) care cuprind un rest acil mai pufin se numesc lizolecitine (lizofosfatide): CH2 — O — CO — R, i CHOH CH2O

o

0" N(CH3)2 i o —CH2 — CH2 §i au proprietSti transioactive mai puternice decat ale lecitinelor. Fosfatidilcolina cu douS resturi dipabnitil esle components lipidic principal (80-90%) al „surfac- tantului puimonai*4, material care acoperS alveolele pulmonare §i tmpiedicil colapsul la expirare. AlSturi de aceaslS lecitinS surfaclantul mai cuprinde mtr-o propose mare fosfatidilglicerol. 401 Fosfatidiletanolaminele (cefaline)

I-'. i'V '•I

Sunt, fosfatide ce cuprind restul fosfatidil legat dc etanoiamina (colaniina): HOCH2CH2NH2. Au structura: CH2 — O — GO — R, R2 — CO — O

cr NH3 I o — CH2— CH2 Se aflci in fesaturi alSturi de lecitine dar in eantit&fi mai mici. Sunt mai abundente in lipideie din fesutul nervos (Tabelul VIII.2).

Fosfatidiletanolaminele au structure amfionicd, au caracter amfipatic, sunt sensibile la peroxidare. Prin metilarea grup&rii aminice se transform^ in lecitine. Fosfatidilserinele (serin-cefaline) Insojesc in cantit&ji mici celelalte fosfolipide in membranele biojogice. Cuprind restul fosfatidil legal de aminoacidul serinS: CH2 — O — CO — R, I R2 —t CO — O — CH

0

0 — CH2 — CH — COO™ Suntlipideamfipalice, posedH o sarcinfi net# (—), Prin decarboxilarea restului de serinS dau na§tere ia fosfatidiletanolamine. FosfatidiSinozitolii (inozitol-fosfatide, fosfoinozitide) Se afbl alMuri de celelalte lipide in toate tesuturile. Sunt mai abundente in substanfa nervoasft. Cuprind restul fosfatidil legat de on polialcool ciclic, inozitol (mezoinozitol). Mezoinozitolul este unul din cei 9-stereoizomeri ai hexahidroxi-ciclohexanului: 402 OH

Fosfatidilinozitolii au structura: 4 R, — CO — O —CH, I“ R2 — CO — O — CH CH2 — O

O'

Pe langdfosfatidilinozitoli rnai exisld fosfatidiiinozitoli-4-fosfat §i fosfatidilinozi toli-4,5- bisfosfat care rnai cuprind until sau doud resturi fosfat legate la inozitol: R— R,o C . CG o CO — H - -CH2 — 2 1 i ■ I 1 R — -CH 0 C 0 R2CO co — H 2 — -

Fosfatidilinozitol-4-fosfat Fosfatidi!inozltol-4,5-bisfosfat Inozitol-fosfatidele au caract:er amfipatic, sunt lipide cu caracter puternic acid, 1a. pH-ul fiziologic poartd sarcini negative, de la 1 pand la 5. Au roluri irnpoitante in procesele de iransmitere a semnalelor extracelulare in toate Jesuturile; sub acfiunea fosfolipazei C elibereazd diacilglicerol §i inozitolfosfaji, efectori ai unor mesageri extracelulari. ■ 403 Plasmalogenele

;V::•1. ■ : :•) '

Sunt fosfolipide mai abundente in mu§chi §i nervi. Se deosebesc de eelelalte fosfatide prin aceea c& gruparea alcooiicfl C^din glicerol este legate eteric de un enol alifatic superior; aicooiul azotat care esterificfl gruparea fosforil este, cel mai frecvent, etanolamina. Structura plasmalogenelor este: CH3 — (CH2)n — CH - CH — O — CH2 I R — CO — O — CH O” i i CH20 — P — o — CH2 — CH2 — N+H3 li o Fosfatidilglicerolii Sunt fosfatide azot. Cuprind unul sau douft resturi fosfatidil legate de glicerol. Difosfatidilglicerolul (cardiolipina) este principala component# fosfoiipidic# a membranei interne mitocondriale. Are formula: CH2 — O — CO —- R, 0“ CH — O — CO — R2

i ! R — CO — O — CH2 CH20 — p — o — CH2 I I li R2 — CO'— O — CH G~" H COH 0 III CH2 — O — P — O— CH2 II o Fosfotidilglicerolul este component al surfactantului pulmonar. V III. 1.4, S FINGOLIPIDELE Sunt iipide siructurale ca §i fosfatidele, fiind absente in grasimile de depozit. Jesutul nervos cuprinde cantitafile cele mai mail de sfingolipide. Sunt derivafi ai unui aminoalcool superior, sfingozina: CH3 — (CH2),2 — CH ^ CH — CH — CH — CH2OH OH NH2 404 sau, mal rar, a derivatului hidrogenat, dihidrosfingozinU: CH3 ™ (CH2)I4 — CH — CH ~~ CH2OH OH NH2 In sfingolipide acidul gras este legal amidic la gruparea —NH2 din sfingozinl Toate sfingolipidele cuprind aceastd amid&, denumitd ceramidii: CH3 — (CH2)12 — CH = CH — CH — OH R —OC— HN — CH I CH2OH

Exists doud categorii de sfingolipide: -sfingomielinele, lipide cu fosfor, care impreuna cu glieerofosfolipidele, alc&tuiesc grupa fosfolipidelor; - glicosfingolipide, care nu mai cuprind fosfor, ci unui sau mai multe resturi glicozil, sunt glicolipide. Sfingonrieliriele Sunt fosfolipide rSspandite in toate structurile membranai*e, in lipoproteinele plasmatice. Sunt deosebit de abundente in substanja nervoasd albS, in nervii periferici. Cuprind o ceramidii legatS de fosforilcolind: CH3 — (CH2)12 — CH = CH — CHOH R — CO — HN — CH CH20 0 O" N(CH3)3 O — CH2 — CH2 ProprietSjile sfingomielinelor sunt asemSnStoare cu ale fosfatidelor, sunt amfioni, au caracter amfipatic. Restul acil §i catena hidrocarbonatS a sfingozinei insumeazft un numfir de alonii de carbon aproximativ egal cu acela aJ resturilor acil din lecitine. Glicosfingolipidele Cuprind ceramidii legate glicozidic de monozaharide (hexoze) sau oligozaharide. Se impait in cerebrozide, glicolipide neutre, §i gangliozide, glicolipide acide. Cerebrozidele se gdsesc in majoritatea jesuturiior dar sunt mai abundente in creier (substanfa albd), in nervi.

Cuprind o ceramidii (cu un acid gras cu 24 atomi de cabron) legate la (3galactozii (galactocerebrozid) sau, mai rai', la (J-glucozii (glucocerebrozid): 405 CH3 — (CH2)ia — CH = CH — CH — OH R — CO — NH — CH HOHpC CH, HC

OH Gaiactocerebrozid Cerebrozidele nu au sarcini electrice; au --caracter amfipatic. In creier, gaiacto- cerebrozidele mai cuprind §i resturi sulfat legate esteric de galactoza, lipide polare denumite sulfatide: Gangliozidele sum glicolipide prezente In cantitdji mici In toate jesuturile, dar sunt mai abundertfe In creier §i nervi. Cuprind o ceramidS (In care acidul gras este frecvent acidul stearic) legate ia un oligozaharid alc&tuit din glucozS, galactoza, N-acdtilgalactozamind. Oligozaharidul este legat la randul lui de unul, dou& sau trei resturi de acid sialic (acidul acetilneuraminic). Gangliozidele se clasificd §i se citesc dupd numfirul resturilor de acid sialic, In monosialo-gangliozide (GM), diasialo-gangliozide (GD) §i trisialo-gangliozide (GT). Natura oligozaharidului este desemnata printr-un indice numeric, 5-n, In care r. arat£ numdrul de unitap hexozil. Seria 1 are patru unitap hexozil. De exemplu, gangliozidul GM, are structura (simplificatft): CM3 CH-CH-OH R — CO —NH—CM /

OH ceramida - Gic - Gal - Gal NHAc - Gal NANA unde; Glc = glucoza Gal = galactoza Gal-NHAc = N-acelil-galactozamina NANA = acid N-acetil-neuraminic 406 ceramicia - Gio - Gal - Gal-NHAc GM,: NANA GDp ceramida - Glc - Gal - Gal-NHAc - Glc I I NANA NANA Components giucidicil a gangliozidelor se g3se§te totdeauna pe faja externa a membranelor, aceste lipide sunt implicate in procesele de pe suprafafa membranelor. Studiui aces tor lipide a fost amplu dezvoitat prin

descrierea unui num&r de maladii ereditare in care deficitul unor enzime hidrolitice specifice pentru diversele legSturi din gangliozide determine intreruperea §irului de reacjii catabolice §i acumularea produsului situat in amonte fata de enzima deficitanl (gangliozidoze). VIII. 1.5. CERURILE Sunt esteri ai acizilor gra§i cu alcooli alifatici sau ciciici (steroli). De exemplu ceara de albine cuprinde in majoritate esterul acidului palmitic cu un alcool cu 32 atomi de carbon. Lanolina, gnisimea de pe lana de oaie, este alc&tuitd in principal din esteri ai lanosterolului, ai colesterolului. Cerurile sunt lipide saturate, cu un caracter foarte pron unfat hidrofob. Ele sunt secretate de epiderma plantelor §i animalelor §i fonneazS un strat protector, impiedicand pierderile de apa. Cerurile naturale sunt amestecuri complexe de diver§i esteri, acizi §i alcooli liberi, hidrocarburi superioare. VIII1.6. LIPIDE NESAPONIFIABILE Aceasfit clasft reunegte compugi cu propriety de solubilitate propri lipidelor §i care nu sunt scindate prin hidroliziL Principalele grape de lipide nesaponifiabile sunt terpenele, carotenoizii, steroizil To|i ace§ti coinpu§i au o structure poliizoprenicti (poliprenicS)? sunt formal derivafi ai izoprenului. Unii dintre ei au formule poliizoprenice tipice: CH3 H — (C5H8)n ™ H sau H — (CH2 — C = CH — CH2 —)nH alfii prezintft un grad mai mic sau mai mare de nesaturare, cuprind funcfii oxigenate. Terpenele Terpenele sunt hidrocarburi, alcooli, aldehide, acizi cu structure poliizoprenice. Sunt foarte rdspandite in regnul vegetal, intr&in compozifia uleiurilor eterice care dau mirosul florilor, al fructelor. Jesutaile animate cuprind §i ele cantitSfi mici de terpene. De 407

:! I; exemplu, geraniolui, famesoM, scualenul, interm ediari in biosin leza colesterolului, vitaminele K §i E, ubichinona, dolicolul. Geranioiul este un alcool alctkuit din douS unil5|i izoprenice: CH3

CH3

I I . CH3 — .C. == .CH — Ch2 —CH2 — c = CH — CH2OH Farnesolul cuprinde trei unit^Ji izoprenice: CH3 CH3 CH3 I I I CH3,™ C = CH ■— CH2 — CH2 — C = CH — CH2 — CH2 — C = CH — CH2OH Geraniolul §i farnesolul, ca esteri pirofosforici, sunt intennediari in biosir) teza colesterolului. Scualenul este o hidrocarburS C30H50, alcatuitii din 6 unit&fi izoprenice, de fapt din dou^l unildp famesil condensate cap-cap. Scualenul prin ciclizare da na§tere la un compos steroidic. CH3 CH3 1

C H3 -

-C= CH -

CH 2

— CH2

CH3

3

1 —CCH —

CH2

C H 2

1 I —C= CH —

C H 2

CH3 1

3

CH3 1

1 X 0 li

1 X O

-

3

C H

CH3 1 1 —C= CH —-

C H

CH — CH2 CH2 — 2 2 2 Scualen Vitaminele K §i E cuprind catene hidrocarbonate poliprenice care le confer# liposolubilitatea. Vitaminele K naturale (K^ gi.Kj) au formulele: o CH 3

Vitamina K, (filochinona) o

H O Vitamina K2 (menachinona) n = 6,7 sau 9 408 Vilamina E (a-locoferolul) are formula:

Vitamma E '' .O Ubichinona (coenzima Q), component redox al lanjului respirator mitocondrial, cuprinde o catena poliizoprenica cu 50 atom! de carbon grefatft. pe nucleul benzochinonei: O H3CO H3CO

H 10 o Ubichinona (coenzima Q) Dolicolii sunt alcooli superiori rftspandifi la plante gi animale, cuprind intre 16 §i 20 unitftfi izoprenice. Mamiferele cuprind un compus cu 100 atomi de carbon. Sub form ft de ester fosforic;'dolicol-fosfat, participft la sinteza glicoproteinelor in reticulul endoplasmatic §i in aparatul Gogi. Are formula: CH3 CH9 |.■-1

H — (CH2 — G = CH — CH2)19 — CH2 — CH — (CH2)2 — OPO*~ Unitatea oligozaharidicft a unei glicoproteine se constitute sub formft de glicozil-fosforil-dolicol, dupft care are loc transferul in bloc al oligozaharidului pe proteina membranarft acceptoai*e. Catena lungft hidrofobft a dolicolului rftmane inglobatft in membrana lipidicft iar lanful oligozaharidic protubereazft pe faja extern# a membranei de unde este transferat. In acest fel glicoproteinele cuprind totdeauna componenta glucidicft pe suprafaja extemft a membranei. Carotenoizii Aceastft categorie de lipide cuprinde hidrocarburi puternic nesaturate cu schelet izoprenic §i derivafii oxigenaji ai acestora. Sunt rftspandifi in regnul vegetal unde joacft roluri importance in reacjiile fotochimice. Cuprind sisteme intinse cu legftturi duble conjugate §i sunt coloratein rogu-portocaliu. Carotenii a-, P~, 7-, sunt hidrocarburi C40H56, 409 rftspandi|i in morcovi, lomate §i aite plante. Formula f}-ca.rotenului este unmltoarea:

Cuprinde un sisiem de I i ieg&turi duble conjugate; tn catena iinearS legiturile dubie au configurajia trans. Cnrotenii. sunt provitamine A. In ficat §i in peretele intestinal, din (i- caroten prin scindare oxidativS (sub acjiunea unei dioxigenaze) se formeazl doud molecule de vitamin^ A (retinal): In aceastS. clasS intrS un numSr mare de compugi lipidici rSspandifi la plante, animate, microorganisme. Sunt derivaji ai unei hidrocarburi ipotetice denumM steran (ciclopentano- perhidrofenantren) erne cuprinde trei nuciee ciclohexanice §i unul ciclopentanic condensate: Diver§ii steroizi diferS intre ei prin grupgri funcjionale §i catene laterale grefate pe nu- cleui steranic, prin prexenfa unor legSturi duble §i prin existen|a unui numar foarte mare de stereoizomeri. Condensarea a douS (sau mai multor) nuciee ciclohexanice cu conformajie scaun permite realizarea a dou& configurajii la punctui de jonc{iune a ciclurilor (cis sau trans). Steranul cu trei jonejiuni A/B, B/C, C/D poate exista sub forma a 64 stereoizomeri, dupd orientarea relative a atomilor de hidrogen legaji la C5, C8) C9, C10, C13, C]4. Scrierea formuielor acestor steroizomeri se face potrivit urmStoarelor convened: leg&turile dirijate spre partea anterioarft a ciclului sunt redate prin linii pline §i sunt denumite ieg&turi (3. Substituenfii care se afl&pe partea opusft (posterioar#) sunt legaji prin ieg&turi a, redate prin linii tntrerupte. In steroizii naturali suh^Htuenfu de la C10» C8? C9,

Vitamina A Steroizii

410 Cl3 gi Ci4 au rotdeauna aceeagi orientare (a sau p). Atomul de hidrogen de la C5 are insd in unii steroizi configurate a (seria 5a), in alfii [3 (seria 5P). Ace§ti doi izomeri ai steranului de la care derive steroizii natural! au primit denumirea de 5a - gi 5p-gonan:

5a-gonan 5p-gonan Prin substituirea unui atom de hidrogen dintr-o grupare -CH2 - a steranului apare posibilitatea existenjei a doi izomeri, a - gi, respectiv, p. Legarea unei grupttri funcfionale a sau P antreneazd diferenje pronunjate in ceea ce privegle reactivitatea gi acpunile biologice. Steroizii care au funcfii mrudite derivft de ia o aceeagi substanj# de baza. In Tabelui Vm.3 sunt prezentate principalele grupe de steroizi; hormonii estrogeni, androgeni, gestagen!, corticosuprarenalieni, acizii biliari gi sterolii. Substanfele active, cardiotonice, din digital# (digitoxigenina, strofantidina, ouabagenina), au, de asemenea, structure steroidicii in acest capitol sunt descrigi sterolii gi acizii biliari. Sierolii sunt alcooli steroidici prezenji la toate organismele vii. Colesterolul este cel mai important sterol din regnul animal. El lipse'gte la piante, microorgan is me, never- tebrate. Este un component esenjial al tuturor structurilor membranare lipoproteice. Este tin steroid C27 cu formula;

In organism se g&segle fie ca alcool liber, fie esterificat cu acizi gragi (acilcolesterol). Colesterolul este o substanj# solid#, alb#, insolubil# in ap#. Are un caracter hidrofob pronunfat. Esterii colesterolului sunt printre cei mai hidrofobi constituent celulari. 411 Colesterolul are un rol structural, este prezent in majoritatea membranelor celulare §i in acela§i timp este precursorul tuturor celorlalji compu§i steroidici. Alfi steroli, inrudiji cu colesterolul sunt 7-dehidrocolesterolul (provitamina D3) §i 5(3 - colestanolul:

7-Dehidrocoiesterol 5(3 - ColestanoS Tabelul VI1L3. Prindpalele grupe cle steroizi natural! §i hidrocarburfle fundamental din care deriva

Acizii biliari sunt componenji ai bilei. La pH-ul alcalin al bilei se g&sesc sub form& cie s&ruri hiliare. Joac2 roluri impoitante la soiubilizarea §i absorbfia intestinal^ a lipidelor. Se formeazS din coiesterol, sinteza §i eliminarea acizilor biliari prin fecale reprezintil o caie do excrejie a colesteroluhii. Sunt steroizi C^. Ei derm! de la un acid ipotetic, acidul colanic. Acizii biliari sunt derivaji hidroxila|i ai acidului colanic, in una sau mai mulie din pozijiile 3, 7 §i 12. Cel mai important acid biliar din bila omului este acidul colic (acid 3a, 7a, 12a -trihidroxicolanic):

Alji acizi biliari sunt; acidul chenodezoxicolic (acid 3a, 7a -dihidroxicoianic), acidul dezoxicolic (acid 3a, 12a -dihiroxicolanic), acidul litocolic (acid 3a-hidroxicoianic). 413 Acizii biliai i se aMin bilTi, sub forma de amide cu glicocolul COOH) sau cu taurina glicocoiic (colil—NH—CH2—COOH) gi acidul taurocolic (colil— §i acedia se aflfs in bilft ca samri, ■

Acid glicocofic Acid taurocolic

Sjre &///
CH2OH CH — O — CO — R + 2R — COOH CH2OH 2~monoacilglicerol 415 Asupra fosfatidelor (a lecitinelor) acjioneazft fosfolipaze cu specificitate carboxiesterazicd; CH2 — O — CO — R, R2 — COOH R2 — CO — 0 — CH CH2 — O • H20 ^2 \ 0 — CH2 — CH2 — N(CH3)3 lecitina CH2 — O — CO — R, HO— C —H I CH2 — O v , 0“ \ p/ o O — Ch2 — CH2 — N(CH3)3 iizolecitina Lizolecitinele au propriety detergente foarte puternice §i contribuie mai departe la solubilizarea lipidelor in intestin. Coles terolul liber §i esterificat prezent in lumenul intestinal provine din trei surse: din alimente, din biHS §i din descuamafiile mucoasei intestinale. Esterii colesterolului sunt hidrolizaji sub acfiunea colesterol esterazei pancreatice. Lipidele alimentare nehidrolizate §i produ§ii de hidrolizil, insolubili sau partial solubili in apa, impreund cu sarurile biliare, formeazd. o solujie micelanl cu un grad de dispersie din ce in ce mai mic. Cand agregatele micelare ating diamelre de aproximativ 5 nm ele patrund in spajiile intervilozitare de la nivelul jejunului proximal §i lipidele din structura miceliilor sunt absorbite. Sdruriie biliare rftman in lumen participand la solubilizarea §i transportul altor molecule lipidice. Abia in porfiunea distald a ileonului sdruriie biliare sunt absorbite printr-un mecanism activ. Prin sistemul portal sdruriie biliare ajung in ficat §i dupd unele remanieri ajung din nou in bild §i intestin (circuit entero-hepatic). in enterocite produ§ii de hidrolizd, totald sau parjiald, ai lipidelor serve sc la reconstituirea moleculelor inifiale, trigliceride, fosfatide, acil-colesteroli. Cdile de sinteza a acestor compuji sunt tratate mai departe. Aceste lipide, unele hidrofobe, altele polare, impreund cu cantitilti mici de proteine formeazd particule lipoproteice denumite chilomicroni. Aceste particule sunt secretate de enterocite in vasele chilifere §i prin sistemul limfatic ajung in circulafia sanguind. Compozijia, transportul §i metabolismul ehilomicronilor sunt tratate, de asemenea, mai departe. Chiiomicronii reprezintft forma de transport §i de distribute a lipidelor exogene cdtre diversele fesuturi ale organismului. O cantitate micfi din produgii digestiei intestinale a lipidelor pdtrund in

organism prin sistemul portal hepatic. Ace§tia sunt acizii gra§i inferiori, ca acid butiric (C4), acid caproic (C6) care se afld in grdsimile din laptele de vacd. VIII.3. METABOLISMUL ACIZILOR GRA§I Componentele lipidice majore ale organismelor animale sunt trigliceridele. Sunt molecule energogene §i metabolism ul ior, degradarea, sinteza, depozitarea §i transportul sunt subordonate acestei funcfii. Trigliceridele, in condifii normale, acoperS aproximativ 40% din nevoile energetice ale organismului. De fapt acizii gragi, care ’ reprezintS aproximativ 90% din greutatea unei trigiicerid, au capacitatea de a inmagazina energie §i de a o elibera prin ardere. Celeialte categorii de lipide - fosfatide, sfingolipide, colesterol - pe langft uneie roluri structurale strict specifice, participS la vehicularea in cuprinsul organismului a trigliceridelor endogene §i exogene. VIII.3.1. DEGRADAREA OXIDATIVA A ACIZILOR GRA§I Acizii gra§i formafi prin hidroliza trigliceridelor exogene sau a celor endogene elibereazd energia chimica potential# inmagazinat& in catenele lor hidrocarbonate prin ardere complete la dioxid de carbon §i apS. Acizii gra§i sunt substratul energogen preferat al multor Jesuturi, ca miocard, mu§ahi scheletici. Creierul nu utilizeazS direct acizi gra§i. In inanijie cand glucoza devine limitantS, in diabet, creierul utiiizeazS ca sursS de energie corpii cetonici, care provin din acizi gra§i. Eritrocitele, care nu au mitocondrii §i lanf respirator, deasemenea, nu pot utiliza acizii gra§i. Axderea acidului palmitic (acidui gras saturat cel mai abundant din organism) are un elect energetic ridicat: Comparativ cu arderea glucozei, acest AG°’ este mult mai negativ. Dac& luSm in considerate energia liberU de reacjie pentru arderea a 100 g de substan$: glucozit AG = - 347 kcal/100 g acid palmitic AG ~ - 914 kcal/100 g Confinutul caloric media al grdsimilor este de 9 kca.l/g, fa{& de 4 kcal/g pentru glucide §i rot alata pentru proteine. CH3 — (CH2)16 — COOK + 23 02 ----- -16 C02 + 16 H20 AGot = - 2340 Real CH3~ (CH2)14- COOH * 8 CoASH * 6 H20--► 8CH3-CO-S - CoA + 28 [H]II

Ciclul acizilor tricarboxilici 8CH3- CO-S - CoA + 24 H20 16 C02 + 8 CoASH + 64 [H] Sums: CH3 - (CHJU - COOH + 23 02 ---------► 16 C02 + 16 H20 Fig. VIII. 3 - Schema generaia a oxidarii unui acid gras 417 Arderea acizilor gragi in organismele vii este cuplat& cu sinteza de ATP, randamentul global al procesului fiind de aproximativ 40%. Oxidarea complete a unui acid gras se desfSgoarS in trei etape (Fig. VIII.3). Prima eiapd, p-oxidare, este specifics catabolismului acizilor gragi, pe cand celelalte, ciclul acizilor tricarboxilici gi lanjul respirator sunt cSi oxidative terminate comune pentru tofi compugii energogeni (glucide, lipide,

proteine). In etapa denumitS B-oxidare molecula de acid gras suferS un atac oxidativ la atomul de carbon din pozijia p, urmat apoi de desprinderea unui fragment cu doi atomi de carbon sub forma de acetil-CoA. Prin repetarea de mai multe ori (de 7 ori in cazul acidului palmitic) a secvenjei (3-oxidative, acidui gras este transformat in n/2 molecule ^ ace|-p„ CoA (n fiind numeral de atomi de carbon ai acidului gras, un numSr par). In aceastS etapS, pe langS acetil-CoA, sunt labiliza{i atom! de hidrogen gi transferafi pe coenzime. Etapa a doua corespunde degradSrii oxidative a resturilor acetil in ciclul acizilor tricarboxilici cu formare de C02 gi coenzime reduse. Procesul se incheie prin oxidarea coenzimelor reduse in lan{ul respirator. Prin fosforilSri oxidative energia este conservatS in ATP. Oxidarea acidului palmitic este cuplatS cu sinteza a 129 molecule ATP. poxidarea, neacfiile ciclului Krebs gi lanjul respirator sunt procese mitocondriale, asociate atat structural cat §i funcjional. Activarea acizilor gra§i. In toate procesele metabolice, fie catabolice, fie anabolice, acizii gragi partieipS ca esteri ai coenzimei A, acil-CoA sau R - CO ~ S - CoA. Activarea are loc in citosol (pe fa{a citosolicS a mitocondriiior) gi este catalizatS. de sintetaze denumite curent tiokinaze (acil CoA sintetaze):Se formeazS intermediar un acil-adenilat, dupS care are loc transferul restului acil pe CoASH. p-Oxidarea acizilor gragi (Ciclul sau spirals lui Lynen) R — COOH + CoASH + ATP R — CO - SCoA + PPj +• AMP 0“ “0 — P — 0 — P — O — P — 0 — CH, Adenina II

O AMP AR—CO— o — P — O — CH? Adenina CoASH II

O > Ft—Co—S—CoA Acil — CoA OH OH' Acil adeniiat 418 Exists tiokinaze cu specificcitSji peritru acizii superior^ mijiocii §i inferiori. Transferal derivap.hr acil-CoA in mitocondrii. J3-Oxidarea are loc In

matrixul mitocondrial iar derivafii acil-CoA se formeazS in citosoi. Membrana interns a mitocondriilor, impermeabilS pentru acil-CoA constitute o barierS xnfre cele donS compartmente. Restoriie acii sunt transferals in matrix prin funcjionarea unei navete la care participS camitina §i douS acii- transferaze localizate una pe faja external §i alia pe cea intemS a membrane!. Carnitina, (3- hidroxi-y-trimelilamottiu-butirat, are formula: (CH3)3N+ — CH2 — CH — CH2 — COO” i ' OH §i poate fomra esteri, acii-camitinS: (H3C)3N+ — CH, — CH — CH2 — COO” I o — GO — R Membrana intemS mitocondriaiS cuprinde o proteinS transportatoare (translocazS) care transports cuplat acii-caniitina in matrix §i camitina in sens invers (Fig. VIH.4.)

Carnif/na Acii - Co A Co ASA Ad/ Cam///no ma/r/x Fig. Vi!!. 4 - Transportu! gruparilor acii prin membrana interna a mitocondriiior cu ajutorul carnitinei $-Oxidarea acil-CoA const! in repetarea de n/2 - 1 a unei secvenje de patru reacfii, douS deliidrogenSri separate de o reacjie de hidratare, prin care C(3 este transfonnatin grupare >C=0; unneazS scindarea IegSturii Ca - Cp de c&tre CoASH (fiolizS) cu formare de acetii-CoA §i un derivat acil-CoA cu doi atomi de carbon mai pujin (Fig. YII1.5). 419 h;

CH3 - {0/i2),7 - etci^CoA FAD

0 CHS C

DA OH, ' Ac//~ Co A (/e/j/droffemzo 0

ii CH, - (C//2)n ~ CH - - CH ~ C ~ SCoA j3 ~ coo//- Co A (A2 - Ay os - coo//- Co A). Eoo// -CoA f//H,v/m 0% ~ {//%)„ - CH OH CH:, 0 II C ~ CCoA H/droxi -oc/Z- CoA ( L - AH -) HAD'* AADH-D/A J3 - A/Hrox/ - oc/f-CoA dod/droge/mo 0 II CHS -/ CH,L - 0 -CH?~C ^ SCoA , -jo (| 0 3 -ce/o-acH- CoA Co ASH 'N Cr/3 CO ~ /A- ceZo-ac/Z-CoA Z/oZaia 0 CH3 - (CHz)n - C ~ SCoA - ac/Z CoA Fig. Vl!i. 5 - p- Oxidarea unui acil-CoA 420 Ecuajia globalS a unui ciciu (J—oxidativ este: CH3 — (CH2)n — CH2 CH2 — CO~SCoA 4 HOH 4- FAD -1- NAD* 4 CoASH ■ -----------^ CH3 — (CH2)n — CO~S — CoA + 7 FADH2 4 NADH 4 H* 4 CH3COSCoA Palmitil-CoA este degradat la acetil-CoA prin repetarea ciclului P-oxidaliv de 7 ori: Paimitf!—CoA 4 7 CoASH 4 7 FAD 4 7 NAD* 4 7 H20 —— 8 aceti!—CoA 4 7 FADH2 4 7 NADH 4 7 H+ Etapele tenninale ale arderii-unui acid gras includ ciclul acizilor tricarboxilici §i lanful respirator. Cele opt molecule de acelil-—CoA formate prin p-oxidarea palmitil-CoA, in ciclul Krebs devin: 8 CH3CO~SCOA 4 16 H20 4 24 NAD* 4 8 FAD 4 8 ADR 4 8 Pj ► -----------► 16 C02 4 24 NADH 4 24 H+ 4 8 FADH2 4 8 ATP 4 8 CoASH Coenzimele FADH2 §i NADH care se formeaz# atat prin P-oxidare cSt. §i in ciclul Krebs sunt oxidate in lanful respirator cu sintezd -cuplatS de ATP; 31 NADH 4 31 H* 4 31/2 02 4 93 ADP + 93 Pj — : -------------------31 NAD+ 4 124 H20 4 93 ATP 51 15 FADH2 4 15/2 Q2 4 30 ADP 4 30 P—15 FAD 4 45 H20 4 30 ATP In total, prin fosforil&i in lanful respirator §i in ciclul acizilor tricarboxilici,

arderea unei molecule de palmitil-CoA genereaza 131 molecule ATP. DacS raport&m aceastd valoare la acidul palmitic beneficial net in ATP este de 129 molecule, dou& leg&turi macroergice sunt cheituite la activarea acidului. RandamentuI de conservare a energiei libere in ATP este ridicat, de aproximativ 40%. P-Gxidarea acizilor nesaturafi Acizii nesaturafi sunt cuprin§i intr-o proporfie mare in lipidele endogene sau cele alimentare. P-Oxidarea acestora se desfSgoarli normal paM in vecin&tatea leg3turii sau ieg&turilor duble originale. Pentru a depftgi unele obstacole pe care le ridicH configurafiile cis ale leg&turilor etilenice din acizii gra§i nesaturafi, ca §i pozifiile acestora in intermediarii P-oxidMi sunt necesare reacfii auxiiiare, catalizate enzimatic. In caziil P-oxid3rii acidului oleic (a oleil-CoA) dupft 3 cicluri de P-oxidare se ajunge la un cis - A3 - enoil - CoA. In acest moment intervine o enzimS auxiliary care prin izomerizarea cis tons §i migrarea dublei leg&turi determine fonnarea tons - A2 - enoil - CoA, intermediar normal al p-oxidftrii (Fig. VIII.6). ;; ) V:

421 VVW 3 /. c/S - A - o/e/ CO r-u 5 Co A CK/3 - ox /Wore '9 i/e//~ Co A J A'cef//■ - Co A ca^ s- Co A c/s - A3- eno//- Co A j c/s - A 3~*~ fra ns -A- er/o/A Co A /cornerozd CD ^ D- Co A irons- A2- OnO// - CoA SxjS-ox/c/orp | S. Ace/// ~ Co A Fig. VIII. 8 - fTQxidarea oleii-CoA P-Oxidarea unui acid polietilenic implied mai multe reaefii particulare. In fig. VIIL7 este ar&tatii P-oxidarea linoleil-CoA. Oxidarea acizilor gragi in peroxizomi In afara p-oxid&rii mitocondriale, acizii gragi, in special aceia cu catend 1 iingS, pot fi oxidafi la acetil-CoA in peroxizomi (Lazarow §i de Duve, 1976). Aceste organite sunt prezente in toate tipurile de celuie eucariote, au diametre de aproximativ o,5 nm §i cuprind o mem bran# simple. Peroxizomii sunt sediul oxidSrii mullor compugi endogeni sau exogeni, oxiddri catalizate de oxidaze cu produefie de ap& oxigenat&, conform ecuafiei: oxidaza SH2 + 02 ~~- Sox + H202 Mai. departs, apa oxigenatft este fie descompysS, sub acfiunea catalazei, enzim& abundentii in peroxizomi: 2 H202 —- 2 H20 + G2 fie, servegte ca oxidant in reaefii catalizate de peroxidaze: S’HZ + H202 ---------------------------^ S’ox + 2 H20 Oxidarea acizilor gragi in peroxizomi conduce la acetil-CoA (este o Poxidare). Acetil- CoA difiizeazS. din peroxizomi in mitocondrii unde este oxidate la C02 §i H20 cu sintezS cuplata de ATP sau este converts in corpi cetonici. 422 0 n X /inafeil - CoA (as, c/s ~ ) S-CoA i ox/c/ore.

5-Co A j (c/s - A*-***- /few -.A^- /fe Co Ay \J?

/zomecozo

S~ Co A ./ it 20 irons - A ~ c/s - or - oCeno/i - Co A V j3 - oxic/crre S ~ Co A /W“V\/ a ■/0C/s - A ~ 0/70// “ Co A — SAM V FADH& J- CoA irons- c/s-zA- C/enO/Z Co A '■'ea/L/crc/z -|K--m~— NA 0 S CoA a/ D if s- CoA CronS - AJ- enO/7-CoA Q n ■c ■ Cr- ono/f /corner ozd) /W\A/\ ■S- CcA Crons - Aa- eno/Z Co A Fig. VliL 7 - (3*Oxidarea linoieii-CoA 423 P-Oxidarea peroxizomaie diferd de cea mitocondriaie prin reac|ia de oxidare a acil- CoA la enoil-CoA. In peroxizomi reacjia este catalizate de o oxidaze (acil-CoA oxidaze) §i nu de o dehidrogenaz<1: R — (CH2)n — CH2 — CH2 — CO ~ S — CoA Acii—CoA oxidaza Acii—CoA H202 R — (CH2)n —CM = CH — CO ~ S — CoA enoil—CoA Amploarea P-oxiderii acizilor gra§i in peroxizomi, in special la nivelul ficatului, variazJ in rapoit cu factor! nutrijionali, hormonali, medicamentoji. Numeral peroxi- zomilor §i conjinulul lor in enzimele (i-oxid&ii create semnificativ dupe ingestia de diete bogate in lipide, dupe ingerarea de acizi gra§i superiori, in diabet, in inanijie, dupa administrarea unor medicaments (agen}i hipolipemianfi, aspirind). Aceste fapte pledeazd pentru implicarea peroxizomilor in reglarea metabolismului lipidic.

o10o1

VIII.3.2. CETOGENEZA O cale alternative de utilizare energogene a acizilor gra§i, a acetil-CoA formate piin p-oxidare, are loc prin intermediul „corpilor cetoniciA Sub denumirea de corpi cetonici se infeleg; * acidul acetoacetic CH3 — CO — CH2— COOK; - acidul p-hidroxibutiric, [izomerul D (-)-] CH3 — CH — CH2COOH; i OH - acetona CH3 — CO — CH3. AcetoacetatuI este produsul prirnar care dft prin hidrogenare phidroxibutirat: p-hidroxibutirat dehidrogenaza CH3 — CO — CH2 — COOH CH, — — CH2 — —; CH COOH 3 | ( i NAD" NADH 4- H* OH sau prin decarboxilare ----C02 *f acetone; ^ CH3 CH3 — CO — CH2 — COOH Sinteza de acetoacelat (cetogeneza) are loc, in mitocondriile hepatice, din acetil-CoA formate prin P-oxidarea acizilor gra§i. Procesul decurge astfel: - condensarea a done molecule de acetil-CoA sub acjiunea tiolazei: CH3 — CO ~ SCoA + CH3 — CO - SCoA —CH3 — CO — CH2 — CO - SCoA CoASH Acetoacetil-CoA - condensarea acetoacetil-CoA cu o noud molecuIS de acetil - CoA sub acjiunea unei sintaze: 0 H MG—CoA 1 i smtaza CoA — S — CO — CH3 + C — CH2 —■ CO ~ SCoA I CH3 HOH COASH OH I HOOC — CH2 — C — CH2 — CO ~ SCoA I CH3 Hidroxf-metil-glutaril-CoA (HMG-CoA) - sub acjiunea altei Haze (HMG-CoA liaza) are loe reacfia inversd celei de mai inainte cu eiiberarea acetoacetatului §i a acetil-CoA: OH I HOOC — GH2 — C — CH2 — CO-SCoA CHa — CO — CH2 — COOH + CH3COSCoA I CH3 Acetoacetatul provine din acetoacetil-CoA. Acetoacetatul ca atare, neactivat, reprezintS pentru ficat un metabolit inert, ei difuzeazd in sange de

unde este eaptat de diverse Jesuturi extrahepatice §i ars la dioxid de carbon. Pentru aceasta acetoacetatul este mai intai acfivat. la acetoacetil-CoA printro reacfie de schimb cu suceiniFCoA (intennediar al ciclului acizilor tricarboxilici): CH3--CO—CH2—COO“ acetoacetat HOOC—CH2-CH2—CO~S—COA succinil-CoA HOOC—CH2—CH2—-COO" suceinat Acetoacetil-CoA este apoi scindat in aeetil-CoA sub acjiunea tiolazei: CH3—CO—CH2—CO~SCoA acetoacetil-CoA CH3 — CO — CH2 — CO ~ SCoA + CoASH ^ 2 CH3CO~SCoA Acetii-CoA mai departe este oxidatS. in ciclul Krebs §i Ia.nj.ul respirator. Ficatul nu poate metabolize ac'idul acetoacetic (corpii cetonici) intrucat nu posedd echipamentul enzimatic necesar activdrii acestuia. Acetoacetatul (§i (i-hidroxibutiratul) este utilizat energogen de cdtre miocard, mu§chii scheietici, diafragrn, rinichi, creier etc. Prin cetogenezd creierul devine apt sd utilizeze energogen rezervele lipidice ale organismului. 425 Cetogeneza in condifii .de alimentajie normals, este redusS. Cetonemia nu depS§e§te 1 mg/dl. Cand disponibilllilfile de glucozS scad, in foame, diabet, gesta|ie tarzie (nevoile metabolice ale f&tului sunt mari), in lactajie (se eonsuma glucozS pentru sinteza lactozei) cetogeneza hepaticS este amplificatS. Deficitul de glucozS absolut (foame) sau relativ (diabet) perturbs echilibrul dintre procesul de sintezS a trigliceridelor in fesutul adipos (lipogeneza) §i hidroliza acestora (iipoiizS) cu punerea in circulate de cantitSfi crescute de acizi gra§i liberi care ajung in ficat unde sunt activafi la acil-CoA, Calea cetogenicS are un prim punct de r&scruce la nivelul distribufiei acilCoA spre P-oxidare (dupS transfer in mitoeondrii via acil-camitinS) sau spre sintezS de trigliceride in citosol. Malonil-CoA (vezi mai deparie) inhibit transferul resturilor acil in mitoeondrii §i biocheazS P-oxidarea. In condifii cetogenice concentrajia malonil-CoA este micS (din lipsS de citrat activator al acetil-CoA carboxilazei) §i este favorizatS p-oxidarea acil-CoA la acetil-CoA. Al doilea punct de control al cetogenezei este situat la rSscrucea care diiijeazS acetil- CoA spre sintezS de acetoacetat sau spre oxidare in ciclul Krebs. Amorsarea ciclului are loc prin sintezS de citrat din acetil-CoA §i oxaloacetat. DisponibilMjile de oxaloacetat (care se formeazS din glucozS) vor stabili balanja dintre. cetogenezS §i ardere milocon- drialil In ahsenfa glucozei oxaloacetatul este deficitar §i este favoiizata cetogeneza (Fig. VTL8). j3 - oxidare | ** mitocondriaia Trigliceride Acizi * in Jesutui ----------gra§i Acil CoA adipos liberi ficat in * piasmS | SintezS de ----------------------------------trigliceride in citosol Cetogeneza > Acetii ^ CoA 1 I

----------------Ciclul Krebs Fig. Vill. 8 - Reglarea cetogenezei In cliabetul nelratat cetogeneza este exacerbate, cetonemia poate a tinge valori ridicate, este dep5§M capacitatea {esuturiior exlrahepatice de a arde corpii cetonici (la cetonemii de aproxjmativ 70 mg/dl) §i apare cetonuria. Acidul acetoacetic §i P-hidroxibutiric sunt eliminaji ca sSruri, ei consume din rezerva alcalind a organismului conducand la acidozd. Totcxlatd fiind substanje osmotic active antreneazfi §i pierderi mari de apS (poliurie), deshidratarea organismului. 426 vm.3,3. BIOSINTEZA ACIZILOR GRA§I Sinteza de acizi gragi gi incorporarea lor in irigliceride constituie mecanismul principal de stocare a excesului de glucide alimentare. Capacitatea organismului uman de a depozita glucoza ca glicogen este iimitatd, prisosul de glucide este Intx-o mdsurd considerabild convertit in acizi gragi, respectiv, irigliceride care sunt depozitate in fesutui adipos. Atomii de carbon utilizaji pentru sinteza de acizi gragi sunt furnizaji de acetilCoA formal din glucozd prin glicolizd la piruvat urrnatS de decarboxilarea oxidativd a acestuia din urm
oxaloacetat intr- 0 reaefie ATP-dependentd (sub aejiunea citrat liazei); •427 Pi ADR .Ace// Cn A

M ifocondr/e O'/sof Fig. VIII. 9 - Transportul acetil CoA din mitocondrii Tn citosol -oxaloacetatul este redus la malat sub acjiunea malat dehidrogenazei citosolice; - malatul are dou& posibilMji de evolujie, trece in mitocondrii §i prin dehidrogenare regenereazS oxaloacetat sau, in citosol, suferij o decarboxilare reductive sub acjiunea „enzimei malice": NADP* NADPH + H* COOH J. 1 CHOH COOH I 1 1 J CHa Enzima c - 0 + co2 1 malica 1 COOH CH3 Add malic Acid piruvic Piruvatul trece in mitocondrii unde prin carboxilare genereazd oxaloacetat Aceastd din urmft cale de utilizare a malatului este deosebit de important^, ea fumizeaza o fracfiune din NADPH necesar etapeior reductive ale sintezei de acid gras. Transferal acetil-CoA in citosol, in vederea incorponlrii in acizi gra§i, depinde de disponibilM{ile celulare de oxaloacetat (care se formeazft din piruvat), de citrat, de ATP §i acestea sunt mari in perioadele de aport glucidic crescut, cand ciclul Krebs este saturat §i se acumuleaz& citrat, ATP §i oxaloacetat. Sintcza malonil-CoA, De§i. acetil-CoA furnizeazil tofi atomii de carbon din acidul palmitic totugi procesul de biosintezS necesit& obligatoriu dioxid de carbon (HCO3). Acesta din urm-& carboxileazit acetil-CoA la malonil-CoA: 428 CH3 — CO'-SOoA + HCO3 + ATP ► HOOC — CHaCO~SCcA + ADP + P, maionll—CoA

Reacfia este catalizatS de acetil-CoA carboxilazS (carboxiligazS), 0 enzimS care cuprinde biotinS. Rencjia are loc tn douS etape:

NOOC-CH^CO^ S ~ CoA dee/// Cod | 8/0//J 7/1 enz/mo Cfa/or?//- CoA Reacfia catalizatS de acetil-CoA carboxilaza este etapa cheie, reglatoare a biosintezei aciduiui palmitic,, ea dirijeazS acetil-CoA pe aceastS cale metabolic! Acetil-CoA carboxilaza exists ca monomer cu activitate cataliticS redusS sau ca. poiimer activ. Deasemenea, enzima posedS situsuri la care se pot iega resturi fosforil sub aejiunea protein kinazei A, AMPC - dependents. In plus, cantitatea de enzima din ficat variaza in funejie de starea hormonal^ §i de starea de iiutrijie a organismului. Principalii factori reglatori ai acetil-CoA carboxilazei sunt: Concentrafia citratului. Acumularea de citrat in celule, in citosol, acfioneazS pozitiv asupra acetil-CoA carboxilazei (favorizeazS polimerizarea). Acest metabolit semnalizeazS graciul de saturare cu substrat a ciclului acizilor tricarboxilici §i, indirect, incSrcarea energetics celularS. Palmitil-CoA §i al}i acil-CoA cu catenS lisngS acfioneazS ca efectori negativi, ei favorizeazS trecerea enzimei in forma monomericS, cu activitate redusS. Acumularea in celule a acestor metaboliji semnalizeazS prezenja unui exces de acizi gra§i. Starea hormonal# a organismului, raportul insulinS/glucagon, are un rol hotSrator in modularea activitlijii acetil-CoA carboxilazei. Insulina are efect activator asupra enzimei, din contrS, glucagonui favorizeazS conversia enzimei in forma fosforilatS mai pujin activS. Perioadele de alimentare glucidicS, caracterizate printr-un raport insulinS/glucagon ridicat, sunt favorabile conversiei glucozei in acizi gra§i. Adrenalina §i noradrenalina, prin creglerea concentrajiei AMPc§i act! varea protein kinazei A, inhibSacetil-CoA carboxilaza. Cantitatea de enzima in ficat este reglatS de starea de nutrifie, In perioadele de 429 Cantitatea de enzimei in ficat este reglatd cie starea de nutrijie. In perioadele de alimentafie glucidicd sinteza acetil-CoA carboxilazei este ridicatd. Din contrd, in foame cantitatea de enzimd este mult diminuatd. Acid gras sintaza catalizeazd sinteza acidului palmitic, Este o enzimd, multifuncjionald. La mamifere este o protein# uria§e (50 kd) alcdtuitd din doud lanfuri polipeptidice identice. Un monomer este organizat in mai multe domenii structurale, fiecare domeniu av&nd o funcjie cataliticd specified.

Unele dintre reaefiile biosintezei de acid gras sunt inversui reacjiilor poxiddrii. Acid gras sintaza cuprinde grupdri -SH, la care sunt legafi intermediarii metabolici. Fiecare monomer posedd doud astfel de grupdri. Una dintre ele este fumizata de un rest Cys din ianful polipeptidic. La aceastd grupare sunt ata§ate restul acetil in faza de inijiere §i resturi acil cu 4-14 atom! de carbon in fazele de elongare, Cea de a doua grupd - SH aparfine fosfopanteteinei (derivatd din acidul pantotenic), ata§at# ca grupare prostetied la un domeniu structural al acid gras sintazei. Aceastd component# a enzimei este denumit# proteina trail sportoare de acil (AGP = acyl carrier protein). La aceastd funejie tiol sunt ata§af.i restul malonil §i ceilalfi derivafi acil, Pcetoacil p-hidroxiacil-, enoil. Acid gras sintaza este activd numai ca dimer. Prin iegarea cap-coadd a celor doi monomeri gruparea Cys-SH a uneia dintre monomeri se afld in vecinStatea grupdrii panteteind - SH a celuilalt, In cursul funepondrii enzimei o moleculd de acid gras este sintetizat# prin cooperarea grupdrilor Cys-SH §i Pant-SH aparjinilnd la monomeri distineji. Pe o moleculd dimeried de acid, gras sintazd se arid in curs de form are, simultan, doud molecule de acid palmitic, in fig. VIII. 10 este descrisd sinteza unei molecule de acid palmitic cu participarea unei jurndtdji a dimerului, reprezentat astfel: ~ ~{- Cys - SH ZZZZ3- Pant ' SH Reacjiile care au Ioc sunt: 1. Un rest acetil din acetil-CoA este transferal pe gruparea Cys-SH. Enzima care catalizeazd-reaefia este o transacilazd. 2. Un rest malonil din malonil-CoA este transferal pe gruparea tioiicd a fosfopanteteinei. Se pare cd o acecagi transacilazd catalizeazd reaejiile 1 §i 2. 3. Gruparea acetil, in faza de inijiere sau o grupare acil a acidului gras intermedia! in fazele de elongare, atacd gruparea metilen activd din restul malonil. Simultan are loc o decarboxilare §i form area unui derivat P-cetoacil. in prim a fazd a procesului se formeazd un P-cetoacil cu 4 C. 4. Urmeazd reduceica derivatului P-cetoacil la P-hidroxiacil intr-o neaejie NADPH dependentd. 5. Derivatul P-hidroxiacil prin eliminare de apd trece intr-un derivat tiolesteric al acidului a, p nesaturat (enoil-) 6. Hidrogenarea, NADPH - dependentd, a derivatului enoil - duce la formarea unui acid gras saturat, ca derivat tiolesteric. In prima fazd a procesului se formeazd acid butiric §i apoi acizii gragi cu 6, 8 16 atomi de carbon. 7. Acizii gragi cuprinzand 4 pan# la 14 atomi de carbon nu sunt eliberaji de pe acid gras sinlazd. Numai acidul palmitic este detagat hidrolitic din legdtura sa tiolestericd la 430 MS- Co A CoAcM J. - CO- CM. 3 7?mD-

-C~CO~CMa - COOM @|—COa .SM ~ .S-CO ~CM2 -CO -CMj v MAM PM -h/-M ~SM ! -J-cO-Ctfa ~CM~CMJ nM

u

. s-co - CM ~CM - CMj _ SMAUMM+M*, J// MADP * ,S~CO"CM£~CMa - CM0 C^£)-‘S^CD-CM2-CMa-CMt3 * "J//, k-Mz~co~$-CoA £ i ~' —iC^A ’5 ^) -j-rz7 -r/£-r^/y ' 3' c0z 33s') -s-/V M) -$-C0~C3z-C0~ (c»z)z - ^ CuS _ SM -.J~C0-(CH2)/it -CM ■ CMj ■C//j ■ CM Fig. VIII. 10 - Biosinteza aciduiui palmitic Pant-SH, Gruparile acil ale acizilor grap intermediari (4-14 C) sunt transferal de pe gruparea tioiic&a panteteinei la gruparea Gys-SH vecin&. Gruparea Pant-SH eliberatS este

. ! p. i ;•

inc&rcatit cu o nou3 grupare malonil ji sunt reluate reacjia de condensate §i celelalte reacfii formandu-se un alt acid gras intermediar. Ciclul de elongate se repetft pand la form area acidului palmitic. 8. Ultima reacjie care incheie procesul const&in eliberarea, prin hidrolizS, a acidului palmitic. Eiongarea acizilor gra§i Sinteza de novo prin acid gras sintazft duce la formarea acidului palmitic. Acizii superior! sunt objinuii prin eiongarea acidului palmitic sau a alter acizi exogeni. De§i CHj - ( C )/- CO^ S- Co A -b HOOC-~CHz ~ CD ^ S~ Co A Pofrr?///I-Cod fia/onil- Co A CoACH * COa CH 3~ (CHa)}i" CO - CHZ - CO -u 5-Co A — NAD PH + H k--------------------NAUP* CHr (CHZ)/~ CH -CHa~CQ ^ S-Co A OH ■ HP0 CHr (CHj - CH = CH- CO Co A ■ NADPH+ H -____________________w^NADP* CH^~~ (CPg)jg — CO ~ Co A 61 eon I - Co A Fig. VII!. 11 - Eiongarea palmitil-CoA la stearii-CoA 432 exists m sistem de elongare mitocondrial care funcJioneazS, in esenfft, prin inversarea reacfiilor (i-oxidSrii, la mamifere elongarea are loc In principal in reticulul endoplasmic sub acfiunea unui sistem multienzimatic care.atageazft la acidul preexistent unitSji C2 furnizate de malonil-CoA. In fig. VIII11 se aratS transformarea palmitil-CoA in stearil-CoA. Biosinteza acizilor gragi n€satura$f O proporjie important# a acizilor gragi din iipideie organismului cuprind duble legSturi. Capacitatea organismului uman de a sinteliza acizi nesatura. {i este limitatiL Pot fi sintetizafi • acizi gragi monoetilenici (acid palmitoleic,

acid oleic) dar nu §i acizi polietilenici. Acidul iinoleic indispensabil organismului peniiu sinteza de lecitine, de esteri ai colesterolului, de prostaglandine, poate fi objinut numai pe cale exogen#, este un „acid gras nutritiv esenjiar Acizii gragi monoetilenici, acidul palmitoleic gi acidul oleic sunt obpnuji din acizii saturaji corespunzdtori, Sistemul de desaturare consume oxigen gi NADH gi are loc prin cooperarea a douil enzime, o acil-CoA desaturaz# gi o flavoproteind, citocrom b5 reductaz#. In Fig. VIII. 12 este ar&tat# schema funcfionMi sistem ului desaturant care transform# stearil-CoA in oleil-CoA. £ u2 CHrfChQ-CO^S- Co A sf&ar/Z- Cod 2 O/rocrarr?^re
Hp 0 .Chi3 ~(CHZ)7-CH
tiADH + H* ■ MAH* Fig. VIII. 12 - Transformarea stearil-CoA m oleil-CoA sub ac$unea sistemului desaturant al acizilor gragi 433 CH3 - (CMJ4~ CH^CH- CH2 -CH^CH- (CHJJ - GO ~ SCoA tlnoteH - CoA (Cu : &'*) desaturare T CH3 -(CHj4- CH -CH-CH,- CH-CH -CH- CH^CH-(CHJt ~CO~SCoA c„: A'" elongate CH3 ~'(GHj4- CH^GN -CH2- GH^GH~CH2~ CH^CH-(CHJ6-CQ ~SCoA desaturare CH3 ~(CHJ4~ (CH = CH- CHJ4— CH2- CH-CO -SCoA arahidontl - CoA ( C„: £‘MU) ( eicosatetraenoil - CoA ) Fig. Viil. 13 - Transformarea iinoleii-CoA in arahidonil-CoA Acesl sistem de desaturare mai poate introduce o a doua legfttur& dublft intre groparea carboxil §i precedenta. Acidul oleic nu poate fi insSi transformat in acid linoleic §i acid linolenic. Prin combinarea reacjiilor de elongare §i desaturare acidul linoleic poate fi transformat in acid arahidonic (C20: A5,8,11,14) (Fig. VIIL 13). Jinandu-se seama de faptul'c&in organismul mamiferelor desaturarea §i

elongarea unui acid gras se petrec numai in porfiunea cuprinsS intxe grupaxea carboxil §i legatura dublS preexistent^, se considers c& pozijia dublei legituri cea mai dep&*ta& de gruparea carboxil constitute on criteria de clasificare a acizilor gra§i mai bun decat cel clasic (in care carbonul grupei carboxil este Cj). Denumindu-se carbonul grupSrii metil terminaie C^, acizii nesaturaji dup& pozifia dublei iegftturi cea mai dep3rta$ de carboxil sunt clasificaji in seria co - 9 (acid oleic), a) - 6 (acid linoleic, acid arahidonic), (0 *3 (acid linolenic). VIII.4. METABOLISMUL GLICEROLULUI Glicerolul este component al gliceridelor §i al fosfoglicerideior. Liber se formeazS prin hidroliza tisularS a trigliceridelor. Pentru ca glicerolul sa reintre in fluxul metabolic el este mai intai fosforilat la giicerol fosfat sub acfiunea glicerol kinazei: 434 CHoOH CH2OH I Glicerol CHOH ' kinaza HOCH CH2OH Gliceroi ATP \ CH2O0 ADR Giicerof-P sn-3-glicerol-fosfat AceastS enzimS este foarte active in ficat dar este practic absents, in adipocite. Glicerolul format in Jesutul adipos difuzeazS in piasmS de unde este captat de ficat care il utilizeazS dupS conversie in glicerol fosfat. Glicerol fosfatul mai poate fi objinut din glucozS, din intermediarul glicolitic dihidroxiacetonS fosfat, prin reacfia reversibilS: CH2OH

CH2OH

C=0 . . .^ CHOH | ................................| CH20—(p) (i H CH20—(0 NADH + H+ NAD* DupS condifiile specifice ficcSrui fesat, glicerol fosfatul poate evolua pe urmStoarele cSi metabolice: - poate fi transformat in trigliceride sau fosfogliceride (vezi mai departe); - dupS conversia sa intr-un triozofosfat (dihidroxiacetonS fosfat §i 3-PgliceraldehidS) poate urma calea giicoliticS degradativS §i apbi oxidare completS la C02 §i apS; - ca triozofosfat poate fi substrat gluconeogenetic. ' VIII.5. METABOLISMUL TRIACILGLICEROLILOR Triacilglicerolii (trigliceridele) ca formS de depozitare a excesului caloric al organismului se gSsesc in cantitSfi apreciabile in Jesutul adipos. Un adult normal (bSrbat de 40 ani §i 70 kg) cuprinde 15 kg Jesut adipos (135.000 kcal). Energia potentials a acilglicerolilor este cuprinsS in catenele bogate in hidrogen ale resturilor acil. In paragrafele de mai sus s-a tralat modul in care are loc mobilizarea acestei energii §i cum are loc sinteza acizilor gra§i. Mai

departe vor fi prezentate cSile de eliberare a acizilor gra§i, respectiv incorporarea lor in trigliceride. Un alt aspect al metabolismului triacilglicerolilor, compu§i insoiubili in apS, este acela privind transportul lor intre diverse compartimente ale organismului. Exists douS marl fluxuri plasmatice de trigliceride: a)circulajia trigliceridelor alimentare, exogene, de la intestin in restul organismului; b)circulajia trigliceridelor de origine endogenS de la ficat spre (esuluri extrahepatice. 435 In plasmil triglicerideie sunt cuprinse in particule lipoproteice. Chilomicronii reprezintd forma de transport a trigliceridelor exogene iar lipoproteinele cu densitate foarte mica, (very low density lipoproteins, VLDL, pre~P~lipoproteine) transport# triglicerideie sintetizate in treat. VIII.5,L HIDROLIZA TRIACILGLICEROLILOR In {esuturi, acest proces are ioc in etape, pand la gliceroi §i acizi gra$i: Triacitgiicerol -——”-► Diacilgiicerol ——Monoacil -—---* Olicero! gliceroi 1 1 H2O h20RCOOH RCOOH RCOOH Cele trei etape sunt catalizate de enzime dislincte, triaciiglicerol lipazd, diacilgiicerol lipazd §i monoacilglicerol lipazd. Prima etapd este cea mai Tnceatd, de aceea in Jesuturi nu se acumuleazd di- §i monoacilglicerolii. Hidroliza triacilglicerolilor furnizeazd Jesuturilor acizii gra§i utilizafi drept. combustibil sau pentru alte nevoi specifice. Hidroliza triacilglicerolilor in JesutuI adipos este un proces metabolic fundamental, cu ecouri in intreg organismul, acest proces mobilizeazd rezervele calorice majore ale organismului (lipoIizH sau adipolizd). Enzima cheie a lipolizei este triaciiglicerol lipaza adipocitard, cunoscutd ca „lipaza hormon sensibildA Produ§ii lipolizei sunt acizii gra§i §i glicerolul. Jesutul adipos este practic lipsit de gliceroi kinazd §i nu este capabil sd utilizeze glicerolul. Acesta difuzeazd din fesutul adipos in plasmd de unde este preluat de ficat. Concentrajia plasmaticd a glicerolului este o mdsurd a intensitdjii lipolizei. Acizii gra§i rezultafi prin hidroliza triacilglicerolilor pot fi utilizafi pe mai multe edi: a) O fraejiune este degradatd oxidativ pentru a objine ATP necesai' funejiilor adipocitului. b) Acizii gra§i, dupd activare la acil-CoA, pot fi incorporafi in triaciigliceroli §i depozitap in adipocite. Acest proces este dependent de prezenja glucozei in adipocite (§i de insulinemie), din glucozd fiind objinut gliceroi fosfatul. In condijii de echilibru caloric viteza de hidrolizd este egald cu cea de resintezd, conjinutul in triaciigliceroli nu se modified, Glicerolul care difuzeazd in plasmd indied existenja unui proces hidrolitic. c) Acizii gra§i difuzeazd in plasma, constituind fraepunea „acizi gra§i liberi“ (acizi gra§i neesterificaji). Jesuturiie periferice, mugchi scheletici, miocard, diafragm, rinichi, ficat capteazd acizi gragi din plasmd pe care ii utilizeazd ca substanfe energogene. Ficatul rejine circa o treime din acizii gra§i plasmatici pe care ii utilizeazd diferenjiat dupd nivelul absolut ai acestora §i in funejie de starea hormonald a organismului.

Lipoliza, hidroliza triacilglicerolilor adipocitare, este reglatd la nivelul Jipazei hormon sensibileA Enzima este convertibild prin fosforilare defosforilare. Forma fosforilatd prezintd activitale cataliticd ridicatd. Gonversia enzimei este catalizatd de protein kinaza A, AMPC dependentd §i de o protein fosfatazd specified. Factorii hormonali care cresc concentrajia AMPC favorizeazd conversia enzimei in forma activd. Din contrd, sedderea concentrajiei AMPC sau activarea fosfatazei inactiveazd enzima. Catecolamineie, adrenalina eliberatfl. de modulosuprarenale sau noradrenalina elibereat# prin stimulare nervoasS sunt: factor! major! iipolitici, Glucagonul, prin activates adenilat ciciazei §i cre§t.erea concentrajiei AMPC este tin factor Impolitic important. Insulina, prostagiandina E, metilxantinele (cofeina, teofilina) sunt factor! anlilipolitici, ei favorizeazS sinteza de triacilgliceroli In jesutul adipos (acjiune lipogeneticS). VIII.5.2. BIOSINTEZA TRIACILG.LICE.ROLILOR Pentru sinteza acestor compu§i, organismui dispone de douS cSi care diferS prin na.tura precursorului care cuprinde glicerolui: a)caiea monoacilglicerolului; b) caiea giiceroi fosfatului. Acizii gra§i sunt incorporaji in acilgliceroli ca derivaji activi, acil-GoA: CoASH R — COOH R - CO--S — CoA ATP AMP+PP Diverse acil transferaze catalizeazft transferul grupiSrii acil pe acceptori. Caiea monoaciigliceroluiui func|:iorteaz3 in enterocite §i reprezintft o modaiitate rapidS §i economics de resintezS a triaeilglicerolilor din produgii de digestie, absorb!}! din intestin: CH2O CH2OC H OR I 1 CHOC CHOCO OR R j j 1 RCOSC i CH2OH oA CH2OH 2Mono 4S 1,2aciiCO; H Diacil giicer glicero! oi ~T~T~ RCOSCoA CoASH CH2OCOR

I CHOCOR I CH2OCOR

Triacilglicerol Triacilglicerolii astfel sintelizaji, impreunS cu fosfoiipide, colesterol, acilcolesterol §i proteine sunt incorporaji in chilomicroni §i secretate mai departe in vasele liinfatice. Caiea giiceroi fosfatului este operajionalS in majoritalea Jesuturilor (Fig. VIII.34). In aceastS cale biosinteticS se formeazS ca intermediari acizii fosfatidici. De la ace§ti compiled sunt objinute §i glicerofosfolipidele. Sinteza de triacilgliceroli tire loc in toate jesuturile. Totu§i formarea acestor compu§i in ficat §i in Jesutul adipos joacS un rol important in economia energetic^ a organismului. Sinteza triaeilglicerolilor in Jesutul adipos (lipogeneza) reprezinta modalitatea de stocare a excesului caloric, lipidic sau glucidic, al organismului. Giiceroi fosfatul este objinut aproape in exclusivitate din glucozd, din intermediarul glicolitic, dihidroxiace- tonofosfat. Acest fapt face lipogeneza dependents de giicemie insulinemie. Acizii gra§i incorporaji in triacilglicerolii din adipocite provin din mai multe surse: 437

RzCQSCoA CoA __ CHsO ® Hz 0 Pi _ CHzOCORi I CHOCOPi CHzO ® CM 1 4 CHOCORz \RZON Ac/c/ /05'/&/7bVr JJSac//Q//cero/ R$CQS£bA- CoA _ c//2 ! CH&CORt CH? OCORd 77 r/aCf-

Fig. VIII. 14 - Blosinteza triacigllcerolilor (cafea glicerol fosfatului) a) Hidroliza triaciigliceroliior (iipoliza) fumizeaz& acizi gra§i care sunt reincorporaji in aceste molecule. Triacilglicerolii se aflU intr-o stare dinamicS, cantitatea ior este stationary, dacS sinteza §i hidroliza sunt echilibrate. b) Sinteza de novo (din glucozd) a acizilor gra§i este 0 surs& potentials Totu$i la om conversia glucozei in acizi gra§i la nivelul tesutului adipos este foarte redusS practic neglijabild. 438 ■ Hidrotiza intestinala a grasimilor i _________________________________________ Absorbpa produ§ilor de hidrotiza T Resinteza trigliceridetor In celulefe mucoasei intestinaie fncorporarea triglicerideior in chilomicroni §i trecerea tor in circulape Hidrotiza trigticeridetor din chitomicroni sub acpunea lipoprotein - lipazei din fesutul adipos §i captarea acizifor gra§/ Ef

Activarea acizilor gra§i §i fncorporarea lor in trigiiceride cu participarea | giiceroi - fosfatuiui furnizat de glucoza ■ i____________________________—.——--------Fig. Vili. 15 - Circuitui grasimilor exogene c) Sursa majors care determ inS o cre§tere neta a conjinutului de acizi gra§i in JesutuI adipos sunt triacilgiicerolii prezenji in piasmSsub formS de chilomicroni (care transports triacilgiicerolii de engine alimentarS) §i de VLDL (lipoproteine cu densitate foarte micS). Acestea din urmS sunt sintetizate in ficat, ele transports triacilgiicerolii de origine endogenS. Triacilgiicerolii prezenji in chilomicroni §i VLDL sunt hidroiizaji de lipoproteinlipazS §i acizii gra§i obfinuji sunt captaji de adipocite ,§i apoi incorporaji in triacilgliceroli. In Fig. VIII. 15 §i VIII. 16 sunt arState etapele prin care excesul de grSsimi alimentare §i/sau de glucide este depozitat in Jesutul adipos. 439 Hidroliza amidonului §i a dizaharldeior m intestin

t Absorbpa rnonozaharidelor $i trecerea lor In ficat ,

* Giicoiiza la piruvat, decarboxllare oxidativa la acetlf - CoA §i sinteza de acizi gra§i in hepatocit

r Sinteza de trigliceride fncorporare in llpoproteine cu densitate foarte mica r Secrefia VLDL In circulape f Hidroliza trigliceridelor din VLDL sub acpunea iipoproteiniipazei din fesutui adipos §i captarea acizilor gra§i

r Activarea acizilor gra§i§i incorporarea lor in trigliceride impreuna cu g/iceroi - fosfat furnizat de glucoza Fig. Vili. 16 - Circuitui glucideior exogene pana la constituirea depozitului de grasimi adipocitare Ficatui dispune de o capacitate mare de sintezd a (riacilglicerolilor. Poate objine giicerol fosfat atat din glueozfi cat gi prin activarea glicerolului capiat din plasm ft. Gliceroi kinaza este deosebit. de active in hepatocite. Acizii gragi sunt ob{inu|i pe doud c&i: a) sinteza de novo, din glucozd; ficatui este principals. organ de conversie a giucozei in lipide; b) captare din plasma'din fracfiunea acizi gragi liberi, contribujia aeestei surse depinde de concentrajia acizilor gragi §i de distribufia lor spre ardere, cetogenezS sau sinteza de triacilgliceroli. Ficatui nu-este un organ de depozitare a triacilglicerolilor, Acestea dupfi sinlezS sunt incorporate, impreuml cu alte lipide gi proteine, in VLDL gi apoi secretate in plasmfl. Din VLDL circulante prin acjiunea lipoprotein lipazei, Jesuturile extrahepatice Igi procurfi acizi gragi. (Fig. VIII, 15). VII1.6. METABOLISMUL GLICEROFOSFOLIPIDELOR Toate membranele biologice au structure lipoproteicd, dar fiecare membranS cuprinde un mozaic de lipide, gticerofosfoiipide, sfingolipide, coiesferol, in raporturi bine determinate. Specificitatea gi constanja compozifiei lipidice a membranelor aratd ca fiecare tip de molecula lipidica are un rol bine delerminat in asigurarea structurii gi funcfiei specifice a unei membrane. Fosfatidele, ca gi alte lipide, se afkl In stare dinamicft, ele sunt, degradate gi resintetizate continuu. Fosfolipidele din reticulul endoplasmic al

hepatocitului au un timp de injumlitilfire media de numai cateva zile, resturile acil fiind reinoite mult mai repede decfit glicerolul. Mai mult decat atat, viaja biologic^ medie a fosfoiipidelor este mai scurtS decat aproteinelor membranare. Reinoirea rapid# a fosfoiipidelor, in particular reinoirea resturilor acil, se explic# prin degradarea oxidativB a resturilor de acizi nesaturaji. Transformable 'metabolice ale fosfatideior constau in: a) hidroliza la substanfele componente, acizi gragi, giicerol fosfat, colinS sau all. alcool; b) sintezli din precursori (sintez# de novo); c) schimbul unor componente din.moleculele fosfoiipidelor (acizi gragi, alcooli) cu substanfele libere; d) interconversiunea fosfatideior prin modificarea resturilor de alcool (de exemplu serinS etanolaminfi, -etanolamin# —» coiinS). Schimbul de componente, interconversiunile, degradarea partial# gi reutilizarea produgilor permite remanierea compozifiei lipidice a diverselor membrane, asigurandu-se pentru fiecare tip compozifia sa specifics. Sinteza de novo a glicerofosfolipidelor utilizeaza ca intermediar comun acidul fosfatidic, objinut aga cum s-a arfitat la biosin teza trigliceridelor. O particularitate a biosintezei fosfatideior este participarea unor precursori In forme active de derivaji ai citidin difosfatului (CDP) ca CDP-colinii, CDPetanolaminft, CDP-diglieerid: 441

HH,

QH OH CDP - ctanolamina 442 RrCO- 0 - CHZ R,~ CO- 0- CM I

CDF — diglicerid Reacfiile de formare a acestor derivafi sunt: Acid r CDP fosfatidi diglicerid c CTP PP: Colina Fosforil-colina CDP-colina ATP ADP CTP PPi CDP - etanolamina este obfinuta prin reacjii similare. In Fig. VIII. 17 sunt ar&tate cftile de obfinere a principaleior categorii de glicerofosfo- lipide. De subliniatposibilitatea interconversiunii fosfatidiietanolamin£—» fosfatidil-serinS prin schimbui dintre serinS libera §i fosfatidiRetanolaminSl (reacfia 6), ca §i trecerea fosfaddil-serinil —» fcsfatidiletanoIaminSprin decarboxilare (reacfia 4); prin metilare restui de etanolamin^ este transformat in rest de colinS (reaefia 5). Donor ul de grupflri metil este S - adenoziRmetionina (metionina activS). . Degradcirea fosfatidelor. Asupra glicerofosfolipidelor acjioneazfi diverse fosfolipaze A,, A2, B (iizo£osfolipaz&), C (Fig. VIIL18). 0 fosfolipazeD care deta§eaz& alcoolul este cunoscutft numai la plante. Prin acfiunea secyenfialS. a acestor enzime fosfatidele sunt hidi*olizate la acizi gragi, glicerol §i fosforil-colinl Aceste enzime acfioneazS independent una de cealaM, produ§ii de reaefie servind la reconstituirea altor molecule. Prin astfel de reaefii are loc redistribuirea componeritelor in diverse fosfolipide, remanierea lor in raport cu faciori nutrifionali, metabolici sau de mediu. 443 n ft [} Act Go A ^ G/icero/~ fos far i XJ AddfosM'd/c • {G- digitm,id COP- colina — CMP* : y A Pns/nMIco/m X / S-adsnoz/Ihomociskmd /} ;2K —- CBP-elemismm- -CMP LGK 'PPi -GPL

\ / Fttsfafidil- eisnoimind y V __ senna fmkiidi!serins $-adenoid- zneh'onina J£l_ ( DO, DIP PPi V. J 1 CDP-dig/icerid L-- Inozi/ol G\ | "-MP PosMiiiiinoiiird ATP—J POP-------j Fosfafidii - inozihi- / - ( ATP /WP J Pas fa Tv'//- irwdfol ~T,S~ Fig. VIII. 17 - Metabolismul fosfatidelor fis, G H A « j 1 & • C - M | 0 P ^ vT /a oy0-A y D Fig, VIII. 18 - Punctele de scindare a unui giicerofosfolipid sub ac$iunea fosfolipazeior (A,, A2, C,D) Activarea unor fosfolipaze membranaie prin acjiunea unor stimuli extern! §i inijierea de rSspunsuri intracelulare constituie o inodalitate de transmitere de semnaie inlracelulare. Activarea fosfolipazei A2 elibereazS din fosfolipide acid arahidonic materie primft pentru biosinteza de prostaglaudine §i ieucolriene. AI{i compugi biologic activi (hormoni, neurotransmijiStori, factori de create re) activeazfi fosfolipaza C care acjionSnd asupra inozitolfosfolipidelor membranare elibereazd diacil-glicerol (1,2-diglicerid) §i inozitolfosfat (mono-, bis- sau trisfosiat), mesageri iniracelulari ai semnaieior extracelulare (vezi capitolul privind hormonii).

444 VHI.7. METABOLISMUL SFINGOLIPIDELOR Sfingozina, components a sfingoiipidelor este sintetizatil din acid palmitic (de fapt palmitil-CoA) §i serinii, a§a cum se aratft in Fig. VIII. 19. -COS -Off/i * mo -CH - CHzOH h CoMO-* PiridoxffC-P ! CH -(Cf!z)lz -Cfk -OH, -CO-CH - CHZ OH h 3 - ceh-dihidrosf/npzing NAOPH+H*. NADPt CHs-(CHm CH2-CHZ-CH-CH- CHZ0H ^ h mz d/hidrosfirtpfozm mm FAD — ) serm CHs-(CHja- CH = CH~CH-CH-CH2OH OH k sfiripoz/nd Fig. VIII. 19 - Biosinteza sfingozinei De la sfingozinS se obfine ceramidul prin reacjia: CoASH sfingozina + aci! - S ~ CoA--------—— ► acil-sfingozina (ceramid) Sfingomielinele sunt objinute de la ceramide prin reacjia: CDP ceramid + CDP - colina sfingomielina. 445 La sinteza sfingoglicoiipidelor participft deriva|ii UDP-galactozS, UDPglucozS, UDP- N-acetil-galactozamin2 care fumizeazS resturile glicozil active. Pentru acidul N-acetil- neuraminic (NANA, acid sialic) forma activate este aceea de CMP-N-acetil-neuraminat. In Fig. VIII.20 se arafS succesiunea de reacjii pentru sinteza gangliozidului GM,. Sfingoz/rid—Acd- Cod ■ Cerom/d ■ UDP-G/c G/c-cerom/d ■GDP-Go/ 6ok G/c -cerom/d --------^mp CMP-MM CMk i (_____________________________________ i' , bo/-Gk -cerom/d (GMS)

GAM l-----------------------------------------MOP-Go/MAc ----------------------------------------------------- - Ga/GHAc - Go/- 6k - cerom/d(GM2) MM j, ■ GDP-Go/ ■GDP Go/- Go/ZZMc -Ga/-Gk -ceromid/SMf) Nm Fig. VIII. 20 - Biosinteza unui gangliozid (GM, Degmdarea sfingolipidelor are loc sub acfiunea secvenfiald a numeroase hidrolaze cu specificitate pentru fiecare tip de legdturd din moleculele lor. La sfingomieline atacul Incepe prin aejiunea unei fosfoesteraze (sfingomielinazd) care deta§eaz£ fosforil-colina; asupra ceramidului acjioneazd o ceramidazd (carboxiamidazd). In cerebrozide §i gan- gliozide hidroliza are loc prin deta§area resturilor glicozil incepdnd de la capdtul nereduedtor. Fiecare tip de legdturd giicozidicd este scindatd de o glicozidazd specified. Ample cuno§tin{e despre aceste enzime hidrolitice, multe dintre ele localizatein lizozomi, au fost objinute prin studiul unor boli ereditare caracterizate prin acumulare de sfingoiipide in viscere, in creier (lipidoze sau sfingolipidoze). Deficienfa sau absenja unei hidrolaze biocheazd secven|a de degradare §i produsul situat in amonte fall de enzima deficitard se acumuleazd. In Fig. VIII.21 sunt ardtate edile de degradare a sfingolipidelor §i principalele deficienje enzimatice care provoacd lipidoza. 446 Gai ~ Gal - NHAc - Gal - G/c - Ceramid (GMJ \ NANA 0 GMf galgtozidaza Gal - NNAc - Gal - Glc - Ceramid (GMJ i NANA 0 Hexozaminidaza Gal - Glc - Ceram id (GMJ NANA GM3 sialidaza Gal - Glc - Ceramid ( Ceramid lactozid) Lactocerebrozidaza Glc “ Ceramid ( Glucocecerebrozid) Galactocerebrozidaza a Sfingomielinaza a Ceramid 4a Ceramfdaza Sfingozina + Acid gras Gel- Ceramid A Sfingomielma 0

Sulfatidaza Os$-O-GAL- Ceramid (Suifatid) Fig. Vlti. 21 - Degradarea sfingolipidelor Gal = galactoza; Gai-NHAc = Nacetil-gaiactozamina; Glc = glucoza; NANA = acid N-acetii-neuraminic Bcala asociata cu deficitul enzimatic: 1 - Ganaliozidoza; 2 = Boaia Tay-Sachs; 3 = Boala Gaucher; 4 = Boala Farber; 5 = Boala Niemann-Pick; 8 =Boala Krabbe; 7 = Leucodlstrofie metacromatica 447 iy'

Boala Niemann-Pick este una dintre lipidozele cu cea mai mai*e frecvenj# (1 caz la 330.000 nQscufi vii). Boala este datorat# defieitului de sfingomielinaz# lizozomal# din ficat, splin#, creier etc. Se acumuleaz# caniitdji excesive de sfingomieline in Jesuturi. Boala se manifests clinic cu hepato- §i splenomegalie, tulburfti digestive, intSrziere psihomo- torie,

convulsii. Gangliozidom GMt este datorat# defieitului enzimatic til unei galactozidaze care deta§eaz# restul galactozil terminal din GM,. Aceeagi enzim# acfioneaz# §i asupra glicoproteinelor §i mucopolizaharidelor. Boala are atat manifested viscerate (hepato- §i splenomegalie, poliadenopatie), alSturi de manifestSri nemopsihice, dismorfism. Boala Tay-Sachs (gangliozidoza GM2, idiojia amaurotic# infantile) este determinate de deficitul in hexozaminidaz# A, hidrolaz# ce deta§eaz# Nacetil-galactozamina din GM2. Se acumuleaz# in creier cantilaji excesive de GM2 determinand intarzieri psihomotorii, cecitate, cre§terea anormal# in volum §i greutate a creierului. Boala Krabbe (galactocerebrozidoza) este determinate de deficitul enzimatic in galactocerebrozidaz#, enzim# care detajeaz# galactoza din cerebrozide, iipide abundente in substanja alb# a sislemului nervos, Boala se manifest# precoce cu demielinizSri intinse la nivelul creierului. Este absent# suprainc#rcarea visceral#, deoarece galactocerebrozidele se afl# in cantit#{i mici in aceste organe. Boala Gaucher. In aceast# lipidoz# deficitul enzimatic intereseaz# hidrolaza lizozomal# care deta§eaz# glueoza din glucocerebrozide. Enzima se afl# in splin#, ficat, rinichi, intestin, creier. Glucocerebrozidele sunt intermediari in cursul degradftrii gangliozidelor. Se acumuleaz# in jesuturi (spiina este afectata in principal) glucocerebrozide, aldturi de GM (, GM2. Al#turi de splenomegalie, tabloul clinic este dominat de tulburM hemaloiogice, in true at membrana eritrocitar# cuprinde cantit#Ji importante de gangliozide. Leucodistrofia metacromatied. Deficitul enzimatic in aceast# boala este situat la nivelul hidrolazei (sulfatidaz#) care deta§eaz# resturile sulfat din sulfatide. Se acumuleaz# in sistemul nervos (substanja alb#), in rinichi, ficat etc., cantMji excesive de sulfatide. Boala se manifest# prin tulburari neurologice §i psihice. VIII.8, METABOLISMUL COLESTEROLULUI . Coiesterolui este principal!# steroid din organismele animale. El este 3p~hidroxi~5~colesten:

448 Colesterolul indepline§te numeroase funcjii: a) Liber sau ca acil-colesterol este element, structural al membranelor celulare §i al lipoproteinelor plasmatice. Catena alifatic3 §i nucleul rigid al steranului inserafi Tntre moleculele fosfolipidice din slraturile dublu lipidice regleazd fluiditatea membranelor (Fig. VIIL22). Creierul, indeosebi substanja albfu cuprinde cantitaji relativ mari de colesterol liber. Con^inutul in colesterol al creierului §i al nervilor create in perioada de mielinizare dupii care rdmane constant tot restul viejii. Acest colesterol este stabil metabolic. Ficatul este al doilea (esut in ceea ce prive§te conjinutul total in colesterol, in mare parte ca acil- colesterol §i cu un

turnover foarte rapid. Cortexul adrenaleior, gonadele cuprind mult colesterol raportat la gram de fesut, aceste giande sintetizeazd hormoni steroidici. Lipoproteinele plasmatice cuprind colesterol in proporjii variabile (Tabel VIII.4). Aceste particuie reprezintS forme de transport al colesterolului intre diverse eompartimenie ale organismului, intestin-fieat-jesuturi extrahepatice. ■)

i: r; ; Fig. VI!!. 22 - Intercalarea colesterolului printe moleculele de fosfolipide regieaza | fluiditatea membranelor b) Colesterolul este precursorul hormonilor steroidici-corticosuprarenalieni, sexuali. c) Colesterolul este precursor al acizilor biliari. d) Colesterolul (sau un precursor al sdu) este materia prim ft pentru sinteza calcifero- lului (vitamina D3). 449 VIII.8.1. DIGESTIA §1 ABSORBJIA COLESTEROLULUI Colesterolul din organism provine at&t din alimente (aproximativ 0,5 g) c&t §i prin sintezd endogend (1 g). Colesterolul este cuprins numai in alimente de origine animald, cele mai bogate surse sunt ouSle, ficatul, creierul. in intestin, colesterolul exogen se adaugd colesterolului din bilS §i aceluia din celulele mucosale descuamate. Prin acjiunea'solubilizantS a bilei, colesterolul este incorporate micelii §i esterii sunt hidroiizafi sub acjiunea colesteroi estetazei pancreafice, In final, impreund cu eeilalfi produgi ai digesiiei lipidice, colesterolul este absorbit din faza’midelarS, p5trunzand in enterocite. Capacitatea mucoasei intestinale de a absorb! cdiesterol este IsmitatH gi numai o fracfiune din colesterolul exogen este absorbit (aproximativ 300 mg). In celulele mucosale o parte din colesteroi este esterificat §i impreund cu alfi component este incoiporat in chilomicroni, lipoproteine ce sunt secretate In vasele limfatice care dreneazd intestinal §i via canalul toracic ajung In circulafia sanguine (A se vedea mai depart© metabolismul colesterolului)* VTII.8.2. BIOSINXEZA ;COLESTEROLULtJI Colesterolul este sintetizat in organism din precursori simpli. Toate fesuturile sunt dotate cu eehipamentul enzimatic necesar sintezei de colesteroi, ficatul gi intestinal dejinand insa primele locuri. Substanfa nervoasd esle sediul unei siiiteze active de colesteroi numai in limpid

mielinizfmi nervilor gi fondnl de colesteroi din oreier nervi este metabolic inert. Adrenalele glandeie sexuale siiuetizcazft colesteroi ce este utilizat mai departs pentru sinteza de hormoni, acest fond nu participd la circuitul metabolic al colesterolului. Ficatul este fumizoru! principal de colesteroi pentru fesuturile extrahepatice §i totodatS, este locul de tranzit al colesterolului in vederea excrefiei. In mucoasa intestinal^ are loc o biosintezd activd de colesteroi, §i acela pierdut prin descuamarea epiteliului intestinal este in partea reabsorbit. Materia primd pentru sinteza colesterolului este acetil-CoA care poate fi obfinutd din glucozd (glicolizd la piruvat §i decarboxilare oxidativd), acizi gra§i (prin p-oxidare) §i din catenele unor aminoacizi (dupd transaminare"§i degraddrea catenei temare). Cantitdfile cele mai mari de acetil-CoA sunt fumizate.de acizii gra§i. 450 ColesteroM §i ceilalji compu§i steroidici aparjin grupului de compu^i poliizoprenici. El se formeaz# prin condensarca a §ase unilafi de izopren aciiv. Biosinteza colesterolului poate fi impSrjM in mai multe etape: a) formarea hidroxil-metil-glutaril-CoA (HMG - CoA) din acetilCoA; b) transformarea HMG - CoA in Jzopren biologic ac£ivfci; c) condensarca a §ase unit2{i izoprenice cu formarea unei hidrocarburi C30, scualen; d) ciclizarea scualen ului §i formarea piimului compus steroidic, lanosterol; e) transformarea lanosterolului in colesterol. a) Hichmi-metil-glularil-CoA este metabolit intermediar §i al cetogenezei. Exist# dou# fonduri metabolice de HMG - CoA, unul mitocondrial care duce la corpi cetonici §i aitul citosolic din care se objin steroizi. Sinteza HMG - CoA are loc prin reac{iiie: CH3 — GO ~ S - CoA + CH3 — CO ~ S — CoA i CH3 — CO — CH2 — CO - S — CoA

HOGG ™ CHa G — CH2— CO - CoA CH3

HMG — CoA h) Transformarea HMG - CoA in mevalonat este on proces reductiv, dependent de NADPH §i este prima etap# specifics colpsterologenezei, este etapa reglatorie a procesului: ‘ ........................................^ OHV HOOC -r- Qbig HMG — CoA reductaz# c —‘CH2 — CO ~ SCoA r; CH3-

2 NADPH + 2 H* 2 NADP* + CoASH OH HOOC — CH, — C — CH2 — CH2OH i CH3 acid mevalonic 451 Reacjia este catalizatS de HMG-CoA reductazd, enzimft localizatd la nivelul reticulului endoplasmic. Este alCcHuild dintr-un lanf. poiipeptidie (887 aminoacizi) cu doufi domenii structurale, unul hidrofob, membranar gi altul care proemineazd in citosol. Activitatea ca tali tied este localizatd pe acesta din urm2. Activitatea enzimei este reglatd prin mai multe mecanisme. Cantitalea de protein# enzimaticd este controlat# atat la nivelul sintezei, a transcrierii genei, cat §i prin modificdri ale vitezei de degradare a enzimei. Timpul de injumUtilJire pentru HMG-CoA reductazd de 2-4 ore este mult mai scurt decat pentru alte enzime. Colesterolul ceiular este probabil factorul reglator principal, el acjioneazd ca represor al sintezei enzimei, pe de o parte §i accelereazd degradarea enzimei, pe de alia. Un alt mecanism reglator pentru HMG-CoA reductazd are la bazd conversia enzimei prin fosforilare - defosforilare. Activitate cataliticd mai ridicatiS manifestdnd fonna defosforilatd. Conversia enzimei este partial dependent# de concentrajia AMPC. Insulina, prin promovai'ea defosforildrii enzimei este principalul factor fiziologic care controleazd biosinteza colesterolutui. Hormonli tiroidieni au deasemenea, ac£iunc colesterologeneticd. Glucagonul la nivel hepatic, are acjiune negative asupra biosintezei colesterolului, foarte probabil prin conversia, AMPC - dependent#, a HMG-CoA reductazei. Glucocorticoizii, prin mecanisme incd neclare, diminueazd activitatea reductazei. Pornindu-se de la existenja unci corelajii intre nivelul colesterolemiei §i incidenja bolilor cardiovasculare au fost intreprinse numeroase cercetdri pentru a gdsi mijloace cdi de reducere a cantitdjii de coleslerol din organism, inclusiv diminuarea biosinlezei endogene. Astfel au fpst. i'dentificaji sau sintetizafi divert compu$i care inhibit sinteza colesterolului. Unul dintre acedia, lovastatin (mevinolin) s-a dovedit a fi un inhibitor competitiv puternic pentru HMG-CoA reductaza. Formula compiisului este: Lovastatinul este iipsit de toxicitate §i a fost .iritrodus in trata,mental hipercolestero- lemiilor.

COON CHz 452 Din mevalonaf prin Erei reacfii de fosforilare se obfine mevalonat-3-fosfo5-pirofosfa£; acesta din urmS prin decarboxiiare §i pierderea unui rest fosfat nagtere la Jzoprenul activu care exists in douft forme izomere, de dirnetil-alilpirofosfet §i de izopentenU-pirofosfat: OH I HOOC — CH2 — C — CH2 — CH? OH I . OH, mevaionat 3 ATP 3 ADR HOOC — CH2 — C — CH2 — CH2 — o — 0— © 0-® mevaionat-3-fosfO‘5-pirofosfat

CH2 = C — CH2 — CH? — O — ©— @ CH3 — C = CH—CH2 — O — 0— © izopentenil — PR ' dimetil-aiii - PP c) Prin condensare cap-coadS a douS unitSJi izoprenice se obfine un compus C10 (geranil-pirofosfat); acesta mai deparie cu o nouS moleculS de izopren activ formeazS an derivat Ci5 (farnezil-pirofosfat). DouS molecule CI5 prin condensare cap-cap formeazS o hidrocarburS C3a-scualen: CH3 CH3 CH3 — C = CH — CH2 — O — © — © + CH2 = C — CH3 — CHa — O — © — © © PP, CH3 OR ! I CH3 — C = CH — CH2 — CH2 — C = CH — CH2 — O — © — © gerantl — PP

453 C|H3 CH2 = —

C

—

CH2

C H g —

-O-©-®

PFi CH CH3

1 — C-CH — CH> — CH2

CHa 1

3 3

1

— C=CH — CH2 — CH, —

I CG H

~CHS—0 — ®~®

farnezil — PP NADPH + HP NADP* ChL 1 I 3— C - CH — CH2 — — C « CH — CH2 — 3

CH3

^ FARNEZIL— PP 2 PP-t CH3 |

3

C 1 H CH2—C = CH — g CH2 — — C CH2 — C ~ CH H2 — CH2 — 1 — CH3

CH3

1 1 0 = CH — CH2 I C « CH — CH2 CH3

scualen d) Sub aefiunea unui sistem enzimatic complex scualenul este transformat intr-un steroid C30, lanosterol:

Scualen Epoxidaza Ciclaza Hidroxllaza (NADPH, C2)

e) Transformarea lanosterol colesterol implied pierderea a trei grupSri CH3 (prin oxidai*e la - COOH §i apoi decarboxilare), hidrogenarea unei duble leg&turi §i migrarea alteia. Aceste reaejii pot avea loc in seevenfe variate, rezultand numero§i intennediaii in Fig. VITI.23 se arata una din aceste seevenje. 454

-co2

~2f£ mX ff “ Desmtf/-/Masters/(C^}

Fig. VIII. 23 - Transformarea lanosteroHcolesterol ViII.8.3. CATABOLISMUL COLESTEROLULUJ Nucleul steranic al colesterolului, ca §i al altor steroizi, nu poate fi degradat in organism, el este eliminat ca a tare. Caiea principal^ de excrejie a colesterolului este bila care cuprinde atat colesterol cat $i acizi biliari, cataboliji ai acestuia. O cale auxiliary de pierdere de colesterol este descuamarea pielii §i a epiteliului intestinal. Jinandu-se seama de importanja excrefiei biliare rezultd cd tranzitul colesterolului prin ficat este obligated u in vederea eliminSrii sale. Mai trebuie subliniat cS acizii biliari in afard de faptul cd sunt cataboliji ai colesterolului au $i roluri esenjiale la digestia §i absorbfia lipidelor din intestin. Bila cuprinde relativ mult colesterol, in cea mai mare parte neesterificat (aproximativ 1,5 g/i in bila hepaticS §i 6,5 g/1 in bila vezicuiarS). Colesterolul, hidrofob, este menjinut in solujie prin asociere cu substanfe amfipatice, lecitine §i s&ruri biliare. Solubilizarea 455 ■ l. if. .H :

;

coiesterolului necesiUl un raport bine determinat mire fosfolipide - colesterol - shruri biiiare, modified minore ale unuia din ire eomponenjii sistemului determine scoaterea coiesterolului din solujie. Colesterolul cristalizat in jurul unui nuclei! alc&tuit din proteine §i bilirubin^ formeazS calculi biliari care pot opri total sau parjial fluxul bilei (colelitiazd). Colesterolul biliar, cel din epiteliul intestinal descuamat §i colesterolul din alimente se amestecS in intestin §i o parte este absorbit impreunii cu alte lipide. Intrueat colesterolul biliar este prezent intr-o forms, micelarS el este absorbit preferential de cel exogen. Colesterolul neabsorbit este in final eliininat cu fecalele. Formeie de eiiminare sunt acelea de coprostanol §i coprostanonS, rezultate prin acjiunea florei bacteriene asupra coiesterolului:

Coprostanoi

Transformarea coiesterolului in acizi biliari este cea mai important# cale de catabolizare a coiesterolului (Fig. VIIL24). Acizii biliari se formeaz# in hepatocite, sunt secretaji in canalleuiele biiiare §i dup& tranzit prin vezica biliarfi sunt deversaji cu bila in duoden. Acizii sintetizaji in ficat sunt denumiji acizi biliari primari (acid colic §i acid chenodezoxicolic), Tot in ficat acizii biliari sunt conjugaji cu glicocol sau cu lamina rezultand acizii glicocoiic, taurocolic, glicochenodezoxicolic §i taurochenodezoxicolic. In bilit se afhl sub form# de sSruri (saruri biiiare). In intestin dupfi ce au parficipat la solubilizarea lipidelor aiimentare §i la absorbfia acestora, sunt supu§i unor tronsformSri catalizate de enzime ale florei bacteriene intestinale: tndepSrtarea grupei hidroxil din pozijia 7 §i hidroliza legSturii amidice. Se formeaz# in acest fel acizi biliari secundari: aciclul dezoxicolic (din acid colic) §i acidul litocolic (din acid chenodezoxicolic). In segmentul distal al ileonului acizii biliaii sunt resorbijl printr-un niecanism activ §i prin sistemul port ajung din nou in float. La nivelul ficatuiui acizii biliari sunt conjugaji §i impreuml cu alji acizi biliari primari sunt secretaji in bilii §i apoi eiiminaji in intestin realizandu-se astfel circuitul enterohepatic al aciziJor biliari. La fiecare tui# a circuitului enterohepatic o cantitate oarecare de acizi biliari scap& reabsorbjiei §i sunt eliminafi cu fecalele. Aceast# pierdere nets de acizi biliari constituie o cale de excrejie a coiesterolului. Se estimeazS eft o molecule individuals de acid biliar parcurge de ealevn ori circuitul ficatintestin-ficat-intestin inainte de a fi eliminate. Jinandu-se seama eft londul de acizi biliari al unui adult este de 5-6 g §i eft acedia circuit de 5-6 ori rezultft eft 20-30 g de acizi biliari parcurg zilnic circuitul enterohepatic. Pierderile de acizi biliari prin fecaie sunt apreciate la aproximativ 0,5 g/zi. 456 Co/esf&roZ | H/cZrox//a'n | J)&ffraa/arB ox/c/&£v& | a cafene/ /afero/e /fc/cZ co//c zic/'c/ cZ&rtOcfejrox/co/sc (ac/cZ Z/f/crr pr/mar) (ac/^ Z>///o/r pr/morj

Fig. VIII. 24 - Metaboiismuf acizilor biliari VIII.9, LIPIDELE PLASMATICE Trigliceridele din Jesutul adipos §i din celelalte fesuturi reprezintS cel mai important depozit de rezerve energetice ale organismului (aproximativ 135.000 kcal pentru an adult normal). Aceste depozite se formeazS din

grSsimile ingerate in exces sau sunt forma de stocare a surplusului de glucide exogene. Transports trigliceridelor alimentare §i a celor sintetizate endogen la locurile de depozitare §i apoi distribujia ior cftlre organele consumatoare presupune un flux plasmatic continuu de trigliceride §i de alte categorii de lipide. Trigliceridele hidrofobe se asociazii cu alte iipide §i cu proteine sub forms de lipoproteine. Pe iangS transports de trigliceride^ lipoproteineie piasmatice mai au §i alte roluri; - transports coiesterolul exogen §i cel sintelizat in ficat spre Jesuturile extrahepatice §i invers: vehiculeazS ai|i compu§i lipidici (vitamine liposolubile); -participft la pSstrarea compozifiei lipidice a membranelor; -regleazS procese metabolice celulare. 457

j. 1; a I

■i Lipoproteinele cuprind diverse componente proteice §i lipidice tn proporjii relativ constante, ceea ce denoLl existenja unor interacjiuni cu un Inalt grad de specificitate. Componentele proteice ale iipoproteinelor sunt denumite apolipoproteine (apo-A, apo-B, apo-C etc.). Lipoproteinele au o structure

comunti, lipidele nepolare, trigliceridele §i esterii coiesterolului, formeazS un miez hidrofob ImbrScat fntr-un strat de component polari, apolipoproteine, fosfolipide, colesterol. Lipoproteinele cuprind §i cantitSji rnici de glucide (sub form& de glicoproteine). Asocierea diverselor componente se face prin forfe necovalente §i in timpul metabolism ului intravascular al Iipoproteinelor au loc schimburi §i transferuri de lipide §i proteine intre diversele lipoproteine circulante sau intre acestea §i {esuturi, sub acfiunea unor proteine specifice sau ca procese de echilibru. Apolipoproteinele pe larig& funcfia de componente amfipatice a Iipoproteinelor mai indeplinesc §i funcjii specifice, ofer& situsuri de recunoagtere pentru receptorii de pe suprafaja celulelor sau funcfiorseaza ca activatori (sau inhibited) ai enzimelor care participti la metabolismul lor. VIII.9.1, ANAUZA LIPIDELOR PLASMATICE Lipidele plasmatice pot fi analizate prin dou& procedee: a) dozarea lipideior ca specii moleculare, prin reacfii specifice sau prin extracfie cu solvenji selectivi §i dozarea fiecSrei fracjiuni; lipemia totaled §i concenlra|iile diverselor categorii sunt prezentate in Tabelul VIII.4; b) separarea Iipoproteinelor ca entitaji morfofuncfionale §i cercetarea compozijiei lor proteice §i lipidice. Prin acest gen de anaiize s-a putut infelege dinamica lipideior plasmatice, geneza §\ modul lor de utilizare. Lipoproteinele plasmatice pot fi separate prin ultracentrifugare §i prin electroforezd. Tabelul V1JI.4 Concentrajia lipideior scrice (adult normal) (dupa: Ministei-ul SSnata|ii $i Academia de §tiin|e Medicate, Metode curente pentru anaiize de laborator clinic, ' Editura Medicala, 1982) Lipide mgldl Lipide totale 550 - 750 Trigliceride 30 - 140 Colesterol total 120 - 260 Fosfolipide 180 - 260 totale Acizi gragi liberi 12- 16 Ultracentrifugarea are la bazS diferenjele de densitate in sapor! cu confinutul lipopro- teinelor in lipide §i proteine. Trigliceridele pure au density de 0,95 g/cm3 o lipoprotein^ cu un conjinut egal de lipide §i proteine are o densitate de 1,065 g/cm3; proteinele pure au densitiiji mai mari de 1,28 g/cm3. In campuri gravitajionale puternice (de aproximativ 100.000 xg) lipoproteinele, dupli densitatea mediului dc suspensie se vor sedimenta (dacS au densitiiji mai maid decat ale mediului) sau vor flota, claai au densitati mai mici. Prin 458 Oi s ultracentrifugSri in medii cu densit&{i potrivite a'u fost objinutc din ser patru fracjiuni lipoproteice rnajore; - chilomicronii; - lipoproteineie cu densitate foarte mica (VLDL, de la very low density lipoproteins);

- lipoproteineie cu densitate mica (LDL, de la low density lipoproteins); - lipoproteineie cu densitate mare (HDL, de la high density lipoproteins). Lipoproteineie, in principal prin componentele ior proteice superficial©, poarta sarcini elec trice §i pot fi separate prin electroforeza. Separarea se efectueaza la pH alcalin (8,6) §i componentele sunt vizualizate cu ajutorul unor coloranji cu afinitate pentru lipide. Electroforeza lipoproteinelor se efectueazd pe geluri de agarozS, de poliacrilamida. Prin aceasta tehnica sunt separate patru fracjiuni (Fig. VIII.25):

sMmicrm J3-/fp0prohiffi pre - j8-//popr#fme oC~ //pffpm/me (+) Fig, VIII. 25 - Fracjiunile lipoproteice care pot fi separate la electroforeza pe un suport solid a unui ser uman chilomicronii care nu migreaza; . - pre-p-iipoproteinele; (J-l-ipoproteinele; a-lipoproteineie. ■ Aceste fracjiuni corespund: pre-p-lipoproteine - VLDL P - lipoproteine = LDL a - lipoproteine = HDL In Tabelul VIII.5 sunt prezentale uneie date privind lipoproteineie plasmatice. De notat ca serul objinut din s&nge normal recoltat dimineaja dupa 8-10 ore de nemancare (a jeun) nu cuprinde chilomicroni §i VLDL sunt prezenji in urme. Acizii gra§i liberi, asociaji cu serum albumina, nu constituie o fracjiune lipoproteicS propriu zisa. O importanja deosebita pentru injelegerea rolurilor §i a dinamicii concentrajiilor lipoproteinelor serice prezinta apolipoproteinele. In Tabelul VIIL6 sunt descrise principalele apolipoproteine, rolurile pe care le au, concentrajiile lor. 459 460 Lipoproteineie

Sf

Densit Diam ate etru (g/cm (nm) 3 )

400

0,96

Fractiunea lipoprotsica

Chilomicroni

4^oro

Lipoproteins cu 20 - 0.96densitate 400 1.009 foarte mica. VLDL, pre-plipoproteine Lipoproteine cu 01,006densitate mica, 20 1.063 LDL, pfipoproteine Lipoproteine cu 1,065densitate 1,125 mars, HDL, celipoproteine Acizi gra§i 1,28 liberi, AGL Tabelui VIIL5. piasmatice Prot Lipide % eins Tot Tri Coie Aci % ai gi Fos ster bc b fo- oi oi. ce iipi rid de e 98 86 0,51-2 3-8 1-3 1 99 94 89 55 512126-8 10 18 14 94 65 75 20 8355-10 12 40 80 25 50 453- 20143-5 50 6 30 18 55 99

1

-

-

-

-

Apolipoproteineie plasmatice

75 600

Greut atea molec ulara (dalto ni) 0,430x10 s

25-75 510x10 s

20-25 2,23,5x1 06

10-20 -

0,25x 10®

-

Acizi gra§i iiberi

1

Tabelul V11J.6 Apolipopr oieina Greutaie molecular ^ (dalloni) Apolipopr oieina A

Apolipopr oieina B

Apolipopr oieina C

Cone. in plasma mgld! (mediiJ llmile) 235(170325) 150(90210) 46(26-66) , 14

Apo A Apo A I 28000. Apo A II 17000 Apo A IH 46000 Apo B 97(60Apo B 48 155) 241000 Apo B100 513000

Apo C Apo C I 7000 Apo C II 10000 Apo c m 9000 Apo D 35000

ii 4-7

Funcfie

Constituent major al HDL Activator al LCAT

Constituent major al: CM LDL, VLDL Biosinteza §i secrejia lipoproteinelor Interactie cu receptor! celulari Constituent al CM, VLDL, HDL, LDL Activator al LCAT

Activator al lipoproteinlipazei Inhibitor al lipoproteinlipazei Apolipopr Transporter de oieina D colesterol esterificat 8 - 10 intre diverse lipoproteine Apolipopr Apo E 3-5 InteracJioneazS cu oieina E 36000 receptori din hepatocit VIII. 9.2. CHILOMICRONII Sunt lipoproteine cu un conjinut foarte mare de lipide (98-99%) §i pujine proleine (1-2%). Au dimensiuni man, refracts lumina §i confers plasmei un aspect lactescent. Au densMji mai mici decat ale serului (1,006) §i prin pSstrarea serului la rece chilomicronii se ridicd la suprafaja sub forma unui strat cremos. Chilomicronii sunt sintetizaji in celulele mucoasei intestinale §i incorporcazft lipidele alimentare absorbite. Sunt secretafi in vasele limfatice care dreneazS intestinal §i la nivelul canalului toracic tree in plasmS. Imediat dupS secrete particulele au o compozifie diferitS de acelea circulante, de aceea se face distinejia intre particulele primate, chilomicronii nSscanzi §i cele secundare, chilomicronii propriu-zi§i. Particulele nSscande cuprind apoB48, apoA. ComplementuI de apolipropro- teine C §i E il dobandesc in plasmS prin transferul acestor proteine de la HDL. Chilomicronii sunt prezenji in plasmft dup& ingerare de alimente bogate in 3-8 8 - 15

grdsimi. In Fig. VIII.26 se arata intensitatea rSspunsului lipemic (cre§terea trigliceridemiei dupft ingestia de gr&simi) §i durata acestui r&spims la subieejii normali. Dup& 6-7 ore de la ingestia de grSsimi chilomicronii dispar din sange, plasma se clarified. 461

Timp (ore) Fig. VIII. 26 - Modificarea lipemiei totale dupa ingestia de grasimi (raspuns lipemic) Catabolismul chilomicronilor are loc in doua etape, In prima etap3 trigliceridele components'sunt hidrolizate sub ac|iunea lipoproteinlipazei. Aceas# enzima (sau grup de enzime) acfioneazd specific asupra leg&turilor l §i 3 din acilgiiceroli formandu-se 2-monoacilgliceroI, compus hidrolizat mai departe la glicerol §i acizi-gra§i> Tesuturile cele mai bogate in lipoproteinlipazti sunt fesutul adipos, mugchii scheletici, miocardulv glanda mamard, pulmon. Aceste Sesuturi utilizeazlTacizi gi*a§i pentru oxidare (mujchi), 'depozitare (Jesut adipos) sau secrefie de gr&simi (gianda mamarS).'Enzimaseafl'3pesuprafajaluminal3acndbfeliului vascular fiindaiicoratSprin glicozaminoglicani. Heparina elibereazS enzima in plasmS. Lipoproteinlipaza esl:e activate dc apolipoprpleina C II, component al chilomicronilor. Lipoproteinlipazele din diverse {esuturi au propriety cinetice diferite. Enzima din inimS are afinitafe mai mare pentru substrat (K^ mic) dec|U enzima din fesutul adipos. COnd nivclul chiloinicionilor esie sc2zut, miocardul cxtrage cu vilezu mai mare trigliceridc plasmatice decat {esutul adipos. Lipoproteinlipaza din {esutul adipos adnge viteza maxima dup& ee enzima miocatdicl este deja saturate In plus, activitatea' lipoproteinlipazei in jesulnl adipos cste rcglatft dc factor! muirifioriali §i hotmondli. Activitatea enzimei cre§te dup3 ingestia de gr3simi §i/sau glucide. Aceste efecte sunt probabil mediate de insulins. Activitatea lipoproteinlipazei din gldnda mamarit este dependents' de stimularea piin proIaetiflS, are activate' ridicaS numai in perioadele de laetafie. Pe rnftsurft ce hidtoliza triglieeridelbr avanseazd, coinponentii superficial devin supmnumerariLOolesterolul liber, fosfdlipidele, apolipoproteinelc C sunt nansferate pe HDL. Treptaf ehilomicronii devin ^resturi chilomicfonice^ A doua etap3 a catabolismului chilomicronilor constS in captarea .-resturilor de c&tre ficat, captare facilitate de apoiipoproteina E. Componenfii resturilor chilomicronice sunt hidrolizafi §i utdizaji, in mod specific.; Pe aceastS cale ajunge la ficat o parte din colesterolul exogeiv ; cel

intestinal. Colesterolul eliberat din; •resturile. chilomicronice; inhib& HMGCoA reductaza, regland sinteza colesterolului in hepatocit. 462 Metabolismu! chilomicronilor este perturbat ia subiecjii cu deficite inSscute de lipoprotein lipazS, de apo B. Boala familialS, hiperchilomicronemie (hiperiipoproteinemie de tip I) este determinate de deficient in iipoproleinlipazS. Concentrajia chilomicronilor, a trigliceridelor prezintS cregteri marcate p persistente. Au loc depuneri de trigliceride in (esuturi (xantoame). Incidenfa aterosclerozei la acegti bolnavi este joasS. Anomalia sintezei apolipoproteinei B-4B la nivel intestinal are drept urmare imposibiiitatea formSrii chilomicronilor p transportul lipidelor exogene. Se acumuleazS trigliceride in celulele intestinale p consecutiv este perturbatS. absorbfia altor lipide
eliherat in plasmS, iar acizii grap sunt captaji in jesuluri. Pmgrcsiv cu scSdcrca trigliceridelor arc loc p picrdcrca de apo-C II care trcce pe HDL. In acclap (imp particuiele se imbogSjcsc in 463

,,

colesterol, furnizat dc catre HDL. Apoliproproteina D components a HDL funcJioneaz& ca o acil-colesterolestei'-a'ansfemzfi §i coleslerolul esterificat este transferal din HDL pe VLDL. Imbogftfirea VLDL in colesterol mai poate avea loc cu participates lecitin —co- lesterolacil transferazel (LCAT) enzimfl plasmatic! Apolipoproteina C I, component al VLDL, activeazfi aceastft enzimS. LCAT catalizeazit reacjia: Lecitin a + colesterol ---------^ 2 - iizoiecitina + acilcoiesterol. Lizolecitina mai hidrofiM este elibera® in plasma, iar acilcolesterolul

apolar migreazS In miezui particulei. Locurile superficial eiiberate vor fi ocupate cu colesterol furnizat de HDL. Nu se cunoa§te mc;l ponderea relative a celor doua cfii de imbogSJire a VLDL in colesterol Paraiei cu hidroiiza trigliceridelor, imbogHjirea in colesterol, apolipoproteinle C tree la HDL. Apolipoproteina B este ins& pSstrat! fiind regAsitii integral in particulele IDL (intermediate density lipoproteins) §i apoi in LDL care rezultfl din VLDL. In cursul acestor transformftri diametrul particulelor scade de la 25-75 nm la 20-25 nm, greutatea molecularii reducandu-se aproximativ la jumatate. VTII9.4. LIPQPROTEINELE CU DENS IT ATE MICA (LDL, P-lipoproteine) Sunt panicule lipoproteice cu densitftfi cuprinse intre 1,006 §i 1,063 §i diametre de 20- 25 nm, Au un confinut lipidic de 75-80%, componenta majoritarS fiind colesterol, 35- 40% colesterol esterificat, 5-10% colesterol liber, 20-25% foslblipide §i numai 8-12% trigliceride. Apolipoproteina majoritarS este apo B-100. LDL se formeazii in plasmS din VLDL dupa indep&rtarea trigliceridelor VLDL sub aejiunea lipoproteinlipazei §i imbog&Jire in colesterol LDL sunt prezente in sangele recoltat dimineaja duptl un post de 8-10 ore §i cuprinde aproximativ 70% din coleslerolul total plasmatic (Tabeiul VIII.7). ConcentrapHe colesterolului total LDL - colesterol si HDL-colesterol in ser Tabeiul VII1.7 Colesterol mgidl nmoli/l ■■ 220 Colesterol total 260 ' .. 5,7. - 6,7 LDL - colesterol 150 - 190 3,9 - 4,9 HDL-colesterol (barbaji) ■ 35 -.55 0,9 - 1,4 HDL-coleslero! 45 - 65. 1,2 -1,7 (femei) LDL au rolul de a furniza colesterol diverselor jesuturi. Mecanismul de transfer al colesterolului din LDL in Jesuturi a fost descris de Goldstein §i Brown (1976). Calea LDL descris^ de Goldstein §i Brown constituie totodatS §i un mecanism de reglare a capfMx, depozitiirii §i sintezei.de colesterol in Jesuturi, de preveniie a acumuiarilor sale in celule. 464 Calea LDL cuprinde mai multe etape: a) LDL plasmatice prin infermediul apo B-100 $i apo E interac|ioneaz2 cu receptori specifici de pe suprafafa celuleior. Receptoml LDL este o glieoproteinfi cu 839 aminoacizi. £ste organ izat In cinci domenii stnictu- rale, trei extracelulare, unul membranar §i unul citoplasmatic (Pig. VI1L27L Domeniul C-tenninal, citosolic, participfi la endocitoza receptorilor. ocupafi cu LDL, Domeniul membranar cuprinde 22 amino- acizi in majoritate hidrofobi. Domeniul N-terminai cuprinde situsul de recunoa§tere a apo B-100 §i apo E §i de legare a LDL. UrmStorul dorneniu cuprin- zand aproximativ 400 aminoacizi se remarcd prin omologia sa structural^ cu precursorul EGF (fac- torui de creglere a epidermei). Nu se cunoa§te ce funcfie are aces-t. dorneniu in receptoml LDL. Cel de al treilea dorneniu extracelular, cu 58 amino- aeizf este intens glicozilat. Muirulrul.de

receptori pe un anumii tip de celull este variable este regiat printr-un mecanisrn feedback de concentrajia LDL. ■in spajiul extracelular, b) Lipoproteinele fixate pe receptor! sunt translocate in interiorul celulei dupS care parti- cuiele lipoproteice fuzioneazd cu lizozomii (endo- eiioza). c) In lizozomi componentele LDL, proteine, fosfolipide, acilcolesterol, trigliceride sunt hidroli- zate de enzimele iizozomale. Coleslerolui liber este ufiiizai. in pane pentru nevoiie proprii ale eeiulei (peniru constmcpa membranelor, sintezlt de hor- moni steroidici, de acizi biliari) iar ceea ce prise- se$te este esterificat §i depozitat in celuiS. Aceastil reaejie este catalizaLl de o acil-CoA ;—=**- coles- 'teroi acii transferazft (ACAT) rezultand esteri ai colesterolului cu divert acizi celulari, in principal acid palmitic, acid palmitoleic, acid oleic. De notat al esteri! colesterolului din lipoproteinele plasma- tiee cupfind in majoritate rest linoleil Coleslerolui liber furnizat celulelor' de LDL exercita o aejiune represiva asupra s'intezei de novo.a colesterolului, prin inhibijia HMG-CoA reductazei §i sinteza colesterolului in fesuiurile extrahepatice este menjinutd la un nivel salzut. Calea LDL pe lfingfl regiarea cantitdjii de coles- terol intracelular intervine $i in regiarea nivelului plasmatic al LDL. Numarul.de receptori pentru LDL variazS cu cantitatea de pariicule lipoproteice la care sunt expose celulele, exists o relafie inversft nitre concentra{ia LDL §i num&rul de receptori. In acest fel se. previne acumularea colesterolului in celule §i pe de altri parte, face posibikl acqperirea nevoilor celulare in coiesterol la niveluri scSzute de lipoproteine extracelulare. In mod

■Fig. Vli!. 27 - Receptoru! LDL 465 normal. In stare slafionarft, numdrul de receptori este mijlociu §i cantit^|ile de colesterol objinute din LDL impiedica supraacumularea colesterolului. ScMerea concentrate! LDL determine cre§terea numarului de receptori membranari $i intensificareaA capt&rii LDL. Cre$terea concenlra{iei LDL determine modificSri inverse ceior de mai sus. In primul rand, receptori! ceiulari existenji se satureazft cu LDL furnizand celuiei mult colesterol Pe lang& inhibijia sintezei de novo a colesterolului are loc §i o senders a numarului de receptori LDL, celula revine la o stare stajionara. Afinitatea receptorilor membranari pentru LDL este foarte mare, se evalueaz£ c£ ei func{ioneazit maximal la o concentra|ie a colesterolului LDL de 25 mg/dl. La om valoarea normals a colesterolului - LDL este de 120 mg/dl, valoare mult superioara aceleia care ar asigura funejionarea optimal a receptorilor LDL. Acest fapt explica incidenja crescuta a alerosclerozei la om. intr-adevar, speciile care nu fac in mod normal ateroscleroza au valori LDL §i colesterol - LDL apropiate de cele ideale. Unele tipuri celulare poseda mecanisme alternative de ingiobare a LDL, mecanisme independente de receptori! clasici LDL. Macrofagele Incorporeaza LDL care prezinta ale componentelor proteice sau lipidice. Receptori! care

recunosc astfel de LDL modificate sunt cunoscufi ca ‘‘scavenger receptors" sau receptori pentru acetil-LDL. Modificariie biochimice ale LDL au loc in vivo, intravascular §i pot consta in acetiiari, glicoziiari ale apolipoproteinelor (apo B-100, apo E) §i/sau alterari oxidative ale componentelor lipidice nesataate. Captarea LDL modificate de ciStre macrofage constituie unul din procesele cele mai timpurii care due la acumularea de lipide in perejii arterelor §i formarea pllcilor atermomatoase. Hepatocitele posethl o class distinctS de receptori pentru LDL (care prezinta specificitate pentru apo E) avand astfel capacitatea de a internaliza aceste particule lipoproteice. Nu s-a stabilit incS ce pondere are ficatul in catabolismul final al LDL. JinSndu-se seama de rolul LDL, fumizor de colesterol pentru fesuturile extrahepatice, coneentrafiile colesterolului-LDL apolipoproteinei B 100 au valoare predict! vS mult mai buna dec2t coiesterolemia totalR ca factor! de rise In ateroscleroza. Cre§terile concentrajiilor acesior parametri se coreleazS cu riscu1 de a face ateroscleroza. VIIL9.5. LIPOPROTEINELE CU DENS IT ATE MARE 'v (HDL, a-lipoproteine) Aceastd fraefiune Iipoproteica este alcStuilS dintr-o populate foarte heterogena de particule, cu densitaji cuprinse intre 1,065 §i 1,125. Au un conjinut lipidic de 50-55%, predominand fosfoiipidele 20-30%, colesterolul 17-23% §i pujine trigliceride 3-6%. Component proteica majoritara este apo-A (apo-A I, apo-A II) dar cuprind cantitft|i rnici §i din alte apolipoproteine (C, D, E). Nu cuprind insa apo-B. HDL sunt sintetizate §i secretate de hepatocite sub forma unor particule nascande cu o compozijie foarte simpia. HDL nascande au o forma discoidald, sunt alcatuite dintr-un strat dublu lipidic format din fosfolipide, colesterol liber §i apolipoproteine In principal, apo-A §i apo-E. Prin schimburi Intre celelalte iipoproteine plasmatice §i celule particulele nascande se transforma in HDL mature. In aceste transformari un rol deosebit II are LCAT plasmatic!! (lecitincolesterol acil transferazS) activate de apo-A II component al HDL nascande. Sub aejiunea acestei enzime colesterolul este esterificat la acil-coiesterol: lecitina + colesterol ----------lizoiecitina + linoleil - colesterol. Colesterolul esterificat migreaza in interiorul particulei constituind un miez hidrofob. Locurile ramase vacanie in stratul superficial al HDL sunt ocupate de colesterol preluat 466 din |esuturi §i din alte lipoproteine plasmatice (chilomicroni). Conpnutul In colesteroi al HDL cregte panS la nivelul particulelor mature. HDL sunt lipoproteir^e prezente In sangele recoltat de la un subiect nonnal (dupd 8 - 10 cm de post) Jildturi de LDL HDL cuprind aproximativ 30% din colesterolul total din plasmS. Colesteiolul- HDL este mai mare la femei (45-65 mg/dl) decat la bSrbap (35-55 mg/dl) (Tabelul V1II.7). HDL sunt catabolizaji in final la nivelul ficatului. Prin intennediul apo-E particulele interacjioneazii cu receptori de pe suprafa|a hepatocitelor, sunt intemalizap §i componentele degradate.

