Diario de Laboratorio Bioquímica 1. SISTEMAS BUFFER Y MECANISMOS REGULADORES DEL pH Alumno: Jaime Wilfredo García Viera. Carné: GV01009. Objetivos. 1. Comprobar que el pH de una solución cambia cuando varia la concentración de iones de Hidrogeno 2. Comprobar la acción amortiguadora de los sistemas buffer 3. Valorar la importancia de los sistemas buffer en el mantenimiento del equilibrio acido-base del organismo. Resumen de sistemas buffer y el mecanismo de acción de regulación de pH del cuerpo. Las soluciones buffers, son soluciones que resisten cambios de su pH. Estas soluciones mantienen constante el pH cuando se adicionan pequeñas cantidades de ácidos o bases. Una solución buffer debe contener un ácido débil y una sal de éste ácido Según la teoría de Bronsted y Lowry Definimos ácido como una sustancia que, en solución, desprende protones (H+), mientras que una base es una sustancia que, en solución, desprende iones oxhidrilo (OH-) o capta protones. Cuando un ácido libera un protón se convierte en una base conjugada, y a la inversa, cuando una base acepta un protón se convierte en un ácido conjugado. Si las cantidades de H+ y OHson idénticas la solución resulta neutra. Si la concentración de H+ excede la concentración de OH-, la solución resultara ácida. Por el contrario si la concentración de OH- excede la concentración de H+, la solución resultara básica o alcalina. pH El pH es una expresión matemática de la concentración de protones (H+). el pH es el logarítmo negativo de la concentración de los iones hidrógeno. pH = - log [H+] La escala de pH se extiende desde 0 a 14 en solución acuosa. Las soluciones con pH menor a 7 son consideradas ácidas; las que poseen un pH mayor a 7 son básicas o alcalinas; finalmente un pH de valor 7 indica la neutralidad de la solución. También se define el pOH, que mide la concentración de iones OH-. pOH = - log [OH-] Regulación del pH Existen tres sistemas de regulación de pH o del Equilibrio Ácido-Base
1) Sistemas Buffer de los Líquidos Corporales, de respuesta inmediata. 2) El sistema respiratorio, eliminando o reteniendo CO2 3) Riñón, excretando excedentes por orina
La Hemoglobina constituye el principal buffer de la sangre, de accionar extremadamente eficiente gracias a su elevada concentración y a la gran cantidad de residuos de histidina que posee en su estructura. Es menester mencionar que la carboxihemoglobina tiene su capacidad buffer algo aumentada con respecto a la oxihemoglobina, lo cual es una contribución muy importante ya que, como antes mencionamos el CO2 es un ácido potencial Bicarbonato El sistema Ácido Carbónico-Bicarbonato es el buffer más importante de nuestro organismo. Existen múltiples características que hacen de este sistema un regulador de pH el más eficaz en el hombre. En primer lugar se trata de un sistema que está presente en todos los medios tanto intracelulares como extracelulares. A primera vista su pKa parecería corresponder a un buffer poco útil para nuestro organismo ya que su valor es de 6,10. Sin embargo este hecho se ve compensado por la posibilidad de regular independientemente las concentraciones tanto de la especie aceptora de protones como la dadora de protones. La reacción química está dada por: H2CO3 H+ + HCO3Como mencionamos anteriormente el H2CO3 está en equilibrio con el CO2. Por consiguiente la ecuación de Henderson-Hasselbach esta dada por:
pH = 6,1 + log [HCO3-] -----------[CO2] De este modo la concentración de la especie aceptora de protones (H2CO3) va a estar regulada por un sistema de intercambio de solutos a nivel renal y la concentración de la especie dadora de protones (CO2) será regulada por un sistema de intercambio de gases a nivel pulmonar. Si tomamos los valores de concentración para el CO2 y el H2CO3 y calculamos el valor del pH utilizando la ecuación de Henderson-Hasselbach obtendremos 7,40 como resultado, lo que implica que este buffer es ideal para mantener la homeostasis de nuestro pH. REGULACIÓN RESPIRATORIA DEL PH Nuestro sistema respiratorio se encarga de regular la presión parcial de dióxido de carbono (PCO2) arterial. El CO2 es barrido en los pulmones por la ventilación. La presión parcial de dióxido de carbono es proporcional a su concentración. Nuestros pulmones regulan indirectamente la
concentración de ácido del organismo. Al ser la PCO2 de la sangre mayor que la alveolar, en condiciones normales se va a producir una difusión neta de CO2 hacia el interior del alveolo desde donde será eliminado.
