“Determinación de alcaloides en orina” Granados J.1, Malpica L.2, Ordoñez E.3, !arez ".# Gr!po 2$%2. &o'icolo()a. E*!ipo %. 1,2,3,#. Est!diantes de +io*!)mica Dia(nóstica. ni-ersidad "acional !tónoma de M/'ico. 0ac!ltad de Est!dios !periores !a!titln. Departamento de ciencias ioló(icas. ección de io*!)mica 4 5armacolo()a 6!mana -. 17 de Ma4o, ol. ta. Mar)a las &orres &orres !a!titln 8zcalli, Estado E stado de M/'ico 9.%#$#:.
;EME" Los alcaloides son bases orgánicas, su variedad estructural es muy grande, tanto en su esqueleto carbonado como en el tipo y número de sustituyentes. El nitrógeno, que debe estar presente para que una molécula sea catalogada como alcaloide, se encuentra como amina primaria, secundaria, terciaria o sal cuaternaria. Algunos alcaloides poseen actividad fisiológica, principalmente a nivel de sistema nervioso, algunos se han manifestado como altamente tóicos, y otros en dosis apropiadas, son utili!ados en la industria farmacéutica" el uso inadecuado de los alcaloides como drogas de abuso representa un problema de salud en la sociedad actual. En el laboratorio se han creado diversos métodos para la etracción de alcaloides de muestras biológicas, la mayor#a se basan en el aprovechamiento de las propiedades qu#micas de los compuestos, en este estudio se utili!aron solventes como cloroformo y éter et#lico. Asimismo eisten técnicas de reconocimiento de alcaloides, éstas se fundamentan en la capacidad de los alcaloides para combinarse con el yodo y metales pesados como bismuto, mercurio, tugsteno" con los cuales forman precipitados. precipitados. Algunos de los reactivos empleados para el reconocimiento de alcaloides son$ %eactivo de &ayer, 'ragendorff, (ouchardat y &andelin. En el presente reporte se muestran los resultados obte obteni nido doss con con la real reali! i!ac ació ión n de las las técn técnic icas as ante antess menc mencio iona nada dass adem además ás de la determinación por inmunoensayo de alcaloides en orina obteniendo como resultado la presencia de )*+ en la muestra anali!ada. 9L+; L ?O;D Al-aloids, 'ragendorff, 'ragendorff, &ayer, &ayer, (ouchardat, (ouchardat, mmunoassay mmunoassay
8"&;OD8@" 1o eiste una definición eacta para los alcaloides, pero se puede considerar como$ 23n compuesto orgánico de origen natural 4generalmente vegetal5, nitrogenado 4el nitrógeno se encuentra generalmente intrac#clico5, derivados generalmente de aminoácidos, de carácter más o menos básico, de distribución restringida, con propiedades farmacológicas importantes a dosis ba6as y que responden a reacciones comunes de precipitación7 8 se clasifican en$ Alcaloides 9erdaderos cumplen estrictamente con las caracter#sticas de la definición de alcaloide$ son formados a partir de aminoácidos, tienen siempre un nitrógeno intrac#clico, son de carácter básico y eisten en la naturale!a normalmente en estado de sal. :rotoalcaloides son aminas simples con nitrógeno etrac#clico, de carácter básico y son productos del metabolismo de los aminoácidos. :seudoalcaloides presentan algunas de las caracter#sticas de la definición de alcaloide, pero no son derivados de aminoácidos. Alcaloides imperfectos son derivados de bases púricas, no precipitan con los reactivos espec#ficos para alcaloides. 4;alagovs-y <==<5 1o son alcaloides los aminoácidos, las betala#nas, los péptidos, los amino a!úcares, las vitaminas nitrogenadas, las porfirinas, algunas bases como la tiamina ampliamente distribuida en los seres vivos y los al-il aminas de ba6o peso molecular. 4>u-ins-li <===5 En cuanto a su estado natural, los alcaloides son esencialmente sustancias presentes en todos los órganos de la planta, pueden encontrarse mayoritariamente en ho6as 4cocaina, nicotina, pilocarpina5, en flores 4escopolamina, atropina5, en frutos 4alcaloides del opio, peletierina, coniina5, en semilla 4piperina, arecolina5, en corte!a 4quinina, tubocurarina5, en la ra#! 4emetina y cefalina5. 4;alagovs-y <==<5 La función de los alcaloides en las plantas no es aún clara, eisten algunas sugerencias sobre el 2rol7 que 6uegan estas sustancias en los vegetales como$ ? /irven como productos de desecho o almacenamiento del nitrógeno sobrante, esta función es equivalente a la del ácido úrico o de la urea en los animales. ? 