HDL joadi un roi important in metabolismul colesteroluluu participS la transportul acestuia din Jesuturile extrahepatice in ficat, sediul catabolismului colesterolului (transformare in acizi biliari gi excrepe prin bilft). Concentrapile colesterolului - HDL §i apoiipoproteinei-A sunt considerap factori de rise pozitiv in aterosclerozl Subiecpi care prezintit nivelele ridicate ale acestor parametri sunt protejap, au un rise scSzuf de a face aterosclerczk VIII.9.6. ACIZI. GRA§I LIBER! (AGL, acizi gragi-neesterificap, NEFA ~ non esterified laity acids, FFA = free fatty acids) Aceastd fraepune lipidicft este constiluitft din acizii gragi prezenp in plasmii ca atare gi nu drept constituenp ai alter iipide. Acizii gragi sunt greu solubiii In ap$, §i in plasmS sunt legap de serumalbumin&. 0 moiecuD de serumalbuminfi poate lega 7 molecule de acid gras in situsuri spedfice. Capacitatea serumalbuminei de a lega acizi gragi, in mod normal, nu este saturate. Concentrapa acizilor gragi in plasmft este midi dar supusS unor fluctuapi importante In raport cu factori nutriponali gi hormonali. In perioada postabsorbtivft au concentrapi de aproximativ 0,5 nmoli/1, In foame cresc inoderat (0,7-0,9 nmoli/I). In diabetul netralat, in inanipe ating nivelele de pans la 2 nmoli/I. Acizii gragi liberi din plasma provin in majoritate din jesutul adipos, cantitatea de acizi gragi exportatS de Jesutul adipos depinzSnd de balanja dintre IipolizS gi iipogenezil AGL sunt captap de etttre diverse {esuturi gi utiiizap energogen. Cu exceppa creierului gi hematiilor toate ceielalte fesuturi extrag acizi gragi din plasma. Cand nivelul plasmatic al AGL este ridical, capacitatea de ulilizare de efitre jesutu.rile extrahepatice este depagihl. In aceste condipi ficatul capLeaz# o proporpe mare din AGL pe care ii converted in trigiiceride, pe care le exports ca VLDL gi In corpi cetonici. VIII.9.7. DISLIPIDEMIILE i |; .

Plasma vehiculeazd cantitdp importante de Iipide care sufera oscilapi ample in raport cu divergi factori nutriponali, metabolic! sau hormonali, prin modificarea vitezei influxului sau efluxului lor plasmatic. Studii epidemiologice intreprinse In ultimele decenii au stabilit o corelape stransd intre modificMle lipidelor sanguine gi incidenja bolilor cardiovasculare, a aterosclerozei.

467 Modificarea concenlrajiei lipideior totale plasmatice, a uneia dintre fracfiuni sau ailerarea raporlului dintre diversele componente este denumial dislipidemie. Dadi jinem seama ch Iipidele sunt incorporate in lipoproleine rezuM c& orice dislipidemie este o dislipoproteinemia. Dislipoproteinemiile sunt hiper- §i hipolipoproteinemii, ultimate fund mult mai rar intalnite decat primele. Hiperlipoproteinemiile eonstau in cregterea concentrajiei fracjiunilor normaie LDL (P-lipoproteine) gi HDL (a-lipoproteine) sau aparijia gi persistenjain ser a chilomicronilor gi/sau a VLDL (pre-(Jlipoproteine), lipoproteine care sunt, practic ahsente Intr-un ser recoUat dimineafa dup& o noaple de posh Dtslipidemiile eredilare, familiale, sunt datorate alterhrii genelor care controieazh sinteza, transportul sau utilizarea lipoproteinelor. In alte cazuri alterarea tabloului lipidic sanguin este secundanl altor maladii. Hiperlipoproteinemiile primare, familiale, au fost clasificate dupa Fredrickson in cinci tipuri, I~V, tipul II manifestandu-se in doiul variante II a gi II b. In. Tabelul VIII.8 §i Fig. VIII.28 sunt date caracteristicile hiperlipoproteinemiilor primare in formele lor tipice. In practice tabloul lipidic sanguin, manifestSrile clinice, pot fi mult mai heterogene. In funcfie de exprimarea genei defects, de momenta! evoiufiei bolii. Tabelul VIU.H Hiperifpoprotoinemiilc familiale Varsta la Ti care se Aspecte pu Mamfeslari clinice manifest biochimice l o. I Conilarie I li pcrclii lomi Xantoame eruptive, crone? m e lipemia retinalis. Hipertrigliceriden hepato- splenomegalie, ie dureri. ahdominale

II a

La orice varsla

lib

La orice varslit

III

Adult

IV

Adrift

Hipercolesteioilc mie LDL erescute Hipercol esterolen lie LDL §i VLDL crescute Hipeitiigliceridem ie Hipercolesterolen ie VLDL cu con|inu! ridicat in colesterol §i mobilitate anormaia. Hiperlrigliceri demie Hipercolesterdeir ue

Xantomatoza, boala vasculara atnriosclero ti.cS premature Obezitale, lipsesc xantoamele, boalS vasculara ateriosderotica pnematurS Xantoame einptive, boala vasculara aieriosclerotica accelerate

Obezitale, boala VLDL crescute vasculara aterioscleroHipeitrigliceridern tica prematura., ie hepatosplenomegalie, hiperuricemie V Adolesce C h i J 01 ni cro n nt e mie VLDL Xantoame eruptive, crescute Hpemia retinalis, boala Hipertrigliceride vasculara mie arteriosclerotica premaHipercolesterole tura mie Hiperlipoproteinemia de tip I (hiperchilomicronemie, hipertrigliceridemie exogen;! majont). Caracieristic pentru aceas$ dislipidemie este prezenja chilomicronilor in cantitate mare. RSspunsul lipemic (cregterea posiprandialh a iipidemiei) la acegh .bolnavi este foarte intens gi persistent. Send are un aspect. Idptos gi prin phstrare la rece separS un strat cremos de trigliceride. Lipidograma cuprinde o bandii intensS in regiunea chilomicronilor. Trigliceridemia este crescuth, colesterolul prezintil cregleri mai moderate. Defectul biochimic al acestei dislipidemii cons'll Intr-o deficient a lipoproteinlipazei, enzimh implicate in delipidarea chilomicronilor gi epurarea lor plasmatich. Boala se manifests clinic din primele luni de via$ prin dureri abdominale, hepatosplenoinegalie. Au loc depuneri de grBsimi in Jesuturi (xantoame). Incident aterosclerozei este sc&zut3. 468 CMm/c/wi . e£

prs J?

,Ei« ;ji,V 0 ML 1 ( il I

Fig. VIII. 28 - Modificarile lipidogramei Tn diverse dislipoproteinemii 469 Hiperlipoproteinemia de tip II (hiperhetalipoproteinemie) Este datorald unei deficienje (cantitative §i calitative) a receptorilor membranari pentru LDL ceea ce duce la cre§terea concentrajiei LDL (Plipoproteine) §i a colesterolului vehiculat de LDL. Totodatd, diminuarea influxului de LDL in celule are ca rezultat §i amplificarea sintezei endogene de colesterol, nu se mai manifesto acjiunea represivd a colesterolului exogen asupra HMG-CoA reductazei. in stare homozigotd boala are un debut precoce, cu depuneri de lipide in {esuturi (xantomatozd). Riscul pentru aterosclerozd este foarte ridicat. In forma Il-a, forma purd a bolii, modificarea lipidicd major*! este hipercolesterolemia, cre§te coIesterolul-LDL. in forma Il-b se adaugd §i o cregtere a VLDL, cu hipertrigliceridemie. Uneori forma Il-a §i Il-b pot fi intdlnite la acela§i bolnav, hipertrigliceridemia fiind intermitentd. Hiperlipoproteinemia de tip III (hiperlipoproteinemie familiald mixtd, hiperlipopro- teinemie cu bandd p ldrgitd). Tabloul lipidic sanguin este modificat m sensul unei cre§teri, in general moderate, a colesterolului §i trigliceridelor. Lipidograma cuprinde o bandd P largd, care acoperd §i zona pre-p. Aceasta s-ar datora formdrii unei lipoproteine anormale cu proprietdji comune LDL §i VLD1 (P-VLDL). Defectul biochimic al bolii este deficitul de apo-E sau sinteza unei proteine nefuncfionale. Boala se manifest*! clinic la vSrsta adultd cu leziuni ateromatoase §i rise crescut pentru accidente vasculare cerebrale §i coronariene. Hiperlipoproteinemia de tip IV (hipertrigliceridemie major*! endogend, hiperprebeta- lipoproteinemie). Boala se datoreazd unui dezechilibru intre fluxul plasmatic de VLDL care transport*! trigliceridele sintetizate endogen (din acizi gra§i objinufi prin sinteza de novo din glucozd) §i capacitatea redusd de epurare plasmaticd a VLDL. Nu se cunoa§te unde este situat defectul metabolic. Tabloul lipidic este modificat in sensul cre§terii concentrapei VLDL §i a trigliceridelor; colesterolul este normal sau moderat crescut. Manifestdrile ciinice devin evidente la adult, fiind adesea asociate cu diabet, obezitate. Modificdrile Iipidice caracteristice hiperlipoproteinemiei de lip IV sunt comune cu acelea induse de toxice, alcoolism, consum exagerat de glucide. Hiperlipoproteinemia de tip V (hipertrigliceridemie majord endogend §i exogend, hiperprebetalipoproteinemie cu hiperchilomicronemie). In aceastd hiperlipoproteinemie trigliceridemia este crescutd atat pe seama chilomicronilor (care Iransportd grdsimile exogene) cat §i pe seama VLDL (care transportd trigliceridele endogene). Lipidemia create dupd mese bogate in lipide §i/sau glucide. Manifestdrile ciinice apar la vdrsta adultd, dureri andominale, xantoame eruptive,

. hepatosplenomegalie. Rise crescut pentru boli vasculare aterosclerotice. Hipolipoproteinermile familiale Deficitul congenital de a-lipoproteine (deficit familial de HDL, boala Tangier). Boala este determinatd de un deficit al sintezei de apo-A, component proteic ai HDL. Concentrajia plasmaticd a HDL este redusd, ca §i colesterolul :HDL §i fosfolipidele. In numeroase celule, macrofage, celule musculare netede, celule Schwann se acumuleazd colesterol. Boala se manifestd precoce, cu spienomegalie, anomalii neurologice, hipertrofie amigdaliand. Abetalipoproteinemia familiald. Este determinatd de o sintezd defectuoasd (cantitativ sau calitaiiv) a apo-B §i apo-C, apolipoproteine din chilomicroni §i VLDL. Tabloul lipidic sanguin este modificat in sensul uhei hipolipidemii totale, sunt reduse trigliceridele, colesterolul, fosfolipidele. Sunt absents Iipoproteinele cu densitate <13363 (LDL, VLDL, chilomicroni). Deficitul enzimatic la nivel intestinal are ca rezultat imposibilitatea formftrii chilomicronilor, a absorbjiei intestinale a trigliceridelor §i a altor lipids exogene (maiabsorbfie lipidic&). Tabloul clinic pe langft manifestSrile digestive mai cuprinde tulbur&ri neurologice, oftalnooiogice, hematologice determinate in cele din urm& de deficienja organismului In lipide. AceastS clasft este alc&tuM din substanje de natura lipidicS, derivate din acizi gra$i nesaturaji, cu un spectru larg de efecte biologice, hormoni paracrini. Toate Jesuturile mamiferelor sintetizeazd prostaglandine ca r&spuns la divert stimuli, natura §i concentra- fiile locale ale diverselor prostaglandine sunt implicate In fiziopatologia multor procese fundamentale ca vasomotriciiatea, inflamafia, tromboza, secrejia gastric&, reproducerea, funcfia renald, transmisia nervoasS. Termenul de prostaglandine a fost introdus in 1935 de von Euler pentru a descrie un material lipidic extras din lichidul seminal §i care exercitS acjiune contractiia asupra miometrului. Interesul pentru prostaglandine s-a amplificat vertiginos IncepSnd din jurul anului 1960 odata cu perfecfionarea tehnologiilor de cercetare a lipidelor. S-a stabilit multiplicitatea prostaglandinelor propriu-zise, natura lor chimica,* diversitatea acfiunilor fiziologice §i farmacologice, au fost descoperite noi clase de compujh Toate aceste lipide active cuprind 20 atomi de carbon,* ele deriva de la acizi gra§i §i au fost denumite „eicosanoizi“ (de la alcanul C^H^, eicosan). Grupul eicosanoizilor cuprinde: - prostaglandinele „primare“ sau „clasice“ (PG); - endoperoxizii prostagiandinici (PGG2, PGH^; - prostaciclina (PGI2); - tromboxanii (TX); - leucotrienele (LT). Prostaglandinele sunt, formal, derivafi a unui acid gras C20, ipotetic, acid prostanoic: VIIIJO. EICOSANOIZII (prostaglandine, tromboxani, leucotriene) Stmctura chimicS 10 H2C

471 Diversele PG se deosehesc prin natura substituenjilor din nucleul pentanic (§i unde este eazui prin izomeria geometric^ a/jJ) §i alc&tuiesc senile PGAPGL Catenele lateraie se pot diferenfia prin numftrui dubldor legfliuri, care este desemnat printr-un indice inferior PGj» PG2, PC3. La om ceie mai abundente PG sunt acdea din subseria 2 derivate din acidul arahidonic (acid A5,8,11’14 - eisosatetraenoic). Acidul A8,11,14 ~ eicosatrienoic (acid dihorn'o-yHnolenic) dS na§tere la subseria PGp de ia un acid eicosapentaenoic derivS subseria PG3. Dintre prostagiandinele primare, ia orn-cele mai imporfante sunt PGE2 §i PGF2a cu structurile: '■

PGE2

Prostaciciina (PGI) are structural

COOH HO^ Tromboxanii cuprind un heterocidu piranic (cu oxigen). TXA2, foarte instabil, trece u§or (enzimatic sau neenzimatic) In TXB2, prin hidroiiza punjii interne eterice:

472 Leucofrienele (LTA, LTB. LTC, LTD, LTE) sunt aeizi gra§i C20 ce cuprind trei legaturi dtible conjugate, Compusul cel mai activ este LTA4:

VII. 10.1. BIOSINTEZA EiCOSANOiZILOR Sinteza cie eicosanoizi are loc la rrivelul tuturor jesuturilor, fiecare tip de celuLI este aptil s& sintetizcze una sau mai multe substanje din aceasti clasA Eicosanoizii, spre deosebire de alfi mediatori ehimici. (hormoni, neurotransmitdtoriX nu sunt depoziiafi in celuie, ca atare sau sub forma de precursor!, dup3 sintezft sunt eliberafi §i acjioneazft imediat. Sinteza de prostaglandine este deciangatft de o diversitate foarte mare de stimuli (umorali, electric!. mecanici etc.) ce ajung la nivelul membranelor celulare. Prima etapS a cascadei.de reacjii care duce la sinteza §i eliberarea de eicosanoizi este- O' modificare a ,,st&rii fosfolipidelor membranare" §i/sau activarea fosfolipazei A2 care atacS hidrolitic iegjltura esteriefi. din pozifia 2 a glicerofosfolipidelor (fosfatidilcoline, fosfatidilinozitoii) eliberftnd un acid gras, de regulft acid arahidonic, De la acidul arahidonic pornesc dou& cfti biosintetice, dupS cum asupra lui. aclioneazS ciclooxigeneza (PG sintazft) sau lipoxigenaza (Fig. VIIL29 §i VIIL30). Cantitatea, seria ji subseria de PG sintetizate de diverse celule depinde de: - natura substratului disponibil (acid eicosatrienoic, tetraenoic sau pentaenoic); - echipamenlul enzimatic celular, de baianfa dintre ciclooxigenazU §i lipoxigenazd, de prezenfa alter enzhne specifice unora dintre ramificafii; - prezenfa de inhibitori. specific! ai uneia dintre efti; - natura stimulului, traumft, ischemie, catecolamine etc. Ciclooxigenaza (sau prostaglandin sintaza) este o hemoproteinS cu activitate dublS, dioxigenazidt (incorporeazS molecula 02 in substrat) §i peroxidazieft (descompune peroxidul). Sub acfiunea acestei enzime se obfin endoperoxizi eiclici, PGG2 §i PGH2, compu§i labili (t i 5 minute) din care rezuM PG clasice, prostacielina §i tromboxanii (Fig. VIII.29). Ace§ti endoperoxizi au §i ei activity biologice, sunt substanfe vasoactive foarte puternice. 473

Sfimv/i

Fig. VUI- 29 - Biosinteza prostagiandineior: prostaeiciin&, PGE2f PGF2(X, tromboxans 474 cm.

a-OH com s-f/ocro

0//C/00 IW¥ //z> Fig. VIII. 30 - Biosinteza leucotrienelor De la endoperoxizi pomesc trei c&i de sintezft care due la PG clasice (PGE2 §i PGF^), la prostaciclin& (sub aejiunea prostaciclin sintazei) §i la tromboxani (tromboxan sintazd). Profilul enzimatic specific fiec&rui |esut va determina predominenja uneia sau alteia dintre aceste c&i. Tromboxan sintaza este mai abundent&in creier, inim&, fibrobla§ti de pulmon, splinS* leucocite, plachete. Endoteliul vascular, inima §i multe alte Jesuturi sintetizeazS 475 prostaciclina. Prostaglandinele ciasice sunt, de asemenea, sintetizateinfr-o multitudine de fesuturi, ca pulmon, creier, stomac, rnugchi, Lipoxigenaza acfioneazS prin iniroducerea unei grapari peroxi in acidul arahidonic rezultSnd 5-hidroperoxi-eicosatetraenoat (5-HPETE) compus instabii care trece ugor In 5-hidroxi-eicosatetraenoat (Fig. VIII.30). De la 5-IIETE se obfin ieucolrienele (cuprind trei legSturi duble conjugate cu configurafie cis). Compusul cel mai acliv este LTA4, De la LTA4 rezultS LTB4 (prin desfacerea punfii eterice §i alte remanieri) sau LIC4 prin fixarea glutationului (sub acjiunea glutation-S-transferazei). Cascada de sintezS a eicosanoizilor (cascada arahidonatului) poate fi intreruptft la diverse niveluri prin acjiunea unor inhibitori. Unii dintre acegtia sunt compugi naturali endogeni, dar sunt descrise numeroase subsianfe de sintez& care intrerup cascada arahidonatului, multe dintre ele agenji medicamentogi. Corticosreroizii inhibit fosfolipaza A2 §i eliberarea substratului, intrerupand cascada de reacjii in etapa inifiaLI Mecanismul de acjiune a corticosteroizilor implied induefia sintezei de proteine. Plachetele sanguine care nu au echipamentul de sintezd proteied nu vor fi influenjate de corticosteroizi. Medicamentele antiinflamatoare nesteroidice, dintre care cel mai reprezentativ este aspirina, acid acetil-salicilic, inhiba ciclooxigenaza prin

aeetilarea ireversibild a proteinei. Plachetele sunt mai sensibile la aspirind lntrucat nu au capacitatea de a rdnoi moleculeje de enzimd modificate gi ciclooxigenaza rSmane inactivS pe toat& durata existenjei lor. In alte tipuri de celule (endoteliul vascular) sinteza de noi molecule enzimatice inlocuiegte treptat moleculele inactivate. Un num&r foarte mare de cornpugi sunt studiaji pentru abilitatea lorde a inhiba seiectiv biosinteza prostaglandinelor, de a dirija calea biosinteticil spre formarea unui anume compus. Au fost descrise numeroase clase de agenji cu aejiune inhibitoare mai mult sau mai pufin specified asupra cascade! arahidonatului, care probabil, vor intra in arsenalul terapeutic uman. VIII. 10.2. CATABOLISMUL PROSTAGLANDINELOR Viaja biologicd a eicosanoizilor circculanji este foarte scurtft (de exempli! TXA.211/2 = 30 minute, pentru prostaciclina t1/2 « 3 minute). Prostaglandinele primate sunt eliminate rapid la nivelul pulmonului (la o singurS trecere ptttmftnul refine 95% din PG din sange). Principalii metaboliji ai PG sunt derivafii 15-ceto, rezultafi prin acjiunea PG-15~hidroxi dehidrogenaza. Prostaciclina este metabolizatd la 6-ceto-PGFj, (Fig. VIIL31), Trombo- xanul A2 este transformat rapid in TXB2. VIII. 10.3. ACJIUNILE BIOLOGICE ALE EICOSANOIZILOR Eicosanoizii au activitaji biologice multiple care depind nu numai de natura compusului, PGE, PGF, prostaciclinft, TX, LT, dar gi de cea a tipului celular, a specieL Uneori in acelagi tip de celuia acfiunile exercitate de cdtre unele sau altele dintre prostaglandine sunt opuse (de exemplu contracts sau relaxeazS musculatura netedS, favorizeaz& sau impiedieft agregarea plachetarii) gi balanfa dintre cele doud efecte determine natura gi amploarea rdspunsului. Prostaglandinele sunt mesageri chimici, sunt hormoni paracrini. Mecanismele ultime prin care se exercitd acjiunea lor reglatoare nu sunt complet elucidate. In unele cazuri sunt incriminate variajii ale concentrafiei nucleotidelor ciclice (AMPC sau GMPC), 476 0

f V Ajefatiofit/ urmri 0 "" \^\ ^ COM

i Met* befit/ u/mri

p

/ ■

rosfj Cf c/f*?2 i s. / X. ^S v^ Afcfed& //tt vfiftjsi

, OH 6 - cefo Fig. VIII. 31 - Catabollsmul prostaglandinelor PGE2 §i PGF2a §i al prostaciclinei inodiflcdri ale nivelului inlraceluiar al ionilor Ca2+ sau activarea transcrieri genice §i sinteza de protein© specific©, Prostaglandinele primarc se formeazS in cantiulji apreciabile la nivelul tractului gastrointestinal infiuen|and motilitatea tubului digestiv, secrefia §i absorbfia la nivelul diferitelor segment© ale accsluia. PGF 2a are acjiune contractiLI asupra musculaturii netede longitudinale §i circulare. Pe cand PGEU relaxeazd musculatura circular! PGE2 are acjiune 477 S

I; !■: ;■ r go inhibitorie asupra secrejiei de sue gastric ca gi asupra absorbjiei intestinale. Prostaglan- dinele din seria E au fost introduse in terapia umantt ca agenji antiulceirogeni. Prostaglandinele E §i F au roluri deosebite in fiziologiapl&mfmului, a ciiilor respiratorii, sunt implicate in st&ri patoiogice ca edem pulmonar, embolie, aslrn etc. PGF^ ai'e aejiune contractile asupra traheei, bronhiiior, pe cand PGE2 are aejiune bronhodilatatoare. La nivelul sistemului renal, prostaglandinele joac& roluri reglatoare asupra fluxului renal sanguin, a excrejiei de sodiu §i homeostaziei apei. In sistemul nervos central prostaglandinele sunt implicate in procese fundamentals de reglare a transmisiei sinaptice, determine modified! ale nivelului nucleotidelor ciciice. PGE scade concentrajia GMPC cu efecte tranchilizante, anticonvulsionante, iar PGF2a create concentrajia GMPC, cu efecte contrare. Prostaglandinele exercitd roluri deosebite asupra sistemului reproduc&tor. La bSrbaji, infiuenjeaz& spermatogeneza §i fertilitatea, ia femei controieazS ciciul ovarian, contractibi- litatea miometrului. PGF2ot §i analog! chimici ai acestuia au aejiune contractile asupra musculaturii netede din uter sunt utilizate la declan§area travaliului, in avortul terapeutic. Prosticiclina §i tromboxanul (TXA2) alciituiesc un sistem de control al homeostaziei tonusului vaselor sanguine §i ai agregSrii plachetare. TXA2 are aejiune contractile asupra musculaturii netede din vasele periferice, din arterele coronariene, de credere a tensiunii aiteriale. La nivelul plachetelor favorizeazS agregarea §i forrnarea trombusului. Prostaciciina are aejiuni opuse cu cele exercitate de TXA2, relaxeazd muscuiatura vaselor §i este un factor antitrombic, impiedica agregarea plachetelor. Leucotrienele- (LTB4 este probabil compusul cel mai activ) acjioneaza ca

agenji ehemotactici §i chemocinetici determinand acumuiarea de neutrofile in focarul inflamator. La nivelul phlmanului exercitxl aejiune contractile asupra musculaturii netede din parenchim §i bronhii avand un rol important in astmul bron§ic. LTC4 a fost identificat cu a§a-zisa “slow reacting substance of anaphylaxis*4, descoperitdin urmS cu mai bine de 40 ani, rftspunzStoare de producerea §ocului anafilactic. fill

Cap. IX. METABOLISMUL PROTEINELOR §1 AL AMINOACIZILOR IX. L INTRODUCERE In organismele vii proteinele constitute, din punct de vedere cantitativ, partea cea mai xnsemnata dintre compugii organici. Eie se prezintd intr-o mare diversitate structural!! §i fndeplinesc' funcfii foarte variate §i inalt specializate (vezi capitolul ,JProteine“).. Corespunzdtor, metabolismul proteinelor este deosebit de complex; el cuprinde, evident, cele doud aspecte, anaboiismal si catabolismul. AMfaolismut, sau biosinteza din amiiioacizia proteinelor a lost descrisd, din anurnlierajiuni, mai !nainteIXa^ni)pIexita“ tea procesului trebuie Incd addugatS compie'xitatea biosintezei- aminoacizilor din compugi de altd nature, in ce prive§te calabolismul fie cd este vorba de proteine dliv alimente sau de proteine din lesuturL el este relativ simplu in prima empd, aceea a eliberSni aminoacizilor prin hidrolizk. Etapele urmStoare, constSnd in utilizarea aminoacizilor pentru producere de energie sau pentru sinteza de glucide, lipide §i a unui numdr insemnat de compu§i cu funcjii biologice specializate, sunt variate §i complexe. Capitolul acesta cuprinde aspectele cele mai important^ ale catabolismului proteinelor §i aminoacizilor care sunt specifice organismului uman; sunt prezentate, de asemenea, biosinteza aminoacizilor neesenjiali §i participarea aminoacizilor la sinteza a numerogi compu^i cu funcfii specializate.

IX.2. STAREA DINAMICA A PROTEINELOR. BILANJURI AZOTATE Proteinele din organismele vii se reinoiesc permanent Pentru menfinerea constant# a proporfiei lor in {esuturi, vitezele de sintezd §i de degradare ale proteinelor trebuie sd fie egale, ceea ce constituie o stare stationary Vitezele de reinoire ale proteinelor se exprimd prin timpul de injumdtdjire, Tl/2, insemnand durata (in minute, ore sau zile) dupdxare jum&tate din cantitatea proteine! date se reinoie§te. De exemplu Tl/2 pentru proteinele musculam §i conductive este de cca 21 zile, in timp ce pentru proteinele hepatice totaie este 5-6 zile. O serie de proteine hepafice, in special enzime, au insd Tl/2 de ordinal orelor sau chiar al minutelor (Tabelui IX.l). La om, hemoglobina are Tl/2 de 120 zile in timp ce Tl/2 a colagenului §i a alter proteine de structur'd sunt prea lungi pentru a ft mSsurate. Deoarece prin degradarea proteinelor se obfin in primd instanjd aminoacizi, iar, pe de altH parte, biosinteza proteinelor are ca punct de plecaie tot aminoacizi], se poate scrie relajia; biosinteza aminoacizi —---------------------------proteine hidroliza Aceasta redd, in linii man, legdtura indisolubild dintre proteine §i aminoacizi la nivelul organismeior vii. Insd, in timp ce proteinele sc transforms cantitativ in aminoacizi, reutilizarea lor pentru sinteza de proteine noi este numai parjiald; cealaltd parte suferd 479 Tabelid IX.h T 1/2 af unor enzime din ficat Enzima Tl/2 (®re) Ornitin d&carhoxiiaza 6 * aminolevulinat sintetazS ARM poiimeraza i Triptofan oxigenaza Serin dehidrataza Glucokinaza Gfucozo - 6 fosfat dehldrogenaza 0,2 0,3 13 2.5 4.0 12.0 15,0 degraded cu producere de amoniac, dioxid de carbon §i ap3, sau participS la sinteza altor compu§i specializaji; in locul lor, la sinteza protelnelor sunt utiiiza{i arninoacizi provenifi din. proteine. alimentare §i prin sintezS endogenS. Balanja azotului in organismul uman coosld in raportui intre cantitatea de azot ingerata sub forms de proleine (sau alji compu$i cu azot) §i cantitatea de azot excretatfi prin urind sub fonM de amoniac §i uree (care reprezint^ cea mai insemnatS parte), la care se adaugfs azotul excreta! prin fecale §i piele. Balan(a este eehilibrat# dacd aportui exogen compen.sea.zd pierderile, situafie intSlniUl la adultul normal; ^ea este negrdivd dacd (N ingerg_< N excreta! int£Unitii In iijfnijie. bob infectioase, jfiemoragii.

triiurnatisme) §i pozitivS daca (|M__jngerat > N excreted (c.amcteristicjl Qi^amsiEekaria cre§tere(Tn' convaleseenpi, la femeia ins¥rcinataT~" Cunoa§terea baiamei azotului are mare valoare in stabilirea necesaiului zilnic de proteine in hranft. In recomandftrile care se fac (Tabelul IX.2) trebuie s;i se jinS searml §i de tipul de proteine; valoroase sunt, in primal rand, proteinele care conjin a§a numifii ^arninoacizi esenj.iali‘\ dar §i ceilaiji arninoacizi natural! in propotfie cat mai apropiatS necesaiului sintezei de proteine cndogene. Tabelul fX.2 NecesaruS de proteine (dupa rccomandftriie 0 M .S j Necesar de proteine In Varsta grame / kg corp / zi 0 - 3luni 2,3 3-12. luni 1-2 1-15 ani 0,7 -0,9 15 -19 ani . 0,65 ADULT 0,60 480 1X3. DIGESTIA PRGTEMELOR ALIMENTARE §1 ABSORBXIA AMINOACIZILOR. HIDROLIZA " PROTEINELOR ENDOGENE Proteinele, asem2n2tor giucidelor §i ligidelor hidrolizabile, nti sunt absorbite la nivelol innuluif Prlii hldrofiza totals proteineTeT^Ti^^anTinoacizi care seXiBsorb. Hidroliza proteinelor alimentare se face sub acpunea combinatH a enz-imelor din sucurile gastric, pancreatic §i intestinal. De§i to ate aceste enzime catalizeazS hidroliza legfilnriJor peptidice, tnlre eie exists diferenfe de specificitate. Se disting endopeptidaze care asigurd. scindarea numai a legdturilor peptidice. din interiorul lan junior §i exopeptidaze care scindeazS numai leg&turile peptidice formate de aminoacizii de la capete cu restul macromoleculei proteice sau peptidice. Tabelul IX.3. cuprinde principalele enzime proieolitice digestive. Tabelul IX.3 Enzimele proteolitice digestive Sucu!

Sucul gastric (pH 1,52,5)

Sucul pancreati c (pH 7,5 r 8, 0)

Proenzima

Enzima

Substratai Produ§ii

Pepsinoge n

Pepsina

Proteine

Gastricsin a Proiabferm Chimozin entul a (Renina, Labferme ntui) Tripsinoge Tripsina . n Chimotrips Chimotrip in ogen sina -

Proteins Cazeina din iapte Poiipeptid e Poiipeptid e

Poiipeptid e Poiipeptid e Coaguleaz a iapte ie Peptide Peptide

Proelastaz a

Elastaza

Elastina

Peptide §i aminoaciz i Carboxipe Poiipeptid Proptidaza e, peptide carboxipe §i ptiProteine, aminoaciz ciaza peptide i Aminopep Peptide Peptide §i Sucul tidaza aminoaciz intestinal i (pH 6,2Dipeptida Aminoaciz 7,3) Dipeptide ze i O caracteristic& a majorit&jii enzimelor digestive este cS. sunt secretate de entire celulele produedtoare in formelinactive) numite proenzime sau zimoseni: explicajia fine, pe de o parte, de necesitatea de a intra rapid in aepune (biosinteza ior necesitand un anumit timp), pe de aM parte, se protejeaz2.de aejiunea ior insSgi celulele produdltoa- re §i canalele prin care sunt excretate. Actiyarea are loc prin detagarea de la capete sau 481 din interior a unor oligopeptide, realizandu-se dupd caz, c^demascare^a. centrului activ.. sau cons1ituu:ca acesluia din starempreformatd (vezi capitoiuf „Enzime“). Pepsinogenul este produs de celulele „principale“ ale mucoasei gastrice. Odatd secretat in stomac, pepsinogenul este rapid activat la pepsing in prezenja ionilor H+ §i apoi autocatalitic; activarea const3 in indepgrtarea unui fragment cuprinzand 42 resturi de aminoacizi de la capdtul N-terminal al lanfului polipeptidic unic al pepsinogenului. Secrejia de acid clorhidric este deci la fel de necesarg ca §'i secrejia pepsinogenului pentru digestia proteinelor in stomac. Pepsina acjioneazg optim la pH in jur de 2; ea este o endopeptidazg care alacd specific legSturile peptidice la care participd, prin grupdrile aminice, aminoacizii aromatici §i in micg mMsura metionina §i leucina: H20 l C 4- NH — CH — C — Rn+1 = fenilalaninS, tirozlna, ||| I || metionina,' leucina O1 O Gastricsma, numita §i pepsina C, se formeazg al&turi de pepsing prin activarea intr- un ait"mod a pepsinogenului; pH~uf optim de acfiune al gastricsinei este ceva. mai mare decat al pepsinei (aproximativ 3). Q^icsina__ acjioneazg predominant la copii in truest la acedia sucul gastric are o aciditate ceva mai micg. Chimozina este prezenta numai in sucul gastric al sugarilor. In prezenja 2+ Ca chimozina transformd procazeina in cazeind.. care este apoi hidrolizatd de pepsleft In stomac, proteinele alimentare sunt mai intai denaturate (daloritd pHului foarte scazut); este favorizata astfel aejiunea hidroliticd specified a pepsinei §i gastricsinei. Se objin polipeptide §i oligopeptide, nu insd.

aminoacizi liberi. Sucul pancreatic, care este secretat in intestinul subjire, confine tripsinogen, chimotripsinogen, proelastazg,gi procarboxipeptidazd, Tripsinogenul este transformat in tripsina prin indepgrtarea, din capdtul Nterminal, a unui hexapeptid; procesul are loc sub aejiunea enterokinazei, enzima secretatd de mucoasa intestinal#, dar §i autocatalitic. Dupd indepgrtarea hexapeptidului, molecula (ripsinei se pliazd formandu-se centrul activ in care se afld His-29, His.-46 §i Ser-183 (Fig. IX,1). Tripsina hidrolizeazd legdturile peptidice la care participd, cu gruparea CO, aminoacizii arginind §i iizind. ghimotripsino^emiL este transfonnat in chimotripsing prin indepgrtarea a doud dipeptide, proces care lire loc sub aejiunea (ripsinei. Din lanfui polipeptidic unic al chimotripsinogenului, ce confine 245 resturi de aminoacizi, rezultd trei lanfuri mai scurte care menjin, in linii mari, conformajia zimogenului datoritd unor legdturi disulfurice incruci§ate (45-58; 168-182; 191-221). Prin ,,goluriletl create se permits accesul substratului la centrul activ (Fig. IX.2). Chimotripsina asigurg scindarea legdturilor peptidice la care participd, cu grupdrile CO, fenilanina, tirozina §\ triptofanul. Elastaza, care asigura hidroliza specified a unor legdturi din elasting, se objine din groelastazd sub aejiunea cataliticg a tripsinei. Procarboxipeatidaza se transformd in carboxipepffdazd, de asemenea, sub aejiunea tripsinei. Carboxipeptidaza asigurd scindarea specified a legdturilor peptidice la care participd cu gruparea NH, aminoacizii C-terminali. Ea este deci o exopeptidazd.. Definitivarea hidrolizei se realizeazd prin aejiunea enzimelor produse la nivelul intestinului subjire; aminopeptidaza (exopeptidazd) scindeazd specific aminoacizii din NH — CH ■ i R„ 482 £9 / ri/~,4sprisp~Asprilsp~ Zys - His umsm 86 Ht'sSer 183 ‘JH

Fig. IX.1 - ilustrarea transformarii tripsinogenului in tripsina cu fdrmarea centrului activ (care cuprinde cele doua resturi de histidina §i restul de serina) Ce/7frv/&C/-/V

Fig. IX.2 - Formarea chimotripsinei din chimotripsinogen; cele doua dipeptide Tndepartate sub acfiunea tripsinei §j chimmotripsinei sunt Ser-Arg (14-15) §i Thr-Asn (147-148) capetele N-terminale ale peptidelor, iar dipeptidazele (care aefioneazS chiar la iiivelul enterocitelor) asigura ruperea ultimelor leg&turi peptidice. Absorbjia aminoacizilor are loc ia nivelul intestinului subfire; dupS absorbjie ei sunt preluafi, in form# liberS, de sangele portal care ii transports la ficat. Ficatul utilizeazS o bunS paite din aminoacizi pentru sinteza proteinelor proprii §i a proteinelor serice. Restul de aminoacizi este distribuit, prin circulafia sistemicS, la celelalte fesuturi. 483 Absorbjia propriuzisft a aminoacizilor (sau transportul prin epiteliul intestinal) prezintS cateva caracteristici: 1.existenja urmStoarelor translocaze de grup: a. pentru aminoacizii neutri cu moleculft mica; b. pentru aminoacizii neutri cu molecule mari §i aminoacizii aromatici; c. pentru aminoacizii bazici §i cisteina; d. pentru aminoacizii cu caracter acid;

e.

pentru prolina, hidroxi-prolinS §i glicina. Translocazele seamSnfr in multe privinje cu enzimele: prezintil fenomenul de saturare cu substrat, sunt susceptibile la ac{iunea unor inhibitori etc. 2. este deci transport actiy; 3. necesitS ioni de Na* in medialdin acest punct de -vedere transportul aminoacizilor seamfiml cu cel al glucozei; 4. sunt transportaji numai aminoacizii cu configuratie L; Absorbjia unor oligopeptide (de ex. dipeptide) §i chiar a unor proteine nu este total exclusfl. Altfel nu se pot explica anumite date experimentale cum ar fi, de exemplu, rtispunsul imun la unele proteine administrate pe cale digestivl Sunt cunoscute o serie de tulbunlri (boli) cauzate de dereglitri ale transportului aminoacizilor. Cateva dintre acestea se prezintii in Tabelul IX.4. Tabelul IX.4 Tulburari cauzate de absorbjia defectuoasS a unor aminoacizi Simptom §i Denumirea Cauza manifestare Boala Deficienfa de Transportul defectuos a! Hartnup niacina §i deci amioaciziior cu masa manifestare moleculara mare §i a identica lipsei celor aromatici, inclusiv acestei triptofanul. Cum in vitamine organism o mica parte din (pelagra). necesarui de niacina se sintetizeaza din triptofan, lipsa acestuia echivaleaza cu lipsa parfiaia a niacinei. Cistinuria infecfii ale Transportul defectuos al tractuiui urinar amioaciziior bazici, al £/ pietre la cisteinei dar §i ai cistinei. rinichi. Defectul de absorbfie este atat la nivel intestinal cat §i la nivel renal. Cistina este foarte soiubila in mediu apos (urina). Glicinuria Nu se semnaleaza Absorbfie defectuoasa a anormalitafi proiinei, hidroxiprolinei §i ciinice: glicinei atat la nivel eliminare intestinal cat $i la nivel urinarS renal. crescuta. 484 in ceea ce prive§te hidroliza proteinelor din fesuturi, ea are loc continuu dar cu intensity diferite. De aici diferenfa mare intre timpii de injumdtdfire a diverselor proteine. Enzimele care catalizeazd. aeeastd hidroliza se numesc catepsine; s-au identificat mai multe variante de catepsine, notate cu A, B, C,

$i D, Toate au acfiune specified (asigurd scindarea numai a anumitor legdturi peptidice), de ex. cele de tip A, B §i C acjioneazd, in ordine, asemanator pepsinei, tripsinei §i chimotripsinei. Hidroliza proteinelor endogene este influenjatd de nurnero§i factori intre care denaturarea §i activarea lizozomilor mdresc viteza procesului in toate Jesuturile; hormonii glucocorticoizi mdresc vitezain tesutul muscular,'iar insulina reduce viteza in tesuturiie iasulinodependente. IXA FGNDUL DE AMINOACIZL AMINOACIZII ESENTIALI Cantitatea de aminoacizi liberi existentd la un moment dat in organism constituie fondul de aminoacizi al acelui organism. Pent.ru c& aminoacizi liberi se aflfi practic in toate jesuturile §i organele precum §i in umori (mai ales in sange) este greu de stabilit valoarea exacts in fiecare moment a acestei cantit&fi. Tolu§i nojiunea este important^ pentru rajiuni teoretice §i scopuri didaetice. Dinamica fondului de aminoacizi constd in concurenja intre procesele prin care ei se objin §i cele prin erne se consuma sau se indepaxteazd. Aminoacizi! se obfin pe trei edi; prin absorbjia ceior rezultaji la hidroliza proteinelor alimentare, prin hidroliza proteinelor endogene §i prin sinteza endogend. Din fondul comun, fiecare Jesut (celuld) i§i procurd tipul §i cantitatea aminoacizilor necesari in momenta! dat. Principala utilizare este pentru biosinteza proteinelor; la acest proces participd toji aminoacizi! natural!. Pe de altd parte, divert aminoacizi sunt utilizafi in gluconeogenezd, sintezd de lipide §i compugi specializaji. Catabolizarea-proces pennanent dar variabil ca intensitate- §i eliminarea lor (in cantitdfi rnici) prin urind sunt alte modalitdji de consum al aminoacizilor (Fig. IX.3.). Dree Proteine exogene Proteine endogene CO, + H,0 + energie Catabolism Sinteza endogena FOND COMUN DE AMINOACIZI Sinteze de ai$i compu§i: giucoza, lipide, hormoni, nucleotide, hem etc. Aminoaciduria Proteine specifice Anabolism Fig. IX.3 - Constituirea §i utifizarea fondului metabolic comun de aminoacizi Dacdprin hidroliza proteinelor alimentare §i a ceior endogene se furnizeazd fondului comun loatd gama de aminoacizi natural!, sinteza endogend din compu§i proteici nu este 485

Vi ' : i 'i.

posibild decat in cazul unora dintre acegtia. Organismul uman nu este in mdsurd sd sintetizeze schdetul atomilor de carbon al unui numar de noua aminoacizi; ei se numesc: „aminoacizi esen{iali“ §i se procure in special din aiimente: valina, tecucina, izoleucina, lizina, metionina, treonina, fenilalalina, iriptofanul §i hislidina. in perioada de credere, organismul are nevoie gi de cantitdji mai mari decat poate sintetiza, de arginind; el se numegte „semiesenj.iar6. DC.5* CATABOLISMUL AMINOACIZILOR: D EZ AMIN AREA OXIDATIVA §1 CICLUL UREOGENETIC IX.5.1. ASPECTE GENERALE Prin degradarea complete a aminoacizilor se asigurd, ca §i prin degradarea glucidelor §i iipidelor, producere de energie pe seama careia se sintetizeazd ATP. La om, contribujia aminoacizilor (§i deci a proteinelor) la producerea de energie este in media de 10%, dar in numeroase situajii (de exemplu inani|:ia prelun gitd) ea poate fi mai insemnatd. Este de menfionat cd organismul uman nu poate depozita aminoacizii aflaji in exces; in schirnb, a§a cum s-a vdzut la mefabolismui glucidelor §i iipidelor, organismul uman transform# aminoacizii in glucoz# (§i giicogen) precum §i in diverse lipide. Pentru aceasta, divergii aminoacizi sunt mai intai degradaji parjial 1a. compugi ca acetiLCoA, fumarat,_a-cetoglutarat etc. Degradarea total# §i degraddrile paijiale constituie la un loc catabolism ul aminoacizilor. Diversitatea structural# a acestor compugi determin# si o mare diversitate a cdilor catabolice. Exist# totugi §i uneie edi care sunt

comune tuturor aminoacizilor sau edi comune unor grupuri de aminoacizi. Acestea sunt: - dezaminarea; - incorporarea amoniacului in uree in vederea excrejiei din organism; , - conversia scheletului de carbon al aminoacizilor la intermedium metabolici comuni. Dintre acestea, in continuare se trateazd primele dou#. IX.5.2. DEZAMINAREA OXIDATIVA A AMINOACIZILOR §1 TRANSPORTUL AMONIACULUI REZULTAT Prima etapd in degradarea total# sau parjiald a aminoacizilor const# in dezaminarea lor; prin dezaminare se indepMeazd grupdrile amino din pozifia alfa, pe seama lor formandu-se amoniac. Etapa cuprinde reaejii de transaminare §i o reaejie de dehidrogena- re. Deoarece dehidrogenarea este o oxidare, etapa este denumitd curent „dezaminare oxidativd“; uneori este utilizatd denumirea echivalentd „transdezaminare‘\ Transaminarea const# in schimbul de grupdri amino cu grupdri carbonil intre alfa- aminoacizi §i alfa-cetoacizi. Rt — CH — COOH + FL — C — COOH ~~—^ Rt — C — COOH + R2 — CH — COOH f II ^ II i NH2 O 0 NH2 Reacpile de transaminare sunt total reversihile; coenzima transaminazelor (aminotrans- ferazelor) este piridoxalfosfatul. Alte dale privind transaminazele, inclusiv mecanismul reaefiilor de transaminare sunt prezentate in capitolul „Vitamine §i coenzimeA 486 In organismul uman, reacjii de transaminare au loc in toate fesuturile dar mai intens in ficat, rinichi, inim3, pl&mani, creier. Varietatea loreste mare dac& avem in vedere cd fiecare dintre cetoacizii piruvic, oxaloacetic §i acetoglutaric reac|ioneaz& cu aproape tofi aminoacizii natural! (mai pufin prolina, treonina §i lizina) §i cu ineft unii care nu sunt natural!. Deosebit de impoitante pentru etapa de dezaminare oxidativd sunt transaminftri- le notate 1, 2 $i 3: H 1 -CH — —C— ) CH3—-c — COOH CH,—C —COOH COO COOH + R- i! -| +R3j H|j iI Ii0 NH2 NH2 0 Reac{iile acestea ale acidului piruvic cu diver§i aminoacizi (cei menjionafi mai inainte) sunt catalizate de enzimele numite alaninS-piruvat transaminaze; rezultatul ior este efi giuparile amino de pe diver§i aminoacizi se colecteazd in alaninl COOH COOH 2) CH3 — CH — COOH + C = 0 I I NH2 (CH2)2

N5 —o —X

o II -o

OOOH GPT ____5s*. CH3 — 0 — COOH + CH — NH2 li I O (CH2)2 COOH Prin aceasta reaejie, catalizatft de glumatic piruvic transaminazS (GPT), corelata cu reacjiile de la punctul anterior, toate grupMIe amino sunt colectate in acidul glutamic. COOH COOH COOH COOH | | J CH — NH2 0 = 0 CH — NH2 GOT I 4* I T I ........._ CH2 (CH (CH2)2 COOH COOH COOH COOH AceastiS reaefie transam catali d glutamic ultima de inare, zatd e oxaloacetic transaminazft (GOT) le completeazd pe celelalte in sensul cS gruparea amino a acidului aspartic poate txece §i direct pe acidul a-cetoglutaric. In cadrul etapei de dezaminare oxidativa, acidul glutamic este transformat prin dehidrogenare in acid iminoglutaric; reaejia este calalizatd de glutamatdehidrogenazft (G1DH). COOH COO H Glutamatdehidrogen | aza i ■ CH -------------^ C <---— NH2 NH | (CH2) (CH2)2 / 2 I NAD+ NADH + H+ I COOH (NADP (NADPH + •CO A H+) OH In legaturfi cu accastd reaejie reversibihl se remarcS faptul c& in calitate de coenzimd poate funcj'iona atat NAD+ cat $i NADP+. Mai precis, in procesul de 487 dezaminare oxidativd coenzima este NAD+ in (imp ce in procesul invers, de biosintezd a aminoacizilor, coenzima este NADPH 4- H + (se va vedea la biosinteza aminoacizilor). Activitatea glutamatdehidrogenazei este controlatS prin efectori alosterici: activatori sunt GDP §i. ADP iar inhibitori sunt GTP §i ATP. Deci scMerea resurselor de energie ale oelulei accelereazd. degradarea aminoacizilor. Acidul iminoglutaric reacfioneazd spontan cu apa form3ndu~se acid acetoglutaric §i amoniac: COO COO H H I 1

1 l . .. ..w c « + H20 C-*<« 0 NH | 1 (CH2 (CH2) )2 2 1 COO COO H H in sintezd, reacjiile de transaminare cupiate cu dehidrogenarea acidului glutamic, deci etapa de dezaminare, se prezintd astfel: Alanina Acid piruvic

NADH + H* NAD* ■ (NADPH + H+) NADP* Prin oxidai’ea in lanjul respirator a NADH 4- H\ care se formeazft in cursul dezaminarii oxidative, se produce energie; ea se adaugft la cea eliheratS prin oxidarea catenelor de carbon ale aminoacizilor in cazul degrad&rii complete ale acestora. In organism, in special in ficat §i m rinichi, se produce §i o dezaminare directs a aminoacizilor. Exlstd aici D-aminoacidoxidaze §i Laminoacidoxidaze, ultimele avand coenzima FMN §i acjionand conform reacjiei: R — CH — COOH 4- FMN ----------^ R — C - COOH + FMNH? I II NH2

NH

Iminoacizii rezullafi, asemdn&tor acidului iminoglutaric, formeazd cu apa amoniac §i cetoacizi. Intensiiatea acestor reacfii este redusd. Pe de altd parte, dezaminfuile D- aminoacizilor sub acpunea D-aminoacidoxidazelor (care au coenzima FAD) nu au valoare §i pentru faptul cd aminoacizii eliherafi din proteine sunt forme L. Doi aminoacizi, serina §i cisteina, elibereaza amoniac §i in cursul catabolizdrii lor spre acid piruvic (vezi „ulilizarea scheletului de atom! de carbon al aminoacizilor"). In organism ul uman, pe cdile ardtate dar mai ales prin dezaminarea oxidativd, se 488 formeazd cea mai mare parte a amoniacului. Prin oxidarea aminelor, hidroliza ureei prezent&in secrejiile tubului digestiv cat §i prin degradarea sub acjiunea florei microbiene a resturilor de proteine din intestin rezulta cantitilfi suplimentare de amoniac. Amoniacul este ddunator organismului, creierul resimpndu-se in primal rand.; pentru a preveni efectui nociv, acest campus trebuie rapid utilizat sau indepdrtat. Singura utilizare este pentru sinteza de aminoacizi neesenjiali, a§a cum va

reie§i in continuare. Indepdrtarea surplusului de amoniac, de§i are loc printrun proces complicat, se reaiizeazd cu mare eficienjd. In primui rand, de la diversele fesuturi sau alte locuri unde este produs, amoniacul este colectat la nivelul ficatului §i rinichilor. Probabil tot pentru a preveni efectui nociv, doar o micd parte este transportatd ca atare (in form# libera) prin sange; dovadd este concentrajia plasmatic# foarte redusd (10-20 pg/100 ml plasmd). Acest amoniac este preluat de ficat. La ficat ajunge prin sistemul port §i amoniacul produs in intestin din resturi de proteine. Tot acest amoniac extern se adaugd la cantitatea foarte mare de amoniac produsd de cdtre ficat. In jesuturi, paitea cea mai insemnatd a amoniacului este incorporate, sub found de gaipdri amidice,in glutanriind. Reacpa de fomnare a glutaminei din amoniac §i acid glutamic, catalizatd de'glutaminsintetazd, este ireversibild ca unnaie a scinddrii ATP in ADP + P^ COOH COOH I 1 I 1 Glutaminsintetaz + CH — CH — a NH2 NH2 (CH2)2 (CH2)2 COOH c(° x ATP ADP + P, NH, Activitatea glutaminsintetazei este controlatd alosteric prin mai mulfi modulatori (vezi reglarea activltafii enzimelor) intre care insuji amoniacul este modulator pozitiv; evident, acest elect reglator al amoniacului contribuie la diminuarea efectului sdu nociv. Glutamina, aminoacid fard acjiune ddundtoare, este preluatd de sange de unde este extras# apoi in principal de rinichi care dispun de enzima glutaminazd, In sange coneentrafia glutaminei este de 3-5 ori mai mare decat. a altor aminoacizi ceea ce reflect# nu numai rolul acestui aminoacid in transportul amoniacului dar §i necesitatea pentru diferite biosinteze (de exemplu a nucleotidelor). Reacjia catalizatd de glutaminaz#, la randul ei ireversibild, este: COOH I CH — NH2 I Giutamtnaza (CH2)2 + H2O —=---k° X

NH2

COOH CH — NH2 (CH2)2 + NH3 COOH 489 In rinichi, amoniacul format din glutamind se adaugd celui prodtis aici prin dezaminarea oxidativa sau pe alte cdi. El difuzeazd prin membrana zonei tubulate §i accept&nd protoni, dd na§tere ionului amorsiu care apare in urind. Eliminarea sub aceastd found a unei p^rji a amoniacukii prezintd important §1 in legdturd cu menjinerea rezervei alcaline

a plasmei. Amoniacul produs §i colectat. de ficat, care reprezintd la un loc de 8-9 ori mai mult decat cel renal, este transformat tot aici in uree, compus foarte solubil in media apos §i fard efect ddundtor; ureea va fi preluatd de sange §i eliminate prin urind. IX.5.3. BIOSINTEZA UREEI Formarea ureei are loc in cadrul unei secvenfe ciclice de reac{ii cunoscutd §i sub nuinele de ciclul ureogenetic sau ciclul Krebs-Henseleit; unele dintre reacjiile ciclului se desfd§oard in miLocondriile hepatocitelor, altele in citosol (Fig. IX.4).

■ Car6a/mZ- , fosfyZ ^rPAPP^P; 2ArP Fig. IX.4 - Schema generala a ciciului ureogenetic Ciclul ureogenetic debuteazd prin condensarea, in interiorul mitocondriilor, a amoniacului cu C02 §i ATP: reacjia este catalizatd de carbamilfosfatsintetaza mitocondriald: NH2 Mg2* I C02 + NH3 + 2ATP + H20 ------C - O + 2ADP + Pi O ~ P03H2 Carbamiltosfat Sinteza unui mol de carbamilfosfat: necesita hidroiiza a doi moli de ATP; energia liberd servegte la formarea a doud legdturi dintre care una macroergicd. Este necesard §i prezenfa ionilor de Mg2+. 490 Penfru ca exists §i o carbamilfosfatsintetazS ciiosolica, care asigurS formarea carbamilfos- fatului necesar sintezei nucieoiidelor primidimce (vezi metabolismul compu§ilor purinici §i pirimidinici), precizarea „mitocondriaM“ sau ^cilosolidT este absolut necesarl • Carbamilfosfatsintetaza mitocondrialfi este o enzimft alostericd a cftrei activitate este modulate pozitiv de un derivat al aciduliii glutamic, N-acetilglutamatul; ei produce o modificare conformafionala profundi a enzimei marindu-i afinitatea pentru ATP. Activitatea N-acetil-giutamatsintetazei, enzima ce catalizeazS sinteza Nacetilglutamatului, este crescutS de mai rrmlji aminoacizi, mai ales arginina. Tot la nivelul mitocondriei tire loc transferul grupdrii carbamil de pe carbamilfosfat pe ornitinfi; in aceastS. reacjie, catalizani de ornitin-

NH2 1

CH2 1 (CH2)2

c=o+1 O - P03H2

CH — NH2 1 COOH

i- 2 X

carbamiltransferaz2. (OCT), numitft §i omitintranscarbamilaza, se formeazfi citx'ulina. Enzima OCT este prezenta §i in sange unde activitatea ei se dozeazft fiind utiLl in investigarea ficatului (deoarece provine numai de la acest organ): 0 II NH2. ... OCT ---------p, <----

CH2 1 (CH2)2 + CH — NH2 1 COOH.

Ornitina Citrulina In citosoi, unde ajunge prin simphl difuziune, citrulina se condenseazd cu acidul aspartic in prezenja arginin-succinatsintetazei; se formeazU acidul. argininsuccinic. Reacfia e posibilS- numai cu participarea ATP care se scindeaza in AMP §i PPf (deci sunt utilizate arnbele leg&turi macroergice): . COOH OH NH — CH — CH2—COOH NH — C = NH NH —C = NH CH2 (CH2)2+ H2N — CH — CH2—COOH — OH — NH2 COOH ATP GOOH Citrulina (forma tautomera) CH3 \ AMP + PP, (CH2)2 CH —NH2 COOH Acidul argininsuccinic 491 Reacfia aceasla impreund cu cele doud reacjii care au Ioc in continuare evidenfiazd. cd acidul aspartic este furnizorul celei de a doua grupdri aminice pentru sinteza ureei (prima provenind din NH3). Unndtoarea reacfie, reversibild, a ciclului ureogenetic constd in scindarea acidului arginin-succinic in arginind §i acid fumaric; enzima, argininsuccinatliaza, prin specificitatea stereochimicd, exclude formarea acidului maleic (izomerul acidului fumaric). Acidul fumaric este intermediar al ciclului acizilor Iricarboxilici. Intrand in acest ciclu, acidul fumaric este (ransformat in acid oxaloacetic, care prin iransaminare regenereazd acidul aspartic gi astfel este susjinutd sinteza ureei.

NH2 HOOC

X 1! o X z

COOH NH - CH - CH2 - COOH NH - C = NH ! Argininsuccinat-liaza CH2 -----------fe1 CH2)2 1 CH NH2 1 COOH

\

1 CH2

CH

I

(CH2)2 1

II

+

CH \ COOH

CH - NH2 1 COOH

/ \oIIo

Argtnina Prin hidroliza argininei, catalizatd de arginazd, se obfine uree §i ornitind. Activitatea arginazei este dependents de Co24 §i Mn2+; arginaza este o enzimd cu specificitate absolute. NH2 NH - C = NH2 NH i 1 1 1 CH2 CH2 Arginaza 1 N 1 H2O -------H (CH2)2 + (CM2)2 + ; CH - NH2 CH - NH2 | 1 1 COOH COOH Prin ornitind se reia secvenja reacfiilor ciclului ureogenetic. Formarea unei molecule de uree necesitd, a§a cum a reie§it din prezentarea reacfiilor, scindarea a patm legaturi macroergice; singura justificare pentru acest consum ridicat de ATP o reprezintd transfoiTnarea amoniacului intr-un compus netoxic care este foarte solubil, deci poate fi transportat de sange in forms liberd la rinichi eliminat. Pentru uree nu existd un prag de eliminare renald astfel incat toatd cantiiatea sintetizatd este rapid indepdrtatd prin tuind. 492 Valoarea uremiei (la adult 20-40 mg/100 ml plasma) si in special cantitatea de uree excrelatS zilnic prin urinS (15-30 g/24 ore) reflect deosebita intensitate cu care se desf3§oar& ciclul ureogenetic, pe plan.mai general intensilatea catabolismului proteic. IX.5,4. RELATE INTRE CICLUL UREOGENETIC §1 CICLUL ACIZILOR TRICARBOXILICI Intre ciclul ureogenetic' §i ciclul acizilor tricarboxilici exists o stransa legStur^; relafia prin intermediul acidului fumaric (cu regeneraiea acidului aspartic) s~a menponat ceva mai uiainte. Pe de alia parte, oxidarea in acidul Krebs a a-cetoglutaratului favorizeazd deplasarea in sensul • fornSrii

amoniacului a echilibrului reacpei catalizalcde glutamatdehidrogenazS §i, prin cuplare cu lanjul respirator, fonnarea unei cantitap crescute de ATP. La disponibilitatea de amoniae §i ATP astfel create se adaugS eieetul de activare a carbamilfosfatsinletazei de altre ATP (prin intermediul acetilglutamatului), toate convergand spre o sinteza crescutd a ureei. Schematizat, aceste interrelapi sunt prezentate in Fig. 1X.5. 0% \*2AmPiA Catiam//- /ips/g/ UR£E'

' A rp Cf/ru/ina A AMP+PP;

Ac/

p

£ aspartic Ac/c/occe/og/o/ar/c Act'd oxa/oy acertc

faO / Ac/cf arg/n/nS UCC//7/C Arp/a/rh Ac/c/ fumatic Ac/ci g/u/am/c _ C/du/adzi/or# ti/car/tox/titi Fig. IX.5 - interreiafiile dintre ciclul ureogenetic §i ciclul acizilor tricarboxilici Intre cele douft cicluri exists §i relafii energetice. Cele paf.ru legaturi macroergice consumate la fonnarea unei molecule de uree echivaleza cu patru molecule de ATP care se hidrolizeazd la ADP + P,; acest ATP este obipnut prin fosforilarea ADP care acompaniazS oxidarea intermediarilor din ciclul Krebs. IX.5.5, BOLI CAUZATE DE DEFECTE IN METABOLIZAREA AMONIACULUI

Produceiea in exces a amoniacului sau indepSrtarea insuficient de rapidS datoritd unor defecte genetice in sinteza enzimelor carbamilfosbitsintetazS §i omitin-carbamiltrans- ferazS determine acumularea lui in sange §i jesuturi, cu multiple consecinje; Jesuturile consumS cantitap man de a-cetoglutarat (in reacpa catalizatd de glutamatdehidrogenazft), -493 intensitatea ciclului Krebs dirninud, deci scade prodacerea de ATP. S-a mai ardtat in ultima vreme cd, cel pujin in creier, pentru glutaminsintetazd amoniacul este nu numai substrat ci §i modulator pozitiv. Cum reacfia catalizatd de glutaminsintetaza necesitd ATP, consumul acestuia va create corespunzdtor; creierul resimte rapid deficitul de ATP de aceea in hiperamonemii aldturi de stUri vomitive, ataxie, iritabilitate, letargie, se semnalizeazd intarzierea dezvoitdrii mintale ca urmare a unor leziuni pe creier. Se pot aduce unele ameliordri printr-un regim alimeniar sdrac in proteine §i prin adaosul la hrand a unor a-cetoacizi; ei vor incorpora amoniacul in aminoacizii utilizabili pentru biosinteza proteinelor deci concentra{ia acestuia in sange va scadea. §i in sinteza celorlalte enzime ale ciclului ureogenetic pot exista defecte; bolile cauzate sunt numite citrulinuria (defect arginin-succinatsintetaza), arginino-succinic acidemia (defect arginin-succinat-liaza), hiperargininemia (defect arginaza). Copiii cdrora ie lipse§te total oricare dintre enzimeie ciclului ureogenetic mi supraviejuiesc perioadei neonatale. IX.6. CATABOLISMUL AMINOACIZILOR: UTILIZAREA SCHELETELOR DE CARBON IX.6.1. ASPECTS GENERATE Aminoacizii (deci proteinele) sunt utilizaji aldturi de glucide §i lipide la acoperirea necesitdfilor energetice ale organismelor animate. Curent, organismul uman i§i procurd aprox. 10% din energie pe seama degraddrii aminoacizilor. in ansamblul ei, degradarea aminoacizilor este complex#, datoritd faptului cd ace§tia sunt variaji ca structurd. Partea complicat'd a acestui proces fine insd numai de transformarea fiecarui aminoacid intr-unul din intermediarii ciclului acizilor tricarboxilici sau in compu§i aflaji in stransa legdtura cu acest ciclu: oxaloacetat, a-cetoglutrat, succinil-CoA, fumaralppiruvat, acetoacetil-CoA, acetil-CoA (Fig. IX.6). De aici incolo degradarep este comund cu a glucidelor §i lipidelor. In legaturd cu schema degradativa a aminoacizilor se mai menjioneazd: a) unii au cate doud cdi de transform are in intermediarii menfionaji: tirozina §i feniialanina la acetoacetil-CoA §i fumarat, izoieucina ia succinil-CoA §i acetil-CoA; b) intermediarii la care sunt degradafi servesc si pentru sinteza de glucide (gluconeo- genaza) sau pentru sinteza de lipide. Se numesc aminoacizi glucogenici cei care se degradeazd la oxaloacetat, oc-cetoglutarat, succinilCoA, fumarat §i piruvat; aminoacizii care se degradeazd ia acetoacetil-CoA §i acetil-CoA sunt cetogeni (din ei, aldturi de alte lipide, se sintetizeazd corpii cetonici). Cei doi aminoacizi de la punctul a) sunt atat glucogeni cat §i cetogeni. Toate transformdrile aminoacizilor spre divergi intennediari includ obligaforiu transamindri §i dezamindri. Dacd, pentru unii simpla transaminare

sau hidrolizd §i transarninare conduce direct la intennediari, pentru alfii sunt necesare §i alte reacfii. Este de refinut cd majoritatea reacjiilor cdilor degradative sunt reversibile (chiar dacd la scrierea lor se omite punerea semnului reversibilitdjii). Aceasta prezintd important in sensul cd sunt utilizate §i in biosinteza aminoacizilor. Try Ala Gly Leu Gys ■ Lys Ser Phe Thr Tyr ! 1 T Acid piruvic Lys Acid citric

tie Met Vat Gin G/u His Pro Arg Fig. IX.6 - Gonversia aminoacizilor la intermediari ai cicluiui acizilor tricarboxilici sau compu§i inrudi|i cu aceftia IX.6.2. ALANINA, TREONINA, GLICINA, SERINA, CISTEINA (§1 CISTINA) SE DEGRADEAZA LA ACID PIRUVIC Aceste transformed sunt cuprinse in schema general#: L-Treonina I Glicina if L-serina Aianin& « - _ c Acid piruvic

.I Acetil-CoA Treonina formeaz# glicina prin scindarea caializat# de treonin-aldolaz#: L~cistin# l L-cisteina 495 Treonin-aldoiaza NH2 H3C — CH.4- CH —COOH O -j- H H3C — CHO + H2N — CH2 — COOH Glicina se transform# in serin# prin hiclroximetilare cu metilen-FH4: CH2 — NH2 I+ COOH Enzima serindehidrataza catalizeaz# eliminarea apei din serin# cu formarea (dup# rearanjare) a unui iminoacid; cu apa, acesta trece spontan in acid pirn vie (elimin&ndu-se NH3): Serin hidroximetilen- -transferaza H20 CH2 — OH CH — NH9 COOH N5,N10~metilen-FB4 FH4 CH2 — OH CH — NH2 COOH Serin-dehidrataza H2O

CH2 II c — NH2 1 COOH + H2O -NH3

CH3

1 C= NH j 1 CO OH

CH3

i c-o 1 COOH In ficat, sub aejiunea unui sistem enzimatic complex (aseman#tor complexului piruvatdehidrogenazei), glicina cedeaz# metiienui acidului tetrahidrofolic (eiiminand C02 §i NH3). Av#nd in vedere schema de rnai sus cat §i reversibilitatea totalil a reaepei catalizat# de serinhidroximetilentransferaza, in ficat serina §i treonina al&turi de glicina sunt transformate prioritar in C02 §i NH3 fiind furnizorii principali de metilen

pentru acidul tetrahidrofolic. Revenind la acetaldehid#, formal# aJfiluri de glicina la scindarea treoninei sub aepunea'treonin-aldolazei, aceasta, prin oxidare la acid acetic §i reaejia celui din urm# cu CoA conduce la formarea acetil-CoA: CH3 — CHO + H20 Aidehiddehidrogenaza FAD FADH2 CH3 — COOH Acetat-tiokinaza CH3 — COOH + CoASH + ATP ___ _ » CH3-c^ o + SCoA AMP + PP-, Cistina, care apare in hidrolizatele proteice ca urmare a faptului c# enzimele proteolitice din tubul digestiv §i din celule nu sunt capabile s# scindeze legaturile disulfurice, este transformat# in cistein# printr-o reaepe de reducere catalizat# de cistinreductaz#: 496 CH2 — Q CH — NH2 COOH Se cunosc trei cei cie transformare a cisteinei in acid piruvic: in prima, gruparea SH este eiiberatS ca SO;; in a doua ca SON', tar in a treia ca H2S; ultima, considerate ca principal# la om, const# dintr-o' reacjie de transaminare §i o reacfie de transsulfurare: CH2 — CH2 SH . CH3 SH i Transamin I Transsulfurare are 1 CH — NH2 r. ~ n r *C-o i 1 COOH COOH 2H H2S COOH Triptofanul elibereazd alanine in cursul degraded! sale specifice. Deoarece al doilea produs al degradSrii triptofanului este acetil-CoA, intreaga suite a reacjiilor se va prezenta la categoria aminoacizilor care se degradeaz# la acetil-CoA. Alanina (inclusiv cea rezultata din degradarea triptofanului) se transforme in acid piruvic prin intermediul reacjiilor de transaminare desense la dezaminarea oxidative a aminoacizilor. IX.6.3. ARGININA, PROLINA, HISTIDINA, GLUT AMINA §1 ACIDUL GLUTAMIC SE DEGRADEAZA LA ACID a~CETOGLUTARIC Aceste transformed au loc dupe schema generate: Prolina Histidina

Acid piroiin-5carboxilic Acid-4-imidazoion-5-propionic /Acid N-formiminoglutamic Acid glutamic A Arginina Ornitina

Acid urocanic

Semialdehida acidului glutamic Glutamina

CH, CH — NH, Cistin-reductaza CH2— SH 2 CH — NH, COOH NADH+H+ NAD+ COOH T Acid a-cetoglutaric U <: ■ T Z: j 'V c i;l ;

Pit 497 Reacjia prin care arginina. se transforms. in omitinft este una dintre reacfiile ciclului ureogenetic. Printr-o reacfie de transaminare, ornilina formeazS semialdehida aciduiui glutamic: HOOC — CH — (CH2)3 — NH? + HOOC — C — (CH2)2 — COOH II o HOOC — CH — (CH2)2 — CHO + HOOC — CH — (Ch2)2 — COOH NH2 . NH2 semialdehida aciduiui glutamic

Semialdehida aciduiui glutamic este oxidate la acidul glutamic intr-o reacfie caializald de o dehidrogenazS cu coenzima NAD*: H?0 HOOC — CH — (CH2)2 CHO HOOC — CH — (CH2)2 — COOH NH2

NAD" NADH + H+ NH2 Transform area aciduiui glutamic in acid a-cetoglutaric este cunoscuta (vezi dezaminarea oxidative a aminoacizilor): Printr-o reacfie de oxidare (catalizaD de prolinoxidazS), urmatii de o reacfie spontanft de desfacere a ciclului, prolina se transforms in semialdehida aciduiui glutamic; de aici se urmeazd calea degradativS comund cu arginina:

1/2 02 'v COOH

H20

+ H20 >*COOH HOOC — CH — (CH2)2—OHO NH2 Cele palm reacfii prin care histidina se transform^ in acid glutamic, cu precizarea rmmeior enzimelor §i a intermediarilor, sunt: CH^CH — COOH urocanat- hidrataza ~~r ' HO 2 NH3 Acid urocanic - CH2 — CH — COOH HistidinNH NH? amonioliaza -* N s 498 o NH CH2—• CH2~~ COOH 4imidazolon5propionat Imidazolonpropionaza ~r * H2Q-

HOOC — CH — CH2— CH2 — COOH

Acid N-formi- minoglutamic Formimino•transferaza NH2 HOOG —CH— CH2 — CH2 —COOH FH4 5-Forminino-FH4 Acid glutamic Transformarea glutaminei este' cunoscuta. IX,6.4. ASPARGINA §1 ACIDUL ASPARTIC SE DEGRADEAZA LA OXALOACETAT .Aspargina se. hidrolizeazd la acid aspartic intr-o reacjie cetalizatS de asparginazd: ■+H2O '■ H?NOC — CH2 — CH — COOH --► HOOG — CH2 — CH — COOH I ' -NHg I NH2 NH2 Acidul aspartic este transformat in acid oxaloacetic in reacjia catalizatd de GOT (vezi dezaminarea oxidativS a aminoacizilor), IX.6.3. IZOLEUCINA, VALINA §1 METIONINA SE DEGRADEAZA LA SUCCINXLCoA Aminoacizii alifatici cu catena rarnificatS valina, izoleucina §i leucina se degradeazS prin succesiuni * de reacjii care conduc la succinil-CoA pentru valind, acetil-CoA: §i succinil-CoA pentru izoleucina, acid acetoacetic §i acetilCoA pentru leucinS (Fig. IX.7). In faza de inceput a degradSrii cei trei aminoacizi parcurg reacjii comune catalizate de enzirne unice: o transaminaza specifics pentru aminoacizi cu catena ramificatS, complexul multienzimatic a-cetoacidehidrogenazS (asemanStor complexului a-cetoglutarat- dehidrogenazd) §i aciLCoA dehidrogenazd (asemdnator acil-CoA dehidrogenazei responsabild de dehidrogenarea acizilor gra§i activaji). Ceielalte reacjii ale cSilor degradative ale ceior trei aminoacizi sunt asemdndtoare dm’ se petrec sub acjiunea unor enzime specifice. Urmdrind succesiunea reacfiilor de degradare din Fig. IX.7 se observd cd in cazul izoleucinei intervine in final transformarea propionil-CoA in succinilCoA; aceasta me loc prin umidloarea succesiune de reacjii: COO~ 1 MetilProprioniimalo- nilCH? — CH3 1 CoA COO" CoAmuta CH2 + HCO~ CO carboxllaza HC — za ____w. CH2 -SCoA CH3 CO CO ~ ~ SCoA SCoA ATP A UP + .MetilPP, maionilCoA 499 Leucina

Valina I CH-NH2 I COOH Transaminare CH3-CH~CH3 I c=o I COOH NAD4, \ I t CoASH NADH +H+V1 *C02 CO ~ SCoA FAD \\ FADH2Vj H2C=C~CH3 l CO"" SCoA HO-HZC-C~CH3 I CO - SCoA AMD* *\ I ( H0H NADH ^V|VCo4Sf/ OHC-CH-CH, i COOH ^ OAvaterff HOOC-CH-CH, i COOH AT ^COASH AMP + PP/Vi HOOC-CH- CH3 \ CO-SCoA Mutaza Izoleucina CH3- CH~GH2 - CH3 CH—NH2 l COOH ^ Transaminare CH3 — OH—CH — CH3 1 c=o I COOH NAD* \ 1 & CoASH NADH +H,*V| * C02 CH- CH— CH2— CH3 1 CO-SCoA PAD

FADH. CH3-C=CH-CH3 j CO - SCoA j^HOH OH CHr CH-CH-CH, I CO -SCoA NAD* \ I NADH +H*V j CH3-CH-CO -CH3 I CO - SCoA . CoASH CH3 CH3 I . 1 CO~SCOA CH2 Acetil-CoA 1 CO~SCoA C02v,, [Mt/faza Succinif - Co A CO-SCoA CH3- CH-CH3 CH2 CH-NH, \ COOH Transaminare CH3-CH 3I CHa CH, I C™ o I COOH NAD* )| f °ASW NADH +H*^/^ ^ C02 CH3“ CH- CH, i CH2 CO ~ SCoA PAD \| FADH2& ^ CH,-C-CH3 il CH-CO - SCoA CO 2*1 II C - CO - SCoA HO ^HOH CHy i C-CH, - COOH

CH.-CO ~ SCoA CH, j* CH, Succinii’CoA Fig.iX.7 ~ Catabolismul aminoaciziior aiifatici cu 1 1 CO-SCoA e = 0 l CH2

I COOH Acetoacetii - CoA catena ramificata 5()0 Metilmalonii-CoA mutaza are drept coenzimS un derivat sintetizat in organism din vitamina Bi2. Dup& produpi degrad&rii leucinei, aceasta nu aparjine grupului din care fac parte izoleucina §i valina; schema ei do degtadare a fost prezentatd totu§i aici pe baza analogiei ■reacjiiior cu ale celorlalfi doi aminoacizi. Metionina este catabolizatd la succinil-CoA printr-un §ir lung de transform dri dintre care unele au fost prezentate in legdturS cu S-adenozilmetionina in calitate de coenzimM pentru transferal radicalilor metil, altele la catabolizarea izoleucinei. In schema din Fig. IX.8. sunt date toate reacfiile transformarii metioninS-succinil-CoA, formulele fiind scrise numai pentru acelea care nu au fost prezentate in aM parte. Homocisteina NH2

I H3C~S~ CH2

-

CH2-CM-COOH

■ATP V S-adenozilmetionina Acceptor / Acceptor metiiat S-adenoziihomocisteina / Hfi Adenozina NH2 I HS-CH2 -CH2~CH~COOH HOOC~CH-CH2-OH i NH2 NH2

I HOOC~CH~~CH2~S-CH2- CH2~CH~ ^H2 Cistationina HOOC -CH- CH2-SH<^

COOH

NH2

^ H2o NH3

o II H3C-CH2-~C-CQQH

A cid cc - cetobutiric CoA - SH CoA A. NAD4 NADH + H* ,0 CH3-CH2- C SCoA Homocisteina Succinil - CoA Fig. iX.8 - Catabolismui metioninei 501 ; ; ;I ■I -I ■:

IX.6.6. LEUCINA §1 LiZINA SE DEGRADEAZA LA ACID ACETOACETIC SAU ACETOACETIL-CoA Degradarea Ieucinei a fost descrisS. la punctui IX.6.5. In organismele animale, dintre diferitele c^i degradative cunoscute pentru lizinft cea prin intermediarul saccharopinft a fost identificatd in float. Pentru a se ajunge la aceto- aeetil-CoA se parcurg nou& reacjii catalizale cle enzime specifice (Fig. IX.9). H i H,N -CH,-CH}-CH,-CH,- C-COOH NH, +a. - ceto glutarat NADPH NADP+ + H+ H i HOOC ~ CH, - CH,- CH2 - C - COOH Acid a- aminaadipic NADH NAD* Acid a - cetagiuiaric \ fc k/y

Acid glutamic HOOC - CH,- CH, - CH,~ C-COOH O O l! H3C-CH^CH-C -SCOA Grotonii - CoA CoASH C02 AT NAD* NADH C02, X H,0 OH O l it H,C-CH-CH,-C-SCOA P - hidroxi - butiril - CoA NAD' NADH COOH l CH2 CH, H 1 i HC-HN - CH} - CH2 - CH, -CH,-C~ COOH I i COOH NH, Saccharopina H,0 + NAD * NADH # t 'F o II Acid glutamic H HC - CH, -CH, - CH, - C -COOH NH, Semialdehida acidului a - aminoadipic O II HOOC - CH, - CH, - CH - C-COOH Glutaril ■ CoA FAD O l! FADH,M y HOOC - CH,-CH^CH-C-SCoA Giutaconii ■ CoA o o ii ii H3C-C-CH,-C-SCOA Acetoaceti! - CoA Fig.!X.9 ‘ CaSea de degradare a lizinei in ficat

Deoar.ece nici acidul aceloaeelic, nici acetoaceUl-CoA nu pot fi transformate in glucozd, leucina §i lizina sunt aminoacizi strict cetogeni. 502 1X6.7. TRIPTOFANUL SE DEGRADEAZA LA ACETIL-CoA §1 ALANIN'A Degradarea are loc pe o cale complicate pe pai'cursul cSreia heterociclul indolic se desface succesiv. De la un intemiediar, acidul 3-hidroxiantranilic, se sintetizeaza cantitSfi mici de vitamina PP; de aceea lipsa.acestei vitamine poate fi suplinita parfial prin iiiptofan. Degradarea este redate in Fig. IX. 10. IX.6.8. FENILALANINA §1 TIROZINA SE DEGRADEAZA LA ACID FUMAKIC §1 ACID ACETOACETIC Cei doi aminoacizi aromatici se degradeaz# pe o cale unic#, specified tirozinei. Fenilalanina se transform# In tirozin# prin hidroxiiare cu 02 intr-o reaejie catalizat# de fenilalaninhidrcxilaz#; coenzima acestei enzime este tetrahidrobiopterina, asem#n#toare structural §i functional cu acizii teu*ahidrofolici: CH2 — CH — COOH O, f' rr riv ll I ^ ■ NH2 ------------...........;- -* 1 .......HQ/VX CH2 —CH — COQH NH» Tetrahidro- Dihidro-biobiopterina (THBP) pterina (DHBP) H

Tetrahidrobiopterina H

OH OH Dihidrobiopterirta In cursul catabolizSrii tirozinei (Fig. IX. 11), o reaejie important# este deschiderea nucleului benzenic sub actiunea homogentizatoxidazei; aceast# reaejie implied participarea vitaminei C, glutationului §i a ionilor Fe2* §i Cu2+. 503

C-CH2-CH-COOH

11 i o NH2 NH-CHO N - formil kinurenina H2O

Formiat

C-CH,-CH-COOH NH2 Nhh Kinurenina

NADPH NADP*

C-CH^CH-COOH II o NH2 MH2 3-hidroxikinurenina

I

Acid 3 - hidroxiantranilic

o2 o

COOH NH2 co2 NH2

I HC ~ C ~C — C ~C ~COOH ll I I I O H H H NAD* NADH NH2 l HQOC-C =C~C^C~COQH l i i H H H HzO NH3

NADH NAD* HOOH - CH2 - CH2-CH2~C -COOH ll o

T Acetoacetil - CoA Fig. IX.10 - Calea de degradare a triptofanului 504

co2 4 - hidroxifenilpiruvat oxidazS HO \ OH

CH2- COOH

Acid homogentizic o2 Homogentizic - oxidaza HOOC - C =C-C-Cf/9 -C-CHi-CQQH I i II HHO O Maieiiacetoacetat izomeraza HOOC-C =C-C~ C//9-C- Ctf? - CQCH l II II

H

H O Fig.-tX.11 - Conversia tirozinei in acid fumaric §i acid acetoacetic 505 :

:U?L; "'jd 4 j' .. lilii IX.6.9. BOLT CAUZATE DE DEFECTE IN UTILIZAREA 'SCHELETULUI DE CARBON AL AM1NOACIZILOR In ■ legiiturft cu catabolizarea aininoacizilor sunt cunoscute un num&r mare de boli cuprinse in categoria larga ale „erorilor inSscute de metabolism". Ele sunt cauzate mai ales de rnodific&i genetice a unora dintre enzimele implicate in cdile degradative specifice. Deoarece enzimele modificate au Km, Vmax, afinitate pentru coenzimii etc., diferile de cele normale, ele sunt, fie lipsite complet de aclivitate, fie eS au aceasta activitate mult diminuata. In conseeinja, cilile calabolice sunt blocate la nivelul acestor enzime iar intermedium antedori se acumuleazd; in concentrajii man ei pot fi toxici sau pot da nagtere la alfi produ§i toxici, care sunt de fapt cauza boliior. In majoritatea cazuriior, aceste boli se manifests foarte curand dupa nastere. DacS nu sunt identificate la limp §i dac5 nu se iau masuriie corespunzStoare multe dintre ele au consecinfe drastice pentm tot restul viejii, iar, uneori, sunt cauza decesului. Exists posibiiitatea identific&rii acestor boli prin semne clinice, analize enzimatice §i ale compugilor toxici acumulaji in sange. Pe de altd parte, deoarece multe dintre enzimele cSilor degradative ale aininoacizilor pot fi detectate in culturile de celule din fiuidul amniolic, este posibil in prezent §i diagnostical prenatal Feniicetonuria. Frecvenja acestei boli este de aproximativ 1 la 10000 nagteri. Forma numitft „clasic2T este datorata unui defect in sinteza piSrJii proteice a fenil-alaninhidro- xilazei; in forma „atipicfC defectul este la nivelul sintezei coenzimei (telrahidrobiopteri- na). Din fenilalanina care se acumuleazil prinlr-o reacjie de transaminare se produce acid fenilpiruvic §i din acesta, in continuare, acid fenil-lactic, acid fenilacctic §i fenilacetilglutamind: COOH I CH— OH Tirozina CH2

NH—CH—COOH

CH I CH i C 2 o NH2

506 Acidul fenilpiruvic §\ toji ceilalji compu§i formaji din el sum toxici in special pentru creier la nivelul cSruia se produc leziuni care sunt responsabile de aga nurnita Jdiojie fenilpiruvidT; se produc, deasemenea, demielinizSri ireversibile. Pe de altS parte, fenilalanina are efect inhibitor asupra tirozinhidroxilazei §i asupra triptofanhidroxilazei, fiind cleci afectate sintezele L-DOPA §i serotoninei. Depistarea precoce a bolii face posibil tratamentul: diets cu confinut redus de fenilalaninii (pentru forma clasicS) §i administrare de tetrahidrobiopterina (pentru forma atipicS), Alcaptonuria: este datoratS unui defect in biosinteza altei enzime implicate, in catabolizarea fenilalaninei §i lirozinei, respectiv homogenlizatoxidaza. Acidul homogenti- zic, care se acumuleazS in sange, trece in urinS; aceasta se inchide la culoare in contact cu aerul datoritS formarii unor produgi de oxidare ai acidului homogentizic; in forme severe se coloreazS §i {esuturile in special cele conjunctive, tot datorinl pigmenjilor formaji din acidul homogentizic. Degi prin ur-inS boala se semnaleazfi din copilSrie, consecinjele ei intre ctire o anumitS form3 de artritS apar dupS treizeci de ani; nu prezintS un pericol atat de mare ca fenilcetonuria. Urina cu miros de ar\ar (Maple syrup disease): boalS datoratS activitSjii scSzute a complexului multienzimatic al a-cetoacid-dehidi'ogenazei care catalizeazS a doua reacfie in catabolizarea aminoacizilor alifatici cu catena ramificatS (valina, leucina, izoleucina). In forma „clasicS‘\ din cauza mutajiilor suferite, activitatea complexului este sub 2% din cea normals, in forma „intermediarS“ activitatea este intre 2-10% iar in forma „intermitentSu se pSstreazS 10-20% din activitate. Mutajiile in cazul abestor forme se rSsfrSng asupra sintezei normale a componenielor proteice ale complexului multienzimatic, S-a stabilit ca exists §i o forma datoratS deficienjei coenzimeior din complex, in special tiaminpirofosfatul (TPP). Indiferent de formS, boala este cauzatS de toxicitatea, resimJitS mai ales de creier (intarzierea dezvoltSrii mintale), a celor trei aminoacizi §i a acetoacizilor corespunzStori, care se acumuleazS. In cazurile severe, dacS boala nu este depistatS §i nu se intervine printr-o diets sSracS in cei trei aminoacizi sau administrare de tiaminS (cand lipsegle TPP-ul), copii care o mogtenesc mor repede dupS naglere. O boala cu manifestSri asemSnatoare este acidemia datoratS aeumuISrii de acid izovalerianic, intermediar in degradarea leucinei; defecl.ul in acest caz este la nivelul izovaleril-CoA-dehidrogenazei. AlSluri de alimcntafie sSracS in leucinS in acest caz are efect adminstrarea de glicinS care reacfioneazS cu acidul izpvaierianic formand un complex iipsit de toxicitate.

Aciduria melilmalonicd: este cauzatS de o dereglare in conversia melilmalonii-CoA la succinil-CoA, reacfie catalizatS de metilmalonil-CoA mutazS, a cSrei coenzimS este 5’- dezoxiadenozilcobalamina. Defectul genetic este la nivelul sintezei acestei coenzime din vitamina BE2, Se acumuleazS acid mei'ilmalonic §i cetane cu catene lungi. Formele severe ale bolii se caracterizeazS prin comS §i §oc In primele saptSmani de viajS. Alte consecinje: hipotonie, hepatomegalie, osteoporozS. Hiperoxaiuria; consta in excrejia urinarS a unor cantitSji mari de acid oxalic, nefroliliazS §i insuficienjS renalS. Cauza aici este o deviajie (datoratS activitSjii scSzute a enzimei a-cetoglutarat-carboxiligazS) spre o calc obignuit. minors a catabolizSrii glicinei, 507 iI; it '■!- J

cale ce conduce la formarea acidului oxalic; acesta formeazfl cu calciul oxalat de calciu insolubil care se depune ca „pietre“ in bazinetul rinichilor sau uretere. Din §irul foarte lung al bolilor cauzate de defect© ale enzimelor ce catalizeazS reacjii ce fac parte din caile de catabolizare ale aminoacizilor se mai menjioneaza hiperproline- miile, histidinemiile §1 argininemiile.

IX.7. BIOSINTEZA AMINOACIZILOR NEESENJIALI IX.7.1. ASPECTE GENERALE S-a arStat anterior c& noun din cei 20 de aminoacizi natural! nu pot fi sintetizaji de cSire organismul urnan (aminoacizi! „esenjiali“ sau „nutri{ionaI indi$pensabili“), arginina fund produsd in caniitaji mici, insuficienie in perioada de credere (semlesenfial). Analog degradarii, in biosinteza aminoacizilor neesenjiali se disting o serie de aspecte generale dar §i numeroase cai particulare datorate, evident, diversit&jii structurale ale acestor compugi. Dup& cum va reie^i, muJte dintre reacfiile proceselor de biosinteza sunt comune cu cele de degradare, dar parcurse in sens invers. Dintre aspectele generale importante sunt: a) Sursele atomilor de carbon; b) Sursa §i modul de incorporare a azotului. a) Din studii realizate in special cu compugi marcaji a rezultat eft scheletele de carbon ale aminoacizilor neesenjiali provin dintr-o serie de intermediary in principal ai metaholismului glucidic: acidul a-cetoglutaric, acidul oxaloacetic (ciclul acizilor tricarboxilici), acidul piruvic §i acidul 3fosfogliceric (glicoiiza), ribozo-5-fosfat §i eritrozo-4-fosfat (caiea penlozofosfajilor). De la fiecare din ace§ti compu^i se formeazft de regulft mai mulji aminoacizi care constituie o familie (Fig. IX. 12). In figurft se redau sintezele tuturor aminoacizilor, dar sintezele.de aminoacizi neesenjiali (valabile pentru organismul uman) sunt numai cele reprezen'tate prin sftgeji nebarate. b) Singura sutsft de azot pentru biosinteza aminoacizilor de cfttre organismul uman o reprezintft amoniacul. O parte a amoniacului format prin degrad area compu§ilor cu azot este utiiizat in acest scop. La aceasta se adaugft amoniacul absorbit din intestin. Caiea cea mai insemnatft de formare din amoniae a grupftrilor amino ale aminoacizilor constft in parcurgerea in sens invers a reacjiilor catalizate de glutamatdehidrogenazft §i aminoatransferaze. Deplasarea echilibrului reacjiilor catalizate de aceste enzime in sens catabolic sau anabolic este decisft de concentrajiile compu§ilor cat §i de acjiunea unor mecanisme de reglaj extrem de eficiente. Astfel, glutamatdehidrogenaza este o enzimft aiostericft (constand din §ase subunitftfi) care au iocusuri specifice pentru mulji modulatori. Reacjia generals catalizatft de glutamatdehidrogenaza, considerand dezaminarea acidului glutamic §i reacjia cu apa a acidului iminoglutaric, este: Acid-glutamic + NAD* (sau NADP+) + H20 Acid-a-cetog!utaric + NH3 + NADH + H*{NADPH + H+) 508 Fan?///<3: - gc/da/a/ g/uri/n/c -gc/du/a/ dOftarP/c ~serine/ -ac/du/ut p/ruric ~am/rwgc/’zf/or aro marie/

Ac/d °c - ce/og/oriric \ ^ G/u... G/ff Pro Arg Ac/d oxa/oaceh’c i Aslfa Ac/d J- P-g//ceric \ Se/\^ Cys G/y Ac/dft/ruric Ari' X A/a Ceu P£P t rir/Prozo~ 4-P 7y/' rip -hisrid/'/je/ P/hozo-d-P iri/s Fig. IX.12 - Schema generals de biosinteza a aminoacizilor pornind de !a infermediari ai metabolismuiui glucidtc Echilibrul reacjiei poate fi deplasat spre dreapta prin activarea enzimei de cdtre ADP §i GDP §i spre stSnga sub acfiunea ATP §i GTP. Activitatea enzimei este controlatd §i prin tiroxind §i hormoni,st.eroizi, inclusiv.prin coenzime: NAD* este utilizatd priori tar la eliberarea NH3 in timp ce NADPH + H+ ia fixarea acestuia (deci in procesul de biosinteza). De pe acidul glutamic, format prin reaejia generaid de mai sus gruparea amino este transferal^ pe alte schelete de atomi de cai*bon, parcurgandu~se tot in sens in vers, reacjiile de transaminare. > Secundar, incorporarea amoniacuiui in aminoacizi are loc prin reacjiile cuplate catalizate de glutaminsintetazd §i un complex enzimatic cu insupi de transaminazd §i reductazd: 509 0 COOH Glutamin< i sintetaza 1 NH2 (CH2)2 + NH5 (CH2)2 + ADP + ATP 1 + Pi CH — HH2 i 1 COOH

CH — NH2 j 1 COOH

2

0 Transamin C^ COOH are. COOH i\ I NH2 i reducere 1 (CH2)2 (CH2)2 + (CH2)2+ + NADPH + H+ | NADPCH — NH2 l CH — NH2 1 C=0I 1 COOH COOH COOH Reacjia cala.lizat.ri de glutaminsintetazS s-a intftlnit §i in iegatuni cu transported amoniacului. Pe de alia parte, aceia§i reacjie serve§te §i la sinteza glutaxninei necesare c&ii de formare a nucieotidelor purinice. Deoarece are aceste funcjii variate in cadrul metabolismului compu§ilor cu azot, reacjia §i enzima care o catalizeaza au fost studiate in profunzime. La cele anltate in capitolul de enzime §i ceva mai inainte in acest capitol, se adauga c& in organismele animate, pe fondul general a1 mecanismelor descrise, intre glutaminsi'ntetazele din fesuturi diverse s-au remarcat diferenje semnificative (num&r diferit de efectori alosterici, sau chiar efectori diferiji). In reacjia cuplati are loc o aminare reductiva a a-cetoglutaratului, donorul de azot fiind glutamina. IX.7,2. CAILE PARTICULARS DE BIOSINTEZA Cele anltate in legfilura cu aspectele generale au cuprins §i sintezele acidului glutamic §i glutaminei. in conlinuare se dau cilile parliculare de biosinteza ale celorlalji aminoacizi neesenjiali, urmand schema generate din Fig. IX. 12. Prolina se simelizeazii din acidul glutamic prin parcurgerea in sens invers a reacjiilor din calea degrudaliva; mici diferenfe apar la form area semialdehidei acidului glutamic care in biosinteza esie calalizatfl de o kinazddehidrogenazii gi la ultima reacfie catalizatft de o dehidrogeiwte cu coenzinte NADPH: 510 Glutarnat- kinazo- | dehidrogenaza

COOH COOH

COOH Calea este reglatd prin feed back, proiina inhiband aiosteric prima enzimd.

Cum s-a ariUat., arginina este un aminoacid semiesenjial. Se admite c& nu sinteza ca atare difera intre perioada de cre§tere §i cea de dupft aceasta ci viteza mult mai mare cu care arginina este transformald in uree In prima perioada. Sinteza, la om, a arginine! se face printr-o suitd de reacjii: COOH COOH COOH I | i l ! 1 aCH—CH—NH2 [ CH— ce NH2 1 NH2 | tf gi ut ' u ATP ar CHNADPH+ ADR H+ NADP at 2 2 GIU l VJ 1 VJ CH2 V y 1 1 —.......... 1 CH2 CH2 ' P,CH2 c° IfO 1 N ' OPO3H2 cx COOH ^H Acid 5Semial fosfodehida glutamic aeidulu i glutami c COOH i CH—NH2 ■ , 1 Ciclul Qj_j ureogenetic I2 CH2 CH2—NH2 Ornitina arginina •Acidul aspartic se sintetizeozS din acidul oxaloacetic prin transaminare, de exemplu in prezenja GOT (vezi catabolismul aminoacizilor). In organismele animale, formarea asaparaginei din acidul aspartic are loc printr-o reacfie numai partial .asemandtoare formftrii glutarninei din acidul glutamic; enzima, asparaginsintetaza,. utiiizeaza insd. glutamina (kept sursS de grupare-NH2, iar ATP este scindat la AMP + PPj . Gin Glu HOQC — CH2 — CH — COOH NH2 H2N - OC — CH2 — CH — COOH AMP + PP, NH, Transform area aeidului 3-fosfoglieeric in seriml are loc prin secvenja de reacfii: 511

COOH 1 CH •— OH Dehidro-genaza NAD+ NADH + H+ COOH I c-o Transaminare COOH 1 CH — NH2 Fosfa- COOH taza | -----CH — NH2 H2C — 0P02H2 H2C — OPO3H2 Acid fosfopiruvic H2C — OPO3H2 Fosfoserina HX — OH Serina participS la sinteza cisteinei in cadrul unui proces complex corelat cu transferul tie radicali metil de cStre S-adenozil-metionin3. Ceddnd metilui unor acceptori, S- adenozil-metioninia se transforms in Sadenozilhomocisteina, care, in reacjie cu serina, formeaza cisteina (Fig.. IX,13): NH, o? to o=> CH, — S — (CHJ, -CH- COOH CH3 OH OH S-adenczilmetioninS NH. Acceptor Acceptor metilat CH,-$- (CHJ,-CH-COOH NH, OH OH S-adenozithomodsteina • H,Q V' ^•^■AdenozinS NH, I S-(CHJ,-CH-COOH CH2-CH -COOH NH,

cistationinS NH, HO-CH,-CH-COOH H2O

-► HS- (CHJ, -CH - COOH NH, homocisteinS HS-CH2-CH~COOH + HO -(CHJ, -CH- COOH I 5 NH, NH, cisteina bomosertna Fig, 1X.13 - Proceseie de metilare cu S-adenoziimetionma sunt coreiate cu sinteza cisteinei din serina Prin reacjia succesivS a unei dehidrataze §i a unei transaminaze, homoserina se transform^ in acid a-cetobutiric, care, prin decarboxilare, conduce ia propionil-CoA §i in final ia succinil~CoA. Prin cedarea fragmentului de un carbon acidului tetrahidrofolic, serina se transforms, in glicocol, reacjia aceasta fiind reversibilS (vezi importanja acestei transfomnSri in Cap. „Vitamine §i coenzime“): 512 CH2 — OH CH2 — NH2 + H2O

CH — NH2 # COOH COOH FH4 W5fN,0-m@tilen FH4 Formarea alaninei din acidul piruvic are ioe prin reaefiile de transaminare (care sunt reversibiie) prezentate la catabolismul aminoacizilor. Biosinteza tirozinei se face de la fenialanind care se hidroxileazd In prezenja fenilalnin hidroxilazei (vezi catabolizarea fenilalaninei §i tirozinei). Deoarece fenilalanina este aminoacid esenfial, formarea in cantitafile necesare a tirozinei depinde de aporlul prin brand a fenilalaninei. Aproape iofi aminoacizii naturali participd, in organismul uman, la formarea unor compu§i cu funcjii variate. In aceastd categoric se incadreazd sintezele hemului §i nucleotidelor, care, datoritd importanjei deosebite, se trateazd in capitole speciale. In capitolul „Hormoni“ a fost prezentate participarea tirozinei la sinteza catecolaminelor §i a hormonilor tiroidieni. Formarea din aminoacizi a altor compu§i specializafi, inclusiv funcjiile acestora, se prezintd in cele ce urmeazd. IX.8.1. COMPU§I REZULTAJI PRIN DECARBOXILARBA AMINOACIZILOR primare numite amine biogene. Enzirnele care catalizeazd reacfiile se numesc decarboxi- laze; unele dintre aces tea au specificitate absolute, allele au specificitate de grup. Toate au snsd aceea§i coenzimd §i anume piridoxalfos fatal. Simplificat, reacfiile de decarboxilare se redau prin;

In realitate, aminoacidul formeazd mai intai o baza Schiff cu piridoxalfosfatul §i sub aceastd formd are loc decarboxilarea; in final, amina se desprinde de coenzimd. Cfiteva enzime biogene importante: Histamina, rezultd din histidind; enzima este L-aminoacid-decarboxilaza care mai catalizeazd decarboxilarea DOPA, 5-hidroxitriplofcinului,' fenilalaninei, tirozinei §i triptofanului. IX.8. FORMAREA DIN AMINOACIZI A UNOR COMPU§I CU FUNCTII SPECIALIZATE In organism, o bund parte dintre aminoacizi pot fi dccarboxilaji; se formeazd amine R — CH — NH2 Decarboxiiaza R — CH2 — NH2 COOH 5.13 Histamina produsd in sistemul nervos are rol de neurotransmitator, dar contxoleazJ. §i presiunea. sanguine (s-a evidential acjiunea bipotensivd la nivelui hipolalamusului). Histamina produsft in stomac are rol de stimulare a secrcjiilor acide. Cimetidina (tagametul), cu formula apropiatS, inhibit competitiv histamina (leg&ndu-se de aceia§i receptor!). In cursul reacjiiior aiergice are ioc, de asemenea, eiiberarea de histamina. Serotonins rezul tail's din triptofan care mai fntai se hidroxileazS §i apoi se decarboxi- leaz£ (tn prezenfa L-aminoacid-decarboxilazei): Hi

CH2-~~CH—COOH NH2

I

Triptofanhiclroxitaza -----N* H CH2—CH —COOH m2 5—hidroxitriptofan GQ2

Serotonins Serotonina se sintetizeazl in sistemul nervos cetral unde are rol de mediator chirnic controland funcjii motorii: senzafia dureroasS., comportamentul sexual. Prodocerea isuficienta sau degradarea rapida la acid metoxi-indolilacetic, care este forma de eliminare din organism, determine slilri depresive, Inhibitor! ai monoamino-oxidazei (MAO), principala enzimfi din calea degradativd, ca acidul lisergic, prelungesc durata de viapl. a serotoninei in organism. Se mai sinfcetizeazS in celule cromafine din alte | esuturi, indeplinind, intre allele, rol de vasoconstrictor §i stimulator al

contracjiei musculaturii netede. Acidul 7-aminoabutilric (GABA), cu formula H2N — CH2 — CH2 — CH2 — COOH, rezulta prin decarboxilarea, care are Ioc numai in sistemul nervos, a acidului glutamic; enzima este specified, glutamat-decarboxilaza. GABA ca gi glicina, sunt neurotransmi{d- tori de tip inhibitor. Fixarea lor pe receptori ia nivelui membrane! post sinaptiee create permeabilitatea pentru ionul Cl™ determinand hiperpolarizarea acesteia. Putresceina (1,4-diaminobutan) §i cadaverina (1,5-diaminopentan) rezuM prin decarboxilarea ornitinei, respectiv lizinei. H2N — CH2 — CH2 — CH2 — CH2 — NH2 H2N — CH, — CH2 — CH2 — CH, — CH2 —■ NH2 putresceina cadaverina Prin condensed intre ele, dar §i cu 1,3-diaminopropanul, rezulta compugi poliaminici mai simpli (spermidina), sau mai compiicaji (spermina). H3N+ — CH2 — CH2 — CH2 — NTH2 — CH2 — CH2 — CH2 — CH2 — N+H3 Spermidina (ionizat&) 514 Poliaminele, datoritd sarcinilor pozitive, se asociazS usor cu ADN §i ARN care sunt poiianioni; xntre efectele acestor asocieri sunt stabiiizarea structurilor acizilor nucleici dar §i stimularea biosin tezei lor. In culturile de celule, poliaminele au rol de factori de cre§tere; sunt, de asemenea, stabilizator! ai celuleior, organitelor celulare §i membranelor. Prin decarboxilarea serinei se formeazS colamina, care, prin meiiiare, formeaziS colina; ace§ti aminoalcooli intrd in structura unor lipide complexe (lecitine, cefaline). Cu acetil- CoA, colina formeazd acetilcoiina care este mediator chimic la nivelul joncjiunilor neurornusculare. Prin decarboxilarea cisteinei se fomieaza tioetanolamina (cisteamina) care este component al coenzimei A. Din acidul aspartic se pot forma doi compu§i de decarboxilare: -a-alanina dacd decarboxilarea are loc la C^; -(Talanina dual decarboxilarea are loc la C£r Totu§i form area p- alaninei, care este de asemenea, component al coenzimei A, nu a fosr identificatd la om; se pare cd aid singura surs&de (3alanind o reprezint£ degradarea pirimidinelor. IX.8.2. BIOSINTEZA GLUTATIONULUI Spre deosebire de muite peptide (care se ohfin prin prelucrarea post traducere a unor proteine, cum este cazul prelucrMi proopiomelanocortinei POM.C), glutationul (7- glutamibcisteinil-glicina) se sintetizeaz3 direct din cei trei aminoacizi. Pentru fiecare dintre Icgftturilc peptidice care se formeazft se consume cate 0 moleculd de ATP. Cele doufi reacjii §i enzimele care le cataiizeazS. sunt: COOH H2N— CH — Y-giutamiiCO— - CH — COOH NH~ COOH ! 1 cisteini i CH2 CH2 sintstaza CH2 CH2 1+ 1 i 1 CH2 SH CH, SH ATP ADP-fPj CH —NH2

CH—NHg

0-O

COOH

CH —COOH | 1

CO— NH™ | 1 OH. 1

COOH y-glutamsicssteina ~CH —CO—NH — CH2—COOH

X 0—

OH. CH2 CH, 1 1 Glutation1 CH2 SH sintetaza H2N — SH 1+ CH2— COOH-^7~S^ CH — ATP ADP+P, CH— NH2 NH2 COOH COOH glutation 515 In ficat §i in rinichi s-a evidential; aceste reac|ii fac parte dintr-un ciclu numit „Y- glutamir care cuprinde biosinteza glutalionului dar §i degradarea sa simultanlt cu transferul aminoacizilor prin membrana celulard (Fig. IX. 14). In acest ciclu rolul esenjial il are enzima y-glutamil-lranspeptidaza (7GT), localizatS in membranS; ea asigurd form area intre acidul glutamic eliberat din glutation §i aminoacizi a unor complexe acid glufamic-aminoacid din care in citosol se elibereazfl aminoacizii §i acidul glutamic. Numeroasele func|ii ale glutationului au fost prezentate in alte capilole.

