Determinación Del KLa

INFORME PRÁCTICA: TRANSFERENCIA DE OXÍGENO EN PROCESOS FERMENTATIVOS.

Cindy Yurani Correa Villa1, Iowel Montoya Valencia2, María Susana Pérez Grisales3, David Eduardo Tibaduiza García4 & Ana María Valencia Palacios5

Universidad Nacional de Colombia- Sede Medellín [email protected], [email protected], [email protected], [email protected], [email protected]

Resumen: Los bioprocesos en su gran mayoría son desarrollados en condiciones aeróbicas, por esta razón es de suma importancia el estudio de la demanda de oxígeno de los microorganismos y cómo debe darse la transferencia de oxígeno en el medio de cultivo, lo cual se determina por el coeficiente volumétrico de transferencia de oxígeno k La. Con el fin de determinar el coeficiente se utilizó un método indirecto (oxidación de sulfito) y un método directo (método dinámico). Los resultados obtenidos fueron kLa en el método indirecto: s-1 en el medio de ml y kLa para el método directo: s-1. Se infiere entonces de acuerdo a los resultados obtenidos que el k La se ve afectado por factores como agitación, turbulencia y volumen, y el método más exacto y adecuado para determinar este parámetro es el método dinámico puesto que este a diferencia del método indirecto, tiene en cuenta los requerimientos de los microorganismos en el bioproceso. Palabras clave: Coeficiente volumétrico de transferencia de oxígeno ( kLa), demanda de oxígeno, oxidación de sulfito, método dinámico.

1. INTRODUCCIÓN. En los procesos biotecnológicos a escala industrial se utilizan caldos de cultivo (medios de cultivo en estado acuoso) compuestos por fuente de carbono y energía, fuente de nitrógeno, sustancias orgánicas como vitaminas y sustancias inorgánicas como sales. Además de estos compuestos la aerobiosis se convierte en un factor fundamental para el desarrollo del bioproceso, por ello el oxígeno se convierte en un sustrato esencial utilizado por los microorganismos para su crecimiento, mantenimiento y producción de metabolitos. Es claro entonces que para un bioproceso a escala industrial es necesario además de la selección, el diseño y escalado de los biorreactores, un estudio preliminar que determine el requerimiento de oxígeno en el medio de cultivo, puesto que la escasez de este afecta el rendimiento del proceso. Por ende es indispensable garantizar una entrada y distribución adecuada de oxígeno al medio de cultivo y es preciso entonces estimar la tasa de transferencia de oxígeno (OTR: Oxygen Transfer Rate) en diferentes escalas y a diferentes condiciones de operación. (García F, Gómez E, 2009)

Commented [1]: nosotros ya tenemos organizado el informe en doble columna solo haria falta lo de uds