Fosfato Este buffer ejerce su acción fundamentalmente a nivel intracelular, ya que es aquí donde existe una mayor concentración de fosfatos y el pH es más próximo a su pKa (pKa = 6,8). Este sistema también posee una acción importante a nivel de los túbulos renales, que presentan un pH menor a 7:
H2PO4- H+ + HPO42REGULACIÓN RENAL DEL PH Regula el HCO3- recuperado o reabsorbido del filtrado glomerular. El bicarbonato es filtrado continuamente hacia la luz del túbulo renal de modo que en el filtrado glomerular intacto la concentración de bicarbonato es prácticamente igual a la del plasma, de ahí la importancia del proceso de reabsorción del mismo. A la concentración fisiológica de bicarbonato plasmático (24 mEq/l), prácticamente todo el bicarbonato filtrado va a ser reabsorbido. Este proceso tiene lugar fundamentalmente en el túbulo contorneado proximal (TCP) donde se reabsorbe un 85%. El resto es reabsorbido en el asa de Henle (10-15%) y en el túbulo contorneado distal (TCD) y colector. Genera HCO3- nuevo que reemplaza al que se pierde amortiguando ácidos producidos por el organismo. Si a pesar del proceso de reabsorción la concentración de bicarbonato plasmático permanece por debajo del valor normal, en las células tubulares se va a sintetizar bicarbonato. Esto sucede fundamentalmente en el túbulo contorneado distal a partir del CO2 procedente de la sangre o del propio metabolismo de la célula tubular por acción de la anhidrasa carbónica. El H2CO3 así generado se disocia en bicarbonato que se reabsorbe hacia la sangre y un protón que es eliminado. Secreta HCO3- en condiciones de alcalosis crónica. El sistema renal es lento en su ejecución como sistema amortiguador, requiriendo entre 10 y 20 horas para iniciar una actuación eficaz y 4-5 días para desarrollarse por completo. Es por eso que su accionar es muy eficaz en condiciones de desequilibrio crónico. pKa La relación entre las concentraciones de AH, y están dadas por la Constante de Disociación del Ácido (Ka) que es característica de cada sustancia: [H+] [A-] Ka = ----------------[AH]
La tendencia de cualquier ácido débil a disociarse, es decir la “fuerza del ácido”, está dada por la constante de disociación. Cuanto mayor es Ka, más disociado estará el ácido en solución y mayor será su fuerza. El valor de pH en el cual el ácido se encuentra disociado en un 50% se conoce como pKa. Podemos calcularlo con la siguiente fórmula: pKa = - log Ka En este caso a menor pKa, mayor será el grado de disociación del ácido en solución. Cuando trabajamos con ácidos fuertes el cálculo del pH se reduce a la expresión que enunciamos anteriormente. Sin embargo cuando trabajamos con soluciones buffer para calcular el pH utilizamos la ecuación de Henderson-Hasselbach: pH = pKa + log [A-] ------[AH] Es importante destacar que ecuación de Henderson-Hasselbach es válida para valores de pH cercanos al pKa del ácido considerado. Sin embargo es extremadamente útil en medicina ya que los valores de pH de los buffers de nuestro organismo siempre van a ser cercanos a sus respectivos pKa. PARTE EXPERIMENTAL Reactivos:
Acido Acético 0.1 N Hidroxido de Sodio 0.1 N Buffer Fosfato 0.05 M pH 7.4 Azul de Bromotinol 0.02% Acido Clorhidrico 0.1 N Acetato de Sodio
CH3-COOH NaOH H2PO4 / HPO4 (indicador de pH) HCl CH3-COONa
Material:
Gradilla para tubos Tubos de ensayo Pipetas Graduadas de 1 mL, 5 mL y 10 mL Papel pH
1. Prepare dos tubos de ensayo y rotúlelos 1 y 2 respectivamente. 2. Mida 9.0 mL de agua destilada con una pipeta de 10 mL y viértalos en el tubo N°1 3. En el tubo N°2 vierta 4.5 mL de solución acido acético 0.1 N y 4.5 mL de solución de acetato de sodio 0.1N; estos volúmenes deberán ser medidos con respectivas pipetas de 5mL, Mescle bien.