LX.8.3. SINTEZA CREATINEL RELAJIA CREATINA-CREATINFOSFAT. CREATIMNA Giicina, arginina §i S-adenozilmetonina sunt sursele de carbon §\ de azot ale creatine! (acidul N-metil-guanidin acetic). Prim a reacjie In biosinteza, care are loc numai in mu§chi, este reprezentatS de transferul grupiirii amidice de pe argininS. pe glicind; se fonmeazd acidul guanidinacetic §i ornitina. Reacfia este catalizatS de glicin-amidinotransferaza: CH, — NH NH2 CH?— —C NH2 1^ NH 1 CH2

CH2

1 CH2 + H2N — I CH — NH2

CH2 — COOH

_ / NH2 ' HN = C . + COOH

N

N —CH2—

1

1 CH2 1 CH — NH2 i COOH

1 H COOH 516 in reacjia urmdloare, acidul guanidinacetic este medial de cdlre S~a.denozilmelion.ind: se formeazd creatina; ^NH2 HN « C X N — CH2— C00H S-adenozil metionina S-adenozilhomocisleina / HN NH2 N--CH2—COOH H CH3 ■ creatina Dupd cum s-a vdzut (Cap. „Energetica biochimicd“)> cand concentrafia de ATP din mu§chi este ridicatd creatina este fosforilatd in reacjia catalizatd de creatinfosfokinazd: H / NH2 CPK / N~PO3H2 HN = C + ATP HN - C + ADP X X H — CH2 — COOH N — GH? — COOH CH3

CH3

Creatinfosfatul este singurul compus cu legdturi macroergice pe care organismul il poate depozita in anumite limile §i numai in mu§chi. in debutul unui efort fizic creatinfosfatul reformeazd ATP-ul, tot prin reacfia catalizatd de CPK; eliberarea ATP-ului din creatinfosfat este mai rapidd decat formarea lui pe seama glicolizei sou a lanfului respirator. Creatinfosfokinaza sericd este una dintre enzimele a cdrei aclivitate create mult in infarctul miocardic. Dozarea activitHfii totale a ei §i a izoenzimelor prezinta o mare important peniru diagnostic (vezi Cap. „Enzimeu). O parte din creating (cca. 2% zilnic) este transformatd neenzimatic in creatinind printr- o reacjie de deshidratare: /NH2 HN -C X N — CH2 — COOH CH3 H2O

/ NH — CO HN = C . | X N —• CH2 CH3 creatinina Creatinina se elimind prin urind. Fiind produsd aproape in totalitate de mu§chi, canlitatea de creatinind formats este proporfionald cu masa muscuiard. Pe de altii parte, clearence-ul de creatinind este o metodd simpld, extrem de utild in investigarea funcjiei renaie. IX.8.4, C0MPU§I3 DE „CONJUGARE“ AI AMINOACIZILOR Aminoacizii glicocol, glutamind cisteind formeazd cu o serie de iniermediari sau produ§i final! ai degraddrii unor compugi endogeni sau exogeni complexe care se numesc . „compu$i de conjugare" sau „conjugafi“. Taurina, care se formeazd din cisteind, participd, de asemenea, la conjugdri: 517

I s

■ \ AM ? •;• H2C — SH I HC — NH2 COOH Compu§ii conjugal au diferite funcjjii, de exemplu; Glicocolul §i taurina conjugal acizii biliari, care dup& cum s-a arStat (vezi „Metabolis- mul Iipidelor“), sunt esenfiali penl.ru digestia §i ab$orb(ia lipidelor. Pe de altd parte, glicocolul conjugS o serie de acizi organici de origine exogenH sau endogena. Astfel forma de eliminare din organism a acidului benzoic este benzoii-glicina sau acidul hipuric; in vederea conjugSrii, acidul benzoic este mai intai activat (benzoil-CoA): Cisteindioxigenaza ~T O* H2C — S03H HC — NH2 I COOH H2C-~S03H -► H2C — NH2

co?

Acid hipuric Aminoacizii aromatici cu gruparea carboxil in catena laterals se conjugS cu glutamina; de exemplu acidul fenilacetic formeazft cu glutamina fenil-acetilglutamina: COOH I CH2 — CO — NH — CH — CH2 Fenil-acetil-glutamina CH^ — CO — NH2 Conjugarea cu cisteina, numitS §i „conjugare mercapturic&u este caracteristicS derivator aromatici halogenafi; acizii mercapturici, care se formeazfu se dimind prin urinS. IntrucSt conjughrile au loc la nivelul ficatului, starea funcfionalS a.acestui organ poate fi investigate §i prin capacitarea de conjugare; in acest scop se dozeazft acidul hipuric dupd patru ore de la ingerarea unei doze test de benzonat de sodiu. 518 Cap* X, METABOLISMUL HEMOPROTEINELOR X.l. ASPECTE CHMICE O sene de eompu§i hetopnoteici cu important© fimcjii biologice cum sunt mioglobinele (Mb), Iiemoglobinele (Fill), dtcraomii, catalazele, an ca grupdri pnostetice variante de hem. Qricare found de hem este on derivat substituit §i complexat culler al heterociclului numit. porfind. La baza, stmcturii porfinei stampatru nuclee pirolice legate prin patru pursfi metinice (la nivelul atomilor de carbon a). Important are §i derivatul hidrogenat al porfinei, numit porfmogen, In care punfile metin sunt inlocuile cu punfi metilen: —\f a a V H

Pirol Porfinogen Porfina Porfinogenul §i porfina no apar in stare liberd in organismele vii deoarece in cursul biosintezei se formeazd direct derivafii substituifi ai acestora iar catabolizarea incepe, la r&ndul eL cu deschiderea sistemului tetrapirociclic substituit Precizarea pozijiei substituienplor pe porfind §i porfinogen reclamd modali!d(i precise de numerotare; dintre ceie propose, curent se utilizeazd urmdtoarea (datoritd lui H. Fisher): nucieeie pirolitice se noteazd de la I la IV (Qricare poate fi primal), corespunzdtor, pozijiile lor se numeroteazd L..8 iar carbonii punjilor metinice (metilenice) se noteazd a...5 (Fig. X.l). Derivafii porfinei care au cate on subslituient la fiecare dintre carbonii se numesc porfirine iar derivafii corespunzdtori ai porfinogen uiui se numesc porfirinogeni. Intre ace§tia se . afld protoporfirinele §i protoporfirino- genii care au cate 4 substituienfi metil, cSte 2 substituienfi vinil §i cate 2 resturi de acid propionic. Izomerii numero§i sub forma cdrora existd protoporfi12

Fig. X.1 - Numerotarea nucieelor pirolice §i a atomilor de carbon in porfina §i porfinogen 519 rinele (protoporfirinogenii) 1-a determinat. pe H. Fisher sd-i a§eze tntr-o anumitft ordine notandu-i cu cifre romane. Protoporfirina IX, care impreund cu Fe2+ (pe care il complexeazd) constitute hemui din Hb p Mb (cored hem b), are urmdtoarea a§ezare a substituienfilor: tn poziflile 1, 3, 5, p 8 metil, in pozi|iiie 2 p 4 vinil iar in pozijiile 6 p 7 resturi de acid propionic, Hemui acesta este cel mai rdspandit in organismu! uman (peste 95% din total), Alte hemuri intalnite sunt cel notat a care diferd de b prin substituienfii de la C, p Cg (o catena cu trei resturi izoprenice, respectiv o grupare formil) p hemui c care diferd de b prin substituienpi de la C2 p C4 (ambii radicali etil). Aceste hemuri se arid in stmcturile citocromilor, notafi corespunzdtor a p c. In Fig, X.2 se redd

structura hemului b (care insd, pentru a fi stabile trebuie sd formeze o Iegdturd prin intermedia! Fe2+) p un mod simplificat de redare a acestuia (unde M = metil, V == vinil, P = resturi de acid propionic). Discujia urmdtoare se focalizeazd asupra hemului b. CHS CH ~ CH, .S1 H,C ~K A IV N II CH, / CH, / COOH III CH, CH = CH, / CH, COOH CH, CH,

Fig. X.2 - Structura hemului de tip b p o reprezentare simplificata a.acestuia In protoporfirina IX legdturile simple aiterneazd cu legdturile duble pe intreg sistemul aledtuit din nuclee pirolice + punfi metinice. Conjugarea continue determine planaritatea moleculei. De aceea in hem ionul de Fe2+ este legal in mod echivalent de cei patru atomi de azot ai nucleelor pirolice (legftturi eoordinative). In Hb §i Mb neoxigenate Fe2+ formeazd o aM Iegdturd coordinativa (a cincea) cu un rest de histidina (proximal;!) din globing; in starea oxigenatd a Hb p Mb fierul formeazd o a §asea Iegdturd, cu 02, care se interpune intre Fe2* p o aM histidind din globina (histidina distald) (Fig. X.3). Conjugarea continue a legdturilor in proloporfirind determind p o mare stabilitate a acestui sistem (energie minimd); tot conjugarea explicd p capacitatea ridicatd a porfirinelor de a absorbi radiajii din spectrul vizibil fapt cdruia 11 se datoreazd culoarea specified. Atat porfina, diversele porfine substitute cat p hemui absorb in special radiajiile cu X ~ 400 nm; aceastd bandd de absorbjie se numepe banda Sore! p pe baza intensildiii ei diversele porfirine pot fi dozale. Protoporfirina IX, hemui, alte porfirine, prezintd §i alte benzi de absorbjie (mai pufin intense) in jurul valorilor de 550-600 nm, al caror

520 rf/s (87 °c sau 33/3) N N A

H/s (38 °c sau 63J3) Fig. X.3 - Legaturiie Fe2+ din hemul b cu atomii de azot, 02 §i cu resturile de His din globina nuin&r §i formal depind de multi factori intre care pH-ul, iax* in cazul hemului din hemoproteine de faptul dacd acestea sunt sau nu oxigenate. Prin iradierea porfirinelor cu radiajii situate in banda Soret se ob|ine o puternicd fluorescent ro§ie, care, la randul ei, poate fi utilizatil ca mijloc de dozare. Lipsa conjugMi continue, cum este in cazul copro- §i uroporfirinelor (vezi biosinteza) se traduce prin iipsa culorii. Compugii din care se sintetizeazd hemul in organismele vii sunt extrem de sirnpli: aminoacidul glicoco 1 §i succinil-CoA care este unul dintre intermediarii ciclului acizilor Iricarboxilici. Biosinteza are loe in foate {esuturiie dar cu intensitate mai mare ea se desf8§oar& in celuleie sistemului eritroformator din mdduvd, .ficat §i splind; se disting urmatoarele etape: - sinteza acidului 5-aminoIevulinic; - form area porfobilinogenului; - formarea protopoifirinei IX; - unirea protoporfirinei IX cu Fe2+. Sinteza acidului 5-aminolevuIinic are loc in mitocondrii (unde se produce succinil- ~CoA). Redatd simpiificat, sinteza constd din douS reacfii catalizate de aceea§i enzimd, 8-aminolevulinatsintaza (8-ALAS); mai intai o moleculd de giicocol se coodenseazd cu una de succinii-CoA. formSndu-se un intermediar instabil, acidul a-amino-fL cetoadipic, prin a carui decarboxilare rezuM apoi acidul 8-aminolevuIinic (ALA); X.2, BIOSINTEZA HEMULUI X.2,1. ETAPELE BIOSINTEZEI 521 COOH ~ | 8-ALAS CH—NH2 + CH2 COOH CH2 COA-SH CO-SCoA glicocoi SuccinihCoA COOH CH2 C Hl \ 8 -ALAS

c=0 CjH ~ NH2 C02 COOH acid a ■’amino- - .. p - ceto - adipic COOH CH2

CHt r° CH— NH2 acid - aminolevulinic (ALA) Coenzima 5-ALAS este piridoxalfosfatul. Formarea bazei Schiff in ire aceasta §i glicocoi este obligatorie pentru condensarea succinil-CoA cu glicocolul. CH- O HO v , . SCH?0-PQ3H2

CH-N-CH^COOH

CHrO-POsH2 + H2N~CH3-COOH■H’°

Coenzima baza Schiff 5 -ALAS Eliberarea grupMi amino a ALA are loc numai dup5 formarea aciduiui 5aminolevulinic, printr-o reacfie de hidroiizA ALA trece din mitocondrie in citosol unde se sintetizeazU mai xntai porfobilinogenul. Sinteza constS in condensarea a dou& molecule de acid 5aminolevulinic cu eliminarea a douti molecule de ap3; porfobilinogenul este un derivat trisubstituil al pirolului. Reacjia est.e catalizaiii de enzima 5aminolevulinatdehidrataz&, numitd §i porfobili- nogen-sintazS.

Porfobiiinogen 522 Prima din §irui multelor reacfii In form area protoporfirinei IX constH In condensates a pafru molecule de porfobilinogen cu eliminarea a patru molecule de- amoniac. Produsul condens&rii este: - uroporfirinogenul I, dacd este prezentd o singurd enzimd, porfobilinogende- zaminaza (numitS §i uroporfirinogen I sintazd):

A P \______/ / H2N

fcC H Porfobilinogen - dezamlnaza 4NHS . H J= H2C NH HN s H CH9

Uroporfirinogen l - uroporfirinogenul III, dacd sincron cu poifobilinogendezaminaza acfioneazd enzima uroporfirinogen III eosintazd: A*NS Hfi H HSN Porfobilinogen - . dezamlnaza ' Uroporfirinogen-III- cosintaza 4NH3

Uroporfirinogen HI In mod normal, se objine o cantitate mare de uroporfirinogen III (care este precursor al protoporfirinei IX) §i pufin uroporfirinogen I. Se pare insd cd mai intai se sintetizeazd numai uroporfirinogen I de la care, prin deschiderea ciclului, "rdsturnarea" pirolului IV §i reciciizare s-ar objine uroporfirinogenul III Transformarea uroporfirinogenului III in protoporfirind IX se face printr-o serie de reacfii de decarboxilare §i dehidrogenare. Mai Intai se decarboxileazd cele patru resturi de acid acetic (pozifiile 1, 3, 5 §i 8) sub acfiunea uroporfirinogen decarboxilazei formandu-se eoproporfirinogenul III; acesia txece In mitocondrie, compartiment in care se desfd§oard toate reacjiile urmdtoare care asigurd formarea protoporfirinei IX, dar §i unirea acesteia cu Fe2\ In primal rand resturile de acid propionic de la nucleele I §i II (pozijiile 2 §i 4) sunt decarboxilate, radicalii etil rezultaji fiind dehidrogenafi oxidativ la radical] vinil, reacfii catalizate de aceeagi enzimd, coproporfirinogen oxidaza. Produsul 523 la radical! vinil, reacfii catalizate de aceea§i enzimd, coproporfirinogen oxidaza. Produsul este protoporfirinogenul IX care mai are indS nucleeie

pirolice unite prin punji melilenice (din lipsa unei conjug&ri electronice extinse acest. compus, ca de altfel §i cei precedent, este incolor). Protoporfirinogen oxidaza determine dehidrogenarea protoporfirinogenului IX la protoporfirina IX (care este coloratS ca urmare a conjugarii electronice extinse). Aceste transformed sunt: h: M H2C CH2 H ^NH HN H2CH ^ CH, Uroporfirinogen A ' decarboxiiaza \ ^ 4 CO, PA M HC: AT V A/
M

H If ■A/. 1 V .A/v M Protoporfirinogen oxidaza <■ V6H

M

NV' CH2 CH H2CH K NH HN M -CH2 P M Protoporfirina IX PM Protoporfirinogen IX in celule, formarea hemului prin complexarea protoporfirinei IX cu Fe2+ este catalizate de hemsinletaztl numitli. §i ferochelatazl In vitro aceastft complexare are loc §i neenzimatic dar cu vitezd micl 524 MV \________________________________________________/ M Ferochefataza Protoporftrina IX + Fe -— - - -► P /----------------------------------------------------------------\ P M W /=■ Fe i M Hem (protohem ) X.2.2. REGLAREA BIOSINTEZEI HEMULUI Pe parcursul §irului de reacfii ale biosintezei hemului sunt mai multe puncte de control. Cel mai important se realizeazft, firesc, la nivelul enzimei 5-ALAS, care este comtrolatfl pe cale duhlS; a) prin mecanism alosteric, modulatorul negativ principal fiind produsul final, hemul. Rglarea alostericfl este favorizatil de desf3§urarea in acela§i compaitiment. (mitocondrie) a primelor §i ultimelor reacfii din calea de sintezS; b) prin inducfie-represie, mecanism priori tar dovedit printre altele §i prin timpul de injumiitftfire mic al 8-ALAS (60-80 minute pentru cea din ficat).

Sinteza este indusfi prin scMerea concentrate! hemului in timp ce represia prin cre§terea peste limitele nor- male a concentrafiei acestuia; la represie piulicip^ §i un aporepresor, evident o proteinfl, de care hemul se leagft (Fig. X.4). Sued nil - CoA -t* Ctiefna

Fig. X.4 - Represia prin exoes de hem a 5-ALAS 525 O serie de alji compu§i exogeni sau endogeni au acfiune inductoare asupra 5-ALAS hepatice: barbiturice, insecticide, sulfamide, hormoni estrogeni. Se crede c<1 inducfia este legate in aceste cazuri. de necesit&{i crescule in CiL P-450 care participS la metaboli- zarea inductoriior. Pe de aM pale, glucoza §i alfi hidrafi de carbon au ac|iune represoare asupra sintezei 5ALAS hepatice, element cu important# terapeulicS. In fesuturile eritropoietice hipoxia create activitatea 5-ALAS, fiind farh efect asupra celei hepatice. In afara 5-ALAS, alte enzime implicate In biosinteza hemului sunt supuse reglajului; se menjioneaza ferochelataza inhibatS alosteric tot prin exces de hem. In ultimii ani, s-a arhtat c& existit corelajii Intre vitezele de sintezft ale hemului §ti diferitelor proteine cu care acesta formeazft heteroproteine. De exemplu, hemul influenjeazh viteza de sintezS a globinei in ribozomii specializafi; in iipsa hemului sinteza. nu are loc. X.2.3. PORFIRIILE Reglarea deosebit de eficienta a biosintezei hemului asigurS inclusiv producerea intermediarilor in cantithfi dictate strict de necesitajile de moment ale organismului viu. De aceea, in condifii fiziologice, cantlthtile in exces de astfel de intermediari, care se eliminS prin urinil sau fecale, sunt foarte mici. DeficienJ.ele enzimtice diverse determine sthri patologice caracterizate prin eliminarea crescutS a unora dintre intermediari! din biosinteza hemului; aceste st&ri poartii numele comun de porfirii. Porfiriile cauzate de defecte enzimatice ereditare se numesc primare; cu o excepfie, fiecare porfirie primard este cauzatfl de sinteza d.eficitar& a unei singure enzime din toate ceie implicate in sinteza hemului. Porfiriile seeundare sunt; consecutive alter afeejiuni ca de exemplu intoxieafiile sau diabetul cu acidoziL De§i in majoritatea tipurilor de porfirii defectul enzimatic este prezent in mai multe {esuturi, consecinfele se manifesto prioritar la nivelul unora dintre acestea. Mai freevente sunt porfiriile hepatice, porfiriile eritropoietice, uneori mixte (eritropoietice-fhepatice).

Inainte de prezentarea am&n unfits a porfiriilor hepatice §i eritropoietice o sumarizare a hiosintbzei hemului este necesarS (Fig. X.5). Principalele porfirii. hepatice acute cu determinism genetic sunt "porfiria acutft intcrmitent&”, "porfiria variegata", "coproporfiria ereditarS" §i "porfiria cutanea tarda”. Ele au o serie de elemente comune cum ar fi transmiterea autosomal dominants, manifestarea simptomatoIogicS t&rzie, respectiv la pubertate (deseori rhmanand latentS toata viafa), debut provocat freevent de factori externi, in special medicamento§i (sulfamide, estrogeni, barbiturice, anticoncepfionale). Din punci de vedere biochimic, la debulul oricareia din cele trei tipuri se semnaleazh o eliminate crescuth de acid 8aminolevulinic porfobilinogen in urinh cat §i o activitate ridicath a 5-ALAS hepatice. Pe acest fond comun existri desigur caracteristici clinice §i biochimice pentru fiecare tip de porfirie hepalicS ereditarft, care sunt trecute sumar in revisit in continuare. Porfiria acuta iniermitentS: boala apare la persoane heterozigote pentru gena responsabilh de producerea uroporfirinogensintetazei. Activitatea scftzut# cu circa 50% a acestei enzime la bolnavi faja de normal! determine acumularea tinor cantitSfi crescute. de acid 5-aminolevuIinic §i porfobilinogen care se eliminS prin urind. Cei doi compu§i sunt incolori; in contact cu aerul §i lumina ei se polimerizeazS formand compugi colorafi, ceea ce face ca urina acestor bolnavi s& se inchida ia culoare prin §edere. 526 8 GLICINA + 8 SUCCINIL - CoA Cure at se semnaleazd cre§terea activifcdfii 8- ALAS hepatice in fazele acute ale bolii. Cum s-a ardtat anterior, activitntea S-ALAS este controiatd §i prin mecanismul de tip inducfie-represie care opereazd dependent de concentrafia hemului. Utilizarea masivd a acestuia pentru producerea de cdire ficat a hemoproteineior de tipul Cit P-450, implicate in metabolizarea medicamentelor care declan^eaza „boala, este factorul care determ ind cregterea activitdfii 8-ALAS. La. persoanele fdrd defect in sinieza uropoifirinogen. sintetazei acest mecanism de reglare nu este insofit de cre§terea eliminarii de acid 5-aminolevuIinic §i porfobili- nogen. De curand s-a ardtat cd in porfiria acutd intermitentd se incadreazd §i cazurile, foarte rare, in care defectul enzimotic este la nivelul porfobilinogen sintetazei. Simptomele clinice ale bolii sunt variate: dureri abdominale cu varsdturi, paralizii periferice ce pot cuprinde musculatura respiratorie. Cauza dureriior abdominale este sigur o perturbare a inervafiei vegetative care la nivelul intestinului se manifesto prin peristaltism necontrolat, cu spasme §i dilatapi. Tulburdrile la nivelul sistemului nervos periferic due ia pareze §i paralizii; leziiinile in sistemul nervos central duo, dupd iocalizare, ia Parkinson, psihoze, depresii, halucina|ii. Cer- cet&rile recenie atestd cd, cei pujin la nivelul sistemului nervos, acumularea de acid 8-aminoIevulinic §i porfobilinogen blocheaza ATP-aza Na-K. Porfiria cutanea tarda numitd §i porfiria hepatied cronicd este cea mai freevent intalnitd porfirie. Este cauzatd de deficienja paifiald a uroporfiilnogen decarboxilazei. Caracteristiciie biochimice ale bolii sunt eli min area crescutd de uroporfiilnogen III $i uropoifirinogen I; principal a deosebire fa|d de eeleialte porfirii hepatice este

cd §i la debutul acul al bolii eiiminarea de acid 8- aminolevulinic §i porfobilinogen este doar u§or erescutd sau chiar .normal#. Principaiele manifestdri clinice sunt fotosensi- bilitatea cutanatd (eriteme, vezicule, cicalrici) tulburdri abdominale §i neurologice; ele sunt exacerbate de estrogeni, alcool de unele medi- camente. Analiza de organe reiiefeazd o fluores5 - ALAS *8 CoA + 8 CO, 8 ACID 6 - AMINOLEVULINIC Porfobilinogen sintaza \ ^8HsO 4 - PORFOBILINOGEN Uroporfirinogert I sintaza *-► 4 NH9 W■ UROPORFIRINOGEN I Uroporfirinogen III cosintaza UROPORFIRINOGEN III Uroporfirin ogen decarboxtlaza -^ 4 CO, COPROPORFIRINOGEN II) Coproporfirinogen oxidaza ~~>2CO,+4H PROTOPORFIRINOGEN IX Protoporfirinogen oxidaza " —► 6 H PROTOPORFIRINA IX Ferochelataza ~ - Fe* s 'HEM Fig. X.5 - Schema generaia a biosintezei hemului cenjd intense a ficatului (datorita cantit&filor mari de porfirine) in limp ce eritrocitele §i celuiele mSduvei spinHrii nu sunt fluorescente. Pe baza de date experimentale recente, fotosensibilitatea cutanatd este interpretatS aslfel: cand sunt in exces, uroporfirinogenii I §i HI difuzeazal in piele unde in contact cu lumina (radiajiile din banda Soret) tree in st&ri excitate capabile sd reaejioneze cu 02 din care se produc radicali: -ionul superoxid (02), hidroxil (*OH) §i aljii, inciusiv H202. Ace§tia atacii lizozomii §i alte organite ceiulare; din iizozomi se elibereaztl enzime care ataca Jesutul cutanat producandu-se efecteie menjionafe mai inainte (vezi "Speeii reactive aie oxigenului” in capitolui de energetic^ biochimictl). Copropotfiria ereditara este cauzatd de defectul enzimatic creditor in biosinteza coproporfirinogen oxidazei, enzima mitocondriaia care catalizeaza

conversia coproporfi- rinogenului III in protoporfirinogen IX. Se caracterizeazS prin eliminare renaia (mai pujin prin scaun) a unor cantit2j.i excesive de coproporfirinogen III. In contact cu aerul, coproporfirino- genul III este oxidat rapid la eoproporfirina III, care este coloratd in ro§u. §i in cazul acestei porfirii, la debut se eliminS cantitdji crescuie de acid ^-aminolevulinic §i porfobilinogen. Sub acest ultim aspect, ca §i din punctul de vedere al debutului (administrarea de medicamente ca barbituricele §i tranchilizantele), inciusiv a manifestSrilor clinice (dureri abdominale §i afeejiuni tile sistemului nervos), coproporfuia ereditara. se aseairulna cu porfiria acuta intermitenta. Tabloul clinic al hold este complectat insS cu fotosensibilitatea cutanatl Porfiria variegata sau protocoproporfiria ereditara are drept cauzft, dup2 unii autori, numai sinteza defectuoasd a protoporfirinogen oxidazei. Dupd aljii, la acest defect se adaugd §i o incapacitate de sinteza a ferochelatazei. Boala apare rar §i numai in zona Africii de Sud. Biochimic se manifest# prin excrejia excesiva de protoporfirin#, coproporfirin# III, uroporfirina §i - numai la debut - de acid 5-aminolevulinic §i porfibilinogen prin urinS, uroporfirinS, eoproporfirina §i protoporfirin# prin fecale. AlSturi de ace§ti precursor! ai hemului apare §i o porfirinS atipicii, notat# X, hidrofild, ce are ata§at un rest peptidic. Eliminarea de intermediari este uneori crescut# §i In stilri latente. Plasma acestor bolnavi are o fluorescent ro§ie intense. Simptomele clinice sunt asemanStoare cu ale coproporfiriei ereditare, inciusiv fotosensibilitatea cutanatil Porfiriile eritropoietice sunt ’'porfiria eritropoietial congenital#” §i "protoporfiria". Porfiria eritropoietic# congenital# este o boal# rar#, al c#rei defect metabolic primar este sinteza defections# a uroporfirinogen III cosintetazei. Ca urmare, se produc cantitftji mari de uroporfirinogen I §i coproporfirinogen I care se elimin# prin uriml §i fecale. Ca §i in cazul porfiriilor hepatice, porfirinogenii se oxideaz# rapid la porfirinele corespunza- toare, urina c#p#tand o culoare ro§ie §1 prezentand fluorescent sub aejiunea radiafiei ultraviolete. Fluorescent# prezint# §i eritrocitele. Diagnostical diferenjial faj# de porfiriile hepatice se bazeaz# §i pe faptul c# eliminarea urinar# de acid 8-aminolevu- iinic §i porfobilinogen este normal#. Acumularea de uro- coproporfirinogen I In eritrocite diminu# durata de viaj# a acestora (prin hemoliz#), sc#zand §i depozitele eritrocitare din m#duva osoas#. Create eliminarea de bilirubins. Cei doi porfirinogeni 1 difuzeaz# in fesuturi, in special in piele, caitilaje §i rinichi. Clinic se constat# hepatomegalie, fotosensibilitate foarte mare cu producere de eriteme §i vezicule care las# cicatrici. Uneori apar deformajii la faj# §i maini. Depozitele mari de porfirinogeni I (care se transform# In porfirine I) din clinji determin# colorarea in ro§u a acestora §i fluorescenja la iradieri cu ultraviolete; acestea sunt alte caracierisfiei care servesc diagnosticului timpuriu al bolii. Protoporfiria este determinate de deficient sintezei ferochelazei §i este asocial# chimic cu producerea de urticarii in urma expunerii la Iumin#. Eritrocitele, plasma §i fecalele conjin ca.ntit#Ji mari de protoporfirina IX, iar reticulocitele (eritrocitele tinere) §i pielea prezint# fluorescenja ro§ie. 528

Coproporfiriile secondare sunt mult mai frecvente decaf cele determinate genetic. Multe boil intre care hepatitele, anemia pernicioasd, ca §i intoxicajiite'cu metale grele (plumb) sau cu suhstanje organice (benzen, alcool, tetraclorurd. de carbon) pot duce la elimindri crescute de porfirine. In bolile hepatice cu coiestazd se gdsesc deseori uro- §i coproporfirinogenii de tip I, In general, mecanisrnele producerii coproporfirinogeniilor secondare nu sunt cunoscute. in intoxicajiile cu plumb se pare cd are loc o substitute a fierul ui cu plumbui. Dupd caz, sinteza hemului in mdduva osoasd §i ficat este mai mult sau mai pufin perturbatd. X.3 CATABOLISMUL HEMULUI X3.1. ETAPELE INIJIALE Hemul din diferitele hemoproteine se catabolizeazd printr-un mecanism unic dar cu viteze diferite in primele etape. La om §1 la animale de experienjd carora li s-a administrat glicind sau acid 5-aminolevulinic marcaji radioactiv s-a constatat aparifia in limp a cloud maxime de producere a bilirubinei, principalul intermediar in degradarea hemului. Primul maxim apare la circa trei zile §i el corespunde formfmi §i degraddrii parjiale a hemoproieinelor nehemoglobinice, in particular a Cit. P-450 §i -cataiazei; cel de al doilea maxim apare in cazul gobolanilor in intervalul 40 la 80 zile de la adminis- trarea precursorilor radioctivi ai hemului. La om, al doilea maxim, care cuprinde circa 75% din radioctivifatea administrate, apare dupd 120 zile. Aceastd bilirubind derivd numai din degradarea Hb gtiut fiind cd durata de viafd. a eritrocitelor este chiar de 120 zile. Catabolismul hemoglobinei eritrocitare incepe odatd cu ruperea membranelor celulelor imbdtranite. Corespunzdtor celulelor care se distrug, la un om adult, se degradeazd zilnic in jur de 6 g Hb, respectiv 300 mg hern. Hb eliberatd in plasmd este fagocitatd de macrofagele sistemului reticuloendotelial, in special ale ficatului, splinei gi ganglionilor limfatici, sediul principal al catabolismuiui. Exists controverse referitoare la inceperea degraddrii hemului; unii afirmd cd procesul are loc numai dupd desprinderea acestuia de globind; mai susjinutd de date experirnentale este interpretarea cd primele reacfii ale catabolismuiui au loc inaintea desprinderii hemului de componenta proteicd. Primele reacjii ale degraddrii conduc la deschiderea pe cale oxidativd a inelului porfmic din hem; oxidarea se face la carbonul metinic a gi carbonii a din nucleele pirolice I gi II. Ea se realizeazd cu G, sub acjiunea cataliticd a hemoxigenazei microzomiale fiind necesard prezenja NADPH gi a Cit. P 450, uitimul In calitatea lui de component al lanjului transporter de electroni microzomial. Intermedia! se obfine a-hidroxihemina, compus in cam fierul este in stare oxidatd, Fe3+; sub acjiunea in continuare a 02 are loc •scindarea propriu-zisd, carbonul metinic fiind eliminat sub formd de CO iar atomii de Ctt din nucleele pirolice I gi II sunt oxidaji la grupdri carbonii. Compusul acidic oxidat al hemului, legat ined de globind, se numegte verdoglobind. Urmeazd desprinderea din verdoglobind a globinei gi a Fe3*; compusul tetrapirolic acidic oxidat, care devine liber, se numegte biliverdind. Globina eliberatd poate fi reutilizatd pentru sinteza hemului sau este hidrolizatd la aminoacizi. Fierul va fi utilizat imediat pentru biosinteza de hem sau va fi depozitat sub formd de feritind ori siderofilind.

Hem (iegat de giobina) a - HldroxfhemmM (legata da giobina) Verdogiobina

' X.3.2. BELIRUBINA; FORMARE, PATR.UNDERE IN FICAT, CARACTERISTICI, CONJUGARE, EXCREJIE BILIARA Cataboiismal hemului continufi cu reducerea biliverdinei la bilirubind; aceasta reacjie este catalizatS de biliverdin-reductaza (coenzimS NADPH). Bilirubina are culoare galben-orange foarte intense Biiiverdin reductaza Biiiverdina p?— ► NADPH + H* NADP+

Biiirubina Deoarece bilirubina este cel mai important dintre intermediarii degradMi hemului structura §i proprietSjile ei au fost intens studiate. In comparable cu biiiverdina, bilurubina este mai pujin polarS la pH-ul fiziologic. Pe baza datelor objinute la difracjia

Fig. X.6 - Starile posibile ale bilirubinei in fiuidele biologice: A - asociata prin legaturi de hidrogen interne; B - cu iegaturiie de hidrogen desfacute; C - sub forma de dianion 531 razelor X prin cristale de bilurubin! s-a stabilit c! formula "linear!" utilizat! curent nu red! detaliile structurale; in realitate grup!rile carboxil ale resturilor de acid propionic formeaz! legSturi de hidrogen atat cu grup!rile carbonil ale celor dou! nuclee pirolice marginale cat §i cu hidrogenul de la atoinii de azot ai nucleelor pirolice centrale. Dac! aceast! structure se menfine §i in fluidele biologice, se expfic! de ce bilirubina este foarte pufin solubil!. Desfacerea parfial! a leg!turilor de hidrogen §1 ionizarea grupdrilor carboxil nu este exclusa. Echilibrul celor trei forme posibiie ale bilirubinei in mediile biologice este reprezentat in Fig, X.6.

Etapa urm&toare a cafabolismului hemului are loc in ficaf; deci bilirubina format! in alte fesuturi decfU ficatul, este transporta hi spre acesfa, Datorit! insolubilitSfii ei, transports prin sange se face sub forma de complex solubil bilirubin!-albumin! serie!. Recent s-a anltat cl aibumina serial specifics, are mai multe locusuri de legare a bilirubinei. La pH-ul fiziologic de 7,4 este ocupat complet un singur locus (legarea la acesta se face rapid §i reversibil) §i intr-o m!surl mult mai micl un al doiiea locus, La valori de pH mai mici bilirubina se poate lega, cu randamente mici la inc! dou! locusuri. Legarea bilirubinei de albumin;! poate fi inhibat! de o serie de medicamente cum sunt sulfarnidele §i unele antiinflamatoare ca §i de substanfe de contrast utilizate in colangiografie. De asemenea, prezenja. in plasm! a unor cnntit^Ji mari de acizi gra§i liberi determ in! modificSri conformajionale majore in slructura album inei serice, avand ca rezultat diminuarea capacitiljii de legare a bilirubinei. Din motivele menfionate, probabil §1 din altele inch necunoscute, capacitatea de legare a bilirubinei de dire aibumina serid este Limitat! (circa 25 mg bilirubin! legat! in sangele unui adult). Dad bilirubina produs! in alte Jesuturi decat in ficat depa§e$te capacitatea de transport de dtre sange, ea difuzeaz! in {esuturi. Cu toate d bilirubina este deslul de puternic legal! de albumin!, ea este extras! cu ugurinj! din sange de cStre. ficat. P!trunderea in hepatocite a bilirubinei se face in form! liber!, aibumina transportoare rdmanand in plasm!. Desprinderea bilirubinei de albumin! este facilitat! de interacjia complexului cu receptorii de albumin! situaji la suprafaja celuleior hepatice. In ce prive§te mecanismul trecerii bilirubinei prin membrana hepatocitului, date experimentale numeroase confirm! existenja unui transporter specific (o protein!). Deoarece nu se consum! energie §i nici nu este nevoie de prezenja ionilor de Naf procesul este o difuzie facilitat!. Aceast! difuziune are loc numai dad bilirubina' este ionizat! (Fig. X.6); dovada o constituie inhibarea printr-un proces competitiv a difuziunii bilirubinei de c!tre o serie de compu§i organic! cu structuri asem!n!toare, care se afll in form! dianionid. Odat! phtruns! in hepatocit, bilirubina este complexat! de c!t:re dou! proteine notate Y (numit! "ligandin!") §i Z. La concentrafii mai mici ale bilirubinei ea se leag! aproape exclusiv de proteina Y, proteina Z - cu afinitate mai mic! - intrand in ac{iune numai la concentrafii crescute ale bilirubinei. vStudii recente arat! c! ligandina, care reprezint! circa 5% din proteinele citoplas- matice ale hepatocitelor, este neunitar!. Exist! cei pu|in trei variante dintre care unele leag! mai mulfi compu§i ca medicamente, hormoni, alfi dianioni asem!n!tori bilirubinei; unele au chiar !nsu$iri enzimatice. Prin complexarea bilirubinei de c!tre cele dou! proteine este impiedicat! atat iegirea ei din hepatocite cat §i p!trunderea in organitele celulare; acest din urma aspect are o mare importanj!, studii in vitro efectuate in ultimii ani demonstxand.c! bilinibina inhib! respirafia mitocondrial!, efect complet pre.venit de prezenfa ligandinei. In vederea excrefiei biliare a bilirubinei, ea este trecut! din nou intr-o form! solubil!; de aceast! dat! are loc esterificarea unuia sau ambelor resturi propionil cu acidul glucuronic. Introducerea radicaiilor glucuronil se face prin reaefia bilirubinei cu

532 UDP-glucuronatuI In prezenfa UDP-glUcuronil-transferazei care face parte integrants din membrana microzomialS. Se objin bilirubi-nmonoglucuronidul §i biiirubindiglucuronidul care la un loc poartS numele de bilirubina "conjugate". Biiirubindiglucuronidul se ohfine §i printr-o reacfie de dismutare intre douS molecule de bilirubinmonogiueuronid: ^ Bilirubina

b) Dismutaza .......... 2 Bilirubinmonogiueuronid *- -Bilirubind/giucuronid + bilirubina In ficat forma principals a bilirubinei conjugate este de monoglucuronid. In prezent se §Ue cS in ficat exists mai multe glucuronii transferaze. Cea care asigurS conjugarea bilirubinei catalizeazS §i conjugarea unor steroli; activitatea ei este indusS de substrat (bilirubina) dar §i de fenobarbital. Bilirubina conjugate este transportatft, printr-un mecanism activ, in canaliculele biliare. Capacitates de transport este midi in raport cu cea de conjugate, astfel incat ea se constituie ca un mecanism limitaiiv cu rdsfrangere asupraintregului metabolism al bilirubinei. ' . Spre deosebire de hepatocite, in biiS cea mai mare parte a bilirubinei este sub formS de diglucuronid. X.3.3. ETAPELE FINALE Ultimele etape ale degradSrii hemului au loc in intestin unde bilirubina conjugate ajunge prin intermediul bilei. In ileonul terminal §i in intestinal gros, resturile de acid glucuronic sunt indepdrtate sub aejiunea (3gIucuronidazei produsS de bacteriile intestinale; bilirubina liberS este supusS unor reaejii de reducere succesive catalizate de reductaze produse tot de bacterii. Primul compus obfinul prin reducere, care datoritS 533 lipsei conjug&rii nu are culoare, es'te urobilinogenul (mezobilirubinogen). O parte midi din urobilinogen este redus in continuare la stercobilinogen, de asemenea, incolor. Stercobilinogenul §i in micft nnlsurii urobilinogenul sunt eliminaji prin fecale, In contact cu aerul ei se oxideazS partial (dehidrogeneazd) trecand in urobilind, respectiv stercobilind, care sunt compu§i coIorajL Cea mai mare parte a urobilinogenului este reabsorbitd din intestin; ajuns

prin circulajia portal#. la ficat (circuiafie enterohepaticii) este reexcretat prin bill. O midi parte din urobilinogenul reabsorbit se eliminli pe cale renal#. O reabsorb{ie creseul# trndus# printr-o eliminare renal# de asemenea crescut#, cuplate cu instabilitatea urobilinogenului in urina acid#, constituie un indicator al metabolism ului bilirubinei. Pe de ait# parte, absenja urobilinogenului in fecale §i urin# indie# o obstrucfie complete a canalului biliar. Reacjiile finale ale catabolismului hem ului §i structurile compu§ilor corespunz#tori sunt redate in continuare (E este —CH2—CH3): BUirubina conjugate ^+»acid glucuronic BUirubina 4H M EM P P MM E M EM P P MM E \ y x_______/ \_____/ \_____/ x x \_______x \_____/ \_____/

Urobilinogen

Stercobilinogen

Urobilina Stercobilina X.3.4. HIPERBILIRUBINEMIILE La om, concentrajia normal# a bilirubinei serice totale este cuprins# intre iimitele 0,41 mg/100 ml. Nu se cunosc cazuri de scSdere marcat# a bilirubinei sub limita inferioar#. In schimb, sunt frecvente cazurile depii§irii limitei superioare; in aceste situajii bilirubina din sange trece in Jesuturi. Colorarea intense in galben a pielii §1 mucoaselor este un semnal clinic primar al acestor st#ri cunoscute sub numele comun de icter. Cauzeie dep#§irii nivelului normal al bilirubinei serice sunt diverse: cre^terea vitezei de formare a bilirubinei (deci a degrad#rii hemoproieinelor): scdderea capacitdjii de captare a bilirubinei de c#tre ficat; sc#derea capacit^Jii ficatului de a conjuga bilirubina; perlurbarea mecanismului eliminflrii prin hil#; tulburari extrahepatice ale fluxului biliar. 534 Patologia metabolismului bilirubinei este complex# deoarece, frecvent, acjioneazd simultan mai mulji dint re factorii enumerafi. inainte de prezentarea principalelor forme de icier se face precizarea cd din punct de vedere clinic este deosebit de important raportul bilirubind neconjugatd/bilirubind conjugal# din plasm#. Concentrafia celor doud forme se stabile§te pe baza reacfiei cu acidul diazobensulfonic (reacjia Van den

Berg); fracfiunea care formeazd imediat cu acest reactiv un compos de cuplare de cuioare ro§u-purpuriu se nume§te bilirubind "direct#", cea care reacJioneazS nurnai dupii adaosul de metanol (sau acetond) se nume§te "indirect#". Bilirubina directs corespunde formei conjugate, cea indirect# este forma neconjugatd, legat'd de albumina sericd. Reacjiile acestea nu sunt foarte specifice; s~a demonstrat prin alte metodte cd raportul normal in plasmd pentru bilirubina neconjugatd/ bilirubina conjugate este de 30/1 in timp ce reacfia Van der Berg dd o valoare mai micd a acestui raport. (circa 10/1), Funcjie de tipul de bilirubind prezent in plasmd, se disting hiperbilirubinemii cu bilirubind neconjugatd (de Mreien(ie") §i hiperbilirubinemii cu bilirubind conjugate (de "regurgitare"); in anumite cazuri, in pLasmd apar in concetrajii crescute ambele tipuri de bilirubind. 1) Hiperbilirubinemiile cu bilirubina neconjugatd pot fi cauzate de oricare dintre primii trei factori enumeraji anterior (sau o asociere a lor). a) Cazul cel mai frecvent este "icterul neonatal" considerat a 0 "fiziologic". Practic fiecare nou-ndscut ire astfel de icter, in jur de 50% fiind declaraji clinic. Din stu'dii epidemiologice a rezultat cd ia circa 5% dintre nou ndscuji bilirubinemia este mai mare de 15 mg/100 ml, ia aproximativ 16% este peste 10 mg, la ceilalji fiind in jur de 5-6 mg. Dupd primeie trei zile, bilirubina incepe sd scadd revenind la normal in 7-10 zile. Cauzele icterului neonatal sunt hemoliza acceleratd corelatd cu o "imaturitate" a ficatului de a prelua, conjuga §i excreta bilirubina. Capacitatea de conjugare este in primal rand afectatd deoarece ficatul nu sintetizeazd cantitatea de UDP-glucuronat necesard conjugdrii. Complicalii in aceste cazuri pot apdrea la concentrajii plasmatice ale bilirubinei de peste 20 mg/100 ml; bilirubina neconjugatd este capabild sd strdbatd bariera hematoencefalicd producand encefalopatia toxicd sau kernicterul. Prin capacitatea sa de a induce metabolizarea bilirubinei, fenobarbitalul are efect favorabil (ca de altfel §i in alte forme de icter). b) Sindromul Crigler-Najjar dedip I este o boald ce se datoreazd unui defect genetic cu transmitere autosomal recesivd; defectul constd in incapacitatea ficatului de a sintetiza UDP-glucuronil transferaza specified pentru conjugarea bilirubinei. Cum s-a ardtat, eliminarea bilirubinei prin bild nu se poate face decaf sub formd conjugatd. De aceea, bilirubina se acumuieazd in sange unde concentrajia rdmane ridicatd (de reguld peste 20, uneori ajungand la 50 mg/100 ml ser). Eliminarea de urobilinogen este foarte redusd, Funcfiile ficatului, i-nclusiv conjugdrile altor compu§i nu sunt alterate. Pdtrunderea bilirubinei in sistemul nervos central cauzeazd modifiedri profunde (kemieter), determinand moartea in perioada neonatald. Se citeazd totu§i cazuri de supra viefuire pan# in jur de 20 ani. Fenobarbitalul, in calitatea lui de inductor al metabolismului bilirubinei, este fdrd efect in acest sindrom. Oarecai*e efecte are fototerapia (k = 425475 nm); se pare cd prin iradiere bilirubina este fragmentatd in compugi polari, eliminabili pe cale renald. c) In sindromul Crigler-Najjar de tip II defectul creditor in sinteza UDPglucuronil transferazei (transmitere autosomal dominantd) este nurnai partial. O complicate (tot de naturd genetied) pare a fi conjugarea bilirubinei la bilirubin diglucuronid. In sange se

535 arid, de asemenea, numai bilirubina libera dar concentrajia acesteia nu depd§e§te 20 mg/100 ml ser. Tabloul clinic este mai pujin sever fajd de sindromul Crigler-Najjar de tip I. In primul rand semnele nu apar decat in tinereje §i la adult. Nu apar complicajii la nivelul sistemului nervos central. Pe de aM parte, doze mm de fenobarbital amelioreazd boala fund stimulate cre§terea depozitului de bilirubina in ficat, sinteza de proteine Y §i Z, cregterea fluxului biliar. d) Sub denumirea de boala lui Gilbert sunt euprinse un grup heterogen de tulburdri ale captarii bilirubinei de c&tre ficat §i ale mecanismului de preluare a bilirubinei conjugate de cdtre canaiiculele biliare. In unele cazuri aceste tulburari sunt insqfite de o activitate sedzute a UDP-glucuronil transferazei, in allele de o duratS de viajd mai mica a eritrocitului, deci o produejie suplimentard de bilirubina. Au fost semnalate mutajii In seevenja proteinelor Y §i Z §i modified!*} in capacitatea de ionizare a bilimbinei. In medic, bilirubina seried nu depd§e§te 3 mg/100 ml dar exists fluctuafii destul de insemnate; ia ace§ti boinavi, created peste valoarea medie se seinnaleazd in slresuri diverse, exereijii fizice, in infbmetare (dupd circa 48 ore). Patogenaza acestor procese nu este complet Idmuritd. e) Bilirubina iiberd din ser create de asemenea, in intoxicajii diverse ("hiperbiiiru- binemia toxicS"): cu cloroform, telraclorurd de carbon etc. 2) Hiperbilirubinemii cu bilirubina conjugate: a) In icterul numit "obsfcructiv" acumularea bilimbinei conjugate in sange §i difuzarea ei in {esuturi este urmarea blocMi parjiale sau totale a canaleior biliare; mai freevent blocarea se produce prin formarea de calculi (litiaza biliard), cazurile mai rare fiind datorate tumorilor sau congestiilor in aceastd zond. Dacd obstructs canalului biliar este totald, in intestin nu se mai afid urobilinogen, scaunul este decolorat. Ace§ti derivaji ai bilirubinei nu se elimind nici prin urind. Nu sunt ined. pe deplin cunoscute mecanismeie prin care bilirubina conjugate trece din canalele biliare sau eeluleie hepatice in fluxul sanguin. b) Icterul "idiopatic cronic” (sindromul Dubin-Johnson) este cauzat de un defect genetic transmisibil, al secrejiei bilirubinei conjugate (dar §i al|i compu§i conjugal!) din eeluleie hepatice in capilarele biliare. Bilirubina seried este in mod curent pujin crescutd (2-5 mg/100 ml, rareori mai mult), dar din aceasla peste 50% este conjugatd. Sindromul apare rareori inaintea pubertdfii. Culoarea ficatului este foarte inchisd datorid form&rii unui pigment care este destul de asemdndtor melaninei. c) Sindromul Rotor se deosebe§te numai partial de sindromul DubinJohnson in sensul lipsei pigmentului brun din hepatocite. 3) Hiperbilirubinemii cu ambele forme de bilirubind: a) Icterul "hemolitic" apare freevent §i ia aduiji. Distrucjia anormald a eritrocitelor poate avea diverse cauze intre care §1 anemia pernicioasd. Degradarea masivd a hemoglobinei este posibild datoritd inductibilitdjii hemoxigenazei. Ca urmare create bilirubina neconjugald din plasmd. Dacd hemoliza este foarte puternied, in plasmd (§i deci in jesuturi) create §i bilirubina conjugatd, deoarece, cum s-a ardtat. mai inainte, etapa limitantd de vitezdin cataboiismul hernului este reprezentatd de trecerea bilirubinei conjugate din eeluleie hepatice in bilk Degradarea masivd a hemoglobinei se

traduce in acest caz §i printr-o eliminare crescutd de urobilinogen prin fecale §i urind. Hemoliza avansaid este compensate parpial printr-o intensificaie a eritropoiezei in mdduva osoasd. b) Icterele "hepalocelulare" apar in suferinjele hepatice diverse cum sunt hepatita acutd virald, puseele evolutive ale hepatitelor cronice, hepatopatiile alcoolice §i cirozele hepatice. In toale aceste cazuri sunt afectate atat captarea, glucuronoconjugarea ciit §i excrejia bilirubinei. Raportul intre bilirubina conjugatd §i cea din plasmd este diferit de 536 la o afecfiune la alta §i depinde in toate cazuriie de gravitates bolii. Cele mai mari created ale bilirubinei totale se semnaleazd in hepatita aculd virala, valoarea ei putfmd atinge chiar 20 mg/100 ml plasm<1 In aceastd boald paralelismul concentrafiei bilirubinei eu activitatea unor enzime seriee (GOT, GPT §i GIDH) este evident: cre§terea eoncentrafiei bilirubinei §i a activitdpi acestor enzime in perioada de 1.0-14 zile de la debutul bolii §i revenirea treptatd Sa normal dupd 6-8 sdptdmani. Dacd hepatita virald este Tnsojitii de fenomene colesiatice pronunfate, scauneie devin palide §i urobilinogenul dispare din urM (in lipsa colestazei el este decelabil la acest. nivel). Reaparijia urobilinogenului in urind coincide cu reluarea fluxului biliar §i reflects inceputul vindecdril. Cregterile bilirubinei in puseele hepatice cronice §i in ficatul gras de etiologie alcoolicd sunt rareori peste 2-3 mg/100 ml plasmd; in cirozd, bilirubina totald variazd intre valoarea normal# §i 3-4 mg/100 ml plasmd. Cap. XI. METABOLISMUL NUCLEOTIDELOR PURINICE §1 PIRIMIDINICE Nucleotidele purinice §i pirimidinice sunt biomolecule fundamentale pentru toate organismele vii, participdnd la procese esenjiale: - sunt componente structurale ale acizilor nucleici, ARN §i ADN, macromolecule informa|ionale; - nucleozideie trifosforilate, in particular ATP, prin leg&turile fosfat macroergice participd la tranzacjiile energetice celulare; - nucleotidele ciclice, 3\5’-AMP §i 3\5’-GMP, au roluri reglatoare ale funcjiilor celulare, sunt mediator! ai mesajelor extracelulare; - derivaji ai nucleotidelor ca CDP-colind, CDP-diglicerid, UDP-glucozS, UDP- glucuronat, sunt intermediari activi in procese biosintetice; - coenzimeie NAD, NADP, FAD, CoASH cuprind in structura lor §i un nucleotid cu adeninl In Tabelul XI. 1. sunt prezentate denumirile §i prescurtMIe celor mai important compu§i din aceastii clasd, baze, nucleozide §i nucleotide. In capitoiele anterioare au fost tratate pe larg, structurile chimice §i funcjiile unora dintre nucleotidele purinice §i piiimidinice. In capitolul de fat'd se va prezenta biosinteza, interconversiunile §i catabolismul acestora. XLL METABOLISMUL NUCLEOTIDELOR PURINICE Rolul major ai nucleotidelor purinice este acela de components ale acizilor nucleici §i distribujia purinelor (ca §i a pirimidinelor) in aceste macromolecule se realizeazd prin rnecanisme genetice. Metabolismul general al organismului trebuie $3 asigure existenfa unui fond'cuprinzand cantitatea §i varietatea de nucleotide necesare sintezei de ADN §i ARN, Acest fond se reaiizeazd:

- prin sinteza de novo a ribonucleotidelor; - conversia parjiala a ribonucleotidelor in dezoxiribonucleotide; - interconversiunile nucleotidelor; , -reutilizarea bazelor purinice, a nucleotidelor ce rezultd prin degradarea celulard a acizilor nucleici. Toate celulele cuprind ARN §i pot reutiliza, dupft unele remanieri, prod.u§ii de degradare. Sinteza de novo are ioc aproape in exclusivitate in ficat de unde produ§ii final! sau unii intermediari sunt preluafi de cdtre fesuturile extrahepatice. Se pare cd eritrocitele joacd un rol important in acest transfer. Fracfiunea de nucleotide purinice in exces fajd de nevoi este converted in acid uric, catabolit final excretabiL 538 Baze. nucleozide §i nucleotide purinice fi pirimidinice Tabei XU, Baza

Nudeozid (baza + riboza)

Nucfeotid Nudeozid monofosfat (NMP)

Adenozin a Guanozin a

Acid adenilic, AMP Acid guanilic, GMP Acid inozinic, IMP Acid xantilic, XMP -

Nudeozid difosfat (NDP)

Nudeozid trifosfat (NTP)

A DP

ATP

GDP

GTP

-

-

XDP

XTP

UDP

UTP

CDP

CTP

TDP

TIP

Purina Adenina (6-amino-purina) Guanina (2-amino-6-hidroxipurina) Hipoxantina (6hidroxi~purina) Xantina (2,4-dihidroxi-purina) Acid uric (2,4,8-trihidroxipurina) Pirimidina Uracii (2,4-dihidroxipirimidina) Citozina (2TiidroxP4-aminopirimidina) Timina (2,4-dihidroxi-5-meti!pirimidina)

Inozina Xantozin a -

Uridina Citidina Timidina (cu dezoxirib oza)

Acid uridilic, UMP Acid citidilic, CMP Acid timidilic, TMP

Acid orotic (2J4-dihidroxi“p! Acid orotidilic, Orotidina rimidin-6*carboxiiat) OMP XI. 1.1. BIOS.INTEZA DE NOVO A NUCLEOTIDELOR PURINICE Biosinteza IMP Materiile prime pentru sinteza nucieului purinic sunt reprezentate de aminoacizii glicind, acid aspartic, glutamind, dioxid de carbon, unitSji Crtetrahidrofoiat. Prin utilizarea de precursor! marcaji cu 15N §i 54C s-a stabilit originea fiecdrui atom din nucleul purinic (Fig. XI.1). Totodatd, aceste studii au demonstrat c& pdsfmie, mamiferele §i aile specii utilizeazd aceleagi reacfii pentru sinteza nucleotidelor purinice. Riboza este funiizatd de glucozd pe caiea penlozofosfajilor.

Asparfat N1°~For mil~FH^

Glufamina FN-Mete nilFig. XI.1 ■- Precursorii nucieului purinic In aceastd cale biosin teticS nu se formeazd haze purinice iibere ci direct ribonucleotide. Leg&tura P-N-glicozidicS se stabilegte cu mult inaintea constituirii nucieului heterociclid. Primul ribonucleotid al secvenjei de novo cuprinde baza purinic# hipoxantina (6-hidroxi-purin#) §i poartd denumirea de acid inozinic sau inozin monofosfat (IMP). De ia IMP se objin apoi nucleotidul cu adenin# (AMP) §i cel cu guanin# (GMP). In Fig. XI.2. este prezentaid succesiunea de reacjii care, pomind de la 5-fosfo-ribozS conduce la IMP. Reacjia (1) const# in activarea restului ribozil la 5-fosforibozil-a-1 -pirofosfat (PRPP), catalizat# de PRPP sintetaz#. PRPP este un compus cheie in metabolismul nucleotidelor, este precursor §i al nucleotidelor pirimidinice. De asemenea, PRPP furnizeaz# restul 5-P- ribozil §i in reacjiiie de reciclare a bazelor purinice. PRPP sintetaza este supus# acjiunii reglatoare a diver§i factori. Cu urmStoarea reacjie, (2), incepe de fapt caiea specified sintezei purinelor. Gruparea amidied a glutaminei inlocuiegte restul pirofosfat din PRPP rezultand 5-fosforiboziI-(I-l- ainind. De remarcat schimbarea a —► (5 a configurajiei C, al ribozei §i constituirea viitoarei leg&turi jl-N-glicozidicd a nucleotidelor. Atomul de azot introdus este N9 puiinic. Enzima, amidofosforilx)zil transferaza, este cel de al doilea panel de control al secvenjei. 540 541 ®~0~ CM, hi OH OH PRPP ®oAM ATP P y_ 4 2

0H GLUT AM IN A ® '

CHz

n | UOTAtlAT a VSl V H*A Sjii¥Q-(?>)-Q OH OH m H lC$ ^ h 1 (f)-o ~ c 0*Ctt w 9 ^ ,0K NHZ OH 7f ,HH3 H

HH oJC!f NS,M°t10rEHiL \ fOLAT tiffOL AT H NH • i -ode t^ HC-HHJ A hi) GH OH ATP ADPfPi OH OH to'LkAA. ~ooc \ CH HC V I AsparfoT fyM -Qoi -OOC / Hu mo rot 0 OOC li HCHCX'\ _ i H ji x Pu -OOC X® /7 0 J ®\\ © /* —^-- CH^=^—«<- |i CH 3 vi y QIQT/NA U/ >h HN

H/80ZA‘5~P\ \R/BOZ4'S-P piaozA^S-p HZN yL\r'N< N/0-FORM ic HL ©-7 0 11 X HZN^ Ny / CH-

TOUT

%4a.rr

(?=»cx c y Hi 0 H *° J ym V*J ’ I li HL / i y -JVP \R!SQZ4-5-P JP/SOFA^-P j Fig. X1.2 - Biosinteza IMP j P/80ZAS-P. • RiBO ZASP A Ghjfom/ T no ~p P t 1 q G/u^orr * ~)oc + © . H PO 4r

^ R/80ZA-5-P; I Prin condensarea 5-P-ribozilaminei cu glicinS (reacfia 3) se introduc atomii C4, C3 §i N7 ai nucleului purinic. Reacfia consume ATP §i dace la formrea de 5P-ribozil- glicinamidS. In reacfia (4) gruparea C, formii cedatS de N5,N10 - metenil-tetrahidrofolat

introduce un nou atom de carbon (C8 purinic). Se formeazS 5-PribaziI~N»formilglicinamidii. O nouS moleculS de glutaminS cedeazS gruparea amidicS (reacfia 5) rezultSnd un derivat amidinic ( — C = NH), 5-P-ribozd-N-fonnilgUcinamidina. NH2 Acest nou atom de azot este N3 purinic. UrmeazS o reacfie de condensate, reacfia (6), dependents de ATP, prin care se inchide nucleul heterociclic imadazolic. Noul metabolit este 5’-Pribozil-aminoimidazol. Prin carboxilare directs (reacfia 7) se introduce atomul Q purinic, rezuitand 5’-P- ribozil-aminoimidazol-carboxilat. In urmStoarele douS reacfii acidul aspartic furnizeazS atomul N5 purinic. Are loc o condensate, dependents de ATP, cu formarea 55 -P-ribozilaminoimidazol-succincar- boxamidS (reacfia 8) urmatS de eliberarea fumaratului (reacfia 9) §i formarea 5’-P- ribozil-aminoimidazol-carboxamidS. In reacfia (10), N10-formil-tetrahidrofolat introduce atomul C2 puiinic formandu-se 5’- P-ribozil-formamidoimidazol-carboxamidS. Prin eliminarea de apS intre grupSrile formii §i amidS (reacfia 11) se inchide nucleul hexagonal, constiduindu-se ribonucieotidul purinic, inozin monofosfat (IMP). Sinteza de novo a IMP, pe iangS materiile prime amintite, necesitS prezenfa ionilor Mg2\ K+ §i ATP. Se consumS §ase legSturi ~P, secvenfa este exergonicS ireversibilS. Biosinteza AMP §1 GMP IMP, produs al cSii biosinletice de novo, nu are roiuri ca atare, el este convert!! mai departe in AMP §i GMP, ribonucleotidele funcfionale. Fracfiunea de IMP care nu este transformatS in AMP §i GMP este catabolizatS in acid uric §i excretatS. In Fig. XI.3. sunt arState reacfiile de transformare IMP —» AMP §i IMP —> GMP. In secvenfa IMP —» AMP, gruparea aminicS din acid aspartic tnlocuiegte- gruparea oxigenatS din nucleul purinic. Intr-o reacfie dependents energetic de GTP se formeazS acid adenilosuccinic care eliberand acid fumaric dS na§tere la AMP. Transform area IMP —» GMP are loc tot in douS etape. Se introduce mai intai funcfia oxigenatS la C2 cu formarea intermediarS a nucleotidului cu xantinS (XMP); in a doua etapS, cu consum de energie furnizatS de ATP, glutamina cedeazS gruparea amidicS care inlocuie§te funcfia oxigenatS de la C6 rezultSnd GMP. Fiecare din cele douS secvenfe necesitS energie furnizatS de un nucleotid trifosfat, sinteza de GMP consumS ATP, iar cea de AMP utilizeazS GTP, Acest fapt oferS posibilitatea controlului reciproc al sintezei nucleotidelor cu adeninS §i cu guaninS. 542 COON ■*\ HC| HOOC OH k

GDftR

®- Rikozi/ ■ A aof ac/en//o^s ucc/n/c 4c/eni/o succ/na/ H/n/e>toza \ Ajmaraf

( x/rP )

0 /\ x

/v*

GrtP Fig. Xi.3 - Biosinteza AMP §s GMP din IMP 543 Biosinteza nucleotidelor cu leg&turi fosfat macroergice •Nucleozid difosfajii (NDP) §i nucleozid trifosfajii (NTP) cuprind cate una §i respectiv, cate dou& grupdri Reacfia primary de incorporate a energiei metabobce in aceste grupSri ~P este fosforiiarea oxidative de la nivelul lanfului respirator sail de la nivel de substrat: A DP + Pi -----------------------------ATP + H20 prin care se formeazft ATP din ADP. Fosforiiarea din ciclul acizilor tricarboxilici genereazfi GTP. Prin transferul ~P din ATP pe un nucleozid difosfat pot fi obfinute celelalte nucieozide trifosforilate: ATP + NDP ■—ADP+NTP Reacfia este catalizatS de nucleozid difosfat kinaza. LegStura -P din NDP rezultil prin reacfia; ATP + NMP ---------------------------► ADP + NDP cataiizatS de nucleozid monofosfat kinaze. Adenilat kinaza (miokinaza): ATP + AMP 2 ADP este larg distribuitft §i are roluri importante In utilizarea potenfialului energetic al sistemului adenilic. Biosinteza dezoxiribonudeotidelor Sinteza de ADN are loc numai in faza S (de sintezS) a ciciului celular care preg&te§te celula pentru diviziune. In celelalte faze concentrafia intracelularS a dezoxiribonucleoti- delor este foarte midi. Dezoxiribonucleotidele sunt obfinute prin transformarea unitafii ribozil din nucleozid difosfafi in 2’-dezoxiribozil (Fig. XI.4). Echivaienfii reducdtori de pe NADH sunt transferafi pe o protein^ micfi cu grup&ri -SH, tioredoxina, care trece in forma redusd, ditiolidk Mai departe, sub acfiunea ribonucieotid reductazei are loc reducerea restului ribozil la dezoxiribozil. Reglarea biosintezei de novo a purinelor Biosinteza de novo a nucleotidelor purinice trebuie sa asigure concentrafii celulare adecvate ale acestor compu§i pentru sinteza de acizi nucleici. Un mecanism reglator asigurft cantilatea de IMP §i un altul repartizarea acestui nucleotid intre AMP §i GMP. Transformarea nucleozid monofosfafilor in trifosfa.fi, ATP §i GTP, este controlatd de incJtrcarea energetic^ celularfi. 544 bozo baza

OH OH Ribonuaboz/R . rec/acfaza

Rihonucfeoz/cb tf/bo&fcrY M^zOx/r/bonuafeoz/c/ ov'r&s/cy/ T/orecfax/nb 07/ SH |Tiorec/oxina

Fig. Xi.4 - Biosinteza dezoxiribonucieotidelor Metabolitul cheie al biosintezei nucleotidelor purinice este PRPP §i prin diverse meca- nisme este reglald atat formarea cat §i utiiizarea sa. Nucleotideie AMP, GMP, ATP, GTP, produ§ii finali ai biosintezei de novo, ac| ioneaz& ca efectori negativi asupra PRPP sintetazei §i asupra amidofosforibozil transferazei (Fig. XL5), enzime de a c&ror activitate depinde concentra{ia PRPP. De asemenea, disponibilitajile de substrate sunt factori de reglare. Pentru PRPP sintetaza concentrajia celulard de 5-P-ribozS determine viteza de reacfie. Alte nucleotide care utilizeazd PRPP ca precursor, nucleotideie pirimidinice, NAD, FAD, CoA, inhiba PRPP sintetaza, gradul de inhibifie depinzand.de concentrafia tolaId a acestor compu§i. Amidofosforibozil transferaza este reglatd atat de concentra|ia substxatului, PRPP, cat §i de produ§ii finali. Enzima poate exista intr-o formd monomericd active catalitic, §i 545

una dimericft, inactive Cre§terea concentrate! PRPP promoveazS depoHmerizarea asocial cu activitarea enzimei; nucleotidele purinice acJioneazS, In sens opus, dimeri- zarea enzimei §i sc&derea eficienjei catalitice, Glutamina, cosubstratu! amidofosforibozil transferazei, accelereazS reacjia §i create fiuxu! de metabolic pe caiea biosinteticSL TransformSrile IMPAMP §i IMP GMP sunt regiate prin inhibiS-ie feed-back de produ§ii finali (Fig. XI.5). In plus, nevoia de ATP pentru sinteza de GMP §i de GTP pentru objinerea de AMP, face posibilS func|ionarea unui control pozitiv §i reciproc. Prin aceste mecanisme concentrafiile nucleotideior cu adeninS §i guanind sunt corelate cu nevoile celulare. XU 2. INTERCONVERSIUMLE §1 REUTILIZAREA PURINELOR Acizii ribonucleic! sunt continuu degradaji, ARNm cu vitez& mai mare, ARNr inai tncet. Legftturile S’-S’-fosfodiesterice sunt scindatederibonucleaze. Nucleotidele eliberate din ARN, impreunft cu acelea obfinute prin sinteza de novo sau din purine exogene, alc&tuiesc un fond metabolic comun accesibil tuturor celulelor. In cadrul acestui fond au 546 loc diverse transform Sri §i interconversiuni prin care se realizeazS raportul optim intre nucleotide pentxu sinteza de aclzi nucleici. Fracfiunea de purine in exces faja de nevoi va fi transformat.5 in acid uric §i eliminate din organism. Nucleotidele pot fi transfoimate in nucleozide prin hidrolizS, catalizatS de 5’- nucleotidaze sau de fosfataze nespecifice.

PURINA

PURINA HDfyo 0 OH OH Pe aceastd cale se formeazS inozina §i guanozina: IMP + H20 -> inozinS + P, GMP + H20 -> guanozina + Pf Reacfia: AMP + H20 adenozina + P-t are o contribute neinsemnatS.in metabolismul AMP. Adenozina se formeazSin jesuturile mamiferelor mai degrabS prin scindarea S-adenozil-homocisteinei, produs secundar al reacfiilor de metilare cu S-adenozil-metioninS. Nucleozidele purinice sunt scindate la baze printr-o reacfie fosforiliticft, cataliza.Pl de nucleozid fosforilaze: PURINA HONpC 0 4 * ^ OH ON

PURINA 7/ * )-p- f?iiozo Reacfia este u§or reversibill. In sens fosforilitic este utilizail pentru eliberarea guaninei din guanozind §i a hipoxantinei din inozinSL Adenina nu este, practic, eliberatif din adenozina pe aceastl cale. 547 O alts transformare pe care o pot safer! purineie libere sau derivajii lor este dezaminarea, prin care o funcfie ~NH2 este tnlocuitS cu una oxigenatil Reacfia poate avea loc la nivel de nucleotid, nucleozid sau bazS purinicS (Fig. XI.6). Dezaminarea AMP la IMP, sub acjiunea AMP dezaminazei, este ealea cea mai probabilS de metabolizare a AMP:

Guanin dezaminaza (guanaza) transforms guanina in xantina:

548 549 AMP dezaminaza H20 Pi GMP IMP -i------------- - | __H20 5 -Nucleotidaza j T —----------------> ^ Pi Guanozina Pi Inozina NH3

NH3

H2 O H2 O

V_ AMP i 5 - AdenozK- homocisteina \. H2O — Pf 5-Nucleotidaza

Adenozina ATP 1-P-Ribozd--tr=^j Guanina Nucleozid fosforilaza

Adeno Adenozin zin f dezamina i j 1 kinazd za 1-P-Riboza Hipoxantina .HGPRT Nucleozid fosforilaza PRPP~^A pp i —/ / HGPRT H20 Guanaza H20, NH2(H)^ Xantina H20-^ 2(H)—< Xantin^ oxidaza PRPP- PPj — V^ADP 1-P-Riboza Adenina • (IMP) APR! Xantin oxidaza -PRPP — PPi Add uric Execretie prin urina (mp) Excretie prin urind Fig. XI.6 - Cai de interconversiune, reutilizare §t catabolizare a nudeotidelor purinice.

Homociste/nd La. mamifere este absents, enzima care transforms adenina in hipoxantinS. Jin&ndu-se seama de distribujia §i activitSfile enzimelor, cSile principale prin care sunt eliberate purinele din nucleotide sunt: SintezS de novo x IMP X AMP §i GM r Guanozi —yr—Guanina P na H2O Pi Pi 1-P-Riboza 7-T H,0 P; Inozina Hipoxantina Riboza Guanina §i hipoxantina sunt purinele eliberate in cursul metabolismului nucleotidelor la mamifere. Adenina se formeazS in cantMfi extrem de mici. Purinele libere sunt reincorporate, in cea mai mare pane, in nucleotide $i utilizate din nou pentru sinteza de acizi nucJeici (salvage pathway). Guanina §i hipoxantina neutilizate sunt catabolizate la acid uric. Adenina este excretatft ca atare prin urinS (Fig. XI.6). Reutilizarea bazelor purinice (salvage pathway) Se cunosc dou& c&i de reincorporare a bazelor purinice in nueleozide §i/sau nucleotide. 1) Condensarea bazei purinice cu PRPP §i formarea directa, a ribonucleotidului, reacjie catalizata de fosforiboziltransferaze:

Purina PP; ©OH? c 0 PHR/HA OH OH jOuc/eo//c/ Exists o enzima specified pentru adenina (APRT) §i o alta pentru guanina §i hipoxantina (HGPRT). Cea de a doua este rdspunzdtoare de reciclarea continue a guaninei §i hipoxantinei care se formeazatn cantitriji apreciabile in organism. 550 2) incorporarea purinei In nucleotid in dou5 etape: HOHz C O

2a! H0H2 C 0 POR/NA HO OH /-P- Riboza i-PURINA — b-@ xr

HO OH Nuc/eozicf -h Pi catalizatA de nucleozid fosforiiazil §i

PLSR/NA PU&/MA Nuc/eozicf ~ ATP A DP

Nucfeo^'cf catalizatft de nucleozid kinazft. Calea 2 (2a + 2b) are o important minora in reciclarea purinelor. Reacfia 2a, reversibilft, este utilizat£ in sens catabolic (<--); reaepa 2b servegte la fosforilarea adenozinei. Reutiiizarea bazelor purinice are loc in toate fesuturile fiind un proces mult mai economic decat sinteza de novo. Pornindu-se de la purin& §i l-P~ribozft se cheltuiesc douft leg&turi ~P fa|& de 7 necesare sintezei de novo. XI.L3. CATABOLISMUL PURINELOR Bazele purinice, endogene sau exogene, care nu sunt incorporate in nucleotide sunt transformate in acid uric §i eliminate pe cale renaLL Acidul uric (2,6,8-trihidroxi-purina) are ca forma stabilS cea lactam (cetonicS):

551

Se formeazft din hipoxantinS §i din xandnii prin oxidare sub acjiunea xantin oxidazei: 0

0

Nan/zha

Xantinoxidaza are o structure dimeric# §i o mas# de aproximaliv 275 kdaltoni. Cuprinde dou# molecule de FAD, 2 atomi de molibden §i 8 atom! de fier care particip# ia transpoitul intermediar a! echivalenfilor reducStori pan# la dioxigen. In cursul acestei reacfii are loc reducerea monoelectronic# a dioxigenului (02 + e -> 0'2) §i formarea ionului superoxid, surs# potential# a altor radicali ai oxigeiiului. La mamifere, xantin oxidaza este abundent# in ficat §i in intestin. Enzima hepatic# acjioneaz# asupra bazelor purinice de origine endogen# (prove nite din acizi nucleici sau prin sintez# de novo) (Fig. X1.6). Enzima intestinal# transform# purinele objinute prin digestia acizilor nucleici din alimente. Acestea sunt hidrolizate sub acjiunea nucleazelor pancreatice §i intestinaie la nucleotide. Nucleotidele sub acjiunea nucleotidazelor (sau fosfataze nespecifice) tree in nucleozide. Nucleozidele pot ft absorbite ca atare sau sunt scindate fosforilitic la baze. Studii cu precursori marcaji au ar#tat c# la om purinele formate pe aceast# cale sunt transformate in mucoasa intestinal# in acid uric, iar pirimidinele sunt oxidate la cataboliji finali. Rezult# c# bazele din acizii nucleici exogeni nu sunt incorporate in compu§i lisulari. Acidul uric astfel format este in parte absorbit §i in parte eiiminat, dup# ce sufer# uncle transformdri in prezenja florei bacteriene. La mamifere, acidul uric este un caiabolit final, reprezint# forma de elirninare a azotului purinic. La alte specii, p#s#ri, reptile, acidul uric joac# rolul §i de caiabolit al azotuiui proteic. Astfel de specii sunt denumite uricotelice, fa{# de ureoteiice care elimin# azotul proteic ca uree. Uricotelismul reprezint# o adaptare a viejuitoarelor la un media s&rac in ap#, acidul uric pujin solubil este excreta! in state semisolid! Eliminarea de uree u§or solubil#', antreneaz# pierderi mari de lichide din organism. Jinandu-se searna de cele arittate mai inainte, acidul uric se formeaz# din: - nucleotidele exogene $i sinteza sa tire loc in intestin; - nucleotidele AMP §i GMP rezultate prin degradarea acizilor ribonucleici

eelulari; - nucleotide provenite prin sintez# de novo (IMP, GMP, AMP) §i neutilizate la form area de acizi nucleici, ca urmare a unui dezechilibru. intre sinteza §i nevoi. Acidul uric ate dou# funejii acide, una mai tare 9 cu pK = 5,75, repiezentat# de gruparea = N — H §i alta cu pK = 10,3, = ik — H. In plasma §i lichideie interstijiale acidul uric se gSsegte ca sane monosodic#: Acidul uric este un campus greu solubil in ap#, monouralul de sodiu fiind ceva mai solubil. Plasma, cu un conjinut de Na+ de 0,13 M este saturate in monourat de sodiu la o concentrate de 6,8 mg/dl. Aceasta corespunde de fapt valorii mijlocii a uricemiei (6,9-7,5 mg/dl la b#rba[i §i 5,7-6,6 mg/dl la femei).

0” No 552 Elimiftarea renaiS a monouratului de sodiu este un proces complex, desfS§uratin palm timpi, filtrare glomerularS, reabsorbfie tubularS, secrejie §i reabsorbfie tubuIarS postsecretoiie. Pe mSsurS ce procesui de acidifiere a urinii progreseazS uratul trece in acid uric. La un pH = 5,75 uratul §i acidul uric coexists in cantitSji egaie iar la pH < 5 predominS acidul uric, mai pujin solubil. Excrefia de acid uric in 24 ore este de 400-600 mg. Acidul uric este o substanfS u§or oxidabiia §i prin capacitatea sa de a capta radical! liberi este incriminat ca factor protector faJS de agresiunea oxidants continue la care sunt expuse majoritatea {esuturilor organismului. Cele mai multe dintre mamifere posedS o enzimS, uricaza, care transforms acidul uric in alantoinS:

,4 c/cf ur/c

COp H, N I H N

0 H H 4 fanfo/no Enzima este absents tocmai la acele specii (om, maimufS) care nu pot sintetiza acid ascorbic, Se considers cS funcfia antioxidants a acidului uric ar compensa incapacitatea unor organisme de a sintetiza acidul ascorbic, compus major al potenfialului antioxigenic. XI.1,4. PATOLOGIA METABOLISMULUI PURINELOR Guta este o maladie a cSrei tulburare biochimicS majors este hiperuricemia. Clinic se manifests prin dureri aitritice episodice sau cronice, nefrolitiazS §i depozite de acid uric in {esuturi moi (tori guto§i). Guta primarS este determinate de o eroare metabolicS ereditarS prin care se sintetizeazS acid uric in exces (majoritatea cazurilor) sau este incetinit clearance-ul acidului uric (gutS renalS). Hiperuricemia mai poate sS aparS ca o consecin{S a alter (ulburSri (guts secundarS.). Turnoverul rapid al acizilor nucleici (leucemii, anemic hemoliticS, iradiere) este asocial cu hiperuricemii. Cre§terea concentrapei uratului in sange §i in Iichidele interstijiale, depS§irea pragului de solubilitate, determinS precipitarea uratului monosodic, in primul rfind in jurul articulajiilor de la exlremitSfi. Reacfia inflamatorie declan§atS de cristalelc de urat fagocilate de leueocite stS la baza crizelor de artritS gutoasS. La nivel renal este favorizatS formarea de calculi de urat §i, in urinile mai acide, de acid uric, Mecanismele patogenice ale hiperuricemiei sunt heterogene §i complexe. Cre§terea 553 I*;

i'i

j I 111 ! ■; • ; y ; concentrajiei PRPP, metaboiit cheie in sinteza de novo §i la reutilizarea bazelor purinice, este factoml etiopatogenic principal al hiperuricemiei. Cre§terea fondului de PRPP este rezultatul unei sinteze crescute sau incetinirii rilmulai de utilizare. Au fost descrise mai mulle deficite enzimatice care mSiesc fondul de PRPP §i, respectiv, determina hiperuricemie: a) Variante de PRPP sintetaza cu activitate catalitica crescuta sau cu sensibilitate redusft la inhibifia prin produ§i finali. b) Deficient de HGPRT, enzima cheie a reutilizdrii guaninei §i hipoxantinei. c) Deficient de glucozo-6-fosfataz5; absenfa acestei enzime impiedicS eiiberarea glucozei din glucozo-6~P §i acesta din urmft este pompat pe calea pentozo~fosfa{ilor cu producere in exces de ribozo-5-P, materia prima din care se objine PRPP. Hiperuricemiile, primare sau secundare, suntcorectate prin administrareade alopurinol. Acest. produs, analog structural al hipoxantinei OH JL H C / N H OH HC x II H V | II /CH Alopurinol Hipoxantina inhiM xantinoxidaza §i impiedicft transformarea hipoxantinei in xantina §i a acesteia din uimd in acid uric, in aceste condifii, hipoxantina §i xantina sunt excretate drept cataboli|i finali ai purinelor. Hipoxantina §i xantina sunt mult mai solubile decat acidul uric, nu se depun in jesuturi, evit&idu-se efectele nocive ale hiperuricemiilor. In plus, hipoxantina §i xantina in exces favorizeaz& conversia lor in ribonucleotide (sub acjiunea fosforibozUtransferazei), cu scfiderea concentrajiei PRPP §i mic§orarea fluxului de metaboliji spre sinteza de novo. Sindromul Lesch-Nyhan este caracterizat prin hiperuricemie severa §i prin maiiifestari neurologice bizare, agresivitate, tending de automutilare, deficient mintaia. Deficitul biochimic, bine caracterizat, consta in deficienja totaia a hipoxantin-guanin-fosforibozil transferazei, cu pierderea capacitnjii de reutilizare a bazelor purinice. Ca urmare, crejte concentra{ia PRPP §i ritrnul sintezei de novo. Gena defecta este situata pe cromozomul X §i deficitul enzimatic complet se manifesta numa^la bM>afi. Bazele biochimice

ale manifestarilor neurologice nu sunt cunoscute. XL2. METABOLISMUL NUCLEOTIDELOR PIRIMIDINXCE Nueleotideie pirimidinice au roluri similare cu acelea purinice §i metabolismul acestor corapu§i prezinta mulle elemente comune, aiaturi de triisaturi specifice. a) Bdzele pirimidinice sunt sinietizate din precursor! simpii, aminoacizi §i C02 (Fig. XI.7). 554 Glutamina C U C°2

-As par tat Fig. XI.7 - Precursor!! nucleului pirimidinic b) 5-Fosforibozil-a-1 -pirofosfat (PRPP) este precursor al restului 5-P-ribcziI din nucleotidele primidinice, dar iegdtura N-glicozidicd se realizeazd dupd constituirea nucleului pirimidinic (nu inainte ca in cazul nucleotidelor purinice). c) Fondul de unitdfi Ct-FH4 furnizeazd gruparea metil din timing. d) Biosinteza de novo a pirimidinelor este inhibatd a tat de nucleotide pirimidinice cat §i purinice. " e) Produgii de degradare a aciziior nucleici -tisulari pot fi reciclafi. La pirimidine funcjioneazd mecanisme eficiente de reutilizare a nucleozidelor §i mi a bazelor. f) Dezoxiribonucieotidele pirimidinice sunt obfinute in mod similai' cu acelea purinice. XI.2.1. BIOSINTEZA DE NOVO A NUCLEOTIDELOR PIRIMIDINICE Sinteza nucleotidelor pirimidinice utilizeazd ca materii prime aminoacizi, C02, unitdfi active C|, PRPP (Fig. XI.8). Prirnul metabolit ai cdii, carbamil fosfatul, este comun §i pentru ureogenezd. Exists xnsd doud fonduri de carbamil fosfat, unul mitocondrial, ureogenetic, §i altul citosolic, pirimidinogenetic. Enzimele care genereazd carbamil fosfat sunt distincte, utilizeazd surse diferite de azot, NH3 cea ureogenetic a §i glutamina cea pirimidinogenetica, reaefia (1); C02 + glutamina + ATP —► H2N - CO~P + ADP + glutamat Prima reacfie specified biosintezei de pirimidine (reaefia 2) este catalizatd de aspartat transcarbamilazd §i conduce la form area aciduiui carbamilaspartic. Prin condensarea aeestuia din urmd (reaefia 3) se inchide nucleul heterociclic §i dupd dehidrogenare (reaefia 4) se obfine un campus pirimidinic, acidul orotic (2,4-dihidroxi-6-carboxi- pirimidind), In reaefia 5 are ioc transferal restului 5-P-ribozil din PRPP pe acidul orotic rezultand un nucleotid-acid orotidilic (orotidinmonofosfat, OMP). Enzima care intervine

555 fffafsmma c% o Gtete- moF - AFPGzrjbam/7 Foster swfetezo ADP 0=c ^o^(b CarPa/ni/fos/ai Asparfat Pi Aspar/a/ ^ transcarbamdaza' aa "C=a G% ^CM-COOH 0 N H Add cardam/faspardc Nz 0 J\ Q) ■Dihidrooro/aza f/P ofN ©0H2C 0 te OP OP UMP OMP OecorOox/tezo CO, OPNPCOQH ©OP^Oy OP OP Ac if orofte/Z/c (OMP) Qrotef fosforiboz// A frofisferdzo Q> ~pppp A ' HN i XN-COOH 0' p Add d/d/drooroA/c

Otete/yoroteZ Cfei7/orope/7ffZ3 Pr O ii PP CP PAD NADZteP C00M

H AciP orof/c Fig.Xl.8 - Biosinteza cie novo a UMF in aceastS etapH, orofcat fosforibozil transferaza este similar^ cu HGPRT §i APRT. Primul nucleotid pirimidinic functional, UMP, se formeazS prin decarboxilarea OMP (reacfia 6). Enzimele cSii de sintez& a UMP au o localizare dubl£, citosolici (enzimele 1-3 §i 5-6) §i mitocondrialS, (enzima 4). Enzimele citosolice sunt organizate in dou& complexe 556 multienzimatice. Primal complex, alc&tuit din carbamil fosfat sintetazU, aspartat transcarbamilaza §i dihidroorotazfi, produce acid dihidroorotic; acesta difuzeazS din citosol in mitocondrie unde este dehidrogenat sub aejiunea dihidroorotat dehidrogenazei loealizatS pe membrana interna, Acidul orotic trece in citosol fiind supus acjiunii complexului al doilea (alc&tuit din orotat. fosforibozil transferazd §i OMP decarboxilaza) §i transformat in UMP (Fig. XI.9). Dihidroorotat dehidrogenaza Mito- , con - < drie Dihidroorotat Giutamina, C02> ATP Aspartat membrana interna

membrana externa Orotat PRPP Carbamilfosfat sintetaza Aspartat transcarbamitaza

Orotat fosforibozil transferaza

Dihidroorotaza

OMP decarboxilaza

UMP Fig. Xi.9 - Localizarea intracelulara a enzimefor participants la biosinteza UMP De la UMP sunt obfinute ceielalle nucleotide pirimidinice. Prin fosforilari catalizate d.e kinaze rezuM IJDP §i UTP: UMP ATP UDP 7~S ATP UTP ADP + P( ADP + P. Nucleotidul cu citozind, CTP. este obfinut din UTP prin mlocuirea funcjiei oxigenate de la C4 cu gruparea aminicS furnizata de glutaminS (sub aejiunea CTP sintetazei): 557 ATP ADR + P, UTP

^ CTP Glutamina Giutamat Timina, sub forma de IMP (dezoxiribotimidiranonofosfat) rezulta prin metilaiea IMP: ■fj

Timicfi/ai s/nfaio HI O' 0 N ■CH, A jf A/ ~ fleOZen O)0H FHL

F^L OH JUMP

TflP NS,N1 °-Metilen-FH4 furnizeazS grupareaQ §i doi atom! de hidrogen necesari grupei -CH3 gi sc transform^ in dihidrofoiat (FH2). Conversia FH2 FH4: Dihidrofoiat reductaza FPL

FH4 NADPH + H+ NADP* este obligatorie pentru reducerea fondului de unit£fi C5 active. Jesuturile in diviziune, unde are loo o sintezft rapidS de TMP, sunt foarte sensibiie la inhibifia dihidrofoiat reductazei. Mulfi compu§i cu aceasUl ac|iune, unii analog! chimici ai acidului folic, sunt, utilizaji in chimioterapia canceruiui. ATP + C02 f Glutamina $ f / 0 <$> / / Nucleotide purinice pppp. 4 Carbamil fosfat Carbamil aspartat Orotat ■e5-P - Riboza ~b ATP OMP-^UMP-^UDP U dUDP V TDP-^—TMP* •dUMP Fig. X1.10 - Reglarea biosintezei nucleotideior pirimidinice Sagsflle pline ( -4-indica reacjii; sagefile punctate (—->) indica un control pozitiv (+) sau unul negativ (■) Reglarea sintezei de novo a nucleotideior pirimidinice. Sinteza de novo a nucleotideior trebuie s& asigure cantitatea §i va.rietat.ea de nucleotide purinice §i pirimidinice necesarS sintezei acizilor nucleici. Pe l?mg5 reglarea separata a biosintezei purinelor §i pirimidi- nelor, func{ioneaz& §i un control incruci§at intre sinteza acestor doud grupe de nucleotide. Principalele puncte de control (Fig, XI. 10) sunt: - inhibijia feed-back a aspartat transcarbamilazei de c&tre nucieotidele pirimidinice, cel mai putemic inhibitor fiind CTP; r-i

; i! 559 - nucleotidul cu uracil, precursor comun al celorlalte pirimidine, inhibS. carbamil fosfat sintetaza; aceastS enzimfi este inhibat£ §i de nucleolidele purinice; - PRPP §i PRPP sintetaza intervin ca factori reglatori §i la sinteza de pirimidine, PRPP activeazft formarea carbamil fosfatului, iar nucleotidele pirimidinice (TDP) inhibit PRPP sintetaza. XI.2.2. REUTILIZAREA §1 CATABOLISMUL NUCLEOTIDELOR PIRIMIDINICE Aiaturi de nucleotidele pirimidinice objinute prin sintezit de novo, fondul metabolic al acestor compugi cuprinde §i nucleotidele eliberate din acizii nucleici celulari. Ca §i in cazul purineior, acizii nucleici exogeni nu contribuie

la acest fond. Metabolismul nucleotidelor are loc prin reacfii similare cu acelea descrise la purine: Nucleotid H20 Nucleozid Pi > Baza pirimidinica Pi 1-P-Riboza Nucleozidele pirimidinice sunt reciclate dupfi fosforilare: nucleozid kinaz& T ATP ADP nucleotid 0 kinazi accept# ca substrat uridina §i citidina §i o alta. timidina. In cazul purineior aceastd cale metabolic# este de mic# important, singur# adenozina putand fi fosforilatd la AMP. Bazele pirimidinice lihere, spre deosebire de cele purinice, nu mai sunt reutilizate ci degradate la compu§i cu molecule mic# ((3-aIanin# gi acid (3aminoizobutiric) a&turi de C02 gi NH3 (Fig. XI.ll). (3-Alanina gi acidul (iaminoizobutiric sunt fie excreta}! ca atare, fie catabolizali pe cSile oxidative terminate. 560 0 HN

0

(Jrac/Z Hz0~ C/toz/na ~ NADPH+H - A/ADP + 0 II f/O-C \ H-N I o=c"H' I H CHZ

! CHZ

OH- CP3 N- Carbam//-J3~a/anina

fl-Afamna o~c: A cid N- carbamH-B - a mi no,, „ /zobi/fyr/c .OH

^NHZ Ac/d carbarn/c COOH CHCH3 CHZNH2

Ac/d 3 -amino- . /zoourfr/c C02 a NH3 Fig. XI.11 - Catabolismul bazelor purinice XI.2.3. PATOLOGIA METABOLISMULUI PIRIMIDINELOR Cercet&i recenie au pus in evident unele defecte metabolice ale metabolismului pirimidinelor. Cea mai bine caracterizatrl din punct. de vedere biochimic este orotaciduria ereditarS, in care se excreta cantitSfi man de acid orotic §i orolidM. Defectul metabolic este situat la nivelul complexului multienzimatic care utilizeazft acidul orotic ca substrat. Neputand sintetiza piiimidine bolnavii sunt dependent de aportui exogen continuu al acestor compu§i. 561 Cap. XII HORMQNII

:V. '■!

I'M XILL INTRODUCERE Un organism monoceluiar poate efectua toate funcjiile necesare pentru intrejinerea sa §i r&spunde nemijlocit la semnalele veriite din mediul inconjurfttor. La organimsle pluricelulare apare diferenjierea celularS in vederea efectu&rii unor activit^Ji de inaltS specialitate. Coordonarea. diverselor funcjii indeplinite de celuie depSrtate neoesit& mecanisme de comunicare intre celuie individuale sau grupe de celuie. AceastS comunicare se reaiizeazS prin intermedia! unor compu§i chimici - mesageri sau molecule semnal - eliberafi de anumite celuie, care transport o informafie de la o celuie la alia. Sistemul nervos §i sistemul hormonal, fiecare prin mijloace proprii, dar interdependente, au rolul de a coordona r&spunsurile diverselor celuie, fesuturi, la semnalele venire din mediul extern sau cel intern. Corrmnicarea nervoasa se face interneuronal sau intre un neuron §i o celulft muscularS, o celuie secretorie.

Neuronii acJioneazS numai la distanfe mici §i comunicarea neuronals are loc intr-un timp foarte scurt (milisecunde). Comunicarea hormonal!! se poate face ia distanfS, un hormon eiiberat de o celulS. poate acfiona asupra oric&rei alte celuie din organism sii exists o relajie structural^ intre acestea. Comunicarea hormonal^ se face intr-un timp mai lung decat cea nervoasS (de La secunde la ore). Intre comunicarea nervoasS §i cea hormonal# exists o asem&nare fundamental, ambele sisteme opereaz# cu ajutorut moleculeior semnal. Asemftnarea dintre cele douS sisteme este inc# §i mai profundi, anumite molecule semnal sunt comune atat sistemului nervos cSt §i celui honnonal. De exemplu, noradrenalina ca hormon este eliberaf# de medulosuprarenal# §i acfioneaz# la distant asupra fesutului Jintii. Noradrenalina este ins# e liberal# §i de c#tre neuronii simpatici funcfionand ca neutrotransmif#tor. Mecanismele de transducjie a semnalelor extracelulare - nervoase sau hormonale - sunt comune pentru ceie dou# sisteme. Mesajul transmis prin intermediul acetilcolinei, eliberat# de neuronii parasimpatici (colinergici), este receptat intr-o ceiul# (Int# (de exemplu o ceiul# muscular# neted#) §i transformat in r&spuns intracelular printr-un mecanism transductor identic cu acela care prelucreaz# §i semnale hormonale. Interrelaflile dintre sistemul nervos §i cel endocrin merg §i mai departe, secrejiile hormonale sunt influence, direct sau indirect, de c#tre creier §i in mod reciproc, hormonii influenjeaz# activitatea sistemului nervos central, Termenul de hormon a fost introdus de c#tre William Bayliss §i Ernest Starling in 1904 pentru a descrie funcjia. secretinei, substanj# eiiberat^ in sange de c#tre duoden in momenta! p#trunderii confinutului gastric §i care stimuleaz# secrefia exocrin# pancreatic# necesar# digestiei. Potrivit acestei definifii clasice, hormonul este o 562 suhstanjft elaboratft de o eelulft sau grup de celule specializate (celule endocrine), este secretatft in sftnge §i prin sistemul circulator ajunge la o alii! celuift {intft, care rftspunde printr-o modificare a furtcjiei sale. Giandele endocrine, hormonii produ§i gi {esuturile Jintft alc&tuiesc un .sistem de comunicare intre diverseie pftrfi ale organismului, sistemul hormonal In afara celulelor, a glandelor specializate in sinteza §i secrefia de hormoni, cercefftrile mai recente au arfttat eft orice tip de Jesut produce §i secretft substance care pot influenfa funcjiile altei celule. Ficatul, rinichiul, irtima etc., pot fi considerate §1 ca organe endocrine. Celulele, {esuturile capabile sft recepteze §i sft rftspundft la un mesaj hormonal sunt Jintft pent.ru acel hormon. Un hormon poate influenja activitatea mai multor tipuri celulare, uneori rftspunsul acestor celule este diferit de la un tip celular la altul. In sfSrsit, o eelulft poate fi Jinta a doi sau mai multor hormoni, rftspunsul acesteia putftnd fi identic sau diferit Conceptul clasic de eelulft endocrinft, hormon, eelulft {.intft a fost Iftrgit, denumirea de hormon este atribuitft orieftrui compus chimic, elaborat §i secretat.de o eelulft care afecteazft activitatea altei celule, Honnonii pot fi; - hormoni endoerini, sunt secretaji de efttre celula produefttoare In sange §i ajung: la ceiuia {intft prin sistemul circulator; - hormoni paracrini, sunt secretaji de o eelulft §i acfioneazft asupra celulelor invecinate, fftrft a ajunge in torentui circulator;

- hormoni autocrinl sunt scretaji de o eelulft. In spafiul extracelular §i acjioneazft ca mesageri pentru celula care i-a produs. Uneie molecule semnal au numai una din aeeste calitftji, dar altele pot funejiona ca hormoni endoerini fa{ft de un jesut {intft §i ca hormon paracrin fafft de alte celule. Somatostatina, hormon hipotalamic, este hormon endocrin fajft de adenohipofizft, la care ajunge prin sistemul circulator portal hipotalamo-hipofizar. In pancreas, somatostatina este un honnon paracrin, este produsft de celule D §i acjioneazft asupra celulelor A §i B invecinate, care secretft glucagon §i insulinft. Natura chimicft a hormonilor este foarte variant (Tabelul XII.I). Un mare numftr dintre ei sunt peptide mici, polipeptide sau molecule proteice mari. Hormonal hipotalamic TRH este un tripeptid. Hormonal de cre§tere uman cuprinde 191 aminoacizi. Un grup de hormoni, cei corticosuprarenalieni §i sexual! au o strueturft steroidieft. Hormonal 1,25- dihidroxi-calciferol, derivatdin vitaminaD3, aparjineaceleia§i familii. Hormonii tiroidieni §i catecolaminele sunt compu§i cu moleculft mieft derivaji din aminoacidul tirozinft. Mulji alji hormoni sau neurotransmi{fttori sunt derivaji ai aminoacizilor. O altft grupft de hormoni - eicosanoizii - sunt derivaji ipotetici ai hidrocarburii cu 20 C, eicosan. Aeeastft grupft cuprinde prostaglandinele, tromboxanii §i leucotrienele. Transportul honnoniior in sdnge. Honnonii clasici, endoerini, circulft intre celula secretorie §i tesutul jintft prin sange. Honnonii solubili sunt prezenji ca atare in plasm ft. In aeeastft calegorie inirft mama majoritate a honnoniior de natunl peptidieft §i catecolaminele. 563 Tabelul XIU Clasificarea hormonttor dupa natura dsimica Hormonii Hormonii derivafi Hormonii peptidici steroidici de la tirozina Cortisol Insulin^ (Glucocorticoid) Adrenalina Aldosterona Glucagon (mineralocorNoi'adrenalinU Tetraiodotironina Parathormon dicoid) (tiroxina, T4) CalcitoninS Estradiol Tiiiodotironina (T3) Oxitocina Estron& Vasopresina Testosterone Gonadotropine 1,25 -(OH)2-D3 Corticotropina (ACTH) ToreotropinS (TSH) Prolactina (PRL) Factor! de cregtere (IGF, EOF, PDGF, NGF) Somatotropina Hormonii hipotalamici

eliberatori (RH) Secreting GastrinS Colecistokinina

Hormonii steroidici §i cei tiroidieni sunt compugi hidrofobi §i pujin solubili. Acegti hormoni in plasrml sunt asociafi cu proteine transportoare specializate, cu specificitate inallii, denumite proteine (adesea giobuline) de Iegare (hormone-binding globulin). Astfel de proteine sunt TBG (thyroxinebinding globulin), CBG (cortisol-binding globulin), SHBG (sex hormonebinding globulin), DBP (D-binding protein). Deoarece hormonul liber, nelegat este forma biologic active, afinitatea gi capacitatea de legate a proteinei transportoare determine num&ul de molecule de hormon liber. Serumalbumina poate lega mulf! dintre hormonii liposolubili. Degi are afinitate mai micft pentru unul sau altul dintre hormoni, concentrafia sa ridicatS Ii confers o capacitate mare de Iegare, ea putSnd lega cantitSJile excedentare de hormoni plasmatici. XII.2. RECEPTORII HORMONAL! Capacitatea unei celule de a r&spunde la un mesaj hormonal este determinate de prezenla in acea celulS, pe suprafafa sa sau intracelular, a unui component capabil s& recunoascS hormonul, sft ii fixeze gi s& inijieze evenimente care sft constituie rftspunsul ceiular la mesagerui extern. Aceste componente sunt receptorii hormonali. Pentru unii hormoni, cei peptidici, pentru catecolamine, in general pentru hormonii hidrosolubili, receptorii sunt situafi in membrana plasmid Pentru hormonii liposolubili, steroidici gi hormonii tiroidieni, receptorii sunt intracelulari (nucleari). Receptorii sunt proteine, de cele mai multe ori proteine oligomerice sau multidome- niale, care cuprind cel pufin doud regiuni active, una de fixare a hormonului §i alia 564 regiune care prelucreazd §i transfer# (transduce) semnalul extern unui mecanism efector intracelular care xl transform# in rdspuns biologic, Receptorii funcfioneaz# ca proteine alosterice, cele douS situsuri active comunic# intre ele prin tranzifii conformafionale inijiate de fixarea hormonului in situsul de legare. Interacjiunea hormon-receptor este asemSnStoare interacfiunxx unui substrat cu central activ enzimatic. Aceastd interacfiune se realizeaz# prin forfe necovalente, este reversibiia, prezint# o specificitate foarte inalbl prin complementaritatea chimicS §i geometric# dintre hormon §i centrul de legate. Interacjiunea hormon-receptor poate fi'descris& H + R =5F=fc H • R Constanta de disociere a complexului HR, kd: k „ [H][R] mdsoar# afinitatea receptorului pentru hormon. Aceste constante au valori .intre 10'6 M §i I0*10 M, ceea ce denotd o afinitate foarte mare intre un

hormon §i receptorul sdu. Ocuparea receptorilor cu hormon prezintd fenomenul de saturate. Daca se reprezinta fracjiunea de receptori ocupa.fi Y= [HR] [R tola! • in funcjie de concentrafia hormonului liber, nelegat, se obfine un arc de hiperbold. Palierul curbei corespunde ocuparii cu ligand a tuturor situsurilor de legare de pe receptor. Concentrafia hormonului cand 50% din situsuri sunt ocupate, dd valoarea numeric# a kd (Fig. XII. 1).

Fig. XII.1 - Curbs de saturate cu ligand a unui receptor hormonal Y = [HR]/ [Rtolal] Afinit^Jile receptorilor pentru hormoni sunt mari, in acord cu concentrafiile plasmatice reduse ale hormonilor. De asemenea, gradul de ocupare a receptorilor trebuie sd corespundd §i fluctuafiilor mici pe care le suferft concentrafiile hormonilor circulanfi. 565 % ^: i

v ?!

Specificitatea unui receptor penlru hormonul specific este foarte mare, totu§i, este posibil ca un receptor s& lege §i alfi compu§i, analog] ai hormonului. Un compus (altul decat hormonul specific) care se leagd la un receptor §i legarea sa determine un r&spuns celular este denumit agonist. Un compus care se poate lega la un receptor, dar legarea sa este neproductiv&, nu inifiazd un rftspuns, este un antagonist, Cuno§tin{eie privind nalura §i mecanismele de func{ionare a receptorilor au fost obfinute, muite dintre ele, prin examinarea rdspunsuriior ceiulare la diver§i agoni§ti sau antagoni§ti, natural! §i de sintezH Intensitatea rilspunsului celular la un mesager depinde de num&rul de receptori, de gradul de ocupare al acestora cu ligand. In unele cazuri, s-a. constatat ca rdspunsul biologic este maxim inainte ca toji receptorii s& fie ocupaji cu ligand. Celula dispune deci de receptori de rezervd (spare receptors), peste nivelul neeesar obfinerii unui rSspuns biologic maxim. Se considers, cd in aceste cazuri, numitrul de receptori este mai mare decat capacitatea sistemului transductor, de prelucrare a information Receptorii hormonaii se arid intr-o stare dinamica, numdrul de receptori per celula este variabi! in raport cu diver§i factori, Nivelul hormonului in sange poate regia numdrul de receptori. Un nivel ridicat prelungit, poate determine diminuarea numdrului de receptori (down-regulation). Prin aeeasta se realizeazft o desensihilizare a Jesutului la hormonul specific penlru receptor. In alte cazuri s-a constatat o credere a numdrului de receptori per celuld la o expunere prelungitd (up-regulation). Fenomenul de down-regulation este intalnit la mulji hormoni, ca insulin!!, glucagon, hormon de credere. Se admite cd scaderea numdrului de receptori la o slimulare celulard susjinutd me loc prin endocitoza complexelor hormonreceptor. Complexele endocitate pot fi degradate intracelular. In alte cazuri, endocitoza este reversibild. Receptorii din pmticuleie endocitate sunt conservaji intracelular in vezicule secretorii. Laprimirea unor semnale externe ei sunt redistribuili pe suprafaja celulelor. Un alt mecanism sau o altd fafeta a mecanismului de reglare a activit&jii receptorilor, a cfistribujiei lor ceiulare, consul in modificarea lor prin fosforildri catalizate de protein kinaze specifice. Mecanismul este aproape

general, fiind bine caracterizal in cazul. receptorului adrenergic ((Jadrenergic). Inactivarea acestui receptor are loc prin fosforildri, la resturi de serind, a complexului hormon-receptor, sub acpunea unci kinaze specifice (Padrenergic receptor kinase, p-ARK). Receptorul liber, fdrd ligand, nu este substrat a! enzimei. Complexul hormon-receptor fosforilat este internalizat prin endocitoza. in veziculele endocitice receptorul este defosforilat. Dacd concentrajia hormonului circulant scade, receptorii sunt redistribuiji in membrana plasmicd. Receptorul insulinei §i receptorii factorilor de cre§tere (EOF, PDGF) dispun de un alt mecanism. de reglare a activitdjii lor. Ace§li receptori au aclivitate intrinsecd de protein kinaze §i, in acela§i limp, sunt §i substratul acestor enzime. Fixarea hormonului la receptor determine autofosforilarea acestuia din urmd, cu alterarea funcjiei sale (vezi mai departs). Cu ioatd diversitatea chimicd. a hormonilor, a efectelor ceiulare pe care ace§tia le provoacd, a specificifdfii inalte pe care o manifestd interacfiunea hormon-receptor, pattern-ul structural al receptorilor este mai limitat. Receptorii penlru mai mul|i hormoni au unele dasaiuri comune §i sunt grupaji in familii. Receptorii apar{Mnd aceleia§i familii prezinta asemdndri structural §i transmit mesajele externe prin mecanisme transductoare comune, Cuno§tin{ele actuate privind natura §i modal de funcjionare a receptorilor permit clasificarea lor in receptori intracelulari (nucleari) §i receptori membranari. Acegiia din urmd sunt grupafi in doud familii, cea a receptorilor tnrudiji cu receptorul adrenergic §i familia receptorilor cu aclivitate protein kinazicd (irozin-specificd. O primd familie de receptori membranari cuprinde receptorii penlru catecolamine (receptori adrenergici), receptorii penlru acetil-colind de tip muscarinic din mugchii netezi, din celuie secretorii, unele sublipuri de receptori pentru serotonind, proteinele fotore- ceptoare din retina, ca rodopsina. Din aceasta familie, receptorul (3-adrenergic este cel mai bine cunoscut (Fig. XII.2). Este o proteinii transmembranarik cu masa de 64 kD. Capatol Nterniinal, extracelular cuprinde douft lanjuri oiigozaharidice (legate la asparagina). Cuprinde 7 segments elicoidaie, hidrofofae, paralde, ihlgobate in grosimea membranei. Intre elice se aflft 3 bade extraceiulaie §i 3 bucle intracelulare. Segmentul C-terminal intracelular, poale fi fosforilat la xesturi seril de o kinazS specific! j/jQOZoharide Situsul de legare a hormonului este localizat pe fafa extern# a receptomlui §i este aJciltuii dintr-un buzunar intre elicele transmembranare. 0 bucla intracelular# particip# la transducerea semnalului extern (prin intermedin! proteinei G). Acetilcolina este neurotransmi}8tor al neuronilor colinergici. Acetilcolina utilizeaz# dou# tipuri de receptor!, elasificafi ca receptor! nicotinic.! §i muscarinic!, dupS. sensibilitatea lor la nicotin# sau muscarin#, do! alcaloizi folosiji ca agonist! in cercet#rile privind receptor!! colinergici. Receptor!! de tip nicotinic mediaz# acjiunile acetilcolinei in neuronii din sistemul nervos central, la joncfiunile neuromusculare din mu§chii striafi. Receptor!! de tip muscarinic, pe lang# participarea lor la transmiterea interneuronai# a. mesajelor, sunt impiicaji in contracjia mu§chilor netezi, In secrefia endocrin#

sau exocrin# a unor glands. Receptorii colinergici de tip muscarinic (M,, M2, M3) aparjin familiei de receptor! cu cele §apte elice transmembranare (Fig. XII.2). Rodopsina §i alte proteine fotoreceptoare din retina au structuri asem#n#toare receptorilor de tip adrenergic. Rodopsina am o mas# molecular# de 40 kD §i cuprinde 7 segmente elicoidale transmembranare (Fig. XII3). Gruparea cromofor# 11-cis-retinal este plasata in central moleculei, intre dou# dice. Rodopsina se aseam#n# cu receptorii hormonal! nu numai structural ci §i prin mecanismul de txansducjie a luminii, semnalul extern, intr-un nlspuns celular. Rodopsina poate fi fosforilat# in regiunea, Cterminal#, in mod similar cu fosforilarea receptorului adrenergic. Receptorii din aceast# familie au un mecanism comun de transmitere a mesajului extra- celular c#tre ma§in#ria biochimic# a celulei, prin .intermediul proteinelor G (vezi mai departe).