La demanda de oxígeno de un microorganismo está parametrizada por la OTR, la cual se calcula por medio del coeficiente de transferencia de oxígeno, más conocido como kLa (siendo kL el coeficiente de transferencia de masa de la fase líquida, y a el área superficial específica total disponible para la transferencia de masa, dado que kL y a no se pueden medir fácilmente de forma individual, por lo general son agrupados juntos como un único parámetro) y el gradiente de concentraciones entre la interfase y la fase líquida, que en síntesis son la fuerza motriz en términos de concentraciones. A lo largo de los años se han desarrollado numerosas correlaciones empíricas y técnicas experimentales para la determinación del coeficiente kLa, que pueden dividirse en 2 tipos de métodos: indirectos y directos. Los métodos indirectos no se utiliza biomasa, sino que se realiza una simulación del proceso real mediante agentes y tecnicas analiticas quimicas, entre los más utilizados se encuentra el método de oxidación de sulfito de sodio y el metodo de eliminacion de gases. y métodos directos. Los métodos directos utilizan biomasa por ello son más exactos, el más conocido es el método dinámico (García F, Gómez E, 2010). Experimentalmente se llevó a cabo como método indirecto, el método de oxidación del sulfito y como método directo, el método dinámico. En el método de de oxidación del sulfito se simula la condición fermentativa mediante el uso del sulfito de sodio, un reactivo que en medio ligeramente alcalino reacciona rápidamente con el oxígeno en presencia de un catalizador Cu 2+ o Co2+. Aunque este método ha sido ampliamente utilizado por ser bastante ejemplificante, los resultados dependen de las condiciones de operación y de la rapidez con que se realice, por lo cual se generalmente obtienen valores de kLa mayores que otras técnicas, por lo que en la industria su aplicación se ha ido reduciendo (Doran, P. 1998). El método dinámico consiste luego de medir la actividad respiratoria con que crecen activamente los microorganismos, se detiene la inyección de oxígeno hasta llegar a no menos del 10% de dicha actividad (concentración) atribuyendo la disminución de la concentración de oxígeno en el biorreactor a su consumo por el microorganismo y inmediatamente cada 10 segundos por 4 minutos se toma dato de concentración de oxígeno disuelto a fin de obtener puntos que permitan un análisis gráfico cuya pendiente refleja el valor kLa (Laboratorio de procesos biológicos, 2017). El objetivo del presente trabajo es medir el k La por el método de oxidación de sulfito y por el método dinámico, variando condiciones como volumen, agitación y turbulencia, para conocer el impacto que tienen estos factores sobre la transferencia de oxígeno.

2. MARCO TEÓRICO. En las fermentaciones aeróbicas, el oxígeno es un sustrato crítico que necesita ser continuamente alimentado, debido a su baja solubilidad en el agua este puede llegar a ser un limitante en la velocidad de reacción (Garcia Ochoa and Gómez,2009). El oxígeno, es un gas que a temperatura ambiente se dispersa en una masa líquida a través de la interfase gas-líquido. Este concepto de la película doble, compuesta de una película fina de gas y una película de líquido en la interfase, fue desarrollado por Lewis y Whitman (Lewis & Hitman, 1924), originalmente para un fenómeno de transferencia en “Estado de equilibrio continuo”- Este estado está caracterizado por un flujo continuo e invariable de todos los componentes del sistema, de modo que las concentraciones son constantes con el tiempo y además se mantienen constantes las condiciones ambientales de presión y temperatura. Bajo estas limitaciones la transferencia de oxígeno en el agua puede expresarse como: NO2 = KLa (Cs - Cl ) x 10 -3

(1)

N = Masa de oxígeno transferido [kgO2/h] KL = Coeficiente de difusión de oxígeno en la película líquida [m/h] a = Área interfacial [m2]