'ebido a que en su mayor#a, los alcaloides son asociados con ácidos orgánicos que le facilita el transporte en la planta, pueden servir como productos de almacenamiento del nitrógeno no metaboli!ado o para transporte del mismo" en el caso de las /olanaceas midriáticas, los ésteres del tropano se forman en las ra#ces y son transportados a las partes aéreas donde pueden ser hidroli!ados. ? La microqu#mica ha permitido mostrar en forma general, que los alcaloides son locali!ados en los te6idos periféricos de los diferentes órganos de la planta, es decir en el recubrimiento de las semillas, corte!a del tallo, ra#! o fruto y en la epidermis de la ho6a" esto nos permite pensar que los alcaloides cumplen una importante función como es la de proteger a la planta, por su sabor amargo de estos, del ataque de insectos. ? Los alcaloides pueden servir de reguladores del crecimiento, se ha demostrado que los alcaloides derivados de la putrescina se incrementan notablemente durante la germinación de algunas plantas como la cebada, cuando se encuentran en suelos deficientes de potasio. 4>u-ins-li <===5 Las técnicas de reconocimiento son basadas en la capacidad que tienen los alcaloides en estado de sal 4etractos ácidos5, de combinarse con el yodo y metales pesados como bismuto, mercurio, tugsteno formando precipitados" estos ensayos preliminares se pueden reali!ar en el laboratorio o en el campo. 4;alagovs-y <==<5 M&E;8LE > MA&ODO
A <@ mL de orina se le reali!aron tres etracciones distintas, la primera se reali!ó adicionando *+l 1 hasta llegar a un p*BC. /e continuó con tres etracciones con éter et#lico obteniendo as# el etracto etéreo D" posteriormente a la fase acuosa restante se alcalini!o con hidróido de amonio hasta conseguir un p*B y se procedió nuevamente a reali!ar tres etracciones con éter et#lico obteniendo as# el etracto etéreo D< la fase acuosa se reetra6o con cloroformo 4tres etracciones5 obteniendo as# el etracto DF +loroformico. 3na ve! obtenidos los tres etractos se les aGadió sulfato de sodio anhidro a cada uno. /e procedió a evaporar los etractos casi a sequedad para as# poder reali!ar por separado a cada etracto las pruebas presuntiva 'ragendorff, &ayer (ouchardart y &adelin, en placa de porcelana. Hinalmente se reali!ó un inmunoensayo que permite detectar la presencia de anfetaminas, metanfetaminas, morfinaIopiáceos, coca#na y )*+ utili!ando una prueba de uso comercial 4nstanJ vie5 ;EL&DO )abla . :ruebas presuntivas para alcaloides
E*!i po
Dra(endor55 BCF
Ma4er BCF
+o!c6ardat BCF
Mandelin BCF
lcaoloide identi5icado
1
2
3
1
2
3
1
2
3
1
2
3
1
in identi5icar
2
C
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C
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)abla <$ nmunoensayo reali!ado a la orina
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"L88 DE ;EL&DO
in identi5icar
El consumo de sustancias alcaloides en el mundo va cada ve! en aumento. Los alcaloides se pueden encontrar en diferentes fluidos biológicos dependiendo de su metaboli!ación, por lo cual se cuantificó en un orina. Los alcaloides tienen propiedades caracter#sticas entre las que destaca que la mayor#a de ellos son poco insolubles o insolubles en agua pero se disuelven bien en solventes como el cloroformo o el éter. La otra caracter#stica es que al tener caracter#sticas básicas que le confiere el nitrógeno en su estructura, al estar en medio ácido se forman sales las cuales son muy solubles en agua y poco solubles en otros solventes. La cualidad de formar sales en medio ácido de los alcaloides, permite formar sales dobles con compuestos con mercurio, oro, platino, bismuto o iodo. Estas sales dobles suelen obtenerse como precipitados y muchas son caracter#sticas desde el punto de vista cristalográfico.)odo lo anterior posibilita reali!ar pruebas presuntivas en dicha cualidad. La mayor#a de los alcaloides son insolubles o muy poco solubles en agua, y solubles en alcohol, éter, cloroformo u otros solventes orgánicos. /e combinan con ácidos para dar sales, comportándose entonces como bases. El carácter básico de los alcaloides está dado por la presencia de un nitrógeno am#nico o como átomo trivalente en su estructura. Las sales de los alcaloides son bastante solubles en agua e insolubles en solventes orgánicos. :ara la investigación de tóicos alcaloidicos en la muestra biológica se requiere de ciertos procesos