Fig. Xlf.2 - Receptorul adrenergic (receptor cu 7 elice transmembranare) j

Fig. XII.3 - Structura rodopsinei (cuprinde 7 segmente elicoidaie transmembranare) Un al doilea grup de receptori cuprinde receptorul insulinei, receptorii unor factori de cre§- tere, ca EGF (epidermal growth factor), PDGF (platelet derived growth factor). Receptorul insulinei este prezent in membrana aproape a tuturor celulelor de la mamifere. Mumd- rul de receptori perceJulS variazS de la 10 2 la 105. Este un heterotetramer, a2 p2 (Fig. XII.4).

568 Lanjurile a cuprind 719 resturi aminoacidice, cede (3 620 resturi. Lanjurile a sunt in totalitate extraceluiare. Lanjurile (3 au segmentele N-terminale extraceluiare, cate un segment transmerhbranar §i capetele C-terminale se afid in citoplasmd, Lanjurile a §i [3 sunt legate prin punji disulfurice. Receptorul cuprinde un situs de legare a insulinei, cons- tituit din segmente N-terminale ale lanjurilor a, Insulina este specificat'd de o singurd gend, o subunitate aP este sintetizatd ca un lanf unic, ce cuprinde un peptid semnai N-terminal. O proprietate specified a familiei de recepferi edreiaii aparjine receptorul insulinei este aceea de a manifesta activitate protein kinazied dupd ocuparea situsului extracelular cu ligand,, ActivitaLea protein kinazied este localizatd in doud domenii intracelulare ale lanjurilor p. No se cunoa§fce cum are loc comunicarea intre cele doud regiuni indepdrtate ale receptorului. Acjiunea

protein kinazied a receptorului activat se manifest initial asupra receptorului insu§i, avand loc o autofosforilare. Specificitated acestei enzime este deosebitd, ea fosforileazd resturi de tirozind. Receptorul insulinei este fosforilat la cate doud resturi Tyr din fiecare lanf p. Autofosforilarea receptorului este asociatd cu o cre§tere a eficienjei sale ca protein kinazd, avand loc fosforilarea unor proteine celulare care exprimd in cele din urmd rdspunsul biologic la impactul hormonal. Receptorul factorului de credere epidermal (EGF) tire masa de 170 kD. Este alcdtuit dintr-un singur lanj poiipeptidic. Regiunea N-terminald este extraceiulard, cea C-terminald se afld in citoplasmd. Domeniul cu activitate protein kinazied tirozin-specificd este intracelular. Receptorul funejioneazd In mod similar cu receptorul insulinic, Existd o bund analogic structurald intre regiunea intracelulard a receptorului EGF §i domeniile corespunzdtoare ale lanjurilor P din receptorul insulinei. Un receptor hibrid a fost construit in laborator cuprinzand lanjurile a §i regiunile extraceluiare aie lanjurilor p din receptorul insulinei §i porfiunea intracelulard a receptorului EGF (Fig. XII. 5). Acest receptor hibrid este funcjional, legarea insulinei activeazd protein kinaza receptorului, mecanismul de com unicare intre ceie doud domenii nu a fost alterat. Activitatea protein kinazied tirozin-specificd este intalnitd la. receptorii tuturor hor- monilor care influenjeazd cre§terea §i divi- ziunea celulard. Se considers cd acjiunea mitogend necesitd fosforilarea la resturi Tyr a unor proteine reglatoare. Receptorii nuclearl O categoric distinct# de receptori, prin distribute gi prin modal de acfiune, sunt receptorii hormonilor steroidici (progestine, estrogeni, androgeni, corticoste- roizi, dihidroxi-D3) §i receptorul hormonului tiroidian. Ace§ti hormoni au caracter hidrofob, sunt lipofili §i penneazd u§or membrana plasmicd celulard. Exists unele date care susjin ideea cd transportul acestor hormoni prin membrana plasmicd nu are loc prin simpld difuzie, el putand fi un transport medial de anumite proteine. in orice caz, pdtrunderea honnonului in celuld nu este limitantd pentru

OOC

COO' Fig. XU.5 - Receptoru! hibrid insulina-EGF. 569 DomenJuf C/Q /spare:, /o T}J?A/ /a harm on 427 523 t ZElztr “■■ 60s ess 73s '777 iziimmEMim ) £67 633 £30 S r~ ■ . wz imnmniuiuiLL LLU 3&4 B37i !&S 250 J// 55/ £95 T na "nmmmmn | r_ zj f9 i f24 <99 2 4 Ti fllilill i 2 5 ./ -t£2 f£9 2 4 \ . xl. IL 427 m Racop/Qr penfru Gfi/COCQr//CQ/c/ Mfn&ro/ocor/zco/c/ PropesJerona P-s £open JPAvc/rox/ ~J?j Porn"?on oro/a/o/n fe) Fig. XII.6 - Receptorii hormonilor steroidici §i tirojdieni acjiunea sa. Receptorii specific! prin care ace§ti horrnoni %i exprim! rolurile lor regiaioare sunt nucieari. Se admite posibilitatea prezenjei leceptorilor §i tn citoplasm! sau existenja unor proteine de transport citoplasmatic al hormonilor. Receptorii peniru ace§ti horrnoni au fost izolafi si caracterizafi (Fig. XII.6). Sunt proteine cuprinzand cateva sute de resturi aminoacidice. Regiunile Nterminale, mai lung! sau mai scuite, sunt variabile. Domeniul de legare a hormonului este situat ia capital C-terminal Fiecare receptor posed! uri domeniu prin care se poate lega la cromatin!, la ADN cromosomial, activand transcrierea acestuia. Aceste regiuni au aceea§i localizare In molecula receptorului, §i prezint! o inalt! analogic structural!. Aceste domenii sunt bogate tn restuti de cistein! §i formeaz! motive structurale care se adapteaz! pe adSneitura name (major groove) a dubieior elice de ADN,

Domeniile de legare la ADN din moleculele receptorilor sunt activate prin fixarea hormonului, numai complexele hormon-receptor se fixeaz! pe anumite segmente ale unei gene denumite ,,hormon-responsive element*4, HRE. Fixarea receptorilor pe aceste HREs regleaz! viteza. cu care gena respective este transcris!. Efectul reglator poate determina cre§ierea vitezei de transcriere, se sintetizeaz! mai mult ARN mesager ce va fi tradus in proteina specific!, In unele cazuri transcrierea genei aflat.;! sub controlul unui HRE este Incetinita, efectul hormonal constand in scMerea cantiulfii unei proteine date, Receptorii activaji de hormonii specific! opereaz! ca factor! de transcriere, Segmentelc de ADN la care se leaga complexele receptor-hormon (HRE) au fost identificate (Tabelul XII.2). Glucocarticoizii, progesterona, aldosterona §i androgen!! recunosc §i se leag! la acela§i HRE. Estrogenii §i hormonul Iridoidian au HRE distincte. Efectele hormonale sunt tranzitorii. Complexele receptor-hormon se desfac §i totodat! receptorul se dela^eaz! de pe ADN. Hormonul, probabil intr-o form! modificat!, difuzeaz! din ceiui!. Receptorul poate participa la un nou ciclu de activare la sosirea semnalului in celulfi. 570 XII.3. MECANISMELE DE ACJIUNE A HORMONILOR Funcjiile reglatoare ale hormonilor ia aivel celular se exercitd prin raociularea activit&fii unor proteine, de ceie mai multe ori enzime, proteine de transport, proteins contractile, canale ionice etc. Aceste proteine, Jinta unuia sail a mai multor hormoni, prezintfi activity fie ca armare a unor modificari cantitative, fie prin conversia lor in forme cu propriet&fi diferite. Hormonii steroidici §i tiroidieni, cu receptori nucieari, acfioneazd direct asupra cromatinei, asupra ADN,' activand (sau incetinind) transcrierea genelor. Acjiunea honnonului se manifests direct in cregterea (sau diminuarea) vitezei de sintezS a unor proteine. Tabelul XII.2. Secventele de ADN care afcatiiiesc HREs (hormone responsive elements) penf.ru divers! hormoni Hormonii ' ■ Structura HRE GGTAC An nnTGTTCT GOT AC Glucocorticoizi A n nnTGTF CT ! Progestine GGTACAnnnTGTTC Mineraiocorticoizi T GGTAC Androgeni AnnnTGTTCT Estrogeni Hormoni AGGTCAnnnTGArC tiroidieni Acid CT retinoic AM Pc GATCAnnnnnTGAC C GATCAnimnnT G A C C TGACGTCA n poate fi oricare din cele patru baze. Hormonii peptidici, catecolamineie au receptori membranari, acjiunea lor In interiorul celulei es(.e mediatS de un alt compus (mesager second) format, ca rSspuns la semnalul extern, Mesagerul secund exercitS roluri reglatoare, care pot fi

de modulare a activMjii proteinelor existente in ceiuiS, dar §i de inducjie a sintezei de noi molecule proteice. Insulina §i alji hormoni cu roluri proliferative celulare (hormoni mitogeni) exercitS. roluri reglatoare al cSror numitor comun pare a fi aclivitatea protein kinazicft lirozin- specified a receptorilor lor . XIL3T. MECAMSMUL DE ACJIUNE A HORMONILOR STEROIDICI §1 TIROIDIENI Receptorii acestor hormoni, ap cum s-a ar&tat mai inainte, sunt nucieari §1 acegtia, dupS activare consecutivS legdrii honnonului, acJioneazS ca factor! de transcriere pentru gene care cuprind „hormone-responsive elements'4 (HRE) recunoscule de complexele receptor-hormon (Fig. XII.6). Tabehd XU.3. Regiarca exprcsiei unor gene tie catre hormoni steroizi §i hormoni tiroidfcni (2 expresia genes este tiiminuat$ de hormon) Glucocorticoizi Tirozinaminotrarrsfe Float raza Triptofan oxigenaza Ficat Glutamin sintetaza Float Transferina Ficat a-Fetoproteina 2 Ficat a^-Globulina Ficat MetalotioneinS Ficat Ovaibumina Oviduct (pasare) Proopiomela.nocoi.1i Adenohipofiza na 2 Estrogent Ovaibumina Oviduct (pasare) Apo B-VLDL Ficat Glncozo-6-P Uter dehidrogenaxa Progesterone Ovidina Oviduct (pasare) Ovaibumina Oviduct (pasare) Uteroglobina Uter Efectu! inductor al hormonilor steroidici asupra sintezei unor proteine poate fi observat asupra organismelor intregi. Astfel, este foarte bine cunoscutd acjiunea proliferativd a estrogenilor §i progesteronei asupra uterului la mamifere sau asupra oviductului la p&sSri. Totodatd, au fost identificate numeroase proteine a cftror sintezS este crescutd (uneori diminuatft) sub acjiunea aces tor hormoni (Tabelul XII.3). Honnonii tiroidienK pe l§ngS inducjia sintezei unor proteine specificate de gene nucieare, au capacitatea de a activa sinteza unor proteine specificate de genomul mitocondrial, proteine care participil la procesele oxidative mitocondriale. XII.3.2. MECANISMUL DE ACTIUNE A HORMONILOR PEPTIDICI §1 A CATECOLAMINELOR Hormonii din aceastft grupa au receptorii situaji pe suprafaja celulelor, ei no pdtrund in celula. Fixarea hormonului pe receptor activeazS un sistem 'transductor care transforms semnalul extern (mesagerul prim, hormonal),

intr-un semnal intracelular (mesager second). Mesagerul secund exercita acjiuni reglatoare care constituie r3spunsul celulei Jintd la hormon. in 1950 Earl Sutherland a descoperit nucleotidul ciclic 3\5’-AMP (AMP C) §i c3 acest compus.este mediatorul intracelular al adrenaline! in hepatocite. Acjiunea glicogenolitica a adrenaline! poate fi mimatS de AMPC. Studiile care au urmat au ardtat c& acjiunile altor hormoni sunt mediate intracelular de AMPC (Tabelul XIL4). TotodatiS, dup3 fundamentarea conceptului de acfiune hormonal^ mediate, de un mesager secund, au fost descoperiji §i alfi compu§i care 572 Semno/ e*7&. ! &rn [ rr}B'$Ct'ffer pr/rn)

Semno/ ''^/&rr? A HP^

ft&'Spuns Fig. Xii.7 - Schema generaia a mecanismului de ac^iune a hormonilor cu receptor! membranari indeplinesc aceastS funcfie: 3\ 5’-GMP (GMPC). Ca2\ diacilglicerol, inozitoltrisfosfat §\ alfii. Cu toatS varietatea foarte mare a hormonilor, totu§i, numanil mesagerilor intracelulari este mult mai redus. Mai mulji hormoni utilizeazS acela§i mesager secund.. Mecanismul de acfiune a hormonilor mediat prin mesageri secunzi, presupune existenfa unor sisteme transductoare care dupS receptarea semnalului s£ il prelucreze, sS il transmits unor sisteme efectoare, care sS dea najtere moleculei cu rol de mesager secund. Aceste sisteme mesageriale cuprind (Fig. XII.7): a) receptorui hormonal; b) un sistem de cuplare a complexului receptor-hormon cu sistemul efector; funcjia de cuplare a receptorilor cu sistemele efectoare aparpne unei familii de proteine, denumite proteine G; c) un sistem efector care s& genereze mesagerul secund,intraceiular; exists mai muite sisteme efectoare care produc divert mesageri secunzi; d) acfiunea mesagerului secund asupra unei sau mai multor proteine {intS care determinS rSspunsul biologic la impactul hormonal. In Tabelul XII.4. sunt prezentafi honnonii §i mesagerii intracelulari care le mediazS rSspunsurile. Receptorii acestor hormoni au structuri asemSnStoare

cu a receptorilor adrenergic!, aparjin unei familii de proteine cunoscute ca proteine cu §apte elice membranaie (vezi mai sus). Proteinele G Sunt proteine membranare care cupleazS functional receptorii hormonali de sistemele celulare generatoare de mesageri secunzi. Aceste proteine au proprietatea de a lega nucleotide cu guaninS (GDP sau GTP), de unde denumirea de proteine G. ReprezintS o familie de proteine heterotrimerice cu slructura a(3y. Lanjurile (3 (35-36 kD) §i y (7-10 kD) sunt pujin diferite de la o proteinS G la alia. Ind'ividualitatea unei proteine G ii este conferitS de subunitatea a (41-45 kD ).Silusul de Iegare a nucleotidului cu guaninS este localizat pe lan{ul a. Forma inactivS a unei proteine G este GDP - apy. ; i'v ;-r. fi

■ :: "d : 573 Tabelul X1I.4. Mesagerif secunzi ai unor hormoni Hormoni care an ca mesager sec and AMP c Glucagon Catecolamine prin receptori p -adrenergici Catecolamine prin receptori (X 2 adrenergici Parathormonul Calcitonina Vasopresina Angiotensina II (scade cone. AMPC) Soniatostatina (scade cone. AMPC) Corticotropina CRH (hormonul eiiberatoral corticotropinei) Hormoni care an mesager second GMPe Factorul atrial natriuretic (ANF) Rodopsina Hormoni care au ca mesager second Ca"*, IP? §ilsau diaciiglicerol Catecolamine prin receptori
hormonului la ace§lia. Complexele receptor-honnon acjioneazS in mod catalitic asupra unei proleine G cu care este cuplat receptorul §i determine schimbul dintre GDP legal la subunitatea a §i GTP din media. Concomitent cu acest schimb tire loc disocierea GTP* a de dimerul (iy H-R

GDP Ac|iunea complexului H-R asupra proteinei G este cataliticil, o molecule de complex H*R determine schimbul GDP-GTP pe multe molecule de proteind G, ceea ce constituie un moment de amplificare a semnalului hormonal. 574 Subunitatea a • GTP reprezintS forma aetivii a proteinei G. Subunitalea a este diferitS- structural §i functional de ia o proteinii G Sa alia, ea interac{ioneazii cu sisleme efectoare ■ diferite, generand diver§i mesageri secunzi (Fig. XIL8). Proteina G care activeazS adenilat ciclaza este denumitS Gs> respectiv as. Adenilat ciclaza transforms ATP in AMPC, receptorii cuplaji cu aceasta proteinS determ inS o cre§tere a concenirajiei AMPC in celtiiS. Proteina G;, cu o subunitate .ais inhibit activitatea adenilat ciclazei §i concenlrajia nucleotidului ciclic se reduce in cazul activSrii acestei proteine. Proteinele G care cupleazS receptori hormonali cu sistemul efector al fosfolipazei C sunt denumite G (au o subunitate ap). Ocuparea acestor receptori cu liganzi determine formarea mesageriior secunzi diacilglicerol §i inozitoltrisfosfat prin hidroliza unor fosfatide membranare §i secundar create concentrafia citoplasmaticS a Ca2+. Rodopsina, proteina fotoreceptoare din cekile..retiniene (conuri), este cupIatS cu o proteinS aparjinand familiei G denumita transducing. Exists multe alte proteine G ale eSror identitate §i funcjie sunt in curs de precizare. Pentru acestea se folosegte denumirea de G0 (o de ia others). GDP

Fig. XII.8 - Ciclul catalitic al unei proteine G (Gs) 575

AMPC adenilat ciclaza §i AMPC - fosfodiesteraza 3\5’-Adenozinmonofosfatul (AMPC), mesagerul second structural

a 1 multor hormoni, are Concentrafia sa celulanl este i'oarte mic5. Un semnal hormonal determina insS cre§teri semnificative ale concentrajiei sale. AMPC este sintetizat din ATP sub ac$iunea adenilat. ciclazei (Fig. XII.9). Adenilat ciclaza este prezendl la toate organismele, de la bacterii pand la om. In celule eucariote este situate in membrana piasmidi, pe faja citoplasmicd §i este cuplatd functional cu proteine G, de tipul G, sau G,. Proteinele Gs, prin subunitatea GTP * as au acfiune stimulatoare asupra adenilat ciclazei, interacjiunea acestor proteine cu ccmplexele receptor-ligand detenninand o credere a concentrajiei AMP C (Tabelul XIL4). Proteinele G;, prm subunitatea ai? din conlrS, scad activitalea adenilat ciclazei. Concentrajia AMPC la activarea unui receptor cuplat cu G; nu create. Acfiunea G* nu este o acjiune inhibitorie directs. Se pare c& in aceste cazuri subunitatea cx^ se aM in exces fata de cxs §i se ■forrneazft majoritar Gi fajd de Gs. Hormonii care au receptori cuplafi cu G{ sunt, catecolaminele prin receptori a2, angiotensina II, somatostatina.

ATP AMPC Fig. XII.9 - Biosinteze AMP ciciie (AMPC) 576 Acjiunile biologice initiate de AMP, sunt de scuilit duraiii deoarece acest

compus este rapid descompus prin hidrolizS la 5’-AMP (Fig, XII. 10). Enzima care catalizeazft reacjia este 3\5’~AMPC fosfodiesterazft. Exists mai multe izoforme ale fosfodiesterazei, larg ritspzindite. In vivo, activilatea acestor enzime este controlatS de diver§i factori, viaf.a. biologies a mesageruiui secund AMPc depinzand atat de activitatea adenilat cidazei, cSt §i de cea a fosfodiesterazelor, DouM substance, cafeina teofiiina, principiile active din cafea §i ceai, au acjiuni inhibitorii asupra AMP, fosfodiesterazei. Prin menjinerea AMP, la tin nivel ridicar un (imp mai indelungat, ele mimeazfl acjiunea unor hormoni care cresc concentrafia AMP,. Mulfi alp compugi moduleazd activitatea fosfodiesterazei in vivo. Protein kinaze §i fosfoprotein fosfataze AMPC, mesagerul secund al muitor hormoni, are ea mecanism de acjiune activarea unor protein kinaze. Familia de protein kinaze activate de AMP, sunt cunosciHe ca protein kinaze A (subgrupa I §i II). Ele au speciffcitate pentru resturi de serin3 (Ser) sau treonind (Thr), Prin acjiunea protein kinazelor asupra unor proteine (enzime) are loc conversia in forme fosforilate eu activitdfi distincte de cele ale formelor defosfo. Protein kinazele A au o structure heterotetrameridi R2C2. SubonitAfile R sunt reglatoare, iar ceie C sunt catalitice.. Tetramerul este inactiv, centrele active ale subunit5{ilor catalitice sunt mascate. AMP, se leagft la subumfbfile R din tetramer (o subunitate are doua situsuri de legare) §i elibereazS subunitdfile catalitice: R2Ca + 4AMPc 2C + Ra(4AMPc) Protein kinazele activate de AMP, exists sub forma a doua izoenzime I §i II. Majoritatea (esuturilor cuprind ambele forme §i ele sunt stimulate selectiv de hormoni. Conversia proteinelor, a enzimelor, in fonne fosfo, prin activarea unei protein kinaze AMP, - dependente determine nlspunsul biologic la semnalul extern. (Fig. XII. 11). Cu toate cil divergi hormoni determine formarea aceluiagi mesager secund, totugi, r&spunsul celular poate fi mai mult sau mai pujin specific prin natura proteinelor care sunt substrat ai protein kinazei AMPc-dependente-k Fenotipul particular al celulei determine, in cele din 0 “O — p ii 0

Fig. XIL10 - Descompunerea AMP, sub acjiunea fosfodiesterazei 577

PTPif/WP Proton# P-frstkfm ffespufts Fig. Xll.11 - Modul de acjiune a ununi hormon cupiat cu o proteina Gs. Cuplarea receptorului hormonal cu o proteina G, determine inhibijia adenilat ciclazei urm&, nlspunsul specific la un semnal extern. Sau acela§i mesager extracelular poate determina r&spunsuri diferite m celule fintif diferite, particularitatea r&spunsului depinzand de natura proteinelor substrat pentru protein kinaze, de modul in care fosforilarea afecteazd funcjia proteinei. Hormonii ai cMror receptori sunt cuplaji cu proteine G;, determine o scMere a concentrajiei AMPC, in ceiuld vor domina formele defosfo ale proteinelor. 578 Protein fosfataze. Stingerea rflspurisului inijiat de un hormon care

determine o cregtere a nivelului celular de AMPC are loo in mai multe moduli (Fig. XII.12). Autohidroliza GTP din as • GTP gi inactivarea proteinei G intrerupe transmiterea mesajului de ia receptor la adenilai ciclazil. Fosfodiesteraza descompune mesagerul AMPC gi opregte fluxul de informajie la acest nivel. In sfargit, o aitd modalitate de stingere a unui rdspuns hormonal este acela de a defosforila proteinele fosforilate de protein kinazele A, de convesie a acestora ia starea anterioarS recept&rii mesajului extern. Defosforilarea proteinelor este calalizatS de protein fosfataze: P-proteina + H20 ------------------- Defosfoproteina + Pf Protein fosfatazele au deci roluri importante in exprimarea efectelor hormonilor 1a. nivel celular. Aceste enzime prezint3 multiple izoforme gi sunt eie ingile jinta a diverse mecanisme reglatoare, unele hormonaie. PrezintS specificity distincte pentru leg&turi fosforil-Ser, fosforil-Thr gi fosforil-Tyr. Fosforilarea sau defosforilarea afecteazft activitatea proteinelor in moduli foarte variate: - mftregte sau micgoreazS activitatea cat.aliticli a unei enzime (de exemplu glicogen fosforilaza este activS ca P-enzimd; glicogen sintaza este active in form# defosfo); - modified sensibilitatea unei enzime fafU de efectori; - daeft proteina convertitS prin fosforilare este ea ins&gi o kinazfr are loc o amplificare in cascade a unui semnal initial (de exemplu glicogen fosforilazokinaza); ~ fosforilarea poate modifica concentrajia unor metabolifi regia tori (de exemplu eoncentrafia fructozo-2, 6-bisfosfat, reglator al glicolizei gi al gluconeogenezei). in afara rolurilor mai bine cunoscute de regime a unor seevente metabolice, ciclul fosforilare-defosforilare a proteinelor intervine in multe alte procese, diviziune celuiarM, transcrierea gi traducerea genelor, permeabilitatea membranarS. Au fost identificate multe enzime gi alte proteine care suferit conversia defosfo ^ fosfo intr-un proces dependent de AMPC. Prin acest mecanism sunt controlate procese fundamental ca glico-genoliza gi sinteza de glicogen, glicoliza gi gluconeogeneza, oxidarea gi biosinteza acizilor gragi. Cregterea concentrajiei AMPC in ficat, mugchi, |esut adipos, determine conversia spre formele fosfo a enzimelor cheie implicate in aceste procese avand ca rezultat accelerarea lor. Aceste procese furnizeazft organismului substrate oxidahile pe seama rezervelor, AMPC este cunoscut ca semnal al foamei (hunger signal).

*

\

. ^ —7 Ctdc

A o'/sn/JaT RdspunS t ATP frofeu 'X /

s ATP . G T Fb zc t pr of e/ n & G

A M pc

eft sf er oz a

!/ yi 5

Raspuns AMP Fig. XII.12 - Stingerea unui raspUns hormonal mediat de AMPC ).| Pr | of p>r &i o7e n \ Y m; ki —— no za I A l /’, L....J ) 0 P-Proteind AG 0 P' ^ 579 Horrnonii care scad concentrafia AMPC, fac sd predomine formele defosfo ale unor enzime §i determine deplasarea metabolismului spre procese anaholice, de depozitare a glicogenului, a lipidelor. Mecanismeie moleculare de reglare a acestor procese sunt descrise mai departe. Horrnonii care utilizeazd AMPC ca mesager secund pot aefiona §i prin inducjia sintezei de proteine. Intr-adevar multe efecte hormonale mediate de acest nucleotid ciclic sunt rezultatul cre§terii concentrajiei de proteine specifice. AceastS acfiune poate avea loc prin conversia fosforilare .** defosforilare a unor proteine ce participH la transcrierea sau traducerea unor gene. Tot.u§i, cercetari mai noi au permis implicarea AMPC ca factor de transcriere, in mod asemn&n&tor mecanismului de acfiune a hormonilor steroidici. S-a identificat o protein & care, pe de o parte-leagft AMPC §i pe de

alia interacjioneaztf un segment de ADN specific (hormone responsive dement). Acest HRE are structura TG ACGTCA. Nucieotidul ciclic 3’ 5’-GMP are' o structure asenulnatoare cu a 3’ 5’-AMP. De asemenea, el este sintetizat §i deseompus prin reacfii similar© catalizate de guanilat ciclazft §i de GMPC fosfodiesterazM (Fig. XIL13). GMPC functioneazS ca mesager intracelular al unor hormoni. In multe cazuri GMPC antagonizeazS efectele AMPC. AMPC mediator aS expreski gersice GMPC9 guanilat ciclaza §i GMPC fosfodiesteraza

0~

0 0

-p-------0 OH

GMPc fosfo - c//e
concentrafiei intracelulare de GMPC. GMPC, prin intermediul unei protein kinaze §i a unei cascade de fosforilare induce nlspunsul celular. Un hormon care aefioneazd prin activarea guaniiat ciclazei membranare este factorul atrial natriuretic (ANF sau natriopeptind). Acest hormon este un peptid cu 28 aminoacizi (la om). Este secretat de celuie cardiace atriale la diverse semnale. Acfiunile sale. la. nivelul rinichiului, al medulosuprarenalelor (zona glomerular^) are ca efect cre§ferea volumului urinar, crejterea elimindrii de Na\ sedderea secrejiei de renind, de aldosterond. La nivel molecular, ANF stimuleazd guaniiat ciclaza membranard in celulele Jintd, are loc o cre§tere a GMPC §i relaxarea mujchilor netezi. Guaniiat ciclaza citoplasmaticd, soiubild, este sistemul efector pentru oxidul de azot (NO).Acest compus a fost identificat cu endothelium-derived relaxing factor (EDRF), este produs §i aefioneazd ca hormon paracrin asupra muitor celuie, este un factor reglator al presiunii sanguine, mediazd citotoxieitatea, este irriplicat. in neurotransmisie. Oxidul de azot este sintetizat de un sistem enzimatic cu funefie oxidazied - NO sintetaza - din aminoacidul arginind. Oxidul de azot activeazd in celuie fintd guaniiat ciclaza citoplasmaticd. GMPC format, mediazd relaxarea mu§chilor netezi GMPC este mediatorul semnalelor iuminoase in celulele retiniene, conuri §i bastona§e. In aceste celuie, GMPt aefioneazd asupra unor canale pentru Na+, le menfine in stare deschisd. Un sernnal luminos receptat de rodopsind, prin intermediul unei proteine din f am ilia G, transducina, determind activarea GMPC fosfodiesterazei §i are loc sedderea concentrafiei intracelulare a GMP C, Rezultatul acestui fapt este inchiderea canalelor pentru NaU cre§te concentrafia lor intracelulard §i are loc o hiperpolarizare a membranei care se va constitui in senzafia de lumind. Fosfolipaza C §i mesagerii intracelulari diacilglieerol §i inozitoltrisfosfat Un alt sistem txasnsductor al semnalelor externe in mesageri intracelulari are ca sistem efector fosfolipaza C (PLC) care aefionand asupra unor fosfolipide membranare da nagtere la un diacilglieerol (DAG) §i la inozitoltrisfosfat (I P3). Acest sistem mesageri al este ulilizat de divert honmoni, neurotjnansmifdtori §i alte semnale externe (Tabelul XII.4). Fosfolipaza C este activatd de o proteind G denumitd Gp, cu o subunitate txp. Fosfolipaza C aparjine unei familii de hidrolaze care rupe legdturi fosfoesterice din fosfatide. Enzima acestui sistem transducer mesagerial aefioneazd asupra fosfoinozi- tidelor (fosfatidilinozitoL4,5-bisfosfat) membranare (Fig. XII. 14). Produgii de reaefie sunt un diacilglieerol (DAG) §i inozitoltrisfosfatul (1P3). DAG compus lipofil r&mane in memhrand iar IP3, polianion §i puternic hidrofil, difuzeazd in citoplasmd. Cei doi compu§i, impreund sau separat, aefioneazd ca mesageri secunzi pentru hormonii ai edror receptori sunt cuplafi cu proteine Gp. '•Diacilgliceroiul activeazd proteinkinaza de tip C. Aceastd enzima are specificitate pentru resturi Ser sau Thr, dar este distinetd de protein kinazele A, activate de AMPC. Protein kinaza C prezintd mai multe izoforme. Unele sunt activate numai de DAG, altele necesitd pentru activitate cataliticd deplind pe langd

DAG §i ioni Ca2*. Proteinele fosforilate de aceste kinaze exprimd efectul biologic al hormonului (Fig. XII. 15). 581 CHg OCORf CHQCORa

/nOZA 7r/s/OS/aC : /o/ CHZ OCORj CH OCOR£ CH~ OH c. _Dioci/c?/'cero/ (DA G) DH OH ©0)------k OH /rrOZ©o/- tr/sfosiai ( 7 Pj ) Fig. XII. 14 - Formarea mesagerilor secunzi diacilglicerol (DAG) §' mozitoltrisfosfat (IP3) sub acjiunea fosfolipazei C

Fig. XII.15 - Modui de ac|iune a unui hormon cuplat cu o proteins Gp> activator al fosfoiipazei C 582

InozitoltrisfosatuL ceiaialt produs al reacfiei PLC, acfioneazd asupra membrane! reticuiului endoplasmic (reticul sarcoplasmic) determinand o credere pronunfata a concentrafiei Ca2+ citoplasmic (sarcoplasmic). Aceasta membranScuprinde canale cationice deschise de IP3. Ionii Ca2+ sunt molecule semnal pentru multe proteine, enzime, diverse procese celulare. Ionii Ca2+ in asociere cu DAG sau independent de acesta, activeaza protein Mnaze C, efectul hormonal fiind iczultatul conversiei defosfoproteina ** fosfoproteinl RSspunsul celular la stimuli externi care activeazi fosfolipaza C se sting prin reciclarea DAG ji IP3. Diacilglicerolul poate fi utilizat pe diverse c&i. Poate fi transformat intr-un fosfatid §i reinserat in stratul dublu lipidic membranar. Poate fi substrat pentru fosfolipaza A2, care scindeazd hidrolitic ieg&tura carboxil esteried de la C2. Acidul gras din aceastd pozifie este frecvent acid arahidonic, eliberarea sa inifiazd evenimente care due la sinteza de prostaglandine, leueotriene. Inozitoltrisfosfalul are 0 viafd scurtd, el da nagtere la diver§i metabolifi prin fosforilare §i defosforiiari selective. Ace§ti metabolifi ai IP3 au, mulfi dintre ei, roluri biologice importante. Dintre moleculeie semnal care utilizeazd ca mesagef intracelular IP3 este acetilcoiina prin receptori de tip muscarinic (subtipul M3). Astfel de receptori mediazd efectele acetilcolinei asupra mugchilor netezi, secrefia unor glande endocrine sau exocrine. IP3 delermina crejterea concentrafiei Ca2+ citoplasmatic pe seama rezervelor intracelulare. Ionii Ca2+ in mu§chti netezi activeazd 0 kinazd, componenta a lanfului u§or din miozind (myosin light chain kinase, MLCK), care autofosforileazd miozina. Aceasta fosforilare este urmata de interaefiunea actind-miozina, de contracfie. Ca2+ mesager intracelular al semnalelor externe Ionii Ca2+ mediaza efectele intracelulare ale multor hormoni sau a unor semnale nervoase. Ionii Ca2+ regleaza contracfia mugchilor striafi §i netezi, controleaza secrejiile exocrine, endocrine, au un rol deosebit in diviziunile celulare, sunt modulatori ai multor procese metabolice fundamentale. Concentrafia citosolica a Ca2+ in repaos este foarte mica. Pentru 0 celuld de la mamifere aceasta este de ordinul a 10'7-10'6M. Aceastd concentrafie mied contrasteazd cu niveiui calciului extracelulnr ( ~ 10‘3M) ceea ce creaza un gradient de concentrafie foarte pronunfat (de cateva ordine de m&rime) intre cele doua compartimente. Concentrafia mica a Ca2+ in citoplasmd este menfinutd prin funefionarea unor mecanisme care scot Ca2+ din celuld (pompe de Ca2+), prin permeabilitatea naturald foarte mica a membranelor pentru cation!, prin funefionarea unor mecanisme care depoziteaza Ca2+ in mitocondrii §i reticul endoplasmic (reticul sarcoplasmic in mu§chi). Nivelul scdzut al Ca2+ in citoplasma previne form area de fosfafi de caiciu greu solubili (anionii fosfat sunt prezenfi in celule in cantitdfi mari). Totodatd, pornindu-se de ia un nivel foarte scazut este u§or de realizat. 0 cre§tere rapidd §i substantial^ a concentrafiei citosolice a Ca2*. Oscilafii de mare amplitudine ale concentrajiilor intracelulare sunt caracterisiice compandor cu roluri mesageriale. AMPC, IP3 §i alfi mesageri prezintd rnodifiedri de concentrafie prin aparifia §i disparifia lor in reaefii enzimatice. lonul de

583 Ca2+ este o enlitate chimica permanent;!, numai prin deplasdri intre diverse compartimente poate t'i modulatd concentrajia sa. Cre§terea concentrajiei Ca2+ in choplasmd are loc prin p&trunderea caiionului din fluidul exlracelular sau prin eliberarea sa din reticuiul endoplasmic. Depozitul de caiciu din mitocondrii intervine dear in tamponareu variajiilor pe termen lung ale calciului citosolic. Rdspunsurile mediate de Ca2+ sunt unele foarte rapide §i de scurtd duratd, pe cand altele se instaieaza mai incet §i dureazd mai mult. Riispunsurile

rapide (de ordinul milisecundelor) sunt mediate de influxul Ca2+ din exterior dupd stimuldri elec!rice., Modificdrile de concentrajie a Ca2+ mai lente §i prelungite au loc prin deschiderea de canale care sunt controlate de anumiji liganzi. Ca2+ funejioneazd ca mesager impreund cu AMPC, GMPC, DAG sau IP3 sau independent de acedia. Calmodulina. Rolurile regiatoare ale Ca2+ sunt mediate de proteine specifice de legare a caiionului. O proteind cu aceastd funejie, prezentd in toate celulele eucariote este calmodulina. Este o proteind mied, cuprinde 148 nminoacizi; restul Lys din pozijia 115 + este purldlorul unei grupdri cuaternare de arnoniuN(CH3)3. Proteina este alcdtuitd dintr-un segment: linear elicoidal §i doud domenii term inale globulare (Fig. XII.16). Fieeare domeniu globular posedd cate doud situsuri de legare a Ca2+. Calmodulina fixeazd pand la 4 Ca^/moleculd. Un ion de Ca2+ realizeazd 6-8 Iegdturi coordonative la care participd grupdri -COO' din resturi Asp §i Glu, grupdri >C=0 din legdtura peptidied §i molecule de apd. Fixarea Ca2+ la calmodulind determind o tranzifie conformajionala a moleculei, o suprafajd nepolard este descoperitd §i poate interactions cu o proteind Jintd.. Activitatea acesteia din urmd este aiteratd de contactul ei cu calmodulina. Concentrajia celulard a calmodulinei este sufucient de mare pentru ca aceastd proteind sd nu devind limitantd pentru procesul dat. Interacjiunile dintre Ca2"- §i calmodulind, pe de o parte, §i dintre Ca-calmodulind §i proteina Jintd, pe de alta, sunt u§or reversibile. Cand inceteazd stimularea- celulard concentrajia Ca2* scade, calmodulina elibereazd ionii Ca2+ §i revine la conformajia anterioard, detag3ndu-.se de pe proteina Jintd. Aceasta din urmd igi redobSndegte §i ea starea anterioard.

Fig. XII.16 - Structura calmodulinei 584 Ca - calmodulina regleaza o mare diversiiate de procese: - regleazS contracjia mu§chilor netezi §i a microfilamenleior din celule nemusculare (implicate in molilitatea celularS, mitozS, endocitozS, exocitozS); - activeazS pom pa de Ca2+ din membrana plasmicS; - regleaz& activitatea unui numSr de protein kinaze, eie singure modulatori ai alter enzime; - interacjioneazS cu .celelalte sisteme mesageriale prin reglarea activitSfii adenilat ciclazei, guanilat ciclazei, fosfodiesterazelor.

In unele cazuri calmodulina este o pane components a unei enzime oligomerice cSreia ii confers sensibilifate la Ca2*, Astfel in glicogen fosforilazokinazS, cu slructura cuaternarS (a\iyS) 4, subunitatea 8 este calmodulins. Activitatea cataliticS deplinS. a enzimei este dohanditS prin fixarea ionilor Ca2+ la aceastS subimitate. Troponina C este o proteins mniditS cu calmodulina. Ha este un component al aparatului contracti! al mu§chi'lor stria}! Troponina C impiedicS asocierea miozinei cu actinS. DupS legarea Ca2* la troponina C are loc o modificare conformafionalS care permite legarea miozinei la actinS §i contracjia mu§chiului. Mecanismul de acfiune a unor hormoni care regleaza cre§terea §i proiiferarea celulara Insulina §i alji factor! de credere, IGF-I, EGF, PDGF, FGF, NGF (vezi mai departe) regleazS cre§terea §i diviziunile celulare. Mecanismele prin care semnalul extern ajunge in nucleu §i care sunt moleculele care au rolul de transductori ai mesajului mitogen sunt incS pufin cunoscuie. O deschidere* spre mfelegerea acestor procese a fost observajia cS mulji hormoni erne infiuenJeazS proiiferarea celulelor au receptori membranari care posedS activitate protein kinazicS specifics fa}S de resturi Tyr. A§a cum s-a arStat mai sus, receptorii insulinei, al IGF-I (insulin-like growth factor), al EGF (epidermal growth factor) au un domeniu intracelular care dobande§te activitate protein kinazicS tirozin- sepcificS dupS legarea hormonuiui. Are loc o autofosforiiare a receptorului ceea ce amplifies funejia sa kinazicS. AceastS funejie se manifests §i asupra. unor proteine celulare. De§i au fost identificate diverse proteine fosforilate la resturi Tyr ca rSspuns la un semnal mitogen, nu este incS bine injeles mecanismul §i nivelul la care este alterat aparatul proliferativ celular. Un factor comun penlru multe semnale mitogene este activarea unei familii de kinaze denumite MAP kinaze (mitogen-activated phosphokinases). Aceste kinaze sunt distincte de kinazele activate de AMPC, de DAG sau Ca2*. Substratele lor sunt, proteine cu diverse roluri, insuficlent cunoscute, in diviziunea celulelor. MAP kinazele funcfioneazS ca enzime convertibile prin fosforilare desfosforilare, formele fosfo sunt active, ele reprezintS semnale mitogene pozitive, formele defosforilate

m 11 Z'l' 585 au rolul de semnale mitogene negative, Conversia MAP kinazeior este

catalizatd de enzime, o MAP idnazokinazU §i o MAP kinazofosfatazi: Afat MAP kinazokinaza cat §i MAP kinazofosfataza au specificitate dublft, fosfo- rileazS, respectiv, hidroiizeazS gruparea fosforil de la un rest de treoninft §i unul de tirozina situate in secvenja Thr - Glu - Tyr. Glanda tiroidii produce doi hormoni, tetraiodotironina (T4 sau tiroxina) §i triiodoti- ronina (TV) care regleazd procese metabolice fundamentale ale tuturor tesuturilor §i sunt esent-iali pentru viajS. GIandaliroid& este a§eza13 in partea anterioanl a gatului, este alc3tuit3 din doi lobi uniji printr-un istm. La adult cantare§te aproximativ 20 g. Unit&file funcjionale ale tiroidei sunt foliculii tirnidkcii alc3tui{i dintr-un strat de celule epitelialecare delimiteazS unmiezgelailnos. ornogen, denumit coloid, Acest coloid constS dintr-o solujie concentrate dg lireoglobulinfl. Foliculii tiroidieni au o, retea capilarfl bogatfl. Structure. Hormonii Tiroidieni sunt derivap iodurafi ai unui compus ipotetic, derivat de la tirozin3, tironina: MAP kina2

Thr Tyr Thr Tyr

XII.4. HORMONII TIROIDIENI

J! 2* 3___2 HO h/ V' \ /~ 0 —CHZ—CH COO/-/ I 5' e 5e Tiroxina sau T4 este 3,5,3 \59 - tetraiodotironina: I I HO

I I 586 T< este 3,5,3’ - triiodotironind: I H °-0"° Ace§ti hormoni cuprind iod $i functia tiroidiand este intim corelatd cu metabolismul acestuielem^at. Biosinteza. Biosinteza hormoniior tiroidieni este un proces complex care se desfd§oard in celulele tiroidiene §i in coloid (de fapt la interfafa dintre celuie §i coloid); implied pe lingd un aparat enzimatic complex, participarea iodului §i tireoglobulinei ca precursori (Fig. XII. 17). ~ ~~ " Etapeie sintezei de hormoni tiroidieni sunt: - captarea ioniior de iodurd, I\ din plasmS; - oxidarea iodului §i iodumiea unor resturi tirozil din tireoglobuiind (organificarea iodului); -cuplarea resturilor d.e tirozind ioduratd §i formarea de T3 §i T4 ca pdrji componente ale tireoglobulinei; -endocitoza tireoglobulinei din coloid in celuie, hidroliza proteinei, eliberarea de T3 §i T4 §i secrejia acestora in sdnge. lodul pdtrunde in organism ca. ioni de iodurd, prin absorbfie in tractul gastrointestinal, din apd, alimente, impuritdp ale sdrii de buedtdrie. Din plasmd ionii 1“ sunt captaji tie tiroidd printr-un proces activ, dependent de ATP (pomoa de iod). 0 cantitate mied de iodurd traverseazd membrana celulard reversibil, prin difuzie. Prin transport activ tiroida este aptd sd realizeze o concentrate a iodului care, in deficient de iod, poate sd fie de 4050 ori nivelul plasmatic al iodului. Captarea iodului in tiroidd este inhibatd de ioni ca perclorat (C10'4), pertehnetat (XhO‘4), tiocianat (SCR), competitori ai iodului pentru mecanismul de transport. Aceastd inhibijie este utilizatd in unele procedee de explorare a funefiei tiroidiene. Oxidarea iodului are loc pe suprafaja apicald a celulelor tiroidiene unde este localizatd tireoperoxidaza care catalizeazd reaefia: r + H202 + 2H+ --------------------------l+ + 2HaO Peroxidul de hidrogen se formeazd intraceiular sub aejiunea unei oxidaze NADPH dependente: NADPH + H+ + 02 ----------------------NADP + H202 Forma oxidatd a iodului, probabil T, nu este eliberat din centrul activ al enzimei, el este utilizat in continuare la iodurarea tireoglobulinei. Tireoglobulina este o glicoproteind cu masa de 660 kdaltoni §i un conjinut de glucide de 8-10%. Cuprinde peste 100 resturi tirozil per moleculd. Sinteza sa are loc in celulele tiroidiene §i dupd glicozilare este secretatd in coloid. Tireoglobulina este ioduratd, sub aepunea tireoperoxidazei, la interfafa dintre celuie §i coloid. Prin monoiodurare se formeazd resturi de monoiodotirozind (MIT) §i prin diiodurare resturi de diiodotirozind (DIT).

A

587 .‘ $ tv Vi

,/> OH++H& moaza r 7+i , , Li] +2HJ -CH-CO.. - ---------NH-SHCO1 l'H? h t^ \ I X f1 r" ii kJ i,.. JJ T 1' OH OH

,I n//U''\ -OHGO|

j T/reoperox/HaU ] -.........-HH-LH-Cr i

CH2

c%

' "ii

rf. .'"NI iJ

■7

\J OH DU

J1 OH MIT I T/rer/penz/HazH j

'-OHCO...................HH-CH-COOH, OH,

QH Fig. XII.17 - Biosinteza hormonilor tiroidieni (T3 §i T4) Printr-un proces, al clirui mecanism nu este incii cunoscut., la care participa de asemenea tireoperoxidaza are loc cuplarea resturilor MIT §i DIT cu formare de T3 (dintr- un rest DIT §i anal MIT) §i T4 (din doud resturi DIT) care rfimfm ancorate in lanful polipeptidic al lireoglobulinei. Tireoglobulina ioduranf este pitstratd. In coloid §i reprezintao rezerva u§ormobilizabilS de hormoni tiroidieni. Eliherarea T3 §i T4 din tireoglobuliml implied pittrunderea proleinei in cei.uiele liroidiene. Suprafapi apicalit a celulelor Inglobeaza picaturi de coloid prin endocitoza pic&turile sunt internalizate. Urmeazii apoi fuziunea picdturilor de coloid cu lizozomii §i hidroliza lireoglobulinei. AlSturi de aminoacizi diver§i. care intrd In fondu) metabolic celular, sunt: cliberate T 4, T3, MIT §i DIT. Hormonii T3 §i T4 sunt secretap In sange. MIT §i DIT sunt supuse unui proces de deiodurare (sub aefiunea unci deioduraze NADP- dependentd) si iodul este recuperat ca l\ Tiroida secret;! In principal T4 §i mai pufin T3. T3 din sange provine §i prin deiodurarea periferic! a T4, T3 este de cafeva ori mai activ biologic decat T4. Se consider;! ca la nivel celular aeponeaza numai T3, Transport. Hormonii tiroidieni, insolubili, circul! in plasm! fixaji pe dou;l proteine transportoare specifice, TBG (thyroxine binding globulin) §i TBPA (thyroxyne-binding prealbumin) §i de serumalbuminfl. TBG, gllcopratein! cu masa de 50 000 daltoni,.este sintetizat! in fieat §i cantitatea de TBG este reglat! de divergi factor! hormonali. Estrogenii cresc sinteza acestei proteine, androgenii §i glucocorticoizii O' scad. TBG leag! aproximativ 70% din hormonii tiroidieni, are afinitate mai mare pentru T4 decal, pentru T3. Posed! cate un situs de legate per mol. TBPA leag! numai T4, avfmd afinitate §i capacitate mai midi, decat TBG. Serumalbumina, cu afinitate midi dar capacitate mare, transport! aproximativ 10% din T4 §i 30% din T3. Activitate biologica prezint! numai hormonii iiberi, ceea ce reprezint! 0,04% din totalul T4 §i 0,4% din totalul T3. Metabolism. Timpul de injum!t!|ire pentru T4 este de 6-7 zile §i de 1,5 zile pentru T3. Calea majors de metabolizare a hormonilor tiroidieni consul in deiodurare progresiva la nivelul fesuturilor periferice ca rinichi., fieat,-mugchi (Fig. XII. 18). Prin monodeiodurare T4 d! nagtere la doi compugi, T3 cu

activitate hormonal! mai mare decSt T4 §i rT3, biologic inactiv. Aproximativ 30-40% din T4 formeazS T3 §i 40% trece In rT3. T3 format prin deiodurare periferic! contribuie intr-o propor|ie de 80-90% la realizarea nivelului plasmatic de T, circulant Distribufia T4 spre formare de T3 sau rT3 (depinzand de activit!{iie relative ale 5 §i 5’-monodeiodurazei) constituie un mecanism de reglare a concentrajiei hormonilor tiroidieni circuIanfL T3 §i rT3 sunt in continuare deiodtiraii la diiodotironine, T2, §i monoiodotironine, T,, inactive, epurate rapid din plasm! (Fig. XII. 18). T4, In proporjie de aproximativ 20% este metabolizat! §i pe alte cai. Este conjugate cu acid glucuronic sau cu acid sulfuric ,§i eliminat.it prin hil! §i prin urinii. Prin transform!ri ale catenei laterale (transaminare §i decarboxilare oxidaliva) T4 §i T3 dau nagtere la acizii triiodo- §i tetraiodotiroacetic, cataboliji solubiii, excretabili prin uriml:

Acid tetraiodotiroacetic Add triiodotiroacetic 589

J HOrx j' J, m-o( \-~oj rh

Fig. XH.18 - Deiodurarea tetraiodotironinei (I4)

Re glare. Sinteza §i secrejia de horinoni tiroidieni se afkl sub controlul unui sistem feedback megativ la care participH tireotropina hipofizar& (TSH), hormonal hipotalamic eliberator de tireo tropin# (TRH) §i hormonii tiroidieni circulanfi (Fig. XII. 19). Sinteza gi secrejia de TRH este controlat# de centri nervogi din creier prin intermediul hormonilor tiroidieni din plasm#. Niveie scdzute de T3 stimuleaz# formarea de TRH care la rSndul s#.u, determine sinteza gi secrejia de TSH. TSH acjioneaz# asupra tiroidei (via AMPC) activSnd transportul iodului in tiroid.#, organificarea ioduiui, endocitoza gi hidroliza tireoglobuiinei gi secrejia de hormoni in sange. Cregterea nivelului plasmatic al hormonilor tiroidieni blocheaz# evenimentele de mai inainte, pe de o parte, prin acjiune inhibitorie la nivelul hipotalamusului §i, pe de alia, prin inhibifia secrejiei de TSH. La acestea mecanisme reglatorii parlicip# numai T3, prezent. ca atare in sange sau care se formeaz# prin deiodurarea T4 in hipofiz#. In afara controiului hipotalamo-hipofizar, tiroida posed# mecanisme de auloreglare pentru menjinerea st#rii de eutiroidie, independente de TSH. In deficicnja de iod, tiroida secret# mai mult T3 decat in mod normal, T3 este mai s#rac in iod dar mai aetiv biologic. De asemenea, pentru a compensa sc#derea iodului plasmatic, tire loc o cregtere a captSrii iodului in tiroida. In cazul cregterii concentrajiei V intratiroidal scade viteza etapelor de organificare a iodului (effect Wolff-Chaikoff). 590 /mbu/suri din cork)!' I I J _ _.... t .t dip odnJnwiJs WH Adenobipofi/n TSH Somnboskhbb _tS ©! 0 ; 1 / Tiroid a| / +

7s Ti?d ®n3s

n

/' £ r3 ///t ■// /* Fig. XII.19 - Reglarea funcjiei tiroidiene. TSH = tireotropina; TRH = hormonul eliberator de tireotropina; T3 =

triiodotironina; T4 = tetraiodotironina Un all mecanism reglator a) nivelului hormonilor liroidieni circulanfi esie transfor- marea T4 in T3 versus rT3. In inanijie este favorizat# conversia T4 — > rT3 pentru a diminua arderile §i consumu! de materiale energogene. Actiuni biologies. Funcfia metabolic# general# a hormonilor liroidieni este aceea-de a controia metabolismul oxidativ, procesele de ardere, prin care se objLin energie metabolica (ATP) §i e#ldur# (aejiune calorigena). Sub acfiunea hormonilor liroidieni, cre§te vitezametabolismului bazal, diminueaz#rezervele energetice iipidice sau glucidice, catabolismul proteic este intensficat (bilanful azotat se negativeaz#). Totodat#, honnonii liroidieni joac# roluri esenjiale in dezvoltarea fetal# §1 postnatal#, in particular asupra sistemului nervos §i scheletic. La nivel celular, hormonii liroidieni ca §i cei steroidici, acfioneaz# prin activarea unor gene care sunt, transcrise §i exprimate ca proteine cu funejii specifice, Se admite c# numai T3 este activ. Membrana celular# pare a fi traversal# liber §i in citoplasm# T3 este preluat de receptor! cu afinitatc joasii, dup# care hormonul trece pe receptorul nuclear. Receptorul activat acfioneaz# ca factor de transcriere, activeaz# transcrierea unor gene care cuprind HRE (hormone responsive element) specifice. Se consider# c# acfiunea primar# a T3, de reglare a metabolismului oxidativ, este rezultatul cre§terii sintezei de Na+/K+ - ATPaz#

591 (pompa de sodiu). Aceastd pompi este prezentd In fiecare celuhl §i

funcfionarea sa este consumatorul principal de ATP. Complexul receptor~T:i inleracfioneazd §i cu gene miiocondriale stlmuland transcricrca acestonu Cre§terea vitezei de sintezd a unor enzime miiocondriale poate fi o altd cale prin care hormonii tiroidieni influenjeazd metabolissmul oxidativ celular. Efect.de hormonilor tiroidieni asupra dezvoltSrii fetale §i poslnatale par a fi datorate, activdrii (ranscrierii genei homionului.de cre§tere hipofizar (GH) §i a genei NGF (nerve growth factor). XII. 5. HORMONII CARE REGLEAZA CALCEMIA (hormonii calciotropi) Concentrapa calciului in fluidul exlracelular §i calcemia sunt, mcnjinute la valori constante in ciuda 'fluctuajiilor in aport, excrejie $i depozitare a calciului in oase. Homeostazia calciului exlracelular este asiguratft de hormonal paratiroidian, calcitonind §i 1.25-dihidroxi-colecalciferol (l,25dihidroxi-D3, l,25(OH)2D3, calcitriol) care acfioneazit asupra osului, rinichiului §i inlesfinului. Corpul omului cuprinde aproximativ i kg calciu, cea inai mare parte (99%) in oase §i dinji sub forma de hidroxiapatitd insolubikl 0 fracfiune a calciului din os (1-2%) se afld in fluidul periosteal §i pe suprafa{a osului §i participd la schimbul cu calciul exlracelular. Calciul din oase, pe langdrolul structural, reprezintd o sursd de calciu pentru asigurarea homeostaziei extracelulare. Calcemia este cuprlnsii mire 9 §i 11 mg/dl (2,25-2,75 mmoli/1) §i calciul plasmatic este alcdtuit din trei fraejiuni: - Ca2+ complexat de anioni cu moleculd midi, ca citrat, fosfat, reprezintd aproximativ 6% din total; -Ca2+ complexat de proteine, in special de serumalbulinfr, -Ca2+ liber, calciu ionizat, care reprezintd aproximativ jumatate din total. Calciul ionizat reprezinul forma active a calciului §i conccnlrajia sa este foarte fin controlatd, cu variaji interindividuale foarte mici (1,1-1,3 mmoli/1). Calciul intraceluhrr reprezintd numai o midi fraejiune (1()'7-10'6M) din calciul total. Concentrafia calciului intracelular, citosolic este de 1000-10000 ori mai mied decat a calciului exlracelular (10"3M) §i este menpnutd la un nivel foarte scdzut prin impermeabi- litatea membranei plasmatice pentru calciu §i prin funeponarea unor mecanisme active §i foarte eficiente de scoatere a calciului din celule (pompe de calciu). In mitocondrii reticul endoplasmic este sechestratd o cantitate de calciu care poate fi mobilizatd in cerere. Multe procese intracelulare sunt mediate de fiuctuapi ample §i rapide ale calciului intracelular prin influx de calciu exlracelular sau prin eliberarea sa din depozitele intracelulare. 592 XIL5.L HORIVIONUL PARATIROIDIAN Giandele paratiroide, alcdtuite din doufi perechi, sunt situate in partea anterioard a gatului, in spatele capsulei tiroidiene. Elaboreazft §i secrete hormonul paratiroidian, PTH. Structur'd. PTH este poiipeplid cu 84 resturi amioacidice. Diferenfele structural interspecii sunt reduse, Activitatea biologic^ este locaiizatH in segmentul 1-34.. Biosintezd, PTH ca oriee proteind secretorie, este sintetizat. in ribozomi ata§a(i pe reticulul endoplasmic, sub forma unui precursor prepro-PTH cu 115 resturi aminoacidice. Segmentul peptidic N-terminal cu 25 resturi

aminoacidice, segment pre- sau peptid seirmal, este indep&iat in cisterenele reticului endoplasmic §i sub forma de pro-PTH pdtrunde in aparatul Golgi. La acest nivel pierde segmentul pro, un hexapeptid N-terminal §i devine hormonul activ, PTH. PTH nou sintetizat poate fi secretat imediat, stocat in granule de depozit sau este degradat sub acpunea unor peptidaze intracelulare. Principalele fragmente rezultate sunt PTH,.36 §i PTH37.84. Fragmentul N-terminal este rapid degradat la di- §i tripeptide. Fragmentul Cterminal este depozitat in granule impreunft cu PTH §i este eliberat.in circulape odahl cu acesta din urmft. Conirolul secrepeL Spre deosebire de alfi hermoni la care cantitatea de hormon circulanl: depinde de vileza de sinlezS §i/sau de ritmul secrepei,in cazul glandelor paratiroidiene cantitatea de PTH este reglati la nivelul degradflrii intraglandulare. Pre-pro-PTH, pro-PTH §i PTH sunt sintetizap continuu §i intr-un ritm constant, independent de fiuctuapile calciuiui extraeelular. Cantitatea de PTH din glandft depinde de viteza degradarii sale, ea Tiind dependents de calcemie. Cre§terea calcemiei accelereazd degradarea, §i o sc2dere a calcemiei diminueazft degradarea PTH,.mai mult hormon fiind disponibil pentru secrcpe. Eliberarea honrtomilui este stimulate, de asemenea, de sdSderea calcemiei. Metabolism. Timpul de injum&tiSpre al PTH circulant este scurt. Degradarea sa are loc in Jesuturi periferice, in special in ficat, prin reacjii analoage cu acelea care au loc in paratiroidS. Fragmentele peptidice rezultate (fragment N-terminal §i C-terminal) tree in sistemul circulator §1 se adaugtl acelora eliberate din paratiroide. Fragmentele N-terminale, cu activitate biologic^, au t,/2 de 10 minute; fragmentele C-terminale au viep mai lungi (t!/2 de 20-40 minute). Acpune. Paralhormonul are acpune hipercalcemiantft, se opune tendinjei de scSdere a calcemiei, prin cre§terea eliberdrii calciuiui din oase, scMerea excrepei renale §i promovarea absorbpei intestinale a calciuiui (acpune indirect#). Celulele Jinta ale acestor organe funeponeaz# ca bariere celulai*e intre compartimentul fluid extracelular §i lumenul tubular renal si intestinal §i compartimentul fluid al osului. Receptorul pentru PTH. este situat in membrana plasmic# a celulelor pntft §i interaepunea receptorului cu hormonul are ca rezultat cregterea concentrapei AMPC. Nu se cunosc ins# factorii direct implicap in exprimarea efectelor PTH. 593 ! =fo;

In os, PTH acjioneaz# asupra diferenjierii §i activit#|ii diverselor tipuri de celule (osteobla$ti, osteoda§ti, osteocite) avand ca rezultal resorpjia osului, degradarea matricei organice §i soiubilizarea substances minerale, cu eliberarea In fluidul extracelular a ionilor Ca2+ §i fosfal La nivel renal, PTH create reabsorhjia calciuiui pan# aproape de 100% §i inhib# reahsorbfia ionilor fosfal. (acfiune fosfaturic#). Efectele osoase §i renale cresc caicemia, f#r# o cre§tere echivalent# a concentrafiei fosfatului, impiedicandu-se astfei atingerea unor concentrajii crilice la care ace§ti ioni s# formeze fosfat tricalcic insolubil. Efectul hipercalcemiant al PTH prin intervenjie renale este foarte rapid. R&spunsul osos este mai lent dar de o amploare mult mai mare. Efectele osoase ale PTH sunt independents de cele asupra rinichiului. Acjiunea resorptiv# osoas#' se manifest# §i la animate nefrectomizate sau in celule osoase in culturi. PTH promoveaz# absorbjia calciuiui din intenstin prin.tr-un mecanism indirect. Activeaz# 1 a - hidroxiiaza renal#, enzim# erne transform# 25hidroxi-D3 inactiv in 1,25 - dihidroxi-D,, metabolitul activ al vitaminei D3. XII.5.2. CALCITONINA Calcitonina este produs# de celulele C adiacente celulelor foliculare ale tiroidei. Este un polipeptid cu 32 resturi aminoacidice §i masa de 3700 daltoni. Cuprinde o punte disulfuric# intre primul §i al §aptelea rest aminoacidic (Fig. XII.20). Calcitonina
XII.5.3. 1,25 DIHIDROXICOLECALCIFEROL (CALCITRIOL) (l,25-Dihidroxi-D3; 1,25 (OH)2-D3) Acest hormon este un derivat al vitaminei D:i (colecalciferol):

(1,25-Dihidroxi-Dg; 1,25 (OH)2-D3) Vitamina D3 este sintetizatS in organism din colesterol §i aportul exogen este necesar numai in cazul unei insuficiente expuneri la lurninH. Precursorul imediat al vitaminei D3, denumit provitamina D3, este 7-dehidrocolesterolul (Fig. X1I.21). Transformarea 7- dehidrocoleslerol vitamina D3 este o reacfie de fotolizj ee are loc numai in stratul malp'ighian al epidermei sub acjiunea radia.Jiilor ultraviolete. Cantilatea de vitamina D3 sintetizata in organism depinde de gradui de expunere la lumind. Vitamina D3 cuprinsa in alimente, fiind liposolubil'S este dizolvatS in grSsimi §i este absorbita impreuna cu iipidele. Vitamina D3 de la nivelul pielii §i al intestinului'este transportalil la ficat de o proteina specifica, DBP (B-binding protein). In ficat sufera o hidroxilare in pozifia 25 §i da najtere ia 25-hidroxi-D3 (25(OH)D3). Acest metabolit: trece din nou in circulate, este transports! de DBP la rinichi. La nivelul tubilor contorji proximali, D3 sufera o noua hidroxilare (sub acfiunea la - hidroxilazei) §i se formeaza la, 25 - dihidroxi-D3 (L25(OH)2D3) hormonul activ. Hidroxilarea. in

pozifia ia este etapa iirnitanta de viteza §i activitatea la -hidroxilazei controleaza cantitatea de hormon sintetizat. In plasma hormonul l,25(OH)2D3 circuit legal de aceeagi proteina DBP, Metabolism. 1,25 (OH)2D3 are o via{3 foarte scurta. Este inactivata in rinichi prin hidroxiiari suplimentarein pozijiile 23,24,26 la metabolifi inactivi. Calea de eliminare este bila. Centrolul sintezei calcitrioluiui se exercita in etapa trecerii 25 (OH)D3 in l,25(OH)2D3 sub acfiunea la -hidroxilazei. Prin mecanism feedback produsul final inhiha propria sa formare. PTH direct sau prin acjiunea sa hipofosfatemianta stimuleazS activitatea la - hidroxilazei §i sinteza de calcitriol. 595 J:R i

:; R H

:: i • •, ; M

/- fJcfi/Frocofsskro/ (prmlmm $ ) FofoUzi | 2&fifdmfhz3 Ficaf

Fig. XH.21 - Biosinteza caicitrioiuiui (1,25-dihidroxi-coJecaiciferol, 1 ,25-(OH) 2D3) 596 Un alt mecanism de reglare a sintezei de calcitirol se reaiizeazd prin scdderea activitiljii 24 -hidroxilazei de cdtre PTH. Cand activitatea enzimei este mare intrd in competijie cu la -hidroxilaza §i transform^ 25 (OH) D3 in 24, 25 (OH)2D3, metabolit inactiv. Scdderea activitSjii 24-hidroxilazei va facilita intervenjia la -hidroxilazei §i sinteza hormonului. Cregterea concentrajiei de PTH favorizeazd sinteza de calcitriol prin activarea la -hidroxilazei §i inactivarea 24 -hidroxilazei (Fig. XIL22). Acpuni. l,25(OH)2D3 este on hormon liposolubil cu o structure inruditd cu a steroizilor §i mecanismul de acfiune la nivel celular este similar. Interacjioneazd cu un receptor nuclear §i complexui hormomreceptor activeazd cromatina §i transcrierea unor gene specifice. O proteind a cdrei sintezd este indusd de l,25(OH)2E>3 este proteina de legate a calciului din intestin (GBP, Ga-binding protein). Totu§i aceastd proteina no exprimd toate acjiunile hormonale ale l,25(OH)2D3. in afard de intestin, au fost identificaji receptori penttu l,25(OH)2D3 in celule osoase §i alte Jesuturi. Hormonal ar interveni in promovarea diferenjierii celulare.

1oc 25 2^25(0Hp3 > (0H)2D3 Fig. XII.22 - Reglarea biosintezei caicitrioluiui I

597

.. •; JesutuI fintS de predilecjie a] l,25(OH)2D3 este intestinul unde promoveazS. absorbjia calciului §i a fosfatului, transcoiarea lor din lumen in spajiul extraceiular. Acest proces are loc in trei timpi; (1) traversarea marginii in perie §i a membrane! microvilare; (2) transportul prin celule; (3) traversarea membranei bazale §i inlrarea in fluidul extraceiular. Nu este incS stabilit in ce etapS §i prin ce mecanism intervine calcitriolul. Inducfia sintezei de CBP nu poate explica singurS cre§terea absorbed de calciu §i fosfat prin peretele intestinal.

XII.6. HORMONE PANCREATICI Activitatea endocrine a pancreasuiui este localizata la nivelui insulelor Langerhans. Diversele tipuri de celule insulare, A, B, D, F, secrets fiecare un hormon. Celulel B (70% din numftrul total de celule) secrets insulina, celulele A (28%) glucagon, celuiele D (5%) somatostatina §i celulele F, polipeptidul pancreatic. Insulina gi glucagonul sunt factorii regia tori principaii ai homeostaziei glicemice, somatostatina regleazh secrejia de insulina §i de glucagon. Polipeptidul pancreatic regleazft diverse funcjii ale tractului gastrointestinal. XIL6.L INSULINA

Este principals hormon cu acjiune ftipoglicemiant&. S true turd, Insulina este o protein^ micil cu mnsa de 5734 daltoni gi cuprinde 51 resturi aminoacidice. Este alcfttuitS din douft lanfuri, un lan{ A (cu 21 resturi aminoacidice) §i unul B (cu 30 resturi aminoacidice) legate prin doud pun{i disulfurice (A7 - B7 §i A^-B^); o a Item ieghturd disuifuricii leagd restul Cis-A^ cu Cis-An (Fig. XIL23). Insuiinele alter specii diferS de cea umanfi. Diferenfa cea mai mica exist# intre insulina umanh §i cea de pore, acestea deosebindu-se numai prin natura restului C-terminal ai lanjului B. La om este treonina, la pore alanina. Insulina de pore din care s-a delagat treonina terminals este practic lipsitH de antigenicitate §i este folosit# In tratamentul diabetului. Prin tehnologia ADN recombinant s-a objinut insulina umanfi penlru uz terapeutic. Insulina formeaz# cu ionii Zn2+ agregate, dimeri, tetrameri, hexameri. in pancreas insulina se afl& sub form# de hexameri. Forma active circulanta. este probabil monomerul. Biosintezd. Insulina, ca §i aite proteine secretorii, este sintetizaf# sub forma unui precursor, pre-pro-insuiinS. Segmentui N-terminal, pre, cu 23 aminoacizi, peptidul semnal hidrofob are rolul de a conduce polipeptidul ntlscfind in cisternele reticului endoplasmic unde este IndepMat. Proinsulina, polipeptid cu 86 resturi aminoacidice, cuprinde lanjuriie Gly-lle-VaKGiu-Gln-Cys-Cys-Ala-Ser-Val-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-lGU-Gfu-Asn-TyrCys-Asn 5| 50 IE j 21 B I T Phe-Val-Asn-GIn-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-CysGly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys Ala 5 10 16 20 25 30 Fig. XII.23 - Structura insulinei 598 A §i B ale moleculei virtuale de insulins legate prin punfi disulfurice. Capfilui N-terminal ai ianfului A este legal de capfttul C-terminal al lan|uiui B prin intermediul unui peptid de JegiHurl Proinsulina esle transportatd din reticulul endoplasmic in aparatul Golgi unde, este transformat& in insulins. Prelucrarea proinsulinei are loc sub acfiunea unei endopeptidaze care rape dotul leg^turi peptidice flancate de resturi aminoacidice bazice. Rezultd trei fragmente asupra dirora acfioneaxtl o .carboxipeptidazS care deta^eaza resturile de arginind §i Iizind de la capital C-terminal al Ianfului B (din insuiind) §i al peptidului de legStunl. (Fig. XII.24). Complexitatea structural;! a proinsulinei este necesard stabilirii corecte a punfilor disulfurice din insulinS. Lanfurile A §i B separate nu se pot organize spontan in molecula activd a insulinei.

* 31 32 32 33 >— .............................. . ..............- —----[ tzopeplia'm -3Ara 't ~/lys tmi/lm (31 mmoacizi) Pep fid C (31 mmaclzl) Fig. XII.24 - Transformarea proinsulina insulina 59b

Insulina, peptidul C §i o cantitate mic# de proinsulin# sunt incorporate in granule secretorii §i sunt eliberate impreun# in circulatie. Reglarea secrepei. Gliceinia este factorul reglator principal al secrejiei de

insulina. Giicemia a jeun (80-100 mg/dl) este suficient# pentru a declan§a secrepa de insulina. •Eliberanea iasulinei create odat# cu giicemia, raspunsui maxim ob{inandu-se la 300-500 mg/dl In afar# de glucoza mu Ip alp factori influenfeaz# secrefia de insulin#: -alte monozaharide u§or metabolizabile ca fructoza, manoza au efect stimulator; -aminoacizii, in special arginina, iizina §i leucina, stimuleaz# putemic seciefia de insulina; - agonigtii a - adrenergici inhib# secrepa de insulin!!; adrenalina prin a recepjpe este an inhibitor fiziologic al secrepei de insulina; - somatostatina, produs# de celulele D din pancreas, prin acfiune paracrin#, inhib# secrepa de insulin#; - GIP (gastric inhibitory polypeptide), polipeptid eliberat de mucoasa duodenal# §i jejunal# la ingestia de glucoz#, stimuleaz# eliberarea de insulin#; acpunea GIP explica constatarea mai veche c# glucoza administrate oral este un secretagog mai puternic pentru insulin# decat glucoza administrate intravenos. Metabolism. Timpul de mjum#t#pre al insulinei este de 3-5 minute. Insulina este inactivate in principal in ficat, prin dou# mecanisme: a) desfacerea legdturilor disulfurice interlanf printn-o reacfie de schimb cu glutation, catalizat# de glutation-insulin transhidrogenaz#: 4 GSH + insulina .—: ^ 2 GSSG + lanj B + ianj A Lanfurile A §i B separate sunt degradate rapid prin proteoliz#; b) o proteaz# specific# atac# molecula de insulin# ca atare. Mecanisme de acpune. Insulina controleaz# procesele fundamental de stocare §i de mobilizare a rezervelor calorice, permite adaptarea metabolic# a organismului la trecerea de la starea de post la starea de nutripe, Insulina are roluri majore, in deosebi, la animalele care se hranesc intermitent, este mai pupn important# pentru animalele care primesc hrana continuu (ierbivore). Insulina este hormonul care domin# faza anabolic# a metaboiisrpului. In perioadele de alimentare favorizeaz# depozitarea excesului caloric sub form# de lipide, glicogen, proteine. In afar# de roluri metabolice insulina exercit# acfiuni mitogene specifice factoriior de cre§tere, infiuenfeaz# cre§terea fetal#, diferenperiie celulare, regenerarea (esuturilor. , Nu exist# fesuturi punt# specifice pentru insulin#. Toate fesutmile cuprind receptorul insulinic (5.000 - 20.000 receptori per celul#) §i sunt apte s# r#spund# la mesajele transportate de acest hormon. Structura receptorului insulinic a fost descris# mai sus. El aparpne familiei de receptori cu activitate protein kinazic# specific# pentru tirozin#. Varietatea foarte mare a efectelor celulare produse de insulin#, distribufia ubicuitar# a receptorilor s#i, nu permit o explicate unitar# a tuturor acestor acpuni. Se admit mai multe modele privind mecanismul de acfiune a insulinei: a) Activifatea protein kinazic# a receptorului activat, prin fosforilarea unei proteine, inifiaz# o cascad# de fosforil#ri §i defosforil#ri care altereaz# activitdple sau/$i determin# inducfia (represia) sintezei unor proteine reglatoare. Aceste proteine exprim# efectele celulare specifice ale insulinei.

600 b) Insulina determine prin exocitozd - endocitozft redistribuirea unor proteine intre membrana plasmicd citoplasmd. Astfel de redistribute sufera proteina transportoare peniru glucozd, pentru aminoacizi, receptorul pentru LDL (lipoproteine cu densitate micS), transferina. Aceste proteine faciliteazd transportul substanjelor nutritive in celule, permit depozitarea substanfelor excedentare ca glicogen, lipide, proteine. c) Insulina determine activarea unui sistem elector intracelular §i formareade mesageri secunzi. Mai mul|i compu§i au fosl incriminafi ca mesageri intracelulari ai insulinei. O ipotezd susfinutd de date experimental din ee in ce mai nunieroase atestd. ideia acfivMi, printr-un mecanism Tned neelucidat (independent de o proteindG), a unei fosfolipaze de tip C. Substratul acestei enzime este on glicozil-fosfatidil-inozitol. Ace§ti component mevnbranari cuprind o unitate fosfatid.il-inozitoi inseratd in membrand §i o unitate polizaharidicS extraceluiaixl Cap&tuI polizaharidului, printr-o unitate de a -giueozamind este legal la pozipa 6 a restului de inozitoi Aceste componente glicolipidice membranare servesc la ancorarea unor proteine pe suprafafa celulelor. Sub acfiunea fosfoiipazei C se formeaz.it diaciigiiceroi §i un glicozil-fosfoinozitol (Fig. XII.25). Se admite cd, ulterior, prin alte reacjii hidrolitice se formeazd inozitoi-1-fosfat §i giucozamind care aldturi de DAG sunt mesagerii intracelulari ai insulinei. Jinta acestor mesageri pare a fi o fosfoprotein fosfataz.il, enzimd care determine conversia unor proteine din forme fosfo in defosfoproteine. Intr-adevdr, multe dintre efectele metabolice ale insulinei sunt antagonice cu ceie prom ovate de AMPC, activator al protein kinazei A. Defosforildrile induse de ‘insulind activeaxd glicogen sintaza, piruvat dehidrogenaza, piruvat kinaza, 6-fosfofructo-2-kinaza, acetil-CoA carboxilaza, HMG-CoA reductaza, enzimele cheie ale secvenfelor anabolice care determine sinteza de glicogen, de triacilgliceroli, de colesterol. De asemenea, defosforilarea inhibit enzime catabolice reglatoare ca glicogen fosforilazd, triacilglicerol lipazd, fructozo-2, 6-bisfosfatazd. Acpuniie insulinei asupra metabolismului glucidic. Insulina mediazd transportul transmembranar de glucozd in adipocite, tesut. muscular §i alte tipuri de celule. Acest efect este realizat prin redistribuirea proteinei transportoare de glucozit din vezicule intracelulare pe supra'faja celulelor. Insulina, indirect, favorizeazd influxul de glucozit in hepatocite. in aceste celule transportorul pentru glucozit funcjioneazd ca o poartd dependent numai de gradientul de concentrate a glucozei intre spafiul extracelular §i interiorul celulei. In hepatocite, insulina induce sinteza de glucokinazd. Fosforilarea rapidd a glucozei intracelular detemiind influxul de glucozit in ficat. Insulina favorizeazit toate cdile de utilizale a glucozei in mu§chi, ficat, fesut adipos. In ficat, glucoza este depozitatd ca glicogen §1 este convertitd in acizi gra§i. Ace§tia din urmd incorporaji in triacilgliceroli sunt exportaji ca VLDL (lipoproteine cu densitate foarte micd). In mu§chii scheletici, glucoza este utilizatd ca substrat energogen §i excesul este pdstrat ca glicogen. In.tesutul adipos, glucoza este utilizatd mai ales pentru a furniza giicerolfosfat, metabolitul de la care se sintetizeazd triacilgiicerolii. In ficat, insulina exercitd o putemicd acjiune antigluconeogeneticS prin represia

enzimei determinate de vitezit, fosfoenoipiruvat carboxikinazd. Acjiunile cumulate ale insulinei asupra metabolismului glucidic au ca rezultat scaderea glicemiei. -r

601 l;i M

^HeOCO&t CHOCO l G/icon PLC

' OH X HO \ —F” OH

sl/'coz// HosTaH /c///inoz/To/

6/icon 0 Vr W OH OH ©0 J-------i l

2

! u HpO ,CHzOCt CHtQM of/cozi/-' moz/fo/- P

CHa OCORt X LHOCORI on JJ^oC/X(y/n era/

OH inozt/o/~1-(p) G/ucotomina G//'can Fig, XII.25 - Mecantsmui de action e a insulinei prin mediatori intracelulari rezulta|l prin hidroliza unor glscolipide membranare

h Acliuniie insulinei asupra metabolismului lipidic pot fi descrise global ca acfiuni antilipolitice §i lipogenetice. Insulina influenjeazft metabolismul lipidic prin acjiunile direcle asupra adipocitelor dar §i prin efectele sale asupra ficatului. La nivelul Jesutului adipos, insulina faciliteazii influxul de glucozft, transformarea glucozei in glicerolfosfat, activarea iipoproteinlipazei. Aceasta din urmil hidrolizeaz&triacilglicerolii transportafi ca VLDL sau chilomicroni. Acizii gra^’i rezultafi sunt depozitafi ca triacilgliceroli. De asemenea, insulina inhibit triacilglicerol lipaza din {esutul adipos (lipaza hormon- sensibM) dirninuand efluxul de acizi gra§i din adipocite cu scMerea nivelului de acizi gra§i liberi (neesterificaji) din plasmil. Insulina are acfiune anticetogenicd. scade producfia de coipi cetonici (acid acetoacetic §i acid (Lhidroxibutiric). 602 AcjtiunUe insulinei asupra rnetabolismului aminoacizilor §i al proteinelor. Insulina faciliteazS transportul aminoacizilor cu R neutru In mugchi,

stimiiieaz<1 sinteza proteicS §i Incetinegte degradarea proteinelor, in afara acestor roluri generate, insulina influenjeazS sinteza unor proteine specifice intervenind la nivelul transerierii genelor. Multe din acjiunile hormonale trie insulinei au la bazd inducjia sau represia sintezei unor proteine specifice, ca glucokinaza, fosfoenolpiravat carboxikinaza. Rolurile insulinei ca factor de cre§tere. Prin studii pe culturi de celule, in vitro, s-a stabilit Cit insulina stimuIeazS proliferarea unor tipuri celulare, acfionand ca factor de cregtere. Insulina Insftgi gi receptorul insulinic prezintS analogic structural*! cu IGF (IGF-I gi IGF-II, insuiine-like growth factors). Receptorul insulinic activat posedd activitate protein kinazicd, Insugire Intalnibl gi la receptorii altor factori mitogeni. Hormon pancreatic sintetizat In celulele A (a), din insulele Langerhans, are acfiune antagonicft insulinei. Este un agent hiperglicemiant. StructureU secrete, metabolism. Glucagonul este un poiipeptid cu 29 resturi aminoacidice (Fig. X 11.26). Este sintetizat sub forma unui precursor pre-pro-glucagon. Segmental N-terminal pre (peptid semnal). este de.tagat In reticulul endoplasmic. Pro- glucagonul este prelucrat In aparatul Golgi cu formarea mai rnultor fragmente polipeptidice. In plasmS, alfituri de glucagon circuit §1 aceste fragmente inactive. XII.6.2. GLUCAGONUL

Fig. XIL26 - Structura glucagonului 603 rb hU i.' ;:A ■■ ; ; Vi;\!: I W; k: . ; ;■

'■ '

i if|: ;• vi ri i I .! i. m m-v? U::N : ; Glucagonui are t1/2 cie aproximativ 5 minute. Este degradat rapid in ficat prin detagarea a doud resturi aminoacidice de la capital N-terminai. Glucagonui este secretat in sangele portal gi la o singura trecere prin ficat o fracfiune important^ este inactivate. Acjiunile reglatorii majore ale glucagonului se manifesto la nivel hepatic. Re glared secretfeL Agentul reglator major al secrejiei de glucagon este glucoza care inhibit secrejia de glucagon. 0 serie de alji factor! influenfeazd secrejia acestui hormon. Somatostatina, produsa de celule de tip D din insulele Langerhans, exercitd un efect inhibitor asupra secrejiei glucagonului. Aminoacizii, agonigtii (3 adrenergici stimuleazS secrejia. Acfiuni. Glucagonui exercitd,acjiuni metabolice opuse cu ale insulinei, rezultatul global al acestora fiind cregterea glicemiei. Acjiunile sale se exercitd in primal rand la nivel hepatic, concentrajia sa in sangele portal fiind mai mare decat in sangele sistemic. Efectele intraceluiare ale glucagonului sunt mediate de AMPc a card concentrajie create sub acjiunea hormonului gi de protein kinaza A activatd de AMPC. Acjiunea principals a glucagonului este cea gluconeogeneticd, sintezd de giucozd din precursors neglucidici. Glucagonui induce sinteza enzimelor cheie gluconeogenetice, fosfoenolpiruvat carboxikinazd, fructozo1, 6-bisfosfatazfi, glucozo-6-fosfatazd. Prin activarea protein kinazei A gi conversia enzimelor in forme fosforilate, create fluxul de metabolifi pe Galea gluconeogenezei gi diminueazd ritmul glicolizei. Conversia giicogen fosforilazei gi a glicogen sintazei in forme fosforilate activeazd glico- genoliza gi inhibd sinteza de glicogen. Glucoza objinutd astfel trece in sdnge, create glicemia. Metabolismul lipidic in hepatocit este deplasat spre (3 - oxidarea acizilor gragi gi cetogenezd. Diminuarea glicolizei limiteazd cantitatea de ace til CoA gi implicit gi de malonil - CoA. Absenja malonil - CoA ridicd inhibijia pe care aceasta o exercitd asupra carnitin-acil transferazei, acizii gragi cu catend lungd pdfrund in mitocondrii gi sunt supugi P - oxiddrii gi sintezei de corpi- cetonici. Conversia glucozei in acizi gragi gi sinteza de trigliceride este diminuatd (acjiune antilipogeneticd). Glucagonui nu influenjeazd metabolismul glucidic in mugchi. Un alt Jesut care rdspunde la glucagon este jesutul adipos. Prin cregterea concentrajiei AMPC, este activatfi lipoliza gi inhibatd iipogencza. Acizii gragi eliberaji in sange sunt preluaji de ficat unde sunt supugi oxiddrii mitocondriale. In diabet gi in inanijie glucagoneinia este crescutd §i, respectiv, nivelul plasmatic al insulinei este scdzut (raport insulind/glucagon mic), metabolismul glucidic hepatic este deviat spre cetogenezd si hiperglicemie

(Fig. XIL27). Un raport insulind/glucagon ridicat, specific perioadelor de apod glucidic inverseazd evenimentele de mai sus, metabolismul hepatic este deplasat spre utilizarea glucozei (Fig. XII.28). XII.6.3. SOMATOSTATINA Acest hormon a fost descris inijial ca factor hipotalamic care inhibd eiiberarea somatotropinei hipofizare (GH-RIH). Ulterior somatostatina a fost identificatd gi in pancreas (este produsd de celule D insulare), in tractul gastrointestinal, in creier. Somatostatina este elaboratd sub forma unui precursor cu greutate moleculard relativ mare. Prin prelucrarea acestuia rezultd doud forme active ale somatostatinei, cuprinzand 28 gi respectiv, 14 resturi aminoacidice. 604

D/utef sou Inmf/s C: i Insulins t AM ft i Prukm&mzzA v

© m-2 \Fru-2J-fl © Glucagon 6/ieogen “0 G/B~5~P- ,, i G/ucozI

I

Fig. XII.27 - Metabolismul glucidic hepatic in diabet (sau Irvanijie), raport insulina/giucagon sc&zut PFK = fosfofructokinaza 1 sau 2; FDPazS = fructozo-1,6-bisfosfataz# Somatostatina prin acjiune paracrin# inhibit secrefia cie glucagon, de insulin# ca §i a unor horm.oni gastrointestinali, secretin#, colecistokinin#, GIP (gastric inhibitory polypeptide). Somatostatina in creier are probabil funcjie de neutrotransmi{#tor. 605 / :T

_> Af/rnenters i eu g/aceA x 0 f tfttu/m I V v f F-25-P,

X\ Am iMA...... . .L I c) PteSaS/S,? j Gi/'cegen fi 6/c-§~ /X— 6A corn -H -, tru-o-P ~x Tit 9[7m9]{ M.5-P, s 41 PiruvsG -*----------------------------------------XX P0Z Ac/t/gm teeter Fig. Xli.28 - Metabolismul glucidic hepatic in perioadele de alimentare glucidica, raport insulina/gtucagon ridicat. RFK ^ fosfofructokinaza t sau 2; FDR = fructozo-1,6-bisfosfataza XII.6.4. POLIPEPTIDUL PANCREATIC Acest compus este produs de celule de tip F din insulele Langerhans. Este un polipeptid eo 36 res tori aminoacidice. Funcfia sa nu este mcft precizatTi. Se presupune c3 ar avea rol in secrejia de bicarbonat de c&tre pancreas. 606 XIL7, HORMONI! GASTR.OINTESTINA.LI TractuI gastrointestinal secret# multe sobstanfe active cu roluri in digestie, absorbjie, in tranzitul alimentelor in tubul digestiv. Unele dintre acestea acjioneaz# ca hormoni endocrini (sunt eliberaji in sSnge gi ajung la fesutul Jint# prin sistemul circulator), aljii acjioneaz# asupra celulelor Tnvecinate (acjiune paracrin#) sau ca neurotransmijhtori sau neuromodulatori. Dup# a.sem#n#ri structurale §i funcjionale principalii hormoni gaslrointestinali sunt grupaji in dou# familii: 1) familia seeretinei care cuprinde secretina, GIF (gastric inhibitory polypeptide), VIP (vasoactive intestinal polypeptide) gi glucagon; 2) familia gastrin#-colecistokinin#. Secretina este sintetizat# de ceiule (S) din duoden gi jejunul proximal. Este un polipeptid cu 27 resturi aminoacidice, are caracter bazic (cuprinde patru resturi Arg), Prezint# omologie structural# cu ceilalji hormoni ai familiei, cu glucagonul se aseamSn# prin 14 resturi aminoacidice, Secretina este eiiberat# cand conjinutul acid ai stomacului atinge mucoasa duodenal#. Acfiunea sa const# in crcgterea irigajiei sanguine a pancreasului gi

stimularea secrejiei de ap# grbicarbonat. Prin acest. efect secretina joac# un rol important in neutralizarea conjirmtului intestinal. De asemenea, secretina favorizeaz# form area unei bile fluide gi hogat# in bicarbonat. GIF (gastric inhibitory polypeptide), Acest polipeptid cu 43 resturi aminoacidice este produs de mucoasa duodenal# gi jejunal#. Are acjiune inhibitorie asupra aclivij#jii gi secrejiei gastrice. De asemenea stimuleaz# eliberarea de insulin# de c#tre celulele pancreatice. VIP (vasoactive intestinal polypetide). Polipeptid cu 28 resturi aminoacidice. Este prezent in nervi gi vase gi prin acjiune paracrin# regleaz# motilitatea tubului digestiv, relaxarea sfincterelor, debitul sanguin. Glucagonul este produs de ceiule A r#sp#ndite in mucoasa gastric# gi intestinal#. Nu se cunoagte rolul fiziologic ai glucagonului fonnat la acest nivel. Ileonul gi colonul sintetizeaz# poiipeptide cu structuri gi funcjie similare cu cele ale glucagonului (enteroglucagon). Colecistokininele. Celulele mucoasei duodenale §i ale jejunul ui proximal elaboreaz# un polipeptid precursor prin a carui prelucrare rezult# peptide active cuprinzand de la 4 la 39 resturi aminoacidice (CCK 4, CCK 8, CCK 12, CCK 33 §i CCK 39). in plasm# se afl# in cantitatea cea mai mare colecistokinina 8. Secrejia de colecislokinin# este declangat# de contactul mucoasei intestinale cu conjinutui. stomacal cuprinzand produsele digestiei parjiale a alimentelor gi cu un pH acid, Colecistokinina acjioneaz# ca hormon, stimuleaz# seciejia pancreatic# §i contracjia vezicii biliare. Gastrina este eiaboratfiin principal de mucoasa gastric# (regiunea antral#), de cea duodenal#. Exist# sub forma mai multor peptide cu 14, 17 sau 34 resturi aminoacidice (Gu, G17, 634). Fiecare gastrin# cuprinde cate un rest tirozil gi exist# in form# sulfatat# sau nesulfatat#. Activitatea biologic# rezid# in cap#tul C-terminal al peptidelor. Pentapeptidul C-terminal este identic in toate formele gastrinei ca gi ale colecistokininei.. Secrejia de gastrin#.este declangat# de stimularea vagului gi de contactul antrului piloric cu chimul. Gastrina stimuleaz# secrejia de acid, de pepsin# de c#tre mucoasa gastric#, are acjiune hiperrrofiant# asupra mucoasei gi cregte motilitatea gastric#. Alte peptide active din traciul gastrointestinal. Din tubul digestiv au fost izolate multe alte peptide care acjioneaz# prin mecanisme paracrine gi neurocrine (prezenja lor in sange este nesemnificativ#).

607 Substanja P (polipeptid cu 11 resturi aminoacidice) stimuleazacontracfia

musculaturii netede a intestinului. Somatostatina, inhibit secrefia de gastrinS, secretina, colecistokinind Motilina (polipeptid cu 22 resturi aminoacidice) elaborate de mucoasa intestinal^ stimuleaz& secrefia de acid §i pepsinS de cStre mucoasa gastric^ §i contracjia mu§chi!or netezi inteslinali. Glandele suprarenale (adrenale) sunt alc&tuite din dou& regiuni distincte cu origini embriologice, structuri §i funcfii diferite. Porfiunea corticaia (90%) se dezvolta din mezoderm §i are o structure epitelialS. Medulara (10%) este de origine nervoasa. Cortexul produce hormoni de naturd steroidicd, corticosteroizii. Meduiara eiaboreazS substance denumite catecoiamine. Medulara impreuna cu sistemul nerves parasimpatic §i simpatic alc&tuiesc un sistem neuroendocrin - simpatoadrenal - cu rol In adaptarea organismului la diverse solicitari, acute sau cronice, Medulara poate fi considerate o parte a sistemului nervos simpatic, un ganglion care §i-a pierdut terminafiile axonale. Produ§ii elaborafi de medulara - catecolaminele - sunt eliberaji direct in sange. Medulara este alcatuitS. din ceiule denumite cromafine (feocromocite) datorita proprietafilor lor tinctoriale. Cu acid cromic se coloreaza in brun, datorita oxidMi catecolaminelor la melanine. Celulele cromafine au o origine embriologica comuna cu celuiele ganglionare ale sistemului nervos simpatic. Grupuri de ceiule cromafine se g&sesc $i in lungul nerviior simpatici din piamfm, float, intestin etc. (ceiule cromafine ectopice). Medulosuprarenaia este inervatade fibre preganglionare ale sistemului nervos simpatic, fibre colinergice. Vascularizafia se face printr-un sistem vascular portal ce se formeaza din capilarele din cortex, in acest sistem glucocorticoizii ating concentrafii mult mai ridicule decat in circuiafia sistemica. Medulosuprarenala elaboreazS compu§i denumifi catecoiamine (cuprind nucleul catecolului, 1, 2 -dihidroxibenzen): dopamin£* noradrenalina (norepinefrina) §i adrenalin# (epinefiin#): XII.8. HORMONE MEDULOSUPRARENALIENI Structure chimicft a catecolaminelor OH OH OH

CH OH \ CHOH ! CH2-NH2 CH~ NHo CH-HH-CHo DopdminB Nordo'reaa/iad 608

A dread!f'nbi

Medulosuprarenala elibereazS in sange adrenalin# (80% din secrefia totals) §i noradrenalin# (20%). Noradrenalinaindepline§te §i funcjia de neurotfansmijdtor la nivelul lermmafiilor nervilor postganglionari simpatici (terminapi adrenergice) sangele cuprinde o fracfiune din noradrenalina eliberat# pe aceast# cale, cea care nu a fost recaptatS imediat la nivelul sinapseior. Celulele cromafine ectop'ice cuprind noradrenaline sintetizatS in situ sau captatd din sange. Adrenalina nu este sintetizat&in celulele cromafine extramedulare, dar poate fi prezenf&in aceste celule prin captare din plasm! Dopamina este absents in sange. Ea se g5se§te in anumite regiuni ale sistemului nerves central. Are rol de neurotransmi$tor la nivelul unor terminajii nervoase, dopaminergice. Biosinteza catecoiaminelor, Catecolaminele sunt objinute din tirozini. Acest aminoacid rezultd prin hidroliza proteinelor endo sau exogene sau prin hidroxilarea fenilalaninei, aminoacid nutritiv esenfial Trans form area tirozin# adrenaline are loc prin patru reaefii ce au loc in granulele cromafine §i in citosolui celulelor cromafine (Fig. XIL29), Transformarea noradrenaline adrenalin# 'are loc in citosoi, este catalizalft de o metil transferazS (feniletanolamino-N-metil transferaz#) care utiiizeazft ea donor de grupSri metil S-adenozil-meiionina, Reacfia are loc numai in celulele cromafine din medular^i este controlat# pozitiv de cortisolul (glucocorticoid) prezent in sangele portal care * unge din cortex in modular#. OH

OH
I CHMV* i 2 coon JJopo CO?

.Dopornma Br/na

AscorboA OH

CH OH

CH OH CHlNHCH3 DsAh'roosconbo/ NQrocAenoAna S-Aaknoz}/ Ac/rOrroAna homoc/sM/no Fig. XH.29 - Biosinteza catecoiaminelor 1) Tirozin hidroxilaza; 2) Dopa decarboxiiaza (piridoxal fosfat dependents); 3) dopamin hidroxilaza; 4) feniletanolamino-N-metil transferaza 609 i' i

h: Depozitare §i secrefie. CeioJele medulosuprarenaliene cuprind

noradrenaline §i adrenalins depozitate impreunft cu ATP-Mg2+, ioni de Ca2* §i o proteinS specified cromograninS, in granule (cromafine). Unele granule cuprind adrenaline, unele noradrenaline §i allele cuprind ambele catecolamine. Prin stimularea nervoasS a medularei, dependents de influxul ionilor de 2 Ca *, confinutul granuieior cromafine este eliberat in sange (in principal adrenalina §i in can ti late mai mic& noradrenalina). Sangele mai cuprinde noradrenalina ce a scdpat. din sinapsele1 adrenergice cea eliberatS din celulele cromafine ectopice. Metabolismul catecolaminelor, Catecolaminele au o viapl foarte scurtft, im de 10-30 secunde. Activitatea catecolaminelor circulante este intreruptS rapid prin capture in fesuturi, in principal in ficat §i in rinichi, §i metabolizare la compu§i inactivi secretabili. CanlitSji mici de catecolamine sunt eliminate ca atare pe cale renalS. Catabolismul catecolaminelor are loc cu participarea a dou& enzime, catecol-O-metil txansferazS (COMT) §i monoamin oxidaza (MAO) (Fig. XII.30). Sub acjiunea combinatS a acestor enzime rezultS in final atfit din adrenalins c§t §i din noradrenalinS, catabolitul denumit acid 3-inetoxi-4-hidroxi-mandelic (acid vanilmandelic). In urinS, alSturi de acid vanilmandelic, se aflfi §i cdtaboliji intermediari. Catecolaminele §i c'atabolijii lor urinari sunt eliminafi in cantitate mare in feocromocitoame. Acpuni. Adrenalina §i noradrenalina ac{ioneazS asupra unui numSr mare de fesuturi. Receptorii adrenergici au fost descri§i mai sus, ei apar|:in. familiei de receptor! membranari alcStuiJi din §aple dice transmembranare. A fost recunoscutS existenfa a douS clase de receptori adrenergici, a §i p, fiecare clasS alcStuitS din subclasde af §i a2, respectiv, pt §i p2* Ace§ti receptori sunt cuplafi cu sisteme mesageriale secunde diferite §i rSspunsul unui Jesul la catecolamine va depinde de natura receptorilor adrenergici pe care ii posedS ca §i de natura sistemelor efectoare proprii fiecSrui tip de celulil. Receptorii P, §i p2 sunt cuplafi cu adenilat ciclaz&prin intermediul proteinei Gs, cu acfiune stimulatoare §\ ocuparea acestor receptori determinS cre§terea concentrafiei intracelulare de AMPC; receptorii a2, cuplafi cu o protein# G- cu efecte negative asupra adenilat ciclazei, determine scSderea concentrafiei AMPC. Ocuparea receptorilor a, determinS o crejtere a concentrafiei intracelulare a Ca2*fie prin influx din spafiul exlracelular, fie prin eliberare din depozite (medial# de inozitol Uisfosfat). In tabelul XIL5 sunt ar#tate acfiunile catecolaminelor in diverse Jesutmi §i natura receptorilor' care mediaz# aceste efecte. Prin acfiunile asupra sistemului circulator, asupra melaboiismului energogen, prin reglarea secrefiei anumitor hormoni, catecolaminele au roluri importante in adaptaiea organismului ia agresiuni interne sau externe, fizice sau psihice (frig, emofii, anoxie, hipoglicemie etc.). Efectele metabolice, mediate in principal de c#tre adrenalin#, au ca rezultat cre§t.erea consumului de oxigen §i a producfiei de ATP §i cSldur# la nivelul a numeroase fesuturi, La nivelul musculaturii scheletice este activate giicogenoliza care elibereaz# substratul glicolizei. La nivel hepatic giicogenoliza §i gluconeogeneza furnizeaz# glucoz# pentru menfinerea

glicemiei §i asigurarea combustibilului pentru creier. In fesutul adipos este stimulate lipoliza care furnizeaz# acizi gra§i pentru uzul 610 OH -OH MM HoredfSnaJiaa COMT CHOH OH2HH2

Hormsknefrm MHO"' \ MHO s r / COOH COM!

CHOH hzNH-CHj H drew7/rd COM7 OOHj /' 0-.CH, CHOH t DH2NHCH3 Metansfr/ns /-''MHO OOOff Hn/d S-me/oA/- $■ -d/dree/-mande/Zc (acid ye;?//-mndeZZc) Fig. XII.30 - Catabolismul catecolaminelor COMT = Catecol-O-metil transferaza; MAO = Monoaminoxidaza fesuturilor periferice §i glicerol, substrat gluconeogenetic. Inhibifia secrefiei de insulin^ reduce consumul de glucozS sanguine de cdtre {esuturiie periferice, aceasta r&m&nand disponibilS pentru creier. Medulasuprarenala nu este esenjialS pentru viajd, dar in absen[a secrejiei medulare organismul este inapt de a face faf&divergiior factori stresanji care acjioneazS permanent. 611

XII9. HORMONE CORTICOSUPRARENALIENI Cortexul suprarenalei este alcetuit din irei zone distincte histologic, un

strat exterior (zona glomerulosa), unul median (zona fasciculata) §i unul intern (zonareticularis). Zona glomerulosa este producfttoare de mineralocorticoizi, zona fasciculata (cea mai dezvoltatft la om) §i zona reticularis produc glucocorticoizi §i hormoni androgeni. Zona extern& §i cele doud zone interne se comports ca doml unite# separate prin produsele secretate §i prin mecanismele reglatorii. Acjiuni mediate de receptorii adrenergic) Tabeul XJL5 Recepto lesitt r Efect Cregterea vitezei gi forjri de Miocard p, contrac|ie Mugchi Contrac|ie neted din vase P* Relaxare Intestin <*2, P; Retaxare, scaderea motilitajii Rinichi Inhibi|ia eiiberarii de renina Pa Eliberare de renina Broahiole P2 Dilatare Mugchi. scheietici Pa Glicogenoliza Pancreas Inhibi|ia eiiberarii de insulina Jesut adipos p, Lipoliza Tract genitourinar a, Contrac|ie Structura. Hormonii corticali sunt steroizi (coiticosteroizi) C2] (mineralocorticoizii §i glucocorticoizii) §i C19 (androgenii). In cortexul suprarenalei se afle un numftr mare.de steroizi,/ dar aceia care sunt secretaji in cantitdfi suficiente pentru a exercita acfiuni hormonale sunt: cortisolul (glucocorticoid) ^aldosterona (mineralocorticoid), dehidroepian- drosterona §i androstendiona (androgeni). In Fig. XIL31 sunt aretate structurile acestora. Aldosterona cu grupare aidehidicd la C18 prezinte §i o structure semiace talice. Biosinteza. Precursorul corticosteroizilor este colesteroiul objinut, In majoritate, prin capture din lipoproteinele plasmatice ((3 -iipoproteine) sau prin sintezd de novo. Adrenalele cuprind rezerve de coiesterol sub forme de acil-colesterol. Cele dou& unit^lji funcjionale ale corticalei difer& prin distribujia unor enzime ceea ce face ca aldosterona se fie sintetizate numai in zona glomerulosa (lipsitft de 17a - hidroxilaze); cortisolul §i androgenii se formeaz3 numai in zona interne (aceasta nu posede 18-hidroxidehidrogenaza, necesare sintezei aldosteronei). Etapa comun3 pentru sinteza corticosteroizilor este transfoimarea colesterolului in pregnenolone sub acjiunea unei enzime ce cuprinde citocromul P-450 see (de la side chain cleavage). Procesui decurge intramitocondrial prin hidroxilare succesive la C22 §i C^, scindarea legeturii C^-CA §i eliberarea unui fragment C6 (aldehide izocaproice) (Fig. XEL32), De la pregnenolone se ramifice secvenfele care due la glucocorticozi, mineralocorticoizi §i la androgeni (Fig. XII.33). 612

m2

OM

Corf/sofv/ CH2GH I

0/f CHzOH II

Atdosterond

Aadrostendiona , Dehidroepiand/vsteronS Fig. XII.31 - Structuril© hormonilor corticosuprarenalieni (corticosteroizi)

P~ecjaeno/on& Fig. XII.32 - Transformarea colesterolului in pregnenolena 613 :\ !i\\ ii:

CH2OH

Fig. XII.33 - Biosinteza hormonilor corticosteroizi 614 Calea care duce la cortisol incepe fie prin hidroxilare la Ci7 (sub acfiunea unei 17 a - hidro- xilaze) §1 formate de 17 a - hidroxi-pregnenolone, fie prin acfiunea combinat! a unei dehidrogenaze (3(3 - hidroxisteroid dehidrogenaz3) §i a unei izomeraze (A5 -> A4 - izotneraz!) cu formare de progesterone. 17 a - Hidroxilarea are loc numai In zona interna. Prin alte doud hidroxil3ri la C2{ (sub acfiunea 21-hidroxilazei) §i la Cu (sub acfiunea 1 ip - hidroxilazei) se formeazd cortisol. Sinteza de aldosterone nu implied hidroxilare la C57; prin hidroxilare la C2{ §i apoi la Cn se formeazd 11-dezoxicorticosterona cu acfiune mineralocroticoidd slab! §i respectiv, corticosierona (cu acfiune glucocorticoid!). La rozMoare, corticosterona este hormonul glucocorticoid

major. Reacfia specified pentru fdrmarea aldosterone!, localizat!la nivelul zonei externe a cortexului, este transformarea grupei metii C!8 in grupare aldehidicd (prin hidroxilare §i dehidrogenare). Sinteza de steroizi C19 in cortexul suprarenalei este localizat! la nivelul zonei interne (zona fasciculata plus zona reticularis) §i in condifii fiziologice este redus! cantitativ §i fdr! semnificafie. Dupd hidroxilare la Cl7, are loc deta§area catenei laterale (sub acfiunea unei liaze) §i se formeazd dehidroepiandrosteron! din 17a - hidroxi - pregnenolon! §i androstendiond din 17a - hidroxi - progesterone; produsul principal este dehidroepiandrosterona, care mai departe este conjugat cu acid sulfuric, atatin andrenale cat §i in ficaf. Androgenii corticali nu au activitate hormonal*! ca atare, ci dupd transform are in testosterone §i dihidrotestosterond in fesuturi fintd. Secrefie $i transport. Corticosteroizii nu sunt depozitafi in celul!, ei sunt, secretafi imediat dupd sintezd. in sSnge circul! fixafi pe proteine transportoare specifics sau pe serumalbumind. Fracfiunea liber! este cea active biologic. Cortisolul este iransportat in condifii bazale, in proporfie de aproximativ 70%, de transcortine sau CBP (cortisol-binding protein). Serumalbumina leagd cu afinitate mice aproximativ 15% din cortisolul plasmatic. Aldosterona §i androgenii corticali sunt fixafi pe serumalbumin! care are afinitate mice dar capacitate mare de legare. Metabolism. Timpul de injumdtdfire pentru cortisol este de 1,5-2 ore. Corticosteroizii sunt catabolizaji printr-o varietate mare de reaefii care ii inactiveazS §i ii transform! In compuji hidrosolubili, excretabili. Calea major! constd in hidrogenarea dublei legdturi de la C4, a grup!rii cetonice de la C3 dup! care urmeaz! conjugarea cu acid glucuronic. Se formeazd. catabolilul:

615 u-'-'

j!