Cs = Concentración de saturación del gas en el líquido [mg/L] Cl = Concentración de oxígeno en el líquido [mg/L] La ecuación anterior tiene una gran limitación en su aplicación, pues excluye una variación de concentración de oxígeno en la interfaz líquida, lo cual en la práctica es imposible. Estudios posteriores (Higbee, 1935) describieron el fenómeno en condiciones de “equilibrio discontinuo”. En este estado está caracterizado porque las concentraciones del gas en cualquier punto del sistema cambian con el tiempo. Este cambio puede ser el resultado de cambios en la concentración de oxígeno en el aire, su flujo, o cambios en las condiciones ambientales de presión y temperatura (Yánez, n.d.) Para el estudio de un problema de transferencia de masa, son importantes las condiciones de la interfase. Con excepción a los casos de transferencia extremadamente intensos o de acumlación de particulas sólidas en la interfase la experiencia muestra que existe equilibrio entre las fases a través de la interfase. Es decir, si una burbuja de aire se mueve en un líquido en una fermentación, el oxígeno debe pasar desde el interior de la burbuja hacia el líquido para ser consumida por las células. En otras palabras, la concentración de oxígeno en el gas, junto a la interfase, está en equilibrio con la concentración de oxígeno en el líquido, también junto con la interfase.(Erazo & Cárdenas, 2001) La eficiencia en la aireación de un sistema fermentativo depende de la solubilidad del oxígeno, la velocidad de difusión en los medios de cultivo, la demanda de oxígeno del cultivo y la capacidad del biorreactor de satisfacer dicha demanda en la población microbiana. La concentración de oxígeno disuelto en los medios de cultivo depende de la velocidad de consumo (oxygen uptake rate, OUR) de las células y de la velocidad de transferencia del mismo (oxygen transfer rate, OTR). La OTR depende del coeficiente de transferencia de oxígeno kLa y del gradiente entre la concentración de equilibrio y la concentración actual en el líquido, e incide sobre los índices de productividad y los rendimientos. (Soler & Buitrago, 2010) El kLa depende de una gran cantidad de factores uno de estos es la velocidad de agitación (Alves et al. 2010) la cual modifica el régimen de turbulencia y disminuye el tamaño de burbuja. Sin embargo, el consumo de energía es proporcional a la velocidad a la tercera potencia y al diámetro del agitador a la quinta, incidiendo en el costo de operación. Adicionalmente, debe tenerse en cuenta que altas velocidades de agitación tienen una influencia negativa en la productividad de complejos enzimáticos, debido al efecto de los esfuerzos de corte sobre el cultivo . Otros factores que afectan la transferencia de oxígeno son las características geométricas y operacionales de los recipientes de fermentación, la composición del medio de cultivo, la viscosidad, la tensión superficial, la concentración de oxígeno en la corriente de gas, la morfología del microorganismo y el área superficial que proveen las burbujas.(Soler & Buitrago, 2010) además, la concentración de microorganismo así como las propiedades de biocatalizador son también factores que influyen en el kLa. (Michelin et al.2013) Es de suma importancia siempre realizar en un balance de masa del oxígeno en estado estacionario, en el cual se mide el contenido de oxígeno de las corrientes hacia o desde el fermentador, para determinar como será el comportamiento dinámico con respecto a la transferencia. Como el proceso se desarrolla en estado estacionario se obtiene que la diferencia entre el flujo de entrada y el flujo de salida del oxígeno debe ser igual a la velocidad de transferencia de oxígeno desde el gas hacia el líquido:

(2) VL= Volumen del líquido en el fermentador [L] Fg= Caudal volumétrico de gas.[L/h] CAG = Concentración de oxígeno en fase de gas.[g/L] i y o= subíndices, se refieren a las corrientes de entrada y salida respectivamente. Dado que la concentración de gas se mide generalmente como presión parcial, puede incorporarse la ley de los gases ideales con lo cual se obtiene la siguiente expresión:

(3)

R= Constante universal de los gases PAG= Presión parcial de oxígeno en el gas T= Temperatura absoluta Las presiones parciales de oxígeno en las corrientes de entrada y de salida no suelen ser muy diferentes durante la operación por lo que es necesario medirlas con una gran precisión, por ejemplo, utilizando un espectrómetro de masas. La temperatura y el caudal de gases también deben ser medidos con cuidado para asegurar un valor preciso de NA. Esto es sumamente útil en algunos de los métodos empleados para la determinación de kLa. 2.1 Métodos de determinación de k La. Para determinar kLa existen varios métodos que se dividen en dos grupos: -

Métodos indirectos: Uso de técnicas fisicoquímicas que simulan el proceso real dado que no hay presencia de biomasa en estos. Estos métodos pueden dar valores más altos que los reales, debido a que la velocidad de absorción se ve favorecida por las reacciones químicas, las cuales consumen el oxígeno en la fase líquida rápidamente.

-

Métodos directos: Condiciones reales de un bioproceso. Tienen en cuenta la demanda de oxígeno del microorganismo ya que hay presencia de biomasa.