4. Mida el pH en ambos tubos con el papel indicador que le será proporcionado por el docente. Tubo 1 pH :__________ Tubo 2 pH: ____________ 5. Con una pipeta de 1 ml graduada en decimas, agregue a cada tubo 1.0 ml de HCl 0.1N, mezcle bien. 6. Mida de nuevo el pH en ambos tubos. Tubo 1pH:___________________ Tubo 2 pH:___________________ Anote Resultados. _________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________
CURVA DE TITULACION DEL ACIDO ACETICO En esta parte, la adición de NaOH al ácido acético, conduce a la formación de acetato de sodio. La cantidad de sal formada en cada tubo dependerá de la cantidad de NaOH añadida. Cuadro 1. Cantidad de Reactivo por tubo de ensayo. Tubo
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
A acet
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
NaOH
0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
4.0
4.5
5.0
pH Utilizando la formula de Henderson- Haselbach, calcule el pH de los tubos de la curva de titulación del N° 2 al 10. Tubo 2 pH= pKa + log ________ Tubo 3 pH= pKa + log ________ Tubo 4 pH= pKa + log ________ Tubo 5 pH= pKa + log ________ Tubo 6 pH= pKa + log ________ Tubo 7 pH= pKa + log ________ Tubo 8 pH= pKa + log ________ Tubo 9 pH= pKa + log ________ Tubo 10 pH= pKa + log ________
1. Coloque en una gradilla 11 tubos de ensayo ordenados y numerados correlativamente. 2. Transfiera a cada uno de los tubos 5.0 mL de de acido acético 0.1N usando una pipeta de 5mL 3. Con una pipeta graduad agregue a cada tubo las cantidades de hidróxido de sodio 0.1 N, indicados en el cuadro. 4. Agregue a cada uno de los tubos 5 gotas de indicador universal 5. Mezcle bien los tubos y observe el color obtenido. 6. Compare el color obtenido 7. Selecione el tubo que usted considere que tiene la máxima acción amortiguadora y determine el pH, usando la ecuación de Henderson-Haselbach. 8. Grafique el valor de pH de cada tubo y la cantidad de hidróxido de sodio 0.1N agregada a cada uno de ellos. Colocando el pH en las Ordenadas y el volumen en mL en las abscisas.
Preguntas? ¿En que tubos es igual la cantidades de ácido acético no neutralizado y acetato de sodio? _________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________ ¿En que región de la curva es minimo el cambio de pH después de la adición de cantidades equivalentes de base? _________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________
¿Cuál es la explicación al cambio de pH observado en la curva? _________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________
¿En que tubo ocurrió la total neutralización del ácido acético por la base? ________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________
ACCION AMORTIGUADORA EN LOS LIQUIDOS CORPORALES (IN VITRO)
En esta parte reproduciremos la forma en que el sistema renal participa en mantener el equilibrio acido-base del organismo, analizando el papel que juega la solución Buffer Fosfato presente en el filtrado glomerular (pH 7.4), el cual acepta los iones de hidrogeno eliminados por el riñon durante el proceso de formación de orina (pH 6) En condiciones normales, la velocidad de secreción de hidrogeniones es del orden de 3.5 mmol/min y la velocidad de filtración de bicarbonato es de 3.46 mmol/min, es decir la cantidad de ambos iones es practicamente la misma, neutralizandose en la luz tubular. Por tanto la excreción directa de H+ libres, es mínima de 0.1 mEq/día como máximo. 2. Así pues, para eliminar el exceso de hidrogeniones por la orina, se debe combinar este ión hidrógeno con tampones intratubulares: I. Como “acidez titulable” : a) en forma de fosfato: HPO4= + H+ = H2PO4-; este sistema tiene un pK de 6.8, y por tanto es activo entre 7.3 y 6.3 de pH. b) en forma de creatinina: es cuantitativamente poco importante, su interés es por tener un pK de 4.8, y poder actuar en los rangos bajos del pH urinario. PARTE EXPERIMENTAL. 1- Utilizando una pipeta serológica de 5mL, mida 5 mL de una solución buffer fostato pH 7.4 y transfiéralos a un tubo de ensayo (Este buffer fosfato en esta practa representa el liquido del filtrado glomerular) 2- Agregue al tubo 5 gotas de indicador azul de bromotimol, agitar. 3- Titule la solución del tubo agregando gota a gota y agitando acido clorhídrico (HCl) 0.1 N utilizando una pipeta serológica de 5mL hasta obtener un color amarillo (esto ocurre aproximadamente a pH 6) Anote en su plan de trabajo el volumen gastado HClen la titulación 4- Los H+ que usted agrega por medio del HCl 0.1 para cambiar el pH del buffer fosfato desde 7.4 hasta 6 representan a los H+ que el riñon agrega al filtrado glomerural para eliminarlos con Na+ t recyoar eb esta firna base (HCO3-)
Preguntas:
¿Cuál es el papel que desempeña la solución buffer fosfato y la solución HCl 0.1N en este experimento? ________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________
¿Cómo son eliminados los iones H+ por las células renales a la luz del túbulo? _____________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________
Calcular cuantos mEq de ase (NaHCO3) son restaurados a la sangre (pH 7.4) por la excresion de un litro de orina pH 6.0 haciendo uso de datos obtenidos en la titulacion del buffer fosfato con la solución HCl.