■ I ": !’ 'I ' i

L; Aciiuni. Corticosteroizii utilizeazS receptori intracelulari care acJioneazS la nivelul genomului ceular. Receptorul pentru cortisol este prezent in aproape toate celulele gi acest hormon influenjeazS un numSr foarte mare de procese. Degi strue turn receptorului ca gi elementele regiatoare din cromatinS cu care interacJioneazS complexul cortisol-receptor (CRE- cortisolresponsive element) sunt bine caracterizate, pufine din efectele biologice ale cortisolului pot fi explicate la nivel molecular. Au fost descrise numeroase proteine a cSror sintezil este indusS sau represatS de cortisol. Astfel de proteine sunt: tirozinamino- transferaza, triptofan oxigenaza, proopiomelanocortina, transferina, iipocortina. Cortisolul exercilS ac(.iani metabolice antagonice cu ale insulinei gi care sunt, evidente in deosebi in perioadele de foame, de solicited susfinute. La nivel hepatic, cortisolul stimuleazS gluconeogeneza prin aport. crescut de materii prime (aminoacizi din mugchi gi glicerol din Jesutul adipos), dar gi prin inducjia unor enzime gluconeogenctice. Glucoza este parjial depozitatS. ca glicogen, partial trece in sange. Efluxul glucozei are un efect hiperglicemiant fiind corelat gi cu o captare redusS. a glucozei in mugchi gi in Jesutul adipos. In. mugchii scheletici, cortisolul exercitS o acjiune catabolicS asupra proteinelor, aminoacizii eliberaji constituind substratul gluconeogenezei hepatice. Cortisolul are acjiuni catabolice gi asupra fesutului adipos periferic, lipoliza eiiberand in sange acizi gragi gi glicerol. Cortisolul (hidroeortizona) exercitS acjiuni importante asupra sistemelor de apftrare imunologic gi infiamator. Cortisolul scade amplitudinea numdrului de limfocite, altereazS funcjiile mediatoare gi efectoare ale acestor celule. Acjiunile antiinflamatoare ale cortisolului sunt rezultatul reducerii numSrului de leucocite (in special polimorfonucleare) la sediul injuriei, inhibS

proliferarea fibroblaglilor, inhibit fosfolipaza A2intrerupand astfel cascada arahidonatului gi producjia de prostaglandine gi de leucotriene. Aldosterona parlicipS la menjinerea homeostaziei hidrice gi electrolitice. Jesutul principal fiiitS pentru aldosterone este rinichiul, la. nivelul cSruia determine retenjia ionilor Na+ gi in mod secundar promoveazS eliminarea renalS de H*\ K* gi NHJ Retenfia.de sodiu antreneazS gi retenjia osmotieS de ape. De asemenea, aldosterona regleazft transportul electrolijilor prin celulele epiteliale de la nivelul glandelor salivare, glandelor sudoripare, intestin. Acjiunea aldos'tcronei la nivelul tubilor renali (distali §i colectori) conste in promovarea transporiului transcelular de sodiu din lumenul tubilor in spajiul interstijial. Acest transport are loc prin permearea pasive (prin canale ionice) a membranei apicale. lonii Na+ sunt scogi din celule printr-un mecanism activ, consumator de ATP (pompa de sodiu acjionate de Na7K+ - ATPazS). Exists dovezi cS aldosterona ar induce sinteza proteinelor care alcStuiesc canalele de sodiu din membrana apicale gi cregterea concentrajiei intracelulare a sodiului, dar nu intervine in sinteza Na7K+ - ATPazei. De asemenea, aldosterona induce sinteza unor proteine mitocondriaie gi cregte capacitatea sistemului de sintezS a ATP-ului, care va asigura energia necesarS scoaterii sodiului din celuiS. 616 Controlul secretfeL Sinteza §i secrejia de cortisol sunt reglate prin trei mecanisme care se intrep&trund §i a cilror contribute depinde de starea fiziologicd, de gradul de solicitare a organismului. ‘ Nivelul plasmatic al cortisolului suferJl o variable diurnS (ritm circadian), probabil rezultat al altemanjei perioadeior de alimentare, de veghe-somn. Nivelul maxim al cortisolemiei este atins in intervalul 6-8 a.m., perioada de trezire din somn; minimul este situat spre seard (in jurui orei 6 p.m.). Un al doilea mecanism de control cuprinde axul hipotalamohipofizar. Corticotropina hipofizard (ACTH) controleazJi-sinteza.de steroizi la nivelul deta§ftrii catenei laterals §\ formSrii pregnenolonei. Secrejia de ACTH se afld la randul ei sub controlul hormonului hipotalamic eliberator, CRH, Cortisolul plasmatic, produs al stimulSrii prin CRH §i ACTH, inhibd rapid secrejia de CRH, §i mai lent, pe cea de ACTH (se presupune prin inhibifia transcrierii genei, proopiomelanocortinei, precursor al ACTH). Un al treilea mecanism de control este operational in stiriie de stress. Solicitdrile emojionale, durerea, pe dii nervoase superioare mediazd eiiberarea de CRH §i de ACTH. Aceste rSspunsuri pot depSgi controlul prin feed-back negativ sau ritrnul circadian. Efectele metabolice declanjate de cortisol furrfizeazS organismului mijloacele de a riispunde la stress. Acest: rfispuns este mai lent decat cel medial de catecolamine, dar are o dural# mai lung# §i cu ecouri mai adSnci in metabolism. Controlul secrejiei de aldosterone are ioc prin mecanisme distincte de acelea care opereaz# in cazul glucocorticoiziior. Acest control se realizeaz# prin sistemui renin#- angiotensin#, care are un rol deosebit in reglarea volumului fluidului extracelular §i a presiunii sangelui (Fig. XII 34). Rcnina este o enzim# proteoliticii produs# de celulele aparatuiui juxtaglomerular §i elibcratSin sange sub influenja unui numftr de factori, de presiunea sangelui, de concentrajia sanguinft a clorurii de sodiu. In plasma, renina

Scdderea [fo/umu/u/ \----- ■ ------1 f/Wij/ui -. +*(f)\ Ce.p/s \(Ps e/frmhrkn L d/pum/rmde /| ! Amo/mmpe/i j j .»*_ pgr/ins t Angiofmm! ©~ Emimds | conms/s dngicfensim 1 ! ! i SmhtM Yo/ufm/hij f/mufai cx/metukr i i i [eV/^r] -______________A/dmfemi © © ! /v ; H/perhkmie dipohiem/s \ nstsnfixdddj s/dpd Fig. XII.34 - Reglarea secre|iei de aldosterona 617 ac{ioneaz& asupra unei proleine piasmatice angiotensinogen, din care detageaze un decapeptid, angiotensina. I (Fig. XII.35). Aceasta din urme, sub acfiunea unei alte enzime piasmatice (enzimli de conversie) este transformate intr-un octapeptid, angiotensins II. Angiotensina II este o substanjit vasoactive foarte puternice prin constricjia arteriolelor. La nivelul zonei glomerulosa, angiotensina II determine eliberarea aldosteronei. Cregterea nivelului plasmatic al aldosteronei determine retenjie de sodiu §i secundar cregterea volumuiui §i a presiunii sangelui. Timpul de acfiune al angiotensinei II este foarte scurt, este degradatft rapid sub acfiunea angiotensinazei. Un alt mecanism de control al secreliei de aldosterone, independent de sistemul renina-angiotensine, opereaze prin concentra|ia ionilor K+. 0 ugoarii eregtere a kalemiei stimuleazi secrejia de aldosterone care prin acpune kaliurice va restabili valoarea kalemiei. Scdderea kalemiei, din contra, inhibe secrefia de aldosterone. Hormonii tesliculari poarte denumirea de androgeni. Hormonii ovarieni sunt estrogenii gi progestinele. Androgenii, hormonii sexuali masculini, sunt sintetizaji in celuleie interstijiale (celuie Leydig) din teslicui. Principalul androgen testicular este

testosterona; tcslicului mai secrete eantMfi mici de dihidroteslosterone. Acesta din urme se formeaze gi in jesuturile Asp - Fry - Tyr - He ■ -H/s - Pro - PFe - His - Leo-Leo j EW] Asp -Arp - Tyr - He - His - Fro - PFe - His - Leu Huff/oLeusm I j i \Pmitna He moers/e] Asp-Arp- ve/ - Tyr-He -His-Pro-Fite I ArrpioiemmI Arp-Vo/-Tyr-He-His-Pro-Pie H/ig/oiensinsM \J/}gio/ensmzP\ Produsi iuschvi Fig. XII.-35 - Formarea angiotensinei II XII. 10. HORMONII SEXUALI XI1.10.1. ANDROGENII 618

Jintil, din testosterona circulantH Testosterona $i dihidrotestosterona sunt steroizi C19 §i au 'formulele;

Testosterone Dihidrotestosterona AIji steroizi C.i9 prociusi de cotexul suprarenale!, intermediuri in sinleza iestosteronei In testicul sau rezultaji prin transform &ri periferice ale hormonilor circulanji au activitate androgenic;! mai mare sau mai mica. Acestea sunt dehidroepiandrosterona, A5 - androstendiol $i androstcndionH: 0

A5 - Androstendiol

Androstendiona Biosintezd, Sinleza Iestosteronei in celulele inlerstijiale are loc prin aceleaji reacjii intermediate ca sinteza de cortices teroizi. Etapa limitantil de vitezd este de asemenea, scindarea catenei laterale din coleslerol §i forrnarea pregnenolonei. Transformarea pregnenolo- nei in testosterone are loc pe douft c«1i diferite prin ordinea in care ac('ioneazj5 17 a - hidroxilaza §i cuplul 3 P - hidraxisteroid dehidrogenaza §i A5 —> A4 izomeraza (Fig. XI1.36). La om calea major*! de form are a testosterone! trece prin progesterone. Dihidrotestosterona se formeazS. in testicul sau fesuturi periferice prin acfiunea unei 5 a - reductaze NADPH -depcndente:

: i

619

620 Secrete §i transport, Hormonal este eliberat in sange pe mdsurd ce se formeazd; nu existd forme de depozifare. Transports plasmatic este efectuat de o proteind care ieagd atdl testosterona cat §i esierogenii - SHBG (sex hormone-binding globulin) sauTEBG (testosterone- estrogen-binding globulin). Proteina are afinitate mai mare pentru testosterond decat pentru estrogeni. SHBG este sintetizatd In ficat §i producjia sa este influenjatd de o serie de factor! Estrogenii cresc sinteza acestei proteine, hormonii Uroidieni o scad. Metabolism. Testosterona este catabolizatd rapid, in ficat §i alte Jesuturi, la produgi inactivi sau cu activitate androgend slabd. Principalii catabolifi urinai'i ai testosteronei sunt androsteroma §i etiocolanolona (17-cetostercizi)

eliinina{i sub formd de sulfo- sau glucuronoconjuga{i: Acfiune. Testosterona intrd liber in celule. In unele jesdturi este transformatd in dihidrotestosterond. Ace§ti doi hormoni interacjioneazd cu acela§i tip de receptori intraceluiari, dihidrotestosterona avdnd afinitate mai mare decat testosterona. Complexui hormon-receptor interaclioneazd cu cromatina gi activeazd lranscrierea unor gene. Proteinele sintetizate mediazd efectele biologice ale hormonului. Nu este cunoscut dacd toate acjiunile testosteronei sunt expresia sintezei unor proteine specifice. Testosterona controleazd procesele fundamentale necesare dezvoltdrii §i funcjiondrii organelor sexuale, aparijlei §i intrejinerii caracterelor sexuale secundare, spermatogenezei. Androgenii stimuleazd sinteza proteicd, acfiune deosebit de puternicd la pubertate,-care duce la dezvoitarea oaselor §i muschiulaturii scheletice. Contralul secrepei. Dezvoitarea §i funcjia secretoare a organelor sexuale masculine sunt controlate printr-un mecanism de feedback negativ la care participd gonadotroprinele hipofizare, LH §i FSH, hormonui e libera tor hipotalamic, GnRH §i testosterona circulantd. LH, hormonui luteinizant, stimuleazd sinteza de testosterond in celulele interstijiaie, acjiune similard cu aceea exercitatd de AC1TI asupra cortexului adrenalei. FSH, hormonui foliculostimulant, controleazd spermatogeneza. FSH 'are rolul de a induce (in celulele Sertoli) sinteza unei proteine, ABG (androgen-binding protein) care Ieagd cu mare afinitate testosterona, eliberatd din .celulele interstijiale §i o transportd la sediul spermatogenezei, unde se realizeazd o concentrate hormonald mult superioard celei din sangele periferic. Eliberarea gonadotropinelor hipofizare este stimulat'd de hormonui hipotalamic - GnRH. Testosterona circulantd in concentrafii mai mari inhibd atat secrejia de gonadotropine hipofizare ca §i eliberarea GnRH in sistemul portal hipofizar.

Androsterond Etiocolanolona 621 XII. 10.2. HGRMONII OVARIENI Ace§ti hormoni aparjin la doud grupe, estrogenii §i progestinele. Pe ldngS sinteza ovariand, estrogenii se mai formeazd in cantitS-fi raid in adrenale, testicul §i alfe fesuturi ca ficat, piele. In timpul gestapei unitatea fetoplacentard. sintetizeazS cantitdji mari de progesterond. Structure Principalul hormon estrogen de origine ovariand este 17 P estradiolul. In {esuturile extraovariene se formeazS mai ales estrond. Estrogenii sunt steroizi C)8, cu caracter aromatic, sunt acizi foarte slabi:

17 p - Estradiol

Hormon ul progestativ este progesterona, steroid C21;

BiosintezcL Estrogenii sunt: simedza.fi prin aceleaji reacfii intermediare ca §i androgenii. Transform area androgenilor in estrogeni are loc sub acjiunea unui sistem enzimatic denumit aromatazd* Procesul debuteazd prin hidroxilare la C19 dupd •care urmeazd indepdrtarea acestui atom ca dioxid de carbon §i aromatizarea nucleului A. Prin aromatizarea testosteronei se obfine 17 P -estradiol; androstendiona dd najtere la estrond. Estrona §i estradiolul se transforms reversibil unul in celdlalt sub acfiunea unei 17 p - reductaze (Fig. XII.37). Progesterona, intermediar in sinteza tuturor hormonilor steroidici, se objine a§a cum s-a ardtat mai inainte. 622 Go/esteroC *~Pregrw/w/ow77°c ~ Gr&gnenolona .............DeAidrQepmdmfa/wi ! I I 1 j Grogeskrm -- - //«< - Progesterone -......................^MmhudionS — n i! t s ■_„n Tes/oshrw? \\iL7Elt3ZL.S \drvm$feti j! « 17J3 - /sAwG/W Gs/m/ \ Fig. XN.37 - Biosinteza estrogeniior Secrefie §i transport, DupS sinteza hormonii sunt elsherafi in sSnge; nu se cunosc forme de depozitare. Estrogenii sunt transportafi de SHGB (sex hormone-binding globulin). Progesterona se leagfl de aceea§i protein# care fixeaz# §i cortisoiul (CBG- cortisol-binding globulin). Afinitatea CBG pentru cei doi hormoni este egaLl Catabolism. Catabolismul estrogeniior are loc predominant in ficat §i catabilitul principal este estriolul (Fig. XII.38), eliminat dup# conjugate prin bill §i fecale. CatabolituI principal al progesteronei este pregnandiolul, eliminat pe cale renal# sub form5 de 20-glucuronid:

Acfiuni biologice. Hormonii ovarieni ca gi alfi hormoni steroidici, inieracfioneazd cu receptori intracelulari §i determine transcrierea unor gene specifice. Totu§i hormonii ovarieni exercit# multe alte acfiuni care nu pot fi explicate prin acest mecanism. Hormonii ovarieni controleaz# dezvoltarea aparatului reproducStor femenin, aparijia §i menfinerea caracterelor sexuale secondare, regleaz# ciclul ovarian, fecundarea, gestapia, nagterea §i lactajia. Estrogenii §i progesterona acjioneaz# fie sinergic, fie antagonist. Contralul secrepei, Sintezasecrejia hormonilor ovarieni este reglat# de gonadotropinele hipofizare, LH §i FSH, de GnRH. LH stimuleaz# producjia de estrogeni §i progesterona de c#tre ovar, controleaz# ciclul ovarian; FSH stimuleaz# secrejia de estrogeni, dezvoltarea foliculiior ovarieni. 623

Fig. Xii.38 - Cataboiismul estrogenilor XIL11. HORMONII HIPOFAZARI §1 HIPOTALAMICI Hipofiza (glancla pituitari) este situate la baza creierului in §aua turceascS. Are ciimensiunile 10x13x6 mm §i eantMregte aproximativ 0,5 g. Este aldUuM dintr-un lob anterior §i altul posterior. Un iob intermediar (pars inermedia) este dezvoltat la majoritafea vertebratelor, dar la om este rudimentar. Hipofiza este legate de hipotalamus prin tija pituitary. Adenohipofiza reprezintft dou& treimi din glandH §i cuprinde lobul anterior §i sistemul vascular portal care se Ibrmeazd din capilarele eminenjei mediane §i coboarS prin vene port ale lungi in hipofiza anterioarS. Aceste vase transports hormonii hipotalamici la adenohipofiza. Exists §i un flux retrograd de sange intre adenohipofiza §i eminenfa mediant care pennile un control feed-back adenohipofizd —> hipotalamus. Lobul posterior al hipofizei impreunfi cu nuclei! paraventricular §i supraoptic din hipotalamus §i conexiunile nervoase intre aceste structuri alchtuiesc o unitate funcjionald -neurohipofiza. XII.11.1. HORMONII ADENOHIPOFIZARI Adenohipofiza produce §i secret# hormoni care regleazh dezvoltarea §i funcjiile alter glande endocrine (hormoni tropi sau tropine) sau au rol in reglarea processor metabolice fundamentale din Jesuturi periferice: - somatotropina, hormonul de cregtere, GH (growth hormone);

- corticotropina, ACTH (adrenocroticotropic hormone); - gonadotropine, LH (luteinizing hormone) §i FSH (follicle stimulating hormone); - tireotropina, TSH (thyroide-stimulating hormone); - prolactina, PRL, hormonul lactogen. Adenohipofiza cuprinde cinci tipuri de celule secretorii, celule somatotrope, corticotrope, gonadotrope, tireotrope, lactolrope, fiecare tip secretand un singur hormon. 624 Funcjia adenohipofizei este reglate de. c3tre peptide elaborate in diverse aril ale hipotalamusului. Substanjele eliberate de terminafiile fibrelor nervoase hipotalamice in capilarele emirienjei mediane sunt transportate prin sistemul vascular portal la hipofizS Hormonii hipotalamici stimuleazS secrefia tropinelor hipofizare §i sunt denumifi RH (releasing hormone) sau inhibit eliberarea acestora, suntRIH (release-inhibiting hormone). Hormonii hipotalamici sunt peptide, cuprind intre 3 resturi aminoacidice (THR) §i 44 resturi (GnRH) (Tabelul XII.6). Tabelui Xfl.6. Hormonii hipotalamici Hormon TRH (hormon eliberator al tiruotropinei)

Secverqa aminoacidicd

piro-Glu-His-ProNH2 ss 11 Somatostatin*-14 1 1 Ala-Gly-Cys-Lys-Asn-Phe-Phe(GI4-RIH) Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys-NH2 Gn-RH {honnon piro-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gty-Leu-Argeliberator al Gn) Pro-Gly-NH2 CRH (hormon Ser-Glu-Glu-Pro-Pro-Ile-Ser-Leu-Aspeliberator al Leu-Thr-Phe-His-Leu-Leu- Arg-Glu-ValACTH) Leu-Glu-Mel-TIir-Lys-Ala-Asp-Gln-LeuAla-Glu-Gli't- Ala-His-Ser-Asn-Arg-LysLeu-Leu Asp-Ile-Ala-NH2 GH-RH (hormon Tyr-Ala-Asp-Al'a-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyreliberator al GH) Arg-Lys-Val-Leu-GlyGln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-GlnAsp-Ue-Met-Ser-Arg-GlnGln-Gly-Glu-Ser-Asn-Gln-Glu-Arg-GlyAla-Arg-Ala-Arg-Leu-NH2 Eliberarea hormonilor hipotalamici §i a tropinelor hipofizare este reglate prin mecanism feedback de cStre concentrajia plasmatic2a hormonilor periferici. Un nivel mai scfizut al hormonului circulant, tn conjuncfie cu diver§i stimuli nervo§i, constituie semnalul pentru secrejia unui honnon hipotalamic eliberator (RH). Ajuns la hipofizh prin sistemul vascular port, declan§eaz3 secrejia unei tropine specifice care aclionand la nivelul unei glande endocrine periferice Jinte determine mociil'icfui trofice §i secretorii care au ca rezultat eliberarea in circulate a hormonului. Hormonal periferic, intr-o concentrate mai mare, redreseazft un parametru biologic specific §i in acela§i limp, inhM secrejia de tropind hipofizard ca §i secrefia de RH (eventual stimuieazd

eliberarea unui hormon hipotalamic inhibitor, RIH), In unele cazuri funcfioneazd §i o bucld scurtd inhibitorie prin circulafia sanguiml retrograde nitre hipofizd §i hipotalamus. Hormonii adenohipofizari sunt de nature peptidicd §i dupe inrudirile structurale, evolutive §i funcjionaie sunt impdrjiji in trei grupe: 1) grupa corticotropinei, cuprinde peptidele derivate dintr-un precursor comun, pro- opio-melanocortina (grupa POMC); 2) grupa hormonilor somatomamolropi; 3) grupa hormonilor glicoproteici. '0

625

:

Peptide derivate din pro-opiomeianocortina (POMC) POMC este un polipeptid cuprinz&nd aproximativ 250 resturi aminoacidice prin a c3rui prelucrare posttraducfionald se objin diverse fragmente cu funcjii hormonale, neutroirans- miptori, neuromodulatori. POMC este sintetizatS in lobui anterior a! hipofizei (in celule corticotrope), in lobui intermediar (la aceie specii la care acest lob este dezvoltat), in creier, placenta, t.esticul., Prelucrarea POMC formarea peptidelor active are loc prin scind3ri la niveiul unor legiSturi peptidice intre aminoacizi bazici (lizina, arginina), recunoscute de o end.opept.i- daz3 celulai‘3 (cu specificitate asemnSniitoare cu a tripsinei). Fragmentele peptidice sunt in continuare scurtate de la capete sub acjiunea unor exopeptidaze (de reguJS carboxipep- tidaze). Prin alte transformed, metilare, acelilare, amidare etc., activitatea biologic^ a peptidelor este poten(at3 sau, din contrS, diminuat£ sau anulald. Prin prelucrarea primani §i secundarfl a POMC rezultS mai multe peptide active (Fig. XXL39). Exists diferenje iritre prelucrarea POMC in lobui anterior, in pars intermedia, in {esuturile extrahipofizare §i diferenje interspecii. La

om, prin prelucrarea POMC in lobui anterior hipofizar se objin un fragment Nterminal, un peptid de legSturS, ACTH. §i P - LPH Foliiepfid cu 3jsrm'm//r 250 reshri mOwm'Oice 5mm dfGwvers/efmOffpepMii . fftpsw-Mt, mkx/pepwm)* CIZZZIZD CZZJ I-----------------------PepPd d- terminal Pepl/d de Add (tft) iepdh/rd (33) L p~LPd (30 dm ~H3 ~CUP\ 18-39 717 ' 77-9/ f-hdorfm ' 17-75 pregnenolone, sub stiniulare corticolropft create sinteza de

glucocorticoizi §i de androgeni corticali. Sinteza §i secrejia de corticotropin# sunt reglate prin hormonal hipotalmic eliberator, CRH, care controleaz# sinteza. POMC. Cre§terea concentrajiei plasmatice a coriisolului inhibit, atat secrejia de CRH cat §i de ACTH. Secrepa de ACTH prezint# un ritm diurn, similar cu acela al cortisolemiei, dar intarziat cu aproximaliv 1 or#. Secrefia maxima, de ACTH are loc intre 1 §i 4 noaptea. In condifiile de stress, eliberarea de ACTH este mediate de sistemul nervos central. ACTH stimuland activitatea adrenalelor determine cre§terea cortisolemiei cu efecte metabolite adaptative. ACTH exercit# acjiuni reglatoare §i in Jesuturi extrasuprarenaliene ca promovarea lipolizei in [esutuL adipos, facilitarea captMi glucozei §i aminoacizilor in mu§chi, stimularea secrejiei de insulin# de ciitre ceiulele |3 din pancreas. Aceste efecte devin pregnante in stari patologice cand create produc|ia de ACTH. Fig. XII.40 - Structura ACTH (cortcotropina)

627 Grupul hormonilor somatomamotropi

i "•

Acest grup cuprinde hormonal de credere (GH = growth hormone, somatotropin a) §i proiactina.(PRL sau hormonal lactogen). Un peplid cu structure asem&nfttoare acestora este eiahorat de placentd, somatomamotropina corionic# (CS sau hormon lactogen placentar). Ace§ti hormoni polipeptidici euprind 191 restart aminoacidice (GH §i CS) §i, respectiv, 199 (PRL). Intre GH §i CS exists omologie structural Sin propor|ie de 85% iar intre PRL §i GH omologia este de numai 13%. Hormonul de cre§tere (GH, somatotropina) este sintetizat in celulele somato trope; cel mai abundent tip de celule adenohipofizare (35 - 40% din gland#). Hormonul uman (diferit de cel al altor mamifere) este alc&uit dintr-un singur ianf polipeptidic cu 191 resturi aminoacidice. Hormonul de cre§tere exercM doud serii de acjiuni: * controleazd cre§terea postnaiaLl, dezvoltarea scheletului, a Jesuturilor moi; - regleazft metabolismul general - giucidic, lipidic, proteic, mineral la nivelul jesuturilor periferice. Acjiunea de hormon de credere este indirecta, este mediata de IGF-I §i

IGF-II (IGF = insulin-like growth factor) sau somatomedine. Hormonul de cre§tere controleazd sinteza §i eiiberarea acestor factori de cfttre ficat §i alte {esuturi. Acjiunile metabolice ale GH converg spre facilitarea proceselor anabolice, biosintetice, prin asigurarea materiilor prime §1 a surselor energetice. GH stimulcazS sinteza proteinelor prin mecanisme multiple; faciiifeazd transportul intracelular de aminoacizi, create sinteza de ARNm, accelereazS incorporates aminoaci- zilor in proteine, scade metabolismul proteinelor §i al aminoaciziior. Sub acjiunea GH bilanful azotat al organismului se pozitiveazh. La nivelul metabolismuiui giucidic, efectele GH sunt antagonice cu ale insulinei: scade utilizarea perifericii a glucozei, inhibit glicoliza §i stimuieazB gluconeogeneza hepaticd. In cazul hiperproducfiei de GH apar semnele caracteristice hipoinsulinismului, hipergiicemia §i cetonemia. Metabolismul lipidic, sub acjiunea GH, este deplasat spre mobilizarea trigliceridelor de rezervh, cre§te lipoliza §i nivelul acizilor gra§i liberi din sfmge. In Jesuturile periferice este stimulate arderea acizilor gra§i. Hormonul de cregtcre infiuenfeazS metabolismul mineral prin cre§terea reten}.iei ionilor de calciu, fosfat, magneziu. Reglarea sintezei §i secrejiei de GH este controlat# pozitiv §i negativ de c3tre hipotalamus printr-un hormon eliberator (GH-RH) ji altul inhibitor (GHRIH sau somatostatin#). Secrejia de GH este episodic# §i pulsatile. Hormonul de cregtere circulant inhibS propria sa secrejie prin promovarea eiibedlrii somatostatinei. IGF-I (somatomedina C) are de asemenea acfiune inhibitorie asupra secrejiei de GH prin aceea c
Neurali

Somnul Absenja emojiilor Stress (traumatisme, Agonigti P -adrenergice emojii, infec{ii) Antagonist! a Agonigti a -adrenergici adrenergici Antagonist! p adrenergici L - Dopa Metabo Hipoglicemie Hiperglicemie lic! (toame) Aminoacizii Nivel crescut de acizi plasmatici ‘ Uremie gra§i liber! in sange crescuta Obezitate Hormo GH - RH Somatostatina (GH-RIH) nali Nivel seazut de IGF-I Hipotiroidism Estrogen! Glucagon VasopresinS Hormonii hipofizari glicoproteici Din acest grup fac parte gonadotropinele (Gn), FSH §i LH, §i tireotropina (TSH). O structure analoagS prezintS gonadotropins. placentarS. (hCG = human ehoronic gonadotropin). Ace§ti hormoni au o origine ancestral# comund. Hormonii glicoproteici au o structure dimeric# aji. Subunitatea a const# dintr-un lanf polipeptidic cu 96 resturi aminoacidice §i este identic la tofi cei patru hormoni. Cuprinde dou# unitSji oiigozaharidice legate covalent la resturi de asparagine. Subunitatea (3, difer# de la un hormon la altul, cuprinde 115 resturi aminoacidice la LH §i FSH, 110 la tireotropina §i 147 la hCG. Lanjui P din hCG cuprinde 5 unit## oligozaharidice, subunitatea JJ din FSH, LH §i TSH cate doua. Subunitatea p este purtdtoare de activitate biologies, dar capacitatea de legare la receptorii celulari aparjine dimeruiui. Tireotropina (TSII), este sintetizata in celuiele tireotrope. TSH acponeazS asupra glandei tiroide stimuland sinteza de T4 §i T3. Intervine in toate fazele acestui proces, captarea §i activarea iodului, iodurarea tireoglobulinei, cuplarea tirozinelor iodurate, hidroliza tireoglobulinei §i secrejia hormonilor. Acfiunea troficS a TSH asupra tiroidei este un efect tardiv §i este datorat eiiberSrii §i ac|iunii hormonilor tiroidieni insS§i. Reglarea elibenteii TSH are loc printr-un mecanism feedback tipic, ia care participS hormonul hipotalamic eliberator (TRH) cu acjiune pozitivS asupra tiroidei §i eliberarea in circulate de T4 §i T3. Hormonii tiroidieni inhibS atat. sinteza secrejia de TRH cat 629 §i pe cea a TSH. Aceastii ultima aefiune pare a fi mediate cie somatosiatintL T4 §i T3 stimuieazS sinteza de somatostatin!! care, la ranclul ei, inhibit eiiberarea de TSH. TSH sc formeazS §1 in alte regiuni ale creierului avand rolul de neurotransmijator. Gonadoiropinele. LH (hormonul luteinizanl) §i FSH (hormonal stimulator al foliculilor) controleaz# funcjiile glandelor sexuale. Sunt secretate de celulele gonadotrope (5-9% din totalul celulelor adenohipofizei). Gonadotropina corionica (hCG) este prodush de placenta §i prin acfiuni se aseam3n& cu LH.

FSH la femeie promoveazfi dezvoltarea foliculilor ovarieni, prepare foliculul pentru ovulafie §i mediazS eiiberarea de estrogeni indusit de LH. La bftrbat, FSH acjioneazil asupra celulelor Sertoli din testicul §i induce sinteza proteinei transportoare de testosterone (ABP = androgen-binding protein) §i promoveazh spermatogeneza. LH, la femei promoveazS sinteza de estrogeni §ti de progesterone, inijiazd ovulajia. La hhrbat, stimuleaz! producfia de testeosteroml de cStre celulele interstifiale. Secrefia de gonadotropina hipofizare este reglahl pozitiv printr-un hormon hipotalamic eliberator (GnRH) care stimuleazS secrefia de LH §i de FSH. Hormonii sexuali circulanji inhibit atat secrefia de hornion hipotaiamic eliberator cat §i secrefia tropinelor hipofizare. XII. 11.2. HORMONII NEUROHIPOFIZARI Neurohipofiza elaboreazh §i secret?! doi hormoni, vasopresina sau hormonul antidiuretic (ADH) §i oxitocina. Ambii hormoni sunt nonapeptide, diferind prin douS resturi aminoacidice. Vasopresina umanh (Arg-vasopresinh) este identic?! cu cea a alter specii. Vasopresina de la pore cuprinde In local restului Arg un rest Lys (Lysvasopresina) (Fig. XII.41). Vasopresina (Arg-vasopresina), are o masfi de 1084 daltoni §i caracter bazic pronunfat (pi - 10,9). Oxitocina (masa de 1007 daltoni) este mai pufin baziett ca urmare a absentei restului Arg sau Lys. Biosinieza. Hormonii neurohipofizari sunt: sintetizaji in hipotalamus, vasopresina In nucleul supraoptic, oxitocina lit nucleul paraventricular, sub forma unor precursori cu molecula mare. Prin prelucrarea acestor precursor! rezultiL pe de o parte vasopresina §i neurofizina II, §i pe de ■V / i 3 $S5 7 8 9 ■ Ii3 M ~ Cys - Tyr - He -■ Sin - Asn ~ Cys -- Pro - Leu - Bly ~ CDNHZ s..............................................—i Ox/foci ns //J -Cys - Tyr - the - 5/n -4so - Cys - Pro -Org - 0/y - C0W2 ! I S................................ .-................s Vosopres/oc (many bmp orginm - mop remit) 030 ~ Cys - Jyr - Phe - 6/n - fan - Cys - Pro - Lys - ff/y ~ C0A% i i I I S------------------------------------------ S Voscpresm porcino (Cm - mopresins ) Fig. XII.41 - Structurile oxitocinei §i vasopresinei 630 alUl parte, oxitocina gi neurofizina I. Hormonal impreunfi cu neurofizina specifier* sunt framporfaji in lunguJ axonilor gi depozifa{i in terminajiile nervoase din hipofiza posterioarft. Exocitoza grariulelor eiibereazil in circulajia sanguine pe iaiigii nonapeptid gi neurofizina corespunzStoare. Eliberarea oxiiocinei gi a vasopresinei este declangat& de stimuli diferiji. Viafa biologic^ a horminilor neurohipofizari este scurtS (t!/2 de 2-4 minute), sunt rapid cafabolizaji in jesuluri periferice. O parte din vasopresinS este eliminate ca alare prin urine.

Vasopresina participS la homeostazia osmolalitiipi gi a volumului liuidului exiracelular prin reglarea elimindrii renaie de ape. In prezenfa vasopresinei debitul urinar scade de la 15-20 ml/min, la aproxima^iv 1 ml/min gi osmolalitatea urinii create de la. 300 mosmoli/kg la 600-800 mosmoii/kg. Vasopresina acjioneazii asupra epiteiiului tubilor contorji distal! gi colectori crescand fluxul transcelular de ape din lumen in fluidul exiracelular. Hormonul mSregte permeabilltatea pentru ap3 a membrane! lum inale a epiteiiului tubular, probabil prin cregterea numSrului de canale pentru ape. Vasopresina acJioneaz3 prin cregterea concentrajiei AMPC gi activarea proteinkinazei A, dar nu este mc3 identificat efectorul ultim al aces tor aejiuni. Receptorii pentru vasopresina au fost identificaji gi in alte tesuturi §i ocuparea acestora determine efecte mediate de AMPC, cu giieogenolizfi. in float, eliberare de ACTH in adenohipofizd, constricjia arteriolelor (aejitine vasopresoare). Nu este inca lemurit rolul fiziologic al acestor acpurii. Stimulii fiziologici pentru eliberarea vasopresinei este eregterea osmolalittljii plasmei (hemoconcentrare) gi scfiderea volumului liuidului exiracelular sesizate de osmoreceptori situaji in hipotalamus gi de baroreceptori din sistemul circulator. Vasopresina prin retenfie de ape restabilegte concentrafia gi volumul sangelui. Oxitocina exercite aejiune contractile asupra mugchiulaturii netede din liter. Are roi in inifierea travaliului la femeia gestante la termen gi expulzarea ffiiului. Receptivitatea uteruiui pentru oxitocina este regiabi de hormonii sexuali, estrogenii m&resc iar progesterona scade receptivitatea. O altii aejiunea a oxiiocinei, cea mai important^ fiziologic, este contracfia celulelor mioepiteliaie ce inconjofire alveolele mamare gi'ejecjia laptelui. Eliberarea de oxitocina este determinate prin mecanisme neuroumorale de impulsuri ce pornese de la nivelul glandei mamare sau al uteruiui. XII. 12. EPIFIZA (GLANDA PINEALA) Epifiza este o structure conieft situate in partea superopdsterioare a peretelui celtii de al treilea ventricul. Este alcetuite din celuie epiteliale (pinealocite) grupatein jurul unei cavitej'i centrale cme la adult, in genere, se caicifiaz.3. Epifiza la mamifere, spre deosebire de vertebratele inferioare, nu are conexiuni direcie cu creierul gi cu oebii. Pineaia primegte impulsuri nervoase (via ganglionul cervical superior) privind iluminarea gi intunericu! independent de percepfia congtiente de iumine. La amfibiene, pineaia are roluri antagonice cu ale melanotropinei (MSH), determine contracjia celulelor melanofore gi deschiderea culorii tegumentului. La mamifere se admite eft tire rol in reglarea bioritmurilor endocrine circadiene gi sezoniere, in controlul funcjiilor sexuaie (inhibit eliberarea de gonadotropine), a ritmurilor sezoniere de reproducere la mamiferele inferioare. 631 In epifizS au fost identificate numeroase substanje bioactive (noradrenaline melatonin! serotonin! histamine, dopamine, peptide ca THR, LH-RH, vasotocin! analog al vasopresinei §i oxitocinft) al&turi de proteina specific! epifizina. Melatonina (O-metil-N-acetil-serotonina) este produsul specific al epifizei:

Melatonins

~CH2-CH2~hiti~CO~CH3 * Sinteza melaioninei pome§te de la amirioacidul triptofan (Fig. XU.42). Reacjia li/nitantS de viteri este reacfia (3) catalizatS de serotonin-N-acetil transferaza. Seerejia de melatonin# este maxima noaptea §i activitatea acetiltransferazei variaz# in aceia§i mod. Confinutol epifizei in ■ aceast# enziml create ia trecerea de la iluminaie la intuneric, de pan# la 100 de ori. Totu§i, in afar# de ciclul luminS-intuneric eliberarea de melatonin# este influenfatS §i de alfi factor! somn, postiu! diet! aetivitate. Nu s-a stabilit rolul celorlalfi produ§i ai pinealei.

y H Triphfd/} \ NHZ 0 m

HO Off, iJ M

"2 0,'2 N H -f/ k H 5- H/droxi- fripfafan -C0Z N- ace/H-semtoma 1®

-GH2-Cd2-HH2 m.

H H ■CHr0Hz-m-C0-CH3 Meladon/na 632 Fig. XII.42 Biosinteza melatoninei 1) Triptofan hidroxilazS; 2) Amirtoacid decarboxilaz&; 3) Serotonin-N-acetil transferazS; 4) Hidroxlindol-0-metil transferaza. XII. 13. ENDORFINE In creier au fost identificate numeroase peptide cu roluri reglatoare asupra funcjiei nervoase superioare. Uneie dintre aceste substanfe sunt prezente §i incite regiuni. ale corpului, indeplinind funcfii diferite de acelea pe care le au in creier. in Tabelul XII.8 sunt prezentaji cajiva din acegti compugi (neuropeptide). StrueturHe unor neuropeptide Tabelul XII 8 SomatostatinS. 14 ■]—————■——-A Ala-Gly-Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys-ThrPhe-Thr-Ser-Cys Ser-Aa-Asn~Ser-Asn-Pro-Ala-Met-Ala-ProSomatostatin^ Arg-Glu-Arg-Lys-Ala-Gly28 Ss 11 -Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-Tip-Lys-Thr-PheThr-Ser-Cys His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Asp-Asn-TyrVIP (vasoactive Thr-Arg-Leu-Arg-Lysintestinal Glu-Met-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Serpeptide) Ile-Leu-Asn-NH2 NPY Tyr-Pro-Ser-Lys-Pro-Asp’-Asn-Pro-Gly-Glu(neuropeptidul Asp-Ala-Pro-Ala-Glu- Asp-Leu-Ala-Arg-TyrY) Tyr-Ser-Ala-Leu-Arg-His-Tyr-Ile-Asn-LeuIle- T y r~ Arg-Gl u - Arg-T y r-NH 2 Arg- Pro-Lys-Pro-Gln-Gln-Phe-Phe-GlySubstan|a P Leu-Met-NH2 ColecistokininS Asp-Tyr(SOU-Met-Gly-Trp-Met-Asp-Phe(CCK) NH2 DSIP (delta Trp-Ala-Gly-GIy-Asp-Ala-Ser-Gly-GIu sleep inducing . peptide) Met-Encefaliri5 Tyr-'Gly-Gly-Phe-Met Leu-Encefalina Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu Tyr-GIy-Gly-Phe-Met-Thr-Ser-Glu-Lys-Sera - Endorfina Glu-Thr-Pro-Leu-Val-Thr Hormonii hipotaiamici (RH §i RIH) §i hormonii neurohipofizari au fost trataji anterior. Peptidele din creier au roluri deosebite in procese homeostazice, in comportament, memorie, inv&fare, durere, somn etc.

Endorfxnele sunt neuropeptide cu acfiuni asemSn&toare cu ale morfinei, principiul activ extras din opiu, substanfS analgezicS §i euforicS. PlecSndu-se de la constatarea ck morfina intalnegte in creier receptori cu care interacfioneazS s-a dedus ck acegti receptori sunt destinaji unor substance endogene. Aceste substance au fost descoperite §i denumite endorfine. Initial au fost identificate douk substance morfine-like, pentapeptide, Met-encefalina §i Leu-encefalina (Tabelul XII 8), Ulterior s-au ad&ugat §i altele, a-, (3-, y-endorfina, dinorfina, a-neo- gi (i-neo - endorfina. Aceste peptide rezultS din prelucrarea unor precursor! polipeptidici, Proopiomelan- cortina (POMC) da nagtere la a-, P~, y-endorfinS §i Metencefalina (din fragmentul (3- LPH) (Fig. XII.43). 1! :

i1 ' 633 j~ -MeJ-cmsfcfm-A ! 61-66 H------- ------
rezultat prin scindarea POMC) Un all precursor, proencefalina A, da nagtere !a patru molecule de Metencefalinil §‘i una de Leu-encefalinil Proencefalina B (pronorfinft) formeaz&aneo, p-ncoendoriiml §i dinorfmA Prelucrarca acestor precursor! se face diferenjiat in diverse arii ale creierului §i distribujia endorfinelor este diferita in diver§i neuroni. XII. 14. FACTORI DE CRE§TERE Cre§ierea fizicft a organismului este reglafa de hormoni^ clasici ca somatolropina hipofizard (GH), hormonii tiroidieni, corticosteroizii §i alfii. In afara controlului global ai crejjterii organismului, la nivel celular actioneazS numero$i factor! careregleazif diverse momente din viafa celulelor (proliferare, dezvoltare, diferenfiere). Ace§ti factori au fost denumifi factori de cre§tere (growth factor, GF). Factorii de cre§tere acfioneazd prin mecanismele generate ale hormonilor clasici, sunt recunoscuji de receptori membranari §i sernnalul extern este prelucrat prin acelea§i mecanisme transductoare. Sistemele efectoare celulare sunt de asemenea, comune cu cele ale alter mesageri extraceiulari. Existenja unor factori exogeni necesari cregterii celulare a reiegit din observajiile c8 supraviefuirea §i muliiplicarea celulelor in ctikuri, in vitro, este dependents de adSugarea la mediile de culturd a unor ingrediente naturale complexe, ca ser sau extract embrionic. Cercetfrrile intreprinse pentru identificarea componenjilor activi ai acestor ingrediente au dus la descoperirea unor peptide necesare bunei dezvoltfiri a celulelor denumite factori de cre§tere. Ace§ti factori acjioneazS §i in vivo, ei regleazd diferenjierile celulare In viafa embrionar&, cregterea, dezvoltarea, vindecarea rfmilor. Numarul factorilor de cregtere descri§i panit acum este reiativ mare §i me'reu se descopera alfii. Denumirea lor s-a fficut dupd una sau alta din proprietaple lor specifice, dup& tipul celular (fesut) unde a fost descoperit sau duptl numele fesutului asupra cSruia s-a presupus cd ar aefiona in mod specific. Uneori until aceluiagi factor i-au fost atribuite nume diferite, fiind descoperit independent de mai multi autori §i in diverse laboratoare. Astfel FGF (Fibroblast growth factor) a fost descris ca adipocyte growth factor, glial growth factor, macrophage growth factor §i muite alteie. Cunogtinfele mai ample privind factorii de credere au perm is gruparea lor in familii dupd asemhnfiri structurale, duptl nalura tipurilor celulare asupra carora acjioneazh §i a modului in care intervin in proliferarea gi diferenjierea celulelor. Mai departe sunt, descrise cateva familii de factori de cregtere. XIL14.L FAMILIA EGF (Epidermal growth factor) Principaiii reprezenfanfi ai acestei famili sunt EOF (Epidermal growth factor, factory! de cre§tere a epidermei) TGFa (Transforming growth factor a, factoral de toHisformare a) EGF a fost izolat initial dintr-un extract de glands salivar! de la goarece §i identificat. prin acfiunea sa proliferativ! asupra epidermei. Ulterior s-a gfisit cil EGF este produs de celuie de origine diversfl §i de la specii diferite. EGF uman a fost identificat cu un peptid izolat anterior din urina femeilor gravide - urogastrona - §i care avea acfiimea protectoare asupra mucoasei gastrice. EGF este un peptid cu 53 resturi aminoacidice. Este rezultat al prelucrdrii

unui pre-pro- EGF. Gena aeestui precursor este situat! in vecMtatea Imediat! a genei interleufcinei-2. Receptorul EGF este o protein! membranar! glicozilat!, cu mas! de 160190 kD. Receptorul activat dezvolt! activitate protein kinazic! tirozin-specific! care se manifest! prin autofosforiiarea receptorului ca §i asupra unor proteine citosoiice. EGF acfioneaz! ca factor de cregtere asupra epiteliilor de origine ectodermal!. Prezenja sa in concenirajii ridicate in lichidul amniotic susfine rolurile EGF in proliferarea §i diferenjierea celular! in viaja fetal!. EGF este prezent, de asemenea intr-o concentrate mai mare, in colostra avdnd roluri in matunuea epiteliului digestiv in viaja neonatal! TGFa (Transforming growth factor) este un peptid cu 50 resturi aminoacidice, omolog in proporfie de 35% cu EGF, TGFa utilizeaz! acelagi receptor ca §i EGF. TGFa a fost identificat ca produs al unor celuie tumorale, dar apoi s-a stabiiil c! ei este sintetizat §i de c!tre celuie normale (sistem nerves, pieie). Are aejiuni similare cu ale EGF. Al&turi de acesta din urm!, TGFa ar avea roiuri importante in dezvoltarea fetal!. Este de rernarcat c! TGFa a fost gSsit intr-o cantitate relativ ridicat! in pieiea pacienjilor cu psoriasis. XII.14.2. FAMILIA FGF (Fibroblast growth factor, factor de cregtere a fibroblasiilor) Termenul de FGF include un numftr de peptide inrudite, expresie a cel pufin 7 gene. Formele majore corespund unei proteine de 13,4 kD cu caracter bazic (pi 9,6) §i alteia cu caracter acid (pi 4,5). Forma bazic! este produs! de muite Jesuturi de origine mesodermal!, pe c!nd FGF acid se afi! numai in jesutul nerves gi retin!. FGF aeponeaza ca factor de cregtere asupra multor linii celulare. FGF a fost descris cu nume diferite pan! a fost stability identitatea presupugilor factory FGF bazic este identic cu Adipocyte growth factor, Heparin-binding growth factor, Macrophage growth factor, Tumor angiogenesis factor, Prostatic growth factor gi FGF acid cu Endothelial growth factor I, Retinaderived growth factor, ' XII.14.3. FAMILIA PDGF (Platelet derived growth factor, factorul de cregtere eliherat de plachete) PDGF a fost descoperit in cadrul studiilor intreprinse pentru a explica de ce serul este mai eficient decat plasma in suspnerea proliferSrii celulelor In culturi, in vitro. S-a conchis c& In cursul coagul&rii sSngelui piacheteie elibereazS un factor mitogen, PDGF. PDGF este concentrat In granulele alfa gi degranularea elibereazfi PDGF, care prin rolurile sale stimulatorii asupra proliferSrii celulelor iniJiazS procesele care due la repararea. leziunilor tisulare, la vindecarea rSnilor. PDGF este produs de o, varietate mare de celule atat In via{a embrionard cat gi la adult, avand un rol important in reglarea cregterii. PDGF este o proteins dimericS cu masa de 30 kD. Lanfurile individuale A gi B sunt identice in proporpe de 60%. PDGF dimeric exists in trei izoforme, AA, AB gi BB. Receptorii pentru PDGF (170 kD) sunt prezenp pe numeroase tipuri eelulare, in special de origine mesenchimal! Receptorul este un dimer format din subunit&p a gi p. Cele trei izoforme ale PDGF se leagS cu afinitSfi diferite

la receptorul dimeric. A’cest mod de interaepune creiazS o varietate largS de posibilitSp pentru PDGF de a regia multiplicarea celulelor. Receptorul PDGF activat prezintS activitate protein kinazicS specifics pentru resturi de tirozinS. PDGF regleazS diviziunile eelulare, el pare a fi semnalul pentru ca o celulS sS treacS punctul de restriepe, s& traverseze faza G, a ciclului celular sau $& treacS din faza G0 In faza S, de sintezd a ADN, care precede mitoza. PDGF eliberat de plachete in cazul unor leziuni, are roluri importante in vindecarea ftnilor. In plus, PDGF este gi un puternic agent chemotactic pentru macrofage. Fibroblagtii gi celulele endoteliale sunt deosebit de sensibile la aepunile proliferative ale PDGF, multiplicarea acestor celule frind esenpaM pentru vindecarea pl&gilor. PDGF are un rol important. gi in patofiziologia pldcilor ateromatoase, Leziunile suferite de intima vaselor determine agregare plachetarS, degranulare gi eliberare de PDGF. Prin rolurile sale chemotactice gi proliferative asupra celulelor musculare netede, PDGF contribute la iniperea formSrii plScii ateromatoase. XII.14.4. FAMILIA TGFp (Transforming growth factor p) Aceastft familie cuprinde trei factori, TGF ph IGF p2 gi TGF p3. Toji sunt dimeri (25 kD) ai unei subunitAji identice. TGFp este un factor de cregtere bifuncponal, inhibit dar gi stimuleazd cregterea celular#. Efectul antiproliferaliv se manifesto asupra multor tipuri de celule, In deosebi asupra celulelor epiteiiale. Efectul stimulator mai tardiv gi probabil indirect, este observat asupra unor celule ca fibroblagti gi osteoblagti. Efectul mitogen sau antiproliferativ depinde de tipul celular, de mediul hormonal gi de mulp alp factori ined neprecizafi. TGFP are probabil roluri importante in dezvoltarea embrionului, in fazele inipale . acpon&nd mitogen, ca in fazele mai tarzii sS inhibe selectiv proliferarea celulelor. 636 XII. 14,5. FACTORII DE CRE§T£RE INSULIN-LIKE (IGF, somatomedine) Existenja aces tor factori a fost postulatd incd din 1957 ca substance secundare induse de somatotropina hipofizard (GH) §i care mediazS, acjiuniie de hormon de cregtere ale acesteia. Exists dot IGF, IGF-1 (somatomedina C, o somatomedinS adevSratS) §i IGF-II. IGF-I este un peptid cu 70 resturi aminoacidice (pi 8,1-8,5) §i care prezintS un grad limit de omologie structuralS cu proinsulina. IGF-II, peptid cu 67 resturi aminoacidice, are caracter neutru. .PrezintS o oarecare asemSnare cu IGF-I §i cu insulina. Factorii de credere insulin-like sunt sintetizaji de diverse Jesuturi, dar ficatui este sediui principal al acestei sinteze, Producjia de IGF in ficat, dar §i in celelalte {esuturi, este eontrolatS de GH. Sinteza de IGF In anumite {esuturi se afld sub controlul specific al altor semnale, estrogenii controleazS sinteza In endometru, ACTH §i angiotensina II in adrenale, gonadotropinele in gonade. Somatomedinele circuld in plasmS in asociere cu o proteind de legare specified. IGFBP (IGF - Binding Protein), care are masa de 150 kD. Sinteza §i concentrajia plasjmatied a acestei proteine sunt controlate de GH §i de starea de nutrijie a organismuiui. In foame sau in deficient de GH sinteza hepatied de IGFBP este sedzutd. De asemenea adolescenjii sau indivizii cu

acromegalic au un nivel plasmatic de IGFBP mai ridicat Acjiuniie celulare ale IGF sunt mediate de doud tipuri de receptori. Receptorul pentru IGF-I are o structure tetrameried (a2 p2) §i prezintd un grad mare de omologie structurald cu receptorul insulinei. Acest receptor este prezent in toate Jesuturile §i cu afinitate mai mied leagd §i IGF-II §i insulina. Receptorul IGF-I activat ca §i cel al insulinei, prezintd activitate protein kinazied. tirozin-specificd. Receptorul IGF-II este format dintr-un singur Ian|. polipeptidic (270 kD). Receptorul nu dezvoltd activitate protein kinazied, insu§ire intalnitd la mulfi receptori ai factorilor mitogeni, Receptorul IGF-II leagd cu afinitate mied §i IGF-I, dar nu leagd deloc insulina. Receptorul IGF-II este identic cu receptorul de legare a unor proteine glicozilate. Aceste proteine se fixenzd pe receptor prin resturi de manozd-6fosfat (receptor MGP). Silusurile de legare pe receptor a IGF-II §i a proteinelor manozilate sunt distincte. Prin insu^irea §i de receptor MGP, receptorul IGF-II ar avea rolul de transporter transcelular al hormonului. Acjiuniie in vivo ale IGF-II sunt rezultatul legdrii sale atat la receptorul IGF-I cat §i la cel specific pentru IGF-II. Distribufia ubicuitai'd a receptorilor IGF §i prezenja lor din viaja embrionard §i fetald pand la bduaneje, pledeazd pentru roluri importante in credere §i dezvoltare. De asemenea, ei intervin in regiarea rdspunsuriJor tisulare la boli §i injurii. Somatomedinele acjioneazd uneori ca factori mitogeni, aiteori stimuleazd diferenjierea celulard §i sinteza unor component specifici. * ** Pe idngd factorii de cre§tere care stimuleazd proliferarea unei game iargf de tipuri celulare, aljii regleazd funejii inalt specializate ale celuielor diferenjiate (NGF) sau sunt factori care participd la formarea diverselor populajii de celule sanguine (hemopoezd) din celuie primitive din mdduvd sau organe limfoide. Unii factori hemopoetici sunt multipotenji, ei stimuleazd proliferarea §i dezvoltarea mai multor populajii celulare (IL-3) sau sunt factori de cregtere pentru o singurd linie celulard (eritropoetind). 637 XI!. 14.6. NGF (Nerve growth factor, factorial de credere a nervilor) NGF este o proteind hexameried (140 kD) alcdtuitd din subuiiitHji a, (5 §i y. Subunitatea (3 posedd activitatea biologies §i prezinfd 25% omologie structural cu Lanfurile A §i B 'ale insulinei. Efectul principal al NGF este acela de a prom ova supraviefuirea, diferenjierea §i cre§terea tenninafiilor nervoase axonale. Neuronii nu se multiplied, NGF nu are aejiune mitogend pentru' sistemul nervos matur, dar acjioneazd in acest sens pentru precursor^ fesutului nervos. NGF accelereazd diferenfierea celulelor primordiale in neuroni simpatici §i senzoriali. In alte {esuturi, gradientul chemotactic ai NGF determ ind inervarea selective a acestora. In afara roiurilor specifice asupra sistemului nervos, NGF intervine §i in rSspunsurile inflamatorii §i imune, exerci td aejiuni chemotactice asupra leucocitelor neutrofile. XII.14.7. FAMILIA CSF (Colony - stimulating factor)

Aceastd familie cuprinde faefori de cre§tere care controleazd proliferarea celulelor albe sanguine. Denumirea. de factor care stimuleazd formarea de colonii provine de la tehnicile experimentale care au dus la idenlificarea lor, tehnici bazate pe formarea. de colonii pe agar dupS insdmunfare cu mdduvd osoasd. Factorii din familia 'CSF determine diferenjierea §i proliferarea celulelor primitive in granulocite, macrofage sau ambele. S unt descrise patru CSF; Granulocyte - macrophage - CSF Granulocyte - CSF Macrophage - CSF multi - CSF (identic cu interleukina - 3) Sursa principal de CSF sunt limfocitele T stimulate cu antigeni, dupd care urmeazd monocitele, fibrobla§tii §i celulele endoteliale. XII. 14.8. ERITROPOIETINA (Erythropoesis stimulating factor, ESF) Este o glicoproleind (39 kD). Eritropoietina induce cateva cicluri proliferative ale celulelor primitive din mdduvd ca apoi sd sfimuteze mitoza la proeritrocite, celule diferenjiate care sintetizeazd hemoglobina. Eritropoietina in viaja fetald este sintetizaid de cdtre ficat, ca apoi sinteza sa sd fie preluatd de rinichi. Stimuli! pentru sinteza eritropoietinei sunt hipoventilafia, anemiile, altitudinea inaltd. 638 XII, 14.9, LNTERLEUKINELE (XL) Limfocitele produc numeroa.se peptide (allele decfd anticoipii) care In mod autoc-rin, paracrin sau la distant mare (endocrin) exercM funcjii reglatoare asupra sistemului imun. Aceste peptide au fost descrise ca limfokine (citokine fntr-un sens mai larg). Ceie mai rnuite dintre limfokine exercitd mai mult decat o singurS acfiune biologicd §i denumirile lor inifiale, ca factor de diferenfiere a celulelor B, factor de cre§tere pentru celulele T, au devenit. necorespunzdtoare. Pentru factorii care regleazd cre§terea §i diferenfierea limfocitelor s-a propus termenul de interleukine. Au fost descrise noud interleukine (IL-1—IL-9). Acfiunile biologice ale interleukinelor depd§esc adesea cadrul sistemului imun, ele sunt produse §i de alte celule sau au efecte reglatoare asupra unei mari divcrsit&fi de tipuri celulare. Pe de aM parte, unii factori regiatori activi §i asupra limfocitelor §i-au pdstrat denumirile cu care au fost descrigi inijial, CSF, TNF, interferoni, cu toate cd prin mod de producere §i acfiuni §i ei aparfin familiei interleukinelor. fnterleukina-1 (IL-1). Peptid care prezintd doud izoforme, a (159 resturi aminoacidice) §i P (153 resturi). Interleukina-1 este produsd de multe tipuri celulare, producdlorii principali in vivo sunt monocitcle/macrofagele. Interleukina-1 exercitd un spectra larg de acfiuni slimulatoare asupra celulelor imune §i asupra unor celule din afara sistemului imun. Interleukina-l este considerate mediatorul major al unui rdspuns inflamator. Determine reacfii inflamatorii imediate, locale (infiltrafii, edem) §i rdspunsuri sistemice ca febrd, rdspunsul de fazd acutd ai ficatului. Acfiunile in vivo ale interleukine!-1 sunt foarte complexe prin inducerea de mediatori secundari, PDGF, IL-6, TNF, CSF. Interleukina-2 (1L-2). Peptid cu masa de 15 kD. Are funcjii imunologice importante in primul rand, inifiazd proliferarea celulelor T activate. Receptorii

pentru interleukina-2 sunt absenji pe celule T in repaos, ei apar la cateva ore dupd activare prin expansiunea clonald a celulelor. Interleukina-2 stimuleazdactivitatea citoiiticaa celulelor T citotoxice (killer). Interleukina-3 (IL-3). peptid cu masa de 23-26 kD. A fost descrisd initial ca un CSF (mulli-CSF). Stimuleazd proliferarea. §i dezvoltarea celulelor progenitoare eritroide, megakariocite, eozinofile, neutrofile §i macrofage §i susfine reinoirea celulelor primitive multipotente. lnterleukina-4 (IL-4). A fost descrisd inijial ca Factorul 1 stimulator ai limfocitelor B. Acfioneazd ca factor de cre§tere pentru celulele B, activate dupd fixarea antigenului. De asemenea, stimuleazd celulele T In repaos, mdre§te activitatea citotoxicd a celulelor T killer. Inierkukina-6 (IL-6). Peptid cu 184 resturi aminoacidice. Este produsd de o mare varietate.de celule §i receptorii pentru interleukind-6 sunt prezenfi pe multe tipuri celulare. In sistemul imun, interleukina-6 induce diferenjierea celulelor B, dar nu §i proliferarea acestora. Asupra unor celule tumorale are acfiune proliferated. Interleukina-6 eliberafd Tmpreund cu interleukina-l §i TNF (Tumor necrosis factor), prin mecanism endocrin, indue „rdspunsul de fazd acutd“ ai organismului. Pe langd febrd, acest rdspuns se manifest#, prin sinteza hepatied a unor proteine (proteine de fazd acutd). Astfel de proteine sunt, o^-glicoproteina acidd, componentul C3 al complementului, haptoglobind, o^-macroglobulind, a, -anliproteazd. 639 fnlerlukinci-8 (IL-8). Aceast# leaking a fast descoperit# in 1987 ca unul dintre cei mai important mediatori ai rfispunsurilor inflamatorii de apSrare. IL-8 este o protein# mica, cu 72 resturi aminoacidice §i o mas# de 8383 daltoni. Are caracter bazic (pi ~ 9,3). Este rezistent# la acjiunea peptidazelor. IL-8 este produs# de o varietate foarte mare de tipuri celulare, monocite, macrofage, cellule epiteliale, fibrobla^ti, condrocite, keratinocite, celule epiteliale diverse, astfel meat orice Jesut al organismului este capabil s# elibereze aceast# citokin#. Stimuli! principal pentru eliberare de IL-8 sunt IL1 gi/sau TNF. Infecfiile, ischemia, traumele de orice fel asociate cu cregteri ale nivelurilor de IL-1 gi TNF determine eliberare de IL-8. Celulele Jint# pentru IL-8 sunt leucocitele neutrofile. NumSrul de receptori pentru IL-8 este de 50.000-70.000 per celul#. IL-8 induce in neutrofile trei tipuri de r&spunsuri: - activarea sistemului contract#, ceia ce determine aderarea neutrofilelor la celule endoteliale gi migrare; ■- exocitoza de granule gi vezicule secretofii cu eliberare de enzime proteolitice (elastaz#) gi proteine adezive; - explozia respiratorie, exprimat# prin cregterea activitSfii NADPH oxidazei gi a produejiei de specii reactive ale oxigenului, cu aejiune destructive. IL-8 este la fel de active asupra neutrofilelor ca gi PAF (factorul activator al plachetelor) gi leucotriena B4 (LTB4), dar acjiunea sa chemoatractant# gi de recrutare a neutrofilelor este de mai lung# duratS, TNF (Tumor necrosis factor, factorul necrozant al tumorilor). Este produs in

principal de macrofagele activate, dar gi de multe alte celule. Prezint# un spectre larg de aejiuni biologice pe celule Jint# imune gi altele din afara sistemului imun. Exist# dou# izoforme, TNFa (cachectin#) gi TNFp (limfotoxin#). Cei doi factori utilizeaz# acelagi receptor gi acfiunile lor sunt asem#n#toare. ~ TNF a fost descoperit prin acjiunea sa de regresie, in vivo, a unor tumori la goarece. Aceast# aejiune necrozant# a fost demonstrate in vitro gi pe tumori umane. Efectul major, in vivo, al TNF este acela de a media, impreun# cu interleukina-1 gi interleukina-6, r#spunsurile inflamatorii locale gi sistemice. Efectele locale ale TNF asupra vasculari- zajiei poate explica regresia tumorilor in vivo. XII. 14.10. INTERFERONII (INF) Au fost descoperiji (1957) prin acjiunea lor antiviral#. Sunt proteine induse intr-o celul# de cStre virugi gi care apoi interfereaz# cu replicarea viral#. Spectrul de aejiuni ale interferonilor este ins# mult, mai larg, au aejiuni antiproliferative gi imunoreglatore. Au fost denumiji in rapori cu tipurile de celule produc#toare„ interferon a (leucocite), interferon [5 (fibroblagli) gi interferon y (limfocite). Ulterior au fost stabilite multiplicitatea structural# gi specificitatea acjiunilor interferonilor. Interferonul 7 este structural distinct de interferonii a gi JL Primul este produs numai de iimfocitele T. El induce sinteza antigenelor de suprafaj#, a complexelor majore de histocompatibilitate (MHC) clasa I gi clasa II. Are activitate antiviral#, aceasta pare a fi secundar# prin stimularea produejiei de interferoni a gi (L Interferonul 7 a fost introdus in terapia unor boii maligne gi autoimune (artrit# reumatoidi, scleroz# multipl#). 640 Interferonii a p [3 sunt.peptide Cu aproximativ 170 resturi aminoacidice p Imre ei exists omoiogie structural) In proporpe de 34%, Interferonii a p p utiiizeaza acelap receptor, la care se leag) cu afinitilji diferite. Gena pentru receptomi inlerferonilor a p P este iocalizat) pe cromosomul 21. Interferonul a este produs In principal de leucocite, iar cel p de fibroblapi. Interferonii a p P au acfiuni antiproliferative, ei contracareaz) acpunea mitogen) a alter factor! ca CSF-1, PDGF, EOF, IL-2 p IL-4. Aeepi interferon! stimuieaz) activilrljile accesorii ale macrofagelor, produejia de citokine. Acfiunea antiviral) a acestor factor! este rczultatul deg.rad3rii ARN viral XII.14.11-. ONCOGENELE §1 CONTROLUL CRE§TERII CELULARE ' In tumori maligne de la diverse specii, produse de viru§i, au fost identificate genep proteine codificate de aceste gene care, intr-un fel sau altul, au fost implicate In proliferarea necontrolat) a celulelor. Aceste gene au fost denuinite oncogene (virale) p proteinele specificate, oncoproteine. Din diverp virap sau din tumoriie provocate de ei, in special retrovirup (virup cu ARN) dar p virup cu ADN, au fost izolate cateva zeci de oncogene. Aceste gene au fost desemnate prin litera v- (de la virus) tirmat) de irei litere care, in genere, indie) sursa original) a genei. De exemplu, v- sve este oncogena virusului producStor de sarcom Rous la p)s)ri, v - erb B este oncogena din virusul producStor de eritroblastoz) la p)s3ri, v - sis este oncogena virusului product tor- de sarcom la maimuj). De asemenea, se utiiizeaza expresia oncoproteina sre, erh-B, sis, O legStur) intre oncoproteine p factorii de crepere peptidici (GF) a fost

stability atunci cand s-a recunoscut c) oncoproteinele sunt Inrudite cu constituenji celulari normal] p c) genomui celular gazd) posed) gene identice sau asem)n)toare cu genele virusului tumorigen. Retrovirupi (virupi cu ARN) au abilitatea de a incorpora in genomui propriu fragmente de ADN aparjinand celulei gazd) p & a trece prin transfeefii o porjiune a propriului lor genom in cel al celulei infectate. Astfel prin trecerea repetat) a viruplor prin celule ei pot dobandi versiuni alterate ale gen el or celulei gazd). Genele celulare inrudite cu o oncogen) viral) au fost denumite C-oncogene sau protooncogene, Protooncogenele specifics proteine care controleaz) creperea celulari! norm all pe cand oncogenele determin) un pattern de crepere alterat. Pe king) oncogenele izolate din tumori produse prin infeejii virale, au fost identificate gene capabile s) determine transform area celulelor p din tumori de origine nonviral). De accea termenul de oncogen) (one) este atribuit oricSrei gene care poate i:i rSspunzStoare de alterarea modului de crepere norm alii a celulelor. In genere, oncogenele sunt versiuni alterate ale unor gene celulare normale care prin proteinele pe care ie codific), prin viteza de transcriere p traducere (viteza de exprimare) sau prin alte c)i modifies creperea celular) (proliferare, diferenjiere, dezvoltare). Au fost descrise mai multe mecanisme prin care o gen) celular) normal) (protooncogen)) este activate la oncogen) (gen) tumorigen)). Unele mecanisme au la baz) 'infeejiile virale, altele nu. O gen) poate fi activat), transcrierea sa p apoi sinteza proteinei codificate sunt accelerate in unna unei infeejii virale, dac) in genomui celulei normale se insereaz) on fragment de gen) care acfioneaz) ca gen) reglatoare (promotor sau enhancer). Produsul l '-:‘

641 genei normals, cu rol in proliferare, se exprimd exagerat, celula dobdnde§le caraclere proliferative noi. Oncogenele pot fi versiuni alterate ale protooncogenelor ca urmare a unor murajii suferile in cursui trecerii genei de la celula gazdd la virus. Structura altera id a unei proteins care are roluri reglatoare in proliferare va putea determina malignizarea celulei, Astfel oncogena viralS ras specified o proteind din famiiia proteinelor G, dar ca urmare a unor mutapi, capacitatea acestei proteine G de a hidroliza GTP (activitate GTP-azicd) este redu'sd. Proteina G la un semnal mitogen rdmane activate permanent, sau un limp mai indelungat. Traaslocdrile cromosomiale pot aduce in vecindtatea unei gene care specifiers factori de control pentru cre§terea celula.nl fragmente de gene

care joacd roluri reglatoare (de ex. de enhancer pentru alte gene normale). Astfel intr-un cancer a! limfocitelor B urnane (limfom Burkitt) gena myc, prin translocdri intre cromosomii 8 $i 14, ajunge sub controiul seevenjei reglatoare „enhancer“ al genelor care codified lanjurile grele (H) ale imunoglobulinelor. Proteina specificate dc gena myc este o proteind de legare la ADN, care coniroleazd mitoza. Activarea sistcmului imun determine, pe langd sinteza de anticorpi §i activai*ea genei myc ceea ce arc ca efect transformarea neoplazicd a celulei. Un alt mecanism posibil de transformare a unei protooncogene in oncogene este amplificarea genial, cre§terea numerului de gene in genom, ceea ce va duce la o supraproduejie de proteina reglatoare. Mai deparle sunt descrise succint dileva. oncogene (virale sau nonvirale) §i proteinele specificate de acesle gene, modul in care aceste proteine intervin in diviziunea sau diferenjierea celulelor. Unele oncogene virale codified proteine identice sau asemdndtoare cu factori de cre§tere: v-sis specified o versiune pujin modificatd a lanjului B al PDGF; v-hst, int2 specified o proteiml foarte asemdndtoare cu FGF; v-vgj codified TGF. O grupd de oncogene codified forme modilicate ale receploriior unor factori de credere: v-erb B codified o form# Irunchiatd a receptorului EGF; oncogenele erb-A specified proteine asemdndtoare receploriior pentru hormonii steroidici '§i tiroidieni; oncogenele kit, fms se exprimd ca receptori pentru PDGF §i, respectiv, pentru CSF-1. Un numdr de oncogene, ca sre §i abl, codifial proteine membranarc care au activitate protein kinazied tirezin specified sau regleazd activitatea acestor kinaze. Produsul oncogenei erb-B, versiune aiteratd a receptorului EGF, posedd un domeniu protein kinazic cu specificitate pentru resturi de li^ozind. Oncogenele din famiiia ras codified proteine cu roluri in etapele postrcceptor ale transduefiei semnalelor mitogene. Una dintre aceste proteine este o found modificatd de proteiml G, cu activitate auto-GTPazicd redusd. O familie mai numeroasd de oncogene specified proteine nucleare. Astfel sunt oncogenele myc, fos, jun. Proteinele specificate de genele normale sunt prezenfe in nucleu §i prin legare la ADN sau alte mecanisme controleazd evenimente timpurii ale diviziunii unei celule. 642 Cap.XIIL APA, PROCESELE HIDROELE'CTROLITI'CE §1 ECHILIBRUL ACIDOBAZIC XIII.1. INTRODUCERE Apa este principalul constituent al tuturor fiinjelor vii gi implinegte roluri fundamenlale. mtr«adev8r, in calitate de constituent al diverselor organisms, ea intrd in structura {esuturilor, o parte este distribuitil in spapile libere dintre rnoleculele mari (in genere, profceice) iar o parte este repnutd ia suprafafa macromoleculelor, ea "apfl legafS". De fapt, ins&§i structurile proteineloi;

acizilor nueleici §i ehiar ale membranelor bioiogice sunt rczultate din interacpunea lor cu apa. Pe de, aM parte, apa este "mediu intern" in care se distribute toate substan(ele solubile, organise §i anorganiee. Datoritd acestei insu§iri de solvent, apa. transports in organism atat substanfele nutritive cat p produsele de excrepe rezultate in anna diverselor metabolisme. De altfel, apa este ea insdp un metabolit (universal) tmpiinind. fie rol de reactant, fie rol. de produs de reacfie in numeroase §i diverse reacpi biochimice fundamentals: digestie, disiocarea. majorildfii constituenplor organismului, reacpi de oxido-reducere, reacpi in urma cdrora se elibereaza energie (hidroliza ATP-ului §i a alter compu§i macroergici). In sfarpf, apa trebuie considerate §i ca un aliment, indispensabil care asigurd in organism desfajurarea normald a metaboiismului luturor ceiorlalte prineipii nutritive. XIII.2. CONJINUTUL §1 REPARTTJTA APEI IN ORGANISM' De§i apa se afl3. totdeauna in proporpi apredabile in diverse organisme (peste 60%), gradul de hidratare al lor variazS cu natura species. De exempli*, organismele tin or animale marine, inferioare, sunt. aproape tot atat. de bogate in apa. cat §1 medial in care trfnesc (96,45%). Conpnutul in apd al verlcbratelor este mai redus din eauza scheietuiui care ocupS o mare parte din corp §i este sdrae in apa. In ceea ce privepe organismul omului, conpnutul in apd se afld in raport direct cu. suprafapi corpornid. Pe de altil parte. In funepe de adipozitate, coipul omului conpne in ire 58 §i 66% apa. La un .oin adult cu adipozitate normals (22%) organismul cuprinde apd in proporpe de. circa 60% din greutate. Bine injeles, cu cat cantitatea de grdsime este mai redusd cu atat proporpa de apa este mai mare p invers (Fig. XIII.l). De aceea, oamenii de tip allelic cuprind proporpi mai mari de apd in corp, fafil de celelalte tipuri constiluponale. O influenjd. remnreabild asupra conpnutuhii in apd al organismului exercitd §i varsta. AstfeL un'embrion de cafeva zile conpne 97% apd; fdtul de 3 luni conpne 94% iar organismul copilului la na§tere cuprinde 66%. Ulterior, apa din organism continud: sd seadd facet cu varsta, menpnandu-se intre limitcle specificate (58-66%). De asemenea, conpnutul In apd al organismului variaza §i cu sexul; femeile avand un conpnut mai redus de apa (cu 10%), eomparativ cu bdrbapi (Fig. XIII.2). 643

Normal Gras Slat □ Masa corpara/a grasa Masd corporo/d l/psita ^ de grdsime Fig. X! 11.1 - Conjinutul procentuai in apa al diferitefor tipuri constitujionaie

Fig. Xflt.2 - Con|inutu! In apa at corputui, In func|ie de sex varsta 644 In organism, apa este repartizatd in vasele sangvine §i limfatice, spafiile intercelulare §i in celule. In .afara de iocalizarea lor, aceste domenii se deosebesc prin compozijie §i roluri funcfionale. Datoritd diferenfierilor existente, ele sunt grupate in doud sectoare hidrice: sectoral, intracelular care reprezintd aproape 50% din greutatea corpului §i sectoral extracelular care reprezintft 20% din greutatea corpului (Fig. XIII.3). Cele doud sectoare hidrice (infra §i extracelular) sunt separate prin membrana celulard a carei penneabiUtate selective} determine deplasdrile apei §i elecfiolifilor. De fapt, aceastd membranS este impermeabilS pentru cationii Na+ §i anionii maid §i este permeabild pentru cationii K+ §1 anionii mici. Ca urmare, compozifia lichidelor extra §i intracelulare este diferitd (Fig. XIII.4). Din Fig. XIII.4. reiese cd, in esenfd, lichidul extracelular este "o solufie de clorurd de sodiu" pe ednd lichidul intracelular este "o soitijie de fosfaji §i proteinat de potasiu". Intr-adevdr, lichidul intracelular cuprinde o cantitate foarte mied de CD §i practic, deloc Na+; in schimb, confine o cantitate foarte

mare de ioni K+ §i fosforici precum §i o proporfie mare de proteine. Sectoral extracelular este constituit - la randul sdu - din doud compartimente: lichidul interstitial care ocupft spafiile intercelulare reprezentdnd 1.6% din greutatea corpului §i plasma, sangvind care reprezintd 4% din greutatea corpului. Aceste doud compartimente sunt separate prin perefii vaselor capilare, permeabili pentru electrolifi §i molecule Stomac use P/dmuiV cor a oraid 4^

Plasma sangumd ,/fV. dm greutatea Pie/e Lichid interstitial. fC70 dfn greutatea corporate Liedid intrace/u/ar 1 50% d/r greutatea j " corporate j Fig.Xil[.3. Reparti Jia apei fn organism (dupa Gamble) 645

F/g.XfIL4. Compozijia electrolitica a iichidelor intra- §i extraceluiare, exprimata In mEq/L (dupa Gamble). organice mici dar nu totdeauna permeabili pentru proteine. DatoritS pcrmeabilitSfii selective a perejilor vaselor sang vine apar diferenje in compozijia com parti mentelor extxacelulare. Astfel, plasma cuprinde concentrafii mari de ioni Na+ §i CI“, concentrafii reduse de ioni K+ §i fosforici precum §i concentrajii apreciabile de proteine. Lichidul interstijial cuprinde mult mai pufine proteine Insd compozijia sa m anioni §i cation! cste asemdnfltoare cu cea a plasmei. Din sectorul extracelular, pe langa lichidul interstijial §i plasma sangvinZS mai fac paite: iimfa (interstijial^ §i din vasele limfatice), fluidele din Jesuturile conjunctive, 646 fluidele din oase §i fluidele transcelulare. Acestea din urmd sunt reprezentate, Tn special, de: lichidul din traclul digestiv, urinft, hilfi §i lichidu! cefalorahidian. Fluidele transceiulare se deosebesc de categoriile precedente deoarece Tmpiinesc roluri funcfionale parifculare in organism §i no sunt Tn acelea§i relajii cu lichidul intraceiular, cum sunt limfa §i plasma sangvinS. In ceea ce prive§te repaitifia apei din corp in diverse orgarie sau lichide este de remarcat ca ea se face Tn proporfii foarte variate, Astfel, iichidele afarft de sange - cuprind Tntre 96 §i 99% apft, (esulurile cca, 80% (cu limiteie

70-83%) §i scheletul 22% (Tabelul XIII. 1), De§i confinutul in ap2 al mu§chiIor nu depage§te pe cel al celorlalte fesuturi moi sau pe cel al sangeiui, totugi din cauza masei musculare mari din corp - apa cuprinsft in mugchi reprezint*! jumfttate din confinutul global al apei din organism. Determ inarea apei totale din organism s-a fecut de mai multi! vreme, folosind metode din ce in ce mai precise §i mai simplificate. In schimb, apa cuprinsil in fesuturi nu s-a putut determina totdeauna ({esut slab, fesut gras) cu foarte mare rigurozitate. Actualmente exists ins! posibilitatea determimlrii cu precizie a apei din organism - inclusiv, a celei din fesuturi §i grdsimi - prin utilizarea unui anaiizor de impedanp! bioelectric^. Tabelul XIILL Confinutul fn apa aS unor orgaue, tesuturi si lichide din organismul onuilui Organul, % % % % [.esuiul sau din din apa din din apa Orga lichidul greutat toiald a greuta toiald a nul, ea organis tea orgalesut orgtmu midui orgam nismului ul lui, dui sau (esutid jesulul lichid ui sau tu sau ul lichidid lichiui didui Plam Saliva 99,5 anul 78-79 Transpirajia 99,5 Pancr 78 easul 0,6 Lichi dul 99 Intesl 77 3 cefalorahidia inul n Mu§c Corpul vitros 98 0,1 hii 73-76 50 Sucul gastric 97 Piele 72 7-11 a Ficat Limfa 96 ul 70 3-5 Grasi Laptele 89 mile 30 12 Sangele 78-83 Schel 20-30 10-12 etul 10 Rinichiul 77-84 Denti 0,5 na 10 Inima 79 2-5 Smal 2 0,1 |ul XIII.3. ECHILIBRUL APEI IN ORGANISM Volumul total ai apei din organismul unui om sSndtos este constant iar variafiiie lui zilnice sunt, totdeauna mai mici decat i% din greutatea corpului. Acest fapt dovedegte dl In organism exists, in permanent, un echilibru Tntre apa ingeratd §i cea excrelath (Tabelul Xf.2), 647

PSstrarea. acestui echilibm este cu atat mai remarcabihl cu cat se §tie c& inger&rile §i excrefiile zilnice variazfi de la individ la individ iar la aceea§i persoaml, de la o zi la alta. De fapt, constanja echilibrului se datoregte bunei funcJionSri a sistemului reglator din hipotaiamus precum §i activityjilor renal& §i hormonal# (In special, a vasopresinei hormon antidiuretic secretat de hipofiza posterioara). Bine tnjeles, reglarea normal# este posibil# numai intre anumite limite de variajie aie apei din organism. Cand acestea sunt dephgite, echilibrul se strict §i apar fie pierderi masive, fie acumulhri excesive. Echilibrul zilnic a! apei Tabelul XIII.2. Apa ingeratd (ml) Din lichidele aprox ingerate . Din constitupa alimentelor solide Prin oxidarea principiilor imediate dintr-o rajie care procura 2500 cal: 100 g proteine 41 110 g Jipide aprox 118 . 244 g glucide 135 294

1500 800

Apa excretala (mi) Eliminare prin urina Eliminare prin piele (respirajie insensibila) Vaporizaie la niveiul plamanilor Eliminare prin fecale

1500

600 400 100 ■

300 Total:

2600 m]

2600 ml XIII.3.1. NECESARUL ZILNIC DE APA Dateie tabelului XIIL2 araUl c# majoritatea apei ingeiate provine din iichide §i apoi din cea aflat# in alimentele solide. O cantitate mult mai mica, dar care se formeaz# zilnic, este cea rezultatS din oxidarea principiilor imediate, in urma metabolizSrii lor. lntr-adevfu\ 1 g glucid (amidon) genereaz# 0,6 g ap#, 1 g protein# 0,41 g §i 1 g lipid genereaz# 1,07 g ap# metabolic#. Din cauza factorilor de variabilitate (condijii de dim3, natura activstafii depuse) nu s-a pututstabili cu precizie necesarul zilnic de ap&. Totugi, se considers c# adultul s#n#tos -care desfSgoar# o activitale moderate in dim# temporal# - are nevoie de 1500-2000 ml ap#/zi. Nevoile cresc cu 500 ml/zi in caz de transpirajie datorif# climei calde sau activit&jii intense §i cu 500-1500 ml/zi in caz de febr#, vomismente, diaree. In anumite boli renale necesarul de ap# este apreciat la 3000 ml/zi. In toate aceste situafii aportul de ap# trebuie respectat §i implinit cu strictefe. Altfel, se produc modific#ri ale echilibrului hidric iar variajia lui cu numai 1-2% conduce, in mod inevitabil, la boli grave sau chiar la moane. Total aprox.:

648 XIII,3.2. PIERDERILE DE APA A§a com rezuM din tabelul XIII.2, pierderile de apd au loc in mod obi§nuit prin pidmani, piele, urina si tract gastro-intestinal. La randul lor, aceste pierderi variazd - in mod semnificativ - cu condipile de dim a, natura rape! aiimentare §i starea de sanatate. Intr-adevdr, pierderile de apd prin transpirape §i pidmani sunt mult crescute in condipi de climd uscatd, temperaturi ridicate ale mediului ambiant, activitate intense sau febrd (determinate de diverse cauze). In asemenea cazurL pierderile de apd prin transpirape pot depd§i chiar 2,5 L/ord. Pe de altd parte, apa secretatd prin traclul gastrointestinal - care in mod obignuit este reabsorbitd - se poate pierde §i ea In cantitate apreciabild prin diaree sau da toritd alter boll intestinale. In ceea ce prive§te apa pierdutd prin urina, se consider^ cd ea variazd' direct proporponal cu cantitatea de apd ingeratd. Insd, independent de aportul hidric, tin an urn it volum de apd este necesar toldeauna: pent.ru excrepa substanjelor osmotic - active; in special, ureea §i clorura de sodiu. La randul lor^cantildple excretate din aceste substance depind de aportul proteic §i al sdrii din rape, in aceste condijii, calculele au ardtat cd fiecare gram de proteind dietary corespunde la 5 rnosm. §i fiecare gram de sare (clorurd de sodiu) genereaza 34 mosm (1 rnosm ~ 1 mmol substanjd solubilizatd x n; In care n = numdrul particuleior produse prin disociere). O rape obi§nuitd care confine 100 g proteine §i 10 g sare genereazd: (100 x 5) + (10x34)= 840 mosm, Jin&nd seama de faptul eft rinichiul poate concentra urina la aproximativ 1400 mosm/L, rezulta cd numai pentru excrepa acestor substanje solubile este necesar un volum de 840 : 1400 = 600 ml apd, XIII.3.3. EXCESUL DE APA Ori de cate ori aportul de apd depd§e§te capacitatea de excrepe renald in organism se creiazd condipi pentru acumularea unui exces de apd. Aceastd situape nu are loc in mod obi§nuit, datoritd bunei funepondri a hipofizei posterioare, rinichiului §i adrenalelor. CondiJiile in care apa din organism se acumuleazd in exces sunt urmdtoarele: (1) secrejie mare de homnon antidiuietic (vasopresind) produs de hipofiza posferioard,* (2) insuficienjd corticosuprarenaliand; (3) insuficienjd renald acuta; (4) boald de inimd congest! va (severd); (5) ciroza ficatului; (6) ingerare exageratd de lichide. Bine injeles, acumularea excesivd determind §i ea dezechilibrul apei, anticnand astfel tulburdri grave In organism. XIII. 4. PROPRIET A JIILE FIZICO-CHIMICE ALE APEI ■ Apa are o serie de proprietdp fizico-chimice cu totul remarcabile si care o singularizeazd fafd de celeiaife fluide, f&cand-o un lichid aparte. XIII.4.I. STRIJCTURA §1 POLARITATEA MOLECULEI DE APA Structura molecule! de apd este cea a unui tetraedru regular care are in central sdu atomul de oxigen. Acesta prezintd patru orbital! hibridizap, sp3. Dot din ei conpn CMQ un singur electron de valenjd al oxigenului iar ceilalfi doi orbital! conjin cate o pereche de electroni. Orbitalii atomului de oxigen cuprinzSnd cate un electron se suprapun, fiecare, cu orbilalul Is a cate unui atom de hidrogen §i formeazd orbitalii de iegdturd O-H indreptap cdtre doud vMuri vecine ale tetraedrului. Ceilalji doi orbital! - cuprinzand fiecare o pereche de electron! neparticipanp ai oxigenului - sunt indreptaji cdtre

celelalte doud varfuri ale tetraedrului (Fig. XIH.5). 649 j;

•' '• ;; X

Fig. Xlli.5 - Structure tetraedrica a molecule! de apa Din cauzS perechile de electron* neparticipanji ai oxigenuiui exercM o acjiune de respingere asupra electronilor de leg&tunl, unghiul dintre cele douS leg&turi O-H este de 105°; pujin mai mic decat unghiul la centra al unui tetraedru regulat (109,5°). Din panel de vedere electric, molecula de ap& este neutrd dar distribufia electronic^ in cuprinsul ei se face neunifonn. Intr-adev;1r, oxigenui - cu cei 8 protoni in nucleul sau ~ atmge mai putemic electronii de legating decat alrage unical proton din nucleul atomului. de hidrogen. Altfel spus, regiunea oxigenuiui este relativ bogalft in electroni (deci negative), pe cand. regiunea atomilor de hidrogen - practic, lipsiji de tnvelig electronic - este pozitivSL Datoritd acestui caracter, mult mai electronegativ al oxigenuiui, legStura O-H este pofara. Atomul de oxigen poart# o sarcinfi partial negative de - 0,82 iar fiecare atom de hidrogen are cate o sarcin& partial pozitiv&, de +0,41. Aceaste separare a sarcinilor dil na§tere unui dipol permanent cu centrui de greutate al sarcinilor negative la atomul de oxigen §i cu cel al sarcinilor pozitive aflat pe bisectoarea unghiului dintre legftturile O-H (Fig. XIIL6). O Hidrogen ~©

Fig. XIII.6 - Dipolul unei molecule de apa (dupa Rawn) 650 XIII.4.2. LEGATIJRA DE HIDROGEN §1 ASOCIERILE MOLECULARE Faptul molecula apei este un dipol are ca prim$ consecinjfi interacjiunea electrostatic^, ce se stabilejte intre regiunea pozitivS a unei molecule §i regiunea negativ3 a aitei molecule. De fapt, interacjiunea electrostatics se exercitS intre nucleul hidrogenuiui aparJinSnd unei molecule dipol de ap£ §i perechea de eledroni nepaiticipanji ai oxigenului din aim moleeuiS. AceastS atraefie dipol - dipol cste numitS legdturd de hidrogen (Fig. XIII.7). O Hidrogen

Fig. XIII.7 - Legatura de hidrogen dintre doua molecule de apa Pe de alia parte, caracterul dipolar ai moleculelor de apfi favorizeazS §i asocierea lor mutual*!, conducand la anuniite aranjamente geometrice. Ele sunt intrutotuJ conforme cu structura geometries a moleculei de apfi (Fig. XIII.8). Structura de tetrahidrol, corespunzStoare asocierii ilustrate in Fig. XIIL8 (b), este tipieft ghejii §i - in oarecare mSsurS - apei lichide. Complexele acesfea rezultate din asociere sunt temporare; ca a tare, ele nu dureazS decat foarte pujin. Intr-adevSr, s-a constatat cS timpul de injumStSfire pentru asociere - disociere al moleculelor de apS este aproximativ de o microsecundS. Bine injeles, in asocierea §i disocierea aceasta, legSturile de hidrogen sunt cele care se stabilesc §i se desfac, fM a se modifica in niciun fel caracterul de dipol al moleculelor respective. Y HH : H : k — ; |, O' H 1/ ■ H o: 1 \ / 0 Q,.. ~H H / / 1 H H ov x

w a b Fig. XIII.8 - Asocierea moleculelor de apa; a) Asocierea a doi dipoli de apa b) asocierea unei molecule central© de apa cu aite patru molecule de apa prin legaturi de hidrogen : V.F

U-'i 0 :5G ’1: 7 7 ■H ■A

..V •; 651 Din punct de vedere energetic, legaturile de hidrogen sunt mult mai slabe decat legaturile chimice. Astfel, pent.ru desfacerea. unei legilturi de hidrogen Intre dipolii apei se cheltuiegte o energie de cca 4,5 kcalmol' 1; cu mult mai mic& decSt cea corespunzSb toare desfacerii unei Ieg&turi covaiente O-H, care necesitd o energie de 110 kcaLmol'1. De§i, individual, legatura de hidrogen este slaM, ea participa - In numar mare §i cu rol hotMtor - la stabilitatea structural^ a multor constituent important ai organismului (proteine, acizi nueleici) precum §i a unor metabolifi Pentru a se putea tnjelege rolul biologic al leg&turilor de hidrogen este necesar s3.se precizeze faptul c3 asemenea leg&turi nu se stabilesc numai Intre molecule de ap3 ci §i In cazurile In care atomul de hidrogen-unit covalent cu un atom de oxigen sau de azot dintr-o molecu!3-se af!3 la distanfa de 0,27-0,30 nm fatft de un alt atom de azot sau de oxigen; care au perechi de electron! neparticipanfi §i aparjin unei molecule vecine (Fig. XUI.9). — CH2— -4 O-\H~ H i — CH2 — O~\HRK H R! \H H GH2—CH3 R" / \ R’ Fig. Xlli.9 - Formarea legaturilor de hidrogen intre moleeuleie de alcool §i apa, intre doua molecule de etanol §i intre oxigenui carbonilic al unei peptide §1 hidrogenui de la azotui peptidic al unei peptide adiacente Se constat*! ca multe macromolecule confin legSturi de hidrogen (intramoleculare) dar asemeneadegaturi se pot stabili §i Intre macromolecule diferite (intermoleculare). Aceste dotal tipuri de legSturi de hidrogen sunt piezentate In Fig. XIII.10 §i Fig. Xffi.ll (dupaRawn). H HH —C N■ \ /

/—% oCitozina H/ ..... /\ / H— N C—N \/ \ C = /V / H—N Guanina \ H Fig. XIII.10 - Legaturl de hidrogen intermoleculare, formate intre perechi de baze complementare (citozina §i guanina) Tn molecula de ADN (dupa Rawn) 652 (b) Hx \ (*) i R1 O R2 O 11 i ~C— O o N~C 11 R1 I R2 ' ~“C— i I | II i !1 c -N— 1 H H H. - — ~ C— c H N C“ ~ I i — i 2H20 i I Ii A z. H H HH i i R R H ,HH 3 O 4 \ 0 I ii 1 — - -C— C N- c N— — | H i l i 1 \ H H H H R 3 O R4 O i II l II c ~C“ A/ ~c — MH —C 1 —I1 1 1 I1HH

H

H A

/A HH ■ Fig. Xiil.11 a) Legaturi de hidrogen intermoleculare, formate infre apa §i cate un ianj polipeptidic; b) Legaturi de hidrogen intermoleculare, formate Tntre cele doua lan|uri pofipeptidice ale aceieia§i proteine (dupa Rawn) Este de remarcat eft stabilitdfile legftturilor de hidrogen infra- §i intermoleculare sunt aproximativ egale. Pentru acest moliv, schimbarea unui tip de leg&turd in ceidlall tip prezinta avantaj minim din puncl de vedere energetic. XIIL4.3. CALDURA SPECIFICA §1 CALDURA DE VAPORIZARE Dupa amoniac, apa are alldura specific^ - $au capacitatea termicS - cea max mare. Datorit# acestui fapt ea poate primi sau ceda o cantitate apreciabilft de c&ldur&, fftrS a-§i schimba simfitor propria sa temperature. Pentru organismul viu este foarte util faptul ca apa are capacitate termicft mare. Intr- adevftr, dacd in media intern nu ar fi apa care s& inmagazineze o cantitate mare de c&ldurS fanl a-§i schimba. temperatura, dildura eliberatft in numeroase reacjii metabolice ar determina denaturarea multor macromolecule celulare (proteine, enzime, 653

;•' ;

acizi nucleici) contribuind astfel la modificarea structurii lor tridimensionale, ceea ce ar antrena pierderea unor funcjii biologice importante. Apa are §i o mare c&Idur! de vaporizare. Aceasta este cantitatea de caldura necesarS iransformarii apei lichide in vapori, la o temperature date. La punctul de fierbere (100° penlru apa) cfildura de vaporizare a apei este mult rnai mare decat a altor lichide cu greutate moleculani mice, aflate §i ele la punctul lor de fierbere (Tabeiul XJIL3). Tabelul XJ/IJ. Caklurile de vaporizare ale unor lichide cu greutate molecular# mica, aflate la punctul lor de fierbere (1 atmosferd). Lichidiil Greuiatea Hvap

molecular a 18 32 46

(calg1) 540 263 204 164

Apa Mefanol Etanol 1Propanol 60 Acetona 58 125 Benzen 78 94 Qoroform 119 59 Evaporarea unui iitru de ap! prim piele §i prin mucoasa c&iior respiratorii face ca sa se piard! 580 kca! din dlidura coipului. Pe de ait! parte, organismul omului adult pierde zilnic (fM a se fine seama de pierderile prin transpirafie) cca. 1200 ml ap
Fig. XIII.12 - Punctele de toptre §l de fierbere ale analogilor: H2Of H2S, H2Se |i H2Te celorlalte demen te care urmeazd oxigenului in grupa Vl-a din sistemul periodic. Astfel, dupd cum remit# din Fig. XIII. 12, finand searna de constantele fizice ale combinafiilor analoge gi exlrapoland, ar (rebui ca. apa sd aibd p.t. - 100° gi p.f. -80°; deci sii fie in stare de vapori la temperatura obignuitd. Datoritd faptului cd apa are punctul de topire cu 100° mai mare (0°) gi punctul de fierbere cu 180° mai ridicaf (100°) decat ar trebui, ea se glsegte la temperatura obignuitd In stare liehidd §i nu in stare de vapori, ca ceilalfi dihidraji analog!. Insugirea de a fi liehidd ii confer# - in primul rand - roiui de media intern, in to ate organismele. ' XIXI.4.5, APA CA DIZOLVANT Apa este cel mai bun gi important dizoivant. Ea dizolvd atat electroli{ii (acizi, baze, sdruri) cat gi substanje neionizate (anorganice sau organice). Dizoivarea electroiijilor se infelege ugor dacd se fine searna de faptul cd insdgi moiecula de apd este un dipol. Din aceastd cauzft gi datoritd capacitd| ii apei de a stabili ugor legaiuri de hidrogen, apa interacjioneazd rapid cu substanjele polare pe care le dizolvd. Practic, cand se introduce in apd o asemenea substanfd - spre exemplu, clorurd de sodiu (NaCI) in stare solid# -forjele electrostatice care Jin ionii 'in rejeaua erisfalina sunt distruse gi ionii eliherafi se inconjoard imediat cu cate o p&turd hidratantd, format# din molecule de apd, numild sfera de solvatare (Fig, XIII. 13).

Fig. XIII.13 - Soivatarea ionilor de Na+ §i Ci~ ca urmare a dizolvarit cforurei de sodiu cristaline in apa (dupd Rawn) 655 Acest fenomen, de solvatare, este posibil deoarece forfele de interacfiune dintre solvent §i ionii sdrii sunt mai puternice decat: forjele dintre ionii respectivi in rejeaua cristalind. Bineinjeles, aga cum se observd §i in Fig. XIII. 13, dipolii apei - care inconjoard ionii eliberaji din rejeaua cristalind - se orienteazd diferit fatd de cele doud feluri de ioni: cu poiul negativ (regiunea oxigenului) in imediata vecindtate a ionului Na* §i cu polul pozitiv (regiunea

hidrogenului) in apropierea imediata a ionului Cl~\ Sfera de solvatare care inconjoard ionii ii impiedicd sa se apropie intre ei, u§urandu-le independent in diverse depiasari; spre exemplu, in traversarea membranelor celuiare. Aceste traversdri sunt diferenjiate pentru divergii ioni, in funcjie de mdrimea ionilor hidrataji; ele sunt rapide in cazul ionilor hidrataji cu razd micd §i sunt ienfe pentru ionii hidrataji cu razd mai mare. Prezenja pdturei hidratante la suprafaja ionilor creiazd i'nsd §i unele neajunsuri; in special, cand doi ioni incdreaji electric diferit trebuie sd se combine (Fig. XIIL14). H \ \/ o ®N /P / --C© H o " °\...... -'H °\ H H H o \ II © O m O—P — O i® H o-“ Mg Fig. Xiil.14 - Atracfla ionilor de sarcini opuse, in apa De fa.pt, din eauzd cd in apd ionii sunt protejaji - unul faj.d de altul - prin sferele lor de solvatare, alracjia electrostatic^ dintre o pereche de ioni cu sarcini opuse ajunge sd fie foaite micd; practic, egald cu cea corespunzdtoare legdturii de hidrogen. Multe macromolecule care datoritd structurii lor chimice cuprind grupdri sau atomi susceptibili la stabilirea unor legdturi de hidrogen cu apa - de tipul proteinelor sau acizilor nucieici - se pot hidrata ele. In solujii apoase diluate, macromoieculele rejin o parte din apd la. suprafajd, constituindu-se astfel apa legend. Aga dap in solujie se poate distinge apa legat'd §i apa libera. Aceasta. din urmd constiluie mediui in care se depiaseazd apa legat'd odatd cu macromolecula pe care o hidrateazd. Este de remarcat cd prin infennediul apei legate se pot stabili diverse schimburi intre molecule §i apa liberd. Macromoieculele nepolare (apolare) - de lipul unor hidraji de carbon -Aunt insolubile in apa. Aceasta se datoregte faptului cd interaejiile "apd - apd" sunt mai puternice deedt cele dintre apd §i macromolecula apolard. Ca unnare, moleculele apei forfeazd molecuiele apolare sd se adune intpreund §i le inconjoard. In asemenea cazuri se spune cd apa exercitd un efect hidrofobic fatd de moleculele apolare adunate impreund, care sunt hidrofobe (Fig. XIII15). In opozijie cu substanjele hidrofobe se afld cele ugor solubile in apd menfionate anterior - cai’e sunt hidrofile. O comportare paniculard fajd de apd o prezintd substanjele amfipatice caracterizate prin afinitate dubla: pentru apd gi pentru solvenji apoiari. Substantele amfipatice se

orienteazS cu grupitrile polare (hidrofile) spre ap& - interacjionSnd cu ea - §i cu cele hidrofobe se IndreapUl spre solvenjii apolari, A§a se explicit dispunerea substanjelor amfipatice (spre exempiu, acizii gra§i cu molecule mari) sub forms de filme la suprafaja apei. De fapt, in acest caz, fiecare moleculS de acid gras este dispusS perpendicular pe suprafaja apei avand implaniata In ea gruparea hidrofild, carboxil.

O Hidrogen Q Substanfa O Oxigen nepolara Fig. XIII.15 - interact hidrofobe intre apa §i o substanja nepolara (dupa Rawn) r■ AS ' : ■! >' : j C-: ;-H P: | 7 : ;• 657 XIIL5. PROCESELE HIDROELECTROUTICE XIII. 5. L IONIZAREA APEI §1 PRODUSUL IONIC AL APEI Degi apa purd - complet lipsitd de sdruri §i gaze dizolvate - este considerate neelectrolit, ea conduce totugi curentui electric. La temperatura de 25°, conductibi- litatea specified, a apei este de 6x1 O'8 ohm'1 x cm-1. Se admit e cd aceastd conductibi- litate electricd a apei se datoregte faptuiui cd

o parte din moleculele ei sunt ionizate. Deoarece In mediu apos ionul H+ nu este liber ci alagat unei molecule de apd - constituind astfel ionul hidroniu (H3Q+) (Fig. XIII. 16) ionizarea apei poate fi scrisd conform ecuajiei:■ HH 2 H20 ^ H30+ + OH~ Este de notat. cd protonul hidratal se repre- zintd in serfs fie ca H30\ fie ca H+ injeiegan- du-se cd ionul de hidrogen se afid in apd totdeauna sub formd hidratatd. Ecuajiei reversibile de ionizare a apei ii corespunde o constantd de echilibru, datd de una din expresiile: H—O* 0 H ®H V* H

H H \& O Fig. XItl.16 - Formarea ionului hidroniu [H,Q*][OH-] [H20]2 sau KKh = [Hf] [HO ~ ] [H20] (2) La temperatura de 25°C apa se afid ionizatd in proporfie de o moleculd la 555 milioane de molecule. De aceea se considerd cd, prin ionizare, apa practic nu~gi schimbd concentra{ia, Aceastd concentrate se calculeazd ugor Jinand seama de faptul cd 1 1 apd are masa 1000 g gi greutatea moleculard a apei este 18 g mol1. Deci, apa are concenlrajia = 1000 : 18 ~ 55,6 M. In aceste condijii, expresia precedentd (2) devine: 55,6 Keck - [H+] [OH”] Prin determindri de conductibilitate electricd s-a stabilit cd valoarea constantei de echilibru pentru ionizarea apei este: 1,8 x 10'16, inlocuind aceastd valoare in expresia anterioard, se obfine: 55,6 x 1,8 x 10’i6 = [H+] [OH-] deci: 10*1< * [H+] [OH^ Aceastd expresie se numegte produsul ionic al apei gi se noteazd cu Kw. Prin urmai'e, Kw- [H+] [OH”] - 1
O solute este neutnl, ca apa pure, cand cuprinde ioni H+ §i ioni OH~ in aceea§i concentrate. Deci, in apa pure §i in solujii neutre la 25°; [H+] - [OH“] - 10“7 In genere, se spune al o solujie are reacjie acidS cand cuprinde o cantitate oarecare de acid liber (necombinat) §i cfl are reacjie bazicft (alcalind.) dace cuprinde o cantitate de baz& necombinatiL in solujiile acide concentrajia ionilor H+ este mai mare ca in apa punl §i ~ implicit - decat concentrajia ionilor OH“. in solujiile alcaiine situajia este inverse. La temperatura de 25°, pentru solujii acide: [H+] > 1Q~~7 > [OH ] §i pentru solujii alcaiine: [OH~l > 10“7 > [H+] Aceste relajii aratfi cd aciditatea unei solujii este caracterizat& cantitativ de concern trajia ionilor H+ din solujie iar alcaiinitatea de concentrajia ionilor OH". Ins&, intre concentrajia ionilor H+ §i OPT existil relajia data de produsul ionic al apei: [H+] [OH~] = 1Q“U (la 25°). Aceasta aratd ca fiecarei concentrajii a ionilor OH~ ii corespunde o concentrate unicd §i bine determinatH, a ionilor H*, datd de relajia: [OH-] 1014 [OH" ] Prin unnare, a§a cum se caracterizeaz£ aciditfljile - cu ajutorul concentrajiei ionilor H+ - se pot caraeteriza §i bazicihljile tot cu ajutorul concentrajiei ionilor H+; anume, in solujii bazice (alcaiine) [H+] < 10‘7. Jinandu-se seamS de acest fapt, se poate scrie: in solujii acide [bP] > tO'7 In solujii neutre [H+] = 10"7 In solujii alcaiine [H+] < 10"7. Nofiunea de pH §i utilitatea ei. Multe procese biochimice din organism depind de concentrajia ionilor de hidrogen, [H+J. Astfel, transportul oxigenului in sange, reacjiile chimice catalizate de enzime, generarea energiei metabolice in ciirsul respirajiei sunt numai cateva exemple din multitudinea fenomenelor §i proceselor biochimice care depind de concentrajia ionilor de hidrogen din mediu intern. Domeniul de vjinajie al concentrajiei ionilor H+ in organism este enorm; de la 0,1 M in stomac la niai pujin de 10"7 M in citosolul celular. Deoarece iiustrarea unor variajii a§a de largi ale concentrajiei ionilor de hidrogen este incomodie s-a eonvenit ca pentru precizarea reacjiei solujiilor in locul concentrajiei ionilor H+ stl se foloseascS logaritmul s&u cu semn schimbat, desemnat cu simbolul pH. EI este o prescurtare a expresiei "pondus hidrogeniiH (- puterea hidrogenului). Oricfirei concentrajii a ionilor H+ ii corespunde o valoare pH bine determinate, ' definite de eeuajia: pH = - log [HI Concentrafiei ionilor de hidrogen 10"7 li corespunde pH = 7 iar valorilor concentrafiei ionilor H* mai mici decat 10'7 corespond vaiori pH mai mari decat 7; cu atat mai maid, cu cat solufiile sunt mai-alcaline. A§a dan pentru solufii acide pH < 7 pentru solufii neutre pH = 7 pentru solufii aicaline pH > 7

Acelea§i motive care au condus ia iritroducerea mftrimii pH au determinat §i folosirea valorii pGH in local concentrafiei ionilor OH~~. Deci: pOH - - log [OH“] Jinand seama §i de expresia pOH, rezuitd cd pentru definirea reacfiei unei solufii se pot folosi 4 m&rirni, cede din coloana. "unifate de mSsurft” a tabeiului X1IL4. Tabelul XJ/J.4. Unltaple de masura uUHzatc pentru aprecierea reacfiei and solujit Reac[ia Unilatea de masura acidd neutrd alcalind + -7 7 [H ] > I0 - ur < 10-7 [OH-] < ur7 = H)“7 > 10-7 pH <7 =7 >7 pOH >7 =7 <7 In legSturii cu caracterizarea reacjiei unei solufii, utiiizand oricare din unitftfile de mdsurii din tabelul XIIL4, este de fecut urmStoarea precizare: unei modificSri cu o unitate a valorii pH-ului ii corespund variafii foarte diferite ale cantit&fii de ioni H* §i anurne: ii corespund variafii mari cand valorile pH sunt mici §i variafii infirne cand valorile pH sunt mari. Pe de albl parte, scSderea la. jumState sau dublarea concentrafiei ionilor H+ dintr-un media se manifest'd prin cregterea, respectiv sc&derea, valorilor pH corespunzfttoare cu cate 0,30 unit&fi. Acest fapt rezultd imediat din tabelul XIII.5. Tabelul XIII.5. Conccntrafiile Ionilor H+ si valorile pH corespunzatoare ale unor soliitii [IF] [IF] mmolIL pH mmolIL pH 20 7,70 60 7,22 ' 25 7,60 70 7,16 30 7,52 80 7,10 35 7,46 100 7,00 40 7,40 120 6,92 50 7,30 140 6,86 160 6,80 Valorile pH ale unor lichide din organism precum §i ale unor lichide folosite in mod curent (in special, in alimentafie) sunt prezentate in Fig. XIII17. 660

r PH 0 1 2 3 4 5 '6 7 Q 9 10 11 12 13 14 Fig, XNI.17 - Valorise pH ale unor lichide cunoscute Din Fig, XIII17 reiese cfi valoarea pH = 7 a. apei pure diferS de cea a sucului pancreatic (pH = 8) cu o unitate, a§a cum diferft pH-ul sucului gastric (j)H -2) de cel. a.l sucului de lamaie (pK~3). Ins! apreciind cu ajutoruJ

concentrafiei ionilor de hidrogen aceste valori reiese c! diferenja de o unitate de pH intre sucul pancreatic §i apa. pur! eorespunde la 90 nmol [H+]/L, pe cftnd diferenja de aciditate dintre sucul de IfSmaie §i sueul gastric (corespunz&oare tot unei unit!|i de pH) este de 9 mmol [H+]/L sau 9,000.000 nmol; deci de 100:000 on. mai mare, Cele menjionate aid araUl c! unltatea pH nu are aceea§i valoare in toate regiuniie sc!rii de pH cand este apreeiad In coneenlrafie de ioni hidrogen. Aceasta' este datoritft faptului c! inlre pH §i [H+] exists o relajie logaiitmicil §i nu linear! Cm^elerizarea reaciiei (acid! neof.nl sau .alcalinft) unei solufii se poate face prin mSsurltori bazate pe diverse mctode electrocliimice folosind. pH metre, aparate foaite sensibile §i precise. Determinlriie exacte de pH mint utile pentru diagnosticarea unor mafadii precum §i pentru aprecierea funcjionlrii diverselor organc. Sprc exemplu, valoarea. normals‘a pH- ulut sangvin este 7,4 dar la diabetici ea. este mai redusil O atare sii.uaj.ie este cunoscut! sub numele d.e acidozd. Condijia opus! in care pH«ul sangvin este mai mare decat 7V4 se numeric alcalozd. Ea se insfaleaz! in special, in stflri de hiperventilajie pulmoriar! precum §i in cazul vomismenteior prelungite. Deoarece medial intern poate 0 asemlnat perfect cu o solujie apoasl complex! comportIrile acizilor §i bazcior In solufii apoase prezintl interes deosebil. Aceste compoitfui sunt expuse - pe scurf - in eeie ce urmcaz! insistandu-se asupra conlribujiei lorja piistrarca echilibrului acido-bazic din organism. in generc, se consider! di un acid este cu atat mai fare cu cat prezinl! o tendintS mai putemic! de a ceda protoni iar o bazS este cu atat mai fare cu cat tinde mai mult si. accepts (lege) protoni, Pentru stabilirea tariei acizilor §i bazcior se ia in considerate comport area acestor subsfante fajd de apft care reacfioneaz! ca bazfi faf.fi de acizi §i ca acid fa{3 de baze: XIH.5.3. SPECII DE ACIZI §1 BAZE; TA.RI.A LOR. (a) AH + HOH =*=* (b) B + HOH A“ + H30+ BH+ + OH661 Rcacjiile (a) §i (b) se incadreazil in categoria reacfiilor protolitice deoarece in ele se mobilizeazS protoni intre doml perechi simple de conjugafi acid baza, Astfel, in reacfia reversibiia (a) o prinul pereche de conjuga|i esle constiluita din acidul AH care are tending sdcedeze protoni trecand in baza sa conjugate A~~ iar aceasta. baza fixeazS protoni refScand acidul AH in reacfia inverse, de la dreapta la stanga: AH ^ H+ + A“ A doua pereche de conjugaji in reacfia (a) esle constituM din HOH - co rol de bazd - care fixand protoni trece in acidul sSu conjugal H-,0+ iar acesta, prin eiiberare de protoni, reface baza HOH in reacfia inversd: HOH 4- H+ *=*= H30* In reacfia reversibiia (b) o pereche de conjugafi esle format^ din baza B cu tendinfa de a fixa protoni trecand in acidul sdu conjugal BH+ care - in reacfia de la

dreapta la stanga - reface baza eliberand protoni; B + H+ *=* BH+ A doua pereche de conjugafi in reacfia (b) esle constiluita din HOH care in acest caz are rol de acid - cu tendinfa de a ceda protoni trecand in baza sa conjugate OH”. La riindul ei? aceasta. baza prin fixare de protoni, in reacfia inverse, reface acidul HOH; HOH ^ H+ + OH” Constanta de echilibru a reacfiei reversibile (a): JA-HH3O-] Kh "[ A H ] [ H 0 H ] ajuta la caracterizarea tariei acidului. Intr-adevfrr, cu cat echilibru! esle deplasat mai spre dreapta, dec! Kcch are 0 valoare mai mare, cu atat acidul respectiv este mai tare. Insa, dacS in expresia acestei constante de echilibru se inlocuiegte concentrafia apei neionizate cu valoarea ei - practic invariabibl, 55,6 - §i se trece in membrul I, se obfine: K0 - 55,6 KMh [A1[H301 [AH] Noua constants, Ka, se nume$te constants, de acidiiate §i ea caracterizeazfi efectiv tMa acidului In ceea ce private tikia acizilor, este de remarcat eft acizii tari cedeaza protoni mai u§or decat ionii hidroniu, astiel cS in reacfia (a) echilibrul este deplasat total spre dreapta. Bine infeles, bazele A~ - conjugate cu acizii tari - sunt bttze numai principial (in solufii apoase) cftci ele practic, nu fixeazft protoni, Deci, pentru acizii tari constantele de acidiiate nu au sens. Tdria bazelor se stabile§te in mod similar, plecandu~se de la reacfia protoliticft (b). Constanta sa de echilibru este: K JBHMIHO-] ech “ [8][HOH) iar constanta de bazicitate Kb este datft de expresia: Kb - 55,6 Kech [BH*][HO-] [B] 662 Cu cat Kb are o valoare mai mare, Cu atat baza este mai tare. Dar pentru uniformizarea uni- de irulsur& a tdriei acizilor §i bazelor s-a convenit ca in iocui constantei Kb (constantei de bazicitate) t&ria bazeior s;l se caraclerizeze §i ea printr-o constants de aciditate, K*; anume, cea a acidului sdu conjugat. Se infelege, in acesie condifii, cli baza este cu atat mai tare cu cat are o constants de aciditate mai midi (acidul s&u conjugat fiind mai slab). De fapt, relafia cantitativd care exists intre Constanta de bazicitate a bazei §i constants de aciditate a conjugatului sSu este: Ka - Kb = [HaQ*] [OH-] = 10"1d (la 25°) AceastS ultima relate permit© s& se ob|inS imediat constanta corespunz&toare unui conjugat cSnd se cunoa§te aceea care define§te t&ria celuilalt:

10~14 nr §i Ka = 10-H nr AsemdnStor trecerii de la [H+] la pH, se poate face §i trecerea de ia valorile constantelor de aciditate, Ka, exprimate prin puteri negative ale lui 10, la logaritmii lor negativi, ob{inandu-se valori pKa pKa - - log Ka Jinand seama .de simbolul pKa, acizii. se pot clasifica astfel: acizi tari cu pKa < 1; acizi de tcirie mijlocie cu pKa cuprins intre valoxile 1 §i 5; acizi slabi cu pKa > 5. Majoritatea acizilor cu insemndtate metabolic# deosebitS, aflaji in fesuturile §i fluidele din organism, sunt acizi de t#rie mijlocie sau slab#* Ace§tia impreun# cu constantei© lor de aciditate, exprimate in ambele moduri (Ka §i pKJ, figureaz# in Tabelul XIIL6. Tabelul XIII.6. Valorile constantelor de aciditate (Ka §1 pKa) ale unor acizi important dsn punct de vedere biochimic, determinate ia teimperatura de 25° Acid K PK„ 4,30 x H2CO3 10'7 6,37 5,61 x HC07 10'" 10,25 7,52 X H3PO4 10'3 2,12 6,23 X 1 H2P07 G'a 7,21 2 HPO '2,20 X ’12,67 10'13 CH—COOH 1,76 x 4,75 10'5 HOOC—{CH2)5—COOH trsapta I 4,58 X 4,34 5 10' treapta II 3,89 X 5,41 6 10' OH I I HOOC-CH„— e—CH2— COOH I I COOH 8,40 x treapta I 10'4 3,08 treapta li 1,80 X 4,74 10'5

treapta II!