2.1.1 Métodos indirectos. 2.1.1.1 Método de gassing out estatico. Método de gassing out estatico o el método de eliminación de gas consiste en medir la velocidad de incremento de la concentración de oxígeno disuelto en el medio; se reduce esta concentración hasta valores cercanos a cero, haciendo pasar un gas inerte (suele ser nitrógeno gaseoso) por el sistema durante al menos 20 min. Se suspende el flujo de nitrógeno, se reinicia la aireación a las condiciones de operación establecidas (velocidad de agitación y velocidad de aireación) y se se mide con una sonda polarográfica el incremento en O2 disuelto de un medio de cultivo. Este método presenta como

ventaja que puede aplicarse para diferentes medios de cultivo y los resultados corresponden a condiciones en que no hay consumo de oxígeno. A escala industrial se requieren grandes cantidades de N2 para eliminar todo el oxígeno y el tiempo de respuesta del electrodo puede introducir errores. (Patel N., Thibault J., 2009) 2.1.1.2 Metodo de oxidacion de sulfito El método de oxidación de sulfito también conocido como método de Cooper, mide la velocidad de oxidación del sulfito a sulfato, siendo análogo a la transferencia de oxígeno en microorganismos, este método es lento, no considera la reología del medio y suele dar valores sobreestimados aunque su elaboración es fácil y no necesita de equipos costosos.(Patel N., Thibault J., 2009) La ecuación estequiométrica que representa a la reacción que ocurre entre sulfito y O 2 es la siguiente:

(4) Para que la reacción se realiza correctamente es indispensable que la solución del sulfito este a un pH ligeramente alcalino y se requiere la presencia de un catalizador que puede ser una pequeña alícuota de una solución de Cu2+ o Co2+. La velocidad de la reacción puede representarse según la ecuación:

(5) Donde k es la constante de velocidad y m y n son coeficientes que deben determinarse experimentalmente y representan al orden de la reacción para sulfito y oxígeno respectivamente. Las ecuaciones que representan al balance de materia para el O2 y Na2SO3 son las siguientes:

(6)

(7) Donde VL es el volumen del reactor, CA y CB son las concentraciones de O2 disuelto y sulfito en el medio, CAF y CBF son las concentraciones de O2 y sulfito en la alimentación, Q es el caudal de alimentación, Cuando se alcanza el estado estacionario el término de consumo químico puede eliminarse de las ecuaciones anteriores sustrayendo, así se obtiene la ecuación que permite calcular el kLa:

(8)

En las condiciones de operación, la concentración remanente de sulfito en el medio, la concentración de O2 en la alimentación y en el reactor son despreciable frente a la concentración de sulfito en la alimentación con lo que la ecuación puede reducirse a:

(9) Una diferencia operacional importante entre este método y el tradicional de Cooper es que en el original la concentración elevada de sulfito mantiene relativamente constante el pH. El procedimiento experimental consiste en llenar el biorreactor con un volumen determinado de solución estándar de sulfito de sodio (Na2SO3), al cual se le adiciona una solución que contiene Cu+2, llevar el experimento a las condiciones de agitación y temperatura deseadas. A intervalos de tiempo regulares tomar volúmenes conocidos de muestra. Cada muestra se mezcla con una solución estándar de yodo en exceso, y finalmente esta solución se titula con una solución estándar tiosulfato de sodio (Na2S2O3), usando solución de almidón como indicador del punto final (colorimetría). Las reacciones que ocurren el el proceso son: SO3 -2 + I2 + H2O → SO4-2 + 2 I- + 2 H+ (10) 2 S2O3 -2 + I2 → S4O6-2 + 2 I - (11) El yodo tiene una baja solubilidad en agua, sin embargo el complejo triyoduro (I3-) es muy soluble, de modo que las soluciones de yodo se preparan disolviendo I2 en una solución concentrada de yoduro de potasio KI, así que es realmente el triyoduro la especie que se usa en la titulación. 2.1.2 Métodos directos 2.1.2.1 Método de gassing out dinamico. También conocido solamente como método dinámico, en este se miden de los niveles de O 2 en cultivos que están creciendo en el fermentador, este método puede determinar el k La durante una fermentación real y es muy rápido aunque requiere de un sensor muy rápido y preciso el cual suele ser costoso, trabaja en un rango limitado de concentraciones de O2 pues el nivel no puede caer por debajo de una concentración crítica y es difícil de aplicar en fermentaciones con alta demanda de O2. Este método consiste en detener de forma temporal el flujo de gas (oxígeno puro o aire dependiendo del requerimiento) en el biorreactor para eliminar la adición de oxígeno al caldo líquido de tal manera que la disminución de la concentración de oxígeno en el biorreactor puede ser atribuida enteramente a su consumo por el microorganismo. La medición se divide en dos secciones como puede observarse en la figura 1.