como etracción, y la aplicación de metodolog#as de identificación. El ob6etivo de la etracción es el aislamiento de los alcaloides de la muestra problema. /i la muestra constituye un material sólido se procederá con el método de etracción continua. En caso de ser una muestra l#quida se tiene el método clásico, por lo que se empleó esta metodolog#a que sigue el principio de la solubilidad del l#quido problema en ciertos solventes orgánicos, basándose en el carácter básico de los alcaloides y en el hecho de su eistencia como sales de ácidos orgánicos o como recombinaciones solubles en otras sustancias. En este tipo de métodos la presencia de prote#nas en la orina puede ser una interferencia a la hora de reali!ar las pruebas presuntivas, ya que las prote#nas facilitan la formación de emulsiones entre el agua y los solventes de etracción, que dificultan la separación de los alcaloides. :or esta ra!ón se procede a obtener filtrados libres de prote#nas si se requiere. 'ebido a que los alcaloides son compuestos de carácter básico, la solubilidad de estos en diferentes solventes va a depender del p*, esto de acuerdo a la forma en que se encuentren, ya sea en forma de base o sal" en forma de bases son solubles en solventes no polares como benceno, éter et#lico, cloroformo, mientras que en forma de sales son solubles en solventes polares como el agua. Es por esto que se reali!aron varias etracciones, el procedimiento de etracción de alcaloides en orina se inicia con la acidificación de la muestra. Este procedimiento tiene dos ob6etivos$ 5 :recipitación de prote#nas que puedan interferir con la etracción y separar a los alcaloides que pueden estar unidos a ellas y <5 La formación de las sales de los alcaloides, lo que propiciará una mayor disolución en la muestra 4 que mayoritariamente es acuosa5 para su posterior etracción. La primera etracción fue una etracción etérea ácida, a este p* la mayor#a de los alcaloides quedan en la fase acuosa por estar en forma de sales 4solubles en agua pero no son bien solubili!adas en solventes orgánicos5, por lo que solo algunos alcaloides quedaran en la fase orgánica dependiendo de sus composición qu#mica pero siendo una minor#a. La segunda etracción se llevó a cabo en un p* básico, como se ha mencionado anteriormente, los alcaloides son compuestos que actúan como bases y su solubilidad var#a de acuerdo al p*. As#, al imponer un p* básico se despla!a a los alcaloides de sus
combinaciones salinas" las bases liberadas son en seguida solubili!adas en el solvente orgánico 4Kter5. :or lo tanto esta ve! la fase orgánica contendrá la mayor#a de los alcaloides de la muestra de6ando en la fase acuosa solo unos cuantos además de algunas impure!as. 3na tercera etracción se reali!ó con el solvente no polar, cloroformo, donde se encontraran en caso de haber, alcaloides tales como la morfina, atropina, brucina y estricnina debido a las caracter#sticas fisicoqu#micas de estos compuestos y a la polaridad del cloroformo ya que posee una constante dieléctrica mayor al éter de petróleo lo que lo hace más polar por lo que solubili!a en menor medida a los alcaloides en forma de bases. :ara la determinación de alcaloides en orina se reali!aron pruebas presuntivas como ya se mencionó, estas pruebas se basan en la capacidad que tienen los alcaloides de formar sales dobles con los compuestos de mercurio, oro, platino, bismuto, yodo, etc. Estos compuestos forman parte de los llamados reactivos de los alcaloides o reactivos de precipitación de alcaloides, aunque los precipitados pueden ser causados por prote#nas, beta#nas, curcuminas y algunos polifenoles, lo que lleva a tener un falso positivo. +omo la ausencia de precipitado es indicativa de que no hay alcaloides, se usan estos reactivos como prueba presuntiva de su presencia. El dato positivo no es definitivo y es recomendable la reali!ación de pruebas más espec#ficas para su determinación y caracteri!ación. 