4,00 X 1 5,40 6 O' NH*4 ■ 5,62 X 9,25 10'’° CH3— NH+3 2,70 X 10,66 10'" * Determinari la temperatura de 18°. 663 Ecualia Henderson - Hassefhakh. In ire Constanta de aciditate a unui acid (de tiirie- mijlocie sau slaM) aflat 'in solufie apoasS §i concentrajia ionilor de hidrogen (pH-ul) din solufia respective sc af!3 o relate stransii bine determinate, cunoscutil sub numele de ecua{ia Henderson - Hasselbalch. Ha poate fi stability u§or plec&nd chiar de la expresia constantei de aciditate a acidului din solujie, Astfel, prin referire la cazul general al unui acid de f&rie mijlocie*sau slabs care reacponeazS protolitic cu apa - conform reacjiei precedente (a) - s~a stabilit cu expresia constantei de aciditate a acidului, AH, este: i: :

K= [A'][H30*] [AH] Logarifmand intreaga rela|ie se ob|ine:

log K8 = log log t H3O* ) Schimband locul HI temtenii ecuafiei penlru log Ka §i log [H30+], se ajunge la relajia: -iog[H,o*] - log Ka + log [A') [AH] sau pH = pKa + log [Al [AH] Aceasta. este ecuafia Henderson - Hasselbalch care pune direct m relafie constanta de aciditate a unui acid, aflat in solujje apoasfi, cu pH-ul solujiei respective. Jinand seama de faptui c;l In ecuajia Henderson - Hasselbalch figtireaxS concentrajia unei haze anionice, [A‘], acceptoare de protoni §i concentrajia acidului nedisociat, [AH], care are tendinja sit cedeze protoni, ecualia poate fi modificata - exprimSnd-o in forma ei cea mai general] - astfel: pH-pK^ing t accePtor de protom ] a [ donor de proton! j Di?p] com se va vedea mai departs ecuajia Henderson-Hasselbalch este foarte utikl §i penlru explicarea moduiui de funcjionare a sisf.emelor tampon. XIII.6. ECHILIBRUL ACIDO-BAZIC In organismul omului, reacjia mediului intern este u$or crescut] peste neutralitate; pH: 735 - 7,45. P&strarea acestor limite de variajie este imperious] penlru desf3$urarea normal:] a tuturor proceselor vitale. Pentru menjinerea constant] a pH-ul ui in media intern organismul foIosc$te trei mecanisrne funcjionale: a) neutralizarea acizilor §i bazelor de cfure sistemele tampon; b) elirninarea. renal] a excesului de acizi; c) elirninarea pulmonar] a dioxidului de carbon (cel mai frecvcnt abundent produs final de metabolism). Injelegerea moduiui in care sistemele tampon neulralizeaz# acizii p bazele presupune cunoa§terea proprietdfii fundamentale a subsianjelor tampon. Acest.ea, sub form] de solujie, se opun modific&rii pH-ukii propriu la adaosul unui acid sau al unei baze. Cu aife cuvinte, ele "lamponcazS" acizii §i bazele. Amestecul, m solujie, a doutl snbstanje tampon cu acjiuni complementare - in sensul e:l una din elc se opune sodden! pH-ulji determinate de adaosul unui acid - iar eealall] se opune cre^erii pH-ului determinate de adaosul unei baze - formeaz] un si stem, tampon, Cele doud substance din conslitujia oricftrui sistem tampon pot fi: un acid slab §i sarea sa alcalina.sau o baz:I slab] §i sarea 664 sa aeickl Indiferent de natura erchimicit (acid, baz&, sare) componenta sistemului' care neutralizeazS acizii se numegte componenta bailed iar cea care neutralizeazS bazele este componenta acidd. Soiu{ia fiecSrui sistem

tampon are un anumit pH, dat de ecuajia Henderson - Hasselbalch; oM-px [acceptor de P^-oni j [ donor de proton! j in care Ka este constanta de aciditate a componentci acide, acceptorul de protoni este componenta bazial iar donornl de protoni este componenta acida a sistemului tampon considerate ■ In cursul func{iori3ru (temponftrii) componentele sistemului tree ana in cealaM. Astfeh la adaosui de acid (deci de ioni H+) in solujia unui sistem tampon constituit dintr~un acid AH §i baza sa anionicS. A"", accaste components bazica accepts protonii trece in acidul sau conjugal (neionizat): A“ *f H+ —- AH In mod similar, dud in solatia sistemului se introduce o baz& (deci ioni OH"") componenta acidS AH libereazfx protoni neutaiizand ionii OH'~ §i ea. trece in baza sa conjugate: AH + GH“~ — HOH + A" Bine Infdes, cantitatea de acid sau de baza care se adaugS sistemului tampon no trebuie sil fie prea mare c&ci atunci capacit.af.ea tampon a sistemului este deputed, Capaciiatea tampon a unui sistem tampon se exprim& in unitelji definite astfel: un sistem tampon are capacilatea tampon unitarS. (1) cand la 1000 ml solujie tampon irebuie- sa se adauge un echivalent de acid tare sau de bazfi tare pentru ca pH-ui sistemului sd se schimbe cu o unifate. Prin urmare, dimensiunea capaeittepi tampon este: n Echiv/L/pH. Un sistem tampon este cu atSt mai eficace cu cat. concentrafia lui global! * (soma concentrafiilor componentelor) este mai mare, eflei consumarea lor in timpul tamponSrii mi este apreciahilS; pe de altil parte, eficacitatea unui sistem tampon este cu at St mai mare cu cat. raportul dintre concenirafiile componentelor este mai apropiat de 1. (deci ambele coiieenfrajii suite mat apropiate) dici consumul lor in timpui tamponfirii ie indepSrteazS mat pujin. De fapt, se consider^ ca efectul tampon este maxim numai cSnd pH-ul solujiei respective varia.zfuiteM.in interval foarte strans in. jurul valorii pKa; practic, egal cu pKa ± 2 unit. pH. Cele mai importante sisteme tampon care funcjioneazii. permanent in organism sunt: (1)sistemul acid carbonic - bicarbonate (2) sisfemul fosfafilor, (3) sistemul proteinclor (4) sistemul hemoglobinei (erne reprezintel un caz particular de sistem tampon cu componenta. proteief'b XIIL6.L SISTEMUL TAMPON ACID CARBONIC - BICARBONAT Acpunea tampon contents sangeiui depinde, in prirnul rand, de echilibrul cc se stabile§te intre trei constituent ai sSi: acid carbonic, bicarbonat §i. dioxiduS de carbon provenit din respira|ia. tfeulariL Acesta din urnifi se aflft in sfmge atat sunt forma dizolvatft, CO^ , cat §i sub forma gazoasS, C02(gj, prezent In aerul din intcrstijiile pulmonare. Echilibrul global ai ceior trei componente este rezulfatul tnsurnarii a trei echilibre parjiale ((a), (b) §i (c». 665 Primal echilibru parjiai este cel corespunzStor disocierii reversibile a acidului carbonic:

(a) C03 H" + HCCr [ H *■ J [ H C O3" ] [H2COJ Acesla este afectat de un al doilea echilibru, stabilit intre dioxidul de carbon dizolvat $i acidul cai'bonic: C02(aq) + HOH =*=*= H2C03 (b) K„ [H2C03] [ C02{ aq) ] [ H2OJ InsS dioxidul de carbon dizolvat este in echilibru cu cel gazos: C02(g) + HsO C02 (aq) [ CO, (aq) ] (c) K. [C02(g)](H20] Pentru a se afla echilibrul global care caraclerizeazS capacitatea tampon a sangelui, dependents de acest sistem, se fac urmStoarele operajiuni matematice asupra celor trei constante de echilibru stabilise anterior: - se rezoIvS relajia (b) in favoarea [H2C03] §i se substitue in (a), objinanduse: (d) [H*][HCO3-; K2[C0s(aq)][H20; (e) se rezolvfi relajia (c) in favoarea lui CO, (aq) §i se substituie in (d). Se obfine: [H-] [HC03 ] K, (0 K2 • K3 [ C'02 (g) ] [ H20 f se tree toate valorile constante in primul termen §i se obfine: IfHCOC] K4 = K, • K2 • K3 [ H20 f , [C02 (g) Deoarece dioxidul de carbon gazos este intrutotul corespunzStor presiunii sale parjiale in spajiul aerian pulmonar, in expresia precedents (f) se poate face inlocuirea: [C02(g)] cu pC02(g). Deci: (g) K.= [H'J [HCOf] pC02(g) AceastS ultiniS ecuajie aralS cS, de fapt, capacitatea tampon a sangelui depinde numai de concentrajia bicarbonalului (anionului bicarbonic) pe care1 confine §i de presiunea parjialS a dioxiduiui de carbon aflat in aerul pulmonar. Intr-adevSr, dacS pH-ul sangvin 666 este ameninfat sd scadft din cauza urtui proces metabolic in care apare on exces de ioni H\ componenta hazicd a acestui sistem, HCOp, intervine conform reacfiei: HV HCO3-— H2C03

Acidul carbonic rezultat se descompune imediat: H2C03 —- C02(aq) + H2Q iar C02(aq) trece in fazd gazoasd, rndrind pC02 in pldmam; de unde se eiimind ulterior print expirafie, Cu alte cuvinte, cre§terea concentrajiei ionilor de hidrogen in sange are ca efect cregterea presiunii dioxidului de carbon la nivel pulmonar. In situafia inverse iampondrii acizilor, dacd - datoritd unui proces metabolic - pH-ul sangvin este ameninfat s& creased, el este repede restaurat grajie faptului cd dioxidui de carbon aflat in atmosfera pulmonard trece in faza apoasd §i formeazd acidul carbonic in sangele din capilarele pulmonare. (Fig. XIILI8). HCof(aq) 1 H2CQ3 (aq) 1 002(sq) + H2 O Faza apoasa a celulelor sanguine care trece prin capifare in plaman Spap'ul aerian pulmonar Fig. XIII. 18 - Regiarea pH-uiui sangvin prin sistemu! tampon acid carbonicbicarbonat ■ ■ (dupa Rawn) Acidul carbonic Hind - pand la urmd componenta acidd a sistemului, se opune tendinfei alcalinizante, neutralizand-o: H2C03 + OH" —- H20 + HC03" A§adar, indiferent dacd in media intern apare 0 tending acidifiantd sau alcalinizantd, rezerva de dioxid de carbon gazos (din aerui pulmonar) se face utild §i le neutralizeazd intervenind - cum s-a ardtat - prin componentele sistemului tampon add carbonic - bicarbonat. Deoarece aceastd rezervd de dioxid de carbon gazos din pldmdni este apreciabild §i se poate modifica dupd nevoie - prin ritmul respirator, pH-ul sangvin rdrndne neschimbat, in condifii norm ale. In genere, se considerd cd sistemul-tampon acid carbonic - bicarbonat este cel mai rdspdndit din punct de vedere cantitativ §i funefioneazd eficient atat in lichidul extracelular cat §i in plasmd. In mod normal, in plasmd §i lichidul extracelular raportul bicarbonaf/acid carbonic este 20/1 §1 pH-ul mediuJui respectiv are valoarea 7,4. Cand in 667

7: N 6 /g

sange create mult concentrajia bicarbonatului sau scade apreciabil concenlrafia acidului carbonic, pH-ul dep#§e§te valoarea normals (7,35 7,45) §i apare staj*ea de alcaloxii. In condi{ii inverse, pH-ul scade sub limita inferioar# (7,35), decdapndu-se slarea de acidozd. Dupa cum s-a mai' menjionat, o asemenea .situajie se intalne§te la diabetici. tntr-a.dev&r, in diabel -pH-ul sangvin poate scMea chiar pana la valoarea 6,8 (care este fatal3). X1IL6.2. SISTEMUL TAMPON AL FOSFAJILOR Acesf; sistem este alciituit din dou# silruri: fosfat monohidrogenat (Na2HP04 sau K2HP04) - care constitue componenta bazica a sistemului - §i fosfat dihidrogenat (NaH2P04 sau KH2P04) care este componenta acidic De fapt, componentele func|ionaie in cursul tamponSrii sunt anionii acesfor s&uri: HFOj“ §i H2POT La pH-ui normal (= 7,4), concentrajia anionului fosfat. monohidrogenat este aproximativ de 5 on mai mam decaf: cea a anioniilui fosfat dihidrogenat. Componenta bazica, H.POjb lamponeaz# acizii fixand ionii H+ eliberafi de acid: HP042“+ H+----------------------------- CLP Op Componenta. acidd, H2PQT, prin eliherare de protoni neulralizeaz# ionii OH; ai bazclon H2POp + OH""—* H20 + HPO*" Dupfi cum se observe, prodysi.1 rezultaji In ambele cazuri sum componentele sistemului §i care au frecut una in cealaMm cursul tampon&rii. Aceste componente sunt, respectiv, un acid slab si 0 bazil slab# (vezi constantele lor de aciditate in tabelul XIII,6). Sistemul tampon al fosfajilor este operant. ~ in special - in hematii §i in celulele tuhulilor renalh X1II.6.3. SISTEMUL TAMPON AL PROTEINELOR

Acesf sis tern de§i este predominant in celulele JesuturtIors opereaz# §i in plasm#. In constitujia lui intr# proteine care funefioneaz# ca anioni la pH-ui slab aicalin ai mediului intern. In combinajie cu ioni HL anionii proteici constifuie componenta acid# a sistemului (H - prot.ein3) §i tamponeaz# bazele tari iar in combinajie cu cationii rnetalelor alcaline (Na, K) formeaz.il componenta bazica (Na - protein#, sau K - protein#) §i tamponeaz# acizii tari. Mecanismul tamponSrii* In ambele cazuri, poate fi redal. prin reaejii de felul: HCi + Na - proteina —NaCI + H - proteina NaOH +■ H - proteina —H20 -1- Na - proteina Se observ# - in cazul acesla - c# prin tamponare acidul §i baza fare au trecut in produ$i neutri (NaCI, H20) iar componeiUele sistemului s-au transformat una in cealalt#. Fieeare din eie preztnta aciditate sau ba.zicit.ate moderat# astfei incat pH-ul mediului nu este afectat (cum ar fi fost, fM tamponare, in prezenfa acidului fare, sau a bazoi tari). 668 XIII.6.4. SISTEMUL TAMPON AL HEMOGLOBINEI Hemoglobina intrS in constiiiifia. a doua sisteme tampon: (a) hemoglobin;!. acidd (HHb) - hemoglobinat de potasiu {KHb) §i (b) oxihemoglobind acidd (HHb02) - oxihemoglo- binat de potasiu (KHb02). Ambele sisteme i§I pot exercita acjiunea tampon datoritft faptului cS hemoglobina cuprinde, in partea sa proteic&,-multe resturi de histidinS, Iniradevar, nucleul imidazolic din constitufia histidinei are capacitatea s& accepte §i sd cedeze H+ la unul din atomii de azot (cel din pozijia 4) ai heterociclului. Astfel, nucleul imidazolic fimcjioneazd ca bazfi: HN' 4 3 + H* NH

sau ca acid: •f HIST + OH" + H,0 NH NH PSsfjand forma, de scriere a reacfiilor de tamponare utilizalft la sistemul tampon al proteinelor, in cazul sistemelor din care face parte hemoglobina reacpile respective sunt: KOH + HHb —-KHb + H20 KOH + HHbO? —-KHb02 + H20 HCi + KHb —-HHb + KC! HCl + KHb02 —-HHbOz + KC! §i de data aceasta, ticidul tare §i baza s-au transformat, in urma tampondrii, in produgi neutri (sare, apd). Totodatd, componentele sistemului au trecut una in cealalhl pdsiriind aciditatea §i bazicitatea lor moderate ITmTa fi afectat pH-ul mediului. XIII.6.5. COOPERAREA PLAMAN-RMICHI ALlturi de sistemeie tampon, celelalte douh modality de rnenjinere constants a echiiibrului aeido-bazic in medio intern se realizeazd prin cooperarea dintre phlman §i rinichi. Intr-adev&r, aga cum s-a menfionat la descrierea sistemului tampon acid carbonic - bicarbonat, pldmanul are o rezervd apreeiabiih de dioxid de carbon gazos pe care o poate modifica prin ritmul respirator, De fapt, eliberiind mai mult, sau mai pujin dioxid de carbon - in funejie de amplitudinea §i freevenja respirajiei - pldmanul acjioneazd direct gi rapid asupra echiiibrului acid carbonic * bicarbonat din mediui intern. Aceasld intervenfie rezuM imediat din schema ilustraUl in Fig. XIII.19. 669

Pe cle ailh parte, rinichiul intervine $i el asupra aceluia§ echilibru acid carbonic - bicarbonat, restabilind concentrajia sangvinft a anionilor HC0 3“

prin reabsorbjie §i eliminSnd ionii FT (Fig. XIIL19). Trebuie msh precizat eft ionii H+ nu sunt eliminafi, ca alare, total prin urinft ci rinichiul me capacitatea de a-i neulraliza - in buna pai*te ingiobandu-i fie in ioni NH *A prin combinarea lor cu aimoniac ( H+ + NH3 — NH4 ), fie in miioni H2P04~ , in urma reacjiei: HPO*" + H* —- H2P04~ . MEDIUL INTERN C02 + H20^=^H2C03^^HC02-f H + F----------------------------------—------------ ----------4co2 / PLAMAN (l RINICHI 4^ Fig. Xiil.19 - Cooperarea intre piaman §\ rinichi pentru pastrarea echilibrului acido-bazic ai sangeiui Cap. XIV. MATRICEA EXTKACELULARA In concepfia clasicd matricea extracelulard este considerate ca un suport inert' general de anumite celule pe care acestea stau fixate. In funcjie de natura formajiunii careia aparfin, celulele generatoare de matrice au primit diferite denumiri: fibrobla§ti care predomind in fibrele de leg&turd, condrobla§ti care formeazd cartilajele, osteobla§ti care participd la constituirea oaselor. Actualmente concepfia clasicd privitoare la matricea extracelulard este completatd, cdpdtand o noua viziune, pe baza multiplelor date experimentale efectuate in acest scop. Intr-adevdr, azi se §tie precis cd exists - in permanent - numeroase iegdturi structurale §i funcfionale tore matrice §i celulele generatoare. AstfeL s~a constatat cd unii constituent intracelulari produc §i direcfioneazd dispunerea macromoleculelor matriceale pe suprafefele celulelor, contribuind decisiv la organizarea matricei extracelulare. Pe de altd parte, diverse studii speciale din acest domeniu au demonstrat cd o matrice extracelulard, ordonatd, influenfeazd distribufia §i funcfionarea celulelor care o susjim Matricea extracelulard este constituitd - in mare - din proteine cu aspect fibrilar incluse intr-un gel polizaharidic hidratat. Alat proteinele cat §i polizaharidele matricei interacfioneazd strans §i se asambleazd in structuri tridimensionale. Toate acestea sunt prezentate in cele ce urmeaziL XIV. 1. CONSTITUENT!! CHIMICI AI MATRICEI EXTRACELULARE XIV. l.L PROTEINELE Din matricea extraceSulard s-au izolat initial doud proteine: una extrasd cu acizi §i alta cu solufi-i alcaline diluate. FaptuI cd ambele proteine precipitd, in anumite condifii, sub formd de fibre cu proprietdji asemdndtoare fibrelor de colagen a fdcut ca ele. sd fie considerate, respectiv, drept colagen acidosolubil §i. colagen alcalino-solubil. Acesta din urmd ar putea fi socotit adevdratul precursor al fibrelor de colagen. , Matricea extracelulard cuprinde §i proteine serice, a§a cum confine §i ioni minerali identici cu cei ai serului sangvin. Unele studii efectuate cu ajutorul isotopilor radioactivi au ardtat cd diversele proteine din matrice prezinta un metabolism foarte intens, stimulat de procese degradative proteolifice, Printre enzimele participante mai

frecvent la aceste degraddri s~au pus in evidenfd colageneza §i tripsina. Este de remarcat cd in matricea extracelulard existd diverse tipuri de fibre elastice care se deosebesc intre ele prin proteinele constitutive: colagen, elastind, reticulind. Aceasta din urmd este o proteind asemdndtoare colagenului dar diferd de el prin faptul cd cuprinde §i multe poliozide. Insd proteinele predominate in fibrele matriceale sunt colagenul §i elastina. 671 Colagenul

Colagenul este cea mai abundentS proteins din organismul uman. El se

aflft in propoitie de 23% din totaiitatea proteinelor corpuiui Dupft cum rezultft din Tabelul XIV. 1, organeie moi cuprind pujin colagen; in schimb, organeie de tipul pielei §i tendoanelor confin coiagen mai mult de 70% (din greutatea lor uscatft). In cazul osului, dep colagenul reprezintft numai 23% din. masa uscatft, aceastft cantitate corespunde la aproximativ 90% din matricea lui organic*! Tabelul XIV,L Concentrate cotagenului, elastinei ss protettglicanfitor polianionici din unelc organe (g/100 g tesut uscat). • Proteogli Colage Elasti cani Organ n nd anionic i Oase (demmeraliz ate) 88 0,8 Case (in totaiitate) 22,8 0,2 Tendon ul lui 86 4,4 0,5 Ac-hile Piele 71,9 0,6 Cornee 68,1 4,5 20,4Cartilaj 46-64 37,1 Ligament 17 74 Aorta 12,24 30-57 5,9 Plaman 10 3-7 Ficat ' 3,9 0,16- 0,30 Frincipala funcjie a colagenului in organism este de a conferi rezistenfft si de a pftstra integritatea structural# a fesuturilor in eonstitujia cftrora intrft. Totodatft, colagenul este unicul constituent al organismelor superioare care prezintft rezistenjft la tracfiune. Pe baza unor studii mai vechi, a dainuit multft vreme pftrerea eft in organism colagenul care se formeazft in cursul dezvoltftrii rftmane tot restul viefih Aceasta revine la a spune eft pentru colagen nu ar exista o stare dinamieft de reinoire, a§a cum exists pentru alte proteine. Oserie de cercetftxi ulterioare au arftfat insft eft in diverse procese normaie (involujia uteruiui dupft najtere, vindecarea rftnilor) §i patologice (scorbut) colagenul este supus §i ei unor importance procese metaboiice de biosintezS sau degradative. De altfel, cauzele mai multor boli, intre care §1 ateroscieroza, sunt explicate - in mare mSsurS - prin modificSri survenite in metabolismui colagenului. Bineinieles, acest metabolism implied biosinteza §i degradarea colagenului (colagenoliza). Ambele procese sunt descrise in cele ce urmeazft. a) Biosinteza colagenului. Acest proces este astftzi bine cunoscut. EI presupune parcurgerea a 10 etape ce se succed intr-o secvenjft bine ordonatft §i care permit trecerea 672 de la aminoacizi liberi la fibrila cle coiagen. Aceste etape sunt: (1) asamblarea aminoacizilor; (2) hidroxilarea unor resturi de prolina (prolil) §i de

lizind (lizil); (3) formarea helixuiui; (4) glicozilarea; (5) expulzarea din celuLI; (6) u*ansportul la fibrila in credere; (7) transformarea procolagenului In coiagen; (8) formarea aldehideior; (9) formarea fibrilei; (10) stabilirea leg&turilor incruci§ate. Unirea aminoacizilor are loc in fibroblagti, trecandu-se prin acelea§i etape prin care se biosintetizeazft toate proteinele. Este caracteristic ins5 faptui o& printre aminoacizii constitutivi predominS glicina (33%) reprezent&nd fiecare al treilea rest aminoacidic (X - Y - Gli)n, intr-o m
:^i

673 Tabelul XJV.2. Tipurile de colagen Tip id Nr. Lanfu colag lanfur ri enic ilor distin distin cte cte . Tipi

2 1

a, a) Otj (I)

Masa lanfurilo r (kD) 95 95

TipH

1

a, (II)

95

Tip HI

1

a, (III)

95

Tip IV

2 1 3

a, (IV) a, (IV) a, (V)

170185 130-

Tip V

Distribufia tisulard Piele, tendon, os, cornee Cartilaj, disc intervertebral, coip vitros Piele fetalS, sistetn cardiovascular Membrana bazala Aceleagi Jesuturi ca la

a2 (V) 200 Tip VI

3

Tip VII

I

Tip VIII

1 3

Tip IX Tip X Tip XI ,

1 3

Oj(V) a, (VI) a* (VI) Ob (VI) a, (VII) a, (VIE) a, (IX) a, (IX) 03 (IX) a, (X) a, (XI) a2 (XI)

tipul I, dar in cantitaji mult mai mici

140240

Vilozitaji placentare

170

Membrane placentare

- 150

Celule endoteliale Cartilaj hialin

85 59

Cartilaj hialin Cartilaj hialin

- 100 03 (XI) Dintre cele 11 tipuri distincte de coiagen, cele mai rftspandite in organismele superioare sunt primele patru tipuri menfionate in Tabelul XIV.2. In forma restr&nsft, compozifia lor molecularft - care exprimft natura lanfurilor constitutive - se scrie adesea in felul urmfttor: I [20,(1), 0,(1)]; li [3o,(l!)]; HI [30,(111)]; IV [2a,(IV), a2(IV)j. Este de remarcat faptul eft lanfurile a din constitufia oricftrui tip de colagen se deosebesc de lanfurile a din alte proteine deoarece au "pasul" mult mai mare (9,3 A); deci sunt mai intinse. Distanfa dintre doi aminoacizi mftsuratft in lungimea elicei este de 3,3 A fafft de 1,4 A din lanfurile a obi§nuite. Aceastft dispunere spafialft este impusft de 674 Fig. XIV.1 - Tripla elice a tropocolagenului 28,6 A • Hidroxiprotina o Prol/na 0 G/ic/'na

Fig. X!V,2 - Asocierea moleculeior de tropocoiagen

numeroasele resturi de prolinS aflate in lanp Intr-adev&r, heterociclurile de prolin& stanjenesc form area unei elice mai strdnse (cu pasul mai mic). Asocierea a trei lan|uri a (3aj sau 2ax §i lotj) §i impletirea lor, until asupra altuia, tot in forma heiicoidaM au ca rezultat formarea unei elice triple cu pasul de ~ 28 A (Fig. XIV.1). In ansamblu, aceasta este structura unit&tii de baza a colagenului, numita tropocoiagen (Fig. XIV. 1). Tropocolagenul se prezinta sub forma unui bastona§ lung (300 nm) §i subjire (1,4 nm). In fibrele de colagen moleculele de tropocoiagen sunt asociate at&t in lungime cat §i in Idjime. Pe de aM parte, fiecare molecule este deplasatS fata de cea al&turatd cu un sfert din lungimea ei (Fig. XIV. 2). In acest fe! fibra capM un aspect striat; cu zone mai clare separate de zone mai intunecate. 675 La grupele OH din hidroxilizinS aflate in unele pozi{ii aie lanfurilor a se leag& glicozidic restun constituite din glucozS §i galactozS (glucozil galactozft). AceastS. giicozilare (Fig. XIV.3) precede expulzarea din celull Coiagenul aflat in stadiu de formare intracelularS se numeric procolagen. Expulzarea lui din fibroblast are loc printr-un mecanism inc& necunoscut. In spafiul extracelular procolagenul pierde unele resturi peptidice, neimpletife, de la capStul N-terminal al lanjurilor care cuprind porjiuni cu 20 resturi de aminoacizi (telopeptide). Indepdrtarea acestor resturi de aminoacizi are loc sub acfiunea hidrolizantft a procolagen ~ peptidazei (Fig. XIV.4). Hidroxi/fzina

Ga/actoz CHZQH Hi /

Lant Fig. XIV.3 - Unirea entitajii dizaharidice cu grupul hidroxil al restului de hidroxilizina din catena polipeptidica a procolagenului

Peptide N~terminate Peptide CJterminals C~terminate Procolagen Proeolagenpept/daza T

Fig. XiV.4 - Transformarea procolagenului ?n tropocolagen 676 Dupa cum se observe in Fig. XIV.4, odatS. cu indepSrtarea ceior trei peptide N- terminale (fiecare avand masa de aproximativ 15 kD), se indep3rteaz2...§i trei peptide de ia capetele C-terminale (fiecare cu masa de aproximativ 30 kD). Regiunile C-terminale ale ceior trei lanfuri a cuprind leg&turi disulfidice intercatenare. Ulterior, moleculeie de tropocoiagen rezultate se autoasambleaza in microfibrile care se dispun paralel, fiind stabilizate prin legSturi covalente, incrucigate. Formarea legaturilor incrucigate din microfibrile necesita parcurgerea urmdtoarelor 4 categorii de procese extracelulare (Fig. XIV.5): (1)oxidarea unor resturi de lizind gi hidroxilizind la aidehideie corespunzdtoare (alizinS gi hidroxializinS) sub acfiunea enzimei numitS colagen - iizin oxidaza care este inactive faf& de aminoacizii respectivi cand se afl& in stare liberd; (2)condensarea aldehidelor formate cu resturi de lizina condudmd la

bazele Schiff corespunzStoare; (3)condensSri (aldolic5 gi crotonicii) a doua resturi de aldehidd; (4)condensarea, de tip crotonic, a aldehidei cu resturi de histidina. Datorita acestor legaturi incrucigate inter- gi intramoleculai'e, fibrileie de colagen capStd o mare rezistenfa mecanicl Este de remarcat ca odatd cu inaintarea in varsta numSrul legaturilor incrucigate create. Pe de altd parte, diversele tipuri de colagen (Tabel XIV.2) se deosebesc intre ele gi prin nunmlrul legaturilor incrucigate precum gi prin grosimea fibrelor. Astfel, colagenui de tip I este constituit din fibre mai groase care au un confinut mai redus de hidroxilizinli gi giucide. Mai multe microfibrile de colagen, vizibile numai la microscope! electronic, se asociazS, constituind fibrele de colagen, vizibile la microscopul optic. In fond, din punct de vedere al compozifiei gi structurii sale, fibrila de colagen este produsul final al unei agregSri proprii - bine cunoscute gi controlate - de aminoacizi dispugi in anumite secvenfe. Din reunirea mai multor fibrile rezuM fibra de colagen (Fig. XIV.6,) Este de remarcat ca degi biosinteza colagenului dec urge in acelagi fel in toate fesuturile (parcurgandu-se cele 10 etape menfionate anterior), microfibrilele rezultate se dispun in mod deosebit in diverse organe. Astfel, in tendoane formafiunile fibrilare (microfibrile, fibrile) sunt dispuse in m&nunchiuri paralele; in piele microfibrilele sunt orientate intr-un acelagi plan iar in cartiiaje ele sunt asociate cu proteoglicani, astfel incat nu se mai pot recunoagte microfibrilele individuale. O aM deosebire important in cazul colagenului din diverse organe sau fesuturi se refer& la diametrul microfibrilelor: el este de 150-250 A in cartiiaje, 300 A in comee, 600 A in piele gi 300-1200 A in tendoane. De asemeni, odata cu inaintarea in varsta, diametrul microfibrilelor de colagen din diverse fesuturi cregte apreciabil, putand ajunge pSnd la valoarea maxima de 2000 A. b) Colagenoliza. Colagenui izolat din diverse fesuturi se reinoiegte in perioade variabile de timp, in funcfie de organul caruia aparfine. Astfel, studiile cu izotopi radioactivi - facute pe goboiani - au dovedit ca timpul de injumatajire al colagenului din piele este de 200 zile, al celui din mugchi de 60 zile gi al celui din ficat de 30 zile. Se cunosc gi situafii in care colagenui se degradeazS gi se reinoiegte mult mai repede; spre exemplu, in involufia uterului dupa nagtere gi in vindecarea ranilor. Indiferent de ritmul de reinoire, in procesele fiziologice normale exista un echilibru foarte bine pastrat intre biosinteza colagenului gi degradarca lui. Aceasta degradare se mai numegte colagenoliza gi are loc sub acfiunea unor enzime hidrolitice numite colagenaze. Colagenazele sunt secretate de catre celulele fesutului conjunctiv sub forma inactiva, de procolagenaze. In mediul extracelular ele sunt activate gi igi exercita acfiunea hidrolitica. 677 a) Ox/darea resturi/or de //z/nd $/ hidroxi/izina • -¥// NH l CH-(CH2)_3~CH2-NHz ------------------^2 ► CH-(0H2)3 ■CHO CO CO -HH3

Ifzin -oxidaza rest de tizind rest de a/izirta (sou hidraxHizind) (sau hidraxializina] h) Condensarea unui rest de a/iz/na cu un rest de lizina: NH CH-(CH2)3 ~CH=O -h H2N~(CN2). CO. -Hz0 I NH I -CH I CO NH WH CH~(CH2)3 ~ CH = N ~ (CHZ )it - CH CQ i CO I baza SchiPF c) Condensarea crotonicd a doua rtsturi de a/izina : NH CH=0 CH-(CH2)3-CH~O + H2C-(CH2)Z CO NH ' CH*0 CH-(CHZJ3-CH=C-(CH2) 2 CO H20 ! NH ■CH bo \ hlU T’ 'CH \ CO d) Condensarea a/deh/dei nesaburate cu unrest de histidind r CH-0 . NH CH'(CH2)3~CH=C-(CHZ)2-CH + /N-HzO NH I CO CO -Hb il ■H CH2 ■CH-CO

CO CHO

NH *t * CH-(CHzj3~CH-CH~(CH2)2-CH pA -----------------N OH 2 -HN -CH-COFig. XIV.5 - Formarea legaturilor incruci§ate in colagen 678 FUhazam Procese core ou be 7n membranelB in'tracc/u/are 1

Membrana plasmabicd 2 de Scindarea peptideior de extens/e Mol ecu h iinn n/~\ r ^ Q\tb [0 OH^~ op bvpti Mo/ecu/a de co/agen [OH0 0 aHx V Asamb/are bn pssgrrg^^ microFibri/e Asomb/are Trt Fihni/e mature de co/agen ^50 n m \V*. i Fihrila de co/agen T Agregare In Fibre de co/agen

IN——1 . ..... ....^ Fihrd de caiagen Fig. XiV.6 - Schema principaleior procese inter- §i extraceiuiare implicate In formarea fibreior de colagen

='; - ^ 679

In urrna intervenpei colagenazeior, din colagen rezulta peptide cuprinzand hidroxipro- lina sau chiai hidroxiprolina libera. Hidroxiprolina nu poate fi reutilizatft pentru biosinteza de colagen, De aceea, este luata de sange (devenind un component al plasmei) §i dusS la ficat unde este degradata. O

parte din hidroxiprolina piasmatica se elimina prin urin&. Pentru motivul ca toate procesele degradative ale colagenului au ioc cu intervenpa colagenazeior iar in urtna acpunii lor se elibereazd hidroxiprolina, dozarea acestui aminoacid in plasma §i in urina are rol de diagnostic. Intradev&r, nivelul crescut al hidroxiprolinei libere in plasma sau al celei urinare este adesea un indicator prepos pentru aprecierea diverselor st&ri patologice insopte de colagenolize (hiperparatiroidism primar, unele boli osoase). Elastina Elastina este cea mai importanta protein a din fibrele elastice. Ea se afia in aorta, de unde se §i izoleaza u§or. De fapt, aorta conpne elastina in proporpi cuprinse intre 30 §i 57% din greutatea uscata. Fiind insolubiia, elastina ram&ne dupa indepartarea tuturor celorlalte componente solubile. Elastina se diferenpaza pupn de colagen prin compozipa sa in aminoacizi; nu conpne hidroxilizina §i cuprinde o proporpe foarte mica de hidroxiprolina. In schimb, conpne mai multa prolind (aproximativ 10% din totalul aminoacizilor) §i muM glicina (aproximativ 30%). De asemeni, elastina are in constitupa sa foarte mulp aminoacizi nepolari. Ca §i colagen ul, elastina este sintetizata in fibrobla§ti iar rezultatul biosintezei este, inipal, proelastina. Aceasta cuprinde majoritatea aminoacizilor caracteristici (menponap anterior) §i devine elastina propriuzis& numai dupa "secrepa" in medial extracelular. In acest mediu ea se une§te cu colagenul §i alp constituenp. Trebuie subliniat faptul c& elastina formeaza agregate de c&te doud molecule care se unesc covalent datorita resturilor de lizina constitutive. La aceste legaturi covalente participa o molecuia de lizina, ca atare, ce se condenseaza la gruparea - NH2 libera ru gruparea cabonil dintr-un rest de lizina dezaminatS oxidativ la stadiul de lizilaldehida. Procesul descris aici este.cu totul asemandtor celui care are ioc cand se stabilesc legaturile intra§i intercatenare din microfibrilele de colagen. Insd, de cele mai multe ori, in elastina se stabilesc legaturi covalente prin participarea la condensari a trei radicali de lizil-aldehida, (aparpn&nd, fiecare, c&te unui lanfpolipeptidic) §i un radical lizil - ca atare - dintr-un al patrulea. lanf polipeptidic. Compusul rezultat din aceasta condensare se nume§te desmozina (Fig. XIV.7). Un izomer al desmozinei este izodesmozina care cuprinde ligandul din pozipa 4 (a desmozinei) in pozipa 2 (Fig. XIV.8). Datorita structurii acestor doi compugi izomeri se stabilesc veritabile "punp de legatura” intre catenele polipeptidice ale elastinei, asigurandu-se totodata - §i posibilitatea de alungire sau scurtare in direcpi diferite (elasticitatea). In hidrolizatele de elastina s-a identificat §i Iizin-norleucina (Fig. XIV.8) care poate creia legaturi incruci§ate numai intre doua catene polipeptidice. Schematic, legaturile incruci§ate din elastina se pot reprezenta ca in Fig. XIV .9 iar elastina in forma contractata §i intinsd, ca in Fig. XIV.10. Este de remarcat ca in Jesuturi elastina se asociaza cu giucide §i lipide. Aceasta acumulare de lipide in fesutul elastic al arterelor coronare §i aorta constitue unul din factorii patogenici ai aterosclerozei. Ca §i colagenul, elastina este degradata prin hidroliza enzimatica. Hidroiaza corespunzStoare acestui proces se nume§te elastazB. 680

HH -CHgCHgCHz CH* C\H2 CHZ HC, *0 c. NH $ CHfCHfCHfCH ^° ^3 CH2 CH2

IA CH2 CH2 CH .HA

Fig. XIV.7 - Formarea desmozinei CO OH CH-NHS

HZH COOH /zadesmoz/na HOOC-CH~(CH2)^-m-(CHz)^~CH ~ COOH NH2 NH2 Liz/'n-nor/eucina Fig. X1V.8 - Izodesmozina §i iizin-norleucina

Fig. XIV.9 - Conexiuni fntre lanjuriie poiipeptidice ale elastinei 681 !{ = :•:

❖ Forka de kens/une

■M"- cN Re tea ^ r.nntnt ffe/axare co,ntr aetata

Malecula de elast/na. Leqore ?ncrucisata Retea expan data. Fig. XiV.10 - Eiastina in rejea contractata §i In rejea expandatS XIV. 1.2. GLIC0ZAMIN0GLICANI1 §1 PROTEOGLICANII Glicozaminogiicanii

In esenjH, gelul polizaharidic din matricea extracelularft este constituit din glicozamino- glicani. Ace§tia sunt: (1) acidul hialuronic, (2) condroitin sulfajii; (3) keratan sulfajii; (4) deramatan sulfatul; (5) heparina §i (6) heparan sulfatul. Unitrile repetitive dizaharidice din constitujia unora dintre ei sunt redate in Fig.

XIV.11 iar in Fig. XIV. 12 const! tujiile tuturor sunt prezentate rezumativ. In fig. XIV.12 structurile glicozaminoglicanilor sunt reprezentate numai din punct de vedere calitativ §i nu reflects compozijia in acid uronic a glicozaminoglicanilor hibrizi -de felul hegarinei sau dermatansulfatului - care con{in atilt acid L - iduronic cat §i acid D - glucuronic. In fig. XIV. 12 sunt redate §i Irizaharidele de leg&turS (Gal-Gal - Xyl -) pentru condroitin sulfa{i, heparinS, heparan sulfat §i dermatan sulfat (vezi proteoglicanii corespunzatori). Unele nojiuni referitoare la jshimia glicozaminoglicanilor au fost date in capitoiul consacrat studiului glucidelor. In completarea acestor cunoftinfe §i pentru a se putea infelege mai bine rolurile glicozaminoglicanilor, se fac §i preciz&rile din capitoiul de fa{&. Organizarea supramolecularci a glicozaminoglicanilor din matricea extracelularci. Studiile de microscopic electronic^ §i de rezonanjd magnetic^ nucleard efectuate asupra glicozaminoglicanilor - at&t in vitro cat §i in vivo au dovedit existenja structurilor secundarft §i teifkurS la ace§ti compu§i. IntradevSr, experience in vitro au arfitat eft glicozaminogiicanii formeazft agregate moleculare. Stabilitatea relative a acestor agregate depinde de echilibrul care exists (sau nu) intre tendinja legdturilor de hidrogen de a uni lanfurilejungi polizaharidice intre de §i repulsia electrostatic^ dintre sarcinile polianionice constitutive. In agregate, glicozaminogiicanii - cu structura prim aril corespunz&toare lanfurilor polizaharidice caracteristice - au §i o a§ezare spn{ial& ordonatft, determinatft de structurile lor secondary §i terjiarft, Structura seeundarft a glicozaminoglicanilor corespunde, pentru fiecare in parte, cate unei eliee dubie (dublu helix). Astfel, in Fig. XIV. 13 sunt prezentate structurile secondare - de dice dubie - pentru condroitin-6-sulfat $i keratansulfat. 682

2 C02H

X 3.

X 4.

CH.QH

CHsOSOsH

Fig. XIV.11 - Unit§Jiie repetitive dizaharidice din constitute glicozaminoglicanilor 1. acid hiaiuronic, 2. condroi?in~4 sulfat, 3. dermatan sulfat, 4. condroitin-6sulfat, 5. keratan sulfat H\

683 'S' s ACID HiALURGNIC CONDROIT1N SULFATi » KERMAN SULFAT! I SI K : HEPARiNA Si HEPARAN SULFAT % DERMATAN SULFAT ^GLcUK ^-GlcNAc^ GlcUA ^UGLCNAC^L GlcUA GalNAc GLcUA Gal ^^GalXyl -£-* Sen I A-SMI 6-SULFAT GlcNAc^+GaL i2iA»-acNAo Gal ^J^‘/rGlcNAc-^-*A&n (KERATAN SULFATi) '"4? B-SULFAT 6-SULFA.T ^GalNAc^Thn(Ser)CKE!UTA« SULFATi) Gat-Meu Ac 6-SULFAT. liUA^-GlcN ^^GlcUA^GLcNAc^^GlcUA GalGalXyl -^Sen I I 2-SULFAT SG3“SAU Ac idUA ^GaLHAc-^^ GlcUA ^GalNAc ^^GlcUA^^Gal^Gal^^Xyl^->Ser II 2-5ULFAT i*-SULFAT Fig. XIV.12 - Structura chimica a glicozaminoglicanilor §l proteoglicaniior. GlcUA - acid glucuronic, IdUA = acid iduronic, GlcN = D-glucozamina, GalN = D-galactozamina, Ac = acetil, , Gal = D-galactoza, Xyl = xiloza, Ser ^ Lserina, Thr = treonina, Asn = L-asparagina, Man = D-manoza, NeuAc = acid N-acetilneuraminic

Fig. XIV.13 - Unitajile dizaharidice repetitive (l,II), structurile primara §i secundara ale condroitin-6-sulfatului (111) §i keratan sulfatuiui (IV). Regiunile anionice (@) sunt reprezentate de gruparile ester suifat §i carboxiL Ele sunt a§ezate in poziiii echivalente la cele doua elice. Regiunile hidrofobe (ha§urate) sunt §i ele a§ezate Tn pozljii echivalente la ceie doua elice. :VU! , vA AC i n, !?]■: ?t 1 ■ ?!i: H !. Vi i: !i ; ’V i-Vf V Structurile secundare ale celorlalfi glicozaminoglicani diferS - de cele

prezentate in Fig, XIV.13 - in felul urmStor: Acidul hialuronic nefiind sulfatat §i avand GlcNAc in loc- de GalNAc se deosebegte de slructura condroitin-6suIfatuiui prin stabilirea unei legSturi de hidrogen suplementare intre OH de la C4 al GlcNAc §i oxigenui din ciclul acidului glucuronic. DatoritS orientSrii spafiale a Iiganzilor anionici din unitSjile repetitive proprii, la condroitin-4suIfat §i la dermatan sulfat grupftrile polare sunt mai concentrate cStre linia de centra a elicei respective decat in slructura secundarS a condroitin-6sulfatului. Structura ter(iar$ a glicozaminoglicanilor a fost evidential# §i ea - mai intai - in vitro. Experience speciaJe fScute in aceastS direcjie au arStat cS acidul hialuronic formeazS rejeie de fibrile groase care - in anumite condifii "se destramS" in filament© foarte fine. Acelea§i rejeie de filamente s-au gSsit §i la acidul hialuronic nativ constatandu-se, totodatS, cS acesta are tending sS formeze agregate reticulate chiar cand matricea extracelularS il confine in cantitSji foarte mid. Condroitin sulfajii se comports diferittn cazul form&ii de agregate ordonate, ca rejeie. Astfel, condroitin-6-sulfatul avand grupSrile sulfat (sarcinile anionice) in exteriorul catenei polizaharidice poate forma rejeie. In schimb, deoarece la condroitin-4-sulfat grupSrile anionice sunt orientate spre linia de centra a elicei corespunzStoare (vezi explicable date la stractura sa secundarS), se exercitS o repulsie electrostatics apreciabilS intre ele §i - ca urmare - acest glicozaminoglican nu formeazS rejeie §i - bineinjeles - nici agregate. Keratansulfajii formeazS agregate reticulare. Cele de keratan monosulfat sunt mult mai stabile decat agregatele de keratan polisulfat (cu grupSri anionice sulfat la toate pozijiile posibile de esterificat in unitatea sa repetitivS). Dermatan sulfatul formeazS agregate ordonate, mari (cu mai mult de 10 catene asocial©). A§a cum au arStat experienfeie efec- tuate in vitro, aceste agregate se stabilesc §i se disociazS in funcfie de concentrafia salinS a mediului ambiant. Este interesant faptul cS spre deosebire de glicozaminoglicanii menjionali anterior, dermatan sulfatul poate fonna copolimer (duplex) cu condroitin-4-suifatul. Agregatele in care elicele duble cuprind, fiecare, doi glicozaminoglicani diferiji se numesc heteroagregate. In aceastS categorie intrS §i cele constitute din copolimerul dermatan sulfat - condroitin-4-sulfat In mod asemSnStor, agregatele formate din helixuri duble in care cele douS catene polizaharidice confin acela§ fel de glicozaminoglican se numesc hom.oagre.gaie. Indiferent dacS sunt homo- sau heteroagregate, toate prezintS tendinfa de a se desvolta (de a "create"), m3rindu-li-se stabilitatea. Agregarea glicozaminglicanilor prezintS o deosebitS important biologies. Intr-adev&r, odatS formate agregatele se atageazS la anumite proteine rezultand proteoglicanii respectivi (vezi mai depart©, biosinteza proteoglicanii or). Ulterior, ace§tia se fixeazS la unele proteine tisulare; spre exemplu, la fibrele de colagen. Cum insS fiecare fesut i§i me proprii sSi constituenji proteici, caracteristici, rezultS cS in organism tntreg procesui. in c:tre este implicatS agregtirea glicozaminoglicanilor depinde §i rSmane coordonat de natura fesuturiior. Ca urmare, acestea dobandesc proprietSji specifics. Astfel, in cornee, ordonarea. precise a agregatelor de glicozaminoglicani prinlre fibrele de colagen constitutiv asiguiS transparenfa;

Tnsugire esenfialS pentru funejia vitalS a vederii. In agregatele de la nivelul corneii au fost evidenfiate heteroduplexuri foarte stabile constitute din condroitin sulfat §i keratan sulfat. 686 Localizarea giieozamingliccmilor rolurile lor, Localizarea glicozamingiicanilor este multiple §i variatS, in funcjie de rolurile pe care ei (sau proteoglicanii GerespunzStori) le indeplinesc in diverse organe. In cele ce urmeazd se fac precizMle necesaxe atkt referitoare. Ia localizare cat §i cu privixe la unele roluri. Acidul hialuronic se afld in Jesuturi embrionare, cordon oinbilical, lichid sinovial, corp vitros, piele, tendoane. De asemeni, ei a fost identificat §i in jesutul conjunctiv degradat. Acidul hialuronic contribuie la menjinerea turgescenjei matricei extraceiulare §i datoritS structurii sale, terjiare, reticulate, inlesne§te anumite migr&ri - celulare sau subcelulare - in cursul morfogenezei precum §i in perioadele de vindecare a r&nilor. Condroitin sulfajii sunt localizafi in pieie, cornee, tendoane, cartilaje §i in regiunile de caicifiere a oaselor. In aceste regiuni ei confedl o structural endoscheleticd foarte utilM in menjinerea forme! oaselor respective, Keratan sulfajii se gSsesc in cornee, cartilaje (mai ales in cartilajul costal) §i in oase. La nivelul corneii, keratan suifatul I §i dermatan sulfatul prezintS a§a- cum s-a mai menfionat - o dispunere regulahl printre fibreie de colagen §i implinesc astfel rolul decisiv in asigurarea transparenjei corneii, inlesnind vederea. Dermatan sulfatul este localizat in piele, tendoane, valvele cardiace, aorta, sclent Prezenfa dermatan sulfatuiui in sclerft este considerate utile pentru menjinerea formei ovoide a ochiului. Heparina se afie, in special, in plMmani, ficat, piele, mastocite. Heparina este un anticoagulant puternic. Acest rol il implinegte atSt prin fixarea factorilor de coagulare IX §i XI, cdt §i prin acjiunea sa asupra antitrombinei III din plasrmt lntr~adevftr, s-a constatat ce unirea in proporjie 1:1a heparinei cu antitrombina III accelereaze mult capacitatea acestei proteine plasmatice de a inactiva proteazele serice; in special, trombina. Este de remarcat eft heparina se poate uni - in mod specific - §i cu protein lipaza aflate in perejii capilarelor, determinand astfel eliberarea acestei enzime in circulafia sangvinft. Heparan sulfatul se gftse§te in fibroblasteie pielei, pereteie aortei, sinapse, membrana bazaie din rinichi. La acest nivel renal, heparan sulfatul joace un roi important in determinarea filtrftrii glomerulare. Alte aspecte privitoare la rolurile heparan sulfatului sunt relevate, mai departs, la proteoglicanii cared conjin. Proteoglicanii In organising eucariotelor proteoglicanii sunt produ§i de majoritatea celulelor §i reprezintS principalii component ai matriceior peri - §i extraceiulare. La nivelul acestora proteoglicanii implinesc funcjii multiple, acjionfmd ca atare sau in asociere cu alji compugi structural! important (colagen, elastinft, fibronectinft, lamininft). Datoritft unor asemenea interacjiuni, proteoglicanii sunt considers# ca cei mai determinanji factori de organizare ai matricei extraceiulare. 687

.! ; i:V ■P ii.lL! Din punct de vedere constitutional, preteoglicanii con{in elite o proteins centrals (miezul proteic) pe care sunt fixate foarte numeroase catene de glicozaminoglicani. (Fig. XIV. 14).

In majoritatea cazurilor, numSrul lanfurilor poliglicanice fixate pe miezul proteic variazS intre 2 §i 60, in funefie de num&rul resturilor de hidroxiaminoacizi din catena polipeptidicS respective Intr-adevSr, la nivelul unor asemenea hidroxiaminoacizi se fixeazS, prin legSturi O-glicozidice, trizaharidele (Xyl-Gal-Gal) care atageazS - In fiecare proteoglican - in proteina centrals glicozaminoglicanii corespunzStori (Fig. XIV 15). InsS, a§a cum se observS §i in Fig. XIV 15, atagarea glicozaminoglicanilor se poate face §i prin NdegSturS la resturi de acid aspartic (sau asparaginfi) din catena polipeptidicS. Tot din Fig. XIV, 15 reiese cS pentru keratan sulfat exists ambele modalitSfi de iegSturS la proteina centraiS: legSturS O-glicozidicS (identificatSin cartilaje) §i N-Ieg&turS (evidenfiatS in cornee). Pe de altS parte, preteoglicanii diferS intre ei prin lungimea lanfurilor glicanice precum §i prin gradul lor de sulfatare. DatoritS acestui fapt, proprietSfile proteoglicanilor variazS in funefie de natura catenelor sulfatate. Cu alte cuvinte, fiecare catenS sulfatatS - intr-o anume mSsurS §i cu o secvenjS bine determinatS a grupSrilor suifat - are propriet&Ji specifice §i indeplinegte funct'ii caracteristice. Trebuie insS remarcat cS structura proteoglicanilor este susceptibilS de modificSri apreciabiie. Totdeauna, aceste modificSri sunt in raport direct cu rolurile bioiogice care trebuie impiinite. Jinandu-se seam a de faptui cS glicozaminoglicanii care intrS in constitujia proteoglica- nilor au fost descri§i anterior atSt din punct de vedere al compozifiei lor chimice cat §i al funefiilor bioiogice, in cele ce urmeazS se vor releva numai unele aspecte - foarte noi - referitoare la structura §i rolurile proteoglicanilor. Componenta. prate ted (centrala ) Condroit/n - sulfat

Legaturi Fig. XIV.14 — Schema dispunerii ianjurltor de condroitin sulfat pe componenta proteicS intr-un proteoglican care confine acest glicozaminogiicaru 688 CONDROlTiN SUL FAT DERMATAN SUL FAT HEPARAN SULFAT (sFi)- 0- Xy t-Gal-Gal- GleA (SER~)-QG&LNAc ^ GlcNAc-Gal— KELRATAN SULFAT \

Gs,t" S A ASP/W-GicNAc-GlcNAc-Man / \ Man-GLcNAc— KERMAN SULFAT Man -GlcNAc - KERATAN SULFAT Fig. XIV. 15 - Legaturife glicozaminoglicanilor constitutivi cu miezui proteic in diver§i proteoglicani # I) Proteoglicani cu roi in organizarea matricei extraceiulare a) Agrecanul Ce! mai reprezentativ proteoglican din aceasfd categoric §i - totodatd - cel mai bine cunoscut este agrecanul. De fapt, agrecanul este numele generic dat intregei categorii de proteoglicani fiind constituit dintr-un num&r enorm de agregate multimoieculare care conjin - la randul lor - foarte mulji monomeri proteoglicanici, fixup necovalent la hialuronan (echivalentul proteoglicanic al acidului hialuronic). in Fig. XIV. 16 este prezentatd structura unui singur agregat de proteoglicani iar in Fig. XIV 17 sunt ar&tate (§i explicate) interacjiile care au loc la formarea unui agrecan. Agrecanul se aflS, in special, in cartilaje; de unde a fost izolat §i analizat. S-a stabilit astfel c& agrecanul izolat din cartilaje - aflate in organismul omului §i al cainelui - are on miez proteic cu greutatea molecular*! cuprinsii intre 225 §i 250 kD. De asemeni, prin analize multiple s-a ajuns sil se cunoa$c& §i secvenjele de aminoacizi din acest miez proteic. Pe de altd parte, s-a constatat c& aproape 90% din masa unui agrecan este de naturS glucidicd, formats - in majoritate - din catene de condroitin sulfaji dar include §i catene de keratan sulfat precum §i oligozaharide de legSturS (cu O - sau NlegSturS). Catenele de condroitin sulfat sunt fixate la dipeptjde care cuprind secvenfe Ser - Gly §i se afl& in regiunea central*! a miezului proteic. A ■Nv;' i ■ ■ :;:j v 689

ACID HI ALU RON 1C PROTEINA DE IEGATURA KERMAN 5ULFM CONDROITIN SUL FAT MIE2UL PROTEIC SUBUNIT ATI Fig. XIV. 16 - Reprezentarea schematic^ a unui agregat de prpteoglicani Principala funcfie biological a agrecanului const# in distribuirea sarcinilor la nivelul joncfiunilor care sunt supuse la greutdji apreciahile. b) ProteogUcani boga(i tn leucina in fesutul conjunctiv din diverse organe s-a constatat c& sunt distribuiji cu precadere - trei proteoglicani cu greutate molecular# mic# §i la care componenta proteic# respectiv# este bogat# in leucin#. Acegti proteoglicani sunt; biglicanuf, decorina gi fibromodulina. Bigiicanul gi decorina confin, fiecare, una sau dou# catene de condroitin sulfat sau dermatan sulfat fixate la capital N-terminal (~NH2) al proteinei centrale. Fibromodulina cuprinde mai muite catene de keratan sulfat, fixate prin N-legStur#, la regiunea centrals a miezului proteic, bogat# in resturi de leucin# (Fig. XIV. 18). La decorin# gi biglican proteinele lor centrale conjin cate 12 unitdfi repetitive, dispuse consecutiv gi constituite din 24 resturi de aminoacizi. Printre acegtia se gSsesc muite resturi de leucin#, plasate tn pozifii fixe. Secvenfele homoloage din fibromodulina confin 10 unitaji repetitive formate din 23 aminoacizi. Pe de altS parte, la acegti trei proteoglicani aminoacizii terminal! ai miezului proteic sunt diferiji, De aceea, gi^ legSturile glicozaminoglicanilor cu lanful polipeptidic se deosebesc in aceste regiuni extreme. Intr-adevdr, la decorind gi biglican atagarea calenelor glicanice respective se face prin O-leg #tur# deoarece lanfurile polipeptidice au la extreme hidroxiaminoacizi. In schimb, la fibromodulina nu

690 exists aceastB situajie §i de aceea catenele de kcraian sulfat se unesc prin NAegdturfg la regjunea central?! - bogatd in ieucind - a miezului proteic. In ceea ce privegte rolurile biologice ale proteoglicanilor bogafi in leucinft se constats unele asenuinM §i deosebiri, Astfel, deeorina §i fibromodulina sunt considerate ca avand funcjii decisive in organizarea matricei extracelulare pentru molivul ek fixarea lor pe colagenul de lip I §i II determine intarzierea formarii fibrilelor §i a fibrelor. subfiri ale aeestei proteine. Este de remarcat c3 fixarea fibromodulinei pe colagenul din conslitufia corneii se face diferit de modul de fixare al decorinei. Biglicanul nu are capacitatea. de a se fixa pe colagen §i - de aceea. - se consider^. cS intervenjia sa in organizarea matricei extracelulare..nu se exercild la nivelul asamblftrii fibrelor de colagen. In schimb, biglicanul se acumuieazd la suprafafa §i in preajma celulelor fiind implicat in morfogene- zd §i diferenjiere celulanl

Fig. XIV. 17 - lnterac|ii!e implicate Tn alcatuirea unui agrecan. . Domeniul G} al agrecahului reprezinta o regiune de legatura la hialuronan. Acest domeniu confine o imunoglobina (A) urmata de proteoglican repetat (buclele B §\ B’). Un aranjament similar - dar proteic in totaiitate - se reg&se§te in proteina de legatura (L.P.), Ambele formafiuni, domeniul G, §i proteina de legatura, se fixeaza la o unitate dizaharidica, repetata (HA1(?) din hialuronan. Se remarca in figura §i unirea domeniului G, cu proteina de legatura (L.P.) prin interac{iunea existenta Tiitre bucieie imunoglobuiinelor respective. Domeniul G2 al agrecanului confine §i el bucie repetate de proteoglican dar acestea nu au proprietatea de a se uni cu hialuronanui. Fiecare agregat confine o singura catena de hialuronan (cu greutatea molecuiara 0,5-1*10* D) are atagate circa 100 agrecam §i molecule proteice de iegatura (masa totals “200*106 D).

i: 691 MiE2 PROTEIC BOGAT IN LEUC1NA ini :U ’-I

:?•' r ? i ; i' •; j'/\ BiGUCAN DECORINA FIBROMODULINA . ........ 1 ' - n \< v ^ CATENE DE ^ CS/DS Y

CATENE DE KS ^ VVV ■* - 1 * ‘ < < Fig. XIV. 18 - Structuriie asemanatoare §i comparabiie ale proteoglicanilor bogaji In leucina: biglicanul, decorina §i fibromodulina CS - condrotinsulfat, DS= dermatan sulfat, KS = keratan sulfat c) Tipul (X de colagen privit ca punte de legdturd tntre proteine §i proteoglicanii din matricea extracelulara Colagenul de tip IX face legfttura §i apropie tntre ele categoria proteicft a colagenilor de cea a proteoglicanilor. Intr-adevSr, colagenul de tipul IX este, in fond, un proteoglican heterogen care confine catene oc^IX), a2(IX), a3(IX) cu 70% condroitin sulfat fixat pe catena a2(IXj. In cartilaje acest proteoglican este localizat la suprafafa fibrilelor, formand legftturi incroci§ate cu colagenul de tip II. Catena sa de condroitin sulfat (cu greutate molecularft ~ 40 kD) este ata§atft la un rest de serinft cai'e face parte dintr-o secvenfft de 5 aminoa- cizi, Val - Glu - Giy - Ser - Ala (Asp), din catena a2 (IX). Colagenul de tip IX se aflft §i. in corpul vitros al ochiului dar diferft de cel care se gftse§te in cartilaje atat prin structura primary a componentei proteice cat §i prin componenta glicarticft. De asemeni, catena proteicft central# a colagenului de tip IX din corpul vitros este mai scurtft dealt a celui din cartilaje iar condroitin sulfatul corespunzfttor are o mas5 molecularft de aproximativ 350 kD; deci de cca 10 ori mai mare decat la colagenul IX din cartilaje. Studiile de microscopie electronic^ au relevat faptul eft fibrilele de colagen din coipul vitros sunt mult mai ata^ate de glicozaminoglicani decat in cartilaje. A§a cum s-a mai menfionat, o asemenea dispunere spafialft se considerft a fi absolut necesarft pentru optimizarea tnmsmisiei luminii prin matrice §i pentru pftstrarea structurii globulare a ochiului. 692 IL Proteoglicani m rol Sa suprafaja celulara a) Sindecanul Sindecanul reprezinta o familie de proteoglicani aflaji la suprafaja poiimorfa celulara. Ei confin catene glicanice de heparan sulfat san de condroitin sulfat. Ca structure, la sindecan se poate observa: (1) un dome'niu restarts citoplasmatic, cuprinzand capdtul C- terminal de la catena polipeptidica respective, (2) o regiune transmembranartt, confinand - in continuare - o porfiune din miezul proteic §i (3) ectodomeniul care este regiunea mare (25 kD) aflatS de cealaM parte a membranei §i care cuprinde tot restul miezului proteic impreun& cu catenele de gficozaminoglicani (condroitin sulfat sau heparan sulfat) fixate pe el (Fig. XIV. 19). Este de remarcat ca familia proteoglicanica de sindecan poate avea mai multe forme proteice dar pastreaza neschimbate structurile domeniiior transmembranar §i citoplasmatic. Imediat in afara membranei, pe catena polipeptidica a sindecanului se distinge (Fig. XIV. 19) o dipeptida caracteristica. Aceasta este foarte sensibiia la acjiunea proteazica. In fig. XIV.

19, la Structura sindecanului se poate observa ca in regiunea citoplasmaticS a lanpilui polipeptidic se afld trei resturi de tirqzina. Ele prezinta interes deosebit deoarece pot deveni veritabiie substrate de fosforilare sub acjiunea kinazelor proteice. Or, se §tie ca acestea sunt enzime-cheie m numeroase cSi de transrnitere a semnalelor. De asemeni, regiunea din citosol a sindecanului cuprinzand resturile de tirozM reprezinta, totodata, §i domeniul in care se pot stabili legaturi incruci§ate cu diverse elemente citoscheletice. Insa, in sindecan au loc adesea permutM intre polimerii glicanici cu condroitin sulfat §i cei cu heparan sulfat. Acest fapt dovede§te cd la sindecan se pot fixa diver§i liganzi extraceluiari. Dai' fixarea de molecule matriceale la suprafaja celulara poate informa celulele respective de compozifie fizico-chimica a mediului inconjurator, Pentru acest motiv, se considera ca piincipaia funcjie biologic# a sindecanului este cea de receptor cu roi imediat in transmiterea semnalelor. SINDECAN TROMBOMODULINA CITOSOL MEMBRAN

TIRQZINE Fig. XiV. 19 - Proteogiicanii de la suprafaja celulara: sindecanul §i trombomoduiina. 693 h) Trombomoduiina Trombomoduiina se poate alia at at in forms de proteogiican cal §i ca neproteoglican. Cand s-a indentificat forma sa de proteogiican, i s-au studiat proprietajile biologiee ale ambelor componente: proteins §i glicozaminoglican. S-a consialat cS partea sa proteicS este o glicoproteinS membranani a endoteliului vascular avand greutate molecuiarS 57 kD §i o acti.vitate cvasi - anticoagulants (pe trei sferturi anticoagulants). Intr-adevSr, trombomoduiina inhibS coagularea determinatS de fibrinogen - sub inducerea Irombinei. De fapt, ea promoveazS inactivarea Irombinei de cStre antitrombinS §i dupS. fixare, activeazS forma zimogenicS a proteinei C anticoagulante. Din punct de vedere structural, la trombomodulinS se disting mai multe domenii traversate de miezul proteic care are capStul N-terminal in extremitatea superioarS iar capStul C-terminal in citosol (Fig. XIV 19). La nivelul miezului proteic se distinge o regiune cu 6 unitSji repetitive, urmatS de o porjkme scurtS (cuprinzand muM serinS/tre- oninS) la care este alasatScomponenca glicozaminoglicanicS. In continuare, coborand spre

capStul din citosol se aflS o regiune iransmembranarS §i apoi "coada" cu Cterminal Dupa cum se remarcS in Fig. XIV. 19, trombomoduiina coniine o singurS cat,end glicanicS - formats din condroitin sulfat. Acesta este mult sulfatat iar catena sa se terminS cu o trizaharidS sulfatalS avand secven{a: Gal N Ac (S04)C- Glc A - Gal N Ac (S04)2. Activitatea anticoagulants a trombomodulinei este atribuitS - in cea mai mfire mSsurS - componetuei sale proteice gi pare cS n-ar depinde de multiplele suhstitujii cu sulfat din condroitin sulfaful respectiv. Tofusl s-a doveditcS forma de proteogiican a trombomodulinei are -o capacitate mai mare de reglare a coagulSrii sangelui. Aceasta denofS cS porpunea glicozaminoglicanicS potenfeazS activitatea ei anticoagulants. O remarcS de ordin general, desprinsS din cereetfiri recente referitoare la activilatetS biologicS a proteoglicanilor -este aceea cS ei - atat cei difuzaji in matricea extracelularS cal §i cei de la suprafafa celulelor pot conslitui adesea puncle sau regiuni de fixare tisularS a factorilor de cre§tere. Prin aceasta, mul(i proteoglicani devin capabili sS moduleze §i activitatea factorilor de credere. Funcfiile biologiee ale proteoglicanilor giicozaminoglicanilor La descrierea proteoglicanilor §i glicozaminoglicanilor care intrS in constitufia matricei extracelulare s-au menjionat §i funefiile implinite de fiecare in parte. Totu§i, pentru a se putea creia o vedere de ansamblu asupm aceslor funclii, de sunt rezumate in labclul XIV. 3.. Tabelul XIV. 3. Prlncipalele funepi biologiee ale proteoglicanilor §i glicozaniinogticanilor - Sunt c-omponente structural in matricea extracelulara. - Interacjioneaza specific cu colagenul, elastina, fi.bronecti.na, laminina §1 alte proteine din maliice. - Datorita compozijiei lor pol.ianionice leaga cationi. - Contribue la turgescen|a caracteristica a unor {esuturi. - joaca rol de "site" in matricea extracelulara. - Inlesnesc migrarea celularS (in special, acidul hialuronic). - Permit compresibiiitatea cartilajelor (acidul hialuronic §i controitin snlfajii). - Asigura transparenfa conieala (keratan sulfatul I p dermatan sulfatul). - Joaca rolul de component structural in sclera (dermatan sulfatul). - An ticoag ul a n t (heparin a). - Sunt componente ale membranelor plasmatice, la nivelul carora pot acliona ca receptori §i particlpa. la adeziunea celularS precum §i la interacjiile celula - cel.ula (in special, heparan sulfatul), - Determine schimbud selective la nivelul glomerulului renal (heparan sulfatul). Asocien intre unele foiicfil ale proteogiicunilor sau glicozaminoglicanilor constitutivi §i anumite boli S-a menfionat anterior di acidui hialuronic inlesnegte migrarea celuiarft. Da tori til acestei capacit&Ji, el poate permite §i migrarea. celuleior tumoraie prin matricea ex trace! ulanl Insft, la randul lor, celulele tumoraie posedft. capacitatea de a induce sinteza de efttre fibroblajti a unor canlitSji sporite de acid hialuronic. Se infelege deci eft In acest fei este mult uguratft propria desvoltare a celuleior tumoraie. Aga cum s-a specificat mai inainte, heparan sulfatul funcjioneazft ca

receptor participftnd atat la adeziunea celuiarft cat. §i la interacfiile celulft celulft. -Insft, celulele tumoraie refin la suprafata lor numai eantitftp foarte reduse de heparan sulfaL Acest. fapt contribue - fftrft indoialft - la pierderea capacit^Jii lor de aderare. Biosinteza §i degradarea proteoglicanilor I) Biosinteza proteoglicanilor. Acest. proces implied : (a)sinteza proteinei centrale (miezului proteic), (b) formarea trizaharidei de legftturft §i atagarea la miezul proteic, (c) sinteza §i lungirea catenelor oligozaharidice de glicozaminoglicarii, (d) incheierca (tenninarea) acestor catene. a) Sinteza miezului proteic are loc in reticulul ehdoplasmatic din aminoacizi specific!. Este de remarcat faptul eft in afarft de aminoacizi! participant! la formarea miezului proteic, alj'i aminoacizi suferft dezaminftri gi astfel devin donatori de grupe.-NH2 necesare biosintezei de aminozaharuri participate la formarea glicozaminoglicanilor constitutivi. Cu alte cuvinte, aminoacizii servesc atat la biosinteza componentei proteice cat §i la biosinteza componentei glucidice a proteoglicanilor. b) Formarea trizaharidei de legftturft §i ataprea la miezul proteic sunt procese care au loc tot; in reticulul endoplasmatic §1 decurg in ordinea urmfttoare: Inifial se stabile§te o legftturft O-giscozidicft intre xilozft (Xyl) §i on rest de serinft din lanj.ul poiipeptidic a! proteinei centrale. Procesul are loc in urma transferului xilozei din UDP-xilozft la serinft. Ulterior, la restul de xilozft se atapazft un prim rest de galaetozft(Gal) cu care se une§te glicozidic §i apoi aceasta din urmft ata§eazft - tot prin legftturft glicozidicft - un al doilea rest de galactozft. Se constitue astfel trizaharida de legftturft Xyl - Gal - Gal. In proteoglicanui cu keratan sulfat II legfttura O-glicozidicft se stabilegte intre serinft (sau traoninft) din ianjul poiipeptidic §i galaetoza - N ~ acetilatft, transfemtftde iaUDP-Gal-NAc. Ata§area la miezul proteic se poate reaiiza §i prin stabilirea unei legftturi N- glicozaminice intre N-acetilgSucozft (din lanful ol'igozaharidic) §i N~amidic al unui rest de asparaginft din lanful poiipeptidic; ca in glicoproteinele cu Nlegfttuil c) Sinteza §i lungirea catenelor oligozaharidice sunt procese care se desfft§oarft in aparatul Golgi. Resturiie glucidice din aceste catene sunt procurate prin transfer din nucleotidele corespunzfttoare (UDP-glucid), sub acfiunea glicozil transferazeLor specifice fieeftrui rest de glucid. Lungirea lanfului se face ireptatincepand de la restul de gaiactozft terminal al trizaharidei de legftturft (Fig. XIV. 20). Sistemele enzimatice implicate in lungirea catenei oligozaharidice sunt in mftsurft sft reprodueft fide! complexele glicozaminoglicanilor, acjionand totdeauna conform principiului ”o enzimft, o legftturft".. , 695

■i ■ ii;:: ?Sj

u: m ] M U m i,;-;

® SulPotransferaza Fig. XIV. 20 - Biosinteza ianfului oiigozaharidic al condroitin-4-sulfatuiui din proteoglicanul corespunzator d) Terminarea catenelor oligozaharidice implied douft procese: (1) progresarea cregterii catenei glicozaminoglicaniior in afara regiunii membranare §i (2) sulfalarea la anumite pozijii ale unora din resturiie glucidice constituente. Enzimele care cataiizeazft introducerea. grupelor sulfat sunt diverse sulfotransferaze care folosesc, ca donor de aceste grupe, sulfatul activ de la 3 - fosfoadenozin-5-fosfosulfat (PAPS). Exists sulfotransferaze specifice pentru fiecare din pozifiile 02, 3, 4, 6 ale resturilcr glucidice acceptoare. Dupd formarea catenei glicozaminoglicaniior, la unii din ei se fac modificSri steri.ee sub acfiunea epimerazei care catalizeazS trecerea anumitor resturi de acid D-glucuronic (D-glucuronil) din catenS in resturi de acid L-iduronic (L-iduronil). Biosinteza proteoglicanilor se aflS sub direct reglaj hormonal. In special, insulina §i glucocorticoizii intervin in biosinteza componentelor glucidice ale divergilor proteoglicani. Astfel, insulina favorizeazd biosinteza acidului hialuronic §i a condroitin sulfafilor. Acest fapt expiicd de ce ia diabelici este mai mare pericolul infeetdrii cu bacterii a fesutului conjunctiv din tegumente sau din diverse aite organe. Cortizonul inhibd biosinteza

glicozaminoglicaniior componenfi, ceea ce expiicd acfiunea defavorizantd a acestui hormon in procesul de vindecare a rdnilor. II) Degradarea proteoglicanilor. In majoritatea fesuturilor s-a remarcat o degradare relativ rapidd a proteoglicanilor. Spre exemplu, in rinichi timpul de injumdtdfire al glicozaminoglicaniior componenfi este de 3-8 zile. 696 Degradarea proteoglicanilor incepe sub acjiunea proteoglicanazei. Aceasta este o metaloenzimS, bine cunoscutii, cu greutatea molecular^ de cca 24,5 kD p cu pH optim de activitate cuprins intr-un domeniu mare (pH: 59). De asemeni, proteoglicanaza are gi o specificitate iarga deoarece catalizeazS hidroliza leg&turilor dintre condroitin suifaji §1 proteinele centrale respective, in multe organe §1 in numerogi proteoglicanl Pe de altS. parte, proteoglicanaza are §1 capacitatea de a indepSrta peptidele de extensie din procoiagen, precum gi de a degrada fibronectina. Dup5 intervenjia preteoglicanazei, degradarea proleoglicanilor este continuatS sub acjiunea unor hidrolaze lizozomale (exo gi endoglicozidaze) iar leg&turile ester-sulfurice sunt hidrolizate de cittre sulfataze. Dintre glicozidaze, mai bine cunoscute - prin acjiunea gi specificitatea lor - sunt urmtttoarele: 1) P - glucuronidaza care este o exoglicozidazft gi hidrolizeazS legStura P glicozidicii a acidului glucuronic (sau iduronic) aflat la capetele nereduc&toare ale lanJunior polizaharidice. Suhstratele care cuprind acegti acizi uronici gi asupra cSrora acjioneazft P - glucuronidaza sunt: dermatan sulfatul, heparan sulfatul, condroitin sulfajii gx acidul hialuronic; 2) a - L - iduronidaza este o exoglicozidazS care indepSrteazi hidrolitic resturi de acid iduronic ce se gfeesc la capetele nereducStoare ale lanjurilor polizaharidice; 3) P - D - acetil - hexozaminidaza este o exoglicozidazS care hidroiizeaz£ leg&turile P - glicozidice ale N-acetilglucozei gi N-acetilgalactozei prezente la capetele nereducS- toare ale glicozaminogiicanilor. Suhstratele utilizate sunt: condroitin sulfajii, acidul hialuronic, dermatan sulfatul gi keratan sulfajii (I gi II); 4) p - gaiactozidazele sunt exoglicozidaze gi exists sub mai multe forme in jesuturile animate. Ele au specificitate mare fajft de keratan.suifaji deoarece acegtia cuprind multe legfituri P - galactozidice. Ins3 aceleagi p galactozidaze acide admit ca substrat gi condroitin sulfajii; 5) aril-sulfatazele hidrolizeazfi legSturile grupfirilor sulfat din condroitin suifaji, keratan sulfat gi dermatan sulfat. Ele prezinte specificitate in raport cu locul ocupat. de gruparea sulfat in N -acelilglucozaminii sau in Nacetilgalactozamim't; 6) iduronat sulfataza este o exoeiizimft specified ce cliveazS sulfatul de la C2 dintr-un rest de acid iduronic aflat la cap&tul nereducStor al heparinei, heparan sulfatului gi dermatan sulfatului. In fig. XIV. 21 este prezentatS schematic degradarea proteoglicanilor, fiind menjionate gi enzimele care hidrolizeazft trizaharidele de leg&turS dintre glicozaminglicani gi miezul proteic precum gi polipeptidazele care scindeazii lanjurile polipeptidice respective. Este de remarcat cS in cazul proteoglicanilor exists mi echilibru dinamic menjinut permanent intre biosintez3 gi degradare. Tulburarea echiiibrului

conduce la diverse shlri patologice, prezentate mai departe (ultimul subcapitol). 697 POUPEPT/DAZb 'T ' I' Prottina^Serind^PrGieirid^Smnd^Prvteina

Fig, XiV. 21 - Degradarea proteoglicaniior XIV. 2. ROLUL MATRICEI EXTRACELULARE iN CURSUL MORFOGENEZEI Matricea extraceiularS are un rol foarte important In cursui morfogenezei. Cercetftrile fftcute in acest domeniu au arStat c& mui{i constituent ai matricei extraceluiare controleazS fiecare etapIS morfogeneticS -§i participil efectiv ia desfSgurarea acestor etape. Actualmente se consider^ chiar c& unele modificSri ce survin in sinteza §i localizarea divergilor component m matricei extraceluiare determine anumite anomalii morfofuncjionale. 698 be ascmenea, s-a consiaU.il eft in ‘cursul desfftgurSrii ontogenetice se schimbft §i proporjia sau nalura constil.uenj.iJor matricei extracelulare, odatft cu fnncjjile pe care ea le capfttft in scopul dirijftrii proceselor morfogenetice. Spre exempiu, In cursul morfogenezei corneii, pe mftsurft ce {esutul pierde apft, in matricea extracelufarft scade concenirajia acidulai hialuronic §i create proporjia condroitin sulfajilor. Ceva mai mult, In cursul dexvoMrii ontogenetice se modified §i tipul de coiagen aflat in matricea extracelularil Spre exempiu, celulcle crestei neuralc sintetizeazft initial coiagen de tip I, integral in slructuri matriceale de tip fibrilar. Ulterior, in cursul dezvollftrii, se sintetizeazft coiagen de tip II. Insft acesta este specific pentru malricea extracelularil cartilaginoash.

XIV. 3. MODIFICARILE CONSTITUENTILOR MATRICEI EXTRACELULARE Constituenfii matricei extracelulare pot suferi douft genuri de modifieftri: fiziologice patologice. ■ Modificariie fiziologice sunt asociate - in special - cu inaintarea in varstft iar cele patologice se datoresc, adesea, ftincfionftrii anormaie a unor enzime care participft la anabolismul sau caiabolismul constituenfilor respective in cele ce urmeaxft sunt, menjionate cateva rnodificSri cantitative §i e&litative ale unora din constituent^ matricei extracelulare. XIV. 3.1. MODIFICAPJ IN FUNCTIE DE VA'RSTA OdatS cu inaintarea in varstS, la nivelul matricei extracelulare au loc rnodificSri imporfante din punct de vedere canfitativ. Astfel, concentrajia colagenului create cu vftrsta (in special, la nivelul pielei, aortei, diverseior catilaje), in limp ce scad concentral'iile glicozaminoglicanilor §i apei. Acest ultim fapt are ca rezultat schimbarea proprietftfilor fizice ale macromoleculelor matriceale; inciusiv ale colagenului care manifesto tendinja de a cristaliza in inieriorul fibrelor. in ceea ce privejle sc&derea concentrajiei glicozaminoglicanilor, este de remarcat cS. ea se face preferential: numai pentru unii din ei §i numai in anumite organe. Spre exempiu, in cartilaje scade, in special, concentrajia condroitin-6-sulfatului, se reduce - in mai micS m&surft - concentrajia condroitin-4-sulfatului iar concentrafia keratan sulfatului nlmane neschimbatft sau adesea cregte. Deoarece lanjurile poiizaharidice de controitin sulfa# §i keratan sulfat sunt ata§ate ia aceea§i catena polipeptidicii centrals, se considers eft odatft cu inaintarea in varsift au loc modifieftri ale biosintezei proteoglicanilor numai in unele regiuni dintr-un acela§i complex functional. Asemenea rnodificSri parfiale au consecinfe importante pentru gradul de hidratare al jesutului respectiv (cartiiajului) precum §i pentru posibiiitatea eventualei sale calcifieri. 699 XIV. 3.2. COLAGENOZELE Colagenozele sunt boli in care au loc modifialri calitative §i cantitative ale coiagenului. In categdria acestor boli se incadreaza artrita reumatismaia, osteoartrita, lupusul eritematos precum §i uncle boli eredilare. In cele ce urmeaz<1 - aici, imediat - se specific^ defectele metabolice dovedite in unde din aceste colagenoze. In artrita reumatismala s-a constatat o activitate foarte crescutS a enzimelor proteolitice lizozomale. DatoritS acestui fapt, proteinele (in special colagenul) sunt degradate hidrolitic. Ca urmare, se reduce foarte mult num&rul fibrelor de colagen din Jesutul corespunzStor §i in locul lor apar infiltrate inflamatorii. Trebuie remarcat insS cS in artrita reumalismalS sunt degradate partial §i macromoleculele de acid hialuronic din lichidul sinovial. in colagenozele ereditare sunt implicate defects enzimatice care conduc la ffagilitatea §i hiperextensibilitatea unui numSr mare de Jesuturi. Printre aceste defecte enzimatice mai frecvente sunt deficienjele de: lizinhidroxilaza, procolagen-N-peptidazft §i procolagen-C- peptidazli. Asemenea deficienje enzimatice, asociate. cu tulbur&ri ale metabolismului cuprului, se intalnesc in sindromul Ehlers ~ Danlos §i in sindromul Menkes. In principiu, lipsa oricSrei enzinie necesare sintezei de procolagen §i modific&rilor care au loc dup& eliberarea lui din celul&.reprezintft cauze potentiate pentru

declan§area unei boli ereditare. Colagenozele determinate genetic nu se datoresc totdeauna numai lipsei de enzime implicate in formarea coiagenului. Astfel, in sindromul Marfan lanfurile a2 sunt mai lungi §i nefuncfionale, ceea ce atrage stabilirea unor legdturi incruci§ate anormale. Pe de altfi parte, maladia numita osteogenesis imperfecta - care se caracterizeazS prin dezorganizarea totals a tendoanelor, ligamentelor, scheletului, sclerei - are drept cauzS biosintetizarea de cStre fibrobia§ti a unui colagen fetal (cuprinzand trei lanjuri polipeptidice identice de tip a,) in locul coiagenului normal (constituit. dintr-un lanj de tip a2 §i douS. lanjuri de tip a,). AceastS singurS diferenja structural# are multiple repercusiuni delavorabile manifestate la nivelul organelor menjionate: sclera este albastrS, auzul este scazut, oasele se deformeazS §i se fractureaza u§or, etc. , XIV. 3.3. UNELE MODIFICARI CALITATIVE DOBANDITE In avitaminoza C (scorhut) are loc o marcata deficienja de prolil hidroxilaza datoritS iipsei de vitamina C care activeazS enzima. In consecinfS, nu se mai fac hidroxiiarile prolinei §i lizinei din const!tujia coiagenului §i astfel intreaga stiucturS a acestuia este alterata. In diabet se remarcS o ingrojare a perejilor vaselor sangvine ale retinei. Aceste modificSri pot conduce la scaderea vederii §i chiar la orbire. In ceea ce prive§te repararea jesuturilor dupa rSniri (sau inflamajii) s-a constatat ca ea este IntovSrSgitS adesea de proliferare fibroblastic# §i cicatrizare. De fapt, formarea cicatricei presupune constituirea unor manunchiuri (pachete) de fibrile de colagen. Trebuie remarcat insa ca in cazul organelor parenchimale (spre exemplu, ficatul) cicatrizarile repetate §i inlocuirea {esutului normal cu colagen (ca in ciroza) pot conduce la deficient© in funcjionarea organelor respective. XIV. 3.4. MUCOPOLIZAHARIDOZELE Mucopolizaharidozele sunt o categorie de boil genetice care se caracterizeazft prin depozitareain {esuturi §i excrefia urinary excesivft de glicozaminogiicani (mucopolizahari- de, in denumirea mai veche). Aceste maladii se datoresc incapacitftf.il organismelor respective de a sintetiza unele enzime iizozomale implicate in degradarea glicozaminoglicanilor. Referitor la deficienfele enzimatice caracteristice unor mucopolizaharidoze sunt de fftcut urmfttoarele remarci §i exemplificftri utile: - In deficienfa genetieft de (3 - glucuronidazft s-a constatat eft se excretft prin urinft dermatan sulfat, heparan sulfat, condroitin sulfat dar niciodatft acid hialuronic. El. este degradat inifial de hialuronidazft pftnft la stadiul de tetrazaharid cu structura: (Glc UA - P 1,3 Glc NAc - p 1,4) 2 iur apoi se perfecteazft - pe alte efti - §i degradarea tetrazaharidului. - In deficienfa inftscutft de P - D - acetilhexozaminidazft trebuie precizat mai intai faptul eft s-au identificat douft izoenzime (A §i R) ale acestei enzime. Izoenzima A este formats din douft subunitftfi diferite: a §i p, in timp ce izoenzima B confine numai subunitftfi p. In aceastft situafie, studiile au demonstrat eft deficienfa genetieft de B - D - acetilhexozaminidazft se referft, de fapt, la lipsa uneia sau alteia din subunitftfile izoenzimelor respective. Astfel, in maladia Toy - Sachs lipsegte subunitatea a §i deci izoenzima A este inactivft. In boa,la Sandhoff lipse§te subunitatea p, ceea ce are ca rezultat a tat

deficienfa izoenzimei A cat §i a izoenzimei B. In ambele maladii au loc acumulftri masive de gangiiozide in creer, fapt care conduce la moarte prin infarct. Jin and seama de aceste precizftri, cele douft maladii genetice (Tay Sachs §i Sandhoff) atribuite deficienfei de p - D - acetilhexozaminidazft, sunt - mai de grabs - sfingolipidoze deeftt mucopoiizahari- doze §1 de aceea ele nu sunt menfionate in Tabelul XIV. 4. Intr-adevftr, In aceste cazuri biomolecula cea mai mult afectatft de lipsa enzimei respective este o gangliozidft. In deficienfa genetieft de p - acid - galactozidazft se constatft acumulftri tisulare atat de keratan sulfat cat §i fragmente de glicoproteine, - Deficienfa inftscutft de a - L - iduronidazft este caracteristicft sindromului Hurler iar lipsa genetieft a iduronat sulfatazei este cauza sindromului Hunter (Tabelul XIV. 4.). Faptul eft in toate deficienfeie genetice de enzime care degradeazft glicozaminoglicanii proteoglicanii corespunzfttori rftman ca atare, se creiazft posibilitatea acumulftrii lor - in canlitftfi anormal de mari - la nivelui diverselor fesuturi. Aceastft situafie antreneazft, la randul ei, multiple §t variate modific&ri tisulare. Intr-adevftr, in mucopolizaharidozele cunoscute au ioc t'recvetite schimbftri in structum scheletuiui, dezvoltarea organelor este - in genere - iniftrziatft, acuitatea auditivft se diminuiazft sau chiar se pierde, se instaleazft o evidentft intarziere mentftlft, se produc tulburftri cardio-pulmonare de diverse genuri §i inlensitftfi, se declan§eazft hepatosplenomegalie etc. In Tabelul XIV. 4. sunt menfionate tipuri deosebite de mucopolizaharidoze, indicandu- se pentru fiecare in parte glicozaminoglicanii eliminafi predominant prin urinft. 701 Tahehd XIV. 4.

Mucopoiizaharidoze bhunele Demmi maladies rea prescur tata Hurler, MPS I Scheie, Huiier/Schei e

/)efeciitl ei?,vimatic

a ~ L iduronidaza.

DS, HS

DS, HS

Hunter

MPS II

Tduronat sulfataza

Saniilippo A

MPS III A

Sanfi.Ii.ppo B

MPS III B

HSN - sulfataza. (sulfamidaza) a-Nacetilglucozaminida za

Saniilippo C

MPS III C

Morquio

MPS IV

Asemanato are cu Morquio

—

MaroteauxLamy DeficienjS de (5 glucuronida zS

MPS VI MPS VII

Aceliltransferaza

HS
Nacetilgalactozamina- KS 6-suIfat (3 -galactozidaza KS Nacelilga3actozami.il o-4-sulfataza (3-gl ucuronidaza

DS DS,HS( I) cs

NHS, KS aeelUgIucozarnino6-sulfataza MPS = mucopolizaharidoza; DS - dermatan sulfat ; KS = keratan sulfat; HS heparan sulfat. In genere, pentru diagnosticarea mucopolizaharidozelor se cerceteazS activMjile enzimatice in fibrobla§li» leucocite, diverse tesuturi, sen Este tnsfi de remarcat faptul ciS se poate stabili defectul enzimatic specific §i prin determinarea activitfifii unor enzime in lichidul amniotic. Asemenea determinSri prenatale sunt foarte importante pentru diagnosticarea mucopolizaharidozelor cu evolu|ie leiaLl Cap. XV* NOTIUNI PE NUTRIflE XV. L INTRODUCERE Nutrijia este o discipline §tiin{.ifica, special#, care studiaz# bazele biochimice §i fiziologice ale alimentapei. ViaJ'a oricitrei fiin{e presupune o cheltuiaia continue de energie §i, totodata, o permanent# degradare a constilaeniilor organismuiui. Atat Modiftcare lira nume

MPS

vm

Melabo lifii urinari

nevoile de energie c3.t §i cele corespunzatoare remoirii conslituenjilor tisulari sunt implinite de alimentajie. insS, pentru ca s# poalS r#spunde acestor nevoi, alimentele Irebuie s# aiba cornpo/ijii chimice adecvate §i s# fie consumate in canlililji suficienie. In decursui Jimpului, nutrijia §i-a propus §i a reu§it s& slabiieascd grupul complet de alimente necesare rajiei zilnice a omului. Mai mult chiar, la major! talea alimenielor s-a putut fixa §i cantitatea optima din fiecare precum §i asocierile lor cele mai potrivite pen tin implinirea nevoilor organismuiui. Pe de alt# parte, $~a determinat modul in care variaxd necesarul alimentar al omului s&ndtos pe tot parcursui vie|ii iar, in ultimul timp, nuti*i[ioni§tii au reu§it sS infeleagfi in ce fel unii factori alimentari afecteaz# §i sunt afectaji de diverse boli sau tralamente medicate. Toate aceste obieetive la care a ajuns s& nlspund# nutrijia sunt expuse - pe scun - in cele ce urmeazS, O prim# problem ii care va fi studiata in acest capitoi este cea a necesarului nutritiv al omului, finand seama de cheltuieliie energelice depuse in diverse condijii fiziologice. A doua problems important# - §i dezvoltatii in capitolul de faj& - este cea a principiilor nutritive din constitujia hranei. O a treia. problems - care va fi expustl in ultima parte a capitolului private datele referitoare la constitujia principalelor produse aiimentare, In incheierea acestui Capitol se vor face unele considerajii relative la modul in care se poate asigura sanStatea prin nutrijie cored# XV.2. NECESARUL NUTRITIV Necesarul nutritiv al unui organism corespunde nevoilor lui energetice iar acestea sunt determinate de urmatorii factori: biosinteza constituenjilor specifici ai organismuiui, menjinerea temperaturil corpului §i efectuarea de travalii mecanice (activitatea muscular#). Intr-adevfvr, organismul trebuie s# dispun# in permanent de energie pentru implinirea cerinjelor anahoiismului, Aceasta necesitate este mai accentuate in perioada de cregtere §i scade pe milsura ce organismul respectiv inainteaz# in vSrsta (deoarece scade ritmul de sintezii a constituenjilcr tisulari). Pe de alt# parte, organismul consum# energie pentru ca s& poatS indeplini o serie de activitS.fi fiziologice care au loc in cuprinsul sSu (respirafie, circulate sanguind, menjinerea tonusului muscular, peristal lism intestinal) precum §i activitSfile pe care le desfS§oar# in mediul ambiant. In sfar§it, cand temperatura mediului este sc#zut3, organismul trebuie s3 cheltuiasc# energie pentru a-§i menfine propria temperatura, producSnd cSldura necesarS acoperirii pierderilor termice. 703 XV. 2.1. CHELTUIALA DE ENERG1E In principiu, necesarul energetic ai unui organism aflat in stare de intrefinere este egal cu cheltuiala lui energqtied. Se spune c& un organism este m „stare de intre£inere“ sau de „echilibru energetic14 atunci cand procesele anaboiice sunt compensate perfect de cele catabolice, asa incut conslituenjii organismului I§i menfin acela§ nivel. DatoritS egalibljii dintre necesarul energetic §i cheltuiala de energie, stabilirea necesarului se reduce, intr-o primS. aproximajie, la stabilirea cheltuielii. Cheltuiala energetics variazS mult in diverse condijii. Ea poate fi

determinate prin introducerea subiectului in interiorul unei camere izolate din punct de vedere termic §i prin m&surarea energiei eliberate. Aceasta este reprezentate de pierderea c&ldurii §i de produsele de excrejie. De regulft, este mult mai convenabil sti se m&soare consumul de oxigen al subiectului deoarece, in majoritatea cazurilor, pentru 1 litru oxigen consumat se cheltuie§fe o energie egalil cu aproximativ 4,83 Kcal (20 kJ). Acest. rezultat face posibilS calcularea indirect!! a cheltuielii de energie prin ntesurarea cantitejii de oxigen consumat in cazul destegur&ii diverselor tipuri de activiteji. Asemenea rmlstmltori au demonstrat cS pentru fiecare individ cheltuiala de energie depinde de trei factori: ritmul metabolsimuiui bazi.il, efecfele tennogenetice - specifice activitefii dinamice - §i nivelul activitafii fizice (rrmsculare) depuse. Metabolismul bazal Determiiterile cheltuielii energetice (corespunz&toare necesarului energetic §i exprimate prin consum de oxigen) au ardtat c& - in stare de repaos §i echilibru termic - cheltuiala depinde de caracterele somatice ale omului. De fapt, in aceste condifii, cheltuiala energeticd - ireductibite in condijii fiziologice - este numite metabolism bazaL Metabolismul bazal a fost exprimat §i in funcjie de suprafafa corporate. In acest caz, el corespunde unei chelluieli energetice de 1000 kcal/24 ore/1 m2 suprafa$ corporals. Numele de ^metabolism bazaD este justifical de faptul c3 este corespunziitor cheltuielii energetice necesara menjinerii unor activity fiziologice bazale; respirajie, ritm carditfc, funcjie renate, echilibru osmotic, activitate cerebrate, temperatura corpului. Este de precizat eft determiiterile de metabolism bazal trebuie sfi se fad! totdeauna in condijii standard. Acestea presupun existenfa unui mediu cu temperature caldS. in care subiectul, aflat in stare de veghe, se stea in repaos complet iar rn&sur&torile respective se-i fie fecute dupe 12 ore de la ultima mase. La persoanele de acela§i sex §i aceea§i varstft, valorile metabolismului bazal sunt constante. Pentru indivizii de aceea§i vftrste ele variazS cu sexul, fiind totdeauna mai man la bfirhaji iar pentru persoane de a.cela§ sex, valorile metabolismului bazal variaze cu varsta, fiind mai mari la tineri §i mai scSzute la bfttrani. In atari de vanajiiie in funcjie de varste §i sex, intalnite in condijii fiziologice, metabolismul bazal prezinte vai'iafii importante in unele afecjiuni; mai ales in cazuri de tulburdri endocrine. Spre exemplu, in hipertiroidism el este mult crescut iar in hipotiroidism este redus. De asemenea, adminislrarea unor medicamente determine vaiiajii ale metabolismului bazal. Astfel, metabolism ul bazal create sub influenja medicamentelor stimulatoare ale sistemului nervos. 704 Efectele termogenetice Metabolismul baza! nu reprezintd decat o parte din cheltuiala energeticd a individului. Pentru cunoa§terea cheltuielii energetice totale trebuie ca la metabolismul bazai sd se adauge cheltuiala energeticd ce corespunde activitafii musculare iar, in uncle condifii de media, trebuie luatd in considerare §i acheltuiald energeticd fie de terrnogenezd, fie de termoliza. Prin cheltuiala de terrnogenezd se infelege cheltuiala de energie impusd organismului de necesitatea pdstrdrii temperaturii proprii atunci cand

temperatura mediului este prea scdzutd provoacd o pierdere termicd excesivd. Intr-adevdr, in aceastd situajie organismul trebuie sd-§i intensifice metabolismul principiiior imediate astfel incat sd compenseze pierderea termicd excesivd. Pe de altd parte, organismul este pus uneori in situajia sd se opund unei cre§teri a propriei lui temperaturi detenninatd de o temperatura prea ridicatd a mediului, In asemenea cazuri, organismul respectiv transpird astfel incat evaporarea transpirafiei sd determine scdderea temperaturii corpului (termoliza). Cheltuiala energetica determinate de activitatea fizicfi depusa Aceastd cheltuiala variazd cu intensitatea activit&Jii depose: cu cat efortui este mai mare, cu atat §i cheltuiala energeticd este mai crescutd peste cea corespunzdtoare metaboiismului bazai. In Tabelul XV. 1. sunt prezentate cheltuielile energetice in funcfie de unde categorii de activitdfi depuse. Tabelul XV. 1. Cheltuielile energetice corespunzatoare diverselor tipuri de activitati fizice Cheltuiala Nalura activitafii depuse energeticd (kcalhnin.) Activitate sedentara (munca intelectuala) < 2,5 Activitate musculara ugoar2 (munca de 2,5 - 4,3 creator, tipograf, hucatar) Activitate musculara medie (munca de 5,0 - 7,4 gradinar, iaborant) Activitate musculara intensa (munca de 7,5 - 9,9 tampiar, spargator de lemne) Activitate muscular^ thane intensa (munca > 10 de pietrar, incarcator cu lopata) !not lent 11,1 Inot rapid 14,2 705 in legSturS cu energia cheltuita de organism in timpul efoitului, trebuie precizat faptul eft numai o parte din ea se transform*! in lueru mecanic deoarece randamentul activitftjii musculare este relativ redus (cca 30%). Necesarul energetic Dupft cum s-a mai menfionat, la un organism sftnfttos aflat in stare de intrefinere, necesarul energetic procurat de hranft echilibreazft perfect cheltuiala lui totala de energie. On de cate ori aportul depft§e§te cheltuiala, greutatea corpului create; organismul respectiv se ingragft. Intr~adevftr, calculele au dovedit eft la un potential energetic de aproximativ 3500 kcal corespunde o cantitate de 0,45 kg grftsime corporal! Invers, cand necesarul energetic este inferior cheltuielii depose organismul slftbe§te. Situajiile extreme in aceste douft direcjii sunt: obezitatea §i respectiv, malnutrijia. In Tabelul XV.2 sunt prezentate valorile medii (§i extreme) ale necesarului energetic pentru copii §i adulji in cazul desfft§urftrii unor activitftfi fizice u§oare. Tabelul XV 2. Necesarul energetic al copiilor §i adulpSor in functie de varsta, greutate si frialtime

Calegoria

Copii mici

Varst a (ani)

Greuta tea (kg)

Inalfime a (cm)

Necesarul energetic (kcal) Valori medii limile

0-0,5 0,5-1

6 9

60 71

kg x 115 kg x 105

95- 145 80- 135

9001.800 1.30020 112 2.300 7-10 132 2.400 1.65028 3.300 2.000Barbafi 11-14 45 157 2.700 3.700 15-18 176 2.10066 2.800 3.900 2.500/ 19-22 70 111 2.900 3.300 2.30023-50 70 178 2.700 3.100 2.00051-75 70 178 2.400 2.800 76 + 70 178 2.050 1.6502.450 1.500Femei 11-14 46 157 2.200 3.000 1.20015-18 55 163 2.100 3.000 1.70019-22 55 . 163 2.100 2.500 1.60023-50 55 163 2.000 2.400 51-75 55 163 1.4001.800 2.200 76 + 55 163 1.2001.600 2.000 Necesarul energetic variaxft cu: caracterele somatice imediate (greutate, malfime), varsta, activitatea fizicft desfft§uratft, condifiile de climft §i starea de sftnfttate. Intr- adevftr, studiile efectuate pe pacienji spitalizaji au dovedit eft stresul catabolic sever, caracteristic unor boli, determine cre§terea cu mai mult de 100% a cheltuielii norm ale de energie. In asemenea cazuri se produce §\ un dezechilibru azotat foarte marcat. Compensarea lor imediatft se realizeazft prin marirea substanfialft a necesarului 706 energetic, adicri prin suplhnerite de hrand adecvahl Situajii similare de marirea necesarului energetic prin suplimente de brand se intainesc in condijii de sarcind sau de aldptare, cand nevoile sunt crescute cu 300-500 Copii

1- 3 4- 6

13

90

1.300 1.700

kcai/zi. In cazul copiilor de diferite varste (copii mici, aflafi la pubertate, adolescenji) nevoile ener- getice sunt determinate nu numai de compensarea metabolismului bazal §i a cheltuielilor prin efort fizic ci, intr-o mdsurd considerabila, §i de credere (dezvoltare). Bineinjeles, §i in aceste condif.il cre§terea nevoilor energetice se asigura prin suplimente alimentare corespunzatoare. XV. 2.2. COMPOZEpA §1 ENERGIA RAJIEI ALIMENTARE Din timpuri foarte vechi, experienja umand a condus la stabilirea celei mai potrivite compozifii a hranei pent.ru asigurarea completd a necesarului nutritiv. Se injelege insd cd aceasta compozifie optima nu poate fi universald §i invariabild in toate zonele geografice, ea depinzand de condifiile climatice in care se dezvoltd §1 trdiegte omul; este in raport cu confinutul in substance nutritive ale soiului pe care cresc vegetable utilizate ca surse alimentare; este in funcfie de posibilitdfile de pdstrare §i depozitare a alimentelor precum §i de obiceiurile tradifionale de prelucrare culinard. Ace§ti ultimi doi factori contribuie, de multe ori, la scdderea valorii nutritive a hranei. Totugi, indiferent de natura §i acjiunea factorilor de variabilitate, experienja a dovedit cd o compozifie optimd de brand se asigurd numai prin includerea, in proporjii bine echilibrate, a tuturor principiilor nutritive. Din punct de vedere calitativ, necesarul esenjial pentru nutrifia omului sdndtos este prezentat in Tabelul XV.3. Tabelul XV.3, Princlpille esenjlale cle niitritie ale omului Categoria Speciile c'orespunz&loare Histidina'l izoleucina, leucina, lizina, Aminoacizi metionina (cisteina1 2)), fenilalanina (tirozina 2>), treonina, triptofanul, valina Acizi gra§i Acid iinoleic (acid arahidonic 2)), acid a linolenic 3) Acid ascorbic, biotina4) 5, cobalamina, acid Vitamine folic, nia.cina, acid pantotenic, hidrosolubil piridoxina, riboflavina, tiamina e Vitamine liposolubile A,D5\ E, K4) Elemente Calciu, clor, magneziu, fosfor, potasiu, sodiu minerale Oligoeleme Crom, cupru, iod, fer, mangan, molibden, nte seleniu, zinc. Fibre Necesare pentru peristaltismul intestinal Apa Componentul cel mai „critic“ al rajiei Energie Ulilizarea glucidelor, lipidelor §i proteinelor in proporjii variate 1) Necesar pentru copii foarte mid §i probabil necesar pentru copii mai man sau pentru adulji. • 2) Cisteina, tirozina §i acidul arahidonic economisesc- - respectiv necesarul. de metionina, fenilalanina §i acid iinoleic.