Figura 1. Gráfica representativa del método dinámico.

Primero se mide la actividad respiratoria de microorganismos que crecen activamente en biorreactor en un caldo de cultivo adecuado. Se suspende la aireación hasta que la concentración de oxígeno disuelto llegue cerca de su valor crítico (oxígeno suficiente para utilización en el mantenimiento de los microorganismos). Antes de que la OD alcance su valor crítico, el aire se introduce nuevamente en el biorreactor y suponiendo que la reoxigenación del caldo es suficientemente rápida para permitir el crecimiento de las células, el nivel de OD alcanzará un valor de estado estacionario que refleja un balance entre el suministro de oxígeno y el consumo existente. Este método permite la determinación del kLa a través del análisis gráfico y la ecuación característica del mismo que permite relacionar la concentración y el cambio de esta en el tiempo (velocidad de transferencia de oxígeno) mediante la ecuación (Taguchi H, 1966):

(12)

3. ANTECEDENTES 4. METODOLOGÍA 4.1.

Método

indirecto:

Oxidación

del

sulfito

de

sodio.

Se realizaron cinco experimentos en Erlenmeyer con sulfito de sodio para la determinación de la transferencia de oxígeno, donde se varió el volumen del medio de trabajo con respecto al volumen del matraz. Sólo un Erlenmeyer incluía deflectores y las condiciones de temperatura y agitación fueron de 30°C y 200 rpm respectivamente, para todos los experimentos. A continuación en la Tabla 2., se presenta en detalle la información. Tabla 2. Experimentos para la determinación de la transferencia de oxígeno por el método indirecto: oxidación del sulfito

Experimentos: Método Oxidación del Sulfito

Experimento

Volumen del Erlenmeyer (mL)

Volumen Deflectores medio sin células (mL) (Na2SO3 0.5 N)

1

1000

100

No

2

1000

200

No

3

1000

400

No

4

250

250

No

5

250

100

Si

Se adicionó el sulfito de sodio en las proporciones descritas por la Tabla X. Se desea que el Na2SO3 en exceso reacciona con el oxígeno en presencia de Co2+ o Cu2+ como catalizadores produciendo sulfato de sodio, como se muestra a continuación según la ecuación (13). Para ello se toma un volumen de la solución catalizadora sulfato de cobre (CuSO4) 1M que es adicionado al medio de cultivo con fin de obtener una concentración final de 1 x 10-3M. En particular, para el primer experimento se agregó al medio 0,1 mL de una solución de cobre 1M. (13) Cabe agregar, que la velocidad de reacción que se presenta en la ecuación (13) está influenciada considerablemente por el pH. En particular, se estableció para esta práctica un pH ligeramente alcalino (pH igual a 8). 4.1.1 Toma de muestras. Inmediatamente se adiciono el catalizador en el Erlenmeyer, se comenzó a contabilizar el tiempo. Se extrajo una alícuota de 2 mL cada 20 minuto, para determinar la evolución del consumo de oxígeno por parte del Na2SO3. Como esta sustancia se encuentra en exceso, lo que no reacciona se le adiciona rápidamente 3 mL de una solución de yodo en exceso 0,5 N, con el fin de detener la reacción de oxidación del sulfito de sodio. Dicha reacción en presencia de yodo se muestra a continuación acorde con la ecuación (14).