'ebe tomarse en cuenta que los reactivos empleados en las pruebas presuntivas se encuentran en una fase acuosa acidificada. Estas pruebas no pueden reali!arse directamente sobre las etracciones con solventes orgánicos 4debido a la redisolución de los precipitados5, por lo cual se evaporó la mayor parte del solvente antes de la reali!ación de las pruebas y para concentrar la muestra anteriormente obtenida. Los reactivos yodados que precipitan a los alcaloides en solución acuosa ácida ba6o la forma de polJiodatos comple6os son los siguientes$ 'ragendorff %eactivo de 'ragendorff contiene )etrayodo (ismuto de :otasio, este compuesto reacciona con alcaloides dando lugar a la formación de un compuesto de coordinación en el que tres moléculas del alcaloide mantienen una interacción de coordinación electrostática con el átomo de bismuto del reactivo. El resultado de esta reacción es la formación de un precipitado naran6aJro6i!o cuando se le adiciona este reactivo a una solución ácida de alcaloides, por lo cual detecta alcaloides que forman sales de amonio estables en solución ácida.
8ma(en 3. 9roceso de la reacción en la pr!ea de Dra(endor55
&ayer El reactivo de &ayer se compone de yoduro de mercurio y potasio, este reactivo se utili!a para identificar alcaloides débilmente básicos.
8ma(en. # 9roceso de la reacción en la pr!ea de Ma4er
(ouchardat El reactivo de (ouchardat contiene yodoJyoduro de :otasio. La aparición de un precipitado floculento marrón o castaGo blanco es tomada como resultado positivo. /egún lo seGalado por +harles /tephenson el reactivo de (ouchardat 4también conocido como reactivo de agner5 es útil para la identificación de atropina y coca#na, ambas con estructura seme6ante aunque con efectos diferentes. La mayor#a de estas reacciones tienen una sensibilidad para reconocer alcaloides en cantidades de entre =.=J=.Mg 4siendo la reacción de 'ragendorff la más sensible pero
también la que puede presentar más falsos positivos5 pero la sensibilidad puede variar dependiendo del reactivo. Además aunque estos reactivos pueden reconocer una gran cantidad de alcaloides cada reactivo es más sensible para determinadas estructuras de estos y para reaccionar con diversos componentes que pueden generar interferencias. :or e6emplo la reacción de 'ragendorff es más sensible para interactuar con alcaloides que contienen aminas terciarias, en cambio la reacción de (ouchardart es más sensible para reaccionar con la morfina y sus derivados. La prueba de &andelin que contiene vanadato de amonio es una reacción de oidoJ reducción entre el reactivo 49N
+abe seGalar que no son pruebas que confirmen la eistencia como tal de alcaloides totalmente espec#ficos y según algunos autores sugieren que la forma de reportar los resultados para alcaloides de una forma más correcta es mane6ar un sistema que va de cuatro O a Q para conocer de forma relativa la cantidad de alcaloide presente en la muestra. En el laboratorio de toicolog#a, una ve! que se cuenta con la muestra de orina se reali!a el test de antidoping o determinación de alcaloides haciendo uso de una técnica fácil, rápida, barata y altamente espec#fica llamada inmunocromatograf#a en placa. Este método se basa en la reacción inmunológica que se reali!a en una membrana cromatográfica. La :rueba &ulti'rogas en Nrina 1/)A1) 9ER es un inmunoensayo cualitativo para detectar la presencia de drogas yIo sus metabolitos en orina humana de acuerdo a puntos de corte espec#ficos, en un solo ensayo. La :rueba &ulti'rogas 1/)A1) 9ER provee únicamente un resultado anal#tico preeliminar. 3n &étodo qu#mico alterno más espec#fico debe utili!arse para obtener un resultado anal#tico confirmatorio. +romatograf#a de ;ases I Espectrometr#a de &asas es el método confirmatorio preferencial. +onsideración cl#nica y 6uicio profesional debe aplicarse a cualquier resultado de prueba de drogas, particularmente al mane6ar resultados positivos. Los inmunoensayos en orina para detección de drogas se han convertido en uno de los métodos más aceptados para rastreo eaminación preeliminar. Estos ensayos permiten a los laboratorios eliminar una gran cantidad de espec#menes negativos y enfocarse en una cantidad menor de muestras inicialmente positivas La prueba nstantJ9ie es un inmunoensayo cromatográfico de flu6o lateral de un paso con tiras reactivas que incluyen 5 3na almohadilla con6ugada color vino que contiene anticuerpos antidrogas y <5 una membrana de nitrocelulosa que contiene una L#nea ) 4)est Line o L#nea de Eamen5 y L#nea + 4l#nea de control5. La l#nea ) es revestida con el ant#geno de droga" La l#nea + es revestida con Anticuerpo g;. Esta prueba es un inmunoensayo de uniones competitivas.