3) Unii autori considers ca acidul. linolenic nu ar fi. esenjial pentru om 4) Biotina §i vitaniina K sunt sintetizate §i de catre flora bacteriand din intestin. 5) Prin expunerea pieiei la razele solare se reduce necesarul dietar de vilamina D. 707

;;

in categoria principiilor nutritive, conslituente permanente ale hranei, un loc central il ocup# grupul glucidelor, lipidelor §i proteinelor deoarece prezenfa acestora este absolut obligatorie in orice rape alimentar# complet#. De aceea, eie sunt numite „principii imediate44, fiind utilizate de organism in primui rand. Dintre ele, glucideie §i lipidele particip#, in special, la procurarea de energie iar proteinele sunt folosite pentru refacerea tisulara. Cu > toate acestea, a§a cum au dovedit determin#rile respective, proteinele au §i ele o valoare energetic#, proprie, de care se fine seam#. la calcularea cantit#fii totale de energie a rafiei. Pentru determ inarea energiei totale disponibile in limn# se ia in considerate totdeauna energia eliberat# prin oxidarea celor tiei tipuri de principii nutritive imediate (glucide, lipide, proteine) aflale in rajia alimentar#. Aceast# energie se mSsoari piin metode calorimetrice. Determin#rile Scute prin arderea fiec#rui fel de principiu imediat (in bomba calorimetric#) au dus la concluzia c#. arderea unui gram de glucide libereaz# 4,1 kcal, a unui gram de lipide 9,3 kcal §i a unui gram de proteine 5,4 kcal. Aceste valori reprezint# cdldurile de combustie aie fiec#rui tip de principiu nutritiv imediat. Jinand seama de faptul c# in organism glucideie §i lipidele sunt oxidate complet (pan# la dioxid de carbon ap#), ca §i in bomba calorimetric#, se poafce conchide c# pentru aceste categorii de principii imediate valorile c&ldurilor de combustie sunt identice cu valorile energelice elective ale substanfelor in organism. Proteinele ins# nu sunt oxidate complet in organism - pan# la dioxid de carbon, ap# §i azot - ca in bomba calorimetric#. Cea mai mare parte din carbonul §i hidrogenul pe care-1 cuprind.se transform#, prin oxidare, in dioxid de carbon §i ap# iar azotul lor, precum §i cate o parte din carbon §iAhidrogen, se elimin# sub form# de produ§i azotafi prin urin#; in special, sub form# de uree. In aceste condijii, valoarea energetic# efectiv# a proteinelor in organism nu este egal# cu c#ld.ura lor de combustie in bomba calorimetric# ci este mai mic#. Sqizand ins# din cSldura de combustie a proteinelor, in bomb#, aceea a ureii §i a celorlalji compugi azotaji - eliminaji prin urina - se obpne valoarea energetic# efectiv# a proteinelor in organism. Aceast# valoare este de 4,1 kcal pentru 1 g proteine (in lex: de 5,4 keal/g, valoarea calorific# sau c#idura de combustie a proteinelor in bomba calorimetric#). C#ldurile de combustie §i energiile disponibile corespunz#toare pentru

cele trei categorii de principii imediate sunt prezentate in Tabelul XV.4. Tabelul XVA. CaSdurile de combustie si cnergiile disponibile fn organism pentru cele trei categorii de principii nutritive imediate Energia Principiul Cdldura de disponibild in tmtriliv combustie organism, imediat kcallg keal/g Glucide 4,1 4,1 Lipide 9,3 9,3 Proteine 5,4 4,1 Dup# cum se observa, cifreie consemnate in Tabelul XV. 4 arat# c# energia disponibil#, confinut# in unitatea de mas#, pentru lipide este mai mult decat dubl# fa}:# de cea corespunz#toare glucidelor sau proteinelor. 708 XV.3, PRINCIPIILE NUTRITIVE Aga cum s-a mai menfionat, fiecare categoric de principii nutritive prezentate in tabelul XV.3 - igi are funcfiile sale specifice gi reJafii bine determinate cu.organismuL Cu toate acestea nici una din categoriile de principii nutritive nu funcjioneazd sau nu acfioneazA independent Asemenea inter-relafii vor fi ilustrate in cele ce urmeaz3; ins3, pentru rafiuni de ordiri didactic, fiecare categoric este prezentatS separat, subliniindu-se camcterele sale specifice. XV ,3.1. GLUCIDE'LE Cea mai mare parte din hrana obignuitft a omului este constituit3 din glucide sau zaharuri. Prezenfa obligatorie a glocidelor in rafia alimentary este justificata de faptul c3 eie sunt principii nutritive energizante prin excelenjit. Inlr-adey&r, aga cum se gtie din studiul metabolismului glucidelor, degradarea lor in organism furnizeaz3 energie pentru toate funcfiile acestuia §i, in mod special, peritru activitatea muscularl Glucidele prezinl3 avantajul c3 pot fi ugor digerate gi absorbite; de asemenea, ele ajul3 la metabolizarea altor categorii de principii nutritive; in special, a lipidelor. Deoarece in organism porfiunea glicerolicS a unor categorii de iipide (trigliceride) §1 catenele hidrocarbonate ale unor aminoacizi (glucoformatori) se pot transforma in glucozS, glucidele s-ar p3rea c3 nu sunt absolut esenfiale in tafia alimentary. Toixigi, in ahsenfa lor se instaleazS starea de „cetoz3“ (vezi metabolismul glucidelor gi metabolismul lipidelor) gi, ca urmare, apar iilte turburiSri metaboiice grave; pierderi semnificative de ap3 gi de anumifi eiectrolifi, degradSri excesive de proteine musculare, etc, Pentru prevenirea acestor efecte defavombile se recomand3 ca rafia zilnic3 s3. include un aport de 50-100 g glucide. Din punct de vedere calitativ pot fi utilizate pentru hran3 oricare din glucidele ce elibereazti, in urma digestiei, monozaharidele: glucoz3, galactoza, fructoz3, manoz3. De fapt; in rafia. obignuit# a omului intr3 urm3toarele glucide: amidonul (polizaharid din vegetale), zaharoza (dizaharid din sfecla de zah3r sau trestia de zah3r) laetoza (dizaharid din lapte), glucoza gi fructoza (monozaharide din fructe). In organism, d.up3 cum se gtie, toate aceste glucide ajung s3 se transforme in glucozfi. In genere, este preferabil ca glucidele s3 fie consumate „in forme

naturale" datority. faptului ca surseie naturale cuprind gi al'te substanfe necesare organismuiui (vitaminele B, E gi substanfe minerale in cereale; vitaminele B, C gi substanfe minerale in cartofi; vitamina C gi substanfe minerale in fructe). Insfp in aceasta privin{3, un neajuns il constituie faptul c3 multe principii nutritive din alimentele care confin gi glucide se indep3rteaz3 sau sunt: distruse in limpul prelucrarii surselor naturale. Spre exemplu, cfmd bobul de grim este transformat in f3in3 aM, se indep3rteaz3 stratul de la suprafaja externa a bobului (cortexul) gi a germenului de gram Surseie vegetale care procur3 glucidele hranei obignuite a omului cuprind insa gi celuloza. Aceasta, degi face parte din categoria glucidelor, nu este digerata in tractul digestiv uman. Ea este totugi va!oroas3 din punct de vedere dietetic deoarece stimuleaza peristaltismul intestinal gi ajut3 la form area gi eiiminarea fecalelor. (A se vedea mai departe „fibrele alimentareA) Alte glucide care intrS in constitujia hranei obignuite a omului sunt pentozele (monazaharide) gi polizaharidele formate din pentoze, Acestea din urm3 nu au valoare nutritivd, fiind absorbite gi excretate, ca atare. Ins3, unele pentoze sunt: txansformate in organism - dup3 cum s-a ar3tat la metabolismul glucidelor - in glucoztl participand astfel in mod indirect la implinirea rolurilor acesteia. 709 XV.3.2. LIPIDELE Lipidele sau grSsimile reprezinta categoria de principii nutritive care constituie o components important^ a ra[iei aiimentare. Ne-cesitatea prezenjei lipidelor in rajie rezultb din urmStoarele insu§iri specifice pe care acestea le prezintS: (1) - au cea mai „concentratiT valoarea energetics din rajie. Intr-adevSr, a§a cum s-a arStat in subcapitolul precedent, lipidele elibereazS in organism 9,3 kcal/g, mai mult decat dubiul energiei eliberate de glucide sau proteine (cate 4,1 kcai/g); (2) - se pot consuma in stare uscatS (ca atare) spre deosebire de proteine §i polizaharide care nu au gust in stare uscatS §i nu pot fi consumate decat dupS o prealabilS prepai*are (de obicei, cu apS). (3) - sunt soivenji pentru vitaminele liposolubile (A,D,E,K) §i pentru caroteni (provita- mine A), substanje aflate §i ele in rajia alimentarS; (4) - inlesnesc absorbjia vitaminei D §i, prin aceasta, a calciului, ajutand astfel - in mod indirect - la utilizarea calciului de eStre organism (in special, la fixarea lui in oase §i dinfi); (5) - contrihue, dupS metabolizare in organism, la formarea „ lipidelor de depozit“ care ajulS la protejarea organelor interne (rinichi, inimS, ficat) §i la p&strarea temperaturii constante a corpuiui; (6) - ajutS la prelungirea procesului de digestie, incetinind secrejiile stomacale ce conjin acid clorhidric. DatoritS acestui fapt, apare senzajia de sajietate §i de ingreunare dupS o masS bogatS in grSsimi. In ceea ce prive§tc insu§irea lipidelor de a furniza energie organismului, se remarca diferenfe intre ceie de origins animalS §i cele de origins vegetalS. In general, lipidele animale au o valoare biologies superioarS celor de origins vegetalS deoarece ele conjin mai multe vitamine liposolubile; in special, vitaminele A §i D. Lipidele de. origins animalS conjin o proporjie semnificativ

mai mare de acizi saluraji iar colesterolul se aflS numai in aceastS categoric de iipide. Diferenjele. de compozijie clintre lipidele animale §i vegetale pot avea implicajii importante in siarea de sSnState. Intr-adevSr, la populajiile care consumS multe grSsimi animale incidenja obezitSJii, cancerului de colon §i bolilor de inima (coronariene) este foarte mare. De altfel se §tie cS impreunS cu fumatul §i hiperiensiunea, nivelul crescut al colesterolului seric, ca urmare a hrSnirii cu rajii bogate in colesterol (grSsimi animale), reprezintS un factor de rise important in instalarea §i progresarea procesului aterosclerotic. De$i capacitatea de dizolvare a vitaminelor liposolubile de cStre lipidele de origins vegetalS este mai redusS, ele au o valoare biologies apreciabilS cJatoritS faptului cS pot cuprinde acizi gra§i esenjiali. DupS cum s-a mai menjionat, principalii acizi gragi esenjiali sunt: acidul linoleic, acidul Iinolenic §i acidul arahidonic. Ei intrS, in proporjii diferite §i utile, in constitujia tuturor uleiurilor comestibile; extrase din seminjeie anumitor specii vegetale. PanS in prezent, nu exists recomand&ri speciale cu privire la necesarul de acizi gra§i esenjiali. S-a constatat InsS cS intr-o rajie alimentarS care procurS 2000-3000 keal/zi, 5 g acid linoleic, ajung sS implineascS nevoile organismului. De altfel, aceastS camitate este mult inferioarS celei de 23 g/zi, apreciatS ca disponibilS in hrana obi§nuitS. DatoritS acestei disponibilitSJi se explicS faptul cS nu se intalne§te deficienjS de acizi gra$i esenjiali. Acidul Iinolenic §i alji omologi ai lui (cu Irei duble legSturi), precum $i acidul arahidonic (cu patru duble legSturi) sunt indirect sau direct precursori. ai Jeucotrienelor, prostaglandinelor §i tromboxanilor care funcjioneazS ca „hormoni localiL A§a cum se §tie, printre alte insu§iri, prostaglandineie au §i rolul de a rolul de a irnpiedica agregarea plachetard, Relativ recent s-a emis pdrerea cd incidenja redusd a boliior de inimd coronariene ia eschimo§ii din Groenlanda trebuie atribuitd prezenpi acizilor gra§i esenpali, cu trei duble legdturi, care intrd in constitujia graimiior somoniior §i scrum biilor, hrana de hazd a acestei populapi. De altfei, in ultimii ani s-a stabilit cd aportul dietar in care acizii gragi esenpali reprezintd 1-2% din valoarea sa energeticd asigurd totdeauna prevenirea deficienjii ciinice. Lipidele sunt consumate in cantitate mai mare in regiunile pupn luminate de scare, Populapile care trdiesc in climd temperata nu pot consuma cantitdp excesive de lipide fdrd consecinfe ddunatoare pentru organism, intr-adevdr, cand consumul de lipide este foarte mare se diminueazd, in mod apreciabil, cei de giucide. Acest fapt atrage, dupd cum s-a mai spus, instalarea stdrii de cetoza. Este totugi de remarcat cd predispozipa la cetozd pare a fi, in mare rndsurd, o problemd de adaptare. Astfel, s-a constatat cd eschimogii, trdind intr-o regiune in care nu se produc alimente cu conpnut glucidic, au cagtigat toleranjd mare pentru lipide. §i obezii au o toieranpl mare pentru lipide. Pe de alia parte, existd unele populapi care - datoritd resurselor locale insuficiente s-au obignuit sd consume in rape can tit dp foarte rnici de grdsimi. De§i in asemenea imprejurdri efectele ddunatoare nu sunt imediat vizibile, cu timpul se manifesid gi deficient de vilamine liposolubile, ca urmare a deficienpi de lipide din rape. In aceste cazuri apar diverse- modificdri cutanate, eczeme iar in stdri de deficienjd extremd se poate ajunge chiar la intarzieri de cregtpre gi dezvoltare. XV3.3. PROTEINELE

Proteinele sunt principii nutritive cu rol plastic, in sensul cd sunt necesare pentru cregterea organismului tfmdr gi menpnerea (intrepnerea) celui adult.. In mod normal, in organism are loc o reinoire proteicd, zilnicd, in proporpe de 1-2% din totalul proteinelor coipului. Importanfa §1 necesitatea prezenjei proteinelor in rapi, pentru menpnerea bunei funcpondri a celulelor din organism p pentru asigurarea refacerii Jesuturilor uzate (piele, pdr, unghii), rezultd din faptul cd organismul adult elimind zilnic produse azotate prin urind, salivd, fecale; chiar atunci, cand el se afld in stare de inanipe. Deoarece in inanipe produsele azotate eliminate provin din degradarea proteinelor tisulare proprii organismului, se infelege ed este neapdrat nevoie ca acesta sd prim eased, odatd cu rapa, proteine care sd le inlocuiascd pe cele pierdute. Numai astfel organismul se poate menpne in stare de „echilibru azotatA Se spune cd un organism se afld in echilibru azotat: cand cheltuiala de substanje azotate, in special de proteine, este acoperitd de un aport corespunzdtor de proteine in rapa alimentard. Pe de altd parte, necesitatea proteinelor in rape pentru asigurarea sintezei de proteine noi in Jesuturi este deosebit de evidentd in unele stdri fiziologice speciale; spre exemplu, in gestape gi lactape. Intr- adevdr, femeile gravide au nevoie de o alimeniape mai bogatd in proteine pentru construirea substanfelor proteice noi, necesare dezvoltdrii uterului gi fdtului. De asemeni, femeile care aldpteazd au gi ele nevoie de un regim mai bogat in proteine pentru ca aces tea sd serveased in organism la formarea proteinelor laptelui. Dupd cum s-a menponat in capitolul privind proteinele, pentru formarea de proteine proprii organismul are nevoie de 20-22 aminoacizi. Cu exceppa a 8 dintre ei, numip aminoacizi esenpali, top ceilalp aminoacizi pot fi sintetizap gi in organismul omului. Cei 8 aminoacizi esenpali figureazd gi in Tabelul XV.5, in care sunt menponate cantitdple apreciate ca necesai*e copiilor gi adulplor. 711 A§a cum s-a specificat In Tabelul XV.3, histidina s-a dovedit cS. este un aminoacid esenjial pentru copii irsici (cu necesar zilnic de 28 mg/kg corp) dar nu s-a stabilif necesarul ei pentru copii mai marl. De asemenea, pan3 de curand, arginina a fost §i ea considerate aminoacid esenjial necesar dezvoltMi normale a copilului. Tabelul XV.5 Necesarul zilnic* de aminoacizi esenjiali In funcjie cle vdrstS Conjinutul in Copii Copii aminoacizi esenjiali Aminoaci mic (4-6 (10-12 Adult ai proteinelor de dul luni) ani) call la te superioara (mg/g proteina) Izoleucin 70 42 a 28 10 Leucina 161 42 14 70 Lizina 103 44 12 51 Metionin 58 22 ' 13 26 a (-t-

cisteina) FenOaian 125 14 ■ 73 ina 22 (Hirozina) Treonina 87 28 7 35 Triptofan 17 3,3 3,5 11 Valina 93 25 10 48 *) In mg/kg greutate corp. Majoritatea proteinelor cai*e intri in constitujia hranei cuprind toji aminoacizii esenjiali in proporjii diferite. Cu privire la aceste propoitii sunt necesare urmitoareie precizM : (I) cantit&file de aminoacizi esenjiali din rajie §i proporjii I e dintre ei trebuie sfi fie foarte apropiate de necesarul organismului in ace§li aminoacizi; (2) daca un aminoacid esenjial se a fill inlro cantitate foarte micS, sau lipse§te in rajia proteicft, biosinteza proteinelor in organism scade paml la un nivel foarte redus sau chiar inceteazS; (3) in anumite alimente unul sau mai mulji aminoacizi esenjiali se pot g5si in cantitSji foarte mici in raport cu aljiL Acest fapt modified mult proporjia de aminoacizi esenjiali necesari organismului; (4) aminoacidul esenjial din rajie care se aflli in cantitate foarte mica, sau este absent, se nume§te aminoacid limitant. In organism, dup& asimilarea proteinei respective, ei se afli in cea mai redusS cantitate din necesarul zilnic de aminoacizi; (5) aminoacidul esenjial limitant este factorul determinant pentru stabilirea cantMjii §i calMjii proteinei utilizatil de organism. Jinand seama de precizMle menjionate, se mjelege efi nu toate proteinele din rajie sunt in m&surS stl procure toji aminoacizii esenjiali §i sa acopere nevoile azotate ale organismului, adieft sa se transforme in proteine proprii lui. Aceastft inspire se numegte valoare biologica sau metabolicci a proteinelor. 712 Proteinele complexe (cu numdr mare §i variat de aminoacizi, inclusiv aminoacizi esenfiali) au vaiori bioiogice mari §i se numesc proteine complete. Cele care cuprind un numdr limitat de aminoacizi esenfiali §i neesenfiali nu sunt in mdsurd sd procure organismului material necesar pentru refacerea fesuturilor proprii; e! e au vaiori bioiogice mid §i se numesc proteine incomplete. In general, proteinele de originii animald (din came, lapte §i prod use lactate) sunt proteine complete, in timp ce proteinele de originii vegetal# (din legume §i fructe) sunt proteine-incomplete. Aces £ fa.pt relevd superioritatea proteinelor de originii animals, fajd de cele de originii vegetal#. De aceea, in alcdtuirea unei rajfii alimentare adecvate trebuie sd se asocieze cu grijd alimenlele ce confin proteine sdrace in aminoacizi cu cele care cuprind aminoacizi! respectivi in cantitSi'i suficiente. In cazuri contrare, prin administrarea mai mdelungatd de rajii neadecvate, din acest punct de vedere, apar deficienje. proteice cu manifestdri multiple, variate §i grave. Printre ele se observe frecvent scdderea rezistenfei la infecfii, intarzieri in vindecarea riinilor §i chiar instalarea depresiunii nervoase (sub diferite aspects).

Pe iangd prezenfa anumitor aminoacizi (in special, cei esenfiali) in constitujia proteinelor din rafie, un alt factor care afecteazd utilizarea lor este raportul dintre potenfiaiul energetic ai rafiei §i proteinele pe care ea ie confine. Intr-adevdr, echilibrul azotat necesitd atai un aport adecvat de proteine, cat §i unul de components energetice. Deficient oriciireia din aceste doud categorii de componente are ca rezultat un echilibru azotat negativ, caracterizat prin excrejii azotate mai mari decat refinerile. In schimb, cand aportul energetic al ra{iei este mare §i suficient pentru acoperirea nevoilor organismului, echilibrul azotat este atins u§or cu un aport proteic relativ redus (deoarece catenele hidrocarbonate ale aminoacizilor respectivi nu sunt solicitate §i ele pentru degraddri cu producere de energie). Cercetarile au demonstrat eft pentru menfinerea echilibrului azotat, apoitul energetic al rafiei trebuie sd fie ega.1 cu 1,5 x cheltuiala de energie corespunzdtoare metabolismului bazal. In aceste condifii, tafia cea mai potrivitd (pentru menfinerea echilibrului azotat) este aceea care procurd proteine in proporfse de 12-15% din aportul energetic. Intr-adevdr, rafiile prea bo gate in proteine nu confer# avantaje specials ci, mai degrabd, produc neajunsuri. Astfel, la copii prematuri administrarea rafiilor cu confinut proteic prea mare poate determina efecte toxice. Pe de altd parte, rafiile foarle bogate in proteine ale adulfilor produc tulburdri ale funcfiilor renale. Activitatea fizied desfdguratd joacd §1 ea un rol important in stabilirea nivelului proteic dietar. S-a constatat cd, in genere, activitatea. fizied determind cre§terea reterifiei azotate din proteinele rafiei. Aportul insuficient al hranei (deci cantitdfi insuficiente de proteine §i de aliments energetice) determind malnutriiia proteino-energetied. Ea este combdtutd prin cregterea cantitativd §i calilativd atilt a. componenteior proteice cat §i a celor energetice din rafie. Malnutrifia proteino-energetied se poate declan§a §i in caz de malahsorbfie, intervenfii chirurgicale pe tractul digestiv sau in diverse boli grave. In asemenea situafii recuperdrile necesitd administrarea de suplemente nutrifionale (proteice §i energetice) sub control riguros §i supraveghere medicaid. XV.3.4. VITAMINELE Dupd cum s-a menfionat in capitolul consacrat sludiului vitaminelor §i coenzimelor (Cap. Ill), in funefie de solubilitatea in apd sau grdsimi, exist# doud categorii de vitamine: hidrosolubile §i liposolubile. Indiferent de categoria edreia ii aparfine, fiecare vitamin# se afld in cantitdfi variate in diverse aliments (Tabelul XV. 19). 713 i

Digestia vitaminelor comport# uncle particularit#ji. Astfel, dup# ingerarea §i trecerea in tractul gastro-intenstinal a alimentelor care confin vi(amine hidrosolubile, acestea din urm# sunt absorbite in vena port# iar surpiusul lor este excretat prin urina. Datorit# acestor procese, vitaminele hidrosolubile se depoziteaz# numai in foarte mica m#sur# in organism §i, de aceea,‘ este necesar ca ele s# fie procurate in mod continuu de c#tre rafia alimentar#. Totu§i, in ficat se depoziteaz# constant, mici cantitSji de acid folic. Tot in ficat se mai depoziteaz# foarte pufin acid ascorbic §i mai mult# vitamin# B12. In ceea ce prive§te vitaminele liposolubile - care se g#sesc a tat in lipidele vegetale cat §i in cele animale din hran# - ele sunt digerate odat# cu grSsimile respective. Prin urmare, dup# absorbjia la nivel intestinal ele sunt incorporate in chilomicroni §i transportate la ficat. Acesta este organul principal de depozit al vitaminelor A, D §i K iar fesutul adipos reprezint# cel mai important loc de depozit pentra vitamina E. Vitaminele liposolubile no se excret# prin urin#. De§i vitaminele nu reprezint# materiale structurale §i nu au valoare energetic# sunt important^ pentru organism datorit# rolurilor funcjionale pe care le implinesc. Intr- adevar, a§a cum s-a arStat in Cap. Ill, majoritatea lor sunt constituent enzimaiici (coenzime). in aceast# calitate vitaminele particip# aproape la toate reacjiile metabolice; at#t la degrad#ri cat §i la constituire de structuri tisulare. Dup# cum s-a mai precizat, pentru implinirea funcjiilor biologice organismul omului are nevoie zilnic de cantit#fi foarte mici de vitamine (cateva mg sau chiar micrograme) iar rajia alimentar# trebuie s# le procure

regulat §i in m#sur# necesar#. Acest necesar de vitamine variaz# cu varsta, sexul, starea fiziologic#, clima §i natura activit#{ii depuse. Cu toate cauzele multiple de variafie a necesarului vitaminic, se indie# totu§i unele niveluri absolut indispensable bunei funejionari a organismului. Aceste niveiuri, menfionate in Tabelul XV.6, sunt raportate la persoane san#ioase care depun o munc# ugoar# §i in climat temperat. Este de remarcat c# acest necesar vitaminic, adus de rajia alimentar# zilnic#, trebuie s# fie riguros respectat; in caz eontrar, atat dep#§irile cfit §i reducerile aportului vitaminic atrag tulbur#ri metabolice §i dezechilibre periculoase pentru starea de s#n#tate a organismului. Excesul vitaminic se acumuleaz# in corp provocand st#ri grave de toxicitate. Asemenea situajii au fost puse in evidenj# in cazul supradozelor de vitamin# A, vitamin# D §i vitamin# E. In cazul vitaminei liposolubile K se pot produce st#ri de toxicitate cand se folosesc iratamente indelungate cu cantit#fi mari de medicamente ce confin vitamina K (dispersat# in ap#). In schimb, ingerarea unor cantit#ji excesive de vitamine hidrosolubile este u§or tolerat# de organism, cu excepjia situajiei intalnite la administrarea in cantitate mare de niacin# sub form# de acid nicotinic cand se constat# efecte secundare nocive. §i exceseie de vitamin# C sau de vitamin# B6 sunt mai greu suportate. In general, cu excepjia unor indicajii lerapeutice exprese, administrarea supradozelor de vitamine este periculoas# §i trebuie evitat#. Pe de alt# parte, deficienfa sistematic# §i prelungit# de vitamine in rafia alimentar# declan§eaz# anumite maladii. Exemple de asemenea situafii sunt prezentate in Tabelul XV.7. 714 Tabelul XV. 6. 1 2 3 4 Necesarul zilnic de vitamine al omului Cate Var Greu Indlli Vitaminele Viiamine hidrosolubile goria sta tate mea liposolubile (an a (cm) A D E K Vit. Tiam Ribofl PP Vit. i) (kg) (ug fa (mga f C ina avina (mg B6 1 RE) g) -TEf a (m (mg) (mg) NEf (m } 2} g g) g) ) 0,0 Copii 7, mici 0,5 6 60 315 5 3 5 30 0,3 0,4 5 0,3 9 71 375 4 35 0,4 0,5 1 0,6 10 6 0,6 0 -1 1 Copii 1-3 13 90 400 10 6 5 40 0,7 0,8 9 1,0 2 12 4-6 500 7 45 0,9 U 20 112 10 0 ■■ 1,1 7132 700 io 7 3 45 13 1,4 28 1,0 1.2 10 0 Barb 11100 4 ati 14 45 157 0 10 10 5 50 1,3 1,5 17 1,7 15- 66 176 100 ■ 10 6 60 1,5 1,8 20 ■ 2,0

Fo lal Cs )

Vit. Bi2 fag )

25 35

0,3 0,5

50

0,7

75 10 0 15 0 20

1 ‘ 1,4 2,0 2,0

18 1924 2550 51 + ■ Feme i

1114 1518 1924 1550 51 +

72

177

79

176

77

173

0 100 0 100 0 100 0

10 10 10 5 5

10 10

46

157

800

10 8

55

163

800

10 . 8

58

164

800

10 8

63

163

65

160

Femei gravide

800

5

8

800

5

8

800

1 0

10

5 7 0 8 0

60

8 0 4 5 ■ 5 5 6 0 6 5 6 5 6 5 6 5

1,5

1,7

19

1,5

1,7

39

60

1,2

1,4

15

2,0

50

1,1

1,3

15

1,4

60

1,1

1,3

15

1,5

U'

1,3

15

1,3

15

60

60

2,0 2.0

1,6

60

1,1

1,6

60

1,0

12

13

3,6

70

1,5

1,6

17

'j

Feme ala 130 95 i care pte 0 10 12 1,6 1,8 20 2,1 aza 1) Echivalen|i de retinol. 1 ecMv.retinoI~l pg rettnol~6 gg B - caroten 2) Exprimat in colecalciferol 10 gg colecalciferol=400 U.L de vitamina D 3) Exprimat in echivalenji de a ~ tocoferol, 1 mg a = tocoferol = 1 a - TE 4) Exprimat in echivalen$i de niacina. 1 NE (echiv .niacina) = 1 mg niacina sau 60 mg triptofan dietar. Defcctc mctaboiice determinate de lipsa imor vitamine hidrosoiubile cu rol coenzimatic Vitamina Boaia Defectul metabolic* Acidemie Biolina Propi onil - CoA propionica Aciduric Vitami carboxilaza Fonnarea de metilmalonica Mala na B12 cobalamid-coenzima bs orbfia folat ul o i Acid Transportul aciduiui folic Boaia Hartnup folic . Transportul triptofanului Cistationinurie; Niacina Cistationinaza; homocislinurie Piridoxina cistanioninsintetaza Hiperalaninemie, Tiamina Piruval dehidrogenaza acidoza laclica * Dcfeclele enzimaticc pot fi corectate prin administrarea unor doze man din vitaminele respective. Deficienfele de vitamine liposolubiie (avitaminozelerespective) seintSInesc, in special, la copii care nu au depozite adecvate in organism. La adulfi, deficienjeie de vitamine liposolubiie sunt rare. Cand se intalnesc, sunt aproape totdeauna datorate malabsorbjiei, ohstrucfiei editor biliare sau altor cauze care afecteazh metabolismui lipidelor. XV.3.5. MINERALELE

0 20 0 20 0 20 0 15 0 18 0 18 0 18 0 18 0 40 0 28 0

2,0 . 2,0 2,0

2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2.2 2,6

Mineralele sunt substanfe nutritive care se afla in rafia alimentarS §i in organism, atat sub form;! de compu§i anorganici cat §i organici. In general, se considers cS. pentru nutrifia omului sfmatos sunt absolut necesare 16 substanfe minerale. De§i substanfele minerale din organism reprezintd numai 4-5% din greutatea corpqlui, elejsunt indispensabile pentru menfinerea stdrii de sSnState. In organism substanfele minerale implinesc funefii importante atat biochimice cat §i fiziologice. Jinand seama de aceste roluri, se infelege u§or necesitatea procurdrii regulate a mineralelor de cdtre rafia alimentard. O rape mixtil §i variatd - cu alimente de origin;! animals §i vegetalS - procurd, totdeauna, substanfe minerale in cantilSji adecvate. In ceea ce prive§te proporfiile, in organism unele minerale se gdsesc in cantitafi mai marl (aport de cca 100 mg/zij. Ele sunt numite macrominer ale. Din aceastii categoric fac parte substanfele minerale care cuprind elementele: calci-u, fosfor, sodiu, potasiu, clor §i magneziu. Principalele caracteristici biochimice si rolurile fiziologice ale acestor elemente sunt rezumate in taheiul XV. 8. Spre deosebire de macrominerale - care sunt necesare organismului in cantit&fi de ordinal miligramelor - alte minerale se gasesc in cantilSfi foarte mici, de ordinal microgramelor. Insa §i ele sunt absolut necesare pentru desf3§urarea in bune condifiuni, a tuturor proceselor vitale. Aceste substanfe se numesc oligominerale iar elmentele corespunzdtoare, oligoelemente, Sunt considerate esenfiale pentru organism urmdtoarele oligoelemente: cromul cobaltul, cuprul, iodul, ferul, manganul, molibdenul,seleniul, zincul §i fluorul. in tabelul XV.9 sunt rezumate principalele atracteristici ale acestor oligoelemente. Tabelul XV.8 1 2 3 Principalele caracteristicj ale macromineraleior esenfiaie Elemeni Sursele 1} Metabolismu Funcpile ul §i l Bolile sau Bolile sau necesar simptomele simptomele ul zilnic deficien$ei3> loxicitdpi Calciul Produse Absoib|ia. Constituent Rahitism la copii Survine in caz de 800lacate, necesitS al oaselor §i Osteomalacie la absorbfie excesi 1200 fasole, proteine dinfilor; adulfi Poate datoritS mg frunzele care leaga reglarea contribui la liipervitaminozei vegetalelor calciu. funcfiei osteoporozd sau hipercalcem Reglarea nervoase §i cauzatS de prin niusculare hiperparatjvitamina D, roidism, sau parathorhipercalcemia mon, idiopatica calcitonins Fosforul Boabe de Controleaza Constituent La copii rahitism Raportul Ca:+/Pj 800cereaie, absorbfia al oaselor §i La adulfi redos in ser 1200 fasole, vitaminei D. dinfilor, osteomalacie stimulea- za mg mazare, Nivelele intermediaril hipeitiioidism car- tofi, serice sunt or fosforilafi secundan poate

Sodiul 11003300 mg

morcovi; came, pe§te, pui, oua Sare (ciorara de so- diu), came de vita, came de pui; sfecla, morcovi

Potasiul 18755625 mg

Vegetale, fructe (nuci, banane, mere, struguri, portocale) boabe de cereaie

Clorul 17005100 mg

Sarea (clorura de sodiu)

Magnez iul 270400 mg

In vegetale cu frunze verzi (confinand clorolila).

reglate de reabsoibpa tinichiului Metabolismu l sau este reglal de aldosteronS

metabolici, ATP, acizi nucleici Cation principal m fluid extracelular. Regleaza volumul plasmatic, ecbi- libru acido-bazie, funcfia nervoasa $i cea musculard, Na7fC ATP - aza

Metabolismu l sau este reglal de aldosteronS Cation principal in fluidul intraceular; implicat in funcfia nervoasa §i muscular^, Na+/K+ - ATP - aza Implicat iii echilibrul lichi- delor §i electrolifilor, component al sucului gastric

Constituent al oaselor §i dinfilor, cofactor enzima- tic (kinaze, etc.) 1) Alte surse sunt detaliate in Tabelul XV. 19

conduce la pierd de substanfa osoasa. Necunoseute in cazul rafiilor normale. Deficienfa apare dupa diverse maladii sau r3nrri.

Hipertensiune (la persoane susceptibile)

Deficienfa de potasiu apare dupa raniri sau terapie cu diuretice; deficienfa de potasiu determine slabirea: tonusului muscular, paralizii, confuzii mentale. Deficienfa apare la copii mici hranifi cu ratii lipsite de sare. La adulfi deficienfa apare dupd vomismente, in caz de terapie diuretica §i in boll renale Deficienfa apare dup& malabsorbfie sau diaree sau in caz de alcoolism

Scaderea (oprire ritmului cardiac; ulcerul intestinu subfire

Scad mult reflex tendoanelor §i reflexul respirafi

2) In general, mineralele necesitS pentru absorbfie proteine de transport. Rareori absorbfia este completa; ea este afeclatd de alte substance nutritive din rafie (oxalati, fitaji care cheieaza cationii bivalenfi). TranspoituI §i depozitarea necesitd de aseraeni proteine specials. Excreta are loc prin fecale (pentru mineralele neabsorbabile) §i prin urind. transpira|ie, bil&. 3) Aportul de minerale in exces produce simptome toxice §i simptome nespecifice, diaree. iritabilitate. QC Tabelul XV. 9 Principaleie caracteristici ale micromineralelor (oligoeiementelor) esentiale Sursele1} Metabolismu!2) Funcpile Bolile sau Element simptomele al si deficienpi necesar til ziinic Cromul Drojdia de 0,05-0,2 here, boabe Cr3^ mg de cereale, constituent Reduce toleranfa la ulei de al "facglucoza; defigermene de toralui de cienla ca urmare a poramb, tolerant al hranirii parencame, peste. glucozei” terale Cobaltul Alimente de Necesar formarii Necesar Deficients de 5-8 pg origina animal moleculei de numai intrvitamina BI2 a vitamina B!2 atat cat constituent al vitaminei Bn Cuprul Legume verzi Transportat de Constituent 1,3-3 frunzoase, albumina; legal la a] mg legume ceruloplasmins oxidazelor uscate, ffucte Anemie hipocroma, (nuci, microcitard; straguri); deficients dupa came, malnutritie, sinciustacee dromul lui Menke Constituent al La copii: cretinism Sare iodinala, Inmagazinat in tiroxinei La adulfi: gu§S, Iodu] animale tiroida ca tireoglotriiodviro hipotiroidism. 150 pg marine bulina ninei mixedem Feral Transportat ca Constituent Anemie hipocromS, 12-15 Legume transferina; al hemoglo- microcitarS mg (patrunjel, depozi- tat ca binei §i al spa- nac, feritina sau enzimelor salata verde, hemosiderina, se care con£in varza), ffucte pierde prin celule hem/citocro (caise, nuci) descuamate §i prin mi oua, came sangerari

Bolile sau simpto mele loxicit

.

Toxicit rar iht nita; deficie s dupa malad Wilson Tirotox oza, guga

Sidero hemocroma S ered tara

Mangan ul 2-5 mg

Molibde nul 75-250 pg Seleniul 55-70 pg

Zincul 12-15 mg

Legume verzi, boabe de cereale, came, pe§te, pro- duse lactate, ceai

Legume verzi, unele cereale, came (rinicbi) Boabe de cereale, legume (ro§ii, ceap&)

Came (ficat), oua, lapte; boabe de cereale, drojdie de bere

Cofactor pentru hidrolaze. decaiboxiiaz e, transferaze. Participa la sinleza de glicoprotein e §i proteoglican i

Deficient necunoscuta la om

Intoxic ile prin inhala produc simpto e psitice Parkin nism Deficient^ secundara; in urma hranirii parenterale

Acfiune antioxidanta sinergica cu cea a vitaminei E

Constituent al glutation peroxidazei

Cofactor pentru multe enzime: lactat dehidrogana - za, fosfataza aleaiina, anhidraza carbonica

Deficient^ slaba cand solul este same in Se. Deficients secundarS. dupa nutii|ie parenteral^. §i dupa malnutritie proteicS §i energetics. Hipogonadism, intarzierea cre§terii §i a viridec&ii rSnilor; scaderea simtu- rilor gustului §i mirosului; deficien|a dupa acrodermatita enteropatic& §i dupS nutrifie parenterala Card dentare; osteoporoza (?).

Fluorul3 Apa potabila, Mare§te * ceai; alimente rezistenla 1,5-4 de origina oase- lor §i a mg marina dinfilor 1) Alte surse sunt detaliate in Tabelul XV.19 2) Aportul excesiv mineral determina simptome de toxicitate simptome nespecifice, diaree, mtabilitate. 3) Fluorul este esen|ial pentru cre§terea §obolanului. De§i la om fluorul m s-a dovedit a fi strict esenfial, fluorarile an un rol bine definit in prevenirea §i tratamentul cariilor dentare.

Megad ele determ ne pieide paiu- l deuna §i star de iiitabil e Intake gastro estinala, vomis nte

Fluoro dental

Trebuie subliniai faptul cd mineralele se afl! in organism tnir-o stransa §i continu! int.eifuncjionalitate. De aceea, infervenfia unei substanje minerale sau a unui element afecteaz! (stimuland sau inhibancl) funejionarea alter minerale. Acfiunile sinergice stimulative ale mineralelor se remarca, in special, in starile de sires fizic sau emotional. Daca asemenea star! se prelungesc, aportul substanjelor minerale din rajia alimentar! trebuie s! fie mftrit. S-a constatat, pe de alt! paxte, c! persoanele cu a port energetic sedzuda tori l! ditto.i urinate, varsfei sau sfilului de viaf! sedentar, nu-§i pot implini nevoile de substanje minerale. In asemenea cazuri interval sindroame mai mult, sau mai pujin grave. In ultima vreme, deficienjele minerale menjionate in Tabelele XV.8 §i XV.9 - au fost asociate cu o mare varietate de bob care au ms! mai mulji factori cauzali. Spre exemplu, boaia de inim! coronarian! a fost atribuit! deficienjii de oligoelemente. Dar aceast! atribuire nu poate constitui o eauzii exclusive eftei, dup! cum se §lie, exist'd mai mulji factori care - Tmpreun! - trebuie consideraji responsabiii cauzali ai bolii. Oricum, pan! nu se vor elucida muitiplele probleme referitoare la intervenjia §i necesarul nutritiv de oligoelemente, ramane vaiabild concepjia actual! potrivit careia nutrijia mineral*! optim! a omului s!n!los necesit! consum de alimente cu confinut mineral ridicat §i complet. XV.3.6. SUBSTANTELE ALIMENT ARE BIOACTIVE Intr-o rape alimentard obignuit! (complet!) cea mai mare parte a aportului alimentar este de origin! vegetal! (legume, produse din cereale, fructe), in care predomind. glucidele. Ele mai contin ins! §i aite principii nutritive; proteine, lipide, vitamine, minerale, ap!, fibre aiimentare preeum §i substanje bioactive. Substanfeie aiimentare bioactive includ numeroase combinafii chimice cu activitate biologic! marcati. §i care fac parte din diferite categoril de compu§i organici: alcooli, acizi, glicozizi, alcaloizi etc. in Tabelul XV.10 este prezentat! o scurlS-clasificare a. unor categoril de substanje aiimentare bioactive, menfionSndu-se pentru fiecare categoric - dup! eaz - exempie, insu§iri sau sursele vegetale care le cuprind §i din care, pot fi procurate. Tabelul XV JO Uncle category de prindpii aiimentare bioadive 1. Enzime vegetale. 2. Fitohomioni (heteroauxina, honnon de cregtere pentru plante). 3. Pigmenji vegetal! (carotenoizi, flavonokie) 4. Glicozizi (glicozizi! cardiotonic!, ami.gdalina, solamina). 5. Alcaloizi (cofeina, teofilina, ieobromina, nicotina, chinina). 6. Uleiuri eterice. §i r&§ini (menta, portocale, marar). 7. Acizi. organici (din fructe §i legume - confera gust.acru). 8. Taninuii (imprirna gust astringent). 9. Substanje antibiotice §i fitoncide (ceapa, usturoi, lirean). 71.9 v

Suhstanjele alimeniare bioactive se gasesc in cantitd.fi relativ marl in numeroase piante medicinaie folosite curent in scopuri farmacologice sub formal de ceaiuri (de mdtase de porumb, cozi de cire§e, izmd, mu§efel, sundtoare). Cercetdrile moderne au ardtat. oil substanjele alimeniare bioactive

influenjeazd funcjiiie unor organe interne in doze infinitezimale. Da tori efectelor multiple exercitate asupra ficatului, pancreasului, stomacului, intestinului, sistemului circulator, sistemului nervos, rinichiului, glandelor endocrine, prezenja constants in organism a principiilor bioactive este imperioasd. De aceea, rajia zilnicd trebuie sd cuprindd alimente cat mai variate asigurandu-se astfel procurarea aces tor substanje atat de necesare. Este de remarcat faptul cd muled vreme semnificajia nutrijionald a substanjelor bioactive nu a fost sesizatd. Aceasta se datoreazd faptului cd atat cre§terea cat §i dezvoltarea organismului nu sunt afectate de ahsenfa principiilor bioactive (a§a cum sunt afectate de lipsa altor principii nutritive: proteine, glucide, lipide, vitamine, minerale). Pe de altS parte, in majoritatea alimentelor (vegetale) suhstanjele bioactive se gdsesc in cantitdfi mici §i de aceea nu s-au putut clecela decat. folosind tehnici fine §i precise. XV .3.7, FIB RELE ALIMENT ARE Ca §i substanjele nutritive bioactive, fibrele alimeniare sunt principii de natunl vegetald, aflate in rajia obi§nuitd (complete) a omului. In general, aceasta categoric de substanje include principiile energetice ale hranei nedigerabile de cdtre enzimele intestinale §i neabsorbabile prin mucoasa intestinal d. Cercetdrile au dovedit insd cd in aceea§i categoric a fibrelor alimeniare pot fi cuprinse §i substanje de felul gumelor, gelurilor, mucilagiilor. Intr-adevdr, deji acestea din urmd nu au o structure fibrilard ele prezintd o serie de propriety care justified inglobarea in categoria fibrelor alimeniare. In decursul timpului, fibrele alimentare au fost clasificate dupd diverse criterii. Astfel, Jinandu-se seama de rolul pe care-1 irnplinesc in plantele edrora aparjin, fibrele vegetale (§i totdatd, alimentare) au fost grupate in trei mari categorii: -fibre structurale (celuloza, lignina, unele hemiceluloze, pectine); -game §i mucilagii; -polizaharide de depozit. Fibrele structurale intrd in componenja (structura) perefilor celulari ai pianielor; gumele §i mucilagiile au rol in reconstruirea regiunilor vegetale vdtdmate iar polizaharidele de depozit reprezintd rezervele nutritive ale plantelor. Din punct de vedere al comportdrii lor fajd de acizi §i baze, fibrele se impart in doud grupe: -fibre insolubile in acizi $i haze (celuloza, lignina, unele hemiceluloze); - fibre solubile in acizi §i baze (pectine, unele hemiceluloze, gume, mucilagii, polizaharide de depozit). Fibrele insolubile in acizi §i baze se mai numesc „fibre brute“. Aceastd grupa este restransd, cuprinz&nd aproximativ jumdtate din categoria fibrelor vegetale deoarece in cursul extraejiei (cu acizi sau cu baze) se Indepdrteazd aproape toji pentozanii: 80% din hemicelulozd, 90% din lignind §i aproximativ un sfert (20-25%) din celulozd. 720 Din punct de vedere al constitufiei lor chimice, fibrele vegetale se impart in unri&toarele categorii; - Celuloza: polimer liniar al glucozei, format din circa 3000 unitaji; - Hemicelulozele: polimeri polizaharidici diferiji; mai mult de 2500,

constituip din pentoze §i hexose; - Pectineie: polimeri de acid galaeturonic; - Lignina: polimer de fenilpropan; ~ Gumele, mucilagiile, polizaharidele de depozit: polizaharide foarte ramificate, nefibrilare, conpnand acid galaeturonic, acid glucuronic, xilozd, arabinoza gi manoza; - Alte substance eterogene: acid fide, steroli vegetali, saponine, taninuri. Dupil cum fezultS din aceastd clasificare, este de remarcat cd majoritatea fibreior vegetale care intrd in rafia alimentary a omului sunt polimeri glucidici. Ultima categoric din clasificare nu cuprinde polimeri glucidici dar in intestin prezintd comportamente asemdndtoare cu fibrele gi - de aceea - au fost grupate impreund. Trecand in revista fiecare categoric de fibre din ultima clasificare, este necesar sa se facd unele precizari cu privire la proprietdple lor mai imporlante. Celuloza este irisolubild in apd gi nescindatd de ciitre enzimele tubului digestiv al omului. Enzimele din flora intestinal# saprofitd scindeazd, in unitdp structurale, cca. 15% din fibrele celulozice. Cu toate acestea, produgii rezultap nu sunt absorbip prin peretele intestinal. Hemicelulozele. In intestin ele cu capacitatea de a refine apa gi de a fixa (lega) unii cationi. Enzimele florei bacteriene din intestin hidrolizeazd cca 85% din hemicelulozd dar, ca gi in cazul celulozei, produgii rezultap nu sunt absorbip in organismul omului. Pectineie pot forma geluri datoritil uiiei mari hidrofilii pe care o au gi, la fel cu hemicelulozele, pot lega unii cationi sau acizi (acizii biliari din intestin). In intestinui gros, unele enzime aflate in flora saprofitd scindeazd cca. 95% din pectin# dar acidul galaeturonic rezultat nu este absorbit. in organism. Lignina este un copoiimer aromatic; deci nu este de natunl glucidicd. Se consider^, ed reprezintd componentul vegetal , cel mai pujin digerabil. In alimente ea intrd in proporpi diferite: se afld in cantitate mai mare in cereale gi mai pupnd in legume gi fructe. In intenstin lignina fixeazd sdrurile biliare gi alte subslanje organice, ceea ce poate determina sedderea absorbpei intestinale pentru alte principii nutritive. Dupd cum s-a mai menponat, gumele, mucilagiile, gelurile §i polizaharidele de depozit nu au structure fibrilard (nu intrd in constitujia peretelui celular al plantelor). In intestin ele au o capacitate red usd de fixare a cationilor dar, datoritil absorbpei apei, formeaza geluri care leagd acizii biliari sau alte subslanje organice. In categoria subslanielor vegetale nedigerahik intrd acidul fitic gi sdrurile lui (fitapi) care au capacitatea de a lega cationi. Astfel se pot explica unele pierderi digestive de fer sau zinc. Din examinarea principalelor caractere ale categoriilor de fibre alimentai*e, cuprinse in ultima clasificare, se pot desprinde rolurile lor fiziologice, dcosebit de favorabile, pe care le implinesc in intestin: (1) absorbpa apei (in special, prin rejinere in ochiurile rejelei de fibre); (2) modificarea digestiei gi absorbpei unor principii nutritive, explicat'd de faptul cd gelul format de fibre face o fillrare selective, in funepe de dimensiunile particulelor digerate; (3) modificarea tranzitului intestinal (durata tranzitului este invers proporponald cu cantitatea fibreior alimentare din rape); (4)

absorbpa unor substanfe 721 organice toxice sau cu potential carcinogenetic (in special, produ§ii rezultaji din degradarea aciziior biliari sub acjiunea florei bacteriene); (5) legarea unor cation! (Mg2+, Ca2+, Fe2+, Zn2+); (6) acjiunea hipolipemiantH (in special, scMerea concentrator colesterolului §i trigliceridelor din sange). Reducerea absorbfiei lor intestinale, prin intervenjjia- fibrelor vegetale, ar fi explicat'd de fixarea pe fibre a colesterolului §i a aciziior biliari. (7) Fibrele mai solubile contribuie iaatenuarea cregterii niveluiui glucozei in sange imediaf dupa Iuarea mesei (datoratd reducerii secrefiei insulinice). Aportul insuficient de fibre alimentare in rajie (mai mic de 20 g/zi) poate conduce, cu timpul, la instalarea unor afecjiuni grave, men|ionate in Tabelul XV. 11. Se consider# cd proporpa optimd, necesara, de fibre, alimentare in rafia zilnicd este de 30 g pentru persoane cai'e depun efort fizic mediu §i priinesc prin rajie 2700 Kcal/zi. Apoitul de'fibre alimentare trebuie sd lie totdeauna direct proportional cu aportul caloric al rajiei. Asigurarea unui aport. corespunzdtor de fibre alimentare se realizeazd prin introducerea in rajia zilnicd a iegumelor, fructelor §i prin consumarea de paine fdcutd din fdind integral# sau cu confinut bogat de tdrafe. Ins# aportul dc fibre alimentare nu trebuie sd dep#§easc# 50 g/zi deoarece - datorit# efecteior de absorbjie §i legarea ionilor tit intestin - se pot produce pierderi de principii nutritive minerale (Zn, Mg, Fe, Ca) sau tulburSri in utilizarea unor vitamine (B6, B12, C). Tabelul XVJ1 Afectium datorate partial consuimilui de ratii sarace !n fibre alimentare Afecliimi metabolice Afecjiuni determinate de determinate de scaderea tn volum a scaderea cu 30% a. conjinulului intestinal aporlului de fibre Colon iritabil Cardiopatie ischemica Constipate Diabet Cancer de colon Obezitate Divex'ticulita intestinala Dislipemii Apendicita cronica Sarcina toxica. Varice Litiaza biliara Hemoroizi Carii dentare XV.3.8. APA Apa este socotit# drept alimented indispensabil care asigurdin organism desf#§urarea normal# a metabolismului tuturor celorlalte principii nutritive. Totodat#, apa este cel mai abundent principiu nutritiv deoarece reprezint# cca 2/3 din greutatea corpului. 722 In corpul unui adult sSnfttos §i aflat in condifii normale se gftsesc - in medie - 45 litri ap&. Din aceasta se pierde aproximativ 3 litri zllnic prin excrefie, transpirafie gi perspirafie. Pierderile de apfi ale organismului depind aproape total de natura activity|ii depuse gi de condifiile mediuitti inconjurator. Aceste pierderi pot fi cuprinse inti*e cantitaji mai mici de I

litm/zi la per,soane sedentare aflate in climS temperate gi cantitaji mari, de cca 10 Iitri/zi, la persoane care desf&goarft munca la lemperaturi ridicate. Dacft pierderile mari ds ap& nu se corecteazS imediat prin inger&ri masive de'apS, lapte, firucte gi zarzavaturi (Tabelul XV. 12), in organism apar deficienfe severe cu repercusiuni foarte grave. Una dintre acestea este deplefia de sare (clorurS de s(xliu) care insofegte adesea deshidratdrile inaintate. Tabelul XV.12 ConUnutuI In apa ai unor aEimente si bSutur! aflate in rajia zilnicd Alimeriud sail Conjiwaul in apabautura (%) Paine alba 35,8 Morc-ov 88,2 Mere 84,37 Fere 83,83 Struguri 79,12 Pepene verde 94,96 Lapte total 87,4 Lapte smanlanit 90,5 Vin ' 85,6 Bere 92,1 On (fieri) 73,7 Zahar rafinat 0,5 Uiei • — XV.4. PRINCIPALELE PRODUSE ALIMENTARE Produsele alimentare cele mai imporiante gi frecvente in rafia omului se impart in dou& mari categorii: 1) produse alimentare de origine animals gi 2) produse alimentare de origine vegetahl Aceastd clasificare nu corespunde numai diferenjei de origine a produselor; ea fine seama - totodalft - gi de unele deosebiri in compoxifia chimicft a alimentelor respective. Intr-adevftr, cu excepfia lopteiui, toate produsele alimentare de origine animals sunt Iipsite aproape complet de glucide pe cand cele de origine vegetal^ sunt bogate in glucide dar euprind mai pufine proteine §i lipide. Pe langft aceste doutl mari categorii se consider^ c;1 exists gi o a treia categoric (mai res- transS) de produse alimentare gi cam cuprinde: produsele zaharoase, Ixluturile gi condimentele. Categoriile de produse alimentare menfionate sunt descrise in cele ce urmeazH. 723 XV.4.1. PRODUSELE ALIMENTARE DE ORIGINS ANIMALA Laptele §i produsele lactate Vaioarea nutritiva a laptelui a fost recunoscutS din cele rnai vechi timpuri; el fiind considerat totdeauna drept un aliment complet. Intr-adevftr, laptele confine pe lang3 cele trei categoni de principii imediale (proteine, iipide, glucide) importante minerale §i vifamine. Proteinele. • Acestea sunt: cazeina, lactoglobulina §i lactalbumina. Ultimele doua proteine enumerate sunt constituite, fiecare, din rnai multe

fmcjiuni.- Dintre fracjiunile lactoglobulinice, mai bine cunoscutiS §i cercetatft este (3 - lactoglobulina. Aceasta, irnpreunfi cu cazeina, reprezintS proteinele complete ale laptelui deoarece cuprind toj'i aminoacizii esenjiali. Cazeina este o fosfoproteinS care - in lapte - se aflA asocial cu calciu (cazeinat de calciu), fiind distribuita sub forma unei solujii opalescente ce confer^, in parte, opacitatea alba a laptelui. Lipideie,. In lapte lipideie se gSsesc distribuite sub forma unei emulsii. foarte fine §i stabile. Ele sunt trigliceride, lecitine §i colesterol. Lipideie laptelui reprezintS cele mai gustoase §i - totodahl - cele mai digerabile gr&simi cunoscute, diferind de toate celelalte prin compozijie: cuprind top acizii gra§i saturaji cu nunulr par de atomi de carbon (de la C4 la C24) §i nmlfi acizi gra§i nesalurap. Glucidete. Glucidul caracteristic al laptelui este Iactoza (dizaharid constiluit din glucozft §i galactozS). Lactoza este mai pupn dulce decat zaharoza. Elementele minerale. Cele mai rejarezu/fative elemente minerale din lapte sunt: calciul, fosforul, sodiul, potasiul §i clorul. In sdm. \ laptele cuprinde foarte pupn fer. DatoritS acestuijapt, survine uneori anemia feriprivu in cazul unui consum prelungit §i exclusiv lactat. Insft iipsa ferului din laptele matern nu dauneazfi sugarilor deoarece ei se nasc cu o rezervfi de fer care le acopedl necesarul pentru aproximativ 6 luni. Dup3 acesi timp, lipsa ferului din lapte poate fi suplinitfi de cel aflat in g£Ubenu§ul de ou §i in preparatele fainoase cu care se suplimenleazfl hrana sugarilor. Viia.mi.nele. Vitaminele laptelui aparpn ambelor categorii: liposolubile §i hidrosolubile. Dintre cele hidrosolubile predominh: riboflavina, piridoxina, niacina, acidul panlotenic §i vitamina B,2. Vitamineie liposolubile (A, D, E §i K) se af!3 concentrate in fracpunea gras3 a laptelui. In schimb, laptele este sflrac in tiamina §i vitamina C. Proporfiile in care se gasesc in lapte diver§i-i constituent variazii in raport cu specia de la care provine laptele respectiv (Tabelul XV.13). Tahelul XV.13. Compo/Jtia procentuala a laptelui provcnit de la diferite sped! Substance Protein Gras Specia Lactoza minerale e. inn' (cenu§a) Femeie 1,0* 2,9 6,7 0,2 ■ Vaca 3,7 3,5 4,5 0,75 Capra 4,2 4,1 4,6 0,8 Bivolija 4,3 8,2 5,0 0,8 Oaie 5,7 6,8 4,5 0,85 * Valorile din tabel stmt expiimate in grame pentru 100 nil lapte. 724 Datoritd proporfiilor diferite de constituent! este foarte greu sd se inlocuiascd iaptele de brand a! unei gpecii cu Iaptele provenit de la alul specie, Cu privire la compozifia cantitativd a laptelui de femeie, menfionatd in Tabelul XV.13, este de remarcat cd ea se refers la cel cu care se hrdnesc sugarii dupd catva timp de la nagfere (nu in primele zile). Imediat dupd nagtere glanda mamard secreta colostrul care cuprinde o proporfie mai mare

de proteine; cel pufin dubld decat Iaptele obignuit. Dintre proteinele care predomind in colostru se remarcd lactoglobulinele, considerate aproape identice cu y - globulinele din plasmd. in aceastd fracfiune globulinicd din lapte se gdsesc numerogi anticorpi protectori, ceea ce explicd imunitatea conferitd de Iaptele matern pentru nou-ndscufi. Pe iangd lapte, ca atare, in hrana omului intrd gi unele produse lactate. Principalele produse lactate folosite in alimentafie sunt: smantana, untul, branza gi produsele lactate acide. Smantana. Dacd Iaptele proaspat nu se fierbe ci se pdstreazd catva timp, fdrd. a-1 agita, se observS cd grasimea pe care o cuprinde se concentreazd la suprafafa sub forma unei pdturi. Aceasta este smantdna care confine 3035% lipide. Odatd cu Iipidele, In smantand se concentreazd gi vitamlna A din lapte. Aldturi de aceasta, smantana mai cuprinde gi alfi constituent ai laptelui (proteine, sdruri, lactozd). Untul. Prin agitarea dirijatd a smantanei se separd Iipidele, constituind untul. El confine peste 80% din Iipidele laptelui. Totodatd, in unt este concentratd aproape intreaga canlitate de vitamind A din lapte. Binexnfeles, ca gi smftntdna, untul mai cuprinde gi proteine, sdruri, lactozd. Branza se obfine prin separarea cazeinei (asociatd cu o cantitate mai mare sau mai micd de lipide) din lapte. Exist'd diverse varietdfi de branzd (de vacd, de burduf, cagcaval, schweitzer) obfinute in condifii deosebite de preparare. In compozifia branzei (de once fel) intrd urmdtoarele substanfe: apd (25-40%), proteine (16-26%), lipide (18- 30%), substanfe minerale (0,54%) gi foarte pufine glucide. Produsele lactate acide. In aceastd categoric intrd: Iaptele bdtut gi iaurtul. Aceste produse lactate acide au o deosebitd valoare nutritivd; cu totul asemdndtoare celei a laptelui dulce iar constituenfii se afld sub forme ugor asimilabile. Pentru acest motiv ele sunt folosite mult atilt in alimentafia omului sdnatos cat gi a unor bolnavL Oudle Aga cum Iaptele este alimentul complet gi special produs pentru hrana mamiferului tandr, tot astfel oui de pasdre reprezintd alimentul complet §i anume alcdtuit pentru embrionul de pasdre. In cele menfionate aci, se fac referiri numai la constitufia oului de gdind care - dupd cum se gtie - pe Iangd faptul cd. asigurd dezvoltarea embrionului de pui, reprezintd §i un exeelent aliment pentru om. Oui (de gdind) este constituit din coajd (11%), aihug (59%) §i gdlbenug (30%). Partea sa comestibild (albugul §i gdlbenugul impreund) cuprinde: proteine 13%, lipide 11,8% glucide 1% gi sdruri minerale 0,8%. Deoarece albugul confine 88% apd el poate fi considerat drept o solufie de proteine gi sdruri. Majoritatea proteinelor din albug este format# din albumine; in cantitate mai 725 mare se afld ovalbumina iar in proporjie mai micd ovomucoidul §i avidina. Aceasta din unnd formeaza o combinape complex^,' slabild, cu biotina impiedicand-o sd~§i exercife acjiunea sa vitaminicd. Insd. prin fierbere avidina se denatureazd §i ea. In felul acesta, albu§ul coaguiat (inlarit) nu mai pdstreazd capacitalea de a inhiba biotiria, Gdlhenu§ul este mai consistent; decat. albu§ul (coniine 49% apa).

Gdlbenu§ui se deosebe§te de albu§ §i prinlr-un conjinut mare de lipide §i viaimme. Lipideie din gdlbenu§ (33%) sunt in maxea ior majoritate (30%) fosfolipide iar restul (cca. 3%) colesterol allat in stare emulsionald. Fosfolipidelc din ou sunt de tip lecitine, bogate in colind §i acizi gra§i nesaturaji. Gdlbenu§ul cuprinde §i el proteine imporlante, complete, con]in2nd top aminoadzii esenfialL Dintre elementele minerale, in gdlbenug predomind: calciul, ferui, fosforul (ca fostap), sulful, potasiul iodul, manganul §i cuprul Gdlbenu§ul este - totodatd - §i o bogatd sursd vitaminicd. El conpne vitaminele liposolubile A, D, E iar dintre cele hidrosolubile predomind vitaminele B2 §i B(r GSlbenu§uI nu conpne insd vitamina C. Carnea Valoarea nulritivd §i eompozipa chimicd a carnii, cu care se hrdne§te omul, variazd relativ pujitt In raport cu specia de la care ea provine. De aceea, con.siderap.ile fdcute aici privesc deopotrivd carnea dc vacd, vijel, berbec. rniel, pore §i pasare (Tabelul XV.14). Tabelul XV.14 Contmutul carnii fn apa, pHncipii {mediate §( substance minerale Substa Specia de Protein nce pro\>emen{ Apd Lipide Glucide e mineral a a carnii. e Vaca. 39* 17,4 8,3 0,3 0,194 . Vifel , 64 17,1 7,4 0,3 0,224 Berbec 43 14,1 18,2 0,2 0,677 Mi el 77 20,1 o2 Pore 33 10,1 13,7 0,2 0,607 Gasca 70 16,4 31,5 0,817 Gaina 70 21,6 2,7 0,243 Raja 72 16,0 28,6 0,661 * Valorile consemnate in label reprezinta procente din prod us ul analizat. Cei mai important constituent ai cdi*nii este reprezentat de proteine iar dintre ele, cea mai valoroasd este miozina care predomind in jesulul muscular. Miozina este o proteind completd §i de valoare nulritivd egald cu cea a proteinelor din lapte §i oua. Se considerd eft, practice carnea nu coniine glucide. In realitate, ea cuprinde cantildji foarte mici (sub 0,5%) de glucide iar ficatul coniine cantilaji apreciabile de glicogen. Dintre minerale, carnea cuprinde - in gqnere - mult fosfor (ca §i gdlbenugul) dar pujin calciu (a 10-a parte din cel aflat in lapte). In schimb, carnea conjine cantitftji mai mai*i 726 de potasiu, dor gi sodiu. In proporfii 'mai mici - dar totdeauna prezente - in came se g#sese elementele mineraie fer gi cupru. Printre vitaminele din constitufia c#rnii se remarc# cede din complexui B (in special, tiamina, riboflavina gi niacina). Carnea conjine pufine vitamine liposolubiie gi vitamin# C. Numai ficatui animalelor menfionate in Tabelul XV. 14 cuprinde proporfii mai man de vitamine liposolubiie gi cantitafi importante de riboflavin# precum gi de vitamin# Bl2, Pegtele Xesutul muscular ai pegtilor este constituit din aceleagi substanfe ca gi

cel provenind de la animalele menfionate anterior (Tabelul XV. 14) iar proporfiile in care inti# majoritatea principalilor constituent ai carnii de mamifer sau pas#re gi ai celei de pegte sunt mult apropiate (Tabelul XV. 15). Exist! ins# deosebiri in ceea ce privegte proporjia de lipide deoarece carnea de pegte conjine - in genere - pufine substanfe grase. Totugi, unele variet#fi de pegte fac excepfie din acest punct de vedere; spre exemplu, scrumbiile confin cca 13% lipide. in lipidele pegtilor predomin# acizii gragi superior! nesaturafi. Pentru acest motiv pegtele este considerat o surs# excelent# de acizi gra§i esenlialL Majoritatea proteineior din Jesutul muscular al pegtilor sunt de natur# superioar#, cuprinzand aproape tofi aminoaazii esenpali iar elementele mineraie sunt din cele mai valoroase pentru organismul uman. In funcfie de natura pegtilor (de ap# dulce sau marini), elementele mineraie predominate sunt diferite. Astfel, pegtii de ap# dulce eonjin - in special magneziu, fosfor, fer gi cupru iar cei de ap# strata sunt bogaji in iod, fiuor, cobalt; vanadiu gi zinc. Ficatul anumitor pegli (mbrrhua, ton albastru) reprezint# o prefioas# surs3 natural# de vitamine A gi D. Dintre vitaminele hidroso- lubile, caniea de pegte cuprinde in special: niacina, vilamina B, gi B 2. In Tabelul XV. 15 sunt prezentate valorile procentuale in care se g#sesc principalele substanfe nutritive din constitufia fesutuiui muscular al unor pegti de ap# dulce gi marini. Tabelul XV.15 Constituents! principals as tesutukii muscular de peste Substa Felui pe§telui Protei Lipid Gluci nfe Denum Apa ne e de minera Caiegoria irea ie De apa dulce Crap 33* 7,5 3,9 0,121 ■ gliuca 18,7 0,6 0,772 Pastrav 19,2 0,760 0,1 De apa sarata Morun 38 16,5 0,4 . 0,783 Scrumb ie 35 18,7 12 0,827 Calcan 14,9 10,5 0,721 * Valorile din label reprezinta procente din produsul analizal 727 Din datele Tabelului XV,15, precum §i din cele menfionate anterior, rezuM cd includerea pe§telui in rajia alimentary a omului este cat se poate de indicate. Trebuie tuate insa precaujii privind consumarea sa deoarece camea de pe§te se altereazd foaite u§or.' XV .4.2. PRODUSELE ALIMENT ARE DE ORIGINE VEGETALA Se obi§nuie§te a se grupa alimenlele de origind vegetald in urmStoai'ele trei mari categoric (1) cereale, (2) legume §i (3) fructe. La randul lor, Iegumele §i fructele se grupeazd in mai multe subcategorii. Cerealele Cerealele folosite de obicei pentru hrana omului sunt: graui, porumbul,

orezul §i secara, Deoarece in aiimentajie se folosesc preparate care au la baza fdina objinutd din boabele (seminjele) cereaielor, in cele ce urmeazd se fac - mai intai - unele eonsiderajii cu privire la constitujia boabelor. Constituent principali ai seminjeior (boabelor) de cereale sunt: apa (11%), proteine (11%), glucide (70%) §i minerale 2%. Frocentul de lipide este variabii: 0,5 - 8%. . Proteinele fac parte din categoria celor simple §i anume: prolamine, globuline, albumine, gluteline §i gliadine. Lipidele cereaielor conjin cantitdji apreciabile de trioleind §i, de aceea, se gdsesc sob forma, lichidd la temperatura obi§nuit&. Glucidele sunt reprezentate, in cea mai mare parte, de amidon §i - intr-o proporjie mai mica - de celulozd. Elementele minerale sunt loealizate atal in slraturile de invelig ale bobului cat §i in embrion. Cele mai abundente sunt: potasiu, magneziu, calciu §i fosfor. Ullimele dou& elemente minerale citate se afld, In parte, sub forma de acid fine (hexafosfatul inozitolului). Acidul fitic - ca atare - nu este utilizat de catre organismul omului; de asemeni, el impiedica absorbjia calciuIuL Pentru acest motiv, se considers ed cerealele au un elect anticalcifiant. Exist'd insa unele cereale (grau, seem'd) care conjin o enzirnd. (iitaza) capabiid sd hidrolizeze acidul fitic, diminuand astfel efectul anticalficiant. Orezul este cereala cea mai sdracd in proteine, lipide §i minerale. In schimb, bobul de orez este foarte bogat in amidon (cca. 80%). Porumbul este o cereaid cu bobul bogat in lipide (cca. 4%). Din embrionul bobului de porumb se extrage a§a - numitul ulei de germene de porumb, cu mare valoare nutritivd deoarece conjine acizi gra§i polinesaturaji, esenjiali. Proteina principals din porumb este zeina cu conjinut scdzut in aminoacizi esenjiali, fiind lipsitd complet de triptofan §i lizind. Pentru acest motiv, ea este consideratd o proteind cu valoare biologicd redusd. De asemeni, porumbul este sdrac in vitamine din complexul B. 728 Faina §i painea Pentru prepararea fainil albe (70% extracfie) se indep&teaz# - in timpul rn&cinatului - tarafa §i germenele (in proporjie de 30%). Faina integrals se obfine prin mScinarea intregului bob. Pentru ca sS poabS servi ca aliment, faina - care confine amidon insolubil treboie sS devinS. u§or digerahilfo Modul cel mai potrivit de realizare a acestui deziderai este transformarea sa in paine (panificafia). Panificafia se bazeazS pe proprietatea glutenului (constituit din giiadinS §i gluteliml) de a forma cu apa o cocfo In procesul panificafiei coca „cre§te‘\ adicS i§i mSre§te voliimul §i devine afSnatfi refinand in masa ei dioxid de carbon produs de fermentafia alcoolicS a giucozei sub acfiunea drojdiei de here. La randul sdu, glucoza provine din amidon sub acfiunea amilazei din fainl Prin coacere, coca crescutS se intSre§te luand aspectul spongios al painii. TotodatS, in timpul coacerii o parte din amidonul insolubil al fftinii este transformat in amidon solubil §i dextrine care reprezintS compu§i u§or digerabili. In afarS de paine, din fSinS se mai fac §i alte preparate (fSinoase §i de patiserie) erne intrS in alimentafia cuienta a omului; macaroane, tSifei, biscuifi, cozonac, prdjituri etc. Legumele

Legumele constitue o categoric de vegetale foiosite mult in alimentafie deoai'ece cuprind numeroase substanfe nutritive §i pot fi .preparate in moduri foarte variate, Spre deosebire de alte categorii de vegetale, legumele ofenf - ca paite comestibilS - fie una din regiunile lor constitutive (r5d&cina, tulpina, bulbul, florile, fructele, semin fele, frunzele) fie plantele in Tniregime. Din punct de vedere al compozifiei lor chimice, legumele conjin muM ap& (75-95%), glucide (1-2%) §i cantitafi reduse de proteine precurn §i de gr&simi. In schirnb, legumele cuprind proporfii important e de vitamine §i elements minerale. Legumele sunt grupate in 10 clase: (1) rftdScinoase, (2) bulbifere, (3) tuberculifere, (4) varzoase, (5) fructoase, (6) p&stdioase §i boabe (leguminoase), (7) frunzoase, (8) condimentare (9) perene §i (10) ciuperci comestibile. Aceste categorii - ilustrale prin exemple - §i cu speciticarea constituenfilor caracteristici sunt conserrmate in Tabelul XV,16. Fructele Fructele sunt alimenle de origin^ vegetala care au o valoare energetic^ aproape dubl& faffi de cea a Iegumelor. AceasLl proprietate este datoratd confinutului lor bogat in glucide: zahaiwi simple (glucoza, fructozS), zaharozft §i amidon in fructele tropicale (banane). Fructele conjin §i mulle vitamine precum §i elemente minerale. Proteinele §i lipidele nu intra decat in cantMfi foarte mid in compozifia fructelor. Ins& unele fructe (nuci, mdsline) confin multe lipide si, de aceea, sunt foiosite pentru extragerea uleiurilor respective. Cu excepfia vitaminelor, in Tabelul XV.17, sunt rnenjionafi constituenfii principal! ai unor fructe foiosite curent in alimentafia omului. 729 Da.toritft compozi|iei lor bogale in elemente nutritive fruetele trebuie sft be neiipsite in ra{ia alimentarft, complete, a ornului. Eilcienfa maxima o are consumul de fructe proaspele calci oricare ar fi formele de conservare, acesfea contribuie la pierderea unora din principiile lor nutritive. Cu privire ia consumul fructelor proaspele esfe preferabil sf\ se m&nance cele bine coapte caei conjin proporjii rnai mari de zaharuri simple, asimilabile u§or, fopl de fruetele necoapte (verzi). Daca din cauza unor afeepuni este indicat numai consumul fmctelor sub formfi de eompot, fierberea trebuie sd fie vapidft, evitandu-se pierderile de substanjc nutritive. Tabelul XV. 16 Principalcle categorii de legume folosite in ra|ia alimentary §i constitmmjii lor caractcristici Catego Example Constituienji • Ulilizari ft ria de caractcristici aefurni legume 1

2

3

4

R&dSci noase

morcov

vitamine: Bit B2; caroten elemente mineraie: Fe, Cu, Ca, P

Se folose§te in tratamen- tul colitei

(fosfat) substanje peclice pfitrunjel p&st&mac

telinit

ridiclii

sfeclii

Tubercu cart of lifere

Bulbifer e ceap& usturoi praz

730 I 2 VArzoas varzA e

vilamina C uleiuri volatile, eterice uleiuri volatile, eterice vitamine: B|5 B2, C vitamine: A, complex B.C. saruri de calciu substance aromate vitamine: Bit B2, C; compu$i sulfurap specil'iei glueide vitamine: Bj, B2, C mineraie: K, Ca, P radicali metil Lib eri amidon asparaginX. luberina (proteinft) vilamina C; Fe

plants condimentanl plants condimenlarS are aejiune diuretic^ (ceai)

an aejiune diuretics constituienjii iau parte la diverse biosinteze in organism §i proeese de .de- toxifiere in Beat aliment de bazS hidrocarbonat (substituent a] eerealelor)

glueide vitamine: complex B, C uleiuri volatile elemente mineraie: Ca, P

vermifug vermifug

3 substance tioanogenetic e vita- mina C, minerale: Ca

4 Xrnpiedica fixarea iodului In tiroidA

aejiune colagogfi

guite conopidA Fructoa se

patlAgele vinete tomate arciei

castrave|i

PAstaio a.se §i legumi noase

dovlecei fasoie, mazSre, linte, barne, soia

Frunzoa spanac, sal at A se verde, lobodA, m&cri§ Condim entare

Ferene

Piper, mu§tar, boia, usturoi, ceapA, praz, hrean, chtmen, cimbru, leugfean, mArar, tar- hon, pStrunjel, dafin, scopi- §oarA, vanilie, anason sarea de hucatarie Sparanghel Anghinare Hreanul

vitamins: complex B,C,K minerale: Ca, K caroten, vitamine B,, B2, C minerale: Fe,K,Ca,Mg,P, Cl ascorbatoxida za: descompune vit C minerale caroten §i vi.ta.mme B,, B2, C, E, PP minerale: Ca, K, P, Fe, Mg pioteine glucide (in formele uscate) §i lipide: acizi gra§i esen'Jiali vitamine; B,; B2, E, K caroten minerale: Fe, P, Ca, Cu, K oleiuri eterice cu mi.rosuri aromate.

valoare nutritivA redusa

Foloeite in forma proaspAtA §i u scatA la prepanurea rnancamrilor §i produselor zaharoa.se

Cl, Na, Mg, Ca, I diuretic elect colagog glucide vitamina C enzime (peroxidaza)

minerale: K, Ca, Mg, Fe Ciuperc Diverse i varielAJi comesti bile

Drojdia de here

apA minerale:K, P, Fe, Ca, Mg, Cu, Na vitamine: A, Bj, B2, C, D protein e lipide foarte bogalA in vitamine din complexul B

731 Tabelul XV. 17 IYincipiile nutritive din constitutia unor fructe Fruct Apa . Lipi Subs e Prot de Glucide tanc eiae fara celuloza e celuloza mine rals 84,3 Mere 7* 0,40 12,13 1,98 0,42 83,8 Pere 3 0,35 9,16 0,29 Prun 82,7 e 8 0,66 10,08 5,41 0,71 Vi§in 80,5 0,4 e 7 1,29 3 11,17 0,52 Strug 79,1 0,48 uri 2 1,01 15,21 _ ' Porto 84,2 cale 6 1,08 6,08 6,08 Pepe ne verd 94,9 0,0 e 6 0,72 6 4,13 0,10 0,28 Pepe ne galb 91,5 0,1 en 0 0,83 3 6,35 0,66 0,52 Capg 86,9 0,4 imi 9 0,59 5 0,24 2,32 1,82 Zme 85,1 0,40 5,33 2,92 0,49 ura 2 * Valorile consemnate in tabel reprezinta procenle din prod us ul analizat. XV.4.3. ALTE PRODUSE ALIMENTA.RE

A§a cum s-a mai men^ionau o grupii micii de produse alimentare cuprinde: produsele zaharoase, b&uturile §i condimentele. Eie fac parte din rajia compieta a omului de§i nu cuprind principii nutritive inlr-o proporfie apreciabilil; comparabilS cu produsele de origine animalfl sau vegetakl Produsele zaharoase Aceste produse sunt duiciuri concentrate $i caracterizate prin conjinutul lor in zaharuri cu moleculd micd (glucoza, fructoza, zaharoza) care le conferft gustul dulee, phlcut. Sunt u§or digerabile §i absorbabile iar in urma metaboliz&rii eiibereazd eantit&fi reiativ mari de energie. In compozijia produselor zaharoase mai pot intra: mierea, amidorml, laptele, diverse grSsimi (unt, margarinS), seminfe de plante (alune, nuci), fructe (conservate in zahar sau alcool) gemuri, gelatin;!, subshinje aromate, coloranfi (naturali sau artificiali). Produsele zaharoase se clasificd - la randul lor - in urmatoarele categorii: duiciuri, preparate din zahar §i fructe, produse din zah&r §i seminfe oleaginoase, mixturi complexe. Dulciurile. Acestea sunt constituite din glucide pure. Exemple: zahar, miere, bomboane, rahat. Preparate din zahar §i fructe. In aceastd categorie intrd: dulceaja, gemul, fructele zaharisite, jeleul. Produse din zahar §i semin(e oleaginoase. Exemple de asemenea produse sunt: ciocoiata §i halvaua. Mixturi. complexe. Acestea sunt produse de cofetarie: checuri, funsecuri, torturi, inghejatd. 732 Bauturile BButurile consurnate curent sunt grupale in douft categorii: Muturi alcoolice §i bSuturi nealcooiice. Bduturiie alcoolice. In funcjie de materia primS din care provin, modul de preparare- §i proporjiile de alcool etilic conjinut, bduturiie alcoolice sunt foarte variate. De§i alcoolul etilic - pe care-I cuprind - poseda o valoare energetic;! apreciabiLI (7 'kcal/g), datoritd acfiuniior sale farmacologice devine, repede, nociv organismului. De aceea, consumul b&uturilor alcoolice trebuie sS fie restrans. Bduturiie alcoolice consurnate free vent sunt; vinul, berea, lichiorurile. In afarii de aport calorigen, 'valoarea nutritive a b&uturilor alcoolice este discutabila. Bduturiie nealcooiice. Aceste b&uturi au valori nutritive evident© §i de aceea sunt utilizate curent. Bduturiie nealcooiice care se consume mai mult sunt: apa potabilS, apele minerale, sifonul, ceaiurile medicinale, sucurile de fructe §i de legume, nectarul, siropurile de fructe, diverse bfiuturi cu efecte stimulente (ceai, cafea, cacao). Dintre bduturiie nealcooiice, valoare nutritivft deosebitS au sucurile de fructe §i de legume. Ele pdstreazd in compozijie principiile nutritive ale plantelor (fructe sau legume) din care provin: glucide, siiruri minerale, vitamine §i diverse substance bioactive. Pentru acest moliv, multe din ele sunt indicate §i in tra.tament.ul unor afeejiuni. Condimentele

Condimentele au valoare nutritive foarte redusft (practic, nyld) dar ~ datoritd compozijiei lor bogate in substance aromatizante - sunt foiosite la prepararea alimentelor §i a multor produsc zaharoase. In funcjie de gustul pe care-I confetti, condimentele sunt grupate in 5 categorii: - Condimente acide: ojel, acid citric, acid tartric. - Condimente picante: piper, mu§tai\ boia. - Condimente arornate: chimen, cimbru, tarhon, leu§tean, m&rar, p&trunjel, dafin, vanilie, anason - Condimente aiiaeee: usturoi, ceapa, praz, bream, - Condimente saline; sarea de buclitarie Constituienj'ii unora dintre aceste condimente sunt menjionafi in Tabelul XV. 16. XV.4A ALIMENTE BOGATE IN AMINOACIZI ESENJIALI In subcapitolui privind proteinele, ca o categoric de principii nutritive, s-a subliniat faptul cd prezenja §i proporjia echilibratd a aminoacizilor esenjiali in produsele alimentare din rajie joacd roluri decisive in crejterea organismelor tinere §i in menjinerea stHrii de intrejinere a organismului adult. Alimentele de feiul: produse lactate, carne (de vitii, pore, pasare), pe§te, au un conjinut ridicat de proteine care cuprind aminoacizi esenjiali in proporjii apreciabile §i echilibrate, corespunzaioare nevoilor organizmului. In schimb, dupa cum reiese din Tabelul XV. 18, multe legume §i fructe conjin proteine care cuprind cantit&Ji foarte mici sau sunt lipsite compfet de unii aminoacizi esenjiali. Acest fapt face ca rrici resiul aminoacizilor esenjiali din proteinele legumielor sau fruetelor respective s3 nu mai fie utilizat pentru refaceri tisulare ci nurnai in scop energetic. Neajunsul poale fi insft corectat prin asocierea in rajie a produselor alimentare cuprinzand proteine sftrace in aminoacizi esenjali (sau lipsite de anumiji aminoacizi esenjiali) cu alimente care conjin proteine complementare; adiefr bogate in aeeea§i aminoacizi esenjiali. Prin asemenea 733 combin&ri potrivite se reu§e§te sd se acopere necesarul nulritiv al organismului cu proteine utilize bile. De fapt, unul din cele mai importante deziderate in alcdtuirea ra|iiior alimentare cu conjinut proteic cat mai util este reprezeniat de echilibrarea aminoacizilor esenfiali. Tabelul XV. IS Con|iiu?tii( in anunoacizi esentiali at unor alimente Can Coti tiuti piut Aminoacizi Alimenml ca ui esenjiali (mg) Cat ($) prot T L P T egor Dewmrre eic r e Ly M h ls Va h ies a (g) p u s et a l l r Ce 1 4 4 1 2 2 3 2 real Faina de 1 3 1 3 9 6 9 8 e gran no 7,0 9 7 6 4’ 6 7 4 2

Tarawa de graa Germene le de grau Orez

Ou

Albu§ GSlbenu§

29

4,6 U

6 191

31 1.7

13

34 ' 2,72

Lapt e

Pe$l e

Unt 246 Caimac 64 (smantan a)

8.9 23

tanrt

4,3

Bering Scrumbie

Cam e Vaca Vaca ficat Vaca creer

Pore Pore costiji Pore ficat

7 4

250

453 453

453 453

453 453

91 47

120 47

137 93

1 6 1 4 0 5 1 3 9 9 0 3 2 0 9 3 9 2 4 9 5 7 1 3 5 4 6 2 5 3 8 1 1 4 1

2 7 3 1 1 0 1 1 0 7 2 9 6 2 3 5 8 0 9 2 2 6 0 8 4 2 6 9 3 0 7 1 7 8 8 3 9 8 3 8 2 8 3 0 4 8 8 6 8

1 9 0 9 9

5 1 6" 6 7 2 5 6" 8

1 8 5 7 6

5 0 3

2 6 3 4 0" 3

2 0 4 1 8 5 6 7 8 1 7 8 0 7 0 6 8 0 4 0 8 3 2 6 6 7 7 2 3 4 4 3 2 4 7 6 7 0 0

1 3 3* 7 0* 1 8 8* 5 7 0 “ 1 9 6’ 2 6 8 1* 2 7 7 5* 2 1 6 7’ 9 9 7* 6 1 0* 2 2 4

2l 4 1 2 3 4 3 3 1 0 9 5 4 5 0 3 4 2 0 3 5 4 1 4 5 1 5 2 2 9 2 1 8 2 9 4 6 7

2 1 3

1 3 0

6 0 4

8 8 9 0 0

2 1 8 1 7 1 5 1 4 1 4 6 1 5 3 6 4 7 1 1 4 7 8 5 3 7 8 6 2 2 8 3 1 6 7 6 4 9 5

2 6 2 1 9 0 6 1 3 1 5 7 5 6 3 8 4 8 9 6 5 0 7 2 5 6 8 9 2 4 2 8 1 8 2 9 5 8 8

8 6 . 5 0 3 1 5 0 1 4 0 3 8 4 1 0 7 3 4 0 0 3 9 7 3 4 1 1 5 4 3 3 4 2 2 3 8 1 2 9 5 4 4 8

0 Fruc le

6 1 7 6 8

Mar

130

0,26

Caisa

38

0,38

Cantakip Curmala

100 10

0,70 0,22

1 6

Smochin a Portocala

38

046

2 0 5

180

1,8

Leg Fasole ume verde Morcov Salaia verde Can of Tomaia

125

2

100

1,1

100

0,3

100 240

5

2 8 9 1 3 3 6

2,1 24 2 2 1 6

8 1 0 3 1 1 6 5 9 _* 1 2 0 9 8

1 4 6 8 1 8 7 9 5 4 8 1 0 4 4 8 7 5 9 9 1 0 1 7 6

2 “ 5 1 3

0

0

4

4

1 2 3 8

1 9 4 1

1 2 5 6

1 0 4 8 ■

2 2 3* 6 2 0’ 5 7 5 2 3 4 0* 8 3 9* 8 4 3 8’

1 1 6 1 6 7* 7

2 7

9

2 6

7 2 *

9 1

7 6

9 0 4 2

9 6 5 1

1 0 1 7 0

1 5 7 6 7

2 7 6 4 0 _ * 9 9 7 9

Tomata 7 1 5 5 5 6 200 1,8 (sue) 4 2 0 2 0 0 * Aminoacid esenjial limitant. XV.4,5. REPARTIZAREA UNOR PRINCIPII NUTRITIVE IN CELE MAI IMPORTANTE PRODUSE ALIMENTARE Laincheierea studiului principiilor nutritive (in subcapitolul 3) §i dupd descrierea ceior mai importante produse intrand in alcdtuirea rajiei zilnice a omului (expusd in acest subcapitol), este util sd se faed o prezemare sinopticd a relajiilor de strictd dependent dintre cele cloud categorii de substance alimentare. In acest scop s-a mtocmit Tabelul XV.19. Cercetarea Tabelului XV. 19 permite - totodatd - §i evidenjierea unui nou criteriu de grupare pqsibild a produselor alimentare; anume, in funcjie de conjinutul lor in principii nutritive. Intr-adevdr, din Tabelul XV. 19 se desprinde clar cd majoritatea principiilor nutritive intrd in constitujia anumitor alimente; indiferent de provenienja lor animald sau vegetal! Un nuindr mai redus de principii nutritive se gdsesc in alte alimente iar in cateva alimente se afla §i mai pujine principii nutritive. 734 Tahelul XV. 19 Repartizarca principiilor nutritive In cele tnai importafite produse alimentare Principii Produse alimentare

nutritive Apa. Glucide Lipide Proteinc Vitamine Vitamina A Tiamina Riboilavin a Piridoxina Niacin a Vitamina Bn Biotina Inozitoi Acid folic Acid pantoteni c Vitamina C Vitamina D Vitamina E Vitamina K Bioflavon oide File monte mineral e

Bauturi, fructe, legume Zahar, sirop, miere, boabe de cereale, fructe, legume Unt, margarina, uleiuri vegetale, grasimile din came, produse lactate, nuci, seminfe de plante oleaginoase Came (de vita, de pore, de pasare), pegte, oua, lapte §i produse lactate, boabe (seminfe) de cereale Ficat, oua, ulei de Heat de pe§te, lapte §i produse lactate, fructe §i zarzavaturi Drojdia de bere, boabe (nedecorticate) de cereale, came, pe§te, pui, gal ben u§ de on, nuci, legume Drojdia de bere, boabe de cereale, came (organe), galbenu§ de ou, nuci, legume Drojdia de bere, boabe de cereale, germene de grau, came, legume cu Frunze verzi comestibile Carne (slaba), pui, pegte, drojdie de bere, lapte §i produse lactate, orez nede- corticat Carne (organe) pe§te, oua, branza Galbenu§ de ou, ficat, orez nedecorticat, drojdie de bere, boabe de cereale, legume Boabe de cereale, drojdie de bere, carne, lapte, nuci, fructe citrice, zarzavaturi Frunze verzi §i radacini de zarzavaturi, carne (organe), drojdie de bere, boabe (nedecorticate) de cereale, lapte Carne (organe), g&lbenug de ou, drojdie de bere, boabe de cereale, germene de grau, legume Fructe citrice, cantalup, pepene verde. c&pguni, tomate Pegte (sardele, heringi), lapte §i produse lactate, carne (organe), faina de oase, galbenu§ de ou Germene de grau, oua, carne (organe), uleiuri vegetale, cartofi, Frunze verzi de zarzavaturi Frunze verzi. de zarzavaturi, galbentig de ou, fasoie soia Fructe citrice Lapte §i produse lactate, legume cu Frunze verzi, Faina de pe$te

Calciu Cl or Cobalt •Crotrt Cupru Per Fluor Fosfor Magneziu Mangan Molibden Potasiu

Sare, carne, maslirie, Faina de secara Came (organe), pui, lapte, legume cu Frunze verzi, fructe Ulei de germene de porumb, boabe nedecorticate de cereale, drojdie de bere Carne (organe), legume, nuci, struguri Came, pui, pegte, oua, legume cu Frunze verzi, fructe us cate Ceai, apa fluorinata, faina de oase Carne, pegte, pui, oua, lapte gi produse lactate, legume, boabe de cereale, nuci Boabe nedecorticate de cereale, legume verzi, nuci Boabe nedecorticate de cereale, legume cu Frunze verzi, nuci, galbenug de ou Legume, lapte, ficat Carne (slaba), boabe nedecorticate de cereale, seminfe de floarea soarelui, legume, fructe uscate Pegte (heringi), drojdie de bere, boabe nedecorticate de cereale, germene de grau Sare, produse lactate, felina Pcgle, oua, came, varza Pegte Came (organe), drojdie de bere, fasoie soia

Seleniu Sodiu Sulf Vanadiu Zinc 735 XV.5. CONTRIBUJIA NUTRTJ1EI LA PASTRAREA SANATApi Din prezentarea nofiunilor esenfiale de nutrifie, expose in acest capital, se poate deta§a eu u§urinj& ideea cd rafia alimentary corespunzdtoare necesitdfilor organismului este cea care confine alimente variate §i cu concentrajli mari de principii nutritive. Majoritatea acestora sunt cuprinse in Tabelui XV. 19. Este de subliniat faptul eft asemenea principii nutritive se afld intr-o stransd inter-relafie. Aceasta este total corespunzdtoare inter- relafiei metabolismelor desf&gurate continuu in organism. A§a cum funefionarea defectuoasd a unei enzime participante sau absenfa unei singure reaefii biochimice tulburd intregul metabolism din care face parte §i antreneazd disfunefii in metabolismele conexe, tot astfel absenfa unuia sau mai multor principii nutritive din rafie poate determina tulburari funefionale sau chiar maladii de origine nutrifionald. Tulburdri funefionale (sau unele maladii) pot fi provocate §i de excesul principiilor nutritive. Astfel, a§a cum s-a mai menfionat, rajiiie cu confinut lipidic ridicat favorizeazd ateroscleroza §i bolile cardiace coronariene. De asemenea, ingerdrile sistematice - (imp mai indelungat - de rajii bogate in lipide predispun la cancer de colon, de san §i de prostata. Pe de altd parte, regimul alimentar foarte sdrat determind hipertensiune §i accidente vasculare cerebrale. Prin umiare, §i excesul alimentar este nociv. De aceea, compozifia rafiei alimentare, trebuie sd fie riguros controlatd §i ajustatd

astfel incat sd se poatd mldtura - cat mai repede posibil - cele doud situajii extreme: subalimentafia §i suprn-aliinentnfia. Intr-adevdr, in cazul apoitului insuficient de substanfe nutritive este necesar sd se administreze suplimentele alimentare corespunzdtoare cerinfelor. Pe de altd parte, excesul nulritiv trebuie cornbdtut prin reducerea cantitativd §j calitativd a substanfelor alimentare, pand la atingerea striclului necesar stdrii de intrefinere. In vederea realizdrii unor asemenea deziderate §i pentru a se putea pdstra in permanenjd echilibrul alimentar este nevoie sd se coreleze aporturile principalelor categorii de principii nutritive ale rafiei cu cheltuiala energetied depusd. Studiile statistic© efectuate in aceastd problem# au dus la concluzia cd cele mai corespunzdtoare proporfii ale principalelor categorii de principii nutritive, necesare acoperii nevoilor energelice, sunt cele din Tabelui XV.20. Tabelui XV.20 Aporturile principaiclor categorii de principii nutritive ale rafiei, exprimate tn proccntc din cheltuiala energetica % din cheltuiala Prificipiul nulritiv energetied lolala Glucide totalc 58 zaharuri complexe §i din surse 48 natural e zahar rafinat 10 Lipide to tale 30 saturate 10 nesaturate 10 pollnesaturate 10 Colesterol (mg/zi) 300 Sare (g/zi) 5 736 Jinand seama de cifrele consemnate in Tabelul XV.20 §i de avanlajele sau neajunsurile consumului anumitor aliments, se pot formula citeva considerafii utile. Astfel, pentru asigurarea,sanMjii §i !n!5turarea riscurilor Infinite (hiperlipemie, diabet, hipertensiune, aterosclerozft, obezitate) este necesar ca in alimentafia normals s£ se urmSreascS reducerea consumului de glucide (in special, concentrate), de lipide (grSsimi saturate, colesterol) §i de sare; Este preferabil ca inlocuirea parjiaia a gnlsimilor saturate din.rafie sS se realizeze prin uleiuri cuprinzand acizi gra§i nesaturafi; inclusiv, cei esenjiali. Pe de aitS parte, este recomandahilS cre§terea consumului de legume §i fructe asigurSndu-se astfel aportul constant §i suficient de vitamine, minerals §i fibre alimentare. Un alt fapt deosebit de important este ca administrarea rafiilor complete s& fie regulate, la intervale bine stabilite §i respectate. In caz contrar, pierderile energetics nu mai pot fi acoperite de aporturile alimentare. In asemenea condijii, organismul consume din propriile rezerve energetice (glicogen, lipide de depozit). Situafia aceasta nefavorabilS este inialniUt §i la inceputul perioadelor de nealimentafie. Ulterior, dac& lipsa. de alimentafie se prelungegte rezervele energetice proprii se epuizeazS §i se ajunge chiar la utilizarea proteinelor constituente. Consumul proteinelor

proprii este evidenjiat printr-un in tens bilan{ azotat negativ, ceea ce reprezintii o situate foaite grav& pentru organism §i care irebuie evitatS cu desiivar§ire. GLOSAE Acetal. Produsul condensSrii unei aldehide cu doua molecule de alcool. Aeetil-CoA. Tiolesterul coenziniei A cu aci- dul acetic. Metabolit implicat in transfor- rnarile metabolice ale glucidelor, iipidelor §i aminoacizilor. Actina. Proteina muscular^ asociata cu miozina sub forma de actomiozina. Deasemenea, sub form& de filamente esfe componentul principal ai citoscheletului celulelor eucariote. Actinomicina D. Antibiotic care prin legare la ADN inhibit elongarea lanfurilor de ARN. Adeailat cidaza. Enzima, catalizeazS for- marea AMP ciclic- din ATP. Adipodt. Ceiula. specializata pent.ru a depo- zita lipide (triacilgliceroli). ADN, Acid dezoxiribonucleic. Polinucleotid care inmagazineaza . informajia genetica pentru to ate tipurile de celule §i pentru unii virugi. ADNC. ADN completnentar, segment de ADN obfinut in vitro cu ajutorul transcriptazei inverse §i a unui ARN mesager. ABN himeric. ADN recombinant ale carei parfi provin din doua sau mai multe surse. ADN ligaza. O enzima care catalizeazS legarea (prin legatura 3’,5’fosfodiest.e- rica) a doua fragmente de ADN. ABN polimeraza. Enzima care catalizeaza form area lanfurilor de ADN din dezoxiri- bonucleotide trifosforilate. ADN recombinant. Un ADN modificat care este format prin inserjia unei secvenfe de dezoxiribonucleotide care nu erau prezente anterior in ADN. Aerob. Un organism care necesitS. aerul (dioxigenul) pentru existenfa sa. Alele. Forme alternative ale unei gene. Alosteric. O enzima (proteinS) cu mai multe centre de legare a unor liganzi, Ocuparea unui centru altereaza afinitatea ceiuilalt sau celorlalte centre pentru liganzii specifier Amfipatic (amfifil). Compus care prezinta o regiune hidrofila §i una hidrofobS. AMP ciclic (3’,5’-adenozin monofosfat). Molecula cu roluri reglatoare. Este mesa- gerul second al multor hormoni. Anabolism. Acea parte a metabolismului care cuprinde reacpile de biosinteza a consti- tuenfilor organismului. Anaerob. Organism care poate trai in absen- fa aerului. Angstrom (A). Unitate de lungime egala cu ltT8 cm (0,1 nm). Anomeri. Stereoizomeri ai formelor cicli.ce ale monozaharidelor care difera prin configurajiile atomului de carbon carboni- lic semiacetalizat. Anticodon.' Secvenf# de trei nucleotide din ARN de transfer care corespunde unui codon din ARN mesager. Anticorp. ProteinS (imunoglobulina) care interaefioneaza in mod specific cu o substanfa macromoleculara str&ina (antigen). Antigen. Substanfa macromoleculara strai- na care pStrunsS intr-un organism, de- clan§eaz5 sintezS de anticorpi. Antiparalel. DouS catene de ADN sunt antiparalele cand una dintre ele evolueazS. V —> 5’ gi cealalta in sens invers (5’—» 3’). Doua lanfuri polipeptidice.sunt.antiparalele cand un lanf evolueaza in sensul capat N-

terminal capat C~terininal §i celalalt in sens opus. ARN. Acid ribonucleic. Poliribonucleotid cu roluri in transferal informafiei genetice de la ADN la proteine. ARN mesager (ARNm). Specie de ARN, monocatenar, cuprinzand succesiunea codonilor care specified seevenfa aminoacizilor dintr-o proteinS. ARN polimeraz#. Enzima care catalizeaza formarea lanfurilor de poliribunucleotide. ARN ribozomiai (ARNr). Specii de ARN aso- ciate cu proteine §i care alcatuiesc ribozomii. ARN de transfer (ARNj). Specii de ARN cu rol. de activare a aminacizilor §i de transport al acestora la locul sintezei proteice (ribozomii). 739 Autocataliza. Proces de catalizS in care catalizatorul este un produs al reacpei pe care o catalizeaza. Autoradiografie. TehnicS de detectare a unei molecule radioactive prin vizualizarea sa prin efectele produse pe o pladt fotografica. Autotrof. Un organism care tgi construiegte constituent proprii din COa gi H2G. Plantele sunt autolrofe (se hranesc singure). B, celuie. Celule ale sistemului imun. Prin diferenjiere formeaza celule care sinteti- zeaza imunoglobuline. B,, forma. Forma a ADN dublu catenar, cuprinde 10,5 haze per tura, Biblioteca genica. Colecfie de fragmente donate care reprezinta mtreg genomul unui organism. Bibliotecile genice pot fi alcatuite din ADN genomic sau din ADNC. Bio!uminescen{3. Producere de lumina de c&tre un sistem biochimic. Bistrat lipidic. Un strat dublu de lipide am- Fipatice cu capetele hidrofile orientate spre mediul apos gi cu regiunile hidrofobe orientate spre interior. Carbon asimetric. Atom de carbon legat la patru grupari diferite. Carcinogen. Un campus chimic care poate produce cancer. Carotenoid. Compus poliizoprenic, cu un grad inalt de nesaturare, liposoiubil. Catabolism. Acea parte a metabolismului care cuprinde reacpile de degadare a constitu- enjiior organismului. Catalizator. Compus care accelereazS o reacpe chimica prin scaderea energiei de activare. La./ sfargitul transformarii catalizatorul este nemodificat, Centru activ. Regiune a unei molecule enzi- matice care leaga substratul §1 determine transformarea sa in produs (produgi). Cetogenic. Despre unii aminoacizi care in cursul metabolizSrii lor conduc la acetoa- cetat (corp cetonic) sau acetil-CoA (potential cetogenic). Cetoz£. O stare a organismului caracterizatS prin producpe masiva de corpi cetonici, cu hipercetonemie gi cetonurie. Chelat. Complex de coordinate Tntre molecule care au mai multe centre de legare. Chiralic, compus. Un compus cu asimetrie moleculara, prezinta doua eonfigurapi nesuperpozabile. Chiralitate. Proprietatea unei molecule sau obiect de a nu se suprapune imaginii sale Tn oglinda. Cidu ceiular. Toate stadiile prin care trece o celula de la o generate celular& la alta. Un ciclu ceiular cuprinde fazele Gh G2, S §i M.

Cistron. Unitate genetica care codifica un lan{ polipeptidic. Ciiocrom. Hemoproteinl care funcjioneaza ca transporter de electroni. CitopSasniS. Conpnutul ceiular delimitat de membrana plasmicS, excluzand nucleul. Citoschelet. Structuri filamentoase din cito- plasma celulelor eucariote. Citosoi. Porpunea lichidS a citoplasmei. Ciona. Grup de celule sau molecule identice care deriva dintr-o aceiagi celula sau moleeula parentala. Clorofila. Pigment fotosintetic de culoare verde care cuprinde un complex porfirinic cu magneziu. Codon. Secvenja de trei nucleotide din ARN masager care specific# un aminoacid. CoenzimS. Substanfa neproteic# care se asociaza cu proteina enzimatica pentru a forma un catalizator acliv. Cofactor. Compus cu moleeula mica nece- sar activitajii catalitice a unei enzime. Poate fi un ion sau o coenzima. Configurate. AranjamentuI tridimensional stabil pe care covalen^ele d impun unei molecule. Conforma|ie. AranjamentuI tridimensional pe care o moleeula il adopts prin rotajii in jurul legaturilor simple. Constanta Michaelis. Parametru cinetic al unei enzime. MSsoar# afinitatea enzimei pentru substrat. Are valoarea concentrafiei de substrat cand reaepa enzimatica se desfagoara cu viteza semimaxima. Constitutiv. O enzima sau proteina care este sintetizata cu o vitez# relativ constant#, indiferent de condipile metabolice sau nutritive ale organismului. Corpi cetonici. Denumirea colectiva atribuita acetoacetatului, phidroxibutiratului gi aceto- nei, produgi ai catabolisirmlui acizilor gragi. Formarea lor in exces constitue dereglarea metabolic# major# in diabetul zaharat. Cosmida. Plasmid# in care secvenjele de ADN din bacteriofagul lambda necesare pentru impachetarea ADN au fost inserate prin tehnologia ADN recombinant. 740 Cromatina. Fibre de nucleoproteine care alcatuiesc cromozomii eucarioteior. Cromatografie. Procedeu de separate a unor molecule aparpnand aceleia§i familii pe baza diferenjelor de afinitate dintre aces- tea §;i doua faze nemiscibile mobile. Cromozom. Structuri alcatuite din ADN §i proteine vizibile in nucleul celular in metafaza. Majoritatea genelor unui organism se afl£ in cromozomi. Cuplare chemiosmoticS. Sinteza de ATP pe seama unui gradient electrochimic general de procesele oxidative mitocondriale. Dalton. Unitafce de masa atomica (1,66.10-24 g.) Dezaminare (deaminare). Reacpe prin care se indeparteaza dintr-un amino acid sau alt compus o grupare aminica. Denaturare. Modificarea conformapei native a unei proteine sau acid nucleic. Bializa. Indepartarea moleeulelor mici dintr- o solupe complexa de substance macro- moleculare cu ajutoml unei membrane semipermeabile. Biferenfiere. Modificarea caracterelor unei celule, a genelor care sunt

exprimate, ca rezultat al cregterii p replic&rii. Diploida, celula. Celula care cuprinde cate doi cromozomi din fiecare tip. Celulele somatice sunt diploide. Dipol. Structura chimica in care sarcinile pozitive §i cele negative sunt desparpte. Oisulfura. Produsul oxidarii (dehidroge- narii) unui tioalcool. Bomeniu, structural. O regiune dintr-o mole- cula proteica cu structuri secundaril §i terpara proprii gi care prezinta un anu- mit grad de autonomie funcponala. Dominant. Alela al caret fenotip se expri- ma fie ca organismul este homozigot, fie heterozigot pentru acea alela. Duplex, ADN. ADN cu structura dublu elicoidala. Echilibru. Starea unui sistem chimic in care viteza transformarii in sens direct este egala cu viteza transformarii in sens invers. Ecuapa Henderson-Hasselbalch. Relape care Ieaga pH-uI unui sistem tampon de vaioarea pK a acidului §i de raportul dintre concentrapa sarii §i concentrapa acidului. Ecuapa Lineweaver-Burk. Inversul ecuapei Michaelis-Menten. Are forma ecuapei unei drepte. Ecuapa Michaelis-Menten. Relape care leagS viteza unei reacpi enzimatice de concentrapa substratului. Are forma ecu- ajiei unui arc de hiperbola. Efector alosteric. Compus care fixandu-se intr-un centru alosteric altereaza proprie- taple proteine! (enzimS). Eicosanoid. Compus biologic activ derivat din acid arahidonic, acid gras cu 20 atomi de carbon. Electrofil. Compus sau grupare cu deficit electronic (cu orbitali vacanp) §i care ataca centre cu electroni neparticipanp (centre nucleofile). ElectroforezS. Deplasarea unor particule intr- un camp electric. Tehnica pentru analiza amestecurilor de molecule dintr-o solupe pe baza mobilitapi lor electroforetice. ESuat EfluentuI dintr-o coloanS. cromatogra- fica. Enantiomeri. Izomeri de configurape care difera prin sensui acdvitapi lor optice. Endergonic. Proces pentru care modificarea energiei libere are o vaioare pozitiva. Endocrin. Celula sau glanda care sintetizea- za §i secret# in sange un hormon. Endonucleaza. O enzimS care scindeaza legaturi fosfodiesterice din acizii nucleic! situate in interiorul lanfurilor. Endopeptidaza. O enzima care scindeaza legaturi peptidice situate in interiorul lanjului polipeptidic. Energie libera. Funcpe termodinamicS care descrie capacitatea unui sistem de a efec- tua un lucru util (la temperatura, volum §i presiune constante). Enhancer. O secvenfa de ADN care stimuleaza transcrierea unei gene. Enhancer-ul este situat fie in aval, fie in amonte de promotorul genei. Entropie. Funcpe termodinamicft care descrie gradul de dezordine a unui sistem. Epimeri. Stereoizomeri ai monozaharidelor cu ■ mai multe centre asimetrice

care difera insa numai prin configurapa unuia dintre aceste centre. Eucariot. Organism sau celula ia care nucleul este deiimitat printr-un invelig de restul citoplasmei. Eucromatina. Stare a cromatinei mai pupn condensata §i activa transcripponal. Exergonic. Proces care decurge cu scaderea energiei libere a sistemului. 741 Exon. Segment al unei gene care este transcris §i apoi exprimat sub forma de protein! ExonudeazS. O enzima care scindeaza iegaturi fosfodiesterice terminale din acizii nucleici. Exopepficiaza. O enzima care scindeaza Iegaturi peptidice terminale din proteine. Fenotip. Caractereie morfologice §i funcpo- nale ale unui organism, expresie a caracte- relor genetice. Pluorescesifa. Emisia de lamina de cfttre o molecula excitatS, aeesta din urma revenind la starea bazala. Fosfodiester. Compus derivat din acidul fosforie in care doua din funcfiile sale acide sunt esterificate cu alcooli. Leg 2- tura internucleotidica din acizii nucleici este o legatura 3\5’ - fosfodiesterica, Fosforilare. Ata§area la o biomolecula a unui rest fosforil. Fosforilare oxidative. Sinteza de ATP cuplat2 cu procesele oxidative mitocondriale. Fosforoliza. Scindarea unei Iegaturi, a unei molecule de catre acidul fosforie. Furan. Compus heterociclic fundamental cu ciclu pentagonal cuprinzand ca heteroatom un atom de oxigen. Furanoza. Monozaharid cu structura semi- acetalica cuprinzand un ciclu de cinci atorni. Gr Faza unui ciclu celuiar cuprinsa intre o mitoza §i faza S. G2. Perioada unui ciclu celuiar cuprinsi Intre faza S §i urmatoarea mitoza. AG. Diferenja dintre energia libera a rezul- tanjilor 'gi energia libera a reactanjilor (energie liberS de reaepe). Gena. Porpune a genomului care codified o proteina. Genom. ConjinutuI genetic total al unei celule sau virus. Genotip. Ansamblul caracterelor ereditore ale unui organism determinate de alcatuirea genomului sau. Glicozid. Deri vat de tip acetalic al formelor semiacetalice ale monozaharideior. Gradient. Direcpa dupa care are loc variapa (crescatoare sau descresc2toare) a unui parametru fizic, chimic sau biochimic. Hap!oid&, celula. Celula care cuprinde numai cate un cromozom din fiecare tip. Hem. Complex al protoporfirinei cu ferul. Gruparea prostetica a hemoproteinelor. Heterocromatina. O stare condensate a cromatinei gi cu o activitate transcripjio- nala redusa. Heteropolimer. Un polimer cuprinzand doua. sau mai multe tipuri de unitap monomerice. Heterotrof. Un organism care se hr2ne§te cu compugi organici complex!,

sintetizaji de alte organisme. Heterozigot. Un organism care posed a doua aide diferite ale aceleiagi gene. Hidrofil. Un compus sau grupare chimic2. cu afinitate pentru api Hidrofob. Un compus sau grupare chimica cu caracter nepolar (nu are afinitate pentru apa). Hidroliza. Scinderea unei Iegaturi, a unei molecule, de catre apa. Homeosfazie. Menpnere la un anumit nivel a parametrilor fizicochimici, functionali ai unui organisjn. Homopolimer. Un polimer alcatuit dintr-un singur tip de uni tap monomerice. Homozigot. Un organism care poseda doua aide identice ale unei aceleiagi gene. Inductor. Un compus care adaugat la un media de cultura sau introdus intr-un organism deter-* mina accelerarea sintezei unei proteine. Inhibitor enzimatic. Un compus care combi- nandu-se cu o enzima ii mic§oreaza activitatea cataliticll. Intron. Segment al unei gene care este transcris dar care este indeplrtat inainte de traducere (nu se exprima ca lanf polipeptidic). In vitro. In legatura cu ceia ce se petrece In afara organismului (in eprubeta), In opo- zipe cu in vivo. Izoenzime. Forme multiple ale aceleia§i enzi- me. Au aceiagi activitate catalitica dar se diferenpaza prin una sau mai multe insu§iri. Izomeri. Compu§i care au aceiagi constitupe dar difera prin una sau mai multe insu§iri. Kitiaza. O enzim2 care catalizeaza fosfori- larea unei molecule acceptor. In genere donorul de grup fosforil este ATP. Liaza. O enzima care catalizeaz2' o reaepe de eiiminare cu formarea unei Iegaturi duhle, sau inversul acesteia. Ligand. Denuniire generica care descrie orice compus capabil de a se lega la o macromolecul2 (proteina, ADN). LIgaza. O enzima care catalizeaza o reaepe de condensare endergonica, suspnuta energetic prin hidroliza ATP (sau a altui compus macroergic). 742 LISGZOHK Organit celular bogat In enzime hidrolitice. M. Perioada unui ciciu celular cand are loc mitoza. Macroergic. Un compus sau o legftturS. covalent! a carui hidroliza decarge cu o c!dere mare de energie libera, Meioza. Proces prin care ceiule dipioide suferS o diviziune formand ceiule sexuale haploide. Mesager. O molecula care transport! un mesaj, o informafie, de la o celul! la alta celula. Mesager secund. Molecula mica care se formeaz! intracelular ca raspuns la un mesager extracelular (hormon) §i care exereit! roluri reglatoare. Metabolism. Totaiitatea transform aiilor biochimice care au loc intr-un organism, Metafaza. Stadiul mitozei sau meiozei cand top cromozomii sunt alineafi de o parte §i alta a ecuatorului. MiceSie. Agregat de molecule lipidice polare Tn care gruparile hidrofobe sunt orientate spre interior §i cele hidrofile spre medial apos. Mitocondrie. Organit celular care cuprinde majoritatea sistemelor enzimatice

necesare oxidarilor celulare (ciciu acizilor tricar- boxilici, beta-oxidare, lanf respirator). MitozS. Faza a diviziunii celulare, cromozomii replicap s-au segregat §i unneazil diviziunea. Muta{.ie. O alterare permanents a unei gene sau a unui grup de gene. Mutant. Gena sau organism care posed! o alterare a genoinuiui (o mutatie). Mutarotajie. Modificarea activitajii optice a unui monozaharid imediat dupa dizol- varea sa pan! se- stabile§te echilibrul tnire anomerii a §i ($ ai formelor furanozice §i piranozice. Northern blot. TehnieS'de a transfera un ARN dintr-un gel de. agaroza pe un filtru de nitroceluioza pe care ARN va fi apoi detectat cu o proba potrivita. Nucleaza. O enzima care desface hidrolitic legSturile internucleotidice din acizii nucleici. Nudeofil. Un compus sau grupare care poseda perechi de electroni neparticipanfi §i poate ataca centre cu deficit electronic (electrofile). Nudeol. Structure sferiea vizibila in nucleu Tn- cursul interfazei. In nucieol are loc sinteza de ARN ribozomial. Nucleozotn* Particula alc!tuit! dintr-un fragment de ADN care Tnvele§fce un agregat ^ de histone. Nucleozomii sunt legaji Tntre ei prin segmente de ADN nenucleozomal. OncogenS. Gena de origins celular! sau viraia care inserandu-se Tn genomul unei ceiule animale determine cregterea abe- ranta a acesteia. Oxidare. Pierderea de. electroni (sau de hidro- gen) de catre un compus. p - Oxidare. Secvenf! metabolic! de oxidare a acizilor gra§i prin deta§area succe- siv.! de acetii-CoA. Palindrom. Secvenfa de ADN dublu elico- idal care este aceia§i cand cele doua catene sunt citite din direcpi opuse. Permeazd. O protein! care catalizeaz! tra.nspo.rtul unei anume molecule de pe o parte a unei membrane pe cealalt! parte. Peroxizomi. Organite celulare care cuprind diverse oxidaze, enzime care reduc dioxo- genul la peroxid de hidrogen. Piran. Compus heterociclic fundamental cu ciciu hexagonal cuprinzand ca heteroatom oxigenul Piranozd. Forma semiacetaiic! a unui monozaharid cuprinzand un ciciu de §ase atomi. Plasmid!. Molecula mica de ADN, extra- cromozomiala, circular! §1 care se replied independent de ADN gazda. Polimorfisin molecular. Calitatea. unei pro- teine cu o anurnit! funefie de a exista Tn forme multiple specificate genetic. Polizom (poiiribozom). Complex format prin asocierea unei molecule de ARN mesager cu mai mul{i ribozomi care sintetizeaz! fiecare cate un exemplar din proteina specificata de ARNm. Potential redox (E). Tendinfa unui cuplu redox de a ceda sau de a primi electroni. Freproproteina. Precursor inactiv al unei proteine secretorii. Dupa Tndepartarea peptidului pre (peptid semnal) se transforma Tntr-o proproteina. Procanot. Un organism sau celul! care nu are nucleu sau alte organite subcelulare.