(14) El exceso de I2 se determina mediante la titulación con tiosulfato de sodio 0,075 N, el cual reacciona con el yodo residual. Para esto es necesario hacer uso de un indicador, por lo que se

empleó 2 o 3 gotas de almidón (1%). El almidón es adicionado hacia el final de la titulación, oscureciendo notablemente el color de la misma, la cual en principio (antes de adicionar el indicador) era amarillo claro. Finalmente, la titulación se continúa hasta que la solución se torna transparente. La reacción que ocurre se describe a continuación según la ecuación (15).

(15) Cada experimento se llevó a cabo por duplicado y se tomaron un total de cinco muestras cada 20 minutos. 4.1.2 . Determinación de la concentración de oxígeno Para la determinación de oxígeno se realiza por el método de volumetría mediante retroceso, es decir, la obtención de la concentración de g/L O2 tuvo el siguiente tratamiento matemático basado en las relaciones estequiométricas de la ecuación 13,14 y 15. Moles de Yodo (I2)y Moles de tiosulfato de sodio (Na2S2O3)presentes El yodo participa en las reacciones Según las ecuaciones 2 y 3. El yodo inicialmente se adiciona en exceso (I2exc) en la reacción 14, y la parte de yodo que no reacciona (I2Res) es identificada por volumetría tiosulfato de sodio (Na2S2O3) en la reacción 15: Ecuación 15 Donde Concentración Molar del tiosulfato de sodio Volumen gastado de tiosulfato de sodio en la titulación Ecuación 14 Despejando de la ecuación 16 Reemplazando las ecuaciones 20 y 17 en 19 Concentración de Oxigeno (O2) disueltos en el medio para oxidar el sulfito de sodio De la ecuación 13 se tiene que reaccionan con 1, es decir, Despejando de la ecuación18 Reemplazando 23 en 21

Remplazando 24 en 22 Luego Donde =concentración de oxígeno en g/L =volumen de sulfato de sodio en L =concentración molar de sulfato de sodio =concentración molar de yodo =volumen de yodo adicionado en la muestra en L Volumen de muestra en L, tomado en cada 20 minutos

4.2. Método directo: Método gassing out dinámico. Se utilizó también el método dinámico para la determinación del coeficiente volumétrico de transferencia de oxígeno. Inicialmente se inoculó el biorreactor con una levadura comercial Saccharomyces cerevisiae en presencia de un medio de cultivo apropiado y se llevó a cabo la respectiva calibración del electrodo de oxígeno con base en las condiciones de operación del biorreactor (temperatura, aireación y agitación). Una vez la concentración de oxígeno disuelto (OD) era estable, se inició el experimento suspendiendo la aireación y sustituyendo el aire por nitrógeno gaseoso hasta al alcanzar una concentración de OD crítica tal que el sistema no fuera anaerobio, es decir, la concentración de OD descendió a una concentración crítica no inferior al 10% del valor de saturación. A partir de ese momento, se suspendió la entrada de nitrógeno, se suministró de nuevo aire y se tomó registro del oxígeno disuelto cada 10 segundos hasta alcanzar de nuevo la saturación.

5. RESULTADOS 5.1 Método indirecto: Oxidación de sulfito de sodio En la tabla XX se organizan los datos obtenidos en el análisis titulométrico con tiosulfato de sodio para cada muestra tomada del medio de cultivo de 100 mL por cada 20 minutos. TablaXX. Volumen gastado en la titulación con tiosulfato de sodio con respecto al tiempo de muestreo en el experimento 1.