La droga o el metabolito de droga en el espécimen de orina compite con el Ant#geno cubierto en la membrana de nitrocelulosa para los sitios de unión limitada de los anticuerpos con6ugados. +uando una cantidad de orina adecuada es aplicada a la almohadilla de muestra en el dispositivo, la orina emigra por acción capilar a través de las tirillas reactivas. /i el nivel de droga en la muestra es inferior al punto de corte, la l#nea color vino tendrá que unirse con los ant#genos revestido en la membrana de nitrocelulosa y formar una L#nea ) color vino indicando un resultado negativo. /i el nivel de droga en la orina es igual o mayor al punto de corte del eamen, se unirá con los anticuerpos con6ugados de manera que ninguna L#nea ) se forme, indicando as# un resultado positivo. La L#nea + deberá formarse independientemente si hay o no presencia de la droga a eaminar. )etrahidrocanabinol 4)*+, JJ)*+, JJ)*+5, es el más activo de los principales componentes, as# como el principal metabolito de canabinóides, tales como marihuana y hashish. Los canabinóides se han utili!ado como un depresivo del sistema nervioso central. La sobredosis y el uso continuo de canabinóides pueden llevar al abuso de la sustancia, lo cual puede causar daGo severo yIo permanente al sistema nervioso humano. La detección de )*+ en orina humana ha sido mayormente utili!ado para encontrar el abuso de canabinóides. O"L8O"E /e reali!aron etracciones 4etérea ácida, etérea básica y clorofórmica5 para la etracción de alcaloides en una muestra de orina, la etracción etérea básica da una mayor cantidad de alcaloides ya que el p* básico permite que los alcaloides de6en su forma de sales y pasen a su forma básica, la cual es completamente soluble en solventes orgánicos. Esta etracción se diferencia de la etracción clorofórmica que también se encuentra a p* básico ya que el éter es menos polar que el cloroformo, las bases de los alcaloides se disuelven me6or en solventes que son menos polares. Las pruebas presuntivas no arro6aron resultados concluyentes ya que en general estas dependen de la apreciación de los colores de los individuos que evalúen las pruebas. :ara ello se reali!ó la prueba de &andelin pudiendo determinar parcialmente, la presencia de algunos alcaloides, pero se debe tomar en cuenta que esto no demuestra la presencia como tal de alcaloides ya que pudiera haber otras sustancias que interfieran con el resultado. :ara ello se reali!ó la prueba de inmunoensayo la cual confirmó la presencia de )*+, resultando lógico debido al tratamiento 4infusión5 que se le dio a la muestra. ;E0E;E"8 S ;alagovs-y L. 4<==<5 2Tu#mica orgánica, Hundamentos teoricoJprácticos para el laboratorio7, Eudeba. EspaGa. :p. UVJV< S >u-ins-li.+. 4<===5 Harmacognosia, estudio de las drogas y sustancias medicamentosas de origen natural7 (arcelona, Ediciones Nmega.pp. F
S HLN%E/, E. 4<==5. Estudios farmacognósticos y fitoqu#micos. 3niversidad 1acional de )ru6illo. :erú. S LNN&/, ). 4F.5 2Hundamentos de toicolog#a7. EspaGa$Acrivia.