Prochiralic!, molecula. Moleeul! care printr-o singura substitute devine asimetric! (capata un centra chiralic). 743 Frotomeri. Lanjurile polipeptidice individuale care alcStuiesc o proteina oligomeric! Prostetica, grupare. Compus neproteic care Tmpreuna cu a proteina formeaza o molecula funcjionala. Pseudogena. Un segment de ADN inactiv care rezulta prin mutajii ale unei gene parentale active. Punte disulfurica. Legatura -S-S- intre doua segmente polipeptidice realizat# prin oxidarea a doua rest.uri de cistern! Puromicina. Antibiotic care inhibS sinteza proteica prin competijia dintre puromici- na §i un aminoacil-ARNt pentru situsul aminoacil de pe ribozomi. Receptor hormonal. Proteina celuiara care poseda un situs de recunoa§tere §i de legare a unui hormon cu care formeaza complexul hormon-receptor. Reducere. Ca$tigul de electroni (sau de hidro- gen) de catre un compus. Renaturare. Revenirea unei macromolecule (proteina, -ADN) la conformajia nativa anterioara denaturarii. Replicare. Sinteza a doua molecule dublu elicoidale de ADN, identice intre ele §i identice cu molecula parental#. Represie enzimatica. Reducerea vitezei de sinteza a unei enzime m prezenfa unui represor. Represor. Proteina reglatoare care inhibit transcrierea uneia sau mai multor gene. S. Unitate Svedberg. Constanta de sedimen- tare, l$=10'i3s. Mascara viteza de sedi- mentare a unei molecule intr-un camp centrifugal. S, faza. Perioada din ciclul celular situata intre fazele Gx §i G2 cand are loc sinteza de ADN. Salifiere (salting out). Precipitarea unei pro- teine din solujie prin adaugarea unor cantitafi mari de sare (ca sulfat de amoniu). Semiacetal. Produsul condensarii unei aide- hide cu o molecula de alcool. Sintaza. O enzima care catalizeaz# o reac- Jie sintetica fara participarea ATP sau a altui compus macroergic. Sintazele sunt liaze. Sintetaza, O enzima care catalizeaza o reac- pe sintetica cu participarea ATI3 sau a altui compus macroergic. Sintetazele sunt: ligaze. Southern blot. Tehnica de a transfera ADN de pe un gel de agarozl pe un filtru de nitroceluloz# pe care ADN este apoi detectat cu ADN sau cu ARN complementer. Tehnica introdusa de E. Southern. Stare stafionara. Stare a unui sistem deschis cand intrarile §i ie§irile sunt echivalente, compozijia sistemului ramanand relativ constant! Stereoizomeri. Izomeri sterici, difer! prin configurajiile moleculelor. T, celule. Tip de celule ale sistemului imun. Tampon. Solujie care tinde sa~§i pastreze pH-ul propriu la adaugare de acid sau de baza. O solujie tampon cuprinde canti- tati relativ mari dintr-un acid §i baza sa conjugate Tioalcool. Compus care cuprinde funcjia - SH. Tioeter. Compus cu formula R-S-R. Tiosemlacetal. Compus objinut prin conden- sarea unei molecule de aldehida cu un tioalcool.

Traducere. Etap# a exprimarii informajiei genetice corespunzand sintezei unui lanf polipeptidic pe baza informajiei Tnscrise Tn ARN mesager. Transcriere. Etapa a expritnarii informajiei genetice corespunzand sintezei de ARN utilizandu-se o catena tipar de ADN. Transcriptaza inversa (revers transcripta- za). Enzim# care catalizeaza sinteza unui ADN utilizand o catena tipar de ARN. Transport activ. Transportul transmembranar al unei molecule cu consum de energie chimica. Transport facilitat. Transportul transmembranar al unei molecule cu ajutorul unei proteine transportoare. Vector. Plasmid# sau virus Tn care se introduce un ADN cu scopul multiplicarii acestuia. Z, forma. Form# a ADN dublucatenar cu o dice stanga (forma B este o elice dreapta). Western blot. Tehnica de transfer a unei proteine pe un filtru de nitroceluloza pe care apoi proteina este analizat! Zimogen. Precursorul inactiv al unei enzime (proenzima). 744 UNELE PRESCURTARI UTILIZATE CURENT IN RIOCHIMIE A adenin# A alaninS Ach acetilcolina ACTH corticotropin#, hormon adrenocorti- cotrop ADN(DNA) acid dezoxiribonucleic ADP adenozin difosfat Ala alanina ALA del ta- am ino le v u 1 in at AMP adenozin monofosfat AMPC adenozin monofosfat ciclic, 3’5’-*ade- nozin monofosfat Arg arginin# ARN(RNA) acid ribonucleic ARNm acid ribonucleic mesager ARNr acid ribonucleic ribozomial ARNt acid ribonucleic, de transfer Asn asparagina Asp acid aspartic Asx acid aspartic sau asparagina ATP adenozin trifosfat R acid aspartic sau asparagina bp perechi de baze BPG 2,3 - bisfosfoglicerat C cisteina C citozina COP citidin difosfat CMP citidin monofosfat CoA sau CoASH coenziina A CoQ coenziina Q, uhichinona (forma oxidata) CoQH2 coenzima Q (forma redusa) CTP citidin trifosfat D acid aspartic D datton ti dezoxi (deoxi) DEAE dietilaminoetil DG sau DAG diacilglicerol DHAP dihidroxiacetonofosfat OOP A dihidroxifenilalanina E acid glutamic EF factor de elongare EGF factorul de cre§tere a epidermei F fenilalanina FAD flavin adenin dinucleotid (forma oxi- datS) FADH2 flavin adenin dinucleotid (fonna redusa) FMN flavin mononucleotid (forma oxidata) FMNH2 flavin mononucleotid (forma redusa) Fru fructoza G glicinS (giicocol) G guaninS GABA acid y - aminobutiric Gal galactoz# GDP guanozin difosfat Gla acid y - carboxiglutainic Gin glutamina Glu acid glutamic Glx acid glutamic sau glutamina Oly glicin# (giicocol)

GMP guanozin monofosfat GMPC guanozin monofosfat ciclic, 3’5’~ guanozin monofosfat GSH glutation (forma redusa) GSSG glutation (forma oxidata) GTP guanozin trifosfat H histidina Hb hemoglobin^ HDL lipoproteine cu densitate mare His histidine HMG-CoA 3~hidroxi-3~metil-gIutariI-CoA Hyp 4 -hidroxi-prolina I izoleucina IDL lipoproteine cu densitate intermediary IF factor de inifiere Ig imunoglobulina He izoleucin# IMP inozin monofosfat IP3 1,4,5 - inozitoitrisfosfat FTP inozin trifosfat L leucina Leu leucina LCAT lecitin-colesterol aoiltransferaza LDH lactat dehidrogenaza 745 LDL lipoproteine cu densitate mica Lys lizina M metionina Man manoza Mb mioglobina Met metionina MHC complex major de histocompatibilitate N asparagina NAD+ nicotinamid adenin dinucleotid (forma oxidata) NADH nicotinamid adenin dinucleotid (forma redusa) NADP* nicotinamid adenin dinucleotid fosfat (forma oxidata) NADPH nicotinamid adenin dinucleotid fosfat (forma redusa) NANA acid N-acetilneuraminic NDP nucleozid difosfat NMP nucleozid monofosfat NTP nucleozid trifosfat P proiina P[ fosfat anorganic PPj pirofosfat anorganic PDGF factorul de cre§tere derivat din plachete PEP acid fosfoenolpiruvic PFK fosfofruclokinaza PG prostaglandi.ua Phe fenilalanina PKU fenilcetonurie PLP piridoxal fosfat PRPP 5-fosforibozil- a - pirofosfat Q glutamina Q coenzima Q (forma oxidata) QH2 coenzima Q (forma redusa) R arginina S serin a S unitate Svedberg SAM S -adenozil-metionina SDS dodecilsuifat de sodiu T timing T treonini TCA acid tricarboxilic Thr treonin& TDP timidin difosfat TMP timidin monofosfat TPP tiamin pirofosfat Trp triptofan TTP timidin trifosfat Tyr lirozinS U uracil UDP uridin difosfat UMP uridin monofosfat UTP uridin trifosfat ¥ vaiina Vmax vitezS maxima Val vaiina VLDL lipoproteine cu densitate foarte mica W triptofan XMP xantozin monofosfat Y lirozina Z acid glutamic sau glutamina 746

BIBLIOGRAFIE SELECTIVA Adams R.L«, Knowler J.T., Leader D.P. - The biochemistry of the nucleic acids. Chapman and Hail, N. Y., 1992. Akiyama S.K., Nagata K., Yamada K.M. - Cell surface receptors for extracelular matrix components, Biochim. Biophys. Acta, 1990, 1031, 91. Alberts B., Bray D., Lewis J. et at. - Molecular biology of the ceil- (2nd edition) Garland Publishing Inc. N.Y., 1989. Altman S., Kirsebom L., Talbot S. - Recent studies of ribonuclease P,-FASER J., 1993, 7, 1. Anfebi Elizabeth, Fishloek D. - Biotechnology - Strategies for Life, The MIT’ Press, Cambridge, Massachusetts, 1986. ' Arnheim N., Erlich H. - Polymerase chain reaction strategy, Annu. Rev. Biochem1992, 67, 131. Baggiolini M.M., Clark-Lewis L - Interleukin -8, a chemotactic and inflammatory cytokine, FEES Letters, 1992, 307, 97. Beato M. - Gene regulation by steroid hormones, Cell, 1989, 56, 335. Birnbaumer L., Abramowitz J., Brown A.M. - Receptor-effector coupling by G proteins, Biochim. Biophys Ada, 1999, 1031, 163. Boulanger P., Polonovski J., Biserte G., Dautrevaux M. - Biochimie medicate, 2e edition, Masson, Paris, 1989. Cecil T.R. ■- RNA as an enzyme, Sci. Am., 1986, 255, 64. Cech T.R, - Ribosomes and their medical implications, JAm.MedAssoc., 1988, 260, 3030, Champe Pamela C., Harvey A.R. - Biochemistry, 2nd edition, F.B. Lippincot Company, Philadelphia, 1994. Clarke S. - Protein isoprenylation and methylation at carboxyl-terminal cysteine residues, Annu. Rev. Biochem., 1992, 61, 355. Cohen P. - The role of protein phosphorylation in the hormonal control of enzyme activity, Eur. J. Biochem., 1985, 151, 439. Cristea-Popa Elena, Popescu Aurora, Tru{.ia E., Dinu Veronica. - Tratat de biochimie medicals, Bucurejti, 1991. Davidson V.L., Sitfman D.B. - Biochemistry, 3rd edition, Harwal Publishing, Philadelphia, 1994. Devlin M.T. - Textbook of Biochemistry with clinical correlations, Wiley and Sons Inc. Publication, N.Y., 1992. Druker B.J., Mammi H.J., Roberts T.M. - Oncogenes, growth factors and signal transduction, N. Engl. J.Med., 1989, 321, 1383. Ecker R.H. - Lipoprotein lipase. N .Engl J Med. 1989,526, 1060. Etsensteui B.L - The polymerase chain reaction. A new method using molecular genetics for medical diagnosis, N .Engl J Med., 1992, 322, 178. Evans R. - The steroid and thyroid hormone receptor super family, Science, 1988, 240, 889. Farago A., Nishizuka Ya. - Protein kinase C in transmembrane signalling, FEES Letters, 1990, 263, 350. Fersht A. - Enzyme Structure and Mechanism, 2nd edition, Freeman, N.Y., 1985. Furie B., Furie B.C. - Molecular and cellular biology of blood coagulation,' N.Engl.J.Med., 1992, 326, 800. Fuyuhiko Tamanoi. - Inhibitors of Ras farnesyltransferases, Trends Biochem.

Sci., 1993,18, 349. Gibson Q.H. * Hemoproteins, ligands and quanta, J.Biol.Chem., 1989, Minireview Compendium, pg. 20155. 747 Gordon D J., Rifkind B.M. - High density lipoprotein - the clinical implications of recent studies, N.EnglJ.Med., 1990,52/, 1311. Green M. - Biochemical mechanisms of constitutive and regulated pre-mRNA splicing, AmuMev.Ce.il Biol., 1991, 7, 559. Li J., Guerrier-Tagada, Altman S. - Targeted cleavage of mRNA in vitro by RNAase P from Escherichia Coli, Proc. Nall. Acad. Sci1992, 59, 3185. Halligan B.D., Edwards K.A., Liu L.F. - Topoisomerases, JBiol.Chem., 1985, 269, 2475. Hardingham T.E., Fosang J.Amanda. - Proteoglycans:many forms and many functions, FASEB J1992, <5, 866. Jacnisch R. - Transgenic, animals, Science, 1988, 240, 1468. Jacob F., Monod J. - Genetic regulatory mechanisms in protein synthesis, JMolBioL, 1961, 5, 318. Khochbin S.j Lawrence J. - Antisens nucleic acids, EmboJ., 1989, 5, 4107. Kornberg A. - DNA replication, J.Biol.Chem., 1988, 1, 263. Krant J. - How do enzymes work?, Science, 1988, 242, 533. Krebs H. - The history of the tricarboxylic acid cycle, Perspect.Biol.Med., 1970, 14, 154. Lewis R.A., Ausren K.F., Soberman R.J. - Leukotrienes and other products of the 5-lipooxyge- nase pathway, N.EnglJ.Med., 1990, 323, 645. Lomako J., Lomako W., Whelan W. - A self glucosylating protein in tine primer for rabbit muscle glycogen biosynthesis, FASEB J., 1988, 2, 3097. Long D.M., Ulbenbeck O.C. - Self cleaving catalytic RNA, FASEB J1993, 7, 25. Lucas P.C, Granner D.K. - Hormone response domains in gene transcription, Annu.Rev.Bio~ chem., 1992, 67, 1131. Maniatis TM Reed R. - The role of small nuclear ribonucleoprotein particles in pre-mRNA splicing, Nature, 1982, 325, 673. Margineanu D.G. - Energetica lumii vii, Ed. Edimpex-Speranfa, Bucuregti, 1992. Mincu I., Fopescu Aurora, Ionescu-T£rgovi§te C, - Elemente de biochimie §i Tiziologie a nutripei, Vol.L, Edit. Medicals, Bucuregti, 1985. .Murray R.K., Granner D.K., Mayes P.A., Rodwell V.W. - Harper’s Biochemistry, 23rd edition, Appelton and Lange, 1993. Noller H. - Ribosomal RNA and translation, Anna.Rev.Biochem., 1991, 60, 191. Papa S., Guerrieri F., Lorusso M., Boffoli D. - Mechanism of Proton Translocation by the b-c, Complex of Mitochondrial Respiratory Chain; in "Water and ions in biological systems", Edited by Alberte Pullman, V. Vasilescu, L. Packer, Plenum Press, N.Y., 1985. Paul W.E. (editor) - Fundamental Immunology, Raven Press, N.Y., 1989. Perufz M.F. ~ Myoglobin and hemoglobin: role of distal residues in reactions with haem ligands, Trends BiochemSci., 1989, 14, 42. Pilkis S.J., El-Maghrabi M., Claus T.!L - Hormonal regulation of hepatic gluconeogenesis and glycolysis, Annu.Rev Biochem., 1988, 57, 755. Proud W.K., Yugen E.H., Barry W. - Disorders of Ajnino Acid Metabolism; in

Basic Neurochemistry, eds. Siegel. G., Agranoff-B., Albers R.W., Molinoff ?., Raven Press, N.Y., 1989. Ptashne M. - Gene regulation by proteins acting nearby and at a distance,'Nature, 1986, 322, 697. Rabemacker T.W,, Parck R.B., Dwek R.A. - Glycobiology, Amu Rev Biochem., 1988, 57, 285. Rasmussen H. - The calcium messenger system (I,II), N.EnglJ .Med., 1986, 314, 1094, 1164. Rawn J.D. - Biochemistry, Neil Patterson Publishers, Carolina Biological Supply Company, Burlington, North Carolina, 1989..... Raz L, Katz A., Spencer M.K. - Epinephrine inhibits insulin mediated glycogcnesis but enhances glycolysis in human skeletal muscle, AmJ.Physiol., 1991, 260, E 430. Ro mine os J.M., Iannuzzi M.C. - Identification of the cystic fibrosis gene; chromosome walking and jumping, Science, 1989, 245, 1059. Rusu V., Baran T., Ilranisteanu D.D. - Biomembrane §i patologie, Vol. I, Ed. Medicals, Bucure§ti, 1988. 748 Rusu V,, Baran T., Br$ni§teanu D.D. - Biomembrane §i patologie, Vol.II, Ed, Medicala, Bucure§ti, 1991. Saldanha R., Mohr G., Belfort M., Lambwitz A.M. - Group I and group II introns, FASEB J., 1993, 7, 15. Sancar A,s Sanear G. - DNA repair enzymes, Anna .Rev .B iochem., 1988, 57, 29. Sanger F., Nicklen S., Coulson R. - DNA sequencing with chain terminating inhibitors, P roc .Natl Acad.Sci1977, 74, 5463. Scott J.E. - Supramolecular organization of extracelluar matrix glycosaminoglycans, in vitro and in the tissues, FASEB J., 1992, 6, 2639. Scriver C.R. et al. (editors) - The metabolic basis of inherited diseases, McGraw-Hill, 1989. Sodeman W.A., Sodetnan T.M. - Pathologic Physiology, Seventh Ed., W.B. Saunders Company, Philadelphia, 1985. Southern E, - Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis, JMol.Blol., 1975, 98, 503. Steinberg D., Parthasarathy S.? Carew T.E., Khoo J.C., Witztum JUL - Beyond cholesterol Modifications of low-density lipoprotein that increase its atherogenicity, N.Engl J Med., 1989, 320, 915. Stryer L. - Biochemistry, 3"* edition W.H. Freeman and Company, N.Y., 1988. Thomas DJL - Concepts in protein folding, FEES Letters, 1992, 307, 10. Turner P. - Controlling roles for snurps, Nature, 1985, 316, 105. Utermann G. - The mysteries of lipoprotein (a), SciAm., 1989, 246, 904. Van Sehaftingen E. - A protein from rat liver confers to glucokinase the property of being antagonistically regulated by fructose - 6 - phosphate and fructose ~ 1 - phosphate, Ear J.Bio- chem., 1989, 179, 179. Voet D., Voet Judith G. - Biochemistry, John Wiley and Sons Inc., N.Y., 1990. Walsh M.P. - Calcium. - dependent mechanism of regulating of smooth muscle contraction, Biochem,CellMoLt 1991, 69, 111. Watson J.B., Crick F.H.C. - Molecular structure of nucleic acids, Nature,

1953,171, 737. Weil J.H. - Biochimie generale, Ed. Masson, Paris, 1989. Weinberg R.A., - The molecules of life, Set Am., 1985, 253, 48. Weintraub H. - Antisens RNA and DNA, SciAm., 1990, 262 , 40. Wikstrom M. - Identification of the electron transfers in cytochrome oxidase that are coupled to proton pumping, Nature, 1989, 338, 776. WiUison J.D., Foster B.W. - Textbook of Endocrinology, W.B. Saunders Company, N.Y., 1992. Yardin Y., Ulhrich A. - Growth factor receptor tyrosine kinases, Annu.RevBiochem., 1988, 57, 443. Young R.A. - RNA polymerase II, Annu.Rev.Biochem., 1991, 60, 689. 749 i INDEX A Abetalipoproteinemie familiala. 470, 471 ABG (androgen binding globulin) 621 Ac v. anticorp ACAT v. acilCoA-colesterol aciltransferaza Acceptor de protoni 664 Acetaldehida activa 330 Acetalfosfatid v. plasmalogene Acetat tiokinaza 496 Acelil-CoA 116, 123, 327, 331, 333, 339, 419, 420, 450 Acetil-CoA carboxilaza v. acetil-CoA carboxili- gaza Acedl-CoA carboxiligazS. 123*, 429 Acetil-coenzinm A v. acetilCoA Acetilcolina 370 Ace-tilcolin esteraza 110 N-Acelil-galactozamina 303, 382, 391 N-Acetil-galactozidaza 701 N“Acetil-glucozamin
seiina Acid a-amino-P-imi.dazoliPpropionic v. histidina Acid a-amino-p-indolilpropionic v. triptofan Acid p-amino-izobutiric v. fkaminoizobutirai Acid aamino-izocaproic v. leucina Acid a-amino-izovalerianic v, valina Acid 5-aminolevulinic 18*, 521, 522, 325, 527 Acid a-amino-S-metiltiobutiric v. metionina Acid a-amino-p-metil~valerianic v. izoleucina Acid a-amino-propionic v, alanina Acid p-amino-propiomc v. p-alanina Acid a- amino-succinic v. acid aspartic Acid a-aniino-p-tio-butiric v. homodsteina Add a-amino-Ptio~propiofiic v. cisteina Acid arahic 395* Acid arahidonic 395*, 396, 434, 472, 474, 475, 710 Add arginine succinic vezi argminosuccinat Acid ascorbic 128, 129*, 293, 353, 354, 503, 673 Acid aspartic 17*, 20, 22* Add azotes 219 Acid behenie 395* Acid benzoic 518 Acid 1,2-bisfosfogUceric v. 1,2-bisfosfoglicerat Acid 1,3-bisfosfogliceric v. 1,3bisfosfogli.cerat Acid 2,3-bisfosfogliceric v: 2,3~bisfosfogIicerat Acid butiric 395* Add capric 395* Acid caprilic 395* Acid caproic 395* Acid catbamil-fosforic v. carbamil-fosfat Acid carbamil-aspartic v, carbamil aspartat Acid y-carboxiglutamic 59, 138* Acid cerebronic 395* Add a-cetoglutaric v. cx-eetogiutarat Acid 3-eeto-L-gulonic v. 3-ceto-L-gulonat Add chenodezoxicolic 413, 456, 457 Add cistcic 28 Add citidilic v. CMP Acid citidin monofosforic v. CMP Acid citidin difosforic v. CDP 751 Acid citidin trifosforic v. CTP Acid citric v. cilrat Acid colanic 413 Acid colic 413 Acid condroitin sulfuric v. condroilin sulfat Acid conjugat .662 Acid dehidroascorbic v. dehidroascorbat Acid dezoxicolic 413, 456, 457 Acid a,e-diamino-caproic v, lizina Acid a,5~diamino~valerianic v. omitina Acid diazobenzensulfonic Acid difosfogliceiic v. acid bisfosfogliceric Acid dihidrofolic v. dihidrofolat Acid dihidroorotic v. diliidroorotat Acid 3,7dihidroxi-eolanic v, acid chenodezo- xicolic Acid 3,12-dihidroxi-colaruc v. acid dezoxicolic Acid 6,8-ditiooclanoic v. acid Lipoic Acid eicosatetraenoic v. acid arahidonic Acid elaidic 395, 396 Acid enolpiruvic v. enolpiruvat Acid fenilacctic v. fenilacetat Acid fenillactic v. fenillactat Acid fenilpiruvic v. fenilpiruvat Acid fitic 721 Acid folic v. folat Acid formiininoglulamic 497, 499 Acid fosfalidic 399, 400, 441

Acid fosfoenolpiruvic v. fosfocnolpiruvat Acid 2 fosfogliceric v, 2-fosfoglicerat Acid 3 fosfogliceric v. 3-fosfoglicerat Acid 6-fosfogluconic v. 6-fosfogiuconat Acid fumade v. fumarat Acid glicocolic v. glicocolat Acid glicochenodezQxicolic 456 Acid gluconic 305 Acid glucuronic 351, 353, 354, 388, 390, 391, 532, 533, 684 Acid glutamic 17\ 20, 22* Acid gras poEnesaturat 292 Acid gras sintaza 77, 427, 430-432 Acid guanilic v. GMP Acid guanozin difosforic v. GDP Acid guanozin monofosforic v, GMP Acid 3\5’-guanozin monofosforic v.GMPc Acid guanozin trifosforic v. GTP Acid L-gulonic v. L-gulonat Acid hialuronic v. hialuronat Acid (3-hidroxibutiric v. (3hidroxibutirat Acid 3-hidroxi-colonic v. acid litocolic Acid pdridroxi-fenilpiruvic v. p-hidroxi-fenil- piruvat Acid hidroxinervonic 395* Acid hipocloros 285, 291 Acid hipuric 518 Acid homogentizic v, homogendzat Acid L-iduronic v. L-iduronat Acid inozinic v. IMP Acid inozinmonofosforic v. IMP Acid izocitric v. izocitrat Acid izovalerianic 507 Acid lactic v. lactat Acid iauric 395* Acid lignoceric 395* Acid linoleic 395*, 710 Acid linolenic 395*, 710 Acid Y-linolenic 395 Acid lipoic 116, 278, 330 Acid lisergic 514 Acid litocolic 413, 456, 457 Acid maleilaceloacelic v. maleilacetoacctat Acid malic v. malat Acid malonic v. malonat Acid N-metilguanidinacetic 517 Acid metilmaionic 507 Acid 3-metoxi-4-hidroxi~mandelic 610, 611 Acid 5-metoxi-indolacetic 514 Acid mevalonic v. mevalonat Acid mirislic 395* Acid nalidixic 166, 218* Acid nervonic 395* Acid neuraminic 303, 304 Acid oleic 395*, 396 Acid onic v. aldonic Acid orotic v. orotat Acid orotidilic v. OMP Acid oxalic v. c>xa.lat Acid oxaloacetic v, oxaloacetat Acid ot-oxoglutaric v. a-cetoglutarat Acid palmitic 395* Acid palmitoleic 395*

Acid acid pantoic 122 Acid pantotenic 122 Acid paracloramercuribenzoic 93 Acid pirofosforic v. pirofosfat Acid a-pirolidiri-carboxilic v. prolina Acid pii'olin-5-carboxilic 497, 498 Acid piruvic v. piruvM Acid prostanoic 471 Acid ptcroic 127 Acid ptcroilglutamic v. acid folic Acid retinoic 131 Acid sialic 304, 382 Acid stearic 395* Acid succinic v. succinat Acid taurochenodczoxicolic 456 Acid taurocolic v. taurocolat 752 Acid tetrahidrofolic v. leteahidrofolat Acid tetraiodoliroacetic 589, 590 Acid timidilic v. TMP . Acid timidin difosl’oric v. TDP Acid timidin monofosforic v. TMP Acid timidin trifosforic v. 1TP Acid 3a,7a,12a-trihidroxicolanic v, acid colic Acid triiodotiroacetic 589, 590 Acid uric 290, 539*. 549, 551-553 Acid uridilic v, UMP Acid uridin difosforic v. UDP Acid uridin monofosforic v. UMP Acid uridin trifosforic v. UTP Acid urocanic 497, 498 Acid uronic v. acid alduronic Acid vamlmandelic v. acid 3-metoxi-4'hidroxi- mandclic Acid xantilic v, XMP Acid zaharic v. acid aldaric Acidoza 661, 668 Acidurie metilmalonica 126 Aciladenilat 418 Acil-CoA 266, 271, 272, 418 Acil-CoA-colestcroI.aciitransferaza 465 Acil-CoA dehidrogenaza 420, 499 Acil-CoA desaturaza 433 Acil-CoA oxidazS 424 Acil-CoA sintefaze 91, 418 Acil-colesterol 411 Acilgliceroii 397, 398 Acizi biliari 130, 413-415, 456-457, 518 Acizi biliari conjuga|i 414 Acizi biliari primari 456 Acizi biliari secundaii 456 Acizi dezoxhihomicleici v. ADN Acizi gra§i 394-396, 417-434, 707* Acizi gras! esenfiali 433, 710 Acizi gra§i liberi-plasmatici 458, 467 Acizi grari neesteri.fi caji v. acizi gra$i liberi plasmatic! Acizi mercapturid 518 Acizi nucleici 140 Acizi ribonucleic! v, ARN Aconilat 335 Aconitaza 335 Acridina 188, 226 ACTH v. corticotropina Actina 13* Actinomicina D 188, 218 Activita|i bazale 704

Acpunc antri'ahitica 133 Adenilare 108 AdeniJat ciclaza 576-578 Adenilat kinazS 91, 265, 271, 320, 544 Ademlosuccinat 542, 543 AdeninS 140, 141, 154, 175, 539* Adenin fosfoiibozil transfcraza 550 S-AdenozilhomocisteinS 512 5- AdenozilmetioninS 122, 501, 512, 517 AdenozinS 142, 539*, 547 Adenozin difosfat v. ADP Adenozln monofosfat v. AMP 3\5’-Adenoz.m monofosfat v. AMPC Adenozin monofosfat ciclic v. AMPC Adenozin irifosfat v. ATP ADH v. vasopresina ADN 128, 139, 153, 154 ADN A 157 ADN 33 145, 157 ADN Z 145, 157, 158 ADNC 172, 235,.241, 242 ADN complementar v. ADNC ADN circular 158 ADN giiazS 164, 166, 169 ADN ligaz# 164, 165, 167, 169 ADN metilaza 173 ADN mitocondriai 160, 282, 288 ADN polimeraza I 164, 167, 169 ADN polimeraza II 164 ADN polimeraza III 164, 167, 169-172 ADN polimeraza a_172 ADN polimeraza |3_172 ADN polimerazil 172 ADN polimeraza 5_172 ADN polimeraza ADN dependent^ 164 ADN polimeraza ARN dependents v. revers- transcriptaza ADN primaza 164, 167 ADN recombinant 232, 233 AD.N recombinat 232, 242 ADN replicaxa 164, 165 ADN satelit 159 ■ADN supers pmalat 157, 158 ADP 144, 268, 273-275, 277, 285, 488 ADP ribozilare 216 Adrenalins *130, 369, 370, 375, 5642 608-611 Ag+ 95 Ag v. antigen AGL v, acizi grasi liberi plasmatic! Aglicon 307 Agonist 566 Agrecan 689 Agregate moleculare 682 Alariina 14, 15*, 22*, 122, 495, 496, 500, 515, 560, 561 P-Alanina 182 515 6- ALAVS v. 5-aminolevulinat sintetazS AlantoinS 553 Alcaloi;;.! 719* Alcaloza 661, 668 753 Alcapton v. homogentizat Alcaptonurie 507 Alcool dehidrogenaza 71, 76, 113, 380 Aldehid dehidrogenaza 380 Aldimina v. baza Schiff Aldohexoxa 296 Aldolaza 45", 323 Aldolaza A 76, 323 Aldolaza B 380, 381 Aldopentoza 296 Aldosterona 564*, 612-618 Aldotetroza 296 -AldotriozS, 295 Aldoza 294 Aldoreductaza 381 Alizina 28 Alopurinol 146, 148, 554 Alosterie 97 Aloza 296 Altroza 296 a-Amanitina 188 Amfibolic 339, 340 Amidofosforibozil transferaza 540, 541, 545, 546 Amidon311 Amilaza 13", 76, 86, 312, 314 A mil o-1,4-1,6-gluca n transferaza 367 Amilo-

l,6-gl.ucozidazft 31.4 Amilopeclina 311-313 AmilO“l,4-l,6-transglicozilaza 371, 372 Amiloza 311, 312 Amine biogene 513 Aminoacid 14, 707* Aminoacid cetogen 494 L-Aminoacid decarboxilaza 514 Aminoacid, esenpal 711, 712*, 734* Aminoacid esenjial limitant 712 Aminoacid glucoformator 355, 358, 494 DAminoacid oxidaza 488 L-Ami.noacid oxidaza 118, 488 Aminoacid tieesenpal 508 Aminoacid semiesenlial 483, 508 Aminoacil adenilat 206, 207 AminoacilAMP v. aminoacil adenilat Aminoaci3-ARNt 197> 2(n_ 20J! Aminoacil-ARNt sintetaza 208 y-Aminobutirat 514 2-Amino-6-hidroxipurma v. guanina P-Aminoizobutirat 560, 561 8-AminoJcvulinat 18*, 521, 522, 525, 527 5-Aminolevulinat dehidrataza 522 S-Aminolevulinat sintaza 96, 521, 522, 525, 527 Aminopeptidaza 481 6-Aminoporina v. aden.ina Aminotransferaza 71, 486 Amiriozaharuri 303 Aniilal 276 AMP 123, 143, 269-271, 320, 539*, 542, 543 AMP ciclic v, AMPV 3\5 VAMP v. AMP, AM Pc 145, 220, 321, 572-574, 576-580 AMP dezaminaza 548 3’,5'-AMP lbsfodiesteraza 576, 577 Anabolism 259 An aero b 253, 268, 274, 275, 285 Analizor de impedanja bioelectxica 647 Androgen 612-615, 618 Androstan 412 Androstendiol 619 A5-Androstendiol 619 Anrfrostendioiia 612, 614, 621 Andioslerona 621 ANP v. factorul atrial natriuretic Angiotensina I 617 Angiotensina II 302 617, 618 Angiotensinaza 618 Angiotensinogen 617, 618 Anhidraza carbonica. 71, 76, 106, 110 Anhidrida 264 Anomerie 300 Antagonist 566 Anti, forma 145 Antibiotic 719 Anticodon 139, 178, 179 Anlicorp v. imunoglobulina AnUdiuretic v. vasopresinS. Antigen 53-55 Antimicina A 276 Antioxidant 130, 131, 135 o^-Antiproteaza 52 arAntitripsina v. arantiproteaza Antitnombina 61, 694 Anlivitamina 114 Apa 643, 707', 722, 723' A pa. legata 643, 656 Apa oxigenaia 291 Ap«,A v, diade.nozin tetrafosfat Apoenzima 75, 120 Apolipoproteina 458 Apolipoproteina A 52*, 461*

Apolipoproteina B 52*, 461* Apolipoproteina B48 461* Apolipoproteina B100 4612 463 Apolipoproteina C 461*, 462 754 Apolipoproteina D 461* Apolipoproteina E 46 T Apoprotein# 49 APR!' v. adcsun fosfonhozil iransferaza Arabinoz# 296, 382 Arabinoza-5-fosfat 349 Arahidonat 472, 474, 475 Arginaz# 76, 492, 494 Arghun# 17*, 20, 22\ 483, 492*, 493*, 516 Arginina-succinat 491, 493, 494 ArgininS-sucdnat liaz# 492, 494 Arginina-succinat sintetaza 491, 494 Arginino-sueciftic acidemie 494 Argininvasopresin# 630 (T ARK (p-adrenergic receptor kinase) 566 Aril-sulfataz# 697 ARN 139, 175, 176 ARN de transfer v. ARN( ARN initiator 167, 169 ARNm 139, 176, 177, 192, 193 ARN mesager v.ARN,,, ARN nionocistronie 177 ARN nuclear de dimensiuni inici 176, 181, 193, 200 ARN nuclear heterogen 177 ARN policislronic 177 ARN poligenic 177 ARN polimeraza ADN dependent# 173, 182-185 ARN polimeraz# ARN dependent# 201, 202 ARN polimeraza I 187 ARN polimeraza II 187 ARN polimeraza III 187 ARN polimeraz# holoenzima 182, 183 ARN polimeraza mitocondrial# 187 ARN ribozomial v, ARNr ARNr 176, 180, 190, 19 i, 199 ARN ribozomal v. ARNr ARNr 5 S 180, 199 ARNr 5,8 S 180, 199 ARNr 16 S 180, 199 ARNr 18 S 180, 199 ARNr 23 S 180, 199 ARNr 28 S 180, 199 ARNr 30 S 199, 200 ARNr 45 S. 199, 200 ARNt 139, 176, 178, 179 Aromataza 622, 623 Artrila reumalismal# 700 Asparagma 17*, 20, 22\ 384, 385, 499, 500, 684*, 688 ' Asparagin sintetaza 511 Aspaitat 286, 688 Aspaitat aminotransferaza v. GOT Aspaitat carbamil transferaz# 102 Aspaitat trnnscaj-bamilaza v. aspaitat carbamil tmnsferaza ATP 115, 123, 144, 164, 262, 268'*, 271, 273, 277, 285, 319, 488 d-ATP 164 ' ATP-aza v, ATP fosfohicirolaza . . ATP-aza Na/K dependenta 76, 591 ATP fosfohidrolaza 76 ATP sintetaza 274, 275, 280, 281*, 288, 527 • Avery, O. 153 Avitaminoza 114, 716 8-Azaguanina 146, 148 4-Azauraci.l 146 Azauridina. 148 Azatioprin 146, 148 Azidotimidin# 146, 148 Azide 277

B B, ADN ]45, 156 Bacteriofag 238 Balanfa azotata 480 BarnH I 234* Banda Soret 520, 521 Bayiiss, W. 562 Baza conjugata 662 Baza Sc luff 26, 522 Biunuri 733, 735 Benzoat de sodiu 518 Benzoil-CoA 518 Benzoil-glicin# v. acid hipuric Retain# 27 Biblioteca ADNC 241, 242 Biblioteca genomic# 239, 241 Rigli.ean 690, 691, 692* Bilirubina 530-535 Bilirubina conjugata 533, 535, 536 Bilirubina direct# 535 Bilirubina indirect# 535 Bilirubina libera 536 Bilirubina neconjugata 535 Bilirubina seric# total# 534 Bilirubindiglticuronid 533 Bilirubinmonoglucuroftid 533 Biliverdina 529, 530 Biliverdin reductaza 530 Biocalalizatoii 67 Bioenergetic# 256, 278 Biotin# 123 1,3-Bisfosfogfieerat 272, 274, 323-325 23-Bisfosfoglicerat. 105, 324, 325 Bisfosfoglicerat fosfaiaza 325 Bisfosfoglicerat kinaza 325 Bisfosfoglicerat mutaza 325 Boala Andersen 376 Boala" Farber 446, 447 Boala Forbes 376 Boala Gaucher 446, 447 Boala Gilbert 536 Boala von Gierke 376 Boala Hers 377 Boala Hug 377 Boala Krabbe 446, 447 Boala Me Ardle 377 Boala Nieman-Pick 446, 447 Boala Sandhoff 701 Boala Tangier 470 Boala Tay-Sachs 446, 447, 701 Boala cu uiina eu mires de aifar (maple syrup disease) 507 Bodansky 84 Bohr, efect 106 2,3 BPG v. 2,3-bisfosfoglicerat Bradikminfi 30* 5-Bromouracil 225 C C3 52* C4 52* CH 56 Cl56 Ca2+ 587 76, 370, 573, 574*, 583, 584 CAAT, caseta 187 Cadavenna 26, 514 Caleeinie 592 Calcitonina 564, 594 Calc-itriol v. 1,25-dihidroxicolecalciferoi Calciu exiracelular 592 Calciu plasmatic 592 Calciu intracelular 592 Calciu ioirizat 592 Calea Embden-Meyerhof-Parnas v. glicoliza Calea fosfogluconatului v. calea pentozofosfa|ilor Calea glicerol fosfatului 437, 438 Calea glucuronatului 351 Calea LDL 465 Calea monoacilglicerolului 437 Calea pentozofosfajilor 342-350 Calea polio! ica 381 Calmodulins 368, 370, 584, 585 Capacitate tampon 665, 666 Capacitate tennica 635 Carbamil aspartat 555, 556 Carbamil fosfat 266, 555, 556 Carbamil fosfat sintetaza 555, 556 Carbamil fosfat sintetaza. (glutamina) 555 Carbamil fosfat sintetaz& mitocondriala • 490, 491, 493 Carbaminoacid 27 Carhoxilare 123 Carboxipeptidaxa 76, 481 CardiolipinU v. difosfatidil glicerol Carentii vitaminica 114 Carnitina 419 Carnitin aciltransferaxa 419 a-Caroten 131, 409 p-Caroten 131, 1327 136, 409, 410 y-Caroten 131, 409 Carotenoizi 409, 410 Catabolism 259 ■. Catalaza 76, 110, 286, 292. 519 Cataliza 69 Catecol 608

Catecolamine 363, 364, 608-611 CatecoI-O-melii transferaza (COJMT) 610, 611 Catena codificatoare 181 Catena necodilicatoare 181 Catepsina 485 ■ Cazeiri3'481 Cat de fosforilare 277 CBP (cortisol-binding protein) 615, 623 C13P (Ca-binding protein) 597 CDP 539* CDP-colina 441-443 CDP-di aciJ glicerol 441 -443 CDP-diglicerid v, CDPdiacilglicerol CDP-etanolamina 441-443 . Cefallna v. fosfatidiJetanolamina Celobioza310 Celule A 598 Celule B 598 Celule D 598 Celule F 598 Celule cromafine 608 Celule hipofizare corticotrope 624 Celule hipofizare gonadotrope 624 Celule hipofizare lactotropc 624 Celule hipofizare somatotrope 624 Celule hipofizare Ureotrope 624 Celule inierstijiale v. celule Leydig Celule Leydig 618 Celulozil 721 Centrul activ enzimatic 77, 78 Centrul catalitic 78 756 Ceramics 405 Ceramidazft 446, 447 Cerebrozid 405, 406 . Ceride v. cenui Ceruri 407, 408 CerulopJasmina 45*, 52* Celimina v. baz2 Schiff a-Cetoacid 27, 116 a-Cetoadd dehidrogenaza 499, 505 P~Celoacil-CoA 420 [3-Cetoacil-CoA tlolaza 420 Cetogeneza 424-426, 604 oc-Cetogluiarat 115, 118, 286, 335, 487, 488, 497* a-Cetogiutarat dehidrogenaza 336, 337, 488 3-Ceto-L-gulonat 353, 354 2-Ceto-L-gulonolactona 353, 354 3~Ceto-L-gulonolaetona. 353, 354 Cetonemie 426 Cetonurie 426 Cetoza 294, 297, 711 , Changeux, IP. 97 ChargalT, E. 154 '■ Chela]! 138 Cheluiiaia energetic# 704, 705*, 736* Chiloinicroni 416, 459-463, 460* Chimotripsina 38*, 72, 74, 78, 110, 481, 485 Chimotripsinogen 481 Chiral ic, centru 20, 295 Ciancobalamina 124, 125*, 501 Ciclooxigenaza 473, 474 Ciclopentanoperhidrofenaniren 290 Clclul addului citric v. cidul aeizilor

tricarboxilici Cidul acizilor tricarboxilici 276, 330-340, 493, 521 Cidul alanina-glucoza. 359, 360 Clclul celular 173, 285 Ciclul Con v. clclul lactat-glucoza Ciclul Felig-Malettc v. clclul alanina-glucoza Ciclui y-glutarnii 516 Ciclul Krebs v. ciclul acizilor tricarboxilici. Ciclul Krebs-Henseleit v. ciclul ureogcnetic Ciclul lactat-glucoza 360 Ciclul rodopsinei 131, 132* Ciclul TCA v. cidul acizilor tricarboxilici Ciclul ureogcnetic 490* Cimelidina 514 Cisteaminfc 26, 515 Cisteiml 16*, 20, 22*, 122, 481, 488, 495, 512, 518 Ostein dioxigenaza 518 Cistina 27, 495-497 Cislin reductaza 497 Cistron 177 Citidilat v. CMP Citidina 142 Ciridin difosfat v. CDP CilicUn monofosfat v, CMP Cilidin Infos fat v. CTP Cifocromi 13*, 65, 76, 91, 271, 272, 277, 519 Citociom a 91, 129*, 272, 277, 281 Citocrom a3 91, 272, 277, 281 Cltocrom b5 277, 433 Citocrom b5 reductaza 433 Citocrom c 48*, 65, 91, 129*, 271, 272, 278*, 281 Citocrom c, 91 Citocrom c oxidaza v. complexul respirator IV Citocrom P450 284, 290, 526, 527, 529, 612 CitozM 140, 141, 154, 1.75 CiIrat 320, 333, 335, 427, 428 Citrat liaza 335 Citrat sintaza 9], 333, 335 Citrulinft 18*, 491 .CHrulinurie 494 Cl a trina 387 Oonarca ADN 237 Clonarea genelor 232, 246-248 CJonh 233 Cloramfenicol 218* CMP 144 d-CMP 144 t CMP-N-acetil-neuraminat 446 Co A v. coenzima A CoA-SH v. coenzima A Cobalt 492 Cod genetic 203, 204*, 205, 206 Codoni 139, 179, 203 Codoni de inifiere 205, 209 Codoni nonsens 205 Codoni sinonimi 205 Codoni tenninatori 205 CoeQcient Hill. 101

Coeficient termic de rcacfie 85 Coenzima. 75, 114 CoenzimaA 122, 123 Coenzima Q 277-281, 279*, 409 Coenzhne fiavinice v. FAD si FMN Coenzime ni.cotinami.dice v. NAD si NADPCofactor 75 Cola gen 13*, 479, 671, 672*, 687, 692, 694* Colagenuza 67], 677 Colagenoli.za 767 Colagenoza 700 Colanaina v. etanolarruna Colan 413 Coleealciferol 595, 596 Colecistokinina 564, 607, 633* Colestan 413 Colestanol 412 Colesterol esteraza 415 Colesterol seric 458* Colina 400, 515 Complex-B 115 Complex enzima-subsirat 69 Complex ES v. complex enzima-substrat Complex major de histocompatibilitate 56, 57' Complex multienzimalic 77 Complex respirator I (v. NADH CoQ oxidore. duclaza) 280-282 Complex respirator 1.1 (v. succinat CoQ oxidoreductaza) 280-282 Complex respirator III (v. CoQ cilocrom c reduc- taza) 280-282 Complex respirator IV (v. cilocrom oxidaza) 277, 280-283, 290 Complex de tranzijie 68 Compiled macroergici 271, 272 COMT v, catecol-O-metil transfera.za Condimente 731s, 733 Condroblast 671 Condroido sulfat 682, 6837, 684', 687, 689, 690, 693, 694 Condroitin-4-sulfat 3897 391 Condroi.tin-6 - suifat 3897 391, 392 Conformable and 145 Con formal! e baie 302 Conformable R 100 Conformalie scaun 302 Conformable sin 145 Conformajie T 100 Conjugare. mercapturica 518 Constants de aciditate 662, 6637 664 Constanta de bazicitate 662, 663 Constanta de echilibru 263, 264, 658, 662, 666 Constanta Michaelis 88, 90, 92 Consum de oxigen 704 Cooperare plaman-rinichi 669, 670* Coproporfirie ereditara 528 Coproporflrii secundarc 529 Copropoiimna 62 CoproporlirinS III 528 Coproporfirinogen 62 Coproporfirinogen I 528 Coproporfirinogen III 528 Coproporfirinogen III oxidaza 524, 528 Coprostanol 456 Coprostanona 456 CoQ v. coenzima Q CoQEU v. coenzima Q

CoQ-citocrom c reductaza v. complexul respirator III Corepresor 99, 222, 223 Corey, R. 36 Cori, C. 360 Cori, G. 360 Coriogonadotropina v, gonadotropina corionica Corpi cetoniei 424 Corticosteroid 612-618 Corticosterona 614 Corticotropin^ 564*, 617, 624, 626, 627 Cortisol 564*, 612-617 Cosmida 238 CP v. creatin foslat CPK v, creatin fosfo kinaza Creatin a 516 Creatinfosfat 273, 516 Creadnibsfokinaza 45, 273, 51.7 Crealinkinaza v. creatin fosfo kinaza Creadnina 516 CRH v. hormonul de eliberare a coriicotropinei CricK, F 154, 155, 205 Criobiologic 85 Cromatina 159 Cromogranina 610 Crornoproteine 50 Cromozomi 159 Crotonaza CS v. somatomamotropina corionica CSF (colony stimulating factor) 638 CTP 102, 164, 265, 557, 558 d-CTP 164 CTP sintctazft 557, 558 Cu24 76, 503 Cuplare chimica 266, 284 Curba Michaelis 88 Caidura de combusde 708 Caidura de vaporizare 653 Caidura do topire 654 D D, serie optica-296, 297 d- v. dezoxi D2 v. ergocalciferol D3 v. colecalciferol 1,25 (OH)2 - D3 v. 1,25 dihidroxi D3 DAG v. diacilglicerol DBP (D-binding'protein) 595 Decarboxilare 120, 122 Decarboxilare oxidativa a piruvalultrl 329-333 Decarboxiiaza 513 Decorina 690, 691, 692* Decuplarea fosforilarii oxidative 283 Defecte metabolice 716* Dehidroascorbat 128, 129 7-DeIddrocolesterol 133, 412, 595, 596 758 11 -Dehidrocorticosterona 612-614 , Dchidroepiandrosterona 612-614, 6I9» 620 7-Dehidrocrgosterol 133 Dejoduraz£ 589, 590 Denaturare proteine 48, 49

Denaturare ADN 150, 151 Dermatan suliat 389', 391, '682, 683', 684*, 687 ' Desmozina 680, 681* Determinant antigenic 53 Dextrina314 Dex Irina limits 314 Dezaminare.486, 488 Dezaminare oxidativa 486 Dezoxiadenilat v. dAMP 5’Dezoxiadenozilcobalainln3. 124, 125, 507 Dezoxiadenozinft 124,-142 Dezoxicitidilat v, d-CMP Dezoxicitidina. 142 11 -Dezoxicoiticosterona 614 llDezoxicorlizol 614 DezoxiguanozinS 142 Dezoxiguanozin monofosfat v. dGMP Dezoxiribonucieoti.de 143, 544, 545 Dezoxiiibonudeozide 142 Dezoxiriboza 140, 304 6-Dezoxi-L-gal.actoza v. fucoz<1 Dezoxiguanilat v. dGMP Dezoxitimidilat v, dTfvlP Dezoxitimidina. 142 Dezoxiltmidin monofosfat v. dTMP Dezoxizahaniri 304 Diacilglicerol 397, 573, 574\ 581-583, 601, 602 Diadenozintelralbsfat 146, 147 Diastereoizomeri v. diastereomeri Diastereomeri 296 DLfosfalidil-gliceroI 404 Difoafogliceiat v, bi.rio.s/ogluxral Digestia glucidelor. 312, 314, 315 Digestia lipidelor 415, 416 DihidrobiopterinS 503, 609 Dihidrofolat 558 Dihidrofolat reduciaza 558 Dlhidrolipoat dehidrogcnaza 118 Di.hidroorolal 556, 557 Dihidroorotat dehidrogenaza 556, 557 Dihidrosfmgozina 405 Dihidrotestosterona 618, 619 Dihidrouridina 179 . Dihidroxiacetona 297, 346 Dihidroxiaceton fosfatul 286, 347, 380 1
Disdfura 27 Dizaharid 308 Dizaharid dicarbonilic 308 Dizaharid monocarborulic 308 Dizaharid nereducStor 308 Dizaharid reducator 308 Di.z2hari.daza 314, 315 Dolled 384, 409 Dolled fosfat 384 Domenii structural^ 44, 45 Donor de proton] 664 DO PA 609 DOPA decarboxilaza 609 Dopamina 608, 609 Dopamln hidroxilaxii 609 Down regulation 566 DSIP (delta sleep inducing peptide) 633* Dubla dice de ADN 155, 156, 682 Duplex v. dubla dice E E v. energie interna E v. potcnpal redox F,0 v. potential redox standard Echiilb.ru acklo-hazic 664, 669, 670 Ecliilibru energetic 704 Echivalent reducStor 277, 281-284, 286 EcoR I 234*, 235 EcoR II 234* Ecuajie Henderson-Hasselbalch 664, 665 Elect Bohr 106 Efect cooperativ 102 Eicct YVolf-CbaikolT 590 Efect alostenc 99-102 Efect heterotrop 99, 102 Efect homotrop 99, 102 Elector alosteiic 99. 102 EGF v. factor dc cregtere ai epidennei Eicosanoizii 471-478 Elastaza 481, 680 Elastina 481, 671,' 672\ 680, 681*, 682*, 687, 694 Electroforeza serului 51 Elemente ininerale 707*, 735* a-Elicea lanlurilorpolipeplidi.ee 36-39 Elongarea acizilor gragi 432-433 Elongarea ADN 165, 167 ■ ■Elongarea ARN 182, 185 Elongarea lanfului poiipeptidic 206, 210-213 Enantiomer! 296 Encefalina 633 Endogiicozidaza 697 Endooucleaza 153

Endopeptidaza 72, 481, 482 Endoperoxid prostaglandin!© 474 Endorfuul 633, 634 rx-Endorilna 626, 633*, 634 |3~Endorfina 626, 633, 634 y-Endortina 626, 633. 634 ot-oeo-Endorfina 633 p-neo-Endorfma 633 Energie de activare 69, 85 Energie disponibila 708* Energie interna 262 Energie legala 256 Energie libera 262-266 Energie libera de reaejie standard 263, 264 Enhancer (seeventa) 187, 188' Enoil-CoA 420 Enoil-CoA hidrataza 420 EnolazS, 326 Entalpie 68, 262 EnterogluCagon 607 Enterokinaza v. enteropeplldaza Enteropeptidaza 482, 483 Entropic 262, 263 Enzima de de ram ill ere 367 Enzima maliea 428 Enzima de ramifiere 371, 372 Enzime alosterice 99 Enzime bifunejionale 367 Enzime digestive 481 Enzime inductibile 88, 219, 223 Enzime lizozomaie 291 Enzime proteolitice 481 Enzime represibile 219, 223 Enzime de restriefie 153, 233, 234 Epimeraza 113, 378, 696 Epimeri 296 Epimerizare 296 Epinefrina v. adrenaline erb 641 erb A 642 erb B 642 Ergocalciferol 133 Ergosterol 133 Eritromscina 218* Eiitropoelina 638 Britroza 296 Erilroza-4-fosfat 346 Erilruloza 297 ES v. complex enzima-substrat Estran 412 Estradiol 564*, 622-624 Estriol 623, 624 Estrogen 572*, 622-624 Etanoiamina 26, 515 Etiocolanolona 621 Exoglicozidaza 697 Exon 160, 177, 189 Exopeptidaza 72, 481, 482 V Factor anli.hcmofilic 58* Factor atrial--natriuretic 581 Factor Christmas 58* Factor de coagulare 58*, 137, 1.38 Factor de cregtere (GF) 564*, 585, 634-

642, 694 Factor de cregtere a epidermei (EGF) 585 Factor de cregtere a fibroblagtilor (FGF) 635 Factor de cregtere a nerviior (NGF) 638 Factor de cregtere eliberat de plachete (PDGF) 636 Factor de cregtere insulin-like (IGF) 637 Factor de credere- insulin-like I (IGF-I) 585, 637 Factor de credere insulinlike H (IGF-II) 637 Factor de cuplare 282 Factor de eliberare a tropinelor hipofizare v. hormon de eliberare a tropinelor hipofizare Factor de elongare a lanfului polipeptidic 210 Factor Magcman 58* Factor inhibilor al eiiberarii de tropine liipofizare v.. hormon eliberator de tropine hipofizare Factor de inifiere al sintezei protei.ee 208, 209 Factor necrozant al tumorilor 640 Factor rho 186 Factor sigma 183 Factor stabilizator al Obiinei 58*, 61 Factor Stuart Prower 58* Factor transformant (3 (TGP |3) 636 FAD/FADH, 116, 117*, 118, 276, 277, 282, 286, 488 Fag 238, 276, 277, 282 Fagocitoza 291, 343 Farnesol. 408 760 S-Faraeziiare 216, 217 Farnezll pirofosfat 217, 218 S-Famezil transferaza 216, 217 Fe2"' 76, 277, 278, 281,503, 520, 521, 524 Fe3+ 76,277,529 Feed-back 98 Fenilacetat 506, 518 FemiaeetilgkUamina 506 Fenilalanina 152 19, 22*, 482, 503\ 506*. Fenilalanin hidroxilaza 503, 506 Fenilcctomuie 506 Fenilelanulamin-N-melil tmnsferaza 609 Fenil-lactat 506 Fenil-piruvat 506 Ferihem 290 FcritinS 13*, 529 Fermenji 67 Ferochelatazl 2 Ferohem 290 arFetoprotei.na 52* FGF v. factor de cregtcrc a fibroblajtiior FH4 v. foiat Fibre alimentarc 707*, 720 Fibre de colageu 675, 677, 679 Fibre structuiaic 720 FibrilS de colageu 677, 679 FibrinS 58*, 61 Fibrinogen 132 482 37-62, 582 694 FibrinolizS 62 Fibrinopeptide 60, 61 Fibroblast 671, 680, 702 Fibroina 40 FibromodulinS 690-692 Fibroneclina 65, 66, 687, 6942 697 Filochtnona 136, 137*. 408 Fischer, H. 80 Fitohormoni 719* Fitoncide 719* Havinadenindinucleotid v. FAD Flavinniooonucieotid v. FMN Flavinnucleotide 117 Ravoproteine 118, 279, 281 5*-Florouracil 146 FMN 1.172 279, 281 FMNI-F 118 H4-Folat v. tetrahidrofolat Foiat 94, 126, 129 N-Formil-metioninS 208, 209 NFonnil-melionil-ARNj 208, 209, 210 N-Fonnil-teiraludrofolal 210 N-Fonnimino-

tclrahidrofolat 128 Fosfataza 107 Fosfataza alcalina 45* Fosfalid v. giicerofoslblipid Fosfatidil-colina 400*, 401 Fosfatidil-etanolamina 4002 402 Fos fatidil-gliceroli 404 Fosfatidil-ijiozitol 402, 403 FosfaUdil-inozitol-4-fosfat 403 Fosfatidii-inozitol“4,5-bisfosfat 403 Fosfatidil-seiinS 400*, 402 3-FosfoadenoziI-5-fosfosulfafc 391, 392 Fosfocrealina v. crealin fosfat FosfodiesterazS 576, 577 Fosfoenolpiruvat 272, 273, 275, 326, 355-357 Fosfoenolpiruvat carboxikinaza, 355-357, 362, 362, 363 Fosfofructo-1 -kinaza 319, 320, 355, 362 Fosfofrueto-2-kinaza 321, 362 Fosfofructo-2-kinaza/fructozo~2,6-bis fosfataza 321 3-FosfogIlceraldehida v. gIiceraldehida-3-fosfat 3-Fosl'ogliceraldehid dehidrogenaza v. giicer-- aidehid-3-fosfat dehidrogenaza 2- Fosfoglicerat 324, 325, 380 3- Fosfogiicerat 274, 286, 325, 326, 511 Fosfoglicerat kinazft 274, 324 Fosfoglicerat imUaza 326 Fosfogliceridc v. glicerofosfoiipide Fosfoglicerol v. gliccrol fosfat 6-Fosfogluconat 305, 344, 345 6-Fosfogluconat dehidrogenazS 345 6-Fosfogluconolactona 344 Fosfoinozitid v. fosfatidilinozitol Fosfokinaza 107 Fosfolipaza 415, 416, 443 Fosfolipaza Af 443, 444 Fosfolipaza A-> 91,443,444 FosfolipazS C 443, 444, 581, 582, 601, 602 Fosfolipaza D 443, 444 Fosfoljpide seri.ce 458* Fosfoproleine 49 Fosfoprolein fosfataza v. protein fosfataza 5-Foslbribozil-p-l-amina 540, 541 5-Posforibozil-a-l-pirofosfat v. PRPP Fosforibozii transferaze 550 Fosforilare 107 Fosforilare la nivei de subslrat 274*, 324, 326, 336 Fnsforiiare oxidativa 274’. 278 bosl’oroliza 366 Fosioirarisieraza 76 Fotohza 230 roJosinieza 259 F-1.6-P, v. fructo/.o-l.b-bisfosl'at Fragmcnte Okazaki 167, 169 Franklin, R. 154 Fredrickson 468 Fructokinaza 379 FructofuranozS. 302 Fructoza 297, 301, 302, 379-382 761 Fructozo- i ,6-bisi'osfat 306, 307, 319, 321, 323, 326, 347, 357 Fructozo-2,6-bisfosfat 321, 322, 364 Fn]clozo-l,6~bisfosfataz3 322, 357, 362 Fructozo-2,6-bisfosfatazS 321, 322 Fructozo-1-,6-bisfosfat liaza v. akiolaza Fructozo-1-fosfat 380 Fructozo-6-fosfat 306, 307, 319, 346, 347, 381 Fructozidaza 314 Ftiocol 137 Fumarat 337, 492, 505 Furan 299 Furanoza 299 Funcjii de stare 261 G■ G, v. energic libera G, proteine 217, 573-575 G0, faza a ciclului celular 173 G,, faza a ciclului celular 173 G2, faza a ciclului celular 173 GABA v, acid yammobutiric Galactilol 379 Galactocerebrozid 405, 406 Galactocerehrozidaza 447 Galactocerebrozidoza v. boala Krabbc Galactokinaza 377, 379 Galactopiranoza 302 D-Gaiactoza 296, 377-379, 382, 684"

Galactoza-1 -fosfat 377, 379 Galactoza-1 -fo.sfat-u.nd.D fransferaza 378 D-GalactozamiuS 303, 382, 388, 684* Galactozemie 379 p-Galactozidaza 219, 314, 447, 697 Galactozutie 379 Gangliozid 406, 407, 446 Gangliozidoza GM, 446, 447 Gangliozidoza GM, v. boala Tay Sachs Gastiicsma 481 Gastrina 564*, 607 GC, caseta 187 GD v. disialogangliozid GDP 272, 275, 488 Gena 159 Gena operator v. operator Gena promoter v. promotor Gena reglatoare 220 Gena structural^ 160 Genom. 159, 160 Geranil pirofosfat 453 Geranioi 4.08 Gestagen, hormon v. progestine GF v. factor de cregtere Gli v. somatotropina GH-RH v. hormon eliberalor al somatotropinei GH-RIII v. somatostatin^ GIP (gastric inhibitory polypeptide) 607 Gla. 59 ■ Giiceraldehida 295, 296, 380 GJiceraldehida-3-fosfat 323, 346, 347 Gliceraldehida-3-fosfat dehidrogenaza 113, 323 Glicerat kinaza 380 Glicerid v. acilglic-erol Glicerofosfolipide 399-404, 441-444 Gliceroidooctuloz^-1,8bisfosfat 349, 350 Gllceroidooctuloza-8-fosfat 349, 350 Glicerol 355, 359, 397, 434; 435 Gliccrol fosfat 286, 359, 399, 435 Glicerol fosfat dehidrogenaza 286 Glicerol kinaza 380, 434, 435 GlicinS 14, 15, 22*, 484, 495, 496, 516, 517, 521, 522, 673 Giiciii-anjidin-transieraza 516 Glicocol v. gliciiia Glicocolat 414, 456, 457 Glicoforina 387 Glicogen 122, 311-313, 364-377 Glicogen fosforilaza 45*, 107, 366 Giicogen fosforilaza A 368 Glicogen fosfodlazft B 368, 369 Giicogen fosforilazofosfataza 368 Giicogen fosforilazokinaza 368, 369 GUcogenina 371, 372 Glicogcnogencza, 371-377 GlicogenolizS 122, 366-370, 604 Glicogenoze 376, 377 Giicogen.sintaza 13*, 107, 371 Giicogen sintaza A 373 Glicogen sintaza B 373 Glicogen sintazofosfataza 373 Glicogen sintazokinaza 373 Glicolaldehida 346, 347 Glicolipide 400*, 405 Glicoliza 318-329 Giicoliza anaeroba 327 Glicoproteine 50, 382-388 Glicoproleina benzii III 387, 388 tx,Glicoproteina 52* Glicosfmgolipidc 405-407 Glicozaminoglicani 388, 682, 687, 688*, 694 Glicozid 307,719* Glico/idaze 385, 386 Glicozil-fosfaiidil-inozitol 601, 602 Glicozil-fosfo-inozi.tol 601, 602 Gliooztl Iransferaza 385, 386 Globina 224 * (X,-Globuline serice 51 oc2-Globuline serice 51 762 (3-Globuline scricc 51 y-Globuline sericc 51 Glucagon 363, 364, 369, 370, 375, 564\ 603-607 i,4-GIucan~ib$fat-g]ucozU transferazS v. glicogen fosfoiilaza

Glucidc 294, 708*, 709, 735* Glueitol v. sorbitol Glucocerebrozid 405 Giucocoriicoizi 290, 363, 364, 485, 572*, 612-617, 696 Glucokinaza 317, 318, 355, 363, 601 Glucomutaza 367 Gluconeogcneza 351, 355-365, 604 Glucopiranoza 302 Glucoza 296, 301, 314, 315, 316, 526 Glucozamina 303, 382, 388, 601, 602, 684* Giucozo-I-fosfat 71, 351, 366, 367, 371 Glucozo-6-fosfat 71, 306, 307, 317-319, 344, 367 Glucozo-6-fosfatazS 71, 357, 363, 367 Glucozo-6-fosfat dehidrogenaza. 71, 344, 351 Glueozo-6-fosfat izomeraza 71,319 a! GlucozidazS 314 1,6-Glucozidaza 367 Glucuronat 136, 306, 351, 353, 533. 535, 684* p-Giucuronid v. (Jglucuronozid Glucuronidare 352, 533 P-Glucuronidaza 533, 697, 701 Glucuronii transferazS v. glucuionozil transfe- raza Giucuronoconjugare v. glucuronidare Glucuronoconjugati v. glucuronozizi Glucuronozid 137, 352 Glucuronozil transferazS 352, 353, 533 Glutamat 126, 138, 286, 487, 499, 508 Glutamat decarboxilazS 514 Glutaim.t.dehidrogenaza 91, 111, 537 Glutamat-oxaioacetat transaniinaza 111,286, 487, 499,537 Glutamat-piruvat iransaminaza 111, 487, 537 y-Gl oiamil-cistei n-si nletaza 515 y-Glutamil transpeplidaza 111, 516 y-GIutamiJ-cisteinil-glicinS v. glutation Ghifaminaza 489 Gluiatnina 17*, 20, 22*, 361, 489, 497, 510, 517 GlutaminsintetazS 45*, 107, 108, 489, 494, 510 Glutation 30*, 292, 293, 515 Glutation oxidat 343, 344 Glutation redus 343, 344 Glutation-insulin transhidrogenaza 600 Glutation peroxidazS 136, 292, 343, 344 Glutation reductaza 293, 343, 344 Glutation sintetaza 515 GM v. monosialogangliozid GMP 143, 539*. 542,. 543. dGMP 143 GMP ciclic v. GMPc GMPc 145, 573, 574*, 580, 581 GMPc fosfodiesterazS 580, 581 GnRI-1 v. horntonul eliberatoral gonadotropinelor GNG v. gluconeogcneza Gonadotropine 564*,624, 629, 630 GonadotropinS- eorionica (placentarS) 629 Gonan 411 5a-Gonan 411 5p~Gonan 411 GOT v. glutamat-oxaioacetat Iransaminaza GPT v. glutamat-piruvat iransaminaza Grupare prostetica 277 GSM v. glutation redus GSSG v. glutation oxidat GT v. Irisialogangliozid GTP 164, 204, 205, 206, 208, 275, 488 dGTP-164 Guanaza v. guanin dezaminazS. Guanidina 20 Gu a nil at v. GMP

Guanilat ciclaza 580, 581 OuanlnS 140, 141, 154, 175, 5392 549, 550 Guanin dezaminazS. 548 Guanozlna 142, 539*, 547 Guanozin difosfat v. GDP Guanozin monofosfat v. GMP 5*,3*- Guanozin monofosfat v. GMPc Guanozin tetrafosfat 146 Guanozin trifosfat v. GTP Guanozi.n-5,-tiifosfat-3*-difosfat 146, 147 L-Gulonat 128, 353, 354 L-Gulonolactona 353, 354 Gulonolacton oxidaza 353 Guloza 296 Gumc 720, 721 Guta 553, 554 H H v. entalpie Hae III 234* Haptoglobina 52* Haworth, formule 300 Mb v. hemoglobina HDL v. lipoproteinc cu densitate mare HDL-colesterol 464* Helieaza 164, 169, 170 Hem 62,. 75, 218, 277, 519-521, 525, 529 Hem a 520 Hem b 520 Hem e 520 Hem catabolism 529 Hem rcglarea biosintezei 525 763 Hemiceiuloza 721 Hemoglobin^ 13\ 437 457 487 62, 64, 102, 129, 224, 277, 290, 479, 519, 520, 529, 665, 669 Hemoglobina A2 105 Hemoglobina E 105 Hemoglobina l7 105 Hemoglobina M 232 Hemoglobina S 231, 232 Hcmoglobine mutants 231 Hemoproleine 62 Hem oxigenaza 529 Hem sinlelu2& 524, 527, 529 Henderson-Hassdl>aleh,ccuajic 664, 665 Heparansullat 3897 682, 6847 687, 693 Heparina 389739.1, 393, 682, 6847 687 Heptoza 294 Hertone 159 Hetcroagregate 686 Heteroglican 311 Heteroproteina 49 Hexokinaza 271, 317, 355 Hexokinaza-D v. glucokinaza Hexoza 294 Hexozaminidaza 447 HGPRT v. hipoxanUn-guamnibsfonI>ozU transferaza Hialuronan 689 Hialuronat 3897 390, 391, 682, 6837 6847 687 Hialuronitlaza 391 Hibrklare moicculara 152 Hidraji de carbon v. glucide Hidrazona 289 Hidrocorlizon v. cortisol Hidrolaza 112, 289 Hidrolaza lizozomala 697 Hidroperoxid 398 Hidroperoxid lipidic 398

Hidroperoxieicosatetraenoat 475, 476 p-Hidroxi-acil-CoA 420 (5-Hidroxi-acil-CoA dehidrogenaza 420 Hidroxiaiizina 678* 2-Hidroxi-4-aniino-pinmidina v. citozina p-Hidroxibutirat 424 p-Hidroxibutirat dehidrogenaza 424 Hidroxicobalamina 124 25-HidroxicoIecalcii'erol 134, 595, 596 p-HidroxIfemlalanina v. tirozina a-Hidroxiheminft 529 Hidroxiindol-O-melil transferazS 632 Hidrox.il glicozidic 298 Hidroxil semiacetalic v, hidroxil glicozidic Hidroxilare 289, 290 1 a-Bkiroxilaza 595-597 Up-Hidroxilaza 614, 615 17a-Hidroxilaz3 612, 615 18-Hidroxilaza 614, 615 21-Hidroxilaza 614, 615 24- Hidroxilaza- 597 25- Hidroxilaza 596 HidroxilizinS 1297 673 3-Hidroxi-3-metil-glutarii-CoA v. HMG-CoA Midroxiprolina 1297484, 673 6-Hidroxi-punna v. hipoxantina 3P~Hidroxi$teroid dehidrogenaza 614 18-Hidroxisteroid dehidrogenaza 612, 615 17a-Hidroxipregnenoiona 614, 615 17a~Hi.dj.miprogesterona 614 5Hidroxitriptai'ninS v. serotonins HidroxitriptofSn 129, 632 25-Hidroxivitamina D3, vezi 25 hidroxicoleealciferol Hind II 153 Hind III 234* Hiperamonietnie 494 Hiperargininemle 494 Hiperbilirubinemie 534-537 Hiperbilirubinemic cu bilirubina conjugate 536 Hiperbilirubinemie cu bilirubina neconjugata 535 Hiperbilirubinemie mixta 536 Hiperbilirubinemie toxica 535 Hiperiipidemie 468 Hiperlipoproteinemii familiaie 468-470 Hiperoxalurie 507 Hipedipoproteinemie de tip I 468, 470 Hiperiipoproteinemie de tip II 468, 470 Hipedipoproteinemie de tip III 468, 470 Hiperiipoproteinemie de tip IV 468, 470 Hipedipoproteinemie de tip V 468, 470 HipoUpoproteinemie familiala 470. 471 HipoxantinS 5397 549, 550 Hipoxantin-guanin fosforibozil transferaza 550 Histamina 26, 514 HistidinS 167 19, 227 483, 497. 669 Ilistidin amonioliaza 498 Histone 137 487 159 Histona H, 160-162 Histona H2A 160-162 Histona H“D 160-162 Histona H3 160-162 Histona H4 160-162 HMG-CoA 425, 451 HMG-CoA liaza 425 HMG-CoA-sintazfi 425 ’ HMG-CoA reductaza 451, 452 HoloenzimS (ARN polimeraza) 183 Homoagregate 686 Homocisteina 187125 Hompcistcin-meliltransferazS 126 Homocislinurie 126 Homoglicani 311 764 Homogentizat 507 Homogentizat oxidazS 305, 507 Homosenna 512 Mormon 542-562 Mormon adrenocorticotrop v. corticotropins Mormon antidiuretic v.

vasopresinS Mormon autocrin 563 Mormon calciolrop 592-598 Mormon de cregtere v. somatotropin^ Mormon eUberator al tropinelor iiipofizare (RH) 625 Mormon liberator al corticotropinei 617, 625 Mormon eliberatcr al GH 625 Mormon eUberator al gonadotropinelor 621, 623, 625 Mormon eUberator ai tlreotropinei 30*, 590, 391, 625 Mormon endocrin 563 Mormon foliculoslimulant 621, 623, 629, 630 Mormon lactogen v. prolactin & Mormon luteinizant 621, 623, 629, 630 Mormon paracrin 563 Mormon paratiroidian v. parathormon Mormon stimulator al mclanocitelor v. MSH Mormon tireotrop v. tireotropina Hpa H 234* HRE (hormone-responsive-element) 188,570,571, 591 HumulinS 243 I Icier fiziologie 535 Icier hemolitic 536 Icier hepatocelular 536 Icier idiopalic cronic 536 Icter neonatal 535 Icier obstructiv 536 Icier toxic 535 Idiojic femlpiriivica 507 IDL v. lipoproteine cu densitate intermediary Idoza 296 a-L-Iduranat 388, 391, 684* Iduronat sulfataza 697 a-L-iduronidaza 697, 701 Ig v. imunoglobulina IGF v. factor de cregtere insulin-like IGF-I 585, 637 IGF-IL 637 1GF-BP (IGF-binding protein) 637 IL v. interleukine Imidazol 19, 123, 669 Imidazolon-propionaza 499 lminoacizi 488 IMP 539*, 540-542 Imunoglobulina 13*, 53, 54-57 Imunoglobulina A 52*, 54 Imunoglobulina D 54 Imunoglobulina F 54 Imunoglobulina G 52*, 54 Imunoglobulina M 52*, 54 Imuran v. azatiopiin Jndol 19 Inductor 219 INF v. interferon Inhibitor aiosleric 98, 99 Inhibitor competitiv 94 Inhibitor de fosfataza-1 373, 374 Inhibitor MAO 514 inhibijie alosterica 98, 99 Inhibijie competitive 92, 93 Inhibijie ireversibila 92, 93 Inhibijie necompetiliva 94 Inhibijie reversibila 92 Inijierea replicarii ADN 165, 166, 167 Inijierea transcrierii ADN 182, 183 Inijierea sinlezei proteic-e 206, 208-210 Inozina 179, 539*, 547 Inozin monofosfat v. IMP Inozilol 402, 403 1-Inozitol fosfat 601 Inozitol fosfatide v. fosfatidil-inozitoli 1,4,5-InozitoItrisfosfat 573, 574*, 581-585 • Insulin^ '!3\ 32", 38*, 48", 237, 364, 375, 485, 564*, 598-603, 696 Insulin-like growth factor v. factor de cregtere insulin-like (IGF) Tnteracjie hidrofoba 34, 35, 657* lod 587, 588 lodacetamida 93 Jodoaeetat 323 IodotironinS 586 lodotirozina 587 Ion hidroniu 658 Integrine 66 Interferon 640, 641 Interferon a 640, 641 Interferon (i 640, 641 Interferon y

640 Interleukina 639-640 Interleukina 1, 639 Interleukina 2, 639 IntcrleukinS 3, 639 Interleukina 4, 639 Interleukina 6, 639 Interleukina 8, 640 765 Inlennediar energetic comun 268, 269, 284 Intron 160, 177, 189-196 IB, v. inozitoltdsiasfat Izoaloxazina 117 Izocitrat 335 Izoci(3*at dehldrogeaaza 91, 110, 335, 336 Izodesmozina 680, 681* Izoenzime 77 IzoleucinS 14, 15*, 22*, 97, 494, 495, 499, 500 Izomeraza 112, 124 A5-A4Izomeraz3 614, 615 Izoineria cis-trails a adzilor gra§i uesaturaji 395, 396 Izomeria ot,_|3 410,411 IzopentemJ-pij’ofosfat 451, 453, 454 Izopien 278, 407 Izopren biologic activ v, izopentenil-pirofosfat Izoliocianat 289 Izovalerii-CoAxlehidmgenaza. 507 J Jacob, F. 97, 177, 219 K Kanamicina 218* Katal 84 Kcat 90 Kendrev/,! 42 Keralan sulfal 389\ 682, 683*, 684*, 687, 689, 691 Kerali.na 38 Kcrnicler 535 Khorana 203 Ki 93 Kinaze 70, 274 Kin v. constanta Michaetis Koshland, D.EJr. 80 Krebs, H. 333 L L, serie optica 297 Labferment 48 i Lactam 140 Lactat 72, 327, 355 Lactat deliidrogenaza 13*. 45*., 72, 77. Ill, 113, 327 Laelim 140 Laetocerehrozidaza 447 Lactoflavina v, riboflavina Lactaza 314, 315 Lactoza 219, 310 Laminina 687, 694* Lanosterol 451, 454, 455 LanJ respirator nii.tocondri.al 119,275* LanJ respirator nefosforiiant 290 Lanjuri a (din colagen) 673, 674 Lanjuri
Legatura monoglicozidica 309 Legatura polar# 650 Legatura tiolesterica 122 Lencina 14, 15*, 22*, 482, 486, 500*, 502'*, 690, 691 Leucodistrofie metacromatica 446, 447 Lcucotriena 471, 710 Leucotriena A 4 473, 475 Lcucotriena B,f 475, 478 Leucotriena C4 475, 478 Leu-encel'alina 633* LH v. hormon luteinizant LH/FSIl-RH v. hormon eliberator al gonadotropi- nelor Liaze 112 Lichid amniotic 702 Lichid interstijial. 645, 646 Ligandina v. protcina Y Ligaze 112 Lignina'721 Lineweaver-Burk,- cctiajie 92 Linoleil-colesterol 464 766 Lipaza 415 Lipaza hormon-sensibila v. triaeilglieerol lipaza Lipide 394-478, 708, 710, 7357 Lipide nesaponiflabile 394, 407-415 Lipide plasmatice 457-471, 458' Lipide saponifiabile 394 Lipidoza 446 Lipoat dehidrogenaza 330, 331 lipoil reduclaz-transacetilaz# 330, 332-334 Lipoliza 436 Lipoproteine 50, 130 oc-Lipoproteine v. lipoproteine cn densitate mare P-Lipoproteine v. lipoproteine eu densitate mica Lipoproteine cu densitate foarte mica 459, 460*, 461, 463, 464 Lipoproteine cu densitate intermediary 464 Lipoproteine cu densitate mare 459, 460*, 461, 466-467 Lipoproteine cn densitate mica 459, 460*, 461, 464-466 Lipoprotein lipaza 110, 462, 463, 602 Lipotropin# 626 Lipoxigenaza 475, 476 Li/il aldehida 680 Lizil hidroxilaza 673 Lizina 177 20, 227 1297 483, 486, 502, 673 Lizin-norleucin# 680, 681' Lizin-vasopresin# 630 Lizofosfatide 401 Lizoleciline 401 Lizozim 487 74, 82 Lizozomi 485 Lixoza 296 Locus v. situs Lovastatin 211, 452 P'LPH. 626, 627, 633, 634 Y-LPH 626, 627, 634 LT v. leucotriena LTA4 v. leucotricn# A, LTB4 v. ieucoiricna LTC4 v. leucotriena C4 Lynen, F. 418 IVL M, laza a eiclului celular 170 Mac Loed, 153 Macrofagc 291 (XjMacroglobulina 527 61 Macrominerale esenpale 716, 717" Malat 94, 286, 337 Malat dehidrogenaza 286, 337 Malnutrijie 713 Malonat 94, 337 Malonil-CoA 426, 428-432 Maltaza 314 Maltoz# 309 Mamotropina v. prolactin# Manitol 305 Manoza 296, 382, 684 Manozamina 303 MAO v. m o no a mi m3 xi d a za MAP Jdnaza 585, 586 Matrice exlxacelulara 671, 682, 691, 692, 698, 699 Maxam si Gilbert, lelinic# 248, 249, 250 McCarty, 153 Mediu intern 643

Melanotropin# 626, 627 Melatonin# 632 Memhran# interna mitocondrial# 280, 282 Menachinon# 137, 408 Menadiona 137 Mercaptid 28 6- Mereaptopurina 146 Mesager prim 572, 573 Mesager secund 572, 573 Meselson-Stahl (experienja) 162, 163 Metabolism bazal 704 Metaloenzime 75 Metaioilavoprotelne 118 Metaloproteine 50 Met-enccfalin# 6337 634 Methemoglobina 1297 226 N7 N^-meteniJ- FH4 128 Metil-eitidina 179 5-Metil-citozina 173 Metilcobalanuna 124 p-Metil-crotoniJ-CoA carboxilaza 123 N7 Ni,J - Metilen-FH4 128, 55S N5-Metil-FH4 126, 494 Metii-glucopiranozid 307 7- Meiil-guanozina 197, 200, 215 Metilmalonic acidurie 507 Melilmalonil-CoA 125, 499, 507 Metilmalonil-CoA mulaza 126, 499, 501, 507 5-Metilu.racil v. timina Medomna 177 20, 227 122, 125, 215, 481, 486, 499’, 501‘ 5-Metoxl-N-aceti.lserotomna v. melatonin# Mevalonat 451 Mevalonat-3-i'osfo-5-pirofosfat 453 Mevinolin v. lovastatin Mezobilinibinogen v. urobilinogen Mezoinozitol. 402, 403 Mg2" 270 MHC v. complex major de lustocompatibilitate MHC clasa I 56, 57* MHC clasa II 56, 57* Microfibrile de colagen 677, 679 B2-Microglobulina 52* . Micromineraie v, oligoelemente esenjiale Microorganisme 291 Mieloperoxidaza 291 Minerale 716 Mineralocorticoizi 290, 612-618 MioglobinS 38*, 42*, 43, 48*, 63, 64, 102, 277, 519, 520 Mioinozilol v. mezoinozitol Miokinaza v. adenilat kinaza Miozina 13*, 45*, 48* MIT v, monoiodotirozina Mitchell, P. 284 Monoacilglicerol 389, 390 Monoaminoxidaza (MAO) 91, 610, 611 Monod, J. 177, 219 Monoglicerid v. monoacilglicerol Monoiodolironina 389, 390 Monoiodotirozina 587, 588, 589 Monosialogangliozid 406 Monourat de sodiu 552, 553 Monoxigenaza 289 Monozahadde 294, 295, 305 Motilina 68 MSH v. melanotropin& Muc.ilagii 720, 721 Mucopolizaharidc 701 Mucopolizaharidoze 391 Mullis, K. 246 Mutajie 225, 230-232, 288, 291 Mutajie prin delejie 231 Mutajie priii inserjie 231 Mutajie prin substitute 230 Mutajie prin transversie 231 Mutajie prin tranzijie 230, 231 Mutaza 124 N NAD 116 NAD" 116, 119, 276, 277, 280, 283, 286, 287, 487 NADH 119, 276, 277, 280, 283, 286, 287 NADH-CoQ reductaza 280 NADP 119 NADP" 119, 127, 286, 289*, 290*, 487 NADPH 286, 289*, 290*, 342, 343, 344, 345, 349 NADPH oxidaza 291, 343, 529, 530 NANA v. acid N-acetil-neuranumc Natriopeptina v. factoral atrial natriuretic Naveta glicerol-fosfat 286 Naveta malat-aspartat 286 NDP v. nucleozid difosfat Nccesar energetic 706* Necesar nutritiv 703 Necesar vitaminic 714, 715*

Ncfrolitiazft 507 Neotnicina 218* Neu.rofi.zina 630, 631 Netirofizina 1 630,631 Ncurofizina II 630, 631 Neuropeptide 633* Neutrofile 291 NGF v. factoral de crestere al nervilor Niacin3 118, 503 Nicotinamide! 118 Nicolinamid-adenin dimicleolid v. NAD Nicolinamid-adenin dinucleotid fosfat v, NADP Nierenberg, M. 203, 204 Nitrozamine 130 NMP v. nucleozid monofosfat NO v. oxid de azot NO sintetaza 581 Noradrenaline 290, 564*, 608-611 Norepine.fiina v. noradrenaline N’PY (neuropeptid Y) 633* OTP v. nucleozid trifosfat Nucieaza 153, 552 Nucleoproteine 50 Nucleotid 142, 143, 539 Nucleofidaza 552' Nucleozid 142, 539 Nucleozidaza 547 Nucleozid difosfat 144, 544 Nucleozid difosfat kinaza 91, 544 Nucleozid fosforilaza 547, 551 Nucleozid kinaza 551 Nucleozid monofosfat 143 Nucleozid monofosfat kinaza 544 Nucleozid trifosfat 144, 544 Nucleozomi 161, 162 Nutrijie 703 O O,' v. superoxid OAA v. oxaloacetai Ochoa, S. 203 OCT v. ornitin-carbamil-fosfat Iransferaza OctozS 294 768 Okazaki, R. 167 ' Oleii-CoA 422 Oligoelemente esenjiale 716, 718* Oligominerale v. oligoelemente esenjiale Oligopeptide 29, 30* Oiigozaharide 294, 308-310 Oligozaharid transferazS 385 Oligozid v, oligozaharid OMP 539*, 555, 556 OMP ciecarboxilaza y. orolidilat deearboxilaza Oncogena 641, 642 Oncogena-c 641 Oncogena-v 641 Oncoprotein^ 641 Operator 220, 221 Operon 219, 220, 221 Opsina 131 Organisme autotrofe 259 Organisme heterotrofe 259, 263 Ormtina 18*, 491, 493;- 498 Oniiiin-carhainif-fosfat transferaza (OCT) 491, 494 Orotaciduric 561 Orotat 539*, 555, 556 Oroiidina 539* Orotidin monofosfal v. OMP Orosomucoid v. arglicoproteina Osteoblagti 671 Osteogenesis imperfecta 700 Osteomalacic

Ovalbumin^ 38*, 189 Oxalat 94, 507 Oxaloacctat 124, 333, 337, 338, 355, 356, 426, 428, 486, 492 P-Oxidarc 418-424 Oxidoreduetaze 112 Oxi.d de azot 581 Oxitocina 30*„ 564*, 630, 631 Oze 294 Ozide 294 P Pso (pi),5) 102 PAF v. factorul activator al placheteior Palade, G. 180 Palindrom- 233 Palmitil-CoA 445 PanteleinS 430 Parathormon 564*, 593. 594 Pauling! 35, 36 PCL v, piruvat carboxiligaza PCR (polymerase chain reaction) 246-248 PDGF v. factoml de eregtere eliberat de plachete Pectine 720 Peiiicili.ua 74 Pcntoza 294 Pentozurie esenjiala 353 PEP v. fosfoenolpiruvat PEPCK v. fosfoenolpiruvat carboxikinaza PepsinS 13*, 38*, 48*, 72, 86, 481, 482 Pepsina C v. gastricsina Pepsinogen 481, 482 Peptid C 599, 600 Peptid semnal 598 Peptide 39 Peplidil transferaxa 210, 214 Penneaza 219 Peroxid 422 Peroxidare 292, 398 Peroxidaza 76 Peroxid de hidrogen 343 Peroxid lipidie 292, 343 Peroxizomi. 290, 424 Perutz, M. 43, !04 PG v, prostaglandins. PGE2 472, 474, 476-478 PGF2CE 472, 474, 476-478 PGG2 v. endoperoxid prostaglandinic PGH2 v. endoperoxid prostaglandinic PGL, v. prostaciclina pH 659, 660*,661*, 664, 665 pH izoeiectric 22*, 24, 48 pH optim 86 pi v. pH izoeiectric Pigmenji vegetal] 719* Pinealodle 631 Piran' 299 Piranoza 299 Piridinfi 119, 120 Piridoxal 120 Piiidoxal fosfat 120, 121, 513, 522 Piridoxamina 120 Piridoxamina fosfat 120, 121, 486 PiridoxinS 120 Pirimidina 140, 539 Piritradimce, bazc 140, 539 Piro fosfat 123 PirofosfatazS. 269, 271 Pirol 19, 519, 522 Piruvat 72, 115, 118, 124, 275, 286, 326, 329, 355, 486, 488, 494 Piruvat carboxiiaza v. piruvat carboxiligaza Piruvat carboxiligaza 123*, 338, 339, 355, 362

769 Piruvat dehidrogenaza 77, 329-334, 362 Piruvat deludrogenaz ib siataza 332334 Piruvat dchidrogenaz kinaza 332-334 Piruvat kinaza 45*, 75, 275, 326, 327, 355, 362, 363 Piruvat kinaza L 326 Piruvat kinaza M 326 pK aminoacizi 22* PLC v. fosfolipaza C Plasmalogeni 404 Plasniide 159, 235, 236 Plasnumf 62 Plasminogen 62 PLP v. piridoxal fosfat pOH 660 Poll A 198 Poli A polimeraza 198 Poliadenilare 198 Folia mi nil 514 Poliizopren 407 Polimorfism molecular al fragmenielor de res- triejie 255-258 Polinucleotid 149 Polinucleozomi 162, 163 Polipeptid 29 Polipeptid pancreatic 606 Poliozide v. polizah.ari.de Poliribozomi 215 Polizaharide 294, 310-312, 721 Poiizomi v. poliribozomi Porfma 62, 519-521 Porfinogen 62, 519-523 Porflria acuta in tenni tenia 526 Porfiria cutanea tarda 527 Porfiria erilropoielica congenitaia 528 Porfiria vaiiegata 528 Pcrfirii 526-529 Porfirii primarc 526 Porfiiii secundare 526 Porfirina 62, 520, 521, 529 Porflinogen 62, 520 Porfobilinogen 521-523, 527, 528 Poifobilinogen dezaminaza 523 Porfobilinogen sinteiaza (sintaza) 522, 523 Potenjial redox 265, 266 Potenjial redox standard 266, 283 Potenjial de transfer 271, 273 PPj v. pirofosfat Prealbumina 52* Pregna.ii 413 Pregnandiol 623 Pregnenolone 612, 613, 614 Pre-p-lipoproteine v. lipoproteine cu densilate foarte mica Preproinsulina 598 Piibnow, caseta 1 83 Primaza 169 Primer v. ARN inijiator Primozom 167, 170 Principii imediate 114, 708 Pii'ncipii nutritive 707, 708*, 709, 736 PRL v. prolactina Proaccelerina 58* Procarboxipeptidaza 481, 482 Procolagen 676 ProcoIagenazS 677 Proconvertin# 58* Produse all men tare 723, 735* Prod use aiimentarc de origine animal# 724-728 Produse aiimentarc de origine vegetal# 728-732 Produse zaharoase 732 Produs ionic al apei 658, 659, 663 Proelaslaz.a 481, 482 Proelaslina 680 Proenzimfi v. zimogen Progesterona 572, 614, 615, 622, 623 Progestine 622, 623 Prohormon 130, 133 Proinsulina 598, 599 Prolactina 564*, 624, 628, 629 IVolil hidroxilaza 673 Prolina 16*, 19, 22*, 129, 484, 495, 497, 516, 517,673 Premotor 183, 184, 187, 220, 221 Proopiomelanocortin# 626, 627 Propiotri! CoA 358, 499 PropionilCoA carboxilaza 358, 499 Prostaeiciina 472, 474, 478

Prostaciclin sintaza 474 Prostaglandina 471, 472, 474, 476, 477, 478, 710 Prostaglandins E2 472, 474, 476, 477, 478 ' Prostaglandina F2a 472, 474, 476, 477, 478 Prostaglandin sintaza v« ciclooxigenaza Proteaze 70 Protein# G 217, 573-575 Protein^ Gi 575, 576 ProteinS G0 575 Protein# Gfl 575, 581, 582 Protein^ Gs 575, 576 ProteinS reactiva C 52*, 61, 694 Protein# Y 532, 536 Proteinfi Z 532, 536 Proteine 30, 711, 735 Proteine complete 713 Proteine incomplete 713 770 Proteine plasmatice 51, 52* Protein tosfataza 577-580 Protein kinaza 566, 577-580 Protein kinaza A 577, 578, 579 Protein kinaza C 581, 582 Protein iirozin kinaza 585, 642 Proteoglicani 388-393, 682, 687, 688*, 689, 690, 692 Proteogiicani poltanionici 672 Protooncogena 641 Protoporfirie 528 Protoporfnina 63, 520 Protopculirina IX 520-525, 527, 528 Protoporiirmogen 63, 520 Protoporfirinogen IX 524 Protoporfm nogen oxidaza 524 ProtTombimt 58*, 59, 60, 137 Provitamine 131, 133 PRPP 540, 541, 555, 556, 560 PRPP sintetaza 540, 541, 554, 560 Pseudoeoiinesleraza 110 Pst I 234* PseudouridinS 179 Psicoza 297 Pteridina 126 Pteroilheptagl u ta mat 127 * Pteroilmonogl utainat 127* Pteroilpentaglutamat 127* PPM v. paralhormon Punct de fierbere 654 Punct de topire 654 Punte disulfurica v. legillura disulfurica Purina 140, 290, 539 Puririice, haze 140, 539 Purin nucleozid fosforifaza 547 Puromicina 218* Putre.seeina.514 R Racemaza 113 Racemic 297 Radical fenoxi 136 Radical hidroxil 528 Radical peroxi 136, 398 Radical poliizoprenoidic 137 Radical superoxid v. superoxid Reacjie anaplerotica 340 Reacfie cndergonica 67, 68, 263, 266 Reac|ie endoterma 68 Reaejie exergonica 67, 68, 263, 266

Reaejie exoterma 68 Reaejie polimerazica in 3an| 246-248 Reaejie protolitica 662 Reaches van den Berg 535 Reaefii cuplate 266, 284 Receptor 564-571, 694* Receptor adrenergic 566, 567, 612 Receptor a-adrenergic 610, 612 Receptor [3-adrenergie 566, 567, 610, 612 Receptor colinergic. 567 Receptor colinergic muscarinic 567 Receptor colinergic nicotinic 567 Receptor nuclear 569, 570 Receptorul factorului de cregtere a epjdermei (EGF) 568, 569 Receptorul hormonilor tiroidieni 570 Receptorul hormonilor steroidici 570 Receptorul insulinei 568,' 569, 600 Receptorul LDL 465 Regiare alostericS a cnzimelor 97 Reglare covalenta a enzimelor 107 Renaforarea ADN 150, 151, 152 Renina 617, 618 ■ Repararea ADN 225, 230 RepHcare (a ADN) 139, 162, 163, 165, 172 Replicarc semiconservativa 163 Replicator 165 Replicaza v. ARN polimeraza ARN-dependenta Replizom 164, 166, 170 Represor 220 * Restrictaza v, enzima de restriclie Restun cliilomicronice 462 Reticulum 671 Retinal 131, 410 Retinal izomeraza 131 Retinoid 130 Retinol 130, 131*, 132*. 253 Relroinhibi|ie 98 Retrovirus 175 Revers trauscriptaza 174, 175 RH v. honnon de eliberare a tropinelo.i; hipofizare Ribitil. 117 Ribitol 117 Riboflavina T17 Ribonudeaza 33*, 38*, 546 RibonucleazaP 73, 74, 198, 199 Ribonucleotid 142, 143 Ribonucleozid 142 Ribonucleozid reductaza 545 Ribolimidina 179 Riboza 140, 175, 296 ‘Riboza-5-fosfat 345, 540, 541 Riboza-5-fosfat cetoizomeraza 345 5’-P-Ribozil-aminoinridazol 541, 542 5,-P-Kibozii-at‘ninoiinidazoI - carboxamidS 541, ■ 542 771 5‘-P-RiboziI-aminoimiciazoi carhoxiiat 541, 542 S’-P-Ribozil-aniinoimldazol succincarboxamida 541. 542 5*-P“RiboziI-fornianiido-imidazol-carboxamid# 541, 542 S'-P-Ribozil-N-forirulglicinatnida 541, 542 SM^Ribozd-N-fonnilglicinamidina 541, 542 5,~P-Ribozil-glicinamida 541, 542 Ribozim 191, 199 Ribozonii 180, 181, 208-215 Ribuloza 297 Ribuloza-5-fosfat 344, 345 Ribuloza-5-fosfat epimeraza 345 Rifampieina 188, 218* RIH v. honnon inhibitor al eliberarii de tropme hipofizare

Rodopsina 131, 567, 568, 581 Rotenonil 282 S S v. entropie S, faza a ciclnlui celular 173 Saccharopina 502 Salifiere 47, 51 Salmina 48* Saponine 721 SAM v. S-adenozil-metiojiina Sanger. F. 32, 250-252 Schiff, baze 26 Scualen 408, 451, 454 Secretin# 562, 564*, 607 Secvenja Embden-Meyerhof-Parnas v. glicoliza SedoheptulozS-1,7-bis.fosfat 349, 350 Sedoheptuloz#-7-fosfat 346 Seleniu 136 Setniacetal 298 Semicetal 298 Semitisaceta) 323 Sene sterica D 297 Serie sterica L 297 Senna 16* 19. 22*, 122, 390, 445, 488, 495, 509*, 684*, 689 Serin dehidrataza 496 Serin-hidroximetil-transferaza 496 Serotonina 514, 632 Serum albumin# 13*, 38*, 48*, 52*, 53 Sex hormone-binding globulin (SHBG) 623 Sfera de solvatare 655, 656 SEngoglicolipide 405-407 Sfingolipide 404-407, 445-448 Sfingolipidoze 446 Sfingomieline 400*, 405, 445 Sfingomielinaz# 446, 447 SOngozina 404, 445 Sialidaza 447 Siderolilina v. translcrina Silencer (secven]a) 187 Sindecan 693* Sindrom Cdgler Najjar lip I 535 Sindrom Crigier Najjar tip II 535 Sindrom Dubin Johnson v. icier idiopatic cronic Sindrom Ehlers Danlos 700 Sindrom Hunter 393*, 701 Sindrom Hurler 393*, 701 Sindrom Lesch-Nyhan 554 Sindrom Marfan 700 Sindrom Maroteaux-Lamy 393* Sindrom Menkes 700 Sindrom Rotor 536 Sindrom SanfUippo 393* Sindrom Wemicke-Korsakoff 351 Sintrofie 260 Sis 642 Sistem redox 266 Sis tern tampon 664, 665, 668, 669 Sistem tennodinamic deschis 261 Sistem tennodinamic izoiat 260 Sistem tennodinamic irrchis 260 Situs A (aminoadd) 181, 209, 210 Situs P (peptid) 181, 210, 211, 212 SNURP 193. 194 SOD v. superoxid dismutaza Somatomamoti'opinil corionica 628 Somatomedin# C v. IGF I Somatomedine 628, 637 Somatostatin# 237, 604, 605, 633* Somatotropin# 13*, 564*, 624, 628, 629 Sorbitol 305, 381. 382 Sorbitol dehidrogenaza Hi, 381, 382 Sorboza 297 Southern , tehnica 152, 253-255 Southern, E. 253 Speciileita.te de reacjie 70 Specificitate de substrat 70, 71 Specillcitate stereochimica. 70, 72 Specii reactive ale oxigenului 290* Spectrin# 13* Spermidina 514 Spcrmina 514 Spirala Jui Lynen 418 Splicozom 193 Src 641 Stare de inlrefinere, v. echilibru energetic Stare de Iranzijie 68 Starling, E. 562 Stefan 410 Stereobilin# 534 Stercobilinogen 534 Steroizi

410-415, 509' 772 Steroli 411, 72] Stereospecificitate 73 Streptomicina 218* ■ Structura cuaternara a proteinelor 45 Structura primarS a proteinelor 32 Structure secundara a a proteinelor 35 Structura secundarit |3 a proteinelor 39 Structura tertiara a proteinelor 40 Structura dublu elicoidala a ADN 156 Structura in foaie plisata v. structura secundara Suhstanja P 608, 633* $ubsfcan|a amfipatica 657 Substanfa apolara 656 Suhstan|a hidrofM 657 Substanfa hidrofoba 657 Substanfa polara 656 Substanfe alimentare bioacdve 719, 720 Substance tampon 664 Subunitatea sigma (a ARN polimerazei) 183, 184 Succinat 94, 336,425 Succinat-CoQ reductaza 282 Succinat dehidrogenaza. 73, 118, 279, 282, 337 Succinil-CoA 275, 336, 425, 499, 500, 521, 522 Sucemil-CoA-acetoacetat tioforaza 336 Succinil-CoA sintetaza 275, 336 Succinil-CoA tiokinaza v. succinil-CoA sintetaza Sue gastric 481 Sue intestinal. 481 Sue pancreatic 481 Sucroza v. zaharoza Sulianilamida 94 N-S ulfat-galactozamin£ 303 Suifatid 406 Sulfatidaza 447 Superelice de ADN 158 Superoxid (anion sau radical) 290-292, 343, 528 Superoxid dismutaza 76, 291, 292 Surfactant pulmonar 401, 404 Sutherland, E. 572 §untul pentozo-fosfajilor v. ealea pentozo-fosfajilor Sya forma 145 T T, v. monoiodotironina T2 v. dhodolironina T3 v. triiodotironina rT3 v, 33* »5*triiodotironina T4 v. tetraiodotironina Tagatoza 297 ■ Talasemie (3 190 Taloza 296 Tamponaie 664, 665 Taninurie 719*, 721 Taq polimeraza 240 Taq I 234* TATA, casetS. 187 Taurina 414, 518 Taurocolat 414, 456, 457 Tautomerie imino-amino 141 Tautomeric lactinvlactam 140 TO PA (thyroxine-binding prealbumin) 589 TOG (thyroxine-binding globulin) 589

Tbx v. tromboxan TCA v. acid tricarboxilic TDP (sau dTDP) 539* TERG (testosterone-estrogen-binding globulin) 621 Telopeptid 676 Temperatura de topire a ADN 150 Temperatura optima de acfiune a enzimelor 85 Teoria cuplarii chemiosmotice 284, 285, 289 Teona cuplarii chimice prin intermediari comuni 284 Teoria cuplarii conformajionale 284 Terapie genica 245 Terminal transferaza 236 Terminarea replicarii ADN 165, 167 Terminarea transcrierii ADN 182, 185, 186 Terminarea sintezei ianfuM polipeptidic 206, 214, 215 Termodinamica 260 Termogeneza 705 Termogeninft 283 Temioliza 705 Terpene 407-409 Testosterone 564*, 618-621 Tetraciclina 218* Tetralridrobiopterina 503, 506, 609 Tetrahidrofolat 127, 129*, 496 Tetrahidrol 651 Tetraiodotironina 289, 509, 564*, 586-592 Tetroza 294 TGF (transforming growth factor) 636 TGF (3 636 THF v. tetrahidrofolat Tiamina 115 Tiamin pirofosfat v. TPP Timidilat v. TMP Timidilat sintaz£ 558 Timidina 539* Timidin difosfat 539* Timidin monofosfat 539* Timidin trifosfat 539* Timina 140, 141, 154 6-TioadcninS. 146, 148 Tioaminoacid 20 Tioetanolamina v. cisteamina Tioeter 20 6-Tioguanina 146 Tiokinaza 271, 418 773 Tiol 20 Tiolaza 420, 424, 425 Tioredoxina 545 Tiosemiacetal v. semitioacetal TiouridinS 179 TireoglobulinS 48*, 587-589 TireoperoxidazS 587-589 ' Tireotropina 564*, 590, 591, 624, 629, 630 Ttronina 586 Tiroxina v. tetraiodotironinS Tirozinaza 76 TirozinS 16*, 19, 22*, 130, 482, 503*, 505*, 506 Tirozinhidroxilaza 507, 609 TMP (sau dTMP) 128, 144, 558 TNF (tumor necrosis factor) 640 TNF a 640 TNF p 640 Tocoferol 135*, 293, 409 Tocol 135 Topoizomeraza 158, 164 Topoizomeraza 1 166 Topoizomeraza II 164, 166 Topoizomeri 158 Toxina difterica 218* OTP 115, 329, 336, 346, 507 Traducere 139, 203, 206 Transace tilaza 219 Transacilaza, 430 Transaldolaza 346, 347

Tiansaminare 120, 121*, 485*, 487, 488 Transaminaza v. aminotransferazS TranscetolazS. 346, 347 Transcorlina 615 Transcriere 139, 181, 187 Transcriere inversa 201 Transcrlptaza inversa v. revers transcriptaza Transdezainiuare 486 Transfecjie 232 Transferaza 112 Transferaza terminals 236 Transferina 13*, 52*, 529 Translocaza 207, 481 Transsulfurare 120, 122, 497 Treonina 16*, 19, 22*, 97, 483, 485, 495*, 684* Trconin aldolaza 496 TreonindehidratazS 99 Treoza 296 TRH v. hormon eliberator al tireotropinei Triacilglicerol 397, 398, 435-441 Triacilglicerol lipaza 415, 436, 602 Tributirina 397 Triglicerid v. triacilglicerol Trigitceride seri.ee 458* Triglicerid lipaza v, triacilglicerol lipaza 2,4,8 -Trihidroxipurina v. acid uric TriiodotironinS 564*, 586-592 3*3*,5*'triiodotironinS 589, 590 Trioleina 397, 398 Trioza 294 Triozofosfat 323 Tiiozofosfat izomeraza 323 Tripsina 72, 481483, 671 Tripsinogen 481 Triptofan 16*, 19, 22*, 129*, 484, 486, 497, 504, 514, 632 Triptofan hidroxilaza 507 Trisialogangliozid 406 Tristearina 397, 398 Trizaharid de legatura 693 ’ Tiizaharid sulfatat 694 Trombina 58*, 59-61, 694 Trombomodulina 58*, 61, 693*, 694 Tromboxan 472, 710 Tromboxan A2 472, 474, 478 Tromboxan B2 472, 474 Tromboxan sintaza 474 Tropocolagen 675* Tropomiozina 195, 197 TSH v. tireotropina TSH-RH v. hormonul eliberator al tireotropinei TTP (sail dTTP) 164,539* Turgescenja 694* TX v. tromboxan TXA2 v. tromboxan A2 ' TXB2 v, tromboxan B2 Tesut glucodependent 353 U Ubichinona v. eoenzima Q UDP 539*, 557 UDP-N-acetil-galactozamiita 446 UDP-galactoza 378, 446 UDP-galactoza pirofosforilaza 378 UDP-glueoza 271, 351, 352, 371, 446 UDP-glucoza—>galactoza-1 -fosfat uiidil transferal 378, 379 *" UD P-gl ucozo-4-epi meraza 378 UDP-glucoza-pirofosforilaza 351, 371 UDPglucuronat 351, 352, 533 UDP-glucuronil transferaza 533, 535 U.L 84 , Uleiuri eterice 719* UMP 144, 539* Up-regulation 566 Uracil 140, 141, 175 Urat monosodic 552, 553 Urat

oxidaza 553 Ureaza 71, 110 774 Uree 71 Ureirde 493 Ifreotelic, organism 552 Uricaz# 553 Uricotelic, organism 552 Uridin# 142, 539* Uridin difosfat v, UDP Uridin monofosfat v.'UMP Uridin trifosfat v. UTP Urobilin# 534 Urobilinogen 534,, 536 Urocanat hidrataza 498 Uroporfmna 62 Uroporlirinogen 62 Uroporiliinogen I 523, 527 Uroporlirinogen HI 523, 527 Uroporfirinogen HI cosintaza 523, 528 Uroporiliinogen decarboxilaza 523, 527 UTP 164, 271, 539*, 557 V v-erb 642 v-src 642 VH 56 VL 56 Valina 14, 15*, 22*, 483, 499* Valoarea biologic# a proteinelor 712 Vasopresin# 30*, 564*, 630, 631, 648, 649 Vector 233 Vector de clonare 233 Vector de expresie 243 Vector retroviral 243, 244 Verdoglobin# 529 VIP (vasoactive intestinal polypeptide) 607, 633* Virusul iinunodeficienfei umane 175 Vitamere 114, 118, 126, 133 Vitamina A v. retinol Vitamina antipernicioasS' v. cianocobalainin# Vitamina B, v. tiamin# Vitamina B2 V. riboflavin# Vitamina B6 vezi piridoxin# Vitamina vezi cianocobalamina Vitamina C v. acid ascorbic Vitamina D z v. ergocalcifero] Vitamina D3 v. eolecalciferol Vitamina E v. tocoferol Vitamina Kj v. filochinon# Vitamina K2 V. menachinon# Vitamina K3 v. menadion# Vitamina PP v. niacin# Vitamine 114, 707* Vitaniine hidrosolubile 114, 713 Vitamine liposolubile 1 14, 130, 710, 713, 735 Viteza reacjie 83 Viteza maxima 88, 90, 92 VLDL v. lipoprotein© cu densitate foarte mica W Watson, 1 154, 155 Watson si Crick, model 155, 156 Wilkins, M. 154, 161 X ■ Xantina 290, 539*, 548, 549 Xantin oxidaza 290, 549, 552 Xantozin# 539* Xantozin monofosfat v, XMP Xantozin difosfat v. XDP Xantozin trifosfat v. XT'P XDP 539* Xilitol 353, 354 Xilitol dehidrogenaza 353, 354 .Xiloz# 296, 382, 390, 684* Xiluloza 297, 353, 354 D-Xiluloz# 353, 354 L-Xiluloza 353, 354 XiluIoza-5fosfat 345, 346 XMP 539*, 542,543 XTP 539* Z Z, ADN 145, 156, 157 Zaharaz# 309, 314, 315 Zaharoz# 309 Zaharuri v.

gluci.de Zidovudina v. azidoUmidina Zimogen 108, 481 Zinc 76 Zona fascicuiata 612 Zona glomeruloza 612 Zona reticularis 612 775