Volumen titulación con tiosulfato de sodio en L Tiempo

Muestra 1

Muestra 2

20

0,0145

0,014

40

0,017

0,0202

60

0,0235

0,025

80

0,028

0,0265

100

0,0312

0,0293

Los datos de la tabla XX se construye la gráfica 1 para visualizar el comportamiento con el tiempo del volumen de tiosulfato requerido por las muestras. Gráfica XX. Evolución de volumen de tiosulfato de sodio utilizado con respecto al tiempo en el experimento 1. Con base a estos valores se procedió determinar la concentración de oxigeno presente en el experimento 1 aplicando la ecuación 26 planteada en la metodología (Tabla ZZ), para ello también se utiliza los datos de la tabla YY que resume los valores de concentración de tiosulfato de sodio, sulfito de sodio y yodo empleados en el análisis volumétrico. Tabla YY. Concentraciones de las soluciones utilizadas en el método indirecto Datos

Sulfito de sodio

Yodo

Tiosulfato sodio

Volumen (L)

0,002

0,003

-

Concentración Inicial [N]

0,5

0,5

0,075

de

Tabla ZZ. Concentración de Oxígeno en mol/L por cada 20 minutos de muestreo en el experimento 1. Tiempo

Muestra 1

Muestra 2

20

0,0000109

0,0000062

40

0,0000344

0,0000644

60

0,0000953

0,0001094

80

0,0001375

0,0001234

100

0,0001675

0,0001497

Los resultados de la concentración de oxigeno obtenidos en la tabla ZZ se modela su comportamiento con el tiempo representado en la gráfica ZZ. Gráfica ZZ. Comportamiento de la concentración de oxigeno con respecto al tiempo en el experimento 1 Los valores de las pendientes () obtenidas en la gráfica XX están relacionados con del coeficiente volumétrico de transferencia de oxígeno (), esto es gracias a la cuantificación mediante titulación volumétrica por retroceso, como se menciona en la metodología, el cual es determinada por las series de reacciones 13,14 y 15 Para la determinación del coeficiente KLa se realiza el siguiente cálculo: Dado que en el medio se da un rápido consumo de oxigeno por parte del tiosufito, se tiene que:

Dónde: = 0,00025 es la solubilidad del oxígeno en agua a 25 °C. y presión de 1 atm. Por lo tanto,

5.2 Método dinámico A través del sistema de control del biorreactor se obtienen mediciones directas de oxígeno disuelto en el tiempo (cada 10 segundos durante 4 minutos). Con la información obtenida se lleva a cabo la construcción de la gráfica P, la cual nos da una idea de la dinámica del proceso.

Gráfica P. Método dinámico directo: Porcentaje de oxígeno disuelto contra el tiempo [s].

Como se está trabajando con oxígeno disuelto (OD), para realizar los cálculos se debe tener en cuenta la ecuación (12) y la relación existente entre el CAL y el OD. (16) Siendo b una constante de proporcionalidad que depende de la presión, temperatura y composición del gas de entrada y de la composición y temperatura del medio de cultivo, sin embargo despreciando este hecho, podemos ver que CAL y el OD son proporcionales y por ende obtenemos la siguiente ecuación:

(17) Mediante el uso de la linealización de la curva obtenida en la gráfica P , se obtiene una nueva gráfica que expresa la velocidad de transferencia del oxígeno disuelto con respecto %OD como se observa en la gráfica O, y por medio de la ecuación característica de esta línea conocemos el valor numérico del kLa.

Gráfica O. Linealización de la variación del oxígeno disuelto con respecto al tiempo contra el porcentaje de oxígeno disuelto.

La ecuación de la curva de tendencia lineal asociada a la gráfica O es la siguiente: y = -0.0202x + 1.0984 (18) Donde y es dOD/dt y x es %OD en el medio. A partir de esta ecuación y sabiendo que independientemente la naturaleza negativa de la gráfica O puede aplicarse valor absoluto a la pendiente, se obtiene para el método dinámico de kLa = 0,0202 s-1.

6. ANÁLISIS DE RESULTADOS.

6.1. Determinación del coeficiente volumétrico de transferencia de oxígeno por el método Iodométrico La velocidad de reacción entre el sulfito de sodio y el oxígeno es lo bastante rápida de manera que todo el oxígeno que entra en la solución es inmediatamente consumido. Dicho esto, el sulfito de sodio es equivalente a la velocidad de transferencia de oxígeno, donde la etapa controlante del proceso será la transferencia de materia entre la interfase gas-líquido. En consecuencia como se podría anticipar, a medida que transcurre el tiempo el volumen de tiosulfato de sodio empleado en la titulación aumenta, en virtud de una mayor cantidad de yodo y por tanto de una mayor cantidad de sulfito de sodio que ha reaccionado con el oxígeno. Dicho método proporciona una estimación del coeficiente volumétrico de transferencia de masa que debe ser mayor en comparación con el determinado por otros métodos, puesto que el proceso se realiza en ausencia de células y no se tiene en cuenta las características reológicas asociadas al medio de cultivo real. Cabe resaltar además, que la velocidad a la que las células consumen oxígeno en los fermentadores determina la velocidad a la que el oxígeno debe transferirse al medio de cultivo, por lo que la demanda de oxígeno dependerá de la bioquímica de cada tipo de microorganismo. No obstante, el análisis de la transferencia de oxígeno a escala de matraz, permite proponer las condiciones de operación del biorreactor cuando se pretende escalar el proceso; empleando como criterio de escalado el coeficiente de transferencia de oxígeno, en aquellos cultivos aeróbicos donde la concentración de oxígeno disuelto es un factor clave. Por otro lado, la oxidación del sulfito de sodio en presencia de oxígeno, es una reacción lo bastante sensible a las condiciones de operación, lo que inherentemente hay una imprecisión asociada a la determinación del KLa. En otras palabras, factores como el pH, la temperatura y la concentración de catalizador pueden afectar considerablemente el coeficiente cinético de la reacción. En particular, en estudios previos se ha observado que a valores de pH ligeramente alcalinos se da una mayor absorción del oxígeno. Para esta práctica, se estableció inicialmente el pH de la solución en 8, sin embargo, a medida que transcurre la reacción hacia la formación de productos, pueden haber cambios de pH que a larga afectan la velocidad de reacción entre el sulfito de sodio y el oxígeno (Linek, Moucha, & Kordač, 2005; Rubio, Grima, Sanz, & Peral, 1983).

6.2 Método dinámico. Mediante este método se pudo determinar un incremento en la velocidad de transferencia de concentración de oxígeno en el medio, presentando una variación desde 15,4% hasta 54,6% en 4 minutos. Se observó que al burbujear un gas inerte como el nitrógeno se elimina eficazmente el oxígeno en el medio, puesto que redujo la concentración inicial del mismo desde 54,6,% hasta 15,4% en menos de 1 minuto, un valor aproximado a la concentración crítica de oxígeno. La razón principal para no exceder el valor crítico o incluso llevar la concentración 0% es las células microbianas necesitan un concentración mínima de oxígeno para realizar cada una de las actividades metabólicas primordiales, para garantizar que las células no sean sometidas a condiciones anóxicas (estrés oxidativo), la concentración s no puede ser inferior al 10% así se garantiza condiciones adecuadas para el mantenimiento del cultivo. Es significativo también observar que de la actividad respiratoria inicial de microorganismos que crecen activamente en el biorreactor (54,6%), mediante la realización de la experimentación varía hasta la concentración crítica y una vez se retoma el proceso de aireación termina por obtener una concentración de 54,6%, lo que nos sugiere que esta es la demanda de oxígeno ideal para el microorganismo en el medio de cultivo dado. Todos los procesos celulares en condiciones aerobias emplean el oxígeno como aceptor final de electrones para el proceso de la respiración, lo que conlleva a que este sea uno de los limitantes para el diseño de los biorreactores. Esta limitación puede darse tanto por factores como la agitación y el flujo de recirculación. En esta práctica el método dinámico para la determinación del k La se llevó a cabo en condiciones de no agitación, razón por la cual se pudo presentar un menor valor del mismo, lo que sugiere que si en el proceso de biotransformación se requiere un mayor valor de coeficiente de transferencia de oxígeno se podría optimizar mediante las variaciones de agitación e incluso con las variaciones de diámetro de las burbujas provenientes de la corriente de aireación. 6.3 Comparación entre el método indirecto y el método directo

7. REFERENCIAS